(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｒ１−Ｏ−ＯＣ−Ｒ２−ＣＯ−Ａ２−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３・Ｘ−  （Ｉ）
〔式中、Ａ２は、Ｏ又はＳであり、
Ｒ１は、
一般式（１）：
【化１】
0004004095.tif 000014
（式中、Ｒ１１は、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換のニトロフェニルアゾ基であり、ｎは１〜４の整数であり、Ｒ１１の少なくとも１つが、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であり、ｎが２〜４の場合には、Ｒ１１はそれぞれ同じか又は異なってもよい）で表される基であり、
Ｒ２は、フェニレン基、又は炭素数１〜４の低級アルキル基で置換されていることのある炭素数が２〜４のアルキレン基であり、そしてＸ−は、陰イオンである〕
で表される化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物を基質物質として用いることを特徴とする、コリンエステラーゼ活性測定方法。
【請求項３】
コリンエステラーゼ活性測定における、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物の、基質物質としての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規化合物、及びその新規化合物を基質として用いるコリンエステラーゼ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清（血漿）中のコリンエステラーゼは、擬性コリンエステラーゼ（ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ；系統名：Ａｃｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＥＣ  ３．１．１．８）と呼ばれ、神経系に関与する真性コリンエステラーゼとは区別される。その生合成は肝臓で行われ血中に放出されるため、血中のコリンエステラーゼを測定すれば、肝機能、抗コリンエステラーゼ剤使用時の体調、有機リン中毒、ネフローゼ症候群、又は甲状腺機能亢進症等の診断・治療上等に対して有益な指標を得ることができるので、臨床診断分野において重要な測定項目となっている。
【０００３】
コリンエステラーゼの測定方法としては、アセチルコリンを基質として、生成する酢酸をフェノールフタレインの発色に導き、これをｐＨの変化単位として表示する方法が古くから行われてきた。その後、この酢酸を酢酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸キナーゼ、及びＮＡＤＨ−乳酸デヒドロゲナーゼ系へと接続する方法、あるいはベンゾイルコリン、又はトルイルコリンを基質として生成するコリンに、コリンオキシダーゼとペルオキシダーゼを作用させて、過酸化水素による色素の酸化発色に導く方法、又は４−ヒドロキシベンゾイルコリンにオキシゲナーゼとＮＡＤＨとを組み合わせる方法等、検出系に酵素を組み合わせた酵素的測定法が開発された。一方、チオコリンエステルもコリンエステラーゼによって容易に水解を受けるため、アセチルチオコリン、ブチリルチオコリン又はプロピオニルチオコリン等の基質から生成するチオコリンの−ＳＨ基の、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の黄色を追跡する方法も汎用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の測定方法において、フェノールフタレインの発色法は測定感度が不十分であり、検出系に酵素を組み合わせた酵素的測定法は、使用する酵素の安定性や特異性等の問題があり、試薬の性能を維持するのに注意を払う必要があった。更に、チオコリンによる発色法についても、反応液や検体中に、共存する他のチオール化合物や酸化還元性物質の干渉を受け易く、酵素学的測定法と同様に試薬の性能維持の面で問題がある。すなわち、従来法では、使用する基質に応じて生成する芳香族、若しくは脂肪族カルボン酸又はコリン、若しくはチオコリンを酵素による発色系に導くか、あるいは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の発色系に導くかが限定され、また、その指示反応系におけるアスコルビン酸、ビリルビン又はグルタチオン等の還元性物質や他のチオール類の干渉が生じるため、根本的な改善がなされない状況下で種々の測定法が使用されていた。
そこで、本発明者等は、これらの問題点を解決するために、発色性の置換基を構造中に含むコリンエステラーゼ活性測定用の新規基質物質を設計して合成し、この新規基質物質を用いてコリンエステラーゼ活性を測定する方法を鋭意検討し、本発明を完成させた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
Ｒ1−Ａ1−ＯＣ−Ｒ2−ＣＯ−Ａ2−（ＣＨ2）2−Ｎ+（ＣＨ3）3・Ｘ-  （Ｉ）
〔式中、Ａ1 及びＡ2 は、それぞれ同じか又は異なり、Ｏ又はＳであり、Ｒ1 は、Ｒ1 −Ａ1 Ｈとして、芳香族又は芳香族性複素環式のヒドロキシ化合物又はチオール化合物を示し、Ｒ2 は、飽和若しくは不飽和の置換若しくは非置換の炭素数２〜４の炭素鎖であり、そしてＸ- は、陰イオンである〕
で表される化合物に関する。
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を基質物質として用いることを特徴とする、コリンエステラーゼ活性測定方法にも関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
