(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種又は異種のビオチン導入物少なくとも２個と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン１個とを含む、ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項２】
少なくとも１個のビオチン導入物が、ビオチン導入結合成分であり、少なくとも１個のビオチン導入物が、ビオチン導入標識物質である、請求項１に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項３】
結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、請求項２に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項４】
抗体フラグメントがＦａｂ’である、請求項３に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項５】
ビオチン導入標識物質が、ビオチン導入酵素、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項６】
前記ビオチン導入酵素が、ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質である、請求項５に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項７】
前記ビオチン導入酵素が、ビオチン導入ルシフェラーゼである、請求項５に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項８】
架橋アビジンが、架橋卵白アビジン、架橋ストレプトアビジン、又は架橋リコンビナントアビジンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項９】
ビオチン導入結合成分が、１分子中に含まれるビオチン数が１であるビオチン導入結合成分である、請求項２〜８のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
【請求項１０】
（１）アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋アビジンを調製する工程、
（２）同種又は異種のビオチン導入対象物をビオチン化することにより、同種又は異種のビオチン導入物を調製する工程、及び
（３）前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ビオチン導入物とを結合させることにより、請求項１〜９のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を形成させる工程
を含むことを特徴とする、前記ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を使用することを特徴とする、分析方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用試薬。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋アビジンを含む新規複合体、前記新規複合体の製造方法、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及び分析用キットに関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用した高感度測定法の一つに酵素免疫測定法があり、代表的なものとして、ヘテロジニアスエンザイムイムノアッセイ、例えば、固相化抗体と標識化抗体とを用いたサンドイッチ法、又は固相化抗体と標識化抗原とを用いた競合法等がある。
これらの方法で用いられる酵素標識化抗原又は酵素標識化抗体は、種々の方法で調製されてきた。例えば、初期には、抗原又は抗体と酵素との混合液に、二価性の反応性を有するグルタルアルデヒドを加え、抗原又は抗体と酵素とのポリマーをランダムに調製する方法が開発された。その後、ペルオキシダーゼの表面アミノ基が少ないこと、そして、化学反応試薬に対しての耐性が強いことを利用した改良も試みられた。すなわち、まず、ペルオキシダーゼにグルタルアルデヒドを反応させた後に、過剰のアルデヒド基を除去し、得られたアルデヒド導入ペルオキシダーゼと、抗体とを混合することにより、必要な酵素標識化抗体のみを合成する方法が開発された。また、ペルオキシダーゼが糖鎖を持つことを利用して、過ヨウ素酸で糖鎖を酸化してアルデヒドを生じさせ、抗体のアミノ基と結合させることにより、高収率に酵素標識化抗体を得る方法も開発された。
【０００３】
一方、種々の架橋剤も開発され、抗体と酵素とを結合する反応に用いられるようになった。その中でも、スクシンイミドとマレイミド基とを両端に持つようなヘテロバイファンクショナルな架橋剤が開発され、酵素のアミノ基と抗体のヒンジ領域のＳＨ基とを特異的に結合し、収率良く酵素標識化抗体を得ることもできるようになった。
【０００４】
抗原又は抗体と酵素とを架橋剤で結合する前記方法以外にも、アビジン−ビオチン反応を利用した抗原又は抗体と酵素との結合方法も開発されてきた。この方法では、二つの試薬を組み合わせて使用する方法が一般的である。すなわち、一方では、ビオチン化試薬を用いることにより、抗原又は抗体にビオチンを導入した抗原又は抗体（ビオチン導入抗原又はビオチン導入抗体）を調製しておく。他方では、（１）化学結合法により、酵素とアビジンとの複合体（酵素標識化アビジン）を調製しておくか、あるいは、（２）ビオチン導入酵素とアビジンとを適当な比率で混合することにより、ビオチンを介した酵素とアビジンとの複合体（酵素標識化アビジン）を調製しておく。
