(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で示されるスチリル色素を含有する還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
【化１】
0003889834.tif 000006
前記式（Ｉ）中、Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＮＲ’Ｒ’’で表される置換アミノ基であり、前記Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘはハロゲンアニオンを表す。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示されるスチリル色素が、下記式（ＩＩ）で示されるスチリル色素である請求項１に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
【化２】
0003889834.tif 000007
【請求項３】
電子伝達体を含有し、前記電子伝達体がジアホラーゼである請求項１または２に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
【請求項４】
還元型ニコチンアミド補酵素が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である請求項１〜３のいずれか一項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
【請求項５】
乾式測定用である請求項１〜４のいずれか一項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
【請求項６】
ジアホラーゼの存在下、下記の式（Ｉ）で示されるスチリル色素と液体試料に含まれる還元型ニコチンアミド補酵素とを反応させて前記スチリル色素を褪色させ、可視部の吸光度の変化を測定する還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【化３】
0003889834.tif 000008
前記式（Ｉ）中、Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＮＲ’Ｒ’’で表される置換アミノ基であり、前記Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘはハロゲンアニオンを表す。
【請求項７】
前記式（Ｉ）で示されるスチリル色素が、下記式（ＩＩ）で示されるスチリル色素である請求項６に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【化４】
0003889834.tif 000009
【請求項８】
液体試料が、血液、尿、骨髄液、リコール、胸水、腹水、汗、涙または唾液である請求項６または７に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【請求項９】
スチリル色素０．１〜１０．０ｍｏｌに対しジアホラーゼ０．１２〜１．２０ｍｋａｔの割合である請求項６〜８のいずれか一項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【請求項１０】
還元型ニコチンアミド補酵素が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である請求項６〜９のいずれか一項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【請求項１１】
乾式測定法である請求項６〜１０のいずれか一項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の還元型ニコチンアミド補酵素測定用試薬を担体に付着させた還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試験片。
【請求項１３】
還元型ニコチンアミド補酵素が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である請求項１２に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試験片。
【請求項１４】
乾式測定用である請求項１２または１３に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試験片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方法並びに測定用試験片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
還元型ニコチンアミド補酵素、すなわち、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）は、生体内での酸化還元反応に関与する補酵素である。したがって、還元型ニコチンアミド補酵素を測定することにより、これに関連する酵素または基質の測定ができる。
【０００３】
従来から、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定方法としては、以下のような方法が知られている。
（１）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収または蛍光を直接測定する方法。
（２）触媒の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィンの蛍光を測定する方法。
（３）電子伝達体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとＮＴＢやＭＴＴ等のテトラゾリウム塩とを反応させてホルマザン色素を生成し、その可視部の吸収を測定する方法。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の測定方法は、以下の問題を有する。まず、前記紫外部の吸収および蛍光を測定する方法（１）は、尿等を測定対象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍光を有する共存物質、例えば、リボフラビン等のビタミンＢ2剤、フルオレッセインナトリウム等の蛍光造影剤によって妨害を受ける。この問題は、前記（２）の方法も同様である。
【０００５】
また、前記テトラゾリウム塩を発色剤として用いる方法（３）は、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質による影響で、ブランク発色を生じるという欠点がある。
【０００６】
この他に、ＮＡＤＨを用いずに生体試料中の成分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法があるが、前記テトラゾリウム塩を用いる方法（３）と同様に、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を受けて発色が阻害されるという欠点がある。
【０００７】
