(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌由来の単離された抗原性蛋白質であって、配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列からなる抗原性蛋白質。
【請求項２】
配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列であってマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号：１に記載の塩基配列からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号：１に記載のポリヌクレオチドに０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、５０℃で１２〜２０時間インキュベートした後、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、５０℃で洗浄する条件においてハイブリダイズ可能であり、かつマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入した細胞で発現された抗原性蛋白質を単離する工程を包含する、マラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の抗原性蛋白質の抗原性断片であって、下記アミノ酸配列から選ばれるものである抗原性断片。
ＥＬＤＳＧＥＶＣＧＩＰＴＴＦＫ
ＰＴＴＦＫＴＲＤＥＷＫＧＫＫＶ
ＴＲＤＥＷＫＧＫＫＶＶＩＶＳＩ
ＬＶＫＲＶＤＥＬＫＡＫＧＶＤＡ
ＫＧＶＤＡＶＹＶＩＡＳＮＤＰＦＶＭ
ＴＧＫＬＱＮＡＳＩＤＴＩＬＹＫＶ
【請求項７】
請求項１記載の抗原性蛋白質の抗原性断片であって、配列表の配列番号：４２〜４４のいずれかに記載のアミノ酸配列から選ばれるものである抗原性断片。
【請求項８】
請求項１記載の抗原性蛋白質又は請求項６もしくは７記載の抗原性断片に対するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１記載の抗原性蛋白質又は請求項６もしくは７記載の抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の診断薬。
【請求項１０】
請求項１記載の抗原性蛋白質又は請求項６もしくは７記載の抗原性断片をマラセチアアレルゲンの標準品とし、該抗原性蛋白質に対する抗体を用いてマラセチアアレルゲンの免疫学的定量を行うことを特徴とする、マラセチアアレルゲンの定量方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マラセチア菌を原因菌とするアレルギー疾患及び感染症の診断、治療、予防に利用可能な、マラセチア菌より単離精製された新規な抗原性蛋白質、その抗原性断片、該抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する抗体等に関する。
さらに、本発明は、組換えマラセチア抗原性蛋白質、該抗原性蛋白質をコードする遺伝子、さらにその蛋白質のエピトープ等に関する。
背景技術
アレルギー疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作されることにより、血清および組織で抗原（アレルゲン）に特異的なＩｇＥ抗体（レアギン抗体）が産生され、再びその抗原に暴露されることにより、肥満細胞又は好塩基球と結合したＩｇＥと特異的なアレルゲンが組み合わさると、ＩｇＥが細胞表面上で架橋し、ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果としては、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球遊走因子又は各種ロイコトリエン等の放出が挙げられる。そして、それにより長期間の気管支平滑筋の収縮を起こす。放出されたこれらの物質は、ケミカルメディエーターであり、ＩｇＥと特定のアレルゲンの組み合わせにより起こるアレルギー症状を惹起する。アレルゲンの効果はそれらを通じて現れる。これらの効果は抗原が体内に入る経路及び肥満細胞又は好塩基球上にＩｇＥが沈着するパターンに依存して全身的又は局所的に起こり得る。局所的症状は一般にアレルゲンが体内に入った位置の上皮表面に起こる。全身的効果は、血管内の抗原へのＩｇＥ−好塩基球応答の結果であり、アナフィラキシーショックがその典型である。これらの一連の反応において重要な働きをしているのが、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞である。抗原刺激により活性化されたＴｈ細胞の産生する種々のサイトカインのうち、ＩＬ４はＩｇＥ産生を促進する。
ヒトにアレルギー症状を惹起させる物質は多岐にわたっており、これまでアレルゲンは、花粉あるいは室内塵に代表される多くの物質の集合体として扱われていた。近年になって、分離精製技術及びアレルゲン活性評価法が進展した結果、アレルゲンは単独あるいは数種の主要な物質がその本体であることが明らかとなった。特に、スギ花粉、ダニ、ネコアレルゲン等において急速な進歩を遂げ、スギ花粉よりCry j １、Cry j ２、ダニよりDer f １，Der f ２，Der f ３、ネコよりFel d １といった主要アレルゲンが単離されている。更に、それらのアレルゲン蛋白質をコードする遺伝子も単離され、遺伝子工学的手法により純粋なアレルゲン蛋白質を大量に調製することが可能になっている。
アレルギー疾患の診断においては、まず原因となっている抗原を同定する必要があり、そのためにまず100種を超える市販の抗原エキス、時には自製のものについて、疑わしい抗原エキスを用いて皮内テストにより試験を行っている。原因抗原としての可能性の高い抗原が見つかると、ＲＡＳＴ法等による血清中のＩｇＥ抗体価の測定、誘発テスト、又は全血やリンパ球を用いたヒスタミン遊離試験により抗原を特定することができる。しかし、これらの抗原エキスには明確な力価が規定されていないため、使用の際にはアナフィラキシー誘発の危険性を伴うため注意が必要である。アレルギー疾患の治療法としては、抗ヒスタミン薬、ステロイド性抗炎症薬、メディエーター遊離抑制薬などが使用されているが、診断により特定された抗原を用いた減感作療法が優れた治療法である。しかし、現在の減感作療法は抗原液を週１〜２回、小量ずつ皮内に投与し３〜４ケ月かけて増量し、維持量に上げ、更に１〜３年投与し続ける必要がある。増量が容易であれば、優れた治療効果をより容易に得られることが期待できる。しかし、前記のように使用する抗原の力価がはっきりしないため、更にその抗原が多くの不純物を伴っているため、重篤な副作用が起こることがあり、使用に大きな制限がある。
マラセチア（Malassezia、以下、M.と略す）属に属する菌としては、M. furfur（Pityrosporum ovaleやPityrosporum orbiculareとも呼ばれている），M. pachydermatis, M. sympcdialis等が知られている。マラセチアは各種動物やヒトの体表に常在しているといわれており、その病原性及びアレルギー疾患における役割については、古くから研究されてきた。病原性については、皮膚炎、癜風、毛包炎、フケなどの原因菌として疑われている。また、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患との関連も疑われており、原因菌として関わっている可能性が高い。
現在、マラセチア由来の抗原エキスが市販されているが、これらはM. furfur（以下、Ｍ．ファーファと記す）の培養物より得られた未精製または部分精製物であり、当然、蛋白質、糖、脂質を始めとする複雑な混合物であると考えられる。
従来、このようにして得られた抗原エキス中に含有されるマラセチア由来のアレルゲン性蛋白質としては、マラセチア菌由来の粗抽出物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離後、アレルギー患者の血清中ＩｇＥ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出される、87，76，67，45，37，28，25，14，13kDa等の多くのＩｇＥ結合性蛋白質がアレルゲン性物質として報告されている（Siv Johanssonら，Acta Derm Venereol, 71巻，11-16頁，1991年；E. Jensen-Jarolimら，J. Allergy Clin Immunol, 89巻，44-51頁，1992年；Zargariら，Allergy, 49巻，50-56頁，1994年）。このようにマラセチア菌の生産する蛋白質は、非常に多岐にわたるため、SDS-PAGEによる分離だけでは不十分であり、従来報告されているSDS-PAGEにおける単一の蛋白バンドが、均一の蛋白質であるとは到底考えられない。すなわち、SDS-PAGE上、同一の蛋白バンドを示す蛋白質は通常複数個存在するため、ＩｇＥ結合性蛋白質が単一の蛋白バンドを示したとしても、そのバンド中に含まれる他の多くの蛋白質と分離する必要があり、そのためには他の効果的な分離方法を組み合わせる必要がある。更に、診断、治療の目的で利用されるためには、抗原性蛋白質を単離し、複数の患者血清を用いて、抗原性を明らかにすること、主要アレルゲンであることを明らかにすること、さらに蛋白化学的に品質を明確にした抗原性蛋白質を供給するための製造法を確立する必要がある。そのため、各種クロマトグラフィーによる分離、抗原活性の測定を繰り返し、均一かつ単一の抗原性蛋白質を単離する必要があり、最終的に得られた蛋白質については、SDS-PAGEの単一性のほかに、イオン交換クロマトグラフィーによる単一性、等電点電気泳動的な単一性を確認する必要がある。
しかしながら、前記各種の報告によればそれらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される物質は、まるで各々単一のＩｇＥ結合性蛋白質であるかのように扱われている。しかし、実際にはそれらの単離精製には誰も成功しておらず、そのバンドがいかに相互に無関係の、また多くの蛋白質の混合物であるかについては、全く考察されていない。従って、当然、その複雑な混合物の中からＩｇＥ結合性蛋白質を単離し、さらに単離された蛋白質としてアレルギー患者血清を用いて抗原性の確認を行おうとした例は全くない。さらに、その蛋白化学的性質、アミノ酸配列に関しては全く報告されていない。そのため、上記の報告に見られるＩｇＥ結合性蛋白質相互の異同、関連性（一方が他方のプロテアーゼによる分解物である等）等については全く不明である。
このように、マラセチア菌は、アトピー性皮膚炎を始めとするアレルギー性疾患の原因真菌として注目されているにも関わらず、それらの複雑な蛋白質混合物である粗抽出物からＩｇＥ結合性蛋白質の単離精製には誰も成功していない。もちろん、単離された蛋白質としてアレルギー患者血清を用いた抗原性の確認は行われていない。さらに、その蛋白化学的性質、アミノ酸配列に関しては全く報告されていない。また、その蛋白質をコードする遺伝子の単離の報告例もない。
発明の開示
原因菌の可能性を診断するためには、微生物学的培養試験の他、上記のようなマラセチア菌体抽出物である粗抗原を用いた皮膚試験、誘発試験、RAST法やヒスタミン遊離測定などによる各種ＩｇＥ抗体の定量試験、等により診断が行われている。しかし、この粗抗原は多種類の不純物を含んでいるため、正確な診断ができない。また、皮膚試験、誘発試験に用いる際、副作用等が生ずる危険性がある。さらに、アレルギー疾患の有用な治療法である減感作療法に使用するためには、アナフィラキシー誘発の危険性を伴うため、この粗抗原の投与量が極度に制限され、治療効果を期待できず、また、感染防御のためにワクチンとして利用することも難しい。現在までのところ、このマラセチア由来の精製された、純粋な抗原の単離に成功した例はなく、マラセチア菌による感染やアレルギー疾患の診断、治療に非常に大きな困難が生じている。
従って、かかる現状を考慮し、本発明は次の目的を達成するものである。
（１）本発明の第１の目的は、マラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌由来の単離された抗原性蛋白質であって、配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列からなる抗原性蛋白質を提供することにある。
（２）本発明の第２の目的は、配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列であってマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供することにある。
（３）本発明の第３の目的は、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列からなる前記（２）記載のポリヌクレオチドを提供することにある。
（４）本発明の第４の目的は、配列表の配列番号：１に記載のポリヌクレオチドに０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、５０℃で１２〜２０時間インキュベートした後、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、５０℃で洗浄する条件においてハイブリダイズ可能であり、かつマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチドを提供することにある。
（５）本発明の第５の目的は、前記（３）または（４）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入した細胞で発現された抗原性蛋白質を単離する工程を包含する、マラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有する抗原性蛋白質の製造方法を提供することにある。
（６）本発明の第６の目的は、前記（１）記載の抗原性蛋白質の抗原性断片であって、下記アミノ酸配列から選ばれるものである抗原性断片、
ＥＬＤＳＧＥＶＣＧＩＰＴＴＦＫ
ＰＴＴＦＫＴＲＤＥＷＫＧＫＫＶ
ＴＲＤＥＷＫＧＫＫＶＶＩＶＳＩ
ＬＶＫＲＶＤＥＬＫＡＫＧＶＤＡ
ＫＧＶＤＡＶＹＶＩＡＳＮＤＰＦＶＭ
ＴＧＫＬＱＮＡＳＩＤＴＩＬＹＫＶ
を提供することにある。
（７）本発明の第７の目的は、前記（１）記載の抗原性蛋白質の抗原性断片であって、配列表の配列番号：４２〜４４のいずれかに記載のアミノ酸配列から選ばれるものである抗原性断片を提供することにある。
（８）本発明の第８の目的は、前記（１）記載の抗原性蛋白質又は前記（６）もしくは（７）記載の抗原性断片に対するモノクローナル抗体を提供することにある。
（９）本発明の第９の目的は、前記（１）記載の抗原性蛋白質又は前記（６）もしくは（７）記載の抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の診断薬を提供することにある。
（１０）本発明の第１０の目的は、前記（１）記載の抗原性蛋白質又は前記（６）もしくは（７）記載の抗原性断片をマラセチアアレルゲンの標準品とし、該抗原性蛋白質に対する抗体を用いてマラセチアアレルゲンの免疫学的定量を行うことを特徴とする、マラセチアアレルゲンの定量方法を提供することにある。
本発明者らは、アレルギー患者の診断、治療に有用なマラセチアアレルゲンの単離を目的として、マラセチア属に属する一菌株であるＭ．ファーファＴＩＭＭ２７８２の菌体内の成分に着目し、菌体抽出物である粗抗原を用いた皮膚テスト陽性で、ＲＡＳＴ陽性の患者血清を用いて探索した結果、ＭＦ−１〜１３と命名した１３種の抗原性蛋白質の単離に成功すると共に、これらの抗原性蛋白質のいくつかについては部分アミノ酸配列の決定にも成功した。そして、単離されたマラセチア抗原性蛋白質の部分アミノ酸配列の情報をもとに合成したプライマーとなるポリヌクレオチドを用いて、Ｍ．ファーファ細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを材料としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を行い、目的とするマラセチア抗原性蛋白質をコードする遺伝子の一部を得た。次に、このＰＣＲ断片の全部または一部をプローブとして用い、Ｍ．ファーファ細胞のｃＤＮＡライブラリーより目的とする遺伝子を単離した。また、ＭＦ−１のアミノ酸配列を基にオーバーラッピングペプチドを合成し、これを用いて患者血清のＩｇＥ抗体に対するエピトープの検索、ＭＦ−１モノクローナル抗体に対するエピトープの検索を行い、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープを見出すことができることを明らかにし、本発明を完成した。
即ち、本発明の１の態様は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質又はその抗原性断片に関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離精製された抗原性蛋白質と同等の免疫学的性質を有することを特徴とする組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片に関する。
本発明の他の態様は、本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離精製された抗原性蛋白質又はその抗原性断片、あるいは本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片に対する抗体又は抗体断片に関する。
本発明の他の態様は、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離精製された抗原性蛋白質又はその抗原性断片、あるいは本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の診断薬に関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離精製された抗原性蛋白質又はその抗原性断片、あるいは本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の治療薬に関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離精製された抗原性蛋白質又は本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質をマラセチアアレルゲンの標準品とし、該抗原性蛋白質に対する抗体を用いてマラセチアアレルゲンの免疫学的定量を行うことを特徴とする、マラセチアアレルゲンの定量方法に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２のMono Qによるクロマトグラフィーの結果を示す図である。
第２図は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２のMono Q分画物について、患者血清中のＩｇＥ抗体との結合性を示す図である。
第３図は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２のMono Q分画物のSDS-PAGE後にＣＢＢ染色を行った電気泳動の図である。
第４図は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２のMono Q分画物のSDS-PAGE後にイムノブロッティングを行った電気泳動の図である。
第５図は、Mono QクロマトグラフィーによるMF−１のピークを示す図である。
第６図は、Mono QクロマトグラフィーによるMF−２のピークを示す図である。
第７図は、Mono QクロマトグラフィーによるMF−３のピークを示す図である。
第８図は、Mono QクロマトグラフィーによるMF−４のピークを示す図である。
第９図は、マラセチア粗抗原２７８２の二次元電気泳動の図である。クーマシーブリリアントブルー染色により蛋白質の検出を行う。
第１０図は、マラセチア粗抗原２７８２の二次元電気泳動の図である。健常者ＩｇＥ抗体（Ａ）およびアレルギー患者ＩｇＥ抗体（Ｂ）を用いてイムノブロット法によりスポットを検出する。
第１１図は、MF−１、MF−２、MF−３、MF−４及びMF−13のSDS-PAGE（還元条件下）による電気泳動の図である。
第１２図は、抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４のＩｇＥ結合性の濃度依存性を示す図である。
第１３図は、MF−３のＩｇＥ結合性の濃度依存性を示す図である。
第１４図は、MF−３のピリジルエチル化物のＨＰＬＣによる精製を示す図である。
第１５図は、MF−２（ピリジルエチル化物）のリジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
第１６図は、MF−３（ピリジルエチル化物）のリジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
第１７図は、２種類のＭＦ−５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較の図である。
