(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）水性ゲルの存在下に、高分子化合物を該化合物の加水分解酵素で加水分解して、高分子化合物のオリゴマーを前記水性ゲルの中に取り込ませ、
（２）該水性ゲルからオリゴマーを取り出し、
（３）該オリゴマーを取り出した水性ゲルに、再度、高分子のオリゴマーを取り込ませる工程
を繰り返し行うことを特徴とするオリゴマーの調製方法。
【請求項２】
水性ゲルがポリアクリルアミドゲル又は多糖ゲルである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴマーを効率的に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然高分子化合物であるタンパク質、多糖類、核酸などを酵素分解することにより、それぞれのオリゴマーが得られる。これらのオリゴマーは、バイオテクノロジーの発展に伴い医学、栄養学、農学などの分野で様々な用途が提案されている。その中でも、オリゴマーの重合度が200以下の場合のもの、特に3〜20ぐらいのものが最も注目されている。
【０００３】
オリゴマーの製造方法としては、一般的に酵素による高分子化合物の分解が行われている。しかし、この方法では、原料となる高分子化合物が酵素により分解され、目的とする重合度のオリゴマーが生成しても、更なる分解により目的外のモノマー等を生成してしまう。従って、反応時間を長くしても目的のオリゴマーは高収量では得られない上に、モノマーの分離が必要である。
【０００４】
オリゴマーを効率良く得る方法として、例えば、限外膜分離法、酵素固定化法など様々な方法が用いられている。
【０００５】
しかし、限外膜分離法では、（1）装置が大型化する、（2）反応液の高圧循環により酵素の活性が低下する、（3）膜の規格に制限がありオリゴマーの分子量の自由な設計が困難である、などの欠点がある。
【０００６】
また、酵素固定化法は、（1）酵素を固定化することによる酵素活性が低下する、（2）固体−液体反応であるために反応速度が低下する、などの欠点がある。
【０００７】
いずれにせよ、現時点では目的に応じた重合度を有するオリゴマーを選択的に効率良く得ることは非常に困難である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、オリゴマーを効率良く製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記のオリゴマーを調製する方法を提供するものである。
【００１０】
項１．水性ゲルの存在下に、高分子化合物を該化合物の加水分解酵素で加水分解して、高分子化合物のオリゴマーを前記水性ゲルの中に取り込ませることを特徴とするオリゴマーの調製方法。
【００１１】
項２．（1）水性ゲルの存在下に、高分子化合物を該化合物の加水分解酵素で加水分解して、高分子化合物のオリゴマーを前記水性ゲルの中に取り込ませ、
（2）該水性ゲルからオリゴマーを取り出し、
（3）該オリゴマーを取り出した水性ゲルに、再度、高分子のオリゴマーを取り込ませる工程
を繰り返し行うことを特徴とするオリゴマーの調製方法。
【００１２】
項３．水性ゲルがポリアクリルアミドゲル又は多糖ゲルである上記項1又は2に記載の方法。
【００１３】
項４．高分子化合物の加水分解により得られたオリゴマーを含む水性ゲル。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のオリゴマーを調製する方法は、水性ゲルの存在下に、高分子化合物を該化合物の加水分解酵素で加水分解して高分子化合物のオリゴマーを前記水性ゲル中に取り込ませることを特徴とする。
【００１５】
本発明において使用されるオリゴマーの原料となる高分子化合物の種類は特に限定されない。例えば、天然高分子、カルボキシメチルセルロース等の修飾された天然高分子、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリ−3−ヒドロキシ酪酸エステル、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリカプロラクトン等の、エステル結合、アミド結合又はグリコシド結合を有する非天然高分子化合物等が挙げられ、その中でも天然高分子が好ましい。
【００１６】
例えば、デンプン、デキストラン、カラギーナン、キチン、キトサン、ペクチン、ペプチドグリカン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン等の多糖類、タンパク質、ペプチド、核酸などが挙げられる。それら高分子化合物の重合度も何ら限定されるものではなく、例えば、1万〜100万程度、好ましくは1万〜10万程度を例示できる。
【００１７】
高分子化合物の分解（以下、「酵素反応」ともいう。）に用いる酵素の種類も限定されず、高分子化合物の種類等に応じて適宜選択される。例えば、キチン、キトサンの分解にはキチナーゼ、キトサナーゼ、リゾチーム、セルラーゼ等、ペクチンにはペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ等、ペプチドグリカンにはグルコシダーゼ等、グリコサミノグリカンにはグルコサミニダーゼ等、プロテオグリカンにはプロテオグリカナーゼ、プロテアーゼ等、タンパク質にはプロテアーゼ等、核酸にはヌクレアーゼ等を用いることができる。これらの中でも、例えば、キトサンの場合にはアスペルギルス由来のセルラーゼを使用するのが特に好ましい。
