(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で示される化学物質コロールミシン。
【化１】
0003905604.tif 000013
【請求項２】
下記の式（II）で示される化学物質コロールミシン。
【化２】
0003905604.tif 000014
【請求項３】
シュードアルテロモナス属に属し、請求項１又は２記載のコロールミシンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に前記コロールミシンを生成蓄積させ、該生成蓄積した前記コロールミシンを採取することを特徴とする請求項１又は２記載のコロールミシンの製造法。
【請求項４】
シュードアルテロモナス属に属する微生物が、シュードアルテロモナス・スピーシーズF-420である請求項３記載のコロールミシンの製造法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のコロールミシンを有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物が生産する新規抗生物質並びにその製造法及び用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
感染症等の治療に有効な医薬品として抗生物質の役割が大きい。従来、抗生物質としてはβラクタム系、アミノ配糖体系、マクロライド系、ポリエーテル（イオノフォア）系化合物等が知られており、これらは抗菌剤として使用されている（現代化学・増刊９「抗生物質研究の最先端」、大野雅二・大村智編、東京化学同人、1987年、4-15、医薬と微生物生産（下）、岡見吉郎、奈良高編、学会出版センター、1982年、128-157）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在抗菌剤として多くの化合物が用いられているが、自然耐性菌の存在や、薬剤耐性を獲得した菌の出現などの問題がある。薬剤耐性としては薬剤自身が菌細胞に取り込まれなくなる、薬剤が分解、修飾などの方法で不活性化される、薬剤の作用点が変化して薬剤が無効になる、などの耐性機構が知られ、その解決策として新たなより優れた抗菌剤が求められている（病原菌の薬剤耐性（機構の解明とその対策）、橋本一・井上松久編、学会出版センター、1993年、1-17）。
本発明は、このような耐性菌に対する問題を解決するため、新規な抗菌性物質を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる事情を鑑み、新規な抗菌活性物質の探索を行い、その結果シュードアルテロモナス属に属する菌株の培養液からコロールミシンを単離し、また該化合物が新規化合物であることを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記の式（Ｉ）又は（II）で示されるコロールミシンである。
【０００５】
【化３】
0003905604.tif 000002
【０００６】
【化４】
0003905604.tif 000003
【０００７】
また、本発明は、シュードアルテロモナス属に属しコロールミシンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にコロールミシンを生成蓄積させ、該生成蓄積したコロールミシンを採取することを特徴とするコロールミシンの製造法である。そして、上記シュードアルテロモナス属に属する微生物としてはシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420が挙げられる。
さらに、本発明は、コロールミシンを有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
以下にコロールミシン〔式（Ｉ）又は式（II）の化合物〕の理化学的、生物学的性質を示す。
【０００９】
１．物質の色：無色
２．分子量：433
３．分子式：C25H39NO5
高分解能質量分析：実測値  434.2898  〔(M+H)+〕
計算値  434.2906 (C25H40NO5)
４．核磁気共鳴シグナル：
１）1H-NMR（重DMSO：500MHz）
δppm  0.74(3H, t), 0.83(3H, t), 1.1-1.5(16H, br), 1.37(3H, s), 1.74(2H, m), 2.38(1H, dd), 2.58(1H, dd), 2.86(1H, m), 2.88(1H, m), 4.83(1H, m), 5.09(1H, s), 5.29(1H, t), 5.70(1H, m), 5.91(1H, t), 6.45(1H, m), 7.26(1H, s), 9.83(1H, s)
２）13C-NMR（重DMSO：500MHz）
δppm  8.0(q), 13.9(q), 22.1(t), 24.1(q), 26.1(t), 27.2(t), 28.6(t), 28.89(t), 28.92(t), 30.9(t), 31.22(t), 31.25(t), 44.0(t), 55.1(d), 56.0(d), 63.8(d), 87.2(s), 125.1(s), 127.6(d), 128.2(d), 130.9(d), 132.8(d), 133.9(d), 168.4(s), 170.1(s)
