(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）不活性白血球毒素（Ｌｋｔ毒素）前駆体を、Ｌｋｔ毒素を産生することなく、産生および分泌し、そして（ii）ウシに、天然に活性Ｌｋｔ毒素を産生するパスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella harmolytica）に対する防御免疫応答を誘発する、遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項２】
天然にＬｋｔ毒素およびＬｋｔ毒素前駆体を産生し、そして染色体上の天然の位置に、ａ）Ｌｋｔ毒素前駆体を活性化する翻訳後アクチベーターをコードする翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＬｋｔ毒素オペロン；ｂ）Ｌｋｔ毒素前駆体をコードするＬｋｔ構造遺伝子；およびｃ）Ｌｋｔ毒素の分泌に必要なタンパク質をコードする２つの遺伝子を含有するパスツレラ・ヘモリチカから、翻訳後アクチベーターを産生しない遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカを産生するための翻訳後アクチベーター遺伝子の部位特異的突然変異誘発を含む遺伝子修飾により得られる、請求の範囲第１項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項３】
Ｌｋｔ毒素前駆体が、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセッシングされない発現産物である、請求の範囲第１項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項４】
Ｌｋｔ毒素前駆体が、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセッシングされない発現産物である、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項５】
Ｌｋｔ毒素前駆体が、ＬｋｔＡ遺伝子によりコードされる、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項６】
翻訳後アクチベーター遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項７】
翻訳後アクチベーター遺伝子がＬｋｔＣ遺伝子である、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項８】
翻訳後アクチベーター遺伝子が、組換えＤＮＡ技術、化学的に引き起こす部位特異的突然変異誘発、または放射能により引き起こす部位特異的突然変異誘発により修飾される、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項９】
組換えＤＮＡ技術が、（i）単一または複数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失、（ii）標的構築物を用いる相同的組換え、または（iii）プラスミド分離である、請求の範囲第８項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項１０】
構造遺伝子が組換えＤＮＡ技術、化学的に引き起こす部位特異的突然変異誘発、または放射能により引き起こす部位特異的突然変異誘発により修飾されている、請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ技術が、（i）単一または複数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失、（ii）標的構築物を用いる相同的組換え、または（iii）プラスミド分離である、請求の範囲第１０項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ。
【請求項１２】
天然にウシにおいて活性Ｌｋｔ毒素を産生するパスツレラ・ヘモリチカに対する防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物であって、該ワクチン組成物が、
ａ）請求の範囲第１項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ、
ｂ）医薬的に許容し得る媒体
を組合せて含むものである、ワクチン組成物。
【請求項１３】
天然にウシにおいて活性Ｌｋｔ毒素を産生するパスツレラ・ヘモリチカに対する防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物であって、該ワクチン組成物が、
ａ）請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ、
ｂ）医薬的に許容し得る媒体
を組合せて含むものである、ワクチン組成物。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカを含む、細菌ベクター。
【請求項１５】
生物学的に活性な分子をさらに発現する、請求の範囲第１４項に記載の細菌ベクター。
【請求項１６】
該遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカ微生物に取込まれたプラスミドをさらに含み、該プラスミドが生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を持つ、請求の範囲第１５項に記載の細菌ベクター。
【請求項１７】
請求の範囲第２項に記載の遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカを含む、細菌ベクター。
【請求項１８】
生物学的に活性な分子をさらに発現する、請求の範囲第１７項に記載の細菌ベクター。
【請求項１９】
該遺伝子修飾パスツレラ・ヘモリチカに取込まれたプラスミドをさらに含み、該プラスミドが生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を持つ、請求の範囲第１８項に記載の細菌ベクター。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生ワクチンとしての使用に適した修飾微生物に関する。本発明はまた、生物ベクターとしての修飾微生物の使用に関する。本発明は、更に、ワクチン組成物に関する。
