(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織中の生細胞の核内に、遊離したヌクレオチドを送達するための、以下の手段を含む装置：
a)ウイルスベクターの非存在下で該遊離したヌクレオチドを保持する貯水部、
b)一定の注入圧力下において該組織の該生細胞間の細胞外環境に該遊離したヌクレオチドを注入するための注入手段、ならびに
c)それにより該ヌクレオチドの該生細胞内への取り込みおよび局在化ならびに該生細胞の核内への該遊離したヌクレオチドの局在化が容易になる一定のインキュベーション圧力下における該組織の維持および該組織が圧力傷害を受けることを防止するのに十分に非透過性である、該組織の密封のための被膜。
【請求項２】
被覆と組織との間に液体が存在する、請求項１記載の装置。
【請求項３】
被覆と組織との間の領域からの漏出を防ぐために該被覆に配置された密封手段をさらに含む、請求項１記載の装置。
【請求項４】
ヌクレオチドを注入する前に組織によって占められる空間から液体および気体を排除するための洗い流し手段をさらに含む、請求項１記載の装置。
【請求項５】
洗い流し手段に、非透過性被覆と非透過性被覆を通して洗い流し用の気体を通過させるためのポンプ輸送手段とが含まれる、請求項４記載の装置。
【請求項６】
組織が生存している動物に属する、請求項５記載の装置。
【請求項７】
ヌクレオチドが懸濁液中にて提供される、請求項１記載の装置。
【請求項８】
ヌクレオチドが溶液中にて提供される、請求項１記載の装置。
【請求項９】
ヌクレオチドが、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項１記載の装置。
【請求項１０】
注入手段がカテーテル系である、請求項１記載の装置。
【請求項１１】
カテーテル系に、組織を含む領域を密封するための閉塞手段がさらに含まれる、請求項10記載の装置。
【請求項１２】
閉塞手段に膨張可能なバルーンが含まれる、請求項11記載の装置。
【請求項１３】
インビトロにおいて、ウイルスベクターの非存在下で生細胞の核内に遊離したヌクレオチドを送達するための、以下の手段を含む装置の使用：
a)加圧槽、
b)該生細胞および該遊離したヌクレオチドの保持のために該加圧槽の内部に配置された皿、ならびに
c)該加圧槽の内部に一定のインキュベーション圧を確立し、それによって該生細胞への該遊離したヌクレオチドの取り込みおよび該生細胞の核内への該ヌクレオチドの局在化を引き起こすための加圧手段。
【請求項１４】
ヌクレオチドが懸濁液中にて提供される、請求項13記載の使用。
【請求項１５】
ヌクレオチドが溶液中にて提供される、請求項13記載の使用。
【請求項１６】
ヌクレオチドが、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項13記載の使用。
【請求項１７】
エクスビボにおいて、ウイルスベクターの非存在下で組織中の生細胞の核内に遊離したヌクレオチドを送達するための、以下の段階を含む方法：
a)送達されるヌクレオチドの、注入手段内部への配置、
b)該注入手段から該生細胞間の細胞外環境への該ヌクレオチドの注入、ならびに
c)該生細胞内への該ヌクレオチドの取り込みおよび該生細胞の核内への該ヌクレオチドの局在化を引き起こすための、保護手段を有する該組織の周囲への一定のインキュベーション圧の確立。
【請求項１８】
エクスビボにおいて、ウイルスベクターの非存在下で組織中の生細胞の核内に遊離したヌクレオチドを送達するための、以下の段階を含む方法：
a)該生細胞間の細胞外環境へのヌクレオチドの配置、ならびに
b)該生細胞内への該ヌクレオチドの取り込みおよび該生細胞の核内への該ヌクレオチドの局在化を引き起こすための、加圧手段を有する該組織の周囲への一定のインキュベーション圧の確立。
【請求項１９】
一つの生物体の全体が加圧手段の中に配置される、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、インビボおよびエクスビボの双方における、組織の細胞内へのヌクレオチドの送達の分野に関し、特に、外因性ヌクレオチドの細胞への取り込みおよび細胞核内への局在化をもたらすための制御された圧力の使用に関する。
先行技術の説明
デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）などの外因性ヌクレオチドを生体組織の細胞へ効果的に送達することは、高度の医療および研究において極めて重要な問題となってきている。トランスフェクションまたはその他の遺伝的もしくは薬学的な操作のためには、インビボおよびエクスビボの双方において、遊離した核酸を細胞内に送達する必要がある。核酸を含む薬物の効果を発揮させるには、それを生体組織の細胞に組み込ませる必要がある。実際には、多くの応用例において、ヌクレオチドを細胞の取り込むだけでは不十分であり、その核内に局在化させる必要がある。
残念ながら、現在のところ、非損傷組織の細胞内への外因性ヌクレオチドの効果的な送達を容易にするために利用できる方法または装置はない。特に、ヌクレオチドの効果的な取り込みおよび核への局在化を確実に行うための既知の方法または装置は現在のところ皆無である。一方、細胞群にDNAを単純に曝露した際に取り込みおよび局在化を生じるのは、細胞のごく一部、一般的には5％未満である。
ヌクレオチドを送達するための最も一般的な方法は、DNAと複合体を形成することによって細胞内へのDNAの進入およびその後の核への局在化を促進する、陽イオン性脂質などの製剤によるものである。現在までのところ、これらの製剤では、インビボまたはエクスビボのいずれかで、非損傷組織において10％よりも高い効率でトランスフェクションが達成された例は報告されていない。さらに、これらの製剤の多くは有毒または有害であることが知られているため、生体組織に製剤自体を曝露することは望ましくない。
もう一つの送達方法は、DNAをカプセルで包むことに基づく。例えば、スゾカ（Szoka, Jr）らは米国特許第4,394,448号において、DNAまたはその断片を生細胞に挿入する方法について記載している。まず、DNAまたはその断片を水性混合物として調製する。続いて、この水性混合物を脂質小胞形成性組成物と有機溶媒との混合物に添加する。その結果、DNAは小胞中に被包化され、これが生じた後で、この小胞を標的細胞と接触させる。その接触によって挿入が起こる。この方法および関連した変法のトランスフェクション効率は現時点でも非常に低い。
インビボでの取り込みのために用いることができる、DNA送達のさらにもう一つの方法は、DNAをウイルスベクターに組み込み、続いてそれを標的細胞に感染させることに基づく。これによって達成されるDNAの送達比率は、脂質製剤を用いた場合よりも高いが、ウイルスベクターの使用には多くの危険性が伴う。ベクターは、潜在的に有毒である可能性があり、免疫的な副作用を有する場合も多く、その中には依然として未知のものもある。したがって、この方法は、研究においては一般化しているが、一般的な臨床適用、特にヒトへの使用には許容され得ないと考えられている。
最後に、サンフォード（Sanford）らにより米国特許第5,179,022号および第5,204,253号において開示されている方法では、生細胞に生体材料を送達するために、加速された射出微粒子（microprojectile）を用いている。このうち前者の特許では、第1の真空槽によって射出微粒子に速度を加え、受け取り板（receiving plate）によってそれを偏向させ、板の開口部を通して第2の真空槽に移動させる。第2の真空槽の中で、射出微粒子は生体材料に進入し、続いてその内部に取り込まれる。後者の特許によれば、この射出微粒子は、「低温性の」ガスショック−外界温度の気体から生じるガスショック波によって加速される。加速された射出微粒子は標的となる細胞または組織の表面を貫通し、それらの内部に取り込まれる。
この遺伝子銃による方法にはいくつかの欠点がある。第1に、これは高度の衝突エネルギーをもたらすため、インビボおよびエクスビボのいずれにおいても、非損傷組織への使用には適していない。第2に、射出微粒子は最初の衝突時に運動エネルギーの大部分を失うため、組織内では容易には移動しない。また、組織内で粒子を加速させることができる方法も開発されていない。
発明の目的および利点
上記の点を考慮して、本発明の目的は、インビボおよびエクスビボの双方において、外因性ヌクレオチドを組織の細胞内に効果的に送達するための方法および装置を提供することである。特に、本発明の方法および装置により、多くの状況において、曝露した細胞の中で核への局在化を生じるものの比率が90％を超えるという高い送達効率が可能となる。
また、外因性であって潜在的に有毒な物質を必要とせずに、溶液中の純粋なヌクレオチドの送達を可能にすることも本発明の目的である。特に、本発明は、ヌクレオチドと複合化するためにこれまで必要であったウイルスベクターおよび外来性の粒子または物質を必要としない。また、遺伝子銃を用いる技術の場合のように、高速の外来性材料に細胞が曝露されることもない。
