(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物の検出/識別用培地であって、反応培地と、少なくとも1種の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質を含むタイプであり(ただし、4-[2-(4-オクタノイルオキシ-3,5-ジメトキシフェニル)ビニル]キノリニウム-1-(プロパン-3-イル-カルボン酸)カチオンおよびアニオンを含む基質を除く)、この検出/識別は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、前記培地は、
*保存に対して安定な、すぐに使用できる液体状またはゲル状であり、かつ、
*乳化安定化剤として、培地中における脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)の濃度が０．５重量％≦[FASE]≦５重量％となるような量の少なくとも1種類の脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)またはFASE/脂肪酸(FA)混合物および、
アルコール、アミド、含硫黄溶媒、およびこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも1種類の溶媒(S)
を含み、
前記FASEが、以下のもの:
-エチレンオキシド(EO)を20単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート(TWEEN(登録商標)20);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート(20EO)(TWEEN(登録商標)60);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート(20EO)(TWEEN(登録商標)80);および
-これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする培地。
【請求項２】
前記溶媒(S)が、メタノール、エタノール、およびメトキシエタノール；ジメチルホルムアミド(DMF)；ジメチルスルホキシド(DMSO)；およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の培地。
【請求項３】
基質を溶媒S中に含む少なくとも1種類のストック溶液を、FASE、またはFASE/FA混合物および培養培地の少なくともいくつかの成分と混合することにより得られることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
FAがC4〜C20の飽和または不飽和脂肪酸、およびこれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
さらに、少なくとも1種類のアニオン界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
前記アニオン界面活性剤が、7-エチル-2-メチル-4-ウンデシルハイドロジェンスルフェートまたはその塩類であることを特徴とする請求項５に記載の培地。
【請求項７】
前記アニオン界面活性剤が、7-エチル-2-メチル-4-ウンデシルハイドロジェンスルフェートのナトリウム塩類(TERGITOL-4(登録商標))であることを特徴とする請求項６に記載の培地。
【請求項８】
色原性または蛍光原性基質が、酵素の標的部分および発色団または蛍光団部分からなり、その標的部分が下記のもの:
-蛍光団または発色団部分の水酸基にαまたはβ位置で結合している単糖、二糖および/または多糖単位からなる配糖体;
-α-アミノ酸またはペプチド;
-有機酸;および
-硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩およびホスホジエステル
を含む群から選択され、
その発色団または蛍光団部分が下記のもの:
-キノン/アントラキノンおよび誘導体;
-アミノ-およびヒドロキシ-クマリンおよび誘導体;
-フルオレセインおよび誘導体;ならびに
-インドキシルおよび誘導体
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
前記有機酸が-O-CO(CH2)n-CH3(式中、nは0と20の間)であることを特徴とする、請求項８記載の培地。
【請求項１０】
前記アントラキノン誘導体がジヒドロキシアントラキノン(アリザリン)であることを特徴とする請求項８記載の培地。
【請求項１１】
脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)の溶媒(S)に対する重量比が、20:80と80:20の間であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
培地中の基質の濃度(mg/l)が、1≦[基質]≦2000の通り定義されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
その培養培地が、以下のもの:
-マッコンキー、コロンビアANC、PALCAMおよびサブローゲンタマイシン-クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地;および
-コロンビア+/-血液、トリプカーゼ大豆、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１４】
検出/識別されるべき微生物が、医学上または産業上の関心がもたれる微生物であることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
前記微生物が、サルモネラ属、シュードモナス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属またはカンジダ属に属するものであることを特徴とする請求項１４に記載の培地。
【請求項１６】
-溶媒S中に含まれる色原性または蛍光原性エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質、およびFASE、またはFASE/FA混合物の少なくとも1種類から少なくとも1種類のストック溶液を調製すること;
-培養培地に前記溶液および他の添加物を添加すること;ならびに
-全体を均質化すること
からなることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を得る方法。
【請求項１７】
-分析しようとするバクテリアを請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地または請求項１６に記載の方法で得られる培地に接種すること;
-接種した培地を適当な条件下にインキュベートすること;および
-バクテリアによる基質の加水分解を明らかにするコロニー周辺の発色を読み取り/解釈すること
からなることを特徴とするエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性を有する菌株の検出/識別方法。
【請求項１８】
エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物の検出/識別用培地(液体またはゲル)の乳化安定化剤としての、脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)、またはFASE/脂肪酸(FA)の使用であって、前記培地は培養培地と少なくとも1種類の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質(ただし、4-[2-(4-オクタノイルオキシ-3,5-ジメトキシフェニル)ビニル]キノリニウム-1-(プロパン-3-イル)カルボキシレートおよびアニオンを含む基質を除く)とを、前記培地中に存在する色原性または蛍光原性エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質用の少なくとも1種類の溶媒Sであって、アルコール、アミド、含硫黄溶媒、およびこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも1種類の溶媒と組み合わせて含み、前記培地中におけるFASEの濃度が０．５重量％≦[FASE]≦５重量％となるような量であり、
前記FASEが、以下のもの:
-エチレンオキシド(EO)を20単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート(TWEEN(登録商標)20);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート(20EO)(TWEEN(登録商標)60);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート(20EO)(TWEEN(登録商標)80);および
-これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１９】
前記溶媒(S)が、メタノール、エタノール、およびメトキシエタノール；ジメチルホルムアミド(DMF)；ジメチルスルホキシド(DMSO)；およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生化学的手段による微生物の分析、特に反応培地(特に栄養培地)の接種によるバクテリア菌株の検出および識別の分野である。後者は、標的菌株に特異的な酵素と反応し得る色原性または蛍光原性基質を含み、問題となる各コロニーについて発色または蛍光を生じる。
【０００２】
本発明の枠内において特により興味深い点は、医療環境におけるか産業環境におけるかを問わず、病原性の微生物または品質を示す微生物、より特定して言えば、エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼタイプの酵素活性を有する微生物、例えば、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、リステリア(Listeria)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)およびカンジダ(Candida)属のバクテリアまたは酵母、特に、大腸菌(Escherichia coli)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)およびカンジダアルビカンス(Candida albicans)を検出/識別することである。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌の菌株の存在は、多くの場合、β-グルクロニダーゼやβ-ガラクトシダーゼ活性などのオシダーゼタイプの酵素活性を明らかにすることによって示される。
【０００４】
同様に、リステリア属は、β-グルコシダーゼ活性の存在を明らかにすることにより検出される。
【０００５】
アミノペプチダーゼ活性も、微生物のグループ、属または種を明らかにするために利用できる。例えば、アラニンアミノペプチダーゼ活性により、グラム陰性バクテリアとグラム陽性バクテリアとを区別することが可能である。
【０００６】
サルモネラ属の菌(これは人間において様々な感染症(腸チフス、食中毒)の原因となる)は、色原性(例えばインジゴ生成性)合成基質を加水分解可能な非特異的エステラーゼを有する。
【０００７】
サルモネラ属、より一般的にはエステラーゼ活性を有するバクテリアの検出/識別は、従来、エステラーゼ活性を有する疑いのあるバクテリア(特にサルモネラ属)のコロニーの検出/識別が可能なゲロース(gelose)分離培地上または液体分離培地上で行われている。こうした培地への接種は、分析する試料に前述の培地を浸漬するか、または試料を培地に接触させることによって行われる。
【０００８】
エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼ活性を有するバクテリアは、それらの酵素遺伝子型において、培地中に存在する基質の標的結合を開裂させ、この結果、前述の基質の一部である活性化された発色団または発蛍光部分を放出させる。この結果、発色または蛍光が生じて加水分解が起こったことがわかり、したがって、標的バクテリアまたは標的バクテリアのコロニーの存在が明らかになる。
【０００９】
ルーチン化された試験を大規模に実行できるようにするためには、検出/識別培地が安定で、対応する検出/識別方法を操作を制限することにより可能な限り単純化する必要がある。また、その方法が高感度(発色の高い強度)で一次オーダーの特異性を示すことが重要である。前述の酵素活性を示すバクテリアの検出/識別用のこれらのタイプの培地および方法の別の基本的パラメーターは、疑わしいコロニーが明らかにされる割合である。
【００１０】
一方、エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼなどの酵素基質は、これらの活性を有する微生物(特にバクテリア)の培養培地と適合性の問題を示すことが知られている。さらに、このような基質は経時的に安定していないが、これは問題の酵素活性に対する感度が保存時間とともに減少することを意味する。
【００１１】
こうした情況の中で、「Synthese de substrats indigogeniques. Mise en evidence de l'activite esterasique des salmonelles」(「インジゴ生成性基質の合成。サルモネラ属のエステラーゼ活性の証明」)と題する学術論文(A. Agban他、Eur. J. Med. Chem. (1990) 25、697-699)は、インジゴ生成基質、すなわち特にペラルゴン酸5-ブロモインドキシル(C9)、および胆汁酸塩、すなわちデオキシコール酸ナトリウムを含むゲロース培養培地を開示する。このような培養培地は、特許文献仏国特許第2 697 028号について後述するのと同じ欠点がある。
【００１２】
仏国特許第2 697 028号は、胆汁酸塩(デオキシコール酸ナトリウム)から選択される界面活性剤とともに、インドール基を有するカプリル酸エステル(カプリル酸5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル)からなる色原性エステラーゼ基質を含む、サルモネラ属の菌の存在を明らかにするために培養培地を開示する。この色原体およびこの胆汁酸塩は、サルモネラ属の菌の成長を可能にする栄養培地に含まれている。仏国特許第2 697 028号が教えるところによれば、胆汁酸塩は、既にエステラーゼ基質を含んでいる選択培地に直接加えられる。
