(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
cgcccgggct gagggagccg acggcacgcg gcggctcacg gcgtggcacg cggaacgtcc gggcttgcac ctcacgtcac gtgaggaggt ataatggacg gcgtcagaga agggaｇcggc catgで表される塩基配列を有する、TipA遺伝子プロモーターの-10領域配列であるCAGCGT配列のTATAAT配列への変異を導入した、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異TipA遺伝子プロモーターの有する塩基配列を含むDNA。
【請求項２】
cgcccgggct gagggagccg acggcacgcg gcggctcacg gcgtggcacg cggaacgtcc gggcttgcac ctcacgtcac gtgaggaggt ataatggacg gcgtctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taccatgで表される塩基配列を有するTipA-LG10遺伝子プロモーターの-10領域配列であるCAGCGT配列のTATAAT配列への変異を導入した、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異TipA-LG10遺伝子プロモーターの有する塩基配列を含むDNA。
【請求項３】
外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が請求項１または２に記載のDNAの有する塩基配列であって、プロモーター配列下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Rhodococcus属細菌用構成型発現ベクター。
【請求項４】
配列番号１０１に表される塩基配列を有するpNit-RT1、配列番号１０２に表される塩基配列を有するpNit-RT2、配列番号１０５に表される塩基配列を有するpNit-RC1、配列番号１０６に表される塩基配列を有するpNit-RC2、配列番号９９に表される塩基配列を有するpNit-QT1、配列番号１００に表される塩基配列を有するpNit-QT2、配列番号１０３に表される塩基配列を有するpNit-QC1、配列番号１０４に表される塩基配列を有するpNit-QC2、からなる群から選択される請求項３記載のRhodococcus属細菌用構成型発現ベクター。
【請求項５】
Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、請求項３または４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なDNA領域を含み、大腸菌中で複製可能な請求項３から５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項３から６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項３から６のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて４℃から３５℃の温度で組換えタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を発現し得る発現ベクターに関する。
【０００２】
また、本発明は、宿主細胞中で組換えタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび構成型発現ベクター、および該ベクターを用いて組換えタンパク質を発現させる方法に関する。さらに、本発明はRhodococcus属細胞内で異なるベクター上にコードされる複数の遺伝子を同時に共発現する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
現在、真核生物由来のタンパク質を組換え体として大量調製するためには大腸菌を宿主とした発現システムが広く用いられている。これは該システムが扱いが容易でかつ最も研究が進んでいるからである（Weickert et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 494-499 [1996]）。
【０００４】
一方、本発明者は以前にRhodococcus erythropolisも組換えタンパク質生産の宿主として用いることができることを示した（特願2002-235008）。R. erythropolisは4 ℃から35 ℃まで増殖可能な放線菌の一種で、この菌を宿主とした発現システムの最大の特徴は4 ℃など10 ℃以下での組換えタンパク質生産が可能な点である。他の大腸菌やバチルス属細菌、酵母菌、Sf9昆虫細胞（Cereghino and Cregg, Curr. Opin. Biotechnol. 10 422-427 [1999]、 Miller, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 97-101 [1993]）を用いたシステムでは、10 ℃以下での組換えタンパク質生産は極めて困難である。10 ℃以下で組換えタンパク質を生産させることで、それまでは生産困難だったタンパク質、例えば宿主細胞の増殖を阻害するものや30 ℃前後では不溶化するもの、低温に適応した生物由来のタンパク質、などを生産することが可能になった。
【０００５】
本発明者等は、pTipベクターと呼ばれる一群のRhodococcus属細菌用発現ベクターを構築し、組換えタンパク質生産に用いていた（特願2002-235008）。これらベクターは、抗生物質チオストレプトンでその発現が誘導されるTipA遺伝子のプロモーターを含み、その下流に外来遺伝子（発現させるべき遺伝子）をクローン化するためのマルチクローニング部位（MCS）を含む。従ってpTipベクターは、チオストレプトン誘導型発現ベクターであり、これら発現ベクターで形質転換されたRhodococcus属細菌においては、チオストレプトンが培養液中に添加されたときにのみ、外来タンパク質の生産が誘導される。
【０００６】
【非特許文献１】
Weickert et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 494-499 [1996]
【非特許文献２】
Cereghino and Cregg, Curr. Opin. Biotechnol. 10 422-427 [1999]
【非特許文献３】
Miller, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 97-101 [1993]
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように本発明者らは、pTipベクターと呼ばれる一群のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを構築し、組換えタンパク質生産に用いていたが、未だ２点開発すべき点が残されていた。
【０００８】
第１に、前記pTipベクターはすべて、Rhodococcus属細菌内で自律複製するために必要なDNA領域（複製起点等）が一つの内在性プラスミドに由来していたために、別々の外来遺伝子を含む複数の発現ベクターを同時に、安定に、Rhodococcus属細菌内に共存させることは困難であった。これは同一の自律複製起点を持つ異種プラスミドが細菌内で共存できない、プラスミド不和合性（plasmid incompatibility）と呼ばれる現象によるもので、多くの細菌でこの現象が報告されている（Novick, Microbiol. Rev. 51 381-395 [1987]）。異種プラスミドを単一の細菌の菌体内で共存させることが出来れば、複数の組換えタンパク質を同時に生産することが出来る。例えば、20Sプロテアソームと呼ばれるタンパク質複合体はαサブユニットとβサブユニットの２つのポリペプチドから構成されており、機能的な20Sプロテアソーム複合体を組換え体として生産する場合には、これら２つのポリペプチドを共発現させなければならない。２つのポリペプチドを単一細胞内で共発現させる際には、１つの発現ベクターに複数の外来遺伝子を導入することによって、達成することも出来るが、ベクターのサイズが大きくなったり、制限酵素部位の都合上クローニング過程が複雑になったり、不便であることが多い。現在までRhodococcus属細菌において、複数の発現ベクターを用いた組換えタンパク質の共発現系はWO02/055709に記載されたものが存在した。
【０００９】
第２に、Rhodococcus属細菌の研究のためには、誘導型発現ベクターのみならず、構成型発現ベクターも重要なツールであるが、構成型発現ベクターが未開発であったことである。なお、既知のRhodococcus属細菌における構成型発現ベクターとしては、変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターを用いたものや（特開平9-28382、特開平10-248578）、rrnプロモーターを用いたものが知られている（Matsui et al., Curr. Microbiol. 45 240-244 [2002]）。
【００１０】
Rhodococcus属細菌の中には、PCB（polychlorinated biphenyl）や農薬等、様々な難分解性化合物を分解する菌株が多数知られており（バイオレメディエーション）（Bell et al., J. Appl. Microbiol. 85 195-210 [1998]）、また、ある菌株はアクリルアミド等有用な化合物を菌体内に蓄積させる事も知られていて、すでに工業生産に利用されている（バイオプロセス、バイオリアクター）（Yamada et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60 1391-1400 [1996]）。従って、上述した２点の改良点が克服されれば、組換えタンパク質生産時のみならず、バイオレメディエーション、バイオプロセスの研究時においてもRhodococcus属細菌用発現ベクターの利用性が増すと考えられる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
まず、プラスミド不和合性の問題を解決するためには、本発明者らが先に構築したpTipベクターに用いていたRhodococcus属細菌内で自律複製するために必要なDNA領域とは配列が違う同等の配列を新たに分離し、利用する必要がある。前記pTipベクターでは全てR. erythropolis JCM2895株から分離した内在性プラスミドpRE2895（5.4キロベースペアー；以下kbと略）のうち、自律複製に必要最小限なRepAB遺伝子を含む領域（1.9 kb）を用いていた。従って、他のR. erythropolis株からDNA配列の異なる内在性プラスミドを分離し、新規発現ベクターを構築することとした。また、Rhodococcus属細菌の形質転換体選択マーカーとして、前記pTipベクターにおいてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発していたが、複数のプラスミドで形質転換するためには、別の抗生物質に対する耐性遺伝子を新規に開発する必要がある。本発明者は、R. erythropolis DSM 313株がクロラムフェニコールに対して耐性であることを見出し、耐性を付与している遺伝子を分離し、利用することとした。
【００１２】
さらに、構成型発現ベクター開発のため、TipA遺伝子プロモーターに変異を導入し、構成的に、即ち、チオストレプトン非依存的に、外来遺伝子を発現せしめる変異体を作製することとした。
【００１３】
このようにして、pRE2895が有する自律複製に必要な領域および誘導型のTipA遺伝子プロモーターを有する前記pTipベクターの他に、新たに異なる自律複製するために必要なDNA領域を有するベクターであって、TipA遺伝子プロモーターを有しており誘導発現が可能なベクター、前記pTipベクターとは異なる自律複製するために必要なDNA領域を有するベクターであって、TipA遺伝子プロモーターに変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能なベクター、および前記pTipベクターと同じ自律複製するために必要なDNA領域およびTipA遺伝子プロモーターに変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能なベクターを構築した。これらのベクターのうち自律複製するために必要なDNA領域が異なる２種類のベクターであって、それぞれ異なる外来タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで一つの宿主を共形質転換することが可能であり、該共形質転換した宿主で該異なる外来タンパク質を同時に共発現させることが可能である。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  TipA遺伝子プロモーターの-10領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異TipA遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるDNA、
[２]  -10領域配列の変異が、CAGCGT配列のTATAAT配列への変異である[１]のDNA、
[３]  配列番号１０７で表される塩基配列を有する、[２]のDNA、
[４]  外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が[１]から[３]のいずれかのDNAの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Rhodococcus属細菌用構成型発現ベクター、
[５]  配列番号１０１に表される塩基配列を有するpNit-RT1、配列番号１０２に表される塩基配列を有するpNit-RT2、配列番号１０５に表される塩基配列を有するpNit-RC1、配列番号１０６に表される塩基配列を有するpNit-RC2、配列番号９９に表される塩基配列を有するpNit-QT1、配列番号１００に表される塩基配列を有するpNit-QT2、配列番号１０３に表される塩基配列を有するpNit-QC1、配列番号１０４に表される塩基配列を有するpNit-QC2、からなる群から選択される[４]のRhodococcus属細菌用構成型発現ベクター、
[６]  Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、[４]または[５]の発現ベクター、
[７]  さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なDNA領域を含み、大腸菌中で複製可能な[４]から[６]のいずれかの発現ベクター、
[８]  [４]から[７]のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体、および
[９]  [４]から[７]のいずれかの発現ベクターを用いて４℃から３５℃の温度で組換えタンパク質を生産する方法。
さらに、本発明は以下の通りである。
[１０]  Rhodococcus属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミド、
[１１]  Rhodococcus属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なRep遺伝子、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を有する[１０]の環状プラスミド、
[１２]  ローリングサークル型の複製様式に必須なDNAの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第3845位から第5849位の塩基配列である、[１１]の環状プラスミド、
[１３]  配列番号９０に表される塩基配列を有するDNAまたは配列番号９０に表される塩基配列を有するDNAに相補的な配列を有するDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを有する[１０]から[１２]のいずれかのプラスミド、
[１４]  [１０]から[１２]のいずれかの環状プラスミドを含む形質転換体、
[１５]  ローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を４℃から３５℃の温度条件下で発現しうる発現ベクター、
[１６]  Rhodococcus属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なRep遺伝子、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を有する[１５]の発現ベクター、
[１７]  ローリングサークル型の複製様式に必須なDNAの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第3845位から第5849位の塩基配列である、[１６]の発現ベクター、
[１８]  外来遺伝子を発現誘導するための誘導型プロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む[１５]から[１７]のいずれかの発現ベクター、
[１９]  発現誘導のための誘導型プロモーターがTipA遺伝子プロモーターで、誘導物質がチオストレプトンである、[１８]の発現ベクター、
[２０]  プロモーターの塩基配列が[１]から[３]のいずれかのDNAの有する塩基配列からなる[４]の発現ベクター、
[２１]  配列番号９３に表される塩基配列を有するpTip-RT1、配列番号９４に表される塩基配列を有するpTip-RT2、配列番号９７に表される塩基配列を有するpTip-RC1、配列番号９８に表される塩基配列を有するpTip-RC2からなる群から選択される[１５]から[１９]のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター、
[２２]  Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクターであって、プラスミドpRE2895由来のRhodococcus属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なDNA配列および[１]から[３]のいずれかのプロモーター配列DNAを含む、Rhodococcus属細菌中で４℃から３５℃の温度条件下で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクター、
[２３]  プラスミドpRE2895由来のRhodococcus属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なDNA配列がRepAおよびRepB遺伝子を含む1.9kbの領域のDNA配列である[２２]の発現ベクター、
[２４]  構成型プロモーター配列の下流に、さらにリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む[２２]または[２３]の発現ベクター、
