(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
0003999275.tif 000005
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって置換されていてもよい低級アルキルを示し、Ｒ3は水素原子もしくは低級アルキルを示し、またはＲ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環もしくはジヒドロフラン環を形成し、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は同一または異なって水素原子または低級アルキルを示し、破線は結合の存在または不存在を示す）
で表わされる化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）：
0003999275.tif 000006
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって置換されていてもよい低級アルキルを示し、Ｒ3は水素原子を示すか、またはＲ2と一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4は水素原子または低級アルキルを示し、破線は結合の存在または不存在を示す）
で表わされる化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）：
0003999275.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4がメチルであり、Ｒ3が水素原子、破線は結合の不存在を示すか、Ｒ1がヒドロキシメチルであり、Ｒ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4が水素原子、破線は結合の不存在を示すか、またはＲ1がヒドロキシメチルであり、Ｒ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4が水素原子を示し、破線は結合の存在を示す）で示される化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはその水和物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、グルタミン酸輸送体阻害剤に関する。さらに詳しくはグルタミン酸の取り込みを阻害することにより、細胞外のグルタミン酸濃度を上昇させ、神経伝達を活性化させる作用を有するジテルペン化合物に関する。
本発明阻害剤は、シナプス可塑性や記憶の基礎的メカニズムといわれる長期増強（ＬＴＰ）を増大させると考えられることから、記憶障害等の治療剤として利用することができる。また、神経性疾患解明への有用なツールとして使用できる。
背景技術
グルタミン酸輸送体（FEBS Lett.vol.325,1,2.95-99,1993）は、正常状態においては神経の接合部（シナプス）で興奮性伝達物質として放出されたグルタミン酸を回収している。それにより興奮性の神経伝達を抑制すると共に細胞外のグルタミン酸濃度を低く保ち、グルタミン酸による神経細胞毒性から神経細胞を守っている。一方、脳器質変性、脳血管障害等による老年期注意力および記憶障害においては、シナプス伝達が正常に行われていないと考えられる。グルタミン酸作動性神経の刺激伝達を改善する手段の一つとして、グルタミン酸輸送体阻害剤を用いてグルタミン酸の細胞内への取り込みを阻害することが挙げられる。すなわちグルタミン酸の細胞内への取り込みを阻害することにより、細胞外のグルタミン酸濃度を上昇させ、シナプス可塑性や記憶の基礎的メカニズムといわれる長期増強（ＬＴＰ）を増大させ、シナプス伝達効果を高め記憶障害等を改善するものである（Nature,Vol.319,774-776,1986）。これまでにアミノ酸誘導体でのグルタミン酸輸送体阻害剤は見いだされてきたが（特開平７−１２６２５０）、いずれも医薬にはなり得ず、アミノ酸誘導体以外の化合物が望まれていた。
発明の開示
上記に鑑み、本発明者らはアミノ酸誘導体以外のグルタミン酸取り込み阻害剤について研究を行ってきた。
本発明者らは鋭意研究の結果、ジテルペン誘導体にグルタミン酸輸送体阻害活性を有する化合物を見出した。
すなわち本発明は、下記一般式（Ｉ）：
0003999275.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって置換されていてもよい低級アルキルを示し、Ｒ3は水素原子もしくは低級アルキルを示し、またはＲ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環もしくはジヒドロフラン環を形成し、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は同一または異なって水素原子または低級アルキルを示し、破線は結合の存在または不存在を示す）
で表わされる化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤に関する。
さらに詳しくは、ａ）一般式（ＩＩ）：
0003999275.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって置換されていてもよい低級アルキルを示し、Ｒ3は水素原子を示すか、またはＲ2と一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4は水素原子または低級アルキルを示し、破線は結合の存在または不存在を示す）
で表わされる化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤、
