(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ
［ここでＸは任意のアミノ酸を表わし、Ｙ及びＺは２つともＧｌｙを表わすか又はＹはＧｌｕを表わし、ＺはＡｒｇ又はＬｙｓを表す］からなる、ストレプトアビジンに結合するペプチド。
【請求項２】
任意の蛋白質のアミノ酸配列のＣ−末端、Ｎ−末端またはその配列内部で融合した請求項１記載のペプチドの配列を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列を、適当なプロモーターの制御下に発現可能に有しかつこのＤＮＡ配列に続く５′−又は／及び３′−方向に、発現すべきタンパク質又はタンパク質部分をコードするもう１つのＤＮＡ配列の導入を許す制限切断位置を有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項４】
プロモーターと共にオペレーターも含有する、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適当な宿主細胞で発現させることによって該組換えタンパク質を製造する方法において、請求項２記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を使用することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項６】
発現産物の存在をストレプトアビジンと標識との複合体により検出する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ストレプトアビジンと酵素標識とから成る複合体を使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
酵素標識としてアルカリ性ホスファターゼを使用する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
融合タンパク質としての発現した組換えタンパク質の分離をストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより行う、請求項５から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
アフィニティークロマトグラフィーのためにストレプトアビジン−アガロース基質を使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アフィニティークロマトグラフィーの際に、ストレプトアビジンの天然リガンド、その合成誘導体、あるいは請求項１記載の合成ペプチドを加えて融合タンパク質を溶出する、請求項９又は１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、該ペプチドに融合されているタンパク質にストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）結合親和性を付与するペプチド、このようなペプチドを含む融合タンパク質及びこのような組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を自体公知の方法で適当な宿主細胞で発現させることによって該組換えタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多数の種々の宿主細胞において外来タンパク質を効率的に発現させる系は十分に確立されているけれども、遺伝子工学的タンパク質製造の際の組換え遺伝子産物の検出及び精製は依然として問題である。このことは、特に重要な天然タンパク質が予め単離されておらず、その結果該タンパク質の生化学的特性について確認することもできないし、また該タンパク質に対する特異的抗血清又はモノクロナール抗体も得られていない場合に該当する。このような状況は、最近複製連鎖反応が開発されたために頻繁に起っている［Ｂｌｏｃｈ  Ｗ．（１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０、２７３６−２７４７］。それというのもこのような開発によって、精製された天然タンパク質そのものよりも、該タンパク質をコードする遺伝子に関する情報を得ることの方がしばしば容易であるからである。
【０００３】
該タンパク質に対する特異的免疫試薬が使用できないような場合に、組換え遺伝子産物の検出を可能にするためには、組換えタンパク質に融合される短いペプチド先端部（ペプチドタグ＝Ｐｅｐｔｉｄ−ｔａｇｓ）が使用された。このような融合ペプチド配列がタンパク質配列のアミノ−又はカルボキシ末端で結合される場合には、該ペプチド配列は特異的抗体によって認識される。このようなペプチド先端部の例は、Ｍｙｃタグ（Ｍｙｃ−ｔａｇ）［Ｍｕｎｒｏ及びＰｅｌｈａｍ（１９８６）  Ｃｅｌｌ  ４６、２９１−３００；Ｗａｒｄ等、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６］、フラッグペプチド（Ｆｌａｇ−Ｐｅｐｔｉｄ）［Ｈｏｐｐ等、（１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６、１２０４−１２１０］、ＫＴ3−エピト−プペプチド（ＫＴ3−Ｅｐｉｔｏｐ−Ｐｅｐｔｉｄ）［Ｍａｒｔｉｎ等  （１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６３、８４３−８４９；Ｍａｒｔｉｎ等  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５、１９２−１９４］、α−チューブリンエピト−プペプチド（α−ＴｕｂｕｌｉｎｅｐｉｔｏｐＰｅｐｔｉｄ［Ｓｋｉｎｎｅｒ等  （１９９１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１４１６３−１４１６６］及びＴ７遺伝子  １０−タンパク質−ペプチド−タグ（Ｔ７  Ｇｅｎ  １０−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｅｐｔｉｄ−Ｔａｇ）［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７、６３９３−６３９７］であり、これらのペプチドは、組換え遺伝子産物の検出のために、また若干の場合にはその精製のためにも有効に使用された。さらに前記例の大部分において、これらの短いペプチド先端部（通常アミノ酸の長さ３〜１２個）はタンパク質の生物学的機能を阻害せず、従って発現後に必ずしも分離しなくてもよいことも確認された。
