(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を分子量が既知であるヒアルロン酸ナトリウムと共に紫外線照射する第１ステップと、第１ステップ後の前記ヒアルロン酸ナトリウムの分子量をクロマトグラフィーによって求める第２ステップと、前記紫外線照射前のヒアルロン酸ナトリウムの分子量に対する前記第２ステップにて得られた前記ヒアルロン酸ナトリウムの分子量の変化に基づいて前記被検物質の光毒性の評価を行う第３ステップと、からなることを特徴とする光毒性物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光毒性を持つ物質の評価方法に関し、さらに詳しくは高分子化合物の光分解反応により光毒性の評価を行う方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
太陽光によって皮膚に病的な反応を生じる場合を光過敏症と呼ぶが、この内最も頻度が高いものは、光毒性を有する化学物質や薬剤等によって引き起こされるものである。光毒性物質は植物、食品、医薬品、化粧品、香料、化学工業製品、除草剤、殺虫剤等に含まれている。
【０００３】
これらの光毒性を有する物質の評価方法は大別してin vivo testとin vitro test との２通りで行われている。in vivo testとしては、マウスやラット等の動物に薬剤を投与した後、紫外線照射を動物に行いその反応を調べる方法が知られている。
【０００４】
また、in vitro testとしては、培養細胞のニュートラルレッドの取り込み減少や、感作リンパ球の増殖反応、リノール酸の過酸化反応をみる方法等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来行われている方法には、次のような問題があった。動物や細胞を用いた評価方法は、使用する個体や細胞の間での反応のバラツキが多い。また、検査方法が複雑であったり、費用が掛かる。さらに、物質の評価方法に動物を用いることに対しては、動物愛護の点から代替方法が望まれている。
【０００６】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、光毒性の評価を簡便、安価にて行える光毒性の評価方法を提供することを技術課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、臨床経験上、抗精神剤として広範に利用されているクロルプロマジン（Chlorpromazine：ＣＰＺ）を長期間服用していた患者の硝子体が、著しく液化していることに気づいた。また、ＣＰＺはフルフェナジンやチオリダジン等の抗精神剤と同様に、光過敏症の副作用を有している光毒性を持つ物質であることが報告されている。これらのことから、光毒性物質と硝子体の構成成分であるヒアルロン酸ナトリウムの光分解反応との関連性に着目し検討した。
【０００８】
その結果、光毒性の評価を行いたい被検物質を高分子化合物と共に紫外線照射した後、前記高分子化合物の分解反応を測定することによって光毒性の評価を行うことができることを見出した。さらに詳しくは、高分子化合物が光分解によって低分子量化するため、分解反応によって生じた高分子化合物の分子量を測定することにより、光毒性の評価を行える。分子量の測定は、予め既知分子量の高分子化合物を用いてクロマトグラフィーにて検量線を作成しておくことで簡単に求めることができる。
【０００９】
また、この使用する高分子化合物は多糖類であるヒアルロン酸ナトリウムを使用することが好ましい。さらに、ヒアルロン酸ナトリウム以外にもカルボキシル基を持つ多糖類であるアルギン酸、ペクチン等でも使用することが可能である。さらにカルボキシル基を持たない多糖類でも、光増感反応により分解される多糖類であれば使用することが可能であると考えられる。例えばプルランやメチルセルロースはクロルプロマジンやプロマジン光増感反応により分解することが確認したので、このような多糖類を用いることも考えられる。
【００１０】
さらにまた、上記の光毒性物質の評価方法は、フェノチアジン骨格及びその類似構造を備えている物質を対象とすると特に優位に評価が行える。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を以下に説明する。
【００１２】
＜検量線作成＞
本発明の一実施形態では、光毒性の評価を行う被検物質を高分子化合物の一つであるヒアルロン酸ナトリウム（以下、ＮａＨＡと記す）と共に紫外線を照射し、所定時間後に光分解されたＮａＨＡの分子量を測定することにより、光毒性反応を引き起こす可能性の有無、強さの評価を行った。
【００１３】
事前準備として、分解されたＮａＨＡの分子量を求めるため、鶏冠より抽出生成した既知分子量のＮａＨＡ（1.89×104Da、10.8×104Da、46.0×104Da、63.7×104Da、84.7×104Da、99.3×104Da、141×104Da、213×104Da）を用いて、液体クロマトグラフにおける既知分子量毎のＮａＨＡの保持時間（Retention Time）を測定し、この測定結果を基にＮａＨＡの保持時間に対する検量線を作成した。（図１参照）
この検量線はｙ＝１３．２１−０．８８９９５ｘの式にフィットした（ここで、ｙはＮａＨＡの分子量の対数をとったもの、ｘはＮａＨＡの保持時間である）。また、後述する光分解反応後のＮａＨＡの分子量は、液体クロマトグラフから得られるＮａＨＡの保持時間を上述の式に入れることにより求めることができる。