前記一般式（Ｉ）において基Ｒ1 は、置換若しくは非置換の芳香族基又は芳香族性複素環式環基であり、好ましくは、コリンエステラーゼの活性測定時の反応ｐＨ領域（弱酸性〜アルカリ性、具体的にはｐＨ５〜１０、特にはｐＨ７〜９．５）で、前記一般式（Ｉ）で表される化合物から遊離される「Ｒ1 −Ａ1 Ｈ」が、フェノキシド誘導体、フェニルメルカプチド誘導体又はキノイド誘導体を誘導して分光学的に区別される発色をともなうものであれば特に限定されるものではない。
Ｒ1 −Ａ1 Ｈは、更に好ましくは、置換若しくは非置換フェノール、置換若しくは非置換ナフトール、置換若しくは非置換ヒドロキシインドール、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノキサゾン、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノキサゾン−Ｎ−オキシド、置換若しくは非置換フルオレセイン、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノチアゾン、置換若しくは非置換チオフェノール、又は置換若しくは非置換チオナフトールである。
【０００７】
前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フェニル基Ｒ1 は、好ましくは一般式（１）：
【化３】
0004004095.tif 000002
〔式中、Ｒ11は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基又は置換若しくは非置換のニトロフェニルアゾ基であり、ｎは１〜５の整数であるが、ｎが２〜５の場合には、Ｒ11はそれぞれ同じか又は異なってもよいものとし、そして、Ｒ11の少なくとも１つが、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるものとし、更に、Ｒ11は、一般式（１ａ）：
【化４】
0004004095.tif 000003
（式中、Ｒ111 は、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であり、ｍは１〜５の整数であるが、ｍが２〜５の場合には、Ｒ111 はそれぞれ同じか又は異なっていてもよく、そしてＲ111 の少なくとも１つが、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるものとする）
で表される基であることができるものとする〕
で表される基である。
【０００８】
更に、また、好ましい置換若しくは非置換フェニル基Ｒ1 は、上記一般式（１）において、Ｒ11が式（１ｂ）：
【化５】
0004004095.tif 000004
〔式中、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ同じか又は異なり、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、前記式（１ａ）で表される置換フェニル基、非置換フェニル基又は置換フェニル若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であり、ＢはＣＯ又はＳＯ2 であり、ｐ及びｑは、それぞれ同じか又は異なり、１〜３の整数であるが、ｐ又はｑが２又は３の場合には、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものする〕
で表されるフェノールフタレイン又はフェノールスルホンフタレイン誘導体であることができる。
【０００９】
また、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換ナフチル基Ｒ1 は、好ましくは一般式（２ａ）：
【化６】
0004004095.tif 000005
又は一般式（２ｂ）：
【化７】
0004004095.tif 000006
〔前記式中、Ｒ21は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、非置換フェニル基又は置換フェニル若しくはニトロフェニルアゾ基であり、ｒは１〜７の整数であるが、ｒが２〜７の場合には、Ｒ21はそれぞれ同じか又は異なっていてもよく、そして一般式（２ａ）の場合には、それぞれ２〜８位の少なくともいずれか１つ、又は一般式（２ｂ）の場合には、それぞれ１位、又は３〜８位の少なくともいずれか１つに、ニトロ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、又は置換若しくは非置換ニトロフェニルアゾ基であるＲ21が存在するものとする〕
で表される基である。
【００１０】
また、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換インドリル基Ｒ1 は、好ましくは一般式（３）：
【化８】
0004004095.tif 000007
〔式中、Ｒ31は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ32は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、前記式（１ａ）で表される置換フェニル基、又は非置換フェニル基であり、ｓは１〜４の整数であるが、ｓが２〜４の場合には、Ｒ32はそれぞれ同じか又は異なっていてもよい〕
で表される基である。
【００１１】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フェノキサゾニル基Ｒ1 又はそのＮ−オキシド体の基Ｒ1 は、好ましくは一般式（４）：
【化９】
0004004095.tif 000008
〔式中、Ｒ41は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ＥはＮ又はＮ→Ｏ（Ｎ−オキシド）であり、ｔは１〜６の整数であるが、ｔが２〜６の場合には、Ｒ41はそれぞれ同じか又は異なってもよい〕
