(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非線形走査型レーザー顕微鏡によって物質の微細構造を測定する方法であって、
あらかじめ決定された基本周波数Ｗの集束レーザービームでもって選択された部位を走査し、それにより該部位が励起して前記基本周波数Ｗの第三高調波３Ｗを構成する信号を生成することによって試験体の画像を形成する工程と、
収集手段によって前記信号を収集する工程と、
前記収集された３Ｗ信号から該第三高調波３Ｗ以外の周波数信号を実質的に除去する工程と、
該除去後の３Ｗ信号を検出器に送信する工程と、
処理及び表示のために前記検出器の出力を蓄積する工程と
を具備することを特徴とする走査型レーザー顕微鏡を用いた測定方法。
【請求項２】
前記走査が前記集束ビーム及び前記試験体を相対移動させることによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記走査が、前記試験体に沿って及び／またはその表面と交差して及び／またはその試験体を貫通して行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
あらかじめ決定された基本周波数の集束レーザービームでもって試験体を逐点走査することにより該試験体の画像を形成するのに適合する非線形走査型レーザー顕微鏡であって、前記走査部位を励起することで前記基本周波数の高調波を構成する信号を生成し、この信号が処理及び表示のため蓄積手段に蓄積されるものにおいて基本周波数の前記高調波がその第三高調波であることを特徴とする。
【請求項５】
前記ビームが短パルスレーザーによって生成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記短パルスレーザーが近赤外線スペクトル領域で動作することで、可視あるいは紫外線波長領域に前記第三高調波を設定することを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記集束ビーム及び前記試験体を相対移動させる手段をさらに備えることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記短パルスレーザービームがサブピコ秒の範囲以下のパルスを伴う連続波モードロックレーザーによって生成されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学顕微鏡使用法、より特別には、走査型レーザー顕微鏡によって物質の微細構造を測定するための方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
共焦型顕微鏡のように、種々の形態を有する走査型レーザー顕微鏡は、現代型の光学顕微鏡としてますます用いられてきている。それらの多数の有利性の中には、奥行き感度が試験体の断面図を得ることができるまでに改善されると同時に、種々の形態のデジタル画像処理生成を促進するデジタル画像の収集することがある。
【０００３】
ところで、光学顕微鏡における従来の課題は、透明体または試験体の測定及び調査である。位相差顕微鏡のようないくつかの独創的な技術は、このような試験体から位相差情報を得ることで発展してきた。位相差顕微鏡は、試験体を通過する光の非可観測位相差を可視振幅差または同様の結果を与える差動干渉に変換する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法は物質の線形反射係数に基づいているため、たとえば光学ガラスのようにせいぜい２くらいしか違わないものや、透明体の不均一性、近接する境境界面、もしくは他の物質に埋め込まされた薄層のようなものの微細な差異を分解するには線形反射係数ｎの差異が微小すぎる。
【０００５】
これらの困難性を解決しようとして、第二高調波の画像化による走査型光学顕微鏡が開発されてきた。しかるに、この第二高調波顕微鏡は、一定のコントラストレベルと従来の顕微鏡によって得られる以上の解像度が要求されるため、非中心対称構造を有する物質すなわち純結晶物質や他の特別な構造を備えた物質の観測のみに限られるという課題があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明の目的の一つは、上述した技術の欠点ないしは制約を克服すること、並びに種々のタイプの物質からなる試験体の高解像度を有する画像を生成する走査型レーザー顕微鏡を提供することである。
【０００７】
本発明によれば、この目的が、非線形走査型レーザー顕微鏡によって物質の微細構造を測定する方法であって、あらかじめ決定された基本周波数Ｗの集束レーザービームでもって選択された部位を走査し、それにより該部位が励起して前記基本周波数Ｗの第三高調波３Ｗを構成する信号を生成することによって試験体の画像を形成する工程と、収集手段によって前記信号を収集する工程と、前記収集された３Ｗ信号から該第三高調波３Ｗ以外の周波数信号を実質的に除去する工程と、該除去後の３Ｗ信号を検出器に送信する工程と、処理及び表示のために前記検出器の出力を蓄積する工程とを具備することを特徴とする（請求項１）。
