(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号１に示されるアミノ酸配列を有するセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
該ＤＮＡ分子が配列識別番号１に示される核酸配列を有する請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載のＤＮＡ分子を包含するベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを包含するホスト細胞。
【請求項５】
該ＤＮＡ分子が組換えＤＮＡ分子である請求項１〜２のいずれかに記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子及びそれに外科的に結合されたプロモーター及び翻訳活性化配列を包含する発現構築物(construct)。
【請求項７】
請求項６に記載の発現構築物で形質転換された真核生物又は原核生物ホスト細胞。
【請求項８】
該ホスト細胞がAcremonium chrysogenum細胞である請求項７に記載のホスト。
【請求項９】
配列識別番号１に示されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％配列同一性を有し、セファロスポリンＣ（又はその誘導体）を７−ＡＣＡ（又はその対応する誘導体）に変換できる単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列識別番号１に示されるアミノ酸配列を包含する請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
該ポリペプチドが固定化されている請求項９又は１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
ａ）  ホスト細胞を
(i)ホスト細胞内で機能する発現コントロール配列、及び
(ii)発現コントロール配列に外科的に結合されたセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列であって、ＤＮＡ配列は請求項１〜２又は５のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有するもの、
を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換すること、
ｂ）  ステップａ）で形質転換したホスト細胞を、該セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼの発現を可能にする条件下で、培養すること、
を包含する真核生物又は原核生物ホスト細胞内でセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを発現する方法。
【請求項１３】
セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを真核生物又は原核生物ホスト細胞内で発現する方法であって、該ポリペプチドは請求項９〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、
ａ）  ホスト細胞を
(i)ホスト細胞内で機能する発現コントロール配列、及び
(ii)発現コントロール配列に外科的に結合された該ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子
を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換すること、
ｂ）  ステップａ）で形質転換されたホスト細胞を、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を可能にする条件下で、培養すること、
を包含する方法。
【請求項１４】
セファロスポリンＣ又は式（Ｉ）
0003889438.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ（ＮＨＲ５）ＣＯ２Ｒ４、−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｒ４又は−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｒ４から選択される基を表し、
Ｒ２は、カルボン酸又はカルボキシレート基又は塩、エステル又はこれらの保護された誘導体を表し、
Ｒ３は、水素原子又は−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２又はピリジニウムメチル基から選択される基を表し、
Ｒ４は、水素原子又はカルボキシル保護基を表し、及び
Ｒ５は、水素原子、ベンゾイル基又はアミノ保護基を表す。］
を有する誘導体を、７−アミノセファロスポラン酸又は式（II）
0003889438.tif 000019
［式中、
Ｒ２は、カルボン酸又はカルボキシレート基又は塩、エステル又はこれらの保護された誘導体を表し、
Ｒ３は、水素原子又は−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２又はピリジニウム基から選択される基を表す。］
を有するこれらの対応する誘導体に一段階変換する方法であって、
セファロスポリンＣ又はその誘導体を請求項９〜１１のいずれかに記載のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理することを包含する方法。
【請求項１５】
セファロスポリンＣ又は式（Ｉ）
0003889438.tif 000020
［式中、
Ｒ１は、−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ（ＮＨＲ５）ＣＯ２Ｒ４、−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｒ４又は−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｒ４から選択される基を表し、
Ｒ２は、カルボン酸又はカルボキシレート基又は塩、エステル又はこれらの保護された誘導体を表し、
Ｒ３は、水素原子又は−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２又はピリジニウムメチル基を表し、
Ｒ４は、水素原子又はカルボキシル保護基を表し、及び
Ｒ５は、水素原子、ベンゾイル基又はアミノ保護基を表す。］
を有する誘導体を、７−アミノセファロスポラン酸又は式（II）
0003889438.tif 000021
［式中、
Ｒ２は、カルボン酸又はカルボキシレート基又は塩、エステル又はこれらの保護された誘導体を表し、
Ｒ３は、水素原子又は−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２又はピリジニウムメチル基から選ばれる基を表す］
を有するこれらの対応する誘導体に一段階変換する方法であって、
セファロスポリンＣ又はその誘導体を請求項１〜２又は５のいずれかに記載のＤＮＡの発現によって得ることができるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素で処理することを包含する方法。
【請求項１６】
セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼが固定化されている請求項１４〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
セファロスポリンＣを、７−アミノセファロスポラン酸が製造される条件下において、請求項９〜１１のいずれかに記載のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理することを包含するセファロスポリンＣから７−アミノセラロスポラン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体を７−アミノセファロスポラン酸またはこれらの対応する誘導体へ一段階で変換するための酵素法に関する。該一段階変換は、Pseudomonas vesicularis B965から、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から、またはＤＮＡ、特に本明細書で開示されるPseudomonas vesicularis B965、若しくは何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から誘導されるＤＮＡの何れかの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素を用いて行われる。
セファロスポリンはＣ、セファロスポリン生合成経路の発酵産物であり、これ自身抗生物質としてグラム陰性菌に対して幾つかの活性を有することが示されているが、セファロスポリンＣの主要な商業的利用は、他のセファロスポリン様抗生物質の基礎単位としての利用である。特に、Ｄ−α−アミノアジピル側鎖を除去し、非常に有用な中間体７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を得ることができる。これは、セファロチン、セファロリジンおよびセフロキシムを含む広範囲の半合成セファロスポリン抗体の前駆体となる。
