(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンによって触媒活性が影響されず、次の理化学的性質を有することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ：
（ａ）作用：Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸を基質として、Ｎ−アセチルノイラミン酸を産生する作用を有する
（ｂ）基質特異性：Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸を基質とするが、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびピルビン酸を基質としない
（ｃ）至適pH：７〜８
（ｄ）安定pH：４〜１２
（ｅ）作用適温：３０〜３７℃
（ｆ）安定温度範囲：０〜３０℃まで安定
（ｇ）阻害物質：ｐ−クロロメルクリ安息香酸及び塩化水銀
（ｈ）無機質の作用：１０ｍＭの塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）及び硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）により酵素活性は変化しない
（ｉ）分子量：ゲル濾過法による測定で１０６ｋダルトンにピークを示す。
【請求項２】
グルタチオンによって触媒活性が影響されないことを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ。
【請求項３】
エチレンジアミン四酢酸によって触媒活性が阻害されないことを特徴とする請求項１または２記載のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ。
【請求項４】
大腸菌に由来する請求項１乃至３のいずれかに記載のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びそれを用いることを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造方法に関する。
【０００２】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、その触媒活性がマンガン、カルシウムもしくはそれらのイオン、またはグルタチオンによって影響されず、またその活性がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害されないことを特徴とする新規な酵素である。
【０００３】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルノイラミン酸は、その誘導体及び重合体を含めて、近年医薬品の原料として注目されている。このため、従来からこのＮ−アセチルノイラミン酸を大量生産するための技術開発が行われてきており、現在、更に経済的な製造法の確立が求められている状況である。
【０００４】
かかるＮ−アセチルノイラミン酸を酵素的に製造する従来の方法として、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ及びエピメラーゼを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸を反応させる方法〔Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30, 827-828 (1991)〕、及びＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いて、強アルカリの条件下でＮ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸を反応させる方法等が挙げられるが、前者の方法は、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸への転換率が２８％と低く、また後者の方法は、比較的強いアルカリ条件下を使用するため、作業上の安全性、反応後の排水処理、機器の耐性等の観点からまだまだ改良の余地があった。
【０００５】
ところで、以前より、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成に関与する酵素としてＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（EC 4.1.3.19）の存在が知られている。このＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸とからＮ−アセチルノイラミン酸を合成する反応を触媒する酵素である。
【０００６】
かかる酵素は、中性領域でこの反応を触媒するため、少なくとも従来法による問題はなく、Ｎ−アセチルノイラミン酸の酵素的製造に有用であると考えられる。
【０００７】
しかしながら、現在まで見つけられたＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、病原菌の一種である髄膜炎菌に由来するものであり、その取得・調製の困難性から未だ単離精製されておらず、その工業的利用は難しいと考えられる〔ブラックロウ（Blacklow)ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry) 237, 3520-3526 (1962)〕。一方で、大腸菌の粗抽出物にＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性の存在が報告されている〔Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 371, 1101-1106 (1990); Glycobiology.1,93-100 (1990)〕が、これらの報告では、被検物として細胞抽出物（粗精製物）を用いている点、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を該酵素に対する非特異的測定法を使用して測っている点等から、測定している活性がＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼによるものであるという信憑性は低い。また、更に加えて、最近、大腸菌中のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの存在を否定する文献が発表されており〔Biochem. J. (1995) 308, 501-505〕、この中で、大腸菌中でのＮ−アセチルノイラミン酸合成はＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼではなく、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼが担っていると報告されている。
【０００８】
