(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸単離物。
【請求項２】
前記コード配列が、図１においてエキソンとして示される配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核酸。
【請求項３】
前記コード配列が、図１においてエキソンとして示される配列を含んで成る請求の範囲第２項記載の核酸。
【請求項４】
前記コード配列が、図１のコード配列の対立遺伝子である請求の範囲第１項記載の核酸。
【請求項５】
イントロンを含んで成る請求の範囲第１〜３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項６】
図１に示されるイントロンを含んで成る請求の範囲第５項記載の核酸。
【請求項７】
前記イントロンが図１のイントロン３である請求の範囲第６項記載の核酸。
【請求項８】
図２に示されるアラビドプシス  タリアナ種のFCAアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の挿入、欠失、付加又は置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸単離物であって、トランスジェニック植物におけるコードされたポリペプチドの前記核酸からの発現による生成が前記植物の開花特徴に影響を及ぼすことを特徴とする核酸。
【請求項９】
図２に示されるアラビドプシス  タリアナ種のFCAアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸であって、トランスジェニック植物におけるコードされたポリペプチドの前記核酸からの発現による生成が前記植物の開花特徴に影響を及ぼすことを特徴とする核酸。
【請求項１０】
前記開花特徴が、開花のタイミングである請求の範囲第８項または第９項記載の核酸。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが植物の開花を早める能力を有する請求の範囲第10項記載の核酸。
【請求項１２】
イントロンを含んで成る請求の範囲第８〜11のいずれか１項記載の核酸。
【請求項１３】
図１に示されるイントロンを含んで成る請求の範囲第12項記載の核酸。
【請求項１４】
前記イントロンが図１のイントロン３である請求の範囲第13項記載の核酸。
【請求項１５】
FCA γBのヌクレオチド配列、すなわち図１のエキソンヌクレオチド：1140−1865、2121−2191、2279−2357、4433−4515、4596−4647、4845−4912、5273−5339、5427−5507、5595−5659、5866−5925、6014−6150、6494−6577、6663−7130、7296−7475、7630−7809、7901−7933、8120−8152、8322−8354、8538−8603、8736−8781、8899−9256を有する請求の範囲第８項又は第９項記載の核酸。
【請求項１６】
図8bに示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１７】
図8aに示されるコード配列を含んで成る請求の範囲第16項記載の核酸。
【請求項１８】
前記コード配列が、図8aのコード配列の対立遺伝子である請求の範囲第16項記載の核酸。
【請求項１９】
図8bに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の挿入、欠失、付加又は置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸であって、トランスジェニック植物におけるコードされたポリペプチドの前記核酸からの発現による生成が前記植物の開花特徴に影響を及ぼすことを特徴とする核酸。
【請求項２０】
図8bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸であって、トランスジェニック植物におけるコードされたポリペプチドの前記核酸からの発現による生成が前記植物の開花特徴に影響を及ぼすことを特徴とする核酸。
【請求項２１】
前記開花特徴が、開花のタイミングである請求の範囲第19項または第20項記載の核酸。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが植物の開花を早める能力を有する請求の範囲第21項記載の核酸。
【請求項２３】
前記ポリペプチドの発現のための調節配列をさらに含んで成る請求の範囲第１〜22項のいずれか１項記載の核酸。
【請求項２４】
誘導可能プロモーターを含んで成る請求の範囲第23項記載の核酸。
【請求項２５】
請求の範囲１〜22項のいずれか１項記載のコード配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る核酸の植物の開花特徴に影響を与えるための使用。
【請求項２６】
前記核酸が誘導可能プロモーターを含んで成る請求の範囲第25項記載の使用。
【請求項２７】
請求の範囲第１〜22項のいずれか１項記載のコード配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る核酸単離物であって、前記核酸がDNAであり、そして前記ヌクレオチド配列がアンチ−センス転写のための調節配列の制御下にあることを特徴とする核酸。
【請求項２８】
誘発可能プロモーターを含んで成る請求の範囲第27項記載の核酸。
【請求項２９】
植物細胞の形質転換のために適切であり、そして請求の範囲第１〜24及び28項のいずれか１項記載の核酸を含んで成る核酸ベクター。
【請求項３０】
請求の範囲第29項記載の異種核酸を含む宿主細胞。
【請求項３１】
細菌である請求の範囲第30項記載の宿主細胞。
【請求項３２】
植物細胞である請求の範囲第30項記載の宿主細胞。
【請求項３３】
そのゲノム内に前記異種核酸を有する請求の範囲第32項記載の植物細胞。
【請求項３４】
半数体ゲノム当たり１つよりも多くの前記ヌクレオチド配列を有する請求の範囲第33項記載の植物細胞。
【請求項３５】
請求の範囲第32〜34項のいずれか１項記載の植物細胞を含んで成る植物。
【請求項３６】
請求の範囲第35項記載の植物の自家受粉による子孫もしくは交配による子孫又はそれらの後代、あるいは請求の範囲第33または34記載の植物細胞を含んで成る、そのような植物、子孫又はその後代のいずれかの部分又は胎芽、たとえば種子。
【請求項３７】
植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法であって、植物の細胞内での請求の範囲第１〜24項のいずれか１項記載の異種核酸によりコードされるポリペプチドの発現を引き起こし、又はその発現を可能にすることを含んで成る方法。
【請求項３８】
植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法であって、植物の細胞内での請求の範囲第１〜24項のいずれか１項記載の異種核酸からの転写を引き起こし、又はその転写を可能にすることを含んで成る方法。
【請求項３９】
植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法であって、植物の細胞内での請求の範囲第27〜28項のいずれか１項記載の核酸からのアンチ−センス転写を引き起こし、又はその転写を可能にすることを含んで成る方法。
【請求項４０】
トランスジェニック植物の製造のための請求の範囲第１〜24項のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項４１】
トランスジェニック植物の製造のための請求の範囲第27項又は28項記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物における開花の遺伝的調節及びそこに関与する遺伝子のクローニング及び発現に関する。より具体的には、本発明は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のFCA遺伝子及び他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに植物におけるそれらの遺伝子の操作及び使用に関する。
植物における効果的な開花は、特に意図する生成物が花又はそれらから生成される種子である場合に重要である。この１つの観点は、開花のタイミングであり、すなわち開花の促進又は遅延は農場主及び種子生産者に対して有用である。開花に影響を及ぼす遺伝子機構の理解は、標的植物の開花特徴を変えるための手段を提供する。開花が収穫物の生産に対して重要である種は、種子から成長する多くの、実質的にすべての作物であり、そしてそれらの重要な例は、たぶん暖たかな気候の地域において最とも農業経済的に重要な穀物類、米及びトウモロコシ、並びにより温和な地域における小麦、大麦、オート麦及びライ麦である。重要な種子産物は、ナタネ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ及びモロコシである。それらの根から収穫される多くの収穫物は毎年、種子から成長せしめられ、そしてそれらのいづれかの種類の種子の生成は、植物の開花する能力、授粉される能力、及び種子を結ぶ能力にひじょうに依存する。園芸においては、開花のタイミングの調節は重要である。開花が調節され得る園芸植物は、レタス、キクヂシャ及びアブラナ属の野菜、たとえばキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワー、並びにカーネーション及びフウロソウを包含する。
アラビドプシス・タリアナは、長日下で早く及び短日下で遅く開花する、通性(facultafive)長日植物である。それは小さく、十分に特徴づけられた遺伝子を有し、比較的早く形質転換され、そして再生され、そして急速な成長サイクルを有するので、アラビドプシスは、開花及びその調節を研究するための理想的なモデル植物である。
急速な植物相誘発（floral induction）のために必要とされる遺伝子の１つは、FCA遺伝子（Koornneefなど。1991）である。この遺伝子の突然変異を担持する植物は、長い光周期及び短い光周期下で野生型よりも一層遅く開花する。異なった突然変異fca対立遺伝子内には開花時期の相当の範囲が存在する。最も極端なもの(fca−１)は、40枚までの葉を伴って長い光周期下で開花し、他方fca−３，fca−４は、野生型のランドスパーク・エレクタの９ロゼット葉に比較して、約20のロゼット葉を伴って開花する。すべてのfca突然変異体の後期開花は、水分吸収された種子又は異なった成長年齢の植物が４℃で３〜８週間の春化処理を付与される場合、長い及び短い光周期で早く開花する（Chandler and Dean 1994）。
本発明者は、アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子、ブラシカ（Brassica）からの相同体及び突然変異配列をクローニング化し、そして配列決定した。
本発明の第１の観点によれば、FCA機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子が提供される。当業者は、“FCA機能”とは、アラビドプシス・タリアナのFCA−遺伝子のような開花のタイミングに表現型的に影響を及ぼす能力、特にアラビドプシス  タリアナにおけるfca突然変異を補足する能力を意味することを理解するであろう。
本発明の核酸は、図２に示されるようなアミノ酸を含んで成るポリペプチド、又はそれらの対立遺伝子、変異体、誘導体又は突然変異体をコードするすることができる。特に、変異体は、図２のアミノ酸配列における３番目のメチオニン及び２番目のメチオニンの上流のアミノ酸残基が含まれない配列を包含する。そのような短いポリペプチドをコードする核酸の変異体（variant）、突然変異体（mutant）及び誘導体（derivative）はもちろん、本発明の種子の態様により提供される。
本発明の核酸は、アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子の配列を有し、又はその提供される配列の突然変異体、変異体（又は誘導体）又は対立遺伝子であり得る。好ましい突然変異体、変異体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特に本明細書において論ぜられるような開花を促進する能力を保持するタンパク質をコードするものである。開花の促進は、開花を進行せしめ、早め、又は速めることができる。他の好ましい突然変異体、変異体及び対立遺伝子は、野生型又は提供される配列を有する遺伝子に比較して、開花を遅らせるタンパク質をコードする。突然変異体又は変異体を生成するための配列の変更は、核酸における１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の挿入、欠失又は置換によるものであり、それらは１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を導びく。もちろん、コードされるアミノ酸配列に影響を与えない核酸の変更も包含される。特定の変異体、突然変異体、対立遺伝子及び誘導体がさらに下記で論ぜられる。
