(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト臍帯血から有核細胞を分離し、
分離した有核細胞を、増殖・分化誘導因子であるＦＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ及びＳＣＦを加え培養することにより分化誘導させることを特徴とする、肝細胞又は/及び肝前駆細胞の生産方法。
【請求項２】
ヒト臍帯血から有核細胞を分離し、
分離した有核細胞を脾臓に注入することによって免疫不全動物（ヒトを除く）に移植することにより肝細胞又は/及び肝前駆細胞に分化誘導させることを特徴とする、肝細胞又は/及び肝前駆細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト臍帯血中の有核細胞を肝細胞若しくは肝前駆細胞に分化誘導させる方法と、それによって得られる肝細胞若しくは肝前駆細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、劇症肝炎・肝硬変・肝癌など重症の肝疾患患者に対しては肝移植治療以外に有効な治療法がなく、本邦では年間約４万人の肝疾患死亡者を数えている。
物質代謝の中心器官である肝臓では、このように臓器移植の要望が強いものの脳死肝移植治療・生体肝移植治療共に倫理的にも医療経済的にも問題が多く、ドナーの慢性的不足や移植免疫による拒絶反応の問題もある。また、人工肝臓の開発も困難さが指摘されている。代替治療として肝細胞移植が試みられているが、細胞供給源としてヒト肝臓が必要であり、現状では適用の拡大は難しい。
１９８８年に米国の２つのグループがヒトの多能性胚性幹細胞／生殖系列細胞（ＥＳ／ＥＧ）について報告し(Thomson, J.A., et al. (1998) Science, 282, 1145-1147; Shamblotte, M.J., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13726-13731)、ヒト（ＥＳ／ＥＧ）細胞から分化させた様々な細胞を移植治療に応用できる可能性が高まった。しかしマウスＥＳ細胞からの肝細胞分化誘導の研究も緒についた段階であり、現時点では公的機関におけるヒトＥＳ（様）細胞研究そのものに制約が多い。実験動物モデル系では、骨髄移植を受けたラットの肝臓内にラットドナー由来の肝細胞が認められること［Petersen et al.,(1999) Science, 284, 1168-1170］、ラット骨髄細胞を培養系で肝（様）細胞に分化可能なこと(Oh, S., et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 500-504)が示された。マウスではドナー由来の造血幹細胞が肝細胞に分化したこと［Lagasse et al.,(2000) Nature Med. 6, 1229-1234 ］、更に、ヒトでも骨髄移植患者の肝内にドナー由来の肝細胞が認められること［Theise,N.O., etal.,(2000) Hepatology, 32, 11-16］からヒト肝細胞の供給源として骨髄造血幹細胞を利用出来る可能性が考えられているが、ドナーにはかなりの負担になる。一方、これまで、ヒト臍帯血を用いた検討に関しての報告は皆無である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、肝細胞移植治療等に使用し得る肝細胞（若しくは肝前駆細胞）に容易に分化誘導され得る細胞供給源であって、ドナーへの負担が少ない細胞供給源と、これを肝細胞（若しくは肝前駆細胞）に分化誘導させる方法並びにこの方法により得られる肝細胞（若しくは肝前駆細胞）を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究の途上、ヒト臍帯血に着目し、ヒト臍帯血有核細胞を種々の増殖・分化誘導因子を加え培養したところ、細胞はヒトアルブミン遺伝子を発現し、培養液中にアルブミンの産生を認めた。
また、ＳＣＩＤマウスの脾臓に臍帯血中の有核細胞を移植したところ、４および６週後の肝細胞にヒトアルブミン遺伝子の発現およびヒトアルブミンを認めた。
アルブミンは肝細胞により生合成されるタンパク質であり、培養細胞および移植動物にヒトアルブミン遺伝子およびヒトアルブミンが検出されたことは、臍帯血有核細胞が肝細胞に分化誘導されたことを示している。
本発明者らは、上記した如き事実と知見に基づき研究を重ねた結果本発明に到達した。
【０００５】
即ち、本発明は、ヒト臍帯血中の有核細胞を分化誘導させてなる肝細胞又は/及び肝前駆細胞に関する。
【０００６】
また、本発明は、肝細胞移植治療に用いる上記肝細胞又は/及び肝前駆細胞に関する。
【０００７】
更に、本発明は、ヒト臍帯血中の有核細胞を分化誘導させることを特徴とする肝細胞又は/及び肝前駆細胞の生産方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、ヒト臍帯血中の有核細胞を分化誘導させる方法としては、直接或いは体外培養で分化・増殖させる方法が挙げられる。
直接培養で分化・増殖させる場合の例としては、例えば、ヒト臍帯血から分離・調製した有核細胞を免疫不全動物に移植することにより肝細胞又は/及び肝前駆細胞に分化誘導させる方法等が挙げられる。ここで、免疫不全動物としては、ヒトの重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）と同様の病態を呈する動物、例えばＳＣＩＤマウス等が挙げられる。
ヒト肝細胞への分化は、ヒトアルブミンの遺伝子発現（ＲＴ−ＰＣＲ法）と、アルブミンタンパク質発現（免疫組織染色とウエスタンブロッティング法）により確認することが出来る。
【０００９】
