(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ブタ核酸の試料を採取すること、および
（ii）ＫＩＴ遺伝子の全部または一部の複製が存在するか否かを決定するために（ｉ）で得られた核酸を分析すること、
を含むブタ毛色ゲノタイプの決定方法。
【請求項２】
ブタ核酸はゲノムＤＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ii）は、ＰＣＲサイクルの一またはそれ以上および一対の適切なプライマーにより、少なくともＫＩＴ遺伝子の一部を増幅することを含むものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＲ生産物を定量するものである請求項３記載の方法。
【請求項５】
一対のプライマーは、
GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC
CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG、
GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA
TCACCATAGCAACAATATTCTGT、
TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC
CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC、または
GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA
GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC
である請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
一対のプライマーは、ＫＩＴ遺伝子の境界に存在する特異領域および複製領域をハイブリッド形成するものである請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
決定は、内部標準との比較を含むものである請求項３〜６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
内部標準は、一対の適切なプライマーを用いたＰＣＲサイクルの一またはそれ以上により、少なくとも別のヌクレオチド配列の一部を増幅することによって生成されるものである請求項７記載の方法。
【請求項９】
内部標準ＰＣＲ生産物を定量するものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
内部標準ＰＣＲ生産物は、少なくとも筋カルシウム放出チャンネル（ＣＲＣ）遺伝子の配列の一部を増幅することにより生じるものである請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
下記一対のプライマーは、内部標準ＰＣＲ反応のために用いられるものである請求項１０記載の方法。
CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTおよび
AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC
【請求項１２】
下記一対のプライマーは、内部標準ＰＣＲ反応のために用いられるものである請求項１０記載の方法。
GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAGおよび
TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG
【請求項１３】
内部標準ＰＣＲ反応は、ＫＩＴ配列の増幅と同時に進行するものである請求項８〜１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１４】
ＫＩＴ領域のコピー：内部標準領域のコピー、の比率を決定するものである請求項８〜１３のいずれか一に記載の方法。
【請求項１５】
さらに下記段階を含む請求項１〜１４のいずれか一に記載の方法。
（iii）任意の存在する複製がＩまたはＩPいずれの存在によるものであるかを決定すること
【請求項１６】
少なくとも複製領域の１つにおいて欠失が存在するか否かを決定するものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
非欠失領域のコピー：欠失領域のコピー、の比率を決定するものである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも一対のプライマーとともにＰＣＲを行うための試薬を含む一またはそれ以上の試薬を含み、前記一対のプライマーは、
GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC
CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG、
GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA
TCACCATAGCAACAATATTCTGT、
TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC
CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC、または
GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA
GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC
である、ブタ毛色ゲノタイプ決定用キット。
【請求項１９】
キットは、ブタゲノムＤＮＡの試料とともに使用されるのに適合したものである請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
一対のプライマーは、ＫＩＴ遺伝子の境界に存在する特異領域および複製領域をハイブリッド形成するものである請求項２３記載のキット。
【請求項２１】
さらに、一またはそれ以上のＰＣＲサイクルにより、少なくとも別のヌクレオチド配列の一部を増幅することのできる、第二の一対のプライマーを含む請求項１８〜２０のいずれか一に記載のキット。
【請求項２２】
第二の一対のプライマーは、少なくとも筋カルシウム放出チャンネル（ＣＲＣ）遺伝子の配列の一部をハイブリッド形成するものである請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
第二の一対のプライマーは下記配列を有するものである請求項２２記載のキット。
CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTおよび
AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC
【請求項２４】
第二の一対のプライマーは、少なくともブタインターフェロン−β遺伝子の配列の一部をハイブリッド形成するものである請求項２１記載のキット。
【請求項２５】
第二の一対のプライマーは下記配列を有するものである請求項２４記載のキット。
GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAGおよび
TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG
【発明の詳細な説明】
本発明は、毛色に関するブタゲノタイプを決定するブタ核酸のスクリーニング方法およびこの方法を実施するために使用されるキットに関する。
ラージホワイト(Large White)やランドレース(Landrace)等のヨーロッパ商業豚種の間では、白色が優勢な毛色である。しかしながら、いくつかの色やそれを組み合わせた商業的に重要な着色種がある。デュロク(Duroc)は肉が柔かく、赤であり、真っ直ぐな体で重々しい筋肉質動物のピエトレイン(Pietrain)は斑点、そして多産のチャイニーズメイシャン(Chainess Meishan)は黒である。
毛色は、いくつかの理由により養豚業にとって重要である。まず、いくつかの市場では、皮膚が白色のものの肉が好まれる。これは、豚肉はしばしば皮膚を付着させたままで市場で取引される事実や、着色豚の皮膚は、たとえ毛を取り去っても毛根色を示し、肉の表面はカビによって斑点が生じたように思われ、需要者の否定的な見方を招くことになる。その結果、このような市場では、胴体から皮膚を取り去るための追加の費用がかかる。例えば、アメリカでは、着色体は約１％の皮膚欠陥に関係しており、毛を取り、色素を除去するために皮を剥ぐことが要求される。この結果、着色豚は一般に値引きして売られている。
二番目に、ブタの外見（すなわち、毛色の種類）に関する粗悪な変種は、毛色以外の特性が遺伝子的に一貫することが要求されるので、ブタ生産取引者に動物の遺伝子的一貫性と質に関する疑問を抱かせる。
加えて、ブタ飼育者は、繁殖個体群の一貫性を確保したい。従って、飼育者は、交配種の繁殖により生産される子孫がいつも白色であることを確実にしたいと希望する。反対に、ピエトライン(Pietrain)の生産者は、交配種からいつも特徴的なピエトライン色が産出されることを確実にしたいと希望する。伝統的な動物飼育実務では、過去においてブタ系列から色素（白色以外）を取り除くことも試みられた。
その動物が着色であるか望ましい白色であるかを決定する遺伝子は、Ｉ（毛色抑制用）と示される。色の出現を阻止する遺伝子（Ｉ）は、色を発現させる遺伝子（ｉ）より優勢である。伝統的な白色種の選択は、ｉの頻度を減少させたが、それはまだ白色異種接合担持動物の個体群に残っている。これらの動物は、それらが他の異種接合動物とつがいとなって着色した子孫を生産するときにのみ確認される。個体群から劣性の対立遺伝子を除去しうるつがいテストのプログラムを通してのみ、異種接合が確認できる。このプログラムは、時間と金銭がかかり、費用効果がない。従ってｉ／ｉ動物は、当然に生産される。
加えて、ＩP(I-patch)と呼ばれるＩのもう一つの対立遺伝子の存在によってこの状況は、一層複雑になる。このＩP対立遺伝子は、ｉより優勢であるがＩより劣性である。従って、ＩP／ＩPまたはＩP／ｉゲノタイプを有する動物は着色斑点を有する。
ヨーロピアンワイルドピッグ(European wild pig)とラージホワイド種(Large white; Swedish Yorkshire)間の交配で開発された関連系列を用いて、ブタの遺伝子地図上のＩ遺伝子の位置が決定された。この遺伝子は、ブタのクロモソーム８上にあり、アルブミンの遺伝子と、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲＡ）のα−サブユニットに関する遺伝子の近くに存在する(Johansson et al,Genomics 14;965-969(1992))。マウスの遺伝子地図は、マウスクロモソーム５上の相同性領域を含む。この領域は、Ｗ(優勢white spotting)、Ｐｈ(Patch)およびＲｗ(ranp white)と呼ばれるマウス毛色の決定に役立ついくつかの遺伝子を含んでいる。マウスのＷ遺伝子は、ＫＩＴ遺伝子と共にあり、Ｗ位置の突然変異ゲノタイプは、ＫＩＴ遺伝子の構造的変化に起因するものであることが示された(Cabot et al, Nature 335;88-89 (1988)、Geissler et al, Cell 55;185-192(1988) and Nocla et al, EMBO Journal 9;1805-1813(1990))。
我々は、ブタのＫＩＴ遺伝子が毛色の決定に関連することを見いだした。特に、ＩまたはＩPとｉとの相違が、少なくともＩまたはＩP対立遺伝子のＫＩＴ遺伝子の一部の複製であることを見いだした。この複製は、結果として存在するＫＩＴ遺伝子の特定領域の２またはそれ以上のコピーを生じうる。
従って、このことにより、対立遺伝子Ｉ、ＩPとｉとを区別する方法、および毛色に関するブタ特有のゲノタイプの決定方法が開発されたのである。
それゆえ、まず第一の態様として、本発明は、
（ｉ）ブタ核酸の試料を採取すること、および
（ii）ＫＩＴ遺伝子の全部または一部の複製が存在するか否かを決定するために（ｉ）で得られた核酸を分析すること、
を含むブタ毛色ゲノタイプの決定方法を提供する。
このＫＩＴ遺伝子配列の複製が存在することは、ＩまたはＩP対立遺伝子のいずれかが存在することを示す。いくつかのブタ個体群においては、ＩPの出現率は低いか全く存在しないことが知られている。このような個体群においては、複製が存在するかまたは存在しないかを決定することは、特定のブタゲノタイプに関しては、合理的なある程度の信頼性を得るに十分である。このように、ＫＩＴ遺伝子の複製が存在するかしないかの単純な決定によって、特定のブタ毛色ゲノタイプについては、合理的に高い信頼性をもって決定できる。
しかしながら、他の個体群においては、ＩとＩPの存在の区別をすることが必要となるであろう。
ＩとＩPの双方はＫＩＴ遺伝子中に複製をもつが、ＩのみでＩPがないものは、複製領域の一つに欠失を示す。それゆえ、それに基づいて、これらの対立遺伝子間の区別が可能となる。
このように、この方法はさらに以下の段階を含む。
（iii）複製がＩまたはＩPいずれの存在によるものであるかを決定すること
この決定方法は、複製領域の少なくともひとつに欠失が存在するか否かを分析することによって、適切になされる。
ブタＲＮＡは、ＫＩＴ遺伝子中に複製が存在するか否かを決定するために分析されるけれども、本発明の方法は、ブタゲノムＤＮＡ上で適切になされる。
