(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の断片化と逐次分解とを行って得た複数の断片の質量分析を行い、得られた複数の質量データを、あらかじめ求められている各種タンパク質のアミノ酸配列データと照合し、各質量データに対応した配列データを有するタンパク質に各質量データを割り当てるとともに、割り当てられた各質量データにおいて逐次分解による質量データと配列データとの一致状態を求め、複数のタンパク質に同様の質量データの割り当てを行い、逐次分解による質量データと配列データとの一致状態が高いタンパク質を選出することを特徴とするタンパク質の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の同定方法に関し、詳しくは、遺伝子工学等において重要なタンパク質の同定を短時間で容易に行うための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
タンパク質を同定する方法として、タンパク質を直接アミノ末端（Ｎ末端）シーケンサーにかけてＮ末端アミノ酸の部分配列分析を行い、得られた分析結果と、タンパク質のアミノ酸配列データベースとを照合することによってタンパク質を同定する方法が知られている。しかし、この方法では、タンパク質のアミノ末端が塞がれているためＮ末端配列分析が不可能な場合、さらに、タンパク質全体のＮ末端からのアミノ酸配列（一般に２０残基程度）という比較的少ない情報でタンパク質の同定を行わなければならないため、情報量が少なく、必ずしも十分な同定を行えるとはいえなかった。
【０００３】
また、タンパク質を酵素的又は化学的に断片化して質量分析を行う方法も知られている。この方法は、トリプシン等のタンパク質中の特異的アミノ酸で切断する方法で得られたペプチド断片の質量をアミノ酸配列データで作ったそれと対応させて同定する方法であるが、一般に最低二種類の切断方法のデータを必要とし、かつ、酵素の純度、その切断の特異性等に問題があり、実験方法と解析の両面に困難があった。また、例えば、カルボキシペプチターゼは、一般に、ペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）からアミノ酸を逐次分解し、遊離してくるアミノ酸を分析する方法であるが、この方法では、副反応によって内部切断が起こる場合があり、途中から分解してくるアミノ酸と、Ｃ末端から分解してくるアミノ酸とを混同することがあった。さらに、質量分析でマススペクトルを用いる場合でも、マススペクトル上に多数のピークが存在するため、ピークを区別することは困難であった。
【０００４】
そこで本発明は、マススペクトル上に多数のピークが存在していても、容易にかつ精度よくタンパク質の検索・同定を行うことができるタンパク質の同定方法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のタンパク質の同定方法は、タンパク質の断片化と逐次分解とを行って得た複数の断片の質量分析を行い、得られた複数の質量データをあらかじめ求められている各種タンパク質のアミノ酸配列データと照合し、各質量データに対応した配列データを有するタンパク質に各質量データを割り当てるとともに、割り当てられた各質量データにおいて逐次分解による質量データと配列データとの一致状態を求め、複数のタンパク質に同様の質量データの割り当てを行い、逐次分解による質量データと配列データとの一致状態が高いタンパク質を選出することを特徴としている。
【０００６】
【発明の実施の形態】
図１乃至図６は、本発明のタンパク質の同定方法の原理を説明するためのものであって、図１は元の試料となるタンパク質を表している。まず、このタンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって４個のペプチドＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４から構成されているとする。次にこのタンパク質を断片化した場合、例えば、図２に示すように、Ｐ１とＰ２とがアスパラギン酸（Ｄ）の部位、Ｐ２とＰ３とがセリン（Ｓ）の部位、Ｐ３とＰ４とがセリン（Ｓ）の部位でそれぞれ断片化されたとすると、このときのマススペクトルＭ１には、各ペプチドに対応した４個のピークが表れる。
【０００７】
断片化された一つのペプチドＰ２に対してＣ末端側の逐次分解を行うと、図３に示すように、Ｃ末端側から逐次アミノ酸が分解され、このときのマススペクトルＭ２には、ペプチドＰ２及びＣ末端側のアミノ酸が一つずつ外れたペプチド断片に対応したピークが表れる。
【０００８】
