(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１のアミノ酸番号１のMetをＮ−末端とし、アミノ酸番号630〜688のいずれかの間のアミノ酸をＣ−末端とするアミノ酸配列〔アミノ酸配列Ａ〕；あるいは
（２）前記アミノ酸配列Ａに対して、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されているアミノ酸配列；
を有する、Kex2プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換されたメタノール資化性酵母である形質転換体。
【請求項２】
前記アミノ酸配列ＡのC-末端のアミノ酸が配列番号：１におけるアミノ酸番号630〜682のいずれかのアミノ酸である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記アミノ酸配列ＡのC-末端のアミノ酸が、配列番号：１におけるアミノ酸番号630〜679のいずれかのアミノ酸である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記酵母が、ピキア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）又はキャンディダ（Candida）属酵母である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項５】
前記酵母が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）又はキャンディダ・ボイディニイ（Candida boidini）種である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
Kex2プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質の製造方法であって、
（１）配列番号：１のアミノ酸番号１のMetをＮ−末端とし、アミノ酸番号630〜688のいずれかの間のアミノ酸をＣ−末端とするアミノ酸配列〔アミノ酸配列Ａ〕；あるいは
（２）前記アミノ酸配列Ａに対して、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されているアミノ酸配列；
を有し、且つ、Kex2プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む発現ベクターでメタノール資化性酵母を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物からKex2プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする方法。
【請求項７】
前記酵母が、ピキア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）又はキャンディダ（Candida）属酵母である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）又はキャンディダ・ボイディニイ（Candida boidini）種である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛋白質の採取を、培養上清から、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性クロマトグラフィーにより行う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
キメラ蛋白質から目的ペプチドの切り出し方法において、
（１）請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法によりKex2プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質を製造し、そして
（２）目的ペプチドのＮ−末端に隣接して位置するArg−Arg、Lys−Arg又はPro−Arg配列及び目的ペプチドを有するキメラ蛋白質に、前記（１）において製造した蛋白質を作用させ、目的ペプチドを得る、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有し、培養液中に大量に分泌されるＫｅｘ２誘導体及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、前述の分泌型Ｋｅｘ２誘導体の利用法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのキメラタンパク質発現法による生理活性ペプチド生産法が試みられており、目的ペプチドの遊離方法として、化学的あるいは酵素的切断法が用いられている。化学的方法としては、亜硝酸によるアスパラギン残基の開裂、ＣＮＢｒによるメチオニン残基の開裂がある（Itakura et al. Science 198, 1059, 1977）。しかし、この方法は、目的ペプチドの修飾が避けらず、精製のコストにも問題がある。
【０００３】
酵素的方法には、リジンのＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼ−Ｉ）、グルタミン酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するスタフィロコッカルプロテアーゼＶ８が用いられている（特公平６−８７７８８）。しかし、前述の化学的方法やエンドプロテアーゼは１アミノ酸残基を認識するため、目的ペプチドを効率的にキメラタンパク質から切り出すためには目的ペプチドにこれらのアミノ酸残基が含まれないことが前提となり、生産できるペプチドが限定される。このため、複数のアミノ酸残基を認識する汎用性の高い切断方法が求められている。
【０００４】
プロホルモン変換酵素は、生体内でペプチドホルモンをその前駆体から生成する酵素であり、インビトロにおいても、タンパク質からペプチドホルモンを切り出すための酵素として望ましい性質を持つことが期待される。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のプロホルモン変換酵素で、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断する、カルシウム依存性セリンプロテアーゼである。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、Ｎ末端側にシグナル配列をＣ末端側に疎水性アミノ酸が連続する膜貫通領域を持つ８１４アミノ酸残基からなるタンパク質で、細胞内ではトランスゴルジに局在する。
【０００５】
なお、Ｋｅｘ２プロテアーゼをコードする塩基配列及び対応のアミノ酸配列を配列表・配列番号１に示す。サッカロマイセス・セレビジアエを宿主としたＣ末端領域を欠失したＫｅｘ２誘導体の遺伝子発現およびその解析の結果、配列番号１のアミノ酸配列１から６１４までのアミノ酸配列を有するＫｅｘ２誘導体は、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を保持し、培養液中に分泌されることがわかっている（Fuller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,86, 1434-1438, 1989 、特開平１−１９９５７８）。なお本明細書において、Ｋｅｘ２プロテアーゼの誘導体を配列番号１のアミノ酸配列１からのアミノ酸数によって表記する。即ち、配列番号１のアミノ酸配列１から６１４までのアミノ酸配列を有するＫｅｘ２誘導体は、Ｋｅｘ２−６１４と表記する。
【０００６】
今までに、分泌生産が検討されたＫｅｘ２誘導体に、ｓｓ−Ｋｅｘ２とＫｅｘ２Δp がある。
ｓｓ−Ｋｅｘ２は、Ｋｅｘ２−６１４に３アミノ酸残基のペプチドが付加したＫｅｘ２誘導体で、サッカロマイセス・セレビジアエを宿主として生産が検討された（Brenner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 89, 922-926, 1992）。宿主にプロテアーゼ欠損株（ｐｅｐ４）を用いて発現され（４ｍｇ／Ｌ培養液）、培養上清から精製効率２０％で精製された。精製したｓｓ−Ｋｅｘ２は、Ａｓｎ型糖鎖分解酵素EndoH 処理により分子量が低下することから、Ａｓｎ型糖鎖を持つことが示唆されている。さらに合成基質を用いた酵素活性のｐＨ依存性や基質特異性についても検討されている。
【０００７】
Ｋｅｘ２Δp は、本明細書においてはＫｅｘ２−６６６と表されるＫｅｘ２誘導体で、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主として生産条件が検討され、活性の９０％が培養上清に分泌すること、また分泌したＫｅｘ２Δp の分子量は７０ｋＤａで、細胞内における分子量１２０ｋＤａに比べ小さいことがわかった（Germain et al. Eur. J. Biochem. 204, 121-126, 1992）。さらに、分子量７０ｋＤａのタンパク質はＫｅｘ２を発現した培養上清にも見られること、また、Ｋｅｘ２Δp の３８５番目のセリン残基（Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性の触媒部分）をアラニン残基に置換させると、培養上清に見られるＫｅｘ２Δp の分子量が細胞内のそれと同じ１２０ｋＤａになることから、７０ｋＤａのタンパク質は、培養液中でＣ末端部分が欠失したＫｅｘ２Δp （１２０ｋＤａ）の自己分解物と考えられている。
【０００８】
さらに、分解物の分子量およびＫｅｘ２プロテアーゼの基質特異性から予想された切断部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列（配列番号１；アミノ酸配列番号５０３−５０４番目）をＬｙｓ−Ｌｅｕ配列に変えた誘導体Ｋｅｘ２Δ504 の発現が試みられた。しかし、この場合も培養液中には７０ｋＤａのタンパク質が見られ、Ｋｅｘ２Δp は自己分解時には必ずしも合成基質から予想されるＬｙｓ−Ａｒｇ配列を切断していないこと、また、Ｋｅｘ２プロテアーゼの認識部位となるような配列が他に存在しないことから、Ｋｅｘ２Δ504 は合成基質から予想される配列と全く違う配列を認識して自らを切断している可能性が示唆されている。
【０００９】
このように、Ｋｅｘ２誘導体については、合成基質を用いた基質特異性の研究は行われているが、タンパク質を用いた場合の基質特異性はわかっていない。また、種々のＫｅｘ２誘導体の分泌生産量に関する知見も少なく、Ｋｅｘ２−６１４以外のＫｅｘ２誘導体が安定に分泌生産可能かどうかについてもわかっていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、Ｋｅｘ２プロテアーゼ酵素活性を有する酵素を大量に供給する方法を提供することを課題とし、本発明を完成した。さらに、本発明は、工業スケールでも本酵素がキメラタンパク質から目的とするペプチドを切り出すために有用な酵素であることを実験的に示すものである。
具体的には、工業的スケールでのキメラタンパク質発現法による有用ペプチドの製造において、Ｋｅｘ２プロテアーゼ酵素活性を有する酵素が利用できるためには、以下の３点の課題の解決が必要である。
【００１１】
まず第１の課題は、Ｋｅｘ２誘導体の生産量の向上である。今まで報告されている中でＫｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素として最も生産量が多いのはｓｓーＫｅｘ２で、その生産量は培養液１Ｌあたり約４ｍｇである。しかし、この生産量は、工業スケールでキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すために用いる酵素の生産量としては少ない。また、Ｋｅｘ２Δp のような分泌型Ｋｅｘ２誘導体は、培養液中で自己分解する可能性が示唆されていて、しかも、その切断部位が予想できないことから、どのような誘導体をデザインすれば生産量を上げることができるかわかっていない。
【００１２】
従って、自己分解しないＫｅｘ２誘導体の選出および当該Ｋｅｘ２誘導体の高発現系の構築が必要になる。なお、本明細書において、自己分解とはＫｅｘ２プロテアーゼ活性の低下を伴う自分自身の分解を意味し、Ｋｅｘ２プロテアーゼのＬｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１；アミノ酸配列番号１０８〜１０９）の自己切断に伴う成熟化（Brenner & Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 922-926, 1992 ）を意味するものではない。
【００１３】
次に第２の課題には、他のプロテアーゼが混入していない高純度のＫｅｘ２誘導体の精製方法の確立が上げられる。今まで報告されているＫｅｘ２誘導体の活性は、合成基質のみを用い、タンパク質を基質とした評価がないため、他のプロテアーゼが混入しているか否かわかっていない。特に工業スケールでのキメラタンパク質の切り出しにおいては、反応条件の細かなコントロールが困難で、他のプロテアーゼの混入は著しく目的ペプチドの回収率を低下させる可能性があり、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を高純度に精製する必要がある。
【００１４】
最後に第３の課題として、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素によるキメラタンパク質の切断条件設定が上げられる。タンパク質の高次構造が、酵素活性、反応条件下における酵素の安定性、あるいは、基質の認識に影響を及ぼすことは当業者には良く知られている。一方、先述の報告では、これらの点についてほとんど検討されていない。特に、キメラタンパク質発現法では、キメラタンパク質が不溶性封入体を形成する場合が多いので、これを可溶化するために尿素等の変性剤が用いられる。しかし、一般に酵素がどのような構造を有していれば尿素存在下で酵素活性を保持できるかはわかっていない。従って、Ｋｅｘ２プロテアーゼや分泌型Ｋｅｘ２誘導体が、タンパク質から目的とするペプチドを切り出す酵素として使用可能か否かはわかっていない。
【００１５】
また、他のプロホルモン変換酵素についても、大量生産には成功しておらず、これらの酵素が試験管内でキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すための酵素として用いることが可能か否かもわかっていない。従って、Ｋｅｘ２プロテアーゼを始めとするプロホルモン変換酵素をキメラタンパク質から目的ペプチドを遊離させる酵素として用いるためには、効率的な発現方法と精製方法の確立、さらに、試験管内でタンパク質を基質としたときの切断条件の設定が必要である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前述の課題の解決方法を検討した結果、Ｎ末端１位から６１８〜６９８のアミノ酸配列を有するＫｅｘ２誘導体は培養液中で自己分解することなく分泌生産量が著しく増加すること、また、宿主にメタノール資化性酵母を用いればさらに生産量が増加することを見いだし、Ｋｅｘ２誘導体の大量供給を可能にした。また、分泌型Ｋｅｘ２誘導体を、培養上清濃縮液から、陰イオン交換クロマト、疎水クロマトの２ステップでＳＤＳ−ＰＡＧＥ上単一バンドまで精製し、精製したＫｅｘ２誘導体には、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出す条件では、目的ペプチドを分解し、回収率を低下させるような他のプロテアーゼ活性が見られないことを確認した。
【００１７】
