(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩を有効成分とする、コリオラス属（Coriolus）若しくはファネロカエテ属（Phanerochaete）に属する微生物のペルオキシダーゼ生成促進剤、又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物のカタラーゼ生成促進剤。
【請求項２】
５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩が５−アミノレブリン酸生産菌の発酵液である、請求項１記載の促進剤。
【請求項３】
ペルオキシダーゼがマンガンペルオキシターゼ又はルグニンペルオキシターゼである、請求項１又は２記載の促進剤。
【請求項４】
５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩を、コリオラス属（Coriolus）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物の培養液に添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ又はカタラーゼの生成促進方法。
【請求項５】
５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩が５−アミノレブリン酸生産菌の発酵液である、請求項４記載の促進方法。
【請求項６】
ペルオキシダーゼがマンガンペルオキシターゼ又はルグニンペルオキシターゼである、請求項４又は５記載の促進方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物による酵素の生成を大幅に増大させることができる微生物の酵素生成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学反応プロセスは、天然に存在しない多くの化合物を生み出し、そこから排出される化学物質を除去するために多くのコストを必要とする。このため、化学物質の放出を極力抑えた新規なプロセスや放出される化学物質処理の効率化が切望されている。
化学物質の過剰な放出を出来るだけ抑制するために、これまで化学触媒を用いてなされているプロセスを生体機能、すなわち酵素等の触媒機能に代替することを目指した研究開発が盛んに行われている。例えば、パルプ製造において木材チップのパルプ化やその漂白工程を微生物やそれが作る特定の酵素を用いて行おうとする研究（バイオサイエンスとインダストリー，Vol.50、No.9、(1992)）が行われている。また、酵素を用いた化学物質の処理方法も数多く検討されている。例えば、繊維の漂白、数の子やコンタクトレンズ等の殺菌工程で大量に用いられ、過剰となった過酸化水素をカタラーゼによって分解する方法（酵素利用ハンドブック、地人書館、404-410)などが検討されている。
【０００３】
しかしながら、このような酵素は、微生物や動植物からの採取によっているため、生産性が低く、コスト高となり、応用局面が限られるなどの問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようすとる課題】
従って、本発明の目的は、微生物による酵素の生成を大幅に増大させることができ、該酵素を効率良く採取することができる方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意研究を行った結果、微生物の培養液に５−アミノレブリン酸等を用いれば、微生物による酵素の生成が大幅に促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩を有効成分とする、コリオラス属（Coriolus）若しくはファネロカエテ属（Phanerochaete）に属する微生物のペルオキシダーゼ生成促進剤、又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物のカタラーゼ生成促進剤を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、５−アミノレブリン酸又は５−アミノレブリン酸のエステル、アミド若しくは塩を、コリオラス属（Coriolus）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物の培養液に添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ又はカタラーゼの生成促進方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、有効成分として５−アミノレブリン酸、５−アミノレブリン酸のエステル、アミド又は塩を用いる。