ウシ呼吸器系疾患（ＢＲＤ）コンプレックス、輸送熱または肺炎パスツレラ症は、ウイルス感染、有害環境および貧免疫状態が併合することにより動物が細菌感染しやすくなる多因性疾患である。ＢＲＤは、ウシフィードロット産業における経済的損失の主たる原因である。この疾患に関連する主要な微生物は、細菌パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella harmolytica）血清型１である。（Schiefer et al.,1978）。正常条件下では、Ｐ.ヘモリチカは上気道の正常フローラの１種であり、肺クリアランス機構が害された場合のみ肺のコロニー形成が起こって疾病に至る(Frank and Smith, 1983)。菌力因子（virulence factors）の多くは、Ｐ.ヘモリチカに関連しており、夾膜ポリサッカライドなどの表面構造（Adam et al.,1984）および熱不安定性の反芻動物白血球に特異的な分泌化外毒素（Shewen and Wilkie,1982）を含む。
この外毒素または白血球毒素（Ｌkt）は、主な肺の防御や続く免疫応答を害したり、白血球溶解の結果炎症を引き起こすことにより病原性に関与し得る。Ｌktの特性対比により、それが、アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツシスを含む種々の細菌により産生されるＲＴＸファミリー毒素の一員であること、それらの殆どがＥ.coliにより産生されるものであることが示されている（Strathdee and Lo,1989）。全てのＲＴＸ毒素は、標的細菌内に小孔を開けることによって、浸透圧バランスを妨害し、標的細菌の破壊を導くという働きをする。作用様式はＲＴＸ毒素と同一であるが、その標的細胞は、タイプや交差種特異性の点で大きく変わる。この毒素ファミリーは、構造的に、毒素内にグリシン豊富反復構造があることを特徴とし、これはカルシウムに結合し、標的細胞における認識および結合の役割、小孔形成にかかわる疎水性ドメインの領域、翻訳後活性化のための必要条件、および分泌のためのＣ−末端シグナル配列への依存関係を持つ。活性ＲＴＸ毒素の産生および分泌は、少なくとも４つの遺伝子、Ｃ、Ａ、ＢおよびＤの活性を必要とする。Ａ遺伝子は、構造毒素をコードし、Ｃ遺伝子は翻訳後アクチベーターをコードし、ＢおよびＤ遺伝子は、活性毒素の分泌に必要なタンパク質をコードする。Ｌktは、一つのプロモーターにより転写される４つの隣接遺伝子（ＣＡＢＤ）からなるオペロンによりコードされている。Ｌktは、広い宿主細胞特異性を持つその他多くのＲＴＸ毒素とは異なり、反芻動物の白血球に限定される標的細胞特異性を持つ（概説：Coote,1992）。
Ｌktは、実験的攻撃後のフィードロットにおける肺炎の発病率と重篤度を減少する効果を示すＬkt（Gentry et al.,1985；Mosier et al.,1986；Shewen and Wilkie,1987；Shewen et al.,1988）を含有する疾病耐性に関する分野の抗毒素抗体および市販の培養上清ワクチンによる防御免疫にも関連している（Presponse;Langford Inc.,Guelph,Ontario,Canada）。この培養上清ワクチンは、抗Ｌkt抗体を含む以外に、培養上清に存在するその他の可溶性抗原に対する免疫応答も刺激するので、抗Ｌktと防御との間に直接的な相関関係は要求されないこともある。
この分野でのパスツレラ細菌ワクチン（不活性ワクチン）の使用は、肺炎性パスツレラ症を制御するという限られた成功しか収めておらず、数回の実地試験では、細菌ワクチンベースのワクチンを投与しても疾病を防御せず、または疾病の増大を導く場合もあった（Bennett,1982;Morter et al.,1982）。細菌ワクチンには、部位反応をもたらし得るアジュバントの使用が必要であるという不利点もあり、防御のためには多くの場合で多回用量を必要とする。
本発明の目的は、従来技術のもつ課題を１つ以上解決することである。
従って、一態様では、本発明は、部分的にまたは完全に不活性化されているＬkt毒素を産生する修飾微生物を提供する。
“修飾”という用語は、組換えＤＮＡ技術またはその他の技術、例えば、化学的にまたは放射能により引き起こされる突然変異誘発、による修飾を含む。組換えＤＮＡ技術は、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入に関連し、そのＤＮＡはあらゆる適切な方法により導入できる。適切な方法には、コンピーテント細胞の形質転換、形質導入、接合および電気穿孔がある。
本発明の更なる実施態様では、微生物のＬkt構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを含むＬkt毒素オペロンが部分的にまたは完全に不活性化されている修飾微生物が提供される。
請求の範囲および説明で使用した“Ｌkt毒素オペロン”という用語は、Ｌkt毒素オペロン産物であるＬkt毒素の発現にかかわるような遺伝子を含むことを意図する。Ｌkt毒素オペロンに含まれる遺伝子には、翻訳後アクチベーター遺伝子（Ｃ）、構造遺伝子（Ａ）および活性化Ｌkt毒素の分泌に必要なタンパク質をコードするＢおよびＤ遺伝子がある。
請求の範囲および説明で使用した“部分的にまたは完全に不活性化”という用語は、組換えＤＮＡ技術および化学的にまたは放射能により引き起こした突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発による遺伝子の修飾を含み、組換えＤＮＡ技術には、標的構築物またはプラスミド分離を用いる、ＤＮＡの導入およびＤＮＡの遺伝子からの欠失があり、単一または複数ヌクレオチド置換、付加および／または欠失を含み、その欠失には遺伝子の完全または部分的欠失がある。
本出願人は、Ｌkt毒素前駆体が有毒活性を低減することを見いだした。意外にも、本出願人は、Ｌkt毒素前駆体が、Ｌkt毒素を産生する微生物による異種攻撃に対する交差防御を表す動物の免疫応答を誘発できることも見いだした。