５．赤外吸収スペクトルにおける主な吸収帯（KBr法）
νmax  3438, 2930, 2860, 1765, 1700, 1655, 1543, 1460, 1381, 1328, 1205, 1110, 1054, 996, 948cm -1
６．紫外線吸収スペクトルにおける主な吸収帯（エタノール中）
λmax=270nm、ε=340
７．比旋光度：〔α〕D25 -5.3 °（c 0.23、クロロホルム中）
８．溶解性：クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノールに可溶。水には難溶。
９．抗菌活性
コロールミシンの1000-0.4μg/ml溶液を用いて直径8mmのペーパーディスク（アドバンテック東洋社製）にそれぞれディスクあたり50μlの溶液を添加した場合の、４種の細菌、即ち、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus IFO12732  、以下「S.a.」）、ビブリオ・コスチコラ（Vibrio costicola ATCC33508、以下「V.c.」）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli IFO3301、以下「E.c.」）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis IFO3134 、以下「B.s.」）に対する生育阻害活性を調べた。ペーパーディスク法による阻止円の大きさを表１に示す。
【００１０】
【表１】
0003905604.tif 000004
【００１１】
コロールミシンは、化学的方法によって合成することもできるが、微生物を用いて生産することも可能である。コロールミシンの生産に用いる微生物としては、シュードアルテロモナス属に属し、コロールミシン生産能を有する微生物であれば特に限定されず、例えば、パラオ共和国海域で採取されたサボテングサ属海藻から分離されたF-420株や該菌株に由来する変異株を挙げることができる。
【００１２】
このF-420株の菌学的性質は次の通りである。
なお、形態観察は、培地にシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420株を植菌し、30℃で24〜48時間培養したのちに光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216、ディフコ社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216、ディフコ社製）を用いた。また、本菌株は培地中の塩化ナトリウム濃度が1％以下では菌の生育が認められないことから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に3％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
【００１３】
ａ．形態
１）細胞の形および大きさ：桿菌、1.5-2.6 × 0.6-1.2μm。
２）細胞の多形性の有無：無し。
３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛。
４）胞子の有無：無し。
５）グラム染色性：陰性。
６）抗酸性の有無：無し。
ｂ．各培地における生育状態
１）マリンアガー平板培養        ：良好に生育、コロニーは円形、凸円状、全縁、湿光、中心部黄色、周辺部乳白色、あるいは黄色、あるいは乳白色のコロニーを形成する。
２）マリンアガー斜面培養        ：良好に生育、糸状、黄色。
３）マリンブロス培養            ：良好に生育、被膜、リングを形成し、培地上部が濁る。
４）マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する。
５）リトマスミルク              ：消化する。
ｃ．生理学的性質
１）硝酸塩の還元：還元しない。
２）MRテスト：陰性。
３）VPテスト：陰性。
４）インドールの生成：生成しない。
５）硫化水素の生成：生成しない。
６）でんぷんの加水分解：分解する。
７）クエン酸の利用：Simmons培地：利用しない。
：Cristensen培地：利用しない。
８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが、硝酸塩は利用しない。
９）色素の生成：非水溶性黄色色素を生産する。
１０）ウレアーゼ活性：陰性。
１１）オキシダーゼ活性：陽性。
１２）カタラーゼ活性：陽性。
１３）生育の範囲（温度、pH）：温度10〜50℃、24〜38℃で最も良好に生育。pH3〜11、最適生育pH範囲6〜10。
１４）酸素に対する態度：好気性。
１５）OF試験：ブドウ糖を酸化的に分解する。
１６）糖類からの酸およびガスの生成の有無：
基礎培地はBaumannのBM培地を使用、30℃、３週間培養後。
生成の有無を表２に示す。
【００１４】
【表２】
0003905604.tif 000005
１７）エスクリンの分解：分解する。
１８）アルギニンの分解：分解しない。
１９）ＤＮＡの分解：分解する。
２０）好塩性：有り、生育塩濃度範囲１〜１０％。