[２５]  配列番号９９に表される塩基配列を有するpNit-QT1、配列番号１００に表される塩基配列を有するpNit-QT2、配列番号１０３に表される塩基配列を有するpNit-QC1、配列番号１０４に表される塩基配列を有するpNit-QC2、からなる群から選択される[２２]から[２４]のいずれかのRhodococcus属細菌用構成型発現ベクター、
[２６]  互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のRhodococcus属細菌由来のプラスミドを含むRhodococcus属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なDNA配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつDNA配列と、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列を有する、Rhodococcus属細菌、
[２７]  互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のRhodococcus属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むRhodococcus属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なDNA配列として、それぞれRhodococcus属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつDNA配列と、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列を有し、外来タンパク質をコードする遺伝子を4 ℃から35 ℃の温度条件下で共発現し得るRhodococcus属細菌、
[２８]  ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、[２７]のRhodococcus属細菌、
[２９]  少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、[４]、[５]、[１５]〜[１９]、[２０]および[２１]のいずれかのベクターであり、もう一方が、[２２]から[２５]のいずれかのベクターもしくは[２２]から[２５]のベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるTipA遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターである、[２７]または[２８]のRhodococcus属細菌、
[３０]  少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、[４]、[５]、[１５]〜[１９]、[２０]および[２１]のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するpTip-NH1、配列番号５０に表される塩基配列を有するpTip-NH2、配列番号５１に表される塩基配列を有するpTip-CH1、配列番号５２に表される塩基配列を有するpTip-CH2、配列番号５３に表される塩基配列を有するpTip-LNH1、配列番号５４に表される塩基配列を有するpTip-LNH2、配列番号５５に表される塩基配列を有するpTip-LCH1、配列番号５６に表される塩基配列を有するpTip-LCH2、配列番号９１に表される塩基配列を有するpTip-QT1、配列番号９２に表される塩基配列を有するpTip-QT2、配列番号９５に表される塩基配列を有するpTip-QC1、配列番号９６に表される塩基配列を有するpTip-QC2、pTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1、pTip-LCH2.1、[２２]から[２５]のいずれかのベクターまたは[２２]から[２５]のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるTipA遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、[２７]から[２９]のいずれかのRhodococcus属細菌、
[３１]  ローリングサークル型の複製様式に必須なDNA配列が配列番号９０に表される塩基配列の第3845位から第5849位のDNAであり、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列がRepAおよびRepB遺伝子を含む1.9 kbの領域のDNAである[２６]から[３０]のいずれかのRhodococcus属細菌、
[３２]  互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のRhodococcus属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むRhodococcus属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なDNA配列として、それぞれRhodococcus属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつDNA配列と、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列を有する少なくとも２種類のベクターでRhodococcus属細菌を形質転換し、培養しそれぞれの発現ベクターが含む外来タンパク質をコードする遺伝子を４℃から35℃の温度条件下で共発現させて該外来タンパク質を産生させる方法、
[３３]  ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、[３２]の方法、
[３４]  少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、[４]、[５]、[１５]〜[１９]、[２０]および[２１]のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するpTip-NH1、配列番号５０に表される塩基配列を有するpTip-NH2、配列番号５１に表される塩基配列を有するpTip-CH1、配列番号５２に表される塩基配列を有するpTip-CH2、配列番号５３に表される塩基配列を有するpTip-LNH1、配列番号５４に表される塩基配列を有するpTip-LNH2、配列番号５５に表される塩基配列を有するpTip-LCH1、配列番号５６に表される塩基配列を有するpTip-LCH2、配列番号９１に表される塩基配列を有するpTip-QT1、配列番号９２に表される塩基配列を有するpTip-QT2、配列番号９５に表される塩基配列を有するpTip-QC1、配列番号９６に表される塩基配列を有するpTip-QC2、pTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1、pTip-LCH2.1、[２２]から[２５]のいずれかのベクターまたは[２２]から[２５]のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるTipA遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、[３２]から[３４]のいずれかの方法、
[３５]  ローリングサークル型の複製様式に必須なDNAの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第3845位から第5849位の塩基配列であり、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列がRepAおよびRepB遺伝子を含む1.9 kbの領域のDNAである[３２]から[３４]のいずれかの方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、Rhodococcus属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築された発現ベクターを包含する。ローリングサークル型の複製様式とは、二本鎖環状DNAの複製の一様式であり、特異的エンドヌクレアーゼの作用により特定のDNA鎖上の特定の位置にニックが入り、そのニックの3'-OH端からDNA合成が開始され、ニックの入っていない環状DNA鎖を鋳型として一回りする形で進む複製様式をいう。このような複製様式をとるためには、ローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域が必要であり、例えばRep遺伝子が挙げられる。さらに、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）が必要である。従って、本発明のローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築された発現ベクターは、ローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域、すなわちRep遺伝子、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を含むプラスミドおよび発現ベクターである。このようなプラスミドは、Rhodococcus属細菌から単離することができ例えば、Rhodococcus erythropolis DSM8424株から単離したpRE8424が挙げられ、その全長配列を配列番号９０に示す。配列番号９０中、第3845位から5849位までがローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域、すなわちRep遺伝子のDNA、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を表す。
【００１６】
本発明は、配列番号９０で表されるプラスミドを構成するDNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAから構成されるプラスミドであって、ローリングサークル型の複製様式で複製し得るプラスミドも包含する。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が500〜1000 mM、好ましくは700 mMであり、温度が50〜70 ℃、好ましくは65 ℃での条件をいう。このようなプラスミドはその全長塩基配列が配列番号９０で表される塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなるプラスミドである。
【００１７】
該プラスミドから得られたローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域であるRep遺伝子、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を含み、さらにプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む発現ベクターも本発明に包含される。さらに、外来遺伝子および転写終結配列を含んでいてもよく、プロモーター活性を有するDNA配列、外来遺伝子および転写終結配列は発現カセット（Expression cassette）を構成する。ここで、プロモーター配列は薬剤等の誘導因子によりその下流に導入した外来遺伝子を誘導的に発現し得るプロモーターも、誘導因子に依存することなく構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターも含まれる。前者の誘導的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、例えばTipA遺伝子プロモーターが挙げられ、チオストレプトンの存在下でその下流の外来遺伝子を誘導的に発現する。さらに、本発明のベクターは、TipAタンパク質をコードするTipA遺伝子、TipA遺伝子の発現を誘導するThcA遺伝子プロモーター等の適当なプロモーターを含んでいてもよい。TipA遺伝子およびTipA遺伝子発現用プロモーターは誘導カセット（Inducer cassette）を構成する。宿主細胞がRhodococcus属に属する細菌である場合、該細菌はチオストレプトンに対して感受性であるため、チオストレプトンに対しての耐性を付与するチオストレプトン耐性遺伝子等を組込む。さらに、TipA遺伝子プロモーターはTipA-LG10プロモーター等のその配列を改変させたものでもよい。TipA遺伝子プロモーターの配列は図１２に示される。
【００１８】
また、後者の構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、前記TipA遺伝子プロモーターを改変したプロモーターが挙げられる。このような改変TipA遺伝子プロモーターとしては、TipA遺伝子プロモーターの-10領域配列に変異を導入したプロモーターが挙げられ、具体的には、-10領域配列の変異が、CAGCGT配列のTATAAT配列への変異であるプロモーターが挙げられる。さらに、このようなプロモーターの一例として、図１９に示す配列に含まれるプロモーターが例示できる。
【００１９】
また、図１２に示すプロモーターの配列を有するDNAまたは図１９に示す配列に含まれるプロモーターの配列を有するDNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなり、それぞれのプロモーター活性と同等の活性を有するポリヌクレオチドもプロモーターとして用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が500〜1000 mM、好ましくは700 mMであり、温度が50〜70 ℃、好ましくは65 ℃での条件をいう。このようポリヌクレオチドはその全長塩基配列が上記プロモーターの塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなるプロモーターである。
【００２０】
本発明は、さらに前記ベクターにさらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なDNA領域ならびに大腸菌の形質転換体選択マーカーを含むベクターも含まれ、このようなベクターはRhodococcus属細菌と大腸菌とのシャトルベクターとして利用できる。この際、大腸菌では構成型発現ベクターとして利用することができる。大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なDNA領域としてはColE1、ColE2配列等、大腸菌の形質転換体選択マーカーとしてはアンピシリン耐性遺伝子などの公知のものを使用することができ、これらは公知の大腸菌用クローニングベクターから得ることができる。
【００２１】
TipA遺伝子プロモーター、ローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域、２本鎖複製起点領域DSO（double-stranded origin）および１本鎖複製起点領域SSO（single-stranded origin）を含み、さらに前記プロモーター配列の下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列および大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なDNA領域を含むRhodococcus用発現ベクターとして、配列番号９３に表される塩基配列を有するpTip-RT1、配列番号９４に表される塩基配列を有するpTip-RT2、配列番号９７に表される塩基配列を有するpTip-RC1、配列番号９８に表される塩基配列を有するpTip-RC2が例示できる。また、TipA遺伝子プロモーターの代わりにTipA遺伝子プロモーターの-10領域配列の変異がCAGCGT配列のTATAAT配列への変異であるプロモーターを有するベクターとしては、配列番号１０１に表される塩基配列を有するpNit-RT1、配列番号１０２に表される塩基配列を有するpNit-RT2、配列番号１０５に表される塩基配列を有するpNit-RC1、配列番号１０６に表される塩基配列を有するpNit-RC2が例示できる。これらの、配列番号で表される塩基配列からなる構成するDNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAから構成されるベクターであって、外来遺伝子を宿主微生物中で発現し得るベクターも本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が500〜1000 mM、好ましくは700 mMであり、温度が50〜70 ℃、好ましくは65 ℃での条件をいう。このようなベクターはその全長塩基配列が上記ベクターの配列番号で表される塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなるベクターである。配列番号で示される以下のベクターについても同様である。
【００２２】
本発明は、さらに上記のローリングサークル型の複製様式に必要なDNA領域（Rep遺伝子、DSOおよびSSO）ではなく、他の自律複製に必要なDNA領域を含む発現ベクターをも包含する。このように複製に必要なDNA領域が異なる発現ベクター同士は、一つの宿主に同時に導入し、安定に保持することができる。他の自律複製に必要なDNA領域として例えば、RepA遺伝子およびRepB遺伝子が挙げられる。RepA遺伝子およびRepB遺伝子を含むDNA領域は、Rhodococcus属細菌、例えばR. erythropolis JCM2895株から分離した内在性プラスミドpRE2895から単離することができる。RepA遺伝子およびRepB遺伝子を含む1.9 kbの領域は、配列番号４９の第6233位から第8166位であり、このうちRepA ORFは6765位から7652位、RepB ORFは7652から7936位である。また、RepA遺伝子およびRepB遺伝子を含むDNA領域は後述の参考例に記載のベクターpHN129の制限地図（図１）を参照すれば得ることができる。また、配列番号４９の第6233位から第8166位で表される塩基配列からなるDNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ベクターに自律複製能を付与するDNAも本発明のRepA遺伝子およびRepB遺伝子を含む1.9 kbの領域として用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が500〜1000 mM、好ましくは700 mMであり、温度が50〜70 ℃、好ましくは65 ℃での条件をいう。このようなDNAはその全長塩基配列が配列番号４９の第6233位から第8166位で表される塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAである。この自律複製に必要なDNA領域およびTipA遺伝子プロモーターの-10領域配列がCAGCGT配列のTATAAT配列へ変異したプロモーター、さらにその下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む発現ベクターを含む発現ベクターはマルチクローニング部位に組込まれた外来遺伝子を誘導因子に依存することなく構成的に発現することができる。このような発現ベクターとして、配列番号９９に表される塩基配列を有するpNit-QT1、配列番号１００に表される塩基配列を有するpNit-QT2、配列番号１０３に表される塩基配列を有するpNit-QC1、配列番号１０４に表される塩基配列を有するpNit-QC2、からなる群から選択されるRhodococcus属細菌用構成型発現ベクターが挙げられ、さらにチオストレプトンの存在下で、導入された外来遺伝子を誘導的に発現し得る配列番号４９に表される塩基配列を有するpTip-NH1、配列番号５０に表される塩基配列を有するpTip-NH2、配列番号５１に表される塩基配列を有するpTip-CH1、配列番号５２に表される塩基配列を有するpTip-CH2、配列番号５３に表される塩基配列を有するpTip-LNH1、配列番号５４に表される塩基配列を有するpTip-LNH2、配列番号５５に表される塩基配列を有するpTip-LCH1、配列番号５６に表される塩基配列を有するpTip-LCH2、pTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1およびpTip-LCH2.1の誘導性プロモーターを前記のTipA遺伝子プロモーターの-10領域配列の変異がCAGCGT配列のTATAAT配列への変異であるプロモーターに置換したベクターが挙げられる。なお、誘導型発現ベクターはTipA遺伝子もしくはその変異体およびTipA遺伝子発現用プロ���ーターを含む誘導カセットならびにチオストレプトン耐性遺伝子も含んでいる必要がある。
