(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式（Ｉ）：
【化１】
0003990284.tif 000027
を有するペプチド又はその塩。
【請求項２】
次の構造式（II）：
【化２】
0003990284.tif 000028
を有するペプチド又はその塩。
【請求項３】
次の構造式（III）：
【化３】
0003990284.tif 000029
を有するペプチド又はその塩。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドの低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項５】
次の構造式（VI）：
【化４】
0003990284.tif 000030
（式中、Ｒは、低級アルキル基を表す。）により表される請求項４に記載の低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項６】
前記式（VI）において、Ｒがメチル基である請求項５に記載の低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項７】
次の構造式（Ｉ）：
【化５】
0003990284.tif 000031
を有するペプチド又はその塩であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６の培養液から分離精製されるペプチド又はその塩。
【請求項８】
次の構造式（II）：
【化６】
0003990284.tif 000032
を有するペプチド又はその塩であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６の培養液から分離精製される請求項７に記載のペプチドから誘導されるペプチド又はその塩。
【請求項９】
次の構造式（III）：
【化７】
0003990284.tif 000033
を有するペプチド又はその塩であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６の培養液から分離精製される請求項７に記載のペプチドから誘導されるペプチド又はその塩。
【請求項１０】
請求項７に記載のペプチドの低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項１１】
次の構造式（VI）：
【化８】
0003990284.tif 000034
（式中、Ｒは、低級アルキル基を表す。）により表される請求項１０に記載の低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項１２】
前記式（VI）において、Ｒがメチル基である請求項１１に記載の低級アルキル化誘導体又はその塩。
【請求項１３】
次の構造式（IV）：
【化９】
0003990284.tif 000035
を有するペプチド又はその塩。
【請求項１４】
次の構造式（IV）：
【化１０】
0003990284.tif 000036
を有するペプチド又はその塩であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６の培養液から分離精製されるペプチド又はその塩。
【請求項１５】
次の構造式（Ｖ）：
【化１１】
0003990284.tif 000037
を有するペプチド又はその塩。
【請求項１６】
次の構造式（Ｖ）：
【化１２】
0003990284.tif 000038
を有するペプチド又はその塩であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６の培養液から分離精製されるペプチドまたはその塩。
【請求項１７】
請求項１、１３および１５に記載されるペプチドの少なくとも１種を産生する能力を有することを特徴とするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＲｔＩＢ０２６（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−  ７４３６）。
【請求項１８】
次の（ａ）および（ｂ）からなる群から選択される少なくとも何れか１種を有効成分として含有する抗ウイルス剤：
（ａ）請求項１〜１６の何れか１項に記載のペプチドまたはその塩、および
（ｂ）請求項１７に記載のシュードモナス属の菌株。
【請求項１９】
脂質膜を有するウイルスに有効な請求項１８に記載の抗ウイルス剤。
【請求項２０】
二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを有するウイルスに有効な請求項１８に記載の抗ウイルス剤。
【請求項２１】
動物（ヒトを含む）の疾病原因ウイルスに有効な請求項１８ないし２０の何れか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項２２】
前記動物が、哺乳類（ヒトを含む）、鳥類、魚類および甲殻類からなる群から選択される請求項２１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項２３】
請求項１、１３および１５のペプチドから選択される少なくとも１種のペプチドを産生する能力を有するシュードモナス属の菌体を培養し、その培養物より請求項１、１３および１５のペプチドから選択される少なくとも１種のペプチドを回収することを特徴とする、
請求項１、１３および１５のペプチドから選択される少なくとも１種のペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なペプチド並びにその誘導体および塩に関する。
また、本発明は、新規なペプチドを産生することのできる新規な菌株に関する。
さらに、本発明は、新規なペプチドの製造方法にも関する。
また、本発明は、（ａ）上記新規なペプチドおよびその誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩、並びに（ｂ）上記新規な菌株、からなる群から選択される少なくとも一種を有効成分として含有する抗ウイルス剤にも関する。
背景技術
ウイルスおよび細菌等の微生物は、様々な感染症の原因因子であることが知られている。細菌を原因とする感染症に対しては、抗生物質等の研究開発が進み、多くの医薬品が実用化されている。これに対して、ウイルスを原因とする感染症に対する医薬品は、近年のウイルス学の発展にともないその原因ウイルスの特定は進んでいるものの、抗菌剤ほどには実用化が進んでいないのが現状である。
例えば、魚介類等の水産養殖場に発生するウイルス感染症に対しては、現在、マダイのイリドウイルスワクチン、サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ウイルスワクチン等が実用化されているに過ぎず、抗ウイルス剤については研究開発段階であり、未だ実用化には至ってはいない。
水産分野での抗ウイルス剤に関する文献としては、例えば、特開平１−９５７９２号公報を挙げることができる。この公報には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．４６ＮＷ−０４Ａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−９５７９）が産生する物質（４６ＮＷ−０４Ａ）が、サケ科魚類のヘルペスウイルス（ＯＭＶ）や伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）のようなウイルスに対して抗ウイルス活性を有することが記載されている。
上記物質に関しては、水産学シリーズ  ７９、「海洋微生物の生物活性物質」、日本水産学会監修、株式会社恒星社厚生閣（平成２年４月１５日発行）にも記載されている。記載事項によると、上記公報に記載される抗ウイルス活性を有する物質（４６ＮＷ−０４Ａ）が、構成成分としてトレオニン１残基、セリン２残基、バリン１残基、グルタミン酸１残基、イソロイシン１残基およびロイシン３残基であり、ロイシンのＮ末端に３−ヒドロキシデカノイル基が結合した分子式Ｃ５４Ｈ９５Ｎ９Ｏ１６の白色粉末であると記載されており、上記物質（４６ＮＷ−０４Ａ）はＨＩＲＡＭＯＴＯらの報告（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３巻、１０８７〜１０９０頁、１９７０年）したビスコシンに極めて類似した構造を有することが記載されている。また、この物質（４６ＮＷ−０４Ａ）を産生するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｉと同定されたことも報告されている。
上記ビスコシンに関しては上記報告以外にも何種類かの類似化合物が報告されており、目的および用途も多種多様である。
しかしながら、上記報告例以外にも魚病ウイルスの予防又は治療を目的とした開発に関する報告が多数なされているにも関わらず、ウイルス病の予防又は治療を目的とした水産用医薬品の上市は前記したようにマダイのイリドウイルス、サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ウイルス等に対するワクチンに限られており、抗ウイルス剤については実用的な状況には至っていない。
発明の開示
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、新規な抗ウイルス剤を提供することを課題とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、鋭意研究した結果、魚類由来腸内細菌のなかに抗ウイルス剤の有効成分となり得る三群の新規物質を見出し、本発明を完成した。具体的には、本発明者らが見出した第一群に属する新規な物質は、構成アミノ酸が、グルタミン由来のアミノ酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合したペプチドである。本発明は、この新規な物質およびその塩を提供する。また、本発明は、この新規な物質およびその薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する抗ウイルス剤も提供する。
より詳細には、上記本発明者らが見出した第一群の抗ウイルス剤の有効成分には、次のペプチドが含まれる：
構成アミノ酸が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合した、環状構造を有するデプシペプチドであって、次の構造式（Ｉ）を有するもの（以下、「本発明のペプチドＭＡ０２６」ともいう。）。
0003990284.tif 000002
さらに、本発明者らは、上記本発明のペプチドＭＡ０２６から誘導される３種類のペプチド誘導体も抗ウイルス剤の有効成分として使用し得ることを見出した。これらの３種類のペプチド誘導体も新規物質である。本発明は、これらの新規な誘導体およびその塩を提供する。また、本発明は、これらの誘導体およびその薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する抗ウイルス剤も提供する。
上記抗ウイルス剤の有効成分である３種類の誘導体のうち、第１の誘導体とは、構成アミノ酸が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合した、環状構造を有するデプシペプチドを低級アルキル化した誘導体（以下、「本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６」ともいう。）である。
第２の誘導体とは、構成アミノ酸が、α，γ−ジアミノ酪酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合した、環状構造を有するデプシペプチド誘導体であって、次の構造式（ＩＩ）を有するもの（以下、「本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６」ともいう。）である。
0003990284.tif 000003