このうち、エステル又はアミドとしては具体的には、例えば、５−アミノレブリン酸メチルエステル、５−アミノレブリン酸エチルエステル、５−アミノレブリン酸プロピルエステル、５−アミノレブリン酸ブチルエステル、５−アミノレブリン酸ペンチルエステル、５−アミノレブリン酸ヘキシルエステル、５−アミノレブリン酸ヘプチルエステル、５−アミノレブリン酸オクチルエステル、５−アミノレブリン酸ノニルエステル、５−アミノレブリン酸ドデシルエステル、５−アミノレブリン酸ヘキサデシルエステル、５−アミノレブリン酸イソプロピルエステル、５−アミノレブリン酸シクロヘキシルエステル、５−アミノレブリン酸ベンジルエステル、５−アミノレブリン酸フェネチルエステル、５−アミノレブリン酸−３−フェニルプロピルエステル、５−アミノレブリン酸エトキシエチルエステル、５−アミノレブリン酸−２−（ヒドロキシメチル）テトラフラニルエステル、５−アミノレブリン酸−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラニルエステル、５−アミノレブリン酸アセトアミド、５−アミノレブリン酸−ｎ−ヘキサノイックアミド、５−アミノレブリン酸−ｎ−ノナノイックアミド等が挙げられる。また塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、酪酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウムあるいはアルキルアンモニウム塩等が挙げられる。更に、これらの５−アミノレブリン酸、そのエステル、アミド又は塩は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。これらの化合物及びその合成方法は特開平４−９３６０号公報に記載されている。
【０００９】
また、これらの５−アミノレブリン酸等は、５−アミノレブリン酸を含有する５−アミノレブリン酸生産菌の発酵液であってもよい。５−アミノレブリン酸生産微生物としては、例えばロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-0072009 (FERM P-16217)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Spheroises)IFO12203、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-17(FERM P-11752)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-286(FERM P-12542)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-2S5(FERM P-12543)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-386(FERM P-13159)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-450(FERM P-14085)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-520(FERM BP-5255)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-649-B(FERM P-15974)、ロドバクター  セファロイデス（Rhodobacter Sphaeroides)CR-002(FERM P-15312)等が挙げられる。発酵液は、５−アミノレブリン酸を含有するものであれば特に制限されずに使用することができる。
【００１０】
本発明の微生物の酵素生成促進剤が適用される微生物としては、例えばコリオラス属（Coriolus）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ルートロータス属（Pleutrotus）、ブジェルカンデラ属（Bjerkandera）、コプリヌス属（Coprinus）、キャンディダ属（Candida）又はピクノポーラス属（Pycnoporus）等に属するものが挙げられる。より具体的には、コリオラス  ベルジカラー（Coriolus versicolor）、ファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、ルートロータス  オストレータス（Pleutrotus ostreatus）、ブジェルカンデラ  アダスタ（Bjerkandera adusta）、コプリヌス  シネレウス（Coprinus cinereus)、キャンディダ  ボンビコラ（Candida bombicola）、キャンディダ  トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ  ボイジニイ（Candida boidinii）、ピクノポーラス  コッシネウス（Pycnoporus coccineus）等が挙げられる。
【００１１】
また、生成する酵素は、ポルフィリン構造を有するもの、例えばカタラーゼや、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼなどの場合に、特に好適である。
なお、本発明の有効成分である５−アミノレブリン酸は、ポルフィリンの前駆体であるが、ポルフィリン構造を有する酵素の生成の反応に寄与する原料の１つを添加しても、他の条件に変化がなければ最終的な生成量は増加しないから、本発明の微生物の酵素生成促進剤は、単に原料の１つを添加したものとは異なり、当業者が容易に想到し得るものではない。
【００１２】
