(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固着させたムジナタケ(Psathyrella velutina)レクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固相に固着させたムジナタケレクチンとの複合体を形成させる工程を含む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法。
【請求項２】
アガラクトＩｇＧと固相に固着させたムジナタケレクチンとの複合体を抗ＩｇＧ抗体により検出することを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固着させたムジナタケレクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固相に固着させたムジナタケレクチンとの複合体を形成させる工程の後、抗ＩｇＧ抗体と反応させることを特徴とする請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
抗ＩｇＧ抗体が、標識物質で標識された、または標識され得る抗ＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項２または３に記載の測定方法。
【請求項５】
標識物質が、ペルオキシダーゼである請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
抗ＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体である請求項２〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアガラクトＩｇＧの測定方法を用いてアガラクトＩｇＧを測定することを特徴とする、リウマチの検出方法。
【請求項８】
リウマチが、慢性関節リウマチであることを特徴とする請求項７記載のリウマチの検出方法。
【請求項９】
アガラクトＩｇＧとムジナタケレクチンとの複合体を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定する方法に使用するキットであって、構成成分として、固相に固着されたムジナタケレクチンを含むことを特徴とするアガラクトＩｇＧ測定キット。
【請求項１０】
アガラクトＩｇＧとムジナタケレクチンとの複合体を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定してリウマチを診断する方法に使用するキットであって、構成成分として、固相に固着されたムジナタケレクチンを含むことを特徴とするリウマチ診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固相に固着されたレクチンを用いるアガラクトＩｇＧの測定方法及びアガラクトＩｇＧの測定キットに関する。また本発明は、固相に固着されたレクチンを用いたアガラクトＩｇＧの測定方法を用いてアガラクトＩｇＧを測定することを特徴とするリウマチの検出方法、アガラクトＩｇＧ測定キットおよびリウマチの診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチは多発性関節炎を主症状とし、その他全身の臓器組織に広範な炎症を呈する疾患である。慢性関節リウマチ患者血清中には、リウマチ因子と呼ばれる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部位に存在するエピトープを認識する自己抗体が存在することが知られている。このことは、リウマチ因子を産生するリウマチ患者のＩｇＧが、健常人のＩｇＧとは異なる構造を有していることを示唆している。リウマチ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖鎖構造を詳細に解析した結果、リウマチ患者血清中ではガラクトース（Ｇａｌ）残基を欠損した糖鎖を持つＩｇＧ（アガラクトＩｇＧ）が顕著に増加していることが明らかとなっている。すなわち、健常人血清中のＩｇＧのＦｃ部位における糖鎖部分は、基本的には複合型２本鎖構造であって、Ｇａｌ残基の有無、フコース残基の有無、β−マンノース残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の有無による１６種類のオリゴ糖の混合物であり、この１６種のオリゴ糖の相対比率は健常人ＩｇＧでは常に一定である一方、リウマチ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位に存在する糖鎖部分は、複合型２本鎖構造ではあるが、Ｇａｌ残基を２分子とも欠いた糖鎖の比率が増大していることが明らかとなっている。従って、リウマチ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖鎖部分には構造異常が起きており、この糖鎖構造異常を認識することがリウマチ因子のマーカーとしての役割を果たすこととなる。
【０００３】
現在の慢性関節リウマチの診断方法としては、リウマチ因子（アガラクトＩｇＧに対する自己抗体）を測定する方法が主流で、変性ＩｇＧに対して反応するリウマチ因子をラテックス凝集反応で測定している。また、リウマチ因子はＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの３種に分類することができ、最近では、各々のリウマチ因子を測定することにより、診断における感度および特異性等について議論されている。前述したように、これらのリウマチ因子の起因物質はＩｇＧの糖鎖異常の結果生じるアガラクトＩｇＧであると考えられている。したがって、起因物質であるアガラクトＩｇＧを直接に測定することが、慢性関節リウマチを診断する上で重要と考えられる。
【０００４】
アガラクトＩｇＧの測定方法としては、特開平５−８７８１４号公報に記載された技術が挙げられる。この技術は、抗ヒトＩｇＧ抗体と正常ヒトＩｇＧ（当該明細書中では単に「ヒトＩｇＧ」と記載されている）と反応するレクチン（ＲＣＡ；リシナスコミニスアグルチニン）とを用いて、ヒト血清中の正常ＩｇＧをサンドイッチすることにより正常ＩｇＧ量を測定することを基本原理としている。すなわち、慢性関節リウマチ患者では血液中の正常ＩｇＧがアガラクトＩｇＧへ異常代謝されるため、正常ＩｇＧが減少することに着目し、減少した正常ＩｇＧ量を測定することにより、増加したアガラクトＩｇＧ量を推定する測定方法である。しかしながらこの測定方法は、血液中の総ＩｇＧ量の変動によって推定されるアガラクトＩｇＧ量も変動してしまう点、およびアガラクトＩｇＧの直接的な定量方法でないことから、正確なアガラクトＩｇＧ量の値を得ることが困難である点において、問題が残されていた。なお当該公報では、抗ヒトＩｇＧ抗体を固相（不溶化担体）に固定化したものを用いることは開示されているが、本発明のようにレクチンを固相に固定化したものを用いることは開示されていない。また当該公報には、固相に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体に、ヒト血清中のＩｇＧ（正常ＩｇＧおよびアガラクトＩｇＧの混合物）を結合させ、その中の正常ＩｇＧのみをレクチン（ＲＣＡ）で認識（すなわち抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチン（ＲＣＡ）とにより、正常ＩｇＧをサンドイッチする）し、正常ＩｇＧの測定値を基にアガラクトＩｇＧ量を測定する技術については開示されているが、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによりアガラクトＩｇＧを直接サンドイッチする技術（アガラクトＩｇＧの直接的な定量方法）については開示されていない。本発明は、当該公報に記載の発明とその構成が明確に異なり、さらに当該公報に記載の発明にはない顕著な効果を有するものである。この効果については後述する。
