(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
画像を分析する方法であって、
該方法は、
（１）少なくとも１つの新しい画像を取り込む工程であって、該少なくとも１つの新しい画像は、複数の新しい画像スポットを含み、該複数の新しい画像スポットの各々は、積分光学密度パーセント（ＩＯＤ％）および位置を有する、工程と、
（２）マスター複合体画像を生成する工程であって、該マスター複合画像は、複数のマスター複合体スポットを有し、該複数のマスター複合体スポットの各々は、ＩＯＤ％および位置を有する、工程と、
（３）マスター複合体を生成する工程であって、該マスター複合体は、該複数のマスター複合体スポットの各々に対する位置、ＩＯＤ％、位置許容誤差、およびＩＯＤ％許容誤差を含む、工程と、
（４）該複数のマスター複合体スポットの各々に対する位置許容誤差およびＩＯＤ％許容誤差のうちの少なくとも１つを用いて、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットを検索し、識別し、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットを該複数のマスター複合体スポットのうちのいくつかのスポットに一致させることにより、セグメント化された画像および対応する画像データファイルを作成する工程と
を包含し、
所定の条件を満たす位置許容誤差およびＩＯＤ％許容誤差のうちの少なくとも１つを有する該複数のマスター複合体スポットのうちのいくつかのスポットが、検索され、識別され、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットに一致される、方法。
【請求項２】
前記工程（４）は、
（Ｉ）前記少なくとも１つの新しい画像を前記マスター複合体画像に位置合わせする工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（４）は、
（ＩＩ）前記マスター複合体から複数のアンカーポイントを選択する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（４）は、
（ＩＩＩ）対応するアンカーポイントの位置の位置許容誤差内にある位置を有し、かつ、対応するアンカーポイントのＩＯＤ％のＩＯＤ％許容誤差内にあるＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応するアンカーポイントに一致させる工程をさらに包含し、
該対応するアンカーポイントに一致する該検出された新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットは、複数の一致した新しい画像スポットを形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの新しい画像は、２次元電気泳動ゲル画像であり、
前記工程（４）は、
（ＩＶ）前記複数の一致した新しい画像スポットの各々の対の間にベクトルを作成する工程と、
（Ｖ）該複数の一致した新しい画像スポットの各々の対に対するベクトル間のベクトル差を計算することにより、複数のベクトル差を形成し、該複数の一致した新しい画像スポットから、ベクトル差が、該複数のベクトル差内における最大ベクトル差の所定のパーセント以内にある該一致した新しい画像スポットを除去することにより、複数の不一致の新しい画像スポットを形成する工程と
をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（４）は、
（ＶＩ）前記マスター複合体から複数の明確に定義されたスポットを選択し、対応する明確に定義されたスポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応する明確に定義されたスポットに一致させ、該対応する明確に定義されたスポットに一致する該検出された新しい画像スポットを前記複数の一致した新しい画像スポットに加える工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（４）は、
（ＶＩＩ）前記マスター複合体から複数の飽和スポットを選択し、対応する飽和スポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応する飽和スポットに一致させ、該対応する飽和スポットに一致する該検出された新しい画像スポットを前記複数の一致した新しい画像スポットに加える工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（４）は、
（ＶＩＩＩ）前記マスター複合体から複数のウイークスポットを選択し、対応するウイークスポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応するウイークスポットに一致させ、該対応するウイークスポットスポットに一致する該検出された新しい画像スポットを前記複数の一致した新しい画像スポットに加える工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（４）は、
（ＩＸ）前記複数の一致した新しい画像スポットの外にある新しい画像を検索することにより、識別されていない新しい画像スポットを見つける工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（２）は、
（ａ）複数の画像を選択するユーザ選択を受け取る工程であって、該複数の画像の各々は、バックグラウンドを有し、該複数の画像の各々は、該複数の画像の他の画像における複数のスポットに対応する複数のスポットを有し、該複数のスポットの各々は、ＩＯＤ％、物理的形状、およびスポット位置を有する、工程と、
（ｂ）該複数の選択された画像を平均化する工程と
を包含し
該平均化する工程は、
（ｉ）該複数の画像のバックグラウンドを用いて平均複合バックグラウンドを計算する工程と、
（ｉｉ）複数のスポットのＩＯＤ％を平均化することによって、前記複数のマスター複合スポットの各々に対して平均複合ＩＯＤ％を計算する工程であって、該複数のスポットは、該複数の画像の各々におけるスポットであって、該複数のマスター複合体スポットのうちの１つに対応するスポットからなる、工程と、
（ｉｉｉ）複数のスポットの物理的形状を平均化することによって、該複数のマスター複合体スポットの各々に対する平均形状を計算する工程であって、該複数のスポットは、該複数の画像の各々におけるスポットであって、該複数のマスター複合体スポットのうちの１つに対応するスポットからなる、工程と、
（ｉｖ）複数のスポットのスポット位置を平均化することによって、該複数のマスター複合体スポットの各々に対する平均スポット位置を計算する工程であって、該複数のスポットは、該複数の選択された画像の各々におけるスポットであって、該複数のマスター複合体スポットのうちの１つに対応するスポットからなる、工程と、
（ｖ）該複数のマスター複合スポットの各々に対して、該平均複合ＩＯＤ％に対する標準偏差を計算する工程と、
（ｖｉ）該複数のマスター複合スポットの各々に対して、該平均スポット位置に対する標準偏差を計算する工程と
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（Ｉ）は、
（ａ）共通のアンカーポイントを識別する工程であって、該共通のアンカーポイントは、新しい画像共通アンカースポットおよびマスター複合共通アンカースポットに対応する、工程と、
（ｂ）該マスター複合共通アンカースポットの位置を決定する工程と、
（ｃ）該新しい画像共通アンカースポットの位置を決定する工程と、
（ｄ）該新しい画像共通アンカースポットの位置が該マスター複合共通アンカースポットの位置と位置合わせされるように位置修正を適用する工程と
を包含する、請求項２の方法。
【請求項１２】
（ｅ）前記マスター複合共通アンカースポットに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｆ）前記新しい画像共通アンカースポットに該マスター複合共通アンカースポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ＩＩ）は、
（ａ）前記マスター複合体を検索することにより、所定数の第一次アンカーポイントを識別する工程を包含し、
該所定数の第一次アンカーポイントの各々は、
（ｉ）該所定数の第一次アンカーポイントの他の第一次アンカーポイントから少なくとも所定の分離閾値分だけ分離されており、
（ｉｉ）所定の飽和値範囲内にある飽和値を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ＩＩ）は、
（ａ）前記マスター複合体を検索することにより、所定数の第一次アンカーポイントを識別する工程を包含し、
該所定数の第一次アンカーポイントの各々は、
（ｉ）該所定数の第一次アンカーポイントの他の第一次アンカーポイントから少なくとも所定の分離閾値分だけ分離されており、
（ｉｉ）所定の飽和値範囲内にある飽和値を有し、
（ｉｉｉ）平均複合ＩＯＤ％に対して４０％未満である標準偏差パーセント（ＳＤ％）を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ＩＩＩ）は、
（ａ）前記複数のアンカーポイントにおける各アンカーポイントに対して、
（ｉ）該アンカーポイントの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該アンカーポイントに対してＩＯＤ％を決定する工程と、
（ｉｉｉ）該アンカーポイントに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｖ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、アンカーポイント±２０％に対するＩＯＤ％に等しいＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｖ）該工程（ｉｖ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該アンカーポイントに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ＩＩＩ）は、
（ａ）前記所定数の第一次アンカーポイントにおける各第一次アンカーポイントに対して、
（ｉ）該第一次アンカーポイントの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該第一次アンカーポイントに対してＩＯＤ％を決定する工程と、
（ｉｉｉ）該第一次アンカーポイントに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｖ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、アンカーポイント±２０％に対するＩＯＤ％に等しいＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｖ）該工程（ｉｖ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該第一次アンカーポイントに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
を包含する、請求項４または１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．１ｍｍであり、前記Ｙ位置座標許容誤差は、０．１ｍｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ＩＩ）は、
（ｂ）前記マスター複合体から、０．２＜Ｓ＜０．８を満たすような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合スポットを選択することにより、第１の複数の選択されたマスター複合スポットを形成する工程と、
（ｃ）該第１の複数の選択されたマスター複合スポットから複数の第二次アンカーポイントを選択することであって、該複数の第二次アンカーポイントにおける各選択されたマスター複合スポットは、該複数の第二次アンカーポイントにおける他の選択されたマスター複合スポットから少なくとも３ｍｍだけ分離されるように選択される工程と
をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ＩＩＩ）は、
（ａ）前記複数の第二次アンカーポイントにおける各第二次アンカーポイントに対して、
（ｉ）該第二次アンカーポイントの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該第二次アンカーポイントに対してＩＯＤ％を決定する工程と、
（ｉｉｉ）該第二次アンカーポイントに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｖ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、アンカーポイント±２０％に対するＩＯＤ％に等しいＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｖ）該工程（ｉｖ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該第二次アンカーポイントに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．５ｍｍであり、前記Ｙ位置座標許容誤差は、０．５ｍｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（Ｖ）は、
（ａ）前記複数の一致した新しい画像スポットにおける各一致した新しい画像スポットに対して、
（ｉ）該一致した新しい画像スポットをその対応するアンカーポイントに接続する一致した新しい画像スポットベクトルに対して、一致した新しい画像スポットベクトル長を計算する工程と、
（ｉｉ）該一致した新しい画像スポットベクトルに最も近い５個のベクトルのベクトル長を平均化することにより、平均最近（ｎｅａｒｅｓｔ）ベクトル長を形成する工程と、
（ｉｉｉ）該平均最近ベクトル長から該一致した新しい画像スポットベクトル長を減算することにより、該一致した新しい画像スポットに対する第１のベクトル差を決定する工程と、
（ｂ）該複数の一致した新しい画像スポットにおけるすべての一致した新しい画像スポットに対する該第１のベクトル差を合計することにより、第１のベクトル差合計を形成する工程と、
（ｃ）前記複数の不一致の新しい画像スポットにおける各不一致の新しい画像スポットに対して、
（ｉ）対応する不一致のアンカーポイントの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該対応する不一致のアンカーポイントに対してＩＯＤ％を決定する工程と、
（ｉｉｉ）該対応する不一致のアンカーポイントに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｖ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該対応する不一致のアンカーポイント±２０％に対するＩＯＤ％に等しいＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｖ）該工程（ｉｖ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該対応するアンカーポイントに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当て、該見つけられた新しい画像スポットを該複数の一致した新しい画像スポットに加える工程と、
（ｄ）該工程（ａ）を繰り返すことにより、該複数の新しい画像スポットにおける各一致した新しい画像スポットに対する第２のベクトル差を決定する工程と、
（ｅ）該複数の一致した新しい画像スポットにおけるすべての一致した新しい画像スポットに対して該第２のベクトル差を合計することにより、第２のベクトル差合計を形成する工程と、
（ｆ）該第２のベクトル差合計が該第１のベクトル差合計より小さい場合、
（ｉ）該ベクトル差が最大ベクトル差の所定のパーセンテージ以内にある一致した新しい画像スポットを、該複数の一致した新しい画像スポットから除去し、該複数の不一致の新しい画像スポットに加える工程と、
（ｉｉ）該工程（ｃ）から（ｅ）を繰り返す工程と
を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程（ＶＩ）は、
（ａ）前記マスター複合体から、０．２＜Ｓ＜０．８であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合体スポットを選択することにより、複数の明確に定義されたスポットを形成する工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（ＶＩ）は、
（ｂ）前記複数の明確に定義されたスポットにおける各明確に定義されたスポットに対して、
（ｉ）該明確に定義されたスポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該明確に定義されたスポットに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｉｉ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内における新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｉｖ）該工程（ｉｉｉ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該明確に定義されたスポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．１ｍｍであり、前記Ｙ座標位置許容誤差は、０．１ｍｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ＶＩＩ）は、
（ａ）前記マスター複合体から、Ｓ≧０．８であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合体スポットを選択することにより、複数の飽和スポットを形成する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項２６】
前記工程（ＶＩＩ）は、
（ｂ）前記複数の飽和スポットにおける各飽和スポットに対して、
（ｉ）該飽和スポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該飽和スポットに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｉｉ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｉｖ）該工程（ｉｉｉ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該飽和スポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．４ｍｍであり、前記Ｙ位置座標許容誤差は、０．４ｍｍである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ＶＩＩ）は、
（ｃ）前記複数の飽和スポットにおける飽和スポットであって、前記見つけられた新しい画像スポットが対応する飽和スポットの数を決定する工程と、
（ｄ）該複数の飽和スポットにおける該飽和スポットの数に等しい新しい画像飽和スポットの数に該見つけられた新しい画像スポットを分割する工程と
をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ＶＩＩＩ）は、
（ａ）前記マスター複合体から、Ｓ≦０．２であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合体スポットを選択することにより、複数のウイークスポットを形成する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
前記工程（ＶＩＩＩ）は、
（ｂ）前記複数のウイークスポットにおける各ウイークスポットに対して、
（ｉ）該ウイークスポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定する工程と、
（ｉｉ）該ウイークスポットに対してスポット番号を決定する工程と、
（ｉｉｉ）第１の感度を用いて、Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｉｖ）該工程（ｉｉｉ）において新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該ウイークスポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てる工程と
をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．２ｍｍであり、前記Ｙ位置座標許容誤差は、０．２ｍｍである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記工程（ＶＩＩＩ）は、
（ｃ）前記第１の感度より高い第２の感度および形状基準を用いて、前記工程（ｂ）を繰り返す工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）において、前記新しい画像において見つけられていない前記複数のウイークスポットにおける各ウイークスポットに対して、該複数のウイークスポットにおける該ウイークスポットのエリア（ａｒｅａ）と同じであるエリアを有する新しい画像ウイークスポットを該新しい画像に加える工程と
をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ＩＸ）は、
（ａ）第１の感度を用いて新しい画像を検索することにより、第１の複数の識別されていない新しい画像スポットを見つける工程と、
（ｂ）該第１の感度より高い第２の感度および形状基準を用いて、前記複数の一致した新しい画像スポットおよび該第１の複数の識別されていない新しい画像スポットの外にある新しい画像を検索することにより、第２の複数の識別されていない新しい画像スポットを見つける工程と
を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
（Ｉ）第１の複数の画像と第２の複数の画像とを比較する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記工程（Ｉ）は、
（ａ）前記第１の複数の画像における各スポットに対してＩＯＤ％の統計平均を計算する工程と、
（ｂ）前記第２の複数の画像における各スポットに対してＩＯＤ％の統計平均を計算する工程と、
（ｃ）該第１の複数の画像における各スポットが該第２の複数の画像における各スポットとは統計的に異なるかどうかを決定する工程と
を包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
コンピュータプログラムロジックが記録されたコンピュータが使用可能な媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトであって、該コンピュータプログラムロジックは、コンピュータシステム内のプロセッサが、少なくとも１つの画像を分析することを可能にし、該コンピュータプログラムロジックは、
該プロセッサが、新しい画像を表すデータを受け取ることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは画像取り込み手段であって、該新しい画像は、該新しい画像上のプロテインに対応する複数の新しい画像スポットを含み、該複数の新しい画像スポットの各々は、積分化光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）および位置を有する、手段と、
該プロセッサが、マスター複合体画像を生成することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはマスター複合体画像生成手段であって、該マスター複合体画像は、該マスター複合体画像上のプロテインに対応する複数のマスター複合体スポットを含み、該複数のマスター複合体スポットの各々は、ＩＯＤ％および位置を有する、手段と、
該プロセッサが、マスター複合体を生成することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはマスター複合体生成手段であって、該マスター複合体は、該複数のマスター複合体スポットの各々に対する位置、ＩＯＤ％、位置許容誤差、およびＩＯＤ％許容誤差を含む、手段と、
該複数のマスター複合体スポットの各々に対する位置許容誤差およびＩＯＤ％許容誤差のうちの少なくとも１つを用いて、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットを検索し、識別し、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットを該複数のマスター複合体スポットのうちのいくつかのスポットに一致させることにより、セグメント化された画像および対応する画像データファイルを作成することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは検索、識別および一致手段と
を含み、
所定の条件を満たす位置許容誤差およびＩＯＤ％許容誤差のうちの少なくとも１つを有する該複数のマスター複合体スポットのうちのいくつかのスポットが、検索され、識別され、該複数の新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットに一致される、コンピュータプログラムプロダクト。
【請求項３７】
前記プロセッサが、前記新しい画像を前記マスター複合体画像に位置合わせすることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは位置合わせ手段をさらに含む、請求項３６に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項３８】
前記プロセッサが、前記マスター複合体から複数のアンカーポイントを選択することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは選択手段をさらに含む、請求項３７に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項３９】
前記プロセッサが、対応するアンカーポイントのＩＯＤ％のＩＯＤ％許容誤差内にあるＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応するアンカーポイントに一致させることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはアンカーポイント検出および一致手段をさらに含み、該対応するアンカーポイントに一致する該検出された新しい画像スポットのうちのいくつかのスポットは、複数の一致した新しい画像スポットを形成する、請求項３８に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの新しい画像スポットは、２次元電気泳動ゲル画像であり、前記コンピュータプログラムプロダクトは、
前記プロセッサが、前記複数の一致した新しい画像スポットの各々の対の間にベクトルを作成することを可能する少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはベクトル作成手段をさらに含み、
該プロセッサが、前記複数の一致した新しい画像スポットの各々の対に対してベクトル間のベクトル差を計算することにより、複数のベクトル差を形成し、該複数の一致した新しい画像スポットから、ベクトル差が該複数のベクトル差内における最大ベクトル差の所定のパーセンテージ内にある該一致した新しい画像スポットを除去することにより、複数の不一致の新しい画像スポットを形成することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはベクトル差計算手段をさらに含む、請求項３９に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４１】
前記プロセッサが、前記マスター複合体から、複数の明確に定義されたスポットを選択し、対応する明確に定義されたスポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応する明確に定義されたスポットに一致させ、該対応する明確に定義されたスポットに一致する該検出された新しい画像スポットを該複数の一致した新しい画像スポットに加えることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは明確に定義されたスポット検出および一致手段をさらに含む、請求項４０に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４２】
前記プロセッサが、前記マスター複合体から、複数の飽和スポットを選択し、対応する飽和スポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応する飽和スポットに一致させ、該対応する飽和スポットに一致する該検出された新しい画像スポットを該複数の一致した新しい画像スポットに加えることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは飽和スポット検出および一致手段をさらに含む、請求項４１に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４３】
前記プロセッサが、前記マスター複合体から、複数のウイークスポットを選択し、対応するウイークスポットの位置の位置許容誤差内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、該検出された新しい画像スポットを該対応するウイークスポットに一致させ、該対応するウイークスポットに一致する該検出された新しい画像スポットを該複数の一致した新しい画像スポットに加えることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはウイークスポット検出および一致手段をさらに含む、請求項４２に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４４】
前記プロセッサが、前記複数の一致した新しい画像スポットの外にある新しい画像を検索することにより、識別されていない新しい画像スポットを見つけることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは識別されていないスポットを見つける手段をさらに含む、請求項４３に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４５】
前記プロセッサが、第１の複数の画像と第２の複数の画像とを比較することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは比較手段をさらに含む、請求項４４に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４６】
前記選択手段は、
前記プロセッサが、前記マスター複合体を検索することにより、所定数の第一次アンカーポイントを識別することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは検索手段を含み、
該所定数の第一次アンカーポイントの各々は、
（ｉ）該所定数の第一次アンカーポイントの他のアンカーポイントから少なくとも所定の分離閾値分だけ分離されており、
（ｉｉ）所定の飽和範囲内にある飽和値を有する、請求項３８に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４７】
前記選択手段は、
前記プロセッサが、前記マスター複合体から、０．２＜Ｓ＜０．８であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合スポットを選択することにより、第１の複数の選択されたマスター複合スポットを形成することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは飽和選択手段と、
該プロセッサが、該第１の複数の選択されたマスター複合スポットから、複数の第二次アンカーポイントを選択することであって、該複数の第二次アンカーポイントにおける各選択されたマスター複合スポットは、該複数の第二次アンカーポイントにおける他の選択されたマスター複合スポットから少なくとも３ｍｍだけ分離されるように選択することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第二次アンカーポイント選択手段と
をさらに含む、請求項４６に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４８】
前記アンカーポイント検出および一致手段は、
前記複数の第二次アンカーポイントにおける各第二次アンカーポイントに対して、前記プロセッサが、
（ｉ）該第二次アンカーポイントの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定し、
（ｉｉ）該第二次アンカーポイントに対してＩＯＤ％を決定し、
（ｉｉｉ）該第二次アンカーポイントに対してスポット番号を決定し、
（ｉｖ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該アンカーポイント±２０％に対するＩＯＤ％に等しいＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを見つけ、
（ｖ）新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該第二次アンカーポイントに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第二次アンカーポイント検索手段を含む、請求項３９に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項４９】
前記明確に定義されたスポット検出および一致手段は、
前記複数の明確に定義されたスポットにおける各明確に定義されたスポットに対して、前記プロセッサが、
（ｉ）該明確に定義されたスポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定し、
（ｉｉ）該明確に定義されたスポットに対してスポット番号を決定し、
（ｉｉｉ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つけ、
（ｉｖ）新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該明確に定義されたスポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは明確に定義されたスポット検索手段を含む、請求項４１に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５０】
前記Ｘ位置座標許容誤差は、０．１ｍｍであり、前記Ｙ位置座標誤差は、０．１ｍｍである、請求項４９に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５１】
前記複数の飽和スポットは、Ｓ≧０．８であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合スポットを含む、請求項４２に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは飽和スポット検出および一致手段は、
前記複数の飽和スポットにおける各飽和スポットに対して、前記プロセッサが、
（ｉ）該飽和スポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定し、
（ｉｉ）該飽和スポットに対してスポット番号を決定し、
（ｉｉｉ）Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つけ、
（ｉｖ）新しい画像スポットが見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該飽和スポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチンルーチンまたは飽和スポット検索手段を含む、請求項４２に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５３】
前記複数のウイークスポットは、Ｓ≦０．２であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合スポットを含む、請求項４３に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはウイークスポット検出および一致手段は、
前記複数のウイークスポットにおける各ウイークスポットに対して、前記プロセッサが、
（ｉ）該ウイークスポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定し、
（ｉｉ）該ウイークスポットに対してスポット番号を決定し、
（ｉｉｉ）第１の感度を用いて、Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つけ、
（ｉｖ）新しい画像スポットが該領域内において見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該ウイークスポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはウイークスポット検索手段を含む、請求項４３に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５５】
前記複数のウイークスポットにおける各ウイークスポットに対して、前記プロセッサが、
（ｉ）該ウイークスポットの位置に対応するＸ位置座標およびＹ位置座標を決定し、
（ｉｉ）該ウイークスポットに対してスポット番号を決定し、
（ｉｉｉ）第２の感度および形状基準を用いて、Ｘ位置座標±Ｘ位置座標許容誤差およびＹ位置座標±Ｙ位置座標許容誤差によって定義される領域内において新しい画像を検索することにより、該領域内において新しい画像スポットを見つけ、
（ｉｖ）新しい画像スポットが該領域内おいて見つけられた場合、該見つけられた新しい画像スポットに該ウイークスポットに対するスポット番号と同じであるスポット番号を割り当てることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第２のウイークスポット検索手段と、
該第２のウイークスポット検索手段によって見つけられていない該複数のウイークスポットにおける各ウイークスポットに対して、該プロセッサが、該複数のウイークスポットにおける該ウイークスポットのエリアと同じであるエリアを有する新しい画像ウイークスポットを該新しい画像に加えることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたはウイークスポット追加手段と