【００１３】
胆汁酸塩類の使用に伴う別の問題は、それらが動物起源の出発原料であるという事実(このため品質にある程度の変動が避けられない)に起因する。
【００１４】
さらに、生物学的活性の面で結果の改善をなし得る。
【００１５】
この培養培地は、エステラーゼ基質の安定性の点ですべての望ましい保証を与えるものではない。さらに、後者は、培養培地との混和が不完全であることが分かる(これは、感度、迅速性および安定性の点から見て、得られる結果の質を明らかに落とすものである)。
【００１６】
仏国特許第2 697 028号による培養培地が粉末状であることも注意すべきである。これは、液体またはゲル培地を再構成するために、利用者がまず操作を行わなければならないことを意味する。こうした拘束条件は使用するエステラーゼ基質が安定性に欠けている結果である。さらに、仏国特許第2 697 028号の教えるところによって調製されたゲロース培地は半透明ではなく、この結果、標的バクテリアのいずれかのコロニーに伴う発色を読み誤る危険がある。
【００１７】
PCT特許出願WO-92/17607は、TERGITOL-4(登録商標)(7-エチル-2-メチル-4-ウンデカノエートハイドロジェンスルフェートまたはそのナトリウム塩)を含むサルモネラ属の菌の検出用培地に関する。この添加剤は、サルモネラ属を標的とする検出培地の選択性を改善するとされている。TERGITOL-4(登録商標)の濃度は、寒天ゲロース/キシロース/リジンを基礎とする培養培地中2〜30ml/lで変えることができる。前述の文献によれば、サルモネラ属の菌の検出はもっぱら競争による選択的成長の原理に基づく。
【００１８】
PCT特許出願WO-99/41409は、サルモネラ属の菌を検出するための色原性エステラーゼ基質に関する。
【００１９】
前記文献は、サルモネラ属の菌に特異的なエステラーゼ/リパーゼと反応し、C8脂肪酸エステルへの親和性を有する色原性化合物の使用を提案する。問題の色原性化合物は式[4-[2-(4-オクタノイルオキシ-3,5-ジメトキシフェニル)ビニル]キノリニウム-1-(プロパン-3-イル)カルボキシレート]＋[臭化物または塩化物イオン]−のアニオンとカチオンを含む。より正確には、使用される基質は、カルボキシレートカチオンの、例えばC8エステルである。
【００２０】
WO-99/41409による方法は、ソルビタン脂肪酸エステル(特にモノラウリン酸エステルTWEEN(登録商標)20)の使用についても記載している。これらの製品は、培地1リットル当たり2gの割合で界面活性剤として使用される。
【００２１】
さらに、このPCT特許出願の教示による特異的基質は、メタノール、エタノールまたはN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)との混合物として栄養培養培地に導入できる。界面活性剤を使用する場合には、基質および溶媒と同時にではなく別個に導入する。
【００２２】
いずれにせよ、WO-99/41409に開示された手段は、検出培地に含まれる酵素基質の安定性を改良するものとして提供されてはいない。
【００２３】
さらに、様々な文献が、1つの酵素活性の検出のためにいくつかの基質を含む培養培地、および種々の酵素活性の検出のために数種類の基質を含む培養培地を開示している。
【００２４】
例えば、特許文献WO-95/04157は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルガラクトシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルグルクロニド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルグルコシドまたは6-クロロ-3-インドキシルガラクトシドなどの種々の色原性オシダーゼ基質を含む培養培地について記載している。このような培地は、特に大腸菌Escherichia coli種と他の大腸菌類(coliform)バクテリアを区別するために使用される。
【００２５】
前記文献は、オシダーゼとホスファターゼのような異なる酵素に特異的な色原性基質を含む培地についても記載している。これらの基質の例は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルN-アセチルグルコサミニドおよび5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシルホスフェートである。このような培地は、特に、カンジダアルビカンスとカンジダ属の他の酵母の区別を可能にする。
【００２６】
特許文献WO-00/53799は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)検出用の色原性培地について記載している。この培地は、2つの色原性基質の組合せ、特に5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシグルコシドおよび5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシルホスフェートを含んでいる。このような培地の主たる意義は擬陽性または擬陰性を避け、黄色ブドウ球菌と他の種またはストレプトコッカス属を区別することである。
【００２７】
しかし、特許文献WO-95/04157およびWO-00/53799には、記載された培地が、培地に含まれる酵素基質の安定性を改善するために開発されたものであることを示す点は全くない。
【００２８】
脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)は特に食物および医薬調剤において広く使用される既知の界面活性剤である。一例としては、DICKINSONらによる論文「J. Colloid Interface Sci. 1999 Apr. 15; 212 (2): 466-473」を挙げることができるであろう。これは、カゼイン酸ナトリウムとエチレンオキシドを20単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート(TWEEN 20)とを含むエマルジョンの安定化に関する。問題のエマルジョンは水中油型エマルジョン(pH6.8でn-テトラデカン30体積%)である。この技術分野は、選択培地上の発色反応によって特異的酵素活性を有するバクテリアを検出する分野からは比較的遠い。
【００２９】
GRAMらによる論文「Clin. Chem. 1985 Oct.; 31 (10); 1683-8」は、抗トロンビンIII検定培地中でのポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート(TWEEN 80)の使用に関するもので、この培地はさらにポリエチレングリコール、トロンビン溶液および合成色原性ペプチド基質も含む。使用される添加剤は、検定の良好な実行を確実にするためのもので、活性トロンビン濃度を増加させるものとして提供されている。ここでもやはり、このタイプの技術的課題は、色原性基質を含む選択的な培養培地を使用して特異的酵素活性を有するバクテリアを検出する培地に特有な課題とは非常に異なったものであると言わざるを得ない。
