(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能を染色体上で欠損させたマウスであって、Ｂ細胞の過剰応答を誘導し、Ｔｈ２型の反応を惹起させるＴＮＰ−ＫＬＨと百日咳毒素とを含むアラムアジュバントを免疫することにより、野生型マウスと比べてアレルギーを発症しやすくしたマウスのＴｈ２型過剰免疫応答モデル動物としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｂ細胞の過剰応答のみならずアレルギーなどを発症しやすくなる、免疫グロブリン様受容体ファミリーの抑制性受容体遺伝子であるＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物に関する。さらに、本発明は、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法や、アレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体液性免疫と細胞性免疫を司るＴ細胞は主にＣＤ４+Ｔ細胞であり、このＣＤ４+Ｔ細胞はサイトカインの産生パターンからそれぞれＴｈ（ヘルパーＴ細胞）１、Ｔｈ２細胞に分類できる。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γ、ＩＬ（インターロイキン）−２を産生し、マクロファージの活性化を引き起こすことが知られている。一方、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等を分泌することにより、Ｂ細胞の活性化及び抗体産生を促すことが知られている。現在、Ｔｈ１、Ｔｈ２の分化に関する研究が注目を集めているが、それは免疫疾患の成因と強く関わっていると考えられているからである。Ｔｈ１は遅延型アレルギー、臓器特異的自己免疫疾患と、Ｔｈ２は１型アレルギー、全身性の自己免疫疾患（ＳＬＥほか）との関連性が指摘されているが、Ｔｈ１とＴｈ２は互いに拮抗関係にあるので、これらの疾患をＴｈ１、Ｔｈ２をコントロールすることにより予防したり、治療したりすることができると期待されている。実際、リーシュマニアなどに対する感染症の抗原とともにＩＬ−１２を投与すると、発症を予防するＴｈ１が誘導され、感染を免れることが報告されている。
【０００３】
他方、Ｂ細胞、マスト細胞、樹状細胞、マクロファージに発現が見い出されているマウスのＰＩＲは免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体ファミリーに属するＩ型膜貫通型糖タンパクで、細胞外に６個のＩｇドメインを有し、細胞内の構造の違いからＰＩＲ−Ａ、ＰＩＲ−Ｂの２つのサブタイプに分類されている。かかる免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂ（J. Biol. Chem. 272, 7320-7327, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997）は、主に免疫系の種々の多様な細胞で対になって発現するＩｇ様受容体（ＩｇＬＲ）ファミリーの活性化型受容体又は抑制性受容体であることが知られている（Science 290, 84-89, 2000）。上記ＰＩＲ−Ａは、細胞表面での発現、及び活性化シグナルの伝達のためにＦｃ受容体γ鎖を必要とすることが報告されている（J. Exp. Med. 188, 991-995, 1998; J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999; J. Immunol. 161, 4042-4047, 1998; J. Biol. Chem. 274, 30288-30296, 1999）。他方、ＰＩＲ−Ｂは、その細胞質部分に免疫受容体型チロシンを基にした抑制モチーフ（ＩＴＩＭｓ）を有し、インビトロにおいてＢ細胞上にある抗原受容体（ＢＣＲ）や、その他の活性化型受容体と結合させることにより受容体が介する活性化シグナルを抑制することが報告されている（J. Immunol. 161, 4042-4047, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95. 2446-2451, 1998; J. Exp. Med. 187, 1355-1360, 1998）。しかしながら、その生理機能及びＰＩＲのリガンドは未だ不明である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、生体内でのＴｈ２型免疫応答の機構や、アレルギーの発症機構が解析することができ、かつＢ細胞の過剰応答のみならずアレルギーなどを発症しやすい、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を提供すること、及び該Ｔｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を用いた、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法や、アレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法や、アレルギー疾患の診断方法等を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、免疫グロブリン様受容体ファミリーの抑制性受容体であるＰＩＲ−Ｂの生理的機能の解明について鋭意研究を進めたところ、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスが、Ｂ細胞の過剰応答のみならずアレルギーなどを発症しやすい、Ｔｈ２型に偏った体液性応答を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のような所見に基づき完成するに至った。上記ＰＩＲ−Ｂ欠損（ＰＩＲ−Ｂ-/-）マウスを調べたところ、腹腔内におけるＢ−１細胞数を増加させ、またかかるＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ−１細胞及び脾臓Ｂ−２細胞は、ＢＣＲに対し高い感受性を示すことを見い出した。これらの知見に基づいて、Ｔｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を構築した。また、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスをＴ非依存性（ＴＩ）抗原により免疫したところ、野生型マウスと比較してＩｇＭ応答が増強していることがわかった。このことから、ＰＩＲ−Ｂは、生理的条件下でＢＣＲを介した活性化シグナリングの抑制能を有し、またＢ−１細胞集団のサイズを下方調節し得ることを見い出した。さらに、本発明者らは、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにＴＤ抗原（Ｔｈ２型の反応を惹起するＴＮＰ−ＫＬＨと百日咳毒素を混ぜたアラムアジュバント）を免疫したところ、ＩｇＧ１の抗体価が特に上昇することや、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのＩＬ−４産生が野生型マウスと比較して顕著に増加していることを見い出した。これらの観点から、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスはＴｈ２型に偏った体液性応答を示すことや、偏った体液性応答が、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟不全に起因することを明らかにした。また、本発明においては、これらの知見に基づいて、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法や、アレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法や、アレルギー疾患の診断方法等を構築した。
【０００６】