セファロスポリンＣから７−ＡＣＡを製造するための現在の工業的方法は、Ｄ−α−アミノアジピル側鎖の化学的開裂である。使用に際しては幾つかの異なった方法がある（例えば、A Smithの、"Comprehensive Biotechnology: the Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine"第３巻、（"The Practice of Biotechnology: Current Commodity Products")、H W Blanch et al.編、esp.pp.163-185、Pergamon Press, Oxford,UK, 1985参照）が、これらはすべて、基本的には、アミノ基およびカルボキシル基の適切な保護を用いたイミノ−ハライド法である。例えば、Morin et al (J.Am. Chem. Soc.,84, 3400 (1962)）によって開発されたニトロシルクロライド開裂は、現在Ciba Geigy (Fechtig et al, Helv. Chim. Acta, 51, 1108(1968)）によって開発されたイミノエステル法に取って代わられている。
これらの化学的方法は、保護および開裂のための化学薬品のコスト、要求される低い操作温度（例えば−２０℃）を得るための費用、複雑な、時として多段階のプラントのコスト、毒性の化学薬品（例えば、トリメチルシリルクロライド、五塩化リンおよび塩化クロロアセチル）を含有することを測定するためのコスト、および非常に不純なセファロスポリンＣ（又は誘導体）出発物質を精製する必要性を含めた幾つかの不利益を有する。
従って、安価で、簡単な技術を含み、環境に優しく、安全である、セファロスポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（または対応するその誘導体）に変換する方法を提供する必要性がある。このような基準により、ここで酵素方法が用いられることにつながる。
セファロスポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（またはその対応する誘導体）に変換するための効果的な生物学的方法または酵素方法をサーチすることは、たいてい失敗に終わっている。セファロスポリンＣを７−ＡＣＡに変換するための二段階酵素方法に関する文献がある。これらは、最初に、Ｄ−アミノ酸のオキシダーゼを用いてセファロスポリンＣをグルタリル−７−ＡＣＡに変換し（例えば米国特許第３６５８６４９または３８０１４５８を参照）、次いでグルタリル側鎖を開裂して７−ＡＣＡを得ることが必要である。二段階酵素方法は、例えばShibuya et al, Agric. Biol. Chem., 45, 1561-1567 (1981)に開示されているが、これらは全て、一段階方法に比べて効率が低下し、複雑さが増加するという不利益がある。
低活性の一段階酵素反応の報告もある。例えば、ＥＰ０２８３２１８、ＥＰ０３２２０３２、およびＥＰ０４０５８４６には、Arthrobacter viscosus、Bacillus Megaterium、および他のバシルス種からそれぞれ誘導される酵素を用いるセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの一段階変換が開示されている。ＥＰ０４７４６５２には、Pseudomonas diminutaから誘導されるセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの一段階変換に使用しうる酵素が開示されている。この分野の広範囲の研究にもかかわらず、先に開示されたような単離された酵素が商業的に適切な量の７−ＡＣＡを製造するのに使用できることは、まだ示されていない。
従って、我々が、セファロスポリンＣ（またはその誘導体）を７−ＡＣＡ（またはその対応する誘導体）に一段階で変換することができるアミドヒドロラーゼ（アミダーゼまたはアシラーゼとしても知られる）酵素を産生するPseudomonas vesicularisの菌株を単離したことは特に予想されていない。観測されるこの酵素の活性は、野生型の菌株では非常に弱いが、以下の部分的な酵素の精製で有用な活性が得られる。更に、アミノヒドロラーゼ酵素活性をコードする遺伝子も単離され、配列決定され（配列識別番号１）、増加した量の酵素を生産するためにE. coliのような組換えホスト中で発現された。加えて、単離されたアミノヒドロラーゼ酵素は、これを固定化しうるが、有意に酵素活性を維持するのに十分丈夫であることが本発明の特徴である。酵素の固定化は、７−ＡＣＡの大規模発酵合成で使用するための酵素の適合に特に重要なステップである。発酵において遊離の酵素に比べて固定化された酵素を使用することは、酵素に対する要求を有意に減少し、引き続いて７−ＡＣＡの製造のコストを減少する明確な利益を有する。
従って、本発明の第一の側面では、セファロスポリンＣまたはその誘導体を、７−アミノセファロスポラン酸またはその対応する誘導体に変換する一段階変換方法であって、前記セファロスポリンＣまたはその誘導体を、Pseudomonas vesicularis B965、または、何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物、またはＤＮＡ、特に前記Pseudomonas vesicularis B965、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ分子の何れかの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理することを具備した方法を提供する。
本発明の他の側面では、セファロスポリンＣまたは式（Ｉ）のこれらの誘導体を、
0003889438.tif 000002
但し、
Ｒ1は、−ＣＯ（ＣＨ2）3ＣＨ（ＮＨＲ5）ＣＯ2Ｒ4、−ＣＯ（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｒ4または−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｒ4から選択される基を表す。
Ｒ2は、カルボン酸またはカルボキシレート基または塩、エステルまたはこれらの保護された誘導体を表す。
Ｒ3は、水素原子または−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＮＨ2またはピリジニウムメチル基から選択される基を表す。
Ｒ4は、水素原子またはカルボキシル保護基を表す。
Ｒ5は、水素原子、ベンゾイル基又はアミノ保護基を表す。
７−アミノセファロスポラン酸または式（II）の対応するこれらの誘導体へ一段階で変換するのための方法であって、
0003889438.tif 000003
但し、Ｒ2およびＲ3は先に定義したとおりである。
式（Ｉ）の化合物を、Pseudomonas vesicularis B965、または、何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物、またはＤＮＡ、特に前記Pseudomonas vesicularis B965、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ分子の何れかの発現から誘導されるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理で処理することを具備した方法を提供する。
本発明の好ましい側面では、式（Ｉ）の化合物は、セファロスポリンＣ（即ち、Ｒ1が−ＣＯ（ＣＨ2）3ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯ2Ｈ基であり、Ｒ2がカルボン酸基であり、Ｒ3が−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である。）であり、式（II）の化合物は７−アミノセファロスポラン酸（即ち、Ｒ2がカルボン酸基であり、Ｒ3が−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である。）である。
本発明の更なる側面では、真核生物または原核生物ホスト内でＤＮＡ配列をクローニングするのに使用される組換えＤＮＡ分子であって、前記組換えＤＮＡ分子が、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の発現をコードする配列識別番号１に示されるＤＮＡ配列、またはセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の発現をコードする配列識別番号１に示されたＤＮＡ配列の機能変異から得たＤＮＡ配列から選択されるＤＮＡ配列を含有するものを提供する。
本発明の更に好ましい側面では、ＤＮＡまたは組換えＤＮＡは配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列またはこれらの機能的変異の一部または全部から選択されるＤＮＡ配列を含む。
本発明の他の側面では、真核生物または原核生物ホスト内でＤＮＡ配列をクローニングするのに使用される組換えＤＮＡであって、前記組換えＤＮＡ配列が本発明の配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列、またはセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の生物学的活性を有するポリペプチドの発現をコードする配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異を含有するものを提供する。
本発明の更に他の側面では、配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズするか、または突然変異によって配列識別番号に記載のＤＮＡ配列に関連されたＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ分子を提供する。
ここで使用される「配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異」の語は、
（ｉ）配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の対立変異であるＤＮＡ配列；
（ii）上記配列（ｉ）または配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列；
