(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核候補を抽出してなる複数の細胞の４次元顕微鏡画像において、抽出された複数の該核候補からから、一つあるいは複数の核を初期情報として選択する工程と、
（ｂ）該初期情報に基づいて、予め設定したリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出してリンク情報を得る工程と、
（ｃ）得られたリンク情報から核領域でないリンク情報を削除する工程と、を含み、
前記得られたリンク情報から核領域でないリンク情報を削除する工程は、
（ｃ−１）核候補を抽出してなる複数の細胞の４次元顕微鏡画像において、前記初期情報を除く抽出された複数の該核候補からから、一つあるいは複数の核を第二初期情報として選択する工程と、
（ｃ−２）該第二初期情報に基づいて、前記初期情報に基づくリンクとは異なる方向に、予め設定したリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出して逆リンク情報を得る工程と、
（ｃ−３）前記リンク情報から該逆リンク情報にない核候補を除去する工程、
を含むことを特徴とする核領域認識法。
【請求項２】
請求の範囲１において、該４次元画像は、観察対象の細胞について焦点面を変化させて２次元画像を複数撮影し、かつ、該２次元画像を時系列に複数撮影することで焦点面、時点で異なる複数の２次元画像であることを特徴とする核領域認識法。
【請求項３】
請求の範囲１，２いずれかにおいて、該リンク情報を得る工程は、該一つあるいは複数の初期情報にリンクする核候補を時系列的に一方向にリンクさせるものであることを特徴とする核領域認識法。
【請求項４】
請求の範囲３において、該リンク情報を得る工程は、時系列的に古い核候補から新しい核候補へとリンクさせるものであることを特徴とする核領域認識法。
【請求項５】
請求の範囲１乃至４いずれかにおいて、該第二初期情報を、前記リンク情報から選択することを特徴とする核領域認識法。
【請求項６】
請求の範囲１乃至５いずれかにおいて、前記リンク情報は、時系列的に古い核候補から新しい核候補へとリンクさせるものであり、該逆リンク情報は、時系列的に新しい核候補から古い核候補へとリンクさせるものであることを特徴とする核領域認識法。
【請求項７】
請求の範囲１乃至６いずれかにおいて、リンクは、ｚ軸方向および／あるいは時間軸方向に形成されるものであることを特徴とする核領域認識法。
【請求項８】
請求の範囲１乃至７いずれかにおいて、二つの核領域がｘ−ｙ平面でオーバーラップしている場合には、二つの核領域はリンクしていると判断することを特徴とする核領域認識法。
【請求項９】
請求の範囲８において、オーバーラップした領域の面積がそれぞれの二つの核領域の面積に対して所定の割合を占めた時に、二つの核領域はリンクしていると判断することを特徴とする核領域認識法。
【請求項１０】
請求の範囲９において、該オーバーラップした領域の面積をそれぞれ核領域の面積で割った値が、共に所定の閾値を超えた場合に、二つの核領域はリンクしていると判断することを特徴とする核領域認識法。
【請求項１１】
請求項１乃至６いずれかにおいて、二つの核領域間の距離が予め設定した距離よりも小さい時には、二つの核領域はリンクしていると判断することを特徴とする核領域認識法。
【請求項１２】
（ａ）核候補を抽出してなる４次元顕微鏡画像において、抽出された該核候補から順リンクを作る核を一つあるいは複数選択する工程と、
（ｂ）該選択された一つあるいは複数の核を第一初期情報として、所定のリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出して順リンク情報を得る工程と、
（ｃ）該リンク情報から（ａ）工程で選択した核と異なる一つあるいは複数の核を逆リンクを作る核として選択する工程と、
