(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする、高血糖による血管内皮細胞の傷害を、血管平滑筋細胞に作用することなく、抑制する薬剤。
【請求項２】
高血糖による血管内皮細胞の傷害が、高血糖に伴う動脈疾患である請求項１記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は動脈疾患の治療及び予防に有用な薬剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ(Hepatocyte Growth Factor)を有効成分として含有する動脈疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動脈は、組織学的には内膜、中膜及び外膜の３層から構成されており、内膜は単層の内皮細胞と内皮下層からなり、中膜は主として平滑筋線維と弾性線維から構成されている。また、外膜は境界を有することなく周囲の結合組織に移行している。動脈疾患は一般によくみられる疾患であり、また生命維持に欠くことのできない脳、心臓、腎臓などの臓器に重大な影響を及ぼすので重要であり、最も一般的な疾患は動脈硬化症である。動脈硬化は、動脈壁の肥厚、改築、弾性低下をきたし動脈壁が硬化する限局性の動脈病変の総称であり、病理形態学的には粥状硬化、石灰化硬化及び細動脈硬化に分類され、臨床的には粥状硬化と細動脈硬化が重要である。現在、臨床病理学的に最も注目を集めているのは、比較的大きな動脈に発生し、動脈の狭窄閉塞をきたす粥状硬化であり、硬化が進行すると、動脈の狭窄閉塞による脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞、間欠性跛行などの重篤な疾患が出現する。粥状硬化の発生機序については、必ずしも明確になっていないが、動脈内皮細胞が化学的因子や機械的因子により傷害を受け、そこを介して単球が内膜に侵入してマクロファージとなり、マクロファージが変性（酸化）ＬＤＬ（低比重リポプロテイン）を取り込むことにより泡沫細胞化し、動脈硬化が発症するという説が有力である。一方、近年、粥状硬化の発生進展における中膜平滑筋細胞の役割が注目されている。内膜の傷害その他により、血小板の粘着、凝集が起こり、そこから放出された種々の血管作用物質が内膜透過性を亢進させたり、中膜平滑筋細胞の増殖を刺激し、粥状硬化病変の進展をきたす可能性があることが指摘されている。糖尿病性合併症の血管傷害において内皮細胞の関与が認識されつつある（分子糖尿病学の進歩-基礎から臨床まで-１９９４，２３４-２４３頁，金原出版刊）。糖尿病に伴う動脈硬化においても、内皮細胞の傷害、平滑筋細胞の増殖が想定される。その成因の基本は、高血糖状態の持続であることが想定できるが、そのメカニズムは不明な点が多く、ポリオール代謝異常、後期グリケーション終末生成物の関与、低酸素説などの仮説が挙げられている。一方、ＨＧＦは膵臓ランゲルハンス島の培養系においてその増殖促進することが知られている(Otonkoski et al., Diabetes 43, 947-953, 1994)。しかし、血糖値が低下することは報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来から動脈硬化症などの動脈疾患を治療するために種々の治療法が試みられてきているが、従来の動脈硬化の予防・治療は、血中のＬＤＬコレステロールを下げることを主眼としており、コレステロール吸収阻害剤やコレステロール合成阻害剤などが用いられてきたが、その効果が不十分であったり、またその副作用（例えば、食欲不振、胃腸障害、過敏症状等）などの問題から新たな予防・治療剤の開発が望まれている。
ところで、血管内皮細胞はＮＯやＣＮＰなどの血管拡張因子・平滑筋細胞増殖抑制因子を産生・分泌しており、内皮細胞が損傷を受けると血管平滑筋細胞の増殖が誘発されることが知られており、本発明者等は前記の発生機序に基づき、傷害を受けた血管内皮細胞を迅速に修復することができれば、平滑筋細胞の増殖を主体とする病変を予防・治療することが可能であることに想到したが、現在まで血管平滑筋細胞に作用することなく、血管内皮細胞のみを増殖させる因子についてはほとんど報告されていない。
本発明者等は、かかる観点から、血管平滑筋細胞に作用することなく、血管内皮細胞のみを増殖させる因子について鋭意研究した結果、ＨＧＦがかかる作用を有すること見出し、ＨＧＦが動脈疾患、特に血管平滑筋細胞増殖を主体とする病変の予防・治療に有用であることが判明した。
【０００４】
上記のＨＧＦは肝実質細胞を in vitro で増殖させる因子として見出されたタンパク質である（Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450, 1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1986、 FEBS Letter, 22, 311, 1987、Nature, 342, 440, 1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990）。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見されたＨＧＦは、本発明者らをはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治癒などの種々の活性を示している事が明らかとなり、研究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。
