(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗精製ダウノマイシンからダウノマイシンを吸着させた疎水性多孔質合成樹脂担体を、メタノールを含有するｐＨ３．５〜６に緩衝化された水性溶液でダウノマイシンを溶出し、そして溶出液から少なくとも９８％の相対純度を有する精製されたダウノマイシンを回収することを特徴とするダウノマイシンの精製方法。
【請求項２】
粗精製ダウノマイシンを吸着させた疎水性多孔質合成樹脂担体が、ｐＨ約１〜５の酸性水溶液に粗精製ダウノマイシンを溶解させた溶液と疎水性多孔質合成樹脂担体との接触により前記担体にダウノマイシンを吸着させ、次いで前記酸性水溶液でダウノマイシンを吸着した前記担体を洗浄することにより調製される請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
ダウノマイシンを吸着した担体を洗浄するのに用いられる酸性水溶液が緩衝化されている請求項２記載の精製方法。
【請求項４】
メタノールを含有するｐＨ３．５〜６に緩衝化された水性溶液が、クエン酸緩衝液により緩衝化されている請求項１〜３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
メタノールを含有するｐＨ３．５〜６に緩衝化された水性溶液が、メタノール対水溶液の容量比が８０対２０〜２０対８０を有する請求項４記載の精製方法。
【請求項６】
粗製ダウノマイシンが相対純度８０〜９６％を有する請求項１〜５のいずれかに記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アントラサイクリン抗生物質ダウノマイシンの高純度製品を得るための精製方法に関する。
背景技術
ダウノマイシン（ダウノルビシンとも称されている）は、放線菌の培養液から得られることが知られており、実験腫瘍に対して広域抗癌スペクトルを有するアントラサイクリン抗生物質である（米国特許第３，６１６，２４２号明細書参照）。そして、現に、癌化学療法剤として臨床的にも広く利用されている。
ダウノマイシン（以下、「ＤＭ」と略記する場合あり）を初めとする類似のアントラサイクリン抗生物質は、前記培養液から粗精製したものを、カチオン交換樹脂（例、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＣ５０）にかけ、塩化ナトリウム含有水または水と塩化ナトリウムを含有するメタノールで溶離することにより、さらに精製されている（特公昭４９−４４３４７号、特開昭５０−１５８８０号）。また、重合体状イオン交換樹脂（例、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＥＲ１８０）もしくはＣＭセファロース樹脂（例、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＨＢ）に前記抗生物質を吸着させた後、酸性の水と極性溶媒の混合物を用いて溶離する工程を含む方法も公表されている（特開昭５９−１１８７９７号ならびにそれに由来する特公平４−３９４７６号、分割出願の特開平７−２５２２９１号：これらに対応する米国特許第４，８６１，８７０号）。さらに、後者の公報には、上記重合体状イオン交換樹脂で処理する前の予備精製工程において吸着性多孔質合成樹脂担体（例、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＸＡＤ２）に粗精製アントラサイクリン抗生物質を吸着させた後、水／メタノール（５：１）（ｖ／ｖ）混合物を用いて前記抗生物質を溶離することも記載されている。
以上の従来技術の吸着、溶離手段によれば、一定の高純度ＤＭを得ることもできるようであるが、高純度製品を得ようとすればする程、目的とするＤＭの回収率が低下し、逆に回収率を高めようとすればする程、製品の純度を高めることができない。特に、培養液からＤＭを回収しようとする場合、その後の結晶化を初めとする精製工程により除去することが困難な不純物（たとえば、後述するＨＰＬＣ分析でＤＭより保持時間の大きいもの）が精製ＤＭに随伴してくる傾向がある。
したがって本発明の目的は、出発粗精製ＤＭから高純度ＤＭを高い回収率で、しかも簡便な方法で得ることのできる精製方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、高純度製品を得るためのイオン交換樹脂（例、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＥＲ１８０）を用いる処理に先立って、予備精製の工程で使用されている吸着性（もしくは疎水性）合成樹脂担体を用い、特定の溶離（または溶出）条件を選ぶことにより、高回収率でかつ高純度のＤＭを得ることを見い出した。たとえば、上記特開昭５９−１１８７９７号公報に記載されているように、高純度製品を得るためにイオン交換樹脂の使用が必須である予備精製工程で使用されていたにすぎない疎水性合成樹脂担体の使用だけで、上記課題が解決できることは全く驚くべきことであろう。
したがって本発明によれば、粗精製ダウノマイシンからダウノマイシンを吸着させた疎水性多孔質合成樹脂担体を、水混和性有機溶媒を含有するｐＨ２．５〜６に緩衝化された水性溶液でダウノマイシンを溶出し、溶出液から精製されたダウノマイシンを回収することを特徴とするダウノマイシンの精製方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明にいう粗精製ダウノマイシン（ＤＭ）は、それを含有する培養液から、それ自体既知の分離もしくは精製方法に従って菌体その他の固形物が除去され、ＤＭがある程度濃縮されているものであれば、ＤＭの含有率はいかなるものであってもよい。このような分離もしくは精製方法には上記従来技術として紹介した方法をも包含され、それらの方法を介して得られる比較的純度の低いＤＭ含有物をも包含される。また、もし該当する場合には、半合成工程を経て得られる一定の不純物を随伴するＤＭ含有処理物をも、本発明にいう粗精製ＤＭに包含される。
