(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH9.0および温度70℃で活性を有し、pH9.0および温度65℃でパルプ処理を行うECFパルプ漂白処理において、非酵素処理パルプと比較してソフトウッド・パルプのISOブライトネス増加が少なくとも1％以上の増加を示すキシラナーゼであって、下記からなる群より選択されるキシラナーゼ：
a．アミノ酸配列がSEQ.ID No.19に示したアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するキシラナーゼ；
b．寄託番号：CBS 670.93、671.93、または672.93で寄託されている株からなる群から選択される微生物から得られることを特徴とするキシラナーゼ。
【請求項２】
ソフトウッド・パルプのISOブライトネス増加が1.5乃至5％の増加を示すことを特徴とする、請求項１記載のキシラナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２記載のキシラナーゼをコードする単離されたDNA配列。
【請求項４】
微生物宿主細胞をトランスホーメーションしうるベクターであって、請求項３記載のDNA配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項５】
DNA配列が微生物宿主中において該DNA配列の発現を保証する発現シグナルに機能的に結合することを特徴とする請求項４記載のベクター。
【請求項６】
(a)請求項４または５記載のベクター、(b)請求項３記載のDNA配列、若しくは(c)請求項１または２記載のキシラナーゼ、を含むか、あるいは(d)寄託番号：CBS 670.93、671.93、または672.93のいずれかで寄託されている微生物宿主。
【請求項７】
前記微生物宿主が前記DNA配列を発現することを特徴とする請求項６記載の微生物宿主。
【請求項８】
酵母であるか、あるいはバチルス属、ストレプトミセス属またはアスペルギルス属に属する、請求項６または７記載の微生物宿主。
【請求項９】
前記キシラナーゼが適当な培地におけるキシラナーゼを生産する微生物の培養、および培養物からのキシラナーゼの回収により入手しうることを特徴とする請求項１または２記載のキシラナーゼの調製方法。
【請求項１０】
前記微生物が請求項６〜８のいずれか１項記載の微生物宿主である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
キシランを分解するため、ウッドパルプ（ハードウッド若しくはソフトウッドパルプまたはリグノセルロース物質を含む）を脱リグニン化するため、若しくはパルプを漂白するための、または紙、板、若しくはフラッフパルプの製造プロセスに使用するための、請求項１または２記載のキシラナーゼを含有する酵素調製物。
【請求項１２】
請求項１または２記載のキシラナーゼまたは請求項11記載の酵素調製物によるキシランの処理を含むキシランの分解方法。
【請求項１３】
請求項１または２記載のキシラナーゼまたは請求項11記載の酵素調製物による処理を含む、ウッド・パルプ（ハードウッド若しくはソフトウッドパルプまたはリグノセルロース物質を含む）の脱リグニン化方法。
【請求項１４】
請求項１または２記載のキシラナーゼまたは請求項11記載の酵素調製物による処理を含むハードウッドまたはソフトウッドパルプを含むパルプの漂白方法。
【請求項１５】
請求項１または２記載のキシラナーゼまたは請求項11記載の酵素調製物の、キシランを分解するため、ウッドパルプ（ハードウッド若しくはソフトウッドパルプまたはリグノセルロース物質を含む）を脱リグニン化するため、若しくはパルプを漂白するための使用、または紙、板、若しくはフラッフパルプの製造プロセスにおける使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新しい微生物および新しい酵素に関する。特に、該酵素はアルカリ耐性キシラナーゼである。これらのキシラナーゼは、グラム陽性であってアルカリ耐性の微生物から得られる。このキシラナーゼは製紙およびパルプ工業で使用される条件下、即ちpH9および温度70℃で使用しうる。
発明の背景
キシランは植物ヘミセルロースの成分である。キシランは1,4-グリコシド結合したβ−D-キシロースからなる。通常、キシランはキシロースおよびその他のペントース、ヘキシロースおよびウロン酸を含む側鎖を有している。
製紙工業においてパルプの漂白は重要なステップである。製紙およびパルプ工業におけるパルプ処理に使用されるステップの概略を以下に示す：
いわゆる酸素脱リグニンステップにおいてパルプをpH10-12、80℃で処理し、大部分のリグニンを除去する。残ったパルプは2-5%のリグニンを含む。このリグニンがパルプを茶色にしている。続いてパルプを多段階漂白プロセスにおいて漂白する。この漂白では塩素、二酸化塩素、過酸化水素および／またはオゾン等の化学物質を使用して高品質紙用のパルプを得る。
パルプの茶色の原因となっているリグニンを除くのに塩素および塩素含有化学物質が使用されることが多い。これらの化学物質の使用でダイオキシンおよびその他の塩素化有機化合物が生成する。これらの化合物は環境を脅かすので、同様の廃棄物を生ずる化学物質の使用を控える傾向にある。
この事は無塩素の方法；全塩素フリー（TCF)およびエレメンタリー塩素フリー（ECF)を開発する傾向を推進している。これらの方法では過酸化水素またはオゾンを漂白に使用している。
製紙およびパルプ生産工程に酵素ステップを導入することには、幾つかの利点がある。
キシラナーゼは製紙およびパルプ処理に非常に有用であることが分かってきた。キシラナーゼはパルプからのリグニンの抽出を増加するという報告がある。キシラナーゼは酵素脱リグニンステップの後に使用されることが多い。
