(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞ＤＮＡ中に導入するための組換えベクターにおいて：
a）標的細胞中に感染し、発現を指令することができるレトロウイルスベクターのＤＮＡと、
b）少なくとも１つの配列が、哺乳動物の腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、少なくとも１つの天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列とを
機能的に結合して含有してなる組換えベクターであって、
前記天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列が、メリチン、プレメリチン、セクロピン、プレセクロピン、プレプロセクロピンもしくはマガイニン、またはこれらの組み合わせのアミノ酸配列をコードする組換えベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えベクターであって、
前記組換えベクターが、
a)Ｕ３−Ｒ−Ｕ５構造を含む５’ＬＴＲ領域と、
b)少なくとも１つの配列が、哺乳動物の腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、少なくとも１つの天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列と、
c)完全にまたは部分的に欠失されたＵ３領域を含む３’ＬＴＲ領域であって、前記欠失されたＵ３領域が、プロモーター変換を受けるようにポリリンカー配列により置換されており、Ｒ領域およびＵ５領域がこれに続いている３’ＬＴＲ領域とを
機能的に結合して含有してなる組換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えベクターであって、天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする前記配列が、メリチン、プレメリチン、プレプロメリチン、セクロピン、プレセクロピン、プレプロセクロピン、マガイニン、アピダエシンもしくはデフェンシンペプチド、またはこれらの組み合わせのアミノ酸配列をコードする組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の組換えベクターであって、前記ポリリンカー配列が、少なくとも１つのユニークな制限部位、および／または少なくとも一つの前記レトロウイルスベクターのコーディング配列の発現を制御する制御要素および／またはプロモーターよりなる群の１つまたはそれ以上の要素から選択される、少なくとも１つの異種ＤＮＡ断片の挿入配列を具備する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えベクターであって、前記コード配列が、少なくとも一つのコーディング配列の発現を制御する制御要素および／またはプロモーターから選択される、少なくとも１つの非コード配列をさらに含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項４〜５の何れか１項に記載の組換えベクターであって、前記制御要素が、トランス作用性分子により制御可能である組換えベクター。
【請求項７】
請求項４〜５の何れか１項に記載の組換えベクターであって、前記制御要素および／またはプロモーターが、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、β−アクチン、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、Ｂ細胞またはＴ細胞特異的なプロモーターおよび腫瘍特異的なプロモーターの群から選択され、および／またはＨＩＶ、ＷＡＰ、ＭＭＴＶ、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター；炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含む、膵臓特異的な制御要素およびプロモーター；免疫グロブリンおよびＭＭＴＶリンパ球特異的制御要素およびプロモーターを含む、リンパ球特異的な制御要素およびプロモーター；およびグルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるかまたは乳腺に対して発現を指令するMMTVＰ２を含む、ＭＭＴＶ特異的な制御要素およびプロモーター；Ｔ細胞受容体遺伝子、ＣＤ４受容体プロモーターを含む、Ｔ細胞特異的な制御要素およびプロモーター；および免疫グロブリンプロモーターおよびｍｂ１を含む、Ｂ細胞特異的な制御要素およびプロモーターよりなる群の１つまたはそれ以上の要素から選択される組換えベクター。
【請求項８】
請求項１に記載の組換えベクターであって、前記レトロウイルスベクターのＬＴＲ領域が、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＭＳＶ、ＳＩＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＢＬＶおよびＭＰＭＶのＬＴＲよりなる群の少なくとも１つの要素から選択される組換えベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の組換えベクターであって、前記１以上のコード配列が、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコール脱水素酵素、ピューロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ヒグロマイシンおよび分泌アルカリ性ホスファターゼを含む、タンパク質をコードするマーカー遺伝子、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、チトクロームＰ４５０を含む、タンパク質をコードする治療用遺伝子、およびＰ．Ｔ．Ｏ．、ＳＤＩを含むタンパク質をコードする細胞周期制御遺伝子、またはｐ５３を含むタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、または抗増殖遺伝子、またはＩＬ−２を含むサイトカインよりなる群の１以上の要素から選択される組換えベクター。
【請求項１０】
組換えレトロウイルスベクター系において：
a)真核生物細胞ＤＮＡ中に導入するための組換えベクターにおいて：
aa)標的細胞中に感染し、発現を指令することができるレトロウイルスベクターのＤＮＡと、
bb)少なくとも１つの配列が、哺乳動物の腫瘍、ウイルス、細菌および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、少なくとも１つの天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列とを
機能的に結合して含有してなる組換えベクターであって、
前記天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列が、メリチン、プレメリチン、セクロピン、プレセクロピン、プレプロセクロピンもしくはマガイニン、またはこれらの組み合わせのアミノ酸配列をコードする組換えベクターと、
