(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a)から(c)のいずれかに記載のDNAからなる糖転移酵素をコードするDNA。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA。
(b)配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA。
(c)配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードする分裂酵母由来のDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAがコードする蛋白質。
【請求項５】
糖鎖付加が減少された蛋白質を産生する能力を有する分裂酵母の製造方法であって、分裂酵母ゲノム中の請求項１に記載のDNAの蛋白質コード領域を変異させることにより該DNAの機能を欠損させることを特徴とする方法。
【請求項６】
分裂酵母細胞に、蛋白質コード領域に変異が導入された請求項１に記載のDNAまたはその一部を含むDNAを導入して、該蛋白質コード領域に変異が導入された請求項１に記載のDNAまたは該その一部を含むDNAと、分裂酵母ゲノム中の請求項１に記載のDNAとの間で相同組換えを起こさせることにより、分裂酵母ゲノム中の請求項１に記載のDNAの機能を欠損させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の方法によって製造された分裂酵母であって、分裂酵母ゲノム中の請求項１に記載のDNAの機能の欠損により糖鎖付加が減少された蛋白質を産生する能力を有する分裂酵母。
【請求項８】
Schizosaccharomyces pombeである、請求項７に記載の分裂酵母。
【請求項９】
請求項７または８に記載の分裂酵母を用いて、糖鎖付加の減少された蛋白質を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分裂酵母の糖転移酵素をコードするDNA、及び該DNAの機能を欠損させることにより蛋白質への糖鎖付加を行なう能力が減少させられた分裂酵母の製造、該分裂酵母を利用した糖鎖付加の少ない外来蛋白質を産生させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母は動物細胞と比較して、分裂速度が速く、安価な培地で生育が可能なこと、また細菌と比較して、翻訳後修飾が動物細胞と類似していること、特に細菌では付加しない糖鎖が付加することから、組換えDNA技術で得られたDNAを用いた蛋白質産生の宿主として注目を集めた。
しかし、動物細胞と酵母では一部の糖転移酵素が異なり、従って酵母で産生された蛋白質に、動物細胞で見られない大量のマンノースから成る糖外鎖（以下高マンノース型糖鎖と称す）が付加する場合が多く経験された。そして高マンノース型糖鎖の付加は、蛋白質の生産性、蛋白質の抗原性や体内動態等に影響を及ぼし、酵母での組換え蛋白質生産の大きな問題点となっていた。
【０００３】
酵母は出芽酵母と分裂酵母に大きく分類され、出芽酵母においては、高マンノース型糖鎖を付加する糖転移酵素遺伝子OCH1が見出され(Nagasu, T., et.al., Yeast, 8, 535-547, 1992)、OCH1を欠失した酵母株を用いて組換え蛋白質を産生させると高マンノース型の糖鎖が付加しないことが見出された。しかし、分裂酵母においてはハイブリダイゼーション等の通常の方法では出芽酵母のOCH1に対するホモログが見つからず、高マンノース型の糖鎖が付加しない変異体を作製することはできなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、分裂酵母の糖転移酵素をコードする遺伝子を特定し、その遺伝子の機能を失わせた分裂酵母を使って糖鎖付加の少ない蛋白質を産生させることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高温においては浸透圧を調整した条件でしか生育できない分裂酵母変異体に、分裂酵母のゲノムDNAライブラリーを導入し、その性質を相補できるゲノムDNA断片から、出芽酵母のOCH1とホモロジーがある配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を見出した。その遺伝子は分裂酵母の糖転移酵素をコードする遺伝子であると考えられ、分裂酵母からその遺伝子を欠失させたところ、欠失させない分裂酵母では付加していた高マンノース型の糖鎖が付加しなくなったことを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００６】