で表される基である。
【００１２】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換フルオレセイン化合物（Ｒ1 −Ａ1 Ｈ）は、好ましくは一般式（５）：
【化１０】
0004004095.tif 000009
〔式中、Ｒ51、Ｒ52及びＲ53は、それぞれ同じか又は異なり、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ｕ及びｖは１〜３の整数であり、ｗは１〜４の整数であるが、ｕ又はｖが２又は３の場合、及びｗが２〜４の場合には、Ｒ51、Ｒ52及びＲ53は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものする〕
で表される化合物である。この置換若しくは非置換フルオレセイン化合物の３’−ＯＨ又は６’−ＯＨが、前記一般式（Ｉ）における−Ａ1 Ｈに相当する。
【００１３】
更に、前記一般式（Ｉ）において、置換若しくは非置換ヒドロキシフェノチアゾン化合物（Ｒ1 −Ａ1 Ｈ）は、好ましくは一般式（６）：
【化１１】
0004004095.tif 000010
〔式中、Ｒ61及びＲ62は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４のスルホアルキル基、炭素数１〜４のヒドロキシスルホアルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、炭素数２〜５の低級アルカノイル基、炭素数２〜５のカルボキシアルキル基、アミノ基、炭素数２〜５の酸アミド基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基、水酸基、カルボキシル基、スルホ基、又は非置換フェニル基であり、ｘ及びｙは、それぞれ同じか又は異なり、１〜３の整数であるが、ｘ又はｙが２又は３の場合には、Ｒ61及びＲ62は、それぞれ同じか又は異なっていてもよいものとする〕
で表される化合物である。この置換ヒドロキシフェノチアゾン化合物の７−ＯＨが、前記一般式（Ｉ）の−Ａ1 Ｈに相当する。
【００１４】
陰イオンＸ- は、特に限定されるものではないが、コリンエステラーゼ活性を顕著に妨害しない陰イオンが好ましい。具体的には、例えば、ハロゲン化物イオン、硫酸水素イオン、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン）、アルカンスルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン）、又はカルボン酸イオン（例えば、酢酸イオン）を挙げることができる。また、前記式（Ｉ）において陰イオンＸ- を除いた陽イオン部分２分子以上と塩を形成する２価又はそれ以上の有機酸イオン（例えば、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン又はフマル酸イオン）、又は無機酸イオン（例えば、硫酸イオン、又はリン酸イオン）であることもできる。
【００１５】
本明細書において、ハロゲン原子とは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又はフッ素原子である。炭素数１〜４の低級アルキル基には、直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基が含まれ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、又はｔ−ブチル基を挙げることができる。炭素数１〜４の低級アルコキシ基には、直鎖状又は分枝鎖状の低級アルコキシ基が含まれ、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基を挙げることができる。炭素数１〜４のスルホアルキル基又はヒドロキシスルホアルキル基は、スルホ基で置換された前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基又はヒドロキシアルキル基である。炭素数２〜５の低級アルカノイル基は、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸から誘導されるアシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、又はイソバレリル基を挙げることができる。
【００１６】
炭素数２〜５のカルボキシアルキル基は、カルボキシル基で置換された前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基である。炭素数２〜５の酸アミド基は、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸のアミド基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換されたアミノ基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基でモノ置換されたアミノ基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でジ置換されたアミノ基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の同一若しくは異なる低級アルキル基でジ置換されたアミノ基である。炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミン部分と炭素数２〜５の酸部分とからなる酸アミド基は、前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基でモノ置換されたアミン部分あるいは前記の炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状の同一若しくは異なる低級アルキル基でジ置換されたアミン部分と、炭素数２〜５の直鎖状又は分枝鎖状の低級アルカン酸部分とからなる酸アミド基である。
