(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成を時間的に異ならせながら移動相を分析装置に供給していく移動相グラジエント装置において、
複数種類の移動相をそれぞれ制御された流量で供給する移動相供給部と、
前記移動相供給部から供給された移動相を混合する混合器と、
前記混合器により混合された移動相を管内にその長さ方向に沿って供給された順に収容していくグラジエントチューブと、
前記グラジエントチューブを前記移動相供給部と前記分析装置との間で切り替えて接続する流路切替えバルブとを備えた移動相グラジエント装置。
【請求項２】
前記流路切替えバルブには前記グラジエントチューブが複数本接続されている請求項1に記載の移動相グラジエント装置。
【請求項３】
試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から前記分離カラムに至る流路に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフにおいて、
前記移動相供給部として請求項１又は２に記載の移動相グラジエント装置を備え、前記グラジエントチューブに収容された移動相を１台の送液ポンプにより供給するようにしたことを特徴とする高速液体クロマトグラフ。
【請求項４】
前記試料注入部には試料中の目的成分を濃縮するトラップカラムが設けられている請求項3に記載の高速液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組成を時間的に異ならせながら移動相を分析装置に供給していく移動相グラジエント装置と、そのような移動相グラジエント装置を備えた分析装置の一例としての高速液体クロマトグラフに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
これまでの高速液体クロマトグラフは、クロマトグラフの分離性能向上と分析時間短縮のためグラジエント分析が行われている。グラジエント分析とは、移動相の組成を分析開始時から終了時までの問に変化させる分析方法のことである。移動相組成を変更させるために、高圧グラジエント法では、２台の送液ポンプを用意し、例えば１台のポンプから水、もう１台のポンプからはメタノールを送液し、流量比を変えながら、かつ合計流量は常に一定になるように送液する。すなわち、水を１００％の状態から０％まで送液を行なうと同時に、メタノールは０％から１００％まで流量を変化させながら送液を行なう。低圧グラジエント法では、１台の送液ポンプを使用し、移動相を供給するバルブの切換えにより移動相組成を制御する。
【０００３】
しかし、この２つの移動相が混合されにくい場合には、分析の再現性不良やピーク形状不良などの問題を引き起こす。そこで、その問題を回避するため、通常、グラジエント分析を行なう際には複数の移動相が混合される部位に混合器（ミキサー）を配置することにより移動相の混合性能を改善している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
通常、混合器は内部容量が１０μＬ以上ある。一方、ミクロ分析のように流量が小さい場合、例えば５μＬ／分の場合には、混合器内部の液置換だけでも２分間以上かかり、全分析時間の遅延の主な原因となっている。
また、混合器に至る配管などの容量も全分析時間の遅延に影響をもたらす。
本発明の第１の目的は、混合器やその近くの配管も含めたグラジエント調製部での時間遅れをなくしてグラジエント分析に必要な移動相を供給できる移動相グラジエント装置を提供することである。
本発明の第２の目的は、そのようなグラジエント装置を備えた分析装置の1つの応用例としての液体クロマトグラフを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の移動相グラジエント装置は、複数種類の移動相をそれぞれ制御された流量で供給する移動相供給部と、その移動相供給部から供給された移動相を混合する混合器と、その混合器により混合された移動相を管内にその長さ方向に沿って供給された順に収容していく移動相配管（グラジエントチューブという）と、そのグラジエントチューブを前記移動相供給部と分析装置との間で切り替えて接続する流路切替えバルブとを備えている。
