(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０×１０５パスカル（Ｐａ）に相当する５０バール以上の圧力で圧縮されたコラーゲンスポンジよりなる本質的に緻密なコラーゲン膜によって、少なくとも一方の面が覆われた少なくとも一つの多孔コラーゲン層を含むコラーゲン支持体を形成する複合物を含有する人工皮膚用支持体。
【請求項２】
第一のコラーゲンゲルを乾燥させて調製したコラーゲンフィルムよりなる本質的に緻密なコラーゲン膜によって、少なくとも一方の面が覆われた少なくとも一つの多孔コラーゲン層を含むコラーゲン支持体を形成する複合物であって、
前記本質的に緻密な膜は前記多孔層と結合する前に調製され、調製した膜を第二のコラーゲンゲル上に堆積させ、その後、全体を凍結及び凍結乾燥して前記複合物を得ることを特徴とする複合物を含有する人工皮膚用支持体。
【請求項３】
前記コラーゲン産物が、コラーゲン、及び、多糖類、グリコサミノグリカン、キトサン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、デキストラン若しくはその誘導体、アルギン酸若しくはその誘導体、又はカラゲナンとコラーゲンとの混合物から選択される請求項１又は２記載の人工皮膚用支持体。
【請求項４】
それぞれが多孔層及び本質的に緻密な膜である二層のうち少なくとも一方が、正常な生細胞、遺伝的に改変された生細胞、又は悪性生細胞を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工皮膚用支持体。
【請求項５】
生細胞が、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のランゲルハンス細胞、血液由来の内皮細胞、血液細胞、マクロファージ若しくはリンパ球、脂肪細胞、皮脂細胞、軟骨細胞、骨細胞、破骨細胞、及び、血液由来のメルケル細胞からなる群より選択され、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性のものである請求項４記載の人工皮膚用支持体。
【請求項６】
正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の繊維芽細胞を多孔層の中に含み、かつ、ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のメルケル細胞、血液由来のランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液由来の細胞、及び神経細胞からなる群より選択される、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の生細胞を緻密膜の表面上に含む請求項４又は５記載の人工皮膚用支持体。
【請求項７】
コラーゲンスポンジが、５０バール（５０×１０５Ｐａ）〜２００バール（２００×１０５Ｐａ）の間の圧力で圧縮され、前記圧縮は２０〜８０℃の間の温度で行われるものである請求項１〜６のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項８】
多孔層が、コラーゲンスポンジを含むものである前記請求項のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項９】
コラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンフィルム及び／又はコラーゲン膜が、哺乳動物に由来するコラーゲンを含む前記請求項のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１０】
コラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンフィルム及び／又はコラーゲン膜が、海洋生物のコラーゲンを含む前記請求項のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１１】
海洋生物のコラーゲンが、非着色皮膚領域を呈示する魚類から得られるものである請求項１０記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１２】
２層のうち少なくとも１つが、可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲンとの混合物を含むコラーゲンゲルから、例えば繊維の形状で、製造される前記請求項のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１３】
コラーゲンがＩ型及び／又はＩＩＩ型のコラーゲンである請求項１〜１２のいずれか１項記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１４】
有効物質の可能性があるものの効能を試験管内で試験するために使用される請求の範囲１〜１３のいずれか１項に記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１５】
生体内における皮膚の損傷領域を再構築するために使用される請求の範囲１〜１３のいずれか１項に記載の人工皮膚用支持体。
【請求項１６】
ａ）まず、第一のコラーゲンゲルを乾燥させるか、又は、コラーゲンゲルの凍結−凍結乾燥によって得られるコラーゲンスポンジを圧縮することにより、本質的に緻密なコラーゲン膜を調製し、
ｂ）第二のコラーゲンゲルを別に調製し、
ｃ）前記本質的に緻密な膜を前記第二のコラーゲンゲル上に堆積させるか、又は前記第二のコラーゲンゲルを前記本質的に緻密な膜上に注ぎ；そして最後に、
ｄ）全体を凍結−凍結乾燥して複合物を得る
ことからなる、少なくとも一方の面が本質的に緻密なコラーゲン膜で覆われた少なくとも一つの多孔コラーゲン層を含む人工皮膚用支持体の製造方法。
【請求項１７】
緻密な膜を調製するために使用するコラーゲンスポンジを、５０バール（５０×１０５Ｐａ）以上の圧力で圧縮する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
２０〜８０℃の間の温度で圧縮工程を行う請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
コラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンフィルム及び／又はコラーゲン膜を、コラーゲン、又は、コラーゲンと多糖類、グリコサミノグリカン、キトサン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、デキストラン若しくはその誘導体、アルギン酸若しくはその誘導体、又はカラゲナンとの混合物のいずれかを用いて調製する請求項１６〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物に由来するコラーゲンを使用する請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
コラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンフィルム及び／又はコラーゲン膜が、海洋生物のコラーゲンを含む請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
２層のうちの少なくとも一方又は両層が架橋されている請求項１６〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
架橋が、物理的架橋、又は、アルデヒドを用いた、化学的架橋である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
細胞発生に好適な化合物を製造中に添加する請求項１６〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
２層のうち少なくとも一方に、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の生細胞を導入する工程を有する請求項１６〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
生細胞が、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のランゲルハンス細胞、血液由来の内皮細胞、血液細胞、マクロファージ若しくはリンパ球、軟骨細胞、骨細胞、破骨細胞、血液由来のメルケル細胞、皮脂細胞、脂肪細胞及び神経細胞からなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
繊維芽細胞を多孔層に導入する請求項１６〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のメルケル細胞、血液由来のランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液由来の細胞及び神経細胞からなる群より選択される、生細胞を緻密膜の表面上に堆積させる請求項１６〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