さらに、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出す条件において、尿素濃度により分泌型Ｋｅｘ２誘導体の基質特異性が変化することを見いだし、目的ペプチド内にＫｅｘ２プロテアーゼの認識配列を２カ所含む場合でも目的ペプチドを７５％の効率でキメラタンパク質から切り出せることを示した。また、中量スケールで、精製したＫｅｘ２−６６０を用いてキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４からｈＰＴＨ（１−３４）を切り出すことができること、すなわち、分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産量、純度、キメラタンパク質からの目的ペプチドの切り出し効率等が工業スケールの生産にも適応できることを示し、本発明を完成させた。
【００１８】
上記の課題を解決するため、本発明は、配列番号：１に示すＫｅｘ２プロテアーゼのアミノ酸配列において、アミノ酸番号１のＭｅｔをＮ−末端としアミノ酸番号６１８〜６９８の間のいずれかのアミノ酸をＣ−末端とする天然のアミノ酸配列、又はこの天然のアミノ酸配列に対して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により修飾されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでメタノール資化性酵母を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から採取することにより得られるＫｅｘ２プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質を提供する。なお、上記の蛋白質を含めて、本明細書では、「Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素」、「Ｋｅｘ２プロテアーゼ誘導体」、「分泌型Ｋｅｘ２誘導体」等という場合がある。
【００１９】
本発明はまた、前記の蛋白質をコードする遺伝子、特にＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターでメタノール資化性酵母を形質転換することにより得られる形質転換体を提供する。
本発明はさらに、前記蛋白質の製造方法であって、上記発現ベクターにより形質転換されたメタノール資化性酵母を培養し、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする方法を提供する。該蛋白質は、培養上清から、陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーを用いて行うのが好ましい。
【００２０】
本発明はまた、前記蛋白質を用いた、キメラタンパク質からの目的ペプチドの切り出し方法を提供する。キメラ蛋白質は、目的ペプチドに保護ペプチドが付加されたタンパク質であり、目的ペプチドと保護ペプチドの接合部が、前記蛋白質が認識するアミノ酸配列であれば、前記蛋白質により目的ペプチドを切り出すことができる。また、目的ペプチドと保護ペプチドとの接合部位が、前記蛋白質が認識するアミノ酸配列でない場合においても、目的ペプチドと保護ペプチドの間に前記蛋白質の認識部位を挿入することにより、前記蛋白質を用いて目的ペプチドを切り出すことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質は、後記のごとく蛋白質の長さ、特にＣ−末端の位置により生産分泌効率が顕著に異る。本発明は、高い生産分泌効率をもたらす長さを有する蛋白質を提供するものであり、配列番号：１におけるアミノ酸配列の１位のＭｅｔから６１８〜６９８位のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を有するＫｅｘ２プロテアーゼ誘導体である。本発明のＫｅｘ２プロテアーゼ誘導体のＣ−末端は、好ましくは配列番号：１のアミノ酸配列の６３０位〜６８８位のいずれかのアミノ酸であり、さらに好ましくは６３０位〜６８２位のいずれかのアミノ酸であり、さらに好ましくは６３０位〜６７９位のいずれかのアミノ酸である。配列番号：１の前記アミノ酸配列の一部分からなる上記の種々のアミノ酸配列を、本発明においては天然のアミノ酸配列と称する場合がある。
【００２２】
しかしながら、酵素タンパク質のアミノ酸配列中の活性に関与する領域以外の領域において複数個のアミノ酸の他のアミノ酸による置換、アミノ酸の欠失又はアミノ酸の付加を行っても、その酵素の活性が維持されることは当業者によりよく知られている。従って、本発明は、上記の天然のアミノ酸配列を有するＫｅｘ２プロテアーゼ誘導体の他に、上記天然のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾されているアミノ酸配列を有し、なおＫｅｘ２プロテアーゼの活性を有している蛋白質も包含する。
【００２３】
本発明はまた、前記の種々のポリペプチドをコードする遺伝子、特にＤＮＡを提供する。この様なＤＮＡは、例えば配列番号：１に示すような塩基配列、又は同じアミノ酸配列をコードする他の塩基配列を有する全長ＤＮＡ又は目的とするＤＮＡを含有するＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、所望によりオリゴヌクレオチドを連結するか、又は前記のＤＮＡの適当な場所に翻訳終止コドンを導入する等の常法に従って作製することができる。また、前記の修飾されたアミノ酸配列を有するＤＮＡは、例えば配列番号：１に記載の塩基配列を有する天然の全長ＤＮＡ又はその断片を鋳型とし、使用し、所望の変異を含むプライマーオリゴヌクレオチドを変異原プライマーとして使用して、部位特定変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等の常法を用いて作製することができる。
【００２４】
本発明の発現ベクターは、使用する宿主において機能し得るプロモーター等の発現制御領域を含有する。例えば、メタノール資化性酵母を宿主として使用する場合には、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素のプロモーター、グリセロリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、アルコールオキシダーゼのプロモーター、ギ酸脱水素酵素のプロモーター、メタノールオキシダーゼのプロモーター等が使用できる。
【００２５】
本発明の宿主としては、メタノール資化性酵母が使用でき、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属するものが好ましく、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、キャンディダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）種等が挙げられる。特に好ましい酵母はキャンディダ属又はピキア属の酵母、例えばキャンディダ・ボイディニイ、及びピキア・パストリスである。
【００２６】
即ち、本発明者等は、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を、キメラタンパク質からペプチドを工業スケールで切り出すための酵素として利用可能にするためには、１）生産量が高く大量に供給できること、２）高純度で目的ペプチドを切断する他のプロテアーゼの混入がないこと、３）タンパク質を基質とした切断条件が設定できること、の課題の解決が必要であると考え、以下の検討を行った。
【００２７】
まず、最初の課題であるＫｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素の生産量を上げる条件について検討した。Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を工業スケールで大量に精製するためには、生産量が多いことはもちろん、その精製が簡単であることが重要であり、このためには、Ｋｅｘ２誘導体を他のタンパク質が少ない培養溶液中への分泌させることが有利であると考えた。分泌型Ｋｅｘ２誘導体には、前述のようにｓｓＫｅｘ２に関する報告があるが、その生産量は４ｍｇ／Ｌ培養液で、工業的スケールで用いるためには少ない。そこで、種々の分泌型Ｋｅｘ２誘導体をコードする遺伝子を作製してサッカロマイセス・セレビジアエを宿主として発現させ、分泌生産量を調べた。
【００２８】
本発明において使用したＫｅｘ２誘導体は、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、Ｋｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８及びＫｅｘ２−６９９である。Ｋｅｘ２誘導体の遺伝子の発現には、サッカロマイセス・セレビジアエのグリセルアルデヒドー３ーリン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターを用いた。これらの発現ユニットを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビジアエを３０℃で一晩培養し、培養液中のＫｅｘ２プロテアーゼ活性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として測定した。
【００２９】
その結果、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、Ｋｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８２及びＫｅｘ２−６８８の遺伝子の発現ユニットを導入した酵母の培養上清には、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性が検出されるが、Ｋｅｘ２−６９９の遺伝子の発現ユニットを導入した酵母の培養上清には、活性は検出されないことがわかった。このことから、Ｋｅｘ２誘導体を培養上清に分泌させるためには、Ｎ末端１位からｍ位までのアミノ酸残基（ｍ＝６１４〜６８８）を有する誘導体の遺伝子を用いればいいことが明らかになった。
【００３０】
さらに、ＯＤ６６０あたりの分泌生産量は、実施例１によれば今までに報告があるＫｅｘ２−６１４に比べ、Ｋｅｘ２−６６０及びＫｅｘ２−６７９では有意に多いことも見いだした。また、培養上清を分画分子量サイズ１０，０００の限外ろ過膜を用いて２０倍濃縮したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果、Ｋｅｘ２−６６０及びＫｅｘ２−６７９は、Ｋｅｘ２−６１４に比べ、Ｋｅｘ２活性だけではなく、分泌量も増加していることが明らかになった。また、これらの分子量はアミノ酸残基数に対応し大きくなること、すなわち、今回の培養においては、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主としたＫｅｘ２Δp のように自己分解物が蓄積していないことが明らかになった。
【００３１】
さらに、実施例９によれば、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、およびＫｅｘ２−６７９の培養液ＯＤ６６０あたりのＫｅｘ２活性は、今までに報告されているＫｅｘ２−６１４に比べ１０倍以上高いこと、また、Ｋｅｘ２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８のＫｅｘ２活性は、それぞれＫｅｘ２−６１４の６倍と３．４倍で、Ｋｅｘ２−６９９のＫｅｘ２活性は検出できないことが明らかになった。
【００３２】
すなわち、培養液のＫｅｘ２活性は、発現するＫｅｘ２誘導体のＣ−末端のアミノ酸残基がＫｅｘ２の６３０から６７９番目のアミノ酸残基までであるとき高くなるが、それ以上ではＣ−末端領域が長くなるほど低くなることも明らかになった。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から、上記の結果はＫｅｘ２の分泌量が増加していることも確認した。さらに、今回は、Ｋｅｘ２誘導体のアミノ酸残基が増加するほどその分子量も増加し、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主にしたＫｅｘ２Δp の生産の場合のように自己分解物が蓄積しないこともわかった。
【００３３】
今回作製した分泌型Ｋｅｘ２誘導体は培養上清で自己分解を起こすことなく蓄積できることがわかったので、発現系をサッカロマイセス・セレビジアエの系から培養液あたりの生産量が高いメタノール資化性酵母、例えばキャンディダ・ボイディニイを宿主とした発現系に換え、Ｋｅｘ２−６６０の生産検討を行った。その結果、生産量を培養上清１Ｌあたり３４０ｍｇまで上げることができた。この量は、約２００ｇの生理活性ペプチドｈＰＴＨ（１−３４）をキメラタンパク質から遊離させることができる量であり、本発明により、工業スケール量でキメラタンパク質から有用ペプチドを切り出すために必要な量の酵素を供給できることを示している。従って、メタノール資化性酵母としてキャンディダ（Candida)属酵母が好ましいことが明らかになった。
【００３４】
次に、２番目の問題点である、分泌型Ｋｅｘ２誘導体の純度について述べる。まず、分泌生産量が多かったＫｅｘ２−６６０を培養上清から精製した。サッカロマイセス・セレビジアエで細胞外に分泌したＫｅｘ２−６６０を、０．２ｍＭカルシウム存在下で、培養上清を限外濾過（分子量３０，０００）で濃縮し、その後陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーで単一バンドまで精製した（回収率５７％）。この回収率は今まで報告されている中で最も高く、この方法で高純度のＫｅｘ２誘導体を大量に供給できることが明らかになった。
【００３５】
また、Ｋｅｘ２誘導体のタンパク質を基質としたときの基質特異性、他のプロテアーゼの混入の可能性について調べるために、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４に精製した過剰量のＫｅｘ２−６６０を作用させ、そのとき生じるペプチドの構造を調べた。なお、βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４は、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端から１３９アミノ酸残基までのポリペプチドのうち、７６番目と１２２番目のシステイン残基をセリン残基に置換したβＧａｌ−１３９Ｓに、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ配列及びヒト副甲状腺ホルモン由来のプロ配列（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を介してｈＰＴＨ（１−８４）を結合させたキメラタンパク質である。βＧａｌ−１３９Ｓのアミノ酸の配列を配列番号２に、ｈＰＴＨ（１−８４）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３６】
その結果、生じたペプチドのＮ末端の配列は、Ｋｅｘ２プロテアーゼの基質特異性から予想されるペプチド断片由来であり、精製したＫｅｘ２−６６０には、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出す時に問題になるような他のプロテアーゼが混入していないことがわかった。
精製したＫｅｘ２−６６０を用い、第３の課題、タンパク質を基質としたときの切断条件について検討した。
【００３７】
