(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が前立腺癌を発症する危険性があるか否か、あるいは、PG1遺伝子の突然変異の結果として該個体が前立腺癌に罹患しているか否かを判定する方法であって、該個体から採取された核酸試料中にあり、かつ、下記に示す1種以上のPG1関連バイオアレリックマーカーに存在するヌクレオチドが、前立腺癌発症の危険性を示すものであるか否か、あるいはPG1遺伝子の突然変異に起因する前立腺癌罹患を示すものであるか否かを判定することを含む、前記方法。
0003889927.tif 000230
【請求項２】
PG1関連バイアレリックマーカーが、バイアレリックマーカー99-622/95、4-77/151、4-71/233、4-73/134、99-598/130、及び99-576/421から成る群から選択される、請求項１に記載方法。
【請求項３】
バイアレリックマーカー99-622/95におけるGの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バイアレリックマーカー4-77/151におけるGの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
バイアレリックマーカー4-71/233におけるAの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
バイアレリックマーカー4-73/134におけるGの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
バイアレリックマーカー99-598/130におけるGの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
バイアレリックマーカー99-576/421におけるGの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項２から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
PG1関連バイアレリックマーカーが、バイアレリックマーカー4-14/240、99-217/277、及び99-221/377から成る群から選択される、請求項１に記載方法。
【請求項１０】
バイアレリックマーカー4-14/240におけるCの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
バイアレリックマーカー99-217/277におけるTの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
バイアレリックマーカー99-221/377におけるAの存在が、前記個体が前立腺癌発症の危険性を有していること、あるいは前記個体が前立腺癌に罹患していることを示すものである、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料の請求項１に記載のPG1関連バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定することを含む、遺伝子型判定方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のPG1関連バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定するための、配列番号179の少なくとも12ヌクレオチドからなる連続したスパンまたはその相補配列を含むポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
前記連続したスパンの3’末端が前記ポリヌクレオチドの3’末端に位置し、前記ポリヌクレオチドの3’末端が前記PG1関連バイアレリックマーカーの1ヌクレオチド上流に位置する、マイクロシークエンシングアッセイにおける請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記スパンが前記PG1関連バイアレリックマーカーを含む、ハイブリダイゼーションアッセイにおける請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記連続したスパンの3’末端が前記ポリヌクレオチドの3’末端に位置し、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの3’末端に存在する、特異的増幅アッセイにおける請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記連続したスパンの3’末端が、前記ポリヌクレオチドの3’末端に位置する、シークエンシングアッセイにおける請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の背景)
癌は遺伝的な損傷が重なることで細胞がクローン増殖したものであり、最終的には細胞成長や組織浸潤、転移(細胞形質転換)が無制限に起こるようになる。癌のタイプとは無関係に、形質転換細胞にはさまざまな形の損傷したDNAが含まれる。これには大雑把にみても染色体転座があり、さらに微妙なものになると、DNAの増幅や再配列、点変異などがあげられる。
【０００２】
発癌性変異種の中には、生殖系列で遺伝して変異保因者の癌発症率を高めるものがある。しかしながら、ほとんどの場合、癌は明らかなメンデル遺伝による単純な一遺伝子疾患として起こるわけではない。多くの癌で第一度近親者が癌を発症する危険度は２倍ないし３倍程度高くなるにすぎないのである(Mulvihill JJ, Miller RW & Fraumeni JF, 1977, Genetics of human cancer Vol 3, New York Raven Press)。あるいは、体外にある何らかの発癌物質に曝露されるなどの理由で、体細胞的にDNA損傷が生じることもある。通常、癌症例の大半はこのような体細胞性の変異が原因で生じている。
【０００３】
癌の年齢依存性に関する研究から、通常の細胞が浸潤癌に変わるためには、突然変異が何度か連続して起こる必要があるのではないかと考えられた。人間での変異率は一般に10-6/遺伝子/細胞であるため、1つの細胞が独立した多くの変異種になる可能性は極めて低い(Loeb LA, Cancer Res 1991, 51: 3075-3079)。それにもかかわらず、2つの機序が組み合わさることで癌が発生する。変異種の中には細胞の増殖を促進して次の変異の標的細胞集団を増やすものがある。また、ゲノム全体の安定性に影響する変異種もあるため、ミスマッチ修復タンパク質の場合と同じで結果として全体としての変異率が高くなる(Arnheim N & Shibata D, Curr. Op. Genetics & Development, 1997, 7:364-370より)。
【０００４】
生物における通常の細胞増殖は、細胞周期として知られる複雑な過程によって行われる。細胞周期活性の程度と各周期ごとに経時的なステップの系統的な実行を調節することで、生物に通常みられる発達と恒常性が維持される。逆に、癌細胞の特徴ともいうべき無秩序な増殖や変異率の増加、異常な転位および遺伝子増幅の多くは、細胞周期の正常な調節または進行の乱れが直接に影響して生じている可能性がある。事実、過去数十年にわたって癌に関与しているとされてきた遺伝子の多くが、現在では細胞周期の始点の調節または細胞周期の間に発生する事象の調整に直接または間接的に影響していると考えることができる。
【０００５】
最近の研究で、癌において突然変異することの多い遺伝子が３つのグループに分類された。第１の遺伝子群はオンコジーンと呼ばれる遺伝子のグループであり、その産物によって細胞増殖が活性化される。通常の非ミュータントはプロトオンコジーンと呼ばれる。突然変異が起こると細胞増殖の促進が過度または不適切な状態で活性化し、その遺伝子は細胞内で1個の変異遺伝子が細胞の表現型に影響するほどに優勢なものとなる。活性化したオンコジーンが生殖系列のミュータントに伝達されることはほとんどない。おそらく、すべての細胞で発現するとオンコジーン自体が死に至るためであろう。したがって、オンコジーンの研究は腫瘍組織でしか行うことができない。
【０００６】
オンコジーンおよびプロトオンコジーンは、その機能に応じて複数の異なるカテゴリーに分類することができる。この分類には、成長因子(すなわち、sis、int-2)、受容体および非受容体タンパク質チロシンキナーゼ(すなわち、erbB、src、bcr-abl、met、trk)、膜関連Gタンパク質(すなわち、ras)、細胞質タンパク質キナーゼ(すなわち、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ-MAPKファミリ、raf、mos、pak)または核転写因子(すなわち、myc、myb、fos、jun、rel)などのシグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる(これについては、Hunter T, 1991 Cell 64:249; Fanger GR et al., 1997 Curr.Op.Genet.Dev.7:67-74; Weiss FU et al., ibid. 80-86を参照のこと)。
【０００７】
癌において突然変異することの多い遺伝子で構成される第2の遺伝子群は、腫瘍抑制遺伝子と呼ばれる遺伝子のグループであり、その産物によって細胞成長が抑制される。ガン細胞において突然変異すると遺伝子は通常の機能を失い、細胞の表現型を変えるために遺伝子のコピーがいずれも不活性化される必要があるという点で細胞内で劣性的に作用する。最も重要なのは、Harrisとその同僚らによってはじめて明らかにされた細胞融解の実験(Harris H et al., 1969, Nature 223:363-368)から分かるように、このような腫瘍の表現型が野生型アレルによって救出される場合があるということである。腫瘍抑制遺伝子の生殖系列での突然変異は伝達され、よって家族性の症例または散発性の症例から得られる構造DNAおよび腫瘍DNAの両方で研究がなされている。腫瘍抑制因子の現在のファミリとしては、DNA結合転写因子(すなわち、p53、WT1)、転写調節因子(すなわち、RB、APC、おそらくBRCA1)、タンパク質キナーゼインヒビター(すなわち、p16)などがあげられる(これについては、Haber D & Harlow E, 1997, Nature Genet. 16:320-322を参照のこと)。
【０００８】
癌において突然変異することの多い遺伝子で構成される第3の遺伝子群は変異誘発遺伝子と呼ばれるものであり、これはゲノムの完全性が維持および/または突然変異率が低く維持される要因である。2つのアレルの機能がいずれも失われると、細胞の突然変異率が高くなり、結果としてプロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子が突然変異を起こす。変異誘発遺伝子は、上述したような野生型アレルを修復するだけではこのクラスの遺伝子によって引き起こされる腫瘍化を抑制することができないという事実以外は、腫瘍抑制遺伝子としても分類できるものである。失活が原因で変異誘発表現型を生じる可能性のある遺伝子としては、ミスマッチ修復遺伝子(すなわち、MLH1、MSH2)、DNAヘリカーゼ(すなわち、BLM、WRN)またはDNA修復およびゲノム的な安定性に関与している他の遺伝子(すなわち、p53、おそらくBRCA1およびBRCA2)などがあげられる(これについては、Haber D & Harlow E, 1997, Nature Genet. 16:320-322; Fishel R & Wilson T. 1997, Curr.Op.Genet.Dev.7: 105-113; Ellis NA,1997 ibid.354-363を参照のこと)。
【０００９】
最近になって遺伝子マッピングの高度な手法が開発されたことで、ヒトに発生する特定のタイプの癌に関連した遺伝子に関するリストが日々増え続ける結果となっている。ヒトハプロイドゲノムには、長さ3×109塩基対の二本鎖DNAに80,000〜100,000の遺伝子が含まれていると思われる。人間は複相体であり、父由来のものと母由来のものの2個のハプロイドゲノムを有している。特定の遺伝座の配列は、1つの個体群内でも個体ごとに異なる場合があり、同じ個体でも染色体上の座の2つのコピー間で異なる場合がある。こうした違いは多型と呼ばれるものであるが、遺伝子マッピング手法ではこれを利用してヒトの表現型に関連した遺伝子の所在をマッピングすることが多い。
【００１０】
上述した腫瘍抑制遺伝子などの機能の消失が癌の原因になる遺伝子の検出には、マッピング技術の1つであるヘテロ接合性消失(LOH)法と呼ばれる手法が用いられることが多い。腫瘍抑制遺伝子は、点変異などの最初の突然変異(または小さな欠失または挿入)によって腫瘍抑制遺伝子の1つのアレルが不活性化される2ヒットの機序で癌を生じることが多い。多くの場合、この最初の突然変異が後の世代に次々と継承される。
【００１１】
多くの場合は腫瘍抑制遺伝子の他方のコピーが含まれる染色体全体またはその一部が除去される欠失などの自然発症による体細胞変異である第2の突然変異によって、腫瘍抑制遺伝子のコピーが2つとも不活性である細胞が発生する。
【００１２】
腫瘍抑制遺伝子に欠失が生じると、腫瘍抑制遺伝子の近くにある遺伝マーカーではいずれもアレルが1つ失われる。したがって、患者が何らかのマーカーに対してヘテロ接合的である場合、腫瘍組織はヘテロ接合性を失ってホモ接合性またはヘミ接合性のものとなる。このヘテロ接合性消失は一般に、失われた領域に腫瘍抑制遺伝子が存在することを示す有力な証拠となる。
【００１３】
すべてのゲノムをカバーする、マイクロサテライトなどの極めて多型度の高い遺伝マーカーを利用し、罹患個体から得た血液と腫瘍試料のペアを複数組遺伝子型判定することによって、腫瘍抑制遺伝子が存在する可能性のある位置を見つけることができる。ほとんどの病理学的腫瘍試料には腫瘍以外の組織も含まれているため、腫瘍試料では、情報性のあるマイクロサテライトのヘテロ接合性の完全消失ではなく相対強度の低下が認められる。したがって、従来から行われているLOH解析では一般に定量的なPCR解析が必要になるため、この手法で検出できる内容には限界があることが多い。LOHに関する研究のもう1つの限界は、一般に数メガベースにわたる比較的大きめの候補領域の定義しかできないという事実にある。このような候補領域を精緻なものとするには、数百名の罹患患者から得た腫瘍組織において同定されたLOH領域での最小オーバーラッピング部分を定義する必要がある。
【００１４】
遺伝子マッピングに対するもう1つの方法は、連鎖解析と呼ばれるものである。この方法では、一家系内で複数の世代にわたって遺伝マーカーの伝達と特異的な形質の伝達との間の相関を確立することを基本としている。この方法では、一般にマイクロサテライトマーカーであるマーカー200〜300個程度を10Mbあたり1つの平均密度で分散させ、罹患した家系の全構成員の遺伝子型を判定する。家系に含まれる全構成員の遺伝子型を比較することで、複数セットのアレルを両親のハプロイドゲノム由来のものと考えることができる(ハプロタイピングまたは相判定)。次に、すべての家系の子孫において組換え断片の起源を判定する。形質と同時分離したものをトラッキングする。すべての家系から得たデータを蓄積した後、統計学的な方法を用いてマーカーと形質がすべての家系で独立に分離する尤度を判断する。統計分析の結果、アレルを発生させる形質を有する確率の高さに応じて1つまたは複数の領域が候補として選択される。連鎖解析の結果は、独立的な分離の可能性が1/1000(LODスコア > 3として示す)未満である場合に有意である。別のマーカーを用いて組換え個体を同定することで、候補結合領域がさらに正確に示される。これは最も多くの場合は2〜20Mbの範囲である。
【００１５】
連鎖解析に関する研究は一般に、マイクロサテライトマーカー(単純縦列型反復配列多型または単純配列長多型と呼ばれることもある)を使用することに依存している。これには、高い長多型度を示すため結果として情報提供レベルも高い単純な配列の縦列型反復の小さなアレイ(ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復)も含まれる。現在までのところ、ヒトゲノムで解明されているマイクロサテライトの数はわずか5,000程度にすぎない(Dib et al., Nature 1996, 380: 152)ため、連鎖解析の解像度はどんなに良くても平均約600kb程度に限られてしまう。
【００１６】
明確なメンデル遺伝パターンを示す単純な遺伝形質のマッピングには、連鎖解析が効果的に利用されている。ここ10年の間に、連鎖解析によって約100の病理学的形質生成遺伝子が発見された。
【００１７】
しかしながら、連鎖解析法を複雑な遺伝形質に利用するのは困難であることが分かっている。これはおそらく、同義遺伝子および/または環境因子の作用が様々に組み合わさるためであると思われる。このような場合、Risch, N.およびMerikangas,K.によって最近発表された(Science 1996, 273: 1516-1517)ように、こうした状況に連鎖解析を適用する上で必要な罹患家系を相当数集めるのに労力と費用がかかりすぎてしまう。最後に、連鎖解析は情報性のある大きな家系がない場合の形質の研究には利用できない。一般に、これは散発性の症例と関連のある形質発生アレルの同定を試みる場合などにあてはまる。
【００１８】
前立腺癌の出現率は、ここ数十年の間に劇的に増加している。西欧諸国と米国の白人個体群のいずれにおいても、男性100,000人あたり平均で30〜50人の割合である。これらの国々では、前立腺癌は診断によって得られる最も一般的な悪性腫瘍となっており、米国人男性に見られる癌4例あたり1例が前立腺癌なのである。前立腺癌の出現率は、中国での100,000人あたり2人からアメリカ黒人男性の100,000あたり80人にまでおよぶ極めて個体群特異的なものである。
【００１９】
フランスでは、前立腺癌の出現率は男性100,000人あたり35人であり、10年ごとに10/100,000人の割合で増え続けている。当然ながら前立腺癌による死亡率も増加している。フランス人男性の癌による死因の第2位が前立腺癌であり、70歳を超える高齢のフランス人男性では前立腺癌は第1位である。このため、前立腺癌は特に人々の高齢化という観点から、公衆衛生関連の非常に大きな問題となっている。
【００２０】
男性の平均余命が短くなる要因の平均40%が前立腺癌によるものである。完全に局在性のものであれば、前立腺癌は外科手術によって治癒させることが可能なものである。しかしながら、平均成功率は約50%程度にすぎない。前立腺から転移した後に癌であることが診断されると、前立腺癌は治療法のない致命的な疾患である。
【００２１】
早期での診断は、前立腺特異抗原(PSA)値に依存したものであり、この方法を用いると臨床徴候が認められるようになる7年も前から前立腺癌を検出することができる。しかしながら、PSA値による診断では、器官にある悪性の疾患と悪性ではない疾患の正確な区別ができないため、その有効性には限度がある。
【００２２】
したがって、早期での前立腺癌予測を可能にする高信頼度の診断手順および前立腺癌の予防および治療方法には、いずれも高い需要がある。本発明は、PG1遺伝子すなわち前立腺癌に関連した遺伝子と、前立腺癌の原因となり得る遺伝子のアレルを検出するための診断法ならびに試薬、前立腺癌を治療するための治療方法に関するものである。
【００２３】
(発明の開示)
本発明は、PG1遺伝子として同定される前立腺癌に関連した遺伝子の同定と、これに関与する試薬や診断方法、治療方法に関するものである。また、本発明は、新規のPG1関連バイアレリックマーカー群を発見したことに基づくものである。詳細な説明部分に記載のPG1関連バイアレリックマーカーの定義を参照のこと。これらのマーカーは、PG1遺伝子に隣接する非コード領域とコード領域の両方にある。これらのマーカーの位置と周囲の配列に関する知識とを用いて、マーカー位置でヌクレオチドの同一性判定に有用なポリヌクレオチド組成物の設計の他、癌や前立腺癌をはじめとする疾患の遺伝的なベースを判断する上で有用な一層複雑な関連性およびハプロタイピングの研究もなされている。また、本発明による組成物および方法には、薬剤および診断法の開発用の標的の同定や、癌および前立腺癌を含む疾患に作用する薬剤に対する差次的かつ有効な応答ならびにこれらの薬剤による副作用のキャラクタリゼーションにおいて活用できる。
【００２４】
本発明の第１の実施形態は、組換えポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドであって、哺乳動物のゲノム配列、遺伝子またはその断片を含むかまたはこれで構成されるポリヌクレオチドである。一態様において、上記の配列は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来のものである。好ましい態様では、ゲノム配列は配列番号 179のヒトゲノム配列またはこの配列に対する相補体である。第2の好ましい実施態様では、ゲノム配列は、配列番号 182および配列番号 183の2個のマウスゲノム断片のうち一方から選択される。この実施形態のさらに他の態様では、核酸が、配列番号 179の配列のヌクレオチド1629〜1870を含む。任意に、前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物のゲノム配列、好ましくは以下の配列番号 179、182および183から選択される配列の連続したスパンのヌクレオチドからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよく、前記連続したスパンが、少なくとも6ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長または500ヌクレオチド長であってもよい。
【００２５】
本発明の第2の実施形態は、組換えポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドであって、哺乳動物のcDNA配列またはその断片を含むかまたはこれで構成されるポリヌクレオチドである。一態様において、上記の配列は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来のものである。好ましい態様では、cDNA配列は配列番号 3、69、112〜124および184のヒトcDNA配列またはこの配列に対する相補体から選択される。第2の好ましい実施形態では、cDNA配列は、配列番号 184のマウスcDNA配列である。任意に、前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物のゲノム配列、好ましくは以下の配列番号 3、69、112〜124および184から選択される配列の連続したスパンのヌクレオチドからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよく、前記連続したスパンが、少なくとも6ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長または500ヌクレオチド長であってもよい。
【００２６】
本発明の第3の実施形態は、哺乳動物のPG1タンパク質またはその断片をコードする、組換え型ポリヌクレオチド、精製または単離されたポリヌクレオチド、またはこれらの相補体である。一態様において、PG1タンパク質配列は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来のものである。好ましい実施形態では、PG1タンパク質配列は、配列番号 4、5、70、および125〜136のヒトPG1タンパク質配列から選択されるものである。第2の好ましい実施形態では、PG1タンパク質配列は配列番号 74のマウスPG1タンパク質配列である。任意に、前記PG1ポリペプチドの断片が、配列番号 4、5、70、74、および125〜136から得られる少なくとも8、10、12、15、20、25、30、50、100または200アミノ酸が連続したストレッチならびに他のヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1ポリペプチドからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよい。
【００２７】
本発明の第4の実施形態は、本願明細書に開示のポリヌクレオチドプライマーおよびプローブである。
【００２８】
本発明の第5の実施形態は、哺乳動物のPG1タンパク質またはその断片を含むかまたはこれで構成される、組換え型ポリペプチド、精製されたポリペプチドまたは単離されたポリペプチドである。一態様において、PG1タンパク質配列は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来のものである。好ましい実施形態では、PG1タンパク質配列は、配列番号 4、5、70、および125〜136のヒトPG1タンパク質配列から選択されるものである。第2の好ましい実施態様では、PG1タンパク質配列は、配列番号 74のマウスPG1タンパク質配列である。任意に、前記PG1ポリペプチドの断片が、配列番号 4、5、70、74、および125〜136から得られる少なくとも8、10、12、15、20、25、30、50、100または200アミノ酸が連続したストレッチならびに他のヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1ポリペプチドからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよい。
【００２９】
本発明の第6の実施形態は、本発明のポリペプチドに対する特異的結合能を持つ抗体組成物である。任意に、前記抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。任意に、前記ポリペプチドが、ヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1タンパク質、好ましくは配列番号 4、5、70、74、または125〜136から選択される配列の、少なくとも8、10、12、15、20、25または30アミノ酸のエピトープ含有断片であってもよい。
【００３０】
本発明の第7の実施形態は、本発明のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターである。任意に、前記ベクターが、発現ベクター、遺伝子治療ベクター、増幅ベクター、ジーンターゲティングベクターまたはノックアウトベクターであってもよい。
【００３１】
本発明の第8の実施形態は、本発明のいずれかのベクターを含む宿主細胞である。
【００３２】
本発明の第9の実施形態は、ノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたPG1遺伝子を含む哺乳動物の宿主細胞である。
【００３３】
本発明の第10の実施形態は、本発明のベクターを含む非ヒト宿主哺乳動物または動物である。
【００３４】
本発明のさらに他の実施形態は、ノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたPG1遺伝子を含む非ヒト宿主哺乳動物である。
【００３５】
本発明のもう1つの実施形態は、後に癌または前立腺癌が個体に発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異の結果として個体が癌または前立腺癌に罹患したか否かを判断する方法であって、個体から核酸試料を採取し、本発明の１種またはそれ以上のPG1関連バイアレリックマーカーに存在するヌクレオチドが、後に前立腺癌が発生する危険性を示すものであるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異が原因の前立腺癌を示すものであるか否かを判断することを含む方法である。任意に、前記PG1関連バイアレリックが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカー、または99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。
【００３６】
本発明のもう1つの実施形態は、後に前立腺癌が個体に発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異の結果として個体が前立腺癌に罹患したか否かを判断する方法であって、個体から核酸試料を採取し、ヌクレオチドがPG1関連バイアレリックマーカーにおいて１つまたはそれ以上の多型に現れるか否かを判断することを含む方法である。任意に、前記PG1関連バイアレリックが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカー、または99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。
【００３７】
本発明のもう1つの実施形態は、検出可能な表現型に関連したPG1遺伝子のアレルを得る方法であって、検出可能な表現型を発現する個体から核酸試料を採取し、この核酸試料と、PG1タンパク質をコードする核酸を特異的に検出できる薬剤とを接触させ、PG1タンパク質をコードする核酸を単離することを含む方法である。この方法の一態様では、接触させるステップが、核酸試料と、前記PG1タンパク質をコードする核酸に対する特異的ハイブリダイズが可能な少なくとも１種の核酸プローブとを接触させることを含む。この実施形態のもう1つの態様では、接触させるステップが、核酸試料と、PG1タンパク質に対する特異的結合能を持つ抗体とを接触させることを含む。この実施形態のもう1つの態様では、検出可能な表現型を発現する個体から核酸試料を採取するステップが、前立腺癌に罹患した個体から核酸試料を得ることを含む。
【００３８】
本発明のもう1つの実施形態は、検出可能な表現型に関連したPG1遺伝子のアレルを得る方法であって、検出可能な表現型を発現する個体から核酸試料を採取し、この核酸試料と、ヒトゲノムの8p23領域内の配列を特異的に検出できる薬剤とを接触させ、核酸試料中のPG1タンパク質をコードする核酸を同定し、かかるPG1タンパク質をコードする核酸を単離することを含む方法である。この実施形態の一態様では、癌または前立腺癌に罹患した個体から核酸試料を得る。
【００３９】
本発明のもう1つの実施形態は、個体における前立腺癌の危険度をカテゴリー化する方法であって、かかる個体から得た試料をアッセイし、この個体が前立腺癌の危険度増大に関連のあるPG1のアレル変異体を有しているか否かを判断するステップを含む方法である。この実施形態の一態様では、試料は核酸試料である。もう1つの態様では、PG1転写の存在頻度を判断することによって核酸試料をアッセイする。この実施形態のもう1つの態様では、試料はタンパク質試料である。この実施形態のもう1つの態様では、この方法はさらに、試料中のPG1タンパク質が前立腺癌に関連のあるPG1アイソフォームに特異な抗体と結合するか否かを判断することを含む。
【００４０】
本発明のもう1つの実施形態は、個体における前立腺癌の危険度をカテゴリー化する方法であって、PG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカー１種またはそれ以上の多型塩基の同一性が、前立腺癌の危険度が高くなったことを示すものであるか否かを判断するステップを含む方法である。
【００４１】
本発明のもう1つの実施形態は、PG1タンパク質、好ましくは配列番号 4のタンパク質またはその一部に特異的に結合する分子を同定する方法であって、配列番号 4のタンパク質またはその一部をコードする核酸を、配列番号 4のタンパク質またはその一部が細胞内で発現されるタンパク質と接触するようにかかる細胞に導入するステップと、配列番号 4のタンパク質またはその一部と特異的に相互作用する、かかる細胞内で発現されるタンパク質を同定するステップと、を含む方法からなるものである。
【００４２】
本発明のもう1つの実施形態は、配列番号 4のタンパク質またはその一部と特異的に結合する分子を同定する方法である。この方法の一ステップは、配列番号 4のタンパク質またはその一部をコードする第1の核酸を、第1の指標ポリペプチドをコードする第1の指標核酸と結びつけ、第1の融合タンパク質をコードする第1のキメラ核酸を作出することを含む。第1の融合タンパク質は、配列番号 4のタンパク質またはその一部と、第1の指標ポリペプチドとを含む。この方法のもう1つのステップは、被験ポリペプチドをコードする第2の核酸を、第2の指標ポリペプチドをコードする第2の指標核酸と結びつけ、第2の融合タンパク質をコードする第2のキメラ核酸を作出することを含む。第2の融合タンパク質は、被験ポリペプチドと第2の指標ポリペプチドとを含む。第1の指標タンパク質と第2の指標タンパク質との間の関連性から検出可能な結果が得られる。この方法のもう1つのステップは、第1のキメラ核酸および第2のキメラ核酸を細胞に導入することを含む。もう1つのステップは、検出可能な結果を検出することを含む。
【００４３】
本発明のさらに他の実施形態は、精製または単離された哺乳動物のPG1遺伝子またはcDNA配列である。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態としては、前立腺癌患者、組織または株化細胞由来の低頻度PG1アレルまたはミュータントの核酸配列およびアミノ酸配列があげられる。本発明はまた、個体または組織試料でこれらのミュータントPG1配列を検出することを利用して、前立腺癌を診断し、前立腺癌が発生する危険度を評価または特定の前立腺腫瘍の考え得る重症度を評価する方法も包含する。
【００４５】
本発明のもう1つの実施形態は、固相に付着する本発明のあらゆるポリヌクレオチドを包含する。また、固相に付着する本発明のポリヌクレオチドは、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のあるポリヌクレオチドすなわち後述のようなポリヌクレオチドを包含する。任意に、前記ポリヌクレオチドが、単独でまたは少なくとも2、5、8、10、12、15、20または25の本発明の異なるポリヌクレオチドで構成されるグループで単一の固相に付着するものであってもよい。任意に、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドが、本発明のポリヌクレオチドと同一の固相に付着してもよい。任意に、多数のポリヌクレオチドが固相に付着する場合、これらのポリヌクレオチドが無作為に定まる位置に付着してもよいし、順序の決まったアレイで付着してもよい。任意に、前記順序の決まったアレイがアドレス指定可能なものであってもよい。
【００４６】
本発明のさらに他の実施形態は、PG1関連バイアレリックマーカーでのアレルの同一性を判定するためのあらゆるポリヌクレオチドまたはこれを判定するのに使用されるあらゆるポリヌクレオチドを使用することを包含する。また、PG1関連バイアレリックマーカーでのアレルの同一性を判定するのに使用される本発明のポリヌクレオチドは、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のあるポリヌクレオチドすなわち後述するようなポリヌクレオチドを包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドが、本願明細書に開示の配列を含んでもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドが、本願明細書に記載のポリヌクレオチドで構成される、あるいは本質的にこれで構成されるものであってもよい。任意に、前記判定を、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイまたはアレル特異的増幅アッセイにおいて行ってもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを、固相、アレイまたはアドレス指定可能なアレイに付着してもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
【００４７】
本発明のもう1つの実施形態は、PG1関連バイアレリックマーカーを含むヌクレオチドセグメントを増幅するためのあらゆるポリヌクレオチドまたはこの増幅に使用するためのあらゆるポリヌクレオチドを使用することを包含する。また、PG1関連バイアレリックマーカーを含むヌクレオチドセグメントを増幅するのに使用される本発明のポリヌクレオチドは、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のあるポリヌクレオチドすなわち後述するようなポリヌクレオチドを包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドが本願明細書に開示の配列を含んでもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドが、本願明細書に記載のあらゆるポリヌクレオチドで構成されるまたは本質的にこれで構成されるものであってもよい。任意に、前記増幅をPCRまたはLCRによって行ってもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを、固相、アレイまたはアドレス指定可能なアレイに付着させてもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドは標識してもよい。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態は、生物学的試料の遺伝子型判定方法であって、アレルのPG1関連バイアレリックマーカーでの同一性を判定することを含む方法を包含する。また、本発明の遺伝子型判定方法は、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のある方法すなわち後述するような方法を包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーである。任意に、前記方法はさらに、前記バイアレリックマーカーでの第2のアレルの同一性を判定することを含む。ここで、前記第1のアレルと第2のアレルとが互いに(Watson & Crick塩基対判定による)塩基対ではない。任意に、前記生物学的試料が単一の固体または被検体由来のものである。任意に、前記方法をin vitroにて実施してもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーを、前記個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの2つのコピー両方について判定してもよい。任意に、前記生物学的試料が複数の被検体または個体由来のものであってもよい。任意に、前記方法がさらに、前記判定ステップの前にバイアレリックマーカーを含む前記配列の一部を増幅することを含んでもよい。任意に、ここで、前記増幅を、宿主細胞中に複製起点および前記一部を含む組換えベクターのPCR、LCRまたは複製によって行ってもよい。任意に、ここで、前記判定を、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイまたはアレル特異的増幅アッセイによって行ってもよい。
【００４９】
本発明のさらに他の実施形態は、個体群におけるアレル頻度を推定する方法であって、前記個体群におけるPG1関連バイアレリックマーカーでのアレルの比例表現(proportional representation)を決定することを含む方法であってもよい。また、本発明による個体群でのアレル頻度推定方法は、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のある方法すなわち後述するような方法も包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、上記の判定を、PG1関連バイアレリックマーカーでのアレルの比例表現の判定を、前記個体群の各個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの2つのコピー両方についてアレルの同一性を判断し、この個体群について前記PG1関連バイアレリックマーカーでの前記アレルの比例表現を算出することによって行ってもよい。任意に、比例表現の判定を、前記個体群中の一定数の個体または各個体から得た生物学的試料をプールしたものに対して、本発明の遺伝子型判定方法を実施し、全体に対する前記ヌクレオチドの相対量を算出することで達成してもよい。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態は、遺伝子型と表現型との間の関連性を検出する方法であって、a)本発明の遺伝子型判定法によって形質陽性個体群における少なくとも１つのPG1関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、b)本発明の遺伝子型判定法によって対照個体群における前記PG1関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、c)前記遺伝子型と前記表現型との間に統計的に有意な関連性が存在するか否かを判断するステップと、を含む方法である。また、遺伝子型と表現型との間の関連性を検出する本発明による方法は、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のある方法すなわち後述するような方法も包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記対照個体群が、形質陰性個体群または無作為に定まる個体群であってもよい。任意に、前記遺伝子型判定ステップa)およびb)の各々を、前記個体群各々から得てプールした単一の生物学的試料について行ってもよい。任意に、ステップa)およびb)の前記遺伝子型判定各々を、前記個体群内の各個体から得た生物学的試料またはそのサブサンプルについて個別に行ってもよい。任意に、前記表現型が、疾病、癌または前立腺癌、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する応答または抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用であってもよい。任意に、前記方法が、前記形質陽性個体群および前記対照個体群における表現型をステップc)の前に判定するステップをさらに含んでもよい。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態は、個体群における一組のバイアレリックマーカーについてハプロタイプ頻度を推定する方法であって、a)本発明の遺伝子型判定法によって、前記個体群またはそのサブサンプルの各個体のゲノムに存在する前記一組のバイアレリックマーカーの2つのコピー両方について、少なくとも１つのPG1関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、b)本発明の遺伝子型判定法によって、前記個体群または前記サブサンプルの各個体のゲノムに存在する第2のバイアレリックマーカーの2つのコピー両方について、前記第2のバイアレリックマーカーでのアレルの同一性を判定することによって、前記第2のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、c)ステップa)およびb)で判定されたヌクレオチドの同一性にハプロタイプ判定法を適用し、前記頻度の推定値を得るステップと、を含む方法を包含する。本発明によるハプロタイプ頻度推定方法は、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のある方法すなわち後述するような方法も包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記第2のバイアレリックマーカーが、PG1関連バイアレリックマーカー、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーおよび前記第2のバイアレリックマーカーが、4-77/151および4-66/145であってもよい。任意に、前記ハプロタイプ判定法が最尤推定アルゴリズムであってもよい。
【００５２】
本発明のさらに他の実施形態は、ハプロタイプと表現型との間の関連性を検出する方法であって、a)本発明のハプロタイプ頻度推定方法によって、形質陽性個体群における少なくとも１種のハプロタイプの頻度を推定するステップと、b)本発明のハプロタイプ頻度推定方法によって、対照個体群での前記ハプロタイプ頻度を推定するステップと、c)前記ハプロタイプと前記表現型との間に統計的に有意な関連性が存在するか否かを判断するステップと、を含む方法を包含する。また、ハプロタイプと表現型との間の関連性を検出する本発明による方法は、本願明細書の開示内容に記載の限定事項のある方法すなわち後述するような方法も包含する。任意に、前記PG1関連バイアレリックが、配列番号 179に位置するPG1関連バイアレリックマーカー、99-1485/251、99-622/95、99-619/141、4-76/222、4-77/151、4-71/233、4-72/127、4-73/134、99-610/250、99-609/225、4-90/283、99-602/258、99-600/492、99-598/130、99-217/277、99-576/421、4-61/269、4-66/145および4-67/40からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーまたは99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576および4-66からなる群から選択されるPG1関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記PG1関連バイアレリックマーカーおよび前記第2のバイアレリックマーカーが、4-77/151および4-66/145であってもよい。任意に、前記ハプロタイプのp値が、癌、好ましくは前立腺癌のある形質陽性個体群との関連性において1×10-3未満であってもよい。任意に、前記対照個体群が形質陰性個体群または無作為に定まる個体群であってもよい。任意に、前記表現型が、疾病、癌または前立腺癌、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する応答または抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用であってもよい。任意に、前記方法が、前記形質陽性個体群および前記対照個体群における表現型をステップc)の前に判定するステップをさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明のさらに他の実施形態および態様は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになろう。
【００５４】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
本発明の実施には、当業者間で周知である、化学、免疫学、分子生物、生化学、タンパク質化学および組換えDNAテクノロジーに関する従来の手法も包含する。かかる手法については、十分に説明された文献がある。たとえば、Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed. 1984)、Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984)、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)、PCR Technology (H.A. Erlich ed., Stockton Press)、R. Scope, Protein Purification Principles and Practice (Springer-Verlag)およびMethods in Enzymologyシリーズ(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)などを参照のこと。
【００５５】
定義
本願明細書において同義に用いられるものとして、「核酸」「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、2つ以上のヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のいずれかで構成されるRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド配列を含む。本願明細書において、形容詞としての「ヌクレオチド」という用語は、特に長さを限定せず一本鎖または二本鎖のRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド配列を含む分子を示す。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、分子を意味する個々のヌクレオチドまたは多種多様なヌクレオチド、あるいは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド内のヌクレオチドである場合はプリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分およびリン酸基またはリン酸ジエステル連鎖を含む、大きな核酸分子に含まれる個々の単位を示す名詞としても使用する。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、少なくとも1つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するものとして使用するが、(a)選択的結合基、(b)プリンの類似形態、(c)ピリミジンの類似形態(d)たとえば類似の糖類などの類似の結合基、プリン、ピリミジンおよび糖は、たとえばPCT公開第WO 95/04064号を参照のこと。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは50%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチド、最も好ましくは90%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチドで構成される。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ex vivo生成またはこれらの組み合わせの他、従来技術において周知の精製方法を用いるなど、周知のどのような方法で調製したものであってもよい。
【００５６】
本願明細書において、「精製された」という表現は絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的に定義することを意図している。少なくとも1桁、好ましくは4桁または5桁まで、出発原料または天然原料を精製することが、特に意図するところである。
【００５７】
本願明細書では、他の核酸、含水炭素(charbohydrate)、脂質およびタンパク質(ポリヌクレオチドの合成に使用される酵素など)を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクター、あるいは線状ポリヌクレオチドから共有結合的に緊密なポリヌクレオチドを分離することを示す上で、「精製された」という表現を使用する。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリヌクレオチド配列およびコンホメーション(線状vs.共有結合的に緊密)を呈する限り、実質的に純粋なものである。実質的に純粋なポリヌクレオチドは通常、約50%、好ましくは60〜90重量%/重量の核酸試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%を上回る。ポリヌクレオチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリヌクレオチドバンドを可視化するなどの方法によって示されている。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００５８】
「ポリペプチド」という用語は、長さとは無関係にアミノのポリマー全般を示す。したがって、ポリペプチドという定義の中には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。この用語はまた、ポリペプチドのプロスト（prost）発現修飾に特異なものでもこれを除外するものでもなく、たとえば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などが共有結合的に付加されたポリペプチドもポリペプチドという用語に明示的に包含される。さらに、この定義には、１種またはそれ以上のアミノ酸類似物(たとえば、非天然由来のアミノ酸、生物学的な独立系における天然でのみ発生するアミノ酸、哺乳動物の系由来の修飾アミノ酸などを含む)を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドの他、従来技術において周知の天然由来および非天然由来の他の修飾も含まれる。
【００５９】
本願明細書において、「単離された」という表現で示す物質は、その本来あるべき環境(たとえば、天然由来のものである場合は自然環境)から外されたものでなければならない。
【００６０】
本願明細書では、核酸、脂質、含水炭素および他のタンパク質を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを示す上で、「精製された」という表現を使用する。ポリペプチドは、試料の少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリペプチド配列を呈する限り、実質的に純粋なものである。実質的に純粋なポリペプチドは通常、約50%、好ましくは60〜90%w/wのタンパク質試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%を上回る。ポリペプチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリペプチドバンドを可視化するなどの方法によって示されている。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００６１】
本願明細書において、「非ヒト動物」という用語は、人間以外のあらゆる脊椎動物および鳥類を示し、通常は哺乳動物、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバおよびウマなどの家畜動物、ウサギすなわちげっ歯類、さらに好ましくはラットまたはマウスである。本願明細書において、「動物」という用語は、あらゆる脊椎動物、好ましくは哺乳動物の意味で用いられる。「動物」および「哺乳動物」のいずれの用語も、「非ヒト」という用語が明記されている場合を除き、ヒトの被検体も明示的に含むものとする。
【００６２】
本願明細書において、「抗体」という用語は、ポリペプチド単体または少なくとも１種の結合ドメインで構成される複数のポリペプチドの集合を意味する。この場合、抗体結合ドメインは、抗体分子の可変ドメインの折り畳みで形成され、内面形状および電荷の分布が抗原の抗原決定基の特徴と相補的な三次元結合空間を形成する。これによって、抗原に対する免疫反応が可能になる。抗体としては、結合ドメインを有する組換えタンパク質の他、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2断片をはじめとする断片があげられる。
【００６３】
本願明細書において、「抗原決定基」は、抗原-抗体反応の特異性を決定する抗原分子の一部であり、この場合はPG1ポリペプチドである。「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、空間コンホメーションにわずか3個のアミノ酸を含むことができるものであるが、これはエピトープ独特の特徴である。通常、エピトープにはこのようなアミノ酸が少なくとも6個含まれており、一般にはこのようなアミノ酸が少なくとも8〜10個含まれる。エピトープを構成しているアミノ酸の判断方法としては、x線結晶解析、二次元核磁気共鳴の他、H. Mario Geysen et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002、PCT公開公報第WO 84/03564号および同第WO 84/03506号などに記載されているようなPepscan法をはじめとするエピトープマッピングがあげられる。
【００６４】
「DNAコンストラクト」および「ベクター」という用語は、本願明細書では、人工的に設計され、自然環境中では類似の核酸配列が見出されていない少なくとも2個の核酸配列を有する、精製されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドを意味するのに用いられる。
【００６５】
「形質」および「表現型」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、生物の可視的な性質、検出可能な性質またはこれ以外の場合であれば測定可能な性質一切を意味するものであり、一例としては疾病の徴候または疾病に対する感受率があげられる。本願明細書では、「形質」または「表現型」という用語は主に、癌または前立腺癌の徴候またはこれに対する感受率、あるいは、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する個体の応答または抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用の徴候またはこれに対する感受率を意味するのに用いられる。
【００６６】
「アレル」という用語は、本願明細書では、ヌクレオチド配列の変異体を示す。バイアレリック多型は2つの形態を有する。一般に、最初に同定されたアレルが起始アレル、他方のアレルが選択的アレルとされる。複相生物は、アレル形態に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【００６７】
「ヘテロ接合率」という用語は、本願明細書では、特定のアレルでヘテロ接合的である個体が個体群で出現する率を示す。バイアレリックの系では、ヘテロ接合率は平均で2Pa(1-Pa)に等しい。式中、Paは共通アレルの最小頻度を意味する。遺伝研究に役立つものとするために、遺伝マーカーのヘテロ接合性を適当なレベルに定め、無作為に選択した個人がヘテロ接合的になる確率が最も高くなるようにする必要がある。
【００６８】
「遺伝子型」という用語は、本願明細書では、個体または試料中に存在するアレルの同一性を示す。本発明の文脈では、遺伝子型は、個体または試料中に存在するバイアレリックマーカーアレルのことを示すものであると好ましい。試料または個体のバイアレリックマーカーでの「遺伝子型を判定する」という表現は、バイアレリックマーカーの部分で個体が保持している特異的ヌクレオチドまたは特異的アレルを判断することである。
【００６９】
「突然変異」という用語は、本願明細書では、頻度1%未満の異なる遺伝子または個体間のDNA配列の違いを示す。
【００７０】
「ハプロタイプ」という用語は、個体または試料中に存在するアレルの組み合わせを示す。本発明の文脈では、ハプロタイプは、特定の個体において見出され、表現型に関連のあるバイアレリックマーカーアレルの組み合わせを示すものであると好ましい。
【００７１】
「多型」という用語は、本願明細書では、異なるゲノムまたは個体間で2以上の選択的ゲノム配列またはアレルが出現することを示す。「多型の」という表現は、特異的ゲノム配列の2以上の変異体が個体群に見出される可能性がある状態を示す。「多型部位」は、バリエーションが発生する座である。単一ヌクレオチド多型は、単一塩基対の変化である。一般に、単一ヌクレオチド多型は、多型部位で１種のヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることである。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入も単一ヌクレオチド多型の原因である。本発明の文脈では、「単一ヌクレオチド多型」は、単一ヌクレオチド置換を示すものであると好ましい。一般に、異なるゲノム間または異なる個体間では、多型部位は2つの異なるヌクレオチドによって引き起こされる。
【００７２】
「バイアレリック多型」および「バイアレリックマーカー」という用語は、本願明細書では同義のものとして用いられ、個体群に2つのアレルを極めて高い頻度で有するヌクレオチド多型を示す。「バイアレリックマーカーアレル」は、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチド変異体を示す。通常、バイアレリックマーカーは単一ヌクレオチド多型である。しかしながら、稀にではあるが、本発明の目的でバイアレリックマーカーを構成する最大5つのヌクレオチドの挿入および欠失を伴う場合もある。一般に、本発明によるバイアレリックマーカーの共通性の少ないアレル頻度は1%を上回り、好ましくは頻度が10%を上回り、さらに好ましくは頻度が少なくとも20%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも0.32)、さらに一層好ましくは頻度が少なくとも30%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも0.42)であることが実証されている。共通性の少ないアレル頻度が30%以上のバイアレリックマーカーを「高品質バイアレリックマーカー」とする。
