(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子を含む溶液の液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、その液滴中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶生成装置において、
電磁波に対して透過性を有する材料で板状に形成され、生体高分子を含む溶液の液滴およびこの液滴中で生成された生体高分子の結晶を保持する円形枠が形設されたチップ本体を備え、そのチップ本体の円形枠に保持された液滴中で生成され円形枠に保持された生体高分子の結晶をチップ本体ごと結晶構造解析に供し得るようにしたことを特徴とする、生体高分子の結晶生成装置。
【請求項２】
前記チップ本体に取着され、少なくとも一部が生体高分子を含む溶液に対して親和性を有しその一部または全体がチップ本体の前記円形枠内の液滴中に浸漬される溶液保持用補助部材をさらに備えた請求項１記載の、生体高分子の結晶生成装置。
【請求項３】
前記チップ本体の円形枠の縁部に、先端部が円形枠の内縁から僅かに突出して円形枠の中心を指向するように付設され、親水性の先端部を有し周面が疎水性であって少なくとも先端部が円形枠内の液滴中に浸漬される１個もしくは複数個の円錐状の溶液保持用補助部材をさらに備えた請求項１記載の、生体高分子の結晶生成装置。
【請求項４】
前記チップ本体に前記円形枠が複数形成された請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の、生体高分子の結晶生成装置。
【請求項５】
前記チップ本体に、それを結晶構造解析装置の取付部に取り付けるための突出部が形設された請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の、生体高分子の結晶生成装置。
【請求項６】
前記チップ本体に、それを搬送装置によって搬送する際に搬送装置の把持手段がそのチップ本体を支持するための把持部またはそれを人手によって搬送する際に把持用器具でそのチップ本体を支持するための把持部が形設された請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の、生体高分子の結晶生成装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛋白質に代表される生体高分子の結晶を生成させるために使用される結晶生成装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質に代表される生体高分子の三次元立体構造を明らかにすることは、その生体高分子の、生体中における生理機能を解明することができるばかりでなく、合理的な医薬品の開発（ドラッグデザイン）を進める上でも極めて有用である。この生体高分子の三次元立体構造を解析する実用的な手法としては、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法とＸ線結晶構造解析法とがあるが、解析上、生体高分子の分子量に制限の無いＸ線結晶構造解析法が、今後は特に有効であると考えられている。ところが、このＸ線結晶構造解析法では、解析に供するための生体高分子の単結晶を作製しなければならない。しかも、構造解析の分解能を向上させるためには、結晶性の良い単結晶を作製する必要がある。
【０００３】
生体高分子、例えば蛋白質の単結晶を作製する方法としては、現在、蒸気拡散法が広く採用されている。シッティングドロップ蒸気拡散法では、図１１に示すように、１μｌ程度の少量の蛋白質を含む水溶液１をウエル溶液保持プレート２内の凹部３に滴下し（ハンギングドロップ蒸気拡散法では、少量の蛋白質を含む水溶液１を、カバーガラス６の下面側となる面に滴下して付着させ）、また、容器状凹部（ウエル）４の内底部に沈殿剤５を収容しておき、カバーガラス６によって容器状凹部４の上部開口を密閉する。これにより、蛋白質を含む水溶液１は、水分の蒸発によってやがて過飽和状態となり、その水溶液１中で蛋白質の結晶７が析出することになる。
【０００４】
蛋白質の結晶７が得られると、その結晶７は結晶構造解析に供されるが、結晶構造解析においては、Ｘ線回折測定装置によって結晶の回折強度測定を行うために、水溶液１中で成長した結晶７をウエル溶液保持プレート２内の凹部３から取り出す必要がある。このために従来は、まず、図１２の（ａ）に示すように、ナイロンループと呼ばれるナイロン製のリング（直径が１ｍｍ程度もしくはそれ以下である）を具備するツール８を用いて、蛋白質の結晶７を水溶液１の一部と共に凹部３内から取り上げる。通常、この操作は、顕微鏡下で手作業により行われ、図１２の（ｂ）に示すように、ツール８のリング内には、蛋白質の結晶７が水溶液１と共に保持される。次に、図示していないが、ツール８のリング内に保持された水溶液１の水分を抗凍結剤で置換させた後、図１２の（ｃ）に示すように、蛋白質の結晶７および抗凍結剤１’を保持したツール８をマウント用チューブ９に装填する。そして、結晶７を保護するために抗凍結剤１’を急速凍結させ、この後に、図１２の（ｄ）に示すように、ツール８のリング内に保持された蛋白質の結晶７に対しＸ線を照射して回折強度の測定を行う。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
