(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・ステラータ、キャンディダ・パラプシロシス、ロドトルーラ・ルブラ、ハイフォピチア・ブルトニ、サッカロマイセス・ユニスポラス及びチゴサッカロマイセス・バイスポラスからなる酵母群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵母又はその培養物もしくは抽出物からなる抗酸化剤。
【請求項２】
請求項１記載の抗酸化剤を含有する医薬。
【請求項３】
抗動脈硬化剤である請求項２記載の医薬。
【請求項４】
請求項１記載の抗酸化剤を含有する化粧品。
【請求項５】
請求項１記載の抗酸化剤を含有するLDL抗酸化食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗酸化剤に関し、特に動脈硬化進行の危険因子である低比重リポタンパク質（LDL）の酸化を抑制する抗酸化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
成人病の一つである動脈硬化は、LDLの酸化変性が発端となっており、この酸化は、一般に、生体内のラジカル（活性酸素等）から攻撃を受ける酸化修飾や脂質酸化の過程で生じる物質（マロンジアルデヒド等）によりLDL中のアポタンパク質が修飾されることによって起こるものとされている。このため、動脈硬化の予防・治療に抗酸化活性を有する物質が注目されている。
【０００３】
また、動脈硬化の予防・治療以外にも抗酸化剤の用途は広く、特に天然物由来の抗酸化物質を得ることは医薬、あるいは食品への利用を中心に期待が寄せられている。
【０００４】
天然物由来の抗酸化物質としては、多くは報告されていないが、従来よく知られているトコフェロールのほか、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）より分離される物質（特開平5-153990号公報）、酵素処理を行った酵母タンパク質分解物（特開平8-100175号公報）等、特定の微生物に由来する抗酸化物質が報告されている。
【０００５】
一方、抗酸化活性を有する物質の探索には、効率的な抗酸化活性の評価方法の確立が必要である。従来の抗酸化活性の評価法としては、リノール酸を用いたロダン鉄法、TBARS法、フリーラジカルの還元を見るDPPH法等が行われている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来の評価法では、微生物の有する抗酸化活性を評価する場合には、微生物の破砕、抽出等の煩雑な操作を行う必要があり、また土壌サンプル、発酵食品等の抗酸化活性の評価にそのまま応用することができなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、抗酸化作用を有する微生物を簡便に探索できる方法を確立し、かつこれにより優れた抗酸化剤を得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、活性酸素発生剤としてローズベンガルを添加した培地及び添加しない培地中で微生物を培養し、生菌数又は濁度の測定値の比を求めることにより、簡便に抗酸化活性を有する微生物の評価が可能であり、またその評価結果は、従来の抗酸化活性評価法の１種であるTBARS法と良好な相関性を有するものであること、及び当該評価方法により、特定の酵母が優れた抗酸化活性を有し、抗酸化剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、キャンディダ・ステラータ、キャンディダ・パラプシロシス、ロドトルーラ・ルブラ、ハイフォピチア・ブルトニ、サッカロマイセス・ユニスポラス及びチゴサッカロマイセス・バイスポラスからなる酵母群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵母又はその培養物もしくは抽出物からなる抗酸化剤を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
〈抗酸化剤〉
