(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主細胞中で発現される成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターであり、該発現ベクターにより発現される該ポリペプチドは配列番号１の１５９アミノ酸配列からなり、そして該ポリペチドは該宿主細胞から細胞外へ分泌されることができ且つ哺乳動物中でＶＺＶ抗体応答をひき起すことができることを特徴とする上記組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主細胞がミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター腎臓細胞、ヒト線維芽細胞又はヒト組織細胞である請求項１記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
発現ベクターによって切断型VZVｇｐＩを産生し且つ分泌する、請求項１記載の組換えDNA発現ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドであり、該プラスミドにより発現される該ポリペプチドは配列番号１の１５９アミノ酸配列からなり、そして該ポリペチドは該宿主細胞から細胞外へ分泌されることができ且つ哺乳動物中でＶＺＶ抗体応答をひき起すことができることを特徴とする上記プラスミド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドであり且つ哺乳動物中でＶＺＶ抗体応答をひき起すことができる、分泌切断型バリセラ・ゾースターウイルス糖蛋白質を製造する方法であり、
ａ）該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供し、該ヌクレオチド配列は該発現ベクターを含有する宿主細胞によって発現されることができるものであり、
ｂ）該ベクターを宿主細胞中にとり入れ、次いで
ｃ）該ベクターを含有する宿主細胞をヌクレオチド配列が糖蛋白質に発現されるために適した条件下に維持する、各工程からなることを特徴とする上記方法。
【請求項６】
発現ベクターがヌクレオチド配列と操作可能に連結されたプロモターを含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が哺乳動物細胞であり、そしてヌクレオチド配列がさらにリーダー配列をコードするヌクレオチド領域を含む請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞がミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター腎臓細胞、ヒト線維芽細胞又はヒト組織細胞である請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
発現ベクターがプラスミドである請求項５〜８のいずれか１項記載の方法
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドである組換え分泌切断型ＶＺＶｇｐＩであり、該ポリペプチドは該ポリペプチドが産生される哺乳動物細胞から細胞外へ分泌され、そして該ポリペプチドは動物宿主中で抗体反応をもたらすことができる少なくとも１の抗原性エピトープを含む、上記組換え分泌切断型ＶＺＶｇｐＩ。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドである組換え分泌切断型ＶＺＶｇｐＩの有効量及び通常のワクチン担体を含むことを特徴とする水痘及び／又は帯状ヘルペスに対する免疫感作用ワクチン。
【請求項１２】
水痘及び／又は帯状ヘルペスに対する免疫応答を刺激するためのワクチンを製造するために使用する、請求項１に記載のポリペプチドである分泌切断型ＶＺＶｇｐ。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列からなる分泌切断型ＶＺＶｇｐ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、哺乳動物細胞中でバリセラ・ゾースター（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス（ＶＺＶ）の分泌切断型（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）糖蛋白質（Ｔｇｐ）を発現できる組換えプラスミドの構築に関する。本発明の分泌Ｔｇｐは抗体反応を誘発できる少なくとも一つのエピトープを含む。本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対するワクチンにおけるこの分泌Ｔｇｐの産生及び利用を包含する。本発明はまたＶＺＶの検出用の診断アッセイでの分泌Ｔｇｐの使用に関する。本発明はまた分泌Ｔｇｐに特異的な第一の抗体、及び第一の抗体に特異的な第二の抗体に関する。これらの第二の抗体はまたＶＺＶに関する診断アッセイに有用である。
背景技術
バリセラ・ゾースターウィルスは、二つのはっきりした臨床上の症状の発現である小児水痘（バリセラ）及び帯状ヘルペス（ゾースター）の原因物質である。バリセラは、ＶＺＶの感染の結果であり、一方ゾースターは、癌及びＡＩＤＳの患者を含む高齢者及び免疫抑制者に主として起こるＶＺＶ再活性化の結果である。米国において年間２５０万の推定の水痘患者及び１２０万の帯状ヘルペスの患者がいる。帯状ヘルペスの患者の数は、人口が高齢化するにつれ増加することが予想される。帯状ヘルペスの最も普通の合併症の一つは、皮膚の発疹の開始後４週から数年にわたって続く相互に影響しあう痛みを特徴とするヘルペス後神経痛を含む。ＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）の他の合併症は、脳炎、肺炎及び播種性ゾースターを含む。
ＶＺＶは、アルファヘルペスウィルス群の一つである。ＶＺＶは、約１２５０００塩基対の線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含み、長ユニーク（Ｕｌ）−逆方向短反復（ＩＲｓ）−短ユニーク（Ｕｓ）−末端短反復（ＴＲｓ）の塩基配列よりなる。ＶＺＶのＤＮＡは、ｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV及びｇｐＶと名付けられた５種の糖蛋白質をコードし、その内ｇｐＩ−ｇｐIVは、感染細胞及びＶＺビールス粒子中で容易に検出される（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、１７５９−１８１６、１９８６、Ｄａｖｉｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７、１１９５−１１９７、１９８６）。これらの糖蛋白質は、高い免疫原性をもち、感染したヒトの中和抗体及び細胞媒介性免疫反応の両者を導きだす（Ｄａｖｉｓｏｎら、同上、１９８６）。
ビールス粒子の外被糖蛋白質の中でも最も多くしかも免疫原性であるＶＺＶのｇｐＩは、補体依存性中和抗体の形成を引き出しそしてまた抗体依存性細胞の細胞障害を媒介する。ｇｐＩをコードする遺伝子は、ＶＺＶゲノムのユニーク短（Ｕｓ）領域に位置する。ＶＺＶ糖蛋白質上の主な抗体結合部位（エピトープ）の一つは、ＶＺＶのｇｐＩで同定されている（Ｖａｆａｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２５４４（１９８８））。このエピトープ（ｅｌと名付けられる）を含む合成ペプチド（１４個のアミノ酸残基）は、高マンノース中間体（８２ｋＤａ）により認識されたが、ＶＺＶｇｐＩの成熟形（９５ｋＤａ）により認識されなかった抗体応答を誘発した（Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１３、３１９−３３６（１９８９）。抗ペプチド抗体のＶＺＶ中和活性の欠如とともにこれらの結果は、ｅｌエピトープのＯ−結合及び／又はＮ結合グリコシル化の状態及び程度がｇｐＩの立体配座に影響するか、又は抗ペプチド抗体により認識される抗原性決定因子に影響する立体障害を生ずることを示唆した。
弱毒化されたバリセラ・ゾースターウィルスワクチンは、幼児に従来行われている予防接種用とともに、白血病の小児における水痘の感染に対して日本では使用されている。このワクチンは、最近米国において白血病の小児にテストされており、そして健康な小児に使用し、さらに高齢者のＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）の予防に使用されることが期待されている。弱毒化したバリセラワクチンは、ＶＺＶ感染に対して免疫を誘発するのに安全且つ有効であることが示されているが、天然の感染と同様に、弱毒化したバリセラワクチンは、ヒトの後根神経節に潜伏し、そして再活性化して、ヘルペス後の神経痛及び脳炎のその付随する神経性合併症とともに、帯状ヘルペスを生ずる。
