(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源が発する光から所定波長の光を励起光として分離し、該励起光を試料に照射する励起分光系、前記励起光を受けたときに前記試料が発する蛍光の一部を検出し、その量を示す蛍光信号を出力する第一の光検出器、及び、前記励起光の一部を対照光として受けるように配置された第二の光検出器を備える蛍光分光光度計において、
前記第二の光検出器の出力信号と前記光源の点灯に起因する迷光に相当する信号成分との差分に相当する対照光信号を出力する対照光信号生成手段、及び
前記対照光信号に基づいて前記蛍光信号を補正することにより得られる信号を測定信号として出力する信号補正手段
を備えることを特徴とする蛍光分光光度計。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光分光光度計に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に蛍光分光光度計は、光源が発する光から所定波長の光を分離し、その光を励起光として試料に照射する励起分光系、励起光を受けたときに試料が発する蛍光から所定波長の光を分離する蛍光分光系、及び、蛍光分光系により分離された光を検出してその量に応じた信号（以下、蛍光信号とよぶ）を出力する蛍光検出器を備えている。このような蛍光分光光度計において、試料が発する蛍光の量はその試料に照射された励起光の量に比例するため、蛍光信号に基づいて試料の定量分析を行おうとしても、正しい分析結果は得られない。このことを考慮し、多くの蛍光分光光度計では、ビームスプリッタ等の光学素子を用いて励起光の一部を対照光（リファレンス光）として取り出し、該対照光の量を光ダイオード等の検出器（以下、対照光検出器とよぶ）により検出し、該対照光検出器の出力信号（以下、対照光信号とよぶ）に基づいて蛍光信号を補正するようにしている。より具体的には、蛍光信号の強度と対照光信号の強度との比に応じた信号を測定信号として最終的に出力する。このようにすると、例えば光源光量の変動等により励起光量が変化しても、測定信号がそれに影響されることがなくなる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記蛍光分光光度計の対照光検出器で検出される光には、励起光から抽出される対照光だけでなく、光源の点灯に起因する迷光も含まれている。この迷光量が対照光量に対して無視しうる程度に小さい場合は、上記のような補正により十分に正しい測定信号が得られる。しかし、実際には、対照光量に対する迷光量の比率が上記補正にとって無視しえない程度に大きくなる場合もある。例えば、一般に光源の光量は波長に応じて変化するため、特定の波長又は波長領域で励起光量が極めて小さくなることがある。このような場合、励起光から取り出される対照光の量もそれに応じて小さくなり、迷光の影響が無視できなくなる。また、蛍光分光光度計では励起光の光源としてキセノンランプ等の強力な光源を用いるのが一般的であるが、励起分光系に用いられる反射鏡や回折格子等の光学素子は、そのような強力な光を長期に渡って受けることにより徐々に劣化し、その反射率が短波長側から徐々に低下してくる。この結果、短波長領域における励起光量が極めて小さくなり、それから取り出される対照光量が小さくなって、迷光の影響が無視できなくなる。以上のように、迷光の影響が無視できない程度にまで対照光量が小さくなると、上記対照光信号の強度は真の対照光量に対応する強度よりも大きくなるため、その対照光信号に基づく上記補正処理により得られる測定信号の強度は正しい強度よりも小さくなってしまう。しかし、このような問題は、上記従来の蛍光分光光度計では全く考慮されていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明は、
光源が発する光から所定波長の光を励起光として分離し、該励起光を試料に照射する励起分光系、前記励起光を受けたときに前記試料が発する蛍光の一部を検出し、その量を示す蛍光信号を出力する第一の光検出器、及び、前記励起光の一部を対照光として受けるように配置された第二の光検出器を備える蛍光分光光度計において、
前記第二の光検出器の出力信号と前記光源の点灯に起因する迷光に相当する信号成分との差分に相当する対照光信号を出力する対照光信号生成手段、及び
前記対照光信号に基づいて前記蛍光信号を補正することにより得られる信号を測定信号として出力する信号補正手段