【０００５】
ここで、前記化学結合法（１）は、酵素とアビジンとを、グルタルアルデヒド又はヘテロバイファンクショナルな架橋剤で結合するもので、酵素と抗体との組合せに代えて、酵素とアビジンとを組み合わせること以外は、前記の酵素標識化抗体調製法をそのまま利用することができる。
一方、前記方法（２）で使用する前記ビオチン導入酵素は、酵素として、例えば、ルシフェラーゼを使用する場合に、遺伝子操作法により得ることができる。例えば、ルシフェラーゼの遺伝子とビオチンアクセプターの遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、ルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビオチンが結合され、ビオチン導入酵素（ビオチンが導入されたルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質）を得ることができる。
【０００６】
このようにして得られたビオチン導入抗原又はビオチン導入抗体と、酵素標識化アビジンとを用いる方法では、例えば、一般に、分析対象化合物（抗原）を含む被検試料と、抗体固定化担体とを反応させた後、洗浄操作を行い、次に、前記ビオチン導入抗体を反応させ、再び洗浄を行った後、酵素標識化アビジンを反応させ、抗体固定化担体と分析対象化合物との複合体に結合した酵素標識化アビジン由来の酵素量を測定することにより、抗原量を知ることができる。
【０００７】
このようなアビジン−ビオチン反応を利用した免疫測定法は、予め酵素標識化アビジンを調製しておけば、種々の抗体をビオチン化するだけで標識物として使用することができるという点や、化学的な処理で活性に大きなダメージを受ける酵素でも、遺伝子操作でビオチン導入酵素として発現させることにより、活性を維持したまま酵素標識化アビジンとして用いることができるというメリットがあるが、操作ステップが多くなることや、測定毎のデータに再現性が乏しいという欠点を持っている。
反応ステップを減らすために、ビオチン導入抗体、アビジン、及びビオチン導入酵素の三者を予め混合して、酵素標識化抗体（ビオチン導入抗体−アビジン−ビオチン導入酵素複合体）として用いる試みもなされたが、反応性が著しく低下したり、安定性が非常に悪くなったりして、そのままでは試薬として使用することはできなかった。
【０００８】
また、前記アビジン−ビオチン反応は、前記の免疫学的分析方法以外にも、ＤＮＡプローブを用いるＤＮＡ又はＲＮＡ分析方法、あるいは、受容体−リガンド分析方法にも適用されており、これらの分析方法にアビジン−ビオチン反応を適用した場合にも、免疫学的分析方法と同様の問題があった。
従って、本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を解消し、アビジン−ビオチン反応の長所を有しながら、操作ステップが少なく、迅速且つ簡易であって、しかも、正確な分析方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、
［１］同種又は異種のビオチン導入物少なくとも２個と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン１個とを含む、ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［２］少なくとも１個のビオチン導入物が、ビオチン導入結合成分であり、少なくとも１個のビオチン導入物が、ビオチン導入標識物質である、［１］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［３］結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、［２］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［４］抗体フラグメントがＦａｂ’である、［３］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［５］ビオチン導入標識物質が、ビオチン導入酵素、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素である、［１］〜［４］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［６］前記ビオチン導入酵素が、ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質である、［５］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［７］前記ビオチン導入酵素が、ビオチン導入ルシフェラーゼである、［５］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［８］架橋アビジンが、架橋卵白アビジン、架橋ストレプトアビジン、又は架橋リコンビナントアビジンである、［１］〜［７］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［９］ビオチン導入結合成分が、１分子中に含まれるビオチン数が１であるビオチン導入結合成分である、［２］〜［８］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
［１０］（１）アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋アビジンを調製する工程、
