(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物アルスロバクテルＤＳＭ９７７１。
【請求項２】
Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントイン及び／又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の酵素反応によるＬ−α−アミノ酸の製法において、反応を、微生物アルスロバクテルＤＳＭ９７７１及び／又はこの微生物により生産される酵素を用いて行うことを特徴とする、Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントイン及び又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の酵素反応によるＬ−α−アミノ酸の製法。
【請求項３】
イソプロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、メチルチオエチル、イソブチル、インドリルメチル、シクロヘキシルメチル、ベンジル、ナフチルメチルおよびフェニル、その際、ベンジルは、ｐ−フッ素、ｐ−塩素、ｐ−アミノ、ｐ−メトキシ、ｐ−カルボキシルにより置換されていてもよい、から成る群から選択された置換基を有する、Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントインを反応に使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、静止微生物である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い比活性で、Ｄ−又はＬ−又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントイン又はＤ−又はＬ−又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を反応させて、相応するエナンチオマー純粋なＬ−α−アミノ酸にすることができる新規の微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｎ−５−モノ置換されたヒダントインをエナンチオマー純粋なＬ−α−アミノ酸にする発酵もしくは酵素反応のために、数多くの方法が、文献中に記載されているか、又は特許出願されている(Syldatk, C., Mueller, R., Pietzsch, M., Wagner, F., MICROBIAL AND ENZYMATIC PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS FROM D,L-5-MONOSUBSTITUTED HYDANTOINS in : Biocatalytic production of amino acids and derivatives (Rozell, J. D. and Wagner, F., eds.) Hanser Verlag, Muenchen, 1992, 129〜176頁参照)。
【０００３】
Yokozeki, K., Sano, K., Eguchi, C., Iwagami, H. 及びMitsugi, K.[(1986):OPTIMAL CONDITIONS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF L-AROMATIC AMINO ACIDS FROM THE CORRESPONDING 5-SUBSTITUTED HYDANTOINS, Agric. Biol. Chem. 51, 729〜736頁]及びYokozeki, K,. Hirose, Y.及びKubota, K.[(1986):MECHANISM OF ASYMMETRIC PRODUCTION OF L-AROMATIC AMINO ACIDS FROM THE CORRESPONDING HYDANTOINS BY FLAVOBACTERIUM SP., Agric Biol. Chem., 51, 737〜746頁]は、フラボバクテル(Flavobacter)ｓｐ．ＡＪ−３９１２からの精製されたヒダントイナーゼを用いる５−アリールアルキルヒダントイン、例えば、５−ベンジルヒダントインの加水分解の反応メカニズムを記載している。その際、正−及び逆反応の相対速度が測定されており、かつＤ−５−ベンジルヒダントインのＮ−カルバモイル−Ｄ−フェニルアラニンへの正反応は、Ｌ−５−ベンジルヒダントインのＮ−カルバモイル−Ｌ−フェニルアラニンへの加水分解に比べて、明らかにゆっくりと生じることが示された。Ｄ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインは反応して、痕跡量でしかＮ−カルバモイル−Ｌ−メチオニンにならないので、５−アルキルヒダントインのエナンチオ選択的加水分解のメカニズムについての記載はなかった。
