(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２６位のSerから３７１位のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１位のMetから３７１位のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の糖転移酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち２７０位のTから１３０７位のTまでの塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち１９５位のAから１３０７位のTまでの塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガングリオシドは、シアル酸を含む両親媒性糖脂質分子であり、脊椎動物の神経組織（ Suzuki, K. (1965) J. Neurochem.  12,969-979）に豊富に見出される。すでにガングリオシドについては多くの研究がなされており、それらが神経系の発達、維持、及び修復において重要な役割を果たしていること（Schaal, H., Wille, C., and Wille, W. (1985) J. Neurochem. 45,544-551）、ガングリオシドの生物学的機能は神経栄養因子（Ferrari, G., Anderson, B. L., Stephens, R. M., Kaplan,D. R., and Greene, L. A. (1995) J. Biol. Chem. 270,3074-3080）、神経栄養因子のレセプター及び、成長因子のレセプターのモディファイヤー(Modifiers)Bremer, E.G., Hakomori, S., Bowen-Pope, D. F., Raines, E., andROSS, R. (1984) J. Biol. Chem. 259, 6818-6825）であること等が知られている。さらに、体内へガングリオシドを全身的に投与すると、種々の病理的条件において神経栄養性効果を示すことも知られている。
【０００３】
一方、ガングリオシドが神経系の機能に影響し、細胞成長と分化を制御する分子メカニズムについてはいまだ明らかでない。従来は、培養細胞、又は実験動物にガングリオシドを外因的に添加してその効果を観察する方法のみがなされていた。これらの問題は、いくつかのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離(Joziasse, D. H., Shaper, J. H., Van den Eijnden, D. H., VanTunen, A. J., and Shaper, N. L. (1989) J. Biol. Chem. 264,14290-14297、 Narimatsu, H., Sinha, S., Brew, K., Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)され、それらの遺伝子操作により細胞の糖化の型を改変することが可能となり著明に解決されてきた(Ikematsu, S., Kaname, T., Ozawa, M., Yonezawa, S., Sato, E.,Uehara, F., Obama, H., Yamamura. K., and Muramatsu, T.(1993) Glycobiology. 3, 575-580、 Ioffe, E., and Stanley, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 91, 728-732、 Metzler, M., Gertz, A., Sarkar, M., Schachter, H., Schrader,  J. W., and Marth, J.D. (1994) EMBO J. 13, 2056-2065)。例えば、培養細胞において炭水化物をリモデルし、実験動物において炭水化物を遺伝子的に修飾することが試みられ(Takamiya, K., Yamamoto, A-, Furukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Okada, M., Fukumoto, S., Haraguchi, M., Takeda, N.,Fujimura, K., Sakae, M., Kishikawa, M., Shiku, H., Furukawa,K., and Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,10662-10667)、予想されなかった又は明確には知られていなかった炭水化物の新規な機能が見出された。
【０００４】
複合型ガングリオシドのうち、GM1は最も研究されているものであり、脊椎動物の脳に存在する主なガングリオシドである。GM1はまた、コレラトキシンBサブユニットと特異的に結合してcAMP応答(Holmgren, J., Lonnroth, I., Mansson, J. E., and Svennerholm, L.(1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 2520-2524)のような重要な生物学的現象をもたらすことが知られている。さらに、GM1はFSH及びLHのようなペプチドホルモンのレセプター機能に関与していること、及び神経系の多くの病理的状況に対する治療応用に効果的であるということも知られている。
【０００５】