しかしながら、本発明方法がより効率的に適用できるのは、ＤＭの相対純度が約８０％以上、好ましくは８０〜９６％である。本明細書で使用する場合の「相対純度」とは、試料を後述するＨＰＬＣ分析した結果得られる各成分の溶出挙動を示す総ピーク面積に対するＤＭ由来のピーク面積の割合を意味する。
粗精製ＤＭを吸着させるのに使用する疎水性多孔質合成樹脂担体としては、本発明の目的に沿う機能を有するものであればいかなる種類のものであってもよいが、具体的にはスチレンとジビニルベンゼンから特殊な方法で重合して得られる多孔質（もしくは多孔性）ポリマーを挙げることができる。このような多孔質ポリマーは、製造方法に従って、比表面積、細孔容積を異にするが、後述する本発明の具体例に沿って使用することにより、所定の効果を得ることができるものであれば、それらの物性により限定されない。
しかしながら、一般的に、比表面積が４００〜８００ｍ２／ｇの範囲にあり、細孔容積が０．６５０〜１．５ｍｌ／ｇにあるものが好適に使用できる。このような多孔質ポリマーは、市販されているものから選ぶこともでき、限定されるものでないが、三菱化学株式会社製のダイヤイオン（商標）ＨＰ２０（以下、ＨＰ２０と略記する）または同ＨＰ２０ＳＳ（以下、ＨＰ２０ＳＳと略記する）を都合よく使用することができる。
上記のような、粗精製ダウノマイシンを吸着させた疎水性多孔質合成樹脂担体からのＤＭの溶出は、本発明によれば、水混和性有機溶媒を含有するｐＨ２．５〜６に緩衝化された水性溶液が使用される。水混和性有機溶媒は本発明の目的に沿う限り特に限定されるものでないが、経済性と溶出効率の両者を兼ね備えたものとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンを挙げることができる。これらのうち、特に好適なものは、メタノールおよびアセトンである。このような溶媒を使用するとき、これらの溶媒と水溶液は、使用する溶媒によって最適混合比が変動するので限定できないが、一般的に、溶媒対水溶液は、それぞれ容量基準で、８０対２０〜２０対８０の割合で使用できる。たとえば、メタノールを使用する場合には、メタノール／水溶液は、６０〜８０／２０〜４０、特に、約７０／約３０の割合で使用でき、アセトンを使用する場合には、アセトン／水溶液は、２０〜４０／８０〜６０、特に約３０／約７０の割合で使用できる。
これらの有機溶媒を含有する水性溶液は、特に、ｐＨ２．５〜６に緩衝化されていることが必要である。ｐＨが２．５より低いと、一般的に得られる製品におけるＤＭの相対純度が低くなる傾向があり、一方、ｐＨが６を超えるとＤＭの回収率が低くなる傾向がある。緩衝化に使用される緩衝剤は、製品に悪影響を及ぼさないものであれば、いかなる緩衝剤であってもよい。限定されるものでないが、かような緩衝剤としては、重フタル酸カリウム−ＨＣｌ、グリコール酸−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム−ＨＣｌ、クエン酸カリウム−ＨＣｌ、クエン酸カリウム−クエン酸、コハク酸−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、酢酸ナトリウム−ＨＣｌ、酢酸ナトリウム−酢酸、クエン酸−Ｎａ２ＨＰＯ４、酒石酸−酸石酸ナトリウム、乳酸−乳酸ナトリウム、アコニチン酸−ＮａＯＨ、コハク酸−ＮａＯＨ等を挙げることができる。これらのうち、特に、クエン酸ナトリウム−ＨＣｌが好ましい。
また、緩衝剤の濃度は、使用する緩衝剤の使用によって、０．０５Ｍ−１Ｍのものが使用できるが、好ましい例であるクエン酸ナトリウム−ＨＣｌの系では、約０．１Ｍクエン酸ナトリウムを使用するのが好適である。
上記樹脂担体からそれに吸着しているＤＭを溶出する操作温度は、ＤＭまたは樹脂担体に変性などの悪影響を及ぼさない温度であれば、どのような温度であってもよいが、室温（１０〜３０℃）、付近が都合よい。さらに、かような樹脂担体は、通常、カラムに充填した態様で操作するのがよいが、これに限定されない。
粗精製ＤＭを吸着させた疎水性多孔質合成樹脂担体の調製は、上記溶出に悪影響を及ぼさない方法に従ったものであれば、どのような方法でＤＭが前記樹脂担体に吸着されたものであってもよい。しかしながら、具体的な調製は、ｐＨ約１〜５の酸性水溶液（以下、酸性水ともいう）に粗精製ＤＭを溶解させた溶液と前記担体との接触によりその担体にＤＭを吸着させ、次いで前記酸性水でＤＭ吸着樹脂担体を洗浄することによるのが好ましい。酸性水は粗精製ＤＭを溶解するのに使用するものと、ＤＭ吸着樹脂担体を洗浄するものとが、同一または異っていてもよい。酸性水のｐＨ調節は、単に塩酸によって行ってもよいが、上述したような緩衝剤を使用して行ってもよい。好ましくは、０．１Ｍクエン酸水溶液を使用することができる。また、酸性水のｐＨは、約２．５付近に調節することが、特に好ましい。このような酸性水による洗浄は、洗浄液中に不純物の存在が認められなくなるまで続ける。洗浄液中の不純物の存否は、たとえば分光光度計を使用して確認すればよい。
以上の本発明方法によって精製されたＤＭは、必要により、同一または異なる構成からなる上記方法で繰り返し処理してもよい。
また、上記の方法により精製されたＤＭ含有画分からのＤＭの回収は、有機溶媒を留去した後の溶液から、クロロホルムなどを使用するそれ自体既知の抽出方法により回収してもよい。しかしながら、好ましくは、相対純度が一定値以上の画分を集め、その溶液を水酸化ナトリウムなどでｐＨ約８．５に調節し、溶液量の約半量のクロロホルムを加えてＤＭを抽出し、有機溶媒相を減圧下に濃縮乾固した後、これに少量のクロロホルム／メタノール（２０：１）を加えて溶解し、次いでこの溶液を過剰量のヘキサン中に加えてＤＭを析出せしめ、析出したＤＭを濾取するのが、より高品位のＤＭを回収できるので好ましい。
