(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（図５Ａ〜Ｄ）で表されるポリヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項２】
配列番号１（図５Ａ〜Ｄ）の７９〜８１番目に位置する開始コドンａｔｇから５７１〜５７３番目に位置する終止コドンｔａａに至る４９５ｂｐのポリヌクレオチド配列の読み枠（open reading frame）からなる請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１（図５Ａ〜Ｄ）で表されるポリヌクレオチド配列、または、配列番号１（図５Ａ〜Ｄ）の７９〜８１番目に位置する開始コドンａｔｇから５７１〜５７３番目に位置する終止コドンｔａａに至る４９５ｂｐのポリヌクレオチド配列の読み枠（open reading frame）、に対応するＲＮＡ核酸分子。
【請求項４】
ＤＮＡである請求項１または２の核酸分子。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列で表される組換えタンパク質であって、下記の特性を有する：
（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で見かけの分子量が２１，０００ダルトンである；
（ｂ）正常二倍体の若いサイクリン細胞に比較して相対的に正常二倍体老化細胞で強く発現する；そして、
（ｃ）該タンパク質を分裂している若いサイクリン細胞で発現させると該サイクリン細胞のＤＮＡ合成を阻害する。
【請求項６】
請求項５記載の組換えタンパク質を哺乳動物に免疫して得られる、該タンパク質に特異的な抗体。
【請求項７】
ポリクローナル抗体である請求項６の抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、組換ＤＮＡ技術の分野のものである。本発明は、細胞の能力を老化させる遺伝子配列およびタンパク質に関する。本発明は、政府基金により援助されたものである。該政府は本発明について一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書に引用して組み込まれた米国特許出願07／808,523号（１９９１年１２月１６日に出願）の一部を継続するものである。
発明の背景
正常なヒト二倍体細胞は、有限の増殖成長能力を有している（ヘイフリック，Ｌ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９６１年）；ヘイフリック，Ｌ．、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１４頁（１９６５年））。実際に、イン・ビトロでの制御条件下では、培養ヒト細胞は最大限に増殖しても約８０累積集団倍加（cumulative population doublings）までである。そのような細胞の増殖能力は、細胞が経験する累積集団倍加数の関数であることが見い出された（ヘイフリック，Ｌ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９６１年）；ヘイフリック，Ｌ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１４頁（１９８５年））。この能力は、また細胞提供者のイン・ビボ年齢に反比例している（マーチン，Ｇ．Ｍ．等、ラボラトリー・インベスティゲーション、２３巻、８６頁（１９７９年）；ゴールドシュタイン、Ｓ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、６４巻、１５５頁（１９６９年）；シュナイダー，Ｅ．Ｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７３巻、３５８４頁（１９７６年）；レギルティ，Ｙ．等、ゲレオントロジア、１９巻、３０３頁（１９７３年））。
増殖成長に対するその能力を消盡した細胞は、“老化”してしまったと言われる。イン・ビトロでの細胞老化は、形態学的変化により示され、かつ外来成長因子に対する細胞の応答機能減退を伴う。従って、細胞老化は、細胞の増殖能力の喪失を表すものである。イン・ビトロでの細胞老化現象を説明するため、様々な理論が提案されているが、実験的証拠は、増殖能力の年齢依存性喪失が遺伝子プログラムの機能であろうことを示唆している（オーゲル．，Ｌ．Ｅ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、４９巻、５１７頁（１９６３年）；デ・マース，Ｒ．等、ヒューマン・ジェネティックス、１６巻、８７頁（１９７２年）；Ｍ．ブックワルド、ミューテーション・リサーチ、４４巻、４０１頁（１９７７年）、マーチン、Ｇ．Ｍ．等、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、７４巻、１３７頁（１９７４年）；スミス，Ｊ．Ｒ．等、Mech．Age．Dev．、１３巻、３８７頁（１９８０年）；カークウッド，Ｔ．Ｂ．Ｌ．等、セオリティカル・バイオロジー、５３巻、４８１頁（１９７５年））。
イン・ビトロにおけるヒト繊維芽細胞での細胞融合研究は、細胞老化の静止状態型が、増殖状態型よりも優勢であることを示している（ペレイラ−スミス，Ｏ．Ｍ．等、ソマティック・セル・ジェネティックス、８巻、７３１頁（１９８２年）；ノルウッド，Ｔ．Ｈ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７１巻、２２３頁（１９７４年）；ステイン，Ｇ．Ｈ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１３０巻、１５５頁（１９７９年））。
老化現象に対する洞察が、老化細胞および若い（即ち、非老化）細胞を融合して、ヘテロジカリオン（heterodikaryons）を形成する研究から得られている。ヘテロジカリオンの“若い”核で老化を引き起こすためには（ＤＮＡ合成の阻害により判定するとき）、融合する前に、老化細胞でタンパク質合成が起こらなければならない（バーマー，Ｇ．Ｃ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９４巻、１８７頁（１９８２年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ．Ｋ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４４巻、４５５頁（１９８３年）；バーマー，Ｇ．Ｃ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４５巻、７０８頁（１９８３年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ．Ｋ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８頁（１９８４年））。
同様に、老化繊維芽細胞ｍＲＮＡの若い繊維芽細胞へのマイクロインジェクションが、若い細胞のＤＮＡ合成能力（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、サイエンス、２３２巻、３９３頁（１９８６年））と細胞の細胞周期のＳ（静止）期に入る能力のいずれをも阻害することが見い出されている（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、５４４頁（１９８５年））。研究者らは、イン・ビトロで老化細胞内で増殖されるユニークなｍＲＮＡを同定した（ウエスト，Ｍ．Ｄ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻、１３８頁（１９８９年）；ジョルダノ，Ｔ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８５巻、３９９頁（１９８９年））。
ヒト二倍体内皮細胞は、これらの細胞がイン・ビトロで細胞老化を真似することから、細胞老化研究の代替細胞型を与えるものである（マシアーク，Ｔ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９１巻、４２０頁（１９８１年）；ゴードン，Ｐ．Ｂ．等、イン・ビトロ、１９巻、６６１頁（１９８３年）；ジョンソン，Ａ．等、Mech Age．Dev．、１８巻、１頁（１９８２年）；ソーントン，Ｓ．Ｃ．等、サイエンス、２２２巻、６２３頁（１９８３年）；ヴァン・ヒンスベルグ，Ｖ．Ｗ．Ｍ．等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、４２巻、１０１頁（１９８６年）；ニコルス、Ｗ．Ｗ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３２巻、４５３頁（１９８７年））。
加えて、ヒト内皮細胞は、様々な機能的かつ可逆の表現型を発現する能力がある。内皮細胞は、幾つかの静止型および非末端分化型を示す（フォークマン，Ｊ．等、ネイチャー、２８８巻、５５１頁（１９８０年）；マシアーク，Ｔ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９４巻、５１１頁（１９８２年）；マドリ．Ｊ．Ａ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９７巻、１５３頁（１９８３年）；モンテサノ，Ｒ．、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９９巻、１７０６頁（１９８４年）；モンテサノ，Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、３４巻、４６０頁（１９８８年））。
イン・ビトロにおけるヒト細胞分化の経路は、イン・ビトロでの成長因子誘導内皮細胞増殖を阻害するサイトカイン類により媒介される細胞静止状態の誘導に関与することが示唆されている（ジェイ，Ｍ．等、サイエンス、２２８巻、８８２頁（１９８５年）；マドリ，Ｊ．Ａ．等、イン・ビトロ、２３巻、３８７頁（１９８７年）；クボタ，Ｙ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０７巻、１５８９頁（１９８８年）；イングバー，Ｄ．Ｅ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０７巻、３１７頁（１９８９年））。
内皮細胞増殖の阻害因子（inhibitors）は、イン・ビトロでの内皮細胞分化中に引き起こされるごく初期の転写事象の調節因子としても機能しており、キャピラリー様、管状内皮細胞表現型の形成に関連する（マシアーク，Ｔ．等、インプルーブメント・アンド・アドバンス・オブ・オンコロジー、デ・ビータ，Ｖ．Ｔ．等、出版、Ｊ．Ｂ．リッピンコット．フィラデルフィア、４２頁（１９９０年）；ゴールドゲイバー，Ｄ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６巻、７６０６頁（１９９０年）；ヘラ，Ｔ．等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１６７巻、６３７頁（１９９０年））。細胞増殖の阻害因子とは以下のものを含む：
１．インターロイキン−１ａ（ＩＬ−１ａ）（モンテサノ，Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９９巻、１７０６頁（１９８４年）；モンテサノ，Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１２２巻、４２４頁（１９８５年）；マシアーク，Ｔ．等、サイエンス、２４９巻、１５７０−１５７４頁（１９９０年））；
２．腫瘍壊死因子（フレイター−シュローダー，Ｍ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８４巻、５２７７頁（１９８７年）；サトー，Ｎ．等、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート、７６巻、１１１３頁（１９８６年）；プバー，Ｊ．Ｐ．、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、１３３巻、４２６頁（１９８８年）；シマダ，Ｙ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１４２巻、３１頁（１９９０年））；