【０００４】
ドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８Ｃ２号明細書から、高い生産性を有し、かつ主に、５−モノ置換されたヒダントインのＤ−及び／又はＬ−及び／又はＤ，Ｌ−形及び／又は相応するＮ−カルバモイル−アミノ酸及び／又は記載の両方の物質群の混合物から、脂肪族Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−メチオニンを、式１中に示された反応メカニズムに従って製造するアルスロバクテル(Arthrobacter)ｓｐｅｃ．ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０が公知である。ここで、”アルキル”は、前記の基質スペクトルを、例として表している。矢印の太さは、観察された速度を示している。
【０００５】
【化１】
0003905575.tif 000002
【０００６】
ＤＳＭ７３２９及び７３３０の比活性は、殊に、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を介してＬ−α−アミノ酸にするＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントインの反応のためには確かに注目に値するが、実際には、製造技術的に充分な比活性が、誘導物質の使用下でのみ達成されうることは、比較的不利であることが判明している。このために、有利には、５−インドール−３−イルメチル−３−メチル−イミダゾリジン−２，４−ジオン（Ｎ３−ＩＭＨ）が使用される。この誘導物質を使用しないと、明らかに、ＤＳＭ７３２９及び７３３０のヒダントイン分解酵素系の比活性は、明らかに、比較的僅かであるのみである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ここに記載の従来技術に対して、本発明の課題は、簡単に培養することができ、かつより多い量もしくは速度で、Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントイン及び／又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸から、Ｌ−α−アミノ酸を製造することができる酵素を製造する更なる微生物を提供することである。相応するＬ−α−アミノ酸の製法並びに微生物の使用も、課題である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
これらの課題は、微生物ＤＳＭ９７７１で解決される。これらの微生物は、１９９５年２月２８日に、ＤＳＭ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig)に、寄託されており、相応する証明書を、明細書に添付している。
【０００９】
ＤＳＭ９７７１とは、菌株アルスロバクテルｓｐｅｃ．ＤＳＭ７３３０の自然淘汰により得られる突然変異株である。ＤＳＭ９７７１は、親生物に比べて、次の重要な利点を有する：
−ＤＳＭ７３３０に比べて、より高い比活性でのヒダントイン分解酵素系の構成性生産。これにより、製造工程において、さもなければ必要である誘導物質、例えば５−インドール−３−イルメチル−３−メチル−イミダゾリジン−２，４−ジオン（Ｎ３−ＩＭＨ）を放棄できることは、特に有利である。
【００１０】
−誘導物質不在に基づき、促進される細胞成長。
【００１１】
−所望の場合には、この微生物の比活性を、Ｎ３−ＩＭＨを用いて誘導することにより、更に高めることができる。
【００１２】
−ＤＳＭ９７７１の静止細胞を用いると、５−メチルチオエチルヒダントインのＬ−メチオニンへのバイオトランスフォーメーションは、立体選択的に生じる（９９．８％エナンチオマー純粋）。
【００１３】
−基質の反応が、非常に高い濃度で、４８時間で、ほぼ定量的に行われる（収率＞９０％）。
【００１４】
菌株ＤＳＭ９７７１は、親生物ＤＳＭ７３３０から、これが、誘導物質５−インドール−３−イルメチル−３−メチル−イミダゾリジン−２，４−ジオン（Ｎ３−ＩＭＨ）を用いての酵素系の誘導を必要とせずに、より高い酵素活性（ファクター２．３）を示すことにおいて、特に明瞭に、際立っている。このことは、意外であり、かつ当業者に予測できないことであった。殊に、発見された突然変異株が、優れた特性を有するという事実は、容易には推測できない。加えて、誘導物質使用の不在は、明らかにより迅速な細胞成長をもたらし、特に有利である。
【００１５】