第３の誘導体とは、構成アミノ酸が、α，γ−ジアミノ酪酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合した、鎖状ペプチド誘導体であって、次の構造式（ＩＩＩ）を有するもの（以下、「本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６」ともいう。）である。
0003990284.tif 000004
また、本発明者らは、上記本発明のペプチドＭＡ０２６等を含む第一群のペプチドに追加して、抗ウイルス剤の有効成分として使用し得る第二群および第三群のペプチドも見出した。これらの第二群および第三群のペプチドも新規物質である。本発明は、これらの第二群および第三群のペプチド並びにその塩を提供する。さらに、本発明は、これらの第二群および第三群のペプチド並びにその薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する抗ウイルス剤も提供する。
本発明が提供する第二群のペプチドとは、構成アミノ酸が、グルタミン由来のアミノ酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン３残基、およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合したペプチドである。この第二群のペプチドには、構成アミノ酸が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン３残基、およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシデカノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合したペプチドであって、次の構造式（ＩＶ）を有するもの（以下、「本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６」ともいう。）が含まれる。
0003990284.tif 000005
第三群のペプチドとは、構成アミノ酸が、グルタミン由来のアミノ酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基、およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシドデカ−５−エノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合したペプチドである。この第三群のペプチドには、構成アミノ酸が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基、およびロイシン５残基であり、３−ヒドロキシドデカ−５−エノイル基がＮ末端のロイシン残基にアミド結合したペプチドであって、次の構造式（Ｖ）を有するもの（以下、「本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６」ともいう。）が含まれる。
0003990284.tif 000006
上記本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の新種の菌株の培養液から精製することができる。本発明は、このＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の菌株（以下、「本発明のＲｔＩＢ０２６株」ともいう。）、およびこの菌株の培養物から本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の少なくとも１種を製造する方法も提供する。
本発明のＲｔＩＢ０２６株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（２００１年４月より、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに改称）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３６で２００１年１月２９日に寄託された菌株である。
以下、本発明の抗ウイルス剤の有効成分として使用することのできる３種類のペプチドであって、本発明に係る新種の菌株（ＲｔＩＢ０２６株）の培養物から得ることのできるペプチド（ＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６）、並びに新種の菌株（ＲｔＩＢ０２６株）について詳細に説明する。
＜ペプチドＭＡ０２６＞
本発明のペプチドＭＡ０２６は、構成アミノ酸残基が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基からなり、上記式（Ｉ）の構造を有する。式（Ｉ）から明らかなように、本発明のペプチドＭＡ０２６のＮ末端のアミノ酸残基は、ロイシンであり、このロイシンのアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合している。また、本発明のペプチドＭＡ０２６は、環状構造を有している。この環状構造は、ペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、セリンの水酸基とイソロイシンのカルボキシ基との間のエステル結合により形成されている。
本発明のペプチドＭＡ０２６の塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩）、塩酸塩、酢酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のペプチドＭＡ０２６は、魚類の消化管から分離したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の菌株の培養物から分離、精製することができる。具体的には、本発明者らが見出したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の新種の菌株（本発明のＲｔＩＢ０２６株）の培養液を濾過、濃縮、脱塩、シリカゲルカラムによる分離、高速液体クロマトグラフィーによる分離を行うことによって分離精製することができる。魚類の消化管から本発明のペプチドＭＡ０２６を産生する菌株を分離する方法の一例を後掲の実施例１に示す。
本発明者らが見出したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の新種の菌株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３６として２００１年１月２９日に寄託した。
＜ＲｔＩＢ０２６株＞
本発明のＲｔＩＢ０２６株について以下に詳細に説明する。
本発明のＲｔＩＢ０２６株の菌学的性質を調べた結果を以下に説明する。
１）生理生化学的性状検査
本発明のＲｔＩＢ０２６株の生理学的性質についての検査結果を以下の表１−１および表１−２に示す。検査方法はＳｔａｎｉｅｒらの報告（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３，１５９−２７１，１９６６）等を参考にして行った。
0003990284.tif 000007
0003990284.tif 000008
上記表１−１および表１−２に示すように、グラム染色陰性、桿菌、鞭毛を持って運動し、Ｏ−ＦテストがＯｘｉｄａｔｉｖｅである等の結果から本菌株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属すると考えられる。
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１，１９８４）に記載されている細菌種の中で本菌株と最も性状の類似している菌株は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｖであった。しかしながら、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が４％以上異なることから、本菌株は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｖとは異なる。
２）１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の比較
本発明のＲｔＩＢ０２６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を決定し、得られた配列をもとに系統解析を定法に従い行ったところ、標準菌株であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ｂｉｏｖａｒ  Ａ）、Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ、Ｐ．ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ等の菌株と、９８％以上の相似性があり、系統樹において同一のクラスターに属する菌株であることが明らかとなった。
３）ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験
上記１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の比較から本発明のＲｔＩＢ０２６株と９８％以上の相似性が認められた４菌株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ｂｉｏｖａｒ  Ａ）、Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ、Ｐ．ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓを対象にＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験を行った。この結果、試験した４菌株全てで相同性が７０％以下となった。
以下の表２に、相同性の割合を示す。なお、表２には上述した１６Ｓ  ｒＤＮＡの結果も併せて示した。
0003990284.tif 000009
このＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験によって７０％以上の相同性が見られた細菌株は同一種とみなされることが国際微生物分類委員会によって定められている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．４，４６３−４６４（１９８７））。
以上の１）〜３）の結果および新規な物質である本発明のペプチドＭＡ０２６等を産生することから、本発明者らは、本発明のＲｔＩＢ０２６株は、新種に属する菌株であると決定した。
本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の新種に属する菌株には、本発明のＲｔＩＢ０２６株の他、その子孫およびそれらの変異体、および菌学的性質において本発明のＲｔＩＢ０２６株と同一の種と認められら細菌株であって、本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の少なくとも１種を産生することのできる菌株も含まれる。
また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株であれば、本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の少なくとも１種を産生することのできる菌株も本発明に含まれる。
本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の製造方法、並びにＲ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６について以下に説明する。
本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の製造方法、並びにＲ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６について以下に説明する。