（ｄ）該逆リンクを作る一つあるいは複数の核を第二初期情報として、所定のリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出して逆リンク情報を得て、逆リンク情報に基づいて該順リンク情報から誤認識された核候補を除去する工程、を含むことを特徴とする核領域認識法。
【請求項１３】
（ａ）核候補を抽出してなる４次元顕微鏡画像において、抽出された該核候補から順リンクおよび逆リンクを作る核をそれぞれ一つあるいは複数選択する工程と、
（ｂ）予め設定したリンク条件に基づいて、該順リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から順次抽出して順リンク情報を得る工程と、
（ｃ）予め設定したリンク条件に基づいて、該逆リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から抽出して逆リンク情報を得て、該逆リンク情報に基づいて該順リンク情報から誤認識された核候補を除去する工程、を含むことを特徴とする核領域認識法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３いずれかに記載の核領域認識法を用いた細胞系譜作成法であって、前記リンク情報において、リンク情報の枝が増えたところを細胞分裂とみなすことを特徴とする細胞系譜作成法。
【請求項１５】
（ａ）核候補を抽出してなる４次元顕微鏡画像において、抽出された該核候補から順リンクを作る核を一つあるいは複数選択する工程と、
（ｂ）予め設定したリンク条件に基づいて、該選択された一つあるいは複数の核にリンクする核候補を該４次元画像から順次抽出して一連の順リンク情報を得る工程と、
（ｃ）該順リンク情報から逆リンクを作る核を一つあるいは複数選択する工程と、
（ｄ）予め設定したリンク条件に基づいて、該逆リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から順次抽出して一連の逆リンク情報を得て、該逆リンク情報に基づいて該順リンク情報から誤認識された核候補を除去する工程を含み、順リンク情報の枝が増えたところを細胞分裂とみなすことを特徴とする細胞系譜作成法。
【請求項１６】
（ａ）核候補を抽出してなる４次元顕微鏡画像において、抽出された該核候補から順リンクおよび逆リンクを作る核をそれぞれ一つあるいは複数選択する工程と、
（ｂ）予め設定したリンク条件に基づいて、該順リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から順次抽出して一連の順リンク情報を得る工程と、
（ｃ）予め設定したリンク条件に基づいて、該逆リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から順次抽出して一連の逆リンク情報を得て、該逆リンク情報に基づいて該順リンク情報から誤認識された核候補を除去する工程を含み、順リンク情報の枝が増えたところを細胞分裂とみなすことを特徴とする細胞系譜作成法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は細胞系譜抽出方法に係り、詳しくは、観察対象の４次元顕微鏡画像から細胞系譜を作成する方法に関するものである。また、本発明は、好適には、ノマルスキー型透過型微分干渉顕微鏡（以下「ノマルスキー顕微鏡」という）で撮影した線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の発生過程の４次元画像から、細胞系譜を作成する方法に関するものである。
背景技術
線虫は１９６５年にＳｉｄｎｅｙ  Ｂｒｅｎｎｅｒによって見出された実験生物で、現在の分子生物学で特に詳しく解析されている実験生物（大腸菌、酵母、線虫、ハエ、アフリカツメガエル、セブラフィッシュ、ネズミ等）の一つである。線虫は、これらの実験生物の中では多細胞生物の最も単純な生物として位置付けられている。線虫は、受精卵が成虫になるまで、おおよそ三日間を要する。