３．トランスホーミング増殖因子β（transforming growth factor−β）（ベイルド，Ａ．等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１３８巻、４７６頁（１９８６年）；ムリュー，Ｇ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８４巻、５６００頁（１９８７年）；マイリ，Ｊ．Ａ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０６巻、１３７５頁（１９８８年））；
４．ガンマ−インターフェロン（フリーセル，Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０４巻、６８９頁（１９８７年）；ツルオカ，Ｎ．等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１５５巻、４２９頁（１９８８年））および
５．腫瘍プロモーター、ホルボールミリスチリン酸（ＰＭＡ）（モンテサノ，Ｒ．等、セル、４２巻、４６９頁（１９８５年）；ドクトロウ，Ｓ．Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０４巻、６７９頁（１９８７年）；モンテサノ，Ｒ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３０巻、２８４頁（１９８７年）；ホシ，Ｈ．等、ＦＡＳＡＢジャーナル、２巻、２７９７頁（１９８８年））。
老化を逆行させ、かつ細胞の増殖能力を回復することへの期待は、多くの分野の努力活動にかかわっている。老齢疾患の多くは、この能力の喪失に関わっている。加速された加齢を特徴とする悲惨な疾患、早老症（progeria）もまた、細胞の増殖能力の喪失に関連するものである。この能力の回復は、この疾患の、他の年齢関連疾患の、さらに加齢自身の治療に、広い範囲にわたるかかわりを持つものである。
加えて、培養細胞の増殖能力の回復は、医薬および製薬工業において利用される。非形質転換細胞を不滅化する能力を用いれば、ある種の組織、さらには細胞生産物を無限に供給することも出来る。
従って、細胞老化の重要性は、数年来、高く評価されてきた（スミス，Ｊ．Ｒ．、セルラー・エイジング、モノグラフス・イン・デベロップメンタル・バイオロジー；ソイアー，Ｈ．Ｗ．（出版）、Ｓ．カーガー、ニュー・ヨーク、Ｎ．Ｙ．、１７巻、１９３−２０８頁（１９８４年）；スミス，Ｊ．Ｒ．等、イクスペリメンタル・ゲロントロジー、２４巻、３７７−３８１頁（１９８９年）、本明細書に参照して組み込んである）。研究者らは、細胞老化に関連した遺伝子をクローン化することを試みている。ＤＮＡ合成阻害因子（an inhibitor of DNA synthesis）の存在と細胞老化現象の間の相関関係が認識されている（スピアリング，Ａ．Ｉ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１７９巻、１５９−１６７頁（１９８８年）；ペレイラ−スミス，Ｏ．Ｍ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ．Ｋ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９８４年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ．Ｋ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４４巻、４５５−４６２頁（１９８３年）。更に、ある種の老化関連ＲＮＡ分子の相対量（relative abundance）が同定されている（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年））。
幾つかの研究室では、“サブトラクション−ディファレンシャル（subtraction-differential）”スクリーニング法を用いて、老化細胞中で優先的に存在するＲＮＡ種に由来するｃＤＮＡ分子を同定している（クラインセック，Ｄ．Ａ．、エイジ、１２巻、５５−６０頁（１９８９年）；ジョルダノ，Ｔ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８５巻、３９９−４０６頁（１９８９年）；シエラ，Ｆ．等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、９巻、５６１０−５６１６頁（１９８９年）；ペレイラ−スミス，Ｏ．Ｍ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー、（付録０（１２部Ａ））、１９３頁（１９８８年）；クラインセック，Ｄ．Ａ．、スミス，Ｊ．Ｒ．、エイジ、１０巻、１２５頁（１９８７年））。
“サブトラクション−ディファレンシャル（subtraction-differential）”スクリーニングと名付けられた１つの方法では、ｃＤＮＡ分子のプールを老化細胞から作成し、次いで、成長細胞のｃＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズして、これらの成長細胞に存在する核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子を“控除（subtract out）”する。“サブトラクション−ディファレンシャル”法は、ある目的のためには有用であるけれども、老化関連ｃＤＮＡ分子が、老化の原因に関わっているのか、それとも老化の結果として生成したものかを確定できないという難点がある。実際に、この方法で同定された配列の多くは、細胞外マトリクスのタンパク質をコードすることが見い出されている。そのようなタンパク質の発現における変化が、老化を引き起こすのではないようである。
発明の要約
本発明は、ある部分では、正常ヒト細胞がイン・ビトロで有限の複製能力を示し、ある回数分裂した後、老化に至るという観察に関係する。細胞が老化すると、それらは、細胞の大きさの肥大、細胞外マトリクス成分の変化、有糸分裂促進物質刺激に対する不応答、および成長調節遺伝子発現の機能減退のようないくつかの形態学的および生化学的変化を示す。
本発明は、老化細胞中に生成するＤＮＡ合成阻害因子を同定するものである。この阻害因子は、老化表現型の発現において重要な役割を果たす。阻害因子をコードする遺伝子は、老化細胞ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類発現ベクターに組み込むことにより同定した。次いで、該ｃＤＮＡライブラリーを若い、サイクリング細胞（cycling cell）内にトランスフェクションし、ＤＮＡ合成の開始を抑制するこれらのライブラリーの構成メンバーを同定した。
効率的ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションにより、３種の別々のｃＤＮＡクローンにおいて、老化細胞由来の阻害因子（ＳＤＩ）配列と推定されるものの分離が出来た。１種（ＳＤＩ−１）の発現は細胞老化にして２０倍増加したのに対し、他のもの（ＳＤＩ−２とＳＤＩ−３）は一定を保った。
要するに、本発明は、機能的なアッセー（assay）を用いて、ＤＮＡ合成阻害因子のクローニングを達成するものである。この方法を応用して組織特異的分化および腫瘍抑制遺伝子のような、細胞周期の負の調節に関連する他の遺伝子をクローン化することも出来る。この方法を用いて、３種の阻害因子配列がクローン化されている。これらの配列の１つ（ＳＤＩ−１）は、細胞老化と密接に関係しているようである。
詳細には、本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンパク質をコードする核酸分子を提供するものである。
本発明は、特に、核酸分子がＤＮＡであって、そしてＤＮＡプラスミド（ｐｃＤＳＲα△など）に組み込まれるものである、実施態様に関係している。
本発明は、上述の核酸分子がＳＤＩ−１であり、それが図５＜配列番号１＞で示された配列を有するものである、実施態様にも関係している。
本発明は、核酸分子がＲＮＡである実施態様も包含している。
本発明は、当該ＲＮＡ分子に相補的な配列、および生理学的条件下で該分子をもう一方とハイブリダイズさせるに十分な長さを有する核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）にも関係する。
本発明は、また、当該細胞に、受容細胞（および特に腫瘍細胞またはイン・ビトロ培養での細胞）におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンパク質をコードする上述の核酸分子の有効量を与えることを含んで成る、ヒト細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する方法を与えるものである。
本発明は、当該細胞に、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンパク質をコードするＲＮＡ分子に相補的な配列を持ち、かつ生理学的条件下でもう一方とハイブリダイズさせるに十分な長さを持つ核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の有効量を与えることを含んで成る、静止または老化ヒト細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を抑制する方法を提供するものでもある。特に意図されるのは、細胞が皮膚細胞または損傷または火傷組織に存在する細胞である場合の実施態様である。本発明は、更にリンパ球、管組織（動脈、小動脈、毛細管、静脈など）、肝臓、腎臓、心臓および他の筋肉、骨、脾臓などの皮膚以外の組織における本発明の薬剤の使用を意図するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクター、ｐｃＤＳＲα△（ＢはＢamＨＩ部位を表す）の構造を示す。
図２は、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃＤＮＡクローンを同定するものである。３本の異なる棒は、独立したトランスフェクション実験を表しており、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い標識指数を示す。
図３は、アンチセンスＳＤＩ ｃＤＮＡトランスフェクションを示す。アンチセンスｃＤＮＡ発現プラスミドを作り、若い細胞中にｐＣＭＶβと同時トランスフェクションした。レーン１：対照ｐｃＤＳＲα△、レーン２：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１、レーン３：ｐｃＤＳＲα△アンチＳＤＩ−１、レーン４：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−２、レーン５：ｐｃＤＳＲα△−アンチＳＤＩ−２。
図４は、細胞加齢中の総ＲＮＡからのポリＡ＋ＲＮＡ回収における変化を示す。
図５は、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を与える。
発明の詳細な説明
Ｉ．細胞老化
培養における、ヒト正常二倍体繊維芽細胞の複製的老化は、充分に確立され、かつ広く受け入れられている細胞加齢モデルである（ヘイフリック，Ｌ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１１−６３６頁（１９６５年）；ノルウッド，Ｔ．Ｈ．，およびスミス，Ｊ．Ｒ．、ハンドブック・オブ・ザ・バイオロジー・オブ・エイジング（第２版）Ｃ．Ｅ．フィンチおよびＥ．Ｌ．シュナイダー、バン・ノストランド出版、ニューヨーク、２９０−３１１頁（１９８５年）；ゴールドシュタイン，Ｓ．、サイエンス、２４９巻：１１２９−１１３３頁（１９９０年））。有限回数の集団倍加（population doublings）後、細胞が老化すると、それらは分裂したり大きくて平らな形態を表したりする能力を失う。この現象の根底にある原因となるメカニズムは、生化学レベルおよび分子レベルで老化細胞を特徴付ける多くの観察にも拘わらず、まだ理解されていない。
