(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製原点を支持するプラスミドと、ｔｒｃ  プロモーターと、シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５又はＮｏ．７で表されるＤＮＡと、転写ターミネーターとから構成した大腸菌を用いてアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ（ミラノ）の細胞外製造を付与する発現ベクターで大腸菌菌株を形質転換し、
該発現ベクターを形質転換させた大腸菌菌株を成長媒体中において培養し、
固定相が達成される前に対数成長相中においてアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ蛋白質の発現を誘起し、そして、
成長媒体からその生成物を分離することによりアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍを製造するようにしたことを特徴とするアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍを製造するための発現方式。
【請求項２】
シグナル配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５又はＮｏ．７で表されるＤＮＡがＯｍｐＡシグナル配列の誘導体を含むものであることを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項３】
培養を一定の温度で開始し、そして温度を誘起の前、誘起と同時に又は誘起の後に対数成長相において上昇させることを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項４】
培養を２９から３１℃で、好ましくは約３０℃で開始させ、そして温度を対数成長相において３７℃に上昇させることを特徴とする請求項５に記載の発現方式。
【請求項５】
培養を一定の温度、好ましくは２５から３７℃で行うことを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項６】
成長媒体が少なくとも５０の光学濃度に達したときに誘起を行うことを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項７】
採収を最適細胞培養状態で行うことを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項８】
成長媒体をトリプトンで適切に補充された酵母菌抽出物から構成したことを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【請求項９】
成長媒体には抗生物質がないことを特徴とする請求項１に記載の発現方式。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はアポリポ蛋白質ＡＩミラノ（Ａｐｏ  Ａｉ−Ｍ）を製造するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培地中に高いレベルの目的蛋白質を生じさせる発現方式に関する。その生成物はアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療に使用され得る。
発明の背景
高められたレベルの血清コレステロールと冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）の発生との間に明瞭な相互関係が存在することが疫学的かつ長期的な研究に基づいて繰り返し確認された。しかしながら、血漿中のコレステロール搬送の複雑なメカニズムの定義はＣＨＤの危険を決定する上で循環リポ蛋白質の選択的な機能の承認を与えた。
事実上、４つの主要な循環リポ蛋白質、すなわち、キロミクロン（ＣＭ）、非常に低い密度（ＶＬＤＬ）、低い密度（ＬＤＬ）および高い密度（ＨＤＬ）リポ蛋白質がある。ＣＭは腸脂肪吸収の寿命の短い生成物を構成するが、ＶＬＤＬおよび特にＬＤＬは組織に、組織の間に、そして動脈壁に対してコレステロールを搬送する原因となる。これに反して、ＨＤＬは周辺組織からコレステロールを除去することに直接関連しており、「逆コレステロール搬送」（ＲＣＴ）として知られるメカニズムにより、肝臓または他のリポ蛋白質のいずれかにコレステロールを運び戻す。
ＨＤＬの「保護的」役割は多くの研究において確認された（例えば、ミラー氏等著、（１９７７年）、ランセツト、第９６５頁乃至第９６８頁およびホワイン氏等著、（１９８１年）、アテローム性動脈硬化症、第３９巻第４１１頁乃至第４１９頁「ｅ．ｇ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｌａｎｃｅｔ  ９６５−９６８  ａｎｄ  Ｗｈａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ３６：４１１−４１９」）。これらの研究において、高められたＬＤＬのレベルはＶＬＤＬのものより少なく、心臓血管疾患の非常に高い危険と関連しているが、高いＨＤＬレベルは心臓血管疾患の保護を与えると考えられている。ＨＤＬの保護的役割はさらに、ウサギに対するＨＤＬ注入がコレステロールにより誘発される動脈障害の発生を妨げること（バデイモン氏等著、（１９８９年）、実験研究論文、第６０巻、第４５５頁乃至第４６１頁「Ｂａｄｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６０：４５５−４６１」）および／またはこれらの退化現象を誘起し得ること（バデイモン氏等著（１９９０年）、臨床研究論文、第８５巻、第１２３４頁乃至第１２４１頁「Ｂａｄｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１２３４−１２４１」）を示す生体内研究により強力に支持された。
ＨＤＬの保護メカニズムの研究における最近の関心はアポリポ蛋白質ＡＩ（Ａｐｏ  ＡＩ）、即ちＨＤＬの主要蛋白質成分に焦点が合わせられている。Ａｐｏ  ＡＩの高い血漿レベルは減少されたＣＨＤの危険および冠状動脈障害の存在と関連している（マシジユコ氏等著、（１９８３年）、イギリス国内医療ジャーナル、第３０９巻、第３８５頁乃至第３８９頁、セドリス氏等著、（１９８６年）、サーキュレーション、第７３巻、第９７８頁乃至９８４頁「Ｍａｃｉｅｊｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：３８５−３８９，Ｓｅｄｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｉｒｃｖｌａｔｉｏｎ  ７３：９７８−９８４」）。
ヒトアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍ）はＡｐｏ  ＡＩの天然変異体である（ワイスグレーバー氏等著、（１９８０年）、臨床研究ジャーナル、第６６巻、第９０１頁乃至第９０７頁「Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６６：９０１−９０７」）。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍにおいて、アミノ酸Ａｒｇ１７３はアミノ酸Ｃｙｓ１７３に置き換えられている。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍはポリペプチド鎖ことに１つのＣｙｓ残基を含むので、単量体または二量体の形状で存在する。これら２つの形状は化学的に交換可能であり、そして用語Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍは本明細書中においてこれら２つの形状間を区別しない。ＤＮＡレベルについて突然変異はＣ−＞Ｔ変化のみであり、すなわちコドンＣＧＣがＴＧＣに変化した。しかしながら、このＡｐｏ  ＡＩの変異体は最も関心のある変異体の１つであり、その変異体において、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍ本体はＨＤＬコレステロールレベルのかなりの減少を特徴とし、しかも動脈疾患の危険が明らかに増加することがない特徴を有している（フランセシニ氏等著、（１９８０年）、臨床研究ジャーナル、第６６巻、第８９２頁乃至第９００頁「Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：８９２−９００」）。系統樹の検査により、これらはアテローム性動脈硬化症から「保護」されるものと思われている。ヒト成熟Ａｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩ−Ｍは２４３個のアミノ酸からなっている。それらは先駆体蛋白質、２６７個のアミノ酸からなるプレプロＡｐｏ  ＡＩおよびプレプロＡｐｏ  ＡＩ−Ｍとして合成されている。１８個のアミノ酸プレペプチドは６個のアミノ酸の付加物を有するプロ蛋白質を残して分泌組織で切り裂かれる。プロＡｐｏ  ＡＩおよびプロＡｐｏ  ＡＩ−Ｍは次いで血漿蛋白分解活性により成熟形状に変換される。
組み換えＤＮＡ技術によつてＡｐｏ  ＡＩを製造することが試みられていた。ヨーロツパ特許出願公開第０２６７７０３号公報には、大腸菌からのＡｐｏ  ＡＩの製造が記載されている。その方法はＡｐｏ  ＡＩの１部分がβガラクトシダーゼのＮ−端末アミノ酸残基にまたは蛋白質Ａの１つまたはそれ以上のＩｇＧ−結合領域に、またはヒトＡｐｏ  ＡＩのプロ配列に融合されている空想的なポリペプチドを記載している。酵母菌菌株中のＡｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの発現およびアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療に製造された成分の使用は国際特許出願公開第ＷＯ９０／１２８７９号公報に開示されている。
Ａｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩ−Ｍをコード化する遺伝子は酵母菌を認知し得る分泌（変性されたＭＦアルファ−１リーダー配列を包含する）をコード化しかつ成熟蛋白質用の遺伝子に上流で融合されたシグナルを処理するＤＮＡ配列を備えていた。
Ａｐｏ  ＡＩを製造する大腸菌方式はホツペ氏等著、（１９９１年）、生物化学ジャーナル、第３７２巻、第２２５頁乃至第２３４頁「Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７２：２２５−２３４」に記載されている。この方式に記載された発現レベルは０．３〜４．８ｍｇ／リツトル培地間の範囲にある。その方法は細胞内発現に基礎を置いている。
Ａｐｏ  ＡＩはまた細胞内発現方式においてβ−ガラクトシダーゼに対する融合蛋白質として製造された（ロレンツエツテイ氏等著、（１９８６年）、ＦＥＢＳ通信、第１９４巻、第３４３頁乃至第３４６頁「Ｌｏｒｅｎｇｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  １９４：３４３−３４６」）。生産レベルは約５ｍｇ／ｌバクテリア培養であった。この研究において、大腸菌中の発現の効率における遺伝子の５’端の影響が分析された。ｌａｃＺ遺伝子が大腸菌中のＡｐｏ  ＡＩ発現の分析用マーカーとして使用された。そのｌａｃＺ遺伝子はＡｐｏ  ＡＩ３’端に融合された（イサツチ氏等著、（１９８９年）、遺伝子、第８１巻、第１２９頁乃至１３７頁「Ｉｓａｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８１：１２９−１３７」）。
アポリポ蛋白質Ａ１およびアポリポ蛋白質Ａ１−Ｍに関する約５ｍｇ／リツトル成長媒体の従来技術に開示された生産レベルはそれらが経済的に関心をそそるには余りにも低い。
アポリポ蛋白質Ｅの分泌製造に関する発現方式はヨーロッパ特許第３４５１５５号明細書に記載されている。この方式においてアポリポ蛋白質Ｅが大腸菌中で製造され、その後ペリプラズム中で回収され得る。０．１５〜０．４５ｇ／リツトルまでの収率が予想されるがしかし立証されていない。
発明の概要
本発明の目的は従来技術で得られた収率よりかなり高い収率において、組み換えＤＮＡ技術によるアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ（ミラノ）、以下にＡｐｏ  ＡＩ−Ｍと記載するアポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍを製造する方法を提供することにある。本発明によればＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ／リツトルの約１０００倍までの、すなわち少なくとも４．５ｇ／リツトルまでのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍが大腸菌中に誘起し得る発現方式により得られ、大腸菌中において、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍは従来の生物化学方法により純化され得るバクテリア培地に分泌される。