この遺伝子からＲＮＡを生産すると、ＤＮＡ配列の一部を複製することの結果として生ずるいくつかの影響があるかもしれない。これらは、動物の体のすみずみにおける、ＲＮＡ生産の抑制、ＲＮＡ合成水準の変化、ＲＮＡの大きさや生産速度の変化またはＲＮＡ生産分布の変化を含むものである。また、複製の上位の影響によって生ずる、他の遺伝子からのＲＮＡ生産の影響もあるかも知れない。
ステップ（２）で行われる決定は、一対の適切なプライマーを用いたＰＣＲ法の使用を含む。ＰＣＲまたはポリメラーゼ連鎖反応は、熱安定な変形のＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、限定されたＤＮＡ分子の領域をインビボで増幅しうる手法として広く用いられている。増幅のための領域である二つの公知の配列が選択され、これらの領域に対応するオリゴヌクレオチドの合成がなされる。もし、このプライマーがＤＮＡの同じ断片上に互いに十分近くにあれば、これらの間の領域が増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応は、いくつかの増幅サイクルからなる。各サイクルは、一般に９４℃で、変性段階を伴って始まり、ＤＮＡ分子の鋳型の二つの成分が分離される。この温度は、合成オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型にアニールできる温度に引き下げられる（一般に５０〜６０℃）。鋳型に対して高濃度のプライマーを用いて、鋳型−鋳型ハイブリッド形成の前に、プライマーは鋳型にアニールする。このアニール温度は、アニールが、鋳型内のＤＮＡの補足領域のみに起こり、他の不完全な補足領域に起こらないように選択される。この温度は、次いで７２℃に上昇され、この温度で熱安定なＤＮＡポリメラーゼが結合したプライマーを延長し、このようにして補足的に鋳型にＤＮＡストランドが生産される。
反応の初期において、各サイクルは、存在する鋳型を２倍に増幅する。これらの新たに合成された各ストランドは鋳型として作用するため、特定された領域に対応する分子の増加は指数関数的である。しかしながら、反応の末期（一般に２５サイクル経過）になると、反応成分（例えばプライマー）の消耗により、増殖が指数関数的でなくなり、鋳型分子の濃度上昇がアニーリング段階での鋳型−鋳型ハイブリッド形成の増加を招く。このような反応では、生産物の量は指数的段階をのぞいて、最初に存在した鋳型の量に直接関連する。使用されたサイクルの数によって、反応を指数的段階にとどめておくことを確保できるということは、ここで述べたように量的な応用において重要である。
ＰＣＲは、ＫＩＴ遺伝子の複製が存在するか否かを決定する種々の方法で使用される。まず、プライマーは、ｉではなくＩまたはＩPに複製されたＫＩＴ遺伝子の部分の増幅が使用されるように選択される。このＰＣＲは、いずれかのクロモソーム中のシングルコピーにのみ存在することが知られている対照配列を増幅させるプライマーを使用する二回目のＰＣＲと比較される。個々のＰＣＲ反応生成物の比の比較は、もし必要なら、存在するＫＩＴ領域の複製の概算を可能にする。明らかに、もし問題のＤＮＡ領域がＩまたはＩPでは二つのコピーに存在し、ｉ対立遺伝子では一つのコピーにのみ存在すると仮定すれば、ＫＩＴ生産物と対照生産物との比は、以下のように表される。
ゲノタイプ  ＫＩＴ／ＣＯＮＴＲＯＬ
Ｉ／Ｉ            ２
ＩP／Ｉ          ２
ＩP／ＩP        ２
Ｉ／ｉ            １．５
ＩP／ｉ          １．５
ｉ／ｉ            １
実際には、得られた比は、進行している二つの増幅反応の反応速度の差異によって変更してもよい。
前述した方法で使用する適当なプライマーのペアーは、
GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-順方向
CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-逆方向
および、
GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA KIT2-順方向
TCACCATAGCAACAATATTCTGT KIT2-逆方向
および、
TC(A/C)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC KIT3-順方向
CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC KIT3-逆方向
および、
GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA KIT4-順方向
GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC KIT4-逆方向
となる。
前述したように、対照ＰＣＲ反応の含有物は、増幅生産物の比の決定のための直接比較を許容する。
これは、選択された対照シーケンスとの関連によって好ましく達成される。というのは、このブタクロモソームがシングルコピーをもたらすことが知られているからである。このように、対照シーケンスのための適当なプライマーの使用により、ＰＣＲ生産物が生じ決定できる。ＫＩＴ遺伝子に対応するＰＣＲ生産物はこのような直接複製度の直接な読みを提供する。
適当な対照シーケンスのある例は、筋肉カルシウム放出チャンネル遺伝子（ＣＲＣ）のエクソンであり、適当なプライマーのペアは、
CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC順方向
AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC逆方向
もう一つの適当な対照シーケンスの例は、ブタに似たインターフェロン−β遺伝子(Artursson et al, Journal of Interferon Research 12;153-160(1992))、以下の適当なプライマーのセットである。
GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG INF-β順方向
TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG INF-β逆方向
他の適当な対照プライマーのためのシーケンスは、ブタに似た脳下垂体グリコプロテインホルモンの共通のαサブユニット（Kato et al, Journal of Molecular Endocrinology 7; 27-34 (1991))と、ブタに似たルテイナイジングホルモン(luteinizing hormone)のβサブユニットの遺伝子に由来する部位を含む（Ezashi et al, Journal of Molecular Endocrinology 5;137-146(1990))。
最もありそうなことは、ＫＩＴ遺伝子とその対照シーケンスのためのＰＣＲがブタＤＮＡのシングルサンプル上で同時に行われることである。