【００２３】
本発明の上記発現ベクターに外来遺伝子を組み込み、宿主微生物に導入し該宿主微生物を培養することにより、該外来遺伝子を発現させることができる。発現ベクターへの外来遺伝子の組込みは公知の遺伝子工学的手法により行うことができ、宿主微生物への発現ベクターの導入も公知の手法で行うことができる。さらに、宿主微生物の培養も、それぞれの微生物に適合した培地を用いて適当な条件下で培養を行えばよい。ベクターを組込む宿主生物としては、Rhodococcus属細菌および大腸菌が挙げられる。ここで、外来遺伝子とは、本発明のベクターを用いて発現させようとする標的タンパク質をコードする遺伝子であり、宿主細胞以外の生物由来のタンパク質をコードする遺伝子をいう。本発明のベクターを用いて発現産生させるタンパク質は限定されず、いかなるタンパク質も対象となり得る。本発明の発現ベクターを導入する宿主生物が低温で増殖可能な微生物、例えばR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacus等のRhodococcus属細菌である場合、通常の微生物の増殖に適した温度条件、即ち約15 ℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の至適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその微生物の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主微生物の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が20 ℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
【００２４】
発現ベクターが含んでいるプロモーターが誘導型のプロモーターの場合、誘導物質の宿主微生物の培養系に添加することにより、外来遺伝子の発現産生を誘導することができる。本発明の発現ベクターが含む誘導型プロモーターとして、TipA遺伝子プロモーターが挙げられ、該遺伝子プロモーターを含んでいる場合、チオストレプトンの添加により発現産生が誘導される。この際チオストレプトンは、終濃度0.1 μg/ml以上、好ましくは１ μg/ml以上となるように添加すればよい。ただし、10 μg/mlを越えると生育が悪くなる。また、本発明の発現ベクターが構成型のプロモーターを含んでいる場合は、誘導物質を添加することなく外来遺伝子が発現産生される。
【００２５】
本発明の発現ベクターのうち、自律複製に必要なDNAが互いに異なる発現ベクターは同一の微生物細胞に同時に共形質転換することにより、該細胞内で安定に維持され、それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子を同時に発現産生させることができる。この場合、それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子は同じタンパク質をコードするものでも、異なるタンパク質をコードするものでもよい。例えば、２つのサブユニットからなるタンパク質のそれぞれのサブユニットを自律複製に必要なDNAが互いに異なる別々の発現ベクターに組込んで、同一の微生物細胞に導入することにより、一つの細胞内で各サブユニットが同時に発現され、サブユニット同士が会合して完全なタンパク質が産生される。この際、発現ベクターは構成的に外来遺伝子を発現し得るもの、誘導的に発現し得るものの何れの組合わせを用いてもよいが、自律複製に必要なDNAが異なる複数の発現ベクターのすべてを誘導的に外来遺伝子を発現し得るものにし、発現誘導物質で発現誘導することにより、２種類以上の外来タンパク質を同時に発現産生させることができる。
【００２６】
さらに、本発明の発現ベクター中の大腸菌用複製起点について異なるものを選択することにより、大腸菌においても２種類のタンパク質を同時発現させることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔参考例１〕
（１）  Rhodococcus erythropolis由来の、Rhodococcus属細菌内で自律複製可能なプラスミドの分離とその一部DNA配列の決定
Rhodococcus erythropolisと大腸菌の複合ベクターを作成するために、まずRhodococcus属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。すると、Rhodococcus erythropolis JCM2895 株にその存在が確認された。このプラスミドにpRE2895と名前を付けた。以下にプラスミドの分離と、そのDNA配列決定について具体的に述べる。
【００２８】
Rhodococcus erythropolis JCM2895株を5 mlのLB培地（1% Difco Bacto Tryptone、0.5% Difco Yeast Extract、1.0% 塩化ナトリウム）にて、30 ℃で30時間培養した菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてpRE2895を精製した。この際、Buffer P1 250 μlに懸濁後、Buffer P2 250 μlを加える前に、5 μlのリゾチーム（100 mg/ml）を加え37 ℃で30分インキュベートした点を除いては、使用説明書通りに作業した。
【００２９】
上記DNAサンプルを制限酵素EcoRIで処理し、1.0%アガロースゲル電気泳動（100 V、30分）に供したところ、約5.4 kbのDNA断片１本の存在が確認された。
【００３０】
この約5.4 kbのDNA断片をゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、使用説明書通りに精製した。得られたEcoRI断片を常法（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に従って、プラスミドpBluescript II SK (+)（STRATAGENE社製）のEcoRI部位にサブクローンし、このプラスミドにpHN79と名前を付けた。
【００３１】
pHN79をReverse、M13-20両プライマー（共にSTRATAGENE社製）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer（ABI社製）を用いて、使用説明書に準じて、pHN79の塩基配列を約400塩基ずつそれぞれ決定した。相同性検索の結果、pHN79にサブクローンされたRhodococcus erythropolis JCM2895株由来のDNA領域はその99.8%の配列がGenBankに受入番号AF312210として登録されている5403塩基対の環状DNA、pN30と一致した。
【００３２】
分離したpRE2895は全塩基配列を決定しなかったが、pN30との相同性は極めて高く、また制限酵素切断地図もpN30の配列から予想されるものと一致したことから、これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。また、pN30はMycobacterium fortuitum 002株から分離された内在性プラスミドpAL5000 （Rauzer et al., Gene 71 315-321 [1988]、 Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996]）、Rhodococcus erythropolis NI86/21株から分離されたpFAJ2600（De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 [1997]）と相同性が高く、類似の機構で自律複製していると考えられた。pAL5000は推定RepA遺伝子、推定RepB遺伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するために十分であるため、本発明者らが分離したpRE2895も同様の領域のみを発現ベクター中に組み込めば、Rhodococcus属細菌内で自律複製するために十分と考えられた。
【００３３】
（２）  ベクタープラスミドpHN136の構築
前記（１）で分離したpRE2895の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミドの一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った（図１）。
【００３４】
プラスミドpBluescript II SK (-) （STRATAGENE社製）をテンプレートとして、配列表中の配列番号１、２に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、PCRと略記： Saiki et al., Science, 239 487-491 [1988]）によるDNAの増幅を行った。なお、用いたPCR用の酵素はPfu turbo （STRATAGENE社製）である。その結果、アンピシリン耐性遺伝子（図中においてはAmprと表記）と大腸菌内で自律複製させるために必要なColE1配列領域を含む2.0kbの増幅されたDNAを得た。このDNA断片を制限酵素SacIとBsrGIで二重消化し、1.0%アガロースゲル電気泳動（100 V、30分）に供し、該DNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて、使用説明書に準じて精製した。
【００３５】
一方、pN30（前記（１））の配列をもとにRhodococcus属細菌内で自律複製するために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。なお、同プライマーの配列は配列表中の配列番号３、４で示される。プラスミドpHN79をテンプレートとして、両プライマーを用いてPCRによる増幅を行ったところ1.9 kbの増幅されたDNAを得た。このDNA断片を制限酵素BsrGIとSacIで二重消化し、1.0%アガロースゲル電気泳動（100 V、30分）に供し、該DNA断片を切り出し、上述の方法と同様に精製した。
【００３６】
上記２つの精製されたDNA断片をDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて、使用説明書通りにライゲーションし、得られたプラスミドにpHN129と名前を付けた。
【００３７】
次にpHN129に存在する制限酵素認識部位BamHI、SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、pHN129をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。このPCR断片をBglIIとPstIで二重消化して得られた0.5 kbのDNA断片をpHN129のBamHI、PstI部位にサブクローンした。結果、BglIIとBamHIで連結された部分においては推定RepA遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下ORFと略記）内であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BamHI認識部位が除去された。またSalI認識部位はBamHI認識部位のごく近傍に存在したが、配列番号５に記載のプライマー中において、SalI認識部位が除かれ、かつ、コードされるアミノ酸が置換されないよう設計されていることから、BamHI認識部位と同時にSalI認識部位も除去されている。このプラスミドにpHN135と名前を付けた。
【００３８】
次にpHN135に存在する制限酵素認識部位BglIIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN135をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。このPCR断片をPstIとBamHIで二重消化して得られた0.5 kbのDNA断片をpHN135のPstI、BglII部位にサブクローンした。結果、BamHIとBglIIで連結された部分においては推定RepB遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BglII認識部位が除去された。この結果得られたプラスミドにpHN136と名前をつけた。
【００３９】
（３）  ベクタープラスミドpHN143の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チオストレプトンを用いるが、Rhodococcus erythropolisは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければならない。そこでStreptomyces azureusが持つチオストレプトン耐性遺伝子、tsr遺伝子（Bibb et al., Mol. Gen. Genet. 199 26-36 [1985]：図中においては、Thiorと表記する）を複合ベクター中に組み込むこととした。なお、この遺伝子がRhodococcus erythropolis内で機能し、チオストレプトン耐性を付与することはすでに報告されている（Shao and Behki, Lett. Appl. Microbiol. 21 261-266 [1995]）。以下に、同遺伝子の分離について具体的に述べる（図２）。
【００４０】
まず、PCRのテンプレートに使用するStreptomyces azureus JCM421７株のゲノムDNAを以下のように調製した。5mlのSB培地（1% Difco Bacto Tryptone、0.5% Difco Yeast Extract、0.5% 塩化ナトリウム、0.1% Glucose、5 mM塩化マグネシウム、0.5% グリシン）にて30 ℃で培養した同菌株を500 μlのSETバッファー（75 mM 塩化ナトリウム、25 mM EDTA [pH8.0]、20 mM Tris-HCl[pH7.5]）に懸濁した。そこに、5 μlのリゾチーム溶液（100 mg/ml）を加え、37 ℃で30分インキュベートした。そして、14 μlのプロテアーゼK溶液（20 mg/ml）と60 μlの硫酸ドデシルナトリウム溶液（10%）を加え、よく混合した後55 ℃で2時間インキュベートした。その後、200 μlの塩化ナトリウム溶液（5 M）と500 μlのクロロホルムを加え、20分間室温で回転撹拌した。遠心分離し、700 μlの上清をとった。これをイソプロパノール沈殿後、乾燥させ、50 μlのTE溶液（10 mM Tris-HCl[pH8.0]、1 mM EDTA [pH8.0]）に溶解した。
【００４１】
上記のように精製したStreptomyces azureus JCM4217株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号７、８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、チオストレプトン耐性遺伝子を含む1.1 kbの増幅されたDNAを得た。なおこのDNA断片はプラチナ Pfx DNA ポリメラーゼ（Gibco BRL社製）を用いたため、その末端は平滑末端である。このDNA断片を精製し、常法（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に従い5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpGEM-3Zf(+)（Promega社製）のHincII部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からHindIII認識部位-tsr遺伝子ORF-EcoRI認識部位である）。このプラスミドにpHN137と名前を付けた。
【００４２】
次にpHN137に存在する制限酵素認識部位SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１０に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をHindIIIで消化して得られた0.6 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号１１、１２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をEcoRIで消化して得られた0.5 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のHindIII、EcoRI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはtsr遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、SalI認識部位が除去された。このプラスミドにpHN143と名前を付けた。
【００４３】
（４）  ベクタープラスミドpHN62の構築