本願第１発明の抗酸化剤に使用される抗酸化活性を有する酵母は、第２発明の抗酸化活性を有する微生物の評価方法により高い抗酸化活性を有するものとして選択されたものである。
【００１２】
本発明の抗酸化剤としては、上記酵母の１種もしくは２種以上、又はその培養物もしくは抽出物をそのまま使用し又は含有せしめたものであればよいが、培養物を用いる場合、酵母を殺菌した上で用いることもできる。
【００１３】
酵母、抽出物等の取得は、常法に従って行うことができ、その方法は特に限定されるものではない。すなわち、酵母自体を利用する場合は、例えば、YM培地等、通常酵母の培養に用いられている培地で定常期に達するまで培養した後、その培養物を遠心分離に付して集菌し、イオン交換水等で洗浄して培地成分を取り除くことにより得ることができる。また抽出物を利用する場合は、例えば、上記菌体に適当な溶媒を加えガラス・ホモジェナイザー等を用いて菌体を破砕し得られた菌体破砕液から各種溶媒を用いて抽出・分離して適宜濃縮、乾燥等することにより得ることができる。
【００１４】
本発明の抗酸化剤は、抗動脈硬化剤等の医薬として有用である。かかる医薬の剤型としては特に限定されないが、例えば、賦形剤、崩壊剤、甘味剤等を適宜用いて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤等の経口製剤とすることができる。
【００１５】
本発明の抗酸化剤を医薬として使用する場合の投与量は、微生物の種類、投与法、患者の年齢、性別、体重、容態等によって異なるが、経口投与の場合、成人患者に対して１日あたり抽出物の凍結乾燥品として１mg〜10ｇとすることが好ましい。
【００１６】
また本発明の抗酸化剤は、化粧品、特に皮膚化粧品において、皮膚の老化の抑制やシワ形成を抑制し得る配合成分として使用することができ、例えば油／水型、水／油型の乳化化粧料、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、パック剤、ファンデーション等の種々の形態の化粧品に用いることができる。
【００１７】
更に、本発明の抗酸化剤を任意の割合で食品に添加することにより、LDL抗酸化食品とすることができる。また、食品に添加後に発酵させてもよい。このような食品としては、酒類、醸造製品（酢、味噌、醤油等）、乳製品（チーズ、バター等）、乳酸菌製品（発酵乳、ヨーグルト等）、発酵食品（発酵豆乳、漬物、塩辛、納豆、パン、乳腐等）などが挙げられる。
【００１８】
前記の列挙された酵母のうち、チーズ、ケフィア等の発酵乳製品への応用には、サッカロマイセス・ユニスポラスが好適であり、ワイン等の発酵酒の用途には、キャンディダ・ステラータ、ロドトルーラ・ルブラ、サッカロマイセス・エレガンスが好適であり、SCP（微生物タンパク質）等への応用には、キャンディダ・マルトーサが好適である。
【００１９】
本発明の抗酸化剤に用いられる酵母は、ほとんどが既に食品用途等に用いられ安全が確認されているものであり、医薬、食品、化粧品等に適用する上で安全なものである。
【００２０】
〈抗酸化活性を有する微生物の評価方法〉
本願第２発明の抗酸化活性を有する微生物の評価方法によれば、抗酸化活性を有する微生物を容易に探索することができる。
【００２１】
まず、評価の対象とする微生物を、活性酸素発生剤としてローズベンガルを添加した培地及び添加しない培地に接種し、光照射下で培養する。
【００２２】
本発明の評価方法による評価対象となる微生物としては特に限定されないが、例えば、酵母のほか、乳酸菌、ビフィズス菌、納豆菌等の細菌、糸状菌、放線菌等が挙げられる。
【００２３】
本発明の評価方法において使用されるローズベンガルは、可視光線の照射により特異的に活性酸素（一重項酸素）を発生させる薬剤であり、市販品として容易に入手することができる。ローズベンガルの添加量は、培地に対して0.0001〜１mM、特に0.005〜0.02mMが好ましい。
【００２４】
本発明の評価方法において使用される培地は、固体培地及び液体培地のいずれでもよく、対象とする微生物の培養に一般に用いられるものを使用すればよい。例えば、酵母の場合にはYM培地等、乳酸菌の場合にはMRS培地等、ビフィズス菌の場合にはBL培地等を使用することができる。