蛋白質に代表される生体高分子の結晶の生成、ならびに、得られた結晶のＸ線回折測定には、上述したような方法が、従来は一般的に用いられている。この従来の方法では、水溶液１中で蛋白質の結晶７が成長すると、その結晶７をＸ線結晶構造解析に供するために、ツール８を用いて個々の結晶７をウエル溶液保持プレート２の凹部３内から取り出し、さらに、専用のマウント用チューブ９に結晶７を装填する必要がある。ところが、この操作は、通常、手作業で行われるため、大量の蛋白質結晶の結晶構造解析を行おうとする場合には、極めて非効率的であって多くの時間がかかり、また、作業者の労力の負担も大きくなる、といった問題点がある。
【０００６】
なお、固体基板の表面上において蛋白質の結晶核の形成を行わせ結晶成長させる不均一核形成反応を利用した方法では、結晶は、固体基板の表面上に吸着された状態で成長する。したがって、大形の結晶にまで成長させた場合には、結晶の下面全体が基板と接着しているため、結晶を取り出す際に、結晶が壊れてしまったり結晶内にクラックが入ってしまったりして、結晶構造解析に使用できなくなる、といった問題点を生じることとなる。
【０００７】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、結晶の生成後において結晶を結晶構造解析に供する際に、結晶生成場所からの結晶の取出しおよび結晶構造解析装置への結晶の装填のための操作を簡略化して、作業の効率を向上させるとともに作業者の労力の負担を軽減させ、また、結晶の取出しおよび装填のための操作を自動化することも可能にする結晶生成装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、生体高分子を含む溶液の液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、その液滴中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶生成装置において、電磁波に対して透過性を有する材料で板状に形成され、生体高分子を含む溶液の液滴およびこの液滴中で生成された生体高分子の結晶を保持する円形枠が形設されたチップ本体を備え、そのチップ本体の円形枠に保持された液滴中で生成され円形枠に保持された生体高分子の結晶をチップ本体ごと結晶構造解析に供し得るようにしたことを特徴とする。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１記載の結晶生成装置において、前記チップ本体に取着され、少なくとも一部が生体高分子を含む溶液に対して親和性を有しその一部または全体がチップ本体の前記円形枠内の液滴中に浸漬される溶液保持用補助部材をさらに備えたことを特徴とする。
【００１０】
請求項３に係る発明は、請求項１記載の結晶生成装置において、前記チップ本体の円形枠の縁部に、先端部が円形枠の内縁から僅かに突出して円形枠の中心を指向するように付設され、親水性の先端部を有し周面が疎水性であって少なくとも先端部が円形枠内の液滴中に浸漬される１個もしくは複数個の円錐状の溶液保持用補助部材をさらに備えたことを特徴とする。
【００１１】
請求項４に係る発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の結晶生成装置において、前記チップ本体に前記円形枠が複数形成されたことを特徴とする。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の結晶生成装置において、前記チップ本体に、それを結晶構造解析装置の取付部に取り付けるための突出部を形設したことを特徴とする。
【００１５】
請求項６に係る発明は、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の結晶生成装置において、前記チップ本体に、それを搬送装置によって搬送する際に搬送装置の把持手段がそのチップ本体を支持するための把持部またはそれを人手によって搬送する際に把持用器具でそのチップ本体を支持するための把持部を形設したことを特徴とする。
【００２１】
請求項１に係る発明の結晶生成装置においては、生体高分子を含む溶液の液滴がチップ本体の円形枠に保持され、この状態で液滴から溶媒が蒸発することにより、生体高分子を含む溶液の過飽和度が増大していき、その液滴中で生体高分子の結晶が析出し成長する。この場合において、チップ本体は電磁波に対して透過性を有する材料で板状に形成されているので、チップ本体の円形枠で結晶が生成すると、チップ本体上から結晶を取り出さなくても、チップ本体ごと結晶構造解析に供することが可能になる。
【００２４】
