(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、心筋症治療剤。
【請求項２】
心筋症が突発性心筋症（ＩＣＭ）である、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
突発性心筋症が肥大型心筋症（ＨＣＭ）または拡張型心筋症（ＤＣＭ）である、請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
重症の心筋症に適用するための、請求項１〜３のいずれか記載の治療剤。
【請求項５】
患部を切開あるいは開胸することなく、エコー使用下でカテーテルを使用し視覚的に患部心筋内に直接ＨＧＦ遺伝子を投与するための、請求項１〜４のいずれか記載の治療剤。
【請求項６】
ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）―リポソームの形態にある、請求項１〜５のいずれか記載の治療剤。
【請求項７】
ＨＧＦ遺伝子がネイキッドDNA（naked DNA）の形態にあることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載の治療剤。
【請求項８】
心臓の腹部側心筋に投与するための、請求項１〜７のいずれか記載の治療剤。
【請求項９】
少なくとも各週１回で８回投与するための、請求項１〜８のいずれか記載の治療剤。
【請求項１０】
ＨＧＦ遺伝子として少なくとも１０μｇを用いる、請求項１〜９のいずれか記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＨＧＦ遺伝子を非侵襲的に投与して心筋障害を治療する遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤に関する。具体的には、ＨＧＦ遺伝子を心筋内に非侵襲的に投与することからなる心筋障害遺伝子治療法、特に、エコー使用下でＨＧＦ遺伝子を障害心筋部位に注入し、より効率的に心筋症等の心疾患又は狭心症、心不全を治療する心筋障害遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤に関する。更に、ＨＧＦ遺伝子以外の他の遺伝子にも適用可能な遺伝子治療法であって、エコー使用下に障害組織部位に非侵襲的に遺伝子を投与することからなる遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤に関する。
背景技術
近年のめざましい医療技術の向上に関わらず循環器領域においては、未だ多くの問題が未解決であり、その中の一つの重要な課題として、心筋障害の問題が挙げられる。
心筋障害とは心筋の器質的および機能的異常に起因する疾患の総称であり、例えば心筋症の場合、高血圧、代謝異常症、虚血等の基礎疾患に続発する二次性心筋症と、明らかな基礎疾患なしに発症する突発性心筋症（ＩＣＭ）に分類される。ＩＣＭのうち、遺伝子レベルでの病因解明が最も進んでいるのは肥大型心筋症（ＨＣＭ）である。ＨＣＭでは患者の半数以上に常染色体性優性遺伝形式に従う明らかな家族歴が認められる。このような多発家系を対象とした連鎖解析が行われ、これまでに５つの原因遺伝子座が同定され、その内の４座では原因遺伝子自体が特定されている。
また、拡張型心筋症（ＤＣＭ）の症例の多くは孤発例であるが、約２０％には家族歴が認められる。このような多発家系を対象とした連鎖解析から、７種の原因遺伝子座（ただし原因遺伝子は不明）が特定されている。
しかしながら、心筋障害に関しては、このように原因遺伝子の特定と発症機構の解明についての研究が行われている状況であり、遺伝子治療に向けた具体的な動きは現在まで行われていない。
一方で、最近の分子生物学の飛躍的向上により、遺伝子導入法による細胞機能の賦活化が可能となり、種々の取り組みがなされてきた。特に、心臓への遺伝子導入法については、静脈内注入法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０，６２６−６３０（１９９２））、直接注入法（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８２，２２１７−２２２１（１９９０）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０，２４１４−２４２４（１９９４））又は、プラスミドをそのまま用いる冠動脈内拡散注入法（Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１０９，７１６−７２０（１９９５））等の幾つかの報告があるものの、非侵襲的で具体的な治療法につながるものではなかった。
発明の開示
本発明は、これまで有効な治療法が見出されていなかった心筋障害の非侵襲的な治療法及びそれに用いる治療剤を提供することを目的とする。すなわち本発明は、ＨＧＦ遺伝子を非侵襲的に投与して心筋障害を治療する遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤を提供することを目的とする。具体的には、ＨＧＦ遺伝子を心筋内に非侵襲的に投与することからなる心筋障害遺伝子治療法、特に、エコー使用下でＨＧＦ遺伝子を障害心筋部位に注入し、より効率的に心筋症等の心疾患又は狭心症、心不全を治療する心筋障害遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤を提供することを目的とする。更に、ＨＧＦ遺伝子以外の他の遺伝子にも適用可能な遺伝子治療法であって、エコー使用下に障害組織部位に非侵襲的に遺伝子を投与することからなる遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは鋭意検討の結果、遺伝子としてＨＧＦ遺伝子を使用し、非侵襲的に直接患部心筋層に注入することで有効な効果が得られることを見出した。すなわち本発明者らは、患部を切開あるいは開胸することなく、エコー使用下で視覚的に患部心筋層にＨＧＦ遺伝子を注入することが効果的であることを見出した。当該治療法は非侵襲的な治療法であるため、病状に応じて何回でも当該遺伝子を投与することが可能であり、従って効果的な心筋障害の治療を行うことができる。
