(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を取付けるための冷却ホルダ本体と、
その冷却ホルダ本体に取付けられる試料を覆うために、その冷却ホルダ本体に取外し可能に取付けられるキャップと、
前記冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断熱部材
を備えた冷却ホルダであって、
前記キャップをはめ込むためのキャップ用溝が前記冷却ホルダ本体に形成されていることを特徴とする冷却ホルダ。
【請求項２】
前記断熱部材は先端の尖った断熱ピンであり、その断熱ピンは冷却ホルダ本体の側面および底面にそれぞれ複数取付けられていることを特徴とする請求項１記載の冷却ホルダ。
【請求項３】
前記冷却ホルダ本体の内部に保冷剤が充填されていることを特徴とする請求項１又は２記載の冷却ホルダ。
【請求項４】
試料観察室に連通する予備室を備えた走査電子顕微鏡において、
次の（ａ）〜（ｃ）の構成を有する冷却ホルダを備えると共に、
（ａ）キャップをはめ込むためのキャップ用溝が形成されており、試料が取付けられる冷却ホルダ本体
（ｂ）その冷却ホルダ本体に取付けられる試料を覆うために、その冷却ホルダ本体に取外し可能に取付けられるキャップ
（ｃ）前記冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断熱部材
前記冷却ホルダが前記予備室に配置されたときに、前記キャップを冷却ホルダ本体から取外すキャップ取外し手段が前記予備室に設けられている
ことを特徴とする走査電子顕微鏡。
【請求項５】
前記キャップ取外し手段は電磁式の吸着機能を有すると共に、前記キャップは磁性材で作製されており、前記キャップはキャップ取外し手段により吸着されて冷却ホルダ本体から取外されることを特徴とする請求項４記載の走査電子顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水分を含んだ試料の観察に用いて最適な冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水分を含んだ生物試料を走査電子顕微鏡（SEM：Scanning Electron Microscope）で観察する際、その試料はできるだけ生体時に近い状態に維持する必要がある。しかし、生物試料はその７０〜９０数％が水分であり、試料を摘出後そのまま走査電子顕微鏡内に挿入すれば装置内が真空のため、水分が気化し乾燥による収縮変形を起こすことが多い。
【０００３】
そこで、現在、生物試料を走査電子顕微鏡で観察する場合、液体窒素で試料を冷却する機構を備えた走査電子顕微鏡を用意し、その走査電子顕微鏡で生物試料を凍結乾燥させながら観察することが行われている。この場合、試料中の水分は凍結されたままとなり長時間形態を維持し観察できる利点がある。
【０００４】
しかしながら、このような走査電子顕微鏡では、液体窒素で試料を冷却する機構を備えなければならず、その分コストアップとなる。さらに、この走査電子顕微鏡では、凍結試料表面に付着した霜を除去するためのヒーターを備えているが、このようなヒーターの設置もコストアップにつながっている。
【０００５】
ところで、このような問題を解決する発明として特公昭５１−１６２５２がある。この発明は、生物試料を試料ホルダ上に保持して試料ホルダと共に液体窒素に浸して凍結させ、その液体窒素中で凍結試料を蓋体で包囲し、その後蓋体で包囲された凍結試料を走査電子顕微鏡の予備室に導入し、その予備室において蓋体を開けるようにしたものである。この発明を利用すれば、走査電子顕微鏡に試料冷却機構を備える必要はなく、また、霜取り用のヒーターも走査電子顕微鏡に備える必要はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特公昭５１−１６２５２の発明においては、生物試料を液体窒素に完全に浸して凍結させるので、液体窒素中で生物試料が試料ホルダから外れてしまうことがある。
【０００７】
