(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカスに含ませることによって、少なくとも１種のファージに対する耐性を該ストレプトコッカスに与えることができるＤＮＡフラグメントであって、プラスミドｐＭＺ２３（寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８）中に存在する３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、プラスミドｐＭＺ３１（寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８９）中に存在する６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメント、又は配列番号１の塩基配列を有するフラグメントから成る、上記ＤＮＡフラグメント。
【請求項２】
ストレプトコッカスに含ませることによって、少なくとも１種のファージに対する耐性を該ストレプトコッカスに与えることができるＤＮＡフラグメントであって、プラスミドｐＭＺ２３（寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８）中に存在する３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、プラスミドｐＭＺ３１（寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８９）中に存在する６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメント、又は配列番号１の塩基配列を有するフラグメントと緊縮条件下でハイブリッド形成し、かつ該ＤＮＡフラグメントを該ストレプトコッカスに含ませることによって、ファージφＳｆｉ２１又はファージφＳｆｉ２に対する耐性を該ストレプトコッカスに与えることができる、上記ＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡフラグメントを有するストレプトコッカスであって、該ＤＮＡフラグメントが該ストレプトコッカスのゲノム中に組込まれているか、又は複製可能なプラスミドを介して該ストレプトコッカス中に保持されている、上記ストレプトコッカス。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡフラグメントを有するストレプトコッカスであって、該ＤＮＡフラグメントが該ストレプトコッカスのゲノム中に組込まれているか、又は複製可能なプラスミドを介して該ストレプトコッカス中に保持されている、上記ストレプトコッカス。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡフラグメントを含む複製可能な又は組込み可能な組換えベクター。
【請求項６】
請求項２に記載のＤＮＡフラグメントを含む複製可能な又は組込み可能な組換えベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡフラグメントをベクター中にクローン化してベクター構築体を形成させ、該ベクター構築体をストレプトコッカス中に導入することを含む、少なくとも１種のファージに耐性なストレプトコッカスの製造方法。
【請求項８】
請求項２に記載のＤＮＡフラグメントをベクター中にクローン化してベクター構築体を形成させ、該ベクター構築体をストレプトコッカス中に導入することを含む、少なくとも１種のファージに耐性なストレプトコッカスの製造方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により産生される、ファージ耐性ストレプトコッカス。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法により産生される、ファージ耐性ストレプトコッカス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、それを含む乳酸菌をバクテリオファージに対して耐性にする、バクテリオファージＤＮＡフラグメントの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌がファージ攻撃を受け易いことは、多量のミルクを処理するヨーグルト産業の重大な問題である。不衛生のためにヨーグルト製造プロセス中にバクテリオファージ（又はファージ）が導入される可能性がある。これらはまた、溶原性ファージ（すなわち、潜伏した形で細菌のゲノムに組み込まれたファージ）の溶菌段階にエントリーした後に出現する可能性がある。これらの攻撃の発生を減ずるために、産業界は一般に、ある一定のファージに一般的に耐性である乳酸菌の種々の株の混合物の使用に、又は製造の各段階に順繰りに、乳酸菌の種々の株を使用することに頼っている。しかし、これらの系は、乳酸菌の様々な株を使用することを必要とし、このことが他の使用菌株に比べて有益な菌株の感覚刺激性(organoleptic)又は構造的(textural)特性を遮蔽すると言う欠点を有する。それ故、有益な乳酸菌の株の耐性スペクトルを拡大する手段を有することができるならば、特に有利であると考えられる。
【０００３】
ファージに対する乳酸菌の自然耐性は一般に細菌に由来し、ファージ粒子の制限／修飾、ファージ粒子の吸着の妨害及び／又はファージ溶菌段階の不発(abortion)の機構に関係する。これらの耐性はより一般的に細菌プラスミドによってコードされる。したがって、Ｌａｒｂｉ等はファージに対する耐性の少なくとも３種類の細菌機構を有するストレプトコッカス  サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）亜種サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の２菌株を開示する（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，５９，３４９〜３５７，１９９２）。
