(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物中の遺伝子の発現を抑制またはダウンレギュレートするための経口投与用医薬組成物であって、該遺伝子または該遺伝子転写物の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチドを 含んでなり、その際、該オリゴヌクレオチドは非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有し、かつ少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを含み、および一つの２'−置換リボヌクレオチドを３'末端に有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドがさらに少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを５'末端に含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチド中のすべてのリボヌクレオチドが２'−置換リボヌクレオチドである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該２'−置換リボヌクレオチドが２'−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドである請求項１ないし３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含む請求項１、２ または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨ活性を活性化しうる少なくとも４つの隣接デオキシリボヌクレオチドの領域を含む請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルよりなる群から選ばれた１または２以上のインターヌクレオチド結合を含む請求項１ないし６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
本質的にすべてのヌクレオチドがホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
該オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項１ないし８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
すべてのヌクレオチドがホスホロチオエート結合により連結されている請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該オリゴヌクレオチドがさらに少なくとも２つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該オリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドの各末端に少なくとも一つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該オリゴヌクレオチドが、ウイルス、病原生物、または細胞の遺伝子または遺伝子転写物の部分配列に相補的である請求項１ないし１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該オリゴヌクレオチドが、ＡＩＤＳ、口のヘルペス、生殖器のヘルペス、乳頭腫のゆうぜい、インフルエンザ、口蹄疫、黄熱、水痘、帯状疱疹、成人Ｔ細胞白血病、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌腫および肝炎よりなる群から選ばれた疾患に関与するウイルスの遺伝子または遺伝子転写物の部分配列に相補的である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが、アルツハイマー病に関連するタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子転写物の部分配列に相補的である請求項１ないし１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該オリゴヌクレオチドが、アメーバ症、シャガス病、トキソプラズマ症、ニューモサイトーシス、ランブル鞭毛虫症、隠足症、トリコモナス症、マラリア、回虫症、フィラリア症、旋毛虫症および住血吸虫症感染よりなる群から選ばれた寄生虫疾患を引き起こす寄生虫中のタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子転写物の部分配列に相補的である請求項１ないし１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該オリゴヌクレオチドがＨＩＶの遺伝子または遺伝子転写物の部分配列に相補的であり、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結された約１５〜２６ヌクレオチドを含み、３'末端にあるこれらヌクレオチドの少なくとも一つが２'−置換リボヌクレオチドであ る請求項１、２または９に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳動物中の遺伝子の発現を抑制またはダウンレギュレートするための経口投与用医薬の製造のための請求項１ないし１７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、遺伝子発現の制御に関する。さらに詳しくは、本発明は動物中で遺伝子の発現をダウンレギュレート（down-regulate）するための合成オリゴヌクレオチドの使用に関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド治療法の開発の可能性は、最初、１９７７年および１９７８年に発行された３つの論文で示唆された。パターソン（Ｐaterson）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. （ＵＳＡ）（１９７７）７４：４３７０〜４３７４）は、セルフリーのｍＲＮＡ翻訳が該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの結合によって抑制されうることを開示している。ザメクニク（Ｚamecnik）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９７８）７５：２８０〜２８４および２８５〜２８８）は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ゲノムの一部に相補的な１３ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドが感染ニワトリ線維芽細胞中でのＲＳＶの複製を抑制し、初代ニワトリ線維芽細胞の悪性肉腫細胞へのＲＳＶ媒体トランスフォーメーションを抑制することを開示している。
合成オリゴヌクレオチドがウイルスの増殖および腫瘍形成を抑制するのに使用しうるというこれら初期の指摘に続いて、ＨＩＶ（たとえば、米国特許第４,８０６,４６３号参照）、インフルエンザ（たとえば、ライター（Ｌeiter）ら（１９９０）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. （ＵＳＡ）８７：３４３０〜３４３４参照）、水泡性口内炎ウイルス（たとえば、アグリス（Ａgris）ら（１９８６）Ｂiochem.２５：６２６８〜６２７５参照）、単純ヘルペス（たとえば、ガオ（Ｇao）ら（１９９０）Ａntimicrob.Ａgents Chem.３４：８０８〜８１２参照）、ＳＶ４０（たとえば、バーグ（Ｂirg）ら（１９９０）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１８：２９０１〜２９０８参照）およびヒトパピローマウイルス（たとえば、ストレイ（Ｓtorey）ら（１９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：４１０９〜４１１４参照）などの広範囲のウイルスを抑制するための合成オリゴヌクレオチドの使用が示されている。近年、抗ウイルス剤としての合成オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの使用はアグラワル（Ａgrawal）によって詳しく検討されている（Ｔrends in Ｂiotech.（１９９２）１０：１５２〜１５８）。