第１８図は、２種類のＭＦ−６ＰＣＲ断片のヌクレオチド配列の比較の図である。
第１９図は、ＭＦ−１ｃＤＮＡとＭＦ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較の図である。
第２０図は、ＭＦ−３ｃＤＮＡとＭＦ−４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較の図である。
第２１図は、ＭＦ−１オーバーラッピングペプチドのアミノ酸配列である。
第２２図は、ＭＦ−１オーバーラッピングペプチドとＭ．ファーファＲＡＳＴ陽性患者血清の反応である。
第２３図は、ＭＦ−１ｃＤＮＡとＭＦ−１ゲノムＤＮＡの比較の図である。
第２４図は、Phenyl SuperroseクロマトグラフィーによるMF−１３のピークを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の精製抗原性蛋白質及びそれに機能的同等の抗原性蛋白質
本発明の抗原性蛋白質は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質（以下、単に「マラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質」、あるいは単に「精製抗原性蛋白質」と略す場合がある。）である。ここで「実質的に純粋な、単離された」とは、蛋白質として実質的に均一であり、他の不純な蛋白質を実質的に含まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても等電点電気泳動においても単一な物質として認識される単離された蛋白質であることをいう。
また、本発明の精製抗原性蛋白質は、マラセチア粗抗原に対して皮膚反応陽性のアレルギー疾患患者が反応する、マラセチア由来の主要アレルゲンであることを特徴とする蛋白質である。
また、本発明の精製抗原性蛋白質は、マラセチア属の真菌細胞内に存在する抗原性蛋白質である。
また、本発明の精製抗原性蛋白質は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体、特にマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に認識されるエピトープを有することを特徴とする蛋白質である。
また本発明の精製抗原性蛋白質を得るのに用いられる菌株としてはマラセチア属に属する菌株であればいかなる菌株でもよく、その具体例としては、例えばM.furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782株が挙げられる。該菌株はMalassezia furfur TIMM2782と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）〕にＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１１（原寄託日；平成７年９月１２日、国際寄託への移管請求日；平成８年７月２９日）として寄託されている。
本明細書でいうマラセチフ由来の主要アレルゲンとは、マラセチアアレルギー患者（市販のマラセチア粗抗原である抗原エキスに対して皮膚反応陽性のアレルギー疾患患者）の５０％以上に反応する、ＩｇＥ抗体に認識される精製抗原性蛋白質である。
本明細書でいうアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対する結合能は、125Ｉ標識抗ＩｇＥ血清を用いたＲＡＳＴ法、酵素標識抗ＩｇＥ血清を用いたDirect−ＲＡＳＴ  ＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法により測定して、標準血清との比較等により有意な結合が得られることをいう。
本発明のマラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質は、分子量が１００００〜１０００００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）で、等電点（未変性下または８Ｍ尿素変性下）が４〜１０のものであり、マラセチア属の真菌細胞内に存在するものである。具体的には、以下のMF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６、MF−７、MF−８、MF−９、MF−１０、MF−１１、ＭＦ−１２、ＭＦ−１３等が挙げられる。以下、これらについての分子量、等電点、部分アミノ酸配列について述べる。
（I）MF−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約２１ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量を示し、未変性下の等電点は約４．８および８Ｍ尿素変性下の等電点は約５．３であり、配列表の配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（II）MF−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約２０ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量を示し、未変性下の等電点は約４．８および８Ｍ尿素変性下の等電点は約５．８であり、配列番号：４６、配列番号：４７、および配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。
（III）MF−３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約２７ｋＤａ、非還元条件下でも約２７ｋＤａの分子量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．５であり、配列番号：４９、配列番号：５０、および配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。
（IV）MF−４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約２６ｋＤａ、非還元条件下でも約２６ｋＤａの分子量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．３であり、配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（v）MF−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約６６ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．１であり、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（VI）MF−６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約４３ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．２であり、配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（VII）MF−７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約１５ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．０であり、配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（VIII）MF−８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約３０ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約５．４であり、Ｎ末端がブロックされている。
（IX）MF−９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約４０ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約５．３である。
（X）MF−１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約４４ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．２であり、配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
（XI）MF−１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約４５ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約６．４であり、Ｎ末端がブロックされている。
（XII）MF−１２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約１００ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点は約５．０である。
（XIII）MF−１３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で約１６ｋＤａの分子量を示し、未変性下の等電点は約８．１であり、配列番号：５７で示されるアミノ酸配列を含んでいる。
本発明のマラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質としては、マラセチア由来のヒトを始めとする哺乳類の抗原として認識される蛋白質であればよく、上記に例示した１３種類の精製抗原性蛋白質に制限されるものではない。
更に、これらの精製抗原性蛋白質を用いた診断は、従来のマラセチア粗抗原である抗原エキスを用いた皮膚試験やＲＡＳＴ法による診断の結果と相関している。即ち、粗抗原を用いた皮膚試験で陽性の患者の多くがマラセチア粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性である。そして、これらの粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性の患者の５０％以上が、上記の単離精製された本発明の精製抗原性蛋白質に対して高いＩｇＥ抗体価を有している（後述の実施例における表２及び表３を参照）。
また、本発明の精製抗原性蛋白質は、マラセチアアレルギー患者に投与した場合、投与された患者のマラセチア菌に対するアレルギー応答を軽減させることができるものである。
さらに、本発明においては、前記のような精製抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等の抗原性蛋白質をも提供する。例えば、上記１３種類の精製抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物として、例えば、各種M. furfur、更にM. furfur以外のマラセチア属真菌の機能的同等物も本発明に含まれる。即ち、MF−２は、ペルオキシゾーム膜蛋白質であるPMP-20〔Ｌ．ガラード（L.Garrard）ら、ジャーナル  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem．）第23巻、第13929-13937頁（1989年）〕とホモロジーがあり、同様の免疫学的性質を有するマラセチア由来の蛋白質は本発明に含まれる。また、MF−３及びMF−４は異なる蛋白質であるが、いずれも鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼとホモロジーがあり〔Ｔ．マツモト（T. Matsumoto）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、第30巻、第3210-3216頁（1991）；Ｍ．Ｌ．ルドウィッグ（M. L. Ludwig）ら、ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J. Mol. Biol．）、第219巻、第335-358頁（1991）〕、またＭＦ−５はジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＤＬＤＨ）、ＭＦ−６はマレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ＭＦ−１３はシクロフィリンとそれぞれホモロジーがあり、同様の免疫学的性質を有するマラセチア由来の蛋白質も本発明に含まれる。
なお、安定性の強化及び／又は所望の反応性の強化、すなわち診断目的からすれば、抗原と抗体の特異的結合を強化し、治療目的からすればアレルギー反応を減弱化または酵素活性を消失させるために、本発明の精製抗原性蛋白質を改変し、誘導体化したり、ポリエチレングリコール（PEG）法〔ヴィー（Wie）ら，インターナショナルアーカイブス  オブ  アレルギー  アンド  アプライド  イムノロジー（Int. Arch. AIlergy Appl. immunol．，第64巻，第84-99頁（1981）〕を用いてＰＥＧと結合させることができる。蛋白質の改変には、ピリジルエチル化、還元、アルキル化、アシル化、適当な担体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、又は塩酸グアニジン処理も含まれる。
（２）本発明の抗原性断片
本発明の抗原性断片は、前記の精製抗原性蛋白質に含まれる抗原エピトープを有することを特徴とする精製抗原性蛋白質由来の抗原性断片である。例えば、MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６、MF−７、MF−８、MF−９、MF−10、MF−11、MF−12、MF−13等に含まれる抗原エピトープを少なくとも１個含む精製抗原性蛋白質由来の抗原性断片が例示される。なかでも、少なくとも１個のＴ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープを含むものが好適なものとして挙げられる。本発明の抗原性断片に、哺乳類、特にヒトにおける免疫応答、例えば最小量のＩｇＥの刺激、ＩｇＥの結合、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の生産の誘起、又は増殖などのＴ細胞応答及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アナージー誘導などを引き起こす、マラセチア由来の精製抗原性蛋白質の断片が含まれる。
本発明の抗原性断片を治療目的で用いる場合には、Ｔ細胞応答性活性化作用が小さいか、又はＴ細胞アナージー作用を誘起するものが望ましい。また、本発明の抗原性断片は、マラセチア菌に特異的なＩｇＥ抗体に対して実質的に結合能を有しないか、ＩｇＥ抗体への結合が起こる場合でも、肥満細胞又は好塩基球からヒスタミン等のメディエーターを遊離しないような程度の結合能であるのが好ましい。即ち、ＩｇＥ抗体への結合が起こる場合でも、該抗原性断片は、マラセチア由来の精製抗原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥ抗体に結合するものが好ましい。このように本発明の抗原性断片は、治療目的で用いる場合には、精製抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ賦活活性を有するものが好ましい。従って、マラセチアアレルギー患者に投与した場合、投与された患者のマラセチア菌に対するアレルギー応答を軽減させることができるものである。
本発明の抗原性断片の抗原性は、ヒトのボランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、ＲＡＳＴ、ＥＬＩＳＡ、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験においても評価することができる。
エピトープとは、レセプター、特に抗体（免疫グロブリン）、組織適合性抗原及びＴ細胞レセプターにより認識される基本的要素又は最小単位であり、エピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸配列を含む。エピトープのアミノ酸配列を模してあり、マラセチアアレルゲンに対するアレルギー応答を下げることができるアミノ酸配列もエピトープとして用いることができる。現在利用できる蛋白質の構造に関する情報を用い、マラセチアアレルギー患者に十分な量で投与すると、マラセチア菌に対する患者のアレルギー応答を変えるであろうマラセチアアレルゲンペプチドを設計することができる。また、マラセチアアレルゲンの患者にアレルギー反応を誘起する作用を阻害することができる試薬又は薬剤を設計することもできる。そのような薬剤は、例えばマラセチアアレルゲンに対するＩｇＥ抗体に結合し、それによりＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後の肥満細胞からの脱顆粒を妨げるように設計することができる。
また、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの選択は、マラセチアアレルゲンに対して感受性の個体（ＩｇＥ仲介免疫応答を有する個体）から得られたＴ細胞を含むリンパ球をアレルゲン由来のペプチドと共に培養し、例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込み促進作用を測定し、ペプチドに応答してＴ細胞の増殖が起こるかどうかを決定することによって、ヒトＴ細胞の刺激活性（幼若化活性）を測定することができる。Ｂ細胞エピトープを含むペプチドの選択は、マラセチアアレルゲンに対して感受性の個体から得られた血清を用いて、アレルゲン由来のペプチドと反応させ、結合したＩｇＥ量を測定することにより、ＩｇＥ結合ペプチドを選択することができる。
本発明の抗原性断片の範囲内には、マラセチアアレルゲンを始めとするマラセチア由来の精製抗原性蛋白質の断片と免疫学的に関連する、例えばその断片に対する特異的な抗体や特異的なＴ細胞に認識される、交差反応性を有するペプチドも含まれる。
本発明の抗原性断片を調製するには、単離された精製抗原性蛋白質を原料として、リジルエンドペプチダーゼ、トリプシン等のプロテアーゼによる酵素消化、臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗原性を有する断片を蛋白質の精製において既知の方法により単離精製することにより得ることができる。また、マラセチア由来の抗原性蛋白質をコードする遺伝子の一部を用いて、目的の抗原性断片を発現、調製することもできる。更に、抗原性断片の化学構造に関する情報を基に、ペプチド合成技術を利用して化学合成による製造も可能である。
また、遺伝子工学的手法、化学合成的手法を用いることにより、アミノ酸の置換、挿入及び欠失も可能である。例えば、安定性の強化及び／又は所望の反応性の強化のために、本発明の抗原性断片を改変し、誘導体化したり、少なくとも１個のアミノ酸を欠失、挿入、置換、付加させることもできる。更にD-アミノ酸、非天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸類似体に置換したり又はこれらを付加して本発明の範囲内の改変蛋白質又はペプチドを製造することができる。更に、本発明の抗原性断片をポリエチレングリコールと結合させ、化学的に修飾することができる。該抗原性断片の改変には、還元、アルキル化、アシル化、又は適した担体への化学的カップリングも含まれる。
このようにして得られた抗原性断片について免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作用、Ｔ細胞アナージー作用、抗体との結合作用等）を測定することにより、抗原性断片を決定、単離することができる。
次に、本発明の精製抗原性蛋白質の製造法について述べる。従来使用されていた粗抗原は、培養物の培養ろ液の凍結乾燥物であったり、又は、培養菌体を適当な方法で破砕し、抽出物を得、これを硫安沈殿、凍結乾燥するといった、極めて限られた方法で精製されたものであった。本発明者らも、これらの粗抗原を原料として蛋白質の精製法として一般的に用いられている方法、例えばゲル濾過、イオン交換等のクロマトグラフィーによる精製を試みたが、これらの手法のみでは単一の純粋な抗原性蛋白質の単離に成功しなかった。
本発明のマラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質は、マラセチア菌体より調製した粗抗原を原料として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キレート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を用いた効果的な分離方法を組み合わせて分画した後、各画分について患者血清ＩｇＥ抗体との結合をＲＡＳＴ法やイムノブロッティング等で測定することにより、アレルギー患者血清中のＩｇＥ抗体と結合する蛋白質を探索する、又は患者のリンパ球を用いて免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作用、Ｔ細胞アナージー作用等）を誘起する蛋白質を種々の方法で探索することにより単離することができる。