（iii）上記配列（ｉ）および（ii）、または配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として変性されたＤＮＡ配列
から選択されるＤＮＡ配列を含有する。
好ましくは、「配列識別番号１に記載のＤＮＡ配列の機能的変異」は、Pseudomonas vesicularis B965に見出される天然のセファロスポリンＣアミノヒドロラーゼの配列（配列識別番号１）に実質的に対応するアミノ酸配列を含有するか、または１以上の欠失、置換、挿入、逆位または対立遺伝子に由来するもの（allelicorigin）の付加等を含めたポリペプチドをコードするであろう。生じたポリペプチドは、天然のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％の相同性を有し、ここで定義した幾つかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を本質的に維持するか、または好ましくは増強された活性またはセファロスポリンＣ基質の存在下で、例えばその基質に対する酵素の親和性を増強する（即ち、Ｋmの減少）ことによって、または反応の速度を増加する（即ち、Ｋcatを増加する）することによって増加した酵素動力学を示すであろう。
本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列の発現を制御する、外科的に結合された転写および翻訳活性化配列を含有することが認識されるであろう。組換えＤＮＡ発現に使用するためのこのような活性化配列は、当分野で周知である。
特に、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列とＧＴＧ、ＣＴＧまたは最も好ましくはＡＴＧのような開始コドンを従来の方法によって組み合わせることを望むことも認識されるであろう。
更に、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列は、終止コドン、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡのようなコード配列の３’末端での調節シグナル、およびｍＲＮＡポリアデニル化およびプロセッシングシグナルを含有しうる。
本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列が遺伝子融合を用いる融合タンパク質として発現されうる（この場合、これらのリーディングフレームは、位相を同じにするように他のタンパクに対するコード配列に結合される。）ことが認識されるであろう。このような遺伝子融合は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性をシグナルペプチドにリンクさせ、形質転換細胞によるその分泌を可能にするように構成される。この技術の他の使用は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を実際にプロモータに隣接配置する必要がなく、正しいリーディングフレーム内のプロモーター配列の後ろのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列のスプライシングを可能にしうる。この技術の他の使用は、親和性タグをセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドに加えることができ、ポリペプチドのアッセイを促進するであろう。
「セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列」の語は、単一または複数の塩基の置換、欠失、挿入または逆位を含めた変異のような１以上の修飾を含み、本明細書で定義したセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現をコードするこれらの配列を含ませる頃を意図している。修飾されたＤＮＡ配列を使用する場合、これらは、Pseudomonas vesicularis B695に見出される天然のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素にアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現をコードする遺伝子コードにより変性されたこれらの組換えＤＮＡ配列である。
この他には、上記の修飾を含めたセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列は、本明細書で定義したセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現をコードしうる。この場合、１以上の欠失、置換、挿入、逆位または対立遺伝子に由来するものの付加等が、例えばその基質に対する親和性を増加する（即ちＫmの減少）ことによって、または反応速度を増加する（即ち、Ｋcatの増加）によって改善された触媒活性を有する酵素の発現を改善させる。
本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列は、他の組換えＤＮＡ配列と組み合わされうる。
例えば、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素は、基質としてグルタリル−７−ＡＣＡを受け入れ、これによってセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列がＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードする組換えＤＮＡ配列と組み合わされうる。この他には、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素は、通常、基質としてセファロスポリンＣを受け入れ、これによってセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列がＤＡＣアセチルトランスフェラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列と組み合わされうる。
本発明の組換えＤＮＡ配列は、これらがそのまま使用されうる何れの場合にも、抗生物質を産生する微生物のゲノムに直接に導入されうる。この他には、本発明の組換えＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ発現ベクターを使用して当分野で公知の標準的技術で導入されうる。この方法で導入する場合、ベクターは一般に、プロモーターおよび／または翻訳活性化配列を更に含有し、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列に外科的に結合され、好ましくは更に形質転換されるホストを同定するための、例えば本明細書中で以下に説明する選択マーカーシステムを用いることが認識されるであろう。
従って、本発明の更なる側面では、本発明の組換えＤＮＡ配列を含有し、更にセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列に外科的に結合されたプロモーターおよび翻訳活性化配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。
この他の側面では、本発明の組換えＤＮＡ配列を、抗生物質を産生しない微生物、例えばEscherichia coliに、直接にまたは組換えＤＮＡ発現ベクターの一部として導入し、in vitroでの抗生物質の産生、または抗生物質の産生に使用するための前駆体のin vitroでの調製を触媒するのに有効なセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有する酵素の発現および単離を行う。セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現がE. coliで意図されない場合でさえも、適切な組換えＤＮＡ発現ベクターを、E. coliのような原核生物ホスト中で複製でき、更なる遺伝子操作を容易にすることが好ましい。
従って、本発明の他の側面に従えば、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された真核生物または原核生物ホストを提供する。
好ましいホストには、Acremonium sppまたはPenicillium sppのような繊維状菌の種、ストレプトマイセスの種、またはE. coliまたはBacillus sppのような他のバクテリアが含まれる。特に好ましいホストは、Acremonium chrysogenumまたはE. coliである。
本発明の更なる側面では、真核生物または原核生物ホスト内でセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を発現する方法であって、
ａ）ホスト細胞を、（ｉ）ホスト細胞内で機能する発現コントロール配列、および（ii）発現コントロール配列に外科的に結合されたセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換すること、
ｂ）ステップ（ａ）で形質転換されたホスト細胞を、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性の発現を可能にする条件下で培養すること、
を具備した方法を提供する。
ここで開示された組換えＤＮＡ配列は、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼの発現をコードしない所定長さの組換えＤＮＡを含有する。これらの非コード配列は、全組換えＤＮＡ配列の有用性を少しも損なわないが、組換えＤＮＡ配列から誘導されるより小さな制限フラグメントを使用することが便利でありるか、または望まれうる。制限フラグメントは、例えば当分野で周知の方法で、適切な制限エンドヌクレアーゼ酵素または特異的エキソヌクレアーゼ酵素を用いて開裂することによって得ることができる。