【０００６】
本発明の高速液体クロマトグラフは、移動相供給部として上の移動相グラジエント装置を備え、グラジエントチューブに収容された移動相を１台の送液ポンプにより供給するようにしたものである。
その高速液体クロマトグラフでは、サンプル導入部直前のグラジエントチューブの中に組成勾配をもつ移動相を予め封入しておき、試料注入直後にそのグラジエントチューブ中の移動相を試料注入部を介して分析カラムに送り込む。このとき、グラジエントチューブに収容された移動相を１台の送液ポンプにより供給するので、従来の高圧グラジエント法の場合の２台の送液ポンプ間のばらつきや、低圧グラジエント法の場合のバルブの切換えに基づく分析ラインでの移動相の送液精度の低下を防ぐことができる。
【０００７】
【作用】
本発明の高速液体クロマトグラフでは、分析開始時に、予め移動相の組成変化が達成されているため、分析開始後、遅れ時間なく移動相の組成変化が始まり、分析カラムでの分析が開始される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
図1は第１の実施例の移動相グラジエント装置を適用した高速液体クロマトグラフの一実施例を示したものである。
六方バルブ２にはグラジエントチューブ４が接続されている。グラジエントチューブ４はステンレス、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、キャピラリーチューブなど、クロマトグラフィーで使用可能な配管であり、少なくとも1回の分析で必要とされる移動相を収容できる容量を備えている。グラジエントチューブ４は組成が調製されて供給された移動相を、供給された順に収容する。グラジエントチューブ４内では、時間が異なって供給された移動相間で混合が起こりにくくするために、内径が細い方が好ましいが、流路抵抗との兼ね合いで適当な内径のものを選択する。
【０００９】
バルブ２の1つのポートには混合器６を介して２台の移動相供給ポンプＰ１，Ｐ２が接続されている。ポンプＰ１とＰ２はそれぞれ異なる溶媒を移動相として供給するものである。バルブ２の他のポートには試料注入器８が接続され、試料注入器８の下流には試料成分を分離する分離カラム１０が接続され、さらに、分離カラム１０の下流には分離された試料成分を検出する検出器１２が接続されている。試料注入器８は自動的に注入を行なうオートサンプラーとすることもできるし、手動で注入するインジェクタとすることもできる。分離カラム１０及び検出器１２は測定対象に応じて適当なものを選択することができる。バルブ２の更に他のポートには組成が一定の移動相を供給するポンプＰ３が接続され、バルブ２の更に１つのポートはドレインに接続されている。
【００１０】
バルブ２は、実線の流路に設定すると、混合器６で混合された移動相をチューブ４を経てドレインへ流し、ポンプＰ３から供給される移動相を試料注入器８を経て分離カラム１０につながる流路に接続する。一方、バルブ２を破線の流路に設定すると、ポンプＰ３から供給される移動相によってグラジエントチューブ６内に収容された移動相を押し出し、その移動相を試料注入器８を経てカラム１０につながる流路に供給する。
【００１１】
この実施例の動作の例として、通常のオートサンプラーでの応用例を示す。ポンプＰｌには水、ポンプＰ２にはメタノール、ポンプＰ３には水とメタノールを混合した液、例えば水：メタノール＝７０：３０の混合液を用意しておく。ポンプＰ３はカラムの初期安定のため常に流速５μＬ／分程度で運転状態にしておく。
【００１２】
バルブ２を実線の流路の状態に設定し、移動相組成勾配を持たせるグラジエントチューブ４にポンプＰ１，Ｐ２から移動相組成を変えながら移動相の送液を行なう。分離カラム１０を通る分析流路の流速は、例えば上に示したような５μＬ／分というような小さな値であるが、混合器６を経てグラジエントチューブ４に移動相を充填する際の流速は分析流路の流速とは関係なく大きな値に設定することができる。そこで、グラジエントチューブ４に移動相を送り込む流量を例えば１ｍＬ／分としておけば、グラジ工ントチューブ４の内部容量が１００μＬであれば、移動相の充填は６秒で完了する。
【００１３】