本発明のさらにもう一つの目的は、ヌクレオチドを送達するための、コストが低く、構造が単純で、かつ操作しやすい装置を実現させることである。
これらをはじめとするその他の目的および利点は、以下の説明および添付した図面を考慮することによってさらに明瞭になると思われる。
発明の概要
驚くべきことに、細胞外ヌクレオチドの存在下で、非損傷組織中の生細胞を圧力下に置くことによって、細胞核内への該ヌクレオチドの取り込みおよび局在化が起こることが明らかになっている。したがって、本発明によるヌクレオチド送達系では、組織中の細胞を、ヌクレオチドを含む高圧の液体環境下に置く。本発明では、溶液の送達および組織の加圧のために、種々の異なる系を使用する。いくつかの態様において、送達系および加圧系は同一の系である。このことは、組織中にヌクレオチド溶液を注入するための注射器様の器具を用いることによって達成される。その他の態様において、加圧系は気体槽または機械的な万力であり、送達系は、管状構造を閉塞させ、管状構造の内部に水密性の区域を作成するためのバルーンが装着されたカテーテルである。
このヌクレオチド送達系は、器管または生物体の全体を含め、一時的に密封することが可能ないかなる組織に対しても作用しうる。多くの態様において、組織は、非透過性で非弾性の被覆を用いて覆うことによって圧力傷害から保護される。その他の態様では、組織は圧力傷害を受けることはないと考えられ、液体の通過部分からそれを密封遮断するだけで十分である。組織が、管状構造またはすでに内包されている空間である管腔を有する器管である場合には、バルーンまたは一時的な結紮（タイラップ（tie-wrap）など）によって密封する必要があるのは、液体の入り口および出口の箇所のみである。
【図面の簡単な説明】
図1は、初期状態における本発明の好ましい態様を示す。
図2は、組織を装着した時の図1のヌクレオチド送達系を示す。
図3は、加圧後の図1のヌクレオチド送達系を示す。
図4は、一つの器管の全体に対して作用する別の態様を示す。
図5は、血管との連結を保ったままの管状組織の区域に対して作用する別の態様を示す。
図6は、シリンジの代わりに機械的加圧手段を用いる別の態様を示す。
図7は、加圧後の図6の態様を示す。
図8は、管状構造の内腔にヌクレオチド溶液を送達するために、2つのバルーンと組み合わせたカテーテルを用いる別の態様を示す。
図9は、バルーンを膨張させた後の図8の態様を示す。
図10は、バルーンが、管状構造の壁にヌクレオチド溶液を送達するための内管を有する、図8の別の態様を示す。
図11は、ヌクレオチド溶液が送達される際のその流れの向きを矢印で示した、図10の態様を示す。
図12は、バルーンを備えた2本のカテーテルを器管の加圧のために用いる別の態様を示す。
図13は、単離した組織または細胞培養物に対して作用する別の態様を示す。
図14は、培養物にヌクレオチド溶液を導入した後の図13の態様を示す。
図15は、培養物を加圧槽の内部に配置した時の図13の態様を示す。
図16は、本発明に従い、ヒト伏在静脈に対してトランスフェクションを行った際のトランスフェクション効率を、加えた圧力の関数として示したものである。
図17は、本発明に従い、ヒト伏在静脈に対してFITC-ODNのトランスフェクションを行った際のトランスフェクション効率に対する、被覆の効果を示す。
図18は、本発明に従い、ヒト伏在静脈に対してIL-6アンチセンスODNをトランスフェクションさせた後の、IL-6蛋白質産生の阻害を示したものである。
図19-Aは、本発明に従い、第1の被験者のヒト伏在静脈へIL-6アンチセンスODNをトランスフェクションさせた後の、IL-6 mRNA産生の阻害を示したものである。
図19-Bは、第2の被験者に対する、図19-Aと同様のグラフである。
図19-Cは、第3の被験者に対する、図19-Aと同様のグラフである。
図20は、本発明に従い、ウサギ頸動脈に対してインビボでトランスフェクションを行った時の、蛍光顕微鏡によって測定したトランスフェクション効率を示す。
図21は、本発明に従い、蛍ルシフェラーゼをコードするDNAを有するウサギ頸動脈に対してインビボでトランスフェクションを行った時のルシフェラーゼ活性を、対照健常細胞および動脈硬化のある細胞のそれぞれについて示したものである。
図22は、本発明の方法に従い、ラット血管平滑筋細胞に対してインビトロでトランスフェクションを行った時のトランスフェクション効率を示す。