【００２５】
培養は、対象とする微生物をローズベンガル添加培地及びローズベンガル無添加培地に接種し、光照射下で、定常期に達するまで（約24時間）培養する。その際の光照射は、例えば蛍光灯照射で、1000〜1500luxとすることが望ましい。
【００２６】
両培地で同一時間培養した後、両培地の生菌数又は濁度を測定する。例えば、固形培地の場合には、コロニーカウンターにて生菌数を測定すればよく、液体培地の場合には、適宜希釈して分光光度計で濁度を測定すればよい。濁度の測定は、600〜700nm、特に650〜660nmで行うのが好ましい。
【００２７】
次いで、得られた各測定値の比（ローズベンガル添加培地／ローズベンガル無添加培地）を求め、抗酸化活性を評価する。この比が高いほど微生物の抗酸化活性が優れていることを示し、例えばローズベンガルの添加濃度を0.02mMとした場合、この比が0.05以上であれば抗酸化剤として有用であるということができ、特に0.2以上であるのが好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
試験例１
(1)  18mmφの試験管に５mlのYMブロスを入れ、121℃、15分間滅菌した。食経験のある酵母菌株２種（Candida kefyr IFO 0008及びRhodotorula rubra IFO 1101）を、スラントから各試験管に１白金耳接種し、28℃で24時間好気培養し、前培養液とした。
本培養は、500mlの坂口フラスコに液体培地100mlを入れ、前培養液を１％接種し、28℃で12時間及び24時間好気培養した。終濃度が０〜1.0mMになるように任意にローズベンガル（シグマ社製）を無菌的に添加した寒天培地に、本培養液をスパイラルプレーターにより塗抹後、28℃、72時間蛍光灯照射下（1000〜1500lux）で培養し、コロニーを形成させた後、コロニーカウンターでコロニー数を測定した。生菌数とローズベンガル濃度との関係を図１(A)に、またローズベンガル添加培地／ローズベンガル無添加培地の生菌数比とローズベンガル濃度との関係を図１(B)に示す。
図１より、２つの菌株間のローズベンガルに対する感受性には約100倍の大きな差が認められ、Rhodotorula rubra IFO 1101は、ローズベンガルにより生成された一重項酸素に対し抵抗性を有していることが確認された。
また、Rhodotorula rubra IFO 1101は、赤色酵母でありその色素は定常期になると生産される傾向が見られるが、図１の通り、12時間（未着色，対数増殖期中期）と24時間（赤色，定常期初期）の結果から感受性に差は認められず、色素（抗酸化物質として知られるカロチノイド色素）と一重項酸素に対する抵抗性との間に関係は認められなかった。
【００３０】
(2)  次いで、液体培地（YMブロス）について、前培養液を５mlの新鮮培地（ローズベンガル無添加）、及びローズベンガル添加培地（0.5mM，0.01mM）にそれぞれ50μl、すなわち１％接種した後、28℃の恒温室で18時間蛍光灯照射下（1400〜1500lux）で好気培養した。容器による励起光の遮断の可能性を確認するため、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製及びガラス製の３種の容器、並びにアルミ箔にて光を遮断したものについて同様に培養を行い、18時間培養後の本培養液を適宜希釈してから分光光度計でOD660を測定し、ローズベンガルによる増殖阻害度を比較した。この結果を図２に示す。
ローズベンガル入りYM液体培地は濃度が高くなると発泡を起こしたため高濃度（0.5mM）の添加は不可能であったが、0.01mMでは問題がなかった。また、ローズベンガルはλ550nm付近で極大吸収を示したが、660nmでは吸光度の増加は認められなかった。
図２の通り、容器間に差は見られないことから、通常の微生物操作同様、ガラス製の18mmφの試験管で実験を行うことができ、液体培地においても寒天培地同様、感受性を比較できることが確認された。