さらに、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定方法において、測定操作等の観点から乾式測定の実現が求められている。本発明は、前記従来の問題を解決し、紫外部に吸収若しくは蛍光を有する共存物質および還元性物質の影響を受けず、乾式測定が可能な還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方法並びに測定用試験片の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬は、下記式（Ｉ）で示されるスチリル色素を含有する。
【０００９】
【化５】
0003889834.tif 000002
【００１０】
前記式（Ｉ）中、Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＮＲ’Ｒ’’で表される置換アミノ基であり、前記Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘはハロゲンアニオンを表す。
【００１１】
前記式（Ｉ）で示されるスチリル色素としては、下記式（ＩＩ）で示されるスチリル色素が好ましい。
【００１２】
【化６】
0003889834.tif 000003
【００１３】
この特殊なスチリル色素は、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの少なくとも一方と作用させると、紫外部に蛍光等を有する共存物質およびアスコルビン酸、ビリルビン等の影響を受けず、高い選択性でＮＡＤＨ等を測定できる。具体的には、１０-6Ｍ以下の微量のＮＡＤＨ等の測定が可能である。さらに、この特殊なスチリル色素は、乾式測定に供しても高い反応性を失うことがない。このように、本発明にかかるスチリル色素は、高い反応性を有し、乾式測定に適用できるが、これは、スチリル色素の分子構造中のメチン鎖に酸性官能基が付加されているためと推察される。
【００１４】
本発明の測定用試薬において、電子伝達体を含有してもよい。また、この電子伝達体としてアホラーゼを用いることが好ましい。また、本発明の測定用試薬において、還元型ニコチンアミド補酵素は、通常、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である。また、本発明の測定用試薬は、乾式測定用であるのが好ましい。
【００１５】
つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法は、ジアホラーゼの存在下、前記式（Ｉ）で示されるスチリル色素と液体試料に含まれる還元型ニコチンアミド補酵素とを反応させて前記スチリル色素を褪色させ、可視部の吸光度の変化を測定する。
【００１６】
本発明の測定方法において、前記液体試料としては、例えば、血液、尿、骨髄液、リコール、胸水、腹水、汗、涙または唾液があげられる。本発明の測定方法において、電子伝達体としてジアホラーゼを用いることが好ましく、この場合、通常、前記スチリル色素０．１〜１０．０ｍｏｌに対しジアホラーゼ０．１２〜１．２０ｍｋａｔの割合で用いる。
【００１７】
本発明の測定方法において、還元型ニコチンアミド補酵素は、通常、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である。また、本発明の測定方法は、乾式測定法であるのが好ましい。
【００１８】
つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試験片は、前記本発明の電子伝達体を含有する還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬を担体に付着させたものである。この測定用試験片は、例えば、前記本発明の電子伝達体を含有する測定用試薬を担体に含浸する方法、若しくは、前記試薬を担体に塗布、印刷または噴霧することにより作製できる。本発明の測定用試験片において、還元型ニコチンアミド補酵素は、通常、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素である。また、本発明の測定用試験片は、乾式測定用であるのが好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
Ｒ1の具体例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基等のアルキル基が挙げられる。
【００２０】
Ｒ’、Ｒ’’によって置換されたベンゼン環の具体例としては、４−ジメチルアミノベンゼン、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、ユロリジン等が挙げられる。
【００２１】
Ｘの具体例としては、塩化物、臭素化物、フッ素化物およびヨウ素化物等のハロゲン化物があり、例えば、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等のスルホン酸イオン、メチル硫酸イオンおよびエチル硫酸イオン等の硫酸イオンが挙げられ、その他、過塩素酸イオン、硝酸イオン等のイオンも例示できる。
【００２２】
本発明にかかるスチリル色素の具体例としては、下記の式（ＩＩ）に示す２−［１−シアノ−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム アイオダイドがあげられる。
【００２３】
【化７】
0003889834.tif 000004
【００２４】
つぎに、本発明にかかるスチリル色素の製造の一例について説明する。スチリル色素として、２−［４−（４−ジメチルアミノ）フェニル−１，３−ブタジエニル−１−シアノ］−３−エチルベンゾチアゾリウム アイオダイドを合成した。
【００２５】
すなわち、まず、２−シアノメチル−３−エチルベンゾチアゾリウム アイオダイド１．２ｇおよび４−ジメチルアミノシンナムアルデヒド０．７ｇを１０ｍｌの無水酢酸に加え混合する。この混合物を、８０℃のウオーターバスで２〜３分間加熱すると、針状結晶が析出する。さらに、２０分間加熱し、析出した針状結晶を吸引ろ過して分離し、メタノールで洗浄して、ついでメタノールから再結晶すると前記スチリル色素が１ｇ得られる。
【００２６】
本発明において、電子伝達体としては、ジアホラーゼが好ましい。
【００２７】
本発明にかかるスチリル色素は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合計１モルに対して、好ましくは０．１〜１０．０モル、より好ましくは０．５〜２．０モル用いればよい。電子伝達体、すなわちジアホラーゼは、触媒として作用するので、その量は触媒量でよい。先に述べたように、通常、０．１〜１．０ｍｋａｔ／ｌのような割合で用いる。
【００２８】
その他の測定パラメーターは、主として電子伝達体によって制約を受けるので、電子伝達体がジアホラーゼの場合、通常のｐＨの範囲は５〜９、好ましくはｐＨ７〜８であり、温度は通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃である。なお、本発明にかかるスチリル色素は、反応性が高いため、反応に要する時間は瞬時に近い極めて短い時間である。
【００２９】
本発明が対象とする液体試料は、通常、体液、例えば血液またはその成分（血漿、血清等）、尿、髄液または細胞抽出液等であるが、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの少なくとも一方を含む液体試料ならいずれも本発明の対象となる。
