(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素III型が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項６】
請求項５記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素III型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素III型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素III型の製造法。
【請求項７】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項８】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素II型が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素II型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素II型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素II型の製造法。
【請求項１３】
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１４】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素Ｉ型が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素Ｉ型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素Ｉ型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素Ｉ型の製造法。
【請求項１９】
請求項１、７及び１３のいずれかに記載のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をＤ−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトールを採取することを特徴とするエリスリトールの製造法。
【請求項２０】
請求項５、１１及び１７のいずれかに記載の細胞をＤ−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトールを採取することを特徴とするエリスリトールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質の製造法、及びエリスリトールの製造法に関する。
エリスロース還元酵素は、エリスロースを還元してエリスリトールを生成する反応を触媒する酵素である。この酵素には、Native-PAGE上の移動度と等電点の相違から、Ｉ型、II型、III型の３種類のアイソザイムが存在する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスリトールは、低カロリーなのに甘味度が高く、しかも非う蝕性を有することから、食品、飲料の甘味料として多用されている。
エリスリトールの工業的規模の製造方法として、グルコース等の基質から、トリコスポロノイデス（Trichosporonoides）属、モニリエラ（Moniliella）属の微生物等のエリスリトール生産菌をグルコース等の基質に作用させる方法が実用化されている（特公平６−３０５９１号公報、同６−３０５９２号公報、同４−１１１８９号公報、同４−６３５号公報、特開平１０−９６号公報、同９−１５４５８９号公報）。
【０００３】
これらのエリスリトール生産菌のうち、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）  ＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４３０）によるエリスリトール生産には、エリスロース還元酵素Ｉ、II及びIII 型が関与していることが報告されている（K. Tokuoka, et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145-155 (1992)）。
【０００４】
トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株によるグルコースからエリスリトールまでの代謝経路は図１に示す通りである。
図示したように、グルコースは、解糖（Glycolysis）によりグルコース−６−リン酸（Glc-6-P）や、グリセルアルデヒド３−リン酸まで分解された後、ペントースリン酸回路（Pentose Phosphate Shunt）に入り、エリスロース−４−リン酸（Erythrose-4-P）となる。
【０００５】
このエリスロース−４−リン酸が脱リン酸化されてＤ−エリスロース（D-Erythrose）が生じ、このエリスロースが還元剤ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ（以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈという。）による還元を受けて、メソ−エリスリトール（meso-Erythritol）が生ずる。
エリスロース還元酵素Ｉ，IIおよびIII型はいずれも、かかる一連の反応のうち後者の還元反応（エリスロースが、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、メソ−エリスリトールに還元される反応）を触媒する。
【０００６】
しかし、エリスロース還元酵素Ｉ型、II型及びIII型に関する報告は、酵素学的性質に限られており、本酵素の遺伝的情報については従来解明されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エリスリトールの効率的な製造方法、並びにその生産菌を確立するために、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするＤＮＡの構造を解明し、これらの利用方法を提供することにある。
【０００８】
エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを解読することができれば、酵母等の細胞に組込む等の手段により大量の該酵素活性を有するタンパク質が発現し、エリスリトールの大量生産につながる可能性は勿論のこと、遺伝子工学的手法を用いて高いエリスリトール生産性を有する変異体酵素の開発、関連酵素をコードする遺伝子のクローニング等、様々な用途において有用であるものと考えられる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために研究を重ねた結果、トリコスポロノイデス属の微生物が生産するエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を見出すに至った。
【００１０】
すなわち、本発明者らはまず、微生物から酵素を取得・精製して、ペプチドマッピングによりトリコスポロノイデス属の微生物が生産する第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を部分的に解読し、これを基にしてプローブを作製した。
このプローブでエリスリトール生産菌のノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、エリスロース還元酵素III型の発現量が多い時期を特定した。該酵素の発現量が多い時期のｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１１】
次いで、ｃＤＮＡライブラリーを前記プローブでスクリーニングし、第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡの塩基配列を解読した。
【００１２】
また、本発明者らは、上記で得られた第１のエリスロース還元酵素のｃＤＮＡ全長を基にしてプローブを作製し、前記ｃＤＮＡライブラリーを用い、後述のような条件でハイブリダイゼーションを行いスクリーニングした結果、第２および第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡの塩基配列を解読した。
【００１３】
さらに、これらスクリーニングしたｃＤＮＡを用い、大腸菌発現ベクターに組込み、大腸菌菌体内でヒスチジンタグ融合タンパク質として、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質を発現させた。
こうして得られた組換えタンパク質の活性、基質特異性等について調べた結果、天然型エリスロース還元酵素と同様の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を有していることを確認した。
また、栄養要求性の酵母へプラスミドを導入しても、正確な発現が誘導されることを確認した。
本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
すなわち、請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
請求項２記載の本発明は、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
請求項３記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡである。
【００１５】
請求項４記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡである。
【００１６】
請求項５記載の本発明は、請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素III型が発現可能な形態で導入された細胞である。
請求項６記載の本発明は、請求項５記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素III型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素III型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素III型の製造法である。
【００１７】