ＨＧＦは主に間葉系の細胞により産生されていることが解明されており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給される、所謂パラクリン機構が成立していることが明らかにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにおいてもＨＧＦの産生が高まることから、所謂エンドクリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えられる。
このようなＨＧＦの受容体に関して、最近の研究から、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが確定的になった(Bottaro et al., Science 251, 802-804, 1991; Naldini et al., Oncogene 6, 501-504, 1991)。また、ＨＧＦが静脈内皮細胞の増殖促進作用を有することが報告されている(J. Cell Biol., 119, 629, 1992)。
上述のようにＨＧＦに関しては多くの知見が得られているが、ＨＧＦが血管平滑筋細胞に作用することなく、血管内皮細胞のみを増殖させる作用を有することは従来知られていない新規な知見である。さらに、ＨＧＦが高血糖による血管平滑筋細胞の増殖には影響を与えず、高血糖による血管内皮細胞の減少を抑制することは従来知られていない新規な知見である。
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は新規な動脈疾患治療剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする動脈疾患治療剤；
▲２▼動脈疾患が、血管平滑筋増殖を主体とする動脈疾患である上記▲１▼記載の動脈疾患治療剤；
▲３▼動脈疾患が、ＰＴＣＡ後の再狭窄である上記▲１▼記載の動脈疾患治療剤；及び▲４▼動脈疾患が、高血糖に伴う動脈疾患である上記▲１▼記載の動脈疾患治療剤に関する。
【０００６】
本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照)。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００７】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００８】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【０００９】
本発明の治療剤は上記のＨＧＦを有効成分とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるように、血管平滑筋細胞を増殖させることなく、血管内皮細胞の増殖を促進する作用を有する。更に、ＨＧＦは、傷害を受けていない組織には作用を示さず、傷害を受けている組織にのみ作用するので、副作用を惹起するおそれが少ないという特長を有する。従って、本発明の治療剤は、動脈疾患、特に血管平滑筋細胞の増殖を主体とする病変の治療・予防に有効であり、これらには例えば下記の疾患（１）〜（３）が包含される。
【００１０】
（１）ＰＴＣＡ(percutaneous transluminal coronary angioplasty)後の再狭窄
（２）末梢循環不全（閉塞性動脈硬化症等を含む）
（３）動脈硬化症
また、本発明の治療剤は、血管内皮細胞の増殖を促進する作用を有することから、心筋梗塞後の側副血行路形成にも有効である。さらに、本発明の治療剤は、糖尿病などにおける高血糖による内皮細胞の傷害、糖尿病性合併症などに有効である。ここで、高血糖とは、例えば、空腹時の血液中のグルコース濃度が１１０ｍｇ／ｄｌ以上である状態をいう。また、糖尿病では、このグルコース濃度が１４０ｍｇ／ｄｌ以上となっている。
【００１１】
本発明の治療剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）における動脈傷害に起因する種々の疾患の治療・予防に適用される。
【００１２】
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１３】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１４】