b)前記レトロウイルスベクターをパッケージングするために必要なタンパク質をコードする、少なくとも１つのレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を有するパッケージング細胞株とを
含有してなる組換えレトロウイルスベクター系。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えレトロウイルスベクター系であって、
前記組換えベクターが、
a)Ｕ３−Ｒ−Ｕ５構造を含む５’ＬＴＲ領域と、
b)少なくとも１つの配列が、哺乳動物の腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、少なくとも１つの天然に存在する治療用抗菌性ペプチドをコードする１以上のコード配列と、
c)完全にまたは部分的に欠失されたＵ３領域を含む３’ＬＴＲ領域であって、前記欠失されたＵ３領域が、プロモーター変換を受けるようにポリリンカー配列により置換されており、Ｒ領域およびＵ５領域がこれに続いている３’ＬＴＲ領域とを
機能的に結合して含んでなる前記レトロウイルスベクター系。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のレトロウイルスベクター系のパッケージング細胞株を、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組換えベクターでトランスフェクションすることにより産生されるレトロウイルス粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えレトロウイルス粒子で標的細胞を感染させることにより産生されるレトロウイルスプロウイルスであって、３’ＬＴＲ中のＵ３または前記ポリリンカーおよび該ポリリンカーに挿入された任意の配列が、感染標的細胞における逆転写の過程で複製されて、得られたプロウイルスの３’ＬＴＲと同様に５’ＬＴＲにも現れ、また５’ＬＴＲのＵ５が、感染標的細胞における逆転写の過程で複製されて、得られたプロウイルスの５’ＬＴＲと同様に３’ＬＴＲにも現れるレトロウイルスプロウイルス。
【請求項１４】
ヒト以外の動物細胞中にインビトロおよびインビボでヌクレオチド配列を導入するための方法であって、請求項１０に記載の組換えレトロウイルスベクター系により産生される組換えレトロウイルスで標的細胞集団を感染させることを具備する方法。
【請求項１５】
ヒトを含む哺乳動物の、腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患の遺伝子治療用の薬学的組成物を製造するための、請求項１に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１６】
ヒトを含む哺乳動物の、腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患の遺伝子治療用の薬学的組成物を製造するための、請求項１０に記載の組換えレトロウイルスベクター系の使用。
【請求項１７】
請求項１２に記載のレトロウイルス粒子を治療的有効量含有する薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３に記載のレトロウイルスプロウイルスのｍＲＮＡ。
【請求項１９】
前記組換えベクターが、ＲＮＡウイルスベクターである請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項２０】
請求項１２に記載のレトロウイルス粒子に感染した宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
本発明は、哺乳動物の腫瘍およびＨＩＶ感染のようなウイルス感染および細菌感染や真菌感染を治療するための、天然に存在する抗菌ペプチドまたはその誘導体をコードする配列を有する組換えベクターに関する。特に、本発明は、レトロウイルスベクターに関する。さらに、本発明は、このような配列を有し、且つプロモーター変換を受けるレトロウイルスベクター（プロコン（Procon）ベクター）に関する。これらのベクターは、腫瘍またはウイルス特異的な制御要素をも有するため、当該治療用抗菌ペプチドは、関係する患部細胞のみに送達されて発現し、無関係な周辺細胞には影響しない。
発明の背景
遺伝子欠損、癌およびウイルス感染症のような多様な疾患を治療するための遺伝子を細胞へ導入することが、遺伝子治療の主要な目的である。遺伝子治療を用いた多くの臨床プロトコールが現在進行中ではあるが、癌や、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の感染により引き起こされるＡＩＤＳのような疾患を治療するのはきわめて困難である。ハチ毒の主要成分である両親媒性ペプチドのメリチン（melittin）は、選択的抗癌活性（Sharma, 1992；Sharma, 1993）および抗ＨＩＶ活性（Wachingerら，1992）を有することが示されており、ベントン（Benton）らの米国特許第4,822,608号およびエルフル（Erfle）らのWO特許出願91/08753は、両者ともこれらの治療的特性に関するものである。
１９８９年４月１８日発行の、「ヒメノプテラ（HYMENOPTERA）毒またはそのタンパク質もしくはポリペプチド成分を含む薬剤を使用する、哺乳動物感染を治療するための方法および組成物」と題する、ベントンらの米国特許第4,822,608号は、ヒメノプテラ毒またはそのタンパク質もしくはポリペプチド成分のような、天然の二次物質が抗菌剤を増強する作用を有していることを教示している。この参照文献はさらに、このような組成物が、種々の疾患に対する抗ウイルス作用、制癌作用および抗癌作用をも増大させ得ることを示唆している。さらに詳細には、ベントンらの参照文献は、ミツバチ毒素の主要成分であるメリチンを、所定の感染症に対して抗菌活性を有する多彩な抗生物質と組合せて使用することを開示している。さらにこの参照文献は、メリチンと多彩な抗生物質とを種々の治療的有効量で組合せることにより、相乗的な効果が得られることを教示している。
エルフルらのWO特許出願91/08753は、哺乳動物のＨＩＶ感染症の治療方法および組成物に関する。さらに詳細には、ヒメノプテラ毒またはそのタンパク質もしくはポリペプチド成分を使用して、哺乳動物のＨＩＶ感染症を治療するための方法および組成物に関し、ここで各該組成物は哺乳動物宿主中に導入され、哺乳動物のＨＩＶ感染細胞におけるウイルス複製を制限または実質的に阻害するように作用する。
これらの研究では、精製メリチンペプチドが培養細胞に与えられているが、これは実験目的には有用であっても、治療には適切とはいえない。精製メリチンタンパク質のインビボ投与（例えば、静脈内）もまた、その治療レベルを維持するには比較的高い濃度および反復投与を必要とするため好ましくない。さらに、この種の全身投与は、この両親媒性ペプチドを、標的細胞のみならず他の細胞にも到達させて有害な副作用を引き起こす可能性があるため、メリチンまたは他の抗菌性ペプチド（詳細にはメリチンペプチドおよび以下に述べるペプチド）の送達をターゲティングできるようになれば有利となろう。
別の群に属する重要な治療用遺伝子としては、ヤママユガ（giant silk moths）のサナギから単離されたセクロピン類（cecropins）（Boman, 1995; Hultmarkら，1980）がある。メリチンに類似した構造の３つの主要なセクロピン類、即ち、セクロピンＡ、ＢおよびＤである（Hultmarkら，1980）。セクロピンＡおよびＢは、哺乳動物細胞に対して何ら明瞭な有害作用はなく、特異的な抗菌活性を示す（Steinerら，1981）。最近ムーア（Moore）と彼の共同研究者は、セクロピンＢ、Ｐおよびシバ−１（Shiva-1）抗菌性ペプチドが、種々の腫瘍細胞株に対して抗癌活性を示すことを証明している（Mooreら，1994）。
