(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、増幅プローブおよび捕獲プローブを使用し、そして該セットの各メンバーは、第一の核酸セグメントおよび第二の核酸セグメントを含み、
ここで、該第一の核酸セグメントは、最小３３ヌクレオチドから最大約１００ヌクレオチドの長さを有し、ここで該第一の核酸セグメントおよび該第一の核酸セグメントが結合するＨＩＶ核酸のセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第一の核酸セグメントは、以下：
【化１】
0003907201.tif 000102
からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示され、そして、該第二セグメントは、第二ヌクレオチド配列を含み、ここで該ヌクレオチド配列および増幅マルチマーのバックボーンオリゴヌクレオチドセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、該増幅マルチマーのバックボーンオリゴヌクレオチドセグメントは、該増幅プローブの該第二の核酸セグメントにハイブリダイズし、かつ標識オリゴヌクレオチドに相補的でなく、ここで該第二の核酸セグメントは、ＨＩＶゲノムに相補的でなく、そして、
該第二の核酸配列が、
【化２】
0003907201.tif 000103
を含む、合成オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２】
請求項１に記載の合成増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、該セットの第一核酸セグメントが、配列番号５〜１３、１７〜４０、４５、４６および４９〜５３からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列からなり、ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示される、オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３】
ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、増幅プローブおよび捕獲プローブを使用し、そして該セットの各メンバーは、第一の核酸セグメントおよび第二の核酸セグメントを含み、
ここで、該第一の核酸セグメントは、最小３３ヌクレオチドから最大約１００ヌクレオチドの長さを有し、ここで該第一の核酸セグメントおよび該第一の核酸セグメントが結合するＨＩＶ核酸のセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第一の核酸セグメントは、以下：
【化３】
0003907201.tif 000104
からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示され、そして、
該第二セグメントは、第二ヌクレオチド配列を含み、ここで該ヌクレオチド配列および固相に結合したオリゴヌクレオチドの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第二のヌクレオチド配列は、ＨＩＶ核酸に相補的でなく、そして、
該第二のヌクレオチド配列が、
【化４】
0003907201.tif 000105
を含む、合成オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項４】
請求項３に記載の合成捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、該セットの第一核酸セグメントが、配列番号１４〜１６、４１〜４４、４７、４８および５４からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列からなり、ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示される、オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項５】
ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、増幅プローブおよび捕獲プローブを使用し、そして該セットの各メンバーは、第一の核酸セグメントおよび第二の核酸セグメントを含み、
ここで、該第一の核酸セグメントは、最小３３ヌクレオチドから最大約１００ヌクレオチドの長さを有し、ここで該第一の核酸セグメントおよび該第一の核酸セグメントが結合するＨＩＶ核酸のセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第一の核酸セグメントは、以下：
【化５】
0003907201.tif 000106
からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示され、そして、
該第二セグメントは、第二ヌクレオチド配列を含み、ここで該ヌクレオチド配列および増幅マルチマーのバックボーンオリゴヌクレオチドセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、該増幅マルチマーのバックボーンオリゴヌクレオチドセグメントは、該増幅プローブの該第二の核酸セグメントにハイブリダイズし、かつ標識オリゴヌクレオチドに相補的でなく、ここで該第二の核酸セグメントは、ＨＩＶ核酸に相補的でなく、そして、
該第二の核酸配列が、
【化６】
0003907201.tif 000107
を含む、合成オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項６】
請求項５に記載の合成増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、該セットの第一核酸セグメントが、配列番号５〜４４からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列からなり、ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示される、オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項７】
ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、増幅プローブおよび捕獲プローブを使用し、そして該セットの各メンバーは、第一の核酸セグメントおよび第二の核酸セグメントを含み、
ここで、該第一の核酸セグメントは、最小３３ヌクレオチドから最大約１００ヌクレオチドの長さを有し、ここで該第一の核酸セグメントおよび該第一の核酸セグメントが結合するＨＩＶ核酸のセグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第一の核酸セグメントは、以下：
【化７】
0003907201.tif 000108
からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示され、そして、
該第二セグメントは、第二ヌクレオチド配列を含み、ここで該第二ヌクレオチド配列および固相に結合したオリゴヌクレオチドの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応し、ここで該第二のヌクレオチド配列は、ＨＩＶ核酸に相補的でなく、そして、
該第二のヌクレオチド配列が、
【化８】
0003907201.tif 000109
を含む、合成オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項８】
請求項７に記載の合成捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、該セットの第一核酸セグメントが、配列番号４５〜５４からなる群から選択される第一ヌクレオチド配列からなり、ここで、該群の全ての該第一ヌクレオチド配列は、該セット内に示される、オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項９】