請求項７記載の本発明は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
請求項８記載の本発明は、下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質。
請求項９記載の本発明は、配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項８記載のＤＮＡである。
【００１８】
請求項１０記載の本発明は、配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項１０記載のＤＮＡである。
【００１９】
請求項１１記載の本発明は、請求項８〜１０のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素II型が発現可能な形態で導入された細胞である。
請求項１２記載の本発明は、請求項１１記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素II型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素II型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素II型の製造法である。
【００２０】
請求項１３記載の本発明は、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
請求項１４記載の本発明は、下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ｅ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質。
請求項１５記載の本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡである。
【００２１】
請求項１６記載の本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列を含むＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡである。
【００２２】
請求項１７記載の本発明は、請求項１４〜１６のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素Ｉ型が発現可能な形態で導入された細胞である。
請求項１８記載の本発明は、請求項１７記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素Ｉ型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元酵素Ｉ型を採取することを特徴とするエリスロース還元酵素Ｉ型の製造法である。
【００２３】
請求項１９記載の本発明は、請求項１、７及び１３のいずれかに記載のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をＤ−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトールを採取することを特徴とするエリスリトールの製造法である。
請求項２０記載の本発明は、請求項５、１１及び１７のいずれかに記載の細胞をＤ−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトールを採取することを特徴とするエリスリトールの製造法である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質は、エリスリトール生産菌であるトリコスポロノイデス属に属する酵母に存在し、トリコスポロノイデス・メガチリエンシスは、その代表的な酵母である。
【００２５】
まず、本発明の第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの取得について説明する。
本発明の第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば本発明者らが確立したように、エリスリトール生産菌から取得した酵素活性を有するタンパク質を精製して部分的に解読したアミノ酸配列を基にしてプローブを作製した後、このプローブを用いて、前記菌のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことにより、取得することができる。
【００２６】
本発明者らは、まずスクリーニングのためのプローブを得るべく、エリスリトール生産菌から常法によりエリスロース還元酵素III型を取得し、精製した後、該タンパク質のアミノ酸配列を部分的に解読した。
トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株からエリスロース還元酵素III 型を取得し、精製するには、H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 941-945, 1992に記載の方法に従って行えばよい。
なお、この方法に限らず、遠心分離、透析、種々のクロマトグラフィーを組み合わせた通常のタンパク質の取得、精製方法によることができる。
【００２７】
精製したエリスロース還元酵素III型のアミノ酸配列を部分的に解読するには、目的のタンパク質を短いペプチドに酵素分解し、常法によりペプチドマッピングを行い、単離されたアミノ酸配列を決定することにより行うことができる。
アミノ酸配列の決定は、エドマン分解により行うことができ、自動アミノ酸シークエンサーを用いると簡便に行うことができる。
【００２８】
次に、本発明者らは部分的に解読したアミノ酸配列から設計したプライマーを用いて、エリスリトール生産菌のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、プローブを作成した。
【００２９】
部分的に解読したアミノ酸配列からのプライマーの設計は、常法によって行うことができる。
例えば、アルド−ケト還元酵素ファミリーのアミノ酸配列を参考にして、部分的に解読したアミノ酸配列の中からの一部分（配列表の配列番号６および７参照）を選択し、それぞれの配列からセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（配列表の配列番号４および５参照）を設計することができる。
【００３０】
エリスリトール生産菌のｃＤＮＡは、エリスリトール生産菌の培養物からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを調製して、このｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により得ることができる。
ＲＮＡの抽出にはTRIZOL（Gibco BRL社製）等を用いることが簡便である。また、ｍＲＮＡの調製には、DYNABEADS mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いると、簡便に行うことができる。
【００３１】
こうして得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、予め設計しておいたセンスプライマー（配列表の配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー（配列表の配列番号５参照）を用いて、ＰＣＲ反応により増幅させる。このようにして、本発明者らは、ＰＣＲ増幅産物として、長さ３９８ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを得ることができた。
【００３２】
このＰＣＲ増幅産物をベクターにライゲーションし、形質転換した後、先に決定したエリスロース還元酵素III型の部分アミノ酸配列を含んでいるか否かを解析した。
その結果、エリスロース還元酵素III型をコードするＤＮＡの一部であることが確認されたので、このｃＤＮＡフラグメントを、後述のプラークハイブリダイゼーションにおいて、プローブとして用いることとした。
なお、このフラグメントは、配列表の配列番号１記載の塩基配列のＮ末端から１８４〜５８２番目に相当する。
【００３３】
続いて、本発明者らはエリスリトール生産菌のｃＤＮＡライブラリーを作製するに当たり、エリスロース還元酵素III型の発現量が多い時期について予め検討することとした。
【００３４】
エリスリトール還元酵素III型の発現量を調べる方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション等の方法がある。例えば、培養時間を変えて培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株からtotal ＲＮＡを抽出し、先に設計したプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションを行う。その結果、４８時間培養物（図２のレーン３）が、エリスロース還元酵素III型の発現量が最も多いことが明らかとなった。
【００３５】
そこで、本発明者らは、エリスロース還元酵素III型の発現量が最も多い時期のエリスリトール生産菌のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためには、エリスリトール生産菌の培養物からＲＮＡを抽出してｍＲＮＡを精製し、これに相補的な２本鎖ｃＤＮＡを合成して、ファージベクターにアダプターを介して組込めばよい。
ＲＮＡの抽出は、TRIZOL（Gibco BRL 社製）等を用いることが簡便である。また、ｍＲＮＡの調製には、DYNABEADS mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いると簡便に行うことができる。
【００３６】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は、岡山−Burg法、グブラー−ホフマン（Gubler-Hoffman）法を採用できるが、簡略な点から後者の方法が好ましい。
実際には、ZAP Express cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社製）を用い、キットの説明書に従いライブラリーを作成する方法が簡便で好ましい。
本キットで用いるZAP Express Vectorは、ｃＤＮＡライブラリー中では直鎖上のファージＤＮＡであるが、in vivo excisionによりカナマイシン耐性遺伝子を含んだ環状のプラスミド（ファージミド）として取り出すことが可能である。