【０００４】
これらの融合ペプチドは特にタンパク質の検出のために適しており、従って発現収量及び精製プロトコルの最適化のための重要な補助作用物質であるけれども、精製工程順序において該ペプチドの有する親和性を適用する範囲は限定されている。この理由は、従来記載されたペプチドの有利な特性がこれらのペプチドの抗体に対する強い結合に基いていることである。従って、タンパク質がペプチド先端部を介して、固定化抗体を有するアフィニティーカラムに結合されている場合、このタンパク質を再び同カラムから溶離するためには、かなり極端な、従ってほとんど保護的でない条件（すなわち非生理学的ｐＨ値又はカオトロピック試薬）を適用しなければならない。しかし組換えタンパク質が機能的な形で生産された場合には、精製の間に変性条件を可及的に回避するのが望ましい。もっとも前記例の３つ［Ｈｏｐｐ等（１９８８）；Ｍａｒｔｉｎ等（１９９０）；Ｓｋｉｎｎｅｒ等（１９９１）］に関してのみ、タンパク質ペプチド融合物を比較的緩和された条件を用いて、つまり例えば合成ペプチドと競合的に溶離できることが判明したにしぎない。しかしこられの場合にも欠点が残っている、それというのもペプチド先端部を標的とするモノクローナル抗体は高価であるか又は十分な量で得ることは困難であるからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の課題は、
ｉ）組換えタンパク質の機能を阻害することなくこのタンパク質と結合することができ、
ｉｉ）容易に使用できる試薬での検出を可能にしかつ
ｉｉｉ）容易に制御できる検出特性を示す
短いペプチド配列を開発することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明により、次のアミノ酸配列・Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ［前記配列中Ｘは任意のアミノ酸を表わし、Ｙ及びＺは両方Ｇｌｙを表わすか又はＹはＧｌｕを表わし、ＺはＡｒｇ又はＬｙｓを表わす］を包含するペプチドによって解決される。つまり本発明の範囲では、前記のペプチド配列がストレプトアビジン、もしくは“核”−ストレプトアビジン（ストレプトアビジンのタンパク質分解による生成物）［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及びＷｉｌｃｈｅｋ、Ｍ．  （１９８９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２５９、３６９−３７６］に対する高い結合親和性を有することが確認された。
【０００７】
従って前記配列が融合タンパク質中に存在する場合には、この融合タンパク質も高いストレプトアビジン親和性を有する。従って相応の融合タンパク質も同様に本発明の対象である。この場合、ペプチド配列は融合タンパク質のカルボキシ末端に存在していてもよいが、理論的にはまた該タンパク質のアミノ末端又はアミノ酸配列内部にあってもよいが、これは不利な特性、例えば生物学的特性の阻害又は破壊等を伴わない場合に限る。
【０００８】
融合タンパク質中に存在するタンパク質は、完全タンパク質ならびにタンパク質の突然変異体、例えば欠落突然変異体又は置換突然変異体であってもよく、最後にまた、本発明の融合タンパク質と結合されたタンパク質の関心部分のみを得ることも可能である。
【０００９】
本発明による融合タンパク質は、ストレプトアビジンと標識とから成る複合体と結合させることによって容易に検出することができ、この際標識としては当業者に周知のすべての標識を使用することができる。このようなタンパク質検出のその他の経過も当業者に周知の条件下で行うことができる。
【００１０】
本発明の他の対象は、適当なプロモーター及びオペレーターの制御下に発現可能に配置された、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を有しかつこのＤＮＡ配列に続く５′−方向に、発現すべきタンパク質又はタンパク質部分をコードする他のＤＮＡ配列の導入を許す数個の制限切断位置を有する発現ベクター、特に、細菌発現ベクターである。
【００１１】
本発明の発現ベクターによって、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列の前により容易に配置しかつ例えばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現後に本発明の融合タンパク質を得ることができる。ペプチド配列の５′−方向の制限切断位置に、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入する（これは本発明の発現ベクターを作成する他の方法手段のように当業者の常用の手段である）と、カルボキシ末端にストレプトアビジン親和性をもたらす本発明のペプチドを有する融合タンパク質が得られる。
【００１２】
本発明の発現ベクターにおいて、制限切断位置は、必ずしも該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の最初の塩基又は最終塩基の直ぐ隣りになくてもよい。しかし好ましくは制限切断位置は、転写の際に読み枠が損われずかつペプチドと該タンパク質のアミノ酸配列との間に少数の、好ましくはせいぜい１０個の付加的アミノ酸の結合が生じるように存在すべきである。
【００１３】
本発明の他の対象は、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適当な宿主細胞で本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させる自体公知の方法により発現させることによって、前記組換えタンパク質を製造する方法である。本発明の方法の利点は、発現産物の存在をストレプトアビジンと標識との複合体により容易に検出することができ又は／及び融合タンパク質としての所望のタンパク質を精製するための分離をストレプトアビジンアフィニティクロマトグラフィーにより行いうる点にある。