そのため、潜伏を避けそして排除するサブユニットワクチンは、ＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）によりかかりやすい高齢者の免疫応答を上昇させるためにだけでなく、小児の免疫化にも望ましい。本発明により意図されるこのサブユニットワクチンは、１種以上のＶＺＶ糖蛋白質を発現する組換えウィルス（例えばワクチニアウィルス）の構築により産生され、そして本発明により特に意図されるように、多量に産生され且つ精製され、そしてＶＺＶ感染に対する免疫化及び／又は免疫応答を高めるために使用される分泌性の高免疫原性ＶＺＶ糖蛋白質より構成される。さらに、これら高純度のＶＺＶ糖蛋白質は、ワクチンを接種されたヒト及び高齢者のみならず、免疫抑制のヒト（白血病の小児、ＡＩＤＳ及び癌の患者）のＶＺＶ感染に対する免疫状態の評価のための診断手段として使用できる。
ＶＺＶｇｐＩの遺伝子は、既に単離され、プラスミドに挿入されそしてワクチニアウィルス発現系に組込まれている。ｇｐＩ蛋白質はワクチニア発現系により産生されていたが、産生物は、細胞内に残り、そのため生体内で抗原応答を導き出すのに適していなかった。
発明の開示
本発明の新規性は、哺乳動物細胞から分泌される切断型のＶＺＶｇｐを産生する発現ベクターの構築にある。
１種以上の高免疫原性ウィルス性エピトープを含む分泌切断型ＶＺＶ糖蛋白質を発現する本発明の組換えワクチニアウィルスの適用は、（１）ＶＺＶ感染に対するサブユニットワクチンのような組換えウィルスを使用すること、ここでワクチン接種後のＶＺＶ糖蛋白質の分泌は、ＶＺＶ感染に対してのみならずＶＺＶ糖蛋白質に対してより強力な免疫応答を与える、（２）免疫不全者のみならず健康な小児の一次的ＶＺＶ感染（水痘）に対して、そして高齢者のＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）に対する免疫性を高めるためにサブユニットワクチンとして、１種以上のエピトープを含む高純度の免疫原分泌ＶＺＶ糖蛋白質を多量に使用すること、そして（３）ＶＺＶ糖蛋白質に対する抗体状態の検出及び評価のための特異性の高いターゲット抗原としての診断キットにおいて、分泌切断型ＶＺＶ糖蛋白質の精製された調剤を使用すること、を包含する。ＶＺＶ再活性化は、癌及びＡＩＤＳの患者に普通に見られるので、これらの患者におけるＶＺＶ感染の血清上の診断も必要になる。さらに、高齢者の人工増加によりＶＺＶ再活性化が臨床上の徴候の開始前に痛みを生じ、そして又脳炎、肺炎及び播種性ゾースターをもたらすので、これらの患者の早期治療の唯一つの望みは、診断の迅速な手段に在る。本発明の組換的に産生した分泌ＶＺＶ糖蛋白質の診断キットへの適用は、ＶＺＶ感染の診断の迅速な且つ安価な手段を提供する。
本発明は、分泌切断型ＶＺＶｇｐ用の発現ベクター及びＶＺＶ蛋白質の細胞外分泌を行う該ベクターの構築に関する。
さらに詳細には、本発明は、感染させた、トランスフェクションさせた又は形質転換させた宿主から細胞外に分泌され、哺乳動物にＶＺＶ抗体応答を生じさせるバリセラ・ゾースターウィルス（ＶＺＶ）の切断型糖蛋白質（ｇｐ）を、該宿主中に発現できるヌクレオチド塩基配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。
本発明の他の態様は、哺乳動物細胞中での分泌切断型ＶＺＶｇｐＩ、II、III、IV又はＶの組換体の産生を含む。
本発明のさらに他の態様は、分泌切断型バリセラ・ゾースターウィルスｇｐを産生する方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、分泌切断型バリセラ・ゾースターウィルス糖蛋白質を産生する方法に関し、該方法は、
ａ）該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、ここで該ヌクレオチド配列は、ベクターを含む宿主により発現でき、そして該ヌクレオチド配列は、欠失した糖蛋白質のＣ−末端領域をコードする領域の実質部分を有するバリセラ・ゾースターウィルス糖蛋白質を連続的ヌクレオチド配列によりコードできる核酸の群から選ばれ、それにより該ｇｐは該宿主から細胞外に分泌され、そして該ｇｐは哺乳動物にＶＺＶ抗体応答を生ずることができる、
ｂ）該宿主中に該ベクターを組み入れ、
ｃ）該ヌクレオチド配列の該糖蛋白質への発現に好適な条件下に該ベクターを含有する宿主を維持する各工程
よりなる。
本発明の他の態様は、分泌切断型ＶＺＶｇｐに関する。
本発明のさらに他の態様は、ＶＺＶの診断アッセイに分泌切断型ＶＺＶｇｐを用いることに関する。
本発明の他の態様は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対するワクチンを産生するために分泌切断型ＶＺＶｇｐを使用することにある。
本発明の別の他の態様は、ＶＺＶ抗体の診断及びモニターのためのキットを包含する。
さらに詳しくは、本発明は、分泌切断型ＶＺＶｇｐ抗体の検出のためのコンパートメント化キットを包含し、それは、該ＶＺＶｇｐ抗体に対して特異性を有する抗体を得るように適合された少なくとも１個の第一の容器、並びに前記の第一の容器の抗体を検出可能なリポーター分子を含むように適合された少なくとも１個の第二の容器よりなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｅｌエピトープを有する切断型ＶＺＶｇｐ遺伝子を含む組換えプラスミドの構築の概略図である。ｐＧＥＭ−４転写ベクターにクローンしたＶＺＶｇｐＩ遺伝子（Ｖａｆａｉ他、同上、１９８８）は、ｅｌエピトープから下流でＢｇｌII（Ｂ）制限酵素により、そしてｐＧＥＭポリリンカーにおいてＥｃｏＲＩ（Ｅ）により開裂された。切断型ｇｐＩ遺伝子は、実施例で詳述したように、電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）され、平滑末端され、そしてワクチニアウィルス挿入ベクターｐＳＣｌｌのＳｍａＩ（Ｓ）でクローン化された。
図２は、組換えワクチニアウィルスによる切断型ＶＺＶｇｐＩの発現を示す。ＢＳＣ−１細胞は、図２において記載された切断型ＶＺＶｇｐＩを有し且つｅｌエピトープを含む組換えワクチニアウィルス（ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIと名付けられる）により感染された。２２時間後、感染された細胞は、１時間［３５Ｓ］メチオニンによりラベルされ、そして細胞ライゼートが実施例で記載されたように生成された。細胞ライゼートは、以下のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）及びヒト血清により免疫沈降され、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析された。ｅｌエピトープに向けられたＭＡｂ７９．７；ＶＺＶ血清陽性ヒトからのヒト血清（Ｈ−ｓｅｒｕｍ）；ＶＺＶｇｐＩに向けられ且つｅｌ以外の１種以上のエピトープを認識するＭＡｂＣ１；ＶＺＶｇｐＩに向けられ且つｅｌエピトープのグリコシル化型のみを認識するＭＡｂＧ７；ＶＺＶｇｐIVに向けられたＭＡｂＧ６；ＶＺＶｇｐIIに向けられたＭＡｂＦ８；及びＶＺＶｇｐIIIに向けられたＭＡｂＥ１０。ＴｇｐＩＢｇｌIIのプレカーサー及びグリコシル化型のサイズ（キロダルトン）が左に示される。
図３は、感染細胞からのＴｇｐＩＸｍａIIIの発現及び分泌を示す。左のパネルでは、細胞は、ＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIにより感染され、そして２２時間後、感染細胞は、１時間の間［35Ｓ］メチオニン（２００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルされた。細胞を採集し、細胞ライゼート（ＣＬ）を調整し、ＭＡｂにより免疫沈降させ、そして９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。右のパネルでは、細胞は、上記のように感染され、そしてラベルされた。パルス・ラベル期間後、細胞を５回血清を含まない媒質で洗い、２時間３７°で血清を含まない培地でインキュベートした。組織培養流体（ＴＣＦ）を採集し、ＭＡｂにより免疫沈降させ、そして９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＭＡｂＦ９は、ＶＺＶヌクレオキャプシド蛋白質に向けられる。ＴｇｐＩＸｍａIIIのコア及び処理型のサイズ（キロダルトン）は、左に指示される。
図４は、感染細胞からのＴｇｐＩＢｇｌIIの発現及び分泌を示す。左のパネルにおいて、細胞は、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIにより感染され、そして２２時間後、感染細胞は、１０分間の間［35Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルされた。細胞を採集するか又は血清を含まない媒質で洗い、ラベルを１、２、３及び７時間追跡した。未感染細胞（Ｕｎ）を１０分間パルスラベルし、７時間追跡した。細胞ライゼート（ＣＬ）を調整し、ＶＺＶｇｐＩｅｌエピトープに向けられるＭＡｂ７９．７（ａ）、及びＶＺＶｇｐＩに向けられるがｅｌ以外のエピトープを単に認識するＭＡｂＣ１（ｂ）により免疫沈降させた。右のパネルにおいて、１、２、３及び７時間追跡した未感染（Ｕｎ）及びＶＶＴｇｐＩＢｇｌII感染細胞からの組織培養流体（ＴＣＦ）を、ＭＡｂ７９．７（ａ）及びＭＡｂＣ１（ｂ）により免疫沈降させた。サンプルを、上記のようにＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＴｇｐＩのプレカーサー及びグリコシル化成熟型の見かけのサイズ（キロダルトン）を示す。
