(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、糖尿病性虚血性疾患（ただし糖尿病性神経障害を除く）の治療剤。
【請求項２】
虚血部位へ投与するための、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患又は糖尿病性心筋梗塞である、請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
虚血部位の筋肉内へ投与するための、請求項１〜４のいずれか記載の治療剤。
【請求項６】
ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）―リポソームの形態にある、請求項１〜５のいずれか記載の治療剤。
【請求項７】
必要に応じて複数回投与するための、請求項１〜６のいずれか記載の治療剤。
【請求項８】
ＨＧＦ遺伝子として少なくとも５０μｇを用いる、請求項１〜７のいずれか記載の治療剤。
【請求項９】
糖尿病性虚血性疾患（ただし糖尿病性神経障害を除く）の治療剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用。
【請求項１０】
糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患又は糖尿病性心筋梗塞である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）―リポソームの形態にある、請求項９〜１１のいずれか記載の使用。
【請求項１３】
ＨＧＦ遺伝子として少なくとも５０μｇを用いる、請求項９〜１２のいずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を用いた糖尿病性虚血性疾患の治療剤及び治療法に関する。具体的には、ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する糖尿病性虚血性疾患治療剤やＨＧＦ遺伝子を虚血部位へ投与することを特徴とする糖尿病性虚血性疾患治療法などに関する。
背景技術
ＨＧＦは、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、その遺伝子クローニングがなされたタンパク質である（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１２２，１４５０（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４８９，（１９８６）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，２２，２３１（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３２００（１９９１））。その後の研究により、ＨＧＦはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝再生因子として障害肝の修復再生に働くだけでなく、血管新生作用を有し、虚血性疾患や動脈疾患の治療または予防に大きな役割を果たしていることが明らかとなってきた（Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，４７ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ，２２７−２３４（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０，１９３７−１９４１（１９９３），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，３８１−３９０（１９９８））。すなわち、ウサギの下肢虚血モデルにおいてＨＧＦを投与すると、顕著な血管新生が見られ血流量の改善、血圧減少の抑制、虚血症状の改善が生じたとの報告がなされている。これらの報告により、今日では、血管新生因子の一つとしてＨＧＦが発現、機能していると考えられるようになった。
このようにＨＧＦは血管新生因子の機能を始めとして種々の機能を持っており、医薬品として活用するための色々な試みがなされてきた。しかし、ここで問題となってきたのがＨＧＦの血中での半減期である。ＨＧＦの半減期は約１０分と短く、血中濃度を維持することが困難であり、また、ＨＧＦ有効量の患部への移行性が問題となった。
一般的にタンパク性製剤の場合は静脈内への投与の多いことが常識となっており、前記虚血性疾患モデルに対するＨＧＦの投与に関しても、例えば静脈や動脈内への投与の例が示されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，３８１−３９０（１９９８））。このような動物モデルに対する静脈あるいは動脈内投与により、虚血性疾患あるいは動脈疾患に対するＨＧＦの有効性が明らかにされているものの、具体的なＨＧＦの有効な投与方法あるいは投与量等については、未だ結論が出されていない。特にＨＧＦタンパクの場合は、前記のような半減期の問題、患部への移行性の問題もあり、ＨＧＦタンパクの有効な投与法あるいは投与量等については、未だ結論が出されていない。