２１）βガラクトシダーゼ：陰性。
２２）ＧＣ含量（モル％）：４２．３。
２３）イソプレノイドキノン：主たるユビキノン  Ｑ−８、
マイナー成分としてＱ−７、Ｑ−９を含む。
【００１５】
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第８版の分類基準にしたがって公知の菌種と比較した。本菌株は好気性グラム陰性桿菌で極毛を有し、ブドウ糖を酸化的に分解、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性であった。さらに、ゼラチンを液化し、DNAを加水分解し、GC含量が50％以下であることから従来の分類法に従えばアルテロモナス属に所属すると考えられた。現在、アルテロモナス属は、16S rDNA塩基配列の相同性から２つの属に分かれるが、以上に記した本菌株の表現形はシュードアルテロモナスにより近いと判断されることより、本菌株をシュードアルテロモナス・スピーシーズ（Pseudoalteromonas sp. ）と同定した。そして、この菌株をシュードアルテロモナス・スピーシーズ（Pseudoalteromonas sp. ）F-420とし、平成９年２月１８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16084として寄託した。
【００１６】
次に培養法について述べる。
本発明の培養においては通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖密などの糖類、酢酸等の有機酸、グリセリン等のアルコール類などが単独または組み合わせて用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・ステープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育やコロールミシンの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１７】
培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度は30℃が適当であり、培地のpHは3〜11で培養することができ、6〜10が望ましい。液体培養で通常１〜４日間培養を行うと、コロールミシンが培養液中および菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１８】
培養物からコロールミシンの単離精製は、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出液と培養濾液とを合わせて酢酸エチルなどで抽出する。抽出液を濃縮し、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより、コロールミシンを得る。
【００１９】
本発明の抗菌剤は、コロールミシンを有効成分とする。有効濃度は、抗菌性を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、１〜200 μg/mlとするのが好ましい。本発明の抗菌剤は特に好塩性を示すグラム陰性細菌に有効である。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
〔実施例１〕
種菌としてシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420を用いる。該菌株を1000ml容量の三角フラスコ中のマリンブロス（ディフコ社製、37.4g/l）200mlに植菌し、30℃で24時間振盪（110rpm）培養した。このようにして得られた培養液4.8リットルを遠心分離した。遠心分離によって得られた菌体を、200mlのエタノールで抽出し、濃縮した。濃縮物を水200mlに懸濁させ、酢酸エチル400mlによって分配抽出し、濃縮した。得られた濃縮液をクロロホルムーメタノール（100 ：1〜40：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、抗菌活性フラクションを得た。ついで活性フラクションを濃縮し、移動相としてクロロホルムを用いたゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（日本分析工業製ジャイゲル-1HF、内径20mm×長さ300mm）で精製し、抗菌活性を有するコロールミシン2.4mgを得た。ここで得たコロールミシンは、前記した理化学的性質および生物学的性質を示した。
【００２１】
〔実施例２〕
種々の濃度のコロールミシンのメタノール溶液（濃度200,40,10,2,0.4μ/ml ）を直径8mmのペーパーディスク（アドバンテック東洋社製）に１ディスクあたり50μl 添加した。
種々の好塩性を示すあるいは示さない細菌をマリンアガー2216(TM)（ディフコ社製）寒天培地上に植菌して前述のペーパーディスクをこの寒天培地上に置いた。その後、この寒天培地を30℃で16から40時間放置し、ペーパーディスク周辺に形成された阻止円を観察した。この結果を表３に示す。
【００２２】
【表３】
0003905604.tif 000006
【００２３】
