(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質導入し得るＡＡＶ粒子内にＤＮＡ基質をインビトロパッケージするために有用な無細胞抽出物を産生するための方法であって、
（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶ由来のカプシド遺伝子コード配列およびＲｅｐ遺伝子コード配列を含むが逆方向末端反復配列を全て欠くｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工程と、
（ｂ）該宿主細胞培養物を、哺乳類類細胞においてＡＡＶの生産的ウィルス感染を促進することが公知であるヘルパーウィルスに感染させる工程と、
（ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェクトされた細胞培養物から該細胞のホモゲナイゼーションによって無細胞抽出物を調製する工程と、
を包含し、
該インビトロパッケージングは、細胞内環境以外で起こる、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ基質を無細胞抽出物と合わせるための方法であって、
ａ．請求項１に記載の方法によって該無細胞抽出物を産生する工程と、
ｂ．該抽出物をＤＮＡ基質と合わせる工程と、
を包含する、方法。
【請求項３】
ＤＮＡ基質をパッケージングするための方法であって、
ａ．請求項１に記載の方法によって抽出物を産生する工程と、
ｂ．該抽出物をＤＮＡ基質と合わせる工程と、
ｃ．工程（ｂ）において得られた抽出物を、ＤＮＡ基質のパッケージングを促進する条件下でインキュベートする工程と、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記インキュベーション工程の後に、前記ヘルパーウィルスを不活性化するのに十分な温度で十分な時間前記抽出物を加熱する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記加熱工程の後に、前記抽出物をクロロホルムで抽出する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ基質がＡＡＶ末端反復配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ基質が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、チロシンヒドロラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、第ＸＩＩＩ因子および第ＩＸ因子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子またはコード配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ｄＡＡＶベクターがｐＩＭ４５である、請求項１〜７のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ヘルパーウィルスがアデノウィルスである、請求項１〜８のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘルパーウィルスがアデノウィルス５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト細胞培養物である、請求項１〜１０のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト２９３細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パッケージングを促進する条件が、
約７ｍＭのＭｇＣｌ2と、それぞれ約０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと、約４ｍＭのＡＴＰと、それぞれ約０．２ｍＭのＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰと、約４０ｍＭのクレアチンリン酸と、約３７．５μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼと、約０．１０〜１００μｇ／ｍｌの基質ＤＮＡと、約０．５容量の前記抽出物と、約３０ｍＭのｐＨ約７．５のヘペス緩衝液とを含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
謝  辞
本発明は部分的にNational Institute of General Medical Science（ＲＯ１ＧＭ３５７２３０２）およびNational Heart, Blood, and Lung Institute（ＲＯ１ ＨＬ／ＤＫ５０２５７）からの助成金によって支援された。米国政府は、本発明に関する権利を享受し得る。
序  論
技術分野
本発明は、特定の哺乳類形質導入ベクター、ならびにインビトロでカプシド形成された哺乳類形質導入ベクターの産生および使用方法に関する。
背  景
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する（Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129 1992）。パルボウイルスビリオンは、３つの構造タンパク質と、直線状の１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムとによって構成される。粒子は、正１２面体対称性を有し、１８〜２６ｎｍの直径を有する。ＡＡＶの５つの血清型が同定されているが、最も広く特徴付けられているのはＡＡＶ−２である。ＡＡＶ−２の完全なヌクレオチド配列が報告されているが（Srivastavaら、J. Virol. 45:555-564 1983）、これは４６８０個の塩基を有する。このＡＡＶゲノムは、１４５個の塩基からなる末端逆方向反復（terminal inverted repeats）（ＴＲ）を有する。
変異研究によって、ＡＡＶゲノム中少なくとも３つの領域が同定されている。ｒｅｐ領域は、ＡＡＶ ＤＮＡの複製および／またはレスキューに必要な４つのタンパク質をコードする。Ｒｅｐタンパク質は、４つの重複するポリペプチド、即ちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０で構成される。ｃａｐ領域は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードすると思われ、これらの領域における変異体は、ＤＮＡの複製を行うことができるが、感染性粒子は形成しない。変異研究によって、ＤＮＡの複製には逆方向末端反復がシスで必要であることが分かっている。
ＡＡＶの３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、９０、７２および６２ｋＤａの分子量を有し、１：１：１０の比率でビリオン中に存在する。遺伝子研究によって、ＶＰ２およびＶＰ３はそれら自身によって子孫ＤＮＡをカプシド形成し得ることが分かっている（Hermonatら1984 J. Virol. 51:329-333; Tratschinら1984 J. Virol. 51:611-619）。しかし、カプシドタンパク質の完全補体を有するものに比べて、ＶＰ１を欠くビリオン粒子は感染性が低い。ＡＡＶ、Ｂ１９および昆虫細胞中で発現するアリューシャン病ウィルスのものを含むパルボウイルス構造タンパク質は、空のカプシドにアセンブル可能である（Ruffingら1992 J. Virol. 66:6922-6930, 1992; Brownら1991 J. Virol. 65:2702-2706; Christensenら1993 J. Virol. 67:229-238）。核の蓄積（nuclear accumulation）およびその後の粒子アセンブリを効率的に行うためにはサブユニットが複合体を形成しなければならないことが、ＡＡＶカプシドタンパク質の細胞下分布に関する結果によって示唆されている（Wistubaら1995、印刷中）。
ＡＡＶは、組込みプロウィルスとして、あるいは溶解性感染によって繁殖され得る（Atchisonら1965 Science 149:754-756; Hogganら1972 Proceedings of the Fourth Lepetite Colloquium, Cocoyac, Mexico, North-Holland, Amsterdam, pp. 243-249）。潜伏感染を形成する能力は、ＡＡＶのライフサイクルの一部であるように思われる。特別な状況下以外において（Yacobsonら1987 J. Virol. 61:972-981; Schlehoferら1986 Virology 152:l10-117; Yalkinogluら1988 Cancer Res. 48:3123-3125）、ＡＡＶは、生産的ウィルス感染を開始するためのヘルパーウィルスの存在を必要とする。ヘルペス科またはアデノウイルス科のいずれかのメンバーは、必要なヘルパー機能を提供でき（Atchisonら1965 Science 149:754-756; Melnick 1965 J. Bacteriol 90:271-274; McPherson 1985 Virology 147:217-222）、また、ワクシニアウィルスは少なくとも部分的なヘルパー機能を提供することができる（Schlehoferら1986 Virology 152:l10-l17）。ヘルパーウィルスが存在しない場合、ＡＡＶは子孫を全く産生せず、代わりに、宿主染色体に組み込まれてプロウィルスを形成する（Hogganら1972; Bernsら1975 Virology 68:556-560; Handaら1977 Virology 82:84-92; Cheungら1980 J. Virol. 33:739-748）。希に例外もあるが、ＡＡＶプロウィルスは安定なようである。しかし、ＡＡＶプロウィルスを有する細胞株が、後にヘルパーウィルスに重複感染した場合、ＡＡＶゲノムは切除されて通常の生産的感染を経る（Hogganら1972; Cheungら1980 J. Virol. 33:739-748）。後にレスキューされ得る潜伏感染を確立するこの能力は、ヘルパーウィルスが存在しない場合にＡＡＶの生存を確実にするメカニズムであるように思われる。