図23は、本発明に従い、蛍ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドDNAによって潅流したラット腎臓におけるルシフェラーゼ活性を示したものである。
発明の詳細な説明
図1は、ヌクレオチド溶液送達系の好ましい態様の初期状態を示す側面図である。この態様において、系は、ヌクレオチド溶液40を収容するための貯水部10、およびプランジャー12を備える注射器様の構造を含む。ヌクレオチド溶液には、DNA、RNA、または関連した分子が含まれる。貯水部10は、プランジャー12の反対側で管14と通じている。管14の周囲には、貯水槽10に近い方から順に、活栓16、圧力ゲージ18、収縮した状態の被覆20、およびノッチ22が取り付けられている。ノッチ22は、管14の遠位開口端30と隣接している。被覆20は、組織を圧力傷害から保護するため、透過性および弾性をいずれも有さない。活栓16は、最初は閉塞した位置にあり、溶液40が貯水部10から管14に通過することを防止する。
図2は、管状組織標本24が装着された様子を示したものである。開放端30を、生存状態にある管状組織24の近位端の内側に差し込む。ノッチ22を組織24の近位端の内側に合わせ、組織24が開放端30から抜け落ちることを防止するために、結び目または結紮26Aを施す。続いて、被覆20を引き伸ばして組織24を覆う。結紮26Aは、被覆20および組織24が管14に付着した箇所で、それらの周囲に巻き付ける。この態様において、結紮糸はタイラップ26Aである。
この時点で、活栓16を回して開放位置に合わせ、ヌクレオチド溶液40を管14および被覆20に入れて、被覆20の開放端28を介してすべての気体および液体を洗い流す。この洗い流しを終えた後、水密性密封を行うために、被覆20の遠位開放端28の周囲をタイラップ26Bで結ぶ。この場合には、タイラップ26Bを被覆20および組織24の両者の周囲に巻き付ける。当然ながら、タイラップ26Bを被覆20のみの周囲に巻くことも可能である。しかし、タイラップ26Bは必ず堅く巻き付ける必要がある。
図3は、組織24中のヌクレオチド溶液40を加圧する方法を図示したものである。活栓16を回して開放位置に合わせて、ヌクレオチド溶液40が注入圧力下で被覆20の内部に注入されるように、プランジャー12を押し込む。被覆20の内部の圧力を、一般的には300mmHgから1500mmHgの範囲である、既定のインキュベーション圧に達するまで上昇させる。この時点では活栓16は閉じられている（図示していない）。続いて、組織24を一定時間インキュベートした後、タイラップ26Bの結び目を解いて、加圧を解除する（図示していない）。
図4は、一つの器官に対して作用するヌクレオチド送達系の別の態様を示したものである。この態様においては、保護被覆120によって器官124の周囲を覆う。器官124は、血液を器官に運ぶ動脈112、および血液を排出する静脈114を有する。まず、管14を動脈112の内腔に挿入する。続いて、動脈112および静脈114の周囲を被覆120によって覆う。器官124から液体が漏出するのを防ぐため、動脈112の部位で被覆120の周囲をタイラップ126Aで締結するとともに、静脈114の部位で被覆120の周囲をタイラップ126Bで締結する。タイラップ126Aは、管14を動脈112に差し込むことはできるが、動脈112からの漏出が起こらないよう十分に密封されるようにしっかりと締め付ける。この時点で、ヌクレオチド溶液40を注入し、器官124をインキュベートする。インキュベーション期間の後、タイラップ126Aおよび126Bを除去して、器官124内に血液をもう一度流す。これらの差異を除き、この態様は、好ましい態様の構造および操作と同一である。
図5は、例えば血管などの管状組織の区域に作用する別の態様を示したものである。この態様においては、生きた動物の身体と連結したままの管状構造224の内腔に管14を挿入する。被覆シート220で管状構造224の周囲を覆い、締結具228を用いてシート220の2つのフラップを密着させて管状にする。この態様において、締結具228はヒートシールであってもよい。2本のタイラップ226Aおよび226Bを用いてシート220の周囲を締結する。タイラップ226Aは管14が挿入される部位のシート220の周囲を締結し、タイラップ226Bはシート220のもう一つの端の周囲を締結する。したがって、タイラップ226Aおよび226Bによって、管状構造224の区域230は水密性となる。この時点で、ヌクレオチド溶液40を注入し、区域230をインキュベートする。インキュベーション期間の後、タイラップ226Aおよび226Bを除去して、区域230に血液をもう一部潅流する。これらの差異を除き、この態様は、好ましい態様の構造および操作と同一である。