図２にグラジエントチューブ４に収容された移動相の組成の状態の一例を示す。この実施例ではチューブ４には、出口側（カラム側）から入口側に向かって体積で７５％の範囲では水の組成が７０％から３０％に直線的に減少するように組成変化した移動相が充填されており、それより入口側には水の組成が３０％で一定となった移動相が収容されている。
【００１４】
グラジ工ントチューブ４への移動相の充填を完了した後、オートサンプラー８にて試料注入をおこない、分析を開始する。分析が開始されたらバルブ２を回転させて破線の流路に切り替え、グラジ工ントチューブ４中の移動相を分離カラム１０ヘと送り込む。バルブ２の回転とともに、グラジエントチューブ４内で移動相の最初の部分、すなわち水７０％の部分の移動相が、注入された試料を分離カラム１０へと搬送する。分離カラム１０の先端では試料の先端濃縮が行われるが、グラジエントチューブ４内の移動相が次々と移動相組成を変えながら、すなわち、水の混合比が小さくなりながら分離カラム１０ヘと送り込まれ、分離カラム１０では試料のグラジエント分析が行なわれていく。
【００１５】
１５分間が経過するとグラジエントチューブ４内の組成変化部分はすべて外に押し出され、続いてその後５分間水３０％の状態の移動相が分離カラム１０へと送り込まれる。これで一連の分析が終了し、再度バルブ２が回転させられて実線の流路の状態になり、初期状態へと戻る。
【００１６】
図１の実施例の動作の例として、分析用の移動相は同じであるが、ポンプＰ３からは有機溶媒リッチの溶液（いわゆる移動相など）としておけば、分離カラム１０の洗浄が可能になる。すなわち、目的成分の溶出が終了したら、バルブ２を切り換えて分離カラム１０にポンプＰ３から有機溶媒リッチの溶液を流すことによって、分離カラム１０内の不要な成分を押し出すことができる。ただし、この場合には、試料注入前にグラジエントチューブ４内の移動相を押し出し始めておく。
【００１７】
（実施例２）
図３は第２の実施例の移動相グラジエント装置を備えた他の構成の高速液体クロマトグラフの実施例を示したものである。
六方バルブ２及びそれに接続されたグラジエントチューブ４は図１の実施例と同じである。この実施例ではポンプＰ１、Ｐ２から供給される移動相を混合する混合器として、微量流量の混合が可能なＳＴＡＲユニット２０とダイナミックミキサ２２からなるＳＴＡＲミキサーシステムを用いた。
【００１８】
ＳＴＡＲユニットとは、図４に示すように流路を複数に分岐させるコネクタ３０、分岐した流路を合流させるコネクタ３２、及び両コネクタ３０，３２間に並列に接続された分岐数だけの流路３４−１〜３４−３から構成されている。分岐流路３４−１〜３４−３の数はこの例のように３本には限られない。各分岐流路３４−１〜３４−３は抵抗により流速を制御する配管（例えば内径０.１ｍｍ）と容量によって遅れ時間を制御する配管（例えば内径０．８ｍｍ）とから構成され、各分岐流路３４−１〜３４−３ごとに両配管の比率が設定されている。
【００１９】
ダイナミックミキサ２２は流路内にスターラチップを収納したチャンバーを持ち、下部に設けられたスターラによりそのチャンバー内のスターラチップを回転させてチャンバー内の液を混合させるものである。
【００２０】
図３の流路の説明に戻ると、この実施例の試料注入部は、試料中の目的成分を濃縮するために、トラップカラム２４と六方バルブ２６を備えている。六方バルブ２６の１つのポートに希釈液を供給する送液ポンプＰ４が接続され、その希釈液流路に試料を注入するオートサンプラー２８が設けられている。トラップカラム２４はバルブ２とバルブ２６の間に接続されている。
分離カラム１０はバルブ２６に接続され、分離カラム１０の下流に検出器１２が接続されている。バルブ２６の他のポートに組成が一定の移動相を供給する送液ポンプＰ３が接続されている。
【００２１】
トラップカラム２４としては、目的成分を吸着する膜の上流側に、又は上流側と下流側の両方に目的成分を拡散する膜を配置したものが好ましい。目的成分を吸着する膜としてはスチレン樹脂、シリカゲル、イオン交換樹脂、又はこれらを化学修飾した物質を含む膜を用いることができる。また、目的成分を拡散する膜としては、焼結フィルター、セラミック、金属メッシュ又はセルロース繊維を用いることができる。このようなトラップカラムの詳細は特願平１０−２６３７６３号に記載されており、この実施例でもその文献に記載されているものを用いることができる。