＜ペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の製造方法＞
本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６は、本発明のＲｔＩＢ０２６株の培養液をカラムクロマトグラフィー等に供することにより精製することができる。
具体的には、本発明のＲｔＩＢ０２６株の培養液を、シリカゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに供することにより精製することができる。本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６を本発明のＲｔＩＢ０２６株の培養液から精製する方法の一例を後掲の実施例２に示した。
図１は、実施例２に記載の方法に従って行った高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムの一例である。図１に示す３つのピークのうち、保持時間１７．７分（ピーク番号１）で溶出される画分に本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６が含まれる。保持時間１９．０分（ピーク番号２）で溶出される画分に本発明のペプチドＭＡ０２６が含まれる。保持時間２１．４分（ピーク番号３）で溶出される画分に本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６が含まれる。
＜ペプチドＲ１ＭＡ０２６＞
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６は、構成アミノ酸残基が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン３残基、およびロイシン５残基からなり、上記式（ＩＶ）の構造を有する。式（ＩＶ）から明らかなように、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６のＮ末端のアミノ酸残基はロイシンであり、このロイシンのアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合している。また、本発明のＲ１ＭＡ０２６は環状構造を有している。この環状構造は、ペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、セリン残基の水酸基とＣ末端のロイシン残基のカルボキシ基との間のエステル結合により形成されている。
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６の塩には、上記本発明のペプチドＭＡ０２６で述べたものが含まれるがそれらに限定されるものではない。
＜ペプチドＲ２ＭＡ０２６＞
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６は、構成アミノ酸が、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基、およびロイシン５残基からなり、上記式（Ｖ）の構造を有する。式（Ｖ）から明らかなように、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６のＮ末端のアミノ酸残基はロイシンであり、このロイシンのアミノ基に３−ヒドロキシドデカ−５−エノイル基がアミド結合している。また、本発明のＲ２ＭＡ０２６は環状構造を有している。この環状構造は、ペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、セリン残基の水酸基とＣ末端のイソロイシン残基のカルボキシ基との間のエステル結合により形成されている。
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の塩には、上記本発明のペプチドＭＡ０２６で述べたものが含まれるがそれらに限定されるものではない。
次に、本発明のペプチドＭＡ０２６から誘導される３種類のペプチド誘導体であるＡＬ−ＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６について詳細に説明する。
＜ペプチドＡＬ−ＭＡ０２６＞
第１の誘導体（本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６）は、上述した本発明のペプチドＭＡ０２６を低級アルキル化した誘導体である。即ち、本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６は、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基を構成アミノ酸残基とする、環状構造を有するデプシペプチドの低級アルキル化誘導体である。本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６の環状構造は、本発明のペプチドＭＡ０２６と同様に、ペプチドを構成するアミノ酸のうち、セリンの水酸基とイソロイシンのカルボキシ基との間のエステル結合により形成されている。また、本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６のＮ末端は、ロイシンであり、そのアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合している。本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６において、低級アルキル化は、前記構成アミノ酸残基の少なくとも１つの官能基においてなされている。
低級アルキル基としては、直鎖、分岐状又は環状の低級アルキル基が含まれる。低級アルキル基の炭素原子数は、低級アルキル化誘導体が抗ウイルス活性を有する限り特に制限はないが、製造の容易性、製造コスト等を考慮すると１〜４個程度であろう。
本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６において、低級アルキル化されている官能基は、低級アルキル化した誘導体が抗ウイルス活性を奏する限り特に制限はない。例えば、ペプチドを構成するアミノ酸残基が有する遊離のアミノ基やカルボキシ基が含まれる。また、低級アルキル化には、上記アミノ基のＮアルキル化やカルボキシ基のエステル化が含まれるが、これに限定されるものではない。
低級アルキル化誘導体（本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６）の一例を挙げると、本発明のペプチドＭＡ０２６において、グルタミン酸残基が有する遊離のカルボキシ基の低級アルキル化誘導体であって、次の構造式（ＶＩ）を有するものを挙げることができる。
0003990284.tif 000010
（式中、Ｒは、低級アルキル基を表す。）
本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６のうち、上記式（ＶＩ）で表される低級アルキル化誘導体は、本発明のペプチドＭＡ０２６にアルキル化剤を用いてアルキル基を導入することにより製造することができるがこの方法に限定されるものではない。使用し得るアルキル化剤には、ジアゾメタン、ヨウ化メチル、トリメチルシリルジアゾメタン、イソブチレン、ヨウ化エチル等が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６の塩には、上記本発明のペプチドＭＡ０２６で述べたものが含まれるがそれらに限定されるものではない。
＜ペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６）
第２の誘導体（本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６）は、本発明のペプチドＭＡ０２６のグルタミン残基がα，γ−ジアミノ酪酸に置換したこと以外は、本発明のペプチドＭＡ０２６と同じである。即ち、本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６は、構成アミノ酸残基が、α，γ−ジアミノ酪酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基からなり、上記構造式（ＩＩ）を有する。上記構造式（ＩＩ）から明らかなように、本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６のＮ末端のアミノ酸残基はロイシンであり、このロイシンのアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合している。また、本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６は、環状構造を有する。この環状構造は、ペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、セリンの水酸基とイソロイシンのカルボキシ基との間のエステル結合により形成されている。
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６は、本発明のペプチドＭＡ０２６のグルタミンの第一級カルボン酸アミドをホフマン転位により、第一級アミンに変換し、製造することができる。ホフマン転位には、［Ｉ，Ｉ−ビス（トリフルオロアセトキシ）ヨード］ベンゼン（以下、「ＢＴＩ」ともいう。）等を適宜用いることができる。
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の塩には、上記本発明のペプチドＭＡ０２６で述べたものが含まれるがそれらに限定されるものではない。
＜ペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６＞
第３の誘導体（本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６）は、上記本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の環状構造を形成するセリン残基とイソロイシン残基との間のエステル結合が加水分解され、鎖状ペプチドになったこと以外は、ＢＴＩ−ＭＡ０２６と同じであり、上記構造式（ＩＩＩ）を有する。上記構造式（ＩＩＩ）から明らかなように、本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６は、構成アミノ酸残基が、α，γ−ジアミノ酪酸４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基からなる。本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６のＮ末端は、ロイシンであり、このロイシンのアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合している。本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６には環状構造はなく、鎖状ペプチド誘導体である。
セリン残基およびイソロイシン残基間のエステル結合の加水分解反応は、例えば、アルカリ加水分解により行うことができる。使用し得る塩基としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、水酸化ナトリウム、アンモニア、ナトリウムメトキシド等を挙げることができる。
本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６の塩には、上記本発明のペプチドＭＡ０２６で述べたものが含まれるがそれらに限定されるものではない。
＜抗ウイルス剤＞
次に、本発明の抗ウイルス剤について以下に詳細に説明する。
