(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する吸着材であって、該吸着材は水不溶性の担体にペプチド誘導体が固定化されており、該ペプチド誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列を含有する、吸着材。
【請求項２】
前記ペプチド誘導体の熱安定性、薬剤安定性、γ線滅菌安定性および高圧蒸気滅菌安定性のうち少なくとも１つの性質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドよりも優れている、請求項１に記載の吸着材。
【請求項３】
前記ペプチド誘導体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に(Lys)nまたは(Cys)mが付加されており、ここでｎおよびｍは０から９までの整数である、請求項１または２に記載の吸着材。
【請求項４】
前記ペプチド誘導体が70個以下のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の吸着材。
【請求項５】
高圧蒸気滅菌が施されている、請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項６】
γ線滅菌が施されている、請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項７】
前記水不溶性の担体が多孔質である、請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項８】
前記水不溶性の担体が親水性である、請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項９】
前記水不溶性の担体の排除限界分子量が15万以上かつ500万以下である、請求項７または８に記載の吸着材。
【請求項１０】
生体から得られた血液、血漿、または他の体液中に存在する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着除去するために用いられる、請求項１〜９のいずれかに記載の吸着材。
【請求項１１】
溶液から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着除去する方法において使用するための請求項１〜９のいずれかに記載の吸着材の製造における配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチド誘導体の使用であって、該方法は、該吸着材と該溶液とを接触させる工程を包含し、該溶液は、生体から得られた血液、血漿、または他の体液である、使用。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の吸着材が、溶液の入口、出口を有する容器内に含まれ、そして該吸着材の容器外への流出防止手段が備えられている、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する吸着材および吸着装置、ならびに免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去方法に関する。
背景技術
近年、慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患、あるいは糸球体腎炎、臓器移植の拒絶反応、腫瘍、感染症などの疾患において、血液中に存在する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体が、疾患および現象の原因または進行に密接な関係を有することが明らかになりつつある。
そこで、血液、血漿などの体液中から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を特異的に吸着除去することにより、上記疾患の進行を防止し、症状を軽減し、さらには治癒を促進することを期待して、いくつかの吸着除去材の利用が試みられてきた。例えば、免疫グロブリンとの結合性を有するプロテインＡをシリカマトリックス上に固定化した免疫吸着材（特開昭62-242628号公報）は、免疫グロブリンＧおよびその免疫グロブリン複合体に特異性が高い吸着材として知られている。また、疎水性化合物を不溶性担体上に固定化した免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材（特開昭57-122875号公報）は、既に本邦で臨床応用されている。
しかしながら、これまで試みられてきた吸着材、例えば上記プロテインＡ吸着材は、官能基であるプロテインＡが黄色ブドウ球菌由来の分子量約4.2万ダルトンの異種タンパク質であるため、体液に接触させて使用する際にプロテインＡの溶出によってその抗原性から生ずる副作用の危険性があること、滅菌時の安定性に問題があり滅菌方法が限定されること、固定化後の保存安定性に欠けることなどの欠点がある。また、特開昭57-122875号公報に記載されている免疫グロブリンおよび／または免疫複合体の吸着材は、目的物質の吸着特異性、吸着能力などの吸着特性が劣るという欠点がある（天野泉ら、「血液浄化療法・上巻」日本臨床、第49号、第649〜654頁（1991年増刊））。このように従来知られている免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着するための吸着材は、安全性、安定性、吸着特異性、吸着能力などの観点から、前記病因性の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体が体液中に存在することに起因する疾患の治療に使用するには適切とはいえない。
発明の開示
本発明の目的は、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する吸着特異性が高く、かつ滅菌処理時または保存中における吸着特性の低下が極めて少ない、安定性、安全性の高い吸着材およびこの吸着材を用いた吸着装置、ならびに免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去方法を提供することにある。
本発明者らは、（１）プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、リウマチ因子など免疫グロブリン結合タンパク質として知られている種々のタンパク質（土屋尚之、臨床免疫、第23巻、896〜903頁（1991年）；P. Akessonら、Mol. Immunol.，第27巻、523〜531頁（1990年）；およびL. Bjorck、J. Immunol.，1194〜1197頁（1988年））が、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対して、極めて高い吸着特異性を有していること、（２）アミノ酸残基数が数十個程度以下のペプチドは、異種の天然高分子タンパク質に比べて、生体に対する抗原性が極めて小さいこと、および（３）このような短いペプチドが熱安定性に代表される高い安定性、特に滅菌処理に対する高い安定性および保存安定性を有していることなどの利点を考慮し、各種免疫グロブリン結合タンパク質のペプチド化を種々検討した。その結果、プロテインＧの部分ペプチドを用いることにより、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する高い吸着特異性およびその吸着性能を指標とした熱安定性、薬剤安定性、または滅菌安定性を有し、かつ抗原性に起因する副作用の可能性が低いペプチドを得ることに成功した。
プロテインＧは、免疫グロブリン結合タンパク質の１つであり、ストレプトコッカス属の細菌細胞壁に存在する分子量約５万ダルトンのタンパク質である。そのcDNAは既にクローニングされており、このcDNAより推定されるアミノ酸配列から、プロテインＧは448個のアミノ酸残基からなると共に、その配列内にはいくつかの類似の繰り返しアミノ酸配列が存在し、この繰り返しアミノ酸配列がアルブミンおよび免疫グロブリンとの結合ドメインであることが推測されている。例えば、S. R. Fahnesyookら、J. Bacteriol.、第167巻、870〜880頁（1986年）；U. Sjobringら、J. Biol. Chem.、第266巻、399〜405頁（1991年）を参照のこと。B.Gussら、EMBO J.,第5巻、1567〜1575頁（1986年）には、プロテインＧの配列中の免疫グロブリン（IgG）結合ドメインを示唆するＣ１、Ｃ２またはＣ３と表示された繰り返しアミノ酸配列領域が記載されている。Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３の各アミノ酸配列の共通アミノ酸と非共通アミノ酸とをまとめると、IgG結合ドメインのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示す通りとなる。
