(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合した腫瘍特異的または組織特異的または細胞特異的なプロモーターを含む、複製可能な単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
ウイルスベクターのゲノムが、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合した腫瘍特異的または組織特異的または細胞特異的なプロモーターを含む、単純ヘルペスウイルスベクター。
【請求項３】
必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合した腫瘍特異的なプロモーターを含む単純ヘルペスウイルスベクターを有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項４】
腫瘍細胞が、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌腫細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、リンパ腫細胞、肝癌細胞、中皮腫および類表皮癌腫細胞からなる群より選択される種類のものである、請求項３記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
以下の段階を含む、単純ヘルペスウイルスの複製可能なベクターを調製する方法:
(A)該単純ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを単離する段階、および
(B)ウイルスが、(1)腫瘍細胞を死滅させ、(2)正常細胞に対する一般的な毒性を欠き、(3)必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合した腫瘍特異的プロモーターを含むよう、該ゲノムを永続的に改変する段階。
【請求項６】
ベクターの単純ヘルペスウイルスがHSV-1である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ベクターの単純ヘルペスウイルスがHSV-2である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ウイルス複製に必要な少なくとも１つのウイルス蛋白質の発現を制御し、かつ選択的にまたは正常細胞よりも高いレベルで腫瘍細胞において誘導される腫瘍細胞特異的プロモーターを有する単純ヘルペスウイルスベクターを有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項９】
必須単純ヘルペスウイルス遺伝子がHSVのごく初期の遺伝子である、請求項１記載の複製可能な単純ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
HSVの極く初期の遺伝子がICP4遺伝子である、請求項９記載の複製可能な単純ヘルペスウイルス。
【発明の詳細な説明】
本発明は、腫瘍細胞を死滅させる能力を有する改変型単純ヘルペスウイルスの使用に関する。より具体的には本発明は、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合するような腫瘍または細胞特異的な調節配列を含む、複製可能な単純ヘルペスウイルス１型(HSV-1)に関する。さらに腫瘍または細胞特異的なHSV-1は、神経毒性がなく、非分裂細胞では複製できないが、特定の腫瘍細胞を死滅させることができるようにすることができる。また、特定の疾患のための動物モデルを産生するために、細胞または組織特異的なHSV-1が複製し特定の細胞種を死滅させるように構築できるが、これは細胞特異的な排除と呼ばれる。細胞または組織特異的なHSV-1による細胞特異的な排除は、活動が過剰な細胞または本来の場所に発現していない細胞が基礎となる病因で引き起こされる病気を治療するのにも使用されうる。
過去において、動物又はヒトにおける種々の型の腫瘍の治療能力についてウイルスが試されてきた。先行技術で提案された癌のウイルス療法の治療メカニズムは、(i)免疫拒絶、即ちいわゆる「異型発生」現象を誘発するために腫瘍細胞表面上に新しい抗原を産生させること、および、(ii)ウイルスにより直接細胞を死滅させる、いわゆる癌融解法を含む[Austinら、Adv. Cancer Res. 30:301(1979);コKobayashiら、Adv. Cancer Res. 30:279(1979);Morre、Progr. Exp. Tumor Res. 1:411(1960);Russel、Sem, cancer Biol. 5:437〜443]。動物でもヒトでも腫瘍治療は野生型ウイルス、または継代した弱毒化ウイルス、または感染細胞調製物に基づく[コバヤシ等、Adv. Cancer res. 30:279(1979);キャッセル等、Cancer 52:856(1983);モアー、Progr. Exp. Tumor Res. 1:411(1960)]。
数種の動物モデルおよび動物腫瘍が野生型ウイルスを用いた癌融解法を研究するために使用されている[モアー、Ann. Rev. Microbiol. 8:393(1954);モアー、Progr. Exp. Tumor Res. 1:411(1960)]。少なくとも９種のウイルスが、マウス、ラット、ウサギおよびモルモットの種々の腫瘍に関して、ある程度の腫瘍後退を誘導する能力を有することが示された。しかし、これら初期の動物実験に見られる主な欠点はウイルスの全身感染であった。
全身感染を避けるために、抗癌剤として使用するためのウイルスの遺伝子技術は非分裂細胞では複製し得ないように改変したウイルスの創出に焦点を当ててきた。分裂細胞で複製できるウイルスは、正常な非分裂細胞では複製できないために、迅速に分裂している腫瘍細胞に優先的に感染する。
複製欠損レトロウイルスを神経系腫瘍の治療のために使用するには、産生用細胞が必要であり、また、複製欠損レトロウイルス粒子各々が一個の細胞のみに感染するだけで、その後他の細胞に感染して増殖し得ないので、限界があることが示された。この様な複製欠損レトロウイルスは他の腫瘍細胞へ広まらないので、深層性の多重層腫瘍にインビボで完全に浸透することは不可能であろう[マーカート等、Neurosurg. 77:590(1992)]。
レトロウイルスベクターを用いた癌治療の臨床試験は合衆国で承認された[カルバー、Clin. Chem 40:510(1994)]。レトロウイルス含有細胞がヒト患者で成長中の脳腫瘍に移植された[オールドフィールド等、Hmm. Gene Ther .4:39(1993)]。使用されたレトロウイルスは、HSV-1のチミジンキナーゼ(HSV-tK)遺伝子を周囲の脳腫瘍細胞へ運搬し、抗ヘルペス剤であるガンシクロビルに対する感受性を腫瘍細胞に賦与する。オールドフィールドの記述のように、現行のレトロウイルスに基づく癌の治療法の限界のいくつかは、(1)産生されるウイルスの低力価、(2)産生細胞移植塊の周囲の領域に限定されるウイルスの拡散、(3)産生細胞株に対する免疫応答の可能性、(4)レトロウイルス感染細胞による挿入変異誘発や形質転換の可能性、(5)「自殺」産物がレトロウイルス感染細胞と産生細胞を死滅させるので、プロドラッグであるガンシクロビルによる一回のみの治療計画が可能であり、(6)レトロウイルスで形質転換した細胞に直接接触している細胞に限定される周辺効果である[Bi W.L.等、Human Gene Therapy 4:725(1993)]。
癌細胞で毒素遺伝子を選択的に発現させるアプローチのひとつは、「分子化学療法」と呼ばれるもので、毒素をコードする配列の発現を制御するため、腫瘍に発現される遺伝子の転写調節配列(TRS)を使用するものである。Garverら、(1994)Gene Therapy 1:46〜50;Mi11erおよびVile、FASEB J. 9:190〜199(1995)。組織特異的な調節配列が以下のような「自殺遺伝子」の発現を制御するために使用されてきており、引き続き(a)レトロウイルスの仲介する遺伝子導入、(b)DNAの直接的な注入、または(c)アデノウイルス-ポリリジンの仲介するトランスダクションが行われる。Huber, B.E.ら、(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039〜8043;Harris, J.D.ら(1994)Gene Ther. 1:170〜175;Vile, R.ら(1994)Human Gene Ther. 5:29〜35;Kuriyama, S.ら(1991)Cell Struct. Funct. 16:503〜510;Vile, R.G.ら(1993)Cancer Res. 53:3860〜3864;Garver, R.I.J.ら(1994)Gene Ther. 1:46〜50。