また、特公昭５１−１６２５２の発明においては、前記蓋体は試料ホルダから取外せないようになっており、試料観察中においても蓋体は試料ホルダに付いたままである。このため、試料傾斜を行ったときに蓋体が対物レンズなどに当たってしまい、試料傾斜において制限を受けたり、場合によっては対物レンズや試料ホルダが破損してしまう。
【０００８】
さらに、特公昭５１−１６２５２の発明においては、冷却された試料ホルダと、試料観察室の試料ステージ間の断熱対策は行われていない。このため、試料ステージ側の熱が試料ホルダに伝わると、試料中の水分が急激に気化し、長時間にわたって水分を含んだ状態での試料観察を行えなくなる。一方、試料ホルダ側の熱が試料ステージに伝わって試料ステージが冷却されると、試料ステージが熱ドリフトし、観察視野が大きく変動してしまう。
【０００９】
本発明はこのような点に鑑みて成されたもので、その目的は、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行うことができる冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成する本発明の冷却ホルダは、試料を取付けるための冷却ホルダ本体と、その冷却ホルダ本体に取付けられる試料を覆うために、その冷却ホルダ本体に取外し可能に取付けられるキャップと、前記冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断熱部材を備えた冷却ホルダであって、前記キャップをはめ込むためのキャップ用溝が前記冷却ホルダ本体に形成されていることを特徴としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
図１は、本発明の冷却ホルダの一例を示したものである。
【００１３】
図１において、１は冷却ホルダ本体であり、冷却ホルダ本体１の形状は円柱状であって、冷却ホルダ本体１は蓄熱性が良いたとえば黄銅（真ちゅう）で作られている。そして、リング状のキャップ用溝２が冷却ホルダ本体１の上面に形成されており、この溝２の内側上面Ｓは粗めのサンドペーパーでこすられて、カーボンテープ剥離防止溝３がその上面Ｓに形成されている。
【００１４】
一方、冷却ホルダ本体１の底面には、先端の尖った３本の断熱ピン（断熱部材）４ａ，４ｂ，４ｃ（４ｃは図１に示されていない）が取付けられている。これら３本の断熱ピンは、熱絶縁部材であるたとえばテフロンで作られている。
【００１５】
さらに、冷却ホルダ本体１の側面には、先端の尖った２本の断熱ピン（断熱部材）５ａ，５ｂとビス受け５ｃが取付けられている。これら２本の断熱ピンとビス受け５ｃは、熱絶縁部材であるたとえばテフロンで作られている。また、冷却ホルダ本体１の側面には、２つのピンセット差込穴６が開けられている。
【００１６】
図２は、冷却ホルダ本体１を底面側から見た図であり、前記断熱ピン５ａ，５ｂとビス受け５ｃは、冷却ホルダ本体１の側面に１２０度間隔で取付けられている。
【００１７】
また、図１において７はキャップである。このキャップ７の径は前記溝２の径とほぼ同じであり、キャップ７は溝２にはめ込めるようになっている。そして、中空状のキャップ７は蓄熱性が良いたとえばＳＵＳ（ステンレススチール）で作られており、つまみ８がキャップ７の上面中央部分に取付けられている。このつまみ８は、磁性材であるたとえば鉄で作られている。図３はキャップ７の断面を示したものであり、この図に示すように、キャップ内面は凹凸ができるように加工されている。
【００１８】
以上の１〜８の構成で、本発明の冷却ホルダが構成されている。なお、図１において、９はカーボンの両面テープ、１０はカビなどの生物試料、１１は液体窒素１２を入れた容器、１３はピンセットである。
【００１９】
以下に、図１の冷却ホルダを用いた試料凍結の手順について説明する。
【００２０】
まず、オペレータは、図１に示すように、カーボンの両面テープ９を冷却ホルダ本体１のキャップ用溝２の内側上面Ｓに張り付ける。次にオペレータは、その張り付けたカーボンテープ９の上に生物試料１０を取付ける。
【００２１】
このようにして試料の冷却ホルダ本体への取付けがすむと、オペレータは、キャップ７のつまみ８をピンセット１３でつまんで、キャップ７を容器１１中の液体窒素１２に浸す。そしてオペレータは、適当な時間を待ってからキャップ７を液体窒素１２中から取り出し、冷却されたキャップ７を図４に示すように、冷却ホルダ本体１のキャップ用溝２にはめ込む。
