(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、マンニトール、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃葉抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、及び刺梨抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種とを含有する虫歯又は歯周病の予防及び／又は治療用組成物であって、
乳酸菌が、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ラムノーサス及びラクトバチルス・ジョンソニーからなる群から選ばれる１種又は２種以上である上記組成物。
【請求項２】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトールとを含有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス・サリバリウスとキシリトールを含む請求項２記載の組成物。
【請求項４】
食品又は口腔用組成物の形態にある請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
チューインガム、キャンデー、チョコレート、チュアブル錠、又は歯磨きの形態にある請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、マンニトール、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃葉抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、及び刺梨抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種とを含有する虫歯菌及び／又は歯周病菌の増殖抑制用組成物であって、
乳酸菌が、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ラムノーサス及びラクトバチルス・ジョンソニーからなる群から選ばれる１種又は２種以上である上記組成物。
【請求項７】
虫歯菌及び／又は歯周病菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム及びプレボテラ・インターメディアからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項６記載の組成物。
【請求項８】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトールとを含有する請求項６又は７記載の組成物。
【請求項９】
ラクトバチルス・サリバリウスとキシリトールを含む請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
食品又は口腔用組成物の形態にある請求項６〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
チューインガム、キャンデー、チョコレート、チュアブル錠、又は歯磨きの形態にある請求項６〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物に関する。
背景技術
乳酸菌が人の健康に有用であることは広く知られた事実であり、特に消化管内において、有害菌の増殖を抑制するなどの作用を有することから整腸薬として医薬品にも配合されている。近年、整腸作用とは別に乳酸菌の有用性が明らかにされつつある。その中で、虫歯、歯周病等の口腔内疾患に対する有用性を示すデータも公開されている。特開昭６１−９１１２６号公報には各種乳酸菌の滅菌菌体あるいは水抽出物の歯周病等の代表的原因菌であるバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌に対する有効性が示されているが、これは滅菌菌体を用いたものであり、生きた乳酸菌の口腔内疾患への応用は示されていない。
また、ＷＯ９９／０７８２６によれば、ある種の特定の乳酸菌が虫歯、歯周病等の口腔内疾患に有効であるとのデータが開示されているが、虫歯、歯周病等の口腔内疾患に対する効率的な利用形態や実施方法に関する技術は未だ解決されていない。例えば、虫歯、歯周病等の口腔内疾患に対する利用形態として、菌液あるいは乳酸菌粉末の塗布をするなどの方法が考えられるが、人が容易にこの方法を実施するには、時間帯、場所において制限がある。また、このような手段では、期待される効果は一時的であり、効率的な利用形態としては充分とはいえない。また、キシリトールが虫歯の発生に抑制的に働くことは広く知られた事実であり、キシリトール入りチューインガムなどの口腔用組成物が多く市販されているが、その虫歯抑制効果は充分とはいえない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、口腔内疾患の予防、治療に、殺菌剤などの塗布などに比較して安全であり、何時でも手軽に利用でき、かつ、有効成分が口腔内で持続的に溶出される口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、従来のキシリトール含有組成物と比較して、口腔内疾患の予防、治療に、より有効な口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物が、虫歯の原因とされるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）等の虫歯菌や、歯周病の原因とされるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）等の歯周病菌の増殖に対し、抑制効果を示すこと、さらにまた、驚くべきことに、ストレプトコッカス・ミュータンスやポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、プレボテラ・インターメディアの増殖に対し、キシリトール等の甘味料や砂糖等の糖類、各種植物抽出物は単独ではほとんど影響しないが、生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物にこれらの甘味料や糖類、各種植物抽出物を配合することで、生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物単独よりも際だった、これら口腔病原菌の増殖抑制効果を示すことを発見した。