図５は、フルサイズＶＺＶｇｐＩ遺伝子を有する組換えワクチニアウィルス（ＶＶｇｐＩと名付けられる）の発現を示す。細胞は、ＶＶｇｐＩにより感染され（Ｃａｂｉｒａｃら、１９８８）、そして２２時間後細胞は図３に記載されたようにパルス追跡され、そして未感染（Ｕｎ）及びＶＶｇｐＩ感染細胞（ＶＶｇｐＩ）からの細胞ライゼート（ＣＬ）及び組織培養流体（ＴＣＦ）を、ＶＺＶｇｐＩｅｌエピトープに向けられるＭＡｂ７９．７により免疫沈降させた。サンプルを実施例に記載したようにＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・産生物のサイズ範囲（Ｖａｆａｉ他、１９８８）は指示される。
図６は、切断型ＶＺＶｇｐＩを有しそしてｅｌエピトープを含む組換えワクチニアウィルス（ＶＶＴｇｐＩ）に対して産生されたウサギ抗体によるＶＺＶ感染細胞の免疫沈降を示す。細胞は、ＶＺＶにより感染され、そして４８時間後、天然のＶＺＶｇｐＩへのＮ−結合オリゴ糖の付加を妨げるツニカマイシン（ＴＭ）（１５μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルされた。細胞は、採集されるか、又は洗浄され、そしてＴＭ（１５μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下２時間追跡された。細胞ライゼートを製造し、ＶＺＶｇｐＩ及びｇｐIVの両者及びウサギ抗ＶＶＴｇｐＩ抗体（ＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩ）を認識するＭＡｂＣ１（ａ）により免疫沈降させた。サンプルを、実施例に記載したようにＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＶＺＶｇｐＩ及びｇｐIVのプレカーサー・生成物の見かけのサイズ（キロダルトン）（Ｖａｆａｉ他、同上、１９８８）は、右に指示される。リゾチーム（１４．３ｋＤａ）、β−ラクトグロブリン（１８．４ｋＤａ）、α−キモトリプシノーゲン（２５．７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３．０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６８．０ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）及びミオシン（２００．０ｋＤａ）を、内サイズマーカーとして使用した。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、哺乳動物の細胞において抗体応答を誘発できる少なくとも１種のエピトープを有する切断型ＶＺＶｇｐ（Ｉ、II、III、IV又はＶ）遺伝子を持つ組換えプラスミドの構築を含む。特に、本発明は、生体内で哺乳動物細胞から宿主生物中に分泌できる、切断型ＶＺＶｇｐを産生できるワクチニアウィルス（種痘ウィルス）発現系に関する。
一つの態様において、本発明は、本明細書に記載されたように、ｅｌエピトープを有する分泌性切断型ＶＺＶｇｐＩ（ＴｇｐＩＢｇｌII又はＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIとして呼ばれる）を有する組換えプラスミドの構築及び哺乳動物細胞におけるワクチニアウィルス発現ベクターによる該蛋白質の産生に関する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されたように、分泌切断型ＶＺＶｇｐＩ（ＴｇｐＩＸｍａIII又はＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIとして呼ばれる）を有する組換えプラスミドの構築及び哺乳動物細胞におけるワクチニアウィルス発現ベクターによる該蛋白質の産生に関する。
他の態様では、本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスの治療のためのワクチン組成物の製造及び使用を含む。
既に使用されているワクチンは、一般に、（Ｉ）ウィルスは無毒にされているが或る形の遺伝的弱毒化により殺されていない、弱毒化された生ウィルス型のワクチン、又は（II）ウィルスから単離され精製され、そしてホルマリン又は或る他の化学的又は物理的処理により不活性化された特異的なウィルス成分よりなる。本発明はタイプIIのワクチンを含み、ここでウィルスから単離され精製され、そしてホルマリン又は他の処理により不活性化された特異的なウィルス成分は分泌切断型のＶＺＶｇｐであると考えられる。明細書及び請求の範囲で他に特定していない限り、ＶＺＶｇｐは、ＶＺＶｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶを意味する。さらに、明細書及び請求の範囲で使用される「切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、ＶＺＶｇｐの中間のサイズのセグメント（フルサイズのＶＺＶｇｐではない）として規定され、この領域のアミノ酸配列Ｃ−末端の実質的な部分（又は全て）が欠失されている。本発明はまたＶＺＶに対するワクチンに使用する組換え分泌性切断型ＶＺＶｇｐの産生を含む。
他の態様では、本発明は、分泌切断型ＶＺＶｇｐを含むタイプIIワクチンに関する。
ワクチンは、感染物質によりひき起こされる将来の害作用に対する免疫学的保護がもたらせられるように生存生物の免疫系を刺激するために使用される物質を意味する。患者（又は動物）に対する本発明によるワクチンの投与は、全ての周知又は標準の技術により行うことができる。これらは、経口の消化、消化器官への挿管又は気管支・鼻へのスプレイを含む。ヒト又は動物の血流に担体ミクローブを到達させる、静脈内注射のような投与の他の方法は、担体ミクローブが再生できないとき、許容できる。
さらに他の態様では、本発明は、ＶＺＶ用の診断アッセイ、そしてさらに、ＶＺＶ感染の種々の臨床上の顕在並びにワクチン接種されたヒトのＶＺＶ抗体の検出用の診断キットに関する。
本発明は、ＶＺＶｇｐ蛋白質を得る初期の試みをさらに進めた方法を提供する。従来では、ＶＺＶｇｐＩに関する周知の遺伝子は、プラスミド中に挿入され、そしてワクチニアウィルス発現系中に組込まれた。しかし、この発現系により産生されるＶＺＶｇｐＩは、細胞内即ち哺乳動物の細胞内に止まり、従って抗原活性（抗体の産生）を行わせることができない。本発明が見出したものは、哺乳動物細胞から分泌される切断型ＶＺＶｇｐ例えばｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶを産生即ち発現できるワクチニアウィルスにおける発現ベクターである。この切断型ｇｐは、侵入宿主中で中和抗体の産生を生ずるエピトープをさらに含む。ＶＺＶｇｐ遺伝子は、図１に示されるように、ｐＧＥＭ転写ベクターでクローン化され、制限酵素例えばＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII制限酵素により開裂され（Ｃ−末端領域の一部又は実質的に全てを除き）、平滑末端化され、そしてワクチニアウィルス挿入ベクターｐＳＣｌｌのＳｍａＩ部位でクローン化される。
好ましい態様では、本発明は、以下のように組換えＤＮＡ発現ベクターの構築を含む。５７５ヌクレオチド（ＶＺＶゲノムのヌクレオチド１１５７１２−１１６２８７にわたる）及びＳｍａＩ部位から上流のｐＧＥＭ−４ポリリンカーから１７ｂｐを含む５９２−ｂｐＤＮＡフラグメントは、ｇｐＩオープンリーディングフレームを含む平滑末端ＶＺＶＢｇｌＩＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１１５７１２−１１８１８１にわたる）を有するｐＧＥＭ組換え体から、それぞれＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIにより開裂される（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、同上、ｐ．１８００−１８０１、１９８６、参考としてここに引用される）。１５９アミノ酸残基を持つｇｐＩのＮ−末端領域及び１７．５ｋＤａの見積もられたサイズをコードする切断型ｇｐＩ（ＴｇｐＩ）ＤＮＡは、平滑末端化され、ｐＳＣｌＩプラスミドベクターのＳｍａＩ部位でクローン化され（図１）、そして実施例に記載されたようにワクチニアゲノム中に挿入される。切断型ｇｐＩ（ＴｇｐＩＢｇｌII）は、ＶＺＶｇｐＩの予言されたアミノ酸配列の残基１０９及び１２３の間の１４アミノ酸残基内に位置するｅｌエピトープを含む（Ｖａｆａｉ他、同上、１９８８、Ｖａｆａｉ他、同上、１９８９）。ＴｇｐＩＢｇｌIIはｇｐＩのＣ−末端領域で４６４アミノ酸残基を欠失し、それは明らかにｇｐＩの膜固定領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。
他の好ましい態様では、本発明は、以下のように組換え発現ベクターの構築に関する。ＳｍａＩ部位から上流のｐＧＥＭ−４ポリリンカーから１７ｂｐ及び１６３０ＶＺＶヌクレオチド（ＶＺＶゲノムのヌクレオチド１１５７１２−１１７３４２にわたる）を含む１６４７−ｂｐＤＮＡフラグメントは、ｇｐＩオープンリーディングフレームを含み、平滑末端ＶＺＶＢｇｌＩＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１１５７１２−１１８１８１に及ぶ）を有するｐＧＥＭ組換え体から、ＥｃｏＲＩ及びＸｍａｌIIによりそれぞれ開裂される（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、同上、ｐ．１８００−１８０１、１９８６）。５１１アミノ酸残基によりｇｐＩのＮ−末端領域をコードする切断型ｇｐＩ（ＴｇｐＩＸｍａｌII）ＤＮＡは、平滑末端化され、ｐＳＣｌＩプラスミドベクターのＳｍａＩ部位でクローン化され、そして実施例に記載されたようにワクチニアウィルスゲノム中に挿入される。ＴｇｐＩＸｍａｌIIは、ｇｐＩのＣ−末端領域で１１２アミノ酸残基を欠き、それは明らかにｇｐＩの膜固定領域を含む。
