(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１】
0004014430.tif 000056
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出するステップと、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。
【請求項２】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数２】
0004014430.tif 000057
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出するステップと、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。
【請求項３】
前記バンドの位置に関する情報は、前記電気泳動像上での所定の基準位置とバンドとの間の距離で表されることを特徴とする請求項１または２記載の微生物識別方法。
【請求項４】
前記バンドの位置に関する情報は、当該バンドに含まれるＤＮＡ断片のサイズで表されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項５】
前記バンドの強度に関する情報は、前記電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、前記画像データの階調分布に基づいて算出されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項６】
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係は、各プライマーごとに各バンドの位置に関する情報と各バンドの強度に関する情報との対応を示すことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項７】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項８】
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項９】
前記電気泳動像のバンドを検出するステップは、前記電気泳動像において前記参照用ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片または前記ＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づくしきい値を設定し、前記電気泳動像において前記しきい値以上の発光強度を有するバンドを選択するステップを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項１０】
前記データベースには複数種類の微生物についての前記対応関係が記憶されたことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項１１】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する前記画像データを補正するステップと、
前記補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数３】
0004014430.tif 000058
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出するステップと、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。
【請求項１２】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する前記画像データを補正するステップと、
前記補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数４】
0004014430.tif 000059
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出するステップと、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。
【請求項１３】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データ変換手段により得られた前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、
前記複数のプライマーと前記バンド情報検出手段により検出された前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について作成された前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するバンド配置手段と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、
前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記識別手段は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数５】
0004014430.tif 000060
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出する手段と、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する手段とを含むことを特徴とする微生物識別装置。
【請求項１４】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データ変換手段により得られた前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、
前記複数のプライマーと前記バンド情報検出手段により検出された前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について作成された前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するバンド配置手段と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、
前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記識別手段は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数６】
0004014430.tif 000061
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出する手段と、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する手段とを含むことを特徴とする微生物識別装置。
【請求項１５】
識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出する処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置する処理と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、
前記識別対象となる微生物を識別する処理とを、
前記コンピュータに実行させ、
前記識別する処理は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数７】
0004014430.tif 000062
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出する処理と、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する処理とを含むことを特徴とする微生物識別プログラム。
【請求項１６】
識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出する処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置する処理と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、
前記識別対象となる微生物を識別する処理とを、
前記コンピュータに実行させ、
前記識別する処理は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数８】
0004014430.tif 000063
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出する処理と、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する処理とを含むことを特徴とする微生物識別プログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物識別方法、微生物識別装置および微生物識別プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭等から排出される有機系廃棄物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解することにより肥料が作成される。
【０００３】
このような生ゴミ処理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）において、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。
【０００４】
しかしながら、より良質な肥料を作成するためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御するためにも必要である。また、作成された肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の情報を知ることも重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、微生物群の情報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難しい細菌については調べることが困難であった。
【０００６】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うにはＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００７】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００８】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【０００９】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより微生物の状態を分析することが可能となる。
【００１０】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物との対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から微生物群を構成する微生物を識別することはできない。
【００１１】
そこで特開２００１−２７５７００号公報には、ＰＣＲ法を利用し、最適化したＰＣＲ用のプライマーとＰＣＲ条件を用いて一種類の微生物から微生物固有のＤＮＡ断片を１カ所だけ取り出すことが可能なＳＳＣ−ＰＣＲ（Single Strain Counting-PCR）法が提案されている。しかしながら、複数の細菌に対してＳＳＣ−ＰＣＲ法を適用した場合、単一の細菌にＳＳＣ−ＰＣＲ法を適用した場合には十分得られていたＤＮＡ断片が少量しか増幅されない場合や、電気泳動像では観察できなくなることがある。これは、プライマーの結合力が強いＤＮＡ領域が集中的に増幅されるのに対して、プライマーの結合力が弱いＤＮＡ領域は増幅の競争に負けて、増幅効率が低くなるためであると考えられる。