【００２２】
いま、例えば、図３の流路で、送液ポンプＰｌによりＳＴＡＲユニット２０、ダイナミックミキサ２２及びグラジエントチューブ４を水で満たしておく。その後、送液ポンプＰｌを停止させ、送液ポンプＰ２からメタノールを送液すると、ＳＴＡＲユニット２０内の各分岐流路３４−１〜３４−３の遅れ時間の差から合流側コネクタ３２にはステップ状に組成の異なる移動相が時間を追って現れる。図４の例でいえばメタノール含有量が３３％、６７％、１００％の順に移動相組成が変化する。合流側コネクタ３２を通過した移動相はダイナミックミキサ２２にて混合され、良好なグラジエントカーブを描きながらグラジエントチューブ４の中に入っていく。ミクロ液体クロマトグラフィのような微量での移動相混合を行なう場合、ＳＴＡＲユニット２０とダイナミックミキサ２２の組合わせは特に有効である。
【００２３】
図３の実施例では、バルブ２は実線の流路に設定すると、ＳＴＡＲミキサーシステム２０，２２を経て混合された移動相をグラジエントチューブ４に充填していくことができる。バルブ２の破線の流路では、バルブ２６を経て供給される移動相によりグラジエントチューブ４内に収容されていた移動相が押し出される。
【００２４】
バルブ２６は実線の流路に設定すると、ポンプＰ４から供給される希釈液により送られてきた試料中の目的成分がトラップカラム２４で捕捉される。一方、バルブ２６の破線の流路では、ポンプＰ３により供給される移動相がバルブ２６からバルブ２の破線の流路を経てグラジエントチューブ４内に収容されていた移動相を押し出し、トラップカラム２４に捕捉されていた試料中の目的成分を分離カラム１０へ供給し、分離カラム１０で分離された目的成分が検出器１２で検出される。
【００２５】
第２の実施例は、グラジエントチューブ４とトラップカラム２４による濃縮注入を組み合わせたものである。グラジエントチューブ４内の移動相組成は第１の実施例の動作で示したものと同様であるとする。
動作においては、まず、バルブ２，２６がともに実線の流路に設定され、グラジエントチューブ４内への移動相充填が第１の実施例と同様に行なわれる。その際、この実施例でもサンプルの注入が行なわれるが、注入されたサンプルはポンプＰ４から供給される希釈液により希釈されながらトラップカラム２４に搬送されトラップカラム２４に吸着しながら濃縮されていく。
サンプルの濃縮及びグラジエントチューブ２４ヘの移動相充填が終了したら、バルブ２，２６が回転して破線の流路に切り替えられ、グラジエントチューブ４内の移動相がトラップカラム２４ヘ送られ分析が開始される。
【００２６】
ミクロ流量の場合、特にトラップカラム２４には上に示したような膜トラップを使うことにより配管容量を抑えることが可能となる。また、グラジエントチューブ４内の移動相充填の際の混合器として、上に示した配管抵抗比の違いを応用したＳＴＡＲミキサーシステムを利用することにより、低流量域でも再現性のよい組成勾配を持たせることができる。
【００２７】
図３の実施例において、分離カラム１０としてCadenzaＣＤ−Ｃ１８（内径１ｍｍ、長さ７５ｍｍ）（インタクト社の製品）を使用し、検出器１２として吸光光度計（検出波長２５４ｎｍ）を用いた。移動相として、ポンプＰ１からＨ2Ｏ、ポンプＰ２からＣＨ3ＣＮ−ＥｔＯＨ（５０：５０）（アセトニトリルとエタノールの５０：５０の混合溶液）を供給してそれらの混合比率を変えながら容量５００μＬのグラジエントチューブ４内に１ｍＬ／分の流速で移動相を充填した。ポンプＰ３からは移動相としてＣＨ3ＣＮ−ＥｔＯＨ（５０：５０）を２０μＬ／分の流速で供給し、ポンプＰ４からは希釈液としてＨ2Ｏを１ｍＬ／分の流速で供給した。試料として安息香酸エステル（約１００ｎｇ）を測定した。
【００２８】
その結果のクロマトグラムを図５に示す。横軸及び図中の数値は保持時間（分）であり、縦軸は検出強度である。▲１▼〜▲５▼は各安息香酸エステルのピークであり、▲１▼は安息香酸メチル、▲２▼は安息香酸エチル、▲３▼は安息香酸プロピル、▲４▼は安息香酸ブチル、▲５▼は安息香酸ヘキシルである。５種類の安息香酸エステルが明瞭に分離されており、従来のグラジエント分析法に比べて何ら遜色がない。なお、最初の大きなピークは不純物である。このクロマトグラムには現れていないが、グラジエント分析用移動相の調製時間が短縮されている。