最後に、既に記載したように、ＤＳＭ９７７１は、慣用の誘導物質の存在下に使用することもできる。微生物ＤＳＭ９７７１を、誘導物質Ｎ３−ＩＭＨの存在下に培養することにより、例えば、酵素活性は、ファクター２．７上昇する。
【００１６】
Ｄ−、Ｌ−又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントイン又はＤ−、Ｌ−又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の酵素反応によるＬ−α−アミノ酸の製法を、反応を、微生物ＤＳＭ９７７１及び／又はこの微生物の生産する酵素を用いて行うことにより実施する。新規の微生物並びに著しく改善された方法の間の比活性及び収率に基づき、本発明の方法は、例えば、ドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８Ｃ２号明細書から公知の方法から類推するのは、容易ではない。
【００１７】
この方法は、勿論、原則的に次により実施することができる：
（ａ）静止細胞又は死んだ細胞
（ｂ）微生物のマッシュ
（ｃ）粗製エキス
（ｄ）多かれ少なかれ精製された微生物の酵素。
【００１８】
方法を、微生物それ自体を用いて実施する場合には、これを、静止微生物又は死んでいる微生物を用いて行うのが最もよく、これにより、これらが、基質それ自体を利用することがない。
【００１９】
方法を、微生物により生産される酵素を用いて行う場合には、これは、微生物のマッシュ（例えば、フレンチプレス又はガラスビーズミル(Glasperlenmuehle)により得られる）、粗製エキス又は微生物の多かれ少なかれ精製された酵素を用いて行うことができる。
【００２０】
Ｌ−α−アミノ酸の記載の製法は、本発明の微生物もしくはその酵素により、立体特異的に進行する（エナンチオマー純度９９．８％）。
【００２１】
本発明は、この微生物の突然変異株又は変体を培養するために、又はカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子を取得するために、又はカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子を微生物又は細胞に挿入するために、又はＬ−α−アミノ酸を製造するために微生物ＤＳＭ９７７１を使用することにも関する。
【００２２】
微生物ＤＳＭ９７７１の突然変異株又は変体の培養は、例えば、自然発生突然変異の選択により行うことができる。もう１つの可能性は、例えば、化学物質及び／又は放射線及び／又はＵＶ−光の作用による突然変異である。
【００２３】
微生物からの１種以上の遺伝子の取得は、例えば、酵素の遺伝子の配列分析に、又は微生物への挿入に役立ち、その際、遺伝子を挿入される微生物の選択により、前記の方法に決定的な酵素を大量に製造する微生物が得られる。場合により、遺伝子を、動物又は植物細胞中に導入することもできる。遺伝子の導入は、微生物学で慣用の方法で、例えば、ベクターを介して行う。
【００２４】
記載の新規微生物は、一連の酵素を大量に製造し、これにより、記載の方法のための細胞物質の活性は、非常に高い。従来、この方法のためにより高い活性を有する菌株は、公知ではない。
【００２５】
微生物ＤＳＭ９７７１の一般的な基質スペクトルは、ドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８Ｃ２号明細書中に、微生物ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０のために記されている基質スペクトルと一致する。
【００２６】
前記の反応式に従って、種々異なる５−置換されたヒダントインが、反応してＬ−α−アミノ酸になる。本発明では、ヒダントイン中の基は、アルキル基であってよく、分枝鎖であってよく、環状であってよく、１個以上のヘテロ原子により置換されていてよく、芳香族であってよく、複素芳香族であってよい、等。困難は、５−メチルヒダントイン、５，５−ジ置換されたヒダントイン、複数置換されたフェニルヒダントイン、例えば、５−３’−メチル−４’−アミノメチルフェニルヒダントイン、ヒダントインに直接接しているかさばった置換基で、例えば、５−ｔ−ブチルヒダントイン並びにヒダントインの近くに帯電置換基を有する基で、例えば５−β−カルボキシルエチルヒダントイン、５−γ−アミノプロピルヒダントイン、５−δ−アミノブチルヒダントインの場合のみ、生じる。これに対して、多数の化合物、例えば、置換基、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、メチルチオエチル、イソブチル、インドリルメチル、シクロヘキシルメチル、ベンジル、ナフチルメチル、フェニル（その際、種々異なる置換基が可能である、例えば、ベンジル、ｐ−フッ素、ｐ−塩素、ｐ−アミノ、ｐ−メトキシ、ｐ−カルボキシル）を有する５−置換されたヒダントインを反応させることができる。可能な置換基が多く、かつ可能な置換基もしくはアミノ酸基の官能性が高いことにより、原則的に、全ての典型的な５−置換されたヒダントイン又は相応するＮ−カルバモイルアミノ酸が、基質として該当するので、ヒダントインもしくはカルバモイルアミノ酸中の５−置換基に、原則的な制限があるとは認められない。
