(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重に蛍光標識された標本に励起光を照射し、前記標本から発せられる蛍光を観察する蛍光顕微鏡装置において、
前記標本から発せられる蛍光の明るさを検出する検出素子と、
前記標本から発せられる蛍光を波長毎に調光する調光手段と、
前記検出素子により検出された波長毎の蛍光の明かるさに基づいて観察される蛍光の明るさが波長毎に等しくなるように前記調光手段を制御する制御手段と、を具備したことを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記調光手段は、光の入射角により分光透過特性が変化するフィルタであることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記調光手段は、特定の波長領域で透過率の異なるフィルタであることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学や生物学の分野において、生物組織などの標本の状態を観察するときに用いられ、特に標本から発せられる複数の波長領域の蛍光を写真撮影する蛍光顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、この種の蛍光顕微鏡装置は、医学や生物学、その他の分野において、生物の組織細胞上で蛍光標識された蛋白や遺伝子などを検出するために用いられる。
【０００３】
特に近年では、標本に蛍光標識した場合、微弱な蛍光しか発しない物質であつても、複数の蛍光標識による多重染色によって他の物質との位置関係を調べるために多用されるようになつている。
【０００４】
最近では、このような多重染色標本を観察するために蛍光顕微鏡装置には、各染色の蛍光の波長を識別するために多重染色用の蛍光ダイクロイックミラーが用いられている。
【０００５】
しかしながら、多重染色の標本の作製時に、蛍光顕微鏡で得られる各蛍光標識による各蛍光の明るさのバランスを取ることは、これら蛍光の明るさを確認することが出ないことから難しいものとなつている。
【０００６】
例えば、特開平８−３２０４３７号公報には、標本の照明光路上に、波長に対して透過特性が可変なフィルターを挿入し、蛍光標識に対する励起光の光量を調整し、各蛍光標識による蛍光の明るさのバランスを取っている。
【０００７】
一方、蛍光顕微鏡装置を用いての蛍光写真撮影では、蛍光の照度が低いため、フィルムが低照度不規則特性を示す照度領域での使用となり、フィルム感度濃度に過不足を生じ、適正な露光による撮影ができない。
【０００８】
特に、蛍光観察時には、蛍光標本がその発光波長にピークを持つように特徴的な色を呈するため、カラーフィルム使用時にはＲ（赤）、Ｇ（緑）、Ｂ（青）の３種類の乳剤層がそれぞれ異なる割合で低照度不軌を起こすので、使用する蛍光色素の色により適正な露出の写真を得られないという問題がある。
【０００９】
このような事から例えば特開平５−１６５０７９号公報では、標本の蛍光波長を検出し、カメラの露出時間を変化させて露出補正を行い、良好な写真撮影を行っている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特開平８−３２０４３７号公報の技術のように各蛍光の明るさのバランスを取る方法では、標本からの観察光を基に人手で各蛍光の明るさのバランスを調整するので、この調整作業に対する熟練が必要であるとともに、人手による作業であることから調整に時間が掛かる。
【００１１】
一般に蛍光色素は、暗くかつ時間経過による褪色が生じ易いので、迅速な作業が要求される。
又、上記特開平５−１６５０７９号公報の技術では、標本から得られる蛍光の明るさを波長毎に検出し露光時間に補正を加えているが、多重染色の標本に対しては、各蛍光波長毎に露光を繰り返し行うので、多重露光を行わなければならず、写真撮影作業に時間が掛かるう上、蛍光色素の褪色の問題も生じる。
【００１２】
そこで本発明は、多重に染色された標本を観察するのに、作業の簡易化を図るとともに標本の褪色を軽減して、各蛍光標識による蛍光の明るさのバランスが取れる蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１によれば、多重に染色された標本に励起光を照射し、前記標本から発せられる蛍光を観察する蛍光顕微鏡装置において、標本から発せられる蛍光の明るさを検出する検出素子と、標本から発せられる蛍光を波長毎に調光する調光手段と、検出素子により検出された波長毎の蛍光の明かるさに基づいて観察される蛍光の明るさが波長毎に等しくなるように調光手段を制御する制御手段とを備えた蛍光顕微鏡装置である。
【００１４】
請求項２によれば、請求項１記載の蛍光顕微鏡装置において、調光手段は、光の入射角により分光透過特性が変化するフィルタである。
請求項３によれば、請求項１記載の蛍光顕微鏡装置において、調光手段は、特定の波長領域で透過率の異なるフィルタである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（１）以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
図１は蛍光顕微鏡装置の構成図である。
照明用の光源１から放射された光の光路上には、ダイクロイックミラー２が配置されている。このダイクロイックミラー２は、光源１から発せられた光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長領域の光のみを反射する作用を有している。