（実施例３）
図６にグラジエントチューブを複数本備えた実施例を示す。
四方バルブ２ａ，２ｂの間に２本のグラジエントチューブ４−１，４−２が接続されている。バルブ２ａの1つのポートには、図１の実施例と同様に混合器６を介して２台の移動相供給ポンプＰ１，Ｐ２が接続されている。バルブ２ｂの１つのポートには、図１の実施例と同様に試料注入器８が接続され、試料注入器８の下流には試料成分を分離する分離カラム１０が接続され、さらに、分離カラム１０の下流には分離された試料成分を検出する検出器１２が接続されている。バルブ２ａの１つのポートには図１の実施例と同様に組成が一定の移動相を供給するポンプＰ３が接続され、バルブ２ｂの１つのポートはドレインに接続されている。
【００２９】
バルブ２ａ，２ｂは、実線の流路に設定すると、混合器６で混合された移動相をグラジエントチューブ４−２を経てドレインへ流し、ポンプＰ３から供給される移動相をグラジエントチューブ４−１を経て試料注入器８から分離カラム１０につながる流路に接続する。一方、バルブ２を破線の流路に設定すると、混合器６で混合された移動相をグラジエントチューブ４−１を経てドレインへ流し、ポンプＰ３から供給される移動相をグラジエントチューブ４−２を経て試料注入器８から分離カラム１０につながる流路に接続する。
【００３０】
図１のシステムではグラジエントチューブヘの移動相の充填と分析は順を追って実行しなければいけないが、図６の実施例では移動相送液ポンプＰｌ，Ｐ２によりグラジエントチューブ４−２に移動相を充填しながら、移動相送液ポンプＰ３によりグラジエントチューブ４−１に充填済みの移動相を分析カラム１０ヘと押し出していく。また、グラジエントチューブ４−１を用いた分析の終了とグラジエントチューブ４−２への移動相充填の終了をまって、バルブ２ａ，２ｂを回転させることにより、グラジエントチューブ４−１を移動相の充填、グラジエントチューブ４−２を分析へと切り換えることが可能となる。すなわち、図６のシステムは、移動相充填に必要な時間を短縮させることにより、特に低流速での分析の場合に問題となる繰り返し分析における分析時間の短縮が可能となる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の移動相グラジエント装置は、グラジエントチューブを備え、そのグラジエントチューブに予め移動相の組成を変化させた移動相をその長さ方向に沿って収容しているので、使用に際してはただその移動相を取り出していくだけで、移動相の組成を時間的に変化させていくことができる。
この移動相グラジエント装置を高速液体クロマトグラフに利用すると、分析開始時に、予め移動相の組成変化が達成されているため、分析開始後、遅れ時間なく移動相の組成変化が始まり、分析カラムでの分析を開始することができ、混合器での時間遅れをなくしてグラジエント分析を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施例の移動相グラジエント装置を適用した高速液体クロマトグラフの一実施例を示す流路図である。
【図２】グラジエントチューブに収容された移動相の組成の状態の一例を示す断面図である。
【図３】第２の実施例の移動相グラジエント装置を適用した高速液体クロマトグラフの他の実施例を示す流路図である。
【図４】図３の実施例におけるＳＴＡＲユニットを概略的に示す流路図である。
【図５】図３の実施例を用いて測定したクロマトグラムの一例を示す波形図である。
【図６】第３の実施例の移動相グラジエント装置を適用した高速液体クロマトグラフの他の実施例を示す流路図である。
【符号の説明】
２，２６      六方バルブ
４，４−１，４−２      グラジエントチューブ
６，２０，２２      混合器
８，２８      試料注入器
１０      分離カラム
１２      検出器
２４      トラップカラム
P１，P２，Ｐ３，Ｐ４      ポンプ
【図１】
0003865119.tif 000002
【図２】
0003865119.tif 000003
【図３】
0003865119.tif 000004
【図４】
0003865119.tif 000005
【図５】
0003865119.tif 000006
【図６】
0003865119.tif 000007