しかしながら、複合型ガングリオシドの生理学的機能についての詳細な分析にとって、個々の構造の合成にあずかるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子についていまだ利用可能となっていないという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、以上の問題に鑑み鋭意研究し、複合型ガングリオシドの生理学的機能の詳細な分析のために、個々の構造の合成にあずかるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子を利用可能とすることに成功したものである。すなわち、本発明者等は、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.-)(β1,3Gal-T)遺伝子であって、その産物がGD1bの発現を決定するようなcDNAクローンの単離に成功した。さらに、該cDNAを適当なプレカーサー構造を有する種々の細胞系に導入することにより、また、該cDNA遺伝子を導入された細胞からの抽出液を用いたインビトロアッセイから、該酵素が、GM1及びアシアロ-GM1(GA1)の合成を触媒することを見出した。また、該酵素のラット組織間、及びラット脳における遺伝子の発現パターンについても重要な知見を得、係る知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明においては、抗GD1bモノクローナル抗体を用いて、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（β1,3-galactosyltransferase gene）（EC 2.4.1.62）のcDNAの発現クローニングを行うものである。このため、ポリオーマＴ抗原遺伝子とGM2/GD2シンターゼcDNAを用いて遺伝子導入されたマウスメラノーマ株B16であるKF4Cが、cDNAライブラリー遺伝子導入のための受容細胞株として使用される。また、GD3シンターゼのcDNAクローンであるpD3T-31は、ラット脳RNAとpcDNAI発現ベクターを用いて調製したcDNAライブラリーと共に共-遺伝子導入(co-transfect, co-transfection)する。
【０００８】
さらに、本発明によれば、単離されたcDNAクローンpM1T-9は、その遺伝子産物がサイトプラスミックドメインの４アミノ酸、トランスメンブレンドメインの２１アミノ酸、及び大きな触媒ドメイン(catalytic domain)の３４６アミノ酸を有するタイプIIの膜タンパク質であることを示唆するものである。
【０００９】
また、本発明において、GM2/GD2シンターゼ遺伝子を導入したマウスメラノーマ株B16に該cDNAを導入することにより、GM1の新合成(neo-synthesis)をもたらす。
【００１０】
さらに、本発明において、該細胞系にpM1T-9及びGD3シンターゼcDNAをco-transfectした場合にGM1同様GD1bも発現することを見出した。さらに、pM1T-9の、あらかじめGM2/GD2シンターゼ遺伝子を遺伝子導入したL細胞株（GM3シンターゼ欠失）への導入は、アシアロ-GM1（asialo-GM1)を発現することを見出した。上記本発明における知見によれば、酵素分析により示唆されたように、GD1b/GM1/GA1シンターゼが同一であることを確認するものである。
【００１１】
さらに、本発明においては、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の、ラット組織からの全RNAを用いたノーザンブロットにおいて、1.6kb mRNAが、脾臓、胸線、腎臓、および精巣において強く発現されるという知見を得た。さらに、成体ラットの脳組織における遺伝子の発現レベルは特に高くない一方、該遺伝子は、胎生１２日のラット胎仔脳においては高いレベルであり、出生とともにピークに達し、その後成体ラットの脳と同程度の低レベルへ落ちるという知見を得た。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２６位のSerから３７１位のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上、通常１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１位のMetから３７１位のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上、通常１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を提供するものである。
【００１４】
さらに、上記記載の糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち２７０位のTから１３０７位のTまでの塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち１９５位のAから１３０７位のTまでの塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１７】
さらに、本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列とハイブリダイズし、かつβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（糖転移酵素）をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。このようなハイブリダイズするDNA又はRNAは、好ましくはβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を保持しているものであり、ストリンジェントな条件下、例えば50%ホルムアミド、5xSSC、10% Na-デキストラン、 20mM Na-ホスフェート(pH6.5)、42℃のハイブリダイゼーション条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするものである。