キシラナーゼはリグニンとセルロースに連結しているヘミセルロース鎖を切断する。キシラナーゼ処理後、リグニンは次のステップで容易に除去される。
従って、キシラナーゼの使用は予備漂白における活性塩素の消費を25-30%減少させる。この塩素の減少は生成する紙の質を低下させることはない（ビカリ(Viikari）等、1986. Proc. of the third Int.Conf.Biotechnology in Pulp and Paper Ind.，ストックホルム、p.67-69およびバパイ(bajpai)およびバパイ(bajpai). 1992. Process Biochemistry. 27:319-325）。
また、キシラナーゼ処理は漂白工程における他の化学物質の必要量も減少させる。
クラフトパルプの漂白における菌類由来のキシラナーゼの使用が報告されている。この酵素の至適pHおよび温度は、pH=3-5およびT=30-50℃である。これらの値は従来の条件であるpH≧9および温度≧70℃の漂白工程で使用するには理想的とは言えない。
高いpHおよび／または温度至適値を有する細菌由来のキシラナーゼも漂白工程で使用した報告が成されている。これらの一部を以下に示す；バチルス  パラミス（Bacillus pumilus）（pH=7.9，T=40℃、ニッセン(Nissen)等、1992. Progress in Biotechnology 7:325-337)、ジクトボグロマス  サーモフィラム（Dictvoglomus thermophilum)(pH=6-8，T=70℃、ヨーロッパ特許出願EP0 511 933）、B.ステアロサーモフィラス(stearothermophilus）T-6(pH=9.0，T=65℃、ショーハム(Shoham),Y等、（1992）Biodegradation 3,207-218)、B.ステアロサーモフィラス(stearothermophilus)(pH=9，T=50℃、WO 91/18976)およびサーモアネアロバクタ  エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）（68℃、デブロイス（Deblois)およびウィーゲル(Wiegel).1992. Progress in Biotechnology 7:487-490）。
上述のほとんどのキシラナーゼはpH≧9および温度≧70℃で活性を示すが、工業的条件（即ち、パルプの漂白）における有効性、例えばパルプのブライトネスの増加に関する有効性は限られたものであり、有意に変化しうる（例えば、WO 91/18976参照、pH9および50℃におけるパルプのブライトネスの増加はISO規格で僅か0.5%であった）。
発明の概要
本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関しており、かつ、該キシラナーゼが16SリボゾームDNA配列がSEQ.ID No.20に示したようにDSM 8721株の16SリボゾームDNA配列と92%の一致を示す微生物に由来することを特徴とする。
また、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関しており、かつ、該キシラナーゼが以下に示す登録番号：CBS666.93、667.93、669.93および673.93で登録されている株を含む群から選択される微生物に由来する事を特徴とする。
さらに、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関しており、かつ、該キシラナーゼがpH9.0、温度65℃でパルプの酵素処理を行うECFパルプ漂白工程において酵素未処理のパルプよりもソフトウッド・パルプのISOブライトネス1.0%、望ましくは1.5乃至5.0%の増加をもたらすことを特徴とする。
また、本発明はpH9.0および温度70℃でかなりの活性を示すキシラナーゼに関しており、かつ、該キシラナーゼがpH9.0、温度65℃でパルプの酵素処理を行うECFパルプ漂白工程において酵素未処理のパルプよりもソフトウッド・パルプのISOブライトネス1.0%、望ましくはハードパルプのISOブライトネス1.5乃至5.0%の増加をもたらすことを特徴とする。
発明の詳細な説明
本発明は東アフリカのケニアのアルカリソーダ湖の周辺で採取された土壌および水試料から単離された微生物に関する。これらの微生物は好アルカリ性、グラム陽性であり、バチルス属に属する（以下参照）。
この微生物をさらにキシラン寒天拡散検定法でスクリーニングした。このテストで透明帯を示す株を潜在的なキシラナーゼ生産株として単離した。
この株をpH10およびT=45℃で生育させた。遠心後、培養培地をpH9および温度80℃の検定でキシラナーゼ活性を調べた（実施例2）。
この条件下でキシラナーゼ活性を生産する8種の株が見つかった。これらの微生物は登録番号CBS 666.93、667.93、668.93、669.93、670.93、671.93、672.93および673.93でオランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・デ・シメルカルチャーに寄託された。