本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する新種の菌株および本発明のＲｔＩＢ０２６株；本発明のペプチド（ＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６）および本発明のペプチドＭＡ０２６の誘導体（ＡＬ−ＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６）並びにそれらの塩は、それぞれ単独で又は組み合わせて抗ウイルス剤の有効成分として使用することができる。本発明のペプチドおよびペプチド誘導体の塩を抗ウイルス剤の有効成分として用いる場合、その塩には上記本発明のペプチドＭＡ０２６の塩として言及したものが含まれるが、薬学的に許容し得る塩であればそれらに限定されない。
本明細書において、抗ウイルス剤とは、対象とする動物（ヒトを含む）がウイルスに感染することを予防し、ウイルスに感染した動物を治療し得る作用を有するものが含まれる。本発明の抗ウイルス剤が有効な動物には、哺乳類（ヒトを含む）、鳥類、魚類および甲殻類が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗ウイルス剤が対象とし得るウイルスには、次のウイルスが含まれる。
・脂質膜を有するウイルス。ここで、脂質膜とは、エンベロープと呼ばれるウイルス外膜の他に、ウイルス粒子内膜も含まれる。
このようなウイルスには、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、イリドウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、フィロウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
これらの脂質膜を有するウイルスの宿主には、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ）、鳥類（例えば、ニワトリ）、魚類（例えば、ニジマス、サケ、ウナギ、アナゴ、マダイ、ブリ）、甲殻類（例えば、エビ）等が含まれるがこれらに限定されない。
宿主を哺乳類とする脂質膜を有するウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、家畜由来ヘルペスウイルス）、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス等が含まれるがこれらに限定されない。宿主を魚類、甲殻類とする脂質膜を有するウイルスとしては、サケ科魚類の伝染性造血器壊死症原因ウイルス（ＩＨＮＶ）、アメリカウナギのラブドウイルス（ＥＶＡ）、ヨーロッパウナギのラブドウイルス（ＥＶＥＸ）、エビ類のイエローヘッド病原因ウイルス（ＹＨＤＶ）、サケ科魚類のヘルペスウイルス（ＯＭＶ）、ウナギのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、エビのホワイトスポット病原因ウイルス（ＷＳＳＶ）、エビの急性ウイルス血症原因ウイルス（ＰＲＤＶ）、マダイのイリドウイルス症原因ウイルス（ＲＳＩＶ）等が含まれるがこれらに限定されない。
・一本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するウイルス
このようなウイルスには、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、ＩＨＮＶ等）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、フラビウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス等）、フィロウイルス（エボラ出血熱ウイルス等）、ピコルナウイルス（エビのタウラ症候群ウイルス等）等が含まれるがこれに限定されない。
これらの１本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するウイルスの宿主には、哺乳類、鳥類、魚類、甲殻類等が含まれ、これらのウイルスの宿主となり得る具体的な動物およびそれらを宿主とする具体的ウイルスは上述したものが含まれるがこれらに限定されない。
・二本鎖ＤＮＡをゲノムとして有するウイルス
このようなウイルスにはヘルペスウイルス、バキュロウイルス（ＷＳＳＶ、ＰＲＤＶ等）、イリドウイルス（ＲＳＩＶ等）、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）が含まれるがこれらに限定されない。これらの二本鎖ＤＮＡをゲノムとして有するウイルスの宿主には、哺乳類、鳥類、魚類、甲殻類等が含まれ、これらのウイルスの宿主となり得る具体的な動物およびそれらを宿主とする具体的ウイルスは上述したものが含まれるがこれらに限定されない。
なお、上述したウイルスの分類方法は、主としてウイルス形状の観点、ウイルスゲノムによる分類方法に基づくものである。本発明の抗ウイルス剤を適用することのできるウイルスの範囲はこの分類方法に必ずしも拘束されるとは限らない。
本発明の抗ウイルス剤の適用方法および適用形態は、有効成分が投与対象において抗ウイルス活性を発揮し得るものであれば特に制限はない。
例えば、本発明のＲｔＩＢ０２６株は、経口投与することができる。本発明のＲｔＩＢ０２６株を魚類、甲殻類に経口投与する場合には、餌料に混合したり、カニューレ法により強制的に投与することができる。また、ＲｔＩＢ０２６株は、何れの養魚餌料にも添加することができる。餌料に混合する場合、ＲｔＩＢ０２６株の凍結乾燥粉末を肝油等に分散させたものを餌料に添加することもできる。
添加量は、対象とする動物の種類、動物の生活環境、対象とするウイルスの種類、疾病の程度等に応じて当業者であれば適宜設定することができる。一例を挙げると、養殖池のような屋外で飼育するニジマスには、餌料１ｇ当たり１０４〜１０８ＣＦＵのＲｔＩＢ０２６株を添加することによりウイルス病の発病率を抑え、歩留まりを上げることができる。
また、本発明のＲｔＩＢ０２６株は、魚類や甲殻類に投与する場合は浸漬投与することもできる。さらに、本発明のＲｔＩＢ０２６株の投与以外の適用方法には、飼育水中で本発明のＲｔＩＢ０２６株を生育させること等が含まれる。さらに、濾過材中に本発明のＲｔＩＢ０２６株を生育させ、飼育用水中のウイルスを不活化することによっても効果を奏することができる。
本発明のＲｔＩＢ０２６株は、生菌の状態で動物に投与することが抗ウイルス効果の観点から好ましい。
一方、本発明のペプチド（ＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６）および本発明のペプチドＭＡ０２６の誘導体（ＡＬ−ＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６）並びにそれらの塩の投与方法および投与形態も抗ウイルス活性を発揮し得るものであれば特に制限はなく、経口投与、注射、噴霧等により投与することができる。
例えば、ヒトその他の脊椎動物に経口投与する場合、その剤形に制限はなく、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤等の形態にすることができる。これらの剤形にするための製剤化方法にも特に制限はなく、それ自体は既知の方法により行うことができる。例えば、錠剤にする場合、本発明のペプチドおよび／又はその誘導体を、結晶セルロース等のバインダー、コーンスターチ等の錠剤崩壊剤、タルク等の潤滑剤等と混合し、必要に応じてさらに、希釈剤、緩衝剤等と混合することにより行うことができる。また、注射のように非経口投与とする場合には、それ自体は既知の方法により、本発明のペプチドおよび／またはその誘導体を植物油、合成樹脂グリセリド等の水性又は非水性溶媒中に溶解、懸濁又は乳化し、必要に応じて可溶化剤等の添加剤と共に製剤化することができる。さらに、本発明のペプチドは、喉等にある病巣に直接噴霧により投与することもできる。
また、本発明のペプチドは、家畜等に対しては、直接投与の他、飼育環境中に散布することもできる。
魚類や甲殻類に経口投与する場合の投与形態は、上述した本発明のＲｔＩＢ０２６株と同様に、餌料に混合したり、カニューレ法により強制的に投与することができる。また、浸漬投与、飼育用水中に直接投与することもできる。注射投与する場合は、例えば、生理食塩水のような通常医薬品の溶媒に用いられる溶媒に溶解させて投与することができる。
添加量は、対象とする動物の種類、体重、魚類等の場合はそれらの飼育環境、対象とするウイルスの種類、疾病の程度等に応じて当業者であれば適宜設定することができる。
実施例
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜養殖ニジマスからの本発明のＲｔＩＢ０２６株の分離＞
１．分離源のニジマスは、山梨県内の養魚場で飼育しているニジマス（魚体重４６０ｇ、全長３４．５ｃｍ）であった。
２．１のニジマスを開腹し消化管を摘出した。これを滅菌したメスで切り開き、下記に示すａ）培養液中に入れ、２５℃で５日間培養を行った。
３．２で得られた培養液の一部を下記ｂ）の平板培地に塗抹して培養した結果、得られたコロニーをランダムに３２個釣菌した。分離コロニーを少なくとも２回、同平板培地に画線培養し、純分離を行った。
４．分離した菌それぞれについて下記ａ）の培地で２５℃、５日間培養した培養濾液（菌体を濾過除菌したもの）を得た。その濾液について培養細胞を用いて抗ウイルス活性を評価したところ、強い抗ウイルス活性を持つ１菌株（ＲｔＩＢ０２６株）を得た。
抗ウイルス活性の評価は、以下に示すＢｕｒｋｅらの方法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９，８７２−８７６、１９８０）を一部改良した方法に従い、行った。
▲１▼抗ウイルス活性測定試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、ハンクス液で希釈する。
▲２▼▲１▼の希釈液とハンクス液で希釈したウイルス液（ＩＨＮＶ  ＨＶ７６０１株；１００〜２００ＰＦＵ／検体）をそれぞれ０．２ｍＬ等量で混ぜ、１０℃で２時間作用させる。
▲３▼予め、２４時間前から２４ウェルの細胞培養用プレートに培養しておいたＣＨＳＥ−２１４細胞に▲２▼の作用後の試料を３０分間接種する。
▲４▼試料をウェルから抜き取り、０．８％のメチルセルロースを添加したＭＥＭ培地を重層して７日間培養する。
▲５▼培養プレート上の細胞を３．７％ホルマリン水溶液で固定し、１％クリスタルバイオレットで染色後プラーク数を計測する。
▲６▼抗ウイルス活性は試料未添加のウェルを基準にプラーク数の減少を割合で示す。
（培地の組成）
ａ）ポリペプトン  ５．００ｇ、肉エキス  ２．５０ｇ、酵母エキス  ２．５０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２０ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、グルコース  １．００ｇ、ＮａＣｌ  ５．００ｇ、蒸留水  １０００ｍＬ、ｐＨ７．５、１２１℃で１５分間高圧滅菌
ｂ）ａ）に細菌用寒天１５．００ｇを添加。
以下の実施例において、抗ウイルス活性の評価は上記の方法で行った。
（実施例２）
＜本発明のＲｔＩＢ０２６株培養液からの、本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の精製＞
１．培養濾液の調製；上記実施例１で得られたＲｔＩＢ０２６株の培養は、以下の表３に示す組成の培地を用いた。
0003990284.tif 000011
予め斜面培養した同菌１白金耳を同培地に接種し、２５℃で一晩培養したもの５ｍＬを２．５Ｌの同培地に添加して２５℃で５日間培養した。培養液を遠心分離し、さらにその上清を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過して除菌を行った。培養濾液は合計２０Ｌを１ロットとして以下の精製を行った。
２．培養濾液の濃縮・脱塩；１で調製した培養液をダイヤイオン  ＨＰ−２０ＳＳ（６２．５×１２０ｍｍ）カラムに通液させ、精製水５Ｌおよび８０％のメタノール水溶液（３Ｌ）で順次洗浄した。次に、９５％のメタノール水溶液で目的物質を含む画分を溶出した。さらに本画分について減圧濃縮を行い、再度水に懸濁した上で再びダイヤイオン  ＨＰ−２０ＳＳ（９５×４５ｍｍ）に通液させた。以下前記と同様に精製水１Ｌおよび８０％メタノール水溶液１Ｌで洗浄後、メタノールで目的物質を含む画分を溶出した。