【００１７】
具体的な置換フェノール（Ｒ1 −ＯＨ）、及び置換チオフェノール（Ｒ1 −ＳＨ）の例としては、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、３，４−ジニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−４−クロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジブロモ−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフェノール、２−メチル−４−ニトロフェノール、２，６−ジメチル−４−ニトロフェノール、２−メトキシ−４−ニトロフェノール、２，６−ジメトキシ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−６−メチルフェノール、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチル−４−ニトロフェノール、若しくは４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチルフェノール、又は前記置換フェノールに相当する置換チオフェノール、更にフェノールフタレイン、フェノールスルホンフタレイン、ブロムフェノールブルー、又はクロルフェノールレッドを挙げることができる。
【００１８】
また、置換ヒドロキシフェノキサゾン（Ｒ1 −ＯＨ）の例としては、７−ヒドロキシフェノキサゾン、４−メチル−７−ヒドロキシフェノキサゾン、又は８−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシフェノキサゾンを挙げることができ、置換ナフトール（Ｒ1 −ＯＨ）及び置換チオナフトール（Ｒ1 −ＳＨ）としては、例えば、４−ニトロ−１−ナフトール、６−ニトロ−２−ナフトール、２−クロロ−４−ニトロ−１−ナフトール、２−メチル−４−ニトロ−１−ナフトール、若しくは１，３−ジクロロ−６−ニトロ−２−ナフトール、又は前記置換ナフトールに相当する置換チオナフトール等を挙げることができる。また、置換ヒドロキシインドール（Ｒ1 −ＯＨ）の例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−ヒドロキシインドールを挙げることができる。更に、置換フルオレセイン（Ｒ1 −ＯＨ）の例としては、４，５，６，７−テトラクロロフルオレセイン、又は４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン（ローズベンガル）等を挙げることができ、置換ヒドロキシフェノチアゾン（Ｒ1 −ＯＨ）の例としては、６−ブロモ−ヒドロキシフェノチアゾン、又は１，９−ジメチル−ヒドロキシフェノチアゾン等を挙げることができる。
【００１９】
前記一般式（Ｉ）において好ましいＲ2 は、２価の置換若しくは非置換の飽和若しくは不飽和の炭化水素基であって、その炭化水素基が一般式（Ｉ）中のＲ2 に隣接する２つの−ＣＯ−基、及び−Ｏ−と一緒になって形成されるジカルボン酸の環状酸無水物から誘導される基である。Ｒ2 の置換基は、ハロゲン原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基、アミノ基、炭素数１〜４の低級アルキル基でモノ置換若しくはジ置換されたアミノ基、又は水酸基であり、これらの同一又は異なる１〜６個の置換基を有することができる。好ましいＲ2 は、隣接する２つの−ＣＯ−基間の炭素数が２〜４の置換若しくは非置換のアルキレン基（例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、プロピレン基、若しくはエチルエチレン基）又はアルケニレン基（例えば、ビニレン基、若しくはプロペニレン基）である。
【００２０】
別の好ましいＲ2 は、一般式（Ｉ）中のそのＲ2 に隣接する２つの−ＣＯ−基間の最短炭素鎖の炭素数が２〜４の置換若しくは非置換のシクロペンチレン基、シクロペンテニレン基、シクロヘキシレン基、シクロヘキシニレン基若しくはアリーレン基である。ここで、Ｒ2 の炭素鎖の構成炭素原子が同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルキル環若しくはシクロアルケニル環又は置換若しくは非置換の炭素数６〜１０のアリール環の環構成炭素原子である場合には、一般式（Ｉ）中のＲ2 に隣接する２つの−ＣＯ−基間の炭素鎖が２種存在する。従って、「最短炭素鎖」とは、それらの２種の炭素鎖の内、炭素数の少ない方の炭素鎖を意味する。
【００２１】
シクロペンチレン基、シクロペンテニレン基、シクロヘキシレン基、又はシクロヘキセニレン基としてのＲ2 は、例えば、１，２−若しくは１，３−シクロペンチレン基、１，２−若しくは１，３−シクロヘキシレン基、１，２−若しくは１，３−シクロペンテニレン基、又は１，２−若しくは１，３−シクロヘキセニレン基を挙げることができる。シクロアルケニル部分の不飽和結合部分は、前記の最短炭素鎖内に含まれていても、又はもう一方の炭素鎖中に含まれていてもよい。
アリーレン基としてのＲ2 は、好ましくは炭素数６〜１０個のアリーレン基であり、例えば、１，２−フェニレン基、１，２−ナフチレン基、２，３−ナフチレン基、又は１，８−ナフチレン基を挙げることができる。
アリーレン基としてのＲ2 は、環炭素原子１又はそれ以上がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子又はイオウ原子）で置き換わっていることができる。
【００２２】