本発明はこれらの発見に基づいて完成されたものである。
すなわち本発明は、生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種（以下、これらの成分を「乳酸菌成分」又は単に「乳酸菌」と呼ぶこともある）と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、マンニトール、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃葉抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、及び刺梨抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種（以下、これらの成分を「添加物質」又は「添加物」と呼ぶこともある）とを含有する口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供するものである。
本発明に使用される抽出物は、水、含水アルコール（特にエタノール）、アルコール（特にエタノール）により、室温〜溶媒の沸騰温度までの温度で抽出された抽出物である。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いる乳酸菌としては特に制限はないが、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌、特にヒト口腔内常在菌であるラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、腸管内常在菌であるラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及びラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）などが安全性の面でも好適であり、より好ましくは口腔内常在菌であるラクトバチルス・サリバリウスである。これら乳酸菌は、本発明の口腔用組成物の一日摂取量あたり、乳酸菌数で、好ましくは１００万個から１０００億個、より好ましくは１億個から１０００億個、最も好ましくは１０億個から１０００億個を配合することが望ましい。
生きた乳酸菌としては、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。乳酸菌含有物としては、乳酸菌懸濁液；乳酸菌培養物（菌体、培養上清液、培地成分を含む）；乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等乳酸菌発酵した飲食品からなる乳酸菌発酵乳；等が挙げられる。乳酸菌培養ろ液としては、乳酸菌培養物から乳酸菌を除去した培養ろ液が挙げられる。処理物としては、乳酸菌、乳酸菌含有物、乳酸菌培養ろ液の濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等）、液状物、希釈物等が挙げられる。
本発明の組成物中の乳酸菌成分の配合量は、任意でよいが、使用目的（予防又は治療）に応じて適宜定めればよく、通常、０．０００１〜９０質量％、好ましくは０．００１〜２０質量％、さらに好ましくは０．０１〜１０質量％の範囲が適当である。
しかしながら、長期間に亘って保健上ないし健康維持の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよいし、また本有効成分は、安全性について問題がないので、上記範囲よりも多量に使用しても一向にさしつかえない。
本発明の口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物の形態は、乳酸菌成分の少なくとも１種と、添加物質の少なくとも１種を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、チューインガム、キャンデー、チョコレート、チュアブル錠、歯磨き等の食品又は口腔用組成物の形態が好ましい例として挙げられる。
本発明の組成物中の添加物質の量は、乾燥乳酸菌を使う場合、目的に応じて、少し倍散した濃厚菌末を少量添加して好ましい菌数にしたり、多めに倍散したうすい菌末を多量添加して好ましい菌数にしたりできるので、幅が広い。例えば、キシリトールの場合、好ましくは０．１〜９５．０質量％、さらに好ましくは１〜９０．０質量％、最も好ましくは１０〜６５質量％である。
また、本発明の組成物中の乳酸菌成分と添加物質の質量比率は、例えば、乳酸菌とキシリトールの場合、好ましくは１：５〜１０００である。
食品や口腔用組成物、例えばチューインガムやチョコレートへの生きた菌体の配合には、凍結乾燥した菌体又はその倍散物が利用できる。凍結乾燥菌体の倍散物を調製するには、例えばデンプン、乳糖、白糖などが利用できる。好ましくはデンプンや乳糖で、１ｇ当たりの生菌数を１００億個から２０００億個に希釈したもの（乳酸菌倍散物）が配合操作の面で適している。