１次元および２次元タンパク質ゲル分析により、老化細胞に特異的なマーカータンパク質はほとんど無いことが明らかにされている（リンカーン，Ｄ．Ｗ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５４巻、１３６−１４６頁（１９８４年）；ワング，Ｅ．等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１００巻、５４５−５５１頁（１９８５年）；スコッティー，Ｊ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３１巻、２１０−２１７頁（１９８７年）；ベイロイテール，Ｋ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８５巻、５１１２−５１１６頁（１９８８年））。老化細胞を特定する抗原性決定因子が、原形質膜上に見つけられた（ポーター，Ｍ．Ｂ．等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１４２巻、４２５−４３３頁（１９９０年））。フィブロネクチンおよびコラゲナーゼなどの細胞外マトリクスの成分が、老化細胞の中で過剰に発現されることが見い出された（ウエスト，Ｍ．Ｄ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻、１３８−１４７頁（１９８９年）；クマザキ，Ｔ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、１３−１９頁（１９９１年））。しかしながら、これらの観察と細胞老化との関連性は明らかでは無い。
最近、幾つかの成長調節遺伝子の発現における変化が明らかにされた。c−fos cdc２、サイクリンＡおよびＢの発現が老化細胞では減少することが見い出された（セサドリ，Ｔ．およびカンピシ，Ｊ．、サイエンス、２４７巻、２０５−２０９頁（１９９０年））。同様に、老化細胞は、網膜芽腫タンパク質をリン酸化する能力がないことを明示している（ステイン，Ｇ．Ｈ．等、サイエンス、２４９巻、６６６−６６９頁（１９９０年））。これらの観察は、これらが全て成長促進遺伝子発現の低下変化であることから、当該細胞がＳ期に入る能力の無いことを強力に説明し得ると思われるが、しかしながら、これらが老化の原因であるのか、結果であるのかは明らかではない。
老化を引き起こす役割を持つと思われる遺伝子発現におけるもう１つの付加的な変化は、若い繊維芽細胞ではなく、老化繊維芽細胞により生成されたＤＮＡ合成の阻害因子（群）である（スピアリング，Ａ．Ｉ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、５４１−５４５頁（１９９１年）参照）。阻害因子（群）が存在する証拠は、最初、ヘテロカリオン実験から得られ、その中で老化細胞は、ヘテロカリオンの中の若い核内でＤＮＡ合成の開始を阻害した（ノルウッド，Ｔ．Ｈ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミイー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、７１巻、２２３１−２２３４頁（１９７４年）；ペレイラ−スミス，Ｏ．Ｍ．、およびスミス，Ｊ．Ｒ．、ソマティック・セル・ジェネティックス、８巻、７３１−７４２頁（１９８２年））。老化細胞質体と若い細胞全体を含むサイブリッド（cybrids）の研究は、老化細胞中の、表面膜結合タンパク質のＤＮＡ合成阻害因子の存在に対して、更なる支持を与えるものであった（ドレッシャー−リンカーン，Ｃ．Ｋ．、およびスミス，Ｊ．Ｒ．、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９８４年））。このことは、老化細胞由来の表面膜含量が豊富な調製物、またはその膜から抽出したタンパク質を若い細胞の培養培地に加えたとき、ＤＮＡ合成を阻害することが見い出されることで直接説明された（ペリラ−スミス，Ｏ．Ｍ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５年）；ステイン，Ｇ．Ｈ．、およびアトキンス，Ｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８３巻、９０３０−９０３４頁（１９８６年））。この阻害因子の生化学的方法による精製は、現在までのところ、成功していない。しかしながら、マイクロインジェクション実験では、ＤＮＡ合成阻害性メッセンジャーＲＮＡが非常に多く存在することが示されている（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年））。
ＤＮＡ合成阻害因子（群）をコードする遺伝子（群）のクローン化を試みるために、機能的スクリーニング法（a functional screening procedure）が用いられた。この方法により、若いサイクリング細胞中に導入した場合にＤＮＡ合成阻害活性を示す３種のｃＤＮＡを分離および同定した。これらの分子は、“老化細胞由来阻害因子群”（“ＳＤＩ”）として本明細書に引用している。
II．細胞老化の阻害因子群のクローニング
本発明の実施に際し、老化ヒト二倍体繊維芽細胞中に存在するＤＮＡ合成阻害性配列群の分子クローニングのために有効な方法が好適に用いられる。生物学的に重要な遺伝子群のクローン化を試みる場合そうであるように、その生産物の活性は容易に検出し得るのに、細胞老化にかかわる所望の遺伝子を精製するのは可能でないこともある。
このような遺伝子配列を同定するために構想され得る１つの方法は、老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャル（differential）またはサブトラクティブ（subtractive）スクリーニングを用いることであろう。この方法は、ヴェルナー症候群患者由来の細胞において過剰発現されるｃＤＮＡ分子を同定するのに用いられている（ムラノ，Ｓ．等、モレキュラー・セル・バイオロジー、１１巻、３９０５−３９１４頁（１９９１年８月））。ヴェルナー症候群は、希に遺伝する疾病である。それは早熟加齢（premature aging）により特徴付けられている。自然の加齢とヴェルナー症候群との関連性は知られていない。
不運にも、このようなスクリーニングは、老化細胞の特定には重要であるけれども、老化の主要な原因ではない、多数の遺伝子を同定するだろう。更に、全長ｃＤＮＡのクローニングにおける技術的な制約が、これらの方法によりクローン化される遺伝子群の機能決定を困難にしている。これらの理由から、このようなディファレンシャル法は、老化関連遺伝子配列群を同定するには、一般的に適切でもなく、また最も望ましい方法でもない。
反対に、発現スクリーニングは、このような老化関連遺伝子配列群の好ましい同定および分離方法を与えるものである。このスクリーニング法では、クローン化した遺伝子を受容細胞において発現する能力を有するベクター内でｃＤＮＡを直接クローン化する。こうして、ＤＮＡ合成における何等かの阻害に対して直接受容細胞をスクリーニングすることが出来る。
発現スクリーニングにおいて、最も重要な段階は、ｃＤＮＡの合成である。酵素は、夾雑物がないように、注意深く選択されるべきである。ｃＤＮＡ合成は、満足の行く結果（即ち、正確な逆転写および十分な長さの転写サイズ）が得られることを確実にするために、好ましくは数回繰り返される。最終的に、ｃＤＮＡ生産物は、好ましくは、断片になったり早すぎて終了したｃＤＮＡ生産物を除去するために、サイズ画分される。二本鎖ｃＤＮＡ生産物は、次いで、大きさに基づく画分、即ち、０．５−２．０、２．０−４．５、４．５−１０kb画分に好適に分けられる。膜結合タンパク質の多くが、相対的に高い分子量を有するという推定のもとに、２−４．５kb ｃＤＮＡ画分を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡ群は適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＳＲα△の中に挿入され、挿入された配列群は若い細胞内で高いレベルで転写され得る。
最も好ましいトランスフェクション法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションであり、高い割合で若いサイクリング細胞を一時的に発現させる条件下で行われる。トランスフェクション頻度は、実験毎に変化するため、ｃＤＮＡプールプラスミドを、ｐＣＭＶβ（β−ガラクトシダーゼをコードする）などのマーカープラスミドと一緒にトランスフェクションし、標識指数をβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のみでアッセイした。一般に、トランスフェクションした遺伝子群の同時発現は、トランスフェクション・コンピテントな細胞が多くのプラスミドを受け入れることから、かなり高い。この簡単な同時トランスフェクション法は、細胞外ＤＮＡを発現する細胞におけるＤＮＡ合成の評価を可能にした。
同時トランスフェクションされるプラスミド量は、パイロット試験から決定された。トランスフェクション頻度と加えたプラスミドの量との間の相互関係は、マーカープラスミドを用いて試験され、最大効率は、プラスミド１００−５００ngの範囲で得られる。この結果を考慮に入れて、好ましくはｃＤＮＡライブラリーを、各プールが５種の独立したプラスミドクローンを含む小さいプールに分けた。次いで、ｐＣＭＶβ約１００ngとｃＤＮＡプラスミド約４００ngとで同時トランスフェクションを行う。これらのパラメーターは、マーカープラスミドのトランスフェクション頻度を低減すること無く、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞におけるｃＤＮＡの同時発現を最大にすることが見い出された。
スクリーニングの第２ラウンド後、ＤＮＡ合成の強力な阻害を示した単一のプラスミドを、第１ラウンドスクリーニングの時に陽性と判断されたプールからうまく分離することが出来た（図２）。図２では、第１ラウンドスクリーニングにおいて陽性を示したｃＤＮＡプールを個々のプラスミドに分け、再びトランスフェクションした。各ｃＤＮＡプール（Ａ、ＢおよびＣ）について、プラスミドＮｏ．１ないし５は、それぞれ単一プラスミドトランスフェクションの結果を示している。プールＢでは、Ｎｏ．１プラスミドは、単なる空のベクターであることが分かった。プラスミドの阻害性活性は、好ましくは、核マイクロインジェクション実験により、更に確かめられる。このような実験は、分離されたプラスミドがＤＮＡ合成を阻害する能力を持つ配列群を含むことの、より直接的な証拠を与えるものである。
III．本発明の分子およびそれらの使用
本発明は、ＤＮＡ合成を阻害するかまたは可能にするいずれかの様々な化学薬剤の使用を意図するものである。このような薬剤は：（１）オリゴヌクレオチド、（２）核酸結合タンパク質、または（３）オリゴヌクレオチドまたは核酸結合分子のいずれかの構造によく似た構造の化合物（即ち、“ペプチドもどき”剤）であり得る。
本発明の薬剤は、活性細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を誘導するか、または老化または静止細胞における、このような阻害を抑制するかのいずれかの能力を持つものであり、それらは、広範囲の治療および応用に用いられ得る。