【００１８】
以下、本発明を実施の形態に即してより詳細に説明する。なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等などの略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用の略号を使用した。
【００１９】
（核酸）
ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ＲＮＡ    リボ核酸
ｍＲＮＡ  メッセンジャーＲＮＡ
Ａ      アデニン
Ｃ      シトシン
Ｇ      グアニン
Ｔ      チミン
（その他）
ＴＬＣ  thin layer chromatography
Trf                transfectionまたはtransfectant
β-1,4 GalNAc-T    β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase
β-1,3 Gal-T       β1,3-galactosyltransferase
α2,8S-T           α2,8 sialyltransferase
CMP-NeuAc          cytocine monophosphate-N-acetylneuraminic acid
UDP-GalNAc         uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine
UDP-Gal            uridine diphosphate galactose
CT-B               cholera toxin B
Et.Br.             Ethydium bromide
【００２０】
【発明の実施の形態】
材料及び方法
（細胞及び抗体）
マウス細胞株KF4Cは、KF3027(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-12089)のプラスミドpMIK-Hyg/M2T1-1（pMIK/HygベクターにGM2/GD2シンターゼcDNAをインサートしたもの）の安定な遺伝子導入体である。B78-2は、B78（B16のサブライン）へのpM2T1-1の安定な遺伝子導入体である(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-12089)。これらの細胞は、ハイグロマイシン(hygromycin,250μg/ml)（Calbiochem-Novabiochem、ラホヤ,CA）添加又は無添加のDulbecco改良イーグル最小必要培地(D-MEM)7.5%牛胎児血清(FCS)及び300μg/mlのG418(Sigma、セントルイス,Mo）中で保持できる。
【００２１】
L1-17は、GM2/GD2シンターゼcDNAクローンの遺伝子導入L細胞である。すなわちpCDM8(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku, H.,and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-12089)に組込まれたpM2T1-1と、pSV2neoの遺伝子導入体であり、アシアロ-GM2発現性である。GD1bと特異的に反応するモノクローナル抗体(mAb370)及び、抗アシアロ-GM1モノクローナル抗体(mAb229)は本発明者等により以下のように作製可能である。
【００２２】
すなわち、リポソームにそれぞれのガングリオシドを組込んでAKRマウスに２週間隔で免疫後、その脾臓細胞をNS-1ミエローマ細胞と融合する。HAT培地で選択後、培養上清を用いてガングリオシドに対するELISAを行い、特異的抗体をピックアップする。
【００２３】
（プラスミド及びcDNAライブラリー）
ラット脳cDNAライブラリーはpoly(A)+RNAと、pcDNAI発現ベクター(Invitrogen, サンジエゴ、CA)を用いて作製可能である。このライブラリーは、3.5x106個以上の独立したコロニーを含んでいるものが好ましい。
【００２４】
宿種バクテリアとしてはE.Coli MC1061/P3を使用可能である。
【００２５】
プラスミドpMIK/D3T-31は、GD3シンターゼcDNAクローンであるpD3T-31(Haraguchi, M., Yamashiro, S., Yamamoto, A., Furukawa, K.,Takamiya, K.,Lloyd, k. 0., Shiku, H., and Furukawa, K.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10455-10459)のXhoIフラグメントを、pMIK/Neo発現ベクター（東京医科歯科大学、丸山博士より提供。新細胞工学実験プロトコール、「発現プラスミドの構築」254-259ページ、東京大学医科学研究所編、秀潤社、1993年）へインサートして作製することが可能である。
【００２６】
（β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのcDNAクローンの単離）