培養若しくは生検に由来するさまざまなタイプの細胞の連続培養又は同時培養のいずれかによって生細胞が提供される請求項１６〜２８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
長年の間、コラーゲンが、生細胞を含む人工組織を製造するためのかけがえのないマトリックスであることが明らかになっている。
得られた生体材料は、ますます薬剤学の分野で使用されるようになっており、損傷を受けた結合組織の調製、又は、生体に改変細胞を導入し、また、その中で生存させることによる遺伝子治療にとって将来非常に有望であると考えられている。
【０００２】
さらに、化粧品産業や皮膚用医薬産業では、それらの研究分野において動物試験が次第に用いられなくなっているため、ますます「試験管内」試験のために再構築皮膚が使用されるようになっている。
このような理由があるため、世界中でいくつかの研究グループが、皮膚や軟骨、骨、腱、再構築角膜などの生きた人工組織を製造するためのコラーゲンベースの支持体を開発しようと努力してきたわけであり、このような新しい生体材料には無数の応用分野がある。
【０００３】
本発明が対象とする技術分野において実施された主要な研究は、主に、以下のチームによるものであることに留意されたい：Ｙａｎｎａｓ  Ｉ．，  Ｃｏｌｌｏｍｂｅｌ  Ｃ．，  Ｔｉｎｏｉｓ  Ｅ．，  Ｂｏｙｃｅ  Ｓ．，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．，  Ｂｅｌｌ  Ｅ．，  Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ  Ｙ．，  Ｍａｒｕｇｕｃｈｉ  Ｔ．，  Ｈａｎｔｈａｍｒｏｎｇｗｉｔ  Ｍ．，  Ａｕｇｅｒ  Ｆ．Ａ．  及びＯｓｂｏｒｎｅ  Ｃ．Ｓ．；例えば、米国特許第５，２７３，９００号参照。
【０００４】
これらの研究者はすべて、ゲル又はコラーゲンスポンジのいずれかを用いるが、後者は、フリーズドライ（凍結乾燥）によって得られる。
膜の多層には、少なくとも一方の表面、好ましくは２面上で覆われたスポンジ状の質感をもち、主にコラーゲンＩＩからできたマトリックス層、及び、類似した質感をもち、比較的不透性のバリア層が少なくとも含まれるということが、文献ＷＯ９９／１９００５号公報から分かる。
この文献によると、バリア層は天然の動物性膜からなるということである（７頁２３〜３２行目、及び８頁１０〜３０行目参照）。
【０００５】
このバリア層は、本来の組織細胞の浸透、すなわち増殖を防止することを目的としたものである。なぜなら、この膜は、骨、特に軟骨を再構築するために設けられたものだからである。したがって、この膜は、多孔層の主原料として、軟骨、好ましくは、ブタの硝子軟骨から得られるコラーゲンＩＩを使用する必要がある（７頁１４〜１６行目参照）。
【０００６】
軟骨細胞又はコンドロサイト細胞の有する増殖又は再生速度は、繊維芽細胞など柔組織細胞の再生速度よりもずっと遅いため、速く増殖する柔組織細胞の侵入を阻止しつつ、それらが増殖できるように分離する必要がある。この文献は、細胞へ固定し、コンドロサイトの増殖を支えるコラーゲンＩＩ細胞の増殖を保護するバリア層を用いることによる解決策を記載することを目的とする（２頁１５〜２０行目参照）。
さらに説明される発明の構成においては、まず、各層がヒトの生細胞を増殖させることができる二層の材料が調製されるが、これは、従来の技術に較べて自明でなく、かつ完全に予想を超える解決法を構成するものである。
ＷＯ９６／０８２７７号公報の文献は、腹膜再生のプロステーシスとしてコラーゲン膜を使用することに関するもので、同じ出願人の以前の発明を構成している。この文献では、好ましい態様は、コラーゲンゲルが貼り付いたコラーゲンスポンジを含む混合膜であって、無毒性のガス状流動体の中でコラーゲンゲルを乾燥させて得られている膜である（特に、このＰＣＴ出願の１２〜１３頁の実施例２を参照）。
【０００７】
しかし、実施例２には、得られたスポンジを１５０バールの気圧下で１５秒間圧縮すること、そして、この圧縮スポンジ上に１％コラーゲンのコラーゲンゲルを載せ、このゲルを室温で乾燥させることによって混合膜を作成することが記載されている。
１５秒間、１５０バールの圧力下で得られるスポンジ圧縮物により、２つの主要な緻密層から始まって上記混合膜を形成するが、この膜は、本発明が目的とするものとは異なる構造物を構成する。さらに、本発明の場合には、予想外の方法で、本願発明に係る二層構造物が、ヒト生細胞を、それらを保護しつつ増殖させるようにして、少なくとも一層に播種するのに適していることが発見されたのである。
【０００８】
ＦＲ  ２  ６７９  ７７８号公報の文献は、同一の出願人による、さらに別の先行発明を構成していることに留意されたい。
ＥＰ０  ６８６  ４０２号公報の文献は、ゼラチン層で完全に覆われた、コラーゲンを含む支持体、及び凍結乾燥状態にある混合物という２層からなる、癒着防止用術後処置のためのコラーゲン膜に関する、同一の出願人による先行文献をさらに構成している。ここで、ゼラチン層の重要な目的は、癒着を防止する膜を接着させる作用を行なうことであり、また、細胞存在下では３７℃で溶解することによって速やかに再吸収されることに留意されたい。
【０００９】
ロレアル社（Ｌ’ＯＲＥＡＬ）のＥＰ０  ７８９  ０７４号の文献は、ランゲルハンス細胞を含む皮膚の同等物に関するものである。
この出願においては、３頁第４欄に記載されている支持体自体は、先行技術による不特定の支持体であることに留意されたい。これは、混合コラーゲン／繊維芽細胞格子、予め上皮を除去した真皮、人工膜、コラーゲンを含む皮下代替物、及び細胞の生存に適したプラスチック又はその他の支持体から作り出すことができる（４欄３〜１２行目）。
【００１０】
この文献は、常法に従って事前に分離しておいたヒト・ケラチノサイトを、これも既知の方法に従って同様に予め分離しておいたヒトメラノサイトと混合して混合培養したもので覆われ、皮膚の層間剥離によって得られた真皮を使用する限りにおいて、本発明のとは異なっている。本文献は、本発明の構成に含まれる緻密な層を想定しておらず、上皮剥離された真皮とは明らかに異なる多孔性の基層と重要な方法で結合したヒトの生細胞を播種することを可能にするものである。
最後に、ＷＯ第９１／１６０１０号公報の文献は、生きた皮膚複合物の同等物について記載しているが、これらは、まず、市販品である繊維芽細胞を接種したウシ・コラーゲンスポンジ膜を購入することから始まっている（８頁第３及び４段落参照）。
【００１１】
接種後、このスポンジを逆転させ、表面上部を、ペプシン処理することができ（第８頁最終段落参照）、一般的にはウシ・コラーゲンである無孔性コラーゲンで積層する。ペプシンによる処理の目的は、テロペプチドを取り除くためであることが示されている（９頁１〜４行目参照）。コラーゲン溶液のｐＨを中性ｐＨに調節し、コラーゲンを沈殿させる。コラーゲンは、スポンジの上に薄層を形成するので、全体を６０分間３７℃で培養する（第９頁第１段落の１行目）。
そして、培養したケラチノサイトを積層層上に接種し、さらに新たな培養をｐＨ７．２及び３５℃で１０日間行う。
本発明の構成において、以下の説明から帰結されるように、二重層構造がまず形成され、これは、重要な方法で緻密層で覆われたコラーゲンスポンジから構成されるが、この緻密層は、以下の説明にあるように予想外の技術効果を提供している。
【００１２】
生きた人工組織を製造するための支持体を製造する上で克服しなければならない主な問題点は以下、十分な物理的な強度、３７℃付近の温度に対する感度の低さ、細胞の発生と代謝に適した生物学的性質、酵素分解に対する低感受性、及び、最後に、一定の適用、特に、好ましくは一方の層ができるだけ緻密で、もう一方が多孔性になっている二層構造物を再構築された皮膚に存在させること：
である。
これまでに行われた研究では、上記の制約条件のすべてを十分に満たすコラーゲン支持体は提供されなかった。
【００１３】
本発明の目的は、技術的な観点からも、産業上の観点からも棚上げされたままになっていた、これらの問題を解決することである。
本発明は、特に、化粧品、皮膚用医薬品、又は医薬品に工業規模で応用可能な、非常に単純かつ安価な方法で、これらの技術的問題点のすべてを解決することを可能にする。
【００１４】
第一の特徴によれば、本発明は、好ましくは空気中若しくはガス状流動体の中で、コラーゲンゲルを乾燥させて調製したコラーゲンフィルム、又は、極めて大きな力で圧縮したコラーゲンスポンジのいずれかよりなる本質的に緻密なコラーゲン膜によって少なくとも一方の面が覆われた少なくとも一つの多孔コラーゲン層を含むコラーゲン支持体を形成する新規の複合物を提供する。
本発明に係る複合物のさらに別の有利な特徴によれば、約５０．１０５パスカル（Ｐａ）に相当する約５０バール以上、好ましくは５０バール（５０．１０５  Ｐａ）〜２００バール（２００．１０５  Ｐａ）の間の圧力でコラーゲンスポンジを圧縮し、選択的に、２０〜８０℃の間、好ましくは４０〜６０℃の間の温度でこの圧縮を行う。
【００１５】
この複合物の有利な特徴の一つによれば、このコラーゲン産物は、コラーゲン、及び、多糖類、特にグリコサミノグリカン、キトサン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、デキストラン若しくはその誘導体、アルギン酸若しくはその誘導体、又はカラゲナンとコラーゲンとの混合物から選択される。
