(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースからなる細胞培養用多孔質担体を用いた動物細胞培養において、
該細胞培養用多孔質担体が０．５ｍＥｑ／ｇ〜２．５ｍＥｑ／ｇの荷電密度及び２０μｍ〜５０μｍの孔径を有するとともに、
下記式（１）で求められる細胞培養用担体の移し替え比が１００倍〜１０００倍となるように、表面および／または内部に細胞を付着した古い多孔質担体を、細胞を付着していない新しい多孔質担体と混合することにより、担体から担体へ細胞を移し替え、連続的に増殖させることを特徴とする動物細胞の逐次培養方法。
移し替え比＝（ａ＋ｂ）／ａ  ・・・  （１）
ただし、  ａ＝古い培養担体の乾燥重量
ｂ＝新しい培養担体の乾燥重量
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、バイオインダストリー分野で発展しつつある多孔質担体を用いた細胞培養技術にかかわり、詳しくは、細胞活性を損うことなく連続的に細胞を増殖させることによる細胞培養スケールアップ技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、担体を用いた細胞培養における、担体から担体への細胞の継代方法としては、トリプシンに代表される酵素処理により担体から細胞を回収した後、血清を含む培地でトリプシンを不活性化させるか、キレート試薬処理により担体から細胞を回収した後、培地を添加してキレート試薬を中和して、それから新しい担体を加え移し替える方法が一般に知られている（Ｐｈｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ    ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄ  （１９８８）８０，松谷豊、動物細胞培養法入門（１９９３）２１５−２２３）。
【０００３】
しかしながら、トリプシンは、細胞の生存率を変化させ、細胞の表面結合性分子を取り除いてしまう（Ｋｅｌｌｙ  Ｒ．Ｏ．他、Ｏｎ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３）など、細胞に大きなダメージを与えてしまう欠点があることが知られている。加えて、大量培養の場合は、細胞の剥離・回収のための付帯装置が必要になると共に、細胞剥離工程が煩雑となる、あるいは長時間を要するという欠点を持ち合せている。また、トリプシンには、由来する動物からのウイルスや核酸などが混入している恐れがあり、これらによって生産物（医薬品など）が汚染される問題からも、トリプシンの使用は好ましくない。
【０００４】
このほか、担体から担体への細胞の継代方法として、培養が集密状態に近づいた時に新しい担体を加える方法が知られている。例えば、「ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ粒子」（Ｐｈｒｍａｃｉａ社製）を用いた例（Ｍａｎｏｕｓｏｓ．Ｍ．ほか、Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １５（１９８０）５０７−５１５）や、アクリル酸エステルやメタクリル酸エステルのような親水性合成高分子からなる担体での例（特開平５−９１８７２号公報）が知られている。しかしながら、前者は特殊な細胞（ＲＤ：ヒト横紋筋肉種）を用いた場合に限られ、かつ古い担体から遊離した細胞塊を分散する操作が必要である上、移し替え比は１．４〜２．０倍と低比率である点で問題があり、後者は、移し替え比が１５倍以下と低比率であり、不十分なものであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然系高分子からなる多孔質担体を用いた動物細胞培養において、細胞に対してトリプシンやキレート剤等を使用せずに、担体から担体へ細胞を移し替え、細胞活性を損なうことなく、連続的に増殖させる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明を完成させた。すなわち本発明は、多孔質担体を用いてその３次元構造中に細胞を固定し、培養液中を浮遊させる培養方法において、細胞を付着した古い担体と、細胞を付着していない新しい担体を混合することで、古い担体から新しい担体へ細胞を乗り移らせることにより、トリプシン等の酵素やキレート剤を使用せずに細胞の継代を可能にすることに成功し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、セルロースからなる細胞培養用多孔質担体を用いた動物細胞培養において、該細胞培養用多孔質担体が０．５ｍＥｑ／ｇ〜２．５ｍＥｑ／ｇの荷電密度及び２０μｍ〜５０μｍの孔径を有するとともに、
下記式（１）で求められる細胞培養用担体の移し替え比が１００倍〜１０００倍となるように、表面および／または内部に細胞を付着した古い多孔質担体を、細胞を付着していない新しい多孔質担体と混合することにより、担体から担体へ細胞を移し替え、連続的に増殖させることを特徴とする動物細胞の逐次培養方法である。
移し替え比＝（ａ＋ｂ）／ａ  ・・・  （１）
ただし、  ａ＝古い培養担体の乾燥重量
ｂ＝新しい培養担体の乾燥重量
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００８】
本発明における天然高分子としては、セルロース、ゼラチン、コラーゲンなどがあり、これらのうちセルロ−スが特に好ましい。
本発明においては、細胞培養用担体として天然高分子および／またはその誘導体からなる多孔質担体を用いることが肝要である。多孔質担体を用いることによって、多孔構造をもたない担体では行われ得なかった高比率での細胞移し替え（スケールアップ）が可能になる。これは、多孔質担体のほうが単なる球形担体に比べ、担体粒子あたりの固定細胞数が多いため、増殖して古い担体から遊離する細胞数が相対的に多いことと、多孔質ならではの３次元構造ゆえに、その遊離してくる細胞を新しい担体が獲得しやすいためと考えられる。
