(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ポピリエ・セマダラ（Bacillus popilliae semadara）ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８株。
【請求項２】
バチルス・ポピリエ・セマダラＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８株をコガネムシ科昆虫に作用させることを特徴とするコガネムシ科昆虫の防除方法。
【請求項３】
バチルス・ポピリエ・セマダラＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８株の胞子をコガネムシ科昆虫に作用させることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
コガネムシ科昆虫がドウガネブイブイ昆虫であることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
コガネムシ科昆虫を防除するための微生物製剤であって、バチルス・ポピリエ・セマダラＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８株の胞子を含む微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する新規微生物、その胞子を用いたコガネムシ科昆虫の防除方法および微生物製剤に関する。前記微生物は、植物害虫であるコガネムシ科幼虫に対して乳化病を誘発することができるので、コガネムシ科昆虫に対する微生物農薬として利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、芝地、牧草地、農地、果樹園、庭園などにおいて植物害虫となっているコガネムシ科昆虫に対して、その防除には化学合成された農薬を用いることが一般的であった。しかし、環境問題が重要視される時代背景下、自然環境や人体への悪影響が懸念される化学農薬に代わって、環境保全に貢献することのできる安全性の高い生物的防除法が切望されている。
【０００３】
上記のような観点から、昆虫に対して殺虫性を有する微生物を用いた微生物農薬が開発されており、例えば、鱗翅目や蚊の幼虫に対して病原性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の生菌又はその殺虫成分を農薬とするいわゆるＢＴ剤は代表的なものとして知られている。
【０００４】
コガネムシ科昆虫についても、乳化病に冒されたマメコガネ（Popillia japonica）幼虫から単離されたバチルス・ポピリエに属する微生物が、マメコガネ幼虫に対して乳化病を誘発することが知られており、既に、米国においては該微生物を用いた微生物製剤が市販されている。しかしながら、該微生物は日本で重要害虫となっているドウガネブイブイ（Anomala cuprea）に対しては効果がない（農業有用微生物−その利用と展望−  梅谷献二、加藤肇  ２３６頁  １９９０年）ため、我が国においてコガネムシ科幼虫防除剤として使用するには満足できるものではなかった。
【０００５】
ドウガネブイブイに対して殺虫性を有するバチルス属細菌としては、バチルス・チューリンゲンシスに属する微生物（バチルス・チューリンゲンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１株、特開平８−２２８７８３号公報）が知られているが、バチルス・ポピリエに属する微生物では知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、ドウガネブイブイをはじめとするコガネムシ科昆虫の防除に有効な微生物、及びその胞子を用いたコガネムシ科昆虫の防除方法及び微生物製剤を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ドウガネブイブイやセマダラコガネ（Blitopertha orientalis）の幼虫に対する強い殺虫活性を有するバチルス・ポピリエに属する新規な微生物を見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）セマダラコガネ及びドウガネブイブイ に殺虫性を示すことを特徴とするバチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）に属する微生物、（２）バチルス・ポピリエ・セマダラ（Bacillus popilliae semadara）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８）である（１）に記載の微生物、（３）上記（１）に記載の微生物をコガネムシ科昆虫に作用させることを特徴とするコガネムシ科昆虫の防除方法、（４）上記（１）に記載の微生物の胞子をコガネムシ科昆虫に作用させることを特徴とする（３）に記載の方法。（５）コガネムシ科昆虫がドウガネブイブイ 昆虫であることを特徴とする（３）に記載の方法。（６）コガネムシ科昆虫を防除するための微生物製剤であって、（１）に記載の微生物の胞子を含む微生物製剤、に関するものである。
【０００９】