さらに、種々の非ウイルス性の病原体を抑制するため、並びにある種の細胞遺伝子の発現を選択的に抑制するために合成オリゴヌクレオチドが使用されている。それゆえ、ウイルスの増殖、非ウイルス性の病原体の増殖および細胞遺伝子の選択的発現を抑制する試薬としての合成オリゴヌクレオチドの有用性は充分に確立されている。
このようなウイルス、病原体および選択的な遺伝子発現の抑制においてより効果的な改良されたオリゴヌクレオチドがもっと最近になって開発されている。インターヌクレオチド結合に修飾を有するこれらオリゴヌクレオチドの幾つかは、非修飾の対応物に比べて一層効果的であることが示されている。たとえば、アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９８８）８５：７０７９〜７０８３）は、ホスホジエステル結合した通常のオリゴデオキシヌクレオチドに比べてオリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよびある種のオリゴヌクレオチドホスホルアミデートがＨＩＶ−１を抑制するうえで一層効果的であることを教示している。アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９８９）８６：７７９０〜７７９４）は、初期および臨床的に感染した細胞においてＨＩＶ−１を抑制するうえでオリゴヌクレオチドホスホロチオエートが有利であることを開示している。
さらに、オリゴヌクレオチド内に１を越えるタイプのインターヌクレオチド結合を有するキメラオリゴヌクレオチドが開発されている。ペダーソン（Ｐederson）ら（米国特許第５,１４９,７９７号および同第５,２２０,００７号）は、ヌクレオチドメチルホスホネートまたはホスホルアミデートによってフランキングされたオリゴヌクレオチドホスホジエステルまたはオリゴヌクレオチドホスホロチオエートコア配列を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。ファードン（Ｆurdon）ら（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９８９）１７：９１９３〜９２０４）は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートかまたはメチルホスホネート領域に加えてオリゴヌクレオチドホスホジエステルの領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。カーチン（Ｑuartin）ら（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９８９）１７：７５２３〜７５６２）は、オリゴヌクレオチドホスホジエステルおよびオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。イノウエ（Ｉnoue）ら（ＦＥＢＳ Ｌett.（１９８７）２１５：２３７〜２５０）は、デオキシリボヌクレオチドおよび２'−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドの領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。
これら修飾オリゴヌクレオチドの多くはアンチセンスオリゴヌクレオチド治療法の潜在的な効能を改善するのに貢献してきている。しかしながら、これら公知のオリゴヌクレオチドにはある種の欠点が依然として存在し、これら欠点はこれらオリゴヌクレオチドの治療剤としての有効性を制限しうる。たとえば、ウィックストローム（Ｗickstrom）（Ｊ.Ｂiochem.Ｂiophys.Ｍeth.（１９８６）１３：９７〜１０２）は、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルがヌクレアーゼにより媒体された分解を受けやすく、それゆえインビボでの生体利用性が制限されることを教示している。アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９０）８７：１４０１〜１４０５）は、オリゴヌクレオチドホスホルアミデートまたはメチルホスホネートはＲＮＡにハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨを活性化しないことを教示しているが、このＲＮアーゼＨの活性化はアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能にとって重要である。それゆえ、治療学的特性が改善されたオリゴヌクレオチドを使用した遺伝子発現の制御方法に対する必要性が存在する。
潜在的なＡＩＤＳ治療剤としてのホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチドの開発に関して幾つかの報告が刊行されている。オリゴヌクレオチドの化学的および分子的なメカニズムに関する広範な研究はこの治療戦略の潜在的な価値を示してはいるものの、これら化合物のインビボでの薬動力学および代謝については殆どわかっていない。
最近、このトピックに関して予備的な研究が刊行された。アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９１）８８：７５９５〜７５９９）は、２０−ｍｅｒのホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチドのマウスへの静脈内および腹腔内投与を記載している。この研究では、投与した投与量の約３０％が最初の２４時間に尿中に排泄され、主として肝臓および腎臓に蓄積した。血漿半減期はそれぞれ約１時間（ｔ1/2α）から４０時間（ｔ1/2β）の範囲であった。同様の結果はその後の研究においても報告されている（イバーセン（Ｉversen）（１９９１）Ａnti−Ｃancer Ｄrug Ｄesign６：５３１〜５３８；イバーセン（１９９４）Ａntisense Ｒes. Ｄevel.４：４３〜５２；およびサンズ（Ｓands）（１９９４）Ｍol.Ｐharm.４５：９３２〜９４３）。しかしながら、オリゴヌクレオチドを静脈内および腹腔内投与した場合に安定性の問題がある。
それゆえ、治療すべき動物および条件およびターゲティングすべき遺伝子に適合させるべく容易に操作できる、遺伝子の発現をダウンレギュレートするための一層有効な治療法を開発する必要性が依然として存在する。好ましくは、これら方法は、遺伝子をターゲティングするうえで簡単で痛みがなく正確でなければならない。
発明の要約
本発明は、動物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を提供するものであり、該方法は該遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを経口で投与することを含み、それによって静脈内や他のインビボ投与法の形態において経験される合併症（complications）が回避される。
ある種のオリゴヌクレオチド（ホスホジエステル以外の結合を有し、少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを有する）は動物に経口投与した後にインビボで比較的安定であり、これら分子が胃腸管から有効に吸収され種々の生体組織に分布することがわかった。この発見を活用して、動物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法である本発明を開発した。
この方法はまた、動物における種々の遺伝子（動物の成長に必須の遺伝子を含む）の機能を調べる手段でもある。現在のところ、遺伝子の機能はマウスなどの「ノックアウト」動物を作製するという骨の折れる仕事によってのみ調べることができる。この仕事は困難であり、時間を要し、しかも「ノックアウト」が致死的な表現型を生じるために動物の成長に必須の遺伝子については行うことができない。本発明は、このモデルの欠点を克服するものである。
本発明の方法において、標的遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を薬理学的に許容しうる担体中にて該遺伝子を有する動物に経口で投与する。該オリゴヌクレオチドは該遺伝子の発現を抑制し、それによってその発現をダウンレギュレートする。
本発明の目的のためには「動物」なる語は、ヒト並びに他の哺乳動物、並びに爬虫類、両生類および昆虫を包含する。「経口投与」なる語は、食物摂取による口を介した、または食道を含む胃腸管系の他の部分を介した調合物の提供をいう。
