(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
0003865781.tif 000004
で表されるＫ−２５２ａを含んだ微生物菌体をアルカリ液で処理することにより、該Ｋ−２５２ａを次式（ＩＩ）
0003865781.tif 000005
で表されるＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換し、該Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を微生物菌体外へ溶出させた後、得られたＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩をメチル化することによりＫ−２５２ａに再度変換し、これを単離、回収することを特徴とするＫ−２５２ａの精製方法。
【請求項２】
式（Ｉ）
0003865781.tif 000006
で表されるＫ−２５２ａを含んだ微生物菌体をアルカリ液で処理することにより、該Ｋ−２５２ａを次式（ＩＩ）
0003865781.tif 000007
で表されるＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換し、該Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を微生物菌体外へ溶出させた後、Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を単離し、得られたＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩をメチル化することによりＫ−２５２ａに再度変換し、これを単離、回収することを特徴とするＫ−２５２ａの精製方法。
【請求項３】
式（Ｉ）
0003865781.tif 000008
で表されるＫ−２５２ａを含んだ微生物菌体をアルカリ液で処理することにより、該Ｋ−２５２ａを次式（ＩＩ）
0003865781.tif 000009
で表わされるＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換し、該Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を微生物菌体外へ溶出させた後、Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を、樹脂を充填したカラムにかけることにより分離し、得られたＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩をメチル化することによりＫ−２５２ａに再度変換し、これを単離、回収することを特徴とするＫ−２５２ａの精製方法。
【請求項４】
アルカリ液に用いるアルカリ類がアルカリ金属の水酸化物である請求の範囲１〜３のいずれかに記載のＫ−２５２ａの精製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｋ−２５２ａの精製方法に関する。
背景技術
Ｋ−２５２ａは微生物で生産される生理活性物質である（特開昭６０−４１４８９）。その活性はプロテインキナーゼＣ阻害剤に分類され種々の薬理作用を示す。
従来のＫ−２５２ａの精製方法は、培養液を濾過して微生物菌体を取得し、その微生物菌体に含水もしくは無水の例えばメタノール、アセトン等の有機溶媒を添加し抽出した後、濾過して微生物菌体と抽出液に分離し、得られた抽出液を濃縮し無水有機溶媒でさらに収率良く抽出し、活性炭、ダイヤイオンＨＰ−１０等の吸着剤及びシリカゲル、シラナイズドシリカゲル、酸化アルミナ、デキストラン等の担体を用いたカラムクロマトグラフィー方法等により分離した後、濃縮し粗結晶を得る方法である。この方法で得られる結晶の純度及び収率は必ずしも十分ではなく純度を上げるためには再結晶の工程を必要とする。また培養液の濾過性が著しく悪く、少量の濾過は可能であるものの大容量の櫨過は困難である。
また、培養液に直接有機溶媒を添加し抽出し濾過により抽出液を取得する方法も可能であるが、Ｋ−２５２ａの各種の有機溶媒に対する溶解度は５〜１０ｇ／ｌ程度であり、例えばアセトンに対する溶解度は５ｇ／ｌと高くないことから、添加する有機溶媒量は培養液と等量以上必要となり処理容量が極度に多くなること、抽出液の純度が悪いことからカラム処理等を必要とする。
発明の開示
本発明によれば、式（Ｉ）
0003865781.tif 000002
で表されるＫ−２５２ａを含んだ微生物菌体をアルカリ液で処理することにより、該Ｋ−２５２ａを次式（ＩＩ）
0003865781.tif 000003
で表されるＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換し、該Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を微生物菌体外へ溶出させた後、得られたＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩をメチル化することによりＫ−２５２ａに再度変換し、これを単離、回収することを特徴とするＫ−２５２ａの精製方法が提供される。