まず、キメラタンパク質から目的ペプチドを遊離させる際に汎用される尿素の影響について検討した。Ｋｅｘ２−６６０を、０〜４．０Ｍ尿素存在下で合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに作用させた結果、１．０Ｍ、２．０Ｍ及び４．０Ｍ濃度では、尿素が存在しない場合に比べ、活性がそれぞれ７０％、４０％及び１０％に低下することがわかった。一般的に、不溶性封入体を尿素溶液に溶解後、プロテアーゼ等を作用させる条件としては２．０〜４．０Ｍの尿素溶液が用いられる。従って、キメラタンパク質の溶解条件等を検討すれば、Ｋｅｘ２−６６０はキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すための酵素として使用可能と考えた。
【００３８】
次に、Ｋｅｘ２−６６０をキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４に作用させたときの、１．５〜３．０Ｍ尿素の影響について調べた。Ｋｅｘ２プロテアーゼによって切断が予想される配列は、Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号２；アミノ酸配列番号１３−１４、以下切断部位Ａと記す）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（プロ配列部分、以下切断部位Ｂと記す）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号３；アミノ酸配列番号４３−４４、５１−５２、以下、それぞれ切断部位Ｃ及び切断部位Ｄと記す）の４カ所に存在する。なお、それぞれの部位のＣ末端側がプロテアーゼによって切断される。
【００３９】
Ｋｅｘ２プロテアーゼ処理で生じるペプチドフラグメントの構造および量について調べた結果、１．５〜２．５Ｍの範囲では尿素濃度が高いほうがＫｅｘ２−６６０の切断効率は高いが、尿素濃度２．５Ｍと３．０Ｍでは、切断効率に差がないことがわかった。さらに、尿素の基質特異性に与える影響に関しては、尿素濃度が上昇するに従い、切断部位Ｂの切断効率は良くなるが、切断部位Ｃの切断効率は、２．５Ｍ尿素濃度でピークを迎えること、その結果、尿素濃度が高い方が、キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−８４）の回収率が良いことがわかった。また、切断部位Ｄの切断は観察されなかった。３．０〜４．０Ｍの尿素濃度でも、同様の傾向が観察された。これらの知見は、合成基質を用いた場合からは予想できず、本発明により初めて明らかになった。
【００４０】
Ｋｅｘ２−６６０を用いてβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件についてさらに検討した。キメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件で、種々の量比のＫｅｘ２−６６０（キメラタンパク質１ｍｇあたりＫｅｘ２−６６０を２５ｋＵ、５０ｋＵ、１００ｋＵ、１５０ｋＵ及び２００ｋＵ）を作用させ、生じるペプチドフラグメントの構造と回収率について調べた。５０ｋＵ／ｍｌのＫｅｘ２−６６０を用いた場合、約７５％の効率でｈＰＴＨ（１−８４）が切り出された。また、このとき、約１０％のβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４が残っていた。
【００４１】
βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４はＫｅｘ２−６６０量を増加させるに従って減少し、２００ｋＵ／ｍｌではほぼ完全に消失した。しかし、同時にｈＰＴＨ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−８４）の割合も増加し、ｈＰＴＨ（１−８４）の回収率は増加しないことがわかった（図２０）。一方、Ｋｅｘ２−６６０量を増やしても、ｈＰＴＨ（１−４４）増加分以上にｈＰＴＨ（１−８４）量が減少することはなく、後述の実施例２で精製されたＫｅｘ２−６６０には、キメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件において、Ｋｅｘ２プロテアーゼと基質特異性が異なる他のプロテアーゼは混入していないことが確認された。
【００４２】
また、反応条件を選べば、目的ペプチドにＫｅｘ２プロテアーゼの切断部位を持つ場合でも、キメラタンパク質から効率良く（切り出し効率７５％）目的ペプチドを切り出すことができることが判明した。なお、この切り出し効率は、ファクターＸａを用いた場合のｈＰＴＨ（１−８４）の切り出し効率５０％（Gardella et al. J. Biol. Chem.265, 26, 15854-15859, 1990）より高い。
【００４３】
Gardellaらは、ファクターＸａの認識部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列がｈＰＴＨ（１−８４）に存在しないにも関わらず、酵素量を増加させたり反応時間を長くした場合ｈＰＴＨ（１−８４）の回収率が下がることから、混入するプロテアーゼまたはファクターＸａ自身がｈＰＴＨ（１−８４）を分解している可能性を示唆している。ｈＰＴＨ（１−８４）にはＫｅｘ２プロテアーゼの切断配列が２ヶ所存在するにも関わらず、高い回収率でｈＰＴＨ（１−８４）が得られたという事実は、本発明により生産量が増加し、精製されたＫｅｘ２誘導体が、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すための酵素として有用であることを示している。
【００４４】
さらに、精製したＫｅｘ２−６６０は、尿素非存在下で可溶性キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４から、尿素存在下で不溶性キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４から、ｈＰＴＨ（１−３４）を切り出すことができ、保護ペプチドや切断部位領域が異なるキメラタンパク質を基質とした場合にも働き、広く工業的に応用できることがわかった。また、尿素非存在下でもプロテアーゼの混入は検出できなかった。
【００４５】
すなわち、生産量が増加し、単一バンドまで精製された分泌型Ｋｅｘ２誘導体には、キメラタンパク質から目的ペプチドを遊離させる条件では尿素の存在の有無に関わらず、目的ペプチドを分解し、回収率を下げるような他のプロテアーゼが混入していないこと、また、このＫｅｘ２誘導体は、目的ペプチドにＫｅｘ２プロテアーゼの認識部位が存在する場合でも、条件を選べば効率良く目的ペプチドを回収できること、さらに、培養液１Ｌあたりの発現量は、約２００ｇの目的ペプチドを遊離できる量であり本発明で得られた分泌型Ｋｅｘ２誘導体が工業的スケールでキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すために必要な量を供給できることが明らかになった。
【００４６】
【実施例】
以下の参考例および実施例等により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。まず、本発明のための材料として用いたプラスミド、大腸菌と酵母および、各実施例に共通な基本的な実験操作等について述べ、さらに参考例、実施例の順に述べる。
【００４７】
プラスミド
プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］は、β−ガラクトシダーゼのＮ末端から９７番目までのアミノ酸からなるペプチド（７６番目のシステイン残基がセリン残基、４０，４１，７１、と７５番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置換されている：βＧａｌ−９７Ｓ４Ｄと呼ぶ）にグルタミン酸残基を介してｈＣＴ［Ｇ］（ヒトカルシトニンの３２番目のアミノ酸のＣ末端にグリシン残基が付加したペプチド）が結合したキメラタンパク質を大腸菌ラクトースオペロンのプロモーターにより発現できるプラスミドである。
【００４８】
目的とするペプチドをコードするＤＮＡ領域を読み枠を合わせてＥｃｏ  ＲＩ−Ｓａｌ   IＤＮＡフラグメントとして導入すれば、βＧａｌ−９７Ｓ４Ｄとのキメラタンパク質を発現することができる。なお、このプラスミドを含有する大腸菌Ｗ３１１０株は、Escherichia coli  ＳＢＭ３２３と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０３）として１９９１年８月８日に寄託されている。
【００４９】
プラスミドｐｔａｃＣＡＴは、合成プロモーターｔａｃによりクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現できるプラスミドである。このプラスミドを含有する大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia coli  ＳＢＭ３３６と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４３６として１９９６年３月１日に寄託されている。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］とｐｔａｃＣＡＴは、可溶性ｈＰＴＨ（１−３４）キメラタンパク質発現ベクターｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）作製の材料として用いた（参考例２および図５、図６）。
【００５０】
プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］は、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］のβＧａｌ−９７Ｓ４Ｄをコードする遺伝子をβＧａｌ−２１０Ｓ（β−ガラクトシダーゼのＮ末端から２１０番目までのアミノ酸からなるペプチドで７６，１２２および１５４番目のシステイン残基がセリン残基に置換されている）をコードする遺伝子に置換したプラスミドである。
【００５１】
ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで消化して得られるβＧａｌ−２１０Ｓをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで消化して得られるベクター部分を含むＤＮＡフラグメントと連結して得ることができる（図２４）。なお、ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- の製作方法については、特公平６−８７７８８に開示されている。ｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］は、合成ヒト副甲状腺ホルモン前駆体（ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４））遺伝子のクローニングおよびプラスミドｐＧＰ＃１９の作製の材料として用いた（参考例１および図５）。
【００５２】
プラスミドｐＣＲIIは、インビトロジェン社から購入し、ＰＣＲ産物を直接クローニングするために用いた。
プラスミドｐＹＥ−２２ｍは、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを利用し、その間にマルチクローニング部位（ＭＣＳ：Eco RI  → Sal I）を持つ発現ベクターで、プロモーターはEco RI側にあり、選択マーカーにＴＲＰ１遺伝子を、複製開始点に２μｍＤＮＡの一部（Inverted Repeats）を持つ。なお、プラスミドｐＹＥー２２ｍを有する大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia coli  ＳＢＭ３３５と命名し、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４３５として１９９６年３月１日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（図１２）。
【００５３】
プラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（５．０）ｂ（Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254, 1988 ）は、ＰＣＲ法によりＫｅｘ２誘導体の遺伝子を作製するための鋳型として用いた（図１２）。プラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（RI-Pvu II ）（特開平１−１９９５７８）は、Ｋｅｘ２−６１４のＣ末端に１４アミノ酸（配列番号４）からなるペプチドが付加したタンパク質の発現ベクターｐＹＥ−６１４の作製のために用いた（図１３）。
プラスミドｐＮＯＴｅｌｌは、アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを利用し、その間に制限酵素 Not I  部位を持つ発現ベクターで、選択マーカーにＵＲＡ３遺伝子を持つ（特開平５−３４４８９５）。
【００５４】
大腸菌と酵母
コンピテントセルの大腸菌ＪＭ１０９株は東洋紡（株）から購入し、プラスミドの調製およびキメラタンパク質発現に利用した。大腸菌ＪＭ１０１株とＭ２５株（Sugimura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 753-759, 1988 ）は、それぞれキメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４およびβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の生産に用いた。Ｋｅｘ２プロテアーゼ分泌発現のための宿主には、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｋ１６−５７Ｃ株（MAT α leu2 trp1 ura3 kex2-8  ：Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.  156, 246-254（1988））およびキャンディダ・ボイディニイ（Candida boidinii  ）ＴＫ６２株を用いた。
【００５５】
ＴＫ６２株は、キャンディダ・ボイディニイＳ２ＡＯＵ−１株から取得されたＵＲＡ３変異によるウラシル要求株である（Sakai, Y., et al., J. Bacteriol., 173,7458〜7463, 1991）。なお、キャンディダ・ボイディニイＳ２ＡＯＵ−１株は、Candida  boidinii  ＳＡＭ１９５８と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微工研条寄第３７６６号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７６６）として、１９９２年２月２５日に寄託されている。
【００５６】
培地
大腸菌の培地には、ＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２．４％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール）、ＳＢ２培地（２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１．２％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 ）、およびＮＵ培地（０．３％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．５％（ｗ／ｖ）グルコース、０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 、０．３％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．２７％（ｗ／ｖ）Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．１２％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．２ｇ／Ｌ  ＮＨ4 Ｃｌ、０．２％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4 、４０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＡｌＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、４ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｍｇ／Ｌ  Ｈ3 ＢＯ3 ）を用いた。