FCA遺伝子をコードする領域を包含する好ましい核酸配列は図１に示されており、そしてFCA ORFをコードする推定されるアミノ酸配列が図２に示される。核酸は、コードされたアミノ酸配列の変更を伴って又は伴わないで（遺伝子コードの縮重による）、ヌクレオチドの置換及び／又は１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入及び／又は置換の組合せにより変更することができる。
本発明の核酸は、コードされたアミノ酸配列が変更されても又は変更されていなくてもいずれにせよ、イントロン、例えば図１に示されるイントロン、たとえばイントロン３（たとえば本明細書に示されるような種々の態様におけるような）を含んで成る。たとえば、変異体FCAαB（この核酸配列は図３に示される）は、図１の配列のイントロン３を、その配列の翻訳が図２のアミノ酸配列とは異なったアミノ酸配列をもたらすように含んで成る（図１のイントロン３は、潜在的に転写体において使用される、3026−3028での停止コドンを含む）。
本発明はまた、提供される配列のいづれか１つと共に核酸を含んで成るベクター、好ましくはその核酸配列によりコードされるポリペプチドが発現され得るベクターを提供する。そのベクターは好ましくは、植物細胞の形質転換のために適切である。本発明はさらに、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を包含する。従って、本発明の核酸を含んで成る宿主細胞、たとえば植物細胞が供給される。前記細胞の範囲内で、核酸が染色体内に組込まれ得る。ハプロイドゲノム当たり１つ以上の非相同（heterologus）ヌクレオチド配列が存在することができる。たとえば、これは、下記で論ぜられるように、内因性レベルと比較して、遺伝子生成物の高められた発現を可能にする。
本発明の核酸を含んで成るベクターは、特にそのベクターがゲノム中への組換えのために細胞中に核酸を導入するために使用される予定である場合、プロモーターを含む必要はない。
たとえば、FCA配列以外の、アラビドプシス・タリアナ核酸において開花に影響を及ぼすことができるポリペプチドをコードする配列以外の、注目の種又は起源の核酸又は遺伝子を有さないか又は実質的に有さない、実質的に純粋な又は均質の形の、それらの環境から単離され、そした／又は精製された本発明の核酸分子及びベクターが提供され得る。本発明の核酸は、cDNA，RNA、ゲノムDNAを含んで成り、そして完全に又は部分的に合成のものであり得る。用語“単離物”とは、すべてのそれらの可能性を包含することができる。
本発明はまた、開示される核酸配列のいづれかの発現生成物、及び適切な宿主細胞、例えばＥ．コリにおいて適切な条件下でそれらのためのコードする核酸からの発現による前記発現生成物の製造方法も包含する（例７を参照のこと）。当業者は、ベクターを十分に構成することができ、そして組換え遺伝子発現の生成物の発現及び回収のためのプロトコールを企画することができる。１又は複数の適切な調節配列、たとえばプロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切なベクターが選択され又は構成され得る。さらなる詳細については、たとえばMolecular Cloning：A Laboratory Manual：第２版、Sambrookなど、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。形質転換法は、使用される宿主に依存し、そして十分に知られている。核酸構造体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技法及びプロトコールは、Short Protocols in Molecular Biology,第２版、Ausubelなど、eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。Sambrookなど。及びAusubelなど。の開示は、引用により本明細書に組込まれる。
たとえばそれらのためのコードする核酸からの発現により組換え的に生成された、精製されたFCAタンパク質、又はそのフラグメント、突然変異体又は変異体は、例７に例示されるように、当業界において知られている技法を用いて抗体を生成するために使用され得る。抗体、及び抗体の抗原−結合フラグメントを含んで成るポリペプチドは、下記でさらに論ぜられるように他の種からの相同体を同定することにおいて使用され得る。
抗体を生成する方法は、タンパク質又はそのフラグメントにより哺乳類（たとえば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、羊又はサル）を免疫化することを包含する。抗体は、当業界において知られている種々の技法のいづれかを用いて、免疫化された動物から得られ、そして好ましくは、興味ある抗原に対する抗体の結合を用いてスクリーニングされ得る。たとえば、ウエスタンブロット技法、又は免疫沈殿法が使用され得る（Armitageなど、1992, Nature 357：80-82）。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり得る。
哺乳類を免疫化する他の方法又は補充として、適切な結合特異性を有する抗体が、たとえばそれらの表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを表わすλバクテリオファージ又は線状バクテリオファージを用いて、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に生成されたライブラリーから得られる；たとえば、WO 92/01047を参照のこと。
ポリペプチド又はペプチドに対して生ぜしめられた抗体は、相同ポリペプチドの及び次にコードする遺伝子の同定及び／又は単離に使用され得る。従って、本発明は、FCA機能を有するポリペプチドを同定し、又は単離するための方法を提供し（本明細書に開示される態様に従って）、ここで前記方法は、FCAポリペプチド又はそのフラグメント、変異体又は突然変異体を結合することができ、又は好ましくは、図２又は図８ｂに示されるアミノ酸配列を有するようなポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体（たとえば完全な抗体又はそのフラグメント）の抗体−結合ドメインを含んで成るポリペプチドによりポリペプチド候補をスクリーニングすることを含んで成る。特異的結合メンバー、たとえばFCAポリペプチド又はその突然変異体、変異体又は誘導体を結合し、そして好ましくは、それらに対して特異的である抗体の抗原結合ドメインを含んで成る抗体及びポリペプチドは、それらを使用する方法におけるように、本発明のさらなる観点を表わす。
スクリーニングのためのポリペプチド候補はたとえば、注目の植物に由来する核酸を用いて創造された発現ライブラリーの生成物であり得、又は天然源からの精製方法による生成物であり得る。
抗体を結合することが見出されたポリペプチドが単離され、そして次に、アミノ酸配列決定にゆだねられ得る。いづれかの適切な技法が、完全に又は部分的にポリペプチドの配列を決定するために使用され得る（たとえば、ポリペプチドのフラグメントが配列決定され得る）。アミノ酸配列の情報は、候補核酸に対するハイブリダイゼーションにおいてプローブ又はプライマーとして使用するための１又は複数のオリゴヌクレオチド（たとえば、オリゴヌクレオチドの縮重プール）を企画することにより、又は下記に論ぜられるように、コンピューター配列データベースを調査することにより、ポリペプチドをコードする核酸を得ることに使用され得る。
さらに、本発明は、細胞又はその祖先中への本発明の核酸の導入の結果としてその核酸を含んで成る植物細胞を含んで成る植物、及びそのような植物のセルフェド（selfed）又はハイブリッド子孫、またそのような植物、又は子孫のいづれかの部分又は前駆体、たとえば種も包含する。
FCA遺伝子は、RNA−結合タンパク質として同定される種類のタンパク質に対して相同性を有する大きなタンパク質（図２に示される796個のアミノ酸）をコードする（Burd and Dreyfuss, 1994）。それらのタンパク質は、80個のアミノ酸、すなわちRNA認識モチーフを含み、そしてモジュラー（modular）構造を有し、すなわちそれらはいくつかのRNA結合ドメイン、及びアミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン及びプロリンに富んでいる補助ドメインを含むことができる。RRMタンパク質は、RRMドメイン内での及びそれらの周囲での相同性に基づいてサブファミリーに分割され得る。FCAタンパク質は、ドロソフィラ・エラブ（Drosophila elav）遺伝子により例示されるRNA−結合タンパク質（クラスター（cluster）1028. 16；BEAUTYデータベース研究、Worleyなど., 1995を用いて同定される）のサブファミリーに対して最とも相同である（Robinowなど., 1988）。このファミリーの他のメンバーは、ドロソフィラ（Drosophila）致死（sexlethal）タンパク質；ヒト神経系タンパク質HuD, HuC, Hel−Ｎ１及びHel−Ｎ２；並びにアフリカツメガエルのタンパク質elrA, elrB, elrC, elrD及びetr−１を包含する。FCAは２種のRNA−結合ドメインを有するが、他方elav遺伝子のファミリーのメンバーのほとんどは３種のRNA−結合ドメインを有する。elavファミリーの最初の２つのRNA−結合ドメイン（及びドメイン間の空間）は、FCAタンパク質におけるRNA−結合ドメインに類似する。FCAタンパク質と同じように、elavは高いグルタミン含有率を有する領域を有する。酵母及びＣ．エレガンス（C. elegans）からの未知の機能の２つの遺伝子からのORFに対して強い相同性を示す20個のアミノ酸領域がFCAタンパク質のＣ末端近くにも存在する。
FCA転写体は択一的にスプライスされる。転写体の５つの形が細胞において生成される。本明細書において、FCA転写体βと呼ばれる１つの形は約２kbであり、そしてイントロン３内で早すぎる終結及びポリアデニル化を示す。FCAαA及びαBはスプライスされる19〜20のイントロンを有するが、しかしイントロン３（２kb）は存続する。FCAαAはαBと同じであるが、但し、イントロン１３では、異なった５′及び３′エキソン／イントロン連結が使用される。FCAαAは7055bpでの５′エキソン／イントロン連結（ゲノム配列図１）及び7377bpでの３′エキソン／イントロン連結を使用する。FCAαBは7130bpで５’エキソン／イントロン連結（ゲノム配列図１）及び7295bpでの３’エキソン／イントロン連結を使用する。FCA転写体γA及びγBは両者とも、イントロン３を除去され、そしてγA及びγBはそれぞれαA及びαBと同じ、イントロン１３のまわりでの連結を用いる。γBのみが、RNA−結合ドメイン及び保存されたＣ−末端ドメインの両者をコードする（図10）。
RNA−結合タンパク質は、後−転写調節のいくつかの面に関与することが示されている。RNPモチーフは、他のRNA分子又は他のタンパク質のいづれかとの相互作用のための開放プラットホームとしてRNAを従事せしめるβシートRNA結合表面を形成する。RNPモチーフ含有タンパク質をコードする最も十分に特徴づけられた遺伝子の１つは、ドロソフィラSEX-LETHAL遺伝子である（Bellなど、1998）。そのSEX-LETHALタンパク質は、ドロソフィラにおける性別を決定する経路内でのそれ自体及び他の転写体のスプライシングを変えることに関与する。代わりにスプライスされた生成物のみが、活性タンパク質を与える。従って、この遺伝子生成物は、雌の状態を決定し、そして維持することを担当する。他のRNA−結合タンパク質は、核における特定の転写体を局在化し、又は特定の転写体の翻訳を妨げることによって機能することが示されている。６種の独立して単離されたfca突然変異体が記載されており、そして本発明者は３種の場合においてFCA活性の低下を引き起こす配列の変化を同定した。fca−１突然変異誘発は、位置6861（図１）でのＣヌクレオチドをＴに転換した。従って、グルタミンのコドン（CAA）が、停止コドン（TAA）に変更される。fca−３突然変異誘発は、位置5271でのＧヌクレオチドをＡに転換した。この突然変異の効果は、新しい３′側スプライス連結がエキソン８中に、28個のヌクレオチドを使用するように、イントロン７の３′側スプライス連結を変更することである。fca−４突然変異誘発は、位置4570（イントロン４内）での分解点による転移（遺伝子250kbの３′端を取り去る逆位）の結果である。