本発明に用いるＫ−２５２ａを含む微生物菌体は、Ｋ−２５２ａ生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる。
Ｋ−２５２ａ生産能を有する微生物としては、米国ＡＲＳカルチャーコレクションにＮＲＲＬ１５５３２として寄託されているノカルデイオプシス・エスピー（Nocardiopsis  sp.）Ｋ−２５２（特開昭６０−４１４８９号公報）等があげられる。
栄養培地は、Ｋ−２５２ａ生産能を有する微生物を培養するのに通常用いられる培地であればいずれでもよく、例えば通常の放線菌の培養に用いられる栄養培地があげられる。培養法としては、液体培養、特に深部攪拌培養法が適している。
培養温度は２５〜４０℃、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８の中性付近で培養することが望ましい。
微生物菌体中にＫ−２５２ａを蓄積させた後、培養を停止し精製に用いる微生物菌体を得る。微生物菌体中に蓄積されるＫ−２５２ａ濃度は、１．０ｇ／リットル菌体体積以上が好ましく、５．０ｇ／リットル菌体体積以上が特に好ましい。
微生物菌体は、遠心分離等により収穫できる。遠心分離する前に培養液に塩酸、硫酸、硝酸、酢酸等の酸、好ましくは硫酸を添加しｐＨ２〜４に調整した後微生物菌体を収穫するのが好ましい。
遠心分離には、いかなる遠心分離機も用いうるが、例えばウェストファリアー、α−ラバル等の遠心分離機が好ましい。これら遠心分離機は、大量の培養液を連続的に分離処理でき、かつ洗浄水による微生物菌体の洗浄が同時に行える点で好ましい。
収穫した微生物菌体は、１０〜８０体積％、好ましくは３０〜５０体積％となるように、アルカリ液に懸濁し微生物菌体を処理する。アルカリ液に用いるアルカリ類としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム等の１〜３価の金属類及びアンモニウム等の水酸化物、炭酸塩及び炭酸水素塩等があげられる。具体的には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム等の水和物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸水素塩等が例示され、アルカリ金属の水酸化物が好ましい。
アルカリ液のアルカリ濃度は、０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１〜２ｍｏｌ／ｌである。
アルカリ液で微生物菌体を処理する方法としては、アルカリ液に懸濁した微生物菌体を、３０〜９０℃、好ましくは６０〜８０℃で、１〜２４時間、好ましくは３〜５時間加温する方法があげられる。このアルカリ液の処理により微生物菌体内のＫ−２５２ａは加水分解されてＫ−２５２ｂ又はＫ−２５２ｂアルカリ塩に変換されるとともに、微生物菌体外に抽出される。
該アルカリ液で抽出されたＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を吸着樹脂又はイオン交換樹脂等の樹脂を充填したカラムにかけ分離することができる。アルカリ液抽出液を樹脂で処理する場合は、微生物菌体を分離し行うが、微生物菌体が懸濁したまま行うことももできる。微生物菌体分離は、例えばヌッチェ、桐山ロート、フィルタープレス、バスケット分離機等を用いた濾過で行うことができる。
吸着樹脂としては、例えば三菱化成社製ＳＰ−２０７、ＨＰ−２０、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０等、ロームアンドハース社製ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−２８４、Ｓ−３０、Ｓ−３７、ＥＳ−３３等の吸着樹脂があげられる。イオン交換樹脂としては、例えば三菱化学社製ＰＡ−３０４、ＰＡ−４１２等、ロームアンドハース社製のＩＲＡ−４１０、ＩＲＡ−９１１、Ａ−２６、ＥＳ−１０９、Ａ−１０１Ｄ、ＥＳ−１１１等、ダウケミカル社製のＤＯＷＥＸ−２、−４等、バイエル社製のＭＰ−５００Ａ、ＭＰ−５０８０等の強塩基性イオン交換樹脂があげられる。
Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を保持した吸着樹脂又はイオン交換樹脂を水又は含水有機溶媒で洗浄後、有機溶媒又は含水有機溶媒を用いてＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を樹脂から溶出する。
洗浄に用いる含水有機溶媒としては、例えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等からなる水を含んだ極性溶媒をあげることができる。含水濃度は、２０％以上、好ましくは５０％以上である。