チオストレプトンによって誘導型発現をさせるためにはRhodococcus属細菌内にTipAタンパク質を存在させなければならない。そのために、Rhodococcus erythropolisから構成的なプロモーターを分離し、その下流にTipAタンパク質をコードする構造遺伝子を連結した（図３）。構成的に機能するプロモーターとしてはRhodococcus erythropolisのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするThcA遺伝子（Nagy et  al., J. Bacteriol. 177 676-687 [1995]）のプロモーター配列を用いた。
【００４４】
テンプレートに使用するStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAはStreptomyces azureusからゲノムDNAを調製したときと同様に作業し、精製した。また、Rhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAは5 mlのLB培地で培養した点を除いてはStreptomyces azureusからゲノムDNAを調製したときと同様に作業し、精製した。
【００４５】
上述のように精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号１３、１４に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。その結果、TipA遺伝子のORF並びにその下流の転写終結配列を含むDNA（図中においてはTipAと表記）を得た。
【００４６】
このPCR断片の片方の末端をBglIIで消化して得られた0.9 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、上述のように精製したRhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号１５、１６に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、アルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするThcA遺伝子（Nagy et al., J. Bacteriol. 177 676-687 [1995]）のプロモーター配列（図中においてはALDHpと表記）を含むDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.2kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、BamHI部位にサブクローンした結果、ThcA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にTipA遺伝子のORF並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、pHN33と名前を付けた。
【００４７】
次にpHN33に存在する制限酵素NcoI認識部位２カ所（以下、NcoI(1)、NcoI(2)と表記する）を除去するため以下の作業をおこなった。
【００４８】
まず、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１７に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.5 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号１８、１２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をKpnIで消化して得られた0.6 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはTipA遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、NcoI(1)認識部位が除去された。このプラスミドにpHN50と名前を付けた。
【００４９】
次にpHN33に存在する制限酵素認識部位NcoI(2)を除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１９に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.8 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号２０、１２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をKpnIで消化して得られた0.3 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはTipA遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、NcoI(2)認識部位が除去された。このプラスミドにpHN51と名前を付けた。
【００５０】
最後に以下の作業を行った。pHN50をXbaIとSacIで二重消化して得られた0.7kbのDNA断片とpHN51をSacIとKpnIで二重消化した0.4kbの断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした。結果、NcoI(1)とNcoI(2)両方の制限酵素部位を欠いたTipA遺伝子を持つプラスミドを取得し、これにpHN62と名前をつけた。
【００５１】
（５）  ベクタープラスミドpHN153の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するために、TipA遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子としてThermoplasma acidophilum由来のプロリンイミノペプチダーゼ（Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 [1996]：以下PIPと略記する）をコードする遺伝子のORF（図中においてはPIP ORFと表記）を連結し、さらにその下流に転写のリードスルーを抑制するために転写終結配列を連結した。以下に具体的に述べる（図４）。
【００５２】
前記（４）にて精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、２２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子のプロモーター配列（図中においてはTipApと表記）を含む0.2 kbの増幅されたDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpBluescript II SK (+)のSmaI部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からKpnI認識部位-TipA遺伝子プロモーター配列-SacI認識部位である）。このプラスミドにpHN150uと名前を付けた。
【００５３】
次に、プラスミドpRSET-PIP （Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 [1996]：以下PIPと略記する）をテンプレートとして、配列表中の配列番号２３，２４に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なお、配列表中の配列番号２４のプライマーはPIP遺伝子の終止コドンを除いて、かつタンパク質の精製を容易にするために6×HisタグがPIPタンパク質のC末端に付くように設計されている。6×Hisタグは、６つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる（Crowe et al., Methods Mol. Biol. 31 371-387 [1994]）。このPIP遺伝子を含む0.9 kbのDNA断片を制限酵素NcoIとSpeIで二重消化し、pHN150uのNcoI、SpeI部位にサブクローンした結果、TipA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にPIP遺伝子のORFを含むプラスミドが作成され、pHN151uと名前を付けた。
【００５４】
次に、前記（４）にて精製したRhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号２５，２６に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、ThcA遺伝子の転写終結配列（Nagy et al., J. Bacteriol. 177 676-687 [1995]：図中においてはALDHtと表記）を含むDNAを得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素SpeIとXbaIで二重消化し、pHN151uのSpeI、XbaI部位にサブクローンした。その結果、TipA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にPIP遺伝子のORFを含み、またそのすぐ下流にThcA遺伝子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、pHN153と名前を付けた。
【００５５】
（６）  ベクタープラスミドpHN169の構築
Rhodococcus erythropolisをプラスミドで形質転換するためには適当な形質転換マーカーが必要になる。そこでRhodococcus属細菌内で機能する強力なプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、使用することとした。プロモーターとしては、Streptomyces属細菌由来の Elongation factor TuをコードするTuf1遺伝子プロモーターを用いることとしたが、これは同プロモーターが強力に下流の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである（Wezel et al., Biochim. Biophys. Acta 1219 543-547 [1994]）。また、薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテトラサイクリン耐性遺伝子を用いた。以下に具体的に述べる（図５）。
【００５６】
前記（４）にて精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号２７、２８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、Tuf1遺伝子のプロモーター配列（図中においてはTuf1pと表記）を含む0.2 kbの増幅されたDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpBluescript II SK (+) のHincII部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からKpnI認識部位-Tuf1遺伝子プロモーター配列-EcoRI認識部位である）。このプラスミドにpHN158と名前を付けた。
【００５７】
次に、プラスミドpACYC184（Rose, Nucleic Acids Res. 16 355 [1988]）をテンプレートとして、配列表中の配列番号２９、３０に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、テトラサイクリン耐性遺伝子（図中においてはTetrと表記）を含むDNAを得た。この1.3kbのDNA断片を制限酵素XhoIとSpeIで二重消化し、pHN158のSalI、SpeI部位にサブクローンした結果、Tuf1遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN159と名前を付けた。
【００５８】
次にpHN159に存在する制限酵素認識部位BamHIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表３１、３２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのDNA断片はPfu turbo DNA ポリメラーゼを用いたため、その末端は平滑末端である。このPCR断片の片方の末端をXhoIで消化して得られた0.5 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号３３、３４に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をNotIで消化して得られた1.1kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpBluescript II SK (+)のXhoI、NotI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BamHI部位が除去された。このプラスミドにpHN165と名前を付けた。
【００５９】
次にpHN159に存在する制限酵素認識部位SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号３１、３５に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXhoIで消化して得られた0.8 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号３６、３４に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNA ポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をNotIで消化して得られた0.8 kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのPCR断片を同時にプラスミドpBluescript II SK (+) のXhoI、NotI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、SalI認識部位が除去された。このプラスミドにpHN166と名前を付けた。
【００６０】
最後に以下の作業を行った。pHN166をSphIとSpeIで二重消化して得られた0.9 kbのDNA断片をpHN165のSphI、SpeI部位にサブクローンした。結果、BamHIとSalI両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを取得し、このプラスミドにpHN169と名前をつけた。
【００６１】
（７）  ベクタープラスミドpHN170、pHN171の構築
前記（２）から（６）までに分離してきた遺伝子群を連結し、Rhodococcus属細菌内で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った（図６）。
【００６２】
pHN143をSacIで消化して得られた1.1 kbのDNA断片をpHN136のSacI部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向から推定RepB遺伝子ORF-tsr遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである）。その結果できたプラスミドにpHN144と名前をつけた。
【００６３】
次に、pHN62をXbaIとKpnIで二重消化して得られた1.1 kbのDNA断片をpHN144のXbaI、KpnI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN152と名前をつけた。
【００６４】
次に、pHN153をBsrGIとXbaIで二重消化して得られた1.2 kbのDNA断片をpHN152のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN154と名前をつけた。
【００６５】
次に、pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6 kbのDNA断片をpHN154のXbaI部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-ThcA遺伝子プロモーター配列である）。その結果TipA遺伝子プロモーターの制御下に置かれたPIP遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにpHN170と名前をつけた。
【００６６】
また組み換えタンパク質の高発現化のため、TipA遺伝子プロモーター下流のリボソーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージgene10由来の配列（Gold and Stormo, Methods Enzymol. 185 89-93 [1990]）に変化させた（図６）。以下に具体的に述べる。
【００６７】
プラスミドpHN170をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１，３７に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドプロモーター（以下TipA-LG10プロモーターと表記する: 図中に置いてはTipA-LG10pと表記）を得た。この0.2 kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNcoIで二重消化し、pHN170のBsrGI、NcoI部位にサブクローンした。その結果TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたPIP遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにpHN171と名前をつけた。図１２にTipAプロモーター配列を、図１３にTipAプロモーターのTipA-LG10プロモーターへの改変のためのリボソーム結合部位(RBS)配列の改良を示す。
【００６８】
（８）  ベクタープラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1の構築前記（７）で述べたプラスミドからレポーターであるPIP遺伝子を除き、マルチクローニング部位を導入するため以下の作業を行った（図７）。
【００６９】
配列表中の配列番号３８、３９に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、70 ℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はNcoIとSpeIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成DNA（図中においてはMCS Linker NNcoと表記）をpHN170のNcoI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-NH1と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４０、４１に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成DNA（図中においてはMCS Linker CNcoと表記）をpHN170のNcoI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-CH1と名前をつけた。