本発明のさらなる観点は、図１に示されるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を用いる、アラビドプシス・タリアナ以外の植物種からのFCA相同体を同定、及びクローニングする方法を提供する。核酸ライブラリーは、当業者に良く知られている技法を用いてスクリーンされ得、そして次に、それにより同定された相同配列が試験される。アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子についての配列情報の提供は、アラビドプシス及び他の植物種からの相同配列の獲得を可能にする。サザンハイブリダイゼーション実験においては、アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子を含むプローブが、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）及びブラシカ・オレラセアエ（Brassica oleraceae）から抽出されたDNAにハイブリダイズする。６個のコピーでＢ．ナパスゲノム上に通常存在するほとんどのアラビドプシス遺伝子に比較して、FCA遺伝子はわずか１対の染色体上に２度存在する。ブラシカ・ナパスからのFCA相同体が単離され、そして配列決定され、そしてエキソン内で平均86.1％のヌクレオチド配列の相同性、イントロン内で平均65.8％のヌクレオチド配列の相同性及びアミノ酸レベルで78％の同一性（87％の類似性）を示す。このブラシカ遺伝子はアラビドプシスFCA遺伝子における突然変異を十分に補足し、そして従って十分に機能する相同体として考慮され得る。相同体はまた、アンチリヒナム（Autirrhinum）、タバコ、テンサイ、トマト、エンドウ、小麦、トウモロコシ、米、ライ麦、ロリウム（Lolium）及びオート麦からサザンブロット分析により検出されている。
コード配列を包含するヌクレオチド配列が図８ａに与えられ、そして図８ａの配列によりコードされるアミノ酸配列が図８ｂに示されているブラシカFCA相同体は、アラビドプシスFCA遺伝子について開示される観点に従って、本発明のさらなる観点を表わし、そして提供する。たとえば、図８ｂの配列に対して少なくとも80％の同一性を有する突然変異体、対立遺伝子及び変異体が包含されるが、但しその高レベルのアミノ酸の同一性は論ぜられるような機能的に有意なドメイン又は領域に限定されている。
本発明はまた、図１に示されるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を用いて得られるFCA相同体又は図２に示されるそのアミノ酸配列をコードする核酸にも及ぶ。好ましくは、アラビドプシス・タリアナ以外の種からのそのヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列は、図１のヌクレオチドによりコードされる配列と、好ましくは、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％、又は少なくとも約70％、又は少なくとも約75％、又は少なくとも約78％、又は少なくとも約80％の相同性、最とも好ましくは少なくとも約90％の相同性を共有し、そしてコードされるポリペプチドは、アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子、好ましくは開花のタイミングに影響を及ぼす能力を有する表現型を共有する。それらはアラビドプシス・タリアナのFCAに比較して、開花を促進し、又は遅延することができ、そして突然変異体、変異体又は対立遺伝子は野生型と比較して開花を促進し、又は遅延することができる。“相同性”は、同一性を言及するために使用され得る。
ある態様においては、特定の配列の対立遺伝子、変異体、誘導体、突然変異体又は相同体は、その特定の配列と低い全体的な相同性を示し、すなわち約20％、又は約25％、又は約30％、又は約35％、又は約40％、又は約45％の相同性を示す。しかしながら、機能的に有意なドメイン又は領域においては、そのアミノ酸の相同性は、より高い。図９におけるように、アラビドプシス・タリアナ及びブラシカ・ナパス遺伝子のFCAポリペプチドのアミノ酸配列の比較は、機能的な有意性、すなわち植物の開花特徴、たとえば開花のタイミングに影響を及ぼす役割を有するドメイン及び領域を示す。たとえば、欠失突然変異誘発が、ポリペプチドの領域の機能及び開花タイミングの影響におけるその役割又はその必要性を試験するために使用され得る。
本明細書に提供されるヌクレオチド配列の情報又はそのいづれかの一部は、相同配列、すなわち開花特徴に影響を及ぼす能力について試験され得る発現生成物を見出すためにデータベース調査に使用され得る。それらは、FCA機能、又は遅延された開花である突然変異表現型を補足する能力（ここで、遅延は春化処理により表わされ得る）を有することができる。
春化処理は当業界において良く知られており、そして適切な条件は当業者の自由である。植物は、種まきの直後、種子段階で春化処理され得る。それは、５℃＋／−１℃の温度で、８時間の光周期（たとえば蛍光、PAR9.5ｍモル。ｍ-2・Ｓ-1、Ｒ／FR比：3.9）で、８時間、実施され得る。
公開の配列データベースにおいて、本発明者は最近、ランダム配列決定プログラムにおいて得られた、RRMドメイン内の及びそのＣ−末端領域におけるFCAと相同性を共有するいくつかのアラビドプシスcDNAクローン配列を同定した。データベースのBLAST及びFASTA研究は、同定される23個のアラビドプシス発現性配列標識（EST）を同定した。FCA遺伝子の異なった領域（中央及び３′側）を有するそれらのクローンが得られ、そして低い緊縮ハイブリダイゼーション実験に使用された。８個のクローンが、FCA遺伝子の３′部分に対して良好な相同性を示し、２個のクローンが中央部分に対して良好な相同性を示し、そして１つのクローンが両者に対して良好な相同性を示す（42A4−もう１つのRNA−結合タンパク質）。同様に、ランダムに配列決定された米のcDNAの中で、本発明者は10個の米ESTを同定した。それらは低い緊縮条件下でFCAゲノム及びcDNAクローンにハイブリダイズする。５個のクローンは、FCA、特にＣ1480に対して良好なハイブリダイゼーションを示す。
相同性を配列決定し、それらの発現パターンを研究し、そしてそれらの発現の変更の効果を試験することにより、開花時期の調節においてFCAに対して類似する機能を実施する遺伝子が得られる。もちろん、それらの配列の突然変異体、変異体及び対立遺伝子は、アラビドプシス・タリアナFCA遺伝子について上記で論ぜられるのと同じ点から本発明の範囲内に包含される。
本明細書に開示されるように、アラビドプシス・タリアナ及びブラシカ・ナパスのFCA遺伝子間の高レベルの相同性は、たとえば配列保存性に基づいて企画されたオリゴヌクレオチド（たとえば縮重プール）を用いて、追加の相同体の同定にも利用され得る。
さらなる観点によれば、本発明は、アラビドプシス・タリアナ以外の種からのFCA相同体を同定する方法又はそれをクローニングする方法を提供し、ここで前記方法は図１に示されるヌクレオチド配列又は図８ａに示されるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を用いる。たとえば、そのような方法は、相同体を捜すために図１及び図８ａの配列間に保存される配列を含んで成るオリゴヌクレオチドを使用することができる。従って、核酸（この発現が植物の開花特徴に影響を及ぼすことができる）を得るための方法が提供され、ここで前記方法は、標的／候補体核酸へのオリゴヌクレオチド、又はそのようなオリゴヌクレオチドを含んで成る核酸分子のハイブリダイゼーションを包含する。標的に又は候補体核酸はたとえば、そのような核酸を含むことが知られているか又はそのような核酸を含むと思われる生物から得られるゲノム又はcDNAライブラリーを含んで成る。好結果をもたらすハイブリダイゼーションが同定され、そして／又は標的／候補体核酸がさらなる研究及び／又は使用のために単離され得る。
ハイブリダイゼーションは、核酸のプロービング、及び適切な緊縮条件（既知の技法に従って）及び／又は核酸増殖の方法、たとえばPCRにおけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用下で陽性のハイブリダイゼーションの同定を包含する。プロービングのためには、好ましい条件は、さらに研究され得る陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションを有する単純なパターンが存在するために十分な緊縮条件である。少数の陽性クローンのみが存続するまで徐々にハイブリダイゼーションの緊縮性を高めることは、当業界において良く知られている。
核酸ハイブリダイゼーションをさらに使用してのもう１つのプロービングとして、DNA配列を増殖することが企画されたオリゴヌクレオチドが、通常の方法を用いての核酸の増幅を含有するPCR反応また他の方法に使用され得る。たとえば、“PCRプロトコール”；A Guide to Methods and Applications", Eds. Innisなど、1990, Academic Press, Yew Yorkを参照のこと。
プローブ又はPCRプライマーの企画への使用のために好適な好ましいアミノ酸配列は、本明細書における図２及び８ｂのアミノ酸配列を有する、開花特徴、たとえば開花のタイミングに影響を及ぼすことができる少なくとも２つのFCAポリペプチド間に保存される（完全に、実質的又は部分的に）配列である。
アミノ酸配列の情報に基づけば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが、遺伝子コードの縮重を考慮して、企画され得る、そして適切な場合、候補体核酸からの生物のコドン使用法が誘導される。
好ましくは、核酸情報への使用のための本発明のオリゴヌクレオチドは、約10個又はそれよりも少ないコドン（たとえば６、７又は８個）を有し、すなわち約30個又はそれよりも少ない長さのヌクレオチド（たとえば18, 21又は24個）である。
そのようなPCR生成物が耐性遺伝子に対応するか又はしないかの評価が種々の手段で行なわれ得る。そのような反応からのPCRバンドは、生成物の複雑な混合物を含む。個々の生成物はクローンされ得、そしてそれぞれの生成物は個々にスクリーンされ得る。興味ある植物中への導入についての機能を評価するために、形質転換により分析され得る。
一般的に、本発明の核酸は、開花において遅延される（この遅延は春化処理により補正され得る）突然変異表現型を補足することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る。また、本発明は、開花のタイミングに影響を及ぼす能力を有するポリペプチドをコードする野生型遺伝子の突然変異体又は変異体であるヌクレオチド配列を含んで成る核酸を提供し、ここで前記突然変異体又は変異体表現型は、開花において遅延され、そして開花のタイミングは、春化処理により補正される。それらは、Putterillなど、1995, Putterillなど、1993により報告されるCO遺伝子及びLeeなど、1994により報告されるLD遺伝子から区別される。LDは、遺伝子における突然変異が春化処理により補正される遅れた開花を付与することにおいてFCA遺伝子に類似する特徴を示すが、しかしLDはアラビドプシス・タリアナ及びランドスバーク・エレクタの生態型における開花時期に影響を及ぼすために第２の遺伝子生成物を必要とする（Leeなど、1994、Koornneefなど、1994）。従って、多くの植物種においては、LD遺伝子のみの操作は、開花時期に影響を及ぼさない。FCAの作用は、BHYB（hy３）における突然変異が早い開花を付与し、そしてhy３突然変異体中への損なわれていないBHYB遺伝子の導入が正常な開花時期を復帰せしめることにおいて、フィトクロムＢの作用に対して反対に作動する（Westerなど、1994）。LD及びCOは、本発明の範囲から排除される。FCR及びその突然変異体、変異体及び対立遺伝子は、LD突然変異を補完しない。LD及びその突然変異体、変異体及び対立遺伝子は、FCA突然変異を補完することができない。
FCAアミノ酸配列は、CO及びLDのアミノ酸配列とは、全体的に異なっている。
FCAの作用はまた、開花時期を変更する、分裂組織特性は又はMADSボックス遺伝子の生態型発現から区別され得る（Weigel and Nilsson, 1995, Chungなど、1994、Mandel and Yanofsky, 1995, Mizukama and Ma, 1992）。早く開花する表現型とは別に、分裂組織特性又はMADSボックス遺伝子の生態学的過剰発現は、植物の植物性及び植物相表現型に多くの追加の不安原因を生成する（低い背丈、減じられた頂芽優勢（upical dominance）、不稔性の花）。
また、本発明によれば、異なったイントロンが除去されているヌクレオチドの配列をそのゲノム中に組込んだ植物細胞が供給される。本発明のさらなる観点は、ヌクレオチドの配列を含んで成るベクターを植物細胞に導入し、そして前記ベクターと前記植物細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こし、又は可能にし、前記ゲノム中に前記ヌクレオチドの配列を導入することを包含するそのような植物細胞を製造するための方法を提供する。
本発明の植物細胞を含んで成る植物がまた、そのいづれかの部分又は胎芽、種子、自動選択給餌された又はハイブリッドの子孫、及びそのいづれかの部分又は胎芽と共に提供される。