セクロピン類は、生きた非病原性菌による誘導を行った後、ヤママユガのヒアロフォラ・セクロピア（Hyalophora cecropia）の血リンパから最初に単離された。主要な昆虫セクロピン類（Ａ、ＢおよびＤ）は、３５〜３７残基の長さで、システインを含まず、柔軟なグリシン−プロリン結合により中性のＣ末端に結合した強塩基性Ｎ末端を有する。ＮＭＲにより推定されるセクロピンＡの全体構造は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏヒンジによりつながれた２つのほぼ完全な両親媒性セグメントである。ブタの小腸からセクロピン様３１残基ペプチド（セクロピンＰ1）（Leeら，1989）単離されたことは、セクロピン類が動物界に広く存在することを示唆している。セクロピン類の作用機作としては、膜におけるチャネル形成およびこれに続く細胞溶解が想定されている。
ＳＢ−３７（セクロピンＢに近い類縁体）およびシバ−１（セクロピンＢと約４０％の配列相同性を共有し、且つ同じ電荷分布および疎水性を保持するセクロピンＢ類縁体）は、幾つかの哺乳動物の白血病およびリンパ腫細胞株をインビトロで細胞溶解することが証明されている。1994年のムーアらの発表は、完全な開示のために、ここで引用することにより本明細書の一部とされる。同様な抗腫瘍効果が、類縁抗菌性ペプチド群であるマガイニン類（magainins）について証明されている（Crucianiら，1991; Ohaskiら，1992）。
遺伝子治療のためのレトロウイルスベクター（ＲＶ）の使用は多くの関心を集めており、現在、治療用遺伝子を導入するための方法として、欧米の種々の承認されたプロトコール中で選択されている（Kotaniら，1994）。しかし、これらのプロトコールの多くは、治療用遺伝子を有するＲＶにより標的細胞をインビトロで感染させ、首尾よく感染した細胞を次に患者個体に戻すことを必要とする（Rosenbergら，1992; 総説についてはAnderson, 1992を参照のこと）。標的細胞集団を容易に単離することができる場合（例えば、リンパ球）には、このようなエキソビボ（生体外）遺伝子治療プロトコールが、病状を改善させるのに最適である。さらに、標的細胞のエキソビボ感染では、使用前に厳密な安全性試験を実施した濃縮ウイルスを大量投与することが可能である。
残念ながら、遺伝子治療が可能な適応症のうち、容易に単離し、培養し、次いで再導入できる標的細胞が関与しているのは極く僅かにすぎない。さらに、エキソビボ遺伝子治療の複雑な技術およびそれに伴う高いコストのため、世界中で汎用されることは事実上不可能となっている。将来、容易で且つ費用効果の高い遺伝子治療を行うためには、注射またはＲＶ産生細胞の単純な移植の形でウイルスベクター、またはウイルスベクターを産生する細胞を患者に直接投与するインビボのアプローチが必要とされるであろう。
この種のインビボアプローチは、当然ながら種々の新たな問題を提起する。まず第一に、全てに優先して、安全性の問題に取り組む必要がある。おそらく、ウイルスは、ウイルス産生細胞の移植により産生されるので、産生されるウイルスを前もって検査する機会はないであろう。このようなシステムの使用に伴う明確な危険性を認識し、さらにこの危険性を最小限にする新たなシステムを作るように努めることが重要である。
多くの細胞内プロトオンコジーンは、感染細胞のゲノム中にプロウイルス型レトロウイルスゲノムが本質的にランダムに組込まれ、それらの挿入で活性化されることにより同定されてきた（Varmus, 1988）。他の既存症状を治療するための治療用遺伝子を有するＲＶを用いて治療された患者において、同様の機作により癌が引き起こされるかもしれないという可能性が、再燃する倫理上の問題を提起してきた。多くの研究者は、現在用いられている全てのＲＶのように、複製能が欠損したＲＶが、細胞増殖の制御に関与している細胞遺伝子中またはその近傍に組込まれる可能性は、非常に小さいということを認めている。しかし一方、単一の感染から複製能のあるレトロウイルス集団が爆発的に増加すると、最終的にこのような表現型の組込みを本当に実現可能なものとするのに十分な組込みが起き得るとも考えられている。
レトロウイルスベクター系は、複製能を有するウイルスが生じる確率が最小限になるように至適化がなされる。しかし、ＲＶ系の成分間の組換え事象によって、病原性の可能性をもった複製能を有するウイルスが発生し得ることが詳細に報告されており、それ故、多くの世代のベクター系は組換えの危険をが最小になるように作成されている（SalmonsとGuenzburg, 1993に総説されている）。しかしながら、これらの組替え事象の具体的確率に関してはほとんど知られていない。このウイルスベクター系または他のウイルスベクター系に伴う危険をゼロに低下させることは不可能であろうから、情報に基づき、危険性−受益性の決定を常に行う必要がある。すなわち、（１）レトロウイルス組込みによる単一遺伝子の挿入分裂または活性化、および（２）現世代パッケージング細胞株において、組換えにより複製能を有するウイルスが発生する危険の確率を経験的に決定することが非常に重要になってくる。これらの事象の発生機作を詳細に検討することにより、これらの事象を制限すべくデザインされた新しいタイプの系を作成することが可能となろう。
インビボ遺伝子治療の実際的な観点、即ち、安全性、ならびに効率および純粋に実用的な面から考慮すべきは、ＲＶのターゲティングである。ベクターが有する治療用遺伝子は、必要な標的細胞でのみ発現されるべきであり、全組織および細胞で無差別に発現されてはならないことは明らかである。導入すべき遺伝子が、特定の腫瘍細胞を除去することを目的とする毒素遺伝子であるならば、このことは特に重要である。他の非標的細胞の除去は、明らかに非常に有害であろう。伝達される治療用遺伝子の発現のターゲティングは、種々の方法により達成することができる。
レトロウイルス系は、２つの成分よりなる（図１）：
１）レトロウイルスベクター自体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が標的細胞に導入すべき治療用遺伝子（場合によりマーカー遺伝子を含む）により置換されている改変レトロウイルス（ベクタープラスミド）である。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換により、ウイルスは顕著に不活性化するため、この系の第２成分を補って、失われたウイルスタンパク質を改変レトロウイルスに提供し、前記ウイルスを救出する必要がある。
第２成分は、
２）大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製能を有するウイルスを産生する能力は欠いている細胞株である。この細胞株は、パッケージング細胞株として知られており、改変レトロウイルスベクターをパッケージすることができる遺伝子を含む第２プラスミドでトランスフェクションされた細胞株である。このプラスミドは、ビリオン産生に必要なウイルスタンパク質の合成を指令する。