【０００５】
アガラクトＩｇＧの直接的な定量方法としてはTsuchiyaらの報告（J.Immunol.,151,1137-1146(1993)）がある。この方法は、プロテインＧとビオチンで標識したムジナタケ(Psathyrella velutina)レクチン（ＰＶＬ）とにより、アガラクトＩｇＧをサンドイッチするものであるが、この測定方法では高価なプロテインＧおよびビオチンで標識したＰＶＬが必要であり、特に、ＰＶＬは凝集性を有するためビオチン標識は容易でなく、さらにビオチンで標識したＰＶＬの安定性においても大きな問題点を抱えている。本発明は、当該報告の発明ともその構成が明確に異なり、さらに当該報告に記載の発明にはない顕著な効果を有するものである。この効果についても後述する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来技術を踏まえると、アガラクトＩｇＧを高感度かつ低コストで、簡便に直接定量できる方法が必要とされている。すなわち本発明の目的は、検体中のアガラクトＩｇＧを高感度、低コスト、かつ簡便に直接測定する方法を提供するものである。また、本発明の他の目的は、この測定系を利用してリウマチ、特に慢性関節リウマチを検出する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的はアガラクトＩｇＧ測定キットおよびリウマチ診断キットを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アガラクトＩｇＧと反応するレクチンを固相に固着させることによって、レクチンの凝集性、標識レクチンの安定性の問題を解決でき、さらにアガラクトＩｇＧの高感度測定が可能になることを見出し、さらに低コストかつ簡便なアガラクトＩｇＧの測定法等を提供することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固着させたレクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固相に固着させたレクチンの複合体を形成させることによって検体中のアガラクトＩｇＧを測定する方法、この測定方法を用いてリウマチ、特に慢性関節リウマチを検出する方法、アガラクトＩｇＧ測定キットおよびリウマチの診断キットに関する。
【０００９】
好ましくは、形成される複合体を抗ＩｇＧ抗体で検出する。より好ましくは、複合体を形成させる工程の後に、抗ＩｇＧ抗体と反応させる。またレクチンは、好ましくはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特異的に結合するレクチンであり、特に好ましくはムジナタケ(Psathyrella velutina)レクチン（ＰＶＬ）である。
【００１０】
また本発明は、レクチンと抗ＩｇＧ抗体とによりアガラクトＩｇＧをサンドイッチする工程を含む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法に関する。レクチンは固相化されていることが好ましい。レクチンは、好ましくはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特異的に結合するレクチンであり、特に好ましくはムジナタケ(Psathyrella velutina)レクチン（ＰＶＬ）である。
【００１１】
慢性関節リウマチの診断法として、リウマチ因子の測定法、原因物質であるアガラクトＩｇＧの間接的測定方法あるいは高度技術および高価材料が必要な直接的測定方法が報告されているが、本発明によればアガラクトＩｇＧを直接定量する簡便かつ低コストな測定方法が提供され、および本測定法により簡便、低コストかつ高感度で慢性関節リウマチの検出ができる。また、そのためのキットが提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）アガラクトＩｇＧの測定方法
本発明の測定方法は、少なくとも固相に固着させたレクチンと検体中のアガラクトＩｇＧとの複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の測定方法において、レクチンを固着させる固相体としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ラテックス、ガラス、架橋デキストリン、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミド等が挙げられる。
【００１４】
これらの固相体にレクチンを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。特に物理的吸着が、操作が簡便な点で好ましい。
【００１５】
また、レクチンを固着させた固相体の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこへ検体中のアガラクトＩｇＧや他の分子種が固着すると、正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相体と接触させる前にブロッキング物質を添加してレクチンが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、哺乳動物、例えばウシ等から採取できる血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白、乳酸発酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００１６】
また、固相体に固着させたレクチンに検体中のアガラクトＩｇＧを結合させた後に、固相体の表面を洗浄液で洗浄して非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等が挙げられる。
【００１７】
ＩｇＧは血液中の免疫グロブリンの約８０％を占め、約１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、半減期が１６〜２３日間の糖タンパク質である。複合型二本糖鎖がＣＨ２領域の２９７番目のアスパラギンに結合しており、健常人では、１〜２分子のＧａｌ残基を含んでいる。一方、慢性関節リウマチ患者の血液中のＩｇＧ分子の糖鎖においてはＧａｌが著しく減少して、複合型二本糖鎖の両末端でＧｌｃＮＡｃ分子が露出した状態になっている。この糖鎖異常によりこの抗体が抗原性を示すようになり、自己抗体（リウマチ因子）を産生すると考えられている。この糖鎖異常（Ｇａｌの欠損）を有する抗体がアガラクトＩｇＧである。
【００１８】
レクチンとしては、アガラクトＩｇＧと反応すれば特に制限はされないが、好ましくはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン（β−ＧｌｃＮＡｃ）残基に特異的に結合するレクチンである。このようなレクチンとしては、Triticum vulgaris由来のレクチン、Datura stramoniun由来のレクチン、Lycopersicon esculentum由来のレクチン、Soianum tuberosum由来のレクチン、Laburnum alpinum由来のレクチン、Oryza sativa由来のレクチン、Phytolacca americana由来のレクチン、Ulex europaeus II由来のレクチン、Psathyrella velutina由来のレクチン（ムジナタケレクチン；ＰＶＬ）等が挙げられる。
【００１９】