本発明はさらに、植物の細胞内で異種FCA遺伝子配列（又は論ぜられるような、その突然変異体、対立遺伝子、変異体又は相同体）の発現を含んで成る、植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法を提供する。用語“異種”とは、問題のヌクレオチド遺伝子／配列が遺伝子工学を用いて、すなわちヒトの介入により、植物又はその前駆体の細胞中に導入されていることを示す。遺伝子は、ゲノム外ベクター上に存在し、又は好ましくは、ゲノム中に安定して導入され得る。異種遺伝子は、同等の内因性遺伝子、すなわち開花の調節において同じか又は類似する機能が通常行なう遺伝子を置換することができ、又はその挿入される配列は、内因性遺伝子に付加することができる。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝子発現及び従って、本発明の開花に影響を及ぼすことができるよう、選択されるプロモーターの制御下で遺伝子の発現を定める能力である。さらに、たとえば野生型よりも高いか又は低い活性を有する。野生型遺伝子の突然変異体及び変異体が、その内因性遺伝子の代わりに使用され得る。
本発明を用いて変更され得る主な開花特徴は、開花のタイミングである。FCA遺伝子の遺伝子生成物の過少発現は、春化処理によりより早い開花に克服され得る遅延された開花を導びき（fca突然変異表現型及び例３のアンチセンス実験により示されるように）；過剰発現はより早い開花を導びくことができる（例２，４及び５）。この程度の調節は、たとえばハイブリッド生成における雄及び雌親系の同時開花を確保するのに有用である。もう１つの使用は、成長する季節を拡張し、又は減じるために、気候の指図に従って開花を早めたり又は遅らせたりすることである。これは、アンチセンス又はセンス調節の使用を包含する。
本発明の核酸、たとえばFCA遺伝子又は相同体は、外部的に誘導性の遺伝子プロモーターの制御下に配置され、従って、使用者の制御下に開花のタイミングを定めることができる。これは、花の製造、及び続く出来事、たとえば種子の製造が、たとえば切り花又は装飾用植木鉢用植物において、市場の需要を満たすよう時期を設定され得ることにおいて好都合である。植木鉢用植物の開花の遅延は、製造者から売買の点にその製品を輸送するために利用できる期間を長くするのに好都合であり、そして開花時期の拡張は購入者にとっても明らかな利点である。
さらなる観点において、本発明は、本発明により供給されるヌクレオチド配列、たとえばアラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子、他の植物種、たとえばブラシカ、たとえばブラシカ・ナパスからの相同体、又はそのいづれかの突然変異体、変異体又は対立遺伝子に操作可能に連結される誘発可能プロモーターを含んで成る遺伝子構造体を提供する。
論ぜられるように、これは遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明はまた、前記遺伝子構造体により形質転換された植物、及びそのような構造体の植物細胞中への導入及び／又は適切な刺激、すなわち効果的な外因性インジューサーの適用による、植物細胞内での構造体の発現の誘発を含んで成る方法を提供する。
プロモーターに適用されるような用語“誘導可能”とは、当業者により十分に理解される。本質的に、誘導可能プロモーターの制御下での発現は、適用される刺激に応答して“スイッチオンされ”、又は高められる。いくつかの誘導可能プロモーターは、適切な刺激の不在下で、検出できるレベルの発現をほとんど引き起こさない（又は発現を引き起こさない）。他の誘導性プロモーターは、刺激の不在下で検出できる構造的な発現を引き起こす。どんなレベルの発現が刺激の不在下で存在しても、いづれかの誘導可能プロモーターからの発現は、正しい刺激の存在下で高められる。好ましい刺激は、発現のレベルが表現型特徴を変えるための有効な量によるその相当の刺激の適用に基づいて高まる場合である。従って、誘導可能（又は“スイッチ可能”）プロモーターが使用され得、ここでこのプロモーターは、所望する表現型を引き起こすには低過ぎる（及び実際的にはゼロである）レベルの刺激の不存下で基本的レベルの発現を引き起こす。刺激の適用に基づいて、発現は、所望する表現型を引き起こすレベルに高められる（又はスイッチオンされる）。
細胞中に選択された遺伝子構造体を導入する場合、当業者に良く知られている一定の考慮が取られるべきである。挿入されるべき核酸は、転写を駆動する効果的な調節要素を含む構造体内にアセンブルされるべきである。細胞中に構造体を輸送するための方法は利用できる。構造体が細胞膜内にいったん入ったなら、すぐに、内因性染色体材料中への組込みが生じるだろうし、又は生じないであろう。最終的に、植物に関与する限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生され得るようにあるべきである。
前記配列を含むDNAフラグメントにより形質転換された植物は、植物の遺伝子操作についてすでに知られている標準の技法により生成され得る。いづれか適切な技法、たとえばその天然の遺伝子トランスファー能力を利用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）により担持される武装されていないTi−プラスミドベクター（EP-A-270355， EP-A-0116718, NAR 12(22)8711-87215, 1984）、粒子又は微小発射体衝撃（US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616）、マイクロインジェクション（WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966）、エレクトロポレーション（EP 290395, WO 8706614）又は直接的なDNA摂取の他の形（DE 4005152, WO 9012096, US 4684611）を用いて、植物細胞をDNAにより形質転換することができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換は、双子葉植物種を形質転換するために当業者により広く使用されている。アグロバクテリウムは、いくつかの単子葉植物種を外来性DNAにより形質転換することが報告されているけれども（WO 92/14828）、微小発射体衝撃、エレクトロポレーション及び直接的なDNA摂取は、アグロバクテリウムが無効化であり又は無能である場合に好ましい。他方では、異なった技法の組合せが、形質転換方法、たとえばアグロバクテリウム被覆された微小発射体による衝撃（EP-A-486234）又は創傷を誘発するための微小発射体衝撃、続く、アグロバクテリウムと共に同時培養（EP-A-486233）の効率を増強するために使用され得る。
形質転換法の特定の選択は、一定の植物種を形質転換するためのその効率、及び選択される特定の方法論を有する、発明を実施する人の経験及び好みにより決定されるであろう。植物細胞中に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択が、本発明に不可欠ではなく又は本発明を限定するものではないことは、当業者に明らかであろう。
本発明において、過剰発現は、センス配向でのヌクレオチド配列の導入により達成され得る。従って、本発明は、植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法を提供し、ここで前記方法は、前記植物の細胞内の核酸から、本発明の核酸のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの発現を引き起こし、又は発現を可能にすることを含んで成る。
遺伝子生成物ポリペプチドの過少発現は、アンチセンス技法又は“センス調節”を用いて達成され得る。
遺伝子発現をダウン−レギュレートするためのアンチ−センス遺伝子又は部分的遺伝子配列の使用は現在、十分に確立されている。二本鎖DNAは、そのDNAの“アンチ−センス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のmRNAに対して相補的であるRNAを生成するよう、“逆の配向”に、プロモーターの制御下で配置される。次に、相補的アンチ−センスRNA配列が、複合体を形成するためmRNAと結合すると思われ、これが標的遺伝子からの内因性mRNAのタンパク質への翻訳を阻害する。これが作用の実際の形式であるか否かはまだ確かではない。しかしながら、その技法が作動することは、確立された事実である。たとえば、Rothsteinなど、1987；Smithなど、1988；Zhangなど、1992；Englishなど、1996を参照のこと。逆配向でのコード配列に対応する完全な配列は使用される必要はない。たとえば、十分な長さのフラグメントが使用され得る。アンチ−センス阻害のレベルを最適化するためにコード配列の種々の部分から種々のサイズのフラグメントをスクリーニングすることは、当業者にとって通常の出来事である。開始メチオニンATGコドン、及びたぶん、その開始コドンの上流の１又は複数のヌクレオチドを含むことは好都合である。適切なフラグメントは、約14〜23個、たとえば約15，16又は17個のヌクレオチドを有することができる。
アンチ−センス調節は、適切な構造体に誘発可能なプロモーターを使用することによって、それ自体、調節され得る。
従って、本発明はまた、植物の開花特徴に影響を及ぼす方法を提供し、ここで前記方法は前記植物の細胞内の本発明の核酸からのアンチ−センス転写を引き起こし、又はその転写を可能にすることを含んで成る。
標的遺伝子の追加のコピーがセンス下で、すなわち標的遺伝子と同じ配向で挿入される場合、過剰発現が生じる個体及び標的遺伝子からのタンパク質の過少発現が生じるいくつかの個体を包含する広範囲の表現型が生成される。挿入した遺伝子が内因性遺伝子の単に一部である場合、トランスジェニック集団における過少発現個体の数は上昇する。センス調節、特にダウン−レギュレーションが生じるこの機構は、十分には理解されていない。しかしながら、この技法はまた科学文献及び特許文献に十分に報告されており、そして通常、遺伝子制御のために使用される。たとえば、van der Krol, 1990；Napoliなど、1990；Zhangなど、1992を参照のこと。
従って、本発明はまた、植物の開花特徴に影響を及ぼすための方法を提供し、ここで前記方法は、開花特徴に影響を及ぼす能力を有するポリペプチドの活性を抑制するために前記植物の細胞内の本発明の核酸からの発現を引き起こし、又はその発現を可能にすることを含んで成る。ここで、ポリペプチドの活性は好ましくは、植物細胞内での過少発現の結果として抑制される。
FCAの変性されたバージョンが、植物の開花特徴に影響を及ぼすことに使用され得る。たとえば、fca−１，fca−３又はfca−４として本明細書において同定される突然変異体が使用され得る。それらの突然変異体をもたらす配列変化及びその得られる表現型は、上記で論じられている。
早い開花を引き起こすためのFCA活性の促進：
FCA活性を減じる突然変異は、長日及び短日条件下で遅い開花を引き起こし、これは、開花を構成的に促進することにおけるFCA関与を示す。二重突然変異実験はまた、FCA機能が花序／植物分裂組織自体の付与に関する遺伝子生成物、たとえばLEAFY, APETALA１及びTERMINAL FLOWERの上流及び下流の両者に必要とされることを示している。従って、FCA機能は、LEAFY, APETALA１及びTERMINAL FLOWER遺伝子生成物に応答する分裂組織の能力に関与され得る。
十分にスプライスされたFCA転写体は、これまで分析されたすべての条件下で非常に少数で存在する。fca突然変異は劣性のトランスジェニックfca植物であるけれども、導入された野生型FCA遺伝子のためのホモ接合体は、１つのコピーを担持する植物よりも、わずかに早く開花し（例２）、これはある条件下で、FCA転写体のレベルが開花時期を制限することを示唆する。これは、開花が遺伝子の発現を変更するために外来性プロモーターを用いることによって操作され得ることを示唆する。さらに、大部分の転写体が、活性タンパク質を生産し得ない形で存在する。従って、代わりのスプライシングは、比較的低レベルのFCAタンパク質を維持するための特定の制御機構であり得る。イントロンを欠いているFCA遺伝子の植物への導入によるこのスプライシングパターンの変更は、促進された開花を付与する、より高いレベルのFCAタンパク質を付与することができる。
非誘発性又は誘発性条件下での早い開花の惹起：
野生型アラビドプシス植物は誘導条件下で非常にすばやく開花し、そしてFCA遺伝子は、低レベルであるが、開花の前に発現される。FCA生成物のレベルは、プロモーターが、たとえばCaMV35S又はmeri５の融合体の導入により高められ得る。さらに、イントロンを欠いているFCA遺伝子の導入は、FCAタンパク質のレベルを高め、そしてすべての条件下でより早い開花を引き起こす。
遅い開花を引き起こすためのFCA活性の阻害：
fca突然変異は、アラビドプシスの遅い開花を引き起こす。トランスジェニックアプローチが、FCA活性を減じるために使用され得、そしてそれにより、広範囲の植物種の開花を遅らせ又は妨げることができる。種々の方法が使用され得る。次に、この遅い開花は、そのようなことが所望される場合、水分吸収された種子、又は異なった年齢の植物を春化処理に付与することによって克服され得る。
センス又はアンチ−センスRNAの発現：
いくつかの場合、内因性植物遺伝子の活性が、上記で論ぜられたように、トランスジーンからか相同アンチセンスRNAの発現により減じられている。同様に、トランスジーンからのセンス転写体の発現が、上記で論ぜられたように、遺伝子のその対応する内因性コピーの活性を減じることができる。FCA遺伝子からのアンチセンス転写体の発現は、その内因性遺伝子の活性を減じ、そして遅い開花を引き起こすことが示されている（例３）。
