(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のゲノムにおいて、下記の変異：
（１）位置921の塩基がシトシン（C）からチミン（T）への置換
（２）位置1755の塩基がアデニン（A）からグアニン（G）への置換
（３）位置2443〜2456の塩基の欠損
（４）位置2531の塩基がシトシン（C）からチミン（T）への置換
（５）位置2678の塩基がアデニン（A）からチミン（T）への置換
（６）位置2826の塩基がアデニン（A）からグアニン（G）への置換
の１以上を有することを特徴とする慢性関節リウマチに関与するゲノム。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質において、位置159のアスパラギン酸からグリシンへの変異を有するタンパク質。
【請求項３】
生体から分離した試料を用いて行う方法であって、請求の範囲第１項記載のゲノムを検出することを特徴とする慢性関節リウマチの発症可能性の検出方法。
【請求項４】
生体から分離した試料を用いて行う方法であって、請求の範囲第１項記載のゲノムの転写産物を検出することを特徴とする慢性関節リウマチの発症可能性の検出方法。
【請求項５】
ゲノムの転写産物がタンパク質である請求の範囲第４項記載の慢性関節リウマチの発症可能性の検出方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載のゲノム、それらの転写産物またはそれらの変異を検出する方法を利用した慢性関節リウマチの発症またはその発症可能性の判定キット。
【請求項７】
請求の範囲第１項記載のゲノムの転写産物である変異型タンパク質を持つ慢性関節リウマチ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡを主成分とする慢性関節リウマチの治療薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、変異を有するゲノム、それらの転写産物およびそれらの変異を利用したヒト慢性関節リウマチの診断方法、その発症可能性の判定方法およびそれらの検出用の診断キットに関し、さらに、当該リウマチの治療方法およびその治療薬剤に関するものである。
背景技術
慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ。以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く利用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子の存在は、その陽性率が３ヶ月以内で３３％、１２ヶ月以上においても８８％程度（治療、第７３巻、第３号、第２３〜２７頁、１９９１年）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体ＩｇＭ抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（特開平  １０−５１３２５７号参照）。
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・憎悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な治療とを行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。ＲＡは、世界的には罹患率１％以下の疾患であるが（ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第３２２巻、第１２７７〜１２８９頁、１９９０年）、患者の同胞では約８％以上が発症する（セル（Ｃｅｌｌ）、第８５巻、第３１１〜３１８頁、１９９６年）ことから、その原因因子として何らかの遺伝的要因が想定されている。また、環境が原因因子の１つと考えられていることから、あらかじめ発症可能性を知ることにより、日常生活において、例えば、食餌、ウイルス感染およびストレス等に注意することにより発症を遅らせたり防ぐことが可能である。さらに、診断を早め、早期に適切な治療を行うことによってＲＡの進行を遅らせることが可能であり、予後の改善が期待される。
ＲＡは、その直接の原因の一つとして、アポトーシスの過剰の抑制がある。これに関して、以下のような報告がある。ＲＡ患者の滑膜細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗Ｆａｓ抗体によりアポトーシスが誘導される（アースリティス・アンド・リウマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｈｅｕｍ．）、３８巻、第４８５〜４９１頁、１９９５年）。また、ＲＡのモデル動物であるヒトＩ型Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）ｔａｘトランスジェニックマウスに抗Ｆａｓ抗体を投与すると、関節の浮腫および関節炎が抑制され（ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、９８巻、第２７１〜２７８頁、１９９６年）、さらにＳＣＩＤマウスの背部に移植されたＲＡの滑膜組織は抗Ｆａｓ抗体の投与により消失するとの報告がある（アースリティス・アンド・リウマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｈｅｕｍ．）、４１巻、第１２５１〜１２５７頁、１９９８年）。
国際公開ＷＯ９８／５１７９１号には、本願発明者らが、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、慢性関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤ１Ｓ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳ１００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
また、リウマチ、第３９号、第２号、第４４４頁および第４４５頁には、本願発明者らが、前記先願発明の各疾患遺伝子について、前記（１）の疾患遺伝子に関係するマーカーＤ１Ｓ２１４およびＤ１Ｓ２５３の疾患遺伝子として、デスレセプター３（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３：以下「ＤＲ３」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患感受性遺伝子である可能性を示唆している。
本発明は、ヒトＤＲ３におけるゲノムの変異とＲＡの発症またはその発症可能性との関係を解明し、その変異を利用してＲＡの発症またはその発症可能性を高精度に診断することのできる方法を提供することを課題としている。また、本発明は、ＲＡに関するＤＲ３の変異したゲノムまたはそれらの変異した転写産物を検出するための有用な診断キットを提供するものであり、さらには、ＤＲ３に変異を持つＲＡ患者に対する有効な治療方法および治療薬剤を提供するものである。
発明の開示
このような状況下において、本願発明者らは鋭意研究を行った結果、被験者から得られた細胞において、ＤＲ３の配列番号１のゲノムに下記の変異を有するゲノムを見出した。
（１）位置９２１の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換
（２）位置１７５５の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換
（３）位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損
（４）位置２５３１の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換
（５）位置２６７８の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換
（６）位置２８２６の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換
また、位置１７５５の塩基は、ＤＲ３ゲノムのエクソン領域内にあり、配列番号３にアミノ酸配列が示されるＤＲ３タンパク質においては、位置１５９のアミノ酸のアスパラギン酸からグリシンへの変異を意味する。一方、上記（１）および（３）〜（６）の変異は、ＤＲ３ゲノムのイントロン領域にある。
ＲＡの発症に関与するゲノムは従来から複数存在することが知られているが、本発明の変異したゲノムは、これらのＲＡ発症原因の一部を構成するものである。
これらの知見より、被験者から得られた細胞におけるＤＲ３の変異したゲノムおよびその転写産物を指標としたＲＡの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＲＡの診断方法）、およびこれらの変異を検出する診断キットが有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな予防法、治療法および治療薬剤としても有用である。以下、本発明について詳述する。
本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。また、転写産物とは、ゲノムが転写および翻訳される結果生じる産物であり、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびタンパク質などが挙げられる。
また、位置１７５５の塩基は、ｃＤＮＡとしてジーンバンクに登録されている配列（アクセッション番号ＮＭ＿００３７９０）の５６４番目の塩基に相当する。このゲノムＤＮＡのエクソン５の３’末端の塩基を基準とし、一塩基後のイントロンの塩基を１番目とすると位置２４４３〜２４５６の欠損は、エクソン５の３’末端から６２２〜６３５番目の塩基の欠損に相当する。また、エクソン６の５’末端の塩基を基準とし、一塩基前のイントロンの塩基番号を−１番目とすると、位置２５３１の変異は、−５３８番目、位置２６７８の変異は−３９１番目、位置２８２６の変異は−２４３番目の塩基に相当する（図１参照）。なお、Ｔが２８塩基連続する領域（位置２４４３〜２４７０）においては、その数が３塩基分増減する可能性があり、変異型ゲノムのＴが１４塩基連続する領域も同様にしてその数が３塩基分増減する可能性がある。
本発明に係るＲＡの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＲＡの診断方法）および判定キット（換言すれば、ＲＡの診断キット）において、ゲノムおよびその転写産物、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが利用でき、たとえば、ｍＲＮＡは、必要に応じてｃＤＮＡに変換して利用することもできる。これらのゲノムは、たとえば、ＲＡの発症またはその発症可能性の判定用のプローブとしても有用である。さらに、たとえば、これらの変異を１つ以上含むゲノム断片も同様にプローブとして有用である。
また、ゲノムから発現されるタンパク質などの転写産物についても変異を検出することができる。これらのゲノムの転写産物についてもＲＡの発症またはその発症可能性の判定用の試薬またはそれらの原料として有用である。
（ａ）ゲノムの利用
本発明において、ゲノムを利用する場合、変異ゲノムの同定、およびＲＡの診断（即ち、ＲＡの発症またはその発症可能性の判定）は、たとえば、以下のようにして実施できる。
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、たとえば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して使用することができる。
ゲノムの変異の検出方法としては、たとえば、特に限定されないが、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法などが挙げられる。
配列番号１の位置２１〜４８２５の塩基配列は、たとえば、以下のプライマーの組み合わせ（１〜３）によりゲノムから増幅されるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスにより決定できる。尚、配列番号１の位置１〜２０の塩基配列は、ｃＤＮＡとしてジーンバンクに登録されている配列（アクセッション番号ＮＭ＿００３７９０）である。
１：配列番号１の位置２１〜３８のセンスプライマーと配列番号１の位置１５１７〜１５３５のアンチセンスプライマー。
２：配列番号１の位置１０５１〜１０７８のセンスプライマーと配列番号１の位置４０５８〜４０８５のアンチセンスプライマー。
３：配列番号１の位置４０２３〜４０４３のセンスプライマーと配列番号１の位置４８０９〜４８２５のアンチセンスプライマー。
本発明で利用される変異は、配列番号１の位置１７５５の塩基のＡからＧへの置換、配列番号１の位置２５３１の塩基のＣからＴへの置換、配列番号１の位置２６７８の塩基配列のＡからＴへの置換、配列番号１の位置２８２６の塩基のＡからＧへの置換は、配列番号１の位置１０５１〜１０７８のセンスプライマーと配列番号１の位置４０５８〜４０８５のアンチセンスプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスにより検出でき、さらに配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損が検出できる。言い換えれば、上記した５つの塩基の変異が同時に生じている場合、上記ＰＣＲ産物により同時に検出できる。