従って、本発明の好ましい実施態様では、不活性化Ｌkt毒素は、Ｌkt毒素前駆体である。前駆体は、Ｌkt構造遺伝子のプロセッシングされない発現産物であり得る。Ｌkt構造遺伝子は、Ｌkt Ａ遺伝子であり得る。
微生物は、天然にはＬkt毒素を産生しないものであってもよい。その微生物は、その中にＬkt Ａ遺伝子などのＬkt構造遺伝子が導入されている、細菌、ウイルスまたはカビであり得る。
しかしながら、好ましい実施態様では、微生物は、Ｌkt毒素を天然に産生するものである。Ｌkt毒素を天然に産生する微生物は、パスツレラ・ヘモリチカであり得る。
本出願人は、Ｌkt毒素を天然に産生する微生物は、前駆体産物の翻訳後アクチベーターを除去することにより、不活性Ｌkt毒素前駆体を産生するように操作できることを見いだした。従って、好ましい実施態様では、この微生物はＬkt毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生できないか、または不活性化された、Ｌkt毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生する。翻訳後アクチベーターは、Ｌkt Ｃ遺伝子産物であり得る。
好ましい実施態様では、微生物のＬkt Ｃ遺伝子は、不活性化されているか、または部分的または完全に欠失している。Ｌkt Ｃ遺伝子は、部位特異的突然変異誘発により不活性化することができる。Ｌkt Ｃ遺伝子は、どのような単一または複数ヌクレオチド置換、付加および／または欠失によっても不活性化できる。好ましくは、Ｌkt Ｃ遺伝子は、標的構築物を用いる相同的組換えにより不活性化する。標的構築物は、所望の挿入部位のフランキング配列に相同な配列によりフランクされた選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、水銀などの有害物質に対する耐性を与える遺伝子であることができ、または抗生物質耐性決定子であってもよい。抗生物質耐性決定子は、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性またはストレプトマイシン耐性をコードする遺伝子であり得る。
ある環境では、修飾微生物内に取り込まれた機能性抗生物質耐性遺伝子を持つのは望ましくない場合もある。従って、本発明は、反復配列などの遺伝子エレメントを含む標的構築物を包含し、この遺伝子エレメントは、標的構築物が一旦、宿主染色体による相同的組換えを受けると、抗生物質耐性遺伝子の削除を容易にするものである。
本発明は、選択マーカーを含まない標的構築物も包含する。例えば、標的構築物は、欠失のあるＬkt Ｃ遺伝子のセグメントを含むこともある。宿主染色体と共に標的構築物が相同的組換えを受けた結果、欠失箇所が染色体Ｌkt Ｃ遺伝子へ導入されることになる。この場合、Ｌkt毒素の産生がないことに基づいて組換え体を選択できる。
標的構築物は、宿主細胞へ鎖状形態で直接導入できる。あるいは、標的構築物は自殺（スイサイド）または非複製ベクターを介して導入することもできる。自殺ベクターは、宿主微生物中で複製できないどのようなプラスミドであってよい。天然にＬkt毒素を産生する微生物は、ｐＥＰベクターに対して非許容宿主であることが多い。従って、ｐＥＰベクターは、本発明で使用できる自殺ベクターの例である。
その他の実施態様では、部位特異的突然変異誘発は、プラスミド分離の技術により達成できる。例えば、選択マーカー遺伝子で分断されたＬkt Ｃ遺伝子のフラグメントを含有するプラスミドを微生物へ導入することができる。続いて、その微生物は、第２の選択マーカー遺伝子を含有する第２のプラスミドで形質転換させることができる。その後、両方のプラスミドを含む宿主細胞は、第１のプラスミドに対してのみ選抜する培地により継代できる。そのため、第１のプラスミドは失われるが、選択マーカーを含む分断Ｌkt Ｃ遺伝子フラグメントの染色体への組換えが起こる場合もある。そのため、このプロセスは、分断Ｌkt Ｃ遺伝子の染色体Ｌkt Ｃ遺伝子への組換えを促進でき、そうして染色体Ｌkt Ｃ遺伝子を不活性化する。
本発明の更なる態様では、部分的にまたは完全に不活性化されているＬkt毒素をコードする発現ベクターを提供し、該ベクターはＬkt構造および／または翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＬkt毒素遺伝子をコードしており、該Ｌkt毒素オペロンは部分的または完全に不活性化されている。
請求の範囲および説明で使用した“発現ベクター”という用語は、外来ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を発現する染色体または染色体エレメントを含む。
Ｌkt Ａ遺伝子産物は、染色体Ｌkt Ａ遺伝子から発現させることができる。染色体Ｌkt Ａ遺伝子は、その本来の位置で染色体上にあることができ、またその本来の配置以外の位置で染色体へ挿入することもできる。更に、Ｌkt遺伝子産物は、プラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬkt Ａ遺伝子から発現させることができる。そのため、一実施態様では、Ｌkt Ａ遺伝子を含有する染色体外エレメントは、機能的染色体Ｌkt Ａ遺伝子と不活性化染色体Ｌkt Ｃ遺伝子をもつ微生物へ導入できる。染色体外エレメントから発現されるＬkt Ａ産物は、染色体遺伝子から発現されるＬkt Ａ産物を補うことができる。
あるいは、Ｌkt Ａ遺伝子産物は、全体的にプラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬkt Ａ遺伝子または遺伝子群から発現させることができる。染色体外エレメント上にあるＬkt Ａ遺伝子は、染色体外エレメントに対する選択の存在下または存在下のいずれかで発現させることができる。そのため、一実施態様では、Ｌkt Ａ遺伝子を含有する染色体外エレメントを、機能的染色体Ｌkt ＡおよびＬkt Ｃ遺伝子を欠く微生物に導入することができる。機能的Ｌkt ＡおよびＬkt Ｃ遺伝子を欠く微生物は、微生物の突然変異誘発により製造できる。突然変異誘発は、Ｌkt ＡおよびＬkt Ｃ遺伝子またはその部分の欠失をもたらすものであり得る。