ＫＩＴ遺伝子（その部分を含む）の任意の複製が存在するか否かを決定するための第二の方法は、Ｉ対立遺伝子に独特のヌクレオチド配列は複製領域の境界に存在するという事実に基づく。それゆえ、このようなヌクレオチド配列または接合点に特異的なプライマーの使用により、Ｉ対立遺伝子の頻度を決定することが可能である。
ＫＩＴ遺伝子の構造の決定のための第三の方法は、複製の存在または欠損に密接に関連する遺伝子多型を使用することである。このような遺伝子多型は、ＫＩＴ遺伝子自身またはＫＩＴに関連したクロモソーム部位において生じるかもしれない。複製の存在／欠損に完全に関連する単結合マーカー、または高い情報テストの部分的関連を表すマーカーの結合が開発された。例えば、ＳＳＣＰ（単鎖形成遺伝子多型）法は、このような遺伝子多型の開発に使用される。この方法の原理は、ＰＣＲによって生産された二本鎖ＤＮＡが、非変性ゲル電気泳動によって分離された単鎖ＤＮＡが変性されることによる。非変性状態下で、単鎖ＤＮＡの比率は元に戻るが、二重鎖ＤＮＡを形成する単鎖ＤＮＡはイントラストランド相互作用によって二次構造を形成する。遺伝子多型の二つのタイプは、この方法によって明らかにされるかもしれない。まず、二つの対立遺伝子間の核酸シーケンスの相違は、電気泳動法で移動した割合の相違を明らかにする単鎖ＤＮＡの二次的構造に影響を与えるかもしれない。二番目に、核酸シーケンスの相違は、しばしばヘテロ二重鎖ＤＮＡ（ヘテロ二重鎖とは、異なる対立した二つの単鎖分子によって形成された二重鎖ＤＮＡ分子である。）の移動に影響を与える。
複製部位のコピー数に関連するＫＩＴ遺伝子の構造の決定の第四の方法は、パルスフィールドゲル電気泳動の使用を含む。パルスフィールドゲル電気泳動は、大きなサイズのＤＮＡ断片が分析できる技術である。この適用において、このプロセスは、ＫＩＴ遺伝子におけるＩ対立遺伝子を有する動物のＤＮＡの複製部位の特別の部位でゲノミックＤＮＡを切断する制限的エンドヌクレアーゼを用いる。このような酵素によるゲノミックＤＮＡ切断は、ＤＮＡ結合膜の転位によるパルスフィールド電気泳動による。複製する部位のための特別のプローブは、ゲル上の原点の決定に使用され、適当なＤＮＡサイズ標品とこのフラグメントのサイズが比較される。動物からのＤＮＡは、ＫＩＴ遺伝子のある部分の複製を含み、この特別のフラグメントはサイズが大きい。異種接合動物は、二つの異なるサイズの特別のバンドを表わし、小さいものは複製されなかったｉ対立遺伝子、大きいものは複製されたＩまたはＩP対立遺伝子である。この技術は、複製部位の二つのコピー以上を含む対立遺伝子を、複製の長さによるサイズの増加を有するフラグメントによって現わす。
第２の観点において、本発明は、
（ｉ）ブタゲノムＤＮＡの試料を得る、
（ｉｉ）前記（ｉ）からのゲノムＤＮＡを１ないしそれ以上の適当なプライマーとハイブリット形成する、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）からのハイブリット形成された核酸を用いて１ないしそれ以上のＰＣＲサイクルを実行する、および
（ｉｖ）ＰＣＲ反応生成物の量を測定する
ことからなるブタにおける毛色のゲノタイプの決定方法を提供するものである。
この観点の該方法は、また、
（ｖ）任意の複製存在（duplication present）がＩあるいはＩPの存在に起因するものかどうか決定する
というさらなる工程を含み得るものである。
好ましくは、この決定は、少なくとも１つの複製領域における欠失の有無を分析することにより行われる。
遺伝標識と特定の形質に対して応答し得る遺伝子との連合（association）は、遺伝子組換えによって破壊することができる。これゆえ、対象となる標識と遺伝子との物理的距離が近くなればなるほど、遺伝子組換えが、これらを分離するということが生じにくくなる。
さらに、代替的なＤＮＡ標識の対立遺伝子と、特定の形質と連合するものであることが既に示されているものである、特定の遺伝子（例えば、本明細書において論議するＫＩＴ遺伝子）と連合するものとして公知のＤＮＡ標識の対立遺伝子との、リンク（linkage）を作り出すことが可能である。これゆえ、ＫＩＴ遺伝子を述べる現想定において、代替的なクロモソーム８標識(chromosome 8 markers)の特異的対立遺伝子の選択を通じて、ＫＩＴ遺伝子に連合した標識のある対立遺伝子を選択することによって、非直接的に特定の毛色を有するブタを選択することが、少なくとも手短に、可能となるであろう。ブタ  クロモソーム８上のＫＩＴ遺伝子にリンクするものとして公知のこのような標識の例は、ＫＩＴ遺伝子それ自体における、あるいは血小板誘導成長遺伝子（ＰＤＧＦＲＡ）およびアルブミンのα−サブユニットに関する近接してリンクした遺伝子における、遺伝的多形性を含むものである。
ＫＩＴ遺伝子と連合する好ましい遺伝標識は、ミクロサテライトである。これらは、約５０００ベース毎でゲノム回りに本質的にランダムに生じる、４、３、あるいは、より通常、２個のヌクレオチドが、繰り返す単純な配列である（単ゲノム当たり約６００００ミクロサテライト）。複製の間のＤＮＡポリメラーゼのスタッタリング（stuttering）および組換えの間の等しくない交差（crossing-over）は、反復ユニットのロスあるいはゲインに帰結するものと考えられる。このことは、ミクロサテライトは通常多形であり、そしていくつかの反復長さの対立遺伝子を有し得ることを意味する。
リンクしたミクロサテライト配列の例は、Ｓ００８６（Ellegren et al, Genomics, 16:431-439(1993)）、Ｓ００１７（Coppieters et al,Animal Genetics 24:163-170 (1993)）、Ｓｗ５２７、Ｓｗｒ７５０およびＳＷ９１６（Rhorer et al, Genetics, 136:231-245 (1994)）を含むものである。上述した標識の任意のもの、あるいは実際に、ブタ  クロモソーム８上のその他のリンクした標識、を用いて、毛色にリンクしたＫＩＴ遺伝子の対立遺伝子に関して非直接的に選択することが可能であろう。
本明細書において議論するように、本発明はＫＩＴ遺伝子ＤＮＡ配列コピー数の測定に頼っている。このために、複製されたＫＩＴセグメントを代表するヌクレオチド  プローブ、もしくはその一部、または実際に、このようなブタ  プローブに十分な類似性を示すその他のヌクレオチド  プローブが用いられ得る。例えば、このような測定を実行するために以下のような方法を用いることができる：
（ｉ）  ＫＩＴ遺伝子のＤＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列から誘導されたヌクレオチド  プローブ、およびそれより誘導された、ＲＮＡを用いて、あるいは例えば、マウス（Gokkel et al, Oncogene 7, 1423-1429 (1992)）および／またはヒト（Giebel et al, Oncogene 7, 2207-2217 (1992)）からのものを、用いる。これらのプローブは、保存（conservation）のために、ブタ遺伝子にハイブリッド形成されるであろう。