このように、本発明者らはエコー使用下で視覚的に直接患部組織に遺伝子を投与することにより効果的な治療が行えることをはじめて見いだしたものであり、各種の臓器特異的な疾患の遺伝子治療が本発明方法で可能であることを明らかにした。
例えば、ＨＧＦ遺伝子を用いる場合、本発明の方法により、各種の臓器特異的な疾患、例えば肺線維症あるいは、肝硬変、肝線維症等の治療を行うことも可能である。更に、ＨＧＦ遺伝子以外の他の遺伝子治療用の遺伝子も、前記本発明の方法により効果的な治療を行なうことができる。
すなわち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、非侵襲的投与のための心筋障害治療剤、
（２）ＨＧＦ遺伝子を心筋内に投与するための、上記（１）記載の治療剤、
（３）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（１）又は（２）記載の治療剤、
（４）エコー使用下に障害心筋部位に非侵襲的に投与するための、上記（２）又は（３）記載の治療剤、
（５）少なくとも各週１回で８回投与するための、上記（１）〜（４）のいずれか記載の治療剤、
（６）ＨＧＦ遺伝子として少なくとも１０μｇを用いる、上記（１）〜（５）のいずれか記載の治療剤、
（７）心筋障害が心筋症、狭心症又は心不全である、上記（１）〜（６）のいずれか記載の治療剤、
（８）障害の治療に有効な遺伝子を有効成分として含有する、エコー使用下に障害組織部位に該遺伝子を非侵襲的に投与するための遺伝子治療剤、
（９）組織障害部位が心筋である、上記（８）記載の治療剤、
（１０）遺伝子がＨＧＦ遺伝子である、上記（８）又は（９）記載の治療剤、
（１１）ＨＧＦ遺伝子を非侵襲的にヒトを含む哺乳動物の心筋内に投与することを含む、心筋障害の遺伝子治療法、
（１２）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（１１）記載の治療法、
（１３）ＨＧＦ遺伝子を、エコー使用下に障害心筋部位に非侵襲的に投与する、上記（１１）又は（１２）記載の治療法、
（１４）ＨＧＦ遺伝子を少なくとも各週１回で８回投与する、上記（１１）〜（１３）のいずれか記載の治療法、
（１５）心筋障害が心筋症、狭心症又は心不全である、上記（１１）〜（１４）のいずれか記載の治療法、
（１６）エコー使用下に障害組織部位に非侵襲的に障害の治療に有効な遺伝子を投与することを含む、遺伝子治療法、
（１７）障害組織が心筋である、上記（１６）記載の治療法、
（１８）遺伝子がＨＧＦ遺伝子である、上記（１６）又は（１７）記載の治療法、
（１９）非侵襲的投与用心筋障害治療剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用、
（２０）ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの形態にある、上記（１９）記載の使用、
（２１）エコー使用下に障害心筋部位に非侵襲的にＨＧＦ遺伝子を投与するための治療剤である、上記（１９）又は（２０）記載の使用、
（２２）心筋障害が心筋症、狭心症又は心不全である、上記（１９）〜（２１）のいずれか記載の使用、
（２３）エコー使用下に障害組織部位に非侵襲的に障害の治療に有効な遺伝子を投与するための遺伝子治療剤製造のための遺伝子の使用、
（２４）障害組織が心筋である、上記（２３）記載の使用、
（２５）遺伝子がＨＧＦ遺伝子である、上記（２３）又は（２４）記載の使用。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用されるＨＧＦ遺伝子とは、ＨＧＦを発現し得る遺伝子を言い、当該遺伝子には、発現されるポリペプチドがＨＧＦと実質的に同効である限り、その遺伝子配列の一部が欠失又は他の塩基により置換されていたり、他の塩基配列が一部挿入されていたり、５’末端及び／又は３’末端に塩基が結合したような遺伝子も包含される。かかる遺伝子としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２７７７６７８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７２，３２１（１９９０）などに記載のＨＧＦ遺伝子が例示され、これらの遺伝子を本発明で使用することが出来る。
ここでＨＧＦ遺伝子（ＨＧＦをコードするｃＤＮＡ）の塩基配列は、前記文献に記載されている他、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＨＧＦのｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。またＨＧＦ遺伝子の改変等も、前記基本書に従い当業者ならば容易に行うことができる。