そして、タンパク質全体の断片化とＣ末端側の逐次分解とを行うと、図４に示すように、タンパク質の各ペプチドＰ１〜Ｐ４への断片化と、各ペプチドＰ１〜Ｐ４に対するＣ末端側の逐次分解とがそれぞれ行われ、マススペクトルＭ３には、各ペプチド断片に対応したピークが発生する。実際のマススペクトルでは、各ペプチドＰ１〜Ｐ４及び逐次分解された各ペプチド断片の分子量が混在した状態になり、どのピークがどのペプチド断片に対応するかは、不明な状態となっている。
【０００９】
また、ピークの発生量やその高さは、断片化及び逐次分解の反応条件により異なり、例えば、図５に示す３個のマススペクトルＭ４，Ｍ５，Ｍ６は、同じタンパク質（ウシカルボニックアンヒドラーゼＩＩ）を、反応時間を変えて断片化及び同時に起こる逐次分解により得られた断片のマススペクトルである。これらのマススペクトルを比較すると、反応時間によってピークの量や高さが異なり、すなわち、反応によって発生するはずのペプチド断片の全てがピークとして表れるとは限らないことがわかる。
【００１０】
本発明では、このようにして断片化及び逐次分解を行い、質量分析により得られた複数の質量データをあらかじめ求められている各種タンパク質のアミノ酸配列データと照合することにより、タンパク質の同定を行うが、単に質量データと配列データとが一致するというだけではなく、逐次分解によって得られた質量データを重要な要素として同定するようにしている。
【００１１】
検索に際しては、全ての質量データをもとにして行ってもよいが、反応条件が緩和で一部が切断されなかった場合等も考慮し、あるいは、反応条件がきつくて副反応が起こり、所定部分以外で切断されたときなども考慮する。
【００１２】
図６は、６個の質量データｍ１〜ｍ６をもとにしてペプチドを特定する際の手順を示している。まず、多数の質量データの中から任意の一つの質量データを取出し、これをデータベース上の多数のタンパク質の配列データと比較し、対応している配列データがあれば、そのペプチドの各配列データの中に、他の質量データと対応するデータがあるかどうかを検索する。そして、そのペプチドの配列データに対応する質量データを取出し、各質量データを各配列データにそれぞれ割り当てる。
【００１３】
図６における第１のペプチドＰ１では、Ｎ末端側のペプチド断片に対応する質量データｍ３に対して、ｍ１はこのペプチド断片のＣ末端側のアミノ酸が１つ外れた状態、ｍ２はアミノ酸が２つ外れた状態に対応し、ｍ６のＣ末端側のアミノ酸が１つ外れたものがｍ４に対応したものとして割り当てられる。すなわち、ｍ１，ｍ２は、ｍ３の逐次分解によって発生したペプチド断片であり、ｍ４は、ｍ６の逐次分解によって発生したペプチド断片となる。このときの逐次分解による質量データと配列データとの一致状態を示すトランケーション数（逐次分解数）ｉは、ｍ３部分で「３」、ｍ６部分で「２」、ｍ５部分では「１」となる。このトランケーション数ｉは、前記データベースにおける配列データが、Ｃ末端から最大１０残基までアミノ酸が１つずつ外れた残りのペプチド残基の分子イオンの大きさをデータとして持っている場合は最大が１０であり、１０回までは各質量データと配列データとの比較を行う。
【００１４】
そして、このトランケーション数ｉをもとにして一致度を比較するためのスコアＳｔを計算する。このスコアＳｔは、トランケーション数ｉの最大が１０である場合は、下記の式１によって計算する。
【００１５】
【式１】
0003924062.tif 000002
【００１６】
式中、ｉはトランケーション数であり、Ｎｉは同じトランケーション数が検出されたペプチド断片の数である。したがって、前記図６のペプチドＰ１においては、
（３２×１＋１２×１＋２２×１）／（１＋１＋１）＝（９＋１＋４）／３＝１４／３＝４．６７
となり、スコアＳｔは４．６７となる。
【００１７】
次に、同様のデータの検索を行い、対応する他のペプチドＰ２を選び出す。このペプチドＰ２では、ｍ３がｍ５の逐次分解によって発生したもの、ｍ２がｍ１の逐次分解によって発生したものと割り当てられている。トランケーション数ｉは、図に示すように、左側から順に、２，１，１，２となり、スコアＳｔを計算すると、
（２２×２＋１２×２）／（２＋２）＝２．５
となる。
【００１８】
ｍ番目に選び出されたペプチドＰｍでは、ｍ３がｍ６の逐次分解によって発生したもの、ｍ３，ｍ１，ｍ２がｍ５の逐次分解によって順次発生したものと割り当てられている。この場合のトランケーション数ｉは、２及び４となり、スコアＳｔを計算すると、
（２２×１＋４２×１）／（１＋１）＝１０
となる。
【００１９】
このようにして各質量データを対応する配列データに割り当て、それぞれについてスコアＳｔを計算していく。そして、最終的にスコアＳｔの大きい順にペプチドを選出していく。そして、残りの質量データにおいても同様の操作を行ってペプチドあるいはペプチド断片をスコアＳｔの大きい順に順次選出し、最終的には、総合的に判断して一番大きなスコアＳｔを持つタンパク質を同定する。
【００２０】