感染性ＡＡＶビリオンのインビトロアセンブリには、パッケージされたＤＮＡ上における逆方向末端反復の存在が必要であり、これは、インビボでのパッケージングのシグナルがＴＲ配列内にあることを示唆している（Samulskiら1989 J. Virol. 63:3822-3828; McLaughlinら1988 J. Virol. 62:1963-1973）。野生型ＡＡＶの１１０％を越えるゲノムの大きさは、低いカプシド形成効率につながる。インビボにおけるＡＡＶアセンブリに関する動力学的な研究によって、完全な粒子が現れる前に空のカプシドが産生されることが明らかになった（MyersおよびCarter 1980 J. Virol. 102:71-82）。随伴性のＤＮＡ複製（concomitant DNA replication）が無い場合に、予備形成したカプシド内に子孫ＤＮＡをパッケージすることが提案されている。また、アリューシャン病ウィルスＤＮＡのパッケージングモデルによれば、カプシド形成は、子孫ＤＮＡと空のウィルスカプシドとの相互作用、その後の置換合成、そしてＤＮＡの最終的パッケージングによって開始されることが示唆される（WillwandおよびKaaden 1980 J. Virol. 64:1598-1605。
ウィルス形質導入ベクターとしてのＡＡＶの使用は、HermonatおよびMuzyczka（Proc. Natl Acad. Sci. 81:6466-6470 1984）によって初めて実証された。マップ位置５２と９２との間において、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠失させてベクターｄｌ５２−９１を作り、ＳＶ４０制御下における細菌性ネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。アデノウィルスに感染させておいたヒト細胞内に組換えプラスミドをトランスフェクトすることによって、ｄｌ５２−９１／ネオウィルスストックを得た。野生型ｃａｐ遺伝子を有するプラスミドで同時トランスフェクトすることによって、欠けているカプシドタンパク質を供給した。この方法により、１０6までの感染単位／ｍｌを有するｄｌ５１−９１／ネオウィルスストックを生成した（Hermonatら1984 J. Virol., 51:329-333）。これらのストックの形質導入頻度は、野生型ウィルスの組込み頻度、０．５％〜５．０％とほぼ同じであった（Laughlinら1986 J. Virol. 60:515-524（1986）; Handaら1977 Virology 82:84-92）。ＡＡＶ ＴＲ配列および変化量の非反復ＡＡＶ配列を有する他のＡＡＶベクターは、外来ＤＮＡをヒト細胞内に効率的に形質導入できることが実証されている（McLaughlinら1988 J. Virol. 62:1963-1973; Samulskiら1987 J. Virol. 61:3096-3101; Samulskiら1989 J. Virol. 63:3822-3828）。
ｒＡＡＶ形質導入ベクターを使用する際の困難点の１つは、組換えウィルスストックを増殖させるために必要とされる煩雑な手順である。組換えストックの増殖には、ＡＡＶおよびヘルパーウィルス遺伝子両方が存在する必要があり、産生される組換えウィルスストックはしばしば、混入物としてアデノウィルスおよび野生型ＡＡＶウィルス粒子の両方を有する。トランスのＡＡＶ Ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を供給するための野生型ＡＡＶ感染性プラスミドを使用すると、許容不可能に高いレベルの野生型ＡＡＶウィルス、即ち約１０：１の野生型対組換え体比率を有するストックが産生される（HermonatおよびMuzyczka 1984; McLaughlinら1988; Tratschinら1985 Mol. Cell Biol. 5:3251:3260; Lebkowskiら1988 Mol. Cell Biol. 8:3988-3996; Vincentら1988 Vaccine 90:353-359）。理由は明らかではないが、野生型ウィルスの増幅に対する強い選好性がある。野生型ＡＡＶウィルスを用いた相補性によって組換えウィルスストックを増幅させる場合にも同じことが言える。
関連文献
組換えストックにおける野生型ＡＡＶウィルスのレベルを低減するべく、いくつかの方策が試されている。HermonatおよびMuzyczka（1984）は、λバクテリオファージＤＮＡの２．５ｋｂフラグメントを野生型ＡＡＶプラスミドの非必須領域内に挿入することによって、組換えゲノムｉｎｓ９６λ／Ｍを産生した。これは、トランスにおいてＡＡＶ遺伝子産物の全てを複製および供給し得たが、それ自身が大き過ぎてパッケージできなかった。１０5〜１０6／ｍｌの組換え力価を得ることができたが、ストックには５％〜１０％レベルの野生型ウィルスが混入していた（HermonatおよびMuzyczka 1984 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:6466-6470; McLaughlinら1988 J. Virol. 62:1963-1973）。明らかに、混入野生型ＡＡＶウィルスは、相補ヘルパープラスミドｉｎｓ９６λ／ＭとＡＡＶベクター配列との間の組換えの結果であった。いくつかの研究所は、末端反復の一部を欠き、あるいはｒｅｐ変異を含み、それ故に、パッケージ不可能な相補ＡＡＶプラスミドの使用を試みている。（Tratschinら1985 Mol. Cell Biol. 5:3251-3260; Lebkowskiら1988 Mol. Cell Biol. 8:3988-3996。この方法によっても、相当なレベルの野生型混入（１％〜５０％）が生じるが、これは、おそらく、ｒＡＡＶおよび相補プラスミドの重複部分の相同な組換えに起因する。さらに、この組換えストックの力価は少ない（１０2〜１０3／ｍｌ）。
Samulskiら（1989）は、組換えＡＡＶゲノムと相補ヘルパーＡＡＶプラスミドとの間に相同配列が無い相補プラスミド（ｐＡＡＶ／Ａｄ）を構築した。このプラスミドは、アデノウィルス５末端反復を側面に有するＡＡＶコード配列で構成されていた。明らかに、これらのアデノウィルス末端は、通常アデノウィルスＤＮＡ複製に用いられるメカニズムによって、アデノウィルス感染細胞内へのトランスフェクションの後に、相補ＡＡＶプラスミドに制限された増幅を受けさせた。ｐＡＡＶ／Ａｄ相補プラスミドは、１０4〜１０5／ｍｌの組換えウィルス力価を生じ、検出可能な野生型ＡＡＶの混入が全く無かった（Samulskiら1989 J. Virol. 63:3822-3828）。
Vincentら（Vaccine 90:353-359 1990）は、末端反復を欠くＡＡＶゲノムの組込みコピーを有するいくつかのＨｅＬａ細胞株を単離した。末端反復が無いことによって、細胞がアデノウィルスに重複感染した際の、組込みＡＡＶ配列のレスキューおよびパッケージングが防がれた。これらの株の中の１つ（ＨＡ２５ａ）は、１０3〜１０4／ｍｌの力価を有する組換えストックを生成することが可能であった。明らかに、産生されたウィルスの力価が少なかったのは、パッケージング細胞株内における野生型ＡＡＶ遺伝子のコピー数が少なかったためであった。Mendelsonら（Virology 166:154-165 1988）もまた、構成的にＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現する細胞株をいくつか単離した。
ChejanovskyおよびCarter（Virology 171:239-147 1989）は、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子内におけるアンバー変異体（ｐＮＴＣ３）の単離を報告している。この変異は、誘導可能ヒトセリンｔＲＮＡアンバーサプレッサーを有するサル細胞株上でそれを増殖させることによって効率的に抑制することができた。得られたウィルス力価は１０7〜１０8／ｍｌ（同じサルの株で得られる野生型力価の約１０％）であったが、アンバー変異の復帰頻度は約１０-5であり、従って、許容不可能なレベルのｗｔＡＡＶの混入を生じた。
ｒＡＡＶストックを増殖させる現在の方法は、HermonatおよびMuzyczka（1984）によって考案され、Samulskiら（1989）によって記載されているｐＡＡＶ／Ａｄを用いて、あるいは、ＡＡＶまたはアデノウィルス末端配列を有しないヘルパーＡＡＶプラスミドを用いて改変されたものである。これらの方法は、約１０6／ｍｌのｒＡＡＶ力価を生成し、そして依然として、検出可能な量のｗｔＡＡＶを含有し得る。さらに、この方法によって調製されるｒＡＡＶは、顕著なアデノウィルス混入、ならびに、宿主細胞株内に存在する外因性ウィルスの混入を含む。これらの困難点の全ては、ＡＡＶのインビトロパッケージング系を開発することによって解決され得る。Mollaら（Science 254:1647-1651, 1991）がＲＮＡウィルスであるポリオウィルスのインビトロパッケージング系を報告しているものの、哺乳類ＤＮＡウィルスのインビトロパッケージング系が記載されていない。
