(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス由来のＣＲ、ＣＮ２又はＮ２４を含むｃＤＮＡが、該ｃＤＮＡとプロモーターの間に２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた挿入遺伝子を介在させることによりスイッチング発現するように導入されており、該挿入遺伝子の存在下では該Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡが発現されないが、該挿入遺伝子の除去により該ｃＤＮＡが発現され、かつヒトのＣ型肝炎と同様の病態を示すことを特徴とする、ヒトを除くトランスジェニック動物。
【請求項２】
ヒトのＣ型肝炎と同様の病態が、血清中のＧＰＴの上昇、肝組織での好酸体の出現及び肝細胞の脱落、クッパー細胞の肥大及び増加、又はリンパ球の集簇である請求項１記載のヒトを除くトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎モデル動物に関する。本発明のモデル動物は、Ｃ型肝炎の発症機構の解明、治療手段の開発等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」という）の遺伝子をマウスなどの小動物に導入し、導入した遺伝子を発現させて肝炎の発症モデルをつくろうという試みはこれまでも多く行われてきた（C.Pasquinelli ら Abstract book of 2nd international meeting on hepatitis C virus and related viruses(July 31-August 5, 1994 San Diego,USA)、C.Pasquinelli ら Abstract book of 3nd international meeting on hepatitis C virus and related viruses(August 28-September 3,1995 Gold coast,Australia) 、Kazuhiko Koikeら J.General Virology 76 p3031-3038 1995、T.Kato Arch Virol 141 p951-958 1996 ）。しかし、ほかの多くの遺伝子と異なり、ＨＣＶ遺伝子はマウス個体への組み込みが困難であり、また、うまく組み込まれてもＨＣＶ蛋白質の産生が認められない例がほとんどであった。さらに、ＨＣＶ蛋白質の産生が認められたきわめて稀な例でも胎児期より蛋白質が産生され、免疫寛容になるために、生後も典型的な肝炎症状を呈するものはなく、肝炎モデルにはなりえていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトの疾患の発症機構を解明し、その治療手段を開発するにあたっては、その疾患と酷似した病態を示すモデル動物が重要な役割を果たす。
しかし、上記のようにＣ型肝炎に関しては、そのようなモデル動物が未だに作りだされておらず、このことがＣ型肝炎の発症機構を解明する上での一つの障害となっている。
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、その目的は、ヒトＣ型肝炎と同様の病態を示す新規なモデル動物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッチング発現するようにマウスに導入することにより、マウスにヒトのＣ型肝炎と酷似した病態を発症させることができるのを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡが導入されていることを特徴とするＣ型肝炎モデル動物である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
最初に、本発明のモデル動物の特徴について説明する。
本発明のＣ型肝炎モデル動物の一例では、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡがスイッチング発現するように導入さている。ここで「スイッチング発現」とは、所望の時期に特定の遺伝子を発現させることができる発現システムをいう。スイッチング発現は、例えば、発現させようとする遺伝子とそのプロモーターの間に、所望の時期に除去可能な配列を介在させることや薬物などにより誘導可能なプロモーターを使用することにより構築できる。前者の具体例としては、Cre/loxP発現システム（Nat Sternberg ら J.Molecular Biology 150.p467-486 1981、Nat Sternberg ら J.Molecular Biology 150.p487-507 1981）を挙げることができる。Cre/loxP発現システムは、２つのloxP配列にはさまれた挿入遺伝子（これが、プローモーターと目的とする遺伝子の間に介在し、その遺伝子の発現を抑制する）と、挿入遺伝子を１つのloxP配列とともに除去するP1ファージCre ＤＮＡ組換え酵素（以下、単に「Cre 」という）とからなり、Cre を作用させることにより任意の時期に目的の遺伝子を発現させることができる。loxP配列は、大腸菌P1ファージの遺伝子に由来するＤＮＡであって、下記のような塩基配列を有する長さ34bpのＤＮＡである。