【０００８】
請求項１に記載の方法発明において、前記走査が前記集束ビーム及び前記試験体を相対移動させることによって行われ（請求項２）、前記走査が、前記試験体に沿って及び／またはその表面と交差して及び／またはその物体を貫通して行われる（請求項３）。
【０００９】
さらに、本発明は、あらかじめ決定された基本周波数の集束レーザービームでもって試験体を逐点走査することにより該試験体の画像を形成するのに適合する非線形走査型レーザー顕微鏡であって、前記走査部位を励起することで前記基本周波数の高調波を構成する信号を生成し、この信号が処理及び表示のため蓄積手段に蓄積されるものにおいて基本周波数の前記高調波がその第三高調波であることを特徴とする（請求項４）。
【００１０】
請求項４に記載の装置発明において、前記ビームが短パルスレーザーによって生成され（請求項５）、前記短パルスレーザーが近赤外線スペクトル領域で動作することで、可視あるいは紫外線波長領域に前記第三高調波を設定するものであり（請求項６）、前記集束ビーム及び前記試験体を相対移動させる手段をさらに備え（請求項７）、前記短パルスレーザービームがサブピコ秒の範囲以下のパルスを伴う連続波モードロックレーザーによって生成され（請求項８）るものとすることが好ましい。
【００１１】
周波数Ｗの高強度光が照射されると、すべての物質は、照射光の第三出力及び非線形物質係数Ｘ(3) に依存した大きさで、ある第三高調波３Ｗを発生する。それはまた、条件、すなわち基本的な高調波の位相速度との相関と調和する位相に依存している。完全な位相整合によってさえも、同質の媒体で精密に集束されたビームは、相互に影響する配置のために第三高調波発生が起こらないことが知られているが、異質の媒体では、境界面が密接し、他の媒体で包埋された物質の薄層にて顕著な第三高調波信号が発生することが知られている。これらの信号は、前記層の反射率が非常に近接しているときでさえも、以下に説明されるように発生する。走査型レーザー顕微鏡は、境界面と、周囲の媒体と第三高調波発生率が相違する小試験体とを第三高調波発生光が検出する観測をする。
【００１２】
透明な物質（すなわち、光学的共鳴点から離れた物質）の第三高調波発生は、広範囲で変化する。たとえば、種々の光学ガラスにおいては、非線形物質係数Ｘ(3) が１００も異なるが、前述したようにそれらの反射係数ｎはせいぜい２しか違わない。気体近似理論によれば、Ｘ(3) ＝（ｎ2 −１）4 及び第三高調波光の出力が［Ｘ(3) ］2 ＝（ｎ2 −１）8 と比例することが予言される。これは、反射係数ｎの小さな値が大きな第三高調波となって反映されることを意味する。それゆえに、第三高調波の生成は、物質間の差異を検出することのに有効となる。加えて、非線形性が含まれることにより、このような顕微鏡は、フィールドの実際の奥行きより小さい物体を測定し、それゆえに、奥行き方向及び横方向の双方向においてより優れた空間解像度を示す。
【００１３】
本発明は、より完全に理解されるべく添附図面を参照しつつ好ましい一実施形態に基づいて説明される。
【００１４】
図の細部を詳細に参照すると、次のことが強調される。すなわち、実施例の方法により、及び本発明のみの好ましい実施形態の実例となる検討を目的として本発明の特徴が示され、本発明の原理及び概念面の最も有益で容易に理解される説明となろうことを提供することの理由で説明される。この事については、本発明の基本的な理解のために必要とされる以上のさらなる詳細をもって本発明の構造的な詳細を示す試みはなされず、本発明のいくつかの形態がどのようにして実施例に具体化されるかの説明が図を参照して当該技術分野の当業者にとって自明であるようになされる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
図１を参照しつつ、第三高調波顕微鏡の動作原理を概略的に説明する。顕微鏡対物レンズ２は、短パルスでかつ高強度である基本周波数Ｗのレーザービーム４を試験体８内部の焦点６に集束し、周波数３Ｗの第三高調波ＴＨをそこに生成する。第三高調波は、収集レンズ１０により収集されてフィルタ１２を通過し、基本周波数Ｗである原ビームについてそのどんなに僅かなものでも除去されて最終的に検出される。試験体８は、ｘ方向及び／またはｙ方向及び／またはｚ方向（すなわち、試験体に沿って、及び／またはその表面と交差して、及び／またはその試験体を貫通して）にそれを移動することと、レーザービームを照射することによって走査される。すべての走査部位からの第三高調波信号は、画像を形成するため電気的に収集される。
【００１６】
図２は、非線形走査型レーザー顕微鏡の第１実施例にかかる概略的な図である。同図では、必要最大出力が試験体に影響を与える平均出力レベルに達することなく得られるような短パルス式であるべき高強度レーザー源１４が示されている。最も好ましくは、近赤外線領域（より好ましくは、１〜２μｍ）のレーザー源であるのがよい。このようなレーザー源は、１０〜１００ｍｗの平均出力を生成するピコ秒レンジ以下のパルスを有するＣＷ（連続波）モードロックレーザーであることがさらに好ましい。
【００１７】
