(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいて、セルロース結合領域が欠失しており、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
(a) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失し、１個〜９個のアミノ酸の付加、挿入、欠失若しくは置換が生じたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求の範囲第２項に記載の遺伝子を含んでなる発現ベクター。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が糸状菌の細胞である請求の範囲第４項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属に属する微生物の細胞である請求の範囲第５項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求の範囲第４項〜第６項のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び該培養によって得られる宿主細胞若しくはその培養物から請求の範囲第１項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、タンパク質の生産方法。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の方法により生産されたタンパク質。
【請求項９】
請求の範囲第１項又は第８項に記載のタンパク質を含んでなるセルラーゼ調製物。
【請求項１０】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
【請求項１１】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
【請求項１２】
セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
【請求項１３】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
【請求項１４】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
【請求項１５】
セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
【請求項１６】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求の範囲第１０項〜第１５項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状又は安定化された液体状で含有してなる洗剤添加物。
【請求項１８】
請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物。
【請求項１９】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
【請求項２０】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
【請求項２１】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、請求の範囲第１項若しくは第８項に記載のタンパク質又は請求の範囲第９項に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、セルロース結合領域を欠失させることにより、セルロース含有繊維加工や洗剤、紙パルプ用途における効果を増加させたエンドグルカナーゼ酵素とその製造方法、及び効果を増加させたセルラーゼ調製物に関するものである。
背景技術
セルロース含有繊維を、その繊維に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、あるいは着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている（ヨーロッパ特許第３０７，５６４号）。
着色されたセルロース含有繊維は繰り返し洗濯をすることによって毛羽が生じ、着色生地の色を不鮮明にすることが知られている。そこで、洗剤中にセルラーゼを含ませることによって、毛羽を除去し、着色生地の色を鮮明にする、すなわち澄明化することから（ヨーロッパ特許第２２０，０１６号）、セルラーゼを含んだ洗剤が欧米を中心に市販されている。
上記の用途においては、主に木材腐朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）やフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。最近では経済性を高めるために、これらセルラーゼ成分から繊維処理に高活性を有するエンドグルカナーゼのみを単離し、遺伝子工学的にその効果を増強したセルラーゼ調製物が使用されている。例えば、これら高活性エンドグルカナーゼとしては、綿生地に強く作用するフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のＥＧＶ（国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号）やＮＣＥ４（国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号）があり、リヨセル生地に強く作用するリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）由来のＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩとファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）由来のＰＣＥ  Ｉがある（国際公開第ＷＯ００／２４８７９号）。
上記の用途において用いられるエンドグルカナーゼのうち、前出のＥＧＶ（国際公開第ＷＯ９１／１７２４３号）、ＮＣＥ４（国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号）、ＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、ＰＣＥ  Ｉ（国際公開第ＷＯ００／２４８７９号）などは、そのアミノ酸配列から、同じファミリー（ファミリー４５）に属するエンドグルカナーゼであるとされており、また、ここに挙げられた酵素が持っている構造には共通性が見られる。すなわち、これらのエンドグルカナーゼは、その基質であるセルロースに結合するための機能を持ったセルロース結合領域（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ、以下「ＣＢＤ」という。）、活性の中心となる触媒領域（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ、以下「ＣＡＤ」という。）、及びこれら２つの領域を連結する、親水性アミノ酸残基の含量が高いリンカー領域からなる。
ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであるＥＧＶにおいて、ＣＢＤ領域を欠失させた酵素を用いた解析が為されているが（特表平９−５００６６７；Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（２０００）．３２５−３２９）、セルロース結合領域（ＣＢＤ）を欠失させることによって、エンドグルカナーゼの有するセルロース繊維の毛羽除去活性が向上するといったような報告はされていない。エンドグルカナーゼの持つセルロース結合領域がエンドグルカナーゼ活性を示す上で担っている役割については未だ未解明な部分が多く、特定の菌、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属由来のセルラーゼに関する報告（Ｋｉｏｖｕｌａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ，２（１９９８），３−２３）のような限定された範囲での検討にとどまっている。接合菌由来のエンドグルカナーゼの持つセルロース結合領域について詳細に検討した知見は、これまでに知られていない。
上記の用途において、セルラーゼの効果を向上させるため、又はセルラーゼの性能を向上させるための数々の工夫が今までに行われてきた。例えば、酵素に変異を加えて性質を変化させたり、培養条件を改良して酵素の生産性を向上させるといったことが行われてきた。しかしながら、使用するセルラーゼのコストが高いために、工業的実用化レベルに見合うセルラーゼ調製物を提供するためには、さらなるセルラーゼ効果の向上へのニーズがある。また、最近では、経済性を高めるために、繊維処理に高活性を有するエンドグルカナーゼのみを遺伝子工学的に増強したセルラーゼ調製物が使用されている。従って、このような高活性セルラーゼについてはさらなる活性の向上が望まれている。
発明の開示
本発明の目的は、活性の向上したエンドグルカナーゼ、及びこれを含むセルラーゼ調製物、並びにこれらを用いたセルロース含有繊維の各種処理方法を提供することにある。
本発明者らは、接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいて、セルロース含有繊維への作用におけるセルロース結合領域のもつ役割について鋭意検討し、セルロース結合領域が欠失しているエンドグルカナーゼが、セルロース結合領域を持っているエンドグルカナーゼよりも綿、リヨセル等に対する毛羽除去活性がはるかに高いことを見出し、本発明に至った。
従って、本発明は、セルロース結合領域を欠失させることにより、セルロース含有繊維に対する毛羽除去効果が向上した接合菌由来のエンドグルカナーゼ（例えば、セルロース結合領域を欠失させることにより、セルロース含有繊維に対する毛羽除去効果が向上した、ＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、及びＰＣＥ  Ｉのアミノ酸配列を含んでなるエンドグルカナーゼ活性を示す酵素、エンドグルカナーゼ活性を示すその改変タンパク質、又はそれらの相同体）、及びそれらのエンドグルカナーゼを含有するセルラーゼ調製物に関するものである。また、本発明は、これらのようなエンドグルカナーゼをコードする遺伝子によって形質転換された宿主細胞にて生産されたエンドグルカナーゼに関するものであり、さらに、セルロース結合領域を欠失して活性の向上した上記エンドグルカナーゼ又は上記セルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する方法に関するものである。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいて、セルロース結合領域が欠失しており、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
（２）接合菌由来のファミリー４５に属するエンドグルカナーゼにおいて、セルロース結合領域が欠失しており、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
（３）接合菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物及びファイコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物からなる群より選択される微生物である、（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（４）接合菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する微生物である、（３）に記載のタンパク質。
（５）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質、エンドグルカナーゼ活性を示すその改変タンパク質、又はエンドグルカナーゼ活性を示すそれらの相同体。
（６）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
（７）（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体をコードする遺伝子。
（８）（７）に記載の遺伝子を含んでなる発現ベクター。
（９）（８）に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１０）宿主細胞が糸状菌の細胞である（９）に記載の宿主細胞。
（１１）宿主細胞がフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属に属する微生物の細胞である（１０）に記載の宿主細胞。
（１２）（９）〜（１１）のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養する工程、及び該培養によって得られる宿主細胞若しくはその培養物から（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体を採取する工程を含んでなる、タンパク質の生産方法。
（１３）（１２）に記載の方法により生産されたタンパク質。
（１４）（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体を含んでなるセルラーゼ調製物。
（１５）セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