【００１４】
前記のように、発現産物、つまり融合タンパク質の存在を検出するためには、ストレプトアビジンを任意の標識との複合体として使用することができ、この際本発明の範囲では酵素標識が好ましい。この場合さらにタンパク質を検出するための自体公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスターン法等も用いることができる。
【００１５】
本発明方法の他の利点は、発現された融合タンパク質の精製を、固定化ストレプトアビジンを有するカラムによるアフィニティ−クロマトグラフィーによって容易に行うことができることである。この場合溶出は、極めて緩和された条件下で、例えばビオチン又はビオチン類似化合物を加えて、又はペプチド合成によって得られたストレプトアビジン親和性ペプチドを用いて有利に行うことができる。
【００１６】
本発明の範囲では、ビオチンを用いる溶出が好ましい。またアフィニティ−クロマトグラフィーのためには、好ましくは、ストレプトアビジン−アガロース基質又はオイペルギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）TMＣに結合されたストレプトアビジンの充填されたカラムを使用する。
【００１７】
本発明の上記説明から、本発明によるペプチド及び該ペプチドを有する融合タンパク質に、発現産物、すなわち融合タンパク質の迅速にして信頼できる検出が可能になる場合には、いかなる優れた利点が備わっているかを見てとることができる。この際ストレプトアビジンは、蛍光標識又は酵素標識のような標識と結合しても得られる。安価で容易に使用できる試薬であると、いえる。さらに発現された融合タンパク質は、本発明によるペプチドの存在による、容易に制御可能のストレプトアビジン結合特性を示すので、発現産物の容易な精製が可能になり、これはまた工業的規模でも実施可能である。
【００１８】
本発明の融合タンパク質の発現は、本発明による発現ベクターを用いることによって容易になり、このような発現ベクターは発現すべきすべてのタンパク質に関して一般的に適用することができる。本発明のペプチドは融合タンパク質において残りのタンパク質部分の生物学的活性を阻害せず、従って必ずしもさらに使用する前に分解しなくてもよい。しかしなんらかの理由から万一分解が望ましい場合には、本発明による発現ベクターは、該タンパク質に対するＤＮＡ配列を導入するための制限切断位置とペプチドをコードする配列との間に、さらに特異的プロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ配列を有するようにも形成されていてよい。従って発現産物の発現後、場合によっては同産物の精製又は検出後には、ペプチド配列の分解を容易に行うことができる。
【００１９】
次に図面を用いながら実施例により本発明を詳述する。
【００２０】
一般的技術
Ａ）  遺伝子工学的方法、試薬
ＤＮＡ操作は、常用の遺伝子工学的方法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｉｓｃｈ、 Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ］により行った。クローニング及び発現のためには、菌種エシエリヒア・コリＫ１２  ＴＧ１（ｓｕｐＥ、ｈｓｄ△５、ｔｈｉ、△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）［Ｆ´、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩq  Ｚ△Ｍ１５］）［Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｔ． （１９８４） Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｉｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｅｎｇｌａｎｄ］及びエシエリヒア・コリＫ１２ ＪＭ８３（ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｒｐｓＬ（＝ｓｔｒＡ）、φ８０、ＬａｃＺ△Ｍ１５）［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ．、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ．及びＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ．（１９８５）、Ｇｅｎｅ ３３、１０３−１１９］を使用した。制限酵素はベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社、ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社及びギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社で入取し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社で入手した。制限消化及び複製連鎖反応（ＰＣＲ）はメーカーによって推奨される条件下で行った。特定部位の突然変異誘発のためには、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）による改良規定を用いた［Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ、Ｊ．、Ｗｉｔｎｅｙ、Ｆ．及びＹｕｃｋｅｎｂｅｒｇ、Ｐ．（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５、７８６−７９１］。オリゴデスオキシヌクレオチド合成は、応用生物装置・ＤＮＡ自動合成装置を使用して行った。共有ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体はアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社で入取し、ストレプトアビジン−アガロースはビオモール（Ｂｉｏｍｏｌ）社又はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社産である。これらすべての試薬は、該ストレプトアビジン、タンパク質分解により短縮されたタンパク質の形を含有している［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及びＷｉｌｃｈｅｋ、Ｍ．（１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９、３６９−３７６］。