【０００９】
多孔質担体としては、粒子径が１００μｍ〜５ｍｍのものが好ましく、さらに１８０μｍ〜２１０ｍｍのものが好ましい。また、孔径が１０μｍ以上のものが好ましく、さらに２０μｍ〜５０μｍのものが好ましい。
また、多孔質担体としては、正荷電密度は０．１〜４．０ｍＥｑ／ｇのものが使用できるが、細胞増殖性の面から、０．５〜２．５ｍＥｑ／ｇの範囲が好ましい。本発明は、細胞が古い担体から新しい担体に能動的に移動する性質を利用したものであるが、細胞の乗り移り効率は、古い担体からの細胞の遊離効率が律速となる。そこで、シード培養（細胞移し替え前の培養）で、荷電密度の低い担体を使用することにより、古い担体から新しい担体への細胞の移動速度は速くなる。これは、担体の荷電密度が低いほど、細胞を付着させる荷電引力が小さいので、シード培養で増殖した細胞が、担体から遊離する頻度が高いためである。
【００１０】
また、古い担体の、担体あたりの付着細胞密度が高いほど、新しく増殖した細胞が遊離する頻度が高いため、結果として細胞の移し替え効率が高くなる。
本発明では、細胞培養担体の移し替え比が１．１〜１０００倍まで良好に細胞の移し替えが見られるが、移し替え比が小さ過ぎるとスケールアップ効率が悪く実用的ではないため、１６〜１０００倍であることが好ましい。また１０００倍までの高比率でのスケールアップを可能にしたことにより、大量培養を行う際のスケールアップ回数を減らすことができ、これはすなわち細胞培養設備コストの削減にもつながる。ここで、移し替え比は以下の式で表される。
【００１１】
移し替え比＝（ａ＋ｂ）／ａ
ただし、  ａ＝古い培養担体の乾燥重量
ｂ＝新しい培養担体の乾燥重量
本発明においては、培養液を懸濁状態または擬似浮遊状態で古い担体から新しい担体へ細胞を移し替えることが好ましい。これはいったん沈降させて細胞が担体から担体へ乗り移らせる操作段階を踏む必要がなく、培養系として均一な状態を保持したまま、細胞の移し替えを行うことを表している。それによって細胞は古い担体から新しい担体に均一に移動する。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例中多孔質担体の荷電密度、粒径、孔径は次の方法で測定した。
（１）荷電密度
多孔質担体を０．３Ｎ  ＨＣｌ水溶液、１０-4Ｎ  ＨＣｌ水溶液、１０％Ｎａ2 ＳＯ4 水溶液（この時、滴定用の濾液を採取）、水で洗浄し、乾燥した後、前記濾液に０．１Ｍクロム酸カリウム水溶液２ｍｌを加え、１Ｍ  ＡｇＮＯ3 水溶液で滴定する。滴定量、乾燥後の多孔質担体の重量を下記式に代入し、荷電密度を算出した。
【００１３】
荷電密度＝滴定量（ｍｌ）／乾燥後の多孔質担体の重量（ｇ）〔ｍｅｑ／ｇ〕
（２）粒子径、孔径
粒子径は、未乾燥状態のまま光学顕微鏡（オリンパス光学工業社製ＩＭＴ−２）により測定した。この際、５０μｍ以下の微粒子については、洗浄後の未乾燥粒子を液体窒素で急速冷却して構造を保ったまま凍結した後、真空中で凍結乾燥し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（日立製作所製Ｓ−５７０）を用いた観察測定も併用した。
【００１４】
孔径は、凍結乾燥処理した試料を金スパッタリング処理してＳＥＭで適当な倍率に拡大し観察測定した。担体が真球や真円でない場合にはもっとも短い直径をもって測定した。
【００１５】
【実施例１】
動物細胞培養用多孔質担体として、セルロースを材質とする多孔質担体「旭化成マイクロキャリヤ」（商品名；旭化成工業株式会社製、直径２００μｍ、孔径３０μｍ、荷電密度０．９８ｍＥｑ／ｇ）を用意し、この担体を乾燥重量２．０ｇ／ｌの密度になるよう、１００ｍｌ容スピナーフラスコ（ベルコ社製）中に、１０％子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬株式会社製）１００ｍｌに懸濁して準備し、遺伝子組み替えＣＨＯ細胞（マウスIL-4生産株）を２．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して37℃で撹拌培養を５日間行った。５日目の細胞密度は６．４×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌだった。この培養をシード培養と呼ぶことにする。また、ここで使用した培地を増殖培地と呼ぶことにする。別の１００ｍｌ容スピナーフラスコに、同様に「旭化成マイクロキャリア」を０．１９ｇ／９５ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養５日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を５ｍｌ添加し、培養を継続した。なお、この実施例での移し替え比は、２０倍である。
【００１６】
移し替え後の培養中は毎日、細胞密度および下記式で表わされる付着率を測定した。付着率の増加は、古い担体から新しい担体への細胞の移動効率を表わす。
付着率＝ｘ×１００／（ｘ＋ｙ）
ただし、ｘ＝細胞を付着した多孔質担体の数
ｙ＝細胞を付着していない多孔質担体の数
その結果、図１に示されるように、移し替え後も細胞は順調に対数増殖を繰返した。また、付着率の増殖（図２）から、細胞が古い多孔質担体から新しい多孔質担体へ乗り移ったことが確認できた。
【００１７】
【実施例２】
動物細胞培養用多孔質担体として、下に示すような異なる荷電密度を持つ４種類の「旭化成マイクロキャリヤ」を準備した。
▲１▼０．５８ｍＥｑ／ｇ
▲２▼０．９８ｍＥｑ／ｇ
▲３▼１．５９ｍＥｑ／ｇ
▲４▼２．０２ｍＥｑ／ｇ