図6は、送達系および加圧系が異なる図5の別の態様である。図6において、ヌクレオチド溶液40は、管状構造224の内腔に同じ方法で送達される。しかし、タイラップ226Aおよび226Bをシート220上に配置した後で、図7に示すように、シート220の周囲に剛性の管状の外被250を配置して、外被250を取りまくようにして万力252を配置させる。外被250は内周方向に柔軟性があり、それが形作る管の直径は可変性であるが、軸方向には剛性であり、直径が変わった場合でも依然として実質的には管状のままであるようになっている。締め付け用ねじ254によって万力252が締め付けられ、外被250が強固に牽引されて、管状構造224の内部に圧力が生じる。この圧力はインキュベーション期間を通じて保たれ、その後、ねじ254を緩めることによって加圧が解除される。これらの差異を除き、この態様は、図5の態様の構造および操作と同一である。
図8は、カテーテルを介してヌクレオチド溶液が管状構造の内腔に送達される、本発明の別の態様を図示したものである。カテーテル314を管状構造324の内部に挿入する。カテーテル314はその端部316で閉鎖する。端部316から一定の距離を置いた部位には、開口部330が存在する。カテーテル314のポート330の前後には、2つのバルーン332Aおよび332Bが取り付けられている。最初は、バルーン332Aおよび332Bは収縮した状態にある。
図9は、動作時の図8の態様を図示したものである。バルーン332Aおよび332Bは膨張させられ、膨張した箇所で管状構造324を閉塞して、管状構造324の内部に密封された区域334を作り出す。続いて、カテーテル314を通してヌクレオチド溶液340を送達させ、開口部330から排出させる。溶液340は加圧されているため、区域334も加圧される。インキュベーション期間の後、バルーン332Aおよび332Bを収縮させると、区域334は再び減圧される。
図10は、カテーテルに装着されたバルーンが、管状構造の壁にヌクレオチド溶液を送達させるための小型の細管を有する、図8の別の態様を示したものである。図10は、バルーン432がすでに膨張させられた状態のこの態様を示しているが、ヌクレオチドはまだ送達されていない。この態様では、カテーテル314には開口部330はない。バルーン432は、バルーン432の内部に、カテーテル314の区域において孔452と直接連結した細管450を有する。
図11は、動作時の図10の態様を示したものである。加圧されたヌクレオチド溶液440がカテーテル314を通して送達された場合、溶液440は孔452から排出され、細管450を通って移動し、管状構造324の壁に到達する。これらの差異を除き、この態様は、図8の態様と同一である。
図12は、2本のバルーン付きカテーテルを用いて一つの器官を加圧する。図8のもう一つの別の態様を示したものである。バルーン552付きのカテーテル550を、器官524とつながった動脈512に挿入し、バルーン562付きのもう一つのカテーテル560を、器官524からの排出路である静脈514に挿入する。最初は、バルーン552および562は収縮している（図示していない）。それぞれのカテーテルを挿入した後で、それらを膨張させることにより、動脈512および静脈514を閉塞させる。この時点で、加圧されたヌクレオチド溶液540を器官524に送達させる。これらの差異を除き、この態様は、図8の同様と同一である。
図13は、加圧槽を用いる、本発明のもう一つの別の態様を示したものである。図13において、皿610には生体組織の培養物624が含まれる。図14は、加圧されていないヌクレオチド溶液640を培養物624に導入する方法を示したものである。この後、皿610を加圧槽の中に置く。図15に示すように、槽650はまだ加圧されていない。続いて槽650を密閉および密封し、ダクト660を介して二酸化炭素などの加圧気体を槽650に導入し、溶液640および培養物624を加圧する。インキュベーション期間の後、ダクト660を閉鎖して加圧を解除する。この態様は、生物体全体の細胞にヌクレオチドを導入するためにも用いることができる。これを実施するためには、生物体を槽660の内部に置いて、生物体の細胞に取り込ませるためのヌクレオチドを含む加圧気体をダクト660を介して導入する。