【０００４】
ファージに対する耐性のこれらの細菌機構を利用して、ファージに対する乳酸菌の耐性のスペクトルをさらに拡大することができる。かくして、Ｓｉｎｇ  Ｗ．Ｄ．等はファージに対する耐性の細菌機構をコードする異なるプラスミドをそれぞれ含むラクトコッカス  ラクチス亜種ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）のクローンの産生を記載している（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５９，３６５〜３７２，１９９３）。
【０００５】
最後に、ファージに対する乳酸菌の耐性機構の他の可能性のある起源がＨｉｌｌ  Ｃ．等によって最近、提示されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，６４１９〜６４２６，１９９０）。ラクトコッカスラクチスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントは、それらを含むラクトコッカス  ラクチスにファージ耐性を実際与えることができる。関係する耐性機構はまだ明らかではない。しかし、ファージの発達に重要な調節シグナルの過剰発生又は滴定(titration)にこれらのフラグメントが関係していると考えることは合理的である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ストレプトコッカスにファージ耐性を与えることができる、ファージの新規なＤＮＡフラグメントを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであって、それを含むストレプトコッカスに、少なくとも１種のファージに対する耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特に、プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６キロベース（ｋｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡフラグメントと相同であるか又はハイブリッド形成するフラグメントに関する。
本発明はまた、少なくとも１種のファージに対して耐性なストレプトコッカスの製造方法であって、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであるが、少なくとも１種のファージに対する耐性をストレプトコッカスに与えることができるＤＮＡフラグメントをベクター中にクローン化し、組換え体ベクターをストレプトコッカスに導入する方法にも関する。
【０００８】
本発明はまた、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであるが、ストレプトコッカスに少なくとも１種のファージに対する耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特にプラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡフラグメントに相同であるか又はこれとハイブリッド形成するフラグメントを、それらのゲノム中に又は反復可能なプラスミドを用いて、組込んで含むストレプトコッカス属の微生物にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明によるＤＮＡフラグメントを含む組換え複製又は組込みベクターも本発明の対象である。
本発明によるＤＮＡフラグメントによって形質転換されたストレプトコッカスは、前記ＤＮＡフラグメントが単離されるファージに対してだけでなく、これらのファージと相同(homologous)であるファージに対しても、またこれらのファージとは異種(heterologous)であるある種のファージに対してさえも耐性であると言う驚くべき性質を有する。
【００１０】
それ故、本発明によるＤＮＡフラグメントは、ストレプトコッカスのファージ耐性スペクトルをかなり拡大することを可能にする。このために、ストレプトコッカスを、様々な耐性機構を有すると考えられる、本発明による１種以上のフラグメントを含むベクターによって形質転換することができる。さらに１種以上の細菌耐性機構を有する、本発明によるベクターによってストレプトコッカスを形質転換することもできる。
【００１１】
意外にも、本発明によるフラグメントによって与えられる耐性スペクトルは、前記フラグメントを含むストレプトコッカスの菌株に依存して種々であり得る。最後に、異なる耐性スペクトルをそれぞれ有する、有益なストレプトコッカス菌株のクローンの開発を考えることもできる。したがって、これらのストレプトコッカスクローンを、例えば、ヨーグルト又はチーズを製造するためのミルクの工業的発酵中に順繰りに用いることが有利であると考えられる。
【００１２】
以下の説明において、“相同ファージ”とは、細菌の同じ菌株を攻撃し、同様な溶菌挙動を有するファージ群の一部であるファージを意味すると理解される。これに反して、上記で定義した２条件を満たさないファージは異種ファージである。
【００１３】
本発明の目的のために、“相同配列”とは、少数の塩基の置換、欠失又は付加においてのみ本発明による配列から異なる配列を意味すると理解される。このような関係において、遺伝暗号の縮重のために、同じポリペプチドをコードする２種類のＤＮＡ配列は、特に相同であると見なされる。本発明による配列と８０％より大きい相同を示す配列も相同配列と見なされる。後者の場合には、本発明による配列の塩基と同じである相同配列の塩基の数対本発明による前記配列の塩基の総数の比によって、相同が評価される。
【００１４】