なおこれらのレクチンの中でも、アガラクトＩｇＧと反応し、正常ＩｇＧと反応しないことが十分確認されていることからムジナタケレクチン（ＰＶＬ）が特に好ましい。
【００２０】
ＰＶＬはムジナタケの子実体中に存在する分子量約４万のタンパク質である。このレクチンは、従来のレクチンに比べてＧｌｃＮＡｃに対して高い親和性を示し、特にＧｌｃＮＡｃβ１→４結合よりもＧｌｃＮＡｃβ１→６結合およびＧｌｃＮＡｃβ１→３結合に高い親和性を有する。また、このＰＶＬが、前記アガラクトＩｇＧ分子に存在する複合型二本糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃと反応することが報告されている。
【００２１】
本発明で使用されるＰＶＬとしては、市販のＰＶＬ、公知の方法（特開平１−１３９５９９号公報）によるムジナタケレクチンの子実体からの抽出・精製したＰＶＬあるいは公知の遺伝子工学的方法を用いた組み換え体ＰＶＬでも良い。
【００２２】
本発明の測定方法において、形成されたアガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体を検出する方法は特に制限されない。なお、抗ＩｇＧ抗体はアガラクトＩｇＧと反応することから、アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体の検出は抗ＩｇＧ抗体により行うことが好ましい。アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体の検出は、当該複合体の形成後に、形成された当該複合体を抗ＩｇＧ抗体と反応させて検出してもよいし、先にアガラクトＩｇＧと抗ＩｇＧ抗体を反応させ、次いでアガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体を形成させて検出してもよい。好ましくは、
アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体形成後に、抗ＩｇＧ抗体と反応させて検出を行う。
【００２３】
抗ＩｇＧ抗体は、好ましくは標識物質で標識された、または標識され得る抗ＩｇＧ抗体である。また、好ましくは抗ヒトＩｇＧ抗体である。
本発明で使用することができる抗ヒトＩｇＧ抗体は、市販の抗ヒトＩｇＧ抗体、市販のヒトＩｇＧをマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物に免疫して得られるポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体でもよい。前述の市販の抗ヒトＩｇＧ抗体は入手が容易であるので好ましい。また、プロテインＧおよびＰＶＬの認識結合部位は共にアガラクトＩｇＧ分子のＦｃ部分に集中しているが、抗ヒトＩｇＧ抗体はＦｃ以外の部位をも認識することから、アガラクトＩｇＧとのサンドイッチ状複合体を形成させる上で好ましい。
【００２４】
なお本発明は、レクチンと抗ＩｇＧ抗体とによりアガラクトＩｇＧをサンドイッチして、アガラクトＩｇＧを直接検出する技術、すなわちレクチンと抗ＩｇＧ抗体とによりアガラクトＩｇＧをサンドイッチする工程を含む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法も包含する。レクチンは固相に固着されていることが好ましく、好ましいレクチンや好ましい抗ＩｇＧ抗体、その他の好ましい実施態様は上述と同様である。
【００２５】
以下、ＰＶＬと抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した場合を例にとって説明する。他のレクチンや、他の抗ＩｇＧ抗体も同様に使用できる。
本発明において検体中のアガラクトＩｇＧをＰＶＬを用いて測定するには、通常いわゆるサンドイッチ法（特公平６−４１９５２号公報等参照）が用いられる。すなわち、アガラクトＩｇＧ分子中の糖鎖とＰＶＬとの親和性とアガラクトＩｇＧ分子中の蛋白部分に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の親和性を利用し、三者のサンドイッチ状複合体を形成させて複合体を測定する方法であり、通常、ＰＶＬを固相体に固着させ、該サンドイッチ状複合体を分離して測定する方法である。例えば、アガラクトＩｇＧを含む検体を、固相体に固着されたＰＶＬと接触させ、次いで標識物質で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と接触させることによって、検体中のアガラクトＩｇＧ、ＰＶＬおよび標識抗ヒトＩｇＧ抗体とを反応させて、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−標識抗ヒトＩｇＧ抗体からなる複合体を形成させ、前記複合体と遊離の標識抗ヒトＩｇＧ抗体とを分離し、前記複合体中の標識物質を検出することにより検体中のアガラクトＩｇＧを測定する方法が挙げられる。
【００２６】
また、非標識の抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて形成させた固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧ抗体の複合体に、抗ヒトＩｇＧ抗体に特異的に結合する標識された抗抗ヒトＩｇＧ抗体を接触させることによって、前記複合体と該標識抗抗ヒトＩｇＧ抗体との複合体を形成させ、その標識物質を検出することにより、検体中のアガラクトＩｇＧを測定することもできる。なお、この方法で使用できる抗抗ヒトＩｇＧ抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体を製造するためにヒトＩｇＧを免疫した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識する抗体である。
【００２７】
前記サンドイッチ法において、ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧ抗体の複合体形成順序は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である（「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。
【００２８】
抗ヒトＩｇＧ抗体または該抗体に免疫学的親和性を有する抗イムノグロブリン抗体（抗抗ヒトＩｇＧ抗体）の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、アイソトープ (125Ｉ、131I、3Ｈ等)、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸等）、化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）が挙げられるが、通常タンパク質の標識に使用可能なものであれば、特に限定されない。なお、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００２９】
前記の抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。
【００３０】
標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオキシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００３１】
本発明の測定方法においては、検体中のアガラクトＩｇＧの濃度は、予め既知濃度のアガラクトＩｇＧ標準液を用いてアガラクトＩｇＧ濃度と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いる方法によって、定量することができる。