（ｉｉ）  ある動物のＫＩＴ蛋白質のアミノ酸配列が公知である場合、この蛋白質あるいはその一部をコード化するＤＮＡの考えられるヌクレオチド配列が、推測されることができる。この点に基づき、ブタＫＩＴ遺伝子に関するプローブとして、混合されたオリゴヌクレオチド調製物を用いることができる。
（ｉｉｉ）  ＫＩＴ遺伝子の全体あるいはその一部、例えば、ｖ−ＫＩＴ（Besmer et al,Nature 320:415-421(1986)）、に対して機能的相同性を有する蛋白質に関する蛋白質配列（および対応ヌクレオチド配列）に基づき、プローブを設計することができる。
上記したようにして誘導されたプローブの全ては、例えばナイロン膜（例えば、ハイボンド  エヌ  アメルシャム  インターナショナル(Hybond N Amersham International)）の如きハイブリット形成のために適当なマトリックスに移された、動物誘導核酸調製物を、サザンブロット法、ノーザンブロット法あるいはドットブロット法によって、プローブするために用いられることができる。ＫＩＴと、マトリックス結合核酸に対しハイブリッド形成する比較対照プローブとの数の割合は、ＫＩＴコピー数を測定するために用いられることができる。結合プローブの量は、プローブを放射性同位元素で標識付けすることで定量可能である。その他に、非同位核酸標識化キットが現在入手可能であり、これもまた用いることができる。
マトリックスに対する動物誘導核酸のハイブリッド形成を包含する手順の逆もまた可能である。ここにおいて、プローブはマトリックスに結合され、そして、ハイブリッド形成プロトコルを通じて、先に述べたような方法で標識付けされたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを捕捉するために用いられ、これによって、結合量の定量をなさしめる。結合量は、条件が正しければ、存在するＫＩＴおよび比較対照核酸配列の総量（またはコピー数）に相関するものとなる。
ＰＣＲ増幅ＤＮＡを定量するその他の方法は、放射線標識化をベースとする方法を含むものである。その一例は、一方あるいは双方のオリゴヌクレオチド  プライマーを放射線標識し、続いて、ＤＮＡゲルのオートラジオグラフの濃度計測に通じて、ＰＣＲ産物における放射線活性の定量を行うことである。別の手順は、異なる同位体とのＰＣＲ反応の２つの産物に関してのオリゴヌクレオチドの差別的な標識付けであり、沈降、濾過、分画遠心、あるいはその他の方法による、取り込まれなかった標識化オリゴヌクレオチドの除去後において、それぞれの分離された産物の定量を可能とするものである。ＰＣＲ産物はまた、臭化エチジウムあるいはＳＹＢＲグリーン（モレキュラー  プローブス  インコーポレーテッド(Molecular Probes Inc.)）のような染料を、濃度計測計あるいは蛍光定量計と組み合わせて利用するその他の染色法によっても定量され得る。
２つの別々の産物を算出するために２つのＰＣＲが同じ試験管内で進行する分画ＰＣＲ(differential PCR)の産物を定義するさらに別の方法は、本発明において述べるように、タクマン（商標名）(TaqManTM)システム（パーキン  エルマー  コーポレーション（Perkin Elmer Corp.)の使用である。このシステムにおいては、増幅されるべき領域をフランキングする(flanking)２つのオリゴヌクレオチド  プライマーに加えて、第３のオリゴヌクレオチド  プローブが、増幅された領域に結合するために用いられる。前記フランキング  プライマーは標識付けされず、一方、前記プローブは２つの蛍光標識を担っている。前記プローブの３’末端上は、レポーター  ダイ(reporter dye）であり、このものの蛍光は、該プローブの５’末端に付着された別の蛍光体によってクエンチされる。ＰＣＲの間に、該プローブは産物ＤＮＡ分子に結合する。ＰＣＲが進行するに従って、このような産物は、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼが該プローブの５’クエンチング  ダイを置き換わるように切断する間のテンプレートとして使用される。クエンチ剤のこの除去は、検出すべき前記レポーター  ダイから蛍光を許容する。蛍光の度合いは、産生されたＰＣＲ産物の量に比例し、そしてそれゆえ、その量の測定となる。１つの反応は、それぞれ別々のゲノムＤＮＡ領域に相応する、ＰＣＲプライマー群と２つのプローブとの２つの別々のセットを含むものであり得る。この方法において、定量的ＰＣＲに関する基準に従う限り、それぞれのテンプレート領域の相対量が測定可能である。
蛋白質核酸が、上記ハイブリッド形成手順のいずれにおいても用いられ得る（パーセプティブ  バイオシステム  インコーポレーテッド、ケンブリッジ、マサチューセッツ(PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge, MA)）。
第３の観点において、本発明は、
（ｉ）ブタ  ＫＩＴ  蛋白質の試料を得、そして
（ｉｉ）上記（ｉ）で得られた蛋白質をＫＩＴ遺伝子の全部ないしは一部の複製が存在しているか否か決定するように分析する
ことからなる、ブタの毛色のゲノタイプを決定する方法を提供する。
ＫＩＴのエピトープないしは相関する蛋白質群のエピトープに対する抗体は、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ法により、動物中に存在するｃ−ＫＩＴ蛋白質のレベルないしは形態を測定するために使用可能である。抗体はまた、ＫＩＴ遺伝子の種々の対立遺伝子からなり、そしてゲノタイプがＥＬＩＳＡ法によって測定された、異なるＤＮＡ構造に対しても生起され得る。
第４の観点において、本発明は、ブタ  ゲノムＤＮＡにおけるＫＩＴ遺伝子配列の全部ないし一部の複製の存在を表示することが可能な１ないしそれ以上の試薬からなる、ブタの毛色のゲノタイプを決定するためのキットを提供する。
ＩとＩPとの間の差を考慮した上記の論議から、この差はまた、ゲノタイプ群間を識別するために利用され得るものであることが認識できるであろう。欠失が、Ｉの複製された領域の１つ（この場合Ｉは複製された領域の２つのコピーを含む）にのみ存在し、ｉには存在しないようにしか出現しない場合、これはＩのマーカーとなる。オリゴヌクレオチド  プライマーは、前記欠失が認められる位置のいずれかの側面に、ゲノムＤＮＡに対しハイブリッド形成され得るように設計されることができし、そして産物の２つ可能なサイズをもたらすようにＰＣＲが実行される。
４塩基対欠失が存在するところから得られたものは、欠失のない同じ領域から得られたものより４塩基対だけ短いであろう。これらの２つの産物の相対量は、先に述べた方法のいずれによっても測定することがかのうであるが、１つの好ましい方法は、適当な検出装備を有する装置における電気泳動、あるいはタックマン(TaqMan)装置（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)）と組み合わせて、蛍光染料で標識付けされたオリゴヌクレオチド  プライマーの１つを有することを、包含するものである。