【００２２】
こうして、試料１０がキャップ７で覆われると、キャップ７内の試料まわり雰囲気中に存在している水分子は、冷却されたキャップ７の内面にトラップ（吸着）される。このとき、図３に示したように、キャップ内面は表面積が増すように凹凸に加工されているので、キャップ７内のほぼ全ての水分子がキャップ内面にトラップされる。また、冷却されたキャップ７によって、キャップ７の外側面に対向するキャップ用溝２の表面も冷却されるので、キャップ７の外の水分子がキャップ７内に侵入しようとしても、その水分子は全て溝２の表面またはキャップ７の外面でトラップされる。
【００２３】
次にオペレータは、冷却ホルダ本体１のピンセット差込穴６にピンセット１３を差込み、冷却されているキャップ７が取付けられた冷却ホルダ本体１をピンセット１３を用いて液体窒素１２に浸す。図５は、冷却ホルダ本体１が液体窒素１２に浸されている状態を示した図であり、この図に示すように、冷却ホルダ本体１の中間位までが液体窒素１２に浸されている。
【００２４】
こうして冷却ホルダ本体１は液体窒素１２で液体窒素温度に冷却され、そして試料１０は凍結する。
【００２５】
以上、図１の冷却ホルダを用いた試料凍結の手順について説明したが、この凍結方法によれば、試料１０を覆うように冷却されたキャップ７を冷却ホルダ本体１に取付け、キャップ内の水分子をそのキャップ内面にトラップさせた後で冷却ホルダ本体１を冷却するようにしているので、試料が凍結してもその試料表面に霜が付くことはない。
【００２６】
また、図１の冷却ホルダにおいては、冷却ホルダ本体表面にカーボンテープ剥離防止溝３が形成されていて、カーボンテープ９はその溝３にしっかりと食い込んでいる。このため、冷却ホルダ本体１が液体窒素で冷やされてカーボンテープ９が冷却されても、カーボンテープ９が冷却ホルダ本体１から剥がれることはない。逆にこのような溝３を設けないと、冷却されたカーボンテープ９は粘着性を失って、金属の冷却ホルダ本体１から簡単に剥がれてしまう。
【００２７】
また、図１の冷却ホルダを用いた凍結方法によれば、試料を液体窒素に全く浸さずに凍結させるので、液体窒素中で試料が冷却ホルダから外れるということはない。
【００２８】
以上説明したように、図１の冷却ホルダを用いた本発明の凍結方法によれば、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができる。
【００２９】
さて、これより、図５の状態にある冷却ホルダを走査電子顕微鏡で観察するまでの手順について説明する。
【００３０】
まず、オペレータは、図４のピンセット１３を用いて冷却ホルダ本体１を液体窒素１２から取り出し、冷却ホルダを図６に示すように試料ホルダ１４に取付ける。
【００３１】
このとき、冷却ホルダ本体１のビス受け５ｃが試料ホルダ１４のビス穴１５に一致するように冷却ホルダが試料ホルダ１４に取付けられ、オペレータは、ビス１６をビス穴１５にねじ込んでビス受け５ｃに当接させる。このようなビス固定により、冷却ホルダ本体１は試料ホルダ１４に固定される。この固定状態においては、冷却ホルダ本体１は、前記断熱ピン（４ａ〜４ｃ，５ａ，５ｂ）とビス受け５ｃによって試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、試料ホルダ側の熱は冷却ホルダ本体１に伝わらない。
【００３２】
また、試料ホルダ１４の側面にはネジ穴（図６には示されていない）が設けられており、図６に示すように、交換棒（キャップ取外し手段）１７の先端がそのネジ穴にねじ込まれて取付けられている。交換棒１７の先端には電磁石１８が設けられており、この電磁石１８は、交換棒の内部に引かれた電線１９を介して電源２０に電気的に接続されている。この電源２０は交換棒の取手部分に取付けられていて、内部に電池を備えると共に電磁石への通電をオンオフするスイッチＳＷを備えている。
【００３３】