（１６）セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
（１７）セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる前記方法。
（１８）着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
（１９）着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
（２０）セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
（２１）繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、（１５）〜（２０）のいずれか１つに記載の方法。
（２２）（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状又は安定化された液体状で含有してなる洗剤添加物。
（２３）（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物。
（２４）古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
（２５）紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
（２６）動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、（１）〜（６）及び（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は（１４）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる前記方法。
１．セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼ
本発明は、接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいて、セルロース結合領域が欠失しており、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質に関する。
本明細書において、「接合菌」とは、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）に属する微生物、すなわち、有性生殖で配偶子嚢が接合して接合胞子を生じる菌類を意味し、該接合菌門には接合菌綱（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）とトリコミケス綱（Ｔｒｉｃｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）が含まれる。本発明における接合菌としては、特に制限されないが、好ましくは接合菌綱に属するもの、より好ましくはケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）に属するもの、さらに好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属又はファイコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属に属するもの、最も好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属するものを用いる。
本明細書において、「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。さらに、「ＣＭＣ  アーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍｌを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍｌに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍｌ中にＤＮＳ試薬３．０ｍｌを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍｌで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。なお、ＤＮＳ試薬は文献（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、第１９〜２０頁、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することができるが、例えば、次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍｌに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍｌ、及びロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍｌに結晶フェノール１０ｇを加え、さらに水を加えて溶解して１００ｍｌとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍｌに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、該酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。
エンドグルカナーゼは、そのアミノ酸配列等の情報から複数のファミリーに分類されている。本発明におけるエンドグルカナーゼはいずれのファミリーに属するものであってもよいが、好ましくはファミリー４５に属するものである。ここで、「ファミリー４５に属する」エンドグルカナーゼとは、触媒領域（ＣＡＤ）内に（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｌａ）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｃｙｓ又はＡｌａ）の共通配列を有するものをいい、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のＥＧＶ（特表平  ５−５０９２２３）やＮＣＥ４（国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号）などもファミリー４５に属している。
ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼのタンパク質は、機能の面から、触媒領域（ＣＡＤ）、セルロース結合領域（ＣＢＤ）、及びこれらを連結するリンカー領域に分けられる。セルロース結合領域（ＣＢＤ）は、その名の通り、セルロースに結合する領域として存在することが知られており、配列の特徴として、次のような共通配列が保存されていることが確かめられている（Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ａ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：４４３−４５０，１９９５）。
0003970770.tif 000002
ここで、Ｘａａは限定されないいずれかのアミノ酸を示すが、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３１位のＸａａは存在しなくてもよい。その他のＸａａは必ず存在しており、限定されないいずれかのアミノ酸を示す。Ｘａａ以外のアミノ酸は３文字表記法に従った。このＣＢＤ領域はＣＡＤのＮ末端側又はＣ末端側のどちらかにリンカーを介して連結されているが、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のＮＣＥ５（アミノ酸配列：配列番号３８、ｃＤＮＡ配列：配列番号３９）のように、元々ＣＢＤを持っていないファミリー４５エンドグルカナーゼも報告されている。
リンカー領域については明確な認識配列は無いものの、ＳｅｒやＴｈｒなどの親水性のアミノ酸残基に富んだ配列となっており、また、その長さはエンドグルカナーゼの種類によって異なる。
本発明における接合菌由来のエンドグルカナーゼとしては、例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ファイコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属由来の国際公開第ＷＯ００／２４８７９号記載のエンドグルカナーゼ活性を示す酵素、すなわち、ＲＣＥ  Ｉ（配列番号１）、ＲＣＥ  ＩＩ（配列番号３）、ＲＣＥ  ＩＩＩ（配列番号５）、ＭＣＥ  Ｉ（配列番号７）、ＭＣＥ  ＩＩ（配列番号９）及びＰＣＥ  Ｉ（配列番号１１）が挙げられる。これらの酵素のアミノ酸配列における各領域の配置は、以下の表１のようになっている。
0003970770.tif 000003
また、ＲＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  Ｉ及びＰＣＥ  ＩのＮ末端アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６に示すように同定されている（国際公開第ＷＯ００／２４８７９号）。
本発明のタンパク質は、上記のようなエンドグルカナーゼにおいてセルロース結合領域を含まないものであればよく、エンドグルカナーゼ活性を有する限りにおいて、他の領域について特に構造的な制限はない。従って、本発明のタンパク質は、リンカー領域を含んでも含まなくてもよく、また、リンカー領域の一部を含んでもよいが、好ましくは、１０アミノ酸程度のリンカー領域の断片が残っているとよい。
本発明の別の態様では、本発明は、配列番号１（ＲＣＥ  Ｉ）、配列番号３（ＲＣＥ  ＩＩ）、配列番号５（ＲＣＥＩＩＩ）、配列番号７（ＭＣＥ  Ｉ）、配列番号９（ＭＣＥ  ＩＩ）若しくは配列番号１１（ＰＣＥ  Ｉ）で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質に関する。さらに、本発明は、このようなタンパク質の改変タンパク質及び相同体であって、エンドグルカナーゼ活性を示すものに関する。
本明細書において、「改変タンパク質」とは、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ又はＰＣＥ  Ｉのアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸の付加、挿入、削減、欠失、又は置換などの改変が生じたアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を意味する。該改変に係るアミノ酸の数は、改変タンパク質がエンドグルカナーゼ活性を有する限りにおいて特に制限されないが、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらに好ましくは１〜９個である。
本明細書において、「相同体」とは、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、及びＰＣＥ  Ｉのアミノ酸配列をコードする遺伝子、例えば、配列番号２又は配列番号１３（ＲＣＥ  Ｉ）、配列番号４（ＲＣＥ  ＩＩ）、配列番号６（ＲＣＥ  ＩＩＩ）、配列番号８（ＭＣＥ  Ｉ）、配列番号１０（ＭＣＥ  ＩＩ）、配列番号１２（ＰＣＥ  Ｉ）等で表される塩基配列においてセルロース結合領域をコードする部分を除いた塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子（塩基配列）によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、  ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、及びＰＣＥＩのアミノ酸配列又はその改変タンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を含んでなるプローブと相同体をコードする遺伝子とがハイブリダイズする一方で、このプローブが、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号に記載のエンドグルカナーゼＮＣＥ４遺伝子（配列番号１８）及び国際公開第ＷＯ９８／５４３３２号に記載のエンドグルカナーゼＳＣＥ３遺伝子（配列番号１９）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する（なお、ここで、ＤＮＡ量は、ＮＣＥ４遺伝子、ＳＣＥ３遺伝子、相同体をコードする遺伝子とも同量使用することとする）。より具体的には、プローブとして標識化した、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ等のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後に前記プローブを添加し、１５時間のハイブリダイゼーション（４２℃）を行った後、０．４％ＳＤＳ及び６Ｍ尿素を添加した０．５倍濃度ＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）を用いて４２℃で２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣを用いて室温（約２５℃）で１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