【００７３】
ポリヌクレオチドにおいてこのポリヌクレオチドの中心に対するヌクレオチドの位置は、本願明細書では以下の通りとする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が奇数である場合は、ポリヌクレオチドの3'末端および5'末端から等距離にあるヌクレオチドをそのポリヌクレオチドの「中心に」あるとみなし、中心のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドまたは中心のヌクレオチド自体を「中心から1ヌクレオチド以内」とする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が奇数であれば、たとえばポリヌクレオチドの中心にある5カ所のヌクレオチド位置はいずれも中心から2ヌクレオチド以内ということになる。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が偶数である場合は、このポリヌクレオチドには結合が含まれ、ポリヌクレオチドの中心のヌクレオチドは存在しない。したがって、中心の2つのヌクレオチドのいずれも「中心から1ヌクレオチド以内」とみなされ、ポリヌクレオチドの中心にある4つのヌクレオチドはいずれも「中心から2ヌクレオチド以内」という具合になる。
【００７４】
「上流」という用語は、本願明細書では、特異的な基準点からポリヌクレオチドの5'末端に向かう位置を示す。
【００７５】
「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本願明細書では同義に用いられ、二重らせん状のDNAにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が2つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、シトシン残基およびグアニン残基が3つの水素結合によって結合した、その配列の同一性がゆえに、互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す(Stryer, L., Biochemistry, 4th edition, 1995を参照のこと)。
【００７６】
「相補的」または「その相相補体」という用語は、本願明細書では、相補領域全体を通してもう１種の特異的ポリヌクレオチドとWatson & Crick塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。この用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、2つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【００７７】
本願明細書において、「PG1関連バイアレリックマーカー」という用語は、PG1と連鎖不平衡状態にある一組のバイアレリックマーカーに関する。PG1関連バイアレリックマーカーという用語は、セクションI.D.にて後述する最初の関連性解析で使用されたあらゆるバイアレリックマーカーを含むものであり、この中には配列番号 21〜38および57〜62に含有されるバイアレリックマーカーも含まれる。PG1関連バイアレリックマーカーという用語は、配列番号 179に位置し、独自に参照数字を付して列挙した以下のすべての多型を包含する。すなわち、2159位に5-63-169 GまたはC、
2443位に5-63-453 CまたはT、4452位に99-622-95 TまたはC、
5733位に99-621-215 TまたはC、8438位に99-619-141 GまたはA、
11843位に4-76-222 GTの欠失、11983位に4-76-361 CまたはT、
12080位に4-77-151 GまたはC、12221位に4-77-294 AまたはG、
12947位に4-71-33 GまたはT、13147位に4-71-233 AまたはG、
13194位に4-71-280 GまたはA、13310位に4-71-396 GまたはC、
13342位に4-72-127 AまたはG、13367位に4-72-152 AまたはG、
13594位に4-72-380 Aの欠失、13680位に4-73-134 GまたはC、
13902位に4-73-356 GまたはC、16231位に99-610-250 TまたはC、
16388位に99-610-93 AまたはT、17608位に99-609-225 AまたはT、
18034位に4-90-27 AまたはC、18290位に4-90-283 AまたはC、
18786位に99-607-397 TまたはC、22835位に99-602-295 Aの欠失、
22872位に99-602-258 TまたはC、
25183位に99-600-492 TATTGの欠失、
25192位に99-600-483 TまたはG、25614位に5-23-288 AまたはG、
26911位に99-598-130 TまたはC、32703位に99-592-139 AまたはT、
34491位に99-217-277 CまたはT、34756位に5-47-284 AまたはG、
34934位に99-589-267 TまたはG、35160位に99-589-41 GまたはC、
39897位に99-12899-307 CまたはT、40598位に4-12-68 AまたはG、
40816位に99-582-263 TまたはC、40947位に99-582-132 TまたはC、
45783位に99-576-421 GまたはC、47929位に4-13-51 CまたはT、
48206位に4-13-328 AまたはT、48207位に4-13-329 GまたはC、
49282位に99-12903-381 CまたはT、50037位に5-56-208 AまたはG、
50054位に5-56-225 AまたはG、50101位に5-56-272 AまたはG、
50220位に5-56-391 GまたはT、50440位に4-61-269 AまたはG、
50562位に4-61-391 AまたはG、50653位に4-63-99 AまたはG、
50660位に4-62-120 AまたはG、50745位に4-62-205 AまたはG、
50885位に4-64-113 AまたはT、51249位に4-65-104 AまたはG、
51333位に5-28-300 AまたはG、51435位に5-50-269 CまたはT、
51468位に4-65-324 CまたはT、51515位に5-71-129 GまたはC、
51557位に5-50-391 GまたはC、51566位に5-71-180 AまたはG、
51632位に4-67-40 CまたはT、51666位に5-71-280 AまたはC、
52016位に5-58-167 AまたはG、52096位に5-30-325 CまたはT、
52151位に5-58-302 AまたはT、52282位に5-31-178 AまたはG、
52348位に5-31-244 AまたはG、52410位に5-31-306 Aの欠失、
52524位に5-32-190 CまたはT、52580位に5-32-246 CまたはT、
52712位に5-32-378 Aの欠失、52772位に5-53-266 GまたはC、
52860位に5-60-158 CまたはT、53092位に5-60-390 AまたはG、
53272位に5-68-272 GまたはC、53389位に5-68-385 AまたはT、
53511位に5-66-53 GAの欠失、53600位に5-66-142 GまたはC、
53665位に5-66-207 AまたはG、53815位に5-37-294 AまたはG、
54365位に5-62-163 Aの挿入、54541位に5-62-340 AまたはTおよびこれらの相補体を含む。PG1関連バイアレリックマーカーという用語はまた、独自に参照数字を付し、かつ24位に2つの選択的塩基のうち一方がある47merを各々含有する2つの配列番号も併せて列挙した以下のすべてのバイアレリックマーカーを含む。
配列番号 185および262の4-14-107、配列番号 186および263の4-14-317、配列番号 187および264の4-14-35、配列番号 188および265の4-20-149、
配列番号 189および266の4-20-77、配列番号 190および267の4-22-174、
配列番号 191および268の4-22-176、配列番号 192および269の4-26-60、
配列番号 193および270の4-26-72、配列番号 194および271の4-3-130、
配列番号 195および272の4-38-63、
配列番号 196および273の4-38-83、配列番号 197および274の4-4-152、
配列番号 198および275の4-4-187、配列番号 199および276の4-4-288、
配列番号 200および277の4-42-304、配列番号 201および278の4-42-401、
配列番号 202および279の4-43-328、配列番号 203および280の4-43-70、
配列番号 204および281の4-50-209、配列番号 205および282の4-50-293、
配列番号 206および283の4-50-323、配列番号 207および284の4-50-329、
配列番号 208および285の4-50-330、配列番号 209および286の4-52-163、
配列番号 210および287の4-52-88、配列番号 211および288の4-53-258、
配列番号 212および289の4-54-283、配列番号 213および290の4-54-388、
配列番号 214および291の4-55-70、配列番号 215および292の4-55-95、
配列番号 216および293の4-56-159、配列番号 217および294の4-56-213、
配列番号 218および295の4-58-289、配列番号 219および296の4-58-318、
配列番号 220および297の4-60-266、配列番号 221および298の4-60-293、
配列番号 222および299の4-84-241、配列番号 223および300の4-84-262、
配列番号 224および301の4-86-206、配列番号 225および302の4-86-309、
配列番号 226および303の4-88-349、配列番号 227および304の4-89-87、
配列番号 228および305の99-123-184、配列番号 229および306の99-128-202、
配列番号 230および307の99-128-275、配列番号 231および308の99-128-313、配列番号 232および309の99-128-60、配列番号 233および310の99-12907-295、配列番号 234および311の99-130-58、配列番号 235および312の99-134-362、
配列番号 236および313の99-140-130、配列番号 237および314の99-1462-238、
配列番号 238および315の99-147-181、配列番号 239および316の99-1474-156、
配列番号 240および317の99-1474-359、配列番号 241および318の99-1479-158、
配列番号 242および319の99-1479-379、配列番号 243および320の99-148-129、
配列番号 244および321の99-148-132、配列番号 245および322の99-148-139、
配列番号 246および323の99-148-140、配列番号 247および324の99-148-182、
配列番号 248および325の99-148-366、配列番号 249および326の99-148-76、
配列番号 250および327の99-1480-290、配列番号 251および328の99-1481-285、
配列番号 252および329の99-1484-101、配列番号 253および330の99-1484-328、
配列番号 254および331の99-1485-251、配列番号 255および332の99-1490-381、
配列番号 256および333の99-1493-280、配列番号 257および334の99-151-94、
配列番号 258および335の99-211-291、配列番号 259および336の99-213-37、
配列番号 260および337の99-221-442、配列番号 261および338の99-222-109およびこれらの相補体。
【００７８】
「非遺伝子的」という用語は、本願明細書では、配列番号 179のヒトPG1ゲノム配列では生じないPG1関連バイアレリックマーカーならびにポリヌクレオチドおよびプライマーを示すものである。「遺伝子的」という用語は、本願明細書では、配列番号 179のヒトPG1ゲノム配列で生じるPG1関連バイアレリックマーカーならびにポリヌクレオチドおよびプライマーを示すものである。
【００７９】
「抗癌剤」という用語は、哺乳動物において腫瘍細胞の成長率、転移率または生存度を低下させることができる薬剤または化合物、哺乳動物において腫瘍の大きさを小さくするかまたは腫瘍を消すことのできる薬剤または化合物、あるいは癌に罹患した哺乳動物または人間の平均寿命を延ばすことのできる薬剤または化合物を意味する。抗癌剤には、個体群、特にハイリスク個体群において癌が発生する危険性を減らすことのできる化合物も含まれる。「抗前立腺癌剤」という用語は、前立腺癌細胞由来の細胞または腫瘍に対してこれらの効果を有する抗癌剤である。
【００８０】
「抗癌剤に対する応答」および「抗前立腺癌剤に対する応答」という表現は、化合物代謝機能、プロドラッグを活性薬に変化させる機能、個体での薬剤の薬動学(吸収、分布、脱離)および薬動力学(受容体関連)も含まれるがこれに限定されるものではない薬効を意味する。
【００８１】
「抗癌剤に対する副作用」および「抗前立腺癌剤に対する副作用」という表現は、薬剤の主な薬理学的作用が長期にわたっておよぶことで生じる治療の副作用、あるいは特有の宿主因子と薬剤との相互作用によって生じる特異体質の副反応を意味する。これらの副作用には、皮膚科学的毒性、血液学的毒性または肝臓毒性などの副反応が含まれるがこれに限定されるものではなく、さらに、胃および腸管での潰瘍形成、血小板機能障害、腎性傷害、腎炎、多量の水様分泌物を伴う血管運動性鼻炎、血管神経性浮腫、全身性蕁麻疹および気管支喘息から、咽頭浮腫および気管支収縮、低血圧、性的機能異常およびショックまでも含まれる。
【００８２】
本願明細書において、「相同」という用語はタンパク質配列および/または核酸配列間の相似性を意味し、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムのうち適当なものを用いて評価できるものである。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALW(Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448、 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410、Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410、Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272)があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)(たとえば、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410、Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272、Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402を参照のこと)を用いてタンパク質配列および核酸配列の相同性を評価する。特に、5つの専用BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施する。
【００８３】
(1)  BLASTPおよびBLAST3で、アミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較
(2)  BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較
(3)  BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列(両方の鎖)を6つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較
(4)  TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を、6つの読み枠(両方の鎖)すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較
(5)  TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を6つの読み枠で変換したものを、6つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較
【００８４】
BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、本願明細書では「ハイスコアセグメント対」と呼ぶ類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定(すなわち整列化)されると好ましい。好ましくは、使用するスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445、Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17:49-61)。このマトリックスほど好ましいものではないが、PAMまたはPAM250マトリックスも使用できる(たとえば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships:  Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington:  National Biomedical Research Foundationを参照のこと)。BLASTプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計学的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計学的な有意性を求めるKarlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計学的な有意性を評価すると好ましい(Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268参照のこと)。
【００８５】
I.  PG1遺伝子およびタンパク質の単離およびキャラクタリゼーション
I.A.  8p23領域−LOHに関する研究: 異なる癌のタイプでの8p23領域の関係
相当量のLOHデータによって、異なる癌のタイプに関連する遺伝子がヒトゲノムの8p23領域内に位置しているという仮説を裏付ける。Emi et al.は、肝細胞癌、結腸直腸癌および肺非小細胞癌の症例における8p23.1-8p21.3領域の関係を示した(Emi M, Fujiwara Y, Nakajima T, Tsuchiya E, Tsuda H, Hirohashi S, Maeda Y, Tsuruta K, Miyaki M, Nakamura Y, Cancer Res. 1992 Oct 1; 52(19): 5368-5372)。Yaremko, et al.は、87の結腸直腸癌試料での8番染色体マーカーに対するLOHの2つの主要な領域の存在を示した。最も顕著な消失が8p23.1-pterについて見出された。このとき、情報性のある症例の45%にアレルの消失が認められた(Yaremko ML, Wasylyshyn ML, Paulus KL, Michelassi F, Westbrook CA, Genes Chromosomes Cancer 1994 May;10(1):1-6)。Scholnick et al.は、声門上喉頭扁平上皮癌の症例において8番染色体マーカーに対するLOHの3つの異なる領域の存在を示した。彼らは、8p23マーカーD8S264のアレル消失によって、声門上扁平上皮癌に罹患した患者の悪い予後を統計的に有意なレベルで独立に予測できることを示した(Scholnick SB, Haughey BH, Sunwoo JB, el-Mofty SK, Baty JD, Piccirillo JF, Zequeira MR, J. Natl. Cancer Inst. 1996 Nov 20; 88(22): 1676-1682 and Sunwoo JB, Holt MS, Radford DM, Deeker C, Scholnick S, Genes Chromosomes Cancer 1996 Jul; 16(3):164-169)。
【００８６】
他の研究では、Nagai et al.が肝細胞癌(HCC)の症例120例でのLOHのゲノムワイドスキャンによって8p23の特定領域におけるヘテロ接合性消失率が最も高いものを示した(Nagai H, Pineau P, Tiollais P, Buendia MA, Dejean A, Oncogene 1997 Jun 19; 14(24): 2927-2933)。Gronwald et al.は、腎明細胞癌における8p23-pterの消失を示した(Gronwald J, Storkel S, Holtgreve-Grez H, Hadaczek P, Brinkschmidt C, Jauch A, Lubinski J, Cremer, Cancer Res. 1997 Feb 1; 57(3): 481-487)。
【００８７】
同じ領域が前立腺癌の特定の症例にも関与している。Matsuyama et al.は、前立腺癌の症例で8p23バンドの特異的な欠失をD8S7プローブを用いたFISHによってモニタリングして示した(Matsuyama H, Pan Y, Skoog L, Tribukait B, Naito K, Ekman P, Lichter P, Bergerheim US Oncogene 1994 Oct; 9(10): 3071-3076)。彼らは、8p23の欠失が認めらたが8p22マーカーLPLは保持された相当数の症例を記録することができた。さらに、Ichikawa et al.は、前立腺癌転移抑制遺伝子の存在を推定し、ヒト染色体を導入後に極めて転移性の高いラット前立腺細胞における転移の抑制について研究することによって、これを8p23-q12に局在化した(Ichikawa T, Nihei N, Kuramochi H, Kawana Y, Killary AM, Rinker-Schaeffer CW, Barrett JC, Isaacs JT, Kugoh H, Oshimura M, Shimazaki J, Prostate Suppl. 1996; 6: 31-35)。
【００８８】
近年になって、Washbum et al.は、31例のヒト前立腺癌のLOHに関する研究によって、8p23に特異なアレル消失の認められる相当数の腫瘍を見出すことに成功した(Washbum J, Woino K, and Macoska J, Proceedings of American Association for Cancer Research, March 1997; 38)。これらの試料において、彼らは遺伝子間隔(genetic interval)D8S262-D8S277をカバーする欠失のある最小オーバーラッピング領域を定義することができた。
【００８９】
連鎖解析に関する研究: 8番染色体上での前立腺癌結合領域検索
本願発明者らは、8番染色体に対するマイクロサテライトマーカーマッピングを使用して、前立腺癌を発症した47の家系から194例の個体について連鎖解析に関する研究を実施した。多点解析では連鎖が弱いという結果が出たが、二点ロッドスコア解析では以下に示す通り有意な結果は得られなかった。
【表１】
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【００９０】
連鎖解析で得られた有意ではない結果については、バイアレリックマーカーの連鎖不平衡を利用した新しいマッピング方法によって、前立腺癌の散発性症例の原因である遺伝子を同定した。
【００９１】
I.B.  バイアレリックマーカーを用いた連鎖不平衡で疾病の原因である候補座を同定
連鎖不平衡
散発性形質に関連のある候補遺伝子を持っている可能性のあるものとして染色体領域を同定後、同定した領域内で候補遺伝子の位置を一層正確なものとする優れた方法は、罹患(形質+)個体群と対照(形質-)個体群とを比較して、形質といくつかのマーカー遺伝子型との間の統計学的な関連性を探すことである。
【００９２】
関連性解析は、多くの場合がバイアレリックマーカーを使用することに依存している。バイアレリックマーカーは、１種の塩基位置でバイアレリック多型を呈するゲノム由来のポリヌクレオチドである。定義によって、バイアレリック多型の最小アレル頻度は1%である。アレル頻度が1%を下回る配列変異体を珍しい変異種と呼ぶ。ヒトゲノムに沿って存在する可能性のあるバイアレリックマーカーは107個である。
【００９３】
関連性解析は、形質と遺伝マーカーとの間の相関を定めようとするものであり、連鎖不平衡(LD)の現象をベースにしたものである。LDは、個体群において相関するハプロイドゲノム上の隣接する座におけるアレルに対する傾向として定義される。2つの遺伝座が同一の染色体上にある場合は、同一の染色体セグメント(すなわちハプロタイプ)上にあるアレルのセットがまとまったブロックとして後の世代に次々と受け継がれていくことが多い。組換えによって変化することがなければ、ハプロタイプは血統間を通して継承されるだけでなく個体群を通しても継承される可能性がある。このようにして個体群レベルで生じる現象は、同一の染色体上の異なる座で特異的アレルの対が発生することが無作為に定まるのではなく、無作為からの逸脱が連鎖不平衡と呼ばれるものである。
【００９４】
関連性解析によって得られた結果は、本質的にアレル頻度を定量的に計算した値に基づくものであるため、生殖系列での変異の解析に最もよく当てはまる。これは主に、検討対象となる腫瘍試料中には正常細胞も存在するのが普通であるため、アレル頻度を腫瘍組織試料中で定量化するのが困難なことが理由である。したがって、癌の遺伝学に当てはまる関連性解析は、腫瘍抑制遺伝子の同定に対して最も良く研究されることになる。
【００９５】
連鎖不平衡マッピングによる形質局在化
特定の形質の原因である遺伝子または一部原因である遺伝子は、いくつかのフランキングマーカーを用いた場合にいずれもLD状態になる。このような遺伝子をマッピングするために、この形質を生み出す原因である1つまたは複数の遺伝子に関連するフランキングマーカーの特異的アレルを同定する。連鎖不平衡マッピングを用いて特定の形質に関連する1つまたは複数の遺伝子を見出すための手法についてなされた説明では形質の原因となっている1つの遺伝子の位置を決定することに言及しているが、同一の手法を用いて形質に対して部分的に影響している遺伝子を同定することも可能であるのは明らかであろう。
【００９６】
(1以上の罹患家系での関連のある個体に限って実施する上述の連鎖解析法との対比で)通常の個体群の範囲内で関連性解析を行う。
【００９７】
バイアレリックマーカーAと形質Tとの間の関連性は、主にバイアレリックマーカーと形質との間に考え得る3つの関係が原因で生じる可能性がある。第１に、バイアレリックマーカーAのアレルαが形質Tの直接の原因である(たとえば、Apo E e4アレルとアルツハイマー病)。しかしながら、遺伝子マッピング研究に使用するバイアレリックマーカーの過半数が無作為に選択されるものであるため、これらのマーカーは主に遺伝子の外でマップする。したがって、アレルαが形質Tの直接的な原因となる機能変異である尤度は極めて低い。
【００９８】
バイアレリックマーカーAと形質Tとの間の関連性は、バイアレリックマーカーが極めて接近して形質座に結合している場合にも生じ得る。換言すれば、関連性は形質発生アレルとアレルαが連鎖不平衡状態にあるときに生じる。バイアレリックマーカーが形質の原因である遺伝子に極めて近い場合、一層広範囲におよぶ遺伝子マッピングで形質Tを有する人々において遺伝子が変異のあるマーカー座に近いことを見つけることができる(すなわち、形質の原因である遺伝子または形質の原因である遺伝子のうちの1つ)。形質の原因である遺伝子に極めて近いバイアレリックマーカーの群を用いて後にさらに説明するように、原因遺伝子の位置をバイアレリックマーカーと形質との間の関連性曲線のプロファイルから導き出すことができる。原因遺伝子は、形質との関連性が最も高いマーカーの近傍に見出される。
【００９９】
最後に、バイアレリックマーカーと形質との間の関連性は、偶然にもアレルαの頻度も異なる、形質を有する人々と形質を持たない人々とが遺伝的に異なる個体群部分集合に相当する場合に起こり得る(個体群層別化)。この現象は、大きな異種性試料を用いることで回避される。
【０１００】
関連性解析は、共通の多型を呈する遺伝子の感受率を効率よく確認するのに特に適しており、一因子性遺伝の疾患よりも頻度が比較的高い多因子性の形質に関与している。
【０１０１】
連鎖不平衡マッピングの
候補遺伝子同定への応用
一組のバイアレリックマーカーを用いた関連性解析の汎用的な戦略は、十分に定義された表現型によってキャラクタリゼーションした2つの個体プール(罹患個体のプールと未罹患対照例のプール)をスキャンし、これらのプール各々において選択した複数のマーカーについてアレル頻度を測定することである。十分な高密度バイアレリックマーカーのアレイを用いて形質陽性の関連性が確認された場合、原因遺伝子はこれに関連するマーカーの物理的な近傍に位置している。形質に対する関連性が陽性のマーカーは、形質座と連鎖不平衡状態にあるためである。バイアレリックマーカーの高密度セットを用いた関連性解析によって同定される特定の形質の原因である遺伝子のある領域は、連鎖解析で同定されるものと比較すると長さが平均で1/20〜1/40程度である。
【０１０２】
上述したようにして陽性の関連性を確認した後、関連性解析で確認されたマーカーを持つ、後述するように構成されたヒトゲノムライブラリから得たBAC(バクテリア人工染色体)を完全に配列決定する。
【０１０３】
候補領域の配列を決定して解析した後、適当なソフトウェアを用いて選択した数の対照と罹患個体とを比較することによって、候補領域(エキソンおよびプロモーターならびに他の潜在的な調節領域)内の機能配列に形質の原因である変異がないかどうかスキャンする。後述のマイクロシークエンシング法を用いて多数の罹患個体および対照をスクリーニングすることによって、候補変異をさらに確認する。
【０１０４】
候補変異は以下のように同定される。予測機能領域各々についての配列を増幅するために、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを指定する。罹患患者および未罹患対照から得たゲノムDNA試料について予測機能配列各々をPCR増幅する。ゲノムPCRによって生じる増幅産物で自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応を行い、ABI 377シークエンサ上で電気泳動する。ゲル画像解析およびDNA配列抽出の後は、配列データを自動的に解析し、罹患症例と未罹患対照とにおける配列のバリエーションの存在を検出する。各個体の両方のDNA鎖を比較することによって、配列をシステマティックに立証する。
【０１０５】
次に、個々の試験フォーマットについて述べる部分で後述するようなマイクロシークエンシング法を用いて、罹患個体と対照の大きな個体群をスクリーニングすることによって多型を立証する。多型は、それが罹患個体および対照において予想した関連性に匹敵する頻度で現れる場合に候補変異であるとみなされる。
【０１０６】
関連性解析: 統計分析およびハプロタイピング
上述したように、連鎖解析は一般に疾病遺伝子を数メガベースの染色体領域に局在化するものである。位置をさらに正確にするには、組換え体の数を増やすために別の家系をさらに解析する必要がある。しかしながら、長く続いている家系でも組換えが認められることはほとんどないため、この方法は非現実的なものとなる(Boehnke, M, 1994, Am. J. Hum. Genet. 55: 379-390)。
【０１０７】
連鎖不平衡、結合座におけるアレルの非ランダム関連性は、別の組換え体を得る上での選択的な方法を提供し得るものである。まず特定の形質の原因である遺伝子の変異遺伝子を持つ染色体を変異または遊走による個体群に導入すると、変異遺伝子は常に独特の結合マーカーセット(ハプロタイプ)を有する染色体に存在する。したがって、これらのマーカーと疾病変異との間は完全な不平衡状態である。疾病変異は特異的なマーカーアレルのセットと結合した状態でのみ存在する。以後の世代では疾病変異とマーカー多型との間に組換えが発生し、不平衡が漸進的に消失する。不均衡散逸の程度は組換えの頻度によってさまざまであるため、疾病遺伝子に最も近いマーカーの方が、疾病遺伝子から離れたマーカーよりも高いレベルの不平衡を示しやすい(Jorde LB, 1995, Am. J. Hum. Genet. 56: 11-14)。現在の個体群での連鎖不平衡パターンは過去の多くの世代における組換え作用を反映したものであるため、不平衡解析によって組換え体の試料を効果的に増やすことができる。したがって、連鎖不平衡パターンの解析によって達成されるマッピング解像度は連鎖解析の解像度よりもかなり高い。
【０１０８】
実用上は、候補遺伝子を持つ領域を定義するために、適当な数のバイアレリックマーカー(50〜150キロベースあたり1マーカーの密度)を使用して、罹患個体群および対照個体群の遺伝子型判定を行う。次いで、カイ二乗統計試験(自由度1)によって罹患個体および対照個体における各バイアレリックマーカーの遺伝子型頻度を比較する、マーカー/形質の関連性解析を行う。
【０１０９】
最初のスクリーニング後、罹患個体群および対照個体群において関連性が陽性である領域内の別のマーカーの遺伝子型を判定する。次いで2通りの相補解析を行う。第１に、マーカー/形質の関連性解析(上述)を行って、形質の原因である遺伝子の位置を正確に定める。また、ハプロタイプ関連性解析を行って、祖先/優先的キャリアハプロタイプの頻度およびタイプを定義する。一組のバイアレリックマーカーの情報性を組み合わせることによるハプロタイプ解析は、関連性解析の効力を高め、単一のマーカーでの研究による偽陽性データおよび/または負のデータを排除することができる。
【０１１０】
症例個体群および対照個体群における特定のバイアレリックマーカーのセットについて考え得るハプロタイプすべての頻度を推定し、カイ二乗統計試験(自由度1)でこれらの頻度を比較することによってハプロタイプ解析を行う。最尤推定(EM)アルゴリズム(Excoffier L & Slatkin M, 1995, Mol. Biol. Evol. 12: 921-927)を適用して、EM-HAPLOプログラム(Hawley ME, Pakstis AJ & Kidd KK, 1994, Am. J. Phys. Anthropol. 18: 104)を使用し、ハプロタイプ推定を行う。EMアルゴリズムを利用して、無関係な個体から得た遺伝子型データしか使うことのできない症例でのハプロタイプ頻度を推定する。EMアルゴリズムは、データが曖昧であるおよび/または不完全である場合に有用な繰り返し最尤推定法を汎用化したものである。
【０１１１】
以下、バイアレリックマーカーを利用した連鎖不平衡解析を8p23領域に適用し、前立腺癌に関連する遺伝子を同定することについて説明する。
【０１１２】
I.C.  連鎖不平衡マッピングの8p23領域への適用
8p23領域でのYACコンティグの作成
まず、8p23領域を含むYACコンティグを以下のようにして作成した。全ヒトゲノムについてのCEPH-Genethon YACマップ(Chumakov I.M. et al. A YAC contig map of the human genome, Nature, 377 Supp.: 175-297, 1995)を用いて、D8S262およびD8S277の両遺伝マーカー周囲の領域に詳細なコンティグを作成する。領域の遺伝マーカーD8S1706、D8S277、D8S1742、D8S518、D8S262、D8S1798、D8S1140、D8S561およびD8S1819について利用できるスクリーニングデータを使用して、この領域に局在化して以下のCEPH YACのセットを選択した。832_g_12、787_c_11、920_h_7、807_a_1、842_b_1、745_a_3、910_d_3、879_f_11、918_c_6、764_c_7、910_f_12、967_c_11、856_d_8、792_a_6、812_h_4、873_c_8、930_a_2、807_a_1、852_d_10。上述した遺伝マーカーならびに8p23領域に位置していると思われる他の一般に利用できるマーカーを使用し、PCRによって上記のYACのセットを試験した。これらの研究の結果、遺伝マーカーD8S262およびD8S277周囲にYAC STSコンティグマップが作製された。2つのCEPH YACすなわち920_h_7(インサートサイズ1170kb)および910_f_12(インサートサイズ1480kb)がこの領域での最小タイリング路(minimal tiling path)を構成し、その推定サイズは約2メガベースである。
【０１１３】
このマッピング作業の間、公に知られたSTSマーカーWI-14718、WI-3831、D8S1413E、WI-8327、WI-3823、ND4をコンティグ内に精度よく位置付けした。
【０１１４】
ヒトゲノムの8p23領域内でD8S262-D8S277断片をカバーする
BACコンティグの作成
YACコンティグを作成した後は、BACコンティグを次のようにして作成した。Woo et al. Nucleic Acids Res., 1994, 22, 4922-4931に記載されているようにしてBACライブラリを得た。簡単に説明すると、リンパ芽球様細胞株由来(個体N°8445、CEPHファミリ由来)のBamHIまたはHindIII部分消化DNAのpBeloBAC11ベクター(Kim et al. Genomics, 1996, 34, 213-218)へのクローニングによって、異なる2つの全ヒトゲノムライブラリを作製した。BamHI部分消化によって得られたライブラリには、平均インサートサイズ150kbで110,000クローンが含まれていた。これは、ヒトハプロイドゲノムで5ゲノム相当である。HindIII部分消化によって調製したライブラリは、平均インサートサイズ150kb、ヒトゲノムで3ゲノム相当である。
【０１１５】
BACスクリーニング
上述したようにして作製したヒトゲノムBACライブラリを上述したすべてのSTSでスクリーニングした。両方のライブラリのクローンから得たDNAを単離し、高スループットPCR法(Chumakov et al., Nature 1995, 377: 175-298)を用いて上述したSTSでPCRスクリーニングを行うことができるように三次元フォーマットでプールした。簡単に説明すると、三次元プールは、STSでのクローンのスクリーニングに必要なPCR反応の数を、各クローンを個別にスクリーニングする場合と比べて少なくとも1/100に減らすことができるような方法で被検試料を再配置することからなる。従来のアガロースゲル電気泳動と自動画像獲得および処理とを併用して、PCR増幅産物を検出した。
【０１１６】
最終ステップでは、STS陽性のクローンを個別にチェックした。Cherif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 6639-6643に記載されているようにしてM期染色体に対する蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)を実施し、BACの副染色体(subchromosomal)上での局在部位を系統的に確認した。
【０１１７】
制限酵素NotIでの消化後にパルスフィールドゲル電気泳動によってBACインサートサイズを求めた。
【０１１８】
BACコンティグ解析
STSスクリーニングによって選択し、FISH法によって確認した順列BAC(ordered BAC)をコンティグに構築し、このうちいくつかのコンティグから得たインサート末端の部分的配列決定によって新たなマーカーを作製した。これらのマーカーを使用し、染色体領域D8S277周囲をカバーする推定サイズ2メガベースのBACクローンのコンティグのギャップを満たした。コンティグから選択したBACクローンをサブクローニングおよび配列決定した。
【０１１９】
BACサブクローニング
最初にアルカリ法を用いて各々のBACヒトDNAを抽出し、次いで超音波処理によって剪断した。得られたDNA断片を末端修復し、調製用のアガロースゲル上で電気泳動を行った。サイズが所望の範囲にある断片をゲルから単離し、精製および連結して直線化および脱リン化した平滑末端プラスミドクローニングベクター(pBluescript II Sk(+))を得た。このBACサブクローニングの手順について実施例1で説明する。
【０１２０】
実施例1
各BACクローンの終夜培養液3リットルから得られた細胞を、既存の手法を用いてアルカリ法で処理し、ゲノムDNAインサートを含有するBAC DNAを得た。塩化セシウム勾配でのBAC DNAの遠心分離後、BAC DNA約50μgを精製した。3通りの条件でBAC DNを5〜10μg超音波処理し、所望のサイズの断片を得た。これらの断片を、4デオキシトリホスフェート(100μM)の存在下で、Ventポリメラーゼ2単位を用いて20分間70℃にて容積50μl分処理した。このようにして得られる平滑末端断片を低融点1%アガロースゲルでの(60ボルトで3時間)泳動によって分離した。これらの断片をゲルから切除し、アガラーゼで処理した。クロロホルム抽出およびMicrocon 100カラムでの透析後、溶液中のDNAを濃度100ng/μlに調節した。酵素消化によって直線化してアルカリホスファターゼで処理したpBluescript II Sk(+)ベクターDNA 20ngにBAC断片化DNA 100ngを添加することによって、一晩連結を行った。最終容積10μlで40単位/μlのT4 DNAリガーゼ(Epicentre)の存在下にて連結反応を行った。連結産物を電気穿孔して適当な細胞にした(ElectroMAX E.coli DH10B細胞)。細胞混合物にIPTGおよびX-galを添加し、これをアンピシリンを含む寒天平板培地表面に接種した。37℃にて一晩インキュベートした後、組換え(白)コロニーを無作為に抽出し、保管および配列決定用に96穴マイクロプレートでアレイ化した。
【０１２１】
BACの部分的配列決定
得られたBACクローンのうち少なくとも30に対して、染料-プライマーサイクル配列決定の手順に従って末端対方式の手法(各末端から500bp配列)による配列決定を行った。対応するDNA領域に沿って選択したマーカーの相対位置を示すマップが得られるまで対方式の配列決定を行った。BACインサートの配列決定および順序決定を実施例2において説明する。
【０１２２】
実施例2
インサートをフランキングするベクタープライマーを使用し、終夜細菌培地でのPCRによってサブクローンインサートを増幅した。ABI Prism DNA配列解析ソフトウェア(バージョン2.1.2)を用いて、ABI 377シークエンサでの蛍光自動配列決定によってこのインサートの末端配列(各末端で平均500塩基)を求めた。
【０１２３】
R. Staden製のGap4ソフトウェアを使用して、BACサブクローンから得た配列断片を構築した(Bonfield et al. 1995)。このソフトウェアを用いることで、配列断片から単一の配列を復元することができる。異なる断片のアライメントから推定された配列をコンセンサス配列と呼ぶ。本願発明者らは、定方向配列決定法(プライマーウォーキング)を用いて配列およびリンクコンティグを完成させた。
【０１２４】
図１は、構築されたコンティグを構成するオーバーラッピングBACサブクローン(標識BAC)およびコンティグに沿った既存のSTSマーカーの位置を示す。
【０１２５】
BACコンティグに沿ったバイアレリックマーカーの同定
BACコンティグの構築後、コンティグに沿ってバイアレリックマーカーを同定した。ヒトゲノムにおける情報性のあるバイアレリックマーカーの評価対象分布(ヘテロ接合率が42%を上回るバイアレリック多型)を2.5〜3kbで1とすると、バイアレリックマーカー1つの同定に500bpのゲノム断片6つをスクリーニングしなければならない。潜在的マーカー1つあたり6対のプライマー(各々約500bpの増幅断片を画定)を上述したBAC部分配列から得た。プライマーはいずれも、得られた増幅断片の系統的な配列決定を容易にする共通の上流オリゴヌクレオチドの尾を含んでいた。約100の個体から得たDNAプールでBAC由来の各配列を増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応に用いる条件を最適化し、500bpの配列解読で95%を上回るPCR産物が得られるようにした。
【０１２６】
BACサブクローン由来のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムPCRから増幅して得られる産物に対し、染料-プライマーサイクル配列決定プロトコルを用いて自動ジデオキシターミネーター配列決定反応を行った。ゲル画像解析およびDNA配列抽出に続いて、適当なソフトウェアを用いて配列データを自動的に処理し、配列の品質を評価するとともに、プールした増幅断片の中からバイアレリック部位の存在を検出した。各プールの両方の鎖の配列を比較することによって、バイアレリック部位を系統的に確認した。
【０１２７】
周知のアレル頻度のプールを敷く円シングすることで確認すると、100の個体で構成されるプールを配列決定することによって検出されるバイアレリック多型の頻度についての検出限界は、マイナーなアレルで0.3 +/- 0.05である。このように、上記の方法で選択するバイアレリックマーカーでは、マイナーなアレルで頻度0.3〜0.5、メジャーなアレルで頻度の0.5〜0.7であり、平均ヘテロ接合率が42%を上回るため、これらのバイアレリックマーカーは「情報性のあるバイアレリックマーカー」となる。
【０１２８】
実施例3において、スクリーニング後の個体から得られるゲノムDNA試料を調製し、バイアレリックマーカーを同定することについて説明する。
【０１２９】
実施例3
対象領域でバイアレリックマーカーを作製するために使用する個体群は、フランス人の異質個体群に相当する約100の無関係な個体で構成したものであった。
【０１３０】
各ドナーの末梢静脈血から次のようにしてDNAを抽出した。
【０１３１】
EDTAの存在下で血液30mlを採取した。2000rpmで10分間遠心後に細胞(ペレット)を収集した。溶解液(最終容積50ml、トリス10mM、pH7.6、MgCl2 5mM、NaCl 10mM)で赤血球を溶解した。溶解液中にペレットの懸濁液を再懸濁させた後、上澄み中に残留している赤血球を除去するのに必要な回数だけこの溶液を遠心(10分間、2000rpm)した。
【０１３２】
白血球のペレットを以下の組成を有する溶解液3.7mlで42℃で終夜溶解した。
- 3ml TE 10-2(トリス-HCl 10mM、EDTA 2mM)/NaCl 0.4M
- 200μl SDS 10%
- 500μl K-プロテイナーゼ(TE 10-2 /NaCl 0.4M中にK-プロテイナーゼ2mg)
【０１３３】
タンパク質を抽出するために、1ml飽和NaCl(6M)(1/3.5v/v)を添加した。強く撹拌した後、溶液を10000rpmで20分間遠心した。
【０１３４】
DNAを沈降させるために、100%エタノール2〜3容量を上記の上澄みに添加し、この溶液を2000rpmで30分間遠心した。DNA溶液を70%エタノールで3回洗浄して塩を除去し、2000rpmで20分間遠心した。ペレットを37℃で乾燥させ、TE 10-1を1mlまたは水1mlの中に再懸濁させた。260nmODを測定することによって(1単位OD＝50μg/ml DNA)、DNA濃度を評価した。
【０１３５】
DNA溶液中にタンパク質が存在すると判断するために、OD 260/OD 280の比を求めた。後述する以後のステップではOD 260/OD 280比が1.8〜2の間にあるDNA沈降物のみを使用した。
【０１３６】
DNA増幅
各BACを単離した後、複数対のプライマー(各々500bpの増幅断片を画定)を設計した。各プライマーは、増幅の対象となった特異塩基の上流に共通のオリゴヌクレオチドの尾を含んでいたため、各プライマーセットから得た増幅産物を、共通の配列を用いてシークエンシングプライマーとして配列決定することができる。OSPソフトウェアを使用して、BAC由来の配列のゲノム増幅に使用するプライマーを定義した(Hillier L. and Green P. Methods Appl., 1991, 1: 124-8)。GENSET UFPS 24.1合成装置にて、ホスホラミダイト法でプライマーを合成した。
【０１３７】
実施例4には増幅反応に用いる手順を示す。
【０１３８】
実施例4
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって以下のようにして各配列を増幅した。
- 最終容積              50μl
- ゲノムDNA            100ng
- MgCl2                2mM
- dNTP(各々)          200μM
- プライマー(各々)    7.5pmol
- Ampli Taq Gold DNAポリメラーゼ(Perkin)      1単位
- PCR緩衝液(10X=0.1M トリスHCl  pH 8.3、0.5M KCl)  1X
【０１３９】
加温蓋のあるパーキンエルマー製9600 ThermocyclerまたはMJ Research製PTC200で増幅を行った。94℃で10分間加温した後、35サイクル行った。各サイクルはっ次のような構成とした。94℃で30秒、55℃で1分、72℃で30秒。最終的な伸長のために、72℃で7分間で増幅を終了した。
【０１４０】
蛍光計およびインターカレート剤(分子プローブ)としてのPicogreenを用いて、96穴マイクロタイタープレート上で、どの程度の量の増幅産物が得られたのかを判断した。
【０１４１】
ゲノムDNAを得た100の個体各々について増幅産物の配列を求めた。バイアレリックマーカーを含有する増幅産物を同定した。
【０１４２】
図１は、8p23 BACコンティグに沿ったバイアレリックマーカーの位置を示している。この第1のマーカーのセットは候補座の中密度マップに相当し、マーカー間距離は平均で50kb〜150kbである。
【０１４３】
次に、後述するように関連性解析を行うのに使用可能な第1のマーカーのセットを用いて同定された領域の極めて高密度なマップを得るために、上述した方法で第2のバイアレリックマーカーのセットを作製した。高密度マップには平均2〜50kbの間隔でマーカーが含まれていた。
【０１４４】
次に、関連性解析において、後述のようにして上記のバイアレリックマーカーを使用した。
【０１４５】
罹患個体および未罹患個体由来のDNA試料の収集
病理学的記録または根治的な前立腺切除記録に基づいて、臨床的な算入(inclusion)基準に従って前立腺癌患者を集めた。この研究に含める対照はいずれも、民族的および年齢的に罹患例と同じになるようにした。前立腺癌の存在または危険性を示す臨床基準および生物学的な基準がすべて認められないかという点と、関連の家族性前立腺癌症例がないかという点の両方から、各事例をチェックした。罹患個体と対照個体のいずれも無関係の事例に相当するものであった。
【０１４６】
関連性解析では、次のような独立した個体の2つのプールを使用した。第1のプールは、前立腺癌に罹患した個体で構成されるプールであり、個体数は185であった。これら185の前立腺癌症例のうち、45の症例が散発性であり140の症例が家族性であった。第2のプールは、疾患の認められない104の個体で構成した対照プールである。
【０１４７】
同様の基準に基づいて集めた個体から得た別の罹患(総試料数281)および対照試料(総試料数130)を用いてハプロタイプ解析を行った。
【０１４８】
罹患個体および対照個体の遺伝子型判定
関連性解析を行うための汎用的な戦略は、上述した2つの個体群各々に含まれるすべての個体から得たDNA試料を個々にスキャンし、これらの個体群各々での上述したバイアレリックマーカーのアレル頻度を求めることであった。
【０１４９】
各個体から得たDNA試料に対して行ったゲノムPCRによって得られた増幅断片にマイクロシークエンシング反応を施し、各個体群における上述したバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。
【０１５０】
上述した条件と同様の条件でゲノムPCRによって、バイアレリックマーカーを生成するためのDNA試料および増幅産物を得、蛍光ddNTP(各ddNTPに特異的な蛍光)と、多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズさせた適当なオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーとを用いて、自動マイクロシークエンシング反応を行った。相補蛍光ジデオキシヌクレオチド類似物(温熱サイクリング)を用いてDNAポリメラーゼによって3'末端で特異的に伸長させると、プライマーを沈降させて取り込まれなかった蛍光ddNTPを除去した。ABI 377配列決定装置での泳動によって反応産物を解析した。
【０１５１】
マイクロシークエンシングの一手順について実施例5で説明する。
【０１５２】
実施例5
マイクロタイタープレートで、PCR産物5μlを、精製混合物{2U SAP(アマシャム)、2UエキソヌクレアーゼI(アマシャム)、SAP10X緩衝液1μl: トリス-HCl 400mM、pH8、MgCl2 100mM、H2Oで最終容積5μl}5μlに添加した。反応混合物を37℃で30分間インキュベートし、94℃で10分かけて変性させた。10秒間の遠心後、マイクロシークエンシング用オリゴヌクレオチド(23mer、GENSET、粗合成、5OD)10pmol、0.5U Thermosequenase(アマシャム)、Thermosequenase 16X 緩衝液(アマシャム)1.25μl、いずれも多型に相当する蛍光ddNTP(パーキンエルマー) {0.025μl ddTTPおよびddCTP、0.05μl ddATPおよびddGTP}、H2Oを用いて、最終容積20μlとして、マイクロプレートにて全精製反応混合物(10μl)にマイクロシークエンシング反応を行った。GeneAmp 9600サーモサイクラーでのPCRプログラムを以下の通り実施した。94℃で4分間、55℃で5秒間/94℃で10秒間を20サイクル。反応産物を沈降が認められるまで4℃でインキュベートした。マイクロタイタープレートを1500rpmで10秒間遠心した。MgCl2 2mMを19μlと100%エタノール55μlとを各穴に加えた。室温にて15分間インキュベートした後、マイクロタイタープレートを4℃にて3300rpmで15分間遠心した。適切なサイズに折りたたんだ箱の上でマイクロタイタープレートを逆さにした後、4℃にて300rpmで2分間遠心して上澄みを廃棄した。次に、このマイクロプレートを減圧乾燥機で5分かけて乾燥させた。ホルムアミドEDTA添加液2.5μl(9μg/μlデキストランブルーをEDTA 25mMおよびホルムアミド1.8μlに溶解したもの0.7μl)にペレットを再懸濁させた。10%ポリアクリルアミドゲル/12cm/64穴をABI 377シークエンサで5分間予備稼働した。100℃にて5分かけて変性させた後、各マイクロシークエンシング反応産物0.8μlをゲルの各穴に仕込んだ。遊走(1ゲルあたりPCR産物のマイクロタイタープレート2枚に2時間30分)後、取り込まれたddNTPから放出される蛍光シグナルを、GENESCANソフトウェア(パーキンエルマー)を使用してABI 377シークエンサで解析した。ゲル解析に続いて、各増幅断片に存在するバイアレリックマーカーのアレルの判定を可能にするソフトウェアでデータを自動的に処理した。
【０１５３】
I.D.  関連性についての初期研究
連続した2段階のステップを通して関連性解析を実施した。第1のステップでは、罹患個体群および未罹患個体群での図１のバイアレリックマーカーの頻度を判定することによって、候補遺伝子の大雑把な局在部位を確認した。この大雑把な局在部位確認の結果を図２に示す。この解析から、前立腺癌の原因である遺伝子が4-67で示されるバイアレリックマーカー付近にあることが分かった。
【０１５４】
解析の第2フェーズでは、上述した超高密度マーカーセットを用いて、前立腺癌の原因である遺伝子の所在をさらに正確に確認した。このようにして得た局在部位を図３に示す。
【０１５５】
図３に示されるように、解析の第2フェーズで前立腺癌の原因である遺伝子が4-67で示すバイアレリックマーカー付近(最も確率が高いのはマーカーを含む約150kbの領域)にあることが確認された。
【０１５６】
ハプロタイプ解析
罹患個体群および未罹患個体群においてバイアレリックマーカー99-123、4-26、4-14、4-77、99-217、4-67、99-213、99-221および99-135(配列番号 21〜38)の各アレルのアレル頻度を判定した。ハプロタイプ解析に使用するマーカー(配列番号 21〜38)、各マーカーのアレル、未罹患個体および前立腺癌に罹患した個体の両方における最大頻度のアレル、未罹患個体および前立腺癌に罹患した個体の両方における最小頻度アレル、これらのアレルの各個体群での頻度について、独自に振った識別番号を表1に列挙する。
【０１５７】
2〜9のマーカーに対して理論的にみて潜在的に異なるすべてのハプロタイプの中から、前立腺癌との関連性が強い11のハプロタイプを選択する。これらのハプロタイプ解析の結果を図４に示す。
【０１５８】
図2、図3および図4は、連鎖解析の結果と配列決定の結果をまとめたものであり、これらの図によってマーカー間の物理的な順序および/または距離を推定することができる。
【０１５９】
図4で得られた値の有意性は、以下に示すコンピューターシミュレーションの結果によって強く示された。コンピューターシミュレーションについては、罹患個体および未罹患対照から得られたデータがプールされ、図4にまとめたデータのコンパイルに用いた罹患個体群と未罹患個体群から抽出した同数の個体を含む2つのグループに無作為に割り当てられた。図4のハプロタイプ5に含まれる6つのマーカーについて上記の人為的なグループにハプロタイプ解析を実施した。この実験を100回繰り返し、結果を図5に示す。100回の繰り返しのうち、p値が1×10-4未満であったのは得られたハプロタイプのわずか5%にすぎなかった。一方、図4のハプロタイプ5ではp値は9×10-7であった。さらに、図４のハプロタイプ５について見ると、5×10-3未満という有意なレベルであったのは得られたハプロタイプのわずか6%にすぎず、5×10-5未満の有意なレベルを示したものは1つもなかった。
【０１６０】
このため、図４のデータを使用し、単一のマーカーアレルまたはハプロタイプごとに関連性を評価することで、これに対応するキャリアが前立腺癌を生じる危険度を推定することができる。相対危険度の有意な閾値を使用する基準試料個体群に適用する。
【０１６１】
診断の技術では、さまざまな方法を用いて、被検者が前立腺癌が発生する危険度が高いことに関連したバイアレリックマーカーパターンを有しているか否か、あるいはミュータントPG1アレルによって生じる前立腺癌に罹患しているか否かを判断することができる。これらの方法としては、ファミリ研究、単精子DNA解析または体細胞ハイブリッドなど、ハプロタイピングでの個々の染色体解析を可能にするあらゆる方法があげられる。
【０１６２】
これらの方法ではそれぞれ、被検者から核酸試料を得た上で、図4、図6Aおよび図6Bに列挙するバイアレリックマーカー１つまたはそれ以上についてのバイアレリックマーカーパターンを判定する。図６Aに列挙するバイアレリックマーカーは、図４のハプロタイプ解析に用いられたものである。図６Aの1番目の列には、バイアレリックマーカーがあるBACクローンを列挙する。図６Aの2番目の列には、マーカーに対して独自に振った識別番号を列挙する。図６Aの3番目の列には、バイアレリックマーカーの第1のアレルの配列識別番号を列挙する。図６Aの４番目の列には、バイアレリックマーカーの第2のアレルの配列識別番号を列挙する。たとえば、バイアレリックマーカー99-123の第1のアレルは配列の配列番号が21であり、同じバイアレリックマーカーの第2のアレルは配列の配列番号が30である。
【０１６３】