本発明の特徴はペプチドを成長媒体中に分泌され得るシグナル配列により率いられるＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ用の遺伝子からなる構造遺伝子を調整する誘起可能なプロモーターである。誘起後に該方式は１．５ｇ〜４．５ｇＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ／成長媒体のリツトルの範囲において異常に高い発現レベルを特徴とするものである。最適な生成物の品質を達成するために、しかしながら、採収は最大収率が達成される前に行われ得る。
生物化学分析は製造された蛋白質のＮ−およびＣ−端末アミノ酸配列および合計アミノ酸組成が血漿から分離されたヒトＡｐｏ  ＡＩ−Ｍと同一であることを示した。円形二色性スペクトル分析は組み換えＡｐｏ  ＡＩ−ＭおよびヒトＡｐｏ  ＡＩの同様のシワを示唆する。
従って、本発明の１つの態様は大腸菌を使用するＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの細胞外製造を付与する新規な発現ベクターに関するもので、該ベクターは複製の適切な原点を支持するプラスミドと、誘起可能なプロモーター配列と、シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列と、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍをコード化するＤＮＡ配列と、転写ターミネーターとからなっている。
本発明にしたがって変性される適切な基本プラスミドは従来の技術文献に記載されかつ組み換え方法に使用されている良く知られたプラスミドから選択され得る。
本明細書で使用される用語Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍは広い意味において解釈されるものとしかつまたＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ蛋白質の機能的変異体および断片を含むものを意味する。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍをコード化するＤＮＡ配列はプレプロ蛋白質、プロ蛋白質または好ましくは成熟蛋白質をコード化するｃＮＤＡ配列にすることができる。
強力に誘起することができる大腸菌プロモーターはそれ自体当該技術において良く知られている。例として記載することができるのは、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）により誘起されるｌａｃプロモーター、トリプトフアンにより抑えられかつ３−インドリル酢酸により誘起されるｔｒｐプロモーター、ＩＰＴＧにより誘起され得るｔｒｃまたはｔａｃプロモーター（ｔｒｐとｌａｃとの間の混成物）、および感温ラムダ抑制体ｃＩ８５７と組み合わせて、３０℃以上の温度で誘起され得るラムダ−ＰLまたはラムダＰRプロモーター、ならびにこれらのプロモーターの機能的派生物である。現在好適なプロモーターはｔｒｃプロモーターである。
本発明において使用可能であるシグナルペプチドは当該技術において良く知られかつ本発明がいつたん知らされれば当業者により容易に選択され得る。例としてｏｍｐＡシグナル配列の派生物を記載することができる。
本発明に使用され得るターミネーターは当該技術において良く知られたターミネーターから当業者によつて容易に選択され得る。
本発明の他の態様は発現ベクター、すなわち発現方式により変換される大腸菌宿主微生物に関する。適切な大腸菌菌株は当業者には容易に明らかである。
本発明のさらに他の態様は、
成長媒体中に形質転換された宿主微生物を培養し、
固定相が達成される前に対数成長相中にＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの発現を誘起し、そして
成長媒体から生成物を分離する工程からなる、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍを製造する方法に関する。
誘起に適切な時間、最適温度変化および採収は以下で記載されるように選ばれる。
１実施例において、培養を約２９から約３１℃の低い温度で、好ましくは約３０℃で開始し、そして温度をその場合に固定成長相が達成される前に約３７℃に上昇させる（対数成長相において）。この温度上昇は発現ベクターの誘起に関連して行われ得るが、しかし、誘起前または後に、すなわち誘起前または後約３時間で行うことができる。
好ましくは、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍ生成物の発現を誘起し、そして温度を、少なくとも５０の最適密度（Ｏ．Ｄ）、例えば約５０ないし約１００の範囲の密度が達成されるとき上昇させる。本明細書において、これは誘起および温度上昇が培養の開始から約１５時間ないし２０時間で行われることを通常意味している。
他の実施例において、培養は一定温度において、例えば約２５から約３７℃の範囲において行われる。
採収は好ましくは最適細胞培養状態で行われる。
成長媒体は好ましくはトリプトンにより適切に補充された酵母菌抽出物からなる。最適には、製造媒体は抗生物質がない。
発明を実施するための最良の形態
実施例
ベクターの構造および大腸菌菌株とベクターの形質転換
以下の大腸菌Ｋ１２菌株が使用された。すなわちＨＢ１０１  Ｆ-，ｈｓｄＳ２０（ｒＢ-，ｍＢ-）ｓｕｐＥ４４，ａｒａ１４，ラムダ-，ｑａｌＫ２，ｌａｃＹ１，ｐｒｏＡ２，ｒｓｐＬ２０，ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，ｒｅｃＡ１３，ｍｃｒＡ（＋），ｍｃｒＢ（−），（ボイヤー氏等著、（１９６９年）、微分子生物化学ジャーナル、第４１巻、第４５９頁乃至第４７２頁「Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：４５９−４７２」）；ＤＨ５アルフアＦ-，Ｆ８０ｄｌａｃＺＤＭ１５，Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｑＦ）Ｕ１６９，ｒｅｃＡＩ，ｅｎｄＡＩ，ｇｙｒＡ，ラムダ-，ｔｈｉ−Ｉ，ｈａｄＲ１７，（ｒｋ-，ｍｋ+），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡＩ，（ＢＲＬ  ＵＳＡ）；ＲＶ３０８ＤｌｚｃＸ７４，ｇａｌＯＰ：：ＩＳ２（ｑａｌＯＰ３０８），ｓｔｒＡ，ラムダ-（モーラー氏等著、（１９８０年）、微分子生物化学ジャーナル、第１３９巻、第１４７頁乃至第１６１頁「Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：１４７−１６１」），およびＢＣ５０  ｘｙｌ−７，ａｒａ−１４，Ｔ４−Ｒ，ラムダ-（スウェーデン国所在のカビ・フアーマシア・エービー）である。菌株ＨＢ１０１およびＤＨ５アルフアはＤＮＡ断片のサブクローン化のために使用された。