【００１２】
以上のように、識別対象となる微生物が複数の微生物からなる微生物群である場合には、増幅の競争反応が起こるために増幅したバンドの強度をもとに細菌の検出または同定を行うことが難しくなる。
【００１３】
本発明の目的は、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生物識別方法、微生物識別装置および微生物識別プログラムを提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
第１の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数９】
0004014430.tif 000002
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出するステップと、面積比率Ｒ２に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを含むものである。
第２の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１０】
0004014430.tif 000003
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出するステップと、面積比率Ｒ３に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを含むものである。
【００１５】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００１６】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００１７】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００１８】
ここで、この微生物識別方法においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００１９】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００２１】
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
【００３３】
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００３４】
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００４０】
バンドの強度に関する情報は、電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、画像データの階調分布に基づいて算出されてもよい。
【００４１】
バンドの位置に関する情報は、電気泳動像上での所定の基準位置とバンドとの間の距離で表されてもよい。あるいは、バンドの位置に関する情報は、当該バンドに含まれるＤＮＡ断片のサイズで表されてもよい。
【００４２】
バンドの強度に関する情報は、電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、画像データの階調分布に基づいて算出されてもよい。
【００４３】
複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係は、各プライマーごとに各バンドの位置に関する情報と各バンドの強度に関する情報との対応を示してもよい。
【００４４】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００４５】
この場合、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
【００４６】
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００４７】
この場合、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像に対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データの階調を補正することにより、電気泳動像におけるバンドの発光強度の正確な比較が可能となる。
【００４８】
電気泳動像のバンドを検出するステップは、電気泳動像において参照用ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片またはＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づくしきい値を設定し、電気泳動像においてしきい値以上の発光強度を有するバンドを選択するステップを含んでもよい。
【００４９】
この場合、発光強度がしきい値未満であるバンドは増幅効率が低く再現性の低いＤＮＡ断片のバンドである。また、発光強度がしきい値以上であるバンドは増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のバンドである。したがって、しきい値以上の発光強度を有するバンドを選択することにより、増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のみを分析することが可能になる。それにより、識別結果の信頼性が向上する。
【００５０】
データベースには複数種類の微生物についての対応関係が記憶されてもよい。これにより、識別対象となる種々の微生物を識別することができる。
【００５１】
第３の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する画像データを補正するステップと、補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１１】
0004014430.tif 000004
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出するステップと、面積比率Ｒ２に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを含むものである。
第４の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する画像データを補正するステップと、補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１２】
0004014430.tif 000005
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出するステップと、面積比率Ｒ３に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを含むものである。
【００５２】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００５３】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００５４】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００５５】
ここで、この微生物識別方法においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００５６】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００５７】
また、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００５８】
さらに、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像に対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データの階調を補正することにより、電気泳動像におけるバンドの発光強度の正確な比較が可能となる。
【００６０】
第５の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データ変換手段により得られた画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、複数のプライマーとバンド情報検出手段により検出されたバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について作成された対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するバンド配置手段と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、識別手段は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１３】
0004014430.tif 000006
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出する手段と、面積比率Ｒ２に基づいて識別対象となる微生物を識別する手段とを含むものである。
第６の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データ変換手段により得られた画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、複数のプライマーとバンド情報検出手段により検出されたバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について作成された対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するバンド配置手段と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、識別手段は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１４】
0004014430.tif 000007
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出する手段と、面積比率Ｒ３に基づいて識別対象となる微生物を識別する手段とを含むものである。
【００６１】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００６２】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００６３】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００６４】
この微生物識別装置においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００６５】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００６７】
第７の発明に係るコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出する処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置する処理と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、識別対象となる微生物を識別する処理とを、コンピュータに実行させ、識別する処理は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１５】
0004014430.tif 000008