【００１６】
このダイクロイックミラー２の反射光路上には、対物レンズ３が配置されている。この対物レンズ３の集光位置には、各蛍光標識により例えば２重染色された標本４が配置される。
【００１７】
又、ダイクロイックミラー２の標本４からの透過光路上には、クイックリターンミラー５を介してカメラ６が配置されている。このクイックリターンミラー５は、ダイクロイックミラー２の透過光路上に挿入して光路を曲げたり、ダイクロイックミラー２の透過光路上から離脱させて標本４からの標本像をカメラ６側に伝達するものとなっている。
【００１８】
上記光源１とダイクロイックミラー２との間には、調光手段７が配置されている。
この調光手段７は、標本４から発せられる蛍光を波長毎に調光する機能を有するもので、例えば光の入射角により分光透過特性が変化するフィルタ７ａが用いられている。
【００１９】
図２はかかるフィルタの特性を示す図である。このフィルタ７ａは、光源１からの光の進行方向に対して入射角０°又は４５°に設定するように回転自在に設けられ、光線の入射角が０°であれば、光線に対する透過帯域が長波長側になり、光線の入射角が４５°であれば、光線に対する透過帯域が短波長側に移動するものとなっている。
【００２０】
一方、クイックリターンミラー５の反射光路上には、結像レンズ８を介して２次元エリアセンサ９が標本面と共役な位置に配置されている。この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する検出素子としての機能を有している。
【００２１】
制御装置１０は、調光手段７のフィルタ７ａへの入射角を０°と４５°とに設定し、これら入射角のときの２次元エリアセンサ９から出力された各輝度信号を入力し、これら輝度信号から標本４からの蛍光における波長毎の明かるさに基づいて観察される蛍光の明るさが波長毎に等しくなるように調光手段７のフィルタ７ａの角度を制御する機能を有している。
【００２２】
具体的に、この制御装置１０には、メモリ部１１、比較部１２及び出力部１３の各機能が備えられている。このうちメモリ部１１には、２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号が格納されるものとなっている。又、比較部１２には、外部情報入力手段１４が接続されている。
【００２３】
この外部情報入力手段１４には、カメラ６に使用するフィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性を補正するための補正値が格納されている。
上記比較部１２は、調光手段７のフィルタ７ａへの入射角を０°と４５°とにそれぞれ設定したときに２次元エリアセンサ９から出力された各輝度信号を入力し、これら輝度信号において各ピーク値を検出してこれらを比較座標とし、これら比較座標の輝度値が等しければ作業を終了し、かつ等しくなければ出力部１３に対し、フィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性の補正を掛けて調光手段７のフィルタを回転させる指令を与える機能を有している。
【００２４】
この出力部１３は、フィルタ７ａの回転指令を受けると、例えばフィルタが低波長側から長波長側に変化する方向で、かつ一定量の角度づつ回転させる回転駆動信号を調光手段７に送出する機能を有している。
【００２５】
次に上記の如く構成された蛍光顕微鏡装置の作用について図３に示す調光制御のフローチャートに従って説明する。
制御装置１０は、ステップ＃１において、開始スイッチの確認を行い、この開始スイッチがオンになっていれば、制御を開始し、次のステップ＃２で外部情報入力手段１４に格納されているフィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性を補正するための補正値を読み込む。
【００２６】
なお、外部情報入力手段１４にフィルムの指定がない場合には、Ｒ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性の補正は行わない。
次に制御装置１０は、ステップ＃３において、出力部１３から回転駆動信号を調光手段７に送出し、この調光手段７のフィルタ７ａへの入射角が０°になるように設定する。
【００２７】
このようにフィルタ７ａへの入射角が０°に設定すれば、フィルタは、図２に示すように長波長側の透過帯域として作用する。
この状態に、光源１から放射された光は、調光手段７のフィルタ７ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長領域の光のみ励起光として反射する。
【００２８】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３を通して染色された標本４に集光される。
この励起光により標本４では、長波長側に励起波長帯域を持つ色素が励起され、その波長の蛍光が発生する。
【００２９】
この標本４からの蛍光は、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射し、結像レンズ８により例えば図４に示すような標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。
【００３０】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する。
この２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００３１】
