(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群からの１つまたは２つの分子、並びに、第１のフルオロホア及び発色団からなる非ＦＲＥＴのラベル対を含んでなり、核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができるプローブであって、前記発色団が、フルオロホア及び消去剤からなる群から選択され、このプローブとターゲットとの相互作用が、プローブの第１の立体配座から第２の立体配座への変化を引き起こし、それにより、前記ラベル対のラベル間の距離を変化させ、一方の立体配座のみにおいて、前記第１のフルオロホアの蛍光を少なくとも２５パーセント消去させるのに十分にラベルが相接することを特徴とするプローブ。
【請求項２】
前記プローブが、互いにハイブリダイズしてハイブリッドを形成できる２つの分子を含み、前記ラベル対が、前記分子の一方が、前記ハイブリッドの末端において前記分子の一方に結合し、ハイブリッドにおける消光効率が少なくとも６０％であり、スペクトルのオーバーラップに基づいて予想される消光効率より少なくとも１０％高いことを特徴とする請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記プローブが、１つの分子を含む請求項１記載のプローブ。
【請求項４】
前記非ＦＲＥＴラベル対の成員が、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイズした末端ヌクレオチドに結合したとき、少なくとも６０％であり、スペクトルのオーバーラップに基づいて予想される消光効率より少なくとも１０パーセント高い消光効率を与えることを特徴とする請求項３記載のプローブ。
【請求項５】
前記非ＦＲＥＴラベル対の成員が、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイズした末端ヌクレオチドに結合したとき、少なくとも７０％であり、スペクトルのオーバーラップに基づいて予想される消光効率より少なくとも３０パーセント高い消光効率を与えることを特徴とする請求項４記載のプローブ。
【請求項６】
発色団が消去剤であることを特徴とする請求項４または５記載のプローブ。
【請求項７】
消去剤が、ＤＡＢＣＹＬであることを特徴とする請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
発色団が、前記第１のフルオロホアの最大励起より短い最大励起波長を有するフルオロホアであることを特徴とする請求項４または５記載のプローブ。
【請求項９】
前記分子が、互いにハイブリダイズして３−２５ヌクレオチド長のハイブリッドを形成することのできるアームに隣接した、７−１４０ヌクレオチドのターゲットと相補的な領域を有する自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項４から７のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１０】
２つの非ＦＲＥＴラベル対を含むことを特徴とする請求項１記載のプローブ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のプローブを含む検出試薬を含むアッセイ用試薬キット。
【請求項１２】
核酸増幅を行う試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記増幅が、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＬＣＲ、Ｑ−ベータ複製、及びＮＡＳＢＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
前記増幅がＰＣＲであることを特徴とする請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載のプローブを該プローブのターゲットを含むと考えられるサンプルに接触させ、蛍光の変化を測定することを含んでなる検出過程を含むことを特徴とするアッセイ方法。
【請求項１６】
多重アッセイ方法であることを特徴とする請求項１５記載のアッセイ方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ法による増幅を含み、検出がリアルタイムで行われることを特徴とする請求項１５または１６記載のアッセイ方法。
【請求項１８】
発色団の対を含む少なくとも１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを、該プローブのターゲットを含むと考えられるサンプルに接触させ、少なくとも前記発色団の極大吸収において吸収を測定することにより検出することを含み、前記プローブが、天然オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、前記プローブが、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含み、このプローブとターゲットとの相互作用が、プローブの第１の立体配座から第２の立体配座への変化を引き起こし、それにより、前記発色団の間の距離を変化させ、１つの立体配座のみにおいて、検出可能に吸収を変化させるのに十分に発色団を相接することを特徴とするアッセイ方法。
【請求項１９】
前記プローブが、互いにハイブリダイズして３−２５ヌクレオチド長のハイブリッドを形成することのできるアームに隣接した、７−１４０ヌクレオチドのターゲットと相補的な領域を有する自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１８記載のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の一部は、国立保健協会(National Institute of Health)によって与えられた許諾番号HL-43521-07の下で政府の援助によってなされた。合衆国政府は、発明の該当部分について権利を有する。
本発明は、フルオロホア(fluorophore)及び発色団ラベルを含む核酸ハイブリダイゼーションプローブ、並びに、それを含む及びそれを使用するキット及びアッセイに関する。
背景
現存する多くの異なるタイプのアッセイは、核酸ハイブリダイゼーションプローブを用い、シグナル発生のためにフルオロホアの蛍光の変化を利用しており、この変化は、フルオロホアの他の分子または部位との相互作用の変化によるものであり、フルオロホアと相互作用する分子又は部位との間の距離の変化によってもたらされる。
これらのアッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動、即ち”ＦＲＥＴ”でのシグナル発生に基づくものであり、それによると、第１のフルオロホアを、他のフルオロホアまたは消去剤のいずれかである相互作用する共鳴受容体から離間させる距離の変化によって蛍光が発生する。フルオロホア−消去剤の対を含む。フルオロホアと相互作用する分子又は部位の組み合わせは、”ＦＲＥＴ対”として知られている。ＦＲＥＴ対相互作用の機構は、対の一方の成員の吸収スペクトルが他の成員、第１のフルオロホアの発光(emission)スペクトルとオーバーラップすることが必要である。相互作用する分子又は部位が消去剤である場合、その吸収スペクトルはフルオロホアの発光スペクトルとオーバーラップしなければならない。Stryer, L.,"Fluorescence Energy Transfer as a Spectroscopic Ruler", Ann.Rev.Biochem., 1978, 47:819-846("Stryer,L. 1978");BIOPHYSICAL CHEMISTRY part II, Techniques for the Study of Biological Structure and Function, C.R. Cantor and P.R. Scimmel, pages 448-455（W.H. Freeman and Co., San Francisco, U.S.A., 1980）("Cantor and Scimmel 1980");及びSelvin, P.R., "Fluorescence Resonance Energy Transfer", Methods in Enzymology 246:300-335(1995)("Selvin,P.R. 1995")。ＦＲＥＴ相互作用の有効な、または実体的な程度は、対の呼吸及び発光スペクトルが高度にオーバーラップすることを必要とする、ＦＲＥＴ相互作用の効率は、そのオーバーラップに線形に比例する。Haugland, R.P., Yguerabide,Jr., and Stryer, L.,"Dependence of Kinetics of Singlet-Singlet Energy Transfer on Spectral Overlap", P.N.A.S.（U.S.A.）63:24-30(1969)("Haugland等1969")。列挙した技術は、大きなシグナルを得るために、高度なオーバーラップが必要であることを教示する。フルオロホア−消去剤対を含むＦＲＥＴ対は、それを基にして選択される。
Matayoshi等，Science 247:954-958に記載された１つの好ましいＦＲＥＴ対は、消光部位（即ち、消光ラベル）としてＤＡＢＣＹＬを含み、フルオロホア（即ち、蛍光ラベル）としてＥＤＡＮＳを含む。ＤＡＢＣＹＬの呼吸スペクトルはＥＤＡＮＳの発光スペクトルと高度にオーバーラップし、これら２つを良好なＦＲＥＴ対とする。ＤＡＢＣＹＬのような、それ自体は蛍光性ではない消去剤を含むＦＲＥＴ対を用いることの利点が認識されているにもかかわらず、同定されているＦＲＥＴ対は極めて少ない。一般に、スペクトルの高度なオーバーラップが必要であるため、フルオロホア−消去剤対の数は極めて限られている。しかも、そのような対は、アッセイデザインの柔軟性及び多重アッセイ(multiplex assay)におけるシグナルの明瞭化を含む多くの理由から、極めて望ましいものである。
ＦＲＥＴ及びＦＲＥＴ対を利用した種々のラベル化核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び検出アッセイが知られている。そのような構成の１つは、Cardullo等，(1988), P.N.A.S. 85:8790-8794及び1981年7月17日に出願されたU.S.284469を基礎とする優先権主張したHeller等，EP 0070685.A2に記載されている。それは、ターゲットＤＮＡの隣接配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドの対を含むプローブを用いる。一方のプローブ分子は、その５’末端にフルオロホアである蛍光ラベルを含み、他のプローブ分子は、やはりフルオロホアである異なる蛍光ラベルをその３’末端に含む。プローブがターゲット配列にハイブリダイズされたとき、２つのラベルは互いに極めて接近する。サンプルが適当な周波数の光で刺激されると、一方のラベルから他方への蛍光共鳴エネルギー移動が起こる。ＦＲＥＴは、ラベルからのスペクトル応答の変化において検出可能な変化を生じ、ターゲットの存在を信号化する。一方のラベルは”消去剤”であり、この出願においては、受け取ったエネルギーを熱として放出する相互作用する部位（または分子）を意味する。
他の溶液相構成は、オリゴデオキシヌクレオチド対及びＦＲＥＴの対を含むプローブを利用する。しかし、ここで２つのプローブ分子は、お互いに及びターゲットＤＮＡの相補鎖に完全に相補的である（Morrison and Stols, "Sensitive Fluorescence-Based Thermodynamic and Kinetic Measurements of DNA Hybridization in Solution", Biochemistry 32:309-3104（993）及びMorrisonの1986年1月10日に出願されたU.S.出願番号817841を基礎とする優先権主張したEP 0 232 967 A2）。各プローブ分子は、その３’末端に接合したフルオロホア及びその５’末端に接合した消光部位を有する。この２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が互いにアニールされたとき、各々のフルオロホアは他方の消光部位と極めて接近して保持される。この立体配座におけるプローブは、フルオロホアが次いで適当な波長の光で刺激されると、蛍光が消光部位によって消光される。しかし、いずれのプローブ分子がターゲットに結合すると、相補的なプローブ分子の消光効果は無くなる。この立体配座ではシグナルが発生する。このプローブは、ターゲットに結合した立体配座において、ＦＲＥＴによって自己消光するには長すぎる。
ＦＲＥＴ対及び鎖(strand)置換として知られている現象を利用する溶液相構成は、Diamond等，米国特許第4,766,062号；Collins等，米国特許第4,752,566号；Fritsch等，米国特許第4,725,536号及び第4,725,537号に記載されている。典型的には、これらのアッセイは、２分子核酸複合体を含むプローブを含んでいる。ターゲット配列のサブセット(subset)を含む短い一本鎖は、アニールされてプローブのターゲット結合部位全部を含む長い一本鎖となる。よって、この立体配置におけるプローブは、一本鎖と二本鎖の両方の部位を含む。Diamond等は、これらのプローブが、短い方の鎖に結合した32Ｐラベルまたはフルオロホアのいずれか、及びプローブ立体配座がその複合体であるとき互いに隣接して保持される消去剤部位をさらに含むことを提案している。
ＦＲＥＴ対を利用する他のタイプの分子プローブアッセイは、1992年12月10日に出願されたBagwellの米国特許出願第990,298号を基礎とする優先権主張し、1994年6月15日が公開日の欧州特許出願0 601 889 A3に記載されている。
ＦＲＥＴ対を利用する他のタイプの核酸ハイブリダイゼーションプローブアッセイは、いわゆる"TaqMan"アッセイであり、Gelfand等の米国特許第5,210,015号及びLivak等の米国特許第5,538,848号に記載されている。"TaqMan"アッセイでは、ＤＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチドプローブがターゲット鎖にハイブリダイズしたとき、その切断によって単独又は複数のヌクレオチドを放出する。その放出は、ＦＲＥＴ対の消去対ラベル及びフルオロホアラベルを分離する手段を提供する。Livak等によると、末端ラベルされた"TaqMan"プローブの”直線化(straightening)”も消光を減少させる。