【００３７】
本発明者らは、前記ｃＤＮＡライブラリーについて、先に得たプローブを用いてエリスロース還元酵素III型をコードするＤＮＡをスクリーニングした。
スクリーニングは、ジゴキシゲニン標識したプローブによるプラークハイブリダイゼーションにより行うことができる。
【００３８】
本発明者らは、スクリーニングの結果、プローブに対し陽性を示したファージからプラスミドに変換後、ＤＮＡシークエンスを行った。
例えばまず、スクリーニングにおいてプローブに対し陽性を示した数個のプラークを単離し、ファージを増幅して、ファージＤＮＡからIN  VIVOにおいてインサートを含むファージミド部分を切り出す。これを取り扱いを容易にすべくプラスミドの形に変換し、大腸菌に感染させてプラスミドを増幅した後、このプラスミドについて、ＤＮＡシークエンスを行う。
本発明者らはＤＮＡシークエンスにより、配列表の配列番号１に示す全長１１１９ｂｐの塩基配列を見出した。
本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配列も、併せて配列表の配列番号１に示した。該アミノ酸配列は、部分的に解読したアミノ酸配列を含んでおり、この配列を有するタンパク質がエリスロース還元酵素III型タンパク質であった。
【００３９】
また、エリスロース還元酵素III型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図３に示す。図３からわかるように、５’末端から１２２番目の塩基部分にBan I切断部位、８４７番目及び１０５７番目の塩基部分にEcoR I切断部位、１０９３番目にBamH I切断部位を有する。
【００４０】
このエリスロース還元酵素III型タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号１参照）は、先に判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規なアミノ酸配列である。
このことから、本発明に係るエリスロース還元酵素III型タンパク質は、新規なアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００４１】
次に、本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡについて説明する。
本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質については、以下の方法で取得することができる。
すなわち、前記菌のエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡ全長を基にして作製したプローブを用いて、エリスロース生産菌のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、後述のような条件で行うことによって、本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００４２】
本発明者らは、本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡとして、配列表の配列番号２に示す全長１０７７ｂｐの塩基配列を見出した。
本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配列も、併せて配列表の配列番号２に示した。該アミノ酸配列は部分的に解読したアミノ酸配列と一致するので、この配列を有するタンパク質が、エリスロース還元酵素II型タンパク質である。
【００４３】
エリスロース還元酵素II型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図４に示す。図４からわかるように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、１４８番目及び５２０番目の塩基部分にAcc I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩基部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にSal I切断部位、８４７番目の塩基部分にEcoR I切断部位を有する。
【００４４】
このエリスロース還元酵素II型タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号２参照）は、先に判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規なアミノ酸配列である。
このことから、本発明に係るエリスロース還元酵素II型タンパク質は、新規なアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００４５】
さらに、本発明の第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの取得について説明する。
本発明の第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質についても、基本的には、本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡについての上記方法と同様の方法で取得することができる。
すなわち、前記菌のエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡ全長を基にして作製したプローブを用いて、前記菌のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、前記請求項３（ｂ）と請求項４、又は、請求項５（ｄ）と請求項６に記載した条件で行うことによって、本発明の第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００４６】
本発明者らは、本発明の第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡとして、配列表の配列番号３に示す全長１１２１ｂｐの塩基配列を見出した。
本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配列も、併せて配列表の配列番号３に示した。該アミノ酸配列は部分的に解読したアミノ酸配列と一致するので、この配列を有するタンパク質が、エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質である。
【００４７】
エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図５に示す。図５からわかるように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩基部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にAcc I切断部位及びSal I切断部位、８４７番目の塩基部分にEcoR I切断部位を有する。
【００４８】
このエリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）は、先に判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規なアミノ酸配列である。
このことから、本発明に係るエリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質は、新規なアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００４９】
本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質は、エリスロース還元酵素活性が損なわれない限り、配列表の配列番号１、２、又は３記載のアミノ酸配列に対して、１若しくは複数の位置での１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５０】
このような、配列表の配列番号１、２、又は３記載のアミノ酸配列に対して、１若しくは複数の位置での１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、例えば部位特異的突然変異法（Methods in Enzymology, 100, pp. 448 (1983)）や、突然変異処理のほか、生物の種あるいは菌株による差等の天然に生じる変異によっても取得することができる。また、遺伝子組換えに関する実験マニュアル（Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp. 448 (1983)）、ＰＣＲ法（Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practial Approach IRL Press pp.200 (1991)）によっても取得することができる。
上記のような置換等を含むアミノ酸配列が、エリスロース還元酵素活性を有することは、該配列を含む遺伝子を適当な細胞で発現させ、発現産物のエリスロース還元酵素活性を調べて確認することができる。エリスロース還元酵素活性は、該酵素がエリスロースを還元する際に補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使うことから（図１参照）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の変化を比較することにより測定できる。
【００５１】
本発明の第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡであることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、このＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載する塩基配列のうち、Ｃ末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００５２】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５３】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には、途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについて市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物のエリスロース還元酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５４】