このような改変タンパク質又は相同体としては、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、又はＰＣＥＩのアミノ酸配列と、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。なお、ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
本発明のタンパク質は、セルロース結合領域を含まないタンパク質である。従って、上記の改変タンパク質及び相同体もまた、セルロース結合領域を含むものであってはならない。これは、対象となるタンパク質のアミノ酸配列を調べ、その中に上記共通配列（Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ａ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：４４３−４５０，１９９５；配列番号１７）が存在するか否かを調べることによって確認することができる。
また、本発明のタンパク質は、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。従って、上記の改変タンパク質及び相同体もまた、エンドグルカナーゼ活性を有するものでなければならない。これは、対象となるタンパク質のエンドグルカナーゼ活性を、上述の方法を用いて調べることにより確認することができる。
本発明のタンパク質は、接合菌由来の公知のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列に基づき、そのセルロース結合領域を含まないアミノ酸配列を含むタンパク質として、当業者に公知の方法により調製することができる。このような方法としては、例えば、エンドグルカナーゼを生産する接合菌の培養中にプロテアーゼによってリンカー部分を分解してセルロース結合領域を欠失させる方法、遺伝子工学的手法によりセルロース結合領域を持たないエンドグルカナーゼを人為的に発現させる方法等が挙げられる。本発明のタンパク質のうち、特に上記の改変タンパク質及び相同体は、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、当業者に公知の遺伝子工学的手法により調製することもできる。
本発明のタンパク質は、繊維加工、洗剤、紙パルプ用途において、セルロース結合領域を有する元来のエンドグルカナーゼよりも高い効果を奏することができ、特に、リヨセルのような再生セルロース系繊維の毛羽除去活性（タンパク重量当り）、及び綿ニットのような綿生地の毛羽除去活性（タンパク重量当り）については、はるかに高い効果を得ることができる。この点に関し、本発明のタンパク質は、再生セルロース繊維（例えば、リヨセル）の毛羽除去活性（タンパク重量当り）について、好ましくは、セルロース結合領域を有する精製エンドグルカナーゼの２倍以上、より好ましくは２．５倍以上、最も好ましくは３倍以上の活性を有し、あるいは、綿ニットのような綿生地の毛羽除去活性（タンパク重量当り）について、好ましくは、セルロース結合領域を有する精製エンドグルカナーゼの５倍以上、より好ましくは１５倍以上、最も好ましくは２０倍以上の活性を有する。
２．遺伝子、発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び該宿主細胞を用いるセルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼの生産
本発明は、本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体をコードする遺伝子及び該遺伝子を含んでなる発現ベクターに関する。
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体をコードするものであればよく、その具体的な塩基配列の詳細については特に限定されないが、本発明のタンパク質としてセルロース結合領域欠失型のＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ又はＰＣＥ  Ｉを発現させるためには、例えば、配列番号２（ＲＣＥ  Ｉ）、配列番号４（ＲＣＥ  ＩＩ）、配列番号６（ＲＣＥ  ＩＩＩ）、配列番号８（ＭＣＥ  Ｉ）、配列番号１０（ＭＣＥ  ＩＩ）又は配列番号１２（ＰＣＥ  Ｉ）で表される塩基配列を含むものを利用することができる。
すなわち、本発明の遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質、エンドグルカナーゼ活性を示すその改変タンパク質、又はエンドグルカナーゼ活性を示すそれらの相同体をコードする遺伝子である。
また、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２又は配列番号１３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２で表される塩基配列においてセルロース結合領域をコードする部分を除いた塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２又は配列番号１３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２で表される塩基配列においてセルロース結合領域をコードする部分を除いた塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
ここで、ストリンジェントな条件下とは前項１．で説明した条件をいう。
また、上記遺伝子の塩基配列は、後の形質転換に使用する宿主細胞の種類に応じて最適化することもできる。このような塩基配列の最適化は、例えば、宿主細胞におけるコドン使用、宿主細胞におけるイントロン認識配列等に関して行うことができる。コドン使用に関する最適化は、例えば、コードされるアミノ酸配列を変更することなく、宿主細胞において高頻度で使用されるコドンを出来るだけ多く含むように塩基配列を改変することによって行うことができ、これにより、遺伝子からタンパク質への翻訳の効率を向上させることができる。イントロン認識配列に関する最適化は、例えば、コードされるアミノ酸配列を変更することなく、宿主細胞においてイントロンと認識され得るＤＮＡ配列を全く含まないか、又は出来るだけ含まないように塩基配列を改変することによって行うことができ、これにより、目的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの安定性の向上を図ることができる。イントロン認識配列は宿主細胞の種類によって異なるが、不完全菌類に属する糸状菌におけるイントロン認識配列としては、例えば、ＧＴＡＧＮ、ＧＴＡＴＮ、ＧＴＡＡＮ、ＧＴＡＣＧＮ、ＧＴＧＴＮ、ＧＣＡＣＧＮ、ＧＴＴＣＧＮ（それぞれの配列において、「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｃ又はＧを示す。）等のＤＮＡ配列を挙げることができる。
本明細書において、「コドン最適化遺伝子」とは、コドン使用及び／又はイントロン認識配列に関する最適化により得られる遺伝子を意味するが、好ましくはコドン使用に関する最適化により得られる遺伝子、より好ましくはコドン使用及びイントロン認識配列に関する最適化により得られる遺伝子である。また、該コドン最適化遺伝子は、好ましくは不完全菌類に属する糸状菌における発現のために最適化されたものである。このようなコドン最適化遺伝子としては、例えば、国際公開第ＷＯ００／２４８７９号記載のコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥ  Ｉ遺伝子（配列番号１３）においてセルロース結合領域をコードする部分が欠失したものが挙げられる。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞内において複製可能で、かつ、本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体を発現可能な状態で、目的の遺伝子（本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体をコードする遺伝子）を含んでなる。このような発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないベクター、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。あるいは、該発現ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明の発現ベクターは、これを宿主細胞に導入して本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体を発現させるために、本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体をコードする遺伝子の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター及びターミネーター、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。該プロモーター及びターミネーターは、宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。該シグナルペプチドは、宿主細胞においてタンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよく、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。これらのＤＮＡ配列及び遺伝子マーカーは、本発明の発現ベクター中にそれぞれが機能し得る形で連結される。
さらに、本発明は、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。ここで使用する宿主細胞は、導入された上記発現ベクターが複製し得るものである必要があるため、上記発現ベクターの作製に用いたベクターの種類によって異なる。あるいは、ここで使用する宿主細胞の種類に応じて、該宿主細胞中で複製し得る発現ベクターを作製することもできる。すなわち、本発明のタンパク質、改変タンパク質又はそれらの相同体を発現する形質転換体を得るためには、使用する宿主細胞と発現ベクターを適切に組み合わせる必要があり、このような組合せを宿主−ベクター系という。本発明において使用する宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、宿主細胞として大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌等の微生物を用いる系が挙げられ、好ましくは糸状菌を用いる系が挙げられる。また、これらの系において、他のタンパク質との融合タンパク質を発現するものを用いることもできる。
宿主として糸状菌を用いる場合には、いかなる糸状菌を用いてもよいが、好ましくは、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属するものを用いる。これらの糸状菌の特に好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）若しくはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられる。
本発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法に従って実施することができる。
以上のようにして得られる形質転換体（形質転換された宿主細胞）を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、本発明は、本発明の宿主細胞を培養する工程、及び該培養によって得られる宿主細胞若しくはその培養物から本発明のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体を採取する工程を含んでなる、タンパク質の生産方法に関する。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
３．セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は本発明のタンパク質生産法により生産されるタンパク質を含んでなるセルラーゼ調製物に関する。
一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素の他に、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、防腐剤、非イオン系界面活性剤等を含有する粉末、液体等であり、例えば、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、液体製剤等の形態をとる。本発明のセルラーゼ調製物は、上記セルラーゼ酵素として本発明のタンパク質、改変タンパク質若しくはそれらの相同体又は本発明のタンパク質生産法により生産されるタンパク質（以下「本発明のタンパク質等」という。）を含むものである。さらに、本発明のセルラーゼ調製物は、本発明のタンパク質等に加えて、他のセルラーゼ酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ及び本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよい。