発明の要旨
本発明の目的は、インビトロ反応においてＤＮＡ基質をパッケージして、哺乳類細胞に形質導入し得るアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生する方法を提供することである。本発明の別の目的は、形質導入し得るＡＡＶ粒子内にＤＮＡ基質をインビトロパッケージするのに有用な無細胞抽出物を産生する方法を提供することである。インビトロパッケージされるＡＡＶ粒子、ならびに哺乳類細胞の形質導入においてそれを使用する方法も提供される。
以下においてすぐに明らかになるように、本発明の上記および他の目的は、インビトロにおいてＤＮＡ基質をＡＡＶカプシド内にパッケージすることによりパッケージされたＤＮＡ基質を受容哺乳類細胞に導入し得るウィルス粒子あるいは組換えウィルス粒子を産生し、結果的に、受容細胞内で基質ＤＮＡあるいは基質ＤＮＡの一部を発現あるいは機能させる方法を提供することによって達成される。具体的には、本発明の方法は、（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類細胞培養物を、ＡＡＶカプシドおよびＲｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）上記細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、（ｃ）上記トランスフェクトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、（ｄ）上記抽出物をＤＮＡ基質と合わせる工程と、（ｅ）上記基質ＤＮＡのパッケージングを促進する条件下で上記抽出物をインキュベートする工程とを包含する。より特定の実施形態において、本発明の方法は、上記パッケージされた抽出物を高い温度で加熱する工程をさらに包含し、そして必要に応じて、上記パッケージされた抽出物をクロロホルムで抽出する工程を包含する。
他の実施形態において、本発明は、受容哺乳類細胞に形質導入し得るインビトロパッケージされたＡＡＶ粒子を提供する。このような実施形態の１つにおいて、ＡＡＶ粒子内にパッケージされた基質ＤＮＡは、インビボパッケージング方法によって作られる以前のｒＡＡＶベクターの大きさおよび配列という典型的制約によって制限されない。
本発明はまた、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いて基質ＤＮＡを受容哺乳類細胞に移入する方法、ならびに、基質ＤＮＡのＡＡＶ粒子内へのインビトロパッケージングを行い得る組成物を調製する方法を提供する。
本発明をよりよく理解できるように、以下の定義を示す。
ヘルパーウィルス：アデノウィルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、あるいはワクシニアウイルス等の、適切な真核細胞内に感染したときに生産的ＡＡＶ感染を生じさせるウィルス。
ヘルパーＡＡＶ ＤＮＡ：ＡＡＶ複製および／またはインビトロパッケージングに不可欠な機能を欠く組換えＡＡＶに対して、トランスでＡＡＶ機能を提供するために用いられるＡＡＶ ＤＮＡ配列。
ｒＡＡＶ：組換えＡＡＶ；ＡＡＶ配列の一部、通常最低でも逆方向末端反復あるいはＷＯ９４１３７８８に記載される２重Ｄ配列（double-D sequences）、および一部の外来（即ち、非ＡＡＶ）ＤＮＡを有するＤＮＡ分子。
ｄＡＡＶ：欠損ＡＡＶ；本願の目的において、ｄＡＡＶはＡＡＶのＲｅｐおよびカプシドコード領域を有するが、インタクトな逆方向末端反復を欠いているので、これらをインビボでパッケージすることはできない。
ＡＡＶ粒子：インビボあるいはインビトロでＤＮＡをＡＡＶカプシド内にパッケージすることによって産生される感染性粒子であり、パッケージされたＤＮＡはｗｔＡＡＶゲノムでもｒＡＡＶでもよい。
ＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）：パッケージされたＤＮＡがＴＲＬａｃＺ（ＣＭＶプロモーターの制御下におけるＡＡＶ末端反復およびＬａｃＺコード配列）を有するＡＡＶ粒子。
形質導入：細胞内で遺伝子が発現されるように、ウィルス粒子を用いた遺伝子の細胞への移入（transfer）。
トランスフェクション：他のあらゆる物理的あるいは化学的方法を用いたＤＮＡの細胞への移入。
【図面の簡単な説明】
以下に示す具体的な実施形態の詳細な説明を参照し、本出願書類の一部をなす図面と合わせて考慮することによって、本発明がよりよく理解されるであろう。
図１：ｐＴＲＬａｃＺ、ｐＡＢ１１、野生型ＡＡＶ、ｐＩＭ４５およびｄｌ６３−８７／４５の図。ｐＴＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１における特定の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。これらの制限フラグメントは、表ＩＩに記載されるインビトロパッケージング実験で基質として使用される。この図には、ｄｌ６３−８７／４５におけるカプシド遺伝子の欠失位置も図示されている。ｐＴＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１（Goodmanら、1994 Blood 84:1492-1500）は、ＣＭＶ初期プロモーターおよびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル（図示せず）の制御下においてＬａｃＺコード配列を有するｒＡＡＶプラスミドである。ｐＡＢ１１は、ＣＭＶ配列とＬａｃＺ遺伝子との接合部近傍のＰｓｔＩ部位を欠いている点、ならびにＬａｃＺコード配列内に核局在化シグナルを有する点でｐＴＲＬａｃＺとは異なる。両プラスミドともに、１４５ｂｐの逆方向反復配列以上のＡＡＶ配列を持っていない。ｄｌ６３−８７／４５には、点線で示す領域の欠失がある。ｐＩＭ４５あるいはｄｌ６３−８７／４５のどちらも、ｐＴＲＬａｃＺあるいはｐＡＢ１１と相同な配列を全く持っていない。ｐＩＭ４５あるいはｄｌ６３−８７／４５のどちらも、ＡＡＶ ＴＲ配列を全く持っていない。
図２：インビトロパッケージング細胞抽出物のウェスタン分析。アデノウィルスのみに感染させた、あるいはアデノウィルスに感染させ、かつｄｌ６３−８７／４５またはｐＩＭ４５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした２９３細胞から、実施例１に記載されるように抽出物を調製した。ｐＩＭ４５＋Ａｄ抽出物由来のＲｅｐタンパク質の部分的な枯渇は、タンパク質Ｇ−ビーズ（protein G-beads）に結合したマウスモノクローナル抗Ｒｅｐ７８／６８抗体とともに抽出物をインキュベートすることによって達成された。１０μｌの各抽出物を、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルラー膜に移入し、そして、４つのＲｅｐタンパク質を全て認識する抗Ｒｅｐマウスモノクローナル抗体あるいは３つのカプシドタンパク質を全て認識するモルモットポリクローナル抗カプシド抗体（右パネル）を用いて、Ｒｅｐタンパク質（左パネル）についてプローブした。
図３：インビトロでパッケージされたｐＴＲＬａｃＺウィルスおよびインビボでパッケージされた野生型ＡＡＶの塩化セシウム密度勾配遠心分離。インビトロでパッケージされたｐＴＲＬａｃＺウィルスおよびインビボで産生された野生型ＡＡＶウィルスを、実施例３に記載の平行塩化セシウム密度勾配で遠心分離した。ｐＴＲＬａｃＺ（黒丸）ウィルスは、β−ガラクトシダーゼ染色法によって力価測定し、野生型ＡＡＶ（白丸）は、感染性センターアッセイ（infectious center assay）によって力価測定した。両ウィルス調製物とも、５５℃で３０分間加熱したが、クロロホルムでの抽出は行わなかった。
図４：インビボでパッケージされたｗｔＡＡＶおよびインビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）のショ糖勾配遠心分離。ＣｓＣｌ勾配からのピーク画分を、１５〜３０％のショ糖勾配で沈澱させた。このウィルスを、図３のように力価測定した。ｐＴＲＬａｃＺ（黒丸）、ｗｔＡＡＶ（白丸）、−Ｘ−屈折率。
具体的な実施形態の説明