（２）同種又は異種のビオチン導入対象物をビオチン化することにより、同種又は異種のビオチン導入物を調製する工程、及び
（３）前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ビオチン導入物とを結合させることにより、［１］〜［９］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を形成させる工程
を含むことを特徴とする、前記ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体の製造方法、
［１１］前記の［１］〜［９］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を使用することを特徴とする、分析方法、
［１２］前記の［１］〜［９］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用試薬、
［１３］前記の［１］〜［９］のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用キット
に関する。
【００１０】
本明細書における「分析」とは、「結合分析」、すなわち、２種類の化合物が相互に特異的に結合する性質を利用して、２種類の前記化合物の内のいずれか一方を分析対象化合物とし、それと特異的に結合可能な「結合成分」を用いて前記分析対象化合物を分析することを意味する。特異的な結合を示す前記の２種類の化合物の組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体との組み合わせ、ＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡ若しくはＲＮＡとの組み合わせ、ＲＮＡとそれに相補的なＤＮＡ若しくはＲＮＡとの組み合わせ、受容体とそのリガンド（例えば、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、又はレクチン）との組み合わせ、酵素とそのリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、調節因子、又は阻害剤）との組み合わせ、酵素アナログとその酵素アナログの元となる酵素の基質との組み合わせ、又はレクチンと糖との組み合わせを挙げることができる。なお、「酵素アナログ」とは、元の酵素に対する基質との特異的な親和性は高いものの、触媒活性を示さないものをいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のビオチン−アビジン−ビオチン型複合体は、同種又は異種のビオチン導入物２個以上と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン１個とを含む。前記ビオチン導入物の各々と前記架橋アビジンとの各結合は、ビオチン−アビジン反応による結合である。
【００１２】
本発明では、「アビジン」として、ビオチンに特異的に強く結合することのできる任意のアビジン、例えば、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又は遺伝子操作で得られたアビジン（すなわち、リコンビナントアビジン）等を用いることができる。
アビジンは、同一のサブユニット４個からなるタンパク質である。各サブユニットにはビオチン結合部位が１箇所ずつ存在するため、１分子のアビジンには４分子のビオチンが結合することができる。各サブユニットは共有結合で結合していないため、アビジンに高い熱が加わると、各サブユニットに開裂してしまうことが知られている。
【００１３】
本発明において使用する架橋アビジンは、アビジンの少なくともサブユニット間が架橋（すなわち、分子内架橋）されているものを意味する。前記架橋アビジンには、アビジン１分子のみからなる架橋アビジンモノマー、及び複数のアビジン分子が、更に分子間架橋により共有結合で結合されている架橋アビジンポリマーの両方が含まれる。
【００１４】
前記の架橋アビジンは、アビジンを架橋剤で処理することにより得ることができる。前記架橋剤としては、例えば、アミノ基同士を結合する架橋剤としてのグルタルアルデヒド、ジスクシンイミド、ジメチルピメルイミデート、若しくはジメチルスベルイミデート、又はアミノ基とカルボキシ基とを縮合反応させる架橋剤としての種々のカルボジイミド［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等］を使用することができる。
【００１５】
本発明において使用するビオチン導入物は、任意のビオチン導入対象物をビオチン化したものである。前記ビオチン導入対象物としては、ビオチン化可能であり、しかも、ビオチン化した後のビオチン導入物が、ビオチン−アビジン反応を介して架橋アビジンと結合可能である限り、特に限定されるものではなく、溶液中の任意の物質（例えば、通常の免疫学的分析方法において抗体又は抗原を標識するのに使用することのできる標識物質、あるいは、ビオチンを導入可能な結合成分）であることができる。
【００１６】
前記標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質若しくは蛍光物質結合タンパク質、発光物質若しくは発光物質結合タンパク質、又は放射性同位元素を挙げることができる。
【００１７】
前記酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を挙げることができる。
【００１８】