すなわち本発明は、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能を染色体上で欠損させたマウスであって、Ｂ細胞の過剰応答を誘導し、Ｔｈ２型の反応を惹起させるＴＮＰ−ＫＬＨと百日咳毒素とを含むアラムアジュバントを免疫することにより、野生型マウスと比べてアレルギーを発症しやすくしたマウスのＴｈ２型過剰免疫応答モデル動物としての使用方法（請求項１）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物とは、Ｂ細胞の過剰応答を示し、かつアレルギーなどを発症しやすい、Ｔｈ２型に偏った特徴的な体液性応答を示す非ヒト動物をいい、例えば、ＰＩＲ−Ｂ（ｐ９１Ａ）遺伝子（J. Biol. Chem. 272, 7320-7, 1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-6, 1997、J. Biochem. 123, 358-68, 1998）の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに特に限定されるものではない。かかる非ヒト動物は、ＴＮＰ−ＫＬＨと百日咳毒素とを含むアラムアジュバント等のＴｈ２型の反応を惹起させるアジュバンドを免疫させることにより、野生型非ヒト動物と比べてアレルギーを過剰に発症する。また、上記ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失なった非ヒト動物をいう。また本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。メンデルの法則に従い出生してくる、これらのホモ接合体非ヒト動物におけるＰＩＲ−Ｂ欠損型とその同腹の野生型は個体レベルで正確な比較実験を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。そして本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物の好適例としては、ＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスを、野生型非ヒト動物としては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１２】
ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＰＩＲ−Ｂノックアウトマウス（ＰＩＲ−Ｂ-/-）を作製する。ＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスは、文献（Nature 379, 346-349, 1996）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＰＩＲ−Ｂ遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１３】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、ＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスを得ることができる。そして、かかるＰＩＲ−ＢノックアウトマウスにおけるＰＩＲ−Ｂ遺伝子が染色体上で欠損していることを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウス脾臓Ｂ細胞からＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法や、このマウスの脾臓Ｂ細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００１４】
本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物は、Ｔｈ２型過剰免疫応答のメカニズムの解析や、アレルギーの発症機構の解析などに有用である。本発明のＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能を欠損させたＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物は、Ｔｈ２型過剰免疫応答抑制を起こすことから、またＰＩＲ−Ａの機能抑制が示唆されることから、本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を用いて、これらの生体反応を調節する物質のスクリーニングに使用することができる。すなわち、かかるＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を用いると、ＰＩＲ−Ｂと同様の抑制作用を有する物質等のＴｈ２型免疫応答誘導抑制物質や、Ｔｈ２型免疫応答誘導を促進させる物質等のＴｈ２型免疫応答誘導促進物質や、本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物において機能が低下しているＰＩＲ−Ａの機能を増大させる物質等のＰＩＲ−Ａの機能促進物質や、ＰＩＲ−Ａの機能をさらに抑制する物質等のＰＩＲ−Ａの機能抑制物質や、アレルギー疾患の治療薬などをスクリーニングすることができるだけではなく、アレルギー疾患の診断も行うことができる。
【００１５】
Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法としては、本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、又はＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、Ｂ細胞の活性化、抗体の産生、サイトカインの産生、抗原提示細胞における抗原提示能力の変化等のＴｈ２型免疫応答又はＰＩＲ−Ａの機能の変化を測定・評価する方法を具体的に例示することができるが、これらに特に限定されるものではない。上記Ｂ細胞の活性化の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、Ｂ細胞の発達、Ｂ細胞の増殖、Ｂ−１細胞やＢ−２細胞等のＢ細胞とＢＣＲとの結合に対する感受性などのＢ細胞の活性化を測定・評価し、変化が生じた物質を特定する方法を挙げることができる。抗体の産生の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ２ａ抗体等の抗体産生の増加又は減少を測定・評価し、変化が生じた物質を特定する方法を挙げることができる。サイトカインの産生の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、インターロイキン−４、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２等のサイトカイン産生の増加又は減少を測定・評価し、変化が生じた物質を特定する方法を挙げることができる。また、抗原提示細胞における抗原提示能力の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、樹状細胞等の抗原提示細胞における主要組織適合遺伝子複合体クラスII、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの抗原提示細胞に特異的な抗原の発現量の増加又は減少を測定・評価し、変化が生じた物質を特定する方法を挙げることができるが、上記の測定・評価する方法は特にこれらに制限されるものではないが、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニングに際して、Ｔｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物とを比較・評価することがより好ましい。
【００１６】
アレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、又はかかるＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、Ｂ細胞の活性化、抗体の産生、サイトカインの産生、抗原提示細胞における抗原提示能力等のＴｈ２型免疫応答の変化、又はＰＩＲ−Ａ若しくはＰＩＲ−Ｂの機能の変化を測定・評価し、かかるＴｈ２型免疫応答又はＰＩＲ−Ａ若しくはＰＩＲ−Ｂの機能が改善された物質を特定する方法を具体的に挙げることができるが、これらの方法に特に制限されるものではない。上記Ｂ細胞の活性化の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、Ｂ細胞の発達、Ｂ細胞の増殖、Ｂ−１細胞やＢ−２細胞等のＢ細胞とＢＣＲとの結合に対する感受性などのＢ細胞の活性化を測定・評価し、かかるＢ細胞の活性化が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。抗体の産生の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ２ａ抗体等の抗体産生の増加又は減少を測定・評価し、抗体産生が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。サイトカインの産生の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、インターロイキン−４、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２等のサイトカインの産生の増加又は減少を測定・評価し、サイトカイン産生が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。また、抗原提示細胞における抗原提示能力の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、樹状細胞等の抗原提示細胞における主要組織適合遺伝子複合体クラスII、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの抗原提示細胞に特異的な抗原の発現量の増加又は減少を測定・評価し、抗原提示細胞における抗原提示能力が改善された物質を特定する方法を挙げることができるが、上記の測定・評価する方法は特にこれらに制限されるものではないが、副作用の有無を確認するなどの面から、アレルギー疾患の治療薬のスクリーニングに際して、Ｔｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物とを比較・評価することがより好ましい。
【００１７】
本発明のＴｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法により得られる、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質の候補物質としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）などの物質を挙げることができる。また、本発明のアレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法により得られる、アナフィラキシーショック、気管支喘息、花粉症等のアレルギー疾患の治療薬としては、上記のＴｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質などを有効成分とする治療薬を具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
上記スクリーニング方法により得られる本発明のＴｈ２型免疫応答誘導促進若しくは抑制物質、又はＰＩＲ−Ａの機能の促進若しくは抑制物質は、Ｔｈ２型免疫応答誘導促進や抑制、ＰＩＲ−Ａの機能の促進や抑制を必要としている患者や、アレルギー疾患等のＴｈ２型過剰免疫応答による疾患を発症した患者の治療等に用いることができる。本発明のアレルギー疾患の治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスの作製）
Ｂ１０Ａ由来のＰＩＲ−Ｂ ｃＤＮＡの細胞内領域（１．０ｋｂのEco RI-Xho I フラグメント）をプローブとして、１２９／ＳｖＪのゲノムライブラリー（Stratagene社製）から８．８ｋｂのマウスＰＩＲ−Ｂ遺伝子をもつファージクローンを単離した。このサブクローンからエキソン１〜７と８の５′側の領域から成る５．０ｋｂのEco RV-Eco RIフラグメントを切り出し、Hin cII-Eco RI で切断したpBlue SK+にリクローニングした。これをXba I で切断し、フィルアップし、Sal Iリンカーを付け、５．０ｋｂのXho I-Sal Iフラグメントを５′側フラグメントとした。エキソン１０〜１４を含む別のサブクローンをテンプレートとし、５′側にXho Iリンカーを付けたプライマー（プライマー１：5'-TATCCTCGAGCTTCTCCGACGAAGACATCG-3'；配列番号１）と３′側にSal Iリンカーを付けたプライマー（プライマー２：5'-AGATCGTCGACTGTTCAGTTGTTCCCTTGAC-3'；配列番号２）により２．０ｋｂのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、Xho I-Sal I切断後の２．０ｋｂのXho I-Sal Iフラグメントを３′側フラグメントとした。そして、ポリＡ付加シグナルを持たないpMC1-Neoベクター（pMC1-Neo-pA-；Stratagene社製）のXho Iサイトに５．０ｋｂの５′側フラグメントを、Sal Iサイトに２．０ｋｂの３′側フラグメントを組み込んだ。その後、Xho I-Sal Iで切断し、８．０ｋｂフラグメントをヘルペスウイルス・チミジンキナーゼをもつpIC19R-MC1tkベクターのXho Iサイトに組み込み、ＰＩＲ−Ｂターゲティングベクターを構築した（図１ａ；エキソン９及び１０は膜貫通領域である）。かかるベクターをプラスミドのポリリンカーのなかにあるCla Iサイトで切断し、線状化した。
【００２０】
初期胚繊維芽細胞のフィーダー層上（３７℃，５％ＣＯ2）で維持したＥＳ細胞株ＲＷ４（１０7個）と２５μｇのＰＩＲ−Ｂターゲティングベクターを、６００μｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ−）に懸濁し、０．４ｃｍワイドキュベットを用い、３μＦのキャパシタンスの８００Ｖでエレクトロポレーションを行った。１０分後、その細胞を６０ｍｍディッシュに１０6個ずつ分注した。４８時間後、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．２μＭのＦＩＡＵで選択を開始し、５日目から３００μｇ／ｍｌのＧ４１８に、７日目に２２５μｇ／ｍｌのＧ４１８へ濃度を下げ、８日目にＧ４１８を完全に除き、１０日目に生育したコロニー（１８４個）を９６ウエルプレートにピックアップした。その３日後に２４ウエルプレートに継代し、さらに３日後にその半分を凍結保存し、残りの半分をＤＮＡ回収用に増大し、その２日後にＤＮＡを回収した。サザンブロット解析により相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を２．２％（４個）の頻度で得た。かかる相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した。キメラマウスの確認は、マウス脾臓Ｂ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを図１に示すプローブを用いたサザンブロット法により行った（図１ｂ）。その結果、４匹の雄キメラマウスが生殖系列伝達能を有していることがわかった。上記雄キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスと交配させ、同腹子からヘテロ接合体マウスを作出し、次いで、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせ、メンデルの法則に従いホモ接合体マウスを産生した。なお、かかるホモ接合体マウスの発育は正常であったが、イムノブロット解析により、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスの脾臓Ｂ細胞におけるＰＩＲ−Ｂの発現をタンパクレベルで調べたところ、ＰＩＲ−Ｂの発現の消失が確認された（図１ｃ）。そこで、６〜３２週齢の上記ＰＩＲ−Ｂ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスを使用して、以下の実施例を行った。