本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡであることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、このＤＮＡは、配列表の配列番号２に記載する塩基配列のうち、Ｃ末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００５５】
ここでいうストリンジェントな条件も、明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５６】
本発明の第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号３に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡであることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、このＤＮＡは、配列表の配列番号３に記載する塩基配列のうち、Ｃ末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想される部分である、塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００５７】
ここでいうストリンジェントな条件も、明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５８】
エリスロース還元酵素Ｉ型、II型及びIII型タンパク質をコードするＤＮＡは、それぞれエリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型が発現可能な形態で細胞に導入することができる。
細胞への導入は、エリスロース還元酵素Ｉ型、II型又はIII型タンパク質をコードするＤＮＡの全長を、両端に制限酵素認識部位を持つプライマーでＰＣＲにより増幅させ、この増幅産物を、制限酵素認識部位を利用して各種プラスミドに組込んだ形で行うことができる。
【００５９】
ここで、細胞としては、大腸菌、酵母など発現用細胞として通常用いられるものを使用することができる。
プラスミドとしては、大量発現が容易なプラスミドを選択することが望ましく、大腸菌へ導入する場合、ヒスチジンタグ融合タンパク質、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質、チオレドキシン融合タンパク質などを用いることができる。
発現誘導に際しては、プロモーターを本発明の各ＤＮＡの５’側より上流に、ターミネーターを３’側より下流に、それぞれ組込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、発現用細胞内で機能することが知られているものを用いる必要があり、詳細については、微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992)等に記載されている。
例えば大腸菌へプラスミドを導入する場合、ラクトースオペロンとlac Iを用いたＩＰＴＧによる調節システムを用いると、正確な発現が誘導される点で好ましい。
なお、大腸菌の代わりに栄養要求性の酵母であるS.cerevisiaeへプラスミドを導入しても、ガラクトースにより正確な発現が誘導される。
【００６０】
このように、エリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を培養し、発現誘導を行って、十分に発現が誘導された段階で細胞を収穫して、組換えタンパク質を取り出し、精製することにより、本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質を製造することができる。
一例を挙げると、第１のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を遠心分離により収穫し、超音波処理で細胞を破砕し、得られる組換えタンパク質を、ヒスチジンタグ融合タンパク質のアフィニティーゲルで精製し、エンテロキナーゼでヒスチジンタグ部分を切り離して、組換えエリスロース還元酵素III型を製造することができる。
第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞や、第３のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞からも、同様にエリスロース還元酵素II型、Ｉ型を製造することができる。
【００６１】
本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質の酵素活性は、該酵素がエリスロースを還元する際に補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使うことから（図１参照）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量の変化を比較することにより測定できる。
【００６２】
次に、本発明によるエリスリトールの製造方法について述べる。すなわち、本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をＤ−エリスロースに作用させることにより、エリスリトールを得ることができる。
本発明のエリスロース還元酵素タンパク質をＤ−エリスロースに作用させる際には、該酵素反応溶液が、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解して還元反応を行うことができる。
還元反応は、反応温度３３〜３７℃、好ましくは３６〜３７℃、ｐＨ６．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．５、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが０．１〜０．５ｍＭ、好ましくは０．２〜０．３ｍＭで行うことができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなり過ぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００６３】
また、エリスロース還元酵素タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞をＤ−エリスロースに作用させることによっても、エリスリトールが得られる。この場合、エリスロース還元酵素タンパク質を直接作用させる場合と比べて、補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加する必要がない点で好ましい。
一例を挙げると、エリスロース還元酵素タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を、グルコース、フルクトース、シュクロース等の糖類から選択された炭素源、酵母エキス、ペプトン等から選択された窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等から選択された無機塩を適宜含む培地を用いて、当該細胞の生育し、エリスリトールを生産するのに適した条件で培養することにより、エリスリトールを得ることができる。
【００６４】
本発明に係る組換えエリスロース還元酵素Ｉ〜III型は、従来報告されているエリスロース還元酵素と同等の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を有するものである。
【００６５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより制限されるものではない。
実施例１
（１）トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株からのエリスロース還元酵素III型の取得・精製
H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 941-945, 1992に記載の方法に従い、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４３０）からエリスロース還元酵素III型の取得・精製を行った。
まず、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭＢＰ−１４３０）をグルコース培地（４０％  グルコース，２％  酵母エキス，２Ｌ）で７２時間培養した。
【００６６】
培養物を１０，０００×ｇ、３０分間遠心分離して得た固形物を凍結乾燥し、アセトン処理を行った後、MSK Cell homogenizer（B. Braun Japan社製）を用いてホモジナイズした。
次に、破砕された固形物を１０，０００×ｇ、３０分間の条件で遠心分離を行い、細胞の除かれた画分を得た。
続いて、硫安沈殿により、この画分の分画を行った。すなわち、硫酸アンモニウム４０〜７０％におけるエリスロース還元酵素を含む沈殿を採取し、遠心分離を行って集め５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。不溶の物質を遠心分離で除去した後、前記の緩衝液中で酵素溶液を４℃で２４時間透析した。
【００６７】
透析して得られる上清を、予め５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）により平衡化しておいたDEAE-Toyopearl 650S（１．４×２０ｃｍ）（東ソー社製）のカラムに負荷し、塩化ナトリウムを０ｍＭから１００ｍＭまで直線的に上昇させ、エリスロース還元酵素を含む画分を回収した。
【００６８】
活性画分を集めて硫安沈殿により濃縮し、予め１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいたAF-Blue Toyopearl 650ML（１．４×２０ｃｍ）（東ソー社製）のカラムに負荷し、０ｍＭから２００ｍＭまで段階的に塩化ナトリウムの濃度を上昇させ、エリスロース還元酵素Ｉ型およびII型を含む画分（非吸着画分）ならびにIII型を含む画分（吸着画分）を回収した。