本発明の更に他の側面では、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列またはこれらの対立若しくは機能的に同等な他の変異を有するセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼポリペプチドの発現をコードする遺伝子を含有した組換えＤＮＡ発現ベクターであって、１以上のアミノ酸が本明細書で開示された酵素活性試験において実質的にセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性に影響を与えることなく、付加、置換または削除されているものを提供する。
適切な組換えＤＮＡ発現ベクターは、染色体、非染色体および公知のバクテリアプラスミド、例えばColE1のような「天然」プラスミドまたはpBR322、pAT153、pUC18、pUC19、pACYC184またはpMB9のような「人工」プラスミド、または酵母プラスミド、例えば２μの誘導体のような合成ＤＮＡを包含しうる。
他の適切なベクターは、ファージＤＮＡ、例えばＭ13の誘導体、またはバクテリオファージラムダ（λ）、またはYlp、YEpまたはYRpの誘導体のような酵母ベクターでありうる。
組換えＤＮＡ配列または本明細書で定義されるこれらから誘導される制限フラグメントを含有することを除けば、組換えＤＮＡ発現ベクターも選択されたホスト細胞を機能化するだけでなく、外科的に結合された（このことは、これが正しい方向および位置に配置され、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列の発現を制御することを意味する。）プロモーターおよび翻訳活性化配列を含有しうる。もちろんこのような活性化配列は、本明細書で開示される完全な長さの組換えＤＮＡ分子に見出されうる。
本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターに使用されうる有用なプロモーターの例には、例えばAcremonium sppまたはPenicillium sppから得られるイソペニシリンＮシンセターゼ（ＩＰＮＳ）のpcbCプロモーター、Acremonium sppから得られるエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ（ＤＡＯＣＳ／ＤＡＣＳ）のcefEFプロモーター、Penicillium sppから得られるアシルCoA：6APAアシルトランスフェラーゼのpenDEプロモーター、およびpgk、gpdA、pki、amdS、argB、trpC、alcA、aldD、およびniaDプロモーター配列を含めたAspergillus sppから得られる多数のプロモーター配列が含まれる。
本発明の組換えＤＮＡに使用されうる有用なプロモーター配列の更なる例には、酵母の糖分解プロモーター（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、ＰＫＧのプロモーター）、酵母酸ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）またはアルコールデヒドロゲナーゼ−２（alcA)のプロモーターまたはグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。発現がE. coliのようなバクテリアホストで行われる場合、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターに使用されうる有用なプロモーターは、当分野で周知であり、これらにはλＰＬ／Ｃ1８５７システム、並びにtac、lac、trpEおよびrecAのような他の一般のプロモーターが含まれる。他の適切な発現系は、Ｔ７ポリメラーゼ系である。
加えて、このような組換えＤＮＡ発現ベクターは、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列の挿入のための種々の部位を有する。これらの部位は、これらを開裂する特異的な制限エンドヌクレアーゼによって特徴づけられる。幾つかの開裂部位は当業者に十分認識されている。
発現ベクター、特に選択された組換えＤＮＡフラグメントを挿入し、発現をコントロールする配列にこれを外科的に結合するためにこれら内で選択される部位は、与えられた制限酵素に影響されやすい多くの部位、発現されるタンパク質の大きさ、ホスト細胞タンパク質によって発現されるタンパク質（これは精製で除くことが困難でありうる。）の混入または結合、および当業者に認識された他の因子を含めた種々の因子で決定される。従って、ベクターの選択および組換えＤＮＡ配列の挿入部位はこれらの因子のバランスによって決定されるが、全ての選択が与えられたケースに対して等しく効果的ではない。同様に、全てのホスト／ベクターの組み合わせが、本発明の組換えＤＮＡ配列の発現に等しく影響するように機能することはないであろう。選択は、ホストおよびベクターの適合性、所望のタンパク質の回収の容易さ、および／または組換えＤＮＡおよびこれらに外科的に結合された発現コントロール配列の発現の特徴を含めた種々の因子、または所望のタンパク質の何れかの必要な発現後の修飾に依存して行われる。
組換えＤＮＡ発現ベクターは、形質転換体に対する選択されたホストのスクリーニングを促進する選択マーカーも含有する。真菌の形質転換に使用するための適切なマーカーは当分野で周知であり、これらには、唯一の窒素源としてアセトアミドを使用する能力を形質転換体に付与するアセトアミド（amdS）遺伝子、抗生物質耐性、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンＢ（hygromycin B）およびフレオマイシン（Phleomycin）のようなアミノグリコシド抗生物質に対する耐性、または変性されたチュービュリン遺伝子を用いた形質転換によるベノミルに対する耐性を形質転換体に付与するホスホトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。他の有用なマーカーは、唯一の窒素源としてナイトレートを利用する能力をナイトレートリダクターゼ不全突然変異体に付与するナイトレートリダクターゼ（niaD）遺伝子である。繊維状菌に対する他のマーカー系には、argB遺伝子を用いるアルギニン栄養要求性、trpC遺伝子を用いるトリプトファンＣ栄養要求性、およびpyr-4またはpyrG遺伝子を用いたウラシル栄養要求性の復帰変異が含まれる。
本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ遺伝子および選択されるマーカー遺伝子は、同じプラスミドの一部であることが都合よく、この他としては、これらは、ホストが当分野で周知の何れかの適切な技術を用いて共同形質転換（co-transformation）されなければならない何れの場合でも異なったプラスミドに存在することができる。
組換えＤＮＡ発現ベクターはまた、任意に、染色体若しくはミトコンドリアＤＮＡのフラグメント、好ましくは形質転換されるものと同じ種から誘導される自律性複製配列（ars）によって特徴づけられる。
例えばE. coliのようなバクテリア発現系では、選択マーカーは当分野で非常によく確立されている。特殊な使用の中には、例えばテトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対する抗生物質耐性を付与するマーカーがある。
セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼが全体として純粋である必要がないこと、および当分野で周知の技術によって実質的な精製が行われ、セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性を有する酵素組成物を提供するべきであることが認識されるであろう。
従って、本発明の更なる側面では、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体を７−アミノセファロスポラン酸またはこれらの対応する誘導体に一段階で変換することができるセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを含有する酵素組成物であって、前記酵素組成物がPseudomonas vesicularis B965、または、何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物から、または前記Pseudomonas vesicularis B965、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、或いは潜在的に産生するこれらの継代物の遺伝子物質の何れかの発現から誘導されるものを提供する。
アミノ基およびカルボキシル基の保護で本明細書中で参照される文献は、例えばTheodora GreeneおよびPeter Wutsの「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」（第２版）（John Wiley and Sons Inc. 1991）に開示された従来の保護基を使用するときに参照されるものである保護基を使用する場合の原則は十分に確立されている。GreeneおよびWutsは有用な保護基に対して以下のような多くの基準を提案している。
●  これは、好収率で選択的に反応し、計画した反応に安定な保護された物質を与えなければならない。
●  これは、容易に利用しうる、好ましくは非毒性の反応剤であって、再生された官能基を攻撃しないものにより好収率で選択的に除去されなければならない。
●  これは、その形成または開裂に関連した副生成物から容易に分離できる結晶性誘導体を（新たなステレオジェン中心を生じることなく）形成するべきである。
