(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子発現用のプロモーターとしてマレック病ウイルス１型由来の糖蛋白Ｂ（ｇＢ）遺伝子プロモーターを用いた外来遺伝子発現カセットが組み込まれたことを特徴とする、宿主細胞に持続感染可能な組換えヘルペスウイルスであって、該ｇＢ遺伝子プロモーターが、配列番号２に記載の塩基番号４２２ないし３２２から塩基番号６２１までの配列の上流に更に配列番号２に記載の塩基番号６１から３６０の配列を加えた配列からなる、組換えヘルペスウイルス。
【請求項２】
該ｇＢ遺伝子プロモーターが、配列番号２に記載の塩基番号６１〜５５７の配列からなる請求項１記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項３】
該外来遺伝子が、免疫用抗原をコードする遺伝子である請求項１または２記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項４】
該免疫用抗原が、ニワトリのウイルス感染症予防に有効なワクチン抗原である請求項３記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項５】
該外来遺伝子が、生理活性物質をコードする遺伝子である請求項１または２記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項６】
該組換えヘルペスウイルスが、マレック病ウイルスである請求項１または２記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項７】
該組換えヘルペスウイルスが、マレック病ウイルス１型である請求項６記載の組換えヘルペスウイルス。
【請求項８】
請求項１または２記載の組換えヘルペスウイルスからなる動物用生ワクチン。
【請求項９】
請求項３または４記載の組換えヘルペスウイルスからなる動物用多価生ワクチン。
【請求項１０】
動物が鶏である請求項８または９記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物細胞または動物体内において外来遺伝子を発現させることが可能であり、移行抗体の存在下でも持続感染するため宿主の免疫系の攻撃から逃れながら長期間にわたり抗原刺激を続けることができ、それゆえ移行抗体を有する野外動物に対しても有効なワクチンを提供しうる新規な組換え体ウイルスに関する。本発明はまた、該組換え体ウイルスを用いた動物用多価生ワクチンに関する。本発明はさらに、ホルモンやサイトカインなどの生理活性物質を生体内で産生させるためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いる組換え体ウイルスベクターに関する。
背景技術
ワクチネーションの効率化、および生体への遺伝子導入システムの一つとしてウイルスベクターの研究が盛んに行われ、特に養鶏の分野では鶏痘ウイルスを中心としたポックスウイルスの応用の研究が進んでいる。そうした中で、本発明者らは、より効果的なベクターを開発すべく、鶏のヘルペスウイルスの一種であるマレック病ウイルス１型（以下、「ＭＤＶ１」ともいう）のベクター化について検討を行い、その成果について数々の報告を行ってきた。たとえば、ＭＤＶ１ゲノム上で２０カ所以上の部位を検索した結果、外来遺伝子を安定に保持し、かつマレック病に対するワクチン効果に大きなダメージを与えない外来遺伝子挿入可能部位として、ＵＳ１０遺伝子を同定している［特願平４−２０５９３３号（特開平６−２２７５７号）；フォース・インターナショナル・シンポジウム・オン・マレックス・ディジーズ（４th Ｉnternational Ｓymposium on Ｍarek's Ｄisease）（１９９２）、アムステルダム；Ｖaccine １９９４ Ｖol．１２、９５３−９５７］。このＵＳ１０遺伝子にニューカッスル病ウイルスＦ蛋白遺伝子を挿入した組換え体ウイルスは、ＳＰＦ鶏において充分なワクチン効果を示し、その効果は少なくとも接種後２４週にわたって持続する（フォース・インターナショナル・シンポジウム・オン・マレックス・ディジーズ、１９９２、アムステルダム）。この組換え体ウイルスは、移行抗体を保有する鶏においてもマレック病およびニューカッスル病に対して防御効果を示すことを確認しているが、その防御効果はＳＰＦ鶏に比べて若干低下した。すなわち、ＳＰＦ鶏ではニューカッスル病に対して効率よく１００％の防御効果が示されたのに対し、移行抗体を保有する野外鶏では若干低下し、７０〜９０％というレベルであった（カレント・デベロップメンツ・イン・ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・マレックス・ディジーズ・バイラス・ワークショップ（Ｃurrent Ｄevelopments in the Ｍolecular Ｂiology of Ｍarek's Ｄisease Ｖirus Ｗorkshop）、１９９５、フロリダ）。これは、野外雛に組換え体ウイルスを免疫した場合、移行抗体であるニューカッスル病ウイルスおよびマレック病ウイルスに対する抗体によって組換え体ウイルスの体内増殖が抑制されたためであると考えられた。
発明の開示
このように、組換え体ウイルスからなる生ワクチンを移行抗体を保有する動物に接種した際には、移行抗体をはじめとする宿主の免疫系による当該ウイルスの排除もしくはウイルス増殖の抑制を受けるという問題点が存在する。従って、生ワクチンの特性を活かし、免疫系の攻撃から逃れながら長期間にわたり抗原刺激を続けることが可能な組換え体ウイルスへの改良が望まれる。