本明細書において「オリゴヌクレオチド」なる語は、５'→３'インターヌクレオチド結合により連結された２またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのポリマー（アンチセンス技術の分野で知られた結合を含んでいてよい）を含むことを意味する。そのような分子は３'末端および５'末端を有する。投与する特定のオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを含み、非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合により連結されている。
本発明の目的のためには、「２'−置換オリゴヌクレオチド」なる語は、その２'位にてヒドロキシル基以外の化学基に結合した糖を有するオリゴヌクレオチドをいう。リボース分子の２'−ＯＨは、炭素数１〜６の−Ｏ−低級アルキル、アリールまたは置換アリールまたは炭素数２〜６のアリル、たとえば２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アリール、２'−Ｏ−アルキル（２'−Ｏ−メチルなど）、２'−ハロ、または２'−アミノなどで置換されていてよいが、２'−Ｈで置換されていてはならず、その際、アリル、アリールまたはアルキル基は置換されていなくてもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。
本明細書において用いる「非ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチド」なる語は、そのヌクレオチドのすべてが合成結合、すなわち一方のヌクレオチドの５'端と他方のヌクレオチドの３'端との間のホスホジエステル以外の結合であって５'ヌクレオチドリン酸が化学基で置換されているものを介して共有結合しているオリゴヌクレオチドである。好ましい合成結合としては、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルが挙げられる。本発明の一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドがホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエートを介して結合している。
本発明の幾つかの態様において、投与すべきオリゴヌクレオチドは修飾されている。本明細書において用いる「修飾オリゴヌクレオチド」なる語は、天然に認められるもの以外の修飾された核酸、塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する。たとえば、３',５'−置換オリゴヌクレオチドは、その３'および５'位の両方においてヒドロキシル基以外の化学基（その３'位において）またはリン酸基以外の化学基（その５'位において）に結合した糖を有するオリゴヌクレオチドである。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、ジアミン、コレステリルまたは他の親油性基またはキャッピング種などの置換基が付加したものであってもよい。さらに、該分子中のヌクレオチド当たり一つの非架橋性の酸素に置換を有する酸化されていないまたは部分的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまた修飾オリゴヌクレオチドと考えられる。また、その３'および／または５'端にヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基を有するオリゴヌクレオチドも修飾オリゴヌクレオチドと考えられるし、および／またはヒトの介入なしにはインビボで認められない種々の他の構造的修飾もまた本明細書において修飾されたものと考えられる。
本発明の一つの好ましい態様において、投与すべきオリゴヌクレオチドはその３'末端に少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを含む。ある態様においては、５'末端の４または５のヌクレオチド以外のすべてが２'−置換されたリボヌクレオチドであり、ある態様においてはこれら４または５の非置換５'ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。他の側面において、オリゴヌクレオチドは３'および５'末端の両方に少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを有し、さらに他の態様においてオリゴヌクレオチドは内部のいずれかの位置にある少なくとも４または５の隣接デオキシリボヌクレオチドを除くすべての位置に含まれる２'−置換リボヌクレオチドからなる。本発明の他の側面は、すべて２'−置換されたリボヌクレオチドであるヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの投与を含む。特定の態様は２'−Ｏ−メチルなどの２'−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の他の態様において、投与するオリゴヌクレオチドは少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを有し、好ましい態様においてオリゴヌクレオチドはＲＮアーゼＨを活性化しうる少なくとも４または５の隣接したデオキシリボヌクレオチドを有する。
本発明の幾つかの態様において、投与するオリゴヌクレオチドはウイルス遺伝子、病原生物遺伝子または細胞遺伝子に相補的である。幾つかの態様においてオリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、口または生殖器ヘルペス、乳頭腫のゆうぜい、インフルエンザ、口蹄疫、黄熱、水痘、帯状疱疹、成人Ｔ細胞白血病、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌腫または肝炎に関与するウイルスの遺伝子に相補的である。一っの特定の態様において、オリゴヌクレオチドはＨＩＶの遺伝子に相補的であり、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結された約１５〜２６のヌクレオチド（該ヌクレオチドの３'末端のヌクレオチドの少なくとも一つは２'−置換されたリボヌクレオチドである）および少なくとも４の隣接するデオキシリボヌクレオチドを含む。
他の態様において、オリゴヌクレオチドはアルツハイマー病に関連するタンパク質をコードする遺伝子に相補的である。
さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、アメーバ症、シャガス病、トキソプラズマ症、ニューモサイトーシス（pneumocytosis）、ランブル鞭毛虫症、隠足症（cryptoporidiosis）、トリコモナス症、マラリア、回虫症、フィラリア症、旋毛虫症または住血吸虫症感染などの寄生虫疾患を引き起こす病原体中で発現されるタンパク質をコードする遺伝子に相補的である。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、並びに本発明そのものは、添付の図面とともに以下の記載を読んだときに一層完全に理解される。該図面において：
図１は、放射性標識した修飾ＰＳ−オリゴヌクレオチド１を経口投与した後の該オリゴヌクレオチドの肝臓、腎臓および血漿中での経時変化を示すグラフである；
図２Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラムである；
図２Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１２時間後に採取した血漿試料から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；
図３Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラムである；
図３Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与６時間後のラット肝臓から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；
図３Ｃは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与２４時間後のラット肝臓から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；
