(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換体ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４により生産されるモノクローナル抗体ＫＭ２７６０により認識される、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープに特異的に結合し、かつＣＣＲ４発現細胞に対し細胞傷害活性を有し、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に対して特異的に反応する、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
細胞外領域が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である請求の範囲１記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
ＣＣＲ４発現細胞に特異的に反応する請求の範囲１または２に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
ＣＣＲ４発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す請求の範囲１記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項５】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性である請求の範囲１記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項６】
抗体依存性細胞傷害活性がＴｈ２細胞のアポトーシスを誘導することによるものである、請求の範囲５記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項７】
Ｔｈ２細胞を除去する作用を示す抗体である請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項８】
Ｔｈ２サイトカイン産生抑制活性を示す請求の範囲１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項９】
Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３である請求の範囲８記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
【請求項１０】
遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体から選ばれる請求の範囲１〜９のいずれかに記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求の範囲１０記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１２】
ヒト抗体ＩｇＧ型に属する請求の範囲１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１３】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求の範囲１０記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１４】
ヒト型キメラ抗体が、ＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域と、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とＬ鎖Ｃ領域からなる請求の範囲１１記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１５】
ヒト型キメラ抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求の範囲１１記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１６】
ヒト型キメラ抗体が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む請求の範囲１１記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１７】
ヒト型キメラ抗体が、形質転換体ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）が生産する、抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒトＩｇＧ１サブクラスである、抗体ＫＭ２７６０である請求の範囲１１記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＣ領域およびＶ領域フレームワーク領域からなる請求の範囲１１記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項１９】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求の範囲１８記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項２０】
請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
請求の範囲２０記載のＤＮＡとタンデム型ヒト化抗体発現用ベクターを含む組換えベクター。
【請求項２２】
請求の範囲２１記載の組換えベクターが宿主細胞に導入された形質転換体。
【請求項２３】
形質転換体がＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）である請求の範囲２２記載の形質転換体。
【請求項２４】
請求の範囲２２または２３記載の形質転換体を培養して培養液中に遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を生成・蓄積させ、該培養液から該抗体またはその抗体断片を回収する、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の製造方法。
【請求項２５】
ヒト抗体が、抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む請求の範囲１０記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項２６】
ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む請求の範囲２５記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項２７】
ヒト抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求の範囲２６記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項２８】
ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む請求の範囲２５記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項２９】
ヒト抗体が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む請求の範囲２８記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項３０】
ヒト抗体が、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体である請求の範囲２５〜２９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項３１】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである請求の範囲１〜９のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項３２】
抗体断片が、抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む請求の範囲３１記載の抗体断片。
【請求項３３】
抗体断片のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む請求の範囲３２記載の抗体断片。
【請求項３４】
抗体断片が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む請求の範囲３３記載の抗体断片。
【請求項３５】
抗体断片のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む請求の範囲３２記載の抗体断片。
【請求項３６】
抗体断片が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む請求の範囲３５記載の抗体断片。
【請求項３７】
請求の範囲１〜１９、２５〜３６のいずれか１項に記載された遺伝子組換え抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合している遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項３８】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を免疫学的に検出する方法。
【請求項３９】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出する方法。
【請求項４０】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞の減少または除去剤。
【請求項４１】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＴｈ２サイトカインの産生抑制剤。
【請求項４２】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とする医薬。
【請求項４３】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＴｈ２介在性免疫疾患の治療または診断剤。
【請求項４４】
請求の範囲１〜１９、２５〜３７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とする血液癌の治療剤。
【請求項４５】
血液癌が白血病である請求の範囲４４記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのＣＣケモカイン受容体４（以下、ＣＣＲ４と表記する）の細胞外領域に対して、特異的に反応する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片に関する。さらに、本発明は、細胞傷害活性、Ｔｈ２細胞によるサイトカイン産生抑制活性を示し、特定の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）を含むヒト化抗体、ヒト抗体等のＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片に関する。さらに、本発明は、上記の抗体をコードするＤＮＡに関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡを含むベクターおよび該ベクターにより形質転換された形質転換体に関する。さらに、本発明は、該形質転換体を用いた上記の抗体の製造方法、ならびに該抗体を用いるアレルギー性疾患を始めとするＴｈ２介在性免疫疾患の治療または診断剤等の医薬に関する。さらに、本発明は、該抗体を用いる白血病のような血液癌を始めとする癌疾患の治療または診断剤等の医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息を始めとするアレルギー疾患には好酸球や肥満細胞、ＩｇＥなど様々な因子が関与している。好酸球は炎症局所に浸潤し、脱顆粒によりＭＢＰ（ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等の細胞傷害性塩基性蛋白質を放出して周囲の組織傷害を誘発する。肥満細胞はＢ細胞から産生されたＩｇＥと抗原との免疫複合体と結合することでヒスタミンを放出し、即時型アレルギー反応を誘発する。これらをコントロールしているのはサイトカイン・ケモカイン等の生体機能分子であり、細胞間の情報伝達を担っている。好酸球はＩＬ−５によって分化誘導・寿命延長を受け、さらに脱顆粒が誘発される。ＩｇＥはＩＬ−４によって活性化されたＢ細胞から産生され、抗原との免疫複合体となり肥満細胞の脱顆粒を促す。また肥満細胞からもＩＬ−４、ＩＬ−１３などが産生され、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生に寄与することが判明しており、アレルギーの増強ループの存在が確認されている（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５２，２０５９（１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５，１９（１９９４））。このように炎症性細胞間には巧妙なサイトカイン・ケモカインネットワークが存在し、複雑にバランスを保っている。
【０００３】
これらサイトカイン・ケモカインを産生するのは、細胞表面にＣＤ４を発現しているヘルパーＴ細胞（以下、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞と表記する）である。実際に、気管支喘息患者の気道炎症局所にはヘルパーＴ細胞の浸潤が顕著に見られること、そのうちのかなりのＴ細胞は活性化していること、喘息の重症度や気道過敏性の程度と活性化Ｔ細胞数とが相関すること、さらに末梢血中にも活性化Ｔ細胞が増加していることなどが明らかにされている（Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４５，Ｓ２２（１９９２））。
ヘルパーＴ細胞は、産生されるサイトカインによってＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１４５（１９８９））。Ｔｈ２が産生するサイトカインとして、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などがあげられる。
【０００４】
アトピー性疾患患者より分離した抗原特異的Ｔ細胞クローンは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で刺激するとＴｈ２サイトカインを放出し（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ，，８８，４５３８（１９９１））、喘息患者の気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ：以下ＢＡＬと表記する）や気道粘膜にはＴｈ２細胞が存在することも判明している（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６，２９８（１９９２）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１４４５（１９９３））。アレルギー性炎症動物モデルでのＢＡＬ中細胞のｍＲＮＡ発現を調べると、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５が上昇している（Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，７５，７５（１９９５））。さらに、マウスに誘導したＴｈ２細胞を静脈内および鼻腔内に投与した場合、肺に抗原特異的な喘息様炎症症状が誘導され（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１７３７（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，１３７８（１９９８））、好酸球増多症を引き起こす（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１，３１２８（１９９８））。喘息患者の気道粘膜組織、アトピー性皮膚炎患者の病変部においてはＩＬ−５の発現が認められ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７，１５４１（１９９１）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，７７５（１９９１））、通年性鼻アレルギー患者粘膜のＩＬ−１３の発現強度と血清総ＩｇＥ値、抗原特異的ＩｇＥ値とはよく相関する（治療学，３２，１９（１９９８））。
【０００５】
ケモカインは、白血球遊走および白血球活性化作用を有する塩基性のヘパリン結合性蛋白質の総称であり、一次構造上で保存されたシステイン残基の位置によって、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃのサブファミリーに分類される。現在までに１６種類のケモカイン受容体が同定されており（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，６２６（１９９９））、また、各種ケモカイン受容体の発現は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞などの各白血球表面で異なることが示されている（細胞工学，１７．，１０２２（１９９８））。
【０００６】
ヒトＣＣＲ４は、ヒト未熟好塩基球細胞株ＫＵ−８１２からＫ５−５としてクローニングされた、Ｇ蛋白質共役型の７回膜貫通型受容体であり、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する。ＣＣＲ４の膜貫通領域は４０〜６７番目、７８〜９７番目、１１３〜１３３番目、１５１〜１７５番目、２０７〜２２６番目、２４３〜２７０番目、２８５〜３０８番目と推定されるので、細胞外領域は、アミノ酸配列１〜３９番目、９８〜１１２番目、１７６〜２０６番目、２７１〜２８４番目であり、細胞内領域は６８〜７７番目、１３４〜１５０番目、２２７〜２４２番目、３０９〜３６０番目であると推定される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１９４９５（１９９５））。クローニング当時はＣＣＲ４のリガンドがＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、またはＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であると報告されていた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１８，３３７（１９９６）、ＷＯ９６／２３０６８）。しかし、その後刺激したヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ（以下、ＰＢＭＣと表記する））や胸腺細胞から産生されるＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２１５１４（１９９６））がＣＣＲ４に特異的に結合することが判明した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５０３６（１９９７））。さらに、マクロファージから単離されたＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，１５９５（１９９７））、別名ＳＴＣＰ−１（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２５２２９（１９９７））がＴＡＲＣよりも強くＣＣＲ４に結合することも報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１７６４（１９９８））。