本発明の方法のトランスフェクション効率を、種々の異なる圧力および細胞の種類について評価した。以下の実施例は、発明の例示を目的としたものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。以下の考察において用いた略号の一部は次の通りである：CTRL、対照；ELISA、酵素結合免疫収着法；FITC、フルオレセインイソチオシアネート；FITC-ODN、FITC標識オリゴデオキシリボヌクレオチド；IL-6、インターロイキン-6；ODN、オリゴデオキシリボヌクレオチド；PCR、ポリメラーゼ連鎖反応；VSMC、血管平滑筋細胞。数値nは、それぞれのデータポイントについて評価した培養物の数を示す。示した圧力は、標本に加えられた正味の圧力である。
実施例1
本発明の方法に従って、ヒト伏在静脈に対するFITC-ODNのトランスフェクションを行った。図16は、いくつかのODN濃度に対するトランスフェクション効率を、加えた圧力の関数として示したものである。効率は、FITC-ODNが核に局在していることが蛍光顕微鏡によって確認された内膜細胞および内側細胞の総和の比率として測定した。圧力は50〜760mmHgの範囲とし、生理食塩水中のODNの濃度は5〜100μMの範囲とした。n＝6。
実施例2
実施例1の記載と同様の方法を用い、ODNの濃度を20μMとし、圧力を50〜760mmHgの範囲として、トランスフェクション効率に対する被覆の効果を評価した。図17はこの実験の結果を示したものである。n＝6。
実施例3
アンチセンスODNによる器官全体の培養物におけるIL-6産生の阻害を測定することにより、インビトロでの、本発明の方法のトランスフェクション効率を調べた。トランスフェクション後、静脈の区域を24時間インキュベートした。図18は、アンチセンス体をトランスフェンションさせた培養物を含む増殖培地中のIL-6蛋白質の減少を、ELISAによって検出した結果である。図示した減少のレベルは、トランスフェクションを実施していない静脈および非特異的ODNによるトランスフェクションを実施した静脈の対照培養物において認められたレベルに対する相対値である。n＝6。
実施例4
本発明に従って実施したアンチセンスODNのトランスフェクションによって得られるIL-6 mRNA量の減少を測定するために、定量的逆転写PCR法を用いた。ヒト伏在静脈の3つの標本に対してトランスフェクションを実施、アンチセンス体によるトランスフェクションを施した静脈区域におけるmRNAのレベルを、非処理および逆アンチセンス（対照）ODNによるトランスフェクションを施した区域におけるレベルと比較した。3つの標本に関する結果をそれぞれ図19-A、19-B、および19-Cに示した。mRNAレベルが低下したことは、アンチセンスODNによる処置により、配列特異的な効果が得られたことを示している。
実施例5
本発明の方法に従って、ウサギ頸動脈細胞に対して、FITC-ODNによるインビボでのトランスフェクションを実施した。トランスフェクション効率は、トランスフェクションの4時間後、4日後、および7日後に測定したるFITC陽性の核の比率を、時間の関数として示したものが図20であるn＝2〜3。
実施例6
ウサギ頸動脈に対する、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNA構築物によるインビボでのトランスフェクションの実施後に、蛍ルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定した。健常動脈（正常）および動脈硬化を有する血管（CHOL/inj）に対して、加圧下でのトランスフェクションを実施した。対照（CTRL）の動脈は、非加圧下において、ルシフェラーゼ遺伝子を載せたプラスミドに曝露させた。動脈を5日目に採取し、組織ホモジェネートのルシフェラーゼ活性について解析した。解析結果を図21に示した。n＝2〜4。
実施例7
本発明の方法に従い、ラット血管平滑筋細胞（VSMC）に対して、FITC-ODNによるインビトロでのトランスフェクションを実施した。細胞は、大気圧（正味の圧力では0 atm）または2 atmのいずれかに45分間曝露させた。図22は、FITC-ODN濃度が1μMおよび80μMである場合のトランスフェクション効率を示したものである。n＝4。
実施例8