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について記述する。
ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９）。以下、具体的に説明する。
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。
細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。
また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などに詳しく述べられているため、それらを参照されたい。またＨＶＪリポソーム法とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０，１４４０−１４４８（１９９３）、実験医学，１２，１８２２−１８２６（１９９４）、蛋白質・核酸・酵素，４２，１８０６−１８１３（１９９７）等に記載の方法であり、好ましくはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ），４７９−４８２（１９９５）に記載の方法が挙げられる。
なおＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）も用いることができる。
さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）、日本遺伝子治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
本発明で導入されるＨＧＦ遺伝子以外に、内因性の心筋保護因子や心筋細胞における再生因子を併用することが可能である。例えば、心筋細胞障害時に高度に発現されるＴＧＦ−βや熱ショック蛋白（ＨＳＰ）等の因子は、心筋障害を軽減し心筋修復に関与することが報告されているため、これらの遺伝子を使用することもできる。又、ＥＧＦ等の増殖因子は、組織の種々の細胞障害を修復することが報告されており、これらの遺伝子を用いることも可能である。更には、これらの心筋保護因子や再生因子以外にも、心筋保護や再生に関与する因子も用いることができる。
本発明では、このようにＨＧＦ遺伝子を単独にあるいは他の遺伝子と組み合わせて心臓の心筋細胞に導入し、高度に発現させて、損傷を受けた心筋細胞等に必要な目的蛋白を供給することができる。そしてこれにより、損傷を受けた心筋細胞等の賦活化を図って心筋細胞等を修復再生させ、心筋障害に陥った心機能の回復正常化が出来ることになる。従って本発明の遺伝子治療剤は、重症の心筋症患者に適用が可能であり、心臓移植以外には治療の手段がない患者の救済も可能となった。
さらに本発明の治療剤は、重症の心筋症患者だけでなく、進行中の軽度の心筋症患者にも使用することができる。また、狭心症や心不全等の心筋障害の患者にも使用することができる。
本発明の遺伝子治療剤は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法・投与部位が選択される。投与部位としては、心筋内（障害心筋部位）への投与が好ましい。また投与方法としては、非経口的に投与することが好ましい。
非経口的な投与方法の好ましいものとして、例えば、非侵襲的なカテーテルあるいは非侵襲的な注射器等による投与方法を挙げることができる。更に好ましくは、エコー使用下での非侵襲的なカテーテルあるいは注射器等による投与方法を挙げることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、心筋内に直接ＨＧＦ遺伝子を注入する方法が挙げられる。
本発明の治療剤の投与量としては、患者の症状等によって異なるが、ＨＧＦ遺伝子として成人患者当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ程度の投与量が挙げられる。
またＨＶＪ−リポソームの形態をとる場合は、ＨＧＦ遺伝子として成人患者当たり約１〜約４０００μｇの範囲、好ましくは約１０〜約４００μｇの範囲から投与量が選択される。
本発明の治療剤は、数日ないし数週間に一回投与するのが好適であり、好ましくは各週１回の投与が挙げられる。
投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。治療目的に応じて複数回が好適であり、好ましくは８回投与することが挙げられる。
更に、本発明においては、エコー使用下に障害組織部位に障害の治療に有効な遺伝子を非侵襲的に投与することを含む、新規な遺伝子治療法及びそれに用いる治療剤も提供される。すなわち本発明においては、エコー使用下で視覚的に直接患部組織に遺伝子を投与することにより、効果的な治療が行なえることを初めて見出した。当該治療法では、遺伝子を非侵襲的に投与するため、病状に応じて何回でも所望の遺伝子を投与することが可能であるという、従来にない利点を有する。このような本発明の遺伝子治療法は、ＨＧＦ遺伝子に限らず、遺伝子治療用のあらゆる遺伝子に適用可能である。当該遺伝子治療法は、特に、障害心筋部位に対して適用された場合に効果的である。その際に投与される遺伝子としては、ＨＧＦ遺伝子やＴＧＦ−β遺伝子、ＨＳＰ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子、ＥＧＦ遺伝子等が挙げられる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実験材料及び方法
実験動物
心筋症ハムスター（Ｂｉｏ１４．６）はオリエンタル酵母から購入した。