組換えＡＡＶベクターには、それをヒト遺伝子治療の有力な候補にする特徴がいくつかある。第１に、５ｋｂのクローニング容量により、様々なｃＤＮＡに対応することができる。第２に、ヒト細胞内における形質導入の頻度は高い。これまでのところ、ＡＡＶ形質導入に対して耐性を示したヒトの細胞株あるいは組織はない。第３に、ヒトあるいは動物集団のいずれにおいても、ＡＡＶに関連する疾患はない。さらに、一般に、ｒＡＡＶベクターは、増殖するためには、２つの異なるヘルパーウィルスゲノムを必要とするので、ＡＡＶベクターの自然伝染（natural spread）には固有の限界がある。さらに、プロウィルス細胞がアデノウィルスに重複感染した場合、野生型ＡＡＶゲノムも供給されない限り、Ｒｅｐ-ＡＡＶプロウィルスがＤＮＡの複製を行うことができない（McLaughlinら1988 J. Virol. 62:1963-1973（1988））。ワクチン接種によって、ＡＡＶプロウィルスを持つ固体をアデノウィルス感染から守ることができる。第４に、ＡＡＶプロウィルスは安定なようである。第５に、Ｒｅｐ遺伝子が存在しない場合、ＡＡＶ末端反復は転写的に中立なようである。従って、外来遺伝子をそれら自身のエンハンサーおよびプロモーターエレメントの制御下において有することが不可欠である場合、ＡＡＶベクターは有用であり得る。最後に、ＡＡＶベクターに関する重複感染免疫性は存在しない。細胞株は、いくつかの異なるＡＡＶベクターを用いて、複数回形質導入され得る（Lebkowskiら1988 Mol. Cell Biol. 8:3988-3996; McLaughlinら1988 J. Virol. 62:1963-1973）。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの感染性ウィルスストックの産生を行う以前の方法では、生産的感染の途中に、インビボでのｒＡＡＶゲノムのパッケージングを採用していた。ｒＡＡＶの生産的感染およびインビボパッケージングには、アデノウィルスのようなヘルパーウィルス、ならびにｒＡＡＶゲノムから欠失した必須ＡＡＶ機能を用いた相補性が必要である。結果的に、インビボで産生されたｒＡＡＶウィルスストックは、相当なレベルのヘルパーウィルスおよび野生型（ｗｔ）ＡＡＶを有し得る。さらに、インビボでパッケージされたｒＡＡＶ粒子の力価は、典型的に、ｗｔＡＡＶについて得られるものよりも大幅に少ない。また、細胞培養物内で調製されたＡＡＶベクターは全て、外来性のウィルスの混入を受け易く、この外来性のウィルスは、ｒＡＡＶを増殖させるために使用される細胞内に存在し得る。
本発明は、インビトロにおけるｒＡＡＶゲノムのパッケージング方法を提供することによりこれらの困難点を克服する。インビトロとは、細胞内環境以外で起こることを意味する。ｒＡＡＶゲノムが存在する唯一のＤＮＡであり、それ故に、インビトロでパッケージされたｒＡＡＶウィルスストックへのｗｔＡＡＶあるいはヘルパーウィルスの混入が排除される条件下において、インビトロでのパッケージングを行うことができる。さらに、実施形態の１つにおいて、本発明の方法は、ｗｔＡＡＶゲノムよりも少なくとも２倍大きく且つ基質ＤＮＡ上のＡＡＶ ＴＲ配列の存在を必要としない、基質ＤＮＡの形質導入可能なＡＡＶ粒子の産生を可能にする。
本発明の方法においては、欠損ＡＡＶ（ｄＡＡＶ）ベクターでトランスフェクトし、ヘルパーウィルスに感染させた宿主細胞からパッケージング成分細胞抽出物（ＰＣＣＥ）を調製する。ｄＡＡＶベクターは、ＡＡＶからのＲｅｐおよびカプシド遺伝子コード配列を有するが、逆方向末端反復配列を全く欠いている。ヘルパーウィルスの感染が有る場合、ＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質が産生されるが、ｄＡＡＶ ＤＮＡは複製あるいはパッケージされない。選択されたベクターがＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシド遺伝子を発現させることができ且つパッケージされ得ない限り、数あるｄＡＡＶベクターのどれを用いてもよい。このようなｄＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知であり、ここではこれ以上詳細には説明しない（例えば、Samulskiら1989を参照）。好ましくは、ｄＡＡＶベクターはｐＩＭ４５である（McCartyらJ. Virol. 65:2936-2945 1991）。ヘルパーウィルスは、哺乳類細胞においてＡＡＶの生産的ウィルス感染を促進することが知られている数あるウィルスのいずれであってもよい。ヘルペス科あるいはアデノウィルス科のいずれかのメンバーでも、必要なヘルパーウィルス機能を提供することができる。いくつかの条件下では、ワクチニアウィルスがヘルパーウィルスとして有用であり得る。好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノウィルスであり、最も好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノウィルス５である。ＰＣＣＥの調製に有用な宿主細胞には、ＡＡＶ複製を許容するあらゆる哺乳類細胞が含まれ、これには、ＨｅＬａ細胞あるいはヒト２９３細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に有用なのは、ヘルパーウィルスに感染させたヒト細胞株である。好ましくは、このＰＣＣＥの調製に使用される細胞株は、ヒト２９３細胞である（Grahamら、1977 J. Gen. Virol. 36:59-72）。
ＰＣＣＥの調製は、当該技術分野において周知の手順によって、宿主細胞株を、ｄＡＡＶベクターでトランスフェクトし、そして、ヘルパーウィルスに感染させることによって行われる。トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法（McCutchenおよびPagano, 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41:351-357）、リン酸カルシウム法（Grahamら1973, J. Virol. 33:739-748）、または、これらに限定はされないがマイクロインジェクション、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。トランスフェクションは、ヘルパーウィルス感染細胞を用いて行うことができ、または、ウィルス感染と同時にあるいはその前に行うことができる。ヘルパーウィルスの感染は、従来の方法によって行われる。アデノウィルスをヘルパーウィルスとして用いる場合、望ましい感染多重度は５から１０の間であり得る。トランスフェクションに使用されるｄＡＡＶベクター（および／または他のベクター）の量は、細胞１０6個あたりＤＮＡ約０．２〜１０μｇであるが、異なるＤＮＡ構築物および細胞型によって変動し得る。
典型的に、ＰＣＣＥの調製を行う際には、約６０％のコンフルーエンシーに増殖させた宿主細胞を、１５０ｍｍプレートあたり約２０μｇのｄＡＡＶでトランスフェクトし、そして、約５から１０の感染多重度でヘルパーウィルスに感染させる。感染／トランスフェクト後の細胞を、感染／トランスフェクションから約４８時間〜数日後に収集し、これを先ず冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、その後、冷低張液で洗浄する。洗浄された細胞を、遠心分離によって収集し、少量の低張液中で再懸濁し、そして、４℃でインキュベートする。これらの細胞を、例えば静かな（dounce）ホモゲナイゼーションによって破裂し、ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍにまで高める。４℃でのインキュベーションの後、遠心分離によって懸濁液を清澄にし、上清を保存緩衝液に透析し、そして、低温、好ましくは−８０℃で保存する。巨大分子の低温保存に適した保存緩衝液は、当該技術分野においては周知であり、典型的には、グリセロールのような凍結防止剤を緩衝液中に含有する。好ましくは、保存緩衝液は２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび１ｍＭのＤＴＴである。
ＰＣＣＥは、上記の方法によって最も簡便に調製されるが、例えば、ヘルパーウィルスに感染した細胞から調製した細胞抽出物に精製ＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質を添加するか、あるいは、Ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を構成的に発現する宿主細胞を用いる等の他の方法によって適切なＰＣＣＥが調製され得ることは明らかである。（例えば、Yangら1994 J. Virol. 68:4847）。あるいは、抽出物中に存在するパッケージングに必須な細胞成分を、標準的な生化学的な技法によって単離し、これを精製されたＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質と再結合させて完全なパッケージング抽出物を提供することが可能である。
本発明のインビトロパッケージ方法は、ＰＣＣＥと適切なＤＮＡ基質を合わせ、そしてパッケージングを促進する条件下でインキュベートすることによって行われる。パッケージングを促進する条件には、適切な濃度のＭｇＣｌ2、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰを再生する系および緩衝液が含まれる。必要に応じて、インキュベーション工程の後で、ＰＣＣＥ内に存在し得るヘルパーウィルスを全て不活性化するために、インビトロでパッケージされたウィルス粒子を加熱し得る。熱処理によって、インビトロでパッケージされた粒子に非特異的に結合し得る細胞タンパク質も全て不活性化される。（インビボで産生されたＡＡＶビリオンと同様に）インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子は熱に安定である。本発明の方法の１つの実施形態においては、熱処理したインビトロパッケージ粒子をクロロホルムで抽出する。本発明の第２の実施形態においては、このクロロホルム抽出を省略する。