ここで表の左端に「♯」マークを付した細菌は、発明の実施の形態の欄で記載したデータを再掲したものである。なお、表中の「Salinivibrio costicola」は、前記の「ビブリオ・コスチコラ」（Vibrio costicola  ATCC33508）と同一の細菌である（従来ビブリオ・コスチコラとして登録されていたものであるが、最近になって、サリニビブリオ・コスチコラと名称の変更がなされたものである。その経緯については Melladoら著「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー誌」第46巻817ページより821ページ(1996年発行) に記述されている。また、「Pseudomonas aeruginosa OTA-05-H3株」、「Litoralomonas mutabilis EN102株」、「Pelagiobacter variavilis Ni-2088株」の３株はいずれも本発明者の属する研究室で取得された菌株であり、この表に挙げてある株番号は当研究室で用いられている番号に過ぎない。
【００２４】
表３に示すように、コロールミシンはグラム陽性細菌一般、グラム陰性細菌のうち好塩性を示さないもの、及びグラム陰性細菌のうちコロールミシンを生産するシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420に対する生育阻害効果はないが、コロールミシンの生産を認めるもの以外の好塩性を示すグラム陰性細菌に対して生育阻害活性を示すことがわかる。
【００２５】
〔実施例３〕
Dilution Assay法によりコロールミシンの各種微生物に対する最小生育阻害濃度を調べた。この結果を表４に示す。なお、Dilution Assayとは「液体培地または寒天培地を用いて抗生物質を段階的に希釈した系列を作り、この希釈列に試験菌を接種し、一定時間培養後試験菌の発育を阻止する最小阻止濃度をその抗生物質の力価とする」試験である。
【００２６】
【表４】
0003905604.tif 000007
【００２７】
表４に示すように、コロールミシンは感染症の原因として知られる各種微生物には実用的濃度では抗菌性を示さないことがわかる。なお、この実施例にとりあげた病原菌はいずれも好塩性を示さないものである。
【００２８】
〔実施例４〕
コロールミシンの10mg/ml溶液（原液）を用いてウィルス感染細胞に対する生理活性を調査した。
（１）種々の希釈度のコロールミシン溶液の水疱性口内炎ウィルスを感染させた細胞に対するウィルス増殖阻害を該ウイルスによる細胞変性作用を指標として調べた。この結果を表５に示す。
【００２９】
【表５】
0003905604.tif 000008
【００３０】
表５に示すように、原液の1/160希釈液においても細胞変性作用の減少が観察され、わずかながら増殖阻害が認められた。また、原液の1/40-1/80希釈液では増殖阻害を示したが、その効果にはばらつきがあった。なお、本実験においてコロールミシンによる細胞毒性は観察されなかった。
（２）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてニューカッスル病ウィスルを感染させた細胞の合胞体形成作用を調べた。この結果を表６に示す。
【００３１】
【表６】
0003905604.tif 000009
【００３２】
表６に示すように、該ウイルスによる合胞体形成作用は、原液の1-40-1/80希釈液においてやや抑制が認められた。なお、この実験において細胞凝集(V-ATPase阻害剤に特徴的な生理作用) は観察されなかった。
（３）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてニューカッスル病ウィルスの外被糖蛋白質の１つである赤血球凝集素（ＨＡ）の合成に対する影響を調べた。この結果を表７に示す。
【００３３】
【表７】
0003905604.tif 000010
【００３４】
表７に示すように、ＨＡ糖蛋白質の合成阻害は、原液の1/40から1/80希釈液において観察された。
（４）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてベビーハムスター腎細胞の増殖阻害を調べた。この結果を表８に示す。
【００３５】
【表８】
0003905604.tif 000011
【００３６】
表８に示すように、増殖阻害は、原液の1/400から1/800希釈液においてわずかに観察される。
〔実施例５〕
実施例２と同様の方法でシュードアルテロモナス(Pseudoalteromonas)属及びビブリオ(Vibrio)属に分類される海洋細菌を被検菌としてコロールミシン、抗生物質ペンチルキノリノン（2-Pentyl-4-quinolinone）、ポリミキシンＢの抗菌活性を調べた。この結果を表９に示す。
なお、上記細菌はいずれも好塩性を示すグラム陰性菌である。
【００３７】
【表９】
0003905604.tif 000012
【００３８】
表９に示すように、コロールミシンは、シュードアルテロモナス属あるいはビブリオ属に分類される好塩性のグラム陰性菌について、コロールミシン生産菌株に対しては生育阻害活性を示さないが、コロールミシン非生産菌株に対しては生育阻害活性を示す。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により抗菌活性を有する新規化合物コロールミシンが提供される。