レトロウイルスの仲介する遺伝子治療は「ウイルス制御による酵素/プロドラッグ治療」(VDEPT)と呼ばれる。Huber, B.E.ら、(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039〜8043;Gutierrez, A.A.ら(1992)The Lancet 339:715-721。VDEPTは腫瘍細胞で特異的に発現するが正常細胞では発現しない、複製の起こらないベクターを基礎としている。VDEPTのインビトロでの一例では、アルブミンまたはα-フェトプロテインに対するプロモーターをHSV-tk遺伝子に結合させた,複製の起こらないレトロウイルスベクターの差別的な発現によって、通常の肝細胞と肝癌細胞を区別する。Huberら、上記。VDEPTシステムで通常の肝細胞は、HSV-tk遺伝子がアルブミンプロモーターに結合しているときにはチミジンキナーゼを発現できるが、α-フェトプロテインプロモーターに結合させているときは発現できない。逆に、肝癌細胞ではHSV-tk遺伝子がα-フェトプロテインプロモーターに結合しているときにはチミジンキナーゼを発現できるが、アルブミンプロモーターに結合させているときは発現できない。チミジンキナーゼはヌクレオシドの類似体またはプロドラッグを、分裂細胞で強力な細胞毒性のある薬物へと転換する。チミジンキナーゼの発現はいくつかの異なる細胞種で行われており、リンパ種、肝細胞癌、神経膠腫、繊維肉腫、腺癌、および黒色腫がふくまれる。Huber, B.E.ら、(1991)上記;Mullen, C.Aら、(1992)、PNAS 89:33〜37;Culver, K.W.ら(1992)Science 256:1550〜1552;Ram, Z.ら(1993)Cancer Res. 53:83-88;Moolten, F.L.ら(1990)J. Natl. Cancer Inst. 82:297〜300およびVile, R.G.およびHart, I.R.(1993)Cancer Res. 53:3860〜3864。
癌に対する遺伝子治療戦略では、「自殺遺伝子」または免疫調節遺伝子を新生物細胞に導入するために、多くの異なる輸送方法が使用される。こうした戦略の主な最終目標は、正常細胞に副作用がないように、適切な細胞種を導入遺伝子の発現の標的とすることである。例えば、分化した呼吸器上皮に特異的な蛋白質であるヒト界面活性物質蛋白質AのTRSは、毒素産生遺伝子が非小細胞肺癌細胞を標的にするために使用されてきた。Smith, M.J.ら(1994)Human Gene Therapy 5:29〜35。同様に、腫瘍特異的蛋白質である分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤(SLPI)はSLPIを発現する腫瘍でのプラスミドからのチミジンキナーゼ発現を標的とするために使用されてきた。
1990年代初期に、遺伝子操作した複製可能なHSV-1ウイルスベクターの使用は、最初、抗腫瘍治療に関連して検討された[マーツザ等、Science 252:854(1991)]。複製可能ウイルスは一個の細胞に入り込み沢山のコピーを作り細胞を融解させ次の腫瘍細胞に拡散することができるという利点を有する。チミジンキナーゼ欠損(TK-)変異株、dlsptk、は動物脳腫瘍モデルにおいて、ヒト悪性神経膠腫細胞を破壊することができた[マーツザ等、上記(1994)]。不運なことに、dlsptk変異株は神経毒性に関して穏やかに弱毒化されただけで、腫瘍細胞を死滅させるのに適当な投与量で脳炎を誘発する[マーカート等、Neurosurgery 32:597(1993)]。106のプラーク形成単位(pfu)の複製欠損単純ヘルペスウイルスベクターを頭蓋内投与すると致死率が50％となることが証明されているように、後遺症となる神経毒性のために、この様なベクターの腫瘍治療への使用は制限がある。更に、既知のTK-HSV-1変異株はアシクロビルおよびガンシクロビルのような最も普遍的に使用される効果的な抗ヘルペス剤に対して非感受性である。
それ故、腫瘍細胞を死滅させるための安全で効果的なウイルスベクターの開発が最重要課題である。たとえインビボでヒト腫瘍細胞を死滅させることのできるウイルスベクターを設計するためにさまざまな努力がなされてきたとしても、従来の技術では抗ウイルス剤に対して高い感受性を示し、野生型ウイルスに復帰変異を起こすことができないような、腫瘍細胞を死滅させるのに必要な用量で弱毒化された神経毒性を有するウイルスベクターは産生されなかった。
先行技術での遺伝子治療および分子化学療法では、この治療を行うために、外来のポリヌクレオチドまたは外来のポリヌクレオチドから翻訳された蛋白質に依存している。現在のところ、組織または腫瘍特異的ウイルスベクターが、複製可能なウイルスを用いて実証されたことはない。さらに、組織または腫瘍特異的HSVベクターでは、治療上標的組織を死滅させる上で、ウイルスベクターそのものに依存して示されたことはない。
２つの総説で、S.J. Russell.は腫瘍細胞を標的とする複製するウイルスベクターの使用上直面する、いくつかの難点について議論されている。Russell, Sem. Cancer Biol. 5:437〜443(1994);Eur. J. Cancer 30A:1165〜1171(1994)。複製するベクターの正確さを増大させる戦略はレトロウイルスベクターに焦点が絞られてきた。Russellの総説では腫瘍溶解剤として小ゲノムウイルスの操作が記述されている。このような小ゲノムウイルスの主要な欠点は、通常の組織へ広がっていくため、安全性が欠如していることである。
さらに、tkの細胞特異的発現は、トランスジェニック動物が作製されたとき、レトロウイルスベクターから維持されなかった。このことは細胞特異的なレトロウイルスが仲介する遺伝子治療では、ひとたび細胞がインサイチューで正しい発現が停止してしまうかもしれないため、そのように機能しないかもしれないことを示唆している。RichardsおよびHuber、Human Gene Therapy 4:143(1993)。
従来の技術では、大きなHSVゲノムを制御することが困難であるために、標的とされた腫瘍溶解性に対する潜在的なベクターとしてHSVは無視されてきた。さらに、HSV遺伝子は、細胞遺伝子で行われているように制御されているとは考えられない。細胞ゲノム環境におけるHSV-1遺伝子は、制御において２つの範疇に分類される;極く初期の遺伝子のように制御されるもの(α-遺伝子として知られる)、または初期遺伝子のように制御されるもの(β-遺伝子として知られる)。細胞環境でHSV-1遺伝子は、後期遺伝子のようには制御されない(γ-遺伝子として知られる)。それゆえ、宿主染色体の環境におけるウイルス遺伝子の制御は、ウイルスゲノムでのウイルス遺伝子の発現調節とは対応しないのである。このことはまた、ウイルスゲノム中に置かれた細胞のプロモーターが、内因性の細胞ゲノムとは異なる制御を受けうることを示唆している。McKnightら、CANCER CELLS(癌細胞)4;DNA TUMOR VIRUSES(DNA腫瘍ウイルス)、Cold Spring Harbor(1986)163〜173。別の先行技術により、外来のプロモーターがHSVゲノムの中に置かれたとき、ウイルスプロモーターとして制御されることが示された。このことから、HSVが細胞または組織特異的な様式で標的化されるのではないことが示唆された。Panning, B.およびSmiley, J.R. J. Virol. 63:1929(1989);Roemerら、J. Virol. 65:6900(1991)。細胞特異的な様式でHSVを標的にすることが困難であることのさらなる証明は、Andersonらによる業績となっており、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターについて、遺伝子をCNS神経細胞に輸送するためにはHSVでは不十分なプロモーターであることが示されている。Andersonら、Cell. Mol. Neurobiol. 13:503(1993);Andersonら、Human Gene Therapy 3:487(1992)。
さらにHSVの中では細胞特異的な様式で外来遺伝子が制御されないという証明が、HSV産物が細胞のプロモーターを制御できることを示す実験から得られる。Smileyら、Virology 113:345(1981)。例えばウサギβ-グロビン遺伝子が感染しているHSVゲノムの一部として繊維芽細胞に導入されたとき、この遺伝子はHSVの極く初期のポリペプチドによって活性化される。先行技術の制限範囲では、ウイルスを基盤とする、癌細胞を破壊するが正常細胞をおおむね元のままにしておくことのできる治療法に対して、長期にわたる必要性が存在している。
発明の概要
それゆえ、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合している腫瘍または組織または細胞特異的プロモーターを含むHSVを使用することにより、インビボで特定の標的細胞種または腫瘍細胞を死滅させることができるような、複製可能な単純ヘルペスウイルス(HSV)を提供することが、本発明の目的である。
さらに本発明のもう一つの目的は、非神経組織由来の腫瘍細胞内で選択的に複製され、これを死滅させられるような変異HSV-1ベクターを提供することである。本発明のもう一つの目的は、ウイルスベクターのゲノムが、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合している腫瘍または組織または細胞特異的プロモーターを含むような、単純ヘルペスウイルスベクターを提供することである。
本発明の更なる目的は、ベクターが特定の腫瘍細胞を標的としうるような、腫瘍細胞特異的なプロモーターを含む変異単純ヘルペスウイルスベクターの産生である。本発明のいかなる対象を遂行する上でも、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子は単純ヘルペスウイルスの極く初期の遺伝子でありうる。本発明のベクターで使用されるべき好ましいHSVの極く初期の遺伝子は、必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子がICP-4となる場合である。