【００２１】
Ｂ）  プラスミド構造
本願で使用されたプラスミドｐＡＳＫ４６は、Ｄ１．３Ｆｖ断片のＥ．ｃｏｌｉにおける発現をコードする古い遺伝子構造［Ｗａｒｄ  Ｅ．Ｓ．、Ｇｕｅｓｓｏｗ、Ｄ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ａ．Ｄ．、Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．Ｔ．及びＷｉｎｔｅｒ、Ｇ．（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６］及びｐＡＳＫ４０［Ｓｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｐｆｉｔｚｉｎｇｅｒ、Ｉ．及びＰｌｕｅｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２７８］から構成された。
【００２２】
ｐＡＳＫ４６の完全なＤＮＡ配列は図１〜１１に示してある。同プラスミドの制限酵素切断地図は図１２に示す。
【００２３】
Ｄ１．３Ｆｖ断片のＶＨのＣ末端の４種のペプチド及びＶＬのＣ末端の２種のペプチド［Ｂｏｕｌｏｔ、Ｇ．、Ｅｉｓｅｌｅ、Ｊ．−Ｌ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｇ．Ａ．、Ｂｈａｔ、Ｔ．Ｎ．、Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓ．、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．及びＰｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１３、６１７−６１９］をコードする、ｐＡＳＫ４６の６種の誘導プラスミドを調製した。
ＶＨにペプチド先端部を有する構造物
塩基対６８６−７０６を含む、ｐＡＳＫ４６上のＤＮＡ配列を、ノナペプチドをコードするそれぞれ長さ３０塩基対の下記の配列と置換した。
【００２４】
【化１】
0003865792.tif 000002
【００２５】
ＶＬにペプチド先端部を有する構造物
塩基対１１２７−１１６９を含む、ｐＡＳＫ４６上のＤＮＡ配列を、長さ３６及び４４塩基対の下記の配列と置換した。
【００２６】
【化２】
0003865792.tif 000003
【００２７】
Ｃ）  細胞増殖、誘導及び細胞分解
組換えタンパク質を生産するためには、対応する発現プラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２２℃でアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地で、０．５のＯＤ550が得られるまでインキュベートした。最終濃度１ｍＭを有するＩＰＴＧを加え、温度を場合により２０℃に下げ、タンパク質発現の誘導を３時間続けた。次に細胞を遠心分離し、適当な緩衝液中で再懸濁した。周縁細胞質フラクションの調製のためには、培養細胞１ｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０ｍｌ、５００ｍＭサッカロース、１ｍ  ＭＥＤＴＡ中で氷上でインキュベートした。スフェロプラストを遠心分離によって沈降させ、上澄みを引続き使用する前に滅菌濾過した。この溶液をストレプトアビジン−アガロースカラムによる精製のために使用する場合には、遊離ビオチン群を複合化するために、アビジンを４０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。タンパク質溶液を限外濾過によって濃縮して約１ｍｌの最終容積となし、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１ｌに対して一晩中透析した。少量の沈殿物を、カラムクロマトグラフィー前に遠心分離［ミクロフュージ（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、１４０００ｒｐｍ、１０分、４℃］又はスピン−Ｘ−濾過装置（ｓｐｉｎ−Ｘ−Ｆｉｌｔｒｉｅｒｅｉｎｈｅｉｔ、Ｃｏｓｔａｒ社製）による濾過によって除去した。全細胞タンパク質の溶解部分を調製するためには、培養細胞１ｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（フレンチプレスセル）を用いて１８０００ｐｓｉで破解した。ホモジネートを遠心分離し（４５０００ｇ、３０分、４℃）、遊離ビオチン群の複合化のために上澄みにアビジンを４０μｇ／ｍｌの濃度まで加えた。４℃で３０分インキュベートした後、タンパク質溶液を滅菌濾過し、ストレプトアビジン−アガロースカラム上に施した。全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞４ｍｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）４００μｌ中で再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ適用緩衝液１００μｌ×５を加えた（下記参照）。染色体ＤＮＡをゲル電気泳動前に超音波処理によって切断した。
【００２８】
【実施例】
例  １
フィルター−サンドイッチ試験