多細胞生物は基本的に一つの受精卵（単細胞）が秩序正しく分裂を繰り返して多数の細胞からなる成虫を形成する。受精卵からの分裂の秩序を樹形図的に記述したものを細胞系譜と呼ぶ。線虫は多細胞生物の中で唯一受精卵から成虫までの細胞系譜が明らかにされている。この細胞系譜は１９８３年にＳｕｌｓｔｏｎ等によって決定された。
正常な線虫（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）は全ての個体でその受精卵から成虫になるまでの細胞系譜が一定である。特定の遺伝子に突然変異が起きるとその遺伝子の機能に変化が生じ、細胞分裂のパターン、すなわち細胞系譜がｗｉｌｄ  ｔｙｐｅのものと比べて変化する。この細胞系譜の変化から突然変異した遺伝子の機能を推定し、その推定を出発点にした研究の進展により大量の遺伝子が急速に同定され、また、突然変異体動物が大量生産され始めてきている。これらの資源を有効活用することを考えると、遺伝子、突然変異体解析の出発点である細胞系譜解析の自動化は必要不可欠な技術である。
従来の細胞系譜の作成には、いわゆるノマルスキー顕微鏡が用いられる。ノマルスキー顕微鏡は、偏光版、ノマルスキープリズムのセットにより作成した２種類の光線（同波形、同位相、光路のみ微妙にズレている）を観察対象に照射し、観察対象を透過させる。観察対象を透過する光路の長さや、屈折率の差に起因して透過後の２本の光線の位相はズレている。透過後の２本の光線を偏向板、ノマルスキープリズムのセットを用いて同光路に収束させると、この２本の光線の位相のズレは干渉作用を引き起こす。この干渉作用による明暗像をもって、観察するのがノマルスキー顕微鏡である。この方法によれば、透明な観察対象の内容物の分布や外形状を明暗像で捉えることができる。生物学で言うと、通常の光学顕微鏡では透明に見える細胞の内容物（細胞核）や、外形（細胞膜）を明暗像で捕らえることができる。
線虫の細胞系譜を決定したＳｕｌｓｔｏｎ等はノマルスキー顕微鏡を肉眼で見てスケッチして作成したと言われており、相当の時間（おそらく１年以上）を要したものと思われ、また、その労力は多大なものである。
最近では、ノマルスキー顕微鏡を用いた４Ｄ顕微鏡画像を用いて作成するのが一般的である。特定の焦点で観察される顕微鏡画像は観察対象を特定の位置で水平に切断して得られる２次元（ｘ−ｙ軸）断面像と考えられる。すなわち、焦点を上下に動かす（ｚ軸方向に動かす）ことで観察対象をｚ軸方向の様々な位置で切断した断面像が得られる。これらの画像を統合すると観察対象の３次元の形を捉えることができる（３次元画像）。さらに、このような３次元画像の撮影を時間を追って撮影していくことで観察対象の時間変化を捉えることができる。このようにして撮影したものを４Ｄ（４次元）顕微鏡画像と呼ぶ。
４Ｄ顕微鏡画像を用いる作業はＳｕｌｓｔｏｎ当時と比較して楽になったものと考えられるが、撮影した画像から細胞核、細胞膜を人間が判断しているため、やはりかなりの労力と時間を要する。受精卵から１６細胞くらいまでの作成であっても、１日以上はかかる。
また、細胞系譜を作成するためには、いかに正確に得られた画像から核領域を認識するかが重要となる。しかしながら、画像処理アルゴリズムによる核の認識は完全なものではなく、特に細胞の数が増加するに従い誤って核領域と認識された領域（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）が含まれる。ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅが多いデータからは正しく細胞系譜を構築するのが困難であるため、自動核認識の結果から、誤認された核領域を人間の判断で除去する作業が必要となっていた。
本発明は、かかる従来の細胞系譜の作成に係る課題を解決するべく創案されたものであって、細胞系譜を計算機で構築することにより、細胞系譜を省力でかつ短時間で構築することを目的とするものである。
本発明の他の目的は、誤って核領域と認識される領域（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を効率的に除去することにある。