【００３２】
本発明の測定方法における検体は特に限定されるものではないが、好ましくは液状試料、より好ましくは関節液、血液、血清、血漿、細胞の培養液等の液状試料である。特に、後述のリウマチの検出に本測定法を用いる場合、検体としては関節液、血液、血清、血漿等の体液が好ましい。また、好ましくは、体液はヒト由来のものである。なお、本発明の測定方法に用いるアガラクトＩｇＧを含む検体は、予め精製されている必要はない。すなわち、検体中に他の血清タンパク質などの夾雑物が混在していてもアガラクトＩｇＧを選択的に測定することができるため、それらによって測定結果が影響されることはない。
【００３３】
本発明の測定方法の好ましい一形態を以下に説明する。まず、固相体にＰＶＬを固着（コーティング）させる。固着方法としては、例えば、ＰＶＬを１０％グリセロールを含むpH７〜９程度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相体（例えばマイクロプレートのウェル）に加え、３７℃程度で１〜２時間静置するか、４℃程度で一晩静置して固着させる方法等を挙げることができる。
【００３４】
上記固着後、血清アルブミン等のブロッキング物質を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間静置するか、常温（１５〜２５℃） で１〜２時間静置して、該ＰＶＬが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。次いで、上記ＰＶＬが固着した固相体に、アガラクトＩｇＧを含む検体試料を添加し、例えば、３７℃で２０〜８０分間の最適な時間静置あるいは攪拌し、上記ＰＶＬにアガラクトＩｇＧを結合させる。
【００３５】
その後、この複合体が結合した固相体を、トゥイーン系界面活性剤等を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）等の洗浄液で洗浄する。さらに、前記固相体に、標識物質で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体と標識物質で標識された抗抗ヒトＩｇＧ抗体を添加して、例えば、３７℃で２０〜８０分間静置あるいは攪拌し、アガラクトＩｇＧに前記抗ヒトＩｇＧ抗体（または抗ヒトＩｇＧ抗体−抗抗ヒトＩｇＧ抗体）を結合させる。この操作によって、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧ抗体（または固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧ抗体−抗抗ヒトＩｇＧ抗体）からなる複合体を形成させる。次に、前記複合体の標識物質を検出してアガラクトＩｇＧを測定する。
【００３６】
別に、アガラクトＩｇＧ標準品の濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記検量線とを用いて、未知試料中のアガラクトＩｇＧを定量する。
【００３７】
（２）リウマチの検出方法
上述のように、リウマチ、特に慢性関節リウマチの患者においては、アガラクトＩｇＧの量が増加している。従って、上記のアガラクトＩｇＧの測定方法を用いてアガラクトＩｇＧを測定することによりリウマチの検出をすることができる。この検出には、リウマチの有無だけでなくリウマチの程度の判定も含まれる。
【００３８】
リウマチの検出の判断基準となるアガラクトＩｇＧ量は、検体の種類等によって適宜定められ、測定されたアガラクトＩｇＧ量に基づいて検出を行うことができる。
【００３９】
なお、リウマチ検出の判断基準となるアガラクトＩｇＧ量は、アガラクトＩｇＧ標準品濃度と標識物質の検出結果との関係について作成した検量線を用いて求めたアガラクトＩｇＧ量であっても良く、また当該検量線を用いずに健常なヒト（慢性関節リウマチでないヒト）の検体中のアガラクトＩｇＧ量に対する比であっても良い。
【００４０】
（３）アガラクトＩｇＧ測定キット
また本発明は、アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定する方法に使用するキットであって、構成成分として固相に固着させたレクチンを含むことを特徴とするアガラクトＩｇＧの測定キットに関する。好ましくは、本発明のアガラクトＩｇＧ測定用キットは、さらに抗ＩｇＧ抗体を含んで構成され、抗ＩｇＧ抗体が、標識物質で標識されたもしくは標識され得るものであり、さらに好ましくは、レクチンとしてβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特異的に結合するレクチン（特に好ましくはＰＶＬ）が固着された固相と標識物質で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体から主として構成されるものである。
【００４１】
ＰＶＬを予め固相に固着させたものを使用すれば、上述した測定方法において、固相に固着する操作を省くことができる。また、レクチンの望ましくない凝集を避けることができる。
【００４２】
前記キットには、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度のアガラクトＩｇＧ標準品、標識物質の検出試薬、抗ヒトＩｇＧ抗体を標識する試薬あるいは抗ヒトＩｇＧ抗体を検出する試薬（標識された抗抗ヒトＩｇＧ抗体等）等を加えることができる。また、これらの成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００４３】
また、これらの成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
本発明のアガラクトＩｇＧ測定用キットを用いて検体、例えば関節液、血液、血清、血漿、細胞の培養液等の検体中のアガラクトＩｇＧを特異的に測定することができ、測定範囲も広く、かつ高感度である。
【００４４】
例えば、固相に固着させたＰＶＬおよび標識抗ヒトＩｇＧ抗体を含むアガラクトＩｇＧ測定キットは以下のように使用される。すなわち、固相体に固着させたＰＶＬにアガラクトＩｇＧを含む検体を接触させ、次いで標識抗ヒトＩｇＧ抗体と接触させることによって、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−標識抗ヒトＩｇＧ抗体からなる複合体を形成させ、その複合体に含まれる標識物質を検出することにより、検体中のアガラクトＩｇＧ濃度を測定する。
【００４５】
（４）本発明のリウマチの診断キット
本発明のアガラクトＩｇＧ測定用キットを用いてヒトの血清中のアガラクトＩｇＧを測定した場合、健常人、変形性膝関節炎患者および肝疾患患者に比べて、慢性関節リウマチ患者では著しく高い値を示す。従って、アガラクトＩｇＧを低コストで簡便に測定できる本発明のアガラクトＩｇＧ測定用キットは、慢性関節リウマチの診断を特異的かつ簡便に行うことができる非常に有効な診断キット、すなわち診断薬として使用し得る。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４７】
【調製例１】
（組み換え体ＰＶＬの調製）
＜１＞ＰＶＬのムジナタケ子実体からの精製と抗ＰＶＬポリクローナル抗体の作製
１．抗ＰＶＬ抗体の調製
ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５００ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、J. Biol. Chem.,264, 173-177(1989)に記載された方法により、３００ｇのムジナタケ子実体から、電気泳動的にほぼ均一なバンドを示す約４０ｍｇのＰＶＬを得た。
【００４８】