パッケージされたベクターを作成するためには、ベクタープラスミドをパッケージング細胞株中にトランスフェクションする。これらの条件下で、挿入された治療用遺伝子（場合によりマーカー遺伝子も）を含む改変レトロウイルスゲノムは、ベクタープラスミドから転写されて、改変レトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）中にパッケージングされる。このような組換えウイルス粒子に感染した細胞は、これらの細胞にウイルスタンパク質が存在しないため、新規なベクターウイルスを産生することができない。しかし、治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を有するベクターは存在し、これらは感染細胞中で発現することができる。
発明の目的
本発明の目的は、抗腫瘍、抗ウイルス、抗菌および／または抗真菌活性を有する新規な治療薬を提供することである。
本発明のさらなる目的は、選択された標的細胞に対して高い選択性を有し、かつ有害な副作用の少ない新規な治療薬を提供することである。
本発明
前述および他の目的を達成するために、本発明は、真核生物細胞ＤＮＡ中に導入するための組換えベクターであって、ａ）標的細胞中で感染および発現を指令することができる、ベクターのＤＮＡまたはベクターの少なくとも一部に対応するＤＮＡと；ｂ）少なくとも１つの配列は、哺乳動物の腫瘍、ウイルス、細菌および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、少なくとも１つの天然の治療用抗菌性ペプチドまたはその誘導体をコードする、１以上のコード配列を、機能的に結合して含有するベクターを提供する。
前記ベクターは、好ましくは複製欠損である。
天然の治療用抗菌性ペプチドまたはその誘導体をコードする前記配列は、このような抗菌性ペプチドの全部、一部、類縁体、相同体、組換え体またはその組合せのアミノ酸配列をコードする。
前記配列は、好ましくは非コード配列をも含む。
抗菌性ペプチドまたはその誘導体には、メリチン、種々のセクロピン類およびマガイニン類をコードするものが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらにアピダエシン（apidaecin）およびデフェンシン（defensin）ペプチド類またはその誘導体も含まれる。これらの遺伝子はそのプレプロ型、遺伝子工学により作出されたプレ型、生物学的活性を有するペプチドを与える形態、またはその誘導体の形態で発現させることができる。
前記配列は、好ましくはメリチン、セクロピン、マガイニン、アピダエシンおよびデフェンシン遺伝子の、全部、一部、および類縁体、相同体、誘導体、組換え体またはその組合せのアミノ酸配列をコードする組換え分子である。
ベントンらの先行技術の参照文献に詳述されているように、ミツバチ毒素の主成分であるメリチンは、実質的に２６アミノ酸残基を含むポリペプチドである。これらのアミノ酸残基は、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを含んでいる。さらに、少なくとも最後の６個（Ｃ末端）のアミノ酸が、６個のグリシン残基により置換、改変されているメリチン類縁体は、メリチンに似た治療的有用性を有するようであり、これらのアミノ酸類縁体は、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの構造を有する。ＨＩＶ感染症の治療のためのメリチンの使用は、完全な開示のため参照文献として本明細書に組込まれえうエルフルらのWO特許出願91/08753に開示されている。
本発明の好適な実施態様によれば、前記メリチンの構造類縁体は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるか、または、さらに好適な実施態様によれば、メリチン様のＡｍｆｉｌまたはＡｍｆｉ２およびＧＰ４１ペプチド類である。
本発明のさらに好適な実施態様によれば、治療用抗菌性ペプチドをコードする配列は、ヒメノプテラ毒、ヒメノプテラ毒の少なくとも１つの活性タンパク質成分、ヒメノプテラ毒の少なくとも１つのポリペプチド成分、およびこれらの混合物をコードする。
ヒメノプテラ遺伝子は、好ましくは、ミツバチ毒、マルハナバチ（bumble bee）毒、スズメバチ（yellow jacket）毒、クロスズメバチ（bald-faced hornet）毒、前記毒の活性タンパク質成分、前記毒の活性タンパク質成分、およびこれらの混合物をコードする遺伝子からなる群から選択される。
さらには、メリチンの構造類縁体には、シグナルペプチドおよび活性化ドメインを含むか若しくは含まない両親媒性らせんが含まれる。
好適な実施態様において、当該組換えベクターは、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターから選択される。ウイルスベクターの例は、ＲＮＡウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターである。特に好適なＲＮＡウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり、特にプロコンベクターである。ＤＮＡウイルスベクターの例は、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルスおよびヘルペスウイルス由来ベクターである。プラスミドベクターには、全ての真核生物性発現ベクターが含まれる。
本発明の好適な実施態様において、当該組換えベクターは、レトロウイルスベクターである。
レトロウイルスゲノムは、Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒの構造を有するＲＮＡ分子からなっている（図１）。逆転写の過程で、Ｕ５領域は二重に複製されて、生成したＤＮＡ分子の右側末端に置かれ、一方、Ｕ３領域は二重に複製されて、生成したＤＮＡ分子の左側末端に置かれる（図１）。生じた構造Ｕ３−Ｒ−Ｕ５はＬＴＲ（長い末端反復配列（Long Terminal Repeat））と呼ばれ、したがって同一であり、ＤＮＡ構造またはプロウイルスの両方の末端で繰り返される。プロウイルスの左側末端のＵ３領域は、プロモーターを有する。このプロモーターは、左側のＵ３領域とＲ領域の間の境界で開始して右側のＲ領域とＵ５領域の間の境界で終結するＲＮＡ転写の合成を推進する（図１）。このＲＮＡは、レトロウイルス粒子にパッケージされて、被感染標的細胞中に輸送される。標的細胞において、ＲＮＡゲノムは、上述のように再度逆転写される。
本発明の別の実施態様によれば、右側Ｕ３領域は改変されている（図３）が正常な左側Ｕ３構造が維持されている（図３）、プロモーター変換ベクター（プロコンベクター）を作成することができる；このベクターは、左側Ｕ３領域に位置する正常レトロウイルスプロモーターを利用して、正常にＲＮＡに転写することができる（図３）。しかし、生成したＲＮＡは、改変された右側Ｕ３構造を含有するのみである。感染標的細胞において、逆転写後、この改変Ｕ３構造はレトロウイルス構造の両末端に置かれる（図３）。
改変領域が、Ｕ３領域の代わりにポリリンカーを有するならば、ＷＡＰプロモーターのような組織特異的な発現を指令するプロモーターを含む如何なるプロモーターをも容易に挿入することができる。次にこのプロモーターは、レトロウイルスベクターに結合されて送達された遺伝子を発現するために、専ら標的細胞で利用される。これに代えて、またはこれに加えて、１以上の細胞内配列に対して相同的なＤＮＡセグメントを、遺伝子ターゲティングの目的でポリリンカー中に挿入することもできる。