試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：
（ａ）  該試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）請求項１または２に記載の増幅プローブオリゴヌクレオチドのセット、および、（ｉｉ）請求項３または４に記載の捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程であって、ここで、該試料中において分析物核酸よりモル過剰の増幅プローブおよび捕獲プローブが存在する、工程；
（ｂ）  工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドが、以下：
【化９】
0003907201.tif 000110
を含む固相と結合する、工程；
（ｃ）  その後、該固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）  工程（ｃ）の結合した生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、核酸増幅マルチマーと接触させる工程であって、該マルチマーが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドセグメント、ここで該オリゴヌクレオチドセグメントおよび該増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、および、多数の第二オリゴヌクレオチドセグメント、ここで該第二のオリゴヌクレオチドセグメントおよび標識オリゴヌクレオチドの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、を含む、工程；
（ｅ）  非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）  工程（ｅ）の固相複合体生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｇ）  非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）  工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出し、そしてそれにより該試料中のウイルスの存在を検出する工程。
【請求項１０】
試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：
（ａ）  該試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）請求項５または６に記載の増幅プローブオリゴヌクレオチドのセット、および、（ｉｉ）請求項７または８に記載の捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程であって、ここで、該試料中において分析物核酸よりモル過剰の増幅プローブおよび捕獲プローブが存在する、工程；
（ｂ）  工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドが、以下：
【化１０】
0003907201.tif 000111
を含む固相と結合する、工程；
（ｃ）  その後、該固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）  工程（ｃ）の結合した生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、核酸増幅マルチマーと接触させる工程であって、該マルチマーが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドセグメント、ここで該オリゴヌクレオチドセグメントおよび増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、および、多数の第二オリゴヌクレオチドセグメント、ここで該第二のオリゴヌクレオチドセグメントおよび標識オリゴヌクレオチドの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、を含む、工程；
（ｅ）  非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）  工程（ｅ）の固相複合体生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｇ）  非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）  工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出し、そしてそれにより該試料中のウイルスの存在を検出する工程。
【請求項１１】
試料中のＨＩＶの検出のためのキットであって、以下の組み合わせを含む、キット：
（ｉ）  請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドのセットを含む増幅プローブオリゴヌクレオチドのセット；
（ｉｉ）  請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセット；
（ｉｉｉ）  増幅マルチマーであって、該マルチマーが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドセグメント、ここで該オリゴヌクレオチドセグメントおよび該増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、および、多数の第二オリゴヌクレオチドセグメント、ここで該第二のオリゴヌクレオチドセグメントおよび標識オリゴヌクレオチドの各塩基の少なくとも９０％が正確に対応する、を含む、増幅マルチマー；および
（ｉｖ）  標識オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）を検出するための新規な核酸プローブに関する。
背景技術
AIDSおよびARCの病因物質は、LAV、HTLV-III、ARV、およびHIVとさまざまに呼ばれている。以下、これをHIVと称する。このウイルスのRNAまたはDNAの検出は、種々のプローブ配列およびハイブリダイゼーション形式により可能である。
1987年８月11日に出願されたPCT WO 88/01302には、HIVのDNAまたはRNAの検出にプローブとして用いられる13個のHIVオリゴヌクレオチドが開示されている。1987年６月22日に出願されたPCT WO 87/07906には、HIVウイルスの変異株およびそれらのDNAをAIDS診断に使用することが開示されている。1989年１月27日に出願されたEP 0 326 395 A2には、多発性硬化症に関連する配列を検出するための、ヌクレオチド2438〜2457位の長さのHIV DNAプローブが開示されている。