【００３０】
これらの試料中に含まれる酵素または酵素の基質等の成分を測定しようとする場合、その酵素と基質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチンアミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。これにより、目的とする液体試料中の成分の量、濃度を測定することができる。下記の式（Ｘ）に本発明の測定用試薬の反応の一例を示す。
【００３１】
【化８】
0003889834.tif 000005
【００３２】
前記の式（Ｘ）の右側の反応式において、ジアホラーゼ（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）存在下、ＮＡＤＨにより、本発明にかかるスチリル色素（ｂｌｕｅ ｄｙｅ）が褪色する（ｄｉｓｃｏｌｏｒ）するとともに、前記ＮＡＤＨがＮＡＤとなる。また、前記の式（Ｘ）の左側の反応式は、β−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（β−ＨＳＤ）の存在下、ＮＡＤにより、３β−ハイドロキシバイル酸が３−オキソステロイドになるとともに、前記ＮＡＤがＮＡＤＨとなる。すなわち、この反応は、ＮＡＤを補酵素とするβ−ＨＳＤの酵素反応である。したがって、この場合、本発明によるＮＡＤＨの測定により、β−ＨＳＤ等の測定が可能となる。
【００３３】
この他に、本発明の対象となるのは、例えば、α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなどである。
【００３４】
つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試験片に用いる担体としては、例えば、濾紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ポリエチレンフィルム、ガラス、セラミック等があげられ、測定用試験片の種類に応じ適宜選択される。例えば、測定用試験片を本発明の測定用試薬を担体に含浸して作製する場合は、吸収可能な担体として濾紙が好適であり、また、一般的な担体としては、ポリエチレンテレフタートフィルムが好適である。
【００３５】
この測定用試験片を用いた測定方法は、以下のとおりである。すなわち、まず血液等の液状試料を前記測定用試験片に付着させる。すると、この試験片が褪色するので、この褪色程度を分光光度計若しくはデンシトメーター等で測定することにより、液状試料中のＮＡＤＨ等を測定することができる。
【００３６】
【実施例】
つぎに、実施例について説明する。実施例に用いるスチリル色素として、前記の式（ＩＩ）で表される２−［１−シアノ−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム アイオダイドを用いた。以下に、反応液組成および測定用検体（液状試料）を示す。なお、下記の反応液および測定用検体の組成は、全て最終濃度を示す。
【００３７】
（実施例１）
反応液組成
色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．２０ ｍｏｌ／Ｌ
測定用検体
β−ＮＡＤＨ ０〜５０μｍｏｌ／Ｌ
（実施例２）
反応液組成
色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．２０ ｍｏｌ／Ｌ
測定用検体
β−ＮＡＤＨ ０〜５０μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸 １．０ｇ／Ｌ
つぎに、実施例１、２において、以下の手順で測定を行い検量線を作成した。
（１）反応セルにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を入れる。この量は、実施例１では２．６５ｍｌであり、実施例２では２．５５ｍｌである。
（２）色素液０．１ｍｌ、ジアホラーゼ０．１５ｍｌを反応セルに加えて攪拌した後、２５℃で５分インキュベートする。
（３）各濃度の検体を、実施例１では０．１ｍｌ、実施例２では０．２ｍｌ、反応セルに加え、攪拌後、直ちに６４０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成する。
【００３８】
実施例１の検量線を図１のグラフに、実施例２の検量線を図２のグラフに示す。このように、本発明の実施例では、反応後、直ちに測定に供することができるため、迅速な測定が可能であった。また、実施例２の結果より、還元物質であるアスコルビン酸が共存していても、この影響を受けることなくＮＡＤＨの測定が可能であるといえる。
【００３９】
（実施例３）
下記の組成の含浸液を調製し、これを１０×１０ｃｍの濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製、３ＭＭ，Ｃｈｒ）に含浸し、ついで乾燥機（ＹＡＭＡＴＯ社製、ＤＦ６２）を用い５０℃、１５分間の条件で乾燥させた。そして、この濾紙を、幅５ｍｍに裁断し、両面テープを用いてポリエチレンテレフタレートフィルムに貼着し、さらにこれを５ｍｍに裁断し５×５ｍｍの測定用試験片を作製した。
含浸液組成
色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２） ０．２ｍｏｌ／Ｌ
他方、測定試料として、４種類の濃度のＮＡＤＨ水溶液（濃度：０μｍｏｌ／Ｌ，２０μｍｏｌ／Ｌ，５０μｍｏｌ／Ｌ，１００μｍｏｌ／Ｌ）を準備した。
【００４０】
そして、前記試験片に点着量８μｌで上記ＮＡＤＨ水溶液を点着し、色差計（Σ９０、日本電色社製）を用い、測定時間１２０秒（エンドポイント）および測定温度２５℃の条件で６４０ｎｍでの反射率を測定した。この測定結果を、図３のグラフに示す。
【００４１】
同図に示すように、ＮＡＤＨの濃度に対応する検量線が得られた。また、この実施例は、乾式測定の実施例であるが、測定において高い反応性を確認することができた。
【００４２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬は、前記の式（Ｉ）で示されるスチリル色素を含有する。この特殊なスチリル色素は、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの少なくとも一方と作用させると、高い選択性でＮＡＤＨ等を測定できる。しかも、この測定では、紫外部に蛍光等を有する共存物質およびアスコルビン酸、ビリルビン等の影響を受けない。このため、本発明の測定用試薬を用いれば、前処理等をせずに、高い精度で簡単に試料中のＮＡＤＨ等を測定できる。また、この特殊なスチリル色素は、乾式測定に供しても高い反応性を失うことがないため、これを用いれば、測定用試験片を作成することが可能となる。この測定用試験片を用いることにより、ＮＡＤＨ等の測定がさらに容易となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例におけるＮＡＤＨの検量線を示すグラフである。
【図２】本発明のその他の実施例におけるＮＡＤＨの検量線を示すグラフである。
【図３】本発明のさらにその他の実施例におけるＮＡＤＨの検量線を示すグラグである。
【図１】
0003889834.tif 000010
【図２】
0003889834.tif 000011
【図３】
0003889834.tif 000012