(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液または血漿中のフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度を減少させるための吸着剤の使用であって、前記吸着剤がキャリア物質であり、そのキャリア物質がそれに共有結合したアルカリ性基によって活性化され、かつ１００℃より高い温度で熱処理されたものであり、前記アルカリ性基がアミンおよび／またはアミド基である、吸着剤の使用。
【請求項２】
キャリアー物質が（メタ）アクリレートおよび／または（メタ）アクリル酸アミド由来のコポリマーである、請求項１に記載の吸着剤の使用。
【請求項３】
（メタ）アクリレートおよび／または（メタ）アクリル酸アミド由来のコポリマーがエポキシド基を有する、請求項２に吸着剤の使用。
【請求項４】
コポリマーが懸濁重合によって製造されたものである、請求項２または３に記載の吸着剤の使用。
【請求項５】
コポリマーが、エチレングリコールジメタクリレートおよびグリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテルからの懸濁重合によって製造されるランダムコポリマーである、請求項４に記載の吸着剤の使用。
【請求項６】
コポリマーが、モノマー単位の総重量に対してそれぞれの場合にモノマー単位
（Ａ）１０〜３０重量％の量の（メタ）アクリル酸アミド、
（Ｂ）３０〜８０重量％の量のＮ，Ｎ′−メチレン−ビス（メタ）アクリル酸アミド、および
（Ｃ）１０〜２０重量％の量のアリルグリシジルエーテルおよび／またはグリシジル−（メタ）アクリレート
の懸濁重合によって生成したランダムコポリマーである、請求項４に記載の吸着剤の使用。
【請求項７】
共有結合したアルカリ性基がアミノ化によって導入され、キャリア物質を活性化する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の吸着剤の使用。
【請求項８】
活性化したキャリアー物質の熱処理が１２１℃での殺菌処理である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の吸着剤の使用。
【請求項９】
吸着剤がハウジング中に存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の吸着剤の使用。
【請求項１０】
吸着剤を供うハウジングの容積が２５０〜１２５０mlである、請求項９に記載の吸着剤の使用。
【請求項１１】
ハウジングが、頭部と同じ側に入口ゾーンを有し、ハウジングの底部に出口ゾーンを有する、請求項９または１０に記載の吸着剤の使用。
【請求項１２】
ハウジングがその出口ゾーンにフィルターを有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の吸着剤の使用。
【請求項１３】
フィルターが粒子フィルターである、請求項１２に記載の吸着剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液または血漿中のフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度を減少させるための吸着剤の製造法であって、共有結合したアルカリ性基を導入することによってキャリアー物質を活性化し、次に活性化したキャリアー物質が１００℃より高い温度で熱処理を行うことを特徴とする、方法に関するものである。更に、本発明は、この方法で製造した吸着剤、および血液または血漿中のフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度減少を目的とする吸着装置の製造のための吸着剤の使用に関するものである。
【０００２】
吸着剤は、医学技術に広く行き渡っている。ドイツ国特許ＤＥ３９３２９７１号明細書から知られているような、血液から低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を除去するまたはその濃度を減少させる吸着剤を有する吸着装置は、しばしば報告されている。この報告には、一定の粒度および排除限界を有する有機キャリアーとしての吸着装置材料であって、その表面にＬＤＬ分子が結合しているリガンドを有するものが記載されている。
【０００３】