上式（４）により面積比率Ｒ２を算出する処理と、面積比率Ｒ２に基づいて識別対象となる微生物を識別する処理とを含むものである。
第８の発明に係る微生物識別プログラムは、識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出する処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置する処理と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、識別対象となる微生物を識別する処理とを、コンピュータに実行させ、識別する処理は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａiおよびｂiとし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１６】
0004014430.tif 000009
上式（５）により面積比率Ｒ３を算出する処理と、面積比率Ｒ３に基づいて識別対象となる微生物を識別する処理とを含むものである。
【００６８】
第７および第８の発明に係る微生物識別プログラムによれば、第１および第２の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。
【００７０】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る微生物識別装置を示す図である。
【００７１】
図１に示すように、微生物識別装置は、ＳＳＣ- ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４および結果表示手段５からなる。
【００７２】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベース格納部４はハードディスク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等からなる。
【００７３】
なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはSingle Strain Counting Polymerase Chain Reactionのことであり、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００７４】
図２は、図１の微生物識別装置を用いた微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【００７５】
図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。
【００７６】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ2 および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【００７７】
なお、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【００７８】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【００７９】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては塩基配列の異なる複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。例えば、この場合においては４６種類のプライマーを用いるので、異なるプライマーを含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、４６種類のＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【００８０】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【００８１】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【００８２】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生物のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入する可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由来のものであることが確認できる。
【００８３】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、４６種類のプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【００８４】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【００８５】
図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成される。
【００８６】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、前述の塩基配列の異なるプライマーをそれぞれ含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【００８７】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【００８８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物または微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【００８９】
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【００９０】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【００９１】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【００９２】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【００９３】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【００９４】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【００９５】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【００９６】
図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧの塩基配列（配列番号１４）を有するプライマーを用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【００９７】
図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【００９８】
最初に、図５（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【００９９】
次に、図５（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【０１００】
続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【０１０１】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【０１０２】
図６に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【０１０３】
その後、図７に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【０１０４】
図７に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【０１０５】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０６】
その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【０１０７】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【０１０８】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来のものであることが確認できる。
【０１０９】
続いて、図２に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて電気泳動像の各バンドを検出する（ステップＳ３）。
【０１１０】
ところで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【０１１１】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の画像データの画像補正を行う（ステップＳ４）。
【０１１２】
図８は画像補正の工程の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、画像データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ増幅断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する（ステップＳ４−１）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。
【０１１３】
なお、ここでの発光強度とは、発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１１４】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【０１１５】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する。このようにして、電気泳動像の画像データの階調補正を行う（ステップＳ４−２）。
【０１１６】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【０１１７】
続いて、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいてしきい値を設定し、しきい値未満の発光強度のバンドを削除する（ステップＳ４−３）。これにより、増幅効率が低く再現性の低いバンドを除去することができる。このようにして得られた増幅効率が高く再現性の高いバンドを分析することにより、信頼性の高いデータが得られる。
【０１１８】
図９は、上記のような画像補正を行った後の電気泳動像の画像データの例を示す図である。図９において、レーン１，１０は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像のデータを示している。また、レーン２〜９は、配列番号１〜８のプライマーにおける電気泳動像のデータを示している。なお、配列番号９〜４６の各プライマーについても、図９に示すような電気泳動のデータがそれぞれ得られる。
【０１１９】
続いて、図２に示すように、各プライマーにおけるバンドの位置とＤＮＡサイズマーカにおけるバンドの位置とを比較することにより、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対数）に変換して測定する。さらに、各位置のバンドについて、バンド強度（バンドの発光強度）を測定する（ステップＳ５）。ここでのバンド強度とは、バンドの発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１２０】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１２１】