典型的に、本発明のインビトロパッケージングのインキュベーションは以下のように行われる。約７ｍＭのＭｇＣｌ2と、約３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）と、約０．５ｍＭのジチオスレイトールあるいは類似の還元剤と、それぞれ約０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと、約４ｍＭのＡＴＰと、それぞれ約０．２ｍＭのＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰと、約４０ｍＭのクレアチンリン酸、約３７．５μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼと、約０．１〜１００μｇ／ｍｌの基質ＤＮＡとでＰＣＣＥのアリコート（最終反応溶液の約０．５容量）を調製する。反応物を３７℃で、時間インキュベートする。これらの条件の改変例のいくつかが許容的且つ適切であり、また、それを、得られた感染性粒子の歩留まりをアッセイすることによって容易に決定することができることは、当業者には明らかである。ＡＡＶ粒子に非特異的に結合し得る外来性の細胞タンパク質を全て除去するために、そして、残留ヘルパーウィルスを全て不活性化するために、インキュベーションの後で反応産物を任意に加熱し得る。典型的に、約５５℃、約３０分間の加熱で十分である。クロロホルム耐性粒子の産生が望まれる場合、熱処理反応物をクロロホルムで数回抽出する。クロロホルム抽出を省略した場合は概して、パッケージされた特定の基質ＤＮＡに依存して、クロロホルム感受性粒子とクロロホルム耐性粒子の混合物が産生される。
本発明のインビトロパッケージング法は、２種類のインビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子、即ち、クロロホルム耐性粒子（ＣＲＰ）およびクロロホルム感受性粒子（ＣＳＰ）を産生するのに有用である。本発明のＣＲＰおよびＣＳＰは共に、パッケージされた基質ＤＮＡを受容細胞に移入することができる。これらは、インビトロパッケージング反応における基質ＤＮＡの構造的な要件、およびショ糖勾配沈澱速度によって決定される大きさにおいて互いに異なる。ＣＲＰおよびＣＳＰは、ＣＳＰを調製する場合にクロロホルム抽出工程が省略される以外は、上記本発明のインビトロパッケージング法に従って同一の方法で調製される。
塩化セシウム勾配遠心分離によって測定される密度、ならびにクロロホルム、熱あるいはＤＮａｓｅＩを用いた処理に対する耐性を含むいくつかの基準において、クロロホルム耐性粒子はインビボでパッケージされたＡＡＶ粒子と同じである。ＣＲＰを産生する場合、基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶのゲノムサイズの約１２０％よりも大きくなってはならない。好ましくは、基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの５０％〜１１０％の間であり、最も好ましくは、基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの８０％〜１０５％の間である。さらに、ＣＲＰ産生用の基質は、インタクトなＡＡＶ逆方向末端反復配列あるいはＷＯ９４１３７８８に記載される２重Ｄ配列を有する。最適には、ＣＲＰ産生用の基質ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖のいずれかの複製型（ＲＦ）ＤＮＡである。本発明のインビトロパッケージング法の基質として使用されるＲＦ−ｒＡＡＶは、当該技術分野において周知の技術を用いて産生することができる（例えば、Hermonatら1984; Snyderら1990 J. Virol. 64:6204-6213; およびHongら1994 J. Virol. 68:2011-2015を参照）。典型的に、ＲＦ−ｒＡＡＶは、ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞を、ｒＡＡＶプラスミドＤＮＡおよびアデノウィルスのようなヘルパーウィルスで同時トランスフェクトすることによって調製される。トランスフェクションは、上記と同様の手順によって行われる。ｒＡＡＶ上に存在する特定のＡＡＶ配列に応じて、要求性のＡＡＶ遺伝子を有するがＴＲ配列を欠いているＡＡＶヘルパープラスミドを用いてトランスフェクトすることによって、ＡＡＶ複製およびパッケージング機能に不可欠な欠けているＡＡＶ機能をトランスで提供することができる。好ましくは、ｗｔＡＡＶ ＲＦを形成する組換えの可能性を低くするために、上記ＡＡＶヘルパープラスミドおよびｒＡＡＶは、共通の配列を持たない。最も好ましくは、上記ヘルパーＡＡＶプラスミドは、ｐＩＭ４５である（McCarty 1991）。他のヘルパーＡＡＶプラスミド、例えば、ＡＡＶ ＴＲあるいはｐＨＩＶｒｅｐ（Antoniら1991 J. Virol. 65:396-404）の代わりにアデノウィルス５末端配列を有するｐＡＡＶ／Ａｄ（Samulskiら1989）もまた適切である。ＲＦ−ｒＡＡＶ ＤＮＡは、改変型Ｈｉｒｔ手順（J. Mol. Biol. 26:365-369 1967）のような、当該技術分野において周知の手順によって、トランスフェクトした細胞から単離することができる。これらの手順によって単離されたＤＮＡには、他の細胞成分およびウィルス成分を実質的に含有しない。ＲＦ−ｒＡＡＶは、化学的にあるいは酵素学的に合成することもでき（Snyderら1993 J. Virol. 67:6096-6104を参照）、あるいは、ＡＡＶ ＴＲを有し且つ細菌内で増殖した（progated）円形プラスミドから作ることもできる（Hongら1994を参照）。
本発明のＣＳＰの産生において、基質ＤＮＡは、大きさによって、あるいはＡＡＶ ＴＲ配列の有無によって制限されない。ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの最大２倍までのインビトロパッケージ基質ＤＮＡは、効率的に、受容哺乳類細胞に移入されその中で発現する。ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡの大きさは、大型のＤＮＡを破損することなく操作する能力によってのみ限定される。ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの５０％〜５００％の間であり得る。好ましくは、ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの１００％〜２００％の間である。ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡはいかなるＡＡＶ配列を含む必要もない。具体的には、この基質ＤＮＡはＡＡＶ ＴＲ配列を含む必要はない。しかし、ＡＡＶ ＴＲ配列を含めることは、形質導入後の移入された基質ＤＮＡの効率的な組込みおよびレスキューに有用であり得る。最後に、ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡはＡＡＶ ＲＦの形をとる必要はない。直線状あるいは円形のプラスミドＤＮＡは、ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡとして適している。適切な基質には、化学的にあるいは酵素学的に合成されたＤＮＡが含まれる。
本発明のインビトロパッケージング法に使用される特定の基質ＤＮＡの性質は、受容細胞に移入しようとする特定の遺伝子あるいは他のＤＮＡ配列に主に依存する。基質ＤＮＡは、特定の遺伝子、コード配列、プロモーター、あるいは、上記以外のＤＮＡ配列のいずれにも限定されない。哺乳類受容体内で発現あるいは機能することができるあらゆる遺伝子あるいは他の組換えＤＮＡが、基質ＤＮＡに適切に含まれ得る。（当該技術分野において、マーカー、レコーダー、あるいはレポーター遺伝子として知られている）容易に検出可能な産物を有する遺伝子を、基質ＤＮＡの一部として取り込むことが望ましい場合もあるが、本発明はこのような構築物に限定されない。容易に検出可能なレポーター遺伝子は、腫瘍化あるいは非腫瘍化産物を産生し得る。腫瘍化レポーター遺伝子は、使用可能ではあるが、その発癌性のためにあまり望ましくない。非腫瘍化レポーター遺伝子は、そのほんの一部を挙げると、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホロトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定はされない。インビボでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いて移入されたＤＮＡの例の一部には、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下における細菌性ネオマイシンホスホロトランスフェラーゼ遺伝子（HermonatおよびMuzyczka 1984）、ＡＡＶｐ４０プロモーターの制御下における細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Tratschinら1984 Mol. Cell Biol. 4:2072-2081）、ヒトβ−グロビンｃ−ＤＮＡ（Ohiら1990 Gene 89:279-282）、およびヒト甲状腺刺激ホルモン（Wondisfordら1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39）が含まれる。本発明の方法との組合わせにおいて有用な他の遺伝子あるいはコード配列は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦのようなサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１３のようなインターロイキン、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦのような神経成長因子および神経栄養因子、チロシンヒドロラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、第ＸＩＩＩ因子および第ＩＸ因子である。上記および類似のＤＮＡが、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いた移入に適している。さらに、インビボでパッケージされたＡＡＶ粒子の場合に可能な大きさよりも大きい基質ＤＮＡを用いて本発明のＣＳＰを調製することができるので、本発明の方法によって移入され得る遺伝子あるいは他のＤＮＡ配列の大きさについての制限は比較的少ない。
インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子の力価は、インビボで生成されたウィルスストックの組換えＡＡＶウィルス力価を決定する際に一般に用いられる方法によって決定され得る。選択される特定の方法は、その基質ＤＮＡが持つ特定の遺伝子あるいは他のＤＮＡに依存する。例えば、基質ＤＮＡがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を持つ場合、上記力価は、形質導入体中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の頻度を測定することによって推定され得る。あるいは、ｒＡＡＶ力価は全て感染性センターアッセイによって決定され得る（McLaughlinら1988）。ウィルス粒子力価は、ドットブロットアッセイによって、あるいは当該技術分野において周知の方法を用いて分光光度的に決定され得る。典型的には、本発明のインビトロパッケージング法は、少なくとも１０5／ｍｌの感染性ウィルス力価を提供する。これに対応して、粒子力価は少なくとも１０7／ｍｌである（ＡＡＶ感染性比は典型的に１００：１である）。
本発明のインビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子は、インビボでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いた形質導入のために用いられる方法と同じ方法で受容哺乳類細胞の形質導入に用いられ得る。形質導入とは、基質ＤＮＡの受容細胞への移入、およびその中における発現あるいは機能を意図したものである。このような形質導入手順は当該技術分野において周知である（例えば、McLaughlinら1988; HermonatおよびMuzyczka 1984; Tratschinら1985を参照）。典型的に、受容哺乳類細胞を、ヘルパーウィルス無しで、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子に感染させ得、特に、パッケージされた基質ＤＮＡはＡＡＶ ＴＲ配列を有し、この結果、プロウィルスが形成される。これは、特に、例えば動物などの生活体の形質導入の場合に、選択されるべき方法である。あるいは、上記受容哺乳類細胞を、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子およびヘルパーウィルスに同時感染させる。
上記受容哺乳類細胞は、ＡＡＶによる感染を受けやすいいかなる特定の哺乳類細胞でもあり得、ヒト、ウサギ、サル、マウス、ウシ、イヌ、およびサルを含むがこれらに限定はされない。受容哺乳類細胞は、１次細胞、確立された細胞株、器官性組織（organized tissue）および生体を含む。ＡＡＶは、例えば、マウスおよび霊長類の脳細胞ならびにマウス、霊長類およびウサギの肺細胞を形質導入できることが分かっている。
上記工程の具体的な例を、以下の実施例に示す。しかし、多数の改変例が可能であること、ならびに、これらの実施例が説明の便宜上示されているに過ぎず、そのように明記される場合を除いては本発明を限定するものではないことが当業者には明らかである。
実施例
実施例１：ＡＡＶパッケージング成分（ＰＣＣＥ）を含む細胞抽出物の調製
材料：リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、クレアチンリン酸、クレアチンリン酸キナーゼ、およびアフィジコリンをSigmaあるいはPharmaciaから購入した。タンパク質Ｇ−セファロースはPharmaciaから入手した。抗Ｒｅｐモノクローナル抗体、抗ｒｅｐ５２／４０および抗ｒｅｐ７８／６８の腹水調製物（HunterおよびSamulski 1992, J. Virol. 66:317-324）は、Rockland Incによって調製され、そして使用前にはタンパク質Ｇセファロース上で精製された。ウェスタン検出キットＥＣＬをAmershamから購入し、製造業者の指示に従って使用した。モルモット抗ＡＡＶカプシドタンパク質ポリクローナル抗体は、Dr. R.J. Samulski（University of North Carolina）によって提供された。カチオン性リポソームを、記載（Gao 1991 Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285）に従って調製および使用した。制限エンドヌクレアーゼは、New England BioLabsから購入した。
熱不活性化子ウシ血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ培地中に２９３細胞を維持した（Grahamら1977 J. Gen. Virol. 36:59-72）。１００継代未満を経た細胞のみを使用し、そしてトランスフェクションあるいは感染の１日前にこれらの細胞をプレートした。（ＡＴＣＣから得た）アデノウィルス５を従来の方法によって調製した。ｐＩＭ４５に改名されたｐＩＭ２９＋４５（McCartyら1991 J. Virol. 65:2936-2945）をＡｐａＩを用いて消化し、得られたより大きなフラグメントを再連結することによって、プラスミドｄｌ６３−８７／４５を構築した。プラスミドｐＩＭ４５は、ＡＡＶコード配列を全て有するが、ＡＡＶ末端反復を欠いている。プラスミドｄｌ６３−８７／４５は、（ｐＩＭ４５に対して）１１０３塩基の欠失をカプシドコード領域内に有し、これがフレームシフト変異を引き起こす（図１参照）。
細胞抽出物の調製：コンフルーエンシー約６０％の２９３細胞からなる１５０ｍｍのプレート１０枚を、カチオン性リポソームを用いてプレート毎に２０μｇのプラスミドＤＮＡでトフンスフェクトし（Gao 1991）、そして感染多重度（ＭＯＩ）５でアデノウィルス５に感染させた。これらの細胞を、感染から４８時間後に収集し、２０ｍｌの冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、１０ｍｌの冷低張緩衝液（２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ）で洗浄した。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを、最終容量４．８ｍｌの低張緩衝液中で再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を静かにホモゲナイズし（タイプＢの内筒で２０ストローク）、そして、５ＭのＮａＣｌを０．２ｍｌ加えて、ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍにまで高めた。懸濁液を氷上で１時間インキュベートし、そして、１５，０００×ｇの遠心分離を２０分間行うことによって抽出物を清澄にした。２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液に対して透析を行った後、抽出物を−８０℃で保存した。
ＡＡＶパッケージング抽出物は、アデノウィルスに感染させ、かつｐＩＭ４５あるいは陰性コントロールプラスミドｄｌ６３−８７／４５でトランスフェクトした細胞から調製した。これまでの研究により、プラスミドｄｌ６３−８７／４５中での変異は、パッケージングには完全に欠損であるが、ＡＡＶ ＤＮＡ複製には実行可能であることが実証されている（HermonatおよびMuzyczka 1984）。最後に、アデノウィルスのみに感染させた細胞からも抽出物が作られた。
上記抽出物のサンプルに対してウェスタン分析を行った。それぞれ１０マイクロリットルの細胞抽出物を、８〜１４％のポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移入し、Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質を、それぞれ、抗Ｒｅｐモノクローナル抗体、抗ｒｅｐ５２／４０およびモルモット抗カプシドポリクローナル抗体を用いて検出した。製造業者のプロトコルに従ってＥＣＬキットを使用して、１０個のウェスタンブロットを可視化した。
予想通り、ｐＩＭ４５由来の抽出物は、全てのＡＡＶコードタンパク質、即ち非構造的タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、と３つのＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３とを有していた（図２）。対照的に、ｄｌ６３−８７／４５に感染した細胞から調製した抽出物は、検出可能なレベルのＡＡＶカプシドタンパク質を有していなかったが、通常レベルのＲｅｐタンパク質を有していた。ｄｌ６３−８７／４５抽出物中に切形カプシドタンパク質が存在しなかったことは、おそらく、タンパク質の不安定性もしくは抗体認識に必要なエピトープが存在しなかったことのいずれかに起因するものであった。アデノウィルスのみに感染した細胞から調製した抽出物は、Ｒｅｐタンパク質もカプシドタンパク質も有していなかった。