さらに、本発明者らは、このペプチドの１つであるＣ３ペプチドを担体に結合させてγ線滅菌に対する滅菌安定性についても検討したが、Ｃ３ペプチドの滅菌安定性は必ずしも十分ではなかった。そこで、このＣ３ペプチドの任意のアミノ酸を、遺伝子工学的手法を用いて順次別のアミノ酸に改変することにより種々検討した。その結果、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対して高い親和性を持ち、かつγ線滅菌を行ってもそのペプチドリガンドの吸着性能がほとんど損なわれず、さらに熱安定性、薬剤安定性にも優れた性質を有しているペプチドを得、本発明を完成するに至った。
本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する吸着材は、水不溶性の担体に免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着し得るペプチドが固定化されており、このペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される１種または２種のアミノ酸配列を有する。
本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する吸着材は、水不溶性の担体にペプチド誘導体が固定化されており、このペプチド誘導体は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加の少なくとも１つを含み、かつ、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着し得る。
好ましい実施態様によれば、上記ペプチド誘導体の熱安定性、薬剤安定性、γ線滅菌安定性および高圧蒸気滅菌安定性のうち少なくとも１つの性質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドよりも優れている。
好ましい実施態様によれば、上記ペプチド誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列を含有する。
好ましい実施態様によれば、上記ペプチドまたはペプチド誘導体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に(Lys)nまたは(Cys)mが付加されており、ここでｎおよびｍは０から９までの整数である。
好ましい実施態様によれば、上記ペプチドまたはペプチド誘導体が70個以下のアミノ酸配列からなる。
好ましい実施態様によれば、高圧蒸気滅菌が施されている。
好ましい実施態様によれば、γ線滅菌が施されている。
好ましい実施態様によれば、上記水不溶性の担体は多孔質である。
好ましい実施態様によれば、前記水不溶性の担体は親水性である。
好ましい実施態様によれば、上記水不溶性の担体の排除限界分子量は15万以上かつ500万以下である。
好ましい実施態様によれば、本発明の吸着材は、生体から得られた血液、血漿、または他の体液中に存在する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着除去するために用いられる。
本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去方法は、上記のいずれかに記載の吸着材と、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を含有する溶液とを接触させる工程を包含する。
本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去装置は、上記のいずれかに記載の吸着材が、溶液の入口、出口を有する容器内に含まれ、そして該吸着材の容器外への流出防止手段が備えられている。
好ましい実施態様によれば、上記免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を含有する溶液は、生体から得られた血液、血漿、または他の体液である。
【図面の簡単な説明】
図１は、MK3P47ペプチド発現用プラスミドpUCNTMK3P47の模式図である。実施例に記載されている他のペプチド類の発現用ベクターは、pUCNTMK3P47のNdeI-HindIII間に挿入されているMK3P47ペプチドをコードするDNAを、各実施例に記載されている他のペプチド類をコードするDNAに置き換えたものである。
図２は、MG56、MK3G56、MK3P47ペプチドの塩酸グアニジンによる変性曲線を示す。
図３は、MK3P47、MP47K3、MP47、MP47Cペプチドの塩酸グアニジンによる変性曲線を示す。
図４は、DASM-4によるMK3G56ペプチドの熱変性における過剰熱容量曲線を示す。
図５は、DASM-4によるMK3P47ペプチドの熱変性における過剰熱容量曲線を示す。
図６は、本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着装置の一実施例の概略断面図である。
図７は、３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
Ｉ．定義
本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する：Ala；Ｌ−アラニン残基、Asp；Ｌ−アスパラギン酸残基、Asn；Ｌ−アスパラギン残基、Cys；Ｌシステイン残基、Gln；Ｌ−グルタミン残基、Glu；Ｌ−グルタミン酸残基、Gly；Ｌ−グリシン残基、Ile；Ｌ−イソロイシン残基、Leu；Ｌ−ロイシン残基、Lys；Ｌ−リジン残基、Phe；Ｌ−フェニルアラニン残基、Thr；Ｌ−スレオニン残基、Trp；Ｌ−トリプトファン残基、Tyr；Ｌ−チロシン残基、Val；Ｌ−バリン残基。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側に位置し、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように、通常用いられる様式で記述する。
本明細書においては、ペプチド誘導体とは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加の少なくとも１つを含むペプチドをいう。
本明細書においては、熱安定性は、ペプチド誘導体の熱変性温度の高低に関して言及される。「熱安定性が優れている」とは、ペプチド誘導体の熱変性温度が、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドの熱変性温度と比較して高いことをいう。熱変性温度の測定法の例としては、断熱型示差走査熱量計により生理食塩水などの水溶液中で測定する方法が挙げられる。
本明細書においては、薬剤安定性は、非薬剤処理ペプチドに対する薬剤処理後のペプチドの変性割合に関して言及される。「薬剤安定性が優れている」とは、ペプチド誘導体の変性割合が、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドの変性割合と比較して低いことをいう。ペプチドの変性割合を決定する方法の例としては、適切な濃度の塩酸グアニジンを含有する水溶液中で30℃にて10分間の処理を行った後に測定されるペプチドの蛍光強度と、処理前のペプチドの蛍光強度とを比較する方法が挙げられる。
本明細書においては、γ線滅菌法とは、日本薬局法の「滅菌法」の照射法の中の(i)放射線法に記載される放射性同位元素を含有する線源からγ線を照射することにより、微生物を殺滅する方法をいう。γ線滅菌法の例としては、コバルト60などを含む放射線源を用いて、水溶液中の各吸着材に対して照射を行う方法が挙げられる。γ線滅菌安定性は、非γ線滅菌ペプチドの免疫グロブリンへの吸着力に対する、γ線滅菌を行ったペプチド誘導体の免疫グロブリンへの吸着力の割合に関して言及される。「γ線滅菌安定性が優れている」とは、ペプチド誘導体の吸着力の残存割合が、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドの吸着力の残存割合と比較して高いことをいう。