また一方で、最近の分子生物学の飛躍的向上により、遺伝子導入法による細胞機能の賦活化が可能となり、種々の取り組みがなされており、ＨＧＦ遺伝子を用いて、心臓領域への遺伝子治療が試みられようとしている。遺伝子の導入法については、例えば冠動脈内拡散注入法等の幾つかの報告があるものの、虚血部位への遺伝子導入法など、特に骨格筋に対する筋肉内導入法を用いて、具体的な糖尿病性虚血性疾患に対して、効果を示した例は見出されていない。
さらに、糖尿病を併発する、または糖尿病性に惹起される虚血性疾患においては血管新生が起こりにくく、予後も不良であることが知られているが、このような糖尿病性虚血性疾患に対してＨＧＦ遺伝子の投与が有効であるか否かについては、何ら明らかにされていない。
発明の開示
本発明の目的は、ＨＧＦ遺伝子を用いた糖尿病性虚血性疾患の治療剤及び治療法を提供することにある。
本発明者らは、ＨＧＦ遺伝子が糖尿病性の虚血性疾患に適応できるか否かを明らかにするために鋭意検討を行った結果、当該疾患に対して、直接虚血患部にＨＧＦ遺伝子を投与することにより、極めて有効な効果が得られることを明らかにした。具体的には下肢虚血性疾患において、下肢骨格筋層にＨＧＦ遺伝子を投与することにより、有効な効果が得られることを見出した。前述のように糖尿病を併発する、または糖尿病性に惹起される虚血性疾患においては血管新生が起こりにくく、予後も不良であることが知られている。そのため単なる虚血性疾患と異なり、糖尿病性虚血性疾患に対してＨＧＦ遺伝子が有効であるか否かはこれまで明らかにされていなかったが、本発明により初めてその有効性が示された。
このようなＨＧＦ遺伝子による治療は非侵襲的な治療法であるため、病状に応じて何回でも当該遺伝子を投与することが可能であるという特徴を有する。
すなわち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、糖尿病性虚血性疾患治療剤、
（２）虚血部位へ投与するための、上記（１）の治療剤、
（３）糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（１）又は（２）の治療剤、
（４）糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（３）の治療剤、
（５）虚血部位の筋肉内へ投与するための、上記（１）〜（４）のいずれかの治療剤、
（６）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（１）〜（５）のいずれかの治療剤、
（７）必要に応じて複数回投与するための、上記（１）〜（６）のいずれかの治療剤、
（８）ＨＧＦ遺伝子として少なくとも５０μｇを用いる、上記（１）〜（７）のいずれかの治療剤、
（９）ＨＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、糖尿病性虚血性疾患の治療法、
（１０）ＨＧＦ遺伝子を虚血部位へ投与する、上記（９）の治療法、
（１１）糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（９）又は（１０）の治療法、
（１２）糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（１１）の治療法、
（１３）ＨＧＦ遺伝子を虚血部位の筋肉内へ投与する、上記（９）〜（１２）のいずれかの治療法、
（１４）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（９）〜（１３）のいずれかの治療法、
（１５）ＨＧＦ遺伝子を必要に応じて複数回投与する、上記（９）〜（１４）のいずれかの治療法、
（１６）ＨＧＦ遺伝子として少なくとも５０μｇを投与する、上記（９）〜（１５）のいずれかの治療法、
（１７）糖尿病性虚血性疾患治療剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用、
（１８）糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（１７）の使用、
（１９）糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（１８）の使用、
（２０）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（１７）〜（１９）のいずれかの使用、
（２１）ＨＧＦ遺伝子として少なくとも５０μｇを用いる、上記（１７）〜（２０）のいずれかの使用。
発明の実施するための最良の形態
本発明において使用される「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦ（ＨＧＦタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２７７７６７８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７２，３２１（１９９０）などに記載のＨＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものが挙げられる。ここでＨＧＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、前記文献に記載されている他、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＨＧＦのｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