cDNAライブラリーのプラスミドは従来方法に基づき(Davis, L. G., Dibner, M. D., and Battey, J. F.(1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science. 285-289)、一度増殖し、プラスミドpMIK/D3T-31と共にDEAEデキストラン（Pharmacia Biotech,Uppsala)を用いてKF4C細胞へ遺伝子導入することが可能である。
【００２７】
例えば、10cm皿（Corning, Corning,NY)のサブコンフルエントKF4C細胞1.5x106個に、8μgずつのcDNAライブラリープラスミド及びpMIK/D3T-31を共-遺伝子導入することで可能である。さらに、60分後、10%DMSO/PBSにて２分間処理した後、２日間培養し、遺伝子導入した細胞をプレートから剥がし、1:200希釈でmAb370と氷上45分間インキュベートする。細胞をヤギ抗マウスIgM(Cappel, Durham, NC)でコートした皿に移す（Wysocki, L. J., and Sato, V. L. (1978) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 75, 2844-2848)。プラスミドDNAは、パンニングされた細胞から、Hirt抽出液を作製することにより採りだし可能であり、MC1061/P3へ形質転換することが可能である。拡張したプラスミドDNAを再度遺伝子導入し、同じ操作を繰返す（例えば４回）。その後、それぞれ30コロニーを含む96群を調製し、mAb370結合活性の発現によりスクリーニングすることが可能となる。いくつかの陽性群（例えば２つ）から適当数（例えば17）のクローンをスクリーニングし、KF4C上でGD1bを発現する単一コロニー（例えば３つ）をミクロスケールDEAEデキストラン遺伝子導入及び免疫蛍光(IF)アッセイを用いて単離することが可能である。
【００２８】
（DNAシークエンス）
単離したcDNAプラスミドはXhoI及びHindIIIで消化し、ファージミドブルースクリプト(pBSK)KS(+)ベクターにクローニングすることが可能である。このクローンの欠失変異体は、例えば、Kilo-Sequence欠失キット(Takara, Kyoto)により調製できる。
【００２９】
ダイデオキシヌクレオチドターミネション塩基配列決定方法としては、T3/T7ダイプライマー又は、４種類の追加のカスタムプライマーとＰＲＩＳＭダイターミネーターサイクルシークエンスキットを用いて、モデル377DNAシークエンサー(Applied Biosystems, Foster City,CA)により行うことが可能である。
【００３０】
（β1,3Gal-T遺伝子）
マウスメラノーマ細胞株、KF-4C及びGM2発現細胞株78-2を、トランジエント及び安定な発現システムのための受容細胞として用いることが可能である。
【００３１】
GM1のトランジエントな発現のために、pM1T-9/cDNAIベクターをKF-4CへDEAE-デキストランにより遺伝子導入する。
【００３２】
GD1bのトランジエント発現のために、KF-4CへpMIK-neo／D3T-31とpM1T-9/cDNAIとをco-transfectする。
【００３３】
GA1のトランジエント発現のために、GA2発現L1-17細胞に、pM1T-9/cDNAIを遺伝子導入する。これらのガングリオシドの発現は例えば、IFアッセイとフローサイトメトリーにより検出可能である。
【００３４】
GM1とGD1b発現の安定遺伝子導入体調製のために、pM1T-9/cDNAI及びpMIK-Hyg/D3T-31を、例えばリン酸カルシウム沈殿法(Davis, L. G., Dibner, M. D., and Battey, J. F.(1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science. 290-292)によりB78-2にco-transfection可能である。遺伝子導入体を選択するため、細胞は、G418(300μg/ml)及びハイグロマイシン(250μg/ml）を含むD-MEM/7.5%FCS中で培養する。これらの安定遺伝子導入体のガングリオシドの発現はIFアッセイ及びフローサイトメトリーにより行う。
【００３５】
（フローサイトメトリー分析）
ガングリオシド発現はマウスmAb370(抗GD1b)、mAb229(抗GA1)及びFITC結合コレラトキシンBサブユニット(List Biological Laboratories, Cambell, CA)(GM1)を用いて行う。具体的には、mAbs370及び229では細胞をmAbsと45分間氷上でインキュベートし、FITC結合ウサギ抗マウスIgMと氷上45分間、染色する。
【００３６】
また、細胞表面のGM1を分析するため、細胞はFITC結合コレラトキシンBサブユニットと45分間インキュベートし、FACScan（Becton Dickinson, Mountain View, CA)上でフローサイトメトリーにより分析する。染色の強度は具体的には蛍光強度の対数として任意単位で測定され、４桁スケールで表示する。
【００３７】
フローサイトメトリーのコントロール細胞としては、例えばGD1bとGA1に関しては２次抗体のみ用いて調整することが可能である。GM1発現のためには、ベクターのみの遺伝子導入細胞をFITC結合コレラトキシンBサブユニットで染色して用いる。
【００３８】
（RNA単離及びノーザンブロット）