【０００７】
サイトカイン・ケモカイン産生能を持つＣＤ４＋Ｔｈ細胞にＣＣＲ４が発現していることが示され（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５０３６（１９９７））、さらにＣＤ４＋Ｔｈ細胞の中でもＴｈ２細胞に選択的に発現していることが報告された（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７，１２９（１９９８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１，５１１１（１９９８））。さらに、エフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋）集団中にＣＣＲ４＋細胞が確認され、ＣＣＲ４＋細胞を刺激するとＩＬ−４、ＩＬ−５を産生するがＩＦＮ−γは産生されない（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９））。またメモリーＴ細胞中のＣＬＡ（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）陽性、α４β８インテグリン陰性集団にＣＣＲ４＋細胞が属しており、ＣＣＲ４は腸管免疫ではなく皮膚などの全身性免疫に関わるメモリーＴ細胞に発現していることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６（１９９９））。以上のことから、炎症が誘発された場合に活性化を受けるメモリーＴ細胞はＣＣＲ４を発現し、そのリガンドであるＭＤＣやＴＡＲＣによって炎症局所に遊走して他の炎症性細胞の活性化を促す可能性が強く示唆される。
【０００８】
現在のＴｈ２介在性免疫疾患に対する治療法としては、(1)サイトカイン・ケモカインに対する拮抗剤／ヒト化抗ＩＬ−５抗体（ＳＢ−２４０５６３：スミス・クラインビーチャム社、Ｓｃｈ−５５７００（ＣＤＰ−８３５）：シェーリング・プラウ／セルテック社）、ヒト化抗ＩＬ−４抗体（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９１４，１１０）、可溶性ケモカイン受容体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，６２４（１９９８））など、(2)サイトカイン・ケモカイン産生抑制剤／ＩＬ−５産生阻害剤（特開平８−５３３５５）、レチノイドアンタゴニスト（ＷＯ９９／２４０２４）、トシル酸スプラタスト（ＩＰＤ−１１５１Ｔ、大鵬薬品工業社製）など、(3)好酸球や肥満細胞などの最終的な炎症性細胞を対象としたもの／ヒト化抗ＩＬ−５受容体抗体（ＷＯ９７／１０３５４）、ＣＣケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）拮抗剤（特開平１１−１４７８７２）など、(4)炎症性生体機能分子阻害剤／ヒト化抗ＩｇＥ抗体（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５７，１４２９（１９９８））など、が開発されているが、これらは複雑なサイトカイン・ケモカイン・炎症性細胞間のネットワークの一部を阻害するだけであり、根治的ではない。Ｔ細胞を制御するものとしては抗ＣＤ４抗体があり、重度のステロイド依存性喘息に効果をあげている。しかしＣＤ４分子は免疫担当細胞に広く発現しているため、特異性に欠け、かつ、強い免疫抑制作用を伴うという欠点を有する（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８，１３３（１９９９））。
【０００９】
このことから、これらすべてを抑制するためには、アレルギー反応の上流部、すなわちＴｈ２細胞の制御が必要となる。
現在の重度のＴｈ２介在性免疫疾患患者に対する主な治療法はステロイド投与であるが、ステロイドによる副作用を免れることは出来ない。また、ステロイド投与を中止した場合には、患者の病態はまた元に戻り、長期間のステロイド投与は耐性を獲得するなどの欠点を有する。
これまで、ＣＣＲ４を発現している細胞を検出でき、かつ、ＣＣＲ４発現細胞に対して細胞傷害性を有するモノクローナル抗体は確立されていない。さらに、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制する治療薬はこれまでに知られていない。
白血病においてもＣＣＲ４が発現していることが報告されているが（Ｂｌｏｏｄ，９６，６８５（２０００））、それら白血病細胞を傷害するような治療薬はこれまでに報告されていない。
【００１０】
一般にヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１２４２（１９８５））、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速め（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８））、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６））。
【００１１】
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１（１９８４））、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６））。これらのヒト化抗体は、マウス抗体等のヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４２２０（１９８９））。ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びたことが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，１３５２（１９９１））。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、特にＣＣＲ４発現細胞数を減少させる治療においては、抗体のＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）や抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）等の細胞傷害活性の高さがその治療効果に重要であるが、こうした細胞傷害活性に関しても、ヒトにおいてはヒト以外の動物の抗体のＦｃ領域よりも、ヒト抗体のＦｃ領域の方がヒト補体成分や、単核球、マクロファージ、豆細胞等の様なＦｃ受容体を細胞表面に有するヒトエフェクター細胞をより効率的に活性化できる為、より優れていることが報告されている。例えば、ＧＤ２に対するマウス抗体のＦｃ領域をヒト抗体のＦｃ領域に変換したヒト型キメラ抗体は、ヒトエフェクター細胞による腫瘍細胞傷害活性が上昇することが報告されており（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０））、また、ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体についても同様の結果が報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３（１９８８））。
【００１２】
以上の結果は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、ヒト化抗体の方がマウス抗体等のヒト以外の動物の抗体より望ましいことを明確に示している。
更に、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８））、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５））等の、より分子量の小さい抗体の断片の作製が可能となっている。これらの断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２））。これらの断片についても、ヒトへの臨床応用の場合には、マウス抗体等のヒト以外の動物の抗体よりもヒト化抗体に由来する方が、より望ましいと考えられる。
【００１３】
これまで述べてきたように、ヒト化抗体およびその断片は、単独の使用によっても診断および治療の効果が期待されるが、更に他の分子との併用により、その効果をより高めることが検討されている。例えば、それら分子の一つとしてサイトカインが用いられている。サイトカインは免疫反応における細胞間相互作用を司る種々の液性因子の総称である。抗体の細胞傷害活性には、ＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性等が知られているが、ＡＤＣＣ活性は、単核球、マクロファージ、ＮＫ細胞の様なＦｃ受容体を細胞表面に有するエフェクター細胞によって担われている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，１９９２（１９８７））。種々のサイトカインはこれらのエフェクター細胞を活性化することから、抗体のＡＤＣＣ活性等を高める目的で、抗体と組み合わせて投与することが行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
抗体は重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）および軽鎖（以下、Ｌ鎖と表記する）のＶ領域のＣＤＲを介して抗原に結合し、ＣＤＲのアミノ酸配列が抗体の結合反応性、結合特異性を規定している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３２，２１１（１９７０））。従って、特にＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有し、公知の抗ＣＣＲ４抗体とは異なる結合反応性、細胞傷害活性等を有するヒトＣＣＲ４に特異的に結合する抗ＣＣＲ４抗体が求められている。また、サイトカイン産生細胞であるＣＣＲ４発現Ｔｈ２細胞を選択的に除去できる抗体、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制する抗体、該抗体を用いる診断薬および治療薬が求められている。さらに、造血系細胞が腫瘍化した疾患である白血病等の血液癌を診断および治療するための有用な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＩｇＧ１クラスに属するＣＣＲ４に対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ２１６０より抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡを取得し、それらのＶ領域のＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有することを見出し、該新規ＣＤＲを有するＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域およびヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにクローニングしてヒト化抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０を発現、精製した。該抗体がヒトＣＣＲ４に特異的に反応し、かつ抗原陽性細胞株に対して強い細胞傷害活性を示すことでその細胞数の減少を証明し、該抗体のヒト生体内での使用における有用性を示し、本発明を完成させた。
さらに、本発明者らは、ＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体が白血病細胞、特にＴ細胞系白血病細胞に高率に反応し、かつＣＣＲ４陽性白血病細胞に対する強い細胞傷害活性を示すことでその細胞数の減少を証明し、該抗体のヒト白血病等の血液癌の診断、治療における有用性を示し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、以下の（１）〜（４６）に関する。
（１）  形質転換体ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４により生産されるモノクローナル抗体ＫＭ２７６０により認識されるエピトープに特異的に結合し、かつＣＣＲ４発現細胞に対し細胞傷害活性を有すし、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に対して、特異的に反応する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（２）  細胞外領域が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である上記（１）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（３）  配列番号１７で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープを認識する上記（１）または（２）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（４）  ＣＣＲ４発現細胞に特異的に反応する上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
細胞傷害活性としては、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性などがあげられる。
【００１７】
（５）  ＣＣＲ４発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す上記（１）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性とは、後述する遺伝子組換え抗体を作製する際に用いたＣＣＲ４に特異的に反応するヒト以外の動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも得られた遺伝子組換え抗体が有する細胞傷害活性のほうが高いことを意味する。
【００１８】
（６）  細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性である上記（１）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（７）  抗体依存性細胞傷害活性がＴｈ２細胞のアポトーシスを誘導することによるものである、上記（６）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（８）  Ｔｈ２細胞を除去する作用を示す抗体である上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（９）  Ｔｈ２サイトカイン産生抑制活性を示す上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（１０）  Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３である上記（９）記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（１１）  遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体から選ばれる上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の遺伝子組換え抗体。
（１２）  ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である上記（１１）記載の遺伝子組換え抗体。
（１３）  ヒト抗体ＩｇＧ型に属する上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体。
【００１９】
（１４）  ヒト化抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１１）記載の遺伝子組換え抗体。
（１５）  ヒト型キメラ抗体が、ＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域と、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とＬ鎖Ｃ領域からなる上記（１２）記載の遺伝子組換え抗体。
（１６）  ヒト型キメラ抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１５）記載の遺伝子組換え抗体。
（１７）  ヒト型キメラ抗体が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む上記（１２）記載の遺伝子組換え抗体。
【００２０】
（１８）  ヒト型キメラ抗体が、形質転換体ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）が生産する、抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒトＩｇＧ１サブクラスである、抗体ＫＭ２７６０である上記（１２）記載の遺伝子組換え抗体。
（１９）  ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＣ領域およびＶ領域フレームワーク領域からなる上記（１２）記載の遺伝子組換え抗体。
（２０）  ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１９）記載の遺伝子組換え抗体。
【００２１】
（２１）  上記（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２２）  上記（２１）記載のＤＮＡとタンデム型ヒト化抗体発現用ベクターを含む組換えベクター。
（２３）  上記（２２）記載の組換えベクターが宿主細胞に導入された形質転換体。
（２４）  形質転換体がＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）である上記（２３）記載の形質転換体。
（２５）  上記（２３）または（２４）記載の形質転換体を培養して培養液中に遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を生成・蓄積させ、該培養液から該抗体またはその抗体断片を回収する、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の製造方法。
【００２２】
（２６）  ヒト抗体が、抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む上記（１１）記載の遺伝子組換え抗体。
（２７）  ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む上記（２６）記載の遺伝子組換え抗体。
（２８）  ヒト抗体が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（２７）記載の遺伝子組換え抗体。
（２９）  ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む上記（２６）記載の遺伝子組換え抗体。
（３０）  ヒト抗体が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む上記（２９）記載の遺伝子組換え抗体。
（３１）  ヒト抗体が、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体である上記（２６）〜（３０）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体。
【００２３】