チューインガムへの配合には、ガムベースに、例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、砂糖、ブドウ糖、アスパルテーム等の甘味料やオリゴ糖、デキストリン等で上記乳酸菌倍散物を希釈したものを加えれば良く、甘味料等の添加物をガムベースに加えた後、乳酸菌倍散物を加えても良い。甘味料としては、特に虫歯に対する有用性が知られているキシリトールとの配合が効果の面で相乗効果が期待でき、より好ましい。また、必要に応じて香料等を加えても何ら問題はない。これらの混合物を練合する温度は、好ましくは４０から８０℃、より好ましくは４０から６０℃、最も好ましくは５０から６０℃が適している。
ガムベース、乳酸菌倍散物、甘味料等をこのように練合したものは、通常の方法により、板ガム、粒ガム等に成型して供することができる。このように調製した乳酸菌入りチューインガム組成物は、配合時の生菌数に対して５０％程度の高い生菌回収率を示し、かつ、溶出試験において良好な徐放性を示す。
チョコレートへの配合には、カカオマス及びココアバターの混合物を４０から６０℃で液化させた後、例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、砂糖、ブドウ糖、アスパルテーム等の甘味料やオリゴ糖、デキストリン等で上記乳酸菌倍散物を希釈したものを加えれば良く、甘味料等の添加物を、液化させたカカオマス及びココアバターの混合物に加えた後、乳酸菌倍散物を加えても良い。甘味料としては、特に虫歯に対する有用性が知られているキシリトールとの配合が効果の面で相乗効果が期待でき、より好ましい。また、必要に応じて香料等を加えても何ら問題はない。このように調製した乳酸菌入りチョコレート組成物は、配合時の生菌数に対して１００％近い生菌回収率を示す。
本発明の口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物を適用するのに好適な口腔内疾患の例としては、虫歯、歯周病が挙げられる。
以下に実施例、試験例を示し、より詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されないことは言うまでもない。なおこの明細書中「％」は、他に明記しない限り「質量％」である。
使用した乳酸菌株は以下の通りである。
Ｌｓ：ラクトバチルス・サリバリウスＷＢ２１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９９１号（＝ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９２）、ラクトバシラス・サリバリウスＷＢ２１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９２（寄託日：平成１２年８月１４日）として〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
Ｌａ：ラクトバチルス・アシドフィルスＷＢ２００１株（わかもと整腸薬配合菌株）
ＧＧ：ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ株（ＡＴＣＣ５３１０３）
Ｌａ１：ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１株（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）
実施例１  チューインガム組成物１の製造
恒温槽で３０分間６０℃に加温したガムベース７ｇにキシリトール（東和化成製）９ｇおよびマンニトール（東和化成製）４ｇを加え２分間練合し、再び６０℃にて１０分間加温した。これにラクトバチルス・アシドフィルス菌倍散物（１ｇあたり１．３×１０１１個の生菌を含む）０．０８ｇを加え２分間練合した後、再び６０℃にて１０分間加温した。その後、同操作（２分間練合、１０分間加温）を４回繰り返し充分に練合した。得られた練合物を放冷する過程で、分割、圧延して厚さ約１ｍｍの板状に成型し組成物１を得た。
実施例２  チューインガム組成物２の製造
ラクトバチルス・アシドフィルス菌倍散物の代わりにラクトバチルス・サリバリウス菌倍散物（１ｇあたり３．１６×１０１０個の生菌を含む）０．３５ｇを用い、実施例１と同様に操作し組成物２を得た。
実施例３  チューインガム組成物３の製造
マンニトールの代わりにソルビトール４ｇを用い、実施例２と同様に操作し組成物３を得た。
実施例４  チューインガム組成物１の生菌数測定
本発明の組成物の生菌数測定法は以下の通りである。
１．５％の細菌培養用寒天（和光純薬）を含むラクトバシリＭＲＳ培地（ディフコ）を滅菌後４５から４８℃に冷却し、約２０ｍｌずつ３枚のシャーレに分注し寒天平板を作製した。作製した寒天平板に、適当に希釈した試験溶液を０．１ｍｌずつ加え、コンラージ棒で一様に塗布した後、３７℃で４８から７２時間嫌気培養した。各平板に出現したコロニー数を計測し、平均コロニー数を算出後、試料１ｇ中の生菌数を以下の式により求めた。
試料１ｇ中の生菌数＝平均コロニー数×１０×希釈倍率／試料採取量（ｇ）
実施例１で製造したチューインガム組成物１を幅約１ｍｍ、長さ１５ｍｍ以内に細切し、測定用試料とした。これを約１ｇ正確に秤量し、２０ｍｌの試験管に入れ、希釈液１）を正確に１０ｍｌ加え、以下に示す２種の抽出法により乳酸菌の抽出を行なった。
抽出法１；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を８回繰り返し抽出液を得た。
抽出法２；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を５回繰り返した後、更にスパーテルで１５分間練合し抽出液を得た。