ポリメラーゼ連鎖反応の出現により、主としてpol遺伝子およびgag遺伝子の領域に由来するプローブを用いるアッセイの範囲が刺激された。Spectorら（Clin. Chem.35/8:1581-1587, 1989）およびkellogら（Analytical Biochem 189:202-208, 1990）は、HIV gag遺伝子由来のプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いる、HIVプロウイルスDNAの定量アッセイを開示している。Lomellら（Clin. Chem.35/9:1826-1831）は、HIV pol遺伝子mRNAの保存領域に相補的な増幅可能RNAプローブを開示している。Coutleeら（Anal. Biochem.181:96-105, 1989）は、HIV polおよびgag遺伝子由来の配列に相補的なプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応によるHIV DNAの免疫検出を開示している。1987年12月15日に出願されたEP 0 272 098には、ヌクレオチド8538〜8547位および8658〜8677位の長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いる、HIV RNA配列のPCR増幅および検出が開示されている。1987年１月９日に出願されたEP 0 229 701には、HIV gag領域由来のDNAの増幅によるHIVの検出が開示されている。PCT WO 89/10979には、捕獲プローブおよびリポータープローブを用いて固体支持体に固定する、増幅と溶液ハイブリダイゼーションとを組み合わせる核酸プローブアッセイが開示されている。HIVのgag p 17領域内の領域は、この技法によって増幅された。
他の方法は、「可逆的標的捕獲」と呼ばれる。例えば、Thompsonら（Clin. Chem.35/9:178-1881, 1989）は、HIV RNAの「可逆的標的捕獲」を開示していおり、ここで市販の入手可能なdAテイル化合物オリゴヌクレオチドは、分析される核酸の選択的精製を提供し、そしてHIV pol遺伝子に相補的な標識アンチセンスRNAプローブはシグナルを提供している。Gillespieら（Molecular and Cellular Probes3:37-86, 1989）は、HIV RNAの可逆的標的捕獲のためのプローブを開示しており、ここでこのプローブは、HIV pol遺伝子のヌクレオチド2094〜4682位に相捕的である。
Kumarらは、HIV DNAの「プローブシフト」アッセイを開示している。これは、HIVのgagおよびpol遺伝子に相補的なDNA配列を用いる。プローブシフトアッセイは、標識オリゴヌクレオチドのPCR増幅セグメントへの、溶液中でのハイブリダイゼーションに依存する。そこで形成されるヘミ二重鎖は、非変性ゲル上で分画を行った後検出される。
Kellerら（Anal. Biochem.177:27-32, 1989）は、gagコーディング領域のPstI部位に広がるHIV DNAを検出するための、マイクロタイターベースのサンドイッチアッセイを開示している。
Viscidiら（J. Clin. Micro.27:120-125, 1989）は、固相抗ビオチン抗体およびDNA-RNAハイブリッドに特異的な酵素標識モノクローナル抗体を用いる、HIV RNAのハイブリダイゼーションアッセイを開示しており、ここでプローブは、ポリメラーゼ遺伝子のほぼ全域およびgag遺伝子の3'末端に広がる。
1989年11月16日に出願された欧州特許出願（EPA）第89311862号には、核酸を検出するための固体捕獲法を用いる診断キットおよび方法が開示されており、HIV DNAの検出のために、HIV gag遺伝子に相補的なDNA配列を使用することが記載されている。
同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ-分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
同一人に譲渡された欧州特許出願（EPA）第883096976号には、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ型肝炎ウイルス、Neisseria gonorrhoeae、N. gonorrhoeaeのペニシリンおよびテトラサイクリン耐性、およびChlamydia trachomatisについて開示されている。
1990年７月27日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願第558,897号には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。
1987年11月24日に出願された米国特許第5,030,557号には、プローブの標的への結合を促進するために、分析される核酸に結合して、標的に異なる二次および三次構造を与えるように選択された、「ヘルパー」オリゴヌクレオチドが開示されている。
発明の開示
本発明の１つの局面は、HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、HIVに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。
本発明の別の局面は、HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、HIVに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。
本発明の別の局面は、HIVを検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションに用いるためのスペーサーオリゴヌクレオチドである。
本発明の別の局面は、試料中のHIVの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する：
(a)  該試料を、過剰の(i)HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、(ii)HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
(b)  工程(a)の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
(c)  その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
(d)  工程(c)の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
(e)  非結合マルチマーを除去する工程；
(f)  工程(e)の固相複合体生成物を、該標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
(g)  非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
(h)  工程(g)の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
本発明の別の局面は、試料中のHIVの検出のためのキットであって、このキットは以下の組み合わせを含む：
(i)  増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントとを含む、セット；
(ii)  捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、HIV核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；
(iii)  核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、マルチマー；および
(iv)  標識オリゴヌクレオチド。
発明を実施するための形態
定義
「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」とは、同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号、EPA第883096976号、および米国特許出願第558,897号に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレオチドは、そのN4位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている5'-シチジンである。