本発明の目的のために、“ハイブリッド形成するフラグメント”とは、サザンブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，「分子クローニング，実験室マニュアル」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，アメリカ合衆国，１９８９，９．３１〜９．５８章）によって、本発明によるフラグメントとハイブリッド形成することができるフラグメントを意味すると理解される。非特異的又は不安定なハイブリッド形成を回避するために、緊縮条件下でハイブリッド形成を実施することが好ましい。
【００１５】
最後に、“フラグメント”又は“ＤＮＡフラグメント”とは、例えば、既知方法“ポリメラーゼ連鎖反応”によってインビトロで合成、再現されることができる、又はインビボで、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）若しくはラクトコッカス  ラクチス型の細菌において再現されることができる、ファージ起源の二本鎖ＤＮＡフラグメントと理解すべきである。
【００１６】
本発明によるＤＮＡフラグメントの選別プロセスを実施するために、ファージのゲノムの一部又は全てをカバーするファージＤＮＡフラグメントを含む、ストレプトコッカスライブラリーを作製することができる。このために、ファージＤＮＡを制限酵素によって消化させ、消化物(digest)をベクター中にクローン化し、次に、このベクターを例えばストレプトコッカスに導入する。
【００１７】
次に、形質転換されたストレプトコッカスライブラリーを、例えば第２ファージ耐性ストレプトコッカスライブラリーを分離するために、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージを含む培地において培養する。
次に、固形培地上に第２ライブラリーの希釈物をプレーティングし、次いで、例えば、非形質転換ストレプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大きい耐性を有するクローンを単離クローンから選別することによって、ファージ耐性クローンを従来法に従って単離することができる。
【００１８】
上記方法の代替手段として、あらかじめファージＤＮＡ消化物を電気泳動にかけ、次に問題のフラグメントを含むゲルバンドを溶離することによって、各ファージＤＮＡフラグメントを単離することもできる。次に、各単離フラグメントをベクター中にクローン化し、各ベクターをストレプトコッカスに導入して、例えば、非形質転換ストレプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大きい耐性を有するストレプトコッカスを選別することも可能である。
【００１９】
耐性ストレプトコッカスから、非形質転換ストレプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大きい耐性を有するストレプトコッカスを（ファージＤＮＡフラグメントによって）選別するために、毒性ファージの懸濁液の希釈物を、固形培地中のストレプトコッカス（形質転換されたもの又はそうでないもの）の集密的培養物(confluent culture) 上にプレーティングし、プラーク数を計数し（各プラークは１ファージによる感染から生ずる）、所定の希釈物に関して、非形質転換ストレプトコッカスの培養物上に出現するプラーク数対形質転換されたストレプトコッカスの培養物上に出現するプラーク数の比を算出する。このようにして、少なくとも１００の比、好ましくは１０3〜１０12の比を有する形質転換されたストレプトコッカスを選別することができる。
【００２０】
したがって、Ｓ．サーモフィルス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｕ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対して特に毒性であるファージφＳｆｉ２１から、３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントを単離することが可能であった。このフラグメントはプラスミドｐＭＺ２３中に存在し、このプラスミドはこれを含む菌株Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１として、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５、フランスに１９９５年６月７日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８を与えられた。この３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サーモフィルスに、ＤＮＡフラグメントを選別したファージと相同であるファージに対するのみでなく、異種であるファージに対しても耐性を与えることができる。
【００２１】
Ｓ．サーモフィルス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｕ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対して毒性であるファージφＳｆｉ２から、６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡフラグメントを単離することも可能であった。このフラグメントはプラスミドｐＭＺ３１中に存在し、このプラスミドはこれを含む菌株Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１として、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５、フランスに１９９５年６月７日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８９を与えられた。このフラグメントは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サーモフィルスに、少なくとも１種のファージに対する耐性を与えることができる。
【００２２】