また、配列番号１の位置９２１の塩基ＣからＴへの置換は、配列番号１の位置２１〜３８のセンスプライマーと配列番号１の位置１５１７〜１５３５のアンチセンスプライマーとにより増幅されるＰＣＲ産物のシークエンスにより検出することができる。
つまり、上記変異の検出は、変異を含んだ領域に対するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを作製し、ゲノムから増幅されるＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることにより検出できる。配列番号１のゲノムの１つ以上の上記変異を検出することにより、被験者のＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
本発明で使用されるプライマーは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
また、これらの変異は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
上記の変異のうち、配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損は、ＰＣＲ産物をプラスミドにサブクローニングし、これをシークエンスすることによっても検出できるし、配列番号１の位置２３６９〜２３８９のセンスプライマーと配列番号１の位置２５１４〜２５３５のアンチセンスプライマーとにより増幅されるＰＣＲ産物のサイズの相違によっても検出できる。
（ｂ）転写産物の利用
本発明において、ゲノムの変異により、変化を生じるｍＲＮＡ、タンパク質などの転写産物を検出することによっても被験者のＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
たとえば、転写産物としてｍＲＮＡを利用する場合、変異の部分を含む配列、たとえば、配列番号１の位置１５３４〜３３０６を発現ベクターに組み換え、細胞にトランスフェクションし、ベクター由来のｍＲＮＡを比較する方法及びｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡをシークエンスする方法などによって変異を検出できる。
具体的には、配列番号１の位置１７５５の塩基のＡからＧへの置換、配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損、配列番号１の位置２５３１の塩基のＣからＴへの置換、配列番号１の位置２６７８の塩基のＡからＴへの置換、配列番号１の位置２８２６の塩基のＡからＧへの変異を有するベクターにおいて、配列番号１の位置２６３６〜２７９２が保持されたｍＲＮＡが検出される。このｍＲＮＡの塩基配列の一部は、配列番号４であり、イントロンの挿入によりフレームシフトが生じ、これが原因でアミノ酸残基の変異および終止コドンが出現する。また、このｍＲＮＡから発現されるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。
また、たとえば、配列番号１の位置１５３４〜３３０６を発現ベクターに組み換えたベクター、組み換えたベクターで配列番号１の位置１７５５に相当する部分にＡからＧの変異を導入したもの、配列番号１の位置２５３１にＣからＴの変異を導入したもの、配列番号１の位置２６７８にＡからＴの変異を導入したもの、配列番号１の位置２８２６にＡからＧの変異を導入したベクターをそれぞれ細胞にトランスフェクションし、ベクター由来のｍＲＮＡを比較する。
その結果、配列番号１の位置２６７８にＡからＴの変異を導入したベクターのみで配列番号１の位置２６３６〜２７９２が保持されたｍＲＮＡが増幅され、この変異がスプライス異常を引き起こすことが確認でき、これを検出することもできる。
たとえば、転写産物としてタンパク質を利用する場合、配列番号２のアミノ酸配列において位置１５９のアミノ酸残基がＡｓｐからＧｌｙへ変異したタンパク質を検出する方法、上記のｍＲＮＡのスプライシング異常が原因で生じる配列番号５に示すタンパク質を検出する方法、配列番号５のアミノ酸配列において位置１５９のアミノ酸残基がＡｓｐからＧｌｙへ変異したタンパク質を検出する方法などが挙げられ、好ましくは、配列番号２において位置１５９のアミノ酸残基がＡｓｐからＧｌｙへ変異したタンパク質を検出する方法が挙げられる。この変異型タンパク質の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、たとえば、変異型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、変異型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
一方、ＲＡの直接原因の一つに、アポトーシスの過剰の抑制があるが、アポトーシスは、たとえば、以下の順で引き起こされる。
デス因子（たとえば、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ、Ａｐｏ３Ｌ（ＤＲ３リガンド）およびＴＲＩＡＬなどが挙げられる）がデスレセプター（Ｆａｓ、ＴＮＦレセプターおよびＤＲ３などが挙げられる）に結合し、さらに、アダプタータンパク質（たとえば、ＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤなど）が結合し、さらにカスパーゼ分子群が関与し、最終的にアポトーシスを引き起こす。
たとえば、カスパーゼ８は、刺激により、デスレセプターにアダプタータンパク質を介して結合し、活性化カスパーゼ８となり、さらに下流のカスパーゼ３などを活性化させ、最終的にアポトーシスを引き起こす。また、カスパーゼ８には、カスパーゼ８／ａおよびカスパーゼ８／ｂといったバリアントが知られている。
本発明で検出されるゲノムから発現するタンパク質は、スプライシング異常により変異を有しており、この変異により、デスドメイン領域を欠損したＤＲ３の変異型が発現する。ＤＲ３は、３量体を形成しており、この３量体のデスドメイン領域にアダプタータンパク質が結合することが知られている。この変異型レセプターも同様に正常型レセプターと複合体を形成するが、この複合体には、アダプタータンパク質であるＴＲＡＤＤが結合できず、結果としてカスパーゼ８が活性化されず、アポトーシスが誘導されない。
よって、本発明で検出される変異を有するゲノムから誘導される変異型ＤＲ３は、機能的な働きはなく、ドミナントネガティブに作用すると考えられる。
これらは、たとえば、以下のような手順（１）〜（４）で確認することができる。
（１）被験者からの細胞の取得
診断に使用する細胞は、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、たとえば、末梢リンパ球、滑膜細胞、各臓器などから得ることができる。これらの得られた細胞は、適宜、培養し、増殖して利用することもできる。
使用する細胞は、好ましくは、末梢血単核球が挙げられる。
（２）細胞の刺激
得られた細胞を試薬などで刺激する。刺激に利用する試薬は、通常の刺激に利用する試薬であれば特に限定されないが、たとえば、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ、ＤＲ３リガンドなどのデスレセプターのリガンド、抗Ｆａｓ抗体、アクチノマイシンＤ、放射線、グルココルチコイド、ホルボール  １２−ミリステート  １３−アセテート（ＰＭＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などが挙げられ、これらを１種以上合わせて利用してもよい。また、好ましくは、ＤＲ３リガンド、ＰＭＡ、ＰＨＡなどが挙げられ（ただし、ＰＭＡ、ＰＨＡによる刺激はＤＲ３を含めた様々なシグナル伝達系に関与する）、より好ましくは、ＤＲ３リガンドなどが挙げられる。
試薬を添加する時間は、特に限定されないが、例えば、１時間〜７２時間程度添加すればよく、好ましくは、１２〜４８時間であればよい。
また、別途、刺激を与えない対照となる細胞を用意する。
（３）刺激した細胞および対照の細胞は、たとえば、可溶化緩衝液等で溶解し、カスパーゼ８を検出する。
カスパーゼ８の検出は、通常行われるタンパク質の検出方法であれば、特に限定されないが、たとえば、ウエスタンブロッティングなどにより実施することができる。
ウエスタンブロッティングは、たとえば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、カスパーゼ８に結合する標識された抗カスパーゼ８抗体で検出する方法が挙げられる。
（４）結果
健常者においては、刺激した細胞でのカスパーゼ８の発現量は、刺激をしない細胞でのカスパーゼ８の発現量に対し、低下するのに対し、ＲＡ患者においては、低下しない。
以上より、ＲＡ患者においてＤＲ３の異常によるアポトーシスの誘導の阻害が示された。これは、ＲＡの発症要因であり、すなわち、ゲノムおよびその転写産物の変異がＲＡの診断（発症または発症可能性の判定）に利用できることが裏付けられた。
また、上記の結果より、測定されたカスパーゼ８の濃度を刺激前後で比較し、その濃度が低下しない場合に被験者は、ＲＡ患者であるとの診断またはＲＡの発症可能性が高いと判断することもできる。すなわち、ゲノムの転写産物が影響する他の変異を検出することでもＲＡ患者であるとの診断またはＲＡの発症可能性が高いと判断することができる。
（ｃ）ＲＡの治療方法および治療薬剤としての正常型ＤＲ３の利用
ＲＡの関節では、滑膜細胞が増殖の一因となって関節破壊が引き起こされる。したがって、滑膜細胞にアポトーシスを誘導することのできる抗Ｆａｓ抗体は、ＲＡの治療薬として有効であると考えられる。実際、現在ＲＡの治療薬として抗Ｆａｓ抗体の臨床試験が進められている。一方、ＤＲ３ゲノムの変異に起因した上記の変異型ＤＲ３は、細胞にアポトーシスを誘導することができないため、これがＤＲ３に変異を持つＲＡ患者の病因であると考えられる。ＤＲ３はＦａｓと同様、デスレセプターファミリーに属し、細胞にアポトーシスを誘導することができる。したがって、ＤＲ３に上記の変異を持つＲＡ患者に正常型ＤＲ３を補完すると、細胞にアポトーシスが誘導されると考えられ、抗Ｆａｓ抗体と同様、ＲＡの治療法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、以下のＲＡの治療方法および治療薬剤を提供するものである。
・本発明に係るゲノムの転写産物である変異型ＤＲ３を持つ慢性関節リウマチ患者に、その変異を持たない正常型ＤＲ３または当該正常型ＤＲ３をコードするＤＮＡ、あるいは、このＤＲ３のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする慢性関節リウマチの治療方法。
・本発明に係るゲノムの転写産物である変異型ＤＲ３を持つ慢性関節リウマチ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型ＤＲ３または当該正常型ＤＲ３をコードするＤＮＡ、あるいは、このＤＲ３のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とする慢性関節リウマチの治療薬剤。
実際、後の実施例１０にて詳述するとおり、正常型ＤＲ３の補完はＲＡの治療法として有用であることが実験により認められた。
正常型ＤＲ３の補完方法は特に限定されるものではなく、たとえば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができ、具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法があげられる。また、ＤＲ３のアゴニストとして作用する低分子化合物を補完する場合、当該低分子化合物として具体的には、ＤＲ３リガンドとして公知であるＡｐｏ３Ｌ（カレントバイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．）、第８巻、第５２５〜５２８頁、１９９８年）や、アゴニストとして作用する可能性のある抗ＤＲ３抗体などが挙げられる。抗ＤＲ３抗体として具体的には、イミュニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）（第６巻、第７９〜８８頁、１９９７年）に記載のポリクローナル抗体などが挙げられ、これらは経口または静注などによって体内に投与する方法が考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質を含めた化合物を示す。
また、上記正常型ＤＲ３または当該正常型ＤＲ３をコードするＤＮＡと、上記ＤＲ３のアゴニストとしての低分子化合物は、治療薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することもできる。従って、上記正常型ＤＲ３または当該正常型ＤＲ３をコードするＤＮＡおよび、上記ＤＲ３のアゴニストとしての低分子化合物の少なくとも一方を用いた治療方法も有効である。
（ｄ）慢性関節リウマチの診断キット
本発明に係るＲＡの診断（発症または発症可能性の判定）キットは、上記のゲノムまたは転写産物の変異を検出できる試薬、たとえば、プライマー、プローブ、抗体などを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