本発明において、酵素を生成する微生物の培養方法は、特に制限されず、微生物の種類、目的とする酵素等によって、培地組成、培養温度、培養期間などそれぞれの最適値に設定すればよい。また、微生物の培養液に添加する５−アミノレブリン酸等は、目的の酵素と微生物によって適宜最適な添加量と添加濃度を設定することができるが、通常、培養液中の濃度が０．１〜１０mM、特に１〜５mMとなるように添加するのが好ましい。また、５−アミノレブリン酸生産菌の発酵液を用いる場合も、５−アミノレブリン酸濃度が前記範囲内になるように添加するのが好ましい。
５−アミノレブリン酸等の添加時期は、目的の酵素と微生物によって適宜最適な添加時期を選択することができるが、通常、目的とする酵素が生成する１時間から５日前であるのが好ましい。
【００１３】
例えば、微生物がファネロカエテ  クリソスポリウムであり、酵素がマンガンペルオキシダーゼである場合、実施例１に示したような液体培地でファネロカエテ  クリソスポリウムを３０℃で静置培養し、培養２〜７日目に１〜５mMの５−アミノレブリン酸を添加すると、５−アミノレブリン酸添加から３〜２０日後に通常の２倍から１０倍のマンガンペルオキシダーゼが得られる。また、微生物がアスペルギルス  ニガーであり、酵素がカタラーゼである場合、実施例２に示した培地３でアスペルギルス  ニガーを静置培養し、培養１〜７日目に１〜５mMの５−アミノレブリン酸を添加すると、５−アミノレブリン酸添加から１〜１０日後に通常の２倍から１０倍のカタラーゼが得られる。
【００１４】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物による酵素の生成を大幅に増大させることができ、該酵素を効率良く採取することが可能である。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１６】
参考例１
表１に示す組成の培地１を２００ml調製して５００ml容の浸透フラスコに加え、これにロドバクター  セファロイデスCR-0072009株を植菌し、暗所、３２℃で４８時間往復振とう培養した。培養後、５０００ｇで１０分間遠心して菌体を集め、湿菌体重量が０．５ｇ／１０mlとなるように培地２（表２）に懸濁させ、２１mmの試験管に３mlずつ分注した。このようにして得られた試験管を暗所、３２℃で往復振とう培養し、２０時間後の培養液中の５−アミノレブリン酸を岡山らの方法（CLINICAL CHEMISTRY, Vol.36, No.8, p-1494, 1990）で測定した。その結果、５−アミノレブリン酸は、３１．０mMであった。これを、０．２２μｍのポアサイズのフィルターに通し、５−アミノレブリン酸発酵液を得た。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【００１９】
実施例１
（１）９０mm平板寒天培地（グルコース１％、寒天１．５％、Salt液Ａ（表３）１００ml／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液５．０mM、酒石酸アンモニウム１２mM）で７日間生育したファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium:ATCC-24275）菌糸を５０mlの滅菌水とともにホモジナイズし、菌糸懸濁液を調製した。次に、５本の５０ml容三角フラスコにそれぞれ液体培地（グルコース１％、Salt液Ａ（表３）１００ml／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液５．０mM、酒石酸アンモニウム１．２mM、ジメチルコハク酸２０mM、pH６．０）１０mlを調製し、上記菌糸懸濁液２mlを添加した。３０℃で４日間静置培養し、菌体がマット状になったところで、５本の三角フラスコのうちの４本に、２０mMの濃度で調製し０．２２μｍのポアサイズのフィルターを通して滅菌した５−アミノレブリン酸塩酸塩の溶液を、それぞれ３．０、１．３、０．６５ml添加し（培養液中の濃度はそれぞれ４mM、２mM、１mM）、培養を続けた。
培養液中のマンガンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した。マンガンペルオキシダーゼ活性の測定は、５０mMのマロン酸緩衝液（pH４．５）に、０．５mMの硫酸マンガン、０．１mMの過酸化水素を含む反応液２mlに、上記の遠心分離により除菌した培養液１０μｌを加え、３０℃で１０分間反応させた後のＭｎ3+−マロン酸複合体に由来する２７０nmの吸光度（吸光係数＝１１．６mM-1）を測定した。結果を図１に示す。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
【表４】
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【００２２】
（２）また、（１）と同様にファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium:ATCC-24275）を５０ml容三角フラスコにて、３０℃で４日間静置培養し、菌体がマット状になったところに、参考例１で得られた５−アミノレブリン酸発酵液０．５ml添加した。同様にして、培養液中のマンガンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した。結果を図１に示す。