ＦＲＥＴ対を利用する更に他のタイプの核酸ハイブリダイゼーションプローブアッセイは、Tyagi等の共に係属している米国特許出願第08/439,819号（及び、PCT出願WO95/13399を含む対応する米国外の出願）に記載され、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを利用しており、それは、我々が"Molecular Beacons"として参照するTyagi, S. and Kramer, F.R., "Molecular Beacon:Probes that Fluoresce upon Hybridization", Nature Biotechnology 14:303-308(1996)にある。分子ビーコン(molecular beacon)プローブは、末端領域がターゲット無しで互いにハイブリダイズするが、プローブの中心領域がそのターゲット配列にハイブリダイズすると離間するオリゴヌクレオチドである。プローブ−ターゲット複合体の堅固さは、プローブ−ターゲットハイブリッドと、末端領域による分子内ハイブリッドとが共に存在することを排除する。従って、プローブは立体配座の変化を受け、末端領域の分離によって小さなハイブリッドが形成され、末端領域は堅固なプローブ−ターゲットハイブリッドによって互いに分離する。
この発明の態様は、アッセイに有用な非ＦＲＥＴフルオロホア−消去剤対及び発色団対を含むプローブ；そのような分子または部位の対を用いた多重アッセイを含む改良されたアッセイ；並びに、そのような対を含むキットを包含する。
発明の概要
ＦＲＥＴとは対照的に、消去剤は、及び他のフルオロホアでさえも、核酸ハイブリダイゼーションプローブに、蛍光部位及び消光部位が接触するように結合したとき、ＦＲＥＴの規則に反するときでさえ、フルオロホアのための有効な消光部位として提供できる。さらに、プローブ内でそのように配置された発色団（蛍光または非蛍光）の対は、同一の発色団でも、検出可能な方式で変化する。
ＦＲＥＴでは、第１のフルオロホアは、第１の波長において吸収し、第２の、より長い波長で発光する。第１のものに近接した第２のフルオロホアまたは消去剤は、その吸収スペクトルがその発光と幾分でもオーバーラップする場合、発光されたエネルギーの一部又は殆どを吸収し、フルオロホアの場合は、さらに長い第３の波長で発光し、消去剤の場合は、熱としてエネルギーを放出する。ＦＲＥＴは、波長が増加する方向に進行する。それは、波長が減少する方向には進行しない。本発明のプローブは、”核酸ハイブリダイゼーションプローブ”であり、ここでは、天然のオリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズ可能であり、天然または非天然結合によって結合した天然または修飾したヌクレオチドからなる。ペプチド核酸プローブは、”核酸ハイブリダイゼーションプローブ”であり、当然のことながら、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物のプローブでありうる。ここで用いる”プローブ”という用語は、単分子及び組合わさってシグナルのレベルに影響する分子対も包含する。
本発明のプローブは、アッセイにおいてターゲットと相互作用したときの立体配座の変化を受けることができる。好ましくは、ラベル対は、例えば、フルオロホアと消去剤であり、プローブがターゲットと相互作用しないときの全部または一部の時間に”相接し(touch)”、ターゲットとの相互作用がラベル対を離間させ、それによって”相接”を阻害する。そのようなプローブの例は、以下のプローブ構成の或るものを含む：MorrisonのEP 0 232 967 A2に記載された二分子プローブ、Diamond等の米国特許第4,766,062号に記載された二分子プローブ、Gelfand等の米国特許第5,210,015号及びlivak等の米国特許第5,538,848号（"TaqMan"プローブ）に記載されたような単分子オリゴヌクレオチドプローブ、及び、Tyagi等の米国特許出願番号第08/439,819号、PCT出願番号WO95/13399、及びNature Biotechnology 14:303-308(1996)（”分子ビーコン”プローブ）に記載された自己ハイブリダイズする単分子プローブ。しかし、本発明のプローブは、プローブのそのターゲットとの相互作用によってラベル対が接触するという反対の方法で作用する。このようなプローブのの例は、Heller等，EP 0070685.A2に記載されたような二分子プローブである。我々の最も好ましいプローブ構成は、”分子ビーコン”プローブである。
本発明のプローブが、その立体配座の一方において、第１のフルオロホアと接触、即ち”相接”するように結合したとき、消光部位は、第１のフルオロホアの発光スペクトルとオーバーラップする吸収スペクトルを有する必要はない。さらに、消去剤の吸収波長は、フルオロホアの発光波長より短くすることができる。同様に、第１のものの発光波長より短い波長で吸収する第２のフルオロホアは、上記のプローブ構成において、消去剤として作用し、即ち、第１のフルオロホアによる発光を抑制し、入射エネルギーを光子発光ではなく熱として放散する。
上記のプローブ構成において、ラベル対の吸収スペクトルの変化は、蛍光の変化に換えて、検出シグナルとして用いることができる。吸収における変化が利用される場合、ラベル対は、２つの発色団、即ち、フルオロホア、消去剤、及び他の発色団を含んでもよい。ラベル対は、同一の発色団でもよい。
この発明は、プローブに加えて、そのようなプローブを用いるアッセイ、及び、それらを含むアッセイキットも包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＤＡＮＳでラベルしたＤＮＡの励起及び発光スペクトルを示す。
図２は、テトラメチルローダミンでラベルしたＤＮＡの励起及び発光スペクトルを示す。
図３は、ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトル、及び、９つのフルオロホアの各々の発光スペクトルを示すグラフである。
図４は、複数のフルオロホアの反応性状態の化学構造を示す。
図５は、幾つかの消去剤及び消去剤として用いたフルオロホアの反応性状態の化学構造を示す。
図６は、発色団対の相接したとき及び離間したときの吸収スペクトルを示す。
図７は、多重アッセイにおける４つのプローブを用いた動力学的蛍光測定を示す。
図８は、多重ＰＣＲ増幅アッセイにおける２つのプローブを用いた実時間蛍光測定を示す。
発明の詳細な説明
本発明で有用なプローブ構造の１つのタイプは、全部を参考としてここに取り入れる米国特許出願番号第08/439,819号、PCT出願番号WO95/13399、及びTyagi, S. and Kramer, F.R>, "Molecular Beacons:Probes that Fluorisce upon Hybridization", Nature Biotechnology 14:303-308(1996)に記載された”分子ビーコン”オリゴヌクレオチド構造である。これらのプローブでは、中心のターゲット認識配列は腕（以後、当該用語は「アーム（arms）」を意味する）に隣接し、これらの腕は、プローブがターゲット配列にハイブリダイズしていないときに互いにハイブリダイズし、ターゲット−認識配列（共通して”プローブ配列”と呼ぶ）は、ヘアピン構造の一本鎖ループとなり、腕配列は二本鎖の幹状(stem)ハイブリッドを形成する。プローブがターゲットにハイブリダイズしたとき、ターゲット−認識配列が相補的なターゲット配列にハイブリダイズした場合、比較的堅固な螺旋が形成され、幹状ハイブリッドを解いて腕を離間させる。フルオロホアＥＤＡＮＳ及び消去剤ＤＡＢＣＹＬのようなＦＲＥＴ対は、アルキルスペーサーによって腕に結合してもよい。分子ビーコンがターゲット鎖にハイブリダイズしたとき、フルオロホアの発光は消光される。分子ビーコンがターゲット鎖にハイブリダイズしたとき、ＦＲＥＴ対は１００オングストローム以上離間し、フルオロホアの発光は消光されない。発光された蛍光は、ターゲット鎖の存在を示す。分子ビーコンプローブは、７−１４０ヌクレオチド長のターゲット認識配列、及び、３−２５ヌクレオチド長の幹状ハイブリッド又は”二本幹(stem duplex)”を形成する腕を有する。修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド結合を用いてもよい。分子ビーコンは、例えば、ペプチド核酸（”ＰＮＡ”）プローブであってもよい。