本発明のもう一つの局面に従って、(A)必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合している腫瘍特異的プロモーターを含む単純ヘルペスウイルスベクターと、(B)腫瘍細胞がベクターによってインサイチューで変化し、それにより腫瘍細胞が死滅するような、ベクターの薬学的に許容される賦形剤とを有する、薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者において腫瘍細胞を死滅させる方法が提供される。しかし、本発明のもう一つの局面は、(A)(i)腫瘍特異的な転写調節配列により制御されているようなICP4遺伝子および(ii)γ34.5遺伝子および/または(iii)リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子に改変されている単純ヘルペスウイルスベクターと、(B)ベクターにより腫瘍細胞がインサイチューで改変され、それにより腫瘍細胞が死滅するような、ベクターに対して薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者の腫瘍細胞を死滅させるために提供される方法に向けられている。腫瘍細胞は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経繊維腫、神経膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経繊維肉腫、および神経髄芽細胞腫からなる群より選択される神経系タイプのものがありうる。本発明に従う死滅されうる腫瘍細胞のその他の種類としては、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、繊維肉腫細胞、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉細胞、甲状腺腫瘍細胞、下垂体腫瘍細胞、リンパ腫細胞、肝癌細胞および中皮腫、もしくは類表皮癌細胞からなる群より選択されるものが含まれる。
本発明のさらにもう一つの態様に従って、患者において腫瘍細胞を死滅させるための方法を提供する。この方法は、単純ヘルペスウイルスベクターをその患者に投与する段階を含む。ベクターは腫瘍細胞特異的プロモーターを含み、プロモーターはウイルス複製に必要な少なくとも一つのウイルス蛋白の発現を調節し、プロモーターは正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において、選択的にまたはより高いレベルに誘導する。この方法は、神経系腫瘍細胞、例えば神経膠芽腫細胞、髄芽腫細胞、髄膜腫細胞、神経線維肉腫細胞、星状膠腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、神経線維腫細胞、脳室上衣腫細胞、神経線維腫細胞、ならびに上記で同定される神経系タイプのものにおいて選択的に発現することができるようなプロモーターの使用を含む。
これらまたはその他の対象を満足させるため、本発明の一つの局面に従うような、(i)γ34.5遺伝子および(ii)リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子のひとつまたは両方を発現することができない複製可能な単純ヘルペスウイルスが提供されてきている。好ましい態様では、ベクターは両方の遺伝子での改変を含む。
(A)単純ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを分離する段階と、(B)ウイルスが(1)腫瘍細胞を死滅させ、(2)正常な組織／細胞に対する一般的な毒性を欠き、(3)必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合している腫瘍特異的プロモーターを含むよう、ゲノムを改変する段階とを含む、単純ヘルペスウイルスの複製可能なベクターを調製するための方法も提供されている。本発明のそうしたベクターはまた、(1)抗ウイルス剤への感受性、および(2)全身的な神経毒性の発現を減少させる能力を付与する。例えば、ベクターの単純ヘルペスウイルスは、HSV-1またはHSV-2であり得る。
本発明は、(A)必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合している組織または腫瘍または細胞特異的プロモーターを含む単純ヘルペスウイルスベクターと、(B)特異的な正常細胞がインサイチューでこのベクターにより改変され、それにより細胞が死滅するような、ベクターに対して薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者において特異的な正常細胞を排除する方法を提供する。このような方法は、HSVベクターで使用される細胞特異的なプロモーターが成長ホルモンプロモーターである場合に正常な下垂体細胞を排除することに向けることができる。さらに、細胞を排除する方法は、細胞特異的なプロモーターがプロオピオメラノコルチンである場合に正常な副腎皮質を死滅させることに向けることができる。
しかし本発明のもう一つの目的は、ベクターが腫瘍細胞特異的プロモーターを含み、このプロモーターがウイルス複製に必要な少なくとも一つのウイルス蛋白質の発現を制御し、このプロモーターが正常細胞よりも腫瘍細胞で、選択的にまたは高レベルで誘導されるような単純ヘルペスウイルスベクターを患者に投与する段階を含む、患者の腫瘍細胞を死滅させる方法に向けられている。
本発明は更に、(A)ウイルスゲノムの(i)γ34.5遺伝子と(ii)リボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子が改変された単純ヘルペスウイルスベクターと、(B)ベクターのための薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者を単純ヘルペスウイルス感染から保護する方法もさらに提供する。
好ましい態様において、神経外科学、化学療法または放射線療法を用いて投与する段階をさらに含む。
本発明の変異型ウイルスベクターは宿主の基礎体温以上の高温に感受性であり、脳炎および発熱がある場合にウイルスの複製を更に阻害することによる付加的な安全性という特徴を提供する。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、後述の詳細な説明で明らかになると思われる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を提示する一方で、例示のためだけに記載されている。その理由は、本発明の精神及び範囲内の種々の改変及び修飾は、当業者にはこの詳細な説明から明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図表を参照することにより、より完全に理解されうる。
図１はG92Aの図による遺伝子の配置を示している図である。この図では以下の省略が使用されている:E＝EcoRI、B＝Bam HI、S＝SspI、e/p＝エンハンサー/プロモーター配列。
図２は異なるヒト細胞種で、KOSおよびd120HSVベクターに比較したときの本発明のG92A1およびG92A2 HSVベクターのウイルス感染価を示しているヒストグラムである。E5細胞は安定に遺伝子挿入されたICP4遺伝子を含み、ICP4ウイルスの増殖を支持できる。Hep3BおよびHuH7はアルブミンを発現する細胞である。Det551、SW480、およびMCF7はアルブミンを発現できない。細胞は６ウェルプレートで調製され、単層細胞に指示されたウイルスが感染された(KOS、G92A1、G92A2、d120)。感染細胞はプラークが形成されるまでインキュベートされ、固定され、ギムザまたはX-gal組織化学染色が行われた。プラークを数え平均のプラーク数からPfu/mlが決定された。各感染細胞種に対してプロットされた値は２から14の異なる実験数の平均である。
図３は細胞培養物にMOIが1.5でKOSまたはG92Aを感染させ、感染後の指示された時間でウイルスがウェルから回収され、E5細胞でタイターが測定されたときの、一段増殖曲線を示すグラフである。
図４は、γ34.5遺伝子の両方のコピーに1 KBの欠失とIP60遺伝子に挿入を含む変異型単純ヘルペスウイルスの構築を図式的に説明する図である。
図５は、変異型単純ヘルペスウイルス、G207-1、の配列の配置を示す図であり、基礎である親の野生型(F株)と比較してある。略号における、BはBamHI、BeはBstEII、GはBglII、NはNcoI、SはScaI、StはStuI、及びXはXhoIを示す。
図６は、低い感染多重度(MOI＝0.01)でも、培養されているヒト神経膠芽腫細胞U-87MGを全て死滅させることができる、G207-1とG207-2の能力を説明するグラフである。
図７は、R3616、G207-1、及びG207-2のガンシクロビル(GCV)感受性を説明するグラフであり、G207-1とG207-2はR3616よりもガンシクロビルに感受性が10倍高いことを示す。R3616(F株)はKOS株(野生型)とガンシクロビルに対し同じ感受性を有する。
図８は、無胸腺マウスにおける皮下のヒト脳腫瘍モデルで、ヒト脳腫瘍細胞(U-87MG)の増殖を阻害するG207-1及びG207-2の能力を説明するグラフである。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、複製能力のあるHSV-1がインサイチューで特異的腫瘍細胞または細胞種に入り込み、複数のコピーを作り、特異的標的細胞を融解させ、周囲の正常な細胞に与える影響は比較的微小である同種の別の細胞に拡散する能力を利用する。本発明の単純ヘルペスウイルスは、次の各々の特徴を有する:(1)腫瘍細胞または正常な細胞種の死滅に関する有効性、(2)特異的腫瘍細胞種または特定の正常な細胞種を死滅させる特異性。さらに、本発明の単純ヘルペスウイルスは以下の特徴のいずれかを含んでいてもよい:(a)正常な脳を保護するため、普遍的神経毒性の顕著な弱毒化、(b)単一変異が野生型ウイルス表現型への復帰を引き起こさないための多重欠失、(c)ウイルスの望ましくない拡散を防ぐためのガンシクロビルに対する高感受性。
先行技術の方法は患者の特定の細胞に遺伝的物質を導入する遺伝子治療を用いる。エクスビボの遺伝子治療とは、身体から関連する標的細胞を取り出し、インビトロで細胞を形質導入し、および引き続く患者への改変細胞の再導入することを含む遺伝子治療である。