本発明において、「コガネムシ科昆虫の防除」とは、コガネムシ科昆虫、特にコガネムシ科幼虫の駆除、及びコガネムシ科幼虫による植物虫害の予防及び改善をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明の微生物本発明の微生物は、セマダラコガネ及びドウガネブイブイ に殺虫性を示すことを特徴とするバチルス・ポピリエに属する微生物である。該微生物として具体的には、バチルス・ポピリエ・セマダラ株が挙げられる。バチルス・ポピリエ・セマダラ株は、千葉県千葉市において乳化病に冒されたセマダラコガネ幼虫から、後記実施例に示すようにして単離された株である。バチルス・ポピリエ・セマダラ株は、平成１０年５月２１日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１８の受託番号で寄託されている。その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６８の受託番号が付与された。
【００１２】
本発明のバチルス・ポピリエ・セマダラ株の細菌学的性質を表１に示す。この細菌学的性質、特に４０℃までの温度条件下で生育できる点、及びセマダラコガネに対し乳化病を誘発するという病原性から、本菌株はバチルス・ポピリエに属することを認めた。さらに、本菌株の病原スペクトルを調べたところ、ドウガネブイブイ幼虫に対しても殺虫効果を有することが認められ、従来公知のいずれのバチルス・ポピリエとも異なる新規な微生物であることが判明した。そこで、本菌株をバチルス・ポピリエ・セマダラ株と命名した。
【００１３】
＜２＞本発明のコガネムシ科昆虫の防除方法及び微生物製剤
本発明の微生物をコガネムシ科昆虫に作用させることにより、コガネムシ科昆虫を防除することができる。本発明の微生物をコガネムシ科昆虫に作用させることは、本発明の微生物の菌体又は胞子、好ましくは胞子を、コガネムシ科昆虫、好ましくは幼虫の体内に取り込ませることにより行われる。
【００１４】
本発明の方法は、コガネムシ科に属する昆虫に広く適用し得るが、特にセマダラコガネ及びドウガネブイブイに対して好適に適用することができる。
コガネムシ科昆虫体内に取り込ませるのは、本発明の微生物の菌体であってもよく、本発明の微生物が形成する胞子であってもよいが、胞子が好ましい。胞子は、例えば、次に示すようにして調製することができる。コガネムシ科幼虫、好ましくはセマダラコガネ幼虫あるいはドウガネブイブイ幼虫に本発明の微生物を取り込ませる。具体的には、本発明の微生物を前記幼虫の存在する飼育培土などに散布し、経口的に摂取させるか、又は、体液中に注射することにより注入する。この幼虫を好ましくは３週間〜４週間飼育し、該幼虫体内で本発明の微生物を増殖させる。幼虫体内で増やした胞子は、例えば、幼虫を切開あるいは穴をあけるなどして体液を採取し、得られた体液を例えば遠心分離又は濾過することによって、得ることができる。
【００１５】
本発明の方法において、胞子は、そのまま用いてもよく、あるいは必要に応じて水あるいは中性の緩衝液、例えばＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ８ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 １．４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２４ｇ／１Ｌ、ｐＨ７．４）、リン酸緩衝液、又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、好ましくはＰＢＳ緩衝液で洗浄してもよい。更に、胞子は、乾燥して粉末にしてもよいし、水あるいは上記緩衝液の懸濁液としてもよい。また、胞子は、微生物農薬等の微生物製剤に製造に通常用いられる担体、栄養剤等の成分と混合し、得られる組成物を微生物製剤として使用することもできる。さらに、この組成物にバチルス・チューリンゲンシスの菌体又はその殺虫成分を混合することによって、本発明の微生物と併用してもよく、コガネムシ幼虫に対してこれらの相乗作用が期待される。
【００１６】
本発明の微生物、胞子又は微生物製剤は、コガネムシ科幼虫を防除しようとする芝地、果樹園、農地などに土壌１ｍ2当たり胞子数が１×１０6個から１×１０14個、好ましくは１×１０9個から１×１０13個となるように散布して行う。その後、必要に応じて１ｍ2当たり１Ｌから２Ｌの散水し、及び／あるいは土壌を鍬こみ混和してもよい。懸濁液を用いる場合は、水あるいは前記中性緩衝液で１×１０6個／Ｌから１×１０14個／Ｌ、好ましくは１×１０9個／Ｌから１×１０13個／Ｌとなるように懸濁したものを用いることが好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１８】
【実施例１】
バチルス・ポピリエ・セマダラ株の単離・同定
千葉県千葉市に所在する千葉県農業試験場芝草試験園場おいて１９９７年の夏、セマダラコガネ幼虫が大発生した。高密度となった該幼虫個体群の中には、体が乳白色に変化しているものが多数発見され、そのほとんどが２週間以内に死亡するという現象が観察された。この乳化病に冒されたセマダラコガネ幼虫から以下に示す方法で病原菌株を単離した。即ち、乳白色になり死亡した幼虫に注射針で穴をあけ、血体腔から乳白色の体液を回収した。
【００１９】