たとえば、ゲノムを検出するキットとしては、上記の変異を１つ以上含むゲノム領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記の変異を１つ以上含むゲノム領域を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびチェーンターミネーター法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。また、好ましくは、蛍光標識されたダイデオキシヌクレオチドを含むキットが挙げられる。
たとえば、タンパク質を検出するキットとしては、変異型タンパク質を認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
たとえば、ｍＲＮＡを検出するキットとしては、変異を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、変異を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびチェーンターミネーター法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上、組み合わせたキットが挙げられる。また、好ましくは、蛍光標識されたダイデオキシヌクレオチドを含むキットが挙げられる。
これらの診断（判定）キットを使用することにより、ＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
本発明の診断（判定）キットは、たとえば、プライマーを含むキットの場合、プライマーは、本発明の変異の１つ以上を検出できるものであれば、検出方法に応じて適宜選択することができるが、好ましくは、配列番号１の位置２７１７〜２７３６のセンスプライマーと配列番号１の位置３２８４〜３３０６のアンチセンスプライマーとのセットおよび配列番号１の位置１０５１〜１０７８のセンスプライマーと配列番号１の位置４０５８〜４０８５のアンチセンスプライマーとのセット、配列番号１の位置２１〜３８のセンスプライマーと配列番号１の位置１５１７〜１５３５のアンチセンスプライマーとのセット、さらに好ましくは、配列番号１の位置１５３４−１５５６のセンスプライマーと配列番号１の位置３２８４〜３３０６のアンチセンスプライマーとのセット、配列番号１の位置６６７〜６８７のセンスプライマーと配列番号１の位置１５１７〜１５３５のアンチセンスプライマーとのセットが挙げられる。さらに、プライマー成分に加えて、本発明にかかる変異の存在の検出に応じた一乃至数個の試薬を組み合わせたものであってもよい。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば制限酵素ＡｐａＩ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
発明を実施するための最良の形態
つぎに、本発明を実施例および参考例により説明する。尚、実施例および参考例で使用される略号は、以下の意味を有する。
１０ｘＰｆｕ緩衝液：２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化カリウム、１００ｍＭ  硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  硫酸マグネシウム、１％トライトン  Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン
ＴＡＥ緩衝液：０．０４Ｍ  トリス酢酸、０．００２Ｍ  エチレンジアミン四酢酸
１０ｘＬ緩衝液：１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール
１０ｘＨ緩衝液：５００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１０００ｍＭ  塩化ナトリウム
１０ｘＫ緩衝液：２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１０００ｍＭ  塩化カリウム
１０ｘＰＣＲ  ＩＩ緩衝液：５００ｍＭ  塩化カリウム、１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．３）
１０ｘＳＳＣ：１．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
緩衝液Ａ：１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ９．５）、３００ｍＭ  塩化ナトリウム
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＩＰＴＧ：イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
ＰＭＡ：ホルボール  １２−ミリステート  １３−アセテート
ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン
可溶化緩衝液：５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル
２ｘサンプル緩衝液：５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー
ＴＢＳ溶液：２０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
ＴＢＳ−Ｔ溶液：２０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
洗浄緩衝液：５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％ＮＰ４０、０．０５％デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル
また、Ｍはｍｏｌ／Ｌを、ｍＭは、ｍｍｏｌ／Ｌを；各溶液は特に記載がない限り、水溶液を意味する。
実施例１  ＤＲ３ゲノムの変異した塩基配列の検出
（１）ゲノムＤＮＡは、グアニジンチオシアネート法（日本輸血学会雑誌、第４０巻、第２号、第４１３頁、１９９４年）により健常者およびＲＡ患者の末梢血から調製した。すなわち、ＥＤＴＡ採血した末梢血１０ｍｌに細胞膜溶解液（Ｉ液：０．３２Ｍ  ショ糖、１％（ｖ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５ｍＭ  塩化マグネシウム、１２ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６））２０ｍｌを加え、転倒混和後３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、核を回収した。回収した核に核膜溶解液（ＩＩ液：４Ｍ  グアニジンチオシアネート、１２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３７５ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール、１２ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．６））５ｍｌを加え、５５℃で１０分間保温し、エタノール沈殿によりゲノムＤＮＡを調製した。
（２）得られたゲノムＤＮＡ５０ｎｇに１０ｘＬＡ緩衝液（商品名：宝酒造社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム２．５μｌ、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液４μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：宝酒造社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応は、熱変性９８℃で２０秒間、アニーリング・伸長反応６８℃で５分間、３５サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、市販のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。センス、アンチセンスプライマーは、それぞれ配列番号１の位置１０５１〜１０７８および４０５８〜４０８５の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
（３）精製したＰＣＲ産物のシークエンス反応は、市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：パーキンエルマー社製）を用いてダイターミネーター法で実施した。
ＰＣＲ産物５０ｎｇに混合試薬（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：パーキンエルマー社製）４μｌ、プライマー１．６ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で全量を１０μｌにした。シークエンス反応は、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間、２５サイクルでおこなった。反応液に３Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸でｐＨ５．２に調整）１μｌおよび９５％エタノール２５μｌを加え、氷冷下に１５分間冷却した。反応液を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、沈殿を７０％エタノール１２５μｌで洗浄し、乾燥した。得られた沈殿をホルムアルデヒド／ブルーデキストラン（５：１）溶液３μｌに溶解し、９５℃で２分間加熱処理し、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定した。
プライマーには、配列番号１の位置１５３５〜１５５２の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド、および配列番号１の位置２８９２〜２９１２の相補鎖に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
その結果、ＲＡ患者のＤＲ３ゲノムには、配列番号１に示した健常者ゲノムにおける以下の（１）〜（５）に示す一塩基多型および塩基の欠損が見出された。
（１）位置１７５５の塩基のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換
（２）位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損
（３）位置２５３１の塩基のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換
（４）位置２６７８の塩基のアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換
（５）位置２８２６の塩基のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換
実施例２  配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基配列の欠損の検出
（１）ゲノムＤＮＡ５０ｎｇに１０ｘＬＡ緩衝液（商品名：宝酒造社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム２．５μｌ、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液４μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：宝酒造社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応は、熱変性９５℃で１分間、アニーリング６３℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間、３５サイクルの条件で行った。用いたセンス、アンチセンスプライマーには、それぞれ配列番号１の位置１５３４〜１５５６の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド、配列番号１の位置３２８４〜３３０６の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物をゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。得られたＰＣＲ産物５０ｎｇ、ＴＡクローニングベクター（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ベクター：ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）２５ｎｇ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）３μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションをおこなった。
（２）得られたライゲーション液全量にコンピテント細胞ＤＨ５αを混合し、氷冷下に３０分間インキュベートした。次いで、４２℃のウォーターバスに２０秒間浸けてヒートショックを加えた後、氷冷下に２分間冷却した。これにＳＯＣ培地９００μｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。この培養液をＸ−ｇａｌ  ０．１ｍＭ、ＩＰＴＧ０．１ｍＭおよびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに接種し、３７℃、終夜培養してコロニーを形成させた。