上記の▲１▼および▲２▼の２種類の荷電密度の多孔質担体を乾燥重量２．０ｇ／ｌの密度に、それぞれ別の１００ｍｌスピナーフラスコ中に、実施例１同様の増殖培地１００ｍｌに懸濁して準備し、実施例１同様の遺伝子組み替えＣＨＯ細胞を２×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して37℃で撹拌培養を４日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。シード培養４日目の細胞密度は、上記▲１▼の多孔質担体を用いた培養では４．０  ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、上記▲２▼の多孔質担体を用いた培養では６．０  ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌだった。
【００１８】
さらに、上記の▲２▼、▲３▼および▲４▼の３種類の多孔質担体をそれぞれ、０．１９ｇずつ増殖培地９５ｍｌに懸濁したものを１００ｍｌスピナーフラスコ２本ずつ用意し、上記のシード培養４日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）５ｍｌを下記のような組合わせで移し替えを行い、培養を継続した。なお、この場合の移し替え比は２０倍である。
（１）▲１▼移し替え前０．５８ｍＥｑ／ｇ→▲２▼移し替え後０．９８ｍＥｑ／ｇ
（２）▲１▼移し替え前０．５８ｍＥｑ／ｇ→▲３▼移し替え後１．５９ｍＥｑ／ｇ
（３）▲１▼移し替え前０．５８ｍＥｑ／ｇ→▲４▼移し替え後２．０２ｍＥｑ／ｇ
（４）▲２▼移し替え前０．９８ｍＥｑ／ｇ→▲２▼移し替え後０．９８ｍＥｑ／ｇ
（５）▲２▼移し替え前０．９８ｍＥｑ／ｇ→▲３▼移し替え後１．５９ｍＥｑ／ｇ
（６）▲２▼移し替え前０．９８ｍＥｑ／ｇ→▲４▼移し替え後２．０２ｍＥｑ／ｇ
移し替え後の培養中は毎日、細胞密度および付着率（定義は実施例１と同様）を測定した。付着率の増加は、古い担体から新しい担体への細胞の移動効率を表わす。
【００１９】
その結果、細胞の移し替え後の細胞増殖は、図３（表１）に示されるように、マイクロキャリアの荷電密度の影響を受けず対数増殖した。しかし、細胞の移動効率を表わす付着率の変動は、図４（表２）に示されるように、シード培養で０．５８ｍＥｑ／ｇの荷電密度の多孔質担体を用いた場合では、０．９８ｍＥｑ／ｇのものを用いた場合に比べてその増加が速かった。これは、シード培養で用いるマイクロキャリアの荷電密度が低い（０．５８ｍＥｑ／ｇの場合の）ほうが、細胞移し替え後の細胞移動効率が良いことを表わしている。
【００２０】
【表１】
0003982843.tif 000002
【００２１】
【表２】
0003982843.tif 000003
【００２２】
【実施例３】
動物細胞培養用多孔質担体として、「旭化成マイクロキャリア」（荷電密度０．９８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、実施例１同様の増殖培地１００ｍｌに懸濁して準備し、実施例１同様の遺伝子組み替えＣＨＯ細胞を１．２５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して37℃で５日間撹拌培養を行った。５日目の細胞密度は３．１  ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌだった。この培養を１代目シード培養と呼ぶことにする。
【００２３】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコに、同様の「旭化成マイクロキャリア」０．０４９５ｇを、増殖培地９９ｍｌに懸濁して２代目培養を準備し、上記の１代目培養５日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。なお、この実施例での移し替え比は、１００倍である。
さらに、細胞密度が移し替え後の１００倍程度に増殖したら、再び同様の方法で１００倍比で細胞の移し替えを行った。これを３回繰返して連続して４代目まで培養を継続した。
【００２４】
培養中は毎日、細胞密度の測定を行った。
その結果、細胞の移し替え後の細胞増殖は、図５に示されるように、継代回数を増やしても対数増殖を繰返した。
【００２５】
【実施例４】
動物細胞培養用多孔質担体として、「旭化成マイクロキャリア」（荷電密度０．９８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度のなるよう、１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、実施例１同様の増殖培地１００ｍｌに懸濁して準備し、実施例１同様の遺伝子組み替えＣＨＯ細胞を３×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。３日目の細胞密度は３．８×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌだった。この培養をシード培養とする。
【００２６】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコに、同様の「旭化成マイクロキャリア」１．０ｇ／ｌの密度になるよう増殖培地に懸濁して準備し、シード培養の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）０．２ｍｌを添加し培養を継続した。尚、この場合の移し替え比は１０００倍である。
その結果、移し替え直後の細胞密度は７．６  ×１０3 ｃｅｌｌｓ／ｍｌだったのに対し、９日目の細胞密度は１．３  ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した。また付着率も移し替え直後の０．１％から、９日目には９５％に増加しており、1000倍という高比率の移し替え後も細胞は古い多孔質担体から新しい多孔質担体へ乗り移って増殖した。