「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（すなわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は共有結合によりつくられ、マルチマーは、２つの型のオリゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズした核酸に、および多数の標識プローブにハイブリダイズし得る。このようなマルチマーの組成物および調製は、EPA第883096976号、および1990年７月27日に出願された米国特許出願第558,897号に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。
「スペーサーオリゴヌクレオチド」は、分析されるRNAに結合するが、固相に付着するためのいかなる配列をも含まず、そして増幅プローブによるいかなる検出手段をも含まないオリゴヌクレオチドとして意図される。
用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメントと、増幅マルチマーに特異的にハイブリダイズするセグメントまたはセグメントの反復とを有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチドとして意図される。
用語「捕獲プローブ」は、分析される核酸のヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。
本明細書中で本発明のコーム型分枝ポリヌクレオチドを記載するのに用いられる「大きな(Large)」とは、少なくとも約15個の分枝部位と、標識プローブ結合配列の少なくとも約20個の反復とを有する分子を意味する。
本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられる「コーム型」とは、バックボーンから伸長している多数の側鎖を有する直鎖状のバックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。
「切断可能なリンカー分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断され得る共有結合を含む分子を意味する。
本明細書中に開示された全ての核酸配列は、5'から3'への方向に記載されている。ヌクレオチドは、IUPAC-IUB生化学命名委員会によって推奨されたヌクレオチド記号に従って示す。
溶液相ハイブリダイゼーションアッセイ
溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションの一般的なプロトコルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一本鎖核酸プローブセットを入れたマイクロタイターウェル中に入れる：(1)捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に実質的に相補的な第一結合配列、および、固体支持体（例えばウェル表面またはビーズ）に結合した核酸に実質的に相補的な第二結合配列を有する、および(2)増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と実質的に相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕獲プローブの第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの実質的に相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。
分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体）由来であり得、種々の手段（例えば、プロテイナーゼK／SDS、カオトロピック塩など）によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、0.1kb程に小さくあり得、通常少なくとも約0.5kbであり、そして１kbまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約0.05〜0.2Mの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの組合せ）により行われ得る。
分析される配列に実質的に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも15ヌクレオチド、通常少なくとも25ヌクレオチド、そして約５kb以下、通常約１kb以下、好ましくは約100ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約30ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。
用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影響する。なぜなら、これは用いられるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提供されるシグナルが強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用いるほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられるようになり、それによって偽陽性結果の発生率が減少する。従って、セット中のプローブ数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、より好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好ましくは５〜100個の捕獲プローブおよび５〜100個の増幅プローブである。
HIVのオリゴヌクレオチドプローブ配列は、GenBank由来の18個のHIV株のDNA配列を並べることにより設計した。pol遺伝子内の相同性が最も高い領域を捕獲プローブとして選択し、一方、より相同性の低い領域を増幅プローブとして選択した。非常に異質の領域をスペーサープローブとして選択した。従って、HIVのより多くの株が同定され配列決定されるのに伴って、さらなるプローブが設計され得るか、または現存の好ましいセットのプローブが改変され得る。これは、新規の株または単離株の配列と、上記で用いられた18株の配列とを並べ、同様に相同性の最も高い領域およびより低い領域を同定することによって行われ得る。
スペーサーオリゴヌクレオチドは、起こり得る分解からRNAを保護するために、ハイブリダイゼーション反応混液に加えられるように設計した。捕獲プローブ配列および標識プローブ配列は、捕獲プローブ配列に標識プローブ配列が散在するように、または捕獲プローブ配列が、標識プローブ配列に関して共にクラスター形成されるように設計した。
HIV核酸に特異的にハイブリダイズする、現存の好ましいセットのプローブおよびそれらの捕獲領域または増幅領域を、実施例２に挙げる。
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約10％未満の塩基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基が正確に対応するような正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、90％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。オリゴヌクレオチド配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Learyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1983）80:4045; RenzおよびKurz、Nucl. Acids Res．（1984）12:3435; RichardsonおよびGumport、Nucl. Acids Res.（1983）11:6167; Smithら、Nucl. Acids Res.（1985）13:2399; MeinkothおよびWahl、Anal. Biochem.（1984）138:267を参照のこと。標識は、実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Texas red）、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、NADPH、α-β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが包含される。