３．目的物質の分離；▲１▼シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製。  ２で得た画分を減圧で乾固し、以下に示した組成の溶媒少量に溶解させた。この溶液を予め同溶媒で調製したシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００ＨＧ）に注入し、同溶媒で溶出および分画を行った｛溶出溶媒；酢酸エチル：メタノール：水＝１００：２５：１５（ｖ／ｖ／ｖ）｝。目的物質の検出は、薄層クロマトグラフィーで上記展開溶媒を用いて展開し、実施した（Ｒｆ＝０．２５を示すスポットを０．２％バニリン−硫酸溶液で発色して検出を行った。）。
▲２▼高速液体クロマトグラフィーによる精製。  上記▲１▼で得た目的物質を含む画分を減圧濃縮し、９２％のメタノール水溶液に溶解させ、ＯＤＳカラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ（２０×２５０ｍｍ）を装着した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離を行った。分離条件は流速５．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、溶出溶媒９２％メタノール水溶液で行った。このＨＰＬＣのクロマトグラムを図１に示す。
保持時間１７．７分（ピーク番号１：Ｒ１ＭＡ０２６画分）、１９．０分（ピーク番号２：ＭＡ０２６画分）および２１．４分（ピーク番号３：Ｒ２ＭＡ０２６画分）に認められる各ピークを示す画分をそれぞれ分取し、減圧濃縮した。次に濃縮した各画分を再び９２％メタノール水溶液に溶解し、上記と同じ条件で再度分取を行った。各目的物質は単一のピークを示す画分として分取し、精製を完了した。
上述した方法により得られた本発明のＲｔＩＢ０２６株の培養液（１ロット、２０Ｌ）から本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６がそれぞれ５０ｍｇ、１ｍｇおよび５ｍｇ得られた。なお、本発明のペプチドＭＡ０２６、Ｒ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６の組成比は、本実施例で挙げたものに制限されるものではなく、培養条件（温度、ｐＨ、培養基組成、酸素濃度、菌の状態等）を適宜調整することにより、所望のペプチドの組成比を高めることもできる。
（実施例３）
＜本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の調製（ホフマン転位）＞
実施例２で得た本発明のペプチドＭＡ０２６とビストリフルオロアセトキシヨードベンゼン（ＢＴＩ）１０ｍｇ／ｍＬを５０％アセトニトリル水溶液中で６０℃窒素気流下にて４時間反応した。
反応物から未反応のＢＴＩをジエチルエーテルで除去し、ゲル濾過法（セファデックス  ＬＨ−２０カラム、１０×１８０ｍｍ、メタノール溶液）により反応産物を精製し、本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６を得た。
（実施例４）
＜本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６の調製＞
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６を５０％ジメチルアミン溶液中で室温にて３時間反応後、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６を得た。
（実施例５）
＜本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６の調製＞
本発明のペプチドＭＡ０２６についてジメチルホルムアミド溶液中ＮａＨＣＯ３存在下でヨードメタンを反応させ、メチル化することにより、上記構造式（ＶＩ）においてＲ＝メチル基である本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６を合成した。
（測定例１０１）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６のプロトンＮＭＲのチャートを図２に示す。
（測定例１０２）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６のカーボンＮＭＲのチャートを図３に示す。
（測定例１０３）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６の赤外吸収スペクトルを図４に示す。
（測定例１０４）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６のポジティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートを図５に示す。
（測定例１０５）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６のネガティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートを図６に示す。
（測定例１０６）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６について高分解能質量分析を行った。実測値：１７７６．０８２９（Ｍ＋Ｈ）＋を基に、推定される分子式は、Ｃ８４Ｈ１４６Ｏ２３Ｎ１８であった。この分子式から計算される分子量は、１７７５．０８１１である。
（測定例１０７）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６の元素分析を行い、以下の表４に示す結果を得た。
0003990284.tif 000012
（測定例１０８）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６（無定形状態）の分解点を測定し、１７４℃を得た。
（測定例１０９）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６の比旋光度を測定し、［α］Ｄ１７＝−２９．５°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）を得た。
（測定例１１０）
実施例２で精製した本発明のペプチドＭＡ０２６のアミノ酸分析結果を図７に示す。
アミノ酸分析は、本発明のペプチドＭＡ０２６を６Ｎ塩酸を用いて１１０℃、２４時間加水分解処理を行い、アミノ酸分析計で分析した。なお、以下の測定例における酸加水分解処理はいずれも本測定例１１０での酸加水分解条件で行った。
（測定例１１１）
実施例３で得た本発明のペプチドＭＡ０２６のホフマン転位反応物（本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６）を以下の方法で分析した。
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６（１．８ｍｇ）を酸加水分解し、アミノ酸分析計で分析した。
ホフマン転位前後のアミノ酸組成計算値を以下の表５に示す。
0003990284.tif 000013
ホフマン転位を行うことにより、本発明のペプチドＭＡ０２６のグルタミンがα，γ−ジアミノ酪酸に変換されるため、アミノ酸分析を実施することによりグルタミンの個数が推定できる。
上記表５に示す反応前後の結果を比較すると、本発明のペプチドＭＡ０２６のグルタミン残基数とグルタミン酸残基数の比率は、４：１であることが推定される。よって、本発明のペプチドＭＡ０２６の構成アミノ酸は、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基およびロイシン５残基であることが推定される。
（測定例１１２）
本発明のペプチドＭＡ０２６と水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）をメタノール溶液中で室温にて２０時間反応した。
反応物を０．１Ｎ塩酸で中和し、過剰量の水を加えブタノールで抽出した。
反応抽出物の一部（２．０ｍｇ）を酸加水分解し、アミノ酸分析計で分析した。
得られたアミノ酸組成計算値を以下の表６に示す。
0003990284.tif 000014
ＬｉＢＨ４で還元反応を行うことにより、本発明のペプチドＭＡ０２６中に含まれるエステル結合が切断され、同結合のカルボキシ基が水酸基に変換される。この反応によってエステル結合に関与しているカルボキシ側のアミノ酸を推測することができる。
上記表６に示す結果から、本発明のペプチドＭＡ０２６の環状構造を形成しているエステル結合のカルボキシ側のアミノ酸残基は、イソロイシンであることが推定される。
（測定例１１３）
▲１▼本発明のペプチドＭＡ０２６を、酢酸３ｍＬ中にＣｒＯ３１００ｍｇおよびピリジン０．１ｍＬを含む溶液と、室温にて２０時間反応した。
反応物に過剰の水を加えブタノールで抽出した。
反応抽出物の一部（４．５ｍｇ）を酸加水分解し、アミノ酸分析計で分析した。
▲２▼別途、本発明のペプチドＭＡ０２６を５０％ジメチルアミン水溶液に溶解し、室温で３時間反応した。
反応物を減圧乾燥後、上記▲１▼と同様にＣｒＯ３酸化反応を行い反応物を得た。
反応物の一部（６．８ｍｇ）を酸加水分解し、アミノ酸分析計で分析した。
得られた各アミノ酸組成計算値を以下の表７に示す。
0003990284.tif 000015
ＣｒＯ３で酸化反応を行うことにより、本発明のペプチドＭＡ０２６中に含まれる水酸基が酸化されケトンになることから、遊離水酸基をもつアミノ酸は消失することになる。また、▲２▼の反応ではエステル結合をアルカリ加水分解反応で切断し、上記の酸化反応および反応物のアミノ酸分析を行うことによりエステル結合に関与している水酸基側のアミノ酸を推定することができる。
上記表７に示す結果から、本発明のペプチドＭＡ０２６の環状構造を形成するエステル結合のヒドロキシ側のアミノ酸残基は、セリンであることが推定される。
（測定例１１４）
本発明のペプチドＭＡ０２６をメタノールに溶解させ、等量のジエチルエーテルと混合した。
エーテル中に捕集したジアゾメタンを過剰量加え、１時間密閉下室温で反応した。
反応物を減圧乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーで分離精製した。分離条件は流速５．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、溶出溶媒は９２％メタノール水溶液で行った。
精製物を上記測定例１１２と同様に水素化ホウ素リチウムで還元した。
反応物の一部（０．１ｍｇ）を酸加水分解し、アミノ酸分析を行った。
得られたアミノ酸組成計算値を以下の表８に示す。
0003990284.tif 000016
上記表８の結果から、本発明のペプチドＭＡ０２６のグルタミン酸が唯一の遊離のカルボキシ基を有していることが推定される。
（測定例１１５および１１６）
本発明のペプチドＭＡ０２６を９４℃、１４時間、６ＮＨＣｌの条件で酸加水分解したものについてジエチルエーテルで抽出した。
抽出物を測定例１１４と同様にジアゾメタンでメチル化した。
メチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して得られたフラクションのうち、薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒：酢酸エチル／メタノール／水＝１００：２５：１５（ｖ／ｖ／ｖ）｝でＲｆ＝０．５１を示すものを分取した。この分取したものについてプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルを測定し、以下の結果を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＴＭＳ，Δｐｐｍ）