セルラーゼ調製物の１種である非粉塵化顆粒は、通常の乾式造粒法を用いて製造することが可能である。すなわち、粉末状態の本発明のタンパク質等を、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等に代表される中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩、ベントナイト、モンモリナイト等に代表されるエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物、又は澱粉、粒状セルロース等に代表される中性の有機物の１種又は複数種に混合した後、非イオン界面活性剤の１種若しくは複数種の粉末又は微細に懸濁された懸濁液を加えて十分に混合又は混練する。状況に応じ、固形物を結着させるポリエチレングリコールに代表される合成高分子やスターチなどの天然高分子を適宜添加してさらに混練した後、ディスクペレッターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、さらに好ましくは１〜２０重量％とする。また、顆粒表面をポリマー等でコーティングすることにより、酸素透過や水分透過をコントロールすることも可能である。
一方、液状製剤は、本発明のタンパク質等を含む溶液に、合成高分子、天然高分子等のエンドグルカナーゼ酵素の安定化剤を配合し、必要に応じて無機塩類や合成防腐剤を添加して調製することが可能である。このとき、非イオン界面活性剤の１種又は複数種を配合することも可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、さらに好ましくは１〜２０重量％とする。
４．本発明のタンパク質等及び本発明のセルラーゼ調製物の用途
本発明は、セルロース含有繊維の処理方法に関し、該方法は、セルロース含有繊維を、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含む。接触温度、該タンパク質等又は該セルラーゼ調製物の量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定することができる。
上記の方法は、セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させるために用いることができる。この用途においては、３０〜６０℃程度の温度で、０．００１〜１ｍｇ／ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等又は上記セルラーゼ調製物を使用することが好ましい。
また、上記の方法は、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工するために用いることができる。この用途において、肌触りの改善は、肌触りが悪くなる速度が低減されることにより達成される。該用途においては、３０〜６０℃程度の温度で、０．００１〜１００ｍｇ／ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等又は上記セルラーゼ調製物を使用することが好ましい。
また、上記の方法は、着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化するために用いることができる。
また、上記の方法は、着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供するために用いることができる。この用途においては、例えば、着色セルロース含有繊維（例えば、デニム地）にストーンウオッシュの外観を与えることができる。該用途においては、４０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜１００ｍｇ／ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等又は上記セルラーゼ調製物を使用することが好ましい。
各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度は、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により算出した。該ＨＰＬＣ分析では、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中のアセトニトリルを、濃度０％〜８０％のリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで流すことによってエンドグルカナーゼを溶出し、ＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出する。スタンダードとしては、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同様にＨＰＬＣ分析して用いる。精製ＮＣＥ４は国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号公報に記載の方法に従って、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１［ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７（原寄託：ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３６、原寄託日：１９９６年７月１５日）の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託］を培養し、培養物から精製したものを使用する。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードはＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いる。
また、上記の方法は、セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわ付きを低減するために用いることができる。この用途においては、セルロース含有繊維を柔軟化することができる。
以上のような用途においては、セルロース含有繊維の処理は、その繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行うことができる。すなわち、本発明の上記方法は、洗濯中にセルロース含有繊維を処理することにより実施できる。しかしながら、繊維の処理は、場合によって、ソーキング又はすすぎ中に、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のタンパク質等又はセルラーゼ調製物を添加することによって実施されてもよい。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状又は安定化された液体状で含有してなる洗剤添加物に関し、さらには、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物に関する。
該洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、該洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキル硫酸塩（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＭｅ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロース又はグルコースの脂肪酸エステル、並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
本発明のタンパク質等又はセルラーゼ調製物を洗剤組成物中で用いることにより、粒質土壌除去、色彩澄明化、脱毛羽立ち、脱ピリング及び手粗さ軽減に関し、それらを改善することができる。
さらに、本発明は、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法に関する。
本発明のタンパク質等又はセルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱インキの効率を向上させるため、古紙から再生紙を製造する過程において有用である。上記脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大幅に減少するため、古紙の白色度を向上させることができる。
上記脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品であればよく、特に限定されないが、例えば、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３等のアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、オレイン酸等の補集材などが挙げられ、助剤として、ｐＨ安定剤、キレート剤、分散剤等が挙げられる。
上記脱インキ方法を適用し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるものであればよく、特に限定されないが、例えば、機械パルプと化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙及び下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が挙げられる。さらに、一般に古紙と呼ばれるもの以外であっても、インクの付着している紙であれば、上記脱インキ方法を適用することができる。
さらに、本発明は、紙パルプのろ水性の改善方法に関し、該方法は、紙パルプを、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
該方法によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、有意に改善されるものと考えられる。該方法を適用し得るパルプは特に限定されないが、例えば、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、加工熱処理その他の高収率パルプ等が挙げられる。
さらに、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のタンパク質等又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
該方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
５．微生物の寄託
リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＣＰ９６００１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８９の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９９７年４月２１日付けで寄託されている。
ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＣＰ９９００１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９０の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９９９年７月２日付けで寄託されている。
ファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）ＣＰ９９００２株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９１の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９９９年７月２日付けで寄託されている。
本発明に用いる発現ベクターｐＭＫＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７４（原寄託：ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３０、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
本発明の発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７（原寄託：ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３６、原寄託日：１９９６年７月１５日）の受託番号のもと、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−３５４２９６号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例及び参考例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例及び参考例に限定されるものではない。
なお、以下において、エンドグルカナーゼ活性とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。さらに、「ＣＭＣアーゼ活性」は、セルラーゼ酵素とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）溶液を一定時間インキュベーション後、遊離してくる還元糖量を測定し、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
また、試験の実施にあたっては、国際公開第ＷＯ９８／０３６６７号及び第ＷＯ００／２４８７９号に記載の実施例を参考とした。
〔参考例〕