即ち、まず、M. furfur等のマラセチア属菌をディクソン（Dixon）培地等のオリーブオイル又はツィーン40、60を添加した、マラセチア菌の生育に適した栄養分を含む培地を用い、適当な温度、通気等の条件下で培養し、得られた菌体を適当な方法で破砕し、抽出物を得る。この抽出物よりイオン交換クロマトグラフィー、キレート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーを含む分離手段を用いて抗原性蛋白質を精製することができる。即ち、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、キレート樹脂クロマトグラフィー、電気泳動、もしくはマラセチア由来の抗原性蛋白質又はその抗原性断片に特異的な抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィー等の、ペプチド及び蛋白質の精製に関して既知の方法を各種組み合わせることにより高純度な蛋白質として単離することができる。培養ろ液中に含まれる抗原性蛋白質も同様の方法により単離することができる。
具体的には、実施例で示すように、分子量的に分離不可能な蛋白質を、等電点の違いを利用したイオン交換クロマトグラフィーや疎水性の違いを利用した疎水クロマトグラフィー、金属とのキレート能の違いを利用したキレート樹脂クロマトグラフィー、および分子量の違いを利用したゲル濾過クロマトグラフィー等を組合せることにより、よく似た多数の蛋白質の集合を相互に分離することができる。これらのことは、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロッティングによる分子量的な抗原性蛋白質に関する知見からは予想されなかったことであり、例えば、MF−１とMF−２は分子量的にはほとんど同じであり、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分離不可能なものである。また、MF−３とMF−４も分子量的には分離することが不可能である。
更に各種分離手段の組み合わせについて具体例を述べれば、下記の工程が例示される。
工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー；和光純薬工業株式会社製）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得する工程、
工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー；ファルマシア社製）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得する工程、
工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で渡縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー；ファルマシア社製）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得する工程、
工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー；ファルマシア社製）にかけ、素通り画分をさらに銅キレートクロマトグラフィーにかけて素通り画分又はｐＨ約４で溶出される画分を取得する工程、
工程ｅ：工程ｄで得られる素通り画分又はｐＨ約４で溶出される画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー；ファルマシア社製）で精製し分子量約４万の溶出画分を取得する工程、および
工程ｆ：工程ｅで得られる溶出画分をさらにMono Qイオン交換クロマトグラフィーにかけて精製する工程。
あるいは、下記の工程も一例として挙げることができる。
工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得する工程、
工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得する工程、
工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得する工程、
工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー）にかけ、ｐＨ約５で溶出される画分を取得する工程、および
工程ｇ：工程ｄで得られる溶出画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー）で精製する工程。
次に、本発明の精製抗原性蛋白質（MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、およびMF−13）の製造方法の例についてより詳細に説明する。しかし、以下の工程は、単なる例示であってこれに限定されるものではない。
１．MF−１の製造例について
M.furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー）にかけ素通り画分を銅キレートクロマトグラフィーにかけｐＨ約４で溶出される画分を取得し、濃縮後ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー）で精製し分子量約４万の溶出画分を取得して得られる。
２．MF−２の製造例について
M.furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー）にかけ、ｐＨ約５で溶出される画分を取得し、濃縮後ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー）で精製して得られる。
３．MF−３の製造例について
M.furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー）にかけ素通り画分を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通り画分を濃縮した後ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー）で精製し分子量約４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグラフィーで精製して得られる。
４．MF−４の製造例について
M.furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラフィー）にかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングクロマトグラフィー（例えば、亜鉛キレーティングセファロースファーストフローカラムクロマトグラフィー）にかけ素通り画分を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通り画分を濃縮した後ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィー）で精製し分子量約４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグラフィーで精製して得られる。
５．MF−13の製造例について
M. furfur（マラセチア  ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー）にかけ非吸着画分を集め、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、スーパーデックス７５ｐｇ）にかけ、分子量２万以下の溶出画分を取得し、得られる画分をＳＰ陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.2MのNaClで溶出画分を取得し、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、スーパーデックス７５ｐｇ）で精製して得られる。
また、本発明のマラセチア由来の抗原性蛋白質は、前記のアミノ酸配列の情報をもとに、ＰＣＲ等により該蛋白質をコードする遺伝子を単離し、これらを利用して遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ、哺乳類細胞等において発現されるようにベクターに組み込み、組換え蛋白質として調製することもできる。
（３）本発明の精製抗原性蛋白質又はその抗原性断片に対する抗体又は抗体断片
マラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質又はその抗原性断片に対する本発明の抗体は、本発明のマラセチア由来の精製抗原性蛋白質、該蛋白質の酵素的又は化学的方法による処理により得られる抗原性断片、又は化学合成的に得られる抗原性ペプチドを抗原として使用することにより調製することができる。抗体の作製は常法により行うことができるが、例えば上記の蛋白質又はその断片をアジュバントと共にウサギ等の動物に免疫することによって、抗血清として得ることができる。また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とミエローマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、この細胞を培養することによって調製することができる。これらの抗体は、後述のように、抗原性蛋白質の製造やマラセチアアレルゲン抗原エキスの力価測定等において使用することができる。前記のハイブリドーマとして、抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは５Ｂ４、抗原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは８Ｇ１１、また抗原性蛋白質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは１０Ｃ１とそれぞれ命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）〕にそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−５６０８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６０９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１０（原寄託日；平成７年９月１２日、国際寄託への移管請求日；平成８年７月２９日）として寄託されている。
（４）本発明の精製抗原性蛋白質又はその抗原性断片を有効成分とする診断薬
本発明は、マラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質又はそれに由来する少なくとも１個の抗原エピトープを有する抗原性断片を用いる、マラセチア菌を原因菌としたアレルギー性疾患又は感染症の診断薬を提供する。
ここで述べるマラセチア菌によるアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、マラセチア菌が原因となるあらゆるアレルギー性疾患を言う。また、マラセチァ菌による感染症とは、癜風、マラセチア毛包炎、フケ等のマラセチア菌が原因となるあらゆる感染症をいう。
本発明のアレルギー疾患診断薬は、マラセチア菌によるアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診断試薬として用いる場合は、本発明の単離された精製抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈し常法に従って用いられる。
また、アレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば本発明の単離された精製抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。使用方法は、通常、以下の操作手順による、即ち、アレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量に対し、該精製抗原性蛋白質の溶液を滴定試薬として滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する。
本発明の単離された精製抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片は、マラセチアアレルギー疾患の検出及び診断に用いることもできる。例えば、これはマラセチア菌に対する感受性を評価しなければならない患者から得た血液又は血液成分を、本発明の単離された精製抗原性蛋白質等と適当な条件下でインキュベートし、精製抗原性蛋白質と血液中の成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）との結合の程度を決定することにより診断を行うことができる。
（５）本発明の精製抗原性蛋白質又はその抗原性断片を有効成分とする治療薬
本発明は、マラセチア由来の単離された精製抗原性蛋白質又は少なくとも１個の抗原エピトープを有する抗原性断片を有効成分とする、マラセチア菌を原因菌としたアレルギー性疾患の治療薬を提供する。
本発明のアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与経路により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下剤、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬として使用することができる。本発明のアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人１回あたり約20mg以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明のアレルギー疾患治療剤は、マラセチア菌によるアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。アナフィラキシー誘発作用は少ないか又はなく、人体に対して安全に用いることができるからである。
本発明のマラセチアアレルギー疾患治療剤は、前記の精製された抗原性蛋白質、その抗原性断片を有効成分とするものであり、各種のマラセチア菌によるアレルギー疾患の治療剤および予防剤として用いられる。
本発明のアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限はない。例えば、本発明の精製抗原性蛋白質またはエピトープを有する抗原性断片を乾燥して粉末状とし、マラセチア菌によるアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いることができる。その場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された抗原性蛋白質をフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
減感作治療剤として用いるためには、エピトープを有し、かつマラセチア菌に特異的なＩｇＥに結合しないかまたは結合しても肥満細胞もしくは好塩基球からヒスタミンを放出させないものが特に有利である。
（６）マラセチアアレルゲンの定量方法
本発明はマラセチアアレルゲンの定量方法をも提供する。マラセチア由来の精製抗原性蛋白質に対する抗体は、マラセチア菌を原因菌としたアレルギー性疾患又は感染症の診断に使用されるマラセチアアレルゲンの免疫学的定量に用いることができる。
本発明の単離された精製抗原性蛋白質あるいは後述の組換え抗原性蛋白質をマラセチアアレルゲンの標準品として、それに対する抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ等の定量方法を確立することが容易である。マラセチア抗原エキスとしては、前記のように市販のものがいくつかある、また、マラセチア菌がヒトの頭皮を始めとする皮膚の常在菌であることから、市販のハウスダスト中にもマラセチアアレルゲンが含有されていると考えられる。これらの市販の抗原エキスについてマラセチアアレルゲンの含量を明らかにすることは、診断、治療上非常に有用である。
（７）本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質
本発明は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対する結合能を有するマラセチア由来の純粋な単離された前記（１）の精製抗原性蛋白質と同等の免疫学的性質を有する組換えマラセチア抗原性蛋白質（以下、単に「組換え抗原性蛋白質」と略す場合がある）を提供する。これは例えば、配列番号：８〜１４のアミノ酸配列を有するｒＭＦ−１〜７（ここで、ｒＭＦ−１〜７という表示は、ＭＦ−１〜７を遺伝子組換え手法により得たものを意味する。）からなるペプチド群、及び該ペプチドの機能的同等物が挙げられる。即ち、配列番号：８〜１４のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるペプチド、又は該ペプチドを含むペプチドであって、ｒＭＦ−１〜７に対応するＭＦ−１〜７のそれぞれが有する免疫学的性質と同等の免疫学的性質を有するもの、さらに配列番号：８〜１４のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ｒＭＦ−１〜７に対応するＭＦ−１〜７のそれぞれが有する免疫学的性質と同等の免疫学的性質を有するものが本発明に含まれる。
例えば、ｒＭＦ−１を例にすると、ＭＦ−１と同等の免疫学的性質を有する抗原性蛋白質であって、配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなるペプチド、又は該ペプチドを含む組換えマラセチア抗原性蛋白質がｒＭＦ−１に含まれる。さらに、配列表の配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつＭＦ−１と同等の免疫学的性質を有する組換えマラセチア抗原性蛋白質もｒＭＦ−１に含まれる。ｒＭＦ−２〜７についても同様である。
ここで、免疫学的性質が同等であるとは、同等のマラセチアアレルゲン活性を有することであり、マラセチアアレルゲン活性とは、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体、特にマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体との結合活性をいう。
本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質は、後述の本発明の遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌、出芽酵母などの酵母、麹菌などのカビ、昆虫細胞又は哺乳類細胞等で発現されるように適宜ベクターを選択し、発現ベクターを作製して該細胞に導入し、組換え蛋白質として得られる。従って、本質的にマラセチア由来の他の蛋白質を含まないものである。
本発明の組換え抗原性蛋白質の機能的同等物は、本発明の組換え抗原性蛋白質をコードするＤＮＡの特定部位の突然変異誘発を用い、既知の方法により組換え抗原性蛋白質の構造を改変することができる。例えば、後述のポリヌクレオチド上の１又は２以上の塩基の置換、挿入、欠失又は付加によってアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は付加を起こすことができる。さらに、生物活性を保持したままの変異体を選択することも可能である。
該変異体の作製方法としては、ギャップド・デュプレックス法〔ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Research）第12巻，第24号，第9441〜9456頁（1984）〕、デレーション法〔ジーン（Gene）第33巻，第103〜119頁（1985）〕、ＰＣＲ法〔ジーン（Gene）第102巻，第67-70頁（1991）〕、ウラシルＤＮＡ法〔メソッズ  イン  エンザイモロジー（Methods in Enzymology），第154巻，第367〜382頁（1987），プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proc Natl Acad Sci USA)，第79巻，第7258〜7262頁（1982）〕やカセット変異法（ジーン（Gene），第34巻，第315〜323頁（1985）〕等が知られている。
本発明の組換え抗原性蛋白質の精製を容易にしたり、溶解度を向上させるために、ペプチド鎖にタグ基を付加することができる。タグ基の例としてはポリヒスチジン等が挙げられ、金属アフィニティクロマトグラフィーで精製することができる。さらに必要ならタグ基と目的のペプチドの間にエンドプロテアーゼ特異的な認識部位を導入して該プロテアーゼで処理することにより、無関係な配列を含まないペプチドの単離を容易にすることができる。