このような課題を解決すべく、本発明者らは、ＭＤＶ１由来のプロモーターに着目し、マレック病ウイルス（以下、「ＭＤＶ」ともいう）ゲノムからプロモーター遺伝子と考えられる数種の遺伝子をクローニングした。そしてこれらのプロモーター遺伝子を用いて組換え体ウイルスでの外来遺伝子の発現実験を行った。その結果、本発明者らがクローニングした種々のプロモーター遺伝子の中でも、特に糖蛋白Ｂ（以下、「ｇＢ」という）遺伝子（単純ヘルペスウイルスｇＢ遺伝子に相同な遺伝子）プロモーターを用いた場合に、外来蛋白（たとえば、ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白（以下、「ＮＤＶ−Ｆ」ともいう））の発現に優れた効果を示し、さらに動物での免疫効果においては、予想を超えた極めて優れた効果を奏することを見いだした。すなわち、培養細胞でのＦ蛋白の発現量は明らかに従来のプロモーター（たとえば、ＳＶ４０プロモーター）を用いた組換え体ウイルスよりも少ないにもかかわらず、動物（鶏）での免疫原性はこれに反して予想以上に極めて高く、そのニューカッスル病防御効果は従来の組換え体ウイルスを上回り、これまでの課題となっていた移行抗体を保有する野外鶏に免疫した場合でも安定して９５％以上の防御効果を賦与するものであった。
【図面の簡単な説明】
図１はクローニングした推定ｇＢプロモーター断片を示す模式図である。
図２はｇＢ遺伝子上流の塩基配列、並びに塩基配列決定に用いたプライマーおよびＰＣＲ用プライマーの位置を示す。
図３はｇＢプロモーターによりＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現するインサーションベクタープラスミド（ｐＫＡ４ＢＰＦおよびｐＫＡ４ＢＮＦ）の構築を示す。
図４はＵＳ１０ＢＰＦおよびＵＳ１０ＢＮＦにおけるｇＢプロモーター並びにＮＤＶ−Ｆ遺伝子挿入の理論図およびインサーションベクタープラスミドの構築に用いたＡ４断片の位置を示す。
図５は組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦおよびＵＳ１０ＢＮＦ感染ＣＥＦより抽出したＤＮＡを制限酵素ＰstＩで切断した後、ｇＢプロモーターＰ断片または、Ａ４断片をプローブとして行ったサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
図６は組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦ、ＵＳ１０ＢＮＦおよびＵＳ１０ＢＬＦ接種ニワトリ並びに非接種ニワトリの抗Ｆ抗体価ＥＬＩＳＡ値の推移を示すグラフである。
図７は組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦ接種ニワトリの抗Ｆ抗体価ＥＬＩＳＡ値の推移を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
このような免疫実験で優れた感染防御効果を得たことから、本発明で用いられるヘルペスウイルス由来のｇＢプロモーターは下記のような特性を有することが推察された。
まず、本来、マレック病生ワクチンウイルスは、血中に中和抗体が存在するにもかかわらず鶏体内で持続感染し、ＭＤＶに対する高い抗体価を惹起せしめる。この宿主の免疫系から逃れながら抗原刺激を続けるシステムは未解明であるが、一つの可能性としてウイルスが潜伏感染している組織と、ｇＢをはじめとする抗原を発現する組織が異なることが考えられる。すなわち、ウイルスが潜伏している組織では免疫系の標的となる抗原が発現されておらず、その結果、マレック病ウイルスは宿主の免疫監視から逃れていることが推定される。この潜伏したウイルスはしばしば活性化し、おそらく別の組織に感染してウイルス抗原を発現することにより免疫系を刺激し、高い抗体産生を誘導しているものと推定される。
本発明においてクローニングに成功したｇＢ遺伝子プロモーターによって本来その発現が制御されているｇＢは、ウイルスに対する中和抗体を惹起する糖蛋白であり、ＭＤＶ感染鶏は該ｇＢに対する抗体すなわち中和抗体を惹起するが、ＭＤＶはその中和抗体を避けながら持続感染し、抗原刺激を続けることで抗体価は高く誘導されるものと考えられる。すなわち、ｇＢプロモーターは特定の細胞では発現するが、ＭＤＶが潜伏する細胞ではｇＢを発現させず、その結果、ＭＤＶは宿主の免疫を逃れて持続感染することが可能になっているものと考えられた。従って、ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白の発現にこのｇＢプロモーターを応用することで、Ｆ蛋白の発現がｇＢ同様に制御され、その結果、組換え体ウイルスは免疫系からの攻撃を回避しながら持続感染する性状を回復したものと推定される。
これに対して、これまでに本発明者らが構築してきた種々の組換え体ウイルスに組み込まれたＳＶ４０に由来するプロモーターの場合、プロモーター活性自体は強いものの、上記のような発現の制御機構がないために、従来、潜伏が可能であった細胞においてもその表面にＦ蛋白を発現し、その結果、ウイルスは宿主の免疫系の標的となり、組換え体ウイルスは体内から排除されやすくなったものと考えられる。このような状況から、特に移行抗体存在下においては、より速やかな免疫系による排除によって充分な組換え体ウイルスの増殖が達せられなかったものと考えられた。