をさらに含む、請求項５４に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは識別されていないスポットを見つける手段は、
前記プロセッサが、第１の感度を用いて、新しい画像を検索することにより、第１の複数の識別されていない新しい画像スポットを見つけることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第１の新しいスポット検索手段と、
該プロセッサが、前記第１の感度よりも高い第２の感度および形状基準を用いて、前記複数の一致した新しい画像スポットおよび前記第１の複数の不一致の新しい画像スポットの外にある新しい画像を検索することにより、第２の複数の識別されていない新しい画像スポットを見つけることを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第２の新しいスポット検索手段と
を含む、請求項４４に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５７】
前記少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは比較手段は、
前記プロセッサが、前記第１の複数の画像における各スポットに対して、ＩＯＤ％の統計的平均値を計算することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第１の解析手段と、
該プロセッサが、前記第２の複数の画像における各スポットに対して、ＩＯＤ％の統計的平均値を計算することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは第２の解析手段と、
該プロセッサが、該第１の複数の画像における各スポットが該第２の複数の画像における各スポットとは統計的に異なるかどうかを決定することを可能にする少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチンまたは統計的平均差計算手段と
を含む、請求項４５に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５８】
前記マスター複合スポットの位置および前記新しい画像スポットの位置は、矩形の平行座標で表現される、請求項３６に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの新しい画像および前記マスター複合体画像は、セルプロテインの２次元電気泳動ゲル画像である、請求項３６に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの新しい画像および前記マスター複合体画像は、セルプロテインの２次元電気泳動ゲル画像である、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記ゲル画像は、前記電気泳動ゲルのビデオレコーディング、Ｘ線フィルム、蛍光感光撮影済みフィルム、または、染色ゲル写真用撮影済みフィルムである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ゲル画像は、前記電気泳動ゲルのビデオレコーディング、Ｘ線フィルム、蛍光感光撮影済みフィルム、または、染色ゲル写真用撮影済みフィルムである、請求項５９に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項６３】
前記第１の複数の画像スポットおよび前記第２の複数の画像スポットは、異なる画像取り込み条件（ｉｍａｇｅ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でまたは異なるスポット量（ｓｐｏｔ  ａｍｏｕｎｔ）を用いて取り込まれた同じ画像である、請求項３５に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の複数の画像スポットおよび前記第２の複数の画像スポットは、異なる画像取り込み条件下でまたは異なるスポット量を用いて取り込まれた同じ画像である、請求項５７に記載のコンピュータプログラムプロダクト。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、画像を解析する方法および装置に関し、具体的には、関連または類似する画像（白黒またはカラー）の比較に関する。本発明は、好適な実施形態では、ゲル電気泳動画像を解析して新しいタンパク質またはプロテオーム（proteomes）を同定するため、および／または、ゲル画像を比較してタンパク質の定量的もしくは質的な変化を同定するための、コンピュータベースのプロセス、コンピュータベースのシステム、コンピュータプログラム、および／またはコンピュータプログラム製品に関する。
２．関連技術
酸性および／または塩基性側鎖のため、タンパク質は、正および／または負に帯電した基を含む。電界中でのタンパク質の挙動は、このような正および／または負の電荷の相対数によって決まる。この相対数は、溶液の酸度の影響を受ける。等電点（ｐＩ）で、正および負の電荷は、ちょうどバランスがとられた状態であり、タンパク質は、正味の移動を示さない。約７．５未満のｐＩを有するタンパク質は通常、等電点電気泳動（ＩＦＥ）ゲル中で分析される。これらのゲルのｐＨ勾配は通常予め形成され、サンプルは、ゲルの中性端で付与される（酸性タンパク質--７．５よりも小さいｐＩを有するタンパク質--はすべて、負に帯電される）。電気泳動の開始時、負に帯電したタンパク質はすべて、アノードの方に、即ち、ゲルを通って移動し始める。各タンパク質がそのｐＩに達すると、カソード側およびアノード側からそのタンパク質にかかる電気的な力が等しくなり、従って、タンパク質は「集束」する。７よりも大きいｐＩを有するタンパク質は、非平衡ｐＨ勾配電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）ゲル上で、最良に分解される。従って、タンパク質は再び、中性ｐＨ領域で付与され、塩基性タンパク質（７よりも大きいｐＩを有する）はすべて、正に帯電される。従って、電気泳動中に、これらの塩基性タンパク質は、カソードの方に、即ち、ゲルを通って移動する。
言うまでもなく、ｐＨ勾配が支持マトリックス（ポリアクリルアミド）に共有結合する固定ｐＨ勾配電気泳動ゲルシステム（ＩＰＧ）においても、同じ分離が得られ得る。異なるタンパク質は、異なる割合の酸性および／または塩基性側鎖を有し、従って、異なる等電点を有する。特定の水素イオン濃度（ｐＨ）の溶液では、カソードの方に移動するタンパク質もあれば、アノードの方に移動するタンパク質もある。電荷の大きさと、分子のサイズおよび／または形状に依存して、異なるタンパク質は、異なる速度で移動する。このような電界中での挙動の差が、電気泳動によるタンパク質の分離および／または分析の方法の基本である。
二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）は、タンパク質を分析するための特に効果的なツールである。任意の原核細胞または真核細胞からの細胞抽出物がゲル上に置かれ、個々のタンパク質が、まずｐＩ（第１の次元）により分離され、次いでサイズ（第２の次元）により分離される。その結果、１０００〜５０００スポットもの特性図が得られる。ここで、各スポットは通常、単一のタンパク質である。分解能は、ゲルの組成またはサイズを増加することにより、ならびに／または、放射化学法の使用、銀染色法の使用、および／もしくはゲルの厚さの１．５ｍｍ以下への低減によって感度を高めることにより、向上される。Jungblutらは、２３×３０ｃｍのサイズのゲル上に、５０００個までの、マウス脳のタンパク質スポットがあったことを報告している（Journal of Biotechnology、41（1995）111-120）。
高分解能２ＤＧＥは、塩基性および酸性タンパク質を分析するために使用されている。第１の次元の等電点電気泳動（ＩＥＦ）が、第２の次元のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動と組み合わされ得る（ＩＥＦ−ＳＤＳ）。あるいは、第１の次元の非平衡ｐＨ勾配電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）が、第２の次元のＳＤＳゲル電気泳動と組み合わされ得る（ＮＥＰＨＧＥ−ＳＤＳ）。例えば、O'Farrell、J. Biol. Chem. 250、4007-4021（1975）、およびO'Farrellら、Cell、12:1333-1142（1977）に記載されているように、そのような手順は、当業者に公知である。本明細書において、上記文献全体を参考として援用する。ゲルは、絶対等電点の判定のために使用することはできず、むしろ、観察値に対して使用され得る。これは、例えば高尿素濃度などの実行条件が理想的でないためである（言葉の物理化学的な意味で。--側鎖のｐＫａ値は、水と、高濃度の尿素との間でかなり異なる）。ＮＥＰＨＧＥゲルは、タンパク質の絶対等電点の判定のために使用することができない。タンパク質の等電点は通常、等電点電気泳動中に形成される安定したｐＨ勾配を参照して決定される。O'Farrell（1977）に説明されるように、酸性タンパク質の最良の分解能は、平衡ＩＥＦで得られる。なぜなら、ゲルの、酸性タンパク質を含む領域が、ＮＥＰＨＧＥで圧縮されるからである。塩基性タンパク質の最良の分解能は、ｐＨが７〜１０であるＮＥＰＨＧＥゲルで得られる。タンパク質の全範囲の最高の分解能を得るためには、好ましくは次の２つのゲルが用いられる：（１）酸性タンパク質用のＩＥＦゲル、および（２）塩基性タンパク質用のＮＥＰＨＧＥゲル。もちろん、得られる正確な画像は、両性電解質などの化学薬品、用いられるゲル寸法および／または温度および／または電気的パラメータなどの物理的パラメータ、などの多くのファクタに依存するが、これらに限定されない。
一旦２ＤＧＥゲルが流動されると、多くの方法により画像が現され得る。この方法としては、染色（例えば、クーマシーブルー、銀、または、蛍光もしくは免疫染色）、放射能の直接測定（放射能を検出することができる装置（いわゆるβ−撮像装置、もしくは燐光体画像技術など）、または放射能に敏感な写真フィルムなどを使用する）、Ｘ線写真の放射の蛍光の増大、または上記方法の組み合せ、などがある。さらに、上記方法のうちの幾つかを用いて電気泳動後にタンパク質が検出可能になるように、サンプルは、電気泳動の前に（例えば、モノブロモビマンおよび関連する化合物を用いて）処理され得る。例えば、電気泳動後、２ＤＧＥゲルは、メタノールおよび酢酸を用いて固定され得、ＡＭＰＬＩＦＹ▲Ｒ▼（Amersham）で処理され得、乾燥され得る。次いで、ゲルをＸ線フィルムに接触させて、露光する。ゲルは、Ｘ線フィルムのダイナミックレンジの欠如を補償するために、多数回、ある時間の間露光され得る。各フィルム画像は、異なる位置、サイズ、形状、および／または光学密度の多数の「スポット」を含む。画像上のスポットが解析されて、スポットとタンパク質との対応関係が決定される。
人によるゲル画像の目視検査および目視解析は、制御された条件下で、特定の範囲内で行われ得る（Jungblutら、Quantitative analysis of two-dimensional electrophoretic protein patterns: Comparison of visual evaluation with computer-assisted evaluation、Neuhoff,V.（編）、Electrophoresis‘84、Verlag Chemie GmbH、Weinheim、301-303、および、Andersenら、Diabetes、Vol. 44、1995年４月、400-407。１つのフィルムの解析には、この技術分野においてかなりの熟練および経験を有している人であっても、８時間を超える時間がかかり得る。典型的には、ゲルの画像を得るある方法は、非線形的であり（例えば、銀染色および／またはＸ線フィルム）、タンパク質発現の完全な範囲をカバーする場合（これは、最低の発現のタンパク質対最高の発現のタンパク質の比が１：１００，０００までであり得る）、この非線形性を補正しなければならない場合が多い。さらに、目視解析での定量化が制限される。典型的には、目視解析は、タンパク質の量の変化が２以上のファクタである場合にしかその変化を検出することができない。
定量化を向上し且つゲル膜の評価を助けるために、様々なコンピュータプログラムおよびコンピュータ評価システムが開発されており、例えば、ＰＤＱＵＥＳＴ（Protein Database Inc.、ニューヨーク（New York））、BioImage（Millipore、ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）、Phoretix（Phoretix International、ニューカッスル（Newcastle）、英国）、およびKepler（Large Scale Biology Corporation、ロックビル（Rockville）、メリーランド州）、などがある。BioImage（BioImage、アンアーバー（Ann Arbor）、ミシガン州）などのコンピュータプログラムを使用するために、膜上のゲルの画像はスキャンされて、コンピュータに取り込まれる。デジタル化されたゲル画像は、コンピュータプログラムにより解析される。各スポットには、積分光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）などの強度値と、「Ｘ，Ｙ」デカルト座標などのゲル上の位置とが割り当てられる。BioImageなどのコンピュータプログラムは、スポット位置の分解能および再現性において、最も高い品質を必要とする。ゲル媒体は非常に弾性であるため、ゲルパターンは同一でない。即ち、本質的に同一の条件下で流動される２つのゲルの各スポットは、全く同じ位置には配置されない。２つのゲルが本質的に同一でない条件下で流動されると、対応するタンパク質スポットの位置の差は、さらに大きくなる。
上記のシステムのようなコンピュータ評価システムは、ゲル画像の「スポットリスト」の生成のために、スポット強度およびＩＯＤ％の定量化を改善している。しかし、上記のシステムのようなコンピュータ評価システムは依然として、編集のために、オペレータのかなりの労力を必要とする。評価されるゲル画像は、スキャンなどによりコンピュータに入力される。デジタル化された画像が検索されて、感度閾値を上回る強度または光学強度を有するスポットの位置が特定される。次いで、オペレータは、ゲル画像を編集する。例えば、非常に大きい２つのスポットが互いに近接している場合、コンピュータは、これら２つのスポットを１つの細長いスポットであるとして同定し得る。コンピュータは、実際には２つのスポットがあるとして分解することができない場合がある。そのような場合、オペレータは、画像を手動で編集して、そのスポットを２つのスポットに分割しなければならない。別の例として、コンピュータは、高強度の縞（streak）などのゲル画像上の非タンパク質スポットを、タンパク質スポットであるとして間違って同定し得る。この場合、オペレータは、画像を手動で編集して、この非タンパク質スポットを削除しなければならない。熟練したオペレータが、従来のコンピュータ評価システムを用いて評価されたゲル画像を編集するためには、６〜８時間かかり得る。
Jungblutら（1995）に報告されているように、多数の研究者が、従来のコンピュータ評価システムを用いて、様々な組織または細胞の種類についての２ＤＧＥデータベースを作成してきた。しかし、これらのシステムでは、新しいゲル画像の正確なスポットリストを作成するために、オペレータ側にかなりの労力が必要とされる。さらに重要なことには、従来のコンピュータ評価システムは、同じ細胞の種類の他のゲル画像からの情報を用いて、オペレータが、新しいゲル画像を迅速および／または効率的に解析および／または解釈することを可能にする解析および／または解釈ツールを提供するものではない。従来のコンピュータ評価システムを、少量しか存在しないタンパク質を確実に検出するために使用することはできない。従って、オペレータに必要とされる労力を低減し、且つ、新しいゲル画像が解析および／または解釈され得る速度を増加する、コンピュータベースの解析システムが、当該分野において必要とされている。さらに、同じ細胞の種類の他のゲル画像からの情報を用いる、新しいゲル画像を解析および／または解釈するためのコンピュータベースの解析システムが、当該分野において必要とされている。
従来のコンピュータ評価システムはまた、ゲル画像のグループ間の統計的比較のための完全な解析ツールを提供するものではない。従って、新しいゲル画像を解析および／解釈することができるだけではなく、ゲル画像の様々なグループ間の統計的比較を実行することができるコンピュータベースの解析システムが、当該分野においてさらに必要とされている。
本明細書におけるいずれの文献の引用も、そのような文献が、本願の請求の範囲のいずれかの特許性に関連がある従来技術であるか、または関連があると考えられる資料であることを承認するものとして意図されたものではない。
いずれの文献の内容または日付に関するいずれの記載も、出願時に本出願人が入手可能であった情報に基づくものであり、そのような記載が正確であることの承認を構成するものではない。
発明の要旨
本発明は、電気泳動ゲルの画像を解析する方法、化合物、組成物、および装置に関する。この画像は、白黒であっても、カラーであってもよい（カラー画像は、原色について３つのグレースケール範囲を有し得、従って、以下に説明される方法と同じ方法で解析され得る）。ここでは、説明の目的のためだけに、１つのグレースケールを考慮しており、当業者は、その説明を、容易に３原色またはその組み合わせに広げることができる。
いかなる種類の画像も、以下に説明される態様で解析され得るが、この方法は、例えば、天候パターンを図表にするため、または、地質調査の場合の、雲または地表の連続的な衛星写真などの２つ以上の類似画像が得られるいかなる種類の状況の解析または比較にも、最適である。他の実施例としては、病院での生検の連続的な断面、ＣＴまたはＣＡＴ装置からの連続するスキャニングラン（scanningrun）などがある。バイオテクノロジーでの応用としては、ノーザンブロット、サザンブロット、もしくはウェスタンブロット、１−Ｄゲル、および／または２ＤＧＥゲルなどがあるが、これらに限定されない。以下、本発明を、タンパク質の同定のためのゲル電気泳動画像の解析と、タンパク質または核酸の変化の同定のためのゲル画像の比較とに関して説明する。
本発明の１つの局面では、画像解析方法が提供される。この方法は、以下のステップのうちの１つ以上、例えば、（１）、および少なくとも１つのステップ（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）または（１２）を包含するが、これらに限定されない。
（１）新しい画像を取り込むステップ。ここで、新しい画像は、複数の新しい画像スポットを含み、新しい画像スポットの各々は、スポット番号、積分光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）、および位置を有する；
（２）新しい画像を解析する際に用いられるマスタ複合画像を生成するステップ。ここで、マスタ複合画像は、複数のマスタ複合スポットを含み、マスタ複合スポットの各々は、スポット番号、ＩＯＤ％、および位置を有する；