本明細書においては、高圧蒸気滅菌法とは、日本薬局法の「滅菌法」の加熱法の中の(iii)高圧蒸気法に記載される、適切な温度および圧力の飽和水蒸気中で加熱することにより、微生物を殺滅する方法をいう。高圧蒸気滅菌法の例としては、水溶液中の吸着材に121℃にて20分間オートクレーブ処理を行う方法が挙げられる。高圧蒸気滅菌安定性は、処理を行ったペプチド誘導体の免疫グロブリンへの吸着力に対する、高圧蒸気滅菌処理前のペプチド誘導体の免疫グロブリンへの吸着力の割合に関して言及される。「高圧蒸気滅菌安定性が優れている」とは、ペプチド誘導体の吸着力の残存割合が、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドの吸着力の残存割合と比較して高いことをいう。
II．好ましい実施の態様
以下に、本発明の好ましい実施の形態を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
本発明の吸着材に使用されるペプチドとして配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが、好適に用いられる。このアミノ酸配列領域において最も重要な特徴は、プロテインＧのＣ１、Ｃ２およびＣ３に含まれる配列のＣ末端側（配列番号１のペプチドの47位から56位までのアミノ酸配列）が、
0003908278.tif 000002
であるのに対して、配列番号３のアミノ酸配列においては、
0003908278.tif 000003
であること、すなわち、47位においてAsp→Proの１アミノ酸置換されている点である。このアミノ酸の置換により、滅菌安定性（特にγ線滅菌に対する安定性）が飛躍的に向上するとともに、グアニジン塩酸塩による変性濃度を指標とした薬剤安定性およびカロリメトリーによって測定した熱変性点を指標とした熱安定性も向上することを見い出した。さらにpH安定性にも優れていた。遺伝子工学的手法でアミノ酸を置換することは現在頻繁に行われており、アミノ酸置換によるペプチドおよびタンパク質の特性向上の検討は周知の技術である。しかし、未だかつて１アミノ酸のみの置換により滅菌安定性が飛躍的に向上した例は皆無であり、上記事実は驚くべきことである。
本発明の吸着材に用いられる吸着官能基ペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される１種または２種のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列を繰り返してあるいは組み合わせて含有していてもよい。例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択されるペプチドは、B. Gussら、EMBO J.、第５巻、1567〜1575頁（1986年）に記載のプロテインＧのアミノ酸配列中のＣ１、Ｃ２、およびＣ３に相当するペプチドから選択される１種のペプチドのみを含有するペプチドであってもよく、あるいは、選択された１種のペプチドを繰り返して含有するペプチド（Ｃ１を２個または３個以上、Ｃ２を２個または３個以上、およびＣ３を２個または３個以上含むペプチド）、選択された２種のアミノ酸配列を含有するペプチド（Ｃ１とＣ２、Ｃ１とＣ３、およびＣ２とＣ３を含むペプチド）であってもよい。さらに、選択された２種のアミノ酸配列を任意に繰り返して含有するペプチド（例えば、Ｃ１を２個とＣ２を１個、Ｃ１を２個とＣ３を１個、Ｃ２を１個とＣ３を２個、Ｃ１を２個とＣ３を２個含むペプチドなど）であってもよい。実質的に配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のみからなっていてもよいし、また、このアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列をさらに含有していてもよい。
本発明の吸着材に用いられる吸着官能基ペプチド誘導体は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ酸の欠失、置換、挿入、および／または付加の少なくとも１つを含むアミノ酸配列の少なくとも１種を有するペプチドであり、１種のアミノ酸配列のみからなっていてもよいし、２種以上のアミノ酸配列の組み合わせからなっていてもよい。付加の場合、アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列を有していてもよい。好適なペプチド誘導体は、例えば、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列に対してＮ末端および／またはＣ末端に(Lys)nまたは(Cys)mが付加されているアミノ酸配列を有する（ここでｎおよびｍは０から９までの整数である）。特にＣ末端に(Cys)mを有するものはより好適である。
このようなペプチド誘導体は、体液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する能力を有し得、さらに好ましいことには高圧蒸気滅菌処理、熱処理、薬剤処理、またはγ線滅菌処理後に、配列番号１に記載のペプチドに比較して優れた吸着能力を有する。
また、上記ペプチドとペプチド誘導体とを組み合わせて、本発明の吸着材に用い得る。
本発明の吸着材に用いられるペプチドまたはペプチド誘導体は、通常用いられるペプチド合成法、例えば、固相合成法、段階的伸長法、フラグメント縮合法のような液相合成法により作製してもよいし、ペプチドまたはペプチド誘導体をコードするDNAをベクターに連結し、宿主に導入して組換えペプチドまたは組換えペプチド誘導体を生産させる遺伝子操作法によって作製してもよい。
ペプチドまたはペプチド誘導体の化学合成においては、液相合成法よりも固相合成法を適用する方が操作が簡便である。固相合成法では、例えば、以下のようにしてペプチドまたはペプチド誘導体を合成し得る。（１）有機溶媒に不溶性の支持体に、合成すべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結合させる。（２）αカルボキシ基以外のαアミノ基などの官能基を保護した対応するアミノ酸を、Ｎ末端方向に順に縮合反応により結合させる。（３）結合したアミノ酸のαアミノ基が有する保護基を除去する。（４）上記（１）〜（３）の操作を交互に繰り返す。この一連の操作によりペプチド鎖を延長させて、所望の長さのペプチドを得る。
目的とするペプチドが得られた後、ペプチド鎖を支持体から切断し、保護基の除去を行う。これには、フッ化水素がしばしば用いられるが、安定性、取り扱いやすさの点から、トリフルオロ酢酸（以下TFAという）を用いるのが適切である。切断したペプチドを、1,2-エタンジチオール：アニソール（１：３）を含む95％TFA中で反応させ、保護基の除去と支持体からの切断を行って、粗ペプチドを回収する。これをエチルエーテル沈殿することにより粗精製ペプチドが得られる。
上記得られた粗精製ペプチドは、当業者に公知の種々の方法によって精製され得る。例えば、逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCという）に供することにより分取し、精製される。HPLC条件は、通常タンパク質の精製に用いる系を基本として最適化を行うのがよい。得られたクロマトピークに相当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。得られた精製ペプチド画分について、アミノ酸配列決定機による一次配列解析、アミノ酸組成分析などにより、合成ペプチドの確認を行う。
組換えペプチドまたは組換えペプチド誘導体を遺伝子組換え法によって生産する場合には、目的とするペプチドのアミノ酸配列をもとにこれをコードするDNAを合成し、ファージあるいはプラスミドベクターに導入する。これを適切な微生物（例えば大腸菌）に組み込んで形質転換体を選抜・取得し、公知の方法によって培養する。この培養上清あるいは菌体内から目的のペプチドを精製・単離することは当業者の技術範囲内である。また、適切なベクターを選びさえすれば、酵母、枯草菌なども宿主として容易に利用することができる。
本発明の吸着材の支持体として用いられる水不溶性担体は、特に限定されるものではない。本発明に用いる水不溶性担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子または結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。血液浄化に用いる場合には血液成分と接触した際の補体系、凝固系などへの影響を考慮する必要性があることから、非特異吸着が比較的少なくかつ免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着選択性が良好である親水性担体が好ましい。本明細書中では、親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの平板と水との接触角が60度以下である担体をいう。この様な担体の例としては、セルロース、キトサン、セファロース、デキストランなどの多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体、あるいはこれらの誘導体からなる担体が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの水不溶性担体の中でも−ＯＨ基が存在する担体は、吸着性能および吸着選択性の点で優れている。中でも多孔質セルロースゲルは、