【００５７】
サッカロマイセス・セレビジアエの培養には、ＹＣＤＰ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））を用いた。
キャンディダ・ボイディニイ及びピキア・パストリスの培養には、ＢＭＧＹ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｖ／ｖ）グリセロール、１．３４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ  ｗ／ｏ  ＡＡ：Yeast Nitrogen Base without Amino Acids 、０．４ｍｇ／Ｌビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））、ＢＭＭＹ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｖ／ｖ）メタノール、１．３４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ  ｗ／ｏＡＡ、０．４ｍｇ／Ｌビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））、ＹＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、２％（ｗ／ｖ）グルコース）、ＹＰＧＭ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、３％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）メタノール、１．３４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ  ｗ／ｏ  ＡＡ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））を用いた。
【００５８】
基本的な実験操作
具体的に参考例および実施例に示さない場合は、実験操作は以下の方法に従った。
ＤＮＡプライマーは、フォスホアミダイド法による全自動合成機（アプライドバイオシステムズモデル 380A ）で合成した。ＤＮＡ塩基配列はジデオキシ法で決定した。
制限酵素によるＤＮＡの切断は購入先の指定する３〜１０倍量の酵素を用いて１時間反応させた。プラスミド構造の解析は０．５〜１μｇＤＮＡを用いて２０μｌ反応液中で、ＤＮＡの調製には３〜１０μｇのＤＮＡを用いて５０〜１００μｌ反応液中で行った。反応温度、反応バッファー等の条件は購入先の指定に従った。
【００５９】
アガロースゲル電気泳動サンプルは、反応液に１／５容量の色素液（０．２５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルーを含む１５％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ水溶液）を加え調製した。アガロースゲル電気泳動用バッファーにはＴＡＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた。プラスミドの構造解析にはＭｕｐｉｄ−２（コスモバイオ（株））を用いて１００ボルト１時間の泳動を行ない、ＤＮＡフラグメント調製のためには水平ゲル（20 cm x 15 cm x 0.7 cm）を用いて１５０ボルト４時間または３５ボルト１３時間の泳動を行なった。ゲルはエチジウムブロミド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）で２０分染色した後、紫外線照射してＤＮＡバンドを検出した。アガロースゲル濃度は、分画するＤＮＡフラグメントの大きさに合わせて、１．０、１．５、２．０％（ｗ／ｖ）を用いた。
【００６０】
アガロースゲル中のＤＮＡは、０．１×ＴＡＥバッファーを満たした透析チューブ内にゲルを入れ電圧をかけて溶出させるか、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株））を用いてゲルから抽出した。ＤＮＡ溶液はフェノール処理後、エタノール沈殿を行った。
ライゲーション反応は、０．０５〜１μｇのＤＮＡフラグメントを含む反応液（６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）３０μｌに１０単位のＴ４酵素ライゲースを加え、１６℃で１２〜１８時間反応を行うか、TAKARA Ligation Kit （宝酒造（株））を用いて行なった。
【００６１】
大腸菌の形質転換法は塩化カルシウム法で行い（ＪＭ１０９株はコンピテントな細胞を購入して使用）、形質転換株は薬剤耐性（アンピシリンまたはテトラサイクリン）で選択した。酵母Ｋ１６−５７Ｃ株の形質転換は、リチウム酢酸法（METHODS IN YEAST GENETICS ；A Laboratory Course Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press ）により行い、形質転換株はトリプトファン栄養要求の相補性で選択した。ＴＫ６２株の形質転換法は、阪井らにより報告されている（Sakai et al. J. Bacteriol., 173, 7458 〜7463, 1991）。
【００６２】
Ｋｅｘ２活性測定は水野らの方法に準じた（Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.  156, 246-254, 1988）。すなわち、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、０．２％（ｗ／ｖ）ルブロール、１００μＭ  Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（（株）ペプチド研究所）を含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液１００μｌに、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で希釈したＫｅｘ２  １００μｌを加え、３７℃に３０分放置した。反応は、２５ｍＭ  ＥＧＴＡ５０μｌを添加し停止させた。遊離した蛍光物質（ＡＭＣ）の蛍光強度は、PANDEX  FCA システム（バクスタートラベノール（株）10-015-1  型；（励起波長＝３６５ｎｍ、基底波長＝４５０ｎｍ））を用いて測定した。上記の条件で１分間に１ｐｍｏｌのＡＭＣを遊離するＫｅｘ２量を１Ｕと定義した。
【００６３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Laemmli の方法に準じた（Laemmli  et al. Nature 227, 680-685, 1970 ）。すなわち、試料に１／４容量の４×ＳＤＳサンプルバッファー（３７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー）を加え、９５℃、５分間加熱した。１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（55 mm x 85 mm x 1 mmまたはテフコ社）に供し、２０ｍＡ、８０分間の電気泳動を行った。泳動後、ゲルを染色液（１０％（ｖ／ｖ）酢酸、４０％（ｖ／ｖ）  メタノール、０．２５％（ｗ／ｖ）クマジーブリリアントブルーＲ２５０）で染色した。
【００６４】
その他、別途表示する以外は基本的な遺伝子操作は Moleculor cloning（Maniatisら編、Cold Spring Harbor,  Cold Spring Harbor Laboratory,  New York , 1982）に記載の方法に従って行った。
参考例１．キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の調製
１）ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子の作製（図１及び図２）
ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、図１に示すようにＵ１〜Ｕ７（配列番号５〜１１）およびＬ１〜Ｌ７（配列番号１２〜１８）の１４本のフラグメントに分け、合成した。
【００６５】
ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、各フラグメントを以下のように連結し、作製した（図２）。まず、ＤＮＡフラグメントＵ１（配列番号５）とＬ７（配列番号１８）（各々約１μｇ）を１６単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネースと０．５ｎＭ（１ＭＢｑ以上）の［γ−32Ｐ］ｄＡＴＰを含むリン酸化反応液１５μｌ中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＤＴＴ）で３７℃、１５分間反応させた。これに５ｍＭ  ＡＴＰを含むリン酸化反応液５μｌを加え、さらに３７℃で４５分間反応させた。Ｕ２（配列番号６）とＬ６（配列番号１７）、Ｕ３（配列番号７）とＬ５（配列番号１６）、Ｕ４（配列番号８）とＬ４（配列番号１５）、Ｕ５（配列番号９）とＬ３（配列番号１４）、Ｕ６（配列番号１０）とＬ２（配列番号１３）、およびＵ７（配列番号１１）とＬ１（配列番号１２）についても同様に行った。
【００６６】
上述の７個の反応液をひとつにまとめ、エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。これを８０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、３００ｍＭ  ＮａＣｌに溶解した。このうち４０μｌを９５℃に５分間放置した後、３０分かけて４３℃まで温度を下げた。氷冷後４０μｌのライゲーションＢ液（宝酒造（株））を加え、２６℃に１５分放置した。
このサンプルを５％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、オートラジオグラフィーで、連結したＤＮＡフラグメントを検出した。約２８０ｂｐに対応するＤＮＡフラグメントをゲルから抽出後、定法に従い精製した。
【００６７】
２）βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４発現プラスミドｐＧＰ＃１９の作製（図３及び図４）
合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子を含む約２８０ｂｐのＤＮＡフラグメントには、５’末端には制限酵素Eco RI  部位が３’末端には制限酵素Sal I 部位が存在する。ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子のクローニングはこのEco RI／Sal I   ＤＮＡフラグメントをｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］のEco RI／Sal I 部位に挿入し、行った。
【００６８】
ｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素Eco RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約３．５ｋｂＤＮＡフラグメントを調製した。これと１）で得られた約２８０ｂｐからなるｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子のＤＮＡフラグメントを連結し、プラスミドｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨを得た（図３）。ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＪＭ１０９［ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨ］を得た。
さらに、ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨの制限酵素XhoI  ／EcoRI 部位にリンカーＫＭ０９１（配列番号１９）及びＫＭ０９２（配列番号２０）を導入し、プラスミドｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）を作製した（図３）。なお、このリンカーは、両端に制限酵素XhoIとEcoRI 部位を、その間にSac I 部位を持つ。
【００６９】
ｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）は、制限酵素Sac I およびXho I で消化後、Kilo-Sequence 用 Deletion Kit （宝酒造（株））を用いて、βＧａｌ−２１０ＳをコードするＤＮＡ領域を経時的かつ特異的に欠失させた。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで末端修復をおこなったのち、セルフライゲーションを行ない、βＧａｌ−１３９ＳとｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）がＰｈｅ−Ｍｅｔを介して連結されたキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４をコードするプラスミドｐＧＰ＃１９を得た（図４）。ｐＧＰ＃１９を導入した大腸菌ＪＭ１０９株をＪＭ１０９［ｐＧＰ＃１９］と呼ぶ。
【００７０】
３）キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の調製
ＪＭ１０９［ｐＧＰ＃１９］は２００ｍｌのＳＢ培地を含む１Ｌ容三角フラスコに接種、３７℃にて１６時間振とう培養した。前培養液全量を１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む３ＬのＮＵ培地に接種し、５Ｌ容ファーメンター（ミツワ理化学工業（株）、KMJ-5B-4U-FP型）を用いて、３７℃にて通気撹拌培養した。通気量は３Ｌ／分とし、溶存酸素量は２．０ｐｐｍ以下にならないように撹拌速度を変化させ制御した。
【００７１】
ｐＨは９％（ｖ／ｖ）アンモニア水および１Ｍリン酸を用いてｐＨ７に制御した。炭素源は培養開始後３、９および１４時間目にグリセロールを培養液１Ｌあたり１０ｍｌ、窒素源は培養開始後９．５時間目に５倍濃度のＳＢ培地を培養液１Ｌあたり１０ｍｌ添加し、供給した。消泡剤（ディスフォームCC-222、（株）日本油脂）を培養開始時に３００μｌ／Ｌ添加し、その後は必要に応じて添加した。
【００７２】
培養１８時間後のＯＤ６６０は５５で、培養液１ｍｌ当たり約０．５ｍｇのキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４が生産できた。キメラタンパク質は不溶性封入体として生産され、以下のように精製した。培養液１．５Ｌを、６０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心（日立製作所（株）, 20PR-52D）し、菌体を回収した。菌体を３２０ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレスにて破砕した（１０，０００ｐｓｉ；２回）。