本発明の遺伝子治療方法は組換えHSVを特定の標的細胞種または組織に提供するためのインビボでの方法を含む。しかしながら、細胞外のポリヌクレオチド、またはそのような細胞外ポリヌクレオチドから翻訳された蛋白質に依存して治療を行うほとんどの他の方法と異なり、本発明では標的組織を治療的に死滅させる上でHSVそのものに依存している。
本発明はインビボで腫瘍細胞を破壊し、その過程で腫瘍全体で複製し拡散するために、複製可能なHSVの固有の細胞障害性の能力を利用する代替的なアプローチを提供する。本発明者らの悪性脳腫瘍での初期の研究では、非分裂細胞で複製できない、および/または神経毒性を持たないHSVの変異体が使用された。Martuza, R.L.ら(1991)Science 252:854〜856;Mineta, T.ら(1994)Cancer Res. 54:3963-3966。
HSVの固有の神経病原性のために、神経病原性のない変異体が単離され、これはその他の細胞種では正常に増殖することができる。Fawl, R.L.ら(1994)Sem. Virol. 5:261〜271。急速に増殖する腫瘍と周辺の正常な脳組織の間の差異は、ウイルスが腫瘍に限局的に存在するように思われ、処置を施した動物に副作用を起こさないようなものであった。Martuza, R.L.ら(1991)Science、上記。
単一遺伝子産物の発現を標的とするよりもむしろ、本発明では初期および後期ウイルス遺伝子の転写、およびそれゆえウイルスの完全な溶解性の増殖サイクルに対して必要とされる必須のウイルスIE遺伝子を標的としている。極く初期の遺伝子は転写翻訳の制御体である。必須の極く初期のHSV遺伝子の例としては、ICP4およびICP27がある(ICP27はまたIE63、Vmw63、IE2、UL54、およびα27としても知られている)。しかし、ICP4のみが初期ウイルス遺伝子を発現させるのに必須である。このベクターに潜在的に存在する細胞毒性は腫瘍全体の近接した細胞に広がる新しい感染性のあるウイルス粒子の合成により増幅される。
細胞特異的なウイルスベクターの産生は、動物モデルを産生するため、または発生の異なるステージで特定の細胞を排除することにより発生の間での特定の細胞種の重要性を研究するために、動物の特定の細胞種を除去するといった、腫瘍以外の多くのシステムに応用が可能である。したがって、本発明の方法はまた、細胞機能や病気の状態の研究のための実験動物モデルを創出するために、正常細胞の細胞特異的な排除に対して応用可能である。細胞または組織特異的なプロモーターは、そのような特定の細胞または組織の機能不全を基盤とした病因を有する特定の病気に対する動物モデルを提供するために、本発明のHSV構築物において使用されうる。例えば、インスリン依存性糖尿病の動物モデルを産生するために、必須のHSV遺伝子がインスリンプロモーターにより制御されているような本発明のHSVベクターを用いて、膵臓β島細胞が除去されうる。
ノックアウトトランスジェニックマウスを用いて創出された病気の状態はまた、ノックアウトトランスジェニックマウスでの毒素を標的とするのに使用されたのと同じ遺伝子を用いて個々の動物で創出されうる。例えば、様々な神経細胞特異的プロモーターの制御下でlacZを含むトランジェニックマウスが作製されてきた。Nirenberg, S.およびCepko, C.J. Neurosci. 13:3238(1993)。このようなトランスジェニックマウスでは、lacZの発現は光で活性化可能な色素で検出することができ、その後色素標識した細胞は光で除去された。
本発明では、特定の細胞をインビボで排除するために細胞特異的なHSVに対して動物を曝露することにより、ノックアウトトランスジェニックマウスを産生する必要がなくなっている。表１に掲げられた細胞または組織特異的なTRSのいずれも、請求の範囲とされたHSVベクターで使用されうる。以下では細胞または組織特異的なHSVベクターの例を提供する:(a)ラットのチロシンヒドロキシラーゼプロモーターのBglIIth(-2400)からAluIth(+27)断片(Kim, L.S.ら、(1993)、J. Biol. Chem. 268:15689〜15695)が、カテコールアミン作用性神経特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる;(b)pBP-HのBglIIMBP(-1297)からHindIII(+60)断片(Miura, M.ら(1989)Gene 75:31〜38)がオリゴデンドロサイト特異的なHSVベクターを産生するためにしようされうる;(c)ラットの軽神経フィラメント遺伝子のBglIINF-L(-2003)からSmaINF-L(+75)断片(Reeben, M.ら、(1995)、J. Neurosci. Res. 40:177〜188)が、神経特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる;(d)ヒトのトリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子のSalITPH(-2117)からAvaITPH(+29)断片(Boularand, S.ら、(1995)、J. Biol. Chem. 270:3757〜3764)が、セロトニン/松果体特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる;(e)マウスのプルキンエ細胞蛋白質-2(Pcp-2)遺伝子のXbaIPcp-2(-3.5)からvuIPcp-2(ATG)断片(Vandaele, S.ら、(1991)、Genes & Dev. 5:1136〜1148)が、プルキンエ細胞/小脳特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる;(f)マウスのプロタミン１遺伝子のSstImP1(-4800)からNcoImP1(+95)断片(Peschon, J.J.ら、(1987)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、84:5316)が、精子細胞特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる;(g)マウスのプロオピオメラノコルチンプロモーター(Tremblayら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、85:8890(1988)が、副腎皮質細胞特異的なHSVベクターを産生するために使用されうる。以下のリストは腫瘍特異的HSVベクターの例を提供する:(a)ヒトの表皮性増殖因子受容体遺伝子のSstEGFr(-1109)からSstIEGFr(+1)までの断片(Ishii, S.ら、PNAS 82:4920(1985))は扁平上皮癌、神経膠腫、または乳癌を標的とするための腫瘍特異的HSVベクターを産生するために使用される;(b)ヒトのムチン様糖蛋白質遺伝子(DF3、MUC1)のXmnIDF3(-1656)からXmnIDF3(+31)までの断片(Abe, M.およびKufe, D.、PNAS 90:282(1993))は乳癌を標的とするための腫瘍特異的HSVベクターを産生するために使用される。
さらに本発明の腫瘍特異的HSVベクターは腫瘍特異的遺伝子の生理学的な役割を研究するための動物モデルを産生するために使用されてもよい。表２に掲げられている腫瘍特異的TRSまたはプロモーターのいずれも請求の範囲とされたHSVベクターで使用されうる。
しかし、本発明の細胞または組織特異的なHSVベクターのもう一つの利用は様々な病気の状態の治療に対するものである。表１に掲げられている細胞または腫瘍特異的TRSは特定の病気の状態に関与する細胞を排除するために請求の範囲のHSVベクターにおいて使用されてもよい。ひとつの潜在的な治療的アプローチは慢性痛に関与する特定の神経を排除するためのものとなると考えられる。神経病原性の痛みの治療では、HSVはサブスタンスPのTRSの制御下の必須HSV遺伝子を含む。サブスタンスPを発現する脊髄後根神経節細胞を標的とする。HSVベクターは非分裂細胞に感染するように設計され、抗ウイルス薬に感受性となると考えられる。
さらなる治療上のアプローチは以下のものを含む:(1)イボに対して応答するケラチノサイト/上皮細胞の排除;(2)機能亢進組織での細胞の排除(例、甲状腺);(3)肥満患者での肥満細胞の排除;(4)良性腫瘍の排除(例、良性の甲状腺腫瘍、良性の前立腺肥大症、結節性硬化症);(5)先端肥大症を治療するため、腺下垂体細胞を産生する成長ホルモンの排除;(6)プロラクチン産生を止めるための乳腺刺激ホルモン産生細胞の排除;(7)クッシング病を治療するため、ACTH-産生細胞の排除;(8)クロム親和性細胞腫を治療するため、副腎髄質のエピネフリン産生クロム親和性細胞の排除;(9)インスリノーマを治療するため、インスリン産生β島細胞の排除。
例えば、結節性硬化症は、多組織に侵入する良性腫瘍(過誤腫)により性格付けられている遺伝性疾患(10,000出生につき１例)である。結節性硬化症は、αβクリスタリンの転写調節配列を用いて腫瘍を標的とする、本発明のHSVベクターを用いて治療されうる。IwakiおよびTateishi、Am. J. Pathol. 139:1303(1991)。
もう一つの例では、本発明のHSVベクターが脂肪細胞で特異的に複製しこれを溶解させるように標的とするために、肥満細胞TRS(Graves, R.A.ら、J. Cell Biochem. 49:219(1992))を利用する。分裂しない非癌細胞の治療のために、ベクターは非分裂細胞での増殖に対して弱毒化されることができなかった。また、構築物は抗ウイルス剤(例、tk+)に感受性であるべきである。