実施例２：パッケージング反応用ＤＮＡ基質の調製
（好意により、Dr. R.J. Samulski, University of North Carolinaによって提供された）プラスミドｐＴＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターの制御下においてE.coli β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を有する組換えＡＡＶベクターである（図１）。この２つのプラスミドは、ｐＡＢ１１が内的Ｐｓｔ１部位（internal Pstl site）を欠き、そのＬａｃＺ遺伝子のコード配列内に核局在化シグナルを有する点においてのみ互いに異なる。
ｐＴＲＬａｃＺは、ＨｉｎｄＩＩＩ末端においてｐＢＳ−ＣＭＶ（Pharmaciaより入手）由来の０．９ＫＢのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＣＭＶプロモーターフラグメントに連結され、かつ、ｐＴＲのＢｇｌＩＩ部位にクローニングされる、ｐＣＨ１１０（Pharmaciaより入手）由来のＬａｃＺコード領域を有する、３．７ＫＢのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む。
ｐＴＲは、以下のような段階的な連結によって構築した。プラスミドｄｌ３−９４（McLaughlinら1988）由来の左ＡＡＶ ＴＲを持つ１６０ｂｐのＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを１２７０ｂｐＡｄ２フラグメント（スタッファーフラグメント）に連結させた。得られた１４３０ｂｐのフラグメントを、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルの配列を有する５０ｂｐの合成ＤＮＡフラグメントに、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ適合性末端で連結させた。得られた１４８０ｂｐのフラグメントを、左ＡＡＶ ＴＲを有する１６０ｂｐのＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントの別のコピーに連結させた。得られた１６４０ｂｐのフラグメントをＰｓｔＩで消化し、ゲル精製し、そして、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に連結させた。
２つの理由から、パッケージング実験用にｐＴＲＬａｃＺを選択した。第１に、あらゆる混入野生型ＡＡＶウィルスから容易に区別可能である。第２に、インビトロパッケージング反応の効率を測定する容易な方法を提供した。これは、インビトロ反応の産物を細胞に付与し、その後、感染した細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色することによって行われた。
ｐＴＲＬａｃＺ複製型ＤＮＡの調製のために、２９３細胞を、カチオン性リポソームを用いて、１００ｍｍのプレート毎に１０μｇのｐＩＭ４５およびｐＴＲＬａｃＺ ＤＮＡ（３：１）で同時トランスフェクトし、そして、５ＭＯＩでアデノウィルスに感染させた。レスキューされ複製されたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）ＤＮＡを、Ｈｉｒｔ（J. Mol. Biol. 26:365-369 1967）の方法を用いて、４８時間後に抽出した。アガロースゲル中での電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色の後で、ＡＡＶプラスミドＤＮＡの既知量と比較することによって、ＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）ＤＮＡの濃度を決定した。
実施例３：基質ＤＮＡのインビトロパッケージング
完全なインビトロパッケージング反応物は３０ｕｌ中に、３０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）と、７ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＤＴＴと、それぞれ０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰと、４ｍＭのＡＴＰと、それぞれ０．２ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰと、４０ｍＭのクレアチンリン酸と、３７．５μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼと、０．１７μｇ／ｍｌのｐＴＲＬａｃＺ ＲＦ ＤＮＡと、実施例１の１５ｕｌの細胞抽出物（ＰＣＣＥ）とを有していた。反応物を、３７℃で４時間インキュベートした。反応産物を次に、５５℃で３０分間インキュベートし、そして、他に指示されない限りにおいて、クロロホルムで２回抽出した。ｐＴＲＬａｃＺ ＲＦの代わりに他のＤＮＡ基質を用いて、さらなるインビトロパッケージング反応を行った（表ＩＩ）。
インビトロパッケージング反応の効率を、パッケージされたウィルスのアリコートで細胞を感染させることによって評価した。パッケージング反応の産物を、ウェル当たり５×１０4個の細胞を有する９６ウェルプレートの２９３細胞に加えた。この細胞をアデノウィルス５に同時感染させて、ＡＡＶ導入遺伝子の一過性発現を高め、そして、感染から４８時間後に、記載されているように（Dhawanら1991 Science 254:1509-1512）、Ｘ−ｇａｌを用いて、細胞をβ−ガラクトシダーゼに対して染色した。
野生型ＡＡＶの力価を、感染性センターアッセイによって決定した（McLaughlinら1988）。ウィルスストックのアリコートを用いて、ウェルあたり細胞５×１０4個の密度の９６ウェルプレートの２９３細胞を感染させた。これらの細胞を、アデノウィルス５を用いてＭＯＩ５で同時感染させた。３７℃での３０時間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、濾過デバイスを有するナイロン膜上に移した。０．５ＮのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｌを含有する溶液で飽和させた３ＭＭペーパー上で、膜を３分間湿らせた。膜がブロットされて乾燥した後に、この工程をもう一度繰り返した。膜を、１ＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５ＭのＮａＣｌで中性化し、そして、マイクロ波中で５分間加熱した。膜を、野生型ＡＡＶプローブでハイブリダイズした。プローブにハイブリダイズする膜上のスポットのそれぞれが、ＡＡＶによって溶菌的に感染した細胞１個を表していた。
ｐＴＲＬａｃＺ ＤＮＡをｐＩＭ４５およびアデノウィルスでトランスフェクトした細胞から得た粗抽出物と共にインキュベートすると、反応産物で処理された細胞の相当数がＬａｃＺ遺伝子を発現できた（表Ｉ）。このことは、ｄｌ６３−８７／４５とアデノウィルスとでトランスフェクトした細胞、あるいは、アデノウィルスのみに感染させた細胞由来の抽出物とともにインキュベートした反応産物については言えなかった。ｄｌ６３−８７／４５抽出物は（ｐＩＭ４５抽出物と比較して）カプシドタンパク質のみを欠いていたので、ＴＲＬａｃＺ ＤＮＡの移入および発現を、ＡＡＶカプシドタンパク質を必要とするなんらかのプロセスによって促進した。ｐＴＲＬａｃＺベクターの以前の研究によって、β−ガラクトシダーゼ活性に対して染色することによって得たウィルス力価が、感染性センターアッセイによって決定した感染性ウィルスの力価の約２０分の１の少なさであることが示唆されていた。従って、インビトロパッケージング反応の産物から得たβ−ガラクトシダーゼ形質導入の頻度は、反応混合液１ｍｌ当たり、１０5個もの感染性ウィルスが合成されていたことを示唆した。粒子対感染性の比を１００：１と仮定すると、これは、反応物１ｍｌ当たり１０7個のＡＡＶ組換え粒子の産生を表す。
実施例４：インビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）粒子の密度の決定
ウィルス粒子の密度は、その粒子のタンパク質およびＤＮＡ含有量の関数であるので、我々は、インビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）粒子の密度は野生型ＡＡＶウィルスと区別不可能であると予測した。ＡＡＶビリオン粒子の密度を塩化セシウム勾配遠心分離法によって決定した。インビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）を４ｍｌの塩化セシウム溶液に加え、最終的な屈折率を１．３７２０とした。この溶液をＳＷ５０．１ローター中、４０ｋｒｐｍで、２０時間、４℃で遠心分離した。インビボでパッケージされた野生型ＡＡＶを平行ＣｓＣｌ勾配で行った。勾配の一番上から２００マイクロリットルの画分を取り出して、各画分の屈折率を決定した。その後、画分をＰＢＳに対して透析し、野生型ＡＡＶ、あるいはＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）の力価を、それぞれ、感染性センターアッセイによって、あるいはβ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色することによって決定した。