抽出法１及び抽出法２で得られた抽出液の上清を各々正確に１ｍｌ量り希釈液を加え正確に１０倍希釈した。この１０倍希釈操作を更に４回繰り返し試験溶液とし、試験例に記載した方法により生菌数を求めた。また、求められた生菌数と添加時の乳酸菌理論量から生菌回収率（歩留まり）を求めた。結果を表１に示した。
希釈液１）の組成；１％ペプトン（ベクトンディッキンソン）、０．２％ツイーン８０（関東化学）０．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
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実施例５  チューインガム組成物２の生菌数測定
実施例２で製造したチューインガム組成物２を幅約１ｍｍ、長さ１５ｍｍ以内に細切し、測定用試料とした。
これを約１ｇ正確に秤量し、２０ｍｌの試験管に入れ、希釈液１）を正確に１０ｍｌ加え、以下に示す３種の抽出法により乳酸菌の抽出を行なった。
抽出法１；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を８回繰り返し抽出液を得た。
抽出法２；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を５回繰り返した後、更にスパーテルで１５分間練合し抽出液を得た。
抽出法３；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を５回繰り返した後、更に乳鉢と乳棒で１５分間練合し抽出液を得た。
抽出法１、抽出法２及び抽出法３で得られた抽出液について実施例４と同様に操作し生菌数と生菌回収率（歩留まり）を求めた。結果を表２に示した。
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実施例６  チューインガム組成物３の生菌数測定
実施例３で製造したチューインガム組成物３を幅約１ｍｍ、長さ１５ｍｍ以内に細切し、測定用試料とした。
これを約１ｇ正確に秤量し、２０ｍｌの試験管に入れ、希釈液１）を正確に１０ｍｌ加え、以下に示す抽出法により乳酸菌の抽出を行なった。
抽出法１；試験管ミキサーで１分間混合後５分間静置した。この操作を５回繰り返した後、更にスパーテルで１５分間練合し抽出液を得た。
抽出法１で得られた抽出液について実施例４と同様に操作し生菌数を求めた。結果を表３に示した。
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実施例７  乳酸菌添加時の練合条件（温度、時間）による残存生菌数
ガムベース７ｇ、キシリトール９ｇ、マンニトール４ｇ及びラクトバチルス・サリバリウス菌倍散物０．３５ｇを用い、実施例１の製造法に準じ、以下に示す条件にてチューインガム組成物を調製した。
チューインガム組成物７−１；練合温度５０℃、練合時間１時間
チューインガム組成物７−２；練合温度５０℃、練合時間３時間
チューインガム組成物７−３；練合温度６０℃、練合時間１時間
チューインガム組成物７−４；練合温度６０℃、練合時間３時間
チューインガム組成物７−５；練合温度８０℃、練合時間１時間
チューインガム組成物７−６；練合温度８０℃、練合時間３時間
これら６種のチューインガム組成物につき各々実施例５記載の抽出法３に従い抽出液を得、生菌数と回収率を求めた。結果を表４に示した。
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実施例８  チューインガム組成物からの乳酸菌の持続的溶出の確認
実施例２に示した製造法により得られたチューインガム組成物２を幅約１ｍｍ、長さ１５ｍｍ以内に細切し、約１ｇ正確に秤量し、２０ｍｌの試験管に入れ、予め３７℃に加温した希釈液１）を１０ｍｌ加えた。この試験管について３７℃水浴中で５分間静置後、試験管ミキサーで１分間攪拌する操作を１５０分間繰り返した。この間、経時的（試験開始３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分後）に抽出液を０．５ｍｌ採取し、希釈液１）で希釈し試験溶液を得、実施例４に従い生菌数を求めた。
実施例３に示した製造法により得られたチューインガム組成物３についても同様に試験した。結果を表５に示した。
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試験例１  ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖に対する乳酸菌、乳酸菌及びキシリトールの混合物の効果
この試験には、ストレプトコッカス・ミュータンス（ＪＣＭ５７０５株、以下Ｓｍ）及びＬｓ、ＧＧ、Ｌａ１の乳酸菌株を用いた。また、用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：キシリトールを１％となるように添加した培地Ａ
乳酸菌生菌数測定培地：変法ＬＢＳ寒天培地（光岡知足編、腸内細菌学、４７７頁、朝倉書店、１９９０年）
Ｓｍ生菌数測定培地：バシトラシンを１０μｇ／ｍｌ、グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ寒天培地
乳酸菌、Ｓｍを各々培地Ａで３７℃、一晩前培養し各菌液を得た。この菌液５０μｌを５０ｍｌの培地Ａ及び培地Ｂに接種し、３７℃で乳酸菌及びＳｍの単独培養及び混合培養を行い、経時的に培養液を採取した。採取した培養液５０μｌを適当に希釈し、乳酸菌生菌数測定培地及びＳｍ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表６から表８に示した。
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表６から表８に示したように、Ｓｍの増殖に対し、乳酸菌は強い増殖抑制を示したが、キシリトールはほとんど影響しなかった。乳酸菌にキシリトールを同時に作用させた場合、乳酸菌のＳｍ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