更に、アルミ箔で光を遮断したサンプルが無添加培地と同様に増殖したことから、増殖阻害効果も光照射下でのみ起こり、ローズベンガルは光が照射されない限り細胞毒性を発揮しないことが分かった。
【００３１】
試験例２
試験例１と同様の方法で、ローズベンガルの添加濃度を変え、抗酸化活性の強さの異なる３菌株（Rhodotorula rubra IFO 1101，Candida gropengiesseri IFO 0659，Candida kefyr IFO OOO8）についてOD660を測定した。この結果を図３に示す。
この結果、比較にはローズベンガルの濃度は0.005〜0.01mMが適していることが明らかとなり、また３菌株間での活性酸素に対する抵抗性は、Candida kefyr IFO 0008 ＜ Candida gropengiesseri IFO 0659 ＜ Rhodotorula rubra IFO 1101の順に高いことが示された。なお、ローズベンガルの添加濃度を0.005mMとした場合におけるローズベンガル添加培地／ローズベンガル無添加培地のOD660の比（％）を表１に示す。
【００３２】
試験例３
試験例２と同じ３菌株を使用して、TBARS法により、LDL抗酸化活性を測定した。
試験例１と同様の方法で上記３菌株について前培養液を準備し、500mlの坂口フラスコに100mlの培地を入れ、前培養液を１％接種し、28℃で24時間好気培養した。培養後、遠心分離（7,000rpm，５min，４℃）により集菌し、得られた菌体をイオン交換水で３回洗浄して培地成分を取り除いた。洗浄を終えた菌体に50mlの100％メタノールを加えソニックで軽く分散させた。次いで、菌体をガラス・ホモジェナイザー（ビード・ビーター，バイオ・スペック社製）で破砕し（45sec×３，ビーズ：50ｇ）、デカンテーションにより液体部をビーズと分離させて菌体破砕液を得た。菌体破砕液にクロロホルムを等量加え、１時間室温で振とう抽出した。抽出後、水を少量添加して均等に２層に分層させ、遠心分離（8,000rpm，10min）を２回行い、細胞残渣の上層をメタノール画分として、下層をクロロホルム画分として、それぞれ共栓付き遠心管に分取して保存し（４℃）、メタノール画分をサンプルとした。
シリアンハムスター（雄，10〜14週齢）をMF飼料で５日間予備飼育した後、0.5％コレステロール及び５％ラードを添加したMF飼料で２週間飼育した。解剖前日に24時間絶食させ、腹部大動脈から採血を行い、常法によりEDTA血漿を調製した。この血漿から超遠心法でLDL画分を採取し、リン酸バッファー（PBS）により４℃で24時間透析した後、適宜希釈し酸化反応用LDLとした。
LDL（終濃度250μg/ml protein）は、サンプル添加後、10μM硫酸銅の存在下、37℃で５時間インキュベートして酸化させ、2.5mM EDTA添加の後冷却して反応を止め、反応液中のチオバルビツール酸反応基質（以下、TBARSと略称する）を比色法による吸光度測定から求めた。サンプルの代わりにメタノールを添加したものをコントロールとし、下記計算式(1)に従ってTBARSの生成を抑制した割合をLDL脂質酸化抑制率とした。この結果を表１に示す。
【００３３】
【数１】
0003970975.tif 000002
【００３４】
試験例４
試験例２と同じ３菌株を使用して、アガロースゲル電気泳動法により、LDLのアポタンパク変性抑制を調べた。LDL及びサンプルは試験例３で調製したのと同じものを使用した。
LDL（終濃度250μg/ml protein）は、サンプル添加後、10μM硫酸銅の存在下、37℃で５時間インキュベートして酸化させ、2.5mM EDTA（シグマ社製）を20μl添加後、冷却により反応を終了させた。また、サンプルの代わりにメタノールを添加したものをコントロールとし、インキュベーションを行わずEDTAを添加したものをブランクとした。
反応液２μlを１％アガロースゲル（マルチトラックLDHアイソザイムゲル）にアプライし、90Ｖで45分泳動後コーコレスト・Ａ（日本ケミファ社製）によるコレステロール染色を行った。ゲルを37℃で乾燥後、各レーンの移動距離を測定した。ブランクをLDLが全く酸化されていない状態と仮定し、コントロールと比べてサンプルの添加により移動度の増大が抑制された割合を酸化変性抑制率と定義し、下記計算式(2)に従って酸化変性抑制率を求めた。この結果を表１に示す。