特に、上記ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩフラグメント中に保存される０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを単離することができた。以下の配列表に記載する配列番号１の配列を有するこのフラグメントは、ファージφＳｆｉ２１に相同であるファージ中に比較的良好に保存されると言う特徴を有する。このフラグメントは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サーモフィルスに、少なくとも１種のファージに対する耐性を与えることを可能にする。
【００２３】
６．５ｋｂ、３．６ｋｂ及び０．８ｋｂ  ＤＮＡフラグメントによって与えられる利益と、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントがそれを含むストレプトコッカスに耐性を与えることが初めてできたと言う事実とを考慮して、本発明は少なくとも１種のファージに対する耐性をストレプトコッカスに与えることができる、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントに関する。
【００２４】
特に、本発明は、第一に３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメント及び／又は０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントに相同であるか又はこれとハイブリッド形成することができ、第二に少なくとも１種のファージに対する耐性をストレプトコッカスに与えることができる、任意のＤＮＡフラグメントに関する。特異的にハイブリッド形成する小フラグメントは一般に長さが１５〜２５塩基対（ｂｐ）であるので、長さが少なくとも２０ｂｐであり、この下限が任意に設定されるフラグメントを選択することが好ましい。
【００２５】
少なくとも１種のファージに対して耐性であるストレプトコッカスの製造方法を実施するために、プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメントと相同であるか又はハイブリッド形成するフラグメントをベクター中にクローン化することが好ましい。０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを用いることが好ましい。
【００２６】
ベクターは、例えば大腸菌又はラクトコッカス  ラクチスのような、他の微生物の複製系又は表現系を含むことができる、複製可能な表現プラスミドであり得る。これはまた、組込みベクター(integrative vector)でもよい。ファージの配列の上流に、この配列の発現のために重要な配列（例えば、ストレプトコッカスプロモーター）を配置することが有用ではないことにも注目すべきである。
【００２７】
本発明による発現又は選択プロセスでは、ストレプトコッカス属の細菌、特にＳ．サーモフィルス中に、例えば、接合(conjugation)、トランスフェクション又は形質転換によって導入することができる。この場合に、このように形質転換された微生物が形質転換されたベクターの幾つかのコピーを含むことが好ましい。
【００２８】
本発明によるＤＮＡフラグメント、組換えプラスミド及び形質転換細菌を得る実施例に関する、以下に記載の追加の説明によって、本発明をさらに詳述する。しかし、これらの実施例が本発明の対象を説明するために記載するものであり、いかなる意味でも、それらへの限定を意味するものではないことは、言うまでもない。
【００２９】
ＤＮＡの取扱い、細菌細胞のクローニング及び形質転換は、他に記載しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による上記テキストに記載された操作によって実施される。％は、他に記載しない限り、重量によるものである。
【００３０】
培地：（固形培地として１．５％Ｂａｃｔｏａｇａｒを添加）
−Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，米国）：０．５％トリプトン(tryptone)、０．５％ソイトーン(soytone)、０．５％食肉加水分解物、０．２５％酵母抽出物、０．０５％アスコルビン酸、０．０２５％硫酸マグネシウム、１．９％β−グリセロリン酸二ナトリウム及び水。
−ＬＭ１７：０．５％ラクトースを含むＭ１７培地。
−ＬＭ１７／ＣａＣｌ2：０．０５％ＣａＣｌ2を含むＬＭ１７培地。
−ＭＳＫ：０．１％酵母抽出物を含む脱脂乳（１０％で再構成する粉末）
−ＭＲＳ：１％ペプトン、１％加水分解された食肉，０．５％酵母抽出物，０．５％酢酸ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸二カリウム、０．２％クエン酸アンモニウム、０．００５％硫酸マンガン、２％デキストロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及び水。
−ＨＪ：３％トリプトン、０．２％牛肉抽出物、１％酵母抽出物、０．４％ＫＨ2ＰＯ4
【００３１】
細菌菌株
−１９９４年５月１８日にＣＮＣＭに寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１４２４を与えられたＳ．サーモフィルスＳｆｉ２１。この菌株はファージφＳｆｉ２１に敏感であり、ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＳｆｉ２、φＳｆｉ９及びφＳｆｉｌ８に対して本来耐性である。
−φＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＳｆｉ２及びφＳｆｉ１８に敏感であり、ファージφＳｆｉ９に本来耐性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１。プラスミドｐＭＺ３１又はｐＭＺ２４を含む、この菌株の２種のクローンは、上記寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８及びＣＮＣＭＩ−１５８９でＣＮＣＭに寄託された。