試験例２  ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対する乳酸菌、乳酸菌及びキシリトールの混合物の効果
この試験では、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＪＣＭ８５２５株、以下Ｐｇ）及び試験例１に示した乳酸菌株を用いた。また、用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：キシリトールを１％となるように添加した培地Ａ
Ｐｇ生菌数測定培地：硫酸ゲンタマイシンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＥＧ寒天培地（光岡知足編、腸内細菌学、４７５頁、朝倉書店、１９９０年）
乳酸菌、Ｐｇを各々培地Ａで３７℃、一晩前培養し各菌液を得た。この菌液５０μｌを５０ｍｌの培地Ａ及び培地Ｂに接種し、３７℃でＰｇの単独培養及び乳酸菌との混合培養を行い、経時的に培養液を採取した。採取した培養液５０μｌを適当に希釈し、Ｐｇ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表９から表１１に示した。
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表９から表１１に示したように、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ）の増殖に対し、乳酸菌は強い増殖抑制を示したが、キシリトールはほとんど影響しなかった。乳酸菌にキシリトールを同時に作用させた場合、乳酸菌のＰｇ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
実施例９  チョコレート組成物１の製造
カカオマス４０ｇ、ココアバター２０ｇを５０℃の恒温槽中で１０分間加温しながら、混合、溶解した。キシリトール３０ｇを加えて１分間かき混ぜた後、ラクトバチルス・サリバリウス菌倍散物（１ｇあたり１．３×１０１０個生菌を含む）１０ｇを加えて、さらに１分間混合した。シャーレに分注して室温まで冷やした後、５℃で３時間冷却固化して、チョコレート組成物１を得た。同じ製造法により３ロット製造した。
実施例１０  チョコレート組成物１の生菌数測定
製造したチョコレート組成物１を幅約１ｍｍ長さ１５ｍｍ以内に細切し、測定用試料とした。
約１ｇを正確に秤量し、２０ｍｌの試験管に入れ、希釈液１）を正確に１０ｍｌ加え、試験管ミキサーで攪拌しながら５０℃の恒温槽で５分間加温して、溶解した。この１ｍｌを正確に量り、希釈液を加え正確に１０倍希釈した。この１０倍希釈操作を更に４回繰り返し試験溶液とし、試験例１に記載した方法により生菌数を求めた。また求められた生菌数と添加時の乳酸菌理論量から生菌回収率（歩留まり）を求めた。結果を表１２に示した。
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実施例１１  チュアブル錠の製造
キシリトール（東和化成製）１５０ｇ、レシス（東和化成製）５４ｇ、メチルセルロース（信越化学製）６ｇ、部分α化デンプン（旭化成工業製）４５ｇ、ポリデキストロース（和光純薬製）３０ｇ、ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学フーズ製）６ｇ、カスターワックス（日本油脂製）６ｇ、軽質無水ケイ酸（フロイント産業製）３ｇ、ラクトバチルス・サリバリウス菌倍散物（１ｇあたり１．３×１０１１個の生菌を含む）１５ｇをビニール袋中でよく混合した後、打錠機（６Ｂ−２、菊水製作所製）を用いて打錠し、直径１５ｍｍ、重量１０００ｍｇのチュアブル錠を得た。
実施例１２  徐放性口腔内挿入錠の製造
キシリトール（東和化成製）１５０ｇ、粉末還元麦芽糖（東和化成製）５４ｇ、デキストリン（松谷化学工業製）６０ｇ、グルテン（和光純薬製）１５ｇ、メチルセルロース（信越化学製）６ｇを転動流動層造粒機（ニューマルメライザーＮＱ−Ｌａｂｏ、不二パウダル製）を用いて８０％エタノール溶液を噴霧し造粒した。造粒物を６０℃で１６時間通風乾燥した後に、１８メッシュ篩で整粒し打錠用顆粒を得た。打錠用顆粒２７０ｇにラクトバチルス・サリバリウス菌倍散物（１ｇあたり１．３×１０１１の生菌を含む）１５ｇとカスターワックス（日本油脂製）１５ｇを加えよく混合した後、打錠機（ＲＴ−Ｆ９、菊水製作所製）を用いて打錠し、直径６ｍｍ、重量１００ｍｇの徐放性口腔内挿入錠を得た。
試験例３  ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）の不溶性グルカン産生に対する乳酸菌、乳酸菌及びキシリトールの混合物の効果
乳酸菌はＬｓを用いた。また、用いた培地は以下のとおりである。
培地Ａ：ショ糖を２％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：キシリトールを１％となるように添加した培地Ａ
Ｓｍ、Ｌｓを各々培地Ａで３７℃、一晩前培養し各菌液を得た。この菌液０．１ｍｌを１０ｍｌの培地Ａ及び培地Ｂに接種し、Ｓｍ及びＬｓの単独培養及び混合培養を３７℃で２４時間行った。培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して沈殿（菌体＋不溶性グルカン）を回収し、１０ｍｌのリン酸緩衝生理液（以下、ＰＢＳ）で３回洗浄した。０．１Ｎ  ＮａＯＨ  ５ｍｌを加えて、不溶性グルカンを溶解し、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して、上清を回収した。この上清中の糖濃度をフェノール硫酸法により測定し、不溶性グルカン産生量を調べた。上清０．２ｍｌに５％フェノール０．２ｍｌ、濃硫酸１ｍｌを加えて、１０分間静置後、混和して、さらに２０分間静置した。反応液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、グルコース溶液を用いて作成した検量線に基づき、不溶性グルカン濃度を算出した。結果を表１３に示した。
