(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮａＦを有効成分とすることを特徴とする鳥類用経口アジュバント。
【請求項２】
請求項１において、鳥類がニワトリであることを特徴とする鳥類用経口アジュバント。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の経口アジュバントを、非増殖性のワクチンと共に経口投与することを特徴とする鳥類の免疫応答増強法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鳥類、特にニワトリに非増殖性の抗原を経口的に投与して局所および全身性の免疫応答を誘導することに用いられる経口アジュバント、およびこれを用いた鳥類、特にニワトリの免疫応答増強法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
ワクチンは生体をウイルス，細菌，原虫等の疾病から予防する目的で用いられるものであり、これには弱毒生（増殖性）ワクチンと不活化（非増殖性）ワクチンが知られていて、通常は注射により生体に投与される。しかし注射による投与は、接種部位での炎症およびワクチンの遺残、さらには投与の簡便性に欠けることが問題となっている。
【０００３】
この問題を解決するために一部の弱毒生ワクチンについては投与を経口的に行うことができるものが開発されている。
【０００４】
しかし、不活化ワクチンは経口的に投与されても免疫系を刺激する能力が低いために、免疫系を動かすためには大量の抗原投与を必要とするという問題がある。
【０００５】
また免疫系を刺激できたとしても全身性免疫の不応答性、すなわち経口免疫寛容（あらかじめ経口的に非増殖性の抗原で免疫した場合に抗原特異的に全身性の免疫応答が抑制される現象）が誘導されるという問題があり、さらに抗原単独の経口免疫では分泌型ＩｇＡを中心とする局所の免疫応答を効果的に誘導することは極めて困難である。
【０００６】
そこで、経口免疫寛容を解除し全身性の抗体応答を誘導し、さらに局所の免疫応答を高める目的で経口アジュバントが用いられる。アジュバントは抗原の作用を高める物質、すなわち前記用途では免疫応答を増強する免疫促進剤として用いられ、哺乳類ではいくつかの経口アジュバントが報告されている。例えば主に齧歯類を用いた実験でコレラ毒素、百日咳毒素、大腸菌のある種の株が産生する易熱性毒素、また毒素以外ではサポニンなどが経口アジュバントとしての有効性が報告されている。
【０００７】
最も解析の進んでいるコレラ毒素を例に挙げると、哺乳類においてはこの毒素を経口アジュバントとし、これと抗原的に無関係な他の抗原と共に経口投与することにより、抗原に対する全身性の免疫寛容の成立を妨げるばかりでなく血清中の特異抗体の誘導が起こると共に、局所の分泌液中のＩｇＡの産生を高めることができることが報告されている。
【０００８】
ところで、ニワトリは多頭羽飼育が顕著な家畜動物として知られ、したがって前記した注射によるワクチンの投与法では、簡便性に欠けるために労力が多大になることが従来から大きな課題となっている。
【０００９】
しかしながら、例えばMeinersmann らがコレラ毒素はニワトリで経口アジュバントとして抗体応答を促進する効果がないことを報告している（R.J.Meinersmann et al. Avian Diseases 37, 427-432(1993) ）ように、哺乳類で有効なアジュバントがニワトリにおいても同様に効果があるとは単純に推定できない。これは哺乳類と鳥類の間では特に消化管リンパ装置の違いがあるため、これが大きな要因になっていると推定されるが、いずれにしてもニワトリ用の経口アジュバントを見いだすことは容易でなく、事実、哺乳類については上述のように有効な経口アジュバントが複数報告されているにもかかわらず、ニワトリで有効な経口アジュバントの報告例は未だない。
【００１０】
上述した哺乳類で認められているコレラ毒素の効果の作用機序については多くの研究者がこれをテーマとして精力的に研究を進めているにもかかわらず最終的なモデルは確立されていない。しかし、毒素が細胞に結合することが必須の過程であることは確かであり、これは毒素側のＢサブユニットと細胞側のＧｍ１−ガングリオシドとの相互作用による。コレラ毒素がニワトリでアジュバント作用を示さないのは、この毒素がニワトリの細胞に結合しないためではないことは、この毒素がニワトリの腸管の細胞に働き膜電位の変化を引き起こすとの報告があることからも明らかである。このコレラ毒素の例は、哺乳類では有効なアジュバントであっても必ずしもニワトリで有効でないこと、またin vitroである一面において共通の活性を有するアジュバントであっても、生物の分類学上の綱が異なればin vivo で同じ効果を期待できるとは言えないことを示す好例である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、以上のような従来の技術に鑑み、多頭羽飼育が一般的な家畜動物であるニワトリなどに適用でき、従来の注射に代えて簡便で多大な労力を必要としない経口投与による有効なワクチン接種を実現するために、鳥類用の経口アジュバントを開発すべく鋭意研究を重ねた。