ＤＥ１９７２９５９１号明細書には、血液中のフィブリノーゲンの割合が高すぎることによって引起される疾患を治療しまたは少なくともそれらを予防するためのフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンのリガンドの使用が記載されている。ＤＥ１９７２９５９１号明細書の方法では、リガンドはフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンに特異的に結合し、好ましくは３〜１０個のアミノ酸を有するペプチドである物質として定義される。
【０００４】
トリプトファンまたはフェニルアラニン吸着剤を用いる免疫吸着療法による血漿フィブリノーゲン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の濃度の減少は、Artificial Organs, volume 20, No. 9 (1996), pp. 986-990から知られている。免疫吸着療法では、キャリアーとして休憩のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ゲル粒子を有する吸着カラムが用いられる。それらの表面には、ＰＶＡゲル粒子がトリプトファンまたはフェニルアラニンをアミノ酸リガンドとして有しており、これはスペーサーを介してＰＶＡに共有結合している。血球から分離される血漿は、吸着カラムによって運ばれた後、患者に戻される前に再度血球と再統合される。この免疫吸着療法を用いて、フィブリノーゲン、ＩｇＧおよびＩｇＭが同時に有意に減少する。
【０００５】
一方、吸着は疾患を改善する手段として臨床的に用いられてきてはいるが、吸着の選択性の要求は増してきている。これは、第一に、吸着装置はヒトにとって必要なあらゆるタンパク質あるいはそれらのできるだけ少数を吸着することを許容されないが、他方では、有害なタンパク質の濃度の減少が、患者にとって負担となる体外治療ができるだけ有効となるほど大きいことを意味する。
【０００６】
疾患の多くは、血液の微小循環の欠乏によることが以前より知られている。例えば、下記の表１に示す疾患が挙げられる。
【０００７】
表１：
ＣＮＳ：
発作
ＴＩＡ（一過性脳虚血発作）
ＰＲＩＮＤ（持続性可逆虚血性神経学的欠損）
ＣＮＳの慢性血管疾患
慢性頭蓋内灌流障害
慢性頭蓋外灌流障害
大脳血管灌流障害
痴呆
アルツハイマー病
重症中心眩暈(severe central vertigo)
目：
慢性灌流障害
急性血管閉塞
耳：
突然難聴
内耳性眩暈
メニエール病
肺：
原発性肺高血圧
血栓性の原発性肺高血圧
主要血管の血栓塞栓性疾患
心臓：
移植血管症(transplant vasculopathies)
急性心筋梗塞
不安定狭心症
心臓の小血管疾患
手術不能な重症冠状心疾患
心筋症
腹：
腹部狭心症
腎臓：
腎臓血管症
糸球体腎炎
慢性腎不全
末梢動脈閉塞疾患
急性血管閉塞
血管炎
敗血症性ショック
様々な起源、例えば、腫瘍の散剤性血管内凝固（ＤＩＣ）
Ｉ＋II型糖尿病
糖尿病性網膜症
糖尿病性神経障害
糖尿病性ネフロバシー
【０００８】
これまでは、これらの疾患はほとんどが薬剤で治療されてきており、この方法では、僅かに症状が見られなくなるに過ぎなかった。血液の微小循環およびレオロジーを処理し、影響を与えるのにこれまで知られていた方法は、血漿交換、ヘパリン誘導体外ＬＤＬコレステロール沈澱（ＨＥＬＰ）、およびフィブリンおよび／またはフィブリノーゲンが特異的に結合するリガンドによるフィブリノーゲンの吸着からなっている。この種のリガンドの使用は、ＤＥ１９７２９５９１号明細書に記載されている。好ましくは３〜１０個のアミノ酸を有し、特に好ましい配列がグリシン−プロリン−アルギニン−プロリン−Ｘであるといわれているペプチドが、リガンドとして引用される。
【０００９】
しかしながら、ペプチドの合成的製造は複雑で費用のかかる工程であり、リガンドとしての特異的吸着装置の使用は非常に高価となる。
【００１０】
更に、一定の長さより長いペプチドは抗体反応を誘発して、反復使用の後に、顕著な免疫反応を長期間生じることができる。実際に、免疫防御を減少させるには、できるだけ短いペプチドオリゴマーが用いられるが、免疫原性は完全に除外することはできない。更に、ペプチドの断片の人目に付かない放出である漏洩は特に危険であり、身体の固有構造の成分としてペプチドは生物活性分子であるからである。
【００１１】