【００７０】
前記（７）で述べたTipA遺伝子プロモーター配列とラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドDNAを制限酵素BsrGIとNcoIで二重消化し、pTip-NH1とpTip-CH1のBsrGI、NcoI部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LNH1、pTip-LCH1とそれぞれ名前を付けた。
【００７１】
（９）  ベクタープラスミドpTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2の構築前記（８）で述べたプラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1において、マルチクローニング部位の最も上流のNcoI部位をNdeIに変更するために以下の作業を行った（図８）。
【００７２】
プラスミドpHN170をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４２に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターを含むDNAを得た。この0.2 kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNdeIで二重消化し、pHN170のBsrGI、NdeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpHN183と名前を付けた。
【００７３】
配列表中の配列番号４３、４４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、70 ℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はNdeIとSpeIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成DNA（図中においてはMCS Linker NNdeと表記）をpHN183のNdeI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-NH2と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４５、４６に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成DNA（図中においてはMCS Linker CNdeと表記）をpHN183のNdeI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-CH2と名前をつけた。
【００７４】
プラスミドpTip-LNH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４７に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドDNAを得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNdeIで二重消化し、pTip-NH2とpTip-CH2のBsrGI、NdeI部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LNH2、pTip-LCH2とそれぞれ名前を付けた。
【００７５】
前記（８）、（９）で作成したプラスミドのマップと、マルチクローニング部位周辺の配列をまとめて図９に示す。該図中、実線の矢印はTipA遺伝子プロモーター中に存在するInverted repeat配列を示す。斜線の矢印はThcA遺伝子転写終結配列に存在するInverted repeat配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な-10領域、-35領域、RBSは四角で囲んである。またRBSの中でも最も重要なSD配列（Shine and Dalgarno, Eur. J. Biochem. 57 221-230 [1975]）は下線を引いてある。
【００７６】
（１０）  ベクタープラスミドpTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1、pTip-LCH2.1の構築
前記（８）及び（９）で述べたプラスミドpTip-CH1、pTip-CH2、pTip-LCH1、pTip-LCH2において、マルチクローニング部位のXhoI部位以降の読み枠を市販のpETベクター（Novagen社）の読み枠と一致させるために以下の作業を行った（図１０）。
【００７７】
プラスミドpTip-CH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3 kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-CH1.1と名前を付けた。
【００７８】
プラスミドpTip-CH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3 kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-CH2.1と名前を付けた。
【００７９】
プラスミドpTip-LCH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA-LG10プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この0.3kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LCH1.1と名前を付けた。
【００８０】
プラスミドpTip-LCH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA-LG10プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この0.3 kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LCH2.1と名前を付けた。
【００８１】
（１１）  ベクタープラスミドpHN172、pHN173の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロール実験用プラスミドを作成した（図１１）。
【００８２】
pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6 kbのDNA断片をpHN144のXbaI部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである）。その結果できたプラスミドにpHN172と名前をつけた。
【００８３】
次に、pHN153をBsrGIとXbaIで二重消化して得られた1.2 kbのDNA断片をpHN144のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN164と名前をつけた。次いで、pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6kbのDNA断片をpHN164のXbaI部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである）。その結果できたプラスミドにpHN173と名前をつけた。
【００８４】
pHN170は、TipA遺伝子プロモーター、その下流にPIP ORF、さらにその下流にThcA遺伝子転写終結配列、の３因子が連結された遺伝子カセット（以下Expression cassetteと表記）と、ThcA遺伝子プロモーター、その下流にTipA遺伝子、の２因子が連結された遺伝子カセット（以下Inducer cassetteと表記）両方をもつ。pHN173はExpression cassetteのみをもち、pHN172は両cassetteを持たない。
【００８５】
（１２）  Rhodococcus属細菌の形質転換
Rhodococcus erythropolis  JCM3201株をLB培地100 mlにて対数増殖期に至るまで30 ℃で振とう培養する。培養液を30分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収する。これに100 mlの氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収する。これに100 mlの氷冷10%グリセリン溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収する。この氷冷10%グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を5 mlの氷冷10%グリセリン溶液に懸濁する。400 μlずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで-80 ℃にて保存した。-80 ℃から菌体を取り出し、氷上にて融解し、プラスミドpHN170、またはpHN172、またはpHN173を3 μl (それぞれ約300 ng)加えた。この菌体とDNAの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad社:0.2 cm ギャップキュベット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーIIを用いて、電場強度12.5 kV/cmで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス25 μF、外部抵抗400 Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とDNAの混合液を1 mlのLB培地に混合し、30 ℃にて4時間培養した後集菌し、20 μg/mlテトラサイクリン入りLB寒天培地（寒天は濃度1.8%）に塗布し、30 ℃にて3日培養し、それぞれの形質転換体を得た。
【００８６】
〔実施例１〕
実験方法
まず、以下の実施例２から実施例１２に書かれた実験に用いた手法を列挙する。
プラスミドは全て、常法（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に従って構築した。ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、PCRと略記； Saiki et al., Science 239 487-491 [1988]）には全てPfu turbo （STRATAGENE社製）を用いた。プラスミドから切り出したDNA断片は1.0％アガロースゲル電気泳動に供し、目的のDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いて、使用説明書に準じて精製した。Streptomyces coelicolor A3(2)株、R. erythropolis DSM313株のゲノムDNAの分離法、並びにRhodococcus属細菌からのプラスミドDNAの精製方法は参考例１に記載したものと同一である。大腸菌ER2508株（New England Biolabs社）のゲノムDNAはQIAGEN社製QIAGEN RNA/DNA Mini Kitを用い、使用説明書に準じて精製した。DNA断片の5'末端をリン酸化する必要のある場合は東洋紡社製T4 polynucleotide kinaseを用いた。塩基配列決定にはDNAシークエンサーABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer（ABI社製）を用いた。リガーゼ反応にはNew England Biolabs社製のT4 DNA ligaseを用いた。
【００８７】
用いた主なプラスミド、菌株を表１，２に示す。Rhodococcus属細菌、Streptomyces coelicolor A3(2)株、大腸菌の培養はLuria Broth（LB； 1％ Bacto trypton, 0.5％ Bacto yeast extract, 1％ 塩化ナトリウム）で行った。Rhodococcus属細菌のコンピテントセル作成法、並びに形質転換法は参考例１に記されているが、予めプラスミドを保持しているRhodococcus属細菌のコンピテントセルを作成する際には、適当な抗生物質を含んだLB培地で培養した菌体から行った。形質転換体を選択する際には、テトラサイクリン（液体培地では、8μg / ml、固体培地では20 μg / ml）、 クロラムフェニコール（34 μg / ml）、アンピシリン（50 μg / ml）を用いた。
【００８８】
誘導型ベクターを用いてProline iminopeptidase （以下PIP）または、蛍光緑色タンパク質（以下GFP）をRhodococcus属細菌にて発現させる際には、Rhodococcus属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含むLB培地で30 ℃にて培養し、600 nmの波長で測定したオプティカルデンシティー（O.D.600）が0.6になった時点で、終濃度１μg / mlになるようにチオストレプトン（溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え、さらに16時間培養を続けた。構成型ベクターを用いて発現させる際には、Rhodococcus属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含むLB培地で30 ℃にてO.D.600が2.0になるまで培養した。
【００８９】
PIPのペプチダーゼ活性を測定する方法を以下に詳述する。上記のようにPIPを発現させたRhodococcus属細菌の培養液を、8 μg / mlの適当な抗生物質を含むLB培地で200 μlにメスアップし、60 ℃にて1分加温する。そこにPIPの基質として2 μlのH-Pro-βNA（100 mM；溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え60 ℃にて20分インキュベートする（PIPは60 ℃が至適温度）。PIPによってH-Pro-βNAから加水分解されて遊離したβNAを観察するために、発色剤として134 μlのFast Garnet GBC Salt 溶液（和光純薬社製で濃度0.5 mg / ml ： 1 M 酢酸ナトリウムバッファー（pH 4.2）、10% Triton X-100が溶媒）を加える。PIPが発現していなければ上記混合液は黄色を呈するが、発現していれば赤色を呈する。また、呈色した赤色を吸光分光光度計を用い、550 nmでの吸光度（A550）を測定し、PIP活性を定量した。測定はFast Garnet GBC Saltを加えた後、滅菌水666 μlを加え希釈して行った。
【００９０】
その際、550 nmでは細胞のオプティカルデンシティーも測定してしまうので、550 nmでの細胞のオプティカルデンシティー（O.D.550）は別測定し、測定時に使用したO.D.550に相当する値をA550の値から差し引いて補正した値をAc550とする。すなわち、Ac550=A550-O.D.550×PIPの活性測定に使用した培養液量（ml）で計算される。ユニット値は「20分間の測定で得られる、培養液1 mlあたり、O.D.600=1あたりのAc550の値」とし、「Ac550÷PIPの活性測定に使った培養液量（ml）÷O.D.600」で計算した。
【００９１】
〔実施例２〕
R. erythropolisに存在する新規内在性プラスミドpRE8424の分離
本発明者はR. erythropolisに存在する新規内在性プラスミドを探索し、R. erythropolis JCM2893、R. erythropolis JCM2894、R. erythropolis DSM43200、R. erythropolis DSM8424の４株から小型の環状プラスミドを分離し、それぞれpRE2893、pRE2894、pRE43200、pRE8424と名前を付けた。
【００９２】
これらのうち、pRE2893、pRE2894、pRE43200のDNA配列を一部決定したところ、本発明者が以前にR. erythropolis JCM2895株から分離していたpRE2895（参考例１を参照）とほぼ同一の配列を有していた。pRE2895はプラスミドの複製に関与するRepA、RepBタンパク質をコードする遺伝子をRepABオペロンとして有しているが、これらのタンパク質はMycobacterium fortuitumから分離されたpAL5000プラスミドがコードするRepA、RepBタンパク質と高度に類似しており、pRE2895とpAL5000が類似の様式で自律複製していることが示唆された（Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996], 参考例１）。pRE2895とpAL5000の複製様式は明らかでないが、両プラスミドのRepAタンパク質がColE2プラスミドのRepタンパク質に相同性があるため、ColE2プラスミド同様「θ型」の自律複製様式を有することが考えられた（Hiraga et al., J. Bacteriol. 176 7233-7243 [1994]）。
【００９３】
一方、pRE8424はpRE2895と全く異なるDNA配列を有していた（配列表中の配列番号９０、図１）。このプラスミドは６つのオープンリーディングフレーム（ORF；ORF1からORF6）を持ち、うちORF6がコードするタンパク質（図１４）はローリングサークル様式で自律複製する一群のプラスミドが持つRep遺伝子がコードするタンパク質と相同性が高かった（Khan, Microiol. Mol. Biol. Rev. 61 442-455 [1997]）。中でも、 Arcanobacterium pyrogenes由来pAP1（Billington et al., J. Bacteriol. 180 3233-3236 [1998]）、Streptomyces lividans由来pIJ101（Kendall et al., J. Bacteriol. 170 4634-4651 [1988]）、Streptomyces phaeochromogenes由来pJV1（Servin-Gonzalez et al., Microbiology 141 2499-2510 [1995]）、Brevibacterium lactofermentum由来pBL1（Fernandez-Gonzalez et al., J. Bacteriol. 176 3154-3161 [1994]）、Streptomyces nigrifaciens由来pSN22（Kataoka et al., Plasmid 32 55-69 [1994]）と相同性が高かった（図１５）。これらのプラスミドは、いずれもローリングサークル型プラスミドの中でもpIJ101/pJV1ファミリーに属するもので（Khan, Microiol. Moi. Biol. Rev. 61 442-455 [1997]）、pRE8424もこのファミリーに属するローリングサークル型プラスミドである可能性が示唆された。以下、ORF6はRepと記載する。