を備えることを特徴とする蛍光分光光度計を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に係る蛍光分光光度計では、第二の光検出器が出力する信号をそのまま対照光量を示す信号とするのではなく、その信号から迷光に相当する信号成分を差し引いた差分を、対照光量を示す信号（対照光信号）としている。
【０００６】
上記対照光信号生成手段の一例としては、
前記励起分光系により生成する励起光の波長を設定するための波長設定手段
前記波長設定手段により設定される波長と、該波長の励起光を生成している間に前記第二の検出器が受ける光量に対する迷光量の比率との関係を示すデータを保存するための記憶手段、及び
前記波長設定手段により設定された波長及び該波長に対応する迷光量の比率に基づいて前記第二の光検出器の出力信号を処理することにより前記対照光信号を生成する信号処理手段
を備えるものが挙げられる。
【０００７】
上記記憶手段に保存するデータは、例えば次のような手順で作成される。まず、波長設定手段により励起光の波長を設定するとともに、その波長の光を遮断するような光学フィルタを前記対照光の光路上に配置し、光源を点灯する。このような条件下では、第二の光検出器は迷光だけを検出する。従って、そのときの第二の光検出器の出力信号の強度に基づいて光の量を求めれば、それがすなわち先に設定された波長に対応する迷光量となる。このようにして、所定波長範囲内の各波長に対応する迷光量を求める。こうして励起光の波長と迷光量との関係を示すデータを収集し、そのデータを、例えば波長から迷光量への変換テーブルや関数の形で記憶手段に保存する。
【０００８】
上記のようなデータは、励起光の波長を設定可能な波長領域全体について作成してもよいが、迷光比率の比較的小さい波長領域では迷光の影響が無視できることから、迷光比率の比較的大きい特定の波長領域（つまり、光源の発光量の小さい波長領域）についてのみ、データを作成するようにしてもよい。また、上記のようなデータは、データ作成の対象とされた波長領域内で設定可能な全ての波長について予め作成しておくことが好ましいが、これは本発明にとって必須ではない。例えば、上記波長領域内において適度な波長間隔をおいて選択された複数の波長についてのみ上記のようなデータを予め作成し、実際の測定時には、上記データに基づく周知のデータ補間処理により、実際に設定された波長に対応する迷光量を算出するようにしてもよい。
【０００９】
【発明の効果】
以上のような本発明に係る蛍光分光光度計では、迷光比率が比較的大きい波長領域の励起光を用いても、迷光の影響を補償した正しい測定信号が出力されるため、従来よりも広い波長範囲の励起光を測定に利用することができる。また、回折格子等の光学素子の劣化によりある波長領域で励起光量が減少しても、測定信号はそれに影響されない。このように本発明によれば、蛍光分光光度計の感度が広い波長範囲に渡って長期的に維持される。
【００１０】
【実施例】
図１は本発明の一実施例である蛍光分光光度計の概略的構成を示す図である。図１の蛍光分光光度計１は、光源部１０、励起分光部２０、モニタ部３０、試料室４０及び蛍光分光部５０から主として成る。光源部１０は、光源１１（例えば、キセノンランプ）の発する光を集めるための集光鏡１２を備えている。集光鏡１２により集められた光は、第一のスリット１３を通って励起分光部２０に入る。励起分光部２０に入った光は反射鏡２１により第一の回折格子２２へ向けて反射され、該回折格子２２により波長方向に分散される。回折格子２２により分散された光の一部は第二のスリット２３を通ってモニタ部３０へ入る。こうしてモニタ部３０へ入った光が本発明にいう励起光に相当する。更に、励起分光部２０には、回転軸２２ａを中心として回折格子２２を回転駆動するための格子駆動機構２４が備えられている。励起光の波長は、格子駆動機構２４で回折格子２２の向きを適宜変えることにより、所定波長範囲内で任意に設定することができる。
【００１１】
モニタ部３０における励起光の光路上にはビームスプリッタ３１が配置されており、これにより励起光は２方向に分離される。すなわち、励起光の一部はビームスプリッタ３１を通過し、第一のレンズ３２により集められ、試料室４０内に配置された試料セル４１に到達する。一方、励起光の他の部分はビームスプリッタ３１により反射され、第二のレンズ３３により集められ、対照光検出器３４（例えばフォトダイオード）により検出される。なお、励起光のうちビームスプリッタ３１により反射された部分が本発明にいう対照光に相当する。