（３２）  抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（３３）  抗体断片が、抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）と抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む上記（３２）記載の抗体断片。
（３４）  抗体断片のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む上記（３３）記載の抗体断片。
（３５）  抗体断片が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（３４）記載の抗体断片。
【００２４】
（３６）  抗体断片のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、それぞれＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む上記（３３）記載の抗体断片。
（３７）  抗体断片が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む上記（３６）記載の抗体断片。
（３８）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３７）のいずれか１項に記載された遺伝子組換え抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合している遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【００２５】
（３９）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を免疫学的に検出する方法。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と検体を接触させることにより、検体中のＣＣＲ４を免疫学的に検出することができる。
（４０）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出する方法。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と細胞を接触させることにより、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出することができる。
（４１）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞の減少または除去剤。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の有効量をヒトまたは動物に投与することにより、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を減少または除去することができる。
（４２）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＴｈ２サイトカインの産生抑制剤。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の有効量をヒトまたは動物に投与することにより、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制することができる。
【００２６】
（４３）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とする医薬。
（４４）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とするＴｈ２介在性免疫疾患の治療または診断剤。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の有効量をヒトまたは動物に投与することにより、Ｔｈ２介在性免疫疾患を治療することができ、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と検体を接触させることにより、Ｔｈ２介在性免疫疾患を診断することができる。
（４５）  上記（１）〜（２０）、（２６）〜（３８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片を有効成分とする血液癌の治療剤。
例えば、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片の有効量をヒトまたは動物に投与することにより、血液癌を治療することができ、遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と検体を接触させることにより、血液癌を診断することができる。
（４６）  血液癌が白血病である上記（４５）記載の治療剤。
本発明のＴｈ２介在性免疫疾患としては、急性あるいは慢性の気道過敏性または気管支喘息、アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症などを包含する。
【００２７】
本発明の癌疾患としては、血液癌、特に白血病があげられる。
本発明における遺伝子組換え抗体およびその抗体断片（以下、本発明の抗体と表記する）は、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応すればいかなるものでもよい。好ましくは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６または２７１〜２８４番目を含む領域に特異的に反応する抗体があげられる。さらに好ましくは、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体、ならびに配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目からなるＨ鎖Ｖ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目からなるＬ鎖Ｖ領域を含む抗体があげられる。これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、且つＣＣＲ４と特異的に反応する抗体または抗体断片も本発明の範囲に包含される。
【００２８】
本発明のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
【００２９】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００３０】
具体的な本発明の抗体としては、以下に述べるヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片などがあげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨとも表記する）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬとも表記する）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも表記する）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも表記する）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＣＣＲ４に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００３１】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
抗ＣＣＲ４キメラ抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号１５で示されるアミノ酸配列の２０〜１３８番目のアミノ酸配列、ＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列を有し、抗体のＶＬが配列番号１６で示されるアミノ酸配列の２０〜１３２番目のアミノ酸配列、ＣＬがヒト抗体κクラスのアミノ酸配列を有する抗体ＫＭ２７６０があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
【００３２】
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【００３３】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００３４】
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、およびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００３５】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、ＣＣＲ４に特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＦａｂ’を発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００３６】
本発明のｓｃＦｖは、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明のＣＣＲ４に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００３７】
本発明のｄｓＦｖは、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００３８】
本発明の抗体は、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質または薬剤などを化学的にあるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体または抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質あるいは薬剤などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館（１９９４））により結合させることにより製造することができる。
または、ＣＣＲ４に特異的に反応する抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入する。以上のような遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
【００３９】
薬剤としては、低分子のものが好ましく、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社（１９９６））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２））などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００４０】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と表記する）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と表記する）等があげられる。また、癌細胞を直接傷害するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００４１】
以下に、ＣＣＲ４に特異的に反応し、かつＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域に新規のアミノ酸配列を有するヒト型キメラ抗体の作製方法を例に挙げて説明する。
１．ハイブリドーマ産生抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
ＣＣＲ４をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入してリコンビナントＣＣＲ４蛋白質を得る。あるいはＣＣＲ４を発現した培養腫瘍細胞もしくは該細胞より精製して得たＣＣＲ４蛋白質、あるいは、ＣＣＲ４部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃなど市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。即ち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
【００４２】
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１、Ｅｒｈａｒｄ  ＧｒｏｓｓおよびＪｏｈａｎｎｅｓ  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７９）、第２巻（１９８０）、第３巻（１９８１）；ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善（１９８５）；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、矢島治明監修、廣川書店（１９９１）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５、１６１（１９９０））。
【００４３】
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ社製（以下、ＡＢＩ社と表記する）ペプチド合成機、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ社製（以下、ＡＣＴ社と表記する）ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
【００４４】
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバ・バイオケム社（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１、Ｅｒｈａｒｄ  ＧｒｏｓｓおよびＪｏｈａｎｎｅｓ  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７９）、第２巻（１９８０）、第３巻（１９８１）；ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善（１９８５）；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、矢島治明監修、廣川書店（１９９１）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５、１６１（１９９０））。
【００４５】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例を説明する。
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記１（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。各投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたＣＣＲ４に対しての反応性について、酵素免疫測定法などで確認し（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、医学書院刊（１９７６））、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｈｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））に準じて脾臓を摘出し、脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
【００４６】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６））、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【００４７】
（４）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）などを用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地）にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００４８】
（５）ハイブリドーマ産生抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体の選択
抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）に述べられている方法などに従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体、該抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗ＣＣＲ４抗体あるいはすべての精製抗ＣＣＲ４抗体の結合活性を測定することができる。
酵素免疫測定法：
抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固層化する。ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマ株の具体例としては、ハイブリドーマ株ＫＭ２１６０があげられる。
【００４９】
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する）した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、上記１（４）で得られる抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０７〜５×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３タイプは、比較的強いＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性を有し、治療への応用上、有用である。
【００５０】
２．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
【００５１】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４））、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１））、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０））等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７））、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５））とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３））等があげられる。
【００５２】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプ或いは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ，１７，５５９（１９９８））等があげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【００５３】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖のＶ領域およびＬ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡは以下の様にして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００５４】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７））、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。