前記蛍光物質としては、例えば、フルオレッセイン、ローダミン、ダンシルクロライド、フルオロニトロベンゾフラザン、ユーロピウムキレート、又はサマリウムキレートを挙げることができ、前記蛍光物質結合タンパク質としては、前記蛍光物質をタンパク質に結合し、蛍光物質を集積したものを挙げることができる。
【００１９】
前記発光物質としては、例えば、アクリジウムエステル、アダマンチル−ジオキサン、又はイソルミノールを挙げることができ、前記発光物質結合タンパク質としては、前記発光物質をタンパク質に結合し、発光物質を集積したものを挙げることができる。
【００２０】
前記放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、又は３Ｈを挙げることができる。
【００２１】
本発明において使用することのできるビオチン導入酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素をビオチン化したものである。
このようなビオチン導入酵素は、例えば、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いることにより調製することができる。
前記化学的修飾法は、酵素アミノ酸残基に対して化学的にビオチンを結合させる方法である。
【００２２】
一方、前記遺伝子操作法は、酵素とビオチンアクセプターとの融合タンパク質を宿主細胞中で発現させることにより、ビオチン導入酵素を得るものである。化学的修飾に対して非常に不安定である酵素（例えば、ルシフェラーゼ等）の場合には、遺伝子操作法を用いることが好ましい。前記ビオチンアクセプターとは、宿主細胞中でビオチンを付加される一定のアミノ酸配列を含むタンパク質の総称であり、目的に応じてアクセプタータンパク質に翻訳される配列を含む遺伝子を用いることができる。
酵素（例えば、ルシフェラーゼ）の遺伝子とビオチンアクセプターの遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビオチンが結合され、ビオチン導入酵素（ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質）を得ることができる。
【００２３】
本発明において使用することのできるビオチン導入標識物質の内、ビオチン導入酵素以外のものについては、公知の方法を用いて調製することができる。
本発明において使用することのできるビオチン導入結合成分における前記結合成分は、ビオチンを導入することができ、しかも、分析対象物と特異的に結合可能な結合成分である限り、特に限定されるものではなく、例えば、（ａ）タンパク質である抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）、抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ］、タンパク質抗原、受容体、タンパク質ホルモン、サイトカイン、レクチン、酵素、又は酵素アナログ、（ｂ）核酸であるＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは、（ｃ）タンパク質又は核酸以外の化合物である非タンパク質抗原、非タンパク質ホルモン、酵素に対するリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、転写因子、若しくは阻害剤）、酵素アナログの元となる酵素の基質、又は糖を挙げることができる。
【００２４】
本発明において使用することのできるビオチン導入結合成分の内、結合成分がタンパク質であるもの（例えば、抗体、抗体フラグメント、タンパク質抗原、受容体、タンパク質ホルモン、サイトカイン、レクチン、酵素、又は酵素アナログ）については、ビオチン導入酵素に関して説明した前記の調製方法、すなわち、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いて、結合成分にビオチンを導入することにより調製することができる。
【００２５】
また、本発明において使用することのできるビオチン導入結合成分の内、結合成分が核酸であるもの（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）については、公知の方法を用いて、結合成分にビオチンを導入することにより調製することができる。前記公知方法としては、例えば、４種類のヌクレオチドの内、１種類をビオチン化ヌクレオチド（例えば、ビオチン化ｄＵＴＰ又はビオチン化ＵＴＰ）に置き換えて実施するニックトランスレーション法又はプライマー伸長法、あるいは、４種類のヌクレオチドの内、１種類をアミノ化ヌクレオチド（例えば、アミノ−７−ｄＵＴＰ）に置き換えてＤＮＡ合成を行ない、得られた修飾ＤＮＡと適当なビオチン誘導体とを反応させる方法を挙げることができる。
前記ニックトランスレーション法又はプライマー伸長法に用いるビオチン化ｄＵＴＰ又はビオチン化ＵＴＰとして、例えば、ｄＵＴＰ又はＵＴＰのピリミジン環の５位の炭素原子にリンカーを介してビオチンを結合させたものが市販されており、それを使用することができる。
【００２６】
更に、本発明において使用することのできるビオチン導入結合成分の内、結合成分がタンパク質又は核酸以外の化合物であるものについては、公知の方法を用いて、結合成分にビオチンを導入することにより調製することができる。
【００２７】
本発明のビオチン−アビジン−ビオチン型複合体においては、同種又は異種のビオチン導入物少なくとも２個と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン１個とを含む限り、前記ビオチン導入物の組み合わせは特に限定されるものではなく、例えば、ビオチン導入結合成分とビオチン導入標識物質との組み合わせ、ビオチン導入結合成分と、それと同種又は異種のビオチン導入結合成分との組み合わせ、あるいは、ビオチン導入標識物質と、それと同種又は異種のビオチン導入標識物質との組み合わせを挙げることができ、ビオチン導入結合成分とビオチン導入標識物質との組み合わせを用いることが好ましい。