これらの株のほとんどはニールセン（Nielsen)等（1994、FEMS Microbiol.Lett.117,61-65)によって示された16SリボゾームDNA配列比較を使用した同定のためにデスチェ・サムルング・ホン、ミクロオーガニズメン・ウンド・ゼルクルツレンGmbH（DSM）に送られた。この配列比較に基づき、8種の株はバチルス属と指定され、B.アルカロフィラス(alcalophilus)(DSM 485T）と非常に関連が深い。さらに、配列比較はこれらの8種の株が２つのグループに分類されることを示した。最初のグループはDSM 8721に非常に似ているか、または殆ど同一であり、株1-16-2、1-25-2および1-43-3（各々CBS 670.93、671.93、672.93）を含んでいる。第２のグループはDSM 8718と非常に関連が深く、株2-47-1、2-M-1、1-47-3および2-26-2（各々CBS 666.93、667.93、669.93および673.93）を含んでいる。これら２つのグループへの分類キシラナーゼ・ザイモグラムで確認された。意外にも、第１グループの株、すなわちDSM 8721に関連する株（1-16-2、1-25-2および1-43-3を含む）に由来するキシラナーゼはパルプ漂白において顕著な性能を示した。この性能は本発明の酵素で処理した場合のソフトおよびハードパルプのブライトネスの増加で示され、特にソフトパルプの場合に顕著である。この点で第２グループ、すなわちDSM 8718に関連する株の殆どから得られるキシラナーゼの性能は、他の株と比較して1-47-3株由来のキシラナーゼがハードパルプに関して最良の性能を示したものの十分なものではなかった。本発明の酵素で得られるブライトネスの増加は非酵素処理コントロールパルプと比較して△最終ISOブライトネス増加として少なくとも1.0%である。望ましくはソフトウッド・パルプの場合のブライトネス増加は1.5乃至5.0%であり、ハードウッド・パルプの場合は1.2乃至3.0%である。
本発明はキシラナーゼ活性を有し、かつpH9.0および温度約70℃でかなりのキシラナーゼ活性を有する酵素を開示している。該酵素は上述の登録株から入手しうる。また、該酵素は該寄託株の変異株からも入手しうる。
「かなりの活性」という表現は、本発明の酵素がpH9で、それらがpH7で有する活性の40%、望ましくは60%、さらに望ましくは約80%を有することを意味している。本発明の殆どの望ましい態様では、キシラナーゼの活性がpH7よりpH9の方が高い。
また、本発明は遺伝子工学を用いて開発されたキシラナーゼの生産方法を開示している。第１ステップとして本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子をλファージ（発現）ベクターおよび大腸菌宿主細胞を用いてクローニングする。別に、保存的ドメインに基づいて設計したコンセンサス・プライマーを用いたPCRクローニングを使用することもできる。多くのキシラナーゼのホモロジー比較に基づき、種々のクラスの差が提唱されている（ギルケス（Gilkes）等、1991,Microbiol.Rev.55,303-315）。各クラスに対して特異的な保存ドメインが同定されている。クラスFおよびクラスGのキシラナーゼはこの決定方法に基づいて同定しうる。２つの保存ドメイン間にあるDNAフラグメントをPCRでクローニングしうる。全長クローンはインバースPCRまたは遺伝子ライブラリーのハイブリダイゼーション・クローニングで得ることができる。大腸菌における本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子の発現は活性タンパク質を提供することを示している。該タンパク質はpH9および温度70℃で活性である。
大腸菌における第１のクローニングステップ後、キシラナーゼ遺伝子は、バチルスまたはストレプトマイセス種、アスペルギラス等の繊維状菌類、または酵母等の工業的に望ましい発現宿主に移転することができる。これらの宿主生物で得られる高い発現および分泌レベルは培養培地における本発明のキシラナーゼの蓄積を可能にし、つづいてキシラナーゼをそこから回収しうる。
さらに、本発明は該寄託株から得られ、かつpH9.0および温度70℃でかなりの活性を有するキシラナーゼの調製法に関する。この方法には、適当な培地における本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を発現する寄託微生物または組み換え宿主微生物の培養、およびそれに続くキシラナーゼの回収が含まれる。-
本発明の酵素はオート・スペルト・キシランおよびバーチウッド・キシランに関してかなりの活性を有することが示されている。
さらに、本発明の酵素は漂白活性に関しても検定された。酵素調製物キシラナーゼは少なくとも80℃の温度、少なくともpH9の条件でウッドパルプを脱リグニンすることができる。「ウッドパルプ」とは広く解釈するべきもので、全てのリグノセルロース物質が含まれる。本発明の酵素は製紙およびパルプ生成工程における酸素脱リグニンステップの直後に使用しうる。この酵素は酸素脱リグニンステップの前に使用するのが望ましい。このステップにおけるリグニン濃度はより高く、従ってキシラナーゼの使用の効果がより大きくなる。
本発明の酵素についてハードウッドおよびソフトウッドの両方に関する検定を行った。カッパ還元とは別に、２つのパルプ、ソフトウッドおよびハードウッド・クラフトパルプに関してECF漂白検定法でブライトネスの増加を測定した。本発明のキシラナーゼで生成したブライトネスの増加は漂白化学物質の量の減少をもたらすと同時に、酵素を使用しない場合と同様のブライトネスが達成できた。
さらに、本発明は本発明の酵素調製物の応用、特にウッドパルプを本発明の酵素調製物で処理する工程、およびウッドパルプおよびフラッフを本発明の酵素調製物で処理する工程に応用することに関する。
さらに、本発明は本発明の酵素調製物で処理したウッドパルプから生成する紙、板およびフラッフパルプに関する。
さらに、本発明の酵素調製物は低いセルラーゼ活性を有することが示された。
実施例1
アルカリ-および熱耐性キシラナーゼの単離
試料
土壌および水試料は東アフリカのケニアにあるアルカリソーダ湖の周辺から採取した。
キシラナーゼ生産微生物のスクリーニング
キシラナーゼ生産微生物の単離には２つの方法を採用した：
ｉ）土壌および水試料を0.85%の食塩水に懸濁し、キシラン・寒天拡散検定に直接使用した。