請求項２に係る発明の結晶生成装置では、溶液保持用補助部材の親和性部分または全体がチップ本体の円形枠内の液滴中に浸漬されるので、溶液保持用補助部材の親和性部分の良好な濡れ性による液滴との間での界面張力により、チップ本体の円形枠に液滴が安定して保持される。
【００２５】
請求項３に係る発明の結晶生成装置では、溶液保持用補助部材の親水性先端部がチップ本体の円形枠内の液滴中に浸漬されるので、溶液保持用補助部材の親水性先端部の良好な濡れ性による液滴との間での界面張力により、チップ本体の円形枠内に液滴が安定して保持される。
請求項４に係る発明の結晶生成装置では、生体高分子の結晶化条件を探索するためのスクリーニングテストを効率的に行うことが可能である。
【００２６】
請求項５に係る発明の結晶生成装置では、チップ本体に形設された突出部を結晶構造解析装置の取付部に挿入するなどして、チップ本体を結晶構造解析装置の取付部に容易に取り付けることが可能である。
【００２７】
請求項６に係る発明の結晶生成装置では、チップ本体に形設された把持部を搬送装置の把持手段で把持したり把持用器具で把持して、チップ本体を容易にかつ確実に支持することができる。これにより、搬送装置によるチップ本体の搬送を自動化することが可能になり、また、人手によるチップ本体の搬送をミス無く確実に行うことが可能になる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の好適な実施形態について図１ないし図１０を参照しながら説明する。
【００３３】
図１および図２は、この発明の実施形態の１例を示し、図１は、生体高分子、例えば蛋白質の結晶を生成させるために使用される結晶生成装置の要部を構成する結晶成長用チップの拡大平面図であり、図２は、図１のII−II矢視縦断面図であって蛋白質を含む水溶液の液滴を保持した状態を示す図である。この結晶成長用チップ１０は、板状をなし蛋白質を含む水溶液の液滴を保持するチップ本体１２と、円錐を横に倒した形状を有しチップ本体１２に液滴が安定して保持されるようにする溶液保持用補助部材１４（以下、単に「補助部材１４」という）とから構成されている。
【００３４】
チップ本体１２は三角状をなし、チップ本体１２には、複数、図示例では３つの中空状の円形枠１６が形設され、円形枠１６の形成部以外の部分も大半部が開口部１８となっている。円形枠１６は、蛋白質を含む微量の水溶液の液滴２０を保持することができる。また、開口部１８は、円形枠１６に保持された液滴２０からの水分の蒸発を促進させて、蛋白質を含む水溶液を速やかに過飽和状態に到達させ過飽和度を増大させるようにする機能を有し、また、その総面積を適当に設定することにより蛋白質を含む水溶液の過飽和度が調整される。
【００３５】
また、チップ本体１２には、三角形の各稜角からそれぞれ突き出るように３本の突出部２２が一体形成されている。この突出部２２は、後述するように、Ｘ線回折測定装置のマウント用チューブに結晶成長用チップ１０を取り付ける際に、マウント用チューブに挿入される差込部として機能する。さらに、チップ本体１２には、各突出部２２の基部付近にそれぞれピックアップ用スルーホール２４が穿設されている。このピックアップ用スルーホール２４は、結晶成長用チップ１０を人手あるいは自動化装置により支持して搬送しさらにＸ線回折測定装置のマウント用チューブに取り付ける際に、ピンセットあるいはロボットアームで把持するための摘み部として機能する。これらの突出部２２およびピックアップ用スルーホール２４のいずれか一方または両方とも、特に必要が無ければチップ本体１２に設けなくてもよい。
【００３６】
チップ本体１２は、電磁波に対して透過性を有する材料で形成されており、特にＸ線の波長領域において透過性の高い材料で形成されている。無機化合物、有機化合物および高分子化合物の中には、そのような条件を満たす素材がそれぞれ存在するが、耐水性および耐酸・耐アルカリ性を有すること、熱膨張係数が小さいこと、製造時の加工性に優れていることなどを考慮すると、高分子化合物・高分子フィルムが好ましい。さらには、ポリイミドフィルムは、上記諸条件を満たしていて最も好ましい材料である。
【００３７】
また、チップ本体１２のサイズは、蛋白質の結晶化時にチップ本体１２上に保持させる水溶液の液滴量や結晶成長用チップ１０を収容する容器の大きさなどに主に依存するが、通常は、厚みが０．０１ｍｍ〜１．０ｍｍ程度のものが良く、また、全体の大きさは１．０ｍｍ〜１０．０ｍｍ程度が好ましい。このようなチップ本体１２は、例えばウェットエッチング法を利用して製造することができる。
【００３８】