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約1.5：１であり、より好ましくは少なくとも２：１である。通例、２：１から10,000：１の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約10-5〜10-9Mの範囲であり、試料の核酸濃度は、10-21〜10-12Mまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約10分から20時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約20℃から80℃の範囲で、より通常には約35℃から70℃までで、特に65℃で行われ得る。
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント（0.1〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（0.017〜0.17M））、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、一般的に２〜50％の範囲内の量で存在する。
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジェンシーを変化させる。
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメーターまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメーター、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
実施例
実施例Ｉ
コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成
本実施例は、15個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸長とを有する、コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌクレオチドは、EPA第883096976号に記載の溶液相ハイブリダイゼーションに用いられるように設計した。
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動DNA合成機（Applied Biosystems, Inc.,（ABI）モデル380B）で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、PhostelTM試薬（ABN）を用いる5'リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的なABIプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた（例えば、1.2サイクル）と示されている場合、ABIにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Applied Biosystems, Model 380B DNA合成機で行われる、サイクル1.2および6.4を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。
以下の構造のコーム体を最初に調製した：
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ここで、X'は分枝モノマーであり、そしてRは過ヨウ素酸切断可能リンカーである。
15個の（TTX'）繰り返しによるコーム体の部分を、33.8mgのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス（CPG）（2000Å、支持体１グラム当り7.4マイクロモルチミジン）を用いて、1.2サイクルプロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった：
0003907201.tif 000003
ここでR2
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を表す。
コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、A、C、GおよびTが0.1M、分枝部位モノマーEが0.15M、およびPhostelTM試薬が0.2Mであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー（stepped flowthough）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、5'DMTをアセチル基て置換した。
切断可能リンカーRおよび式3'-RGTCAGTp（配列番号：１）の６塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基（上式のR2）の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にCPG支持体を保持している間に、手動的に行った。R2がレブリニルである場合、0.5Mヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（1:1 v/v）溶液を加え、15分ごとに液体を取り替えながら90分間CPG支持体と接触させておき、続いてピリジン／氷酢酸（1:1 v/v）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカーRおよび６塩基側鎖伸長を、6.4サイクルを用いて加えた。
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、0.1Mであった（0.2MのRおよびPhostelTM試薬を除く；Rは、2-(4-(2-ジメトキシトリチルオキシ）エチル-）フェノキシ2,3-ジ（ベンゾイルオキシ）-ブチルオキシ）フェニル）エチル-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトであった）。
脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（1:1 v/v）の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「CE NH3」を用いて380Bで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を4mlのスクリューキャップWheatonバイアルに集め、60℃で12時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をSpeed-Vacエバポレーターで除去し、残渣を100μlの水に溶解した。
以下の構造の3'バックボーン伸長（セグメントA）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した。
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粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、7M尿素および1X TBEランニング緩衝液を含む）により精製した。