ii）土壌および水試料をキシラン含有液体最小培地またはGAM培地中で各々、45、55および70℃の温度で1-3日間インキュベートした。細菌増殖を示した培養物はキシラン・寒天拡散検定法を用いたキシラナーゼ活性を分析した。
培地
キシラン・寒天拡散検定法および濃縮操作で使用した最小培地（pH9.7）にはKNO31%、酵母抽出物（Difco)0.1%、KH2PO40.1%、MgSO4・７H2O0.02%、Na2CO31%、NaCl4%および4種の市販キシラン混合物（各0.05%）（オート・スペルト由来のキシラン（シグマX-0376）、バーチウッド由来のキシラン（シグマX-0502）、オート・スペルト由来のキシラン（サーバ38500）、ラーチウッド由来のキシラン（ICNバイオケミカルズ103298））を含んでいる。固体化には1.5%の寒天を添加した。
酵素生産に使用した複合培地（GAM)にはペプトン（Difco)0.5%、酵母抽出物（Difco)0.5%、ぶどう糖・H2O1%、KH2PO40.1%、MgSO4・７H2O0.02%、Na2CO31%、NaCl4%が含まれている。pHは1%キシラン添加後4M HCｌで9.5に調整した。
キシラン・寒天拡散検定法
0.85%塩溶液中の細胞懸濁液をキシラン含有最小培地にプレーティングした。各々45および55℃で1-3日間インキュベーション後、コロニーの周辺に透明帯を示す株を潜在的キシラナーゼ生産微生物として単離した。
アルカリ-および熱耐性キシラナーゼ生産株の単離
寒天拡散検定法で透明帯を示した株を100ml振盪フラスコ中の25mlGAM培地で45℃、250rpmのインキュベーター・シェーカー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック、エジソン、NJ，USA)を用い72時間培養した。キシラナーゼ活性はpH9および80℃の培養培地中で測定した（実施例2）。
粗酵素調製物の単離
振盪フラスコ培養は500mlのGAM培地を含む2リットル三角フラスコで行った。このフラスコを45℃、250rpmの振盪インキュベーターで48-96時間インキュベートした。遠心で細胞を培養溶液から分離した（8000rpm）。無細胞培地はYN5フィルターを装着したアミコン・スタード・セル・モデル8400を用いた限外濾過で濃縮した。
実施例2
アルカリ-および熱耐性キシラナーゼの特性
分析法
キシラナーゼ活性の検定法はサムナー（Sumner）検定法（J.Biol.Chem.1921.47,5-9）の修正法を用いて行った。
操作1
オートスペルト・キシランに関するキシラナーゼ活性
200μlの4%オート・スペルト・キシラン懸濁液および適当なバッファで希釈した600μlの無細胞培養培地（実施例1）で試験管を満たす。この試験管を水浴中で15分間インキュベートする。インキュベート後、7.2mlのDNS（ジニトロサリシン酸）試薬を添加する。この混合物を水浴中100℃で10分間加熱する。加熱後この試験管を氷中で冷却する。575nmの吸光度を測定する。酵素試料のバックグランド吸光度を除去するため、以下のようにコントロール実験を行った。基質を含む試験管を上記試験管と同様の条件でインキュベートした。インキュベート後、7.2mlDNSおよび酵素調製物を（この順序で）添加した。キシラナーゼ活性1ユニット（xU）は1分間にキシランから還元糖として測定される1μmolのキシロースを生成する酵素量と定義される。
実際の測定条件はpH7および9、および温度70および80℃であった。バッファにはリン酸バッファpH7および硼酸／KCl pH9を使用した。結果は相対活性として表１に示す。
0003865769.tif 000002
表１、２および３に示した1乃至8の株は以下の寄託番号で寄託されている。
2-47-1＝CBS 666.93，2-m-1=CBS 667.93
2-16-1＝CBS 668.93，1-47-3=CBS 669.93
1-16-2＝CBS 670.93，1-25-2=CBS 671.93
1-43-3＝CBS 672.93，2-26-2=CBS 673.93
操作2
バーチウッド・キシランに関するキシラナーゼ活性
操作1と同様の方法を使用した。4%オート・スペルト・キシラン懸濁液の代わりに、4%バーチウッド・キシラン懸濁液を使用した。検定条件は各々pH7および9、および温度70℃および80℃である。結果を表２に示す。
0003865769.tif 000003
実施例3
70℃および80℃における脱リグニン検定
カッパ検定法
カッパ検定法はTAPPI T236プロトコールを一部修正して行った。酵素溶液はパルプ1g当たり10xU投与し（パルプnb 1に対してオート・スペルト・キシランおよびパルプ2および3に対してバーチウッド・キシラン）（乾燥重量）、pH9、70℃および80℃で2時間インキュベートした。コントロールは酵素添加無しで同様の条件、同様の時間のインキュベーションを行った。３種類のパルプを使用した。
1]  クラフト・ソフト・パルプ
2]  酸素脱リグニン化後のクラフト・ソフト・パルプ
3]  酸素脱リグニン化後のクラフト・ハード・パルプ
0003865769.tif 000004
酵素添加のカッパ数と酵素無添加のカッパ数の差はカッパ・リダクションと呼ばれており、脱リグニン化の指標となる。カッパ・リダクションを表3Aに示す。
0003865769.tif 000005
ブランクは測定せず。
60℃における脱リグニン化
カッパ検定法
カッパ検定法はTappi T236プロトコールを一部修正して行った。酵素溶液をパルプ1g当たり10xUの割合で投与し（バーチウッド・キシランに基づき）（乾燥重量）、pH9、60℃で2時間インキュベートした。コントロールは酵素無添加で同条件、同時間インキュベートしたパルプである。２種のパルプ：
-酸素脱リグニン化後のクラフト・ハードウッド・パルプ（nb2）
-酸素脱リグニン化後のクラフト・ソフトウッド・パルプ（nb4）
0003865769.tif 000006