ｂ）一般式（ＩＩ）において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4がメチルであり、Ｒ3が水素原子、破線は結合の不存在を示す化合物、Ｒ1がヒドロキシメチルであり、Ｒ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4が水素原子を示し、破線は結合の不存在を示す化合物、またはＲ1がヒドロキシメチル基であり、Ｒ2とＲ3が一緒になってＲ3の隣接する酸素原子およびＲ2の隣接する炭素原子を環内に含むフラン環を形成し、Ｒ4が水素原子を示し、破線は結合の存在を示す化合物、もしくはそれらの薬理学的に許容される塩、またはそれらの水和物、
ｃ）ｂ）に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物、ｄ）ｂ）に記載の化合物を有効成分として含有するグルタミン酸輸送体阻害剤に関する。
本明細書中、「低級アルキル」とは、直鎖状または分枝状のＣ1〜Ｃ6アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等を意味する。
本明細書中、「置換されていてもよい低級アルキル」における置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル部分が直鎖状または分枝状のＣ1〜Ｃ3アルキルである低級アルコキシ等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、検体の各濃度におけるグルタミン酸取り込み阻害率を百分率で示したグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のグルタミン酸輸送体阻害剤の有効成分は、ボリビア等で市販されている生薬コラデキルキンチョ（COLA DE QUILQUINCHO）（学名：Lycopodiumcrassum Willd.）より分離される式：
0003999275.tif 000004
で表わされる化合物、文献記載の化合物（Helv.Chim.Acta（1984）1523-30、Bull.Chem.Soc.Jpn（1991）2762-65）、およびこれらの化合物を化学的に修飾することにより得ることができる化合物、である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、および（Ｖ）で表わされる化合物は、生薬コラデキルキンチョより、例えば、以下の方法によって単離できる。すなわち、該生薬を有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、アセトン、エチルアセテート、クロロホルム、ジクロロメタン、ベンゼン、トルエン等で抽出し、さらに抽出物を水と混和しない有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルアセテート、ｎ−ブタノール等を用いて有機溶媒−水系で抽出する。得られた抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離することにより該化合物を得ることができる。
さらなる化合物は、文献記載の化合物（Helv.Chim.Acta（1984）1523-30、Bull.Chem.Soc.Jpn（1991）2762-65）および式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）で表わされる化合物を化学的に修飾して得られる。例えば、反応に関係の無い水酸基をアセチル基、シリル基等の適当な保護基で保護した後、アルキル化、酸化、脱水、ハロゲン化、増炭等の反応を行うことによる。保護基は適切な段階で常法により脱保護する。
「本発明化合物」という場合には、薬理学的に許容される塩、またはその水和物も包含される。例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ±類金属（マグネシウム、カルシウム等）との塩等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
本発明は細胞外のグルタミン酸濃度を上昇させ、シナプス可塑性や記憶の基礎的メカニズムといわれる長期増強（ＬＴＰ）を増大させることが期待されることから、シナプス伝達効果を高めて記憶障害などの改善に有効である。
本発明製剤を上記の疾患の治療あるいは予防を目的としてヒトに投与する場合は、有効成分を散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、もしくは液剤として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、もしくは吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本化合物の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、および滑沢剤などの医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。
有効成分の投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に経口で投与する場合、通常０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。
以下に実施例および試験例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例