更に、本発明において使用するビオチン導入結合成分としては、１分子中に含まれるビオチン数が１であるビオチン導入結合成分（すなわち、結合成分１分子に対してビオチン１分子を導入したビオチン導入結合成分）が好ましく、本発明の好適態様においては、ビオチン導入結合成分として、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を用いることができる。前記ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’は、分析対象化合物に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）から得られる抗体フラグメントＦａｂ’に、ビオチン１分子を共有結合により導入したものである。
【００２８】
前記抗体フラグメントＦａｂ’は、抗体をペプシンで消化することにより得られる抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２を、更に還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール又はメルカプトエチルアミン）で還元することにより調製することができる。すなわち、抗体分子のヒンジ領域には、２本のＨ鎖を連結するＳ−Ｓ結合１個が存在しており、このＳ−Ｓ結合のＣ末端側下流で、ペプシンによる分解を受けるので、抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２のＣ末端側領域には、前記Ｓ−Ｓ結合が残っている。続いて、還元剤により前記Ｓ−Ｓ結合を還元すると、抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２１分子から、Ｃ末端側領域にＳＨ基１つを有する抗体フラグメントＦａｂ’２分子が生じる。
このようにして得られたＳＨ基１つを有する抗体フラグメントＦａｂ’と、マレイミド基を有するビオチン誘導体とを反応させると、抗体フラグメントＦａｂ’１分子当たり、ビオチン１分子が導入されたビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を得ることができる。
【００２９】
本発明において使用することのできるビオチン導入抗原は、抗原に、ビオチン１分子を共有結合により導入したものであることが好ましい。このようなビオチン導入抗原は、ビオチン導入酵素に関して説明した前記の調製方法、すなわち、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いて調製することができる。
【００３０】
本発明のビオチン−アビジン−ビオチン型複合体は、これに限定されるものではないが、例えば、本発明の製造方法により、調製することができる。本発明の製造方法においては、予め、それぞれ別々に調製した架橋アビジンと同種又は異種のビオチン導入物とを、一度に同時に、あるいは、順次、結合させることにより、本発明のビオチン−アビジン−ビオチン型複合体を形成させる。
【００３１】
本発明のビオチン−アビジン−ビオチン型複合体は、例えば、本発明の分析方法に用いることができる。本発明においては、分析対象化合物に応じて、適宜、適当なビオチン導入物（特にはビオチン導入結合成分）を選択することができる。例えば、分析対象化合物が抗原である場合には、その抗原に特異的に反応する抗体又は抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ］にビオチンを導入したビオチン導入抗体又はビオチン導入抗体フラグメントを；分析対象化合物が抗体である場合には、その抗体が認識する抗原にビオチンを導入したビオチン導入抗原を；分析対象化合物がＤＮＡ又はＲＮＡである場合には、それに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡにビオチンを導入したビオチン導入ＤＮＡ又はビオチン導入ＲＮＡを；分析対象化合物が受容体である場合には、その受容体に対するリガンドにビオチンを導入したビオチン導入リガンドを；分析対象化合物が受容体のリガンドである場合には、そのリガンドに対する受容体にビオチンを導入したビオチン導入受容体を；分析対象化合物が酵素である場合には、その酵素に対するリガンドにビオチンを導入したビオチン導入リガンドを；そして、分析対象化合物が酵素のリガンドである場合には、その酵素にビオチンを導入したビオチン導入酵素を、それぞれ使用することができる。
【００３２】
以下、ビオチン導入結合成分として、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を使用し、ビオチン導入標識物質として、ビオチン導入酵素を使用する場合の態様に主に基づいて、本発明（本発明の分析方法、本発明の分析用試薬、及び本発明の分析用キット）を更に説明する。
例えば、これまで説明した方法により得られた（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と、（２）架橋アビジンと、（３）ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合することにより、酵素活性及び抗体活性を共に維持した状態で酵素標識化抗体を得ることができる。これらの酵素標識化抗体を、本発明の分析方法で使用することができる。