Artificial Organs, volume 20, No. 9 (1996), pp. 986-990に記載されているように、免疫吸着療法は、ＰＶＡゲル粒子への結合にアミノ酸トリプトファンまたはフェニルアラニンを用いているので、これもまた複雑で費用がかかる。更に、この療法では、血漿から除くべきではないＩｇＧおよびＩｇＭのような物質が、フィブリノーゲンに匹敵する量で血漿から除かれる。
【００１２】
本発明の目的は、血液または血漿中のフィブリノーゲンおよび／またはフィブリン濃度を一層良好な除去比で減少させることを目的とする吸着剤の製造法を作成することによって、当該技術分野で知られている吸着剤より価格的に有効に製造することができるようにすることである。この方法では、吸着剤は生物分解性であり、免疫防御を引起さないものであるべきである。この目的は、請求項１に記載の方法によって達成される。この方法の好ましい形態の態様、並びに血液または血漿中のフィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度減少を目的とする吸着装置の製造ための吸着剤の使用は、他の請求項に記載されている。
【００１３】
意外なことには、アルカリ性表面を有するキャリアー物質を有する吸着剤を次に１００℃より高い温度で熱処理を施すと、これまで知られている総ての吸着剤よりも明らかに良好なフィブリノーゲン濃度の減少を引起し、処理の後には微小循環が改良されることを見出した。この有効性は、特に熱処理後のキャリアー物質の外部表面上のアミンおよび／またはアミド基によって増加する。これに関して、キャリアー物質が例えばアンモニアによる処理によって単にアミノ化されたか、またはアミンまたはアミド基を有しかつ１００℃より高い温度、特に１２１℃で安定な共有結合した合成側鎖をキャリアー物質に導入したかによっては、差はない。１００℃より高温での熱処理によって、末端位置または１００℃より高い温度、特に１２１℃で安定な側鎖に配置されたアミンまたはアミド基を有する総ての既知吸着装置材料によって示されるフィブリノーゲン濃度の減少を増加させることができる。意外なことには、例えばアンモニアを用いて容易に行われる表面を単にアミノ化し、好ましくは次に熱活性化を行うことにより、優れたフィブリノーゲン結合能が得られる。従って、フィブリノーゲンに特異的に結合するリガンドや合成側鎖を導入する必要はない。
【００１４】
この方法を用いることによって、複雑で費用がかかる吸着剤を製造する必要がなくなる。
【００１５】
処理した血液は患者に戻さなければならずかつ敗血症や炎症を引き起こしてはならないため、殺菌することができること、特に熱によって、例えば１２１℃で殺菌することができることがこのような吸着剤の使用にとって重要である。この本発明の方法では、熱処理および殺菌を単一処理段階だけで同時に行うことができることが特に有利である。更に、本発明によって製造される吸着剤は、生体適合性である。
【００１６】
原則的には、ガラス、炭水化物、セファロース、シリカ、またはアクリレートとメタクリレートとのコポリマー並びにポリアミドのような有機マトリックスなど数種類のキャリアー物質が、本発明による方法での使用に適している。好ましくは、キャリアー物質は有機マトリックスからなり、（メタ）アクリレートおよび／または（メタ）アクリル酸アミドから誘導されるコポリマーが特に好ましい。これらはエポキシド基を有するのが好ましい。「（メタ）アクリル」という用語は、相当するアクリル酸並びにメタクリル酸化合物の両方を意味するものと考えられる。
【００１７】
本発明による吸着剤用のキャリアー物質として最も好ましいものは、モノマー単位の総重量に対してそれぞれの場合にモノマー単位
（Ａ）１０〜３０重量％の量の（メタ）アクリル酸アミド、
（Ｂ）３０〜８０重量％の量のＮ，Ｎ′−メチレン−ビス（メタ）アクリル酸アミド、および
（Ｃ）１０〜２０重量％の量のアリルグリシジルエーテルおよび／またはグリシジル−（メタ）アクリレート
の重合によって生成したランダムコポリマーである。
【００１８】
コポリマーは、好ましくは懸濁重合によって製造される。
【００１９】
このようなコポリマーは、Roehm GmbH [Ltd.]からEupergit C250LまたはEupergit FE162の名称で市販されている。
【００２０】
上記のコポリマー、またはオキシラン基（エポキシド基）を有する別の有機キャリアー物質、例えば、本発明の範囲内でも好ましく用いられ、エチレングリコールジメタクリレートおよびグリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテルの懸濁重合によって得たコポリマーを、キャリアー物質に共有結合したアルカリ性基、好ましくは窒素を含む基、最も好ましくはアミン基を導入することによって活性化する。活性化は、好ましくはアンモニアまたは第一アミンで行い、工程工学および費用節約を行わなければならない理由から、最も好ましいものは、アンモニア水溶液の利用である。