本発明は、上記のような組換えＤＮＡ発現ベクターに関し、感染され、トランスフェクションされた又は形質転換された宿主中で、該宿主から細胞外に分泌されしかも哺乳動物で抗体応答を生じさせ得るＴｇｐを発現できるヌクレオチド配列、そして好ましくは１５９アミノ酸配列（配列番号１）により規定される成熟ポリペプチド、
0003990445.tif 000002
又は５１１アミノ酸配列（配列番号２）により規定される成熟ポリペプチド、
0003990445.tif 000003
0003990445.tif 000004
を含む組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。本発明により包含される感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主は、哺乳動物の細胞例えばミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター腎臓細胞及びヒト繊維芽細胞である。さらに、全てのヒト組織は、好適な宿主として含まれる。本発明は、上記の感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された細胞が、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターによりＴｇｐ（切断型ＶＺＶ糖蛋白質）そして好ましくは配列番号１により規定されるＴｇｐＩＢｇｌII又はＴｇｐＩＸｍａｌIIを産生せしめそして分泌せしめることを含む。
本発明はまた他の分泌性のＴｇｐＩを含む。他の免疫原性エピトープを含む他のＴｇｐＩは、種々の切断型ｇｐＩ遺伝子をクローン化し発現することにより発生できる。他のｇｐＩは、例えば以下の制限酵素を利用することにより得ることができる。
ａ）ＥｃｏＰＩ及びＥｃｏＲＩ（ＥｃｏＰＩは、ヌクレオチド１１５７５１で開裂し、２７６アミノ酸配列の発生を生ずる）。
ｂ）ＢｓｔＥ２及びＥｃｏＲＩ（ＢｓｔＥ２は、ヌクレオチド１１６７５４で開裂し、３１６アミノ酸配列の発生を生ずる）。
ｃ）Ｎｄｅｌ及びＥｃｏＲＩ（Ｎｄｅｌは、ヌクレオチド１１６８３１で開裂し、３４１アミノ酸配列の発生を生ずる）。
ｄ）ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ（ＥｃｏＲＩは、ヌクレオチド１１７０３４で開裂し、４０８アミノ酸配列の発生を生ずる）。
上記のように本発明に含まれる種々のタイプのＴｇｐＩは、即ち、明らかにコード蛋白質の膜固定領域を排除することにより、ＶＺＶｇｐ（例えばｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶ）の細胞外の発現を妨げるＶＺＶｇｐの領域をコードするヌクレオチド配列のＣ−末端領域のその部分を排除するために特異的に構築される。これらの切断型分泌性蛋白質用の好適な発現ベクターの作製では、（細胞外に分泌される）コード化されたＴｇｐは、宿主に抗体応答を引き出すように、少なくとも一つのエピトープ例えばｅｌを維持することがまた必要である。本発明により当業者は、ワクチン及び検出系として使用される種々の好適な発現ベクターを構築することができ、これらは、全て本発明に含まれる。
従って、本発明は、感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主中で成熟ポリペプチドを発現できるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターであり、該ポリペプチドは配列番号１の１５９アミノ酸配列、配列番号２の５１１アミノ酸配列、バリセラ・ゾースターウイスル（ＶＺＶ）の糖蛋白質Ｉのヌクレオチド１１５７１２〜１１８１８１にわたり且つｇｐＩオープンリーデイングフレームを含有するＤＮＡフラグメントのＥｃｏＰＩ／ＥｃｏＲＩの二重消化によって定義される２７６アミノ酸配列、バリセラ・ゾースターウイスルの糖蛋白質Ｉのヌクレオチド１１５７１２〜１１８１８１にわたり且つｇｐＩオープンリーデイングフレームを含有するＤＮＡフラグメントのＢｓｔＥ２／ＥｃｏＲＩの二重消化によって定義される３１６アミノ酸配列、バリセラ・ゾースターウイスルの糖蛋白質Ｉのヌクレオチド１１５７１２〜１１８１８１にわたり且つｇｐＩオープンリーデイングフレーフを含有するＤＮＡフラグメントのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩの二重消化によって定義される３４１アミノ酸配列、及びバリセラ・ゾースターウイスルの糖蛋白質Ｉのヌクレオチド１１５７１２〜１１８１８１にわたり且つｇｐＩオープンリーデイングフレームを含有するＤＮＡフラグメントのＥｃｏＲＩの単一消化によって定義される４０８アミノ酸配列からなる群から選ばれ、そして該ポリペプチドは該宿主から細胞外へ分泌されることができ且つ哺乳動物中でＶＺＶ抗体応答をひき起こすことができることを特徴とする上記組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。
本発明は、また他の切断型ＶＺＶｇｐ（例えばII、III、IV又はＶ）を得るために、上記の組換えＤＮＡ発現ベクターの修飾を含む。ＶＺＶｇｐIIのＤＮＡ配列は、例えばＤａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、１７５９−１８１６、１９８６のｐ．１７８０−１７８１に開示されている。ＶＺＶｇｐIIIのＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、１９８６のｐ．１７８４に開示されている。ＶＺＶｇｐIVのＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、１９８６のｐ．１８００に開示されている。ＶＺＶｇｐIVのＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、１９８６のｐ．１７６８−１７６９に開示されている。本発明の教示により、当業者は、次に分泌ＴｇｐII、ＴｇｐIII、ＴｇｐIV又はＴｇｐＶを発現できる適切な切断型ＶＺＶｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶ遺伝子を含む発現ベクターを構築できる。
本発明が見出したことは、ｇｐＩについて上記のようなｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶのＣ−末端領域をコードする天然のＶＺＶＤＮＡを欠失し、哺乳動物細胞の外側に分泌できるＴｇｐII、ＴｇｐIII、ＴｇｐIV又はＴｇｐＶの産生をもたらし、そして生体内で抗原活性を生ずる即ち抗体の形成を刺激することに関する。
本発明はまた分泌切断型バリセラ・ゾースターウィルスｇｐを産生する方法を含む。この方法は、以下の方法よりなる。
ａ）該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、ここで該ヌクレオチド配列は、ベクターを含む宿主により発現でき、そして該ヌクレオチド配列は、バリセラ・ゾースターウィルスｇｐを連続ヌクレオチド配列によりコードできる核酸の群から選ばれ、ｇｐのＣ−末端領域をコードするＶＺＶｇｐゲノムの実質部分は欠失され、そして該ｇｐは該宿主から細胞外に分泌され、そして哺乳動物の宿主に抗体応答を行う少なくとも１種のエピトープ、さらに例えば配列番号１の１５９アミノ酸配列により規定されるオープンリーディングフレームのポリペプチド又は配列番号２の１５９アミノ酸配列により規定されるオープンリーディングフレームのポリペプチドを含み、
ｂ）宿主中にベクターを組み入れ、
ｃ）該ヌクレオチド配列の該ポリペプチドへの発現に好適な条件下でベクターを含む宿主を維持する。この方法は、該ヌクレオチド配列に操作上伴うプロモーターを含むことができる。この方法は、リーダー配列をコードできるヌクレオチドの領域を含む該ヌクレオチド配列をさらに含む。
Ｔｇｐ（ＶＶＴｇｐ）を有する組換えワクチニアウィルスの発現は、Ｔｇｐ、例えばＶＶＴｇｐＩ、による例えばＢＳＣ−１細胞の感染によって、そしてＶＺＶｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV及びｇｐＶ及びＶＺＶ血清陽性ヒト血清に対して産生されたＭＡｂのパネル又は当業者に周知の他の従来からの方法による細胞ライゼートの免疫沈降によって分析できる。
該Ｔｇｐが感染細胞から分泌されるという事実に関して、細胞はＴｇｐ例えばＶＶＴｇｐＩにより感染され、そして放射性ラベルができる。