RNAは成体ラット組織及び胎仔ラット脳から、酸フェノールを用いて抽出可能である(Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem.162, 156-159)。具体的には、全RNA(20μg）を1.2%アガロース-ホルムアルデヒドゲル上で分離し、GeneScreenPlus膜(Dupont, Boston,MA)上へ移す。［α-32P］-dCTP標識ラットβ1,3Gal-T  cDNA(pM1T-9)、又はβアクチンcDNA(ヌクレオチド69-814)プローブとのハイブリダイズは公知の条件(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-12089)で可能であり、分析は、BAS2000Bio-Imaging分析機(Fuji film、Tokyo）等の使用により可能である。
【００３９】
（糖脂質の抽出及び薄層クロマトグラフィ(TLC)免疫染色）
β1,3Gal-T遺伝子の安定遺伝子導入体は、B78-2メラノーマへのクローン化プラスミド及びpMIK-Hyg/D3T-31（α2,8シアリルトランスフェラーゼ(α2,8S-T)cDNA）の、リン酸カルシウム沈殿によるco-transfectionにより得られる。G418とハイグロマイシン耐性クローンのうち、GD1b発現クローンを、IFアッセイ及びフローサイトメトリーの結果に基づいて選択することが可能である。糖脂質は従来の方法により単離可能である(Furukawa, K., Clausen, H., Hakomori, S., Sakamoto, J., Look,K., Lundblad, A., Mattes, M. J., and Lloyd, K. O. (1985)Biochemistry. 24, 7820-7826)。具体的には、約300μｌの遺伝子導入細胞のパックされた細胞塊と、Hyg遺伝子のみを含むコントロールクローンから、クロロホルム/メタノール(2:1,1:1,1:2)で順に抽出できる。脱塩後、ガングリオシドはDEAEーセファデックスA-50(Pharmacia LKB)イオン交換クロマトグラフィにより分離できる。TLCは、具体的には高精度TLCプレート(Merck,Darmstdt)により、クロロホルム/メタノール/2.5N NH4OH(60:35:8)を用いて行いうる。成分はレゾルシノールを噴霧して可視化できうる。新規合成ガングリオシドは、アルミニウム板上のシリカゲルプレート(Merck)によりTLC免疫染色が可能である(Furukawa, K., Clausen, H., Hakomori, S., Sakamoto, J., Look,K., Lundblad, A., Mattes, M. J., and Lloyd, K. O. (1985)Biochemistry. 24, 7820-7826)。TLC後、プレートを乾燥し、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜上に移す。プレートは非特異的吸着をブロックするため1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液／食塩水中で１時間インキュベートした後、mAbsと１時間室温でインキュベートし、さらにビオチン化ウサギ抗マウスIgG及びアビジンービオチン複合体とインキュベートする。この目的で例えばVectastain ABC-POキット（Vector laboratories, CA)を使用可能である。
【００４０】
（酵素アッセイ）
β1,3Gal-Tは、公知の方法で測定できる(Ruan, S., and Lloyd, K. O. (1992) Cancer Res. 52, 5725-5731)。具体的には、膜分画を調製するために、サンプルを窒素空洞化装置を用いて溶解する。核は低速遠心で除去し、上清を105,000gで１時間４℃で遠心する。
【００４１】
β1,3Gal-Tの酵素活性を分析するには、具体的には反応混合物は次の成分を50μｌに含むものである。150mM MnCl2、0.375% TritonCF-54(Sigma)、UPD-［14C］Gal（2.0x105dpm）(NEN、Boston、MA）、及び100μgのタンパク質を含む膜分画である。これを２時間３７℃でインキュベートした後、生成物はC18Sep-Packカートリッジ(Waters,Milford,MA)で単離し、さらにTLC及びフルオログラフィ(Yamashiro, S., Ruan, S., Furukawa, K., Tai, T., Lloyd, K. O.,Shiku, H., and Furukawa, K. (1993) Cancer Res. 53, 5395-5400)で分析する。
【００４２】
（ホモロジー検索）
ヌクレオチド及びアミノ酸配列ホモロジー検索は、インターネットプログラムBLAST(Natioal Center for Biotechnology Information)を用いて行うことが可能である。またアミノ酸配列と疎水/親水性分析は、ソフトウヱアGENTYX-MACver6.1.0(Software Development、Tokyo）で行うことができる。
【００４３】
【実施例】
（GD1bシンターゼcDNAの発現クローニングの方法）
GD1bシンターゼ遺伝子のcDNAクローンを単離するために、β1,4-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase,  β1,4GalNAc-T）cDNAであるpM2T1-1のKF3027への遺伝子導入体を調製して、GM2発現の新規細胞株を得、この株をKF4Cと命名した。図１に示されるようにα2、8S-T cDNA、pD3T-31及びライブラリーに含まれるβ1、3Gal-T cDNAのco-transfectionの後、GD1bの発現が可能となる。
【００４４】
（GD1bシンターゼ遺伝子のcDNAクローンの単離）