【００７３】
菌体破砕液を４０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心（日立製作所（株）, 05PR-22 ：５０ｍｌ容のプラスチックチューブ（住友ベークライト（株）））した。沈殿を０．５％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む３０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁後、３０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心し、沈殿を回収した。この操作を４回繰り返し、粗精製キメラタンパク質とした。
【００７４】
粗精製キメラタンパク質の純度は約７０％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もり）で、タンパク量は約６７０ｍｇ（ウシ血清アルブミンをスタンダードとし、ブラッドフォード法で定量）であった。
粗精製キメラタンパク質は、ＹＭＣ Packed カラム（2 cm x 25 cm, （株）山村化学研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ミリポア（株） Waters 600E  ）に供し、精製した。キメラタンパク質は、アセトニトリルの直線濃度勾配（A ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；B ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；％Ｂ＝３０％→６０％／６０分、流速１０ｍｌ／分）で溶出した。各画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、純度９５％以上の画分をまとめ、凍結乾燥した。
【００７５】
凍結乾燥したキメラタンパク質は再度０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡに溶解後、ＨＰＬＣに供し、さらに精製した（条件は、グラジエントの条件を％Ｂ＝４０％→６０％／６０分とした以外は同じ）。分析用ＨＰＬＣによる分析で２１０ｎｍの吸光度を指標に、純度９９％上の画分を集め、凍結乾燥し標準品とした。標準品のタンパク量はアミノ酸分析から推定した。
【００７６】
参考例２．可溶性キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４の調製
１）ＣＡＴＰＨ３４発現プラスミドｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）の作製（図５及び６）
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］の制限酵素 Eco RI-Xho I 部位にＲ４リンカー（Ｒ４Ｕ：配列番号２１およびＲ４Ｌ：配列番号２２）を挿入してｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］Ｒ４を作製した。得られたｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］Ｒ４の制限酵素Xho I-Kpn I 部位に、ＰＣＲにより調製したＰＴＨ（１−３４）遺伝子および以下に示すｐｒｏαリンカー（ｐｒｏαＵ：配列番号２３、ｐｒｏαＬ：配列番号２４）を挿入してｐＰＴＨ（１−３４）ｐｒｏαを作製した。なおＰＴＨ（１−３４）遺伝子は、ｐＧＰ＃１９を鋳型とし、プライマーＰ１（配列番号２５）およびＰ２（配列番号２６）を用いたＰＣＲにより調製した（図５）。
【００７７】
次に、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の３’末端に制限酵素Xho I 部位を導入するため、プライマーＣＡＴ１およびＣＡＴ３（配列番号２７および配列番号２８）を合成した。プライマーにＣＡＴ１およびＣＡＴ３を、鋳型ＤＮＡにｐｔａｃＣＡＴを用いたＰＣＲにより、３’末端に制限酵素Xho I 部位が導入されたＣＡＴ遺伝子を得た。これを制限酵素Nco I およびXho I 消化後、ｐｔａｃＣＡＴ由来のSal I -Nco I  ＤＮＡフラグメント（３．６ｋｂｐ）とｐＰＴＨ（１−３４）ｐｒｏα由来のXho I -Sal I  ＤＮＡフラグメント（０．１５ｋｂｐ）と連結してｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）を作製した（図６）。
【００７８】
２）キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４の調製（図７参照）
ｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）を有するＪＭ１０１株をＬＢ培地にて３７℃で培養した。培養液のＯＤ６６０値が０．６になった時点でＩＰＴＧ（イソプロピルベータチオガラクトシド）を終濃度２ｍＭとなるように添加し、さらに３時間培養を継続してキメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４を生産させた。培養終了後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分）により菌体を回収し、懸濁液のＯＤ６６０値が７０となるように溶液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を添加した。
【００７９】
次にこの菌体懸濁液３ｍｌを超音波処理し、菌体を破砕後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）で可溶性画分を分離し、溶液Ａで平衡化したクロラムフェニコールカプロエート（ sigma C-8899 ）カラム（３ｍｌ）にアプライした。１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液Ａでカラムを洗浄後、１０ｍＭクロラムフェニコールおよび１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液Ａでキメラタンパク質を溶出させた。図７は精製前後の試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。なお、レーン１は分子量マーカーを、レーン２は菌体破砕後の可溶性画分を、レーン３は精製後のキメラタンパク質ＣＡＴＰＴＨ（１−３４）を示す。レーン１の左側の数字は分子量マーカーの大きさ（ｋＤａ）を示す。
キメラタンパク質は可溶性画分に生産され、クロラムフェニコールカプロエートによるアフィニティクロマトグラフィーにより容易に精製された。
【００８０】
参考例３．不溶性キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の調製
１）βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の作製（図８〜１０）
ｐＧＰ＃１９を鋳型にＳ０１（配列番号２９）およびＳ０２（配列番号３０）をプライマーとして、ＰＣＲ法により、ｈＰＴＨ（１−８４）の３５番目のコドンＧＴＴを翻訳停止コドンＴＡＡに変換したＤＮＡフラグメントを増幅後、常法により制限酵素 Aat I I−Sal I ＤＮＡフラグメントを単離精製し、ｐＧＰ＃１９の対応する部分と交換して、ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４を作製した（図８）。
【００８１】
次に、ｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）を鋳型にＳ０３（配列番号３１）とＳ０５（配列番号３２）をプライマーとしてＰＣＲ法により増幅後、制限酵素Sal I とSma I で消化したＤＮＡフラグメント、ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４を鋳型にＳ０７（配列番号３３）およびＳ０２（配列番号３０）をプライマーとしてＰＣＲ法により増幅後、制限酵素 Sal IとSma I で消化したＤＮＡフラグメント、並びにｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の複製開始起点を含む制限酵素 Pvu I-Sal I  ＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡライゲースで連結し、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４を作製した（図９〜１０）。
ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４の制限酵素Sma I 部位に（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−ＧｌｙをコードするリンカーＳ０８（配列番号３４）およびＳ０９（配列番号３５）を挿入し、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を作製した（図１０）。リンカーの方向性は、プラスミドを調製後、ＤＮＡ塩基配列を決定し、確認した。
【００８２】
２）キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の生産
キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を大量に得るため、本キメラタンパク質の発現ベクターを導入した大腸菌Ｍ２５［ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４］株を２０Ｌ  ＳＢ２培地中、３７℃で培養した。菌体濃度ＯＤ６６０＝１．０でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように添加し、菌体濃度がＯＤ６６０＝１２まで培養を継続した。消泡剤にはディスフォームCC−222 （（株）日本油脂）を用いた。集菌後、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８．０）に懸濁し、高圧ホモジナイザー(Manton-Gaullin ) による菌体破砕、遠心分離、ＴＥ及び脱イオン水での懸濁洗浄を行って、封入体約１００ｇを得た。
【００８３】
実施例１．サッカロマイセス・セレビジアエを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現
Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を大量に精製するためには、生産量が多いことはもちろん、その精製が簡単であることが重要であり、このためには、他のタンパク質が少ない培養溶液中へ分泌させることが有利であると考えた。分泌型Ｋｅｘ２誘導体としてｓｓＫｅｘ２に関する報告があるが、その生産量は４ｍｇ／Ｌ培養液で、工業的スケールで用いるためには少ない。そこで、まず、種々の分泌型Ｋｅｘ２誘導体を作製し、サッカロマイセス・セレビジアエを宿主として発現させて分泌生産量を調べ、その中から分泌生産量が多いＫｅｘ２誘導体を得ることにした。
【００８４】
１）分泌型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミドの作製（図１１、１２及び１３）
分泌型ＫＥＸ２遺伝子はＰＣＲ法を用いて作製した。プライマーの配列は図１１（ｂ）に示した。ＫＭ０８５（配列番号３６）は、５’末端に制限酵素Eco RI部位（下線部）を、ＫＭ０８８（配列番号３７）、ＫＭ０８９（配列番号３８）、ＫＭ０９０（配列番号３９）とＫＭ０９３（配列番号４０）は、それぞれ５’末端に制限酵素Sal I 部位（下線部）を有する。
また、これらのプライマーは、図１１（ａ）に示すＫＥＸ２遺伝子領域に対応し、ＫＭ０８５は、ＫＥＸ２遺伝子の開始メチオニンをコードする塩基配列を含み、ＫＭ０８８、ＫＭ０８９、ＫＭ０９０とＫＭ０９３は、それぞれＮ末端から、６６０番目、６７９番目、６８８番目、および６９９番目のアミノ酸の直後に翻訳停止コドンＴＡＡが付加した配列のアンチセンス鎖の塩基配列を有する。
【００８５】
制限酵素 Eco RI で切断し直鎖上にしたプラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（５．０）ｂを鋳型に、ＫＭ０８５およびＫＭ０８８をプライマーに用い、ＰＣＲ反応を行った。反応精製物は制限酵素Eco RIおよびSal I で切断し、Eco RI-Sal I  ＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントは、Ｋｅｘ２−６６０をコードするＤＮＡ塩基配列（ＫＥＸ２−６６０）を有し、その上流に制限酵素Eco RI、下流に制限酵素Sal I 部位を有する。
次に、プラスミドｐＹＥ−２２ｍを制限酵素Eco RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約８．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを精製した。これと先に得たＫｅｘ２−６６０をコードする遺伝子を含むEco RI-Sal I  ＤＮＡフラグメントをそれぞれ連結し、プラスミドｐＹＥ−６６０を得た（図１２）。
【００８６】
同様に、プライマーＫＭ０８８の代わりにＫＭ０８９、ＫＭ０９０、またはＫＭ０９３を用いて、それぞれＫｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８８およびＫｅｘ２−６９９をコードする塩基配列（ＫＥＸ２−６７９、ＫＥＸ２−６８８、ＫＥＸ２−６９９）を含むEco RI-Sal I  ＤＮＡフラグメントを回収し、プラスミドｐＹＥ−２２ｍのEco RI-Sal I断片と連結することにより、プラスミドｐＹＥ−６７９、ｐＹＥ−６８８、またはｐＹＥ−６９９を得ることができる。
プラスミドｐＹＥ−６１４は、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（RI-Pvu II ）のＫＥＸ２遺伝子の一部を含むBgl II - Sal I  ＤＮＡフラグメントをｐＹＥ−６６０のＫＥＸ２−６６０遺伝子の一部を含むBgl II - Sal I  ＤＮＡフラグメントとを置換し、作製した（図１３）。
【００８７】
２）形質転換および分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現（図１４および１５参照）
プラスミド（ｐＹＥ−２２ｍ、ｐＹＥ−６１４、ｐＹＥ−６６０、ｐＹＥ−６７９、ｐＹＥ−６８８及びｐＹＥ−６９９）をそれぞれ、Ｋ１６−５７Ｃ株へ導入し、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６８８］及びＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６９９］株を得た。
Ｋｅｘ２誘導体の培養液への分泌量は、培養上清のＫｅｘ２活性測定および濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。
【００８８】