このような状況のもと、Ｎ−アセチルノイラミン酸を酵素を用いて工業的に製造するにあたって、有用な特性（理化学的、酵素的性質）を有する新規なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを発見し、該酵素を用いてＮ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造する反応系を確立することが求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸を基質としてＮ−アセチルノイラミン酸を産生する反応を触媒する酵素であって、新規な特性を有するＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、この新規Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いて、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸から、Ｎ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の下で鋭意検討を重ねた結果、大腸菌に、従来公知のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼとは異なる有用な特性を有する新規なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼが存在することを見いだして、これを単離・精製することに成功した。そして、該酵素が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成に有用であることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオン（以下、これらを総称して金属類ともいう。）によって触媒活性が影響されないことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。
【００１３】
また、本発明は、上記金属類の他、グルタチオンによっても触媒活性が影響されないことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。
【００１４】
更に、本発明は、エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡという。）によりその活性が阻害されないことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。
【００１５】
更にまた、本発明は大腸菌に由来する上記Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。
【００１６】
さらに本発明は、上記のいずれかのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸を基質として、Ｎ−アセチルノイラミン酸を産生する反応を触媒する酵素である。その反応は、具体的には下記の式で表すことができる。
【００１８】
【化１】
0003944866.tif 000002
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、上記反応を触媒する酵素であって、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンによって触媒活性が影響されないことを特徴とするものである。言い換えれば、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸を含む反応系に、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンのいずれか少なくとも一種が適当量存在するとしないとに関わらず、触媒活性が殆ど変化せず、これらの金属類が反応系に存在していなくても上記の反応を触媒する能力を十分発揮する酵素である。なお、ここで適当量とは、一般的に補因子（金属）要求性酵素において、触媒活性に必要とされる補因子（金属）の量を広く意味するが、具体的には〜５０ｍＭの濃度が例示される。
【００１９】
また、別の表現で言い換えると、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質として、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンを必要としないことを特徴とするものである。ここで活性化物質とは、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼに直接的または間接的に作用することにより、反応速度や平衡等を変化させて触媒活性（酵素活性）を高めるような物質を意味し、それがないと反応が進行しない「必須活性化物質」、なくても反応は進行するがあればさらに活性化される「非必須活性化物質」の両者を包含するものである。また、このような活性化物質として、他にマグネシウム、コバルト、カリウム、ナトリウム、銀、鉄またはそれらのイオンを含めることもできる。
【００２０】
従来公知の髄膜炎菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質として、マンガンまたはそれらのイオン等を必要とするものであり〔The Journal of Biological Chemistry. Vol.237, No.11, pp.3520-3526 (1962)等〕、この点で本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼと相違するものである。また、大腸菌に由来すると報告されているＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質としてカルシウムまたはそのイオンを必要としており〔Glycobiology Vol. 1, no.1, pp.93-100 (1990)等〕、この点で本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼと相違するものである。
【００２１】
また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、その触媒活性がグルタチオンによって影響されないことを特徴とするものである。言い換えると、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸を基質とする反応系に、グルタチオンが適当量存在するとしないとに関わらず、その触媒活性が変化しないことを特徴とするものである。ここで適当量とは、一般的にＳＨ化合物要求性酵素において、触媒活性に必要とされるＳＨ化合物の量を広く意味するが、具体的には〜１０ｍＭの濃度を例示することができる。
【００２２】