本発明の治療剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.05mg〜500mg、好ましくは１mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明において、有効成分であるＨＧＦは、血管内皮細胞の増殖を促進する作用を有すると共に、血管平滑筋細胞の増殖を促進せず、更には修復された血管内皮細胞を介して血管平滑筋細胞の異常な増殖を抑える作用をも有している。従って、本発明の治療剤は、前述した動脈傷害、特に血管平滑筋細胞の増殖を主体とする傷害に起因する各種疾患の治療・予防に有用である。更に、ＨＧＦは、傷害を受けている組織にのみ作用するので、副作用の少ない薬剤を得ることができるという効果を奏する。また、本発明において、有効成分であるＨＧＦは高血糖による血管平滑筋細胞の増殖に影響を与えず、高血糖による血管内皮細胞の傷害を抑制する作用を有すると共に、更には修復された血管内皮細胞を介して血管平滑筋の異常な増殖を抑える作用をも有している。従って、本発明の治療剤は、前述した糖尿病性合併症、糖尿病や高血糖に伴う血管傷害、動脈疾患などの治療・予防に有用である。
【００１６】
【実施例】
以下、実験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、以下の実験で使用した材料及び方法は以下のとおりである。
【００１７】
実験材料及び方法
細胞培養
ラット冠動脈内皮細胞（３−６代継代）は、１０％ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地にて維持した。３ケ月令ＳＤラットより得た大動脈平滑筋細胞（６−１０代継代）は、１０％ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含むWaymouth's培地(Gibco, Grand island, NY)にて維持した。新生血管内膜平滑筋細胞は、バルーンにて傷害したＳＤラットの大動脈より得、同様に維持した。細胞は、３７℃にて水蒸気に満たされた９５％空気−５％二酸化炭素の条件下にて培養し、２日に１度培地の交換を行った。
ヒト血管内皮細胞と大動脈平滑筋細胞はクラボー（株）より取得し、上記と同様に維持した。
【００１８】
ＤＮＡ合成の測定法
血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞は、９６穴組織培養用プレート上にまいた。細胞が隙間なく付着した状態において、血管内皮細胞は０．５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養しても増殖しなかった。細胞の相対的なＤＮＡ合成速度は、２４時間の、トリチウムラベル化チミジン（［3Ｈ］ＴｄＲ）の細胞中トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)沈殿物質中への取り込みを測定することで評価した。ＨＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）或いはビークル(増殖因子を含まないコントロール培地)は、［3Ｈ］ＴｄＲを加える１２時間前に添加した。ＴｄＲを添加して２４時間後に細胞を冷ＰＢＳ(−)にて２回、冷１０％ＴＣＡにて２回洗浄した後、４℃にて１０％(wt/vol)ＴＣＡで３０分間処理した。次ぎに細胞をエタノール(９５％)にて軽く洗浄後、０．２５規定水酸化ナトリウム溶液に４℃で、３時間処理して溶かし込み、溶液を中和した。ＴＣＡ沈殿物質中に取り込まれたラジオアイソトープ活性は、液体シンチレーションカウンターにて測定した。
血管平滑筋細胞についてのＤＮＡ合成速度についても同様に試験した。血管平滑筋細胞は、無血清培地にて、４８時間で増殖は停止した。この時点でヒトＨＧＦ、ＦＧＦ、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ウシ血清（５％）又はビークルを加えて１２時間培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して２４時間後に細胞を回収した。
【００１９】
共培養実験
血管内皮細胞を細胞培養用インサート(コースター社、孔径０．４５μｍ)にまき、１０％ウシ血清を加えたＤＭＥＭ培地にて増殖させた。新たに再生された血管内膜平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞は、６穴プレートにまき、５％ウシ血清を加えたWaymouth's培地にて維持した。細胞が隙間なく増殖した状態で、内皮細胞を含有したインサートを、増殖停止状態の平滑筋細胞を入れたウェル中に入れた。内皮細胞と平滑筋細胞は、無血清のWaymouth's培地中にて２４時間共培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを加えてさらに１２時間培養を続けた。相対的なＤＮＡ合成速度は［3Ｈ］ＴｄＲのＴＣＡ沈殿物質中への取り込み量の測定によって評価した。
【００２０】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
血清刺激下隙間なく増殖した状態で、ラット冠動脈血管内皮細胞、ヒト大動脈血管内皮細胞、ラット平滑筋細胞、ラット新生内膜平滑筋細胞、そしてヒト大動脈血管平滑筋細胞よりＲＮＡをＲＮＡゾル(Tel-Test Inc, Texas)を用いて抽出した。ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦレセプター）メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8474-8478, 1993)にて測定した。なお、プライマーとしては下記の配列のものを使用した。ＨＧＦ：
