(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールのコポリマーの表面に存在する反応種の完全又は部分的な不活性化処理からなり、処理が、
（１）１つの抗ラジカル化学処理、
（２）該コポリマーの酸化の程度を改変できる１つの電気化学処理、
および
（３）表面活性剤の存在下での少なくとも１つの洗浄操作からなる１つの処理
の少なくとも１つからなることを特徴とする、電気化学共重合により生産されるピロールのコポリマーの表面反応性を減少させる方法。
【請求項２】
化合物［Ａ］と以下の一般式（II）の化合物：
【化１】
0003924588.tif 000011
の電気化学共重合、および
生産されたコポリマーの表面に存在する式（II）のユニットを付着させることができる反応種を、完全に又は部分的に不活性化するための、生産されたコポリマーの処理
からなることを特徴とする、以下の一般式（Ｉ）：
【化２】
0003924588.tif 000012
｛［Ａ］はピロールユニットを示し、［Ｂ］は共有結合により、又はスペーサーアームを介してユニット［Ａ］に結合するモノマー又はポリマーであってもよい側基を示し、かつＸ及びＹは１以上の整数を示す｝
のコポリマーの表面反応性を減少させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
［Ｂ］がヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体もしくは類似体の１つを示すことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
同一支持体の表面にマトリクス状に配置された電極上で、配列された一般式（Ｉ）のコポリマー（該配列されたコポリマーの少なくとも２つは互いに異なる側基［Ｂ］からなり、異なる側基［Ｂ］からなるコポリマーは異なる電極で担持される）を合成する方法であって、
異なる側基［Ｂ］からなるコポリマーの各々をそれぞれの電極上で逐次合成し、各コポリマーの合成後に請求項２又は３に記載の方法を用いることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、目的のマトリクスの構築に使用するための、電気化学的に合成したポリマーの処理に関する。
生物学的生成物に親和性を有する化合物のマトリクス、例えばペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプター等のマトリクスは、幾つかの方法で構築することができる。３つの主要な方法：光化学的な堆積（deposition）［Fodor Sら、Science, 251, 767-773（1991）］、機械的堆積［Khrapko K.R.ら、DNA Sequencing and Mapping, 1, 375-338（1991）］又は電気化学的な堆積［PCT国際出願、公開番号WO 94/22889号；Livacheら、Nucl.Acids.Res., 22, 15, 2615-2921（1994）］が、記載されている。
オリゴヌクレオチドは、インサイトゥヌクレオチド合成［Fodor Sら、PCT出願WO 94/22889号］又は予備合成オリゴヌクレオチドの連続付着［Fodor Sら；Khrapko K.R.ら；PCT出願WO 94/22889号］のどちらかにより、支持体の異なるポイントに堆積することができる。
最初の場合、支持体の全表面は、ヌクレオチドの各添加後に洗浄される。この洗浄操作により、支持体に存在する過剰な試薬を簡単に除くことができる。それは、支持体の実際の性質に全く関連していない。
二番目の場合（オリゴヌクレオチドの連続付着）では、２つのタイプの処理が記載されている。すなわち、ある筆者らは、全ヌクレオチドの付着後、支持体を最終的に１回洗浄している［Saiki R.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 6230-6234（1989）、Khrapkoら（上述）又はLamtureら、Nucl. Acids.Res., 22, 2121-2125（1994）］。水、又はハイブリダイゼーション緩衝液中でのこの洗浄により、支持体に反応していないプローブを除くことができる。同じ目的で、Livacheらは、オリゴヌクレオチドの付着ごとに水で支持体を洗浄している。この場合には、オリゴヌクレオチドの結合操作と同じだけ何回も洗浄操作がある。