発明の開示
本発明が採用した核領域認識法は、核候補を抽出してなる複数の細胞の４次元顕微鏡画像において、抽出された複数の該核候補からから、一つあるいは複数の核を初期情報として選択する工程と、該初期情報に基づいて、予め設定したリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出してリンク情報を得る工程と、得られたリンク情報から核領域でないリンク情報を削除する工程とを含むものである。
得られたリンク情報から核領域でないリンク情報を削除する工程は、核候補を抽出してなる複数の細胞の４次元顕微鏡画像において、前記初期情報を除く抽出された複数の該核候補からから、一つあるいは複数の核を第二初期情報として選択する工程と、該第二初期情報に基づいて、前記初期情報に基づくリンクとは異なる方向に、予め設定したリンク条件を満たす核候補を該４次元画像から順次抽出して逆リンク情報を得る工程と、前記リンク情報から該逆リンク情報にない核候補を除去する工程とを含むものである。
本発明が採用した細胞系譜作成法は、核候補を抽出してなる４次元顕微鏡画像において、抽出された該核候補から順リンクを作る核を一つあるいは複数選択する工程と、該選択された一つあるいは複数の核にリンクする核候補を該４次元画像から抽出して一連の順リンク情報を得る工程と、該順リンク情報から逆リンクを作る核を一つあるいは複数選択する工程と、該逆リンクを作る核にリンクする核候補を該４次元画像から抽出して逆リンク情報を得て、該逆リンク情報に基づいて該順リンク情報から誤認識された核候補を除去する工程を含み、順リンク情報の枝が増えたところを細胞分裂とみなすことを特徴とするものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係る核認識法および細胞系譜作成法の実施形態について説明する。図１は本発明のシステム図であって、大きく分けると、▲１▼線虫初期胚のノマルスキー型顕微鏡４Ｄ画像を撮影する工程、▲２▼個々の２次元画像において核候補を抽出する工程、▲３▼リンケージテスト（核領域の認識および細胞系譜作成）の三つから構成される。
［４次元顕微鏡画像］
線虫初期胚のノマルスキー型顕微鏡による４Ｄ画像の撮影について説明する。４Ｄ画像が意味することころは、従来技術の欄に記載したとおりであって、焦点を異ならしめて撮影した複数の２次元画像と、該複数の２次元画像を時系列に撮影してなる複数の２次元画像を言う。すなわち、焦点面、時点が異なる複数の２次元画像を統合した画像を４Ｄ画像と言う。本実施の形態で処理対象とする線虫の初期胚の画像は、焦点面を上下に変えて３０〜９０枚の１セットとし、１〜５分毎に撮影する。実験では、８９の焦点面、２０の時系列点について、合計１７８０枚の２次元画像を撮影した。細胞の長尺方向の半径は約６０μｍ、短尺方向の半径は約３０μｍである。撮影は９０秒毎に行った。処理対象の顕微鏡画像の例を図７に示す。横軸が時間軸（時点）、縦軸が焦点軸（焦点面）である。尚、４次元画像は、最も好ましくは、ノマルスキー型透過型微分干渉顕微鏡で撮影したものであるが、４次元画像はこれに限定されるものではない。
［核候補の抽出］
個々の２次元画像における細胞核の位置の抽出について、エントロピーフィルタを用いた核領域の抽出に基づいて説明する。本発明が採用したエントロピーフィルタは、注目画素（ｘ，ｙ）を含む小区画のエントロピーを計算し、得られたエントロピー値を該注目画素（ｘ，ｙ）の新しい値とするものであり、画像から平坦な部分あるいは粗い部分を効率的に抽出するフィルタである。これは、細胞質の画質がザラザラしているのに対して、核領城の画質が比較的平坦であることを利用したものである。
図２に示すように、大きさＭ×Ｎ画素の元画像の中に始点（ｘ，ｙ）を決定する。ｘ：０〜（画像幅−ウィンドウ幅）；ｙ：０〜（画像の高さ−ウィンドウの高さ）である。