補助部材１４は、蛋白質を含む水溶液をチップ本体１２上に滴下して円形枠１６内に液滴２０を保持させる際に、液滴２０がチップ本体１２上から落下しないようにする機能を有している。この補助部材１４は、図３に拡大斜視図を示すように、先端部と底部とが平坦面に形成された円錐形状を有しており、先端部の平坦面１４ａには親水性が付与され、周面１４ｂには疎水性が付与されている。この補助部材１４は、チップ本体１２の円形枠１６の縁部に１個もしくは複数個、図示例では一対、先端部同士が互いに対向するようにかつそれぞれ先端部が円形枠１６の内縁から僅かに突出して円形枠１６の中心を指向するように横向きに取着されている。そして、図２に示すように、チップ本体１２の円形枠１６内に保持される液滴２０中に補助部材１４の先端部（あるいは全体）が浸漬されることにより、一対の補助部材１４の、濡れ性の良好な各先端部と円形枠１６の内周面とに液滴２０が安定して保持されることになる。補助部材１４の周面１４ｂを疎水性にするのは、蛋白質の結晶化時に過剰量の水溶液の液滴が補助部材１４に吸着するのを防止するためである。そして、チップ本体１２の円形枠１６内に液滴２０を保持するためには、補助部材１４の先端部の平坦面１４ａのみが親水性であれば十分である。なお、補助部材１４を複数個、チップ本体１２の円形枠１６の縁部に取着する場合には、材質等が異なる複数種類の補助部材１４を組み合わせて使用することが、蛋白質の結晶化のために好ましい。
【００３９】
補助部材１４の先端部の平坦面１４ａを形成する親水性材料としては、無機化合物、有機化合物および高分子化合物のいずれを採用してもよいが、耐酸・耐アルカリ性、耐腐食性および耐水性を有するものが好ましい。このような材料として、無機化合物ないしは金属物質では、ＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＭｇＯ、ＳｒＴｉＯ３、Ａｕ、Ｐｔ、Ｔｉ等が挙げられる。また、有機・高分子化合物としては、それぞれ表面がプラズマ処理等により部分的に親水性化されたシリコン樹脂、フッ素を含有するフッ素系樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂などを用いることができる。
【００４０】
また、補助部材１４の周面１４ｂを形成する疎水性材料としては、耐酸・耐アルカリ性、耐腐食性、耐水性および微細加工性に優れたものであればどのようなものを用いてもよい。例えば、無機化合物ないしは金属物質としては、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＭｇＯ、ＳｒＴｉＯ３、Ａｕ、Ｐｔ、Ｔｉ等を用いることができる。これらのうちＳｉを除いた材料を使用するときは、表面に撥水化処理を施して表面を疎水性に改質する必要がある。また、有機・高分子化合物としては、上述したシリコン樹脂、フッ素を含有するフッ素系樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂などを用いることができる。これらの材料を使用するときは、表面の改質は不要である。
【００４１】
この補助部材１４は、結晶成長用チップ１０で得られた蛋白質の結晶に対しＸ線を照射したときにＸ線を遮蔽することなく結晶のみにＸ線が照射されるように、そのサイズおよび形状を最適化する必要がある。したがって、図３に示した補助部材１４のサイズは、可能な限り小さくすることが望ましい。そして、製造時の加工性および加工精度を考慮すると、例えば、補助部材１４の先端部の平坦面１４ａの直径ｄ１は、１μｍ〜１００μｍの範囲内であることが好ましく、さらには１０μｍ〜５０μｍであることが好ましい。また、補助部材１４の底部平坦面の直径ｄ２は、０．１ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲内であることが好ましく、０．５ｍｍ〜１．０ｍｍであることがより好ましい。さらに、補助部材１４の厚みｄ３は、結晶成長用チップ１０の全体の大きさおよびチップ本体１２上に保持させる水溶液の液滴量によって決定されるが、好ましくは０．１ｍｍ〜２．０ｍｍ程度、より好ましくは０．２ｍｍ〜１．０ｍｍ程度である。このような補助部材１４は、例えばウェットエッチング法やブラストエッチング法を応用して製造することができる。
【００４２】
次に、上記した構成の結晶成長用チップ１０を用いて蛋白質の結晶を生成させる方法について、図４および図５を参照しつつ説明する。なお、図４の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、図１の、結晶成長用チップ１０の中心位置を通るIV−IV矢視縦断面をそれぞれ示している。
【００４３】
シッティングドロップ用のウエル溶液保持プレート（図示せず；図１１参照）内のリザーバ（ウエル）に沈殿剤を滴下し、図４の（ａ）に示す結晶成長用チップ１０をプレート内の凹部の位置に水平姿勢で設置する。次に、図４の（ｂ）に示すように、ピペット２６を使用して蛋白質を含む所定体積の水溶液の液滴２０を、その液滴２０が補助部材１４に触れるようにしてチップ本体１２の円形枠１６内に滴下する。このとき、液滴２０は、初めに、補助部材１４の、親水性を有する先端部の平坦面１４ａ（図３参照）と接触して、補助部材１４先端部の平坦面１４ａ固有の表面濡れ性により補助部材１４に保持され、その後に、チップ本体１２の円形枠１６の表面張力により円形枠１６内の全体に広がって保持されることになる。したがって、図４の（ｃ）に示すように、液滴２０は、チップ本体１２の円形枠１６内に確実に保持され、チップ本体１４から落下することが防止される。続いて、反応用試薬（上記した沈殿剤）をチップ本体１２の円形枠１６内に滴下して、蛋白質を含む水溶液と反応用試薬とを混合させる。なお、蛋白質の結晶化は、蛋白質を含む水溶液と反応用試薬とを適当な混合比となるように混合させることにより進行することになるが、図４には、蛋白質を含む水溶液の液滴２０のみを示している。そして、反応用試薬を蛋白質を含む水溶液に混合することにより、液滴２０の体積が増加して、液滴２０の全体がチップ本体１２の円形枠１６内に保持されることになる。この状態において、蛋白質の結晶化が行われる。