ＭＤＶ−ｇＢに対応する糖蛋白は多くのヘルペスウイルスに保存されており、いずれのウイルスにおいても感染防御にあずかる抗原であるとされている［エバール（Ｒ．Ｅberl）ら、Ｊ．Ｍed．Ｖirol．２７：３０９−３１６（１９８９）］。このことより、マレック病ウイルスに限らず他のヘルペスウイルスをベクターとして使用する際においてもｇＢ遺伝子のプロモーターを用いることが、目的とする外来遺伝子の効果的な発現と長期的なワクチン効果の持続において非常に有効であると考えられた。好ましい態様としては、用いるヘルペスウイルスに応じたｇＢプロモーター遺伝子（当該ヘルペスウイルスが本来有するｇＢプロモーター遺伝子）を用いることにより効果的な組換え体ヘルペスウイルスを調製することが可能である。そのようなヘルペスウイルスの例としては、ＭＤＶの他に、ヘルペスウイルスサイミリ［デスロシエ（Ｒ.Ｃ.Ｄesrosiers）ら、Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology ５、２７９６−２８０３（１９９４）］、オーエスキー病ウイルス［グラゼンブルグ（Ｋ.Ｌ.Ｇlazenburg）ら、Ｊ.Ｖirology、６９、１８９−１９７（１９９５）］、単純ヘルペスウイルス１型（以下、「ＨＳＶ１」という）［フェデロフ（Ｈ.Ｊ.Ｆederoff）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ５９、１６３６−１６４０（１９９２）］、単純ヘルペスウイルス２型（以下、「ＨＳＶ２」という）［デービッド（Ｊ.Ｂ.Ｄavid）ら、Ｖirology １５５、３２２−３３３（１９８６）］、帯状疱疹ウイルス［ロワ（Ｒ.Ｓ.Ｌowa）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８４、３８９６−３９００（１９８７）］、ウマヘルペスウイルス１型［エリザベス（Ａ.Ｒ.Ｅlizabeth）ら、Ｖirology １８９、３０４−３１６（１９９２）］、ウシヘルペスウイルス１型（以下、「ＢＨＶ１」という）［ウィットベック（Ｊ.Ｃ.Ｗhitbeck）ら、Ｊ．Ｖirology ６２、３３１９−３３２７（１９８８）］、ウシヘルペスウイルス２型（以下、「ＢＨＶ２」という）［ハンマーシュミット（Ｗ.Ｈammerschmitdt）ら、Ｖirology １６５、３８８−４０５（１９８８）］、猫ヘルペスウイルス１型［スペート（Ｒ.Ｓ.Ｓpaete）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８４、７２１３−７２１７（１９８７）、横山直明他、第１１９回日本獣医学会講演要旨集、ｐ１１６（１９９５）］、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、「ＨＶＴ」という）［ソンダーメイジャー（Ｐ.Ｊ.Ｓondermeijer）ら、Ｖaccine、１１、３４９−３５８（１９９３）］、ヒトサイトメガロウイルス（以下、「ＨＣＭＶ」という）［マクドガル（Ｊ.Ｋ.ＭcＤougall）、Ｃytomegaloviruses、Ｓpringer−Ｖerlag、ベルリン・ハイデルベルク］、ヒトヘルペスウイルス６型（以下、「ＨＨＶ６」という）［エリンガー（Ｋ.Ｅllinger）ら、Ｊ.Ｇen.Ｖirol.７４、４９５−５００（１９９３）］、ヒトヘルペスウイルス７型（以下、「ＨＨＶ７」という）［羽田敦子他、第４２回日本ウイルス学会総会演説抄録、ｐ１６６（１９９４）］、エプスタインバー・ウイルス（以下、「ＥＢＶ」という）［デービソン（Ａ.Ｊ.Ｄavison）ら、Ｊ.Ｇen.Ｖirol.６８、１０６７−１０７９（１９８７）］等が挙げられる。
本発明に従えば、上記のようなウイルス接種した宿主細胞内での外来遺伝子の発現の制御という効果に加えて、外来遺伝子発現用のプロモーター遺伝子断片が、通常用いられているＳＶ４０プロモーター遺伝子等に比べると短い遺伝子断片であることから、その分、プラスミドとして構築する際に発現させる構造遺伝子（外来遺伝子）が長い場合にも好都合であり、プラスミド構築、さらには組換え体ウイルス構築を容易に行うことができるという効果も得られる。
以下、ヘルペスウイルスとしてＭＤＶを用いた場合の組換え体ウイルスを例にとり本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ＭＤＶ由来のプロモーターとして、ｇＢ、ＵＳ１０、ＵＳ５３７およびＵＳ４２０［坂口ら、Ｖirus Ｇene ６、ｐ３６５−３７８（１９９２）］をコードする遺伝子の５'側をクローニングし、これらの遺伝子断片を用いて外来遺伝子の発現実験を行った。その結果、これらプロモーターのうち、ｇＢ遺伝子の５'側断片が培養細胞での発現実験において良好な結果を示したことから、以下に記載する通り、ｇＢプロモーターに着目し詳細な検討を行った。
ＭＤＶ１ゲノム上のｇＢ遺伝子の位置はアン・イー・ブックマスター（Ａnne Ｅ.Ｂuckmaster）ら［Ｊ.Ｇen.Ｖirol．６９、ｐ２０３３−２０４２（１９８８）］によって報告されている。その後さらにｇＢ遺伝子とその上流−３６０塩基までの配列が報告されている［ロス（Ｌ.Ｊ.Ｎ.Ｒoss）ら、Ｊ.Ｇen.Ｖirol．７０、ｐ１７８９−１８０４（１９８９）］。しかしながら、そのｇＢ遺伝子の発現に関与するプロモーター領域を同定し、その活性について明らかにした報告はない。そこで、発明者らはまず組換え体ウイルスにおいて必要なプロモーター領域の同定作業を行った。
まず、ロスら［Ｊ.Ｇen.Ｖirol．７０、ｐ１７８９−１８０４（１９８９）］が報告した塩基配列を参考にプライマーを設定し、プライマー伸長法によってさらに上流の塩基配列を解読した。
次に、解読された範囲内で５'側プライマーの設定を、またｇＢ−オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）直前で３'側プライマーの設定を行い、約５００塩基をＰＣＲにより増幅しクローニングした。次に、その下流にＮＤＶのＦ蛋白遺伝子を接続して発現プラスミドを構築した。その際、ＰＣＲで増幅した塩基のうちの３'側半分のみを用いて同Ｆ蛋白遺伝子を発現するプラスミドも構築し、試験に供した。