更に別の好ましいＲ2 は、（１）Ｒ2 の炭素鎖の構成炭素原子の内の一部（２個又は３個）が、同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルキル環、シクロアルケニル環又は置換若しくは非置換の炭素数６〜１０のアリール環〔アリール環の環炭素原子１又はそれ以上は、ヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子又はイオウ原子）で置き換わっていることができる〕の環構成炭素原子であり、そして（２）Ｒ2 の炭素鎖の構成炭素原子の内の他の一部（１個又は２個）が、前記シクロアルキル環、シクロアルケニル環又はアリール環の環構成炭素原子と１つ若しくは２つの−ＣＯ−基との間に介在するメチレン基（−ＣＨ2 −）、エチレン基（−ＣＨ2 ＣＨ2 −）又はビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）である場合である。この場合の−ＯＣ−Ｒ2 −ＣＯ−基は、例えば、２（又は３）−カルボニルシクロペンチルアセチル基、２（又は３）−カルボニルシクロペンテニルアセチル基、２（又は３）−カルボニルシクロヘキシルアセチル基、２（又は３）−カルボニルメチルシクロペンチルアセチル基、２（又は３）−カルボニルメチルシクロヘキシルアセチル基、２−カルボニルフェニルアセチル基、１−カルボニルメチルナフチル−２（又は８）−カルボニル基、２−カルボニルメチルナフチル−３−カルボニル基、２−カルボニルメチルフェニルアセチル基、１−カルボニルメチルナフチル−２（又は８）−アセチル基、又は２−カルボニルメチルナフチル−３−アセチル基、あるいは２，３−ピリジレン基である。
【００２３】
Ｒ2 の炭素鎖の構成炭素原子が、同時に、置換若しくは非置換の炭素数５〜６のシクロアルケニル環の環構成炭素原子である場合に、そのシクロアルケニレン環の不飽和結合部分は、前記の最短炭素鎖内に含まれていても、あるいは含まれていなくてもよい。
【００２４】
本発明の新規基質化合物は、それ自体公知の方法によって調製することができる。本発明化合物の調製工程の代表例を図１に示す。図１中のＲ1 、Ｒ2 及びＡ2 は前記と同様の意味である。より具体的には、基Ｒ2 を含むジカルボン酸無水物と２−ブロモエタノール（あるいは、２−ブロモエチルメルカプタン）とを、例えばベンゼン等の無極性有機溶媒中で１〜６時間加熱還流し、冷却後、炭酸ナトリウム水溶液を加えて、水相を分取し、エーテル洗浄後、塩酸酸性にした後、エーテルで抽出する。このエーテルを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥してブロモエトキシカルボニルカルボン酸（あるいはブロモエチルチオカルボニルカルボン酸）〔図１の前駆体（１）に相当〕を得る。ここで用いられる基Ｒ2 を含むジカルボン酸無水物としては、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、イタコン酸、又はシトラコン酸等の脂肪族ジカルボン酸、更には、ショウノウ酸、シクロヘキサン−１，２（あるいは１，３）−ジカルボン酸、フタル酸、ナフタレン−１，８（１，２あるいは２，３）−ジカルボン酸等の環状酸無水物、又はキノリン２，３−（若しくは３，４−、４，５−、５，６−、６，７−、若しくは７，８−）ジカルボン酸、あるいはこれらの基本骨格上に置換基としてのハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシル基、アミノ基、低級アルキル置換アミノ基、水酸基、及び／又はフェニル基を有する誘導体を挙げることができる。
【００２５】
前記のカルボン酸誘導体〔前駆体（１）〕に塩化チオニルを加え、５分〜１時間加熱還流し、冷却後ベンゼンを加えて減圧濃縮して、塩化チオニルを除去する。これに発色性の芳香族炭化水素化合物（Ｒ1 −ＯＨ）とピリジンのエーテル溶液を加え、１０分〜１時間加熱還流する。ここで用いられる発色性の芳香族炭化水素化合物（Ｒ1 −ＯＨ）としては、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、３，４−ジニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−４−クロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジブロモ−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフェノール、２−メチル−４−ニトロフェノール、２，６−ジメチル−４−ニトロフェノール、２−メトキシ−４−ニトロフェノール、２，６−ジメトキシ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−６−メチルフェノール、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）フェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチル−４−ニトロフェノール、４−（４−ニトロフェニルアゾ）−２−メチルフェノール、７−ヒドロキシフェノキサゾン、７−ヒドロキシ−４−メチルフェノキサゾン、又は４−ニトロ−１−ナフトール等を挙げることができる。冷却後、この反応物を塩酸中に加え、エーテルで抽出し、これを水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し、得られる油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ブロモエトキシカルボニルカルボン酸の芳香族化合物エステル（あるいは、ブロモエチルチオカルボニルカルボン酸の芳香族化合物エステル）〔図１の前駆体（２）に相当〕を得る。このエステル化合物〔前駆体（２）〕の無水ベンゼン溶液中に、トリメチルアミンのガスを、撹拌下、１〜５日間導入する。生じた沈殿を濾別し、ベンゼンで洗浄後、減圧乾燥して固形物を得、これをアセトン等から再結晶し、減圧乾燥することで、コリンエステラーゼ活性測定用の新規基質化合物である発色性芳香族基を有するコリン誘導体（あるいは、チオコリン誘導体）〔図１の「本発明基質」に相当〕を得ることができる。