パッケージング細胞株において、レトロウイルスベクターの発現は、このように正常な非選択性のレトロウイルスプロモーターにより制御される（図３）。しかし、ベクターが標的細胞に入ると直ちに、プロモーター変換が起こり、治療用遺伝子は、ポリリンカー中に導入される選択された組織特異的なプロモーターの制御下で発現される（図３）。実質的に如何なる組織特異的なプロモーターをもこの系に含めて、広い範囲の異なる細胞型に選択的なターゲティングを提供することができるだけでなく、変換後のレトロウイルスベクターの構造および性質は、もはやウイルスのそれとは異なったものとなる。当然ながら、通常のまたは現状のレトロウイルスベクターが、パッケージングベクターにより容易に遺伝子の組換えを受けて、病原性ウイルスを産生する可能性があるため、このことは安全性の観点から極めて重要である。プロモーター変換（プロコン）ベクターは、変換後はもはやＵ３レトロウイルスプロモーターを有していないためレトロウイルスとは異なり、このため、遺伝子の組換えの可能性が低下している。
プロコンベクターを完全に開示するため、１９９４年９月２日に出願されたデンマーク出願DK 1017/94が本出願中に完全に含められる。
したがって、本発明のさらに別の好適な実施態様においては、Ｕ３−Ｒ−Ｕ５の構造の５’ＬＴＲ領域と；少なくとも１つのコード配列は、哺乳動物の腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための、天然の抗菌性ペプチドまたはその誘導体（このような抗菌性遺伝子の一部、類縁体、相同体、組換え体またはこれらの組合せ）をコードする、１以上のコード配列と；完全にまたは部分的に欠失したＵ３領域（欠失したＵ３領域は、ポリリンカー配列により置換されており、Ｒ領域およびＵ５領域がこれに続いている）を含む３’ＬＴＲ領域とを含んでなる、プロモーター変換を受けるレトロウイルスベクター（プロコンベクター）が提供される。
また、本発明のさらに別の好適な実施態様においては、Ｕ３−Ｒ−Ｕ５構造を含む５’ＬＴＲ領域と、完全にまたは部分的に欠失したＵ３領域を含む３’ＬＴＲ領域とを機能的に結合して含有するレトロウイルスベクターが提供される。ここでは、前記欠失したＵ３領域は、１つまたはそれ以上のコード配列により置換されており、Ｒ領域およびＵ５領域がこれに続いている。前記コード配列の少なくとも１つの配列は、ウイルスプロモーターまたは異種プロモーターのいずれかから発現される、哺乳動物の腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療するための天然の抗菌性ペプチドまたはその誘導体をコードする。
本発明において「ポリリンカー」という用語は、如何なるプロモーターまたはＤＮＡセグメントの挿入をも容易にする多くのユニークな制限部位をもった人工的に合成した短いＤＮＡの区間（stretch）について使用される。「異種」という用語は、通常は天然には密接に関連して見い出されることはない任意のＤＮＡ配列の組合せについて使用される。
プロコンベクターとの関連において言及するとき、前記ポリリンカー配列は、少なくとも１つのユニークな制限部位を有し、好ましくは少なくとも１つの異種ＤＮＡ断片を挿入配列として含有する。前記異種ＤＮＡ断片は、好ましくはその発現が標的細胞に特異的な制御要素およびプロモーターから選択される。レトロウイルスプロモーター構造は、ＬＴＲと呼ばれる。ＬＴＲは、標的細胞のゲノムに出入りすることを可能にするシグナルを有する。このような出入りによって移動し得る要素はまた、病原性変化の原因にもなり得る。プロコンベクターは、出入りに必要なシグナルを持たない改変ＬＴＲを有することができる。繰り返すが、このことは、これらのベクター系の潜在的な安全性を増大させる。
遺伝子発現は、プロモーターにより制御される。プロモーター機能の非存在下では遺伝子は発現されない。正常なＭＬＶレトロウイルスプロモーターは、ほとんどの細胞型において活性である点で、ほぼ非選択性である。しかし、非常に特異的な細胞型でのみ活性を示す多くのプロモーターが存在している。このような組織特異的なプロモーターは、レトロウイルスベクターにおける遺伝子発現の制御のための理想的な候補であリ、治療用遺伝子の発現を特異的な標的細胞に限定する。
標的細胞に特異的な制御要素およびプロモーターは、好ましくは、ヒト乳癌を標的として使用することができる、乳漿酸性タンパク質（Whey Acidic Protein）（ＷＡＰ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター；炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含む、膵臓特異的な制御要素およびプロモーター；ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、免疫グロブリンおよびＭＭＴＶリンパ球特異的制御要素およびプロモーターを含む、リンパ球特異的な制御要素およびプロモーター；グルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるかまたは乳腺に対して発現を指令するMMTVＰ２のようなＭＭＴＶ特異的な制御要素およびプロモーター；Ｔ細胞受容体遺伝子およびＣＤ４受容体プロモーターのような、Ｔ細胞特異的な制御要素およびプロモーター；免疫グロブリンプロモーターまたはｍｂ１のような、Ｂ細胞特異的な制御要素およびプロモーターよりなる群の１以上の要素であるが、これらに限定されるものではない。前記制御要素およびプロモーターは、好ましくは、前記レトロウイルスベクターの少なくとも１つのコード配列の発現を制御する。
ＬＴＲ領域は、好ましくは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス肉腫ウイルス（Murine Sarcoma Virus）（ＭＳＶ）、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＥＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）およびメイソン−ファイザー−モンキーウイルス（Mason-Pfizer-Monkey virus）（ＭＰＭＶ）のＬＴＲよりなる群の少なくとも１つの要素から選択されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の抗菌性遺伝子は、ＨＩＶ感染細胞をターゲティングするために、例えばＨＩＶ ｔａｔ応答性要素（ＴＡＲ）の制御下にあるＨＩＶプロモーターまたは最小プロモーターの転写調節下に置かれる。ＨＩＶプロモーターは、ＨＩＶがコードする自己制御性タンパク質であるＴａｔ（Haseltine, 1991）の存在に依存するため、ターゲティングが達成される。すなわち、ＨＩＶに感染してＴａｔを発現する細胞のみが、プロコンベクターに導入された両親媒性ペプチドを産生することができる（図２）。あるいは、前記両親媒性ペプチドは、ＣＤ４またはＴ細胞受容体遺伝子由来のプロモーターのような、Ｔ細胞特異的なプロモーターから発現させることもできるであろう。腫瘍細胞をターゲティングするためには、これらの細胞において過剰発現することが知られている遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ）からのプロモーターを使用することができる。