【００１２】
試料セル４１に励起光が到達すると、その中の試料が蛍光を発する。この蛍光の一部は、第三のレンズ４２により集められ、蛍光分光部５０へ入る。蛍光分光部５０へ入った蛍光の一部は、第三のスリット５１を通って第二の回折格子５２に到達し、該回折格子５２により波長方向に分散される。こうして分散された光のうち、ある波長を有する一部の光は第四のスリット５３を通じて蛍光検出器５４（例えば、光電子増倍管）により検出される。更に、蛍光分光部５０には、回転軸５２ａを中心として回折格子５２を回転駆動するための格子駆動機構５５が備えられている。蛍光検出器５４により検出される光の波長は、格子駆動機構５５で回折格子５２の向きを適宜変えることにより、所定波長範囲内で任意に設定することができる。
【００１３】
図２は蛍光分光光度計１の制御系６０の概略的構成を示すブロック図である。この制御系６０の中心は中央制御部６１であり、使用者は操作部６２を通じて中央制御部６１へ各種命令や設定データを入力することができる。使用者が、励起光を生成する波長（励起波長）や蛍光を検出する波長（蛍光波長）を設定し、測定開始命令を中央制御部６１へ入力すると、中央制御部６１は、上記２つの回折格子２２、５２が設定された各波長に対応する方向に向くように上記２つの格子駆動機構２４、５５を制御し、光源１１を点灯する。測定の間、中央制御部６１は、蛍光検出器５４の出力信号を蛍光信号として、また対照光検出器３４の出力信号を対照光信号としてそれぞれモニタし、各信号の強度を示すデジタルデータをデータ処理部６３へ送る。
【００１４】
データ処理部６３は、データ記憶部６４に予め保存された変換テーブル６５を用いて蛍光信号及び対照光信号の強度データを処理する。変換テーブル６５には、励起波長と迷光比率との関係を示すデータが保存されている。なお、本実施例において迷光比率とは、励起波長をλに設定して光源１１を点灯したときに対照光検出器３４が出力する信号の強度をＲ(λ)とし、Ｒ(λ)のうち迷光に起因する強度成分をｓ(λ)としたときに、次式
β(λ)＝ｓ(λ)／｛Ｒ(λ)−ｓ(λ)｝                      （１）
で求められるβ(λ)の値と定義する。なお、迷光比率の定義は上記に限られるものではないことは言うまでもなく、Ｒ(λ)のうち迷光に起因する強度成分を求めるために利用可能な値であれば、その値は迷光比率とみなすことができる。
【００１５】
いま、励起波長をλ１、蛍光波長をλ２としたときに、蛍光検出器５４の出力信号強度がＦ(λ２)であったものとする。このとき、従来の方法では次式
Ｉ(λ１，λ２)＝α×Ｆ(λ２)／Ｒ(λ１)                  （２）
ただし、αは定数
で求められるＩ(λ１，λ２)を分析に利用していた。しかし、式（２）の計算では、迷光に起因する強度成分がＲ(λ１)に含まれているため、正しい分析結果が得られない。そこで、本実施例の蛍光分光光度計１のデータ処理部６３は、Ｒ(λ１)の代わりに、Ｒ(λ１)からｓ(λ１)を差し引いた値を用いた次式
Ｐ(λ１，λ２)＝α×Ｆ(λ２)／｛Ｒ(λ１)−ｓ(λ１)｝    （３）
で求められるＰ(λ１，λ２)を分析に利用する。式（３）を式（１）及び式（２）を用いて変形すると次式
Ｐ(λ１，λ２)＝Ｉ(λ１，λ２)×｛１＋β(λ１)｝        （４）
のようになる。式（４）には、従来の方法で用いられている関数Ｉ(λ１，λ２)がそのまま含まれている。これは、従来のデータ処理プログラムに新たなモジュールを追加するだけで容易に本実施例のデータ処理部６３を実現することができることを意味している。
【００１６】
変換テーブル６５のデータの作成方法について説明する。式（１）から分かるように、ある励起波長λに対応する迷光比率β(λ)を求めるには、波長λの励起光を生成したときに対照光検出器３４に到達する迷光の強度ｓ(λ)を求めることが必要である。この強度ｓ(λ)は、例えば次のようにして求められる。まず、第一の回折格子２２を励起波長λに対応する方向へ向けた状態で光源１１を点灯する。そして、ビームスプリッタ３１から対照光検出器３４へ至る光路上に、波長λの光を遮断する一方、他の波長の光を通過させるような光学フィルタを配設する。このような条件下で対照光検出器３４により検出される光は、光源１１の点灯により発生する迷光のみであるから、その出力信号強度は迷光強度ｓ(λ)とみなすことができるのである。このように、データを得ようとする各励起波長λ毎に迷光強度ｓ(λ)を測定することにより、変換テーブル６５のデータが得られる。