また、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と、（２）架橋アビジンと、（３）ビオチン導入酵素とは、それぞれ別々に使用することもできる。例えば、抗体固定化担体と分析対象化合物（抗原）とを反応させた後に、
（ａ）前記の３種類の試薬をこの順に添加し、三段階で反応させることもできるし、
（ｂ）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と架橋アビジンとを予め混合しておいたものを反応させた後に、ビオチン導入酵素を反応させ、二段階で反応させることもできるし、あるいは、
（ｃ）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を反応させた後に、架橋アビジンとビオチン導入酵素とを予め混合しておいたものを反応させ、二段階で反応させることもできる。
これらの３種類の試薬を、予め全て混合して使用するか、あるいは、別々に使用するかは、それぞれの測定系に応じて適宜決定することができる。
【００３３】
本発明の分析方法では、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、（２）架橋アビジン、及び（３）ビオチン導入酵素を使用すること以外は、従来公知の免疫学的分析方法、例えば、サンドイッチ法又は競合法にそのまま適用することができる。
例えば、サンドイッチ法を利用し、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と、（２）架橋アビジンと、（３）ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗体を用いる本発明の分析方法では、具体的には、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’とは異なるエピトープで分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、３種類の試薬の混合物である前記酵素標識化抗体を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗体の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
【００３４】
本発明の分析方法においては、３種類の試薬の混合物である酵素標識化抗体を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、３種類の試薬を別々に加えて二段階又は三段階で反応させることもできる。
【００３５】
本発明の分析方法に使用する架橋アビジンは、分子内架橋により各サブユニットが共有結合により連結されているので、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と（２）架橋アビジンと（３）ビオチン導入酵素とを適当な比率で混合し、酵素標識化抗体を調製しても、その酵素活性及び抗体活性を安定に維持することができる。それに対して、架橋されていないアビジンを使用する従来公知の酵素標識化抗体（すなわち、ビオチン導入抗体−アビジン−ビオチン導入酵素複合体）では、酵素標識化抗体としての反応性が著しく低下する。この理由は、アビジン１分子にビオチン２分子（ビオチン導入抗体及びビオチン導入酵素）が結合すると、高い熱を加えた場合と同様に、アビジンに強い力が加わり、サブユニットへと開裂してしまうためと考えられる。
【００３６】
更に、本発明の分析方法では、１分子中に含まれるビオチン数が１であるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’及びビオチン導入酵素を使用すると、酵素標識化抗体の酵素活性及び抗体活性を更に安定に維持することができる。もしも、抗体フラグメントＦａｂ’、抗原、又は酵素中に複数のビオチン分子が存在すると仮定すると、アビジンを介して連鎖的に結合反応が進行し、酵素標識化抗体が巨大分子化し、沈殿形成など好ましくない反応を起こすことが予想されるからである。
【００３７】
本発明の分析用試薬は、架橋アビジンを含む。本発明の分析用試薬は、他の試薬、例えば、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’及びビオチン導入酵素と組み合わせて、本発明の分析方法に用いることができる。
【００３８】
本発明の分析用キットは、架橋アビジン及びビオチン化剤を含む。前記ビオチン化剤としては、従来公知のビオチン化剤を使用することができ、例えば、Ｎ−ビオチノイル−Ｎ’−（６−マレイミドヘキサノイル）−ヒドラジド、又はビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等を挙げることができる。前記分析用キットとは別に用意した抗体フラグメントＦａｂ’及び酵素を、前記ビオチン化剤によりビオチン化して得られるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’及びビオチン導入酵素と、前記分析用キットに含まれる架橋アビジンとを組み合わせて、本発明の分析方法に用いることができる。
【００３９】
本発明の分析用キットは、架橋アビジン及びビオチン化剤に加え、ビオチン導入標識物質（例えば、ビオチン導入酵素）を更に含むことができる。本発明の分析用キットは、架橋アビジン、ビオチン導入標識物質、及びビオチン化剤をそれぞれ別々の試薬として含むこともできるし、あるいは、架橋アビジンとビオチン導入標識物質とを予め混合した混合物、及び単独のビオチン化剤として含むこともできる。
【００４０】