プラスミドｐＵＣ９（ヴイエイラ氏等著、（１９８２年）、遺伝子、第１９巻、第２５９頁乃至第２６８頁「Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８」）はイタリア国、エー・シドリ所在のミラノ大学から得られかつシヤープ氏等著、核酸研究、（１９８４年）、第１２巻、第３９１７頁乃至３９３２頁に記載されたヒトＡｐｏ  ＡＩのｃＤＮＡ複製の８４７ｂｐ  Ｂａｍ  ＨＩ断片のサブクローン化のために使用された。ヒトＡｐｏ  ＡＩ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は受入れ番号Ｘ０２１６２によりジエンバンクデータベースから得ることができる（ザイハンマー氏等著、（１９８４年）、ＤＮＡ３、第３０９頁乃至第３１７頁「Ｓｅｉｌｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＤＮＡ  ３：３０９−３１７」）。このベクターはｐＫＰ５７５と指定された。また、ヒトＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ  ＤＮＡ（イタリア国、エー・シドリに所在のミラノ大学から得られた、場所指定突然変異生成によりＡｐｏ  ＡＩ−Ｍに変換されたＡｐｏ  ＡＩのｃＤＮＡ複製）の８８２  ｂｐ  Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片はプラスミドｐＵＣ９中にサブクローン化された。この派生物はｐＫＰ５７６と指定された。以下で調製されるようなプラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４はプラスミドｐＴｒｃ９９（アマン氏等著、（１９８８年）、遺伝子、第６９巻、第３０１頁乃至第３１５頁に記載されかつアメリカ合衆国ミルウオーキーに所在のフアーマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ社から取得可能「ｄｅｓｃｒｉｂｄ  ｂｙ  Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５；＆ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｒｍａｄｉａ  Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ」）の派生物およびｐＵＣ４−Ｋ（ヴイエイラ氏等著、（１９８２年）、遺伝子、第１９巻、第２５９頁乃至第２６８頁、およびオカ氏等著、（１９８１年）、微分子生物化学ジャーナル、第１４７頁乃至第２１７頁「Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８  ａｎｄ  Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．ｂｉｏｌ．１４７；２１７」）からのトランスポゾン（Ｔｎ９０３）派生カナマイシン抵抗マーカーおよびｐＵＥＸ２（ブレツサン氏等著、（１９８７年）、核酸研究、第１５巻、第１００５６頁「Ｂｒｅｓｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：１００５６」）からのバクテリオフアージｆｄの転写ターミネーター（Ｔ１Ｔ２）を有するｐＵＣ派生物である。
使用された方法
バクテリア菌株をプラスミドＤＮＡの製造のためにかつ小規模発現分析（サンブルツク氏等著、（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ」）のためにアンピシリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌまたはカナマイシン（Ｋｍ）７０μｇ／ｍｌを有するローリア・ベルタニ媒体（ＬＢ）または酵母菌トリプトン媒体（２ｘｙＹＴ）中で成長させた。Ａｐ５０μｇ／ｍｌまたはＫｍ７０μｇ／ｍｌを補充したトリプトース血液寒天ベース（アメリカ合衆国に所在のデイフコ社）が寒天プレート上で細胞を成長させるために使用された。組み換えＤＮＡ技術がサンブルツク氏等著の（１９８９年）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスにしたがつて実施された。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼはベリンガー・マンハイム（ドイツ国所在）、ニユー・イングランド・バイオラブス（アメリカ合衆国、ビバリー所在）およびフアーマシア・エルケービー・バイオテクノロジー・エービー（スウェーデン国、ウプサラ所在）から得られた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）はシグマ（アメリカ合衆国セントルイス所在）から得られた。低いゲル化および溶融温度アガロース（アメリカ合衆国所在のＦＭＣバイオプロダクツのヌシーブＧＴＧ）がＤＮＡ断片を分離するために使用された。ＰＣＲ増幅はパーキン−エルマー／シータス・インスツルメンツ（アメリカ合衆国、ノーウオーク所在）のＤＮＡ熱サイクラーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われた。オリゴヌクレオチドのリンカーおよびプライマーは固体相において亜リン酸塩トリエステル方法を使用するフアーマシア・エルケービー・バイオテクノロジー・エービー（スウェーデン国、ウプサラ所在）からのフアーマシア・エルケービー遺伝子アッセンブラープラスで合成された。ヌクレオチド配列決定は、アプライド・バイオシステム社（アメリカ合衆国所在）からのＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）ターミネーターサイクル配列キツトを使用して、アプライド・バイオシステムズ３７３Ａ  ＤＮＡ配列器で行われた。
使用されたＤＮＡコンピユータプログラム
マツキントツシユプログラムプラスミドＡＲＴＩＳＴ（バージヨン１．２）（クロンテツク、アメリカ合衆国）がプラスミドマツプを描くために使用されそしてＧＣＧ配列分析ソフトウエアパツケージ（アメリカ合衆国ウイスコンシン州マジ損に所在のジエネテイクス・コンピユータ・グループ社）がデジタルＶＡＸコンピユータでＤＮＡ配列を処理するために使用された。
プラスミドｐＫＰ６８３の構造