（３）形成したシングルコロニーをピックアップし、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植え継ぎ、３７℃で終夜培養した。培養液を遠心し、上清を除去した菌体を溶液１（５０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０））１００μｌに懸濁した。アルカリ溶液（０．２Ｍ  水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ）２００μｌを加え、穏やかに混和後、氷冷下に５分間インキュベートし、さらに３Ｍ  酢酸カリウム溶液（酢酸でｐＨ５．５に調整）１５０μｌを加え、氷冷下に５分間インキュベートした。得られた溶液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清にフェノール／クロロホルム（１：１）溶液４００μｌを加え、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。水層にエタノール８００μｌを加え、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、滅菌蒸留水５０μｌに溶解させた。得られた溶液に１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした後、２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ  塩化ナトリウム溶液３０μｌを加え、氷冷下に１時間放置した。得られた溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、滅菌蒸留水３０μｌに溶解させた。
（４）プラスミドＤＮＡのシークエンス反応は、市販キット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：パーキンエルマー社製）を用いたダイターミネーター法で実施した。
プラスミドＤＮＡ３００ｎｇに混合試薬（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：パーキンエルマー社製）４μｌ、プライマー１．６ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で全量を１０μｌにした。シークエンス反応は、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間、２５サイクルでおこなった。反応液に３Ｍ  酢酸ナトリウム（酢酸でｐＨ５．２に調整）１μｌおよび９５％エタノール２５μｌを加え、氷冷下に１５分間冷却した。得られた溶液を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、沈殿を７０％エタノール１２５μｌで洗浄し、乾燥した。得られた沈殿をホルムアルデヒド／ブルーデキストラン（５：１）溶液３μｌに溶解し、９５℃で２分間加熱処理し、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定した。プライマーは、配列番号１の位置２８９２〜２９１２の相補鎖の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
その結果、変異を有するゲノムを増幅したＰＣＲ産物をサブクローニングしたクローンは、配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基配列を欠損していた。
実施例３  電気泳動による配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基配列の欠損の検出
ゲノムＤＮＡ５０ｎｇに１０ｘＰｆｕ緩衝液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）２．５μｌ、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合物２μｌ、２０μＭのセンス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間の後、熱変性９５℃で１分間、アニーリング５５℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間、４０サイクルの条件で行った。プライマーは、センス、アンチセンスプライマーとして、それぞれ配列番号１の位置２３６９〜２３８９の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド、配列番号１の位置２５１４〜２５３５の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。増幅したＰＣＲ産物は、分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）社製）と共にアガロースゲル（３％ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ：宝酒造社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液にて可視化した。結果を図２に示す。
正常型と欠損型の対立遺伝子を保有する検体では、分子量の異なる２つの増幅産物が検出されるが、正常型の対立遺伝子のみ保有する検体では分子量の大きい産物のみが検出された。
実施例４  配列番号１の５つの変異によるスプライシング異常の検出
（１）ＲＡまたは健常者のゲノムＤＮＡ５０ｎｇに１０ｘＬＡ緩衝液（商品名：宝酒造社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム２．５μｌ、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液４μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：宝酒造社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間の後、熱変性９５℃で１分間、アニーリング６３℃で１分間、伸長反応７２℃で２分間、３５サイクルの条件で行った。この反応に使用したプライマーを以下に示す。
0003898126.tif 000002
0003898126.tif 000003
増幅したＰＣＲ産物は、エタノール沈殿により精製した。得られたＰＣＲ産物にＫｐｎ  Ｉ（宝酒造社製）１０ｕｎｉｔ、１０ｘＬ緩衝液（宝酒造社製）３μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を３０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、Ｘｈｏ  Ｉ（宝酒造社製）１０ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）４μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を４０μｌにし、さらに３７℃で４時間保温した。この反応液を分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。得られた約１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物をゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（２）ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（商品名：インビトロジェン社製）３μｇにＫｐｎ  Ｉ（宝酒造社製）１０ｕｎｉｔ、１０ｘＬ緩衝液（宝酒造社製）３μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を３０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、Ｘｈｏ  Ｉ（宝酒造社製）１０ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）４μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を４０μｌにし、さらに３７℃で４時間保温した。この反応液を分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。５．６ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（３）実施例４（１）で精製したＰＣＲ産物５０ｎｇと実施例４（２）で精製したｐｃＤＮＡ３．１ベクター３５ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）４μｌと混合し、１６℃で４時間ライゲーションをおこなった。
（４）実施例２（２）および（３）の方法と同様にしてトランスフォーメーションをおこない、プラスミドＤＮＡを調製した。
（５）プラスミドＤＮＡのシークエンス反応は、市販キット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：パーキンエルマー社製）を用い、ダイターミネーター法で実施した。
プラスミドＤＮＡ３００ｎｇに混合試薬（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：パーキンエルマー社製）４μｌ、プライマー１．６ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で全量を１０μｌにした。シークエンス反応は、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間、２５サイクルで実施した。反応液に３Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸でｐＨ５．２に調整）１μｌおよび９５％エタノール２５μｌを加え、氷冷下に１５分間冷却した。得られた溶液を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、沈殿を７０％エタノール１２５μｌにより洗浄し、乾燥した。得られた沈殿をホルムアルデヒド／ブルーデキストラン（５：１）３μｌに溶解させ、９５℃で２分間加熱処理した。ついで、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定し、配列番号１の位置１７５５の塩基のＡからＧへの置換、配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基の欠損、配列番号１の位置２５３１の塩基のＣからＴへの置換、配列番号１の位置２６７８の塩基のＡからＴへの置換、配列番号１の位置２８２６の塩基のＡからＧへの置換を有する変異型ベクターおよび変異を持たない正常型ベクターを構築した（図１参照）。
（６）構築した正常型または変異型ベクター１０μｇおよびＲＰＭＩ１６４０／２０％ＦＣＳ  ０．２５ｍｌに懸濁した１ｘ１０６個のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を０．４ｍｍギャップのキュベット（ビーエム機器社製）にいれ、室温で１０分間静置した。エレクトロポレーター（ジーンパルサーＩＩ：バイオラッド社製）を用い、２００Ｖ、９５０μＦの条件でトランスフェクションを実施した。電気ショック後、氷冷下に１０分間静置し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで全量を４ｍｌとし、６ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。この細胞にＰＭＡ（シグマ社製）２０ｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ（ディフコ社製）１μｇ／ｍｌを加え、さらに２４時間培養した。
得られた細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水で洗浄後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（商品名：ギブコ社製）を用いた、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法により、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、さらにＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）で処理した後、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１μｇを逆転写反応用キット（ＲＮＡ  ＰＣＲＫｉｔ：パーキンエルマー社製）を用い、通常の逆転写反応によりｃＤＮＡを調製した。