溶出には有機溶媒又は含水有機溶媒が用いられる。溶出に用いる有機溶媒としては、例えばアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等があげられる。含水有機溶媒としては、例えばアセトン、メタノール、エタノール等からなる水を含んだ極性溶媒をあげることができる。含水濃度としては２０％以下、好ましくは１０％以下が好ましい。含水有機溶媒には、必要に応じて水酸化ナトリウム等のアルカリ類又は塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の塩を添加することができる。添加するアルカリの濃度としては、０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌが好ましく、また添加する塩の濃度としては０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌが好ましい。
Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩を含むアルカリ液抽出液又はカラム溶出液は、そのまま又は必要に応じて塩酸、硫酸等の酸を添加し溶出液を酸性としてから濃縮される。濃縮は、溶液１ｍｌ当たりＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩が０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは５〜１０ｍｇとなるまで行われる。また、濃縮溶液は、該溶出液を濃縮乾固して得られるＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に有機溶媒を添加することによっても得られる。添加する有機溶媒量は、Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩１ｇ当たり５０〜２０００ｍｌ、より好ましくは１００〜２００ｍｌである。添加する有機溶媒には上記溶出に用いる有機溶媒が用いられる。
Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩は、メチル化処理することによりＫ−２５２ａに再度変換する。
メチル化処理は、上記濃縮溶液にジメチル硫酸等のメチル化剤をＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に対し１〜２０当量、好ましくは２〜３当量添加し、５０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃で、２〜３６時間、好ましくは６〜１２時間加熱反応させて行なう。
またメチル化処理は、上記濃縮溶液１リットルに対し、メタノール１００〜２０００ｍｌ、好ましくは５００〜８００ｍｌ及び塩酸、硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸等の有機酸又は三菱化学社製ＳＫ−１Ａ、１Ｂ、１１６等、ロームアンドハース社製ＩＲ−１２０Ｂ、２００等、ダウケミカル社製ＤＯＷＥＸ−５０Ｗ等のカチオン交換樹脂を添加し、５０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃で、２〜３６時間、好ましくは６〜１２時間加熱反応させて行なうこともできる。添加すべき無機酸、有機酸、カチオン交換樹脂量は、それぞれＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に対し１〜２０当量であり、２〜３当量が好ましい。
Ｋ−２５２ａは、メチル化処理を行った反応液を減圧濃縮し冷却することにより析出される。減圧濃縮は、７００〜７６０ｍｍＨｇ、好ましくは７２０〜７６０ｍｍＨｇで、温度は３０〜８０℃、好ましくは４０〜５０℃で、飽和濃度以下まで行う。Ｋ−２５２ａを析出させる温度は好ましくは１０〜６０℃である。
また、反応液からＫ−２５２ａを析出させるためには、メチル化処理を行った反応液を濃縮、乾固した後、水を添加し次いで有機溶媒を添加することによっても行うことができる。添加する水の量は反応に用いた溶媒容量の０．０１〜１倍が好ましく、０．１〜０．５倍がより好ましい。また、有機溶媒としては前述の水を溶解する有機溶媒があげられ、添加する有機溶媒の容量としては添加した水の０．５〜１．５倍が好ましい。
析出したＫ−２５２ａは、濾過、乾燥等通常の方法により単離し取得することができる。
本発明の効果を以下の試験例で説明する。
試験例
試験例１．
種菌としてノカルディオプシス・エスピー  Ｋ−２５２（ＮＲＲＬ１５５３２）を用いた。第一種培地として、グルコース０．５ｇ／ｄｌ、溶出デンプン３ｇ／ｄｌ、ソイビーンミール３ｇ／ｄｌ、コーンスチープリカー０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、炭酸カルシウム０．３ｇ／ｄｌ、（殺菌前ｐＨ７．２〜７．４）からなる培地を用いた。種菌１白菌耳を上記種培地１４ｍｌを含む５０ｍｌ太型試験管に植菌し、３０℃で３日間振とう培養を行った。
この第一種培養液４ｍｌを第二種培地４０ｍｌを含む３００ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で、３日間振とう培養を行った。第２種培地の組成は第１種培地の組成と同じである。この第２種培養液４０ｍｌを第三種培地３００ｍｌを含む２リットル容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で、４日間振とう培養を行った。第３種培地の組成は第２種培地の組成と同じである。この第３種培養液９００ｍｌを主発酵培地１６リットルを含む３０リットル容ステンレス製ジャーファーメンターに植菌し、３０℃で、７日間通気攪拌培養（回転数３００ｒｐｍ、通気量１６リットル／分）を行った。主発酵培地組成は第一種培地の組成と同じである。