また、別の表現で言い換えると、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質（「必須活性化物質」、「非必須活性化物質」の両者を含む）としてグルタチオンを必要としないことを特徴とするものである。さらに、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、グルタチオンの他、β−メルカプトエタノール、システイン、ホモシステインによってもその触媒活性は影響されない。
【００２３】
この点、酵素の最適な活性化に、すなわち「非必須活性化物質」としてグルタチオン等が必要とされる髄膜菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼと相違するところである〔The Journal of Biological Chemistry. Vol.237, No.11,
pp.3520-3526 (1962)等〕。
【００２４】
また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、ＥＤＴＡの存在によってもその触媒活性が阻害されないという特性を有する。この特性もまた、ＥＤＴＡの存在によってその活性が阻害される、従来公知の髄膜炎菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼと著しく相違するところである〔The Journal of Biological Chemistry. Vol.237, No.11, pp.3520-3526, (1962)等〕。
【００２５】
このことは、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ2+などの金属イオンが酵素の触媒部位もしくは活性部位に結合等して活性の発現に関与するといった金属酵素ではないことを示唆している。
【００２６】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼには、上記特性を有する全ての酵素が包含されるが、さらに下記の表１に示される理化学的性質を有していることが好ましい。
【００２７】
【表１】
0003944866.tif 000003
かかる理化学的性質の測定条件の詳細については、後の実施例に記載する。なお、表１のうち、ｐＨ安定性について、ｐＨ４〜１２とは、最大活性を１００％とした場合に、その４０％以上の活性を維持しているｐＨ範囲を意味し、またｐＨ７〜１０とは、同様に９０％以上の活性を維持しているｐＨ範囲を意味する（図８参照）。
【００２８】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、前述するように、触媒活性がマンガン、カルシウムまたはそれらのイオンにより影響されないという性質、好ましくは、さらに加えて触媒活性がグルタチオンにより影響されないという性質、より好ましくはこれらの性質に加えて表１に記載する各種の理化学的性質を有するものであればよく、その由来等によって何ら制限されるものではない。
【００２９】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼとして、通常、ラット、ウシ、ヒトなどの哺乳類、微生物等に由来するものが挙げられるが、好ましくは、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis)以外の細菌に由来するものであり、さらに好ましくは大腸菌、とりわけ大腸菌Ｋ１に由来するものである。
【００３０】
また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、同様に上記特性を有するものである限り、その取得方法によって何ら限定されるものではない。
【００３１】
取得方法の一例としては、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを発現・産生する菌株を適当な培地で培養し、その培養菌体の細胞抽出液に含まれるＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを適当な方法で単離・精製する方法等が挙げられる。
【００３２】
この場合、用いられる菌株は、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを発現・産生し得るものであれば特に制限されることなく、また野生菌、変異株、組換体等の別も問わない。好ましくは大腸菌、より好ましくは大腸菌Ｋ１（Escherichia coli K1)（ＡＴＣＣ  ２３５１１）等が例示される。
【００３３】
培養は、微生物、好ましくは大腸菌の培養に通常用いられる栄養源を含む各種の培地で行うことができる。スケールアップが可能である等の点から好ましくは液体培地であり、より好ましくは硫酸アンモニウム０．５％、リン酸水素二カリウム１．４％、酵母エキス０．０５％、ソルビトール２％、硫酸マグネシウム０．１％を有する液体培地等が例示される。培養は、通常２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜１００時間、好ましくは５〜２０時間程度行うことができ、必要により通気や撹拌を加えることもできる。好適な培養方法としては、振盪培養や通気撹拌培養等が挙げられる。
【００３４】
培養後は、自体公知の方法、例えば分画法、各種クロマトグラフィー法（イオン交換法、クロマトフォーカシング法、ゲル濾過法等）等を用いて、各工程のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を有する画分を分離取得することにより、順次Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを単離・精製することができる。
【００３５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性は、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸を基質とする反応系で、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．５、２５〜３７℃、好ましくは３５℃の条件で、１０〜６０分間、好ましくは３０分間反応させた後、生成したＮ−アセチルノイラミン酸の量を適当な方法で測定することにより行うことができる。
【００３６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量は、当業界で公知の方法で行うことができ、例えばレゾルシノール塩酸法〔Acta Chem. Scand., 13, 856 (1959)〕、チオバルビツール酸法（ＴＢＡ法）〔J. Biol. Chem., 234, 1971 (1959)、Biochem. J., 81, 384 (1961)、J. Biochem., 82, 1425 (1977)〕等を用いて、反応生成物（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を比色定量する方法が例示される。好ましくは、チオバルビツール酸法である。