抗ＰＶＬ抗体を作成するために、１５週齢のウサギを３羽免疫した。一回目の免疫は約２ｍｇのＰＶＬをFreund Complete Adjuvantと混合したエマルジョンをウサギ背部皮下に注射した。その後同量のＰＶＬとFreund Incomplete Adjuvantを混合したエマルジョンを筋肉内に毎週一回、３週連続して注射し、一週間後全採血した。得られたウサギ血液は、4℃に一晩静置し、血餅を沈澱させた後、2000×g、4℃で15分遠心して血清を得た。得られた血清についてはオクタロニー拡散法を用いてＰＶＬとの反応を確認した後、抗血清からプロテインＡアフィニティーカラム（アマシャム・ライフ・サイエンス(Amersham LIFE SCIENCE)製）を用いてＩｇＧを精製した。
【００４９】
２．ＥＬＩＳＡによる抗ＰＶＬポリクローナル抗体の検定
96穴プレート（ヌンク(Nunc)製）の各ウェルに17μg/mlのＰＶＬ溶液(25mM NaHCO3/NaOH緩衝液(pH9.4))を100μlづつ分注し、37℃で95分おいた後、145mM NaCl, 5mM リン酸緩衝液(pH7.5)（ＰＢＳ）で一回洗浄した。１％ ウシ胎仔血清アルブミン（BSA-フラクションV；生化学工業株式会社販売）を150μlづつ各ウェルに加え、３７℃に1時間おいてブロッキングを行った。ＰＢＳで１回各ウェルを洗浄した後、希釈した抗ＰＶＬ抗体を100μlづつ加え、３７℃で１．５時間インキュベートを行った。0.1％ Tween-20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で3回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ＋ＩｇＭ ヤギ抗体（コスモバイオ社(Cosmo Bio Co.Ltd)製）を100μlづつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、基質溶液（1mg/ml SIGMA 104 PHOSPHATASE SUBSTRATE, シグマ(Sigma)社製)を100μlづつ加えて、室温に５分おいた後、着色液の波長４０５nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ４０５／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業株式会社販売）にて測定した。
【００５０】
３．抗ＰＶＬ抗体を用いたウエスタンブロット
ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)はLaemmliらの方法(Laemmli, UK.,(1970), Nature 227, 680-685)を一部改変して行った。サンプル緩衝液(50mM Tris-HCl, ２％ SDS, 20％グリセロール, 0.002％ ブロモフェノールブルー(BPB), 5％ β-メルカプトエタノール)と試料とを等量混合した各サンプルを12.5％ ポリアクリルアミドゲルを用いて20mAで約2時間、電気泳動にかけた。泳動後のゲルからPVDFメンブラン（イモビロン；ミリポア(Millipore)社製）への転写は、Nielsen PJ.とTowbin Hの方法(Nielsen PJ. and Towbin H.,(1982),J.Biol.Chem.,257,12316-12321)を一部改変して行った。PVDFメンブランは100％ メタノールに20秒浸した後、蒸留水で数秒洗い25mM トリス−192mM グリシン, 20％メタノール(ブロット緩衝液)に５分間浸した。ブロット緩衝液に浸した濾紙（3MM chromatography paper；ワットマン(Whatman)製）を重ねてメンブラン及びゲルをはさみ、180mAで1時間室温で通電した。転写後、PVDFメンブランを5分間、3回、ＴＢＳＴ(10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1％ Tween 20)で洗浄した。3％ BSAを含むＴＢＳＴ中にメンブランを移し1時間ブロッキングを行った。再びＴＢＳＴで５分間、３回洗浄した後、抗ＰＶＬ抗体を含むＴＢＳＴ中に移し1時間振とうしながら室温においた。ＴＢＳＴで同様に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ(Fc)抗体（プロメガ(Promega)社製）を含むＴＢＳＴ中に移して1時間、振とうしながら室温においた。ＴＢＳＴで５分間洗浄後、ＴＢＳ(ＴＢＳＴのTween 20を含まないもの）で５分間、２回洗浄した後、Western Blue substrate（プロメガ(Promega)社製）中に移して発色反応を行った。適当な発色を確認した後、メンブランを蒸留水で洗い発色を止めた。
【００５１】
４．抗ＰＶＬ抗体の検定
精製された抗ＰＶＬ抗体の検定のためにＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットを行った(図１)。ＥＬＩＳＡでは10000倍の希釈での使用が可能であった。また、ウエスタンブロットでの検定ではムジナタケの抽出物中には40kDaのＰＶＬ以外のバンドは確認されなかった。また、K12株由来の大腸菌の抽出液を用いたウエスタンブロットにおいてもバンドは確認されず交差反応をする蛋白質はないと考えられた。
【００５２】
５．ＰＶＬ部分アミノ酸配列の決定
精製ＰＶＬはリジルエンドペプチダーゼ(Lysyl Endopeptidase, 和光純薬工業株式会社製)を用い断片化した。ゲル濾過により断片化したポリペプチドを分離した。４個のペプチド断片の部分アミノ酸配列が決定された。これらは後述するように、塩基配列から予測されるアミノ酸配列と合致した（図３）。
【００５３】
＜２＞ムジナタケｃＤＮＡの調製
１．ムジナタケ子実体λgt11cDNAライブラリーの調製
ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５００ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、新鮮なムジナタケ子実体をタンパク質変性剤存在下でポリトロンホモジナイザーで破砕し、細胞全ＲＮＡを抽出した。エタノール沈澱後細胞全ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【００５４】
全RNAからのmRNAの精製はPoLyATract mRNA単離システム(プロメガ(Promega)社製)を用い、方法は添付のプロトコールに従った。精製したmRNAからのcDNAの合成はRiboClone cDNA Synthesis Systems AMV RT（プロメガ(Promega)製のキット）を用い、当該キットに添付の試薬を使用した。50mM Tris-HCl(pH8.5), 50mM KCl, 10mM MgCl2, 500μM スペルミジン(spermidine), 10mM ジチオトレイトール(DTT), 1mM dNTPsに加え、1μg ランダムプライマーを加えた後、25ユニット(U) RNasin、4mM リン酸ナトリウム、30U AMV RT(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase)を加えて、1時間37℃でインキュベートした。その後、反応液に最終濃度で40mM Tris-HCl(pH7.2), 90mM KCl, 3mM MgCl2, 3mM DTT, 50μg/ml BSAを加え、0.8U RNase H、23U DNAポリメラーゼIを加えて、14℃で２時間インキュベートした。その後、反応液を10分間、70℃においてcDNAを変性させ、2U T4DNAポリメラーゼを加えて10分間、37℃でインキュベートした後、反応液に最終濃度で20mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて反応を停止させた。フェノール抽出、エタノール沈澱を行った後、10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA(TE緩衝液)に溶解した。cDNAにEcoRIアダプター(プロメガ(Promega)製)を結合し、λgt11ベクターアーム(プロメガ(Promega)製)と結合した。得られたDNAをGigapackIII Gold Packaging Extract(ストラタジーン(Stratagene)社製)を用いてパッケージングし、大腸菌Y1090に感染させた後ファージを回収し、λgt11ライブラリーを調製した。