【００５５】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９））、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５））、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３））およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５））等が用いられる。
【００５６】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４））、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３））、ＮＭ５２２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３））、Ｋ８０２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６））およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５））等が用いられる。
【００５７】
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）によりＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【００５８】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）らのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７））等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００５９】
決定した塩基配列からＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））と比較することによって見出すことができる。
【００６０】
更にＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対してＢＬＡＳＴ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））等の配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
【００６１】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【００６２】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
【００６３】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【００６４】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１））。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域では、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９．，２６６（１９９１））。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７））或いはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４））等による抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【００６５】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記２（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。
【００６６】
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７））等があげられる。
【００６７】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（（ＥＬＩＳＡ法）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））等により測定できる。
【００６８】
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（特開平２−２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０））、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）等があげられる。
【００６９】
抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を製造するための宿主細胞としては、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる反応に関連する酵素活性の低いまたは当該酵素活性を有しない細胞を用いることが好ましい。具体的には、ＹＢ２／０細胞があげられる。
Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素としては、α１，６結合に関与する酵素、具体的にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコースの生合成に関係する酵素、具体的にはＧＤＰ−マンノース４，６−デハイドラターゼ、ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースピロフォスフォリラーゼ、フコキナーゼなどがあげられる。したがって、宿主細胞として用いる細胞の、これらの酵素の遺伝子を欠損させたり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を低下させるかあるいは欠失させたりなどの人為的変異を行うことにより得られた細胞を、宿主細胞として用いることもできる。
【００７０】
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の遺伝子組換え抗体を生産させることが可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、ＹＢ２／０細胞、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞などがあげられる。
当該宿主細胞を用いることにより、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖が、Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖含量が高い抗体を取得することができる。当該抗体は、ＣＣＲ４発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い抗体依存性細胞傷害活性を示す。
【００７１】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する：Ｓｉｇｍａ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＣＳ等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
【００７２】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））等で測定することができる。
【００７３】
（９）ヒト化抗体の活性評価
精製したヒト化抗体の抗原との結合活性、ＣＣＲ４発現細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価することができる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））。
【００７４】
３．抗ＣＣＲ４抗体を用いたＣＣＲ４の検出および定量法
本発明は、本発明の抗体を用いて、ＣＣＲ４またはＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および定量する方法に関する。
本発明の抗体を用いて、ＣＣＲ４、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法、東京化学同人（１９８６））などがあげられる。
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【００７５】
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、分離した、細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【００７６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明の抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体はプレートに吸着させ、もう一方の抗体はＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識した抗体を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【００７７】
４．Ｔｈ２介在性免疫疾患または癌疾患の診断及び治療
本発明のヒト化抗体は、培養細胞株に発現しているＣＣＲ４と特異的に結合し、かつＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性を示すため、Ｔｈ２介在性疾患等の診断、治療において有用であると考えられる。また、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において強い細胞傷害活性を示し、かつ免疫原性を示さず、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
また、本発明の抗体を、被験者の細胞あるいは組織に投与することにより、細胞が産生するＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等の産生を抑制することができる。
本発明に係るＴｈ２細胞としては、好ましくは、活性化Ｔｈ２細胞またはメモリーＴｈ２細胞などがあげられる。具体的には、ＣＤ４５ＲＡ−およびＣＤ４＋の性質を有する細胞があげられる。
【００７８】
本発明の遺伝子組換え抗体が有する細胞傷害活性は、Ｔｈ２細胞に本発明の抗体が結合し、当該細胞にアポトーシスを誘導することなどにより生ずる。また、アポトーシスを誘導することにより当該細胞に傷害を与え、除去することができる。
また、Ｔｈ２介在性免疫疾患または癌疾患の診断方法としては、被験者の細胞あるいは組織に存在するヒトＣＣＲ４陽性細胞を、上述した免疫学的に検出する方法があげられる。
また、本発明の抗体は、Ｔｈ２介在性免疫疾患または癌疾患、また異常なＴｈ２細胞の増加・減少により病態が進行する疾患の診断薬として用いることができる。
さらに、本発明の抗体はその細胞傷害活性によりヒトＣＣＲ４発現細胞を減少もしくは除去できるため、本発明の抗体を用いるＴｈ２介在性免疫疾患または癌疾患の診断方法あるいは治療方法、本発明の抗体を有効成分とする、Ｔｈ２介在性免疫疾患または癌疾患の治療薬および予防薬が提供される。
【００７９】
Ｔｈ２介在性免疫疾患とは、軽度・重度に関わらず、急性あるいは慢性の気道過敏性や気管支喘息、アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症などの炎症性疾患、Ｔｈ２細胞から放出されるサイトカイン・ケモカインによって増殖もしくは活性化し得る好酸球や肥満細胞などの炎症担当細胞、ならびにＴｈ２細胞から放出されるサイトカイン・ケモカインによって産生されるＩｇＥ等の生体機能分子に基づく疾患、また異常なＴｈ２細胞の変動により病態が進行する免疫疾患を示す。
本発明の抗体は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【００８０】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００８１】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体またはペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体またはペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体またはペプチドおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１回当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１
マウス抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の作製：
以下の手順に従い、マウス抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体、ＫＭ２１６０（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９））を産生するハイブリドーマ細胞を作製した。
（１）抗原の調製
ヒトＣＣＲ４（以下、ｈＣＣＲ４と記す）蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１７）をＧｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃを用いて解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端のなかから抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物１（配列番号１）を選択した。また、マウスＣＣＲ４（以下、ｍＣＣＲ４と記す）（ＢＢＲＣ，２１８，３３７（１９９６））蛋白質のアミノ酸配列中、化合物１に相当する部分を化合物２（配列番号２）として選択した。配列番号１および２は、それぞれヒトおよびマウスＣＣＲ４のＮ末端アミノ酸から２〜２９番目に相当する。
【００８３】
略号本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３８，９（１９８４））に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
【００８４】
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン
Ｖａｌ：Ｌ−バリン
【００８５】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
【００８６】
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎδ−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン
【００８７】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
【００８８】
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
【００８９】
(1)化合物１（配列番号１）（Ｈ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＯＨ）の合成
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、１６．８μｍｏｌが結合した担体樹脂（クロロトリチル樹脂、ＡｎａＳｐｅｃ社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所社製）の反応容器に入れ、１ｍｌのＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）を加えて１０分間攪拌し溶液を排出し、さらに１ｍｌのＤＭＦを加えて１分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
【００９０】
（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１６８μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１６８μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・１水和物（１６８μｍｏｌ）およびＮＭＭ（２５２μｍｏｌ）をＤＭＦ（５８８．２μｌ）中で５分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を６０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｂ）担体樹脂を７０７μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。
次に以下のＦｍｏｃ基脱保護工程を行った。
（ｃ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液７０７μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｄ）担体樹脂を７０７μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
こうして、Ｆｍｏｃ基を除去したＨ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の結合した担体樹脂を得た。
【００９１】
次に、（ａ）の工程でＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程、次いで（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を経て、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。以下、工程（ａ）において、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した。次に工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。引き続き、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した。次に工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。以降、工程（ａ）で、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）、（ｂ）の縮合反応工程を２度繰り返した後に（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行うという一連の操作を繰り返した後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）、１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で２時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、減圧下乾燥させて、粗ペプチドとして６３．７ｍｇを取得した。この粗生成物を６０ｍｇのＤＴＴ存在下２ｍｌのＤＭＦに溶解後、逆相カラム（資生堂社製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を２．５ｍｇ得た。
【００９２】