【０００６】
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
Cre は、大腸菌P1ファージに由来する分子量約38kDのＤＮＡ組換え酵素である。
ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッチング発現させることにより、動物がある程度成長した段階でＨＣＶ由来のタンパク質を産生させることができる。このため、従来のＣ型肝炎モデル動物で問題となっていた免疫寛容の問題を回避することができる。
【０００７】
本発明のＣ型肝炎モデル動物の外形的な特徴は、ヒトのＣ型肝炎と同様の病態を示すことである。具体的な病態としては、本実施例にあるように血清中のＧＰＴの上昇、肝組織での好酸体の出現と肝細胞の脱落、クッパー細胞の肥大と増加、リンパ球の集簇などを挙げることができる。但し、これらの病態は、導入するＤＮＡ断片、モデル動物の種類などにより変動するので、本発明の技術的範囲を限定的に定めるものではない。
【０００８】
次に、本発明のモデル動物の作出方法について説明する。
本発明のＣ型肝炎モデル動物は、例えば、以下のようにして作出することができる。まず、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッチング発現させることのできるベクターを作製する。このようなベクターは、例えば、プロモーターとloxP配列を含むベクターに、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをloxP配列の下流に挿入することにより作製できる。プロモーターとloxP配列を含むベクターとしては、Yumi Kanegaeらが作製したPCALNLW 、本発明者が作製したpCALN/pBR などがある。なお、pCALN/pBR を導入した大腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-15753として寄託されている（寄託日：平成８年７月22日）。ベクターに挿入するｃＤＮＡとしては、例えば、実施例にあるＣＮ２、Ｎ２４、ＣＲなどを用いることができるが、これらに限定されるわけではない。このようなｃＤＮＡは、Nobuyuki Kato らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,9524-9528,1990）に従って作製することができる。
【０００９】
次に、作製したベクターから発現カセットを切り出し、これを受精卵に導入し、導入後の受精卵を仮親に移植する。受精卵への導入は、例えば、マイクロインジェクション法など常法に従って行い得る。また、ｃＤＮＡ導入の対象とする動物の種類は、トランスジェニック動物の作出技術が確立されている動物であれば特に制限はない。実施例では、マウスを用いているが、これに限定されることなく、ラット、ウサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどでもよい。
【００１０】
次に、仮親から得られた動物の中からＨＣＶ由来のｃＤＮＡを有しているものを選抜し、さらに、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡがスイッチング発現するものを選抜して、本発明のＣ型肝炎モデル動物を得る。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡを有しているかどうかは、ＰＣＲ法により判断できる。即ち、選抜しようとする動物からＤＮＡを抽出し、それを鋳型とし、導入したｃＤＮＡの両末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成してプライマーとし、ＰＣＲを行う。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡが導入されていれば増幅断片が検出されるが、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡが導入されていなければ増幅断片は検出されない。また、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡがスイッチング発現しているかどうかは、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡの発現を阻害している配列を除去し、in vitro又はin vivo で該ｃＤＮＡに対応するタンパク質が産生されているかどうかを調べればよい。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡに対応するタンパク質が産生されているかどうかは、ウェスタンブロット法や蛍光抗体染色法などにより調べることができる。
【００１１】