また、本発明の分析用キットは、前記ビオチン化剤に代えて、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’及びビオチン導入標識物質（例えば、ビオチン導入酵素）を含む構成とすることもできる。すなわち、本発明の別の分析用キットは、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、（２）架橋アビジン、及び（３）ビオチン導入標識物質を含む。本発明の分析用キットは、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、（２）架橋アビジン、及び（３）ビオチン導入標識物質をそれぞれ別々の試薬として含むこともできるし、あるいは、２以上の試薬を予め混合した混合物として含むこともできる。後者の例示としては、例えば、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と架橋アビジンとビオチン導入標識物質との混合物を含む分析用キット、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’と架橋アビジンとの混合物、及び単独のビオチン導入標識物質を含む分析用キット、あるいは、単独のビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、及び架橋アビジンとビオチン導入標識物質との混合物を含む分析用キットを挙げることができる。
本発明の分析用キットは、それ単独で、あるいは、所望により他の試薬と組み合わせて、本発明の分析方法に使用することができる。
【００４１】
以上、ビオチン導入結合成分として、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を使用し、ビオチン導入標識物質として、ビオチン導入酵素を使用する態様に基づいて本発明を主に説明したが、前記ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’の代わりに、ビオチン導入抗原を用いても本発明を実施することができる。以下、ビオチン導入標識物質として、ビオチン導入酵素を用いる態様について説明する。
例えば、（１）ビオチン導入抗原と、（２）架橋アビジンと、（３）ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗原を用いる本発明の分析方法では、例えば、競合法により抗原を免疫学的に分析することができる。具体的には、分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、３種類の試薬の混合物である前記酵素標識化抗原と、被検試料とを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗原の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
【００４２】
本発明の分析方法においては、３種類の試薬の混合物である酵素標識化抗原を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、３種類の試薬を別々に加えて二段階又は三段階で反応させることもできる。
更には、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’又はビオチン導入抗原に代えて、その他のビオチン導入結合成分、例えば、ビオチン導入抗体、ビオチン導入抗体フラグメント、ビオチン導入ＤＮＡ、ビオチン導入ＲＮＡ、ビオチン導入受容体、ビオチン導入酵素、ビオチン導入リガンド（受容体に対するリガンド及び酵素に対するリガンドを含む）、ビオチン導入酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質にビオチンを導入したもの、ビオチン導入レクチン、又はビオチン導入糖を用いても、同様に本発明を実施することができる。
また、ビオチン導入酵素に代えて、その他のビオチン導入標識物質、例えば、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素を用いても、同様に本発明を実施することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
《実施例１》
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’の調製
ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）をウサギに対し免疫して得られた抗血清から、ＡＦＰ固定化セファロース４Ｂを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーで特異抗体ＩｇＧ分画を得た。
この特異抗体ＩｇＧ分画［０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］に２％重量のペプシンを加え、３７℃の孵卵器で一夜消化を行い、ゲルクロマトグラフィーで分子量１０万の抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２分画を得た。
５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析したＦ（ａｂ’）２分画５ｍｇ（１ｍｌ）に、０．２５ｍｏｌ／ｌ−２−メルカプトエチルアミン［５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］５０μｌを加え、３７℃で９０分間還元した。得られた反応液を、１ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５×１３ｃｍ）に通し、ボイドボリュームに溶出される抗体フラグメントＦａｂ’分画をプールした。