得られたｃＤＮＡ溶液５μｌに１０ｘＰＣＲ  ＩＩ緩衝液（パーキンエルマー社製）２μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム１μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｃｏｌｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：パーキンエルマー社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の後、熱変性９５℃で１分間、アニーリング５５℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間を４０サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応の条件で行った。この反応に使用したセンス、アンチセンスプライマーは、以下のとおりである。
0003898126.tif 000004
なお各々の塩基配列は、センスプライマーＡ、アンチセンスプライマーＡの一部の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドである。
（７）得られたＲＴ−ＰＣＲ溶液を分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（２％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液にて可視化した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。得られたＰＣＲ産物  ５０ｎｇ、ＴＡクローニングベクター（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ベクター：ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）２５ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）３μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションをおこなった。
（８）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定した。プライマーは、センスプライマーＢおよびアンチセンスプライマーＢで表わされるオリゴヌクレオチドを使用した。
その結果、配列番号１の位置１７５５の塩基配列がＡからＧへの変異、配列番号１の位置２４４３〜２４５６の塩基配列の欠損、配列番号１の位置２５３１の塩基配列がＣからＴへの変異、配列番号１の位置２６７８の塩基配列がＡからＴへの変異、配列番号１の位置２８２６の塩基配列がＡからＧへの変異を有する変異型ベクターのｍＲＮＡに配列番号１の位置２６３６〜２７９２が保持されたｍＲＮＡを検出した。
実施例５  サザンブロッティングによるスプライス異常の検出
（１）実施例４（６）で得たＲＴ−ＰＣＲ溶液を分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（２％Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った。ゲルを変性溶液（０．５Ｍ  水酸ナトリウム、１．５Ｍ  塩化ナトリウム）に２５分間浸し、さらに中和溶液（０．５Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  塩化ナトリウム）に３０分間浸した。キャピラリー法により、ゲル内のＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋：アマシャムファルマシア社製）に一晩トランスファーし、ＵＶクロスリンカー（日本ジェネティック社製）によりＤＮＡをメンブレンに固定した。キャピラリーの緩衝液は、１０ｘＳＳＣを用いた。ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ断片の検出は、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ３’−オリゴラベリング・ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出システム（アマシャムファルマシア社製）を用いて以下のとおりに行った。ＤＮＡを固定したメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸分子量５０万（シグマ社製）、キットに付属の５％（ｖ／ｖ）ブロッキング試薬）に浸し、５９℃で３０分間振とうさせながらプレハイブリダイゼーションを行った。
（２）市販キット（Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ３’−オリゴラベリングキット：アマシャムファルマシア社製）により、配列番号１の位置２７１５〜２７３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフルオレセイン標識してプローブとして使用した。このプローブを１０ｎｇ／ｍｌとなるようにプレハイブリダイゼーション溶液に加え、さらに振とうさせながら５９℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。緩衝液（５ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で５分間２回洗浄後、予め５０℃にした緩衝液（１ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で１５分間２回洗浄した。メンブレンを緩衝液Ａで軽くリンスし、緩衝液Ａで１０倍希釈したキットに付属のブロッキング試薬を用いて室温１時間ブロッキングした。メンブレンを緩衝液Ａで軽くリンスし、抗体希釈溶液（キットに付属のアルカリフォスファターゼ標識抗フルオレセイン抗体を０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む緩衝液Ａで５０００倍希釈した溶液）に浸し、室温で１時間インキュベートした。０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有緩衝液Ａで１０分間、３回の洗浄を室温で振とうさせながら行った。メンブレンを緩衝液Ａで軽くリンスし、キットに付属の検出試薬に浸した後、Ｘ線フィルム（フジフィルム社製）に露光させた。結果を図３に示す。
変異型ベクターのみでプローブと結合する転写産物が検出され、５つの変異によるスプライス異常が検出された。
実施例６  配列番号１の位置２６７８の変異が引き起こすスプライス異常の検出（１）実施例４（５）で調製した正常型ベクターに配列番号１の位置１７５５の塩基配列にＡからＧへの変異、配列番号１の位置２５３１の塩基配列にＣからＴへの変異、配列番号１の位置２６７８の塩基配列にＡからＴへの変異、配列番号１の位置２８２６の塩基配列にＡからＧへの変異を市販キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）を用いて以下の方法で作製した。（２）正常型ベクター５０ｎｇに、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液１μｌ、１０ｘＰｆｕ緩衝液２．５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）２．５Ｕ、センス、アンチセンスプライマーそれぞれ６２．５ｎｇを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の後、熱変性９５℃で３０秒間、アニーリング５５℃で１分間、伸長反応６８℃で１５分間を１２サイクルの条件で行った。増幅した産物をＤｐｎ  Ｉで消化し、この反応液１μｌとコンピテント細胞ＸＬ−１ブルーを混合し、氷冷下に３０分間インキュベートした。ついで、４２℃のウォーターバスに３０秒間浸け、ヒートショックを加えた後、氷冷下に２分間冷却した。これにＮＺＹ培地を加え、３７℃で１時間振とう培養した。この培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに接種し、３７℃、終夜培養してコロニーを形成させた。実施例２（３）〜（４）に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定し、それぞれの部位に変異を導入した変異型ベクターを作製した。この反応に用いたプライマーは、以下に示すとおりである。
・配列番号１の位置１７５５の塩基配列にＡからＧへの変異導入
0003898126.tif 000005
・配列番号１の位置２５３１の塩基配列にＣからＴへの変異導入
0003898126.tif 000006
・配列番号１の位置２６７８の塩基配列にＡからＴへの変異導入
0003898126.tif 000007
・配列番号１の位置２８２６の塩基配列にＡからＧへの変異導入
0003898126.tif 000008
0003898126.tif 000009
（３）実施例４（６）の方法と同様にして作製した変異型ベクターをジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞にトランスフェクションし、実施例４（６）と同様の条件でＲＴ−ＰＣＲをおこなった。さらに、実施例５に示す方法と同様にしてサザンブロッティングをおこなった。結果を図４に示す。
配列番号１の位置２６７８にＡからＴの変異を導入したベクターのみにおいて、プローブと結合するバンドが検出され、この変異がスプライス異常を引き起こすことが明らかとなった。
実施例７  ＲＡ患者に対して変異の検出
実施例１（１）〜（３）の方法と同様にしてＲＡ患者に対し、ゲノムの変異を検討した。
その結果、患者本人以外の親族にＲＡ発症者がいる患者群（以下、ＲＡ家系と称する）のＲＡ患者で６０例中６例、ＲＡ家系の健常者で３１例中４例、患者本人以外の親族にＲＡ発症者がいない患者群のＲＡ患者で４９４例中１１例、一般健常者で４８１例中３例において変異が観察され、ＲＡ家系において著しく高頻度に変異が見出された。なお、観察された変異の多くはヘテロ接合体であった。
実施例８  ＤＲ３ゲノムの変異した塩基配列の検出
（１）ゲノムＤＮＡは、グアニジンチオシアネート法（日本輸血学会雑誌、第４０巻、第２号、第４１３頁、１９９４年）により末梢血から調製した。すなわち、ＥＤＴＡ採血した末梢血１０ｍｌに細胞膜溶解液（Ｉ液：０．３２Ｍ  ショ糖、１％（ｖ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５ｍＭ  塩化マグネシウム、１２ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６））２０ｍｌを加え、転倒混和後３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、核を回収した。回収した核に核膜溶解液（ＩＩ液：４Ｍ  グアニジンチオシアネート、１２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３７５ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール、１２ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．６））５ｍｌを加え、５５℃で１０分間保温し、エタノール沈殿によりゲノムＤＮＡを調製した。
（２）得られたゲノムＤＮＡ５０ｎｇに１０ｘＰＣＲ  ＩＩ緩衝液（商品名：パーキンエルマー社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム２．５μｌ、２ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液５μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧＯＬＤ：パーキンエルマー社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の酵素活性化反応後、熱変性反応９５℃１分間、アニーリング反応６０℃１分間、伸長反応７２℃２分間を４０サイクル、最後に伸長反応を７２℃で５分間行った。得られたＰＣＲ産物は、自動分注ロボット（バイオメック２０００：ベックマンコールター社製）によりマルチスクリーンＰＣＲ（商品名：ミリポア社製）を用いて精製した。センス、アンチセンスプライマーは、それぞれ配列番号１の位置２１〜３８および１５１７〜１５３５の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
（３）精製したＰＣＲ産物のシークエンス反応は、市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：パーキンエルマー社製）を用いてダイターミネーター法で実施した。
ＰＣＲ産物５０ｎｇに混合試薬（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：パーキンエルマー社製）４μｌ、プライマー１．６ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で全量を１０μｌにした。シークエンス反応は、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間、２５サイクルでおこなった。シークエンス反応後のサンプルからの未反応デオキシヌクレオチドの除去は、セファデックスＧ−５０（アマシャムファルマシア社製）およびマルチスクリーン−ＨＶ（商品名：ミリポア社製）を用いたゲル濾過法により行った。精製したシークエンス産物に滅菌蒸留水を１０μｌ添加し、９６℃で２分間加熱処理し、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定した。