フィルター−サンドイッチ試験は、Ｓｋｅｒｒａ等［Ｓｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｄｒｅｈｅｒ、Ｍ．Ｌ．及びＷｉｎｔｅｒ、Ｇ．(１９９１） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６、１５１−１５５］によって記載された戦略により行った。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ニトロセルロース−フィルター膜（直径８２ｍｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）上に塗布するか又は点状に施した。
この膜は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びグルコース１０ｍｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地寒天平板上にあった。この寒天平板を、小さなコロニーが見えるまで３７℃で約８時間インキュベートした。これと平行に、２番目のニトロセルロース−フィルター膜に、ＰＢＳ緩衝液(４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ)中のヒューナータンパク質リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）（Ｄ１．３抗体の抗原）５ｍｇ／ｍｌを６時間負荷し、次にＰＢＳ緩衝液中でＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、フラクションＶ）３％ｗ／ｖ及びツィーン２０（Ｓｉｇｍａ社）０．５％ｖ／ｖで２時間遮断した。この“抗体固定膜”を２回ＰＢＳで洗浄し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｂｉｏｍｏｌ社）を含有する液状ＬＢ培地を含浸させ、同じ培地組成を有する寒天平板上に施し、Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを有する１番目のフィルター膜でおおった。このフィルター積層物上の細胞を室温で一晩中（１４時間）インキュベートとしてＣ末端ペプチド先端部を有するＦｖ断片を発現させた。次に上部フィルター膜を分離し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びグルコース１０ｍｇ／ｍｌを含有する新しいＬＢ寒天平板上に置いて、Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを後で増殖するために４℃で保存した。“固定膜”を寒天から分離し、ＰＢＳ／ツィーン（ツィーン０．１％ｖ／ｖを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ストレプトアビジン結合活性を有するペプチドを含む固定化Ｆｖ断片の検出は、予め１０分間添加しておいたアビジン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）２μｇ／ｍｌの存在でストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体（ＰＢＳ／ツィーン中で１：２０００に希釈）と一緒に１時間インキュベートすることによって達成した。該固定膜は、十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィーン；２×ＰＢＳ）後、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ８．８）；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2)１０ｍｌ中でインキュベートした。この緩衝液にはＢＣＩＰ母液［ジメチルホルムアミド中の５−ブロム−４−クロル−３−インドリル−ホスフェート−４−トルイジン塩（Ｂｉｏｍｏｌ社）５０ｍｇ／ｍｌ］３０μｌ及びＮＢＴ母液［ジメチルホルムアミド７０％ｖ／ｖ中のニトロ−ブル−テトラゾリウム（Ｂｉｏｍｏｌ社）７５ｍｇ／ｍｌ］５μｌを加えておいた［Ｂｌａｋｅ、Ｍ．Ｓ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｋ．Ｈ．Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ、Ｇ．Ｊ．及びＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、Ｅ．Ｃ．（１９８４） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３６、１７５−１７９］。３０〜６０分後に、発色反応を蒸留水中で数回洗浄することによって停止し、フィルターを空気乾燥した。
【００２９】
図１３は、プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡＳＫ４６（３）（負の対照として）及びｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌ（４）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１の４種類のコロニーを示す。負の対照を別とすれば、他のどの場合にもストレプトアビジン複合体に対する強い結合シグナルが観察される。これよりも若干弱い結合シグナルは、プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＨ、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳＫ４６−ｐ１４ＸＨに関して検出された（図示してない）。
【００３０】
例  ２