【００２７】
【実施例５】
動物細胞培養用多孔質担体として、２種類の荷電密度を持つ「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇと１．８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、それぞれ１本の１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、１０％牛胎児血清（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を含むe-RDF 培地１００ｍｌに懸濁した。ＨｅＬａ細胞を、１．１  ×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００２８】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコ１本ずつに、前述と同様の２種類の荷電密度の「旭化成マイクロキャリア」をそれぞれ０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。ただし、移し替え前後の多孔質担体の荷電密度は同じものを用いた。
【００２９】
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
その結果、図６に示されるように細胞はいずれも移し替え後に対数増殖し、また図７に示されるように付着率も増加した。また、この際付着率の増加は、シード培養で用いた多孔質担体あたりのＨｅＬａ細胞密度がある一定値を越えた時（移し替え後３日目）から始った。
【００３０】
【実施例６】
動物細胞培養用多孔質担体として、２種類の荷電密度を持つ「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇと１．８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、それぞれ１本の１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、１０％牛胎児血清（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を含むｅ−ＲＤＦ培地１００ｍｌに懸濁した。ＢＨＫ−２１細胞を、３．５  ×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００３１】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコ１本ずつに、前述と同様の２種類の荷電密度の「旭化成マイクロキャリア」をそれぞれ０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。ただし、移し替え前後のマイクロキャリアの荷電密度は同じものを用いた。
【００３２】
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
その結果、図８に示されるように細胞はいずれも移し替え後に対数増殖し、また図９に示されるように付着率も急激に増加した。
【００３３】
【実施例７】
動物細胞培養用多孔質担体として、「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、１０％牛胎児血清（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を含むｅ−ＲＤＦ培地１００ｍｌに懸濁した。Ｖｅｒｏ細胞を、２．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  の密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００３４】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコに、同様の「旭化成マイクロキャリア」を０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
【００３５】
その結果、図10に示されるように細胞は移し替え後に対数増殖し、また図11に示されるように付着率も徐々に増加した。
【００３６】
【実施例８】
動物細胞培養用多孔質担体として、「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇ  ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、１０％牛胎児血清（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を含むｅ−ＲＤＦ  培地１００ｍｌ  に懸濁した。ヒト×ヒトハイブリドーマ細胞（ＨＦ１０Ｂ４）を、１．０  ×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００３７】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコに、同様の「旭化成マイクロキャリア」を０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
【００３８】
その結果、図１２に示されるように細胞は移し替え後に対数増殖し、また図１３に示されるように付着率も徐々に増加した。
【００３９】
【実施例９】
