(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表に記載の配列番号1で示される塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなる高転写活性を有するプロモーター。
【請求項２】
請求項1に記載のプロモータ配列、及び該配列の下流に導入されたペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列を含む組換えプラスミド。
【請求項３】
請求項2に記載の組換えプラスミドで形質転換された磁性細菌。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換磁性細菌を増殖させ、前記ペプチドあるいはタンパク質を得ることからなるペプチドあるいはタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、高転写活性を有するプロモーターに関し、特に磁性細菌内での転写活性に優れるプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換えにより形質転換した磁性細菌内を増殖させることにより、菌体内に生成する磁気微粒子上に生理活性を有するタンパク質などの有用タンパク質を発現させる技術が知られている（特開平8-228782、WO97/35964）。遺伝子の発現に必要なプロモータとして、特開平8-228782では膜タンパク質をコードするmagA構造遺伝子の５’上流側に存在するプロモーター（magAプロモーター）、 WO97/35964ではmps構造遺伝子の５’上流に存在するプロモーター（mpsプロモーター）及びlacプロモーターといった既知のプロモーターが用いられていた。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】
しかし、magAプロモーターおよびmpsプロモーターは細菌の増殖段階で転写抑制を受けるためにタンパク質の高発現が困難であった。また大腸菌における高発現プロモーターの代表であるlacプロモーターはmagAプロモーター、mpsプロモーターよりも転写レベルが低くタンパク質の高発現を期待することはできない。
【０００４】
そこで、本発明の課題は高転写活性を有する新規プロモーターの提供、および該プロモーターを利用した組換えプラスミド、形質転換磁性細菌およびタンパク質の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、第一に、後述の配列表に記載の配列番号1で示される塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなる、高転写活性を有するプロモーター（以下、HT1プロモーターという）を提供する。
【０００６】
上記のHT1プロモーターは、磁性細菌AMB-1（FERM BP-5458）から見いだされた。
［磁性細菌AMB-1の寄託に関する情報］
寄託機関
名称：工業技術院生命工学工業技術研究所(National Institute of
Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology)
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
寄託日：  １９９２年１１月１２日
受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８
【０００７】
本発明は、第二に、上記のＨＴ1プロモーター、及び該ＨＴ1プロモーターの配列の下流に導入されたペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列を含む組換えプラスミドを提供する。
【０００８】
プロモーターおよび所要のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を組み込むプラスミドベクターは特に限定されず、磁性細菌細胞内で安定に複製されるプラスミドベクターであれば用いることができる。
本発明は、第三に、該組換えプラスミドで形質転換された磁性細菌を提供する。
【０００９】
ここで宿主として使用される磁性細菌としては、例えばMagnetospirillum種の微生物｛例：菌株AMB-1（FERM  BP-5458）、MS-1（IFO  15272;ATCC  31632;DSM3856）、MSR-1（IFO15272;DSM6361）｝、及びDesulfovibri種の微生物｛例：菌株RS-1（微工研菌寄13283）が挙げられる。
【００１０】
本発明は、第四に、上記の組換えプラスミドを有する磁性細菌を増殖させ、前記ペプチドあるいはタンパク質を得ることからなるペプチドあるいはタンパク質の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明のプロモーターは、磁性細菌内で宿主のDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識され、かつ高効率で転写されるため目的遺伝子の発現レベルが上昇し,その結果目的遺伝子によりコードされた所要のタンパク質を大量に得ることができる。
【００１２】
本発明は、例えば、特開平8-228782及びWO97/35964に示されたタンパク質含有磁気微粒子作製方法に利用することができる。
【００１３】
【実施例】
下記のI及びIIにおいてとられた手順を図１の説明図に即して以下説明する。
I．磁性細菌AMB-1からの全ゲノム抽出
磁性細菌AMB-1を４０mlのMSGM培地で、8×107cells/mlまで培養後、集菌した。これをサンプルとして、カレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）に記載の方法に従いゲノムを抽出した。
II．組換えプラスミドの調製とプロモーターのスクリーニング
ベクターには大腸菌及び磁性細菌で安定に複製され磁性細菌AMB-1に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードする遺伝子（CAT遺伝子）が組み込まれているpXCAT（Koji Sode, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol.）を用いた。CAT遺伝子上流にはPst  Iサイトが存在している。このCAT遺伝子はリボソームバインディングサイト及び翻訳開始コドンは組み込まれているが、プロモーターは欠失しているため、CAT遺伝子上流にプロモーター領域が挿入されない限りCAT遺伝子は転写されないためCAT遺伝子は発現しない。よって、プロモーターが挿入されたpXCATを保持した大腸菌または磁性細菌のみがクロラムフェニコール耐性またはCAT活性を保有する。