ＨＣＶ由来のｃＤＮＡは、スイッチング発現するので本発明のＣ型肝炎モデル動物は、そのままの状態では肝炎を発症せず、肝炎を発症させるためには、当該ｃＤＮＡの発現を抑制している配列を除去することが必要である。そのような抑制配列を除去するには、ＤＮＡ組換え酵素を用いればよく、例えば、抑制配列が、loxP配列であれば、loxP配列を除去する酵素であるCre を発現するアデノウイルスAxNCreを感染させればよい。Cre 及びAxNCreは、Yumi Kanegaeら Nucl.Acids Res.23,19,38 16-21.1995 の記載に従って作製できる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕Cre/loxP発現システムを利用した発現ベクターの構築
ＣＡＧプロモーター下流の２つのloxP配列にはされまれたネオマイシン耐性遺伝子を挿入した発現カセットを pCALNLW（Yumi Kanegaeら Nucl.Acids Res.23,19,38 16-21.1995 ）から切り出し、pBR322に組み込みpCALN/pBR を作成した（図１）。
ネオマイシン耐性遺伝子およびloxP配列の下流のSwaI切断部位でpCALN/pBR を開裂し、３種類のＨＣＶ由来のｃＤＮＡ (ＣＮ２，Ｎ２４，ＣＲ) を挿入した（図２) 。
【００１３】
ＣＮ２はＨＣＶ遺伝子の 294番から3435番の塩基に対応する3160bpのｃＤＮＡであり、Ｎ24はＨＣＶ遺伝子の2769番から6823番の塩基に対応する4055bpのｃＤＮＡであり、ＣＲはＨＣＶ遺伝子の 294番から9455番の塩基に対応する9162bpのｃＤＮＡである。このＨＣＶ由来のｃＤＮＡは小原らによって、チンパンジーおよびＨＰＢＭａ細胞に感染性が確認されたＲ６血清（Yohko K.Shimizu ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90,6037-6041中の「plasma K」に相当する血清である。）からＲＴ−ＰＣＲ法により分離したものを使用した（Nobuyuki Kato ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,9524-9528,1990 ）。
【００１４】
ＨＣＶ由来のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターから  HindIII切断により、発現カセットを切り出し、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。このＤＮＡをさらに塩化セシウムを用いた比重遠心法にて精製した。得られたＤＮＡを脱塩、エタノール沈殿後ＴＥ buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) に溶解した。
【００１５】
〔実施例２〕トランスジェニックマウスの作出
雌マウス（BALB/cCrSlc 及びC57Bl/10SnSlc 、共に日本エスエルシー株式会社製）に排卵誘起剤投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取した。実施例１で調製したＤＮＡ断片溶液（1-5 μg/ml）を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に約２pl注入した。この操作は、〔「受精卵へのＤＮＡの注入、発生工学実験マニュアル」（野村達次  監修、勝木元也  編）41-76 頁、講談社1987年〕及び〔「前核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、マウス胚の操作マニュアル」(Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual ）（B.Hogan, F.Costantini and E.Lacy/ 著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎／訳）、155-173 頁、近代出版1989年〕の記載に従って行った。
ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Slc:ICR 、日本エスエルシー株式会社製）の卵管に移植し、約20日後に自然分娩又は帝王切開により出生させた。
【００１６】
〔実施例３〕トランスジェニックマウスのスクリーニング
ＨＣＶ遺伝子に特異的な配列をもつプライマーを用いたＰＣＲにより、得られたマウスの体細胞遺伝子へのトランスジーンの組み込みをスクリーニングした。
【００１７】