しかし、本発明者らは、電気化学的に生産されたポリマーの幾つかの堆積が、同じ電極マトリクスの異なるポイントで行なわれる際に、電極間に汚染の生じることがあるのを見いだした。実際、ｎのヌクレオチドの存在下における電極数ｎでのポリマー合成のあいだ、すでにｎ−１のオリゴヌクレオチドでカバーしたｎ−１の電極でｎのオリゴヌクレオチドによる汚染を認めることができる。これにより、ｎのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのあいだにｎ−１のスポットの弱い陽性シグナルが生じる。この現象は、Livacheらによる刊行物［Nucl.Acids. Res., 22, 15, 2615-2921（1994）］に記載される４つのクロス-ハイブリダイゼーションの結果により例証することができる。２つのわずかな汚染（最大シグナル約10％）は、４つの堆積物に見ることができる。それらは、その時には非特異的なハイブリダイゼーションとして判断されていた。しかし、異なるオリゴヌクレオチド配列に関する本発明者らによる連続実験から、それらは実際に汚染物であったことが示されている。
支持体に結合するオリゴヌクレオチドのマトリクスを診断に使用するには、このタイプの汚染を完全に除くことが重要である。ここで、一般的に用いられる洗浄処理は、この結果を生じるには不十分である。
本発明は、時に起こる汚染現象を減少させ、実際に除くため、電気化学的に生産されるポリマーの特異的な処理を目的とした。
この目的により、本発明者らは、電気化学重合のメカニズムを研究した。この重合は特にラジカル反応を含み［Geniesら、J.Electroanal Chem., 149, 101-113（1993）］、ｎ−１のポリマーが合成される際に、一定時間ｎの電極での重合のあいだ生成物を捕捉できる反応種を表面に保持できることが知られている。
本発明者らは、ポリマー表面での生物分子の目的の合成のあいだに認められる汚染物の除去は、ポリマーの表面反応性を減少させることによって成功し得る、という仮説を立てた。
本発明の対象は、コポリマーの表面反応性を減少させることができる処理からなることを特徴とする、電気化学共重合によるコポリマーの合成方法である。
特に、本発明の対象は、化合物［A］と以下の一般式（II）の化合物：
0003924588.tif 000002
の電気化学共重合による、以下の一般式（Ｉ）：
0003924588.tif 000003
｛［A］は電気化学共重合により生じることのできるポリマーのモノマーユニットを示し、［B］は共有結合により、又はスペーサーアームを介してユニット［A］に結合するモノマー又はポリマーであってもよい側基を示し、かつX及びYは１に等しいか、又はそれより大きい整数を示す｝のコポリマーの製造方法であり、電気化学共重合の結果、生産されるコポリマーが、その表面反応性を減少できる処理に付される少なくとも１つの段階からなることを特徴とする。
本発明の意味する範囲内では、［表面反応性］は、生じたコポリマーの表面で、式（II）のユニットを付着することができる反応種の持続性を意味するものと解され、「表面反応性の減少」は、０又はごく低量の式（II）のユニットの付着を可能にするこれらの反応種の少なくも部分的な不活性化を意味するものと解される。この付着から生じる汚染は、それらが検出できなくなるか、又はそれらが陽性シグナルと容易に区別可能なシグナルをごくわずかに生じるまで、除かれるか、もしくは減じられる。
本発明の好ましい具体例によれば、［A］は導電性ポリマーのモノマーを示し、その導電性ポリマーは、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（p-フェニレン）、ポリ（p-フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン及びその置換誘導体（置換基は、例えば飽和又は不飽和の炭化水素鎖（好ましくはC1-3鎖）、芳香族又は非芳香族の環もしくは複素環等）から選択するのが好ましい。導電性ポリマーは、２以上の異なるモノマー［A］、例えばピロールモノマー及びチオフェンモノマーのコポリマーであってもよい。
［A］はピロールユニットであるのが有利である。
本発明の好ましい具体例によれば、［B］はヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体もしくは類似体の１つを示す。
本発明の記載に関して、ヌクレオチドの誘導体又は類似体は、例えばUhlmann［Chemical Review, 90:4, 543-584（1990）］により記載されるような修飾ヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチドの構成の一部を形成するヌクレオチド類似体、核酸合成に一般に用いられる保護された官能基を有するヌクレオチド誘導体を意味するものと解される。
［B］は、Uhlmann（上記刊行物）により記載されるように、核酸とハイブリダイズできる非天然化合物であってもよい。
本発明者らは、３タイプの処理が、ポリマーの反応性の減少に用いることができることを見いだした：