【特許文献１】仏国特許発明第2 697 028号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
このような技術的な状況において、本発明の本質的な目的のうちの1つは、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有するバクテリアの検出/識別用培地であって、分析感度を最適化するように、すなわち、標的バクテリアの存在を明らかにする発色または蛍光強度を最大にするように構成される培地を提供することである。
【００３１】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別用培地であって、分析対象である試料の接種の前には完全に半透明(translucent)である培地を提供することである。
【００３２】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別用培地であって、エステラーゼ基質および/またはオシダーゼ基質および/またはペプチダーゼ基質および/またはスルファターゼ基質および/またはホスファターゼ基質から選択される少なくとも1種類の色原性または蛍光原性酵素基質を含み、保存に対して安定な(検出時の発色または蛍光強度を少なくとも数週間、最大レベルに保つ)培地を提供することである。
【００３３】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別用培地であって、液体またはゲル培地を再構成するために液体で再構成しなければならない乾燥粉末の形ではなく、そのまますぐに使用できる形態で存在する培地を提供することである。
【００３４】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別用培地であって、1種または複数の色原性または蛍光原性酵素基質(これは非常に高価である)の含有量が低減された経済的な培地を提供することである。
【００３５】
本発明の別の本質的な目的は、実行が容易でかつ経済的な前記検出/識別培地を得る方法を提供することである。
【００３６】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ、オシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する菌株の検出/識別方法であって、実行が容易(ルーチン試験)で、経済的(試薬の量、取扱性、ラベル、スピード等)で、信頼性を備え、高感度で、特異的かつ再現性のある方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別培地(前記活性を染料または蛍光性の生成物を放出する加水分解反応の結果として明らかにする)における新規な安定化添加物の使用を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
これらおよび他の目的は本発明によって達成され、それは、第一にまたは主として、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアおよび/または酵母の検出/識別用培地に関し、特に反応培地、特に培養培地と、少なくとも1種の色原性または蛍光原性エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質を含むタイプであり(ただし、4-[2-(4-オクタノイルオキシ-3,5-ジメトキシフェニル)ビニル]キノリニウム-1-(プロパン-3-イルカルボン酸)カチオンおよびアニオンを含む基質を除く)、この検出/識別は、本質的に、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、前記培地は、
*安定な、すぐに使用できる液体またはゲル状であり、
*以下のものを含んでいる:
-乳化安定化剤として、少なくとも1種類の脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)または少なくとも1種類の脂肪酸(FA)またはFASE/FA混合物(少なくとも1種類の脂肪酸ソルビタンエステルおよび少なくとも1種類の脂肪酸を含む)および、
-場合によっては少なくとも1種類の溶媒(S)。
【００３９】
本発明による、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアおよび/または酵母の検出/識別用培地は、上記特許文献WO-95/04157およびWO-00/53799に示された培地から得ることができる。
【００４０】
本発明による培地は、すぐに使用でき、安定性の点で問題を示すことなく液体または半流動体(ゲル)状であるという長所を有する。実際、本発明の培地中に含まれるエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質は、比較的急速に劣化する傾向を有することで知られているが、FASE、FAまたはFASE/FA乳化安定添加剤の存在によって安定化される。
【００４１】
これらの添加剤は、場合によっては溶媒Sとの組合せで、一層の利点、すなわち、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質(これらは従来溶解しにくい)に優れた可溶性をもたらす。これにより、接種前には半透明の検出/識別培地を得ることが可能となり、これにより発色または蛍光の結果の読取りが容易になる。
【００４２】
このFASE、FAまたはFASE/FA添加物は比較的廉価であり、操作手順を簡単にし、用いる基質の量を減らし(安定化)、経済的な面で明らかにコストを節減する。
【００４３】
最後に、本発明による手段は、前述の基質の生物学的活性を改良し、それにより、標的コロニーの発色強度を高め特異性を増す。
【００４４】
この乳化安定化剤の特定のクラス、特にFASEを選択したのは発明者によるものであり、これらは、驚くべきこと、また予想外にも、安定性、半透明性、生物学的活性、感度、信頼性および特異性(これらはすべて本発明の生化学的手段による微生物分析に適している)を与える。
【００４５】
本発明の1つの注目すべき特徴によれば、本発明の対象である検出/識別培地は、基質を溶媒S中に含む少なくとも1種類のストック溶液とFASE、FAまたはFASE/FA混合物とを、培養培地の成分のうち少なくともいくつかと混合することにより得られる。
【００４６】
実際、本発明によれば、上記の1種または複数のFASE、FAまたはFASE/FA混合物の存在下にエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質を溶媒Sに可溶化することが重要であると思われる。次いで、FASE、FAまたはFASE/FA基質と溶媒Sのこの混合物を、培養培地の少なくとも一部(それは好ましくは過冷却ゲルの形である)に組み込む。この操作上の特徴により、本発明の手段によりもたらされる有利な結果の最適化が可能となることが見出された。
【００４７】
好ましくは、FASEは以下:
-エチレンオキシド(EO)を20単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート(TWEEN(登録商標)20);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノパルミテート(20EO)(TWEEN(登録商標)40);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート(20EO)(TWEEN(登録商標)60);
-ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート(20EO)(TWEEN(登録商標)65);
-ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート(20EO)(TWEEN(登録商標)80);
-ポリエトキシル化ソルビタンセスキオレエート(20EO)(TWEEN(登録商標)83);
-ポリエトキシル化ソルビタントリオレエート(20EO)(TWEEN(登録商標)85);および
-これらの混合物
を含む群から選択され、FAは、C4〜C20飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはC6〜C11飽和または不飽和脂肪酸、特に好ましくはC8〜C9脂肪酸、およびこれらの混合物を含む群から選択される。
【００４８】
本発明によって特に選択される製品は、非イオン性乳化剤として食品および化粧産業において広く用いられているソルビタンエステルであるが、従来、それらは微生物学的検出/識別培地においてエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質の安定化剤として使用されたことはない。
【００４９】
前述のFASEの親水性親油性バランス(HLB)は、それぞれ8.6、6.7、4.7、2.1、4.3、3.7および1.8.である。
【００５０】
本発明の有利な変形では、上記乳化安定化剤、特にFASEは、少なくとも1種類の相乗性助剤、好ましくは、少なくとも1種類のアニオン性界面活性剤、特に好ましくは7-エチル-2-メチル-4-ウンデシルハイドロジェンスルフェートまたはその塩類、中でも特にそのナトリウム塩類(TERGITOL-4(登録商標))と組み合わせることができる。
【００５１】
このような相乗性助剤の使用は、標的バクテリア中の酵素活性の存在を明らかにすることをより容易にする。この相乗性助剤は乳化安定化剤、特にFASEの優れた補足剤である。それは、他の酵素活性の発現を落とさずに、選択性ならびに標的微生物中のエステラーゼおよび/またはオシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性の検出を改善することを可能にし、問題の標的微生物の存在を明らかにするために使用できるであろう。特定の理論に拘束されるものではないが、相乗性助剤TERGITOL-4(登録商標)は、標的微生物の細胞膜を通した色原性または蛍光原性なエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質の浸透や酵素の分泌を容易にし、これにより、その活性が求められる酵素に関するこれらの基質への接近容易性を最適化すると考えられる。これは、使用される基質の量を減らしその結果明らかな経済的利点を導き出すことを可能にする。
【００５２】
さらにより好ましくは、TWEEN(登録商標)とTERGITOL-4(登録商標)の組合せが、本発明による検出/識別培地全般に有効であると思われる。
【００５３】
酵素のための標的部分および発色団または蛍光団部分からなる色原性または蛍光原性基質は、特に、その標的部分を下記を含む群から選択される基質から選択するのが有利である:
-発色団または蛍光団部分の水酸基にαまたはβ位で結合している単糖、二糖および/または多糖単位からなる配糖体;
-α-アミノ酸またはペプチド;
--O-CO(CH２)ｎ-CH３(式中、nは0と20の間)などの有機酸;および
-硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩およびホスホジエステルであり、その発色団または蛍光団部分は、特に下記を含む群から選択される:
-キノン/アントラキノンおよび誘導体、特にジヒドロキシアントラキノン(アリザリン);
-アミノ-およびヒドロキシ-クマリンおよび誘導体;
-フルオレセインおよび誘導体;ならびに
-インドキシルおよび誘導体。
【００５４】
エステラーゼ基質の例として挙げられるのは、インドール、特に5-ブロモ-3-インドリルノナノエート、6-クロロ-3-インドリルノナノエートまたは5-ブロモ-3-インドリルデカノエートに由来する色原性エステル基質である。
【００５５】
2-アリザリンオクタノエートは、アントラキノンから誘導される色原性エステラーゼ基質の例として挙げられる。
【００５６】
オシダーゼ基質の例として挙げられるのは、インドールから誘導される色原性オシダーゼ基質、特に6-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-N-アセチルグルコサミニドまたは5-ブロモ-6-クロロ-α-グルコシドである。
【００５７】
2-アリザリン-β-グルクロニドは、アントラキノンから誘導される色原性オシダーゼ基質の例として挙げられる。
【００５８】
蛍光原性オシダーゼ基質の例として挙げられるのは、ヒドロキシクマリン、特に4-メチルウンベリフェロン-β-グルコシド(4-methylumbelliferone-β-glucoside)である。
【００５９】
インドールに由来する基質としては、色原性ペプチダーゼ基質が挙げられる。
【００６０】
蛍光原性ペプチダーゼ基質は、特にアラニルアミノメチルクマリンなどのヒドロキシクマリンに由来する基質である。
【００６１】
スルファターゼ基質として挙げられるのは、インドール、特に5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルスルフェートに由来する色原性基質である。4-メチルウンベリフェロンスルフェートは蛍光原性スルファターゼ基質の例である。
【００６２】
同様にしてホスファターゼ基質として挙げられるのは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートなどのインドールに由来する色原性基質である。4-メチルウンベリフェロンホスフェートは蛍光原性ホスファターゼ基質の例である。
【００６３】
溶媒Sは、対象とする酵素基質、特に色原性酵素基質を可溶化するための補助剤である。これはまた、乳化安定化剤であるFASE、FAまたはFASE/FAの作用を補足する。したがって、これは好ましくは本発明による培地の構成要素である。
【００６４】
本発明の有利な条件によれば、溶媒Sは以下のものを含む群から選択される:
-アルコール、好ましくはメタノール、エタノールおよびメトキシエタノール;
-アミド、好ましくはジメチルホルムアミド(DMF);
-含硫黄溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド(DMSO);
-水性溶媒、好ましくは水および緩衝水溶液;ならびに
-これらの混合物。
実際上、使用が好ましい溶媒はメタノール、DMFおよびDMSOである。
【００６５】
本発明によれば、脂肪酸ソルビタンエステル(単数または複数)(FASE)の溶媒(S)に対する重量比は、20:80と80:20の間、好ましくは30:70と70:30の間、特に好ましくは40:60または60:40である。