参考例１：セルラーゼＮＣＥ５のｃＤＮＡのクローニング
（１）ｃＤＮＡの単離とライブラリーの作成
セルラーゼ成分ＮＣＥ５遺伝子のスクリーニングには、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成しライブラリーを作製した。
▲１▼  全ＲＮＡの調製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）を（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）で２日間培養し、菌体を遠心分離（３５００ｒｐｍ．１０分）により回収した。そのうち３ｇの菌体を滅菌水で洗浄し、液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で磨砕した。この磨砕した菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）により、添付のマニュアルに従い全ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動法により染色像として全ＲＮＡを確認した。
▲２▼  ポリＡテイル＋ＲＮＡ（＝ｍＲＮＡ）の調製
▲１▼で調製した全ＲＮＡのうち１ｍｇから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、添付のマニュアルに従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにアプライしｍＲＮＡを溶出単離した。さらに、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動法によりスメアーな染色像としてｍＲＮＡを確認した。
▲３▼  ｃＤＮＡの合成
▲２▼で調製したｍＲＮＡの５μｇから、Ｔｉｍｅ  Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、添付のマニュアルに従い、ｃＤＮＡ合成を行った。
▲４▼  ｃＤＮＡライブラリーの作製
合成した全ｃＤＮＡの平滑末端に前述のＴｉｍｅ  Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに含まれているＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを、添付マニュアルに従い連結した。このＤＮＡ断片の全量を、ファージベクター、λＺＡＰＩＩ  クローニングキット（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩアームにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用い連結させ、エタノール沈澱後、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。このようにして得られた組換えファージベクターを、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社製）により添付のマニュアルにしたがってｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させ、ファージライブラリーとした。これを用いて目的遺伝子をクローニングした。
（２）ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅と解析
（１）−▲３▼で作製したｃＤＮＡを鋳型にし、セルラーゼＮＣＥ５の部分アミノ酸配列の情報をもとにＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。
各プライマーとしては、以下のような合成オリゴヌクレオチドを作製した。
0003970770.tif 000004
（塩基配列中、ＲはＧ又はＡを示し、ＹはＴ又はＣを示し、Ｉはイノシンを示す。）
ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１μｇのｃＤＮＡを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）と添付の緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、及び１μＭの各プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃１分間、（９４．０℃３０秒間、５５．０℃３０秒間、７２．０℃１分間）Ｘ２５回、７２．０℃５分間。
この反応により約５００ｂｐのＤＮＡが増幅され、これをＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｅｍｉｘ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈｅｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いシーケンスを行った。その結果、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列には、セルラーゼＮＣＥ５の部分アミノ酸配列を全て含んでいた。よって、以降のスクリーニングのプローブとして用いた。
（３）セルラーゼ成分ＮＣＥ５遺伝子のクローニング
▲１▼  プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ＰＣＲ法により増幅させた５００ｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇを、あらかじめＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により、標識化した。
（１）−▲４▼で作製したファージプラークは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロントランスファーメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に写し取り、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでアルカリ処理し、メンブラン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変成後、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５ｍＭ  クエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄し、風乾させＤＮＡを固定した。その後、キットのマニュアルにしたがって、ハイブリダイゼーションを行い、検出反応をし、ＦＵＪＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  Ｘ−ＲＡＹ  ＦＩＬＭ（富士写真フィルム社製）に感光させ、６個の陽性クローンを得た。
▲２▼  ファージＤＮＡの調製
陽性クローンからのＤＮＡの調製は、キットの添付マニュアルに従い、プラスミドＤＮＡとして調製した。
アンピシリンに耐性を示す大腸菌ＳＯＬＲＴＭから、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）にＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドを調製し、これをテンプレートに（２）で使用したＮ末端とＴ−４３．０のプライマーを用い、前述と同様の条件下でＰＣＲを行った。その結果、１個のプラスミドにおいて５００ｂｐの増幅産物を得られた。よって、このプラスミドに目的とするＤＮＡがクローン化されていることが予測されたので、これをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、約１ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。
（４）ｃＤＮＡ塩基配列の決定
（３）の▲２▼において得られた陽性組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドに挿入された約１ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片の塩基配列は、Ｔ３、Ｔ７シーケンス用プライマーを使用し、前述と同様の方法で決定した。結果、この塩基配列は６７２ｂｐのＯＲＦを含んでおり、その塩基配列、及びＯＲＦから推定されるアミノ酸配列はそれぞれ、配列表の配列番号３９、及び配列番号３８に示した。
さらにこのＯＲＦの１〜１８アミノ酸の配列については、本タンパク質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列であると考えられた。
参考例２：ＮＣＥ５遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）における発現ベクターは、プラスミドｐＪＤ０１（ＷＯ００／２４８７９実施例Ｄ１（２）（ｂ）参照）を利用し、以下のように構築した。
（１）ＮＣＥ５発現プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の構築
▲１▼  ＮＣＥ５遺伝子への部位特異的変異導入
ＮＣＥ５遺伝子は、プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に連結できるように、開始コドンのすぐ上流の配列と終止コドンのすぐ下流にあらかじめＢａｍＨＩを含む形でプライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。変異導入用プライマーは以下のようにデザインした。
0003970770.tif 000005
0003970770.tif 000006
ＰＣＲの反応は、参考例１で得られた陽性組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドをテンプレートに、前述と同様の条件下で行った結果、１．０％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅産物を確認したので、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｓ−４００ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にて未反応物を除去しエタノール沈澱後、ＢａｍＨＩにて消化した。次に、全量を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、６７０ｂｐのＤＮＡ断片をＳｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて添付のマニュアルに従い回収し、そのＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍを得た。さらに、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、確認した。
▲２▼  プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５の作製
前述のプラスミドｐＪＤ０１をＢａｍＨＩにて消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、約８．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を前述のＳｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔにて回収し、これを大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社製）を用い添付のマニュアルに従い脱リン酸化した。また、▲１▼で得られたプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍにおいても同様にＢａｍＨＩにて消化し、６７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収しそれぞれをＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２にて連結し、発現プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５を得た。
（２）プラスミドｐＪＮＤ−ｃ５によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、参考例１に記載した（Ｎ）培地にグルコース（３．０％）を加え、アビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍｌ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、ｌｍｇ／ｍｌ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、０．５Ｍシュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μｌ）を加え氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）添加ＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃、５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