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、垂直平面ゲル室でＦｌｉｎｇ、Ｓ．Ｐ．及びＧｒｅｇｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｓ．［（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５、８３−８８］の緩衝系を用いて行った。ウエスタンブロット法のために電気泳動後のゲルをトランスファー緩衝液（メタノール２０％（ｖ／ｖ）を含有する電気泳動用移動緩衝液）中に浸漬した。タンパク質を“半乾燥”法でインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上に、４℃で一定の電流強さ１ｍＡ／ｃｍ2で１時間の間に移した。次に該膜を、ツィーン０．５％ｖ／ｖ及びＢＳＡ３％ｗ／ｖを含有するＰＢＳで室温で１時間遮断した。該膜をＰＢＳ／ツィーンで３回洗浄した後、ビオチンカルボキシル−担体タンパク質を複合化するためにアビジン（ＰＢＳ／ツィーン中２μｇ／ｍｌ）と一緒に１０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ／ツィーン中の１：４０００に希釈したストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体と一緒に１時間インキュベートした。十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィーン；２×ＰＢＳ）後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴプロトコル（例１参照）を用いてウエスタンブロット法を行った。
【００３１】
図１４は、ウエスタンブロット法における相応のタンパク質−ペプチド融合物の検出を示す。プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌ（３）及びｐＡＳＫ４６（４）で形質転換した、誘導Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションの同じアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をインモビロンＰ膜に移した後、相応のペプチド−タンパク質融合物がストレプトアビジン複合体によって検出された。同様な実験においてプラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＨは、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳＫ４６−ｐ１４ＸＨは少し弱いシグナルを示した。全細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する場合にも、比較できる結果が得られた。
【００３２】
例  ３
ＥＬＩＳＡ
９６穴を有する微量滴定板（Ｆａｌｃｏｎ＃３９１２）６列に、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3(ｐＨ９．６）中のリゾチーム３ｍｇ／ｍｌの溶液１００μｌを４℃で一晩中負荷させた。次に室温でＰＢＳ中の脱脂粉乳（ＢｉｏＲａｄ社）２％ｗ／ｖで２時間遮断した。洗浄(３×ＰＢＳ／ツィーン)後に、相応のコロニーの周縁細胞質細胞フラクション各５０μｌを、ＰＢＳ／ツィーン中の希釈度列としてピペットで加え、１時間インキュベートした。未希釈フラクション中のＦｖ断片の濃度は約５０〜１００μｇ／ｍｌであった［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価］。洗浄（３×ＰＢＳツィーン）後、ＰＢＳ／ツィーン中の希釈度１：１０００のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体５０μｌを加え、１時間インキュベートした。未結合複合体をＰＢＳ／ツィーン及びＰＢＳでそれぞれ２回洗浄することによって除去し、ＮＰＰ溶液（ｐ−ニトロフェニルホスフェート０．５ｍｇ／ｍｌ；０．９Ｍジエタノールアミン、ｐＨ９．６；１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）１００μｌをピペットで加えた。呈色シグナルを５〜１０分間発生させ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１００μｌを加えて停止した。吸収値を微量滴定板光度計を用いて測定し、測定値を各希釈度に対する空値を差引いた後の差値Ａ405−Ａ450として記録した。空値は、ペプチド先端部を有しないＤ１．３Ｆｖ断片を含有する周縁細胞質細胞フラクションの希釈度列によって測定し、全希釈度範囲に亙って一定であることが判明した（Ａ405−Ａ450＝０．１９９±０．００９）。
【００３３】
図１５は、相応のプラスミドで形質転換された誘導Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションの希釈度列に伴う、ストレプトアビジン複合体の観察された結合シグナルを示す。
【００３４】
例  ４
ストレプトアビジンアフィニテイークロマトグラフィーによるタンパク質精製
ストレプトアビジン−アガロース（ゲル１ｍｌ当り約１ｍｇのストレプトアビジン）の充填されたカラムを、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０容で平衡化した。相応のプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の周縁細胞質細胞フラクション０．５ｌを前記カラムに塗布し、引続きトリス緩衝液で洗浄した。次にハイブリッドＤ１．３Ｆｖ断片を、１ｍＭイミノビオチン（Ｓｉｇｍａ社）又は５ｍＭリポン酸（Ｓｉｇｍａ社）を同じ緩衝液に溶かした溶液で特異的に溶出させた。このビオチン類似化合物はビオチンそのものよりもはるかに弱くストレプトアビジンに結合するので、該カラムをトリス緩衝液１０容で単に洗浄することによって再生させることができる。すべてのクロマトグラフィー段階を４℃の温度で３０ｍｌ／ｈの流量で行った。全細胞タンパク質の可溶部分のストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーを、約２０ｍｌ／ｈの流量でその他は同一条件下で行った。精製されたハイブリッドＦｖ断片の収量は通常０．５ｍｇ／Ｌ・ＯＤ550 Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の範囲内にあった。Ｄ１．３Ｆｖ−リゾチーム複合体のストレプトアビジンアフィニティー精製のために、Ｄ１．３Ｆｖ（ｐ１１１Ｌ）断片を含有しかつ５０ｍＭ  Ｎａ2Ｈ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して透析しておいた周縁細胞質細胞フラクションに、約３倍モル量のリゾチームを加えた。４℃で１時間インキュベートとし、次に遠心分離した後、生じるタンパク質溶液を、ストレプトアビジン−アガロースアフィニティークロマトグラフィーにかけ（上記）、この際最後に挙げた緩衝液を使用した。