【００３２】
−１９９４年５月１８日にＣＮＣＭに寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１４２１を与えられたＳ．サーモフィルスＳｆｉ９。この菌株はファージφＳｆｉ９に敏感であり、ファージφＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２、φＳｆｉ１８及びφＳｆｉ２１に対して本来耐性である。
これらの３種類のグラム陽性菌株は顕微鏡下で非鞭毛性鎖形成球菌の外観を有する。これらの菌株は非胞子形成性であり、通性嫌気性生物である。
【００３３】
【実施例】
例１：ファージφＳｆｉ２１からのＤＮＡフラグメントのクローニング
Ｉ．１．ファージφＳｆｉ２１からのＤＮＡフラグメントの作製：
液体培地ＬＭ１７／ＣａＣｌ2 ２００ｍｌに、Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ２１の定常期培養物１％と、約１０8粒子／ｍｌを含むファージ懸濁液（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎｅｓｔｌｅ）５００μｌとを接種する。この培地を４２℃において、溶菌が終了するまで（約２時間）インキュベートし、培地をＳｏｒｖａｌＳＳ−３４ローターにおいて８０００ｒｐｍ及び４℃において３０分間遠心分離し、上澄み液を回収し、これを同じローターにおいて１２，０００ｒｐｍ、４℃において６時間再び遠心分離し、次に、ファージ粒子のペレットを緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む）０．５ｍｌ中に再懸濁させる。次に、ファージ粒子のこの懸濁液を−２０℃において保存する（この方法は他のファージの懸濁液の製造にも適用可能である）。
【００３４】
ファージ懸濁液をデオキシリボヌクレアーゼ  ５μｇ／ｍｌとリボヌクレアーゼ  １μｇ／ｍｌとによって３７℃において３０分間処理し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡと０．８％ＳＤＳとを加えて、混合物を３７℃において５分間インキュベートし、次に、プロテイナーゼＫ  １００μｇ／ｍｌを加え、混合物を５６℃において１時間インキュベートする。ＴＥ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５と１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で飽和したフェノール溶液の１倍量によって、続いてクロロホルムの１倍量によって、タンパク質を抽出する。次に、水相中に存在するファージＤＮＡをエタノール（０．３Ｍ  酢酸ナトリウムを含む、ｐＨ５．２）の２倍量中で−７０℃において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、ファージＤＮＡのペレットを水０．４ｍｌ中に再懸濁させる。
【００３５】
ファージＤＮＡの溶液の一部を次に緩衝液（２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ及びＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍｌを含む）中で制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）によって従来通り消化させる。次に、上記条件下でタンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、ファージＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るように、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
【００３６】
Ｉ．２．ファージφＳｆｉ２１のゲノムの大部分をカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレプトコッカスライブラリーの作製：  上記条件下で、ベクターｐＮＺ１２４（Ｍ．Ｄｅ  ＶＯＳ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，オランダ）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって従来法に従って消化させる。この反応の終了時に、タンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、プラスミドＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るように、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
【００３７】
ベクターｐＮＺ１２４（１００ｎｇ）の溶液の若干量と、ＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）の溶液の別の若干量と、水  １７μｌまでとを混合する。混合物を５６℃において２〜５分間加熱し、次に、通常の連結反応用緩衝液２μｌとＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）の溶液１μｌとを加える。この反応の終了時に、タンパク質をフェノールによって抽出し、ＤＮＡを従来法に従って沈殿させる。
【００３８】
図１と図２に挙げたファージの全てに感受性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のコンピテント細胞をＭａｒｃｉｓｅｔ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４３，４９０〜４９６，１９９４）によって作製する。