（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため、撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少ない。従って、これを充填したカラムに体液を高流速で流す場合に、圧密化したり、目詰まりしたりせず、さらに細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい；
（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない；
（３）空孔容積を大きくした場合にも比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる；
（４）合成高分子ゲルなどに比べて安全性が高い；
などの優れた点を有しており、本発明に用いるために最も適した担体の一つである。本発明においてはこれらの担体のみに限定されるものではない。なお、上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
本発明に用いる水不溶性担体にまず第一に要求される性質は、適切な大きさの細孔を多数有すること、すなわち多孔質であることである。本発明の吸着材の吸着対象である免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体は、その分子量が16万から100万までの広い範囲におよび、従って特定できない。そこで、このタンパク質を効率よく吸着するためには、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが他のタンパク質の侵入はできる限り起こらないことが好ましい。
本発明に用いる水不溶性担体においては、多孔質担体の平均細孔径は、300〜10000オングストロームが好ましい。細孔の孔径の測定には水銀圧入法が最もよく用いられているが、本発明で用いる多孔質水不溶性担体の場合にはこの方法を適用できないことが多い。そこで、細孔の孔径の目安としては、排除限界分子量を用いるのが適切である。排除限界分子量とは、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内で最も小さい分子量をもつ分子の分子量をいう（波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人、1988年発行）。排除限界分子量は、一般に、球状タンパク質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられている。本発明に用いる多孔質水不溶性担体の場合、球状タンパク質を用いて得られた値を用いるのが適切である。
種々の排除限界分子量の担体を用いて検討した結果、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着に適切な細孔の孔径は、排除限界分子量が15万以上であることが明らかとなった。すなわち15万未満の排除限界分子量をもつ担体を用いた場合には、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着除去量は小さく、その実用性が低下する。従って、本発明に用いる担体の好ましい排除限界分子量は15万以上である。また、排除限界分子量が500万を超えた場合、体液として血漿または血清を用いる限り、特に大きな問題は生じないが、リガンドとの相互作用のない巨大分子が物理的にリガンドの結合部位を塞ぎ、実質的に有効リガンド量を下げる傾向を示す。さらに、体液として血液を用いる場合、排除限界分子量が500万を超えると血小板の付着の割合が増加する傾向が見られ、本発明の吸着材をDHP（直接血液潅流）型の血液浄化システムで用いる場合、必ずしも十分な性能が発揮できない。一方、排除限界分子量が500万以下ではどのような使用法によっても特に支障はなく、本発明の吸着材を様々な用途に用いるためには排除限界分子量が500万以下であることが望ましい。従って、本発明に用いる担体のより好ましい排除限界分子量は、15万以上500万以下である。
次に、担体の多孔構造については、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が20％以上であり、比表面積が３m2/g以上であることが好ましい。また担体の形態としては、ビーズ状、繊維状、膜状（中空糸も含む）など任意の形状を選ぶことができる。
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用い得る官能基が存在することがリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
次に本発明に用いる担体としては、硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができる。体外循環治療用の吸着材として使用するためには、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要である。そのために充分な機械的強度が要求される。従って、本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。本明細書中では、硬質担体とは、例えば粒状ゲルの場合、以下の条件でゲルをガラス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）に均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失△Ｐと流量との関係が0.3kg/cm2の圧力まで直線関係にあるものをいう。
例えば、両端に孔径15μmのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）にアガロースゲル（Bio-Rad社製のBiogelA-5m、粒径50〜100メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東洋曹達工業(株)製のトヨパールHW-65、粒径50〜100μm）およびセルロースゲル（チッソ(株)製のセルロファインGC-700m、粒径45〜105μm）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失△Ｐとの関係を求めた（図７）。縦軸に流速（cm/分）を、横軸に圧力損失（kg/cm2）をプロットした。この図において、○はトヨパールHW65、△はセルロファインGC700m、●はBiogel-A5mを示す。この結果、トヨパールHW-65およびセルロファインGC-700mが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、BiogelA-5m用は圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。
上記担体へのペプチドまたはペプチド誘導体の固定化においては、ペプチドまたはペプチド誘導体の立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらに非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
上記の担体へ導入されるペプチドまたはペプチド誘導体、およびスペーサーとして用いられる有機化合物は、比較的安定で低分子量の物質であり、例えば、酵素、抗体のようなタンパク質を固定化する場合と比較して、その固定化反応条件は制約が少ない。したがって、固定化方法は特に限定されるものではない。しかし、体外循環治療および血液浄化に用いられ得る吸着材であることを考慮して、吸着材の滅菌時または治療時にペプチド類が担体から容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。例えば、（１）担体が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによってスクシンイミドオキシカルボニル基に置換して、ペプチドまたはペプチド誘導体をアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）、（２）担体が有するアミノ基またはカルボキシル基に、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合試薬の存在下で、ペプチドまたはペプチド誘導体のカルボキシル基またはアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）、（３）ペプチドまたはペプチド誘導体を、グルタルアルデヒドなどの２個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）などが挙げられる。ペプチド類の離脱溶出を極力抑えるためには、共有結合法により結合することが好ましい。