ＰＣＲ成分に関するこの試験術の１つの好ましい利点は、ＰＣＲが対数期を出発する際の識別のロスに対する感受性がそんなに強くないという点である。前記プライマー、それらの結合サイト、および産物は、非欠失および欠失テンプレート領域に関して同じないしは類似であり、これゆえ、一方の産物の他方に対する割合は、反応の異なるステージで変化しそうもないものである。テンプレート／テンプレート  ハイブリッドがの形成が、テンプレート／プライマー  コンプレックスの形成と競合し始めると、それは同時に双方の副反応に影響する。最終的な結果は、それぞれの産物の産生の運動の間における高い相同性となる。
Ｉまたはｉのみを含有しＩPを含有しないブタの系統において、Ｉ対立遺伝子は非欠失および欠失産物の等量を与えるのに対し、ｉは非欠失産物のみを与えるという事実に基づいて、得られる２つの産物の割合が以下に示すようなゲノタイプに相関づけられる。
0003889440.tif 000002
それゆえ、第５の観点において、本発明は、
（ｉ）ブタ核酸の試料を得、そして
（ｉｉ）上記（ｉ）で得られた核酸を、ＫＩＴ遺伝子配列における欠失の存在または不在を同定するように分析する
ことからなるブタの毛色のゲノタイプを決定する方法を提供する。
欠失の存在または不在を単に同定することによって、Ｉとｉとを識別することができる。もちろん、ＩPの存在はこの結果を理解しにくくする。これは、複製の１つのコピーにおける欠失の不在によって、ＩPがこのような試験においてｉを効果的に擬態するゆえである。これゆえ、ＩPを担う系統におけるこの方法の使用は、この対立遺伝子を担う動物をｉｉとして間違って同定しかねない。しかしながら、このような方法は、それでも、例えば、Ｉに関して同型接合性である動物の陽性的同定が必要とされるところの全てである動物繁殖のある観点において、使用され得るものである。
もちろん、それぞれ個々のゲノタイプが、２つの産物の異なる割合を生むか、単一の産物タイプを産生するということもまた認識されるであろう。これゆえ、このような試験は、産生される産物の定量によって個々の動物の絶対的ゲノタイプを決定する手段をも提供する。このような場合において、それぞれの試験に使用されるＤＮＡの量は、産物の量における違いが正確に決定することを確かなものとするように制御されるべきである。
好ましくは、前記決定工程（ｉｉ）は、通常はブタ  ゲノムＤＮＡにおけるものである、ＰＣＲ増幅を包含する。このようなＰＣＲ法において使用することのできるプライマーの好ましい対は、
TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG  KITDEL1-FOR
CCAGCAGGACAATGGGAACATCT  KITDEL1-REV
および
GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT  KITDEL2-FOR
AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG  KITDEL2-REV
を含むものである。
これをアプローチする数多くの代替的方法の１つは、ＰＣＲにおいて、欠失の存在または不在によってＫＩＴ遺伝子のこの領域のそれぞれのバージョンにおいて生じる独特なヌクレオチド配列に結合するプライマーを使用することであろう。このようなプライマーは、対応する配列の存在においてのみ産生を生じるように設計されることが可能である。これゆえ、２つの代替的なプライマーのそれぞれが、異なる蛍光標識とともに用いられた場合、ゲル電気泳動が要求されず、各産物の同定がそれらの蛍光に基づいて行われる。
複製の存在および欠失のコピー数を検査した際に得られた比率に関する特異的な値の遺伝形質に基づき、複製された領域の２以上のコピーを含むＩの対立遺伝子がブタのある品種において存在するという予備的な証拠が存在する。
Ｉのこれらの変形を有する動物間における識別は、存在する複製された領域のコピー数の測定から得られる比率の、欠失の存在の測定から得られる比率との組合せを用いることで、高めることができる。２以上のコピーを有する複製されたバージョンの存在を現在与えるであろうところの対立遺伝子におけるＫＩＴ遺伝子が、以下に示される：
0003889440.tif 000003
複製された領域のコピー数に関する検定法および欠失を含むコピー数に関する検定法の測定において得られた、これらの対立遺伝子の存在およびそれぞれの比率から生じる可能性のあるゲノタイプは以下の通りである：
0003889440.tif 000004
前記２つの試験を組み合わせることによる１つの方法は、タックマンシステム（パーキン  エルマー  コーポレーション）の使用を包含するものである。タックマンのこの特別な適用において、３つのプローブが２セットのＰＣＲプライマーとともに用いられる。１つのプローブは、前記したプライマーの２セットの１つから生じる比較対照産物の測定をなすものである。ＰＣＲのもう一方のセットは、欠失を含むあるいは含まない複製の領域の増幅をもたらす。残りのプローブは、この増幅からの欠失産物あるいは非欠失産物のいずれかを検出する。先に述べた２つの別々の試験から得られるような値を与えることにより、得られたデータから以下に示す２つの計算を行うことができる。
Ａ：ＫＩＴ遺伝子領域のコピー：比較対照領域のコピー
（非欠失ＫＩＴ遺伝子産物＋欠失ＫＩＴ遺伝子産物）／比較対照遺伝子産物
Ｂ：非欠失ＫＩＴ遺伝子：欠失ＫＩＴ遺伝子
非欠失ＫＩＴ遺伝子／欠失ＫＩＴ遺伝子
本発明のそれぞれの観点の好ましい特徴は、必要な変更を加えれば、他の観点に適用かのうであることは認識できよう。
次に本発明を、以下の実施例を参照することで詳述する。しかしながら、これらの実施例は本発明をいかなる方向においても限定するものとして設けたものではない。
実施例３は図１に言及するが、ここにおいて：
図１：ＳＳＣＰ分析の結果を示すものである。
実施例１
（ｉ）ＤＮＡの調製
ＤＮＡは、細胞核を含む組織のいかなる源（source）、例えば白血球、手包、耳切痕および筋肉から調製することができる。ここに、概略を示す方法は、血球製剤に関するものであり、他の組織にもＫ緩衝液に物質を直接懸濁させ、ついで血液の場合と同様な段階の処理を行なうことにより同様に処理できる。ここに概略を説明する方法は、ＰＣＲ増幅に好適な細胞の溶解産物を含有する粗ＤＮＡを産生する。しかしながら、精製あるいは粗ＤＮＡのいかなる調製法も等しく有効である。