質量分析（ＦＡＢＭＳ）；ｍ／ｚ＝３２２７．５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  ４．８（５），Ｇｌｘ  ２．７（２），Ｓｅｒ  ３．１（３），Ｔｈｒ  ２．０（３），Ａｌａ  １．１（１），Ｐｒｏ  ３．１（３），Ｔｙｒ  ３．８（４），Ｌｅｕ  ２．２（２），Ｌｙｓ  １．２（１），Ｉｌｅ  ３．０（３），Ｃｙｓ  １．２（１）
【００９３】
(2)化合物２（配列番号２）（Ｈ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＯＨ）の合成
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、２８．０μｍｏｌが結合した担体樹脂（クロロトリチル樹脂、ＡｎａＳｐｅｃ社製）５０ｍｇを出発原料として、(1)と同様に、工程（ａ）において、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した。次に工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。続いて工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。引き続き、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した。次に工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。以降、工程（ａ）で、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）、（ｂ）の縮合反応工程を２度繰り返した後に（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行うという一連の操作を繰り返した後、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。(1)と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド９６．３ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物２を５．８ｍｇ得た。
【００９４】
質量分析（ＴＯＦＭＳ）；ｍ／ｚ＝３２９７．７（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  ４．１（４），Ｇｌｘ  ４．３（４），Ｓｅｒ  ２．０（２），Ｔｈｒ  ４．６（５），Ａｌａ  １．０（１），Ｐｒｏ  ２．２（２），Ｔｙｒ  ３．９（４），Ｖａｌ  １．９（２），Ｍｅｔ  １．０（１），Ｐｈｅ  １．０（１），Ｌｙｓ  １．１（１），Ｃｙｓ  １，１（１）
【００９５】
（２）免疫原の調製
実施例１の（１）で得られたｈＣＣＲ４部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＳ（ナカライテスク社）を滴下して３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢ  ２．５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析した。
【００９６】
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調整
実施例１の（２）で調製したペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇのコンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。最終投与後３日目のマウスより脾臓を摘出し、ＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で裁断し、ピンセットを用いて解した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、３ｍｌのトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除いた。更に、ＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞融合に供した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９７、以下、Ｐ３−Ｕ１と表記する）を培養し、細胞融合における親株として用いた。
【００９７】
（５）ハイブリドーマ細胞の作製
実施例１の（３）および（４）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１になる様に混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、沈殿した細胞群に３７℃の条件下でポリエチレングリコール溶液（２ｇのポリエチレングリコール−１０００、２ｍｌのＭＥＭ培地および０．７ｍｌのＤＭＳＯからなる溶液）を１０８個の脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、よく懸濁した。更に、１〜２分間毎にＭＥＭ培地を１〜２ｍｌずつ数回加え、最終的にＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌとした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、１００ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１０〜１４日間培養した。融合細胞の増殖が見られたウェルについて、培養上清中ｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物１）に対する結合活性を実施例２の２項（３）に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。活性の認められたウェルについては、培地をＨＴ培地に変えて１回、更に、培地を正常培地に変えて１回、の計２回の限界希釈法によるクローン化を行った。この様にして、マウス抗体ＫＭ２１６０を生産するハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０を得た。第１図に示すようにＫＭ２１６０はｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物１）に特異的に反応した。
【００９８】
実施例２
抗ＣＣＲ４キメラ抗体の作製１．抗ＣＣＲ４マウス抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析：
（１）抗ＣＣＲ４マウス抗体生産ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
実施例１に記載されたハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０よりｍＲＮＡを回収した。ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０の８×１０７細胞よりｍＲＮＡを約４８μｇ調製した。
【００９９】
（２）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
実施例２の１項（１）で取得したＫＭ２１６０のｍＲＮＡの５μｇから、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したｃＤＮＡを２０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκ型のＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ回収した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクター１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後の各々の反応液のうち２．５μｌをＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングした後、適当量を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５，３７６（１９８７））に感染させて、ＫＭ２１６０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして９．３×１０４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして７．４×１０４個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを、添付の使用説明書に従って、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に固定した。
【０１００】
（３）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
実施例２の１項（２）で作製したＫＭ２１６０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ（Ｈ鎖はマウスＣγ１ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２０４７（１９８４））、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡのＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７（１９８０））をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６を得た。
【０１０１】
（４）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４に含まれていたＨ鎖Ｖ領域の全塩基配列を配列番号３に、それから推定されたＨ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を配列番号１５に、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６に含まれていたＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を配列番号４に、それから推定されたＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。なお、配列番号１５および１６に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号３および４に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知のマウス抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））との比較および精製した抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号１５に示したアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号１６に示したアミノ酸配列の１から１９番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
【０１０２】
次に、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域のアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７））により検索した。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖のＶ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５、６および７に、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号８、９および１０にそれぞれ示した。
【０１０３】
２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の構築  ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１、κ型の抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４およびｐＫＭ２１６０Ｌ６を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を以下の様にして構築した。
ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって得るために配列番号１１と１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを、Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを得るために配列番号１３と１４に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでおり、ＤＮＡの合成はジェンセット社に委託した。実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４の２０ｎｇを５０μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号１１と１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行った。同様に、実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６の２０ｎｇを５０μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号１３と１４に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記の方法でＰＣＲ反応を行なった。該反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４６ｋｂのＨ鎖Ｖ領域ＰＣＲ産物、約０．４３ｋｂのＬ鎖Ｖ領域ＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
【０１０４】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μｌとし、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μｌ、制限酵素ＳｍａＩ０．３μｌを加えて２２℃で一晩反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０ＶＨ４１およびｐＫＭ２１６０ＶＬ６１を得た。
【０１０５】
次にヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と上記で得られたｐＫＭ２１６０ＶＨ４１の３μｇをそれぞれ３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００からなる緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＡＮＴＥＸ９３の約１２．７５ｋｂ、ｐＫＭ２１６０ＶＨ４１の約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡ各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片が挿入された第３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈを得た。
【０１０６】
次に上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＨとｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の３μｇを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡからなる緩衝液に加え全量を３０μｌとし、１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて５５℃で１時間反応させた後、更に制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈの約１３．２０ｋｂ、ｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の約０．４１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片が挿入された第４図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を得た。該プラスミドに関して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した結果、目的のＫＭ２１６０Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
【０１０７】
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
実施例２の２項（１）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で消化して直線状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））により導入後、４０ｍｌのＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）培地（ＦＣＳを５％添加）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌになる様に添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例２の２項（３）に示すＥＬＩＳＡ法（二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体を使用）により測定した。
【０１０８】
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例２の２項（３）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンをＫＭ２７６０と命名した。ＫＭ２７６０の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量は約５μｇ／１０６細胞／２４時間であった。また、ＫＭ２７６０の抗体Ｈ鎖Ｃ領域はヒトＩｇＧ１サブクラスである。なお、ＫＭ２７６０は平成１２年２月２４日付で、通商産業省  工業技術院生命工学工業技術研究所（現・経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４として国際寄託されている。
【０１０９】
（３）抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
アッセイ用の抗原には実施例１の（１）で得られたｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物１）をサイログロブリン（以下、ＴＨＹと表記する）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１の（２）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりに４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ、Ｓｉｇｍａ社）を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上述のように調製したコンジュゲートを１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、精製したマウス抗体または精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、マウス抗体を添加したウェルには１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体溶液（ＤＡＫＯ社製）を、ヒト型キメラ抗体を添加したウェルには１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