【００１４】
以上の原理に基づいて、プロモータ領域が挿入されたプラスミドを作製しプロモーター領域をスクリーニングした。
【００１５】
即ち、前述した方法で調製したAMB-1の全ゲノムをSau3A Iで切断後、ブランティングキット（Blunting Kit）（宝酒造製）で平滑末端化した。これをPst Iで切断しブランティングキットで平滑末端化したpXCATとライゲーションした。これを、E.Coli  DHαMCR  にエレクトロポレーション法を用いて導入し、クロラムフェニコールを含んだLBプレートに塗布後３７℃で培養した。
【００１６】
クロラムフェニコールを含んだLBプレート上に形成された各コロニーを、つま楊枝でかきとり２ｍｌのクロラムフェニコールを含んだLB培地で培養した。この培養液からアルカリ法によってプラスミドを抽出した。各プラスミドを、Sph Iによって切断し電気泳動によって切断パターン及び、挿入されたDNA断片の大きさを確認した。
【００１７】
各プラスミドサンプルから切断パターン及びDNA断片の大きさが異なるものを選別し、プロモーター領域をスクリーニングした。
【００１８】
以上の操作によって、磁性細菌AMB-1のゲノムからプロモーター配列を含んだDNA断片をクローニングしたプラスミドpXCAT-HT1を得た。
【００１９】
II  接合伝達体の作製
次に、実施例１で得られたプラスミドpXCAT-HT1、並びにmagAプロモーター（配列表の配列番号２に示すDNA配列からなる）及びmpsプロモーター（配列表の配列番号２に該プロモーターを含むDNA配列を示す）を、それぞれ、pXCATのCAT遺伝子上流にクローニングしたプラスミドpXCAT-PmagA及びpXCAT-Pmps、合計３種の組換えプラスミドを接合伝達により野生株AMB-1に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達における供与菌体として用いたE.Coli S17-1はtra遺伝子を有しているため接合伝達を行う際、ヘルパープラスミド無しで接合伝達が可能である。接合伝達には、MSGM培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０7cells/mlを用い、供与菌体は前日にプラスミドをHanahan法によって導入し発生したコロニーをかき取って109から1010 cells/ml  MSGM培地に懸濁した。菌数で1：50（磁性細菌：大腸菌）に両菌体を混合し、MSGM寒天培地上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ml程度のMSGM培地中に入れ軽く撹拌し、懸濁することによって菌体を回収した。この懸濁液をクロラムフェニコール6.8μg/mlを添加したMSGM培地に植菌しアルゴンガスを通気し微好気状態にした後、25℃で培養した。大腸菌はMSGM培地では増殖しないことから、植菌後増殖した磁性細菌を接合伝達体AMB-1とした。
【００２０】
次に、各接合伝達体のCAT活性を測定した。CAT活性の測定には、FAST CAT Chloramphenicol Acetyltransferase Expression Kit（Molecular Probes,Inc.）を用いた。各接合伝達体の培養液から1×107 cellsの菌体を調製し、1mlの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)で洗浄後、0.5mlの0.1Mトリス緩衝液に懸濁した。これに、20μlのlysis medium（100mM EDTA,100mM DTT,50mM Tris−HCl）と、3μlのトルエンを加えボルテックスミキサーで撹拌した。これを30℃で30分間インキュベートした。60μl  分取し65℃で10分間インキュベートし、10μlのBODIPY(4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaxene)クロラムフェニコールを加え37℃で5分間インキュベートする。これに9ｍＭのアセチルCoAを10μl加え37℃で15分間反応させた。反応後直ちに氷冷しておいた酢酸エチル400μlを加えボルテックスミキサーで撹拌し反応を停止した。15000rpmで5分間遠心後上層を分取し、真空乾燥で完全に乾燥させた。これに酢酸エチル30μlを加え再溶解後、1μlをTLCにスポットし展開した。展開溶液はクロロホルムとメタノールを17：3の割合で混合し、濾紙で平衡化させたものを使用した。
【００２１】
開後、イメージアナライザーを用いてアセチル化されたBODIPYクロラムフェニコールのスポットから得られる蛍光発光を測定した。この蛍光測定値から各サンプルにおけるCAT酵素活性を算出した。サンプル中のタンパク質濃度はバイオラッド・プロテインアッセイキット（Bio-Rad社）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0003877248.tif 000002
（単位：unit/μg  protein）
【００２３】
表１に示すように、本発明で得られた新規プロモーターHT1は、magAプロモーター、mpsプロモーターの約１７〜２３倍のCAT酵素活性を示した。即ち、HT1プロモーターは高転写活性を有するプロモーターであることが示された。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のプロモータは磁性細菌細胞内で従来公知のプロモーターに比し著しく高い転写活性を示す。
該プロモーターを含む組換えプラスミドで形質転換した磁性細菌は増殖により高い生産性で所望のペプチドやタンパク質を生産する。
以下の配列表に示された塩基配列は、左から右へ５’末端から３’末端への方向である。各文字は次の塩基を表す。
Ａ：アデニン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｔ：チミン
【００２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例において、HT1プロモーター配列を含んだプラスミドpXCAT-HT1を調製した手順を示す図である。
【図１】
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