（３）マスタ複合物を生成するステップ。ここで、マスタ複合物は、複数のマスタ複合スポットの各々について、スポット番号、ＩＯＤ％、位置、この位置およびＩＯＤ％についてのスポットの変動性（例えば、パーセンテージで表された標準偏差）、ならびに飽和値（（対象のスポットを得るために用いられた元の画像からの）スポットのいずれかにおいて見られる最大画素強度の値に対応する（この値は、白（０）から黒（１）までのスケール上の割合として表される））を含む；
（４）新しい画像をマスタ複合画像と整列させるステップ；
（５）マスタ複合物からアンカポイントのセットを選択するステップ；
（６）対応するアンカポイントの位置の許容誤差範囲内にある位置を有し、且つ、対応するアンカポイントのＩＯＤ％のＩＯＤ％許容誤差範囲内のＩＯＤ％を有する新しい画像スポットを検出し、そして、検出された新しい画像スポットを、対応するアンカポイントと適合して、適合された新しい画像スポットのセットを形成するステップ；
（７）マスタ複合画像および新しいゲル画像の同じ番号のスポットを結ぶベクトルのセットを計算し、そして、各ベクトルについて、長さおよび角度を決定するステップ；
（８）対象のベクトルと、対象のスポットに最も近いスポットの個数（例えば、約２〜５００個）から生じるベクトルとの間の差に対応するベクトル差を、適合された新しい画像スポットのセットの各々の新しい画像スポットについて計算するステップ。これにより、新しい、適合された新しい画像スポットの各々についてのベクトル差が生成され、その後のステップで、適合された新しい画像スポットのセットから、最良（最短の長さ、およびより小さい数値の角度）のベクトル差の所定のパーセンテージよりも大きいベクトル差の適合を除外する。画像の整列の品質検査を行うため、および、最適な適合が得られるまで、ミス適合の訂正を繰り返し導くために、これらのベクトル差が用いられ得る態様である；
（９）マスタ複合物から、十分に規定されたスポットのセットを選択し、対応する十分に規定されたスポットの位置の許容誤差範囲内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、検出された新しい画像スポットを、対応する十分に規定されたスポットに適合し、これらの適合された新しい画像スポットを、適合された新しい画像スポットのセットに加えるステップ；
（１０）マスタ複合物から飽和スポットのセットを選択し、対応する飽和スポットの位置の許容誤差の範囲内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、検出された新しい画像スポットを、対応する飽和スポットに適合し、これらの適合された新しい画像スポットを、適合された新しい画像スポットのセットに加えるステップ；
（１１）マスタ複合物から弱いスポットのセットを選択し、対応する弱いスポットの位置の許容誤差の範囲内にある位置を有する新しい画像スポットを検出し、検出された新しい画像スポットを、対応する弱いスポットに適合し、これらの適合された新しい画像スポットを、適合された新しい画像スポットのセットに加えるステップ；ならびに
（１２）新しい画像のうち、適合された新しい画像スポットのセット以外の部分を検索して、同定されていない新しい画像スポットの位置を特定するステップ。
本発明の別の局面では、この方法は、画像の第１のセットを、画像の第２のセットと比較するステップをさらに包含する。
本発明のさらに他の局面では、新しい画像は、共通アンカポイントを用いることにより、マスタ複合画像と整列される。共通アンカポイントは、新しい画像およびマスタ複合画像の両方に存在するスポットに対応する。マスタ複合物から選択されたアンカポイントは、一次アンカポイントおよび二次アンカポイントを含み得る。一次および二次アンカポイントは、使用されるマスタ複合物タンパク質を選択するために、画像処理の異なるステージで、異なる選択基準を用いて得られる。
本発明のさらに他の局面では、十分に規定されたスポットは、約０．２＜Ｓ＜０．８の範囲の飽和値Ｓを有する。飽和スポットは、Ｓ≧０．８の飽和値を有する。弱いスポットは、Ｓ≦約０．２の飽和値を有する。
本発明のさらに他の局面では、コンピュータシステムのプロセッサが細胞タンパク質の２次元電気泳動ゲル画像を解析することを可能にするためのコンピュータプログラム論理が記録されたコンピュータプログラム製品が提供される。そのようなコンピュータプログラム論理は、以下のうちの１つ以上を含む。
・プロセッサが新しいゲル画像を表すデータを受け取ることを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または画像取り込み手段。ここで、新しいゲル画像は、新しいゲル画像上のタンパク質に対応する複数の新しいゲル画像スポットを含み、新しいゲル画像スポットの各々は、積分光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）および位置を有する；
・プロセッサが新しいゲル画像を解析するために用いられるマスタ複合画像を生成することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、またはマスタ複合画像生成手段。ここで、マスタ複合画像は、マスタ複合画像上のタンパク質に対応する複数のマスタ複合スポットを含み、マスタ複合スポットの各々は、スポット番号、ＩＯＤ％、および位置を有する；
・プロセッサがマスタ複合物を生成することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、またはマスタ複合物生成手段。ここで、マスタ複合物は、複数のマスタ複合スポットの各々について、スポット番号、位置、ＩＯＤ％、および、飽和値（（対象のスポットを得るために用いられた元の画像からの）スポットのいずれかにおいて見られる最大画素強度の値に対応する（この値は、白（０）から黒（１）までのスケール上の割合として表される））を含む；
・プロセッサが新しいゲル画像をマスタ複合画像と整列させることを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または整列手段；
・プロセッサがマスタ複合物からアンカポイントのセットを選択することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または選択手段；
・プロセッサが、対応するアンカポイントのＩＯＤ％のＩＯＤ％許容誤差範囲内のＩＯＤ％を有する新しいゲル画像スポットを検出し、且つ、検出された新しいゲル画像スポットを、対応するアンカポイントと適合して、適合された新しい画像スポットのセットを形成することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、またはアンカポイント検出および適合手段；
・プロセッサがマスタ複合画像および新しいゲル画像中の同じ番号のスポットを結ぶベクトルのセットを計算することを可能にし、且つ、各ベクトルについて、長さおよび角度を決定するための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または手段；
・プロセッサが、対象のベクトルと、対象のスポットに最も近いスポットの個数（例えば、約１〜５００個）から生じるベクトルとの間の差に対応するベクトル差を、適合された新しい画像スポットのセットの各々について計算することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、またはベクトル差分手段。（これにより、新しい、適合された新しい画像スポットの各々についてのベクトル差が生成され、その後のステップで、適合された新しい画像スポットのセットから、最良（最短の長さ、および／または、より小さい数値の角度）のベクトル差の所定のパーセンテージよりも大きいベクトル差の適合を除外する。高度に飽和されたスポット（約＞３〜４０個未満の飽和ピクセル、約＞９個未満のピクセル）の場合、スポット中心の位置は、例えばスポット形状特性などを用いて判定される。当該分野においてさらに公知であるように、あるいは、本明細書において説明されるように、飽和領域が１個よりも多いスポットをカバーし、飽和領域が、ＭＣＩに存在するスポット数に対応する個数の領域に分割される場合が考慮され得、スポット中心は、この考慮に基づいて計算され得る；
・画像の整列の品質検査を行い、且つ、最適な適合が得られるまで、ミス適合の訂正を繰り返し導くために、これらのベクトル差を使用することを可能にする、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または手段；
・プロセッサが、画像の整列の品質検査を行い、且つ、最適な適合が得られるまで、ミス適合の訂正を繰り返し導くために、これらのベクトル差をどのように使用することができるかを計算することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または手段；
・プロセッサが、マスタ複合物から、十分に規定されたスポットのセットを選択し、対応する十分に規定されたスポットの位置の許容誤差の範囲内にある位置を有する新しいゲル画像スポットを検出し、検出された新しいゲル画像スポットを、対応する十分に規定されたスポットに適合し、これらの適合された新しいゲル画像スポットを、適合された新しいゲル画像スポットのセットに加えることを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または十分に規定されたスポットを検出および適合する手段；
・プロセッサが、マスタ複合物から飽和スポットのセットを選択し、対応する飽和スポットの位置の許容誤差の範囲内にある位置を有する新しいゲル画像スポットを検出し、検出された新しいゲル画像スポットを、対応する飽和スポットに適合し、これらの適合された新しいゲル画像スポットを、適合された新しいゲル画像スポットのセットに加えることを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または飽和スポットを検出および適合する手段；
・プロセッサが、マスタ複合物から弱いスポットのセットを選択し、対応する弱いスポットの位置の許容誤差の範囲内にある位置を有する新しいゲル画像スポットを検出し、検出された新しいゲル画像スポットを、対応する弱いスポットに適合し、これらの適合された新しいゲル画像スポットを、適合された新しい画像スポットのセットに加えることを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または弱いスポットを検出および適合する手段；
・プロセッサが、新しい画像のうち、適合された新しいゲル画像スポットのセット以外の部分を検索して、同定されていない新しいゲル画像スポットの位置を特定することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または、同定されていないスポットの位置を特定する手段；ならびに
・プロセッサがゲル画像の第１のセットをゲル画像の第２のセットと比較することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または比較手段。
本発明のさらに他の局面では、比較手段は、以下のものを含む。
・プロセッサが第１のセットの各スポットについてのＩＯＤ％の統計平均を計算することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または第１のセットを分析する手段；
・プロセッサが第２のセットの各スポットについてのＩＯＤ％の統計平均を計算することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または第２のセットを分析する手段；および
・プロセッサが、第１のセットの各スポットが、第２のセットの各スポットと統計的に異なるかどうかを判定することを可能にするための、少なくとも１つのアルゴリズム、サブルーチン、ルーチン、または統計平均差分手段。
本発明のさらに他の局面では、比較手段は、（上記リストから選択された）タンパク質検出システムの有効ダイナミックレンジが増加され得るような方法で、同じゲルの異なる露光量、または同じサンプルの異なるゲルを、異なる量で組み合わせる可能性を提供する。
特徴および利点
本発明の特徴は、新しいゲル画像を解析および／もしくは解釈すること、ならびに／または、ゲル画像のグループ間の統計的比較を行うことができることである。
本発明の別の特徴は、単一のゲル（デフォルト許容誤差値を用いる）またはマスタ複合画像からの情報を用いて、新しいまたは追加のゲル画像の解析および解釈を導くことである。
本発明のさらに他の特徴は、新しいゲル画像中のスポットの位置を特定する際に、積分光学密度および位置を用いることである。
本発明の利点は、オペレータからの最低限の入力で、新しいゲル画像が解析および／または解釈され得ることである。
本発明の別の利点は、新しいゲル画像が、迅速および／または効率的に解析および／または解釈され得ることである。
本発明のさらに他の利点は、少量で存在するタンパク質を容易に検出できることである。
本発明のさらに他の利点は、本発明が２次元ゲル電気泳動画像の解析および／または解釈に限定されず、画像が白黒であるかカラーであるかに拘わらず、あるいは、画像の解釈および／または認識が必要とされるいかなる状況においても、任意の２つの類似画像を比較するために、本発明を用いることができることである。このプロセスは、任意の画像取り込み装置からの「新しく得られた画像」と、コンピュータ記憶装置から回復された画像との比較を含み得る。別の実施形態では、これは、連続する２つの画像（例えば、ビデオ記録またはリアルタイムビデオ画像）の間の差を同定するために行われるこれらの２つの画像の比較を含み得る。
【図面の簡単な説明】
添付の図面を参照して、本発明を説明する。図中、同一の参照番号は、同一または機能的に類似したエレメントを指す。
図１は、本発明の方法の一実施形態を示すブロック図である。
図２は、図１に示されるステップ１１０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図３は、図１に示されるステップ１２０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図４Ａおよび図４Ｂは、図１のステップ１３０および１４０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図５は、図５Ａおよび図５Ｂの配置を示す。
図５Ａおよび図５Ｂは、図１のステップ１５０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図６は、図１に示されるステップ１６０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図７は、図１に示されるステップ１７０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図８は、図１に示されるステップ１８０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図９は、図１に示されるステップ１９０を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図１０は、図１に示されるステップ１９５を実行するための一実施形態を示すブロック図である。
図１１は、本発明との使用に適した例示的なコンピュータシステムのブロック図である。
実施形態の詳細な説明
１．概説
本発明は、画像を解析するための、コンピュータベースのプロセス、コンピュータベースのシステム、および／またはコンピュータプログラム製品に関する。本発明は、タンパク質の２次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）画像の解析のコンテキストにおいて説明される。しかし、本発明が、２ＤＧＥ画像の解析に限定されず、画像が白黒であるかカラーであるかに拘わらず、あるいは、画像の解釈および／または認識が必要とされるいかなる状況においても、任意の２つの類似画像を比較するために使用され得ることが理解されるはずである。このプロセスは、任意の画像取り込み装置からの「新しく得られた画像」と、コンピュータ記憶装置から回復された画像との比較を含み得る。そのような画像の例としては、組織断面、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡのゲルまたはブロット画像、コンピュータ化された断層撮影（例えば、コンピュータ援用断層撮影（ＣＡＴ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ））のために使用される装置のようなスキャン装置からの断面画像、衛星画像、星の写真、Ｘ線、蛍光写真、または任意の記録画像もしくはリアルタイム画像、などがあるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、オペレータの最小限の入力で、ゲル画像を迅速および／または効率的に解析および／または解釈するための解析ツールを提供する。ゲル画像は、新しいタンパク質が同定され得るように解析および／または解釈される。本発明の方法はまた、ゲル画像を比較してタンパク質の変化を同定するため、即ち、アップまたはダウンレギュレーションのための比較ツールを提供する。
本発明の方法は、マスタ複合画像からの情報を用いて、新しいゲル画像の解析を導く。このようにして、同じ細胞の種類の他のゲル画像からの情報を用いて、新しいゲル画像の解析および／または解釈を導く。この技術は、新しいゲル画像を解析するために必要とされる時間を大幅に短縮する。この技術はまた、新しいゲル画像を解析するために必要とされるオペレータの労力を大幅に低減する。
本発明の方法を実行するために、マスタ複合画像は、オペレータにより選択された画像から生成される。オペレータにより選択され、マスタ複合画像を生成する際に使用される画像は、典型的には、同じ細胞の種類であり、行われているプロジェクトまたは実験の種類に関連する。本明細書において使用される「画像」という用語は、各々に単位のないグレーレベル値が割り当てられた画素からなる表示を指す。例えば、８ビット画像の各画素には、その画素に割り当てられたゼロ（白）から２５５（黒）の範囲のグレーレベルと、飽和値（ゼロから１の範囲で変動する値であり、各スポットの最も暗い画素の値を２５５（８ビット画像の場合）で割った値に対応する）と、スポットが１つよりも多いゲルに適合されている場合、各スポットについてのＸ、Ｙ（位置）およびＺ（定量）の値の標準偏差と、を有する。より大きいビット数の画像ほど、より大きい範囲で、段階の細かいグレーレベルを有する。
マスタ複合画像に対応するマスタ複合物が、生成される。以下により詳細に説明されるように、マスタ複合物は、スポット位置、積分光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）、スポット番号、および飽和値などの、マスタ複合画像上の各スポットの特性を表すデータを含む。マスタ複合物は、新しい画像の解析および／または解釈を助けるために容易に検索され得るデータの編集を提供する。マスタ複合物のスポットに対応する、新しい画像のスポットの位置が特定されると、位置が特定されたこの新しい画像のスポットは、マスタ複合物のスポットに「適合」される。一旦、マスタ複合物のスポットが新しい画像のスポットに適合されると、このマスタ複合物のスポットは、マスタ複合物のスポットの利用可能なプールから除外される。本発明の方法は、一連の検索を通して、マスタ複合物のすべてのスポットの、新しい画像のスポットへの適合を繰り返す。マスタ複合物のすべてのスポットが適合された後に新しい画像に存在している、適合されていないいずれのスポットも、同定されていない新しい画像のスポットを表す。そのような同定されていない新しい画像のスポットは、以前に同定されていないタンパク質を表す。