すなわち本発明は、下記の(a)から(c)のいずれかに記載のDNA（以下該DNAを「och1+」と記載する）。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA。
(b)配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA。
(c)配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードする分裂酵母由来のDNA、およびoch1+がコードする蛋白質（以下「Och1」蛋白と称す）に関する。
【０００７】
ここでストリンジェントな条件の一例は、65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで65℃で１時間0.1 x SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4 x SSCである。
【０００８】
また本発明は、och1+あるいはその一部を用いて、分裂酵母遺伝子中のoch1+の機能を失わせる方法に関する。
【０００９】
ここで、「och1+の機能を欠損させる」には、och1+の蛋白質をコードする領域を変異させて、Och1蛋白の機能を失わせること、およびoch1+の発現を減少させることの双方が含まれる。
「Och1蛋白の機能を失わせる」とは、分裂酵母が産生する蛋白質の大部分に過剰な高マンノース型の糖鎖が付加しないようにOch1蛋白が改変されていることを意味する。
また、「och1+の発現を減少させる」とは、分裂酵母のゲノムにおけるoch1+またはその発現制御領域に変異を導入することにより、該分裂酵母が産生するOch1蛋白量を、該変異を導入しない分裂酵母が産生するOch1蛋白量と比較して、少なくさせることを指す。
【００１０】
更に本発明は、och1+の機能を欠損させることにより糖鎖付加が減少された蛋白質を産生する能力を有する分裂酵母（以下och1+破壊株と称す）およびその製造方法、該方法により製造し得る分裂酵母、好ましくはSchizosaccharomyces pombe、該分裂酵母（och1+破壊株）に、糖鎖付加の少ない蛋白質を産生させる方法、及びその方法により産生された糖鎖付加の少ない蛋白質に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１２】
och1+あるいはその一部を含むDNAは、配列番号１に記載の塩基配列を基にプライマーを設定し、分裂酵母ゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型にPCRを行なうことにより、あるいは分裂酵母RNAを鋳型にRT-PCRを行なうことにより得ることができる。また別法としては、配列番号１に記載の塩基配列を基にプローブを合成して、分裂酵母のゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーより、プローブとハイブリダイズするクローンを選び出し、塩基配列を決定して、och1+あるいはその一部を含むクローンを選択しても良い。
【００１３】
更に、Och1蛋白の発現に影響を与えるoch1+の発現制御領域は、配列番号１に記載の塩基配列を基にプローブを合成して、分裂酵母ゲノムDNAライブラリーより、プローブとハイブリダイズするクローンを選び出し、塩基配列を決定して、och1+の上流あるいは下流配列を含むクローンを選択することにより得ることができる。判明した上流あるいは下流の塩基配列を基にプローブを合成して、更に上流あるいは下流配列を含むクローンを選択しても良い。
【００１４】
発現制御活性を有する領域は、通常コード領域の上流1 kbp、下流500 bpの中に存在する。相同組換えにより単離した領域を欠失させた分裂酵母においてノーザンブロッティングにより定量されるoch1+ mRNA量が減少しているか、あるいは該分裂酵母の産生する蛋白質に過剰な高マンノース型の糖鎖付加が無くなっているかを解析することにより、単離した領域が発現制御活性を有するか否かを判定することができる。
【００１５】
得られたoch1+遺伝子は、発現ベクターに挿入してOct1蛋白質を産生させることができる。発現ベクターは、宿主が大腸菌であれば、例えばpGEX、宿主が酵母であれば、例えばpcL, pREP、宿主が哺乳類細胞であれば、例えばpCMV, pSRα等に挿入する。挿入は例えばSambruck, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載の方法に従って行うことができる。Oct1蛋白質は、His6, GSTとの融合蛋白として発現させると、後の精製が容易になる点で望ましい。