3'バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４pmol／μl）、3'バックボーン伸長（6.25pmol／μl）、側鎖伸長（93.75pmol／μl）、および連結テンプレート（５pmol／μl）を、１mM ATP／５mM DTT／50mMトリスHCl、pH8.0／10mM MgCl2／２mMスペルミジン中で、0.5単位／μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を37℃で２時間インキュベートし、次いで、水浴中で95℃に加熱し、次いで約１時間かけて35℃未満まで冷却した。２mM ATP／10mM DTT、14％ポリエチレングリコール、および0.21単位／μl  T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。DNAをNaCl／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、1mM ATP、5mM DTT、14％ポリエチレングリコール、50mMトリスHCl、pH7.5／10mM MgCl2／2mMスペルミジン、0.5単位／μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.21単位／μl T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
連結反応および精製を行った後、生成物の一部を32Pで標識し、R部位での切断を行い、これは、水性NaIO4で１時間酸化することにより達成された。次いで、試料をPAGEにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で45個の標識プローブ結合部位を有していることが分かった。
実施例２
マルチマーを用いるHIV DNAのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ
本実施例は、HIV DNAアッセイに本発明を使用することを例示する。
「15×3」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式を、本実施例で用いた。「15×3」の呼称は、この形式が２つのマルチマーを用いることに由来する：(1)増幅プローブは、HIV核酸に結合する第一セグメント(A)と、(2)増幅マルチマーにハイブリダイズする第二セグメント(B)とを有し、(2)増幅マルチマーは、セグメント(B)にハイブリダイズする第一セグメント(B*)と、セグメント(C)の15個の反復とを有し、ここでセグメントCは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
本アッセイで用いた増幅プローブおよび捕獲プローブのHIV特異的セグメント、およびそれらの個々の名称は以下の通りであった。
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各増幅プローブは、HIV配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、増幅マルチマーのセグメントに相補的な以下の5'伸長を含んでいた：
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各捕獲プローブは、HIV DNAに対して実質的に相補的な配列に加えて、固相に結合したDNAに対して相補的な以下の下流配列（XT1*）を含んでいた：
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増幅プローブおよび捕獲プローブに加えて、以下のHIVスペーサーオリゴヌクレオチドのセットをハイブリダイゼーション混合物中に含有した。
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マイクロタイタープレートを以下のようにして調製した。
White Microlite 1 Removawellストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、96ウェル／プレート）を、Dynatech Inc.から購入した。各ウェルに200μlの１N HClを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。次いで、このプレートを1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに200μlの１N NaOHを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。プレートを再び1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
ポリ（phe-lys）をSigma Chemicals, Inc.から購入した。このポリペプチドは、phe:lysを1:1のモル比で有しており、平均分子量は47,900mg/molである。平均長さは309アミノ酸であり、155アミン／molを含む。ポリペプチドの1mg/ml溶液を、2M NaCl/1X PBSと混合し、最終濃度0.1mg/ml(pH6.0)にした。各ウェルに、この溶液を200μLずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、30℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
プレートにオリゴヌクレオチドXT1*をカップリングするのに、以下の手順を用いた。XT1*の合成は、EPA第883096976号に記載された。20mgのジスクシンイミジルスベレートを、300μlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解した。XT1*の26 OD260単位を、100μlカップリング緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、pH7.8）に加えた。次いで、カップリング混合物をDSS-DMF溶液に加え、マグネチックスターラーで30分間攪拌した。NAP-25カラムを10mMリン酸ナトリウム、pH6.5で平衡化した。カップリング混合物DSS-DMF溶液を2mlの10mMリン酸ナトリウム、pH6.5に４℃で加えた。この混合物をボルテックスにかけて混合し、平衡化したNAP-25カラムにかけた。DSS活性化XT1* DNAを、3.5mlの10mMリン酸ナトリウム、pH6.5でカラムから溶出した。溶出したDSS活性化XT1* DNAの5.6 OD260単位を、1500mlの50mMリン酸ナトリウム、pH7.8に加えた。各ウェルに、この溶液を50μlずつ加え、プレートを一晩インキュベートした。次いで、プレートを1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。
プレートの最終的なストリッピングは、以下のようにして行った。0.5％(w/v)SDSを含有する200μLの0.2N NaOHを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で60分間インキュベートした。次いで、プレートを1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。
HIV DNAの標準曲線は、HIV陰性ヒト血清でクローン化HIV DNAを希釈し、10〜200tmol（1tmol＝602分子または10-21mol）の範囲に相当する希釈液のアリコートを、上記のように調製したマイクロタイター皿のウェルに配付することにより調製した。
試料の調製は、12.5μlのP-K緩衝液（10mMトリスHCl、pH8.0中の2mg/mlのプロテイナーゼK／0.15M NaCl／10mM EDTA、pH8.0／１％SDS／40μg/mlの音波処理サケ精子DNA）を各ウェルに配付することから成り立った。プレートを覆い、攪拌して試料を混合し、65℃でインキュベートし、核酸を遊離させ、次いでベンチトップ５分間冷却した。