酵素添加におけるカッパ数と酵素無添加のカッパ数の差はカッパ・リダクションと呼ばれ、脱リグニン化の指標となる。カッパ・リダクションを表3Bに示す。
0003865769.tif 000007
実施例4
セルラーゼ活性
セルラーゼ活性の検定はPAHBAH（パラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）検定法（Anal.Biochem.1972,47:273-279）の修正法で行った。
0.9mlの0.5% CMC(カルボキシメチルセルロース）を0.1mlの希釈酵素調製物とpH9、70℃で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、3mlのPAHBAH試薬（0.5M HCｌ中5%のPAHBAH溶液10mlを40mlの0.5M NaOHと混合した：PAHBAH試薬）を添加し、この反応混合物を100℃で5分間加熱した。氷上での冷却後、420nmの吸光度を測定した。酵素試料のバックグランド吸光度を除去するために、コントロール実験を以下のように行った。CMCをpH9、70℃で30分間インキュベーションし、PAHBAH試薬添加後、酵素溶液を添加した。1セルラーゼ・ユニット（cU）は毎分1μmolのグルコースを生成するのに必要な酵素量と定義され（基質としてCMCを使用）、この値はキシラナーゼ活性と相関を有する。検定した全ての株はキシラナーゼユニット当たり10mU以下のCMCase活性を有していた。
実施例5
キシラナーゼ遺伝子およびその断片のクローニング
染色体DNAは従来法（マニアチス(Maniatis)等、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、1989）に従い実施例2で述べた株から単離した。ストラタジーン製のZAP Expressクローニング・システムを使用し、選択した株各々に対しゲノム・ライブラリーを構築した。宿主／ベクターシステムは業者の説明書に従って使用した（カタログ番号#239212,1993年6月30日）。構築を目的として、BamHI部位にライゲーションしたSau3A消化物またはEcoRI部位にライゲーションしたEcoRIリンカーを有するランダム切断DNAを使用した。
組み換えファージを業者の推奨するプラスミド・ベクターにトランスホーメーションした。これらのプラスミド・ベクターについてRBBキシラン・インジケーター・プレートを使用してキシラナーゼ発現を検定した。
陽性コロニーを単離し、以下の培地を使用してキシラナーゼ生産を検定した：
生産培地：
4×LBC：
20g  酵母抽出物
40g  バクト・トリプトン
10g  NaCl
4g  カザミノ酸
を0.25mlの消泡剤を含む脱イオン水で1リットルとし、120℃で20分間滅菌する。コロニーを激しい振盪条件下、30℃で24時間培養した。
熱ショック法（65℃、10分間）で細胞を分解し酵素を単離した。キシラナーゼ活性は上述のように測定した。各コロニーの検定結果を表４に示す。
0003865769.tif 000008
全てのクローンはキシラナーゼを生産すると結論しうる。生成レベルのばらつきは部分的遺伝子フラグメントのクローニングに寄るかもしれないが、ほとんどは挿入物内に存在するキシラナーゼの多様性を反映していると見なしうる。
実施例6
選択されたキシラナーゼ・コード挿入物の特性
キシラナーゼ生成クローンのDNA挿入物はDNAシーケンシングで特徴付けることができる。KEX106の挿入物を分析し、アルカリ耐性キシラナーゼをコードする遺伝子を同定した。該遺伝子のDNA配列をSEQ.ID No.1に示す。
コードされているタンパク質のアミノ酸配列（SEQ.ID No.2）の比較はキシラナーゼタンパク質配列との93%のホモロジーを示した（ハマモト（Hamamoto）等、1987、Agric.Biol.Chem.,51,953-955）。
従って、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列はSEQ.ID No.2のアミノ酸配列と93%以上の一致、望ましくは少なくとも95%の一致、より望ましくは少なくとも98％の一致、最も望ましくは99%以上の一致を示しうる。
実施例7
アルカリ耐性キシラナーゼをコードする遺伝子の内部フラグメントの同定およびクローニング
遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための別法としてPCRクローニングに基づく方法を検討した。多くのキシラナーゼ配列の比較に基づき、保存的配列ボックスを含むコンセンサス・オリゴヌクレオチド・プライマーを設計した。一組のプライマーはF型のキシラナーゼに対するものであり、別の組のプライマーはG型のキシラナーゼに対するものである。
以下のコンセンサス・プライマーを構築した：
FA:5'CAC ACT/G CTT/G GTT/G TGG CA3'：フォワード・プライマー、コンセンサス・ボックス1（SEQ.ID No.3）
FB:5'CAC ACT/G TTT/G GTT TGG CA3'：フォワード・プライマー、コンセンサス・ボックス1（SEQ.ID No.4）
FR:5'TC/AG TTT/G ACC/A ACG/A TCC CA3'：リバース・プライマー、コンセンサス・ボックス2（SEQ.ID No.5）
プライマーFAおよびFBは同じコンセンサス・ボックスに結合するが、ヌクレオチド配列の差が僅かなのでこれらは相補的な特異性を示す。
PCR条件は以下のとおりである：［94℃、1分］,［50℃、1分］および［72℃、1分］30サイクル。F型のプライマーを用いた増幅から生ずるフラグメントをアガロース・ゲルで精製し、サブクローニングした。つづいて、そのDNA配列を決定した。
GAF:5' GAA/G TAT/C TAT/C ATT/C/A GTN GA:フォワード・プライマー、コンセンサス・ボックス1（SEQ.ID No.6）