【００５５】
２．抗ＰＶＬ抗体を用いたcDNAライブラリーのスクリーニング
ＬＢ(Luria Broth)培地中で一晩培養したY1090にλgt11cDNAライブラリーの1.5×104を感染させ15mmプレートにまいた後、42℃で3.5時間インキュベートした。10mM イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside；以下IPTGともいう)溶液に30分間浸しておいたニトロセルロース膜（ミリポア(Millipore)社製）を静かにプレートにのせ、さらに37℃で3.5時間インキュベートした。ニトロセルロース膜を静かにプレートからはがした後、ＴＢＳＴで２回洗浄した。１％ BSAを含むＴＢＳＴ中に移し、室温で1時間ブロッキングした。ＴＢＳＴで１回洗浄した後、抗ＰＶＬ抗体と室温で30分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギIgG抗体(プロメガ(Promega)製)を含む溶液中で30分間室温でインキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、さらにＴＢＳで１回洗浄した。ニトロブルーテトラゾリウム(Nitro blue Tetrazolium；NBT)及びブロモクロロインドイルフォスフェート(Bromochloroindoyl phosphate；BCIP)を含むアルカリフォスファターゼ(alkaline phosphatase；AP)溶液(100mM Tris-HCl(pH9.5), 100mM NaCl 5mM MgCl2)で発色反応を行った。適当な発色が得られたところで20mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA溶液中にニトロセルロース膜を移して発色反応を停止させた。得られた陽性プラークからファージを抽出してY1090に感染させ上記と同様の操作を繰り返して陽性クローンの精製を行った。
【００５６】
３．ＰＶＬcDNAクローンの単離
調製したムジナタケcDNAライブラリーをスクリーニングし、1.4x105 プラーク形成単位(pfu)のプラークから６つの陽性プラークを検出精製した。各々のクローンからcDNAを単離し、EcoRIを用いて切断した後、アガロース電気泳動にてインサートの分子量を確認した。最長のインサートをもつクローンはλPVL231とλPVL2111でインサートの長さはどちらもほぼ同じでおよそ1300bpであった。λPVL511,λPVL3121,λPVL2221のインサートの長さは各々概算で700bp,300bp,250bpであった。λPVL611については電気泳動ではインサートと思われるバンドは確認できず、100bp以下の長さであると考えられた。ＰＶＬの分子量は40kDaであることから(Kochibe,A. and Matta,K.(1989),J.Biol.Chem.,264,173-177)、予想されるＰＶＬのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の長さは1200bp程度と考えらるのでλPVL231とλPVL2111は目的とするＰＶＬをコードする塩基配列の全長か、もしくはそれに近い長さを含むものであると推測された。
【００５７】
＜３＞ＰＶＬクローンの配列の確認
１．ＰＶＬcDNAの塩基配列の決定
λPVL231とλPVL2111からインサートをEcoRI処理によって取り出し、pBluescript SK(+)（ストラタジーン(Stratagene)製）の EcoRIサイトに挿入し、各々SKPVL231とSKPVL2111を作成した。これらを種々の制限酵素で切断し電気泳動で確認した結果この２つのクローンのインサートは同じパターンを示した(データは示していない)。そこでSKPVL231を中心に解析を行うことにした。塩基配列の決定はABI Prism Primer Cycle Sequencing reaction Kit(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用いて行った。また、サーマルサイクラーはGeneamp PCR system 9600(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用いた。シークエンサーは、model 373A(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用いた。決定された塩基配列の解析は、Wisconsin DNA analysis program(The Wisconsin Sequence Analysis PackageTM)を用いて行った。図２に示すようにインサートをRsaI,HindIII,SalIで消化することによって得られた7つのフラグメントをpBluescript SK(+)に挿入して7つのサブクローンを作成し、その7つのサブクローンについてM13-20プライマー(プロメガ(Promega)製)、及びM13リバースプライマー(プロメガ(Promega)製)を用いて双方向から各々について数回づつシークエンシングし、各々のサブクローンのインサートの塩基配列を決定した。さらにSKPVL231のインサートの全塩基配列を確定するために、得られた情報から図２に示す13のプライマーを作成し、それらを用いてインサート全長の塩基配列を決定した。
【００５８】
２．ＰＶＬcDNAの塩基配列の解析
塩基配列解析の結果を図３に示す。インサートDNAの全長は1256bpで、ポリＡテール及びそれに関するシグナルは含まれなかった。これはライブラリー調製の際にランダムプライマーを使用したためと考えられる。得られたインサートDNAの塩基配列についてＯＲＦを検索した結果、900bp以上のＯＲＦは一つしか確認されず、6つのフレームの内4つのフレームについては500bp以下のＯＲＦしか確認されなかった。また残りの1つのフレームには開始コドンも終始コドンも確認されず、より大きなＯＲＦの一部分とも考えられたが、アミノ酸配列の解析で得られた配列がこの中には全く含まれないことと、1256bpだけでアミノ酸に換算すると43kDa以上の分子量となり、アミノ酸配列解析で得られたアミノ酸配列を含むより長いＯＲＦは考え難く、目的の物質をコードしているとは考えにくい。ＰＶＬをコードしていると考えられるＯＲＦは塩基数にして1206bpでアミノ酸に換算すると402残基であった。塩基配列から予想されるアミノ酸配列はＰＶＬの酵素消化によるフラグメントのアミノ酸配列解析から得られた4つのペプチドの部分アミノ酸配列が全て含まれていた(図３の太下線)。また、このＯＲＦの中には先頭のATG配列の他に5つのATG配列が存在するが、これらを開始コドンとするとその内のもっとも長いＯＲＦでも、アミノ酸配列解析で得られた配列を含まない配列が存在し、この結果と一致しない。ＰＶＬをコードしていると思われるＯＲＦの塩基配列から予想される分子量は43006.88であり、SDS-PAGEやゲルフィルトレーションで推定されている分子量(40k)よりも大きかった。