比較部１２は、メモリ部１１に格納された輝度信号を読み出し、フィルタ７ａへの入射角を０°としたときの輝度信号におけるピーク値を検出し、このピーク値の座標とを比較座標とする。
【００３２】
例えば、図４に示すＸラインの１ラインに着目すると、この輝度信号におけるピーク値は図５に示すようにＡ点となり、これが比較座標となる。
次に制御装置１０は、ステップ＃４において、出力部１３から回転駆動信号を調光手段７に送出し、この調光手段７のフィルタ７ａへの入射角が４５°になるように設定する。
【００３３】
このようにフィルタ７ａへの入射角が４５°に設定すれば、フィルタは、図２に示すように低波長側の透過帯域として作用する。
この状態に、光源１から放射された光は、上記同様に、調光手段７のフィルタ７ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長領域の光のみ励起光として反射する。
【００３４】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により染色された標本４に集光される。
この励起光により標本４では、低波長側に励起波長帯域を持つ色素が励起され、その波長の蛍光が発生する。
【００３５】
この標本４からの蛍光は、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射し、結像レンズ８により標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。
【００３６】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する。
この２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００３７】
比較部１２は、メモリ部１１に格納された輝度信号を読み出し、フィルタ７ａへの入射角を４５°とたときの輝度信号におけるピーク値を検出し、このピーク値の座標とを比較座標とする。
【００３８】
例えば、図４に示すＸラインの１ラインに着目すると、この輝度信号におけるピーク値は図６に示すようにＢ点となり、これが比較座標となる。
次に比較部１２は、ステップ＃５において、フィルタ７ａへの入射角を０°と４５°とにそれぞれ設定したときの各比較座標を読み出し、これら比較座標の各輝度値を比較する。
【００３９】
この比較の結果、比較座標の各輝度値が等しければ、比較部１２は、調光制御の作業を終了する。
ところが、これら比較座標の各輝度値が等しくなければ、比較部１２は、ステップ＃６に移り、出力部１３に対し、フィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性の補正を掛けて調光手段７のフィルタを回転させる指令を与える。
【００４０】
この出力部１３は、フィルタ７ａの回転指令を受けると、例えばフィルタが低波長側から長波長側に変化する方向で、かつ一定量の角度づつ回転させる回転駆動信号を調光手段７に送出する。
【００４１】
このようにフィルタ７ａが回転中、２次元エリアセンサ９は、ステップ＃７において、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する。
【００４２】
この２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。ステップ＃８では調光手段によるフィルタ７ａの回転角が０°に達したかを判断する。そして、この回転角が０°に達している場合は、ステップ＃３、＃４で決定した座標値間の輝度値を比較し、両者の輝度値が等しければ調整作業を終了し、異なる場合はステップ＃６に移る。つまり、ステップ＃３、＃４で決定した座標値間の輝度値が等しくなるまで、調光手段によりフィルタ７ａの回転を行なう。
【００４３】
このようにフィルタ７ａを回転させながら調光制御を行い、ステップ＃３、＃４で決定した比較座標間の輝度値が等しくなることがなく、フィルタ７ａへの入射角が０°まで戻ると、比較部１２は、ステップ＃９に移り、フィルタ７ａの入射角が０°と４５°とのそれぞれの場合でステップ＃３、＃４で決定した比較座標間の輝度値の方が少ない方にフィルタ７ａを回転して終了する。
【００４４】
この結果、標本４から発生される蛍光は、各波長毎に調光されて図７に示すようなバランスされた明るさになる。
このように上記第１の実施の形態においては、フィルタ７ａの特性を利用した調光手段７により、０°、４５°でのエリアセンサ９で得られる標本４からの蛍光像より明るさを調光する部位を決定後、前記調光手段７により前記部位の明るさが等しくなるようにフィルタ７ａを回転させるので、多重に染色された標本４を観察する場合に、調光制御の作業の簡易化が図るとともに標本４の褪色を軽減でき、各蛍光標識による蛍光の明るさのバランスを取ることができる。
（２）次に本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００４５】
図８は蛍光顕微鏡装置の構成図である。
ダイクロイックミラー２とクイックリターンミラー５との間には、調光手段２０としての２枚のフィルタ２１、２２が標本４からの蛍光の光路上に対して挿脱自在に配置されている。
【００４６】
これらフィルタ２１、２２は、それぞれ透過率が異なって蛍光の強度を可変するもので、例えば一方のフィルタ２１は、図９に示すように透過率の特性が長波長側で高く、他の波長領域で低く抑えられ、他方のフィルタ２２は、図１０に示すように透過率の特性が低波長側で高く、他の波長領域で低く抑えられたものとなっている。