２つのオリゴヌクレオチドがバクテリアシグナル配列をコード化するＤＮＡ断片にＡｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ  ｃＤＮＡ複製を融合するために合成された（図１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１。１４  ｂｐ  Ｅｃｏ  ＲＩおよびＮｃｏ  Ｉ断片およびｐＫＰ５７５の４０  ｂｐ  Ｎｃｏ  Ｉが合成３７  ｂｐ  Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｎｃｏ  Ｉ断片ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１（図１）によりｐＫＰ５８０と指定されたプラスミドに置き換えられた。この合成ＤＮＡ断片中のＢｂｓ  Ｉ分裂場所はバクテリアシグナル配列をコード化する種々の断片のクローン化を容易にするＭｌｕ  Ｉと同一の分裂場所を付与する。プラスミドｐＫＰ６３１はｐＫＰ５７５（Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍ）の７０２  ｂｐＮｃｏ  Ｉ−Ｄｒａ  ＩＩＩ断片によりｐＫＰ５７５（Ａｐｏ  ＡＩ）の７０２  ｂｐ  Ｎｃｏ  Ｉ−Ｄｒａ  ＩＩＩ断片を置き換えることにより構成された。プラスミドｐＫＰ６３１から８４６  ｐｂ  Ｂｂｓ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片が分離され、そしてｐＫＰ６８２と指定されたプラスミドベクターのＭｌｕ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ断片に挿入された。このベクターはｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）と、ｏｍｐＡシグナル配列の派生物と、２つの転写ターミネーターと、カナマイシン抵抗マーカーとを含んでいる。１５４１  ｂｐ  Ｎｒｕ  Ｉ−Ｎｒｕ  Ｉ断片がｐＫＰ６８２から分離されそして同様なベクターに挿入されたが、ＰｔａｃはＰｔｒｃプロモーターにより置き換えられた。この発現ベクターはｐＫＰ６８３と指定された（図５）。
プラスミドｐＫＰ７６４の構造
プラスミドｐＫＰ７６４（図６）は１４  ｂｐ合成ＤＮＡ断片ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３（図２）により上記のように製造されたプラスミドｐＫＰ６８３の１１５  ｂｐ  Ｄｒａ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を置き換え、強力な変換ターミネーターＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４を含み、そして３’端（図２にＤｒａ  ＩＩＩＤで示している）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に突出するＤｒａ  ＩＩＩの終わりでのＡの導入によりＤｒａ  ＩＩＩ場所を破壊することにより構成された。
プラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４による大腸菌の形質転換
上記のように製造されたプラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４はサンブルツク氏等著の（１９８９年）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスに記載されたように大腸菌菌株ＲＶ３０８およびＢＣ５０を形質転換するために使用された。バイオ反応器内における成長のために使用される大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３およびＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４は以下のように製造された。細胞を３０℃でシエーカーフラスコ内でＫｍで補充されたＬＢまたは２ｘＹＴ中で１晩成長させた。遠心分離後、その細胞をゲルゲン氏等著、（１９７９年）、核酸研究、第７巻、第２１１５頁にしたがつて１／２容量の強度の凍結貯蔵媒体中に再び懸濁させた。部分標本を１ｍｌクリオガラス瓶に分配させかつ使用されるまで−７５℃で貯蔵された。
プラスミドの分析
発現実験およびＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造に使用するプラスミドの構造を制限酵素マッピングを使用して分析させ、そしてＡｐｏ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５の構造遺伝子をヌクレオチド配列決定により確認した。
Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの小規模製造
Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの小規模発現のために、Ｋｍで補充された２０ｍｌのＬＢまたは２ｘＹＴに２５０ｍｌのシエーカーフラスコ中で大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３またはＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４を植え付けた。細胞を激しい振動により１晩３０℃で成長させた。これらの細胞を新鮮な媒体（２０ｍｌ）で１／１００により希釈させ、そしてＩＰＴＧが０．５または１ｍＭの最終濃度に添加されたとき、約１の６００ｎｍにおける光学濃度に３７℃で成長させた。その細胞を追加の９０分または１晩培養させた。細胞を遠心分離により成長媒体から分離しかつ媒体をＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造のために分析させた。媒体の部分標本をフイルタ装置に通し、ニトロセルロースフイルタを除去してそしてＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの量が反−Ａｐｏ  ＡＩ抗体を使用して決定された。また種々の構造から製造されたＡｐｏ  ＡＩ−Ｍが細胞および媒体全体から得られた蛋白質を使用して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン吸い取り分析により決定された。
実施例２
バイオ反応器中でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造
バイオ反応器中で成長させる細胞用の成長媒体
媒体Ａ：１６ｇ／ｌのトリプトン（アメリカ合衆国のデイフコ）、８ｇ／ｌの酵母菌抽出物（アメリカ合衆国のデイフコ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および０．０５ｇ／ｌのカナマイシン。
媒体Ｂ：２．５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、０．５ｇ／ｌのＮａ3−クエン酸塩、５ｇ／ｌの酵母菌抽出物（アメリカ合衆国のデイフコ）。