ペプチド抗原に対する患者の脱感作に成功するためには、ペプチドへの官能基の付加又はペプチド中に疎水性Ｔ細胞エピトープ、疎水性エピトープもしくは疎水性領域を含有しないことにより、ペプチドの溶解度を上げることが必要である。また、ペプチド抗原内のＴ細胞エピトープの適した抗原プロセシングを助けるために、それぞれ少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む領域間にエンドプロテアーゼ認識部位を、前述の組換え又は合成により作製することができる。例えば、LysLys又はArgArgなどの帯電アミノ酸対をペプチド内の領域間に導入することができ、得られるペプチドはカテプシン及び／又は他のトリプシン様酵素による切断に感受性となり、１又は２個以上のＴ細胞エピトープを含むペプチド断片を生成することができる。さらにそのような帯電アミノ酸残基はペプチドの溶解度を向上させることも可能である。
（８）本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、組換えマラセチア抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチド又はその抗原性断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。これは、配列表の配列番号：１〜７に記載の塩基配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、ｒＭＦ−１〜７又はそれらと同等の免疫学的性質を有する抗原性蛋白質をそれぞれコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列表の配列番号：１〜７に記載の塩基配列、又はその一部からなる塩基配列において、１又は２以上の塩基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ｒＭＦ−１〜７と同等の免疫学的性質を有する抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、これらのポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な、マラセチアアレルゲン活性を有する抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
例えば、ｒＭＦ−１を例にすると、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列の全部、又は一部からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、ｒＭＦ−１又はそれと同等の免疫学的性質を有する抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが本発明に含まれる。また、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列、又はその一部からなる塩基配列において、１又は２以上の塩基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせている、ｒＭＦ−１と同等の免疫学的性質を有する抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが本発明に含まれる。さらに、これらのポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なマラセチアアレルゲン活性を有する抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ｒＭＦ−２〜７をコードするポリヌクレオチドについても同様である。
組換えマラセチア抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、以下の方法により、取得可能である。通常の各種のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製されたマラセチア抗原性蛋白質、又は一次元電気泳動もしくは二次元電気泳動により精製されたマラセチア抗原性蛋白質よりＮ末端アミノ酸配列又は内部アミノ酸配列を決定することが可能である。これらアミノ酸配列をコード可能なオリゴヌクレオチドを合成、精製する。通常、１種のアミノ酸は複数のコドンによりコードされているため、このオリゴヌクレオチドはこれら全てのコドンを考慮に入れて合成された混合物である。このオリゴヌクレオチドとオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用い、マラセチア菌より抽出、精製された全ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡ又は抽出、精製されたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行えば、本発明のマラセチア抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドが得られる。ＰＣＲに用いるプライマーは、抗原性蛋白質の二箇所のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを用いても良く、また１回のＰＣＲでｃＤＮＡが増幅しないときは、さらにＰＣＲを繰り返しても良い。
このＰＣＲ反応により得られたｃＤＮＡ断片をＤＮＡハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いて、マラセチア菌のポリ（Ａ）+ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡより作製されたｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、容易に全配列を含むポリヌクレオチド又はハイブリダイズ可能な抗原性蛋白質をコードするポリヌクレオチドを得ることが可能である。ライブラリー作製に用いられるベクターは、ファージ由来でもプラスミド由来でもどちらでも良い。
別の方法として、マラセチア菌より精製されたポリ（Ａ）+ＲＮＡよりｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製し、このライブラリーより産生された蛋白質に対してアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体と結合するクローンをスクリーニングすれば、マラセチアアレルゲン活性を有するマラセチア抗原性蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンが得られる。このｃＤＮＡクローンより発現する蛋白質は、マラセチア抗原性蛋白質である。
後述のマラセチア由来のエピトープをコードする遺伝子も本発明の発明の範囲内であり、マラセチアアレルゲンの全アミノ酸配列をコードする塩基配列より塩基の数が少ない配列を言う。一般に、エピトープをコードする塩基配列は成熟蛋白質をコードする塩基配列から選ばれるが、ある場合には本発明のリーダー配列部分を含むように選ぶのが望ましい。本発明の遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むリンカー配列及び／又は、所望の遺伝子のクローニング、発現あるいは精製に有用な配列も含むことができる。即ち、具体的には少なくとも１つのＢ細胞エピトープをコードし、かつ配列番号：１〜７の塩基配列の一部を有するポリヌクレオチド、又は化学的、物理的方法により一部を改変させたポリヌクレオチドも本発明に含まれる。例えば、本発明に使用した以外のＭ．ファーファおよびそれ以外のマラセチア属の真菌、例えばM.pachydermatis, M.sympodialisの有する、対応するポリヌクレオチドも本発明に含まれる。すなわち、Ｍ．ファーファはその生理学的性質から５群に分類可能であり（医真菌誌、内田勝久）、それぞれが対応する遺伝子を有していると思われ、これらも本発明に含まれる。
さらに、本発明には配列番号：１〜７の塩基配列又は少なくとも１つのＢ細胞エピトープをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明において、ハイブリダイズ可能とは、次のような条件でハイブリダイズできることをいう。すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たなＤＮＡについて、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、得られたＤＮＡが目的とするものであるかどうかを確認することができる。
本発明の遺伝子とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、例えば、本発明で使用したＭ．ファーファＴＩＭＭ２７８２菌は配列番号：５のＭＦ−５遺伝子を有すると共に、この塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する、図１７に示した推定塩基配列を有する遺伝子をも有している。両遺伝子のコードする蛋白質は既知の蛋白質の中でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＤＬＤＨ）とホモロジーを有する。また、本菌は配列番号：６のＭＦ−６遺伝子を有すると共に、この塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する、図１８に示した推定塩基配列をも有する遺伝子も有している。両遺伝子のコードする蛋白質は既知の蛋白質の中でマレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）とホモロジーを有する。さらに、本発明のＭＦ−１遺伝子（配列番号：１）とＭＦ−２遺伝子（配列番号：２）も塩基配列で６０％以上のホモロジーを有し（図１９）、ハイブリダイズ可能である。両遺伝子のコードする蛋白質はCandida boidinii由来のペルオキシゾーム膜蛋白質（ＰＭＰ−２０）とホモロジーがある。また、本発明のＭＦ−３遺伝子（配列番号：３）とＭＦ−４遺伝子（配列番号：４）も塩基配列上６０％以上のホモロジーを有し（図２０）、相互にハイブリダイズ可能である。両遺伝子のコードする蛋白質はスーパーオキシドデスムターゼとホモロジーがあり、実際その酵素活性を有している。従って、アレルギーの原因となっている他の真菌の有する、本発明の塩基配列とハイブリダイズ可能な、組換え抗原性蛋白質をコードする遺伝子も本発明に含まれる。
本発明の遺伝子は特に限定されないが、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、天然又は合成どちらでも構わない。本発明の遺伝子を発現させるために適したプロモーター、エンハンサー及び他の発現調節要素を含む発現ベクターは、例えば、１９８９年コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、Ｊ．サンブルック（J.Sambrook）ほか著、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory manual）第２版に記載されているものを利用することができる。哺乳類、酵母、カビ、又は昆虫細胞で発現された組換え体は、グリコシル化及び適したジスルフィド結合等の修飾を受けることができる。酵母細胞での発現に適したベクターとしては、ｐＹＥＳ２，ＹｅｐＳｅｃ等が挙げられ、入手可能である。昆虫細胞では、バキュロウイルスベクターが商業的に入手でき（ファルミンゲン社製、サン  ディエゴ、ＣＡ）、哺乳類の細胞ではｐＭＳＧベクターが入手可能である（ファルマシア社製）。
大腸菌における発現の場合、ｐＴＶ１１８ベクター等を使用すればよい。また、ｐＭＡＬ、ｐＳＥＭ、ｐＧＥＸを用いると、それぞれマルトース結合蛋白質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質として発現させることができる。融合蛋白質として発現させる場合、キャリヤー蛋白質とマラセチア由来の抗原性蛋白質又はその断片の間の融合連結部位に酵素認識部位を導入するのが特に有利である。融合蛋白質として単離精製後、酵素認識部位での切断、続いて従来の方法を用いた生化学的精製手段により、抗原性蛋白質又はその断片のみを回収することができる。酵素認識部位には血液凝固因子Ｘａまたはトロンビンの認識部位が含まれ、これらの酵素は市販のものが利用できる。さらに、ＩＰＴＧ又は温度等による発現誘導可能なベクターも利用できる。
発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、又はエレクトロポレーション法などの従来法を用いて行う。
（９）本発明の抗原性断片
本発明は、少なくとも１つの抗原エピトープを含む抗原性断片を提供し、これにはその機能的に同等な誘導体も本発明に含まれる。具体的には、配列表の配列番号：８〜１４のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなる組換えマラセチア抗原性蛋白質に含まれる抗原エピトープを含む抗原性断片である。本発明の抗原性断片は、マラセチア菌に特異的なＩｇＥ抗体に対して結合能を有しないか、ＩｇＥ抗体への結合が起こる場合でも、そのような結合は肥満細胞又は好塩基球からヒスタミンを放出させない程度であることを特徴とする。また、本発明の抗原性断片は、マラセチア由来の抗原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥ抗体に結合することを特徴とする。また、本発明の抗原性断片は、抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ賦活活性を有することを特徴とする。
本発明の抗原性断片は、例えば、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む抗原性断片が挙げられる。あるいは、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む抗原性断片が挙げられ、例えば、該Ｂ細胞エピトープが配列表の配列番号：４２〜４４のいずれかに記載のアミノ酸配列から選ばれるものが挙げられる。これらの抗原性断片はペプチド合成技術を利用して化学的に合成することもできるし、遺伝子の一部を用いて形質転換された宿主細胞中で目的のエピトープが発現された組換えマラセチアアレルゲンとしても得ることができる。例えば、抗原性蛋白質を重複のない所望の長さの断片に任意に分けたり、好ましくは所望の長さの重複したペプチド断片に分け、調製する。それらのペプチド断片を抗体との結合作用を測定したり、免疫応答活性を測定する（Ｔ細胞応答性活性化作用、Ｔ細胞アナージー作用等）ことにより、抗原性を決定する。
（１０）本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片に対する抗体又は抗体断片
本発明は、前記組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片に特異的に結合する抗体又は抗体断片を提供する。本発明の抗体は常法により得ることができ、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体断片は前記組換えマラセチア抗原性蛋白質又は抗原性断片に特異的に結合するものであれば特に限定されない。
（１１）本発明の合成オリゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマー
本発明は、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ、合成オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。例えば、本発明は、配列番号：１〜７の塩基配列の全部または一部を含有するプローブ又はプライマーを含む。このプローブを用いたハイブリダイゼーション法により、同等の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子を単離することができる。このプローブは、例えば前記遺伝子または遺伝子断片を適当なベクターに挿入し、大腸菌に導入して複製させた後、菌体破砕液からフェノール等により抽出する。そして、該挿入部位を認識する制限酵素で切断して電気泳動を行った後、ゲルより切り出して調製する。また、プローブは、配列番号：１〜７の塩基配列に基づき、ＤＮＡ合成機による化学合成やＰＣＲによる遺伝子増幅技術によっても調製できる。該プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位体や蛍光で標識することもできる。
（１２）本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又は抗原性断片を有効成分とする診断薬
本発明は、本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又は抗原性断片を有効成分とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の診断薬を提供する。ここで述べるマラセチアアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、マラセチア菌が原因となるあらゆるアレルギー性疾患を言う。また、マラセチア感染症とは、癜風、マラセチア毛包炎、フケ等のマラセチア菌が原因となるあらゆる感染症をいう。
本発明のアレルギー疾患診断薬は、マラセチア菌によるアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診断試薬として用いる場合は、本発明の組換え抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈し常法に従って用いられる。
また、アレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば本発明の組換え抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。使用方法は、通常、以下の操作手順による、即ち、アレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量に対し、該組換え抗原性蛋白質の溶液を滴定試薬として滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する。
本発明の組換え抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片は、マラセチアアレルギー疾患の検出及び診断に用いることもできる。例えば、これはマラセチア菌に対する感受性を評価しなければならない患者から得た血液又は血液成分を、本発明の組換え抗原性蛋白質等と適当な条件下でインキュベートし、組換え抗原性蛋白質と血液中の成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）との結合の程度を決定することにより診断を行うことができる。
（１３）本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又は抗原性断片を有効成分とする治療薬
本発明は、本発明の組換えマラセチア抗原性蛋白質又は抗原性断片を有効成分とするマラセチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の治療薬を提供する。マラセチア由来の抗原性断片を治療目的で用いる場合、本来のマラセチアアレルゲンとＩｇＥが結合する場合より実質的に低い濃度で、そのようなＩｇＥと結合し、その際、肥満細胞又は好塩基球からメディエーターを遊離しない抗原性断片が好ましい。Ｔ細胞応答性活性化作用を有すること、及び／又はＴ細胞アナージー作用を誘起することができるものがさらに好ましい。組換えマラセチア抗原性蛋白質又はその抗原性断片は、実験動物、ヒトのボランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、ＲＡＳＴ、ＥＬＩＳＡ、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験において評価することができる。
本発明の組換え抗原性蛋白質並びにその遺伝子は、マラセチアアレルギー疾患治療剤として利用可能である。該治療剤は、前記の組換えマラセチア抗原性蛋白質、その抗原性断片、あるいはエピトープを有するペプチドを有効成分とするものであり、各種のマラセチア菌によるアレルギー疾患の治療剤として用いられる。さらに、前記の遺伝子も治療剤として利用することができ、その際、哺乳類で発現可能なベクターに挿入し、裸のＤＮＡ分子として、または適当なウイルスベクターに組み込んでウイルス粒子として投与すればよい。この投与により、トレランスを誘導し、疾患を治療することが可能である。