【００２６】
こうして得られる新規基質化合物は、基本的には発色性の置換芳香族基とコリン又はチオコリンとの非対称ジカルボン酸エステルである。具体的な化合物の１例としては、３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、３−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（３，４−ジニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、３−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリン、４−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリン、２−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリン、２−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシカルボニル）シクロヘキサンカルボニルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）シクロヘキサンカルボニルコリン、２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ナフタレン−１−カルボニルコリン、３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）アクリルコリン、又は４−ニトロフェノキシカルボニルメタクリルコリン等を挙げることができる。また、前記の各化合物のコリン構造がチオコリンに置き換わった化合物も含まれる。
【００２７】
本発明による化合物は、コリンエステラーゼと接触させるとコリンエステラーゼ活性と比例する量の発色性置換芳香族化合物を遊離する。従って、その発色体化合物をモニターすることで、直接的にコリンエステラーゼ活性を測定することができるので、コリンエステラーゼ活性測定用の基質物質として有用である。従来の基質は、基質とコリンエステラーゼを接触させて生成する酢酸あるいはコリンを酵素的に発色系に導くか、あるいは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の発色系に導いており、直接的な発色法ではないため、基質自体の分解だけでなく酵素の失活や他の発色系へ導く組成物の劣化等、測定の不正確性に関与する要素が多く、正確にコリンエステラーゼ活性値を得られないことがあった。これに対して、本発明化合物によれば、それらの問題点を一挙に解決することができるという格別な効果を有している。すなわち、本発明による化合物をコリンエステラーゼ活性測定用基質物質として用いれば、コリンエステラーゼによって直接的に検出可能な置換フェノキシド等を生成するので、精度良くコリンエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２８】
前記新規化合物を用いて、生体液、特には血清や血漿中のコリンエステラーゼ活性を測定することができる。すなわち、本発明化合物を基質物質としてコリンエステラーゼと接触させることで、発色性の置換フェノキシド等、ジカルボン酸無水物及びコリン（あるいは、チオコリン）を生成し、この発色性置換フェノキシド等を光学的に検出することで、予めコリンエステラーゼ標品による検量線作成、あるいは標品による活性単位当たりの吸光度変化量を求める等の操作・計算をしておけば、被検試料中に含まれるコリンエステラーゼ活性を定量的に求めることができる。
【００２９】
より具体的には、例えば、血清等の被検試料をｐＨ７〜１０の従来公知の緩衝液（例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）で適宜希釈して、２５〜４０℃に保持し、そこに本発明基質０．０５〜１００ｍＭを含むｐＨ５〜１０の従来公知の緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）を添加して反応させ、波長４００〜５００ｎｍにおける吸光度変化を分光学的に検出し、単位時間当たりの吸光度変化量を求める（いわゆるレートアッセイ法）ことで、精度良くコリンエステラーゼ活性を求めることができる。
【００３０】
このとき、発色性置換フェノキシド等の解離を促進するために、αーシクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、あるいはそれらシクロデキストリンに塩基性官能基（例えば、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル、あるいはトリメチルアンモニオエチル等の４級アンモニウム塩）を導入したシクロデキストリン類を存在させることもできる。また、これらの試薬をキット化する際には、保存性や試料中の干渉物影響の回避等の目的で従来から使用されている各種界面活性剤、防腐剤、キレート剤等を適宜添加して用いることも本発明は包含するものである。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の各実施例で用いた各有機溶媒及び各化合物は、市販の試薬特級品である。
実施例１：３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリンの合成