プロモーター活性の測定法として、まず培養細胞での発現確認を行った。すなわち、鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に該プラスミドを導入し、その発現をＦ蛋白を認識するモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により行った。次にそれぞれのプロモーターを応用した組換え体ウイルスを構築し、組換え体ウイルスにおけるＦ蛋白の発現を確認した。さらに最終的な試験として、各々で得られた組換え体ウイルスを移行抗体保有鶏に接種し、その免疫原性を比較した。その結果、培養細胞におけるＦ蛋白の発現量は組換え体ウイルス間で差がなかったが、鶏に接種した際の免疫原性は予想に反して大きく異なった。すなわち、ＰＣＲで得られた配列すべてを用いた組換え体ウイルスの免疫原性が非常に高かったのに対し、その３’側半分をプロモーターとして用いた組換え体ウイルスでは免疫原性が非常に低いことが示された。
以上のことより、組換え体ウイルスにおいて外来遺伝子の発現に応用すべきｇＢプロモーター領域としては、一般にプロモーター領域としては最小限と考えられる翻訳開始コドンの上流２００〜３００塩基（配列番号２に記載の塩基番号４２２ないし３２２から塩基番号６２１までに相当する配列）程度のみならず、さらに上流に位置する−２６２塩基から−５６１塩基（図２）参照（配列番号１に記載の塩基番号６１〜３６０に相当する配列）内に含まれる転写調節因子を含む領域も併せて非常に重要であると考えられた。すなわち、プロモーターとして最低限必要な配列は、培養細胞でのＦ蛋白の発現結果から考察して、クローニングした約５００塩基の３’側半分程に含まれるが、鶏体内での効果的な発現には上記の５’側半分に含まれる転写調節領域が重要な役割を奏していることが示された。
本発明において外来遺伝子発現に用いられるこのようなプロモーター遺伝子断片の最も好ましい例としては、配列表：配列番号１に記載の塩基番号６１〜５５７の配列を含む遺伝子断片が挙げられる。マレック病ウイルスには種々のサブタイプが存在することから、ｇＢプロモーター遺伝子にもその配列の一部に変異が生じると考えられる。本発明に用いるｇＢプロモーター遺伝子の配列としては、マレック病ウイルスの場合には、配列番号１に記載の上記配列に相同性の高いｇＢプロモーター配列であれば、特に限定なく外来遺伝子の発現に用いることができる。
また、マレック病ウイルス１型以外のヘルペスウイルスにも、ｇＢ蛋白にアミノ酸配列で相同性の高い構造蛋白質が存在し、これらの蛋白を制御するプロモーター配列をも同様に本発明の組換え体ヘルペスウイルス構築に用いることができる。
かかるｇＢプロモーターによって制御されマレック病ウイルスのゲノムに組み込まれる外来遺伝子としては、ウイルス性疾病、細菌性疾病、寄生虫病等各種鶏病疾病のワクチン抗原となり得る蛋白質をコードする種々の遺伝子が挙げられる。たとえば鶏を対象とした多価ワクチンの調製においては、その組み込む外来遺伝子として、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原をコードする遺伝子（たとえばＮＤＶ−Ｆ蛋白またはＨＮ蛋白をコードする遺伝子）、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の糖蛋白をコードする遺伝子、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルス構造蛋白をコードする遺伝子、たとえばＶＰ２をコードする遺伝子またはＶＰ２４３すべてをコードする遺伝子、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のスパイク蛋白をコードする遺伝子並びに伝染性コリーザの原因菌であるヘモフィラス・パラガリナルム（Heamophilus paragallinarum）のＨＡ蛋白をコードする遺伝子等が挙げられる。また、ウイルス性疾病を予防する抗原としては、インフルエンザでは核蛋白（ＮＰ）が血清型を越えて予防効果を示す重要な抗原であることが示されていることから、他のウイルスにおいても核蛋白遺伝子が重要な防御抗原遺伝子である可能性が考えられる。
このように上記に述べたような外来蛋白を発現させるべく、本発明のｇＢプロモーター遺伝子を用いて発現カセットを構築し、これをＭＤＶに組み込めば、ＭＤＶ自身がマレック病ウイルスに対するワクチンとして機能することから、単一のウイルス（組換えＭＤＶ）からなる多価ワクチンが調製される。また、所望により、２価以上のワクチンも調製することが可能であり、単一のウイルスに複数の異なる外来遺伝子発現カセットを導入することにより１種の組換え体ウイルスからなる３価以上の多価ワクチンを調製することも可能である。このようなワクチン調製は、公知の従来技術を応用することで容易に調製することが可能である。
鶏への接種法としては如何なる日齢への接種も可能であるが、本発明の組換え体ウイルスの最大の特徴は移行抗体の存在する孵化直後に接種しても有効性が確保されることである。さらに、発育鶏卵の段階でも接種可能であるが、その時期としては１７〜１８日胎齢が最も適当であると考えられる。
本発明の組換え体ウイルスはまた、上記ワクチン抗原のみならず、接種した動物体内でこれ以外の生理活性蛋白を発現させるためのウイルスベクターとしても有用である。すなわち、本発明の組換え体ヘルペスウイルスは、動物に投与した場合に、一過性の発現系に留まらず、動物体内での免疫系からの攻撃を逃れて持続感染することが可能となることから、外来遺伝子産物を効果的に生体内で産生するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としても極めて有効に作用すると予想される。