【００２７】
本発明のＤＳＭ９７７１と、ＤＳＭ７３２９並びに親微生物ＤＳＭ７３３０との違いに関し、本発明の微生物の優れた比活性と並んで、差違の別の基準として、グリセリンもクエン酸も使用することができるというＤＳＭ９７７１の特性が判明している。ＤＳＭ７３２９にも、ＤＳＭ７３３０にも、これは不可能であった。
【００２８】
この他の公知の微生物からの区別のためには、記載目的に関連のあるドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８．７号明細書を参照されたい。ドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８．７号明細書中の記載によると、なお、ＤＫ−２００（ヨーロッパ特許（ＥＰ−Ａ）第０１５９８６６号明細書）も、ＤＳＭ３７４５も、ＤＳＭ３７４６も、ＤＳＭ３７４７（ドイツ特許（ＤＥ）第３７１２５３９Ｃ２号明細書）も、ＤＳＭ３３０６（ドイツ特許（ＤＥ）第３７０２３８４Ａ１号明細書（米国特許（ＵＳ−Ａ）第５０７１７５２号明細書に相応））も、ＤＰ−Ｂ−１００１も、ＤＰ−Ｂ−１００２（特公平（Ｂ２）０４−３９３１６号公報）も、本発明の微生物の新規性に対して、疑問を差し挟みえないということが明らかである。Guivarch et al.により、Bull. Soc. Chim. Fr. No. 1〜2, 91〜95中に記載されたアルスロバクテル  ウレアファサイエンス(Arthrobacter ureafaciens)を用いるＤ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインからのＬ−メチオニンの形成は、微生物ＤＳＭ９７７１では生じない反応経路を示しており、同様に、特公昭５５−２９６７８号公報には、本発明の微生物ＤＳＭ９７７１を用いて実施する方法と明らかに異なる方法が記載されている。
【００２９】
前記のように、ＤＳＭ９７７１は、その生理学的−微生物学的特性決定に関して、本質的に、微生物ＤＳＭ７３３０と同一である。しかし、ドイツ特許（ＤＥ）第４３１６９２８．７号明細書と異なり、微生物ＤＳＭ９７７１は、炭素源としてのグリセリン及びクエン酸を、使用することができる。
【００３０】
完全細胞の比活性の算出を、次の式に従って行った：
【００３１】
【外１】
0003905575.tif 000003
【００３２】
ＤＳＭ７３３０は、Ｄ，Ｌ−メチルチオエチルヒダントインに関して、次の比活性を有する：
【００３３】
【外２】
0003905575.tif 000004
【００３４】
同一の条件下で、菌株ＤＳＭ９７７１は、Ｄ，Ｌ−メチルチオエチルヒダントインに関して、次の比活性を有する：
【００３５】
【外３】
0003905575.tif 000005
【００３６】
即ち、ファクター２．３のＤ，Ｌ−ＭＴＥＨに関する比活性の上昇。より高い基質濃度及び２倍の湿潤細胞物質の使用下に、
【００３７】
【外４】
0003905575.tif 000006
【００３８】
の比活性が測定された、即ち、ファクター２．３の更なる上昇。
【００３９】
培養の間にＮ３−ＩＭＨにより誘導された湿潤細胞物質の使用下に、次の比活性が測定された：
【００４０】
【外５】
0003905575.tif 000007
【００４１】
即ち、ファクター２．７、もしくは、ＤＳＭ７３３０に対してファクター１４の更なる上昇。
【００４２】
【実施例】
例１：突然変異株の取得
選択圧下での野生菌株ＤＳＭ７３３０の培養により、突然変異株ＤＳＭ９７７１が得られた。選択圧を、特有の窒素源としてのＬ−カルバモイルメチオニン（Ｌ−ＣＡＭ）により、生じさせた。培養を、選択培地１００ｍｌを有する５００ｍｌ振盪フラスコ中で、３０℃で、３日間、１０サイクルに渡り行った。開始培養のための接種菌として、ＤＳＭ７３３０のＢＦＭ１０ｍｇを使用した。次の培養物のために、それぞれ、前記の培養物５ｍｌを使用した。
【００４３】
選択媒体：
グルコース                １０．０ｇ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                ０．９５ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4×３Ｈ2Ｏ         ２．０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ          ０．２ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ        ０．０２ｇ／ｌ