FCAタンパク質の変性されたバージョンの発現：
RNA結合タンパク質は、異なったRNA分子を結合するために必要とされるアミノ酸配列がタンパク質の別々のドメインであるモジュール構造を有する（Burd and Dreyfuss, 1994）。これは、RNA結合タンパク質の機能の１つのみを表示する、切断されたタンパク質又は融合タンパク質の構成を可能にする。FCAの場合、インビトロでの遺伝子の変性及びタンパク質の変性されたバージョンの発現が、内因性の損なわれていないタンパク質の主な阻害を導びくことができ、そしてそれにより、開花を遅らせることができる。これは、種々の手段、たとえば次の手段により達成され得る：
切断されたFCAタンパク質の発現：
いくつかの複数−RNPモチーフのタンパク質は、異なったRNA配列を同時に結合することができる。たとえばＵ１  Ａは、その第１のRNA−結合ドメインを通してＵ１の小さな核RNAに、及びその第２のドメインを通してプレーmRNA配列に結合し、従ってスプライシングを制御する（Burd and Dreyfuss, 1994）。それらのRNPモチーフのわずか１つを有するFCAタンパク質の発現は、十分なサイズのFCAタンパク質の結合を妨げることによって、FCA作用を優先的に阻止ることができる。また、Ｃ末端配列をコードしない突然変異FCAタンパク質の発現は、RNA分子の結合の正しい整合を妨げ、そしてその結果、やはり、野生型FCA結合を阻止する。
本発明の観点及び態様が現在、添付する図面を伴って、例により示されるであろう。さらなる観点及び態様は当業者に明らかであろう。本明細書に言及されるすべての文書類は、引用により本明細書に組込まれる。
図１は、アラビドプシス・タリアナから得られたFCAをコードするゲノム領域の配列である、本発明の１つの態様のヌクレオチド配列を示す。イントロンは小文字で示されており、エキソンは大文字で示されている。特徴：▼（1118）−転写開始；□（1532−1534, 1568−70, 1601−1603）−推定上の翻訳開始ATG；γβ（2753）−β−転写体のポリＡ部位；〕〔（7056−7377）−イントロン１３のまわりの代替可能なスプライシング；＿＿（8771−73）−翻訳停止TAA；γ（9256）−ポリＡ部位。イントロン３内の3026−3028での追加の翻訳停止コドン。
図２は、FCA ORFをコードするヌクレオチド配列に由来する推定されるアミノ酸配列を示す。
図３は、５′及び３′フランキング配列を包含する、FCAαB遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ORF内の配列は、多くの転写体の１つの配列であり、すなわち19個のイントロンがスプライスされているが、しかしイントロン３は残存している。他の多くの転写体の終結の位置が示される。プライマー配列は表２に与えられる。制限部位：SalＩ352；HindIII−776；XbaＩ−1157；HindIII−3125；BglII−3177；ClaＩ−3293；BamHＩ−3549；HindIII−4728；SpeＩ−5003。他の重要な標識：1293−cDNAクローン77Ｂ又はFCA転写体αにおけるこのヌクレオチドの後に付加されるポリＡ末端；897−イントロン３の５′側スプライス部位；2973−イントロン３の３′側スプライス部位。
図４は、ドロソフィラのSEX-LETHAL及びTRA−２遺伝子からのモチーフとFCA RRMモチーフとを比較する。また、酵母及びＣ．エレガンス（C. elegans）タンパク質に対して相同性を有するＣ−末端アミノ酸が示される。
図５は、FCA遺伝子を位置決定するための組換え分析を示す。
図６は、FCA遺伝子を局在化するための相補性分析を示す。
図７は、相補性コスミド上のFCA遺伝子の複雑さ及び位置を示す。
図８は、ブラシカ・ナパスFCA相同体のヌクレオチド配列及びコードされたポリペプチドを示し；図８ａ−ブラシカFCA遺伝子配列含有コード配列；図８ｂ−図８ａのコード配列によりコードされるポリペプチドアミノ酸配列。
図９は、アラビドプシス及びブラシカFCAアミノ酸配列の整合配列を示す。上部はアラビドプシスであり；下部はブラシカである。
図10は、FCA遺伝子から生成された異なった転写体を示す。＿＿：読み取り枠；★：Ｃエレガンス及び酵母ESTにおける保存された領域；Ｒ１，Ｒ２：RNA−結合ドメイン１及び２。
例１−FCA遺伝子のクローニング及び分析
アラビドプシス・タリアナのFCA遺伝子を担持する300kbのゲノム領域の同定
fca突然変異は、染色体４上の29cMに対する可視マーカーにより地図を形成されている。染色体歩行によりクローニングのための出発点として分子マーカーに対する遺伝子座の地図を形成するために、染色体４の上部半分をマッピングするRFLPマーカーの分離パターンを、遅れた開花の突然変異体fca−１（ランドスバーク  エレクタ  バックグラウンドにおける）と多型性の早く開花する生態型コロンビアとの間の交雑からのＦ２からの171個の遅延（ホモ接合性の劣性クラス）開花の個体において分析した。この分析は、マーカーｍ326とｍ226との間で5.2cMの間隔でのFCA遺伝子座を位置決定した。
次に、それらのマーカーを、染色体歩行のための開始点として使用した。それらのRFLPマーカーを含むYACクローンを、コロニーハイブリダイゼーション実験により同定した。初期実験においては、使用されるYACライブラリーは、EG, EW及びABIライブラリーであったが、しかし他のものが利用できるようになるにつれて（yUP−1992年５月）、それらは分析中に組込まれた。明確にハイブリダイズするYACクローンを、サザンブロット分析により確かめた。それらを、PFGE及びサザンブロット分析を用いてサイズ分けし、そして次に、末端プローブを、染色体歩行実験への使用のために逆PCR又は左側端レスキュー（rescue）のいづれかを用いて生成した。大部分の場合、その染色体歩行における個々の段階は、キメラ性YCAクローンにより生成される誤った連鎖を回避するために２種の独立したYACクローンにより包含された。それらは、EG, EW及びyUPライブラリーの有意な画分を構成し、そしてYAC contigのアセンブリーを複雑化した。65個の末端−プローブの生成及び分析の結果は、57個のYACクローンを含むｍ326−ｍ226間隔を包含するYAC contigであった。
ランドスバーグ・エレクタとコロンビアとの間の多型性を、EG9D2の左側の末端−プローブ、YACクローン、yUP13C7右側の末端−プローブ、YACクローンyUP3F7の右側の末端−プローブ及びYACクローンEW20B3の右側の末端−プローブについて決定した。ｍ326−ｍ226の間隔をマッピングする、クロスオーバーポイントを有する組換え体のプールされた子孫に対するそれらのマーカーの分離パターンの分析は、yUP3F7RE及びｍ226により同定される多型現象間までの、FCA遺伝子を担持する領域を定義した。この間隔は、２種のオーバーラップするYACクローンEW20B3及びABI10C10により包含された。
FCA遺伝子の位置をさらに定義するためには、２種のオーバーラップするYACクローン内をマッピングするプローブがさらに必要とされた。これは、YACクローンABI3C4及びABI6C3からの末端−プローブ、YACクローンEW20B3(W5)からのランダムSau3Aフラグメント及び２種のコスミドcAtA２及びg19247を用いることによって達成された。SmaＩ，MluＩ及びPacＩについての制限地図を構成し、そしてYACクローン内のプローブを位置決定するために使用した。
FCA遺伝子座に隣接するクロスオーバーポイントがマッピングされている追加の組換え体を、アラビノース耐性であり、そしてfca（ランドスバーグ  エレクタにおける）とaral（コロンビアにおける）との間での交雑から生成されるＦ２からの早い／中間の開花を有する個々の植物を選択することによって生成した。それらの子孫を、それらがアラビノース耐性対立遺伝子のためにホモ接合性であり、そしてfca突然変異のためにヘテロ接合性であることを確かめるために調べた。それらの個体のうち３種（Ａ２／７，Ａ１／８、及びＡ４／７）を、RFLPマーカー、すなわち3F7RE, Ｗ５, cAtA２, 19247, 3C4LE, 6C3LE及び226により分析した。これは、コスミドcAtA２及び19247内におけるようにFCA遺伝子を担持するゲノム領域の北端を定義した。この情報は、図５に要約される。
FCA遺伝子を定義するための相補性分析：
２種のYACクローンEW20B3及びABI10C10をゲル精製し、そして15〜20kbのアラビドプシス  タリアナ、ランドスバーク  エレクタのゲノムDNAを含む25500のコスミドクローンを担持するフィルターにハイブリダイズした。このコスミドライブラリーは、λcosフラグメントを担持するpHC79からの1.6kbのBglIIフラグメントをベクターpSLJ1711中にクローン化することによって、新規ベクター（04541）において構成された。得られる高い安定性のコスミドクローニングビークルは、植物染色体中へのDNAのトランスファーのためのアグロパクテリウム境界配列、35Ｓ−NPTII植物選択マーカー、Ｅ．コリにおける青色／白色の挿入体選択のためのlacz-laci配列、及び７個のクローニング部位を有するポリリンカーを担持する。
ポジティブにハイブリダイズするコロニーを、HindIII, EcoRＩ及びBamHＩにより消化されたすべてのコスミドクローンを担持するサザンブロットに対して個々のクローンをハイブリダイズすることにより分析した。これは、個々のコスミドの挿入体についての制限地図を生成し、そしてクローンがオーバーラップする挿入体を担持することを示した。コスミドをまた、植物DNAと共に実施し、そしてコスミド挿入体が植物DNAと対応することを確かめるためにハイブリダイズした。この間隔までをマッピングする、２種のコスミドクローン、cAtA２及びcAtB１を、異なったコスミドライブラリー（Olszewski and Ausubel, 1988）から単離した。この分析の結果は、FCA遺伝子座が定義されている300kbの間隔を包含するコスミドcontigであった。
６個の突然変異体fca対立遺伝子を入手でき、この２個はFN照射により生成され、そして１つはＸ−線照射により生成された。照射−誘発性突然変異は時々、ゲノムの再配置又は欠失に関連している。これがFCA遺伝子の位置をさらに細かく区別する場合、YACクローンEW20B3及びABI10C10により包含されるゲノム領域を、すべての６種の対立遺伝子において試験した。２種のYACクローンを、SmaＩ及びMluＩに消化された異なった対立遺伝子からのDNAを担持するPFGEサザンブロットにハイブリダイズした。約50kbのMluＩフラグメントが、fca−４対立遺伝子においてわずかに小さいことが見出された。差異を示す領域に対応する、コスミドクローンのハイブリダイゼーションによるさらなる分析は、変更の部分がコスミドcAtA２及び19247に担持される1.9kbのBamHＩフラグメントにおいて生じたことを示唆した。これは、前記コスミドcontigの北端でのコスミドクローンに対する第１の相補性試験への努力に向けた。
左側端でのクローンから開始する、図６に示される11種のコスミドクローンを、根外植体形質転換方法（Valvekensなど、1988）を用いて、アルビドプシスfca−１突然変異体中に導入した。種子を、自家授粉された耐カナマイシン性個体から収集し、そしてそれらのカナマイシン分離及び流れ時間について分析した。個々のコスミドについて早い開花に対しての相補性を示す形質転換体の数を図６に示す。相補性をもたらす４種のコスミドが、fca−４対立遺伝子における逆位が位置決定されているゲノム領域の末端まで位置決定された。
FCA遺伝子の同定：
相補性コスミドクローン内のゲノム領域に対するコロンビアの対立を遺伝子の完全なゲノム配列を、この部門内で研究されたアラビドプシス配列決定の努力を通して得た（G. Murphy pers. comm.）。前記相補性コスミドに含まれる大部分のゲノム領域を、３種のBamHＩ制限フラグメント、すなわち４，1.9及び２kbのフラグメント上に担持する。それらを単離し、そしてPRL-２ cDNAライブラリーの１×106個のファージクローンに対して別々にハイブリダイズせしめ、又はプールした。このライブラリーは、プールされたRNAサンプルから製造され、そしてTom Newman(Michigan)により利用可能にされた。２kbのBamHＩフラグメント及び３，４及び1.9kbのフラグメントに対してハイブリダイズする４種のクローンを単離し、そして特徴づけた。それらは、約1700bp及び1350bpのサイズの挿入体を有する２種のcDNAクローンを明らかにした。それらの２種のcDNAクローンにハイブリダイズする転写体のサイズの分析は、１つ（fca−４における）が他の対立遺伝子及び野生型に比較してサイズが減じられ、そしてその結果、このcDNAがFCA遺伝子として割り当てられたことを示した。他のクローンは差異を示さず、そして77Ｂとして命名された。