また、図２には、レーザービームを顕微鏡の軸に向けて反射し、試験体の可視検査のための可視光を伝達する二色ビームスプリッタ１６が示されている。
【００１８】
さらに、顕微鏡の光軸に沿って、レーザー１４からの光を試験体８に集束して第三高調波光を生成するための標準的な高出力顕微鏡対物レンズ２（図１をも参照）が示されている。
【００１９】
この実施形態では、走査動作が、顕微鏡ステージ２０をあらかじめ設定された移動量及び方向にしたがって移動する走査機構１８によって得られる。
【００２０】
変更された光は、偏向鏡２２を介して収集レンズ１０により収集され、基本周波数Ｗのすべてのバックグランド光を除去するフィルタ１２に到達し、純粋な第三高調波信号のみが送波されて、たとえば光電子増倍管等の検出器に受光される。電気的に形成される画像は、コンピュータ２６のスクリーンに表示される。
【００２１】
図３に示される変形例においては、公知の走査装置２８により、レーザービームそれ自体により走査がなされる。また、図２の走査機構１８に走査装置２８を組み合わせることも可能である。
【００２２】
図４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は、図２に示される走査型顕微鏡を用いて実施した試験の結果を示している。水（図４（ａ）（ｂ）（ｃ））とオイル（図４（ｄ））の薄膜が二つのガラス板の間に密閉される。
【００２３】
まず準備として、１．５５μｍ（スペクトラ−フィジック社製のＯＰＡＬ（商品名）と称するレーザ光源）の短パルスレーザーを放射し、ビームはツァイス（商標）の平面色消し対物レンズｘ１００（Ｎ．Ａ．１．４）を用いて試験体内に集束される。試験体は、コンピュータ制御された電動式ステージによって０．１μｍ間隔で光軸（ｚ軸）に沿って走査される。第三高調波光は０．５１６μｍの波長を有している。
【００２４】
図４（ａ）（ｂ）（ｃ）は、対物レンズの焦点を通って移動される試験体としての水膜における第三高調波の（任意単位における）強度を示している。高強度の第三高調波発生が、ガラス−水−ガラスの二つの境界面に観察される。焦点が境界面に位置するとき第三高調波発生信号は最大になり、試験体が約１μｍ移動されるとその最大値は半分に減少する。さらに、二つの境界面は、前記膜が約１．５μｍ厚である場合には、図４（ｂ）に示されるように未だ検出されるが、この値以下で該境界面はもはや検出されないで、高強度の第三高調波発生信号が図４（ｃ）に示されるように膜の位置を検出する。この結果は、小さい（ミクロン以下）対象物が均一なマトリクスで包理されるときに発生する第三高調波発生によって検出されることを確認している。
【００２５】
図４（ｄ）は、１５μｍ厚のオイル膜にかかる同様の結果を示している。該オイルは、顕微鏡でよく用いられる液浸オイル（ｎ＝１．５１６）であり、セルのガラス壁に関する屈折率が整合されるものである。それにもかかわらず、同図に示されるように、高強度の第三高調波信号がガラス−オイル双方の境界面で発生する。
【００２６】
このように、第三高調波の発生が複数の物質間で、たとえそれらの線形特性（屈折率ｎ、吸収性）が同様であったとしても、異なることが理解される。第三高調波発生の使用は、試験体における三次元分布写像の作成を促進し、今日、他の顕微鏡技術に役立たせるための不可能もしくは困難な情報を供給する。
【００２７】
本発明は、前述した図示の実施形態の細部に限定されるものではなく、また、本発明はその精神または本質的な属性から離れることなく他の特有の構造をも包含するものであることは、当該技術分野の当業者に明白であろう。したがって、本実施形態は、例証され、かつ非限定的なすべての局面で考察されるべきものであって、本発明の範囲は、前述した説明によってというよりはむしろ、特許請求の範囲によって示されてあり、それゆえ、特許請求の範囲と均等な意義及び範囲内でなされるすべての変更はその範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】第三高調波顕微鏡の動作原理を示す図である。
【図２】非線形走査型顕微鏡の第１の実施形態にかかる概略図である。
【図３】非線形走査型顕微鏡の第２の実施形態にかかる概略図である。
【図４】（ａ）は、境界面に対物レンズの焦点を有する二つのガラス板間にある１５μｍ厚の水薄膜のｚ軸走査による第三高調波の生成強度及び解像度を示すグラフである。
（ｂ）は、約１．５μｍ厚の水膜にかかる図４と同様のグラフである。
（ｃ）は、約１μｍ厚の水膜を有する試験体の走査結果を示すグラフである。
（ｄ）は、二つのガラス板の間にある１５μｍのオイル膜にかかる走査結果を示すグラフである。
【符号の説明】
２  対物レンズ
４  レーザービーム
６  焦点
８  試験体
１０  収集レンズ
１２  フィルタ
１４  レーザー源
１６  二色ビームスプリッタ
１８  走査機構
２０  顕微鏡ステージ
２２  偏向鏡
２６  コンピュータ
２８  走査装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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