こうして、オペレータは冷却ホルダを試料ホルダに取付けると、図７に示すように、試料ホルダ１４を保持した交換棒１７を走査電子顕微鏡の予備室チャンバ２１に取付ける。このとき、試料ホルダ１４は、予備室２２に設けられた受け台２３に取付けられる。
【００３４】
前記予備室チャンバ２１は走査電子顕微鏡の観察室チャンバ２４に取付けられており、前記予備室２２は、観察室チャンバ２４の仕切弁２５が開けられると観察室２６に連通するようになっている。これら予備室２２と観察室２６は、図示していない排気装置によって排気されるように構成されている。
【００３５】
さて、オペレータは、図７に示すように交換棒１７を予備室チャンバ２１に取付けると、予備室２２を排気する排気装置を動作させると共に、交換棒１７を回転させて試料ホルダ１４から外す。なお、このとき、仕切弁２５は閉じられている。
【００３６】
そして、予備室２２が所定圧力に達すると、オペレータは電源スイッチＳＷをオンにし、交換棒１７を操作して、磁化された電磁石１８をキャップ７のつまみ８上に持ってくる。すると、つまみ８は磁性材で作られているので、つまみ８は電磁石１８に吸着される。そしてオペレータは、交換棒１７を操作してキャップ７を冷却ホルダ本体１から取外し、取外したキャップ７を台２７上に置いてから電源スイッチＳＷをオフにする。
【００３７】
次にオペレータは、再び交換棒１７を試料ホルダ１４に取付け、前記仕切弁２５を開けて、交換棒１７を操作して試料ホルダ１４を観察室２６の試料ステージ（図示せず）に取付ける。その後、交換棒１７が試料ホルダ１４から外され、交換棒１７が観察室２６から引き出されてから仕切弁２５が閉じられる。
【００３８】
こうして、試料ホルダ１４が観察室２６の試料ステージに取付けられると、低真空状態にある観察室２６において試料のＳＥＭ観察が行われる。この際、上述したように、冷却ホルダ本体１は、前記断熱ピン（４ａ〜４ｃ，５ａ，５ｂ）とビス受け５ｃによって試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、試料ステージ側の熱が試料ホルダ１４を介して冷却ホルダ本体１に伝わることはない。このため、試料１０中の水分はかなり長い時間をかけて気化し、長時間にわたって水分を含んだ生体時の状態での試料観察を行うことができる。
【００３９】
また、冷却ホルダ本体１は試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、冷却ホルダ本体１側の熱が試料ホルダ１４を介して試料ステージに伝わることはない。このため、試料ステージが冷却されて熱ドリフトすることはなく、良好な試料観察および写真撮影を行うことができる。
【００４０】
また、この例では、図１に示したように、試料１０はカーボンテープ９に取付けられているが、カーボンは導電性があってイオンをためない。このため、電子線照射時にカーボンテープはチャージアップせず、良好な試料像を得ることができる。
【００４１】
また、試料を直に冷却ホルダ本体１に取付けると、電子線照射を行ったときに、金属である冷却ホルダ本体１からの反射電子量が試料からの反射電子量よりもかなり多くなり、得られた試料部分の反射電子像が暗くなることがある。一方、カーボンテープを用いると、冷却ホルダ本体１からの反射電子放出を抑えることができ、試料に関する良好なコントラストの反射電子像を得ることができる。
【００４２】
以上、本発明の一例を説明したが、本発明はこの例に限定されるものではなく、種々の変形が考えられる。
【００４３】
たとえば、図１に示した冷却ホルダ本体１の代わりに、図８に示すような冷却ホルダ本体２８を用いるようにしても良い。
【００４４】
たとえば黄銅で作られた冷却ホルダ本体２８には、ホルダ取付穴２９が中央に開けられていると共に、その穴２９に直交および通ずるようなビス穴３０が開けられている。そして、この冷却ホルダ本体２８を用いた冷却ホルダにおいては、たとえば黄銅またはアルミニウムで作られた円筒状の試料ブロック（試料保持ホルダ）３１が用意されており、試料ブロック３１の上面Ｓ０は粗めのサンドペーパーでこすられてカーボンテープ剥離防止溝が形成されている。この試料ブロック３１は前記ホルダ取付穴２９に落とし込まれて、ビス３２によって冷却ホルダ本体２８に固定される。
【００４５】