【００５９】
＜４＞ＰＶＬcDNAの発現
SKPVL231からHindIIIで切断して得られたフラグメントを発現ベクターPinpoint Xa-1(プロメガ(Promega)製)のHindIIIサイトに挿入してpPPVL231を作成した。このプラスミドで大腸菌JM109を形質転換した。この形質転換した大腸菌を50μg/ml アンピシリンを含むＬＢ(LBamp)で一晩前培養し、100mlのLBampに1mlの前培養液を添加し、37℃で1時間振とう培養後、最終濃度が100μMとなるように IPTGを加えて、さらに4時間振とう培養した。培養液の100μlを取り、室温で10,000×g、5分遠心後、上清を捨てた。ペレットに、50mM Tris-HCl, ２％ SDS, 20％ グリセロール, 5％ β-メルカプトエタノール, 0.002％ BPBの緩衝液を加えて撹拌し、95℃で5分間煮沸した。この後、SDS-PAGE及びウエスタンブロットで解析を行った。
【００６０】
発現ベクターpPPVL231の構造を図４に示す。発現ベクターPinpoint Xa-1は大腸菌内でビオチン化を受けるペプチドの融合蛋白質を発現する。このベクターのビオチン化ペプチドの下流のHindIIIサイトに挿入されたインサートはＰＶＬcDNAのＯＲＦの最初から23bp、アミノ酸にして8アミノ酸残基を欠いている。SDS-PAGEによる解析では、pPPVL231で形質転換した大腸菌の抽出物ではベクター(Pinpoint Xa-1)のみで形質転換した大腸菌の抽出物では認められない53kDaのバンドを確認した。また、ウエスタンブロットによる解析では同じ53kDaのバンドが特異的に抗ＰＶＬ抗体と反応し、ベクター(Pinpoint Xa-1)のみを導入した大腸菌の抽出物には抗ＰＶＬ抗体と反応するバンドは確認されなかった。
【００６１】
本組換え融合タンパク質を、PinPoint protein purification system(プロメガ(Promega)社製のキット)に含まれるアビジン樹脂（Softlink SoftRelease Avidin Resin；プロメガ(Promega)社製）を使用し、キットに添付の公知のプロトコールに従い精製して組換えＰＶＬを得た。この組換えＰＶＬは、レクチン活性及びアガラクトＩｇＧ結合性を示した。
【００６２】
【調製例２】
（アガラクトＩｇＧの調製）
５mgのヒトＩｇＧ、３０mUのストレプトコッカスβ−ガラクトシダーゼ(streptococal β-galactosidase)および０．２１mUのシアリダーゼ(sialidase)を１mlの１００mMクエン酸緩衝液pH６．５に溶解した。つぎに、この混合溶液を３７℃,１８時間反応させた後に、５６℃ １０分間の加熱処理にて反応を停止させた。この溶液に、５〜１０倍量のプロテインＡセルロファイン(Protein A cellulofine；生化学工業株式会社製)結合緩衝液（3M NaCl、1.5M グリシン(pH9.0)）を加えることにより溶液のpHを８．９〜９．２に調整した。つぎに、２gのプロテインＡセルロファインを加えて室温で１０分間穏和に攪拌した。この懸濁液を１０００rpmで１分間遠心分離を行い、プロテインＡセルロファインを回収した。回収プロテインＡセルロファインに１〜２mlのプロテインＡセルロファイン溶出緩衝液（0.1M クエン酸緩衝液(pH５)）を添加して、室温で５分間放置した。つぎに、１０００ｒpmで１分間遠心分離を行い、回収した上清に２M Tris を０．２ml添加した。この溶液をリン酸緩衝生理食塩水（pH７．２〜７．５ 、二価イオン不含；以下、ＰＢＳ（−）と略す）に対して透析し、得られた溶液をアガラクトＩｇＧ標準品とした。
【００６３】
【比較例１】
（既知の測定法によるアガラクトＩｇＧの定量）
アガラクトＩｇＧを直接測定する既知の方法（J.Immunol.,151, 1137-1146(1993))を用いてアガラクトＩｇＧの測定を行った。すなわち、市販のプロテインＧを０．１M 炭酸緩衝液(pH ８．５〜９)中に２０μg/mlに希釈し、この溶液５０μl（１μg／ウエル）ずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク(Nunc)社製）の各ウエルに加え、４℃で１６時間静置することにより、均一にコーティングした。
【００６４】
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウエルのプロテインＧが固着していない部分を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。
【００６５】
次いで、このプレートを洗浄液（０．０５％トゥイーン２０（Tween 20；和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳ (−)）で３回洗浄後、調製例２で精製されたアガラクトＩｇＧの種々の濃度の標準液（１．２５〜２０μg/mlの各濃度）５０μl を前記プレートに加え、３７℃で６０分間静置して反応させた。なお、アガラクトＩｇＧ標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ (−)（以下、「反応希釈液」という）を用いた。
【００６６】
この後、このプレートを前記洗浄液にて３回洗浄し、反応希釈液で希釈した４０μg/mlビオチン標識ＰＶＬ２５μl、および反応希釈液で１２５０倍に希釈したストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（生化学工業株式会社製）２５μlを加え、３７℃で６０分間静置して反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（モス社製：以下、ＴＭＢと略す）を５０μl加え、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。
【００６７】
発色後、プレートに１Ｎ−ＨＣｌを５０μl 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長４５０nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ４５０／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業株式会社販売）にて測定した。得られた結果を図５に示す。
【００６８】
これにより、本測定法によれば、１．２５〜２０μg/mlのアガラクトＩｇＧの定量が可能であることがわかる。
【００６９】
【実施例１】
（アガラクトＩｇＧの定量）
調製例１で精製されたＰＶＬまたは市販のＰＶＬを１０％グリセロールを含む０．１Ｍ 炭酸緩衝液（pH ８．５〜９）で２０μg/mlに希釈し、この溶液５０μl（１μg／ウエル）ずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク(Nunc)社製）の各ウエルに加え、４℃で１６時間静置することにより、均一にコーティングした。
【００７０】
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウエルのＰＶＬが固着していない部分を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。
【００７１】
次いで、このプレートを洗浄液（０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ (−)）で３回洗浄後、調製例２で精製されたアガラクトＩｇＧの種々の濃度の標準液 （０．１２５〜２μg/mlの各濃度）５０μl を前記プレートに加え、３７℃で６０分間静置して反応させた。なお、アガラクトＩｇＧ標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ (−)（以下、「反応希釈液」という）を用いた。