無水コハク酸１０．０ｇ（１００ｍｍｏｌ）と２−ブロモエタノール１２．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）のベンゼン（４０ｍｌ）溶液を４時間加熱還流した。冷却後、反応液を炭酸ナトリウム水溶液（炭酸ナトリウム１４．８ｇを精製水４００ｍｌに溶解した水溶液）中に加えて、撹拌して水相を分取し、水相をエーテルで洗浄後、更に１０％塩酸で酸性にした後、エーテル３００ｍｌで抽出し、この抽出物を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、更に真空で乾燥して、前駆体（１）〔図１参照〕である３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸の白色固形物１６．１ｇ（収率７１．１％）を得た。
【００３２】
引き続き、室温で上記３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸１４．８ｇ（６６ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド１滴と塩化チオニル７．０ｍｌ（９９ｍｍｏｌ）とを加え、１５分間撹拌後、更に１５分間加熱還流した。冷却後、乾燥ベンゼン７０ｍｌを加えて減圧濃縮し、過剰の塩化チオニルを除去した。この残渣に４−ニトロフェノール９．２ｇ（６６ｍｍｏｌ）と無水ピリジン６．５ｍｌ（８０ｍｍｏｌ）の無水エーテル７０ｍｌの溶液を撹拌しながら加え、室温で３０分間反応させ、更に６０分間加熱還流した。冷却後、この反応混合物を冷１０％塩酸３５０ｍｌ中に加え、エーテル７００ｍｌで抽出し、この抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して油状物質を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、Ｒｆ値＝０．３９）で精製し、前駆体（２）〔図１参照〕である３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル１８．２ｇ（収率８１％）を得た。
【００３３】
前記３−（２−ブロモエトキシカルボニル）プロピオン酸４−ニトロフェニルエステル１５．０ｇ（４３．３ｍｍｏｌ）の無水ベンゼン８０ｍｌの溶液中に、水酸化ナトリウム管を通して乾燥させたトリメチルアミンのガス（３０％トリメチルアミン水溶液を加熱して発生させた）を攪拌下、３日間導入した。生じた沈殿を濾別して、これをベンゼン１００ｍｌで洗浄し、室温で減圧乾燥して得られた固形物を、活性炭を用いてアセトンから再結晶し、更に減圧乾燥して３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−Ｉともいう）である殆ど白色の結晶性粉末７．６７ｇ（総収率４３．７％）を得た。この生成物は極めて水に溶け易く、吸湿性を有する。前記生成物の元素分析の結果はＣ15Ｈ21Ｎ2 Ｏ6 Ｂｒ（分子量：４０５．２５）であり、 1Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３４】
実施例２：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水グルタル酸１１．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−IIともいう）である殆ど白色の結晶性粉末１４．２ｇ（総収率３４％）を得た。この生成物は極めて水に溶け易く、吸湿性を有する。前記生成物の元素分析の結果はＣ16Ｈ23Ｎ2 Ｏ6 Ｂｒ（分子量：４１９．２７）であり、 1Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３５】
実施例３：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水２，２−ジメチルグルタル酸１４．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−４，４−ジメチルブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−III ともいう）である白色固形物８．５ｇ（総収率１９％）を得た。この生成物の元素分析の結果はＣ18Ｈ27Ｎ2 Ｏ6 Ｂｒ（分子量：４４７．３３）であり、 1Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３６】
実施例４：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水３，３−ジメチルグルタル酸１４．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）−３，３−ジメチルブチリルコリンの臭化物（以下、ＣｈＥ−IVともいう）である白色固形物４．５ｇ（総収率１０％）を得た。この生成物の元素分析の結果はＣ18Ｈ27Ｎ2 Ｏ6 Ｂｒ（分子量：４４７．３３）であり、 1Ｈ−ＮＭＲシグナル帰属結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0004004095.tif 000011
【００３８】
実施例５：コリンエステラーゼ活性の測定
（１）コリンエステラーゼ標準試料
ヒト血漿由来コリンエステラーゼ（ベーリンガーマンハイム社；ブチリルコリンを基質として１バイアル当たり約１００Ｕ含有）を０．１％牛血清アルブミンを含む生理食塩水５ｍｌに溶解し、更に使用時に０．１％牛血清アルブミンを含む生理食塩水で１０倍に希釈したものをコリンエステラーゼ標準試料とした。
（２）試薬１
ｐＨ７．５の１００ｍＭトリス緩衝液を試薬（１）として調製した。
（３）試薬２
前記各実施例１〜４で調製した合成基質（ＣｈＥ−Ｉ、ＣｈＥ−II、ＣｈＥ−III 、又はＣｈＥ−IV）の５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ−２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）を試薬（２）として調製した。