従って、１つの実施態様では、本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を有するｃＤＮＡ分子を、機能的な（即ち、発現可能な）形で分離する方法を与えるものである。このような“ＳＤＩ”核酸分子、同じくそれらがコードするタンパク質、およびそれらのペプチドもどき類似体は、受容細胞における老化または静止状態の誘導時に、用いる。このような誘導は、早老症（バダム，Ａ．Ｊ．、アーカイブス・オブ・デルマトロジー、１２５巻、５４０頁（１９８９年）；ハーマー，Ｌ．等、オルソペディックス、１１巻、７６３頁（１９８８年）；マーチン，Ｇ．Ｍ．、ナショナル・キャンサー・インスティチュート・モノグラフ、６０巻、２４１頁（１９８２年））；年齢関連疾患（マーチン，Ｇ．Ｍ．、ゲノム、３１巻、３９０頁（１９８９年）；ロー，Ｄ．Ａ．、クリニカル・ゲリアトリックス・メディシィン、６巻、３１９頁（１９９０年）；ムーラディアン，Ａ．Ｄ．、ジャーナル・オブ・アメリカン・ゲリアトリックス・ソサイエティー、３６巻、８３１頁（１９８８年）；アルパート，Ｊ．Ｓ．、アメリカン・ジャーナル・オブ・カルディオロジー、６５巻、２３ｊ頁（１９９０年））；アルツハイマー病（テリー，Ｒ．Ｄ．、モノグラフ・オブ・パソロジー、３２巻、４１頁（１９９０年）；コスタール，Ｂ．等、ファーマコサカイアトリー、２３巻、８５頁（１９９０年））；無力症およびカヘキシー（ヴェルデリー，Ｒ．Ｂ．、ゲリアトリックス、４５巻、２６頁（１９９０年））、または迅速な細胞増殖が望ましくないような疾患または症状の処置に、望ましい。この関係で、本発明の薬剤を治療的に用いて、腫瘍または腫瘍原細胞の迅速な増殖を抑制することが出来る。従って、本発明は、癌を処置するための治療を提供するものである。
ＳＤＩ核酸分子の配列は、静止および老化に関連するＤＮＡ合成の阻害を抑制するのに用いられ得るタンパク質分子を帰結および同定することを可能にする。このような分子のアミノ酸配列は、核酸分子のヌクレオチド配列とそれがコードするタンパク質のアミノ酸配列との間の知られている関係から容易に導き出すことが出来る。本発明は、明らかにされたＳＤＩ核酸分子の転写および翻訳により合成されるタンパク質およびポリペプチド分子を包含している。
本発明により意図されている付加的な種類の分子は、ＳＤＩ配列から発現されるタンパク質の機能とよく似たタンパク質または他の分子（即ち、ペプチドもどき類似体）を含んで成る。
これらおよび他の類似体は、例えば、本発明の試薬のＤＮＡ合成を誘導または抑制解除する能力を活性することにより容易に同定され得、これらの工程を逆にすることが出来る薬剤を同定することにも用いられる。故に、例えば、細胞をＳＤＩオリゴヌクレオチドと類似アンタゴニスト化合物のいずれもが存在する中でインキュベートすることもある。その細胞を追跡して、化合物がＤＮＡ合成を阻害するＳＤＩオリゴヌクレオチドの能力を低減出来るかどうかを測定するのである。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンタゴニストを同定することが出来る“スクリーニングアッセイ”を包含する。逆に言えば、細胞をＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドと疑似アンタゴニスト化合物のいずれもが存在する中でインキュベートすることもある。細胞を追跡して、その化合物がＤＮＡ合成を抑制解除するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を低減出来るかどうかを測定するのである。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンタゴニストを同定することが出来る“スクリーニングアッセイ”を包含する。同様の方法で、これらの薬剤のアゴニストを代替的に同定することも可能である。
このようなスクリーニングアッセイの使用により同定され得るアゴニスト化合物の中には、不妊を引き起こすために使用してもよい化合物がある。同様に、このアッセイは、組織再生または血管新生を抑制するかまたは引き起こすいずれかの能力を持つ化合物の同定を可能にするであろう。このような化合物は、癌の処置に有用であり得る。
タンパク質およびポリペプチドの発現時および望ましい類似体の定義付け時にそれらを使用するのに加えて、本発明のＳＤＩ核酸分子は、ＳＤＩ核酸分子に結合し、その活性を阻害するなどの能力を持つアンチセンス核酸分子を生産するのに用いることが出来る。特に好ましいのは、このような薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合である。
一般に、“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、その配列がターゲットのｍＲＮＡ分子（またはそれに対応する遺伝子）の配列に相補的である核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）であり、ｍＲＮＡ分子（または遺伝子）に結合するか、またはハイブリダイズし、それによって、ｍＲＮＡ分子の遺伝子産物への翻訳を損なう（即ち、弱めたり、妨げたりする）能力を持つものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして働くには、核酸分子はターゲットｍＲＮＡの翻訳を媒介するターゲットｍＲＮＡ分子（または遺伝子）の部分と結合するか、またはハイブリダイズする能力を持たなければならない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヨーロッパ特許出願公開番号263,740；335,451；および329,882と、ＰＣＴ公開番号ＷＯ90／00624に開示されており、これらはすべて、本明細書に参照として組み込んである。
本発明は、特に、ＳＤＩ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子に結合するか、またはハイブリダイズする能力を持つようなアンチセンスオリゴヌクレオチドに関係する。
従って、本発明の一態様では、ＳＤＩ ｍＲＮＡ転写物の翻訳を特異的に遮断するようにデザインされたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、受容老化細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を抑制解除することが出来る。
アンチ−ＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドがこれらの目標を達成し得るような１つの方法は、ＳＤＩ ｍＲＮＡの翻訳開始領域の配列に相補的で、しかもＳＤＩ遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズ出来るのに充分な長さの配列を持つことによるものである。このようなオリゴマーの大きさは、この目的に効果的な任意の長さであることが出来る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０−３０ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは、約１５−２４ヌクレオチドの長さであるだろう。
代替法として、短すぎて、生理学的、イン・ビボ条件下で、ＳＤＩ ｍＲＮＡに安定にハイブリダイズ出来ない長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることもある。このようなオリゴヌクレオチドは、長さにして約６−１０またはそれ以上のヌクレオチドであることもある。本発明に従って用いられるためには、このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくはＳＤＩをコードするｍＲＮＡの翻訳領域座に結合させるように修飾されている。このような修飾分子の例には、抗体（または抗体フラグメント）に結合させたオリゴヌクレオチド、または一本鎖ＳＤＩ ｍＲＮＡ分子に結合出来る他のリガンド（例えば、トリメチルソラリン、８−メトキシソラリンなどの、二価架橋剤など）がある。
二価架橋剤（ソラリン、例えば、トリメチルソラリンまたは８−メトキシソラリン）付加物の１つの反応基に結合させたアンチ−ＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３５０−４２０nmＵＶ光で活性化してＳＤＩ ｍＲＮＡに架橋する能力を持つであろう。従って、このような光強度を調節する（ＵＶランプのワット数を変える、細胞とランプの間の距離を広げる等による）ことにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドと細胞のＳＤＩ ｍＲＮＡとの間の結合程度をコントロールする場合もある。これにより、順次、受容細胞におけるＳＤＩ遺伝子発現の減弱の程度をコントロールすることもまた可能になる。
一般に、アンチセンスオリゴマーは、ＳＤＩ遺伝子のヌクレオチド配列に従って調製され、最も好ましくは、ＳＤＩ−１のヌクレオチド配列（図５）に従って調製される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、生成するオリゴヌクレオチドが、上記したＳＤＩ ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＳＤＩ遺伝子自身のいずれかの上記翻訳座に結合するかまたはハイブリダイズする能力を持つことを前提として、１つまたはそれ以上の部分に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、欠失を含み得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成するには、当業者に知られているどの方法も用い得る（ザメチク等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイスンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８３巻、４１４３頁（１９８６年）；グッドチャイルド等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８５巻、５５０７頁（１９８８年）；ウィックストロム等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ）８５巻、１０２８頁、ホルト，Ｊ．Ｔ．等、モレキュラー・セル・オブ・バイオロジー、８巻、９６３頁（１９８８年）；ゲルウィルツ，Ａ．Ｍ．等、サイエンス、２４２巻、１３０３頁（１９８８年）；アンフォッシ，Ｇ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ．Ｓ．Ａ）、８６巻、３３７９頁（１９８９年）；ベッカー，Ｄ．等、ＥＭＢＯジャーナル、８巻、３６７９頁（１９８９年）；引例はすべて、参照として本明細書に組み込んである）。自動核酸合成機をこの目的のために用い得る。加えて、いかなる配列の所望のヌクレオチドも、カスタムメード分子の商業的供給業者から入手出来る。
最も好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは固相“ホスホルアミダイト合成”を用いて調製してもよい。該合成は、オリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシル末端になるヌクレオチドで誘導された固体支持体に結合させた伸長ヌクレオチド鎖を用いて行われる。該方法は、その５’−ヒドロキシル基が（好ましくは、５’−ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基で）保護されており、そのアミノ基がベンゾイル基（シトシンおよびアデノシンのアミノ基のため）またはイソブチリル基（グアノシンを保護するため）のいずれかで保護されているモノマー単位を用いるＤＮＡの循環合成を含む。このような誘導体の製造方法は、当業者には、よく知られている。
本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤は、さもなければ一時的な増殖性生存能力しかもてない価値ある細胞型（一次組織培養細胞等）に永遠性を与えるために用い得る。従って、これらは、器官または組織移植片または移植植物に関して、研究のために、多数の細胞の蓄積を可能、もしくは助長したりするのに用い得る。それ故に、一実施態様では、本発明の薬剤を器官または組織培養方法と共に用いて、当該方法を促進させることもある。
使用することにより生理学的条件が変わるのであれば、その使用は治療的と言われている。非治療的使用というのは、使用者の外観を変えるものである。