本発明の抗菌性遺伝子はまた、当該分野で既知の他のプロモーターの転写調節下に置くこともできる。このようなプロモーターの例として、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus）、β−アクチン、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、Ｂ細胞またはＴ細胞特異的なプロモーターおよび腫瘍特異的なプロモーターがある。
本発明の１つの実施態様において、レトロウイルスベクターは、ＢＡＧベクター（Priceら，1987）であるが、他のレトロウイルスベクターも含む。
本発明の好適な実施態様によれば、レトロウイルスの組込みに関与するレトロウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つのレトロウイルス配列は、改変されるか、または少なくとも部分的に除去されている。
前記異種ＤＮＡ断片は、好ましくは、１つまたはそれ以上の細胞内配列に対して相同性を有する。制御要素およびプロモーターは、好ましくは、トランス作用性分子により制御可能である。
本発明のさらなる実施態様においては、第１成分として前記したレトロウイルスベクターと；前記レトロウイルスベクターをパッケージングするために必要なタンパク質をコードする、少なくとも１つのレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を有するパッケージング細胞株とを含む、レトロウイルスベクター系が提供される。
パッケージング細胞株は、前記レトロウイルスベクターにおいてコードされないレトロウイルスタンパク質をコードする、レトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を含んでいる。パッケージング細胞株は、好ましくは、ψ２、ψ−Ｃｒｉｐ、ψ−ＡＭ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＰＡ３１７およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ−１２よりなる群の要素から選択される。
上記のレトロウイルスベクター系において本発明の前記レトロウイルスベクターを複製することにより、レトロウイルス性プロウイルスが得られる。ここで、３’ＬＴＲの前記ポリリンカーおよび該ポリリンカーに挿入された任意の配列は、感染標的細胞での逆転写の過程で複製されて、得られたプロウイルスの３’ＬＴＲと同様に５’ＬＴＲ中にも現れる。
本発明のレトロウイルスベクターとは、ＤＮＡ配列レベルでの、ＤＮＡ配列レトロウイルスベクターを意味する。
しかし本発明はまた、レトロウイルス性プロウイルスおよび本発明のレトロウイルス性プロウイルスのｍＲＮＡ並びに本発明によるレトロウイルスベクターおよびそのｃＤＮＡから得られる如何なるＲＮＡをも含む。
本発明のさらに別の実施形態は、ヒトまたは動物細胞中にインビトロおよびインビボで同種および／または異種のヌクレオチド配列を導入するための非治療的または治療的な方法であって、本発明のレトロウイルスベクター系のパッケージング細胞株を、本発明のレトロウイルスベクターでトランスフェクションすることと、該パッケージング細胞株により産生される組換えレトロウイルスで、標的細胞集団を感染することとを含む方法を提供する。上記ヌクレオチド配列は、治療用抗菌性ペプチド、制御配列およびプロモーターをコードする遺伝子または遺伝子の一部よりなる群の１つまたはそれ以上の要素から選択される。
当該レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター系およびレトロウイルスプロウイルス並びにそのＲＮＡは、ヒトを含む哺乳動物における体細胞遺伝子治療用の薬学的組成物を製造するために使用される。さらにこれらは、相同性な細胞内配列中への、ターゲティングされた組込みを行うために使用される。
ターゲティングされた遺伝子発現のためのプロコンベクターの構築の原理
ＢＡＧとして知られているマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター（Priceら，1987）において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ＬＴＲのＵ３領域の無差別な（すなわち、非組織特異的な）ＭＬＶプロモーターにより作動する（図３）。本発明の１つの実施態様に従って、３’ＬＴＲ内に位置するＭＬＶプロモーター（Ｕ３）（図３）が欠失し、且つポリリンカー（このポリリンカーは、異種プロモーターの容易な導入を可能にする）で置換された、ＢＡＧベクターの誘導体が作成された。このＵ３を欠いたＢＡＧベクターは、パッケージング細胞株に導入されると、５’ＬＴＲ内のＭＬＶプロモーター（Ｕ３）から発現される。その生活環において起こるレトロウイルスゲノム中での再配列の結果、標的細胞への感染後、ポリリンカーは、上述のようにレトロウイルスゲノムの両方末端に重複して配置される。こうして、ＢＡＧのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が、標的細胞中では、ポリリンカーまたはポリリンカー中に挿入された任意のプロモーターにより調節される、レトロウイルスベクターを構築することができる（図３）。
さらに、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をメリチン、セクロピンまたは別の抗菌性ペプチドをコードするような治療用遺伝子で置き換えると、任意の挿入されたプロモーターからこの遺伝子を発現させるように、レトロウイルスベクターを操作することができる。
組織特異的なプロモーターおよびＨＩＶからのｔａｔ応答性要素（ＴＡＲ）のような制御要素を有するプロコンベクターは、所定の細胞型、組織および器官において、治療用の天然抗菌性ペプチド配列またはその誘導体の発現を行わせるのに有用であろう。治療用配列の候補としては、メリチン（抗ＨＩＶおよび抗腫瘍作用を有する）、セクロピンおよびマガイニンの配列、およびチミジンキナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびシトシンデアミナーゼ遺伝子を含んだ、細胞死の誘因となる配列を含む。
図  面
図１：レトロウイルスの逆転写の様式を示す図。
図２：メリチンおよびセクロピンをコードする配列を有するレトロウイルスベクター構築物を示す図。
図３：Ｕ３減損ＢＡＧベクター（ＭＬＶ）の構築を示す図。
図４：プレプロセクロピンＡ（PreProCecropin A）遺伝子を有するレトロウイルスベクターｐ１２５．Ｃｅｃｒ．Ａの構築を示す図。
図５：各々プレメリチン（PreMelittin）およびプレプロメリチン（PreProMelittin）遺伝子を有するレトロウイルスベクターｐＢＡＧｐＭｅｌおよびｐＢＡＧｐｐＭｅｌの構築を示す図。
図６：ｐＢＡＧｐＭｅｌおよびｐＢＡＧｐｐＭｅｌを示す図。
図７：ｐＢＡＧを示す図。
図８：トランスフェクションしたセクロピンおよびメリチンクローンのＳ１解析の原理を示す図。
図９：Ｓ１解析：ＰＡＧＥゲル電気泳動およびホスフォイメージング（Phospho-imaging）の表示を示す図。
図１０：プレプロセクロピン（PreProCecropin）をコードする配列を有するレトロウイルスベクターの抗腫瘍活性を示す図。
図１１：メリチンをコードする配列を有するレトロウイルスベクターの抗腫瘍活性を示す図。
図１２：セクロピンおよびメリチンをコードする配列を有するレトロウイルスベクターの、ＨＩＶ ＬＴＲからの発現のダウンレギュレーションを示す図。