【００４７】
これらフィルタ２１、２２は、制御装置１０の出力部１３から出力される駆動信号を受けて蛍光の光路上に挿脱されるものとなっている。
次に上記の如く構成された蛍光顕微鏡装置の作用について図１１に示す調光制御のフローチャートに従って説明する。
【００４８】
制御装置１０は、ステップ＃１０において、開始スイッチの確認を行い、この開始スイッチがオンになっていれば、制御を開始し、次のステップ＃１１で外部情報入力手段１４に格納されているフィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性を補正するための補正値を読み込む。
【００４９】
なお、外部情報入力手段１４にフィルムの指定がない場合には、Ｒ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性の補正は行わない。
次に制御装置１０は、ステップ＃１２において、出力部１３から駆動信号を調光手段２０に送出し、この調光手段２０の一方の長波長側のフィルタ２１を蛍光の光路上に挿入する。
【００５０】
この状態に、光源１から放射された光は、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長用の光成分のみ励起光として反射する。
【００５１】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により多重染色された標本４に集光され、この標本４では、染色された色素が励起され、その波長の蛍光が発生する。
【００５２】
この標本４からの蛍光は、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにフィルター２１により長波長側の蛍光のみが透過し、クイックリターンミラー５で反射し、結像レンズ８により２次元エリアセンサ９上に投影される。この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する。
【００５３】
この２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納され、ここで比較部１２は、メモリ部１１に格納された輝度信号を読み出し、フィルタ２１を挿入したときの輝度信号におけるピーク値を検出し、このピーク値を比較座標とする。
【００５４】
次に制御装置１０は、ステップ＃１３において、出力部１３から駆動信号を調光手段７に送出し、フィルタ２１を取り出すとともに、他方の低波長側のフィルタ２２を蛍光の光路上に挿入する。
【００５５】
これにより、上記同様に、２次元エリアセンサ９は、標本像における低波長側の明るさに応じた輝度信号を出力する。この輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００５６】
比較部１２は、メモリ部１１に格納された輝度信号を読み出し、フィルタ２２を挿入したときの輝度信号におけるピーク値を検出し、このピーク値を比較座標とする。
【００５７】
次に比較部１２は、ステップ＃１４において、一方のフィルタ２１を挿入したときの比較座標間の輝度値の差と他方のフィルタ２２を挿入したときの比較座標間の輝度値の差とを比較し、この比較の結果に基づいて比較座標間の輝度値が最も等しくなるようなフィルタを蛍光の光路に挿入するものとし、これにより観察される蛍光は、各波長毎に調光されてバランスされた明るさになる。
【００５８】
このように上記第２の実施の形態においては、長波長側と低波長側との２枚のフィルタ２１、２２を標本４からの蛍光の光路上に挿脱自在に配置したので、上記第１の実施の形態と同様な効果を奏することは言うまでもない。
（３）次に本発明の第３の実施の形態について説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５９】
図１２は３重に染色された標本に対応する蛍光顕微鏡装置の構成図である。
上記光源１とダイクロイックミラー２との間には、第１及び第２の調光手段２３、２４が配置されている。
【００６０】
これら第１及び第２の調光手段２３、２４は、光の入射角により分光透過特性が変化する各フィルタ２３ａ、２４ａが用いられている。
このうちフィルタ２３ａは、光源１からの光の進行方向に対して入射角０°又は４５°に設定するように回転自在に設けられ、光線の入射角が０°であれば、図１３に示す特性Ｑａのように不透過帯域が長波長側であり、光線の入射角が４５°であれば、同図に示す特性Ｑｂのように不透過帯域が低波長側に移動する透過特性を有している。
【００６１】
又、フィルタ２４ａは、上記フィルタ２３ａと同様に、光源１からの光の進行方向に対して入射角０°又は４５°に設定するように回転自在に設けられ、光線の入射角が０°であれば、図１４に示す特性Ｐａのように透過帯域が長波長側であり、光線の入射角が４５°であれば、同図に示す特性Ｐｂのように透過帯域が低波長側に移動する透過特性を有している。
【００６２】
次に上記の如く構成された蛍光顕微鏡装置の作用について図１５に示す調光制御のフローチャートに従って説明する。尚、図１６に標本を示す。
制御装置１０は、ステップ＃２０において、開始スイッチの確認を行い、この開始スイッチがオンになっていれば、制御を開始し、次のステップ＃２１で外部情報入力手段１４に格納されているフィルムの種別によりＲ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性を補正するための補正値を読み込む。
【００６３】