０．８８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９、Ｈ１０）、０．９４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．３、Ｈ６’）、０．９５（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．１、Ｈ５’）、１．２８（１０Ｈ、ｂｒ、Ｈ５〜９）、１．３９〜１．４６（１Ｈ、ｍ、Ｈ４ａ）、１．５０〜１．５８（２Ｈ、ｍ、Ｈ４ｂ＆Ｈ３’ａ）、１．６０〜１．６９（２Ｈ、ｍ、Ｈ４’＆Ｈ３’ｂ）、２．３０（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．７＆１５．３、Ｈ２ａ）、２．４３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２．８＆１５．３、Ｈ２ｂ）、３．７４（３Ｈ、ｓ、Ｍｅ）、３．９９（１Ｈ、ｍ、Ｈ２）、４．６５（１Ｈ、ｔｄ、Ｊ＝４．９＆８．７、Ｈ２’）、６．１３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．２、ＮＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＴＭＳ，Δｐｐｍ）
１４．１（Ｃ１０）、２１．９（Ｃ６’）、２２．６（Ｃ９）、２２．８（Ｃ５’）、２４．９（Ｃ４’）、２５．５（Ｃ５）、２９．２（Ｃ７）、２９．５（Ｃ６）、３１．８（Ｃ８）、３６．７（Ｃ４）、４１．５（Ｃ３’）、４２．４（Ｃ２）、５０．６（Ｃ２’）、５２．４（Ｍｅ）、６８．６（Ｃ３）、１７２．２（Ｃ１）、１７３．６（Ｃ１’）
これらのデータから、酸加水分解物の構造は、下記構造式（ＸＩ）に示したものであることが決定された。
0003990284.tif 000017
この結果から、本発明のペプチドＭＡ０２６のＮ末端のアミノ酸残基がロイシンであり、このロイシンに３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合していることが推定される。
（測定例１１７）
本発明のペプチドＭＡ０２６のポジティブＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを図８に示す。
（測定例１１８〜１２０）
実施例３で得た本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６について重メタノール溶液中のプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルの測定、並びに質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。
図９および図１０に、それぞれプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルを、図１１に質量分析の結果を示す。
（測定例１２１）
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の赤外吸収スペクトルを図１２に示す。
（測定例１２２）
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の比旋光度を測定し、［α］Ｄ２４＝−０．３°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）を得た。
（測定例１２３）
本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６（無定形状態）の分解点を測定し、１６５℃を得た。
（測定例１２４〜１２６）
実施例４で得た本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６について重メタノール溶液中のプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルの測定、並びに質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。
図１３および図１４に、それぞれプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルを、図１５に質量分析の結果を示す。
（測定例１２７）
本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６の赤外吸収スペクトルを図１６に示す。
（測定例１２８）
本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６の比旋光度を測定し、［α］Ｄ２４＝−６．７°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）を得た。
（測定例１２９）
本発明のペプチドＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６（無定形状態）の分解点を測定し、１６４℃を得た。
上記測定例１１２〜１１７の測定例の結果を併せると、本発明のペプチドＭＡ０２６のアミノ酸配列および平面構造は、上記構造式（Ｉ）に示したものであることが推定される。
また、上記測定例１１８〜１２１および１２４〜１２６の結果を更に併せると、本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６のアミノ酸配列および平面構造は、それぞれ、上記構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に示したものであることが推定される。
（測定例２０１）
実施例２のピーク番号１の画分を精製して得られた本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６のアミノ酸分析を上記測定例１１０と同様に行い、図１７に示す結果を得た。
（測定例２０２〜２０５）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６についてネガティブＥＳＩ−ＭＳ質量分析並びに重メタノール中のプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトル分析を行うことにより、それぞれ、図１８〜２０に示す結果を得た。
（測定例２０６）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６の赤外吸収スペクトルを図２１に示す。
（測定例２０７）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６の比旋光度を測定し、［α］Ｄ２４＝−２５．２°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）を得た。
（測定例２０８）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６（無定形状態）の分解点を測定し、１７１℃を得た。
（測定例２０９）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６を実施例３と同様にホフマン転位を行い、得られた産物を以下に示す条件の高速液体クロマトグラフィーで精製した。
高速液体クロマトグラフィーによる精製
ＯＤＳカラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ（２０×２５０ｍｍ）を装着した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離を行った。分離条件は、５．０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、溶出溶媒は３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液から１００％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡまでの直線勾配で分離を行い、精製を完了した。
得られたホフマン転位反応物ＢＴＩ−Ｒ１ＭＡ０２６についてアミノ酸分析を行い、表９に示す結果を得た。
0003990284.tif 000018
（測定例２１０）
本発明のペプチドＢＴＩ−Ｒ１ＭＡ０２６について質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行い、図２２に示す結果を得た。
これらの結果から、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６の構成アミノ酸に含まれるグルタミン及びグルタミン酸の組成比が４：１であることが推定された。従って、Ｒ１ＭＡ０２６の構成アミノ酸は、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン３残基、並びにロイシン５残基であることが推定される。
（測定例２１１および２１２）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６を測定例１１５および１１６の方法に従い、９１℃、１８時間、６Ｎ  ＨＣｌの条件で酸加水分解したものについてジエチルエーテルで抽出した。抽出物を測定例１１４と同様にジアゾメタンでメチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的の画分は、薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝３：２｝でＲｆ＝０．１３を示した。この分取したものについてプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定したところ、測定例１１５で得られた化合物と同様の結果を得た。
この結果から、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６に含まれるＮ末端のアミノ酸残基はロイシンであり、このロイシンに３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合していることが推定される。
（測定例２１３）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６を測定例１１３、▲１▼と同様ＣｒＯ３で反応し、得られた産物についてアミノ酸分析を行った。また、別途に測定例１１３、▲２▼と同様、ジメチルアミン反応後にＣｒＯ３で反応し、アミノ酸分析を行った。
得られたアミノ酸組成計算値を以下の表１０に示す。
0003990284.tif 000019
上記、表１０に示す結果から、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６の環状構造を形成するエステル結合のヒドロキシ側のアミノ酸残基は、セリンであることが推定される。
（測定例２１４）
本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを図２３に示す。
上記測定例２１１〜２１４の結果を併せると、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６のアミノ酸配列および平面構造は、下記構造式（ＩＶ）に示したものであることが推定される。
0003990284.tif 000020
（測定例３０１）
実施例２のピーク番号３の画分を精製して得られた本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６のアミノ酸分析を上記測定例１１０と同様に行い、図２４に示す結果を得た。
（測定例３０２〜３０５）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６についてネガティブＥＳＩ−ＭＳ質量分析並びに重メタノール中のプロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトル分析を行うことにより、それぞれ、図２５〜２７に示す結果を得た。