この染色体外エレメントは、Ｌkt Ａ遺伝子を含む組換え発現ベクターであってもよい。好ましくは、組換え発現ベクターは、天然にＬkt毒素を産生する微生物においてＬkt Ａ遺伝子を発現させるものである。この組換え発現ベクターは、Ｐ．ヘモリチカにおいてＬkt Ａ遺伝子を発現させることができる。組換え発現ベクターは、pＩＧプラスミドから得ることができる。組換えプラスミドは、pＩＧ３Ｂから得ることができる。組換えプラスミドは、pＩＧ３Ｂ−Ｌktであり得る。
ＡＰＰ（Ｐh）に基づく細菌ベクター系は、宿主細胞へ“裸の（naked）ＤＮＡ”ワクチン分子を送達する別の手段を提供する。このような裸のＤＮＡワクチン／発現系は、細菌系で複製可能なプラスミドと、対象の外来／組換え遺伝子の発現を制御する真核生物プロモーターを含む。
好ましい実施態様では、微生物は、Ｌkt毒素分子の分泌を促進する１種以上の機能性タンパク質を産生できる。この微生物は、機能性Ｌkt Ｂおよび／またはＬkt Ｄ遺伝子を持つことができる。その他の実施態様では、微生物は、Ｌkt毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種のタンパク質を産生できないか、またはＬkt毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種の不活性タンパク質を産生する。この微生物は、不活性Ｌkt Ｂおよび／またはＬkt Ｄ遺伝子を持つことができる。従って、この微生物は、活性なまたは不活性なＬkt毒素分子を分泌できないこともある。
その他の態様では、本発明は、Ｌkt毒素前駆体を含むワクチン組成物を接種した宿主動物において免疫学的応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。Ｌkt毒素前駆体は、Ｌkt構造遺伝子のプロセッシングされていない発現産物であり得る。Ｌkt構造遺伝子は、Ｌkt Ａ遺伝子であり得る。
本発明は、更に、部分的にまたは完全に不活性化されているＬkt毒素を産生する修飾微生物を含むワクチン組成物を提供する。好ましくは、不活性化Ｌkt毒素は、Ｌkt毒素の前駆体である。この前駆体は、Ｌkt構造遺伝子のプロセッシングされていない発現産物であり得る。Ｌkt構造遺伝子は、Ｌkt Ａ遺伝子であり得る。好ましくは、微生物はパスツレラ・ヘモリチカである。好ましくは、微生物のＬkt Ｃ遺伝子は不活性化されているか、または欠質している。
好ましい実施態様では、修飾微生物を含むワクチン組成物は、生ワクチンである。
本発明のワクチン組成物は、アジュバントまたは免疫刺激分子を追加しても、または追加しなくても医薬的に許容できるどのような媒体にも組み込むことができる。
そのアジュバントは適切な種類のものならどれでもよい。アジュバントは、植物油またはそのエマルション、界面活性物質、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシル−アンモニウムブロミド、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ'−Ｎ'ビス(２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン)、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック・ポリポル（pluronic polypols）；ポリアミン、例えば、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、カルボポル；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフシン（tuftsin）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；油状エマルション；および鉱物ゲルおよび懸濁物から選択することができる。アルミなどの鉱物懸濁物、即ち、水酸化アルミニウム（Ａｌ(ＯＨ)3）、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムが好ましい。アジュバントは、ワクチン組成物の総重量に対しおよそ１から７５重量％の量で存在し得る。
Ｌkt毒素前駆体またはＬkt毒素前駆体を産生する能力のある微生物を含む本発明のワクチンが、対応するＬkt毒素を産生するある範囲の血清型の微生物に対する防御を提供する可能性を持つことは評価されるであろう。
その他の態様では、本発明は、活性なＬkt毒素を産生できないように修飾したパスツレラ・ヘモリチカ細菌を含む生物ベクターを提供する。
好ましい実施態様では、この修飾細菌は、Ｌkt毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生できないか、またはＬkt毒素前駆体の不活性化翻訳後アクチベーターを産生する。翻訳後アクチベーターは、Ｌkt Ｃ遺伝子産物であり得る。好ましい実施態様では、修飾細菌のＬkt Ｃ遺伝子は、不活性化されているかまたは欠失している。Ｌkt Ｃ遺伝子は、単一または複数ヌクレオチド置換、付加および／または欠失により不活性化できる。
Ｌkt Ｃ遺伝子は、選択マーカーを含有する標的構築物を部位特異的組換えを経てＬkt Ｃ染色体遺伝子へ導入することにより、不活性化できる。標的構築物は、遺伝子エレメント、例えば反復単位を含むことができ、この遺伝子エレメントは、標的構築物が一旦、宿主染色体による相同的組換えを受けると、抗生物質耐性遺伝子の削除を容易にするものである。あるいは、選択マーカーを含有しない標的構築物を用いてＬkt Ｃ染色体遺伝子内に欠失を導入することもできる。
Ｌkt Ａ遺伝子産物は、染色体Ｌkt Ａ遺伝子から発現させることができる。染色体Ｌkt Ａ遺伝子は、その本来の位置で染色体上にあることができ、またその本来の配置以外の位置で染色体へ挿入することもできる。更に、Ｌkt遺伝子産物は、プラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬkt Ａ遺伝子から発現させることもできる。あるいは、Ｌkt Ａ遺伝子産物は、全体的に、プラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬkt Ａ遺伝子または遺伝子群から発現させることもできる。