さらに、本発明のＨＧＦ遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンパク質がＨＧＦと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、本発明のＨＧＦ遺伝子として使用できる。すなわち、１）前記ｃＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、２）前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、などのうち、ＨＧＦとしての作用を有するタンパクをコードするものであれば、本発明のＨＧＦ遺伝子の範疇に含まれる。ここで前記１）及び２）のＤＮＡは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について記述する。
ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９）。以下、具体的に説明する。
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。
細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。
また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などに詳しく述べられているため、それらを参照されたい。またＨＶＪリポソーム法とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０，１４４０−１４４８（１９９３）、実験医学，１２，１８２２−１８２６（１９９４）、蛋白質・核酸・酵素，４２，１８０６−１８１３（１９９７）等に記載の方法であり、好ましくはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ），４７９−４８２（１９９５）に記載の方法が挙げられる。
なおＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）も用いることができる。
さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）、日本遺伝子治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
本発明で用いられるＨＧＦ遺伝子以外に、血管新生作用を有する公知の因子を併用して、又は単独で用いることが可能である。例えば、ＶＥＧＦやＦＧＦ等の因子は血管新生作用を有することが報告されており、これらの遺伝子を使用することが出来る。またＥＧＦ等の増殖因子は、組織の種々の細胞障害を修復することが報告されており、これらの遺伝子を用いることも可能である。
本発明でいう糖尿病性虚血性疾患とは、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害または、糖尿病性心筋梗塞などであり、これらのいずれの疾患に対しても本発明の遺伝子治療剤を適用することができる。また本発明の遺伝子治療剤は、重症の糖尿病性虚血性疾患の患者だけでなく、進行中の軽度の患者にも使用することができる。
本発明の遺伝子治療剤は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法・投与部位が選択される。投与方法としては、非経口的に投与することが好ましい。また投与部位としては、虚血部位内に投与することが好ましい。ここで「虚血部位」とは、虚血患部及びその周辺を含む部位を指す。
虚血部位においては、具体的には血管内や筋肉内などへの投与が可能であるが、特に、虚血部位の筋肉内に投与することが好ましい。すなわち下肢虚血性疾患においては、下肢虚血部位の骨格筋内に投与することにより、虚血患部の血管新生を促進させ血流量の改善を図り、虚血患部の機能の回復正常化を行うことが出来る。また心筋梗塞等の心疾患においては、心筋内に投与することにより、同様の効果を上げることができる。
好ましい投与方法としては、例えば、非侵襲的なカテーテルあるいは非侵襲的な注射器等による投与方法を挙げることができる。更に、エコー使用下での非侵襲的なカテーテルあるいは注射器等による投与方法を挙げることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、心疾患においては、心室内腔より心筋内に直接ＨＧＦ遺伝子を注入する方法が挙げられる。
本発明のＨＧＦ遺伝子を適用することにより、糖尿病性の虚血性疾患の患者に対して積極的な遺伝子導入による治療を行うことができ、例えば、糖尿病性下肢虚血性疾患の患者においては、従来であれば外科的な患部の切除以外には道のなかった重症の患者に対して、機能の回復が可能となる。