上記に挙げたHIV特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液を各ウェルに加えた（ウェル当り捕獲プローブ50fmol、増幅プローブ50fmol）。プレートを覆い、穏やかに攪拌して試薬を混合し、次いで65℃で30分間インキュベートした。
次いで、中和緩衝液を各ウェルに加えた（0.77M 3-(N-モルホリノ）プロパンスルホン酸／1.845M NaCl／0.185Mクエン酸ナトリウム）。プレートを覆い、65℃で12〜18時間インキュベートした。
各ウェルの内容物をアスピレートして、全ての流体を除去し、そしてウェルを洗浄緩衝液（0.1％SDS／0.015M NaCl／0.0015Mクエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。
次いで、増幅マルチマーを各ウェルに加えた（50％ウマ血清中2.5fmol/μlの溶液40μl／0.06M NaCl／0.06Mクエン酸ナトリウム／4X SSCと1:1で混合した0.1％SDS／0.1％SDS／0.5％「ブロッキング試薬」（Boehringer Mannheim,カタログ番号1096 176））。プレートを覆い、攪拌してウェル中の内容物を混合した後、55℃で15分間インキュベートした。
室温でさらに５分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄した。
次いで、アルカリホスファターゼ標識プローブ（EP第883096976号に開示されている）を、各ウェルに加えた（2.5fmol/μlを40μl/ウェル）。55℃で15分間インキュベートした後、室温で５分間おき、ウェルを、上記のように２回洗浄し、次いで0.015M NaCl／0.015Mクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。
酵素のトリガーとなるジオキセタン（Schaapら、Tet. Lett.（1987）28:1159-1162およびEPA公開第0254051号）をLumigen, Inc.から得、これを用いた。20μlのLumiphos 530（Lumigen）を各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩いて試薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。ウェルを覆い、37℃で40分間インキュベートした。
次いで、プレートをDynatech ML 1000ルミノメーターで読み取った。出力を、反応の間に生じた光の総積分として示した。
結果を以下の表に示す。各標識試料に対する結果は、陰性コントロールの平均値プラス２倍の標準偏差値と、試料の平均値マイナス２倍の標準偏差値との差（デルタ）として表す。デルタが０より大きい場合、試料は陽性であるとみなされる。
HIVプローブの標準曲線から得られる結果を表Ｉに示す。これらの結果より、これらのプローブの能力は、50tmolのHIV DNA標準から検出し始めることが分かった。
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実施例３
HIVウイルスRNAの検出
HIV RNAを、上記と本質的に同じ手順を用いて、以下の改変を行って検出した。
HIV RNAの標準曲線を、HIVウイルス貯蔵品を正常ヒト血清で125〜5000TCID50/mlの間の範囲に連続的に希釈することにより調製した（TCID50は、50％の組織培養物が感染する用量の終点である）。10mgのプロテイナーゼKを、-20℃で貯蔵したホルムアミド中で７％にした5mlのHIV捕獲希釈剤（53mMトリスHCl、pH8／10.6mM EDTA／1.3％SDS／16μg/ml音波処理サケ精子DNA／5.3X SSC／1mg/mlプロテイナーゼK）に加えることにより、プロテイナーゼK溶液を調製した。捕獲プローブ、標識プローブ、およびスペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を、各プローブの最終濃度が1670fmol/mlとなるようなプロテイナーゼK溶液に加えた。上記のように調製したマイクロタイタープレートの各ウェルに、プローブ／プロテイナーゼK溶液を30μlずつ加えた後、各ウェルに適当なウイルス希釈物を10μlずつ加えた。プレートを覆い、振盪して混合し、次いで65℃で16時間インキュベートした。
プレートをインキュベートから取り出し、ベンチトップで10分間冷却した。ウェルを、上記実施例２に記載のようにして２回洗浄した。15×3マルチマーをAmp／Label希釈剤で1fmol/μlに希釈した（2.22ml DEPC処理H2O(DEPCはジエチルピロカルボネート)、1.35mlの10％SDS、240μlの1MトリスpH8.0、20μlのウマ血清を混合することにより調製し、プロテイナーゼK中2mg/mlに調製して65℃で２時間加熱し、次いでこれを240μlの0.1M PMSFに加えて37℃で１時間加熱し、この後、4mlのDEPC処理H2O、4mlの10％SDS、および8mlの20X SSCを加えた）。希釈した15×3マルチマーを40μl/ウェルで加え、プレートを封じ、振盪し、55℃で30分間インキュベートした。
次いでプレートを室温で10分間冷却し、上記のように洗浄した。アルカリホスファターゼ標識プローブをAmp／Label希釈剤で2.5fmol/μlに希釈し、各ウェルに40μlを加えた。プレートを覆い、振盪し、55℃で15分間インキュベートした。
プレートを室温で10分間冷却し、上記のように２回洗浄し、次いで0.15M NaCl／0.015Mクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。基質を加え、発光を上記のようにして測定した。アッセイの感度は、以下の表に示したように約1.25 TCID50であった。
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実施例４
クラスター形成プローブセットと散在プローブセットとの比較
HIV RNAを、以下の改変を行ったこと以外は、実施例３と本質的に同じ手順を用いて検出した。RNA標準は、T7 RNAポリメラーゼを用いて、プラスミドpBHBK10S（Chang, P.S.ら、Clin. Biotech.2:23, 1990）からの9.0KBのHIV転写物の転写により調製した。このHIV RNAを、HAPクロマトグラフィーにより捕獲されたgagプローブおよびpolプローブとのハイブリダイゼーションにより定量した。RNA標準を、上記のプロテイナーゼK希釈剤で1ml当り2.5〜100atomolの間の範囲に連続的に希釈し、捕獲プローブ、標識プローブ、およびスペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を加え、各プローブの最終濃度が1670fmol/mlとなるようにした。捕獲プローブと標識プローブとの２つの配置をテストした：分散（scattered）捕獲プローブ（捕獲プローブには標識プローブが散在している）およびクラスター形成捕獲プローブ（捕獲プローブは標識プローブに関して連続したクラスターの形で配置されている）。クラスター形成プローブのセットを、以下に示す。
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0003907201.tif 000017
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30μlの分析物／プローブ／プロテイナーゼK溶液を各ウェルに加えた後、10μlの正常ヒト血清を加え、実施例３に記載のようにアッセイを行った。表IIIに示すように、分散捕獲配置に対するクラスター形成捕獲配置を用いるアッセイの感度は、類似していた。クラスター形成捕獲伸長物を用いると、感度は50〜100tmolであるが、分散捕獲伸長物を用いると、感度は100〜500tmolであった。
0003907201.tif 000019
上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：アーヴィン,ブルース ディー.