コロニーをＹＣＤＰ培地４ｍｌに接種後、３２℃で一晩振とう培養した。培養液１００μｌをＹＣＤＰ培地４ｍｌに接種後、３２℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍｌを１２，０００ｒｐｍ、５分、４℃（トミー精工；MRX-150 ）にて遠心をし、培養上清を得た。培養上清は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で２〜６４倍希釈後、Ｋｅｘ２活性を測定した。結果を図１４に示す。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］およびＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６８８］のＯＤ６００あたりのＫｅｘ２活性は、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］と比較して、それぞれ２５倍、１５倍と１．２倍であった。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］とＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６９９］の培養上清にはＫｅｘ２活性は検出されなかった。
【００８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルは、培養上清をウルトラフリーC3GC（ミリポア（株）；分画分子量：１０，０００）を用いて２０倍濃縮して調製し、レーンあたり培養上清２００μｌ相当を用いた。結果を図１５に示す。なお、レーン１および７は分子量マーカーを、レーン２はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］を、レーン３はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］を、レーン４はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０] を、レーン５はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］を、レーン６はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６８８］を示している。レーン１の左側の数字は分子量マーカーの大きさ（ｋＤａ）を示す。
【００９０】
Ｋｅｘ２−６６０およびＫｅｘ２−６７９は、活性同様、Ｋｅｘ２−６１４に比べ分泌量が増加していることが明らかになった。また、これらの分子量はアミノ酸残基数に対応し大きくなること、すなわち、今回の培養においては、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主としたＫｅｘ２Δp のように自己分解物が蓄積するのではないことが明らかになった。
Ｋｅｘ２−６６０とＫｅｘ２−６７９の分泌生産量は、今まで報告されているＫｅｘ２−６１４の分泌生産量の10倍以上と非常に多いことがわかった。また、培養上清で顕著な自己分解も見られないことから、生産方法の検討によりさらに生産量が上昇することが期待できる。
【００９１】
実施例２．Ｋｅｘ２−６６０の精製
Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］株をスケールを上げて培養し、培養上清からのＫｅｘ２−６６０の精製を試みた。
Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］をＹＣＤＰ培地３Ｌで、３２℃で一晩培養した。培養上清２．３Ｌは、限外濾過モジュール（UF-LMSII  システム；UF2CS-3000PS；東ソー（株））を用いて、濃縮および緩衝液（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 ）交換を行なった（最終容量：２７５ｍｌ）。
【００９２】
このうち２１０ｍｌをあらかじめ同緩衝液で平衡化したQ-Sepharose XK16（ファルマシア（株））カラムに吸着させた。７５ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液で５０〜３５０ｍＭのＮａＣｌ濃度の直線濃度勾配による溶出（１２０ｍｌ）を行った。流速は３ｍｌ／分で行った。Ｋｅｘ２活性は１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度の溶出画分２４ｍｌに回収した。この溶出液に６．６ｇの硫酸アンモニウムを添加した後、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを６．０に調整し、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 で３０ｍｌにフィルアップした。
【００９３】
このうち１５ｍｌをあらかじめ２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 で平衡化した Phenylsuperose HR 5/5（ファルマシア（株））カラムに吸着させた。２．５ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 で２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配による溶出（１５ｍｌ）を行った。流速は０．５ｍｌ／分で行った。Ｋｅｘ２活性は０．８〜０．６Ｍの硫酸アンモニウム濃度の溶出画分２．２５ｍｌに回収した。各工程でのＫｅｘ２−６６０の回収率を表１に示す。回収率は、各工程の回収率を積算して求めた。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
実施例３．Ｋｅｘ２−６６０のＫｅｘ２プロテアーゼ活性に与える尿素の影響
キメラタンパク質発現法では、キメラタンパク質が不溶性封入体を形成する場合が多く、これを可溶化するために尿素等の変性剤が用いられる。今まで、Ｋｅｘ２プロテアーゼや分泌型Ｋｅｘ２誘導体の活性に尿素が与える影響についての報告はない。そこで、Ｋｅｘ２−６６０のプロテアーゼ活性に与える尿素の影響を、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡおよびキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４を基質として調べた。
【００９６】
１）合成基質を基質としたときのＫｅｘ２−６６０のＫｅｘ２プロテアーゼ活性に与える尿素の影響
実施例２で精製したＫｅｘ２−６６０（最終濃度８０〜１２００Ｕ／ｍｌに調整）を用いて、最終尿素濃度０、１、２、４Ｍでの活性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて調べた。反応条件は、尿素以外は前述のＫｅｘ２活性測定方法に従った。尿素非存在下の活性を１００％としたとき、尿素濃度１、２、４Ｍでの活性は、それぞれ、７０％、４０％、１０％であることがわかった（図１６）。不溶性封入体を尿素溶液に溶解後、プロテアーゼ等を作用させる場合には、一般的には２〜４Ｍの尿素濃度で行われる。従って、キメラタンパク質の溶解条件等を検討すれば、Ｋｅｘ２ー６６０はキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すための酵素として使用可能と考えた。
【００９７】
２）タンパク質を基質としたときのＫｅｘ２−６６０のＫｅｘ２プロテアーゼ活性に与える尿素の影響
参考例１で調製したβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４と実施例２で精製したＫｅｘ２−６６０を用い、Ｋｅｘ２ー６６０のプロテアーゼ活性に与える尿素の影響について調べた。まず、尿素濃度１．５〜３．０Ｍについて、以下の条件で、３７℃、３０分間反応させた。反応液は、４倍容量の５Ｎ酢酸を添加後、５０μｌをYMC-ODS-A302カラム（d 4.6 mm x 150 mm ；（株）山村化学研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；  島津製作所（株） LC6A ）に供し、直線濃度勾配（Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）； B  ：０．０９４％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；％Ｂ＝３０％→６０％／３０分；  流速１ｍｌ／分）で溶出した。
【００９８】
２ｍｇ／ｍｌ        βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４
１００ｍＭ          Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
１．５〜３．０Ｍ    尿素
１ｍＭ              ＣａＣｌ2
５０ｋＵ／ｍｌ      Ｋｅｘ２−６６０
【００９９】
Ｋｅｘ２−６６０処理後新たに生じるピークを分取し、Ｎ末端からのアミノ酸配列の決定およびアミノ酸組成分析を行い、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−８４）およびｈＰＴＨ（１−４４）を同定した。βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４には、Ｋｅｘ２プロテアーゼによって切断が予想される配列は、Ａｒｇ−Ａｒｇ（切断部位Ａ）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（切断部位Ｂ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（切断部位Ｃ、切断部位Ｄ）の４カ所存在する。同定したペプチドフラグメントから、切断部位Ａ、切断部位Ｂ、切断部位Ｃの切断が確認できたが、切断部位Ｄの切断は確認できなかった。
【０１００】
Ｋｅｘ２−６６０処理後生じる各ペプチドフラグメントの回収率は、以下のようにして決定した。
回収率（％）＝ＦＰＡ×ＣＡＡ×１００／（ＣＰＡ×ＦＡＡ）
ＦＰＡ；Ｋｅｘ２−６６０処理を行った後の各ペプチドフラグメントのピークエリア面積
ＣＡＡ；βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のアミノ酸数（２３１アミノ酸）
ＣＰＡ；Ｋｅｘ２−６６０処理を行う前のβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のピークエリア面積
ＦＡＡ；各ペプチドフラグメントのアミノ酸数
【０１０１】
結果を図１７に示す。なお、□、○、●、および△は、それぞれ、βＧａｌ−（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）およびｈＰＴＨ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率を示す。
尿素濃度１．５〜２．５Ｍの範囲では尿素濃度が上昇するに従い、Ｋｅｘ２−６６０により切り出されるペプチドの回収率が増加すること、すなわち、切断部位Ａ切断部位Ｂおよび切断部位Ｃの切断効率が上昇することがわかった。
【０１０２】
一方、２．５〜３．０Ｍの尿素濃度では、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率が低下し、［ｈＰＴＨ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４４）］の回収率はほとんど変わらず、ｈＰＴＨ（１−８４）が増加することから、切断部位Ｂの切断効率は変わらないが、切断部位Ａおよび切断部位Ｃの切断効率が低下することがわかった。すなわち、Ｋｅｘ２−６６０によるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の切断において、２．５Ｍまでの濃度なら尿素濃度は高い方が切断効率が上がるが、２．５〜３．０Ｍの尿素濃度ではその配列により切断効率に差が出ることがわかった。
【０１０３】
そこで、より高い尿素濃度３．０〜４．０Ｍについて、以下の実験を行い、各ペプチドフラグメントの回収率等を調べた。
２ｍｇ／ｍｌ        βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４
１００ｍＭ          Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
３．０〜４．０Ｍ    尿素
１ｍＭ              ＣａＣｌ2
２０ｋＵ／ｍｌ      Ｋｅｘ２−６６０
結果を図１８に示す。なお、シンボル及び回収率の算出は前述の通りである。
【０１０４】
その結果、尿素濃度３．０〜４．０Ｍにおいては、すべてのペプチドフラグメントの回収率に顕著な差は見られなかったが、尿素濃度が上昇するに従い、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率が低下し、ｈＰＴＨ（１−８４）が増加する傾向が見られた。すなわち、尿素濃度が上昇するに従い、切断部位Ｂの切断効率が若干増加し、切断部位Ｃの切断効率は減少することがわかった。
【０１０５】
以上、１．５〜４．０Ｍ尿素濃度でのＫｅｘ２−６６０によるβＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の切断についてまとめると、尿素濃度１．５〜２．５Ｍの範囲では尿素濃度が上昇するに従い、切断部位Ａ切断部位Ｂおよび切断部位Ｃの切断効率が上昇すること、尿素濃度２．５〜３．５Ｍの範囲では、切断部位Ｂの切断効率が上昇するが、切断部位Ｃの切断効率は低下することがわかった。これらの知見は、合成基質を用いた場合からは予想できず、本発明により初めて明らかになった。
キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−８４）の切り出しという観点からは、切断部位Ｂの切断効率が高く、切断部位Ｃの切断効率が低い、３．５〜４．０Ｍの尿素濃度が望ましいことが明らかになった。
【０１０６】
実施例４．Ｋｅｘ２−６６０によるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのｈＰＴＨ（１−８４）の切り出し
実施例３において、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−８４）およびｈＰＴＨ（１−４４）を同定し、これらのペプチドの回収率から、Ｋｅｘ２−６６０によるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の切断効率に尿素が与える影響について検討した。しかし、ｈＰＴＨ（４５−８４）由来のペプチドフラグメントの同定はできていなかった。そこで、ｈＰＴＨ（１−８４）をＫｅｘ２−６６０処理したサンプルを、溶出条件を変えたＨＰＬＣにて分離、解析してｈＰＴＨ（４５−８４）を同定し、前述の条件による溶出では素通り画分に溶出していることを確認した。また、この結果から、切断部位Ｄはほとんど切断を受けないことが明らかになった。
【０１０７】
次に、キメラタンパク質に対して、  種々の量比のＫｅｘ２−６６０（キメラタンパク質１ｍｇあたりＫｅｘ２−６６０を２５ｋＵ、５０ｋＵ、１００ｋＵ、１５０ｋＵおよび２００ｋＵ）を作用させ、３０分後、各ペプチドフラグメントの回収率を調べた。生じるペプチドフラグメントの解析は、前述の結果からグラジエント条件を％Ｂ＝０％→８０％／８０分に変更し、それ以外は実施例３と同様に行った。
１ｍｇ／ｍｌ              βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４
１００ｍＭ                Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
４Ｍ                      尿素
１ｍＭ                    ＣａＣｌ2
２５〜２００ｋＵ／ｍｌ    Ｋｅｘ２−６６０
【０１０８】