本発明の別の応用では、同じサンプルの異なるゲルの同じ画像の異なる露光量が互いに適合され得、そのため、画像が読み出される媒体の「ダイナミックレンジの拡大」が可能となる。この媒体は、典型的には、Ｘ線フィルム、銀もしくはその他の染色ゲル、免疫染色ゲルもしくはそのブロット、または、これらの組み合わせであるが、これらに限定されない。この手順は、本発明において有用であり得る。なぜなら、（ｉ）細胞内のタンパク質の発現率が、１００，０００よりも大きい（即ち、約１，０００であるＸ線フィルムの応答のダイナミックレンジ、もしくは、約１００のダイナミックレンジを有する染色ゲルの応答のダイナミックレンジを超える）ため、および／または（ｉｉ）上記媒体の応答が線形でない（これは、タンパク質スポットの正確な定量化において問題を引き起す）ためである。
一旦、マスタ複合画像が生成されると、新しい画像は、このマスタ複合画像に整列されなければならない。本発明の方法は、アンカポイントの使用により、新しい画像をマスタ複合画像に整列させる。アンカポイントは、新しい画像およびマスタ複合画像の両方に存在するスポットに対応する共通アンカポイントと、規定の基準に基づいてマスタ複合物から選択される一次および二次アンカポイントとを含む。アンカポイントが新しい画像のスポットに適切に適合されることを確実にするために、ベクトル差分品質制御解析が行われる。
本発明の方法は、新しい画像の検索を行い、マスタ複合物に存在する、まだ適合されていない３つの異なる種類のスポットがあるかどうかを調べる。第１のタイプのスポットは、「十分に規定された」スポットである。以下により詳細に説明されるように、十分に規定されたスポットは、約０．２と約０．８との間の飽和値「Ｓ」を有するスポットである。十分に規定されたスポットは、弱くないまたは飽和でないスポットである。第２のタイプのスポットは、「飽和」スポットである。飽和スポットは、約０．８以上の飽和値Ｓを有する。第３のタイプのスポットは、「弱い」スポットである。弱いスポットは、約０．２以下の飽和値を有する。新しい画像にある、十分に規定されたスポット、飽和スポットおよび弱いスポットに対応するスポットは、適合され、これらの適合されたスポットには、マスタ複合物の対応するスポットと同じスポット番号が与えられる。十分に規定されたスポット、飽和スポットおよび弱いスポットの検索が終了すると、新しい画像のうちの、適合されたスポットの範囲外の部分が検索され、同定されていないスポットの位置が特定される。同定されていないスポットの検索は、２つの異なる感度レベルを用いて行われる。位置が特定された、同定されていないスポットは、さらなる解析および評価のために、オペレータに与えられる。
本発明の別の応用では、オペレータが、新しいゲルと、ＭＩＣとして選択された画像とが、同じゲルまたは同じサンプルのいずれかのものであると特定した場合、同じ画像の異なる露光量が、上で概要を述べ且つ以下に詳細に説明される手順と同じ手順を用いて、互いに適合され得る。これらのカテゴリーの２つ以上の画像が組み合わされた後、％ＩＯＤが再計算され、これらの値が、さらなる解析のために用いられる。
上記のような本発明の方法は、新しい画像を解析および解釈するための効率的な解析ツールを提供する。本発明の方法は、以前に解釈された様々な画像を比較するという追加の能力を提供する。例えば、オペレータは、比較される２つ以上の画像グループを同定し得る。このグループは、特定の態様で処理された細胞のグループ、および未処理の細胞のグループ、などである。処理された細胞のゲル画像グループの各スポットは、未処理の細胞のゲル画像グループの対応するスポットと比較され、統計的に有意な差があるかどうかが調べられる。これにより、オペレータが、選択された画像間の統計的比較を行うための簡便な方法を提供する。
２．本発明の方法
次に図１を参照して、本発明の方法の一実施形態を説明するブロック図１００が示される。以下により詳細に説明されるように、本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせを用いて実現され得、そして、コンピュータシステムまたは他の処理システムにおいて実現され得る。ステップ１１０で、新しい画像が取り込まれる。本発明は、新しい画像が２ＤＧＥゲル画像であることに限定されず、本発明が任意の適切な種類の画像を解析するために使用され得ることが理解されるはずである。画像は、当業者に公知の態様で、画像をスキャンしてコンピュータに取り込むすることにより、取り込まれ得る。画像はまた、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、ハードディスクドライブ、光ディスク、フロッピーディスクなどの記憶装置から画像を回復することにより取り込まれ得る。画像はまた、別のコンピュータ、カメラ、インターネットのサイト、または他の任意のソースから通信インタフェースを介して画像をダウンロードすることにより取り込まれ得る。
ステップ１２０で、マスタ複合画像およびマスタ複合物が生成され、解析の種類（新しいゲルのマスタ複合物への適合、同じゲルの２つの露光量の適合、または同じサンプルの２つのゲルの適合）が選択される。ステップ１３０で、新しい画像が、マスタ複合画像と整列される。
ステップ１４０で、マスタ複合物からアンカポイントが選択される。新しい画像が検索され、アンカポイントに対応する、新しい画像のスポットの位置が特定される。新しい画像において、アンカポイントに対応するスポットの位置が特定されると、この新しい画像のスポットは、対応するアンカポイントに適合される。
ステップ１５０で、適合された新しい画像のスポットの各々について、ベクトル差が計算される。最も大きいベクトル差を有する、適合された新しい画像のスポットの適合が、不適合にされる（unmatched）。
ステップ１６０で、新しい画像が検索され、十分に規定されたスポットを検出し、そして適合する。ステップ１７０で、新しい画像が検索され、飽和スポットを検出し、そして適合する。ステップ１８０で、新しい画像が検索され、弱いスポットを検出し、そして適合する。
ステップ１９０で、新しい画像が検索され、同定されていない新しい画像のスポットの位置が特定される。新しい画像のうち、既に適合されているスポット以外の部分が検索される。
手順の始め（ステップ１２０）で、オペレータが、適合されているゲルが、同じゲルの２つの露光量かまたは同じサンプルの２つのゲルのいずれかであることを選択していれば、次いで、コンピュータは、すべてのタンパク質について％ＩＯＤを再計算する。
最後に、ステップ１９５で、画像の様々なセットが比較され得る。オペレータは、比較される画像グループと、行われる統計的比較の種類とを選択し得る。
次に図２を参照して、ステップ１１０を実行するための一実施形態を説明するブロック図が示される。ステップ１で、画像が取り込まれる。画像は、画素および関連するグレーレベル値のコンピュータ画像（picture）である。ゲルに対応する画像は、好ましくは、個々の画像ファイルに格納される。以下により詳細に説明されるように、画像（画素およびグレーレベル値）は処理され、画像を特徴付ける画像データの表が生成される。画像データは、好ましくは、画像（画素）ファイルとは別の画像データファイルに格納される。
判定ステップ２で、画像が新しいプロジェクトに関連するかどうかが判定される。プロジェクトは通常、実験に対応する。例えば、プロジェクトは、ランゲルハウス島（インシュリンを分泌する膵臓の細胞）などの特定の種類の細胞（本明細書では「島（islets）」と呼ぶ）に関する実験に対応し得る。この実験は、通常の島からのゲルの１つのセットと、特定の方法で（サイトカイン、もしくは、島に見られる細胞と相互作用する他の生物学的分子、などを用いて）処理された島からのゲルの別のセットとの解析および／または解釈を含み得る。プロジェクトの実験データは、通常の島および処理された島の両方についての、画像ファイルおよび対応する画像データファイルを含む。プロジェクトの実験データは、好ましくは、プロジェクト「ディレクトリ」にまとめて格納される。
取り込み画像が、新しいプロジェクトに対応しない場合、取り込み画像についての画像データファイル（および画像ファイル）は、既に存在している。この場合、オペレータは、ステップ１２でどのプロジェクトを使用するかを規定するよう求められる。その後、処理は、フローチャートコネクタ２Ａを通ってステップ１３に続く（本明細書で説明されるコネクタ２Ａ〜９Ａは、図２〜図１０において、円で示される）。
取り込み画像が新しいプロジェクトに対応する場合、処理が続けられ、取り込画像の画像データおよび画像データファイルが生成される。ステップ３で、オペレータは、新しいプロジェクトの名前を付けるよう求められる。このようにして、取り込画像の画像ファイル、および取り込画像の画像データファイルは、（プロジェクト名を有するコンピュータディレクトリなどにおいて）プロジェクト名の下で一緒にグループ分けされ得る。その後、処理はステップ４に続く。
ステップ４で、通常の感度を用いて取り込画像全体が検索され、スポットの有無が調べられる。これを行うために、画像ファイルが検索され、暗さまたは光学密度の最大値を表す最大値が探される。これらの最大値は、所定の距離（スポット中心間の距離）だけ互いに分離されなければならない。これは、背景雑音により生成される局部的な最大値だけではなく、光学密度の実際の最大値の位置が特定されることを確実にするために行われる。最大値の各々から、例えば３６個の多数のラジアルベクトルが、中心最大値点から出される。各ベクトルに沿って積分が行われる。各ベクトルについて、変曲点が決定される。各ベクトル上の変曲点は、境界点を表す。すべてのベクトルの境界点が結ばれる。すべてのベクトルの境界点を結ぶことにより生成される境界は、取り込画像中の検出されたスポットの境界を表す。
検出されたスポットの境界の外側にある領域が解析され、スポットの周りの平均背景が決定される。平均背景は、境界を含む境界内部にあるすべての画素から除かれる。これにより、検出されたスポットの積分光学密度（ＩＯＤ）が得られる。積分光学密度パーセンテージ（ＩＯＤ％）は、特定のスポットのＩＯＤであり、総ＩＯＤのパーセンテージとして表される。総ＩＯＤは、画像中のすべてのスポットのＩＯＤの和を求めることにより計算される。
上記ステップ４の検索の実行方法は、当業者に容易に明らかとなる。スポット（または、対象物）の発見には、当業者に容易に明らかとなる多数のアプローチがあるが、行われるタスクに最も適したアルゴリズムが選択されるべきである。例えば、ステップ４を実行するためには、BioImageなどのコンピュータプログラムが使用され得る。
判定ステップ５で、ステップ４の検索の間にスポットの位置が特定されたかどうかが判定される。スポットの位置が特定されていれば、ステップ６で、そのスポットがスポットリストに加えられる。その後、処理はステップ７に続く。
スポットの位置が特定されていない場合も、処理はステップ７に続く。ステップ７で、高感度および形状特性を用いて、取り込み画像全体が検索され、スポットの有無が調べられる。高感度とは、ステップ４で用いられる第１または「通常」の感度よりも高い感度を意味する。多くのパラメータが、画像の検索感度に影響を及ぼす。１つのパラメータは、ある点を最大値として同定するためにその点が位置していなければならない背景からの高さである。第２のパラメータは、最大値を同定するためのスポット中心間の許容可能な距離である。感度を増加させるためには、最大値の、背景からの高さ、即ち、最大値と背景との差が低減される。感度を増加させるためには、最大値のスポット中心間の距離もまた低減される。最適な結果を得るためには、頂部から底部を横切る、即ち、頂部から底部までのスポット間の距離を、スポット分離に関する規則的な態様で（線形または指数関数的に）変化させることが必要であり得る。感度を増加しすぎると、雑音から実際の最大値を分離することは不可能となる。例えば、周囲の画素よりも高い位置にある１つの画素をスポットとして同定する感度を有することは、許容されない。感度を、通常の感度とより高い感度との間に調節する方法は、当業者に容易に明らかとなる。
感度を増加させることにより、より多くのスポットの位置が特定される。しかし、感度を増加しすぎると、不必要な雑音が導入され得る。従って、本発明は、増加された感度を、形状特性とともに用いる。形状特性を規定するために、多くのパラメータが使用され得る。そのようなパラメータの１つは、滑らかな形状の境界である。曲率点がどのように変化しているかを判定するために、境界の曲率が積分される。滑らかな形状の境界を形状特性として用いる場合、真円が、１の形状特性を有する。スポットが真円でなければ、そのスポットの形状特性は、約１未満の値である。形状特性の値が小さいほど、スポットの境界は滑らかでない。潜在的なスポットが、約０．５未満の形状特性を有する場合、ステップ７で、このスポットは、形状に基づいてスポットとは見なされない。例えば、潜在的なスポットが楕円形状である場合、このスポットは、約０．８にほぼ等しい形状特性を有する。約０．８＞０．５であるため、楕円形の潜在的なスポットは、ステップ７で、形状に基づいてスポットと見なされる。別の実施例として、潜在的なスポットが（ゲル画像上の縞のような）細長く細い形状を有する場合、このスポットは、０．１にほぼ等しい形状特性を有する。０．１＜０．５であるため、この細長く細い潜在的なスポットは、ステップ７で、形状に基づいてスポットであるとは見なされない。
判定ステップ８で、ステップ７の検索の間にスポットの位置が特定されたかどうかが判定される。スポットの位置が特定されていれば、ステップ９で、このスポットがスポットリストに加えられる。その後、処理はステップ１０に続く。
ステップ８でスポットの位置が特定されていない場合も、処理はステップ１０に続く。ステップ１０で、処理画像は、編集のために、オペレータに与えられる。そのような編集は、例えば、１つのスポットとして同定された、互いに近接する２つの非常に大きいスポットの分離を含み得る。その後、オペレータは、画像を編集して、スポットを適切な数のスポットに分割する。このステップで必要とされる編集は、取り込み画像のスポットリストを生成するために必要とされる編集だけである。これにより、取り込み画像についての必要なデータ（例えば、スポットの位置およびＩＯＤ％）が提供され、取り込み画像が、本発明の方法の残りのステップに従ってさらに解析および解釈され得る。画像ファイルおよび関連する画像データファイルを生成するための処理画像の処理は、終了ステップ１１で終了する。
次に図３を参照して、ステップ１２０を実行するための一実施形態を説明するブロック図が示される。処理は、図２のステップ１２から、フローチャートコネクタ２Ａを通ってステップ１３に続く。ステップ１３で、オペレータは、マスタ複合画像（ＭＣＩ）を生成するために使用される１つまたは複数の画像を選択する。上の概略で説明したように、ＭＣＩを生成するためにオペレータにより選択される画像は通常、オペレータが行っている特定のプロジェクトまたは実験に関する画像である。例えば、オペレータは、２つのゲル画像グループ、即ち、未処理のまたは通常の細胞に関する１つのゲル画像グループと、処理または刺激された細胞に関する第２のゲル画像グループとを比較するために実験を行っている場合がある。この場合、オペレータは、解釈される新しいゲル画像が、未処理の細胞についてのものであるのか、処理された細胞についてのものであるのかを知っている。この場合には、オペレータは、マスタ複合画像、即ち、未処理の細胞の新しいゲル画像についての未処理の画像、および処理された細胞の新しいゲル画像についての処理された画像、を生成するために使用される画像を適切に選択し得る。
同様に、オペレータが、同じゲルの２つの露光量かまたは同じサンプルの２つのゲルを適合しようとしている場合、オペレータは、ＭＣＩを生成するために正しい画像を選択する。
その後、ステップ１４で、オペレータは、どの種類の解析を行うかを選択するよう求められる。即ち、（１）ＮＧＩが新しいサンプルであるのか、（２）ＮＧＩが、ＭＣＩと同じゲルの異なる露光量であるのか、または（３）ＮＧＩが、ＭＣＩの場合に選択されたサンプルと同じサンプルで、異なる濃度のサンプルであるのかを選択するよう、求められる。この選択により、コンピュータは、その後の解析において異なる「許容誤差値」を用いる。従って、例えば、オプション（１）を選択した場合、通常のデルタＸ、デルタＹおよびデルタＺの値が用いられる（例えば、デルタＸ＝１ｍｍ、デルタＹ＝１ｍｍ、デルタＺ＝２０％）。オプション（２）を選択した場合、画像が同じゲルからのものであるため、デルタＸおよびデルタＹの値は非常に小さいが（例えば、デルタＸ＝０．１ｍｍ、デルタＹ＝０．１ｍｍ）、露光量が異なるため、用いられるデルタＺの値はより大きい（例えば、デルタＺ＝５０％）。オプション（３）を選択した場合、ゲルが異なるため、デルタＸおよびデルタＹは通常であるが（例えば、デルタＸ＝１ｍｍ、デルタＹ＝１ｍｍ）、ゲルに付与されるタンパク質装填量が異なるため、用いられるデルタＺの値はより大きい（例えば、デルタＺ＝５０％）。選択（１）の場合の許容誤差値の例は、以下の文中に示され、選択（２）および（３）の場合の許容誤差値の例は、説明文とともに括弧内に示される。
オペレータが「３」を選択した場合、オペレータは、どれくらいの量のタンパク質がゲルに付与されたか（そして、どれくらいの量のタンパク質がＭＣＩに付与されたかがコンピュータにまだ入力されていなければ、それも）が質問される。
ステップ１５で、オペレータにより選択される選択画像のセット（好ましくは、２つ以上）を平均することにより、マスタ複合画像が計算される。マスタ複合画像は、複数のマスタ複合スポットを含み、各マスタ複合スポットは、ＩＯＤ％および位置を含む。本明細書において用いられる、スポットの「位置」は、任意の適切な参照システムを用いて表され得る。１つのそのような適切な参照システムは、位置が「Ｘ」軸および「Ｙ」軸の対（Ｘ，Ｙ）で規定されるデカルト座標システム（矩形平行座標）である。別の適切な参照システムは、位置が、軸に対する角度「θ」および負でない半径「ｒ」の対（ｒ，θ）で規定される極座標参照システムである。
セットの中の選択画像の各々は、背景と、他の選択画像中の対応するスポットに対応する対応スポットとを有する。平均ＩＯＤ％、平均背景、平均物理形状、スポット位置の標準偏差（ＳＤ）（スポット位置がどれくらい変動し得るか）および／またはスポット定量の標準偏差（スポット発現レベルがどれくらい変動し得るか）、ならびに飽和値（スポットの各々についての数値的に平均された飽和値に対応する）が、選択画像のセットから計算され、ＭＣＩが生成される。新しい画像を解釈するためには、上記値のうちの１つ以上が必要とされる。
オペレータが、ＭＣＩの組について１つのゲルしか選択しなければ、スポット位置およびスポット定量の標準偏差値には、デフォルト値が用いられる。
選択画像のセットを平均するために、選択画像のセットの背景から、平均複合背景が計算される。選択画像のセットの対応するスポットのＩＯＤ％が平均され、マスタ複合画像の各マスタ複合スポットについての平均複合ＩＯＤ％が得られる。選択画像のセットの対応するスポットの物理形状が平均され、各マスタ複合スポットについての平均物理形状が得られる。選択画像のセットの対応するスポットのスポット位置が平均され、各マスタ複合スポットについての平均スポット位置が得られる。各マスタ複合スポットについて、平均複合ＩＯＤ％の標準偏差が、平均スポット位置の標準偏差、および飽和値（スポットの各々についての数値的に平均された飽和値に対応する）とともに計算される。
マスタ複合画像に対応するマスタ複合物（ＭＣ）がまた、生成される。マスタ複合物は、マスタ複合画像に関連する画像データを表形式などで含む。マスタ複合物は、マスタ複合画像の各マスタ複合スポットの位置、ＩＯＤ％、スポット番号、および飽和値（Ｓ）を含む。以下により詳細に説明されるように、飽和値Ｓは、特定の飽和値を有するマスタ複合物からスポットを選択するために用いられる。
マスタ複合物はまた、マスタ複合スポットに対応するタンパク質の分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）を含み得る。