【００１８】
高分子化合物を酵素により分解する酵素反応の条件は、特に限定されるものではない。例えば、該酵素反応は水中で行うのが好ましく、pHを安定させるためにリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。緩衝液の濃度は酵素反応の種類等に応じて適宜選択することができ、例えば、0.01〜2Ｍ程度、好ましくは0.05〜1Ｍ程度が挙げられる。
【００１９】
本発明における酵素反応は、水性ゲルの存在下に行うことが好ましい。本発明における水性ゲルとは、水中で製造されたオリゴマーをその中に保持することができ、酵素がその中に取り込まれていないゲルをいい、例えば、アクリルアミドゲル、多糖ゲルのようなヒドロゲル等を含む。
【００２０】
ポリアクリルアミドゲルとしては公知のものが使用でき、例えば、一般に電気泳動で用いられるゲルを作る方法などの公知の方法で作ることができる。また、目的とするオリゴマーの種類に応じて、架橋度、含水率等を自由に選択することができる。架橋度等を調製することにより、得られるオリゴマーの分子量を自由に選択することができる。更に、このゲルは酵素や微生物等によっても劣化することがないという利点を有する。
【００２１】
多糖ゲルとしては、ゲル化できる多糖類であれば限定されず、例えば、寒天、アルギン酸、マンナン、デキストラン、キトサン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、カラギーナン、ペクチン、ゼラチン、卵白、ジェランガム、ネイティブジェランガム、ローカストビーンガム等が挙げられる。これらの多糖類は公知の方法でゲル化することができ、例えば、アルギン酸ナトリウムの場合にはカルシウムイオンを添加することによりゲル化することができる。
【００２２】
また、必要に応じて公知の方法で架橋することもできる。例えば、糖の強アルカリ溶液に架橋剤としてエピクロルヒドリンを添加し、糖分子間の水酸基をグリセロール−1,3−エーテル結合により架橋する方法が挙げられる。
【００２３】
架橋することにより、得られるオリゴマーの分子量を自由に選択することができる。また、多糖ゲルを使用する際には、酵素の種類（基質特異性）を考慮して、使用する酵素に分解されないゲルを選択する必要がある。
【００２４】
酵素反応を行う際、緩衝液中に酵素を予め入れておき、そこに高分子化合物を添加することにより酵素反応を開始することもできるし、また、緩衝液中に高分子化合物を予め入れておき、そこに酵素を添加することにより酵素反応を開始することもできる。また、高分子化合物と酵素を同時に緩衝液に添加してもよい。
【００２５】
高分子化合物と酵素とを反応させる割合は、特に限定されず、酵素の種類、高分子化合物の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、緩衝液に対して、高分子化合物を0.1〜20重量%程度、好ましくは0.5〜10%程度用い、高分子化合物に対して、酵素を0.01〜10重量%程度、0.05〜5重量%程度使用することができる。
【００２６】
酵素反応の反応時間も限定されず、適宜選択することができる。例えば、10秒〜24時間程度、好ましくは30分〜10時間程度が例示できる。
【００２７】
また、酵素反応を促進するために、及び／又は生成したオリゴマーの水性ゲル中への取り込みを促進するために、撹拌及び／又は振盪を行ってもよい。撹拌及び振盪の速度等については適宜選択することができるが、反応液中の水性ゲルを壊さないように注意する必要がある。
【００２８】
本発明の方法により得られたオリゴマーは水性ゲル中に存在するので、必要に応じてゲルからオリゴマーを取り出せばよい。例えば、水性ゲルとしてアクリルアミドゲルを使用した場合には、水性ゲルに微生物が繁殖しないので、長期間にわたって繰り返し使用することができる。この場合には、オリゴマーを水性ゲルから取り出せばよい。
【００２９】
また、多糖ゲルを使用した場合は、オリゴマーを多糖ゲルから取り出してもよいが、多糖に栄養価があることを考えて、オリゴマーを含む多糖ゲルとしてそのまま食品等に使用することもできる。
【００３０】
オリゴマーを水性ゲルから取り出す方法は特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、ゲルの表面を軽く水洗することにより、ゲルの表面に付着する酵素、高分子化合物、その分解物等を取り除いた後、30秒〜24時間程度、好ましくは5分〜10時間程度水中に浸漬し、必要に応じて振盪、撹拌、加熱等を行うことにより水中に溶出させることができる。水中に溶出したオリゴマーを使用する際の形態も、限定されない。例えば、そのまま使用することもできるし、凍結乾燥して粉末の形で使用することもできる。
【００３１】
オリゴマーを取り出した後の水性ゲルは、再びオリゴマーの取り込みに使用することができるので、オリゴマーの製造を連続的又は間欠的に行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳述に説明する。