Ｔｇｐ例えばＶＶＴｇｐＩに対する抗体は、例えばウサギで発生させることができる（例えば実施例に記載されたようなＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩ）。これらの抗体は、Ｔｇｐ例えばＶＶＴｇｐＩがＶＺＶｇｐにより認識される抗体応答を誘発できるかどうかを決めるためにテストできる。哺乳動物の細胞例えばＢＳＣ−１細胞は、ＶＺＶにより感染され、ツニカマイシンの存在又は不存在下放射性ラベルができる（Ｖａｆａｉ他、１９８９）。本発明のＴｇｐは、天然のエピトープ（例えば配列番号１により規定されたＴｇｐＩに見出されるようなｅｌ）により認識され抗体応答を誘発でき、さらに補体の存在下でＶＺＶ感染性を中和できる。
本発明のワクチンは、非経口（例えば筋肉内、皮下又は静脈内注射により）で投与される。必要な量は、遺伝子生成物の抗原性により変化し、存在するワクチンの代表的な免疫応答を誘発するのに十分な量のみを要する。日常的な実験により必要量は容易に決められる。ワクチンの典型的な最期の投与量は、約０．００１−１００ｍｇ抗原／ｋｇ体重であり、所望のレベルの保護をもたらすのに必要なときには使用される増加量又は複数回投与を伴う。
ワクチンが懸濁又は溶解される製薬上の担体は、接種動物に対して無毒でありそして担体生物又は抗原遺伝子生成物と両立できる全ての溶媒又は固体でよい。好適な製薬上の担体は、液体担体例えば通常の塩水及び生理学的な濃度又はその付近の他の無毒な塩、並びに固体担体例えばタルク又は砂糖を含む。助剤例えばフロイント助剤（完全又は不完全）は、気管支管を経て抗原性を増加するために加えられ、ワクチンは好適にエロゾルの形で存在する。追加免疫が、複数回繰返されて有利な結果を得る。
本発明はまた哺乳動物の宿主において水痘及び帯状ヘルペスに対する免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、該Ｔｇｐに対する抗体の産生を生じさせるのに十分な条件下で、有効量の分泌ＶＺＶＴｇｐ（例えばＴｇｐＩ、ＴｇｐII、ＴｇｐIII、ＴｇｐIV又はＴｇｐＶ）を投与することよりなり、それは当業者により十分に認識されている。投与の有効量は体重１ｋｇ当り０．００１−１００ｍｇの分泌ＶＺＶＴｇｐである。
本発明はまた水痘及び／又は帯状ヘルペスの治療上のコントロールに有用であるモノクローナル又はポリクローナルの抗体を包含する。該抗体は、上記のようにして作製され、哺乳動物例えばヒト、ウマ、ウサギ、ヒツジ、マウスなどに不活性化Ｔｇｐ又はその誘導体を注射し、次に以下に詳述される検出系を用いて該抗体を精製することにより製造される。
他の態様では、本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対する受動免疫化の投与用のヒト・マウスキメラポリクローナル又はモノクローナル抗体のみならず、分泌ＶＺＶＴｇｐ（Ｉ、II、III、IV又はＶ）に対する特異的なヒト又は他の（例えばアフリカミドリモンキー腎臓細胞、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞又はチャイニーズ・ハムスター細胞）ポリクローナル又はモノクローナル抗体の開発に関する。免疫感作とは生物があらかじめ曝された抗原に対する、生物即ちヒトの持続する高い抗体レベルを誘発する方法を意味する。
ここで規定される受動免疫とは、生体内又は生体外の源から患者に予め形成された抗体を与えることに基づく、抵抗性（例えば感染に対する一時的又は持続された保護）を意味する。受動免疫の主な利点は、本発明の上記の態様に記載されたようなＶＺＶに対する多量の抗体の早い利用能である。
ここで規定されるキメラ抗体は、二つの異なる種の免疫グロブリン遺伝子を含む組換えＤＮＡ技術により作製される抗体分子である。ヒト・マウスキメラ抗体は、組換えＤＮＡ技術により、マウス免疫グロブリン遺伝子のＦａｂ部分とヒト免疫グロブリン遺伝子のＦｃ部分とを組合せることにより作製される。ヒト・マウスキメラ抗体の作製は、多量の抗体がこの系で製造でき、そしてヒト・マウスキメラ抗体は、ヒト免疫系の細胞により認識でき、一方非キメラ抗体は、ヒト免疫系の細胞（例えば食細胞）により容易に認識されないために、有利である。キメラ抗体は、マウス系で多量に作製でき、そして本発明に含まれるＶＺＶを認識できる。ヒト・マウス免疫グロブリンは、又イースト中で多量の抗体が作られることが見出され、そしてこの系も又本発明に含まれる。以下の文献は、これら抗体を作製する方法を論じており、ここに引用される。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８１、６８５１（１９８４）、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ他、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８５、８６７８（１９８８）及びＴａｏ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３、２５９５（１９８９）。
本発明は、さらにＶＺＶに対する検出アッセイ（免疫アッセイ）における上記の抗体の使用を含む。
広い範囲の免疫アッセイ技術が、例えば米国特許第４０１６０４３、４４２４２７９及び４０１８６５３号明細書及びＨａｒｌｏｗ他、同上に示されたように、本発明に使用できる。これは、もちろん、従来の競合的結合アッセイのみならず非競合的タイプの単一点結合、及び二点結合、即ち「サンドウィッチ」、アッセイの両方を含む。サンドウィッチアッセイは、最も有用なしかも普通に使用されるアッセイであり、本発明に使用して好ましい。サンドウィッチアッセイ技術の多数の変法が存在し、そして全ては本発明に含まれる。
典型的な新しいアッセイでは、ラベルされていない抗体を固体物質に固定化し、そしてテストされるべきサンプルを結合した分子と接触させる。抗体・抗原の二元複合体の形成を行うに十分な時間のインキュベーションの好適な期間後、検出可能な信号を発生できるレポート分子をラベルした第二の抗体を次に加え、抗体・ラベルした抗体の三元の複合体の形成に十分な時間インキュベートする。全ての未反応物質を洗い流し、そして抗原の存在は、リポート分子により生成する肉眼で認め得る信号の観察により決められる。結果は、肉眼で認め得る信号の簡単な観察により定性的であるか、又は既知の量のハプテンを含むコントロールサンプルと比較することにより定量的である。
新しいアッセイの変法は、サンプル及びラベルした抗体の両者が結合した抗体に同時に加えられる同時アッセイ、又はラベルされた抗体及びテストされるべきサンプルが先ず混合され、インキュベートされ、次にラベルされていない表面に結合した抗体に加えられる逆アッセイを含む。これらの技術は、当業者に周知であり、そして小さい変化の可能性は、当業者にとり容易に明らかであろう。
ここで使用されるとき、「サンドウィッチアッセイ」は、基本的な二点結合技術に関する全ての変法を含む。例えば、これらの抗体は、分泌Ｔｇｐ例えばＴｇｐＩ、ＴｇｐII、ＴｇｐIII、ＴｇｐIV、ＴｇｐＶ又はさらに詳しくは固定化免疫吸着物としての特異的な抗原決定因子（例えばｅｌエピトープ）の使用により配列番号１により規定されるような分泌ｇｐＩを検出するために使用できる。血清は、テストされるべき対象物から得られ、該血清は、固定化されたウィルス性の免疫吸着物に接触する。もし該血清が該免疫吸着物に対する抗体を含むならば、抗体・吸着物コンジュゲートが生ずるだろう。過剰の血清及び非結合抗体を除いた後、第一の抗体に特異的な第二の抗体（前記の第一の抗体は、該免疫吸着物とコンジュゲートを形成できる）は、加えられて二重抗体・吸着物コンジュゲートを生ずる。この二重抗体・吸着物コンジュゲートは、テスト血清が免疫吸着物に対する抗体を含む場合に、生ずる。従って、標準の検出技術をコンジュゲートを同定するのに使用できる。
他の免疫アッセイである競合的結合アッセイでは、問題の分子（抗原又はハプテンの何れか）に特異的な抗体の制限された量は、未知の量の検出されるべき分子の溶液及び検出されるべき分子又はその類似物を検出するようにラベルした既知の量含む溶液の特定の容量と組み合わされる。ラベルされた及びラベルされていない分子は、次いで抗体の利用可能な結合部位に関して競合する。遊離及び抗体結合分子の相分離は、各相に存在するラベルの量の測定を可能にし、それによりテストされるサンプル中の抗原又はハプテンの量を示す。この一般的な競合的結合アッセイの多数の変法が現在存在する。
全ての既知の免疫アッセイにおいて、実施目的のために、抗原に対する抗体の一つ（分泌切断型ＶＺＶｇｐ）は、固相に典型的に結合し、そしてサンドウィッチアッセイにおける第二の抗体又は競合的アッセイにおける既知の量の抗原の何れかの第二の分子は、抗体・抗原反応の肉眼による検出を行うために、検出可能なラベル又はレポーター分子を有する。二つの抗体が、サンドウィッチアッセイにおける如く、用いられるときは、抗体の一つが、例えば分泌切断型ＶＺＶｇｐＩ、II、III、IV、又はＶに特異的であることのみが必要である。以下の記述は、代表的な新しいサンドウィッチアッセイに関するものであるが、一般的な技術が目的とする免疫アッセイのいずれにも適用できるものとして理解されるべきである。