以下、調製例および実施例に従い、本発明をさらに詳細に説明する。
［調製例］
（１）ウイルス株
ｇＢプロモーター遺伝子領域のクローニングおよび組換え体ウイルスの作出にはマレック病ウイルス１型ＣＶ１９８８株を用いた。
（２）ウイルスＤＮＡの調製
ウイルスを鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に接種後、細胞変性効果（ＣＰＥ）を強く呈した時点で感染細胞をハーベストした。この感染細胞をプロテイネースＫ（べーリンガーマンハイム）を０．１％含む１％−ＳＤＳ溶液（０．１％トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％サルコシネート（Ｓarcocinate）；和光純薬工業（株））に浮遊させ、３７℃で一晩放置した。その後フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、適当量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解してウイルスＤＮＡ溶液とした。
（３）ウイルスＤＮＡ断片のクローニング
調製したウイルスＤＮＡ５μｇを制限酵素で切断し、０．８％−アガロースゲル電気泳動で各断片を分離した。エレクトロエリューション法によりゲルからＤＮＡ断片を溶出し、フェノール処理、エタノール沈澱により回収した。得られた断片を適当なプラスミドベクター（たとえばｐＵＣ１１９；宝酒造）にライゲーションキット（宝酒造）を用いて挿入し、コンピテントセル（たとえばＪＭ１０９）をトランスフォームして形質転換大腸菌を得た。次に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地（ＢＩＯ１０１、ＩＮＣ．）で培養した後、アルカリ法によって菌体内のプラスミドを回収した。
（４）塩基配列の決定
遺伝子断片をｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位にクローニングした後、ＪＭ１０９等のコンピテントセルに形質導入した。得られたトランスフォーマントをＬＢ培地で一晩培養した後、その３０μｌにＭ１３ファージ（１０9ＰＦＵ／ｍｌ以上）を６０μｌ感染させ、さらに一晩振盪培養した。遠心分離により菌体を除去後上清よりファージを回収し、常法に従い目的遺伝子断片の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を調製した。得られたｓｓＤＮＡをシークエネース（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）Ｖｅｒ．２．０（東洋紡）を用い、添付のプロトコールに従い塩基配列の決定を行った。
（５）ＰＣＲ
ウイルスＤＮＡ０．１μｇを１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む１×ベント（Ｖent）緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＳＯ4）に溶解後、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、各１００ピコモルの上流側、下流側プライマーおよび１μｌのベントＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎew Ｅngland ＢioLabs))を添加した。反応は９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３５回繰り返した。
（６）蛍光抗体法（ＦＡ）
カバーグラス１枚（マツナミ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）Ｎｏ.１ １８×１８）の入った６ウェルプレートにＣＥＦ１０6細胞／ウエルを接種し、ＦＢＳ５％のイーグル培地で３７℃にて５時間培養した。無血清イーグル培地で２回洗浄した後、リポフェクチン１０μｇ、インサーションプラスミド３０μｇを含む無血清イーグル培地１ｍｌを添加して３７℃にて１６時間培養した。さらにＦＢＳ１０％のイーグル培地１ｍｌを添加して２日間培養した後、カバーグラスを取り出し、室温で２０分間アセトン固定後、−８０℃に保存した。組換え体ウイルスにおけるＦ蛋白発現の確認は、抗ＮＤＶ−Ｆモノクローナル抗体＃３１３［海野（Ｙ.Ｕmino）ら、Ｊ.Ｇen.Ｖirol．７１、ｐ１１９９（１９９０）］をＰＢＳ（−）で２０倍希釈したものを４℃で一晩反応させた後、ＰＢＳ（−）で２０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧを３７℃で２時間反応させ、洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察を行った。
（７）組換え体ウイルスの作出
３７℃で一晩培養した初代ＣＥＦをＥＤＴＡ−トリプシン溶液でハーベストおよび洗浄後、５％牛血清（ＢＳ）添加イーグル−ＭＥＭ（Ｅ−ＭＥＭ：日水）培地に２×１０5細胞／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、その４０ｍｌをファルコン社製組織培養フラスコ（Ｎｏ.３０２８）に入れ、これに約８×１０5個のマレック病ウイルス感染ＣＥＦ細胞を接種し、３７℃で４時間培養した。その後、再びＥＤＴＡ−トリプシン溶液で細胞をハーベストしてＰＢＳ（−）で２度細胞を洗浄し、このうち５×１０6個をバイオラド社製ジーンパルサー（カタログＮｏ.１６５−２０７５）のキュベットに移し、インサーションプラスミドを加え、添付のプロトコールに従ってパルスを加え、ウイルス感染細胞にインサーションプラスミドの導入を行った。次に５％ＢＳ添加Ｅ−ＭＥＭ（日水）１５ｍｌに浮遊させ、直径１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製；Ｎｏ.３００３）に移し、３７℃で培養した。翌日、生着していない細胞とともに培地を除去し、新たに前日培養した初代ＣＥＦをハーベストしたもの（第２のＣＥＦ）を５×１０5細胞／ｍｌに浮遊させた５％ＢＳ添加Ｅ−ＭＥＭ（日水）１５ｍｌを添加して３７℃で４ないし７日間培養した。