該培養液１リットルを濃硫酸にてｐＨ３に調整した後、高速冷却遠心分離機（日立製、ＣＲ−２０）により微生物菌体分離を行ない微生物菌体３００ｍｌを収穫した。微生物菌体３００ｍｌ中には合計２ｇのＫ−２５２ａが含まれていた。この微生物菌体に６００ｍｌの水を添加し、再度遠心分離機により洗浄し洗浄濃縮微生物菌体を得た。
得られた洗浄濃縮微生物菌体に水酸化ナトリウム溶液を加えｐＨ１２とした後、８０℃で３時間加熱した。加熱処理した微生物菌体懸濁液は濃硫酸にてｐＨ７に調整した後、ヌッチェで濾過して微生物菌体を取り除き抽出液を得た。
該抽出液中、Ｋ−２５２ａは、ほぼ１００％Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換され抽出された。
一方、微生物菌体３００ｍｌにアセトンを添加しＫ−２５２ａを８０％で抽出するには１０リットルのアセトンが必要であった。
以上のように、Ｋ−２５２ａは、Ｋ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩に変換することにより有機溶媒を用いることなく、ほぼ１００％微生物菌体から抽出することができる。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
試験例１と同様に培養し得た培養液１リットルを濃硫酸にてｐＨ３に調整した後、高速冷却遠心分離機（日立製、ＣＲ−２０）により微生物菌体分離を行ない微生物菌体３００ｍｌを得た。微生物菌体３００ｍｌ中には、２ｇのＫ−２５２ａが含まれていた。再度遠心分離により洗浄した後、微生物菌体に６００ｍｌの水を添加し微生物菌体懸濁液を得た。
該微生物菌体懸濁液に濃水酸化ナトリウム溶液を加えｐＨ１２とした後、８０℃で３時間加熱した。加熱処理した微生物菌体懸濁液は濃硫酸にてｐＨ７に調整した後、ヌッチェで濾過して微生物菌体を取り除き抽出液を得た。得られた抽出液を吸着樹脂（２００ｍｌ容、ＳＰ−２０７、三菱化学社製）に流速ＳＶ２で通過させた後、樹脂を２００ｍｌの水及び４００ｍｌの５０％メタノールで洗浄した。次いで、１００％メタノール２０００ｍｌで溶出を行った。Ｋ−２５２ｂ又はＫ−２５２ｂアルカリ塩を含むメタノール区分は、１０００ｍｌまで濃縮した。
濃縮液に濃硫酸１ｍｌを添加し、６０℃で３時間加熱することによりＫ−２５２ａに転換した。得られた反応液を冷却後、濾過することにより、純度７５％のＫ−２５２ａ粗結晶が７０％の収率（純品換算で１．４ｇ）で得られた。このＫ−２５２ａの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度９５％のＫ−２５２ａを収率８０％で得た（純品換算で１．１ｇ）。
実施例２
実施例１と同様に微生物菌体を水酸化ナトリウムで処理し、ろ液を吸着樹脂に通過させた後、樹脂を洗浄した。次いで、樹脂に吸着したＫ−２５２ｂ又はそのアルカリ塩をメタノール：水酸化ナトリウム（９：１）で溶出した後、該溶出液を濃縮乾固し、１０００ｍｌアセトンに溶かし、２当量のジメチル硫酸を添加し、６０℃で３時間加熱することによりＫ−２５２ａに変換した。得られた反応液は冷却後、濾過することにより、純度７５％のＫ−２５２ａ粗結晶を７０％の収率（純品換算で１．４ｇ）で得た。このＫ−２５２ａの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度９５％のＫ−２５２ａを収率８０％で得た（純品換算で１．１ｇ）。
実施例３
実施例１と同様に水酸化ナトリウムで微生物菌体を処理した。次いで、菌体を分離せず直接吸着樹脂にかけ、その後実施例２と同様な方法でＫ−２５２ａを取得した。この結果、純度７５％のＫ−２５２ａ粗結晶を７０％の収率（純品換算で１．４ｇ）で得た。このＫ−２５２ａの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度９５％のＫ−２５２ａを収率８０％で得た（純品換算で１．１ｇ）。
実施例４
カラムを強塩基性イオン交換レジン（ＰＡ−４１２）とし溶出液をメタノール：０．１ｍｏｌ／ｌ塩化アンモニウム（９：１）にする以外は実施例２と同様に行った。この結果、純度７５％のＫ−２５２ａ粗結晶を７０％の収率（純品換算で１．４ｇ）で得た。このＫ−２５２ａの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度９５％のＫ−２５２ａを収率８０％で得た（純品換算で１．１ｇ）。
実施例５
微生物菌体を含んだ抽出液を濾過せず直接カラムに通す以外は実施例４と同様に行った。この結果、純度７５％のＫ−２５２ａ粗結晶を７０％の収率（純品換算で１．４ｇ）で得た。このＫ−２５２ａの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度９５％のＫ−２５２ａを収率８０％で得た（純品換算で１．１ｇ）。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、大量の有機溶媒を使用することなく簡便・安価かつ高い精製効率でＫ−２５２ａを工業的規模で精製できる。