ステップ１６で、ＭＣおよびＭＣＩが、オペレータに与えられる。これにより、オペレータが、ＭＣおよびＭＣＩを検討し、且つ、新しいゲル画像（ＮＧＩ）の解析および解釈を続行するべきであることを確認することが可能となる。処理は、フローチャートコネクタ３Ａを通って、図４Ａに示されるステップ１７に続く。
ステップ１７で、オペレータは、ＭＣＩおよびＮＧＩの両方に存在する、ある数（＃）のスポットを選択する。オペレータによるスポットの選択を容易にするために、ＭＣＩゲルパターンおよびＮＧＩのゲルパターンの両方が、オペレータに表示される。ステップ１７で選択されたスポットは、ＮＧＩをＭＣＩに整列させるための共通アンカポイントとして機能する。ＮＣＩおよびＮＧＩの両方に存在するスポットである共通アンカポイントは、２つの画像を互いに整列させるのを助ける。共通アンカポイントは、共通アンカポイントが一列に並べられるように２つの画像を互いに関して数学的に摺動および回転させるために使用される。
各々の共通アンカポイントは、ＮＧＩの新しい画像共通アンカスポットと、ＭＣＩのマスタ複合共通アンカスポットとに対応する。好ましくは、ステップ１７で、オペレータにより、３つの共通アンカポイントが選択される。しかし、他の個数の共通アンカポイントを用いてもよい。あるいは、単一の共通アンカポイントを用いてもよい。
ステップ１８で、ＮＧＩにおいて、各々の共通アンカポイントに対応する新しい画像共通アンカスポットの位置が特定され、その位置が決定される。ＭＣＩにおいて、マスタ複合共通アンカスポットの位置が特定され、その位置およびそのスポット番号が決定される。対応するマスタ複合共通アンカスポットのスポット番号と同じスポット番号が、新しい画像共通アンカスポットに割り当てられる。
ステップ１９で、ＮＧＩが、ＭＣＩと整列される。新しい画像共通アンカスポットの位置が、マスタ複合共通アンカスポットの位置と整列されるように、位置補正が適用される。この位置補正により、新しい画像共通アンカスポットの位置（Ｘ，Ｙ）が、マスタ複合共通アンカスポットの位置と整列されるように補正される。このように決定された位置補正は、ＮＧＩのすべての画素の位置（Ｘ，Ｙ）に適用され、ＮＧＩがＭＣＩと整列される。ステップ１９からステップ７８まで、オペレータからのさらなる入力または介入は必要とされない。
ステップ２０で、ＭＣから、ある数（＃）のアンカポイントが選択される。ステップ２０で選択されたスポットは、ＮＧＩをＭＣＩと整列させるための一次アンカポイントとして機能する。マスタ複合物が検索され、所定数の一次アンカポイントが同定される。好ましくは、５０個の一次アンカポイントが用いられるが、約３〜５００個未満、または、５〜２０、２０〜３０、３０〜６０、６０〜２００もしくは２００〜５００個などの任意の範囲、またはその範囲内の値など、他の数の一次アンカポイントを用いてもよい。
一次アンカポイントは、一次アンカポイントの各々が、少なくとも所定の分離閾値だけ他の一次アンカポイントから分離されるように選択される。所定の分離閾値は、例えば約１〜２００ｍｍの範囲であって、約１０〜４０ｍｍなどである。好ましい分離は、２０ｍｍである。
一次アンカポイントは、一次アンカポイントの各々が、所定の飽和値範囲内の飽和値Ｓを有するように選択される。所定の飽和値範囲は、例えば、約０．２＜Ｓ＜０．８であり得る。この場合、一次アンカポイントは、この範囲外の飽和値を有する画素を含まない。これは、一次アンカポイントが飽和スポットまたは弱いスポットとならないように行われる。スポットが幾つかの飽和画素を含む場合、このスポットをアンカスポットとして使用してはならない。スポットの飽和により、スポットのスポット中心の判定がより困難になるからである。また、弱いスポットの正しい中心を決定する場合、その決定は不正確であり得る。これは、電気雑音により、最も暗い画素の位置が「移動」し得るからである。スポット中心位置はまた、当該分野において公知のように、または、本明細書において記載されるように、スポット形状特性を用いて計算され得る。スポット中心が確実には分からない場合、そのスポットを、画像を整列させるためのアンカポイントとして使用してはならない。さらに、画像をスキャンしてコンピュータに取り込むために用いられるスキャン装置は、高光学密度および低光学密度で線形でないことが多い。約０．２と約０．８との間の飽和値を選択することにより、高光学密度および低光学密度（それぞれ、「飽和」および「弱い」）に関連する線形性の問題点が回避される。
一次アンカポイントはまた、（Ｘ，Ｙ）または平均複合ＩＯＤ％（Ｚ）の標準偏差パーセンテージ（ＳＤ％）を用いて選択され得る。ＳＤ％は、スポットの標準偏差を、そのスポットのＸ、ＹまたはＺ（ＩＯＤ％）の平均値で割った値に、１００％を掛けた値を表す。例えば、一次アンカポイントは、ＩＯＤ％のＳＤ％が約４０％未満となるように選択され得る。
別の実施例として、最良のＸを有する１０〜２０００個のスポット、最良のＹを有する１０〜２０００個のスポット、および最良のＺを有する１０〜２０００個のスポットが選ばれる。その後、選ばれたスポットが十分に分離されているかどうかが判定される。近すぎるスポットについては、ＳＤ％ＸおよびＳＤ％Ｙの和が最も大きいスポットが、捨てられる。このプロセスは、例えば１〜１０００個などの所望の数のスポットが選ばれるまで繰り返される。
ステップ２１で、アンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）およびアンカポイントのＩＯＤ％（Ｚ）を用いてＮＧＩが検索され、ステップ２０で選択されたアンカポイントの各々があるかどうかが調べられる。アンカポイントのセットの各アンカポイントについて、Ｘ位置座標、Ｙ位置座標、ＩＯＤ％、およびスポット番号が決定されている。この情報は、ＭＣから得られる（ステップ２０で選択されたアンカポイントは、ＭＣから選択される）。アンカポイントのセットの各アンカポイントの有無について、新しい画像のうち、Ｘ±δaＸおよびＹ±δaＹで規定される領域が検索される。δaＸは、アンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）のＸ位置座標許容誤差値であり、δaＹは、そのＹ位置座標許容誤差値である。好ましくは、δaＸおよびδaＹはそれぞれ１ｍｍに等しい。しかし、δaＸおよびδaＹは、互いに等しくなくてもよい。Ｘ±δaＸおよびＹ±δaＹで規定される領域が検索され、新しい画像のスポットであって、アンカポイントのＩＯＤ％±ＩＯＤ％許容誤差値に等しいＩＯＤ％（Ｚ）を有するスポットの位置が特定される。これは、Ｚ±δaＺとして表され、δaＺは、ＩＯＤ％許容誤差値である。好ましくは、ＩＯＤ％許容誤差値は、０．１〜５０％であり、例えば、１〜２０、５〜２０、１０〜３０、３０〜５０、または２５〜３５％である。
判定ステップ２２での判定により、ステップ２１の検索で、ＮＧＩにおいて新しい画像のスポットの位置が特定されていれば（ＮＧＩに、アンカポイントに対応するスポットがあれば）、ステップ２３で、位置が特定された新しい画像のスポットに、アンカポイントのスポット番号と同じスポット番号が割り当てられる。その後、位置が特定された新しい画像のスポットと、それに対応するアンカポイントとは、「適合」されると考えられる。その後、適合されたアンカポイントは、検索されるアンカポイントリストから除外される。適合されたアンカポイントはまた、新しいゲル画像のスポットとの適合のために残っている、マスタ複合スポットから除外される。その後、処理は、ステップ２４に進む。
ＮＧＩにおいて、アンカポイントに対応する新しい画像のスポットの位置が特定されていない場合も、処理はステップ２４に続く。
ステップ２４で、検索されるアンカポイントがまだあるかどうかが判定される。検索されるアンカポイントがそれ以上ない場合、処理は、フローチャートコネクタ４Ａを通って、図４Ｂのステップ２６に続く。ステップ２４で、検索されるアンカポイントがまだあると判定されると、ステップ２５で次のアンカポイントが選択される。その後、新しいゲル画像において、アンカポイントのセットのすべてのアンカポイントが検索されるまで、処理はステップ２１に続く。
ステップ２６で、ＮＧＩは、ＭＣＩに適合するように「ゴムシート化（rubber sheeted）」される。当業者に公知のように、ゴムシート化は画像処理用語であり、ゴムシート化により、画像の画素位置に歪んだベクトルが与えられ、「歪んだ」ゴムシート化画像が生成される。ゴムシート化プロセスは、表示および空間計算の目的のためだけに行われる。各画素に関連する生のグレーレベルデータは、変化しないままである。視覚的には、ゴムシート化は、風船などのゴムまたはラテックスのシート上の絵を歪めることと類似している。風船を引っ張ると、絵が延びる、即ち、歪む。
ＮＧＩを、ＭＣＩに適合するようにゴムシート化するために、ＮＧＩのすべての画素の（Ｘ，Ｙ）座標は、別の位置補正により補正され、その結果、ＮＧＩの新しい画像共通アンカスポットが、対応するマスタ複合共通アンカスポット上に幾何学的に適合する（ステップ１７〜１９に関する上記説明を参照）。ゴムシート化プロセスは、共通アンカポイント（ＮＧＩの新しい画像共通アンカスポットと、ＭＣＩのマスタ複合共通アンカスポットとに対応する）を用いて、２つの画像（ＮＧＩおよびＭＣＩ）間の位置調整を提供する。ＮＧＩの解析および／または解釈全体を通してＮＧＩおよびＭＣＩの整列を向上するために、ゴムシート化プロセスは、本発明の方法全体を通して周期的に行われる。ＮＧＩおよびＭＣＩの両方が得られるゲル媒体の弾性および変動性のため、ゴムシート化を繰り返し行うことが必要である。
ステップ２７で、マスタ複合物から、特定の飽和値Ｓおよび特定のスポット中心間距離Ｗを有するスポットが選択される。ＭＣから、約０．２＜Ｓ＜０．８となるような飽和値Ｓを有するマスタ複合物のスポットが選択され、選択されたマスタ複合物のスポットの第１のセットが形成される。飽和値に基づくこの第１の基準により、強すぎるまたは弱すぎるスポットが回避される。強いスポットおよび弱いスポットは、スポット中心を見つけるのが困難であるため、確実なアンカポイントではない。強すぎるスポットは、その中心で飽和される。このスポットの多数の画素がすべて黒いため、スポットの中心を見つけるのが困難である。弱すぎるスポットの場合、電気雑音により、スポットの中心が人為的に移動されやすい。
選択されたマスタ複合物のスポットのこの第１のセットから、二次アンカポイントのセットが選択される。この選択は、二次アンカポイントのセットの選択されたマスタ複合物のスポットの各々が、二次アンカポイントのセットの他の選択されたマスタ複合物のスポットから、所定数（＃）のｍｍよりも大きい距離Ｗだけ分離されるように行われる。これにより、二次アンカポイントについて選択されたスポットが、互いに近接しすぎないことが確実になる。好ましくは、Ｗは、３ｍｍよりも大きい。
別の実施形態では、Ｗは、ゲル画像の頂部からゲル画像の底部に向かって増加する。これにより、ゲル画像の頂部のスポットが非常に小さく、ゲル画像の底部のスポットが非常に大きいことが補償する。さらに他の実施形態では、Ｗは、解釈されている新しいゲル画像の各々について設定され得る、オペレータにより規定される変数であってもよい。
ステップ２８で、二次アンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）および二次アンカポイントのＩＯＤ％（Ｚ）を用いてＮＧＩが検索され、ステップ２７で選択された二次アンカポイントの各々があるかどうかが調べられる。二次アンカポイントのセットの各々の二次アンカポイントについて、Ｘ位置座標、Ｙ位置座標、ＩＯＤ％、およびスポット位置が、決定されている。この情報は、ＭＣから得られ得る（ステップ２７で選択された二次アンカポイントは、ＭＣから選択される）。二次アンカポイントのセットの各々の二次アンカポイントの有無について、新しい画像のうち、Ｘ±δbＸおよびＹ±δbＹで規定される領域が検索される。δbＸは、二次アンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）のＸ位置座標許容誤差値であり、δbＹは、そのＹ位置座標許容誤差値である。好ましくは、δbＸおよびδbＹはそれぞれ、０．５ｍｍに等しい。しかし、δbＸおよびδbＹは、互いに等しくなくてもよい。Ｘ±δbＸおよびＹ±δbＹで規定される領域が検索され、二次アンカポイントのＩＯＤ％±ＩＯＤ％許容誤差値に等しいＩＯＤ％（Ｚ）を有する、新しい画像のスポットの位置が特定される。これは、Ｚ±δbＺとして表され、ここで、δbＺは、ＩＯＤ％の許容誤差値である。好ましくは、ＩＯＤ％は、２０％である。
許容誤差値値δbＸおよびδbＹは、許容誤差値値δaＸおよびδaＹ（ステップ２１参照）よりも小さくてもよい。なぜなら、ステップ２６で行われるゴムシート化プロセスでは、所望のスポットの位置を特定するためにより小さい位置領域を検索しなければならなくなるように、ＮＧＩをＭＣＩにより近接して整列しているからである。しかし、δbＺは、δbＺと同じであってもよい。なぜなら、ゴムシート化プロセスは、位置的な整列にのみ影響を及ぼし、Ｚ（ＩＯＤ％）で表される定量には影響を及ぼさないからである。
判定ステップ２９での判定により、ステップ２８の検索で、ＮＧＩにおいて、新しい画像のスポットの位置が特定されていれば（ＮＧＩに、二次アンカポイントに対応するスポットがあれば）、ステップ３０で、位置が特定された新しい画像のスポットには、二次アンカポイントのスポット番号と同じスポット番号が割り当てられる。その後、位置が特定された新しい画像のスポットと、それに対応する二次アンカポイントとは、「適合」されると考えられる。その後、適合された二次アンカポイントは、検索される二次アンカポイントリストから除外される。適合された二次アンカポイントはまた、新しいゲル画像中のスポットとの適合のために残っているマスタ複合物のスポットから除外される。その後、処理はステップ３１に続く。
ＮＧＩにおいて、二次アンカポイントに対応する新しい画像のスポットの位置が特定されていない場合も、処理はステップ３１に続く。
ステップ３１で、検索される二次アンカポイントがまだあるかどうかが判定される。検索される二次アンカポイントがそれ以上なければ、処理は、フローチャートコネクタ４Ｂを通って、図５Ａのステップ３３に続く。ステップ３１で、検索される二次アンカポイントがまだあると判定されると、ステップ３２で、次の二次アンカポイントが選択される。その後、新しいゲル画像において、二次アンカポイントのセットのすべての二次アンカポイントが検索されるまで、処理はステップ２８に続く。
ステップ３３で、新しいゲル画像が再びゴムシート化され、マスタ複合画像に適合される。このステップは、ステップ２６に関して上で説明された態様と同じ態様で実行される。
ステップ３４〜４８（図５Ａおよび図５Ｂ）は、プロセスのこの時点までにＮＧＩのスポットとＭＣＩのアンカポイントとの間で作られた適合の品質管理検査を行うために実行される。作られた適合の各々は、適合されたスポットの対を形成する。即ち、ＮＧＩのスポットが、ＭＣＩの対応するアンカポイントに適合される。適合されたスポットの対の各スポットは、同じスポット番号を有する。即ち、ＮＧＩにおいて、ＭＣＩの対応するアンカポイントと一致するスポットの位置が特定されると、ＮＧＩの適合されたスポットには、その適合の相手、即ち、ＭＣＩの対応するアンカポイントと同じスポット番号が割り当てられる。適合されるＮＧＩスポットは、適合された新しい画像のスポットのセットに入れられる。適合されたスポットの各対について、ベクトルが作られる。ベクトルの基点は、適合された対のＭＣＩアンカポイント上にある。ベクトルは、適合された対のＭＣＩアンカポイントから、適合された対のＮＧＩスポットまで延びる。このベクトルは、長さと、ＭＣＩアンカポイント上の基点に関して測定される角度とを有する。あるいは、角度は、基点と反対側のベクトル端に関して、即ち、ＮＧＩスポットに関して、測定されてもよい。そのような代替的な測定により、ＭＣＩアンカポイントに関して測定される角度と１８０度異なる角度が得られる。ステップ３４で、各適合対ベクトル（適合された各対のベクトル）の長さおよび角度が計算される。ゲルのエッジ上にあるスポットは、その周囲にある５つの他の適合された対を有することができない。従って、これらのスポットを解析から省略するか、または、ベクトルがエッジスポットに近づくときのベクトルの傾向を外挿するかのいずれかにより、これを補償しなければならない。
ステップ３５で、各適合対ベクトルについて、適合対ベクトルと、それに最も近い５つのベクトルとの間の差が計算される。好ましくは、ステップ３５では５つのベクトルが用いられるが、他の数のベクトルを用いてもよい。これらの最も近い５つのベクトルの長さおよび角度が計算される。最も近い５つのベクトルのベクトル長が平均され、最も近いベクトルの平均ベクトル長が得られる。この最も近いベクトルの平均ベクトル長から、適合対ベクトルのベクトル長を引いて、適合された各対のベクトル差を得る。これにより、適合された新しい画像のスポットのセットに対応するベクトル差のセットが作られる。ステップ３６で、ベクトル差のセットのベクトル差を合計し、ベクトル差の和を得る。
適合対のベクトル差が大きければ、これは、優れた適合が作られていないことを示す。ベクトル差のセットの中の最も大きいベクトル差は、さらに解析されるべき適合を表す。なぜなら、ＮＧＩスポットとアンカポイントとの優れた適合がまだ作られていない可能性があるからである。ステップ３７で、ベクトル差のセットの中で最も大きいベクトル差の所定のパーセンテージに対応する適合対は「切り離され（unmatched）」、切り離された新しい画像のスポット組を形成する。ゲル内の歪みは通常、エッジで最も大きくなるため、ゲル画像の場合、適合を切り離すために選択されるスポット対（即ち、最悪の適合）は、絶対項上ではなく、これらのスポット対の周りにある適合に関して選択されなければならない。これが、特定の領域内での比較により計算されるか、ベクトルグループ内での比較により計算されるかは、当業者に明らかであり、適合される画像の種類に依存する。ベクトル差は、どのベクトル差が、最も大きいベクトル差の所定のパーセンテージ、例えば約１０％の範囲内にあるかを判定するために解析される。ステップ３７で切り離された新しい画像のスポットは、切り離された新しい画像のスポットのセットに入れられる。ステップ３７は、プロセスのこの時点までに作られた最悪の適合を除去するかまたは切り離すように機能する。
ステップ３７で切り離された適合は、ＮＧＩとＭＣＩとの間の整列または位置調整の問題により引き起されている可能性がある。従って、ＮＧＩをＭＣＩに適合させるために、ステップ３８で、別のゴムシート化プロセスが行われる。ステップ３８のゴムシート化プロセスは、ステップ３３などの他のゴムシート化ステップに関して上で説明された態様と同じ態様で行われる。
ゴムシート化プロセスの後、ステップ３７で切り離された対を「再適合」する試みがなされる。ステップ３９で、ＮＧＩが検索され、ステップ３７で切り離された新しい画像のスポットがあるかどうかが調べられる。ステップ３９では、ＭＣＩの対応する切り離されたアンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）と、対応する切り離されたアンカポイントのＩＯＤ％（Ｚ）とを用いてＮＧＩが検索され、ステップ３７で切り離された新しい画像のスポットの各々があるかどうかが調べられる。切り離された新しい画像のスポットのセットの切り離された新しい画像のスポットの各々（ＭＣＩの切り離されたアンカポイントの各々に対応する）について、対応する切り離されたアンカポイントのＸ位置座標、Ｙ位置座標、ＩＯＤ％およびスポット番号が決定されている。切り離された新しい画像のスポットのセットの切り離された新しい画像のスポットの各々の有無について、新しい画像のうち、Ｘ±δcＸおよびＹ±δcＹで規定される領域が検索される。δcＸは、対応する切り離されたアンカポイントの位置（Ｘ，Ｙ）のＸ位置座標許容誤差値であり、δcＹは、そのＹ位置座標許容誤差値である。好ましくは、δcＸおよびδcＹはそれぞれ０．４ｍｍに等しい。しかし、δcＸおよびδcＹは、互いに等しくなくてもよい。Ｘ±δcＸおよびＹ±δcＹで規定される領域が検索され、対応する切り離されたアンカポイントのＩＯＤ％±ＩＯＤ％許容誤差値に等しいＩＯＤ％（Ｚ）を有する新しい画像のスポットの位置が特定される。これは、Ｚ±δcＺとして表され、ここで、δcＺは、ＩＯＤ％の許容誤差値である。好ましくは、ＩＯＤ％許容誤差値は、２０％である。