プラークの出現したシャーレをＥ−ＭＥＭ培地で洗浄後、モノクローナル抗体＃３１３を含む等張液を加え、室温で１時間反応させた。洗浄後、等張液で２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗体（バイオラドコードＮｏ.１７２−１０１１）を加え、さらに室温で１時間反応させた。洗浄後、１０ｍｌ当たり、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ；和光純薬工業（株）、コードＮｏ.３４３−００９０１）５ｍｇと過酸化水素水（三菱瓦斯化学（株）、Ｈ2０2３１％含有）１．６ｍｇを含む０．１Ｍトリス緩衝液を加えて室温で１０〜６０分反応させ、組換え体ウイルスのプラークを染色した。褐色に染色されたプラークの周囲をペニシリンカップで囲い、同カップ内のみを０．１％にＥＤＴＡを含むトリプシン液で消化することにより組換え体ウイルス感染細胞を回収し、新たなＣＥＦと同時培養することにより組換え体ウイルスの純化を実施した。１００％のウイルスプラークがＦ蛋白を発現していることを確認したのち、特願平４−２０５９３３号（特開平６−２２７５７号）記載の方法に従って超音波処理によるセルフリー（cell free）化を２回繰り返して組換え体ウイルスの純化を完全なものとした。
（８）サザンハイブリダイゼーション
ベーリンガーマンハイム社製のＤＩＧ−ＤＮＡラベリングキット（labeling Ｋit）（カタログＮｏ.１５０３５０）を用い、添付のプロトコールに従って、プローブの作製、ならびにハイブリダイゼーションを行った。
上記で得た組換え体ウイルスＤＮＡ適当量を寒天ゲル電気泳動にかけ、泳動後ハイボンドＮ＋（アマシャムジャパン、カタログＮｏ.ＲＰＮ．３０３Ｂ）にトランスファーした。プロトコールに従ってハイブリダイゼーションを行った。その後、ベーリンガーマンハイム社製のＤＩＧ−ＤＮＡデテクションキット（Ｄetection Ｋit)(カタログＮｏ.１５０３５０）を用い、添付のプロトコールに従って、目的ＤＮＡを検出した。
（９）免疫試験
バブコック種の１日齢ヒナに組換え体ウイルス１０4ＰＦＵ／羽を皮下に接種した。各群接種後４週目から経時的に採血し、組換え体ウイルスが惹起する抗Ｆ蛋白抗体価の推移をＥＬＩＳＡにより測定した。ここで用いたＥＬＩＳＡはＦ蛋白を持続的に産生する細胞（β−アクチン遺伝子プロモーターに制御されたＮＤＶ−Ｆ遺伝子によって形質転換されたマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８．６５３）を組織培養用９６ウエルプレートに固相化したものを抗原として用いた抗体測定法であり、特願平５−９６７２７号（特開平６−２８９０２８号）に詳細に示されている。
一方、ニューカッスル病ウイルスに対する感染防御の効果を判定するために、各群の半数のヒナに対し、６週齢時に強毒ＮＤＶ佐藤株１０4致死量で筋肉内攻撃し、２週間観察した。また、マレック病ウイルス１型に対しては、１週齢時に超強毒ＭＤＶ（ｖｖＭＤＶ）株ＲＢ１Ｂ（感染脾細胞）５００ＰＦＵ／羽で腹腔内攻撃し、１０週齢時まで観察した。生残鶏はすべて剖剣して腫瘍病変の有無を調べた。
（１０）鶏体内からのウイルス回収
ヘパリンを吸引した注射器１ｍｌで採血した後、ＰＢＳ（−）を加えて４ｍｌとし、これをコニカルチューブ（ファルコン、カタログＮｏ.２０９９）に入れたフィコール−バック（Ｆicoll−Ｐaque）（ファルマシア）３ｍｌの上に静かに重層し、１５００ｒｐｍにて５分間，遠心分離を行った（クボタ（ＫＵＢＯＴＡ）ＫＮ−３０Ｆ）。リンパ球、単球からなる中間層（バフィーコート（Ｂuffy coat)を分取し、再びＥＤＴＡを０．１％に含むＰＢＳ（−）に懸濁した後、１０００ｒｐｍにて５分間遠心して回収し、これを４時間培養したＣＥＦ（第２のＣＥＦ）に接種し、１０日間培養して観察を行った。ＭＤＶのＣＰＥが認められなかったものに関してはさらに３代目まで継代を重ね判定を行った。
［実施例］
以下、ヘルペスウイルスとしてマレック病ウイルスを用いたベクターを例に、鶏用組換え生ワクチン構築におけるｇＢプロモーター領域のクローニングと組換え体ウイルス構築の例を示す。
実施例１：ｇＢ遺伝子上流領域の塩基配列の決定
ロスらによって記載されたｇＢ遺伝子の塩基配列［Ｊ.Ｇen.Ｖirol．７０、ｐ１７８９−１８０４（１９８９）］を含むＢａｍＨＩ−Ｉ３断片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＳｓｐＩで消化し、得られた約１．２Ｋｂｐの断片をｐＵＣ１１９にサブクローニングした。調製例に従い、プラスミドを用いてｇＢ遺伝子のさらに上流領域の塩基配列の決定を行った。上流方向に約３００ｂｐ読み進んだところで今度は下流方向に塩基配列の決定を行い、ＳｓｐＩサイトが確認されるところまで、合計５５７ｂｐの塩基配列を決定した。これを配列表：配列番号１に示す。配列表：配列番号２における塩基番号５５８から翻訳開始コドンであるＡＴＧ（塩基番号６２４）までは、上記５５７ｂｐの３'側にあたる配列であり、ロスらの上記文献でも報告されているものである。なお、本発明者らが塩基配列の決定に使用したプライマーは配列表：配列番号１の塩基番号２７５から２９１に相当する。