５０ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ８．０で血液を採取して凝固を防止した。５０μｌの血液を小型のクイクロ遠心チューブ（０．５ｍｌのエッペンドルフ（Eppendorf）またはその均等物）に分散させた。４５０μｌの緩衝液を加えて赤血球（ヘムグループ禁止ＰＣＲ）を溶解させ、２秒間滑巻攪拌した。ついで、未処理の白血球および残りの赤血球をマイクロ遠心チューブ内で１３，０００ｇで１２秒間遠心に供した。上澄液を、低圧真空ポンプ系を用いてゆるやかな吸引により除去した。さらに、４５０μｌのＴＥ緩衝液を加えて前記のように遠心処理により集めた白血球および残りの赤血球を溶解させた。赤色がペレット中に残っている場合には、該ペレットが白色を呈するまで繰り返す。ペレット化された白血球から上澄液の最後の１滴を除去したのち、プティナーゼＫを含有する１００μｌのＫ緩衝液を加え、かつその混合物を５５℃で２時間培養した。ついで、この混合物を９５〜１００℃で８分間加熱し、かつＤＮＡの溶解物を、必要時まで−２０℃で保存した。
薬剤
0003889440.tif 000005
溶解物を使用する前に、１．０ｍｌのＫ緩衝液当り１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ（モレキュラー  プローブス  インコーポレイテッド（Molecular Probes Inc.）製）を加えた。
（ii）ＰＣＲ
容量０．２５ｍｌの薄壁のチューブ（パーキン  エルマー（Perkin Elmer）製）中で、反応をつぎのとおり行なった。
4.0μl  5μM  CRC  フォワードプライマー
4.0μl  5μM  CRC  リバースプライマー
4.0μl  5μM  KITI-REVプライマー
4.0μl  5μM  KITI-FORプライマー
4.0μl   2mM  dNTPs(ファルマシア（Pharmacia）
4.0μl  35mM  dNTPs(ファルマシア（Pharmacia）
ワックスビーズ（ＰＣＲゲーム５０，（Perkin Elmer）製）を加え、かつチューブをパーキンエルマー９６００サイクラー中に載置した。ついで、該チューブを８０℃で１５秒間昇温させたのち、４℃に冷却した。ついで、第２回目の薬剤を各チューブに、つぎのごとく加えた。
4.0μl  10×緩衝液
9.6μl  滅菌脱イオン水
0.4μl  （0.5単位）アンプリタク（Ampli Taq）ＮＤＡポリメラーゼ（Perkin Elmer製）
2μl  DNA溶解物
ついで、反応チューブを、９４℃に予熱されたパーキネルマー９６００サーマルサイクラーに載置し、下記に示す手順にしたがってＰＣＲについて行なった。
９４℃で４分間
９４℃で２０サイクルで３０秒間、６２℃で３０秒間かつ
７２℃で３０秒間
必要とされるまで０℃
サイクル数は、ＤＮＡ源として使用される組織に応じて変えることができる。
KITプライマー
フォワード  GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-FOR
リバース    CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-REV
CRCプライマー
フォワード  CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC-FORWARD
リバース    AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC-REVERSE
リバースＫＩＴプライマーおよびフォワードＣＲＣプライマーは、５’端においてＡＢＩ蛍光染料ＦＡＭで標識付けされている。
（iii）ＤＮＡフラグメントの電気泳動および定量
１μｌのＰＣＲを２．５μｌの脱イオンホルムアミド、０．５μｌのＧＳ３５０  ＤＮＡスタンダード、０．４μｌのブルーデキストラン溶液と混合し、９０℃で２分間加熱し、ついで、氷上で急冷した。この溶液３μｌをＡＢＩ３７３  ＤＮＡシークエンサーに入れ、ＤＮＡフラグメントを１×ＴＢＥ緩衝液中で６％ポリアクリルアミド上で７００Ｖ、４０ｍＡ、３２Ｗで２時間にわたって分離した。ＫＩＴおよびＣＲＣ遺伝子からの産生物に相当するフラグメントを、シーンスキャン（Gene Scan）ソフトウエアを用いて定量し、それぞれのバンドのピーク領域を測定した。
（iv）結果
表１に示したデータは、ＤＮＡ溶解物がそれぞれ２３匹の動物から得られ、２回のＰＣＲ試験を各溶解物について行なった実験から得られた結果である。ＫＩＴピーク領域のＣＲＣピーク領域に対する比率は、各ＰＣＲおよび同一動物からのサンプルで得られる平均から計算された。
0003889440.tif 000006
この実験における異なるゲノタイプII、Ｉｉおよびｉｉの動物からの比率数値の上限および下限は、つぎのとおりである。
0003889440.tif 000007
これらの結果は、この試験を用いたゲノタイプの違いを示している。
実施例２
第２の試験は、二重鎖の一端（または遺伝子の残余に比して二重領域が反転している場合あるいは二重鎖領域が非二重鎖領域とともに直接並列に生じない場合には両端）に存在しているＤＮＡの特異な配列を用いる。ＰＣＲに用いるためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ法で用いられるアンニーリング温度で、これらは二重鎖領域の端部で結合領域に対してのみアンニールする。ついで、ＰＣＲは２対のオリゴヌクレオチドを用いて行なわれる。１対は、前記結合領域を走査するプライマーよりなり、第２のプライマーは、Ｉの対立遺伝子含有二重からのみ生じる増幅をする好適距離だけ離れる。プライマーの第２の対は、半数体ゲノムにおけるシングルコピーとしてのみ存在する配列の増幅を許す。同一チューブ内で行なわれるこの反応の産生物は、前記試験におけるように内部基準として作用する。反応特異性からの産生物の結合領域に対する比率は、シングルコピーの比較配列からのそれに関連して測定される。
この試験では、異なるゲノタイプからの産生物の予想比率との間で大きな差異がある。産生物の相対レベルとその比率は、つぎのとおりである。
0003889440.tif 000008
実施例３
（ｉ）ＤＮＡの調製
ＤＮＡは、実施例１に記載のとおりに調製した。
（ii）ＰＣＲ
反応は、容量０．２５ｍｌの薄壁のチューブ（Perkin Elmer製）で、つぎのとおり行なった。
2.0μl  5mM  KITDEL2-FORプライマー
2.0μl  5mM  KITDEL2-REVプライマー
1.0μl  2mM  dNTPs（Pharmacia製）
1.2μl  25mM  MgCl2
2.0μL  10×緩衝液（MgCl2なし）
0.1μL（0.5単位）Ampli Taq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）
0.2μl DNA溶解物
9.7μl滅菌脱イオン水
ついで、反応チューブを９４℃に予熱されたパーキネルマー９６００サーマルサイクラーに載置し、下記に示す手順にしたがってＰＣＲについて行なった。
９５℃で１分間
９５℃で３サイクルで１５秒間、５０℃で２０秒間かつ
７２℃で４０秒間、