次いで、始点として選択した注目画素から（幅、高さ）＝（Ａ，Ｂ）の大きさのウィンドウで画像を区画する。区画されたウィンドウのエントロピーを計算し、得られたエントロピー値を、新しい画素値として、処理画像の座標（ｘ，ｙ）に保存する。図示のものでは、ｘ：０〜（Ｍ−１−Ａ）、ｙ：０〜（Ｎ−１−Ｂ）である。
エントロピー計算は式（１）に基づいて行なわれる。
0003889361.tif 000002
式（１）において、Ｐ（１）は、特徴を計測したい画像領域に対して、濃度ヒストグラムＨ（１）（濃度レベル数がＬであれば、１＝０，１，２，・・・，Ｌ−１である）を求め、頻度の総数（画像領域の画素数）で各濃度レベルの頻度を割って、総画素数が１．０になるように正規化した濃度ヒストグラムである。式（１）によって求められるエントロピーの値を基準にして核領域、細胞質領域の区別を行う。
小区画のエントロピー計算を行いながら元画像を走査することで、効率良く核の位置を抽出することができる。エントロピーウィンドウサイズについては、顕微鏡の種類や倍率等に依存するものであるが、６［ｐｉｘｅｌ］×６［ｐｉｘｅｌ］〜２０［ｐｉｘｅｌ］×２０［ｐｉｘｅｌ］（好ましくは、１０［ｐｉｘｅｌ］×１０［ｐｉｘｅｌ］、または、１２［ｐｉｘｅｌ］×１２［ｐｉｘｅｌ］）の画像領域ウィンドウを用いることで良好な結果を得た。この場合、核領域のピクセルは細胞分裂等の要因によって幅があるが、だいたい１０００ピクセルから１００００ピクセルである。もちろん、前述したウィンドウサイズや核領域のピクセル数は単なる例に過ぎない。
エントロピーフィルタによる処理画像について図８乃至図１０に基づいて説明する。図８はある細胞の顕微鏡画像であり、図９は、図８の画像のエントロピーフィルタによる処理後の細胞の画像（フィルタリング画像）である。図１０は、エントロピーフィルタによる処理後の画像（図９）を閾値を用いて二値化処理したものを、図８の顕微鏡画像に重ね合わせたものである。このようにして４Ｄ画像から核候補が抽出される。
核候補データを抽出する手段は、エントロピーフィルタに限定されるものではなく、他の手段であってもよい。細胞核を抽出する工程は、画像の明暗の細かい変化が少ない領域を核として検出する手法、あるいは、光の角度に沿って広い範囲で明暗の変化の大きい部分を核として抽出する手法を含む。前者の例としては、Ｋｉｒｓｃｈフィルタ、Ｐｒｅｗｉｔｔフィルタ、ＦＦＴフィルタを用いるものが挙げられる。Ｋｉｒｓｃｈフィルタは好ましくは、Ｋｉｒｓｃｈテンプレート型エッジ検出オペレータと移動平均法を組み合わせたフィルタである。Ｐｒｅｗｉｔｔフィルタは好ましくは、Ｐｒｅｗｉｔｔテンプレート型エッジ検出オペレータの出力を２値化し、さらに距離変換を適用するフィルタである。後者の例としては、見た目の光の角度に沿って上下所定ピクセル分の輝度値の合計の差分を取るフィルタが採用される。
［リンケージテスト］
４次元画像に含まれる核候補を抽出しておく。抽出された核候補には、本来核であるものと、本来核ではない部分が誤認識されて核候補となっているものが含まれ得る。リンケージテストによって、誤認された核候補を効率的に除去すると共に、細胞系譜を効率的に作成することができる。
本明細書において、リンクするとは、リンク元とリンク対象の核領域あるいは核候補が、特定の条件を満たす時にリンクしていると判断する。リンクには、図３に示すように、ｚ軸方向のリンクと、時間軸方向のリンクがある。
（ｚ軸方向のリンク）
Ｚ＝ｚとＺ＝ｚ＋ａとのリンクを有効とする（ａは任意）
Ｚ＝ｚとＺ＝ｚ−ｂとのリンクを有効とする（ｂは任意）
（時間軸方向のリンク）
Ｔ＝ｔとＴ＝ｔ−ｃとのリンクを有効とする（ｃは任意）
Ｔ＝ｔとＴ＝ｔ＋ｄとのリンクを有効とする（ｄは任意）
一つの好ましい態様では、ａ，ｂ，ｃ，ｄは１（すなわち、ｚ軸方向あるいは時間軸方向に隣位の画像）である。しかしながら、ａ，ｂ，ｃ，ｄはかならずしも１である必要はなく、ｚ軸方向あるいは時間軸方向に隣位の画像を飛び越えて、他の画像にリンクしてもよい。