【００２３】
図１の結果から明らかなように、５−アミノレブリン酸塩酸塩又は５−アミノレブリン酸発酵液を添加すると、ファネロカエテ  クリソスポリウムによるマンガンペルオキシダーゼの活性が著しく向上した。
通常、単位当たりの酵素の分子活性は一定と考えられるから、図１に示す酵素活性の上昇は酵素の生成量の増加を示すものと言える。
【００２４】
実施例２
９０mmの平板寒天培地（培地３（表５）に１．５％の寒天を加えたもの）で３日間生育したアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger:ATCC 16888）菌糸を５０mlの滅菌水とともにホモジナイズし、菌糸懸濁液を調製した。次に、２つの５０ml容三角フラスコにそれぞれ培地３を１０ml調製し、上記菌糸懸濁液２mlを添加した。
３０℃で２日間静置培養し、菌体がマット状になったところで、２つの三角フラスコの一方に、２０mMの濃度で調製し０．２２μｍのポアサイズのフィルターを通して滅菌した５−アミノレブリン酸塩酸塩の溶液を０．６５ml添加した。５−アミノレブリン酸添加後１５日後に、菌糸を集め、菌糸湿重量１ｇ当たり、海砂１ｇを加え乳鉢で菌糸を破砕し無細胞抽出液を調製し、カタラーゼ活性を調べた。カタラーゼ活性の測定は定法（酵素利用ハンドブック、地人書館、404-410)により行った。結果を表６に示す。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
【表６】
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【００２７】
表６の結果から明らかなように、５−アミノレブリン酸を添加すると、カタラーゼの活性が著しく向上し、カタラーゼの生成量が増加したものと認められた。
【００２８】
実施例３
（１）  ９０mm平板寒天培地（グルコース１％、寒天１．５％、Salt液Ａ（表３）１００ml／ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液５．０mM、酒石酸アンモニウム１２mM）で７日間生育したファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium:ATCC-24275）菌糸を５０mlの滅菌水とともにホモジナイズし、菌糸懸濁液を調製した。次に、５本の５０ml容三角フラスコにそれぞれ液体培地（グルコース１％、Salt液Ａ（表３）１００ml／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液５．０mM、酒石酸アンモニウム１．２mM、ジメチルコハク酸２０mM、pH６．０）１０mlを調製し、上記菌糸懸濁液２mlを添加した。３０℃で５日間静置培養し、菌体がマット状になったところで、５本の三角フラスコに１mMになるようにベラトリルアルコールを添加し、そのうち４本に、２０mMの濃度で調製し０．２２μｍのポアサイズのフィルターを通して滅菌した５−アミノレブリン酸塩酸塩の溶液をそれぞれ３．０、１．３、０．６５ml（培養液中の濃度は、それぞれ４mM、２mM、１mM）添加し、培養を続けた。
培養液中のリグニンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した。リグニンペルオキシダーゼ活性の測定は、２０mMのコハク酸緩衝液（pH３．０）に０．５mMのベラトリルアルコールと０．１mM過酸化水素を含む反応液２mlに、上記の遠心分離により除菌した培養液１０μｌを加え、３０℃で１０分間反応させ反応後のベラトリルアルデヒドに由来する３１０nmの吸光度（吸光係数＝９．３mM-1）を測定した。結果を図２に示す。
【００２９】
（２）用いる微生物をコリオラス  ベルジカラー（Coriolus versicolor:IFO-30340)とし、三角フラスコの液体培地組成が（グルコース１％、Salt液Ａ（表３）１００ml／ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液５．０mM、酒石酸アンモニウム１２mM、ジメチルコハク酸２０mM、pH６．０）とする以外は（１）と同様に行った。結果を図３に示す。
【００３０】
図２及び図３の結果から明らかなように５−アミノレブリン酸を添加すると、リグニンペルオキシダーゼの活性が著しく向上し、リグニンペルオキシダーゼの生成量が増加したものと認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、ファネロカエテ  クリソスポリウムの培養液中のマンガンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した結果を示す図である。
【図２】実施例３（１）において、ファネロカエテ  クリソスポリウムの培養液中のリグニンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した結果を示す図である。
【図３】実施例３（２）において、コリオラス  ベルジカラーの培養液中のリグニンペルオキシダーゼ活性を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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