〔実施例１〕セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ変異体Ｈ４３を発現する遺伝子の構築
コドン最適化エンドグルカナーゼ遺伝子ＲＣＥ  Ｉを含むプラスミドｐ１８−１（ＷＯ００／２４８７９実施例Ｄ３（１）ｇ）参照）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、コドン最適化エンドグルカナーゼ遺伝子を含む断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにクローン化したプラスミドｐＲ１Ｈ４を作製した。このｐＲ１Ｈ４を鋳型に、ＲＣ−４３Ｆ・ＲＣ−４３Ｒの２本の合成ＤＮＡをプライマーにしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて１段目のＰＣＲ反応を行った。反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約６５０ｂｐの遺伝子断片４３−Ｘ２を得た。
参考例２に記載した、元来セルロース結合領域を持たないファミリー４５エンドグルカナーゼであるＮＣＥ５遺伝子を含むプラスミドｐＪＮＤ−ｃ５を鋳型に、ＮＸ−４３Ｆ・ＮＸ−４３Ｒの２本の合成ＤＮＡをプライマーにしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて同じく１段目のＰＣＲ反応を行った。反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約１２０ｂｐの遺伝子断片４３−Ｘ１を得た。
0003970770.tif 000007
ＰＣＲ断片４３−Ｘ１及び４３−Ｘ２と、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてアニーリング・２段目のＰＣＲ反応を行った。プライマーはＮＸ−４３Ｆ及びＲＣ−４３Ｒの２本の合成ＤＮＡを使用し、反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約７００ｂｐの遺伝子断片Ｈ４３を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結したプラスミドｐＲ１Ｈ４３を作製した。酵素等の反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。得られたプラスミドｐＲ１Ｈ４３をＣｙ５−Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）にてシークエンス反応を行い、ＤＮＡシークエンサーＡＬＦｒｅｄ（アマシャム・ファルマシア社製）にてその配列を解析した。反応用のプライマーはキットに添付のＭ１３プライマーを使用した。その結果、Ｎ末端側の分泌シグナルがＮＣＥ５由来のもので、残りの触媒領域（ＣＡＤ）部分がＲＣＥ  Ｉ由来の配列になっており、予想通りの配列になっていることを確認した。塩基配列から推測されるＲＣＥ  Ｉ変異体Ｈ４３のアミノ酸配列を以下に示す。
0003970770.tif 000008
このアミノ酸配列（配列番号２４）において、第１〜１８アミノ酸残基はＮＣＥ  ５由来のシグナルペプチドであり、第１９〜２４アミノ酸残基はＮＣＥ  ５のＮ末端配列であり、第２５〜３６アミノ酸残基はＮＣＥ５又はＲＣＥ  Ｉ由来の配列であり、第３７アミノ酸残基以降の配列はＲＣＥ  Ｉの触媒領域由来の配列である。
なお、上記の方法に従って実施した場合、遺伝子断片Ｈ４３の塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号２４記載の配列、及び３４番目のアミノ酸残基がアラニンとなる配列の２種類が得られるが、以降の操作においては、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を用いた。
〔実施例２〕セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ変異体Ｈ４５を発現する遺伝子の構築
実施例１のｐＲ１Ｈ４を鋳型に、合成ＤＮＡであるＲＣ−Ａ１２１Ｐ及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて、ＲＣＥ  Ｉ遺伝子にアミノ酸置換を導入した。反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約１Ｋｂｐの遺伝子断片Ｌ９を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結したプラスミドｐＲ１Ｌ９を作製した。酵素等の反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。得られたプラスミドｐＲ１Ｌ９をＣｙ５−Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）にてシークエンス反応を行い、ＤＮＡシークエンサーＡＬＦｒｅｄ（アマシャム・ファルマシア社製）にてその配列を解析した。反応用のプライマーとしては合成ＤＮＡであるＨ４−Ｒ１を使用した。その結果、１ヶ所のアラニンがプロリンに変わっており、予想通りの配列になっていることを確認した。
0003970770.tif 000009
このｐＲ１Ｌ９を鋳型に、ＲＣＥ  Ｉ遺伝子の分泌シグナル配列部分をコードする領域の遺伝子を増幅した。ＲＣ−４５１Ｆ及びＲＣ−４５１Ｒの２本の合成ＤＮＡをプライマーにし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）及び添付のバッファー類を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液組成については添付のマニュアルの条件に従い、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社：２４００−Ｒ）の温度条件は、９４℃−１分、５０℃−２分、及び７２℃−１分を２５サイクルとした。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約１００ｂｐの遺伝子断片４５−Ｘ１を得た。
同様に、ｐＲ１Ｌ９を鋳型に、ＲＣＥ  Ｉ遺伝子の触媒領域（ＣＡＤ）をコードする領域を増幅した。ＲＣ−４５２Ｆ及びＲＣ−４５２Ｒの２本の合成ＤＮＡをプライマーにし、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）及び添付のバッファー類を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液組成については添付のマニュアルの条件に従い、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社  ２４００−Ｒ）の温度条件は、９４℃−１分、５０℃−２分、及び７２℃−１分を２５サイクルとした。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約６３０ｂｐの遺伝子断片４５−Ｘ２を得た。
0003970770.tif 000010
ＰＣＲ断片４５−Ｘ１及び４５−Ｘ２を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した後、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡ断片４５−Ｘ３を得た。４５−Ｘ３を鋳型に、ＲＣ−４５１Ｆ及びＲＣ−４５２Ｒの２本の合成ＤＮＡをプライマーにし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）及び添付のバッファー類を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液組成については添付のマニュアルの条件に従い、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社：２４００−Ｒ）の温度条件は、９４℃−１分、５０℃−２分、７２℃−１分を２５サイクルとした。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約７００ｂｐの遺伝子断片Ｈ４５を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結したプラスミドｐＲ１Ｈ４５を作製した。反応条件についてはキットに添付のマニュアルの条件に従った。塩基配列から推測されるＲＣＥ  Ｉ変異体Ｈ４５のアミノ酸配列を以下に示す。
0003970770.tif 000011
このアミノ酸配列（配列番号２９）において、第１〜２３アミノ酸残基はＲＣＥ  Ｉ由来のシグナルペプチドであり、第２４アミノ酸残基はＲＣＥ  ＩのＮ末端配列であり、第２５〜２６アミノ酸残基は使用したプライマーにより導入された配列であり、第２７アミノ酸残基以降の配列はＲＣＥ  Ｉの触媒領域由来の配列である。
〔実施例３〕コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥ  Ｉ遺伝子及びそのセルロース結合領域を欠失した変異体ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３，Ｈ４５のフミコーラ・インソレンスにおける発現
プラスミドｐＪＤ０１（ＷＯ００／２４８７９実施例Ｄ１（２）（ｂ）参照）をＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社製）を用い添付のマニュアルに従い脱リン酸化した。実施例１、２で得られたプラスミドｐＲ１Ｈ４３、ｐＲ１Ｈ４５においても同様にＢａｍＨＩにて消化し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を回収しそれぞれをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１にて連結し、発現プラスミドｐＪＮＤ−Ｈ４３、ｐＪＮＤ−Ｈ４５を得た。
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）を、プラスミドｐＪＮＤ−Ｈ４３、ｐＪＮＤ−Ｈ４５及びコドン最適化ＲＣＥ  Ｉ遺伝子を含むｐＪＩ４Ｄ０１（リゾプス由来のＲＣＥ  Ｉをフミコーラで発現させるためにコドンを最適化したＲＣＥ  Ｉ遺伝子を含むプラスミド：ＷＯ００／２４８７９実施例Ｄ３（３）参照）で形質転換した。すなわち、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７）を（Ｓ）培地（３．０％グルコース、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ  ６．８）中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍｌ  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ２３４（Ｎｏｖｏ社製）、５ｍｇ／ｍｌ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０（ヤクルト社製）、０．５Ｍシュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μｌに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μｌ）を加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養した後、形成したコロニーを形質転換体とした。
得られた形質転換体を（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）で３７℃にて培養し、遠心分離により固形分を除いた培養上清を酵素試料とした。
〔実施例４〕フミコーラ・インソレンス形質転換体からのＲＣＥ  Ｉ変異体の単離精製
フミコーラ・インソレンス形質転換体を、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）に植菌し、３７℃で振とう培養した。プラスミドｐＪＮＤ−Ｈ４３、ｐＪＮＤ−Ｈ４５を導入された形質転換体については５〜６日間培養した。プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１を導入された形質転換体については、リンカー部分における分解がなく、セルロース結合領域を保持したままのＲＣＥ  Ｉ酵素を得たいサンプルについては４日間培養し、一方、リンカー部分の分解が進み、セルロース結合領域が欠失したＲＣＥ  Ｉ酵素を得たいサンプルについては４日間よりも培養を延長し、５〜６日間培養した。得られた各培養液を７，０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液１００ｍｌを、最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨＩＣ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２７０ｍｌ：バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０．３Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。この内プラスミドｐＪＮＤ−Ｈ４３を導入された形質転換体の培養液（以下「Ｈ４３培養液」という。）については硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍのときに得られた画分に、プラスミドｐＪＮＤ−Ｈ４５を導入された形質転換体の培養液（以下「Ｈ４５培養液」という。）については硫酸アンモニウム濃度が０．９Ｍのときに得られた画分に、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１を導入された形質転換体の内、４日間培養を行ったもの（以下「Ｈ４培養液」という。）については硫酸アンモニウム濃度が０．６Ｍのときに得られた画分に、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１を導入された形質転換体の内、培養を延長し、分解を促進した培養液（以下「Ｈ４分解物」という。）については０．９Ｍのときに得られた画分に、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた。そこでこれらの画分各１００ｍｌを分取した。