好ましい実施態様では、微生物は、Ｌkt毒素分子の分泌を促進する１種以上の機能性タンパク質を産生できる。この微生物は、機能性Ｌkt Ｂおよび／またはＬkt Ｄ遺伝子を持つことができる。その他の実施態様では、微生物は、Ｌkt毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種のタンパク質を産生できないか、またはＬkt毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種の不活性タンパク質を産生する。
“生物ベクター”という用語は、生物学的に活性な分子の発現に適した生物学的手段を含むその最も広義で用いている。生物学的手段は、好ましくは生存能のある微生物であるが、死滅微生物を採用してもよい。生物ベクターは、非病原性であるか、または無毒化してもよく、または非病原性または無毒性の有効量で与えることもできる。“生物学的に活性な分子”という用語は、成長因子、ホルモン、酵素、抗原またはその抗原性部分、インターロイキンなどのサイトカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子などの機能性分子を含む。あるいは、この分子は、生物学的に活性な分子をコードする遺伝子または遺伝子群を持つプラスミドで生物ベクターを形質転換させ、その後それを発現させることにより；または、プラスミドおよび／または遺伝子または遺伝子群および／またはその部分を、その遺伝子または遺伝子群またはその部分が発現される染色体および／または天然または非天然の染色体外エレメントを含む宿主ゲノムへ組込んだ場合に、発現される組換え分子であってもよい。
本発明の生物ベクターを用いて１種以上の有用なタンパク質を宿主動物へ提供できることは評価されるであろう。そうして提供されるタンパク質は、協動的に作用して宿主動物において反応の増強を引き起こすことができる。例えば、生物ベクターは、宿主動物中で抗原に対する免疫原性応答を高める分子と共に抗原を産生できる。免疫原性応答を高める分子は、サイトカインであり得る。
本発明の生物ベクターを使用して多価ワクチンを提供できることは評価されるであろう。“多価ワクチン”という用語は、最も一般的な意味で用いており、修飾微生物上の、または修飾微生物によって発現される２つ以上の別個の抗原エピトープに対する免疫応答を誘発する能力があり、その２つ以上のエピトープがその修飾微生物に固有のものである、修飾微生物にまで及ぶものである。しかしながら、より一般的には、多価ワクチンは、該微生物の有毒形態並びに該微生物により発現される、微生物の固有のものではない、異種抗原（例えば、組換え抗原または形質導入、接合または形質転換により導入されるもの）に対する免疫応答を誘発する能力のある修飾微生物を含む。この点で、多価ワクチンは、２種以上の病原体に対するものであって良い。好ましい多価ワクチンは、Ｌkt毒素に対する、また１種以上の病原体由来の少なくとも１種の抗原性エピトープに対する免疫応答を誘発する能力のあるものである。病原体は、パスツレラ種、ヘモフィラス種、モラキセラ種、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種、Ｅ.コリ、フソバクテリウム種、クロストリジウム種、マイコバクテリウム種などの細菌病原体から選択できる。病原体は、ヘモカス種、トリコストロンジラス種などの内部寄生体、またはブーフィラス種などの外部寄生体からも選択できる。あるいは、病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、感染性ウシ鼻腔気管炎（ＩＢＲ）、コロナウイルス、ロタウイルスなどのウイルス病原体から選択してもよい。
本発明は、更に、活性Ｌkt毒素を産生する微生物を提供し、そしてＬkt Ｃ遺伝子を不活性化または欠失することを含む、部分的にまたは完全に不活性化されているＬkt毒素を産生する修飾生物体の製法を提供する。
本発明は、更に、活性Ｌkt毒素を産生する能力のない微生物を提供し、そして機能性Ｌkt Ａ遺伝子を該微生物内へ導入することを含む、部分的にまたは完全に不活性化されているＬkt毒素を産生する修飾生物体の製法を提供する。
本発明は、更なる態様において、Ｌkt毒素産生微生物に対する動物のワクチン接種法を提供し、該方法は、本発明のワクチンの免疫学的有効量を該動物に投与することを含む。
このワクチン接種法は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの家畜の処置に有用である。このワクチン接種法は、ウマ、イヌやネコなどの伴侶動物の処置に使用することもできる。ワクチン接種法は、ヒトの処置に使用することもできる。好ましい実施態様では、ワクチン接種法は、ウシの処置に利用する。好ましくは、このワクチン接種法は、ウシ呼吸器系疾患(ＢＲＤ)コンプレックスの処置に利用する。
本発明によるワクチンまたはワクチンベクターの投与は、経口または非経口投与などの適切な経路によるものである。この投与は、経鼻または経膣などの粘膜投与であることもできる。あるいは、筋肉内、経皮、皮下または腹膜内投与であってもよい。製剤は、乾燥または液体形態であり得る。選択した投与経路によっては、プロテアーゼ阻害剤、抗炎症剤などの付加成分を必要とする場合もある。
本発明は、更なる態様において、病原体に対する動物のワクチン接種法を提供し、該方法は、該病原体の免疫学的有効量の抗原を合成する本発明のワクチンベクターの有効量を該動物に投与することを含む。
更に別の態様では、本発明は、本発明の修飾微生物を培養し、該微生物によって産生された不活性毒素を回収することを含む、不活性Ｌkt毒素の製法を提供する。本方法により産生された不活性Ｌkt毒素は、例えばワクチン中の活性免疫原としてＬkt毒素に対する防御免疫応答を刺激するために使用することができる。
本明細書の説明および請求の範囲全般にみられる、“含む”という用語やその変形の“含んでなる”という用語は、他の添加物、成分、集合体または工程の排除を意図するものではない。
本発明を一層容易に理解できるよう、下記に実施例を非限定的に提供する。
【図面の簡単な説明】
図１。Ｅ.コリのＬkt発現カセットの構築。Ｌkt遺伝子は、Ｌktを発現させるためのポリＨＩＳリーダー配列をフレーム内に持つpＱＥ中にクローン化した。pＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性遺伝子は、pＱＥ−Ｌktプロモーター／レギュレーター配列の５'のユニーク（唯一の）ＸhoＩ制限部位にクローン化した。得られたプラスミド、pＱＥ−ＬktＫは、カナマイシン耐性遺伝子に連結させた制御発現下のＬkt遺伝子を含有する。