図23は、ラット腎臓細胞への、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAによるインビボでのトランスフェクションの効率に対する、圧力の効果を示したものである。ラットは、腎臓を潅流した後、大気圧（0 atm）または2 atmに30分間曝露させた。腎臓をトランスフェクション後3日目に採取し、組織ホモジェネートのルシフェラーゼ活性について解析した。n＝7。
これまでの説明から、本発明者らのヌクレオチド送達系によって、外来性で有毒な可能性のある物質を用いずに、インビボまたはインビトロで非損傷組織の細胞内に外因性ヌクレオチドを導入できることが理解されたと思われる。特に、この方法では、溶液中の純粋なDNAを、90％を超える効率で細胞に吸収させることができ、状況によっては、組織の正常な機能にも損傷を及ぼさない。さらに、上記のいずれの態様も、一般に入手が可能な道具および方法を用いており、操作も容易である。
概要、派生内容、および範囲
上記の説明には多くの限定的内容が含まれているが、これらは本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならず、むしろその特殊な態様を示したものと解釈されるべきである。その他の多くの改変が可能である。例えば、タイラップの代わりに、縫合結紮、縫合締結、または鉗子などのいかなる封鎖機構を使用してもよい。また、組織は管状である必要はなく、被覆によって容易に覆うことができれば十分である。例えば、被覆がなくても組織が高圧を維持することができる場合などには、被覆は必ずしも常に必要ではない。被覆は、組織の過膨張を起こさずに、組織にヌクレオチドを曝露させることができる点、および組織の小孔や側枝を介したヌクレオチド溶液の漏出による圧力の損失を防止する点で有用である。種々のサイズ、形状、および材質の被覆を用いることができる。さらに、組織に圧力を与えるために締め付けられるよう、被覆は弾性体であってもよい。また、非弾性体も、例えばねじることによって締め付けることができ、それによって内部の圧力を高めることができる。さらに、被覆が組織と接触している必要はなく、被覆と組織との間に液体溶液を導入することもできる。
この系は、生物体を加圧環境下に置くことができる場合には、一つの生物体全体の細胞にヌクレオチドを送達することができる。
さらに、ヌクレオチドは溶液中にあっても懸濁液中にあってもよい。安全ではあるが有効な速度でヌクレオチド溶液を送達するためのサーボ機構によって、プランジャーを自動化することもできる。組織を加圧するもう一つの手段は、膨張させることが可能なバルーンを器官それ自体の内腔に導入することである。圧力は300mmHgと低くてもよく、1500mmHgと高くてもよい。ヌクレオチドが細胞核に局在化され、圧力傷害を防ぐために必要な手段が講じられていれば、それよりも低い圧力も、高い圧力も可能である。
一般的に、本発明の方法には、ヌクレオチドを含むいかなる組成物も用いることができる。このような組成物の例は、DNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プラスミド、アプタマー、改変型のDNAもしくはRNA（例えば、ホスホロチオネートまたはリボザイム）、またはDNAと化学的に会合した蛋白質を含む溶液である。送達されるヌクレオチド配列は、明らかに応用の内容に依存する。例えば、移植片の損傷または移植片の病害を予防するための移植片の処置など、このような応用例は多数ある。このような移植片の例には、バイパス手術において使用される血管移植片が含まれる。種々の応用のために効果的なヌクレオチド配列は当技術分野において周知である。
また、核に送達されるいかなる分子も細胞質を通過する必要があるため、一般的には、本発明の方法は細胞の細胞質にヌクレオチドを送達するために用いることができることは明らかである。
したがって、本発明の範囲は、図示した態様によってではなく、付記した請求の範囲、およびそれらの法的な等価物によって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−Ａ】
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【図１９−Ｂ】
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【図１９−Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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