【００６９】
エリスロース還元酵素III型を含む画分を集めて濃縮後、さらに、予め３５％飽和硫酸アンモニウム−１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいた、疎水性クロマトグラフィー用カラムであるButyl-Toyopearl 650S（１１×２０ｃｍ）（東ソー社製）に負荷し、硫酸アンモニウムの濃度を３５％から２０％まで直線的に下降する濃度勾配下において１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を通液し、エリスロース還元酵素活性を有する画分を回収した。
こうして、エリスロース還元酵素III型を精製した。
【００７０】
（２）エリスロース還元酵素III型の部分的アミノ酸配列の決定
上記で精製したエリスロース還元酵素III型について、ペプチドマッピングを行い、部分的なアミノ酸配列を決定した。
エリスロース還元酵素III型を、ピリジルエチル化（H. Hirano: J. Protein. Chem 8. 115 (1989)）し、リジルエンドペプチダーゼ（Roche社製）を用いて消化した。このサンプルをODS-80Tm（東ソー社製）カラムで分離すると、１４個のピークが見られ、このうち２つのピークについて、プロテインシークエンサー477A（Perkin-Elmer社製）によりアミノ酸配列を決定した。
【００７１】
（３）ＰＣＲ反応で用いるプライマーの設計
部分的に解読したアミノ酸配列のうち、アルド−ケト還元酵素ファミリーに含まれるアミノ酸配列を参考にして選択したアミノ酸配列（配列表の配列番号６，７参照）から、センスプライマー（配列表の配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー（配列表の配列番号５参照）を設計し、これを後述のＰＣＲ反応で用いた。
【００７２】
（４）エリスロース還元酵素III型をコードするｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ次に、後述のスクリーニング等で用いるプローブを作製するため、ＰＣＲを行った。
４０％  グルコース培地で３日間培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株から以下の手順で１本鎖ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いた。
培養物からTRIZOL（Gibco BRL 社製）を用いてＲＮＡを抽出し、DYNABEADS mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。
【００７３】
精製したｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
逆転写酵素としてSuper ScriptTM Reverse Transcriptase（Gibco 社製）を用い、プライマーとしてOligo (dT)12-15 primer（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いた。
逆転写反応液の組成は、以下の通りである。
ｍＲＮＡ    １μｇ
ｄＮＴＰ    １０ｍＭ×３μＬ
プライマー  ０．５μｇ
【００７４】
こうして得られるｃＤＮＡを鋳型として、上記（３）で設計したＰＣＲ用のセンスプライマー（配列表の配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー（配列表の配列番号５参照）により、Pfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）を用いて、９４℃  １分−４０℃  １分−７２℃  １分を１サイクルとして２５サイクルのＰＣＲ反応を行った。
【００７５】
ＰＣＲ反応の増幅産物は、長さ３９８ｂｐのｃＤＮＡフラグメントであった。このフラグメントを、EcoR Vで消化したベクターpBS SK+にライゲーションし、さらにＤＨ５α株で形質転換した。先に決定したエリスロース還元酵素III型タンパク質の内部のアミノ酸配列を含んでいるかどうかを解析した。
その結果、得られたｃＤＮＡフラグメントは、エリスロース還元酵素III型の部分的なｃＤＮＡであることが確認された。このフラグメントは、配列表の配列番号１記載の塩基配列のＮ末端から１８４〜５８２番目に相当する。
このｃＤＮＡフラグメントを、プローブとして用いることとした。
【００７６】
（５）トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株のノーザンハイブリダイゼーション
トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株のｃＤＮＡライブラリーを作製するにあたり、培養何時間目の本菌からｍＲＮＡを抽出すべきかを検討するため、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００７７】
トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株を、２４時間、４８時間、７２時間または９６時間の各時間、５００ｍＬ容フラスコ中で、４０％グルコースを含む培地３０ｍＬを用いて、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で撹拌培養した。
培養後、TRIZOL（Gibco BRL社製）を用いて、各培養物からtotal RNAを抽出した。
先に解読した精製酵素から作製したプローブは、DIG RNA Labeling kit（Roche社製）を用いてジゴキシゲニンで標識して用いた。
１．５％  アガロースゲル（０．２Ｍ  ホルムアルデヒド含有）を用い、アガロースゲル電気泳動を利用し、ストリンジェントな条件でノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００７８】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。図２中、レーン１は２４時間培養物の結果、レーン２は４８時間培養物の結果、レーン３は７２時間培養物の結果、レーン４は９６時間培養物の培地の結果を示した。また、フラグメントの長さを比較するために、左端にRNA Ladderの移動度を印した。
【００７９】
図２より、約１．０ｋｂの部分に検出されているバンドの濃度は、４８時間培養物が最も濃いことから、エリスロース還元酵素III型が発現していることがわかる。
この結果から、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株の４８時間培養物が、エリスロース還元酵素III型の発現量が最も多いことが明らかとなり、この時期のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーが、前記酵素の遺伝子解析に適していることが判明した。
【００８０】
（６）トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株のｃＤＮＡライブラリーの作成
上記（５）の結果に従い、エリスロース還元酵素III型の発現量が多い時期のｍＲＮＡから、以下の手順でｃＤＮＡライブラリーを作製した。
トリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株を、前記した４０％  グルコースを含む培地３０ｍＬ中、３７℃、２２０ｒｐｍ、４８時間の条件で、５００ｍＬ容フラスコ中で培養した。
培養物からTRIZOL（Gibco BRL社製）を用いてＲＮＡを抽出し、DYNABEADS mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。
【００８１】
このｍＲＮＡから、ZAP Express cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社製）を用いて、キットの説明書に従いライブラリーを作製した。まず、ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
このとき、逆転写酵素としてMoloney murine leukemia virus reverse transcriptase（ＭＭＬＶ−ＲＴ、STRATAGENE社製）を用い、またプライマーとしてlinker primerを用いた。これらは、上記キットに含まれる試薬である。
【００８２】
逆転写反応液の組成は、以下の通りである。
ｍＲＮＡ    ５μｇ
ｄＮＴＰ    １０ｍＭ×３μＬ
プライマー  ２．８μｇ
【００８３】
得られたｃＤＮＡを、EcoR IサイトとXho I サイトを利用してZAP Express Vectorに挿入し、パッケージングした。
このようにして、タイター（力価）２，３５０，０００pfuのトリコスポロノイデス・メガチリエンシス  ＳＮ−Ｇ４２株のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８４】
（７）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーション及び、エリスロース還元酵素III型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の決定
次に、パッケージングした組換えファージを、大腸菌XL1-Blue MRF´に感染させ、プレート上にプラーク（溶菌班）を形成させた後、前記（４）で作製したプローブを用い、ストリンジェントな条件でプラークハイブリダイゼーションを行った。
【００８５】
プラークハイブリダイゼーションの結果、目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファージの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラスミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染させ増幅させた。
次いで、このXLOLRからプラスミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。
解析の結果、全長１１１９ｂｐの配列表の配列番号１記載の塩基配列であることがわかった。この塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号１に併せて示した。