本発明の薬剤は、例えば皮膚の調子、色、質感等、またはリンパ球、血管（動脈、小動脈、毛細血管、静脈など）、肝臓、腎臓、心臓および他の筋肉、骨、脾臓などの細胞、組織または器官の再生における、加齢の効果を妨げることなどの治療または非治療目的のために局所的に、または組織的に用い得る。本発明の薬剤は、そのような細胞、組織または器官を若返らせるのに用い得る。従って、これらは、医薬等に用いることが出来、それらの医薬等は例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれと同等の物、および好ましくは、適切な溶媒に溶解させた脂肪親和性キャリアーまたは添加物を含んで成るものであり得る。このような溶媒は、例えば、水−エタノール混合物（１０％ないし３０％ｖ／ｖまたはもっと多くのエタノールを含有する）であっても良い。このような製剤は、０００．１％ないし１．０％のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有し得る。適切なキャリアー、添加剤および溶媒は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ（第１６版、オソル，Ａ．出版、マック、イーストン・ペンシルバニア（１９８０年））、この文献は、本明細書に参考として組み込んである）に記載されている。
本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤分子が細胞増殖を刺激する能力を有することから、それらを用いて、火傷、または外科手術後の損傷治癒、回復を促進したり、萎縮した組織等を修復したりすることも可能である。このような実施態様のために、これらの薬剤は、抗生物質、抗菌剤などと共に、局所投与または全身投与用に処方されることもある。
このような本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤分子は、ヒトまたは動物における精母細胞の増殖または卵母細胞の成熟を刺激するのに用い得る。従って、本発明の薬剤は、受容者の受精能力を増進するために使用され得る。
本発明の分子は、受容患者に遺伝子治療を施すために用いても良い。一実施態様では、患者由来の細胞または組織を患者から除去し、活発な成長状態を回復させるのに充分な条件下、本発明の分子で処理する。この使用の好ましい一態様では、個人（例えば、エイズ患者などのように免疫損傷した個人（immune compromised individual）または、リンパ球の提供者として働く、免疫能力の十分な個人（immune-competent individual）など）のリンパ球を脱離し、アンチセンスＳＤＩ核酸で処理することが出来る。これらの分子の投与は、リンパ球を抑制解除するであろう。投与後、リンパ球は患者に再び導入され、感染と戦う能力が増強される。
本発明の分子は、特に、疾病または組織変性のための動物モデルの創製および／または研究に使用するのに適している。従って、本発明の分子を用いて、異常な加齢または細胞変性により特徴付けられる動物モデルのエフェクター（effector）を研究することが出来る。同様に、ＳＤＩ分子（例えば、適切な調節配列と連結させて、受容細胞におけるそれらの発現を可能にさせたもの）を投与して、加齢および組織変性の動物モデルを創製するのに用いても良い。
IV．投与方法
本発明の薬物は、医薬的に有用な組成物を調製する知られた方法に従って製剤化でき、該方法により、これらの材料、またはそれらの機能的誘導体が医薬的に許容され得るキャリヤー媒体と組み合わせて混和物とされる。適切な媒体および他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む、それらの製剤は、例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ（第１６版、オソル，Ａ．出版、マック、イーストン、ペンシルバニア（１９８０年））に記載されている。効果的な投与に適した医薬的に許容され得る組成物を形成させるためには、当該組成物は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその均等物、またはそれらの機能的誘導体を適量のキャリヤー媒体と共に含有するであろう。
更なる製薬方法を用いて、作用の持続期間を制御し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその均等物、またはそれらの機能的誘導体を複合（complex）または吸収するポリマーを用いることにより、放出制御製剤を完成できる。放出制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステル類、ポリアミノ酸類、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、サルフェート）と高分子の濃度、同じく組み込み方法を選択することによって、制御された放出を実行できる。制御放出製剤により、作用持続期間を制御するもう一つの可能な方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその均等物、またはそれらの機能的誘導体を、ポリエステル類、ポリアミノ酸類、ハイドロゲル類、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマー類などのポリマー物質の粒子に組み込むことである。代替法として、これらの薬物をポリマー粒子に組み込む代わりに、これらの物質を、例えば、コアセルベーション技術、または、界面重合により調製されたマイクロカプセル類、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル類およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル類それぞれの中に、またはコロイド状薬剤放出システム、例えば、リポソーム類、アルブミンミクロスフェア類、ミクロエマルジョン類、ナノ粒子類、およびナノカプセル類、またはマイクロエマルジョン類中に封じ込む（entrap）ことが可能である。このような技術は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ（１９８０年）に開示されている。
本発明の組成物は、注射、迅速な点滴、鼻咽喉吸収（鼻咽喉内に）、皮膚吸収による非経口的投与または経口投与用に製剤化されることも出来る。これに代えて、該組成物を筋肉内投与または静脈内投与してもよい。非経口投与のための組成物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳酸を含んでいる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。担体、添加剤または閉鎖包帯を用いて、組織浸透性を増大させたり、抗原吸収を増強させたり出来る。経口投与のための液体投薬形態は、一般にこの液体投薬形態を含有するリポソーム溶液を含んで成ることもある。懸濁状リポソームに適切な形態は、乳液、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルを含み、当技術分野で通常用いられる精製水などの不活性希釈剤を含有する。不活性希釈剤の他にも、このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤または甘味料、香味料、着色料、または芳香料も含み得る。
組成物は、その投与に受容患者が耐え得る場合、“医薬的に許容され得る”と言われる。投与される量が生理学的に有意義である場合、そのような薬物は、“治療的に有効量”で投与されると言われる。薬物は、その存在が、結果として受容患者の生理機能における検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意義である。
一般に、有効量の組成物を与えるために必要とされる投薬量は、受容者の年齢、体調、性別、および疾病の程度、あるとしても当技術分野の通常の技術者により調整され得る他の変化物、などの要因に依存して変化する。
本発明の組成物の有効量は、用量または適用当たり０．０１−１，０００mg／mlで変化し得るが、より少なくまたはより多く用いても良い。
以上、本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参考にすることにより、より容易に理解されるであろう。それらの実施例は、特記したものを除き、例示のために提供したものであり、本発明の限定を意図するものではない。
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーの創製
ｃＤＮＡライブラリーは、細胞系ＨＣＡ２などの正常ヒト新生児包皮繊維芽細胞由来のＲＮＡを用いて得られた。これを行うためには、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯまたはハイクローン）を補った、均衡のとれたアール塩溶液またはハンクス塩溶液のいずれかを含む最小必須成分培地で成育させた。細胞を培養し、それらのイン・ビトロでの寿命を、以下参考として組み込んであるスミス，Ｊ．Ｒ．、およびブラウンシュバイゲル，Ｋ．Ｉ．、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、９８巻、５９７−６０１頁（１９７９年）に記載されている条件下で測定した。静止細胞は、細胞が集密的（confluent）になる前に、正常培養培地を、０．５％血清を含む培養培地に変えることにより作成された。該細胞は、低血清培養で３週間まで維持された。
全細胞ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート／ＣsＣl法（ガルガー，Ｓ．Ｊ．等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１１７巻、８３５−８４２頁（１９８３年））か、またはグアニジウムチオシアネート／フェノール法（コムジンスキー，Ｐ．およびサッキ，Ｎ．、アナリティカル・バイオケミストリー、１６２巻、１５６−１５９頁（１９８７年）、ＲＮＡゾル Ｂ、バイオテックス・ラボラトリー・インコーポレイテッド、テキサス）のいずれかにより分離した。ポリＡ＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィー（コラボレイティブ・リサーチ、マサチューセッツ）により分離した。
上記したように、老化細胞から得られたポリＡ＋ＲＮＡ １０μgは、提供者（ＢＲＬ、ＭＡＤ）の教示に従いＲＮアーゼＨ-／ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いることにより、二本鎖ｃＤＮＡ群に転換させ、Ｔ４ポリメラーゼ処理により平滑末端にした。二本鎖ｃＤＮＡ調製物群は、アガロースゲル電気泳動によりサイズ画分され、発現ベクターに挿入するために、２−４．５kbの画分を分離した。
この目的に用いられる発現ベクターは、３．４kbプラスミドであり、ｐｃＤＳＲα△と呼称されるものである（図１）。プラスミドｐｃＤＳＲα△は、プラスミドｐｃＤＳＲα２９６の誘導体であり、オカヤマ−バーグＳＶ４０プロモーターとＨＴＬＶ−１由来のＬＴＲを含む（タケベ，Ｙ．等、モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、４６６−４７２頁（１９８８年）；Ｍ．ヨシダ博士（キャンサー・インスティテュート・オブ・ジャパン）により提供された）。プラスミドｐｃＤＳＲα△は、ｐｃＤＳＲ２９６からＰｓｔ１−Ｋｐｎ１フラグメントの３３６塩基対（ｂｐ）セグメントを除き、それをｐＵＣ１９由来のＰｓｔ１−Ｋｐｎ１フラグメントの２８塩基対に置き換えることにより形成された。生じたプラスミド（ｐｃＤＳＲα△）は、クローニングベクターおよび発現ベクターとして用いられた。
プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ（ゴーマン，Ｃ．等、モレキュラー・セル・バイオロジー、２巻、１０４４−１０５１頁（１９８２年））は、グレッチェン・ダーリントン博士（テキサス・チルドレンズ・ホスピタル）により与えられた。ｐｃＤベクター（オカヤマ，Ｈ．およびバーグ，Ｐ．、モレキュラー・セル・バイオロジー、３巻、２８０−２８９頁（１９８３年））は、Ｈ．オカヤマ博士（日本、大阪大学）により与えられたもので；該プラスミドは、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルの間に挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（“ＣＡＴ”）遺伝子を有する。ｐｃＤＳＲα△−ｃａｔは、ＨindIII−ＳmaＩ消化ＳＲαプロモーターフラグメントの０．８kbをＨindIII消化ｐＳＶＯｃａｔに、２段階の連結反応を経て、挿入することにより、ｐｃＤＳＲα△から構築された。ｃＤＮＡライブラリーの効率良い発現スクリーニングを可能にするためには、非常に強力なプロモーターが望まれていた。数種の哺乳類発現ベクター（若い細胞内にトランスフェクションされたｐＳＶ２ｃａｔ、ｐｃＤ−ｃａｔおよびｐｃＤＳＲα△−ｃａｔ）の分析から、ＳＲαプロモーターが若いサイクリング細胞におけるＣＡＴ遺伝子の発現を高効率で推進することが見い出された。これらのプラスミドの相対的なＣＡＴ活性は、各反応に用いられるタンパク質量に対して標準化することにより、計算された。転写効率は、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを利用する在来のｐＳＶ２プロモーターよりも約２０倍高かった。
ｐＣＭＶβは、ヒトサイトメガトロウイルス前初期遺伝子（immediate early gene）プロモーターにより駆動されるＥ．コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を搭載している（マックグレゴール，Ｇ．Ｒ．およびキャスケイ，Ｃ．Ｔ．、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１７巻、２３６５頁（１９８９年）；テキサス、ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン、グラント・マックグレゴール博士により提供された）。プラスミドｐβ４４０は、ヒトβ−アクチン配列の４４３ｂｐを搭載している（ナカジマ−イイジマ，Ｓ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ、８２巻、６１３３−６１３７頁（１９８５年）；日本、大阪大学、コーゾー・マキノ博士により提供された）。プラスミドｐＨｃＧＡＰ（ツォ，Ｊ．Ｙ．等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１３巻、２４８５−２５０２（１９８５年））は、ヒトのグリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡの全長を運ぶものであり、メリーランド、ロックビィル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られた。
ｃＤＮＡアンチセンス発現のため、ｃＤＮＡフラグメントの全長をＢamＨＩ消化により、当初クローン化したｐｃＤＳＲα△ベクターから摘出し、逆向きに、連結させた。
アガロースゲルから回収したｃＤＮＡ群を直接、子牛腸アルカリホスファターゼ処理したｐｃＤＳＲα△のＳmaＩ部位に挿入し、Ｅ．コリＭＣ１０６１またはＤＨ−１に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを無作為に釣り、プラスミドの大きさを測定した。これらの手順は、２−４．５ｋｂ ｃＤＮＡの挿入が、試験されたプラスミドの９０パーセント以上で起こるようになるまで繰り返された。次いで、各Ｅ．コリのコロニーをつま楊枝で釣り、５コロニーを集めて１つのｃＤＮＡプールにした。４００以上のｃＤＮＡプールを調製し、９６ウェルのミクロタイタープレート内で生育させ、１４％グリセロール中に−７０℃で保存した。ＤＮＡ分離のために、各ＤＮＡプール由来のＥ．コリを２００ml中に培養し、標準方法のエチジウムブロマイド／ＣsＣl超遠心分離（ガルガー，Ｓ．Ｊ．等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、１１７巻、８３５−８４２頁（１９８３年））に１回または２回かけて処理し、続いて、ＴＥ（１０mMトリスｐＨ８．０、１mMＥＤＴＡ）溶液に対して透析した。
実施例２
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションおよび一時的発現スクリーニング
若い、サイクリング繊維芽細胞（cycling fibroblast cells）を、トランスフェクション前１８時間に、ウェル当たり０．９−１．２×１０5の密度で６ウェル組織培養プレートまたは３５mm組織培養皿に接種した。トランスフェクションは、以下に記載のように微修飾して本明細書に参考として組み込んであるクレン，Ｂ．Ｒ．、ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング・テクニークス・メソッズ・イン・エンザイモロジー、Ｓ．Ｌ．ベルガーおよびＡ．Ｒ．キメル出版、アカデミック・プレス、６８４−７０４頁（１９８７年）；に記載されているようにして行った。
各トランスフェクションのために、ｐＣＭＶβ１００ngとｃＤＮＡプール４００ngを混合し、ホスフェート緩衝化塩水（ＰＢＳ）溶液１９０μlに懸濁し、１０mg／mlのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア、分子量５００，０００）１０μlを加えた。クローニングベクタープラスミド、ｐｃＤＳＲα△の４００ngを対照として、ｐＣＭＶβと共に用いた。細胞をＰＢＳで１度洗浄した後、ＤＮＡ溶液を加え、細胞をＣＯ2インキュベーター内で３７℃で４５分間までインキュベートした。次いで、６４μMクロロキン（シグマ、ミズーリ）を含む血清入り細胞培養培地の２mlを直接加え、更に２．５時間インキュベートした。クロロキン処理後、トランスフェクション混合物を除き、細胞を血清入り細胞培養培地中１０％ジメチルスルホキシドで、２分間処理した。細胞をその後、血清入りの新しい細胞培養培地に戻し、インキュベートして、トランスフェクションしたＤＮＡを発現させた。
トランスフェクション後１８時間で、3Ｈ−チミジン０．５μＣｉ／mlを加え、更に４８時間インキュベーションを続けた。２５％グルタルアルデヒド溶液２５μlを培養培地に加えることにより、細胞を固定し、室温で５分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、直ちに、細胞をＸ−gal反応混合物（１０mMＫＣｌを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１mMＭgＣl2、３mMＫ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］、３mMＫ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］、０．１％トリトンＸ−１００、および１mMＸ−gal）で、２０分間まで処理し、細胞を明青色に染色させた。Ｘ−gal染色後、細胞を水で洗浄し、乾燥して、コダックＮＴＢ核トラックエマルション（Kodak NTB nuclear track emulsion）（コダック、ニューヨーク）を用いるオートラジオグラフィーにかけた。次いで、Ｘ−gal陽性細胞におけるＤＮＡ合成活性を測定した。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、式：
0003865766.tif 000002
を用いて計算された。
候補となるｃＤＮＡプールを個々のｃＤＮＡ群に分け、特定のＤＮＡ合成阻害ｃＤＮＡ配列群を同定するために、更にスクリーニングにかけた。
若いサイクリング細胞の核マイクロインジェクションは、（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、モレキュラー・セル・バイオロジー、６巻、２９９０−２９９３頁（１９８６年）、参照として本明細書に組み込んである）に記載されているようにして行った。要約すれば、５，０００−１０，０００細胞を３５mm組織培養皿の２２mm四方のエッチングした格子状カバーガラス（square etched grid coverslips）（ベルコ）上にプレートした。３日または４日後、核マイクロインジェクションを、ｐＣＭＶβ＋ｃＤＮＡプラスミドまたはｐＣＭＶβ＋ｐｃＤＳＲα△（対照として働く）のいずれかを用いて、最小３００細胞について行った。プラスミドをそれぞれ５０ng／μlの濃度で同時マイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後１８時間で、細胞を3Ｈ−チミジンで２４時間標識し、固定し、Ｘ−galで染色し、オートラジオグラフィーにかけた。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、上記のように計算した。
総ＲＮＡのうち５μgまたはポリＡ＋ＲＮＡ１μgのいずれかを用いて、ノーザンブロット分析を行った。該ＲＮＡは、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上の電気泳動によりサイズ画分され、本明細書に参照として組み込んであるマニアチス，Ｔ．等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年）に記載されているように、ナイロン膜（ＩＣＮ；バイオトランス、前のポール・バイオダインＡ）に移された。放射性活性プローブをランダム・プライマー法により調製し、ブロットは、マニアチス，Ｔ．等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年）に記載されているように、ハイブリダイズした。
ノーザンブロット分析により、ＳＤＩの細胞転写物の大きさはＳＤＩ ｃＤＮＡの大きさに矛盾していないということが明らかにした。このことは、首尾良く発現スクリーニングを行うには、全長ｃＤＮＡをベクターへ挿入する必要があることから、予想されるものであった。
β−アクチンまたはグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブとの再ハイブリダイゼーションのために、使用説明書に従って、フィルターを標識プローブから繰り返し剥がした。そのデータは、アンビス・ラジオアナリティック・スキャンニング・システム（Ambis Radioanalytic Scanning System）により正確に計られた。
ＣＡＴ活性のアッセイは、以下のように測定された：
若いサイクリング細胞を３５mm皿に接種し、上記のようにプラスミド５００ngをトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を皿からこすり集め、ＣＡＴアッセイをゴーマン（ゴーマン，Ｃ．、ＤＮＡクローニング、ア・プラクティカル・アプローチ、ＩＲＬ出版、オックスフォード、イギリス、１４３−１６４頁（１９８５年）、本明細書に参考として組み込んである）により記載されているようにして行った。
実施例３
老化細胞由来のＤＮＡ合成阻害因子群（ＳＤＩ）のｃＤＮＡクローニング
二本鎖ｃＤＮＡ群は老化細胞由来ポリＡ＋ＲＮＡから合成され、若い細胞において細胞質にマイクロインジェクションした場合、ＤＮＡ合成を阻害することが示されている（ランプキン，Ｃ．Ｋ．等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年））。このｃＤＮＡ群は、サイズ画分され、ｐｃＤＳＲα△に挿入された。生じたＥ．コリ クローン群は、小プール群に分けた。高効率トランスフェクションにおいてさえ、実験毎に頻度が変わるため、各プール由来のプラスミドをトランスフェクションマーカープラスミド、ｐＣＭＶβと共に、同時トランスフェクションし、これにより、特定的にトランスフェクション細胞の標識指数の測定が可能になった。マーカープラスミドのトランスフェクション頻度は、３０−９０％の範囲であった。約２０のｃＤＮＡプールをスクリーニングし、５回トランスフェクションを繰り返した後、４プールがＤＮＡ合成阻害活性に対して陽性のままであった。候補となるプール群は、次いで、個々のプラスミドに分け、更にスクリーニングした。