本発明のアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限されないが、例えば、前記の方法により調製された組換えマラセチア抗原性蛋白質、その抗原性断片、もしくはエピトープを有するペプチド、または該遺伝子をベクターに組み込んだＤＮＡ分子を乾燥して粉末状で採取し、マラセチア菌によるアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本発明のアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された組換えマラセチア抗原性蛋白質をフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
本発明のアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与経路により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下剤、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬として使用することができる。本発明のアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人１回あたり約20mg以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明のアレルギー疾患治療剤は、マラセチアアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。アナフィラキシー誘発作用は少ないか又はなく、人体に対して安全に用いることができるからである。
本発明のマラセチアアレルギー疾患治療剤は、前記の組換え抗原性蛋白質、その抗原性断片等を有効成分とするものであり、各種のマラセチアアレルギー疾患の治療剤および予防剤として用いられる。減感作治療剤として用いるためには、エピトープを有し、かつマラセチア菌に特異的なＩｇＥに結合しないかまたは結合しても肥満細胞もしくは好塩基球からヒスタミンを放出させないものが特に有利である。
以下、実施例および比較例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
実施例１
マラセチア由来の抗原性蛋白質の単離及びその物理化学的性質
１−１）マラセチア部分精製粗抗原２７８２の調製
M. furfur TIMM2782株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１１）をディクソン培地（バクトマルトエキストラクトブロス6.0％、バクトオックスゴール2.0％、ツィーン40 1.0％、グリセロールα−モノオレイン酸0.25％）１５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容三角フラスコ50本中で27℃、５日間振とう培養して得た培養物から、遠心分離によって集めた菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した後、菌体湿重量の２倍量のＰＢＳに浮遊させ、等量の０．５ｍｍ径のガラスビーズを加え、ＭＳＫセルホモゲナイザー（Ｂ．ブラウン社製）により菌体を破砕抽出した。得られた菌体破砕抽出液を遠心分離（18,000rpm, 30min）にかけ、上清を得た。この上清を精製水に対して透析、0.45μmのメンブレンフィルターでろ過滅菌後、凍結乾燥することによりマラセチア粗抗原２７８２約900mgを得た。
前記マラセチア粗抗原２７８２約800mgを0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解して、硫安塩析を行った。硫安50％から90％飽和で沈殿する画分を遠心で集め、0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、続いて同緩衝液に透析し、マラセチア部分精製粗抗原２７８２とした。
１−２）マラセチア由来の抗原性蛋白質の探索
マラセチア部分精製粗抗原２７８２を凍結乾燥後、４ｍｇ／ｍｌとなるように２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で溶解後、そのうち１００μｌを２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する同緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPhenyl Superose PC1.6/5（カラム容積0.1ml、ファルマシア社製）にかけ、0.1Ｍ同緩衝液で硫酸アンモニウム２Ｍから０Ｍまでの直線的グラジエント溶出を行った。得られた抗原性蛋白質含有画分をビストリス緩衝液（pH6.5）に対して透析した後、MonoQ PC 1.6/5（カラム容積0.1ml、ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で食塩0Mから0.3Mまでの直線的グラジエント溶出を行った（図１、流速：100μl／分、検出：280nm）。50μlずつ26本に分画後、分画１〜２０について患者血清を用いたDirect RAST（EIA）法によるＩｇＥ抗体結合性を調べた。
即ち、各分画を0.01％ツィーン20入り0.1Mほう酸緩衝液（pH8.0）で10、100、1000倍希釈し、その４５μlを臭化シアンで活性化したペーパーディスクにカップリングし、ついでエタノールアミンでブロッキングした。その後、各ディスクに５倍希釈したプール血清（ＲＡＳＴ法で高値を示した患者血清１０名分をまとめたもの）50μlずつを加えて、その後、希釈したβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、415nmの吸光度を測定した。その結果を図２に示した。図２より複数のアレルゲン蛋白質が存在することが明らかであるが、例えばフラクション６及びフラクション１２、１３付近に患者ＩｇＥと結合する蛋白質が存在する。
また、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により蛋白質の検出（図３）を行うと共に、代表的画分について下記のようにイムノブロッティングを行った。
即ち、それぞれの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜へトランスファーし、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、そして患者プール血清で処理した。その後、希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、アレルゲン蛋白質を検出した。その結果、図４のように、複数のアレルゲン蛋白質の存在が明らかとなった。例えば、フラクション12に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の20kDa付近に検出される蛋白質（アレルゲンMF−１として単離した）等がアレルゲン蛋白質として含まれていることが明らかである。フラクション６には、フラクション12の20kDaとほぼ同じ分子量のアレルゲン蛋白質（アレルゲンMF−２として単離した）および80kDa付近に検出される蛋白質等が含まれていることが明らかである。
１−３）精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−３、MF−４及びMF−13の単離
前記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の凍結乾燥物０．２５ｍｇをビストリス緩衝液（pH6.5）溶液１ｍｌに溶解後、１−２）に示したMono Qによるクロマトグラフィーと同様の方法で、Mono Q HR 5/5（カラム容積１ml、ファルマシア社製）にかけ、ピーク１（図１のフラクション５，６対応分画）、ピーク２（図１のフラクション10，11，12対応分画）、ピーク３（図１のフラクション15，16対応分画）、ピーク４（図１のフラクション18，19，20対応分画）を集めた。それぞれのピークについて、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、最後にMono Qによるイオン交換クロマトグラフィーを行い、ピーク１よりMF−２、ピーク２よりMF−１、ピーク３よりMF−３、ピーク４よりMF−４と命名した、純粋な抗原性蛋白質を単離した。また、マラセチア部分精製抗原２７８２のMono Q非吸着画分を疎水クロマトグラフィーにかけ、MF−13と命名した純粋な抗原性蛋白質を単離した。単離された５種類の蛋白質については、上記の患者プール血清を用いたEIA法によるＩｇＥ抗体結合性を調べることにより、マラセチアアレルゲン蛋白質であることを確認した。
精製方法について詳しく説明すると、Mono Qにより分離されたピーク１〜４をそれぞれ4M硫酸アンモニウムを含有する0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で２倍に希釈後、2M硫酸アンモニウムを含有する0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPhenyl Superose PC1.6/5（カラム容積0.1ml、ファルマシア社製）にかけ、0.1M同緩衝液で硫酸アンモニウム2Mから0Mまでの直線的グラジエント溶出を行った。得られた抗原性蛋白質含有画分を限外濾過膜（MW 10,000）で濃縮後、セファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5x100cm）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量４万付近に溶出される画分を得た。さらに、得られたゲルろ過物を再度Mono Q PC 1.6/5によるイオン交換クロマトグラフィーを行い、前記と同様の溶出を行い、抗原性蛋白質を単離した。即ち、ピーク２よりMF−１（図５）、ピーク１よりMF−２を（図６）、ピーク３よりMF−３を（図７）、ピーク４よりMF−４を（図８）単離した。また、Mono Q非吸着画分を上記と同じPhenyl Superose PC1.6/5（カラム容積0.1ml、ファルマシア社製）にかけ、0.1M同緩衝液で硫酸アンモニウム2Mから0Mまでの直線的グラジエント溶出（図２４）を行い、MF−13と命名した、純粋な抗原性蛋白質を単離した。
１−４）二次元電気泳動によるＭＦ−１〜４の同定及び精製抗原性蛋白質ＭＦ−５〜１２の単離
さらに前記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の１５０μｇを８Ｍ尿素、０．５％ＮＰ−４０、２％β−メルカプトエタノール、０．８％Pharmalyte（ファルマシア製）、０．０１％ブロモフェノールブルーを含む溶液に溶解した。一次元目の等電点電気泳動は、Immobiline DryStripゲル（ｐＨ４〜７、ファルマシア製）を用いて常法により行った。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ExelGel SDS-Homogeneous（１２．５％、ファルマシア社製）を用いて行った後、ＣＢＢ染色により蛋白質の検出（図９）を行うと共に、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写後、皮膚テストにおいて粗抗原に対して陽性で、ＲＡＳＴ法で高値を示したアレルギー患者血清（ＩｇＥ抗体）および健常者血清（ＩｇＥ抗体）を用いてイムノブロットを行い、陽性スポットを検出した（図１０）。陽性スポットのうち、陽性率が高いと判断された分子量約２１ｋＤａで等電点約５．３、分子量約２０ｋＤａで等電点約５．８、分子量約２７ｋＤａで等電点約６．５、分子量約２６ｋＤａで等電点約６．３のスポットについて、Ｎ末端配列の結果などをもとに、各々ＭＦ−１、ＭＦ−２、ＭＦ−３、およびＭＦ−４であると同定した。また、新たに分子量約６６ｋＤａ、等電点約６．１（ＭＦ−５と命名）、及び分子量約４３ｋＤａ、等電点約６．２（ＭＦ−６と命名）、分子量約１５ｋＤａ、等電点約６．０（ＭＦ−７と命名）、分子量約３０ｋＤａ、等電点約５．４（ＭＦ−８と命名）、分子量約４０ｋＤａ、等電点約５．３（ＭＦ−９と命名）、分子量約４４ｋＤａ、等電点約６．２（ＭＦ−１０と命名）、分子量約４５ｋＤａ、等電点約６．４（ＭＦ−１１と命名）、分子量約１００ｋＤａ、等電点約５．０（ＭＦ−１２と命名）の蛋白質がアレルギー患者ＩｇＥ抗体に結合する蛋白質であることを見出し、これらの蛋白質をゲルより抽出し、単離した。
１−５）精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６、MF−７、MF−８、MF−９、MF−10、MF−11、MF−12、MF−13の物理化学的性質
単離したMF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−13はSDS-PAGEで単一のバンドを示した（図１１）。MF−１〜MF−13のSDS-PAGE、等電点電気泳動による分析の結果を表１に示した。ＭＦ−１〜４の未変性下での等電点電気泳動は、IsoGel Plate pH3〜10（ＦＭＣ社製）を用いて常法により行った。ＭＦ−５〜１２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動による分析結果は図９の二次元電気泳動の結果より算出した。
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１−６）精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−13の大量調製
上記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）溶液を予め同緩衝液で平衡化しておいたDEAE−セルロースカラムに吸着させた。同緩衝液で洗浄後、0.1M、0.2M、0.5Mの食塩を含む同緩衝液で段階的に溶出させた。0.1M食塩入り緩衝液溶出画分を限外濾過膜（MW 10,000）で濃縮後、セファクリルS-200HRカラムクロマトグラフィー（1.5x90cm）にかけた。見掛け上の分子量３〜５万の溶出画分を集め、限外濾過膜（MW 10,000）で濃縮後、セファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5x100cm）でクロマトグラフィーを行い、分子量約４万に溶出される画分Ｆ２を得た。このＦ２画分を0.5M食塩入り0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に対して透析後、予め亜鉛イオンをキレートさせ、同緩衝液で平衡化したキレーティングセファロースファーストカラム（1x15cm）クロマトグラフィーにかけた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液のpHを7.0、6.0、5.0、4.0と低下させて溶出した。pH5.0の緩衝液で溶出される画分を集め濃縮後、セファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5x100cm）クロマトグラフィーで更に精製することにより、MF−２を単離した。
亜鉛キレートクロマトグラフィーにおける素通り画分は、次に銅キレートクロマトグラフィーで精製した。即ち、予め銅イオンをキレートさせ、0.5M食塩入り0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したキレーティングセファロースファーストカラム（1x15cm）クロマトグラフィーを行った。同緩衝液で洗浄後、緩衝液のpHを7.0、6.0、5.0、4.0と低下させて溶出した。pH4.0溶出画分を限外濾過膜（MW 10,000）で濃縮後、前記セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで更に精製し、分子量約４万の溶出画分MF−１を得た。また、素通り画分は限外濾過膜（MW 10,000）で濃縮後、前記セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製し、分子量約４万の溶出画分を取得後、更にMono Q陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製し、MF−３及びMF−４を単離した。
上記のマラセチア部分精製抗原２７８２DEAE−セルロースカラム非吸着画分の一部を0.05M NH4HCO3で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 75pg（ファルマシア社製）にかけ、分子量２万以下の画分を集めた。得られた画分を0.05M酢酸緩衝液（pH5）で平衡化したHiTrap SPに吸着させ、0.2M NaClを加えた同緩衝液で溶出させた。溶出画分を0.05M NH4HCO3で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 75pgにかけ、MF−13を単離した。
最終的に、約0.5ｇのマラセチア部分精製粗抗原２７８２を出発材料として用い、MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−13を各々10mg、２mg、３mg、２mg、２mgずつ得た。このように大量調製された抗原性蛋白質は、ＳＤＳ電気泳動、等電点電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析において、前記１−４）及び実施例１０で述べた結果と同様であった。
実施例２
モノクローナル抗体の作製
２−１）マウスの免疫、細胞融合及びハイブリドーマのクローニング
実施例１のようにして得られた、精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２及びMF−３を、それぞれ10μgずつフロイント完全アジュバントに懸濁させ、５週令の雄のBALB/cマウスの腹腔内に投与した。４週後に、フロイント完全アジュバントに懸濁させたアレルゲン20μgで腹腔内に追加免疫後、更にその４週後に生理食塩水に溶解した同じアレルゲン20μgを静脈内に投与した。
最終免疫から３日後に脾臓細胞を取り出し、４：１の割合でミエローマ細胞（P3X63-Ag8.653）と混合し、43％ポリエチレングリコール2000を加えて細胞融合を実施した。これを96穴マイクロプレートのウェルに脾臓細胞２ｘ１０5個／ウェルの割合でまき込み、HAT培地中でハイブリドーマを選択的に増殖させた。培養上清を用いて目的の抗体産生の有無をELISAにより測定し、抗体産生細胞を選択した。その結果、精製抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして５Ｂ４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６０８）を取得した。精製抗原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして８Ｇ１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６０９）を取得した。精製抗原性蛋白質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして１０Ｃ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１０）を取得した。
２−２）腹水の調製及びモノクローナル抗体の精製
予めプリスタンで前処理したヌードマウスの腹腔内に107個のハイブリドーマを注射して増殖させ、１〜２週後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＡカラムのキット（アマーシャム社製）によりモノクローナル抗体を精製した。MF−１に対するＭ−４０モノクローナル抗体、MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体、MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を得た。これらのモノクローナル抗体のアイソタイプは、すべてＩｇＧ１であった。
２−３）モノクローナル抗体の固定化カラムの調製及び同カラムを用いた抗原性蛋白質MF−３の精製
上記のＭ−１モノクローナル抗体１５mgをカップリング緩衝液（0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3）で透析後、１ｇの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に常法に従ってカップリングさせ、抗体の固定化樹脂を調製した。
得られた樹脂を５mlの小カラムに移し、マラセチア部分精製粗抗原２７８２を４０mgとり、これを0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解後、カラムにかけた。0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で充分に洗浄後、抗体に結合した抗原性蛋白質を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（pH2.5）で溶出した。溶出液は直ちに１Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を加えて中性に戻した後、限外ろ過膜（MW 10,000）で濃縮後、上記と同様にセファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5x100cm）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、純度の高いMF−３を約300μg単離した。