マウスの耳介切片を125mg/mlプロティネースＫ溶液（50mM KCl/10mM Tris-HClpH8.3/1.5mM MgCl2 /0.1% ゲラチン/0.45% NP40/0.55% Tween20)中で55℃１ｈインキュベート後96℃10分間加熱した。得られたＤＮＡ溶液５μl をＰＣＲに使用した。ＣＮ２を使用したマウスのスクリーニングのためのＰＣＲのプライマーにはセンスプライマーとして6-294-S20 (5'-TGATAGGGTGCTTGCGAGTG-3')、アンチセンスプライマーとして6-604-R18 (5'-TTGCCATAGAGGGGCCAA-3')を各最終濃度１μM で用いた。ＰＣＲは94℃２分加熱後、94℃１分、55℃２分、72℃２分の反応を40回、サーマルサイクラー（パーキンエルマー）で行った。得られたＰＣＲ産物を３％アガロースに電気泳動し、エチジウムブロマイド染色にて、目的のＤＮＡ産物（311bp)の有無を判定した。図３にＰＣＲ産物のアガロース電気泳動による検出の例を示す。図中のＡおよびＣは陰性マウス、Ｂは陽性マウス、Ｎは陰性対照（BALB/cマウス）、Ｍは陽性対照（pCALN-CN2 プラスミドＤＮＡ）からのＰＣＲ産物、ＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。BALB/cCrSlc から得られたマウス28匹のうち７匹が陽性であり、C57Bl/10SnSlc から得られたマウス３匹のうち１匹が陽性であった。それぞれの陽性マウスを繁殖し、以後の検討に用いた。
【００１８】
Ｎ24遺伝子のスクリーニングにはセンスプライマーとして 6-4269-S20 (5'-TATGACATCATAATATGTGA-3')、アンチセンスプライマーとして6-4599-R20 (5'-CCCGATAATATGCTACAGCA-3') を使用してＣＮ２と同様の方法でＰＣＲを行った。この結果、BALB/cCrSlc から得られたマウス55匹のうち８匹が陽性であり、C57Bl/10SnSlc から得られたマウス16匹のうち４匹が陽性だった。
ＣＲ遺伝子のスクリーニングはＣＮ２と同じプライマーを使用した。BALB/cCrSlc から得られたマウス16匹のうち１匹が陽性だった。
【００１９】
〔実施例４〕培養細胞によるトランスジェニックマウスの発現スクリーニング
本発明のトランスジェニックマウスはスイッチング発現システムを用いているので通常の状態ではＨＣＶ遺伝子は発現しない。発現を開始させるためにCre を作用させる必要がある。このため本発明者は、Cre を発現する組み換えアデノウイルスAxNCreを作成した。アデノウイルスAxNCreの作成は、Yumi Kanegaeらの方法に従った（ Nucl.Acids Res.23,19,38 16-21.1995 ）。
【００２０】
トランスジェニックマウス（ＣＮ２導入、BALB/cCrSlc 由来）より脾臓を外科的に摘出し、脾細胞と線維芽細胞を分離培養した。培養した脾細胞および線維芽細胞にAxNCreを moi＝0,10,100で感染させ、48時間、５％ＣＯ2 、37℃で培養した後細胞を回収した。得られた脾細胞を遠心し、酸性フェノール・グアニジン法にてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型として6-604-R20 をプライマーとしてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成終了後6-294Sプライマーを追加し、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりＨＣＶ由来のＲＮＡ産生の有無を調べた。この方法で２マウス中２マウスに（line8 とline13) ＨＣＶ由来のＲＮＡの産生を確認した（図４）。
【００２１】
さらに、ＨＣＶ蛋白質の発現を確認するためにウェスタンブロット法と蛍光抗体染色法を行った。AxNCreを感染させた３×107 細胞の脾細胞を１×Sample buffer (50mM Tris-HCl pH6.8, ２％ＳＤＳ，10％グリセロール、５％２ＭＥ）60μｌで溶解し 100℃５分間加熱した。得られたサンプルを10−20％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動した。泳動終了後セミドライブロット装置（ミリポア) にてＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。転写した膜を抗コアモノクローナル抗体および抗Ｅ２モノクローナル抗体と反応させた。８マウス中２マウス（line8 とline29) に陽性反応を得た（図５）。なお、本実施例で用いたモノクローナル抗体は、ＨＣＶの遺伝子からコア、Ｅ１、Ｅ２の蛋白質を遺伝子組み換えにより作製し、BALB/cマウスに免疫して、作製した（Masahiko Kaitoら J.General Virology 75 p1775-1760 1994、Tomiko Kashiwakuraら J.Immunological Methods 190 p78-89 1996）。
【００２２】
またスライドグラス上で培養した線維芽細胞にもAxNCreを moi＝100 で感染させ、48時間培養後、アセトン：メタノール＝１：１溶液中で20℃、10分間、固定した。固定した細胞を抗コアモノクローナル抗体、抗Ｅ１モノクローナル抗体および抗Ｅ２モノクローナル抗体と反応させ、間接蛍光法にて検出した。ウェスタンブロット法と同様に８マウス中２マウス（line8 とline29) に陽性所見が得られ（図６〔line8 〕）、陽性マウス（line8 とline29) はウェスタンブロット法と蛍光抗体法で同じだった。
【００２３】
〔実施例５〕in vivo でのＨＣＶ蛋白質発現