図６Aの5番目の列には、バイアレリックマーカーの多型塩基を含む増幅産物の産生に用いられる上流プライマーの配列を列挙する。図６Aの6番目の列には、上流プライマーの配列識別番号を列挙する。
【０１６４】
図６Aの7番目の列には、バイアレリックマーカーの多型塩基を含む増幅産物の産生に用いられる下流プライマーの配列を列挙する。図６Aの8番目の列には、下流プライマーの配列識別番号を列挙する。
【０１６５】
図６Aの9番目の列には、上流プライマーおよび下流プライマーを用いて産生された増幅産物の多型塩基の位置を列挙する。10番目の列には、バイアレリックマーカーの多型位置に見出される多型塩基の同一性を列挙する。11番目と12番目の列には、多型塩基の同一性の判定に用いることが可能なバイアレリックマーカーのマイクロシークエンシングプライマーの位置を列挙する
【０１６６】
配列番号 21〜38のバイアレリックマーカーに加えて、配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー１つまたはそれ以上と密に結合した他のバイアレリックマーカー(99-1482、4-73、4-65で示す)すなわち配列番号 57〜62およびPG1遺伝子も同定した。これらのバイアレリックマーカーとしては、図6Bに列挙する配列番号 57〜62のマーカーがあげられる。図6Bに示す表の列は図6Aの対応する列と同じである。配列番号 58、59、61および62は、添付の配列表に示す位置で配列番号 1のPG1遺伝子にある。
【０１６７】
上述した他のバイアレリックマーカーの遺伝的解析を以下の通り実施する。前立腺癌に罹患した個体および未罹患の個体から核酸試料を採取する。上述した方法を使用して、罹患個体群および未罹患個体群において2つのアレルがそれぞれ発生する頻度を判定する。関連性値を算出し、特定のアレルまたはアレルのスペクトルの存在と前立腺癌との相関を判断する。危険因子の算出に用いる解析には、配列番号 21〜38のマーカーも含めることができる。後述するものなどの診断の技術に配列番号 21〜38のマーカーおよび配列番号 57〜62のマーカーを利用し、個体に前立腺癌が発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子の突然変異が原因で個体が前立腺癌に罹患しているか否かを判断する。
【０１６８】
バイアレリックマーカーパターンを判定するための方法について実施例6で説明する。
【０１６９】
実施例6
前立腺癌またはPG1性前立腺癌に対する感受率を試験する個体から核酸試料を採取する。
【０１７０】
配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカー、PG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはこれらの組み合わせなどの、PG1の前立腺癌関連形態に関連のある１つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーの多型ヌクレオチドを含む増幅産物を産生するプライマー対を用いて、PCR増幅を実施する。いくつかのバイアレリックマーカーの多型ヌクレオチドを含有する増幅産物を産生するプライマー対を用いてPCR増幅を実施する実施形態もある。たとえば、一実施形態では、配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカー、PG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるいくつかのバイアレリックマーカーの多型塩基を含有する増幅産物が産生される。別の実施形態では、配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはPG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される2種またはそれ以上のバイアレリックマーカーの多型塩基を含有する増幅産物が産生される。別の実施形態では、配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはPG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される5種またはそれ以上のバイアレリックマーカーの多型塩基を含有する増幅産物が産生される。別の実施形態では、配列番号 21〜38のバイアレリックマーカー、配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはPG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される6種以上のバイアレリックマーカーの多型塩基を含有する増幅産物が産生される。
【０１７１】
たとえば、増幅産物の産生に用いられるプライマーは、図６Aまたは図6Bに列挙するプライマー(配列番号 39〜56および配列番号 63〜68)を含んでもよい。図6Aおよび図6Bには、増幅反応に用いられるプライマーの一例と、かかるプライマーを用いて産生される増幅産物の多型塩基の同一性および位置とを列挙する。図6Aおよび図6bに示すプライマーを用いた増幅によって得られるバイアレリックマーカーの各アレルの配列を配列番号 21〜38および57〜62として添付の配列表に示す。
【０１７２】
PCRプライマーは、マーカーの多型部位を増幅できる、10塩基長、15塩基長、20塩基長またはそれ以上のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は少なくとも100塩基長(すなわち、多型塩基の片側に50ヌクレオチドずつ)である。他の実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は少なくとも500塩基長(すなわち、多型塩基の片側に250ヌクレオチドずつ)である。さらに他の実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は少なくとも1000塩基長(すなわち、多型塩基の片側に500ヌクレオチドずつ)である。
【０１７３】
図６Aおよび図6Bに列挙するプライマーは単なる一例であり、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62の配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはPG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーあるいはこれらの組み合わせのうち１つまたはそれ以上の多型ヌクレオチドを含有する増幅産物を産生する他のどのようなプライマーのセットでも上記の診断法に利用できることは理解できよう。
【０１７４】
PCR増幅に続き、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカー、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62の配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはPG1遺伝子と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーまたはこれらの組み合わせのうち１つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーの多型塩基の同一性を判定する。上記の実施例5において説明したマイクロシークエンシング手順と、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62の配列の特徴として列挙したマイクロシークエンシングプライマーとを用いて多型塩基の同一性を判定する。配列番号 21〜38および配列番号 57〜62の配列の特徴として列挙したマイクロシークエンシングプライマーは単なる一例にすぎず、多型ヌクレオチド付近、好ましくは多型ヌクレオチドに隣接した位置に3N末端を有するものであればどのようなプライマーであってもよいことは理解できよう。あるいは、後に詳細に説明するPastinen et al., Genome Research 7:606-614 (1997)に記載されているようにしてマイクロシークエンシング解析を実施する。
【０１７５】
あるいは、PCR産物を完全に配列決定してバイアレリックマーカーにおける多型塩基の同一性を判定する。もう1つの方法では、バイアレリックマーカーの多型塩基に特異なアレル特異的オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに増幅産物をハイブリダイズさせることによって、バイアレリックマーカーにおける多型塩基の同一性を判定する。アレル特異的オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを使用することについては後に詳細に説明する。
【０１７６】
従来のドットブロット解析などの上記に列挙した以外の手法によってバイアレリックマーカーにおける多型塩基の同一性を判定してもよいことは理解できよう。
【０１７７】
上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号: 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーまたはその相補配列のうち少なくとも10の連続したヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーまたはその相補配列のうち少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーまたはその相補配列のうち少なくとも20の連続したヌクレオチドを含んでもよい。さらに他の実施形態では、上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーまたはその相補配列のうち少なくとも30の連続したヌクレオチドを含んでもよい。さらに他の実施形態では、上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーまたはその相補配列のうち30よりも多い連続したヌクレオチドを含んでもよい。さらに他の実施形態では、上記の診断手順で用いられる核酸は、配列番号 21〜38および配列番号 57〜62のバイアレリックマーカーの全配列またはその相補配列を含んでもよい。
【０１７８】
I.E. PG1遺伝子の同定および配列決定ならびにPG1タンパク質の局在化
上記のハプロタイプ解析から、バイアレリックマーカー4-14と99-221との間の171kbのゲノムDNAは完全にまたは部分的に前立腺癌の原因である遺伝子を含んでいることが分かった。したがって、この領域内にあるタンパク質コード配列をキャラクタリゼーションし、前立腺癌に関連する遺伝子の位置を得た。後に詳細に説明するが、この解析によってPG1遺伝子として示した171kbの単一のタンパク質コード配列が明らかになった。
【０１７９】
PG1遺伝子の配列決定用の鋳型DNAを以下のようにして得た。BAC 189EO8および463FO1を上述したようにしてサブクローニングした。適当なプライマー、AmpliTaqGold(パーキンエルマー)、dNTP(ベーリンガー)、緩衝席およびパーキンエルマー社推奨のサイクリング条件を用いて、PE 9600サーモサイクラー(パーキンエルマー)でのPCRによってプラスミドインサートを最初に増幅した。
【０１８０】
次いで、ABI Prism 377自動シークエンサ(パーキンエルマー、Appliedd Biosystems部、Foster City、CA)を使用してPCR産物を配列決定した。標準的な染料-プライマー化学およびThermoSequenase(アマシャムライフサイエンス)で、PE 9600サーモサイクラー(パーキンエルマー)を使用し、配列決定反応を行った。JOE、FAM、ROXおよびTAMRAの各染料を用いてプライマーを標識した。配列決定反応に用いたdNTPおよびddNTPは、ベーリンガー社から購入した。配列決定用の緩衝液、試薬濃度およびサイクリング条件はアマシャム社推奨のものを採用した。
【０１８１】
配列決定反応に続いて、EtOHを用いて試料を沈降させ、ホルムアミド添加液に再懸濁し、標準的な4%アクリルアミドゲルに仕込んだ。ABI 377シークエンサにて3000Vで2.5時間、泳動を行った。さらに、ABI Prism DNA配列決定解析ソフトウェアバージョン2.1.2を使用して、配列データを収集して解析した。
【０１８２】
上述したようにして得られた配列データを所有権のあるデータベースに複製し、ここで品質管理および認定のステップを行った。Unixシステムを利用して機能する所有権のある塩基コーラー(base-caller)「トレース」によって、ピークの形状、ピーク間解像度およびノイズレベルを考慮して怪しいピークに自動的にフラグを立てた。所有権のある塩基コーラーでは自動トリミングも行った。怪しいピークを5つ以上含む25塩基以下の伸展はいずれも信頼性が低いものとして除外した。クローニングベクターオリゴヌクレオチドに相当する配列を自動的に配列から除いた。しかしながら、5'末端のベクター配列に属する1〜5個の塩基が得られた配列に含まれることもある。必要があれば、事例ごとにこれらの配列を容易に除去することができる。
【０１８３】
PG1遺伝子のゲノム配列を添付の配列表に示し、これを配列番号 1とする。
【０１８４】
タンパク質、核酸およびEST(Expressed Sequence Tags)の各公共データベースでの相同性検索によって、BAC由来ヒトゲノム配列の潜在的エキソンの位置を定めた。主な公共データベースについては内部で再構築した。Genpeptから重複を除いた融合のデータベース(Benson D.A. et al., Nucleic Acids Res. 24: 1-5 (1996)、Swissprot (Bairoch, A. and Apweiler, R, Nucleic Acids Res. 24: 21-25 (1996)データベースおよびPIR/NBRF(George, D.G.  et al., Nucleic Acids Res. 24:17-20 (1996)データベースからタンパク質データベースNRPU (Non-redundant Protein Unique)を作成した。NRDBソフトウェア(上記Benson et al.)を用いて重複データを取り除き、検索配列の中に含まれる繰り返しをXNUソフトウェア(上記Benson et al.)でマスクした。NRPU データベースを用いて見つけた相同性によって、周知のタンパク質に関連した潜在的コーディングエキソンに相当する配列を同定することができた。
【０１８５】
ESTのローカルデータベースは、GenBank (上記Benson et al.)のgbestセクション(1〜9)で構成したものであるため、そこには一般に利用できるすべての転写断片が含まれている。このデータベースで見出された相同性によって、潜在的に転写された領域を局在化することができる。
【０１８６】
ローカルな核酸データベースには、ESTセクションを除くGenBankおよびEMBL (Rodriguez-Tome, P. et al., Nucleic Acids Res. 24: 6-12 (1996)のあらゆるセクションが含まれていた。上述したようにして重複データを取り除いた。
【０１８７】
BLASソフトウェア(Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)を使用してタンパク質データベースまたは核酸データベースで同様の検索を行った。Fastaソフトウェアを用いてアライメントを正確に求め、Clustal W.を使用して複数のアライメントを得た。被検領域の長さと複雑さならびに基準データベースのサイズに応じて、各解析ごとに相同性の閾値を調節した。
【０１８８】
上記のようにして同定された潜在的エキソン配列をプローブとして使用し、cDNAライブラリをスクリーニングした。陽性クローンの両端を配列決定し、配列伸展を配列番号1のゲノム配列上にポジショニングした。次に、上記のアライメントによって得られた結果を用いてプライマーを設計し、後述するPG1クローニング手順を行うことができるようにした。
【０１８９】
PG1 cDNAのクローニング
PG1 cDNAを以下のようにして得た。ヒト前立腺全RNA (クロンテックラボラトリーズ社、米国Palo Alto、カタログN. 64038-1、ロット7040869)1mgを含有するエタノール懸濁液4:lを遠心し、得られたペレットを室温にて30分かけて空気乾燥させた。
【０１９０】
AdvantageTM RT-for-PCRキット(クロンテックラボラトリーズ社、米国Palo Alto、カタログN. K1402-1)を用いてファーストストランドcDNAを合成した。プライマーPGRT32: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAT(配列番号 10)の20mM溶液1:lをRNA水溶液12.5:lに添加し、74℃にて2分30秒間加熱した後氷浴中にて急冷した。5xRT緩衝液(トリス-HCl 50mM、pH8.3、KCl 75mM、MgCl2 3mM)10:lと、dNTP混合物(各10mM)2.5:lと、ヒト組換え胎盤RNAインヒビター1.25:lとをMMLV逆転写酵素(200単位)1mlと混合した。この溶液6.5:lをRNAプライマー混合物に添加し、42℃にて1時間インキュベートした。水80:lを添加し、溶液を94℃にて5分間インキュベートした。
【０１９１】
このようにして得られた溶液5:lをホットスタート法でのロングレンジPCR反応に使用した。反応での最終容積は50:lとし、rtTHXLを2単位と、GC1.5p.1: CTGTCCCTGGTGCTCCACACGTACTC(配列番号 6)プライマーまたはGC1.5p2 TGGTGCTCCACACGTACTCCATGCGC(配列番号 7)プライマーおよびGC1.3p: CTTGCCTGCTGGAGACACAGAATTTCGATAGCAC(配列番号 9)プライマーを各々20pmol/μlとを使用し、67℃にて6分間、35伸長サイクルで反応を行った。
【０１９２】
上記のようにして得られたPG1 cDNAの配列(配列番号 3)を添付の配列表に示す。前立腺mRNAについてのノーザンブロット解析の結果から、5〜6kb長の主要な PG1 cDNAが存在することが裏付けられた。
【０１９３】
PG1遺伝子のキャラクタリゼーション
配列番号3のcDNAおよび配列番号 1のゲノムDNA配列からmRNA配列を整列化することによって、遺伝子のイントロン/エキソン構造を導き出した。
【０１９４】
PG1ゲノムDNAにおけるイントロンおよびエキソンの位置を図7および図8に示す。図７は、配列番号 1の配列において少なくとも8つのエキソン(標識エキソンA〜H)各々を定義する開始ヌクレオチドおよび停止ヌクレオチドの位置、配列番号 1の配列における5'および3'スプライス部位の位置およびフェーズ、配列番号 1の配列における停止コドンの位置、配列番号 1の配列におけるポリアデニル化部位の位置を列挙したものである。図8は、PG1ゲノムDNAおよびPG1 mRNA内のエキソンの位置、PG1ゲノムDNA内のチロシンホスファターゼレトロ偽遺伝子の位置、mRNA内のコーディング領域の位置、mRNA内のポリアデニル化シグナルおよびポリA伸展の位置を示す。
【０１９５】
図7および図8に示されるように、PG1遺伝子は少なくとも8つのエキソンを有し、この範囲は52kbよりも大きい。第1のイントロンはチロシンホスファターゼレトロ偽遺伝子を含む。G/Cの多い推定上のプロモーター領域は、配列番号 1のヌクレオチド1629と1870との間にある。CCAATボックスは配列番号 1のヌクレオチド1661に存在する。Prestridge, D.S., Predicting Pol II Promoter Sequences Using Transcription Factor Binding Sites, J. Mol. Biol. 249:923-932 (1995)に記載されているようにしてプロモーター領域を同定した。
【０１９６】
(配列番号 3のcDNA配列を基準にして)配列番号 4のPG1タンパク質配列の開始メチオニンとしてあげられたメチオニンが、実際に開始メチオニンとして作用するもう1つのメチオニンよりも下流にありながらもこのメチオニンとインフェーズだという可能性がある。配列番号 1のゲノムDNA配列は、配列番号 4のタンパク質配列の位置番号1のメチオニンよりも上流のメチオニンを含む。実際には上流のメチオニンが本当の開始部位であったとすれば、PG1タンパク質の配列は配列番号 5の配列になる。以下のようにしてPG1 mRNAの5N末端の正確な位置を判断することで、上記の可能性について調査する。
【０１９７】
PG1 mRNAの5N末端の正確な位置を判断する方法の1つとして、クロンテック社から入手可能なMarathon-Readyヒト前立腺cDNAキット(カタログNo. PT1156-1)を使用して5NRACE反応を行うことがあげられる。たとえば、RACE反応ではPG1プライマーPG15RACE196 CAATATCTGGACCCCGGTGTAATTCTC(配列番号 8)を第1のプライマーとして用いることができる。RACE反応における第2のプライマーは配列GGTCGTCCAGCGCTTGGTAGAAG(配列番号 2)を有するPG15RACE130nである。このようにして得られるPCR産物または他のPG1特異的プライマーを用いて得られる産物の配列解析を行うことで、PG1転写物の開始点の正確な配列を知ることができる。
【０１９８】
あるいは、すでに同定されたコード領域の5N末端から伸長する一組のプライマーを用いたPCR増幅を行うことで、PG1転写物の5N配列を判断することができる。いずれにしても、本発明では、配列番号 4または配列番号 5あるいはその断片のいずれかをコードするかまたはこれに相当するPG1核酸および/またはポリペプチドを使用することを考慮に入れている。
【０１９９】
また、PG1遺伝子の選択的スプライシングによって上記にて説明したもの以外の翻訳産物が得られる可能性がある。さらに、配列番号 1のゲノム配列の上流または下流で遺伝子の翻訳産物に寄与する配列が存在する可能性もある。最後に、選択的プロモーターによって本願明細書で説明したもの以外のPG1由来転写物が得られる場合がある。
【０２００】
ヌクレオチド1629と1870との間にある領域のプロモーター活性を後述のようにして確認することができる。あるいは、この領域にプロモーター活性が認められない場合には、PG1遺伝子の発現をドライブする要因となっているプロモーターを後述のようにして同定する。
【０２０１】
PG1遺伝子の上流にあるゲノム配列を、クロンテック社から入手可能なpSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-EnhancerまたはpEGFP-1プロモーターレポーターベクターなどの適当なプロモーターレポーターベクターにクローニングする。簡単に説明すると、これらのプロモーターレポーターベクターは各々、分泌後のアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質などの容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する複数のクローニング部位を含む。PG1コーディング領域上流の配列をレポーター遺伝子上流のクローニング部位に両方の向きで挿入し、適当な宿主細胞に導入する。レポータータンパク質のレベルをアッセイし、クローニング部位にインサートがないベクターでのレベルと比較する。インサートを含むベクターの発現レベルが対照ベクターよりも高いことから、インサートにプロモーターが存在することが分かる。必要であれば、エンハンサを含むベクターに上流配列をクローニングし、弱いプロモーター配列での転写レベルから増大させてもよい。インサートのないベクターで観察されたレベルを上回る有意なレベルから、挿入された上流配列にプロモーター配列が存在することが分かる。
【０２０２】
エキソヌクレアーゼIIIでの消化などの従来の手法を用いて上流DNAに入れ子状態の欠失を構築することによって、上流ゲノムDNA内のプロモーター配列をさらに定義する。このようにして得られる欠失断片をプロモーターレポーターベクターに挿入し、欠失が少なくなったか否か、プロモーター活性を消失させたか否かを判断することができる。このようにして、プロモーターの境界を定義する。必要であれば、部位定方向突然変異誘発またはリンカースキャニングによってプロモーター内の個々の潜在的な調節部位を同定し、プロモーター内の潜在的な転写因子結合部位を個々にまたは組み合わせで消失させる。これらの変異種が転写レベルに対しておよぼす影響については、プロモーターレポーターベクターのクローニング部位に変異種を挿入することで判断する。
【０２０３】
周知の転写因子結合部位に対する相同性か、プロモーター配列を含むレポータープラスミドに対する従来の突然変異誘発または欠失解析によって、PG1プロモーター領域内の転写因子に結合しやすい配列を同定する。たとえば、アッセイ可能なレポーター遺伝子に作用的に結合した、興味の対象であるプロモーター配列を含むレポータープラスミドに欠失を作り出す。プロモーター領域内にさまざまな欠失を有するレポータープラスミドを適当な宿主細胞にトランスフェクトし、欠失による発現レベルへの影響をアッセイする。部位定方向突然変異誘起、リンカースキャニング解析または当業者間で周知の他の手法を用いて、欠失によって発現レベルが落ちる領域内の転写因子結合部位をさらに局在化する。
【０２０４】
PG1遺伝子の上流に所在するプロモーターおよび他の制御配列を使用し、所望の空間的、時間的、発育的または定量的な方法で挿入された遺伝子の発現を指揮することができる発現ベクターを設計する。たとえば、PG1プロモーターは前立腺において活性であると思われるため、これを用いて前立腺における遺伝子発現を指揮する発現ベクターを構築することができる。
【０２０５】
好ましくは、かかる発現ベクターでは、PG1プロモーターを複数の制限部位の付近に配置し、プロモーターが挿入された遺伝子の発現を指揮できるように、プロモーターの下流での発現が望ましいタンパク質をコードするインサートのクローニングを容易にする。染色体外複製、宿主染色体への組み込みまたは一過性発現用に設計された従来の核酸骨格にプロモーターを挿入する。既存の発現ベクターに好適な骨格としては、レトロウイルス骨格、SV40またはウシ乳頭腫ウイルスなどの真核生物のエピゾームからの骨格、細菌性エピゾームまたは人工染色体からの骨格があげられる。
【０２０６】
発現ベクターに挿入された遺伝子から転写されるmRNAのポリアデニル化を指揮するために、発現ベクターには複数の制限部位の下流にあるポリAシグナルも含まれているのが好ましい。
【０２０７】
クロンテック社から入手可能なMatchmaker One-Hybrid Systemキット(カタログ No. K1603-1)に付随のマニュアルに記載されているものなどのワンハイブリッドシステムを使用して、PG1プロモーターの配列と相互作用するタンパク質をコードする核酸を同定する。簡単に説明すると、Matchmaker Matchmaker One-hybridシステムは次のようなものである。結合タンパク質の同定したい標的配列を選択可能なレポーター遺伝子の上流にクローニングし、酵母ゲノムに組み込む。好ましくは、タンデムで標的配列の複数のコピーをレポータープラスミドに挿入する。
【０２０８】
プロモーターに対する結合性能の評価対象となるcDNAとGAL4などの酵母転写因子の活性化ドメインとの間の融合で構成されるライブラリを、組み込まれたレポーター配列を含む酵母菌株に形質転換する。酵母を選択培地に接種し、プロモーター配列に結合した選択可能なマーカーを発現する細胞を選択する。選択培地で成長するコロニーには、標的配列と結合するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。配列決定を行って、融合タンパク質をコードする遺伝子内のインサートをさらにキャラクタリゼーションする。また、インサートを発現ベクターに挿入するか、あるいはin vitro転写ベクターに挿入する。ゲルシフト解析またはDNAse保護解析などの当業者間で周知の手法によってインサートでコードされたポリペプチドとプロモーターDNAとの結合を確認する。
【０２０９】
PG1タンパク質配列の解析
配列番号 3のPG1 cDNAは、353アミノ酸タンパク質(配列番号4)をコードする。添付の配列表に示すように、Prosite解析によって、PG1タンパク質には、ロイシンジッパモチーフ、潜在的グリコシル化部位、3つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位、潜在的cAMP依存タンパク質キナーゼリン酸化部位、2つの潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位、4つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位、5つの潜在的N-ミリストイル化部位、1つの潜在的チロシン硫酸化部位および1つの潜在的アミド化部位が含まれていることが分かった。
【０２１０】
Argos, P. et al., Structural Prediction of Membrane-bound Proteins, Elur.  J. Biochem. 128:565-575 (1982)、 Klein et al., Biochimica & Biophysica Acta 815:468-476 (1985)およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142 (1984)に記載の方法に従って、膜関連ドメインを検索した。この検索によって、肝要な膜ドメインではないかと思われる5つの潜在的膜貫通ドメインが明らかになった。これらの結果から、PG1タンパク質は膜関連となる可能性が高く、肝要な膜タンパク質であると思われる。
【０２１１】
相同性検索を実施し、PG1タンパク質に相同なタンパク質を同定した。PG1タンパク質と相同な配列を持つタンパク質がいくつか同定された。ボックス1、ボックス2、ボックス3の3つの領域で、PG1タンパク質と相同関係にあるいくつかのタンパク質のアクセッション番号を図９に列挙する。
【０２１２】
上述したモチーフはいずれも配列番号 5のタンパク質にも存在するものであり、翻訳によるものである場合は、最初は配列番号 1の核酸の潜在的上流メチオニンから翻訳されることは理解できよう。
【０２１３】
図９に示されるように、アシルグリセロール(glyerol)トランスフェラーゼに、ボックス1、ボックス2(配列番号 11〜14)およびボックス3(配列番号 15〜20)で異なる相同性パターンが認められる。たとえば、E. coliから得たplsCタンパク質(アクセッション番号P26647)は、PG1タンパク質のボックス1およびボックス2の配列と相同な配列を有するが、ボックス3の配列との間には相同な配列がない。この遺伝子の産物は、アシルコエンザイムAから1-アシル-sn-グリセロール-3-ホスフェート(リゾホスファチジン酸、LPA)のsn2位にアシルを移動させる(Coleman J., Mol Gen Genet. 1992 Mar 1; 232(2): 295-303).
【０２１４】
ボックス1およびボックス2では相同であるがボックス3では相同ではない状態は、パン酵母(アクセッション番号P33333)から得たSLCI遺伝子産物およびマウス遺伝子AB005623にも認められる。これらの遺伝子は各々、バクテリアplsC遺伝子においてin vivo変異種で補完できる(Nagiec MM, Wells GB, Lester RL, Dickson RC, J. Biol. Chem., 1993 Oct 15; 268(29): 22156-22163, A suppressor gene that enables Saccharomyces cerevisiae to grow without making sphingolipids encodes a protein that resembles an Escherichia coli fatty acyltransferaseおよびKume K, Shimizu T, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, Aug. 28; 237(3): 663-666, cDNA cloning and expression of murine 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)。
【０２１５】
近年になって、マウスAB005623遺伝子の2種類のヒト相同体すなわちアクセッション番号U89336およびU56417がクローニングされ、ヒト6番染色体および9番染色体に局在していることが見出された(Eberhardt. C., Gray, P.W. and Tjoelker,L.W., J. Biol. Chem. 1997; 272, 20299-20305, Human lysophosphatidic acid acyltransferase cDNA cloning, expression, and localization to chromosome 9q34.3およびWest, J., Tompkins, C.K., Balantac, N., Nudelman, E., Meengs, B., White, T., Bursten, S., Coleman, J., Kumar, A., Singer, J.W.  and Leung, D.W, DNA Cell Biol. 6, 691-701 (1997), Cloning and expression of two human lysophosphatidic acid acyltransferase cDNAs that enhance cytokine induced signaling responses in cells)。
【０２１６】
LPAを酵素でアシル化することで、1，2-ジアシル-sn-グリセロール3-ホスフェートすなわち、グリセロリン脂質およびトリアシルグリセロールの両方のバイオ合成の中間生成物が得られる。分裂促進シグナルの形質導入、アポトーシス誘導、神経インパルスの伝達および膜結合レセプタに媒介される他の細胞性応答に関与しているいくつかの重要なシグナル伝達メッセンジャーは、この代謝経路に属している。
【０２１７】
LPA自体が哺乳動物での細胞増殖の強力な制御因子である。事実、LPAは血清中に見られる主要なマイトジェンの1つである。(これについては、Durieux ME, Lynch KR, Trends Pharmacol. Sci. 1993 Jun; 14(6):249-254, Signaling properties of lysophosphatidic acid.  LPA can act as a survival factor to inhibit apoptosis of primary cells; and Levine JS, Koh JS, Triaca V, Lieberthal W, Am. J. Physiol. 1997 Oct; 273(4Pt2): F575-F585, Lysophosphatidic acid: a novel growth and survival factor for renal proximal tubular cellsを参照のこと。)LPAのこの機能は、脂質キナーゼホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(lipid kinase phosphatidylinositol 3-kinase)によって媒介される。
【０２１８】
ホスファチジルイノシトールおよびその誘導体は、1-アシル-sn-グリセロール-3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ経路から放出されるメッセンジャーのもう1つのクラスを提供する(Toker A, Cantley LC, Nature 1997 Jun 12; 387(6634): 673-676, Signaling through the lipid products of phosphoinositide-3-OH kinase、Martin TF, Curr. Opin. Neurobiol. 1997 Jun; 7(3):331-338, Phosphoinositides as spatial regulators of membrane trafficおよびHsuan JJ, et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997 Mar 1st; 29(3): 415-435, Growth factor-dependent phosphoinositide signaling).
【０２１９】
細胞成長、分化およびアポトーシスは、上記の代謝経路に関与している酵素によって影響され、修飾される。したがって、この経路が変化すれば癌細胞の進行が容易になる可能性がある。酵素インヒビターなどの作用物質を用いて経路での酵素活性を変調すれば、これが癌細胞に対する通常の表現型を維持する一方法になり得るのである。
【０２２０】
前立腺癌由来のDU145細胞株をはじめとする何種類かのヒト癌細胞株の増殖をリゾホスファチジン酸のエーテル結合類似物すなわち4-O-ヘキサデシル-3(S)-O-メトキシブタンホスホネートで効果的に抑制できることが、最近になってAshagbley A、Samadder P、Bittman R、Erukulla RK、Byun HS、Arthur Gらによって示された(Anticancer Res 1996 Jul; 16(4A): 1813-1818, Synthesis of ether-linked analogues of lysophosphatidate and their effect on the proliferation of human epithelial cancer cells in vitro)。
【０２２１】
ボックス3に対する相同性のパターンが異なることから、PG1ファミリの細胞タンパク質と機能的に確証が得られている1-アシル-sn-グリセロール-3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼファミリとは構造面で違いがあることが明らかになったが、この違いは、リン脂質代謝経路における基質の独特な特異性、他の細胞成分との特異的な相互作用またはその両方を示していた。
【０２２２】
以下のセクションVIIIで説明する通り、ヒト前立腺癌細胞の悪性の表現型を元に戻すために、このタンパク質ファミリの持つ潜在的な機能を解明し、潜在的な基質類似物を試験する目的で、PG1遺伝子の酵母相同体にノックアウト変異種を構築するなどの方法でPG1遺伝子の機能をさらに解析することが可能である。
【０２２３】
実施例7
PG1アイソフォームの細胞内局在性の解析
PG1タンパク質の細胞内局在性について研究するために、発現ベクターpEGFP-N1(クロンテック)においてPG1の異なるアイソフォームをクローニングし、トランスフェクトして通常の前立腺細胞株(PNT2A)または腺癌(PC3)前立腺細胞株において発現させた。
【０２２４】
まず最初に、cDNAインサートを作出するために、5'プライマーおよび3'プライマーを合成してPG1読み取り枠の異なる領域を増幅できるようにした。個々に、増幅産物を発現ベクターのEcoRI部位およびBamHI部位に挿入できるようにするための内部のEcoRI部位またはBamHI部位でこれらのプライマーを設計した。制限部位をプライマーに導入し、pEGFP-N1へのクローニング後にPG1読み取り枠が枠内で融合し、EGFP読み取り枠になるようにした。翻訳されたタンパク質はPG1とEGFPとの融合物であった。EGFPはGFPタンパク質(緑色蛍光タンパク質)の変異形態であるため、EGFP融合タンパク質から放出される蛍光を検査することで、異なるPG1アイソフォームの細胞内局在性を検出できる可能性がある。
【０２２５】
解析対象となった異なる形態は、正常なヒト前立腺全RNAに対して行ったRT-PCRで同定された異なるメッセンジャーまたは前立腺癌細胞株LnCaPにおいて同定されたナンセンス突然変異の結果として生じる切断型のいずれかに相当する。リポフェクチン法を用いて異なるPG1構成をトランスフェクトし、トランスフェクションの20時間後にEGF発現を調べた。
【０２２６】
トランスフェクトした異なる形態の名称および内容を以下に列挙する。
A)PG1は、エキソン1〜エキソン8からのコーディングエキソンをすべて含む。
B)PG1/1-4は、選択的スプライシングがゆえに、エキソン1をエキソン4に連結し、エキソン2とエキソン3をなくした選択的メッセンジャーに相当する。
C)PG1/1-5は、選択的スプライシングがゆえに、エキソン1をエキソン5に連結し、エキソン2、エキソン3およびエキソン4をなくした選択的メッセンジャーに相当する。
D)PG1/1-7は、エキソン1〜エキソン6を含み、前立腺腫瘍細胞株LNCaPのゲノムDNAで同定された変異形態に相当する。
【０２２７】
EGFP-N1発現ベクターでのPG1 cDNAインサートのクローニング
Advantage RT-for-PCRキット(クロンテック社リファレンスK1402-2)を用いたRT-PCRによって、ヒト前立腺のcDNAを得た。まず最初に、oligodT含有PG1特異プライマーPGRT32 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAT(20pmol)1μlおよびDEPC処理H2O 11.5μlを、ヒト前立腺から抽出した全mRNA(1μg)(クロンテック社リファレンス64038-1)1μlに添加した。mRNAを74℃にて2分30秒かけて熱変性させ、次いで氷上にて急冷した。5X緩衝液4μl、dNTPs(各10mM)1μl、組換えRNaseインヒビター(20U)0.5μlおよびMoMuLV逆転写酵素(200U)1μlを含有する混合物を変性mRNAに添加した。42℃で60分間逆転写を行った。94℃で5分かけて酵素を熱変性させた。次いで、DEPC処理H2O 80μlを反応混合物に添加し、cDNA混合物を-20℃にて保存した。プライマーPG15Eco3(5' CCTGAATTCCGCCGAGCTGAGAAGATGC 3')およびPG13Bam2(5' CCTGGATCCGCTTTAATAGTAACCCACAGGCAG 3')を異なるPG1 cDNAのPCR増幅に用いた。先に調製した前立腺cDNA混合物5μl、3.3X PCR緩衝液15μl、dNTP(各2.5mM)4μl、プライマーPG15Eco3 20pmol、プライマーPG13Bam2 20pmol、RtthXL酵素1μl、Mg(OAc)2(ホットスタート)2.2μlを含有するPCR反応混合物50μlをセットアップし、94℃で10分間の最初の変性ステップの後に、94℃にて30秒、72℃で10分、67℃で4分を35サイクルの増幅を行った。1%アガロースゲルでの遊走によってPCR産物のサイズおよび完全性を評価した。1X Multicore緩衝液50μlに溶解したEcoRI(プロメガ社リファレンスR601A)2.4単位およびBamHI(プロメガ社リファレンスR602A)2.0単位で37℃にて2時間増幅産物2μgを消化した。次に酵素を68℃にて20分かけて熱失活させ、DNAをフェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈降させ、1%アガロースゲルでの遊走によってその濃度を推定した。
【０２２８】
ベクターを調製するために、1X multicore緩衝液50μlに溶解したEcoRI(プロメガ社リファレンスR601A)2.4単位およびBamHI(プロメガ社リファレンスR602A)2.0単位で37℃にて2時間pEGFP-N1ベクター(クロンテック社リファレンス6085-1)2μgを消化した。次に酵素を68℃にて20分かけて熱失活させ、DNAをフェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈降させ、1%アガロースゲルでの遊走によってその濃度および完全性を推定した。BamHIおよびEcoRIで消化したpEGFP-N1ベクター20ngをBamHI-EcoRI消化PG1 cDNA 50ngに添加した。1Xリガーゼ緩衝液を含有する最終容積20μlのT4 DNAリガーゼ(ベーリンガー社リファレンス84333623)0.5単位を用いて、一晩かけて13℃にて連結を行った。室温にて30分間水に対して透析(ミリポア社リファレンスVSWP01300)することで、連結反応混合物を脱塩した。脱塩連結反応の1/5を、抵抗126オーム、キャパシタンス50μFおよび電位2.5KVでコンピテント細胞ElectroMAX DH10B(ギブコBRL社リファレンス18290-015)25μlにて電気穿孔した。次に、SOB培地500μl中にて37℃で30分間バクテリアをインキュベートした。1/5を、KANAMYCINE(シグマ社リファレンスK4000)40μg/μlを含有するLB寒天に蒔き、37℃にて一晩インキュベートした。
【０２２９】
プラスミドDNAを個々のコロニーの終夜培養液から調製し、配列決定した。同定された異なる形態の中から、次の3種類を用いた。
A)エキソン1〜エキソン8からのコーディングエキソンをすべて含むPG1。
B)選択的スプライシングがゆえに、エキソン1をエキソン4に連結し、エキソン2とエキソン3をなくした選択的メッセンジャーに相当するPG1/1-4。
C)選択的スプライシングがゆえに、エキソン1をエキソン5に連結し、エキソン2、エキソン3およびエキソン4をなくした選択的メッセンジャーに相当するPG1/1-5。
D)ベクターPG1/1-7:  プライマーPG15Eco3およびPG1mut29Bam(5' CCTGGATCCCCTCCATCGTCTTTCCCTT 3')と、鋳型としてのベクターPG1とを用いて、切断型タンパク質をコードするcDNAインサートをPCR増幅によって合成した。このようにして得られるPCR産物を上述したものと同一のプロトコルに沿ってクローニングした。
【０２３０】
ヒト前立腺細胞株へのPG1発現ベクターのトランスフェクション
DNA/リポフェクチン溶液を次のようにして調製した。リポフェクチン(ギブコ BRL社リファレンス18292-011)1.5μlをOPTI-MEM培地(ギブコ BRL社リファレンス31985-018)100μlで稀釈し、室温にて30分間インキュベートした後、OPTI-MEM培地100μlで稀釈して室温にて15分間インキュベートしたベクター0.5μgと混合した。スライドガラス(ヌンクLab-Tek社リファレンス177402A)上で5%ウシ胎仔血清(Dutscher社リファレンスP30-3302)を含有するRPMI1640培地(ギブコ BRL社リファレンス61870-010)に細胞を播種し、5%CO2中にて37℃で成長させた。集密度40〜60%に達した細胞をOPTI-MEM培地300μlで洗浄し、DNA/リポフェクチン溶液を用いて37℃で6時間インキュベートした。DNA含有培地を、ウシ胎仔血清を補充した培地と交換し、37℃にて少なくとも36時間細胞をインキュベートした。スライドガラスをPBS中にて洗浄し、細胞をエタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで処理し、FITC/PI用の二重光路(double-pass)フィルタセットを用いて蛍光顕微鏡で検査した。
【０２３１】
PG1およびPG1/1-4を正常な前立腺細胞株と前立腺癌細胞株の両方にトランスフェクトした後、核の中と周囲に緑色蛍光を検出した(図10および図11)。この結果から、核および/または核膜にPG1タンパク質が局在することが分かる。さらに、エキソン2およびエキソン3はPG1の核への転位には不必要であろうことも示される。また、前立腺癌細胞株と正常な前立腺細胞株との間で、これら2つの形態の細胞内局在性には何ら差異が検出されなかった。
【０２３２】
これとは対照的に、PG1/1-5を用いたトランスフェクション実験では、この形態が正常な前立腺細胞株PNT2Aでは細胞質であるということが分かる。したがって、核への転位の調節にはエキソン4が重要なのであろうということが示される。興味深いことに、癌細胞株PC3で同様のトランスフェクション実験を行うと、PG1/1-5が核およびまたは核周囲に残ることが分かる(図１2)。この結果から、癌細胞株でのPG1アイソフォームの細胞内局在性の調節に何らかの異常が発生していることが分かる。さらに、細胞内での位置の調節に何らかの異常が生じたことで、前立腺腫瘍におけるPG1の正常な機能が間接的に変化しているかもしれないことが分かる。
【０２３３】
最後に、PG1のエキソン6(配列番号 69)において、前立腺癌細胞株LNCaPでナンセンス突然変異を同定した。この突然変異は、切断型タンパク質(配列番号 70)産生の原因である。この切断型タンパク質の細胞内位置を判断するために、PG1/1-7およびPG1を正常な前立腺細胞株PNT2Aにトランスフェクトした。両方の実験で検出される蛍光を比較した結果、非切断型タンパク質が核中および/または核周囲に所在するため切断型が細胞質に局在することが明らかに分かった(図13)。この結果から、変異したPG1は核に到達することのできない切断型タンパク質で翻訳されるということが分かる。また、エキソン7およびエキソン8がPG1の細胞内局在性の調節に重要な役割を果たしている可能性があることも示される。さらに、PG1の細胞内局在性の調節機能が変化することが前立腺の癌化に関与しているのではないかという先の仮説を裏付けるものでもある。
【０２３４】
【表２】
0003889927.tif 000003
【０２３５】
選択的スプライス種
選択的スプライシングは、完全長遺伝子産物の機能を阻害する一般的な自然ツールである。選択的スプライシングによって、動態学的な特徴の異なる酵素アイソフォームが得られることが知られている(ピルビン酸キナーゼ: M1およびM2 Yamada K, Noguchi T, Biochem J. 1999 Jan1;337(Pt 1):1-11。エストロゲン受容体(ER)遺伝子は、エキソン3、エキソン5またはエキソン7の欠失を生む変異スプライシングを持つことが知られている。変異体mRNAから誘発された切断型ERタンパク質は主に、正常なERタンパク質に対する顕著なマイナスの影響をおよぼすリプレッサーとして呈される可能性がある(Iwase H, Omoto Y, Iwata H, Hara Y, Ando Y, Kobayashi S, Oncology 1998 Dec;55 Suppl S1:11-16)'。Yu et al( Yu JJ, Mu C, Dabholkar M, Guo Y, Bostick-Bruton F, Reed E,Int J Mol Med 1998 Mar;1(3):617-620 )は、ERCC1の選択的スプライシングとシスプラチン-DNAアダクトを修復する細胞機能の低下との間には何らかの関連性があることを示した。Munoz-Sanjuan et al (Munoz-Sanjuan I, Simandl BK, Fallon JF, Nathans J, Development 1998 Dec 14;126(Pt 2):409-421)は、ニワトリの発達中胎芽の神経管および隣接する構造の非オーバーラップ空間に分布して存在する線維芽細胞成長因子(FGF)型の2つの遺伝子の2つの異なる形でスプライシングされたアイソフォームの存在を示した。これらの形態のうち1つが分泌され、HoxD13、HoxD11、Fgf-4およびBMP-2の発現を異所的に活性化するが、これは肢の前後のパターニングにcFHF-2が何らかの役割を果たしているということと一致する。
【０２３６】
mRNAスプライシングによって生成される多数のアイソフォームとして存在する細胞接着分子にCD44がある。腫瘍の成長および転移にはCD44の変異体アイソフォームの発現が関連している。(Shibuya Y, Okabayashi T, Oda K, Tanaka N,Jpn J Clin Oncol 1998 Oct;28(10):609-14)彼らは、特定の2つのアイソフォームの比が胃癌および結腸直腸癌の予後を示す有用な指標となることを示した。Zhang YF, Jeffery S, Burchill SA, Berry PA, Kaski JC, Carter ND, Br J Cancer 1998 Nov;78(9):1141-6 °は、ヒトエンドセリン受容体Aが少なくとも2つのアイソフォームを生じる選択的スプライシング(spicing)の対象であることを示した。調査を行ったすべての組織および細胞で切断型受容体が発現されたが、発現レベルはさまざまであった。メラノーマ細胞株およびメラノーマ組織では、切断型受容体遺伝子が主要な種であるが、野生型ETAは他の組織で優勢であった。以上のことから、Zhang et al.は、この切断型ETA受容体の機能および生物学的な有意性は明らかではないが、ETに対する細胞応答を調節する役割があるのではないかという結論に至った。
【０２３７】
実施例8
PG1選択的スプライス種の同定
まず最初に、ヒト前立腺cDNAライブラリをスクリーニングし、PG1 cDNAをクローニングした。約400のcDNAクローンの配列解析を行ったところ、このcDNAライブラリには少なくとも14のアイソフォームが存在することが分かった。配列をゲノム配列と比較することで、これらのアイソフォームが、非常に多くのエキソン間の異なる選択的スプライシングに伴う諸現象が複雑に絡み合うことで生じたものであることが分かった(図14)。
【０２３８】
cDNAライブラリ構築の間にクローニングアーチファクトが生成される可能性を排除し、現存するすべての選択的スプライス結合部を系統的に同定するために、異なるエキソンの境界配列番号 137〜178に特異なプライマーのあらゆる考え得る組み合わせを用いて、正常な前立腺ならびに正常な前立腺細胞株PNT1A、PNT1BおよびPNT2のRNAについてRT-PCR実験を行った。アガロースゲルでの遊走によって、各反応に複数のPCRバンドが存在することを確認した。各バンドを解析し、シークエンシングによってバンドを解析し、特異的なスプライス結合部によって配列に認められる特異的スプライシングに伴う諸現象の有無を図15にプラスマイナスの評点で示した。
【０２３９】
さらに、前立腺腫瘍での異常なスプライシングに伴う諸現象を確認するために、前立腺癌細胞株LnCaPから抽出したRNA(2種類のソースから得たものであり、FCGおよびJMBとする)、CaHPV、Du145およびPC3ならびに前立腺腫瘍から得たRNA(ECP5〜ECP24)について同様の実験を行った。
【０２４０】
最初の5列から明らかなように、正常な前立腺、正常な前立腺細胞株または前立腺腫瘍のRNAではcDNAライブラリで同定したアイソフォームすべてが検出された。cDNAライブラリで検出された異なるスプライス結合部の他に、正常な前立腺または正常な前立腺細胞株では19のスプライス結合部が検出された。2タイプのエキソン結合部(エキソン3-7、エキソン3b-8)は、正常な前立腺、正常な前立腺細胞株、前立腺腫瘍または前立腺癌細胞株のいずれにおいても全く検出されなかった。正常試料と腫瘍試料とを比較することで、腫瘍試料にはそれまで正常試料では検出されなかった2つのエキソン結合部(エキソン3-8、エキソン5-8)がさらに存在することが明らかになった。この結果から、腫瘍化の間、PG1スプライシングの複雑な調節機能が変化し、異なるアイソフォームの比が異常値になるということが分かる。Wilms腫瘍の遺伝的な素因を持つ患者で異なるRNAアイソフォーム間のアンバランスが腫瘍化に関与している可能性がすでに示されている(Bickmore et al., Science 1992, 257:325-7; Little et al, Hum Mol Genet 1995, 4:351-8)ため、上記の結果は特に関心を引かれるところである。
【０２４１】
興味深いことに、正常試料と腫瘍試料とを比較したところ、エキソン結合部の中には、正常試料であればどれにでも存在するが多くの腫瘍試料には存在しないものもあるということが明らかになった。また、PG1スプライシングの調節に異常が見られるとPG1の正常な機能が変化する可能性があるということも分かるが、これは先の仮説をさらに裏付けるものである。
【０２４２】
また、タイプの異なる正常試料同士を比較(2列目vs.3列目、4列目および5列目)することで、いくつかのエキソン結合部の有無による違いも明らかになった。このことから、正常な前立腺細胞株の作出に必要な形質転換過程が同様の変化を生む可能性があることが分かるが、これは先の仮説をさらに裏付けるものである。
【０２４３】
実施例9
PG1遺伝子産物、ミュータントおよび他のPG1ポリペプチドの腫瘍サプレッサ活性の判定
PG1 mRNAの選択的スプライシングまたは停止コドン(配列番号 69のヌクレオチドおよび配列番号 70のタンパク質)を導入するPG1の突然変異のいずれかによって生じたPG1変異体は、その腫瘍サプレッサとしての役割を果たすことができない。PG1腫瘍サプレッサの役割は、前立腺癌から他の形態の悪性腫瘍にまでおよぶ可能性があり、そのようなことが多い。したがって、PG1は、ミュータントをノックアウトするおよび/または野生型PG1遺伝子(配列番号 3または179など)またはその断片を導入するターゲッティングベクターを作出することで癌を遺伝子治療するための最も重要な候補なのである。
【０２４４】
このモデルを実証するために、PG1と、これを選択的スプライシングして得られる変異体または突然変異による変異体を、セクションVIIIで説明する方法によって腫瘍細胞株に安定的にトランスフェクトする。ノーザンブロッティングとウエスタンブロッティングを用いてトランスフェクション効率を判断する。この場合、ウエスタンブロッティングは、最も豊富なPG1 mRNAと選択的スプライシングによる変異体、切断型変異体または他の機能的ミュータント産生物を区別するよう設計したPG1合成ペプチドをPG1用に調製して得られる抗体を用いて行う。本願明細書のセクションIIIおよびVIIに説明する方法を用いて、合成ペプチドおよびポリクローナル抗体を作出する。PG1およびその変異体は、好ましくはヒト前立腺癌、肝臓癌、肺癌および大腸癌由来のさまざまな腫瘍細胞株で効率よく発現される。本願発明者らは、この遺伝子を免疫不全のヌードマウスに注射し、細胞分裂率、DNA合成、軟寒天での成長機能および腫瘍の進行と転移を引き起こす機能にどのように影響しているのかについて判断する。
【０２４５】
あるいは、PG1遺伝子およびその変異体を、これらの遺伝子を高いレベルで発現させるのに用いられるアデノウイルスに挿入する。この方法は、腫瘍が自発的に発生する動物でのPG1発現の効果を調べる上で好ましいものである。細胞および分子生物の分野における当業者間で周知の方法を用いて、特異的アデノウイルスを産生する。
【０２４６】
II.  ポリヌクレオチド:
本発明は、PG1ゲノムまたはcDNAの形でのポリヌクレオチドならびに本発明の方法でプライマーおよびプローブとして用いられるポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、配列表に含まれる任意の配列ならびにその相補配列(その相補体)のうち一配列の連続したスパンのヌクレオチドからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよく、好ましくは、前記配列が配列番号 3、112〜125、179、182〜184から選択されるものである。「連続したスパン」は、6ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長または500ヌクレオチド長である。本発明のポリヌクレオチドは、配列表に列挙した多型塩基を取り囲む正確なフランキング配列を有するものに限定されるものではないことに注意されたい。バイアレリックマーカーまたはバイアレリックマーカーからさらに離れた位置にある本発明のプローブのいずれかのプライマーを取り囲むフランキング配列を意図した用途に合わせて任意の度合いで伸長または短縮するが、本発明では特にこのような配列も念頭においていることを理解されたい。配列表に示すポリヌクレオチドは、意図した用途に合うどのような長さであってもよいことは理解できよう。また、連続したスパンの外にあるフランキング領域がヒトに実際に起こる天然フランキング配列と相同である必要はない。ヌクレオチドの意図した用途に合うヌクレオチド配列が特に考慮される。連続したスパンには、任意に、前記配列のPG1関連バイアレリックマーカーを含んでもよい。任意に、PG1関連バイアレリックマーカーの定義で上述したバイアレリックマーカーのアレルをPG1関連バイアレリックマーカーに存在するものとして特定してもよい。
【０２４７】
本発明は、厳密度の高いまたは中程度の条件下で、配列表に示す配列のポリヌクレオチドならびにこれに対する相補配列とハイブリダイズさせるポリヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記配列は、配列番号 3、112〜125、179、182〜184から選択される。好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、少なくとも6ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長、80ヌクレオチド長、90ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長または500ヌクレオチド長のものである。好ましいポリヌクレオチドは、PG1関連バイアレリックマーカーを含む。任意に、PG1関連バイアレリックマーカーの定義で上述したバイアレリックマーカーのアレルをバイアレリックマーカー部位に存在するものとして特定してもよい。厳密度の高い条件および厳密度が中程度の条件については、以下のセクションX.C.4でさらに説明する。