【００６６】
また、量的な観点から言うと、培地中の(FASE)の濃度(重量%)は以下のものとすることが好ましい:
0.1≦[FASE]≦10、
好ましくは0.5≦[FASE]≦5、
特に好ましくは1.5≦[FASE]≦3.5。
培地中で使用する色原性または蛍光原性基質の量はその濃度(mg/l)が以下のように定義されるものである:
1≦[基質]≦2000、
好ましくは5≦[基質]≦1500、
特に好ましくは25≦[基質]≦1000。
【００６７】
FASEと溶媒Sの溶液の中で使用する基質の量は、培地中のその濃度(g/1)が以下のように定義されるものである:
0.5≦[ストック溶液中基質]≦2000、
好ましくは1≦[ストック溶液中基質]≦1000、
特に好ましくは2≦[ストック溶液中基質]≦200。
【００６８】
検出/識別培地中の培養培地については、以下のものを含む群から選択されるように特定し得る:
-マッコンキー(MacConkey)、コロンビアANC(Columbia ANC)、PALCAMおよびサブロー(Sabouraud)ゲンタマイシン-クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地、好ましくはマッコンキー培地;
-コロンビア+/-血液、トリプカーゼ大豆(trypcase soya)、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、好ましくはコロンビア培地。
【００６９】
実際上、当業者は、標的バクテリアにより、および当業者が知悉している完全によく知られた基準によって培養培地を選択するであろう。
【００７０】
以下に限定されるものではないが、本発明による培地は、医学上または産業上の関心がもたれる微生物、特にサルモネラ属、シュードモナス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属またはカンジダ属の検出/識別に特に適していることが判明した。
【００７１】
サルモネラ属バクテリアの検出の場合には、例えば、マッコンキー培地が培地に選択されるであろう。
【００７２】
さらに、本発明による培地は、場合によっては1種または複数の他の酵素基質(例えば色原性または蛍光原性の酵素基質)、ペプトン、1種または複数の成長因子、炭水化物、1種または複数の選択剤、緩衝液、1種または複数のゲル化剤などの他の添加物を含むことができる。
【００７３】
本発明による培地は直ちに使用できる(つまり、チューブもしくはフラスコ中、またはペトリ皿上への接種の準備ができている)液体またはゲル状である。
【００７４】
本発明による培地は、液体またはゲル状で4℃で数週間、容器内に保存できる。
【００７５】
その他の特徴によれば、本発明は、さらに、実質的に以下のことからなることを特徴とする、上に定義されるような培地を得る方法に関係する:
-色原性または蛍光原性エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質を含む溶媒SとFASE、FAまたはFASE/FA混合物の中の少なくとも1種類から少なくとも1種類のストック溶液を調製すること;
-培養培地にこの溶液および他の添加物を添加すること;ならびに
-全体を均質化すること。
【００７６】
ストック溶液は、基質、溶媒SおよびFASE、FAまたはFASE/FA混合物を順次組み合わせ、場合によっては相乗性助剤を加えることにより個別に調製される。生成物および量は上に定義した通りである。
【００７７】
均質化した後、ストック溶液を、水で予め再生しておいた過冷却ゲル培地に加える。培地は非ゲル状の液体培地、例えば栄養スープでもよい。
【００７８】
培養培地とストック溶液とを混合することにより、直ちに接種できる液体またはゲル状検出培地が得られる。
【００７９】
さらに別の特徴によれば、本発明はさらに、下記の操作からなるエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性を有する菌株の検出/識別方法に関する。
-上に定義されるような検出/識別培地製品それ自体に、または上記の方法によって得られた製品に、分析される標的バクテリアを含む試料を接種すること;
-当業者に知られている適切な条件の下で接種した培地をインキュベートすること;および
-それを例えば37℃でオーブンにおいてインキュベートした後に現像したコロニーの発色または蛍光(これらの発色は、色原性または蛍光原性エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質の標的バクテリアによる加水分解を明らかにする)を読み取り/解釈すること。
【００８０】
最後に、本発明は、エステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出/識別用培地(液体またはゲル)の乳化安定化剤として、脂肪酸ソルビタンエステル(FASE)、脂肪酸(FA)またはFASE/FA混合物を使用することに関し、この培地は特に反応培地および少なくとも1種類の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質を含み(ただし、4-[2-(4-オクタノイルオキシ-3,5-ジメトキシフェニル)ビニル]キノリニウム-1-(プロパン-3-イル)カルボキシレートおよびアニオンを含む基質を除く)、場合によっては、色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび/またはオシダーゼおよび/またはペプチダーゼおよび/またはスルファターゼおよび/またはホスファターゼ基質用の少なくとも1種類の溶媒Sを培地に併せて含む。
【００８１】
以下の実施例は、本発明についてのより明瞭な理解をもたらし、その種々の実施形態および実施態様とともにその利点をすべて評価することを可能にするであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
実施例1:ゲル状培地におけるインドキシル系エステラーゼ基質5-ブロモ-3-インドリルノナノエート(色原性エステラーゼ基質)の可溶性試験
様々な基質ストック溶液を、3番胆汁酸塩(bioMerieux)の存在下、メタノールで調製する。次いで、これらの溶液を様々な体積で過冷却されたゲル状培地(すなわちマッコンキー培地)(水で50g/lの濃度に再生成した)に加える。
【００８３】
プロトコルおよび培地の外観を下記表1中に併せて示す。
【００８４】
【表１】
0003990279.tif 000002
【００８５】
光学的に最も均質の培地は3、4および5で、メタノール濃度が最大の培地である。しかし、これらの培地は「乳汁状」の外観を有し、したがって、エステラーゼ基質はエマルジョン状になっているようである。
【００８６】
実施例2:Tween(登録商標)20(FASE)の添加によるエステラーゼ基質の可溶性改善
溶媒Sとしてメタノールを用いて、一方は3番胆汁酸塩の存在下、他方は3番胆汁酸塩およびTween(登録商標)20[エチレンオキシド(EO)を20単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート]の存在下に、2種類の基質ストック溶液を調製する。次いで、基質の最終濃度500mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培養培地(すなわち、マッコンキー培地)に加える。プロトコルおよび培地の外観を下記表2中に併せて示す。