上記体液から遠心分離により沈殿画分を採取した。顕微鏡観察により、この画分には、細菌の胞子が含まれていると推定された。この画分を６０℃で１５分間熱処理した後、ＭＹＰＧＰプレート（ミュラー−ヒントンブロス(Mueller-Hinton broth)１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ、Ｃ3Ｈ3Ｏ3Ｎａ１ｇ、グルコース０．５ｇ、寒天２０ｇ／１Ｌ）に繰り広げ、３０℃で、嫌気状態で７日間培養した。培地上に形成したコロニーを分離し、再び前記と同様にして培養する操作を繰り返すことにより純粋菌株を分離した。
上記のようにして分離された菌株の細菌学的性質を調べた結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
表１に示す細菌学的性質から、本菌株はバチルス・ポピリエに属することを認めた。バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）に記載されているバチルス・ポピリエの菌学的性質によれば、形態的性質は長さ：１．３〜５．２μｍ、幅：０．５〜０．８μｍの桿菌であり、生育温度が２０〜３５℃である点以外は、表１と一致する。尚、バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジーには、３％ＮａＣｌ存在下での生育については記載されていない。
一方、実施例３及び実施例４に示すように、上記菌株はセマダラコガネやドウガネブイブイなどのコガネムシ科幼虫に対し乳化病を誘発するという病原性を有していた。ドウガネブイブイ幼虫に対しても殺虫効果を有する点で、本菌株は従来公知のいずれのバチルス・ポピリエとは異なる新規な微生物であり、バチルス・ポピリエ・セマダラ株と命名した。
【００２２】
【実施例２】
バチルス・ポピリエ・セマダラ株の胞子画分の製造
腐葉土と砂を３：１の割合で混合した飼育培土を直径６ｃｍのプラスチックカップに２０ｇを入れ、乳化病に感染していた幼虫から採取した胞子を１×１０3個程度散布した。セマダラコガネ３令幼虫をカップに入れ、２５℃で飼育した。幼虫の体が乳白色を帯びてきた時点で体表面を１％次亜塩素酸ナトリウム液で殺菌し、注射針で穴をあけ体液を採取した。該体液から１００００rpm、５分間の遠心分離により胞子を回収した。胞子をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、１×１０9個／ｍｌとなるように調整し、胞子画分とした。
【００２３】
寄託菌株から胞子を調製する際は、幼虫の体液中に注射により栄養細胞を１頭当たり約１００個程度注入し、３０℃で２週間〜４週間飼育し、乳白色になった幼虫の体表面に穴をあけ体液を採取すればよい。
【００２４】
【実施例３】
本発明の微生物のセマダラコガネ幼虫に対する殺虫活性
腐葉土と砂を３：１の割合で混合した飼育培土を直径６ｃｍのプラスチックカップ２０個に各２０ｇずつ入れ、胞子数が１×１０7個となるように実施例２で得た胞子画分を散布した。同様にして胞子数が１×１０7個となるようなカップも２０個用意した。ぞれぞれのカップにセマダラコガネ３令幼虫を１頭ずつ、更にサツマイモ小片を１つずつ入れ、２５℃で４０日間飼育しながら死亡個体数を調べた。また、死亡幼虫体内に胞子が形成されているかどうか体液を顕微鏡で調べた。
【００２５】
結果を表２に示す。胞子を１×１０7個／カップ散布した区では、３０日目以降４０％の幼虫の死亡が確認された。１×１０8個／カップ散布した区においては散布後１４日目から乳白色になった個体が観察され、散布後３０日目で１００％の幼虫が死亡し、６０％が体内に胞子を形成していた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
【実施例４】
本発明の微生物のドウガネブイブイ幼虫に対する殺虫活性
ドウガネブイブイの２令幼虫を用い、実施例３と同様の方法で行った。ただし、飼育培土として腐葉土と火山灰土を１：１の割合で混合したものを使用した。
【００２８】
結果を表３に示す。胞子を１×１０7個／カップ散布した区では、３０日目以降１５％の幼虫の死亡が確認された。１×１０8個／カップ散布した区においては散布後１８日目から乳白色になった個体が視察され、散布後４０日目で９５％の幼虫が死亡し、５５％が体内に胞子を形成していた。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
【実施例５】
ドウガネブイブイ幼虫防除による芝被害の軽減
芝を生やした面積約５００ｃｍ2のポットを用意し、その土中にドウガネブイブイ２令幼虫を１ポット当たり１０頭ずつ埋めた。該ポットに、実施例２で得た胞子を１．２５×１０10個／ｍ2あるいは１．２５×１０11個／ｍ2となるように散布した。また、胞子を散布しない区も対照として設けた。それぞれの区における芝の被害度を３０日間にわたって観察した。試験は各区４連で行い、被害度を平均値で表４に示した。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
【発明の効果】
本発明の微生物は、コガネムシ科幼虫に対し致死性の乳化病を誘発するため、菌体、特に胞子を幼虫に作用させることによってコガネムシ科幼虫を防除し、芝、牧草、果樹、農園芸植物などを該害虫の被害から保護することができる。特に本微生物は、バチルス・ポピリエに属する微生物としては、日本で重要害虫となっているドウガネブイブイの幼虫に対しても殺虫作用を有することが示された初めての菌株であり、よって我が国におけるその使用効果は非常に大きい。その上、自然環境への悪影響や人体への毒性はほとんどなく、本発明の防除方法は地球環境保全にも貢献する優れた防除方法である。