殺菌後、媒体には１０ｇ／ｌの初期グルコース、０．０５ｇ／ｌのカナマイシン、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏおよび０．０７ｇ／ｌのチアミン酸塩を補充した。微量元素溶液（１ｍｌ／ｌ）およびビタミン溶液（０．６５ｍｌ／ｌ）が添加された。微量元素は２７ｇ／ｌのＦｅＣＩ3×６Ｈ2Ｏ，４ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ，７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ，７ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ，８ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ，２ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3，５ｇ／ｌのＭｎＳＯ4×４Ｈ2Ｏ，１１ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏおよび５０ｍｌ／ｌのＨＣｌを含有していた。ビタミン溶液は０．５ｇ／ｌのカルシウムパントテン酸塩、０．５ｇ／ｌのコリン塩化物、０．５ｇ／ｌの葉酸、１ｇ／ｌのイノシトール、０．５ｇ／ｌのニコチンアミド、０．５ｇ／ｌのピリドキシン塩酸塩、０．０５ｇ／ｌのリボフラビンおよび０．５ｇ／ｌのチアミン塩酸を含有していた。アデカノール（０．２ｍｌ／ｌ）が消泡剤として使用された。必要ならば、培養中にさらに他の消泡剤の添加を行うことができる。
醗酵媒体中でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの分析
醗酵媒体のサンプルが遠心分離されかつ上清中のＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度が標識免疫定量法（アポリポ蛋白質ＡＩ  ＲＩＡ１００キツト、論文番号１０９１５２、スウェーデン国所在のカビ・フアーマシア社）により測定された。
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３の培養
強力に凍結された貯蔵培養物が５００ｍｌの媒体Ａを植え付けるために使用されかつ８〜１０時間３０℃で２リツトルの調節されたエルレンマイヤーフラスコ中で予備培養された。バイオ反応器の作動容量の１０％に対応する接種物がバイオ反応器に搬送された。
培養を２．５リツトルの作動容量により３．５リツトルのバイオ反応器（スウェーデン国所在のベラーク社）中で行った。温度は誘起前の成長相中３０℃であり、そして次いで３７℃に上昇された。ｐＨは２５％アンモニアの溶液により７．０に維持された。通気率は１ｖｖｍに保持されかつ溶解酸素圧力（Ｄ．Ｏ．Ｔ．）は羽根車速度を調整することにより３０％に保持された。初期グルコースが消費された後、グルコース供給バツチが、グルコースの６０％溶液を供給することによりグルコース制限に装置を保持して、始められた。初期供給量、０．０４ｇ／分が３時間保持され、そして次いで３時間の間に０．４ｇ／分に徐々に増加された。細胞成長は６００ｎｍでの光学濃度に従うことにより監視された。
１６時間の培養後、５８のＯＤにおいて、蛋白質合成が０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより誘起されそして温度は３７℃に増加された。誘起後４時間Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は２．３ｇ／ｌ、そして追加の２時間後、濃度は２．５ｇ／ｌであつた。結果は図７に示されている。
実施例３
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４の培養
媒体および成長条件は実施例２に記載されたものと同一であつた。５８のＯＤにおいて、１５．５時間の培養後、ＩＰＴＧを加えかつ温度を上昇させた。５時間後、上清中のＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は１．６ｇ／ｌであつた。結果は図８に示されている。
実施例４
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ６８３の培養
醗酵は１．０ｍＭ  ＩＰＴＧが誘起のために使用されたことを除いて、実施例２により行われた。１５時間後、７４のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加しかつ温度を上昇させた。誘起後７．５時間、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの上清濃度は２．０ｇ／ｌである。結果は図９に示されている。
実施例５
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養
培養は、カナマイシンがバイオ反応器の媒体に添加されなかったことを除いて、実施例２に記載されたように実施された。１５時間後、６０のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加しそして温度を上昇させた。１０時間後上清中のＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は３．７ｇ／ｌ、そして誘起後２２時間、濃度は４．４ｇ／ｌであった。結果は図１０に示されている。
実施例６
７５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養
培養が３５リツトルの作動容量を有する７５リツトルのバイオ反応器（スイス国所在のケマツプ社）中で行われた。媒体および成長条件は実施例２におけるものと同一であつた。３０％以上のＤ．Ｏ．Ｔ．値を保持するために、空気圧を誘起に続いている２時間１．４バールに上昇させた。ＩＰＴＧを添加しかつ温度を７５のＯＤにおいて１６時間の醗酵後上昇させた。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は誘起の時間後１．９ｇ／ｌであつた。結果は図１１に示されている。
実施例７
３００リツトルのバイオ反応器内でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養