ペプチド官能基を固定化した担体を、血液、血漿などの体液と接触させて、体液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着除去する方法には種々の方法がある。代表的な方法としては、（１）体液を取り出してバックなどに貯留し、これを吸着材に混合して免疫グロブリンおよびまたは／免疫グロブリン複合体を吸着除去した後、吸着材を濾別して免疫グロブリン免疫グロブリンおよび／または複合体の除去された体液を得る方法、（２）体液の入口と出口を有し、その出口に体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に、吸着材を充填し、これに体液を流す方法などがある。いずれの方法を用いてもよいが、後者の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインで免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。
次に、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する吸着材を用いた本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着装置を、その概略断面図に基づき説明する。
図６に示す容器７は、溶液の流入口または流出口１、溶液の流出口または流入口２、本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体吸着材３、溶液および溶液に含まれる成分は通過できるが免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体吸着材は通過できない吸着材流出防止手段４および５、ならびにカラム６を有する。この容器の形状および材質は特に限定されないが、好ましくは、例えば、容量20〜400ml程度、直径２〜10cm程度の筒状容器が用いられる。
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例
実施例１
ペプチドの化学合成およびセファロースへの固定化
ペプチドの化学合成
Ｎ末端側にシステインを付加したプロテインＧのドメインＣ３の57残基よりなる配列を有するペプチドの合成を、ペプチドシンセサイザーModel 4170型（ファルマシアLKB社製）を用いて固相合成法により以下のように行った。Ｃ末端のグルタミンを結合した支持体であるFmoc-グルタミンNovaSyn KA 0.1mmol（ファルマシアLKB社製）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーに入力されている合成プログラムにより、Ｎ末端の方向に向かって順に、脱保護基反応および縮合反応を繰り返してペプチド鎖を伸長した。すなわち、ピペリジンによりこのアミノ酸が有するα−アミノ基の保護基である9-フロオレニルメチルオキシカルボニル基（以下Fmocという）の除去を行い、N,N-ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦという）で洗浄し、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロフォスフェート（以下HBTUという）とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（以下DIPEAという）とを用いて縮合反応を行い、ＤＭＦで洗浄する操作を繰り返した。アミノ酸は、Fmoc-L-Ala、Fmoc-L-Asn(Trt)、Fmoc-L-Asp(OtBu)、Fmoc-L-Cys(Trt)、Fmoc-L-Gln(Trt)、Fmoc-L-Glu(OtBu)、Fmoc-L-Gly、Fmoc-L-Ile、Fmoc-L-Leu、Fmoc-L-Lys(Boc)、Fmoc-L-Phe、Fmoc-L-Thr(tBu)、Fmoc-L-Trp、Fmoc-L-Tyr(tBu)、Fmoc-L-Valを用い、それらの使用量は基質に対して約５倍モル（0.5mmol）量を、バイアル中で用いた。（ここで、Trt、OtBu、Boc、およびtBuは、それぞれトリチル基、o-第３ブチルエステル、第３ブチルオキシカルボニル基、および第３ブチル基を表す。）
脱保護基反応およびペプチド鎖の切断
全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得られた支持体を３Ｇ−３孔のグラスフィルター上でtert-アミルアルコール、酢酸、およびジエチルエーテルを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって乾燥支持体を得た。バイアル中で、得られた支持体１ｇに、TFA 20ml、1,2-エタンジチオール260μl、およびアニソール780μlを加えて室温で1.5時間撹拌した。その後、この混合物を３Ｇ−３孔のグラスフィルターで支持体と濾別し、この濾液を35℃で減圧濃縮した。これに予め冷却しておいた無水ジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加えて撹拌し、次いで遠心分離し、沈殿した粗ペプチドを収集した。さらに、この粗ペプチドを無水ジエチルエーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥し、目的とする粗精製ペプチドを得た。
ペプチドの精製
得られた粗精製ペプチドを0.1％TFAに溶解して、0.2μmのメンブレンフィルターで濾過し、得られた濾液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供した。HPLCは、Model LC-10Aシステム（島津製作所製）を用い、カラムは逆相系のμBondasphere C18（日本ミリポア．ウォーターズ社製）を用いた。移動相には、Ａ液として0.1％TFA水溶液を、Ｂ液として0.1％TFAを含む80％(v/v)アセトニトリル／水を用い、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。得られたクロマトピークのペプチド相当画分を分取した。分取を数回繰り返し、これを凍結乾燥することにより精製ペプチドを得た。得られたペプチドは、気相プロテインシークエンサー477型（アプライドバイオシステムズ社製）および日立カスタムイオン交換樹脂を用いたアミノ酸分析により解析して、配列番号２に記載のアミノ酸配列のペプチドが得られていることを確認した。
ペプチドのセファロースへの固定化
上記ペプチドを、多孔質セファロース上に固定化することにより以下のようにして吸着材を製造した。セファロースには、チオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシアLKB社製）を用いた。チオプロピルセファロース６Ｂ 50mgに蒸留水50mlを加え、室温で15分間放置して樹脂を膨潤させた。次いで、蒸留水を除去し、0.5M NaClを含む0.1Mトリス塩酸（pH7.5）カップリング緩衝液に置換した。
一方、上記精製ペプチド４mgを、0.5M NaClを含む0.1Mトリス塩酸（pH7.5）カップリング緩衝液400μlに溶解し、上記チオプロピルセファロース６Ｂ 40mgを加えて、４℃で12時間撹拌することにより、精製ペプチドを固定化した吸着材を得た。さらに、得られたペプチド固定化吸着材を吸引濾過し、濾液中のペプチド含量をHPLCによる絶対検量線法で定量することにより、担体上へのペプチドの固定化率を求めた。このペプチド固定化吸着材を、150mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）で十分に洗浄し、吸引濾過し、目的のペプチド−セファロース吸着材を得た。
実施例２
ペプチド固定化吸着材の吸着性能評価
試験１