上述のように、各ペプチド断片におけるＣ末端側の逐次分解の配列データを検索用データとして使用し、分子イオンの大きさ及びＣ末端アミノ酸配列という二つの分解結果に基づいて検索を行うので、断片化逐次分解（断片化と逐次分解とは同時に起きる）の反応条件を適当に選定することにより、Ｎ末端からのデータベースに比べて情報量が極めて多くなるので、検索結果（同定結果）の信頼性が大幅に向上する。
【００２１】
本発明では、タンパク質の断片化及び逐次分解の方法は特に限定されるものではなく、酵素的な方法を使用することもできるが、酵素を使用すると、マススペクトル上に酵素及び酵素を作用させる高分子膜（ポリアクリルアミド）由来のノイズが発生するため、化学的な特異的切断及び逐次分解によってタンパク質の断片化及び逐次分解を行うことが望ましい。具体的な方法としては、特許第２６８６５０５号公報に記載されているタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する方法を挙げることができる。この方法によると、タンパク質のＣ末端からアミノ酸の逐次分解反応が起きると同時に、セリン及びトレオニンのアミノ基側のペプチド結合（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｎ）、及び、アスパラギン酸のカルボキシル基側のペプチド結合（Ａｓｐ−Ｃ）が分解されて断片化される。このような化学的Ｃ末端アミノ酸配列決定法によっって構造解析されたペプチド断片を含むＣ末端アミノ酸配列データ、すなわち、配列から計算で求めたデータをデータベースとし、試料となるタンパク質を同様の手順で断片化逐次分解することにより、従来よりも効率よく確実な検索を実行することができる。
【００２２】
また、実際に得られるマススペクトルには、ペプチド断片のピーク及びこれらの逐次分解生成物のピークが多く表れ、しかも、多少の誤差があるため、質量データとデータベース内の配列データとの比較においては、ある程度の自由度（誤差範囲）を持たせておくことが好ましく、特に、この自由度を例えば±１〜１０％で任意に設定することにより、タンパク質の同定確率を高めることができる。
【００２３】
【実施例】
タンパク質として、ウシカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（分子量２９０２２．２）を用いて同定実験を行った。このタンパク質は、従来のカルボキシペプチターゼ法によりＣ末端を逐次分解して質量分析を行う方法では、現在の質量分析の分析限界及び精度の問題から、解析不可能なものである。
【００２４】
まず、前記特許第２６８６５０５号に記載されている手順に従って化学的Ｃ末端アミノ酸配列決定法を行い、質量分析により、前記図５に示したマススペクトルパターンを得た。現在の実験条件によれば、切断個所の割合は、Ａｓｐ−Ｃで６４％、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｎで３４％となった。全質量数をもとにして既知の全タンパク質の配列データを収めたデータベースにより、前述の方法で質量データの割り当てとスコアの計算とを行った。その結果、ただ一つのタンパク質が製出され、その選出されたタンパク質は、ウシカルボニックアンヒドラーゼＩＩであると同定できた。
【００２５】
このように、既知のタンパク質であれば、適当な断片化及び逐次分解を行い、得られた質量データを、前記配列データのデータベースを適宜な記憶手段に記憶したコンピューターに入力することにより、マススペクトル上の多数のピークを区別して迅速に同定操作を行うことができ、タンパク質の同定を確実にかつ迅速に行うことができる。
【００２６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のタンパク質の同定方法によれば、高い確率で、かつ、短時間でタンパク質の同定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  元の試料となるタンパク質を示す説明図である。
【図２】  タンパク質を断片化した状態を示す説明図である。
【図３】  Ｃ末端側の逐次分解を行った状態を示す説明図である。
【図４】  タンパク質全体の断片化とＣ末端側の逐次分解とを行った状態を示す説明図である。
【図５】  実験によって得られたマススペクトルの例を示す図である。
【図６】  ペプチドを特定する際の手順を示す説明図である。
【符号の説明】
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐｍ…ペプチド、ｍ１，ｍ２，ｍ３，ｍ４，ｍ５，ｍ６…質量データ、ｉ…トランケーション数、Ｓｔ…スコア
【図１】
0003924062.tif 000003
【図２】
0003924062.tif 000004
【図３】
0003924062.tif 000005
【図４】
0003924062.tif 000006
【図５】
0003924062.tif 000007
【図６】
0003924062.tif 000008