さらに、解析用コンピュータ３を用いて、上記で得られた各プライマーにおけるバンド位置およびバンド強度のデータをまとめ、バンドデータの一欄を作成する（ステップＳ６）。
【０１２２】
通常、ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、種類の異なる複数のプライマーを用いて複数のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲの結果、各プライマーにつき１つの電気泳動像が得られる。この場合においては４６種類のプライマーを用いているので、４６種類の電気泳動像が得られる。
【０１２３】
例えば、前述の図９のように１枚の写真に８種類のプライマーの電気泳動像を示す場合においては、合計６枚の写真に４６種類のプライマーの電気泳動像が示される。したがって、各写真について画像データが得られる。
【０１２４】
ここで、図１の微生物識別装置の解析用コンピュータ３においては、このような複数枚の写真にわたって示された４６種類のプライマーのバンドのデータを集め、１つのデータにまとめることが可能である。それにより、サンプルの微生物に関するＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータの一欄を作成することができる。
【０１２５】
解析用コンピュータ３により作成されたバンドデータの一欄には、プライマー名（配列番号）、サイズで表したバンド位置およびバンド強度が記載される。作成されたバンドデータの一欄を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
0004014430.tif 000010
【０１２７】
なお、表１のプライマー名の項目においては、例えば、配列番号１のプライマーがPr１と記載される。
【０１２８】
上記においては、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズで表示する場合について説明したが、後述の実施例において説明するように、バンドの位置をバンドサイズで表示するのではなく、実測した距離に基づいて表示してもよい。この場合、バンドデータの一欄のバンド位置の項目には、例えば実測した距離の比が記載される。
【０１２９】
また、上記においては、バンド強度としてバンドの発光強度分布のピークの高さを測定する場合について説明したが、バンド強度として、バンドの発光強度分布の面積（容量）を測定してもよい。バンドの発光強度分布の面積はバンドに含まれるＤＮＡの含有量に対応するので、発光強度分布の面積をバンド強度として用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１３０】
さらに、バンド検出、画像補正およびバンド位置・バンド強度の測定を行う順番は、上記に限定されるものではなく、必要に応じて逆転する場合もある。
【０１３１】
続いて、図２に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物のデータ（表１）に基づいて、データベース格納部４（図１）のデータベースに登録されている複数の微生物のデータをサーチし、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの複数の微生物の配列番号１〜４６のプライマーPr１〜４６に関するバンドデータとを比較する。さらに、データベースからサンプルの微生物に該当する微生物を後述する方法１〜７のいずれかを用いて検索する（ステップＳ７）。
【０１３２】
以下に、データベース検索（ステップＳ７）の詳細について、順を追って説明する。
【０１３３】
まず、サンプルの微生物およびデータベースの微生物における同一のプライマーの同一位置のバンドを検索する。
【０１３４】
図１に示すように、微生物識別装置のデータベース格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−ＰＣＲのデータ、例えば電気泳動像の画像データやバンドデータの一欄が登録されている。なお、データベースに登録されているバンドデータの一欄の構成は、上記において作成したサンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）の構成と同様である。
【０１３５】
例えば、表２は、データベースに登録されている微生物Ａのバンドデータの一欄を示すものである。なお、この微生物Ａは細菌である。
【０１３６】
【表２】
0004014430.tif 000011
【０１３７】
このようなデータベースに登録されている複数の微生物のバンドデータの一欄から、サンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）に基づいて、同一のプライマーにおける同一位置のバンドを検索する。
【０１３８】
なお、この検索において、データベースの微生物のバンドの位置がサンプルの微生物のバンドの位置からある範囲内でずれて存在する場合、両者は同一位置のバンドであるとみなす。この同一位置のバンドとみなす範囲は、実験の誤差に基づいて決定されるものであり、必要に応じて変更する。
【０１３９】
例えば、図１０に示すように、サンプルの微生物のバンドデータ（表１）に基づいてデータベースの微生物Ａのバンドデータ（表２）をサーチした場合には、図中の矢印で示したバンドが同一プライマーにおける同一位置のバンドとして検索される。
【０１４０】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、このような同一プライマーにおける同一位置のバンドの検索を行う。
【０１４１】
次に、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの微生物のバンドデータとを１つにまとめ、サンプルの微生物およびデータベースの微生物について、各プライマーPr１〜４６における全てのバンドの位置（サイズ）および強度のデータの一欄を作成する。
【０１４２】
例えば、表３は、サンプルの微生物のデータ（表１）と、データベースの微生物Ａのデータ（表２）とをまとめてバンドデータ一欄を作成したものである。
【０１４３】
【表３】
0004014430.tif 000012
【０１４４】
表３に示すように、検索したサンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける同一プライマーの同一位置のバンド（図１０の矢印で示したバンド）に関しては、表中のバンドサイズの項目に、サンプルの微生物のバンドサイズが記載される。
【０１４５】
また、例えばプライマーPr１のサイズ１２９８のバンドのように、サンプルの微生物には存在するがデータベースの微生物Ａには存在しないバンドに関しては、データベースの微生物Ａのバンド強度を０とする。一方、例えばプライマーPr２のサイズ３４３２のバンドのように、データベースの微生物Ａには存在するがサンプルの微生物には存在しないバンドに関しては、サンプルの微生物のバンド強度を０とする。
【０１４６】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物についても、それぞれ表３に示すようなバンドデータの一欄を作成する。
【０１４７】
（方法１）：バンド一致率の算出方法
上記の工程において作成したバンドデータ一覧をもとに、データベースに登録されている微生物Ａの総バンド数に対するサンプルの微生物のうち微生物Ａのバンドに一致するバンド数の割合を求める。
【０１４８】
（方法２）：サンプルの微生物およびデータベースの微生物における相関係数の算出方法
ここでは、上記において作成したバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドにおけるサンプルの微生物およびデータベースの微生物のバンド強度を比較し、両者の相関関係を調べる。
【０１４９】
例えば、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおけるバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドについてサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較すると、図１１に示すような相関関係が得られる。図１１においては、横軸にサンプルの微生物のバンド強度をとり、縦軸にデータベースの微生物Ａのバンド強度をとっている。なお、図１１においては全てのバンドに関するプロットを行っていないが、実際には全てのバンドに関してプロットを行って相関関係を調べる。
【０１５０】
このようにサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較することにより、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける相関係数を算出する。
【０１５１】
また、データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、上記と同様の比較を行ってサンプルの微生物との相関関係を調べ、相関係数をそれぞれ算出する。なお、このような相関係数の算出は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行う。
【０１５２】
ここで、相関係数の算出方法は、算出に用いるデータのとり方により、図１２（ａ）〜（ｃ）に示す３つの方法が上げられる。以下に、３つの方法を説明する。
【０１５３】
（ａ）サンプルの微生物およびデータベースの微生物の全データを用いた相関係数の算出方法
図１２（ａ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度およびデータベースの微生物のバンド強度のデータを０のデータも含め全て用いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを含め、全てのプロットを考慮して相関係数を求めるものである。
【０１５４】
ここで、サンプルが複数の微生物の混合物である場合にこの方法を適用すると、サンプルとデータベースの所定の微生物との間に相関関係があっても、算出により求められた相関係数は小さな値となる。したがって、この（ａ）の方法は、サンプルが単一の微生物の場合に適用することが好ましい。
【０１５５】
（ｂ）サンプルの微生物とデータベースの微生物との両方に存在するバンドのデータのみを用いた相関係数の算出方法
図１２（ｂ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度のデータおよびデータベースの微生物のバンド強度のデータにおいて、０のデータを全て除いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを考慮せず、これ以外のプロットを考慮して相関係数を算出するものである。
【０１５６】
上記の（ａ）の方法において前述したように、サンプルが複数の微生物の混合物である場合には、データベースの微生物のバンド強度が０であるデータを除いた方が、高い相関係数が得られるので好ましい。また、ＰＣＲ反応においては何らかの原因で現れるべきバンドが現れないケースがあり、この場合においては、サンプルの微生物のバンド強度が０であるデータ除いた方が高い相関係数が得られるので好ましい。
【０１５７】
（ｃ）データベースの微生物に存在するバンドのデータを全て用いた相関係数の算出方法
図１２（ｃ）に示すように、この方法は、０のデータを含むサンプルの微生物のデータと、０のデータを含まないデータベースの微生物のデータとを用いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における横軸上のプロットを考慮せず、縦軸上のプロットを含むこれ以外のプロットを考慮して相関係数を算出するものである。
【０１５８】