（測定例３０６）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の赤外吸収スペクトルを図２８に示す。
（測定例３０７）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の比旋光度を測定し、［α］Ｄ２４＝−２３．５°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）を得た。
（測定例３０８）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６（無定形状態）の分解点を測定し、１６６℃を得た。
（測定例３０９）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６を測定例２０９と同様にホフマン転位および高速液体クロマトグラフィーで精製して得られたＢＴＩ−Ｒ２ＭＡ０２６についてアミノ酸分析を行い、表１１に示す結果を得た。
0003990284.tif 000021
（測定例３１０）
本発明のペプチドＢＴＩ−Ｒ２ＭＡ０２６について質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行い、図２９に示す結果を得た。
これらの結果から、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の構成アミノ酸に含まれるグルタミン及びグルタミン酸の組成比が４：１であることが推定された。従って、Ｒ２ＭＡ０２６の構成アミノ酸は、グルタミン４残基、グルタミン酸１残基、セリン１残基、バリン２残基、イソロイシン１残基並びにロイシン５残基であることが推定される。
（測定例３１１および３１２）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６を測定例１１５および１１６の方法に従い、９０℃、１４時間、６Ｎ  ＨＣｌの条件で酸加水分解したものについてジエチルエーテルで抽出した。抽出物を測定例１１４と同様にジアゾメタンでメチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的の画分は、薄層クロマトグラフィー｛展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝３：２｝でＲｆ＝０．１８を示した。この分取したものについてプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定し、以下の結果を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＴＭＳ，Δｐｐｍ）
０．８８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９、Ｈ１２）、０．９４（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４、Ｈ５’＆Ｈ６’）、１．２８（８Ｈ、ｂｒ、Ｈ８＆Ｈ９＆Ｈ１０＆Ｈ１１）、１．５２〜１．６７（３Ｈ、ｍ、Ｈ３’ａ＆Ｈ３”ｂ＆Ｈ４’）、２．０４（２Ｈ、ｍ、Ｈ７）、２．２９（１Ｈ、ｍ、Ｈ４ｂ）、２．３３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１５．３＆８．９、Ｈ２ｂ）、２．３４（１Ｈ、ｍ、Ｈ４ａ）、２．４６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１５．４＆２．８、Ｈ２ａ）、３．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０、ＯＨ）、３．７４（３Ｈ、ｓ、Ｍｅ）、４．０２（１Ｈ、ｍ、Ｈ３）、４．６５（１Ｈ、ｔｄ、Ｊ＝８．６＆４．８、Ｈ２’）、５．３８（１Ｈ、ａｐｐ．ｄｄ、Ｊ＝１８．２＆７．５、Ｈ５）、５．５７（１Ｈ、ａｐｐ．ｄｄ、Ｊ＝１８．１＆７．３、Ｈ６）、６．２２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０、ＮＨ）
これらのデーターから、酸加水分解物の構造は、下記構造式（ＸＩＩ）に示したものであることが推定された。
0003990284.tif 000022
この結果から、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６に含まれるＮ末端のアミノ酸残基はロイシンであり、このロイシンに３−ヒドロキシドデカ−５−エノイル基がアミド結合していることが推定される。
（測定例３１３）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６と水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）を測定例１１２と同様に反応させ、アミノ酸分析計で分析した。
得られたアミノ酸組成計算値を以下の表１２に示す。
0003990284.tif 000023
上記、表１２に示す結果から、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の環状構造を形成しているエステル結合のカルボキシ側のアミノ酸は、イソロイシンであることが推定される。
（測定例３１４）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６を測定例１１３、▲１▼と同様ＣｒＯ３で反応し、得られた産物についてアミノ酸分析を行った。また、別途に測定例１１３、▲２▼と同様、ジメチルアミン反応後にＣｒＯ３で反応し、アミノ酸分析を行った。
得られたアミノ酸組成計算値を以下の表１３に示す。
0003990284.tif 000024
上記、表１３に示す結果から、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６の環状構造を形成するエステル結合のヒドロキシ側のアミノ酸残基は、セリンであることが推定される。
（測定例３１５）
本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳクトルを図３０に示す。
上記測定例３１１〜３１５の結果を併せると、本発明のペプチドＲ２ＭＡ０２６のアミノ酸配列および平面構造は、下記構造式（Ｖ）に示したものであることが推定される。
0003990284.tif 000025
（測定例４０１〜４０３）
実施例５で得た精製物（本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６）について重メタノール溶液中のプロトン核磁気共鳴スペクトルの測定および質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）を行った。
図３１にプロトンＮＭＲのチャートを、図３２にポジティブＦＡＢ−ＭＳのチャートを、図３３にネガティブＦＡＢ−ＭＳのチャートを示す。
（実施例６）
＜本発明のＲｔＩＢ０２６株の投与試験１＞
実施例１で得られた本発明のＲｔＩＢ０２６株をニジマス餌料に混合して経口的に投与を行うことによりサケ科魚類の伝染性造血器壊死症原因ウイルス（ＩＨＮＶ）に対する抵抗性を評価し、養殖魚病ウイルスの感染予防効果を検討した。試験は、室内のプラスチック水槽（１０Ｌ）内で行った。
孵化後１カ月齢のニジマス稚魚（魚体重１ｇ、全長３ｃｍ）６０尾をランダムに３０尾ずつ２群に分けてそれぞれを１０℃で飼育し、投与群についてはＲｔＩＢ０２６株１０７ＣＦＵ／餌料１ｇを含む餌料を、対照群には通常の餌料を１日１回、２週間投与した。投与終了時に１００ＰＦＵ／ｍＬのＩＨＮＶ液に１時間浸漬してウイルスに感染させ、引き続き両群とも通常の餌料を投与して飼育し、その後の経過を観察した。
その結果を図３４に示す。図３４から明らかなように、ＩＨＮＶ感染後、４日目までは投与群と対照群ともに生存率の低下は認められなかった。５日目以降、対照群の生存率が投与群よりも低くなり始め、９日目から生存率の差が大きくなり、ウイルス感染後２３日間で対照群の生存率は２０％になったのに対し、投与群は約７０％生存しており、ウイルス病発病の予防が顕著であった。
（参考例１）
上記実施例１で得られた本発明のＲｔＩＢ０２６株をホルマリン処理し不活化した後、遠心分離により集めて生理的食塩水で洗浄した菌体を餌料に添加し、実施例６に記載した本発明のＲｔＩＢ０２６株の投与試験１と同様の試験を行った。
その結果、不活性な菌体を投与した場合のウイルス感染後２３日での生存率は１６．７％であり、不活化した菌体ではウイルス感染の予防効果が認められなかった。
（実施例７）
＜本発明のペプチドＭＡ０２６の魚類等のウイルスに対する抗ウイルス活性測定＞  サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、アメリカウナギのラブドウイルス（ＥＶＡ）およびヨーロッパウナギのラブドウイルス（ＥＶＥＸ）に対する本発明のペプチドＭＡ０２６の抗ウイルス活性を実施例１と同様の方法により測定した。
得られた結果を図３５に示す。
図３５に示すように、本発明のペプチドＭＡ０２６は、ＩＨＮＶ、ＥＶＡおよびＥＶＥＸに対する高い抗ウイルス活性を有することが分かる。
（実施例８）
実施例７と同様の方法で、本発明のペプチドＲ１ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６のＩＨＮＶに対する抗ウイルス活性を測定し、抗ウイルス活性を確認した。
図３６に結果を示す。
（実施例９）
実施例７と同様の方法で、本発明のペプチドＡＬ−ＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＢＴＩ−ｂａｓｅＭＡ０２６のＩＨＮＶに対する抗ウイルス活性を測定し、抗ウイルス活性を確認した。
図３７に結果を示す。
（実施例１０）
＜本発明のペプチドのインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性＞
インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性の評価方法について、発明者らが実施した方法を以下に示す。なお、本試験に用いたウイルス株は、（社）動物用生物学的製剤協会から供給される家畜衛生菌株を用いた。ブタ由来のインフルエンザウイルスは菌株番号ＶＳ０５０５（Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６株）を使用し、トリ由来はＶＡ０９０２（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８株）を使用した。これらの家畜由来のインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するものは、ヒトのインフルエンザウイルスに対しても抗ウイルス活性を有することが推測される。
▲１▼  抗ウイルス活性測定試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、ＭＥＭ培地＊で希釈する。
▲２▼  ▲１▼の希釈液とＭＥＭ培地で希釈したウイルス液をそれぞれ０．５ｍＬ等量で混ぜ、３７℃で２時間作用させる。
▲３▼  予め、２４時間前から６ウエルの細胞培養用プレートに培養しておいたＭＤＣＫ細胞に▲２▼の作用後の試料を３７℃で１時間接種する。
▲４▼  試料をウエルから抜き取り、１％のアガロースを添加したＭＥＭ培地を重層して２日間培養する。
▲５▼  さらに、０．０１％ニュートラルレッド添加のＭＥＭ−アガロース培地を重層して４時間以上培養を行う。
▲６▼  抗ウイルス活性は試料未添加のウエルを基準にプラークの数の減少を割合で示す。
＊ＭＥＭ培地；ＭＥＭ培地に０．００１％ＤＥＡＥデキストラン、０．０１％トリプシンを含む。
上述の方法で試験を行ったところ、ブタ由来インフルエンザウイルスについて図３８、トリ由来インフルエンザウイルスについては図３９のそれぞれの結果を得た。
（実施例１１）
＜本発明のペプチドの家畜由来ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性＞