【００１６】
och1+遺伝子を挿入した発現ベクターは、宿主に適した方法で宿主に導入する。導入は、例えば、Sambruck, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載の方法に従って行うことができる。
【００１７】
och1+遺伝子を導入した宿主を適当な条件で培養した後、宿主を破壊し、蛋白質画分を抽出する。破砕は、宿主が大腸菌や酵母であればガラスビーズあるいは超音波を用いて、宿主が哺乳類細胞であればホモゲナーザーを用いて行なうことができる。発現ベクターに産生される蛋白質が培養上清に分泌されるよう工夫が施されている場合は、培養上清から目的の蛋白質を回収することができる。
【００１８】
抽出した蛋白質画分より、電気泳動、種々のクロマトグラフィー、例えばアフィニティーカラム、イオン交換カラム、ゲルフィルトレーションカラム等を用いた標準的な方法によりoch1+遺伝子産物を精製できる。導入した遺伝子が、融合蛋白質をコードするように設計されている場合、例えばGSTの場合はグルタチオンカラムにより、His6の場合はニッケルセファロースカラムを用いて容易に精製できる。
【００１９】
och1+の蛋白質をコードする領域を変異させる方法は、分裂酵母遺伝子中のoch1+と、変異を導入したoch1+あるいはその一部を含む環状又は線状DNAとの間で相同組換えを起こさせ、分裂酵母遺伝子中のoch1+を、変異を導入したoch1+に置き換えることを基本とする。組換えに用いられるoch1+の一部を含むDNAは、通常、500 bp以上であり、1 kbp以上であることが望ましい。
【００２０】
PCRまたはクローニングにより得られたoch1+あるいはその一部を含むDNAに変異を導入する方法としては、DNAの塩基配列を操作する組換えDNA技術（ Sambruck, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）、PCRを応用した技術（Ling MM. and Robinson BH., Anal. Biochem. 254(2):157-78, 1997）等、多くの方法が適用可能である。例えば適当な制限酵素で切断した後に、無関係な遺伝子、好ましくは相同組換えを起こした分裂酵母を選択できる選択マーカ遺伝子、更に好ましくは選択マーカとしてウラシル合成系の遺伝子ura4+を挿入する方法を挙げることができるが、適当な変異を導入できる方法であれば、この方法に限られるものではない。適当な制限酵素部位が無い場合にはPCR等により、適当な制限酵素部位を入れてもよい。
【００２１】
変異を導入したoch1+あるいはその一部を含む、環状又は線状DNAは、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等の方法により分裂酵母に導入される。導入した変異遺伝子に選択マーカ、例えばura4+が含まれていれば、選択マーカを持つ分裂酵母のみが生き残る培養条件、例えば選択マーカがura4+であればウラシルを含まない培地中で培養することにより、相同組換えを起こし、変異を導入したoch1+を持った分裂酵母、すなわちoch1+破壊株を選択することができる。
【００２２】
Och1蛋白の発現を減少させる方法は、前述のoch1+の蛋白質をコードする領域を含むDNAに代えて、クローニングしたoch1+の発現制御領域（上流あるいは下流配列を含む）を用い、Och1蛋白の発現に影響を与える塩基配列に変異を導入することにより、前述のoch1+の蛋白質をコードする領域の場合と同様に行うことができる。
【００２３】
また、Och1蛋白の発現を減少させる方法としては、分裂酵母にoch1+の転写産物に相補的なRNA（アンチセンスRNA）をコードするDNAが挿入された発現ベクターを導入して、Och1蛋白の発現を減少させる等の方法も考えられる。
ここで「相補的」とは、och1+の発現を抑制し得る限り、完全に相補的である場合に限られない。通常、80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性があれば良い。
【００２４】
アンチセンスRNAをコードするDNAは、通常、翻訳開始部位等mRNAの機能に重要な役割を果たす部位と相補的な20 bpの鎖長があれば足りる。しかしながら、高次構造をとることによりアンチセンスとして機能しなくなることを考慮すれば、さらに長い鎖長、好ましくは100 bpの鎖長を用いることも可能である。
【００２５】
Och1蛋白の発現を減少させる処理が施され、その結果、産生する蛋白質の大部分に過剰な高マンノース型の糖鎖が付加しなくなっている分裂酵母である限り、本発明の分裂酵母に含まれる。
【００２６】