GBF:5' GAA/G TAT/C TAT/C GTN GTN GA:フォワード・プライマー、コンセンサス・ボックス1（SEQ.ID No.8）
GAR:5' CG/TN ACN GAC CAA/G TA:リバース・プライマー、コンセンサス・ボックス2（SEQ.ID No.7）
GBR:5' CG/TN ACA/G CTC CAA/G TA:リバース・プライマー、コンセンサス・ボックス2（SEQ.ID No.9）
GCR:5' CCR CTR CTK TGR TAN CCY TC:リバース・プライマー、コンセンサス・ボックス3（SEQ.ID No.10）
PCR条件は以下のとおりである：［94℃、1分],[40℃、1分]および[72℃、1分]30サイクル。
Gプライマーを用いた最初のPCRはボックス1およびボックス3に関して構築したプライマーで行った。種々のサイズのフラグメントの混合物をアガロース・ゲルで精製し（250-340bp）、ボックス1およびボックス2に関して構築したプライマーで行う第2のPCRに提供した。単一のフラグメントが増幅され、これをサブクローニングした。PCRフラグメントの平滑末端の修復はPCR混合物に0.5mM  ATP（ベーリンガー・マンハイム）、10ユニットT4  DNAキナーゼ（BRL)およびT4 DNAポリメラーゼ（BRL)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。この混合物をQuiagenのPCR抽出キットで精製した。このフラグメントをマニアチスの方法に従ってアプリジーン製のpUC18xSmaI(CIAP)ベクターにライゲーションした。エレクトロポレーションを使用して大腸菌HB101laqlqにライゲーション混合物をトランスホーメーションした。多くのクローンのDNA配列を決定した。
分析から選択した株が数種のキシラナーゼ遺伝子を宿しており、その一部はF型のコンセンサス・プライマーでクローン化され、他のものはG型のプライマーでクローン化されていることが明らかになった。例として株1-43-3、1-47-3、1-M-1、2-26-2（全てF型）および1-43-3および1-25-2（全てG型）由来の種々のキシラナーゼフラグメントを配列リスト中に示した（表５参照）。
0003865769.tif 000009
次に、特異的プローブとしてクローン化したフラグメントを使用し、ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件を使用しラムダZAP遺伝子ライブラリー由来のクローン化した遺伝子フラグメントを単離した。全てのクローン化した遺伝子はこの方法で単離しうる。
これらの遺伝子は実施例5で示した方法の検出から逃れるので、この方法は特に大腸菌において内在する遺伝子調節シグナルからうまく発現しない遺伝子に対して有効である。サブクローニング法およびDNA配列分析を使用して、種々のアルカリ耐性キシラナーゼをコードする完全な遺伝子を単離し、大腸菌内で生産するための発現シグナルを装着しうる。
実施例8
キシラナーゼ・クローンの特性
コンセンサス・プライマーおよび特異的プライマーの両方を用いて、実施例5で述べたクローンの特性を調べた。クローン化した挿入物の一部にはキシラナーゼ遺伝子のクラスターが存在することが明らかになった。この発見に基づき、単一の遺伝子を大腸菌および枯草菌の両方に対する発現ベクターにサブクローニングした。単一要素キシラナーゼの発現が大腸菌および枯草菌の両方へのトランスホーメーションで得ることができた。バチルス発現システムはPlugBug技術[ref1]に基づくものである。
実施例9
選択されたG型キシラナーゼをコードする挿入物の特性
クローンKEX301の挿入物を分析し、G型キシラナーゼをコードするオープン・リーディング・フレームを同定した。このORFの配列をSEQ.ID No.18に示し、キシラナーゼの誘導アミノ酸配列をSEQ.ID No.19に示した。EMBLデータベース（リリース39、バージョン2）内の相同遺伝子の探索は、G1キシラナーゼの配列がユニークなものであることを示した。68%以上のDNAホモロジーは発見できなかった。また、タンパク質配列もデータベース配列と比較した。最も近い（72%）ホモロジーはxynYキシラナーゼ配列で見つかった（ユ(Yu)等、1993,J.Microbiol.Biotechnol.3,139-145）。
従って、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列は少なくとも72%、望ましくは少なくとも80%、より望ましくは少なくとも90%、さらに、より望ましくは少なくとも95%、最も望ましくは99%以上のホモロジーをSEQ.ID No.19のアミノ酸配列と共有する。
ref1:クワックス（Quax）、W.J.等、1993、Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, ASM,ワシントンDC.,p143。
実施例10
寄託株由来の上清を使用したパルプ漂白実験
全ての実験はXwDED漂白シーケンスを用いたエレメンタリー塩素フリー（ECF）漂白である。パルプの酵素処理はpH9、65℃で2時間行った。実験中の適正な温度を保証するために、酵素を添加する前にパルプをマイクロ波で65℃に加熱した。実験はpH調整した水道水を添加することでパルプを10%一定に保った。寄託株のキシラナーゼ含有培養上清に関するECF漂白の結果を表６に示す。
0003865769.tif 000010
各漂白実験の前に、全ての酵素含有上清はpH9、65℃におけるキシラナーゼ活性を検定した。漂白実験において、オーブン乾燥パルプ1g当たり2キシラナーゼユニットを各上清に使用した。上清の活性は酵素漂白実験と同日に測定した。
実施例11