微量元素塩溶液          １０．０ｍｌ／ｌ
ｐＨ７．０
Ｌ−ＣＡＭ                  ２．０ｇ／ｌ（無菌濾過溶液として添加）
微量元素塩溶液：
クエン酸×Ｈ2Ｏ           １５０ｍｇ／ｌ
Ｈ3ＢＯ4                    ５０ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ            ４ｍｇ／ｌ
ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ          ２０ｍｇ／ｌ
ＭｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ          ４０ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ          ４０ｍｇ／ｌ
ＫＩ                        １０ｍｇ／ｌ
七モリブデン酸アンモニウム  ２０ｍｇ／ｌ
第１０の培養の後に、個々のコロニーの単離のために、寒天プレート上に希釈塗布を、選択培地を用いて実施し、かつこれを、３０℃で、４日間保温した。分けられたコロニーを、つまみ取り、複合培地１を有する斜面細管上に置き、かつ４℃で貯蔵した。次の活性テスト用のバイオマスの取得のために、これらのクローンを、３０℃で１４〜１６時間、複合培地２中で培養した。
【００４４】
複合培地１は、次の組成を有する：
工業用酵母エキス                  １０．０ｇ／ｌ
バクト−ペプトン(Bacto-pepton)    １０．０ｇ／ｌ
グルコース                        １０．０ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                            ３．０ｇ／ｌ
ＭｇＣｌ2×４Ｈ2Ｏ                  ０．１ｇ／ｌ
微量元素塩溶液                  １０．０ｍｌ／ｌ
寒天                              １５．０ｇ／ｌ
ｐＨ                                ７．０
複合培地２は、次の組成を有する：
工業用酵母エキス                    １．０ｇ／ｌ
グルコース                            １０ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
Ｋ2ＨＰＯ4×３Ｈ2Ｏ               ７．６１ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
ＫＨ2ＰＯ4                        ４．５４ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
（ＮＨ4）2ＳＯ4                     ６．５ｇ／ｌ
クエン酸×Ｈ2Ｏ                   ０．３２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．２０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ｐＨ                              ６．８
このように得られた細胞湿潤物質（ＢＦＭ）の酵素活性を、次の反応条件下に、比較して試験した：０．１Ｍトリス−ＨＣｌ−緩衝剤ｐＨ８．５  ８００μｌに、Ｄ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントイン（Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨ）１ｍｇ及び１０％細胞懸濁液２００μｌを添加し、かつ３７℃で３時間培養する。この後、細胞懸濁液を、遠心分離し、かつ澄明な上澄みをＨＰＬＣ−分析学を用いて調べる。
【００４５】
ドイツ微生物寄託局(Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen:DSM)に寄託されたクローンは、特に活性であることが判明している。菌株の分類で、これは、アルスロバクテル群の新種であることが判明した。
【００４６】
本発明の微生物を用いて、前記の反応メカニズムに従って、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を介して、Ｌ−α−アミノ酸に加水分解されうる本発明のＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントインの反応の例を、第１表中に記載した。