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表１３に示したように、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）の不溶性グルカン産生に対し、乳酸菌（Ｌｓ）は強い増殖抑制を示したが、キシリトールはほとんど影響しなかった。Ｌｓにキシリトールを同時に作用させた場合、Ｌｓの不溶性グルカン産生抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
試験例４  乳酸菌培養液によるポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖抑制効果を増強する物質の探索（１）
キシリトールのように、乳酸菌によるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ）の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。用いた乳酸菌はＬｓであり、培地は以下のとおりである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を３０％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、培地Ａで３７℃、２４時間培養したＬｓの培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過して調製したもの。
Ｐｇ生菌数測定培地：硫酸ゲンタマイシンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＥＧ寒天培地（光岡知足編、腸内細菌学、４７５頁、朝倉書店、１９９０年）
Ｐｇを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液１００μｌを１０ｍｌの培地Ｂ及び１０％の各種物質を添加した培地Ｂに接種し、３７℃で２４時間培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｐｇ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し生菌数を求めた。結果を表１４に示した。
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表１４に示したように、Ｐｇの増殖に対し、ソルビトール、エリスリトール、トレハロースは、キシリトールと同様、Ｌｓの培養ろ液の増殖抑制効果を著しく増強する作用を示した。また、マルチトール、マンニトールもまた、Ｐｇ増殖抑制効果を増強する作用を有することが明らかとなった。
試験例５  アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの増殖に対する乳酸菌培養液及びキシリトールの効果
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（ＪＣＭ８５７７株、以下Ａａ）を用いた。本試験例に用いた乳酸菌はＬｓであり、培地は以下の通りである。
培地Ａ：ブレインハートインヒュージョン液体培地（ベクトンディッキンソン）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を２５％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地で３７℃、２４時間培養したＬｓの培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過して調製したもの。
Ａａ生菌数測定培地：ブレインハートインヒュージョン寒天培地（ベクトンディッキンソン）
Ａａを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液を生菌数約１０６／ｍｌとなるように１０ｍｌの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、３％、７％のキシリトールを添加した培地Ａ及び３％、７％のキシリトールを添加した培地Ｂ）に接種し、３７℃で４８時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ａａ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表１５に示した。
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表１５に示したように、Ａａの増殖に対し、乳酸菌の培養ろ液は強い増殖抑制を示したが、キシリトールは影響しなかった。乳酸菌の培養ろ液にキシリトールを同時に作用させた場合、乳酸菌のＡａ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
試験例６  フソバクテリウム・ヌクレアタムの増殖に対する乳酸菌培養液及びキシリトールの効果
フソバクテリウム・ヌクレアタム（ＪＣＭ８５３２Ｔ株、以下Ｆｎ）を用いた。本試験例に用いた乳酸菌はＬｓであり、培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を５０％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、試験例５と同様の方法により調製したもの。