図２。アクチノバシラス・プルロニューモニアエのオーストラリア株から単離した、ストレプトマイシン耐性をコードする４.２kbプラスミドであるpＩＧ３の部分的制限酵素地図（図２Ａ）。２.３kbのＰstＩフラグメント（pＩＧ３１７）は、プラスミド複製をコードし、自己ライゲーションした場合にストレプトマイシン耐性を与えるのに十分であることが分かっているので、これをＥ.コリまたはＰ.ヘモリチカへ形質転換した。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）といlac遺伝子の一部を含有するプラスミドベクターpＩＧ３Ｂは、pＩＣ１９ＲのＨaeIIフラグメントをpＩＧ３１７のユニークＥcoＲＩ部位へ導入することにより構築した（図２Ｂ）。ＭＣＳとプラスミド主幹にて切断するＰstＩを除くユニーク制限酵素部位は、pＩＧ３Ｂ（Ｃ）で示す（図２Ｃ）。
図３。Ｐ.ヘモリチカで使用するＬkt発現カセットの構築。カナマイシン耐性遺伝子と連結させた、pＱＥ−ＬktＫ由来のこのＬkt発現カセットは、Ｓph1Ｉ制限酵素フラグメントとして単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、平滑末端を作り、pＩＧ３ＢのユニークＥcoＲＶにクローン化した。pＩＧ３Ｂのマルチクローニングサイトのユニーク制限酵素部位が全て示されているわけではない。
図４。Ｌkt発現カセットを含有するＰh：Ｌkt-株のウエスタン・ブロット解析。Ｐ.ヘモリチカＥＭＡＩ、Ｐh：Ｌkt-およびＬkt発現カセット（pＩＧ３Ｂ−Ｌkt）を含有するＰh：Ｌkt-株の指数増殖培養由来のサンプルをウエスタン・ブロッティングにより試験した。毒素バンドは、Ｌktに対して生じたウサギ抗血清を用いて検出した。抗Ｌkt血清は、Ｐ.ヘモリチカ株ＥＭＡＩの調製の際にＬktに相当するサイズのポリペプチドとＰh：Ｌkt-／pＩＧ３Ｂ−Ｌktには結合したが、Ｌkt欠損株Ｐh：Ｌkt-の類似サイズのバンドは認識しなかった。
図５。Ｐh中のpＩＧベースのＣＡＴ発現カセット。一連のpＩＧベースの発現カセットをＰh中でＣＡＴ遺伝子を発現させるために構築した。各プラスミドは、ＣＡＴ遺伝子の５'側に並ぶプロモーターを持つ同じ構造であった。この研究に使用したプロモーターは、Ｐh Ｌktプロモーター；パスツレラ・マルトシダの皮膚懐死性毒素から単離したＤＮＴプロモーター；アクチノバシラス・プルロニューモニアエのＡＰＸ１毒素から単離したＡＰＸ１プロモーターであった。
材料および方法
細菌株および生育条件
この研究に使用したＰ.ヘモリチカ株は、NSW Dept.Agriculture,Elizabeth Macarthur Institute,Menangle（EMAI；オーストラリア）またはAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手した。Ｐ.ヘモリチカ株は、ブレイン・ハート・インフュージョン培地（ＢＨＩ）中３７℃で連続振盪しながら生育させた。血液寒天は、５％滅菌脱繊維素ヒツジ赤血球をＢＨＩ寒天に添加することにより、調製した。抗生物質は、カナマイシンを最終濃度２５μg／mlで使用した。Sambrook等（1989）に概説されている標準技術を用いて、Ｅ.コリ株ＤＨ５αを本研究に使用した。
Ｐ.ヘモリチカ ゲノムＤＮＡの単離
ＢＨＩで生育させたＰ.ヘモリチカＥＭＡＩの一晩培養物１ml中に存在する細菌を遠心にて集め、上清を捨てた。ペレットをリソチーム（７.５mg/ml）含有ＴＥ（１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ８.５／１mＭ ＥＤＴＡ）１mlに再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。溶液を０.１Ｍ ＮaＣl、１％ＳＤＳおよび２.５μg／mlプロテイナーゼＫの最終濃度に調整した後、インキュベーションを５０℃で一晩続けた。翌日、調製物を０.５Ｍ ＮaＣlに調製し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００：９９：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）で２回抽出し、次いで、０.６容量のイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを沈澱させた。
Ｌkt遺伝子の単離およびクローニング
Ｌkt遺伝子の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施した。反応は、ゲノムＤＮＡ（ＥＭＡＩ）５０ng、オリゴヌクレオチドプライマー３ng、５０mＭ ＫＣｌ、１０mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ８.３、２.５mＭ ＭgＣl2、２００mg／ml ＢＳＡ、２００mＭのdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰそれぞれ、更にＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus,USA）１単位を含んでなる５０μl容量中で実施した。
反応物を、等容量のパラフィン油で覆い、９４℃まで１分間加熱し、５５℃まで２分間冷まし、７２℃まで５分間加熱した。このサイクルをPerkin-Elmer-CetusのＤＮＡ熱循環を用いて３５回繰り返した。特異的オリゴヌクレオチドは、公開されたＬkt遺伝子の配列に基づき設計した（Lo et al.,1987；Highlander et al.,1989）。２つのオリゴヌクレオチドの配列は、５'ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＴＡＧＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣ３'と５'ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＣ３'であり、クローニングが容易なように５'末端にＢamＨＩ部位および３'末端にＥcoＲＩ部位を持つＰＣＲ産物を産生するように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、遺伝子アセンブラー・プラスＤＮＡ合成機（gene Assembler Plus DNA Synthesiser）（Pharmacia,Sweden）を用いて合成した。Ｌkt遺伝子の予想分子量に相当するＰＣＲ反応産物を遺伝子クリーニング（gene cleaning）（BRESATech,Australia）によりアガロースゲルから単離し、ＢamＨＩおよびＥcoＲＩで制限酵素消化し、pＵＣ１８（Yanish-Perron et al.,1985）の対応する部位にクローン化して、プラスミドpＵＣ−Ｌktを形成した。二本鎖塩基配列決定によりＬkt遺伝子を含有するクローンを確認した（結果表示せず）。