本発明に係る複合物の別の有利な特徴によれば、後者の二層（すなわち多孔層及び本質的に緻密な膜）の少なくとも一方は、特に若年又は高齢の被験者に由来する、正常な、遺伝的に改変された、又は悪性である生細胞を含む。
有利な変法の一つにおいて、生細胞は、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のランゲルハンス細胞、血液由来の内皮細胞、血液細胞、特にマクロファージ若しくはリンパ球、脂肪細胞、皮脂細胞、軟骨細胞、骨細胞、破骨細胞、及び、血液由来のメルケル細胞からなる群より選択され、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性である。
【００１６】
さらに別の有利な特徴によれば、複合物は、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の繊維芽細胞を多孔層に含み、かつ、特にケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のメルケル細胞、血液由来のランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液由来の細胞、及び神経細胞から選択される、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の生細胞を緻密膜の表面上に含む。
本発明のさらに別の有利な態様において、実質的に若い被験者のみから採取された細胞を使用して「若い」再構築皮膚を調製するか、又は、実質的に高齢の被験者のみから採取された細胞から得られた「高齢の」再構築皮膚を調製することが、特に価値あることとなりうる。これらのモデルは、皮膚の老化過程についての我々の知識を向上させ、この過程での活性因子の影響を調べることを可能にする。
【００１７】
本発明のさらに別の有利な態様において、本質的に緻密な膜は、好ましくは、コラーゲンスポンジを含む、多孔層と結合させる前に、特に全体を凍結及び凍結乾燥して該複合物を得る前に膜を調製してそれをコラーゲンゲル上に堆積させることによって、調製する。
本発明に係る複合物のさらに別の態様において、該複合物のコラーゲンスポンジ、及び／又はコラーゲンフィルム、及び／又はコラーゲン膜は、哺乳動物由来、特にウシ由来のコラーゲンを含む。
本発明に係る複合物のさらに別の有利な態様によれば、コラーゲンスポンジ、及び／又はコラーゲンフィルム、及び／又はコラーゲン膜としては、好ましくは硬骨魚の皮膚、より詳しくは非着色皮膚領域を呈示する魚類、さらに詳しくはヒラメ類、さらに優れているのは、例えば、シタビラメ（ｓｏｌｅ）、小ガレイ、ターボット、ブリルなどのヒラメ類など工業的に捕獲されたもので、細かく切断することによって、その非着色の腹部皮膚を簡単に分離できる魚から得られるものから得られる、海洋生物のコラーゲンが挙げられる。本発明において使用可能なコラーゲンを抽出する材料として好ましい魚の皮膚はシタビラメの皮膚である。魚の皮膚から出発するコラーゲン調製は、当業者が参照することのできる、出願人の先行文献であるＥＰ０  ５９２  ５８６号＝ＵＳ−Ａ−５，４２０，２４８に詳しく記載されている。海洋生物、好ましくは硬骨魚のコラーゲンから出発して得られた、このようなコラーゲンスポンジ、及び／又はコラーゲンフィルム、及び／又はコラーゲン膜は、再構築された皮膚の製造に使用されるヒト生細胞と生物適合可能であり、また、これらのヒト生細胞は生存を続けることができるだけでなく、増殖することもできることは特に予想外であった。
【００１８】
本発明の別の有利な態様によれば、哺乳動物、特にウシに由来するコラーゲン、又は、好ましくは海洋生物、特に硬骨魚の皮膚に由来するコラーゲンは、製造工程の構成の中でさらに詳しく記載された、化学的な、あるいは、物理的架橋によって架橋することができる。生物適合的な生体材料の製造という構成において、このような架橋を、再構築皮膚を製造する前述の工程で使用されるヒト細胞とともに使用できることは特に予想外であった。
「生物適合的」とは、本発明の構成においては、生体材料が、ヒト生細胞に対しては毒性がなく、それらの成長と増殖を可能にすることも意味する。架橋には、通常、材料を生物非適合的にする効果があり、そのために生細胞にとって毒性となり、増殖できなくなるということに留意されたい。
【００１９】
本発明に係る複合物のさらに別の有利な態様において、該産物の２つの層のうち少なくとも１つは、可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲンの混合物を含むコラーゲンゲルから、例えば繊維の形状で、製造される。
本発明に係る複合物の場合、コラーゲンはＩ型及び／又はＩＩＩ型のコラーゲンでもよい。
【００２０】
第二の特徴によれば、本発明は、
ａ）まず、好ましくは空気中で又はガス状流動体を用いて、第一のコラーゲンゲルを乾燥させるか、又は、コラーゲンゲルの凍結−凍結乾燥によって得られるコラーゲンスポンジを圧縮することによって、本質的に緻密なコラーゲン膜を調製し、
ｂ）第二のコラーゲンゲルを別に調製し、
ｃ）上記本質的に緻密な膜を、上記第二のコラーゲンゲル上に堆積させるか、上記第二のコラーゲンゲルを上記本質的に緻密な膜上に注ぎ、最後に、
ｄ）全体を凍結−凍結乾燥して、複合物を得る
ことからなる、少なくとも一方の面が本質的に緻密なコラーゲン膜で覆われた少なくとも一つの多孔コラーゲン層を含む複合物を製造する工程も包含する。
本方法のある有利な変法において、緻密な膜を調製するために使用するコラーゲンスポンジを、５０バール（５０．１０５  Ｐａ）以上、好ましくは５０バール（５０．１０５  Ｐａ）〜２００バール（２００．１０５  Ｐａ）の間の圧力で圧縮する。
圧縮工程は、２０〜８０℃の間、好ましくは４０〜６０℃の間の温度で有利に行われる。
【００２１】
本方法の別の有利な態様において、コラーゲンスポンジ、及び／又はコラーゲンフィルム、及び／又はコラーゲン膜は、コラーゲン、又は、多糖類、特にグリコサミノグリカン、キトサン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、デキストラン若しくはその誘導体、アルギン酸若しくはその誘導体、又はカラゲナンとコラーゲンとの混合物を用いて調製する。
本方法の別の変法においては、２層のうちの少なくとも一つ、又は両層とも架橋されている。
有利な変法の一つにおいて、上記架橋は、物理的架橋、特に、真空下での熱脱水（すなわちＴＤＨ）、又は、特にジフェニルホスホリルアジド（すなわちＤＰＰＡ）、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、カルボジイミド若しくはスクシンイミドとの化学的架橋である。
【００２２】
本方法の別の有利な変法においては、細胞発生に好適な化合物、具体的には増殖因子、特にはサイトカイン又はケモカインを製造過程において添加する。
本発明に係る方法のさらに別の有利な態様において、二層の少なくとも一方に、正常か、遺伝的に改変されたか、又は悪性の生細胞を導入する工程を有する。
ある有利な変法の一つにおいて、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のランゲルハンス細胞、血液由来の内皮細胞、血液細胞、特にマクロファージ若しくはリンパ球、軟骨細胞、骨細胞、特に破骨細胞、血液由来のメルケル細胞、皮脂細胞、脂肪細胞、及び神経細胞からなる群より選択される。
本発明の特に有利な態様において、本方法は、繊維芽細胞を多孔層に導入することを含む。
【００２３】
本発明のさらに好ましい態様において、本方法は、特にケラチノサイト、メラノサイト、血液由来のメルケル細胞、血液由来のランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液由来の細胞及び神経細胞から選択される、生細胞を緻密膜の表面上に堆積させることを含む。
本発明に係る方法のある変法において、生細胞は、培養若しくは生検に由来するさまざまなタイプの細胞を連続培養又は同時培養することによって提供される。
【００２４】
第三の特徴によれば、本発明は、上記で定義した、又は、上記で定義した方法によって得られる、又は、下記の記載、特に実施例に関する記載から得られるコラーゲン支持体を形成する複合物の使用も包含する。その特徴において、従来技術に較べて新しいと考えられるものはすべて、その機能、及びその一般性を、特に、有効物質の可能性があるものの効能を試験管内で試験することを目的とした、又は、生体内における皮膚の損傷領域を再構築して人工皮膚を製造することについて、請求の範囲に記載してある。
ある有利な特徴によれば、人工皮膚は、具体的には、組織の老化過程を研究するため、特に皮膚の老化過程を研究、また、任意にこの過程での有効成分の効果を調べるために、実質的に若年者の細胞のみから、又は、実質的に高齢者の細胞のみから得ることができる。
このように、本発明が、上記の技術的問題に対する解決をもたらすことは明らかである。
【００２５】