【００９４】
一般に、ローリングサークル型プラスミドが宿主細胞内で自律複製するためには、前出のRepの他に、２本鎖複製起点（double-stranded origin；以下DSO）、１本鎖複製起点（single-stranded origin；以下SSO）となるDNA配列が必要である。本発明者は様々なpRE8424の変異体を作成し、R. erythropolisを形質転換し、様々な解析を行い、DSO、SSO配列の所在を同定した（図１４）。DSOは配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号5514から5970内に存在すると考えられたが、他のローリングサークル型プラスミドのDSO配列との比較から、配列表中の配列番号９０のヌクレオチド番号5705から5734の配列が最もDSOの機能に重要だと考えられた（図１６）。また、同定したSSO配列を図１７に示す。SSO配列は一般に、ステム - ループ構造など高度な二次構造を持ち、さらに、pIJ101/pJV1ファミリーのプラスミドの場合、ステム - ループ構造のループ部分にTAGCGTなどからなる共通配列が存在する場合が多い。pRE8424のSSOも高度な二次構造を持ち、ループ部分にTAGCGG配列を持つ（図１７）。
【００９５】
本発明者は、上記TAGCGGに変異を持つpRE8424の派生プラスミドがR. erythropolis細胞内に大量に一本鎖DNAとして蓄積していたことを見いだした。一本鎖DNAの蓄積はローリングサークル型プラスミドのホールマークであることから（Khan, Microiol. Moi. Biol. Rev. 61 442-455 [1997]）、pRE8424はローリングサークル様式で自律複製していることが明らかとなった。
【００９６】
pRE8424の派生プラスミドが宿主細胞であるR. erythropolis内で自律複製するためには、Rep、DSO、SSOを含む2.0 kbの領域、すなわち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号3845から5849までの領域、で十分であった（以下の実施例３参照）。
【００９７】
図１４はpRE8424のマップを示す。図１４中には主な制限酵素認識部位が示されていて、６つのORFが矢印で示されている。DSOとSSOの位置が四角で示されている。
【００９８】
図１５はpRE8424、pAP1、pBL1、pJV1、pIJ101、pSN22のRepタンパク質の５カ所の保存された領域（Motif IV、Motif I、Motif II、Motif III、C-terminal motif；Billington et al., J. Bacteriol. 180 3233-3236 [1998]参照）のアミノ酸配列を示す。数字は各領域間に存在するアミノ酸残基の数、即ちギャップのアミノ酸残基の数を示す。完全に保存されたアミノ酸残基は星（*）、高度に保存された領域は2つの点（:）、比較的保存された領域は1つの点（.）で示した。Repタンパク質の機能に重要とされるチロシン残基は四角で囲ってある。
【００９９】
図１６はpRE8424、pAP1、pBL1、pJV1、pIJ101、pSN22のDSOと考えられる配列のうち、特に保存されたDNA部分を示す。更にDSOの機能に特に重要なGGジヌクレオチドは下線を引いてある（Billington et al., J. Bacteriol. 180 3233-3236
[1998]参照）。
【０１００】
図１７はpRE8424のSSO、即ち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号5268から5538の配列と、その取りうる二次構造を示した。二次構造の予測はmfold program, version 3.0 （Michael Zuker, Washington University, St. Louis, Mo.; http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/form1.cgi）によって行った。上述のTAGCGG配列を黒丸で示した。
【０１０１】
〔実施例３〕
pHN372の構築
pRE8424の自律複製に必須な2.0 kbの領域には、不必要な制限酵素認識部位BamHIが存在していたので、これを除去する作業を以下のように行った。
【０１０２】
pRE8424をテンプレートとし、配列表中の配列番号５７（sHN389）、５８（sHN390）に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下プライマーと略記）を用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.0 kbの断片はRepの5'末端側の一部を含む。この断片の5'末端をリン酸化し、pBluescript II SK (+)（STRATAGENE社製）のHincII部位に導入し、できたプラスミドにpHN371と名前を付けた。pRE8424をテンプレートとし、配列表中の配列番号５９（sHN391）、６０（sHN321）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.0 kbの断片はRepの3'末端側の一部を含む。この断片をBamHIで消化した後、5'末端をリン酸化し、pHN371のEcoRV / BglII部位に導入した。できたプラスミドにpHN372と名前を付けた。pHN372は、pRE8424の自律複製に必須な2.0 kbの領域を持ち、かつ、pRE8424には存在したBamHI部位は除去されている。また、BamHI部位の除去は、pRE8424の自律複製の機能には影響しなかった。
【０１０３】
〔実施例４〕
pHN346の構築
Rhodococcus属細菌の形質転換体選択マーカーとして、参考例に示すベクターの構築においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発していたが、複数のプラスミドで形質転換するためには、別の抗生物質に対する耐性遺伝子を新規に開発する必要がある。本発明者は、R. erythropolis DSM 313株がクロラムフェニコールに対して耐性をであることを見いだし、耐性を付与している遺伝子を分離することとした。Rhodococcus属細菌からは、すでに２つのクロラムフェニコール耐性遺伝子が分離されており（cmrA遺伝子、ならびにcmr遺伝子）、これらの遺伝子は互いに高い相同性を有している（De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 [1997]、Desomer et al., Mol. Microbiol. 6 2377-2385 [1992]）。
【０１０４】
R. erythropolis DSM 313株のクロラムフェニコール耐性遺伝子もこれらに相同であることが予想されたので、R. erythropolis DSM 313株ゲノムDNAをテンプレートとし、配列表中の配列番号６１（sHN335）、６２（sHN336）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。なお、該プライマーはcmrA遺伝子とcmr遺伝子において最も相同性が高かった配列をもとにデザインした。その結果、0.7 kbの増幅されたバンドが確認された。このPCR産物のDNA配列を決定したところ、cmrA遺伝子に極めて高い相同性を有していた。決定された配列を元に、配列表中の配列番号６３（sHN349）、６４（sHN351）に記載のプライマーを設計し、インバースPCR（Ochman et al., Genetics 120 621-623[1988]）にてR. erythropolis DSM 313株のクロラムフェニコール耐性遺伝子の全長を分離した。テンプレートとして用いたDNAはR. erythropolis DSM313株のゲノムDNA 0.1 μgをSalIで切断し、リガーゼにより自己閉環化したものである。得られたPCR産物は2.3 kbで、この断片の全DNA配列を決定した。この断片中には１つのORFが存在し、この遺伝子にChlAと名前を付けた（図中ではChlrと表記）。
【０１０５】
R. erythropolis DSM 313株ゲノムDNAをテンプレートとし、配列表中の配列番号６５（sHN361）、６６（sHN362）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.5 kbの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子の5'末端部分を含む。この断片をSacIで消化し、その5'末端をリン酸化した。一方、R. erythropolis DSM 313株ゲノムDNAをテンプレートとし、配列表中の配列番号６７（sHN363）、６８（sHN364）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.3 kbの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子の3'末端部分を含む。この断片をSpeIで消化し、その5'末端をリン酸化した。これら２つのDNA断片を同時にpBluescript II SK (+)のSacI / SpeI部位に導入し、できたプラスミドにpHN346と名前を付けた。pHN346は全長のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むが、該ORF中にもともと存在していたEcoRI部位が除かれている（ただし、コードするタンパク質のアミノ酸配列は変化しない）。
【０１０６】
〔実施例５〕
Proline iminopeptidase（PIP）をレポーター遺伝子として有する誘導型発現ベクターの構築；pHN171、pHN379、pHN348、pHN380の構築
pHN346（実施例４）から1.8 kbのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む断片をXbaIとSpeIで切り出し、pHN154（特願2002-235008）のXbaI部位に導入した。この結果できたプラスミドにpHN347と名前を付けた。pHN171（参考例を参照）から1.1 kbの断片をBsrGIとSpeIで切り出し、pHN347のBsrGI / SpeI部位に導入した。出来たプラスミドにpHN348と名前を付けた。
【０１０７】
pHN171もpHN348もpTipベクター（参考例を参照）のMCSにレポーター遺伝子、PIPが導入された発現ベクターであるが、pHN171がテトラサイクリン耐性遺伝子を形質転換マーカーとして持つのに対して、pHN348がクロラムフェニコール耐性遺伝子を持っていることのみが異なる。また、いずれのプラスミドもTipA遺伝子プロモーターの下流に元来存在していたリボソーム結合部位配列（TipA-RBS）は翻訳効率の良い、バクテリオファージgene 10由来のリボソーム結合部位配列に変更されている（TipA-LG10プロモーター；参考例を参照）。PIPのCの末端側には、タンパク質の精製を容易にするために6×Hisタグが付くように設計されている。6×Hisタグは、６つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる（Crowe et al., Methods Mol. Biol. 31 371-387 [1994]）。
【０１０８】
上述のpHN171とpHN348のDNA配列のうち、pRE2895に由来するプラスミドの自律複製に必須な1.9 kbの領域を、pRE8424に由来するプラスミドの自律複製に必須な2.0 kbの領域に変更するために以下の作業を行った。
【０１０９】
pHN171をテンプレートとし、配列表中の配列番号６９（sHN368）、７０（sHN373）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.2 kbの断片はチオストレプトン耐性遺伝子（tsr遺伝子；図中ではThiorと表記）（Bibb et al., Mol.Gen.Genet. 199 26-36 [1985]）の5'末端部分を含む。この断片をBsrGIとClaIで消化し、pHN171とpHN348のBsrGI / ClaI部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにそれぞれpHN357とpHN358と名前を付けた。pHN372（実施例３）から2.0 kbのpRE8424に由来するプラスミドの自律複製に必須な領域を含む断片をBsrGIとHpaIで切り出し、pHN357とpHN358のBsrGI / HpaI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpHN379、pHN380とそれぞれ名前を付けた。
【０１１０】
〔実施例６〕
pTipベクターの構築
pHN171、pHN348、pHN379、pHN380（実施例５）のPIP遺伝子の代わりに、MCSを導入し、８種類のpTipベクターを構築した過程を示す。なお、今回作成した、pTipベクターのうち、４つ（pTip-RT1、pTip-RT2、pTip-RC1、pTip-RC2；後述）は、参考例１に記載のpTipベクターとは、Rhodococcus属細菌でプラスミドが自律複製するのに必要なDNA領域が異なり、参考例１に記載のpTipベクター全てとRhodococcus属細菌内での不和合性を起こさない（後述）。また、残りの４つ（pTip-QT1、pTip-QT2、pTip-QC1、pTip-QC2；後述）は、参考例１に記載のpTipベクターとはMCSの配列が一部異なっている。
【０１１１】
配列表中の配列番号７１、７２に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはMCS部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、70 ℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた（MCS type 1）。その結果、その末端はNcoIとSpeIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成DNAをpHN379、pHN380のNcoI / SpeI部位にそれぞれサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-RT1、pTip-RC1とそれぞれ名前をつけた。配列表中の配列番号７３、７４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを同様に２本鎖化させ（MCS type 2）、一方、pTip-LNH2（参考例１を参照）から0.2 kbのTipA遺伝子プロモーターとLG10-RBSを含む断片をBsrGIとNdeIで切り出した。これら２つのDNA断片を同時に、pHN379とpHN380のBsrGI / SpeI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpTip-RT2、pTip-RC2と名前を付けた。pTip-RT1から0.3 kbのTipA遺伝子プロモーター、LG10-RBS、MCS type 1を含む断片をBsrGIとSpeIで切り出し、pHN171とpHN348のBsrGI / SpeI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpTip-QT1、pTip-QC1と名前を付けた。pTip-RT2から0.3 kbのTipA遺伝子プロモーター、LG10-RBS、MCS type 2を含む断片をBsrGIとSpeIで切り出し、pHN171とpHN348のBsrGI / SpeI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpTip-QT2、pTip-QC2と名前を付けた。
【０１１２】
図１８-１にpTipベクター（pTip-QT1、pTip-QT2、pTipRT1、pTip-RT2、pTip-QC1、pTip-QC2、pTip-RC1、pTip-RC2）のマップを示す。該図中、Thiorはチオストレプトン耐性遺伝子を、Tuf1pはTuf1遺伝子プロモーターを、Tetrはテトラサイクリン耐性遺伝子を、Chlrはクロラムフェニコール耐性遺伝子を（各pTip-ベクターはTuf1p-TetrまたはChlrいずれか一つを持つ）、ALDHpはTipA遺伝子（TipA）を転写せしめるThcAプロモーターを、Amprはアンピシリン耐性遺伝子を、ColE1は大腸菌の複製起点を、ALDHt はThcA遺伝子転写終結配列を、MCSはマルチクローニング部位を（各pTip-ベクターはMCS type1またはMCS type 2のいずれか一つを持つ）、TipApはTipA遺伝子プロモーターを、TipA-LG10pはTipA-LG10プロモーターをを、RepA&BはpRE2895由来のプラスミドのR. erythropolis内での自律複製に必須な領域を、RepはpRE8424由来のプラスミドのR. erythropolis内での自律複製に必須な領域を（各pTip-ベクターはRepA&BまたはRepのいずれか一つを持つ）示す。なお、実施例９に書かれたpNitベクター（後述）の図が該図、右半分に記してあり、記号などは上記のものと同じである。
【０１１３】
図２０は、TipA-LG10プロモーター - MCS - ThcA遺伝子ターミネーターのDNA配列を示す。該図中、実線の矢印はTipA遺伝子プロモーター中に存在するInverted repeat配列を示す。斜線の矢印はThcA遺伝子転写終結配列に存在するInverted repeat配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な-10領域、-35領域は四角で囲んである。また、四角で囲まれたTATAAT配列はTipA遺伝子プロモーターからNitプロモーターを作成したときに導入した変異を示す（実施例７に詳述）。
【０１１４】
〔実施例７〕
pHN231の構築
まず本発明者は、TipA遺伝子プロモーターに変異を導入して、誘導型から構成型プロモーターに改変することとした。TipA遺伝子プロモーター配列中の「Inverted repeat」領域にチオストレプトン - TipAタンパク質複合体が結合し、自らの遺伝子の転写を促進することは以前から知られていた（Holmes et al., EMBO J. 12 3183-3191 [1993]）。そこで、本発明者は該DNA領域に、inverted repeat構造を破壊する変異を導入したら、TipA遺伝子プロモーターの転写活性に何らかの変化が現れるのではないかと考え、様々なTipA遺伝子プロモーター変異体を作成した。それらのうち、TipA遺伝子プロモーターの所謂-10領域（Fenton and Gralla. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 9020-9025 [2001]）に変異を導入したもの（図１９；CAGCGTからTATAATへの変異）では、チオストレプトン非存在下でも、レポーター遺伝子の発現が観察された（図２０；実施例１０に詳述）。なお、このTATAATからなるDNA配列は、大腸菌において非常に強力なプロモーターとして機能するDNA配列中の-10領域によく見られる配列である。以上のことからこの変異TipA遺伝子プロモーターは構成型プロモーターであると結論された。また、この構成型プロモーターにNit（Non-Inducible TipA；図中ではNitpと表記）プロモーターと名前を付けた。