【００１２】
上述した、哺乳類で有効なアジュバントが鳥類に有効に適用できないことの原因としては、哺乳類と鳥類とでは特に消化管リンパ装置の違いがあり、哺乳類ではよく発達した孤立リンパ装置であるパイエル氏板が複数散在し、この部位が消化管免疫において抗原によるリンパ系細胞の刺激の場であると考えられているのに対し、鳥類で存在するパイエル氏板に相同のリンパ組織は、数は少なく、また組織学的にもその発達は悪く、したがって経口免疫後の応答機序がニワトリと哺乳類とで異なるためと推定される。
【００１３】
本発明者らは、これらのことから、鳥類のアジュバントとして適用できるさまざまな物質を対象として検討し、本発明をなすに至ったものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本願は上記特許請求の範囲の各請求項に記載した発明をその特徴とするものである。
【００１５】
本願の請求項１の発明であるニワトリ等の鳥類用の経口アジュバントは、ＮａＦを有効成分とすることを特徴とする。
【００１６】
ＮａＦは、齲触症の予防や骨粗鬆症の治療に用いられる物質として知られ、また哺乳類用の経口アジュバントとして用いられることも知られている。
【００１７】
J.E.Butlerらは、ラットに卵白アルブミン（投与量の記載なし）を自由摂取で給餌し、１００ｍＭのＮａＦを週に２回、３週間にわたって経口投与すると局所（腸管膜リンパ節）のＩｇＡ抗体産生細胞数、および全身性（脾臓）のＩｇＧ抗体産生細胞数の増加の傾向がみとめられ（ただし有意かどうかの記載はない）、また同様の免疫を２週間に渡り行い、その後さらに腹腔内に抗原を注射した実験例では抗体産生細胞数の有意な上昇が認められることを報告している（Immunology Letters,26(1990) 217-220 ）。しかしながら抗原特異抗体自体が誘導されているかについての言及はされておらず、またこの例では抗体産生細胞数の有意な上昇のためには経口免疫のみでは不十分であったと推定される。またこの報告はラットについてのものであり、鳥類に経口アジュバントとして適用できることについては記載がない。上述したように哺乳類と鳥類では経口アジュバントとしての置換適用は通常推定されないのが普通であり、鳥類用の経口アジュバントとしてＮａＦが有効という知見は、本発明者らにより初めて見いだされたものである。
【００１８】
すなわち、本発明者らは、鳥類用の経口アジュバントとして種々の物質を検討し、鳥類における経口免疫寛容を破り、全身性の免疫応答を高め、且つ局所免疫応答を誘導できる物質としてＮａＦを見いだし、本発明を完成した。
【００１９】
本発明の経口アジュバントは、限定されるものではないが、緩衝液などに溶解した液、あるいはカプセルの剤型として投与することができる。投与量は経口免疫寛容を破る効果が得られる有効な全身性および局所性の免疫を賦与するために３００ｍＭ以上、好ましくは３５０〜８５０ｍＭとすることがよい。
【００２０】
本発明の鳥類用経口アジュバントは、有効成分のＮａＦ以外に、他のアジュバントを含むこともできる。抗原と共に経口投与する場合には、胃酸による抗原の変性を避けるために１〜５％、好ましくは２〜４％程度の重炭酸ソーダ（ＮａＨＣＯ3 ）を混合することができる。
【００２１】
本願の請求項３の発明のニワトリ等の鳥類の免疫応答増強法は、上記経口アジュバントを、非増殖性のワクチンと共に経口投与することを特徴とする。
【００２２】
この発明によれば、多頭羽飼育が一般的であるニワトリなどにおいて、簡便で多大な労力を必要としない経口投与法により、免疫応答性に優れた有効なワクチン接種を実現することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の経口アジュバントは以下のようにして調製することができ、またニワトリなどに対して以下の方法で投与することができる。
【００２４】
例１（アジュバント液等の調製）
（１）所定量のＮａＦを、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に溶解してニワトリ用のＮａＦ経口アジュバント液を調製する。
【００２５】
（２）所定量のＮａＦおよび不活化処理を行った所定のワクチンとを、ＰＢＳに溶解することで、ＮａＦをアジュバントとして含有した経口ワクチンを調製する。
【００２６】
（３）所定量のＮａＦおよび不活化処理を行った所定のワクチンを、３％の重炭酸ソーダを含むＰＢＳに溶解して経口ワクチンを調製する。
【００２７】
【実施例】
実施例１
４００ｍｇの抗原（ＢＳＡ：牛血清アルブミン）およびアジュバント（ＮａＦの濃度：０，１００，２００，４００，８００ｍＭ）を、それぞれ３％の重炭酸ソーダを含むＰＢＳに溶解して免疫原を調製した。