【００３７】
特に精製過程において、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性を求める場合には、上記の反応系にリン酸塩を添加して行うことが好ましい。大腸菌の粗酵素にはフォスファターゼが含まれており、それにより反応系中の基質の一つであるホスホエノールピルビン酸がピルビン酸に変換されるため、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性を正確に評価することが困難だからである。これに対して反応液にリン酸塩を添加しておくと、リン酸塩がフォスファターゼの阻害剤として機能するため、正確にＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性を測定、評価することができる。尚、リン酸塩の塩は特に制限されず、通常使用される塩、具体的にはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム等が例示される。反応条件の具体的な一例を図１に示す。
【００３８】
また、本発明は、上記の本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法である。
【００３９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸は、従来、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ及びエピメラーゼの存在下で、Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビン酸を反応させる方法、コロミン酸の加水分解、卵黄や牛乳（ミルクホエー）等に含まれる糖タンパク質の加水分解等によって製造されているが、前述の本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触媒として、下記の反応を行うことによって製造する本発明の方法によると、前述するように反応系に金属類、ＳＨ化合物等の添加を必要としないことに加えて、収率及び純度に関して有利に製造することができる。
【００４０】
【化２】
0003944866.tif 000004
すなわち、本発明の製造方法は、Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸とを基質として、前述する本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いるものである。製造条件（反応条件）は、適宜選択・調整することができ、具体的には、温度は通常２５〜５０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度、より好ましくは３５℃程度、ｐＨは通常５．５〜９程度、好ましくは７〜８程度、より好ましくはｐＨ７．５程度、インキュベーション時間は通常０．５〜２４時間程度、好ましくは５〜１０時間程度、より好ましくは６時間程度が例示される。
【００４１】
製造に際して、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、粗製品、精製品のいずれをも用いることができる。粗製品を用いる場合、特にＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼにフォスファターゼが含まれる場合は、リン酸塩を存在させた反応系を用いてＮ−アセチルノイラミン酸を製造することが好ましい。
【００４２】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いた本発明の製造法によれば、高純度のＮ−アセチルノイラミン酸を高い収率で得ることができる。本発明の方法によれば反応効率が９５〜１００％程度、純度が９８〜１００％であり、従来のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いる製造方法が反応効率が約５０％程度、純度９９％であるのに比較して、著しく有意な効果を有する。また、反応系に金属類やＳＨ化合物を添加する必要がなく、またこのため最終反応物からこれらの金属類等を排除・精製する必要もない点でも有利である。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００４４】
−実施例１−
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの調製方法
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを産生する大腸菌Ｋ１（ＡＴＣＣ  ２３５１１）を、液体培地（組成：硫酸アンモニウム０．５％、リン酸水素二カリウム１．４％、酵母エキス０．０５％、ソルビトール２％、硫酸マグネシウム０．１％：ｐＨ８．５）中で３７℃の条件下で振盪培養した。８時間後に培養を止め、得られた培養物を遠心分離（９，０００rpm, ２０分間）にかけて、菌体を集めた。この菌体をさらに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）に懸濁・溶解した後、菌体を超音波で破砕し、再度遠心することにより、その上清である細胞抽出液を得た。
【００４５】
この抽出液を透析後、陰イオン交換クロマトグラフィー〔ＤＥＡＥ−セルロース：ワットマン社製、条件；緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８）、流速：４０ｍｌ／分〕、陽イオン交換クロマトグラフィー〔ＣＭ−セルロース：ワットマン社製、条件；緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７）、流速：２ｍｌ／分〕、ゲル濾過クロマトグラフィー〔ULTROGEL AcA44、条件；緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）−１００ｍＭ  ＮａＣｌ、流速：１．５ｍｌ／分〕、陰イオン交換クロマトグラフィー〔RESOURCE Q:ファルマシア社製、条件；緩衝液：Ａ）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）、Ｂ）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）−３００ｍＭ  ＮａＣｌ、グラジエント：０−３００ｍＭ  ＮａＣｌ、流速３ｍｌ／分〕、クロマトフォーカシング〔Ｍｏｎｏ  Ｐ:ファルマシア社製、条件；緩衝液：Ａ）７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．３）−ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｂ）１０倍希釈  Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６−ＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ９）；流速１ｍｌ／分〕及びゲル濾過クロマトグラフィー〔セファデックスＧ−１００：ファルマシア社製、条件；緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、流速：０．４ｍｌ／分〕にかけて、順次Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性画分を取得して、精製した。