９４℃で２７サイクルで１５秒間、５０℃で２０秒間かつ
７２℃で５０秒間、
７２℃で５分間
必要とされるまで４℃
サイクル数は、ＤＮＡ源として使用される組織に応じて変えることができる。
KITプライマー
フォワード  GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT KITDEL2-FOR
リバース    AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG KITDEL2-REV
（ｉｉｉ）電気泳動
１μｌのＰＣＲ産生物を、３μｌの負荷緩衝液（loading buffer）（９５％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレン−シアノール）と混合し、９５℃で３分間加熱し、ついで氷上で急冷した。ついで、サンプルを１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８９ｍホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ．Ｎａ）中の８％の純粋なポリアクリルアミドゲル（Protogel 37.5:1 Acrylamide:bisacrylamide、アトランタ州ナショナル  ダイアグノスティックス（National Diagnostics,Atlanta）上で負荷させた。該ＤＮＡフラグメントは、垂直スラブユニット（ＳＥ  ６００サンフランシスコのヘーファー  サイエンティフィック  インスツルメンツ（ＳＥ  ６００  Hoefer Scientific Instruments,San Fransisco）内で緩衝液が作動するように２０℃の恒温でかつ０．６×ＴＢＥで６Ｗで、４．５時間電気泳動法により分離した。
（ｉｖ）銀染色法によるＤＮＡフラグメントの可視化
電気泳動後、該ゲルは、定着液中で２０分間あるいは追跡染料がもはや検出できなくなるまでゆるやかな攪拌下に培養した。該ゲルを脱イオン水中で３回（各回攪拌下に２分間）洗浄した。ついで、該ゲルを染着液中でゆるやかに攪拌しながら４０分間にわたって培養し、続いて脱イオン水中で簡易洗浄（５〜１０秒間）し、現像液中に直接移した。該ゲルを、バンドが現瞭に可視化されるまで現像液中で培養し、ついで現像は等量の定着液を加えることにより終了させた。最後に、該ゲルを脱イオン水で２分間洗浄した。
薬剤
定着液    脱イオン水中の１０％氷酢酸
染着液    ２ｇの硝酸銀（AgNO3）
２ｍｌの３７％ホルムアミド
２リットルの脱イオン水
現像液    ６０ｇの炭酸ナトリウム（Na2CO3）を２リットルの脱イオン水中に溶解させた。使用直前に３ｍｌの３７％ホルムアルデヒドと４００ｍｌのチオ硫酸ナトリウム（10mg/ml）を加えた。この溶液は、使用時には１０〜１２℃の温度であるべきである。
（ｖ）結果
このＳＳＣＰ解析は、優性白色フェノタイプを有する動物にのみ見出される限り有益な多形性（polymorphism）であることを示している（図１）。１〜８段において、該解析は、多量の白色形質を有するスウェディッシ  ランドレイス  ピッグ（Swedis Landrace pigs）からのＤＮＡについて行なわれ、９〜１０段においてはワイルド形白色形質を有するワイルドピッグについて行なわれた。多形性バンドが示されている。この多形性は、対立遺伝子タイプＩの二重ＫＩＴ遺伝子を有する動物にのみ存在する２つの特異なフラグメントにより特徴づけられている。該フラグメントは、ＫＩＴ遺伝子の二重鎖および非二重鎖コピーを表現する異なる長さのＰＣＲ産生物からのＤＮＡ鎖のヘテロ二重鎖を表わす。５種で代表される４０匹の無関係の動物およびラージホワイト／ワイルドピッグ交配からの１９０匹のＦ２動物を用いるこのマーカーでのスクリーング試験の結果は、表２に示すとおりである。
この結果は、この特別な多形性（polymorphism）は、ＫＩＴ二重鎖の存在と関連して極めて近接している。若干の白色動物がヘテロ二重鎖パターンを示さないように、二重鎖と完全には関連しない。したがって、この多形性は、多量の白色コート色に関して異なるゲノタイプに使用できる遺伝子マーカーそれ自身あるいは他の結合したマーカーとの結合で近密に結合した例である。
0003889440.tif 000009
実施例４
ｉ）ＤＮＡ抽出
ＤＮＡは、実施例１で調製された。
ｉｉ）ＰＣＲ
反応は、容量０．２５ｍｌの薄壁反応チューブ（Perkin Elmer製）中で、つぎのようにして行なった。
0.5ml  5μM  KITDEL1-FORプライマー
0.5ml  5μM  KITDEL1-REVプライマー
1.0ml  2mM  dNTPs（Pharmacia製）
1.0ml  15mM  MgCl2
1.0ml  10×緩衝液
0.1ml  AmpliTag DNAポリメラーゼ
1.0ml  DNA溶解物
ついで、反応チューブは、パーキネルマー９６００サーマルサイクラー内に載置し、つぎの方法によりＰＣＲは行なわれた。
９４℃で４分間、
９４℃で２１サイクルで３０秒間、６０℃で３０秒間、かつ
７２℃で３０秒間、
７２℃で４分間、
必要とするまで４℃
使用するサイクルの数は、ＤＮＡ源として使用される組織に応じて変えることができる。
プライマー
フォワード  TGTGGGAGCTCTTCTCTTAGG KITDEL1-FOR
リバース    CCAGCAGGACAATGGGAACATCT KITDEL1-REV
リバースプライマーは、５’位端においてＡＢＩ蛍光染料ＦＡＭで標識化された。
（ｉｉｉ）ＤＮＡフラグメントの電気泳動および定量化
１μｌのＰＣＲ産生物を、１．５μｌの脱イオンホルムアミド、０．２５μｌのＧＳ３５０  ＤＮＡ標準品、０．２５μｌの負荷緩衝液（５０ｍｇ／ｍｌのブルーデキストラン、２５ｍＭのＥＤＴＡ）と混合し、９０℃で２分間加熱したのち、氷上で急冷した。ついで、１．７５μｌのこの溶液をＡＢＩ３７７  ＤＮＡシークエンサに負荷させ、ＤＮＡフラグメントを１×ＴＢＥ緩衝液中の４．１２％ポリアクリルアミドゲル上で３０００Ｖ、６０ｍＡ、２００Ｗかつ４８℃で分離した。欠失のないあるいは欠失のあるＫＩＴ遺伝子鋳型に相当する９７ｂｐおよび９３ｂｐフラグメントを、ジーンスキャン（Gene Scan）ソフトウエアを用いて定量し、各バンドのピーク領域を測定した。
結果
下記の表は、各２０匹の公知ゲノタイプからＤＮＡ溶解物各溶解物について行なわれたＰＣＲ試験とともにが産生された実験から得られた結果を表わす。四つの塩基対欠失を含まないＤＮＡ鋳型からのピーク領域の欠失を含むそれに対する比率を計算した。
0003889440.tif 000010
この小さなサンプルのためには、各ゲノタイプに対する予想比率値（Ｉｉに対する予想値＝２、ＩＩに対する予想値＝１）の中間である１．５の値が、いずれかの遺伝子に対する動物の点数を分ける線として使用できる。該表から、７／１０ＩＩおよび９／１０ｉは正しいゲノタイプとして決定できる。
0003889440.tif 000011