【００１７】
上記のような変換テーブル６５の作成を容易にするため、本実施例の蛍光分光光度計１には、ビームスプリッタ３１から対照光検出器３４へ至る光路上に光学フィルタ３５を配置している。この光学フィルタ３５はモータ３６により駆動されるアーム３７の先端に取り付けられており、モータ３６を適宜駆動することにより、上記光路上へ光学フィルタ３５を配置したりそこから退避させることができる。光学フィルタ３５は、光を遮断しようとする波長に応じて適宜交換することができるようにすることが好ましいが、迷光が問題となる程に励起光量が低下する波長領域が比較的狭い場合は、その波長領域の光を遮断する一方、他の波長領域の光を通過させるような光学フィルタ３５をアーム３７の先端に固定してもよい。このようにすると、測定の度毎に変換テーブル６５のデータを容易に更新することができる。
【００１８】
変換テーブルの別の形態について図３を参照しながら説明する。図３の変換テーブル７０のデータは励起波長λと迷光強度ｓ(λ)との関係を示すものである。この変換テーブル７０の特徴は、光源１１の発光がない波長領域（例えば、キセノンランプであれば１８５ｎｍより短い波長領域）で予め定められた波長（以下、基準波長とよぶ）λ10に対応する迷光強度ｓ(λ10)のデータを含んでいることである。励起波長λと迷光強度ｓ(λ)との関係を示すデータは、例えば装置の組み立て時に予め実測により（又は、光学系の設計に基づいて理論的に）求めておき、データ記憶部６４に保存しておく。実測による場合は、図１の変換テーブル６５の作成に関して説明したように光学フィルタを用いればよい。このような変換テーブル７０を予め作成しておけば、実際の測定時に、以下のような手順で各励起波長λに対応する迷光比率β(λ)を算出することができる。
【００１９】
まず、基準波長λ10に対応する方向に第一の回折格子２２を向けた状態で光源１１を点灯する。このとき、理論的には波長λ10の励起光が生成されるはずであるが、先に述べたように波長λ10においては光源１１の発光がないため、実際には励起光は生成されない。しかし、光源１１の点灯により迷光は発生しており、対照光検出器３４はこの迷光を受けて信号を出力する。この信号の強度Ｒ(λ10)は波長λ10に対応する迷光強度ｓ(λ10)に相当する。そして、変換テーブル７０に予め保存された迷光強度ｓ10を実測で得られた上記迷光強度ｓ(λ10)に一致させるような補正演算を、変換テーブル７０の全ての迷光強度に対して行えば、各励起波長λに対応する迷光強度ｓ(λ)が得られる。こうして得られた迷光強度ｓ(λ)から、上記式（１）により迷光比率β(λ)が求められる。こうして各励起波長λに対応する迷光比率β(λ)を求めれば、後は先に説明したように式（２）〜式（４）を用いた演算を行うことができる。
【００２０】
なお、図３の変換テーブル７０を用いる上記方法は、励起波長λに対応する迷光強度ｓ(λ)を演算で求めるものであるため、光学フィルタ３５は必要ではない。
【００２１】
本発明に係る蛍光分光光度計の実施例は上記に限られるものではない。例えば、図１の蛍光分光光度計１では、ビームスプリッタ３１により励起光から取り出された光を対照光としたが、このように対照光を取り出すことは本発明にとって必須ではない。例えば、従来の蛍光分光光度計の中には、図１の破線Ｂ１で示したような位置にレンズ及び蛍光検出器を配置したものもあるが、このような蛍光分光光度計にも本発明は適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施例である蛍光分光光度計の概略的構成を示す図。
【図２】  上記蛍光分光光度計の制御系の概略的構成を示すブロック図。
【図３】  変換テーブルの別の形態を示す図。
【符号の説明】
１０…光源部
２０…励起分光部
２２…回折格子
３４…対照光検出器
３５…光学フィルタ
４１…試料セル
５０…蛍光分光部
５２…回折格子
５４…蛍光検出器
６０…制御系
６１…中央制御部
６２…操作部
６３…データ処理部
６４…データ記憶部
６５、７０…変換テーブル
【図１】
0003921889.tif 000002
【図２】
0003921889.tif 000003
【図３】
0003921889.tif 000004