プラスミドＤＮＡによるＰ.ヘモリチカの形質転換
電気コンピーテントなＰ.ヘモリチカは、ＢＨＩ培地に単一コロニーを接種し、ＢＨＩ／血液寒天プレートで一晩培養することにより調製した。培養物はＯＤ600が0.8になるまで生育させ、その時点で培養物は中間対数増殖中であった（データ表示せず）。遠心により細菌を回収し、１５％グリセロールで３回洗浄し、元の容量の１／５０に再懸濁した。電気コンピーテントなＰ.ヘモリチカのアリコート（５０μl）を次の条件を用い、プラスミドＤＮＡで形質転換した：１０００Ω、２.２５kＶおよび２５μＦ、０.２cmキュベット中。その後、適切な抗生物質選択を含有するＢＨＩ寒天上にまく前に、電気穿抗により形質転換した細胞を抗生物質選択なしに３７℃で４時間振盪しながらＢＨＩ培地で生育させた。
抗血清の製造
ＰＣＲにより得られたＬkt転写解読枠（オープン・リーディング・フレーム）をpＵＣ−Ｌktから発現ベクターpＧＥＸ２Ｔへサブクローン化し、フレーム内にＧＳＴ遺伝子があるようにした。ＧＳＴ−Ｌkt融合タンパク質を製造元使用説明書（Pharmacia,Sweden）に従いＧＳＴアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製した。
ウサギに精製タンパク質（１００μg）を２週間間隔で計３用量与え、最初は完全フロイントアジュバント中で、続くワクチン接種は不完全フロイントアジュバント中であった。
ウエスタン・ブロット解析
ウエスタン・ブロット（イムノブロット）解析は、Sambrook et al.(1989)の方法により実施した。ＧＳＴ−Ｌkt融合タンパク質に対して製造したウサギ血清を５０分の１希釈でＬktの検出に使用した。１０００分の１希釈で使用したコンジュゲートは、基質としてテトラメチルベンジジン（McKimm-Breschkin 1990）を持つヒツジ抗血清ウサギＩgアファニティー単離ＨＲＰコンジュゲート化抗血清（sienus）であった。ウエスタン・ブロット解析用の細菌サンプルは、一晩培養物を適切な生育培地で２０分の１に希釈し、３７℃で勢いよく振盪しながらＯＤ６００が０.８になるまでインキュベートすることにより、調製した。この点で全培養物２０μlを含有するサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、バイオ−ラド・トランスブロット・セル（Bio-Rad Transblot Cell）を用いて製造元説明書に記載のようにタンパク質をニトロセルロース（Bio-Rad）に移した。
Ｐ.ヘモリチカのＬkt発現カセットの構築
Ｌkt転写解読枠（ＯＲＦ）をpＵＣ−Ｌktから、図１に概説したようにフレーム内にポリＨis精製シグナルを持つ発現ベクターpＱＥ３０（IQAGEN Inc.,Chatsworth,CA,USA）へサブクローンした。Ｌkt遺伝子のpＱＥ３０からの発現（pＱＥ３０−Ｌkt）は、Ｅ.コリファージＴ５プロモーターおよび２つのlacオペレーター配列の制限下であった。pＱＥ−Ｌkt由来のこの発現エレメントを別のプラスミドへ容易にサブクローニングするために、図１に概説したようにpＱＥ−Ｌktへクローニングする前にカナマイシン耐性遺伝子をpＵＣ４Ｋ（Pharmacia）から単離し、pＩＣ２０Ｒを介してシャトルさせた。得られたプラスミド、pＱＥ−ＬktＫは、カナマイシン耐性遺伝子と、Ｔ５プロモーターに連結させたＬkt遺伝子とを含有し、両方ともユニークＳphＩ制限酵素部位にフランクされている（図１）。
Ｐ.ヘモリチカを形質転換するのに適したプラスミドは、我々の実験室にて開発した。親プラスミドをアクチノバシラス・プルロニューモニアエのオーストラリア株から単離し、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに概説したプラスミドベクターpＩＧ３Ｂへと発展させた。Ｌkt遺伝子含有ＳphＩ制限酵素フラグメントおよび転写調節シグナルをｐＱＥ−Ｔ１Ｋから単離し、ｐＩＧ３ＢのＥcoＲＶ部位にサブクローン化して、図３に概説したＰ.ヘモリチカＬkt Ａ遺伝子発現ベクターｐＩＧ３Ｂ−Ｌktを製造した。
Ｐ.ヘモリチカワクチン株の構築
Ｌkt Ｃ遺伝子の小部位を欠失するよう設計したＰ.ヘモリチカ（ＥＭＡＩ株）染色体の部位突然変異誘発プロセス中、血液寒天プレート上で溶血ゾーンを作ることのできない単離物を得た。この株（Ｐh：Ｌkt-）を更に特性化したところ、Ｌkt ＣとＡの両方の生産について欠陥のあることが示された。
Ｐh：Ｌkt-株は、材料および方法のところで記載のようにｐＩＧ３Ｂ−Ｌktにより形質転換させ、ＤＮＡをカナマイシン耐性コロニーから単離し、制限酵素消化により解析して、ｐＩＧ３Ｂ−Ｌktの予想プロフィールを確認した。
Ｐ.ヘモリチカワクチン株の特性化
ｐＩＧ３Ｂ−Ｌkt含有Ｐh：Ｌkt-株、並びにＰ.ヘモリチカＰh：Ｌkt-およびＡＴＣＣ株の一晩培養物を、ＧＳＴアフィニティー精製Ｌktタンパク質に対して生じるウサギの抗血清を用いてウエスタン・ブロッティングにより試験した。ウエスタン・ブロット（図４）から、Ｐh−Ｌkt-株は血清中に存在するどの抗体とも特異的に結合しないが、野生型ＡＴＣＣ株とｐＩＧ３Ｂ−Ｌkt含有Ｐh：Ｌkt-株の両方は、Ｌkt抗血清と反応する、Ｌktの予想分子量のタンパク質を産生することが理解できる。
実施例１
ウシでのＰｈ毒素--ワクチンの評価