ここで、得られた各活性画分１００ｍｌを、最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ＨＩＣ  疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２７０ｍｌ：バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎで再度アプライした。次に、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０．１５Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速用１０．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。このうち、Ｈ４３培養液については硫酸アンモニウム濃度が１．３５Ｍのときに得られた画分に、Ｈ４５培養液については硫酸アンモニウム濃度が１．０５Ｍのときに得られた画分に、Ｈ４培養液については硫酸アンモニウム濃度が０．７５Ｍの時に得られた画分に、Ｈ４分解物については硫酸アンモニウム濃度が１．０５Ｍの時に得られた画分にリヨセルの毛羽除去活性が認められた。そこで、これらの画分４０ｍｌを分取した。
ここで、得られた活性画分４０ｍｌを、最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ＨＩＣ  疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ：バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速４．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、脱イオン水により流速４．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。この内、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた画分８ｍｌを分取した。
さらに、得られた活性画分を１５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように希釈して調製した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、ＭｏｎｏＳ  １０／１０ＨＲカラム（アマシャム・ファルマシア社製）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１Ｍ  ＮａＣｌへの、０．１Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。この内、ＮａＣｌ濃度が約０．２−０．３Ｍのときに得られた画分にそれぞれリヨセル毛羽除去活性が認められた。そこで、この内の最も活性が強く認められた画分６ｍｌを分取した。これらの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｈ４３培養液、Ｈ４５培養液、Ｈ４分解物から精製したタンパク質については約２５Ｋｄａ、Ｈ４培養液については約４０ＫＤａの単一なバンドを示した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはテフコ社のシステムを用いて実施した。すなわち、電気泳動槽（Ｎｏ．０３−１０１）、電源（Ｍｏｄｅｌ：３５４０）、ゲル１０％（０１−０１５）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーキット（０６−０３０１）を用いた。泳動条件は、１８ｍＡ／１０分、次いで２０ｍＡ／９０分であった。泳動後のタンパク質の検出には、電気泳動用２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ「第一」（第一化学薬品社製）を用いて銀染色を行った。マーカーとしての標準タンパク質は、バイオ・ラッド社のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量標準タンパク質・Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ（１６１−０３０４）を用いた。
なお、上述のリヨセル毛羽除去活性は、以下の方法に従い測定した。
あらかじめ染色されたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製）を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製  ９ｃｍ×１０ｃｍ、重量約２ｇ）を筒状に縫い、下記の条件で各種酵素による毛羽除去処理を行った。この処理により筒状の生地の内側にある毛羽が完全に除去されるのに要するタンパク濃度を算出した。
各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度は、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した各種エンドグルカナーゼのＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出した。スタンダードとしては、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同じくＨＰＬＣ分析したものを用いた。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードはＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。また、精製ＮＣＥ４（配列番号１８の第１１８〜１０８８塩基にコードされる）は、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号公報記載の方法に従い、フミコーラ・インソレンス培養液から単離精製した。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：５５℃
時間：６０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ５（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
ｐＨ６（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともに約１６ｇのゴムボールを４個加えた。
〔実施例５〕フミコーラ・インソレンス形質転換体からの単離精製したＲＣＥ  Ｉ変異体タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の同定
実施例４において精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（テフコ社製）を行った後、ＰＶＤＦ膜へエレクトロブロッティングし、クマジーブリリアントブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。ここから目的のタンパク質がブロットされた部分を切り出し、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列の解析を試みた。Ｈ４５培養液、Ｈ４培養液、Ｈ４分解物から精製した酵素については問題無くアミノ酸配列が読めたが、Ｈ４３培養液から精製した酵素についてはエドマン分解によるシグナルは得られず、Ｎ末端のアミノ酸が修飾保護されていることが判明した。そこで、０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４０，０００：Ｓｉｇｍａ社製）／１００ｍＭ酢酸溶液に３７℃で３０分間浸漬し、膜上のタンパク質未結合部分をブロックした後、Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（宝酒造社製）を用いて５０℃で５時間処理することにより修飾Ｎ末端残基を除去し、あらためてシークエンシングを行った。得られた配列は以下の通りであった。
0003970770.tif 000012
Ｎ末端アミノ酸配列の同定の結果より、Ｈ４培養液から精製した酵素（以下「ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ）」という。）のみがセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持しており、残りのＨ４３培養液から精製した酵素（以下「ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）」という。）、Ｈ４５培養液から精製した酵素（以下「ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）」という。）、及びＨ４分解物から精製した酵素（以下「ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ）」という。）はセルロース結合領域（ＣＢＤ）を有しておらず、触媒領域（ＣＡＤ）のみの構造であることが明らかとなった。
〔実施例６〕セルロース結合領域を欠失したＲＣＥ  Ｉとセルロース結合領域を保持したＲＣＥ  Ｉの綿生地の毛羽除去比活性の比較
実施例５にて単一に精製されたエンドグルカナーゼを用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製：綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行い、除去されずに残った毛羽の量を目視にて判定し、毛羽の残存量が５０％になる精製酵素の添加量を測定した。タンパク量の測定にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス社）を用い、添付のマニュアルの条件に従って行った。なお、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ））は２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）及びＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ））と比べて約１．５倍の推定分子量があるため、仮に定量したタンパク質量が同じであったとしても、中に含まれる酵素分子の数に換算すると、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質のほうには２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質の約２／３の分子数の酵素しか含まれていないことになる。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０又は５５℃
時間：１２０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ７（１ｍＭリン酸緩衝液、脱イオン水を用いて調製）で反応させた。
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の表２に示されるとおりであった。
0003970770.tif 000013
表２の結果から、接合菌由来のエンドグルカナーゼであるＲＣＥ  Ｉは、元は同じ酵素であるにもかかわらず、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失した２５ＫＤａのタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質よりも、はるかに高いレベルで綿生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。
〔実施例７〕セルロース結合領域を欠失したＲＣＥ  Ｉとセルロース結合領域を保持したＲＣＥ  Ｉのリヨセル生地の毛羽除去比活性の比較
実施例５にて単一に精製されたエンドグルカナーゼを用いて、リヨセル生地（豊島株式会社製６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を実施例４記載の方法に改良を加えた条件にて行い、除去されずに残った毛羽の量を目視にて判定し、毛羽が完全に除去されるのに要する精製酵素の添加量を測定した。タンパク量の測定にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス社）を用い、添付のマニュアルの条件に従って行った。なお、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ））は２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）及びＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ））と比べて約１．５倍の推定分子量があるため、仮に定量したタンパク質量が同じであったとしても、中に含まれる酵素分子の数に換算すると、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質のほうには２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質の約２／３の分子数の酵素しか含まれていないことになる。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：９０分