（４）操作
コリンエステラーゼ活性の測定には、Ｈ−７１５０型自動分析装置（日立製作所）を使用した。測定時のパラメーターは以下の通りである。
0004004095.tif 000012
測定機は上記パラメーターに従って、コリンエステラーゼ標準試料１０μｌと試薬（１）（３２０μｌ）を分注して混合し、一定の恒温時間（３７℃、５分間）の後、試薬（２）（８０μｌ）を添加混合して反応を開始させた。このときの吸光度変化（タイムコース）を図２に示す。なお、図２中の記号は、−●−がＣｈＥ−Ｉ、−△−がＣｈＥ−II、−□−がＣｈＥ−III 、−○−がＣｈＥ−IVを表している。コリンエステラーゼ標準試料に本発明基質を含む試薬を添加すると、コリンエステラーゼと本発明基質との反応によって本発明基質から生成する４−ニトロフェノールに由来する吸光度の上昇が確認された。
【００３９】
また、コリンエステラーゼ標準試料の希釈列を調製し、それを試料として上記と同様の操作を行い、試薬（２）を添加してから１８０秒経過後に、それ以後の１２０秒間での、それぞれの基質含有試薬の単位時間当たりの吸光度変化を求めた。結果を図３に示す。なお、図３中の記号は、前記と同様に−●−がＣｈＥ−Ｉ、−△−がＣｈＥ−II、−□−がＣｈＥ−III 、−○−がＣｈＥ−IVを表している。コリンエステラーゼ標準試料の希釈列に対し、各基質毎の単位時間当たりの吸光度変化量は直線性を示しており、コリンエステラーゼと本発明による各基質が反応すると、定量的に４−ニトロフェノールが生成していることが確認された。この結果から、本発明による新規基質物質を用いて、被検試料中のコリンエステラーゼ活性を定量的に測定できることが認められた。
【００４０】
実施例６：血清中のコリンエステラーゼ活性の測定
実施例５に従って、管理血清（商品名：セラケム；Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）中のコリンエステラーゼ活性を測定した。すなわち、ＣｈＥ−Ｉを基質として、その他は実施例５の操作方法に準じて行った。比較として、従来のコリンエステラーゼ測定用試薬（商品名：イアトロファインＣｈ−Ｅレート；ヤトロン社製、基質物質：ブチリルチオコリン）を用いて同様に試験を行った。但し、試料の量は３μｌ、測定波長は６００−４８０ｎｍに変更して行った。それらの各試験を１０回繰り返し行った測定結果を表２に示す。表２に示すように、本発明化合物はコリンエステラーゼ活性測定用の基質として用いることができ、従来のものと遜色なく精度良く血清中のコリンエステラーゼ活性を測定することができた。
【００４１】
【表２】
0004004095.tif 000013
【００４２】
実施例７：２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリンの合成
実施例１の無水コハク酸に換えて、無水フタル酸１３．６ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって２−（４−ニトロフェノキシカルボニル）ベンゾイルコリンの臭化物である殆ど白色の結晶性粉末１０．２ｇ（総収率２２．５％）を得た。この生成物は水に溶け易く、吸湿性を有する。この生成物の元素分析の結果はＣ19Ｈ21Ｎ2 Ｏ6 Ｂｒ（分子量：４５３．２９）であった。前記生成物５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ−ＭＥＳ緩衝液を調製し、実施例５に準じてコリンエステラーゼ標準試料と反応させ、遊離する４−ニトロフェノキシド由来の発色を確認した。
【００４３】
実施例８：４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルチオコリンの合成
実施例１の２−ブロモエタノールに換えて、２−ブロモエタンチオール１４．１ｇ（１００ｍｍｏｌ）を用いること以外は、前記実施例１に記載の合成手順を繰り返すことによって４−（４−ニトロフェノキシカルボニル）プロピオニルチオコリンの臭化物である淡黄白色の粉末７．８ｇ（総収率１８．５％）を得た。この生成物は水に溶け易かった。この生成物の元素分析の結果はＣ15Ｈ21Ｎ2 Ｏ5 ＳＢｒ（分子量：４２１．１９）であった。前記生成５ｍＭを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液を調製し、実施例５に準じてコリンエステラーゼ標準試料と反応させ、遊離する４−ニトロフェノキシド由来の発色を確認した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明による化合物は、コリンエステラーゼの基質であると同時に、その構造内に発色性成分を含有しており、コリンエステラーゼと接触させると、その発色性成分を放出して発色性化合物を生成することができる。しかも、その生成量は、本発明化合物に接触させた前記コリンエステラーゼの活性と比例する。従って、前記発色性化合物をモニターすることにより、直接的にコリンエステラーゼ活性を測定することができ、発色系へ誘導する酵素や試薬を使用する従来法よりも正確な測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規化合物の合成工程の１例を示す説明図である。
【図２】本発明による４種の新規化合物がコリンエステラーゼ標準試薬と接触した際に生成する発色性化合物由来の吸光度変化を示すグラフ（タイムコース）である。
【図３】本発明による４種の新規化合物がコリンエステラーゼ標準試薬の希釈列と接触した際に生成する発色性化合物の単位時間当たりの吸光度変化量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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