【００８７】
【表２】
0003990279.tif 000003
【００８８】
培地2は培地1より良好な光学的均質性を有する。エステラーゼ基質は完全に溶解するか、またはそのミセル粒子がもはや目に見えないエマルジョンの状態である。
【００８９】
実施例3:前記例に記載する2種類の培地の生物学的試験
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド(McFarland)懸濁液から上記2種類の培地のそれぞれに接種した。ペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを、24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表3に示す。
【００９０】
【表３】
0003990279.tif 000004
【００９１】
したがって、Tween(登録商標)20を含む培地では、エステラーゼ活性を示す微生物の菌株についてより強い発色を得ることが可能になる。したがって、基質はその溶解性が高まる点で、あるいは、それがより容易に利用可能な点でより広く使用される。2種の培地の強度差から見て、Tween(登録商標)20の存在下では使用する基質の濃度を低減し、したがってこの種の基質の使用に要するコストを低減できると思われる。
【００９２】
実施例4:グラム陽性またはグラム陰性バクテリア種および酵母に対する別のインドキシル誘導体(色原性エステラーゼ基質)の溶解性試験
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルオクタノエート(色原性エステラーゼ基質)のストック溶液40g/lを、メタノール(40%)およびTween(登録商標)20(60%)の混合物に調製した。次いで、基質の最終濃度500mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわちコロンビアタイプの培地)に加える。この培地をぺトリ皿に注いだ。
【００９３】
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド懸濁液から接種した。ペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを、24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表4に示す。
【００９４】
【表４】
0003990279.tif 000005
【００９５】
したがって、Tween20の存在下では、その属する群に関わらず、エステラーゼ活性を示すすべての微生物において、エステラーゼ活性の発現を明らかにできる。しかも、この使用態様は調べたインドキシル誘導体(色原性エステラーゼ基質)に依存しない。
【００９６】
実施例5:胆汁酸塩の存在下または不存在下かつTween20存在下で、メタノールを他の溶媒に置換する
前述の実施例で使用したメタノールを2種類の他の溶媒、すなわちジメチルスルホキシド(DMSO)およびジメチルホルムアミド(DMF)に代えた。これら3種類の溶媒を、Tween20が存在する状態、および培地中の最終濃度を6.5g/lとし、胆汁酸塩が存在する状態またはしない状態で試験した。下記の表5は、試験した6種類の培地の構成を示す。
【００９７】
【表５】
0003990279.tif 000006
【００９８】
前記実施例と同様の方法、すなわち、上記溶媒のうちの1種類に溶解したエステラーゼ基質を含むマッコンキーゲロース培地上に接種した微生物の存在下に、基質の活性を確認した。結果を下記表6に示す。
【００９９】
【表６】
0003990279.tif 000007
【０１００】
したがって、Tween20が存在する場合には、エステラーゼ基質を溶解するために様々な溶媒を使用することが可能である。しかも、可溶性の点または生物学的結果では、供試溶媒に関係なく胆汁酸塩の添加は変化をもたらさなかった。最も簡単な溶解方法は、胆汁酸塩をさらに加えることなく、溶媒とTween(登録商標)20を混合することであると結論付けられる。
【０１０１】
実施例6:様々な溶媒S/Tween20比の試験
Tween(登録商標)20の存在下、DMSOを用いて種々の基質ストック溶液を調製した。各ストック溶液は異なるDMSO/Tween(登録商標)20の比に相当する。次いで、基質の最終濃度500mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわち、マッコンキー培地)に加える。下記の表7は、試験した6種類の培地の構成を示す。
【０１０２】
【表７】
0003990279.tif 000008
【０１０３】
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド(McFarland)懸濁液から上記6種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを、24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表8に示す。
【０１０４】
【表８】
0003990279.tif 000009
【０１０５】
試験された6種の比では、良好な基質可溶性が得られ、非常に受容可能な発色強度で基質の加水分解を明らかにすることが可能である。発色の最大強度は、40%DMSO/60%Tween(登録商標)20と60%DMSO/40%Tween(登録商標)20の間で得られる。
【０１０６】
実施例7:インドキシル以外にマーカーを有するエステラーゼ基質に対する可溶化方法の試験
試験した基質は1,2-ジヒドロキシアントラキノンオクタノエート(2-アリザリンオクタノエート)である。溶媒としてDMF、DMSO、メタノールまたはメトキシエタノールを用い、いずれの場合もTween(登録商標)20の存在下で様々な基質ストック溶液を調製する。下記の表9は、それぞれの構成によるストック溶液の外観を示す。
【０１０７】
【表９】
0003990279.tif 000010
【０１０８】
次いで、基質の最終濃度100mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわち、マッコンキー培地)に加える。アリザリン系基質の存在下にエステラーゼ活性を明らかにできるように、最終濃度50mg/lのクエン酸鉄塩も培地に加えた。基質全部の溶解を示すストック溶液の1つのみを試験した(DMFにおけるストック溶液)。出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド懸濁液から上記2種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表10に示す。
【０１０９】
【表１０】
0003990279.tif 000011
【０１１０】
したがって、この溶解方法は、インドキシルエステルに特異的ではないが、特に酵素基質の他のファミリーとともに使用することができる。
【０１１１】