【０２４８】
本発明は、ヒト、マウスまたは哺乳動物全体のPG1タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを具体的に例示するものである。大雑把に言うと、本発明のポリヌクレオチドは、PG1の天然由来のヌクレオチド配列を含む。しかしながら、天然由来のサイレントコドン異形または他のサイレントコドン異形を用いてPG1アミノ酸配列をコードすることもできる。ヌクレオチド配列の発現が必要な本発明のいずれかの実施形態のためにPG1遺伝子に変化または付加されるアミノ酸についてみると、概して、周知のコドンでの優先度(preferences)を活用してポリヌクレオチドの使用が意図された特定のヒトまたは非ヒト動物系での発現を最適化できるように核酸配列を選択する。本発明のPG1ポリヌクレオチドは、ヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1タンパク質、好ましくは配列番号 3、112〜125、179、182〜184のPG1ポリヌクレオチド配列およびその相補配列をコードする天然のヌクレオチド配列であってもよい。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号 4、5、70、74および125〜136から少なくとも8、10、12、15、20、25、30、50、100または200アミノ酸で構成される連続したストレッチを有するPG1ポリペプチドならびにヒト、マウスまたは哺乳動物の他のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチドがあげられる。さらに、本発明には、少なくとも8ヌクレオチド、10ヌクレオチド、12ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、500ヌクレオチドの、ヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1ゲノム配列ならびに好ましくは配列番号 179、182、183のヒト、マウスまたは哺乳動物の完全PG1遺伝子およびこれらの相補体の連続したストレッチを含むポリヌクレオチドも包含される。
【０２４９】
本発明は、少なくとも8ヌクレオチド、10ヌクレオチド、12ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチドまたは500ヌクレオチドの、ヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1 cDNA配列ならびにヒト、マウスまたは哺乳動物の完全PG1 cDNAおよびこれらの相補体の連続したストレッチからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドによって構成されるcDNA種およびポリヌクレオチド断片としては、ヒト、マウスまたは哺乳動物のソース、好ましくは配列番号 3、184およびこれらの相補体のうちいずれかに由来の優勢種があげられる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物のうちいずれかのPG1転写の選択的スプライシングによって生じたcDNA種およびその断片、好ましくは配列番号 112〜124のcDNA種およびこれらの相補体を含む。さらに、本発明は、スプライス結合部にわたるポリヌクレオチドからなる、またはこれを含み、好ましくは配列番号 137〜178のいずれかおよびこれらの相補体、さらに好ましくは配列番号 137〜149、151〜169、171〜178およびこれらの相補体を含む、cDNA種および他のポリヌクレオチドを包含する。また、本発明のポリヌクレオチドには、以下のPG1エキソン対に示す順序で、このなかから選択される、互いに隣接したヒト、マウスまたは哺乳動物の単一の種由来の共有結合した2つのPG1エキソンを有するcDNAおよび他のポリヌクレオチドも含まれる。1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、4:5、4:6、4:7、4:8、5:6、5:7、5:8、6:7、6:8、7:8、1:1bis、1bis:2、1bis:3、1bis:4、1bis:5、1bis:6、1bis:7、1bis:8、3:3bis、3bis:4、3bis:5、3bis:6、3bis:7、3bis:8、5:5bis、5bis:6、5bis:7、5bis:8、1:6bis、2:6bis、3:6bis、4:6bis、5:6bis、6bis:7、6bis:8およびこれらの相補体。好ましい実施形態では、エキソンの各対におけるPG1エキソンの配列を以下の通り選択する。
エキソン1に配列番号 100、エキソン2に配列番号 101、エキソン3に配列番号 102、
エキソン4に配列番号 103、エキソン5に配列番号 104、エキソン6に配列番号 105、
エキソン7に配列番号 106、エキソン8に配列番号 107、エキソン1bisに配列番号 108、
エキソン3bisに配列番号 109、エキソン5bisに配列番号 110、およびエキソン6bisに配列番号 111。エキソン8には8つの異なるポリアデニル化部位があるため、エキソン8を包含するヒトcDNA断片を含む本発明のcDNAまたはポリヌクレオチドはいずれも、配列番号 107に示されるエキソン8の最初の330ヌクレオチド、699ヌクレオチド、833ヌクレオチド、1826ヌクレオチド、2485ヌクレオチド、2805ヌクレオチド、4269ヌクレオチドまたは4315ヌクレオチドのみが存在する。
【０２５０】
本発明のプライマーは、ここに開示の配列から従来技術において周知のいずれの方法に対して設計することもできる。好ましいプライマーセットは、配列表に示す配列を有する連続したスパンの同一性の3'末端がプライマーの3'末端に存在するように作られたものである。このような配置によって、プライマーの3'末端を選択した核酸配列とのハイブリダイズが可能になり、プライマーの増幅反応効率またはシークエンシング反応効率が劇的に高くなる。バイアレリックマーカーが連続したスパンの3'末端に位置し、この連続したスパンがプライマーの3'末端に存在するように、アレル特異的プライマーを設計する。このようなアレル特異的プライマーは、バイアレリックマーカーに存在する2つのアレルのうち一方を含む核酸試料と併用する限りにおいて、増幅反応またはシークエンシング反応を選択的に刺激しやすいものである。本発明のプライマーの3'末端は、前記配列のPG1関連バイアレリックマーカー内またはこのPG1関連バイアレリックマーカーの少なくとも2ヌクレオチド、4ヌクレオチド、6ヌクレオチド、8ヌクレオチド、10ヌクレオチド、12ヌクレオチド、15ヌクレオチド、18ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、250ヌクレオチド、500ヌクレオチドまたは1000ヌクレオチド上流あるいはシークエンシング、増幅における意図した用途に適した他の任意の位置または新規な配列またはマーカーの位置に所在する。
【０２５１】
好ましい増幅プライマーとしては、配列番号 39〜56および63〜68に開示のポリヌクレオチドがあげられる。特定の非遺伝子PG1関連バイアレリックマーカーで好ましい別の増幅プライマーを、独自に振ったマーカーの参照番号とPUおよびPR増幅プライマーの配列番号でそれぞれ列挙する。
4-14-107では配列番号 339および382を使用、4-14-317では配列番号 339および382を使用、
4-14-35では配列番号 339および382を使用、4-20-149では配列番号 340および383を使用、
4-22-174では配列番号 341および384を使用、4-22-176では配列番号 341および384を使用、
4-26-60では配列番号 342および385を使用、4-26-72では配列番号 342および385を使用、
4-3-130では配列番号 343および386を使用、4-38-63では配列番号 344および387を使用、
4-38-83では配列番号 344および387を使用、4-4-152では配列番号 345および388を使用、
4-4-187では配列番号 345および388を使用、4-4-288では配列番号 345および388を使用、
4-42-304では配列番号 346および389を使用、4-42-401では配列番号 346および389を使用、
4-43-328では配列番号 347および390を使用、4-43-70では配列番号 347および390を使用、
4-50-209では配列番号 348および391を使用、4-50-293では配列番号 348および391を使用、
4-50-323では配列番号 348および391を使用、4-50-329では配列番号 348および391を使用、
4-50-330では配列番号 348および391を使用、4-52-163では配列番号 349および392を使用、
4-52-88では配列番号 349および392を使用、4-53-258では配列番号 350および393を使用、
4-54-283では配列番号 351および394を使用、4-54-388では配列番号 351および394を使用、
4-55-70では配列番号 352および395を使用、4-55-95では配列番号 352および395を使用、
4-56-159では配列番号 353および396を使用、4-56-213では配列番号 353および396を使用、
4-58-289では配列番号 354および397を使用、4-58-318では配列番号 354および397を使用、
4-60-266では配列番号 355および398を使用、4-60-293では配列番号 355および398を使用、
4-84-241では配列番号 356および399を使用、4-84-262では配列番号 356および399を使用、
4-86-206では配列番号 357および400を使用、4-86-309では配列番号 357および400を使用、
4-88-349では配列番号 358および401を使用、4-89-87では配列番号 359および402を使用、
99-123-184では配列番号 360および403を使用、99-128-202では配列番号 361および404を使用、
99-128-275では配列番号 361および404を使用、99-128-313では配列番号 361および404を使用、
99-128-60では配列番号 361および404を使用、99-12907-295では配列番号 362および405を使用、
99-130-58では配列番号 363および406を使用、99-134-362では配列番号 364および407を使用、
99-140-130では配列番号 365および408を使用、99-1462-238では配列番号 366および409を使用、
99-147-181では配列番号 367および410を使用、99-1474-156では配列番号 368および411を使用、
99-1474-359では配列番号 368および411を使用、
99-1479-158では配列番号 369および412を使用、
99-1479-379では配列番号 369および412を使用、99-148-129では配列番号 370および413を使用、
99-148-132では配列番号 370および413を使用、99-148-139では配列番号 370および413を使用、
99-148-140では配列番号 370および413を使用、99-148-182では配列番号 370および413を使用、
99-148-366では配列番号 370および413を使用、99-148-76では配列番号 370および413を使用、
99-1480-290では配列番号 371および414を使用、
99-1481-285では配列番号 372および415を使用、
99-1484-101では配列番号 373および416を使用、
99-1484-328では配列番号 373および416を使用、
99-1485-251では配列番号 374および417を使用、
99-1490-381では配列番号 375および418を使用、
99-1493-280では配列番号 376および419を使用、99-151-94では配列番号 377および420を使用、
99-211-291では配列番号 378および421を使用、99-213-37では配列番号 379および422を使用、
99-221-442では配列番号 380および423を使用、99-222-109では配列番号 381および424を使用、さらにこれらの相補体。
【０２５２】
3'末端がPG1関連バイアレリックマーカーよりも1ヌクレオチド上流または下流にあるプライマーは、マイクロシークエンシングアッセイにおいて特に有用である。好ましいマイクロシークエンシングプライマーとしては、配列番号 21〜38の位置1〜位置23および位置25〜位置47のポリヌクレオチドならびにこれらの相補体があげられる。特定の非遺伝子的PG1関連バイアレリックマーカーで好ましい別のマイクロシークエンシングプライマーを、独自に振ったマーカー参照番号と2つの好ましいマイクロシークエンシングプライマーの配列番号で以下に列挙する。
配列番号 425および502*の4-14-107、配列番号 426および503*の4-14-317、
配列番号 427および504*の4-14-35、配列番号 428*および505の4-20-149、
配列番号 429および506の4-20-77、配列番号 430*および507の4-22-174、
配列番号 431および508の4-22-176、配列番号 432および509*の4-26-60、
配列番号 433および510の4-26-72、配列番号 434および511*の4-3-130、
配列番号 435および512の4-38-63、配列番号 436および513*の4-38-83、
配列番号 437および514の4-4-152、配列番号 438*および515の4-4-187、
配列番号 439および516の4-4-288、配列番号 440および517の4-42-304、
配列番号 441*および518の4-42-401、配列番号 442および519の4-43-328、
配列番号 443*および520の4-43-70、配列番号 444*および521の4-50-209、
配列番号 445*および522の4-50-293、配列番号 446*および523の4-50-323、
配列番号 447*および524の4-50-329、配列番号 448および525の4-50-330、
配列番号 449*および526の4-52-163、配列番号 450*および527の4-52-88、
配列番号 451および528*の4-53-258、配列番号 452*および529の4-54-283、
配列番号 453および530の4-54-388、配列番号 454および531*の4-55-70、
配列番号 455*および532の4-55-95、配列番号 456*および533の4-56-159、
配列番号 457および534の4-56-213、配列番号 458*および535の4-58-289、
配列番号 459*および536の4-58-318、配列番号 460*および537の4-60-266、
配列番号 461*および538の4-60-293、配列番号 462および539*の4-84-241、
配列番号 463および540の4-84-262、配列番号 464および541*の4-86-206、
配列番号 465および542の4-86-309、配列番号 466および543の4-88-349、
配列番号 467*および544の4-89-87、配列番号 468および545の99-123-184、
配列番号 469および546の99-128-202、配列番号 470および547の99-128-275、
配列番号 471および548の99-128-313、配列番号 472*および549の99-128-60、
配列番号 473および550*の99-12907-295、
配列番号 474*および551*の99-130-58、
配列番号 475および552*の99-134-362、配列番号 476*および553*の99-140-130、
配列番号 477*および554の99-1462-238、配列番号 478および555*の99-147-181、
配列番号 479および556*の99-1474-156、配列番号 480および557の99-1474-359、
配列番号 481*および558の99-1479-158、配列番号 482および559の99-1479-379、
配列番号 483および560の99-148-129、配列番号 484および561の99-148-132、
配列番号 485および562の99-148-139、配列番号 486および563の99-148-140、
配列番号 487および564*の99-148-182、配列番号 488および565の99-148-366、
配列番号 489および566の99-148-76、配列番号 490および567*の99-1480-290、
配列番号 491および568*の99-1481-285、配列番号 492および569の99-1484-101、
配列番号 493*および570の99-1484-328、
配列番号 494および571*の99-1485-251、
配列番号 495*および572の99-1490-381、
配列番号 496および573*の99-1493-280、
配列番号 497および574*の99-151-94、配列番号 498*および575の99-211-291、
配列番号 499および576の99-213-37、SEQ ID 500および577の99-221-442、
配列番号 501*および578の99-222-109、これらの相補体。
【０２５３】
特定の遺伝的PG1関連バイアレリックマーカーで好ましい別のマイクロシークエンシングプライマーとしては、配列番号 179の位置N-Xから位置N-1までの核酸配列、配列番号 179の位置N+1から位置N+Xまでの核酸配列、これらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドがあげられる。ここで、Xは15、18、20、25、30に等しいかまたは15〜30の範囲に等しく、Nは、2159、2443、4452、5733、8438、11843、1983、12080、12221、12947、13147、13194、13310、13342、13367、13594、13680、13902、16231、16388、17608、18034、18290、18786、22835、22872、25183、25192、25614、26911、32703、34491、34756、34934、5160、39897、40598、40816、40947、45783、47929、48206、48207、49282、50037、50054、50101、50220、50440、50562、50653、50660、50745、50885、51249、51333、51435、51468、51515、51557、51566、51632、51666、52016、52096、52151、52282、52348、52410、52580、52712、52772、52860、53092、53272、53389、53511、53600、53665、53815、54365および54541の値のうち1つに等しい。
【０２５４】
本発明のプローブは、ここに開示の配列から従来技術において周知のいずれの方法に対して設計することもでき、特に、本願明細書に開示の特定の配列またはマーカーが存在する場合の試験が可能な方法に対して設計することができる。好ましいプローブのセットは、どのような特定のアッセイ条件の組み合わせであってもバイアレリックマーカーの一方のアレルに選択的に結合するが、他方のアレルには結合しないように本発明のハイブリダイゼーションアッセイにおいて周知の方法で使用できるように設計される。好ましいハイブリダイゼーションプローブは、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長または20ヌクレオチド長から25ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長または80ヌクレオチド長の範囲、あるいは12ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長または50ヌクレオチド長であると特定され、前記配列のPG1関連バイアレリックマーカーを含む、連続したスパンからなる、または本質的にこれからなる、あるいはこれを含むものであってもよい。任意に、PG1関連バイアレリックマーカーの定義において特定した2つのアレルのうちいずれかがバイアレリックマーカー部位に存在してもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーは、ハイブリダイゼーションプローブの中心から6、5、4、3、2または1ヌクレオチドの位置または前記プローブの中心にあってもよい。ハイブリダイゼーションプローブの好ましいセットは、配列番号 21〜38、57〜62、185〜338およびこれらの相補体において開示される。もう1つの特に好ましいハイブリダイゼーションプローブのセットとして、配列番号 21〜38、57〜62、185〜338またはこれらの相補体のうちいずれか1つの位置Xから位置Yまでのポリヌクレオチドがあげられる。ここで、Xは、5、8、10、12、14、16、18に等しいかまたは5〜18の範囲に等しく、Yは、30、32、34、36、38、40、43に等しいかまたは30〜43の範囲に等しく、好ましくは、Xが12でYが36である。特定の遺伝的PG1関連バイアレリックマーカーに好ましい別のハイブリダイゼーションプローブとしては、配列番号 179の位置N-Xから位置N+Yの核酸配列およびこれらの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドがあげられる。ここで、Xは、8、10、12、15、20、25に等しいかまたは8〜30の範囲であり、Yは、8、10、12、15、20、25に等しいかまたは8〜30の範囲であり、Nは、2159、2443、4452、5733、8438、11843、1983、12080、12221、12947、13147、13194、13310、13342、13367、13594、13680、13902、16231、16388、17608、18034、18290、18786、22835、22872、25183、25192、25614、26911、32703、34491、34756、34934、5160、39897、40598、40816、40947、45783、47929、48206、48207、49282、50037、50054、50101、50220、50440、50562、50653、50660、50745、50885、51249、51333、51435、51468、51515、51557、51566、51632、51666、52016、52096、52151、52282、52348、52410、52580、52712、52772、52860、53092、53272、53389、53511、53600、53665、53815、54365および54541の値のうちいずれか1つに等しい。ここで、位置Nのヌクレオチドは、位置Nのバイアレリックマーカー部位でのPG1関連バイアレリックマーカーの定義において特定した2つのアレルのうち一��から選択される。
【０２５５】
必要であれば、本発明のポリヌクレオチドはいずれも、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段によって検出可能な標識を取り込むことで標識可能なものである。たとえば、有用な標識として、放射性物質、蛍光染料またはビオチンがあげられる。好ましくは、ポリヌクレオチドをその3'末端と5'末端で標識する。また、標識を使用してプライマーを捕捉し、プライマーまたは増幅DNAなどのプライマー伸長産物のいずれかの固相での固定化を容易にすることもできる。捕捉された標識はプライマーまたはプローブに付着するため、固相の試薬の特異的結合メンバー(ビオチンおよびストレプトアビジン)との間で結合対を形成する特異的結合メンバーとなり得る。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブに付した標識のタイプに応じて、これは標的DNAの捕捉または検出用に用いられる。さらに、本願明細書において提供するポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それ自体が、捕捉標識として機能するものであることは理解できよう。たとえば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、これは、プライマーまたはプローブの相補部分を結合し、これによってプライマーまたはプローブを固相に固定化するように選択される。ポリヌクレオチドプローブ自体が結合メンバーとして機能する場合は、標的に対して相補的ではない配列すなわち「尾」がプローブに含まれることは当業者であれば理解できよう。ポリヌクレオチドプライマー自体が捕捉標識として機能する場合は、プライマーの少なくとも一部が固相上で核酸と自由にハイブリダイズされる。DNA標識法は当業者間で周知のものである。
【０２５６】
本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブはいずれも、固相に適宜固定化することができる。固相は当業者間で周知のものであり、反応トレーの穴の壁面、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ(または他の動物)の赤血球細胞、duracytes(登録商標)などを含む。固相は決定的なものではなく、当業者によって選択可能である。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズまたは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターの穴の壁、ガラスチップまたはシリコンチップ、ヒツジ(または他の適した動物)の赤血球細胞およびduracytesはいずれも、好適な例である。固相に核酸を固定化するための好適な方法としては、イオン的相互作用、疎水的相互作用、共有結合的相互作用などがあげられる。本願明細書では、「固相」は不溶性または以後の反応によって不溶性にすることのできるあらゆる材料を意味する。捕捉試薬を引きつけて固定化する固有の性能によって固相を選択することができる。あるいは、捕捉試薬を引きつけて固定化する機能を有する別の受容体を固相に保定することができる。別の受容体としては、捕捉試薬自体または捕捉試薬に共役結合される荷電物質と反対の電荷に荷電した荷電物質をあげることができる。さらに別の選択肢として、受容体分子は、固相に固定化(付着)され、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する機能を有するものであれば、どのような特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子は、アッセイの実行前またはアッセイの実行時に捕捉試薬の固相材料への間接的な結合を可能にするものである。このため、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、検査チューブのガラス表面またはシリコン表面、マイクロタイターの穴、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ(または他の適した動物)の赤血球細胞、duracytes(登録商標)および当業者間で周知の他の構成などを固相とすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、固相にて個々にまたは少なくとも2種類、5種類、8種類、10種類、12種類、15種類、20種類または25種類の本発明のポリヌクレオチドのグループで単一の固相に付着または固定化することができるものである。また、本発明によるもの以外のポリヌクレオチドを１つまたはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドと同一の固相に付着させてもよい。
【０２５７】
本願明細書に記載のポリヌクレオチドはいずれも、固相上のオーバーラップ領域内または無作為に選択した位置に付着される。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、一定順序のアレイで付着される。この場合、各ポリヌクレオチドは、固相上の他のいかなるポリヌクレオチドの付着部位とも重複しない別の領域に付着される。好ましくは、別の位置を記録し、アッセイ手順の一部としてアクセスできるように、このようなポリヌクレオチドの一定順序のアレイを「アドレス調節可能な」ように設計する。アドレス指定可能なポリヌクレオチドアレイは一般に、異なる既知の位置にある基質の表面に結合する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置を正確に知ることで、これらの「アドレス指定可能な」アレイがハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用なものとなる。当業者間で周知のアドレス指定可能なアレイテクノロジーを本発明のポリヌクレオチドと併用することが可能である。これらのポリヌクレオチドアレイの特定の一実施形態は、Genechips(登録商標)として周知であり、米国特許第5,143,854号、PCT国際出願公開第WO 90/15070号および同第92/10092号にその概略が説明されている。これらのアレイは一般に、機械的な合成方法または光指向性合成方法を用いて作製できる。これらの方法では、フォトリソグラフィによる方法と固相オリゴヌクレオチド合成との組み合わせを利用している(Fodor et al., Science, 251:767-777, 1991)。オリゴヌクレオチドアレイの固相への固定化は、一般に「Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis(VLSIPS登録商標)」と呼ばれるテクノロジーの開発によって可能になったものである。 このテクノロジーでは一般に、チップの固体表面上でプローブを高密度アレイ状に固定化する。VLSIPS登録商標テクノロジーの一例は、米国特許第5,143,854号および同第5,412,087号ならびにPCT国際出願公開第WO 90/15070号、同第WO 92/10092号および同第WO 95/11995号にあげられている。これらの公報では、光指向性合成法などの手法によってオリゴヌクレオチドアレイを形成する方法について説明されている。固相に固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することを目的とした設計戦略では、ハイブリダイゼーションパターンと配列情報を最大化しようという試みの中で、チップ上でオリゴヌクレオチドアレイを順序付けて表示するための別のプレゼンテーション戦略が開発された。このようなプレゼンテーション戦略の一例が、PCT国際出願公開第WO 94/12305号、同第WO 94/11530号、同第WO 97/29212号および同第WO 97/31256号に開示されている。
【０２５８】
オリゴヌクレオチドアレイが、配列番号 3、21〜38、57〜62、100〜124、179、185〜338、上述した遺伝的PG1関連バイアレリックマーカーに好ましいハイブリダイゼーションプローブおよびこれらと相補的な配列あるいはその断片からなる群から選択される少なくとも１つの配列で、試料に本発明のバイアレリックマーカーのアレルが1つまたはそれ以上含まれているか否かを判断するための少なくとも15の連続したヌクレオチドの配列を含んでもよい。また、オリゴヌクレオチドアレイが、配列番号 179、339〜424およびこれらと相補的な配列あるいはその断片からなる群から選択される少なくとも１つの配列で、PG1関連バイアレリックマーカーの1つまたはそれ以上のアレルを増幅するための少なくとも15の連続したヌクレオチドの配列を含んでもよい。他の実施形態では、アレイが、SEQ ID 425〜578からなる群から選択される少なくとも１つの配列、上述した遺伝的PG1関連バイアレリックマーカーに好ましいマイクロシークエンシングプライマーおよびこれらと相補的な配列あるいはその断片で、マイクロシークエンシング解析を行って、試料にPG1関連バイアレリックマーカーのアレルが1つまたはそれ以上含まれているか否かを判断するための少なくとも15の連続したヌクレオチドの配列を含んでもよい。
【０２５９】
本発明はさらに、後述するような厳密度の高いまたは中程度の条件下で、配列番号 3、69、100〜112または179〜184のいずれか1つとハイブリダイズされるポリヌクレオチド配列を包含する。
(i)  一例であり限定するものではないが、厳密度の高い条件を用いて行われる手順は次の通りである。6×SSC、トリス-HCl(pH 7.5) 50mM、EDTA 1mM、0.02% PVP、0.02%フィコール、0.02% BSAおよび変性サケ精子DNA 500μg/mlで構成される緩衝液にて65℃で8時間から一晩かけてDNAを含有するフィルタをプレハイブリダイゼーションする。好ましいハイブリダイゼーション温度である65℃にて48時間、変性サケ精子DNA 100μg/mlと32P標識プローブ5〜20×106cpmとを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルタをハイブリダイズさせる。あるいは、SSC緩衝液(1×SSCが0.15M NaClおよび0.05 M Naクエン酸塩に相当)の存在下、65℃でハイブリダイゼーションステップを行うことができる。続いて、2×SSC、0.01% PVP、0.01%フィコールおよび0.01%BSAを含有する溶液中で37℃で1時間、次いで0.1×SSCで50℃にて45分かけてフィルタを洗浄することができる。あるいは、2×SSCと0.1% SDSまたは0.5×SSCと0.1% SDSまたは0.1×SSCと0.1% SDSを含有する溶液で68℃にて15分かけてフィルタを洗浄することができる。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブをオートラジオグラフィによって検出することが可能である。厳密度の高い他の使用条件は当業者間で周知のものであり、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,   Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Yに記載されている。このような配列は、ORF2〜ORF1297のうちの1つによってコードされたポリペプチドの相同体をコードするものであると好ましい。一実施形態では、かかる配列は哺乳動物のPG1ポリペプチドをコードする。
(ii)  一例であり限定するものではないが、厳密度が中程度の手順は以下の通りである。DNAを含むフィルタをプレハイブリダイズし、次いで5×SSC緩衝液と標識プローブとの存在下、60℃の温度にてハイブリダイズさせる。続いて、2×SSCを含有する溶液で50℃にてフィルタを洗浄すると、ハイブリダイズさせたプローブをオートラジオグラフィで検出可能である。厳密度が中程度の他の使用条件は当業者間で周知のものであり、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57およびAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Yに記載されている。このような配列は、配列番号 3、69、100〜112または179〜184のうちの1つによってコードされたポリペプチドの相同体をコードするものであると好ましい。一実施形態では、かかる配列は哺乳動物のPG1ポリペプチドをコードする。
【０２６０】
本発明は、１つまたはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドと、必要な試薬の一部またはすべてと、PG1関連バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判断することによって、被検体の遺伝子型を判定するための指示書とを含む診断キットも包含する。キットに含まれるポリヌクレオチドは、任意に、固相に付着されていてもよく、あるいは、ポリヌクレオチドのアレイの一部であるかまたはアドレス指定可能なアレイであってもよい。このキットでは、シークエンシングアッセイ法、マイクロシークエンシングアッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法またはアレル特異的増幅法を含むがこれに限定されるものではない従来技術で周知のいずれかの方法で、マーカー位置におけるヌクレオチドの同一性を判定することができる。任意に、被検体が癌または前立腺癌に罹患する危険性、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する考え得る応答、あるいは抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用の可能性に関して判定結果に評点を付けるための指示書をかかるキットに入れておいてもよい。
【０２６１】
PG1核酸の試薬としての使用
配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3、112〜124のPG1 cDNAと、検出可能な表現型(実施例12の方法および配列番号 69によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルとを使用して、診断の技術または上述したような遺伝子工学的な方法で使用するためのPCRプライマーを調製することができる。配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3、112〜124のPG1 cDNAと、検出可能な表現型(実施例12の方法によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルとをPCR増幅手順に用いることについて、実施例10で説明する。
【０２６２】
実施例10
配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3のPG1 cDNAと、検出可能な表現型(実施例12の方法によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルとを使用して、このような配列にハイブリダイズできる核酸をクローニングするための単離手順、診断の技術および法医学上の技術をはじめとするさまざまな用途に合ったPCRプライマーを調製する。このPCRプライマーは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3、112〜124のPG1 cDNAと、(実施例12の方法によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルまたはこれらと相補的な配列のうち少なくとも10の連続した塩基を含む。好ましくは、PCRプライマーは、これらの配列のうち少なくとも12、15または17の連続した塩基を含む。より好ましくは、PCRプライマーは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3、112〜124のPG1 cDNAと、(実施例12の方法によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルまたはこれらと相補的な配列のうち少なくとも20〜30の連続した塩基を含む。いくつかの実施形態では、PCRプライマーが、配列番号 179のPG1ゲノムDNAと、配列番号 3、112〜124のPG1 cDNAと、(実施例12の方法によって得ることが可能なものなど)の原因であるPG1アレルまたはこれらと相補的な配列のうち31以上の連続した塩基を含むものであってもよい。融解温度がほぼ同じになるように、PCR増幅で一緒に使用するプライマー対のG/C比がほぼ同一であると好ましい。
【０２６３】
さまざまなPCR法が当業者間で周知である。PCRテクノロジーについては、Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa 1997を参照のこと。これらのPCR手順の各々で、増幅対象となる核酸配列の片側のPCRプライマーを、dNTPおよびTaqポリメラーゼ、PfuポリメラーゼまたはVentポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼと共に、適宜調製した核酸試料に付加する。試料中の核酸を変性させ、PCRプライマーを試料中の相補核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後のプライマーを伸長させる。その後、修飾、ハイブリダイゼーションおよび伸長をもう1サイクル開始する。このサイクルを複数回繰り返し、プライマー部位間に核酸配列のある増幅断片を作出する。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドは、ベクターおよびDNAコンストラクトならびに他の形態のプライマーおよびプローブも包含する。これらの実施形態の十分な説明については、以下のセクションVIII、XおよびXIを参照のこと。
【０２６５】
III.  ポリペプチド
PG1タンパク質とポリペプチド断片
「PG1ポリペプチド」という用語は、本願明細書では、本発明のあらゆるタンパク質およびポリペプチドを含むものとする。また、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも本発明の一部を構成する。本発明は、ヒト由来のPG1タンパク質(配列番号 4および5)およびマウス由来のPG1タンパク質(配列番号 74)を具体的に例示するものである。しかしながら、他の多種多様な哺乳動物由来のPG１つも明示的に考慮されており、基準アフィニティクロマトグラフィによる方法で本発明の抗体を用いて単離される。さらに、ヒトおよびマウスのPG1核酸配列をプライマーおよびプローブとして用いて他の哺乳動物ソースから単離されたPG1遺伝子ならびに本願明細書に記載の方法も述べられている。
【０２６６】
また、本発明は、配列番号 125〜136を含むあまり一般的ではない選択的スプライス種から翻訳されたPG1タンパク質と、本願明細書にて説明するようにして同定および得られた天然由来のミュータント、特に配列番号 70を含むPG1の機能的ミュータントから生じたPG1タンパク質を具体的に例示するものである。また、本発明は、PG1タンパク質の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、50または100アミノ酸からなる連続したストレッチを含むポリペプチドを具体的に例示するものである。好ましい実施形態では、アミノ酸の連続したストレッチが、PG1タンパク質配列のアミノ酸の欠失、付加、交換、切断を含む突然変異部位または機能的突然変異を含む。たとえば、前記転属した範囲の配列番号 4で、ArgおよびHis残基のいずれかをアミノ酸位置184に含有するポリペプチドと、ArgまたはIle残基のいずれかをアミノ酸位置293に含有するポリペプチドが、本発明の特に好ましい実施形態であり、これらの突然変異の有無を検出する抗体の製造に有用なものである。同様に、位置228にカルボキシ末端を有するポリペプチドが本発明の特に好ましい実施形態であり、配列番号 69および70で示される突然変異の有無を検出する抗体の製造に有用である。
【０２６７】
同様に、前記連続したストレッチで天然由来のスプライス結合部(2つのヒトPG1エキソン(配列番号 100〜111)が共有結合している点)におよんでコードされる、8、10、12、15または25アミノ酸のペプチド配列を含有するポリペプチドが特に好ましい実施形態であり、PG1選択的スプライス種のさまざまなタンパク質産物の存在、局在および量を検出するための抗体の製造に有用なものである。
【０２６８】
PG1タンパク質は、ヒト、マウスまたは哺乳動物の組織試料から単離されるか、あるいはヒト、マウスまたは哺乳動物の遺伝子から発現されたものであると好ましい。
【０２６９】
本発明のPG1ポリペプチドは、従来技術において周知の一般に用いられる発現方法によって生成できる。たとえば、以下の実施例11を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好都合な宿主に適した発現ベクターに連結する。組換えポリペプチドの形成には真核生物宿主系と原核生物宿主系の両方を使用する。さらに一般的な系のうちのいくつかをセクションIIおよびVIIIで簡単に述べる。次に、ポリペプチドを連結後の細胞または培地から単離し、意図した用途に合う程度まで精製する。精製は、微分抽出、塩分画、クロマトグラフィ、遠心などの従来技術において周知のいずれかの方法で行う。タンパク質のさまざまな精製方法については、たとえば、Methods in Enzymologyを参照のこと。
【０２７０】
また、短めのタンパク質断片であれば化学的な合成によって作出する。あるいは、本発明のタンパク質をヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出する。タンパク質の精製方法は従来技術において周知であり、一例としては、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を破壊した後、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、密度による遠心沈降およびゲル電気泳動によってポリペプチドを微分抽出および分離することがあげられる。
【０２７１】
PG1タンパク質の発現
配列番号 3、69、112〜124または184を含むPG1 cDNAまたは合成DNAを以下の実施例11に述べるようにして使用し、PG1タンパク質およびポリペプチドを発現させる。
【０２７２】
実施例11
発現対象となるPG1タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、従来のクローニングテクノロジーを使用し、発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させる。発現ベクター中のPG1インサートは、PG1タンパク質またはその一部の完全コーディング配列を含むものであってもよい。たとえば、PG1由来インサートは、配列番号 4のPG1タンパク質の少なくとも10の連続したアミノ酸を有するポリペプチドをコードすることができる。
【０２７３】
発現ベクターは、従来技術において周知の哺乳動物、酵母、昆虫またはバクテリアの発現系であればどのようなものであってもよい。これについては、たとえばセクションVIIIを参照のこと。ジェネティクスインスティテュート社(マサチューセッツ州Cambridge)、ストラタジーン社(カリフォルニア州La Jolla)、プロメガ社(ウィスコンシン州Madison)およびインビトロゲン社(カリフォルニア州San Diego)をはじめとするさまざまな提供業者から、市場販売されているベクターおよび発現系を入手することができる。必要があれば、発現を促進して正しいタンパク質折り畳みを容易にするために、Hatfield, et al.の米国特許第5,082,767号に説明されているように発現ベクターを導入する特定の発現生物に合わせて配列のコドンコンテキストおよびコドンペアリングを最適化する。
【０２７４】
PG1タンパク質またはその一部を発現するための方法の一例を以下にあげる。一実施形態では、cDNAのポリAシグナルによるPG1 cDNAの完全コーディング配列を発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させる。あるいは、PG1タンパク質の一部をコードする核酸にメチオニンがなく、開始部位として機能する場合は、従来の手法を利用して開始メチオニンを核酸の第1コドンの隣に導入することができる。同様に、PG1 cDNAから得たインサートにポリAシグナルがない場合は、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5(ストラタジーン)からポリAシグナルを抜き、これを哺乳動物の発現ベクターpXT1(ストラタジーン)に組み込むことで、上記の配列をコンストラクトに付加することができる。pXT1は、Moloneyマウス白血病ウイルスから得られるLTRとgag遺伝子の一部とを含む。コンストラクトにおけるLTRの位置がゆえに、安定したトランスフェクションを効率よく行うことができる。ベクターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。PG1タンパク質またはその一部をコードする配列がポリAシグナルに対して正しい位置にくるように慎重に注意を払いながら、PG1 cDNAまたはその一部と相補的であり、5'プライマーに組み込まれたPst Iと、対応するcDNA3'プライマーの5'末端におけるBglIIとに対する制限エンドヌクレアーゼ配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配列番号 3のPG1 cDNAを含むバクテリアベクターからPG1タンパク質またはその一部をコードする核酸をPCRによって得る。このようにして生じるPCR反応によって得られる精製断片をPstIで消化し、エキソヌクレアーゼでブラントエンド化し、Bgl IIで消化し、精製してpXT1に連結し(この時点でポリAシグナルを含む)、BglIIで消化する。
【０２７５】
産物の説明部分で概説した条件下でリポフェクチン(ニューヨーク州Grand Island、ライフテクノロジーズ社)を使用して、連結産物をマウスNIH 3T3細胞にトランスフェクトする。G418(ミズーリ州St. Louis、シグマ社)600ug/ml中にてトランスフェクト細胞の成長後にポジティブなトランスフェクタントを選択する。
【０２７６】
あるいは、PG1タンパク質またはその一部をコードする核酸をpED6dpc2(マサチューセッツ州Cambridge、ジェネティクスインスティテュート社)にクローニングする。このようにして得られるpED6dpc2コンストラクトを、COS 1細胞などの適当な宿主細胞にトランスフェクトする。メトトレキセート耐性細胞を選択し、エキスパンドする。
【０２７７】
上述した手順を用いて、検出可能な表現型またはその一部の原因であるミュータントPG1タンパク質を発現させることもできる。
【０２７８】
硫酸アンモニウム沈降またはクロマトグラフィを用いた分取などの従来の精製法を利用して、サイズまたは電荷に応じて発現タンパク質を精製する。核酸インサートによってコードされたタンパク質を、標準的な免疫クロマトグラフィ法を用いて精製してもよい。このような手順では、細胞エキスなど発現PG1タンパク質またはその一部を含有する溶液を、PG1タンパク質またはその一部に対する抗体を仕込んだカラムに入れ、これをクロマトグラフィのマトリックスに取り付ける。発現タンパク質を免疫クロマトグラフィのカラムに結合させる。その後、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。特異的に結合した発現タンパク質をカラムから分離し、標準的な手法を用いて回収する。
【０２７９】
PG1タンパク質またはその一部の発現を確認するために、PG1タンパク質またはその一部をコードするインサートを含む発現ベクターを含有する宿主細胞から発現したタンパク質を、インサートを含まない発現ベクターを含有する宿主細胞から発現したタンパク質と比較することができる。インサートを含む発現ベクターを含有する細胞から得た試料には、インサートを含まない発現ベクターを含有する細胞から得た試料にはないバンドが存在することから、PG1タンパク質またはその一部が発現されていることが分かる。通常、このバンドはPG1タンパク質またはその一部に見られる易動度を有する。しかしながら、このバンドの易動度は、グリコシル化、ユビキチン結合または酵素切断などによる修飾の結果として生じるはずの移動性とは異なる場合がある。
【０２８０】
発現PG1タンパク質またはその一部を特異的に認識できる抗体を後述のセクションVIIIにて説明するようにして生成する。
【０２８１】
抗体産生ができない場合は、PG1タンパク質またはその一部をコードする核酸を、キメラポリペプチドを用いる精製スキームで使用するように設計した発現ベクターに組み込む。このような戦略では、PG1タンパク質またはその一部をコードする核酸を、キメラのもう片方をコードする遺伝子と共にフレームに挿入する。キメラのもう片方は、β-グロビンまたはニッケル結合ポリペプチドコード化配列である。このようにして、β-グロビンまたはニッケルに対する抗体を有するクロマトグラフィのマトリックスを用いてキメラタンパク質を精製する。プロテアーゼ切断部位をβ-グロビン遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドとPG1タンパク質またはその一部との間で操作する。これによって、キメラの2つのポリペプチドがプロテアーゼで消化されて互いに分離する。
【０２８２】
β-グロビンキメラの生成に有用な発現ベクターの1つに、pSG5(ストラタジーン)があげられる。これは、ウサギβ-グロビンをコードするものである。ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンIIによって、発現転写物のスプライシングが容易になり、コンストラクトに組み込まれたポリアデニル化シグナルによって発現のレベルが増大する。これらの手法は分子生物分野の当業者間で周知のものである。標準的な方法は、Davis et al.、(Basic Methods in Molecular Biology, L.G. Davis, M.D. Dibner, and J.F. Battey, ed., Elsevier Press, NY, 1986)などの方法テキストにおいて公開されている。さらに、ストラタジーン社、ライフテクノロジーズ社またはプロメガ社からの多くの方法を利用できる。また、In vitro Express登録商標 Translation Kit(ストラタジーン)などのin vitro翻訳系を用いてコンストラクトからポリペプチドを生成してもよい。
【０２８３】
IV.  検出可能な表現型に関連するPG1遺伝子の突然変異の同定
後述の実施例12において説明するようにして罹患個体と未罹患個体から得たPG1遺伝子配列を比較することで、検出可能な表現型の原因であるPG1遺伝子における突然変異を同定する検出可能な表現型は、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、肺非細胞癌、扁平上皮癌または他の条件をはじめとして、変化したPG1機能のさまざまな形での徴候を含む場合がある。突然変異には、PG1遺伝子の点突然変異、欠失または挿入が含まれる場合がある。突然変異は、PG1タンパク質に対するコーディング配列内またはPG1遺伝子の調節領域内に所在する場合がある。
【０２８４】
実施例12
オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、PG1遺伝子のエキソンまたはプロモーター領域各々の配列を増幅する。オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAまたはこれらの相補配列のうち少なくとも10の連続したヌクレオチドを含むものであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAまたはこれらの相補配列のうち少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAまたはこれらの相補配列のうち少なくとも20の連続したヌクレオチドを含んでもよい。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAまたはこれらの相補配列のうち25以上の連続したヌクレオチドを含んでもよい。
【０２８５】
各プライマー対を使用して、このプライマーを得たエキソンまたはプロモーターを増幅する。増幅は、上述したPCR条件を用いて罹患患者と未罹患の対照から採取したゲノムDNA試料について行う。ゲノムPCRから得られる増幅産物に自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応を行い、ABI 377シークエンサにて電気泳動させる。ゲル画像解析およびDNA配列抽出に続いて、ABI配列データを自動的に解析して罹患個体と未罹患個体における配列のバリエーションの有無を検出する。各個体について両方のDNA鎖の配列を判定することによって、配列を確認する。好ましくは、図4のハプロタイプ5について同型接合的な個体とハプロタイプ5または関連のハプロタイプが欠損した対照とを比較して、上記の候補変異を検出する。
【０２８６】
次に、上述したマイクロシークエンシング法を利用して、罹患個体と未罹患個体の前より大きな個体群をスクリーニングすることによって、前立腺癌または他の条件などの検出可能な表現型の原因である疑いのある候補多型を確認する。検出可能な表現型との間に統計的に有意な相関を呈する多型が、検出可能な表現型の原因であると思われる。
【０２８７】
前立腺癌または他の条件などの検出可能な表現型に関連した多型の検出には、他の手法を用いることもできる。たとえば、Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 2776-2770 (1989)に記載されているような一本鎖コンホメーション解析を用いて多型を検出する。この方法では、SSCAゲルでの移動性の変化によって多型を検出する。
【０２８８】
あるいは、固定(clamped)変性ゲル電気泳動、ヘテロ二重鎖解析、化学的ミスマッチ切断の他、Sheffield, V.C. et al,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 49:699-706 (1991)、White, M.B. et al., Genomics 12:301-306 (1992)、  Grompe, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:5855-5892 (1989)およびGrompe, M. Nature Genetics 5:111-117 (1993)に記載されているような従来の手法を利用して、多型を同定する。
【０２８９】
検出可能な表現型の原因であるPG1突然変異が認められる個体から得たPG1遺伝子またはこれから誘導したcDNAを以下のようにしてクローニングする。検出可能な表現型に関連するPG1突然変異の認められる個体から核酸試料を採取する。この核酸試料を、配列番号 179のPG1ゲノムDNA由来のプローブまたは配列番号 3のPG1 cDNA由来のプローブと接触させる。従来の手法を用いてミュータントPG1アレルを含む核酸を同定する。たとえば、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAから誘導したプライマーを用いた増幅反応によって、ミュータントPG1遺伝子またはこの遺伝子由来のcDNAを得る。あるいは、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたは配列番号 3のPG1 cDNAから誘導した検出可能なプローブと、ミュータントPG1遺伝子のある個体から得たゲノムライブラリまたはcDNAライブラリとをハイブリダイズさせることで、ミュータントPG1遺伝子またはこの遺伝子由来のcDNAを同定する。あるいは、PG1突然変異の認められる個体から得た発現ライブラリと、後述するようにして調製した配列番号 4または配列番号 5のPG1タンパク質に対する検出可能な抗体とを接触させてミュータントPG1アレルを得る。配列番号 179のPG1ゲノムDNA、配列番号 3のPG1 cDNAおよび配列番号 4および5のPG1タンパク質を従来からある他のさまざまな手法に適用してミュータントPG1遺伝子を得てもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【０２９０】
もう1つの実施形態では、検出可能な表現型を発現する個体からゲノムライブラリまたはcDNAライブラリなどの核酸試料を得ることで、検出可能な表現型を引き起こすミュータントPG1アレルを単離することができる。この核酸試料をヒトゲノムの8p23領域にある１つまたはそれ以上のプローブと接触させる。ヒトゲノムの8p23領域から得たマーカーとハイブリダイズさせる核酸にシークエンシング反応を施すことで、PG1遺伝子を含む試料中の核酸を同定することができる。
【０２９１】