本発明の治療剤の投与量としては、患者の症状等によって異なるが、成人患者１人当たりＨＧＦ遺伝子として約１μｇ〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは約１０μｇ〜約５ｍｇ、より好ましくは約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲から投与量が選択される。
本発明の治療剤は、数日ないし数週間に一回投与するのが好適であり、投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。本発明の治療剤は、非侵襲的な投与に供されるものであるため、病状に応じて何回でも投与できるという特徴を有する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実験材料及び方法
ＨＶＪリポソーム製剤の作製
１０ｍｇの乾燥脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロールの１：４．８：２の混合物）と、ＨＧＦ遺伝子（１００μｇ）−ＨＭＧ１（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  １  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，２５μｇ）を含有する等張液（１３７μＭ  ＮａＣｌ，５．４μＭ  ＫＣｌ，１０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）２００μｌを混合し、激しく攪拌して超音波を掛けてリポソームを形成させた。精製センダイウイルス（Ｚ株）を３分間ＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ２／ｓｅｃ）した。リポソーム懸濁液とセンダイウイルス（ＨＶＪ）を混合して４℃１０分間、続いて３７℃３０分間加温した。遊離のＨＶＪを除去して、ＨＶＪリポソーム製剤を取得した。
実験動物
投与群：糖尿病ラット（ＤＭ−ラット）の下肢虚血ラット
コントロール・ラット：正常ラットの下肢虚血ラット
ＨＶＪリポソーム製剤の投与法
腹腔内にストレプトゾトシンを投与することにより誘発した１６週齢の糖尿病ラット（１群６匹）に対して、片側大腿動脈の一部外科的切除を行って、下肢部に虚血状態を作製した。
ＨＧＦ遺伝子含有ＨＶＪ−リポソーム製剤を、下肢虚血骨格筋に注入した。
検討内容
リポソーム製剤投与後、側副血行路形成および血流改善効果の指標としてレーザー散乱光解析によるレーザー・ドップラー・イメージャー（ＬＤＩ）を用いて下肢血流を測定した。正常下肢に対する虚血下肢の色調ヒストグラム（ｃｏｌｏｒｅｄ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）の平均値を血液還流比率（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）とした。
下肢虚血部分の毛細血管密度をアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色により測定し、糖尿病下肢虚血ラット群とコントロールの下肢虚血ラット群とで比較した。あるいは、ＨＧＦ遺伝子の投与群と未投与群とで比較した。
参考例１
糖尿病ラットの下肢虚血部位におけるＨＧＦ発現状況
腹腔内にストレプトゾトシンを投与して誘発した１６週齢の糖尿病ラット（１群６匹）およびコントロール群として１６週齢の正常のラット（１群６匹）に対して、片側大腿動脈の一部外科的切除を行って、下肢部に虚血状態をもたらした。
１週間後、レーザー・ドップラー・イメージャーにより虚血部位の血液還流比率を測定した。糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラットの血液還流比率よりもはるかに低いものであった（図１参照）。
３週間後、５週間後にも、虚血部位の血液還流比率を測定したところ、同様に糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラットの血液還流比率よりもはるかに低いものであった（図１参照）。
筋肉内の内在性ＨＧＦの濃度は、糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の筋肉内においてコントロールの下肢虚血ラットの筋肉内よりも顕著に低いものであった。この結果は、糖尿病において血管新生が不良である原因が筋肉内の内在性ＨＧＦの減少によるものであることを示している。このため、糖尿病下肢虚血ラットでは、血管新生が起こりにくくなり、側副血行路が発達しないと考えられる（図２参照）。
実施例１
糖尿病下肢虚血ラットに対するＨＧＦ遺伝子治療の効果（Ｉ）
腹腔内にストレプトゾトシンを投与することにより誘発した１６週齢の糖尿病ラット（１群６匹）および１６週齢の正常ラット（１群６匹）に対して、片側大腿動脈の一部の外科的切除を行って、下肢部に虚血状態をもたらした。大腿動脈の外科的切除後、ＨＧＦ遺伝子（５０μｇ）含有ＨＶＪ−リポソーム製剤を下肢虚血部位の筋肉内に導入した。