【００２１】
キャリアー物質は、球状の未凝集粒子、いわゆるビーズ、繊維または膜の形態で存在し、キャリアー物質の多孔性が表面積を増加させるようにすることができる。多孔性は、例えば、シクロヘキサノールまたは１−ドデカノールのような細孔形成物質を懸濁重合の反応混合物に添加することによって増強することができる。更に、多孔性キャリアー物質の排除限界が少なくとも１０７ダルトンであるときには、フィブリノーゲンが血漿と共に細孔を透過して、アルカリ性基へ通じるようにすることができるのが有利である。
【００２２】
本発明のもう一つの有利な態様は、全血での本発明によって製造した吸着剤を用いることにある。この目的のため、キャリアー物質は、粒度範囲が５０〜２５０imの未凝集球状粒子からなり、排除限界が少なくとも１０７ダルトンである。結果として、血球は、吸着剤を含むカラムを詰まらせたりまたは不合理な数の細胞を保持または凝集することなく、吸着装置と接触することができる。これは、細胞がビーズの滑らかな外部表面に沿って滑り、その結果血小板接着はごく僅かしか起こらず、フィブリノーゲンを含む血漿は細孔中に浸透する機会を有するため、本発明によって製造した吸着剤の場合には排除限界と共にビーズの粒度および球形によって行うことができる。
【００２３】
結果として、血球の除去、単離血漿の処理、および血液成分の再統合のような体外段階は除かれ、その結果、工程の生体適合性が増強し、例えば、相補的活性化(complementary activation)の危険性はかなり減少する。体外段階を除くことにより、処理時間が短縮され、工程が簡略化される結果、患者の安全性および満足のいく状態が達成される。
【００２４】
本発明によって製造した吸着剤を備えた吸着装置は、ハウジングであって、チューブまたはカラム状に組み入れられ、吸着剤を充填剤材料として含むものを有する。通過させる血液または血漿の通常量および本発明による吸着装置の効率に関して、この吸着装置は、好ましく５０〜１２５０mlの容積を有する。吸着装置は、個別的、二重または多重作業で用いることができる。２個以上の吸着装置の場合には、交互に一方の吸着装置に血液または血漿を供給し、他方の吸着装置を再生することができる。これにより、本発明によって製造した吸着剤を用いるときにはより高い効率が得られる。吸着剤を含む吸着装置は、好ましくは、頭部と同じ側に入口ゾーンであって、これを介して血液または血漿が吸着装置に送られる入口ゾーンを有し、この場合に、出口が吸着装置のハウジングの底部に見られるようになるハウジングを有するようなやり方で組込まれている。
【００２５】
例えば、処理した血液または血漿と共に患者の循環系に戻される吸着剤材料から生じる物質のような望ましくない物質を防止するため、フィルターが好ましくは吸着装置の出口に設置される。このフィルターは、好ましくは粒子フィルターである。
【００２６】
例えば、本発明による方法の２つの形態の態様を、以下に示す。
【００２７】
例１：
１２．５％アンモニア水溶液１００mlをRoehm GmbH社製のEupergit C250L(Lot No. 1690419573)１０ｇ乾燥重量に加え、タンブラー上で室温にて４時間インキュベーションした。次に、アミノ化キャリアー物質を蒸留水２００mlずつを用いて１０回洗浄する。メタクリル酸アミド、アリルグリシジルエーテル、グリシジルメタクリレート、およびＮ，Ｎ′−メチレン−ビス（メタクリル酸アミド）からのコポリマーであるEupergitのアミノ化を下式におけるように図解的に示すことができる。
【化１】
0003926573.tif 000002
【００２８】
洗浄して乾燥したアミノ化（すなわち、活性化）したキャリアー物質を、１２１℃で熱殺菌する。
【００２９】