【００３５】
図１６は、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ及びｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションについて行ったストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの溶出プロフィル（２８０ｎｍで吸収）を示す。この中に、クーマシーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）で染色された、イミノビオチン溶液を適用して得られたフラクションのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを図示してある。該図から、ヘテロダイマータンパク質の各鎖がストレプトアビジン親和性ペプチドに融合されていたとしても、Ｆｖ断片の２つのサブユニットが一緒に純粋な形で特異的に溶出されたのを認めることができる。ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌの場合には、２個の鎖はＳＤＳ−ＰＡＧＥで同じ移動度を有していた。従って精製されたタンパク質の機能性もＥＬＩＳＡ実験（例３と同様）によって検出された。ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の全細胞タンパク質を施して、同様に行ったクロマトグラフィーの場合にも、同様に組換えタンパク質が完全なヘテロダイマーとして純粋な形で得られた。
【００３６】
図１７は、同様なストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの溶出プロフィルを示すが、この場合には、リゾチーム、つまりＤ１．３  Ｆｖ断片の抗原を、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションに加えておいた。溶出プロフィルで図示した、クーマシーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）で染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、イミノビオチン溶液で溶出して得られる産物フラクション（２）、比較的に精製されたリゾチーム（３）及び別個に精製された組換えＦｖ断片（４）を示す。痕跡（１）は分子量標準を表わす。組換えＦｖ断片と抗原リゾチームとから成る免疫複合体が特異的に精製されていることがわかる。
【００３７】
例  ５
ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの構造及び使用
ｐＡＳＫ４０［Ｓｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｐｆｉｔｚｉｎｇｅｒ、Ｉ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２７８］から出発して、特異的部位の突然変異誘発及びＰＣＲを用いてｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐを調製した。図１８でｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの制限酵素切断地図を示し、同プラスミドの全ＤＮＡ配列を図１９〜２９に示してある。ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上のポリリンカーは、ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする領域の３′末端に直接存在する２つの制限位置を含む、改良された一組の特異的制限切断位置を有し、その次にストレプトアビジン−結合ペプチド“（Ｓｅｒ−Ａｌａ−）Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ”をコードするＤＮＡ配列が続く（図３０参照）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける外来遺伝子の直接発現（すなわちＯｍｐＡシグナル配列を使用しない）は、ＸｂａＩ切断位置を使用しかつｌａｃＺミニシストロンの終止コドンと構造遺伝子の開始コドンとの間の１６塩基対を含む範囲を再構成して達成することができる。これに対して、ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上にコードされているＯｍｐＡシグナル配列との融合をつくるためには、構造遺伝子をＳｔｕＩ又はＢｓａＩ切断位置を使用してクローン化することができる。ＳｔｕＩ（認識配列“ＡＧＧＣＣＴ”）は、シグナル配列の最終コドン（Ａｌａ）の初めのヌクレオチドの後に平滑末端をつくる。従って精密な融合は、適合しうる制限位置（例えばＳｔｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮｒｕＩ）の助けによって構造遺伝子の直前でつくることができる。ＢｓａＩはクラスＩＩａの制限酵素であって、その切断位置は認識位置から離れている（“ＧＡＧＡＣＣ”、図３０では下線をひいてある）。この酵素で切断することによって、シグナル配列の最外端の３′−末端にある５′−突出ＤＮＡ末端がつくられる（“ＧＧＣＣ”、図３０では小文字で表わしてある）。この末端はクローン化すべき遺伝子の成熟部分のコード領域中に突出しない。この付着末端は、制限酵素ＥａｅＩ及びＥａｇＩによってつくられる末端に連結することができる。また、例えばクローン化すべきＤＮＡ断片を調製する場合ＰＣＲによって、適合しうる制限位置を導入することもできる。このような制限位置は、ＢｓａＩ（又は他のＩＩａクラスの酵素、例えばＢｓｐＭＩ）の認識配列が、つくろうとする付着端の対向側に配置される場合に、遺伝子のアミノ末端をコードする成熟領域を損わない。ストレプトアビジン−結合ペプチドをコードする領域への構造遺伝子の融合は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−制限切断位置（認識配列“ＡＧＣＧＣＴ”）を使用して達成することができる。これによって、請求項１記載の実際のペプチド配列前に、Ｓｅｒコドン（“ＡＧＣ”、図３０では小文字で表わしてある）とＡｌａコドンとの間で直接平滑切断が起こる。Ｓｅｒコドンを再調製しようとする場合には、適合する末端をつくるための種々の制限位置（Ｅｃｏ４７ＩＩＩの他に例えばＳｃａＩ及びＮｒｕＩ）を利用することができる。