推定上のFCA遺伝子の転写体のサイズは、３kb以上であり、これは、そのcDNAクローンが十分な長さでなかったことを示唆する。そのcDNAクローンを配列決定し、そして1811bpの挿入体をコードすることを見出した。プライマーを、ゲノム配列（図３上の印を付けられたBamＸプライマー）及びcDNA配列の５′端（図３上の印を付けられたIanRT１及びIanRT２）から製造した。第１鎖のcDNAを、野生型実生（２葉段階）から単離されたRNAをプライムするためにIanRT２プライマーを用いて製造した。これが、臭化エチジウム染色ゲル上で薄いバンドとして検出されるフラグメントをPCR増幅するためにプライマーBamＸ及びIanRT２と共に使用された。PCR生成物を300倍に希釈し、そしてプライマーBamＸ及びIanRT１を用いて再増幅した。この反応からの生成物を、Ｔ４ DNAポリメラーゼを用いて末端をフィルインし、そして一般的なクローニングベクターBluescript KSII(Stratagene)のEcoRＶ部位中にクローン化した。その生成物を配列決定し、そしてそれが、ゲノム配列と対応し、そしてcDNAクローンの配列を735bp、拡張したことが見出された。
配列を、BlastX, BlastN及びTBlastNを用いて、すべての入手できる配列と比較した。有意な相同体が、RNA結合タンパク質として以前に定義された種類のタンパク質に対して、TBlastN調査において検出された。それらのタンパク質の特徴は、80個のアミノ酸領域を包含する保存されたアミノ酸から製造された１又は複数のRRMモチーフの存在である（図４に示される）。サブ−モチーフRNP２及びRNP１、及び個々の保存されたアミノ酸の位置は、完全なRRMモチーフ内に常に維持される。RT-PCR実験において拡張されたFCA cDNAクローンの配列の翻訳は、その配列の５′領域における複数の翻訳停止コドンの存在を示した。最後の翻訳停止コドンの下流の及びFCAタンパク質の残りと整合する最初のメチオニン残基は、RRMモチーフの中間に位置し、RNP２及びRNP１を分断する。他のRNAタンパク質に対するRRMモチーフの強い相同性は、このMET残基がRCAタンパク質の起点ではなかったことを示唆した。さらに、他方では、多数のRNA−結合タンパク質の転写体をスプライスし、活性及び不活性生成物を生成した。次に、スプライシングを、しばしば自動調節態様で調節し、活性タンパク質の生成を制御した。それらの事実は、RT−PCR実験において生成されたFCA転写体が、RRMモチーフのすぐ上流にイントロンを含んでいることを示唆した。
この仮説を試験するために、いくつかのプライマーを、さらなるRT−PCR実験への使用のためのゲノム配列から企画した。第１鎖のcDNAを、ランダムヘキサマー（Boehringer）により感作された実生（４枚の葉段階）から単離されたRNAから製造した。FCA cDNAの５′側配列〜77Ｂ cDNA（相補性コスミドクローンにハイブリダイズする他のcDNAクローン）の３′端内に存在するプライマー、及びIanRT１は、ゲノム配列からの予測されるサイズの増幅生成物を付与したが、しかし介在イントロンがスプライスされている転写体から予測されるようなより小さな生成物は生成しなかった。次に、cDNAII−BamHＩとして標識された77Ｂ cDNAクローン内に存在するプライマー（図３における）を、IanRT１プライマーと共に使用した。バンドは、30サイクルの増幅の後、臭化エチジウムにより染色されたアガロースゲル上には見えなかった。次に、PCR反応物を300倍に希釈し、そしてプライマーcDNAII−１及びRevEx４（図３に示される）を用いて再増幅した。PCR生成物を、SalＩ及びBglII制限酵素により消化し、そしてSalＩ及びBamHＩ消化されたBluescript KSIIプラスミド中にクローン化した。760bpの生成物の配列分析及びゲノム配列に対する比較は、２kbのイントロンが、FCA遺伝子におけるRRMモチーフを担持する配列に77Ｂ cDNA内のORFを連結するためにスプライスされたことを示した。このスプライシングは、イントロン３により中断される第２の損なわれていないRRMモチーフの存在を示した。
FCA配列とLUMINIDEPENDENS and Co,すなわちアラビドプシスからの他の開花時期遺伝子（Leeなど、1994, Putterillなど、1995）の配列との直接的な比較は、有意な相同性を検出しなかった。
fca突然変異対立遺伝子における突然変異：
cDNAを、突然変異対立遺伝子から単離されたRNAから製造した。これを、cDNAII−BamHＩ及びcDNA−３′ａ；BaMＸ及びIanRT１；fca５′−１及びfca３′−ａ（位置は図３に示される）を用いて増幅した。得られるPCRフラグメントをクローニング化し、そして配列決定し、そして野生型ランドスバーグ  エレクタ転写体の配列と比較した。fca−１突然変異は、位置6861でのＣヌクレオチドをＴに転換した。従って、グミタミンコドン（CAA）が、停止コドン（TAA）に変更される。fca−３突然変異は、位置5271でのＧヌクレオチドをＡに転換した。この突然変異の効果は、イントロン７の３′側スプライス連結部を、エキソン８中の28個のヌクレオチドの新規３′側スプライス連結部に変更することである。fca−４突然変異は、位置4570（イントロン４内の）での分解点を伴っての再配置の結果である。
例２−ブラシカ  ナパス相同体の単離及び配列分析
λDASHRII／BamHＩベクター（Stratagene）中にクローン化されるSau3A部分消化DNAから構成されたブラシカ・ナパスゲノムライブラリーを得た。そのライブラリーを、1811bpのFCA cDNAを用いてスクリーンした。FCA cDNAクローン及び77Ｂ cDNAクローンにハイブリダイズする、12kbの挿入体を担持するクローン単離した。λクローンを、十分な長さの12kbのブラシカ挿入体を開放するSalＩにより消化し、そしてこれをBluescript KSII中にクローン化した。このクローンの制限フラグメント（EcoRＩ, SacＩ及びBamHＩの組合せ）を、Bluescript KSII中にサブクローン化し、そして配列決定した。
12kbのブラシカ・フラグメントをまた、fca突然変異の形質転換のために、アグロバクテリウムの二元ベクターpSLJ1714（Jonesなど、1992）のXhoＩ制限部位中にサブクローン化した。根外植体形質転換法を用いて、fca−４突然変異中に導入される場合、形質転換体の子孫は早く開花する植物を分離する。それらは、9.1枚の葉を伴って成長した野生型ランドスバーク・エレクタ及び24.1枚の葉を有するfca−４に比較して、平均8.3枚の葉を伴って開花した。従って、ブラシカFCA遺伝子は、fca−４突然変異を十分に補足する。
FCA mRNAの発現：
ポリＡ mRNAを次の広範囲の成長段階から単離し：２枚葉、４枚葉、６枚葉及び10枚葉、根及び花部、ノザンブロット上で分別し、そして1811bpのFCA cDNAクローンによりハイブリダイズせしめた。その組合されたFCA転写体γは、試験されたすべての組織においてほぼ同じ量で存在し、但し発現がわずかに低い花部を除く。早熟的にポリアデニル化された転写体βを、プローブとして77Ｂ cDNAクローンを用いて検出した。そのβ転写体は、γA+Bよりも20倍ほど豊富であった。イントロン３を含む転写体αA+Bは、ノザンブロット上では検出されず、そしてRT−PCRを用いてのみ見出された。
FCA発現をまた、RNアーゼ保護アッセイを用いて分析した。プローブ（γB構造体からの725bp〜1047bp）を用いて、γA+B転写体を、長日及び短日の光周期においてこの広範囲の成長段階において類似するレベルで、及び成熟植物のロゼット及び花部において低レベルで検出した。β転写体は、それらの組織において高レベルで存在し、これはノザンブロット分析と矛盾しない。
例１及び２のための方法：
開花時期の成長条件及び測定：
開花時期を、20℃でSanyo Gallenkampの調節された環境下での室において植物を成長せしめることによって、確定された条件下で測定した。短日は、100ワットのタングステンハロゲンランプにより補足された、400ワットの金属ハロゲン力のスターランプによる10時間の照射の光周期から成る。これは、113.7μモルの光子ｍ−２ｓ−１の光合成活性放射線（PAR）のレベル及び2.41の割合の赤外線：遠赤外線レベルを提供する。類似するキャビネット及びランプを、長日のために使用した。光周期は、短日のために使用される同じ条件下で10時間であり、そしてタングステンハロゲンランプのみを用いる場合、さらに８時間、延長された。このキャビネットにおいては、10時間、使用されるランプの組合せが、92.9μモルの光子ｍ２ｓ−１のPAR及び1.49の割合の赤外線：遠赤外線を提供する。８時間の延長は、14.27μモルの光子ｍ−２ｓ−１のPAR及び0.66の割合の赤外線：遠赤外線を生成した。
植物の大集団の開花時期を、温室及びキャビネット条件下で測定した。開花時間は、ロゼットにおける及び花部上での、子葉を除く葉の数を計数することによって測定された。葉の数は、95％信頼限界での標準誤差により示される。種まきから葉の芽の出現までの日数もまた、記録されたが、しかし示されてはいない。葉の数と開花時期との密接した相互関係は、ランドスバーグ  エレクタ及びfca対立遺伝子について、前で示されている（Koorneefなど、1991）。
コスミド及びRFLPマーカー：
λクローンｍ210, ｍ326, ｍ580, ｍ226のDNAを、Elliot Meyerowitz（Caltech, Pasadena）から入手した。全DNAを、YACライブラリーコロニーフィルター及び植物ゲノムDNAブロットに放射性ラベルされたプローブとして使用した。コスミドｇ10086, ｇ4546, ｇ4108, ｇ19247を、Brian Hauge and Howard Goodman（MGH, Boston）から入手し、30mg／ｌのカナマイシンの存在下で培養し、そして−70℃で、グリセロール原液として維持した。全コスミドDNAを、YACライブラリーコロニーフィルター及び植物ゲノムDNAブロットに放射性ラベルされたプローブとして使用した。コスミドクローンcAtA２及びcATB１を、Chris Cobbett（メルボルン大学）から入手し、そして10mg／ｌのテトラサイクリンの存在下で培養した。コスミドpCITd23を、Elliot Meyerowitz（Caltech, Pasadena）から入手し、100μｇ／mlのストレプトマインシ／スペクチノマイシンの存在下で培養し、そして−70℃でグリセロール原液として維持した。pCIT30ベクター配列は、pYAC４由来のベクターと相同性を共有し、そして従って、YACライブラリーコロニーフィルターは、そのコスミドから抽出された挿入体DNAによりハイブリダイズされた。pCITd23の全DNAを、植物ゲノムDNAブロットへの放射性ラベルされたプローブとして使用した。
YACライブラリー：
EG及びABIライブラリーを、Chris Somervill（Michigan State University）から入手した。EWライブラリーを、Jeff Dangl（Max Delbruck Laboratory, Cologne）から入手し、そしてyUPライブラリーを、Joe Ecker（University of Pennsylvania）から入手した。ライブラリーのマスターコピーを、−70℃で貯蔵した（Schmidtなど、Aust. J. Plant Physiol. 19：341-351（1992）により記載されているようにして）。作業用原液を、４℃で選択性キューイブリュー（Kiwibrew）寒天上に維持した。キューイブリューは、選択性完全最少培地（ウラシルを含まない）であり、そして11％のカサミノ酸を含む。ライブラリーの作業用原液は、３カ月ごとに、96−フォークのリプリケーターを用いて再プレート化された。
酵母コロニーフィルター：
８〜24のライブラリープレートからの一連の酵母コロニーDNAを含むHybond−Ｎ（Amersham）フィルター（８cm×11cm）を製造し、そして加工し（Coulsunなど、Nature335：184-186（1988）により記載されるようにして）、そして変性した（Schmidt and Dean Gename Analysis, vol. 4：71-98（1992）により記載されるようにして）。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、製造業者の説明書通りであった。放射性ラベルされたプローブDNAを、ランダム−ヘキサマーラベリングにより調製した。パルスされたフィールドゲル
電気泳動（PFGE）による酵母染色体の調製及び分別：
５mlのキューイブリューを、単一の酵母コロニーにより接種し、そして30℃で24時間、培養した。酵母スフェロプラストを、室温で１時間、2.5mg／mlのNovozym（Novo Biolabs）と共にインキュベートすることにより生成した。次に、１Ｍのソルビトールを添加し、スフェロプラストの最終体積を50μｌにした。１Ｍのソルビトール中、80μｌの溶融されたLMPアガロース（１％In Certアガロース、FMC）を前記スフェロプラストに添加し、その混合物をすばやく振盪し、そしてプラグ型中にピペットで入れた。プラグを1.5mlのEppendorf管中に配置し、そして次に、100mMのEDTA（pH８）中、１mg／mlのプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）１ml及び１％Sarkosylにおいて50℃で４時間インキュベートした。その溶液を取り替え、そしてプラグを一晩インキュベートした。プラグをTEによりそれぞれ30分間づつ、３度、及び0.5×TVBEにより30分間づつ、２度、洗浄した。PFGEを、Pulsaphorシステム（LKB）を用いて実施した。プラグの１／３を、１％アガロースゲル上に負荷し、そして0.5×TBEにおいて、170Ｖ、20秒のパルス時間で、４℃で36時間、電気泳動した。DNAマーカーは、Bancroft and Wolk, Nucleic A. Res. 16：.7405-7418（1988）により記載されるようにして調製されたλ DNAのコンカテマーであった。DNAを臭化エチジウムによる染色により可視化した。