【００３９】
コンピテント細胞を形質転換されたベクターによるエレクトロポレーションによって形質転換する（Ｍａｒｃｉｓｅｔ等）。このために、解凍したコンピテント細胞の懸濁液２００μｌを組換えベクターの沈殿ペレットと混合し、混合物をエレクトロポレーション装置（Ｇｅｎ  Ｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ）のキュベットに入れ、このキュベットを２０００Ｖ，２５μＦ及び４００Ωにさらし、液体培地ＨＪ（さらに、０．５％ラクトースを含む）１ｍｌを加え、混合物を４２℃において４時間インキュベートする。培養物を固形ＬＭ１７培地（さらに、クロラムフェニコール  ４μｇ／ｍｌを含む）上に置く。生き残る細菌がファージφＳｆｉ２１の全ゲノムをカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレプトコッカスライブラリーを構成する。しかし、１個以上のファージフラグメントを組込まずに再循環されるベクターｐＮＺ１２４を含むストレプトコッカスも存在することに注目すべきである。
【００４０】
Ｉ．３．ファージ耐性ストレプトコッカスのライブラリーの作製：  上記ストレプトコッカスライブラリーをＬＭ１７液体培地（さらに、クロラムフェニコール４μｇ／ｍｌと、ファージφＳｆｉ２１粒子懸濁液  １００μｌとを含む）中で培養する（上記Ｉ．１項）。生き残る細菌がファージ耐性ストレプトコッカスのライブラリーを構成する。
【００４１】
Ｉ．４．プラスミドｐＭＺ２３の分析
ファージ耐性Ｓ．サーモフィルスから、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８を与えられ、３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩファージＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＭＺ２３を含むクローンを単離することができた。
プラスミドｐＭＺ２３によって与えられるファージ耐性をマイクロタイタープレート試験によって評価することができる。このために、プラスミドｐＭＺ２３を含むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌクローンをＭＳＫ培地（クロラムフェニコール４μｇ／ｍｌを補充）で培養する。定常期培養物１００μｌをＬＭ１７／ＣａＣｌ2培地（クロラムフェニコール４μｇ／ｍｌを補充）０．９ｍｌで希釈する。上記培地２００μｌと、希釈培養物２２μｌと、上記ファージφＳｆｉ２１懸濁液２．５μｌ／ｍｌとをマイクロタイタープレートの孔に分配する（３通りに；１／１００希釈）。このプレートを４２℃においてインキュベートし、１５分毎に光学密度を６２０〜６３０ｎｍにおいて７．５時間測定する（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）。
【００４２】
同じ試験をファージφＳｆｉ２１と相同なファージ、すなわち、ファージφＳｆｉ２、φＳｆｉ１８及びφＢａｓ３と、ファージφＳｆｉ２１とは異種のファージ、すなわち、ファージφＢａｓ１１及びφＢａｓ１９によって実施した。このために、これらのファージの懸濁液を上記Ｉ．１項に記載したように製造した。
【００４３】
比較のために、ファージの不存在下で形質転換したＳ．サーモフィルス  Ｓｆｉ１株によって、同じ試験を平行して実施する。同じ試験をプラスミドｐＮＺ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィルス菌株によっても実施する。
図１に示す試験結果は、プラスミドｐＮＺ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株が全ての使用ファージに感受性であることを実証する。それ故、プラスミドｐＮＺ１２４は耐性の原因ではない。
【００４４】
図２に示す試験結果は、プラスミドｐＭＺ２３によって形質転換したＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株が全ての使用ファージに耐性であることを実証する。それ故、３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩファージフラグメントが実際にこの耐性の原因である。このフラグメントはファージφＳｆｉ２１と相同なファージ及び異種なファージに対する耐性を与えることができる。
【００４５】
Ｉ．５．耐性度の評価：  プラスミドｐＮＺ１２４又はｐＭＺ２３によって形質転換したＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株のＭＳＫ（クロラムフェニコール４μｇ／ｍｌを補充）中の新鮮な培養物０．３ｍｌと、ＭＲＳアガール培地（０．７％Ｂａｃｔｏａｇａｒ）（５２℃）２．５ｍｌと、評価すべき各ファージの懸濁液の希釈物０．１ｍｌとを混合する（ファージ懸濁液はＩ．１項の記載の通りに調製）。混合物をＬＭ１７固形培地（クロラムフェニコール補充）上でプレーティングし、プレートを嫌気性条件下で４２℃においてインキュベートし、感染病巣の数を固形培地上で（プラークとして）計数する。次に、一定の希釈に関して、ｐＮＺ１２４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク数対ｐＭＺ２３による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク数の比によって、ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ２３比を算出する。
【００４６】
以下の表１に示す結果は、ファージφＳｆｉ２１ゲノムの３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが、ファージφＳｆｉ２１と相同であるファージに対する耐性を与えることができることを実証する。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