【００３５】
【数２】
0003970975.tif 000003
【００３６】
【表１】
0003970975.tif 000004
【００３７】
表１より明らかなように、本発明の抗酸化活性評価法による結果は、クロロホルム−メタノール抽出により得られたメタノール画分の持つ抗酸化活性の結果に強く反映していた。従って、本発明の抗酸化活性の評価方法によれば、微生物の有する抗酸化活性を、容易に評価し、選択することができる。
【００３８】
実施例１
18mmφの試験管に５mlのYMブロスを入れ、121℃で15分間滅菌した。食経験のある酵母菌株19種をスラントから各試験管に１白金耳接種し、28℃で24時間好気培養し、前培養液とした。この前培養液を５mlの新鮮培地（ローズベンガル無添加）及びローズベンガル添加培地（濃度0.02mM）にそれぞれ50μl、すなわち１％接種した後、28℃の恒温室で18時間蛍光灯照射下（1400〜1500lux）で前培養と同様に往復振とう培養（100oscill/min）を行った。培養後の本培養液を適宜希釈してから分光光度計でOD660を測定し、比（ローズベンガル添加培地／ローズベンガル無添加培地）を求め、増殖阻害度を比較した。この結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
0003970975.tif 000005
【００４０】
以上の結果、キャンディダ・ステラータ、キャンディダ・パラプシロシス、ロドトルーラ・ルブラ、ハイフォピチア・ブルトニ、サッカロマイセス・ユニスポラス、チゴサッカロマイセス・バイスポラス、キャンディダ・マルトーサ、トルロプシス・マグノリエ、ロドトルーラ・マイヌータ、ロドトルーラ・グルチニス、ピチア・メンブランファシエンス、キャンディダ・グロペンギエッセリ、サッカロマイセス・エレガンス、サッカロマイセス・バヤヌス、キャンディダ・トロピカリス及びハンズヌラ・ホルスティーの酵母群に優れた抗酸化活性があることが分かった。
【００４１】
実施例２
キャンディダ・パラプシロシス ATCC 6295をYM培地（ディフコ社製）１リットルに接種し、24時間培養した。酵母菌体を集菌、洗浄した後、エタノール100mlで抽出し、下記の処方に従いローションを製造した。
0003970975.tif 000006
【００４２】
【発明の効果】
本発明の抗酸化剤は、優れたLDL抗酸化活性を有しており、LDL抗酸化剤として従来のLDL抗酸化剤と比較し非常に有用であり、動脈硬化の発端とされるLDLの酸化変性を効果的に防止することができるほか、化粧品の配合成分としても有用である。
【００４３】
本発明の微生物の抗酸化活性の評価方法は、従来の評価方法と比較して、以下のような点で有利である。
【００４４】
(1)  菌株そのものを直接評価できることに加え、微生物が数多く存在していると考えられる土壌サンプルや発酵食品の抗酸化活性の評価にそのまま応用することができる。
【００４５】
(2)  そのため、幅広い微生物に対し、簡便かつ迅速に抗酸化活性の評価を行うことができる。
【００４６】
(3)  濁度測定という容易な測定法によることも可能であるため、これまで抗酸化活性測定に必要とされてきた菌体の破砕・抽出という手間を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【図１】菌株の違い及び増殖期の違い（12時間及び24時間）がローズベンガルに対する感受性に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図２】液体培地での培養における容器の違いによる影響を検討した結果を示す図である。
【図３】抗酸化活性の異なる３菌株について、培地中のローズベンガルの濃度を変えて培養を行った場合のOD660及び無添加培地における測定値との比を比較した図である。
【図１】
0003970975.tif 000007
【図２】
0003970975.tif 000008
【図３】
0003970975.tif 000009