リンクの条件について図４に基づいて説明する。図４（Ａ）に示すようにリンク対象となる核領域Ａ，Ｂがある場合に、リンクするための条件は、次の二つのである。一つは、図４（Ｂ）に示すように、二つの核領域Ａ，Ｂがｘ−ｙ平面でオーバーラップしていることである（条件１）。もう一つは、図４（Ｃ）に示すように、リンク元とリンク対象の核領域Ａ，Ｂの位置が指定した距離よりも小さいことである（条件２）。そして、二つの核領域Ａ，Ｂが、条件１，２のいずれかを満たすときに二つの核領域Ａ，Ｂはリンクすると言う。通常は、条件１のみによってリンクを判定する。
条件１に基づくリンク判定について図５に基づいて説明する。図５（Ａ）に示す一つの方式では、ＡとＢの核領域の候補があった時に、１ピクセルでも重なり合う部分がある場合には、「リンクする」とし、１ピクセルでも重なり合う時がない場合には、「リンクしない」とする。また、他の方式では、重なり合う部分の面積に所定の閾値を設け、重なり合う部分が該閾値より大きい時に「リンクする」ようにしてもよい。
さらに、図５（Ｂ）に基づいて、改良された方式について説明する。リンクの対象となる核領域Ａの面積をＳａ、核領域Ｂの面積をＳｂとする。核領域Ａと核領域Ｂを重ね合わせた時に、互いに重なり合う部分の面積をＳｃとする。リンク判定は以下のように行なう。共有部分の面積ＳｃをＳａで割った値をＶａｌｕｅＡ、共有部分の面積ＳｃをＳｂで割った値をＶａｌｕｅＢとする。ＶａｌｕｅＡ、ＶａｌｕｅＢが共に閾値αよりも大きい場合には、「リンクする」とし、ＶａｌｕｅＡ、ＶａｌｕｅＢの少なくともいずれかが閾値αよりも小さい場合には、「リンクしない」とする。好ましい例では、時間軸方向のリンクの場合には、１０％〜２０％の範囲から閾値αを設定する。好ましい例では、ｚ軸方向のリンクの場合には、３０〜５０％の範囲から閾値αを設定する。
上述したように、通常は条件１のみによってリンケージテストを行なう。条件２を設けた一つの理由は、核候補が小さくなると条件１のオーバーラップは厳格すぎてリンクができなくなってしまうため、一定の距離内にある二つの核候補をリンクとみなす必要がある場合があり得るからである。条件２における距離は、ｘ―ｙ−ｚ空間における３次元空間における距離を意味している。したがって、図４（Ｃ）におけるＡ−Ｂ間の距離は３次元距離である。距離を算出する際には、各核候補には設定されている重心座標（ｘ、ｙ）を用いる。また、４次元顕微鏡画像は、撮影時において、各々の画像がｚ軸において何マイクロメートルの高さの写真であるか厳密に決められている。
リンケージテストの手順について説明する。先ず、細胞系譜、または、注目している特定の細胞の細胞分裂系譜を知りたい場合には、画像の中から注目細胞を一つ、あるいは複数指定する。指定した細胞における一つあるいは複数の核領域を第一初期情報（第一出発核）として選択し、予め設定された条件（例えば、図５（Ｂ）に示す条件）に従って、第一出発核をスタートとしてリンクする核候補を画像セットの中から順次抽出する。
指定した核を出発核として下流（時系列的に古いものから新しいもの）へのリンク（順リンク）を順次行なうことで、一連の順リンク情報が得られ、図６上図に示すような予備的系譜が作成される。順リンク情報の枝が増えたところが細胞分裂であると認識することで、リンク情報と同時に細胞系譜を作り出す。図６上図に示す予備的系譜には、本来核でない領域が含まれている可能性がある。
次いで、得られたリンク情報から特定の部分の核領域を第二初期情報（第二出発核）として指定して、図６下図に示すようにリンクの上流（時系列的に新しいものから古いもの）へ再びリンク（逆リンクという）を作成する。順リンクのリンク情報の中で逆リンクのリンク情報に含まれない情報が本来核領域でない領域であると判断され、これらが除去される。すなわち、逆リンクを行なうことによって、本来核領域でないリンク情報が自動的に除去される。