【０１１０】
（４）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の培養上清からの精製
実施例２の２項（２）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２７６０をＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に１〜２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約２００ｍｌよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０を精製し、約１．９ｍｇの精製蛋白質を取得した。得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の約３μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第５図に示した。第５図に示した様に、精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０は、非還元条件下は約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）であり、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの蛋白質の大きさは、ＫＭ２７６０のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：４９，２２６、Ｌ鎖：２４，１６８）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
【０１１１】
３．ｈＣＣＲ４高発現細胞の確立
（１）動物細胞用発現ベクターＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３の構築
動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）のプロモーター領域をサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）からＣＡＧ（ＡＧ（モディファイド  チキン  βアクチン）プロモーターウィズＣＭＶ−ＩＥエンハンサー）に変更した発現ベクター（ＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３）を作製し、ＣＣＲ４遺伝子を組み込むことで発現ベクターを以下のように構築した。
５μｇのｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＮｒｕＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させた後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。次に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させ、アガロースゲル電気泳動にて分画後、ＣＭＶプロモーター領域を含まない約５．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。３μｇのＣＡＧプロモーター（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５））領域を有するプラスミドＣＡＧ−ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）をＳａｌＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）にて平滑末端化し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで３７℃１時間反応してアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣＡＧプロモーター領域を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎし、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３を得た。
【０１１２】
（２）ｈＣＣＲ４発現ベクターの構築
実施例２の３項（１）で得られたＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３とｈＣＣＲ４  ＤＮＡの組込まれたｐｃＤＮＡ３（ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３）とを用いて以下のようにｈＣＣＲ４発現ベクターを構築した。ＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３、ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３共にＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１時間反応させ、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。次にＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させ、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣＡＧプロモーター領域を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片とｈＣＣＲ４遺伝子領域を含む約５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。以下、両ＤＮＡ断片を実施例２の３項（１）と同様の方法を用いて、プラスミドＣＡＧ−ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３を得た。
【０１１３】
（３）動物細胞におけるｈＣＣＲ４の発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、実施例２の２項（２）と同様にエレクトロポレーション法にて行った。ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９）をＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて１×１０７個／５００μｌに懸濁し、実施例２の３項（２）で得られたＣＡＧ−ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３を１０μｇ加えて氷中で１０分間放置した後、専用キュベット（バイオラッド社製）に入れ、２６０Ｖ、５００μＦＤで遺伝子導入を行った。さらに１０分間氷中にて放置した後、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地２００ｍｌに懸濁し、９６ウェル細胞培養用プレートに２００μｌ／ウェルづつ分注した。２４時間後に培養上清を１００μｌ／ウェル除去し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を１００μｌ／ウェルづつ分注し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとした。２週間後、数十株のシングルクローンを選択して拡大培養した。
【０１１４】
（４）ｈＣＣＲ４高発現細胞の選択
実施例１の（５）で作製されたＫＭ２１６０を用いて、蛍光抗体法で選択した。選択した数十株の遺伝子導入細胞各２×１０５個を９６ウェルＵ字プレートに分注した。公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊（１９８５））でビオチン標識したＫＭ２１６０をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）で５μｇ／ｍｌに、また非特異的な染色を防ぐために、ヒトＩｇＧ（ウェルファイド社製）を３．７５ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した抗体溶液を２００μｌ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。陰性対象としては、ビオチン化抗ＩＬ−５Ｒ抗体（ＷＯ９７／１０３５４）を同濃度で用いた。緩衝液にて２００μｌ／ウェルで２回洗浄後、ストレプトアビジン−ＰＥ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を２０μｌ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、最終的に５００μｌに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定し、最も強い蛍光強度の株を１種類選択した。
【０１１５】
実施例３
抗ＣＣＲ４キメラ抗体の機能解析：
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の活性評価
（１）抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトおよびマウスＣＣＲ４に対する反応性（ＥＬＩＳＡ法）
精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のヒトおよびマウスＣＣＲ４に対する反応性を実施例２の２項（３）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。抗原としては実施例１の（１）で得られたｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物１）およびｍＣＣＲ４部分ペプチド（化合物２）をＴＨＹとコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１の（２）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ（Ｓｉｇｍａ社）を用いた。第６図はＥＬＩＳＡ用のプレートの各ウェルに吸着させるＣＣＲ４ペプチドコンジュゲートの量を１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルに固定し、添加する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の濃度を変化させて反応性を検討した結果である。第６図に示したように、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０は、ｈＣＣＲ４部分ペプチドとｍＣＣＲ４部分ペプチドに対して、ほぼ同等の結合活性を有していた。この結果により、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０は、ヒトおよびマウスのＣＣＲ４のＮ末端アミノ酸から２〜２９番目に存在するエピトープを認識することが明らかになった。
【０１１６】
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｈＣＣＲ４高発現細胞との反応性（蛍光抗体法）
精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０と実施例２の３項（４）で作製したｈＣＣＲ４高発現細胞（以下、ＣＣＲ４／ＥＬ−４と表記する）との反応性は、実施例２の３項（４）と同様の方法で測定した。第７図に示した様に、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０はＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対して強い反応を示した。
【０１１７】
２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例２の２項（４）で得られた精製ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
実施例２の３項（４）で得られたｈＣＣＲ４高発現細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１×１０６細胞／０．５ｍｌとなる様に調製し、放射性物質であるクロム酸ナトリウム（Ｎａ２５１ＣｒＯ４）（第一化学薬品社製）を１．８５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
【０１１８】
（２）エフェクター細胞溶液の調製
ヘパリンナトリウム注射液（武田薬品社製）を２００単位（２００μｌ）入れた注射筒を用いて、健常人ヒト末梢血６０ｍｌを採取した。その全量を等量の生理食塩液（大塚製薬社製）にて２倍に希釈し、１２０ｍｌとした。１５ｍｌ容量の遠心管（住友ベークライト社製）１２本にリンフォプレップ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を５ｍｌずつ分注し、その上から希釈した末梢血を１０ｍｌずつ重層し、８００×ｇ、２０分間、室温で遠心分離した。血漿層とリンフォプレップ層の間にあるＰＢＭＣ画分をすべての遠心管より採取して１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）（以下、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩと表記する）に懸濁し、４００×ｇ、５分間、４℃で２回遠心洗浄して５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞とした。
【０１１９】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに実施例３の２項（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで実施例３の２項（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０１〜１０μｇ／ｍｌとなる様に加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、１ウェルあたり１００μｌの上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
【０１２０】
【数１】
0003926153.tif 000002
【０１２１】
その結果を第８図に示した。第８図に示した様に、抗ＣＣＲ４キメラ抗体は０．０１から１０μｇ／ｍｌの範囲で抗体濃度依存的に強い細胞傷害活性を示した。陰性対象として遺伝子非導入株であるＥＬ−４細胞のＡＤＣＣ活性を同様に測定したが、活性は確認されなかったため、この細胞傷害活性はＣＣＲ４特異的であることが示された。以上の結果は、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０が効率よくヒトのエフェクター細胞を活性化してＣＣＲ４を発現したＴｈ２細胞を減少もしくは除去でき、気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのヒトのＴｈ２介在性免疫疾患の診断もしくは治療に有用であることを示している。
【０１２２】
実施例４
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒト末梢血に及ぼす影響：
（１）ヒトＰＢＭＣに対するＡＤＣＣ活性の測定
実施例３の２項（２）と同様の方法でＰＢＭＣを分離し、最終的に１×１０７細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。実施例３の２項（３）で用いたＵ字プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、１×１０６細胞／ウェルとした。ＫＭ２７６０と陰性対照である抗ＩＬ−５受容体抗体ＫＭ８３９９（ＷＯ９７／１０３５４）を２０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、細胞を分注したウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２気流下、３７℃で２４時間培養後、細胞を回収した。細胞傷害性の検出はＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＥＧＦＰ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＢＬ社製）を用いて、アネキシンＶ陽性細胞を死細胞とした。４００×ｇ、３分間、４℃で遠心分離し、５×１０５細胞に対して２００μｌのキットに付属しているＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。その中に１μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＥＧＦＰ試薬を添加し、数回ピペッティング後、遮光して５分間反応させた。反応終了後、４００×ｇ、３分間、４℃で遠心分離し、上清を除いた。軽くボルテックスをかけてペレットを崩し、氷上にて冷却した２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むメタノールを１００μｌ添加し、４℃、１０分間静置した。８０００×ｇ、３０秒間で遠心分離し、上清を除去した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌにて懸濁し、遠心洗浄を２回行った。上清を除去したペレットにＰＣ５標識抗ＣＤ４抗体（ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を１０μｌ、ＰＥ標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を２０μｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＦＡＣＳ用緩衝液を２０μｌ添加し、４℃、３０分間反応させた。その後２．５ｍＭ  Ｃａｃｌ２を含むＦＡＣＳ用緩衝液で３回遠心洗浄し、フローサイトメーター（ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析した。まずＣＤ４とＣＤ４５ＲＡの染色性の違いにより細胞集団を４つに分画した（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＡ−）。次に各分画でのアネキシンＶ陽性率を測定し、細胞傷害％とした。その結果を第９図に示した。ＰＢＭＣはＫＭ２７６０と共培養した場合にのみ細胞傷害性が観察され、またその傷害性はＣＣＲ４陽性細胞の属するＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−分画に特異的に検出された。
【０１２３】
（２）ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生抑制効果