cDNAライブラリーの遺伝子導入と、抗GD1b mAb370によるパニング及びHirt抽出を５サイクルの後、pM1T-9というcDNAクローンが単離された。pM1T-9のpD3T-31とKF4Cへのco-transfectionの後、GD1bの新規発現が図２Ｂに示されるように観察された。これらのトランジエント遺伝子導入細胞において、図２Ａに示すようにFITC結合コレラトキシンBにより染色した際、GM1もまた新しく発現された。
【００４５】
従って、GD1bシンターゼとGM1シンターゼは同一であり、単一の遺伝子によりコードされていることが強く示唆される（Iber, H., Kaufmann, R., Pohlentz, G., Schwarzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FEBS Lett. 248, 18-22)。さらに確認するために、KF4CにpM1T-9のみを遺伝子導入し、GD1bとGM1の発現を調べた。これらの遺伝子導入体はGM1は発現したがGD1bはしなかった。このことは想定されているガングリオシド合成経路(Iber, H., Kaufmann, R., Pohlentz, G., Schwarzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FEBS Lett. 248, 18-22)と一致するものである。さらに、この酵素は、アシアロ-GM2(GA2)からアシアロ-GM1(GA1)の合成を触媒するGA1シンターゼと同一であると考えられてきた。そこで、このcDNAの遺伝子導入によるGA1の合成の有無を調べるために、pM2T1-1により遺伝子導入されたL細胞を、pM1T-9の受容細胞として用いた。L細胞は、GM3シンターゼ活性(Yamashiro, S., Haraguchi, M., Furukawa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A., Nagata, Y., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1995) J. Biol. Chem. 270, 6149-6155)を欠いているために、すべての複合型ガングリオシドを欠いている。図２に示すように、pM2T1-1（安定）とpM1T-9（トランジエント）によるL細胞への遺伝子導入は、GA1特異的mAb229により検出されるように明確にGA1を発現した。
【００４６】
（β1,3Gal-T活性及びその生成物の確認）
本発明により、B78-2（pM2T1-1によるB78の遺伝子導入細胞株）を用いて、pM1T-9又はpM1T-9とpMIK/D3T-31の安定な遺伝子導入細胞を確立した。フローサイトメトリーはGM1（図３Ｂ）又はGM1/GD1b（図３Ｄ）の新規なそして有意な合成レベルを示した。親細胞（B78/M2T1-1）、及び二重の遺伝子導入体（B78/M2T1-1/M1T-9/D3T-31）から抽出されたグリコスフィンゴリピド(glycosphingolipid)がTLCにより分析され、糖脂質成分の変換が予想の通り見出された（図４）。  また、二重遺伝子導入細胞中に、特異的GD1bバンドがTLC-免疫染色により示された。この結果より、クローン化されたcDNA pM1T-9は、GD1b/GM1/GA1シンターゼ遺伝子から由来するということが示された。
【００４７】
（pM1T-9のインサートの配列）
図５に、該クローンのHindIIIとXhoIサイト間のHindIII-XhoIフラグメントを有するpBSKを構築しその塩基配列分析により決定されたpM1T-9のインサートの全配列を示した（配列表の配列番号２参照）。これまで単離された他のグリコシルトランスフェラーゼcDNAと比較して、このcDNAは相対的に小さいサイズであり、全サイズは1613bpである。194bpの5'-非翻訳領域と、1113bpの連続オープンリーディングフレームと、306bpの3'-非翻訳領域で成っている。単一のポリアデニル化シグナルと、70以上のポリアデニル化領域が存在する。
【００４８】
オープンリーディングフレームの最初にある開始コドンはKozak共通開始配列(Kozak, M. (1986) Cell. 44, 283-292)と似た配列内に埋め込まれている。このオープンリーディングフレームは、分子量40,976.1ダルトンの371のアミノ酸からなるタンパク質を予想させる（配列表の配列番号１参照）。最近の利用可能なタンパク質及び核酸データベースの検索によっても、該cDNAと有意のホモロジーを有する他の遺伝子は見出されなかった。４つの他のガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、即ちα1、3Gal-T(Joziasse, D. H., Shaper, J. H., Van den Eijnden, D. H., Van Tunen, A. J., and Shaper, N. L. (1989) J. Biol. Chem. 264,14290-14297)、β1,4Gal-T(Narimatsu, H., Sinha, S., Brew, K., Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)、GalCer-Gal-T(Schulte, S., and Stoffel, W. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90, 10265-10269；Stahl, N., Jurevics, H., Morell, P., Suzuki, K., and Popko, B.(1994) J. Neurosci. Res. 38, 234-242）及び血液型Ｂシンターゼα1、3Gal-T（Yamamoto, F., Marken, J., Tsuji, T., White, T., Clausen, H.,and Hakomori, S. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1146-1151）でさえ、わずか10-16%程度のアミノ酸配列におけるホモロジーを示すだけであった。
