(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを発酵生産するストレプトマイセス（Streptomyces）種微生物を好気的に培地に培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、培養液中の残存アンモニウム態窒素濃度を0.5〜3g／リットルの範囲内に制御し、かつ培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において40g／リットル以下にすることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項２】
培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において22g／リットル未満にすることを特徴とする請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項３】
培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において15g／リットル以下にすることを特徴とする請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下εＰＬという）の製造法に関する。当該物質は、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマ−であるため、安全性が高くかつカチオン含量が高いので、特異な物性を有する。したがって、トイレタリ−用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等への用途が期待されている。特に食品添加物の分野では、天然物系の添加物として大きく注目されている。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を用いたεＰＬの製造法が特公昭59−20359号公報に、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus) 菌株をＬ−リシンのアナログ物質に耐性を有する変異株に変異処理して、得られた該変異株を培地に培養し、培養液中にεＰＬを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするεＰＬの製造法が特公平3-78998号公報に、また、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス菌株のεＰＬの生産に関与する遺伝子を含むプラスミドをクロラムフェニコ−ルを用いて増幅させ、得られた菌株をＬ−リシンを添加した培地にて培養し、培養液中にεＰＬを生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とするεＰＬの製造法が特公平3-42075号公報にそれぞれ記載されている。
【０００３】
しかしながら、これらのεＰＬ製造法は、菌株を特徴としたものであり、培養条件、特に残存窒素濃度を制御すること及び陰イオン濃度を抑制して培養する技術についてはなんら開示されていない。さらに、リン酸濃度を制御し、Ｌ−リジン及び硫酸アンモニウムを培地中に含有することを特徴とするεＰＬ製造法が特開平8-163992号公報に開示されている。しかしながら、この公報では、窒素源である硫酸アンモニウム濃度が2〜20g／リットルになるように追加するのが好ましい旨記載されており、この場合、長時間培養すると陰イオンである硫酸イオン濃度が高くなりすぎるという問題点がある。また、該公報記載の方法は、εＰＬのモノマ−であるＬ−リジンを主原料として、εＰＬを生産するものであり、グルコ−ス等の炭素源と硫酸アンモニウム等の窒素源を原料として直接εＰＬを発酵法で生成するものとは根本的に異なる。
【０００４】
これら従来の方法では、εＰＬ生産性が未だ低く、種々の用途に対応しうる安価なεＰＬを製造するのは困難であるという問題点がある。そこでεＰＬの生産性を高めることにより、工業的に安価な製造法が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、εＰＬの工業的に安価な製造法について鋭意検討を重ねた。その結果、εＰＬ生産能を有するストレプトマイセス属微生物を培養する際に、該培養液中の残存アンモニウム態窒素濃度を0.5〜3g／リットルの範囲内に制御し、かつ、培養液中に添加する硫酸イオン濃度を培養後において40g／リットル以下にすることにより、εＰＬ生産量が増大することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、εＰＬの生産量を増大させ、安価で有利なεＰＬの製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記の通りである。
（１）ε−ポリ−Ｌ−リジンを発酵生産するストレプトマイセス（Streptomyces）種微生物を好気的に培地に培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、培養液中の残存アンモニウム態窒素濃度を0.5〜3g／リットルの範囲内に制御し、かつ培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において40g／リットル以下にすることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（２）培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において22g／リットル未満にすることを特徴とする前記第１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（３）培養液中への添加硫酸イオン濃度を培養後において15g／リットル以下にすることを特徴とする前記第１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【０００７】
本発明に使用できる微生物は、εＰＬを生産する能力のあるストレプトマイセス属微生物であればいずれでも使用可能であるが、特にストレプトマイセス・アルブラス種微生物が望ましい。かかるストレプトマイセス・アルブラス種微生物の具体的な例としては、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus)11011A-1株（ＦＥＲＭ  BP-1109 ）があげられる。
【０００８】
本発明の製造法にあっては、培養液中の残存アンモニウム態窒素濃度を 0.5 〜 3g／リットルに制御することが重要である。培養開始時の培地中のアンモニウム態窒素濃度は通常2.1g／リットル（硫安濃度として10g／リットル）であるが、培養開始後、菌体の増殖及びεＰＬの生産とともに残存アンモニウム態窒素濃度は低下する。残存アンモニウム態窒素濃度が低下した後に、該残アンモニウム態存窒素濃度が 3g／リットルを超えないようにアンモニウム態窒素源を逐次添加もしくは連続添加する。ただし、窒素が完全に消費つくされてしまうとεＰＬの生産も停止してしまうため、常にアンモニウム態窒素が培養液中に残存するように維持することが重要である。
【０００９】