【０１１５】
Nitプロモーターを構築した過程を以下に示す。pHN150u（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７５（sHN217）、７６（sHN218）に記載のプライマーを用いてインバースPCRにてDNAの増幅を行った。なお、pHN150uは、p Bluescript II SK (+) のMCSに、野生型TipA遺伝子プロモーターがクローン化されたプラスミドで、また上記２つのプライマーはその5'末端がそれぞれリン酸化されている。このインバースPCR断片をリガーゼ反応により自己閉環化し、結果出来たプラスミドにpHN231と名前を付けた。pHN231はNitプロモーターがp Bluescript II SK (+) のMCSにクローン化された形になっている。
【０１１６】
〔実施例８〕
PIPをレポーター遺伝子として有する構成型発現ベクターの構築；pHN407、pHN385、pHN409、pHN389の構築
pTip-NH1（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７７（sHN395）、７８（sHN396）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.6 kbの断片はテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。この断片をHpaIとKpnIで消化し、pHN379（実施例５）のHpaI / KpnI部位に導入した。この結果出来たプラスミドにpHN381と名前を付けた。pHN346（実施例４）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７９（sHN397）、８０（sHN398）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.8 kbの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。この断片をHpaIとKpnIで消化し、pHN380（実施例５）のHpaI / KpnI部位に導入した。この結果出来たプラスミドにそれぞれpHN382と名前を付けた。pHN231（実施例７）から0.2 kbのNitプロモーターを含む断片をBsrGIとNcoIで切り出し、pHN381とpHN382のBsrGI / NcoI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpHN383、pHN387とそれぞれ名前を付けた。pHN231（実施例７）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８１（sHN147）、８２（sHN376）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.2 kbの断片はNitプロモーターのうちRBS部分は含んでいない。この断片をBsrGIとXbaIで消化し、pHN381とpHN382のBsrGI / XbaI部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにpHN385、pHN389とそれぞれ名前を付けた。また、このNitプロモーター（RBS部分除く） - LG10RBSのハイブリッドDNAをNit-LG10プロモーターとする。pHN171をテンプレートとし、配列表中の配列番号８３（sHN388）、８４（sHN120）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた1.9 kbの断片はpRE2895由来のRepABオペロンを含む。この断片をBsrGIとHpaIで消化し、pHN387とpHN389のBsrGI / HpaI部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにpHN407、pHN409とそれぞれ名前を付けた。
【０１１７】
またコントロール実験用プラスミドとして、pHN387から、0.2 kbのNitプロモーターをBsrGIとNcoIで切り出した。このDNA断片をpHN380（実施例５）のBsrGI / NcoI部位に導入した。この結果できたプラスミドにpHN410と名前を付けた。
【０１１８】
〔実施例９〕
pNitベクターの構築
pHN407、pHN385、pHN409、pHN389（実施例８）のPIP遺伝子の代わりに、MCSを導入し、８種類のpNitベクターを構築した過程を示す。
【０１１９】
pTip-RT1（実施例６）から2.2 kbの断片をNcoIとKpnIで切り出し、pHN407、pHN385、pHN409、pHN389のNcoI / KpnI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpNit-QT1、pNit-RT1、pNit-QC1、pNit-RC1とそれぞれ名前を付けた。pHN385（実施例８）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８１（sHN147）、８５（sHN160）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.2 kbの断片はNit-LG10プロモーターを含む。この断片をBsrGIとNdeIで消化した。一方、pTip-RT2（実施例６）から、2.0 kbのMCS type 2、アンピシリン耐性遺伝子、ColE1を含む断片をNdeIとKpnIで切り出した。上記２つのDNA断片を同時に、pHN407、pHN385、pHN409、pHN389（実施例８）のBsrGI / KpnI部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにpNit-QT2、pNit-RT2、pNit-QC2、pNit-RC2とそれぞれ名前を付けた。
【０１２０】
図１８-２にpNitベクター（pNit-QT1、pNit-QT2、pNit-RT1、pNit-RT2、pNit-QC1、pNit-QC2、pNit-RC1、pNit-RC2）のマップを示す。略号等は実施例６に記された通りである。
【０１２１】
〔実施例１０〕
TipA遺伝子プロモーター、NitプロモーターからのPIPの発現
pHN380、pHN410、pHN381、pHN387、pHN389を用いて、pTip、pNitベクター群からの遺伝子発現様式を観察した。以下に、その過程と結果を示す。
【０１２２】
まず、R. erythropolis JCM3201株をpHN380、pHN410、pHN381、pHN387、pHN389で、形質転換した。これら形質転換体を用いてPIPのペプチダーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。
【０１２３】
図２０中、形質転換に用いたプラスミドの名前とそれぞれの簡単な特徴が示してあり、黒いバーはチオストレプトンで該形質転換体を処理したとき、網掛けのバーはチオストレプトンで該形質転換体を処理しなかったときのPIPのペプチダーゼ活性を示す。pHN380（TipA-LG10プロモーター - PIPからなる遺伝子カセットをpTipベクターの骨格に持つ）での形質転換体はチオストレプトンによる遺伝子発現制御が働いているが、pHN410（Nitプロモーター - PIPからなる遺伝子カセットをpTipベクターの骨格中に持つ）での形質転換体はチオストレプトンによる遺伝子発現制御が働いていない。また、pHN387はpHN410からチオストレプトン耐性遺伝子と、ThcA遺伝子プロモーター - TipA遺伝子からなる遺伝子カセットを取り除いた形のプラスミドであるが、このプラスミドでの形質転換体もチオストレプトンがなくても、PIPが発現していた。つまり、TipAタンパク質がなくても、Nitプロモーターからの遺伝子発現がおこることを意味する。pHN387、pHN389による形質転換体を用いた結果から、RBSの配列はチオストレプトンによる遺伝子発現制御には関係ないことが示唆された。pHN381はpHN389のNit-LG10プロモーターをTipA-LG10プロモーターに置換したものであるが、pHN381での形質転換体ではPIPの発現は構成的になっていない。以上のことから、Nitプロモーター、Nit-LG10プロモーターが構成型のプロモーターで、その発現にTipAタンパク質を必要としないことがわかる。
【０１２４】
なお、pTip、pNitベクターからのPIPの発現は30 ℃ばかりでなく、4 ℃でも可能であったことを確認した。
【０１２５】
〔実施例１１〕
pRE2895、pRE8424由来プラスミドの自律複製に必須な領域の比較
pTipベクターとpNitベクター群を用いて、pRE2895、pRE8424由来プラスミドの自律複製に必須な領域の特徴を調べた。
【０１２６】
まず、pNit-QC2とpNit-RC2のR. erythropolis JCM 3201, R. fascians JCM10002, R. opacus DSM44193, R. ruber JCM3205 and R. rhodochrous JCM3202に対する形質転換効率を調べた。結果を表3に示す。表３では各１ μgのプラスミドDNAを用いて形質転換した時に、クロラムフェニコールを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。この結果から、R. erythropolis JCM 3201, R. fascians JCM10002, R. opacus DSM44193では、効率の差はあるものの、pNit-QC2とpNit-RC2、いずれでも形質転換が可能であることがわかった。なお、R. ruber JCM3205、R. rhodochrous JCM3202では形質転換体は得られなかった。
【０１２７】
次にpHN409とpHN389（実施例９）でR. erythropolis JCM 3201、R. fascians JCM10002、R. opacus DSM44193を形質転換した。なお、pHN409とpHN389の違いは自律複製に必須な領域がpRE2895に由来するかpRE8424に由来するか、だけである。R. erythropolis JCM3201において、pHN409で形質転換した細胞と、pHN389で形質転換した細胞とで、PIPペプチダーゼ活性を比較したところ、ほとんど差がないか、若干pHN409で形質転換した細胞の方が高かった。この結果は、R. fascians JCM10002、R. opacus DSM44193を宿主とした場合でもほぼ同様であった。また、R. erythropolis JCM3201でのPIPペプチダーゼ活性よりもR. fascians JCM10002、R. opacus DSM44193でのPIPペプチダーゼ活性の方がいずれのプラスミドを用いた場合でも低かった。
【０１２８】
次にpNit-QC2とpNit-RC2のR. erythropolis JCM 3201細胞内でのプラスミドコピー数を調べた。実験手法はProjanらの方法（Projan et al., Plasmid 9 182-190 [1983]）に従った。この方法でプラスミドコピー数を計算するためにはR. erythropolis JCM 3201のゲノムサイズを知る必要があるが、van der Geizeらによれば、R. erythropolis ATCC4277株から派生した株、R. erythropolis RG1株のゲノムサイズが6メガベースペアー（Mbp）であり、かつ、R. erythropolis ATCC4277株とR. erythropolis JCM 3201株がほぼ同等の菌株であることから、R. erythropolis JCM 3201株のゲノムサイズも6 Mbpとして計算した。結果は、pNit-QC2が、47 ± 5、pNit-RC2が、64 ± 5のコピー数であった。
【０１２９】
〔実施例１２〕
プラスミド不和合性
細菌では一般に、同一の複製起点を持つ異種プラスミドは細胞内に共存できないことが多い。これはプラスミド不和合性（plasmid incompatibility）と呼ばれる現象によるもので（Novick, Microbiol. Rev. 51 381-395 [1987]）、Rhodococcus属細菌と近縁のMycobacterium属でも報告されている（Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996]）。本発明者は、配列の異なる２つのR. erythropolis内在性プラスミドを分離したことから（pRE2895とpRE8424）、複数のプラスミドを単一細胞内に共存させ、組換えタンパク質生産に利用できると考えた。そこで、まず、pTip-、pNit-ベクター群のプラスミド不和合性について調べた。
【０１３０】
R. erythropolis JCM 3201に対して、pNit-QC2またはpNit-RC2で第一の形質転換を行い、さらに、これらの形質転換体細胞に対してpNit-QT2またはpNit-RT2で第二の形質転換を行った。第二の形質転換後は、テトラサイクリンのみを含むLB固体培地で形質転換体を選択した。結果を表４に示す。表４中、右から二番目のカラムは、各1 μgのプラスミドDNAを用いて第二の形質転換した時に、テトラサイクリンを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。一番右のカラムは、第二の形質転換後に、第一の形質転換に用いたプラスミドが残っていたコロニーの確率（％）、即ち、第二の形質転換後にテトラサイクリン耐性だったコロニーの出現率を示す。その際、調べたコロニー数は各20コロニー（n = 20）である。表４に示されたように、同じ複製起点を持つ２つのプラスミドを用いた場合、第二の形質転換効率が極端に低下したこと、第二の形質転換後に第一の形質転換プラスミドが高頻度に消失していることから、不和合性を引き起こしたといえる。それに対して、別種の複製起点を持つ２つのプラスミドでは、第二の形質転換効率が低下しなかったこと、第二の形質転換後にも第一の形質転換プラスミドが安定に存在していることから不和合性を起こさなかったことが示唆された。つまり、pRE2895から派生したプラスミドと、pRE8424から派生したプラスミドは完全に「compatible」であるといえる。
【０１３１】
〔実施例１３〕
組換えタンパク質の単一細胞内での共発現
実施例１２に書かれたようにpRE2895から派生したプラスミドと、pRE8424から派生したプラスミドは完全にcompatibleで、一つのR. erythropolis細胞内に共存可能であった。このことを利用して、PIPとGFPの単一細胞内での共発現を試みた。
【０１３２】
まず、pHN187（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８６（sHN337）、８７（sHN338）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.2 kbの断片はGFP遺伝子の5'末端側を含む。この断片をNcoIで消化し、この断片の5'末端をリン酸化した。一方、pHN187をテンプレートとし、配列表中の配列番号８８（sHN339）、８９（sHN340）に記載のプライマーを用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。得られた0.5 kbの断片はGFP遺伝子の3'末端側を含む。この断片をBgllIで消化し、その5'末端をリン酸化した。これら２つのDNA断片を同時にpNit-QT1とpNit-RT1のNcoI / BglII部位にそれぞれ導入し、できたプラスミドにそれぞれpHN425、pHN426と名前を付けた。pHN425、pHN426は全長のGFP遺伝子含み、GFPのC末端側に6×Hisタグが付加されるような配列が融合されている。また、GFP遺伝子内部に存在していたNcoI部位は上記作業中に除かれているが、GFPの機能に変化はない。
【０１３３】
pHN425とpHN389で、R. erythropolis JCM3201を共形質転換し、形質転換体をテトラサイクリンとクロラムフェニコール両方を含む培地で選択した。また、pHN426とpHN409で、R. erythropolis JCM3201を形質転換し、共形質転換体をテトラサイクリンとクロラムフェニコール両方を含む培地で選択した。また、対照実験として、pHN425、pHN426、pHN389、pHN409でR. erythropolis JCM3201をそれぞれ形質転換した。これら６種類の形質転換体を実施例１に記載されたようにしてPIPとGFPを発現させ、ニッケルイオンを用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製した。組換えタンパク質の精製、精製前並びに精製後のサンプルのSDSポリアクリルアミド電気泳動は以下の方法で行った。PIPのＣ末端には6×Hisタグがついており、Ni-NTA Superflow（Qiagen社製）を用いて、その使用説明書に準じて精製を行った。
【０１３４】
以下に具体的な精製法を示すが、精製の作業は4 ℃で行った。タンパク質を発現させた菌体 （20 ml培養液分） を回収し、1 mlのNT-Buffer（50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM塩化ナトリウム、1 mMジチオスレイトール）に懸濁し、1 ｇのガラスビーズ（直径0.105-0.125ミリメートル）を加えた。これをFast-prep FP120（SAVANT社製）にて6 m/秒の速度、20秒間往復振とう運動させることで、細胞を破壊した。20,000×gにて遠心し、その上清700 μlに、予めNT-Bufferで平衡化されたNi-NTA Superflowをベッド体積40 μlになるように加えた。これを１時間回転撹拌しながらNi-NTA Superflowビーズと6×Hisタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをNT-Bufferで４回洗浄した後、120 μlのNTE-Buffer （50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、 100 mM塩化ナトリウム、1 mMジチオスレイトール、400 mMイミダゾール）に３回懸濁することで、ビーズから6×Hisタグのついたタンパク質を溶出させた。上記サンプルのうち10 μlを常法に従い、12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した。SDSポリアクリルアミド電気泳動結果後、ゲルをクマシーブリリアントグリーンG-250で染色した結果を図２１に示した。