●  これは、所定部位の更なる反応を防止するために最小限の追加の機能性を有するべきである。
適切な保護基は、当業者によって容易に認識されるであろう。
式（Ｉ）および（II）の化合物の塩にはアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）のような無機塩が含まれる。
式（Ｉ）および（II）の化合物のエステルは、生理学的に許容しうることが好ましく、これらには、アシルオキシアルキルエステル、例えばアセトキシメチル、アセトキシエチルまたはピバロイルオキシメチルエステルのような低級アルカノイルオキシメチル若しくは−エチルエステル、およびアルコキシカルボニルオキシエチルエステル、例えばエトキシカルボニルオキシエチルエステルのような低級アルコキシカルボニルオキシエチルエステルが含まれる。
先に述べたように、本発明の方法は、セファロスポリンＣまたはこれらの誘導体を本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼで処理することを具備する。このような状況では、「処理する」という語は、基質に酵素を接触する何れかの従来の方法を意味する。
従って、例えば、組成のセファロスポリンＣまたはこれらの誘導体の部分的に精製された溶液または細胞を含まない肉汁を、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素組成物を用いてバッチごとにまたは連続法で処理される供給流れとして使用しうる。このような方法は、基質または酵素を任意に予め精製するか、または精製せずに行なうことができる。
この他には、本発明のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼは固定化され、例えば撹拌されたタンク反応器中で使用されうるか、またはセファロスポリンＣ若しくはこれらの誘導体を通す酵素カラムとして使用されうる。このような固定化された形態のセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素組成物は、更に本発明の更なる側面を構成する。
酵素の固定化法は、当分野で公知である（例えば、「バイオテクノロジー」；７ａ巻、酵素技術（J F Kennedy編）、第７章、347-404頁、VCH Publishers、Cambrige、UK、1987参照）。酵素は、例えば原子価、イオンまたは疎水性相互作用によって支持体に結合されるか、この他には、ゲル若しくは繊維にトラップするか、或いはミクロカプセル化することによる物理的吸着によって支持体に結合される。
適切な支持体物質には、セルロース、澱粉、デキストラン、アガロース、アルギネート及び蛋白質のような天然ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、およびスチレンベンゼンコポリマーのような合成ポリマー、またはシリカ、ベントナイト、ガラスおよび金属のような鉱物が含まれる。
固定化の特に好ましい方法は、臭化シアン若しくはグルタルアルデヒドのような活性化試薬を用いて酵素を支持体に原子価結合すること、またはオキシラン、ヒドラジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、カルボニルジイミダゾールまたはピリジルジチオプロピルのような反応性基で酵素と支持体を原子価結合することによるものである。特に好ましい支持体には、架橋したポリアクリルアミド、アガロースおよびシリカが含まれる。
基質を酵素と接触するための他の方法には、膜反応器の使用、即ち、Pseudomonas vesicularis B965またはセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、若しくは潜在的に産生するこれらの継代物と、セファロスポリンＣ（または誘導体）を産生する繊維状菌を同時に培養することによるものである。
本明細書中で使用される「セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、若しくは潜在的に産生するこれらの継代物」の語は、自発的または誘導された突然変異によって生じうるPseudomonas vesicularis B965の全ての突然変異体であって、これら以外のものがセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生しないものを包含することを意図している。しかし、これらの遺伝物質が、まだ、標準の組換えＤＮＡ技術を適用してセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを発現することができるという事実から、幾つかの非産生物がなお、「潜在的に産生する継代物」となるであろうことに注意するべきである。
菌株の改良の手段としての突然変異誘発の方法は、当分野で周知である。最新の組換え技術は、例えば、他の微生物、例えばE. coliのような他の微生物においてPseudomonas vesicularis B965の遺伝物質の全てまたは一部の発現を含む菌株の改良のより直接的手段を提供する。セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼの発現をコードする組換え遺伝子をPseudomonasの親株に再導入しても、またはしなくてもよい。当分野で周知の他の発現系を使用して、大量の本発明に従った使用のためのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生する。Pseudomonas vesicularis B965の全て若しくは部分的な遺伝物質の発現、または何れかのセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼを産生するか、または潜在的に産生するこれらの継代物は本発明の更なる側面を構成する。
本発明の更なる理解を助けるために含まれる以下の制限を意味しない例には、以下の略号を使用した。
Ｃｅｐ  Ｃ          セファロスポリンＣ
７ＡＣＡ            ７−アミノセファロスポラン酸
ＧＬ−７ＡＣＡ      ７−β−（４−カルボキシブタナミド）−セファロスポラン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）
ｋｂ                キロベース
ＤＴＴ              ジチオトレイトール
ＥＤＴＡ            エチレンジアミン四酢酸
ＭＯＰＳ            ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸
ＳＤＳ              ラウリル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ    ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸塩
ＴＳＢ              トリプトン大豆肉汁（tryptone soya broth）
ＤＭＡＢ            ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド
２ＭＥ              ２−メルカプトエタノール
ＰＶＤＦ            ポリビニリデンジフルオライド
ｇａｃ              ＧＬ−７ＡＣＡおよびＣｅｐｈ  Ｃアミノヒドロラーゼコード遺伝子
調製例１：Pseudomonas vesicularisから得られたアミノヒドロラーゼ酵素活性体の取り出しとアッセイ
（ａ）天然単離物のスクリーニング系
微生物単離物を、L R Hawker & A H Linton, "Micro-Organisms: Function, Form and Enviroment", (Edward Arnold Pubs. 1971);R G Board & D W Lovelock, "Sampling-Microbiological Monitoring of Environments", (Academic Press, 1973);J M Lynch & N J Poole, "Microbial Ecology: A Conceptual Approach", (Blackwell Scientific, 1979);および"The Oxoid Manual, 5th Edition", (Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hants, RG24 0PW)で典型化された標準の微生物学的方法を使用して広範囲の周囲のサンプルから取り出した。
天然から得られる１０５，０００以上の単離物を、アミドヒドロラーゼ活性のスクリーニングで、およそ２６０，０００のアッセイを含むアッセイ系にかけた。このアッセイ系では、単離物を、酵素基質混合物に接種源を供給するために、寒天で固化させた複合媒体で成長させる。初期のスクリーニングの間に酵素基質混合物は、典型的には１００mMのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）；３mg/mlのＣｅｐｈ  Ｃ；３mg/mlのＧＬ−７ＡＣＡ；１３．５mg/mlのクロキサシリンを含有する。新たに成長させた細胞のサンプルを１６から２４時間酵素基質混合物中で培養した。産生された７ＡＣＡをＤＭＡＢと反応させ、次いでBalsingham et al(Biochim. Biophys. Acta, 276, 250-256)の方法で検出した。
この初期スクリーニングから、３８の単離物がＧＬ−７ＡＣＡに対してアミドヒドロラーゼ活性を有すると同定された。更なる試験を、以下に説明する調製１（ｄ）および１（ｅ）の方法を用いて行い、Ｃｅｐｈ  Ｃに対してアミドヒドロラーゼ活性を同定した。ＧＬ−７ＡＣＡアミドヒドロラーゼ活性を３８の単離物のうち、１種類の菌株のみ（単一の散布から誘導された４種類の娘単離物に存在する。）がＣｅｐｈ  Ｃとのアミドヒドロラーゼ酵素活性を有していた。