Ｉ．６．３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの分析：  ３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの一部もファージに対する耐性を与えることができるか否かを判断するために、３．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩのＥｃｏＲＩ１フラグメントをｐＮＺ１２４中にクローン化し、このプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆｉ１に形質転換する。
【００４９】
このために、プラスミドｐＭＺ２３を精製し、これを当業者に周知の方法によって制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、フラグメントにする。次に、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離する。３．６ｋｂフラグメントを含むバンドをゲルから切断し、このバンドを０．４５μｍ遠心分離膜（ＭＣウルトラフリー  フィルター）上に付着させ、これを−２０℃に１０分間貯蔵し、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ａ遠心機中、全体を１０，０００ｒｐｍで室温下２０分間遠心分離する。濾液をＴＥ飽和フェノールによって抽出し、水相を酢酸エチルとエタノールとによって−７０℃において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物を１３，０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ペレットを７０％エタノール溶液０．５ｍｌ中に再懸濁させ、懸濁液を１３，０００ｒｐｍにおいて再遠心分離し、次に、３．６ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを水１０μｌ中に再懸濁させる。
【００５０】
３．６ｋｂ  フラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断し、切断フラグメントを、予めＥｃｏＲＩによって切断したプラスミドｐＮＺ１２４に連結し、組換えプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株に形質転換する。実験条件は上記Ｉ．１項及びＩ．２項に記載の条件と同様である。次に、ファージφＳｆｉ２１に耐性の細菌を上記Ｉ．３項に記載の条件と同様の条件下で選択し、０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩファージＤＮＡフラグメント含有プラスミドｐＭＺ２３ｃを含む、特に耐性のクローンを単離する。
【００５１】
このフラグメントによってストレプトコッカスに与えられた耐性を上記Ｉ．４項に記載の条件下で評価する。以下の表２に示す結果は、ファージφＳｆｉ２１のゲノムの０．８ｋｂフラグメントがファージφＳｆｉ２１に相同であるファージに対する耐性を与えることができることを実証する。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
Ｉ．７．０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決定：  プラスミドｐＭＺ２３ｃを当業者に周知の方法によって精製し、次に、０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントをジデオキシヌクレオチドを用いる既知の方法（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３〜５４６７，１９７７）によって配列決定する。このために、プライマーとして役立つオリゴヌクレオチドを用いて、これをファージ配列のいずれかの側で、プラスミドｐＮＺ１２４に由来する配列とハイブリッド形成させる。
結果は、０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントが以下の配列表に示す配列番号１の配列を有することを実証する。
【００５４】
例２：ファージφＳｆｉ２からの６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡフラグメントのクローニング
ファージφＳｆｉ２のゲノムからのＥｃｏＲＶフラグメントを含有する組換え体プラスミドｐＮＺ１２４を含むＳ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のライブラリーを作製する。このために、上記Ｉ．１項及びＩ．２項に記載の方法と同じ方法を用いる。
次に、ファージ耐性のＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株のライブラリーを上記Ｉ．３項に記載のように作製する。ファージ耐性のＳ．サーモフィルスから、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８９を与えられ、６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶファージＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＭＺ３１を含むクローンを単離することができた。
【００５５】
プラスミドｐＭＺ３１によって与えられるファージ耐性を上記Ｉ．４項及びＩ．５項に記載の試験と同様の試験によって評価することもできる。