検出可能な表現型の原因である突然変異を含むPG1遺伝子の領域を後述するものなどの診断の技術に用いてもよい。たとえば、検出可能な表現型の原因である突然変異を含むオリゴヌクレオチドを、本願明細書で説明するものなどの増幅またはハイブリダイゼーションベースの診断に使用し、検出可能な表現型が認められる個体を検出したり、あるいは後に検出可能な表現型が発生する危険性のある個体を検出する。また、検出可能な表現型の原因であるPG1アレルを本願明細書において説明するような遺伝子治療に利用する。検出可能な表現型の原因であるPG1アレルを発現ベクターにクローニングし、本願明細書にて説明するミュータントPG1タンパク質を発現させてもよい。
【０２９２】
前立腺癌に関連のあるバイアレリックマーカーを探す過程で、PG1遺伝子内に所在する多数の多型塩基を発見した。これらの多型塩基の同一性および位置を、配列番号 179のPG1ゲノムDNAについて添付の配列表に特徴として列挙する。この多型塩基を上述した診断の技術に利用し、後に癌または前立腺癌が個体に発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異の結果として個体が癌または前立腺癌に罹患したか否かを判断する。マイクロシークエンシング解析などの上述した手法を利用して、核酸試料の多型位置にあるヌクレオチドの同一性を判定する。
【０２９３】
１つまたはそれ以上の多型(または他の多型塩基)が前立腺癌に関連した突然変異だという可能性がある。多型が前立腺癌の原因であるか否かを判断するために、上記のハプロタイプ解析の部分で説明したようにして、前立腺癌に罹患した個体および未罹患の個体における各アレルの頻度を測定する。統計的に有意な頻度で罹患個体群に起こる突然変異は、前立腺癌の原因であると思われる。
【０２９４】
同定されたミュータントPG1遺伝子を含むcDNAを上述したように調製し、後述するようにして発現ベクターにクローニングする。発現ベクターから発現されたタンパク質を使用し、後述するようにしてミュータントPG1タンパク質に特異な抗体を作出する。また、前立腺癌の原因であるPG1突然変異を含むアレル特異的プローブを後述する診断の技術に利用する。
【０２９５】
PG1遺伝子と相同な配列を持つ遺伝子を以下のようにして同定する。
【０２９６】
実施例13
あるいは、PG1遺伝子と相同な配列を持つ遺伝子についてスクリーニングを行うcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリを購入するか、あるいは当業者間で周知の技術を用いて作製する。cDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリを、従来の手法によって、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも10の連続したヌクレオチドを有する検出可能なプローブとハイブリダイズさせる。好ましくは、プローブは、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも12、15または17の連続したヌクレオチドを有する。より好ましくは、プローブは、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも20〜30の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち31以上のヌクレオチドを有する。
【０２９７】
Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に、特定のプローブ配列とハイブリダイズさせるcDNAライブラリでcDNAクローンを同定するための手法が開示されている。これと同じ手法を用いて、PG1遺伝子と相同な配列を有するゲノムDNAを単離する。
【０２９８】
簡単に説明すると、検出可能なプローブとハイブリダイズさせるcDNAまたはゲノムDNAクローンを同定し、以後の操作用に単離する。配列番号: 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも10の連続したヌクレオチドを有するプローブを、ラジオアイソトープまたは蛍光分子などの検出可能な標識で標識する。好ましくは、プローブには、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも12、15または17の連続したヌクレオチドが含まれる。より好ましくは、プローブには、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち少なくとも20〜30の連続したヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、プローブには、配列番号 3のPG1 cDNA、配列番号 179のPG1ゲノムDNAまたはこれらと相補な配列のうち31以上のヌクレオチドが含まれる。
【０２９９】
プローブを標識するための手法は周知であり、ポリヌクレオチドキナーゼでのリン酸化、ニックトランスレーション、in vitro転写および非放射性の手法などがあげられる。ライブラリのcDNAまたはゲノムDNAをニトロセルロースまたはナイロンフィルタに伝達し、変性させる。ブロッキング溶液でフィルタをインキュベートした後、このフィルタを標識プローブに接触させ、プローブとハイブリダイズできる配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとプローブがハイブリダイズされるのに十分な時間をかけてインキュベートする。
【０３００】
検出可能なプローブとハイブリダイズされるcDNAまたはゲノムDNAの同定に用いられるハイブリダイゼーション条件の厳密度を変えることで、プローブに対する相同性のレベルが異なるcDNAまたはゲノムDNAを同定して単離することができる。プローブ配列に対する相同性率の高いcDNAまたはゲノムDNAを同定するために、以下の式を用いてプローブの融解温度を算出する。
【０３０１】
14〜70ヌクレオチド長のプローブについて、式：
Tm＝81.5+16.6:log(Na+))+0.41(画分G+C)-(600/N)
(式中、Nはプローブ長である)
を用いて融解温度TMを算出する。
【０３０２】
ホルムアミドを含有する溶液中でハイブリダイゼーションを行う場合、融解温度の算出は以下の式を用いて行う。
Tm＝81.5+16.6:log(Na+))+0.41(画分 G+C)-(0.63%ホルムアミド)-(600/N)
(式中、Nはプローブ長である)
【０３０３】
6×SSC、5×Denhardt's試薬、0.5%SDS、変性断片化サケ精子DNA 100?gまたは6×SSC、5×Denhardt's試薬、0.5%SDS、変性断片化サケ精子DNA 100?g、50%ホルムアミド中にてプレハイブリダイゼーションを行う。SSCおよびDenhardt's溶液の組成については、上記Sambrook et al.に列挙されている。
【０３０４】
検出可能なプローブを先にあげたプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブに二本鎖DNAが含まれる場合、ハイブリダイゼーション溶液への添加前に変性させる。プローブと相補な配列またはプローブに対する相同体を含むcDNAまたはゲノムDNAとプローブとがハイブリダイズできるだけの十分な時間をかけて、このフィルタをハイブリダイゼーション溶液と接触させる。200ヌクレオチド長を超えるプローブについては、ハイブリダイゼーションをTmよりも15〜25℃低い温度で行う。オリゴヌクレオチドプローブなどこれよりも短いプローブでは、Tmよりも15〜25℃低い温度でハイブリダイゼーションを行う。好ましくは、6×SSCでのハイブリダイゼーションでは、約68℃でハイブリダイゼーションを行う。好ましくは、50%ホルムアミド含有溶液でのハイブリダイゼーションでは、約42℃でハイブリダイゼーションを行う。
【０３０５】
上述したハイブリダイゼーションはいずれも、「厳密な」条件下にあるとみなされる。
【０３０６】
ハイブリダイゼーション後は、2×SSC、0.1%SDS中で室温にて15分かけてフィルタを洗浄する。次に、このフィルタを0.1×SSC、0.5%SDSで室温にて30分〜1時間かけて洗浄する。その後、0.1×SSC、0.5%SDS中でハイブリダイゼーション温度にて溶液を洗浄する。0.1×SSC中で室温にて最終洗浄を行う。
【０３０７】
プローブにハイブリダイズされたPG1遺伝子と相同なcDNAまたはゲノムDNAをオートラジオグラフィまたは他の従来の手法によって同定する。
【０３０８】
上述した手順を一部変更してプローブ配列に対する相同性のレベルがもう少し低いcDNAまたはゲノムDNAを同定する。たとえば、検出可能なプローブとの相同性が低いcDNAまたはゲノムDNAを得るには、厳密さの緩い条件を使用する。たとえば、Na+濃度が約1Mのハイブリダイゼーション緩衝液中では、ハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃に5℃ずつ下げる。ハイブリダイゼーション後は、2×SSC、0.5%SDS中でハイブリダイゼーション温度にてフィルタを洗浄する。これらの条件については、50℃を上回る場合に「中程度」の条件、50℃未満のときに「甘い」条件とみなす。
【０３０９】
あるいは、ホルムアミドを含有する6×SSCなどの緩衝液中で、42℃の温度にてハイブリダイゼーションを行う。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中でのホルムアミド濃度を50%から0%まで5%ずつ減らし、プローブに対する相同性レベルを落としたクローンを同定する。ハイブリダイゼーション後は、6×SSC、0.5%SDS中で50℃にてフィルタを洗浄する。これらの条件については、25%ホルムアミドを上回る場合に「中程度」の条件、25%ホルムアミド未満のときに「甘い」条件とみなす。
【０３１０】
プローブにハイブリダイズさせたcDNAまたはゲノムDNAをオートラジオグラフィで同定する。
【０３１１】
PG1遺伝子のアレル変異体またはPG1タンパク質に関係のあるタンパク質をコードする核酸などPG1遺伝子に相同な核酸を得るのが望ましい場合、ハイブリダイズさせた核酸とPG1遺伝子との間の相同性のレベルを簡単に判定することができる。ハイブリダイズさせた核酸とPG1遺伝子との間の相同性のレベルを判定するには、ハイブリダイズさせた核酸とPG1遺伝子の核酸配列を比較する。たとえば、上記の方法を用いて、PG1遺伝子に対して少なくとも95%の核酸相同性を有する核酸を得て同定する。同様に、連続的に(progressively)厳密さの低いハイブリダイゼーション条件を使用して、PG1遺伝子に対して少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%または少なくとも75%相同な核酸を得て同定することができる。
【０３１２】
クローンがPG1タンパク質と一定レベルの相同性を有するタンパク質をコードするか否かを判定するには、PG1タンパク質のアミノ酸配列を、ハイブリダイズされている核酸にコードされたアミノ酸配列と比較する。PG1タンパク質のアミノ酸配列がハイブリダイズされている核酸のアミノ酸配列と密接に関係している場合に相同性があると判定する。配列が密接に関係しているというのは、この配列がPG1配列と同一であるか、1つ以上のアミノ酸置換基が配列に含まれており、同様の特徴を持つアミノ酸が互いに置換された状態にある場合である。上記の方法を使用して、PG1プローブによってコードされたタンパク質に対して少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%または少なくとも75%相同なタンパク質をコードする核酸を得ることができる。
【０３１３】
哺乳動物の前立腺腫瘍組織および細胞株からのミュータントまたは低頻度PG1アレルの単離および使用
ヒト前立腺癌細胞株から単一のミュータントPG1遺伝子を単離した。このミュータントPG1の核酸配列をSEQ IN NO 69に、アミノ酸配列をSEQ IN NO 70に開示する。このミュータントは、コドン位置番号229に停止コドンを含むため、わずか228のアミノ酸で構成される切断型遺伝子産物を生むことが分かった。本発明には、配列番号 69のうち少なくとも8、10、12、15、20または25の連続したヌクレオチドを含み、好ましくはコドン番号229に突然変異がある、精製または単離された核酸を包含する。本発明の好ましい実施形態には、配列番号 71のうち少なくとも8、10、12、15、20または25の連続したヌクレオチドを含む、精製または単離された核酸を包含する。
【０３１４】
本発明は、後に前立腺癌が個体に発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異の結果として前記個体が前立腺癌に罹患したか否かを判断する方法であって、前記個体から核酸試料を採取し、配列番号 69および71からなる群から選択される配列の１つまたはそれ以上の多型塩基に存在するヌクレオチドが、後に前立腺癌が発生する危険性を示すものであるか否か、あるいはPG1遺伝子における突然変異が原因の前立腺癌を示すものであるか否かを判断することを含む。本発明は、配列番号 70のポリペプチドの少なくとも4、8、10、12、15または20の連続したアミノ酸をコードし、好ましくは前記ポリペプチドのカルボキシ末端を含む、精製または単離された核酸も含む。本発明の単離または精製されたポリペプチドとしては、配列番号 70のポリペプチドの少なくとも4、8、10、12、15または20の連続したアミノ酸を含み、好ましくは前記ポリペプチドのカルボキシ末端を含むポリペプチドがあげられる。
【０３１５】
V.  前立腺癌が発生する危険性のある個体またはPG1遺伝子における突然変異が原因で前立腺癌に罹患した個体の診断
癌、前立腺癌または他の条件などの検出可能な表現型に関連のあるPG1遺伝子またはタンパク質における多型の有無について、後述の実施例13で説明するようにして個体をスクリーニングしてもよい。症状のないうちに個体をスクリーニングし、後に癌や前立腺癌、あるいは他の条件が発生する危険性を判断する。あるいは、癌や前立腺癌、あるいは他の条件に罹患している個体でPG1遺伝子またはタンパク質での多型の有無をスクリーニングし、PG1遺伝子を標的にする治療法を適用すべきか否かを判断する。
【０３１６】
実施例14
症状の認められる個体または症状のない個体から核酸試料を採取する。この核酸試料は、上述したようにして血液細胞から採取するか、あるいは他の組織または器官から採取する。前立腺癌に罹患した個体では、腫瘍から核酸試料を採取する。核酸試料は、DNA、RNAまたはその両方を含む場合がある。核酸試料ごとに突然変異が原因で前立腺癌または他の検出可能な表現型が生じたPG1遺伝子にあるヌクレオチドを判断する。
【０３１７】
一実施形態では、上述したようにして核酸試料についてPCR増幅を行い、前立腺癌または他の検出可能な表現型に関連のある多型が同定された領域を増幅する。増幅産物のシークエンシングを行い、その個体に前立腺癌または他の検出可能な表現型に関連のある１つまたはそれ以上のPG1多型があるか否かを判断する。
【０３１８】
あるいは、上述したようにして核酸試料にマイクロシークエンシング反応を施し、その個体に前立腺癌またはPG1遺伝子の突然変異が原因の別の検出可能な表現型に関連のある１つまたはそれ以上のPG1多型があるか否かを判断する。
【０３１９】
もう1つの実施形態では、前立腺癌またはもう1つの検出可能な表現型に関連のある１つまたはそれ以上のPG1アレルに特異的にハイブリダイズされる１つまたはそれ以上のアレル特異的オリゴヌクレオチドと核酸試料とを接触させる。また、増幅反応時にアレル特異的オリゴヌクレオチドと併用する場合、増幅産物産生能を持つ第2のPG1オリゴヌクレオチドと核酸試料とを接触させる。増幅反応時に増幅反応が存在するということは、その個体が前立腺癌またはもう1つの検出可能な表現型に関連のある１つまたはそれ以上のPG1アレルを有していることを示す。
【０３２０】
PG1発現レベルの判定
上述したように、PG1発現の増大、減少またはPG1発現がなくなることによって、あるいはさまざまな転写種の頻度が変わることで、癌、前立腺癌または他の検出可能な表現型に関連のあるPG1多型が何らかの影響をもたらす場合がある。したがって、癌、前立腺癌または他の検出可能な表現型が認められる個体でのPG1発現レベルを未罹患の個体でのPG1発現レベルと比較し、PG1の過剰発現、発現不足、発現喪失または転写種の相対頻度の変化によって、癌、前立腺癌またはもう1つの検出可能な表現型が生じているか否かを判断する。個体を試験して、前立腺癌に関連のあるレベルのPG1発現が認められるか否かを判断することで、後に癌または前立腺癌が発生する危険性があるか否か、あるいはPG1遺伝子の突然変化が原因で前立腺癌に罹患したか否かを判断する。同様に、個体を試験して、検出可能なもう1つのPG1媒介表現型が認められるか否か、あるいは後にこのような条件に当てはまる危険性があるか否かを判断する。
【０３２１】
PG1遺伝子またはPG1 cDNA由来の検出可能なプローブを用いるノーザンブロットによって、罹患個体と未罹患個体とから採取した核酸試料での発現レベルを判定する。Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 and Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されているものをはじめとする従来のさまざまなノーザン手順を用いてPG1発現およびPG1のさまざまな転写種の頻度を検出し、これを定量化する。
【０３２２】
あるいは、後述の実施例15で説明するようにしてPG1発現レベルを判定する。
【０３２３】
実施例15
国際特許出願公開第WO 97/05277に記載されているような長いプローブを用いて、溶液ハイブリダイゼーションによってPG1の発現レベルおよびパターンを解析する。簡単に説明すると、上述したPG1 cDNAまたはPG1ゲノムDNAまたはその断片を、バクテリオファージ(T3、T7またはSP6)RNAポリメラーゼプロモーターのすぐ下流にクローニング部位に挿入し、アンチセンスRNAを作出する。好ましくは、このPG1インサートは、配列番号 1のゲノムDNA配列または配列番号 3のcDNA配列のうち少なくとも100以上の連続したヌクレオチドを含むものである。プラスミドを直線化し、修飾リボヌクレオチド(すなわち、ビオチン-UTPおよびDIG-UTP)を含むリボヌクレオチドの存在下、転写を行う。過剰な二重標識RNAを興味の対象となる細胞または組織から採取したmRNAと溶液中でハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションは、標準的な厳密さの条件下(80%ホルムアミド、0.4M NaCl緩衝液中、pH7〜8にて40〜50℃で16時間)で行う。ハイブリダイズされなかったプローブを、一本鎖RNA特異なリボヌクレアーゼ(すなわち、RNase CL3、T1、Phy M、U2またはA)で消化して除去する。ビオチン-UTP修飾が存在することで、ストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレート上でハイブリッドを捕捉できる。DIG修飾が存在することで、アルカリホスファターゼに結合した抗DIG抗体を使用するELISAによってハイブリッドを検出して定量化できる。
【０３２４】
セクションIIおよびXで説明するようなアレイを用いてPG1遺伝子発現の定量解析を行ってもよい。本願明細書において、アレイという用語は、これとハイブリダイズできるPG1 mRNAの発現を特異的に検出できるだけの十分な長さの複数の核酸で構成される集合体を意味する。たとえば、このアレイは、発現レベルを評価したい遺伝子由来の複数の核酸を含むものであってもよい。アレイは、配列番号 179のPG1ゲノムDNA、配列番号 3のPG1 cDNAまたはこれらと相補な配列またはその断片を含んでもよい。配列番号 3および112〜124の既知のPG1選択的スプライスまたは転写種のうち一部またはすべてをアレイに含ませ、特定の転写種の相対頻度を判断するようにしてもよい。あるいは、たとえば配列番号 137〜178を含むすべての潜在的スプライス結合部とオーバーラップするポリヌクレオチドをアレイに含んでもよい。特定のスプライス結合部の頻度を判断し、形質と相関させたり、ちょうど発現レベルにあることを診断するのに用いたりしてもよい。好ましくは、この断片は少なくとも15ヌクレオチド長である。他の実施形態では、この断片は少なくとも25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも50ヌクレオチド長である。より好ましくは、断片は少なくとも100ヌクレオチド長である。もう1つの好ましい実施形態では、断片は100ヌクレオチド長よりも長いものである。いくつかの実施形態では、断片は500ヌクレオチド長よりも長いものである。
【０３２５】
たとえば、Schena et al. (Science 270:467-470, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10614-10619, 1996)によって説明されているように、cDNAマイクロアレイを用いてPG1遺伝子発現の定量解析を行う。完全長PG1 cDNAまたはその断片をPCR増幅し、高速の装置を用いてシリル化顕微鏡スライドガラス上で96穴マイクロタイタープレートからアレイ化する。プリントされたアレイを湿ったチャンバ内でインキュベートし、アレイの要素を再水和させ、0.2%SDSで1分間を1回と、水で1分間を2回、水素化ホウ素ナトリウム溶液中で5分間を1回のサイクルで洗浄する。このアレイを95℃で2分間、水中に沈め、0.2%SDSに移して1分おき、2回水洗し、空気乾燥させて25℃で暗所に保管する。
【０３２６】
細胞または組織のmRNAを単離するか、あるいは市販されているものを入手し、逆転写のサイクルを1回行ってプローブを調製する。このプローブを14×14mmのカバーガラス下で60℃にて6〜12時間で1cm2のマイクロアレイとハイブリダイズさせる。このアレイを厳密度の低い洗浄用緩衝液(1×SSC/0.2%SDS)中にて25℃で5分間洗浄した後、厳密度の高い洗浄用緩衝液(0.1×SSC/0.2%SDS)中にて室温で10分間洗浄する。独自に用意したフィルタセットを用いた蛍光レーザー走査装置によって、0.1×SSC中でアレイをスキャンする。独立した2つのハイブリダイゼーションの比の平均を取ることによって、正確な分化発現(differential expression)測定値を得る。
【０３２７】
Pietu et al. (Genome Research 6:492-503, 1996)によって説明されているように、cDNA配列の完全長PG1 cDNAまたはその断片を用いてPG1遺伝子発現の定量解析を行ってもよい。完全長PG1 cDNAまたはその断片をPCR増幅し、膜に接種する。次に、さまざまな組織または細胞由来のmRNAを放射性ヌクレオチドで標識する。ハイブリダイゼーションと制御した条件下での洗浄後、ホスホイメージングまたはオートラジオグラフィによって、ハイブリダイズされたmRNAを検出する。実験を2回重複して行った後、分化的に発現されたmRNAの定量解析を行う。
【０３２８】
あるいは、Lockhart et al.(Nature Biotechnology 14: 1675-1680, 1996)およびSosnowsky et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1119-1123, 1997)によって説明されているように、高密度ヌクレオチド配列を利用してPG1ゲノムDNA、PG1 cDNAまたはその断片を用いた発現解析を行うこともできる。配列番号 179のPG1ゲノムDNA、配列番号 3のPG1 cDNA、112〜124の配列またはこれらと相補な配列のうち15〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチップ上で直接合成する(上記Lockhart et al.)か、あるいは合成後にチップにアドレス指定する(上記Sosnowski et al.)。
【０３２９】
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料などの適当な化合物で標識したPG1 cDNAプローブを適当なmRNA集団から合成した後、平均サイズ50〜100ヌクレオチドにランダムに断片化する。次いで、前記プローブをチップとハイブリダイズさせる。上記Lockhart et al.によって説明されているように洗浄し、異なる電界を印加(Sosnowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1119-1123)した後、染料または標識化合物を検出して定量化する。ハイブリダイゼーションを2回重複して行う。異なるcDNA試料で同一の標的オリゴヌクレオチドについてcDNAプローブからのシグナル強度を比較解析することで、PG1 mRNAが分化的に発現していることが分かる。
【０３３０】
上記の方法を用いて、個体が癌や前立腺癌、他の疾病に関連のあるPG1発現パターンを呈しているか否かを判断してもよい。このような方法では、個体から採取した核酸試料のPG1発現を上述したようにしてアッセイする。癌、前立腺癌または別の疾病に関連のあるPG1発現パターンが認められる場合、適当な診断を行ってPG1遺伝子またはタンパク質を標的とする適切な治療法を施す。
【０３３１】
アレル特異的プローブを使用して上記の方法を応用し、癌、前立腺癌または別の疾病に関連のあるPG1アレルが個体にあるか否かを判断してもよい。このような方法では、前立腺癌に関連のあるPG1遺伝子に多型ヌクレオチドを含む１つまたはそれ以上のアレル特異的オリゴヌクレオチドをマイクロアレイに固定する。このアレイを、試料核酸のアレル特異的PG1プローブへのアレル特異的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、被検個体から採取した核酸試料と接触させる。試料核酸の１つまたはそれ以上のアレル特異的PG1プローブへのハイブリダイゼーションによって、PG1遺伝子が原因の前立腺癌に個体が罹患していることや、個体で後に前立腺癌が発生する危険性があることが分かる。あるいは、セクションXで述べる遺伝子型判定方法のうちいずれかを利用する。
【０３３２】
本発明によるバイアレリックマーカーの診断での使用
本発明のバイアレリックマーカーを利用して、特異的な遺伝子型の結果として検出可能な形質を発現する個体または遺伝子型がゆえに後に検出可能な形質が発生する危険性のある個体を特定できる診断試験を開発することができる。
【０３３３】
本発明による診断手法では、被検者が検出可能な形質が発生する危険度増大に関連のあるバイアレリックマーカーパターンを有するか否か、あるいは特定の突然変異の結果として個体に検出可能な形質が認められるか否かを、ファミリ研究、単精子DNA解析または体細胞ハイブリッドなど、ハプロタイピングについての個体染色体の解析が可能な方法をはじめとして、さまざまな方法を利用して判断することができる。本診断法を用いて解析する形質は、検出可能な形質、癌、前立腺癌または別の疾病、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する応答、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用のうちいずれであってもよい。薬剤に対する応答または薬剤に対する副作用を解析して予測する診断法を利用して、個体を特定の薬剤で治療すべきか否かを判断する。たとえば、個体が特定の薬剤での治療にポジティブな応答を示す尤度が診断から明らかになれば、その個体にかかる薬剤を投与する。逆に、個体が特定の薬剤での治療にネガティブな応答を示す可能性が診断から明らかになれば、別の治療計画を検討する。ネガティブな応答は、有効な応答が認められないか、あるいは中毒性の副作用が見られる状況として定義される。
【０３３４】
本発明のマーカーには、臨床薬治験という別の用途もある。抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する応答あるいは抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する副作用を示す１つまたはそれ以上のマーカーを、以下のセクションXIにおいて述べる方法を用いて同定する。次に、かかる薬剤を用いた治験の被検者になりそうな個体をスクリーニングし、薬剤に対して良好な応答を見せる可能性が最も高い個体を特定し、同時に副作用が認められそうな個体を排除する。このようにして、ポジティブな応答が見られそうにない個体が試験に含まれることで測定精度が落ちることなく、安全面で望ましくない問題を生じることもなく、薬剤に対してポジティブな応答をする個体でかかる薬剤による治療の有効性を測定する。好ましくは、このような診断法では、個体から核酸試料を採取し、セクションXで説明する方法で採取した試料の遺伝子型を判定する。
【０３３５】
本発明のもう1つの態様は、個体に形質が発生する危険性があるか否か、あるいは特定の形質誘導アレルが存在する結果、その形質が個体に発現されるか否かを判断する方法に関する。本発明は、個体に複数の形質が発生する危険性があるか否か、あるいは特定の形質誘導アレルが存在する結果、複数の形質が個体に発現されるか否かを判断する方法に関する。これらの方法には、個体から核酸試料を採取し、この核酸試料に、形質が発生する危険性を示すか、あるいは特定の形質誘導アレルが存在する結果、その形質が個体に発現されることを示す、１つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーの１つまたはそれ以上のアレルが含まれているか否かを判断することを含む。
【０３３６】
本願明細書において説明するように、この診断法は1つのバイアレリックマーカーまたは複数のバイアレリックマーカーで構成されるグループをベースにしたものである。
【０３３７】
VI.  受容体/リガンド相互作用への関与についてのPG1タンパク質のアッセイ
以下の実施例16において説明するように、発現されたPG1タンパク質またはその一部が受容体/リガンド相互作用にどのように関与しているのかについて評価する。
【０３３８】
実施例16
PG1遺伝子によってコードされたタンパク質またはその一部が受容体/リガンド相互作用にどのように関与しているのかについて評価することができる。このような関与を調べるアッセイ方法は多く存在し、当業者間で周知のものである。その一例として、以下の参考文献に開示されているアッセイがあげられる。Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan et al. Eds. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscienceの第7.28章 (Measurement of Cellular Adhesion under Static Conditions 7.28.1-7.28.22)、Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987、Bierer et al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988、Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169:149-160, 1989、Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994、Stitt et al., Cell 80:661-670, 1995、Gyuris et al., Cell 75:791-803, 1993。
【０３３９】
たとえば、本発明のタンパク質は、受容体、受容体リガンド、あるいは受容体/リガンド相互作用のインヒビターまたはアゴニストとしての活性を示すことがある。このような受容体およびリガンドの例としては、サイトカイン受容体およびそのリガンド、受容体キナーゼおよびそのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそのリガンド、細胞間相互作用に関与している受容体およびそのリガンド(細胞接着分子(セレクチン(sclectin)、インテグリンおよびこれらのリガンド)、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の抗原提示、抗原認識および発生に関与している受容体/リガンド対を含むがこれに限定されるものではない)があげられるが、これに限定されるものではない。受容体およびリガンドはまた、関連する受容体/リガンド相互作用の小分子インヒビターまたは潜在的ペプチドのスクリーニング用としても有用である。本発明のタンパク質(受容体およびリガンドの断片を含むがこれに限定されるものではない)は、それ自体が受容体/リガンド相互作用のインヒビターとして有用なものである。
【０３４０】
上述したPG1タンパク質またはその一部を薬剤スクリーニング法に利用し、PG1活性のアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターである分子を同定する。このような解析で用いるPG1タンパク質またはその一部は溶液中で浮遊するかまたは固相に結合される。あるいは、PG1タンパク質またはその一部を細胞表面に発現させることもできる。この細胞は、PG1タンパク質またはその一部を自然に発現する場合もあれば、後述するものなどの発現ベクターからPG1タンパク質またはその一部を発現する場合もある。
【０３４１】
薬剤スクリーニングの一方法では、PG1タンパク質またはその一部が発現されるように組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を従来の競合的結合試験または標準的な直接結合試験に用いる。たとえば、PG1タンパク質またはその一部と被検薬剤との間で生じる錯体の形成を直接結合実験で測定する。あるいは、試験薬がPG1タンパク質またはその一部と周知のリガンドとの間での錯体形成を妨げる機能を測定する。
【０３４２】
あるいは、PCT国際出願公開第WO 84/03564号に開示されているような高スループットスクリーニング法を利用する。この手法では、PG1結合活性を試験する小さなペプチドを表面で多数合成し、そこに固定する。被検ペプチドをPG1タンパク質またはその一部と接触させた後、洗浄ステップを実施する。被検化合物と結合したPG1タンパク質またはその一部の量を従来の手法で定量化する。
【０３４３】
PG1タンパク質またはその一部を表面に固定し、被検化合物と接触させる方法もある。水洗ステップの後、PG1タンパク質またはその一部に結合した被検化合物の量を測定する。
【０３４４】
もう1つの方法では、PG1タンパク質またはその一部の三次元構造を判断し、合理的な薬剤設計に利用することができる。
【０３４５】
あるいは、本願明細書に記載のものなどの発現ベクターを用いてPG1タンパク質またはその一部を宿主細胞で発現させる。PG1タンパク質またはその一部は、前立腺癌に関連するアイソタイプであるか、前立腺癌とは関係のないアイソタイプである。PG1タンパク質またはその一部を発現している細胞を一組の被検薬剤と接触させ、これらの被検作用薬がPG1活性におよぼす影響を測定する。PG1活性を変化させる被検薬剤を治療処置に利用する。
【０３４６】
上記の手順を検出可能な表現型の原因であるミュータントPG1タンパク質の評価に応用することもできる。
【０３４７】
PG1タンパク質と相互作用するタンパク質の同定
PG1タンパク質と相互作用するタンパク質を以下の実施例17にて説明するようにして同定する。
【０３４８】
実施例17
Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログNo. K1604-1、クロンテック社)などのTwo-Hybrid系を使用して、PG1タンパク質またはその一部と相互作用するタンパク質を同定する。Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログNo. K1604-1、クロンテック社)に添付のマニュアルに説明されているように、PG1タンパク質またはその一部をコードする核酸を、酵母の転写活性因子GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAと同一フレーム内にくるように発現ベクターに挿入する。PG1タンパク質またはその一部をコードする核酸によってコードされたポリペプチドと相互作用する可能性のあるタンパク質をコードするcDNAライブラリのcDNAを、GAL4の活性化ドメインをコードするDNAと同一フレームにくるように第2の発現ベクターに挿入する。2つの発現プラスミドを酵母へ形質転換し、各発現ベクターでの選択可能なマーカーの発現と、HIS3遺伝子のGAL4依存性発現のみを選択的に行う選択培地プレートに上記の酵母を蒔く。ヒスチジンを含まない培地で成長できるトランスフェクタントをGAL4依存性lacZ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選択とlacZアッセイのいずれにおいても陽性である細胞は、核酸インサートによってコードされるポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするプラスミドを含有している。
【０３４９】
あるいは、Lustig et al., Methods in Enzymology 283: 83-99 (1997)に記載されているシステムを用いて、PG1タンパク質またはその一部と相互作用する分子を同定する。このようなシステムでは、in vitro転写をドライブするプロモーターよりも下流でクローニングされたPG1タンパク質またはその一部をコードしたインサートを含むベクターに対してin vitro転写反応を行う。このようにして得られるmRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に導入する。次いでこの卵母細胞を所望の活性についてアッセイする。
【０３５０】
あるいは、上述したようにして生成されるin vitro転写産物をin vitroにて翻訳する。in vitro翻訳産物を所望の活性についてアッセイしたり、あるいは既知のポリペプチドとの相互作用についてアッセイすることができる。
【０３５１】
米国特許第5,654,150号に記載の系を使用して、PG1タンパク質またはその一部と相互作用する分子を同定してもよい。この系では、cDNAのプールをin vitroにて転写および翻訳し、反応産物を既知のポリペプチドまたは抗体に対する相互作用についてアッセイする。
【０３５２】
さらに他のさまざまな手法でPG1タンパク質またはその一部と相互作用しているタンパク質または他の分子を見出すことができる。一方法において、PG1タンパク質またはその一部を含むアフィニティーカラムを作製することができる。この方法の中には、アフィニティーカラムにキメラタンパク質を含み、PG1タンパク質またはその一部がグルタチオンSトランスフェラーゼと融合しているものがある。細胞タンパク質または上述したような発現タンパク質のプールの混合物をアフィニティーカラムに適用する。Ramunsen et al. Electrophoresis, 18, 588-598 (1997)に記載されているようにして、カラムに付着したポリペプチドと相互作用するタンパク質を単離し、2D泳動ゲルで解析することができる。あるいは、アフィニティーカラムに残ったタンパク質を泳動主体の方法によって精製し、配列決定する。これと同一の方法を用いて、抗体を単離し、ファージディスプレイ産物をスクリーニングし、あるいはファージディスプレイ法によるヒト抗体をスクリーニングすることができる。
【０３５３】
PG1タンパク質またはその一部と相互作用するタンパク質を、Edwards et Leatherbarrow, Analytical Biochemistry, 246, 1-6 (1997)に記載されているようなオプティカルバイオセンサを用いてスクリーニングすることもできる。この方法の主な利点は、タンパク質と他の相互作用分子との関連性の比率を判定できる点にある。したがって、関連性の比率が高い相互作用分子または関連性の割合が低い相互作用分子を特異的に選択することが可能である。一般には、標的分子を(カルボキシメチル(carboxymethl)デキストランマトリックスによって)センサー表面に結合させ、被検分子の試料を標的分子と接触した状態で配置する。標的分子に対して被検分子が結合することで、屈折率および/または厚さが変化する。この変化をバイオセンサーで検出する。ただし、上記の方法は、変化がエバネッセント場(センサー表面から数百ナノメータの範囲)で起こる場合にのみ利用できる。これらのスクリーニングアッセイでは、標的分子はPG1タンパク質またはその一部であることができ、被検試料は組織または細胞から抽出したタンパク質の集合、発現されたタンパク質のプール、コンビナトリアルペプチドおよび/またはキメラライブラリまたはファージディスプレイ法によって選択されたペプチドであることができる。被検タンパク質の抽出もとである組織または細胞はどのような種に由来するものであってもよい。
【０３５４】
他の方法では、標的タンパク質が固定化されたものであり、被検個体群はPG1タンパク質またはその一部である。
【０３５５】
PG1タンパク質またはその一部と薬剤との相互作用を検討するために、マイクロダイアリシスをWang et al., Chromatographia, 44, 205-208(1997)に記載されたHPLC法またはBusch et al., J. Chromatogr. 777:311-328 (1997)に記載されたアフィニティーキャピラリー電気泳動法とを組み合わせた。
【０３５６】
上述した手順を応用して検出可能な表現型の原因であるミュータントPG1タンパク質を評価してもよい。
【０３５７】
VII. PG1ポリペプチドに対する抗体の産生
ヒト、マウスまたは哺乳動物のいずれかのPG1ポリペプチドまたは全タンパク質(配列番号 4、5、70、74、125〜136)を用いて、後述の実施例16で説明するようにして、PG1タンパク質またはその断片に対する特異的結合能を持つ抗体を作出する。この抗体は、完全長PG1タンパク質と結合することができる。PG1の天然由来ミュータント、特に配列番号 70を含む機能的ミュータントから得られたPG1タンパク質を用いて抗体を産生することができる。また、本発明には、PG1タンパク質の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、50または100アミノ酸の連続したストレッチを含むポリペプチドを抗体の製造に利用することも包含される。好ましい実施形態では、アミノ酸の連続したストレッチが、PG1タンパク質配列のアミノ酸の欠失、付加、交換、切断を含む突然変異部位または機能的突然変異を含む。たとえば、前記転属した範囲の配列番号 4で、ArgおよびHis残基のいずれかをアミノ酸位置184に含有するポリペプチドと、ArgまたはIle残基のいずれかをアミノ酸位置293に含有するポリペプチドが、本発明の特に好ましい実施形態であり、これらの突然変異の有無を検出する抗体の製造に有用なものである。同様に、位置228にカルボキシ末端を有するポリペプチドが本発明の特に好ましい実施形態であり、配列番号 69および70で示される突然変異の有無を検出する抗体の製造に有用である。同様に、前記連続したストレッチで天然由来のスプライス結合部(2つのヒトPG1エキソン(配列番号 100〜111)が共有結合している点)におよんでコードされる、8、10、12、15または25アミノ酸のペプチド配列を含有するポリペプチドが特に好ましい実施形態であり、PG1選択的スプライス種のさまざまなタンパク質産物の存在、局在位置および量を検出するための抗体の製造に有用なものである。
【０３５８】
あるいは、ヒト、マウスまたは哺乳動物のPG1タンパク質、好ましくは配列番号 4、5、70、74、または125〜136から選択される配列の、少なくとも8、10、12、15、20、25または30アミノ酸のエピトープ含有断片に対する結合能を持つ抗体を単離できるように、抗体をスクリーニングする。
【０３５９】
PG1タンパク質の特定のアイソフォームに特異的に結合する抗体を作出することもできる。たとえば、この抗体は、上述したようにして採取し、上述したようにして発現ベクターから発現された、前立腺癌または別の検出可能な表現型を引き起こすPG1タンパク質のアイソフォームに対する特異的結合能を持つものである。あるいは、この抗体は、前立腺癌の原因ではないPG1タンパク質のアイソフォームに結合できるものである。ウエスタンブロッティングまたはELISAアッセイなどの手法を用いて、個体から得たタンパク質試料を癌または他の検出可能な表現型を引き起こすPG1タンパク質のアイソフォームの有無について評価する診断アッセイに、このような抗体を利用する。
【０３６０】
抗体の調製には、抗体が結合すると望ましいPG1とは異なる種のPG1を発現する、野生型またはトランスジェニック動物での非ヒト動物または哺乳動物と、PG1を発現しない動物(すなわち、セクションVIIIで説明するPG1ノックアウトアニマル)が特に有用である。PG1ノックアウトアニマルは、PG1曝露領域の大半または全体を外来抗原として認識し、PG1エピトープのアレイが拡がった抗体を産生する。PG1の抗原配列と類似の種を産生する動物の体液性免疫系は、動物の天然PG1種と抗原配列との違いを優先的に認識し、抗原配列における独特な部位に対する抗体を産生する。
【０３６１】
実施例18
実施例11で説明したようにして、PG1タンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェクトした細胞または形質転換細胞から、実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを単離する。たとえばAmiconフィルタ装置での濃度などによって、最終調製物のタンパク質濃度を数μg/mlのレベルに調節する。この状態で、タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を以下のようにして調製する。
【０３６２】
A.  ハイブリドーマ融解によるモノクローナル抗体産生
Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495 (1975)の古典的な方法またはこれから派生した方法によって、PG1タンパク質またはその一部のエピトープに対するモノクローナル抗体をマウスハイブリドーマから調製することができる。Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 53-242も参照のこと。
【０３６３】
簡単に説明すると、数週間の期間にわたって、数マイクログラムのPG1タンパク質またはその一部をマウスに繰り返し接種する。このマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールによって脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)で系を成長させて過剰な未融合細胞を破壊する。融合が成功した細胞を稀釈し、稀釈アリコートをマイクロタイタープレートのウェルに接種して培養成長を継続する。ウェルの上澄み液中の抗体を、Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980)が初めて明らかにしたようなELISAなどのイムノアッセイまたはこれから派生した方法によって検出し、抗体産生クローンを同定する。選択された陽性クローンを培養し、そのモノクローナル抗体産物を収集して使用できるようにする。モノクローナル抗体を得るための詳細な手順については、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記載されている。
【０３６４】
B.  免疫化によるポリクローナル抗体産生
適当な非ヒト動物をPG1タンパク質またはその一部で免疫化することによって、PG1タンパク質またはその一部の異種起源のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を調製することができる。これは、免疫原性を高めるように修飾してもよいし修飾せずにおくことも可能である。適当な非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳動物が選択され、通常、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマである。あるいは、PG1濃度を高めた未精製調製物を用いて抗体を作出することもできる。このようなタンパク質、断片または調製物を、従来技術において周知の適当なアジュバント(たとえば、水酸化アルミニウム、RIBIなど)の存在下で非ヒト哺乳動物に導入する。また、タンパク質、断片または調製物を抗原性を高める薬剤で前処理してもよい。このような薬剤は従来技術において周知であり、一例としては、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、B型肝炎表面抗原およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などがあげられる。周知の手順に従って免疫化動物から得られる血清を収集し、これを処理して試験する。血清に望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体が含まれている場合、免疫親和性クロマトグラフィによってポリクローナル抗体を精製してもよい。
【０３６５】
抗原と宿主種の両方に関係のある多くの要因が効果的なポリクローナル抗体産生に影響する。また、接種部位および用量に対する宿主動物の応答性には差があり、抗原量が不適切な場合と過剰な場合はいずれも低力価抗血清が作出される。少量(ngレベル)の抗原を複数の皮内部位に投与すると最も信頼性の高い結果が得られるように思われる。ポリクローナル抗血清を作出して処理するための手法は従来技術において周知である。たとえば、Mayer and Walker (1987)などを参照のこと。Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971)にはウサギでの効果的な免疫化プロトコルが記載されている。
【０３６６】
一定間隔で追加免疫注射を行い、たとえば濃度が分かっている抗原に対する寒天での二重免疫拡散によって半定量的に測定した抗体力価が低下しはじめたところで、抗血清を収集することができる。たとえば、Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)などを参照のこと。この抗体のプラトー濃度は通常、血清(約12?M)の0.1〜0.2 mg/mlの範囲にある。Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)に記載されているようにして競合的結合曲線を作成し、抗血清の抗原に対する親和性を判定する。
【０３６７】
モノクローナル抗体法またはポリクローナル抗体法のいずれかに沿って調製した抗体調製物は、生物学的試料中の抗原産生物質の濃度を判断する定量的なイムノアッセイにおいて有用なものである。また、これらの調製物は、生物学的試料中の抗原の存在を半定量的あるいは定性的に同定するのにも用いられる。さらに、タンパク質を発現する細胞を殺す目的あるいは体内のタンパク質濃度を落とす目的で治療用組成物に抗体を使用してもよい。
【０３６８】
VIII.  ベクターおよび細胞、動物およびヒトにおけるポリヌクレオチドの使用
本発明の核酸は、発現ベクター、増幅ベクター、PCRに適したポリヌクレオチドプライマー、本発明のポリヌクレオチドを胚性幹細胞に導入し、非ヒトトランスジェニック動物を作出するのに適したベクターを含む。また、PG1遺伝子の機能的突然変異に関連する重症度を緩和または遺伝病を防止するための遺伝子治療の目的で、本発明のポリヌクレオチドを細胞、器官および個体(ヒト個体を含む)に導入するのに適したベクターも本発明に包含される。遺伝子治療、遺伝子組換えベクターおよび本発明の方法のターゲットとして適したものであるPG1遺伝子での機能的突然変異は、PG1遺伝子産物のアミノ酸配列に影響するPG1遺伝子のコーディング領域における突然変異、PG1の発現レベルに影響するプロモーターまたは他の調節領域における突然変異、PG1遺伝子産物の長さまたはPG1選択的スプライシング種の相対頻度に影響するPG1スプライス部位における突然変異、PG1発現レベルまたは発現量あるいは活性に何らかの形で影響する他のあらゆる突然変異を含むがこれに限定されるものではない。ターゲッティングベクターと、胚性幹細胞または体細胞でミュータントPG1遺伝子を野生型PG1遺伝子に変化させる方法とによって、遺伝子治療法を得ることができる。あるいは、本発明には、細胞、器官または個体にすでに所在するミュータントPG1を一切破壊することなく、野生型PG1配列を発現させる方法およびベクターも包含される。
【０３６９】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドと複製開始点とを増幅ベクターについても具体的に例示するものである。好ましくは、このような増幅ベクターは、ポリヌクレオチドを増幅ベクターの残りの部分から切断して精製しやすくするようにこれをフランキングする制限エンドヌクレアーゼ部位と、増幅ベクターの増幅を容易にするための選択可能なマーカーとをさらに含む。最も好ましくは、増幅ベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位が、これらの部位での切断によって同様のサイズの増幅ベクター断片が他に生じないような位置にある。
【０３７０】
このような増幅ベクターを前記増幅ベクターの複製開始点と適合する宿主細胞にトランスフェクトする。この場合、宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であり、好ましくは哺乳動物、昆虫、酵母またはバクテリアの細胞であり、最も好ましくは大腸菌細胞である。トランスフェクトションによって得られる宿主細胞を、好ましくは選択可能なマーカー(抗体など)と適合する条件を選択して、従来技術において周知の培養方法によって成長させる。従来技術において周知の方法(標準的なプラスミド調製など)によって増幅ベクターを単離し、精製することができる。ポリヌクレオチドとゲル電気泳動をはじめとする従来技術において周知の手法で精製される二本鎖ポリヌクレオチド断片とをフランキングする制限エンドヌクレアーゼ部位で特異的に切断する制限酵素によって、本発明のポリヌクレオチドを切断してもよい。
【０３７１】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含む線状ポリヌクレオチドをPCR増幅する。PCR法は従来技術において周知であり、たとえば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号ならびにSaiki, R et al. 1988. Science 239:487-491、さらには欧州特許出願第86302298.4号、同第86302299.2号および同第87300203.4号、ならびにMethods in Enzymology 1987 155:335-350に記載されている。
【０３７２】
トランスフェクションおよび/または遺伝子治療を容易にするのに適した方法をはじめとするさまざまな方法で、本発明のポリヌクレオチドを誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドの誘導体化は、核局在化シグナルを付加して核への標的デリバリーを改善することで達成できる。十分に特性化された核局在化シグナルにヘプタペプチドPKKKRKV(pro-lys-lys-lys-arg-lys-val)がある。好ましくは、閉環状ポリヌクレオチドの場合は、核局在化シグナルの付加は枝分れ構造を形成する修飾ループヌクレオチドまたはスペーサを経由して行う。
【０３７３】
in vivoにて使用する予定である場合は、本発明のポリヌクレオチドを誘導体化してリガンドおよび/または特定の細胞型を標的にして血液経由でポリヌクレオチドを分散させるデリバリービヒクルを含ませるようにするか、あるいは細胞関門を容易に通過できるようにする。このように、本発明のポリヌクレオチドを、従来技術において周知の任意の標的物質またはデリバリー物質と結合または組み合わせる。これらの物質としては、細胞貫通エンハンサー、リポフェクチン、リポソーム、デンドリマー、DNAインターカレーターおよびナノ粒子があげられるがこれに限定されるものではない。特に、本発明のポリヌクレオチドのデリバリー用として用いるナノ粒子は、SynGenixのナノ粒子粒子テクノロジー(nanoparticle particle technology)にあるように、直径が約50ナノメートル未満で無毒、非抗原的であって、アルブミンおよび界面活性剤または鉄で構成される粒子である。概して、本発明のポリヌクレオチドを標的するのに用いられるデリバリービヒクルは、細胞特異的なターゲッティング物質または従来技術において周知の一般的なターゲッティング物質をさらに含むものであってもよく、標的細胞または器官に対する特異的トラップ効率が約5〜約35%となる。
【０３７４】
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療法にてex vivoで使用し、選択的に突然変異が起こった野生型PG1またはPG1タンパク質を産生する細胞または器官を得る。この細胞の作出には、電気穿孔およびリポフェクションを含む核酸を取り込むための標準的な条件下で、１つまたはそれ以上の上述したポリヌクレオチドと一緒に標的細胞をインキュベートする。ex vivoで細胞または器官を処理する方法を実施するにあたり、標的細胞または器官を処理するための溶液調製物中での本発明のポリヌクレオチドの濃度は約0.1〜約100μMであり、好ましくは0.5〜50μM、最も好ましくは1〜10μMである。
【０３７５】
あるいは、核への目的とするデリバリー用にオリゴヌクレオチドを修飾または同時投与することもできる。(1)DNAeおよびRNaseの濃度が低く、(2)オリゴヌクレオチド濃度が高いため、核ではオリゴヌクレオチドの安定性が高まるものと思われる。
【０３７６】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドを従来技術において周知の方法によってビオチンに共有結合し、ビオチン-ポリヌクレオチドプロドラッグを形成することができる。また、アビジンに結合した受容体リガンドまたはアビジンに結合した受容体特異抗体と同時投与することもできる。この場合、受容体は同時投与によって作出されるポリヌクレオチド-ビオチン-アビジン錯体を細胞に取り込ませることのできるものである。取り込みを引き起こす受容体は当業者間で周知である。
【０３７７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを胚性幹細胞に導入し、非ヒトトランスジェニック動物を作出し、次いでトランスジェニック動物での組換えPG1を発現させるのに適したベクターを包含する。酵母人工染色体(YAC)やバクテリア人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1の他、インサートに順応してPG1タンパク質またはその所望の断片をコードできる大きさで従来技術において周知の他のベクターなど、適当な任意のベクター系を利用してPG1のトランスジェニック動物への導入および発現させることができる。部位特異的突然変異誘発によって、PG1遺伝子で任意に選択的な変化、付加および欠失を達成してもよい。適当なベクター系を選択した後、従来技術において周知の手法によって部位特異的突然変異誘発を行い、断片を切断した元の大きなベクターにこの断片を返して連結してもよい。部位特異的突然変異誘発法については、Kunkel, T. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488、Bandeyar, M. et al. 1988. Gene 65: 129-133、Nelson, M., and M. McClelland 1992. Methods Enzymol. 216:279-303、Weiner, M. 1994. Gene 151: 119-123、Costa, G. and M. Weiner. 1994. Nucleic Acids Res. 22: 2423; Hu, G. 1993. DNA and Cell Biology 12:763-770およびDeng, W. and J. Nickoff. 1992. Anal. Biochem. 200:81などを参照のこと。
【０３７８】
簡単に説明すると、本願明細書において使用するトランスジェニックテクノロジーは、PG1遺伝子の一部または遺伝子全体の失活、付加または交換を行うものである。たとえば、先の2段落と実施例にて説明したように、現在のテクノロジーには、非ヒト動物の天然PG1遺伝子を失活させ、あるいは失活させずに、PG1遺伝子を付加することが含まれる。本発明には、ベクターを使用することが包含され、さらにはこのベクターが遺伝子組換えテクノロジーによって先に生殖細胞系に導入された場である非ヒト動物細胞に含まれていようと、あるいはヒトの多能性細胞または体細胞の天然PG1遺伝子であろうと、幹細胞で既存のヒトPG1遺伝子を標的にしてこれを修飾するベクター自体も包含される。この遺伝子組換えテクノロジーは一般に、生殖細胞組織に分化可能な多能性細胞での相同的組換えを利用している。たとえば発現を終了させるための停止コドンを含む非ヒト動物のPG1遺伝子の変化した領域をコードするDNAコンストラクトを、胚性幹細胞の核に導入する。好ましくは、この遺伝子組換え作業にはマウスを利用する。細胞の一部において、導入されたDNAが変化したコピーと置き換えられ、細胞遺伝子の内在するコピーとの間で組換えが生じる。新しく操作された遺伝変化部分を含む細胞を幹細胞と同一種の宿主胎芽に注射し、胎芽をレシピエントであるメスに再移植する。これらの胎芽の中には、ミュータント細胞株由来の生殖細胞を有するキメラ個体に発達するものがある。したがって、キメラ子孫を育種することで、導入した遺伝変化部分を含む新しい菌株が得られる可能性がある。この手順については、Capecchi 1989. Science. 244:1288-1292を参照のこと。