実施例３
精製抗原性蛋白質の診断への応用
３−１）RAST法による特異的ＩｇＥ抗体の測定方法
臭化シアンによるペーパーディスクの活性化、及び精製アレルゲンのペーパーディスクへのカップリングは宮本らの方法（アレルギー、２２巻、５８４−５９４頁、１９７３年）に準じて行った。ポリスチレンチューブにアレルゲンをカップリングさせたペーパーディスク１枚と患者血清５０μlを加えて、室温で３時間インキュベートした。0.2％のツィーン20を含む生理食塩水でペーパーディスクを３回洗浄後、ファルマシア製RAST-RIAキットの125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体50μlを加えて室温で一晩インキュベートした。再度３回洗浄後、ガンマカウンターで放射能を測定した。同時に測定したキットのリファレンス試薬で作成した標準曲線からＩｇＥ抗体価を算出した。標準曲線の上限（＞17.5PRU/ml）より高い値が得られた検体は、ウマ血清で10倍、又は100倍に希釈してから再測定を行い、抗体価を算出した。
３−２）精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４、MF−13による診断
アトピー性皮膚炎（Atopic Dematitis：以下ＡＤと略す。）、アレルギー性喘息（Bronchial Asthma：以下ＢＡと略す。）及び両方の合併（ＡＤ＋ＢＡ）の患者に対して、マラセチア粗抗原による皮膚試験を実施したところ、ＡＤ患者が５７名中４３名（７５％）、ＢＡ患者が９１９名中１０８名（１２％）、ＡＤ＋ＢＡ患者が１０２名中４７名が陽性であり、ＡＤ患者で非常に高い陽性率を示した。また、皮膚テスト陽性のＡＤ、ＢＡ、及びＡＤ＋ＢＡ患者中、各々１００％、５９％、及び８５％の患者がＲＡＳＴ法によるＩｇＥ抗体測定において陽性であった。
マラセチア粗抗原を用いた皮膚試験で陽性、更にRAST陽性（スコア１以上）の患者76例（ＡＤ：30名，ＢＡ：20名，ＡＤ＋ＢＡ：26名）を対象にして、３種類の精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４に対するＩｇＥ抗体価をRAST法（RIA法）で測定した。皮膚試験陰性者（健常人）12名についても同様に抗原性蛋白質に対するＩｇＥ抗体価を測定した。その結果、表２に示すように非常に高率に患者血清中に抗原性蛋白質に対するＩｇＥ抗体が存在することが明確になった。特に、MF−１、MF−２に対する陽性率が高かった。更に、驚くべきことにＩｇＥ抗体価が非常に高く（表３）、特にＡＤの患者ではMF−１、MF−２に対して平均100ＰＲＵ、最高1000ＰＲＵを超える患者もあった。また、マラセチア粗抗原に対するRAST陽性の患者全員の血清中に精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４のいずれかに対するＩｇＥ抗体が存在していた。
また、マラセチア粗抗原を用いた皮膚試験で陽性、更にRAST陽性のＡＤ患者１１例について、MF−13に対するＩｇＥ抗体価をRAST法で測定した。その結果、１１名中９人がRAST陽性であった。
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３−３）精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−３、MF−４の免疫学的性質
患者プール血清を用いたＲＡＳＴcross-inhibitionテストで、３種の精製抗原性蛋白質（MF−１、MF−２、MF−４）の交差反応性を見たところ（表４）、互いに交差しなかった。即ち、それぞれに対して特異的１ｇＥ抗体が患者血清中に存在することが明らかとなった。
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次に、精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４を段階的に希釈し、抗原としての強さをDirect RAST EIA法により測定した。すなわち、精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４の希釈液を臭化シアンで活性化したペーパーディスクにカップリングし、ついでエタノールアミンでブロッキングした。その後、各ディスクに５倍希釈したプール血清５０μｌずつを加えて、その後、希釈したβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１２に示したが、MF−１が最も低濃度で患者血清ＩｇＥに結合することが明らかとなった。
また、精製抗原性蛋白質MF−３を段階的に希釈し、抗原としての強さをELISA法により測定した。すなわち、精製抗原性蛋白質MF−３の希釈液をマイクロプレートにコーティングした後、０．０１％ツィーン２０を含む生理食塩水で洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし、０．０１％ツィーン２０を含む生理食塩水で洗浄した後、プール血清を加えた。３７℃、２時間放置後、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を加え、次に基質溶液を加え、発色後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１３に示した。
実施例４
精製抗原性蛋白質MF−２のシステイン残基のピリジルエチル化物の調製
精製抗原性蛋白質MF−２（0.04mg）をホウ酸緩衝食塩水（pH8.0）200μlに溶解し、これに800μlの５Ｍ塩酸グアニジン、１μlの４−ビニルピリジン、２μlのトリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37℃で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere C4-300、２×150mm、ウォーターズ（Waters）社製；溶媒：0.05％TFA／水で15分洗浄、60分後0.05％TFA/アセトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶出；流速：220μl／分；検出：220nm；カラム温度：40℃、図１４）により単離精製した。得られたものは、非還元条件（メルカプトエタノール非存在）下でのＳＤＳ電気泳動において２０ｋＤａ付近に泳動されること、また、リジルエンドペプチダーゼ消化後得られたペプチド断片（図１５）のうち、配列番号47及び48のＮ末端アミノ酸配列を有するペプチド断片（各々２８．２０、３１．１５に溶出）がピリジルエチルシステイン基を有することから、MF−２のピリジルエチル化物であることが明らかとなった。得られたMF−２のピリジルエチル化物は、MF−２と同様にマラセチアアレルギー患者血清ＩｇＥへ結合することが、ＳＤＳ電気泳動後のイムノブロッティングにより確認された。
実施例５
精製抗原性蛋白質MF−３由来の抗原性断片ペプチドの単離
精製抗原性蛋白質MF−３（0.04mg）をホウ酸緩衝食塩水（pH8.0）100μlに溶解し、これに900μlの５Ｍ塩酸グアニジン、１μlの４−ビニルピリジン、２μlのトリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37℃で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere C4-300、２×150mm、ウォーターズ（Waters）社製；溶媒：0.05％TFA／水で15分洗浄、60分後0.05％TFA/アセトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶出）により単離精製した。得られた精製抗原性蛋白質MF−３の塩酸グアニジン処理体に５０mM N−エチルモルフィン−酢酸（pH9.0）100μl、リジルエンドペプチダーゼ（Achromobacter protease I、和光純薬社製）を加え、37℃で一晩反応後、ＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere C18-300、２×150mm、ウォーターズ（Waters）社製；溶媒：0.05％TFA/水から0.05％TFA/アセトニトリル60％までの直線的グラジエント溶出；流速：200μl／分；検出：214nm；カラム温度：40℃；図１６）にかけた。各ペプチド断片を分取、凍結乾燥後、各ペプチド断片についてマラセチアアレルギー患者血清ＩｇＥに対する結合性を下記のようにＥＬＩＳＡ法により測定した。
即ち、各ペプチド断片（各約１０〜１００ｐｍｏｌ）をペプチドコーティングキット（宝酒造製）を用いて、マイクロプレートにコーティング後、0.01％ツィーン20を含む生理食塩水で洗浄し、３％ＢＳＡでブロッキングし、そして患者血清で処理した。その後、希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、一定時間後吸光度を測定し、抗原性断片を検出した。その結果、20.02、21.41、24.07分付近に溶出されるピークに患者血清ＩｇＥと結合する抗原性断片が存在すると思われた。これらのうち、21.41分のピークはＨＨＱＴＹＶＮＮＬＮＡＡＸＫ（配列番号：５８、Ｘは未決定のアミノ酸である）からなるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれていた。
実施例６
リンパ球幼若化試験
被験者［アレルギー患者８名（表５中No．１〜８）、健常人２名（表５中No．９、10）］より静脈血をヘパリン採血し、フィコール比重遠心法でリンパ球を分離した。細胞数が５×１０5／mlになるように１０％ＦＣＳ添加RPMI1640培地で調製後、0.2mlずつ96ウェルマイクロプレートに分注し、上記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２を10、100μg/mlとなるように、精製抗原性蛋白質（MF−１、MF−２、MF−４）を１、10μg/mlとなるように添加し、５％CO2、37℃で高湿度条件下に５日間培養した。４日目に、0.5μCiのトリチウム化（3Ｈ）−チミジンを加えた。培養終了後、リンパ球を集め、液体シンチレーションカウンターで3Ｈ−チミジン取り込み量を測定した。実験は３連で行い、その平均値を用い、抗原非添加群と添加群の3H−チミジン取り込み量の比をＳＩ（stimulation index）として表わした。結果を表５に示した。表５より明らかなように、患者No．４由来のリンパ球は、精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２に反応して増殖している。また、患者No．１、No．６由来のリンパ球は特にMF−２に反応して増殖している。
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実施例７
マラセチアアレルギー皮内反応診断試薬および診断用滴定試薬の調製
精製されたアレルゲン活性成分を乾燥して粉末状で採取して、マラセチアアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びマラセチアアレルギー診断用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には0.5％フェノールを添加した0.9％生理食塩水を溶媒とし、アレルゲン活性成分の20万倍希釈液を調製して用いる。また、マラセチアアレルギー診断用滴定試薬には、アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒスタミン遊離滴定用試薬の原液としてその希釈液を用いる。
実施例８
減感作治療用抗原製剤の調製
精製されたアレルゲン活性成分を乾燥して粉末状で採取して、マラセチアアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いる。アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度で0.5％フェノールを添加した0.9％生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液とする。
実施例９
室内塵中の精製抗原性蛋白質MF-1の定量とマラセチアの培養
気管支喘息患者住居の室内や寝具などから掃除機により塵を一定条件で採集した。MF−１の定量は、ウサギポリクローナル抗体と実施例２−２）で得られたマウスモノクローナル抗体（Ｍ−４０）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行い、塵は１：１０（ｗ／ｖ）で抽出した上清をMF−１定量のための試料とした。マラセチアの培養のためには、塵を滅菌水で１：１０（ｗ／ｖ）となるように混濁し、平板培地上にまいた。また、寝具表面に滅菌テープを一度貼り、剥がして平板培地上に置いた。培地はＰＤＡ、Ｍ４０ＹＡ、ディクソン寒天培地を用いて、２５℃で１週間培養後コロニー数を算定した。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、１ｎｇ／ｇ塵以上のMF−１の定量が可能であり、寝具由来の塵２４検体中１６検体に８７．１〜１．１ｎｇ／ｇ塵のMF−１が検出された。テープ法による寝具表面のマラセチアの培養成績は、２４検体中１０検体が陽性であった。なお、２４検体中、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるMF−１の検出結果と培養成績の結果が一致していた検体は、陽性８検体、陰性６検体の合計１４検体（５８％）であった。
実施例１０
精製抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６、MF−７、MF−10、MF−13の部分アミノ酸配列の決定
Ｎ末端アミノ酸配列分析を常法により行った。その結果、MF−１は
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
MF−２については、Ｎ末端がブロックされていたため、ピリジルエチル化後、リジルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片をC18逆相HPLCにより分析した。得られた種々のピークを分取し、いくつかについてアミノ酸配列決定を行い、27.07、28.20、31.15分に溶出された３種類のペプチド断片のＮ末端アミノ酸配列をそれぞれ、
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と決定した。
MF−３についても、Ｎ末端がブロックされていたため、ピリジルエチル化後、リジルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片をC18逆相HPLCにより分析した。得られた種々のピークを分取し、いくつかについてアミノ酸配列決定を行い、35.68、36.68、29.15分に溶出された３種類のペプチド断片のＮ末端アミノ酸配列をそれぞれ
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と決定した。
また、MF−４は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
また、MF−５は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
また、MF−６は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
また、MF−７は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
また、MF−10は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
また、MF−13は、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、
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のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
その他の抗原性蛋白質はＮ末端ブロック等のために解析できなかった。
既知蛋白質とのホモロジー検索の結果、MF−２は、配列番号：４８の部分アミノ酸配列がカンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）由来のペルオキシゾーム膜蛋白質（PMP−２０）と、MF−３は上記の部分アミノ酸配列が鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼとホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。また、MF−４は、上記のＮ末端アミノ酸配列が、MF−３と同じく鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼとホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。また、ＭＦ−５は上記のＮ末端アミノ酸配列からデヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼとホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。また、ＭＦ−６は上記のＮ末端アミノ酸配列からマレートデヒドロゲナーゼとホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。また、ＭＦ−７、ＭＦ−１０についてはそれらのＮ末端アミノ酸配列からは既知の蛋白質とのホモロジーは見出せなかった。またＭＦ−１３は上記のＮ末端アミノ酸配列からシクロフィリンとホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。
実施例１１
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−１遺伝子のクローニング
１１−ａ）Ｍ．ファーファからの全ＲＮＡの精製
Ｍ．ファーファＴＩＭＭ２７８２株の菌体より全ＲＮＡを得るため、該菌株を３００ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％バクトイーストナイトロゲンベース、０．５％バクトカシトン、０．１％ツィーン６０、２．０％グルコース、５％ＭＥＭ−ビタミン液）で７２時間培養後、３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により集菌し、菌体を液体窒素により急速凍結した。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、ＲＮＡエクストラクションキット（ファルマシア社製）により１．３ｍｇの全ＲＮＡを回収、精製した。
１１−ｂ）ＭＦ−１遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−１蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列より推定されるオリゴヌクレオチドＭＦ１Ｆ１とＭＦ１Ｆ２を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ１Ｆ１とＭＦ１Ｆ２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：１５と１６に示す。実施例１１−ａ）で精製された全ＲＮＡ１μｇを用いて、ＲＮＡ  ＰＣＲ  キットＶｅｒ．２（宝酒造社製）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＦ−１ｃＤＮＡを増幅した。具体的には、オリゴ（ｄＴ）20−Ｍ４アダプタープライマーを用いて、１μｇの全ＲＮＡからＡＭＶ逆転写酵素の反応（４２℃、６０分間）によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＭＦ１Ｆ１とキットに含まれているＭ１３Ｍ４プライマーを用いて、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１．５分の温度シフトを４０サイクル繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。さらに、このＰＣＲ反応液を鋳型として、２回目のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応）を行った。この反応では、ＭＦ１Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーを使用した。ＰＣＲの結果、約５７０ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。このｃＤＮＡをｐＵＣｌ１８ベクター（宝酒造社製）にクローニングした後、塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号：１７に示す。配列番号：１７より予想されるアミノ酸配列は、ＭＦ−１蛋白質より決定したアミノ酸配列と一致したことから、このｃＤＮＡ断片はＭＦ−１遺伝子であることが明らかとなった。