図４は、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後のラットの排泄尿中の放射能の経時変化を示すグラフである；
図５Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラムである；
図５Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与６時間後にラット尿から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；
図５Ｃは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１２時間後にラット尿から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；
図６は、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後のラットの胃腸管中および糞便中の放射能の経時変化を示すグラフである；
図７は、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１時間、３時間および６時間後にラット胃から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである；および
図８は、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与３時間、６時間および１２時間後にラット大腸から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである。
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中に引用する特許および科学文献は当業者に利用可能な知識を確立するものである。発行された米国特許、許された特許出願、およびそれらに引用された文献は参照のため本明細書中に引用する。
本発明は、標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを経口投与することによる、動物中の遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を提供する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、標的一本鎖核酸分子にワトソン−クリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成に従って結合することができ、かかる結合によって幾つかのメカニズムのうちの一つにより該標的の機能を妨害することが知られている。すなわち、正常な転写、スプライシングまたは翻訳に必要な因子の結合を妨害することによって、該オリゴヌクレオチド中にデオキシリボヌクレオチドの隣接領域が存在する場合にはＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの酵素的分解を誘起することによって、および／または該アンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合した反応性の基を介して標的を破壊することによって。
それゆえ、上記特性のため、かかるオリゴヌクレオチドは本発明の方法に従って動物における特定の遺伝子の発現を制御ないしダウンレギュレートする能力によって治療学的に有用である。
本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレオチドであるが、好ましくは６〜５０ヌクレオチドの長さであり、１５〜３０ｍｅｒが最も一般的である。該オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなり、一方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端とが非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合により共有結合されている。そのような結合としては、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネートおよびリン酸トリエステルが挙げられる。これら結合を有するオリゴヌクレオチドの調製はホスホルアミデートやＨ−ホスホネート化学などの公知の方法に従って行うことができ、これら方法はブラウン（Ｂrown）によって記載されているように（Ａ Ｂrief Ｈistory of Ｏligonucleotide Ｓynthesis. Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs, Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９９４）２０：１〜８）手動または自動合成機により行うことができる。（また、たとえば、ソンボー（Ｓonveaux）「オリゴヌクレオチド合成における保護基」、アグラワル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology２６：１〜７２；ウールマン（Ｕhlmann）ら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８３をも参照）。
組成物のオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸へハイブリダイズする能力を損なうことなく幾つかの方法で修飾できる。そのような修飾は、たとえば、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端の修飾を含み、アミノ基と末端リボース、デオキシリボースとの間の種々の数の炭素残基を有するコレステリルやジアミン化合物などのインターヌクレオシドリン酸結合の該分子への付加、および開裂するまたは反対鎖または関連酵素またはウイルスゲノムに結合する他のタンパク質に架橋するリン酸修飾を含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、修飾した塩基および／または糖（リボースの代わりのアラビノースなど）を有するオリゴヌクレオチド、またはその３'位および５'位の両方においてヒドロキシル基以外の化学基（その３'位にて）およびリン酸基以外の化学基（その５'位にて）に結合した糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。他の修飾オリゴヌクレオチドは、その３'および／または５'末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非架橋性の酸素に置換を有する。そのような修飾は、インターヌクレオシド結合の幾つかまたはすべてにおいて、並びにオリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両末端において、および／または該分子の内部にあってよい。かかる修飾オリゴヌクレオチドの調製については、たとえば、アグラワル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology２６；ウールマンら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８３を参照。
自己安定化されたオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法に有用な修飾オリゴヌクレオチドであると考えられる（タング（Ｔang）ら（１９９３）Ｎucleic Ａcids Ｒes.２０：２７２９〜２７３５）。これらオリゴヌクレオチドは２つの領域：標的ハイブリダイズ領域；および該自己安定化されたオリゴヌクレオチドの内部の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的領域を含む。
これら非修飾および修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知られている（アグラワルら（１９９２）Ｔrends.Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８において概説されている）（たとえば、ウールマンら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８４；および（１９８７）Ｔetrahedron Ｌett.２８：（３１）：３５３９〜３５４２；アグラワル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology２０：６３〜８０を参照）。
これらオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルなどの非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有することによってさらに安定性が付加される。特に有用なオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている。
動物に投与するオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよび少なくとも一つの２'置換されたリボヌクレオチドの両方を含有するという点でハイブリッドオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の目的のためには、「２'−置換された」なる語は、たとえば、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アルキル、２'−ハロゲン、または２'−アミノなどによるリボース分子の２'−ＯＨの置換を意味するが、２'−Ｈの置換であってはならず、その際、アリル、アリールまたはアルキル基は置換されていなくてもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。
本発明の方法において有用なハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはヌクレオチド分解に抵抗し、ＲＮＡまたはＤＮＡと安定な二本鎖を形成し、好ましくはＲＮＡとハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨを活性化する。これらオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの非置換のリボヌクレオチドをさらに含んでいてよい。たとえば、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３'末端における一つの２'置換されたリボヌクレオチドを例外としてすべてデオキシリボヌクレオチドを含んでいてよい。
別の態様では、オリゴヌクレオチドはその３'末端および５'末端の両方において少なくとも一つの置換リボヌクレオチドを有していてよい。
本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドの一つの好ましいクラスは、ＲＮアーゼＨの活性化セグメントを提供すべく隣接ブロック中に４またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。ある場合には、１を越えるそのような活性化セグメントがオリゴヌクレオチド内のいずれかの位置に存在するであろう。本発明によるオリゴヌクレオチドでデオキシリボヌクレオチドが過半数を占めていてよい。実際、そのようなオリゴヌクレオチドは１以外のすべてとなる程多くのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであってよい。それゆえ、好ましいオリゴヌクレオチドは約２〜約５０のヌクレオチドを有し、最も好ましくは約１２〜約２５のヌクレオチドを有するので、その中で存在するデオキシリボヌクレオチドの数は１〜約２４の範囲である。他の有用なオリゴヌクレオチドは２'−置換されたリボヌクレオチドのみからなる。
表１は、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドの幾つかの代表的な分子種を示す。２'−置換ヌクレオチドには、下線を引いてある。
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オリゴヌクレオチド中の２'置換リボヌクレオチドは、リボースの２'位に炭素数１〜６の−Ｏ−低級アルキル、アリールまたは置換アリールまたは炭素数２〜６のアリル、たとえば、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アリール、２'−Ｏ−アルキル、２'−Ｏ−ハロゲン、または２'−アミノを含んでいてよいが、２'−Ｈで置換されていてはならず、その際、アリル、アリールまたはアルキル基は置換されていなくてもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。有用な置換リボヌクレオチドは２'−Ｏ−メチルなどの２'−Ｏ−アルキルである。
好ましくは、本発明によるオリゴヌクレオチドは長さが約２〜約５０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが約１５〜約２５ヌクレオチドであろう。それゆえ、この好ましい場合において、本発明によるオリゴヌクレオチドは１４〜２４の非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有するであろう。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原生物中での種々の遺伝子の発現の抑制、または細胞遺伝子の発現の抑制において有効である。そのような因子を抑制する能力は、種々の疾患状態の治療にとって明らかに重要である。それゆえ、本発明の方法によるオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原生物または細胞遺伝子からの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは長さが約６〜約５０ヌクレオチドである。
本発明の目的のためには、「核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列」なる語は、生理的条件下で、たとえばワトソン−クリック型の塩基対形成（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間の相互作用）によりまたはフーグスティーン型の塩基対形成（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸との間の相互作用）によりまたはＲＮＡへのオリゴヌクレオチド結合の場合における偽結び目形成（pseudoknotformation）を含む他のいずれかの手段により標的核酸配列に結合するオリゴヌクレオチド配列を意味する。生理的条件下での（ワトソンクリック型塩基対形成による）そのような結合は、実際問題として該核酸配列の機能に対する妨害を観察することにより測定される。
本発明によるオリゴヌクレオチドが相補的である核酸配列は、ダウンレギュレートしようとする遺伝子に応じて変わるであろう。幾つかの場合には標的遺伝子または核酸配列はウイルス核酸配列であろう。種々のウイルスを抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用はよく知られている（アグラワル（１９９２）Ｔrends in Ｂiotech.１０：１５２〜１５８において概説されている）。有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なウイルス核酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（米国特許第４,８０６,４６３号）、単純ヘルペスウイルス（米国特許第４,６８９,３２０号）、インフルエンザウイルス（米国特許第５,１９４,４２８号）、およびヒトパピローマウイルス（ストレイら（１９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：４１０９〜４１１４）を含む多くのウイルスについて記載されている。これら核酸配列のいずれかに相補的な配列は本発明によるオリゴヌクレオチドに用いることができ、他のいずれかのウイルスからの核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列も同様に用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製できる既知の核酸配列を有する他のウイルスとしては、これらに限られるものではないが、口蹄疫ウイルス（ロバートソン（Ｒobertson）ら（１９８５）Ｊ.Ｖirol.５４：６５１；ハリス（Ｈarris）ら（１９８０）Ｖirol.３６：６５９参照）、黄熱ウイルス（ライス（Ｒice）ら（１９８５）Ｓcience２２９：７２６参照）、水痘帯状疱疹（vericella-zoster）ウイルス（デービソン（Ｄavison）およびスコット（Ｓcott）（１９８６）Ｊ.Ｇen.Ｖirol.６７：２２７９参照）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、およびキュウリモザイク病ウイルス（リチャーズ（Ｒichards）ら（１９７８）Ｖirol.８９：３９５参照）が挙げられる。