図１３：セクロピンをコードする配列を有するレトロウイルスベクターの、ＨＩＶ ＬＴＲの発現のダウンレギュレーションを示す図。
図１４：セクロピンおよびメリチンをコードする配列を有するレトロウイルスベクターによる、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）からのＬＴＲのダウンレギュレーションを示す図。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。しかし、明らかな改変並びに他の修飾および置換が当業者には明らかであるから、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
本発明を実施するのに使用される組換えＤＮＡ法は、当業者には周知の標準法であり、例えば、「分子クローニング（Molecular Cloning）」、サムブルック（Sambrook）ら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、（１９８９年）およびB. Perbal、「分子クローニングへの実際的ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）」、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）（１９８４年）に詳細に記載されている。
実施例
プレプロセクロピンＡ配列を有するレトロウイルスベクターの作成
ｐ１２５ｇａｌの作成
ＢＡＧとして知られているマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター（Priceら，1987）において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ＬＴＲのＵ３領域の無差別な（すなわち、非組織特異的な）ＭＬＶプロモーターにより作動する（図３）。ＰＣＲにより、３’ＬＴＲ中のＭＬＶプロモーター（Ｕ３）（図３）が欠失した、ＢＡＧベクター誘導体を作成する。この位置には、異種プロモーターを容易に導入できるようにするため、制限部位ＳａｃIIおよびＭｌｕＩを含有するポリリンカーを挿入する。このＵ３を欠いたＢＡＧベクターは、パッケージング細胞株に導入されると、５’ＬＴＲ内のＭＬＶプロモーター（Ｕ３）から発現される。その生活環において起こるレトロウイルスゲノム中の再配列の結果、標的細胞への感染後、ポリリンカーは、デンマーク特許出願1017/94号に記載されるようにレトロウイルスゲノムの両末端で重複して配置される。こうして、ＢＡＧのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が、標的細胞中で、ポリリンカーまたはポリリンカー中に挿入された任意のプロモーターにより制御される、レトロウイルスベクターを作成することができる（図３）。
ＭＭＴＶプロモーター、グルココルチコイドホルモン応答性領域、および乳腺に対して発現を指令する要素を有する領域全てを含む、逆方向反復配列を欠失させたマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）Ｕ３領域（ｍｔｖ−２）を、修飾ＢＡＧベクターのポリリンカー領域に挿入して、ｐ１２５ｇａｌを作成した（図４ａ）。
ｐ１２５ＣｅｃｒＡの作成
図４は、レトロウイルスベクターｐ１２５ＣｅｃｒＡの作成を例示する。図４ａに図示したプラスミドｐＣｅｃｒＡ（Bomanらから入手）は、細菌のｓｐ６プロモーターを前置してクローニングされた、ヤママユガ（ヒアロフォラ・セクロピア；Hyalophora cecropia）のプレプロセクロピンＡ遺伝子のｃＤＮＡを有する。プレプロセクロピン配列は、このプラスミドから、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅して得た：
プライマー１：ＣｅｃｒＡ１：５’−ＴＡＴＧＡＣＧＴＣ−ＴＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴ−３’
プライマー２：ＣｅｃｒＡ３：５’−ＧＧＣＡＧＡＴＣＴ−ＴＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＴ−３’
ＣｅｃｒＡ１は、５’延長部分にＡａｔII制限部位（ＧＡＣＧＴＣ）および３塩基対の保護（ＴＡＴ）を有する。同様にＣｅｃｒＡ３は、５’延長部分にＢｇｌII部位（ＡＧＡＴＣＴ）および３塩基対の保護（ＧＧＣ）を有する。
次にＰＣＲ産物（３７０塩基対）をＡａｔIIとＢａｌIIで消化して、クローニング用の制限部位を作成した（図４ｂ）。
ｐ１２５ｇａｌを制限酵素ＡａｔIIおよびＢａｍＨＩで消化することにより、５０４３塩基対の断片が得られ（図４ｂ）、これにｐＣｅｒｃＡから得たプレプロセクロピンＡ遺伝子を有する断片を連結した。これにより、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII部位を失ったｐ１２５．ＣｅｃｒＡが形成された（図４ｃ）。
プレプロメリチンおよびプレメリチン配列を有するレトロウイルスベクターの作成
図５は、レトロウイルスベクターｐＢＡＧｐＭｅｌおよびｐＢＡＧｐｐＭｅｌの作成を例示する。プラスミドｐＵＭ１３／４（Vlasak, R., Uger-Ullmann, C., Keil, G.およびFrischauf, A-M., ミチバチのプレプロメリチンをコードするクローン化ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，Eur. J. Biochem. 135:123-126(1989)）（図５ａ）は、アピス・メリフェラ（apis mellifera）からのプレプロメリチン遺伝子をコードするｃＤＮＡを有する。このプレプロメリチンおよびプレメリチン配列は、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅して得た：
プライマー１：  ５’−ＡＴＡＧＡＣＧＴＣ−ＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＧＡ−３’
プライマー２：  ５’−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣ−ＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＧ−３’
プライマー３：  ５’−ＴＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧ−ＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＡＡ−３’
プライマー３’：  ５’−ＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＣ−ＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴ−３’
プライマー１は、５’延長部分にＡａｔII部位（ＧＡＣＧＴＣ）および３塩基対保護（ＡＴＡ）を有し、またプライマー２は、５’延長部分にＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）および３塩基対保護（ＴＡＴ）を有する。