５’側プライマー：5'-ＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴ-3'
３’側プライマー：5'-ＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＡ-3'
ｃ−ｍｅｔ：
５’側プライマー：5'-ＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴ-3'
３’側プライマー：5'-ＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣ-3'
増幅したＤＮＡは２％アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドにて染色した。
【００２１】
材料
basic ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＩＬ−１α（インターロキン−１α）及びＩＬ−６（インターロイキン−６）はＲ＆Ｄ社より入手し、ＨＧＦは組換ヒトＨＧＦを用いた。
ベラプロストナトリウム（プロスタグランジンＩ2製剤：ＴＲＫと略す）は、科研製薬から、プロスタグランジンＥ1（ＰＧＥ1）及びプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）は、Paesel and Lorei社から入手した。
生存細胞数の測定法
生存細胞数の測定は、ＷＳＴ−細胞数測定キット（ワコー社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
ＨＧＦの測定法
培養上清中のＨＧＦ濃度は、抗ＨＧＦモノクローナル抗体を使用したELISAの キット（特殊免疫研究所製）により測定した。
統計解析
すべての値は、平均値±標準誤差にて現した。すべての実験は最低３回繰り返した。多重比較における有意差検定には、ダンカンの検定を用いた。危険率５％以下を統計上有意と考えた。
【００２２】
試験例１
血管平滑筋細胞の増殖に対する血管内皮細胞の効果
ラット大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖に対するラット冠動脈血管内皮細胞（ＥＣ）の効果を、ＥＣをＶＳＭＣに添加する共培養法により［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した。その結果を図１に示す。図中、ＥＣ（−）はＥＣなしを、ＥＣ（＋）はＥＣ有りを示す（以下、同様）。１群８ウェルで実験を行った。
図１に示されるように、ＶＳＭＣのＤＮＡ合成が有意に抑制されており、ＥＣはＶＳＭＣの増殖を抑制していることが認められた。
【００２３】
試験例２
新生内膜平滑筋細胞（ｎｉＶＳＭＣ）の増殖に対するＥＣの効果
上記のように、ＥＣにＶＳＭＣに対する増殖抑制作用が認められたことから、この点を確認するため、ｎｉＶＳＭＣの増殖に対するＥＣの効果を検討した。バルーンにて傷害を受けたラット大動脈より得られたｎｉＶＳＭＣはオートクリン−パラクリン機構により種々の成長因子を産生していることが知られている。実験は、ＥＣをｎｉＶＳＭＣに添加する共培養法により［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した。その結果を図２に示す（１群８ウェル）。
図２に示されるように、試験例１と同様に、ＥＣにはｎｉＶＳＭＣに対する増殖抑制作用が認められた。
【００２４】
試験例３
ＥＣの増殖に対するＨＧＦの効果
ＥＣの増殖に対するＨＧＦの効果を［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した。なお、比較としてｂＦＧＦ及び牛胎児血清（ＦＢＳ）についても試験した。ＨＧＦについてはＥＣ培養系に各濃度のＨＧＦを添加（１群８ウェル）、ｂＦＧＦについてはＥＣ培養系にｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加（１群８ウェル）、ＦＢＳについてはＥＣ培養系に２０％ＦＢＳを添加（１群８ウェル）した。その結果を図３に示す。図において、＊＊はＰ＜０．０１（ビークル群に対する比較結果、特に明示のない限り以下同様）を示す。
図３に示されるように、ＨＧＦは１ｎｇ／ｍｌでは効果がなかったが、１０ｎｇ／ｍｌでは［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量が増加しており、ＥＣのＤＮＡ合成を促進し、ＥＣの増殖を促進することが明らかとなった。また、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もＤＮＡ合成を促進した。なお、ＨＧＦ及びｂＦＧＦの間には有意差はなかった。
