(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003889190.tif 000010
を有するN-ω-カルボキシメチルアルギニン。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を含む結合組織グリケーションマーカー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグリケーションマーカーとして有用な新規な化合物であるカルボキシメチルアルギニン（以下「ＣＭＡ」と略すことがある。）に関する。更には、当該ＣＭＡの結合組織のグリケーションマーカーすなわち、例えば、老化マーカー、酸素ストレス傷害マーカー、糖尿病合併症用マーカー等としての使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体組織中のタンパク質は、グルコースなどの還元糖やアスコルビン酸などと非酵素的に反応して糖化される。該反応はグリケーション（非酵素的糖化）またはメイラード反応と呼ばれ、老化や高血糖状態、酸化ストレスの増大に伴って起こる。従って、グリケーション反応生成物は、これらの病態の指標（マーカー）、例えば、老化マーカー、糖尿病合併症マーカー、腎不全マーカーなどとして有用である。例えば、特開平９−１７８７４０号公報には、グリケーション反応生成物の一つであるカルボキシメチルリジン（以下ＣＭＬと呼ぶ）が、糖尿病および糖尿病合併症マーカーとしての利用できることが開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ＣＭＬは生体での存在が普遍的であるがゆえにグリケーションの起きている組織を特定するのは困難である。したがって、組織特異的なグリケーション生成物こそがグリケーションマーカーとして有用と考えられるが、これまで特定組織に固有なグリケーション生成物は見つけられていなかった。グリケーションによって生体中の様々なタンパク質が糖化を受けるが、特に代謝回転の遅い結合組織タンパク質、特にコラーゲンは、長い期間のグリケーションを受ける。
【０００４】
本発明者らは、コラーゲンに未発見の特有なグリケーション生成物が形成されると考え、鋭意検討した結果、コラーゲンまたはその変性物もしくは加水分解物の少なくとも一つのアルギニン残基のグアニジル基がカルボキシメチル化されたグリケーション生成物を見いだした。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、組織特異的なグリケーションのマーカーとして有用な化合物を提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記グリケーションのマーカーを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、結合組織タンパク質に特異的なグリケーションのマーカーとして使用できる新規化合物であるカルボキシメチルアルギニンを見出した。ＣＭＡはアルブミン等のタンパク質には形成されず、コラーゲンに特徴的であった。更にグリケーションモデル（老化モデル）組織において経時的に蓄積されることを確認し、グリケーションマーカーとして利用できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、結合組織特異的な新規グリケーションマーカーとして使用出来る新規化合物である、式：
【０００８】
【化２】
0003889190.tif 000002
【０００９】
を有するN-ω-カルボキシメチルアルギニンにある。
さらに本発明は、
【００１０】
【化３】
0003889190.tif 000003
【００１１】
を有するN-ω-カルボキシメチルアルギニン化合物を含む結合組織グリケーションマーカーにある。
以下、本発明について詳細に述べるが、本発明に使用する物質、製法は下記に限定されるものではない。
【００１２】
今まで、コラーゲン分子にどのようなグリケーション生成物が形成されるのか明らかになっていなかった。そこで本発明者はインビトロでコラーゲンにグリケーションを起こさせ、未知のグリケーション生成物の単離・同定を行った。その方法は以下の通りである。すなわち、牛皮から調製した１％のコラーゲンを２００ｍＭのグルコースとリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３７℃で1ヶ月静置してグリケーションを起こさせた。塩酸によりグリケーション生成物を単離すると塩酸との加熱で構造が壊れるため、本発明者等は、Bensusan等の方法［Bensusan, H.B.等、Biochim. Biophys. Acta, 251, 100 - 108, (1971)］にしたがい、ブタ腎臓由来アミノペプチダーゼを用いてグリケーションさせたコラーゲンを分解し、未知のグリケーション生成物の探索を行った。グリケーションさせたコラーゲンの酵素分解物をアミノ酸分析にかけたところ、未知のアミノ酸ピークが検出された。このピーク成分を精製し、ＭＳ、ＮＭＲにより、N-ω-カルボキシメチルアルギニンであることを確認した。したがって、このグリケーション生成物はコラーゲンのアルギニン残基のグアニジル基がカルボキシメチル化されたものであることが明らかとなった。
【００１３】
そこで、上記で単離されたN-ω-カルボキシメチルアルギニンが、老化、酸素ストレス傷害、糖尿病合併症用のマーカー、すなわち、グリケーションマーカーとして有用であることが示唆された。
【００１４】
N-ω-カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）は、新規物質であり、化学式：
【００１５】
【化４】
0003889190.tif 000004
【００１６】
を有する。
このＣＭＡはアルギニンを原料にして合成できる。合成法については特に限定されるものではないが、例えばアセチルアルギニンをヨード酢酸等とNaOH存在下、反応させた後、同量のHClを加えて加熱し、保護基であるアセチル基を外せば良い。このような方法によって得られたＣＭＡは、液体クロマトグラフィー等、当業界で公知の精製方法により精製品とすることができる。
【００１７】
また本発明のＣＭＡは上記方法で得られたカルボキシメチル化（以下、「ＣＭ化」と呼ぶことがある）コラーゲンもしくはＣＭ化ペプチドを用いて加水分解することによっても得られる。ＣＭ化コラーゲンから得たＣＭＡについてもＮＭＲ分析を行い、上記合成ＣＭＡの分析値と同じ値が得られることを確認した。
【００１８】