たとえば、ＨＩＶ−１遺伝子の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを設計したが、これは有意の抗ＨＩＶ作用を有する（アグラワル（１９９２）Ａntisense Ｒes.Ｄevelopment２：２６１〜２６６）。このオリゴヌクレオチドの標的は種々のＨＩＶ−１単離物の間で保存されていることがわかった。それは５６％Ｇ＋Ｃに富み、水溶性で、生理学的条件下で比較的安定であった。このオリゴヌクレオチドは生理学的条件下で相補的なＲＮＡ標的に結合し、その場合、得られた二本鎖のＴは約５６℃であった。このオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性を、急性および慢性に感染させたＣＥＭ細胞、インビボ条件を模倣した長期培養、ヒト末梢血リンパ球およびマクロファージ、およびＨＩＶ−１感染患者からの単離物を含む幾つかのモデルで試験した（リスツィーウィッツ（Ｌisziewicz）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９２）８９：１１２０９〜１１２１３）；リスツィーウィッツら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９３）９０：３８６０〜３８６４）；リスツィーウィッツら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９４）９１：７９４２〜７９４６）；アグラワルら（Ｊ.Ｔher.Ｂiotech）印刷中）。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、別の態様として病原生物の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有していてよい。マラリア生物、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐlasmodium falciparum）、および多くの病原細菌を含む多くの病原生物の核酸配列が記載されている。このような病原生物のいずれかに由来する核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は本発明によるオリゴヌクレオチドにおいて用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製できる既知の核酸配列を有する病原真核生物の例としては、トリパノソーム・アブルセイ・ガンビエンセ（Trypanosom abrucei gambiense）およびレイシュマニア（Ｌeishmania）（キャンプベル（Ｃampbell）ら、Ｎature３１１：３５０（１９８４）参照）、ファシオラ・ヘパチカ（Ｆasciola hepatica）（ズリタ（Ｚurita）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：２３４０（１９８７）参照）が挙げられる。
抗真菌オリゴヌクレオチドは、たとえばキチンシンテターゼ遺伝子からの核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する標的ハイブリダイズ領域を用いて調製でき、抗菌オリゴヌクレオチドは、たとえばアラニンラセマーゼ遺伝子を用いて調製できる。本発明による処置方法により処置しうる真菌疾患としては、カンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、スポロトリクム症、クロモセス症、皮膚糸状菌症、およびコクシジオイデス症が挙げられる。本発明の方法はまたリケッチア疾患（たとえば、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱）、並びにクラミジア・トリコマチス（Ｃhlamydia trachomatis）やリンホグラニュローマ・ベネレウム（Ｌymphogranuloma venereum）により引き起こされる異性間接触伝播疾患を処置するために用いることができる。アメーバ症、シャガス病、トキソプラズマ症、ニューモサイトーシス、ランブル鞭毛虫症、隠足症、トリコモナス症およびニューモシスチス・カリニ肺炎を含む種々の寄生虫疾患は本発明による方法により処置することができ、回虫症、糸状虫症、旋毛虫症、住血吸虫症、および線虫または条虫感染などの虫（蠕虫）疾患もまた処置できる。マラリアは、それがプラスモジウム・ファルシプ・アルム（Ｐ.falcip arum）、プラスモジウム・ビバス（Ｐ.vivas）、プラスモジウム・オラレ（Ｐ.orale）またはプラスモジウム・マラリア（Ｐ.malariae）により引き起こされたかに拘わらず、本発明の処置方法により処置できる。
上記で示した感染疾患はすべて本発明による処置方法により処置できる。なぜなら、これら疾患の感染因子は知られており、それゆえ該感染因子の増殖に必須の核酸配列、たとえば必須遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する本発明によるオリゴヌクレオチドを調製できるからである。
本発明による方法により処置できる他の疾患状態は、細胞遺伝子の異常な発現または産物によるものである。これら状態は本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することにより処置でき、この点は本明細書ですでに検討した。
本発明による他のオリゴヌクレオチドは、その異常な発現または産物が疾患状態となる細胞遺伝子または遺伝子転写物に相補的なヌクレオチド配列を有していてよい。そのような幾つかの細胞遺伝子の核酸配列が記載されているが、それにはプリオンタンパク質（スタール（Ｓtahl）ら（１９９１）ＦＡＳＥＢ Ｊ.５：２７９９〜２８０７）、アルツハイマー病に関連するアミロイド様タンパク質（米国特許第５,０１５,５７０号）、およびｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、およびｎ−ｒａｓなどの種々のよく知られた癌遺伝子が含まれる。さらに、精子形成、精子の運動性、精子の卵への結合または精子の生存力に影響を及ぼす他の段階に主としてまたは唯一関与する構造タンパク質または酵素の合成を抑制するオリゴヌクレオチドは避妊薬として用いることができる。同様に、女性の避妊薬は、排卵、受精、着床に関与する、またはこれらプロセスに関与するホルモンの生合成に関与するタンパク質または酵素を抑制するオリゴヌクレオチドである。
高血圧は、レニン／アンジオテンシン系においてアンジオテンシン変換酵素または関連酵素の合成をダウンレギュレートするオリゴヌクレオチドにより制御できる。心筋や脳の循環疾患、梗塞、動脈硬化、塞栓症および血栓症に使用するため、トロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制することにより血小板凝集を制御できる。動脈壁中のコレステロールの沈着は、動脈硬化において脂肪酸補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼの合成を抑制することにより抑制できる。コリンホスホトランスフェラーゼ合成の抑制は高脂血症において有用である。
ハイブリダイゼーション阻止（arrest）を疾患の有害作用を減少または除去するために用いることのできる多くの神経性疾患が存在する。たとえば、モノアミンオキシダーゼ合成の抑制はパーキンソン病に用いることができる。カテコールｏ−メチルトランスフェラーゼの抑制は鬱病の治療に用いることができ、インドールＮ−メチルトランスフェラーゼの抑制は精神分裂病の治療に用いることができる。
プロスタグランジンやロイコトリエンの合成に導くアラキドン酸カスケードにおいて選択した酵素の抑制は、血小板凝集、アレルギー、炎症、疼痛および喘息のコントロールに有用である。