動物細胞培養用多孔質担体として、２種類の荷電密度を持つ「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇと１．８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、それぞれ１本の１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、１０％牛胎児血清（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を含むｅ−ＲＤＦ培地１００ｍｌに懸濁した。マウス×マウスハイブリドーマ細胞（ＨｙＧＰＤ，ＹＫ−１−１）を、３．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００４０】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコ１本ずつに、前述と同様の２種類の荷電密度の「旭化成マイクロキャリア」をそれぞれ０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。ただし、移し替え前後の多孔質担体の荷電密度は同じものを用いた。
【００４１】
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
その結果、図１４に示されるように細胞はいずれも移し替え後に対数増殖し、また図１５に示されるように付着率も急激に増加した。
【００４２】
【実施例１０】
動物細胞培養用多孔質担体として、２種類の荷電密度を持つ「旭化成マイクロキャリア」（１．０ｍＥｑ／ｇと１．８ｍＥｑ／ｇ）を準備した。これを乾燥重量０．５ｇ／ｌの密度になるよう、それぞれ１本の１００ｍｌ容スピナーフラスコ中に、無血清細胞培養用添加剤ＲＤ−１（極東製薬株式会社製）を含むｅ−ＲＤＦ培地１００ｍｌに懸濁した。マウス×マウスハイブリドーマ細胞（ＨｙＧＰＤ，ＹＫ−１−１）を、２．５  ×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  の密度に接種して３７℃で撹拌培養を３日間行った。この培養をシード培養と呼ぶことにする。
【００４３】
別の１００ｍｌ容スピナーフラスコ１本ずつに、前述と同様の２種類の荷電密度の「旭化成マイクロキャリア」をそれぞれ０．０５ｇ／１００ｍｌとなるよう増殖培地に懸濁して準備し、上記のシード培養３日目の培養液（細胞を付着した多孔質担体を含む）を１ｍｌ添加し、培養を継続した。ただし、移し替え前後の多孔質担体の荷電密度は同じものを用いた。
【００４４】
移し替え後、細胞密度および付着率の変動を測定した。
その結果、図１６に示されるように細胞はいずれも移し替え後に対数増殖し、また図１７に示されるように付着率も急激に増加した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、天然系高分子からなる多孔質担体を用いた動物細胞培養において、トリプシン等の酵素やキレート剤を使用することなく、細胞を付着した担体に新しい担体を混合することで、細胞を担体から担体へ移し替え、連続的に増殖させることが可能となった。それによって下記のような効果が得られ、本発明は動物細胞の工業的高密度大量培養を可能にするものである。
【００４６】
▲１▼トリプシン処理工程が不要になる。
▲２▼細胞の活性を維持できる。
▲３▼微生物等による汚染の危険性が低下する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図２】本発明の実施例１における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図３】本発明の実施例２における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図４】本発明の実施例２における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図５】本発明の実施例３における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図６】本発明の実施例５における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図７】本発明の実施例５における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図８】本発明に実施例６における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図９】本発明の実施例６における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図１０】本発明の実施例７における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図１１】本発明の実施例７における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図１２】本発明の実施例８における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図１３】本発明の実施例８における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図１４】本発明の実施例９における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図１５】本発明の実施例９における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図１６】本発明の実施例１０における移し替え後の細胞増殖曲線を表す図である。
【図１７】本発明の実施例１０における移し替え後の付着率の変動を表す図である。
【図１】
0003982843.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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