ＨＧＦ遺伝子
ヒトＨＧＦ遺伝子は、ヒトのＨＧＦのｃＤＮＡ（特許第２７７７６７８号）を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ（インビトロゲン社製）に挿入したものを用いた。
実験方法
１．エコー使用下に心筋症ハムスターの心臓にＨＶＪリポソームを用いてレポーター遺伝子であるルシフェラーゼを導入し、１週間後にその活性を調べた。コントロール群はＰＢＳのみをエコー使用下に導入した。ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＬａｍａｔＬＢ９５０７（ＢＥＲＴＨＯＬＯ社））で測定した。
２．エコーカルジオグラム（ＭＤ５００，ＹＯＫＯＫＡＷＡ−ＧＥ）の操作下、心筋症ハムスター（１２週齢）の心臓の腹部側心筋にＨＶＪ−リポソーム製剤を注入し、以下の１）〜３）の検討を行った。
１）心筋内の毛細血管密度をＡＬＰ染色で測定し、ＨＧＦ遺伝子とコントロールの場合を比較した。
２）ＨＶＪ−リポソーム製剤が投与された心臓の血流量を、レーザー・ドップラー・イメージャー（ＬＤＩ）スコアーで評価し、ＨＧＦ遺伝子とコントロールの場合を比較した。
３）心筋のＭａｓｓｏｎ染色を行い、コンピュータ解析により線維化の分布密度を測定し、ＨＧＦ遺伝子とコントロールの場合を比較した。
参照例１
ＨＶＪリポソーム製剤の作製
１０ｍｇの乾燥脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロールの１：４．８：２の混合物）と、ＨＧＦ遺伝子（１００μｇ）−ＨＭＧ１（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  １  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，２５μｇ）を含有する等張液（１３７μＭ  ＮａＣｌ，５．４μＭ  ＫＣｌ，１０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）２００μｌを混合し、激しく攪拌して超音波を掛けてリポソームを形成させた。精製センダイウイルス（Ｚ株）を３分間ＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ２／ｓｅｃ）した。リポソーム懸濁液とセンダイウイルス（ＨＶＪ）を混合して４℃１０分間、続いて３７℃３０分間加温した。遊離のＨＶＪを除去して、ＨＶＪリポソーム製剤を取得した。
参考例２
ルシフェラーゼ活性の測定
ハムスター（１群６匹）にルシフェラーゼ遺伝子１０μｇのリポソーム製剤を投与し、１週間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。
図１に示されるとおり、心臓におけるルシフェラーゼは高値を示し、エコー使用下に遺伝子導入が可能であることが証明された。
実施例１
心筋症ハムスターのＨＧＦ遺伝子による治療
１２週齢の心筋症ハムスター（１群６匹）の心臓の腹部側心筋にリポソーム製剤を注入した。コントロール群としては、コントロールベクターの入ったリポソーム製剤を同様に１２週齢の心筋症ハムスター（１群６匹）に注入した群を設け、未処理群として無処置の心筋症ハムスター（１群６匹）を設けた。その後、各週にリポソーム製剤を計８回注入した。８週後、２０週齢の心筋症ハムスターの心臓の心筋内の毛細血管密度をＡＬＰ染色で測定し、血流量をＬＤＩスコアで評価した。また、ハムスターを安楽死させた後、心臓を摘出しＭａｓｓｏｎ染色後に、コンピュータによる解析にて線維化の分布密度を測定した。
ＡＬＰ染色により、ＨＧＦ遺伝子治療群では顕著に血管新生による毛細管密度の上昇が見られた。この結果を図２に示す。
ＬＤＩスコアは、コントロール群を１００％とすると、ＨＧＦ遺伝子治療群では１６３±７％であり、顕著に血流量が増大していた。この結果を図３に示す。
Ｍａｓｓｏｎ染色の解析では、ＨＧＦ遺伝子治療群で顕著な線維化分布密度の減少が見られた。この結果を図４に示す。
産業上の利用可能性
本発明のＨＧＦ遺伝子を有効成分とする心筋障害治療剤は、患部心筋の血管新生を促し、患部の血流量を増大させると共に、心筋の線維化を抑制、軽減し、心機能を回復させることができる。また本発明の治療剤は、エコー使用下視覚的に患部心筋層へ、非侵襲的にかつ的確に注入することができる。従ってこれらの効果により、本発明の治療剤は心筋障害をより効果的に治療することができるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、心筋症ハムスターの心臓にＨＶＪを用いてレポーター遺伝子であるルシフェラーゼを導入し、ルシフェラーゼ活性値が高値を示したことで、エコー使用下に遺伝子導入が可能であることが証明された結果を示すグラフである。
図２は、心臓における毛細血管密度をＡＬＰ染色で測定し、ＨＧＦ遺伝子とコントロールを比較した結果を示すグラフである。
図３は、心臓の血流量をレーザー・ドップラー・イメージャー（ＬＤＩ）スコアーで評価し、ＨＧＦ遺伝子群とコントロール群、非処理群とを比較した結果を示すグラフである。
図４は、心筋における線維化の分布密度をＭａｓｓｏｎ染色で測定し、ＨＧＦ遺伝子とコントロールを比較した結果を示すグラフである。
【図１】
0003865632.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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