【００４４】
図５に示すように、チップ本体１２の円形枠１６に保持された液滴２０中で蛋白質の結晶２８が析出し成長すると、図示していないが、ピンセットを使用して人手により、あるいは、ロボットアームを備えた自動化装置により、蛋白質の結晶２８を結晶成長用チップ１０ごとプレート内から取り出す。なお、蛋白質の結晶核は、液滴２０中で偶発的に形成されることもあり（均一核形成）、また液滴２０中において補助部材１４先端部の平坦面１４ａ上で形成されることもある（不均一核形成）。続いて、図示していないが、液滴２０の水分を抗凍結剤で置換させた後、結晶成長用チップ１０をＸ線回折測定装置へ搬送し、図６に示すように、チップ本体１２の１つの突出部２２をＸ線回折測定装置のマウント用チューブ９に差し込んで、結晶成長用チップ１０をマウント用チューブ９に装填する。そして、結晶成長用チップ１０上の結晶２８を保護するために抗凍結剤２０’を急速凍結させ、その後に、マウント用チューブ９に取り付けられた結晶成長用チップ１０上の蛋白質の結晶２８に対してＸ線を照射し、結晶２８の回折強度を測定して結晶構造解析を行う。このとき、チップ本体１２にもＸ線が照射されることになるが、チップ本体１２はＸ線の波長領域において透過性の高い材料で形成されているので、チップ本体１２に照射されたＸ線はそのまま透過し、結晶２８のみにＸ線が照射されることになる。したがって、蛋白質の結晶２８をチップ本体１２上に保持したままで結晶２８のＸ線回折測定を行うことができる。
【００４５】
次に、図７および図８は、この発明の別の実施形態を示し、図７は、結晶生成装置の要部を構成する結晶成長用チップの拡大平面図であり、図８は、結晶成長用チップの縦断面図であって蛋白質を含む水溶液の液滴を保持した状態を示す図である。
【００４６】
この結晶成長用チップ３０と図１および図２に示した上記結晶成長用チップ１０とが異なるのは、チップ本体３２の形状である。すなわち、この結晶成長用チップ３０のチップ本体３２は、細長い板状に形成されている。そして、チップ本体３２には、２つの中空状の円形枠３６が並列して形設されており、この各円形枠３６に、蛋白質を含む水溶液の液滴２０がそれぞれ保持される。また、チップ本体３２には、両端からそれぞれ突き出るように一対の突出部３８が一体形成されており、この突出部３８は、Ｘ線回折測定装置のマウント用チューブに結晶成長用チップ３０を取り付ける際の差込部となり得る。さらに、チップ本体３２には、各突出部３８の基部付近にそれぞれピックアップ用スルーホール４０が穿設されており、このピックアップ用スルーホール４０は、ピンセットあるいはロボットアームで把持するための摘み部としての機能を有する。
【００４７】
上記したチップ本体３２の形状以外の構成については、上記した結晶成長用チップ１０と同様である。すなわち、チップ本体３２の円形枠３６の縁部には、円錐を横に倒した形状を有する一対の溶液保持用補助部材３４（以下、単に「補助部材３４」という）が、先端部同士を互いに対向させそれぞれ先端部を円形枠３６の内縁から僅かに突出させて円形枠３６の中心を指向するように取着されている。なお、補助部材３４は、１個だけ設けてもよいし、３個以上設けるようにしてもよい。補助部材３４の詳細な構造も、図３に示した上記補助部材１４と同様である。また、チップ本体３２および補助部材３４のそれぞれの形成材料やサイズ、それぞれの有する機能も、上記した結晶成長用チップ１０と同様である。さらに、この結晶成長用チップ３０を用いて蛋白質の結晶を生成させる方法、および、生成された結晶のＸ線回折測定を行う方法についても、上記した結晶成長用チップ１０を用いた場合と同様であるが、この結晶成長用チップ３０を用いて蛋白質の結晶を生成させた場合においては、上記したＸ線回折測定方法とは異なる方法で結晶のＸ線回折測定を行うことが可能である。その方法について、図１０を参照して説明する。
【００４８】
図９に示すように、チップ本体３２の円形枠３６に保持された液滴２０中で蛋白質の結晶２８が析出し成長すると、ピンセットを使用して人手により、あるいは、ロボットアームを備えた自動化装置により、蛋白質の結晶２８を結晶成長用チップ３０ごとプレート内から取り出す。そして、図１０に示すように、取り出した蛋白質の結晶２８を結晶成長用チップ３０ごと、チップ本体３２の幅より僅かに大きい内径を有するガラスキャピラリ４２内に挿入し封入する。この際、液滴２０は、ガラスキャピラリ４２の内壁面と接触することにより、チップ本体３２の円形枠３６から離脱してガラスキャピラリ４２の上部に残留する。その後、さらに結晶成長用チップ３０をガラスキャピラリ４２の内奥へ挿入することにより、蛋白質の結晶２８を、結晶成長用チップ３０上に保持させかつ液滴２０とは分離させた状態でガラスキャピラリ４２内に装填することができる。このようにして蛋白質の結晶２８がガラスキャピラリ４２内に装填されると、結晶成長用チップ３０上の蛋白質の結晶２８に対してＸ線を照射し、結晶２８の回折強度を測定して結晶構造解析を行う。