制限酵素消化及び逆ポリメラーゼ連鎖反応（IPCR）のための酵母ゲノムDNA：
酵母ゲノムDNAを、Heardなど、（1989）により記載されるようにして、実質的に調製し、但し、酵母スフェロプラストは上記のようにして調製した。最終的に、DNAを、フェノール／クロロホルムにより２度、クロロホルムにより１度抽出し、そしてエタノール沈殿せしめた。５mlの培養物からの収量は、約10μｇのDNAであった。
プラスミドレスキューによるYAC左端プローブの単離：
EG, ABI及びEW YACからのYAC左端フラグメントのプラスミドレスキューを、Schmidtなど、（1992）により記載のようにして行なった。IPCRが、Schmidtなど、（1992）に記載されるプロトコール及びプライマーを用いて、左及び右端フラグメントを生成するために使用された。
ゲルブロット及びハイブリダイゼーション条件：
Hybond−Ｎへのゲルトランスファー、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、製造業者の説明書の通りであるが、但し、DNAはUV Stratalinker処理によりフィルターに固定され、そして／又は80℃で２時間、ベークされた。放射性ラベルされたDNAは、ランダムヘキサマーラベリングにより調製された。
RFLP分析：
２〜３μｇの植物ゲノムDNAを、交雑に使用される親植物から調製し、そして300μｌの体積に分けた。消化されたDNAをエタノール沈殿せしめ、そして0.7％アガロースゲル上で分離し、そしてHybond−Ｎフィルター上にブロットした。放射性ラベルされたコスミド、λ又はYAC末端プローブDNAを、前記フィルターにハイブリダイズせしめ、RFLPを同定した。
RNA抽出：
RNAを、Deanなど、（1989）により記載される方法を用いて抽出した。
ポリＡ RNAを、polyAtract▲Ｒ▼mRNA単離システム（Promega）を用いて単離した。
DNA抽出：
アラビドプシスDNAを、Deanなど、（1992）により記載されるCTAB抽出方法により抽出した。
RT−PCRによるcDNAの単離：
全RNAを、温室において長日下で成長する２〜３枚葉段階での完全な実生から単離した。第１鎖のcDNA合成のためには、体積10μｌ中、10μｇのRNAを65℃に３分間、加熱し、そして次に、すばやく、氷上で冷却した。１μｌのRNAsin,１μｌの標準dT17−アダプタープライマー（１μｇ／μｌ）；Frohmanなど、1988）、４μｇの５×逆転写酵素緩衝液（250mMのトリス−HCl, pH8.3, 375mMのKCl, 15mMのMgCl2）、２μｌのDTT（100mM）、１μｌのdNTP（20mM）、１μｌの逆転写酵素（200単位、Ｍ−MLV Gibo）を含む反応混合物10μｌを製造した。次に、この反応混合物をRNAに添加し、20μｌの最終体積にした。その混合物を42℃で２時間インキュベートし、そして次に、水200μｌにより希釈した。
その希釈された第１鎖合成反応物10μｌ中、2.5mMのdNTP４μｌ、10×PCR緩衝液（Boehringer plus Mg）10μｌ、100ng／μｌの個々のプライマーの溶液１μｌ、水73.7μｌ及び５単位／μｌのTaqポリメラーゼ（Boehringer又はCetus Amplitaq）0.3μｌを含むPCR混合物90μｌに添加した。その反応を、94℃で１分間、55℃での１分間、34サイクル、72℃で２分間、及び次に、最終的に72℃で10分間、行なった。
DNA配列決定：
Sanger方法を用いて、Bluescriptプラスミドベクターにおける挿入された対象のフラグメントを配列決定した。反応は、Sequenaseキット（United States Biochemical Corporation）を用いて行なわれた。
ランドスバーグ・エレクタのコスミドライブラリー及びPRL−２cDNAライブラリーのスクリーニング：
マイクロタイタープレートに配置された26000個のクローンを、LB−tet（10μｇ／ml）プレート上に16のマイクロタイタープレートからのオフセットを置き、そして次に、Hybond Ｎフィルター上にコロニーリフトを取ることによってスクリーンした。CD４−71−PRL２ライブラリー（Ohio State UniversityでのArabidopsis Biological Resource Centerにより供給される）の１×106プラークを、5000のプラークの20個のプレートをプレートし、そして次に、HybondＮフィルター上にプラークリフトを取ることによってスクリーンした。
アラビドプシスの形質転換：
FCA付近からのDNAを含むコスミドを、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1中に移動せしめ、そしてＴ−DNAを、Valvekensなど、1988による記載のようにしてアラビドプシス植物中に導入した。インビトロで生長せしめられた植物の根を単離し、そしてカルス−誘発培地（Valvekensなど、1988）上で２日間、生長せしめた。次に、根を短いセグメントに切断し、そして対象のプラスミドを担持するアグロバクテリウム  ツメファシエンスと共に同時−培養した。根の外植体をブロッティング紙上で乾燥せしめ、そしてカルス−誘発培地上に２〜３日間、置いた。アグロバクテリウムを洗浄除去し、根を乾燥せしめ、そしてアグロバクテリウムを殺害するためのバンコマイシン及び形質転換された植物細胞を選択するためのカナマイシンを含む苗条誘発培地（Valvekensなど、1988）上に配置した。約62週間後、根上の若いカルスが根を生成し始める。それらを除去し、そして発芽培地（Valvekensなど、1988）を含むペトリ皿又はマゼンタポットに配置する。それらの植物は、マゼンタポットにおいて種子を生成する。次に、それらを、トランス遺伝子を含む、形質転換された実生を同定するためのカナマイシンを含む発芽培地上に種まきする（Valvekensなど、1988）。
例３−FCAを担持するＴ−DNA挿入のホモ接合性植物がヘテロ接合体よりも早く開花する
fca突然変異表現型を補充した４種のコスミドクローンの個々の２つの形質転換体を、セルフィド（selfed）し、そして遅く及び早く開花する個体の種子を集め、そしてカナマイシン含有培地上にプレートした。すべての遅く開花する子孫はカナマイシン感受性であったが、しかし早く開花する個体からの子孫は、カナマイシン耐性に対してホモ接合性か又はヘテロ接合性のいづれかであった。これは、FCA遺伝子を含む領域を担持するＴ−DNA上のカナマイシンマーカーが早く開花する表現型を完全に同時分離したことを示す。従って、早期開花に対する相補性は、コスミドの挿入体内の配列によるものであった。LNを、Ｔ−DNA挿入体に対してホモ接合性又はヘテロ接合性のいづれかである早期開花の個体について計算した。
0003898223.tif 000002
fca突然変異表現型の相補性を示す形質転換体における開花時期（合計のLNにより測定される）の分析：
個々のコスミドについて、２つの独立した形質転換体を分析した。葉の数を、Ｆ２個体に対して計数し（この数は、括弧で示される）、次に、前記個体を自動選択給餌し、そして子孫をカナマイシン含有培地上に種まきし、その植物がＴ−DNA挿入体に対してホモ接合性（Ｋ／Ｋ）か又はヘテロ接合性（Ｋ／−）であるかどうかを確立した。
上記表１に示される結果は、ホモ接合体が、分析されたすべての８個の形質転換体において、ヘテロ接合体よりも有為に早く開花したことを示唆する。従って、FCA遺伝子投与量及び従って、最ともらしことには、遺伝子生成物の量の上昇が、より早い開花を引き起こす。
例４−アンチセンス実験
FCA cDNAクローンからの1184bpのBamHＩ（bp3547、図３）／HindIII（bp4731、図３）制限フラグメントを、pBluescript KSIIのBamHＩ／HindIII制限部位中にサブクローン化した。挿入体を酵素BamHＩ及びXhoＩにより開放し、そしてアグロバクテリウム二元ベクターpSLJ6562（J. Jones, Sainsburg Laboratory）中にサブクローン化した。得られるプラスミドは、ノパリンシンターゼ遺伝子からの３′配列により終結される、アンチセンスRNAを生成するためのFCA cDNAフラグメントを転写するCaMV 35Sプロモーターを含む。このプラスミドはまた、植物細胞中に供給するためのLB及びRBアグロバクテリウム配列、及び形質転換体のカナマイシン選択を可能にするためのnos５′−Kan−ocs３′融合体も担持する。前記構造体を、Valvekensなど（1988）の根外植体性質転換方法を用いて、アラビドプシス・タリアナ生態型ランドスバーグ・エレクタ中に導入した。
５つの形質転換体からのセルフェド（selfed）された種子を集め、カナマイシン含有培地上に種まきし、そして10個のカナマイシン耐性個体を土壌に移植した。形質転換体のうち３個の単一のＴ−DNA挿入のために分離し、他は複数のＴ−DNAを有した。ロゼット葉の数としてアッセイされる開花時期を測定した。５個の形質転換体のうち４個からの子孫は遅く開花し、12枚のロゼット葉を生成し、これに比較して、５番目の形質転換体は４枚のロゼット葉を生成した。それらの特定の条件下で生長せしめられた、形質転換されていないランドスバーグ・エレクタ及びfca−１植物は、それぞれ約４枚及び11枚のロゼット葉を伴って開花した。従って、アンチセンス構造体（単一の遺伝子座としての）は、fca−１突然変異の遅く開花する表現型を効果的に繁殖せしめた。
例５−FCA読み取り枠に対するプロモーター融合体の構成
完全なFCA遺伝子、並びに翻訳の推定上の開始点の上流の64bpの配列及びポリアデニル化の部位の下流の500bpの配列を担持するゲノムSalＩ−XhoＩフラグメントを、アグロバクテリウム二元ベクターpSLJ6562（上記に記載される）のXhoＩ部位中にクローン化した。これは、形質転換体の選択のためのnos−kan融合体及び35ＳプロモーターがFCAゲノム領域（21のエキソン、20のイントロン）を駆動している融合体を担持するベクターをもたらした。形質転換体を、この構造体を用いて製造した。
この構造体は、fca−４植物中に導入される場合、長日の光周期下で6.4枚の葉を伴って、植物の開花を引き起こす遅い開花表現型を補正した。これは、一緒に生長せしめられる場合、6.2枚の葉を伴って開花した野生型ランドスバーグ  エレクタに類似した。
例６−イントロン−転写体γA及びγBを欠いているFCA遺伝子の構成
γA構造体を、次の７種のフラグメントを一緒にクローニングすることによって創造した：
ｉ．コスミドCL43B23からのEcoRＩ（ベクターの複数クローニング部位における挿入体連結部に存在する部位）−SalＩフラグメント。このフラグメントは、FCAの５′側プロモーター及び未翻訳領域、及びORFの５′側領域を含む。
ii．cDNAクローン77Ｂからの425bpのSalＩ−HindIII制限フラグメント。
iii．イントロン３の５′側スプライス部位を包含するスプライスされた転写体の領域を、プライマーcDNAII−BamHＩ及びIanRT１と共にRT−PCRを用いて生成した。その生成物を、cDNAII−１及びRevEx４を用いて再増幅し、SalＩ及びBglIIにより消化し、そしてSalＩ及びBamHＩより消化されたpBluescript KSII中にクローン化した。次に、このプラスミドからの270bpのHindIIIフラグメントを、十分にスプライスされた転写体の再構成に使用した。
iv．スプライスされた転写体の領域を、RT−PCR及びプライマーBamＸ及びIanRT１を用いて増幅した。これを、HindIII及びBglIIにより消化し、そしてこの52bpのフラグメントを、十分にスプライスされた転写体の再構成に使用した。
ｖ．スプライスされた転写体の領域を、RT−PCR及びプライマーBamＸ及びRev404（図３上に示される位置）を用いて増幅した。256 bpのClaＩ−BamHＩフラグメントを開始し、そして十分にスプライスされた転写体の再構成への使用のためにゲル精製した。
vi．ClaＩ−SpeＩフラグメントを、FCA cDNAクローン（PRL−２ライブラリーから単離された1811bpのクローン）から切出した。
vii．３′側の未翻訳領域の最後の約140bp及び３′側のゲノム配列の約500bpを担持するSpeＩ−XhoＩフラグメントを、FCAゲノムクローンから単離した。
イントロンを欠いているFCA遺伝子を構成するために使用される前記７種のフラグメントを、２つの部分、すなわち５′側領域及び次に、３′側領域（これらは、次に組合される）においてアセンブルした。
Ａ．５′側領域：フラグメントivを、HindIII／ClaＩ挿入体としてpBluescript KSII中にクローン化した。次に、フラグメントiiを、EcoRＩ／HindIIIフラグメント（cDNAクローニングベクターにおける複数−クローニング部位からのEcoRＩ部位）としてこの中にクローン化した。次に、フラグメントiiiを、フラグメントiiとivとの間のHindIII部位中にクローン化し、ここで正しい配向は、非対称的に位置するRsaＩ部位を用いて決定される。次に、フラグメントｉを、EcoRＩ／SalＩ部位中にクローン化した。