Ｋｅｘ２−６６０未処理および５０ｋＵのＫｅｘ２−６６０で処理したサンプルのチャートを図１９に示した。ピーク１、２、３、４、７は、それぞれ、ｈＰＴＨ（４５−８４）（切断部位Ｃの次のアミノ酸からｈＰＴＨ１−８４のＣ−末端まで）、βＧａｌ（１−１４）（β−Ｇａｌ−１３９ＳのＮ−末端から切断部位Ａまで）、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）（切断部位Ｂの次のアミノ酸から切断部位Ｃまで）およびβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４（キメラタンパク質の全長）である。
【０１０９】
ピーク６、７は、Ｋｅｘ２−６６０量が少ないときに多く、多いときは少なく、ピーク６、７の減少に伴いピーク５が増加することから、ピーク５はキメラタンパク質の切断部位Ａの次のアミノ酸から切断部位Ｂまでのペプチドで、ピーク６はβＧａｌ−１３９のＮ−末端から切断部位Ｂまでまたは切断部位Ａの次のアミノ酸からｈＰＴＨ（１−８４）のＣ−末端までであると思われる（ピーク６はβＧａｌ−１３９ＳのＮ−末端から切断部位Ｃまでの可能性もあるが、Ａｒｇ−Ａｒｇの方がＰｒｏ−Ａｒｇより切れやすいのでこの可能性は低い）。
【０１１０】
また、２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲でピーク１、４、５、６、７の大きさは変化するが、ピーク２、３の大きさはほとんど変わらない。また、２００ｋＵ／ｍｌのＫｅｘ２−６６０を用いた場合でも、新たなピークは生じなかった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−８４）を切り出すために必要なＫｅｘ−６６０量（２５ｋＵ／ｍｌ）の８倍量（２００ｋＵ／ｍｌ）を用いても、Ｋｅｘ２プロテアーゼ以外のプロテアーゼ活性は検出されず、実施例２で精製されたＫｅｘ２−６６０には、キメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件において、問題になる他のプロテアーゼは混入していないことが確認された。
【０１１１】
２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲におけるｈＰＴＨ（１−８４）由来のペプチドフラグメントの回収率を図２０にまとめた。５０ｋＵ／ｍｌのＫｅｘ２−６６０を用いた場合、ｈＰＴＨ（１−８４）は約７５％回収されることがわかった。このとき、約１０％のβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４が残っていたが、Ｋｅｘ２−６６０量を増加させるに従って減少し、２００ｋＵ／ｍｌではほぼ完全に消失した。しかし、同時にｈＰＴＨ（１−４４）の割合も増加し、ｈＰＴＨ（１−８４）の回収率は増加していない。Ｋｅｘ２−６６０量を増やした場合も、ｈＰＴＨ（１−８４）の分解物ｈＰＴＨ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−８４）増加は緩やかであり、２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲でｈＰＴＨ（１−８４）の回収率は６５〜７５％であった。
【０１１２】
以上の結果から、Ｋｅｘ２−６６０は目的ペプチドにＫｅｘ２プロテアーゼの切断部位を持つ場合でも、キメラタンパク質から効率良く（切り出し効率７５％）目的ペプチドを切り出すことができることが判明した。なお、この切り出し効率は、ファクターＸａを用いた場合のｈＰＴＨ（１−８４）の切り出し効率５０％（Gardella et al. J. Biol. Chem., 265(26), 15854-15859, 1990）より高い。Gardella  らは、ファクターＸａの認識部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列がｈＰＴＨ（１−８４）にないにも関わらず、酵素量を増加させたり反応時間を長くしたりするとｈＰＴＨ（１−８４）の回収率が下がることから、混入するプロテアーゼまたはファクターＸａがｈＰＴＨ（１−８４）を分解している可能性を示唆している。
【０１１３】
ｈＰＴＨ（１−８４）にはＫｅｘ２プロテアーゼの切断配列が２ヶ所存在するにも関わらず、高い回収率でｈＰＴＨ（１−８４）が得られたという事実は、本発明により生産量が増加し、精製されたＫｅｘ２誘導体が、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すための酵素として有用であることを示している。
また、Ｋｅｘ２−６６０量を増やした場合もＫｅｘ２プロテアーゼ部位以外の切断により生じるペプチドフラグメントは検出されず、実施例２で精製したＫｅｘ２の基質特異性は高く、また、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出す条件では他のプロテアーゼ活性は検出されなかった。
【０１１４】
実施例６．Ｋｅｘ２−６６０によるＣＡＴＰＨ３４からｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し
キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４よりｈＰＴＨ（１−３４）を切り出すため、参考例２の溶出液より６０μｌを採取しこれに脱イオン水２３９μｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ2 を１．３２μｌ、およびＫｅｘ２−６６０  ３０ｋＵを加え３７℃で１時間加温した。反応後に出現したピークについてアミノ酸分析を行ったところ、ｈＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸組成に一致した（図２１）。
【０１１５】
すなわち、反応溶液に尿素が存在しない状態でも、他のプロテアーゼ活性が検出されず、Ｋｅｘ２−６６０を用いてキメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−３４）が切り出せることが判明した。また、Ｋｅｘ２−６６０はキメラタンパク質の保護ペプチドおよび切断部位領域が異なっても目的ペプチドを切り出すことが可能で、工業的に広く使用できることが期待される。
【０１１６】
実施例７．キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４からのｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し
参考例３で調製したβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の封入体懸濁液（１６０ｇ／Ｌ）２５０ｍｌに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）１００ｍｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ５０ｍｌ、脱イオン水５００ｍｌ、尿素９００ｇを加えて３０℃の恒温槽中３０分撹拌溶解し、暖めた脱イオン水で希釈し、３０℃で５Ｌとした。
【０１１７】
これに２５０ｍＭ  ＣａＣｌ2 溶液５０ｍｌを撹拌しながら穏やかに添加し、さらにＫｅｘ２−６６０を２０ｋＵ／ｍｌとなるように加えた。２時間後、９０％以上の効率で７ｇのｈＰＴＨ（１−３４）が切り出された。用いたＫｅｘ２−６６０量は、キメラタンパク質の１／２０，０００（重量比）以下であり、ｈＰＴＨ（１−３４）がキメラタンパク質から効率良く切り出されることがわかった。
【０１１８】
実施例８．キャンディダ・ボイディニイを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現
実施例１の結果から、Ｋｅｘ２−６６０は、培養液中で顕著な自己分解を起こさないことがわかった。このため、より効率的な発現系を用いれば、生産量の増加が期待できる。メタノール資化性酵母キャンディダ・ボイディニイを宿主とした発現系でＫｅｘ２−６６０の生産を試みた。
【０１１９】
１）キャンディダ・ボイディニイを宿主とした発現プラスミドの作製（図１１及び図２２）
ＮＫＥＸ２−６６０遺伝子は、プライマーにＮＫＥＸ２（配列番号４１）とＫＭ０８８を用いた以外は、実施例１の１）と同様にＰＣＲ法を用いて作製した。ＮＫＥＸ２は、５’末端に制限酵素Not I 部位の塩基配列（下線部）を有し、ＫＥＸ２遺伝子の開始メチオニンの上流−１０７〜−１３２塩基の配列を含む（図１１）。ＮＫＥＸ２−６６０遺伝子（ＫＥＸ２遺伝子の５’非翻訳領域１３２塩基対を有するＫＥＸ２遺伝子）は、ｐＣＲIIにクローニング後、制限酵素Not I を用いて切り出した。ＮＫＥＸ２−６６０遺伝子を含むNot I   ＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＮＯＴｅｌＩのNot I 部位にプロモーター支配下にＫＥＸ２−６６０遺伝子が発現できるように挿入し、ｐＣＵ６６０を作製した（図２２）。
【０１２０】
２）キャンディダ・ボイディニイを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産（図２３）
ＵＲＡ３遺伝子上に存在する制限酵素Bam HIで切断し直鎖上にしたプラスミドｐＣＵ６６０を、ＴＫ６２に導入し、形質転換株ＴＫ６２／ｐＣＵ６６０を選択した。ＴＫ６２［ｐＣＵ６６０］２０株（＃１〜＃２０）をＢＭＧＹ培地で、２７℃で振とう培養した。２日後、前培養液１０ＯＤ・ｍｌ相当を１ｍｌのＢＭＭＹ培地に接種し、２７℃でさらに振とう培養した。３０時間後、培養上清のＫｅｘ２活性を測定した。活性が高い５株について同様に培養し、再現よくＫｅｘ２活性が高かったＴＫ６２［ｐＣＵ６６０］＃１０株を選び、ファーメンターを用いて培養した。
【０１２１】
グリセロール凍結ストックＴＫ６２［ｐＣＵ６６０］＃１０株１ｍｌを２５ｍｌのＹＰＤ培地を含む、３００ｍｌ容三角フラスコに接種、２７℃にて１６時間前培養した。１０．５ｍｌの前培養液（ＯＤ６００＝３８）を２ＬのＹＰＧＭ培養用培地に接種し、５Ｌ容ファーメンター（ミツワ理化、KMJ-5B-4U-FP型）を用いて、２７℃にて通気撹拌培養した。通気量は４Ｌ／分とし、溶存酸素量は２．５ｐｐｍ以下にならないように撹拌速度を変化させ制御した。メタノール、グリセロールおよび窒素源（５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１０％（ｗ／ｖ）ペプトン、６．７％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ  ｗ／ｏ  ＡＡ；１／２５容量／回）は、適宜補充した。
【０１２２】
ｐＨは７．５％（ｖ／ｖ）アンモニア水を添加し、ｐＨ５．５以下にならないように制御した。消泡剤（ディスフォーム CC-222 、（株）日本油脂）を培養開始時に０．５ｍｌ／Ｌ添加し、その後は必要に応じて添加した。図２３に各培養時間の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。培養４８時間後のＯＤ６００は３５３で、この培養により培養上清１Ｌ当たり、約２８００ＭＵのＫｅｘ２−６６０（約３４０ｍｇに相当）が生産できた。
この生産量は、実施例７において、ｈＰＴＨ（１−３４）２００ｇを切り出すことが可能な量であり、本発明のＫｅｘ２誘導体が実際に工業スケールでキメラタンパク質からの目的ペプチド切りだしに利用可能であることを明らかにした。
【０１２３】
実施例９．サッカロマイセス・セルビジアエを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現（２）
実施例１において、Ｃ−末端領域を欠失させたＫｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２−６６０およびＫｅｘ２−６７９）の生産量が、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−６９９、およびに比べ、著しく増大していること示した。本実施例においては、さらに多くのＣ−末端領域を欠失させたＫｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、およびＫｅｘ２−６８２）を作製し、Ｃ−末端領域とＫｅｘ２プロテアーゼの生産量の関係について調べた。
【０１２４】
１）分泌型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミドの作製
分泌型Ｋｅｘ２遺伝子は実施例１、１）の方法に準じて作製した。即ち、プライマーの配列ＫＭ１００（配列番号４２）、ＫＭ１０２（配列番号４３）、ＫＭ１０３（配列番号４４）とＫＭ１０４（配列番号４５）は、それぞれＮ末端から、６３０番目、６４０番目、６５０番目、および６８２番目のアミノ酸の直後に翻訳停止コドンＴＡＡが付加した配列のアンチセンス鎖の塩基配列を有し、５’末端に制限酵素Sal I 部位を持つ。
【０１２５】
分泌型Ｋｅｘ２誘導体遺伝子をコードするEco RI-Sal I  ＤＮＡフラグメントおよびこれらを含む発現ベクターの作製は実施例１、１）の方法にしたがった。なお、Ｋｅｘ２プロテアーゼのＮ末端から６３０番目、６４０番目、６５０番目、または６８２番目までのポリペプチドをそれぞれＫｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６８２と呼び、これらをコードする遺伝子をそれぞれＫＥＸ２−６３０、ＫＥＸ２−６４０、ＫＥＸ２−６５０、ＫＥＸ２−６８２と呼ぶ。
【０１２６】
２）形質転換および分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産（図２５および２６参照）
プラスミド（ｐＹＥ−６３０、ｐＹＥ−６４０、ｐＹＥ−６５０、ｐＹＥ−６８２）を、Ｋ１６−５７Ｃ株へ導入し、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６３０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６４０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６５０] とＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８２] 株を得た。次にこれらの形質転換株、さらに実施例１、２）で調製した分泌型Ｋｅｘ２誘導体生産株についても培養し、Ｋｅｘ２の生産量（培養液へ分泌されるＫｅｘ２量）を、培養上清のＫｅｘ２活性測定および培養上清濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。
【０１２７】
培養は、まず、コロニーをＹＣＤＰ培地に懸濁後、３０℃で振とう培養し、対数増殖期の菌を調製した。次にこの菌を、ＯＤ６６０の吸光度が約０．０２になるようにＹＣＤＰ培地に継代し、さらに約１６時間、３０℃で培養した。Ｋｅｘ２活性測定の結果を図２５に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２６に示す。
培養液ＯＤ６６０あたりのＫｅｘ２活性は、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６３０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６４０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６５０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６６０] 、およびＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６７９] は、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６１４] のほぼ１２倍で、ＫＥＸ２−６３０からＫＥＸ２−６７９の範囲において、Ｋｅｘ２生産量に差がないことが分かった。