また、体外培養で分化・増殖させる方法としては、ヒト臍帯血から分離・調製した有核細胞を増殖・分化誘導因子を加え培養することにより肝細胞又は/及び肝前駆細胞に分化誘導させる方法等が挙げられる。ここで、増殖・分化誘導因子としては、例えば、ＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）、ＳＣＦ（ヒト幹細胞因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＨＧＦ（ヒト肝細胞成長因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、デキサメタゾン等が挙げられるが、ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦの組み合わせが特に好ましい。
肝細胞関連遺伝子（アルブミン等）とグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)のｍＲＮＡの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって確認することが出来る。また、免疫組織染色によってもアルブミン産生細胞を確認することが出来る。
【００１０】
本発明の肝細胞（若しくは肝前駆細胞）は、多彩な肝疾患の治療に適用可能と考えられる。また、肝細胞移植治療にこれを用いた場合には、従来の肝細胞移植治療における問題点であるドナー不足が解消され、ドナーへの負担が解消され、免疫拒絶反応の問題も解決され、更には、コストの大幅削減が期待できる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１２】
実施例１  ヒト臍帯血からの有核細胞の分離
インフォームドコンセントを得た健常成人女性１５例の正常分娩時の臍帯血を、ＡＣＤ−Ａ液を抗凝固剤として含有する１０ｍｌ真空試験管（ニプロ製）に分注して室温保存後８時間以内に使用した。この臍帯血を等量の６％ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）加生理食塩水（ニプロ製アンプル）と混和し、９０分間静置後、上層を回収し下層部分にある大部分の赤血球と分離した。等量のリン酸緩衝液加生理食塩水を加えて細胞を遠心分離にて回収し、リン酸緩衝液加生理食塩水にて一回洗滌した。本細胞調製標品には有核細胞以外に混存した多くの赤血球が認められるが、培地交換を経ることよって徐々に減少していく（図１参照）。
【００１３】
実施例２  ヒト臍帯血有核細胞の培養系での肝細胞への誘導
ヒト臍帯血から分離した有核細胞を、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加高グルコース含有ダルベッコ改変最小基本培地（ＤＭＥＭ；Gibco-BRL社）に種々の増殖・分化誘導因子を加えて組織培養プレート中で３週間培養した。プレートには０．１％ゼラチンコーティングを行い、通常、２×１０６/ｃｍ２の細胞密度にて播いた。加えた因子と濃度は以下に示した。
ＬＩＦ（R and D Systems社，１０ｎｇ/ｍｌ）、ＳＣＦ（R and D Systems社，１０ｎｇ/ｍｌ）、ＦＧＦ［繊維芽細胞成長因子１（Gibco-BRL社，２０ｎｇ/ｍｌ）＋ヒト繊維芽細胞成長因子２（Gibco-BRL社，１０ｎｇ/ｍｌ）］、ＨＧＦ（持田製薬（株），１０ｎｇ/ｍｌ）、ＯＳＭ（DIACLONE Research社，１０ｎｇ/ｍｌ）。
３〜５日毎に培地の約半量を増殖・分化誘導因子を含む新鮮培地と交換し、劣化し易い増殖・分化誘導因子の濃度を維持した。
ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦを添加培養した場合、約７日目から円形の細胞が認められ、２１日目ではその細胞群がかなり増加した。結果を図１に示す。
【００１４】
同様の条件で培養した細胞を１週間毎に３週目まで回収し、全細胞からｍＲＮＡを分離し（Roche社，ｍＲＮＡ分離キット）、逆転写酵素（ＲＴ）によって相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成後、アルブミンとグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってアルブミンとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを検出した。結果を図２に示す。
細胞の種類を問わず常に発現しているため対照として用いたＧＡＰＤＨｍＲＮＡに比べ、７日目で若干のアルブミンｍＲＮＡの発現が見られ、１４日と２１日で発現が増加した。定量的ＰＣＲ（Roche社）によって定量化したところ、１４日目と２１日目におけるアルブミンｍＲＮＡの相対的発現量は７日目の約１０倍であった。
なお、アルブミンｍＲＮＡと対照のＧＡＰＤＨｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる産物のサイズはそれぞれ３５０ｂｐと４００ｂｐである。
【００１５】
一方、ＨＧＦを除いたＦＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦ添加培養２１日では円形の細胞群はほとんど認められず（図３右上）、また、ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦあるいはＦＧＦ/ＨＧＦ/ＳＣＦ添加培養では円形細胞の出現頻度が低かった（図３左下、右下）。ＨＧＦを除いたＦＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦ添加培養ではアルブミンｍＲＮＡの発現はかなり低かった。定量的ＰＣＲによって定量化したところ、約５倍の違いが認められた。この実験結果は、アルブミン遺伝子を発現する肝細胞様円形細胞の効果的な分化・増殖誘導には、４種のサイトカイン、ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦが必須であることを示している。
なお、アルブミンとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる産物のサイズはそれぞれ４００ｂｐと５００ｂｐである。