なお、外部情報入力手段１４にフィルムの指定がない場合には、Ｒ、Ｇ、Ｂでの低照度不軌特性の補正は行わない。
次に制御装置１０は、ステップ＃２２において、出力部１３から回転駆動信号を第１及び第２の調光手段２３、２４に送出し、これら第１及び第２の調光手段２３、２４の各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角が共に０°になるように設定する。
【００６４】
このように各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角が共に０°に設定すれば、フィルタ２３ａは、図１３の特性Ｑａに示すように不透過帯域が長波長側に移動し、フィルタ２４ａは、図１４の特性Ｐａに示すように透過帯域が長波長側に移動する。
【００６５】
この状態に、光源１から放射された光は、これらフィルタ２３ａ、２４ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長用の光成分のみ励起光として反射する。
【００６６】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により３重染色された標本４に集光され、この標本４では、Ｕ励起での蛍光が強調される。
この標本４からの蛍光は、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射し、結像レンズ８により標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。図１７には２次元エリアセンサ上のＸラインでの出力を示す。
【００６７】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力する。この２次元エリアセンサ９から出力された輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００６８】
次に制御装置１０は、ステップ＃２３において、出力部１３から回転駆動信号を第１及び第２の調光手段２３、２４に送出し、このうち第１の調光手段２３のフィルタ２３ａへの入射角を４５°になるように設定し、第２の調光手段２４のフィルタ２４ａへの入射角を０°になるように設定する。
【００６９】
このように各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角を設定すれば、フィルタ２３ａは、図１３の特性Ｑｂに示すように不透過帯域が低波長側に移動し、フィルタ２４ａは、そのままで透過帯域が長波長側になっている。
【００７０】
この状態に、光源１から放射された光は、これらフィルタ２３ａ、２４ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長用の光成分のみ励起光として反射する。
【００７１】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により３重染色された標本４に集光され、この標本４では、Ｂ励起での蛍光が強調される。
この標本４からの蛍光は、上記同様に、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射され、結像レンズ８により標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。図１８には２次元エリアセンサ上のＸラインでの出力を示す。
【００７２】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力するので、この輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００７３】
比較部１２は、ステップ＃２４において、メモリ部１１に格納された上記各輝度信号を読み出し、これらの輝度信号の差を取り、＋ピークの座標をＵ励起の輝度比較座標とし、−ピークの座標をＢ励起の輝度比較座標とする。図１９にはステップ＃２３の輝度値からステップ＃２４の輝度値を引いた値を示す。
【００７４】
次に制御装置１０は、ステップ＃２５において、出力部１３から回転駆動信号を第１及び第２の調光手段２３、２４に送出し、このうち第１の調光手段２３のフィルタ２３ａへの入射角を０°になるように設定し、第２の調光手段２４のフィルタ２４ａへの入射角を４５°になるように設定する。
【００７５】
このように各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角を設定すれば、フィルタ２３ａは、図１３の特性Ｑａに示すように不透過帯域が長波長側に移動し、フィルタ２４ａは、図１４の特性Ｐｂに示すように透過帯域が低波長側に移動する。
【００７６】
この状態に、光源１から放射された光は、これらフィルタ２３ａ、２４ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長用の光成分のみ励起光として反射する。
【００７７】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により３重染色された標本４に集光され、この標本４では、Ｇ励起での蛍光が強調される。
この標本４からの蛍光は、上記同様に、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射され、結像レンズ８により標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。