実施例２：ＰＣＲによるｇＢ遺伝子のプロモーター領域のクローニング
プライマーの設定に際し、上流側のプライマーは実施例１で得られた塩基配列（配列表：配列番号１参照）より、下流側プライマーはロスらの報告［Ｊ.Ｇen.Ｖirol．７０、ｐ１７８９−１８０４（１９８９）］に記載されている配列に従って設計した。すなわち、上流側は配列表：配列番号１の６１から８２の間で、下流側は同じく５６６から５８６の間で設計した。各々の配列を以下に示した。
上流側
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下流側
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ＰＣＲの条件は以下のようである。すなわち、ウイルスＤＮＡ０．１μｇを１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む１×ベント緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＳＯ4）に溶解後、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、各１００ピコモルの上流側、下流側プライマーおよび１μｌのベントＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を添加した。反応は９５℃にて１分、５５℃にて１分、７２℃にて１分のサイクルを３５回繰り返した。その結果、約０．５ＫｂｐのＤＮＡ断片が良好に増幅された。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳｓｐＩで消化し、得られた約０．５ＫｂｐのＤＮＡ断片（以下、「Ｐ断片」という；配列表：配列番号１に記載の塩基番号６１〜５５７に相当する配列）、およびＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで消化して得られた２３０ｂｐのＤＮＡ断片（以下、「Ｎ断片」という；配列表：配列番号２の塩基番号３５９〜５８６に相当する配列）をｇＢ遺伝子プロモーター領域として調製した（図１、図２参照）。
実施例３：ｇＢプロモーターによりＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現するインサーションベクタープラスミドの構築
ＳＶ４０後期プロモーターによりＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現するインサーションベクタープラスミドｐＫＡ４ＢＬＦ（特願平４−２０５９３３号（特開平６−２２７５７号）に記載）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで消化後、０．８％寒天ゲル電気泳動によりＳＶ４０後期プロモーター配列を除去したＤＮＡ断片約７．９Ｋｂｐを回収し、ブラントエンドライゲーションキット（タカラ（ＴａＫａＲａ））により平滑末端化した後、ここにｇＢ遺伝子プロモーターＰ断片またはＮ断片をそれぞれクローニングした。得られたプラスミドのうち、ｇＢプロモーターＰ断片を正方向、すなわちＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現するような方向性で有するプラスミドをｐＫＡ４ＢＰＦ、同様にＮ断片を正方向に有するプラスミドをｐＫＡ４ＢＮＦと命名した（図３）。
実施例４：蛍光抗体法によるＮＤＶ−Ｆ蛋白の発現確認
調製例に従い実施したところｐＫＡ４ＢＰＦ、ｐＫＡ４ＢＮＦのいずれもＣＥＦにおいてＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現することが確認された。なお、各プラスミドを導入した細胞間で蛍光の程度に強弱の差はなくＰおよびＮ断片のＣＥＦにおけるプロモーター活性はほぼ同等であるものと推定された。
実施例５：組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦ、ＵＳ１０ＢＮＦの作出
実施例３で構築した各インサーションプラスミドｐＫＡ４ＢＰＦ、ｐＫＡ４ＢＮＦを制限酵素ＳｃａＩにより線状化した後、組換え体ウイルスの作出の項に従ってＣＶＩ９８８株感染細胞に該プラスミドを導入した。その結果得られた組換え体ウイルスをそれぞれ、ＵＳ１０ＢＰＦ、ＵＳ１０ＢＮＦと命名した。組換え体ウイルスのプラークを抗Ｆ蛋白モノクローナル抗体−ＤＡＢによって染色（特願平４−２０５９３３号（特開平６−２２７５７号））した結果、組換え体ウイルスにおけるＦ蛋白の発現量において両者で大差は認められず、ここでも培養細胞におけるＰおよびＮ断片プロモーターの活性は同程度であることが推定された。
得られた組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦ、ＵＳ１０ＢＮＦに関して、発現カセットの挿入位置を確認するために感染ＣＥＦより抽出したＤＮＡを制限酵素で消化後、サザンハイブリダイゼーションを行った。ｇＢプロモーターＰ断片あるいはＡ４断片のいずれをプローブとして用いた場合においても期待したサイズのバンドのみが検出され、発現カセットの挿入が相同的組換えによっていること、および組換え体ウイルスの純化がなされていることが確認された（図４、図５）。
実施例６：免疫試験
