(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.5〜５ｍＭフェノール、及びそれぞれ 0.5〜２％の濃度の２種の非イオン界面活性剤を含む生物試料中の濁りを除去するための薬剤において、前記非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルとポリオキシエチレン（８）イソトリデシルエーテルであり、また前記薬剤は更に 0.5〜２％の濃度のポリオキシエチル化トリグリセリドを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２】
細胞反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検出する分析における請求項１に係る薬剤の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生物試料、特に血清又は血漿試料中の濁りを除去するための薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
濁りは、通常、多量のトリグリセリド・リッチ・リポプロテイン粒子、例えば、カイロミクロン（乳状脂粒）を有する血漿又は血清試料（脂血試料）中に生じる。
【０００３】
濁りを除去するための公知薬剤は、特に、化学又は臨床診断における脂血試料の測光分析において必要である。もしも、分析すべき成分が、濁りを生じるトリグリセリドの吸収波長と一致する波長で吸収するなら、当該成分の正しい測光分析は、たとえ不可能でないとしても、困難であろう。このことは、測定される成分濃度が非常に低い場合、例えば分析物が細胞反応性タンパク（ＣＲＰ）である場合に、特にあてはまる。
【０００４】
したがって、濁りによる干渉が排除されなければならない測光手法のための典型的な例は、ＣＲＰの分析（assay)である。この分析は試料中のＣＲＰと特異的に反応する抗ヒトＣＲＰ抗体を使用して、不溶性凝集体を生成する。この分析は抗体の添加によって始まり、ＣＲＰ−抗体−凝集体の増加を 340ｎｍの測光法によって測定する。脂血試料中のトリグリセリドもまた、この波長で吸収し、その結果、重複した消光シグナルの危険性が生じる。
【０００５】
脂血試料におけるこの問題を解決するための、濁りを除去するために添加され得る数種の薬剤が当該技術分野では公知である。これに関して、米国特許第4,708,939 号には、水溶液中にポリエトキシル化トリグリセリド及び第２級ｎ−アルカンスルフォネートを含む薬剤が記載されている。この公知薬剤は、ある種の分析、特に免疫濁度測定分析に影響を与え得る比較的高い洗剤濃度を必要とする。更に、ｎ−アルカンスルフォネートは、目的の反応を阻害し得る積極的な洗剤である。したがって、この公知薬剤は、全体的な澄明化性及び最適な抗体−抗原反応をもたらすことができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特にＣＲＰ分析に適用するが、他の分析にも使用し得る濁りを除去するための薬剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による薬剤は、 0.5〜５ｍＭフェノール、 0.5〜２％のポリオキシエチル化トリグリセリド、及びそれぞれ 0.5〜２％の２種の非イオン界面活性剤であるポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルとポリオキシエチレン（８）イソトリデシルエーテルの組み合わせを含む。
【０００８】
【発明の実施の態様】
本発明による薬剤では、試料の全体的澄明化を得るには、ポリエトキシル化トリグリセリド（トリグリセリドエトキシレート）が必要である。好適なポリエトキシル化トリグリセリドは４〜１６の範囲、好ましくは６のＨＬＢ（親水新油バランス）値を有することができる。好ましい濃度範囲は0.5 〜２％である。好ましいポリオキシエチル化トリグリセリドは、Mulsifan RT163 (Zschimmer & Schwarz GmbH & Co.) 又はTagat CH-40 (Goldschmidt AG)という商標名で入手可能である。
【０００９】
ポリオキシエチル化トリグリセリドは、単独では混合物中に溶解できず、沈澱物を生じる。溶解させるには、試料中のポリエトキシル化トリグリセリドの可溶化を助ける少なくとも１種の別な非イオン界面活性剤を必要とする。
【００１０】
使用し得る非イオン界面活性剤の典型的な例としては、Thesit、Tergitol、Triton、Brij、Nonidet P-40、Tween 20 (Sigma-Aldrich Ltd.）が挙げられる。
【００１１】
必要とする非イオン界面活性剤は、１０〜１８個の炭素原子を有する、オキシエチル化数が小さい（分子当たり２〜１０個のオキシエチレン単位）直鎖又は分岐ポリオキシエチレンエーテルである。
【００１２】
別な非イオン界面活性剤は、好ましくは、Genapol X 080 という商標名で入手可能であるポリオキシエチエレン（８）イソトリデシルエーテルである。この非イオン界面活性剤は反応混合物中に溶解するが、単独では澄明化効果を示さない。（上述したように）ポリエトキシル化トリグリセリドを可溶化することが必要である。非イオン界面活性剤が使用され得る好ましい濃度範囲は、0.5 〜２％である。
【００１３】
別な好ましい非イオン界面活性剤は、Sigma から購入することができるポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルである。この界面活性剤もまた、反応混合物中に溶解して、ポリエトキシル化トリグリセリドの溶解を助ける。好ましい濃度範囲は、0.5 〜２％である。