【００２１】
ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂは、Ｂ細胞、マスト細胞（ＭＣｓ）、樹状細胞（ＤＣｓ）及びマクロファージ等の種々の多様な免疫系細胞で、少なくともｍＲＮＡレベル又は逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）レベルで共発現することが明らかになっている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997; J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999; J. Biochem. 123, 358-368, 1998）。ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂの共通エピトープを認識するモノクローナル抗体６Ｃ１を用いて、骨髄由来マクロファージ（ＢＭ−Macrophages）又は骨髄由来の樹状細胞（ＢＭ−ＤＣｓ）のフローサイトメトリー分析（J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999）を行った結果、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの細胞でＰＩＲの発現が減少していることが明らかとなった。このことからかかる細胞では、その表面にＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂが共発現することが示唆された。すなわち、ＢＭ−マクロファージでは、ＰＩＲ−ＡがＰＩＲ−Ｂに対してドミナントであり、一方、ＢＭ−ＤＣｓでは、ＰＩＲ−ＢがＰＩＲ−Ａに対してドミナントであることがわかった（図１ｄ）。他方、ＢＭ−ＭＣｓ及び脾臓Ｂ細胞を分析した結果、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの細胞ではＰＩＲ染色が殆ど消失していたことから、ＰＩＲ−Ｂがかかる細胞表面において全面的に発現することがわかった（図１ｄ）。上記の正常細胞やＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおける細胞の結果から、各免疫系細胞におけるＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂそれぞれの発現プロフィールを明らかとし、これらの結果や文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997; J. Biochem. 123, 358-368, 1998）の記載から、各免疫系細胞におけるＰＩＲ−Ａ／Ｂの発現バランスが、免疫調節に重要であると考えた。他方、マウスＩｇＬＲ、ｇｐ４９Ａ及びｇｐ４９Ｂの発現のバランスが、細胞の種類により特異的であることが知られている（Mol. Cell. Biol. 20, 7178-7182, 2000）。
【００２２】
実施例２（野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ細胞発達のフローサイトメトリー分析）
ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおける脾臓ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞とＴ／Ｂ細胞群の比率が大きく変化しなかったことから、ＰＩＲ−Ｂ欠損は一般的なＴ細胞発達には影響しないということが示唆された。他方、Kubagawaらは、Ｂ細胞の発達、成熟、及び活性化の各過程において、ＰＩＲ分子の発現が調節されることを報告している（J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999）。ＰＩＲの発現レベルは、marginal zone Ｂ細胞において最も高く、腹腔Ｂ−１ Ｂ細胞におけるＰＩＲ発現レベルは、Ｂ−２ Ｂ細胞のレベルより高いことが報告されている（J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999）。そこで、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの各細胞における分子の発現を調べてみた。その結果、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの骨髄細胞におけるＢ２２０及びＩｇＭの発現においては正常なプロフィールを示すことがわかった（図２ａ）。また、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの脾臓Ｂ細胞を野生型マウスのものと比較した場合、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの脾臓Ｂ細胞には、野生型マウスのものと同等のＩｇＭlo及びＩｇＤhiのmature recirculating follicular Ｂ細胞や、ＩｇＭhiＩｇＤhiのtype 2 transitional Ｂ細胞（Ｔ−２ Ｂ細胞）が含まれていたが、未成熟型ＩｇＭhiＩｇＤloのtype 1 transitional Ｂ細胞（Ｔ−１ Ｂ細胞）においては僅かに増加しているのが確認できた（図２ｂ）。Ｂ２２０+脾臓細胞中のＣＤ２３-ＣＤ２１+のmarginal zone Ｂ細胞、ＣＤ２３+ＣＤ２１+のfollicular Ｂ細胞、及びＣＤ２３-ＣＤ２１-Ｂ細胞は、野生型マウスのものに匹敵するレベルでＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおいて確認できた（図２ｃ）。
【００２３】
一方、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおいてＣＤ５+ＩｇＭ+腹腔Ｂ−１細胞が、野生型マウスのものと比較して顕著に増加していたことから［図２ｄ；Ｂ−１細胞の平均％±ＳＤは、野生型マウスで２３．０±４．８（ｎ＝３）、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスで３６．４±５．６（ｎ＝４），Ｐ＜０．０５、図３ｂも参照のこと］、Ｂ−１細胞群の発達及び増加は、ＰＩＲ−Ｂ欠損により促進されることが明らかとなった。かかるＢ−１細胞は、自然抗体を産生し、自己免疫に重要な役割を担っているという報告がある（Annu. Rev. Immunol. 19, 595-621, 2001; Nature 357, 77-80, 1992）。また、Ｂ−１細胞の増加は、ＩＴＩＭを有するＣＤ２２（Science 274, 798-801, 1996; Nature 384, 634-637, 1996）やＣＤ７２（Immunity 11, 495-506, 1999）をいずれかが欠損したマウスにおいても認められている。しかしながら、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの６週齢及び３２週齢では血清中のＩｇＭ量の顕著な増加は確認できなかった。また、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスでは抗二本鎖ＤＮＡ抗体は少なくとも３２週齢まで確認できなかったが、ＣＤ２２欠損マウスでは、同じ発育段階でハイパーＩｇＭ及び自己抗体産生が認められている（Science 274, 798-801, 1996; Nature 384, 634-637, 1996）。