【００７２】
この後、このプレートを前記洗浄液にて３回洗浄し、反応希釈液で希釈した０．３μg/ml ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（生化学工業株式会社販売）５０μlを加え、３７℃で６０分間静置して反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液を５０μl 加え、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。
【００７３】
発色後、プレートに１N HC1 を５０μl 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長４５０nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ４５０／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業株式会社販売）にて測定した。得られた結果を図６に示す。
【００７４】
これにより、本発明の測定法によれば、０．１２５〜２μg/mlのアガラクトＩｇＧの定量が可能であることがわかる。比較例１で示した測定法に比べて約１０倍高感度であり、また、高価なプロテインＧおよびＰＶＬ自体の凝集性のため調製が困難なビオチン標識ＰＶＬが不要である点より、本発明の測定方法は高感度かつ簡便なアガラクトＩｇＧの測定法であることが判明した。
【００７５】
【実施例２】
（各種単糖類の測定系への影響）
アガラクトＩｇＧ標準溶液（２．５μg/ml）に最終濃度５０ｍＭになるように、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｕｌｃｏｓｅ）、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）あるいはマンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）を加えて、実施例１の測定方法に準じて測定を行い、各種単糖類の測定系への影響を検討した。得られた結果を図７に示す。なお、上記単糖類を添加しない際に得られる値を１００％とし、各単糖類が存在する条件下で得られた値を残存率として百分率（％）で示す。図７から、５０ｍＭのＧｌｃＮＡｃ存在で約５０％の阻害を受けることが明らかである。他の単糖類では全く影響を受けず、このことは、本測定方法がアガラクトＩｇＧ分子中に存在する複合型二本糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃとの結合を介した測定方法、すなわちアガラクトＩｇＧを直接的かつ特異的に測定できる方法であることを意味する。
【００７６】
【実施例３】
（健常人、変形性膝関節炎、慢性関節リウマチおよび肝疾患患者の血清中アガラクトＩｇＧの定量）
健常人（１０例）、変形性膝関節炎（以下ＯＡと略す）患者（１０例）、慢性関節リウマチ（以下ＲＡと略す）患者（１０例）および肝疾患患者(１５例)の各血清中に存在するアガラクトＩｇＧの定量を実施例１に記載した方法に従って測定した。得られた測定結果を表１および図８に示す。表１および図８より、ＲＡ患者の血清中のアガラクトＩｇＧの平均値は、健常人に比べ、約２倍の高値を示した。さらにＯＡ患者の血清のアガラクトＩｇＧは健常人のそれとほとんど変化のない値を示した。また、肝疾患患者血清は健常人血清のアガラクトＩｇＧに比べてやや低い傾向を示した。これらの結果より、血清中のアガラクトＩｇＧを測定することにより、これらの疾患からＲＡを特異的に鑑別診断することが可能であることが示された。
【００７７】
【表１】
0003889463.tif 000002
【００７８】
【実施例４】
（本発明のアガラクトＩｇＧ測定キット）
アガラクトＩｇＧ測定キットを下記のものから構成する。
１．レクチン固相化プレート  １枚
２．標準アガラクトＩｇＧ溶液
10μg/ml    0.5ml 凍結乾燥品  １本
5μg/ml    0.5ml 凍結乾燥品  １本
2.5μg/ml  0.5ml 凍結乾燥品  １本
1.25μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品  １本
0.6μg/ml  0.5ml 凍結乾燥品  １本
0.3μg/ml  0.5ml 凍結乾燥品  １本
なお標準アガラクトＩｇＧ溶液は、１％ BSA（PBSで溶解したもの）、0.05％ Tween 20及び0.05％プロクリン（イワキ販売、Supelco Inc.製）の混合溶液で調製後、凍結乾燥した。
３．ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液      10ml  １本
４．ＴＭＢ溶液  10ml  １本
５．反応停止液（1N HCl）  10ml  １本
６．検体希釈液原液（５倍に希釈して用いる）  40ml  １本
この検体希釈液原液の成分は、５％ BSA（５倍濃度のＰＢＳで溶解したもの）、0.25％ Tween 20及び0.25％ プロクリンの混合溶液である。
７．洗浄液原液（５倍に希釈して用いる）  40ml  １本
この洗浄液原液の成分は、0.25％トゥイーン２０を含む５倍濃度のＰＢＳ (−)である。
８．管理標準溶液（血清）  50μl  １本
【００７９】
【発明の効果】
本発明のアガラクトＩｇＧの測定方法により、血清等の検体に含まれるアガラクトＩｇＧを直接的、特異的、極めて高感度、低コストかつ簡便に測定することが可能であり、またレクチンの標識やレクチンの不安定性についての問題を排除することができる。本測定方法に基づく検出法は、関節炎の診断においてＯＡかＲＡかを正確に識別できる特異的検出法として有効な方法である。また、本発明キットも同様な利点を有するキットとして極めて有用である。
【００８０】
また本測定法において、抗実験動物ＩｇＧ抗体を用いることにより、ＲＡのモデル動物（例えば、薬物によりＲＡを誘導したモデル動物や、ＲＡを自然に発症するモデル動物）におけるアガラクトＩｇＧの測定が可能であり、ＲＡ発症の原因解明および医薬品開発の有用な評価方法となる。
【００８１】
【配列表】
0003889463.tif 000003
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0003889463.tif 000005
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【００８２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ．作成した抗ＰＶＬ抗体のＰＶＬとの反応性をＥＬＩＳＡ法により示す。
Ｂ．作成した抗ＰＶＬ抗体の反応性特異性をウエスタンブロット法により示す（電気泳動写真）。
【図２】ＰＶＬｃＤＮＡクローン、SKPVL231の塩基配列決定の基本戦略（シークエンシング・ストラテジー）を示す。
【図３】ＰＶＬｃＤＮＡクローンの塩基配列とアミノ酸配列、及びＰＶＬ部分アミノ酸配列との対応を示す。
【図４】ＰＶＬ発現プラスミドの構造模式図を示す。
【図５】比較例１のアガラクトＩｇＧの標準曲線を示す。
【図６】実施例１のアガラクトＩｇＧの標準曲線を示す。
【図７】実施例２の各種単糖類の測定系への影響を示す。
【図８】実施例３の健常人、ＯＡ患者、ＲＡ患者および肝疾患患者の血清中のアガラクトＩｇＧ濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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