細胞培養実験でＨＣＶ蛋白質発現陽性だったマウス（line8 とline29) を用いてin vivo での発現実験を行った。AxNCreは、マウスの尾静脈から静注により投与、または脾臓に直接注入した。３日後にマウスの肝臓を摘出し、ＨＣＶ蛋白質の発現を解析した。マウス肝切片に１mlのＲＩＰＡバッファー（10mM Tris-HCl pH7.4/１% SDS/0.5% NP40/0.15M NaCl/1mM PMSF)を加えダウンスホモゲナイザー中で20ストロークホモゲナイズした。溶液を 100℃、５分間加熱後、４℃、15分間超音波処理をした。１万４千回転で10分間遠心し、上清を分離した。得られた上清の蛋白濃度を測定し、また、コア蛋白質のＥＩＡ（Takeshi Tanakaら J.Hepatology23:742-745.1995）及びウェスタンブロッティングを行った。
【００２４】
上清５μl に、コア蛋白質ＥＩＡ用の分散液（20mMクエン酸Na、O.5%NaCl、10N Urea）50μl 、さらにコア蛋白質に対する変性液（O.5%NaOH）50μl を加え室温で10分間反応させた。中和液（0.5M NaH2PO4、5% Triton X-100 ）を50μl 加えた後、ＥＩＡ反応を行った。AxNCreを投与したトランスジェニックマウス（line8 とline29) の肝サンプルではＥＩＡ陽性となったが、非トランスジェニックマウスでは陰性だった。ウェスタンブロット法でも同様にトランスジェニックマウスでは21kDa のコア蛋白質、37〜38kDa のＥ１蛋白質、67〜69kDa のＥ２蛋白質が検出されたが（line8 とline29) 、非トランスジェニックマウスでは検出されなかった。
【００２５】
〔実施例６〕トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶ蛋白質発現による肝障害
トランスジェニックマウス（line8 とline29) にＨＣＶ構造蛋白質（コア、Ｅ１、Ｅ２）を発現させて、肝臓におけるＨＣＶ蛋白質の発現と肝臓組織像および血清ＧＰＴ値の変化を経時的に観察した。 AxNCre 109 pfu をマウスの尾静脈より投与した。AxNCre投与後３、５、７、10日目にマウスをと殺した。トランスジェニックマウス肝臓におけるＨＣＶコア蛋白質の発現を定量的にＥＩＡ法で測定すると、７日目まで増加し、10日目には減少した（図７）。血清ＧＰＴ値は５日目まで低値だが、７日目に急激に上昇し、10日目まで上昇した（図７）。肝組織では好酸体の出現と肝細胞の脱落、クッパー細胞の肥大と増加、リンパ球の集族像が３日目から観察でき、その所見は７日目および10日目に急激に増強した。７日目、10日目にはこれらの所見に加え、肝細胞の再生像が強く見られた（図８、図９、図１０）。これらの所見はヒトの急性肝炎とよく似ており、ＨＣＶ構造蛋白質の発現により急性肝障害が誘導されたと考えられた。また好酸体がアポトーシスをおこした肝細胞であることを確認するためにTunnel法（R.Gold Lab.Invest 71 p219-225 1994）により断裂化したＤＮＡを染色、陽性所見を得た。
【００２６】
【発明の効果】
本発明は、新規なヒト疾患モデル動物を提供する。このモデル動物は、ヒトのＣ型肝炎に酷似した病態を示すので、Ｃ型肝炎の発症機構の解明、治療手段の確立に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  pCALN/pBR ベクターの構造を示す図である。
【図２】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡのpCALN/pBR への挿入部位を示す図である。
【図３】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】マウス脾細胞由来のタンパク質のウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図６】マウス繊維芽細胞由来のタンパク質の蛍光抗体染色の結果を示す写真である。
【図７】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入したマウス中の血清ＧＰＴ値及びＨＣＶコアタンパク質の経時的な変化を示す図である。
【図８】  AxNCre投与前のＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入したマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。
【図９】  AxNCre投与後５日目のＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入したマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。
【図１０】  AxNCre投与後７日目のＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入したマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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