許容誤差値δcＸおよびδcＹは、許容誤差値δbＸおよびδbＹ（ステップ２８参照）よりも幾分か小さくてもよい。なぜなら、ステップ３７で行われるゴムシート化プロセスでは、所望のスポットの位置を特定するためにより小さい位置領域を検索しなければならなくなるように、ＮＧＩをＭＣＩにより近接して整列しているからである。不適当な「再適合」の作成を防ぐために、δcＸおよびδcＹは、好ましくは、δaＸおよびδaＹほど小さくない。しかし、δcＺは、δaＺおよびδbＺと同じであってもよい。なぜなら、ゴムシート化プロセスは、位置的な整列にのみ影響を及ぼし、Ｚ（ＩＯＤ％）で表される量子化には影響を及ぼさないからである。
判定ステップ４０での判定により、ステップ３９の検索で、ＮＧＩにおいて新しい画像のスポットの位置が特定されていれば（ＮＧＩに、切り離されたアンカポイントに対応するスポットがあれば）、ステップ４１（図５Ｂ参照）で、位置が特定された新しい画像のスポットに、対応する切り離されたアンカポイントのスポット番号と同じスポット番号が割り当てられる。これにより、この新しい画像のスポットが、アンカポイントと適合される。このアンカポイントは、以前に適合されたアンカポイントと同じであっても異なっていてもよい。その後、再適合された新しい画像のスポットと、それに対応するアンカポイントとは、ステップ３９で検索される切り離されたスポットのリストから除外される。再適合された新しい画像のスポットは、適合された新しい画像のスポットのセットに加えられる。
ステップ４２で、検索される切り離された新しい画像のスポットがまだあるかどうかが判定される。検索される切り離された新しい画像のスポットがまだあれば、処理はステップ４３に続く。
ステップ３９の検索で、ＮＧＩにおいて、切り離されたアンカポイントに対応する新しい画像のスポットの位置が特定されていない場合も、処理はステップ４３に続く。ステップ４３で、次の切り離された新しい画像のスポットが選択される。その後、新しいゲル画像において、切り離された新しい画像のスポットのセットのすべての切り離された新しい画像のスポットが検索されるまで、処理はステップ３９に続く。
新たなゲル画像内で、不適合の新たな画像スポットのセット中の不適合の新たな画像スポット全てが検索されると、処理はステップ４４に続く（図５Ｂ参照）。ステップ４４〜４６は図５Ａのステップ３４〜３６と類似する。ステップ４４〜４６は、適合する新たな画像スポットのセット中で適合する新たな画像スポットのそれぞれの第２のベクトル差を決定するため、ステップ３４〜３６と同様の方法で実行される。適合する新たな画像スポットの第２のベクトル差は合計され、これにより、第２のベクトル差が合計される。ステップ４７において、ステップ４４〜４６で得られた合計されたベクトル差がステップ３４〜３６で得られた合計されたベクトル差より小さいかどうかを判定する。第２のベクトル差合計が第１のベクトル差合計より小さい場合、プロセスは終了し、良好な適合性が得られる。ステップ４７で判定されるように、ベクトル差が前回より小さい場合、プロセスは最悪の適合を不適合にするためステップ３７（図５Ａ参照）に戻ることで繰り返される。ステップ４７で判定されるように、ベクトル差が前回より小さくない場合、適合プロセスが限界に到達し、処理はステップ４８に続く。
制約されなければ、上記プロセスは上記質制御サブルーチンにおいて、ある環境で多くの或いは全ベクトルの不適合を導き得ることを理解されたい（例えば、１０％が毎回不適合で、９％のみが再度適合されれば、適合の全てが最終的に不適合になる可能性がある）。したがって、プロセスを制約する様々な方法を組み込む必要がある。それらは、ベクトル差を適合の数で除算した値として表現する方法、ループの反復回数を制限する方法、不適合となるパーセンテージの可変の選択（例えば、第１のサイクルで１０％、第２のサイクルで９％、第３のサイクルで８％、など）を、それに限定されるものではないが含み得、それぞれは適合の合計数（例えば、合計数が増加している場合、いかなる制約も必要でない）或いはあるサイクルと次のサイクルとの間でのベクトル差の変化の度合いなどの要因によって条件的とされ得る。
加えて、ゲルの特定領域が他領域より（例えば、ゲルの縁部）、より高い空間的変異性（ｓｐａｔｉａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ）を有しやすく、結果として遺伝子適合が毎回不適合となり得、不正確な適合がゲル中央で見落とされる。したがって、ゲルはエリア（セクタ）に分割される必要が有り得、各エリア内で最悪のＸ％を不適合にするためステップ３８における不適合プロセスが繰り返される。
ステップ４８において、最大のベクトル差のうち所定のパーセンテージ（＃％）がステップ３７について上記に考察された方法と同様に選択されるが、それらは不適合ではない。ステップ４８で識別された最大のベクトル差のグループは、新しいゲル画像の分析及び／或いは解釈が終了した後オペレータによって再検討されるアイテムのリストに加えられる。大きなベクトル差を引き起こすスポットは新しいゲル画像を発生させるのに使用されるゲル上のダストであるのか、或いはマスター複合画像上に現れなかった新しいタンパク質なのかどうかを判定するために、オペレータが、リスト上のベクトル差から、新しいゲル画像上のスポットを見つけ得る。処理は次に、フローチャート結合子５Ｂによって図６のステップ４９に続く。
ステップ４９〜５４は十分に明確な（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）スポットを検出及び適合するため実行される。十分に明確なスポットとは、飽和されておらず、弱くないスポットを意味する。一つの例として、十分に明確なスポットは約０．２から約０．８の間の飽和値Ｓを有する。しかし、十分に明確なスポットの飽和値はコンピュータ内にゲル画像を入力するために使用される画像取込デバイスによって変動し得る。上記のように、コンピュータにデータを入力するために使用されるスキャンデバイスは高い光学密度及び低い光学密度において直線的にならない傾向がある。十分に明確なスポットは、したがって、コンピュータにゲル画像を入力するために使用される画像取込デバイスのタイプについて直線範囲にある飽和値Ｓを有する。
ステップ４９において、０．２＜Ｓ＜０．８である飽和値Ｓを有するマスター複合スポット全ては、十分に明確なスポットのセットを形成するためにＭＣから選択される。ステップ５０において、ステップ４９で選択された十分に明確なスポットそれぞれについて、十分に明確なスポットの（Ｘ，Ｙ）位置を使用してＮＧＩが検索される。十分に明確なスポットのセット中の十分に明確なスポットのそれぞれについて、Ｘ位置座標、Ｙ位置座標、及びスポット番号が決定される。この情報はＭＣから獲得し得る（ステップ４９で選択された十分に明確なスポットはＭＣから選択される）。十分に明確なスポットのセット中の十分に明確なスポットそれぞれについて、Ｘ±δdＸ及びＹ±δdＹによって規定される領域内で新しい画像が検索される。十分に明確なスポットの（Ｘ，Ｙ）位置について、δdＸはＸ位置座標許容誤差で、δdＹはＹ位置座標許容誤差である。好ましくは、δdＸ及びδdＹはそれぞれ０．１ｍｍに等しい。しかしδdＸ及びδdＹはお互いに等しくある必要はない。Ｘ±δdＸ及びＹ±δdＹによって規定される領域は新しい画像スポットを見つけるため検索される。
ＮＧＩ及びＭＣＩの間の空間的配向が本質的に完璧であるので許容誤差δdＸ及びδdＹは極度に小さくあり得る。上記ほぼ完璧な配向はステップ３３〜４８に関して考察された空間的補正及び質制御プロセスを介して達成される。
ステップ５０における検索で、決定ステップ５１で判定されるように、新しい画像スポットがＮＧＩにて見つけられれば、見つけられた新しい画像スポットには、ステップ５２での十分に明確なスポットについてのスポット番号と同様のスポット番号が割り当てられる。見つけられた新しい画像スポット及び対応する十分に明確なスポットは「適合」すると理解される。適合した十分に明確なスポットは、次に、検索されるべき十分に明確なスポットのリストから除去される。適合した十分に明確なスポットは、また、新しいゲル画像内のスポットに適合されるべく残っているマスター複合スポットから除去される。処理は次にステップ５３に続く。
新しい画像ステップが十分に明確なスポットを表すＮＧＩ内で見つからなければ、処理はまたステップ５３に続く。
ステップ５３において、検索するべき十分に明確なスポットがまだあるかどうかが判定される。検索するべき十分に明確なスポットがもうなければ、処理はフローチャート結合子６Ａによって図７のステップ５５に続く。ステップ５３において、検索するべき十分に明確なスポットがまだあると判定されれば、ステップ５４で次の十分に明確なスポットが選択される。十分に明確なスポットのセットの十分に明確なスポット全てが新しいゲル画像内について検索されるまで処理はステップ５０に続く。
ステップ５５〜６２は飽和スポットを検出し適合させるために実行される。一つの例として、飽和スポットは約０．８以上の飽和値Ｓを有する。しかし、飽和スポットの飽和値はコンピュータ内にゲル画像を入力するために使用する画像取込デバイスのタイプによって変化し得る。上記のように、コンピュータにデータを入力するために使用されるスキャンデバイスは高い光学密度及び低い光学密度において直線的にならない傾向がある。
ステップ５５において、Ｓ≧０．８である飽和値Ｓを有するマスター複合スポット全てはＭＣから選択されて、飽和スポットのセットを形成する。ステップ５６において、ＮＧＩは飽和スポットの（Ｘ，Ｙ）位置を使用することによってステップ５５で選択された飽和スポットそれぞれについて検索される。飽和スポットのセット内の飽和スポットそれぞれについて、Ｘ位置座標、Ｙ位置座標、及びスポット番号が決定される。この情報はＭＣから獲得し得る（ステップ５５で選択された飽和スポットはＭＣから選択される）。飽和スポットのセット中の飽和スポットそれぞれについて、Ｘ±δeＸ及びＹ±δeＹによって規定される領域内で新しい画像が検索される。飽和スポットの（Ｘ，Ｙ）位置について、δeＸはＸ位置座標許容誤差で、δeＹはＹ位置座標許容誤差である。好ましくは、δeＸ及びδeＹはそれぞれ０．４ｍｍに等しい。しかしδeＸ及びδeＹはお互いに等しくある必要はない。Ｘ±δeＸ及びＹ±δeＹによって定義される範囲は新しい画像スポットを見つけるため検索される。
飽和スポットのスポット中央は相当に不十分に（ｐｏｏｒｌｙ）位置づけられるので、許容誤差δeＸ及びδeＹはδdＸ及びδdＹより大きい。従って、飽和スポットのスポット中央を位置づけるために、より大きなエリアが検索されなければならない。
高い飽和スポット（ここで、９以上の飽和ピクセルを有すると定義される）について、スポット中央の位置がスポット形状特徴を使用することによって決定される。飽和エリアが１つより多いスポットをカバーし、飽和エリアがＭＣＩ内に存在するスポットの数に対応するエリアの数に分割される場合に許容が与えられ、よってスポット中央が計算される。
決定ステップ５７で決定されるように、ステップ５６での検索においてＮＧＩ中に新しい画像スポットが見つけられれば（ＮＧＩに飽和スポットに対応するスポットがあれば）、処理は決定ステップ５８に続く。飽和スポットに対応する新しい画像スポットがＮＧＩに見つけられなければ、決定ステップ６１において、検索すべき飽和スポットがまだあるかどうかを判定する。検索すべき飽和スポットがもうない場合、処理はフローチャート結合子７Ａによって図８のステップ６３に続く。ステップ６１において、検索すべき飽和スポットがまだあると判定されれば、次の飽和スポットがステップ６２で選択される。飽和スポットのセットの飽和スポット全てが新しいゲル画像内について検索されるまで処理はステップ５６に続く。
ステップ５７で飽和スポットに対応する新しい画像スポットがＮＧＩ内に見つけられれば、処理は決定ステップ５８に続く。ステップ５８において、見つけられたＮＧＩスポットがＭＣＩ内の１つより多い飽和スポットに対応するかどうかが判定される。見つけられたＮＧＩスポットが対応するスポットの数は、ＭＣＩのスポット中央を調べることで決定される。見つけられたＮＧＩスポットがＭＣＩ内の１つより多い飽和スポットに対応しなければ、ステップ６０での飽和スポットに対するスポット番号と同一のスポット番号が見つけられた新しい画像に割り当てられる。見つけられた新しい画像スポット及び対応する飽和スポットが次に「適合」すると理解される。次に適合する飽和スポットは検索されるべき飽和スポットのリストから除去される。適合した飽和スポットは、また、新しいゲル画像内のスポットに適合されるべく残っているマスター複合スポットから除去される。次に処理はステップ６１に続き、処理すべき飽和スポットがこれ以上あるかどうかが判定される。
ステップ５８で、見つけられたＮＧＩスポットが、ＭＣＩの１つより多い飽和スポットに対応すると判定される場合は、処理はステップ５９に続く。ステップ５９で、見つけられたＮＧＩスポットは、ＭＣの対応する飽和スポット数に等しい数の新しい画像飽和スポットに分割される。例えば、ステップ５８で、見つけられたＮＧＩスポットがマスター複合体の３つの飽和スポットに対応すると判定される場合は、ステップ５９で、見つけられたＮＧＩスポットは３つの新しい画像飽和スポットに分割され得る。見つけられたＮＧＩスポットが分割されるスポット数は、見つけられたＮＧＩスポットが対応するＭＣＩのスポット中央の数を数えることによって決定される。ＮＧＩの各分割スポットの形状は、ＭＣＩの対応するスポットの（Ｘ，Ｙ）位置形状に基づく。別の実施形態では、ＮＧＩの飽和スポットを分割するために用いられる形状特性は、ＭＣＩでの光学密度の割り当てにおいてサドルポイントを探すことによって、「Ｚ」またはＩＯＤ％形状特性を含み得る。
ステップ５９で、１つの飽和ＮＧＩスポットが分割され、１つより多いＮＧＩスポットを生成する。処理は次にステップ６０に続く。ステップ６０で、生成または分割された各ＮＧＩスポットは、ＭＣＩの対応する飽和スポットと同じスポット番号が割り当てられる。
次に図８を参照して、処理はフローチャート結合子７Ａを介してステップ６３に続く。ステップ６３〜７１は、ウィークスポットの検出および適合を行うために実行される。一例としては、ウィークスポットは、約０．２以下の飽和値Ｓを有する。しかし、ウィークスポットの飽和値は、ゲル画像をコンピュータに入力するために用いられる画像取り込み装置のタイプに基づいて変更され得る。上述のように、データをコンピュータに入力するために用いられ得るスキャン装置は、光学密度が高い場合および低い場合は線形にはならない傾向がある。
ステップ６３で、Ｓ≦０．２であるような飽和値Ｓを有するすべてのマスター複合体スポットがＭＣから選択されて、ウィークスポットセットを形成する。ステップ６４で、ウィークスポットの（Ｘ，Ｙ）位置を用いて、ステップ６３で選択されたウィークスポットのそれぞれに対してＮＧＩが検索される。ウィークスポットセットの各ウィークスポットに対して、Ｘ位置座標、Ｙ位置座標、およびスポット番号が決定される。この情報はＭＣから得ることができる（ステップ６３で選択されたウィークスポットはＭＣから選択される）。ウィークスポットセットの各ウィークスポットに対して、Ｘ±δfＸおよびＹ±δfＹによって規定される領域内で新しい画像が検索される。ウィークスポットの（Ｘ，Ｙ）位置に対して、δfＸはＸ位置座標の許容誤差であり、δfＹはＹ位置座標の許容誤差である。好ましくは、δfＸおよびδfＹはそれぞれ約０．２ｍｍに等しい。しかし、δfＸおよびδfＹは互いに等しくなくてもよい。Ｘ±δfＸおよびＹ±δfＹによって規定される領域が検索され、新しい画像スポットが見つけられる。
許容誤差値δfＸおよびδfＹはδeＸおよびδeＹより小さい。何故なら、ウィークスポットのスポット中央は飽和スポットのスポット中央より高い信頼度で位置が見つけられるからである。しかし、非常に小さい許容値、約０．１ｍｍより小さい値は、電子ノイズによって、ウィークスポットのスポット中央の位置を見つけることがが不確実となるため、適切でない。スポット中央位置はまた、スポット形状特性を用いて計算され得る。
ステップ６４での検索でＮＧＩ内に新しい画像スポットが見つけられないことが判定ステップ６５で判定されると、処理はステップ６６に続く。ＮＧＩ内にウィークスポットに対応する新しい画像スポットが見つけられる（ＮＧＩ内にウィークスポットに対応するスポットが存在する）場合は、ステップ６９で、見つけられた新しい画像スポットに、ウィークスポットのスポット番号と同じスポット番号が割り当てられる。これにより、見つけられた新しい画像スポットとこれに対応するウィークスポットとは「適合する」と理解される。適合するウィークスポットは、次に、検索されるべきウィークスポットリストから除去される。適合するウィークスポットはまた、新しいゲル画像のスポットと適合されるために残されているマスター複合スポットからも除去される。
ウィークスポットに対応する新しい画像スポットがＮＧＩ内で見つけられない場合は、処理はステップ６６に続く。ステップ６６では、ステップ６４の検索が、非常に感度の高いパラメータおよび形状特性を用いて繰り返される。Ｘ±δfＸおよびＹ±δfＹによって規定される領域が、ステップ６４で検索を実行するために用いられた第１の感度より高い第２の感度で検索される。電子ノイズに起因するスポットを除外するために、形状基準もまた用いられる。感度および形状基準の選択は、ステップ７に関連して上述したのと同じ方法で実行され得る。
ステップ６６での検索でＮＧＩ内に新しい画像スポットが見つけられない（ＮＧＩ内にウィークスポットに対応するスポットが存在しない）と判定ステップ６６で判定される場合は、処理はステップ６８に続く。ＮＧＩ内にウィークスポットに対応する新しい画像スポットが見つけられる場合は、ステップ６９で、見つけられた新しい画像スポットに、ウィークスポットのスポット番号と同じスポット番号が割り当てられる。これにより、見つけられた新しい画像スポットとこれに対応するウィークスポットとは「適合する」と理解される。適合するウィークスポットは、次に、検索されるべきウィークスポットリストから除去される。適合するウィークスポットはまた、新しいゲル画像のスポットと適合されるために残されているマスター複合スポットからも除去される。
スポット６６での検索で、ＮＧＩ内に新しい画像スポットが見つけられない場合は、処理はステップ６８に続く。ステップ６８では、ＭＣＩ内の対応するウィークスポットと同じ面積を有するスポットがＮＧＩに追加される。ＭＣおよびＭＣＩに存在するすべてのスポットは、例えＮＧＩで見つけられる対応するスポットの積分光学密度がゼロであっても、最終的にはＮＧＩで見つけられなければならない。ＭＣのスポットをＮＧＩに見つけることができない場合は、スポットを、そのスポットが見つけられると予想されるＮＧＩに追加しなければならない。ＮＧＩに追加されるスポットは、ＭＣＩの対応するスポットと同じ面積を有する。ステップ６９では、ＮＧＩに追加されるスポットには、ＭＣＩ内の対応するウィークスポットと同じスポット番号が与えられる。このようにして、ＭＣ内のスポットのすべてがＮＧＩ内で裏付けされされる「スポットの対話」が存在する。ＮＧＩでスポットが見つけられない場合は、統計学的に裏付けするためにゼロの値が与えられるべきである。ＮＧＩでスポットが「消えた」という事実は実際の結果であり、細胞に何らかの処理を行った結果その特定のタンパク質が抑制されたことを示し得る。ＭＣＩ内のすべてのスポットが裏付けされると、ＮＧＩに追加のまたは残されたスポットがある場合は、新しいタンパク質に対応し得る「新しい」または「未識別」スポットであると定義される。