６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメントの一部も、これを含むストレプトコッカスにこのファージに対する耐性を与えることができる。このために、上記Ｉ．６項に記載の方法と同様の方法によって、プラスミドｐＭＺ３１を精製し、種々の制限酵素によって切断して、フラグメントにし、これらのフラグメントをプラスミドｐＮＺ１２４中にサブクローン化し、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１を組換えベクター（ｐＭＺ３１フラグメントという）によって形質転換する。最後に、ファージ耐性を示す形質転換細菌を上記Ｉ．５項に記載の試験によって選択する。特に、１００より大きい“ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ３１−フラグメント”比を有する細菌を選択する。この比は、ｐＮＺ１２４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク数とｐＭＺ３１フラグメントによる形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク数とによって、算出する。
【００５６】
以下の表３に示す結果は、６．５ｋｂ  ＥｃｏＲＶフラグメントに由来する４種のフラグメント（すなわち、３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ、２ｋｂ  ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩＩ、３．５ｋｂ  ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ及び０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント）がストレプトコッカスに非常に良好な耐性を与えることができることを実証する。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌに与えられる耐性が、たとえフラグメントが核酸配列の同じ部分を有するとしても、フラグメントによって異なることを観察することができる。実際に、３．５ｋｂ  ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントは２ｋｂ  ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩＩフラグメントを含み、３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩフラグメントは０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含む。
【００５９】
さらに、ジデオキシヌクレオチド法による０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決定は配列番号１と同じ配列を示す。プラスミドｐＭＺ３１−［０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ］を含むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株は、図２に示すファージによる攻撃を受けたときに、同じ条件下でプラスミドｐＭＺ２３ｃを含むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株に関して得られる成長曲線と非常に類似した成長曲線を示す。
【００６０】
例３
プラスミドｐＭＺ２３をエレクトロポレーションによってＳ．サーモフィルスＳｆｉ９株に形質転換する。このために、上記Ｉ．２項に記載の方法と同様の方法を用いる。上記Ｉ．５項に記載の試験と同様の試験による、形質転換菌株の耐性スペクトルの評価は、形質転換Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ９株がファージφＳｆｉ２１及びφＳｆｉ２とは異種のファージであるファージφＳｆｉ９に耐性であることを示す。
【００６１】
例４
無菌再構成ミルクに培地の凝固の段階で採取した各菌株の予備培養物（ＭＳＫ培地中）を１％の割合で接種し、このミルクを約４２℃の温度においてｐＨ５．１に達するまでインキュベートし、これを４℃の温度にまで冷却し、次にこれを−７５℃において凍結することによって、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株とｐＭＺ２３形質転換Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株の凍結スターターを調製する。
凍結スターターの混合物としての直接接種によって所定ヨーグルトを調製する。このために、低温殺菌済み再構成ミルク（３．７％脂肪、２．５％脱脂乳粉末）に各凍結スターター６ｍｌを接種し、混合物をｐＨ約４．６５に達するまでインキュベートし、次に、これを４℃の温度にまで冷却する。
【００６２】
【配列表】
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【００６３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳｆｉ１８の存在下及び不存在下でのプラスミドｐＮＺ１２４形質転換Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタイタープレート中での成長曲線（時間の関数としての光学密度）。
【図２】ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳｆｉ１８の存在下及び不存在下でのプラスミドｐＭＺ２３形質転換Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタイタープレート中での成長曲線（時間の関数としての光学密度）。
【図１】
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【図２】
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