３つの別個の陽性プラスミドクローンが得られた。ｃＤＮＡプールＡでは、１つのプラスミド、２番のみが、強力なＤＮＡ合成阻害活性を示した。同様に、プールＢおよびＣでは、１つのｃＤＮＡクローンのみが阻害を引き起こした。挿入されたｃＤＮＡの大きさは、それぞれ２．１kb、１．２kbおよび２．７kbであった。これらのｃＤＮＡ配列は、老化細胞由来の阻害因子として、それぞれＳＤＩ−１、ＳＤＩ−２、ＳＤＩ−３と呼称されている。
ＳＤＩ−１ｃＤＮＡクローン（配列番号１）のヌクレオチド配列、およびＳＤＩ−１のアミノ酸配列（配列番号２）が、決定されている。ＳＤＩ−１について本明細書に表したｃＤＮＡ配列は、Ｕ．Ｓ．特許出願番号07／808,523に記載されているものとは、２８６位に列挙されていないＧを有する点、および１８４３−１８４４位の配列がＧＣではなくＣＧである点で異なっている。今回開示した配列は、その分離と特徴がＵ．Ｓ．特許出願番号07／808,523に記載されているｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１プラスミドの再配列化により、得られたものである。ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１プラスミドで形質転換されたＥ．コリ ＤＨ５は、１９９２年１０月１日、アメリカ合衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、受託番号ATCC６９０８１が与えられている。
実施例４
若いサイクリング細胞へのＳＤＩ配列群マイクロインジェクション
ＳＤＩ配列群の機能活性を立証するために、マイクロインジェクションを行った。ＳＤＩ−１またはＳＤＩ−２のいずれかを搭載したプラスミドをマーカープラスミドと共に、若いサイクリング細胞の核内へ同時マイクロインジェクションした。生じた青色細胞の標識指数を測定した（表１）。これらのプラスミドは、若い細胞のＤＮＡ合成に強力な阻害活性を示した。対照実験のために、空のベクターを、マーカープラスミドと共に、同時マイクロインジェクションした。これは、標識指数を非インジェクション細胞と比べた場合、わずかに阻害を引き起こしており、トランスフェクション実験では観察される現象でもある。ＳＤＩ−３のマイクロインジェクションは、阻害活性がＳＤＩ−１およびＳＤＩ−２トランスフェクション実験よりも低かったため、行わなかった。
0003865766.tif 000003
実施例５
アンチセンスＤＮＡトランスフェクション
阻害活性が配列指向特異的であるかどうかを試験するために、ＳＤＩ−１およびＳＤＩ−２配列のアンチセンス発現ベクターを構築した。いずれの配列もＢamＨＩ部位を欠いていたこと、また、ＢamＨＩ部位は、ｃＤＮＡの両方の末端に存在した（図１）ことから、これらの配列は、容易に摘出され、反対方向に再連結された。アンチセンス配列のトランスフェクションは、結果的に若い細胞におけるＤＮＡ合成を阻害しなかった（図３）。加えて、何等増大も観察されなかった。その結果は、明らかに、ＳＤＩ活性の配列指向特異性を示しており、また、ｃＤＮＡ配列群によりコードされる特異的遺伝子産物群の存在を示唆している。
実施例６
細胞老化中のＳＤＩ ｍＲＮＡの発現
細胞老化中のＳＤＩ ｍＲＮＡ発現における変化を調べるために、若い細胞および老化細胞由来の総ＲＮＡを３２Ｐ−標識ＳＤＩ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このＳＤＩ−１プローブは、２．１kb細胞転写物とハイブリダイズし、ＳＤＩ−２は１．４kb転写物とハイブリダイズし、ＳＤＩ−３は２．５kb転写物とハイブリダイズした（表２）。表２は、若い細胞（Ｙ）と老化細胞（Ｓ）におけるＳＤＩ遺伝子発現の総ＲＮＡノーザン定量分析値を与えるものである。若い細胞および老化細胞由来の総ＲＮＡの各５μgをＳＤＩプローブとハイブリダイズさせた。フィルターは、繰り返し、放射性活性プローブから剥がして、内部対照としてプローブと再ハイブリダイズさせた。各試料におけるＳＤＩ ｍＲＮＡの相対量は、同じフィルター上に検出されるＧＡＰＤＨ量と、ＳＤＩ／ＧＡＰＤＨの相対量により標準化された。
0003865766.tif 000004
細胞老化中、ＳＤＩ−１情報は約３倍増加したが、一方ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３情報は３倍減少した。同じフィルターをβ−アクチンと再ハイブリダイズさせ、次いで内部対照としてＧＡＰＤＨプローブと再ハイブリダイズさせた。その結果は、いずれの対照遺伝子の発現も細胞老化中に、約３倍減少したことを示していた。以前の研究では、細胞老化中β−アクチン発現が２−３倍減少することが観察されている（クマザキ，Ｔ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、１３−１９頁（１９９１年）；セシャドリ，Ｔ．およびキャンピシ，Ｊ．、サイエンス、２４７巻、２０５−２０９頁（１９９０年）；ファース，Ｊ．Ｊ．、ジャーナル・オブ・ゲロントロジー、４６巻、Ｂ１２２−１２４頁（１９９１年））。老化細胞においてβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現がいずれも減少したことから、ノーザン分析用にポリＡ＋ＲＮＡを使用することになった。ポリＡ＋ＲＮＡを、表２で用いられた総細胞ＲＮＡ調製物から分離し、ＳＤＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、続いてβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨそれぞれとプローブした（表３）。表３は、若い細胞（Ｙ）と老化細胞（Ｓ）におけるＳＤＩ遺伝子発現のポリＡ＋ＲＮＡノーザン分析の結果を開示するものである。若い細胞と老化細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１μgを分析に用いた。各試料におけるＳＤＩ ｍＲＮＡの相対量は表２のように計算した。
0003865766.tif 000005
その結果は、明らかに、β−アクチンとＧＡＰＤＨの両方の発現は、それらをｍＲＮＡに基づき比較した場合、以前の観察に一致して、若い細胞と老化細胞とで等しいことを示した。ＳＤＩ遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで比較した場合、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡは、老化細胞では１１倍増加し、それに対し、ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３の発現は、イン・ビトロでの寿命を通して一定に保たれた（表３）。この結果は、ＳＤＩ−１が老化細胞特異的ＤＮＡ合成阻害因子であり、それに対し、ＳＤＩ−２とＳＤＩ−３は、細胞サイクル調節に関係するより一般的な阻害因子であることがほぼ間違いないと思われる。
実施例７
細胞老化中のポリＡ ＲＮＡ含量の変化
ポリＡ＋ＲＮＡノーザン分析対総ＲＮＡノーザン分析の結果が定量的に異なるという観察は、総ＲＮＡ調製物中のポリＡ＋ＲＮＡ含量が、細胞老化中に変化したのかも知れないことを示した。この仮説を試験するために、細胞を連続的に培養し、総ＲＮＡを異なる集団倍加レベルで集めた。ポリＡ＋ＲＮＡは、各試料から分離された。
結果は明らかにポリＡ＋ＲＮＡ含量が細胞老化中に次第に減少したことを示していた（図４）。図４では、細胞を連続的に培養し、総ＲＮＡを集めた。ポリＡ＋ＲＮＡ：総ＲＮＡ％を培養齢（イン・ビトロでの寿命終了％）に対してプロットした。老化細胞は、非常に若い細胞と比較した場合、３−４倍少ないポリＡ＋ＲＮＡを有していた。しかしながら、細胞当たりの総ＲＮＡ含量を計算した場合、老化細胞は、若い細胞より１．３−１．５倍多く有していた（クリストファロ，Ｖ．Ｊ．およびクリチェフスキー，Ｄ．、メディカル・イクスペリメンス、１９巻、３１３−３２０頁（１９６９年）参照）。
ＳＤＩ−１情報が継代培養中、次第に増加するのかどうか、また、迅速な増加が、イン・ビトロでの寿命の終了する間際に起こるのかどうかを判定するために、異集団倍加での培養物由来のポリＡ＋ＲＮＡを32Ｐ標識ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。この分析から、ＳＤＩ−１発現は、培養物が老化するにつれて増加し、最期の数パーセント中に大きく変化することが明らかになった（表４）。表４は、細胞加齢過程中のＳＤＩ−１ ＲＮＡの蓄積を示している。異集団倍加の細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１μgをＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。各試料中のＳＤＩ−１ｍＲＮＡ相対量は、表２と同様に計算した。
0003865766.tif 000006
静止中のＳＤＩ−１発現における変化もまた調べた。若い静止細胞を０．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有培地中に、３週間まで保持した。総ＲＮＡを各週集め、ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズするＲＮＡ量を分析した。ＳＤＩ−１情報は、細胞静止中顕著に増加した（表５）。表５は、細胞静止中のＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの蓄積を示している。０．５％ＦＢＳ含有培地で１、２、３週間培養した若い細胞から得られた総ＲＮＡの各４μgを、ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの相対量は、表２と同様に計算した（Ｃ：１０％ＦＢＳ培地での対照培養）。その結果をＧＡＰＤＨ発現に対して標準化すると、ＳＤＩ−１発現は、２週間後、１０％ＦＢＳ培地における対照分配培養の値と比較して低血清培地で１８倍増加したことが見い出された。
0003865766.tif 000007
ｍＲＮＡ対総ＲＮＡの細胞表現（cellular representation）が、細胞老化中に変化することが見い出された事実は、重要である。イン・ビトロでの加齢の過程中に、細胞当たりの総ＲＮＡが僅かに増加するにも拘わらず、ｍＲＮＡ含量は、次第に減少することが分かった（図４）。この現象は、細胞加齢の過程中、全遺伝子発現が次第に低下することを示しており、また、ノーザンブロット分析を総ＲＮＡで行った場合に、老化細胞においてβ−アクチンとＧＡＰＤＨ遺伝子の発現が低下したことを説明するものである（表２）。しかしながら、若い細胞と老化細胞の間のこれらのハウスキーピング遺伝子（housekeeping genes）の発現レベルは、ノーザンブロット分析をポリＡ＋ＲＮＡで行った場合では、ほとんど一定であった（表３）。この分析により、ＳＤＩ−１情報は、老化細胞において強力に発現し、ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３遺伝子はイン・ビトロでの寿命を通して変化無く発現することが明らかになった。
実施例８
ＳＤＩ−１遺伝子
ＳＤＩ−１遺伝子は、老化細胞特異的ＤＮＡ合成阻害因子をコードする。この遺伝子の発現増加は、細胞がそれらの最終の数分裂期に入った時に起こる（表４）。発現動態は、老化細胞の表現型発現とよく相関している。ＳＤＩ−１遺伝子発現もまた、若い細胞を血清欠乏により静止させ、分裂しないようにした後に、増加することが見い出された。この結果は、老化と同じく細胞静止のＤＮＡ合成阻害においてもこの遺伝子が関与することを示している。血清成長因子の欠乏により静止状態にされた細胞が、老化細胞由来の阻害因子と同様の特徴を持つＤＮＡ合成阻害因子を生産することが示されている（ペレイラ−スミス，Ｏ．Ｍ．等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５年）；ステイン，Ｇ．Ｈ．およびアトキンス，Ｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８３巻、９０３０−９０３４頁（１９８６年））。