【００４６】
尚、各画分に含まれるＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性は、図１に示す手順で行った。まず、リン酸カリウムの存在下でＮ−アセチルマンノミン及びホスホエノールピルビン酸とともに、ｐＨ７．５、３５℃で３０分間インキュベーションした。その後、反応総量の約１／１０容量の０．１Ｎ  塩酸を添加することにより反応を停止し、次いでチオバルビツール酸法を用いて、生成されたＮ−アセチルノイラミン酸の比色を５４０ｎｍの波長で測定する方法で求めた。
【００４７】
なお、チオバルビツール酸法は、以下の方法に従って行った。
【００４８】
−チオバルビツール酸法−
試料０．２ｍｌに０．１ｍｌの過ヨウ素酸試薬を加え、３７℃で３０分間放置する。これに亜硫酸ソーダ液を加えて過ヨウ素酸を消去してから、チオバルビツール酸液を１．０ｍｌ加える。栓をして沸騰湯浴中に７．５分間保ち、発色させる。氷水中で冷やし、２−メトキシエタノール２．０ｍｌを加えて混和し、色素を転溶して比色する。
【００４９】
表２に各精製段階で得られたＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの精製度及び収率を記載する。
【００５０】
【表２】
0003944866.tif 000005
なお、ここでＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性単位（１Ｕ）とは、１分間に１μmolのＮ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチルノイラミン酸に転換する酵素量を意味する。また、蛋白質の量は、ローリー法（Lowry method)によって〔J. Biol. Chem., 193 265 (1951)〕、測定した。
【００５１】
この方法により、最終的に、比活性４８７Ｕ／ｍｇ蛋白の精製標品３０μｇを得ることができた。
【００５２】
この精製標品をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという。１２．５％ポリアクリルアミドゲル）にかけた結果、分子量約５０ｋＤの単一のバンドが得られた（図２）。
【００５３】
一方、セファデックスＧ-100を用いたゲル濾過法では、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは分子量１０６ｋＤを示し、このことから本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、約５０ｋＤのサブユニットからなるホモダイマーであることが示唆された。
【００５４】
−実施例２−
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの理化学的性質
実施例１で精製したＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いて下記の実験を行い、その理化学的性質を調べた。なお、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性は、図１に示す方法に準じて測定した。
【００５５】
（１）金属類の要求性
実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼについて、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成における金属類（金属類のイオン）の要求性を調べた。
【００５６】
金属類（イオン）としては、マンガン（ＭｎＣｌ2）、マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、コバルト（ＣｏＣｌ2）、カルシウム（ＣａＣｌ2）、カリウム（ＫＣｌ）、ナトリウム（ＮａＣｌ）、銀（ＡｇＮＯ3）、鉄（ＦｅＳＯ4）を用いた。
【００５７】
図１に示す反応系において、酵素として０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いて、上記の金属類を一切加えない系、各種金属類を様々な濃度で加えた系でのそれぞれについて生成されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を求めた。マンガン（ＭｎＣｌ2）及びカルシウム（ＣａＣｌ2）についての結果を図３に示す。
【００５８】
マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、コバルト（ＣｏＣｌ2）、カリウム（ＫＣｌ）、ナトリウム（ＮａＣｌ）、銀（ＡｇＮＯ3）及び鉄（ＦｅＳＯ4）についても、この結果と同様に、少なくとも１０ｍＭの濃度でＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性に全く影響を与えなかった。
【００５９】
（２）ＳＨ化合物要求性
実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼについて、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成におけるＳＨ化合物の要求性について調べた。
【００６０】
尚、反応に使用するＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、予めＳＨ化合物を含まない緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で透析して調製した。
【００６１】
ＳＨ化合物としては、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、システイン、ホモシステインを用いた。
【００６２】
図１に示す反応系において、酵素として０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いて、上記のＳＨ化合物を一切加えない系、各種ＳＨ化合物を様々な濃度で加えた系それぞれについて、生成されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を求めた。グルタチオンについての結果を図４に示す。
【００６３】
β−メルカプトエタノール、システイン及びホモシステインについても、図４の結果と同様に、少なくとも１０ｍＭの濃度までＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性に何ら影響を与えなかった。