【００４９】
なお、上記した各実施形態では、チップ本体１２、３２に補助部材１４、３４を取着して結晶成長用チップ１０、３０を構成したが、補助部材１４、３４を具備していなくても、蛋白質を含む水溶液や反応用試薬の液滴がチップ本体１２、３２の円形枠１６、３６から落下せずに円形枠１６、３６内に容易に保持されるような条件の場合、例えば、蛋白質を含む０．５μｌ以下の極微量の水溶液をチップ本体１２、３２上に滴下して蛋白質の結晶化を行う場合、ポリイミドフィルム製のチップ本体１２、３２の円形枠１６、３６の直径が０．５ｍｍ以下である場合などには、補助部材１４、３４を必ずしも設けなくてもよい。
【００６１】
【実施例】
以下、この発明のより具体的な実施例について、実験例を示して説明する。
【００６２】
〔結晶成長用チップの作製例（１）〕
図１および図２に示した構成の結晶成長用チップ１０を、以下のようにして作製した。
【００６３】
厚みが５０μｍであるポリイミドフィルムを材料にし、ウェットエッチングによりポリイミドフィルムを図１に示したパターンに加工した。チップ本体１２のサイズは、その外形に相当する円の直径として７．０ｍｍであった。また、円形枠１６の直径は、１．２５ｍｍとした。
【００６４】
次に、補助部材１４を、異なる３つの方法▲１▼、▲２▼、▲３▼により作製した。
▲１▼  厚みが０．６５ｍｍであるＰ型シリコン基板の表面に１００ｎｍの厚みのＣＶＤ酸化膜（ＳｉＯ２）を形成し、この薄板材をウェットエッチングにより図３に示した形状に加工した（これを「補助部材Ａ」とする）。補助部材Ａの寸法は、ｄ１＝３５μｍ、ｄ２＝８５０μｍ、ｄ３＝０．６５ｍｍ（図３参照）であった。
▲２▼  厚みが０．６５ｍｍであるＰ型シリコン基板の表面に１００ｎｍの厚みのＣＶＤ酸化膜（ＳｉＯ２）を形成し、次いで、ＣＶＤ酸化膜の表面に５０ｎｍの厚みのＣＤＶチッ化膜（Ｓｉ３Ｎ４）を形成した。この薄板材をウェットエッチングにより図３に示した形状に加工した（これを「補助部材Ｂ」とする）。補助部材Ｂの寸法は、ｄ１＝３５μｍ、ｄ２＝８５０μｍ、ｄ３＝０．６５ｍｍであった。
▲３▼  厚みが０．６５ｍｍであるサファイア結晶の薄板材をブラストエッチングにより図３に示した形状に加工した。次いで、得られた部材の周面を撥水性溶液に浸漬させて、周面のみ疎水性とした（これを「補助部材Ｃ」とする）。補助部材Ｃの寸法は、ｄ１＝３０μｍ、ｄ２＝９００μｍ、ｄ３＝０．６５ｍｍであった。
【００６５】
得られた補助部材Ａ、Ｂ、Ｃを上記のチップ本体１２の３つの円形枠１６の縁部にそれぞれ２個ずつ、以下のような組合せで図１に示したように配置して実装した。
補助部材Ａと補助部材Ｂ−これらが実装された円形枠を「円形枠Ｉ」とする。補助部材Ａと補助部材Ｃ−これらが実装された円形枠を「円形枠II」とする。補助部材Ｂと補助部材Ｃ−これらが実装された円形枠を「円形枠III」とする。
【００６６】
〔結晶成長用チップの作製例（２）〕
図７および図８に示した構成の結晶成長用チップ３０を、上記と同様の方法によって作製した。チップ本体３２のサイズは、長さが７．０ｍｍであった。また、円形枠３６の直径は、１．２５ｍｍとした。そして、補助部材Ａ、Ｂ、Ｃをチップ本体３２の２つの円形枠３６の縁部にそれぞれ２個ずつ、以下のような組合せで図７に示したように配置して実装した。
補助部材Ａと補助部材Ｂ−これらが実装された円形枠を「円形枠ｉ」とする。補助部材Ａと補助部材Ｃ−これらが実装された円形枠を「円形枠ii」とする。
【００６７】
〔結晶成長用ユニットの作製例〕
図１１に示した構成の結晶成長用ユニット４４を、以下のようにして作製した。
【００６８】
厚みが１．２ｍｍで１００ｍｍ角である耐熱ガラス基板を材料とし、超音波ドリルを使用してガラス基板の表・裏両面から穿孔することにより、図１１に示した断面形状の透孔４８を９６個形成した。次いで、ガラス基板の全体に撥水化処理を施して、溶液保持プレート４６を作製した。透孔４８のサイズは、開口部の直径が１．０ｍｍで、溶液保持プレート４６の厚み方向における中央部の連通部の直径が３０μｍであった。また、溶液支持部材５０としては、上記した補助部材Ｂを使用した。溶液保持プレート４６の保持には、厚みが５ｍｍで枠幅が１０ｍｍであるアクリル樹脂製の枠を使用して、その上に溶液保持プレート４６を静置した。
【００６９】
〔結晶化テスト（１）〕
ウシ膵臓製エラスターゼを１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、蛋白質を含む水溶液を調製した。また同時に、混合後の濃度が１．５ＭとなるようにＮａＣｌを、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、沈殿剤を調製した。