例えば、サンプルが複数の微生物の混合である場合には、サンプルを構成する微生物の種類を確認するために、０のデータも含めサンプルの微生物のバンドデータを全て用いて相関係数を算出すべきである。その理由は、データベースの微生物のバンドのうち数本のバンドのみがサンプルの微生物のバンドと一致し、さらにたまたまそれらのバンドが良好な相関関係を示す場合においては、サンプルの０のデータを考慮しない上記の（ｂ）の方法により相関係数を算出すると、相関関係のあるバンドが数本であるにも係わらず実質よりも高い値の相関係数が求められるからである。これに対して、このような場合に（ｃ）の方法を用いると、サンプルの微生物の０のデータを考慮するので、（ｂ）の方法を用いた場合ほど相関係数が高くならない。
【０１５９】
相関係数の算出式を以下に示す。
【０１６０】
【数１７】
0004014430.tif 000013
【０１６１】
なお、式（Ａ１）において、Ｎはデータベースの微生物とサンプルの微生物においてバンドのサイズが一致したバンドの数のうち（ａ）〜（ｃ）の方法の各々において対象となるバンドの数である。ａiはデータベースの微生物のバンド強度、ａｋはデータベースの微生物のバンド強度の平均、ｂiはサンプルの微生物のバンド強度、ｂｋはサンプルの微生物のバンド強度の平均（データベースの微生物のバンドと一致した場合のみ）である。ｉはバンドの識別番号であり、１〜Ｎの整数である。
【０１６２】
（方法３）：バンドの一致率の算出方法
前述したように、複数種類の微生物を含むサンプルの微生物から得られるバンド強度は、データベースに格納した微生物のバンド強度よりも弱くなる傾向がある。そこで、相関図を用いてバンドの一致率を算出する。
【０１６３】
なお、実験ごとに電気泳動ゲルを染色する色素の濃度や写真の露光状態でバンドの強度が異なる。そのため、本来、ＤＮＡサイズマーカーなどを用いて、バンド強度の標準化を行う必要がある。ここでは、簡便な方法として、バンド強度の最大値を用いて補正を行う。
【０１６４】
図１３は、データベースの微生物のバンド強度とサンプルの微生物のバンド強度との相関関係を示す相関図である。図１３において、Ｘ軸はサンプルの微生物のバンド強度を表し、Ｙ軸はデータベースの微生物のバンド強度を表す。
【０１６５】
サンプルの微生物のバンドのうちデータベースの微生物のバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置を有するサンプルの微生物のバンドとデータベースの微生物のバンドとの組を求め、図１３の相関図にプロットする。
【０１６６】
相関図に配置されたバンド（プロット）のうち、データベースの微生物のバンド強度が最大のプロットのＹ座標をＡとする。ここでは、データベースの微生物のバンド強度が最大のプロットをｃ３とする。このプロットｃ３を通るＸ軸に平行な直線Ｙ＝Ａを直線Ｓとする。
【０１６７】
また、相関図に配置されたバンド（プロット）のうち、サンプルの微生物のバンド強度が最大のプロットのＸ座標をＢとする。ここでは、サンプルの微生物のバンド強度が最大のプロットをｃ０とする。このプロットｃ０を通るＹ軸に平行な直線Ｘ＝Ｂを直線Ｔとする。
【０１６８】
なお、ここでは、Ａ＝１．０とし、Ｂ＝１．０とする。直線Ｓと直線Ｔとの交点Ｐ０の座標を（Ｂ，Ａ）とする。さらに、原点（０，０）と交点Ｐ０とを結ぶ直線Ｙ＝（Ａ／Ｂ）・Ｘを直線Ｕとする。
【０１６９】
ここで、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足するエリアをＶとする。ここで、エリアＶに位置するバンド数をｍとする。また、エリアＶでＹ軸上を除く範囲に位置するバンド数をＰとする。
【０１７０】
なお、前述したポジティブコントロールによる増幅効率の補正およびＤＮＡサイズマーカによる電気泳動像の輝度補正を行った場合、エリアＶは、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足するエリアとする。
【０１７１】
このとき、バンドの一致率Ｃ１は、以下の式（１）により算出される。
Ｃ１＝Ｐ／ｍ      ・・・（１）
例えば、図１３に示す相関図においては、エリアＶに位置するバンド（プロット）はｃ１〜ｃ６であり、ｍ＝６となる。また、エリアＶでＹ軸上を除く範囲に位置するプロットはｃ１〜ｃ３，ｃ５となり、Ｐ＝４となる。したがって、バンドの一致率Ｃ１はＰ／ｍ＝４／６≒０．６７となる。
【０１７２】
（方法４）：しきい値を設けた場合におけるバンドの一致率の算出方法
前述したように、複数種類の微生物を含むＤＮＡ断片をプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅した場合、プライマーとの結合が弱いバンドは再現性が低い。そこで、信頼性を高めるためにしきい値Ｔｈを設け、エリアＶにおいてしきい値Ｔｈ以上の強度を示すバンドを用いてバンドの一致率を算出する。
【０１７３】
しきい値Ｔｈは、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａの２分の1とする。本実施の形態においては、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であるので、しきい値はＴｈ＝Ａ／２＝１．０／２＝０．５となる。
【０１７４】
ここで、前述のエリアＶにおいてＹ≧Ｔｈをさらに満足するエリアをＩとし、エリアＶにおいてエリアＩを除くエリアをＩＩとする。さらに、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩでＹ軸上を除く範囲に位置するバンド数をＱとする。
【０１７５】
このとき、しきい値Ｔｈ以上の強度を有するバンドの一致率Ｃ２は、以下の式（２）により算出される。
【０１７６】
Ｃ２＝Ｑ／ｎ      ・・・（２）
例えば、図１３に示す相関図においては、エリアＩに位置するバンド（プロット）はｃ１〜ｃ４であり、ｎ＝４となる。また、エリアＩでＹ軸上を除く範囲に位置するプロットはｃ１〜ｃ３となり、Ｑ＝３となる。したがって、しきい値Ｔｈ以上の強度を有するバンドの一致率Ｃ２はＱ／ｎ＝３／４＝０．７５となる。
【０１７７】
（方法５）：面積比率の算出方法
サンプルの微生物とデータベースの微生物のバンドとが一致するという情報だけではなく、一致するサンプルの微生物のバンド強度がデータベースの微生物のバンド強度に接近していることが有効な情報となる。そこで、図１３に示すエリアＩおよびエリアＩＩに位置する各バンド（プロット）に関する三角形の面積を求め、以下に示す方法でバンドの面積比率を算出する。
【０１７８】
各バンド（プロット）に関する三角形とは、そのプロットと、そのプロットと同じＹ座標におけるＹ軸上の点と、原点とを頂点とする三角形である。
【０１７９】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＶに位置するバンド数をｍとし、エリアＶに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｍの整数である。
【０１８０】
このとき、面積比率Ｒ１は、以下の式（３）により算出される。
【０１８１】
【数１８】
0004014430.tif 000014
【０１８２】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＶに位置する他のプロットｃ２〜ｃ６についても面積を求め、エリアＶに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ６に関する面積の合計値を求める。
【０１８３】
また、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であり、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂは１．０であるので、エリアＶの面積は１．０×１／２＝０．５となる。図１３の例では、エリアＶに位置するバンド数ｍは６であるので、エリアＶの面積にバンド数ｍを乗算すると、０．５×６＝３．０となる。
【０１８４】
エリアＶに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ６に関する三角形の面積の合計値を、エリアＶの面積にバンド数ｍを乗算した値で割ることにより、面積比率Ｒ１を求めることができる。
【０１８５】
（方法６）：しきい値を設けた場合の面積比率の算出方法（その１）
データベースの微生物のバンド強度がしきい値Ｔｈ以上であるデータのみを用いて、図１４に示すように、方法５と同様にエリアＩのみにおける面積比率を算出する。
【０１８６】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｎの整数である。
【０１８７】
このとき、しきい値Ｔｈを設けた場合における面積比率Ｒ２は、以下の式（４）により算出される。
【０１８８】
【数１９】
0004014430.tif 000015
【０１８９】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する面積の合計値を求める。
【０１９０】
また、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であり、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂは１．０であるので、エリアＶの面積は１．０×１／２＝０．５となる。図１４の例では、エリアＩに位置するバンド数ｎは４であるので、エリアＶの面積にバンド数ｎを乗算すると、０．５×４＝２．０となる。
【０１９１】
エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する三角形の面積の合計値を、エリアＶの面積にバンド数ｎを乗算した値で割ることにより、面積比率Ｒ２を求めることができる。
【０１９２】
（方法７）：しきい値を設けた場合の面積比率の算出方法（その２）
方法５および方法６による面積比率の算出方法においては、エリアＶの面積（すなわち、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂ×データベースの微生物の最大のバンド強度Ａ）に対する各バンド（プロット）に関する三角形の面積の合計値の割合を求めている。この場合、データベースの微生物のバンドのうち、バンド強度の強いものをより重視した解析になるのに対し、算出される値が小さくなる。そこで、方法７においては、図１５に示すように、エリアＩに位置するプロットについて、データベースの微生物の各バンドの強度ａiを通るＸ軸に平行な直線（Ｙ＝ａi）、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値に対する各バンド（プロット）に関する三角形の面積の合計値の割合を求める。
【０１９３】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｎの整数である。
【０１９４】
このとき、面積比率Ｒ３は、以下の式（５）により算出される。
【０１９５】
【数２０】
0004014430.tif 000016
【０１９６】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する面積の合計値を求める。
【０１９７】
また、プロットｃ１について、直線Ｙ＝ａiとＹ軸との交点のｙ座標は０．７であり、直線Ｙ＝ａiと直線Ｕとの交点のＸ座標はａi・Ｂ／Ａ＝１．０×０．７／１．０＝０．７となる。したがって、プロットｃ１について、直線Ｙ＝ｂi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積は、０．７×０．７×１／２＝０．２４５となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４について直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値を求める。
【０１９８】
エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する三角形の面積の合計値を、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４について直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値で割ることにより、面積比率Ｒ３を求めることができる。
【０１９９】
上記のようにして、サンプルの微生物とデータベースに登録されている複数の微生物の各々との相関係数、バンド一致率および面積比率を算出した後、求めた相関係数、バンド一致率および面積比率に関してそれぞれしきい値を設定する。このしきい値に基づいて、算出した値がしきい値よりも高いものを検索された微生物として選択する。
【０２００】
なお、相関係数に対するしきい値は０．２〜０．６の範囲、好ましくは０．２５〜０．３５の範囲の数値とする。また、方法６における面積比率に対するしきい値は、０．０５〜０．２０の範囲とする。さらに、方法７における面積比率に対するしきい値は、０．０７〜０．３０の範囲とする。
【０２０１】
しきい値が高いほど検索の正確性が高くなる。一方、しきい値を低くすると、可能性のある微生物をデータベースから広く検索することが可能となる。
【０２０２】
最後に、図２に示すように、結果表示手段５（図１）により、しきい値より高い値を示した微生物の名称を相関係数の高い順に検索結果として表示する（ステップＳ８）。
【０２０３】
なお、必要に応じて以下の工程（ステップＳ９）を設けてもよい。
例えば、図２に示すように、画像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。この工程においては、検索結果として表示された微生物がサンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプルを構成する微生物の１つであることを以下のような方法により確認する。
【０２０４】
例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行ってもよい。また、図１１に示すようなサンプルの微生物のバンド強度と検索された微生物のバンド強度との相関図を表示することにより、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法により、検索結果の確認を行うことが可能となる。
【０２０５】
また、データベースへの登録工程を設けてもよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いてデータ検索を行った結果、データベースに同じ微生物が存在しないことが明らかとなった場合に、このサンプルの微生物に関するデータを新たにデータベース格納部４のデータベースに登録するものである。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広がる。
【０２０６】
また、パラメータ等を変更して再び検索を行う工程を設けてもよい。この工程においては、例えば、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した同一位置のバンドと見なすバンド位置の範囲や、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した検索のためのしきい値の設定を変更し、再検索を行う。あるいは、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した相関係数の算出方法を変更し、再検索を行う。それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結果を得ることができる。
【０２０７】
さらに、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドの一欄を作成してこれを表示する工程を設けてもよい。この工程においては、検索された微生物のバンドとは一致しなかったサンプルの微生物のバンド（不一致バンド）の一欄を作成して表示する。
【０２０８】
ここで、サンプルに単一の微生物を用いて１種類の微生物が検索された場合においては、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドが、サンプルの微生物と検索された微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の混合物である場合、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドは、データベース４に登録されていない微生物のバンドである可能性が高い。このように、不一致バンドはサンプルの微生物に関する重要な情報となり得るので、データとして残すことが好ましい。
【０２０９】
以上のような本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合においても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【０２１０】
特に、微生物群をサンプルとして用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【０２１１】
一方、単一の微生物をサンプルとして用いる場合においては、サンプルの微生物とデータベースの微生物との多型を検出することも可能となる。また、サンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともできる。
【０２１２】
ここで、この微生物識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うことができる。
【０２１３】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０２１４】
例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または土壌中の微生物を同定することができる。また、この結果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えることにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な肥料を作製することができる。
【０２１５】
さらに、このような微生物識別方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取した土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度により、汚染状態が示唆される。
【０２１６】
図１６は図１の解析用コンピュータ３として用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【０２１７】
図１６のパーソナルコンピュータは、ＣＰＵ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置３８０を備える。
【０２１８】
ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力するために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラムが記憶される。
【０２１９】
記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処理を行う微生物識別プログラムが記録されている。
【０２２０】
スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳動イメージ入力部２として働く。
【０２２１】
外部記憶装置３８０は、ハードディスク装置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベースを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡＭ３５０上で実行する。
【０２２２】
なお、微生物識別プログラムを記録する記録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハードディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。また、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体に相当する。
【０２２３】
本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメージ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コンピュータ３がバンド検出手段、バンド情報検出手段、対応関係作成手段、同一バンド位置選択手段、バンド配置手段、第１の領域決定手段、第２の領域決定手段、識別手段および第２の識別手段を構成する。
【０２２４】
なお、データベース格納部４に格納されるデータベースは、照合対象となる微生物について図２のステップＳ１〜Ｓ６の処理を行うことにより作成される。
【０２２５】
【実施例】
実施例においては、まず生ゴミ処理機から単離した１２種類の細菌および１２種類のうちの５種類の細菌を混合したモデル菌叢の各々についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行い、得られたデータをデータベースに登録した。
【０２２６】
次に、データベースの作成に用いた１２種類の細菌およびモデル菌叢と同一の細菌およびモデル菌叢をサンプルとして用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により再度ＤＮＡ分析を行った。このサンプルの分析データに基づいて、上記で作成したデータベースからサンプルの細菌の種類を検索し、サンプルの細菌と検索された細菌とが一致するか調べた。以下に詳細を説明する。
【０２２７】
１．データベースの作成
▲１▼生ゴミ処理機の運転方法
家庭用生ゴミ処理機である三洋電機株式会社製ＳＮＳ−Ｔ１（外形寸法：５８０×４５０×７９５ｍｍ）を用い、この生ゴミ処理機に取り付けられている排水口へエアポンプおよび空気量調整器を接続する改良を加えた。この生ゴミ処理機を温度変化の小さい実験室に設置した。
【０２２８】
生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として２５ｋｇ（含水率７０％）の木質チップ（平均粒度１．５ｍｍの杉材）を入れた。処理槽内に野菜４５０ｇ、果物３００ｇ、魚４０ｇ、肉３０ｇおよび米飯１８０ｇからなる１ｋｇの生ゴミを１日に１回ずつ週５回投入し、生ゴミの投入後、生ゴミ処理機の攪拌羽根で処理槽内を攪拌した。
【０２２９】
処理槽内の木質チップの含水率を３５〜４５％に調節することにより良好な処理状態を保った。エアポンプからの通気の量を空気量調整器で調整することにより含水率の微調整を行った。
【０２３０】
▲２▼生ゴミ処理細菌の単離
細菌培養用の寒天培地を５種類作成した。細菌培養用の各寒天培地の組成を以下の表４〜表８に示す。
【０２３１】
【表４】
0004014430.tif 000017
【０２３２】
【表５】
0004014430.tif 000018
【０２３３】
【表６】
0004014430.tif 000019
【０２３４】
【表７】
0004014430.tif 000020
【０２３５】
【表８】
0004014430.tif 000021
【０２３６】
生ゴミ処理機を運転してから４９０日目の処理槽内の木質チップを１０ｇ採取し、滅菌した０．８５％食塩水を９０ｍＬ加えて細菌が木質チップから十分に遊離するまで懸濁した。その懸濁液をさらに１０-6に希釈し、希釈した懸濁液の１００μＬを各寒天培地上に均一に接種した。３日間、３７℃で培養後、すべてのコロニーを新しい寒天培地に移し替えることで細菌の単離を行った。
【０２３７】