本発明のウイルスは、少なくとも一つの必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現での改変を含むように設計される。「必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子」とはウイルス複製に必須であるような蛋白質をコードするHSV遺伝子のことである。WardおよびRoizman、Trends in Genetics 10:267(1994)参照。ウイルス複製に必須のHSV遺伝子の例には極く初期の遺伝子であるICP4およびICP27、DNA複製に必須の遺伝子(VL9、VL5、VL42、DNA pol、およびICP8)、ならびにいくつかのHSV構造遺伝子が含まれる。前記。しかしながら、HSVの極く初期の遺伝子は、好ましくは本発明のHSVにおいて細胞、組織、または腫瘍特異的プロモーターの制御下に置かれるべきHSV遺伝子である。極く初期のHSV遺伝子であるICP4およびICP27はそれらが転写制御遺伝子であるために好ましい。例えば、ICP4はHSV複製に必須の他の遺伝子より先に転写が始まらなければならない。それゆえ、DNA複製に必要なHSV遺伝子(例えばVL9、VL5、VL42、DNA pol、およびICP8)がウイルス複製に必須であるにも関わらず、細胞または組織または腫瘍特異的なプロモーターの制御下にこれらを配置しても、特定のプロモーターまたは特定の細胞種に対して特異的であることが証明されないかもしれない。
また、本発明のウイルスは、一つまたは複数の特異的HSV-1遺伝子の発現にさらなる改変を含むよう操作される。さらに改変されうる特異的HSV-1遺伝子は次の通りである:(1)γ34.5遺伝子および(2)リボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子。この点についての改変は、γ34.5遺伝子とリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子の両方の遺伝子産物の発現を破壊する改変を含む。このような多重変異の存在は、野生型病原性への復帰の可能性を更に減少させる。
本発明は、周囲の正常組織を傷つけずに、脳腫瘍細胞を含む腫瘍細胞を効果的に死滅させることができるため、ウイルスを構築し次いで試験するための方法を提供する。更に、全身投与した薬物に対する感受性を増加させるために、変異をこれらのベクターに挿入することができる。
組織または細胞または腫瘍特異性の達成
単純ヘルペスウイルスは非常に広い宿主範囲を持ち、ほとんどの細胞種に感染することができるようなので、本発明の単純ヘルペスウイルス変異株は腫瘍細胞特異的プロモーターを用いた特定の腫瘍型を標的としてもよい。用語「腫瘍細胞特異的プロモーター」または「腫瘍細胞特異的転写調節配列」または「腫瘍特異的プロモーター」または「腫瘍特異的転写調節配列」とは、正常細胞よりも標的腫瘍細胞において、選択的にまたは高いレベルで誘導される転写調節配列、プロモーターおよび/またはエンハンサーを示している。腫瘍特異的プロモーターは、特定の細胞種または腫瘍細胞で選択的にまたは高いレベルで誘導されるプロモーターを含む。本発明のHSVベクターで使用されうる腫瘍細胞特異的TRSは、表２に列挙されている。用語「組織特異的プロモーター」または「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的転写調節配列」とは、標的細胞または組織種で選択的にまたは高いレベルで誘導される転写調節配列を示す。
本発明のベクターはまた、非神経組織由来の腫瘍細胞内で選択的に複製し、これを死滅させるようにも設計されうる。本発明の単純ヘルペスウイルスベクターは、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターの制御下でのウイルス複製に必要な少なくとも一つのウイルス蛋白質を配置するように設計される。腫瘍特異的プロモーターは正常細胞よりも標的腫瘍細胞において、選択的にまたは高いレベルで誘導される。
野生型の必須単純ヘルペスウイルス遺伝子が発現されない状況において必須単純ヘルペスウイルス遺伝子(例、ICP4)の発現を制御するために、表皮性増殖因子受容体遺伝子のプロモーター(EGFr)または塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)遺伝子のプロモーターまたはNESTINまたはその他の腫瘍関連プロモーターもしくはエンハンサー成分のような、標的腫瘍で高度に発現されている遺伝子のプロモーターを、このような腫瘍特異的なHSV-1変異体が利用する。必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子を機能しないようにするには、遺伝学的な不活性化か、または腫瘍特異的転写調節配列で転写調節配列を置き換えることによっておこなわれうる。
本発明では、必須のウイルス遺伝子産物がそのウイルス自体のプロモーターではなく腫瘍特異的プロモーターの制御下にあるような、宿主範囲の条件付きの単純ヘルペスウイルス変異株を含む。この特異的なプロモーターに対する適切な制御蛋白質を含む許容される細胞では、必須のウイルス遺伝子産物が発現され、ウイルスは非許容細胞に感染するまで複製し近接する細胞へと広がっていくことが可能である。こうした研究は本発明の複製可能な単純ヘルペスウイルスに応用可能である。これらの構築物は、しかしながら、正しい細胞種でのみ複製可能であり(つまり、腫瘍細胞または標的細胞種)、その他の細胞(つまり、周辺の組織)では複製できない。
多くの腫瘍細胞種が正常な、最終段階まで分化した細胞では発現されなくなっているような表現型マーカーを発現している。腫瘍細胞特異的なウイルスを構築するために、この改変された発現様式を利用することができる。このような神経腫瘍での分化制御遺伝子の例には次のものが含まれる;(i)nestinという、通常神経上皮幹細胞で発現するが成熟CNS細胞では発現しない中間径フィラメント蛋白質で、これはヒト脳腫瘍では多量に発現し、神経膠腫で最も顕著である、(ii)塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)という神経外胚葉に対する分化因子および分裂促進剤で、これはヒトの神経膠腫および髄膜種では高度に発現しているが、転移性脳腫瘍または正常な脳組織では発現していない、および(iii)表皮増殖因子受容体(EGFr)という、EGFにより刺激される膜に結合するチロシン特異的な蛋白質キナーゼで、これはヒト高度神経膠腫では非常にしばしば過剰発現し、改変され遺伝子増幅が起こるが、正常な脳ではほとんどそうならない。肺、乳房、喉頭咽頭、膀胱子宮内膜、卵巣、および結腸直腸の癌で発現する分化的に制御された遺伝子の例は分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤(SLPI)である。表１および２は本発明のベクターで使用されうる組織および腫瘍特異的プロモーターの例のリストを提供している。
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腫瘍または組織特異的転写調節配列の制御下に置かれているひとつの特異的な必須HSV遺伝子はICP4遺伝子で、これはまたVmw175、またはIE-3またはIE175遺伝子またはα４として知られている。ICP4はHSV転写の主なトランス活性化因子であり、ウイルスの細胞溶解性増殖のために必須の175kD蛋白質をコードする。ICP4を持たない変異株は初期または後期ウイルスポリペプチドを合成することができない。Preston, C.M.(1979)J. Virol.29:275〜284。Deluca, N.A.ら、(1985)前記。
本発明の組換えベクターのために使用されるひとつの可能なHSVバックボーンはG92Aで、d120という、ICP4遺伝子の欠損変異株由来のHSV-1 KOSから作製された株である。d120はE5のように、ICP4を相補する細胞系でのみ増殖できる。Deluca, N.A.ら(1985)J. Virol. 56:558〜570。
復帰変異株を制御するために、ウイルスストックが標的細胞で、組換え体の初期の単離物から調製される。ベクターが標的細胞で増殖するとき、ICP4欠損の復帰変異の可能性はないと思われる。しかしながら、E5細胞では挿入したICP4遺伝子があるので、E5細胞では低頻度で復帰変異が起こる。この手法は、ひとたびプロモーターが細胞特異的な様式でICP4発現を指向することが決定され、組換え体が単離されたならば、種々の細胞に対してしようされる。これは最初E5細胞で組換え体を単離し、その後特異性を調べることにより行われうる。
ある腫瘍型を標的とするためにウイルスがCNSにはいりこむ可能性はすくないので、すべてのベクターが神経毒性を持たない必要があるわけではない。しかしながら、本発明のベクターはまた米国特許出願第08/264,581号に開示された安全性の特徴を含みうる。組換えHSVが野生株に復帰する可能性がないことは本発明の重要な特徴である。ウイルス病原性または宿主免疫応答をうまく回避する能力に影響するようなその他の遺伝子も欠損してよい。細胞排除のためには非分裂細胞で複製できるようにベクターが構築される。
腫瘍または組織特異的な転写調節配列が必須のHSV遺伝子を制御するような各構築物の効果は、特定のTRSに影響することができない対照細胞ばかりではなく、特定の哺乳動物標的細胞でも評価される。