３週間後、レーザー・ドップラー・イメージャーにより虚血部位の血液還流比率を測定した。ＨＧＦ遺伝子が投与された糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラットや未投与の上記糖尿病下肢虚血ラットと比較し、顕著な増加を示した。
コントロールの下肢虚血ラットの血液還流比率を１００％とすると、ＨＧＦ遺伝子未投与の糖尿病下肢虚血ラットでは６７％であり、ＨＧＦ遺伝子を投与した糖尿病下肢虚血ラットでは１２９％であった。結果を図３に示す（図１参照）。
実施例２
糖尿病下肢虚血ラットに対するＨＧＦ遺伝子治療の効果（ＩＩ）
上記と同じ様に処置をした糖尿病下肢虚血ラット、コントロールの下肢虚血ラットを作製し、ＨＧＦ遺伝子治療を行った。５週間後に各ラットの下肢虚血部位の骨格筋を取り出し、ＡＬＰ染色し単位面積当たりの血管数を比較した。ＨＧＦ遺伝子未投与の糖尿病下肢虚血ラットでは、コントロールの下肢虚血ラットと比較して有意に血管数が少なく、ＨＧＦ遺伝子投与の糖尿病下肢虚血ラットは血管数が有意に増加していた。結果を図４に示す。
参考例２
血管内皮細胞によるＭＭＰ−１の産生に対するグルコース濃度およびＨＧＦ添加の影響
血管内皮細胞（ヒト大動脈由来）を無血清下で、グルコース濃度が０、２５ｍＭ、５０ｍＭとなるような３種の培地で培養し、２４時間培養後の培養液上清のＭＭＰ−１濃度を測定した、
また各々、グルコース添付の３０分前にＨＧＦを１００ｎｇ／ｍｌで添加した場合と比較した。
上清中のＭＭＰ−１濃度が、グルコースの濃度依存的に有意に減少し、ＨＧＦ処理によりＭＭＰ−１の減少が止まり増加することが示された。結果を図５に示す。
参考例３
血管内皮細胞に対するＨＧＦの効果（血管新生に係わる転写因子ＥＴＳ−１の変化）
参考例１と同様に血管内皮細胞を培養し、細胞中に発現する転写因子ＥＴＳ−１のｍＲＮＡ量を測定した。コントロールの内皮細胞の、ＥＴＳ−１のｍＲＮＡ量を１００％とすると、ＨＧＦ未添加の血管内皮細胞では高グルコースの条件により有意に減少していた。一方、ＨＧＦ添加の血管内皮細胞ではコントロールの発現量と比較して同等以上になっていた（Ｐ＜０．０１）。結果を図６に示す。
以上のように、高グルコース条件下の血管内皮細胞では、血管新生のために必須のマトリックス分解酵素であるＭＭＰ−１の産生が減少し、血管新生時に発現、増加する転写因子であるＥＴＳ−１のｍＲＮＡ発現が低下していた。
上記のことから、高グルコース条件下では血管新生がおこりにくくなっていることが明らかにされた。一方、高グルコース条件下の血管内皮細胞にＨＧＦを添加することにより、ＭＭＰ−１の産生、ＥＴＳ−１のｍＲＮＡの発現が顕著に増加し、ＨＧＦにより血管新生がおこりやすくなっていることが示された。
産業上の利用可能性
本発明のＨＧＦ遺伝子を有効成分とする糖尿病性虚血性疾患治療剤は、ＨＧＦの発現の減少した糖尿病性虚血患部に特有の血管新生不良を改善し、顕著な血管新生作用を示すことから、虚血患部の血流量を増大させ病状を改善することができる。しかも、本発明の治療剤は患者の病状に応じて１回以上の投与を行うことにより、その目的である血管新生を促進することができる。従ってこれらの効果により、本発明の治療剤は糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害または、糖尿病性心筋梗塞をより的確に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、参考例１の糖尿病の下肢虚血ラット群および、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における、血液還流比率（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）の経時的変化を示したグラフである。
図２は、参考例１の糖尿病の下肢虚血ラット群および、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における虚血筋肉内の内在性ＨＧＦ濃度を示したグラフである。
図３は、実施例１の糖尿病の下肢虚血ラットへのＨＧＦ遺伝子投与群および未投与群と、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における、血液還流比率を測定した結果を示したグラフである。
図４は、実施例２の糖尿病の下肢虚血ラットへのＨＧＦ遺伝子投与群および未投与群と、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における、下肢虚血部の骨格筋をＡＬＰ染色し、単位当たりの血管数を比較した結果を示したグラフである。
図５は、参考例２のグルコースを添加した血管内皮細胞のＨＧＦ添加群および未添加群と、グルコースを添加していないコントロール群における、培養上清のＭＭＰ−１濃度を測定した結果を示すグラフである。
図６は、参考例３のグルコースを添加した血管内皮細胞のＨＧＦ添加群および未添加群と、グルコースを添加していないコントロール群における、血管内皮細胞中に発現する転写因子ＥＴＳ−１のｍＲＮＡ量を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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