単離したコロニーのうち種類の異なる１２種類の細菌をＳＳＣ−ＰＣＲ用のサンプルとした。単離した細菌はそれぞれＮｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３，Ｎｏ．７００４，Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，Ｎｏ．４０２０であり、細菌Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０、Ｎｏ．１０４１およびＮｏ．１０４８は表４に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．２００１は表５に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４およびＮｏ．４０２０は表６に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．５０６３は表７に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．７００４は表８に示す組成の培地を用いてそれぞれ単離した。また、１２種類のうちＮｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３，Ｎｏ．７００４の５種類の細菌の染色体ＤＮＡを等濃度（各１０ｐｇ／μＬ）で混合し、モデル菌叢を調製した。
【０２３８】
各細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Protocols in Molecular Biology (published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) の2.4.1 〜2.4.2 に記載の“Preparation of Genomic DNA from Bacteria”の方法に従って調製した。
【０２３９】
▲３▼生ゴミ処理機から単離した１２種類の細菌およびモデル菌叢のＤＮＡ分析
ここでは、PE Applied Biosystemの PCR System 9700および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０を用いて、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法により、各細菌について分析を行った。
【０２４０】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、以下の表９に示す４６種類のプライマー（配列番号１〜４６）を用いた。
【０２４１】
【表９】
0004014430.tif 000022
【０２４２】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表１０に示す。
【０２４３】
【表１０】
0004014430.tif 000023
【０２４４】
表１０において、ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2--デオキシアデノシン-5--三燐酸）、ｄＣＴＰ(2--デオキシシチジン- 5-- 三燐酸) 、ｄＧＴＰ(2--デオキシグアノシン-5--三燐酸) 、ｄＴＴＰ(2--デオキシチミジン-5--三燐酸) の等濃度混合溶液である。反応溶液量は、２０μＬとした。
【０２４５】
ここでは、１２種類の細菌およびモデル菌叢の各々について、プライマーとして配列番号１〜４６の各プライマーをそれぞれ含む５５２（１２×４６）種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１４のプライマーとこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１４のプライマーを含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調製した。
【０２４６】
次に、上記のようにして調製した５５２種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の孔部５１にそれぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂにネガティブコントロールおよびポジティブコントロールをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行った。
【０２４７】
ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表１１に示す。
【０２４８】
【表１１】
0004014430.tif 000024
【０２４９】
続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの５μＬを１．５％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．３Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドの位置を測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Smart Ladder）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０２５０】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をインスタントフィルムに撮影した後、スキャナーでコンピュータに取り込んだ。
【０２５１】
コンピュータに取込んだ電気泳動像の画像データを、ソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いて解析し、細菌およびモデル菌叢の各プライマーにおけるバンドサイズおよびバンド強度を求めた。
【０２５２】
なお、この場合においては行っていないが、次のような画像補正の工程をさらに行ってもよい。画像補正として、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することが考えられる。例えば、測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０２５３】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行うことも考えられる。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０２５４】
さらに、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの２００ｂｐのバンドの発光強度の２分の１の発光強度をしきい値として定め、各プライマーにおけるバンドのうち発光強度がしきい値よりも小さなバンドを削除することも考えられる。このようにして発光強度が小さなバンドを削除することにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおいて再現性の低いバンドを削除することができる。それにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおける再現性の向上が図られ、得られたデータの信頼性を向上させることができる。
【０２５５】
▲４▼バンド強度とバンド位置の測定
上記で用いたＤＮＡサイズマーカは、電気泳動によりバンドサイズ（塩基対の数）の異なる１４本のバンドに分離される。この１４本のバンドのサイズは、大きいものから１００００、８０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、８００、６００、４００および２００ｂｐである。なお、この場合においては１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行っているため、１００００ｂｐのバンドと８０００ｂｐのバンドとは分離しない。したがって、１３本のバンドが現れる。１３本のバンド間の間隔は均一ではなく、サイズが大きいバンド程、バンド間の間隔が小さくなる。
【０２５６】
ところで、各プライマーにおけるバンドの位置を表示する方法として、ＤＮＡサイズマーカのバンドの位置と各プライマーにおけるバンドの位置とを比較することにより各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）に変換して表示する方法がある。しかしながら、この方法においては、以下のような問題が生じる。
【０２５７】
例えば、２００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが４０ｂｐ異なる。これに対して、５０００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが１０００ｂｐ異なる。このように、５０００ｂｐ付近では１ｍｍが１０００ｂｐに相当するのに対して、２００ｂｐ付近では１ｍｍが４０ｂｐに相当する。また、スキャナで取り込んだ電気泳動像の画像データの解像度はせいぜいサブｍｍである。
【０２５８】
以上のことから、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）で表示する場合には、バンドサイズの大きなもの程誤差が大きくなる。したがって、この場合においては、バンドサイズによって誤差の大きさを変える必要がでてくる。
【０２５９】
以上のことから、各プライマーにおいて得られたバンドの位置を、バンドサイズで表示するのではなく、泳動距離方向の実測値に基づいて表示する方が、バンド位置の誤差が一定の大きさになるので好ましい。
【０２６０】
なお、電気泳動においては、泳動時間や泳動時の温度で泳動距離が変化する。このため、電気泳動における泳動距離方向の実測値に基づいてバンドの位置を表示するためには、規格化を行う必要がある。以下に、規格化の方法を示す。
【０２６１】
なお、ここでは、規格化を行うために新たにＤＮＡサイズマーカを電気泳動させ、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を撮影した１２枚の電気泳動写真を別途用意した。
【０２６２】
まず、この１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドを基準とし、このバンドから他の１２本のバンドまでの距離を測定した。その結果を表１２に示す。
【０２６３】
【表１２】
0004014430.tif 000025
【０２６４】
なお、この場合においては、前述のように、８０００ｂｐのバンドと１００００ｂｐのバンドとが分離しないため、８０００−１００００ｂｐの１つのバンドとして処理している。また、この場合においては１０００ｂｐのバンドの実測距離を０．００とし、１０００ｂｐよりもサイズの小さなバンドの実測距離を負の値で表している。
【０２６５】
次に、１２枚の写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離を１とし、これを基準として他のバンドの位置の規格化を行った。
【０２６６】
例えば、Ｎｏ．１の写真のデータにおいては、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離が１．６６ｃｍである。したがって、この値１．６６で他のバンドの実測距離の値を割り、それぞれのバンドの位置の規格化を行った。この操作を他のＮｏ．２〜Ｎｏ．１２の写真のデータについても行った。その結果を表１３に示す。
【０２６７】
【表１３】
0004014430.tif 000026
【０２６８】
さらに、表１３に示すように、各サイズのバンドについて、１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）のデータにおける平均を求めた。以上のようにして、ＤＮＡサイズマーカにおいて１０００ｂｐのバンドの位置を基準として他のバンドの相対的な位置（比）を求めた。
【０２６９】