HSV-1ベクターの構築は例えば以下に説明されている。米国特許第5,288,641号、RoizmanおよびJenkins、J. Science 229:1208(1985);Johnsonら、J. Virol. 66:2952(1992);Gageら、J. Virol. 66:5509(1992);SpaeteおよびFrenkel、Cell 30:295(1982);GoldsteinおよびWeller、J. Virol. 62:196(1988)、Coen、Virology(ウイルス学)第７章、Raven Press、1990;BreakefieldおよびDeLuca、The New Biologist、3:203(1991);LeibおよびOlivo、BioEssays 15:547(1993);Gloriosoら、Seminars in Virology 3:65(1992);ChouおよびRoizman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:3266(1992);Breakfieldら、Molec. Neurobiol. 1:339(1987);Shigら、VACCINES 85、Cold Spring Harbor Press(1985)177〜180;Palellaら、Molec. Cell. Biol. 8:457(1988);Matzら、J. Gen. Virol. 64:2261(1983);Mocarskiら、Cell 22:243(1980);およびCoenら、Science 234:53(1986)。
DNA配列の遺伝子操作に対する更なる方法は当技術分野で知られている。一般的にはこうしたことはAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0LOGY(分子生物学での現在のプロトコール)の第１６章(John Wiley and Sons, Inc,);Paolettiら、米国特許第4,603,112(1986年7月)を含む。ウイルス学的な考慮はまたCoen, D.M.、VIROLOGY(ウイルス学)の「Molecular Genetics of Animal Viruses」(動物ウイルスの分子遺伝学)123〜150(第２版)(Raven Press、1990)に総説がある。
G92Aを創出するために用いた組換えプラスミドPtkΔ-ALI4は以下のように構築された。pHSV106(HSVのBamHI Q断片を含む、GIBCO/BRL Life Technologies、Gaithersburg、MD)のHSV tkコード領域からの0.5kbのBglII-KpnI断片がptkΔを創出するためにpSL310(Invitrogen)のBglII-BamHIポリリンカーと置換された。大腸菌lacZ遺伝子とSV40のポリアデニル化シグナル(poly A)を含むpHCL(Kaplitt, M.G.ら(1991)Molecular and Cellular Neurosciences 2:320-330参照)の4.3 kbのHindIII-SalI断片が、DNAポリメラーゼI(Klenow断片)で平滑末端とされ、ptkΔLを創出するためにptkΔの平滑末端とされたBglII部位(tkの+53)にサブクローン化された。ptkΔLではlacZの発現はHSVの初期プロモーターであるHSV tkプロモーターで制御されている。ICP4のコード配列の+178(ATGの123bp上流)からのポリアデニル化部位までを含むpGH108(Roberts、M.S.ら、(1988)、J.Virol. 62:4307〜4320参照)の4.1kbのSalI-MseI断片がKlenow断片で平滑化され、p2335A-1の平滑末端とされたBamHI部位にサブクローンされた。Huber, B.E.ら、(1991)上記、pAL14を生成するためのアルブミンのキャップ部位(Pinkert, C.A.ら、(1987)参照)を参照のこと。アルブミンエンハンサー/プロモーターおよびICP4のコード配列を含むpAL14(平滑末端とされたBstXIおよびEcoRV断片)からの6.4kb断片は、ptkΔL-ALI4を生成するために、ptkΔLのSV40のポリアデニル化部位の直後のポリリンカーにあるXbaI部位のところ(平滑末端化)でサブクローンされた。
G92A DNA構造のサザンブロットハイブリダイゼーション解析
(A)lacZおよびSV40ポリアデニル化配列の存在は標識されたpHCL(acZおよびSV40ポリアデニル化配列を含む)でBamHIおよびSspI消化されたウイルスDNAのハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。G92Aはd120には存在しない3.5および2.2kbの断片を含む。(B)アルブミンのエンハンサー/プロモーター配列の存在は、EcoRIで消化されたウイルスDNAを標識されたp2335A-1とハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。G92Aはd120には存在しない期待される2.8および1.8kbの断片を含む。(C)正しいICP4断片の存在は、EcoRIで消化されたウイルスDNAを標識されたICP4遺伝子を含むpXhoI-C(9.5kbのXhoI-C断片を含む、O'Hare, P.ら(1985)J. Virol.53:751〜760参照)とハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。元のICP4断片は野生型のHSV KOS DNAで観察された。d120およびG92AでのICP4の4.1kbの欠損は、KOSに存在する5.3kb断片ではなく、1.2kbの断片の範囲内に含まれた。さらに、プラスミド(ptkΔL-ALI4)由来の4.7kbのICP4断片がG92Aでのみ観察された。(D)tkのコード配列の中へのlacZ、アルブミンのエンハンサー/プロモーターおよびICP4遺伝子の挿入は、BamHIおよびSspIで消化されたウイルスDNAを標識されたpHSV106(tk遺伝子を含む)とハイブリダイゼーションを行うことにより確認された。プラスミドptkΔL-ALI4由来の２つのDNA(4.5および2.4kb)がG92Aには存在していたが、d120には元のBamHI Q断片(3.4kb)が存在していた。
ウイルス感染細胞におけるIC4蛋白質の発現。
Lab-Tekチャンバースライド(NUNC,Inc.、Naperville、IL)で増殖させたE5(ICP4を相補する)(DeLuca,N.A.良、(1987)上記参照)、HepG2、Hep3B(アルブミンを産生する)およびMCF7(アルブミンを産生しない)細胞に対し、G92A1、G92A2、d12-またはhrR3(ICP6を欠損する変異体HSV)20〜100 pfu/ウェルのウイルスを感染させた。Goldstein, D.J.ら、(1988)J. Virol. 62:196〜205。感染48時間後に細胞は固定され、抗ICP4モノクローナル抗体(Advanced Biotechnologies Inc.、Columbia、MD 21046、USA)、引き続き登録商標ImmunoPureローダミン標識ヤギ抗マウスIgG(Pierce、Rockford、IL 61105)と反応させたICP4陽性のクラスター番号は以下のとおりである:(MCF7、E5、Hep3B、およびHepG2のhrR3感染)＝(6、15、20、9)および(MCF7、E5、Hep3B、およびHepG2のd120感染)＝(0、88、0、0)、(MCF7、E5、Hep3B、およびHepG2のG92A1感染)＝(0、128、28、36)(MCF7、E5、Hep3B、およびHepG2のG92A2感染)＝(0、132、42、70)。いくつかの独立した免疫陽性細胞がMCF7細胞にd120およびG92Aを感染させた後、観察された。lacZ遺伝子はこれら構築物でのレポーターとして使用されるのだが、その他のレポーターが使用されうる(例、ヒト胎盤アルカリホスファターゼまたはその他のHSV遺伝子、またはneoR)。
G92Aプラークでのβガラクトシダーゼの発現
細胞は本発明の構築物に感染させた。プラークが顕微鏡下で見えるようになったとき、細胞はホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドで固定され、X-galで染色された(0.5mg/ml X-gal、5mMフェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウム、2mM MgCl2、リン酸緩衝塩液中)。βガラクトシダーゼを発現する細胞は濃く染色されて見える。
単純ヘルペスウイルスベクターの媒介する肝癌細胞の破壊
本発明の一つの例は肝癌特異的単純ヘルペスウイルス変異株を含み、このとき必須ウイルス遺伝子産物はそれ自体のウイルスプロモーターではなく、アルブミン転写調節配列の制御下にある。さらに特定すれば、マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーター配列が細胞特異的な調節領域として使用されうる。Pinkert, C.A.ら、(1987)Genes Dev. 1:268〜276;Herbst, R.S.ら(1989)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:1553〜1557。アルブミンプロモーターの8.5から10.4kb上流領域がアルブミンプロモーター(300bp)との組み合わせでエンハンサーとして機能し、トランスジェニックマウスの成体肝およびヒト肝癌細胞において、組換えアデノウイルスまたは組換えレトロウイルスを感染後、高レベルの発現をおこなった。Herbst, R.S.ら(1990)、Mol. Cell. Bio1. 10:3896〜3905;Huber,B.E.ら(1991)上記;Kuriyama, S.ら(1991)上記;Pinkert, C.A.ら(1987)上記。アルブミンは肝臓でのみ発現され、転写開始のレベルで制御されている。Tilghman, S.M.ら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5254〜5257)。