１１−ｃ）Ｍ．ファーファのｃＤＮＡライブラリーの作製
オリゴテックス−ｄＴ３０＜スーパー＞（宝酒造社製）を用いて、実施例１１−ａ）の全ＲＮＡ１ｍｇから２０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。該ポリ（Ａ）+ＲＮＡ５μｇを用いて、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）によりｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡとラムダファージベクターλＳＨｌｏｘTM（ノヴァジェン社製）と連結した後、ファージメーカーシステムとファージパックエクストラクト（ノヴァジェン社製）によりインビトロパッケージングを行い、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
１１−ｄ）ＭＦ−１ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｃ）で得られたｃＤＮＡライブラリーを宿主大腸菌ＥＲ１６４７株に感染させ、トップアガロース（０．７％バクトアガーを含むＬＢ培地）と混合後、ＬＢプレート上に重層し、３７℃で一晩培養することによりプラークを形成させた。生じたプラークをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行った。実施例１１−ｂ）で得られたＭＦ−１の約５７０ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）を用いて［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。１．６×１０5個のプラークをスクリーニングした後、陽性のクローンの中からシグナルの強い１０個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−１ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の６００ｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ１−７を選んだ。該ｃＤＮＡをｐＵＣｌ１８ベクター（宝酒造社製）へサブクローニングし、塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：１に示す通りであり、ＭＦ−１遺伝子は、配列表の配列番号：８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
１１−ｅ）Ｍ．ファーファからのゲノムＤＮＡの精製
Ｍ．ファーファＴＩＭＭ２７８２株の菌体よりゲノムＤＮＡを得るため、該菌株を２００ｍｌのＹＮＢ培地で７２時間培養後、３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により集菌し、洗浄液（０．９％ＮａＣｌ、０．０５％ツィーン８０）で５回、ＰＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。菌体を８ｍｌのＰＫバッファーに懸濁した後、等容量のガラスビーズ（径４２５〜６００μｍ、シグマ社製）を加え、ミニービードビーダー（バイオスペス  プロダクツ社製）により菌体を破砕した。菌破砕液にプロテアーゼＫとＳＤＳをそれぞれ終濃度０．１５ｍｇ／ｍｌ、１％（ｗ／ｖ）となるように加え、ゆっくりと攪拌しながら５０℃で３時間処理した。該破砕液をフェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、及びクロロホルム抽出（各１回）し、エタノール沈殿を行って核酸を精製した。１００００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により得られた核酸をＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した後、ＲＮアーゼＡを終濃度４０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４０分間処理した。該溶液をフェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出（各１回）し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収、精製した。
１１−ｆ）ＭＦ−１ゲノムＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｅ）で得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ又はＰｓｔＩにより完全切断した後、それぞれの断片をｐＵＣｌ１８ベクターにクローニングし、２種類のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。実施例１１−ｄ）で得られたＭＦ−１のｃＤＮＡをプローブとして用いて、該ライブラリーからＭＦ−１ゲノムＤＮＡをコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ＢａｍＨＩ断片を含むライブラリーより８．５ｋｂｐ、ＰｓｔＩ断片を含むライブラリーより４．９ｋｂｐのＤＮＡを含むクローンが得られた。４．９ｋｂｐのＰｓｔＩ断片について、ｃＤＮＡの塩基配列をもとにして、塩基配列を決定した。ＭＦ−１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号：１８に示す。この塩基配列よりＭＦ−１遺伝子は、配列表の配列番号：１９に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
さらに、ゲノムＤＮＡには３７ｂｐと３９ｂｐのイントロンが２ヶ所存在していることが明らかになった。ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの関係を図２３に示す。
実施例１２
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−２遺伝子のクローニング
１２−ａ）ＭＦ−２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−２蛋白質の内部アミノ酸配列より推定されるオリゴヌクレオチドＭＦ２Ｆ１を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ２Ｆ１の塩基配列は、配列表の配列番号：２０に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−２ｃＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ反応にはＭＦ２Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用いた。１回目のＰＣＲ反応の結果、約２８０ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号：２１に示す。配列番号：２１より予想されるアミノ酸配列は、ＭＦ−２蛋白質より決定したアミノ酸配列と一致したことから、このｃＤＮＡ断片はＭＦ−２遺伝子であることが明らかとなった。
１２−ｂ）ＭＦ−２ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１２−ａ）で得られた配列番号：２１で表わされる約２８０ｂｐのＭＦ−２ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い１０個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−２ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の５５０ｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ２−２を選んだ。該ｃＤＮＡをｐＵＣｌ１８ベクターへサブクローニングし、塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：２に示す通りであり、ＭＦ−２遺伝子は配列表の配列番号：９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
実施例１３
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−３遺伝子のクローニング
１３−ａ）ＭＦ−３遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−３蛋白質の内部アミノ酸配列より推定されるオリゴヌクレオチドＭＦ３Ｆ１、ＭＦ３Ｆ２、ＭＦ３Ｒ３を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ３Ｆ１、ＭＦ３Ｆ２、ＭＦ３Ｒ３の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：２２〜２４に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−３ｃＤＮＡ断片を増幅した。１回目のＰＣＲ反応にはＭＦ３Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用い、２回目のＰＣＲ反応にはＭＦ３Ｆ１とＭＦ３Ｒ３の組み合わせとＭＦ３Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーの組み合わせを用いた。ＰＣＲ反応の結果、ＭＦ３Ｆ１とＭＦ３Ｒ３の組み合わせでは約３８０ｂｐ、ＭＦ３Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーの組み合わせでは約２８０ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：２５と２６に示す。配列番号：２５と２６より予想されるアミノ酸配列は、ＭＦ−３蛋白質より決定したアミノ酸配列と一致したことから、これらのｃＤＮＡ断片はＭＦ−３遺伝子であることが明らかとなった。
１３−ｂ）ＭＦ−３ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１３−ａ）で得られた配列表の配列番号：２５で表わされる約３８０ｂｐのＭＦ−３ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い６個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−３ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の約７５０ｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ３−１を選び、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：３に示す通りであり、ＭＦ−３遺伝子は配列表の配列番号：１０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
実施例１４
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−４遺伝子のクローニング
１４−ａ）ＭＦ−４遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−４蛋白質のＮ末端アミノ酸配列より推定されるオリゴヌクレオチドＭＦ４Ｆ１とＭＦ４Ｆ２を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ４Ｆ１とＭＦ４Ｆ２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：２７と２８に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−４ｃＤＮＡ断片を増幅した。１回目のＰＣＲ反応にはＭＦ４Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用い、２回目のＰＣＲ反応にはＭＦ４Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーを用いた。ＰＣＲ反応の結果、約７００ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号：２９に示す。配列番号：２９より予想されるアミノ酸配列は、ＭＦ−４蛋白質より決定したアミノ酸配列と一致したことから、このｃＤＮＡ断片はＭＦ−４遺伝子であることが明らかとなった。
１４−ｂ）ＭＦ−４ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１４−ａ）で得られた配列表の配列番号：２９で表わされる約７００ｂｐのＭＦ−４ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い４個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−４ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の約８２０ｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ４−４を選び、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：４に示す通りであり、ＭＦ−４遺伝子は配列表の配列番号：１１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
実施例１５
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−５遺伝子のクローニング
１５−ａ）ＭＦ−５遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−５蛋白質のＮ末端アミノ酸配列より、この蛋白質はＤＬＤＨとホモロジーがあるものと考えられたため、該アミノ酸配列と他生物のＤＬＤＨアミノ酸配列を基にアミノ酸配列ＧＹＶＡＡＩＫＡをコードするオリゴヌクレオチド混合物ＭＦ５Ｆ１と、他生物間のＤＬＤＨアミノ酸配列を比較しホモロジーの高い領域（アミノ酸配列ＭＬＡＨＫＡＥＥ）に対応するオリゴヌクレオチドＭＦ５Ｒ２を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ５Ｆ１とＭＦ５Ｒ２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：３０と３１に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−５ｃＤＮＡ断片を増幅した。１回目のＰＣＲ反応にはＭＦ５Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用い、２回目のＰＣＲ反応にはＭＦ５Ｆ１とＭＦ５Ｒ２を用いた。ＰＣＲ反応の結果、約９００ｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号：３２に示す。配列番号：３２より予想されるアミノ酸配列は、ＭＦ−５蛋白質より決定したアミノ酸配列と一致したことから、このｃＤＮＡ断片はＭＦ−５遺伝子であることが明らかとなった。
１５−ｂ）ＭＦ−５ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１５−ａ）で得られた配列表の配列番号：３２で表わされる約９００ｂｐのＭＦ−５ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い１２個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−５ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の約１．６ｋｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ５−６とｐＭＦ５−７を選び、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：５と３３に示す通りであり、ＭＦ−５遺伝子は配列表の配列番号：１２と３４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。これら２種類の遺伝子は、塩基配列で９２％、コードするアミノ酸配列で９６％のホモロジーを有し、実施例１０に記載のＭＦ−５蛋白質より決定したアミノ酸配列とほぼ一致したため、両方ともＭＦ−５遺伝子であることが明らかとなった。
実施例１６
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−６遺伝子のクローニング
１６−ａ）ＭＦ−６遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−６蛋白質のＮ末端アミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチド混合物ＭＦ６Ｆ１とＭＦ６Ｆ２を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ６Ｆ１とＭＦ６Ｆ２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：３５と３６に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−６ｃＤＮＡ断片を増幅した。１回目のＰＣＲ反応にはＭＦ６Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用い、２回目のＰＣＲ反応にはＭＦ６Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーを用いた。ＰＣＲ反応の結果、約１．０ｋｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片をｐＵＣｌ１８ベクターへクローニングした結果、制限酵素切断パターンが違う２種類のｃＤＮＡが検出された。これらのｃＤＮＡ断片の塩基配列は配列表の配列番号：３７と３８に示す通りであり、塩基配列で９０％、塩基配列より予想されるアミノ酸配列で９４％のホモロジーを有するが、異なる遺伝子であった。配列番号：３７と３８より予想されるアミノ酸配列は、実施例１０に記載のＭＦ−６蛋白質より決定したアミノ酸配列とほぼ一致したことから、これらのｃＤＮＡ断片はＭＦ−６遺伝子であることが明らかとなった。
１６−ｂ）ＭＦ−６ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１６−ａ）で得られた配列表の配列番号：３７及び３８で表わされる約１．０ｋｂｐのＭＦ−６ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い１０個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−６ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の約１．２ｋｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ６−１３を選び、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：６に示す通りであり、ＭＦ−６遺伝子は配列表の配列番号：１３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。この遺伝子は、Ｎ末端のアミノ酸配列のコード領域を欠いているが、実施例１６−ａ）で得られたＭＦ−６のｃＤＮＡ断片とほぼ一致したため、ＭＦ−６遺伝子であることが明らかとなった。
実施例１７
Ｍ．ファーファ由来の抗原性蛋白質ＭＦ−７遺伝子のクローニング
１７−ａ）ＭＦ−７遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