【００４７】
【表１】
0003905575.tif 000008
【００４８】
反応条件：記載の基質濃度を、ＢＦＭ０．５ｇを有する１Ｍトリス−ＨＣｌ−緩衝剤ｐＨ８．５  １０ｍｌ中で、３７℃で４時間保温する。
【００４９】
太字の記載：誘導された細胞、ｎ．ｂ．：測定不可能、＋：検出可能、−：検出不可能。
【００５０】
例２：バイオマスの培養
複合培地１（前記）１００ｍｌを有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ４個に、菌株ＤＳＭ９７７１のＢＦＭ１０ｍｇを、新鮮な斜面培地から接種し、かつ３０℃及び１００ＵｐＭで２３時間培養した。複合培地３をそれぞれ５００ｍｌ有する２０００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ１０個に、第１の前培養をそれぞれ２５ｍｌ接種し、かつ３０℃及び１００ＵｐＭで１４時間培養した。接種時間の後に、この前培養ＩＩを、５０ｌバイオリアクター用の接種菌として使用する。このバイオリアクターに、強力撹拌機を備え付けておき、かつ複合培地４を４５ｌ添加し、ｐＨ６．８及び１２１℃の温度及び約１バールの過剰圧力で、３０分間殺菌した。場合により、栄養培地に、Ｎ３−ＩＭＨ０．５ｇ／ｌを添加する。３０℃に冷却した後に、１０％ＮａＯＨを用いて、ｐＨ７．０に調節し、引き続き、前培養ＩＩからの懸濁培養を接種する。培養を、３０℃及び４００ＵｐＭの撹拌機回転数及び０．８Ｖ／Ｖ／ｍの通気速度で行う。誘導された培養物の沈殿のための１１．５時間もしくは１５時間の後に、細胞懸濁液を遠心分離する。このように得られる湿潤細胞物質は、直ちに、又は−１８℃での中間貯蔵の後、比較的遅い時点で、酵素反応のために使用することができる。湿潤細胞物質２．８ｋｇもしくは２．６ｋｇ（誘導）が、得られる。
【００５１】
複合媒体３：
工業用酵母エキス                  ０．７５ｇ／ｌ
グルコース                            １０ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
Ｋ2ＨＰＯ4×３Ｈ2Ｏ               ７．６１ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
ＫＨ2ＰＯ4                        ４．５４ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
（ＮＨ4）2ＳＯ4                     ４．０ｇ／ｌ
クエン酸×Ｈ2Ｏ                   ０．３２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．２０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．０２ｇ／ｌ
ｐＨ                              ６．８
複合媒体４：
工業用酵母エキス                  ０．７５ｇ／ｌ
グルコース                            ２０ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
Ｋ2ＨＰＯ4×３Ｈ2Ｏ             ０．７６１ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
ＫＨ2ＰＯ4                      ０．４５４ｇ／ｌ（無菌で、溶液としてピペットで添加）
（ＮＨ4）2ＳＯ4                     ４．０ｇ／ｌ
クエン酸×Ｈ2Ｏ                   ０．６４ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．４０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ                ０．０４ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ                ０．０４ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                ０．０４ｇ／ｌ
ｐＨ                              ６．８
例３：