作出されたＵＳ１０ＢＰＦ、ＵＳ１０ＢＮＦのニューカッスル病（ＮＤ）に対するワクチン効果を確認するために１日齢の鶏に接種し、６週後に攻撃試験を行った。その結果を表１に示す。ここで対照のひとつとして用いたＵＳ１０ＢＬＦはＳＶ４０後期プロモーターによりＦ蛋白発現が制御されている組換え体ウイルスであり、作出に用いたインサーションプラスミドｐＫＡ４ＢＦの構築法は特願平４−２０５９３３号（特開平６−２２７５７号）に示されている。この組換え体ウイルスはＳＰＦ鶏に対してはＮＤ攻撃に高いワクチン効果を示すが、ヒナが移行抗体をもつ場合には表１に示したようにＮＤ防御効果は低減する。表１に示すように非接種対照鶏、ＳＰＦ非接種鶏の防御率が０％であるのに対し、ＵＳ１０ＢＰＦでは移行抗体を持ったヒナにおいてもすべての個体が防御し、ｇＢ遺伝子プロモーターによりＦ蛋白が発現されている組換え体ウイルスは良好なワクチン効果を示した。しかし、同様のｇＢプロモーターでもｇＢ−Ｐの半分の長さであるｇＢ−Ｎプロモーターを用いた組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＮＦは全く防御効果を示さなかった。培養細胞におけるＦ蛋白発現は、ＵＳ１０ＢＮＦもＵＳ１０ＢＰＦと同レベルであったにもかかわらず、インビボにおいてはＵＳ１０ＢＰＦとＵＳ１０ＢＮＦは防御効果において大きな違いがあった。このことから、生体に投与する組換え体ウイルスにおける外来遺伝子の発現にはｇＢ−Ｐの領域をプロモーターとして用いることが非常に重要であることが示された。
また、マレック病（ＭＤ）に対するワクチン効果に関しては、表２から明らかなように本発明の組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦは超強毒マレック病ウイルス１型に対して９０％の防御率を示し、その親株（非組換え体）の防御率８９％および市販品ＭＤＶ１ワクチンの防御率８４％と比較すると、これらと同等またはそれ以上の防御効果を有することがわかった。
以上のように、本発明の組換え体ウイルスＵＳ１０ＢＰＦはニューカッスル病（ＮＤ）およびマレック病（ＭＤ）の両ウイルスに対して高い防御能を示すことが明かとなり、多価ワクチンとして機能することが確認された。
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ＥＬＩＳＡ法により測定したニワトリ血清中の抗Ｆ抗体価の推移を図６に示した。非接種群の抗体価は移行抗体によるものであり、時間と共に低下していくことが観察された。ＵＳ１０ＢＬＦは、移行抗体価がある程度低下した時点、すなわち５週目から６週目にかけてようやく抗Ｆ蛋白抗体価の上昇が認められた。一方、ＵＳ１０ＢＰＦ接種鶏においては既に４週目から抗体価の上昇が見られ、攻撃時の６週時にはＵＳ１０ＢＬＦとＵＳ１０ＢＰＦの間に大きな開きが認められた。因みにＵＳ１０ＢＮＦは５週から６週に若干の抗体価上昇が見られるが、ニューカッスル病ウイルス攻撃を防御しうる程度のレベルではないと推定され、攻撃試験の結果を裏付けるものであった。
ＵＳ１０ＢＰＦ接種鶏について、１年間にわたる抗Ｆ抗体価の変動を調べ、その結果を図７に示した。調査期間中の抗Ｆ抗体価は、ＵＳ１０ＢＬＦ接種群に対して行ったニューカッスル病ウイルス攻撃試験で７０％の防御率（表１）が得られた時の抗Ｆ抗体価０．６５（図６）を上回っており、ほとんどの個体において、組換え体によるワクチン効果が少なくとも１年間以上持続することが示唆された。
接種７週後に行ったウイルス回収の成績を表３に示した。ＵＳ１０ＢＬＦは０／５（＋）であり全く回収がみられなかったのに対し、ＵＳ１０ＢＰＦは５／５（＋）であり、ウイルス血症の程度が高いことが明らかになり、インビボにおいてＵＳ１０ＢＰＦは良好な増殖性を有することが示唆された。さらに回収された組換え体ウイルスのプラークはすべてＦ蛋白の発現が確認され、本発明の組換え体ウイルスは生体内においても遺伝的に安定で持続感染しうることが確認された。このことは、本発明のウイルスベクターのシステムが単なる一過性の発現系にとどまらず、移行抗体の存在下においても持続感染し、外来遺伝子産物を効果的に体内で産生するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としても極めて優れた系であることを証明するものである。従って、本発明のシステムは単なるワクチン投与のためのベクターにとどまらず、ホルモンやサイトカインといった生体内において長期にわたって供給が必要な物質のＤＤＳとしても極めて有用であるものと考えられる。
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配列表
配列番号：１
配列の長さ：５５７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
起源
生物名：マレック病ウイルス１型
配列
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配列表
配列番号：２
配列の長さ：６２４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
起源
生物名：マレック病ウイルス１型
配列
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配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴
ＰＣＲ用プライマー
配列
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配列番号：４
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴
ＰＣＲ用プライマー
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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