実施例１０に記載のＭＦ−７蛋白質のＮ末端アミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチド混合物ＭＦ７Ｆ１とＭＦ７Ｆ２を合成、精製しＰＣＲのプライマーとした。ＭＦ７Ｆ１とＭＦ７Ｆ２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：３９と４０に示す。実施例１１−ｂ）に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＦ−７ｃＤＮＡ断片を増幅した。１回目のＰＣＲ反応にはＭＦ７Ｆ１とＭ１３Ｍ４プライマーを用い、２回目のＰＣＲ反応にはＭＦ７Ｆ２とＭ１３Ｍ４プライマーを用いた。ＰＣＲ反応の結果、約０．４ｋｂｐの長さのｃＤＮＡ断片が増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片をｐＵＣｌ１８ベクターへクローニングした。このｃＤＮＡ断片の塩基配列は配列表の配列番号：４１に示す通りである。配列番号：４１より予想されるアミノ酸配列は、実施例１０に記載のＭＦ−７蛋白質より決定したアミノ酸配列とほぼ一致したことから、これらのｃＤＮＡ断片はＭＦ−７遺伝子であることが明らかとなった。
１７−ｂ）ＭＦ−７ｃＤＮＡのクローニング
実施例１１−ｄ）に記載の方法により、実施例１７−ａ）で得られた配列表の配列番号：４１で表わされる約０．４ｋｂｐのＭＦ−７ｃＤＮＡ断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンの中からシグナルの強い５個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからＭＦ−７ｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、最長の約０．４ｋｂｐのｃＤＮＡを含むｐＭＦ７−１を選び、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その塩基配列は配列表の配列番号：７に示す通りであり、ＭＦ−７遺伝子は配列表の配列番号：１４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
実施例１８
ＭＦ−１オーバーラップペプチドの合成及び抗体結合部位の推定
１８−ａ）ＭＦ−１オーバーラップペプチドの合成
ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８、（株）島津製作所製）を用いて、ＭＦ−１オーバーラップペプチドを合成した。各ペプチドのアミノ酸配列は配列番号：８に示すＭＦ−１の配列に基づき、全配列を３３種類のペプチドで網羅した（図２１）。各ペプチドは１５残基（一部１６または１７残基）のアミノ酸からなり、アミノ酸１０残基ずつをオーバーラップしている。
各ペプチドのＣ末端アミノ酸のＦｍｏｃ体があらかじめ結合（０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）した樹脂（５０ｍｇ）をまず、３０％ピペリジン／ＤＭＦ（０．５ｍｌ）で処理してＦｍｏｃ基を除去した。ＤＭＦ（０．６ｍｌ×５回）で樹脂を洗浄後、ＰｙＢＯＰ及びＨＯＢｔで活性化した目的のアミノ酸のＦｍｏｃ体（Ｃ末端アミノ酸の量に対して１０倍過剰量を含むＤＭＦ溶液として用いた）及びＮ−メチルモルホリン／ＤＭＦ溶液を加え、室温で３０分間反応させた。ＤＭＦ（０．６ｍｌ×５回）で樹脂を洗浄した。この一連の操作を、目的とする配列を有するペプチドが得られるまで繰り返した。
次に、この樹脂にＴＦＡを主成分とする混合溶液（９４％ＴＦＡ、５％アニソール、１％エタンジチオール（ＥＤＴ））（０．７ｍｌ）を加えて室温で２時間放置した（尚、トリプトファン含有ペプチドに対しては、ＴＦＡ（９４％）、アニソール（３％）、ＥＤＴ（３％）、２−メチルインドール（５ｍｇ）を、アルギニン含有ペプチドに対しては、ＴＦＡ（８２％）、Ｈ2Ｏ（５％）、チオアニソール（５％）、ＥＤＴ（３％）、エチルメチルスルフィド（２％）、フェノール（３％）の混合溶液を用い、アルギニン含有ペプチドの場合は室温で８時間放置した）。樹脂を濾去し、濾液にエチルエーテル（１４ｍｌ）を加えて結晶化した。析出した結晶を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）で回収し、エチルエーテルで洗浄後、再び遠心分離して上清を除き、結晶を減圧乾燥した。得られた結晶は逆相ＨＰＬＣで純度を検定した。さらに、必要に応じて、ＬＣ−ＭＳで分子量を確認し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
１８−ｂ）ヒト血清中のＩｇＥ抗体に対する結合ペプチドの同定
ペプチドコーティングキット（宝酒造社製）を用いて、９６ウェルマイクロプレートに図２１のペプチドを１μｇ／ウェルとなるようにコーティングした。各ウェルにＭ．ファーファＲＡＳＴ陽性の患者血清１３人分、及びプール血清１、計１４種の血清の２倍希釈液を加え、マニュアルに従い反応させた後、β−ガラクトシダーゼ標識抗ＩｇＥ抗体、続いて酵素基質を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定した。３３個のペプチドに対する健常者由来の血清における吸光度が平均２０であった。この２倍の４０以上の吸光度を示したものを陽性とし、さらに、４０以上を４段階に分け図２２に結果を示した。Ｍ．ファーファＲＡＳＴ陽性の患者血清は、４〜５種類のペプチド断片に対して強く反応した。
１８−ｃ）ＭＦ−１に対するマウスモノクローナル抗体のエピトープの推定
実施例１８−ｂ）に記載の図２１のペプチドをコーティングしたマイクロプレートに、ＭＦ−１に対する３種類のモノクローナル抗体である、Ｍ−４０、ＭｍＡｂ３７およびＭＡｂ５１を加え反応させた後、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体、続いて酵素基質を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｍ−４０およびＭｍＡｂ３７は、ペプチド５に反応し、ＭＡｂ５１はペプチド２５、２６に反応した。図２２の結果を合わせて考えると、これらのペプチドにはＢ細胞エピトープが含まれていることが明らかとなった。
実施例１９
組換えマラセチア抗原性蛋白質の診断への応用
１９−ａ）RAST法による特異的ＩｇＥ抗体の測定方法
臭化シアンによるペーパーディスクの活性化、及び組換えマラセチア抗原性蛋白質のペーパーディスクへのカップリングは宮本らの方法（アレルギー、２２巻、５８４−５９４頁、１９７３年）に準じて行った。ポリスチレンチューブに該抗原性蛋白質をカップリングさせたペーパーディスク１枚と患者血清５０μlを加えて、室温で３時間インキュベートした。0.2％のツィーン20を含む生理食塩水でペーパーディスクを３回洗浄後、ファルマシア製RAST-RIAキットの125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体５０μlを加えて室温で一晩インキュベートした。再度３回洗浄後、ガンマカウンターで放射能を測定した。同時に測定したキットのリファレンス試薬で作成した標準曲線からＩｇＥ抗体価を算出した。標準曲線の上限（＞17.5PRU/ml）より高い値が得られた検体は、ウマ血清で10倍、又は100倍に希釈してから再測定を行い、抗体価を算出した。
１９−ｂ）組換えマラセチア抗原性蛋白質ｒMF−１、ｒMF−２、ｒMF−４による診断
アトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis：以下ＡＤと略す。）、アレルギー性喘息（Bronchial Asthma：以下ＢＡと略す。）及び両方の合併（ＡＤ＋ＢＡ）の患者に対して、該抗原性蛋白質による皮膚試験を実施したところ、ＡＤ患者が５７名中４３名（７５％）、ＢＡ患者が９１９名中１０８名（１２％）、ＡＤ＋ＢＡ患者が１０２名中４７名が陽性であり、ＡＤ患者で非常に高い陽性率を示した。また、皮膚テスト陽性のＡＤ、ＢＡ、及びＡＤ＋ＢＡ患者中、各々１００％、５９％、及び８５％の患者がＲＡＳＴ法によるＩｇＥ抗体測定において陽性であった。
該抗原性蛋白質を用いた皮膚試験で陽性、更にRAST陽性（スコア１以上）の患者76例（ＡＤ：30名，ＢＡ：20名，ＡＤ＋ＢＡ：26名）を対象にして、３種類の組換え抗原性蛋白質ｒMF−１、ｒMF−２、ｒMF−４に対するＩｇＥ抗体価をRAST法（RIA法）で測定した。皮膚試験陰性者（健常人）12名についても同様に該抗原性蛋白質に対するＩｇＥ抗体価を測定した。その結果、非常に高率に患者血清中に抗原性蛋白質に対するＩｇＥ抗体が存在することが明確になった。特に、ｒMF−１、ｒMF−２に対する陽性率が高かった。更に、驚くべきことにＩｇＥ抗体価が非常に高く、特にＡＤの患者ではｒMF−１、ｒMF−２に対して平均100ＰＲＵ、最高1000ＰＲＵを超える患者もあった。また、マラセチア抗原に対するRAST陽性の患者全員の血清中に組換え抗原性蛋白質ｒMF−１、ｒMF−２、ｒMF−４のいずれかに対するＩｇＥ抗体が存在していた。
産業上の利用可能性
本発明により、単離されたマラセチア由来の高純度の精製抗原性蛋白質、これらに由来する抗原性断片、およびこれらの抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する特異的抗体を提供することができる。また、これらの抗原性蛋白質、抗原性断片を有効成分とするマラセチアアレルギー疾患の診断薬、治療薬、予防薬を提供することができる。
さらに、本発明により、新規な組換えマラセチア抗原性蛋白質及びそれをコードする遺伝子、並びに該蛋白質のエピトープなどが提供される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：618
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：２
配列の長さ：551
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：３
配列の長さ：728
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：４
配列の長さ：812
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：５
配列の長さ：1607
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：６
配列の長さ：940
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：７
配列の長さ：306
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：８
配列の長さ：176
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：９
配列の長さ：166
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：１０
配列の長さ：206
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：１１
配列の長さ：224
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：１２
配列の長さ：507
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：１３
配列の長さ：273
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：14
配列の長さ：102
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：１５
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：１６
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：１７
配列の長さ：599
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：１８
配列の長さ：991
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
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配列番号：１９
配列の長さ：177
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：２０
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２１
配列の長さ：261
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：２２
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２３
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２４
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２５
配列の長さ：371
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：２６
配列の長さ：263
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：２７
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２８
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２９
配列の長さ：630
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：３０
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：３、９、１２、１５番目のＮはイノシンを示す。
配列：
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配列番号：３１
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：６、１５、１８番目のＮはイノシンを示す。
配列：
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配列番号：３２
配列の長さ：938
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：３３
配列の長さ：1600
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：３４
配列の長さ：507
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：３５
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：３６
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：３７
配列の長さ：1009
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：３８
配列の長さ：1008
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：39
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：３、12、15、18番目のＮはイノシンを示す。
配列：
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配列番号：40
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：６、９、18番目のＮはイノシンを示す。
配列：
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配列番号：41
配列の長さ：427
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
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配列番号：４２
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４３
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４４
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４５
配列の長さ：２８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４６
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４７
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４８
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４９
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号５０
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号５１
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号５２
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000072
配列番号：53
配列の長さ：28
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000073
配列番号：５４
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000074
配列番号：55
配列の長さ：23
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000075
配列番号56
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000076
配列番号：57
配列の長さ：25
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003990730.tif 000077
配列番号：５８
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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【図１】
0003990730.tif 000079
【図２】
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【図３】
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【図４】
0003990730.tif 000082
【図５】
0003990730.tif 000083
【図６】
0003990730.tif 000084
【図７】
0003990730.tif 000085
【図８】
0003990730.tif 000086
【図９】
0003990730.tif 000087
【図１０】
0003990730.tif 000088
【図１１】
0003990730.tif 000089
【図１２】
0003990730.tif 000090
【図１３】
0003990730.tif 000091
【図１４】
0003990730.tif 000092
【図１５】
0003990730.tif 000093
【図１６】
0003990730.tif 000094
【図１７】
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0003990730.tif 000096
0003990730.tif 000097
0003990730.tif 000098
0003990730.tif 000099
0003990730.tif 000100
【図１８】
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0003990730.tif 000102
0003990730.tif 000103
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【図１９】
0003990730.tif 000105
0003990730.tif 000106
0003990730.tif 000107
【図２０】
0003990730.tif 000108
0003990730.tif 000109
0003990730.tif 000110
【図２１】
0003990730.tif 000111
【図２２】
0003990730.tif 000112
【図２３】
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0003990730.tif 000114
【図２４】
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