（ｂ）菌株Ｂ９６５
Pseudomonas vesicularis株B965の細菌学的特徴は以下の通りである。
１．  形態学
１．１  コロニーの色（栄養寒天またはＴＳＢ寒天で成長されたもの）−卵黄の黄色、半透明
１．２  コロニー形態学−３０℃で３日後、丸く、規則正しく、均質な、凸面状の、平坦な光沢のある０．５ｍｍ直径
１．３  細胞タイプ−桿菌、約１．５μｍ長
１．４  グラム−陰性
１．５  運動性−陽性
１．６  胞子−陰性
１．７  成長温度−最適３０℃、３７℃＋；４１℃−
２．  生化学的特徴
0003889438.tif 000004
（ｃ）培養条件
菌株を、寒天プレート上での単一の単離されたコロニーの二次培養によって維持した。多くの複合寒天培地、特にトリプトン大豆肉汁（ＴＳＢ；オキソイドＣＭ１２９）＋２．０％ｗ／ｖ寒天が良好な成長を持続させた。この培地は、７．３±０．２のｐＨ、および以下の組成を有する。
成    分 ｇ／Ｌ
カゼインの膵臓消化物                  １７．０
大豆ミールのパパイン消化物            ３．０
塩化ナトリウム                        ５．０
二塩基性リン酸カリウム                ２．５
デキストロース                        ２．５
寒天パウダー                          ２０．０
細胞を、寒天プレートの表面でストリークし、２７．５℃で２〜６日インキュベートした。寒天プレートを４℃で保存した場合、コロニーは数週間生存能力を維持した。
長期間の保存のためには、寒天プレートから得た単一コロニーを１０mlの液体培地に接種する。バクテリアの成長のためにデザインされたほとんどの複合培地は安定であり、特にＬ−肉汁を使用することができる。これは以下の組成を有する。
成    分 ｇ／Ｌ
バクトトリプトン（Bacto tryptone）      １０．０
酵母抽出物（oxoid L21）                 ５．０
塩化ナトリウム                          １０．０
接種された肉汁を、２２０rpmで振蘯しながら２７．５℃でインキュベートした。２４時間後、この肉汁を遠心した。細胞ペレットを、１mlの５％グリセロール水溶液に再懸濁し、アリコートとして−２０℃で保存した。
（ｄ）酵素活性試験
基質バッファーは、１３．５mg/mlのクロキサシリンおよびＧＬ−７ＡＣＡ（３mg/ml）またはセファロスポリンＣ（１０mg/ml）を含有する５０mMのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０よりなる。細胞懸濁物または半精製酵素サンプルを基質バッファー中、３７℃で２４時間までインキュベートした。適切なときに、１００μｌのサンプルを採取し、８００μｌの１Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファー（ｐＨ４．２）と混合した。次に、フルラム試薬（fluram reagent）の１００μｌのアリコートを加えて混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートした。フルラム試薬は、フルオレスカミン（fluorescamine）（Sigma Chemical Co）が乾燥アセトン中に１mg/mlで存在するものである。反応混合物中の７ＡＣＡの存在は、遊離の一級アミン基の誘導体化の後、キャリアー流体として１０％アセトン水溶液を用いるフローインジェクションアッセイ系で、３７８nmの波長で励起し、４９５nmの放出光を検出する蛍光スペクトル法を用いて検出される。
加えて、７ＡＣＡの産生もＨＰＬＣシステムで示された。酵素反応混合物を上記のように誘導体化し、２０μｌのサンプルを、ＨＰＬＣグレードの水中に３５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸を含む移動相で、１．５ml/分の流速を用いて３２℃において１５cmのハイパージルＯＤＳ５μカラムにかけた。蛍光スペクトル法による検出は上記の通りである。このシステムでは、基準となる真正の７ＡＣＡは、１０．５分にマイナーな分解物ピークを伴った、６．７分の保持時間を有する。
これらの条件を用いた典型的な実験で、１０μｌの接種用ループを満たすのに十分なＢ９６５細胞が、基質としてＧＬ−７ＡＣＡを用いる１８時間のインキュベートで３２０μｇ／mlの７ＡＣＡを産生した。
（ｅ）酵素の取り出し
Ｂ９６５細胞は、基本的に調製例１（ｂ）の方法によってＴＳＢ寒天プレート上で培養された。該細胞を酵素バッファに採集し、洗浄し、最後に１０mlの冷却した酵素バッファに再懸濁した。酵素バッファーは、１mMのＤＴＴおよび１mMのベンズアミジンを含有する１００mMのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）である。細胞を、６５０Ｗの出力のソニケーター（モデルＷ−３８０、Heat System Ultrasonics Inc, 1938 New Highway, Framingdale, NY 11735, USA）を用い、パワーセッティング２〜３、５０％サイクルで１２分間超音波処理して溶解した。抽出物を１８，０００ｇにおいて、４℃で１５分間遠心して不純物を除去した。上清を取り出し、酵素バッファーで１０ml容積に調節し、次いで固体硫酸アンモニウムを、４℃で穏やかに混合しながら３０％の飽和度までゆっくり加えた。この溶液を上記のように遠心して不純物を除き、上清を上記のように固体の硫酸アンモニウムをゆっくり加えることによって６０％の飽和度に調節した。沈殿した物質を上記のような遠心で採集し、飽和硫酸アンモニウム上に保存した。
アミドヒドロラーゼの更なる精製を、酵素の性質を同定するためのＦＰＬＣシステム（Pharmacia LKB Biotechnology, S-751 82 Uppsala, Sweden）を用いて行った。
３０〜６０％飽和度硫酸アンモニウム沈殿物から取り出された物質をＭＯＰＳバッファ（１０mMＭＯＰＳ  ｐＨ８．０；１mMＤＴＴ；１mMベンズアミジン）に再懸濁した。この溶液を短時間の遠心、ついで０．２ミクロンのフィルターを通す濾過によって不純物を除いた。酵素混合物の５mlのアリコートを、ＭＯＰＳバッファーで予め平衡にされたＨＲ５／５ＭｏｎｏＱカラムにかけた。アミドヒドロラーゼ活性体が、導入の後、２〜４mlの間の溶出物中に取り出された。このフラクションを硫酸アンモニウムの３０％飽和度に調節し、ＨＲ１０／３０フェニルスフェロースカラムに導入した。タンパク質の溶出を、１００mMリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１mMＤＴＴよりなるランニングバッファーを用いて、硫酸アンモニウムの３０％〜０％飽和度で変化する塩勾配を用いて行った。アミドヒドロラーゼ活性体を、これらの条件下で１８．５％〜１５．０％の間の飽和度の硫酸アンモニウムで取り出した。
これらの精製ステップに続いて、以下の典型的な値のアミドヒドロラーゼ活性体を調製例１（ｃ）の方法を用いて得た。
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（ｆ）セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素の特性
物理的特性
１．ゲル濾過による見かけ上の分子量：７００００±４０００
２．ＳＤＳ−Ｐａｇｅによるサブユニット分子量：α３０，０００、β６０，０００
３．見かけ上の化学量論量：α１β１
４．等電点：ｐｌ  １０．５±０．２
５．疎水度：ブチル−、ヘキサニル−、オクチル−またはデシル−誘導体化アガロースに結合せず、６５０〜８００mM硫酸アンモニウムでの溶出でフェニル誘導化アガロースと結合する。
６．１mMＤＴＴの存在下で安定する。
７．５０％若しくはこれ以上の飽和度の硫酸アンモニウム溶液から沈殿する。
動力学
１．最適ｐＨ：８（効果的な範囲７〜９）
２．最適温度：４０℃（４５℃まで安定）
３．Ｋm：１．２〜７．２mMでのＧＬ−７ＡＣＡ基質、Ｋm＝２〜４mM；０．５〜１．５mMでのＣｅｐｈ  Ｃ基質、Ｋm＝０．０１２mM  ３．６mM〜１３２mMでのＣｅｐｈ  Ｃ基質、Ｋm＝６０〜１００mM
４．阻害剤：硫酸アンモニウム＞６％ｗ／ｖ
５．最大特異活性  Ｃｅｐｈ  Ｃ基質を使用した場合、０．１４１μmol  ７ＡＣＡ／分／mg酵素
試験基質
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（ａ）アッセイ応答は、平衡反応条件下で、ＧＬ−７ＡＣＡから産生される７ＡＣＡに対して標準化された生成物収率として与えられる。比較対象に対して、応答がＨＰＬＣの生成物のピーク領域から直接に計算されるように、生成物は７ＡＣＡに等しいモル吸光度係数を有すると仮定した。標準の反応では、１０mg/mlの基質を用い、２７℃、一夜の反応で、調製例２（ｄ）の手順によってＮＭ５２２／ｐＶＳ４４細胞から調製された酵素を１００μｌ使用した。
（ｂ）３mg/mlの基質を用い、２７℃、２時間の反応で、１０μｌの上記酵素抽出物を使用して、アッセイ応答が得られた。
調製例２：アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子のクローニング及び同定
（ａ）P. vesicularisゲノムＤＮＡの単離