さらに、上記で得られた値を見やすくするため、基準とした１０００ｂｐのバンドの位置を１０００とし、１０００ｂｐからの相対的な距離が１．００である８０００〜１００００ｂｐのバンドの位置を２０００とした。以下、これに基づいて、他のバンドについてもバンド位置を導き出した。このようにして、ＤＮＡサイズマーカの１３本のバンドについて、バンド位置（基準値）を求めた。その結果を表１４に示す。
【０２７０】
【表１４】
0004014430.tif 000027
【０２７１】
なお、上記においては、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの位置を基準とするとともに８０００−１００００ｂｐのバンドの位置を１とする規格化の方法について説明したが、規格化の方法はこれ以外であってもよい。
【０２７２】
次に、上記のようにして得られたＤＮＡサイズマーカのバンド位置（基準値）に基づいて、１２種類の細菌の各々について、４６種類のプライマーの各々におけるバンドの位置およびバンド強度を測定した。さらに、測定により得られたデータをまとめ、細菌ごとにバンドデータの一欄を作成した。この場合においては、バンドの発光分布のピークの高さをバンド強度とした。
【０２７３】
なお、前述のようにこの場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による階調補正は行わず、また、発光強度がしきい値より小さいバンドの削除を行わなかった。
【０２７４】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定には、前述のソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いた。また、６枚の電気泳動写真の画像データのバンド位置およびバンド強度のデータを集計して一欄を作成する工程には、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフトウェアを用いた。
【０２７５】
例えば表１５〜表１８は、細菌Ｎｏ．７００４，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびモデル菌叢に関するバンドデータの一欄を示したものである。
【０２７６】
【表１５】
0004014430.tif 000028
【０２７７】
【表１６】
0004014430.tif 000029
【０２７８】
【表１７】
0004014430.tif 000030
【０２７９】
【表１８】
0004014430.tif 000031
【０２８０】
表１５〜表１８において、”５ｍｉｘ”は、５種類の細菌の混合を示す。
他の７種類の細菌Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，およびＮｏ．４０２０についても、このようなバンドデータの一欄を作成した。
【０２８１】
▲５▼細菌のバンドデータ一欄のデータベースへの登録
上記の表１５〜１８に示すＮｏ．７００４，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびモデル菌叢のバンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。同様にして、他の７種類の細菌、Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，およびＮｏ．４０２０についても、バンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。
【０２８２】
２．複数の細菌の混合物をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、複数の細菌の混合物をサンプルとした場合の検索をテストするために、上記のデータベースの作成時に単離した５種類の細菌（Ｎｏ．１０２８,Ｎｏ．１０３０,Ｎｏ．４００４,Ｎｏ．５０６３,Ｎｏ．７００４）を含むモデル菌叢を用意した。モデル菌叢を用いて前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行い、得られたサンプルのデータに基づいて、上記で作成したデータベースから検索を行った。
【０２８３】
なお、モデル菌叢を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行う場合においては、上記５種類の細菌の染色体ＤＮＡをそれぞれ濃度１０μｇ／Ｌずつ含むＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を調製した。
【０２８４】
また、この場合のＤＮＡの分析方法およびバンド強度・バンド位置の測定方法に関しては、データベースの作成時の工程において前述した通りである。この場合においても、前述のソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）および本発明者が作成したソフトウェアを用いた。
【０２８５】
モデル菌叢から得られた電気泳動像とデータベースに登録している細菌Ｎｏ．７００４とのプライマ別のデータを表１９および表２０に示す。
【０２８６】
【表１９】
0004014430.tif 000032
【０２８７】
【表２０】
0004014430.tif 000033
【０２８８】
さらに、表１９および表２０をもとに、モデル菌叢から得られたバンドのサイズとデータベースに登録されている細菌NO．７００４のバンドサイズとを比較し、バンドサイズの比較を行った。バンドサイズの比較結果を表２１〜表２３に示す。
【０２８９】
【表２１】
0004014430.tif 000034
【０２９０】
【表２２】
0004014430.tif 000035
【０２９１】
【表２３】
0004014430.tif 000036
【０２９２】
次に、表２１〜表２３をもとにモデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関図を作成し、モデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４とにおける相関係数、バンド一致率および面積比率を算出した。図１７にモデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関図を示す。
【０２９３】
なお、相関係数の算出は、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフトウェアを用いて行った。また、この場合のパラメータは、バンド位置の誤差（同一位置のバンドとみなすバンド位置の範囲）を±４３とした。また、相関係数の算出方法は、方法２の図１２（ｃ）に示す方法により算出した。また、バンド一致率は、方法１、方法３および方法４に示すバンド一致率の算出方法により算出した。面積比率は、方法５、方法６および方法７に示す面積比率の算出方法により算出した。方法１〜方法７により相関係数、バンド一致率および面積比率を算出したところ、表２４に示す結果が得られた。
【０２９４】
【表２４】
0004014430.tif 000037
【０２９５】
表２４では、サンプルとして用いたモデル菌叢に含まれる５種類の細菌（Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびＮｏ．７００４）を上から上５列に示した。
【０２９６】
方法1、３、４においては細菌Ｎｏ．１０４１のバンド一致率が、モデル菌叢に含まれる細菌のうち最も低いバンド一致率の値を上回った。
【０２９７】
また、方法２においては、細菌Ｎｏ．４０１４の相関係数の値がモデル菌叢に含まれる細菌のうち最も低い相関係数の値を上回った。
【０２９８】
それに対して、方法６および方法７においては、モデル菌叢に含まれる５種類の細菌における面積比率とモデル菌叢に含まれない他の7種類の細菌における面積比率との間で顕著な差を得ることができ、サンプルのモデル菌叢に含まれる５種類の細菌を正確に識別することができた。
また、方法6においては、しきい値を０．０５から０．２０の範囲で設定することができ、例えば、０．１０に設定することが可能である。
さらに、方法7においては、しきい値を０．０７から０．３０の範囲で設定することができ、例えば、０．１７に設定可能である。
【０２９９】
以上のように、複数種類の細菌を含む細菌群を識別対象とする場合においては、前述の方法１から方法７を用いて相関係数、バンド一致率および面積比率を算出し、算出した値をもとに総合的に解析することにより、細菌群に含まれる細菌を正確に識別することが可能となる。
【０３００】
【配列表】
0004014430.tif 000038
0004014430.tif 000039
0004014430.tif 000040
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0004014430.tif 000049
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図８】図２の微生物識別方法に用いる画像処理法の一例を示すフローチャートである。
【図９】図８の画像処理法を用いて処理を行った電気泳動像の画像データである。
【図１０】サンプルの微生物のバンドデータおよびデータベースのバンドデータにおける同一プライマーの同一位置のバンドの検索方法を示す図である。
【図１１】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との相関関係を示す図である。
【図１２】相関係数の算出方法を示す図である。
【図１３】モデル菌叢のバンド強度と細菌Ａのバンド強度との相関関係を示す図である。
【図１４】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との面積比率の算出方法を示す図である。
【図１５】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との面積比率の算出方法を示す図である。
【図１６】図１の解析用コンピュータとして用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【図１７】モデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関関係を示す図である。
【符号の説明】
１  ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置
２  電気泳動イメージ入力部
３  解析用コンピュータ
４  データベース格納部
５  結果表示手段
１１  ＤＮＡ
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ  １本鎖
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ  ２本鎖
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ  プライマー
５０  支持プレート
５１，５１ａ，５１ｂ  孔部
【図１】
0004014430.tif 000064
【図２】
0004014430.tif 000065
【図３】
0004014430.tif 000066
【図４】
0004014430.tif 000067
【図５】
0004014430.tif 000068
【図６】
0004014430.tif 000069
【図７】
0004014430.tif 000070
【図８】
0004014430.tif 000071
【図９】
0004014430.tif 000072
【図１０】
0004014430.tif 000073
【図１１】
0004014430.tif 000074
【図１２】
0004014430.tif 000075
【図１３】
0004014430.tif 000076
【図１４】
0004014430.tif 000077
【図１５】
0004014430.tif 000078
【図１６】
0004014430.tif 000079
【図１７】
0004014430.tif 000080