家畜由来ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性の評価は、実施例１０に示したインフルエンザウイルスの方法を一部改変し、以下に示す方法で行った。なお、本試験に用いたウイルス株は、（社）動物用生物学的製剤協会から供給される家畜衛生菌株を用いた。ブタ由来のヘルペスウイルス（Ａｕｊｅｓｚｋｅｙ‘ｓ  ｄｅｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）は菌株番号ＶＳ１００１（山形Ｓ−８１株）を使用した。ブタ由来のヘルペスウイルスは、ヒトのヘルペスウイルスに対しての抗ウイルス活性を評価する代替ウイルスとして、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，６７  Ｓｕｐｐｌ．３，１９１−１９６，１９９４等に紹介されている。
▲１▼  抗ウイルス活性測定試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、ＭＥＭ培地で希釈する。
▲２▼  ▲１▼の希釈液とＭＥＭ培地で希釈したウイルス液をそれぞれ０．５ｍＬ等量で混ぜ、３７℃で２時間作用させる。
▲３▼  予め、２４時間前から６ウエルの細胞培養用プレートに培養しておいたＭＤＣＫ細胞に▲２▼の作用後の試料を３７℃で１時間接種する。
▲４▼  試料をウエルから抜き取り、１％のアガロースを添加したＭＥＭ培地を重層して２日間培養する。
▲５▼  さらに、０．０１％ニュートラルレッド添加のＭＥＭ−アガロース培地を重層して４時間以上培養を行う。
▲６▼  抗ウイルス活性は試料未添加のウエルを基準にプラークの数の減少を割合で示す。
上述の方法で試験を行ったところ、ブタ由来ヘルペスウイルスについて図４０の結果を得た。
（実施例１２）
＜本発明のペプチドの日本脳炎ウイルスに対する抗ウイルス活性＞
家畜由来日本脳炎ウイルスに対する抗ウイルス活性の評価は９６ウエルプレートを使用したＴＣＩＤ５０法を用いて以下に示す方法で行った。なお、本試験に用いたウイルス株は、（社）動物用生物学的製剤協会から供給される家畜衛生菌株を用いた。ブタ由来の日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）は菌株番号ＶＳ０３０６（Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｓ−２株）を使用した。
▲１▼  抗ウイルス活性測定試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、ＭＥＭ培地で希釈する。
▲２▼  ▲１▼の希釈液とＭＥＭ培地で希釈したウイルス液をそれぞれ０．５ｍＬ等量で混ぜ、３７℃で２時間作用させる。
▲３▼  予め、２４時間前から９６ウエルの細胞培養用プレートに培養しておいたＢＨＫ−２１細胞に▲２▼の作用後の試料を１ウエル当り１００μＬ接種する。接種試料は６段階の５倍希釈列を作り、それぞれ１段階に付き４ウエル接種する。
▲４▼  ５日間以上培養して、各ウエルを観察し、細胞変性の有無を確認する。
▲５▼  ウイルス感染価は、５０％の感染ウエルを示すウイルスの希釈倍率を計算し、試料未添加のウイルス感染価を基準に感染価の減少を割合で示す。
上述の方法で試験を行ったところ、ブタ由来日本脳炎ウイルスについて図４１の結果を得た。
（実施例１３）
＜本発明のペプチドのエビウイルスに対する抗ウイルス活性＞
本発明のペプチドＭＡ０２６およびＢＴＩ−ＭＡ０２６を対象に、エビウイルス（ホワイトスポット病原因ウイルス）に対する抗ウイルス効果を検討した。
体重２０ｇ前後のＰｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ（ブラックタイガー・エビ）をランダムに１０尾づつ隔離飼育した。ホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ  ＬＤ５０値；１０−３．６）をハンクス液で２０００倍に希釈したウイルス液と本発明のペプチドＭＡ０２６および本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６の希釈液（１００μｇ／ｍＬ）を等量混合した。混合液を２５℃で１時間処理した後、同液をエビ一尾あたり０．１ｍＬ筋肉注射し、ウイルス接種を行った。ウイルス感染の有無はウイルス接種後、２週間観察を行い死亡個体については病理所見観察および病変部組織を対象にＰＣＲ法によるウイルス遺伝子検出を実施した。なおコントロール群はハンクス液のみを用いた。
その結果を図４２に示す。図４２からも明らかなように、コントロール群ではウイルス接種後４日以内に全数が死亡したのに対し、本発明のペプチドＭＡ０２６、および本発明のペプチドＢＴＩ−ＭＡ０２６で処理した群は死亡個体が一尾もなかった。
（実施例１４）
＜本発明のペプチドのＣ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス活性＞
本発明のペプチドＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６を対象に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗ウイルス効果を試験した。実験はＭｉｚｕｔａｎｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７，８２２−８２６，１９９６）に準じた以下の方法により、京都大学ウイルス研究所にて、下遠野邦忠博士の指導下で行った。
▲１▼  １ｍＬあたり１×１０６個のＭＴ−２Ｃ細胞に０．１ｍＬあたり１×１０６遺伝子力価のＨＣＶを感染させ、３２℃で４日間培養した。
▲２▼  ９６ウェルプレートに▲１▼の感染細胞が１ウェルあたり１０５細胞となるように分注し、３２℃で１日培養した。
▲３▼  各ウェルに本発明のペプチドをそれぞれ１μＭおよび５μＭの濃度となるように添加し、さらに３２℃で２日培養した。
▲４▼  試験細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素でｃＤＮＡを複製後、１段階および２段階のＰＣＲを行い、ＨＣＶ遺伝子の検出を行った。
▲５▼  ＨＣＶ抑制効果は試験物質を添加していないＨＣＶ感染細胞由来のＰＣＲ産物量の蛍光強度を１００％とし、試験試料を添加した感染細胞由来のＰＣＲ産物の蛍光強度を比較することで評価した。
表１４にこれらの結果を示した。
0003990284.tif 000026
上記表１４から明らかなように、本発明のペプチドＭＡ０２６、ＢＴＩ−ＭＡ０２６およびＲ２ＭＡ０２６は、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制した。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の新規な菌株およびペプチドは、ヒトや家畜のような哺乳類、さらには、魚類、甲殻類等の水産資源に対する感染症の原因となるウイルスに対する抗ウイルス剤として有用なものである。
ウイルスおよび細菌等の微生物は、様々な感染症の原因因子であることが知られている。細菌を原因とする感染症に対しては、抗生物質等の研究開発が進み、多くの医薬品が実用化されている。これに対して、ウイルスを原因とする感染症に対する医薬品は、近年のウイルス学の発展にともないその原因ウイルスの特定は進んでいるものの、抗菌剤ほどには実用化が進んでいないのが現状である。このような状況下、本発明の新規な菌株およびペプチドは、生物の医薬分野における極めて重要な役割を果たすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、高速液体クロマトグラムである。
図２は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図３は、カーボンＮＭＲのチャートである。
図４は、赤外吸収スペクトログラムである。
図５は、ポジティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートである。
図６は、ネガティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートである。
図７は、アミノ酸分析チャートである。
図８は、ポジティブＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ質量分析チャートである。
図９は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図１０は、カーボンＮＭＲのチャートである。
図１１は、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）チャートである。
図１２は、赤外吸収スペクトログラムである。
図１３は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図１４は、カーボンＮＭＲのチャートである。
図１５は、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）チャートである。
図１６は、赤外吸収スペクトログラムである。
図１７は、アミノ酸分析チャートである。
図１８は、ネガティブＥＳＩ−ＭＳ質量分析チャートである。
図１９は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図２０は、カーボンＮＭＲのチャートである。
図２１は、赤外吸収スペクトログラムである。
図２２は、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）チャートである。
図２３は、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ質量分析チャートである。
図２４は、アミノ酸分析チャートである。
図２５は、ネガティブＥＳＩ−ＭＳ質量分析チャートである。
図２６は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図２７は、カーボンＮＭＲのチャートである。
図２８は、赤外吸収スペクトログラムである。
図２９は、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）チャートである。
図３０は、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ質量分析チャートである。
図３１は、プロトンＮＭＲのチャートである。
図３２は、ポジティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートである。
図３３は、ネガティブＦＡＢ−ＭＳの質量分析チャートである。
図３４は、本発明のＲｔＩＢ０２６株の投与試験結果を示すグラフである。
図３５は、ＩＨＮＶ、ＥＶＡおよびＥＶＥＸに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図３６は、ＩＨＮＶに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図３７は、ＩＨＮＶに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図３８は、ブタ由来インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図３９は、トリ由来インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図４０は、ブタ由来ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図４１は、ブタ由来日本脳炎ウイルスに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
図４２は、エビウイルスに対する抗ウイルス活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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