【００６４】
（３）阻害剤
実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼによるＮ−アセチルノイラミン酸の生合成における阻害剤について調べた。
【００６５】
阻害剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＰＣＭＢ（ｐ−クロロメタクリ安息香酸）、ＨｇＣｌ2（塩化水銀）、ＭＩＡ（ヨード酢酸）、Ｈ4Ｐ2Ｏ7（ピロリン酸）を用いた。
【００６６】
図１に示す反応系において、酵素として０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いて、上記の阻害剤を一切加えない系、各種阻害剤を様々な濃度で加えた系それぞれにおいて、生成するＮ−アセチルノイラミン酸の量を求めた。ＥＤＴＡ、ＰＣＭＢ及びＨｇＣｌ2についての結果を図５に示す。
【００６７】
ＭＩＡ及びＨ4Ｐ2Ｏ7については、ＥＤＴＡと同様に、少なくとも１ｍＭの濃度までＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性に何ら影響を与えなかった。
【００６８】
（４）基質特異性、反応生成物の同定
Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸を基質とする系、Ｎ−アセチルマンノサミンとピルビン酸を基質とする系で、それぞれ実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを反応させた。反応は、図１に示す条件に準じて、０から３００分間の範囲でインキュベーションして反応することにより行った。結果を図６に示す。Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸を基質とした場合、インキュべーション（反応）時間にほぼ比例して生成するシアル酸量は増加したが、Ｎ−アセチルマンノサミンとピルビン酸を基質とした場合は、シアル酸の増加は全く認められなかった。
【００６９】
このことから、精製酵素が、Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸に対して基質特異性を示すこと、さらに該酵素が、シアル酸リアーゼ活性を含まないシアル酸シンターゼの純品であることが確認された。
【００７０】
また、反応生成物を、チオバルビツール酸法、ＨＰＬＣによる分析、ＩＲによる分析をすることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸であることを確認した。
【００７１】
（５）酵素化学的性質（ｐＨ、温度の影響）
(i)至適ｐＨ、ｐＨによる安定性
ｐＨが４〜１２の範囲にある各種の反応液を調製して、各ｐＨ条件下で反応を行い、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの至適ｐＨを求めた。反応条件は、インキュベーション（反応）を２５℃で３０分間行い反応液のｐＨを変える以外は、図１に示す方法に準じて行った。結果を図７に示す。
【００７２】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを各種ｐＨ条件下（ｐＨ４〜１２）で一定時間インキュベーションした後の酵素の安定性を調べた。具体的には、まずＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼだけを各種ｐＨ条件下、２５℃で３０分間インキュベーションした。次いで、該酵素液をＮ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸と混合して、該反応液について酵素反応（ｐＨ７．５、２５℃、３０分間）して、酵素の活性を調べた。結果を図８に示す。
【００７３】
これらの結果、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの反応の至適ｐＨは７．５であり、またｐＨ４〜１２の範囲で２５℃、３０分間のインキュベーションしても最大活性１００％に対して４０％以上の活性を維持しており、特にｐＨ７〜１０の範囲では最大活性１００％に対して９０％以上の活性が維持され、安定であることが判明した。
【００７４】
(ii)作用適温の範囲
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒反応を、ｐＨ７．５の条件下で１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、４０℃、５０℃及び６０℃の各種温度で行った。その結果、温度３５℃で最大の活性が得られた（図９）。
【００７５】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを各種温度条件下（０〜６０℃）で一定時間インキュベーションした後の酵素の安定性を調べた。具体的には、まずＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼだけを各種温度条件下、ｐＨ７．５で３０分間インキュベーションした。次いで該酵素液とＮ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸を混合して、この反応液について酵素反応（２５℃、ｐＨ７．５、３０分間）して、酵素の活性を調べた。結果を図１０に示す。
【００７６】
これらの結果から、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性の至適温度は３５℃であり、また温度安定性に関しては、ｐＨ７．５で３０分間インキュベーションする条件下で０〜３０℃程度まで安定であることが判明した。
【００７７】
（６）ミカエリス定数
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成反応における初速度の、両基質（Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノールピルビン酸）の濃度依存性について調べた。
【００７８】
反応は、３０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（pH 7.5）、０．００５Ｕ  Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、各種濃度のＮ−アセチルマンノサミン、ホスホエノールピルビン酸を含む反応溶液（５００μｌ）を用いて、３５℃で３０分間インキュベーションすることにより行い、生成したＮ−アセチルノイラミン酸の量をチオバルビツール酸法で求めた。
【００７９】
Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度依存性を調べる際は、ホスホエノールピルビン酸の濃度は、２０ｍＭとし、ホスホエノールピルビン酸の濃度依存性を調べる際は、Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度は、２０ｍＭとした。