【００７０】
上記した結晶成長用チップの作製例（１）で作製された結晶成長用チップ１０（以下、「チップＩ」という）を、シッティングドロップ用のプレート内に設置した。プレート内のリザーバには、上記した沈殿剤を５００μｌ滴下した。そして、上記した蛋白質を含む水溶液と沈殿剤とを１．０μｌずつ、チップＩの３つの円形枠Ｉ、II、III上に滴下し、液滴を円形枠Ｉ、II、III内に保持した。結晶化テストは、全て２０℃の温度下で４日間、円形枠Ｉ、II、III内に液滴を保持することにより行った。その後、チップＩの円形枠Ｉ、II、III内の液滴を観察したところ、以下のような結果であった。
円形枠Ｉ；補助部材Ａの近傍に蛋白質の結晶が成長していた。
円形枠II；補助部材Ａの近傍に蛋白質の結晶が成長していた。
円形枠III；結晶の成長は見られなかった。
【００７１】
〔結晶化テスト（２）〕
ウシ膵臓製エラスターゼを１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、蛋白質を含む水溶液を調製した。また同時に、混合後の濃度が１．５ＭとなるようにＮａＣｌを、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、沈殿剤を調製した。
【００７２】
上記した結晶成長用チップの作製例（２）で作製された結晶成長用チップ３０（以下、「チップII」という）を、シッティングドロップ用のプレート内に設置した。プレート内のリザーバには、上記した沈殿剤を５００μｌ滴下した。そして、上記した蛋白質を含む水溶液と沈殿剤とを１．０μｌずつ、チップIIの２つの円形枠ｉ、ii上に滴下し、液滴を円形枠ｉ、ii内に保持した。結晶化テストは、全て２０℃の温度下で４日間、円形枠ｉ、ii内に液滴を保持することにより行った。その後、チップIIの円形枠ｉ、ii内の液滴を観察したところ、以下のような結果であった。
円形枠ｉ；補助部材Ａの近傍に蛋白質の結晶が成長していた。
円形枠ii；補助部材Ａの近傍に蛋白質の結晶が成長していた。
【００７３】
〔結晶化テスト（３）〕
ウシ膵臓製エラスターゼを１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、蛋白質を含む水溶液を調製した。また同時に、混合後の濃度が１．５ＭとなるようにＮａＣｌを、濃度が０．１ＭでｐＨ４．６の酢酸アンモニウム緩衝溶液に溶解させて、沈殿剤を調製した。
【００７４】
上記した結晶成長用ユニットの作製例で作製された結晶成長用ユニット４４（以下、「ユニット」という）の溶液保持プレート４６の各透孔４８内へ、補助部材Ｂを溶液保持プレート４６の下万側からそれぞれ挿入して装填した。次に、ユニットの溶液保持プレート４６の上面側にパラフィンオイルを流し込み、溶液保持プレート４６の透孔４８がパラフィンオイルで完全に覆われるようにした。そして、上記した蛋白質を含む水溶液と沈殿剤とを０．５μｌずつ秤取して混合させ、この混合溶液を溶液保持プレート４６上に滴下して、透孔４８内に液滴が収容されるようにした。結晶化テストは、全て２０℃の温度下で４日間、透孔４８内に液滴を保持することにより行った。その後、溶液保持プレート４６の透孔４８内の液滴を観察したところ、補助部材Ｂの上部に蛋白質の結晶が成長していた。
【００７５】
次に、結晶の成長が確認された補助部材Ｂの底面側にマウント用チューブを固定した後、補助部材Ｂを溶液保持プレート４６の透孔４８から引き出し、得られた結晶のＸ線回折測定を行った。なお、この際、マウント用チューブの先端に速乾性の接着剤を塗布し、これにより、補助部材Ｂの固定化を行った。
【００７６】
〔結晶化および結晶装填操作の結果〕
表１に、結晶化テストの結果、チップＩ、IIおよびユニットの補助部材の取出しおよびＸ線回折測定装置への装填の操作性の良否、ならびに、結晶の凍結またはキャピラリへのチップIIの封入の良否をまとめて示す。
【００７７】
【表１】
0003905399.tif 000002
【００７８】
成長した結晶は、チップＩおよびユニットの補助部材Ｂではそれごと取り出して、抗凍結剤での溶液置換および抗凍結剤の凍結を行い、さらにゴニオメータに装填することが可能であった。また、チップIIでは、それを取り出した後、チップIIをガラスキャピラリ内に封入することが可能であった。なお、この操作に要した時間はわずか５秒であった。
【００７９】
〔比較例〕
図１１および図１２に示した従来法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）によって結晶化テストを行い、本発明に係る結晶成長用チップおよび結晶成長用ユニットを用いた結晶化テストとの比較を行った。結晶化テストは、上記した実施例と同一の蛋白質を含む水溶液および沈殿剤を使用し同一の結晶化条件により行った。そして、成長した結晶を、顕微鏡観察下でナイロンループを具備したツールによって取り出し、抗凍結剤による水分置換またはガラスキャピラリ内への封入を行った後、ゴニオメータ上に装填した。この操作に要した時間は、平均すると５０秒であった。