我々は、ある種の分子ビーコンプローブでは、ラベルの対が、プローブがターゲットにハイブリダイズしないときに相接することを見出した。”相接”により、対の吸収スペクトルが有意に変化することを意味する。図６は、相補的末端ヌクレオチドが幹状ハイブリッドの一部である分子ビーコンについての吸収スペクトルを示す。プローブは、一端においてＤＡＢＣＹＬでラベルされ、他端においてテトラメチルローダミンでラベルされている。スペクトル２０は、ターゲットにハイブリダイズせず、腕が互いにハイブリダイズした第１の立体配座のプローブからのものである。スペクトル２１は、ターゲットに結合し、腕がハイブリダイズしていないプローブからのものである。スペクトル２１では、約４８００オングストローム及び５５００オングストロームに極大吸収があるスペクトル２０のスペクトル２１との比較により、腕がハイブリダイズしているときラベル対が”相接”している：４８００オングストロームの吸収が約０．０３３から約０．０２６に減少し、５５００オングストロームの吸収が約０．０４６から約０．０６３に増加していることを示している。ＦＲＥＴは、対の吸収スペクトルを変化させない。Van Der Meer, B.W., Coker, G., III, and Chem S.Y.S., RESONANCE ENERGY TRANSFER, VCH Publishers, Inc．(New York 1994)。２つの発色団が”相接”するか否かは、図６に示したように、１００オングストローム以上離間したとき、それらが吸収スペクトルに相接したとき、吸収スペクトルを比較することによって決定することができる。
我々は、前の段落で述べた様な構成の分子ビーコンの一端に結合した消去剤、例えばＤＡＢＣＹＬが、ＦＲＥＴ規則の変形において他端に結合したフルオロホアを有効に消光し、それによって、核酸ハイブリダイゼーションプローブに用いることができるフルオロホア−消去剤の対の数を極めて増加させることを見出した。
以下の説明では、図１、２及び３に示したスペクトルを参照する。図１は、消去剤ＤＡＢＣＹＬとフルオロホアＥＤＡＮＳとを含む分子ビーコンの励起スペクトル（左側、短波長側の曲線１）及び発光スペクトル（右側、長波長側の曲線２）を示す。図２は消去剤ＤＡＢＣＹＬとフルオロホアのテトラメチルローダミンを含む分子ビーコンの、ターゲットにハイブリダイズしたときの励起スペクトル（曲線３）及び発光スペクトル（曲線４）を示す。
図３は、消去剤ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルと、多数のフルオロホア：ＥＤＡＮＳ（６）、フルオレセイン（７）、ルシファーイエロー(Lucifer Yellow)（８）、ＢＯＤＩＰＹ（９）、エオシン(Eosine)（１０）、エリトロシン（１１）、テトラメチルローダミン（１２）、テキサスレッド(Texas Red)（１３）及びクマリン（１４）の発光スペクトルを示す。ＥＤＡＮＳとクマリンのＤＡＢＣＹＬとの大きなオーバーラップが、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬ及びクマリンとＤＡＢＣＹＬとがＦＲＥＴ対となる理由を示している。曲線１２は、テトラメチルローダミンの発光スペクトルである。これは、ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルと殆どオーバーラップしていない。曲線１３は、テキサスレッドの発光スペクトルである。これは、ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルと全くオーバーラップしない。ＦＲＥＴ規則によれば、蛍光エネルギー移動の程度は、スペクトルのオーバーラップ量の関数である。
最初に、実施例１に記載する方法を用い、幾つかのフルオロホアの、消去剤の例として選択したＤＡＢＣＹＬとのスペクトルのオーバーラップを測定した。計算されたオーバーラップ及びそれから予想される消光の程度を表１にまとめる。
0003898228.tif 000002
アッセイで用いるために、消去剤または相互作用するフルオロホアは、蛍光共鳴エネルギー移動によって、我々が、ここで用いる用語としての”ＦＲＥＴ対”と考えられるための最小の相互作用と定義した、フルオロホアの発光の少なくとも６０％を吸収するために、実施例１の方法によって決定したスペクトルのオーバーラップのように、十分なスペクトルのオーバーラップを持たなければならない。この記載によると、表１のフルオロホアのＥＤＡＮＳのみが、ＤＡＢＣＹＬとＦＲＥＴ対を形成する。しかし我々は、ＤＡＢＣＹＬまたは他の適当な消去剤が、試験した他の７つのフルオロホアと接触、即ち”相接”するとき、有効な消光が達成されることを見出した。
フルオロホアと他のフルオロホアまたは消去剤との”相接”対を有し、その対が上記で定義したＦＲＥＴ対ではないプローブの実施態様を示すため、我々は、一方の末端においてＤＡＢＣＹＬで末端ラベルされ、他端において８つの異なるフルオロホアの１つでラベルされた分子ビーコンプローブを調製した。我々は、実施例２に記載する方法によって消光効率を試験した。表２は、観察された消光効率及び予想されるＦＲＥＴによる消光効率を示す。図６は、”相接”が達成されたことを示し、表２は、ＥＤＡＮＳを除く表２に挙げた全てのフルオロホアを含む非ＦＲＥＴ対について得られた消光に対する影響を示す。
0003898228.tif 000003
”相接”が必要とされるため、全ての分子ビーコンのデザインが、本発明のプローブの候補となるわけではない。プローブがターゲットにハイブリダイズしたときにラベル部位が相接できるようにラベル対が結合する分子ビーコンのみが本発明のプローブとなりうる。上記の末端ラベル以外に、有用な他の立体配置は、軸状ハイブリッドに沿った５つのヌクレオチドによってラベル部位を離間させることである。螺旋は１０ヌクレオチド毎に完全に回転するので、これにより、２つのラベルが螺旋の同じ側になる。螺旋に沿った４または６のヌクレオチドによる離間は候補として好ましくない。特定の分子ビーコンデザインが本発明のプローブとして好ましいか否かを確かめるためには、単にプローブを調製し、それをここに述べる方法によって試験することでよい。
同様に、他のプローブ構造にも当てはまる。ここに述べるデータは、Heller等，EP 0070685.A2、Morrison EP 0232967.A2及びDiamond U.S.4,766,062に記載されたタイプのプローブ対が、プローブの２つの分子を、ここで分子ビーコンについて記載したような形式で末端ラベルしたとき、”相接”を与えることを立証する。候補となる他の立体配置も試験されるべきである。
本発明のプローブは、ラベルが”相接”するが、事実上一時的にのみ”相接”するプローブ、例えば、”TaqMan”プローブまたはプローブに沿ってラベルされた他の一本鎖プローブ等を含む。そのような直鎖状プローブは、ハイブリダイズしないときにランダムコイルを形成する。一時的にのみ”相接”するプローブは、ここに記載した好ましい分子ビーコンプローブに比較して、消光効率が低く、大きなバックグラウンドを生ずる傾向があり、あまり好ましくはない。この発明で有用とするために、そのようなプローブは、実施例２の方法に従って、少なくとも２０％の消光、好ましくは３０％、より好ましくは少なくとも４０％の消光を与える必要がある。