以下、具体例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの例は、本発明ならびに本発明の作用および効果の理解をより容易にする目的で提供するものである。
例１（比較例）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬで洗浄した後、メタノール−酸性水（ＰＨ２．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＨ２．５）として示した。
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム：ＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ  ＯＤＳ、２５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．（ＢＥＣＫＭＡＮ）
移動相：水−アセトニトリル（６２：３８）、リン酸でｐＨ２．２±０．２に調整
流速  ：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出  ：４９５ｎｍ
例２（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ２．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ２．５として示した。
例３（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ３．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ３．０として示した。
例４（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ３．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ３．５として示した。
例５（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ４．０として示した。原料に用いた低純度ＤＭ及び相対純度８８％以上のＤＭ分画を集めたもののＨＰＬＣ分析チャートを、それぞれ図２及び図３に示す。
例６（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ４．５として示した。
例７（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ５．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ５．０として示した。
例８（本発明）低純度ＤＭの精製
低純度ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量３０５ｍｇ、相対純度８０．３％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）２００ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ８６、８８、８９および９０％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図１Ａ〜Ｃ中にｐＨ６．０として示した。
例９（比較例）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び水１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−水（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｃｏｎｔｒｏｌ（Ｈ２０）として示した。
例１０（比較例）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬで洗浄した後、メタノール−酸性水（ＰＨ２．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＨ２．５）として示した。
例１１（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ２．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ２．５として示した。
例１２（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ３．０）（７０：３０）で溶出させた。相対純度９８％以上のＤＭ分画を集め、ＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ３．０として示した。
例１３（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ３．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。この実験は２回行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ３．５として示した。
例１４（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。この実験は２回行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ４．０として示した。
例１５（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．５）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。この実験は２回行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ４．５として示した。