また、ＥＣのＲＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を、トリチウム化ウリジン取り込み量で試験した。その結果を、図４に示す。図において、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図４に示されるように、ＨＧＦ及びｂＦＧＦはＥＣのＲＮＡ合成をも促進することが明らかとなった。
【００２５】
試験例４
ＥＣの増殖に対するＨＧＦとｂＦＧＦとの相加効果
上記のように、ＨＧＦ及びｂＦＧＦは共にＥＣの増殖を促進することが判明したので、ＥＣのＤＮＡ合成に対するＨＧＦとｂＦＧＦとの相加効果を［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した（１群８ウェル）。その結果を図５に示す。図中、＊はＰ＜０．０１を示す。
図５に示されるように、ＨＧＦとｂＦＧＦとの間で相加効果が認められ、この値は２０％ＦＢＳに相当するものであった。
また、ＥＣのＲＮＡ合成及び蛋白合成に対するＨＧＦとｂＦＧＦとの相加効果を、それぞれトリチウム化ウリジン取り込み量及びトリチウム化ロイシン取り込み量で試験した（１群８ウェル）。試験は、トリチウム化チミジンと同様にＴＣＡ法により行った。その結果をそれぞれ図６及び図７に示す。図中、＊はＰ＜０．０１を示す。
図６及び図７に示されるように、ＥＣのＲＮＡ合成及び蛋白合成に対してもＨＧＦとｂＦＧＦとの間で相加効果が認められた。
【００２６】
試験例５
ＥＣの増殖に対するＨＧＦと他のサイトカインの相加効果
ＥＣの増殖に対するＨＧＦと他のサイトカイン（ＩＬ−１α及びＩＬ−６）との相加効果を［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した（１群８ウェル）。その結果を図８に示す。図中、＊はＰ＜０．０１（対ＨＧＦ／ビークル）を示す。
図８に示されるように、ＩＬ−１α及びＩＬ−６はそれぞれＥＣのＤＮＡ合成を促進することが明らかになったが、これらとＨＧＦとの間では相加効果は認められなかった。
【００２７】
試験例６
ＶＳＭＣの増殖に対するＨＧＦの効果
ＶＳＭＣの増殖に対するＨＧＦの効果を［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量で試験した。なお、比較としてｂＦＧＦについても試験した。ＨＧＦ及びｂＦＧＦはそれぞれＶＳＭＣ培養系に各濃度（１，１０及び１００ｎｇ／ｍｌ）を添加（１群８ウェル）した。その結果を図９に示す。図中、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図９に示されるように、ｂＦＧＦは［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量が増加しており、ＶＳＭＣのＤＮＡ合成を促進することが示された。一方、ＨＧＦにおいては、［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量に変化がなく、ＶＳＭＣの増殖作用は認められなかった。
また、ＶＳＭＣに変えて、ｎｉＶＳＭＣについても同様な試験を行った。その結果を図１０に示す。図中、＊＊はＰ＜０．０１を示す。図１０に示されるように、ｂＦＧＦはｎｉＶＳＭＣの増殖を促進し、一方ＨＧＦはｎｉＶＳＭＣの増殖を促進することはなかった。
更に、ｎｉＶＳＭＣのＲＮＡ合成に対するＨＧＦの効果をトリチウム化ウリジンの取り込み量で試験した。その結果を図１１に示す。図中、＊＊はＰ＜０．０１を示す。図１１に示されるように、ＨＧＦはｎｉＶＳＭＣのＲＮＡ合成を促進することはなかった。
以上の結果及び試験例３の結果からして、ｂＦＧＦはＥＣ及びＶＳＭＣの増殖を促進する作用を有する。それに対し、ＨＧＦはＥＣの増殖を促進するが、ＶＳＭＣ（及びｎｉＶＳＭＣ）の増殖を促進する作用はないことが明らかになった。
【００２８】
試験例７
ヒト大動脈血管内皮細胞の増殖に対するＨＧＦの効果
ヒト大動脈血管内皮細胞の増殖に対するＨＧＦの効果を［3Ｈ］ＴｄＲ取り込み量により試験した。なお、比較としてｂＦＧＦ及びＦＢＳについても試験した。ＨＧＦについてはヒト大動脈血管内皮細胞培養系に各濃度のＨＧＦを添加（１群８ウェル）、ｂＦＧＦについてはヒト大動脈血管内皮細胞培養系にｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加（１群８ウェル）、ＦＢＳについてはヒト大動脈血管内皮細胞培養系に２０％ＦＢＳを添加（１群８ウェル）した。その結果を図１２に示す。なお、図中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図１２に示されるように、ＨＧＦは投与量依存的にヒト大動脈血管内皮細胞の増殖を促進した。ｂＦＧＦもヒト大動脈血管内皮細胞の増殖を促進したが、その程度はＨＧＦよりも低いものであった。
【００２９】
試験例８
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＨＧＦ ｍＲＮＡ及びｃ−ｍｅｔ ｍＲＮＡレベルの測定