最強のコラーゲン材料を得るために、本発明者らは、１９９４年７月１９日に許可されたＵＳ５  ３３３  ０９２号公報に記載された方法をさらに詳しく実施した。この技術は、可溶性及び不溶性のＩ型及びＩＩＩ型の天然コラーゲンで、機械的な見地からは非常に強靱で、酵素分解に対する耐性が非常に強い。これら最後の２つの特徴は、架橋技術によって、又は、コラーゲンと強く相互作用するが、細胞に対して毒性を示さない物質を添加することによって、任意に改善することができる。さらには、このコラーゲン製造法によって、バクテリア、ウイルス、又はプリオンによる生物学的汚染の危険性を実質的に排除することが可能になる。
【００２６】
再構築された皮膚を得ることを目的とした支持体の場合、本発明者らは、まず最初に、より緻密な層を製造し、次に多孔性スポンジを製造することによって、二層材料を調製することを思いついた。この方法には、これまで記載されてきたどの表面層よりも格段に緻密である表面層ができるという利点がある。このため、特に、高圧によって緻密化されたスポンジ又はフィルムは、多孔性マトリックスに固定することができる。
上記支持体を組織工学に適用して使用することには、コラーゲン支持体の内側又はその表面で成長することが可能な生細胞又は遺伝的に改変された細胞を接種することが含まれる。
【００２７】
このようにして得られる再構築された生組織は、
・原料又はそれよりも複雑な製剤の効果及び毒性を評価するために、その成分の細胞代謝上の効果を模擬試験するための「試験管内」モデルとして、
・損傷された皮膚、軟骨、骨、腱、角膜などの組織の欠損を克服することのできる再構築組織として、又は、
・特に、遺伝子治療の分野において、一定の生物の欠陥を克服することができる改変細胞を含む生移植片として
化粧品、皮膚用医薬品、又は医薬品に多数応用することができる。
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、本発明のさまざまな実施例に言及する以下の説明から明確になるが、これらの実施例は、単に具体例を示すためのものであって、決して発明の範囲を制限するものではない。上記したように、実施例に記載された特徴であって、従来技術に較べて新しいと考えられるものは、実施例の文脈とは関係なく、その機能、及びその一般性について請求の範囲に記載されている。さらに、実施例６〜１３は、本発明に係る、コラーゲン支持体を形成する複合物について現在の好ましい態様を構成するものである。実施例１４では、特に、有効物質の可能性があるものの効能を試験管内で試験することための人工皮膚を製造するための、又は、生体内における皮膚の損傷領域を再構築するためのコラーゲン支持体としての本発明に係る複合物の価値を示す比較試験について言及している。
【００２８】
本発明の実施例１
ＵＳ５３３１０９２号公報記載の技術による天然コラーゲンの多孔性マトリックスの調製
Ａ−天然コラーゲンの調製
予め洗浄し（２時間）、２５０ｍｌの水に皮膚４００ｇ（固形分：約３０％）という割合で石灰／硫化物混合液（石灰：３．５％、硫化ナトリウム：２．５％）によって除毛した子牛の皮からゲルを調製する。この水浴を４ｒｐｍの速度で回転させながら３０分間続けた。
除毛時間は全部で３６時間であった。
そして、５０ｍｌの浴に対し皮４００ｇの割合で塩化アンモニウム（３％）とメタ重亜硫酸ナトリウム（０．５％）を入れた浴の中で脱石灰した。
この水浴を持続時間は全部で２時間３０分であった。
組織１００ｇ当たり２００ｍｌの水という割合で、２回連続して水で洗って（１回洗浄当たり１５分）塩分を取り除いた。
次に、この皮を磨砕してから、磨砕した材料１ｋｇ当たり５ｌ緩衝液という割合にてｐＨ７．８のリン酸緩衝液（０．７８ｇ／ｌのリン酸二水素カリウム、及び２１．７ｇ／ｌの一水素リン酸二ナトリウム）によって１時間振とうして洗浄した。そして、磨砕した材料１ｋｇ当たり５ｌの水という割合にて軟水で２回連続して洗浄し、４０００ｒｐｍ（ルスレ遠心分離機（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ））で連続遠心分離して、リン酸を除去した。
次に、磨砕された材料を１０％酢酸溶液で酸性化した。この酢酸の量は、コラーゲンに対して５％であり、最終モル濃度は約０．０８Ｍであった。
そして、磨砕した材料を１時間マラキサート化（ｍａｌａｘａｔｅｄ）してペースト状にした。
【００２９】
このペーストをＵＴＬ  Ｔ／−６超音波処理装置に連続してかけてゲルを得た。このゲルのコラーゲン濃度は０．７〜２％であり、酸可溶性コラーゲンの割合は、不溶性コラーゲンに対して１０〜２０％とさまざまであった。
Ｂ−上記の方法で得られるコラーゲンゲルをもつ多孔性マトリックスの調製
２０ｇ／ｃｍ２のコラーゲンゲル（固形分＝０．７５％）を凍結乾燥用トレイに入れて、−３０℃で凍結させてから＋３２℃に温度を上げた。凍結乾燥時間は、４００ミリバールの圧力下では全部で１６時間であった。
凍結乾燥物を１１０℃で圧力４００ミリバールのオーブンの中に入れて、物理的な方法（ＴＤＨ）で凍結乾燥物を架橋した。
【００３０】
本発明の実施例２
１９９６年７月２４日付欧州特許第４６６８２９号に記載された技術による、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）によって架橋された多孔性マトリックスの調製
コラーゲンの凍結乾燥物を、１００μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にコラーゲン１ｇ当たり５〜１５０μｌのＤＰＰＡを含む溶液に入れて２４時間インキュベートした。そして、ＤＰＰＡを除去するためにコラーゲンを１００ｍｌのＤＭＦですすいだ。そして、１００ｍｌのｐＨ８．９のホウ酸緩衝液（０．０４Ｍ四ホウ酸ナトリウム、０．０４Ｍホウ酸）ですすいでＤＭＦを除去した。
最後に、このコラーゲンを同じホウ酸緩衝液の中で一晩インキュベートし、その後、軟水で６時間連続洗浄してホウ酸緩衝液を除去した。
【００３１】
本発明の実施例３
カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって架橋された多孔性マトリックスの調製
コラーゲンは、コラーゲン１ｇ当たり０．２３〜０．６９ｇの濃度のＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）、及び、コラーゲン１ｇ当たり０〜０．４２ｇの濃度のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）によって架橋した。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥する。
【００３２】
本発明の実施例４
グルタルアルデヒドによって架橋された多孔性マトリックスの調製
コラーゲンは、０．６〜１％のＧＴＡを含む溶液中、２０℃で２４〜９６時間架橋した。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥した。
【００３３】
本発明の実施例５
１９９１年５月２９日付欧州特許第２９６０７８号に記載されたようにして、実施例１記載の天然コラーゲンをキトサン及びグリコサミノグリカンと結合させて調製する多孔性マトリックス
水３５６ｍｌに２．５ｇのキトサンを含む水溶液及び１．９ｍｌの酢酸、ならびに４００ｍｌの軟水に１ｇのコンドロイチン４−硫酸を含む溶液を、６００ｇの１．５％コラーゲンゲルに加えた。次に、ｐＨ約４．０のこの混合液を撹拌してから凍結乾燥する。得られたスポンジをＴＤＨによって架橋した。
【００３４】
本発明の実施例６
コラーゲンフィルムで被覆された実施例１記載の多孔性マトリックス
Ａ−フィルムの調製
固形分０．３〜０．８％のコラーゲンゲルを、トレイ１ｃｍ２当たり０．５ｇゲルの割合にて、オーブン内で３０℃、又はフード下で乾燥させた。
１０〜４０％のグリセロールをコラーゲンゲルに加えることができた。
これらの条件下で乾燥させたコラーゲンは透明なフィルムを形成した。
Ｂ−フィルムと上記多孔性マトリックスとの結合
固形分０．７５％である実施例１記載の０．５ｇ／ｃｍ２のコラーゲンゲルを凍結乾燥用トレイの中に置いてから、このゲルの上にコラーゲンフィルムを載せ、全体を凍結乾燥した。
得られた凍結乾燥物をＴＤＨで架橋した。
【００３５】
本発明の実施例７
酸可溶性コラーゲンゲルによって調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は実施例６に記載されたものであるが、フィルムの上に注がれるゲルの性質が、当業者に既知の技術で調製される酸可溶性コラーゲンからなる点で唯一異なる。
【００３６】
本発明の実施例８
アテロコラーゲンゲルによって調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は実施例６に記載されたものであるが、フィルムの上に注がれるゲルの性質が、アテロコラーゲン、すなわち、当業者に既知の技術で調製されるテロペプチドを含まないコラーゲンからなる点で唯一異なる。
【００３７】
本発明の実施例９
キトサン及びグリコサミノグリカンと結合したコラーゲンゲルからなり、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は実施例６に記載されたものであるが、但し、この場合、コラーゲンフィルムの上に注がれるゲルは、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンから構成されている。このゲルの調製は、実施例５に記載されている。