大腸菌で発現されるクローン化されたキシラナーゼ遺伝子によるパルプ漂白
寄託株から得られたクローン化されたキシラナーゼ遺伝子を発現する大腸菌クローン3種に由来するキシラナーゼを、実施例10で説明したパルプ漂白実験で検定した。大腸菌クローンを実施例5と同様に培養した。組み換え酵素は以下に示す3種の方法のうちの1種を用いて大腸菌から単離した。
1.全分解物
この場合、全細胞培養物（細胞＋増殖培地）を収穫した。細胞を超音波で破壊し、65℃で10分間加熱した。この分解物を遠心で清澄化した。
2.細胞ペレット
細胞を遠心で培地から分離した。細胞ペレットを50mM  トリス-HCl(pH7.0）で10ml／g湿重量となるように懸濁した。この細胞懸濁液を超音波で処理し、「全分解物」で述べたように加熱した。
3.培養上清
遠心で培養培地を全細胞から分離した。清澄化した培地を限外濾過して（タンジェンシャル・フロー、10,000MWCOメンブレン）全容積を減少させ、かつ、50mMトリス-HCl(pH7.0）で置換した。
漂白実験の結果を表７に示す。
0003865769.tif 000011
実施例12
寄託株の同定
これらの株のほとんどはニールセン(Nielsen）等（1994、FEMS Microbiol.Lett.117,61-65)によって報告されている16SリボゾームDNA配列の比例を用いた同定を行うためにデスチェ・サムルング・ホン・ミクロオーガニズメン・ウンド・ゼルクルツレンGmbH（DSM）に送られた。この同定の結果を表8に示した。この配列比較に基づき8種の株はバチルス属と指定され、また、これまで知られているバチルス属のうちB.アルカロフィラス(alcalophilus)(DSM 485T）と最も関連が深い。
さらに、配列比較はこれらの8種の株が２つのグループに分類されることを示した。最初のグループはDSM 8721に非常に似ているか、または殆ど同一であり、株1-16-2、1-25-2および1-43-2（各々CBS 670.93、671.93、672.93）を含んでいる。第２のグループはDSM 8718と非常に関連が深く、株2-47-1、2-M-1、1-47-3および2-26-2（各々CBS 666.93、667.93、669.93および673.93）を含んでいる。
本発明のキシラナーゼは第１グループの株、すなわちDSM8721（1-16-2、1-25-2および1-43-3を含む）に関連する株から得られる。従って、本発明のキシラナーゼは16SリボゾームDNA配列がDSM 8721と少なくとも92%、望ましくは少なくとも93.3%、より望ましくは少なくとも96.6%、さらに望ましくは少なくとも99%、最も望ましくは100%のホモロジーを有するバチルス株から得られる。
0003865769.tif 000012
配列リスト
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）氏名：（ギストブロケーズ）Ｂ．Ｖ．
（Ｂ）町名：ウォータリンクセウェブ１
（Ｃ）市：デルフト
（Ｅ）国：オランダ
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：２６１１  ＸＴ
（ii）発明の名称：アルカリ耐性キシラナーゼ
（iii）配列数：２０
（ｉｖ）コンピュータ仕様：
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチ
（Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.0、バージョン＃1.25（ＥＰＯ）
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１１９１塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４７−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６９．９３
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）場所：１．．１１９１
（Ｄ）その他の情報：／生産物＝“キシラナーゼ”
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003865769.tif 000013
0003865769.tif 000014
0003865769.tif 000015
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９６アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（iii）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003865769.tif 000016
0003865769.tif 000017
0003865769.tif 000018
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＦＡ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003865769.tif 000019
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＦＢ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003865769.tif 000020
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＦＲ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003865769.tif 000021
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＧＡＦ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003865769.tif 000022
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＧＡＲ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003865769.tif 000023
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離：ＧＢＦ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0003865769.tif 000024
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＧＢＲ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003865769.tif 000025
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ｃ）単離物：ＧＣＲ
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003865769.tif 000026
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４３−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003865769.tif 000027
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４３−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６９．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0003865769.tif 000028
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：２−２６−２
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７３．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0003865769.tif 000029
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：２−ｍ−１
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６６７．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0003865769.tif 000030
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−２５−２
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７１．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0003865769.tif 000031
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４３−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：
0003865769.tif 000032
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４３−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0003865769.tif 000033
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７４４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ・センス：なし
（vi）起源：
（Ｂ）株：１−４３−３
（Ｃ）単離物：ＣＢＳ６７２．９３
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）場所：１．．７４４
（Ｄ）その他の情報：／生産物＝“キシラナーゼ”
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0003865769.tif 000034
0003865769.tif 000035
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４７アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９：
0003865769.tif 000036
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５２１塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：二本鎖
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（Ａ）生物名：（バチルス）ｓｐ．
（Ｃ）単離物：ＤＳＭ８７２１
（xi）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０：
0003865769.tif 000037
0003865769.tif 000038