【０１３５】
図２１中、奇数番号のレーンは細胞の粗抽出液（即ち、精製前のサンプル）、偶数番号のレーンは金属キレートクロマトグラフィーで精製した後のサンプルを示す。また、レーン1，2はpHN425とpHN389で共形質転換したR. erythropolis JCM3201からのサンプル、レーン3，4はpHN426とpHN409で共形質転換した細胞からのサンプル、レーン5，6はpHN425で形質転換した細胞からのサンプル、レーン7，8はpHN426で形質転換した細胞からのサンプル、レーン9，10はpHN389で形質転換した細胞からのサンプル、レーン11，12はpHN409で形質転換した細胞からのサンプルである。
【０１３６】
図２１のレーン2と4に２本のバンドが見られることから、PIP、GFPが、単一の細胞内で共発現され、精製されたことが示された。また、共発現させたとき（レーン2、4）と、それぞれ単独で発現させたとき（レーン6、8、10、12）のPIP、GFPの発現量に大きな差異は見られなかった。
【０１３７】
表１に実施例で用いた各プラスミドのリストを、表２に実施例で用いた菌株のリストを、表３にpNit-QC2とpNit-RC2のR. erythropolis JCM 3201, R. fascians JCM10002, R. opacus DSM44193に対する形質転換効率を、表４にpNit-QC2、pNit-RC2、pNit-QT2、pNit-RT2によるR. erythropolis JCM 3201への共形質転換の結果を示す。
【０１３８】
【表１】
0003944577.tif 000002
0003944577.tif 000003
【０１３９】
【表２】
0003944577.tif 000004
【０１４０】
【表３】
0003944577.tif 000005
【０１４１】
【表４】
0003944577.tif 000006
【０１４２】
【発明の効果】
本発明の新規なローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を４ ℃から３５ ℃の温度条件下で誘導物質により誘導発現しうる発現ベクターおよび外来遺伝子を誘導物質非依存的に構成的に発現し得るベクターを用いることにより、効率的にRhodococcus属細菌で外来タンパク質を産生させることができ、特に宿主微生物として低温でも増殖し得る微生物を用いることにより、通常の微生物の増殖に適した温度条件、即ち約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させることが可能である。さらに、互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のRhodococcus属細菌由来の発現プラスミドベクターであって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なDNA配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつDNA配列と、pRE2895由来のプラスミドの自律複製に必要なDNA配列を有するベクターは不和合性の問題を起こすことなく、同一の微生物細胞中で安定に維持され、それぞれのベクターが含む外来遺伝子がコードするタンパク質を同一の微生物細胞中で共発現させることが可能である。
【０１４３】
【配列表】
0003944577.tif 000007
0003944577.tif 000008
0003944577.tif 000009
0003944577.tif 000010
0003944577.tif 000011
0003944577.tif 000012
0003944577.tif 000013
0003944577.tif 000014
0003944577.tif 000015
0003944577.tif 000016
0003944577.tif 000017
0003944577.tif 000018
0003944577.tif 000019
0003944577.tif 000020
0003944577.tif 000021
0003944577.tif 000022
0003944577.tif 000023
0003944577.tif 000024
0003944577.tif 000025
0003944577.tif 000026
0003944577.tif 000027
0003944577.tif 000028
0003944577.tif 000029
0003944577.tif 000030
0003944577.tif 000031
0003944577.tif 000032
0003944577.tif 000033
0003944577.tif 000034
0003944577.tif 000035
0003944577.tif 000036
0003944577.tif 000037
0003944577.tif 000038
0003944577.tif 000039
0003944577.tif 000040
0003944577.tif 000041
0003944577.tif 000042
0003944577.tif 000043
0003944577.tif 000044
0003944577.tif 000045
0003944577.tif 000046
0003944577.tif 000047
0003944577.tif 000048
0003944577.tif 000049
0003944577.tif 000050
0003944577.tif 000051
0003944577.tif 000052
0003944577.tif 000053
0003944577.tif 000054
0003944577.tif 000055
0003944577.tif 000056
0003944577.tif 000057
0003944577.tif 000058
0003944577.tif 000059
0003944577.tif 000060
0003944577.tif 000061
0003944577.tif 000062
0003944577.tif 000063
0003944577.tif 000064
0003944577.tif 000065
0003944577.tif 000066
0003944577.tif 000067
0003944577.tif 000068
0003944577.tif 000069
0003944577.tif 000070
0003944577.tif 000071
0003944577.tif 000072
0003944577.tif 000073
0003944577.tif 000074
0003944577.tif 000075
0003944577.tif 000076
0003944577.tif 000077
0003944577.tif 000078
0003944577.tif 000079
0003944577.tif 000080
0003944577.tif 000081
0003944577.tif 000082
0003944577.tif 000083
0003944577.tif 000084
0003944577.tif 000085
0003944577.tif 000086
0003944577.tif 000087
0003944577.tif 000088
0003944577.tif 000089
0003944577.tif 000090
0003944577.tif 000091
0003944577.tif 000092
0003944577.tif 000093
0003944577.tif 000094
0003944577.tif 000095
0003944577.tif 000096
0003944577.tif 000097
0003944577.tif 000098
0003944577.tif 000099
0003944577.tif 000100
0003944577.tif 000101
0003944577.tif 000102
0003944577.tif 000103
0003944577.tif 000104
0003944577.tif 000105
0003944577.tif 000106
0003944577.tif 000107
0003944577.tif 000108
0003944577.tif 000109
0003944577.tif 000110
0003944577.tif 000111
0003944577.tif 000112
0003944577.tif 000113
0003944577.tif 000114
0003944577.tif 000115
0003944577.tif 000116
0003944577.tif 000117
0003944577.tif 000118
0003944577.tif 000119
0003944577.tif 000120
0003944577.tif 000121
0003944577.tif 000122
0003944577.tif 000123
0003944577.tif 000124
0003944577.tif 000125
0003944577.tif 000126
0003944577.tif 000127
0003944577.tif 000128
0003944577.tif 000129
0003944577.tif 000130
0003944577.tif 000131
0003944577.tif 000132
0003944577.tif 000133
0003944577.tif 000134
0003944577.tif 000135
0003944577.tif 000136
0003944577.tif 000137
0003944577.tif 000138
0003944577.tif 000139
0003944577.tif 000140
0003944577.tif 000141
0003944577.tif 000142
0003944577.tif 000143
0003944577.tif 000144
0003944577.tif 000145
0003944577.tif 000146
0003944577.tif 000147
0003944577.tif 000148
0003944577.tif 000149
0003944577.tif 000150
0003944577.tif 000151
0003944577.tif 000152
0003944577.tif 000153
0003944577.tif 000154
0003944577.tif 000155
0003944577.tif 000156
0003944577.tif 000157
0003944577.tif 000158
0003944577.tif 000159
【０１４４】
【配列表フリーテキスト】
配列１〜４８：プライマー、リンカー
配列４９〜５６：ベクター
配列５７〜８９：プライマー、リンカー
配列９０：内在性プラスミド  pRE8424
配列９１〜１０６：ベクター
配列１０７：改変Tip A 遺伝子プロモーター
【図面の簡単な説明】
【図１】誘導型発現ベクターのバックボーンになるプラスミドpHN136の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。
【図２】チオストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミドpHN143の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを、Blu.は平滑末端（Blunt enｄ）を意味する。
【図３】  Inducer cassetteを持つプラスミドpHN62の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。Blu.は平滑末端（Blunt end）を意味する。
【図４】  Expression cassetteを持つプラスミドpHN153の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。CIAPは（Calf Intestine Alkaline PhosphataseをBlu.は平滑末端（Blunt end）を意味する。
【図５】テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドpHN169の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを、Blu.は平滑末端（Blunt end）を意味する。
【図６】  PIPをレポーター遺伝子として持つ誘導型発現ベクタープラスミドpHN170、pHN171の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー:kb）を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを意味する。
【図７】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー:kb）を示す。
【図８】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドpTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー:kb）を示す。
【図９ａ】  pTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LNH1、pTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2のマップを示す図である。各領域の機能と、プラスミドのマップを示す。
【図９ｂ】  pTip-NH1、pTip-LNH1のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図９ｃ】  pTip-CH1、pTip-LCH1のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図９ｄ】  pTip-NH2、pTip-LNH2のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図９ｅ】  pTip-CH2、pTip-LCH2のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図１０】  pTip-CH1.1、pTip-LCH1.1、pTip-CH2.1およびpTip-LCH2.1のマップを示す図である。
【図１１】  PIP活性測定のためのコントロールプラスミドpHN172、pHN173の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー：kb）を示す。また、CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを意味する。pHN170は、「Expression cassette」と「Inducer cassette」両方をもつのに対して、pHN173は「Expression cassette」のみをもち、pHN172は両cassetteを持たない。
【図１２】TipA遺伝子プロモーター配列を示す図である。
【図１３】TipA遺伝子プロモーターのTipA-LG10プロモーターへの改良を示す図である。
【図１４】  pRE8424のマップを示す図である。図中には主な制限酵素認識部位が示されていて、オープンリーディングフレーム（ORF）が矢印で示されている。DSOとSSOの位置が四角で示されている。
【図１５】  pRE8424、pAP1、pBL1、pJV1、pIJ101、pSN22のRepタンパク質の５カ所の保存された領域（Motif IV、Motif I、Motif II、Motif III、C-terminal motif）のアミノ酸配列を示す図である。Repタンパク質の機能に重要とされるチロシン残基は四角で囲ってある。
【図１６】  pRE8424、pAP1、pBL1、pJV1、pIJ101、pSN22のDSOと考えられる配列のうち、特に保存されたDNA配列を示す図である。
【図１７】  pRE8424のSSO、即ち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号5268から5538の配列と、その取りうる二次構造を示す図である。
【図１８−１】  pTipベクターのマップを示す図である。
【図１８−２】  pNitベクターのマップを示す図である。
【図１９】TipA-LG10p - MCS - ALDHt、Nit-LG10 - MCS - ALDHtのDNA配列を示す図である。TipA遺伝子プロモーターの野生型-10領域配列はCAGCGTで、Nitプロモーターの-10領域配列はTATAATで、おのおの四角で囲まれている。
【図２０】R. erythropolis JCM3201株をpHN380、pHN410、pHN381、pHN387、pHN389で、形質転換し、PIPのペプチダーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図２１】  PIP、GFPを不和合性を起こさない２つのベクターに組込み、単一のR. erythropolis JCM3201細胞で、発現、精製し、SDSポリアクリルアミド電気泳動結果後、ゲルをクマシーブリリアントグリーンG-250で染色した結果を示す図である。
【図１】
0003944577.tif 000160
【図２】
0003944577.tif 000161
【図３】
0003944577.tif 000162
【図４】
0003944577.tif 000163
【図５】
0003944577.tif 000164
【図６】
0003944577.tif 000165
【図７】
0003944577.tif 000166
【図８】
0003944577.tif 000167
【図９ａ】
0003944577.tif 000168
【図９ｂ】
0003944577.tif 000169
【図９ｃ】
0003944577.tif 000170
【図９ｄ】
0003944577.tif 000171
【図９ｅ】
0003944577.tif 000172
【図１０】
0003944577.tif 000173
【図１１】
0003944577.tif 000174
【図１２】
0003944577.tif 000175
【図１３】
0003944577.tif 000176
【図１４】
0003944577.tif 000177
【図１５】
0003944577.tif 000178
【図１６】
0003944577.tif 000179
【図１７】
0003944577.tif 000180
【図１８−１】
0003944577.tif 000181
【図１８−２】
0003944577.tif 000182
【図１９】
0003944577.tif 000183
【図２０】
0003944577.tif 000184
【図２１】
0003944577.tif 000185