微生物を、１００mlのＬ−肉汁中、２８℃で後期対数相（late-log phase）で成長させた。この細胞を遠心（４０００ｇ、１０分）によりペレット化し、５mlのＴＮＥＳバッファー（２００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；２５０mMＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）に再懸濁した。３７℃で１時間後、プロテイナーゼＫを５０μｇ／mlまで加え、３７℃で１時間インキュベートを続けた。ＴＮＥＳバッファで飽和された、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４０：１）を等容量加え、懸濁物を１５秒間ボルテックスした。室温で１０分後、層を遠心（１５，０００ｇ、１０分）で分離した。２容量の無水エタノールをゆっくり上清に加え、高分子量のＤＮＡをガラス棒に巻いた。このＤＮＡをＴＥバッファー（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
（ｂ）P. vesicularis遺伝子ライブラリーの構築
約１５０μｇのP. vesicularisＤＮＡを９００μｌ反応物中で５ユニットのSau3AIで１５分間消化した。このＤＮＡをエタノールを用いて沈殿させ、５００μｌのバッファーに再懸濁し、１ＭＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５mMＥＤＴＡ中で作成された３８mlの１０〜４０％蔗糖グラディエントに導入した。一夜遠心（SW28ローター、Beckman L8-M超遠心機中２６０００rpm、１５℃）した後、５００μｌのフラクションを得、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、アガロースゲル電気泳動で分析した。
約２００ngの脱ホスホリル化されたBamHI消化されたpSU18ベクターを標準的な方法で調製した。プラスミドpSU18をDr F de la Cruz (Departmento de Biologio Molecular, Universidad de Cantabria, 39001 Satander, Spain）から得、pSU2173 (Martinez et al, Gene, 68(1988)p159-162)から誘導した。調製したベクターを、約５００ngサイズの分別されたP. vesicularisＤＮＡと結紮した。結紮を、１４℃で一夜、２０μｌの容積で1U T4 DNAリガーゼを用いて行った。結紮混合物は、広く利用可能なE. coli株NM522に形質転換を起こさせる。形質転換体をＬ寒天プラスクロマムフェニコール（３０μｇ／ml）で選別した。
（ｃ）アミドヒドロラーゼをコードするクローンの同定
単一のコロニーを、３０μｇ／lのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天プレートに散布し、２７．５℃で２〜４日成長させた。培養物のアリコートを１０μｌの接種用ループを用いて取り出し、次いで０．５mlの基質バッファーに再懸濁し、更に調製例１（ｃ）の手順に従って処理した。アミドヒドロラーゼ活性を有する単離物をこれらの方法によって同定した。
（ｄ）クローンのアミドヒドロラーゼ活性
調製例２（ｃ）の方法によって同定されたクローンは組換えプラスミド上に活性なgac遺伝子を有する。更なる誘導体プラスミドは、標準的方法によってpSU18にgac遺伝子を導入するために８．１ｋｂPstIフラグメントをクローニングすることによって構築される。このプラスミドをpVS42と命名した。pVS42のP. vesicularisＤＮＡ部分の制限マップを図１（ａ）に示した。ＧＬ−７ＡＣＡまたはセファロスポリンＣを基質として使用したアミドヒドロラーゼ活性は、E. coli/pVS42と、調製例１（ｃ）の方法によって全細胞を用いた元のP. vesicularis単離物との間でほぼ等しい。
E. Coli B1113を、調製例１（ｂ）の方法に従ってＴＳＢ寒天プレートで成長させた。集塊した細胞成長物を、基本的に調製例１（ｄ）の手順に従ったアミドヒドロラーゼを取り出すために、抽出物が細胞を含まなくなる段階まで加工した。
アミドヒドロラーゼ活性体を、該細胞を含まない抽出物をＤＥ５２セルロースカラム（Whatman Ltd, Maidstone, Kent ME14 2LE）にかけることによって更に精製した。抽出物内の大量のタンパク質はマトリクッスに結合し、アミドヒドロラーゼ活性体は保持されない。
この精製ステップに従って、以下の典型的な値のアミドヒドロラーゼ活性体を調製例１（ｃ）の方法を用いて得た。
0003889438.tif 000007
更に、サブクローンを、pVS42プラスミドＤＮＡを制限酵素KpnIで部分的に消化し、得られた反応生成物の混合物を結紮し、標準的な方法でE. coli株NM522に形質転換を起こさせることによって誘導した。調製例１（ｂ）及び１（ｃ）の手順を用いる、得られた単離物のスクリーニングでセファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ活性の増強された多数のクローンを同定した。このような単離物の１つが、pVS44と命名されたプラスミドを含有することが見出された。
pVS44のP. vesicularisＤＮＡ部分の制限マップを図１（ｂ）に示した。
セファロスポリンＣアミドヒドロラーゼ酵素活性体を、調製例１（ｂ）および１（ｃ）の手順を用い、次いで上述のようなＤＥセルロースのカラムによって、抽出物に細胞が含まれなくなる段階までNM522/pVS44細胞から取り出した。調製例１（ｃ）を用いた典型的なアッセイでは、１０μｌの抽出物は、５０mg/mlのセファロスポリンＣを用いた２７℃、３時間のインキュベートから１２μｇ／mlの７ＡＣＡを産生した。これは、B1113株抽出物を用いて得られる等しい段階の精製でB1113株を用いて得られる活性のレベルを超えて約３０倍改善されることを示している。
（ｅ）アミドヒドロラーゼ活性を改善するための追加のサブクローニング
pVS44の活性なgacをコードするP. vesicularis由来のＤＮＡフラグメントのサイズを、進行性エンドヌクレアーゼIII酵素消化によって小さくした。方法論は、Henikoff ("Methods in Enzymology", 155 (1987) 156-165）によって開示されたとおりである。pVS44のP. vesicularisＤＮＡ部分への一方向性の欠失を、XhoI部位で開始したが、pSU18ＤＮＡ部分は、P. vesicularisとE. coli由来のＤＮＡとの間の境界を形成するPstI部位で切断することによってエキソヌクレアーゼIIIの攻撃から保護した。これらの部位は図１に示されている。酵素処理およびHenikoff（上記引用文献中）の方法を用いた反応生成物の自己結紮に続いて、E. coliの形質転換は異なったサイズの欠失を有する変異プラスミドが導入されたコロニーの集団を産生する。該集団を調製例１（ｃ）の方法によってアミドヒドロラーゼ活性についてスクリーニングした。全細胞アッセイをスクリーニングに使用した。２日間、２７．５℃で成長させた細胞を満たした１０μｌの接種ループを１mlの基質バッファー（１０mg/mlセファロスポリンＣ）に懸濁し、３７℃で一夜インキュベートした。このスクリーニングから取り出されたアミドヒドロラーゼ活性の増強された１つの単離物はプラスミドpVS4461を有していた。pVS4461のP. vesicularis由来の部分は図１（ｃ）に示されている。
pVS4461のP. vesicularis部分は、P. vesicularisＤＮＡが元々挿入されていたpSU18多重クローニング領域から誘導される制限部位を用いてEcoRI-HindIIIフラグメントとして取り出される。このEcoRI-HindIIIフラグメント（約２．８ｋｂのもの）を、商業的に利用可能なファジミドベクターpTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals Inc, Milwaukee, Wisconsin 53202, USA）のEcoRI部位とHindIII部位の間でクローニングし、pTZ1861と命名されたファジミドを得た。pTZ1861のＤＮＡを、β−ラクタマーゼ遺伝子の範囲内の単一のScaI部位で切断した。広く利用可能なベクターpACYC184のプラスミド誘導体を、テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントの起源として使用した。このフラグメントを、鈍端に変換し、単離し、ScaI部位で切断され標準的な方法に従ってホスホリル化されたpTZ1861ＤＮＡに結紮した。形質転換に続いて、テトラサイクリン耐性に基づいて選別された単離物をアミドヒドロラーゼ活性についてスクリーニングした。このような活性のテトラサイクリン耐性単離物が１つ選別され、取り出されたファジミドをpTT1861と命名した。pTT1861のP. vesicularis由来の部分はpVS4461のものと同一であり、図１（ｃ）に示した。
種々のアミドヒドロラーゼプラスミドを有するE. coli株を、５０mg/mlＣｅｐｈ  Ｃを含有する基質バッファーに懸濁された、よく成長させた細胞を満たした１０μｌの接種ループを用いて調製例１（ｃ）の方法によってアミドヒドロラーゼ活性についてスクリーニングした。
Ｃｅｐｈ  Ｃアミドヒドロラーゼ活性は、２７．５℃で３時間インキュベートした後に評価した。比較試験として、開示したプラスミドおよびファジミドを導入した単離物の相対活性は以下の通りである。
0003889438.tif 000008
（ｆ）アミドヒドロラーゼ遺伝子配列