ラベルが一時的にのみ”相接”するプローブを示すために、我々は３つの非−自己ハイブリダイズオリゴヌクレオチドプローブを調製した。それらは、１３ヌクレオチド長で、ＤＡＢＣＹＬ（３’末端）、及び、３つのフルオロホア、ＥＤＡＮＳ、フルオレセインまたはテトラメチルローダミンのうち１つ（５’末端）で末端ラベルされている。我々は、これら３つのプローブを、プローブと同じ長さの、ラベルされていない完全に相補的なターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、これら３つのプローブを、３’末端をＤＡＢＣＹＬラベルされた完全に調和したターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。第１のターゲットは、消光を無くし、第２のターゲットは、フルオロホアのターゲットのＤＡＢＣＹＬへの”相接”によって消光を最大にする。実施例２の方法を用いて、我々は、プローブがハイブリダイズしていないとき（ランダムコイル状態）と、各ターゲットにハイブリダイズしたときの消光効率を測定した。これらの結果を表３に示す。
0003898228.tif 000004
表３の結果は、ラベル対（テトラメチルローダミン−ＤＡＢＣＹＬ）が実質的にスペクトルのオーバーラップを持たず、ＦＲＥＴ相互作用が完全に排除されている本発明のプローブについて、ランダムコイル運動による一時的な”相接”により、フルオレセインの約半分（４４％）が消光されたことを示す。ラベル対（フルオレセイン−ＤＡＢＣＹＬ）が、スペクトルが幾分オーバーラップするがＦＲＥＴ対となるには不十分な本発明のプローブは、ＦＲＥＴ対（ＥＤＡＮＳ−ＤＡＢＣＹＬ）を持つプローブと同様に消光された。３つの13-merオリゴヌクレオチドプローブ全てのバックグラウンドは、より良い消光を与え、従ってバックグラウンドに対して高いシグナル比率を与える同様にラベルされた分子ビーコンプローブより、かなり高いことが示された。
この発明で有用とするために、ハイブリッドの相補的末端に結合したときに、非ＦＲＥＴのフルオロホア−消去剤の対が、下記の実施例１及び２に従って試験されたとき所定の基準を満足することを必要とする。この対は、バックグラウンドシグナルを最小とするために、６０％を越える、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の消光度を与えなければならない。さらに、消光効率は、スペクトルのオーバーラップから予想されるより少なくとも１０％大きくなければならなず、それは、”相接”に影響する吸収における有意な変化からつながるものである。好ましくは、消光効率は、スペクトルのオーバーラップから予想されるより少なくとも３０％大きい。
本発明で用いるのに好適な消去剤は、幾つかの基準を満足すべきである。第１に、フルオロホアでない発色団であり；光を吸収して熱としてエネルギーを放散できること。第２に、相対的に良好な吸収剤であり；好ましくは、少なくとも、１０4Ｍ-1の減衰係数を有すること。第３に、消光されるべきフルオロホアに反発または回避しようとしないこと；即ち、フルオロホアが疎水性である場合、消去剤もまた疎水性でなければならず、フルオロホアが正または負に電荷している場合、消去剤も同様に荷電していなければならない。第４に、使用において化学的活性でないこと、特に、破壊的フリーラジカルを生成しないこと。最後に、使用しやすくするため、プローブに結合するための脱離基を含む活性化状態で入手できること。これらの基準を満足する消去剤は、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＭＩ及びマラカイトグリーンを含み、これらは全て図５に示した。
第１のフルオロホアとＦＲＥＴ対を形成しない第２のフルオロホアは、消去剤に換えて用いることができる。好ましくは、第２のフルオロホアは、第１のフルオロホアとスペクトルのオーバーラップを持たないか、最小のオーバーラップしか持たない。第２のフルオロホアを選択するための基準は、消去剤の選択基準と基本的に同じである。第１のフルオロホアがアッセイで励起されるものである異を考慮して、第２のフルオロホアの励起スペクトルは、第１のフルオロホアの発光励起スペクトルより短く、完全又はそれに近い波長でにあるのが好ましい。クマリン、通常青色範囲で発光するフルオロホアは、本発明の分子ビーコンプローブにおいてテトラメチルローダミンに対して消去剤として作用することが示された。
本発明における検出のために蛍光における変化が好ましいが、”相接”は、吸収における変化を検出に用いることを可能にする。図６に関して上記で説明したように、蛍光又は非蛍光の２つのフルオロホアが”相接”したときに、吸収スペクトルが変化する。我々は、これが、両端においてテトラメチルローダミンでラベルされた分子ビーコンを用いて起こることを示した。他のラベル対は、例えば、非−フルオロホアのＤＡＢＣＬＹ−ＤＡＢＣＹＬ、マラカイトグリーン−ＤＡＢＣＹＬ、または、マラカイトグリーン−マラカイトグリーン、あるいは、フルオロホアのフルオレセイン−テトラメチルローダミンとすることができる。図６は、ラベル対を、ＤＡＢＣＹＬ−テトラメチルローダミンとすることができることを示している。吸収検出で用いるために、”相接”及び”非相接”の立体配置におけるプローブの吸収スペクトルを得て、吸収における変化が、試験又はアッセイ及び用いる装置の感度に適したシグナルであることを確認することによって好適な対を選択できる。２つの異なる発色団が用いられるとき、それらのピーク波長における吸収の比率の変化が、シグナル変化を測定する便利な方法である。好ましくは、検出に吸収が用いられるとき、ラベルは、少なくとも３×１０4Ｍ-1の減衰係数を有する。
発色団のプローブへの結合は、従来の手法による。結合点は、例えばアルキルスペーサーなどのリンカーを考慮して、２つのラベルが上記のような”相接”をするようにしなければならない。ハイブリッドの相補的末端ヌクレオチドは（１分子または別個の分子のいずれでも）、ここに述べた分子ビーコンによって示されたように、”相接”を確実にする。
また、本発明は、本発明の発色団の対、好ましくは蛍光体−消去済対を用いたアッセイを包含する。即ち、フルオロホアの蛍光の消光でのシグナルの発生によるアッセイにおいて、本発明は、フルオロホア−消去剤の対を用いることからなる改良がなされ、この消去剤は、例えばＤＡＢＣＹＬであり、消光効率は、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％であって、スペクトルのオーバーラップから予想される消光効率より少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％大きい。本発明のアッセイは、複数の蛍光体−消去剤対を含み、多重シグナルを発生する多重アッセイとすることができる。このアッセイは、定性的または定量的な、検出アッセイであってよい。検出は、例えば、核酸増幅を含む多くの工程の一部をなす。これは、特に、増幅又は他の工程の間に検出が実時間である場合である。周知の増幅工程は、例えば、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第4,965,188；Ｑ-β複製(Lomeli等，"Quantitative Assays Based on the Use of Replicable Hybridization Probes", Clin. Chem. 39, 1826-1831(1989))；ＮＡＢＳＡ；自己保持配列反応（”３ＳＲ”）(Guatelli等，"Isothermal in vitro Amplification of Nucleic Acids by Multienzyme Reaction Modeled after Retrovival Replication", P.N.A.S.（U.S.A.）87：1874-1878(1990))に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”）；及び、転写及び複製反応を含む。