上記実施例１で作製した吸着材について、健常人の血清を用いて、血液中の熱凝集化複合体（免疫複合体のモデル）の吸着性能を評価した。上記吸着材50μl（１容）をバイアル中に採取して、熱凝集化複合体（牧野正彦ら、臨床免疫、第18巻、111〜119頁、(1986)を参照のこと）を20μg/ml含む健常人血清150μl（３容）を加えて、37℃で２時間振盪しながらインキュベートした。また、コントロールとして、未処理の支持体50μl（１容）に、熱凝集化複合体を20μg/ml含む健常人血清150μl（３容）を加えて、37℃で２時間振盪しながらインキュベートした。その後、この懸濁液を5,000rpmで１分間遠心分離を行い、上清液中の複合体量を、富士レビオ（株）社製の体外診断用キット「フレライザClq-CIC」で測定した。
結果を表１に示す。熱凝集化複合体の吸着率は、コントロール血清の値から以下の式より算出した吸着率（％）で示した。また、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM）の吸着性に関しては、ニットウボー社より販売されている体外診断用医薬品「Ｎ−アッセイTIA」測定キットで定量した。結果を表２に示す。さらに、IgGサブクラス（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）については、バィンディングサイト社から販売されている免疫拡散（SRID）法による測定キットにより定量した。結果を表３に示す。
0003908278.tif 000004
0003908278.tif 000005
0003908278.tif 000006
0003908278.tif 000007
上記の結果から、本発明の吸着材の使用によって、免疫複合体の構成成分となるIgGならびに免疫複合体を選択的に吸着除去できること、またプロテインＡで吸着しないIgG3も吸着除去できることが明らかとなった。
試験２
上記吸着材について、リウマチ患者の血清を用いて、血液中の循環免疫複合体の吸着性能を評価した。上記の吸着材を50μl（１容）バイアル中に採取し、リウマチ患者の血清150μl（３容）を加えて37℃で２時間振盪しながらインキュベートした。また、コントロールとして、未処理の支持体50μl（１容）にリウマチ患者血清150μl（３容）を加えて37℃で２時間振盪しながらインキュベートした。その後、この懸濁液を5,000rpmで１分間遠心分離を行い、上清液中の複合体量を試験１に記載の方法で測定した。結果は表４に示す通りであり、コントロール血清の値から算出した吸着率（％）で示した。また、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM）の吸着能に関しても上記方法を用いて定量した。結果を表５に示す。
0003908278.tif 000008
0003908278.tif 000009
表４および表５から、本発明の吸着材の使用により、リウマチ患者の血液中の免疫複合体の構成成分となるIgGならびに免疫複合体を選択的に吸着除去できることが明らかとなった。
実施例３
ペプチド固定化吸着材の高圧蒸気滅菌安定性
吸着材オートクレーブ処理
実施例１で作製した吸着材50μlを、150mM NaClを含有する10mMリン酸緩衝液（pH7.2）１ml中に懸濁し、オートクレーブ滅菌器中で加圧下121℃で20分間熱処理した。
オートクレーブ処理吸着材の吸着性の評価
実施例１で得られた吸着材およびオートクレーブ滅菌処理した上記吸着材を用いて、実施例２と同様に血清の懸濁処理を行い、得られた上清液中の複合体および免疫グロブリンの濃度を測定し、吸着除去率を算出した。結果を、表６および７に示す。
0003908278.tif 000010
0003908278.tif 000011
上記試験結果より、本発明のペプチドを固定化した吸着材は、オートクレーブ滅菌処理により吸着除去能は低下するが、複合体およびIgGに対する吸着除去能力を保持していることがわかった。
実施例４
ペプチド誘導体MK3P47ペプチドの生産
配列番号４に記載のMK3P47ペプチドをコードするDNA（配列番号５のDNA配列）を合成した。このDNAは、pUCNTベクター（特開平4-212692号公報）のそれぞれ制限酵素部位（5'側はNdeI、3'側はHindIII）を利用して連結できるように設計されている。
上記配列を有するDNAを、制限酵素NdeIおよびHindIII（宝酒造社製）の消化によって開裂したpUCNTベクターと、宝酒造社製DNA Ligation Kit Ver.2を用いて手順書に従って連結し、pUCNTMK3P47ベクター（図１）を作製した。
公知の方法を用いてこのpUCNTMK3P47ベクターDNAを大腸菌HB101株（フナコシ販）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を指標として形質転換体を選択した。また、この形質転換体から常法によりプラスミドDNAを抽出し、配列決定することによってpUCNTMK3P47ベクターが設計通りのDNA配列を有していることを確認した。次に、この形質転換体を６ＬのL-ブロス（５g/L NaCl、10g/Lバクトトリプシン、５g/Lイーストエキストラクト）中で37℃にて20時間振盪培養し、菌体を遠心分離（日立RPR9-2ローターを用い４℃で6000rpm、20分間）して回収した。ここで得られたペレットを300mlのTE緩衝液（20mM Tris-HCl、１mM EDTA：pH7.5）に懸濁し、超音波破砕処理（BRANSON250を用い氷中にて６分間３回）を施し、次いで遠心分離（日立RPR16ローターを用い４℃で15000rpm、20分間）を行い、上清を回収した。ここで得られた上清に70℃にて10分間の熱処理を行い、さらに遠心分離（日立RPR16ローターを用い４℃で15000rpm、20分間）してその上清300mlを回収した。この得られた上清からMK3P47ペプチドを、HPLCクロマトグラフィー（カラム：Waters μBONDASPHERE ５μ C18 300A 19.0×150mm）を用いて以下のように精製した。まず、40mlの0.1％TFA溶液を流速５ml/分にて流してカラムを活性化し、300mlのサンプルを同流速にて流し、0.1％TFA＋14％アセトニトリル溶液200mlによりカラムを洗浄し、次いで0.1％TFA＋40％アセトニトリル溶液200mlを用いてカラムから目的のMK3P47ペプチド誘導体を溶出させ、MK3P47ペプチドを含有する画分を分取した。この画分をエバポレーターにて100mlに濃縮および凍結乾燥し、高純度精製標品として1.2ｇのMK3P47ペプチドを取得した。この標品を各種検討に使用した。
実施例５
ペプチド誘導体MP47K3ペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号６に記載のMP47K3ペプチドをコードする配列番号７のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMP47K3ベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のMP47K3ペプチドを精製し、高純度の標品600mgを取得した。
実施例６
ペプチド誘導体MP47ペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号８に記載のMP47ペプチドをコードする配列番号９のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMP47ベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のペプチドMP47を精製し、高純度の標品500mgを取得した。
実施例７
ペプチド誘導体MP47Cペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号10に記載のMP47Cペプチドをコードする配列番号11のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMP47Cベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のペプチドMP47Cを精製し、高純度の標品1.3ｇを取得した。
実施例８
比較用MK3G56ペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号12に記載のMK3G56ペプチドをコードする配列番号13のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMK3G56ベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のMK3G56ペプチドを精製し、高純度の標品1.0ｇを取得した。
実施例９