-ラジカル重合においてアンチラジカル活性又は阻害活性が知られている製品に基づく化学処理、
-ポリマーを還元するか、又は過酸化することのできる電気化学処理、
-支持体に吸収された短い伸長ポリマー鎖を除去できる製品の存在下における洗浄。
本発明の好ましい具体例によれば、コポリマーの表面反応性の減少に用いられる処理は、少なくとも、
-１つのアンチラジカル化学処理、又は
-ポリマーの酸化の程度を改変できる１つの電気化学処理、又は
-表面活性剤の存在下での少なくとも１つの洗浄操作からなる１つの処理、又は
上記３つの処理からの少なくとも２つの組み合わせ
からなる。
本発明による化学処理は、アンチラジカル製品を含有する溶液でポリマーを洗浄することにより簡単に用いることができる。
トコフェロール誘導体（ビタミンＥ族）のような抗酸化剤を用いるのが有利である。また、ラジカル重合の阻害剤及び抑制剤、例えば従来からのスチレンの重合抑制剤であるニトロベンゼン又はベンゾキノンの使用が有利である［Odian.G., Principles of Polymerization, John Wiley & Sons, Interscience Publication（1981）］。これは、適切な溶媒（例えば、水、アセトニトリル、エタノール又はこれら３つの溶媒混合物）に溶解したこれらの製品が、電気化学的に製造したポリマー（例えばポリピロール）の反応性に関して活性であることも分かっているためである。
電気化学処理は、制御した方法、例えば3-電極の電気化学システムで導電性ポリマーを還元するか、又は酸化することにより行うことができる。［B］が安定している可能性のある範囲（例えば、核酸について-1〜+1V/SCE）は、この処理を行うのに選択される。
表面活性剤の存在下での洗浄により、依然として反応性である導電性ポリマーの短鎖を除くことができる。表面活性剤を含有する溶液によるそれぞれの洗浄操作は、微量の界面活性剤の除去を目的とする１以上の洗浄操作にひきつづいて行うことが好ましい。処理を帯電したポリマー（例えば、酸化型のポリピロール）に行う際、除去しやすい非イオン性表面活性剤を選択するのが好ましい。
本発明の方法は、より詳しくは、その表面がマトリクス状に配置された電極からなる同一の支持体上での、少なくとも２つが異なる側基［B］からなる一般式（Ｉ）のアレイ（array）のコポリマー（コポリマーは、異なる電極で担持される異なる側基［B］からなる）の合成での使用を意味する。この明細書では、一般式（Ｉ）のコポリマーは、上記発明による方法を用いることにより、そのそれぞれの電極-支持体で代わるがわる合成される。つまり、各コポリマーの合成後、その表面反応性を減少させる目的を有し、後のポリマー合成で用いられる試薬で汚染されないようにすることができる処理がなされる。
したがって、本発明による処理方法の使用は、水又は緩衝液での洗浄操作と対照的に、電極間の汚染を除去でき、かつ完全に特徴的なプロットのマトリクスを生産することができる。本発明による方法は、実行しやすく、自動化することができる。
すべての場合において、生物学的に重要な分子を担持する導電性ポリマーの支持体は、例えば特許WO 94/22889号に記載の方法により製造される。処理は、異なる各堆積物の合成後にのみ行なわれる。
本発明は、本発明の方法の実施例に言及する以下のさらなる記載により、より良く理解されるだろう。
しかし、これらの実施例は、本発明の対象の例証のためにのみ提示するもので、いかなる限定も加えないものであることは明らかに理解されるべきである。
実施例１：共重合によるポリピロールマトリクスの製造のあいだの本発明による汚染除去方法の実施
1）オリゴヌクレオチドの合成
合成支持体は、互いに独立して絶縁されている48金の電極を有するシリコンプレートからなる。各電極は正方形で、その側面の長さは25、50、100又は200μmである。
ポリピロールポリマーの局部的な合成は、酸化ピロールの核との共重合によりオリゴヌクレオチドが共有的に融合された各電極で行われ、そのポリマーの幾らかはオリゴヌクレオチドを有する。
重合は、PCT出願第WO 94/22889号に記載の方法にしたがって、2x10-2Mのピロール、6x10-8Mの置換ピロール（ピロール基を有するオリゴヌクレオチド、後にpyrで示す）及び0.1MのLiClO4を含む溶液で行う。
5'位にピロールを有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドG-pyr、T1-pyr又はT2-pyr）は、PCT出願WO 94/22889号に記載の方法にしたがって合成し、逆相HPLCにより精製した。
用いたオリゴヌクレオチド配列
0003924588.tif 000004