【００１４】
好ましい実施の形態では、ポリオキシエチレン（８）イソトリデシルエーテルとポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルとの組み合わせが、使用される。このような組み合わせは、ポリオキシエチル化トリグリセリドの非常に効果的な溶解を可能とし、それによって、本発明に係る薬剤の澄明化作用を向上させる。
【００１５】
フェノールは、結局脂質に対して溶解作用を有さないが、界面活性剤と相乗的に作用して澄明化作用を増加させ、濁りを除去する。フェノールの存在は、必要とする界面活性剤の有効濃度を減少させることを助ける。フェノールが存在しないと、より高い濃度の界面活性剤を必要として、余りにも高い粘度を有する試料を生じさせるであろう。
【００１６】
本発明による薬剤中の各成分は、先行技術分野で公知である濁り除去剤として既に使用されている公知物質である。
【００１７】
相乗的作用成分としてのフェノールの使用は、ＥＰ0004857 から公知である。ＥＰ0004857 から、非イオン界面活性剤としてGenapol を使用することも公知である。別な非イオン性界面活性剤の使用は、上記引用した米国特許4,708,939 号から公知である。しかしながら、先行技術は単一成分又はそのサブコンビネーションの使用を開示しているに過ぎない。それらのいずれも、本発明による薬剤のように、これらの全てを組み合わせることを示していない。
【００１８】
本発明による薬剤に含まれる成分の全ては、驚くべきことに、可能性ある抗体−抗原反応への影響を最小限にして、濁りを有効に除去するために必要であることが判明した。理論的には、Genapol はポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルと共に澄明化に有効である。しかしながら、澄明化に必要とする濃度が非常に高いから、いかなる抗体−抗原反応も全体として阻害される。本発明では、もしもMulsifan及びフェノールが添加されるなら、Genapol 及びポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテルの濃度を、免疫学的反応に影響を与えることなく、澄明化を可能とする濃度まで低下させることができる。
【００１９】
基本的には、本発明による薬剤は、高脂血症に寄与する相互作用の可能性が存在する全ての免疫分析法に使用され得る。
【００２０】
（実施例）
以下に示す実施例は、免疫濁度測定法を使用する。当業者はラテックス増強分析、磁気粒子化学発光免疫分析、免疫蛍光分析（偏光及び非偏光）、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay : 酵素連鎖免疫吸収剤分析）、免疫クロマトグラフィ分析、又は脂血及び／又は他の関連した非特異的結合問題を減少させることを必要とする全ての分析法（これらに限定されない）を含む他の方法においても、同様な利点を有することに気づくであろう。これらの方法では、抗体結合特性の有益な維持が、本発明の反応物質の組み合わせによって生じる。
【００２１】
次に、ＣＲＰ検出分析法に使用される本発明による澄明化用剤の一般的な処方を記載する。更に、本発明に係る薬剤によって脂血試料において効果が示された濁り除去を示す実施例を追加する。
【００２２】
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【００２３】
緩衝液Ｒ１はｐＨ7.5 （可能範囲ｐＨ３〜９）に調整し、好ましくは温度３７℃（可能範囲１５〜４０℃）にて使用する。
【００２４】
ＣＲＰ分析では、250 μｌのＲ１を１８μｌの試料と混合する。次いで、３０μｌの抗血清溶液（Ｒ２；抗ＣＲＰ抗体を含む）を添加する。試料とＲ１緩衝液およびＲ２抗血清溶液を混合した後、試料中のＣＲＰがＲ２の抗ヒトＣＲＰ抗体と特異的に反応し、不溶性凝集体を生成する。これらの凝集体の吸光度は、試料中のＣＲＰ濃度に比例する。
【００２５】
Ｒ１緩衝液の目的は、脂血試料中の脂質を溶解し、免疫学的反応に最適の条件を提供することにある。
【００２６】
脂血試料中の濁りの除去
この試験では、澄明化用緩衝液（Ｒ３）を、次の処方で使用した：
ＨＣｌでｐH 7.5 に調整した 100ｍＭのTris緩衝液， 100ｍＭのＮａＣｌ，２％ポリオキシエチレングリコール(PEG)6000 ，２ｍＭのフェノール， 1.0％ポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテル， 1.0％Genapol X 80，及び 1.0％Mulsifan RT 163 。
【００２７】
キュベット中で、１８μｌの強脂血血清を 250μｌのＲ３と共に３７℃で混合した。 340ｎｍでの吸光度変化を経時的に測定した。その結果を図１に示す。
【００２８】
図１に示される吸光度変化の経過が示すように、試料／試薬の割合が１８μｌ： 250μｌである場合、試薬ブランクと対比すれば、約1.5 の濁りが吸光度0.1の澄明化レベルまでに約1.5 分間で減少した。したがって、1.5 分間後には濁りの完全な除去が達成されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】脂血試料から濁りを除去する態様を示すグラフ図である。
【図１】
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