本発明のＣＭＡは老化マーカー等のグリケーションマーカーとして使用することができる。すなわち、生体内のＣＭＡの濃度を、本発明のＣＭＡを標準品として測定し、これにより、生体内の結合組織にどの程度グリケーション反応が起きているか決定することができる。生体内のＣＭＡの濃度、例えば尿中のＣＭＡ濃度を測定する方法は特に限定されない。検出方法を例示すれば、液体クロマトグラフィーにてＣＭＡを検出する方法、液体クロマトグラフィー/質量分析またはガスクロマトグラフィー/質量分析にてＣＭＡを検出する方法等が挙げられる。
【００１９】
このようにＣＭＡは結合組織のグリケーションマーカーとして使用できるが、具体的には、例えば、結合組織の柔軟性低下などの老化進行度、結合組織に於ける糖尿病合併症の罹患あるいは酸素ストレス傷害の有無あるいはその程度等を判定、予測する診断マーカーとして使用できる。また、上記疾病の予防薬あるいは治療薬等の薬効の評価用マーカーとして使用できる。
【００２０】
【実施例】
（実施例１）ＣＭＡの合成
０．２Ｍのアセチルアルギニン（和光純薬、試薬特級）を０．２Ｍのモノヨード酢酸（和光純薬、試薬特級）と1N NaOH（和光純薬、試薬特級）の存在下、37℃で24時間反応させた後、同量の3N HClを加えて110℃で1時間加熱した。得られた反応液から液体カラムクロマトグラフィーによってＣＭＡの精製を行った。カラムはＣ−１８逆相カラム（昭和電工、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｃ−１８  ５−Ａ）を用い、イオンペア剤（ＨＦＢＡ、５０ｍＭ）存在下、アセトニトリル（０→２０％リニアグラジエント）で溶出し、精製されたＣＭＡ画分をロータリーエバポレーター（ヤマト科学製）で濃縮して透明シロップを得た。精製生成物をＮＭＲおよびＭＳにより分析し以下の分析値を得た。
0003889190.tif 000005
この分析値により、得られた生成物がN-ω-カルボキシメチルアルギニンであることが確認できた。これらの分析スペクトルを図１および図２に示した。
（実施例２）コラーゲンのグリケーションに伴うＣＭＡ量の変化
グリケーション（老化）モデル結合組織（コラーゲン）におけるＣＭＡ量測定の実施例を示す。
作成したグリケーションモデルコラーゲン：
酸可溶性Ｉ型コラーゲン（ウシ、皮）              1mg
グルコース（和光純薬、試薬特級）        36mg
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)                 1ml
37℃、0〜34日間静置
このグリケーションモデルコラーゲンをブタ腎臓由来アミノペプチダーゼ[Bensusan, H. B.等,Biochim. Biophys. Acta., 251, 100 - 108, (1971)]により加水分解し、含有ＣＭＡ濃度をアミノ酸分析機（日立、L-8500型）を用いて定量した。
【００２１】
【表１】
0003889190.tif 000006
【００２２】
図３に、インキュベート日数対ＣＭＡ蓄積量の図表を示す。
（実施例３）ラット尻尾腱のグリケーションに伴うＣＭＡ量の変化
実際の結合組織（ラット尻尾腱）のグリケーションに伴うＣＭＡ量測定の実施例を示す。下記のグリケーションモデルタンパク質をブタ腎臓由来アミノペプチダーゼにより加水分解し、含有ＣＭＡ濃度をアミノ酸分析機を用いて定量した。
作成したグリケーションモデルラット尻尾腱：
ラット（Wister種、10週齢、雄性）尻尾腱  10mg
グルコース（和光純薬、試薬特級）                36mg
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)                 1ml
37℃、0〜38日間静置
このグリケーションモデル結合組織をブタ腎臓由来アミノペプチダーゼにより加水分解し、含有ＣＭＡ濃度をアミノ酸分析機を用いて定量した。
【００２３】
【表２】
0003889190.tif 000007
【００２４】
図４に、インキュベート日数対ＣＭＡ蓄積量の図表を示す。
（比較例）ＢＳＡおよびリゾチームのグリケーションに伴うＣＭＡ量の変化
結合組織タンパク質以外のタンパク質（ＢＳＡおよびリゾチーム）のグリケーションに伴うＣＭＡ量測定結果をコラーゲンとの対照比較例として示す。
作成したグリケーションモデルＢＳＡ：
BSA（シグマ社製）                       10mg
グルコース（和光純薬、試薬特級）                36mg
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)                 1ml
37℃、0〜38日間静置
ＢＳＡの結果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
0003889190.tif 000008
【００２６】
作成したグリケーションモデルリゾチーム：
リゾチーム（シグマ社製）                        10mg
グルコース（和光純薬、試薬特級）                36mg
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)                 1ml
37℃、0〜38日間静置
リゾチームの結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
0003889190.tif 000009
【００２８】
上記結果より、ＣＭＡはグリケーションに伴って経時的に、結合組織特異的に蓄積されることが確認されたが、ＢＳＡおよびリゾチームには蓄積されないことが確認された。
【００２９】
【発明の効果】
ＣＭＡは、臨床検査の領域に於いて結合組織に特異的なグリケーションマーカー（老化マーカー、酸素ストレス傷害マーカー、糖尿病合併症用マーカー）として使用し得る有用な化合物である。このことは上記新規マーカーを利用した、新たな結合組織疾病の研究、診断システムの構築の可能性を意味するものであり、その工業的意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣＭＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】本発明のＣＭＡのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図３】グリケーションモデルコラーゲンのインキュベート日数対ＣＭＡ蓄積量の図表を示す。
【図４】グリケーションモデルラット尻尾腱のインキュベート日数対ＣＭＡ蓄積量の図表を示す。
【図１】
0003889190.tif 000011
【図２】
0003889190.tif 000012
【図３】
0003889190.tif 000013
【図４】
0003889190.tif 000014