実施例8:エステラーゼ基質5-ブロモ-3-インドリルノナノエートの可溶性に関するTween(登録商標)20に由来する様々なFASEの試験;
様々な基質ストック溶液を、Tween(登録商標)20、Tween(登録商標)80(ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート)、Tween(登録商標)60(ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート)またはTween(登録商標)65(ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート)の存在下、DMSOを用いて調製する。次いで、基質の最終濃度500mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわち、マッコンキー培地)に加える。表11は、試験した培地の構成を示す。
【０１１２】
【表１１】
0003990279.tif 000012
【０１１３】
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド懸濁液から上記6種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を表12に示す。
【０１１４】
【表１２】
0003990279.tif 000013
【０１１５】
注:試験した各Tween(登録商標)について様々なTween(登録商標)/溶媒比を調製した。しかし、調べた比によらず結果は同様であったため、この実施例では1種類の比のみ掲げた。
【０１１６】
Tween(登録商標)20、Tween(登録商標)80およびTween(登録商標)60によれば、良好な基質可溶性が得られ、非常に受容可能な発色強度で基質の加水分解を明らかにすることが可能である。
【０１１７】
実施例9:Tween(登録商標)20存在下で可溶化されたまたは可溶化されていないエステラーゼ基質5-ブロモ-3-インドリルノナノエートを含むゲル状培地の比較安定性
一方は6.5g/lの3番胆汁酸塩の存在下40g/lの濃度のメタノール溶液として、他方はDMSO(40%)およびTween(登録商標)20(60%)の混合物中40g/lの濃度の溶液として、2種類の基質ストック溶液を調製する。基質の最終濃度500mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわち、マッコンキー培地)に加える。これらの2種類の培地を直径90mmのペトリ皿に注ぎ、+4℃で8週間保存した。1週、2週、4週および8週後に、上記の2種の培地を即時使用のために調製した。
【０１１８】
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド懸濁液から即時使用用に調製した上記2種類の培地に接種し、2種の培地は+4℃で保存した。このペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下表に示す。
【０１１９】
【表１３】
0003990279.tif 000014
【０１２０】
【表１４】
0003990279.tif 000015
【０１２１】
【表１５】
0003990279.tif 000016
【０１２２】
【表１６】
0003990279.tif 000017
【０１２３】
メタノールと胆汁酸塩の混合物に溶解した基質を含む培地は、2週間保存後にはエステラーゼ活性の発現に非常に実質的な低下を示す。この低下は時間とともに増幅される。DMSOとTween20の混合物で溶解した基質を含む培地は、少なくとも6週間までエステラーゼ活性の一定の発現を示す。8週後には、わずかながら(決定的なものではない)エステラーゼ活性の発現低下が見られる。したがって、Tween20は、エステラーゼ基質の安定化を可能にし、この種の基質を含む培養培地の保存および使用をより容易にする。
【０１２４】
注:上記の実施例において、菌株の後の数字は、出願人のコレクションにおいて付与された各菌株の整理番号に相当する。発色強度は以下の通り定義された任意スケールに対応する:
0      活性なし
0.1    痕跡程度の発色
0.5    非常に薄い発色
1      低強度だが識別できる発色
2      中強度の明瞭な発色
3      強い発色
4      非常に強い発色
【０１２５】
実施例10:Tween(登録商標)20存在下で可溶化された、または可溶化されていないオシダーゼ基質6-クロロ-3-インドリル-β-N-アセチルグルコサミニドを含むゲル状培地の比較安定性
一方は50g/lの濃度のDMF溶液として、他方はDMF(40%)およびTween(登録商標)20(60%)の混合物中50g/lの濃度の溶液として、2種類の基質ストック溶液を調製した。基質の最終濃度175mg/lに対応する体積を、過冷却したゲル状培地(すなわち、血液不添加のコロンビア培地)に加える。これらの2種類の培地を直径90mmのペトリ皿に注ぎ、+4℃で8週間保存した。3週、6週、9週および12週後に、上記の2種の培地を即時使用のために調製した。
【０１２６】
出願人のコレクション由来の微生物を、3つの四分円隔離によって0.5マックファーランド懸濁液から即時使用用に調製した上記2種類の培地に接種し、2種の培地は+4℃で保存した。このペトリ皿を37℃で48時間インキュベートした。形成されたコロニーを24時間および48時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下表に示す。
【０１２７】
【表１７】
0003990279.tif 000018
【０１２８】
【表１８】
0003990279.tif 000019
【０１２９】
【表１９】
0003990279.tif 000020
【０１３０】
【表２０】
0003990279.tif 000021
【０１３１】
DMFのみに溶解した基質を含む培地は、3週間保存後にはβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の発現に非常に実質的な低下を示す。この低下は時間とともに増幅される。12週間後にはもはや活性は見られない。DMFとTween20の混合物で溶解した基質を含む培地は、少なくとも6週間までβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の一定の発現を示す。9週後および12週後には、わずかながら(決定的なものではない)β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の発現低下が見られる。したがって、Tween20は、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ基質の安定化を可能にし、この種の基質を含む培養培地の保存および使用をより容易にする。
【０１３２】
上記の実施例において、菌株の後の数字は、出願人のコレクションにおいて付与された各菌株の整理番号に相当する。発色強度は以下の通り定義された任意スケールに対応する:
0      活性なし
0.1    痕跡程度の発色
0.5    非常に薄い発色
1      低強度だが識別できる発色
2      中強度の明瞭な発色
3      強い発色
4      非常に強い発色