【００４９】
予想されるアミノ酸配列の検索及びハイドロパシー解析は、このタンパク質が今まで知られたグリコシルトランスフェラーゼと同様の構造上の特徴を有することを示唆している。アミノ末端近傍に単一の疎水的セグメントがあり、これは21のアミノ酸からなる。この推定されるシグナルアンカー配列はサイトゾル内に４残基を配置し、346アミノ酸をゴルジ体内腔に触媒領域として配置すると考えられる。予想されるアミノ酸配列は、単一のN-グリコシル化部位が143位-145位に存在し、プロリン豊富領域が42位-71位(11/30)に存在することを示す。以上の結果から、該酵素活性発現に必要な最小部位は、細胞膜貫通部位と細胞質領域を除く、２６位のアミノ酸から末端の３７１位までである。
【００５０】
（β1,3Gal-TcDNAの産物はガラクトースをGD2、GM2及びGA2に転移する）
pM1T-9のトランジエント及び安定遺伝子導入の結果により、この遺伝子は、３つの構造、すなわちGD1b、GM1およびGA1の合成を触媒する単一のβ1,3Gal-Tをコードするものであることが強く示唆された。
【００５１】
安定な遺伝子導入細胞のメンブレンフラクションの酵素活性を調べた。図６Ａに示すように、B78のpMIK/M1T-9及びpD3T-31による安定遺伝子導入体からのメンブレンフラクションは、20,000units(pmol/h/mgタンパク質）のGM1シンターゼ活性を示し、一方アクセプターを加えない場合は、有意の生成物が検出されなかった。予想されるように、pMIKベクター自体による遺伝子導入体はほぼゼロ活性であった。GD2、GA2、GlcCer、GD1b、GM3及びGD1aを基質として調べた場合、GD2とGA2はUDP-Galの有意の取込レベルを示した（図６Ｂ）。
【００５２】
（ノーザンブロット分析）
種々のラット組織においてβ1,3Gal-T遺伝子の発現レベルを全RNAを用いてノーザンブロットにより調べた。種々の組織のうち、腎臓、精巣、脾臓及び胸線が相対的に高いレベルの発現を示し、また一方調べたほぼ全ての組織がある程度のレベルの遺伝子転写物を含んでいた（図７Ａ）。
【００５３】
成体ラットの脳組織での遺伝子発現は高くなかった。すなわち、遺伝子発現を、ラット脳の成長段階で分析した結果、該遺伝子はすでに１２日胎仔脳に検出され、生まれるまでは高レベルで維持されたが（図７Ｂおよび図８）、成体ラット脳では発現レベルは低く維持される。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、GD1/GM1/GA1シンターゼ遺伝子の同一性が示される。すなわち、GD1bシンターゼcDNAを単離し、その遺伝子産物が、GalNAcβ1->4Gal-、GalNAcβ1->4(NeuAcα2->3）Gal-又はGalNAcβ1->4(NeuAcα2->8NeuAcα2->3)Gal-のいずれの末端配列を有する糖脂質をもアクセプターとして使うことを示すものである。
【００５５】
GM2/GD2シンターゼ(Yamashiro, S., Haraguchi, M., Furukawa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A., Nagata, Y., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1995) J. Biol. Chem. 270, 6149-6155)の基質特異性分析の場合、GA2合成は相対的に低いものであるが、これと比較して、本発明に基づき、β1,3 Gal-Tの、GM2,GD2,GA2に対するアクセプター活性はそれほど異ならないことが示唆された（図６Ｂ）。
【００５６】
さらに本発明に基づき、係るガングリオシドの生理学的重要性はそれらのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝的改変により、より生理学的に研究され得ることとなる。すなわち、β1,3Gal-T遺伝子の遺伝子操作により最終的には、GD1b/GM1/GA1より高級の複合型ガングリオシドの役割の解明を可能とするものである。
【００５７】
例えば、既に述べたように、ガングリオシドは脊椎動物の神経系の発達上、重要な役割をする分子であり、特にGM1はインビボ及びインビトロでその生理的効果が活発に研究されている。例えば毒物剤、神経外傷、虚血性損傷、変性疾患および機械的侵襲などによる障害に対する修復効果等である(Sabel, B. A., Slavin, M.D., and Stein, D. G. (1984) Science. 225, 340-342, Kapriak, S. E. (1984) Adv. Exp. Med. Biol. 174, 489-497,Svennerholm, L. (1994) Life Sci. 55, 2125-2134)。また、インビトロ培養系においてのGM1ガングリオシドの添加は、神経細胞の神経突起の伸張を誘導又は亢進させうる(Facci, L., Leon, A., Toffano, G., Sonnino, S., Ghidoni, R., and Tettamanti, G. (1984) J. Neurochem. 42,299-305)。