肝臓特異的転写調節配列によりICP4が制御される変異体HSVを構築するためには、ふたつのキメラ遺伝子を含むptkΔL-ALI4というプラスミドが作製された(図１)。β-ガラクトシダーゼ発現がHSVのtkプロモーターにより制御されるように、大腸菌のlacZコード領域およびSV40のポリアデニル化部位は、tkプロモーターのすぐ下流にあるHSV tk遺伝子に挿入された。マウスアルブミンエンハンサー/プロモーター配列は、ICP4をコードする配列(+178のところ、ICP4転写は+301で始まる)およびpolyA付加部位の上流にクローン化された。Pinkert, C.A.ら(1987)上記。
組織特異的なプロモーターはHSVのICP4遺伝子のSalI部位(+178)と翻訳開始部位(0でATG)の間のいかなる部位のところで挿入されてもよい。+178の上流の部位で+301の転写の開始部位まではまた、細胞、組織、または腫瘍特異的な様式で機能的となる可能性が高い。一般的な分子生物学の方法を用いて、その他のプロモーターの挿入を(可能性のある制限酵素部位の範囲を提供することにより)単純化するために、SalI部位のところにポリリンカーを挿入することが可能であろう。プロモーターを含むICP4の配列はGenbankの寄託番号X06461またはEMBLのLocus id HEHSV1G3である。
ptkΔL-ALI4は(プラスミドバックボーンでの唯一のSalI部位のところで)直鎖化され、E5細胞(ICP4遺伝子(-330からmRNAの3'端の約400bp下流まで)が安定に形質転換されたVero細胞)に対してd120のDNAとともに共遺伝子導入が行われた。DeLuca, N.A.ら(1987)Nucleic Acids Res. 15:4491〜4511。組換えウイルスベクターはE5細胞で３回プラーク精製を行った。組換えプラークは(lacZ遺伝子のために)X-gal存在下で青く染まり、ガンシクロビルの存在下で生育した(1mg/ml、それらがtk-であるため)。
E5細胞に存在するICP4遺伝子との組換えを通じて生成するICP4+の復帰変異体がストックに混入する可能性を最小限とするために、ウイルスストックはその後HepG2細胞上で調製された。２つの独立して単離された組換えストックG92A1およびG92A2が調製された。これらの組換え体のDNA構造は、制限酵素消化およびサザンブロット解析により、ICP4、lacZ、アルブミンエンハンサー/プロモーターおよびHSV tk遺伝子に対するプローブを用いて確認された。組換え体はd120のICP4欠損を維持し、さらにHSV tk遺伝子にICP4挿入を含む。
精製単離された組換え体HSVの組織特異性を調べるために、ウイルスストックに対して様々なヒト細胞系で複製をする能力が調べられた。ヒトHep 3B(挿入されたＢ型肝炎ウイルス(HBV))およびHBV HepG2およびHuH7肝臓癌細胞はアルブミンを発現している。Nakabayashi, H.ら(1982)Cancer Res. 42:3858〜3863;Aden, D.Pら(1979)Nature 282:615〜616;Huber, B.E.ら(1991)上記。肝癌細胞は通常、成人肝細胞に比較してアルブミン発現レベルが５〜１０％ほどしかない。Clayton, D.F.ら(1985)Mol. Cell. Biol. 5:2633〜2641。ヒトMCF-7乳腺癌細胞、SW480結腸腺癌細胞、Detroit 551二倍体線維芽細胞は検出可能なアルブミンを発現しない。Huber, B.E.ら(1991)上記。
組換え体ウイルスG92Aの種々の細胞腫でICP4蛋白質を合成する能力が免疫蛍光アッセイによって決定された。細胞は20〜100 pfuのウイルスに感染させその後４０時間後に固定した。抗ICP4モノクローナル抗体がICP4発現細胞を検出するのに使用された。E5細胞でのICP4の発現はHSVの感染後にのみ検出された。ICP4+細胞のクラスターは、G92A1およびG92A2を感染させたときにはアルブミンを発現している細胞(HepG2、Hep3BおよびHuH7)に感染させた後にのみ観察され、一方で、hrR3(ICP6欠損変異株)の感染は試験が行われた全ての細胞種でICP4+細胞のクラスターを引き起こす。非肝癌細胞に組換え体ウイルスを感染させたとき、結果として対照細胞で観察される以上のICP4免疫反応性は検出されなかった。プラスミドが細胞に遺伝し導入されたとき、発現細胞の数はVeroおよびHepG2細胞で同様であった。アルブミンプロモーターICP4構築物を含むプラスミドが一過性発現のためにことなる細胞種で試験されたとき、特異性は見られなかった。ICP4に対する免疫陽性は、(a)腫瘍または組織または細胞特異的なプロモーターによって制御されている、および(b)ウイルスの複製にとって必須であるという２点の両方であるような遺伝子の遺伝子産物を同定している。もしHSV構築物が特定の標的とされた細胞種でICP4を発現することができないならば、感染細胞はICP4に対して免疫陰性であるばかりでなく、プラーク形成も起こりえない。
LacZはHSVの初期プロモーターにより制御されているとき、本発明のベクターで報告されているように使用され(例、tkプロモーター)、この初期プロモーターは発現に先だって極く初期の遺伝子(例、ICP4)の発現を必要とするはずである。当業者に知られる別のレポーターも使用されえた。他の潜在的なレポーターの例には、ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子または特定の抗体のあるような他のHSV初期もしくは後期遺伝子が含まれる。
組換えウイルスのプラーク形成効率は様々な細胞系で決定された。親株野生型株であるKOSは試験が行われたすべての細胞で効率よくプラークを形成するが、一方d120はE5細胞でのみ効率よくプラークを形成した(表５)。他の細胞種のいくつかではわずかなプラーク形成がおこったが、E5細胞での約10-5という頻度で、おそらくウイルスストックでの復帰変異体による。DeLuca, N.A.ら(1985)J. Virol. 56:558〜570。G92Aはアルブミンを発現する肝癌細胞では高い効率でプラークを形成し、非発現細胞では非常に低い効率でプラーク形成が起こる。(表５)。さらに非発現細胞では本当のプラーク形成はみられないが、CPEを示す、またはX-galで染色される細胞クラスターでは見られる。X-gal染色の強度はアルブミン発現細胞で見られるものではずっと低下していた。野生株KOSに対して異なる細胞種でのプラーク形成効率を標準化し、G92A1感染に対し、SW480に対する0.0018から、HepG2細胞での1.1までの範囲、または感受性で６００倍以上の差となるような感受性指数が得られる。
アルブミンのエンハンサー/プロモーターICP4移動遺伝子のみでlacZのレポーター遺伝子を持たない組換え体ウイルスベクターも、ガンシロビルの存在下での増殖により、単離された。これらの組換え体は肝癌細胞でプラークを形成することもできるし、免疫蛍光法により検出されるようなICP4蛋白質も発現している。
本発明は、溶解増殖曲線が細胞特異的な制御因子に依存しているようなウイルスを構築するための方法を提供している。これが一段増殖実験でしめされ、図３に示されており、G92Aの溶解的な増殖がアルブミン発現細胞では見られたが、対照細胞では見られなかった。G92AのMCF7細胞への感染は結果として1/pfu/cell以下の結果となり、一方野生型KOSウイルスが同じMCF7細胞に感染したときには103 pfuのケタですべての細胞が産生を行った。G92AがHsp3B細胞に感染したときには、およそ80pfu/cellの収量が結果として得られており、肝癌細胞では溶解性増殖が起こるが、対照のMCF-7細胞では起こらないことが示される。野生型ウイルスではふたつの細胞種での溶解性増殖の間に差異は認められなかった。従ってHSVは、細胞または腫瘍特異的であるように設計されうる。
本発明では、HSVゲノムの内部に存在するとき、アルブミンエンハンサー/プロモーターが細胞特異的な様式で機能することを示す。いくつかのHSVゲノムに挿入されたいくつかのプロモーター要素が、周辺のHSV配列の制御の特質により、影響を受ける。Roemer, K.ら(1991)J. Virol. 65:6900〜6912;Panning, B.、ら(1989). J. virol.63:1929〜1937。HSVゲノムの範囲内でのアルブミンエンハンサー/プロモーターの細胞特異的活性化では、複製ができず、アルブミンエンハンサー/プロモーターにより制御されている転換遺伝子を含むHSVベクターが肝臓での標的遺伝子治療に有益でありうることが示されており、ここでは細胞の破壊なく細胞特異的な遺伝子発現を行うことが必要とされる。
さらに、腫瘍または組織特異的な本発明の組換えHSVベクターは、免疫調節産物のようなその他のコード配列をさらに含んでもよく、これはウイルスの初期および後期プロモーターの制御下に置かれうる。ウイルスの初期および後期プロモーターの制御下に置かれた外来遺伝子を有するHSVを産生するための方法が、lacZとともに上記に図で説明されている。このような構築物が適切な標的に感染するときに、外来性遺伝子はウイルスが複製している細胞でのみ発現される。HSVはその大きなサイズ(多くの必須でない遺伝子を有する)および大部分の細胞種に感染する能力があることのため、これらの目的には特に有益なベクターとなっている。Roizman, B.ら(1990)Fundamental Virology(基礎ウイルス学)、849〜896ページ。
プラーク形成アッセイ
細胞は１２ウェルプレートで調製され、ウイルスストック(示されているとおり)が0.5 mlのよう量で適用された。(6ウェルプレートであり、0.7mlを感染させた、Hep3B、HepG2、MCF7を感染したKOSを除く)。全く同一のウェルを各ウイルス希釈のために調製し、ふたつの希釈物は各感染細胞種に対して実施した。感染細胞は以下の時間のあいだ、34.5℃でインキュベートした;Hep3Bでは2日間、HepG2では６日間、およびHuH7、Det551、Sw480、MCF7、およびE5に対しては３日間。プラーク形成単位(pfu)は、形成されたプラークの平均数から算出した。組換えプラークはアルブミン細胞種では検出されなかった。真のプラークアルブミン細胞系(MF7、SW480、およびDetroit551))では観察されなかったが、CPEまたはX-galで陽性に染色されるいくつかの細胞のクラスターが観察された。ND:行っていない。S.I.:感受性指標＝(E5に対する比率)/(KOSに対するE5)である。