また、我々の発明は、本発明のラベル化プローブを、アッセイのための他の試薬とともに含む試薬キットも包含する。例えば、キットは、ＰＣＲ用の酵素、プライマー及びバッファーを、増幅された生成物を検出するための分子ビーコンとともに含むことができる。多重アッセイのために、本発明のキットは、多重プローブを含み、その少なくとも１つは本発明のプローブである。例えば、幾つかの分子ビーコンを包含することができ、本発明に従って、各々が消去剤としてＤＡＢＣＹＬでラベルされ、異なるフルオロホアでラベルされている。その場合、少なくとも１つのプローブは、本発明の非−ＦＲＥＴフルオロホア−消去剤の対を含む。他の対は、ＥＤＡＮＳ及びＤＡＢＣＹＬ等の、認識されたＦＲＥＴ対であってもよい。本発明の多重プローブも当然含まれる。蛍光検出での多重化のために、双方の励起スペクトル及び異なるフルオロホアの発光スペクトルのオーバーラップを最小とするのが好ましいと認められる。吸収検出での多重化のために、異なるプローブの吸収スペクトルのオーバーラップを最小にするのが望ましいと認められる。
ここに述べたアッセイ手法を用いて、我々は、すべてが商業的に入手可能なフルオロホアで、その化学構造が知られ刊行物に記載されているフルオレセイン、ルシファーイエロー、ＢＯＤＩＰＹ、エオシン、エリトロシン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド及びクマリンの蛍光を、ＤＡＢＣＹＬが消光できることを示した。また我々は、他の消去剤であるＤＡＮＢＩ及びマラカイトグリーン、及びクマリン等の適当な（短い波長の）フルオロホアを含む非−ＦＲＥＴ対における有効なフルオロホア消光を示した。図４は、フルオロホアの反応性状態の化学構造を示し、図５は、R.P. Haugland(K.D. Larison, ed.)による"Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 5th Ed. 1992-1994と題されたMolecular Probes, Inc., Eugene, Oregon U.S.A.カタログ、著作権1992に報告されたような、クマリン、ＤＡＭＢＩ、マラカイトグリーン及びＤＡＢＣＹＬの反応性状態の化学構造を示す。この分野の研究者は、ここに述べた簡単な手法により、他の発色団を選択し試験することができる。
実施例１
スペクトルのオーバーラップの初期測定
ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルと幾つかのフルオロホアの各々の発光スペクトルとのオーバーラップを決定するために、ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルを測定した。ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルはＤＮＡとの結合で変化するので、我々は、Tyagi and Kramer 1996に記載された方法を用いて、ＤＡＢＣＹＬをオリゴデオキシヌクレオチドに結合させた。このオリゴデオキシヌクレオチドは、５’ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  Ａ-ヘキサアルキルアミノ-ＤＡＢＣＹＬであった。このオリゴデオキシヌクレオチドの６×１０-6Ｍ溶液（４００μ）を石英キュベットに配置し、その吸収スペクトルをPerkin-Elmer Lambda 3A ＵＶ−可視分光計を用いて測定した。このスペクトルの可視部分を図３に示す。異なるフルオロホア（各々がそのターゲットに結合したもの）を含む分子ビーコンの発光スペクトルも同図にプロットした。各スペクトルは、その最大値を１００とし、他の点の値を比例配分するように規格化した。各発光スペクトルについて、最大値の両側の７５％より大きなスペクトルのみを考慮した。”７５％より大きい”とは、発光が、最大発光の少なくとも７５％となる発光波長の範囲を意味する。ＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルと、種々のフルオロホアの発光スペクトルとのオーバーラップの程度は、グラフ上で決定した。ＥＤＡＮＳのスペクトルとのオーバーラップは、４９０ｎｍから５２４ｎｍの間の各波長でのＤＡＢＣＹＬの吸収の合計と、４６９ｎｍから４８９ｎｍの間の各波長でのＥＤＡＮＳの発光の合計との和である。フルオレセインについては、５０７ｎｍから５２７ｎｍの間の各波長でのＤＡＢＣＹＬの吸収の合計と、５０５ｎｍから５３０ｎｍの間の各波長でのフルオレセインの発光の合計との和でえある。ルシファーイエローについては、５０６ｎｍから５４８ｎｍの間の各波長でのＤＡＢＣＹＬの吸収の合計と、５２０ｎｍから５０４ｎｍの間の各波長でのルシファーイエローの発光の合計との和である。ＢＯＤＩＰＹ、エオシン、エリリソンおよびテエトラメチルローダミンについては、オーバーラップは、各々、５１３ｎｍから５３３ｎｍ、５３２ｎｍから５５３ｎｍ、５４２ｎｍから５６３ｎｍ、及び５６０ｎｍから５８８の間の各波長でのＤＡＢＣＹＬの吸収の合計である。（図３に示した）テキサスレッドについては、全ての発光スペクトルを考慮しても全くオーバーラップが無い。我々の定義によるスペクトルのオーバーラップの程度は単位を持たず、表１に示した通りである。
予想される消光効率の計算
化学的部位が、ＦＲＥＴによるフルオロホアの消去剤として役立つためには、その吸収スペクトルが、フルオロホアの発光スペクトルとオーバーラップしなければならない（Stryer, L. 1978;Cantor and Schimmel 1980;amd Se;vin P.R. 1995）。フルオロホアと消去剤との間のＦＲＥＴ（従って、消光）の効率は、消去剤の吸収スペクトルとフルオロホアの発光スペクトルの間のスペクトルのオーバーラップに直線的に比例する。蛍光共鳴エネルギー移動のフォースターの独創的理論からのこの予想は、実験的に確認され（Haugland等1969）、よって、ＦＲＥＴ対の選択の基礎となっている。消光効率とスペクトルオーバーラップとの線形関係を仮定して予測されるフルオロホアの組についての消光の効率または程度は、表１に示した。消光の予想される効率または程度を計算するために、各フルオロホアについてのスペクトルオーバーラップを、ＥＤＡＮＳについてのスペクトルオーバーラップで除して、ＥＤＡＮＳの観察された消光効率を乗じた。消光の予想される程度も表１に示した。
実施例２
候補となるフルオロホアのＤＡＢＣＹＬによる消光の程度を試験するための分子ビーコンの合成