【０３７９】
本発明は、本願明細書で説明するポリヌクレオチドと、ヒトPG1遺伝子で突然変異を作り出す方法を含む、これらのポリヌクレオチドの作出方法を包含する。また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を包含する。これには、本発明の増幅ベクターを有する増幅宿主細胞があげられるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明は、本願明細書に記載の胚性幹細胞と、ヒトPG1タンパク質をコードする遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物および哺乳動物と、を含む。
【０３８０】
組換え宿主細胞およびトランスジェニック動物で一過性遺伝子発現と空間的な遺伝子発現を指揮できるDNAコンストラクト
PG1タンパク質の合成がなされなくなることで、生理学的および表現型の面でどのような結果が生じるのかを研究するために、細胞レベルと多細胞生物レベルの両方で、特に癌などの異常な細胞増殖に関係のある障害に関して、本発明は、PG1ゲノム配列またはcDNの特異的アレル、さらには配列番号 3、112-125、179、182-184のPG1ヌクレオチド配列またはその断片に関して１つまたはそれ以上の塩基が置換、欠失、あるいは付加されたゲノム配列またはcDNAのコピーをコンディショナル発現できるDNAコンストラクトおよび組換えベクターを包含する。これらの塩基置換、欠失または付加は、エキソン、イントロンまたは調節配列のいずれかに所在するものであるが、好ましくは哺乳動物PG1遺伝子の5'-調節配列、より好ましくは配列番号 180またはPG1ゲノム配列のエキソンまたは配列番号 3、112-125または184内のPG1 cDNAである。
【０３８１】
第1の好ましいDNAコンストラクトは、Gossen M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551、Gossen M. et al., 1995, Science, 268: 1766-1769およびFurth P.A. et al., 1994, Proc. Natl Acad. Sci USA, 91: 9302-9306に記載されているような、PG1遺伝子発現を制御するためにE. coli転移因子Tn110から得たテトラサイクリン耐性オペロンtetを主な構成要素とするものである。このようなDNAコンストラクトは、Tn10(tetop)から得られるtetオペレーター配列を7つ有し、これらの配列がPG1遺伝子の最小プロモーターまたは5'-調節配列に融合している。前記最小プロモーターまたは前記PG1調節配列は、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドかポリペプチド(PG1ポリペプチドまたはそのペプチド断片)のいずれかをコードする、検討対象のポリヌクレオチドに作用的に結合されている。このDNAコンストラクトは、HCMVIE1エンハンサ/プロモーターまたはMMTV-LTRなどのプロモーターによる制御下で、同じ細胞が単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質VP16の活性ドメインに融合した野生型(tTA)またはミュータント(rTA)レプレッサーのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む場合に、興味の対象となるヌクレオチド配列のコンディショナル発現系として機能する。特に、本発明の好ましいDNAコンストラクトは、tetオペレータ配列を有するポリヌクレオチドと、tTAレプレッサーまたはrTAレプレッサーをコードする配列を有するポリヌクレオチドの両方を含む。
【０３８２】
コンディショナル発現DNAコンストラクトがミュータントテトラサイクリンレプレッサーrTAをコードする配列を含む具体的な実施形態では、興味の対象となるポリヌクレオチドの発現は、テトラサイクリンの非存在下でサイレントであり、テトラサイクリンが存在すると誘起される。
【０３８３】
相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト:  交換ベクター(replacement vector)
第2の好ましいDNAコンストラクトは、5'-末端から3'-末端に、(a)PG1配列、好ましくはPG1ゲノム配列で構成される第1のヌクレオチド配列と、(b)ネオマイシン耐性(neo)に対するマーカーなどのポジティブ(positive)選択マーカーを含むヌクレオチド配列と、(c)好ましくはPG1ゲノム配列などのPG1配列で構成され、第1のPG1ヌクレオチド配列(a)よりも下流のゲノムに所在する第2のヌクレオチド配列と、を含む。
【０３８４】
好ましい実施形態では、このDNAコンストラクトは、ヌクレオチド配列(a)の上流またはヌクレオチド配列(b)の下流に所在するネガティブ選択マーカーも含む。ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子(Thomas K.R. et al., 1986, Cell, 44: 419-428)、ハイグロマイシンβ遺伝子(Te Riele et al., 1990, Nature, 348: 649-651)、hprt遺伝子(Van der Lugt et al., 1991, Gene, 105: 263-267およびReid L.H. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4299-4303)またはジフテリア毒A断片(Dt-A)遺伝子(Nada S. et al., 1993, Cell, 73: 1125-1135; Yagi T. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9918-9922)からなるものであると好ましい。ポジティブ選択マーカーは、PG1タンパク質をコードする配列を中断するようにPG1エキソン配列内に所在するものであると好ましい。
【０３８５】
これらの交換ベクターについては、Thomas K.R. et al., 1986, Cell, 44: 419-428、Thomas K.R. et al., 1987, Cell, 51: 503-512、Mansour S.L. et al., 1988, Nature, 336: 348-352およびKoller et al., 1992, Annu. Rev. Immunol., 10: 705-30などに説明されている。
【０３８６】
第1の核酸配列(a)および第2の核酸配列(c)は、PG1調節配列、イントロン配列、エキソン配列、あるいは調節配列および/またはイントロン配列および/またはエキソン配列の両方を含む配列内のどこにでも所在する。核酸配列(a)および(c)の長さは、当業者によって経験から判断される。本発明では核酸配列(a)および(c)またはどのような長さも包含することを具体的に意図しているが、通常であれば、1kb〜50kb、好ましくは1kb〜10kb、より好ましくは2kb〜6kb、最も好ましくは2kb〜4kbの範囲の長さが用いられる。
【０３８７】
相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト: Cre-loxP系
これらの新規なDNAコンストラクトでは、P1ファージの部位特異的組換え系を利用している。P1ファージは、Creと呼ばれるリコンビナーゼを有する。このリコンビナーゼは、loxP部位の34塩基対と特異的に相互作用する。loxP部位は、8bpの保存配列で分離された13bpのパリンドローム配列2つで構成される(Hoess et al., 1986, Nucleic Acids Res., 14: 2287-2300)。同一の配向を有する2つのloxP部位間のCre酵素による組換えによって、DNA断片に欠失が生じる。
【０３８８】
Cre-loxP系と相同的組換え法との併用について、Gu H. et al., 1993, Cell, 73: 1155-1164およびGu H. et al., 1994, Science, 265: 103-106によってはじめて明らかにされた。簡単に説明すると、ゲノムの標的位置に挿入する対象となる問題のヌクレオチド配列が、少なくとも2つのloxP部位を同一配向で有し、これらの部位が組換えゲノムから切除すべきヌクレオチド配列のそれぞれの末端に所在する。切除現象を起こすには、組換え宿主細胞の核内にリコンビナーゼ(Cre)酵素がなければならない。リコンビナーゼ酵素は、(a)Araki K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 160-164に記載されているようにCre酵素を直接所望の細胞に接種するか、あるいはBaubonis et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 2025-2029に記載されているように酵素を細胞にリポフェクションすることによって、この酵素を含む培地で組換え宿主細胞をインキュベートする方法、(b)細胞宿主を、組換え細胞宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性であってもよい)と作用的に結合されたCreコーディング配列を含み、Gu H. et al., 1993, Cell, 73: 1155-1164およびSauer B. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5166-5170に記載されているようにして組換え細胞宿主に導入されるベクターとトランスフェクトする方法、(c)組換え細胞宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性であってもよい)と作用的に結合されたCreコーディング配列を含み、Gu H. et al., 1994, Science, 265: 103-106に記載されているようにランダム挿入現象または相同的組換え現象によって細胞宿主のゲノムに挿入されるポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムに導入する方法のいずれかによって、所望のタイミングで導入される。
【０３８９】
選択可能なマーカーが同一配向のloxP部位によってフランキングされるように相同的組換えによってPG1遺伝子に挿入される配列を有するベクターが構築される具体的な実施形態では、Cre酵素での処理によって、選択可能なマーカーが除去され、相同的組換え現象によって挿入されていた興味の対象であるPG1配列が残る可能性がある。また、2つの選択可能なマーカーすなわち、組換え現象を探索するためのポジティブ選択マーカーと、相同的組換え現象を探索するためのネガティブ選択マーカーが必要である。Cre-loxP系で用いられるベクターおよび方法については、Zou Y.R. et al., 1994, Curr. Biol., 4: 1099-1103に記載されている。
【０３９０】
このため、本発明の第3の好ましいDNAコンストラクトは、5'-末端から3'-末端に、(a)PG1配列、好ましくはPG1ゲノム配列で構成される第1のヌクレオチド配列と、(b)ネオマイシン耐性(neo)に対するマーカーなどのポジティブ(positive)選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する2つの配列を同一配向でさらに有するヌクレオチド配列と、(c)好ましくはPG1ゲノム配列などのPG1配列で構成され、第1のPG1ヌクレオチド配列(a)よりも下流のゲノムに所在する第2のヌクレオチド配列と、を含む。
【０３９１】
loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する配列は、ヌクレオチド配列(b)内でコンディショナル切除が探索されるヌクレオチド配列の境界となる適した位置に所在すると好ましい。具体的な実施形態では、相同的組換え現象から所望の時間経過後に切除がなされるようにするために、2つのloxP部位がポジティブ選択マーカー配列の両側に位置している。
【０３９２】
上述した第3のDNAコンストラクトを使用する方法の好ましい実施形態では、リコンビナーゼが認識する2つの部位、好ましくは2つのloxP部位で境界が定められているポリヌクレオチド断片が所望のタイミングで切除される。これは、組換え宿主細胞のゲノム内に、プロモーター配列、好ましくは誘導性プロモーター、より好ましくは組織特異的プロモーター配列、最も好ましくはGu H. et al., 1994, Science, 265: 103-106に記載されているような誘導性かつ組織特異的なプロモーター配列に作用的に結合されたCre酵素をコードする配列が存在するためである。
【０３９３】
組換え細胞宿主のゲノム中にCre酵素が存在することで、上述したようなloxP部位を含む興味の対象であるPG1由来配列を持つ第1のトランスジェニック動物と、Gu H. et al., 1994, Science, 265: 103-106に記載されているように適当なプロモーター配列に作用的に結合されたCreコーディング配列を持つ第2のトランスジェニック動物の2種類のトランスジェニック動物を繁殖できる場合がある。Anton M. et al., 1995,  J. Virol., 69: 4600-4606およびKanegae Y. et al., 1995, Nucl. Acids Res., 23: 3816-3821に記載されているように、Cre遺伝子を含むためCre酵素のデリバリーに必要な細胞の感染または器官のin vivo感染が可能なアデノウイルスベースのベクターを用いることで、Cre酵素発現の空間時間制御を行うことができる。
【０３９４】
上述したDNAコンストラクトを使用して、本発明の所望のヌクレオチド配列、好ましくはPG1ゲノム配列またはPG1 cDNA配列、最も好ましくはPG1ゲノム配列またはcDNA配列の変化したコピーを、標的ゲノムの予め定められた位置内に導入し、標的遺伝子の変化したコピーを作出する(ノックアウト相同的組換え)か、あるいは標的遺伝子のコピーを相同的組換え現象が可能な程度に十分な相同性を持つ別のコピーと交換する(ノックイン相同的組換え)。
【０３９５】
核アンチセンスDNAコンストラクト
好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼII転写が3'末端でポリ(a)なしで行われるように自己切断リボザイム配列と交換された3'ポリアデニル化シグナルを有する。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、Liu Z. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4528-4262などに記載されているように、核からの搬出ができないものである。好ましい実施形態では、これらのPG1アンチセンスポリヌクレオチドが、Eckner R. et al., 1991, EMBO J., 10: 3513-3522に記載されているような、切断された転写物が3'-5'ポリヌクレオチド末端加水分解しないように安定させるためのヒストンの幹-ループ構造をリボザイムカセット内に含む。
【０３９６】
発現ベクター
本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターも含む。発現ベクター系、制御配列および適合性宿主(compatible host)は従来技術において周知のものである。これらの系については、たとえば、米国特許第5,350,671号の第45〜48列を参照のこと。DNA断片をベクターに挿入するための当業者間で周知の標準的な方法のうちいずれかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とからなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを作出する。これらの方法には、in vitro組換えDNA合成法やin vivo組換え法(遺伝的組換え)などを含んでもよい。
【０３９７】
配列番号 3、69、100〜112または179〜184でポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ペプチド、これらの誘導体または類似物の発現を、第2の核酸配列で調節し、組換えDNA分子で形質転換された宿主においてタンパク質またはペプチドが発現されるようにする。たとえば、従来技術において周知の任意のプロモーター/エンハンサエレメントによってタンパク質またはペプチドの発現を制御する。発現の制御に用いられるプロモーターとしては、CMVプロモーター、SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42)、β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)またはtacプロモーター(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)(Scientific American, 1980, 242:74-94の「Useful proteins from recombinant bacteria」も参照のこと)、ノパリンシンセターゼプロモーター領域を有する植物発現ベクター(Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター(Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120)、Gal4 プロモーターなどの酵母または他の菌から得られるプロモーターエレメント、ADC(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターの他、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されてきた下記の動物転写制御領域すなわち、膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646、Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409、MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)、膵臓β細胞中で活性であるインシュリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ球中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658、 Adames et al., 1985, Nature 318:533-538、Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞中で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓において活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58、肝臓において活性なアルファ1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171)、骨髄細胞中で活性なβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94、脳内の乏突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712)、骨格筋肉において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)があげられるが、これに限定されるものではない。
【０３９８】
特に哺乳動物細胞において遺伝子を発現させるのに適した他のベクターは、P1 バクテリオファージおよびバクテリア人工染色体(BAC)からなるベクターの群から選択される。これらのタイプのベクターは、約80〜90kb(P1バクテリオファージ)から約300kb(BAC)の大きなインサートを含む場合がある。
【０３９９】
P1バクテリオファージ
p158またはp158/neo8などのP1 バクテリオファージベクターの作出については、Sternberg N.L., 1992, Trends Genet., 8: 1-16および Sternberg N.L., 1994, Mamm. Genome, 5: 397-404に非常によく説明されている。40kbを上回る大きなポリヌクレオチドを挿入するために、PG1核酸配列を持つ組換えP1クローンを設計する(Linton M.F. et al., 1993, J. Clin. Invest., 92: 3029-3037)。遺伝子組換え実験用のP1 DNAを作出する上では、McCormick et al., 1994, Genet. Anal. Tech. Appl., 11: 158-164に記載されているプロトコルが好ましいプロトコルである。簡単に説明すると、P1プラスミドを有するE. coli(好ましくは菌株NS3529)をカナマイシン25μg/ml含有の適当なブイヨン培地で終夜増殖する。Qiagen Plasmid Maxiキット(キアゲン社、米国カリフォルニア州Chatsworth)を使用して、メーカーの取扱説明書に従ってアルカリ法でE. coliからP1 DNAを調製する。キットに含まれている洗浄溶出緩衝液を用いて、Qiagen-tip 500の2本のカラムで溶菌液からP1 DNAを精製する。次に、フェノール/クロロホルム抽出を行い、さらに70% エタノールでDNAを沈降させる。TE(トリス-HCl 10mM、pH 7.4、EDTA 1mM)にてDNAを可溶化した後、DNA濃度を分光光度法によって評価する。
【０４００】
トランスジェニック動物(一般にはトランスジェニックマウス)でPG1核酸配列を有するP1クローンを発現させることが最終目的である場合、P1ポリリンカー内の稀切断部位(rare-cutting site)(SfiI、NotIまたはSalI)でP1 DNAを切断するなどの方法で、P1 DNA 断片からベクター配列を除去すると望ましい。DNAを単離する目的ではじめて報告された(Schedl A. et al., 1993, Nature, 362: 258-261およびPeterson et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7593-7597)方法と同様の方法を用いて、パルスフィールドアガロースゲルでP1インサートをベクター配列から精製する。この段階で、必要であればMillipore Ultrafree-MC Filter Unit(ミリポア社、米国マサチューセッツ州Bedford、限界分子量30,000)にて上記のようにして得られた精製インサートDNAを濃縮し、NaCl 100mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有するマイクロインジェクション緩衝液(トリス-HCl 10mM、pH7.4、EDTA 250μM)に対して、マイクロダイアリシス(microdyalisis)膜(VS型、0.025μM、ミリポア社)で透析することができる。1%アガロース(Sea Kem GTG; FMC Bio-products)パルスフィールドゲルでの泳動と臭化エチジウム染色によって精製P1 DNAインサートの完全さを評価した。
【０４０１】
バクテリア人工染色体(BAC)
大きなゲノムDNA断片(100〜300kb)をE. coliに安定して維持するために、バクテリア人工染色体(BAC) クローニング系(Shizuya et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794-8797)を開発した。好ましいBAC ベクターは、Kim U. J., et al., 1996, Genomics, 34: 213-218に記載されているpBeloBAC11ベクターからなるものである。ベクターのBam HI部位またはHind III部位への連結を可能にする酵素で部分消化済のサイズ選択ゲノムDNAを用いて、上記のベクターでBACライブラリを作製する。これらのクローニング部位をフランキングするのは、RNA転写またはPCR法による末端プローブの作出に使用可能なT7およびSP6 RNAポリメラーゼ転写開始部位である。E. coliでのBACライブラリの作製後、宿主細胞から超らせん円(supercoiled circle)としてBAC DNAを精製する。サイズ判定とBACのレシピエント細胞への導入前に、これらの円形分子を線状にする。2つのNot I部位によってクローニング部位をフランキングし、クローニングしたセグメントをNot Iでの消化によってベクターから切除できるようにする。あるいは、独特のcosN部位で切断を行う市販の酵素λ-Terminaseを用いるBACベクター処理によって、pBeloBAC11ベクターに含まれるDNAインサートを直線化するが、この切断法によってインサートDNAとBAC配列の両方を含む完全長BACクローンが得られる。
【０４０２】
宿主細胞
ヒト細胞でのPG1遺伝子発現を不完全にするか、あるいは本発明に従って動物細胞のゲノムにおけるPG1遺伝子相当物をPG1 ポリヌクレオチドと交換してPG1ゲノム配列またはPG1 cDNA配列を挿入した状態でPG1遺伝子発現を行う。このような遺伝的な変化は、上述した特異的DNAコンストラクトを用いる相同的組換え現象によって生み出される。
【０４０３】
使用される宿主細胞の1種にマウス接合体などの哺乳動物接合体がある。たとえば、NaCl 100mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有する、トリス-HCl 10mM、pH 7.4、EDTA 250μM中、BACインサートであれば1ng/ml、P1バクテリオファージインサートであれば3ng/μlからの濃度範囲にあらかじめ調節した精製DNA分子などの、興味の対象となっている精製DNA分子をマウス接合体に微量注射する。微量注射するDNAの大きさが大きい場合、Schedl et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 4783-4787に記載されているように、ポリアミンを用いて塩濃度を高くし、DNAが機械的に破壊されてしまうのを防止することができる。
【０４０４】
本願明細書で説明したDNAコンストラクトをはじめとする本発明のポリヌクレオチドのうちいずれかを、胚性幹細胞(ES)、好ましくはマウスのES細胞に導入する。着床前胚盤胞の内部細胞塊の多分化能を持つ未分化細胞からES細胞株を得る。好ましいES細胞株としては、ES-E14TG2a(ATCC No. CRL-1821)、ES-D3(ATCC No. CRL1934およびNo. CRL-11632)、YS001(ATCC No. CRL-11776)、36.5(ATCC No. CRL-11116)があげられる。ES細胞を未分化状態に維持するために、胚性表現型を保存する適当なシグナルを提供し、かつES細胞接着のマトリックスとして機能する成長抑制支持細胞の存在下でこれを培養する。好ましい支持細胞は、実質的にどのようなマウス菌株でも13〜14日目の胚組織から樹立される一次胚線維芽からなるものであり、これをAbbondanzo SJ et al., 1993, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, pp. 803-823に記載されているようにして培養中で保持し、さらにRobertson E., 1987, Embryo-derived stem cell lines. E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 71に記載されているようにして輻射によって成長を抑制するか、あるいはPease S. and William R.S., 1990, Exp. Cell. Res., 190: 209-211に記載されているように抑制濃度のLIFを用いることで成長を抑制する。
【０４０５】
トランスジェニック動物
本願明細書では、「トランスジェニック動物」または「宿主動物」という用語を、本発明の核酸のうち1つが含まれるようゲノムを遺伝的および人工的に操作した非ヒト動物を示すものとして用いる。好ましい動物は、非ヒト哺乳動物であり、本発明による核酸の挿入によってゲノムを人工的かつ遺伝的に変化させたMus(マウスなど)、Rattus(ラットなど)およびOryctogalus(ウサギなど)から選択される属に分類されるものが含まれる。
【０４０６】
本発明のトランスジェニック動物はいずれも、その複数の細胞の中に、クローニングによって得られた組換えDNA配列または合成DNA配列を有する。この配列は、具体的には、PG1コーディング配列、PG1調節ポリヌクレオチドまたは本願明細書にて説明するようにアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列を含む精製された核酸または単離された核酸のうちの1つである。
【０４０７】
本発明による好ましいトランスジェニック動物は、その体細胞系および/または生殖細胞系の細胞に、以下に示すポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチドを有する。
a)  PG1ポリペプチドまたはポリペプチド断片またはその変異体をコードする、精製または単離された非天然核酸。
b)  ヌクレオチド配列 配列番号 179、182または183、ヌクレオチド配列相補体のうち少なくとも8の連続したヌクレオチドを含む、精製または単離された非天然核酸。いくつかの実施形態では、断片の長さを、配列番号 179、182または183またはこれらと相補な配列のうち、少なくとも8、10、15、20または30〜200ヌクレオチド、好ましくは少なくとも10〜50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも40〜50ヌクレオチドの範囲にすることができる。いくつかの実施形態では、この断片が、配列番号 179、182または183またはこれらと相補な配列を200ヌクレオチドより多くを含んでもよい。
c)  ヌクレオチド配列 配列番号 3、69、112〜125または184、これらと相補な配列またはこれらの変異体のうち少なくとも8の連続したヌクレオチドを含む、精製または単離された非天然核酸。いくつかの実施形態では、断片の長さを、配列番号 3、69、112〜125または184またはこれらと相補な配列のうち、少なくとも8、10、15、20または30〜200ヌクレオチド、好ましくは少なくとも10〜50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも40〜50ヌクレオチドの範囲にすることができる。いくつかの実施形態では、この断片が、配列番号 3、69、112〜125または184またはこれらと相補な配列を200ヌクレオチドより多くを含んでもよい。
d)  配列番号 100〜111、これらと相補な配列または断片あるいはこれらの変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、精製または単離された非天然核酸。
e)  配列番号 100〜111またはこれらと相補な配列または断片あるいはこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも2種のヌクレオチド配列の組み合わせを含む、精製または単離された非天然核酸。ここで、ポリヌクレオチドは、核酸内で該核酸の5'末端から3'末端に、SEQ NO 179、182または183と同一順序で配列される。
f)  ヌクレオチド配列配列番号 180またはこれらと相補な配列、あるいは配列番号 180のヌクレオチド配列またはこれらと相補な配列の生物学的に活性な断片または変異体を含む、精製または単離された非天然核酸。
g)  ヌクレオチド配列配列番号 181またはこれらと相補な配列、あるいは配列番号 181のヌクレオチド配列またはこれらと相補な配列の生物学的に活性な断片または変異体を含む、精製または単離された非天然核酸。
h)  (1)  配列番号 180の調節ポリヌクレオチドまたはこれらと相補な配列またはこれらの生物学的に活性な断片または変異体を含む核酸、
(2)  所望のポリペプチドまたは核酸をコードするポリヌクレオチド、
(3)  任意に、SEQ NO 181の調節ポリヌクレオチドまたはこれらと相補な配列またはこれらの生物学的に活性な断片または変異体を含む核酸、
からなるポリヌクレオチド。
i)  本願明細書において先に説明したようなDNAコンストラクト。
【０４０８】
このように、本発明のトランスジェニック動物は、外来遺伝子材料の特異配列を有するすなわち、上記にて詳細に説明したヌクレオチド配列のように「非天然」のものである。
【０４０９】
第1の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物は、細胞の分化に関係のあるさまざまな病理の研究、特に、天然のPG1タンパク質あるいはミュータントPG1タンパク質をコードするポリヌクレオチドの1つまたは複数のコピーをゲノム内に挿入したトランスジェニック動物に関する研究を行う上での良好な実験モデルである。
【０４１０】
第2の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物が、PG1遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で、興味の対象となっている所望のポリペプチドを発現させ、興味の対象となっているタンパク質の合成において高い収率をあげ、結果としてかかるタンパク質を組織特異的に発現させることができる。
【０４１１】
本発明のトランスジェニック動物は、当業者間で周知の従来の手法で設計される。トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作出方法の詳細については、Sandou et al. (1994)の他、1989年10月10日発行の米国特許第4,873,191号,1995年11月7日発行の米国特許第5,464,764号および1998年8月4日発行の米国特許第5,789,215号に記載されている。
【０４１２】
本発明のトランスジェニック動物は、ゲノムに外来遺伝子物質が組み込まれた動物を生み出す手順を応用することによって作出される。この手順では、PG1 コーディング配列、PG1調節ポリヌクレオチド、または本願明細書に記載したようなPG1アンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列のうち、いずれかをコードする遺伝物質またはその一部を採取する必要がある。
【０４１３】
本発明の組換えポリヌクレオチドを胚性細胞またはES幹細胞株に挿入する。この挿入は、Thomas K.R. et al., 1987, Cell, 51: 503-512に記載されているように、エレクトロポレーションで行うのが好ましい。エレクトロポレーションの対象となる細胞をスクリーニング(たとえば選択可能な マーカーによる選択、PCR解析またはサザンブロット解析など)し、好ましくは相同的組換え現象によってゲノムに外来性の組換えポリヌクレオチドが組み込まれたポジティブ細胞を見出す。本発明で利用するポジティブ-ネガティブ選択手順の一例は、Mansour S.L. et al., 1988, Nature, 336: 348-352に説明されている。
【０４１４】
次に、Bradley A., 1987, Production and analysis of chimaeric mice. In: E.J. Robertson (Ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL Press, Oxford, pp.113に記載されているように、ポジティブ 細胞を単離し、クローニングし、3.5日胚のマウス胚盤胞に注入する。次に、胚盤胞をメスの宿主動物に挿入し、妊娠満期まで成長させる。
【０４１５】
あるいは、Wood S.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4582-4585またはNagy A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8424-8428に記載されているように、2.5日胚、8〜16細胞期(桑実胚)の時点でポジティブES細胞を胚と接触させる。内部移行中のES細胞は、生殖細胞系を生み出す細胞を含む胚盤胞を迅速にコロニー化する。メスの宿主の子孫を試験し、どの動物がトランスジェニックであるか(たとえば、どの動物が外来性DNA配列を有し、どの動物が野生型なのか)を判断する。
【０４１６】
このため、本発明は、本発明による核酸、組換え発現ベクターまたは組換え宿主細胞を含むトランスジェニック動物にも関するものである。
【０４１７】
本発明のトランスジェニック動物由来の組換え細胞系
本発明のさらに他の目的は、本願明細書において説明するトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞からなるものである。
【０４１８】
Chou J.Y., 1989, Mol. Endocrinol., 3: 1511-1514およびShay J.W. et al., 1991, Biochem. Biophys. Acta, 1072: 1-7に記載されているようにして、たとえばSV40ラージT抗原などのオンコジーン(onc-gene)を発現するベクターでの一次細胞培養物のトランスフェクションなどによって、本発明によるトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られる細胞から組換え細胞系をin vitroにて樹立する。
【０４１９】
トランスジェニック動物のPG1ポリペプチド(poplypeptide)の機能解析
本願発明者らは、PG1遺伝子を有する異なる BACを使用して、腺癌前立腺細胞株PC3でのFISH実験を行った。検出されたシグナルは1つしかなく、第8染色体の領域がこの癌細胞株で半接合状態にあることが示された。
【０４２０】
PG1の機能を研究するために、PC3 細胞株でPG1の残りのアレルでの相同的組換えによってこれを不活化する。残りのPG1アレルの不活化には、3.0および4.3kbの2つのゲノムDNA 断片(それぞれPG1 プロモーター上流の配列とイントロン1の部分とに相当)をpKO Scrambler Neo TK ベクター(レキシコン社リファレンスV1901)に挿入することによって、ノックアウトターゲッティングベクターを作出する。ターゲッティングベクターにはネオマイシン耐性遺伝子ならびにTk遺伝子が含まれているため、ジェネテシンとFIAUとを培地に追加して相同的組換えを選択する。プロモーターすなわち転写開始部位と組換えアレルのエキソン1に含まれる第1のATGとを、ターゲッティングベクターと残りのPG1アレルとの相同的組換えによって除去する。この結果、組換えアレルでコーディング転写が開始されることはなくなる。親のPC3細胞ならびにヌルの対立遺伝子である半接合細胞を、表現型、培養液中での成長率、寒天中での成長力(足場非依存性成長)ならびにヌードマウスに皮下注射した場合に腫瘍および転移を形成する機能について評価する。
【０４２１】
動物でのPG1の機能を判断し、前立腺腫瘍化に関する動物モデルを生成するために、PG1アレルの組織特異的不活化を誘導可能なマウスを作出する。この目的のために、Cre-loxP系を上述したようにして利用し、動物に対して直接染色体操作ができるようにする。
【０４２２】
第1に、コンディショナルヌルアレルの対立遺伝子を用いてマウスを作出するために、 2つのloxP部位をマウスゲノムに導入する。PG1プロモーターに対する第1の部位は5'、第2の部位はPG1エキソン1に対する3'である。あるいは、微妙な(subtle)突然変異を作り出すか、いくつかのアイソフォームを特異的に突然変異させる上でも、loxP部位を導入して特定のエキソンまたは潜在的なエキソン群をフランキングさせる。機能的PG1メッセンジャーは、Cre酵素によってloxP部位間での組換えが引き起こされるまではこれらのアレルから転写可能なものであることが、特に留意すべき重要な点である。
【０４２３】
第2に、誘導マウスを作出するために、組織特異的プロモーターの制御下、たとえばPSA(前立腺特異抗原)プロモーターの制御下で、Cre遺伝子をマウスゲノムに導入する。
【０４２４】
最後に、組換え型PG1アレルと同型接合的であるCre導入遺伝子を有するマウスを作出することによって、PG1遺伝子の組織特異的不活化を引き起こす。
【０４２５】
遺伝子治療
本発明は、配列番号 179のPG1ゲノムDNA配列、配列番号 3のPG1 cDNAまたは遺伝子治療戦略ので検出可能な表現型の原因であるミュータントPG1タンパク質をコードする核酸を使用することも包含するものであり、これには以下の実施例19および20で説明するようなアンチセンスおよび三重らせんによる戦略も含まれる。アンチセンスによる方法では、mRNAに相補な核酸配列をmRNAと細胞内ハイブリダイズさせ、これによってmRNAにコードされたタンパク質の発現をブロックする。アンチセンス配列は、さまざまな機序によって遺伝子の発現を妨害している。たとえば、アンチセンス配列によって、リボソームがmRNAを翻訳する機能が阻害される場合がある。また、アンチセンス配列によって、核から細胞質へのmRNAの輸送がブロックされ、翻訳に利用できるmRNAの量が限られてしまう場合もある。アンチセンス配列が遺伝子発現を阻害するもう1つの機序として、mRNAスプライシングへの干渉があげられる。さらに別の戦略では、標的mRNAに対する特異的切断能を有するリボザイムにアンチセンス核酸が組み込まれる。
【０４２６】
実施例19
アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製と利用
遺伝子治療に利用されるアンチセンス核酸分子は、DNA配列またはRNA配列のいずれかである。これらの配列は、配列番号 179のPG1ゲノムDNA、配列番号 3のPG1 cDNAまたは検出可能な表現型の原因であるPG1タンパク質をコードする核酸の配列に対して相補な配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸は、二重鎖でのPG1 mRNAの発現を抑制するのに十分な安定性を持つ細胞内二重鎖が形成されるだけの長さと融解温度を持つものでなければならない。遺伝子治療に利用するのに適したアンチセンス核酸の設計戦略については、Green et al., Ann. Rev. Biochem. 55:569-597 (1986)およびIzant and Weintraub, Cell 36:1007-1015 (1984)に開示されている。
【０４２７】
いくつかの戦略では、細胞で正常に転写されるものとは逆の鎖が転写されるように、PG1コーディング領域の配向をプロモーターとは逆にすることによって、アンチセンス分子を得る。転写物の生成にT7またはSP6ポリメラーゼを用いるものなどのin vitro転写系を用いてアンチセンス分子を転写する。もう1つの方法は、アンチセンス配列を持つDNAを発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させることによって、PG1アンチセンス核酸をin vivoにて転写するものである。
【０４２８】
あるいは、細胞で通常転写されるPG1遺伝子の鎖と相補なオリゴヌクレオチドをin vitroにて合成する。このため、アンチセンスPG1 核酸はPG1 mRNAに対して相補的なものであり、mRNAとハイブリダイズさせて二重鎖を得ることができる。いくつかの実施形態では、PG1アンチセンス配列に修飾糖ホスフェート骨格を持たせて安定性を高め、RNase活性に対する感受性を落とすようにしてもよい。アンチセンスを用いた戦略で使用するのに適した修飾の例は、Rossi et al., Pharmacol. Ther. 50(2):245-254, (1991)に記載されている。
【０４２９】
配列番号 179のPG1ゲノムDNA、配列番号 3のPG1 cDNAまたは検出可能な表現型の原因であるタンパク質をコードする核酸の配列と相補なさまざまなタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。好ましい一実施形態では、国際特許出願公開第WO 94/23026号に記載されているような安定したアンチセンスオリゴヌクレオチドと準安定なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてPG1遺伝子の発現を抑制する。これらの分子では、3'末端または3'末端と5'末端の両方が、分子内水素結合で相補塩基対と結合している。これらの分子は、エキソヌクレアーゼ攻撃に耐えることができ、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも高い安定性を示すものであるとなおよい。
【０４３０】
もう1つの好ましい実施形態では、国際特許出願公開第WO 95/04141号に記載されているアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いてPG1遺伝子の発現を抑制する。
【０４３１】
さらに別の好ましい実施形態では、国際特許出願公開第WO 96/31523号に記載されている、共有結合的に架橋したアンチセンスオリゴヌクレオチドをを用いてPG1遺伝子の発現を抑制する。これらの二本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドは、1つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド間共有結合的架橋またはオリゴヌクレオチド内共有結合架橋を含む。ここで、連鎖は、一方の鎖の一級アミン基と他方の鎖または同一の鎖のカルボキシル基との間のアミド結合からなるものであり、一級アミン基は鎖ヌクレオチドの単糖環の2'位において直接置換され、カルボキシル基は他の鎖または同一鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物で置換された脂肪族スペーサ基によって保持されている。
【０４３２】
国際特許出願公開第WO 92/18522号に開示されているアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを用いてPG1遺伝子の発現を抑制することもできる。これらの分子は、分解に対する安定性があり、少なくとも１つの制御タンパク質と結合する転写制御認識配列を有し、そのデコイとして効果的なものである。これらの分子は、「ヘアピン」構造、「ダンベル」構造、「修飾ダンベル」構造、「架橋」デコイ構造および「ループ」構造などを有してもよい。
【０４３３】
もう1つの好ましい実施形態では、欧州特許出願公開第0 572 287 A2号に記載されている環式二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてPG1遺伝子の発現を抑制する。これらの連結オリゴヌクレオチド「ダンベル」には、転写因子を隔絶することによって、これらの因子の制御下でPG1プロモーターに結合して遺伝子の発現を抑制する、転写因子に対する結合部位が含まれる。
【０４３４】
国際特許出願公開第WO 92/19732号に開示されている閉じたアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含されている。これらの分子には遊離端が含まれていないため、従来のオリゴヌクレオチドよりもエキソヌクレアーゼによる分解に対する耐性が高い。これらのオリゴヌクレオチドは多機能であり、標的mRNAから離れた領域のの中にも相互作用の対象となるものがある。
【０４３５】
in vitroでの発現解析を利用して、PG1遺伝子発現を抑制するのに必要なアンチセンス核酸の適切な濃度を判断する。従来技術において周知の手順を用いた拡散、注入、感染またはトランスフェクションなどによって細胞にアンチセンス分子を導入する。たとえば、素のままで裸のオリゴヌクレオチド、脂質に封入されたオリゴヌクレオチド、ウイルスタンパク質によってキャプシド形成されたオリゴヌクレオチド配列、あるいは発現ベクターに含まれるプロモーターに作用的に結合されたオリゴヌクレオチドなどとして体にアンチセンス核酸を導入することができる。発現ベクターは、レトロウイルスベクターまたはウイルスベクター、染色体外複製能のあるベクターまたは組込みベクターなど、従来技術において周知のさまざまな発現ベクターのうちどのようなものであってもよい。ベクターはDNAまたはRNAである。
【０４３６】
さまざまな濃度、好ましくは1×10-10M〜1×10-4Mの濃度でPG1アンチセンス分子を細胞試料に導入する。遺伝子発現を適宜制御できる最低濃度の特定後、最適な用量をin vivoでの使用に適した投与量に換算する。たとえば、培養での抑制濃度1×10-7を用量に換算すると体重1kgあたり約0.6mgになる。実験動物でオリゴヌクレオチドの毒性について試験を行った後であれば、体重1kgあたり100mg前後またはこれ以上のオリゴヌクレオチド濃度になることもあり得る。また、脊椎動物から採取した細胞を除去し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、脊椎動物に再度導入することも考慮されている。
【０４３７】
PG1アンチセンスオリゴヌクレオチド配列をリボザイム配列に取り込み、アンチセンスがその標的mRNAと特異的に結合してこれを切断できるようにすることも考慮されている。リボザイムとアンチセンスオリゴヌクレオチドの技術的な応用方法については、上記のRossi et al.を参照のこと。
【０４３８】
本発明の好ましい用途では、RIAおよびELISAなどの抗体媒介試験、機能的アッセイまたは放射能標識を使用して、アンチセンス抑制がPG1発現にどの程度有効なのかについて判断する。
【０４３９】
本発明のPG1 cDNA、PG1ゲノムDNAおよびPG1アレルを、細胞内での三重らせん形成を主体にした遺伝子治療法に使用してもよい。三重らせんオリゴヌクレオチドを用いてゲノムからの転写を抑制する。これらのオリゴヌクレオチドは特定の遺伝子と関連しているため、細胞活性の変化を研究する上で特に有用である。本発明のPG1 cDNA、PG1ゲノムDNAまたはPG1アレル、より好ましくは、これらの配列の一部を用いて、前立腺癌またはもう1つの検出可能な表現型に罹患した個体、あるいはPG1遺伝子型が原因で後に前立腺癌またはもう1つの検出可能な表現型が発生する危険性のある個体での遺伝子発現を抑制することができる。同様に、PG1 cDNA、PG1ゲノムDNAまたはPG1アレルの一部を用いて、細胞内でのPG1転写の効果を研究することができる。従来、以下の実施例20で説明するように三重らせんでの戦略にはホモプリン配列が最も有用であるとされてきた。しかしながら、ホモピリミジン配列でも遺伝子発現を抑制することができる。このようなホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン:ホモピリミジン配列の主溝に結合する。このため、PG1 cDNA、PG1ゲノムDNAおよびPG1アレルから得られる配列はどちらのタイプも本発明の範囲に包含される。
【０４４０】
実施例20
PG1 cDNA、PG1ゲノムDNAおよびPG1アレルの配列をスキャンし、10merから20merのホモピリミジンまたはホモプリンの伸展を同定する。これを三重らせん主体の戦略に利用してPG1発現を抑制することができる。ホモピリミジンまたはホモプリンの候補伸展の同定後、候補配列を含むオリゴヌクレオチドを、PG1遺伝子を発現する組織培養細胞にさまざまな量で導入することによって、そのPG1発現抑制効率を評価する。このオリゴヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチド合成器で調製するか、あるいはフランスのパリに所在するGENSETなどの独自オリゴヌクレオチドの合成に対応している企業から購入する。
【０４４１】
リン酸カルシウム沈降法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介トランスフェクション法または天然状態での取り込みなどを含むがこれに限定されるものではない、当業者間で周知のさまざまな方法を利用して、細胞にオリゴヌクレオチドを導入する。
【０４４２】
ノーザンブロット、RNase保護アッセイ、PCR法を主体とした戦略などの手法を用いて、処理済細胞の細胞機能またはPG1発現の低下を監視し、オリゴヌクレオチドで処理した細胞でのPG1遺伝子の転写レベルをモニタリングする。
【０４４３】
次に、上記および実施例19で説明するような方法を用いて、実施例19で行ったin vitroでの結果に基づいて投与量を算出し、この投与量で組織培養細胞での遺伝子発現の抑制に効果的なオリゴヌクレオチドをin vivo導入してもよい。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド単位の天然(β)アノマーの代わりにαアノマーを用いてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めることができる。さらに、臭化エチジウムなどのインターカレート剤をαオリゴヌクレオチドの3'末端に付加し、三重らせんを安定させることも可能である。三重らせん形成に適したオリゴヌクレオチドの生成方法については、Griffin et al. (Science 245:967-971 (1989)を参照のこと。
【０４４５】
あるいは、以下の実施例21で説明するように、PG1タンパク質の発現が望ましい遺伝子治療法に、本発明のPG1 cDNA、PG1ゲノムDNAおよびPG1アレルを使用する。
【０４４６】
実施例21
本発明のPG1 cDNA、PG1ゲノムDNAおよびPG1 アレルを用いてPG1タンパク質またはその一部を宿主生物で発現させ、有益な効果を生むことができる。このような手順では、宿主生物でPG1タンパク質を一時的に発現させるか、宿主生物で安定的に発現させる。発現したPG1タンパク質を用いて、PG1の欠損を生む条件または既存のPG1発現レベルを高める条件を扱うと有益である。
【０４４７】
配列番号 4、配列番号5のタンパク質またはPG1アレルをコードする核酸を宿主生物に導入する。核酸の導入は、当業者間で周知のさまざまな手法を用いて行うものとする。たとえば、コードされたPG1タンパク質が宿主生物で発現するように裸のDNAとして核酸を宿主生物に注入し、有益な効果を生む。
【０４４８】
あるいは、配列番号 4、配列番号 5のPG1タンパク質またはPG1 アレルをコードする核酸を、宿主生物で活性なプロモーターの下流にある発現ベクターにクローニングする。発現ベクターは、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターをはじめとして、遺伝子治療用に設計された発現ベクターであればどのようなものであってもよい。
【０４４９】
PG1タンパク質が宿主生物で発現され、有益な効果が得られるように、宿主生物に発現ベクターを直接導入するもう1つの方法では、in vitroにて発現ベクターを細胞に導入する。次いで発現ベクターを有する細胞を選択し、宿主生物に導入し、そこでPG1タンパク質を発現させて有益な効果を得る。
【０４５０】
IX.  非ヒト哺乳動物からのPG1 cDNAの単離
本発明には、ゲノム配列およびcDNA配列ならびにポリペプチド配列を含む哺乳動物のPG1配列も包含される。また、本発明は、配列番号 179、3、182および183をはじめとする本発明のPG1ゲノム配列およびcDNA配列を、ヒト配列由来の配列だけでなく非ヒト哺乳動物由来のPG1核酸配列の単離およびキャラクタリゼーションの方法にも応用することを包含するものである。本発明によるヒトおよびマウスのPG1核酸配列を用いて、非ヒト動物、特に哺乳動物でPG1遺伝子を増幅および同定するためのプライマーおよびプローブを作出することができる。非ヒトPG1配列の同定に用いられるプライマーおよびプローブは、実施例4、5、6、12および13において上述した手法と同一の手法で非ヒトPG1の選択および単離に利用される。
【０４５１】
また、他の相同性タンパク質の配列解析を利用して、これらのプライマーおよびプローブの配列を最適化する。「PG1タンパク質配列の解析」において上述したようにして、さまざまな生物から得たタンパク質同士を比較し、PG1タンパク質産物の構造で相同性の3つのボックスを特定した。これについては図9を参照のこと。これらの相同性タンパク質の核酸配列は高い度合いの相同性を示すのではないかという仮定に基づいて、非ヒト哺乳動物でのPG1 cDNAのPCR増幅に特異なプライマーを作出することが可能である。
【０４５２】
実施例22
プライマーBOXIed: AATCATCAAAGCACAGTTGACTGGAT(配列番号 77)およびBOXIIIer: ATAAACCACCGTAACATCATAAATTGCATCTAA(配列番号 78)を、図９の配列相同性の比較後に、ヒトPG1配列由来のPCRプライマーとして設計した。BOXIed(配列番号 77)およびBOXIIIer(配列番号 78) プライマーを使用して、実施例4で説明した条件下で、マウス肝臓marathon-ready cDNA(クロンテック社)由来のマウスPG1 cDNA配列を増幅した。このPCR反応によって、約400塩基対の産物すなわちboxI-boxIII断片が得られた。この産物に対して、上述したようにして自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応を行い、ABI 377シークエンサ上で電気泳動した。配列解析を行ったところ、核酸レベルとタンパク質レベルのどちらでもヒトPG1との相同性が高いことが確認された。
【０４５３】
400 塩基対のboxI-boxIII断片を用いてRACE解析用にプライマーを設計した。入れ子状態のPRCプライマー2組を用いて、マウス肝臓marathon cDNAでの5'および3'RACE反応で追加の配列情報を得た。5'RACE反応でのプライマーは、moPG1RACE5.350: AATCAAAAGCAACGTGAGTGGC(配列番号 94)およびmoPG1RACE5.276: GCAAATGCCTGACTGGCTGA(配列番号 93)、3'RACE反応でのプライマーは、moPG1RACE3.18: CTGCCAGACAGGATGCCCTA(配列番号 90)およびmoPG1RACE3.63: ACAAGTTAAAATGGCTTCCGCTG(配列番号 91)であった。このRACE反応でのPCR産物について、以下のプライマーを用いたプライマーウォーキングで配列決定した。
moPGrace3S473:  GAGATAAAAG ATAGGTTGCT CA    (配列番号 79)、
moPGrace3S526:  AAGAAACAAA TTTCCTGGG    (配列番号 80)、
moPGrace3S597:  TCTTGGGGAG TTTGACTG      (配列番号 81)、
moPGrace5R323:  GACCCCGGTG TAGTTCTC      (配列番号 82)、
moPGrace5R372:  CAGTAAAGCC GGTCGTC      (配列番号 83)、
moPGrace5R444:  CAGGCCAGCA GGTAGGT      (配列番号 84)、
moPGrace5R492:  AGCAGGTAGC GCATAGAGT    (配列番号 85).
【０４５４】
ここでも、プライマーウォーキングで得られたマウス配列とヒトPG1配列との間に高い度合いの相同性が認められた。入れ子状態のプライマー対をさらに設計し、別のRACE反応に用いて3'マウスPG1配列をさらに伸長させた。moPG3RACE2: TGGGCACCTG GTTGTATGGA(配列番号 95)およびmoPG3RACE2n: TCCTTGGCTG CCTGTGGTTT(配列番号96)。最終RACE反応でのPCR産物については、以下のプライマーを用いたプライマーウォーキングで配列決定した。
moPG1RACE3R94:  CAAATGCATG TTGGCTGT      (配列番号 92)、
moPG3RACES20:  GATGGCTACA CATTGTATCA C    (配列番号 97)、
moPG3RACES5:  TCCTGAATTA AATAAGGAGT TTTC  (配列番号 98)、
moPG3RACES90:  GTTTGTTATT AAAGCATAAG CAAG  (配列番号 99).