【００８０】
【発明の効果】
請求項１に係る発明の結晶生成装置を使用すると、結晶の生成後において結晶を結晶構造解析に供する際に、結晶生成場所からの結晶の取出しおよび結晶構造解析装置への結晶の装填のための操作を簡略化することができるので、作業の効率化および作業者の労力の軽減化を図ることができ、また、結晶の取出しおよび装填のための操作を自動化することも可能になる。したがって、この発明に係る装置は、大量の蛋白質等を迅速に結晶化してＸ線回折測定を行い結晶構造解析する必要がある場合には、特に有効である。
【００８１】
請求項２に係る発明の結晶生成装置では、チップ本体の円形枠内に生体高分子を含む溶液の液滴を安定して保持することができる。
【００８２】
請求項３に係る発明の結晶生成装置では、チップ本体の円形枠内に生体高分子を含む溶液の液滴を安定して保持することができる。
【００８３】
請求項４に係る発明の結晶生成装置では、生体高分子の結晶化条件を探索するためのスクリーニングテストを効率的に行うことができる。
【００８６】
請求項５に係る発明の結晶生成装置では、チップ本体を結晶構造解析装置の取付部に容易に取り付けることができる。
【００８７】
請求項６に係る発明の結晶生成装置では、搬送装置によるチップ本体の搬送を自動化することが可能になり、また、人手によるチップ本体の搬送をミス無く確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明の実施形態の１例を示し、蛋白質の結晶を生成させるために使用される結晶生成装置の要部を構成する結晶成長用チップの拡大平面図である。
【図２】  図１のII−II矢視縦断面図であって蛋白質を含む水溶液の液滴を保持した状態を示す図である。
【図３】  図１および図２に示した結晶成長用チップの構成要素の１つである溶液保持用補助部材の拡大斜視図である。
【図４】  図１および図２に示した結晶成長用チップを用いて蛋白質の結晶を生成させる方法について説明するための図であって、それぞれ図１の、結晶成長用チップの中心位置を通るIV−IV矢視縦断面図である。
【図５】  同じく蛋白質の結晶を生成させる方法について説明するための図であって、結晶成長用チップの拡大平面図である。
【図６】  図１および図２に示した結晶成長用チップを用いて生成された蛋白質の結晶をＸ線回折測定装置のマウント用チューブに結晶成長用チップごと装填して、結晶のＸ線回折測定を行っている様子を示す縦断面図である。
【図７】  この発明の別の実施形態を示し、結晶生成装置の要部を構成する結晶成長用チップの拡大平面図である。結晶成長用チップの縦断面図であって蛋白質を含む水溶液の液滴を保持した状態を示す図である。
【図８】  図７に示した結晶成長用チップの縦断面図であって蛋白質を含む水溶液の液滴を保持した状態を示す図である。
【図９】  図７に示した結晶成長用チップを用いて蛋白質の結晶を生成させた状態を示す結晶成長用チップの拡大平面図である。
【図１０】  図７に示した結晶成長用チップを用いて生成された蛋白質の結晶をＸ線回折測定装置のガラスキャピラリ内に結晶成長用チップごと封入して、結晶のＸ線回折測定を行っている様子を示す正面図である。
【図１１】  従来のシッティングドロップ蒸気拡散法により蛋白質の単結晶を作製する方法について説明するための概略図である。
【図１２】  同じく蛋白質の単結晶を作製する方法について説明するための概略図である。
【符号の説明】
９  マウント用チューブ
１０、３０  結晶成長用チップ
１２、３２  チップ本体
１４、３４  溶液保持用補助部材
１４ａ  溶液保持用補助部材の先端部の平坦面
１４ｂ  溶液保持用補助部材の周面
１６、３６  チップ本体の円形枠
１８  チップ本体の開口部
２０  蛋白質を含む水溶液の液滴
２２、３８  チップ本体の突出部
２４、４０  チップ本体のピックアップ用スルーホール
２８  蛋白質の結晶
４２  ガラスキャピラリ
【図１】
0003905399.tif 000003
【図２】
0003905399.tif 000004
【図３】
0003905399.tif 000005
【図４】
0003905399.tif 000006
【図５】
0003905399.tif 000007
【図６】
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【図７】
0003905399.tif 000009
【図８】
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【図９】
0003905399.tif 000011
【図１０】
0003905399.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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