ラット冠動脈血管内皮細胞（ＥＣ）、ヒト大動脈血管内皮細胞、ラット平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、ラット新生内膜平滑筋細胞（ｎｉＶＳＭＣ）及びヒト大動脈血管平滑筋細胞におけるＨＧＦ ｍＲＮＡ及びｃ−ｍｅｔ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で測定した結果を、図１３（ＨＧＦ ｍＲＮＡ）及び図１４（ｃ−ｍｅｔ ｍＲＮＡ）に示す。
図１３に示されるように、ＨＧＦ ｍＲＮＡは、内皮細胞、平滑筋細胞及び新生内膜平滑筋細胞に発現が認められた。また、図１４に示されるように、ｃ−ｍｅｔ ｍＲＮＡについても、内皮細胞、平滑筋細胞及び新生内膜平滑筋細胞に発現が認められた。
【００３０】
試験例９
ヒト大動脈血管内皮細胞に対する高グルコースの影響
高グルコースのヒト大動脈血管内皮細胞に対する傷害を検討する為に、ヒト大動脈血管内皮細胞を５、５５、１０５ｍＭのグルコース濃度下に培養した後の生存細胞数を、ＷＳＴを用いた生存細胞数の測定で試験した。その結果を図１５に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図１５に示されるように、正常な血糖値５ｍＭと比較して、５５、１０５ｍＭグルコースにより濃度に依存して、生存細胞数が有意に減少した。図において、＊＊はＰ＜０．０１を示す。１０５ｍＭグルコースにおける生存細胞数は、５５ｍＭグルコースよりもさらに有意に（図において、＃＃はＰ＜０．０１を示す）減少した。培養液中の高濃度のグルコースは、濃度依存的にヒト大動脈血管内皮細胞を傷害し、その生存細胞数を減少させた。
【００３１】
試験例１０
ヒト大動脈血管内皮細胞の高グルコースによる傷害に対するＨＧＦの効果
試験例９に記載のようにヒト大動脈血管内皮細胞の高グルコースによる細胞傷害が認められたことから、この傷害に対するＨＧＦの効果を検討するため、ヒト大動脈血管内皮細胞の１０５ｍＭグルコース存在下における培養において、１０、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加し、ＷＳＴを用いてヒト大動脈血管内皮細胞の生存細胞数の測定を行った。その結果を図１６に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図１６に示されるように、対照群と比べ１０５ｍＭグルコースによりヒト大動脈血管内皮細胞の細胞数の有意な減少が再現された（図において、＊＊はＰ＜０．０１を示す）。さらに、このヒト大動脈血管内皮細胞細胞の減少は、１０、１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦの添加により有意に抑制された（図において、＃はＰ＜０．０５を示す）。１０５ｍＭグルコースに１０、１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦを添加した群は、正常グルコース濃度の対照群と差は無かった。すなわち、１０、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦにより、高グルコースによるヒト大動脈血管内皮細胞の傷害が有意に抑制され、ほぼ正常な生存細胞数まで回復した。
以上の結果より、ＨＧＦは高グルコースによるヒト大動脈血管内皮細胞の傷害を抑制させることが明らかになった。
【００３２】
試験例１１
ヒト大動脈血管内皮細胞からのＨＧＦの分泌及びそれに対する高グルコース、ＴＲＫの影響
試験例１０に記載のように、ＨＧＦは高グルコースによるヒト大動脈血管内皮細胞の傷害を抑制したことから、５、５５、１０５ｍＭのグルコース存在下のヒト大動脈血管内皮細胞の培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図１７に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図１７に示されるように、ヒト大動脈血管内皮細胞の培養上清中にはＨＧＦが検出された。５ｍＭグルコース存在下と比較して、５５、１０５ｍＭグルコース存在下に培養したヒト大動脈血管内皮細胞の培養上清中のＨＧＦ濃度は、濃度依存的に有意に減少した。ヒト大動脈血管内皮細胞により確かにＨＧＦが分泌されており、高グルコースにより細胞数が減少するとともに、分泌されるＨＧＦ量も減少することが分かった。
さらに、５ｍＭのグルコース存在下において、１０-6Ｍ、１０-7ＭのＴＲＫを添加したヒト大動脈血管内皮細胞の培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定し、無添加の時と比較した。ＴＲＫは、ヒト大動脈血管内皮細胞の培養上清中のＨＧＦ濃度を有意に増加させた。
【００３３】
試験例１２
ヒト大動脈血管平滑筋細胞に対する高グルコースの影響
ヒト大動脈血管平滑筋細胞に対する高グルコースの影響を検討する為に、ヒト大動脈血管平滑筋細胞を５、５５、１０５ｍＭのグルコース濃度下に培養した後の生存細胞数を、ＷＳＴを用いた生存細胞数の測定で試験した。その結果を図１８に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図１８に示されるように、５ｍＭグルコース存在下と比較して、５５、１０５ｍＭグルコース存在下において、濃度に依存してヒト大動脈血管平滑筋細胞の細胞数が有意に増加した。１０５ｍＭグルコース存在下におけるヒト大動脈血管平滑筋細胞数は、５５ｍＭグルコース存在下よりもさらに有意に増加した。培養液中の高濃度のグルコースは、濃度依存的にヒト大動脈由来培養血管平滑筋細胞の生存数を増加させることが分かった。