Ｆｎ生菌数測定培地：ブレインハートインヒュージョン寒天培地（ベクトンディッキンソン）
Ｆｎを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液を生菌数約１０６／ｍｌとなるように１０ｍｌの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、３％、１０％のキシリトールを添加した培地Ａ及び３％、１０％のキシリトールを添加した培地Ｂ）に接種し、３７℃で２４時間嫌気培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｆｎ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表１６に示した。
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表１６に示したように、Ｆｎの増殖に対し、乳酸菌の培養ろ液は強い増殖抑制を示したが、キシリトールはほとんど影響しなかった。乳酸菌の培養ろ液にキシリトールを同時に作用させた場合、乳酸菌のＦｎ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
試験例７  ポルフィロモナス・ジンジバリスの口腔細胞への付着に対する乳酸菌培養液およびキシリトールの抑制効果
乳酸菌はＬｓを用いた。Ｌｓの培養ろ液は、グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地で３７℃、２４時間培養したＬｓの培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過後、１Ｎ水酸化ナトリウムで中和したもの。
Ｐｇをグルコースが１％となるように添加したＧＡＭ培地で３７℃、一晩培養した。ＰＢＳで洗浄し、生菌数が１０７／ｍｌになるように以下の各培地（培地Ａ、培地Ｂ、２．５％、５％、１０％のキシリトールを添加した培地Ａ及び２．５％、５％、１０％のキシリトールを添加した培地Ｂ）に懸濁し、細胞付着用のＰｇ懸濁液を調製した。
培地Ａ：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（キブコ）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を２５％となるように添加した培地Ａ
口腔細胞は、ヒト口腔培養細胞ＨＯ１−ｕ−１（ＪＣＲＢ０８２８株）を用いた。細胞は、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように２４穴プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し単層を形成させた。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞付着用のＰｇ懸濁液を１ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１．５時間静置した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、滅菌水１ｍｌを加え、１０分間室温に静置して、細胞を剥離した。ＰＢＳで適宜希釈した後、細胞に付着したＰｇの生菌数を測定した。測定には５％ウマ脱繊血を含むＥＧ寒天培地を用い、３７℃、嫌気条件下で３日間培養した。結果を表１７に示した。
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表１７に示したように、Ｐｇの口腔細胞への付着に対し、Ｌｓの培養ろ液は抑制作用を示したが、キシリトールは影響しなかった。さらに乳酸菌の培養ろ液にキシリトールを同時に作用させた場合、キシリトールの添加濃度に依存して付着抑制作用が高まった。特にキシリトール５％、１０％添加では対照および乳酸菌培養ろ液単独添加に対して有意な抑制が認められた。
試験例８  乳酸菌培養液によるポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖抑制効果を増強する物質の探索（２）
キシリトールのように、乳酸菌によるポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。本試験例に用いた乳酸菌はＬｓであり、培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を２５％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、培地Ａで３７℃、２４時間培養したＬｓの培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過して調製したもの。
Ｐｇ生菌数測定培地：硫酸ゲンタマイシンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＥＧ寒天培地
Ｐｇを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液１００μｌを１０ｍｌの培地Ｂ及び０．２〜１０％の各種物質を添加した培地Ｂに接種し、３７℃で９時間培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｐｇ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表１８、表１９に示した。なお表１８、表１９に示す実験は独立に行ったため、表１８の添加物質無添加の場合のＰｇ生菌数と、表１９の添加物質無添加の場合のＰｇ生菌数の数値は異なっている。