およそ１年齢のウシを使用前に採血して、Ｐhに対する抗体が予め存在しないことを確認し、その後、それらを３匹ずつ２つの無作為グループに分けた。０日目に、１グループの３匹にＰh−Ｌktの指数増殖培養物５０ml（５×１０10c.f.u.に等しい）を気管内接種により与えた。ワクチン接種実験に先立ち、ウシに５×１０10から２×１０11の範囲のＰh−Ｌkt-ワクチン株用量を与えるという実験を実施し、臨床兆候について監視し、肺病変が発症したかどうかを測定するため攻撃後１週間で解剖した。試験した全ての用量で肺病変は現れず、またウシも正常範囲外の体温を示さなかった。第２グループは非ワクチン接種対照とした。１４日目にウシに０日目のように再度ワクチン接種した。２８日目に、全てのウシを野生型Ｐhの指数増殖培養物１００mlで気管内直接接種により攻撃した。臨床兆候を次の８日間監視し、その時点で全てのウシを安楽死させ、肺病変をスコアした。
攻撃後８日目の解剖時点で各動物に存在する肺病変の数および重篤度は表１に表す。非ワクチン接種対照をＰhで攻撃すると、攻撃を受けたウシ３匹のうち２匹で急性肺炎が起こった。３番目のウシは、解剖時にＰh感染のなんの兆候も示さなかったが、恐らく、気管を介し攻撃を送達する際のエラーによるか、あるいは、Ｐhが多くのウシでは共生物であるので、このウシでは攻撃前にＰhに対する免疫が発生したのかもしれない。ワクチン接種した動物グループの中で、１匹だけＰh感染の兆候を発症した。それは、右先端葉における幾つかの小葉が硬化（１cm以下のサイズ）した形であった。
この実験は、明らかに、Ｐh誘導ＢＲＤからウシを防御するための生ワクチンとしてＰh−Ｌkt-を使用できる可能性を示している。Ｐh−Ｌkt-株による攻撃はウシ肺において病変を誘導しない（１０11c.f.u.の用量まで）ことが分かっているので、ワクチン株はウシに悪影響を及ぼさないであろう。最も適切な攻撃用量を測定するために実施した実験では、野生型Ｐhによりこの実験に使用した用量で３回攻撃した結果、４８時間以内に動物（３匹中３匹）を死に至らしめた。最高の１×１０11c.f.u.で攻撃した場合でされ、たった１回のワクチン接種でＰh感染の兆候を示し、これは、３匹の非ワクチン接種対照のうち２匹で観測されたレベルよりもかなり低いレベルであった。この動物における病変を更に特性化したところ、それが８日齢以上の慢性形態である（即ち、攻撃前に存在する）ことが示された。この病変から単離したＰhは、Ｌktを産生することが分かっているので、ワクチン株ではない。恐らく、この病変はワクチン接種の際の日和見的な野生型Ｐh感染の定着から生じたと思われる。１匹は、Ｐh−Ｌkt-株のＰh感染の軽い兆候を発症したが、防御免疫においてある役割を持つことが知られている不活性形態のＬktがこの株から発現することにより、得られる防御レベルが増大すると結論付けるのが妥当である。この株からＬktの不活性形態が発現する可能性は、この明細書のほかの部分にも示している（図４）。
外来タンパク質のＰhベクターからの発現
Ｐhから組換え遺伝子が発現される可能性は、本明細書の前述部分のＬkt遺伝子がＰh Ｔox-株内でプラスミドから発現されるところで示した。このプラスミドから発現されるＬktは、ウェスタンブロットにおいてＬktに対して産生される抗血清と反応することが分かった（図４）。ＬktをＰhから発現させる以外に、別の抗原をＬktオペロンの修飾により最初に無毒化しておいたＰh株から発現させて、多価ワクチンを作ることも可能である。
更に、Ｐhが細菌性ベクターとして働く可能性を示すため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の発現を支配する多くのプロモーターを使用した一連のpＩＧベースの発現カセット（図５）を構築した。ＣＡＴ遺伝子は、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を与え、かつ酵素反応において容易に定量される酵素をコードする。我々の研究室では、ＰhにおけるＣＡＴ遺伝子の発現を支配するために使用したプロモーターをパスツレラ科ファミリーに属する様々な細菌から単離した。様々なプロモーター／ＣＡＴカセット（pＩＧ−ＣＡＴ）をＥ．コリにて構築し、次いでこれを材料および方法のところで記載のようにＰhへ形質転換した。プラスミドＤＮＡを抗生物質耐性コロニーから単離し、制限酵素消化により解析して、予想プロフィールを確認した。ＣＡＴ発現カセットで形質転換した全てのＰh株は、抗生物質クロラムフェニコールに対して耐性であることが分かった。各構築物により発現されるＣＡＴ活性のレベルは酵素アッセイにより定量した。
Ｐh／pＩＧ−ＣＡＴの指数増殖培養物のサンプルをペレット化し、細菌をトリスｐＨ８.０に再懸濁した。可溶性タンパク質を超音波および遠心により細菌から単離して、抽出物をＣＡＴアッセイに使用したが、ＣＡＴ酵素アッセイは、反応緩衝液（クロラムフェニコール１mg／ml、3Ｈ−ＣoＡ０.１μl／１５０μl(Amersham International)、トリスpＨ８.０）１５０μlおよびタンパク質抽出物５０μlを含有した。反応を３０分間進行させ、Econoflur（Dupont）シンチレーション液を用いるシンチレーションカウンティングによりＣＡＴ酵素活性レベルを見積もった。ＣＡＴ酵素反応は、ＣＡＴ酵素により3Ｈ基が有機溶媒（シンチレーション液）に不溶性の基質から有機可溶性産物へ転移することに基づく。評価した全てのプロモーターからは、全てのＰh／pＩＧ−ＣＡＴ構築物のバックグラウンドレベルを有意に越える（表２）ＣＡＴレベルが得られ、Ｐh内での外来遺伝子発現を達成するのに適していることが分かった。
細菌ベクターシステムとしてのＰhの開発により、商業的に重要な外来タンパク質をウシ粘膜に送達することが可能になるであろう。送達できるタンパク質種には、免疫系を制御および調節するサイトカインがあり、免疫系を非特異的にアップレギュレーションするのに役立つであろう。ベクター化分子は、その他の病原性細菌からの防御抗原でもあり、多価ワクチンを構築する可能性を提供する。このようなワクチンは、単回ワクチン接種後に１種以上の疾病から防御することが可能である。
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最後に、様々な変形、修飾および／または追加が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、既に記載した部分の構造および配置に導入できると理解される。
文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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