なお、図８において、図１に示した構成と同じものには図１と同じ番号が付けられている。
【００４６】
さて、図８に示した冷却ホルダを用いた場合には、生物試料はカーボン両面テープによって前記試料ブロック上面Ｓ０に取付けられ、前記図４〜７を用いて説明した手順で試料凍結およびＳＥＭ観察が行われる。
【００４７】
また、図８に示した冷却ホルダを用いて生物試料を凍結乾燥させるときには、オペレータは、生物試料が取付けられた冷却ホルダ本体２８を液体窒素に浸して試料を凍結させ、その冷却された冷却ホルダ本体２８を試料ホルダにセットしてからＳＥＭ観察室の試料ステージに装着し、観察室を排気するという手順で試料を凍結乾燥させる。この場合にも、冷却ホルダ本体２８は試料ホルダと熱絶縁され、また、小型の試料ブロック３１は冷却ホルダ本体２８からの冷熱によって低温に冷却されるので、乾燥時に冷熱を長時間必要とする生物試料の凍結乾燥を容易に行うことができる。
【００４８】
さらに、試料の乾燥終了後、試料ブロック３１を冷却ホルダ本体２８から外して試料に真空蒸着を行えば、試料を高真空ＳＥＭで観察することができる。
【００４９】
また、上述した試料ブロック３１の代わりに、フィルターを備えると共に注射器で吸引可能な試料保持ホルダを用いるようにしても良い。この場合にオペレータは、生物試料をフィルター上に置いて試料保持ホルダを注射器に取付け、注射器で水分を吸引して生物試料をフィルター上に固定し、注射器から試料保持ホルダを外して図８に示したホルダ取付穴２９にセットする。そして、上述した手順で、凍結した試料のＳＥＭ観察や生物試料の凍結乾燥、または真空蒸着後における高真空ＳＥＭでの観察が行われる。
【００５０】
また、変形例として、図１と図８における冷却ホルダ本体の内部を中空状に形成し、その空間に保冷剤（例えばポリアクリル酸誘導体）を充填するようにしても良い。このようにすれば、試料を更に長い時間冷却しておくことができる。
【００５１】
また、上記例では、冷却ホルダ本体の底面に３本の断熱ピンが設けられているが、この本数はこれに限定されるものではなく、たとえば４本設けるようにしても良い。同様に、冷却ホルダ本体の側面に設けられる断熱ピンについてもその本数は２本に限定されるものではなく、たとえば９０度間隔に３本設けるようにしても良い。
【００５２】
以上、本発明について説明したが、本発明によれば、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の冷却ホルダの一例を示した図である。
【図２】  図１の冷却ホルダを説明するために示した図である。
【図３】  図１のキャップ７を説明するために示した図である。
【図４】  試料凍結の手順を説明するために示した図である。
【図５】  試料凍結の手順を説明するために示した図である。
【図６】  試料観察の手順を説明するために示した図である。
【図７】  試料観察の手順を説明するために示した図である。
【図８】  本発明の冷却ホルダの他の例を示した図である。
【符号の説明】
１，２８…冷却ホルダ本体、２…キャップ用溝、３…カーボンテープ剥離防止溝、４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ…断熱ピン、５ｃ…ビス受け、６…ピンセット差込穴、７…キャップ、８…つまみ、９…カーボンテープ、１０…試料、１１…容器、１２…液体窒素、１３…ピンセット、１４…試料ホルダ、１５，３０…ビス穴、１６，３２…ビス、１７…交換棒、１８…電磁石、１９…電線、２０…電源、２１…予備室チャンバ、２２…予備室、２３…受け台、２４…観察室チャンバ、２５…仕切弁、２６…観察室、２７…台、２８…冷却ホルダ本体、２９…ホルダ取付穴、３１…試料ブロック
【図１】
0003926103.tif 000002
【図２】
0003926103.tif 000003
【図３】
0003926103.tif 000004
【図４】
0003926103.tif 000005
【図５】
0003926103.tif 000006
【図６】
0003926103.tif 000007
【図７】
0003926103.tif 000008
【図８】
0003926103.tif 000009