【００２４】
実施例３（ＢＣＲに対するＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのＢ細胞増殖反応）
Ｈｏらは、細胞活性化状態に関係なく、マクロファージ及びＢ細胞中のＰＩＲ−Ｂ分子が構造的にリン酸化され、脾臓細胞中のＰＩＲ−ＢがＳＨＰ−１及びＬｙｎと構造的に会合することを報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999）。Ｌｙｎ欠損マウスでは、ＰＩＲ−Ｂのチロシンリン酸化が大幅に減少すること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999）や、ニワトリＤＴ４０細胞上にＰＩＲ−Ｂが組み込まれることにより、ＢＣＲに誘導されるＩｇα／Ｉｇβ、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、及びＰＬＣ−γ２のチロシンリン酸化が抑制されること（Oncogene 18, 2291-2297, 1999）が報告されている。また、ＣＤ２２欠損マウスで観察されるように、ＢＣＲとの結合を受けてＰＩＲ−Ｂ欠損が高感受性Ｂ細胞を誘導することが、ＳＨＰ−１とＰＩＲ−Ｂの構造的会合から明らかとなっている（Science 274, 798-801, 1996; Nature 384, 634-637, 1996）。そこで本発明者らは、ＩｇＭ Ｆ(ａｂ)2抗体による刺激を行い、脾臓Ｂ−２細胞の増殖反応を分析してみた。その結果、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ−２細胞増殖が顕著に増加することを見い出した（図３ａ）。また、ウサギＩｇＧ抗ＩｇＭ抗体により刺激したとき、Ｂ細胞独特の抑制Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲIIＢによる抑制効果をマスキングすることにより、増殖増加がより顕著になった（Immunity 3, 635-646, 1995; Nature 379, 346-349, 1996）（図３ｂ）。抗ＩｇＭＦ（ａｂ′）2抗体を、野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの腹腔に投与し、フローサイトメトリー分析を行ったところ、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの腹腔Ｂ−１細胞は著しい増殖を示したが、野生型マウスではあまり増殖が認められなかった（図３ｃ）。Ｂ−１細胞においてＢＣＲのクロスリンクによって生じる応答に対して、抑制調節因子であることが報告されていることから（Science 274, 1906-1909, 1996）、ＢＣＲの共架橋で生じる細胞増殖応答が、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスで亢進するかどうか調べるために、かかる細胞を可溶性Ｆ（ａｂ′）2ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ４０抗体（ＣＤ４０）、又はＬＰＳで刺激し、［3Ｈ］−チミジンの取り込み量から脾臓Ｂ２２０陽性細胞の増殖を調べてみた。このことから、ＢＣＲとの結合を介した刺激により、ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ細胞が増殖しようとする高感受性状態になることがわかった。しかしながら、インビトロでの野生型マウスの脾臓Ｂ−２細胞とＢＣＲとの結合の結果、デタージェント不溶性膜画分へのＰＩＲ−Ｂの発現が有意の増加を示すことは確認できなかった。このことから、ＰＩＲ−ＢとＢＣＲとの構造的会合性はないことがわかった。従って、ＰＩＲ−ＢはＢＣＲに対する特異的な抑制性共受容体ではないことが考えられる。むしろＰＩＲ−Ｂは何らかのリガンドとの相互作用により、ＢＣＲのシグナリングを調節している可能性が考えられ、一般的にＰＩＲ−Ｂが欠損することにより、ＢＣＲを介した刺激に対してＢ細胞が高感受性を獲得すると考えられる。
【００２５】
実施例４（ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスにおける免疫応答とリンパ節細胞の増殖）
上記の結果から、次に、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにＴＩ抗原として、ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ又はＴＮＰ−ＬＰＳを投与し、各種物質に対する免疫応答を調べてみた。その結果、各物質に対する抗ＴＮＰＩｇＭ抗体応答は、野生型マウスの場合と比し顕著な増加を示し（図４ａ、４ｂ）、かかる結果はＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの高感受性Ｂ細胞の結果（実施例３参照）と整合していた。生体内でＰＩＲ−Ｂの欠損が獲得免疫応答に影響を与えるかどうかを調べるために、野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ欠損マウスをＴＤ抗原（ＴＮＰ−ＫＬＨ＋ＣＦＡアジュバント又はＴＮＰ−ＫＬＨ＋百日咳毒素＋アラムアジュバント）を免疫し、血清中の抗体価を測定した。その結果を図５ａに示す。Ｔｈ２型の反応を惹起するＴＮＰ−ＫＬＨ＋百日咳毒素＋アラムアジュバントで免疫した場合、野生型マウスとＰＩＲ−Ｂ欠損マウスとを比較したところ、野生型マウスに比べてＰＩＲ−Ｂ欠損マウスは、一次免疫応答において抗ＴＮＰ ＩｇＧ１抗体価、又は抗ＴＮＰ ＩｇＭ抗体価が上昇しており、二次免疫応答では抗ＴＮＰ ＩｇＧ１抗体や、抗ＴＮＰ ＩｇＧ２ｂ抗体の上昇が確認できたが、抗ＴＮＰ ＩｇＧ２ａ抗体価は減少していることが確認できた（図５ａ）。上記のようにＰＩＲ−Ｂ欠損マウスにおいて、Ｔｈ２型のサイトカインによって誘導されるＩｇＧ１の抗体価が上昇し、Ｔｈ１型のサイトカインによって誘導されるＩｇＧ２ａ抗体価が減少したことにから、ＰＩＲ−Ｂが生体内でＴＤ抗原に対する免疫応答においてＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２への分化に影響を与えている可能性が示唆された。そこで、ＰＩＲ−Ｂの欠損が生体内でのＴ細胞の活性化、分化、増殖に与える影響を調べるために、野生型又はＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのfootpadにＴＮＰ−ＫＬＨ又はＯＶＡ（オボアルブミン）を免疫し、免疫してから１１日後に単離したＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのリンパ節細胞を抗原で再刺激したときのサイトカイン産生と増殖を測定した。その結果を図５ｂに示す。このことから、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスではＩＬ４（インターロイキン４）産生は促進されるのに対して、ＩＦＮ−γ産生は抑制されていたが、細胞増殖においては顕著な差は認められなかった。以上のことから、Ｔ細胞の活性化、増殖能力の差は、野生型マウスとＰＩＲ−Ｂ欠損マウスでは認められないが、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのＴ細胞はＴｈ２型に偏向しているということが示唆された。この結果は抗体産生で見られた、ＰＩＲ−ＢでＩｇＧ１が増加し、ＩｇＧ２ａが減少する結果と矛盾しない結果であった。
【００２６】
実施例５（ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの成熟の欠陥とＩＬ−１２産生の減少）
ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおけるＴｈ２−過剰応答（Th2-exaggerated responses）の機構はいかなるものかどうかを調べるために、野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウスから骨髄樹状細胞（ＢＭ−ＤＣｓ）を単離し、かかる細胞をＯＶＡでパルスし、ＯＶＡによるパルスの前後におけるＤＣｓ表面マーカーをフローサイトメトリーで分析した。その結果を図６ａに示す。このことから、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＤＣｓは相対的に未成熟であることが明らかになった。抗原パルスを行う前のＭＨＣクラスIIの発現能は、野生型マウスのものと比べてＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＤＣｓでは低く（図６ａ）、他方ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウス由来のＤＣｓ及び野生型マウス由来のＤＣｓで同程度であることがわかった。ＯＶＡによるパルス後の野生型マウス由来のＤＣｓは、よく成熟し、同時にＭＨＣクラスIIやＣＤ８０／８６の発現も増強されていたが、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウス由来のＤＣｓにおいてはこれらの分子の発現の増強は極僅かであることが確認できた。また、抗ＣＤ４０抗体でさらに刺激しても、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウス由来のＤＣｓでは相対的に未成熟な状態を改善することはできなかった。上記未成熟ＤＣｓは、Ｔｈ２型応答を誘導する傾向があることが以前に報告されている（J. Immunol. 167, 1982-1988, 2001）。そこで、Ｔｈ１を強力に誘導するサイトカインＩＬ−１２（Immunity 4, 471-481, 1996）の産生を調べてみたところ、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＤＣｓをＯＶＡ刺激で誘導されるＩＬ−１２の産生が顕著に減少することがわかった（図６ｂ）。なお、かかるＤＣｓに取り込まれたＦＩＴＣ標識化ＯＶＡの量は、野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＤＣｓで同程度であることが確認できた（図６ｃ）。以上のことから、抗原取り込みによるＤＣｓの活性化依存の成熟の度合は、ＰＩＲ−Ｂ欠損と関連していないと考えられる。従って、充分量の抗原刺激を細胞に加えた場合でも、ＰＩＲ−Ｂが欠損することにより、ＤＣｓが相対的に未成熟な状態に押し留めていると考えられる。
【００２７】
細胞シグナリング及び免疫応答に調節機能をもつと考えられる細胞表面分子の増殖因子ファミリーであるＩｇＬＲｓ（Science 290, 84-89, 2000; Activating and Inhibitory Immunoglobulin-like Receptors, 7-15, 2001; Annu. Rev. Immunol. 17, 875-904, 1999）には、human killer cell IgLRや、Ig-like tanscript/leukocyte IgLR/myeloid IgLR（ＩＬＴ／ＬＩＲ／ＭＩＲ）や、leukocyte-assisiated IgLR（ＬＡＩＲ）や、マウス及びヒトに存在するシグナル誘導受容体タンパク質又はＳＩＲＰや、マウスｇｐ４９分子及びＰＩＲなどが知られている。ヒトＩＬＴ／ＬＩＲ／ＭＩＲの各分子は、マウスＰＩＲに最も近い分子と考えられている（J. Biochem. 123, 358-368, 1998; Activating and Inhibitory Immunoglobulin-like Receptors, 7-15, 2001; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 21, 13245-13250, 2000）。本発明では、腹腔Ｂ−１細胞、ＢＣＲ刺激に対するＢ細胞感受性、ＴＩ抗原に対する体液性応答、及びＴＤ抗原に対するＴｈ２応答などを負に調節する生理的機能をＰＩＲ−Ｂが有することを明らかにした。β２−ミクログロブリン欠損マウスにおいてＰＩＲ発現が減少するという報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999）に基づき、ＭＨＣクラスＩ分子がＰＩＲと相互作用することが示唆されているが、ＰＩＲ特異的なリガンドを同定しようとする試みは今日まで成功に至っていない。本発明は、ＰＩＲ−ＢがどのようにしてＢ細胞の活性化の閾値を決定するかを解析できるだけではなく、Ｂ細胞及びＤＣｓを考察した結果に基づき、ＰＩＲ−Ｂのリガンドを解明することができる。具体的には、ＰＩＲの融合蛋白質を作製し、ターゲットの細胞との相互作用を調べることにより、リガンドを同定することができる。また、ＰＩＲの場合、Ｔ細胞上にリガンドが発現している可能性は高いと思われることから、ターゲットの細胞のタンパクをウェスタン解析により分子量の同定を行い、かかるタンパクが既知の分子であれば候補タンパクを作製し、ＰＩＲとの結合を調べることにより、リガンドを同定することができる。
【００２８】
実験方法
方法１（イムノブロット分析）
Ｂ２２０−ビーズ（Miltenyi Biotec社製）を用いたＭＡＣＳソーティングにより、脾臓Ｂ細胞（１０8）からＢ２２０陽性細胞を選択し、溶解した。かかる細胞溶解物の上清に含まれるタンパク質を、７．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ（ImmobilonP, Millipore社製）メンブレン上に移した。かかるメンブレンをヤギ抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体（Santa Cruz Biotech社製）共在下でインキュベートし、その後、二次抗体としてビオチン結合サル抗ヤギＩｇ抗体、及びペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Amersham Pharmacia社製）により標識し、視覚化した。
【００２９】
方法２（抗体及びフローサイトメトリー）
ＦＩＴＣ−、ＰＥ−、又はビオチン−等が結合した抗マウスＩｇＭ抗体（Ｒ６−６０．２）や、抗マウスＩｇＤ抗体（１１−２６）や、抗マウスＣＤ５抗体（Ｌｙ−１）や、抗マウスＢ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２）や、抗マウスＣＤ２１抗体（７Ｇ６）や、抗マウスＣＤ２３抗体（Ｂ３Ｂ４）や、抗ｃ−ｋｉｔ抗体（２Ｂ８）や、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０）や、抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＨＬ３）や、抗ＣＤ８０抗体（１６−１０Ａ１）や、抗ＣＤ８６抗体（ＧＬ１）や、ＣＤ４０（３／２３）や、抗ＭＨＣクラスII抗体（Ｍ５／１１４．１５．２）などのモノクローナル抗体（全ての抗体はBD PharMingen社製のものを使用）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。また、TRI color−結合ストレプトアビジン（Caltag社製）は、ビオチン−抗体を染色するのに用いた。抗ＰＩＲモノクローナル抗体の６Ｃ１（J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999）は、M. D. Cooper博士及びH. Kubagawa博士（アラバマ大学）から供与された。ＩｇＭ Ｆ（ａｂ′）2抗体は、ICN Laboratoriesから購入した。細胞表面の染色は、公知の手法に従って行い、フローサイトメトリー分析は、CellQuest software（Becton Dickinson社製）を用い、FACSCaliburにより行った。ヨウ化プロピジウム染色では、死んだ細胞は分析から除外し、測定した。
【００３０】
方法３（Ｂ細胞の増殖応答）