過剰な高マンノース型の糖鎖が付加しているかどうかは、高マンノース型の糖鎖が多様性を示すことから、例えば、高マンノース型の糖鎖が付加した蛋白質が多様な分子量を示すことより推定できる。すなわち、野生型och1+を持った分裂酵母では、電気泳動でスメアなパターンを示す蛋白質が、変異を導入した分裂酵母でシャープなパターンを示せば、過剰な高マンノース型の糖鎖が付加の無い蛋白質が産生されたことを推定することができる。
【００２７】
以下に、och1+の機能を失わせる方法の具体的な例を記載する。機能を失わせたoch1+を含む線状DNAとして、例えばoch1+の翻訳領域の中央部約60%をウラシル合成系の遺伝子ura4+に置換した線状DNA(och1::ura4+)を作製する。これをura4+を欠損する分裂酵母に導入して、och1::ura4+と分裂酵母中のoch1+の間で相同組換えを起こさせる。その後ウラシルを含まない培地中で培養して、ura4+を持った、すなわち相同組み換えによりoch1+がoch1::ura4+に置き換わった分裂酵母を選択することにより、och1+の機能を失わせた分裂酵母、すなわちoch1+破壊株を得ることができる。
【００２８】
更に本発明は、och1+破壊株を用いて糖鎖付加の少ない蛋白質を産生する方法にも関する。ここで蛋白質は、分裂酵母が産生する蛋白質ならいかなる蛋白質でもよく、分裂酵母由来の遺伝子、分裂酵母由来でない外来遺伝子の何れの遺伝子がコードする蛋白質であってもよい。ここで外来遺伝子とは、分裂酵母で発現させたい遺伝子であり、動物・酵母・細菌等いかなる生物より由来した遺伝子でも構わないが、好ましくは動物由来の遺伝子が望ましい。外来遺伝子は、融合蛋白質等の人工の配列を持っていてもよい。
【００２９】
遺伝子の導入法としては、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、本発明はこれに限られるものではない。具体的に説明すると、例えば酢酸リチウム法は、対数増殖期の分裂酵母を酢酸リチウム中で、30℃、１時間保温し、その後導入DNAおよびポリエチレングリコール溶液を加え、30℃、１時間保温する。これを43℃、15分熱処理した後遠心により細胞を回収し培地中に懸濁して、30℃、２時間振とう培養する。この培養液を選択寒天培地上にひろげ、30℃で３日間培養すると、遺伝子が導入され選択培地上で増殖可能な酵母細胞のみがコロニーを形成する。
【００３０】
本発明には、och1+破壊株により産生された糖鎖付加の少ない蛋白質も含まれるものである。ここで、本発明に記載の分裂酵母より産生された蛋白質は、培養上清あるいは菌体より、アフィニティーカラム・イオン交換カラム・ゲルフィルトレーションカラム等の標準的な方法により精製できる。導入した遺伝子が、融合蛋白質をコードするように設計されている場合、例えばGSTとの融合蛋白質の場合は、融合蛋白質とのアフィニティーカラム、GSTの場合はグルタチオンカラムにより精製することが好ましい。
【００３１】
尚、以上に記載した操作は適当なマニュアル、例えばSambruck, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００３３】
[実施例１]  配列番号１に記載の塩基配列からなる分裂酵母och1+と出芽酵母OCH1のホモロジー
分裂酵母のゲノムDNAライブラリーよりクローニングされた、分裂酵母変異体の高温においては浸透圧を調製した条件でしか生育できない性質を相補できるゲノムDNA断片から、配列番号１に記載の塩基配列からなる分裂酵母の遺伝子och1+を見出した。そして、図１に示すように分裂酵母och1+（SpOCH1）と、出芽酵母OCH1（ScOCH1）との間にホモロジーが見出された。
【００３４】
[実施例２]  och1+破壊株の作製
変異を導入した配列番号１に記載の塩基配列を含むDNAと、分裂酵母och1+の間で相同組換えを起こさせ、och1+破壊株を作製した。
配列番号１に記載の塩基配列を含むDNAの、och1+の翻訳領域内に存在する２つのHindIII切断部位に挟まれた領域を、分裂酵母ura4+に置換したDNAを作製した（図２）。その後、スフェロプラスト法にて分裂酵母を形質転換し、ウラシルを含まない選択培地で培養して、ura4+を持った、すなわち変異が導入されたoch1+を持った分裂酵母を選択し、och1+破壊株を作製した。
【００３５】
[実施例３]  och1+を欠失させた分裂酵母の形態
顕微鏡にて、och1+を欠失させた分裂酵母と野生型分裂酵母を比較した。
図３に示すように、och1+を欠失させた分裂酵母は、野生型分裂酵母に比べて丸く短い形態をしている。また、凝集しやすく、増殖速度も遅い。37℃では生育できないという温度感受性を示すが、培地中に1.5%程度のソルビトールを加え高浸透圧条件とすると、37℃でも生育できるようになる。