汚染の研究に用いたマトリクスモデルは、それぞれが、合成のために異なる堆積物を有する５つの電極を含むウェーハーからなる。つまり、
-電極１：純粋なポリピロールの堆積物（ネガティブコントロール）
-電極２：ポリピロールコポリマー及びオリゴヌクレオチドG-pyrの堆積物
-電極３：ポリピロールコポリマー及びオリゴヌクレオチドT1-pyrの堆積物
-電極４：ポリピロールコポリマー及びオリゴヌクレオチドT2-pyrの堆積物
-電極５：純粋なポリピロールの堆積物。
堆積が行なわれる電極を接続後、プラチナの対電極及びカロメル標準電極（SCE）及び任意に所望のオリゴヌクレオチド-ピロールからなる反応混合物600μlの存在下で、ウェーハーを反応セルに導入する。モノマーの酸化反応及びポリマーの還元反応は、-0.35〜+0.85V/SCEの電位での周期的な変化により供給される。
時間に対する電流の積分（消費される電子量）により、電極表面で生じるポリマー量とフィルムの厚さを算出することができる。これにより、合成の良好な再現性が確実になる。
各合成後、セルとウェーハーは、後述する様々な方法にしたがって洗浄し、次いで前に用いた電極を外し、次の電極を接続する。次いで、別のオリゴヌクレオチド-ピロール対からなる反応混合物にウェーハーを浸す。
最終的に特異的な洗浄操作をした後、ウェーハーを外し、次に蒸留水で洗浄する。
2）オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと検出堆積物の特異性は、支持体に付着したオリゴヌクレオチドに対するプローブ相補性のハイブリダイゼーションによりモニターする。
ハイブリダイゼーション：
ハイブリダイゼーション反応は、G、T1又はT2配列にそれぞれ相補的で、5'位をビオチニル化したオリゴヌクレオチド0.06pmolの存在下、20mM、pH7.4のリン酸緩衝液10μl、NaCl300mM、EDTA2mM、SDS0.5％の最終容量で、15分間40℃で連続的に行う。
検出：
ハイブリダイゼーション後、ウェーハーは、４倍希釈したハイブリダイゼーション緩衝液で室温で洗浄する。PBS-NaCl0.4M、0.5％ツイン20で洗浄後、2.5μg/mlのストレプトアビジン-フィコエリトリン抱合体の存在下、ウェーハーを同じ緩衝液で室温で15分間インキュベートする。PBS-NaCl-ツインで最終的な洗浄を行い、次にウェーハを顕微鏡用スライドにのせ、次いでカバーガラスでカバーする。
次に、マトリクスを蛍光顕微鏡で観察し、各ポイントの蛍光強度を算出する。
3）蛍光シグナルの局在化の特異性に対する処理の影響
一般的なポイント：
すべての洗浄操作は、以下の方法の１つにしたがって、室温で、各ポリマーの合成後（記載する場合を除いて）にウェーハーとセルで行う。
1）水での洗浄（PCT出願WO 94/22889号に記載の方法と同一）
2）水での長期間の洗浄：５回の連続的な水での洗浄操作
3）電気化学処理１：１分間1.2V/SCEでの堆積物の過酸化、次の水での洗浄
4）化学処理：「混合物Ｓ」は、68％のアセトニトリル、16％のエタノール及び16％の水を含む溶媒であり、「混合物Ｓ＋ビタミンＥ」は、溶媒「Ｓ」で１mMにするα-トコフェロールアルコール溶液50mMの希釈物であり、処理は水での洗浄により、容器は水で簡単に洗浄する
5）アニオン性洗剤の存在下での洗浄：水、次いで0.5％硫酸ドデシルナトリウム（SDS）溶液での洗浄、その後の水での別の洗浄操作
6）非イオン性洗剤の存在下における洗浄：水、次に0.3％ツイン20でする洗浄、その後の水での別の洗浄操作
b）結果：
生じた各マトリクスは、オリゴヌクレオチドG、T1及びT2に相補的な３つのビオチニル化プローブと連続的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、後述のように、蛍光強度の測定により検出する。
それぞれ実施例１〜６の結果を再現する結果を、以下の表１Ａ〜１Ｆに示す。
これらの表では、各欄は電極１〜５の１つに相当する。各行は、G、T1及びT2にそれぞれ相補的なプローブの１つに相当する。各ポイントの蛍光強度は０〜+++、又は結果がカッコ間に明記された２つの限定間で変化し、再現性がない場合V（*，*）に分類する。
0003924588.tif 000005
0003924588.tif 000006
0003924588.tif 000007
0003924588.tif 000008
0003924588.tif 000009
0003924588.tif 000010
これらの結果は、３タイプの処理が、汚染による非特異的な反応の減少において、最初の処理（１番）よりも効率的であることを示している：
-過酸化を含む処理（処理番号３）
-アンチラジカル製品：ビタミンＥの存在下での洗浄操作（処理番号４）
-界面活性剤の存在下での洗浄操作（処理番号５及び６）