ステップ６９から、処理はステップ７０に続く。判定ステップ７０では、検索すべきウィークスポットがまだ存在するかどうかが判定される。検索すべきウィークスポットがこれ以上存在しない場合は、処理はフローチャート結合子８Ａを介して図９のステップ７２に続く。ステップ７０で、検索すべきウィークスポットがまだ存在すると判定される場合は、ステップ７１で次のウィークスポットが選択される。処理は次にステップ６４で、新しいゲル画像内で、ウィークスポットセット内のすべてのウィークスポットが検索されるまで続く。
ステップ７２で、識別されているかまたは適合するスポット以外（適合する新しい画像スポットセット以外）の新しいゲル画像全体が、通常のすなわち第１の感度レベルを用いて検索され、未識別スポットが見つけられる。ステップ７２の検索を行うときは、適合するかまたは識別されているスポットは無視される。判定ステップ７３で、スポットが見つけられるかどうかが判定される。ステップ７２で行われる検索でスポットが見つけられる場合は、見つけられた新しい画像スポットは、オペレータが検討を行う予定のリストに追加され、処理はステップ７５に続く。これらのスポットがオペレータの検討リストに入れられるのは、これらが、新しいタンパク質など、まだ識別されていないものを表し得るからである。ステップ７２の検索により、未識別の新しい画像スポットの第１のセットが見つけられる。
ステップ７５で、適合する新しい画像スポットセットおよび未識別の新しい画像スポットの第１のセット以外の新しいゲル画像全体が、高感度および形状特性を用いて検索され、未識別の新しい画像スポットの第２のセットが見つけられる。前述の方法に類似する方法で行われ、新しいゲル画像全体をもっと密に調べるために、上記高感度は第１の感度より高くされる。ステップ７５で行われる検索でスポットが見つけられたと、判定ステップ７６で判定される場合は、見つけられた新しい画像スポットは、ステップ７６で、オペレータによって検討される予定のリストに追加される。処理はステップ７８に続く。
コンピュータ時間を節約し計算が行われ得る速度を高くするために、２ステップ検索方式が用いられる。検索されるエリアからいくつかのスポットを除去するために、先ずステップ７２の第１感度の検索が行われる。ステップ７５の第２感度の検索で行われるような形状特性による検索は、多大なコンピュータ時間を費やす。通常の感度で第１レベル検索を行うことによって、形状による分析を行う必要のあるスポット数が低減される。
ステップ７８で、新しいゲル画像とマスター複合画像とが、解釈および分析プロセス中に生成されるスポット検討リストと共にオペレータに提示される。オペレータは次に、スポット検討リストの各項目をどう扱うかを決定し得る。スポット検討リストの項目は、ステップ４８で決定された「トラブル」ベクトル、ならびにステップ７４および７７で追加された「新しい」（未識別）スポットを含む。オペレータは、これらの項目のそれぞれに関連する画像、およびこれらの項目に関連する表画像データを調べることができる。オペレータは次に、ステップ７９におけるように、未識別スポットがＭＣＩに加えられるべき新しいタンパク質であるかどうかを判定し得る。処理は次に、フローチャート結合子９Ａを介して図１０のステップ８０に続く。
ステップ１４において、オペレータは、２）ＭＣＩの異なる露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）または３）ＭＣＩと同一のサンプルのいずれかを選択した。その後この段階で、コンピュータは画像取り込み媒体の制限された及び／又は非線形応答を補正するための補正プロセスを実行する。オプション２）は、同一のゲルのいくつかの露出（通常、時間の長さが異なる）が収集された場合に用いられることが意図されている。オプション３）は、同一のサンプルが両方のケースを有する場合に用いられることが意図されている。すなわち、ＭＣＩ内のスポットの割合が計算されるケースとＮＧＩ内とのスポットの割合が計算されるケース（ステップ６８および７９において追加されたスポットを除く。ステップ６８および７９においては、ＮＧＩまたはＭＣＩのいずれかに各々、新しいスポットが追加された。）とである。補正の様々な方法が用いられ得るが、好適な方法は、リストから上位５％の割合を取り除き（電子ノイズにより人工的に高くされ得る）（ステップ８０）、その後残りの上位１０％を選択する（ステップ８１）ことを含む。これらの全スポットの割合は、その後ステップ８２で平均化され（補正ファクタの計算）、その後ステップ８３で、ＮＧＩ内のスポットのすべてに関するＩＯＤ値が補正ファクタと乗算される。
次の状態は、ステップ８４でこれら２つの画像に関するＩＯＤ表を統合する。本明細書においては例示の目的のために、これが約０．２＜飽和＜０．８であると仮定するが、言うまでもなくこれは画像検出のタイプと用いられる取り込みシステムとに依存する。これは、検出システム応答の線形範囲内のすべてのスポットをＭＣＩから選択することにより行われる。
ＮＧＩが、ＭＣＩよりも強い露出（またはより多くのサンプルを伴うゲル）である場合、約０．２飽和以下のすべてのスポットに関して、ＮＧＩから得られた値はＭＣＩの値に代用される。
ＮＧＩが、ＭＣＩよりも弱い露出（またはより少ないサンプルを伴うゲル）である場合、約０．８飽和以上のすべてのスポットに関して、ＮＧＩから得られた値はＭＣＩの値に代用される。
最後に、ＭＣＩ内のすべてのスポットの％ＩＯＤが再計算される。このようにして、画像検出システムの見かけのダイナミックレンジの量子化領域を拡張することが可能である。
別の実施形態において、オペレータは、この情報が公知である、新しいゲル画像上のタンパク質に関する分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）を入力するかどうかを質問され得る。その後、「公知の」ＭＷおよびｐＩ値を用いて補間が実行されることにより、ＭＷおよびｐＩが特に公知でない新しいゲル画像上の他の「公知でない」タンパク質に関するＭＷおよびｐＩが計算される。新しいゲル画像上の各スポットに関するＭＷおよびｐＩは、新しいゲル画像に関する表で算出された画像データ（画像データファイル）に追加される。
図１０に示すステップ８５〜９３は、オペレータが実験またはプロジェクトに関連する変更を識別し得るように実行されるステップである。工程８５〜９３は、個々のゲル画像またはゲル画像グループの分析に向けられ、マスター複合体またはマスター複合体画像の使用を含まない。特定の新しいゲル画像を分析し解釈するために、プロセスのこれ以前のステップを通してＭＣおよびＭＣＩが用いられた。
ステップ８５において、オペレータは、いずれの統計的比較を用いるべきかに関して質問される。用いられる統計方法に依存して、ユーザは、この時点において追加のデータを入力することを要求される。これは、例えば、線形回帰分析を行うためには、特定の値が、元のサンプルに関連する何らかの測定可能な特性に対応する各画像に割り当てられるということであり得る。ステップ８６において、オペレータは、比較すべき画像グループを規定することを求められる。このようにして、第１のゲル画像セットが、第２のゲル画像セットと比較され得る。第１および第２のゲル画像セットは、各々１以上のゲル画像を含み得る。
ステップ８７において、各スポットに関して統計的比較が行われる。判定ステップ８８において、スポットが大幅に異なるか否かが判定される。スポットが大幅に異なる場合、処理はステップ８９に続く。スポットが大幅に異ならない場合、判定ステップ９０において、リスト中に統計的に比較すべきより多くのスポットがあるか否かが判定される。リスト中に統計的に比較すべきより多くのスポットがある場合、ステップ９１で次のスポットが得られる。ステップ８７において、すべてのスポットが統計的に比較されるまで処理が続く。ステップ８８においてスポットが大幅に異なると判定された場合、ステップ８９において、一旦すべてのスポットが統計的に比較されるとオペレータが検討するリストにスポットが追加される。
一旦すべてのスポットが統計的に比較されると、ステップ９２においてスポットのリストがオペレータに提示される。各グループに関する表データの平均化された複合体が、元の画像または各グループの平均複合体画像のいずれかと共にオペレータに提示される。最終ステップ９３において処理は完了する。
ステップ８５〜９３の比較プロセスは、以下に述べる実施例により最も良好に理解される。
本明細書に含まれる本発明の動作の記載および関連するフローチャートより、当該分野のプログラマには、コンピュータシステムまたはプロセッサの動作を制御するコンピュータプログラムを用いて本発明を実施する方法が明らかである。当該分野のプログラマは、例えば、本発明の方法をＣ＋＋プログラミング言語で実施し得る。
３．実施例
ステップ８５〜９３の比較の実施例によって、３匹の個々のねずみなどの３匹の異なる動物がどのような理由により３の異なる血圧を有しているかを決定することが望まれ得る。３匹の異なる動物からの動脈細胞の２ＤＧＥゲル画像が比較される。発現が異なるタンパク質を探すためにゲルが比較され、これは動物の血圧と統計的に相関し得る。統計的分析のタイプは、線形回帰である。動物の血圧に匹敵するすべてのスポットの発現の線形回帰が実行され得る。
別の実施例として、１グループのゲル画像が、島細胞などの正常な又は未処置の細胞に関連し得る。第２のグループのゲル画像が、インターロイキン（ＩＬ）−Ｉβで処置された細胞などの処置済み細胞に関連し得る。各セットのゲル画像の各スポットの統計的平均が演算される。第１のセットのゲル画像内の各スポットの統計的平均が、第２のセットのゲル画像内の各スポットの統計的平均と比較されることにより、これらが統計的に異なるか否かが判定される。このようにして、オペレータは、いずれのタンパク質がＩＬ−Ｉβ処置によって変化する（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか）かを迅速に且つ容易に決定することができる。
さらに別の実施例として、１グループの画像が正常なねずみに関連し得、別のグループの画像が糖尿病のねずみに関連し得る。目的は、２つのグループ間の相違を見い出すことである。ゲル画像が２つのセット、すなわち、第１のセットの正常なねずみのゲル画像と、第２のセットの糖尿病のねずみのゲル画像とに分割される。分析は、処置済みおよび未処置の島細胞に関して上述したものと同様の様式で行われ、正常なねずみと糖尿病のねずみとのタンパク質発現の相違が判定される。
４．本発明の実施
上述したように、本発明は、ハードウェア、ソフトウェアまたはその組み合わせを用いて実施され得、コンピュータシステムまたは他の処理システムにおいて実施され得る。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される機能を実行する能力を有するコンピュータシステムに向けられている。例としてのコンピュータシステム１１０２を図１１に示す。コンピュータシステム１１０２は、プロセッサ１１０４などの１以上のプロセッサを含む。プロセッサ１１０４は、通信バス１１０６に接続されている。様々なソフトウェアの実施形態を、例としてのコンピュータシステムに関して述べる。本明細書を読むと、当業者には、他のコンピュータシステムおよび／またはコンピュータアーキテクチャを用いて本発明を実施する方法が明らかである。
コンピュータシステム１１０２はさらに、メインメモリ１１０８、好適にはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含み、さらに２次メモリ１１１０を含み得る。２次メモリ１１１０は、例えば、ハードディスクドライブ１１１２および／または、フロッピーディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブなどを表すリムーバブル格納ドライブ１１１４を含み得る。リムーバブル格納ドライブ１１１４は、周知の様式で、リムーバブル格納ユニット１１１８からの読出し及び／又はリムーバブル格納ユニット１１１８への書込みを行う。リムーバブル格納ユニット１１１８は、フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスクなどを表し、これらはリムーバブル格納ドライブ１１１４により読み出され且つ書き込まれる。後述するように、リムーバブル格納ユニット１１１８は、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータを格納しているコンピュータ使用可能な格納媒体を含む。
別の実施形態において、２次メモリ１１１０は、コンピュータプログラムまたは他の命令がコンピュータシステム１１０２にロードされることを可能にする他の類似の手段またはメモリデバイスを含み得る。このようなメモリデバイスは、例えば、リムーバブル格納ユニット１１２２およびインターフェース１１２０を含み得る。これらの例は、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（ビデオゲームデバイスにおいて見られるような）、リムーバブルメモリチップ（ＥＰＲＯＭまたはＰＲＯＭなど）および関連するソケット、並びに他の、ソフトウェアおよびデータがリムーバブル格納ユニット１１２２からコンピュータシステム１１０２に転送されることを可能にするリムーバブル格納ユニット１１２２およびインターフェース１１２０を含み得る。
コンピュータシステム１１０２は、また、通信インタフェース１１２４を含み得る。通信インタフェース１１２４は、ソフトウェアおよびデータがコンピュータシステム１１２４と、コンピュータシステム１１０２にゲル画像を入力するスキャン装置などの外部装置（図示せず）との間を転送されることを可能にする。通信インタフェース１１２４の例は、モデム、ネットワークインタフェース（イーサネットカードなど）、ＩＮＴＥＲＮＥＴ（インターネット）とインタフェースするのに適したネットワークインタフェース、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどを含み得る。通信インタフェース１１２４を介して転送されるソフトウェアおよびデータは信号１１２６の形態である。これらは、電子、電磁気、光または通信インタフェース１１２４によって受信されることができる他の信号であり得る。信号１１２６は、チャネル１１２８を介して通信インタフェースに提供される。チャネル１１２８は信号１１２６を搬送し、ワイアまたはケーブル、光ファイバ、電話線、セル式電話リンク、ＲＦリンクおよび他の通信チャネルを用いて実行され得る。
本明細書において、用語「コンピュータプログラム媒体」、「コンピュータプログラムプロダクト」、「プログラム格納装置」および「コンピュータ使用可能媒体」は、リムーバブル格納装置１１１８、ハードディスクドライブ１１１２にインストールされたハードディスク、および信号１１２６などの媒体を包括的に呼ぶために用いられる。これらのコンピュータプログラムプロダクトは、コンピュータシステム１１０２にソフトウェアを提供する。
コンピュータプログラム（コンピュータ制御論理とも呼ばれる）は、主要メモリおよび／または第２次メモリ１１１０に格納される。コンピュータプログラムはまた、通信インタフェース１１２４を介しても受信され得る。このようなコンピュータプログラムは、実行されたとき、コンピュータシステム１１０２が本明細書中に記載の本発明の特徴を遂行することを可能にする。特に、コンピュータプログラムは実行されたときプロセッサ１１０４が本発明の特徴を遂行することを可能にする。よって、このようなコンピュータプログラムは、コンピュータシステム１１０２のコントローラを表す。
ソフトウェアを用いて本発明が実施される実施形態では、ソフトウェアはコンピュータプログラムプロダクトに格納され得、リムーバブル格納装置１１１４、ハードドライブ１１１２または通信インタフェース１１２４を用いてコンピュータシステム１１０２にロードされ得る。制御論理（ソフトウェア）は、プロセッサ１１０４によって実行されたときプロセッサ１１０４が本明細書に記載の本発明の特徴を遂行させる。
別の実施形態では、本発明は、例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などのハードウェア要素を用いてハードウェアで主に実行される。ハードウェア状態の機械の実現によって本明細書に記載の機能を遂行することは、当業者には明白である。
更に別の実施形態では、本発明はハードウェアおよびソフトウェア両方の組合せを用いて実施される。
５．結論
本発明を完全に説明したが、等価なパラメータ、濃度、および条件の広範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱せず、かつ、過度の実験を行うことなく同一の事が遂行され得ることが当業者によって理解される。
本発明は、具体的な実施形態と関連して説明したが、更なる改変が可能である事が理解される。本願は、概ね本発明の原理に従って成された本発明の変形、使用または適合化を網羅するように意図されており、また、本開示内容から逸脱していても、本発明が関する技術分野において公知または常用の手法の範囲内に入るような逸脱、および、添付の請求の範囲に以下のように記載されている上記の本質的な特徴に適用可能な逸脱も網羅するように意図される。
学術誌の記事または要約、公開された、または対応する米国または外国特許出願、発行された米国または外国特許、または他の引用文献を含む本明細書で引用した全ての文献は、引用文献で示された全てのデータ、表、図面、テキストを含み、本明細書で参考のためにその全文が援用される。更に、本明細書に引用した文献内に引用された文献の内容の全ても、参考のために援用される。
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法、または従来の方法に言及しているが、これは、本発明のいかなる局面、記載、または実施形態が、当該分野で開示、教示、または示唆されることを認めるものでは全くない。
特定の実施形態に関する上記記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするものであり、これにより、他者は、当該分野における技術の範囲内の知識（本願に引用した文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験を行うことなく且つ本発明の趣旨から逸脱することなく、このような特定の実施形態を様々な用途に合わせて容易に改変および／または適合化し得る。従って、本願に示された教示内容および指針に基づいて、上記の様な適合化および改変は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内であることが意図されている。本明細書中における言い回し（表現）または用語は、説明の便宜上のものであって、制限を加えるものではなく、当業者が、本明細書における用語または言い回しを本願に示した教示内容および指針に照らして、当業者の知識と合わせて解釈すべきであることは言うまでもない。
【図１】
0004004069.tif 000002
【図２】
0004004069.tif 000003
【図３】
0004004069.tif 000004
【図４Ａ】
0004004069.tif 000005
【図４Ｂ】
0004004069.tif 000006
【図５】
0004004069.tif 000007
【図５Ａ】
0004004069.tif 000008
【図５Ｂ】
0004004069.tif 000009
【図６】
0004004069.tif 000010
【図７】
0004004069.tif 000011
【図８】
0004004069.tif 000012
【図９】
0004004069.tif 000013
【図１０】
0004004069.tif 000014
【図１１】
0004004069.tif 000015