我々は、同一のヌクレオチド配列を持つ８つの分子ビーコンを調製した。各分子ビーコンは、、その３’末端にＤＡＢＣＹＬ部位を含み、その５’末端に、我々が試験した候補となる６つのフルオロホア（フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、ルシファーイエロー、ＥＤＡＮＳ、エリトロシン、ＥＡ心、テトラメチルローダミンまたはテキサスレッド）の１つを含む。これらの分子を合成するために、保護されたスルフヒドリル基を５’末端に含み、第１級アミノ基を３’末端に含むオリゴヌクレオチドを、midland Certified Reagents(Midland Texas)から得た。このオリゴヌクレオチドのスルフヒドリル及び第１級アミノ基は、各々、-（ＣＨ2）6及び-（ＣＨ2）7-スペーサーを介してＤＮＡにつないだ。オリゴヌクレオチドの配列は、５’ＳＨ-ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＴＡ ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＧ-アミノ３’である。ＤＡＢＣＹＬのアミン反応性誘導体を、Tyagi and Kramer 1996に記載された方法に従って、このオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させた。結合したオリゴヌクレオチドは、高圧液体クロマトグラフィーを用いて精製した。精製の後、５’末端のスルフヒドリル基から保護基を取り除いた（Tyagi and Kramer 1996）。この調製物を７つの画分に分けた。これらの画分は、フルオレセイン、ルシファーイエロー、ＥＤＡＮＳ、エリトロシン、エオシン及びテトラメチルローダミンのヨードアセトアミド誘導体、及び、ＢＯＤＩＰＹのブルもメチル誘導体と結合させた（分子プローブ）。各場合において、未反応のフルオロホアは、小型カラム（NP-5、Pharmacia）のゲル濾過によって取り除いた。二重にラベルした各オリゴヌクレオチドは、高圧液体クロマトグラフィーでさらに精製し、バッファーＡ（1mM MgCl2及び20mM Tris-HCl pH8.0）に溶解した。
消光効率の決定
３’末端においてＤＡＢＣＹＬで、５’末端においてフルオロホアでラベルされた分子ビーコンは、分子の両側の６つの末端ヌクレーチドがヘアピン幹を形成し、フルオロホアをＤＡＢＣＹＬに極めて接近させるような方法で設計する。ＦＲＥＴ対では、Tyagi等から、蛍光共鳴エネルギー移動によって消光が起こると予想される。非−ＦＲＥＴ対では、ここに定義したように、蛍光共鳴エネルギー移動によっては、消光が起こらない、即ち、消光の最小限必要量より小さいことが予想される。
これらのオリゴヌクレオチドの中間領域は、ターゲットと相互作用できるプローブを構成する。プローブのターゲットとの相互作用は、環状螺旋の巻き戻し、及び、フルオレセインのＤＡＢＣＹＬからの１００オングストロームを越える離間をもたらす。この状態において、蛍光共鳴エネルギー移動は起こり得ず、よって消光は起こり得ない。Tyagi及びKranmerは、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬを、このオリゴヌクレオチドにおけるＦＲＥＴ対のフルオロホアと消去剤として用いたとき、ＥＤＡＮＳの蛍光がＤＡＢＣＹＬに極めて効率的に消光されることを示した。分子ビーコンのターゲットを天下すると、ＥＤＡＮＳの蛍光は十分に回復する。
これら一連のフルオロホアについての消光の程度を決定するために、各分子ビーコンの励起及び発光スペクトルを、ターゲットの添加前及び後に、光子技術(Princeton)蛍光計を用いて記録した。発光スペクトルを得るために、バッファーＡ中の分子ビーコン溶液を、２５℃においてキュベットに保持した。分子ビーコンのフルオロホアの最大励起において溶液を励起し、発光された光の強度を、発光波長の関数として測定した。励起スペクトルは、フルオロホアの最大発光における発光強度をモニターし、励起波長を変化させることにより記録した。ハイブリッドを形成するのに十分な時間を与えた。２つのスペクトルを記録した後、分子ビーコンの５倍モルの過剰のターゲットを溶液に添加した。ハイブリダイゼーションが完了した後、励起及び発光スペクトルを再度記録した。８つの分子ビーコン各々について４つのスペクトルが記録された。ＥＤＡＮＳ及びテトラメチルローダミンを含む２つの分子ビーコンのスペクトルを図１−２に示すが、ターゲットを添加する前のスペクトル（７１、７２、７３、７４）は破線で示し、ターゲット添加後のスペクトル（１、２、３、４）は実線で示した。左側のスペクトルは励起スペクトルである。右側は発光スペクトルである。
消光の程度は、最大発光における発光の強度から決定した。観察された消光のパーセントは、（１−Ｆ0／Ｆt）＊１００と定義し、Ｆ0はターゲット添加前の発光強度であり、Ｆtはターゲット添加後の発光強度である。表２は、試験した７つのフルオロホア各々に観察された消光効率及びＦＲＥＴ機構であるときに予想される消光効率を列挙した。
実施例３
本発明のプローブにおいて用いるために入手できるフルオロホア−消去剤の組み合わせの有用性を示すために、４つの異なる核酸ターゲットを用いる多重検出アッセイを実施した。我々は、１つのヌクレオチドのみによってヌクレオチド配列が異なるターゲットを選択し、これらを検出する４つの異なるラベル化分子ビーコンの組を設計した。これらの分子ビーコンは、３’末端にＤＡＢＣＹＬ部位を有し、５’末端において各々が異なるフルオロホアでラベルされていることと、そのプローブ配列の中心において各々が異なるヌクレオチド配列を有すること以外は、あらゆる点で同一である。これらの分子ビーコンは、青色、緑色、オレンジ色、または赤色のフルオロホアのいずれかでラベルされ、そのプローブ配列の中心において、各々、チミジン、シチジン、アデニン、またはグラノシンのいずれかを有する。青色、緑色、オレンジ色、または赤色の分子ビーコンのヌクレオチド配列は、各々、クマリン-５’-ＧＣＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＴＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＣＧＣ-３’-ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン-５’-ＧＣＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＣＧＣ-３’-ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン-５’-ＧＣＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＣＧＣ-３’-ＤＡＢＣＹＬ、及び、テキサスレッド-５’-ＧＣＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＣＧＣ-３’-ＤＡＢＣＹＬである。これら分子ビーコンのターゲットは、各々、５’-ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＡ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ-３’、５’-ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ-３’、５’-ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ-３’、及び、５’-ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ-３’である。下線を施した残基は、これらの分子の間で唯一異なるヌクレオチド配列を示す。