この抗体フラグメントＦａｂ’分画に、ジメチルホルムアミド０．１ｍｌに溶解したＮ−ビオチノイル−Ｎ’−（６−マレイミドヘキサノイル）−ヒドラジド０．４ｍｇを加え、室温で一夜静置反応させた後、生理食塩水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５×１３ｃｍ）に通し、ボイドボリュームに溶出されるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’をプールした。
【００４５】
（２）架橋ストレプトアビジンの調製
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解した精製ストレプトアビジン１ｍｇに、１％グルタルアルデヒド溶液［０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］２０μｌを加え、混合した後、４℃で１６時間静置反応した。反応混液に、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製した４ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム液２０μｌを加え、室温で４時間静置反応することにより、アルデヒドを還元した。反応混液を０．３ｍｏｌ／ｌ食塩水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５×１５ｃｍ）に通し、ボイドボリュームに溶出される架橋ストレプトアビジンをプールした。
【００４６】
（３）抗ＡＦＰモノクローナル抗体のコーティング
５０ｍｍｏｌ／ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍｌに調整した抗ＡＦＰモノクローナル抗体（オリエンタル酵母社）１００μｌを、白色９６穴プレートの各ウェルに分注し、３７℃で２時間振盪コーティングを行った後、洗浄液［０．１％トウィーン２０を含む２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］で洗浄し、以下の工程に用いた。
【００４７】
（４）酵素標識化抗体の調製
前記実施例１（１）で得られたビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’（最終濃度＝０．１μｇ／ｍｌ）と、前記実施例１（２）で得られた架橋ストレプトアビジン（最終濃度＝１．２μｇ／ｍｌ）と、ビオチン導入ルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質（キッコーマン社）（最終濃度＝０．０７μｇ／ｍｌ）とを、５％グリセロール、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、室温で２時間静置反応してから酵素標識化抗体として、以下の反応に用いた。
【００４８】
（５）ＥＬＩＳＡ法によるＡＦＰの測定
反応緩衝液（０．１５ｍｏｌ／ｌ食塩を含む前記洗浄液）で所定濃度（１ｐｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，及び１００ｐｇ／ｍｌ）に希釈した標準ＡＦＰ溶液１００μｌを抗体コートウェルに分注し、３７℃で１時間振盪反応を行った。洗浄液で４回洗浄した後、実施例１（４）で調製した酵素標識化抗体１００μｌを分注し、３７℃で１時間振盪反応を行った。洗浄液で４回洗浄した後、発光検出器にセットし、０．２ｍｇ／ｍｌルシフェリン、４０ｍｍｏｌ／ｌ−ＡＴＰ、及び１５０ｍｍｏｌ／ｌ硫酸マグネシウムを含む５０ｍｍｏｌ／ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを基質として加え、１０秒間の積算発光量を測定した。
結果を図１に示す。図１から明らかなように、非常に低濃度のＡＦＰに対しても発光量のレスポンスが得られた。
このようにストレプトアビジンを架橋剤処理することにより、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’とビオチン導入酵素との間を、安定に結合することができることが示された。
【００４９】
《比較例１》
比較例として、実施例１（２）で調製した架橋ストレプトアビジンの代わりに、架橋処理を行なっていないストレプトアビジンを使用すること以外は、前記実施例１（４）及び実施例１（５）の手順を繰り返した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＡＦＰ量に対する発光のレスポンスがほとんど見られず、架橋されていないストレプトアビジンでは、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’とビオチン導入酵素との間をうまく結合することができないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、アビジン−ビオチン反応の長所を生かしながら、迅速且つ簡易に、しかも、正確に分析対象化合物の分析を実施することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】架橋ストレプトアビジンを用いるＥＬＩＳＡ法により、ＡＦＰを測定した結果を示すグラフである。
【図２】架橋されていないストレプトアビジンを用いるＥＬＩＳＡ法により、ＡＦＰを測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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