代表的な新しいサンドウィッチアッセイでは、例えば分泌ＴｇｐＩ、II、III、IV又はＶに対して特異性を有する第一の抗体又は配列番号１により規定されている成熟ホリペプチド又はその抗原性フラグメントは、固体の表面に共有的に又は受動的に結合される。固体の表面は、典型的にはガラス又は重合体であり、最も普通に使用される重合体は、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固体の支持体は、管、ビーズ、ディスク又はミクロプレート、又は免疫アッセイを行うのに好適な任意の他の表面の型であってよい。結合方法は、当業者に周知であり、一般に不溶性の担体に分子を橋かけ結合、共有結合又は物理的に吸着することによりなる。結合後、重合体・抗体複合体は、テストサンプルの調整中に洗浄される。テストサンプルの一部分は、次に固相複合体に加えられ、そして抗体中に存在する全てのサブユニットの結合を可能にするに十分な時間２５℃でインキュベートされる。インキュベーション時間は変化するが、一般に約２−４０分の範囲である。インキュベーション時間経過後、抗体サブユニット固相は洗浄され、乾燥され、そしてハプテンの部分に特異的な第二の抗体とインキュベートされる。第二の抗体は、ハプテンに対する第二の抗体の結合を示すために使用されるレポーター分子に結合される。
本明細書及び請求の範囲で使用されるとき、「レポーター分子」は、その化学的性質により、抗原に結合した抗体の検出を可能にする分析上同定可能な信号を与える分子を意味する。検出は、定性的又は定量的の何れかである。このタイプのアッセイで最も普通に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォアー又は放射性ヌクレオチド分子の何れかである。
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の場合、酵素は、一般にグルタールアルデヒド又は過沃素酸塩により、第二の抗体にコンジュゲートされる。しかし、周知のように、広範囲の異なるコンジュゲーション技術が存在し、それは当業者に容易に利用できる。普通に使用される酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスフェート等を含む。特定の酵素とともに使用される基質は、対応する酵素の加水分解により検出可能な色の変化を生ずるように選ばれる。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートがアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとともに使用するのに好適であり、そしてペルオキシダーゼコンジュゲートには、１，２−フェニレンジアミン、５−アミノサルチル酸又はトリジンが通常使用される。蛍光発生基質を使用することも可能であり、それは前記の色発生基質よりむしろ蛍光発生生成物を与える。
酵素をラベルした抗体は、第一の抗体ハプテン複合体に加えられ、結合され、そして過剰の試薬が洗い流される。適切な基質を含む溶液を次に抗体・抗原・抗体の三成分複合体に加える。基質は、第二の抗体に結合した酵素と反応して定性的な可視の信号を生じ、それはさらに通常分光測光的に定量化されて、サンプルに存在してハプテンの量を指示する。
一方、蛍光化合物例えばフロオレセイン及びローダミンは、それらの結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップリングできる。特別の波長の光による照明により活性化されるとき、フルオロクロムをラベルした抗体は、光エネルギーを吸収し、分子中に励起性の状態を誘発し、次に光学顕微鏡により肉眼で検出可能な特徴的な色で光を発する。ＥＩＡにおけるように、蛍光ラベル抗体は、第一の抗体・ハプテン複合体に結合せしめられる。未結合試薬を洗い流した後、残りの成分複合体を次に適切な波長の光に曝し、観察された蛍光は、問題のハプテンの存在を示す。免疫蛍光及びＥＩＡ技術は、ともに極めてうまく確立されたものであり、特に本発明の方法に好ましい。しかし、他のレポーター分子例えばラジオアイソトープ、生物発光分子の化学発光もまた使用できる。必要な目的に適合するように方法をいかに変えるかは、当業者にとり容易に明らかであろう。前記の方法が、直接的に又は間接的に（即ち抗体を経て）ＶＺＶを検出するのに使用できることは、また明らかであろう。
本発明は、またテストされるべき個体の血清、組織又は組織抽出物を、分泌切断型ＶＺＶｇｐ（例えばｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIV又はｇｐＶ）に対する抗体又はその活性フラグメントと、抗体・抗原複合体を形成するのに必要な時間及び条件下接触させ、次に任意の得られた抗体・抗原複合体を検出することよりなる、ＶＺＶを診断する方法を含む。これらの条件は、当業者により十分に認識されている。
他の態様において、本発明は、また分泌性のＴｇｐ（例えばＴｇｐＩ、ＴｇｐII、ＴｇｐIII、ＴｇｐIV、ＴｇｐＶ、Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１により定義されるようなＴｇｐＩＢｇｌII又はＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．２により定義されるようなＴｇｐＩＸｍａｌII）及びその抗原性フラグメント（一つ以上のエピトープ）への応答を生成する抗体の検出のためのキットに関し、該キットは、Ｔｇｐ又はそのフラグメントクに対する該抗体に対し特異性を有する抗体を含むように適合された第一の容器、並びに第一の抗体に対し特異的でありしかも検出可能な信号を与えることができるレポーター分子をラベルした抗体を含む第二の容器を受容するようにコンパートメントになっている。もしレポーター分子が酵素であるならば、該酵素に対する基質を含む第三の容器が設けられる。
本発明の診断キットは、ＶＺＶ糖蛋白質の抗体の状態を検出するのに使用できる。このキットは、ワクチン接種の個体とともにＶＺＶの種々の臨床上の症状を示す個体のＶＺＶの診断及び検出の迅速な方法をもたらす。
実施例
１）材料及び方法
ゾースター感染患者由来のバリセラ・ゾースターウィルス（ＶＺＶ）株ＶＺＶ８６を、Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１３、３１９−３３６（１９８９）に記載された共培養法によりアフリカンミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）中で成長させ、増殖させた。ワクチニアウィルス（菌株ＩＨＤＪ）を、Ｃａｂｉｒａｃ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０、２０５−２１４（１９８８）に記載されているように０．０１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＢＳＣ−１細胞中で成長させた。
２）モノクローナル及びポリクローナル抗体の産生
ＶＺＶ糖蛋白質Ｉ（ｇｐＩ）及びｇｐIV（ＭＡｂ７９．７、ＭＡｂＣ１、ＭＡｂＧ７、ＭＡｂＧ６）、ｇｐII（ＭＡｂＦ８）及びｇｐIII（ＭＡｂＥ１０）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、Ｖａｆａｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２、９５３−９５９（１９８４）、Ｖａｆａｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２５４４−２５５１（１９８８）、Ｃａｂｉｒａｃ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０、２０５−２１４（１９８８）及びＶａｆａｉ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１３、３１９−３３６（１９８９）に既に記載された方法により産生した。ヒト血清を、皮膚の発疹の開始６週間後ゾースター患者から得た。ＶＺＶウィルス粒子に対する抗体は、Ｖａｆａｉ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．７、３２５−３３３（１９８７）に記載されたようにウサギで産生した。
３）組換えワクチニアウィルスの構築
図１は、切断型ＶＺＶｇｐＩ（ＶＶＴｇｐＩＢｇｌII）を含む組換えワクチニアウィルスを産生するために使用する挿入ベクターの構築を説明する。ＶＺＶｇｐＩ遺伝子（Ｖａｆａｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２５４４−２５５１（１９８８））を含む組換えプラスミド（ｐＧＥＭ−４）は、ＶＺＶヌクレオチド配列１１６２８７でｅｌエピトープから下流でＢｇｌIIにより（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、１７５９−１８１６（１９８６））及びｐＧＥＭポリリンカーのＥｃｏＲＩにより開裂された。１５９アミノ酸のポリペプチドをコードする切断型ｇｐＩ遺伝子は、電気溶出され、（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））に記述されたように、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端され、そして挿入ベクターｐＳＣｌｌのＳｍａＩ部位中にリゲーションされた（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、３４０３−３４０９（１９８５））。組換えプラスミドは、ｐＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIと名付けられた（そして図１に示される）。組換えワクチニアウィルスは、Ｍａｃｋｅｔｔ他、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｗ．Ｇｌｏｖｅｒ編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐ．１９１−２１１（１９８５）（修正あり）により記述された方法により得た。１４３Ｂ  ＴＫ-細胞（Ｍａｃｋｅｔｔ他、１９８５）を、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）の非存在下一晩成長させ、次に０．０１ＰＦＵのｍ．ｏ．ｉ．でワクチニアウィルス（菌株ＩＨＤＪ）により感染させ、そして９０分間３７℃でインキュベートした。感染した細胞を、次に業者の指示により３０μｇのｐＶＶＴｇｐＩ及び５０μｇのリポフェクチン試薬（ＢＲＬ）によりトランスフェクションさせた。細胞を感染・トランスフェクション後４８時間で採集し、得られるウィルスを２５μｇ／ｍＬのＢｕｄＲの存在下ＴＫ-細胞中で２回継代した。組換えワクチニアウィルスを、ｂｌｕｏ−ｇａｌ（ＢＲＬ）により染めることにより、自然発生のＴＫ-ウィルスから区別し、そして３サイクルのプラーク精製によりクローン的に単離した。