gac遺伝子のＤＮＡ配列を標準のジデオキシヌクレオチド取り込み法によって得た。プラスミドpVS42、pVS44およびこれらのサブクローンのＤＮＡをシーケンシング反応のテンプレートとして使用した。シーケンシングを、プラスミドのlacZ'部分にアニーリングする、商業的に利用可能なオリゴヌクレオチドプライマーから、またはgac遺伝子の範囲内にアニーリングするためにデザインされたオリゴヌクレオチドから開始した。二本鎖ＤＮＡを、製造者の仕様書に従って、S400 Spun Colunmsを用いて精製し、次いでプライマーと混合し、１／５volの１ＮＮａＯＨを用いて３７℃で１０分間処理した。調製物を１ＮＨＣｌで中和し、標準の方法論（Sequenase Version 2.0 Kit; US Biochemical Corp）に従ったシーケンシング反応に使用した。幾つかの高度にＧＣに富んだ領域は、配列圧縮または早期反応停止を介してシーケンシング人工産物を出現させた。これらは、製造者の推奨する手順（US Biochemical Corp）およびFawcettおよびBartlett (Bio Techniques, 9, 46-49 (1990)）の方法に従って、デオキシグアノシン三リン酸の代わりにデオキシイノシン三リン酸を用いること、およびＰＡＧＥによって解析する前に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでシーケンシング産物を更に反応することを組み合わせて解析された。幾つかの配列は、欠失サブクローンから誘導された。欠失を、Hanikoff（上記参照文献中）の方法に従ったエキソヌクレアーゼIII消化を用いて構築した。誘導されたＤＮＡ配列およびこれら由来のアミノ酸配列を配列識別番号に示した。
（ｇ）アミドヒドロラーゼアミノ酸配列
pTT1861プラスミドによってコードされるgac遺伝子により特徴づけられるアミドヒドロラーゼ酵素をアミノ酸配列分析のために同質になるまで精製した。E. coli株NM522/pTT1861を、１０μｇ／mlのテトラサイクリンを補充し、１．５％w/v寒天で固定化したＴＳＢ培地上で成長させた。成長を３７℃で１８時間行った。寒天表面から削り取ることによって取り出した約１ｇの細胞ペーストを洗浄し、４mlの氷冷したリーシスバッファ（１０mMＭＯＰＳ  ｐＨ８．０；１mMＤＴＴ；１mMベンズアミジン）に再懸濁した。細胞を超音波処理（６５０Ｗ出力のソニケーター、パワーセッティング２で２分間のパルスを４回；氷で冷却されたサンプル）して溶解した。溶解物を１５，０００rpmで３０分遠心して不純物を除去した。酵素精製を、Pharmacia FPLCシステムを用いて行った。約１００mgの可溶性タンパク質を含有する不純物の除去された溶解物を、リーシスバッファーで予め平衡にされたＨＲ５／５ＭｏｎｏＱイオン交換カラムにかけた。アミドヒドロラーゼ活性体は、導入後２〜４mlの間の溶出フラクション中に取り出された。この物質を硫酸アンモニウムで３０％飽和度に調節し、ＨＲ１０／３０フェニルスペロース疎水性相互作用カラムにかけた。タンパク質の溶出を、１mMＤＴＴを含有する１０mMリン酸ナトリウムバッファー中、硫酸アンモニウムの３０％から０％まで変化する飽和度の非直線性グラディエントを用いて行った。アミドヒドロラーゼ活性体は、分子量７０，０００±４０００のタンパク質と等価なフラクションに取り出された。この段階で、３種類のタンパク質のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Pharmacia Phastsystem）で存在していた。アミドヒドロラーゼ活性体を含有する溶出フラクションを遠心膜フィルター装置（Centricon 30 Microconcentrator, Amicon Division of W R Grace, Danvers MA 01923, USA）を用いて濃縮した。約３mgのタンパク質をこの手順で取り出した。タンパク質のアリコートを、ＳＤＳおよび２ＭＥで処理し、HamesおよびRickwoodにより"Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach" (IRL Press）に開示された標準的な方法に従って超純度の試薬を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。約３０，０００と６０，０００の分子量の主要なペプチド種を、ＰＶＤＦ膜（P Matsudaira, J Biol Chem., 262, 10035-10038 (1987)）にブロッティングすることによって取り出した。この物質を、アップライドバイオシステムズ４７７Ａタンパク質シーケンサー（Applied Biosystems Inc., FosterCity, CA 94404, USA）中でエドマン分解によって自動アミノ酸分析にかけた。
以下のＮ−末端アミノ酸配列が得られた。
α−ペプチド（３０，０００の分子量）
0003889438.tif 000009
β−ペプチド（６０，０００の分子量）
0003889438.tif 000010
これらの配列が同定され、これらは配列識別番号１内に存在する。アミノ酸シーケンシングによって同定されたα−ペプチド配列は、プラスミドベクターpTT1861から誘導されたlacZα−ペプチドのＮ−末端と、P. vesicularisgac遺伝子から誘導されたα−ペプチドの開始部分との間の融合タンパク質を表す。lacZ-gac融合の正確な結合は、図３に詳述されている。結合は、ＤＮＡ配列のKpnI部位での正確なインフレーム融合として２つのペプチド配列を結びつける。このKpnI部位が配列内のgac遺伝子の境界を形成するので、調製例２（ｄ）および２（ｅ）で概説した構築方法からは、構築物pVS44並びにpV4461およびpTT1861を含めた全ての誘導体が同様なlac Z-gac融合を示しすことになる。このような構築物の全てにおけるアミドヒドロラーゼ活性の発現は天然のP. vesicularisgacプロモーター以外の組換え系に利用できる。
調製例３：アミドヒドロラーゼの固定化
（ａ）アミドヒドロラーゼの精製
E. coli株NM522/pVS44を、１０μｇ／mlのクロマムフェニコールを補充し、１．５％w/v寒天で固定化されたＴＳＢ培地上で成長させた。成長を、２７．５℃で２日間行った。細胞のペーストを、寒天表面を削り取ることによって取り出し、再懸濁し、リーシスバッファー（１０mMＭＯＰＳ  ｐＨ８．０；１mMＤＴＴ；１mMベンズアミジン）で洗浄した。約６５ｇの細胞ペーストを、３５０mlの氷冷したバッファー中で超音波処理（６５０Ｗ出力、パワーセッティング４、３５ml／分で連続的フローヘッドに５回通した；氷で冷却されたサンプル）して溶解した。溶解物を１５，０００rpmで３０分遠心して不純物を除去し、３１２０mgの可溶性タンパク質を得た。この物質を、予め平衡にされたＤＥ５２セルロースの３００mlカラムに通した。導入後１００ml〜５００mlの間に溶出されたフラクションには、全体で３９８mgタンパク質のアミドヒドロラーゼ活性体が含まれていた。このタンパク質を、遠心膜装置（Centriprep 30 concentrator, Amicon）を用いて濃縮した。
（ｂ）酵素固定化
濃縮された抽出物（３００mgタンパク質、１２．５４ml）を、１００mMリン酸バッファーｐＨ８．０：１mMＤＴＴ；１mMベンズアミジンに調節し、３．０ｇ（乾燥重量）のオキシラン結合されたポリアクリルマトリックス（Eupergit C: Rohm Pharma GmbH, D-6100 Darmstadt Germany）と混合した。固定化（これは、液相から除去されるタンパク質によってモニターされる。）は１１６時間で完了した。約１２０mgのタンパク質が基質に原子価結合された。過剰のタンパク質をリン酸バッファーで洗浄することによって除去した。
（ｃ）固定化された酵素の活性
固定化されたアミドヒドロラーゼの活性を、設定点で反応のｐＨを検出し、維持するようにセットされた自動制御システム（ｐＨ安定システム）を用いて酵素触媒反応を起こさせることによってモニターした。ｐＨのモニターは、設定点からのｐＨの低下が蠕動ポンプを起動し、アルカリ滴定剤の投入量の調節が可能となるように設定した。
水中に５０mg/mlの基質（ＧＬ−７ＡＣＡまたはＣｅｐｈ  Ｃ）を含有する５０mlの容量の反応物を２５℃に維持した。反応を開始するために約３ｇの乾燥重量（１２ｇの湿潤重量）の固定化された酵素を加える前に、反応混合物を滴定剤として２ＭＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調節した。この懸濁物をオーバーヘッドパドルタイプの撹拌器を使用して撹拌した。反応の進行を、滴定剤の添加速度およびインターバルのときのサンプリングによってモニターした。サンプルを、調製例１（ａ）と同様のＤＭＡＢ方によって７ＡＣＡについてアッセイした。この方法によって以下の活性を測定した。
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セファロスポリンＣでの最大変換（２２時間）は１．７％であり、基質としてＧＬ−７ＡＣＡでは９．０％の変換が達成された。
配列表
配列識別番号：１
配列のタイプ：対応するペプチドを有する核酸
配列の長さ：２３９１
鎖状：一本鎖
トポロジー：直線
分子タイプ：ゲノムＤＮＡ
微生物の元の起源：Pseudomonas vesicularis B965
実験用起源：E. coli株B1113内のプラスミドpVS42
特性：P. vesicularisセファロスポリンアミドヒドロラーゼ酵素活性体のポリペプチド配列をコードする。
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配列識別番号：２
配列のタイプ：対応するペプチドを有する核酸
配列の長さ：９３
鎖状：一本鎖
トポロジー：直線
分子タイプ：ゲノムＤＮＡ
微生物の元の起源：Pseudomonas vesicularis B965およびE. coli
実験用起源：E. coli株B1113内のプラスミドpVS42
特色：配列は、Ｎ−末端lacZα−ペプチド、合成pUC18多重クローニング部位領域のＴ７ポリメラーゼプロモーター部分およびgac遺伝子配列の一部を特色とする。
特性：セファロスポリンアミドヒドロラーゼ酵素α−ペプチドとlacZα−ペプチドの融合ポリペプチド配列をコードする。
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【図１】
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