【００３６】
[実施例４]  och1+破壊株の培養と、産生された蛋白質の解析
och1+の破壊が、産生される蛋白質の糖鎖付加に対して、影響を与えるかどうかを検討した。
och1+破壊株及び野生株の分裂酵母を培養し、産生される糖タンパク質、ここでは酸性フォスファターゼを電気泳動し、活性染色を行って酸性フォスファターゼの分子量分布を調べた。
その結果、４に示すように、酸性フォスファターゼは野生型株では分子量が大きくスメアーなパターンを示したのに対し（レーン１）、och1+破壊株では分子量が小さくシャープなバンドとなった（レーン２）。このことは多様性に富み分子量の大きなhigh-mannose typeの糖鎖付加が、野生型株では起こり、och1+破壊株では起こっていないことを示唆している。
【００３７】
更にこのような電気泳動上の移動度の違いが糖鎖付加によるものかどうかを調べるために、エンドグリコシダーゼH(Endo H)による糖鎖切断処理を行った。エンドグリコシダーゼHはN-結合型糖鎖の根元にある、２つのN-アセチルグルコサミン残基の間を切る酵素であるため、エンドグリコシダーゼH処理された糖蛋白質は、ポリペプチド部分から推定される分子量とほぼ同じ移動度を示す。
この結果、エンドグリコシダーゼH処理したレーン３及び４の野生型由来およびoch1+破壊株由来の酸性フォスファターゼのバンドはどちらも同じところに現れ、レーン１と２の移動度の違いは、N-結合型糖鎖の大きさの違いに起因するものであることが示された。
【００３８】
[実施例５]  och1+遺伝子産物のマンノース転移酵素活性
och1+遺伝子産物のマンノース転移酵素活性を、蛍光標識したMan9GlcNAc2-PA及びGDP-マンノースを基質とし、och1+破壊株、och1+発現ベクターを導入したoch1+破壊株、及び野生株の菌体を破砕した粗抽出物を酵素として測定した。
分裂酵母och1+遺伝子をpREP1（Maundrell, K. 1993. Thiamine-repressible expression vectors pREP and pRIP for fission yeast. Gene 123, 127-130）発現ベクターに組み込み、och1+発現ベクターを作製した。och1+発現ベクターを導入しoch1+遺伝子産物を過剰発現させたoch1+破壊株、コントロールとしてベクターのみを導入したoch1+破壊株、及び野生株の菌体を破砕し、100,000 x gで沈殿させたものを酵素として使用した。50 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 mM MnCl2, 0.6% Triton X-100, 0.5 mM 1-deoxymannojirimycin, 2 mM PA-sugar chain, 1 mM GDP-マンノースを反応溶液とし、酵素を加えて酵素反応を開始した。30℃で10, 20, 30分間反応後、99℃５分間処理して反応を停止し、反応産物をTSK Gel Amide-80カラムを用いたHPLCにより分離して、酵素反応を解析した。
【００３９】
図５に示す通り、och1+破壊株ではMan9GlcNAc2-PAへのマンノースの転移は観察されなかったが、野生株ではマンノースの転移が見られ、och1+発現ベクターを導入しoch1+遺伝子産物を過剰発現させたoch1+破壊株では更に多くのマンノースの転移が見られた。
この結果より、och1+遺伝子産物はマンノース転移酵素活性としての活性を有し、S. cerevisiae OCH1遺伝子産物と同様な反応に関与することが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、糖転移酵素の機能を失わせた分裂酵母の入手が可能となり、分裂酵母においても付加糖鎖の少ない蛋白質を産生することが可能となった。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  分裂酵母och1+と出芽酵母OCH1のホモロジーを示す図である。
【図２】  och1+の中央にura4+を挿入したDNAの構築を示す図である。
【図３】  och1+を欠失させた分裂酵母の形態を示す写真である。
【図４】  och1+破壊株で産生された酸性フォスファターゼの解析結果を示す写真である。
【図５】  och1+遺伝子産物のマンノース転移酵素活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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