シークエンスプライマーは、配列番号１の位置１０７３−１１０２の相補鎖の塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
その結果、ＲＡ患者のＤＲ３ゲノムに、配列番号１の位置９２１の塩基ＣからＴへの一塩基多型が見出された。
位置９２１の塩基は、ｃＤＮＡとしてジーンバンクに登録されている配列（アクセッション番号ＮＭ−００３７９０）のエクソン３の５’末端の塩基を基準とし、一塩基前のイントロンの塩基番号を−１番目とすると、−５３番目に相当する。
実施例９  ＲＡ患者に対しての変異の検出
実施例８（１）から（３）の方法と同様にしてＲＡ患者に対して、ゲノムの変異を検討した。
その結果、ＲＡ家系のＲＡ患者で４３例中６例、ＲＡ家系の健常者で２５例中４例において変異が見出された。これら変異が見出された１０人では配列番号１の位置１７５５、２５３１、２６７８、２８２６の各一塩基変異および位置２４４３〜２４５６の塩基欠損が同時に検出された。言い換えれば、上記した６つの塩基の変異または欠損が同時に生じている。なお、観察された変異はいずれもヘテロ接合体であった。
参考例１  正常型および変異型ＤＲ３タンパクの結合実験
（１）ＤＲ３  ｃＤＮＡの調製
ヘパリン採血したＲＡ患者の末梢血１０ｍｌを等量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）と混和し、これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品社）２０ｍｌに重層した。１５００ｒｐｍで３０分間遠心後、末梢血単核球の層を採取し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ）に５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、この細胞懸濁液１０ｍｌを１０ｃｍ  ｄｉｓｈに播き、ＰＭＡ（シグマ社）２０ｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ（ディフコ社）１μｇ／ｍｌの刺激下、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。得られた細胞にＴｒｉｚｏｌ試薬（商品名：ギブコ社製）を１ｍｌ加え、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは逆転写反応用キット（ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ：パーキンエルマー社製）を用い、通常の逆転写反応によりｃＤＮＡを調製した。
（２）得られたｃＤＮＡ溶液５μｌに１０ｘＰＣＲ  ＩＩ緩衝液（パーキンエルマー社製）２μｌ、２５ｍＭ  塩化マグネシウム  １μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｃｏｌｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：パーキンエルマー社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の後、熱変性９５℃で１分間、アニーリング５５℃で１分間、伸長反応７２℃で２分間を４０サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応の条件で行った。この反応に使用したセンス、アンチセンスプライマーは、以下のとおりである。
配列番号２の位置２１〜３８のセンスプライマーと、配列番号２の位置１３２３〜１３４２のアンチセンスプライマー
配列番号４の位置２１〜３８のセンスプライマーと、配列番号４の位置７１２〜７３１のアンチセンスプライマー
（３）得られたＲＴ−ＰＣＲ溶液を分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液にて可視化した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。得られたＰＣＲ産物５０ｎｇ、ＴＡクローニングベクター（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ベクター：ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）２５ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）３μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションを行った。
（４）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定し、配列番号２の位置２１〜１３４２のｃＤＮＡまたは配列番号４の位置２１〜７３１のｃＤＮＡをクローン化したプラスミドを得た。
（５）タグ付ＤＲ３発現ベクターの構築
得られた配列番号２の位置２１〜１３４２がクローン化されたプラスミド２μｇにＢａｍＨ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｘｂａ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＫ緩衝液（宝酒造社製）１．２５μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約１．３ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（６）ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓベクター（商品名：インビトロジェン社製）２μｇにＢａｍＨ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｘｂａ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＫ緩衝液（宝酒造社製）１．２５μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。５．５ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（７）参考例１（５）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇと参考例１（６）で精製したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）４μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションを行った。
（８）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号２の位置２１〜１３４２が組み換えられたエクスプレス（Ｘｐｒｅｓｓ）タグの付いた発現ベクターを構築した。
（９）参考例１（４）で得た配列番号２の位置２１〜１３４２がクローン化されたプラスミド２μｇにＳａｌ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）２．５μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約１．３ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（１０）ｐＥＧＥＰ−Ｃ２ベクター（商品名：クローンテック社製）２μｇを参考例１（９）と同様にしてＳａｌ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、４．７ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（１１）参考例１（９）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇおよび参考例１（１０）で精製したｐＥＧＥＰ−Ｃ２ベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）４μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションを行った。
（１２）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号２の位置２１〜１３４２が組み換えられたＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグの付いた発現ベクターを構築した。
（１３）参考例１（４）で得た配列番号３の位置２１〜７３１がクローン化されたプラスミド２μｇにＳａｌ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）４μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を４０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、フェノール／クロロホルム（１：１）溶液で除タンパクし、エタノール沈殿によりプラスミドを回収した。得られたプラスミドにＢａｍＨ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＫ緩衝液（宝酒造社製）４μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を４０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約０．８ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（１４）ｐＥＧＥＰ−Ｃ１ベクター（商品名：クローンテック社製）２μｇを参考例１（１３）と同様にしてＳａｌ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉにより消化し、４．７ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（１５）参考例１（１３）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇと参考例１（１４）で精製したｐＥＧＥＰ−Ｃ１ベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）４μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションを行った。
（１６）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号４の位置２１〜７３１が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクターを構築した。
（１７）実施例６（１）および（２）の方法と同様にして、参考例１（４）で得た配列番号２の位置２１〜１３４２のｃＤＮＡまたは配列番号４の位置２１〜７３１のｃＤＮＡをクローン化したプラスミドに変異導入をおこなった。変異を導入した塩はいずれも配列番号４または２の５６４番目の塩基（配列番号１の位置１７５５に相当する）であり、この塩基をＡからＧに置換した。この変異導入によりいずれのタンパクも１５９番目のＡｓｐがＧｌｙに置換される。なお、このときに使用したプライマーセットは以下のとおりである。
0003898126.tif 000010
（１８）得られたプラスミドを用い、参考例１（９）〜（１２）と同様にして配列番号２の位置５６４にＡからＧの変異を有する２１〜１３４２が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクターを構築した。また参考例１（１３）〜（１６）と同様にして、配列番号４の位置５６４にＡからＧの変異を有する２１〜７３１が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクターを構築した。
以降、これらタグを付けた発現ベクターを以下のように呼ぶ。
配列番号２の位置２１〜１３４２が組み換えられたエクスプレス（Ｘｐｒｅｓｓ）タグの付いた発現ベクター：ベクターＡ
配列番号２の位置２１〜１３４２が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクター：ベクターＢ
配列番号２の位置５６４にＡからＧの変異を有する２１〜１３４２が組み換えられたＥＧＦＰ
タグの付いた発現ベクター：ベクターＣ
配列番号４の位置２１〜７３１が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクター：ベクターＤ
配列番号４の位置５６４にＡからＧの変異を有する２１〜７３１が組み換えられたＥＧＦＰタグの付いた発現ベクター：ベクターＥ