ＳＤＩ−１発現が老化中および静止中のいずれもで増加するという事実は、それがＤＮＡ合成阻害因子であることを示している（スミス，Ｊ．Ｒ．、ジャーナル・オブ・ゲロントロジー、４５巻、Ｂ３２−３５頁（１９９０年）；本明細書に参照して組み込んである）。あるいは、ＳＤＩ−１配列群は、最近マウス細胞からクローン化された成長停止に特異的な遺伝子群と関係があるかも知れない（シュナイダー，Ｃ．等、セル、５４巻、７８７−７９３頁（１９８８年）；マンフィオレッチ，Ｇ．等、モレキュラー・セル・バイオロジー、１０巻、２９２４−２９３０頁（１９９０年））。
実施例９
ＳＤＩ−１遺伝子産物の発現
２種の異なる細胞性発現系において発現されたＳＤＩ−１ ｃＤＮＡを、イン・ビトロで転写させ、２種の異なるイン・ビトロ系で翻訳させた。２種の細菌性発現系は、十分量のＳＤＩ−１タンパク質を得る確率を最大限にするために用いた。第一の発現系では、ＳＤＩ−１タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として、細菌培養物のリットル当たり５−１０μgの収率で発現した。組換えタンパク質をトロンビンで切断し、精製して、数個の余分なアミノ酸を持つＳＤＩ−１タンパク質を得ることが出来た。第二の発現系では、精製を助けるために６ヒスチジンアミノ末端部（terminal tag）を利用した。この組換えタンパク質は、更に手を加えること無く、使用できる。いずれの系でも、純粋なタンパク質調製物を分離可能であった。
この実験の過程では、イン・ビトロでの転写および翻訳系を用いて、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡの核酸配列から演繹される転写解読枠（open reading frame）を確認した。ＳＤＩ−１タンパク質の計算による分子量は、約１６，０００ダルトンである。イン・ビトロで合成されたタンパク質は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、約２１，０００ダルトンの相対移動度で移動する。この小さな違いは、ＳＤＩ−１の僅かに異常な電荷またはコンホーメーションが原因であり得る。細菌的に発現したタンパク質の部分的なアミノ酸配列は、転写解読枠を立証するものであった（配列番号２）。
細菌的に発現したタンパク質は、無傷の天然タンパク質に対するポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を発生させるために用いられた。このような抗体は、ＳＤＩ−１タンパク質およびＳＤＩ−１タンパク質複合体（complex）の免疫沈降において、合成ペプチドから生産された抗血清よりも効果的であり得る。予備的な免疫細胞化学研究は、１：２０，０００希釈でのウエスタン・トランスファ（a western transfer）で融合タンパク質と強力に反応する最も高親和性の抗血清（抗血清ナンバー５５）を用いて、ＳＤＩ−１タンパク質が、分裂中の若い細胞と比較して老化細胞において相対的に豊富であることを示唆した。老化細胞において、その位置は、核周囲であるように見えるのに対し、若い細胞では、核内に位置した少量のＳＤＩ−１タンパク質であるように見える。特異的に染色させるには、検出可能なレベルのＳＤＩ−１ ｍＲＮＡを発現しない細胞（ＴＥ８５）の固定化細胞単層に対する抗血清を前以て吸収する必要があった。当該細胞は、４％パラホルムアルデヒド、次にメタノールで固定した。
通常、低レベルで遺伝子を発現する細胞において引き起こされたＳＤＩ−１  ｍＲＮＡの発現から生じる細胞表現型を研究し、アンチセンスＳＤＩ−１構築物の効果を調べるためには、ＳＤＩ−１遺伝子が誘導プロモーターの制御下、安定に調整される細胞ラインを得ることが望ましい。この目的のために、メタロチオニンプロモーターの制御下、ＳＤＩ−１を含有する機能的ベクターを構築した。この構築物を若い増殖コンピテント細胞にトランスフェクションした後、１００μM塩化亜鉛と２μM塩化カドミウムの存在下でインキュベーションして、ＤＮＡ合成の開始を約５０％まで阻害した。金属の不存在下では、ＤＮＡ合成の阻害は無かった。対照ベクター（ｐｃＤＳＲα）と共にトランスフェクションし、金属の存在下で成長させた細胞は、金属の不存在下で成長させた同じプラスミドと共にトランスフェクションした細胞の約９０％のＤＮＡ合成能力を有することが見い出されていることから、観察された阻害活性は、金属毒性が原因ではない。
ＳＤＩ−１で観察された阻害効果が発現を駆動するために用いられた特定のプロモーターの性質に関連していないことを示すために、他のプロモーターから発現された、ＳＤＩ−１のＤＮＡ合成阻害能力を調査した。それ故に、若い増殖性ヒト繊維芽細胞をＣＭＶ−β−galおよびＣＭＶ−ＳＤＩ−１と共に同時トランスフェクションした。ＣＭＶ−β−galと細胞のトランスフェクションは、ＤＮＡ合成にほとんど影響しなかったが、一方、ＣＭＶ−ＳＤＩ−１は、これらの特定の実験におけるｐｃＤＳＲαベクターでのＳＤＩ−１よりも効果的でさえあった。
ＳＶ４０ラージＴ抗原は、老化細胞を誘導してＤＮＡを合成させる能力がある。それ故に、ＳＤＩ−１の阻害作用が、Ｔ抗原の発現により克服され得るかどうかを決定することは、興味深いものであった。更に、ＳＤＩ−１の作用が細胞における一般的な代謝不均衡の誘導のせいではないことを決定することが望まれていた。もし、そうであれば、誰もラージＴ抗原がその効果と拮抗するとは予想しないであろう。これらの理由により、細胞を、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡ、およびＴ抗原がその中でＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクターと共に同時トランスフェクションした。このような同時トランスフェクション実験により、ＳＤＩ−１の阻害活性は、ＳＶ４０ラージＴ抗原の同時発現により大幅に破壊されることが明らかになった。
一時的トランスフェクションアッセイ（Transient transfection assays）は、追加のヒト正常繊維芽細胞細胞ライン（新生児包皮細胞ライン（ＣＳＣ３０３））およびＷＩ３８イモータル細胞ライン（immortal cell line）を用いて実施し、ＳＤＩ−１の大部分の阻害効果の普遍性を判定した。いずれの場合でも、かなりの阻害（４０−５０％）が観察された。更に、ＳＤＩ−１は、ＳＶ４０形質転換細胞ラインＧＭ６３９またはヘラ細胞（＜２０％）だけでなくＳＵＳＭＩ（４０％）を阻害することが分かった。ここまでの結果は、ヘラ細胞およびＳＶ４０ウイルスで形質転換された細胞が老化細胞と融合することによって阻害されないという、ヘテロカリオン実験から得られた以前の結果と一致している。このことは、ＳＤＩ−１が、老化細胞において以前に検出された阻害因子と同様の挙動をすることの更なる証拠を与えるものである。
実施例１０
ＳＤＩ−１遺伝子のサザン分析
ＳＤＩ−１の不存在または不活性が不定分裂に対する４種の相補グループのいずれかにおける細胞不滅性の要因なのかどうかを判定するために、染色体ＤＮＡとｍＲＮＡを４種のグループを代表する細胞ラインから調べた。サザン分析により、Ｅco ＲＩでの消化後、予想された５および１０kbバンドが明らかになった。それ故に、これらの細胞ラインのＳＤＩ−１遺伝子中では大きな欠失または転位は全く起っていない。ノーザン分析により、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡは、相補グループＢおよびＣに割り当てられている細胞ライン中においては、少量かまたは存在しないことが測定された。ＳＤＩ−１は、相補グループＡおよびＤを代表する細胞ラインにおいては、より高いレベルで存在した。この結果は、細胞ラインが細胞老化をのがれ得るような機構の一部が、活性ＳＤＩ−１遺伝子の充分なレベルを発現する能力の欠損によることを示唆している。
当該発明は、それらの特定の実施態様に関連して記載されているが、それは更に修飾出来、またこの出願は、一般に、当該発明の原理に従い、また当該発明が属する技術分野の公知または慣用の範囲に属するような、および以上に述べた本質的な特徴に適用され得るような、更に添付の請求範囲に従うような、本開示からの発展を含む、当該発明のどのような変形、使用または適用にも及ぶことを意図していると理解されるであろう。
配列表
（１）  一般的情報：
（ｉ）  特許出願人：ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン
（ii）  発明の名称：老化細胞由来ＤＮＡ合成阻害因子
（iii）  配列の数：２
（iv）  連絡先：
（Ａ）  名宛人：ヴァイル、ゴツチャル・アンド・メンジェス
（Ｂ）  通り：エヌ・ダブリュー、エル・ストリート、１６１５番地
（Ｃ）  市：ワシントン
（Ｄ）  州：ディー・シー
（Ｅ）  国：アメリカ合衆国
（Ｆ）  ＺＩＰ：２００３６
（ｖ）  コンピューター解読書式：
（Ａ）  媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ）  コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパティブル
（Ｃ）  オペレーティング・システム：ＰＣ−ＭＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）  ソフトウエア：PatentIn Release #１．０、Version #１．２５
（vi）  本出願のデータ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（Ｃ）  分類：
（vii）  優先権出願データ
（Ａ）  出願番号：US 07／808,523
（Ｂ）  出願日：１９９１年１２月１６日
（viii）  弁理士／代理人情報：
（Ａ）  氏名：オイエルバッハ、ジェフリー・アイ
（Ｂ）  登録番号：３２，６８０
（Ｃ）  参照／整理番号：２２５−１０２−ＣＩＰ
（ix）  電話連絡先情報：
（Ａ）  電話番号：（２０２）６８２−７０３３
（Ｂ）  ファックス番号：（２０２）８５７−０９３９
（２）  配列番号１の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２１０６塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）  ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）  アンチセンス：Ｎｏ
（vi）  起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス
（Ｂ）細胞の種類：老化ヒト細胞
（vii）  直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー
（Ｂ）クローン名：ＳＤＩ−１
（xi）  配列：配列番号１：
0003865766.tif 000008
0003865766.tif 000009
（２）  配列番号２の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：１６４アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：タンパク質
（iii）  ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）  アンチセンス：Ｎｏ
（vi）  起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス
（Ｂ）ストレイン：ＳＤＩ−１
（vii）  直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー
（xi）  配列：配列番号２：
0003865766.tif 000010
【図１】
0003865766.tif 000011
【図２Ａ】
0003865766.tif 000012
【図２Ｂ】
0003865766.tif 000013
【図２Ｃ】
0003865766.tif 000014
【図３】
0003865766.tif 000015
【図４】
0003865766.tif 000016
【図５Ａ】
0003865766.tif 000017
【図５Ｂ】
0003865766.tif 000018
【図５Ｃ】
0003865766.tif 000019
【図５Ｄ】
0003865766.tif 000020