グルオロホアは、各々がその最適な励起波長で励起され、その最適な発光波長が観察されたとき、１つの分子ビーコンの蛍光発光が他の分子ビーコン各々の蛍光発光から独立に測定できるように選択した。これらの分子ビーコンの等モル混合物を調製し、この混合物の部分標本を４つの管に各々入れた。４つのターゲットのうちの１つを、溶液の温度を２５℃に保持しながら、これらの溶液の各々に添加し、その管の各分子ビーコンの蛍光発光を繰り返しモニターした。各分子ビーコンの蛍光発光の変化を、我々の分光計の回折格子の位置を変えながら、各フルオロホアの蛍光発光を測定するために、励起及び発光波長の任意の対の間を交互に繰り返しモニターした。励起波長を４００ｎｍに保持しながら、クマリンの蛍光発光を４７５ｎｍで５秒間隔でモニターした。これらの波長は、次の５秒には、４９１及び５１５とし（フルオレセイン）、さらに次の５秒には、５７５及び５９５とし（テトラメチルローダミン）、最後の５秒には、５９５及び６１５とした（テキサスレッド）。この一連の測定を、完全に合致したプローブ−ターゲットハイブリッドの蛍光発光が平坦部に達するまで繰り返した。これらの結果は、各分子ビーコンの１つについて、４つの別個の蛍光発光対時間曲線としてプロ���トした。
各ターゲットの添加は、完全に相補的な分子ビーコンの蛍光発光において増大させるが、同じ溶液中に存在する他の分子ビーコンの蛍光発光は増大させない（図７）。ターゲット１００が、その中心ヌクレオチドにアデノシンを有するとき（パネルａ）、四角印１０１で示される青色蛍光が増大し、ターゲット１１０が、その中心ヌクレオチドにグアノシンを有するとき（パネルｂ）、丸印１１１で示される緑色蛍光が増大し、ターゲット１２０が、その中心ヌクレオチドにチミジンを有するとき（パネルｃ）、逆三角印１２１で示されるオレンジ色蛍光が増大し、そして、ターゲット１３０が、その中心ヌクレオチドにシチジンを有するとき（パネルｄ）、ダイヤモンド印１３１で示される赤色蛍光が増大した。管の蛍光発光の色は、どのヌクレオチドの残基がターゲットの中心にあるかを示す。ハイブリダイゼーションのレベル、及び、シグナル検出のレベルのいずれでも、有意な”クロストーク”は存在しなかった。２つの顕著な例外は、中心にグラノシン残基を有するターゲット１１０が、対応する位置にチミジンを持つ分子ビーコンから小さな反応１１２を誘発されたこと、及び、中心にチミジンを有するターゲット１２０が、対応する位置にグラノシンを持つ分子ビーコンから小さな反応１２２を誘発されたことである。これは、グアノシンが、チミジンと比較的安定な塩基対を形成できることによる。また、各ターゲットは、より高い濃度の分子ビーコン及びターゲットが用いられたとき、及び、管を広い波長の紫外線ランプで照射したときに、蛍光発光の色によって視覚的に同定することもできる。
また、我々は、嚢胞性線維症の原因となる遺伝子異常の極めて簡単な検出における本発明の有用性も説明する。嚢胞性線維症の最も一般的な遺伝的原因の１つは、嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）のための５０８位置における３つのヌクレオチドの欠失である。この遺伝子の検出のために２つの分子ビーコンを調製した。一方の分子ビーコンは、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬでラベルされ、野生型ＣＦＴＲ遺伝子配列に完全に相補的なプローブ配列を有する。他方の分子ビーコンは、テトラメチルローダミン及びＤＡＢＣＹＬでラベルされ、突然変異したＣＦＴＲ遺伝子配列に完全に相補的なプローブ配列を有する。これらの分子ビーコンの両方の等モル混合物を含み、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な他の成分（適当なプライマーを含む）を含む３つの管を調製した。野生型遺伝子をコードするＤＮＡを第１の管に添加し、突然変異遺伝子をコードするＤＮＡを第２の管に添加した。第３の管は、いかなるテンプレートＤＮＡを含まない負の対照である。ポリメラーゼ連鎖反応は、管の温度を、各々がＰＣＲサイクルの融解、アニーリング、及び重合過程に相当する摂氏９４、５５、及び７２度にサイクルさせることによって行った。反応の進行は、５５°サイクルの間に各分子ビーコンの蛍光発光を測定することにより、これらの反応の進んでいる間、密閉した管においてモニターした。この目的のために、密閉した管の蛍光発光を実時間でモニターできる温度サイクル装置（System 7700、Applied Biosystems, CA）を用いた。図８は、その結果を示す。野生型（テンプレート）ＤＮＡを含む管（パネルａ）は、フルオレセイン分子ビーコン（四角印１４０）の蛍光発光における増大を示すが、テトラメチルローダミン蛍光発光（丸印１４１）での増大は示さない。突然変異テンプレートＤＮＡを受容した管（パネルｂ）は、テトラメチルローダミンの蛍光発光（丸印１５０）の増大は示すが、フルオレセインの蛍光発光（四角印１５１）の増大は示さない。題３の管では、いずれの分子ビーコンの蛍光発光も増大しなかった。このバックグラウンドシグナルは、逆三角形１４２、１５２で示し、両方のパネルに記載した。この実験は、本発明に従って選択したフルオロホア−消去剤の対を用いることにより、遺伝的対立因子の多重検出を行うことが可能であることを示している。
実施例４
実施例１及び実施例２に記載した方法に従った消光に関する最初の実験に続いて、我々は、より広範囲の精製した分子ビーコンプローブについて、さらに実験した。２０ヌクレオチド長の中心領域と、それに隣接する６ヌクレオチド長で互いに完全に相補的な腕を有する、末端ラベル化分子ビーコンのために、３回のＨＰＬＣ精製を用いた。ラベル対は、一端のＤＡＢＣＹＬと、他端の９つの異なるフルオロホア（図３）である。
予想される消光効率は、図２の方法とは異なる方法で計算した。スペクトルの全体を基礎として用い、計算は、既に議論したHaugland等，1969に従った。ここで、スペクトルのオーバーラップは、∫Ｆ（λ）ε（λ）λ４ｄλ／∫Ｆ（λ）ｄλで定義され、但し、Ｆ（λ）は、波長λにおける規格された蛍光発光であり、ε（λ）は、オリゴヌクレオチドに結合したときの、波長λにおけるＤＡＢＣＹＬの分子励起係数である。全てのスペクトルパラメータは、光子計数蛍光計（Photon Technology International, NJ）を用いて、上記のバッファー中で決定した。
スペクトル全体を用いるので、当然のことながら、オーバーラップの量は実施例１での量より大きくなり、従って予想される消光効率も大きくなる。本発明のプローブにおいて有用なＦＲＥＴ対または非−ＦＲＥＴ対に必要とされる最小の予想される消光効率の我々の定義は、この異なる技術を用いて全て上方に変化する。ＦＲＥＴ対の最小の予想される消光効率は、例えば８０％（実施例１の方法では６０％）であり、本発明のプローブは、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の観察される消光効率を有し、オーバーラップから予想されるものより少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％大きい。得られた結果を、表４に示す。混乱を避けるため、実施例４を除くこの明細書及び請求の範囲の全体は、この実施例４ではなく実施例１及び２の方法に関連した定義に従って解釈されるものとする。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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