【００３８】
例  ６
ｐＡＳＫ６０−ＳｔｒｅｐによるＬＤＬ受容体の可溶領域の発現及び検出
ヒトの“低密度リポタンパク質”受容体は、成熟受容体において分離されたＮ末端シグナル配列を別にすれば、５つのタンパク質領域から成り、そのうちの第４番目はトランスメンブラン部分である。アミノ酸１〜２９２個を有する第１番目のＮ末端タンパク質領域のクローニングのためには、プラスミドｐＬＤＬＲ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ５７００４）［Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ．、Ｄａｖｉｓ、Ｃ．Ｇ．、Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｓ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｗ．Ｊ．、Ｃａｓｅｙ、Ｍ．Ｌ．、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ． （１９８４） Ｃｅｌｌ  ３９、２７−３８］を使用した。相応のＤＮＡ断片を、オリゴデスオキシヌクレオチド−プライマー“５′−ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＣＣＧＣＡＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴ”（Ｎ末端について：制限切断位置ＥａｇＩを有する）及び“５′−ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＴＴＣ”（Ｎ末端について：制限切断位置ＳｃａＩを有する）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、単離しかつ制限酵素ＢａｇＩ及びＳｃａＩで切断する。このＤＮＡ断片を、ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐにおいてその制限切断位置ＢｓａＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩにより、Ｅ．ｃｏｌｉ菌種Ｋ１２  ＪＭ８３を使ってクローン化した。得られたプラスミドを制限分析及びＤＮＡ配列決定した後、クローンから培養物を調製し、前記のようにタンパク質発現を誘導する。得られた細胞の全細胞タンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロット法によってインモビロンＰ膜上に移した。ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（例２参照）を用いて、約４０，０００ダルトンの組換え受容体領域を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＡＳＫ４６のＤＮＡ配列（切断位置ｍ示す）及び同配列によってコードされた、３つの読み枠におけるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】図５の続きである。
【図７】図６の続きである。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】図１０の続きである。
【図１２】ｐＡＳＫ４６の制限酵素切断地図を示す図である。
【図１３】フィルター−サンドイッチ試験における本発明のタンパク質−ペプチド融合物の検出（コロニー）を示す図である。
【図１４】ウエスタンブロット法における本発明のタンパク質−ペプチド融合物の検出を示す図である。
【図１５】形質転換された誘導Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションの希釈度に伴う、ストレプトアビジン複合体の結合シグナル（ＥＬＩＳＡで観察）を示すグラフである。
【図１６】図１５と同様な周縁細胞質フラクションについて行ったストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
【図１７】図１６と同様な周縁細胞質フラクションに抗原（リゾチーム）を加えて行った、図１６と同様なクロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
【図１８】ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの制限酵素切断地図を示す図である。
【図１９】ｐＡＳＫ６０−ＳｔｒｅｐのＤＮＡ配列（切断位置も示す）及びこの配列によってコードされた、３つの読み枠におけるアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】図１９の続きである。
【図２１】図２０の続きである。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】図２７の続きである。
【図２９】図２８の続きである。
【図３０】ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐのポリリンカーの配列の説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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