【００８６】
また、得られた塩基配列について、常法により制限酵素地図を作成した（図３）。図３からわかるように、５’末端から１２２番目の塩基部分にBan I切断部位、８４７番目及び１０５７番目の塩基部分にEcoR I切断部位、１０９３番目にBamH I切断部位を有する。
【００８７】
また、この配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列からなるエリスロース還元酵素III型タンパク質は、先に判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパク質等の既知のアミノ酸配列との相同性が低い新規な配列であることがわかった。
【００８８】
このことから、本発明のエリスロース還元酵素III型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリスロース還元酵素III型は、新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らかとなった。
【００８９】
（８）大腸菌を用いた組換えエリスロース還元酵素III型の発現
配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、開始コドン（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、BamH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つようにもう一方のプライマーを合成した。
先にｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロース還元酵素III型を含むプラスミドを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素III型のｃＤＮＡ全長を増幅した。
ＰＣＲの条件は、エリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを含むプラスミド  ２００ｎｇをテンプレートとし、酵素としてPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）を用いて、１２サイクルで行った。
【００９０】
ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素III型遺伝子が増幅された。このＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET A（INVITROGEN社製）のBamH I、Xho Iサイトを切断し、組込んだ。
エリスロース還元酵素III型遺伝子を組み込んだ状態のプラスミドpRSET Aを、発現用細胞である大腸菌BL21（DE3）pLysS（STRATAGENE社製）に導入し、ヒスチジンタグ融合タンパク質として発現させるべく、大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で２５℃で培養した。発現の誘導は、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加して、ラクトースオペロンを介して行った。
【００９１】
大腸菌を遠心分離（２，９２０×ｇ、１５分間）により集菌し、超音波処理（SONIFIER 250D, BRANSON社）で破砕し、再び遠心分離（２６，４００×ｇ、１５分間）を行って上清を分取した（粗酵素液）。
得られた粗酵素液を、ヒスチジンタグ融合タンパク質のアフィニティーゲルであるNickel Chelated Agarose （B-PER 6×His Spin Purfication Kit, PIERCE社製）で精製した。
次に、ゲル濾過ユニット  ＰＤ−１０（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いて、ゲル濾過によりbufferをenterokinase reaction bufferに置換した。
精製後、エンテロキナーゼ（INVITROGEN社製）でヒスチジンタグ部分を切り離した。その後、夾雑蛋白、ヒスチジンタグ、Enterokinaseを排除するため、イオン交換カラムによる精製を行い組換えエリスロース還元酵素III型を取得した。
【００９２】
実施例２
（１）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーション及び、エリスロース還元酵素II型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の決定
実施例１の（６）で作製したｃＤＮＡライブラリーについて、前記実施例１で得られたエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡ全長を基にしてプローブを作製し、ストリンジェントな条件でプラークハイブリダイゼーションを行った。
【００９３】
プラークハイブリダイゼーションの結果、目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファージの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラスミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染させ増幅させた。
次いで、このXLOLRからプラスミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。
【００９４】
解析の結果、全長１０７７ｂｐの配列表の配列番号２記載の塩基配列であることがわかった。この塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号２に併せて示した。
【００９５】
また、得られた塩基配列について、常法により制限酵素地図を作成した（図４）。図４からわかるように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、１４８番目及び５２０番目の塩基部分にAcc I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩基部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にSal I切断部位、８４７番目の塩基部分にEcoR I切断部位を有する。
【００９６】
このことから、本発明のエリスロース還元酵素II型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリスロース還元酵素II型遺伝子は、新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らかとなった。
【００９７】
（２）大腸菌を用いた組換えエリスロース還元酵素II型の発現
配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、開始コドン（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、BamH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つようにもう一方のプライマーを合成した。
先にｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロース還元酵素II型を含むプラスミドを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素II型のｃＤＮＡ全長を増幅した。ＰＣＲの条件は、実施例１（８）に示したのと同様である。
【００９８】
ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素II型遺伝子が増幅された。このＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET AのBamH I、Xho Iサイトを切断し、組込んで、実施例１（８）と同様にして精製し、組換えエリスロース還元酵素II型を取得した。
【００９９】
実施例３
（１）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーション及び、エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の決定
実施例１の（６）で作製したｃＤＮＡライブラリーについて、前記実施例１で得られたエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡ全長を基にしてプローブを作製し、このプローブを用いて、ストリンジェントな条件でプラークハイブリダイゼーションを行った。
【０１００】
プラークハイブリダイゼーションの結果、目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファージの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラスミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染させ増幅させた。
次いで、このXLOLRからプラスミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。
【０１０１】
解析の結果、全長１１２１ｂｐの配列表の配列番号３記載の塩基配列であることがわかった。この塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号３に併せて示した。
【０１０２】
本発明者らはＤＮＡシークエンスにより、配列表の配列番号３に示す全長１１２１ｂｐの塩基配列を見出した。
また、得られた塩基配列について、常法により制限酵素地図を作成した（図５）。図５からわかるように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩基部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にAcc I切断部位及びSal I切断部位、８４７番目の塩基部分にEcoR I切断部位を有する。
【０１０３】