【００１４】
＜光分解反応後の分子量の測定＞
次に被検物質とＮａＨＡとを混合し、紫外線を所定時間照射した後、その混合液を液体クロマトグラフにより分析し、ＮａＨＡの分解後の分子量を求める。
【００１５】
Pyrexガラス製の２０ｍＬ秤量瓶中、０．０２重量％のＮａＨＡ水溶液を約４×１０-5ｍｏｌ／Ｌの光毒性物質と共に、室温、空気下において４００Ｗ高圧水銀灯を２時間照射した。０分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の各所定光照射時間毎に光照射溶液から所定量だけ取出し、ShodexSB-806HQカラムを取り付けた液体クロマトグラフ（溶出液  ５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮＯ3水溶液、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＮａＨＡの光分解反応を追跡した。
【００１６】
光分解反応後のＮａＨＡの保持時間を液体クロマトグラフの分析結果より求め、求めた保持時間を前述した式に代入することにより、各所定時間毎のＮａＨＡの分子量を求める。さらに、紫外線照射前のＮａＨＡの分子量をＭ0とし、紫外線照射後のＮａＨＡの分子量をＭとして、高分子化学領域にて一般に知られている主鎖切断数（（M0／M）-1：Main Chain Scission Number）を求めた。
【００１７】
上述した方法にて得られた結果を基にして、横軸に紫外線の照射時間（Irradiation Time）、縦軸に照射時間における分子量の変化（主鎖切断数）を用いてプロットし、物質の光毒性の有無、強さを評価、判別した。
【００１８】
ＮａＨＡは単独で紫外線照射を受けても光分解はされ難いが、上述のように光毒性物質の存在下、ＮａＨＡに紫外線を照射することでＮａＨＡが光分解され易くなる。このときの光分解の速度やＮａＨＡの光分解後の分子量等を測定することにより、検査対象物質が光毒性を有するのか否かの判別が可能なため、従来の評価方法に比べ格段に容易に行うことができる。
【００１９】
＜実施例＞
従来より、フェノチアジン骨格を有する物質であり、その光毒性が知られているクロルプロマジン（Chlorpromazine：ＣＰＺ）使用して実験を行った。クロマトグラフ用の蒸留水２０ｍＬ中に、０．２８ｍｇのＣＰＺ（４×１０-5ｍｏｌ／Ｌ）と４ｍｇのＮａＨＡ（０．０２重量％）とを溶かし紫外線照射した。その後、各所定時間毎に１ｍＬ取り出し、液体クロマトグラフにてＮａＨＡの保持時間を測定した。得られた保持時間を前述したＮａＨＡの分子量を求める式に入れ、光分解された後のＮａＨＡの分子量を求めた。
【００２０】
次に紫外線照射前のＮａＨＡの分子量をＭ0とし、紫外線照射時の分子量をＭとして（Ｍ0／Ｍ）−１の式に入れ主鎖切断数を求め、主鎖切断数の経時変化をプロットした。
【００２１】
また、ＣＰＺと同様に光毒性が知られているフェノチアジン骨格を有する物質であるプロマジン（Promazine：ＰＺ）、チオリダジン（Thioridazine：ＴＲＺ）、フルフェナジン（Fluphenazine：ＦＰＺ）、プロメタジン（Promethazine：ＰＭＺ）についても同じ条件にて主鎖切断数を求めプロットした。
【００２２】
さらに、薬剤の添付文書中に副作用として光線過敏症の記載がない物質（光毒性がない物質）であり、フェノチアジン骨格に類似している物質であるカルピプラミン（Carpipramine：ＣＰＰ）、クロカプラミン（Clocapramine：ＣＣＰ）、イミプラミン（Imipramine：ＩＭＰ）、クロミプラミン（Clomipramine：ＣＭＰ）についても同じ条件にて同様の実験を行った。得られた結果を図２に示し、光毒性の作用の程度を相対的に評価した。
【００２３】
図２に示すように光毒性を示さないといわれている物質を被検物質として使用したときにはＮａＨＡの光分解による分子量の減少はあまりなく、活性度が低いことが判る。反対に光毒性を有する物質を被検物質として使用したときにはＮａＨＡの光分解を活性化させていることが判る。したがって、このように光分解反応をみる（ＮａＨＡの光分解後の分子量変化を測定する）ことで被検物質が光毒性を有するか否かが簡単に判別することができ、光毒性物質のスクリーニング方法や光毒性物質の毒性の程度を客観的に評価する方法として適用することができる。
【００２４】
以上、本実施形態ではＮａＨＡの分子量を求めることにより、被検物質の光毒性の評価を行ったが、例えば紫外線の照射前と照射後のＮａＨＡの粘度状態を粘度計にて比較する等、分子量を直接求めなくとも照射前と照射後のＮａＨＡの状態変化（分解反応）が判るような測定であれば光毒性の評価が可能である。
【００２５】
【発明の効果】
以上のように、本発明の光毒性物質の評価方法は、高分子化合物を検査対象物質と混合した後、紫外線を照射することによって高分子化合物が光分解される程度を測定することにより光毒性を評価するものである。したがって、マウス等の個体差のある試験よりも高い再現性を示すと共に、従来の評価方法に比べ簡便、安価にしてin vitroで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】分子量既知のＮａＨＡを用いて検量線を作成した図である
【図２】主鎖切断数の経時変化を示す図である。
【図１】
0003905262.tif 000002
【図２】
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