脾臓Ｂ２２０陽性細胞は、ＭＡＣＳ（Mylteni社製）で精製した。かかる細胞を可溶性抗ＩｇＭＦ（ａｂ′）2抗体、抗ＣＤ４０抗体（ＣＤ４０）、又はＬＰＳで活性化し、刺激してから４８時間後、［3Ｈ］−チミジンの取り込み量から脾臓Ｂ２２０陽性細胞の増殖を測定した。腹腔Ｂ−１細胞の増殖には、野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスに２００μｇの可溶性抗ＩｇＭＦ（ａｂ′）2抗体をそれぞれ腹腔に投与し、上記と同様に測定した。４８時間後、フィコエリトリン結合ストレプトアビジンを加えたビオチン化抗マウスＣＤ５モノクローナル抗体、又はＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体で各マウスの腹腔内細胞を染色し、Ｂ−１（ＣＤ５陽性ＩｇＭ陽性）細胞群の割合を調べた。
【００３１】
方法４（体液性応答及びＴ細胞増殖）
野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ遺伝子欠損マウスに、１００μｇのＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ、５０μｇのＴＮＰ−ＬＰＳ、又は１０μｇのＴＮＰ−ＫＬＨ若しくは水酸化アルミニウムに溶解したＯＶＡを腹腔内投与して免疫した。ＴＤ抗原投与後８週目にマウスに再度抗原を刺激し二次免疫応答を誘導し、血清中のＴＮＰに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法により４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、ＴＮＰ−ＫＬＨ又はＯＶＡによる一次免疫から１１日後に、野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの膝下リンパ節からリンパ節細胞をそれぞれ抽出し、抽出した細胞を上記と同じ抗原又はＴ細胞マイトジェンのいずれかにより活性化させ、刺激してから４０時間後に、上清を回収し、培養上清中のＩＬ−４又はＩＦＮ−γの産生量を、ＥＬＩＳＡにより定量した。培養後３日目の［3Ｈ］−チミジンの取り込みによりＴ細胞増殖を測定した。
【００３２】
方法５（ＤＣ成熟及び抗原取り込み）
ＢＭ−ＤＣｓを調べるために、野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢＭ細胞を、組換えマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（PeproTech社製）共存下でそれぞれ培養し、４日目に培地を交換しさらに培養した。培養６日目に、上記ＢＭ細胞はＭＨＣクラスII分子、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ１１ｃを発現させ、未成熟ＤＣｓとなっていることを確認した。かかるＤＣｓを成熟させるため、５０μｇ／ｍｌのＯＶＡ又は１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０抗体（BD Pharmingen社製）を、細胞回収の２４時間前にＤＣ培養物中に加え刺激した。刺激後、ＤＣ培養物の培養上清を回収し、上清中のマウスＩＬ−１２ ｐ７０をＥＬＩＳＡ（BD Pharmingen社製）により測定した。その後、成熟細胞のマーカーとして、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及び抗ＭＨＣクラスII抗体を用いて上記細胞を染色し、フローサイトメトリー分析にかけた。ＤＣｓによる抗原取り込み量を測定するために、かかるＤＣｓを２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ＯＶＡ（Molecular Probes社製）共存下で、３７℃又は４℃で３時間インキュベートし、その後洗浄してからフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ１１ｃ抗体により染色した。３７℃におけるＤＣｓのＦＩＴＣ−ＯＶＡ取り込み量をフローサイトメトリーで測定した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物は、生体内でのＴｈ２型免疫応答の機構や、アレルギーの発症機構などを解析することができ、かつＢ細胞の過剰応答のみならずアレルギーの発症過程を研究するのに有用であり、またかかるＴｈ２型過剰免疫応答モデル非ヒト動物を用いると、アナフィラキシーショック、気管支喘息、花粉症等のアレルギー疾患の治療薬をスクリーニングすることや、アレルギー疾患の治療方法を提供することができる。
【００３４】
【配列表】
0003926603.tif 000002
0003926603.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図（ａ）と、各マウスにおけるサザンブロット分析の結果（ｂ）、イムノブロット分析の結果（ｃ）、及びＢＭ−マクロファージ、ＢＭ−ＤＣｓ、脾臓Ｂ細胞、及びＢＭ−ＭＣｓの細胞表面上におけるＰＩＲの発現をフローサイトメトリーで調べた結果（ｄ）をそれぞれ示す図である。
（ａ）ＰＩＲ−Ｂ遺伝子の構成と、ターゲッティングベクターの構築（ＴＫ：チミジンキナーゼ遺伝子、Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子）と、ターゲットとするゲノムの構造とを示す。なお、図中のＨはHin dIIIの制限酵素部位を、ＰはPst Iの制限酵素部位を、ＲＩはEco RIの制限酵素部位を、ＲＶはEco RVの制限酵素部位を、ＳはSph Iの制限酵素部位をそれぞれ示す。
（ｂ）ヘテロ接合体同士を交配させて得た同腹のホモ接合体マウスのゲノムＤＮＡをEco RIで切断し、得られた断片を図１ａのプローブ（Pst I−Sph I断片）を用いてサザンブロット分析を行った。５．６ｋｂは野生型アリル（＋）を、４．８ｋｂは変異型アリル（−）をそれぞれ示す。
（ｃ）野生型マウス（＋／＋）又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（−／−）の脾臓Ｂ細胞（２×１０6細胞）を用いて、ヤギ抗ＰＩＲポリクローナル抗体を用いたイムノブロット分析を行った。およそ１２０ｋＤａのＰＩＲ−Ｂの位置を矢印で示す。
（ｄ）野生型マウス（濃色の線）又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（薄色の線）の細胞に、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗マウスＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体（６Ｃ１）又はＰＥ結合ラットＩｇＧ１モノクローナル抗体（点線；コントロール）を反応させ、ＦＩＴＣで標識した、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗Ｂ２２０抗体、又は抗ｃ−ｋｉｔ抗体等のモノクローナル抗体を用いて染色し、ポジティブ細胞を分別した。
【図２】本発明のＰＩＲ−Ｂ-/-マウス及び野生型マウスにおけるＢ細胞の発達をフローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。
（ａ）骨髄細胞をＢ２２０及びＩｇＭで染色し、プロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、及び成熟Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分別した。
（ｂ）脾臓Ｂ２２０陽性細胞をＩｇＭ及びＩｇＤで染色して分別し、成熟ＩｇＭloＩｇＤhiＢ細胞、ＩｇＭhiＩｇＤhiのtype 2 transitional Ｂ細胞（Ｔ−２ Ｂ細胞)、及びＩｇＭhiＩｇＤloのtype 1 transitional Ｂ細胞（Ｔ−１ Ｂ細胞を示した。
（ｃ）脾臓Ｂ２２０陽性細胞をＣＤ２１及びＣＤ２３で染色して分別し、新規に作成したＣＤ２１-ＣＤ２３-Ｂ細胞、ＣＤ２１+ＣＤ２３+Ｂ細胞、及びＣＤ２１+ＣＤ２３-Ｂ細胞を示した。