【０４５５】
5'RACE、boxI〜boxIIIおよび3'RACE断片の重複部分によって、マウスPG1相同分子種の単一の連続したコーディング配列を3つの断片の生成された整列(generated alignment)とすることができた。このような転写物が存在していることを確認するために、予測した連続配列(コンティグ)の5'末端および3'末端付近からプライマーを選択した。選択したプライマーすなわちmoPG15: TGGCGAGCCGAGAGGATG(配列番号 87)およびmoPG13LR2: GGAAACAATGTGATACAATGTGTAGCC(配列番号 86)を使用して、実施例4において説明したPCR条件下で、ここでもマウス肝臓marathon-ready cDNA(クロンテック社)のPCR増幅を行った。このようにして得られるPCR産物はDNA分子がほぼ1.2kbであり、推論したコンティグの配列と同一の配列を有していることが分かった。最後に、moPG15プライマーとmoPG13LR2プライマーにEcoRI部位およびBamHI部位、moPG15EcoRI: CGTGAATTCTGGCGAGCCGAGAGGATG(配列番号 89)およびmoPG15Bam1: CGTGGATCCGGAAACAATGTGATACAATGTGTAGCC(配列番号 88)を付加して修飾したものを使用して、EcoRIおよびBamHIの両制限酵素で切断されたpSKBluescriptプラスミド(ストラタジーン)にクローニングが可能なPCR産物を得た。このようにして得られるコンストラクトのマウスPG1 cDNAについて、上述したようにして自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応を行い、ABI 377シークエンサ上で電気泳動した。マウスPG1 cDNAの配列を配列番号 72に、cDNAに相当する推論アミノ酸配列を配列番号 74に示す。
【０４５６】
実施例23
多能性胚性幹細胞、細胞株ES-E14TG2a(ATCC CRL-1821)のBamHI部分消化DNAをpBeloBACIIベクタープラスミドにクローニングすることによって、マウスBACライブラリを作製した。平均挿入サイズ120kbのクローン約56,000を個々に採取し、ヒトBACライブラリスクリーニングについて上述したようにしてPCRスクリーニング用にプールした。これらのプールをマウスPG1転写物のうちヒト遺伝子のエキソン6に相当する領域から得たSTS g34292でスクリーニングした。このSTSを定義している上流と下流のプライマーは以下の通りである。g34292の上流の増幅プライマー: ATTAAAACAC GTACTGACAC CA(配列番号 75)、g34292の下流の増幅プライマー: AGTCATGGAT GGTGGATTT(配列番号 76)。BAC C0281H06を試験したところ、g34292へのハイブリダイゼーションに関してポジティブであった。このBACを単離し、pGenDelシークエンシングベクターへのサブクローニングによって配列決定した。このようにして得られるマウスPG1の部分ゲノム配列を配列番号 73に示した。上記と同じ行程を繰り返し、得られるマウスPG1の部分ゲノム配列を配列番号 182および183に示した。
【０４５７】
本発明の方法によって、他の哺乳動物のPG1 cDNAおよびゲノム配列を単離することができる。哺乳動物種のPG1遺伝子には、最も豊富なヒトまたはマウスcDNA 種(配列番号 3)に対して少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%の配列相同性を有する各哺乳動物の最も豊富な転写種に、少なくとも100、好ましくは200、より好ましくは500ヌクレオチド長の領域がある。哺乳動物種のPG1タンパク質には、最も豊富なヒトまたはマウス転写種のアミノ酸配列(配列番号 4または74)に対して少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%の配列相同性を有する最も豊富なPG1転写種の推論アミノ酸配列に、少なくとも40、好ましくは90、より好ましくは160アミノ酸長の領域がある。
【０４５８】
X.  個体のバイアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法
本発明の１つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーでの遺伝子型を生物学的試料で判定するための方法が得られる。これらの方法はいずれも、in vitroにて行われるものである。かかる遺伝子型判定方法は、従来技術において周知の手法でPG1関連バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を判断することを含む。これらの方法には、関連性解析時の遺伝子型判定症例-対照個体群での用途の他、特定の形質に関連していることが知られているバイアレリックマーカーのアレルを検出する状況で用途がある。いずれの場合も、個体のゲノム中に含まれるバイアレリックマーカーの両方のコピーを判断し、個体が特定のアレルについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを判断する。
【０４５９】
これらの遺伝子型判定方法は、単一の個体またはプールしたDNA試料から得た核酸試料で行うことができる。
【０４６０】
バイアレリックマーカーの同定について上述した方法と同様の方法を用いて、あるいは後述するような他の遺伝子型判定方法を用いて、遺伝子型判定を行うことができる。好ましい実施形態では、異なる個体から採取して増幅したゲノム断片の配列同士を比較し、新しいバイアレリックマーカーを同定するが、診断や関連性解析での用途で既知のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定する場合はマイクロシークエンシングを使用する。
【０４６１】
X.A.  遺伝子型判定対象DNAのソース
所望の特異核酸配列を含んでいることが明らかであるか、あるいはその疑いが認められるのであれば、精製状態または非精製状態のどのような核酸ソースでも起始核酸として使用することができる。細胞、組織、体液からDNAまたはRNAを抽出する。解析対象となるゲノムDNAのソースに関して言えば、特に制限なくどのような被検試料でも用いることが可能である。これらの検査試料としては、本願明細書において説明する本発明の方法によって試験可能な生物学的試料があげられる。また、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液の他、呼吸器、腸管および泌尿生殖器、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などでのさまざまな外分泌液、細胞培養の上澄み液などの生物学的な流体、腫瘍組織および非腫瘍組織、リンパ節組織を含む固定組織標本、骨髄吸引液および固定細胞標本などのヒトおよび動物の体液もあげられる。本発明に使用されるゲノムDNAの好ましいソースは、各ドナーの辺縁末梢静脈血から採取したものである。ゲノムDNAを生物学的試料から調製する手法は当業者間で周知である。本発明の遺伝子型判定方法に用いられる核酸はどのような哺乳動物ソース由来のものであってもよいものではあるが、核酸試料を採取する被検体および個体は一般にヒトであると理解される。
【０４６２】
X.B.  バイアレリックマーカーを有するDNA断片の増幅
本発明によるバイアレリックマーカーを１つまたはそれ以上含むヌクレオチドセグメントを増幅するための方法およびポリヌクレオチドが得られる。バイアレリックマーカーを有するDNA断片の増幅は、さまざまな方法や目的で利用されるものであり、遺伝子型判定に限定されるものではないことは理解できよう。ただし、すべてではないとはいえ多くの遺伝子型判定法では、興味の対象となっているバイアレリックマーカーを有するDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。このような方法によって、バイアレリックマーカーにわたっているか、あるいはこれに対して遠位または近位にある部位と配列を含む配列の濃度または総数が明らかに増す。診断アッセイでも本発明のバイアレリックマーカーを持つDNAセグメントの増幅に依存する場合がある。
【０４６３】
従来技術において周知のいずれかの方法によってDNAを増幅する。確立されたPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、あるいはこれに手を加えて開発または変更したものによる。本願明細書において使用可能な増幅法としては、欧州特許出願公開第EP A 320 308号および同第EP A 439 182号に記載されているようなリガーゼ連鎖反応(LCR)、Gap LCR (Wolcott, M.J., Clin. Mcrobiol. Rev. 5:370-386)、Guatelli J.C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990)およびCompton J. (Nature 350:91-92, 1991)に記載されている、いわゆる「NASBA」または「3SR」技術、欧州特許出願第4544610号に記載されているようなQ-β増幅、Walker et al. (Clin. Chem. 42:9-13, 1996)および EP A 684 315 に記載されているようなSDA法、PCT国際出願公開第WO 9322461号に記載されているような標的媒介増幅があげられるが、これに限定されるものではない。
【０４６４】
LCRおよびGap LCRは、指数機能的増幅手法であり、いずれもDNA分子にアニールされた隣接プライマーを結合するDNAリガーゼに依存している。リガーゼ連鎖反応(LCR)ではプローブ対を使用するが、これには一次(第1および第2)プローブ2本と二次(第3および第4)プローブ2本が含まれている。プローブはすべて標的に対してモル過剰な状態で使用される。第1のプローブは標的鎖の第1のセグメントとハイブリダイズされ、第2のプローブは標的鎖の第2のセグメントとハイブリダイズされる。一次プローブが5'ホスフェート-3'ヒドロキシル関係で互いに当接し、リガーゼが2本のプローブと共有結合的に融合すなわち連結して融合産物になることができるように、第1および第2のセグメントは連続している。また、第3の(二次)プローブは第1のプローブの一部にハイブリダイズすることが可能であり、第4の(二次)プローブは同様の当接方法で第2のプローブの一部にハイブリダイスすることができる。もちろん、標的が最初に二本鎖である場合は、二次プローブも第1の例で標的相補体にハイブリダイズされる。一次プローブの連結鎖がいったん標的鎖から分離されると、その後は第3および第4のプローブとハイブリダイズされるが、これを連結して相補的な二次結合産物が得られる。連結産物は機能的に標的またはその相補体に相当するものだということを理解するのは重要なことである。ハイブリダイゼーションと連結のサイクルを繰り返すことで、標的配列を増幅することができる。複合的なLCR法については、すでに説明がなされている(WO 9320227)。Gap LCR(GLCR)は、プローブ同士が隣接しているのではなく、2〜3塩基分だけ離れたLCRである。
【０４６５】
mRNAの増幅について見ると、mRNAをcDNAに逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行うこと、米国特許第5,322,770号に記載されているように両方のステップに1つの酵素を用いること、あるいはMarshall R.L. et al. (PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994)に記載されているように非対称Gap LCR(RT-AGLCR)を使用することは、いずれも本発明の範囲内である。AGLCRはGLCRに手を加えてRNAの増幅を可能にしたものである。
【０４６６】
X.C.でさらに説明するように、これらの増幅方法の中には、単一ヌクレオチド多型の検出に特に適しており、標的配列の増幅と多型ヌクレオチドの同定を同時に行うことのできるものがある。
【０４６７】
PCRテクノロジーは、本発明で用いられる好ましい増幅手法である。さまざまなPCR手法が当業者間で周知である。PCRテクノロジーについては、Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A.  Ed.  in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997)および「PCR Methods and Applications」というタイトルの刊行物 (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。これらのPCR手順の各々で、増幅対象となる核酸配列の片側のPCRプライマーを、dNTPおよびTaqポリメラーゼ、PfuポリメラーゼまたはVentポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼと共に、適宜調製した核酸試料に付加する。試料中の核酸を変性させ、PCRプライマーを試料中の相補核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後のプライマーを伸長させる。その後、修飾、ハイブリダイゼーションおよび伸長をもう1サイクル開始する。このサイクルを複数回繰り返し、プライマー部位間に核酸配列のある増幅断片を作出する。PCRについては、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号をはじめとするいくつかの特許にも説明されている。
【０４６８】
バイアレリックマーカーを上述したようにして同定することで、本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片を増幅するためのプライマーとして利用可能な適切なオリゴヌクレオチドを設計できる。増幅は、本願明細書に記載の新規なバイアレリックマーカーの発見にもともと使っていたプライマーか、あるいは本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片の増幅が可能な任意のプライマーのセットを用いて行うことができる。プライマーは、適当な方法で調製可能なものである。たとえば、Narang S.A. et al.のリン酸ジエステル法(Methods Enzymol. 68:90-98, 1979)、Brown E.L. et al.のリン酸ジエステル法 (Methods Enzymol. 68:109-151, 1979)、Beaucage et al.のジエチルホスホラミダイト法(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)およびEP 0 707 592に記載されている固相法などの方法による直接化学合成。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、本発明によって、本発明のバイアレリックマーカー１つまたはそれ以上を有するDNA断片を増幅するためのプライマーが得られる。本願明細書に列挙する増幅プライマーは単なる一例であり、本発明のバイアレリックマーカー１つまたはそれ以上を有する増幅産物を産生するプライマーの他の組でもよいことは理解できよう。
【０４７０】
増幅対象となる各特異配列の異なる鎖と実質的に相補になるようにプライマーを選択する。本発明のプライマーの長さは、8〜100ヌクレオチド、好ましくは8〜50、8〜30またはより好ましくは8〜25ヌクレオチドの範囲とすることができる。これよりも短いプライマーでは標的核酸配列に対する特異性を欠きやすく、一般に鋳型との間の十分に安定したハイブリッド錯体を形成するには温度を低めにする必要がある。一方、上記の範囲よりも長いプライマーは作製に費用がかかり、まれに自家ハイブリダイズによってヘアピン構造が形成されてしまう。安定したハイブリッドの形成は、DNAの融解温度TMに左右される。Tmは、プライマー長、溶液のイオン強度およびG+C含有量に左右される。プライマーのG+C含有量が高くなればなるほど融解温度も高くなる。G:C対は水素結合3つで保持されているが、A:T対には水素結合が1つしかないためである。本発明の増幅プライマーのG+C含有量は、好ましくは10〜75%の範囲であり、より好ましくは35〜60%、最も好ましくは40〜55%の範囲である。特定のアッセイ条件でのプライマーの適切な長さは、当業者らが経験から判断するものである。
【０４７１】
増幅対象となるセグメントの長さはプライマー間の間隔によって決まる。本発明の文脈では、バイアレリックマーカーを持つ増幅セグメントの大きさは少なくとも約25bp〜35kbpであることができる。25〜3000bpの増幅断片が一般的であり、50〜1000bpの断片が好ましく、100〜600bpの断片が極めて好ましい。バイアレリックマーカーに対する増幅プライマーは、マーカーを持つDNA断片の特異的な増幅が可能なものであればどのようなものであってもよいことは理解できよう。セクションIIで説明したように、増幅プライマーを標識化または固相上に固定化する。
【０４７２】
X.C. DNA試料のバイアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法
従来技術において周知の適当な方法を用いて、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドを同定することができる。検出対象となるバイアレリックマーカーアレルが同定され、本発明において具体的に明記されているため、この検出は当業者であればさまざまな手法のうち適当なものを用いて行うことのできる一般的なものである。多くの遺伝子型判定方法では、興味の対象となっているバイアレリックマーカーを持つDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。現時点では標的またはシグナルを増幅するのが好ましいが、増幅を必要としない超高感受性の方法も本遺伝子型判定方法に包含される。バイアレリック多型の検出に利用することのできる当業者間で周知の方法としては、従来のドットブロット解析、Orita et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:27776-2770、1989)に記載されている一本鎖立体構造多型解析(SSCP)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二重鎖解析、ミスマッチ切断検出、Sheffield, V.C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 49:699-706, 1991)、White et al. (Genomics 12:301-306, 1992)、Grompe, M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5855-5892, 1989)およびGrompe, M. (Nature Genetics 5:111-117, 1993)に記載されている他の従来の手法があげられる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、米国特許第4,656,127に記載されているような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いるものがある。
【０４７３】
好ましい方法では、シークエンシングアッセイ、アレル特異的増幅アッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイによって、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接判定する。いくつかの好ましい方法について以下に述べる。極めて好ましい方法はマイクロシークエンシング法である。「シークエンシングアッセイ」という用語は、本願明細書では、二重鎖プライマー/鋳型錯体のポリメラーゼ伸展を意味し、従来のシークエンシングとマイクロシークエンシングの両方を含むものとする。
【０４７４】
1)  シークエンシングアッセイ
シークエンシング法によって多型部位に存在するヌクレオチドを判定することができる。好ましい実施形態では、シークエンシングの前に上述したようにしてDNA試料をPCR増幅する。ジデオキシ媒介法(Sanger法)またはMaxam-Gilbert法のいずれかを用いたDNAのシークエンシング方法は当業者間で周知である。かかる方法は、たとえば、Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Second Edition, 1989)に開示されている。選択的な方法としては、Chee et al. (Science 274, 610, 1996)に記載されているような高密度DNAプローブ配列へのハイブリダイゼーションがあげられる。
【０４７５】
好ましくは、染料-プライマーサイクルシークエンシングプロトコルを使用して、増幅したDNAで自動ジデオキシターミネーターシークエンシング反応を行う。シークエンシング反応での反応産物をシークエンシングゲルに仕込み、ゲル画像解析によって配列を求める。
【０４７６】
プールした試料での多型検出は、同一の位置に異なる塩基が発生することで泳動パターンのピークに重畳が見られることを利用して行われる。各ジデオキシターミネーターには異なる蛍光分子で標識化されているため、バイアレリック部位に対応する2つのピークが配列上の同一位置にある2つの異なるヌクレオチドに対応する別の色として現れる。しかしながら、2つのピークが存在するのは自然放射によるノイズが原因のアーチファクトの可能性もある。このようなアーチファクトを排除するために、2つのDNA鎖を配列決定し、ピークとの比較を実施する。多型配列として登録されるためには、両方の鎖で多型が検出される必要がある。
【０４７７】
上述した手順によって、バイアレリックマーカーを含む増幅産物を同定することができる。100個体からなるシークエンシングプールによって検出されるバイアレリック多型頻度の検出限界を既知のアレル頻度のシークエンシングプールで確認したところ、マイナーなアレルで約0.1である。
【０４７８】
マイクロシークエンシングアッセイ
マイクロシークエンシング法では、単一ヌクレオチドプライマー伸展反応によって標的DNAの多型部位にあるヌクレオチドを検出する。この方法は、標的核酸の興味の対象となっている多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズされる適切なマイクロシークエンシングプライマーを必要とするものである。ポリメラーゼを使用して、多型部位のヌクレオチドと相補な1つのシングルddNTP(鎖ターミネーター)でプライマーの3'末端を特異的に伸展させる。次に、組み込まれたヌクレオチドの同一性を適当な方法で判定する。
【０４７９】
一般に、マイクロシークエンシング反応は蛍光ddNTPを用いて行われ、伸展されたマイクロシークエンシングプライマーをABI 377シークエンシング装置での泳動によって解析し、EP 412 883に記載されているようにして取り込まれたヌクレオチドの同一性を判定する。あるいは、キャピラリー泳動を用いてさらに多数のアッセイを同時に行うようにすることもできる。
【０４８０】
さまざまな方法を利用してマイクロシークエンシングプライマーに付加されたヌクレオチドを検出する。Chen and Kwok (Nucleic Acids Research 25:347-353 1997)およびChen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94/20 10756-10761,1997)に、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した均一相検出方法が説明されている。この方法では、多型部位を有する増幅ゲノムDNA断片を、アレル染料標識ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび修飾Taq ポリメラーゼの存在下、5'-フルオレセイン標識プライマーでインキュベートする。鋳型に存在するアレルに特異な染料ターミネーターによって、染料標識プライマーを1塩基分だけ伸展させる。遺伝子型判定反応の終了時、反応混合物における2種類の染料の蛍光強度を、分離または精製などの処理を行わずに直接解析する。これらのステップはいずれも同一のチューブで行うことができるものであり、蛍光の変化をリアルタイムに監視できる。あるいは、MALDI-TOF質量スペクトロメトリによって伸展したプライマーを解析する。マイクロシークエンシングプライマーに付加された塊ごとに多型部位の塩基を同定する(Haff L.A. and Smirnov I.P., Genome Research, 7:378-388, 1997を参照のこと)。
【０４８１】
確立されたマイクロシークエンシング法あるいはこれに手を加えて開発または変更したものによって、マイクロシークエンシングを行う。他の選択肢としては、いくつかの固相マイクロシークエンシング法があげられる。プライマーまたは標的分子を固相に固定化または捕捉する不均一相アッセイで行うこと以外、基本的なマイクロシークエンシングプロトコルは先に説明したものと同じである。プライマーの分離と末端ヌクレオチドの付加解析を容易にするために、オリゴヌクレオチドを固相に付着させるか、親和分離とポリメラーゼ伸展とが可能な方法で修飾する。合成オリゴヌクレオチドの5'末端および内部ヌクレオチドをさまざまな方法で修飾し、ビオチン化などの異なる親和分離法を可能にすることができる。単一の親和性基をオリゴヌクレオチド上で使用する場合、取り込まれたターミネーターのリジェント(regent)からオリゴヌクレオチドを分離することができる。これには、物理的な分別またはサイズによる分別が必要である。2つ以上の親和基を使用すれば、2つ以上のオリゴヌクレオチドをターミネーター試薬から分離して同時に解析することができる。これによって、1回の伸展反応で複数の核酸種または一層多くの核酸配列情報を解析することができる。親和基は必ずしも初回刺激オリゴヌクレオチド上にある必要はなく、鋳型上にあってもよい。たとえば、ビオチン標識DNAとストレプトアビジン被覆マイクロ滴定ウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン粒子との相互作用を利用して固定化を行うことができる。同様に、オリゴヌクレオチドまたは鋳型を高密度状で固相に付着させる。ddNTPを取り入れたこのような固相マイクロシークエンシング反応はラジオ標識可能なものである(Syvanen, Clinica Chimica Acta 226:225-236, 1994)。あるいは、フルオレセインに結合させることも可能である(Livak and Hainer, Human Mutation 3:379-385,1994)。ラジオ標識ddNTPの検出は、シンチレーションベースの手法で行うことができる。フルオレセイン結合ddNTPの検出は、アルカリホスファターゼと抱合した抗蛍光抗体の結合後、色素生産性基質(p-ニトロフェニルホスフェートなど)と共にインキュベートすることを基本としている。考え得る他のレポーター検出イオン対としては、ジニトロフェニル(DNP)に結合したddNTPと抗DNPアルカリホスファターゼ抱合体(Harju et al.、Clin. Chem. 39/11 2282-2287, 1993)またはo-フェニレンジアミンを基質として用いたビオチン標識ddNTPと西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン(WO 92/15712)があげられる。もう1つの選択的固相マイクロシークエンシング手順として、Nyren et al. (Analytical Biochemistry 208:171-175, 1993)は、Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay(ELIDA)によってDNAポリメラーゼ活性を検出することを主体とする方法について述べた。
【０４８２】
Pastinen et al. (Genome research 7:606-614, 1997)は、固相ミニシークエンシング原理をオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用する単一ヌクレオチド多型の複合検出方法について説明している。固相(DNAチップ)に付着されたDNA プローブの高密度アレイについてはX.C.5でさらに説明する。
【０４８３】
一態様では、本発明によって、ポリヌクレオチドと、マイクロシークエンシングアッセイを行うことによって本発明のバイアレリックマーカー１つまたはそれ以上の遺伝子型を判定する方法が得られる。多型ヌクレオチドに隣接して3'末端を有するプライマーであればどのようなものを使用してもよいことは理解できよう。しかしながら、バイアレリックマーカー部位でのヌクレオチドの同一性の判定には、バイアレリックマーカーに隣接した配列のうち少なくとも8、12、15、20、25または30の連続したヌクレオチドを有するポリヌクレオチドと、対応するバイアレリックマーカーのすぐ上流に3'末端を有するポリヌクレオチドが非常に適している。
【０４８４】
同様に、本発明のどのようなバイアレリックマーカーまたはどのようなバイアレリックマーカーの組み合わせについてもマイクロシークエンシング解析を実施することは理解できよう。
【０４８５】
ポリメラーゼおよびリガーゼを利用したミスマッチ検出アッセイ
一態様では、本発明によれば、ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼおよび/またはリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイによって、生物学的試料で本発明の１つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーのアレルを判定する方法とが得られる。これらのアッセイは、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性を利用したものである。重合反応では、増幅プライマーの3'末端の正しい塩基対形成という点で特に厳密であり、標的DNA配列にハイブリダイズされた2つのオリゴヌクレオチドの結合は、ライゲーション部位付近、特に3'末端でのミスマッチに対して極めて感受性が高い。本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片を増幅するための方法については、上記のX.Bですでに説明した。
【０４８６】
アレル特異的増幅
アレル特異的増幅すなわち選択的な戦略によって、バイアレリックマーカーの2つのアレルを区別し、一方のアレルだけを増幅することができる。これは、多型塩基を一方の増幅プライマーの3'末端に所在させることによって達成される。プライマーの3'末端からの伸展がゆえに、この位置近辺でのミスマッチは増幅に阻害的な悪影響を及ぼす。したがって、適切な増幅条件下で、これらのプライマーのみをその相補アレルで直接増幅する。適切なアレル特異的プライマーおよびこれに対応するアッセイ条件の設計方法については当業者間で周知である。
【０４８７】
ライゲーション/増幅を利用した方法
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」(OLA)では、標的分子の一本鎖の当接配列にハイブリダイズできるように設計された2つのオリゴヌクレオチドを利用する。一方のオリゴヌクレオチドをビオチン標識し、他方を検出可能な状態で標識する。正確な相補配列が標的分子中に見つかった場合は、末端が当接して捕捉および検出が可能なライゲーション基質が得られるようにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。OLAは、単一ヌクレオチド多型を検出でき、Nickerson D.A. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923-8927, 1990)に説明されているPCR法と有利に併用される。この方法では、PCRを用いて標的DNAの指数関数的な増幅を行い、これをOLAを用いて検出する。
【０４８８】
単一ヌクレオチド多型の検出に特に適している他の方法としては、上記のX.Bにおいて説明したLCR(リガーゼ連鎖反応)およびGap LCR(GLCR)があげられる。上述したように、LCRでは2対のプローブを用いて特異的標的を指数関数的に増幅する。各オリゴヌクレオチド対の配列を選択し、これらの対が標的の同一鎖の当接配列とハイブリダイズできるようにする。かかるハイブリダイゼーションによって、鋳型依存性リガーゼの基質が形成される。本発明によれば、バイアレリックマーカー部位の同一鎖の近位配列と遠位配列とを有するオリゴヌクレオチドを用いてLCRを実施することができる。一実施形態では、どちらのオリゴヌクレオチドを設計してバイアレリックマーカー部位を持たせてもよい。かかる実施形態では、オリゴヌクレオチド上のバイアレリックマーカーと相補な特異的ヌクレオチドが標的分子に含まれているかまたは欠けている場合にオリゴヌクレオチドが連結されるように反応条件を選択する。別の実施形態では、WO 90/01069に記載されているように、オリゴヌクレオチドにはバイアレリックマーカーを持たせず、標的分子とハイブリダイズさせたときに「間隙」が形成されるようにする。この間隙に相補 dNTPまたは別のオリゴヌクレオチド対を「満たす」(DNAポリメラーゼによって媒介)。このように、各サイクルの終了時、各一本鎖には次のサイクルの間に標的として機能できる相補体があり、所望の配列の指数関数的なアレル特異的増幅が達成される。
【０４８９】
核酸分子のあらかじめ選択された部位でのヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、リガーゼ/ポリメラーゼ媒介Genetic Bit Analysis登録商標がある(WO 95/21271)。この方法は、あらかじめ選択された部位に存在するヌクレオチドと相補なヌクレオシド三リン酸をプライマー分子の終端に組み入れ、第2のオリゴヌクレオチドと連結させるものである。反応の固相に付加された特異的ラベルの検出または溶液での検出によって反応を監視する。
【０４９０】
2)  ハイブリダイゼーションアッセイ法
バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するための好ましい方法は、核酸ハイブリダイゼーションを利用するものである。かかる反応で都合良く用いることのできるハイブリダイゼーションプローブには、本願明細書で定義するプローブを含むと好ましい。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションなど、どのようなハイブリダイゼーションアッセイを用いてもよい(Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989を参照のこと)。
【０４９１】
ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基対によって2本の一本鎖核酸が二本鎖構造に形成されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補関係にある核酸鎖間またはミスマッチのマイナーな領域を含む核酸鎖間で起こり得る。一方の形式のバイアレリックマーカーとハイブリダイズされ、他方とはハイブリダイズされずに、異なるアレル型を区別することのできる特異的プローブを設計することができる。アレル特異的プローブは対で用いられることが多く、対の一方が起始アレルを含む標的配列とマッチし、他方が選択的アレルを含む標的配列と完全にマッチする。ハイブリダイゼーション条件は、アレル間のハイブリダイゼーション強度に有意な差が認められる程度に厳密なものでなければならず、好ましくは本質的にバイナリ応答を呈し、これによってプローブが一方のアレルとハイブリダイズされる。厳密な配列特異的ハイブリダイゼーション条件の下で、プローブは正確に相補関係にある標的配列とのみハイブリダイズされるが、このような条件は従来技術において周知である(Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989)。厳密な条件は配列依存であり、環境によって異なるものである。通常、厳密な条件は、規定のイオン強度およびpHでの特異配列の熱融点TMよりも約5℃低い温度に選択される。一例であり限定するものではないが、厳密度の高い条件を用いて行われる手順は次の通りである。6×SSC、トリス-HCl(pH 7.5) 50mM、EDTA 1mM、0.02% PVP、0.02%フィコール、0.02% BSAおよび変性サケ精子DNA 500μg/mlで構成される緩衝液にて65℃で8時間から一晩かけてDNAを含有するフィルタをプレハイブリダイゼーションする。好ましいハイブリダイゼーション温度である65℃にて48時間、変性サケ精子DNA 100μg/mlと32P標識プローブ5〜20×106cpmとを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルタをハイブリダイズさせる。あるいは、SSC緩衝液(1×SSCが0.15M NaClおよび0.05 M Naクエン酸塩に相当)の存在下、65℃でハイブリダイゼーションステップを行うことができる。続いて、2×SSC、0.01% PVP、0.01%フィコールおよびBSA 0.01%を含有する溶液中で37℃で1時間、次いで0.1×SSCで50℃にて45分かけてフィルタを洗浄することができる。あるいは、2×SSCと0.1% SDSまたは0.5×SSCと0.1% SDSまたは0.1×SSCと0.1% SDSを含有する溶液で68℃にて15分かけてフィルタを洗浄することができる。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブをオートラジオグラフィによって検出することが可能である。一例であり限定するものではないが、厳密度が中程度の手順は以下の通りである。DNAを含むフィルタをプレハイブリダイズし、次いで5×SSC緩衝液と標識プローブとの存在下、60℃の温度にてハイブリダイズさせる。続いて、2×SSCを含有する溶液で50℃にてフィルタを洗浄すると、ハイブリダイズさせたプローブをオートラジオグラフィで検出可能である。厳密度が高いまたは中程度の他の使用条件は当業者間で周知のものであり、Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989)およびAusubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)に記載されている。
【０４９２】
かかるハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができるものではあるが、固相ハイブリダイゼーションアッセイを利用すると好ましい。ハイブリダイゼーション反応の前に本発明のバイアレリックマーカーを有する標的DNAを増幅する。プローブと標的DNAとの間に形成される安定したハイブリッド二重鎖の有無を検出することによって、試料中の特異的アレルの存在を検出する。ハイブリッド二重鎖の検出は、さまざまな方法で行うことができる。標的またはプローブに結合する検出可能な標識を利用し、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にするさまざまな検出アッセイ形式が周知である。一般に、ハイブリダイゼーション二重鎖をハイブリダイズされなかった核酸から分離し、二重鎖に結合した標識を検出する。当業者であれば、洗浄ステップを用いて余分な標的DNAまたはプローブを洗い流すことは明らかであろう。プライマーおよびプローブに存在する標識を用いてハイブリッドを検出するには、標準的な異質アッセイ形式が適している。
【０４９３】
最近になって開発された2つのアッセイでは、分離や洗浄などを行わなくてもハイブリダイゼーションを利用してアレルを区別することができる(Landegren U. et al., Genome Research, 8:769-776,1998を参照のこと)。TaqManアッセイでは、累積する増幅産物に特異的にアニールされたDNA プローブを消化する。蛍光エネルギー移動によって相互作用するドナー-アクセプタ染料対でTaqManプローブを標識する。増幅時に進行中のポリメラーゼによってTaqManプローブが切断されると、消光アクセプタ染料からドナー染料が解離し、ドナー蛍光が大幅に増大する。2つのアレル変異体を検出するのに必要なすべての試薬を反応の最初に組み合わせ、結果をリアルタイムで監視することができる(Livak et al., Nature Genetics, 9:341-342, 1995を参照のこと)。選択的均質ハイブリダイゼーションを利用した手順では、分子的な指標がアレルの区別に用いられる。分子的な指標は、均質溶液中での特異的核酸の存在を示すヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。標的と結合すると、立体配置的な再編成が起こり、内部で消光されたフルオロフォアが保持される(Tyagi et al., Nature Biotechnology, 16:49-53, 1998)。
【０４９４】
本願明細書において提供されるポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションアッセイに利用して、生物学的試料のバイアレリックマーカーアレルを検出することができる。これらのプローブは、好ましくは8〜50ヌクレオチドを含み、本発明のバイアレリックマーカーを有する配列に対して十分に相補であってこの配列とハイブリダイズすることができ、かつ、好ましくは一方のヌクレオチドにおける変化のみについての標的配列を区別できる程度に特異的であることを特徴とする。本発明のプローブのGC含量は一般に10〜75%、好ましくは35〜60%、より好ましくは40〜55%の範囲である。これらのプローブの長さは、10、15、20または30から少なくとも100 ヌクレオチド、好ましくは10〜50、より好ましくは18〜35ヌクレオチドの範囲とすることができる。特に好ましいプローブは25ヌクレオチド長である。好ましくは、バイアレリックマーカーはポリヌクレオチドプローブの中心から4 ヌクレオチド以内にある。特に好ましいプローブでは、バイアレリックマーカーは前記ポリヌクレオチドの中心にある。これよりも短いプローブでは標的核酸配列に対する特異性を欠きやすく、一般に鋳型との間の十分に安定したハイブリッド錯体を形成するには温度を低めにする必要がある。一方、上記の範囲よりも長いプローブは作製に費用がかかり、まれに自家ハイブリダイズによってヘアピン構造が形成されてしまう。オリゴヌクレオチドプローブの合成方法については先に説明した通りであり、本発明のプローブにも適用可能である。
【０４９５】
好ましくは、本発明のプローブを固相に標識または固定化する。標識と固相についてはIIにおいて詳細に説明した。検出プローブは一般に、PCT国際特許出願公開第WO 92/20702号に開示されているペプチド核酸、米国特許第5,185,444号、同第5,034,506号および同第5,142,047号に開示されているモルホリノ類似物などの核酸配列または未荷電の核酸類似物である。プローブに別のdNTPが付加されることのないように、プローブを「非伸展可能な」状態にしてもよい。類似物はそれ自体が非伸展可能であるため、ヒドロキシル基が伸長に関与できなくなるようにプローブの3'末端を修飾することで、核酸プローブを非伸展可能にすることができる。たとえば、プローブの3'末端を捕捉標識または検出標識で官能化し、ヒドロキシル基を消費するかブロックする。あるいは、3'ヒドロキシル基を単に切断、置換または修飾してもよい。1993年4月19日出願の米国特許出願第07/049,061号には、プローブを非伸展可能にするのに使用できる修飾について記載されている。
【０４９６】
本発明のプローブはさまざまな目的に有用である。これらのプローブを、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションまたはmRNAに対するノーザンハイブリダイゼーションに利用することができる。また、プローブを用いてPCR増幅産物を検出することもできる。アレル特異的プローブへのハイブリダイゼーションをアッセイすることによって、特定の試料中でのバイアレリックマーカーアレルの有無を検出することができる。
【０４９７】
「ハイブリダイゼーションアッセイ」にはアレイ形式の高スループット並列ハイブリダイゼーションが特に包含され、これについては後述する。
【０４９８】
オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイに対するハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチド配列に基づくハイブリダイゼーションアッセイでは、完全にマッチする標的配列変異体とミスマッチ変異体とに対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の違いを利用している。オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイが選択された位置で固相(チップ)に付着した基本的な構造によって、多型情報に効率的にアクセスできる。各DNAチップには、格子状のパターンに配置され、ダイム硬貨程度の大きさまで小型化された個々の合成DNAプローブを数千から数百万含むことができる。
【０４９９】
チップテクノロジーは、すでにさまざまな事例に応用されて成功をおさめている。たとえば、突然変異のスクリーニングが、BRCA1遺伝子、S. cerevisiaeミュータント株およびHIV-1ウイルスのプロテアーゼ遺伝子でなされる(Hacia et al., Nature Genetics, 14(4):441-447, 1996、Shoemaker et al., Nature Genetics, 14(4):450-456, 1996、 Kozal et al., Nature Medicine, 2:753-759, 1996)。カスタマイズベースで、Affymetrix (GeneChipTM)、Hyseq (HyChip and HyGnostics)および Protogene Laboratoriesなどで、バイアレリック多型検出用のさまざまな形態のチップを作製することができる。
【０５００】
一般に、これらの方法では、標的配列に多型性のマーカーが含まれる個体から得た標的核酸配列セグメントと相補関係にあるオリゴヌクレオチドプローブの配列を利用している。EP785280には、単一のヌクレオチド多型検出用のタイリング(tiling)戦略について記載されている。簡単に説明すると、このアレイは一般に、多数の特異的多型について「タイル張り」してもよい。「タイリング」という用語は一般に、興味の対象となっている標的配列に相補な配列と、この配列のあらかじめ選択されたバリエーション(1カ所またはそれ以上の特定の位置でモノマーの基本セットのメンバすなわちヌクレオチド1つまたはそれ以上で置換されているなど)で構成される、規定されたオリゴヌクレオチドプローブのセットの合成を意味する。タイリング戦略はさらに、PCT国際特許出願公開第WO 95/11995号に記載されている。特定の態様では、多数の同定された特異的両アレルマーカー配列でアレイをタイル張りする。特に、アレイにタイル張りをして、それぞれが特定のバイアレリックマーカーまたはバイアレリックマーカーのセットに特異な多数の検出ブロックが含まれるようにする。たとえば、検出ブロックをタイル張りして多数のプローブが含まれるようにし、これらのプローブが特定の多型を含む配列セグメントにまたがるようにする。各アレルに対して相補関係にあるプローブが必ず得られるようにするために、バイアレリックマーカーで異なる対のプローブを合成する。多型塩基で異なるプローブだけでなく、一置換プローブも検出ブロックの中にタイル張りされるのが普通である。これらの一置換プローブは、多型自体の部分に塩基を有し、かつ多型からいずれかの方向に一定数まで塩基を有する。これが残りのヌクレオチド(A、T、G、C、Uから選択される)で置換されている。一般に、タイル張りされた検出ブロック内のプローブには、バイアレリックマーカーから5塩基離れたところまでの配列位置の置換基が含まれる。一置換プローブによって、タイル張りされたアレイの内部が制御され、実際のハイブリダイゼーションと人為的なクロスハイブリダイゼーションとを区別できる。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄が終了したら、このアレイを走査してアレイ上での位置を判定し、この位置に標的配列をハイブリダイズさせる。次に、走査後のアレイから得られるハイブリダイゼーションデータを解析し、バイアレリックマーカーのアレルのうち試料中に存在するもの(1つまたは複数)を特定する。ハイブリダイゼーションと走査は、PCT国際特許出願公開第WO 92/10092号および同第WO 95/11995号、さらに米国特許第5,424,186号に記載されているようにして行われる。
【０５０１】
5)  統合系
多型の解析に用いられるもう1つの技術にマルチコンポーネント統合系があげられる。この系では、PCRおよびキャピラリー泳動反応などのプロセスを単一機能の装置で簡略化かつ区分化する。かかる手法の模範例が、PCR増幅とキャピラリー泳動とをチップに統合することについて説明した米国特許第5,589,136号に開示されている。
【０５０２】
主にマイクロ流体系を使用する場合に統合系の使用を考慮することができる。これらの系は、ガラス、ケイ素、石英またはプラスチックウェーハ上に設計されたマイクロチャネルのパターンがマイクロチップ内に含まれたものである。試料の動きを、マイクロチップの異なるエリアで印加される電力、電気浸透的または流体静動力によって制御し、機能的な顕微値を得ると共に稼働部材なしでポンプ移動させる。電圧を変えることでマイクロ加工されたチャネル間での流体の流れを制御し、マイクロチップの異なる部分にポンプ送りする流体の流量を変化させる。
【０５０３】
バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するために、核酸増幅、マイクロシークエンシング、毛細管電気泳動、蛍光検出などのレーザー誘導検出方法に、マイクロ流体系を組み合わせてもよい。
【０５０４】
XI.  本発明のバイアレリックマーカーを用いた遺伝的解析の方法
複雑な形質の遺伝的解析に利用できる方法は、いくつかのカテゴリに分けられる(Lander and Schork, Science, 265, 2037-2048, 1994を参照のこと)。概して、本発明のバイアレリックマーカーは、遺伝子型と表現型との間の統計的に有意な相関を示すための従来技術において周知のどのような方法においても用途がある。バイアレリックマーカーを連鎖解析に使用したり、アレル共有法(allele-sharing methods)に使用する。好ましくは、本発明のバイアレリックマーカーを使用して、 関連性解析によって検出可能な形質に関連のある遺伝子を同定する。この方法では、罹患家系を使用する必要がなく、複雑かつ散発性の形質に関連のある遺伝子でも同定できる。
【０５０５】
本発明のバイアレリックマーカーを用いた遺伝的解析は、どのような規模で行ってもよい。本発明のバイアレリックマーカーのセット全体または本発明のバイアレリックマーカーのサブセットを使用する。いくつかの実施形態では、本発明のバイアレリックマーカーを含む別の遺伝マーカーのセットを用いる。上述したように、本発明のバイアレリックマーカーは、ヒトゲノムの完全または部分的な遺伝地図に含まれる。これらの異なる用途は、本発明および請求の範囲において特に考慮されているものである。
【０５０６】
XI.A.  連鎖解析
最近まで、検出可能な形質にリンクした遺伝子の同定は主に連鎖解析と呼ばれる統計学的な方法に基づくものであった。連鎖解析には、系図で観察される表現型と遺伝子型の継承パターンを説明するモデルが提案される。連鎖解析では、一家系内で複数の世代にわたって遺伝マーカーの伝達と特異的な形質の伝達との間の相関を確立することを基本としている。この方法では、一般にマイクロサテライトマーカーであるマーカー200〜300個程度を10Mbあたり1つの平均密度で分散させ、罹患した家系の全構成員の遺伝子型を判定する。家系に含まれる全構成員の遺伝子型を比較することで、複数セットのアレルを両親のハプロイドゲノム由来のものと考えることができる(ハプロタイピングまたは相判定)。次に、すべての家系の子孫において組換え断片の起源を判定する。形質と同時分離したものをトラッキングする。すべての家系から得たデータを蓄積した後、統計学的な方法を用いてマーカーと形質がすべての家系で独立に分離する尤度を判断する。形質と一緒に分離されるものもトラッキングされる。すべての家系から収集したデータをプールした後、統計学的な方法を用いて、すべての家系においてマーカーと形質が独立して分離する尤度を判断する。統計分析の結果、形質とリンクした遺伝子を持つ確率の高い1つまたは複数の領域をさらに別の解析用の候補として選択する。連鎖解析の結果は、マーカーと形質の独立的な分離の可能性が1/1000(LODスコア > 3として示す)未満である場合に有意(すなわち、その領域に検出可能な形質に必要な遺伝子が含まれる確率が高い)である。通常、連鎖解析でLODスコアが3よりも大きいとされた候補領域の長さは、2〜20Mbである。上述したようにして候補領域を特定した後、さらに別のマーカーを用いて組換え個体の解析を行うことで、候補領域を正確に把握することができる。連鎖解析研究では一般に、最大5,000のマイクロサテライトマーカーを使用しているため、連鎖解析の理論解像度はどんなに良くても平均約600kb程度に限られてしまう。
【０５０７】
明確なメンデル遺伝パターンを示し、浸透度(すなわち、アレルαの形質ポジティブ保因者の数と個体群におけるα保因者の総数の比)の高い単純な遺伝形質のマッピングには、連鎖解析が効果的に利用されている。ここ10年の間に、連鎖解析を用いて約100の病理学的形質生成遺伝子が発見された。これらの症例の大半では、罹患患者個体の過半数が親類にも罹患者があり、一般の個体群では検出可能な形質が認めらることはほとんどなかった(頻度0.1%未満)。アルツハイマー病、乳癌およびII型糖尿病などの約10の症例で、検出可能な形質は一層普通に見られたが検出可能な形質に関連のあるアレルは罹患個体群でもほとんど認められなかった。したがって、これらの形質に関連のあるアレルはすべての散発性症例の原因であるわけではなかった。
【０５０８】
連鎖解析はさまざまな欠点を伴う。まず、連鎖解析には、検討対象となる形質ごとに適した遺伝モデルの選択肢に対する信頼性の面で制約がある。さらに、上述したように、連鎖解析を使用して得られる解像度には限度があり、追加研究を行って連鎖解析によって最初に同定された2Mb〜20Mbの一般的な領域をさらに正確に分析する必要がある。また、連鎖解析法は、同義遺伝子および/または環境因子の作用が様々に組み合わさる状況などの複雑な遺伝形質に利用するのは困難であることが分かっている。このような場合、Risch, N.およびMerikangas,K.によって最近発表された(Science 273:1516-1517, 1996)ように、こうした状況に連鎖解析を適用する上で必要な罹患家系を相当数集めるのに労力と費用がかかりすぎてしまう。最後に、連鎖解析は情報性のある大きな家系がない場合の形質の研究には利用できない。一般に、これは散発性の症例と関連のある形質発生アレル(薬での治療に対するポジティブまたはネガティブな応答に関連するアレルなど)の同定を試みる場合などにあてはまる。
【０５０９】
XI.B.  アレル共有法
連鎖解析では系図における表現型と遺伝子型の遺伝パターンを説明するモデルを提唱しているが、アレル共有法ではモデルの作製を土台にすえているのではなく、むしろモデルを否定的にとらえている(Lander and Schork, Science, 265, 2037-2048, 1994を参照のこと)。具体的には、罹患した親族が偶然に生じると思われるよりも高い率で同一領域のコピーを継承するということを示し、染色体領域の遺伝パターンがランダムなメンデル分離とは一致しないことを証明しようと試みている。アレル共有法はノンパラメトリック(すなわち、形質の遺伝に関するモデルに何ら推定を必要としない)であるため、複雑な形質の解析にはこの手法の方が連鎖解析よりも有用であることが多い。罹患した親族は、たとえ浸透度が不完全かつポリジーン遺伝であったとしても過剰なアレル共有を示すはずである。アレル共有法は、系図において罹患した親族を研究し、染色体領域の特定のコピーがどの程度の頻度で同祖的(IBD)であるのかすなわち、どの程度の頻度で系図内の共通の祖先から遺伝するかを判断する。これが分かれば、座におけるIBD共有の頻度を偶然期待値と比較することができる。罹患した兄弟姉妹ペアの解析は周知の特殊な事例であり、この方法の最も単純な形である。