プライマー１および２を用いてプラスミドｐＵＭ１３／４に対してＰＣＲを行い、ＡａｔIIおよびＢａｍＨＩ部位を有するプレプロメリチン配列（図５ｂｉ）全体を増幅した後、ＡａｔIIおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドを消化すれば、レトロウイルスベクターｐＢＡＧ（図５ａ）中へクローニングすることが可能になる（図５ｃ）。生じたプラスミドｐＢＡＧｐｐＭｅｌを図６に示す。
プレメリチン配列の増幅は、従来法のＰＣＲと組換えＰＣＲを組合せて行った。プライマー３はメリチン遺伝子内に結合するが、Ｐｒｅ配列の３’配列に対応する５’延長部分を有する。同様にプライマー３’はＰｒｅ配列の３’配列内で結合するが、メリチン遺伝子の５’領域の配列に対応する５’延長部分を有する。最初プライマー対１と３’または２と３によりＰＣＲを行った。これら２つの反応の産物を、次に組換えＰＣＲを作成するために使用した。これは、プライマー３および３’が有する５’延長部分を使用して相互に２つのＰＣＲ産物をハイブリダイズさせる操作である。次に、ｐＢＡＧへのクローニングのためにＡａｔIIおよびＢａｍＨＩ部位を付加する、プライマー１および２の添加により、全プレメリチン配列の増幅を行うことができた（図５ｂii）。プラスミドｐＢＡＧｐＭｅｌ（図６）は、このＰＣＲ産物とｐＢＡＧを、ＡａｔIIおよびＢａｍＨＩで消化した後、これらの断片を連結することにより作成した。
クローンの単離
Ｅｊ細胞をｐ１２５．ＣｅｒｃＡでトランスフェクションして、ネオマイシン耐性を発現するクローンを単離した。単離した６つのクローンは、：セクロピンＡ１．４、セクロピンＡ１．７、セクロピンＡ１．８、セクロピンＡ１０．３、セクロピンＡ１０．４、およびセクロピンＡ１０．８であった。
同様にＥｊ細胞をｐＢＡＧｐＭｅｌとｐＢＡＧｐｐＭｅｌでトランスフェクションして、ネオマイシン耐性を発現するクローンを単離した。単離したプレメリチン遺伝子を含有する３つのクローンは、：プレメリチン１、プレメリチン４、およびプレメリチン６であった。単離したプレプロメリチンを含有する２つのクローンは、：プレプロメリチン１、およびプレプロメリチン５であった。
トランスフェクションしたセクロピン／メリチンクローンのＳ１解析
ｐＢＡＧをＳｐｅＩで消化し、これにより得られた６．１kb断片（３’ＬＴＲ、ポリオーマ初期領域（polioma early region)および５’ＬＴＲを含む）をプローブとして、Ｓ１解析を行った。次にこの断片をポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２Ｐで末端標識し、プレプロセクロピン（クローンＡ１．４、Ａ１．７、Ａ１．８、Ａ１０．４、Ａ１０．３、およびＡ１０．８）、プレメリチン（クローン１、４および６）、およびプレプロメリチン（クローン１および５）を有するレトロウイルスベクター構築物か、または空のベクター単独（ｐＢＡＧクローン３および６）でトランスフェクションした、ＥＪ（ヒト膀胱癌細胞株）細胞クローンから単離した全ＲＮＡとハイブリダイズさせた。
一本鎖核酸のみを切断する酵素であるＳ１ヌクレアーゼ消化すると（図８ｂ）、トランスフェクションしたクローンのゲノムＤＮＡ中に組込まれたレトロウイルスベクター由来のｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションにより生じた２８８塩基対断片が得られた。
次に、６％ポリアクリルアミドゲルを使用して分離を行い、ホスフォールイメージング（Phosphor-imaging）装置（フジ（Fuji）ＢＡＳ１０００）を用いてゲルの露光を行うと、図９に示すように目的のバンドが現れた。
抗腫瘍実験
多くの両親媒性ポリペプチドは、不活性なプレプロ型として合成される（Boman, 1995）。同時翻訳過程においてプレシグナルペプチドの切断を行うエンドペプチダーゼは、全ての細胞に存在すると考えられているが、プロメリチンを活性メリチン型に変換するプロテアーゼは、ある種の細胞にのみ存在するようである（Kreilら，1980）。
ヒト膀胱癌由来の細胞株であるＥＪは、免疫無防備状態の（immuno compromised）ヌードマウスに注射すると腫瘍を形成し、これが徐々に大きく増殖する（図１０）。前記のように得られたメリチンまたはセクロピン発現構築物を有するＥＪ細胞安定クローンの、ヌードマウスにおける腫瘍形成性について試験を行った。一般に、セクロピン、プレプロメリチン、またはプレメリチン遺伝子を有する細胞クローンは、マウスにおける腫瘍増殖速度を低下（図１０〜１１）させ、メリチンおよびセクロピンは両者とも抗腫瘍作用を有することが示されている。別の実験において（データは示していない）、４匹のマウスを用いてセクロピンＡ１．４クローンの試験を行ったが、１匹のみが腫瘍を示すにとどまった。
抗ウイルス活性
メリチンまたはセクロピン発現ベクター、または治療用遺伝子を持たないＢＡＧベクターを有するＥＪ由来細胞クローンと、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合したＨＩＶ ＬＴＲ（従ってＨＩＶプロモーター）を有する指示構築物（ＨＩＶ−ｌｕｃ）を、Ｔａｔを発現する別の構築物の非存在下または存在下でスーパートランスフェクションした。ＨＩＶプロモーター活性化するためにはＴａｔが必要であるため、Ｔａｔの非存在下では、予想通り全ての細胞クローンにおいてＨＩＶ−ｌｕｃ構築物からルシフェラーゼ活性はほとんど検出されなかった。これとは対照的に、Ｔａｔの存在下では、ＢＡＧまたはプロメリチン含有構築物を有する細胞クローンは、高レベルのルシフェラーゼ発現を示したが、プレプロメリチンまたはセクロピン発現構築物のいずれかでトランスフェクションした細胞クローンでは、ルシフェラーゼ発現をほとんど示さなかった（図１２および１３）。このことは、セクロピン、プレプロメリチンおよび程度は低いがプレメリチンが、ＨＩＶ ＬＴＲからのＴａｔ作動性発現を阻害することを示唆している。すなわち、感染細胞からのＨＩＶ産生は、治療用レトロウイルスベクターを有する抗菌性ペプチド遺伝子により阻害されるであろう。この作用により、ＨＩＶ感染細胞からのウイルス産生は消失すると予測される。
図１２および１３と同様の実験を図１４に示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を調節する異なる２種のＭＭＴＶ ＬＴＲ（Wintersbergerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2745-2749）を、ＭＬＶプロモーターの調節下に、プレプロセクロピンまたはプレプロメリチンのいずれかを発現する細胞中に、別個にスーパートランスフェクションした。これらの実験により、セクロピンのダウンレギュレーション作用は、ＨＩＶプロモーターに限定されず、別のレトロウイルスベクターにも及ぶことが示された。
結論として本発明は、メリチン類、セクロピン類およびマガイニン類を含む治療用活性ペプチドの遺伝子またはその誘導体を有するベクター構築物を含んでなる、ＨＩＶを含むレトロウイルス感染症、腫瘍、細菌およびウイルス感染症の治療用生成物を提供する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ−ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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