多剤耐性（ｍｄｒ−１）遺伝子（種々の抗癌剤に対する腫瘍の耐性が生じる原因であり、化学療法の主たる障害となっている）により発現されるタンパク質の抑制は、癌の治療において有益であることが判明している。これら遺伝子のいずれかに由来する核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は本発明によるオリゴヌクレオチドとして用いることができ、その異常な発現または産物が疾患状態となる他の細胞遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチド配列も同様に用いることができる。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、ウイルス感染、病原生物による感染、または異常な遺伝子発現もしくは異常な遺伝子産物の発現に由来する疾患を処置するのに有効な治療医薬組成物の形態で動物被験者に経口または経小腸にて投与する。本発明による方法の幾つかの側面において、オリゴヌクレオチドをたとえばＡＩＤＳの場合にはＡＺＴなどの他の治療薬とともに投与する。
本発明のオリゴヌクレオチドを含有する治療医薬組成物は生理学的に許容しうる担体、たとえば不活性な希釈剤または該ペプチドを一緒に投与する資化しうる可食性の担体を含む。注射以外の経路により血流中に化合物を導入するための薬理学的に許容しうる賦形剤を含む適当な組成物は、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences（第１８版）（ジェナロ（Ｇenarro）編（１９９０）マック・パブリッシング（Ｍack Ｐublishing Ｃo.）、イーストン、ペンシルベニア）に記載されている。オリゴヌクレオチドおよび他の成分は、ハードまたはソフトゼラチンカプセル中に封入し、打錠し、または個体の食事の中に直接混入させることができる。オリゴヌクレオチドは賦形剤とともに配合でき、可食（ingestible）錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、水剤などの剤型にて用いることができる。オリゴヌクレオチドを経口にて投与する場合には、オリゴヌクレオチドを他の食料形態（food forms）および薬理学的に許容しうる香味促進剤と混合する。オリゴヌクレオチドを経小腸にて投与する場合には、オリゴヌクレオチドを固体、半固体、懸濁液または乳濁液の形態に配合し、多くのよく知られた薬理学的に許容しうる添加剤と混練する。除放性の経口デリバリーシステムおよび／または経口投与剤型のための腸溶コーティング、たとえば米国特許第４,７０４,２９５号、同第４,５５６,５５２号、同第４,３０９,４０４号および同第４,３０９,４０６号に記載されているものもまた本発明に包含される。
そのような治療学的に有用な組成物中のオリゴヌクレオチドの量は、適当な投与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または製剤は、経口の単位剤型が動物の体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約２００ｍｇ含有するように調製し、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇ含有するのが最も好ましい。
各剤型の個々の投与量中に含まれる活性成分の単位含量は、それ自体、有効量を構成する必要はないことが認識されるであろう。なぜなら、必要な有効量は複数の投与量単位（カプセル剤や錠剤またはその組み合わせなど）を投与することによって達成しうるからである。
本発明の方法により投与したオリゴヌクレオチドが生体組織に吸収されるか否かを決定するため、またもしも吸収されるのであればどの組織で吸収されるのかを決定するため、以下の研究を行った。種々の生体組織の試料を、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後の増加時間における放射能について分析した。図１は、放射性標識オリゴヌクレオチドの経口投与後のオリゴヌクレオチド等価物の血漿、肝臓および腎臓における経時濃度を示す。これら結果は、該薬剤が胃腸管で吸収され、腎臓および肝臓に蓄積することを示している。
血漿中の放射能の化学的形態をＨＰＬＣによりさらに調べたところ、経口投与１２時間後に完全なオリゴヌクレオチド（Ａ）と代謝物（Ｂ）との両者の存在が示された（図２Ｂ）。完全なオリゴヌクレオチドはまた、投与６時間後（図３Ｂ）および１２時間後（図３Ｃ）に肝臓で検出された。脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、大腸、骨格筋、精巣、甲状腺、表皮および骨髄中での放射能は、放射性標識オリゴヌクレオチドの経口投与４８時間後に検出できた。
オリゴヌクレオチドの吸収を支持する他の証拠は、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後の尿試料の分析から得られた。図４は、放射性標識オリゴヌクレオチドの投与４８時間後の尿中に累積排泄された放射性標識オリゴヌクレオチド量を示す。オリゴヌクレオチドが時間の経過に伴って尿中に排泄され続けていることは、他の組織がオリゴヌクレオチドを吸収したこと、および生体が長期にわたって吸収しえたことを示唆している。図５Ｂおよび５Ｃは、尿中の放射能の大部分は分解産物として存在したけれども、完全なオリゴヌクレオチドもまた検出されたことを示しており、このオリゴヌクレオチドが完全な形で吸収されることを示している。
経口投与後のオリゴヌクレオチドの生体利用性のレベルを決定するため、胃腸管（胃および腸）および糞便中のオリゴヌクレオチドレベルを測定した。図６は、投与したオリゴヌクレオチドの約８０％が残留するかまたは糞便中に排泄されたことを示しており、投与したオリゴヌクレオチドの２０％が吸収されたことを示している。このオリゴヌクレオチドは胃中で安定であり、経口投与６時間後に胃内容物中に有意の分解産物は検出されなかった（図７）。大腸の内容物中の投与オリゴヌクレオチドの大部分もまた完全な化合物として存在した（図８）。
それゆえ、本発明の方法を用いることにより、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの首尾よい吸収が達成され、生体中を広く分布した。完全なオリゴヌクレオチドは血漿および種々の組織中で検出され、尿中に排泄された。これら結果は、経口投与が治療剤としてのオリゴヌクレオチドの送達の強力な手段であることを示している。
以下の実施例は本発明を製造および実施するための好ましい態様を示すが、本発明の範囲を限定するものではない。なぜなら、同様の結果を得るために別法を利用できるからである。
実施例
１．オリゴヌクレオチドの合成および分析
配列番号１の配列を有し、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド３'および５'配列および内部のデオキシリボヌクレオチドを含有するハイブリッド２５−ｍｅｒホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドを以下のようにして合成、精製、および分析した。
非修飾ホスホロチオエートデオキシヌクレオシドを、米国特許第５,１４９,７９８号に記載されたＨ−ホスホネート法を用い、自動合成機（モデル８７００、ミリポア（Ｍillipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ）にて５〜６μモルスケールでＣＰＧ上で合成した。デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートはミリポア（ベッドフォード、マサチューセッツ）から入手した。２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドＨ−ホスホネートまたはホスホロチオエートは、標準法で合成するか（たとえば、Ｍeth.Ｍol.Ｂiol.（１９９３）Ｖolume２０中の「オリゴヌクレオチドおよびアナログのためのプロトコール」を参照）、または市販されているものを用いた（たとえば、グレン・リサーチ（Ｇlenn Ｒesearch）、スターリング、バージニア、およびクローンテック（Ｃlontech）、パロアルト、カリフォルニアからのもの）。２'−Ｏ−メチルヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドのセグメントを、所望のサイクルにて２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドＨ−ホスホネートまたはホスホロチオエートを用いることにより組み立てた。同様に、デオキシリボヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドのセグメントを、所望のサイクルにてデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートを用いることにより組み立てた。組み立て後、ＣＰＧに結合したオリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートを硫黄で酸化してホスホロチオエート結合を生成させた。ついで、オリゴヌクレオチドを濃ＮＨ4ＯＨ中、４０℃にて４８時間脱保護した。