反応液量：５０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ６（１０ｍＭ酢酸緩衝液、脱イオン水を用いて調製）で反応させた。
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の表３に示されるとおりであった。
0003970770.tif 000014
表３の結果から、接合菌由来のエンドグルカナーゼであるＲＣＥ  Ｉは、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失した２５ＫＤａのタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質よりも、高いレベルでリヨセル生地の毛羽除去比活性を示すことが分かる。
〔実施例８〕アルカリ・低温・界面活性剤存在下条件においての、セルロース結合領域を欠失したＲＣＥ  Ｉとセルロース結合領域を保持したＲＣＥ  Ｉの綿生地の毛羽除去比活性の比較
実施例５にて単一に精製されたエンドグルカナーゼを用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製  綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行い、除去されずに残った毛羽の量を目視にて判定し、毛羽の残存量が５０％になる精製酵素の添加量を測定した。タンパク量の測定にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス社）を用い、添付のマニュアルの条件に従って行った。なお、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ））は２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）及びＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ））と比べて約１．５倍の推定分子量があるため、仮に定量したタンパク質量が同じであったとしても、中に含まれる酵素分子の数に換算すると、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質のほうには２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質の約２／３の分子数の酵素しか含まれていないことになる。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（大栄科学精器製作所社製）
温度：３０℃
時間：１２０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ１０（５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、脱イオン水を用いて調製）で反応させた。
処理液には、酵素溶液、約１６ｇゴムボール４個とともに終濃度１００ｐｐｍの非イオン系界面活性剤パーソフトＮＫ−１００（日本油脂株式会社）を加えた。
その結果は、下記の表４に示されるとおりであった。
0003970770.tif 000015
表４の結果から、低温・アルカリ・界面活性存在下といった実際に洗剤を使用するような条件下においても、接合菌由来のエンドグルカナーゼであるＲＣＥ  Ｉは、元は同じ酵素であるにもかかわらずセルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失した２５ＫＤａのタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質よりも、はるかに高いレベルで綿生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。
〔実施例９〕セルロース結合領域が欠失した各種精製ＲＣＥ  Ｉの綿生地の毛羽除去比活性の比較
実施例５にて単一に精製されたエンドグルカナーゼを用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製：綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行い、除去されずに残った毛羽の量を目視にて判定し、毛羽の残存量が５０％になる精製酵素の添加量を測定した。タンパク量の測定にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス社）を用い、添付のマニュアルの条件に従って行った。なお、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ））は２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）及びＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ））と比べて約１．５倍の推定分子量があるため、仮に定量したタンパク質量が同じであったとしても、中に含まれる酵素分子の数に換算すると、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質のほうには２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質の約２／３の分子数の酵素しか含まれていないことになる。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：１２０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ７（１ｍＭリン酸緩衝液、脱イオン水を用いて調製）で反応させた。
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の表５に示されるとおりであった。
0003970770.tif 000016
表５の結果から、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥＩ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）、ＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ＫＤａ）といった、セルロース結合領域が欠失した各種ＲＣＥ  Ｉタンパク質は、どれもセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質ＲＣＥＩ−Ｈ４（４０ＫＤａ）よりも、はるかに高いレベルで綿生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。この事から、触媒領域のＮ末端側に残っているリンカー部分の長短にかかわらず、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失したＲＣＥ  Ｉタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質よりも、はるかに高いレベルで綿生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。また、人為的・非人為的、どちらの欠失のしかたによっても、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失したＲＣＥ  Ｉタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質ＲＣＥＩ−Ｈ４（４０ＫＤａ）よりも、はるかに高いレベルで綿生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。
〔実施例１０〕セルロース結合領域が欠失した各種精製ＲＣＥ  Ｉのリヨセル生地の毛羽除去比活性の比較
実施例５にて単一に精製されたエンドグルカナーゼを用いて、リヨセル生地（豊島株式会社製６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を実施例４記載の方法に改良を加えた条件にて行い、除去されずに残った毛羽の量を目視にて判定し、毛羽が完全に除去されるのに要する精製酵素の添加量を測定した。タンパク量の測定にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス社）を用い、添付のマニュアルの条件に従って行った。なお、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（４０ＫＤａ））は２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質（ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）及びＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４（２５ＫＤａ））と比べて約１．５倍の推定分子量があるため、仮に定量したタンパク質量が同じであったとしても、中に含まれる酵素分子の数に換算すると、４０ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質のほうには２５ＫＤａの精製ＲＣＥ  Ｉタンパク質の約２／３の分子数の酵素しか含まれていないことになる。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：９０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ６（１０ｍＭ酢酸緩衝液、脱イオン水を用いて調製）で反応させた。
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の表６に示されるとおりであった。
0003970770.tif 000017
表６の結果から、ＲＣＥ  Ｉ−Ｈ４３（２５ＫＤａ）、ＲＣＥＩ−Ｈ４５（２５ＫＤａ）、ＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ＫＤａ）といった、セルロース結合領域が欠失した各種ＲＣＥ  Ｉタンパク質は、どれもセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質ＲＣＥＩ−Ｈ４（４０ＫＤａ）よりも、高いレベルでリヨセル生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。この事から、触媒領域のＮ末端側に残っているリンカー部分の長短にかかわらず、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失したＲＣＥ  Ｉタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質よりも、高いリヨセル生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。また、人為的・非人為的、どちらの欠失のしかたによっても、セルロース結合領域（ＣＢＤ）が欠失したＲＣＥ  Ｉタンパク質の方がセルロース結合領域（ＣＢＤ）を保持した４０ＫＤａのタンパク質ＲＣＥＩ−Ｈ４（４０ＫＤａ）よりも、高いリヨセル生地の毛羽除去活性を示すことが分かる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
セルロース結合領域を欠失したＲＣＥ  Ｉ、ＲＣＥ  ＩＩ、ＲＣＥ  ＩＩＩ、ＭＣＥ  Ｉ、ＭＣＥ  ＩＩ、又はＰＣＥ  Ｉなどの接合菌由来のエンドグルカナーゼを作用させると、セルロース結合領域を保持したエンドグルカナーゼに比べその効果を飛躍的に向上させることができるため、セルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、柔軟化などの繊維加工処理や古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善処理において、より少ない酵素量での実施が可能になり、大幅にコストが低減化される。
配列表フリーテキスト
配列番号１３：ＲＣＥ  Ｉタンパク質（配列番号２）に対応するコドン最適化配              列
配列番号１７：ファミリー４５エンドグルカナーゼのセルロース結合領域に見ら              れる共通アミノ酸配列
配列番号２０〜２３：プライマー
配列番号２４：組換えタンパク質
配列番号２５〜２８：プライマー
配列番号２９：組換えタンパク質
配列番号３０〜３５：組換えタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
配列番号３６、３７：プライマー
配列番号３８：ＮＣＥ５アミノ酸配列
配列番号３９：ＮＣＥ５  ｃＤＮＡ配列
配列番号４０〜４３：プライマー
【配列表】
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