このことから、本発明のエリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリスロース還元酵素Ｉ型遺伝子は、新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らかとなった。
【０１０４】
（２）大腸菌を用いた組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の発現
配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、開始コドン（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、BamH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つようにもう一方のプライマーを合成した。
先にｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロース還元酵素Ｉ型を含むプラスミドを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素Ｉ型のｃＤＮＡ全長を増幅した。ＰＣＲの条件は、実施例１（８）に示したのと同様である。
【０１０５】
ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持つエリスロース還元酵素Ｉ型遺伝子が増幅された。このＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET AのBamH I、Xho Iサイトを切断し、組込んで、実施例１（８）と同様にして精製し、組換えエリスロース還元酵素Ｉ型を取得した。
【０１０６】
実施例４
実施例１〜３で得られた精製組換えエリスロース還元酵素III 型、II型及びＩ型について、以下の試験を行った。
（１）基質特異性の比較
実施例１〜３で得られた精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型と、従来報告されているエリスロース還元酵素III型（天然型：H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 941-945, 1992 ）との基質特異性の比較を行った。
Phosphate buffer pH6.5  ５０ｍＭ、基質１２ｍＭ、ＮＡＤＰＨ  ０．２ｍＭ存在下で酵素２０μＬを作用させ（total  １ｍＬ）、３７℃で３４０ｎｍの吸光度変化を５分間に渡り経時的に測定した。
エリスロースを基質として還元する反応速度を１００％として、様々な各種ケトースやアルドースを還元する反応速度の相対値（％）を第１表に示した。
【０１０７】
【表１】
第１表
0004004789.tif 000002
【０１０８】
第１表より、本発明の精製組換えエリスロース還元酵素III型は、従来報告されている天然型のエリスロース還元酵素III型の基質を還元することが明らかである。
また、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型、II型の基質特異性は、ジヒドロキシアセトン及びｐ−ニトロベンズアルデヒドについて、III型よりも相対活性が低いことが特徴であった。
【０１０９】
以上より、本発明のエリスロース還元酵素III型をコードするＤＮＡが発現して得られる組換え酵素は、天然のエリスロース還元酵素III型と同様の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を有していることが明らかである。
また、本発明のエリスロース還元酵素II型及びＩ型をコードするＤＮＡが発現して得られる組換え酵素も、エリスリトールをはじめとする糖アルコールを生産する酵素活性を有していることも明らかである。
【０１１０】
（２）ウェスタンブロット
精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型について、ウェスタンブロットを行った。
各酵素を含む酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分離後、ゲルからＰＶＤＦ膜に移行させた。これに、一次抗体としての抗エリスロース還元酵素III型マウス抗体と反応させた後、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、結合している一次抗体を検出した。結果を図６に示す。
【０１１１】
図６中、ａは、本実施例の精製組換えエリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ｂは、同ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンをＰＶＤＦ膜に移行させ、ウェスタンブロットを行った結果を示す。
図６のａ及びｂにおいて、レーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【０１１２】
図６から明らかなとおり、精製組換えエリスロース還元酵素III型については明らかに抗体反応が検出された。
精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型、II型についても、反応性は低いものの抗体反応を確認することができた。
【０１１３】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型について、ゲル（商品名：Phast Gel (Gradient 8-25)、製造元：アマシャム  ファルマシア社）を用いて、Phast System 全自動電気泳動システム（アマシャム  ファルマシア社製）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図７に示す。
【０１１４】
図７中、ａは、従来報告されているエリスロース還元酵素（天然型：K. Tokuoka, et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145-155）の結果を示し、ｂは、本実施例の精製組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。
図７において、ａの電気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【０１１５】
図７ｂから明らかなとおり、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型ともに、各アミノ酸配列から予想される約３７ｋＤａ（３７，０００Ｄａ）の部分にバンドが確認できた。これは、天然型のエリスロース還元酵素と同じ結果であった（図７ａ）。
【０１１６】
（４）Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ
精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型について、ゲル（商品名：Phast Gel (Gradient 8-25)、製造元：アマシャム  ファルマシア社）を用いて、Phast System 全自動電気泳動システム（アマシャム  ファルマシア社製）によりＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。結果を図８に示す。
【０１１７】
図８中、ａは、従来報告されているエリスロース還元酵素（天然型：K. Tokuoka, et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145-155）の結果を示し、ｂは、本実施例の精製エリスロース還元酵素の結果を示す。
図８において、ａの電気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン▲１▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【０１１８】
図８ｂより、各組換え酵素の結果の移動度の相対的なパターンを見ると、天然型エリスロース還元酵素のデータ（図８ａ）とほぼ同じであった。
なお、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型及びII型ではバンドが２本見られるが、メインでないバンドは精製時にヒスチジンタグが完全に切断されなかった酵素ではないかと考えられる。
【０１１９】
（５）ＩＥＦ−ＰＡＧＥ（等電点電気泳動）
精製組換えエリスロース還元酵素についてゲル（商品名：Phast Gel (IEF pH4-6.5)、製造元：アマシャム  ファルマシア社）を用いて、Phast System 全自動電気泳動システム（アマシャム  ファルマシア社製）によりＩＥＦ−ＰＡＧＥを行った。
ｐＨグラジエントゲルで電気泳動を行い、分離したタンパク質を染色した。
結果を図９に示す。
図９において、レーン▲１▼は等電点マーカータンパク質、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【０１２０】
図９より、バンドの移動度から、それぞれの酵素の等電点を確認できた。すなわち、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型ではｐＩ４．７、精製組換えエリスロース還元酵素II型ではｐＩ５．３、精製組換えエリスロース還元酵素III型では、ｐＩ５．８であった。
なお、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型及びII型ではバンドが２本見られるが、メインでないバンドは精製時にヒスチジンタグが完全に切断されなかった酵素ではないかと考えられる。
【０１２１】
以上の結果より、本実施例で取得した組換えエリスロース還元酵素は、天然型エリスロース還元酵素とほぼ同じ状態で発現できたものと考えられる。
【０１２２】
実施例５
酵母S. cerevisiaeを用いた組換えエリスロース還元酵素III型の発現を試みた。
（１）トランスフォーメーション
実施例１（８）においてエリスロース還元酵素III型遺伝子発現に用いた大腸菌用蛋白発現ベクターpRSET Aから、BamH I及びXho Iにより切断したエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを、S. cerevisiae用プラスミドベクターpYES2/NT（INVITROGEN社製）に連結させた。
【０１２３】
エリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを連結させたプラスミドベクターを、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性を獲得した形質転換体を獲得した。
この形質転換した大腸菌を、５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地を用い、３７℃で培養することで、大腸菌とともにエリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを連結させたプラスミドベクターを増幅させた。この大腸菌からプラスミドベクターを取りだして精製を行った。
【０１２４】
酢酸リチウム法により、エリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを連結させたベクターを、ウラシル要求性のS. cerevisiae INVSc1株（INVITROGEN社製）にトランスフォーメーションした。
エリスロース還元酵素III型遺伝子を獲得した菌株は、ウラシル合成能を獲得するので、プラスミドベクターpYES2/NTの実験手引書に記載されたウラシル欠損最小培地で生育する菌株を拾うことにより、エリスロース還元酵素III型遺伝子を獲得した菌株を選抜した。
【０１２５】
（２）タンパク質の発現
以下、INVITROGEN社のプラスミドベクターpYES2/NTの実験手引書の記載に準じて行った。
先に得られたエリスロース還元酵素III型遺伝子を獲得した菌株を、２％グルコースを含むウラシル欠損最小培地１５ｍＬを用い、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養した。
【０１２６】
培養後、菌株を遠心分離（１，５００×ｇ、５分間、４℃）により集菌し、この菌体を２％ガラクトース、１％ラフィノースを含むウラシル欠損最小培地５０ｍＬに再懸濁し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で４８時間振とう培養した。この培養液を遠心分離（１，５００×ｇ、５分間、４℃）して、菌体を集菌した。
【０１２７】
この菌体約２ｇに、０．５φｍｍのガラスビーズ２ｇを添加し、振とう菌体破砕機（B. Braun Melsungen AG）で１５秒×１０回の条件で振とうを行ない、菌体破砕を行なった。この菌体破砕液を、１２，０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心分離を行い、上清を粗酵素液とした。
【０１２８】
この粗酵素液を、実施例１（８）記載の方法に従い、Nickel Chelated Agaroseにより菌体内から組換えエリスロース還元酵素III型を精製した。
【０１２９】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（２）で得られたS. cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型について、ゲル（パジェル  ＳＰＧ  ５２０Ｌ（アトー（株）製）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図１０に示す。図中、レーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼はS. cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型、レーン▲３▼は大腸菌で発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【０１３０】
図１０のレーン▲２▼から明らかな通り、S. cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型は、大腸菌で発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型及び天然型エリスロース還元酵素III型と等しい分子量で発現させることができた。
【０１３１】
（５）酵素活性の測定
（２）で得られたS. cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型について、実施例４（１）と同様の条件で、エリスロースを基質とした酵素活性を測定した。
その結果、比活性１９．３ｕｎｉｔｓ／ｍｇで活性が確認された。
したがって、活性のある状態で組換えエリスロース還元酵素III型をS. cerevisiaeで発現させることができた。
【０１３２】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質が提供される。
酵母を含む微生物に組込む等の手段により本発明のエリスロース還元酵素III型、II型又はＩ型をコードするＤＮＡを発現させれば、通常の微生物の培養による既知の方法と比較して、該微生物の生産性等に左右されることなく、エリスロース還元酵素III型、II型又はＩ型の大量生産を容易に行うことができる。
このエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型は、天然型エリスロース還元酵素と同等の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を有している。
よって、本発明に係る該酵素をコードするＤＮＡを利用して生産されるエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型は、エリスリトールの工業的生産に有用である。
【０１３３】
また、本発明のエリスロース還元酵素III型、II型又はＩ型をコードするＤＮＡは、遺伝子工学的手法による高いエリスリトール生産能を有する変異体酵素の開発、関連酵素をコードする遺伝子のクローニング等、様々な用途においても有用である。
【０１３４】
【配列表】
0004004789.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】  エリスリトール生産菌によるグルコースからのエリスリトール生合成経路を示す。
【図２】  ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【符号の説明】
レーン１は２４時間培養物の結果を、レーン２は４８時間培養物の結果を、レーン３は７２時間培養物の結果を、レーン４は９６時間培養物の結果を示す。
【図３】  エリスロース還元酵素III型タンパク質をコードするＤＮＡの制限酵素地図である。
【符号の説明】
EcoR I、Ban I 、BamH Iはそれぞれ制限酵素を示し、括弧内の数字は５’末端から数えた塩基数を示す。
【図４】  エリスロース還元酵素II型タンパク質をコードするＤＮＡの制限酵素地図である。
【符号の説明】
EcoR I、Ban I 、Acc I、Hind III、Sal Iはそれぞれ制限酵素を示し、括弧内の数字は５’末端から数えた塩基数を示す。
【図５】  エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコードするＤＮＡの制限酵素地図である。
【符号の説明】
EcoR I、Ban I 、Acc I、Hind III、Sal Iはそれぞれ制限酵素を示し、括弧内の数字は５’末端から数えた塩基数を示す。
【図６】  エリスロース還元酵素のウェスタンブロットの結果を示す図である。
【符号の説明】
ａは、組換えエリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ｂは、同ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンをＰＶＤＦ膜に移行させ、ウェスタンブロットを行った結果を示す。レーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【図７】  エリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【符号の説明】
ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂは、組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【図８】  エリスロース還元酵素のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【符号の説明】
ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂは、組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン▲１▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【図９】  エリスロース還元酵素のＩＥＦ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【符号の説明】
レーン▲１▼は等電点マーカータンパク質、レーン▲２▼は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン▲３▼は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン▲４▼は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【図１０】  組換えエリスロース還元酵素III型のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【符号の説明】
レーン▲１▼は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン▲２▼はS. cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型、レーン▲３▼は大腸菌で発現させた精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。
【図１】
0004004789.tif 000013
【図２】
0004004789.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004004789.tif 000019
【図８】
0004004789.tif 000020
【図９】
0004004789.tif 000021
【図１０】
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