Ｂ．３′側領域：フラグメントviiを、フラグメントvi（ベクターにおける複数のクローニング部位からのXhoＩ−部位）に存在するSpeＩ／XhoＩ部位中にクローン化した。次に、フラグメントＶを、BamHＩ部位中にクローン化し、ここで正しい配向は、非対称的に位置するClaＩ部位を用いて決定される。
次に、フラグメントｖ，vi及びviiを含む３′側領域を、ClaＩ／XhoＩフラグメントとして、５′側フラグメントを含むプラスミド中にクローン化した。
γB構造体を、十分に長いタンパク質をコードする他のスプライスされた形を含むLer RNAからのRT−PCRに由来するクローンからのEcoNＩフラグメントによりEcoNＩフラグメント（スプライスされた転写体の1503bp〜2521bp）を置換することによって生成した。
得られる構造体を、EcoRＩ及びXhoＩを用いてベクターから開放し、そしてアグロバクテリウム二元ベクターpSLJ1714（Jonesなど、1992）のEcoRＩ／XhoＩ部位中にクローン化した。この構造体を担持する形質転換体を生成した。
構造体γAは、ランドスバーグ  エレクタ中に導入される場合、長日の光周期下で5.6枚の葉を伴って、それの開花を引き起こした。これは、それと共に生長せしめられる場合、6.2枚の葉を伴って開花する野生型ランドスバーグ  エレクタよりもわずかに早かった。短日の光周期下で生長せしめられる場合、形質転換体からの子孫の１／４は早く開花した（平均8.7枚の葉を伴う）。これは、それらの条件下で23.5枚の葉を伴って開花する野生型ランドスバーグ  エレクタよりも有意に早い。
例７−Ｅ．コリにおける発現
例６に記載されるγB構造体を、SalＩ及びKpmＩにより消化し、そしてＥ．コリ発現ベクターpRSETC（Invitrogen Corp.）のXhoＩ−KpnＩ部位中にクローン化した。得られるベクターは、金属親和性樹脂（ProBondTMNi2+, Invitrogen Corp.）を用いて活性Ｅ．コリタンパク質から組換えタンパク質の精製除去を可能にする、ポリヒスチジン金属結合ドメインと読み取り枠を整合してクローン化されているFCA cDNAを有する。このFCAタンパク質はアフィニティーカラムに対して十分に結合せず、そしてその結果、SDS−ポリアクリルアミドゲルからの切り出しによりＥ．コリタンパク質から分離された。タンパク質をそのゲルスライスから抽出し、そしてウサギに注射するために使用した。追加免疫を行ない、そして次に、２回採血した。生成される抗体は、１／10,000以上の希釈度で、ナイロン膜上にドットブロットされたFCAタンパク質を検出する。
例８−FCAに対して高い相同性を有するRRMドメインを含む遺伝子を増幅するよう企画されたプライマー
etr−１、すなわちヒト脳mRNAに由来するEST（dbest H11995）；ドロソフィラの性致死（sex lethal）タンパク質；ヒト神経系タンパク質HuD, HuC, Hel−Ｎ１及びHel−Ｎ２；並びにアフリカガエルタンパク質elrA, elrB, elrC, elrD間の相同性に基づいて、一組の変性PCRプライマーが、非常に高い相同性の２つの領域を含むよう企画された。
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例９−優性の陰性突然変異を生成し、そしてFCA遺伝子の発現及びスプライシングパターンを分析するためのFCA誘導体の構成
FCAプロモーターの制御下で転写体αBの第２の読み取り枠を発現する構造体を、第１の読み取り枠（450bp〜1206bp）を欠失することによって構成した。これは、ベクターを消化し、そして再連結する２つの位置でのSphＩ部位を導入するためにオリゴ突然変異誘発を用いて行なわれた。
FCA発現を試験するために、FCAプロモーターGUS融合構造体を製造した。β−グルクロユダーゼ（GUS）遺伝子に融合されるFCAのFCAプロモーター及びエキソンは、イントロン３内のスプライシングをモニターするために構成された。Ｃ−末端で整合して融合されるGUSを有する完全なFCAスプライスされたcDNA（γB）が、細胞内のFCAタンパク質局在性をモニターするために製造された。
例10−アラビドプシスのゲノム内のFCA相同体の同定
ランドスバーグ・エレクタのコスミドライブラリーに等しい４種のゲノムを、完全なFCAゲノムクローンにより、低い緊縮条件（40℃で一晩、１％SDS、５×SSC、0.5％ミルク粉末）を用いてスクリーンした。フィルターを、SSC、0.5％SDSにより、45℃で20分間、２度洗浄した。暴露した後、それらを、SSC、0.5％SDSにより、50℃で20分間、２度、再び洗浄した。61個のコスミドクローン及び２個の負の対照コスミドを採取した。それらのうち５個は、追加のFCAクローンであり、56個の推定上のFCA相同体を残す。ミニプレプス（Minipreps）を、コスミドの10mlのｏ／ｎ培養物から調製し、EcoRＩにより消化し、個々のゲル上での正及び負の対照と共に0.8％ゲル上で試験し、そしてサザンブロットした。それらのブロットを、上記条件を用いて、77Ｂ及びFCA cDNA（元来、61Ａと呼ばれていた）（図７）に別々にハイブリダイズせしめ、そして45℃でのみ、洗浄した。
推定上の相同体のうち：
（ａ）−２つのコスミドは77Ｂに対してのみハイブリダイズし、
（ｂ）−11のコスミドは61Ａに対してのみハイブリダイズし、
（ｃ）−31のコスミドは両cDNAに対してハイブリダイズし、
（ｄ）−13のコスミドはスコアーをつけるのに困難であり、又は検出可能なハイブリダイゼーションを示さず；
（ａ）−２つのコスミドは関連しているようには見えず、
（ｂ）−49Ｃ22及び67Ｉ３が共通するEcoRＩフラグメントを共有し、
−18Ｇ16及び、７Ｌ２が共通するEcoRＩフラグメントを共有し、
（ｃ）−39Ｇ10, 46Ｈ15, 56Ｆ２及び59Ａ８が共通するEcoRＩフラグメントを共有し、
−39Ｇ10及び56Ｆ２が追加のフラグメントを共有し、
−４Ｈ４及び45Ｋ24が２つのフラグメントを共有し、
−少なくとも９つの他の対のコスミドが少なくとも１つのEcoRＩフラグメントを共通して有することができる。
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参考文献：
Bancroft et al.（1998）Nucl. Acids Res. 16：7405-7418
Benfey et al. EMBO J 9：1677-1684（1990a）.
Becker, et al.（1994）The Plant Journal 5, 299-307.
Bell et al.（1988）Cell 55, 1037-1046.
Benfey et al. EMBO J 9：1685-1696（1990b）.
Bower et al.（1992）The Plant Journal 2, 409-416.
Burd et al.（1994）Science 265, 615-621.
Cao et al.（1992）Plant Cell Reports 11, 586-591.
Chandler et al.（1994）J. Exp. Bot. 45, 1279-1288.
Chang et al.（1988）Proc Natl Acad Sci USA 85：7856-6860
Christou et al.（1991）Bio／Technol. 9, 957-962.
Chung et al.（1994）Plant Mol. Biol. 26, 657-665.
Coulson et al.（1988）Nature 335：184-186
Dale et al.（1994）Murphy D. J. VCH, Weinheim, Germany.
Datta et al.（1990）Bio／Technol. 8, 736-740.
Dean et al.（1985）EMBO. J. 4, 3055-3061.
Dean et al.（1992）Plant Journal 2, 69-82.
English et al.（1996）The Plant Cell. 8, 179-188.
Frohman et al.（1988）Proc Natl Acad Sci USA 85, 8998-9002.
Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2, 603-618.
Heard et al.（1989）Nucl Acids Res 17：5861
Jones et al.（1992）Transgenic Research 1, 285-297.
Koornneef et al.（1991）Mol Gen Genet 229, 57-66.
Koornneef et al.（1983）Heredity 74, 265-272.
Koornneef et al.（1994）The Plant J. 6, 911-919.
Koziel et al.（1993）Bio／Technol. 1, 194-200.
Lee et al.（1994）The Plant Cell 6, 75-83.
Lee et al.（1994）The Plant J. 6, 903-909.
Mandel et al.（1995）Nature 377, 522-524.
Medford, J.I.（1992）Plant Cell 4, 1029-1039.
Medford, et al.（1991）Plant Cell 3, 359-370.
Mitzukama et al.（1992）Cell 71, 119-131.
Moloney et al.（1989）Plant Cell Reports 8, 238-242.
Napo i. et al.（1990）The Plant Cell 2, 279-289.
Olszewski et al.（1988）Nucleic Acids Res. 16, 10765-10782.
Potrykus（1990）Bio／Technology 8, 535-542.
Putterill et al.（1993）Mol Gen. Genet. 239, 145-157.
Putterill et al.（1995）Cell 80, 847-857.
Radke et al.（1988）Theoretical and Applied Genetics 75, 685-694.
Rhodes et al.（1988）Science 240, 204-207.
Robinow et al.（1988）Scoence 242, 1570-1572.
Rothstein et al.（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8439-8443.
Sambrook et al.（1989）. Molecular Cloning：A Laboratory Manual.（Cold Spring Harbor, N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory）.
Schmidt et al.（1992）Physical mapping of the Arabidopsis thaliana genome. Genome Analysis Vol.4 Strategies for physical mapping Cold Spring Harbour Laboratory Press 71-98.
Schmidt et al.（1992）Aust J Plant Physiol 19：341-351
Shimamoto et al.（1989）Nature 338, 2734-2736.
Smith et al.（1988）Nature 334, 724-726.
Somerg et al.（1992）Bio／Technol. 10, 1589-1594.
Stiekema et al.（1989）Plant Molecular Biology-11, 255-269.
van der Krol et al.（1990）The Plant Cell 2, 291-299.
Vasil et al.（1992）Bio／Technol. 10, 667-674.
Valvekens et al.（1988）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5536-5540.
Weigel et al.（1992）Cell 69, 843-859.
Weigel et al.（1995）Nature 377, 495-500.
Wester et al.（1994）Plant J. 5, 261-272.
Worley et al.（1995）Genome Research 5：173-184.
Zhang et al.（1992）The Plant Cell 4, 1575-1588.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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