１８０リツトルの作動容量を有する３００リツトルのバイオ反応器（スウェーデン国所在のケモフエルム社）が使用された。接種物はシエーカーフラスコ中の予備培養時間が１４時間であつたことを除いて、実施例２に記載されたごとく調製された。接種物は１８リツトルの作動容量を有する５０リツトルの種子バイオ反応器に移された。シエーカーフラスコ内ならびにバイオ反応器内で使用された媒体は媒体Ａであつた。種子バイオ反応器の媒体は５ｇ／ｌのグルコースで補充されそして温度は３０℃であつた。ｐＨおよび通気は実施例２と同一でありかつＤ．Ｏ．Ｔ．は３０％以下であった。培養物が４のＯＤに達すると、種子バイオ反応器の内容物が３００リツトルのバイオ反応器に移された。このバイオ反応器において媒体の温度、ｐＨおよび通気は実施例２に記載された通りであつた。誘起前にＤ．Ｏ．Ｔ．はその最大にまで羽根車速度を増加しかつその後空気圧を増加することにより３０％にまたはそれ以上に保持された。誘起後空気圧は１５〜２０％のＤ．Ｏ．Ｔ．を結果として生じる２バールに増加された。バイオ反応器中の培養の１６時間後に培養物が５１のＯＤを有したとき、ＩＰＴＧが添加されかつ温度が３７℃に増加された。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は誘起後５時間およびそれに続く時間中１．３ｇ／ｌであり、一方バイオ反応器は冷却され、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの濃度は１．５ｇ／ｌに増加した。結果は図１２に示されている。
実施例８
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＢＣ５０／ｐＫＰ７６４の培養
培養は以下を除いて実施例２に記載されたものと同様に実施された。グルコースの初期量（１５ｇ／ｌ）は１２時間後消費された。その後グルコースの６０％溶液が特定の時間間隔にわたつた直線的に供給量を変化する予めプログラムされた供給特性を使用して加えられた。Ｄ．Ｏ．Ｔ．は３０％で一定に保持され、攪拌機速度により制御された。供給は０．０９ｍｌ／分の流量で開始されかつ４時間中に０．７２ｍｌ／分に増加され、その後４８分一定であつた。その後それは１時間３６分の間に０．５７ｍｌ／１に減少されかつ次いで１時間４８分の間に０．３２ｍｌ／分にかつ次いで５４分の間に０．２２ｍｌ／ｌに減少された。供給は最後に５時間５４分の間に０．１８ｍｌ／１に減少されかつ次いで醗酵の終わりまで４１時間で一定に保持された。１８時間後、６１のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加しかつ温度を上昇させた。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの上清濃度は、誘起後２３時間、１．９ｇ／ｌであつた。結果は図１３に示されている。
実施例９
３．５リツトルのバイオ反応器中でのＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３の培養
培養は醗酵が一定の温度、３０℃で行われた以外は実施例２に記載されたものと同様に実施された。１８時間後、８０のＯＤにおいて、ＩＰＴＧを添加させた。誘起後１７．５時間、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの上清濃度は１．４ｇ／ｌであつた。結果は図１４に示されている。
実施例１０
完全な組み換えＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの特性
Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍを実施例６に記載したように大腸菌により製造しそしてその後標準クロマトグラフ法により純化させた。生成物は図４に示した抽出されたアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に比較された。
Ｎ−端末配列決定
完全な蛋白質のＮ−端末配列をミリゲン・バイオサーチ・プロシーケンサー・タイプ６０００を使用してエドマン減成（２０サイクル）により決定した。見出された配列はＡｐｏ  ＡＩ−ＭのＮ−端末と同一であつた。
Ｃ−端末残基決定
組み換えＡｐｏ  ＡＩ−ＭがカルボキシルペプチダーゼＰ（べーリンガー・マンハイム）で消化され、その後離脱させたアミノ酸がピコタグ（商標）法（ウオーターズ）を使用して分析された。Ｃ−端末残基がグルタミンとして明確に同定された。
アミノ酸組成
完全な蛋白質のアミノ酸組成は酸加水分解後にベツクマン６３００アミノ酸分析機を使用して決定された。その結果は以下の表１に示されている。見出された組成はＡｐｏ  Ａ−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６の組成と矛盾がなかつた。
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円形２色性（ＣＤ）スペクトル
完全な組み換え蛋白質のＣＤスペクトルおよびヒトＡｐｏ−Ａ１標準（シグマ）のＣＤスペクトルが２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．５中で記録された。観察された差異は実験誤差内にあつた（図１５）。
実施例１１
Ｃ−端末断片の特性
５９−残基Ｃ端末断片（残基１８５〜２４３）がヒドロキシルアミンによる分裂により製造された。組み換えＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ（４８０μｇ）を、２Ｍヒドロキシアミン、３Ｍ塩化グアジニウム、０．２Ｍ  ＮａＯＨおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．５ｍｌ分裂溶液中で分解させた。分裂溶液の初期ｐＨは９．４であつた。反応混合物は４０℃で５時間培養された。Ｃ−端末断片はＹＭＣ−パツク蛋白質ＲＰコラム（日本に所在のＹＭＣ社）を使用して、逆相ＨＰＬＣにより純化され、０．２５％ペンタフルオロプロピオン酸を含有する水中で１０〜６０％アセトニトリルの勾配で抽出された。Ｃ−端末断片が３６〜３８％アセトニトリルで単一、非蛍光、鋭いピークとして抽出された。
Ｎ−端末配列
Ｃ−端末断片全体の配列が実施例８に記載されたようなエドマン減成により決定された。見出された配列はＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ、残基１８５〜２４３と同一であつた。
Ｃ−端末残基
Ｃ−端末断片のＣ−端末残基は実施例１０に記載されたと同様なグルタミンとして明確に同定された。
アミノ酸組成
Ｃ−端末断片のアミノ酸組成は実施例１０に記載されたごとく決定され、そして結果は表２において以下に示されている。見出された組成はＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ、残基１８５〜２４３の組成と矛盾がなかつた。
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【図面の簡単な説明】