【００３８】
本発明の実施例１０
上記の多孔性マトリックスはすべて、コラーゲンフィルムで被覆されており、実施例２，３及び４記載の技術によって架橋することができた。
【００３９】
本発明の実施例１１
圧縮されたコラーゲンスポンジで被覆されただけの、実施例１記載のコラーゲン多孔性マトリックス
Ａ−圧縮スポンジの調製
固形分０．３〜１．５％のコラーゲンゲルを実施例１に記載された通りに調製し、凍結乾燥して０．５〜２ｇ／ｃｍ２の重さをもつスポンジにした。
この凍結乾燥物を、２０〜６０℃の温度、５０〜２００バール（５０．１０５  Ｐａ〜２００．１０５  Ｐａ）の圧力で５〜６０秒間圧縮した。
Ｂ−圧縮スポンジと多孔性マトリックスとの結合
実施例１記載のコラーゲンゲルを、０．５ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに載せた。次に、圧縮されたスポンジをこのゲルの上に載せ、全体を凍結乾燥して、圧縮されたコラーゲンスポンジで覆われた多孔性コラーゲンスポンジとした。全体を実施例１記載の通りにＴＤＨで架橋した。
【００４０】
本発明の実施例１２
実施例５で記載されたコラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなり、圧縮されたコラーゲンスポンジで被覆された多孔性マトリックス
実施例５に記載の方法で調製されたコラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなるゲルを、０．５ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに載せ、圧縮されたスポンジをこのゲルの上に載せてから、全体を凍結乾燥した。そして、全体を実施例１記載の通りにＴＤＨで架橋した。
【００４１】
本発明の実施例１３
上記の多孔性マトリックスはすべて、圧縮スポンジで覆われており、実施例２，３及び４記載の技術によって架橋することができた。
【００４２】
本発明の実施例１４
本発明に係る本質的に緊密な膜で覆われた多孔性コラーゲン層を含む複合物と、多孔性コラーゲン層を含むのみで、被覆されていない複合物とを比較するための、全体が実施例１３記載の通りＤＰＰＡで架橋されている、実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスか、又は圧縮コラーゲンスポンジで被覆された実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスを用いて調製される再構築皮膚
再構築皮膚の調製
ａ）正常ヒト繊維芽細胞の培養
高齢又は若年の被験者から任意に採取した正常なヒト繊維芽細胞を用いる。これらを回収して、当業者にとって通常の方法にて６回〜１０回の継代で成長させた。
接種は、多孔性マトリックス１ｃｍ２当たり２５０，０００細胞という割合で実施したが、後者は、実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスのみを含む比較産物であるか、圧縮コラーゲンスポンジで被覆された実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスを含む本発明に係る複合物であり、全体は、実施例１３記載の通りＤＰＰＡで架橋させたものであった。
培養培地は、１０重量％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを添加したＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２  ５０／５０  （ｖ／ｖ）から構成される。
培養は３週間行い、週に３回培地を交換した。
【００４３】
ｂ）正常ヒト・ケラチノサイトの培養
若年又は高齢の被験者から任意に得た正常なヒト・ケラチノサイトの培養を行った；これらを回収して、当業者にとって周知の技術で１回目から３回目の継代培養し、回収した。
実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスの表面、又は、圧縮コラーゲンスポンジで被覆された実施例２記載のＤＰＰＡ−架橋多孔性マトリックスを含み、全体が実施例１３記載の通りＤＰＰＡで架橋されている本発明に係る複合物の表面（その場合には、本質的に緻密なコラーゲン膜の上にケラチノサイトを接種した）のいずれかで、表面１ｃｍ２当たり２５０，０００細胞という割合で接種を行った。
【００４４】
これらの産物の培養は、繊維芽細胞とケラチノサイトの接種を含むが、
３０％のＨＡＭ  Ｆ１２、
１０％のウシ胎児血清、
１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、
１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、
２μｍｏｌ／ｍｌのＬ−グルタミン、
１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮成長因子）、
０．１２ＩＵ／ｍｌのＵＭＵＬＩＮＥ（登録商標）という商標で市販されたインシュリン、
４００ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、
１０−１２ｍｏｌ／ｍｌのコレラ毒素、
５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、
２．１０−９Ｍのトリヨ−ドサイロニン、
１．８．１０−７ｍｏｌ／ｍｌのアデニン、
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、
を添加したＤＭＥＭから構成されるグリーン培地（Ｇｒｅｅｎ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中で行った。
培養は１週間行い、培地は毎日交換した。
【００４５】
ｃ）本発明に係る複合物、及び比較用の非被覆多孔層の培養
培地を毎日交換しながら工程ｂ）の培養を１週間行うと、ケラチノサイトを含む表面層が気相と液相の界面に浮上してくるが、繊維芽細胞を含む層は沈んだままであった。そして、
１０％のウシ胎児血清、
１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、
１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、
２μｍｏｌ／ｍｌのＬ−グルタミン、
１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮成長因子）、
０．１２ＩＵ／ｍｌのＵＭＵＬＩＮＥ（登録商標）という商標であり、市販されたインシュリン、
４００ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、
を添加したＤＭＥＭからなる出現用培地（ｅｍｅｒｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）中で３週間培養を行った。
【００４６】
全培養時間７週間で工程ａ）〜ｃ）により、多層の上皮で覆われた再構築された真皮、３次元コラーゲンマトリックスに定着した繊維芽細胞からなる再構築皮膚が得られた。
真皮−上皮の界面には基底膜が存在することが示され、この膜の中には、免疫標識によって、ラミニン−１、ラミニン−５、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンが存在するのが確認できた。
このように、真皮同等物を３週間培養した後、本質的に緻密な層で多孔性マトリックスを被覆して、本発明に係る複合物にすると、上皮化する前にコラーゲンマトリックスの表面により多くの繊維芽細胞を生じた。
【００４７】
多孔性マトリックスのみの場合、すなわち被覆しなかった場合には、繊維芽細胞の表面層が完全に連続していなければ、ケラチノサイトが下にある真皮同等物に侵入することができ、ケラチノサイトの小島を形成して、全体として異常な外観を呈する。
このように、本発明は、先行技術で使用するために以前から入手可能であった緻密層よりも緻密なものを使用するが、ケラチノサイトの調製に対してより高い安全性を提供できることが明らかである。
本明細書におけるＤＭＥＭという略称は、ダルベッコ修正イーグル培地を意味することを付言しておく。
【００４８】
本発明の実施例１５
有効成分のラミニン産生に対する効果を測定するために、若年のドナー細胞から再構築された皮膚、及び高齢のドナー細胞から再構築された皮膚を、本発明に係る複合物と比較する研究
本実施例における手順は、培養については、本質的に実施例１４に記載されている通りであるが、圧縮コラーゲンスポンジで被覆され、全体が実施例１３記載の通りにＤＰＰＡで架橋されているＤＰＰＡ−架橋多孔性コラーゲン層又は実施例２記載のマトリックスを含む本発明に係る同一の複合物を用いて行った。手順は以下の通りである。
【００４９】
１）再構築皮膚の調製
繊維芽細胞及びケラチノサイトが、それぞれ若年ドナー、すなわち２５〜３５歳のドナーに由来するものである以外は、実施例１４に記載された手順と同じ手順で若年者の再構築された皮膚を調製した。また、高齢又は熟年者の再構築皮膚は、５５歳以上の高齢のドナーに由来する繊維芽細胞及びケラチノサイトを用いて得た。