ホーン,トーマス
チャン,チュー−アン
(ii)発明の名称：溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのHIVプローブ
(iii)配列数：63
(iv)連絡住所：
(A)住所人：モリソン アンド フォースター
(B)番地：ページ ミル ロード 755
(C)市：パロ アルト
(D)州：カリフォルニア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：94304-1018
(V)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース #1.0、バージョン #1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：07/813,583
(B)出願日：1991年12月23日
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：トーマス イー.シオッティ
(B)登録番号：21,013
(C)照会／記録番号：22300-20150
(ix)電話回線情報：
(A)電話：415-813-5600
(B)テレファックス：415-494-0792
(C)テレックス：706141
(2)配列番号:1の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：24塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:1：
0003907201.tif 000020
(2)配列番号:2の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：60塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:2：
0003907201.tif 000021
(2)配列番号:3の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：16塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:3：
0003907201.tif 000022
(2)配列番号:4の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：12塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:4：
0003907201.tif 000023
(2)配列番号:5の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:5：
0003907201.tif 000024
(2)配列番号:6の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:6：
0003907201.tif 000025
(2)配列番号:7の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:7：
0003907201.tif 000026
(2)配列番号:8の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:8：
0003907201.tif 000027
(2)配列番号:9の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:9：
0003907201.tif 000028
(2)配列番号:10の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:10：
0003907201.tif 000029
(2)配列番号:11の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:11：
0003907201.tif 000030
(2)配列番号:12の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:12：
0003907201.tif 000031
(2)配列番号:13の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:13：
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(2)配列番号:14の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:14：
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(2)配列番号:15の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:15：
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(2)配列番号:16の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:16：
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(2)配列番号:17の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:17：
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(2)配列番号:18の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:18：
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(2)配列番号:19の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:19：
0003907201.tif 000038
(2)配列番号:20の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:20：
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(2)配列番号:21の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:21：
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(2)配列番号:22の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:22：
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(2)配列番号:23の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:23：
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(2)配列番号:24の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:24：
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(2)配列番号:25の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:25：
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(2)配列番号:26の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:26：
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(2)配列番号:27の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:27：
0003907201.tif 000046
(2)配列番号:28の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:28：
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(2)配列番号:29の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:29：
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(2)配列番号:30の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:30：
0003907201.tif 000049
(2)配列番号:31の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:31：
0003907201.tif 000050
(2)配列番号:32の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:32：
0003907201.tif 000051
(2)配列番号:33の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:33：
0003907201.tif 000052
(2)配列番号:34の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:34：
0003907201.tif 000053
(2)配列番号:35の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:35：
0003907201.tif 000054
(2)配列番号:36の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:36：
0003907201.tif 000055
(2)配列番号:37の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:37：
0003907201.tif 000056
(2)配列番号:38の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:38：
0003907201.tif 000057
(2)配列番号:39の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:39：
0003907201.tif 000058
(2)配列番号:40の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:40：
0003907201.tif 000059
(2)配列番号:41の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:41：
0003907201.tif 000060
(2)配列番号:42の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:42：
0003907201.tif 000061
(2)配列番号:43の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:43：
0003907201.tif 000062
(2)配列番号:44の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:44：
0003907201.tif 000063
(2)配列番号:45の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:45：
0003907201.tif 000064
(2)配列番号:46の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:46：
0003907201.tif 000065
(2)配列番号:47の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:47：
0003907201.tif 000066
(2)配列番号:48の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:48：
0003907201.tif 000067
(2)配列番号:49の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:49：
0003907201.tif 000068
(2)配列番号:50の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:50：
0003907201.tif 000069
(2)配列番号:51の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:51：
0003907201.tif 000070
(2)配列番号:52の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:52：
0003907201.tif 000071
(2)配列番号:53の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:53：
0003907201.tif 000072
(2)配列番号:54の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:54：
0003907201.tif 000073
(2)配列番号:55の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：20塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:55：
0003907201.tif 000074
(2)配列番号:56の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：20塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:56：
0003907201.tif 000075
(2)配列番号:57の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：29塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:57：
0003907201.tif 000076
(2)配列番号:58の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:58：
0003907201.tif 000077
(2)配列番号:59の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:59：
0003907201.tif 000078
(2)配列番号:60の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：29塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:60：
0003907201.tif 000079
(2)配列番号:61の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:61：
0003907201.tif 000080
(2)配列番号:62の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：37塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:62：
0003907201.tif 000081
(2)配列番号:63の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号:63：
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15X  Combを合成するために用いた全てのサイクル、手順、および配列のリスト
380B DNA合成機用3・1/2"フロッピーディスクに収容されている
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