実際、複合ガングリオシドを欠くβ1,4GalNAc-T遺伝子の破壊されたマウスは、神経伝達速度の減少(Takamiya, K., Yamamoto, A-, Furukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Okada, M., Fukumoto, S., Haraguchi, M., Takeda, N.,Fujimura, K., Sakae, M., Kishikawa, M., Shiku, H., Furukawa,K., and Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,10662-10667)や行動異常等の明確な神経系の機能障害を示す。これらの効果に対応する生理学的機能の解明のため、本発明において見出された、ラット脳の発達段階にのみ見られるβ1,3Gal-T遺伝子の高い発現は、脳組織の分化におけるガングリオシド生成物の重要な役割を示唆するものであり、ガングリオシドやその合成酵素遺伝子の治療方法、治療薬への応用を可能とするものである。
【００５８】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：371
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
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配列番号：2
配列の長さ：1613
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、β1,3Gal-Tの抗GD1bmAbを用いたcDNAクローニングを示す図であり、KF4CはpolyomaT抗原とβ1,4GalNAc-T遺伝子を導入されており、α2,8シアル酸転移酵素とβ1,3Gal転移酵素のcDNAが共に発現すると、GD1bが発現し得ることを示す図である。
【図２】図２は、B78-2及びL1-17において新規ガングリオシドのトランジエント発現を示す図である。クローン化されたcDNA pM1T-9は、GD3シンターゼcDNA、pD3T-31あり（右）またはなし（左）の条件でDEAE-デキストラン法により遺伝子導入した。GM1,GD1bおよびGA1は60時間後、フローサイトメトリーにより特異的プローブを用いて分析した。細線は特異的プローブありの条件での結果を示し、実線はコントロールを示す。
【図３】図３は、安定遺伝子導入細胞でのGM1/GD1bの発現を示す図である。B78-2細胞は、pM1T-9のみ（左）またはpM1T-9とpD3T-31（右）により遺伝子導入された。GM1はＡおよびＢともに発現し、一方GD1bはＤにのみ発現した。細線はmAbs添加サンプルを、また実線は二次抗体のみで処理したものを示す。
【図４】図４は、安定遺伝子導入細胞から抽出されたガングリオシドのＴＬＣの結果を示す図である。
Ａ：レーン１及び２はB78から、レーン３はB78-2、レーン４はB78-2/M1T-9/D3T-31からの抽出したものである。レーン１は、10mgのウエット組織から、レーン２〜４は5mgのウエット組織からのガングリオシドである。標準は、ウシ脳からのガングリオシドである。使用溶媒は、クロロホルム/メタノール/2.5N NH4Cl(60:35:8)である。レゾルシノール噴霧をバンド検出に使用する。
Ｂ：ガングリオシドフラクションのTLC-免疫染色。レーン３および４はＡと同様に調製した後、PVDF膜にブロットし、抗GD1b mAb370により染色した（発色にはABCキットを用いた）。
【図５】図５は、クローン化β1,3Gal-T  pM1T-9の核酸配列を示す図である。
上：単一のオープンリーディングフレームに対する演繹されたアミノ酸配列を塩基配列に加えて示す図である。２１アミノ酸を有する推定トランスメンブラン領域は二重線で示す。N-グリコシル化の可能性部位が下線で示される。ポリアデニル化シグナルが四角でかこまれる。
下：コード領域の演繹されたアミノ酸配列に対する、Kyte、Doolittle(Kyte, J., and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132)に基づくハイドロパシー分析を示す図である。
【図６】図６は、cDNAの安定遺伝子導入体からの抽出物のβ1,3Gal-T活性を示す図である。ここでＡは、GM2アクセプターを用いた場合の酵素活性（UPD-［14C］-Galactoseをドナーとして用いる）を示す 。メンブランフラクションが親株B78-2とB78-2/M1T-9/D3T-31から調製され、酵素活性がGM2をアクセプターとして用いて決定された。GM1バンドが生成物のTLCで観測された。Ｂは、種々のアクセプター構造に対する相対的β1,3Gal-T活性。GM2アクセプターの場合を100%とした。
【図７】図７は、β1,3Gal-T遺伝子のノーザンブロットの結果を示す写真である。Ａは、ラット各組織からの全RNA20μgをアガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレンにブロットする。pM1T-9から調整した32Ｐ-標識プローブとのハイブリダイズがなされたものである。Ｂは、全ラット胎仔（レーン１）、ラット胎仔脳（レーン２〜３）、またはラット脳（レーン４）のRNAが分離され、Ａと同様にブロットされたものである。レーン５および６は脳からのRNA30μgを用いたものである。
【図８】図８は、図７で得られたバンド強度を、エチジウムブロミドで染色された18S rRNAバンド（デンシトグラフ（Signal Analysis, Vienna, VA)にて測定）を用いて補正し、プロットした図である。繰返し実験の結果を+-SDで表現した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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