ａ）材料及び方法
実施例１４の工程ａで述べたように、まず、本発明に係る複合物の多孔性マトリックスに、若年者の細胞プール、又は熟年者ないし高齢者の細胞プールのいずれかに由来する、正常なヒト真皮繊維芽細胞を接種し、実施例１４の工程ａに記載した条件下で２１日間培養を行った。
ｂ）上記２１日間培養した後、若年者の細胞プール、又は熟年者ないし高齢者の細胞プールのいずれかに由来するケラチノサイトから別に調製した上皮層を、複合物の本質的に緻密なコラーゲン膜の表面に接種した。
実施例１４の工程ｂに記載した条件下で１４日間培養を行った。
【００５０】
２）ラミニンの定量
繊維芽細胞−ケラチノサイト複合体を１４日間培養した後、生じた若年又は熟年の再構築皮膚の培養培地に含まれているラミニンを、市販されているＥＬＩＳＡ用キット（タカラ、日本）によって定量した。
これらの結果は、図３で報告した。
図３は、熟年者の再構築皮膚には、１００％対照として使用した若年者の再構築皮膚（ＹＲＳ）の約半分量のラミニンが含まれていることを示している。
【００５１】
３）若年者及び熟年者の再構築皮膚におけるラミニン産生に対する、コレティカ社（ＣＯＬＥＴＩＣＡ）がＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標）という商標で市販している発酵麦芽抽出物などの有効成分の誘導効果の測定
比較試験において、ケラチノサイトについては１４日間培養する点を除けば、手順は上記したとおりである。すなわち、フランスのコレティカ社がＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標）という商標で市販している発酵麦芽抽出物が存在しない（対照）か、０．５重量％存在する中で、若年者又は熟年者の再構築皮膚を１４日間培養して維持した。
培養期間の最後に、上記の実施例と同じように、培養培地に含まれているラミニンをＥＬＩＳＡで定量した。
【００５２】
これらの結果は、図４に報告した。
１００％対照は、高齢者の再構築皮膚（すなわちＡＲＳ）の割合からなる。
図４は、発酵麦芽から抽出された有効成分（すなわちＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標））が、熟年者の再構築皮膚におけるラミニン産生を促進できることを示す。図５に示すように、同一の条件下で、発酵麦芽から抽出された有効成分（すなわちＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標））は、若年者の再構築皮膚におけるラミニン産生を有意に改良しなかった。
このように、発酵麦芽から抽出された有効成分（すなわちＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標））は、熟年者の再構築皮膚におけるラミニン産生を６５％増加させた。同様の理由で、この有効成分は、若年者の再構築皮膚におけるラミニン産生の調節に関係する生理学的過程に影響を与えなかった。
これらの実験によって、若年者の再構築皮膚におけるラミニン生産と熟年者の再構築皮膚におけるラミニン生産との間に見られる相対的な差異を縮小する有効成分の能力と定義される、発酵麦芽抽出物（すなわちＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標））がもつ補償効果の程度を評価することが可能となった。
【００５３】
図５は、有効成分を０．５％で用いると、若年者の再構築皮膚におけるラミニン生産と熟年者の再構築皮膚におけるラミニン生産との間の差を６５％縮小できることを示している。
【００５４】
実施例１６
水生生物の天然コラーゲン多孔性マトリックスの調製
１９９４年７月１９日に付与された米国特許第５３３１０９２号記載の技術によりコラーゲンを得た。
Ａ−水生生物の天然コラーゲンの調製
磨砕し、以下の組成：０．７８ｇ／ｌのリン酸二水素カリウム、及び２１．７ｇ／ｌの一水素リン酸二ナトリウムをもつｐＨ７．８のリン酸緩衝液で洗浄したシタビラメの腹部皮膚からコラーゲンゲルを調製した。磨砕した材料１ｋｇ当たり５ｌの緩衝液という割合にて１時間撹拌して洗浄を行った。次に、磨砕した材料１ｋｇ当たり５ｌの割合にて、軟水で２回連続して洗浄し、その後４０００ｒｐｍ（ルスレ遠心分離機（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ））で連続遠心分離してリン酸を除去した。次に、１０ｌの溶液あたり磨砕した材料１ｋｇという割合で、磨砕した材料を０．２５Ｍ酢酸溶液で酸性化した。そして、４０００ｒｐｍで５分間ゲルを遠心分離した。使用されるゲルは得られた上澄みからなり、そのコラーゲン濃度は０．５％〜２％であった。
【００５５】
Ｂ−上記のように得られたコラーゲンゲルからの多孔性マトリックスの調製
このゲルを２０ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに注入した。そして、−３０℃で凍結させてから＋３２℃に加熱した。全凍結乾燥時間は、４００ミクロバールの圧力下で１６時間であった。次に、４００ミクロバールの真空下１１０℃でオーブン内において１６時間加熱することからなる熱脱水（ＴＤＨ）によって、得られたマトリックスを架橋した。
【００５６】
実施例１７
１９９６年７月２４日付欧州特許第４６６８２９号に記載された技術による、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）によって架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１に記載したコラーゲンマトリックスを、１００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にコラーゲン１ｇ当たり５〜２５０μｌのＤＰＰＡを含む溶液に入れて２４時間インキュベートした。次に、このコラーゲンを１００ｍｌのＤＭＦで洗浄してＤＰＰＡを除去した。そして、１００ｍｌのｐＨ８．９のホウ酸緩衝液（０．０４Ｍ四ホウ酸ナトリウム、０．０４Ｍホウ酸）で洗浄してＤＭＦを除去した。最後に、このコラーゲンを同じホウ酸緩衝液の中で一晩インキュベートし、その後、軟水で６時間連続洗浄してホウ酸緩衝液を除去した。
【００５７】
実施例１８
カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１記載の水生生物コラーゲンマトリックスを、コラーゲン１ｇ当たり０．２３〜０．６９ｇの濃度のＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）、及び、コラーゲン１ｇ当たり０．４２ｇの濃度のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）によって架橋した。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥した。
【００５８】
実施例１９
グルタルアルデヒドによって架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１記載の水生生物コラーゲンマトリックスを、０．６〜１％のＧＴＡを含む溶液中、２０℃で２４〜９６時間架橋した。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥した。
【００５９】
実施例２０
１９９１年５月２９日付欧州特許第２９６０７８号に記載されたようにして、実施例１６記載の水生生物天然コラーゲンをキトサン及びグリコサミノグリカンと結合させて調製する多孔性マトリックス
水３５６ｍｌに２．５ｇのキトサンを含む溶液及び１．９ｍｌの酢酸、そして次に、４００ｍｌの軟水に１ｇのコンドロイチン４−硫酸を含む溶液を、６００ｇの１．５％コラーゲンゲルに加えた。次に、ｐＨ約４．０のこの混合液を撹拌してから凍結乾燥した。
得られたスポンジをＴＤＨによって架橋した。
【００６０】
実施例２１
コラーゲンフィルムで被覆された実施例１６記載の多孔性マトリックス
Ａ−フィルムの調製
固形分０．３〜０．８％のコラーゲンゲルを、トレイ１ｃｍ２当たり０．５ｇゲルの割合にて、オーブン内で３０℃、又はフード下で乾燥させた。１０〜４０％のグリセロールをコラーゲンゲルに加えることができる。これらの条件下で乾燥させたコラーゲンは透明なフィルムを形成する。
Ｂ−フィルムと上記多孔性マトリックスとの結合
固形分０．５％〜２％の水生生物天然コラーゲンゲルを、０．５ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに載せ、次に、このゲルの上にコラーゲンフィルムをこのゲルの上に載せてから、全体を凍結乾燥した。
得られた凍結乾燥物をＴＤＨで架橋した。
【００６１】
実施例２２
圧縮されたコラーゲンスポンジで被覆されただけの、実施例１６記載のコラーゲン多孔性マトリックス
Ａ−圧縮スポンジの調製
固形分０．３〜１．５％のコラーゲンゲルを実施例１に記載されたように調製し、凍結乾燥して０．５〜２ｇ／ｃｍ２の重さをもつスポンジにした。
この凍結乾燥物を、２０〜６０℃の温度、５０〜２００バール（５０．１０５  Ｐａ〜２００．１０５  Ｐａ）の圧力で５〜６０秒間圧縮する。