ボリビアで市販されている生薬（COLA DE QUILQUINCHO,Lycopodium crassum Willd.）1.4kgをメタノール４Ｌに浸漬し７日間室温で静置した後濾過し、濾液を減圧溜去した。これを２回繰り返して得た残留物を、水とエチルアセテートで分配してエチルアセテート可溶部（81g）を得た。エチルアセテート可溶部（80g）を１回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10%H2Oを含むKieselgel 60,70-230mesh，メルク社，400g）に付し、ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝１：１）で溶出する活性画分（7.68g）とｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝１：２）で溶出する活性画分（18.2g）を得た。ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝１：１）溶出画分（7.68g）のメタノール可溶部（5.45g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（120g）に付し、ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝９５：５）で溶出する活性画分（166.4mg）を得た。この画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10g）に付して、ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝９８：２）で溶出する画分（28.1mg）を得た。この画分をＨＰＬＣ（Column:Develosil ODS 250 x 20mm i.d.,溶媒：メタノール3ml/分，monitor:250mm）で２５分に溶出する成分（22.6mg）を集めてメタノールから再結晶して化合物（ＩＩＩ）を６．８ｍｇ得た。
さらに、１回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで得たｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝１：２）溶出画分（18.2g）のメタノール可溶部（14.57g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（240g）に付し、ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝８：２）〜エチルアセテートで溶出する活性画分（9.61g）を得た。この画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200g）に付し、ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（＝７：３）で溶出する画分（1.507g）を、さらに、逆相カラムクロマトグラフィー（Chromatorex ODS,500g）に付し、メタノール：水（＝４：１）で溶出する活性画分Ａ（68mg）と活性画分Ｂ（51mg）を得た。活性画分ＡをＨＰＬＣ（Column:Develosil ODS 250 x 20 mm i.d.,solvent:MeOH-H2O（4:1）3ml/min,monitor:250nm）で47分に溶出する化合物（ＩＶ）（1.4mg）を得た。
さらに、活性画分ＢをＨＰＬＣ（Column:Develosil ODS 250 x 20 mm i,d.,溶媒：メタノール−水（4:1）4.5ml/分，monitor:250nm）で48分に溶出する化合物（Ｖ）（4.0mg）を得た。
化合物（ＩＩＩ）：
融点：162〜165℃（無色針状結晶,メタノール）．
［α］D+81.8°（ｃ=0.30，クロロホルム）．
IR ν（CHCl3）cm-1：1610．
MS（EI-MS）：m／z  362（M+,C21H30O5）．
UV（λmax in MeOH,nm，ε）：294.2（12400），343.4（5900）
1H-NMR（CDCl3400 MHz）δ：1.201（3H,s,19-Me），1.221（3H,s,20-Me），1.323（3H,d,J=7.0,16-Me），1.326（3H,d,J=7.0,17-Me），1.478s（3H,s,18-Me），1.293（1H,m,3b-H），1.482（1H,s,3a-H），1.540（1H,m,1b-H），1.583（1H,m,2b-H），1.720（1H,m,2a-H），1.806（1H,d,J=12.8,5-H），2.942（1H,m,1a-H），3.520（1H,m,J=7.0,15-H），4.567（1H,dd,J=12.8,1.8  6-H），3.727（3H,s,11-OMe），3.792（1H,d,J=1.8,6-OH），6.394（1H,s,12-OH），13.266（1H,s,14-OH）．
13C-NMR（CDCl3,100MHz）（カッコ内はシグナルの帰属を表わす）δ：19.02（2），20.02（16），20.09（17），22.33（20），22.40（18），24.26（15），34.22（4），36.07（19），38.08（1），41.27（10），42.48（3），55.01（5），62.01（11-Me），72.35（6），106.38（8），120.14（13），137.57（11），143.71（9），156.46（12），161.34（14），203.78（7）
化合物（ＩＶ）
融点：168-172℃（黄色結晶、メタノール）
［α］D+153.3（c=0.97，メタノール）．
IR ν（KBr）cm-1:1631．
MS［FABMS］m/z 360（M+ C20H24O6）
UV（λmax in MeOH,nm，ε）：235.3（17900），259.0（15000）,366.6（4000）．
1H-NMR（acetone-d6,400MHz）δ：1.247（3H,s,19-Me），1.262（3H,s,20-Me），1.343（1H,m,3-H），1.462（1H,m,1-H），1.53（1H,m,3-H），1.55（1H,m,2-H），1.628（3H,s,18-Me），1.772（1H,m,2-H），1.870（1H,d,J=13.2,5-H），