（１９）トランスフェクションを行う前日に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁した２９３Ｔ細胞を２ｘ１０５づつ６穴プレートに播いておく。トランスフェクションは、ギブコ社のリポフェクトアミンプラス試薬を用いたリポフェクション法により行った。ベクターＡ０．５μｇとベクターＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅをそれぞれ０．５μｇ混合し、これにリポフェクション試薬（プラス試薬：ギブコ社製）を６μｌ加え、ＤＭＥＭで全量を１００μｌとし室温で１５分間放置した。この溶液にリポフェクトアミン試薬（商品名：ギブコ社製）４μｌおよびＤＭＥＭ９６μｌを加え、さらに１５分間室温で放置後、ＤＭＥＭを８００μｌ添加し、全量を１ｍｌにした。細胞を播いたプレートから上清を除き、この溶液を全量加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３時間培養した。上清を除きＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを３ｍｌ加え、さらに４８時間培養後、細胞を回収した。得られた細胞はＰＢＳで洗浄後、可溶化緩衝液２５０μｌに懸濁し、超音波により破砕した。この細胞破砕液を１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、この上清を細胞可溶化液として実験に供した。
（２０）得られた細胞可溶化液２００μｌに可溶化緩衝液を３００μｌ加え、さらにプロテインＡ−アガロース溶液（ロシュ社製）２５μｌを加え、４℃で４時間転倒撹拌した。１２０００ｒｐｍ２０秒間遠心し、採取した上清に抗ＧＦＰ抗体（サンタクルーズ社製）を１μｇ加え、４℃で２時間転倒撹拌した。この溶液にプロテインＡ−アガロース溶液（ロシュ社製）を２５μｌ加え、４℃で一晩転倒撹拌した。１２０００ｒｐｍ２０秒間遠心し、上清を除去後、洗浄のため沈殿を可溶化緩衝液５００μｌに懸濁して４℃で２０分転倒撹拌した。この洗浄操作を計３回行った後、２ｘサンプル緩衝液３０μｌに懸濁し、９５℃、５分間加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のサンプルとした。
（２１）得られたサンプル２０μｌをプロテインマーカー（プレステインドマーカー、ブロード：アプロサイエンス社製）とともに７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて、常法のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後、セミドライ式ブロッティング装置によりタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写用緩衝液には、１００ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、１０％メタノールを用いた。
（２２）タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を５％脱脂粉乳含有ＴＢＳ溶液に浸し、室温１時間振とうした。次いでＴＢＳ溶液に抗エクスプレス抗体（インビトロジェン社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、室温で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ溶液で１０分間３回洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ溶液にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシア社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、室温で２時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ溶液で１０分間３回洗浄後、検出試薬（ＥＣＬシステム：アマシャムファルマシア社製）に浸し、Ｘ線フィルムに露光させた。
結果を図５に示す。ベクターＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅから発現されるタンパク質はいずれもベクターＡから発現されるタンパク質と結合することが明らかとなった。すなわち、正常型のＤＲ３タンパクが正常型のタンパクとコンプレックスを形成することはもとより、ベクターＣ、Ｄ、Ｅから発現される変異型のタンパクともコンプレックスを形成することが明らかとなった。
参考例２  正常型ＤＲ３とＴＲＡＤＤとの結合に対する変異型ＤＲ３の効果
（１）ＴＲＡＤＤ  ｃＤＮＡの調製
ｃＤＮＡ溶液（ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ：商品名、クロンテック社製）０．５μｌに１０ｘＬＡ緩衝液（商品名：宝酒造社製）２．５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム２．５μｌ、２．５ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合液４μｌ、２０μＭ  センス、アンチセンスプライマーをそれぞれ０．２５μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ試薬（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：宝酒造社製）１．２５Ｕを加え、滅菌蒸留水により全量を２５μｌとし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間の後、熱変性９５℃で１分間、アニーリング６２℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間を３５サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応の条件で行った。この反応に使用したセンス、アンチセンスプライマーは、以下のとおりである。
0003898126.tif 000011
（２）得られた溶液を分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液にて可視化した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。得られたＰＣＲ産物２５ｎｇ、ＴＡクローニングベクター（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ベクター：ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）２５ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）２．５μｌと混合し、１６℃で１時間ライゲーションを行った。
（３）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定し、ＴＲＡＤＤ  ｃＤＮＡをクローン化したプラスミドを得た。
（４）タグ付ＴＲＡＤＤ発現ベクターの構築
参考例２（３）で得たＴＲＡＤＤ  ｃＤＮＡがクローン化されたプラスミド２μｇにＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｓａｌ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）３μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を３０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約１ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（５）ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２ベクター（商品名：ストラタジーン社製）１μｇにＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｓａｌ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＨ緩衝液（宝酒造社製）３μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を３０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。４．３ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（６）参考例２（４）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇと参考例２（５）で精製したｐＣＭＶ−Ｔａｇ２ベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）２．５μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションを行った。
（７）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、フラッグ（Ｆｌａｇ）タグの付いたＴＲＡＤＤ発現ベクターを構築した。以降、このベクターをベクターＦと記載する。
（８）トランスフェクションを行う前日に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁した２９３Ｔ細胞を２ｘ１０５づつ６穴プレートに播いておく。トランスフェクションは、ギブコ社のリポフェクトアミンプラス試薬を用いたリポフェクション法により行った。ベクターの組合せは以下のようにした。
１．ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ  Ｃ（商品名：インビトロジェン社製）０．２μｇ、ベクターＦ０．１μｇ
２．ベクターＡ０．２μｇ、ベクターＦ０．１μｇ
３．ベクターＡ０．２μｇ、ベクターＥ０．１μｇ、ベクターＦ０．１μｇ
４．ベクターＡ０．２μｇ、ベクターＥ０．２μｇ、ベクターＦ０．１μｇ
ベクターＡおよびＥは参考例１に示すものであり、ベクターＡにはエクスプレス（Ｘｐｒｅｓｓ）タグに加えＨｉｓタグが付加されている。なお、ベクターの全量はｐｃＤＮＡ３．１（商品名：インビトロジェン社製）により１μｇとした。上記１−４にリポフェクション試薬（プラス試薬：ギブコ社製）を６μｌ加え、ＤＭＥＭで全量を１００μｌとし室温で１５分間放置した。この溶液にリポフェクトアミン試薬（ギブコ社製）４μｌおよびＤＭＥＭ９６μｌを加え、さらに１５分間室温で放置後、ＤＭＥＭを８００μｌ添加し、全量を１ｍｌにした。細胞を播いたプレートから上清を除き、この溶液を全量加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３時間培養した。上清を除きＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを３ｍｌ加え、さらに２４時間培養後、細胞を回収した。得られた細胞はＰＢＳで洗浄後、可溶化緩衝液２５０μｌに懸濁し、超音波により破砕した。この細胞破砕液を１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を細胞可溶化液として実験に供した。
（９）細胞可溶化液１００μｇに可溶化緩衝液を加え全量を５００μｌとし、さらにプロテインＡ−アガロース溶液（ロシュ社製）２５μｌを加え、４℃で４時間転倒撹拌した。１２０００ｒｐｍ２０秒間遠心し、採取した上清に抗ＨｉｓＧ抗体（商品名：インビトロジェン社製）を１μｇ加え、４℃で２時間転倒撹拌した。この溶液にプロテインＡ−アガロース溶液を２５μｌ加え、４℃で一晩転倒撹拌した。１２０００ｒｐｍ２０秒間遠心し、上清を除去後、洗浄のため沈殿を可溶化緩衝液５００μｌに懸濁して４℃で２０分転倒撹拌した。この操作を２回行った後、洗浄緩衝液５００μｌにてさらに同様の洗浄を２回行い、最後にもう一度可溶化緩衝液５００μｌにて洗浄をおこなった。沈殿を２ｘサンプル緩衝液３０μｌに懸濁し、９５℃、５分間加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のサンプルとした。
（１０）得られたサンプル２０μｌをプロテインマーカー（プレステインドマーカー、ブロード：アプロサイエンス社製）とともに９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて、常法のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後、セミドライ式ブロッティング装置によりタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写用緩衝液には、１００ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、１０％メタノールを用いた。
（１１）タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を５％脱脂粉乳含有ＴＢＳ溶液に浸し、室温１時間振とうした。次いでＴＢＳ溶液に抗Ｆｌａｇ抗体（シグマ社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、室温で３０分反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ溶液で１−２分間３回洗浄後、ＴＢＳ溶液にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシア社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、室温で３０分反応させた。ＴＢＳ溶液で１５分間３回洗浄後、検出試薬（ＥＣＬシステム：アマシャムファルマシア社製）に浸し、Ｘ線フィルムに露光させた。