ペプチド誘導体MK3-7Mペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号14に記載のMK3-7Mペプチドをコードする配列番号15のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMK3-7Mベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のMK3-7Mペプチドを精製し、高純度の標品800mgを取得した。
実施例10
比較用MG56ペプチドの生産
実施例４と同様の方法を用いて、配列番号16に記載のMG56ペプチドをコードする配列番号17のDNAを合成し、このDNAとpUCNTベクターとを用いてpUCNTMG56ベクターを作製した。次いで、大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体を培養し（６Ｌ）、目的のMG56ペプチドを精製し、高純度の標品400mgを取得した。
実施例11
ペプチドの薬剤変性曲線解析
実施例４〜８、および実施例10で得られた各ペプチド１mg/ml水溶液を０〜８Ｍ塩酸グアニジン溶液（30℃）にて10μg/mlに希釈し、日立社製F-2000形分光蛍光光度計にてEM340nm（EX278nm励起）での蛍光強度を測定した。結果を図２および図３に示す。縦軸は蛍光強度（％）、横軸はグアニジン濃度(M)をプロットした。図２では、◇はMG56ペプチド、□はMK3G56ペプチド、および△はMK3P47ペプチドを示す。図３では、◇はMK3P47ペプチド、□はMP47K3ペプチド、△はMP47ペプチド、および×はMP47Cペプチドを示す。その結果、図２および図３に示すように、それぞれの変性濃度の高さを比較すると、MP47C＞MP47＞MP47K3＞MK3P47＞MG56＞MK3G56であった。
実施例12
ペプチドの熱変性点の測定
MK3G56ペプチドおよびMK3P47ペプチドについて、断熱型示差走査熱量計DASM-4(ロシアMashpriborintorg社製:日本側代理店(株)真空理工)によって、蛋白質  核酸  酵素  第33巻、第４号（1988）337-347頁に記載の方法を参考に熱変性点の測定を行った。その結果を図４および図５に示す。縦軸に熱容量（Cp J/g.K）を、横軸に温度（℃）をプロットした。、図４（MK3G56）および図５（MK3P47）に示すように、MK3G56ペプチドの熱変性点が76.3℃であるのに対してMK3P47ペプチドは78.1℃であった。このことは、配列番号３の47位のアミノ酸がProであることにより、熱安定性が明らかに向上することを示す。
実施例13
MK3P47ペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
セルロース系多孔質硬質ゲルであるGCL2000m（チッソ(株)製、球状タンパク質の排除限界分子量300万）90mlに水を加えて全量を180mlとしたのち、２M水酸化ナトリウム60mlを加え40℃まで加熱した。これにエピクロルヒドリン21mlを加え、40℃で撹拌しながら１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化ゲルを得た。
このエポキシ活性化ゲルをサックドライ（グラスフィルターＧ３上で15分間アスピレーターにて吸引）し、エポキシ活性化ゲル１ｇをpH10.0ホウ酸緩衝液2.7ml（0.1M四ホウ酸ナトリウム、0.1M塩化カリウム水溶液10mlに0.1N水酸化ナトリウム水溶液8.74mlを加え、水を加えて20mlにした）に懸濁し、10mgのMK3P47ペプチド（配列番号４）を加えて40℃で60時間振盪しながら反応させた。
反応前後の反応上清をそれぞれ２倍希釈し、各10μlにBCA測定試薬（Pierce社製）100μlを加えて37℃で30分間インキュベート後λ＝550nmの吸光度を測定した。検量線を作製して、反応前後のペプチド濃度および固定化量を計算した。その結果、ペプチドのゲルへの反応収率は34％であり、固定化量は2.1mg/mlゲルであった。
ペプチドを固定した合成吸着材を充分量の生理食塩液で洗浄し、吸着材GCL2000mMK3P47を得た。
さらに、合成した吸着材GCL2000mMK3P47の一部を生理食塩液懸濁状態でγ線滅菌（25kGy）し、γ線滅菌を施した吸着材γGCL2000mMK3P47を得た。（以下、γ線滅菌を行った吸着材には、γを付けて表す。）
得られた吸着材GCL2000mMK3P47またはγGCL2000mMK3P47 100μlに熱凝集化免疫グロブリン複合体（以下モデルICという）20μg/mlを含むヒト血清300μlを加えて37℃で２時間振盪し、上清の血清を遠心分離により回収し、免疫グロブリン（以下IgGという）濃度およびIC濃度を測定して吸着率を算出した。IgG濃度の測定は、ニットウボー社より販売されている体外診断用医薬品「N-アッセイTIA」測定キットにて行い、IC濃度の測定は、酵素免疫測定法フレライザClq-CIC、フジレビオ（株）社製により添付のマニュアルに従った。結果は表８に示すように、Ｃ３ペプチドの47番目のAspをProに置換し、さらに担体への固定化官能基としてＮ末端にLys-Lys-Lys-を付加した組換えペプチドMK3P47をリガンドとしたGCL2000mMK3P47は、ICおよびIgGに対して高い吸着能を示し、かつγ線滅菌によってもその吸着能はほとんど低下しなかった。
実施例14
MK3G56ペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
実施例８で得られたMK3G56ペプチドを用いたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材GCL2000mMK3G56および吸着材γGCL2000mMK3G56を得た。ペプチドのゲルへの反応収率は40％、固定化量は2.5mg/mlゲルであった。
得られたGCL2000mMK3G56またはγGCL2000mMK3G56のIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。Ｃ３ペプチドに担体への固定化官能基としてLys-Lys-Lys-をＮ末端に付加した組換えMK3G56ペプチドを担体としたGCL2000mMK3G56は、IgGおよびICに対して比較的高い吸着率を示したものの、γ線滅菌処理によってその吸着能の大半を消失した。
実施例15
MP47K3ペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
実施例５で得られたMP47K3ペプチドを用いたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材GCL2000mMP47K3および吸着材γGCL2000mMP47K3を得た。ペプチドのゲルへの反応収率は42％、固定化量は2.6mg/mlゲルであった。
得られたGCL2000mMP47K3またはγGCL2000mMP47K3のIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。Ｃ３ペプチドの47番目のAspをProに変換した上に担体への固定化官能基としてＣ末側に-Lys-Lys-Lysを付加した組換えペプチドMP47K3をリガンドとしたGCL2000mMP47K3は、比較例であるMK3G56ペプチドを担体とした場合よりも、ICおよびIgGに対する吸着能におけるγ線滅菌安定性が大きく向上した。
実施例16
MP47ペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
セルロース系多孔質硬質ゲルであるGC700m（チッソ(株)製、球状タンパク質の排除限界分子量40万）90mlに水を加えて全量を180mlとしたのち、２M水酸化ナトリウム60mlを加え40℃まで加熱した。これにエピクロルヒドリン21mlを加え、40℃で撹拌しながら１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化ゲルを得た。
この得られたエポキシ活性化ゲルおよび実施例６で得られたMP47ペプチドを用いたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材GC700mMP47および吸着材γGC700mMP47を得た。ペプチドの反応収率は42％、固定化量は2.6mg/mlゲルであった。
得られたGC700mMP47またはγGC700mMP47のIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。Ｃ３ペプチドの47番目のAspをProに変換した組換えペプチドMP47をリガンドとして用いたGC700mMP47は、実施例18に記載の組換えＣ３ペプチド(MG56)をリガンドとして用いた場合に比べて、ICおよびIgG吸着能におけるγ線滅菌安定性が大きく向上した。
実施例17
MP47Cペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