実施例３の２項（３）と同様にしてＰＢＭＣとＫＭ２７６０（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を２４時間共培養し、ＡＤＣＣ活性を誘導した。培養後、上清を１００μｌ除去し、代わりに１μｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール・ミリステート・アセテート）と２００ｎｇ／ｍｌのＡ２３１８７（カルシマイシン）（ＲＢＩ社製）を含んだ培地１００μｌを加え、最終濃度をＰＭＡが０．５μｇ／ｍｌ、Ａ２３１８７が１００ｎｇ／ｍｌとし、細胞を刺激してサイトカイン産生を誘導させた（条件(1)）。別の刺激条件として、Ａ２３１８７の代わりに抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８００１）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌでサイトカイン産生を誘導させた（条件(2)）。各刺激剤導入後、２４時間培養した後に培養上清を回収してサイトカイン測定キット（バイオソース社製）にてＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、インターフェロン（ＩＦＮ）−γを測定した。第１０図に示すように、ＫＭ２７６０添加群では著明にＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３の産生が抑制されたが、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは影響なかった。
【０１２４】
実施例５
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＴ細胞系白血病細胞株への反応性：
（１）膜表面上への結合性（蛍光抗体法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０と以下のヒトＴ細胞系白血病細胞株８株、ＨＰＢ−ＡＬＬ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，１５１１（１９９４）；急性Ｔ細胞系白血病）、ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２０．１；白血病（Ｔ細胞））、ＭＯＬＴ−４（ＪＣＲＢ９０３１；リンパ腫（Ｔ細胞））、ＴＡＬＬ−１（ＪＣＲＢ００８６；白血病（Ｔ細胞））、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２；急性Ｔ細胞系白血病）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９；急性Ｔ細胞系白血病）、ＰＥＥＲ（ＪＣＢ０８３０、白血病（Ｔ細胞））、Ｈｕｔ７８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６１；皮膚Ｔ細胞系リンパ腫）との反応性を、実施例２の３項（４）と同様の方法で測定した。但しビオチン化ＫＭ２７６０の濃度は１０μｇ／ｍｌとした。第１１図に示したように、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０は８株中５株（ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＰＥＥＲ、Ｈｕｔ７８）に対して強い反応性を示した。
【０１２５】
（２）ＡＤＣＣ活性
実施例５の１項で抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０での反応性が確認された細胞株５株に対するＡＤＣＣ活性の測定を実施例３の２項と同様の方法で測定した。第１２図に示したように、全細胞について抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０は濃度依存的に傷害した。
【０１２６】
実施例６
抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における活性評価（Ｔｈ２サイトカインの産生抑制）：
実施例２の２項（４）で得られた精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を評価するため、カニクイザルに単回静脈内投与後、経日的に約１か月間にわたって採血を行い、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｓｉｇｍａ社製）およびＩＯＮＯＭＹＣＩＮ（Ｓｉｇｍａ社製）刺激によって末梢血白血球にサイトカイン産生を誘導し、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１３とＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γを測定した。以下に方法と結果を記す。
【０１２７】
精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の投与量（蛋白量）はそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇであり、各用量群とも２匹の４歳齢雄カニクイザルに単回静脈内投与を行った。採血は、投与前、投与後１週目、２週目、３週目、４週目に大腿静脈より行った。抗凝固剤にはヘパリン（ヘパリンナトリウム注射液，１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，清水製薬株式会社製）を用い、血液１ｍｌに対しヘパリン２５ｕｎｉｔｓの濃度になるように添加した。平底２４ウェルプレートを用い、各個体の末梢血を５００μｌ／ウェルの容量で２ウェルに分注した。一方には刺激剤（ＰＭＡ終濃度５０ｎｇ／ｍｌ，ＩＯＮＯＭＹＣＩＮ終濃度１μｇ／ｍｌ）を含む培地を、残りの一方には刺激剤を含まない培地をそれぞれ５００μｌ／ウェル加え、軽く撹拌し、５％ＣＯ２、９５％空気、３７℃で２４時間培養した。なお、用いた培地は、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１００ｍｌに対し、ペニシリン・ストレプトマイシン液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）０．５ｍｌ、非働化済牛胎児血清（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５．６ｍｌを添加したものである。培養終了後、各ウェルより血球ごと培養液を回収し、遠心分離（６７００×ｇ，５分，４℃）によって上清を得た。このようにして得られた培養上清に含まれるＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＦＮ−γは、それぞれのサイトカイン測定キット（ＩＬ−４：ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−４  Ｋｉｔ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製；ＩＬ−１３：Ｃｙｔｏ  ｓｃｒｅｅｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製；ＩＦＮ−γ：Ｃｙｔｏ  ｓｃｒｅｅｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いて定量した。各個体のサイトカインの産生量は、刺激剤を添加した量から刺激剤を添加しなかった量を差し引いた値である（０．１ｍｇ／ｋｇ群  個体番号Ｌ−１，Ｌ−２，１．０ｍｇ／ｋｇ群  個体番号Ｍ−１，Ｍ−２，１０ｍｇ／ｋｇ群  個体番号Ｈ−１，Ｈ−２）。その結果を第１３図から第１５図に示した。これらの図は、各個体毎にＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＦＮ−γのそれぞれについて投与前の値を１００％として、投与後の産生量を百分率で表したものである。Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４（第１３図）およびＩＬ−１３（第１４図）はすべての投与群において、投与後１週目から著明に減少し、投与後４週目においてもその抑制は継続した。一方、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ（第１５図）への影響は極めて小さいものであった。
【０１２８】
以上の結果から、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０をカニクイサルに投与すると、少なくとも４週間は末梢血単核球からのＴｈ２サイトカインの産生が抑制されることが明らかとなった。また、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０がカニクイザル生体内において、ＣＣＲ４を発現した末梢血中のＴｈ２細胞を減少もしくは除去したことが示された。
【０１２９】
実施例７
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性：
（１）同系・腹腔内移植モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果
実施例２の２項（４）で得られたｈＣＣＲ４高発現マウス由来細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞を、マウスに腹腔内移植したマウス同系腫瘍モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果を測定した。マウスは８週令、雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア）を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の腹腔内にＰＢＳ（−）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）で１×１０５個／ｍｌに懸濁したＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞を２００μｌ／匹で移植した。その内の５匹に移植４時間後、３日後、６日後、１０日後にクエン酸緩衝液（ｐＨ６に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム水溶液）で２ｍｇ／ｍｌに希釈したＫＭ２７６０を腹腔内に２００μｌ投与した。残りの５匹はキメラ抗体を投与しない陰性対照群とした。移植当日より各群のマウスが腹水を伴う癌の増殖によって死亡するまでの日数を表１に示す。陰性対照群の平均生存日数が１６．４日であったのに対し、ＫＭ２７６０投与群の平均生存日数は２６．２日であった。ＫＭ２７６０投与により５９．８％の生存期間の延長が認められ、ＫＭ２７６０はＣＣＲ４発現白血病細胞の同系・腹腔内移植モデルに対して延命効果を示した。
【０１３０】
【表１】
0003926153.tif 000003
【０１３１】
（２）同系・皮下移植モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果
実施例２の２項（４）で得られたｈＣＣＲ４高発現マウス由来細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞を、マウスに皮下移植したマウス同系腫瘍モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果を測定した。マウスは８週令、雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア）を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１８匹の腹側部の皮下にＰＢＳ（−）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）で１×１０６個／ｍｌに懸濁したＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞を５０μｌ／匹で移植した。うち５匹には移植４時間後、１日１回、５日間連続で、クエン酸緩衝液（ｐＨ６に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム水溶液）で２ｍｇ／ｍｌに希釈したＫＭ２７６０を尾静脈より１００μｌ投与した。この時１回あたりの投与量は２００μｇ／匹となる。また別の６匹には移植４時間後、７日後、１４日後にクエン酸緩衝液で２ｍｇ／ｍｌに希釈したＫＭ２７６０を尾静脈より２００μｌ投与した。この時１回あたりの投与量は４００μｇ／匹となる。残りの７匹はキメラ抗体を投与しない陰性対照群とした。移植後６日目より経時的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各投与群の腫瘍体積の平均値と非投与群の腫瘍体積の平均値に対する比、および投与開始後の生存日数で判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
【０１３２】
腫瘍体積＝（短径）２×長径×０．５
【０１３３】
各群の腫瘍体積の平均値を表２及び第１６図、各群の腫瘍体積の平均値と非投与群の腫瘍体積の平均値の比の結果を表３及び第１７図に示す。移植後１８日目における各ＫＭ２７６０投与群の腫瘍体積の平均値と非投与群の腫瘍体積の平均値に対する比は、２００μｇの５日間連続投与群が０．３５６、４００μｇの３回投与群が０．２５７であり、いずれの投与スケジュールにおいてもＫＭ２７６０はＣＣＲ４陽性白血病細胞の同系・皮下移植モデルに対して増殖抑制効果を示した。
【０１３４】
【表２】
0003926153.tif 000004
【０１３５】
【表３】
0003926153.tif 000005
【０１３６】
（３）異種移植モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果
ＣＣＲ４を発現しているヒトＴ細胞白血病株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１１９）をヌードマウスの皮下に移植したマウス異種移植・皮下腫瘍モデルに対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０の抗腫瘍効果を測定した。マウスは８週令、雄のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア）を用いた。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス２０匹の腹側部の皮下にＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）で１×１０８個／ｍｌに懸濁したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を２００μｌ／匹で移植した。その後５匹ずつ４群に分け、うち３群には移植４時間後、３日後、６日後にそれぞれクエン酸緩衝液で２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌあるいは０．２ｍｇ／ｍｌに希釈したＫＭ２７６０を尾静脈より２００μｌ投与した。この時、各群のＫＭ２７６０投与量は４００μｇ／匹／日、１００μｇ／匹／日、４０μｇ／匹／日となる。残りの１群はクエン酸緩衝液で２ｍｇ／ｍｌに希釈したヒトイムノグロブリンＧ（以下ｈＩｇＧ、ウェルファイド社製）を尾静脈より２００μｌ投与し（４００μｇ／匹／日）、陰性対照群とした。移植後４日目より経時的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は各群の腫瘍体積で判定した。腫瘍体積は下式にて算出した。
【０１３７】
腫瘍体積＝（短径）２×長径×０．５
【０１３８】
各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化をを表４及び第１８図に示す。ＫＭ２７６０のいずれの投与群においても腫瘍増殖の完全な抑制が認められ、ＫＭ２７６０はＣＣＲ４陽性白血病細胞の異種移植・皮下腫瘍モデルに対する増殖抑制効果を示した。
【０１３９】
【表４】
0003926153.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明により、ヒトＣＣＲ４に特異的に結合し、ＣＣＲ４に対する新規なＣＤＲを含む、遺伝子組換え抗体およびその抗体断片が提供される。本発明の抗体は免疫細胞染色におけるヒトＴｈ２細胞の免疫学的検出、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などを始めとするすべてのＴｈ２介在性免疫疾患や異常なＴｈ２細胞のバランスにより病態が進行する疾患、白血病のような血液癌を始めとする癌疾患の診断あるいは治療に有用である。
【配列フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> Gene recombinant antibody and antibody fragment thereof
<140> JP2001-564247
<141> 2001-03-02
<150> JP 2000-59508
<151> 2000-03-03
<150> JP 2000-401563
<151> 2000-12-28
<160> 17
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr Ser
1               5                  10                  15
Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys
20                  25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Asn Ala Thr Glu Val Thr Asp Thr Thr Gln Asp Glu Thr Val Tyr Asn
1               5                  10                  15
Ser Tyr Tyr Phe Tyr Glu Ser Met Pro Lys Pro Cys
20                  25
<210> 3
<211> 414
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 3
atg aac ctc ggg ctc agt ttg att ttc ctt gcc ctc att tta aaa ggt   48
Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                  10                  15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta atg aag   96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys
20                  25                  30
cct gga ggg tcc ctg aaa atc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc   144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe
35                  40                  45
agt aat tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac atg agg ctg   192
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Met Arg Leu
50                  55                  60
gaa tgg gtc gca acc att agt agt gct agt act tat tcc tat tat cca   240