ＤＳＭ９７７１の誘導されない湿潤細胞物質１５ｇ及びＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ２．２５ｇ（１３ミリモル）を、塩水１５０ｍｌ中に再懸濁させ、かつ３７℃、ｐＨ８．５で、Ｎ2−雰囲気及び一定なｐＨ−反応調節下に、２５０ｍｌ撹拌反応器中で、３０時間保温する。引き続き、細胞を遠心分離し、かつ上澄みを、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する。上澄み中に、Ｌ−メチオニン１．６ｇ（１０．７４ミリモル）が、検出される。
【００５２】
収率＝理論量の８２．６％
例４：
ＤＳＭ９７７１の誘導された湿潤細胞物質１５ｇ及びＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ２．２５ｇ（１３ミリモル）を、塩水１５０ｍｌ中に再懸濁し、かつ３７℃、ｐＨ８．５で、Ｎ2−雰囲気及び一定なｐＨ−反応調節下、２５０ｍｌ撹拌反応器中で、３０時間保温する。引き続き、細胞を遠心分離し、かつ上澄みを、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析する。上澄み中に、Ｌ−メチオニン１．７ｇ（１１．４ミリモル）が検出された。
【００５３】
収率＝理論量の８７．８％
例５：
最適なｐＨの測定
Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨをＬ−メチオニンにバイオトランスフォーメーションさせるためのＤＳＭ９７７１の最適なｐＨを測定するために、反応を、グリシルグリシン−ピペラジン−緩衝液を用いて、５．０〜１０．５のｐＨ−範囲で実施した。アッセイを、２つのスポイラーを有する１００ｍｌ振盪フラスコ中で実施した。既に、Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨ１ｇ／ｌが溶かされている０．１Ｍグリシルグリシン−ピペラジン−緩衝液９ｍｌを予め装入した。生体触媒として、ＤＳＭ９７７１の５０％ＢＦＭ−塩水−懸濁液１ｍｌを使用し、かつＮ2−雰囲気下に、３７℃で、３．５時間に渡り、振盪水浴中で、保温した。
【００５４】
８．０〜９．０のｐＨ−範囲では、既に、１時間後に、基質は、完全に分解された。これに対して、最も高いＭｅｔ濃度は、ｐＨ８．０で測定された。この最適値は、２時間の保温の後に、７．０〜８．０のｐＨ−範囲にずれ、その際、同様に、基質は、完全に分解されていた。次の反応を、７．５のｐＨ−値で実施し、それというのも、この場合に、Ｌ−アミノ酸の形成が、促進されるためである。
【００５５】
例６
最適な温度の測定
生体触媒としてのＤＳＭ９７７１を用いて、Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨを、Ｌ−Ｍｅｔに加水分解するために最適な温度を測定するための試験を、同様に、１００ｍｌ振盪フラスコ中で実施した。基質溶液として、０．１Ｍトリス−ＨＣＬ−緩衝液ｐＨ７．５中のＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ５ｇ／ｌを使用した。各温度（２５℃、３０℃、３４℃、３７℃、４０℃、４５℃及び５０℃）毎に、緩衝液−基質溶液を有する２つのフラスコを、３０分間、予備保温し、引き続き、反応を、５０％ＢＦＭ−塩水−懸濁液１ｍｌを用いて開始させた。それぞれの温度に関し、動力学を、５時間に渡り行った。２時間の保温の後に、前記の反応に最適な温度は、３４〜３７℃であることが測定され、これは、野生菌株ＤＳＭ７３３０の最適温度と一致する。
【００５６】
例７：
ＤＳＭ９７７１の誘導された湿潤細胞物質１４０ｇ及びＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ４２ｇ（２４ミリモル）を、塩水１４００ｍｌ中に再懸濁し、かつ３７℃で、Ｎ2−雰囲気及び一定のｐＨ−反応調節下に、１５００ｍｌ撹拌反応器中で、８．５時間保温した。遠心分離の後に、上澄み中に、Ｌ−メチオニン３２．８ｇ（２２０ミリモル）が検出される。
【００５７】
収率＝理論量の９１％
例８：
ＤＳＭ９７７１の誘導された湿潤細胞物質１４０ｇ及びＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ４２ｇ（２４１ミリモル）を、塩水１４００ｍｌ中に再懸濁し、かつ３４℃で、Ｎ2−雰囲気及び一定なｐＨ−反応調節下に、１５００ｍｌ撹拌反応器中で保温する。１．５時間後毎に、Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨ１４ｇ（８０．４ミリモル）を９回添加する。４８時間後に、反応を中断する。生成物Ｌ−メチオニンは、結晶の形で存在するので、反応溶液を、３倍容量の塩水で希釈する。引き続き、細胞を、遠心分離し、上澄みを、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。上澄み中に、Ｌ−メチオニン１４２ｇ（９５２ミリモル）が検出された。
【００５８】
収率＝理論量の９８．８％。