【００８０】
ラインウィーバー・バーク式によって算出した結果、ミカエリス定数は、Ｎ−アセチルマンノサミンについては５．６ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸については０．０４３ｍＭであった。
【００８１】
−実施例３−
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いるＮ−アセチルノイラミン酸の製造
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にＮ−アセチルマンノサミン７１７ｍｇ及びホスホエノールピルビン酸７０２ｍｇを溶解し、この溶液に実施例１で精製取得したＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを０．０６Ｕ加えて、全量を３０ｍｌとし、３０℃で１０時間反応させた。
【００８２】
反応後の、反応液中のＮ−アセチルノイラミン酸の生成量をチオバルビツール酸法で測定して、Ｎ−アセチルノイラミン酸への変換率を求めた。
【００８３】
その結果、反応液中のＮ−アセチルノイラミン酸の量は、９００ｍｇであり、使用したＮ−アセチルマンノサミンに対する変換率は約９７％であった。
【００８４】
Ｄｏｗｅｘ×１（登録商標、ダウケミカル株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーにより反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチルノイラミン酸の結晶８１０ｍｇを得た。
【００８５】
参考例
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ反応系に対するリン酸塩の影響
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの粗製品（実施例１における細胞抽出液を使用）及び精製品（実施例１におけるセファデックスＧ−１００後の最終精製品を使用）について、反応系にリン酸カリウムを入れた場合と入れない場合とで、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性を測定した。反応は図１に示す条件に準じて行った。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
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なお、反応液中のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの活性は、基質（Ｎ−アセチルノイラミン酸、４０μｍｏｌｓ／ｍｌ）５０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌ、酵素液１００μｌからなる反応液を３７℃にて３０分間反応して生成されるＮ−アセチルマンノサミンをＭｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ（モルガン−エルソン）変法で定量することにより測定した。
【００８７】
このことから、精製過程の粗酵素の活性測定には、リン酸塩を添加した反応系を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの正確な活性を評価できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの酵素反応の条件を概説する図である。
【図２】精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた電気泳動像を示す図面に代わる写真である。
【図３】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性に対する金属イオン（マンガンイオン、カルシウムイオン）の影響を示す図である。なお、図面の縦軸は、１分当たりに生じるＮ−アセチルノイラミン酸の量（μｍｏｌ）を意味する。
【図４】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性に対するグルタチオンの影響を示す図である。なお、図面の縦軸は、１分当たりに生じるＮ−アセチルノイラミン酸の量（μｍｏｌ）を意味する。
【図５】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性に対するＥＤＴＡ、ＰＣＭＢ（ｐ−クロロメルクリ安息香酸）、塩化水銀の影響を示す図である。なお、図面の縦軸は、１分当たりに生じるＮ−アセチルノイラミン酸の量（μｍｏｌ）を意味する。
【図６】Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸（図中、○で示す）、またはＮ−アセチルマンノサミン及びピルビン酸（図中、●で示す）を基質にした場合におけるＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼによるＮ−アセチルノイラミン酸の生成量を経時的にみた図である。
【図７】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの至適ｐＨを示す図である。なお、図の縦軸は、最大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの相対活性を、横軸は反応液のｐＨを示す。
【図８】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの安定ｐＨ範囲を示す図である。なお、図の縦軸は、最大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの相対活性を、横軸は２５℃で３０分間インキュベーションした際のｐＨを示す。
【図９】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの至適温度を示す図である。なお、図の縦軸は、最大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼの相対活性を、横軸は反応液の温度を示す。
【図１０】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの安定温度範囲を示す図である。なお、図の縦軸は、最大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの相対活性を、横軸はｐＨ７．５で３０分間インキュベーションした際の温度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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