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
gac agt gtg aag gga cga ttc acc ata tcc agg gac aac gcc gag aac   288
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn
85                  90                  95
tcc cta tat ctg caa atg aat agt ctg agg tct gag gac aca ggc ata   336
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile
100                 105                 110
tat tac tgt gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg   384
Tyr Tyr Cys Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp
115                 120                 125
ggc cga ggg act ctg gtc act gtc tct gca                           414
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130                 135
<210> 4
<211> 396
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(396)
<400> 4
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct   48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1               5                  10                  15
tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc   96
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20                  25                  30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cgg aac att   144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile
35                  40                  45
gtt cat att aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aga ccg   192
Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro
50                  55                  60
ggc cag tct cca aag ctc cta atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct   240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65                  70                  75                  80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca   288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85                  90                  95
ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc   336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100                 105                 110
ttt caa ggt tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc agg ctg   384
Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu
115                 120                 125
gaa atc aga cgg                                                   396
Glu Ile Arg Arg
130
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Asn Tyr Gly Met Ser
1               5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                  10                  15
Gly
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr
1               5                  10
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
1               5                  10                  15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Phe Gln Gly Ser Leu Leu Phe Trp Thr
1               5
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 11
aaggaaaaaa gcggccgcga cccctcacca tgaacctcg                         39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 12
cgatgggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccag                         39
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 13
ccggaattcg cctcctcaaa atgaagttgc c                                 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 14
agccaccgta cgtctgattt ccagcctggt g                                 31
<210> 15
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe
35                  40                  45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Met Arg Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn
85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp
115                 120                 125
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130                 135
<210> 16
<211> 132
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1               5                  10                  15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20                  25                  30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile
35                  40                  45
Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro
50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100                 105                 110
Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu
115                 120                 125
Glu Ile Arg Arg
130
<210> 17
<211> 360
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr
1               5                  10                  15
Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu
20                  25                  30
Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
35                  40                  45
Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu
50                  55                  60
Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly
85                  90                  95
Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met
100                 105                 110
Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val
115                 120                 125
Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
130                 135                 140
Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala
145                 150                 155                 160
Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser
165                 170                 175
Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser
180                 185                 190
Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile
195                 200                 205
Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met
210                 215                 220
Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala
225                 230                 235                 240
Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr
245                 250                 255
Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val
260                 265                 270
Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala
275                 280                 285
Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr
290                 295                 300
Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys
305                 310                 315                 320
Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln
325                 330                 335
Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met
340                 345                 350
Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu
355                 360
【図面の簡単な説明】
第１図はＫＭ２１６０の化合物に対するＥＬＩＳＡ法における反応性を示した図である。
第２図はプラスミドｐＫＭ２１６０ＶＨ４１とｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の造成工程を示した図である。
第３図はプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈの造成工程を示した図である。
第４図はプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の造成工程を示した図である。
第５図は精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＫＭ２７６０、３が低分子量マーカー、４がＫＭ２７６０の泳動パターンをそれぞれ示す。
第６図は精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のＣＣＲ４部分ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＣＣＲ４との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
第７図は蛍光抗体法を用いた、ＣＣＲ４高発現細胞（ＣＣＲ４／ＥＬ−４）に対するＫＭ２７６０の反応性を示した図である。
第８図は上図がＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞、下図がＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性による細胞傷害性を示した図である。
第９図はＣＤ４とＣＤ４５ＲＡの染色性の違いによる４つの分画でのアネキシンＶ陽性率による、ヒトＰＢＭＣに対するＡＤＣＣ活性による細胞傷害性を示した図である。
第１０図はヒトＰＢＭＣからのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ産生抑制効果を示した図である。
第１１図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のヒトＴ細胞系白血病細胞株への反応性を示した図である。
第１２図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０との反応性が確認されたヒトＴ細胞系白血病細胞株に対する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０による細胞傷害性を示した図である。
第１３図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０をカニクイザルに投与した時のＩＬ−４産生量の経時的変化を示した図である。
第１４図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０をカニクイザルに投与した時のＩＬ−１３産生量の経時的変化を示した図である。
第１５図は抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０をカニクイザルに投与した時のＩＦＮ−γ産生量の経時的変化を示した図である。
第１６図はｈＣＣＲ４高発現マウス由来細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞が皮下移植されたマウスに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０を投与した時の腫瘍体積の平均値の経時的変化を示した図である。
第１７図はｈＣＣＲ４高発現マウス由来細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞が皮下移植されたマウスに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０を投与した時の投与群の腫瘍体積の平均値と非投与群の腫瘍体積の平均値の比の結果示した図である。
第１８図はＣＣＲ４を発現しているヒトＴ細胞白血病株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１１９）が皮下移植されたマウスに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０を投与した時の腫瘍体積の平均値の経時的変化を示した図である。
【図１】
0003926153.tif 000007
【図２】
0003926153.tif 000008
【図３】
0003926153.tif 000009
【図４】
0003926153.tif 000010
【図５】
0003926153.tif 000011
【図６】
0003926153.tif 000012
【図７】
0003926153.tif 000013
【図８】
0003926153.tif 000014
【図９】
0003926153.tif 000015
【図１０】
0003926153.tif 000016
【図１１】
0003926153.tif 000017
【図１２】
0003926153.tif 000018
【図１３】
0003926153.tif 000019
【図１４】
0003926153.tif 000020
【図１５】
0003926153.tif 000021
【図１６】
0003926153.tif 000022
【図１７】
0003926153.tif 000023
【図１８】
0003926153.tif 000024