【００２８】
この免疫原を、１週間間隔で３回，５ｍｌづつゾンデを用いて６週齢のニワトリにその食道深部に投与して、経口（p.o.）免疫した。
【００２９】
併せて血清を経時的に採取し、血清中のＢＳＡに特異的なＩｇＧ抗体価を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定し、結果を下記表１に示した。
【００３０】
【表１】
0003944266.tif 000002
【００３１】
この表１の結果から、特に４００ｍＭ以上のＮａＦを投与した群では、０ｍＭのコントロール群と比較して有意な抗体価の上昇が認められた（Ｐ＜０．０１）。
【００３２】
実施例２
実施例１で調製した１００ｍＭ、８００ｍＭのＮａＦを含んだ免疫原、及びＮａＦを含まない（ＮａＦ：０ｍＭ）免疫原を用いて、１週間間隔で３回  ５ｍｌづつゾンデを用いて６週齢のニワトリにその食道深部に投与して経口免疫した。
次に、最終経口免疫後２週目に、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）でエマルジョン化したＢＳＡを筋肉内注射して免疫した。また比較のために経口免疫を行わないニワトリについても同様にフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）でエマルジョン化したＢＳＡを筋肉内注射して免疫した。
【００３３】
各群のニワトリについて、筋肉内注射後２週目に採取した血清中のＢＳＡに特異的なＩｇＧ抗体価を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定し、結果を下記表２に示した。
【００３４】
【表２】
0003944266.tif 000003
【００３５】
この表２の結果から、ＢＳＡ単独（ＮａＦを含まない）で経口免疫した群Ｂでは、非経口免疫群Ａに比べて筋肉内注射免疫後の抗体価は低い値を示し（Ｐ＜０．０５）、経口免疫寛容が成立していると考えられた。また１００ｍＭのＮａＦを含んだ抗原で経口免疫した群Ｃでは非経口免疫群Ａと同等の抗体価を示したが、抗体上昇率は経口免疫群Ｂと統計学的に変わらず、増強効果は認められなかった。
【００３６】
これに対し、８００ｍＭのＮａＦを含む抗原で経口免疫した群では、その後の筋肉内注射によく反応して高い抗体価を示し、増強効果を示す傾向が認められた。
【００３７】
実施例３
実施例１の調製法に準拠してＮａＦを４００ｍＭ含み、抗原量を５０ｍｇから４００ｍｇまで下記表３のように代えた免疫原を調製した。
【００３８】
また比較のために、ＮａＦを含まずに抗原量を５０ｍｇから４００ｍｇまで下記表３のように代えた免疫原を調製した。
【００３９】
これらの免疫原を実施例１と同じ方法で６週齢のニワトリに投与して経口（p.o.）免疫した。また比較のために、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）でエマルジョン化したＢＳＡ（２００μｇ）を筋肉内注射（i.m.）して免疫した。
【００４０】
各群のニワトリについて、初回経口免疫５週目にそれぞれ血清を採取し、局所および全身性の抗体応答を得るために必要な抗原量を調べた。なお全身性の免疫応答としては血清中のＩｇＧ抗体価を指標とし、局所の免疫応答としては胆汁および涙中のＩｇＡ抗体価を指標とした。結果を下記表３，４に示した。
【００４１】
【表３】
0003944266.tif 000004
【００４２】
【表４】
0003944266.tif 000005
【００４３】
この表３，４の結果から、血清中のＩｇＧ抗体価はＮａＦ添加群では５０ｍｇ以上の抗原量で高い抗体価を示した。他方、ＮａＦ無添加群でも抗原量を増すことにより抗体応答を示したが、いずれの場合も、ＮａＦ添加群よりも低い値であることがわかる。
【００４４】
胆汁および涙中のＩｇＡ抗体価は、ＮａＦ無添加経口免疫群ではほとんど検出されなかった。筋肉内注射群においては、非常に高い血清抗体価を示しているにもかかわらず、局所のＩｇＡ抗体はほとんど検出されなかった。これに対しＮａＦ添加経口免疫群では、個体差はあるものの抗原量にかかわりなく局所性のＩｇＡ抗体が検出された。
【００４５】
これらのことから、ＮａＦはニワトリの全身性の免疫応答ばかりでなく、局所性の免疫応答も刺激するアジュバントとして有効に適用できることが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のＮａＦを有効成分とする鳥類用経口アジュバントによれば、鳥類における経口免疫寛容を破り、全身性の免疫応答を高め、且つ局所免疫応答を誘導することができ、これにより、多頭羽飼育が一般的なニワトリなどの鳥類において、簡便で多大な労力を要とせずに、経口投与により免疫応答性に優れた有効なワクチン接種を実現できるという効果が奏される。