Ｂ−圧縮スポンジと多孔性マトリックスとの結合
実施例１記載のコラーゲンゲルを、０．５ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに載せた。次に、圧縮されたスポンジをこのゲル上に載せ、全体を凍結乾燥して、圧縮されたコラーゲンスポンジで覆われた多孔性コラーゲンスポンジとする。全体を実施例１記載のようにＴＤＨで架橋した。
【００６２】
実施例２３
実施例２０に記載されたように、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなり、圧縮されたコラーゲンスポンジで被覆された多孔性マトリックス
実施例２０記載の方法で調製されたコラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなるゲルを、０．５ｇ／ｃｍ２の割合で凍結乾燥用トレイに載せ、圧縮されたスポンジをこのゲル上に載せて、全体を凍結乾燥する。そして、凍結乾燥物を実施例１６記載のようにＴＤＨで架橋した。
【００６３】
実施例２４
上記の多孔性マトリックスはすべて、圧縮コラーゲンスポンジで覆われており、実施例１７、１８及び１９記載の技術によって架橋できた。
【００６４】
実施例２５〜２７：ウシ及び水生生物のコラーゲンマトリックスの細胞代謝を比較する試験
実施例２５：繊維芽細胞の細胞生存能力試験
Ｉ−真皮同等物の調製
比較試験のため、まず、実施例１７記載のＤＰＰＡで架橋された水性生物の多孔性マトリックスを調製した。
比較のために、比較に用いる、これもＤＰＰＡによって架橋されているウシのマトリックスと呼ばれる多孔性マトリックスを、ウシ由来のコラーゲンを用いて実施例１７記載の条件と同一の条件下で調製した。
７回目の継代で使用される若年ドナーのプールから採取された正常なヒト繊維芽細胞を、水生生物及びウシのマトリックスのそれぞれに、増殖及びタンパク質合成実験の場合には１ｃｍ２当たり２５０，０００細胞という割合で、また、水生生物及びウシのマトリックスが組織学実験を目的とする場合には１ｃｍ２当たり３００，０００細胞という割合で接種した。
これらの水生生物及びウシのマトリックスを、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）の割合のＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２からなる培地で培養した。
培養は、週に３回培地を交換しながら１ヶ月間行った。
【００６５】
ＩＩ−実施した分析
１）ＭＴＴとの反応による細胞の生存測定
１重量％のＭＴＴ（すなわち３−（４−（ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）を培養液に加えた。
３７℃で２．５時間インキュベーションを行った。
インキュベーション時間経過後、変換産物（ホルマザンブルー）をＤＭＳＯで可溶化し、５５０ｎｍで光学密度を読み取った。
得られた光学密度は、鮮黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴをホルマザンの青色の結晶に変換することができるコハク酸デヒドロゲナーゼの活性に比例していた。
培養後１日、５日、７日、２２日後、及び１ヶ月後に細胞の生死を測定した。
平均値を測定するために、各マトリックスにつき６個の試料を用意した。
【００６６】
【表１】
0003865635.tif 000002
【００６７】
これらの結果は、添付した図６の曲線にも用いられている。
ひし形の付いた曲線は水生生物のマトリックスによって得られた曲線であり、四角が付いた曲線はウシのマトリックスによって得られた曲線と記した。
これらの結果は、非常に驚くべきことに、水生生物のマトリックスが、正常なヒト繊維芽細胞の生存を可能にするだけでなく、これら正常なヒト繊維芽細胞の増殖も可能にする支持体を構成することを示している。一方、同時に、最初の３週間にもっと優れた培養支持体を構成することも示している。
したがって、これらの試験結果から、驚くべきことに、特に、試験管内で適用するため、さらには、とりわけ、生細胞、特に好ましくは、ヒトの生細胞を含む生体材料を生体内で形成するために組織工学用支持体を製造するには水生生物のコラーゲンが特に適していると結論することができよう。
【００６８】
２）タンパク質合成の測定
ウシ胎児血清を含まない培養液中に３日間にわたって分泌されたタンパク質の合成を、真皮同等物の調製において上記で報告した条件下で１ヶ月培養した後に得られる真皮同等物を１ヶ月後成熟した後に評価した。
ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のミクロＢＣＡ法によってアッセイを行った。
並行して、上記条件下でのＭＴＴ試験により細胞密度を評価した。
相対的タンパク質含量は、光学密度すなわちＯＤと表示される細胞密度単位あたりのタンパク質含有量に相当するため、問題の細胞濃度と等価である。得られた結果を下記の表ＩＩに示す。
【００６９】
【表２】
0003865635.tif 000003
【００７０】
表Ｉと同じように、平均値は６個の試料に基づいたものであった。
【００７１】
３）組織学
水生生物及びウシのコラーゲンマトリックスを２１日間培養した後に得られる真皮同等物を、２％パラホルムアルデヒド溶液中で固定してから、四酸化オスミウム溶液中で後固定し、乾燥させて、Ｅｐｏｎに包埋し、切片化してから、ＣＭＥＡＧＢ（フランス、リヨン）にある透過型電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ  １２００）で観察する。
【００７２】
結論
これらの結果は、水生生物とウシのどちらであっても、３次元マトリックスの非常によい定着が起きたことを示した。培養３週間後、どちらのタイプのマトリックスにおいても、細胞密度は同等であった。しかし、培養１週目に行った増殖実験によって示されているように、実験の開始時から水生生物のマトリックスはより良く細胞接着できるようで、そのために、短い培養時間でより優れた定着が起きた。
タンパク質合成に関する限り、繊維芽細胞の合成能力（相対的タンパク質含量）も、培養１ヶ月後では同等であった。
【００７３】
これらの結果は、発達した水生生物のコラーゲンマトリックスによって、良質の真皮同等物を調製することが可能となることを示しており、これらのマトリックスによって得られた結果は、ウシコラーゲンマトリックスによって得られた結果に匹敵するものであった。
透過型電子顕微鏡下では、ウシ及び水生生物に由来するマトリックスの中に繊維芽細胞を観察することができた。どちらのタイプのマトリックスにおいても、大量の新規に合成された細胞外マトリックスの存在が見られた。この新たに合成された細胞外マトリックスは、最初のスポンジの３次元マトリックスを形成するコラーゲン塊と比較すると、堆積したコラーゲンの繊維が定期的に線状となるために区別することができた。
【００７４】
実施例２６
水生生物のコラーゲンマトリックスのさまざまなタイプの架橋が細胞の生存に及ぼす影響
水生生物のコラーゲンマトリックスのさまざまなタイプの架橋が細胞の生存に及ぼす影響を調べるために以下の試験を行った。
Ｉ）真皮同等物の調製
ａ）使用する支持体又はマトリックス
多孔性層又はマトリックスを製造するために、様々な割合のコラーゲンをコラーゲンゲルに使用し、また任意に、様々な架橋試薬を使用して、様々なコラーゲン支持体又はマトリックスを以下のように調製した。
【００７５】
１）試験１
この試験では、１．３重量％の水生生物コラーゲンから調製した水生生物コラーゲンゲルであって、−８０℃で凍結し、実施例１７記載の標準的な凍結乾燥法を行ってから、乾燥状態のスポンジ１ｇ当たり２５０μｌの割合でＤＰＰＡと架橋させたものから、多孔性スポンジの形状の多孔性マトリックスを製造した。
２）試験２
この試験では、０．７重量％の水生生物コラーゲンを含む水生生物コラーゲンゲルであって、−８０℃で凍結し、標準的な凍結乾燥法を行ってから、試験１同様、乾燥スポンジ１ｇ当たり２５０μｌの割合でＤＰＰＡと架橋させたものから、水生生物スポンジの形状の多孔性支持体を調製した。
３）試験３
この試験では、架橋を実施例２の記載に従って、乾燥スポンジ１ｇ当たり０．４６ｇの割合でＥＤＣと架橋させた以外は、手順は試験１と同じである。
４）試験４
１．１重量％の水生生物コラーゲンを含む水生生物コラーゲンゲルであって、１．１重量％の水生生物コラーゲンの割合に違いがあったが、試験２と同じように−８０℃で凍結し、標準的な凍結乾燥法を行ってから、乾燥スポンジ１ｇ当たり２５０μｌの割合でＤＰＰＡと架橋させたものから得られる水生生物コラーゲンのスポンジを含む多孔性支持体を調製する。
これらすべての試験において、水生生物コラーゲンは、実施例１７に記載された通り、シタビラメの腹部皮膚に由来するものである。
【００７６】
ｂ）これらのマトリックス上における繊維芽細胞の培養
実施例２５のように正常なヒト繊維芽細胞を用いた。ただし、継代８回目のものを使用した。
１ｃｍ２当たり２７５，０００細胞という割合でインキュベーションを行った。培養液は、１０重量％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）の割合のＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２からなる。