3.469（1H,m,1-H），4.19（1H,d,J=2.8,6-OH），4.120（1H,br.,17-OH），4.760（1H,dd,J=13.2,2.8,6-H），4.842（1H,s-like,17-H），4.842（1H,s-like,17-H），
7.691（1H,t,J=1.4,16-H），8.395（1H,br.,11-OH），13.130（1H,br.,14-OH）
13C-NMR（acetone-d6,100MHz）（カッコ内はシグナルの帰属を表わす）
δ:19.73（2），19.90（18），22.98（20），34.85（4），36.44（19），38.08（1），42.44（10），43.34（3），55.66（5），56.45（17），73.23（6），109.34（8），115.74（13），124.48（15），133.91（11），135.24（9），142.44（16），153.33（12），153.91（14），206.96（7）
化合物（Ｖ）
融点：218〜221℃（黄褐色針状結晶、メタノール）
［α］D+33.0（c=0.56，メタノール）．
IR ν（KBr．）cm-1 1611
MS［FABMS］m/z 359（［M+H］+ C20H22O6+H）
UV（λ max in MeOH,nm，ε）：221.2（16800），267.1（13200），327.8（5100），393.5（4500）．
1H-NMR（acetone-d6,400MHz）δ：1.460（1H,m,3-H），1.481（3H.s.20-Me），1.500（3H.s.19-Me），1.730（1H,m,2-H），1.748（1H.m.1-H），1.767（3H,s,18-Me），1.910（1H,m,2-H），2.100（1H,m,3-H），3.343（1H.m.1-H），4.105（1H.br.,17-OH），4.864（1H,s-like,17-H），4.864（s-like,17-H），7.606（1H,s,6-OH），7.705（1H,t,J=1.4,16-H），8.565（1H,br.,11-OH），13.335（1H,br.,14-OH）
13C-NMR（acetone-d6,100MHz）（カッコ内はシグナルの帰属を表わす）
δ：18.24（2），27.34（19），27.94（18），28.35（20），30.83（1），36.88（3），37.41（4），42.82（10），55.50（17），108.05（8），115.53（13），124.28（15），133.45（11），135.28（9），142.36（16），142.92（6），146.51（5）152.11（12），152.48（14），185.52（7）
試験例
グルタミン酸の取り込み阻害活性
小脳顆粒細胞の調製
８日令のSD（Sprague Dawley系（日本SLC，静岡））系ラットの小脳を２０匹分摘出し、０．２５％トリプシン・１ mM ＥＤＴＡ ４Ｎａ液で１０分間３７℃で処理、ピペッティングにより細胞を分散させる。ナイロンメッシュ（Cell Strainer,70μm Nyron,FALCON）を通し、大きな組織塊を除去する。ポリ−L−リジン（poly-L-Lysine）を使用して表面をコーティングした２４穴培養皿２０枚に分散した細胞を分注する。培地はα−ＭＥＭ培地に１０％ウシ血清、２５ｍＭ  ＫＣｌを添加したものを用いる。細胞を２４穴培養皿に分注後２４−４８時間に終濃度１０μＭシトシン、およびβ−Ｄ−アラビノフラノシドを添加し、増殖性細胞（グリア細胞）を除去する。その後、３日ごとに培地交換を行い、１−２週目の細胞を実験に用いた（Manual of the Nervous System,pages 203-206,1989 Alan R.Liss,Inc.）。
グルタミン酸取り込み実験
上記培養細胞の培養液を除去し、クレブス−リンガー液で２回洗浄する。［3H］グルタメート（１μＭ）をクレブス−リンガー液中で１０分間インキュベートし、細胞内に取り込まれた［3H］の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、総取り込み量とした。本発明化合物の添加は各濃度の化合物をクレブス-リンガー液に溶解し、細胞洗浄後１０分間３７℃で前処理する。さらに各濃度の化合物と［3H］グルタメート（１μＭ）を含むクレブス-リンガー液に置換して１０分間３７℃でインキュベートし細胞に取り込まれた［3H］の放射活性を測定した。その結果を図１に示した。
本発明化合物は図１からも明らかなように、神経細胞へのグルタミン酸の取り込みを阻害する活性を持つ。化合物（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の活性（IC50）はそれぞれ３７μＭ、１２０μＭであった。更にこれらの化合物はγ−ブチリル酸（ＧＡＢＡ）の神経細胞への取り込みは阻害しなかった。
製剤例
一般式（Ｉ）で表わされる化合物      １０ｍｇ
でんぷん                            ２４ｍｇ
乳糖                                １２ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース        ０．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム            ０．４ｍｇ
産業上の利用可能性
グルタミン酸輸送体の選択的阻害作用を有し、細胞外のグルタミン酸の濃度を上昇させ、シナプス可塑性や記憶の基礎的メカニズムといわれる長期増強（ＬＴＰ）を増大させ、シナプス伝達効果を高めて記憶障害等の改善が期待できるジテルペン誘導体を提供する。
【図１】
0003999275.tif 000008