ＲＴ−ＰＣＲ法によってグルコース６-ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）ｍＲＮＡは確認できないため、分化誘導された肝細胞は成熟段階に達する前の肝臓幹細胞様であると推測できる。肝細胞成熟因子として知られているＯＳＭをデキサメタゾンと組み合わせて添加したが、成熟効果は認められなかった。
【００１６】
次に、小型円形細胞にアルブミンタンパク質が発現していることを調べるために、免疫組織染色を行った。細胞に通常のアセトン固定処理をして、ウサギ抗ヒトアルブミン抗体（DAKO社）とインキュベーションした後、蛍光色素であるＦＩＴＣを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma社，Ｆ１２６２）と反応させ、蛍光顕微鏡及び位相差顕微鏡によって観察した。ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦ添加２１日後の細胞では約半数が強度に蛍光染色され、アルブミンが細胞内に発現していることが確認された（図４左；４０倍）。４００倍に拡大した図４右図では、細胞の主に細胞質が染色されていることが示され、アルブミンの細胞質内局在性を反映していた。なお、図４の上段は位相差顕微鏡によるもの、下段は蛍光顕微鏡によるものである。
【００１７】
実施例３  ヒト臍帯血有核細胞の重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスへの移植実験
ＳＣＩＤマウス（生後６〜７週目）一匹あたり０．４ｍｇの２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）を皮下に投与後７日目に、３０％肝部分切除手術と共に１０７個の有核細胞（０．１ｍｌリン酸緩衝液加生理食塩水中）を脾臓に注入し、４〜６週後に犠死させ、血清分離と肝臓摘出を行った。マウス血清中のヒトアルブミンはウエスタンブロッティング法にて検出した。マウス血清をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動/ウエスタンブロット後、ヒトアルブミンに対するマウスモノクローナル抗体（CORTEX BIOCHEM社、ＣＲ２１１６Ｍ）を用い、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。ペルオキシダーゼ反応の化学発光による検出はＥＣＬキット（Amersham社）を用いて行った。このヒトアルブミンに対する特異モノクローナル抗体は、マウスアルブミンとも約千分の一の効率で交差するが、ヒト臍帯血有核細胞を注入しない対照マウス血清に比較して有意にヒトアルブミンの発現していることが示された。  結果を図５に示す。図５中、レーン１はヒト血清（１０００倍希釈を１μｌ使用）、レーン３と４はヒト臍帯血有核細胞移植ＳＣＩＤマウス（＃１，＃２）の血清（２０倍希釈を１μｌ使用）、また、レーン２は対照マウスの血清（本特異抗体はマウスアルブミンとも約千分の一の効率で交差反応を示すため、対照マウスの血清でも弱いシグナルが認められる）についての結果である。
この結果は、ヒト臍帯血有核細胞が免疫不全マウス中でアルブミンを産生し、血中に分泌する機能的な肝実質様細胞に分化したことを示唆するものである。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、代謝の中心を担う肝臓の細胞を臍帯血からin vitro で多量に分化・増殖させて利用できれば、多彩な肝疾患の治療に結びつけることが可能となる。また、ヒト臍帯血から肝（幹）細胞を分化誘導できれることは、細胞核移植に頼らずとも、拒絶反応を生じない肝（幹）細胞のレパートリーを準備することが容易であることも示しており、ドナー不足の解消、ドナーへの負担解消、免疫拒絶反応の解決、コストの大幅削減が期待できる。さらに、核移植などによるヒトクローンの心配もなく、倫理面での問題も少ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト臍帯血有核細胞をＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦを含む培地で３週間培養し、２，４，７，１１，１５，２１日目に位相差顕微鏡によって細胞を撮影した図である（倍率４００倍）。
【図２】図２は、ヒト臍帯血有核細胞をＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦを含む培地で３週間培養し、７日毎に細胞を回収し、ヒトアルブミンｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
【図３】図３は、ヒト臍帯血有核細胞をそれぞれＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦ（左上）、ＦＧＦ/ＬＩＦ/ＳＣＦ（右上）、ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＬＩＦ（左下）、ＦＧＦ/ＨＧＦ/ＳＣＦ（右下）の条件下において３週間培養し、細胞回収後、ヒトアルブミンｍＲＮＡと対照のＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
【図４】図４は、ヒト臍帯血有核細胞を種々のサイトカインを含む培地中で３週間培養し、免疫染色によってヒトアルブミンを検出した図である（左：倍率４０；右：倍率４００）。
【図５】図５は、ヒト臍帯血有核細胞移植４週後のＳＣＩＤマウス血清中のヒトアルブミンを免疫ブロッテイング法によって検出した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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