【００３４】
試験例１３
ラット大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対する高グルコースの影響
ＶＳＭＣに対する高グルコースの影響を検討する為に、試験例１２と同様にして、ＶＳＭＣを５、５５、１０５ｍＭのグルコース濃度下に培養した後の生存細胞数を、ＷＳＴを用いた生存細胞数の測定で試験した。その結果を図１９に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図１９に示されるように、５ｍＭグルコース存在下と比較して、５５、１０５ｍＭグルコース存在下において、濃度に依存してＶＳＭＣの細胞数が有意に増加した。培養液中の高濃度のグルコースは、ＶＳＭＣの生存数を増加させることが分かった。
【００３５】
試験例１４
ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦの分泌に対するＴＲＫ、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2の影響
正常グルコース濃度（５ｍＭ）におけるヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法分析し、これに対するＴＲＫ（１０-7、１０-6Ｍ）、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2（１０-6Ｍ）アナログの影響を検討した。その結果を図２０に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図２０に示されるように、ＴＲＫ（１０-7、１０-6Ｍ）、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2（１０-6Ｍ）は５ｍＭグルコース濃度において、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ濃度をそれぞれ有意に増加させた。ＨＧＦの産生を促進することが知られているＴＲＫは、ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦ分泌量を増加させた。
【００３６】
試験例１５
ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦの分泌及びそれに対する高グルコース、ＴＲＫの影響
ヒト血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ量を分析し、高グルコースの影響を検討した。５、５５、１０５ｍＭのグルコース存在下のヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。さらに、ＴＲＫ（１０-6Ｍ）を添加した時のヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ量を測定し、無添加の時と比較した。その結果を図２１に示す。１群８ウェルで実験を行った。
図２１に示されるように、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中にはＨＧＦが検出された。５ｍＭグルコース存在下と比較して、１０５ｍＭグルコース存在下に培養したヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ濃度は、有意に減少した。ヒト大動脈血管平滑筋細胞よりＨＧＦが分泌されており、高グルコースにより細胞数が増加するにも関わらず、分泌されるＨＧＦ量は減少することが分かった。
５、５５、１０５ｍＭのグルコース存在下において、さらに１０-6ＭのＴＲＫを添加したヒト大動脈血管平滑筋細胞の培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＴＲＫは５、５５、１０５ｍＭグルコース濃度において、ＨＧＦ濃度を有意に増加させた。ＨＧＦの産生を促進することが知られているＴＲＫは、高グルコースにおいても、ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦ分泌量を増加させた。
【００３７】
試験例１６
ヒト大動脈血管平滑筋細胞に対する高グルコースの影響
高グルコースのヒト大動脈血管平滑筋細胞に対する作用を検討する為に、ヒト大動脈血管平滑筋細胞を５、１０５ｍＭのグルコース濃度下に培養した後の生存細胞数を、ＷＳＴを用いた生存細胞数の測定で試験した。その結果を表１に示す。１群８ウェルで実験を行った。
表１に示されるように、正常な血糖値５ｍＭと比較して、１０５ｍＭグルコースにより生存細胞数が有意に増加した。表１において、＊＊はＰ＜０．０１を示す。培養液中の高濃度のグルコースは、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の生存細胞数を増加させた。
【００３８】
試験例１７