【０５１０】
しかしながら、アレル共有法では罹患した親族を解析するため、薬剤応答性の遺伝的解析または治療に対する副作用の解析においては、値に限度が生じることが多い。このタイプの解析では家族性の症例を利用できないため、こうした事例で使用するのは非実現的である。事実、同一の時期に同一の医薬品に曝露された2以上の個体を1家系から得られる尤度は極めて低い。
【０５１１】
XI.C.  関連性解析
本発明は、本発明のバイアレリックマーカーを用いて、検出可能な形質に関連のある一組の候補遺伝子の中から1つまたは複数の遺伝子を同定するための方法を含む。一実施形態では、本発明は、バイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーハプロタイプと形質との関連性を検出するための方法を含む。さらに、本発明は、本発明のバイアレリックマーカーアレルとの連鎖不平衡をアレルに引き起こす形質を同定するための方法を含む。
【０５１２】
上述したように、選択的な方法を利用して関連性解析すなわち、ゲノムレベルでの関連性解析、候補領域の関連性解析および候補遺伝子の関連性解析を行うことができる。好ましい実施形態では、本発明のバイアレリックマーカーを用いて候補遺伝子の関連性解析を行う。候補遺伝子解析は、明らかに、形質のバイオロジーに関する情報がいくつか利用できる場合に特定の形質に関係する遺伝子と遺伝子多型とを同定するための手っ取り早い方法になる。さらに、ゲノムレベルでの関連性解析を行うために、本発明のバイアレリックマーカーをヒトゲノムの遺伝マーカーの適当な地図に取り入れる。米国仮特許第60/082,614号に、バイアレリックマーカーの高密度地図を作製するための方法が記載されている。ゲノムの特異的候補領域(特異的染色体または特異的染色体領域など)を示す適当な地図に、本発明のバイアレリックマーカーをさらに取り入れてもよい。
【０５１３】
上述したように、関連性解析は一般的な母集団の中で行われ、罹患した家系での血縁個体についての研究に限られるわけではない。連鎖不平衡と関連性解析は、散発性の形質または多因子性の形質を解析できる極めて価値ある手法である。さらに、関連性解析では、連鎖解析よりも数段精細に形質誘発アレルをマッピングできる精細マッピングのための強力な方法が得られる。系図に基づく研究は、形質誘発アレルの所在を狭めてしまうにすぎない。したがって、本発明のバイアレリックマーカーを用いる関連性解析法および連鎖不平衡マッピング法を用いて、連鎖解析またはアレル共有法によって同定された候補領域における形質誘発アレルの所在を正確に判定できる。さらに、興味の対象となっている染色体セグメントを同定した後は、興味の対象となっている領域に本発明の候補遺伝子などの候補遺伝子が存在することで、形質誘発アレルを同定するための手軽な方法が得られる。本発明のバイアレリックマーカーを用いて、候補遺伝子が形質に関連していることを示すことができる。このような用途は、本発明と請求の範囲とで具体的に念頭においているものである。
【０５１４】
1)  患者対照母集団(取り込み基準)
関連性解析では家族性遺伝を対象としないため、大きな家系の系図を解析するのではなく、患者対照母集団に含まれる特定の遺伝マーカーまたはマーカーセットの有病率を比較する。これは、無相関患者(罹患または形質陽性)個体と無相関対照(無作為または未罹患または形質陰性)個体との比較に基づく患者対照研究である。対照群は、無作為に抽出した個体または未罹患(形質ネガティブな)個体で構成される。この対照群は、未罹患または形質ネガティブな個体で構成されると好ましい。さらに、対照群は、民族および年齢が患者母集団と一致すると好ましい。以下、「形質陽性母集団」、「患者母集団」および「罹患母集団」は同義のものとして使用する。
【０５１５】
関連性解析を用いた複雑な形質の詳細な解析において重要なステップは、患者対照母集団の選択である(Lander and Schork, Science, 265, 2037-2048, 1994を参照のこと)。疾病の定義を狭め、患者母集団を極端な表現型に限定することで、遺伝パターンがメンデルの法則に近い形質を用いて(同一の遺伝的な理由で疾病を持つ患者の)一様な解析を行いやすくなる。したがって、患者対照母集団の選択時の主なステップは、特定の形質または表現型を臨床的に定義することである。臨床表現型、発病年齢、家族歴および重症度の4つの基準を用いるとよいことが多い。好ましくは、本願明細書で説明するものなどの効率的かつ有意な関連性解析を行うために、研究対象の形質が研究対象の母集団で並数分布し、重複せずに明確な表現型が得られるのが好ましい(形質陽性および形質陰性)。それにもかかわらず、たとえこのような並数分布がなかったとしても(事実、一層複雑な遺伝的形質の場合などにはあり得る)、形質陽性表現型の群と形質陰性表現型の群に入れる個体を慎重に選択すれば、本願明細書において提案する関連性による方法で遺伝的形質を解析することはできる。選択手順としては、研究対象の形質における非並数表現型スペクトルから両端の個体を選択し、これらの形質陽性母集団と形質陰性母集団に、明らかに両極にあって好ましくは表現型に重複のない個体が含まれるようにする。これは、連続形質または定量的形質(血圧など)で特に有用である。形質分布の両極端にある個体を選択すれば、これらの複雑な形質に対する解析能力が高くなる。患者対照母集団での取り込み基準の定義は、関連性解析における重要な局面である。劇的に異なるが比較的均一な表現型を選択すると、研究対象となる母集団のサンプルサイズが十分に有意であるという前提で、関連性解析において効率的な比較を行うことができ、遺伝レベルでの著しい差異を検出できる可能性もある。
【０５１６】
好ましくは、本発明において提案するものなどの関連性解析に用いられる患者対照母集団は、並数分布の場合は対応する表現型それぞれが100%を示す、表現型的にみて一様な個体母集団で構成される。形質の分布が並数分布ではない場合は、形質陽性と形質陰性の各母集団は、各々が研究対象の母集団全体の1〜98%、好ましくは1〜80%、より好ましくは1〜50%、さらに好ましくは1〜30%、最も好ましくは1〜20%であり、重複のない表現型を示す個体から選択される、表現型的にみて一様な個体の母集団で構成される。いくつかの実施形態では、形質陽性群および形質陰性群が、研究対象とした母集団のうち極端な表現型が認められる個体で構成される。2つの形質表現型の違いが明確になればなるほど、バイアレリックマーカーで関連性を検出できる確率が高くなる。
【０５１７】
好ましい実施形態では、50〜300の形質陽性個体、好ましくは約100個体からなる第1の群は、その表現型に基づいて募集される。これらの研究には、ほぼ同数の形質陰性個体も取り入れる。
【０５１８】
本発明では、取り込み基準の典型例として、癌または前立腺癌の診断、抗癌剤または抗前立腺癌剤に対する応答の評価、抗癌剤または抗前立腺癌剤での治療に対する副作用があげられる。
【０５１９】
本発明のバイアレリックマーカーをはじめとするバイアレリックマーカーを用いる関連性解析の好適な例としては、以下の母集団を含む。
一種の癌が認められる患者母集団と健常な未罹患対照母集団、あるいは
一種の前立腺癌が認められる患者母集団と健常な未罹患対照母集団、あるいは
抗癌剤治療を行い、治療の結果として副作用が生じた患者母集団と、同一の抗癌剤で治療を行ったが副作用は認められなかった対照母集団、あるいは
抗前立腺癌剤治療を行い、治療の結果として副作用が生じた患者母集団と、同一の抗前立腺癌剤で治療を行ったが副作用は認められなかった対照母集団、あるいは
抗癌剤治療を行って有害反応が認められた患者母集団と、同一の抗癌剤で治療を行ったが有害反応が認められなかった対照母集団、あるいは
抗前立腺癌剤治療を行って有害反応が認められた患者母集団と、同一の抗前立腺癌剤で治療を行ったが有害反応が認められなかった対照母集団。
【０５２０】
2)  患者対照母集団でのアレル頻度の判定
「個体のバイアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法」という見出しでセクションXにて上述した方法の1つ、あるいはこのような目的に適した他の遺伝子型判定手順を使用して、各母集団でのバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定できる。標本プールまたは個々の標本の遺伝子型判定によって、母集団中でのバイアレリックマーカーアレルの頻度を判定できる。必要な遺伝子型判定数を減らす方法の1つに、標本プールを使用することがあげられる。標本プールを使用する上で主な妨げとなるものに、プールを構築する際における正確なDNAレベルを判定するための精度と再現性に関することがある。個々の標本を遺伝子型判定すれば、感受性、再現性および精度が高くなるため、本発明における好ましい方法でもある。好ましくは、各個体を個別に遺伝子型判定し、単純な遺伝子カウントを適用して、特定の母集団でのバイアレリックマーカーのアレルまたは遺伝子型の頻度を判定する。
【０５２１】
3)  患者対照母集団でのハプロタイプ頻度の判定
2つ以上の座で複相個体がヘテロ接合する場合、ハプロタイプの配偶子フェーズは分からないのが普通である。ハプロタイプを推論するための異なる戦略を用いて、この問題を一部解決する(Excoffier L. and Slatkin M., Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927, 1995を参照のこと)。1つの可能性として、多発性部位ヘテロ接合的な複相体を解析から除外し、ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体の個体のみを保持するようにしてもよいが、この方法では、標本構成の偏りと低頻度ハプロタイプの過小評価が生じる可能性がある。もう1つの可能性としては、非対称性PCR増幅(Newton et al., Nucleic Acids Res., 17:2503-2516, 1989、Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2757, 1989を参照のこと)または限界希釈によって1本の染色体を単離し、次いでPCR増幅する(Ruano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6296-6300, 1990を参照のこと)などの方法で、1本の染色体を独立に研究することができる。さらに、ときには家系における系統学的な情報を用いて複数のハプロタイプが推論できる場合もある(Perlin et al., Am. J. Hum. Genet., 55:777-787, 1994)。十分に近い関係のバイアレリックマーカーを得るために、特異的アレルの二重PCRによって標本をハプロタイプ判定する(Sarkar, G. and Sommer S.S., Biotechniques, 1991)。これらの方法は、技術的に複雑である、追加コストがかかる、大規模で一般化できない、あるいは偏りが出る可能性があるなどの理由で、完全に満足のいくものというわけではない。こうした問題を解決するために、Clark A.G. (Mol. Biol. Evol., 7:111-122, 1990)によって導入された、PCR-増幅したDNA遺伝子型のフェーズを推論するハーディワインベルグ平衡(任意交配)に基づくアルゴリズムを使用する。簡単に説明すると、この原理では、曖昧さのない個体である完全ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体を調べることで、標本中に存在するハプロタイプの予備リストを埋める。次に、同一標本に含まれる他の個体で前に認識したハプロタイプが出現する可能性をスクリーニングする。結果がポジティブであったものについては、すべての個体のフェーズ情報が解明されるか、あるいは未解明として定められるかのいずれかになるまで、すでに認識されたハプロタイプのリストに相補ハプロタイプを追加する。この方法では、マルチヘテロ接合性(multiheterozygous)の個体各々に単一のハプロタイプを割り当てるが、これらの個体に2つ以上のヘテロ接合部位がある場合には複数のハプロタイプもあり得る。母集団におけるハプロタイプ頻度を判定するための従来技術において周知の他の何らかの方法を用いてもよい。好ましくは、ハーディワインベルグ比を推測してハプロタイプ頻度の最大尤度推定値が得られる最尤推定(EM)アルゴリズム(Dempster et al., J. R. Stat. Soc., 39B:1-38, 1977)を使用する(Excoffier L. and Slatkin M., Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927, 1995を参照のこと)。このEMアルゴリズムを利用して、無相関個体から得た遺伝子型データしか使うことのできない患者でのハプロタイプ頻度を推定する。EMアルゴリズムは、データが曖昧であるおよび/または不完全である場合に有用な繰り返し最尤推定法を汎用化したものである。EMアルゴリズムを用いてヘテロ接合体をハプロタイプに分ける。ハプロタイプ推定については、「統計学的方法」という見出しの部分でさらに説明する。
【０５２２】
4)  連鎖不平衡に基づく遺伝的解析
連鎖不平衡は、2つ以上の座におけるアレルの非ランダムな関連性であり、複雑な形質に関する遺伝子マッピングを行う上での強力なツールとなる(Jorde L.B., Am. J. Hum. Genet., 56:11-14, 1995を参照のこと)。バイアレリックマーカーは、ヒトゲノム中で密に配置され多数を遺伝子型判定可能であるため、連鎖不平衡に基づく遺伝的解析においては特に有用なものである。
【０５２３】
病因変異を最初に母集団に導入する(新しく発生させた変異または変異保因者からの移植による)際には、1本の染色体に含まれ、被結合マーカーの単一の「背景」または「祖先の」ハプロタイプに所在するようにしておくことが必須である。結果として、マーカーと病因変異との間には完全な不平衡ができあがる。このとき、病因変異は特異的マーカーアレルのセットの存在下に限って認められる。以後の世代では、病因変異とマーカー多型との間に組換えが起こり、不平衡は次第に消失する。この消失のペースは組換え頻度の関数になるため、病因遺伝子から離れた位置にあるマーカーよりも病因遺伝子に最も近い位置にあるマーカーの方で明らかに高い不平衡のレベルが認められることになる。組換えによって途切れてしまわない限り、「先祖の」ハプロタイプおよび異なる座にあるマーカーアレル間の連鎖不平衡を系図と母集団の両方から追跡することができる。
【０５２４】
病因座とマーカー座との間の不平衡を示すパターンまたは曲線には、病因座に対応する部分に極大が1つ認められる。したがって、病因アレルとこれに近い位置で結合された遺伝マーカーとの間の連鎖不平衡の量から、病因遺伝子の位置に関する価値ある情報が得られる場合がある。病因座に関する精細マッピングでは、研究対象とした領域内のマーカー間に存在する連鎖不平衡のパターンについて知ることが大切である。上述したように、連鎖不平衡の解析によって得られるマッピング解像度は、連鎖解析によって得られる解像度よりもかなり高い。連鎖不平衡解析と併用したバイアレリックマーカーの密度の高さから、精細マッピング用の強力なツールが得られる。「統計学的方法」という見出しの部分で、連鎖不平衡を算出するための別の方法についても説明する。ついでながら、遺伝的形質のマッピング方法としての関連性解析は、連鎖不平衡現象を利用したものである。
【０５２５】
3)  関連性解析
上述したように、特異的アレル対は同一染色体上の異なる座に偶然に発生するわけではなく、偶然との違いが連鎖不平衡と呼ばれる。特定の遺伝子における特異的アレルは特定の形質の発生に直接関与しており、形質陰性母集団またはランダムな対照母集団での場合と比べると、罹患(形質陽性)母集団ではその発生頻度が統計的に高くなる。連鎖不平衡が存在する結果、形質誘発アレルを持つハプロタイプに存在する他のすべてのアレルの頻度も、形質陰性個体やランダムな対照例よりも形質陽性個体での方が高くなる。したがって、形質誘発アレルと連鎖不平衡状態にあるいずれかのアレル(特にバイアレリックマーカーアレル)と形質との間の関連性は、その特定のアレル領域に形質関連遺伝子が存在することを暗示するには十分なものである。関連性解析は母集団頻度に的をあてている。バイアレリックマーカーで患者対照母集団の遺伝子型を判定し、狭い範囲に絞って形質誘発アレルの所在を特定することができる。さらに、形質に関連のある特定の1マーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカーは、その形質と関連することになる。連鎖不平衡によって、考えられるあらゆる機能的多型をスクリーニングする方法に代わる手段として患者対照母集団での限られた数の遺伝的多型(特にバイアレリックマーカー)の相対頻度を解析し、形質誘発アレルを見出すことが可能になる。関連性解析では、無相関患者対照母集団でのマーカーアレルの頻度を比較し、複雑な形質を詳細に解析する強力なツールが得られる。
【０５２６】
関連性解析
候補遺伝子由来のバイアレリックマーカーを用いて関連性解析を行うための汎用的な戦略は、個体を2つのグループ(患者対照母集団)に分けて走査し、両方のグループに含まれる本発明のバイアレリックマーカーのアレル頻度を計測して統計的に比較することである。
【０５２７】
解析したバイアレリックマーカーのうち少なくとも1つまたはそれ以上で形質との間の統計的に有意な関連性が特定された場合、関連アレルが形質を誘発する直接の原因である(関連アレルが形質誘発アレルである)か、あるいは関連アレルが形質誘発アレルとの間で連鎖不平衡状態にあるという仮説を立てることができる。このうち、後者の方が可能性としては高い。通常、候補遺伝子の機能に鑑みた関連アレルの特異的な特徴から、関連アレルと形質との関連性に関して別の見通し(原因性または連鎖不平衡)が立つのが普通である。候補遺伝子内の関連アレルは形質誘発アレルではない可能性が最も高いが、実際の形質誘発アレルとの間で連鎖不平衡状態にあるということが、何らかの証拠によって示された場合、関連マーカー付近のシークエンシングによって形質誘発アレルを見出すことができる可能性がある。
【０５２８】
関連性解析は通常、連続した2つのステップで行われる。第1フェーズでは、1つまたは複数の候補遺伝子から得た少数のバイアレリックマーカーの頻度を、形質陽性および形質陰性の両母集団において判定する。解析の第2フェーズでは、関連の遺伝子から得たさらに高密度のマーカーを用いて、候補遺伝子の同一性と特定の形質の原因である遺伝座の位置とをさらに正確に求める。しかしながら、本発明に含まれる多くの候補遺伝子の場合でそうであるが、研究対象の候補遺伝子が比較的短い場合、有意な関連性を得るには第1フェーズのみで十分である。
【０５２９】
ハプロタイプ解析
上述したように、突然変異または転移のいずれかによって病因アレルを持つ染色体が最初に母集団に現れたとき、突然変異遺伝子は必ず、被結合マーカーの独特なセットを持つ染色体すなわち先祖のハプロタイプ上にある。このハプロタイプを複数の母集団にわたって追跡し、特定の形質との統計学的な関連性を解析することができる。個別に行う(アレルごとの)関連性解析を、ハプロタイプ解析とも呼ばれる多点関連性解析で補足することによって、関連性解析の統計学的な効果が大きくなる。このように、ハプロタイプ関連性解析によって、先祖のキャリアハプロタイプの頻度とタイプを定義することができる。ハプロタイプ解析は、個々のマーカーでの解析の統計学的な有意性を高めるという点で重要なものである。特に、一組のバイアレリックマーカーを用いて関連性解析を行うことによって、解析結果の価値が高くなり、マーカー1つで行う解析では偽陽性および/または陰性となる可能性があるデータを排除することができる。
【０５３０】
ハプロタイプ頻度解析の第1ステージでは、同定された本発明のバイアレリックマーカーのさまざまな組み合わせに基づいて考え得るハプロタイプの頻度を判定する。次に、このハプロタイプ頻度を形質陽性個体と対照個体の異なる母集団と比較する。統計的に有意な結果を得るのにこの解析で使わなければならない形質陽性個体の数は通常、30〜300の範囲であり、好ましい個体数は50〜150の範囲である。同じことが解析に使うランダムな対照個体や未罹患個体にもあてはまる。最初の解析の結果から、患者対照母集団でのハプロタイプ頻度、特定の被検形質が認められる特定のハプロタイプを持つ個体での相対危険度、評価した各ハプロタイプについての推定ｐ値が得られる。
【０５３１】
相互作用解析
本発明のバイアレリックマーカーを用いて、ポリジーンの相互作用によって生じた検出可能な形質に関連のあるバイアレリックマーカーのパターンを特定することができる。未結合座に所在するアレル間の遺伝的相互作用の解析を行うためには、本願明細書に記載の手法を用いた個体の遺伝子型判定が必要となる。選択したバイアレリックマーカーのセットに関して適切な統計学的有意性をもってなされるアレル相互作用解析は、本発明においてさらに詳細に説明したものと同様のハプロタイプ解析とみなすことができる。マイクロシークエンシングを用いて遺伝子型判定タイピング(genotyping typing)を行うと好ましい。
【０５３２】
形質とバイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーアレルのハプロタイプとの間の関連性について試験するための方法を以下に述べる。
【０５３３】
XI.D.  統計学的方法
一般に、形質および遺伝子型のいずれかを試験して統計的に有意な相関性を示すための従来技術において周知の方法であれば、どのような方法を用いてもよい。
【０５３４】
母集団でのハプロタイプ頻度の推定方法
上述したように、遺伝子型をスコアリングしても、ヘテロ接合体を区別できないことは珍しくないため、ハプロタイプ頻度の推論は決して容易ではない。配偶子フェーズが分からない場合、多座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度を推定することができる。当業者間で周知の適当な方法を用いてハプロタイプ頻度を推定することができる(Lange K., Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis, Springer, New York, 1997、Weir, B.S., Genetic data Analysis II: Methods for Discrete population genetic Data, Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA, USA, 1996を参照のこと)。最尤推定(EM)アルゴリズムを用いて最尤ハプロタイプ頻度を算出すると好ましい(Dempster et al., J. R. Stat. Soc., 39B:1-38, 1977; Excoffier L. and Slatkin M., Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927, 1995を参照のこと)。この手順は、配偶子のフェーズが不明である場合に多座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度の最尤推定値を得ることを意図した繰り返しのプロセスである。ハプロタイプ推定は通常、EM-HAPLOプログラム(Hawley M.E. et al., Am.  J.  Phys.  Anthropol., 18:104, 1994)またはArlequinプログラム(Schneider et al., Arlequin: a software for population genetics data analysis, University of Geneva, 1997)などを使用して、EMアルゴリズムを応用することによって行われる。EMアルゴリズムは、繰り返し最尤推定法を汎用化した方法であるが、これを以下に簡単に説明する。
【０５３５】
本願明細書の以下の部分では、フェーズが不明な多座の遺伝子型を表現型とし、フェーズが分かっている多座の遺伝子型を遺伝子型とする。
【０５３６】
N個の無相関個体からなる標本をK個のマーカーについてタイピングすると仮定する。観察するデータはフェーズ不明のK座表現型であり、これをF種類の表現型に分類できるものとする。H個の考えられる背後(underlying)のハプロタイプがあるとする(Kがバイアレリックマーカーの場合、H=2K)。
【０５３７】
表現型jについて、cj遺伝子型が考えられると仮定する。よって、以下の式が得られる。
【数１】
0003889927.tif 000004
式中、Pjは表現型jの確率、hkおよびhlは遺伝子型iを構成する2つのハプロタイプである。ハーディワインベルグ平衡に基づいて、pr(hk,hl)は次のようになる。
【数２】
0003889927.tif 000005
【０５３８】
EMアルゴリズムの連続したステップは次のように説明できる。
ハプロタイプ頻度の初期値から開始して、
【数３】
0003889927.tif 000006
となる。
これらの初期値から遺伝子型頻度を推定(推測ステップ)し、もう一組のハプロタイプ頻度(最大化ステップ)を推定する。
【数４】
0003889927.tif 000007
ハプロタイプ頻度のセットの変化が極めて小さくなるまで上記の2つのステップを繰り返す。
【０５３９】
停止基準は、2回の繰り返しでハプロタイプ頻度間に見られる差が最大でも10-7未満になった時点とすることができる。所望の推定精度でこれらの値を調節することができる。
【０５４０】
詳細に言えば、s回目の繰り返しにおいて、推測ステップで以下の式から遺伝子型頻度を算出する。
【０５４１】
【数５】
0003889927.tif 000008
この場合、表現型jに遺伝子型iが発生し、hkおよびhlが遺伝子型を構成する。それぞれの確率は、上記の式1および2から導き出される。
【０５４２】
次に、最大化ステップでは、特定の遺伝子型についてもう一組のハプロタイプ頻度を推定するだけである。この方法は、遺伝子カウント法(Smith, Ann. Hum. Genet., 21:254-276, 1957)として周知である。
【０５４３】
【数６】
0003889927.tif 000009
式中、δitは遺伝子型iにおけるハプロタイプtの数を示す指標変数である。この指標変数の値は、0、1または2である。
【０５４４】
最終的に得られる推定値が最尤推定値になるようにするために、出発値(values of departures)がいくつか必要である。得られた推定値を比較し、推定値間に差がある場合は最尤度につながる推定値の方を保持する。「ハプロタイプ判定法」という用語は、最尤推定アルゴリズムをはじめとして従来技術において周知のあらゆるハプロタイプ判定方法を意味する。
【０５４５】
マーカー間の連鎖不平衡算出方法
さまざまな方法を用いて任意の2つの遺伝位置間の連鎖不平衡を算出することができる。実用上、母集団から得たハプロタイプデータに統計学的な関連性試験を適用して連鎖不平衡を求める。
【０５４６】
本発明のバイアレリックマーカー(Mi,Mj)を少なくとも1つ含む任意のバイアレリックマーカー対間の連鎖不平衡を、Piazzaの式によってアレルの組み合わせ(Mi1,Mj1、Mi1,Mj2、Mi2,Mj1およびMi2,Mj2)それぞれについて算出することができる。
ΔMik,Mjl=ルートθ4-ルート(θ4+θ3)(θ4+θ2)、式中、
θ4=- - = Miにアレルkがなく、Mjにアレルlがない遺伝子型の頻度
θ3=- + = Miにアレルkがなく、Mjにアレルlがある遺伝子型の頻度
θ2= + - = Miにアレルkがあり、Mjにアレルlがある遺伝子型の頻度
【０５４７】
Weir (B.S. Weir, Genetic Data Analysis, Sinauer Ass. Eds, 1996)に記載されているように、δ(複合連鎖不平衡係数)についての最尤推定(MLE)法に基づいて、アレルの各組み合わせ(Mi1,Mj1、Mi1,Mj2、Mi2,Mj1およびMi2,Mj2)でバイアレリックマーカー(Mi,Mj)対間の連鎖不平衡(LD)を算出することもできる。この式によって、遺伝子型データのみが利用でき、ハプロタイプデータがない場合に、アレル間の連鎖不平衡を推定することができる。このようなLD複合試験では、標本母集団中の任意交配を仮定しないため、遺伝子型データについての他のLD試験よりも妥当性が高いように思われる。
【０５４８】
マーカー間の連鎖不平衡を算出するためのもう1つの手段は以下のとおりである。ハーディワインベルグ平衡を満たす一対のバイアレリックマーカーMi(ai/bi)およびMj(aj/bj)について、上述した方法で特定の母集団から4つの可能なハプロタイプ頻度を推定することができる。
【０５４９】
aiとajとの間の配偶子不平衡の推定は、単に、
【数７】
0003889927.tif 000010
である。
【０５５０】
ここで、pr(ai)はアレルaiの確率であり、ajはアレルajの確率である。また、pr(haplotype(ai,aj))は、上記の式3において推定されるとおりである。
一対のバイアレリックマーカーでは、MiとMjとの間の関連性を説明するのに必要な不平衡値は1つのみである。
【０５５１】
上記の値に対する正規化値を次のようにして算出する。
【数８】
0003889927.tif 000011
【０５５２】
むやみに実験を行わなくても他のLD算出方法も使用できることは、当業者であれば容易に理解できよう。
【０５５３】
適当なヘテロ接合率を持つ一組のバイアレリックマーカーでの連鎖不平衡を求めるには、50〜1000の無相関個体、好ましくは75〜200、より好ましくは100前後の無相関個体を遺伝子型判定すればよい。
【０５５４】
関連性試験
表現型と遺伝子型、ここではバイアレリックマーカーにおけるアレルまたはかかるアレルを構成するハプロタイプでのアレルの相関の統計学的な有意性を判断する方法が、従来技術において周知の統計学的試験によって判断されるが、この場合は統計学的な有意性の許容閾値が必要である。特定の方法および有意性閾値の利用方法は当業者間で周知のものである。
【０５５５】
患者母集団と対象母集団とにおけるバイアレリックマーカーアレルの頻度を判断し、これらの頻度を統計学的な試験結果と比較して関連性を試験し、研究対象のバイアレリックマーカーアレルと形質との相関を表す頻度に何らかの統計学的な有意差が認められるか否かを判断する。同様に、患者母集団と対象母集団において、特定のバイアレリックマーカーセットについて考え得るあらゆるハプロタイプの頻度を推定してハプロタイプ解析を行い、これらの頻度を統計学的な試験結果と比較して研究対象の表現型(形質)とハプロタイプとの間に統計学的に有意な相関が認められるか否かを判断する。遺伝子型と表現型との間の統計学的に有意な関連性を調べるための試験に有用な統計学的なツールを用いてもよい。好ましくは、ここで用いる統計学的試験は自由度1のカイ二乗試験である。P値を算出する(P値は、観察された値以上の統計値が偶然に発生する確率を示す)。
【０５５６】
統計学的有意性
好ましい実施形態では、別の診断試験用の前向きなものとしてか、あるいは早期の予防的治療用の予備的な起始点としての診断上の有意性、バイアレリックマーカー関連性に関係のあるp値が、単発のバイアレリックマーカー解析では好ましくは約1×10-2以下、さらに好ましくは約1×10-4以下であり、複数のマーカーを利用するハプロタイプ解析では、約1×10-3以下、さらに好ましくは1×10-6以下、最も好ましくは約1×10-8以下である。これらの値は、マーカーが1つであろうと複数のマーカーを併用したものであろうと、どのような関連性解析にも応用できるものと思われる。
【０５５７】
当業者であれば、上述した値の範囲を起始点として使用し、本発明のバイアレリックマーカーを用いた関連性解析を行うことができる。この場合、本発明のバイアレリックマーカーと癌および前立腺癌との間の有意な関連性を証明し、診断や薬剤でスクリーニングの目的で利用することができる。
【０５５８】
上述した方法を使用して、1つのマーカーアレルまたはハプロタイプの関連性を評価することで、特定の形質、特に本発明にあっては病因、好ましくは癌、より好ましくは前立腺癌が保因者に発生する危険度を推定することができる。親族での危険度についての有意性閾値を使用する基準標本母集団に適合化させる。
【０５５９】
これに関連して、癌または前立腺癌、抗癌剤または抗前立腺癌剤での治療に対する応答、あるいは抗癌剤または抗前立腺癌剤での治療に関連した副作用などの特定の形質との関連性に関する有意性を判断するために評価されるマーカーで考え得るすべての組み合わせまたはハプロタイプのうち、相対危険度係数が1よりも大きい、好ましくは約5以上、好ましくは約7以上のものは、同定されたハプロタイプを持つ個体について特定の形質が発生する「有意な危険度」を示していると考えられる。いわゆる「有意な危険」の境を定量化して正確に評価するのは困難である。特に、上記にて示したように、特定の母集団で観察される複数の形質は、単一の遺伝的素因によって生じたものではなく、環境的な要因や、さらには、明らかに無関係なハプロタイプ関連性が存在することなど、さまざまな要因から生じるという点で多因子性のものである。このため、有意な危険の評価時には、これらのパラメータを考慮に入れ、何らかの形で特定の形質の発生における外部パラメータの潜在的な重要性を重みとして付加する必要がある。本願発明者らは、上記の統計学的な解析に基づく価値のないモデルまたは理論に縛られることなく、特定の形質を発生させる「有意な危険」は、考慮すべき形質ごとに別の形で評価されると考えている。
【０５６０】
もちろん、癌および前立腺癌を治療または診断する現場にいる当業者の方々には、本発明は、特定タイプの癌を発症する危険性のある個体や、抗癌剤または抗前立腺癌剤による治療に対する副作用を示すまたはこれに応答するあるいはしない個体を絶対的に特定することを意図したものではなく、ある程度または一定尤度の発病率を表したり、あるいは特定の薬剤単品または併用での治療に対する特定の個体における副作用または応答を観察することを意図したものであることを理解して頂きたい。
【０５６１】
しかしながら、特定の環境では、この情報を用いて予防治療を開始したり、有意なハプロタイプを持っている個体で、微妙な症候群などの警告的な徴候を予測できるという点で、この情報は極めて価値のあるものなのである。癌の場合、潜在的な素因について知っていることは、たとえこの素因が絶対的なものでなかったとしても、極めて有意な態度で治療にあたったり、食餌を変更する、喫煙などの危険度の高い行動を控えるなどの提案を行ったりといったことがしやすくなる。同様に、潜在的な副作用に対する診断素因を治療にあたる医師に認識させ、かかる副作用が治験時に認められないようにすることも可能であろう。
【０５６２】
表現型の無作為化
上述した第1段階でのハプロタイプ解析の統計学的有意性を確認するために、患者対照個体から得た遺伝子型判定データをプールし、形質表現型に関して無作為化して、さらに別の解析を行うとよい場合がある。個々の遺伝子型判定データを2つのグループに無作為に割り当てる。このとき、各グループには第1段階で得られたデータの蓄積に用いた患者対照母集団から同数ずつの個体が含まれるようにする。第2のステージでのハプロタイプ解析は、これらの人為的なグループ、好ましくは第1段階での解析のハプロタイプに含まれていたマーカーのうち相対危険度係数が最も高かったマーカーについて行うと好ましい。この実験を50〜200回、好ましくは75〜125回繰り返す。このように繰り返し行うことで、有意なp値レベル約1×10-3未満で得られるハプロタイプの比率を求めることができる。
【０５６３】
実施例24
詳細な関連性解析
セクションI.D.で説明した、8p23座と前立腺癌とについて行った最初の関連性解析を、さらに精密さを高めて繰り返した。
【０５６４】
罹患個体および未罹患個体からのDNA標本の収集
セクションIで説明したようにして、病理学的記録または根治的な前立腺切除記録に基づいて、臨床取り込み基準に従って前立腺癌患者を募った。しかしながら、セクションIで述べた前立腺癌に罹患した個体のプールを、被検マーカーに応じて最初の185個体から275〜491個体の範囲まで大きくした。同様に、セクションIで述べた非疾患個体の対照プールを、被検マーカーに応じて最初の104個体から130〜313個体の範囲まで大きくした。
【０５６５】
罹患個体および対照個体の遺伝子型判定
セクションI.D.では、実施例5で説明したように、各個体のDNA標本にゲノムPCRを行って得られる増幅断片のマイクロシーケンシング反応によって各母集団におけるバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。
【０５６６】
関連性解析
それぞれ個別に行う解析と、ハプロタイピング解析の両方を利用して、PG1周囲の8p28座の650kbの領域にわたるマーカーを用いて関連性に関する結果を得た。図１6を参照のこと。この領域について先に行って得られた、図2に示す関連性についての結果と比較すると、領域全体を配列決定した関係で図16の方が細かくなっている。また、PG1の領域において関連性のピーク周囲で作製したマーカーの数も多く、その各々を個別に解析する(よって、この小領域内のデータの密度)試験を行った。検討した各マーカーについての図16に示すハプロタイピング曲線から、このマーカーと同一のBACを持つすべてのマーカーのうち任意の数のマーカーを用いて得られるハプロタイプの極大p値が、前記マーカーとの間でハーディワインベルグ不平衡状態にあることが分かる。
【０５６７】
図16に示すデータは、8p23座の中、特にPG1遺伝子であると同定された領域内の特異的な領域と前立腺癌との強い関連性を表している。PG1小領域についてそれぞれ行った解析での極大p値は3.10-3であるが、PG1小領域の外では、それぞれの関連性について得られるp値の大半が1.10-1未満である。ハプロタイピング解析で得られる極大p値はマーカー内側のPG1のBACで得られるものであり、その値は3.10-6に等しい。
【０５６８】
図17は、PG1遺伝子を含む160kbの領域内で関連性についてのそれぞれの解析で得られた結果を拡大したグラフである。この拡大部分に関与しているマーカーでは、BAC B0189E08の極めて末端に近い位置に所在しているマーカー4-14以外はいずれもBAC B0463F01(図16参照)にある。図17は、図16において極大ハプロタイプを構成していたすべてのマーカーを示している。これらのマーカーの中には、PG1遺伝子のプロモーター、エキソン領域またはイントロン領域内に所在していることが後に明らかになったものもある。遺伝子の外にあるマーカーはいずれも、20%を上回る頻度で存在する最小頻度アレルをもつ情報性のあるバイアレリックマーカーであった。一方、遺伝子内のマーカーは、このような情報性のあるマーカーと、最小頻度アレルの頻度が20%未満のマーカーとが混在したものであった。これらのデータから、図16に示す関連性値の先のピークを確認し、これをPG1遺伝子のある40kbに絞り込む。プロモーター部位から開始されるマーカーでは、マーカーNo. 99-1485との間に有意な関連性が観察され、3’ UTR部位での末端ではマーカーNo. 5-66との間に有意な関連性が観察される。
【０５６９】
図18Aは、PG1遺伝子を含む40kb内で関連性についてのそれぞれの解析で得られた結果を拡大したグラフである。これらのデータから、PG1遺伝子内の7つのマーカーに前立腺癌と関連のある1つのアレルがあり、p値はいずれも近い値で1.10-2よりも有意であることが確認できる。これらのマーカーは、具体的には、99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576、4-66である。図18Bは、PG1遺伝子内でのマーカーの位置と、各部位での考え得る2つのアレルを列挙した表である。各マーカーについて、疾病関連アレルを最初に示してある。症例と対照での頻度ならびに両者の差を示す。各個体マーカーの関連性のオッズ比およびp値も示す。
【０５７０】
図17、図18Aおよび図18Bに示すデータから、PG1遺伝子内のマーカーは前立腺癌との間に関連性があり、この関連性は有効であって考慮した症例が散発性の症例であるのか家族性の症例であるかとは無関係に、同様の有意性値を呈することが分かる。したがって、PG1アレルの中には、家族性または散発性のあらゆるタイプの前立腺癌にもあてはまる危険因子がいくつか存在するはずである。関連アレルのいくつかのp値が1.10-2前後にあるという事実から、これらのマーカーはすべて、互いに連鎖不平衡状態にあり、前立腺癌感作危険度に関連のあるPG1の評価に個別に利用できるのではないかと考えられる。上述した7つのマーカーの前立腺癌関連アレルは、いずれもオッズ比が約1.5であるが、これは、それぞれのマーカーごとに、かかるアレルを持たない個体に比べて前立腺癌に対する感受率が1.5倍高いということを意味している。
【０５７１】
PG1のあるBACでマーカーごとに得られた関連性についての結果の有意性を確認するために、1998年11月10日出願の仮特許出願第60/107,986号に記載されているような新たな統計学的な方法を実施した。
【０５７２】
ハプロタイプ解析
図17に示す160kbの領域内で4つのマーカー(マーカーNo. 4-14、99-217、4-66および99-221)を用いて行ったハプロタイプ解析研究の結果を図19Aに示す。これら4つのマーカーはいずれも、約150の症例と130の対照で前立腺癌との関連性が高いiep値が1.10-3よりも有意であることが分かっているものである。上述した4つのうち2つ、3つまたは4つのマーカーを用いたハプロタイプすべてについて、491の症例患者と317の対照個体で解析を行った。図19Aは、得られた中で最も有意なハプロタイプを個々のオッズ比と共に示すものである。ハプロタイプ11が最も有意(p値約3.10-6)であり、4つのマーカーアレルのうち3つ(4-14 C、99-217 Tおよび99-221 A)が両方のハプロタイプに共通かついずれも同様の領域をカバーしているという点で図4に示すハプロタイプ5と関係がある。マーカーを追加することと、症例または対照の個体数を増やすことの両方の方法でp値の違いを説明する。ハプロタイプ11のオッズ比(3を上回る)は極めて情報性の高いものであり、対照では3%しか存在しなかったが症例ではほぼ10%にのぼる。
【０５７３】
図19Bは、図19Aの結果を得るのに用いたものと同一のマーカーすなわち4つのマーカーおよび同一の個体を使用して、ハプロタイピングの結果を被検者の年齢および前立腺癌の症例が散発性のものであったか家族性のものであったかに応じて区分けしたものを示す表である。図19Bは、解析したすべての母集団を区分けした結果に相当するものであり、PG1関連アレルが、疾病の発病年齢とは無関係に前立腺癌の一般的な危険因子であることを示している。
【０５７４】
図18においてp値が1×10-2より有意であると示された、PG1遺伝子内の7つのマーカー(99-622、4-77、4-71、4-7、99-598、99-576および4-66)の組み合わせすべてに関するハプロタイピングの結果とオッズ比を算出する。これらのデータの一部を図20に示す。2-、3-、4-、5-、6-および7-マーカーハプロタイプすべてを試験した。図20は、各x-マーカーハプロタイプのカテゴリごとに、最も有意なハプロタイプを特定するものである。これらのうち、最も有意なハプロタイプは2-マーカーのハプロタイプ1であり、そのp値は約6.10-5、オッズ比は2であった。対照個体でのハプロタイプの頻度は15%であるが、症例の患者では26%である。これらの頻度は図20に示すすべてのハプロタイプで極めて似通っていることに注意されたい。したがって、この2マーカーハプロタイプを危険な患者での予後/診断について試験するだけで十分である。一方、3以上のマーカーを含むハプロタイプでは、さらに複雑な試験を行う。
【０５７５】
最後に、図21は、PG1遺伝子に見られる19のマーカーすべてを使用して、一連の考え得るx-マーカーハプロタイプ(x＝2、3または4)についてのカイ二乗値として測定した統計学的有意性の分布を示すグラフである。これらのデータから、PG1内の2-マーカーハプロタイプを試験するだけで十分であることが分かる。3-または4-マーカーハプロタイプでの試験によって解析の統計学的な関連性が増すわけではないためである。
【０５７６】
実施例25
寄与危険度
寄与危険度とは、特定の因子に曝露されたことが原因で表現型を呈している個体の母集団中での比率を示すものである。寄与危険度の詳細については、Holland, Bart K., Probability without Equations - Concepts for Clinicians; The Johns Hopkins University Press, pp. 88-90を参照のこと。本例では、検討対象となった表現型が前立腺癌であり、曝露は個々のPG1関連マーカーの1つのアレルまたは個体のゲノムに含まれるハプロタイプである。
【０５７７】
本研究での寄与危険度の算出に用いた式は次のとおりとした。
AR =  PE(RR-1) /  [PE(RR-1)+1]、式中、
ARは、アレルまたはハプロタイプの寄与危険度、
PEは、大きな母集団でのアレルまたはハプロタイプに対する曝露頻度であり、本研究では無作為に選んだコーカサス人男性からなる母集団、
RRは、相対危険度であり、本研究では、母集団が大きく前立腺癌の出現率が比較的低いため、相対危険度をオッズ比で概算する(オッズ比の値については図18Bおよび図20を参照のこと)。
【０５７８】
この場合、前立腺癌の優性伝達モデルすなわち、
PE =(NAA + NAB ) / N
を用いてPEを推定した。
式中、NAAは、特定の無作為母集団でアレルまたはハプロタイプに関連のある病因を持つ同型接合的個体の数、NABはヘテロ接合的個体が前記無作為母集団である数であった。NAAおよびNABについては、図18Bおよび図20に示すような無作為母集団でのアレル頻度を用いて算出し、Nは無作為母集団全体に含まれる個体の数であった。
【０５７９】
本願発明者らは、PG1遺伝子内のマーカーについて、疾病に関連のあるアレルの寄与危険度を算出し、これらの結果を図18Bに示した。図20では、2-マーカーハプロタイプの寄与危険度も同様に示した。これらのデータから、PG1の疾病に関連のあるアレルは、コーカサス人からなる大きな母集団の前立腺癌患者のうち約20%に存在し、有意な価値のある予後徴候診断ツールとなることが分かる。
【０５８０】
配列表のフリーテキスト
配列表には以下のフリーテキストを使用する。
同定方法Proscan
潜在的開始コドン
エキソン1
Tyr phos
上流側の増幅プライマー
多型性断片
多型塩基
下流側の増幅プライマー
相補体
上流側の増幅プライマー99-217-PU、SEQ ID 1 34216 34234から抽出
Klein、KanehisaおよびDeLisi同定方法、潜在的らせん
Eisenberg、Schwarz、Komarony、Wall同定方法、潜在的らせん
Prositeマッチ
潜在的チロシンキナーゼ部位、Prositeマッチ
潜在的カゼインキナーゼII部位、Prositeマッチ
潜在的ロイシンジッパ部位、Prositeマッチ
潜在的部位、Prositeマッチ
潜在的タンパク質キナーゼC、Prositeマッチ
潜在的cAMPおよびcGMP依存性タンパク質キナーゼ部位、 Prositeマッチ
プライマーオリゴヌクレオチド
SEQ ID 4からbox2、AF003136、 P33333、 P26647、 U89336、 U56417、 AB005623に存在
Z72511からbox2
SEQID 4からbox3、AF003136に存在
潜在的マイクロシークエンシングオリゴ
相補体潜在的マイクロシークエンシングオリゴ
多型性断片4-77、SEQ ID 1 12057 12103から抽出
多型性の断片 99-123、SEQ ID 21変異形
SEQ ID 22の塩基A；G
下流側の増幅プライマー99-217-RP、SEQ ID 1 34625 34645相補体から抽出
PG1(13680) SEQ ID 1の多型塩基C
停止コドン
潜在的
増幅オリゴヌクレオチド
シークエンシングオリゴヌクレオチド
Box II
Box III
Box I
SEQ 188、SEQ 265、SEQ 189、SEQ 266に対する上流側の増幅プライマー
SEQ 185、SEQ 262、SEQ 186、SEQ 263、SEQ 187、SEQ 264に対する下流側の増幅プライマー
4-20-149.mis1に対するマイクロシークエンシングオリゴ
【０５８１】
以上、特定の好ましい実施形態について本発明を説明してきたが、本願明細書の開示内容に鑑みて当業者であれば明白な他の実施形態も本発明の範囲に包含される。したがって、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ定義されるものと理解されたい。
【０５８２】
【表３】
0003889927.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】  PG1遺伝子を含有するBACコンティグと、このコンティグに沿ったバイアレリックマーカーの位置とを示す図である。
【図２】  前立腺癌の関連性解析での最初のスクリーニング結果と、低密度マーカー群についてカイ二乗値およびp値で測定したさまざまなバイアレリックマーカーの有意性とを示すグラフである。
【図３】  前立腺癌の関連性解析での最初のスクリーニング結果と、高密度マーカー群についてカイ二乗値およびp値で測定したさまざまなバイアレリックマーカーの有意性とを示すグラフである。
【図４】  ハプロタイプ解析の結果を示す表である。2〜9のマーカーに対して理論的にみて潜在的に異なるすべてのハプロタイプの中から、前立腺癌との関連性が強い11のハプロタイプを選択し、そのハプロタイプ解析結果をここに示す。
【図５】  図4に示すハプロタイプ解析の有意性(p値)を評価する実験の結果を示す棒グラフである。
【図６Ａ】  図４のハプロタイプ解析に用いられるバイアレリックマーカーを列挙した表である。
【図６Ｂ】  PG1遺伝子と連鎖不平衡状態にある別のバイアレリックマーカーを列挙した表である。
【図７】  PG1遺伝子のエキソン、スプライス部位、停止コドンおよびポリAサイトの位置を列挙した表である。
【図８Ａ】  PG1のゲノム構造をその最も豊富なmRNA転写物との比較で示す図である。
【図８Ｂ】  エキソンおよびイントロンを含む、PG1のゲノム構造を示す一層詳細な図である。
【図９】  PG1タンパク質と周知のタンパク質との間のいくつかの相同性を列挙した表である。
【図１０】  腫瘤の前立腺細胞株(PC3)および正常な前立腺細胞株(PNT2)におけるPG1の核周囲/原子核発現の蛍光顕微鏡写真をハーフトーン再現したものである。ベクター「PG1」は、第1〜エキソン8由来のすべてのコーディングエキソンを含む。PC3(上段のパネル)およびPNT2(下段のパネル)について見ると、核がヨウ化プロピジウムで標識された(IP、左のパネル)。2枚の写真が重なった時点で(右のパネル)分かるように、核内および核周囲でEGFP蛍光が検出された(GFP、中央のパネル)ことに注意されたい。
【図１１】  腫瘤の前立腺細胞株(PC3)および正常な前立腺細胞株(PNT2)におけるPG1/1-4の核周囲/原子核発現の蛍光顕微鏡写真をハーフトーン再現したものである。ベクター「PG1/1-4」は、エキソン1をエキソン4に連結し、エキソン2およびエキソン3が存在しない状態にする選択的スプライシングによる選択的メッセンジャーに相当する。PC3(上段のパネル)およびPNT2(下段のパネル)について見ると、核がヨウ化プロピジウムで標識された(IP、左のパネル)。2枚の写真が重なった時点で(右のパネル)分かるように、核内および核周囲でEGFP蛍光が検出された(GFP、中央のパネル)ことに注意されたい。
【図１２】  腫瘤の前立腺細胞株(PC3)におけるPG1/1-5の核周囲/原子核発現と、正常な前立腺細胞株(PNT2)における細胞質発現の蛍光顕微鏡写真をハーフトーン再現したものである。ベクター「PG1/1-5」は、エキソン1をエキソン5に連結し、第2、第3およびエキソン4が存在しない状態にする選択的スプライシングによる選択的メッセンジャーに相当する。PC3(上段のパネル)およびPNT2(下段のパネル)について見ると、核がヨウ化プロピジウムで標識された(IP)。PC3細胞では、2枚の写真が重なった時点で(右上のパネル)分かるように、核内および核周囲でEGFP蛍光が検出された(GFP、上段中央のパネル)ことに注意されたい。
【図１３】  通常の前立腺細胞株(PNT2)における変異形態のPG1(PG1mut229)の核周囲/原子核発現の蛍光顕微鏡写真をハーフトーン再現したものである。ベクター「PG1/1-7」は、第1〜エキソン6を含み、前立腺癌細胞株LNCaPのゲノムDNAにおいて同定された変異形態に相当する。核がヨウ化プロピジウムで標識された(IP、左のパネル)。2枚の写真が重なった時点で(右のパネル)分かるように、細胞質内および細胞質周囲でEGFP蛍光が検出された(GFP、下段中央のパネル)。
【図１４】  存在するエキソンによってヒトPG1について見出された14の選択的スプライス種の構造を示す図である。アスタリスク(*)は、その位置でフレームに停止コドンがあることを示している。スプライス種の右側にある右向き矢印は、読み取り枠がチャートから離れ続けていることを示している。エキソン間のスペースは、その特定の選択的スプライス種からエキソンが喪失していることを示している。上向き矢印は、状況に応じて1bisエキソン、3bisエキソンまたは5bisエキソンが挿入されたことを示している。6bisエキソン記号上のエキソン6のカッコ記号は、エキソン6から最初の60塩基が喪失し、よって6bisエキソンがエキソン6の切断型として存在することを示している。
【図１５】  ヒトPG1での考え得るスプライスジャンクションまたはエキソンの境界すべてに特異的なプライマー(配列番号 137〜178)の考え得る組み合わせすべてを用いて、通常の前立腺、通常の前立腺細胞株(PNT1A、PNT1BおよびPNT2)および腫瘤の前立腺細胞株(LnCaPFCG、LnCaPJMB、CaHPV、Du145、PC3および前立腺腫瘍(ECP5〜ECP24)のRNAについて行われた一連のRT-PCR実験の結果を列挙した表である。NTは、この実験を実施しなかったことを示す。[+]は、エキソン1、エキソン3、エキソン4、エキソン7およびエキソン8と選択的スプライス種との併用を示す。
【図１６】  それぞれ個別に行った(single point)解析とハプロタイピングに関する研究の両方を使用して、PG1周囲の8p23座の650kbの領域にわたるマーカーを用いた関連性解析を行った結果を示すグラフである。
【図１７】  PG1遺伝子を含む160kbの領域内でそれぞれ個別に行った関連性解析の結果を拡大して示すグラフである。
【図１８Ａ】  PG1遺伝子内の40kbにそれぞれ個別に行った関連性についての結果を拡大して示すグラフである。
【図１８Ｂ】  PG1遺伝子内でのマーカーの位置と、各サイトでの考え得る2つのアレルを列挙した表である。各マーカーについて、疾病関連アレルを最初に示してある。症例と対照での頻度ならびに両者の差を示す。各個体マーカーの関連性のオッズ比およびp値も示す。
【図１９Ａ】  図17に示す160kbの領域内で4つのマーカー(マーカーNo.4-14、99-217、4-66および99-221))を用いて行ったハプロタイプ解析に関する研究の結果を示す表である。
【図１９Ｂ】  図19Aの結果を得るのに用いたものと同一のマーカーすなわち4つのマーカーおよび同一の個体を使用して、ハプロタイピングの結果を被検者の年齢および前立腺癌の症例が散発性のものであったか家族性のものであったかに応じて区分けしたものを示す表である。
【図２０】  p値が1.10-2よりも有意で図18に示された、PG1遺伝子内での7種のマーカー(99-622、4-77、4-71、4-73、99-598、99-576、4-66)の組み合わせについて、ハプロタイピングの結果およびオッズ比を列挙した表である。2-マーカーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイプ、4-マーカーハプロタイプ、5-マーカーハプロタイプ、6-マーカーハプロタイプおよび7-マーカーハプロタイプすべてを試験した。
【図２１】  図18Bに列挙した19のマーカーすべてを使用して、一連の考え得るx-マーカーハプロタイプ(x＝2、3または4)についてのカイ二乗値として測定した統計学的有意性の分布を示すグラフである。
【配列表】
0003889927.tif 000013
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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