【０１２８】
また、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８２] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８８] のＫｅｘ２の生産量は、それぞれＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６１４] の６倍、３．４倍で、Ｃ−末端領域が長くなるほど低下した（図２５）。Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−２２ｍ] とＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６９９] の培養上清にはＫｅｘ２活性は検出されなかった。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、Ｋｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８の生産量は、Ｋｅｘ２活性と同様に、Ｋｅｘ２−６１４に比べ増加していることも明らかになった（図２６）。
【０１２９】
実施例１０. ピキア・パストリスを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現
実施例８の結果から、分泌型Ｋｅｘ２誘導体Ｋｅｘ２−６６０はキャンディダ・ボイディニイを宿主とした発現系で大量に生産できることがわかった。Ｋｅｘ２−６６０が他のメタノール資化性酵母でも生産可能なことを、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)を宿主とした発現系（ピキアエクスプレッションキット（Pichia Expression Kit)；インビトロジェン社）を用いて調べた。
【０１３０】
１）ピキア・パストリスを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミドの作製（図１１および図２７参照）
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖上にしたプラスミドｐＹＥ−６６０を鋳型に、ＫＭ０８５（配列番号３６）およびＫＭ０８８（配列番号３７）をプライマーに用い、ＰＣＲ反応を行った。反応精製物はｐＣＲII（インビトロジェン社）にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ＫＥＸ２−６６０遺伝子の両端に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を有するＤＮＡフラグメントを得た。
プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（ピキアエクスプレッションキット）の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に、ＫＥＸ２−６６０遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、ＫＥＸ２−６６０遺伝子がＡＯＸプロモーターにより発現できる向きに挿入されたプラスミドｐＨＩＬ−６６０を得た（図２７）。
【０１３１】
２）ピキア・パストリスを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産
プラスミドｐＨＩＬ−６６０を制限酵素ＮｏｔＩで切断して得られるＫＥＸ２−６６０遺伝子を含む断片を、ピキア・パストリスＧＳ１１５株（ｈｉｓ- ，ＡＯＸ+ ；ピキアエクスプレッションキット）に導入し、ヒスチジンを含まない培地で生育する形質転換株ＧＳ１１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕を選択した。これらの中から、メタノールのみを炭素源とした場合に生育できないＧＳ１１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕（ＡＯＸ- ）５株を得た。これらをＢＭＭＹ培地で培養し、Ｋｅｘ２生産量が多いＧＳ１１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕＃２３を得た。
【０１３２】
ＧＳ１１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕＃２３のＫｅｘ２の生産量を調べた。まず、コロニーを１０ｍｌのＢＭＧＹ培地に接種し、３０℃で２日間振とう培養した。培養液１０ｍｌから遠心して得た菌を２ｍｌのＢＭＭＹ培地に懸濁し、２５℃でさらに２日間振とう培養後、培養上清のＫｅｘ２活性を測定した。その結果、培養上清１ｍｌ当たり約１３５０ＫＵ（約１６０μｇ相当）のＫｅｘ２−６６０が生産していることがわかった。
従って、キャンディダ・ボイディニイ以外のメタノール資化酵母ピキア・パストリスを宿主とした発現系でもＫｅｘ２−６６０は大量に生産できることがわかった。
【０１３３】
【配列表】
0003982866.tif 000003
0003982866.tif 000004
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
0003982866.tif 000052
【０１７７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子作製に用いた合成オリゴマーの配列を示す図である。
【図２】図２は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子の作製方法を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）の作製方法を示す図である。Ｐｌａｃは大腸菌のラクトースオペロンのプロモーターをＴｔｒｐは、大腸菌のＴｒｐＥのアテニュエーターターミネーターを示す。
【図４】図４は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９の作製方法を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＴＨ（１−３４）ｐｒｏαの作製方法を示す図である。
【図６】図６は、キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４を発現するプラスミドｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）の作製方法を示す図である。Ｐｔａｃは、ｔｒｐプロモーターの−３５領域とＰｌａｃの−１０領域の合成プロモーターを示す。
【図７】図７は、大腸菌で発現させたキメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４の精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示した図であり、電気泳動図を示す図面代用写真である。
【図８】図８は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９ＳＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の作製方法を示した図である。
【図９】図９は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の作製方法の前半部分を示した図である。
【図１０】図１０は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の作製方法の後半部分を示した図である。
【図１１】図１１は、ＫＥＸ２遺伝子の構成と分泌型Ｋｅｘ２誘導体の遺伝子を作製するために合成したプライマーの配列およびそれぞれのアニーリング部位を示す図である。
【図１２】図１２は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体を発現するプラスミドｐＹＥ−６６０の作製方法を示す図である。P ＫＥＸ２は、サッカロマイセス・セレビジアエのＫＥＸ２遺伝子のプロモーターを示す。
【図１３】図１３は、Ｋｅｘ２−６１４を発現するプラスミドｐＹＥ−６１４の作製方法を示す図である。
【図１４】図１４は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体のＯＤ６６０あたりのＫｅｘ２活性を合成基質を用いて比較した図である。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］の活性を１として各分泌型Ｋｅｘ２誘導体生産株の培養液の相対活性を示している。
【図１５】図１５は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養上清２００μｌあたりの生産量を比較した図であり、電気泳動図を表わす図面に代る写真である。
【図１６】図１６は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度での活性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質に用いて検討した図である。尿素非存在下におけるＫｅｘ２−６６０の活性を１００％として各尿素濃度における相対活性を示している。
【図１７】図１７は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度（１．５〜３．０Ｍ）におけるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのβＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）および［ｈＰＴＨ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−１４）］の回収率の比較を示した図である。
【図１８】図１８は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度（３．０〜４．０Ｍ）におけるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのβＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）および［ｈＰＴＨ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４４）］の回収率の比較を示した図である。
【図１９】図１９は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のＫｅｘ２−６６０処理前と処理後のＨＰＬＣチャートおよび同定したペプチドフラグメントとβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の関係を模式的に示した図である。チャートのピーク番号と図中のフラグメントの番号とは一致している。なお、フラグメント１、２、３および４はアミノ酸配列決定により同定した。７は溶出時間からの推定、５はβＧａｌ（１−１４）およびｈＰＴＨ（１−８４）の相関からの推定である。また、６については溶出される可能性のあるフラグメントを図中で６として表記した。
【図２０】図２０は、Ｋｅｘ２−６６０の各酵素濃度におけるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）およびｈＰＴＨ（４５−８４）の回収率の比較を示した図である。■、○、●、および▲は、それぞれ、βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）およびｈＰＴＨ（４５−８４）の回収率を示す。回収率の算出は、以下のようにして決定した。ｈＰＴＨ（１−８４）とβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４とに関しては濃度既知の標準品とのピーク面積比から、またｈＰＴＨ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−８４）に関しては濃度既知のｈＰＴＨ（１−８４）のピーク面積比をそれぞれのアミノ酸残基数で補正して求めた。
【図２１】図２１は、キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４のＫｅｘ２−６６０処理前と処理後のＨＰＬＣチャート示した図である。
【図２２】図２２は、Ｋｅｘ２−６６０発現プラスミドｐＣＵ６６０の作製方法を示す図である。
【図２３】図２３は、ＴＫ６２／ｐＣＵ６６０＃１０株の各培養時間におけるＫｅｘ２−６６０の培養上清への分泌の様子を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥであり電気泳動図を示す図面に代る写真である。
【図２４】図２４は、プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］の作製方法を示す図である。
【図２５】各分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養液ＯＤ６６０あたりの生産量を、合成基質を用いたＫｅｘ２活性により比較した図である。Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６１４] の生産量を１として各分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産量を示している。
【図２６】分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養上清２００μｌあたりの生産量を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。レーン１および１２は分子量マーカーを、レーン２〜１１はそれぞれ、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２ｍ] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６１４] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６３０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６４０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６５０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６６０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６７９] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６８２] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６８８] 、またはＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６９９] の培養上清の濃縮液を展開した。レーン１の左側の数字は分子量マーカーの大きさ（kDa ）を示す、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図２７】ピキア・パストリスを宿主としたときのＫｅｘ２−６６０発現プラスミドｐＨＩＬ−６６０の作製方法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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