高グルコースによるヒト大動脈血管平滑筋細胞の増殖に対するＨＧＦの効果
試験例１６に記載のようにヒト大動脈血管平滑筋細胞の高グルコースによる増殖が認められたことから、これに対するＨＧＦの効果を検討するため、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の５ｍＭ、１０５ｍＭグルコース存在下における培養において、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加し、ＷＳＴを用いてヒト大動脈血管平滑筋細胞の生存細胞数の測定を行った。その結果を表１に示す。１群８ウェルで実験を行った。表１に示されるように、５ｍＭまたは１０５ｍＭグルコース存在下において、対照群（ＨＧＦ非添加群）と比べ１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦの添加により、ヒト大動脈血管平滑筋細胞は影響を受けなかった。すなわち、ＨＧＦは正常グルコース濃度においても、高グルコース濃度においても、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の増殖に影響しないことが明らかになった。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
実施例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００４１】
実施例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００４２】
実施例３
注射用蒸留水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、ソルビトール２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＶＳＭＣのＤＮＡ合成に対するＥＣの効果を示す図である。
【図２】ｎｉＶＳＣＭのＤＮＡ合成に対するＥＣの効果を示す図である。
【図３】ＥＣのＤＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図４】ＥＣのＲＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図５】ＥＣのＤＮＡ合成に対するＨＧＦとｂＦＧＦの相加効果を示す図である。
【図６】ＥＣのＲＮＡ合成に対するＨＧＦとｂＦＧＦの相加効果を示す図である。
【図７】ＥＣの蛋白合成に対するＨＧＦとｂＦＧＦの相加効果を示す図である。
【図８】ＥＣのＤＮＡ合成に対するＨＧＦ及び他のサイトカイン（ＩＬ−１α及びＩＬ−６）の相加効果を示す図である。
【図９】ＶＳＣＭのＤＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図１０】ｎｉＶＳＭＣのＤＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図１１】ｎｉＶＳＭＣのＲＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図１２】ヒト大動脈血管内皮細胞のＤＮＡ合成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図１３】ラット冠動脈血管内皮細胞（ＥＣ）、ヒト大動脈血管内皮細胞、ラット平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、ラット新生内膜平滑筋細胞（ｎｉＶＳＭＣ）及びヒト大動脈血管平滑筋細胞におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現を示す電気泳動写真である。
【図１４】ラット冠動脈血管内皮細胞(ＥＣ)、ヒト大動脈血管内皮細胞、ラット平滑筋細胞(ＶＳＭＣ)、ラット新生内膜平滑筋細胞（ｎｉＶＳＭＣ）及びヒト大動脈血管平滑筋細胞におけるｃ−ｍｅｔ ｍＲＮＡの発現を示す電気泳動写真である。
【図１５】ヒト大動脈血管内皮細胞に対する高グルコースの影響を示す図である。
【図１６】ヒト大動脈血管内皮細胞の高グルコースによる傷害に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図１７】ヒト大動脈血管内皮細胞からのＨＧＦの分泌及びそれに対する高グルコース、ＴＲＫの影響を示す図である。
【図１８】ヒト大動脈血管平滑筋細胞のに対する高グルコースの影響を示す図である。
【図１９】ＶＳＭＣに対する高グルコースの影響を示す図である。
【図２０】ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦの分泌に対するＴＲＫ、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2の影響を示す図である。
【図２１】ヒト大動脈血管平滑筋細胞からのＨＧＦの分泌及びそれに対する高グルコース、ＴＲＫの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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