結果を図６に示す。正常型ＤＲ３と変異型ＤＲ３４を同時に発現させると、変異型ＤＲ３の量依存的に正常型ＤＲ３に結合したＴＲＡＤＤの量が減少した（レーン３、４）。すなわち、変異型ＤＲ３は正常型ＤＲ３とＴＲＡＤＤとの結合を阻害した。
参考例３  末梢血単核球におけるカスパーゼ８の発現
（１）ヘパリン採血したＲＡ患者５例および健常人４例の末梢血１０ｍｌを等量のＰＢＳと混和し、これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品社）２０ｍｌに重層した。１５００ｒｐｍで３０分間遠心後、末梢血単核球の層を採取し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ）に５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、この細胞懸濁液１０ｍｌを１０ｃｍのシャーレに播き、ＰＭＡ（シグマ社）２０ｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ（ディフコ社）１μｇ／ｍｌの刺激下または非刺激下、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を可溶化緩衝液１５０μｌに懸濁し、氷冷下に３０分間インキュベートした。この溶液を１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を分取し、細胞溶解液とした。
（２）得られた細胞溶解液１０μｇをプロテインマーカー（プレステインドマーカー、ブロード：アプロサイエンス社製）とともに７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて、常法のＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。泳動後、セミドライ式ブロッティング装置により蛋白質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写用緩衝液は、１００ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、１０％メタノールを用いた。
（３）タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を５％脱脂粉乳含有ＴＢＳ−Ｔ溶液に浸し、室温で１時間振とうした。ついで１％脱脂粉乳含有ＴＢＳ−Ｔ溶液に抗カスパーゼ８抗体（医学生物学研究所社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、４℃で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で１０分間３回洗浄後、ＴＢＳ−Ｔ溶液にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシア社製）を１０００分の１（溶媒に対する容量比）加えた溶液に浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ溶液で１０分間３回洗浄後、検出試薬（ＥＣＬシステム：アマシャムファルマシア社製）に浸し、Ｘ線フィルムに露光させた。
ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトによりカスパーゼ８／ａ、カスパーゼ８／ｂのバンドの濃度を数値化し、ＰＭＡ、ＰＨＡ刺激下の値を未刺激下の値で除した相対値で結果を示した。結果を平均値±標準偏差として以下に示す。
健常者  ：０．７２±０．１９
ＲＡ患者：１．３３±０．２３
細胞の刺激により健常者においては、カスパーゼ８（カスパーゼ８／ａ、カスパーゼ８／ｂ）の減少、すなわち分解が観察されるのに対して、ＲＡ患者においてはカスパーゼ８の分解が観察されなかった。
実施例１０  正常型ＤＲ３を補完することによる細胞死の誘導
（１）正常型ＤＲ３発現ベクターの構築
参考例１の（４）で得た配列番号２の位置２１〜１３４２がクローン化されたプラスミド２μｇにＢａｍＨ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｘｂａ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＫ緩衝液（宝酒造社製）１．２５μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約１．３ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（２）ｐｃＤＮＡ３．１（商品名：インビトロジェン社製）２μｇにＢａｍＨ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、Ｘｂａ  Ｉ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＫ緩衝液（宝酒造社製）１．２５μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を２５μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：フェルメンタス社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。５．６ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（３）実施例１０（１）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇと実施例１０（２）で精製したｐｃＤＮＡ３．１ベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）と４μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションをおこなった。
（４）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号２の位置２１〜１３４２が組み換えられた正常型ＤＲ３発現ベクターを構築した。
（５）変異型ＤＲ３発現ベクターの構築
参考例１（１７）で得た配列番号３の位置５６４にＡからＧの変異を有する配列番号４の位置２１〜７３１がクローン化されたプラスミド２μｇにＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）５ｕｎｉｔ、１０ｘＭ緩衝液（宝酒造社製）４μｌを加え、滅菌蒸留水で全量を４０μｌにした。この反応液を３７℃で４時間保温後、分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ：ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）社製）と共にアガロースゲル（１％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ：ニッポンジーン社製）にてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動した。約０．８ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（６）ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（商品名：インビトロジェン社製）２μｇを実施例１０の（５）と同様にしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、５．５ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから回収し、市販キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）により精製した。
（７）実施例１０の（５）で精製したＤＮＡ断片３０ｎｇと実施例１０の（６）で精製したｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓベクター３０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ＩＩのｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ：宝酒造社製）と４μｌと混合し、１６℃で２時間ライゲーションをおこなった。
（８）実施例２に記載の方法と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号３の位置５６４にＡからＧの変異を有する配列番号４の位置２１〜７３１が組み換えられた変異型発現ベクターを構築した。
（９）正常型、変異型ＤＲ３発現ベクター４μｇをｐＲＬ−ＴＫ（商品名：プロメガ社製）ベクター１μｇとともに、実施例４（６）と同様にしてジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞にトランスフェクションした。なお、ベクターの全量はコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、商品名：インビトロジェン社製）により１１μｇとした。電気ショック後、氷冷下に１０分間静置し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで全量を４ｍｌとし、６ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。細胞を回収しリン酸緩衝食塩水で洗浄後、１００μｌの細胞溶解液（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ：プロメガ社製）に可溶化した。この溶液２０μｌとルシフェラーゼ基質５０μｌ（Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ基質：プロメガ社製）を混合し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ：大日本製薬社製）を用いて発光量を測定した。
ｐＲＬ−ＴＫベクターが導入された細胞ではルシフェラーゼ遺伝子が翻訳されるため、その細胞溶解液は化学発光を呈する。一方、ＤＲ３の発現によりアポトーシスが誘導されると、細胞数の減少により発光量が低下すると考えられる。すなわちこの試験は、細胞死の誘導を発光量を指標として検出するものである。
コントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を導入した細胞溶解液の発光量を１００とし、各ベクターを導入した細胞溶解液の発光量を相対値で示した。結果は以下のとおりである。
正常型ＤＲ３：１１．１
変異型ＤＲ３：１０１．７
正常型ＤＲ３＋変異型ＤＲ３：１０．３
変異型ＤＲ３を導入した細胞の発光量はコントロールとほぼ同等の値を示した。すなわち、この細胞にはアポトーシスが誘導されないのに対して、正常型ＤＲ３と変異型ＤＲ３を等量導入した細胞の発光量は、正常型ＤＲ３のみを導入した細胞と同様低値を示し、細胞死が誘導された。このように正常型ＤＲ３の補完はＲＡの治療法として有用であると考えられる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
本発明は、変異を有するゲノム、タンパク質、それらの変異を利用したヒト慢性関節リウマチの診断方法（換言すれば、発症または発症可能性の判定方法）、上記変異検出用の診断（判定）キット、当該リウマチの治療方法および治療薬剤に関する。本発明によれば、慢性関節リウマチの発病またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができ、有用である。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな予防法、治療法および治療薬剤としても有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、５つの変異の位置を示した図である。
図２は、正常型および欠損型の対立遺伝子の電気泳動パターンを示した電気泳動写真である。
図３は、サザンブロッティングにより５つの変異によるスプライシング異常を検出したＸ線フィルム写真である。
図４は、サザンブロッティングにより配列番号１の位置２６７８の変異が引き起こすスプライス異常を検出したＸ線フィルム写真である。
図５は、抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降を行った後に、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体でウエスタンブロットを行った結果のＸ線フィルム写真である。
図６は、抗Ｈｉｓ抗体で免疫沈降を行った後に、抗Ｆｌａｇ抗体でウエスタンブロットを行った結果のＸ線フィルム写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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