バッチ法を用いて、この方法で得た吸着剤、すなわちそれぞれ１２１℃の熱処理を行ったまたは行っていない活性化したEupergitコポリマーを、それらのフィブリノーゲン結合特性について試験した。このため、クエン酸塩を２０：１の比で加えて凝固防止を行ったそれぞれの試験についてのヒト血漿５mlを、吸着剤１ｇ（乾燥重量）と共にローラーミキサー上で室温にて１時間インキュベーションした。インキュベーション前およびインキュベーション後に、上清中のフィブリノーゲン含量を凝固計（ＢＣＳ，Behring社製）上でCLAUSS法（Clauss, A., フィブリノーゲン測定のための迅速凝固生理学の方法(Quick clotting physiology method for determining fibrinogen: Acta Haematologica (1957) 17, 237-246)を用いて上清を濁度測定法によって測定した。結合能は、インキュベーション前の値および後の値の差から誘導する。例１において、初期フィブリノーゲン濃度は３．３３mg/ml血漿であった。
【００３０】
フィブリノーゲンの減少、すなわちmg/mlゲル（キャリアー物質）でのフィブリノーゲン結合を、それぞれ熱処理したまたはしていない非活性化および活性化吸着剤と比較して示すと図１に示すとおりである。
【００３１】
図１において、
１は、Eupergit（アミノ化）4.79mg/mlのゲルに対応し、
２は、Eupergit（アミノ化、熱活性化）11.13mg/mlのゲルに対応し、
３は、Eupergit（活性基なし）1.8mg/mlのゲルに対応し、
４は、Eupergit（活性基なし、熱活性化）1.7mg/mlのゲルに対応する。
【００３２】
このグラフは、アミノ化されていないキャリアー物質とは対照的に、アミノ基を有するキャリアー物質のフィブリノーゲン結合が有意に大きいことを示している。これは更に、活性化（アミノ化）したキャリアー物質の熱処理によりフィブリノーゲン結合能は著しく増加するが、活性化されていないキャリアー物質の熱処理では追加の結合能は得られないことも示している。
【００３３】
例１を反復して行った結果は図２に示すとおりである。ここでは、初期フィブリノーゲン濃度は２．６mg/ml血漿である。上記の知見を確認した。
【００３４】
図２において、
１は、Eupergit（アミノ化）4.79mg/mlのゲルに対応し、
２は、Eupergit（アミノ化、熱活性化）11.13mg/mlのゲルに対応し、
３は、Eupergit（活性基なし）1.8mg/mlのゲルに対応し、
４は、Eupergit（活性基なし、熱活性化）1.7mg/mlのゲルに対応する。
【００３５】
例２
エチレングリコールジメタクリレートをグリシジルメタクリレートと反応させることによるキャリアー物質の製造
【００３６】
ＷＯ９５／２６９８８号明細書の例１１に記載の方法を用いて、キャリアー物質を製造した。
【００３７】
このようにして得られたキャリアー物質を、上記例１に記載の方法でアンモニア水溶液を用いて活性化した。アミノ化（活性化）したキャリアー物質を、下記の図解表現で示される。
【００３８】
【化２】
0003926573.tif 000003
【００３９】
活性化（アミノ化）したコポリマーの一部を、１２１℃で加熱殺菌した、すなわち熱活性化した。
【００４０】
例１に記載したのと同じ方法を用いて、このようにして得られた吸着剤、すなわちアミノ化しているが熱活性化していないコポリマー、およびアミノ化し熱活性化したコポリマーのフィブリノーゲン結合特性を試験した。初期フィブリノーゲン濃度は、例２では２．８mg/ml血漿であった。
【００４１】
フィブリノーゲンの減少、すなわちフィブリノーゲン結合を、mg/mlキャリアー物質で示すと図３に示すとおりである。
【００４２】
図３において、
１は、吸着剤（アミノ化）7.48mg/mlに対応し、
２は、吸着剤（アミノ化、熱活性化）15.08mg/mlに対応する。
【００４３】
このグラフは、エチレングリコールジメタクリレートとグリシジルメタクリレートからのアミノ化したコポリマーを熱活性化すると、フィブリノーゲン結合能が有意に大きくなることを示している。例２を反復した結果は図４に示すとおりである。ここでは、初期フィブリノーゲン濃度は、３．５mg/ml血漿であった。例２からの上記の知見は、完全に確かめられた。
【００４４】
図３において、
１は、吸着剤（アミノ化）7.48mg/mlに対応し、
２は、吸着剤（アミノ化、熱活性化）15.08mg/mlに対応する。
【図面の簡単な説明】
【図１】吸着剤のフィブリノーゲン結合能を示す図。
【図２】吸着剤のフィブリノーゲン結合能を示す図。
【図３】吸着剤のフィブリノーゲン結合能を示す図。
【図４】吸着剤のフィブリノーゲン結合能を示す図。
【図１】
0003926573.tif 000004
【図２】
0003926573.tif 000005
【図３】
0003926573.tif 000006
【図４】
0003926573.tif 000007