インビトロで合成した粒子は、本物の野生型ＡＡＶと同じ密度を有していた。ｐＴＲＬａｃＺゲノムは、野生型ＡＡＶゲノムに近い大きさ（野生型ＡＡＶの１０４％）であった。図３に示されるように、両方の種類の粒子はともに単一の活性ピークを生じ、この２種類の粒子の密度は事実上同じであった。野生型およびβｇａｌ粒子はともに、１．３８ｇ／ｍｌの密度と等価な１．３６９８のピーク屈折率を有していた。
実施例５：インビトロパッケージング基質ＤＮＡの構造的要件
インビトロパッケージング反応がインタクトな末端反復を必要としたかどうかを決定するために、末端反復中に欠失を含むかあるいは各末端反復に付いた付加的な配列を有する基質とともに、（実施例２に記載したように調製した）１本鎖および２本鎖ＲＦ基質を用いた（表ＩＩ）。プラスミドの末端反復あるいはベクター配列内で切断されたがＣＭＶおよびＬａｃＺ配列をインタクトに残したいくつかの制限酵素の中の１つを用いて、ｐＴＲＬａｃＺプラスミドＤＮＡあるいはｐＡＢ１１ＤＮＡを消化することによって、上記改変基質を生成した（図１）。さらに、我々は、反応の産物についてクロロホルム抽出の影響を調べた。
産物をクロロホルム抽出すると、完全な末端反復を有するインビボ由来のＲＦ基質のみが効率的にパッケージされた（表ＩＩ、ｄｓおよびｓｓＲＦ ＤＮＡ）。１本鎖ゲノムはＡＡＶ粒子内にパッケージされるにもかかわらず、１本鎖（ｓｓ）ＲＦ ＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）ＤＮＡに対する選好性は見られなかった。末端反復の端部に付いたプラスミドベクター配列を有する基質（ＢａｍＨＩ基質）は、２３個だけの付加的な塩基がｐＴＲＬａｃＺゲノムの各端部に付いたもの（ＰｓｔＩ基質）でさえも、効率的にパッケージされなかった（表ＩＩおよび図１）。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を培養細胞に移入する効率が約８分の１の低さであった。同様に、１４５ｂｐの末端反復の末端から欠失した４６ｂｐを有する基質（ＳｍａＩ基質）あるいは１２１ｂｐを有する基質（ＭｓｃＩ基質）も、パッケージされにくかった。
これとは対照的に、β−ｇａｌ移入活性について試験する前にクロロホルムで処理をしなかったインビトロ反応産物は異なる挙動を見せた（表ＩＩ）。先ず、この産物は、クロロホルム抽出産物について見られたものの約２倍の移入活性量を有していたが、このことは、β−ｇａｌ移入活性の相当量がクロロホルム中で安定ではない粒子に起因したことを示唆する。さらに、付加的なβ−ｇａｌ移入活性は、大部分が、ＤＮＡ基質の大きさに不感受性であった。ＢａｍＨＩを用いて消化したプラスミド基質は、野生型ＡＡＶゲノムの大きさの約２倍であったが、それでも効率的に移入された。驚いたことに、付加的なβ−ｇａｌ移入活性は、インタクトなＡＡＶ末端反復配列を必要とせず、ＭｓｃＩあるいはＳｍａＩによって消化された基質は効率的に移入された。最後に、クロロホルム感受性β−ｇａｌ移入産物はＤＮａｓｅＩによる消化に対して感受性を有していた。
実施例６：Ｒｅｐタンパク質および特定の補因子の要件
インビトロでのＡＡＶ ＤＮＡ複製には、Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８の存在が必要であり（Imら1989 J. Virol. 63:3095-3104; Imら1990 Cell 61:447-457; Snyderら1993 J. Virol. 67:6090-6104）、ＡＡＶ ＤＮＡ合成はアフィジコリンによって阻害される。Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８がインビトロパッケージングに必要であるかどうかを決定するために、タンパク質−Ｇセファロースビーズに結合した抗７８／６８モノクローナル抗体を用いた抽出物の免疫沈降によって、パッケージング抽出物からＲｅｐタンパク質を枯渇させた（HarlowおよびLane 1988, in Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, pp. 522-523）。Ｒｅｐタンパク質を免疫沈降させるために、３容量の細胞抽出物を、１容量の抗Ｒｅｐ７８／６８−タンパク質Ｇビーズとともに、４℃で１時間揺らしながら２回インキュベートした。この手順は、抽出物中のカプシドタンパク質の濃度に重大な影響を及ぼすことなく、Ｒｅｐ７８および６８濃度を約１０分の１に低減させることに成功した（図２）。抗Ｒｅｐ７８／６８抗体によって認識されなかったＲｅｐ５２および−４０もまた、おそらくより大きなＲｅｐタンパク質との相互作用によって部分的に枯渇した。枯渇した抽出物をパッケージング活性について試験したところ、その活性が、完全な抽出物に比べて大幅に（約４分の１）低減していたことがわかった（表ＩＩＩ）。１０μｇ／ｍｌのアフィジコリンを完全な抽出物を有する反応産物に加えることによって、活性が約９分の１に低減した。最後に、枯渇した抽出物にアフィジコリンを加えることによって、パッケージング活性がさらに、約２０分の１に低減した。我々はまた、低減したＲｅｐ濃度およびアフィジコリン処理の条件下においてＤＮＡ合成のレベルを測定し、そしてＤＮＡ合成のレベルが、インビトロパッケージングのレベルとほぼ同程度に低減したことを見出した（データは示していない）。これらの結果によって、１つ以上のＲｅｐタンパク質の存在および活性ＤＮＡ合成がインビトロのＡＡＶパッケージングに必要であったことが示される。
二価カチオンＭｇ++およびＡＴＰは、パッケージング活性に不可欠であることが分かった（表IV）。このことはＣＲＰあるいはＣＳＰのどちらについても言えた。Ｍｇイオンの省略によりパッケージング活性が完全に除去され、一方、ＡＴＰあるいはＡＴＰ再生系、クレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼの省略によりパッケージング反応が激しく阻害された（約２０分の１）。ＡＴＰあるいは上記再生系がない場合に見られる残留活性は、おそらく、無細胞パッケージング抽出物が相当な量のＡＴＰを有していた事実を反映している。ＡＡＶ ＤＮＡ複製にはＭｇおよびＡＴＰの両方が必要であるので、これらの補因子に対する必要は意外なことではない。このことはまた、おそらく、４つのデオキシヌクレオシド三リン酸を反応物から省略したときに見られた活性の穏やかな減少（約４０％）を説明する。やはり、デオキシヌクレオシド三リン酸はＤＮＡ複製に不可欠であるが、無細胞パッケージング抽出物は、これらのヌクレオチドを相当量有していたようである。この反応は、部分的に、他の３つのリボヌクレオシド三リン酸、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰの有無にも依存する。
実施例７：ｗｔＡＡＶおよびインビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）のショ糖勾配遠心分離
１５％〜３０％（ｗｔ／ｗｔ）のショ糖の直線状勾配を、１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ８．８）中で調製した。ＣｓＣｌ勾配からのピーク画分を、ＰＢＳに対して透析し、１００ｕｌに調整し、そしてショ糖勾配の上にのせた。この勾配を２．５時間、２０℃、１１０，０００ｇで遠心分離した。画分を収集し、ＰＢＳに対して透析し、そして、ＣｓＣｌ勾配について記載したように、ｗｔＡＡＶあるいはＡＡＶ（ＬａｃＺ）について分析した。
概ね、２つの粒子調製物の沈澱プロファイルは類似していた。両者とも、成熟１１０Ｓ ＡＡＶ粒子の位置において沈澱した種を有していた。さらに、両調製物ともに、比較的低いあるいは比較的高い沈澱係数で沈澱した材料を有していた。分子量が比較的大きい種は、１つよりも多いＡＡＶウィルス粒子からなる集合体であると思われる。分子量が比較的小さい種は、MyersおよびCarterによってインビボで同定されたものに類似のパッケージング中間体であり得る。本グループはＡＡＶパッケージング中の潜在的な中間体を報告しており、これは、成熟ＡＡＶウィルス粒子と密度はほぼ同じであるが、そのショ糖勾配における沈澱係数は、成熟粒子の１１０Ｓに対して６６Ｓである。MyersおよびCarterによって報告された６６Ｓ粒子は、完全なＡＡＶゲノムを有するようであり、そしてＤＮａｓｅＩに対して感受性を有していた。
0003944240.tif 000002
0003944240.tif 000003
0003944240.tif 000004
0003944240.tif 000005
本明細書において言及されている刊行物および特許出願の全ては、各刊行物または特許出願が具体的且つ個別に参考として援用されているのと同程度に、参考として本明細書に援用される。
これで本発明を完全に記載したが、添付の請求の範囲の主旨あるいは範囲から逸脱することなく本発明に対して多数の変更および改変を行うことが可能であることは当業者には明らかである。
【図１】
0003944240.tif 000006
【図２】
0003944240.tif 000007
【図３】
0003944240.tif 000008
【図４】
0003944240.tif 000009