例１６（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ５．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。この実験は２回行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ５．０として示した。
例１７（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０のカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７および９８％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図４Ａ〜Ｃ中にｐＨ６．０として示した。
例１８（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５，ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０ＳＳのカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１００ｍＬで洗浄した後、メタノール−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．０）（７０：３０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７、９８および９９％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図５Ａ〜Ｃ中に黒棒（７０％メタノール）として示した。
例１９（本発明）より高純度の原料ＤＭの精製
より高純度の原料ＤＭ粉末５００ｍｇ（ＤＭ含量４６３ｍｇ、相対純度９５．８％）を酸性水（ｐＨ２．５、ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解して、この溶液をＨＰ２０ＳＳのカラム（５０ｍＬ）にかけた。同酸性水５０ｍＬ及び０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１００ｍＬで洗浄した後、アセトン−０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．０）（３０：７０）で溶出させ、ＤＭ溶出分画のＨＰＬＣ分析を行った。相対純度が、それぞれ９６、９７、９８および９９％以上のＤＭ分画を集めたときの、ＤＭの回収率、回収液量、相対純度を図５Ａ〜Ｃ中に白抜き棒（３０％アセトン）として示した。
原料に用いたより高純度の原料ＤＭ及び相対純度９８％以上のＤＭ分画を集めたもののＨＰＬＣ分析チャートを、それぞれ図６及び図７に示す。
例２０（本発明）精製ＤＭの回収
例１８において、相対純度が９８％以上のＤＭ分画を集めた溶液からＤＭを回収した。集めた溶液のｐＨを４Ｎ水酸化ナトリウムで８．５とし、溶液量の約半量のクロロホルムを加えてＤＭを抽出した。ＤＭを含有する有機溶媒相を減圧下に濃縮乾固した後、これに少量のクロロホルム／メタノール（２０：１）を加えて溶かし、過剰量のヘキサン中に添加した。析出したＤＭを濾取し、減圧下に４０℃で一夜乾燥した。このとき、得られたＤＭ粉末の収量は２４２ｍｇであった。
以上の例より、図１Ａ〜Ｃによれば、本発明方法はコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）（比較例）に比べて、相対純度の高い製品を高回収率で得ることができることがわかる。具体的には、比較例では相対純度が８９％以上の画分（黒丸および黒菱形）は得られず、しかも８８％以上の画分（黒四角）の回収率は１０％以下と低いにもかかわらず、本発明方法、たとえばｐＨ２．５では８８％以上の画分の回収率は６５％を超え、しかも相対純度が８９％以上の画分の回収率も１０％を超える。また、本発明に従う、ｐＨ５．９８では、相対純度が９０％以上の画分く黒菱形）でさえも回収率が１５％を超えている。これらの傾向は、水混和性有機溶媒として、アセトンを使用する場合も同様に認められる（図５Ａ〜Ｃ参照）。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｃは、例１〜８におけるＤＭの回収率、回収液量および相対純度を示すグラフである。
図中の横座標を基準に、ｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＨ２．５）、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０およびｐＨ６．０が、それぞれ例１〜８の結果に対応する。
図２は、出発物質である低純度ＤＭ粉末（相対純度８０．３％）のＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートである。
図３は、例５（本発明）によって得られたＤＭ（相対純度８８％以上）の溶液のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。
図４Ａ〜Ｃは、例９〜１７におけるＤＭの回収率、回収液量および相対純度を示すグラフである。
図５Ａ〜Ｃは、例１８および１９におけるＤＭの回収率、回収液量および相対純度を示すグラフである。
図６は、例９〜１９で使用したより高純度の原料ＤＭ（相対純度９５．５％）のＨＰＬＣ分析チャートである。
図７は、例９〜１９における相対純度９８％以上の画分を集めたもののＨＰＬＣ分析チャートである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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