図１はＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ遺伝子のｃＤＮＡ複写をバクテリアシグナル配列をコード化するＤＮＡ断片に溶解するために使用される２つのオリゴヌクレオチドを示す図である。オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のヌクレオチド配列、独特な制限酵素分裂場所Ｅｃｏ  ＲＩ，Ｂｂｃ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉおよび仮定された大腸菌シグナルペプチド分裂場所（−１＋１）のまわりの導出されたアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２をも示している。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍのアミノ酸端末は＋１により示されている。
図２はプラスミドｐＫＰ７６４用の新規な停止コドンの構成に使用される２つのオリゴヌクレオチドを示す図である。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの導出されたカルボキシル端末アミノ酸を有するヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３および２つの新規な停止コドンＴＡＡ，ＴＡＡが示されている（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
図３は転換された蛋白質Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの導出されたアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６および分子量を有するプラスミドｐＫＰ６８３の９５７ｂｐＤＮＡ断片ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５（Ｎｏｔ−１−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を示す図である。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍのアミノ端末アミノ酸は＋１で示されている。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの二量体化に必須である独特なシステイン（Ｃｙｓ１７３）に下線を施してある。
図４は転換された蛋白質Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの導出されたアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６および分子量を有するプラスミドｐＫ７６４の８５６ｂｐＤＮＡ断片ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７（Ｎｏｔ−１−ＨｉｎｄＩＩＩ）を示す図である。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍのアミノ端末アミノ酸は＋１で示されている。Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍの二量体化に必須である独特なシステイン（Ｃｙｓ１７３）には下線を施してある。
図５は発現ベクターｐＫＰ６８３を示す図である。重要な構造および調整素子はボツクスとして輪郭を付け、矢印はそれぞれ転換および複製の方向を示す。独特な制限酵素場所の幾つかがプラスミド円の外部に示されている。またＮｒｕ  Ｉの２つの場所をも示している。ボツクス内部の付号はＳがシグナル配列、Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍがアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ；、Ｔ１およびＴ２がバクテリオフアージｆｄからのＲｈｏ独立ターミネーターの直列複製、ＫｍがトランスポゾンＴｎ９０３から生じるカナマイシン抵抗マーカー、Ｏｒｉが複製の原点、ｌａｃＩＱが構造的に製造されたｌａｃ−抑制体用の遺伝子（ｌａｃＩq）、Ｐｔｒｃがハイブリツドｔｒｐ／ｌａｃプロモーターｔｒｃである。
図６は発現ベクターｐＫＰ７６４を示す図である。重要な構造および調整素子はボツクスとして輪郭を付け、矢印はそれぞれ転換および複製の方向を示す。独特な制限酵素場所の幾つかがプラスミド円の外部に示されている。図６に使用された付号は図５に使用されたものと同一である。
図７は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号円（○）は６００ｎｍでの光学濃度、ボツクス（ロ）はＡｐｏ  ＡＩ−Ｍ濃度（ｇ／ｌ成長媒体）、矢印（→）は誘起時間（ＩＰＴＧの補充による）である。
図８は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。記号は図７に使用されたものと同一である。
図９は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１０は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１１は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する７５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１２は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３００リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１３は大腸菌菌株ＢＣ５０／ｐＫＰ７６４を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１４は大腸菌菌株ＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３を使用する３．５リツトルのバイオ反応器内でのＡｐｏ  ＡＩ−Ｍの製造を示す図である。付号は図７に使用されたものと同一である。
図１５は組み換え型Ａｐｏ  ＡＩ−Ｍ（太い線）およびヒトＡｐｏ  ＡＩ（細い線）の円形２色性スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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