より免疫原性の分泌切断型ＶＺＶｇｐＩを産生するために、同じ方法論を使用したが、ＶＺＶｇｐＩ遺伝子を含有する組換えプラスミド（ｐＧＥＭ−４）を、ＶＺＶヌクレオチド配列１１７３４２でＸｍａIIIによりそしてＥｃｏＲｌにより（ＢｇｌII及びＥｃｏＲｌの代わりに）開裂した修正を行った。５１１アミノ酸残基を持つｇｐＩのＮ−末端領域をコードする切断型ｇｐＩ遺伝子を、前記のように、電気溶出し、平滑末端し、そしてｐＳＣII中にリゲーションした。組換えプラスミドをｐＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIと名付けた。組換えワクチニアウィルスを上記のようにして得た。そしてＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIと名付けた。
４）組換えワクチニアウィルスの発現
切断型のＶＺＶｇｐＩ遺伝子を有する組換えワクチニアウィルス（ＶＶＴｇｐＩＢｇｌII及びＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIと名付けられた）の発現は、１．０ＰＦＵのｍ．ｏ．ｉ．でＶＶＴｇｐＩによるＢＳＣ−１細胞の感染により分析された。３７℃で２２時間のインキュベーション後、感染細胞を、１時間メチオニンを含まない培地でメチオニンを欠乏させ、次に１時間［３５Ｓ］メチオニン（１００−２００μＣｉ／ｍＬ）によりラベルした。細胞を次いで冷ホスフェート緩衝塩水で３回洗い、そして４ｍＬの溶解緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、０．１ＭＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ）で崩壊させた。ライゼートを２時間氷上に置き、５℃で２時間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ６０ローターで４００００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を、ＶＺＶ蛋白質に対して産生されたモノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて免疫沈降まで−７０℃で貯蔵した（図２及び３を参照）。
図２に示された結果は、１時間のラベリング期間を通して３２ｋＤａポリペプチドに処理されたＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIによる２５ｋＤａの一次翻訳生成物の発現を証明する。２５ｋＤａ及び３２ｋＤａの両蛋白質は、ｅｌエピトープに対するＭＡｂ７９．７により認識できる（Ｖａｆａｉら、１９８８）。ヒト血清は、２５ｋＤａ種と反応した（図２、ライン２）。そしてゲルのより長い暴露は、ＴｇｐＩの成熟形（３２ｋＤａ）とのヒト血清の弱い反応性を示す。３２ｋＤａ蛋白質はまたＶＺＶｇｐＩの完全なグリコシル化型を認識するＭＡｂＧ７と反応した（図２、ライン４）。しかし、ＶＺＶｇｐＩに向けられるがｅｌ以外の一つ以上のエピトープを単に認識するＭＡｂＣ１は、ＴｇｐＩとは反応しない（図２、ライン３）。ＶＺＶｇｐIV（ＭＡｂＧ６）、ｇｐII（ＭＡｂＦ８）及びｇｐIII（ＭＡｂＥ１０）に対するＭＡｂはまたＴｇｐＩのプレカーサー生成物と反応せず（図２、ライン５、６、７）、ＭＡｂ７９．７に対するＴｇｐＩの特異性を示す。
これらの結果は、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIにより発現されたＴｇｐＩが、ＶＺＶ血清陽性ヒト血清のみならずＭＡｂ７９．７による認識に必要な天然の立体配座を維持していることを示す。２５ｋＤａのＴｇｐＩの一次翻訳生成物は、ＴｇｐＩによりコードされる１５９アミノ酸残基から導き出される予想された１７．５ｋＤａより大きいことが分かった。
図３に示される結果は、１時間のラベリング期間を通して７６ｋＤａポリペプチドに処理されたＶＶＴｇｐＩＸｍａIIIにより６０ｋＤａの一次翻訳生成物の発現を証明する。６０ｋＤａ及び７６ｋＤａの両蛋白質は、ＭＡｂ７９．７及びＭＡｂＣ１（ＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・生成物を認識する）及びＭＡｂＧ７（ＶＺＶｇｐＩの成熟したしかも完全にグリコシル化した型のみを認識する）により認識される（図３、レーン１、２及び３）。ＭＡｂＦ８（ｇｐIIに対する）及びＭＡｂＦ９（ＶＺＶ  ＮＣＰに対する）は、ＴｇｐＩ−ＸｍａIIIのプレカーサー・生成物と反応しなかった（図３、レーン４及び５）。ＴｇｐＩＸｍａIIIとのしかしＴｇｐＩＢｇｌIIとではないＭＡｂＣ１の反応性は、ＴｇｐＩＸｍａIII上の追加の１種以上のエピトープの存在を証拠立てる。
５）分泌されたＶＺＶ切断面ｇｐＩの分析
ＢＳＣ−１細胞を、１．０ＰＦＵのｍ．ｏ．ｉ．でＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIにより感染させ、そして２２時間のインキュベーション後、細胞を、１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルした。細胞を、採集するか又は無血清培地で５回洗い、そしてラベルを１、２、３及び７時間追跡した。未感染細胞を１０分間パルスラベルし、７時間追跡した。細胞ライゼートを上記のように生成し、そしてＶＺＶｇｐＩＢｇｌIIエピトープ（ｅｌ）に対するＭＡｂ７９．７（Ｖａｆａｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２５４４−１５５１（１９８８））、及びＶＺＶｇｐＩＢｇｌIIに対するがｅｌ以外の１種以上のエピトープを認識するＭＡｂＣ１により免疫沈降させた。未感染及びＶＶＴｇｐＩＢｇｌII感染細胞からの組織培養流体を集め、ミクロフュージ中で１０分間遠心分離した。上澄液を集め、各サンプルに等容積の溶解緩衝液の添加後、サンプルを５℃で２時間Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ６０ローターで４００００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液をＭＡｂ７９．７及びＭＡｂＣ１により免疫沈降させた（図４参照）。
図４に示される結果は、１０分間のパルスラベリング時間中感染細胞で検出されるプレカーサーＴｇｐＩＢｇｌII（２５ｋＤａ）が、１時間の追跡時間中に３２ｋＤａの蛋白質に処理され、そして２５ｋＤａ及び３２ｋＤａの両方のバンドの強度が、７時間の追跡時間を通して減少することを示す（図４、ＣＬ）。この結果は、ＴｇｐＩＢｇｌII（３２ｋＤａ）の成熟グリコシル化の型が、１時間の追跡時間内で感染細胞の組織培養流体中に現われ、さらに３２ｋＤａＴｇｐＩＢｇｌIIの強度が、７時間の追跡時間中増大することをまた示す（図４、ＴＣＦ）。これらの結果は、ＴｇｐＩＢｇｌIIの完全な処理型が、感染細胞から放出され、そしてＭＡｂ７９．７により認識されるがｅｌ以外の一つ以上のｇｐＩエピトープに対してのみ向けられるＭＡｂＣ１では認識されないことを示す。さらに、感染組織培養流体から精製された３２ｋＤａＴｇｐＩＢｇｌIIのウエスタン・ブロット分析は、分泌性のＴｇｐＩＢｇｌIIがＭＡｂ７９．７により認識されたことを示す。
これらの実験のコントロールは、未切断型（フル・サイズ）ＶＺＶｇｐＩを有ししかも未切断型ＶＺＶｇｐＩを発現する組換えワクチニアウィルス（ＶＶｇｐＩ）によるＢＳＣ−１細胞の感染により与えられた（Ｃａｂｉｒａｃら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０、２０５−２１４（１９８８））。上記のパルス追跡の実験が行われた。ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIとは対照的に、ＶＶｇｐＩ感染細胞からの組織培養流体及び細胞ライゼートの分析は、天然のＶＺＶｇｐＩが感染細胞から分泌されなかったことを示した（図５）。
ＴｇｐＩ−ＸｍａIIIが細胞から分泌されるかどうかを知るために、感染細胞を、１時間［35Ｓ］メチオニンによりパルスラベルし、無血清培地により洗いそして２時間無血清培地でインキュベートした。組織培養流体（ＴＣＦ）を採集し、上記のようにＭＡｂにより免疫沈降させた。この結果は、成熟及び完全にグリコシル化した型のＴｇｐＩＸｍａIIIが細胞から分泌され、そしてＶＺＶｇｐII及びＶＺＶＮＣＰに向けられる、ＭＡｂＦ８、ＭＡｂＦ９（図１、レーン１０及び１１）によってではなく抗ｇｐＩＭＡｂ（図３、レーン７、８及び９）により認識されたことを示す。