培養は、週に３回培地を交換しながら１ヶ月間行った。
各試験タイプごとの平均値を得て平均標準偏差を測定するために、各試験について４個のマトリックスを使用した。
【００７７】
ＩＩ）実施した分析
１）アラマーブルー（ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ：レドックス指示薬）との反応による生存細胞の測定
培養培地から取り出した試料での生存細胞を測定したい時には、使用している培養液の２重量％の割合でアラマーブルーを添加した。
３７℃で２時間２０分インキュベートした後、５３０ｎｍで励起し、５９０  ｎｍで発光させて蛍光を読み取った。
得られた蛍光強度は、細胞の代謝活性に比例していた。
培養後１日、４日、６日、１１日及び１７日目に、１０個の試料について生存細胞を測定した。
結果を以下の表ＩＩＩに示した。
結果は、時間の関数として、蛍光の国際単位にて表示した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
表３の結果は、添付の図７の曲線にも使用した。
それは、真皮同等物における繊維芽細胞の増殖曲線を示す。
黒いひし形の付いた曲線は試験１の結果に対応し、黒い四角が付いた曲線は試験２の結果に対応し、三角形の付いた曲線は試験３の結果に対応し、×印の付いた曲線は試験４の結果に対応した。
時間は横軸に日数で表され、蛍光は国際単位にて、目盛が１５，０００から始まり５５，０００までのスケールで１０，０００ずつ増加するように示した。
結果より以下の結論を導き出すことができた。
【００８０】
結論
結果は、調製されたさまざまなマトリックスが、培養１７日後には、繊維芽細胞を十分に増殖させ得ることを示している。水生動物コラーゲンマトリックスの調製に関わらず、繊維芽細胞は、３次元支持体に十分に付着し、非常に速く分裂してマトリックスに定着した。
増殖プロフィールは、タイプ毎にほんの少しずつ異なるが、調製方法に関わらず、培養１７日後の繊維芽細胞密度は同じようになった。
ＤＰＰＡ又はＥＤＣを用いて異なったタイプの架橋法を行ったが、細胞の更新には影響しないようであった。実際に３週間培養すると、マトリックスの安定性は非常に優れており、分解や収縮はほとんどなかった。
【００８１】
実施例２７
水生生物コラーゲンが、新規合成されたヒトコラーゲンを同定及び測定する上で有利であることを示す試験
本試験は、免疫標識法によって組織学検査を行う点を除けば、実施例２５の試験と同じである。
試験は以下のとおり実施された。
【００８２】
１）真皮同等物の調製
これは、実施例２５記載の真皮同等物であり、培養は、実施例２５記載の条件下で行った。
したがって、この培養は、週に３回培地を交換しながら３週間行い、実施例２５に示されたように、正常なヒト繊維芽細胞が１ｃｍ２当たり３００，０００細胞という割合で接種されていた。
【００８３】
２）組織学
ａ）通常の組織学
４重量％濃度のパラホルムアルデヒドで固定を行った後、材料を脱水し、パラフィンに包埋した。
次に、パラフィンを除去し再水和化した後に７μｍ切片を調製し、マロリー−ヘイデンハイン（Ｍａｌｌｏｒｙ  Ｈａｉｄｅｎｈａｉｎ）染色を行った。
ｂ）免疫標識
４重量％濃度のパラホルムアルデヒドで再び固定を行い、材料をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＯＣＴ化合物に包埋した。すなわち、包埋液を米国インディアナ州エルクハート（Ｅｌｋｈａｒｔ，  Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）にあるマイルズ社（Ｍｉｌｅｓ）から購入し、７μｍ切片は低温下で調製した。
免疫標識は以下の通り実施した。
ｉ．ウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン１次抗体（希釈率１／４０）、及び
ｉｉ．ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）に結合した抗ウサギ２次抗体（希釈率１／１６０）。
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジラクテート）を対比染色として使用した。
【００８４】
３）結果
水生生物マトリックス及びウシのマトリックスからなる支持体は、繊維芽細胞が付着する孔を大なり小なり緩めることが分かった。
繊維芽細胞が多くの割合で表面上に観察され、再構築皮膚を産生するのに好適な被覆物を真皮等価物の上に形成した。水生生物及びウシのスポンジでは、繊維芽細胞の分布は均一であった。
免疫標識において、ウシコラーゲンで形成されるマトリックスは、抗ヒトＩ型コラーゲン抗体で標識されることが分かった（交差）。
一方、水生生物由来のマトリックスは、抗ヒトコラーゲン抗体では非常に僅かにしか標識されなかった。
【００８５】
したがって、水生生物コラーゲンから構成されるスポンジの使用は、新規合成された細胞外マトリックスを同定するのに好適であった。
これらの結果は、様々な抗原の様々な抗体に対する反応に関するハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）教授の研究によっても説明されており、免疫標識後に光学密度測定によって測定され、下記の表ＩＶ、すなわちハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）の表に記載されていた。
【００８６】
【表４】
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【００８７】
結果はＯＤ×１０３（λ＝４５０ｎｍでの光学密度）で表示されていた。
キー：２０１１１（２２５）：抗ヒトＩ型コラーゲン
５０１２１（０３）：抗ウシＩ型コラーゲン
５０１７１（０１）：抗魚（シタビラメ）Ｉ型コラーゲン
【００８８】
この結果の表は、免疫標識において抗体がいずれであっても（抗ヒトＩ型コラーゲン、抗ウシＩ型コラーゲン、抗シタビラメＩ型コラーゲン）、ヒトコラーゲンとシタビラメコラーゲンとの差異は、ヒトコラーゲンとウシコラーゲンの差異よりもずっと大きいことを示している。従って、魚のコラーゲンマトリックスでは、ヒト繊維芽細胞によって合成されるコラーゲンをずっと簡単に同定できることになる。このことは、魚のコラーゲンマトリックス中で合成されたコラーゲンを抗ヒトＩ型コラーゲン抗体で免疫標識して得られた上記の結果を確認するものであり、本発明の特に予想外の優れた結果を構成するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例６の条件下でコラーゲンゲルを風乾して調製したコラーゲンフィルムからなる本質的に緻密な上部コラーゲン膜によって上面を覆われたウシ・コラーゲンの多孔性下部層から製造された本発明に係る複合物を、常法により組織染色して標識した後の断面図である。
【図２】  覆われていない、すなわち、実施例１の条件下にあるという以外は、同じウシ・コラーゲンによって調製された単純な多孔性マトリックスから得られた同様の断面図を示す。ケラチノサイトが表面に限定された深部に含まれていることが示される。
【図３】  ドナーの年齢の影響を示すために、それぞれ、２５〜３５歳のドナーから採取した細胞から得られた若い再構築皮膚、及び、５５歳よりも高齢のドナーから採取した細胞から得られた熟年ないし老齢の再構築皮膚について、再構築された皮膚の培養液中に存在するラミニンの量を示している。結果を「棒グラフ」で表し、産生されたラミニンの量は、対照（ＹＲＳ＝若年者の再構築皮膚）に対する百分率として縦軸上に示す。
【図４】  フランスのコレティカ社（ＣＯＬＥＴＩＣＡ））がＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標）という商標で市販している発酵麦芽抽出物の、熟年者の再構築皮膚におけるラミニン産生に対する誘導効果を示している。ここでも、産生されたラミニンの量は、対照に対する百分率で表した。
【図５】  同じ発酵麦芽抽出物（すなわちＢＡＳＡＬＩＮＥ（登録商標））の補償効果を示している。産生されたラミニンの量は、対照に対する百分率で表した。
【図６】  時間は日数で横軸に、光学密度×１０００は１００ずつの増加単位で縦軸に示した真皮同等物における正常なヒト繊維芽細胞の増殖を示す。ひし形で示した曲線は、水生生物、ここでは魚のコラーゲン多孔性マトリックスを支持体として用いて得られたものであり、また、四角で示した曲線は、ウシ・コラーゲンから得られたものである。
【図７】  真皮同等物における繊維芽細胞の増殖を示す同様の曲線を示す。ここで、時間は日数で横軸に、蛍光は国際単位にて、１５，０００から始め、１０，０００ずつの増加単位で縦軸に示した。黒いひし形で示した曲線は、テスト１の枠内で得られた蛍光を、四角で示した曲線はテスト２で得られた蛍光を、白い三角で示した曲線はテスト３で得られた蛍光を、そして、残りの×印で示した曲線はテスト４で得られた蛍光を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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