（ｄ）腹腔細胞をＣＤ５及びＩｇＭで染色して白血球の分別を行い、ＣＤ５+ＩｇＭ+Ｂ−１細胞を示した。
なお、各図中の区画付近の数字は、全細胞における区画内に存在する細胞の割合をそれぞれ示す。各パネルの結果はそれぞれ３回実施して得られた平均を示す。
【図３】本発明のＰＩＲ−Ｂ欠損マウス由来Ｂ細胞のＢＣＲ刺激に対する増殖応答の結果を示す図である。
（ａ）野生型マウス（■）及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（□）から得られたＢ２２０陽性脾臓Ｂ細胞を、図に示した各濃度の抗μ Ｆ（ａｂ′）2抗体、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０抗体、又は１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ポジティブコントロール）共存下で培養した。なお、それぞれの結果は３回同様の実験を行い、平均値±ｓ．ｄ．で示した。
（ｂ）Ｂ２２０陽性脾臓Ｂ細胞を、２５μｇ／ｍｌの２．４Ｇ２の存在下又は非存在下で１０μｇ／ｍｌの抗μ抗体により刺激し、Ｆｃγ受容体IIＢを阻害した。
（ｃ）野生型マウス（■）又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（□）に、２００μｇの抗μ（ａｂ′）2抗体を腹腔内投与した。投与前、又は投与してから４８時間後に、腹腔リンパ球におけるＢ−１細胞群の割合を、ＣＤ５及びＩｇＭ染色によるフローサイトメトリーで求めた。なお、それぞれの結果は３回同様の実験を行い、平均値±ｓ．ｄ．で示す。野生型Ｂ−１細胞は応答しなかったが、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ−１細胞は、抗μ抗体刺激により増殖した。なお、図中の「*」はＰ＜０．０５を、「**」はＰ＜０．０１を、Ｎ．Ｓ．は有意ではないことをそれぞれ示す。
【図４】本発明のＰＩＲ−Ｂ-/-マウス又は野生型マウスにおけるＴＩ抗原に対する体液性応答を調べた結果を示す図である。
８週齢の野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスを、１００μｇのＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ（ａ）又は５０μｇのＴＮＰ−ＬＰＳ（ｂ）で免疫した。ＴＮＰ特異的ＩｇＭの相対量は、ＥＬＩＳＡにより定量した。免疫する前に回収した血清（pre-immune）、及び免疫してから７日目に回収した血清（immune）は、吸光度４５０ｎｍにより測定した。なお、図中の「○又は□」はＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのものを、「●又は■」は野生型マウスのものをそれぞれ示し、「*」はＰ＜０．０５を、「**」はＰ＜０．０１をそれぞれ示す。
【図５】本発明のＰＩＲ−Ｂ-/-マウス又は野生型マウスにおけるＴＤ抗原に対するＴｈ２型免疫応答を調べた結果を示す図である。
（ａ）ＴＮＰ−ＫＬＨに対する体液性応答を調べた結果を示す図である。８週齢の野生型マウス（黒いボックス：ｎ＝５）又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（白いボックス：ｎ＝５）を、胸腺依存性抗原（ＴＤ抗原）に対する免疫応答を調べるために１０μｇのＴＮＰ−ＫＬＨと０．２５μｇの百日咳毒素を混ぜたものをアラムアジュバントとともにマウスの腹腔に免疫した。さらに２次免疫応答を見るために、初回免疫後８週目に１μｇのＴＮＰ−ＫＬＨと０．２５μｇの百日咳毒素を混ぜたものをアラムアジュバントとともに腹腔に投与した。採血は、免疫前と免疫後２週間ごとに行い、血清中の抗ＴＮＰ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお、図中の矢頭は、マウスを免疫した時期を示す（０週及び８週）。ＥＬＩＳＡにより、ＴＮＰ特異的−ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧｂの相対量を定量した（吸光度：４５０ｎｍ）。なお、図中の「*」はＰ＜０．０５を示す。
（ｂ）ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのリンパ球の抗原に対するＩＬ−４の産生増加、及びＩＦＮ−γの産生減少を示す図である。ＴＤ抗原に対する免疫応答におけるＴ細胞の応答を検討するため、１０μｇのＴＮＰ−ＫＬＨ（上段パネル）又はＯＶＡ（下段パネル）と０．２５μｇの百日咳毒素とを混ぜたものをアラムアジュバントとともにマウスのfootpadに免疫した。一次免疫１１日後に野生型マウス（黒い棒グラフ）、又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（白い棒グラフ）の膝下リンパ節を取り出してリンパ節細胞を抽出し、野生型マウス又はＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのリンパ節細胞をＴＮＰ−ＫＬＨ又はＯＶＡで再刺激した。刺激後４０時間後に培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ−４又はＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより定量した。リンパ節細胞の増殖は培養後３日目の[3Ｈ]−チミジンの取り込みから増殖を定量した。３回行った培養の平均値（±ｓ．ｄ．）をデータとして示した。この結果は、別々に実施した２回の実験から得たが、それらの結果は類似していた。なお、図中の「*」はＰ＜０．０５を、「**」はＰ＜０．０１をそれぞれ示す。
【図６】本発明のＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおけるＤＣｓの成熟不全及びＩＬ１２の産生量の減少についての結果を示す図である。
（ａ）ＤＣの成熟化について調べた結果を示す図である。野生型マウス（太線）又はＰＩＲ−Ｂ-/-マウス（薄い線）のＤＣｓを、ＯＶＡ又は抗ＣＤ４０抗体の存在下／非存在下で２４時間インキュベートした。次に上記ＤＣｓを染色して、ＭＨＣクラスII（Ｉ−Ａ）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６の発現を調べるためにフローサイトメトリー分析を行った。野生型マウスのＤＣｓにおいては、上記３種の分子全てにおいて発現が増加しており、ＤＣが効率的に成熟していることを示唆している。他方、ＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのＤＣｓでは、Ｉ−Ａ発現レベルが低下しており、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は顕著に減少したことから、ＤＣの成熟化が損なわれていることが示唆された。
（ｂ）２４時間培養の間に、ＯＶＡに応答してＤＣｓがＩＬ１２ｐ７０を産生する様子を示した図である。３回行った培養の平均を平均値±ｓ．ｄ．で求めた。なお、図中の「*」はＰ＜０．０５を示す。
（ｃ）野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＤＣｓによる抗原取り込みの様子を示す図である。ＤＣｓは、ＦＩＴＣ結合ＯＶＡ共存下にて、３７℃又は４℃で３時間インキュベートし、洗浄し、次いでＰＥ結合抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。ＤＣｓによるＦＩＴＣ標識化ＯＶＡの取り込みは、フローサイトメトリーにより観察した。野生型マウス及びＰＩＲ−Ｂ欠損マウスのＤＣｓの抗原取り込み量に有意の差は認められなかった。
【図１】
0003926603.tif 000004
【図２】
0003926603.tif 000005
【図３】
0003926603.tif 000006
【図４】
0003926603.tif 000007
【図５】
0003926603.tif 000008
【図６】
0003926603.tif 000009