図１１は、図１０における画像において、順リンクの結果認識された核候補を示す図である。図１１の核候補において、リンケージテスト（逆リンク）の結果に基づいて誤認領域を除去したものを図１２に示す。図１１では、９個の核候補が認識されたのに対して、逆リンクの結果、３個の核候補が核とみなされた。また、オリジナル顕微鏡画像（図８）をエントロピーフィルタで処理して核候補を抽出した図（図１０）では、核領域のみならず多くのいわゆるゴミを含むが、図１１に示すように、多くのゴミは順リンクの過程で排除される。さらに、ゴミは、逆リンクで最終的に綺麗に取り除かれる。また、リンクのプロセスでは、あまりに小さい面積のものを外す閾値（一つの例では、面積閾値は５００［ｐｉｘｅｌ］である）が設けてあるので、順リンク・逆リンクだけではなく、抽出された領域の面積によってもゴミが除外される。
リンケージテストは、誤認された核領域候補の除去するのみならず、誤認領域の除去と同時に、細胞系譜作成を自動的に行なうことができる。前述のように、リンク情報の枝が増えたところが細胞分裂であると認識することで、リンク情報と同時に細胞系譜が作成される。すなわち、順リンクによって予備的な細胞系譜を作成し、次いで逆リンクを行なうことによって、本来核領域でないリンクが自動的に予備的な細胞系譜から削除され、精度の高い細胞系譜が作成される。
逆リンクにおいて初期情報として指定される核は、必ずしも、順リンクにおいて得られたリンク情報の中から選択される必要はない。例えば、複数の４次元画像において、最初に、順リンクの元となる核、逆リンクの元となる核を指定し、その後に、順リンク、逆リンクをそれぞれ行なっても良い。また、リンクは、選択した任意の核から、上流および下流の双方に行なってもよい。
本発明は以下のような有利な効果を奏するものである。
（１）抽出された核候補から細胞系譜を自動的に構築することができ、従来煩雑かつ多大な労力を必要としていた細胞系譜を省力でかつ短時間で構築できる。
（２）核領域として抽出された核候補の中から、誤って核領域と認識される領域（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を効率的に除去することができる。
（３）注目している細胞を選択して、該細胞に関する細胞系譜を構築することができる。
（４）核領域の位置や細胞系譜を、具体的な数値（座標、時間）で表現することができる。
（５）注目している核の位置の変位、移動速度、細胞分裂による核領域の変位を具体的な数値で表現（座標、時間）することができる。
産業上の利用可能性
製薬、医療、農業、食品分野において、ゲノム情報を有効利用した商品開発に利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明に係る細胞系譜抽出方法のフロー図であり、図２はエントロピーフィルタの説明図（左は元画像、右は処理画像）であり、図３はｚ軸方向および時間軸方向のリンクを説明する図であり、図４はリンク条件を説明する図であり、図５はリンク判定を説明する図であり、（Ａ）において左は「リンクする」、右は「リンクしない」を示しており、図６は順リンクおよび逆リンクを説明する図であり、図７は処理対象の４Ｄ顕微鏡画像の例を示す図であり、図８はある細胞の顕微鏡画像であり、図９は図８の画像をエントロピーフィルタで処理した処理画像であり、図１０は図９の画像を閾値処理したものを、図８の顕微鏡画像に重ね合わせたものであり、図１１は核候補を抽出した画像（図１０）の順リンク後の画像であり、図１２は図１１の画像において、リンケージテスト（逆リンク）の結果に基づいて誤認領域を除去したものである。
【図１】
0003889361.tif 000003
【図２】
0003889361.tif 000004
【図３】
0003889361.tif 000005
【図４】
0003889361.tif 000006
【図５】
0003889361.tif 000007
【図６】
0003889361.tif 000008
【図７】
0003889361.tif 000009
【図８】
0003889361.tif 000010
【図９】
0003889361.tif 000011
【図１０】
0003889361.tif 000012
【図１１】
0003889361.tif 000013
【図１２】
0003889361.tif 000014