６）抗ＶＶＴｇｐＩ抗体の産生
ＶＶＴｇｐＩに対する抗体は既に記述された方法（Ｖａｆａｉ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．７、３２５−３３３（１９８７）及びＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１３、３１９−３３６（１９８９）により、ウサギ中で生成された。ニュージーランドホワイト雌ウサギを、背中及び後足の多数の部位で皮下免疫した。免疫前の出血（コントロール血清用に）後、この動物に１×１０7ＰＦＵ／ｍＬのＶＶＴｇｐＩを与えた。これは、それぞれ１×１０7ＰＦＵ／ｍＬのＶＶＴｇｐＩよりなる３回の毎週の注射を与えた。
７）ＶＺＶ感染細胞蛋白質の放射性ラベリング
ＶＺＶは、共培養によりＢＳＣ−１細胞中で成長し、４８時間後、感染細胞をツニカマイシン（１５μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３０ｐｃｉ／ｍＬ）によりラベルした。細胞を、採集するか、又は３回無血清培地で洗い、そしてラベルを、ツニカマイシン（１５μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下で２時間標準の培地で追跡した。細胞を次いで３回冷ホスフェート緩衝塩水により洗い、細胞ライゼートを上記のようにして調整し、ＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩで免疫沈降させた。
８）免疫沈降
未感染、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌII感染、ＶＶｇｐＩ感染、ＶＺＶ感染細胞からの細胞ライゼート（４００μＬ）及び未感染、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌII感染、ＶＶｇｐＩ感染細胞からのライゼート（５００μＬ）組織培養流体を、蛋白質Ａ含有スタヒロコッカス・アウレウスＣｏｗａｎＩの１０％ホルマリン固定懸濁液４０μＬにより４℃で２時間インキュベートした（Ｋｅｓｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５、１６１４−１６１７、１９７５）。２０分間９０００×ｇで遠心分離した後、ＶＺＶ特異性蛋白質を、ＶＺＶ蛋白質に対して産生したポリクローナル抗体（ヒト血清及びＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩ）５０μＬ又はモノクローナル抗体１００μＬの存在下で２０時間４℃で免疫沈降させた。最後に、３０μＬの１０％ホルマリン固定Ｓ．アウレウス懸濁液を加え、４℃で２時間後、吸着した免疫複合体を３回溶解緩衝液により洗い、２０μＬのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。１０μＬの３×サンプル緩衝液（１５０ｍＭトリス、ｐＨ７．０、６％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、０．０３％ブロモフェノールブルー）の添加後、懸濁液を４分間沸騰水中で加熱し、氷で冷却し、Ｖａｆａｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２、９５３−９５９、１９８４及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２５４４−２５５１、１９８８に記載されたように、８−１２％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５参照）。
細胞ライゼートは、ＶＺＶｇｐＩを認識するＭＡｂＣ１及びｇｐIV及びＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIにより免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図６Ａ及びＢに示されたように、結果は、ＭＡｂＣ１と同じく、ＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIは、ツニカマイシンの存在又は不存在下天然のＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・生成物と反応する。これは、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌIIにより発現されたｅｌエピトープが、ＶＺＶの天然のｇｐＩｅｌエピトープにより認識される抗体応答を誘発したことを示す。
９）中和テスト
中和テストは、記述（Ｖａｆａｉ他、１９８７）されたように一定のウィルス変化血清技術により行われた。簡単には、ＢＳＣ−１細胞（１０8）は、共培養によりＶＺＶによって感染された。３日後、感染した培養物が、８０−９０％の細胞変性を示したとき、細胞は、組織培養培地中にこすり落とされ、４℃で２０分間２０００×ｇで遠心分離し、細胞ペレットを４ｍＬの無血清培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、テフロン被覆ホモジナイザー中で氷でダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイズ（１５０回転）した。ホモジネートを、１０分間８００×ｇで遠心分離し、上澄液を中和テストに用いた。１００−２００ＰＦＵを含む部分（０．５ｍＬ）を、ＶＺＶビリオン（Ｖａｆａｉ他、１９８７）に対して産生されたＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩ又はウサギ抗ＶＺＶ抗体（ＲＡｎｔｉ−ＶＺＶ）又は免疫前の血清及び０．２５ｍＬのモルモット補体の異なる希釈（０．１：１０、１：５０及び１：１００）の等容積と混合した。混合物を、２時間３７℃でインキュベートし、６穴プレートで成長したＢＳＣ−１細胞の２穴に接種した。３時間３７℃でインキュベーションした後、接種物を取出し、細胞を洗い、２％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含む培地を上に載せ、５−７日間３７℃でインキュベートした。細胞を次にホルムアルデヒドにより固定し、クレシルバイオレットにより染め、プラークを記述（Ｖａｆａｉ他、１９８４）されたようにカウントした。結果は、例えば補体の存在又は不存在下で精製したＶＺＶビリオン（Ｖａｆａｉ他、１９８７）に対して産生したＲＡｎｔｉ−ＶＺＶ抗体の１：１０希釈で１００％のプラーク減少を示し、そして補体の存在下ＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩの１：１０希釈で５０％のプラーク減少を示す。
配列表
(1)  一般的な情報：
（ｉ）  出願人：バファイ，アバス
（ii）  発明の名称：バリセラ・ゾースターウィルス抗原
（iii）  配列の数：２
（iv）  郵便宛先：
（Ａ）  名前：スカーリー，スコット，マーフィー  アンドプレッサー
（Ｂ）  通り：ガーデン  シティー  プラザ  ４００
（Ｃ）  市：ガーデン  シティー
（Ｄ）  州：ニューヨーク
（Ｅ）  国：米国
（Ｆ）  郵便番号：１１５３０
（ｖ）  コンピュータ読取りフォーム：
（Ａ）  媒体：フロッピー・ディスク
（Ｂ）  コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）  オペレーション・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）  ソフトウェア：パテント  イン  リリース  ＃１．２４
（vi）  現在の出願データ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：１９９０年１０月３日
（Ｃ）  分類：
（viii）  代理人：
（Ａ）  名前：デギグリオ，フランク  エス
（Ｂ）  登録番号：３１，３４６
（Ｃ）  リファレンス／ドケット番号：７９８０
（ix）  通信法：
（Ａ）  電話：（５１６）７４２−４３４３
(2)  配列番号：１
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１５９  アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直線状
（ii）  配列の種類：ペプチド
（xi）  配列：配列番号：１
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(3)  配列番号：２
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：５１１  アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  配列の種類：ペプチド
（xi）  配列：配列番号：２
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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