【００３３】
水性ゲル調製例1
（１）重合容器として直径15mm長さ180mmの両切りガラス管4本を用意し、一端をゴム栓で封をした。ゴム栓部分を底にしてガラス管を立てておいた。
（２）煮沸することにより脱酸素した水120mlに、アクリルアミドモノマー及び架橋剤N,N'-メチレンビスアクリルアミドを溶解させた。
（３）（２）の溶液に重合開始剤として3-ジメチルアミノプロピオニトリル 0.06ml と過硫酸アンモニウム60mg を溶解し、直ちに（１）の重合容器に注入した。上端0.5〜1cmぐらいをキシレンで満たし、モノマー溶液が直接空気（酸素）に接触するのを防いだ。
（４）一夜放置して重合反応を完結させ、その後、ゲルとガラス管の間に水を注入してゲルを抜き出した。円柱状のゲルを長さ15mmに切断しゲル片を作成した。水にゲル片を繰り返し浸漬することにより、可溶性成分を抽出し、ゲル洗浄し、オリゴマー取り込み用の水性ゲルとした。モノマー濃度、架橋剤の濃度を変えることにより、ゲルの含水率、架橋度が異なる3種のゲルを調製した。その組成を以下の表1に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
実施例１
300ml容の三角フラスコ2個（A、B）にそれぞれ調製例1のGCゲルを33個（約87ml）入れたものを用意した。容器Aに反応溶液100ml（キトサン3g、酵素「アスペルギルス由来のセルラーゼ」0.6g、0.1M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液pH5.6を含む）を注入し、50℃に保った。3時間後、その反応液を容器Bに移すと同時に、3gのキトサンを1M酢酸30mlで膨潤させたものを添加した。1N水酸化ナトリウムを用いてpHを5.6に調整し、更に3時間反応を続けた。
【００３６】
反応後、酵素反応液を除き、A、Bそれぞれに水約100mlを注入することによりゲルに含まれるオリゴ糖を溶出させた。この操作を3回繰り返すことによりオリゴ糖溶液を得た。反応液中には、低分子化キトサンが2.1g、溶出液中にはオリゴ糖が3.9g含まれ、その内訳は、DP（重合度）50〜70が3.1g、DP50以下が0.8gであった。なお、重合度はHPLCで測定した。
【００３７】
比較例１
実施例 1と同条件で、GCゲル非存在下に酵素反応を行った。反応液中には、低分子化キトサン4.7g、オリゴ糖DP50〜70が0.33g、DP50以下0.97gが含まれていた。
【００３８】
実施例２
300ml容の三角フラスコ3個（A、B、C）にそれぞれ調製例1のGBゲルを33個（約87ml）入れたものを用意した。容器Aに反応溶液100ml（キトサン3g、酵素「アスペルギルス由来のセルラーゼ」0.6g、0.1M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液pH5.6を含む）を注入し、50℃に保った。3時間後、容器Bに反応液を移すと同時に、3gのキトサンを1M酢酸30mlで膨潤させたものを添加した。1N水酸化ナトリウムを用いてpHを5.6に整え、また溶液も減圧濃縮し、約100mlに保ちながら3時間反応を続けた。次に、容器Cに反応液を移し冷却し一夜保存した。
【００３９】
翌日、その溶液を容器Aに移し、酢酸で膨潤したキトサン3gを追加し、前日と同様に反応し、これを合計3日間続けた。４日目は、キトサンを加えずに反応のみを続けた。
【００４０】
即ち、1日6時間反応させ、3時間毎にキトサン3g追加と同時にゲルを更新することにより、酵素0.6gでキトサンを18g分解した。操作中酵素反応液を除いた容器中のゲルは、水約100mlを注入することにより、ゲルに含まれるオリゴ糖を3回溶出した。全てのオリゴ糖溶出液を合わせると、オリゴ糖は10.1g含まれ、収率（対キトサン）56%となった。以下に、得られたオリゴ糖の重合度別の収率を示す。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
実施例３
300ml容の三角フラスコAに、調製例1のGAゲルを33個（約87ml）入れたものを用意した。容器Aに反応溶液100ml（ゼラチン1g、酵素「アスペルギルス由来のプロテアーゼ」0.05g 、0.1M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液pH7.0を含む）を注入し、45℃に保って3時間酵素反応を行った。反応後、酵素反応液を除き、反応液中に残るオリゴペプチドを同量のゲルで2回抽出した。その後、オリゴペプチドを含むゲルを約100mlの水を注入することにより、オリゴペプチドを溶出した。
【００４３】
この操作を3回繰り返すことによりオリゴペプチド溶液を得た。この溶液はオリゴペプチドを0.67g含み、その約75%以上が4〜11量体であった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のオリゴマーを調製する方法によれば、目的とする分子量のオリゴマーを選択的に、且つ、効率良く得ることができる。また、製造されたオリゴマーが水性ゲル中に取り込まれるので、高分子化合物の反応速度も非常に速くなる。