各種植物抽出物、紅麹、ウコン色素、酵素分解甘草、グリチルリチンは丸善製薬社製のものを用いた。
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表１８、表１９に示したように、Ｐｇの増殖に対し、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃葉抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、刺梨抽出物は、キシリトールと同様、Ｌｓの培養ろ液の増殖抑制効果を著しく増強する作用を示した。
試験例９  ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対する乳酸菌（ビフィズス菌）培養液及びキシリトールの効果
本試験例に用いた乳酸菌はビフィズス菌の２菌種ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＷＢ１００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６１０）、以下Ｂｌ）及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＷＢ１００３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６１２）、以下Ｂｂ）であり、培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｂｌの培養ろ液を２０％となるように添加した培地Ａ
培地Ｃ：Ｂｂの培養ろ液を３５％となるように添加した培地Ａ
Ｂｌ及びＢｂの培養ろ液は、各菌株を、培地Ａで３７℃２０時間培養した培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過して調製したもの。
Ｐｇ生菌数測定培地：硫酸ゲンタマイシンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＥＧ寒天培地
Ｐｇを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液１００μｌを１０ｍｌの培地Ｂ、培地Ｃ、１０％のキシリトールを添加した培地Ｂ及び１０％のキシリトールを添加した培地Ｃに接種し、３７℃で９時間培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｐｇ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表２０に示した。
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表２０に示したように、Ｐｇの増殖に対し、Ｂｌの培養ろ液、Ｂｂの培養ろ液、及びキシリトールはほとんど影響しなかった。ビフィズス菌の培養ろ液にキシリトールを同時に作用させた場合、Ｐｇ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
試験例１０  プレボテラ・インターメディアの増殖に対する乳酸菌培養液及びキシリトールの効果
プレボテラ・インターメディア（ＪＣＭ７３６５株、以下Ｐｉ）を用いた。本試験例に用いた乳酸菌はＬｓであり、培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを１％となるように添加したＧＡＭ培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を５０％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、試験例５と同様の方法により調製したもの。
Ｐｉ生菌数測定培地：５％ウマ脱繊血を含むＥＧ寒天培地
Ｐｉを培地Ａで３７℃、一晩培養した前培養液を生菌数約１０７／ｍｌとなるように１０ｍｌの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、１０％のキシリトールを添加した培地Ａ及び１０％のキシリトールを添加した培地Ｂ）に接種し、３７℃で２４時間嫌気培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｐｉ生菌数測定培地に塗布し、３７℃で３日間嫌気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表２１に示した。
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表２１に示したように、Ｐｉの増殖に対し、乳酸菌の培養ろ液は強い増殖抑制を示したが、キシリトールは影響しなかった。乳酸菌の培養ろ液にキシリトールを同時に作用させた場合、乳酸菌のＰｉ増殖抑制効果はさらに著しく高まることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明の生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、マンニトール、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃葉抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、及び刺梨抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種とを含有する口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物、特にチューインガム組成物は良好な徐放性により、口腔内に持続的に乳酸菌を滞留させることができ、安全で、簡便で、効率的な口腔内疾患の予防と治療に用いることができる。