粗製のオリゴヌクレオチド（約５００Ａ260単位）をＣ18逆相媒体上の逆相低圧クロマトグラフィーにより分析した。ＤＭＴ基を８０％酢酸水溶液で処理することにより除去し、ついでオリゴヌクレオチドを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。
２．オリゴヌクレオチドの放射性標識
35Ｓ−標識したオリゴヌクレオチドを得るため、２段階で合成を行った。配列番号１の３'末端から最初の１９ヌクレオチドをβ−シアノエチルホスホルアミダイト法（ボーケージ（Ｂeaucage）、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs（アグラワルら編）、ヒューマナ・プレス（Ｈumana Ｐress）（１９９３）、３３〜６１頁を参照）を用いて組み立てた。残りの６ヌクレオチドをＨ−ホスホネート法（フローラー（Ｆroehler）、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs（アグラワルら編）、ヒューマナ・プレス（１９９３）、６３〜８０頁を参照）を用いて組み立てた。５つのＨ−ホスホネート結合を含むコントロールドポアガラス（ＣＰＧ）支持体に結合したオリゴヌクレオチド（ＣＰＧを３０ｍｇ；約１μＭ）を、６０ｍｌの二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中で35Ｓ8（４ｍＣｉ、１Ｃｉ／ｍｇ、アマーシャム；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）で酸化した。この酸化反応は時々振盪しながら室温で１時間行った。ついで、同溶媒混合物中の５％非放射性硫黄（32Ｓ8）の２μｌ、５μｌ、および２００μｌを３０分毎に加えて酸化を完了した。溶液を除去し、ＣＰＧ支持体を二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）（３×５００μｌ）およびアセトニトリル（３×７００μｌ）で洗浄した。得られた生成物を濃水酸化アンモニウム中で脱保護し（５５℃、１４時間）、蒸発させた。得られた生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（７Ｍ尿素を含有する２０％ポリアクリルアミド）により精製した。所望のバンドをＵＶ投影下で切り出し、ＰＳ−オリゴヌクレオチドをゲルから抽出し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（ウオーターズ（Ｗaters））およびセファデックスＧ−１５カラムで脱塩した。収量は２０Ａ260単位（６００μｇ；比活性、１μＣｉ／μｇ）であった。
３．動物および処置
雄のスプラーグードーリーラット（１００〜１２０ｇ、ハーラン・ラボラトリーズ（Ｈarlan Ｌaboratories）、インディアナポリス、インディアナ）を本研究に用いた。試験１週間前に被験動物に市販の食餌および任意量の水を与えた。
動物にガバージュにて５０ｍｇ／ｋｇの投与量を投与した。非標識および35Ｓ標識したオリゴヌクレオチドを２５ｍｇ／ｍｌの濃度にて生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）に溶解した。投与量は前処理体重に基づき、最近似の０.０１ｍｌに丸めた。投与後、各被験動物を代謝ケージ中に入れ、市販の食餌および任意量の水を与えた。排尿された全尿を回収し、ついで各代謝ケージを回収期間の後に洗浄した。各被験動物から排泄された糞便を種々の時点ですべて回収し、放射能量を定量する前に糞便試料をホモジナイズした。被験動物からの血液試料をヘパリン処理管にて種々の時点で回収した。血漿を遠心分離により分離した。ペントバルビタールナトリウムでの麻酔下、被験動物を放血によって安楽死させた。安楽死後、各被験動物から組織を回収した。すべての組織／器官の外側に付着している脂肪または結合組織を切り取り、他の器に移し、すべての内容物を清浄にし、個々の重さを計り、その重さを記録した。
４．全放射能の測定
組織および体液中の全放射能の測定を液体シンチレーションスペクトル分析（ＬＳ６０００ＴＡ、ペックマン（Ｂeckman）、アービン、カリフォルニア）により行った。簡単に説明すると、生物学的流体（血漿、５０〜１００μｌ；尿、５０〜１００μｌ）を６ｍｌのシンチレーション溶媒（バジェット−ソルブ（Ｂudget−Ｓolve）、ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合して全放射能を測定した。糞便を破砕し、重さを計り、ついで９倍の容量の０.９％ＮａＣｌ食塩水中でホモジナイズした。このホモジネートのアリコート（１００μｌ）を可溶化剤（ＴＳ−２、ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合し、ついでシンチレーション溶媒（６ｍｌ）と混合して全放射能の定量が行えるようにした。
組織を除いた後、直ちにファットマンＮｏ.１濾紙上にプロットし、重さを計ったのち、０.９％ＮａＣｌ食塩水中でホモジナイズした（湿重量１グラム当たり３〜５ｍｌ）。得られたホモジネート（１００μｌ）を可溶化剤（ＴＳ−２、ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合し、ついでシンチレーション溶媒（６ｍｌ）と混合して全放射能を測定した。各組織試料に加えた０.９％ＮａＣｌ食塩水の量を記録した。ホモジナイズした組織／器官をさらに分析のために使用するまで≦−７０℃で凍結保存した。
５．ＨＰＬＣ分析
尿中の放射能の分析を、本質的にサンズらにより記載された方法（Ｍol.Ｐharm.（１９９４）４５：９３２〜９４３）の変法を用い、イオン対（paired-ion）ＨＰＬＣにより行った。尿試料を遠心分離し、分析の前に０.２−μｍアクロ（Ａcro）フィルター（ジェルマン（Ｇelman）、アンアーバー、ミシガン）に通した。血漿中のハイブリッドオリゴヌクレオチドおよび代謝物をＰＡＧＥの試料調製における上記方法を用いて抽出した。勾配を作るために４つ組ポンプを備えたヒューレットパッカード（Ｈewlet Ｐackard）１０５０ＨＰＬＣを用いたＨＰＬＣにおいてマイクロソープ（Ｍicrosorb）ＭＶ−Ｃ４カラム（レイニン・インスツルメンツ（Ｒainin Ｉnstruments）、ウォバーン、マサチューセッツ）を用いた。移動相は２つの緩衝液を含んでいた：緩衝液Ａは水中の５ｍＭ−Ａ試薬（ウオーターズ、ベッドフォード、マサチューセッツ）であり、緩衝液Ｂは４：１（ｖ／ｖ）アセトニトリル（フィッシャー（Ｆisher））／水であった。カラムを以下の勾配を用いて１.５ｍｌ／分の流速にて溶出した：（１）０〜４分、０％緩衝液Ｂ；（２）４〜１５分、０〜３５％緩衝液Ｂ；および（３）１５〜７０分、３５〜８０％緩衝液Ｂ。カラムを次の分析に移す前に少なくとも３０分間、緩衝液Ａで平衡化した。レディフラック（Ｒedi Ｆrac）フラクションコレクター（ファルマシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー（Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiotechnology)、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いることにより、１分フラクション（１.５ｍｌ）を７ｍｌシンチレーションバイアル中に回収し、５ｍｌのシンチレーション溶媒と混合して各フラクション中の放射能を測定した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ／ＲＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列
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【図１】
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【図４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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