実施例16で得られたエポキシ活性化ゲルおよび実施例７で得られたMP47Cペプチドを用いたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材GC700mMP47Cおよび吸着材γGC700mMP47Cを得た。ペプチドのゲルへの反応収率は64％、固定化量は4.0mg/mlゲルであった。
得られたGC700mMP47CまたはγGC700mMP47CのIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。Ｃ３ペプチドの47番目のAspをProに変換した上に担体への固定化官能基としてＣ末端側に-Cysを付加した組換えペプチドMP47CをリガンドとしたGC700mMP47Cは、実施例18において組換えＣ３ペプチドに相当するMG56をリガンドとした場合、ならびに実施例16においてＣ末端側に-Cysを付加していないMP47ペプチドをリガンドとした場合に比べて、ICおよびIgGに対する吸着率が飛躍的に向上し、さらに、γ線滅菌後もその吸着能はほとんど低下しなかった。
実施例18
MG56ペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
実施例16で得られたエポキシ活性化ゲルおよび実施例10で得られたMG56ペプチドを用いたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材GC700mMG56および吸着材γGC700mMG56を得た。ペプチドのゲルへの反応収率は64％、固定化量は4.0mg/mlゲルであった。
得られたGC700mMG56またはγGC700mMG56のIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。組換えＣ３ペプチドであるMG56をリガンドとしたGC700mMG56は、ICおよびIgGに対して比較的高い吸着率を示したものの、γ線滅菌処理にてその吸着能の大半を消失した。
実施例19
MK3-7Mペプチドの固定化およびγ線滅菌安定性
上記のエポキシ活性化ゲルの代わりにAF-トレシルトヨパール650 0.3ｇをpH9.0の0.5M塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液３mlに懸濁し、実施例９で得られたMK3-7Mペプチドを10mg加えて40℃で60時間振盪しながら反応させたこと以外は、実施例13と同様にして、吸着材HW65MK3-7Mおよび吸着材γHW65MK3-7Mを得た。ペプチドの反応収率は57％、固定化量は3.6mg/mlゲルであった。
得られたHW65MK3-7MまたはγHW65MK3-7MのIgG吸着率およびIC吸着率は、表８に示した通りである。Ｃ３ペプチドに７カ所の変異を導入し、さらに担体への固定化官能基としてＮ末端にLys-Lys-Lys-を付加した組換えペプチドMK3-7MをリガンドとしたHW65MK3-7Mは、実施例18に記載の組換えＣ３ペプチドであるMG56の場合に比べて、ICおよびIgGの吸着能におけるγ線滅菌安定性が大きく向上していた。
0003908278.tif 000012
実施例20
ペプチド誘導体固定化吸着材の高圧蒸気滅菌安定性
実施例17で得られた吸着材GC700mMP47Cおよび実施例18で得られた吸着材GC700mMG56の一部を生理食塩液に懸濁した条件下でオートクレーブ滅菌（121℃、20分間）し、それぞれaGC700mMP47CおよびaGC700mMG56を得た。実施例13と同様の方法を用いて、これらの吸着材のIgG吸着率を算出した。結果を表９に示す。
Ｃ３ペプチドの47番目のAspをProに置換し、かつ担体への固定化官能基である−CysをＣ末端に付加した組換えペプチドMP47CをリガンドとするGC700mMP47は、組換えＣ３ペプチド（MG56）をリガンドとする実施例18で得られた吸着材GC700mMG56がオートクレーブ処理後にIgG吸着能を完全に消失したのに対して、オートクレーブ後も50％と極めて高いIgG吸着率を示した。
0003908278.tif 000013
産業上の利用可能性
本発明のペプチドを固定化した吸着材を用いることにより、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を選択的に吸着除去でき、またプロテインＡで吸着されないIgG3も吸着除去できる。さらに、本発明の吸着材は、安価であり、熱安定性に代表される保存安定性にも優れてオートクレーブ滅菌処理も可能であり、かつ薬剤処理および滅菌処理後においても体液中に含まれる免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を効率よく吸着除去することができる。
配列表
配列番号１
配列の長さ：56
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
他の情報：XbbはValまたはIle、XccはIleまたはLeu、XddはLysまたはGlu、XeeはGluまたはAla、XffはAlaまたはVal、XggはValまたはGluを表す。
配列
0003908278.tif 000014
配列番号２
配列の長さ：57
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000015
配列番号３
配列の長さ：56
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
他の情報：XbbはValまたはIle、XccはIleまたはLeu、XddはLysまたはGlu、XeeはGluまたはAla、XffはAlaまたはVal、XggはValまたはGlu、XhhはLysまたはGlyを表す。
配列
0003908278.tif 000016
配列番号４
配列の長さ：60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
配列
0003908278.tif 000017
配列番号５
配列の長さ：190
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000018
配列番号６
配列の長さ：60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000019
配列番号７
配列の長さ：190
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000020
配列番号８
配列の長さ：57
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000021
配列番号９
配列の長さ：181
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000022
配列番号10
配列の長さ：58
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000023
配列番号11
配列の長さ：184
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000024
配列番号12
配列の長さ：60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000025
配列番号13
配列の長さ：190
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000026
配列番号14
配列の長さ：60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000027
配列番号15
配列の長さ：190
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000028
配列番号16
配列の長さ：57
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003908278.tif 000029
配列番号17
配列の長さ：181
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003908278.tif 000030
【図１】
0003908278.tif 000031
【図２】
0003908278.tif 000032
【図３】
0003908278.tif 000033
【図４】
0003908278.tif 000034
【図５】
0003908278.tif 000035
【図６】
0003908278.tif 000036
【図７】
0003908278.tif 000037