添加するアンモニウム態窒素源の形態としては硫酸アンモニウムが好ましい。ただし、アンモニウム態窒素源として硫酸アンモニウムのみを添加して長時間培養を行うと、硫酸アンモニウムの添加量が多くなり、結果として硫酸イオンが多量に蓄積することになる。そこで硫酸イオン濃度を抑える方法として、アンモニア水を添加する方法が考えられる。εＰＬ生産株においては、アンモニウム態窒素源としてアンモニア水であろうとアンモニウム塩であろうと利用可能であるが、アンモニア水を添加した場合ｐＨが高くなることから、添加量のバランスが重要となってくる。
【００１０】
本発明の製造法においては、ｐＨ調整用のアルカリ物質（εＰＬ生産株を培養すると培養液中のｐＨが低下するため、ｐＨの低下を抑えるためにアルカリが必要）としてアンモニア水を用いることにより、必要窒素量の一部をアンモニア水で補い、アンモニウム塩（好ましくは硫酸アンモニウム）の添加量を少なくし、陰イオンの蓄積量を抑えることによりεＰＬの生産量を増大させるものである。
【００１１】
本発明で使用する培地としては、アンモニウム態窒素源の他に炭素源、無機物及びその他の栄養源を適当に含有する培地ならばいずれも使用できる。炭素源としては、グルコ−ス、フラクト−ス、グリセリン、スタ−チ、ガラクト−ス、マンニト−ル、イノシト−ル、サリシン等のεＰＬ生産株が資化可能なものならいずれも使用できる。培地中の残存炭素源濃度は、培養開始後、菌体の増殖及びεＰＬの生産とともに低下する。残存炭素源濃度が低下したら、炭素源を逐次あるいは連続的に添加する。また、無機物としては、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ナトリウムイオン等が挙げられる。その他の栄養源として、酵母エキスを1 〜5g／リットル含有させることは、菌の生育を良くし、εＰＬの生産においても好ましい結果が得られる。
【００１２】
培養は、好気的条件下で振とう培養、撹拌培養等で行う。培養温度は２５〜３５℃が好ましい。培地のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましいが、培養開始後、菌の生育とともにｐＨは低下する。ｐＨが４まで低下した時点で、アンモニア水を添加してｐＨを４に維持させる。通常１〜７日間でεＰＬは培養液中に蓄積される。
【００１３】
上記εＰＬを含有する培養液を遠心分離もしくはフィルタ−で菌体を除いた後、菌体除去液を精製、脱色し、これを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノ−ル等の有機溶媒で晶析することにより、目的のεＰＬが得られる。
【００１４】
【実施例】
本発明を実施例より更に詳細に説明する。
なお、培養液中のεＰＬ濃度は、イツアキ(Itzhaki) :アナリティカルバイオケミストリ-(Analytical Biochemistry),50,569,1972の方法により測定した。すなわち、培養液を遠心分離して菌体を除いた後、菌体除去液（εＰＬ: 0 〜200 μg ）２mlと１ｍＭメチルオレンジ水溶液２mlとを混合し、室温で３０分間放置してεＰＬ−メチルオレンジコンプレックスを生じさせる。その後、遠心することにより、該εＰＬ−メチルオレンジコンプレックスを除いた上澄水の４６５ｎｍにおける吸光度を測定し、εＰＬ量を求めた。
また、実施例中の％は特に断らない限り、重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％である。
【００１５】
実施例１
グルコ−ス 50g／リットル、酵母エキス 5g／リットル、硫酸アンモニウム 10g／リットル、k2HPO4 0.8g／リットル、KH2PO4 1.36 g／リットル、MgSO4・7H2O 0.5g／リットル、ZnSO4・7H2O 0.04 g／リットル、FeSO4・7H2O 0.03g／リットル、pH 6.8 に調製した２リットルの培地を３リットル容ジャ−に入れ、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)11011A-1株（ＦＥＲＭ BP-1109号）の前培養液100ミリリットルを接種し、３０℃、７００rpm 、通気量３リットル／分で９６時間好気培養を行った。ただし、培養開始後、残存グルコ−ス濃度が10g／リットル以下に低下した時点で、該残存グルコ−ス濃度が50g／リットルになるようにグルコ−スを添加した。以後も同様に残存グルコ−ス濃度が10g／リットル以下になった時点で該残存濃度が50g／リットルになるようにグルコ−スを逐次添加した。また、硫酸アンモニウムについては、グルコ−ス添加と同時にグルコ−スの1/10倍量（重量比）を逐次添加した。ｐＨの調整については、１０重量％アンモニア水を用いてｐＨを４に維持した。
培養中の残存アンモニア態窒素の濃度範囲及び９６時間培養後の硫酸イオン濃度及びεＰＬ生産量を表１に示した。
【００１６】
実施例２
硫酸アンモニウムの逐次添加量をグルコ−スの1/20倍量（重量比）にしたこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。
培養中の残存アンモニア態窒素の濃度範囲及び９６時間培養後の硫酸イオン濃度及びεＰＬ生産量を表１に示した。
【００１７】
比較例１
硫酸アンモニウムの逐次添加量をグルコ−スの1/5倍量（重量比）にしたこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。培養中の残存アンモニア態窒素の濃度範囲及び９６時間培養後の硫酸イオン濃度、εＰＬ生産量を表１に示した。
【００１８】
比較例２
硫酸アンモニウムの逐次添加量をグルコ−スの1/5倍量（重量比）にしたこと及びｐＨの調整に６Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いたこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。培養中の残存アンモニア態窒素の濃度範囲及び９６時間培養後の硫酸イオン濃度及びεＰＬ生産量を表１に示した。
【００１９】
比較例３
硫酸アンモニウムの逐次添加量をグルコ−スの1/2倍量（重量比）にしたこと及びｐＨの調整に６Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いたこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。培養中の残存アンモニア態窒素の濃度範囲及び９６時間培養後の硫酸イオン濃度及びεＰＬ生産量を表１に示した。
【００２０】
【表１】
0003944934.tif 000002
【００２１】
表１の結果から明かなように、残存アンモニウム態窒素濃度が 3 g／リットルを超えた場合（比較例１）及び残存窒素濃度が0.5 g／リットルを下回った場合（比較例２）はεＰＬ生産量が大幅に低下する。また、硫酸イオン濃度が40g／リットル を超えた場合も（比較例３）、εＰＬ生産量が低下する。したがって、培養液中の残存窒素濃度を0.5 〜3 g／リットルの範囲内に制御し、かつ、培養液中への添加陰イオン濃度を40g／リットル以下にすることにより、εＰＬ生産量が増大することがわかる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、εＰＬ生産量を増大させることが可能となり、その結果、安価にεＰＬを製造することができる。