【００７８】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力するので、この輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００７９】
次に制御装置１０は、ステップ＃２６において、出力部１３から回転駆動信号を第１及び第２の調光手段２３、２４に送出し、これら第１及び第２の調光手段２３、２４の各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角を共に４５°になるように設定する。
【００８０】
このように各フィルタ２３ａ、２４ａへの入射角を設定すれば、フィルタ２３ａは、図１３の特性Ｑｂに示すように不透過帯域が低波長側に移動し、フィルタ２４ａは、そのまま透過帯域が低波長側となる。
【００８１】
この状態に、光源１から放射された光は、これらフィルタ２３ａ、２４ａを透過し、ダイクロイックミラー２において光源１から放射された光のうち蛍光色素を励起するために必要な特定の波長用の光成分のみ励起光として反射する。
【００８２】
このダイクロイックミラー２で反射した励起光は、対物レンズ３により３重染色された標本４に集光され、この標本４では、Ｂ励起での蛍光が強調される。
この標本４からの蛍光は、上記同様に、対物レンズ３で捕らえられ、ダイクロイックミラー２でその波長が選択透過され、さらにクイックリターンミラー５で反射され、結像レンズ８により標本像として２次元エリアセンサ９上に投影される。
【００８３】
この２次元エリアセンサ９は、結像レンズ８により投影された標本像の明るさに応じた輝度信号を出力するので、この輝度信号は、制御装置１０のメモリ部１１に格納される。
【００８４】
次に比較部１２は、ステップ＃２７において、メモリ部１１に格納された上記各輝度信号を読み出し、これらの輝度信号の差を取り、＋ピークの座標をＧ励起の輝度比較座標とする。
【００８５】
次に比較部１２は、ステップ＃２８において、上記の通り求めたＵ、Ｂ、Ｇの３点の輝度比較座標の３種の状態での輝度値と各フィルター２３、２４の各回転角と透過率との関係により、各蛍光波長がバランスが取れる最適な回転角を算出する。
【００８６】
そして、出力部１３は、各フィルター２３ａ、２４ａに対し、比較部１２により算出した各蛍光波長でバランスが取れる最適な回転角の回転駆動信号を送出する。
【００８７】
これにより、各フィルター２３ａ、２４ａは、回転し、３重に染色された標本４での各蛍光のバランスが取れる。
このように上記第３の実施の形態においては、光源１とダイクロイックミラー２との間に第１及び第２の調光手段２３、２４を配置したので、３重に染色された標本４を観察する場合に、調光制御の作業の簡易化が図るとともに標本４の褪色を軽減でき、３つの蛍光標識による蛍光の明るさのバランスを取ることができるとともに、目的の測定波長以外のピーク値を除去できる。
なお、本発明は、上記第１乃至第３の実施の形態に限るものでなく種々変形してもよい。
【００８８】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明の請求項１〜３によれば、多重に染色された標本を観察するに、作業の簡易化を図るとともに標本の褪色を軽減して、各蛍光標識による蛍光の明るさのバランスが取れる蛍光顕微鏡装置を提供できる。
又、本発明の請求項３によれば、３重に染色された標本の各蛍光の明るさのバランスが取れる蛍光顕微鏡装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる蛍光顕微鏡装置の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】調光手段として用いられるフィルタの特性図。
【図３】同蛍光顕微鏡装置における調光制御のフローチャート。
【図４】２次元エリアセンサに投影された標本像を示す模式図。
【図５】長波長側で励起したときのピーク値を示す図。
【図６】低波長側で励起したときのピーク値を示す図。
【図７】調光された標本からの蛍光の明るさを示す図。
【図８】本発明に係わる蛍光顕微鏡装置の第２の実施の形態を示す構成図。
【図９】調光手段として用いられる一方のフィルタの特性図。
【図１０】調光手段として用いられる他方のフィルタの特性図。
【図１１】同蛍光顕微鏡装置における調光制御のフローチャート。
【図１２】本発明に係わる蛍光顕微鏡装置の第３の実施の形態を示す構成図。
【図１３】第１の調光手段におけるフィルタの特性図。
【図１４】第２の調光手段におけるフィルタの特性図。
【図１５】同蛍光顕微鏡装置における調光制御のフローチャート。
【図１６】標本を示す図。
【図１７】２次元ラインセンサ上のＸラインでの出力を示す図。
【図１８】２次元ラインセンサ上のＸラインでの出力を示す図。
【図１９】各比較座標間の各輝度値の差の値を示す図。
【符号の説明】
１…光源、
２…ダイクロイックミラー、
３…対物レンズ、
４…標本、
５…クイックリターンミラー、
６…カメラ、
７…調光手段、
７ａ…フィルタ、
８…結像レンズ、
９…２次元エリアセンサ、
１０…制御装置、
１１…メモリ部、
１２…比較部、
１３…出力部、
１４…外部情報入力手段、
２０…調光手段、
２１，２２…フィルタ、
２３…第１の調光手段、
２４…第２の調光手段、
２３ａ，２４ａ…フィルタ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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