0003865319.tif 000008
他の組織、細胞、または腫瘍特異的HSVベクター
本発明の組換えHSVベクターのもう一つの例では、黒色腫が標的とされうる。チロシナーゼのプロモーターがプラスミドpTyr-βgal1(R. vile、St. Thomas Hospitalから分与された)からEcoRIよびXhoI(EcoRI、-2540からXhoI、-46)を用いて切り出されうる。チロシナーゼのプロモーターを含む断片を、ICP4の上流のSalI(G92Aに関して)のところに平滑末端での連結反応により挿入し、その後プラスミドpT14tkΔ-1を作製するため、tyr-ICP4断片がHSVtk遺伝子(pHSV106のBglII/Acc65I部位のところ)に挿入した。これはその後tkローカスおよび組換えウイルスでの相同的組換えにより、HSVd120に再結合し、E5細胞上GCV耐性として、またはRPMI7941細胞(ヒト悪性黒色腫細胞、ATCC HTB 66)もしくはSK-MEL-3細胞(ヒト悪性黒色腫細胞、ATCC HTB69)上プラーク形成により、RrHT14を回収した。
HSVの仲介する腫瘍または組織または細胞特異的な標的細胞の死滅のインビボでの評価
インビボでのヒト腫瘍に対する組換えHSV感染の効果は、ヒト腫瘍増殖を可能とする無胸腺マウスを用いて評価されうる。動物腫瘍の効果は同型動物からの腫瘍細胞を用いて評価されうる。例えば、ヒト肝癌細胞はアルブミンプロモーター/エンハンサーを含むHSVベクターG92Aの効果を試験するために、皮下への異種移植として移植されうる。ある期間、およそ２から６週間経過後、腫瘍が動物で増殖している時に、動物を２群に分ける。１群は50μlの何もいれていない抽出物の新生物内注入を受け(対照)、第２群は同一の注入だがHSVベクターを含む。腫瘍はベルニエ型カリパスで週に二度測定する。ベクター処理群が有意に増殖速度を低下させるかどうかを決定するために、増殖速度を比較する。腫瘍の大きさが動物の荷重になったときに病理学検査のために、動物を屠殺した。
腫瘍部分におけるHSVベクター(G92A)の存在は、挿入されたlacZ遺伝子の発現を測定してX-galの組織化学を用いるか、ウイルス抗原に対する抗体を用いて決定した。その他の組織も同様に検査されうる。特に、肝臓は、ウイルスが感受性細胞種(肝細胞)に拡散するか否かを決定するために検査される。動物は屠殺するが、HSVの存在について調べることができるように、固定はしない。単離された組織を均質化し、検体中のプラーク形成単位の数を定量するためにE5細胞に幡く。HSVを含む検体はさらに、肝癌での増殖、および単離されたウイルスが注入されたベクターであるか否かを示すためにlacZの存在について試験する。DNAはまたこのような検体から単離されうるし、ベクターDNAの存在はlacZ遺伝子、またはHSVtkとアルブミンプロモーター挿入部の間の結合部に対するプライマーを用いて、PCRにより決定されうる。
本発明のHSVベクターの安全性とインビボでのその拡散の可能性を決定するために、腫瘍を持たない動物(例、無胸腺マウス、Balb/cマウス、Sprague-Dawleyラット)に組換えベクター(G92A)を注入する。ウイルスは静脈注射、皮下注射、腹腔内注射で投与される。動物はウイルスの投与後様々な時点で(３、７、１１、１４日;３、４、５週間)屠殺し、その組織を上記に記述したようにして検査する。
リボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子またはγ34.5遺伝子に単一改変を有する単純ヘルペスウイルスベクター
抗腫瘍療法に使用するために弱毒化された単純ヘルペスウイルスベクターを使用する最初の研究では、ベクターが分裂細胞においては複製するが非分裂細胞においては複製しないように一つの遺伝子に変異を有するHSV-1を使用した。この様な単一遺伝子変異型単純ヘルペスウイルスベクター２種は、(1)リボヌクレオチドリダクターゼの大サブユニットをコードするICP6遺伝子に、大腸菌のlacZ遺伝子の挿入を含むため、リボヌクレオチドリダクターゼが欠損している、hrR3[ミネタ, T. et al., Gene Therapy 1:878(1994)とミネタ, T. et al., Neurosurg. 80:381(1994)]と(2)γ34.5遺伝子の両方のコピーに変異があるRR3616、の２種である[マーカート等Neurosurgery 32:597(1993)]。
リボヌクレオチドリダクターゼの変異は多くの方法により構築された。hrR3変異株は、ICP6遺伝子に大腸菌のlacZ遺伝子の挿入を含む。ICP6遺伝子はリボヌクレオチドリダクターゼの大サブユニットをコードする。単純ヘルペスウイルスの他のリボヌクレオチドリダクターゼ変異株は、本発明の変異型ウイルスベクターの構築に適する[ゴールドシュタインとウェーラー、上記;ゴールドシュタインとウェーラー、上記;プレストン等、Virol. 167:458(1988)]。
リボヌクレオチドリダクターゼ(RR)は、DNA前駆体のデノボ合成における鍵となる酵素であり、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドへ還元する反応を触媒する。HSV-1は自身のRR(UL39及びUL40遺伝子)をコードし、RRは２個の非同一サブユニットから成る。ヂュイタ、J. Gen. Virol. 64:513(1983).大サブユニット(分子量140 K)は、ICP6と命名され、小サブユニット(分子量38 K)と強固に会合する。単純ヘルペスウイルスのRRは非分裂細胞における効率のよいウイルス増殖に必要であるが、多くの分裂細胞においては必要ではない[ゴールドシュタインとウェーラー、J. Virol. 62:196(1988);ゴールドシュタインとウェーラー、Virol. 166:41(1988);ジャコブソン等、Virol. 173:276(1989)]。いずれのRRサブユニットもHSV-2に存在する。注目されることは、HSV-1 ICP6がHSV-2 ICP10と同じであること(Nikas et al.、Proteins 1:376(1986);マクローランとクレメンツEMBO J. 2:1953(1983);スワインとハロウェイJ. Virol. 57:802(1986))、および、RRの小サブユニットの変異がRRの活性と神経病原性の両方の喪失になることである(カメロン等、J. Gen. Virol. 69:2607(1988))。hrR3にlacZ遺伝子が存在すると、βガラクトシダーゼの組織化学を使用してウイルス感染腫瘍細胞を同定できる。
U-87MGヒト神経膠芽腫細胞系に対するhrR3(0.1 pfu/細胞)のインビトロでの細胞病理的効果は有意であった。即ち、U-87MG細胞のわずか0.2％しか感染67時間後に生存していなかった。インビボ実験では、U-87MG腫瘍を有する10の動物を任意に分け、5 x 105のプラーク形成単位のhrR3、または培地のみ、のどちらかで腫瘍内処理した。ウイルス処理した群は有為な腫瘍増殖阻害を示した(p<0.01,片側ウィルコクソンの順位検定)。
リボヌクレオチドリダクターゼ欠損(RR-)と他の単純ヘルペスウイルス変異株間の重要な差は、hrR3のアシクロビル及びガンシクロビルに対する高感受性である。当業者に既知のTK-HSV-1変異株はこれらの抗ウイルス剤に耐性であるから、そのような変異株は全身感染または脳炎が起きた場合に除去することは困難であると考えられる。このように、ウイルス性脳炎が起きた場合、hrR3ならば抗ウイルス治療に応答する。
また、単純ヘルペスウイルスRR-変異株は、感染を継続する能力とインビトロにおいて39.5℃にてウイルスDNAを合成する能力が著しく弱体化している[ゴールドシュタインとウェーラー、Virology 166:41(1988)]。それゆえに、この変異株は、神経毒性が弱毒化しており、また感染した宿主の発熱状態では増殖しにくい。この様な性質は、ウイルス性脳炎が発症している場合に、神経毒性が弱毒化され、抗ウイルス療法を受け入れられなければならない治療用ベクターにとって必須である。
R3616のような、γ34.5遺伝子のみに欠損がある単純ヘルペスウイルス変異株は、神経毒性が弱毒化されており、そのため正常脳細胞に与える可能性のある障害を減少する[グッドマン等、J. Virol. 63:1153(1989);チョウ等、Science 250:1262(1990)]。R3616の神経毒性の減少は、神経性蛋白質合成の停止に関係あると推定される。この停止は、野生型単純ヘルペスウイルス感染では他に先んじて起きる[チョウとロイツマン、Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 89:3266(1992)]。γ34.5遺伝子産物は、抗体を用いた感染細胞蛋白質のウェスタンブロットまたはイライザ分析により、またはコンフリューエント(融合性)になった一次細胞で複製がないことにより、検出される[ボロバン等、J. Virol. 68:48(1994)を参照せよ]。γ34.5遺伝子はHSV-2にも存在する[マックゲオッホ等、J. Gen. Virol. 72:3057(1991)]。γ34.5遺伝子はF, 17, MGH-10, CVG-2と名付けられたHSV-1の４株において配列が決定された[チョウとロイツマン、J. Virol. 64:1014(1990)]。γ34.5遺伝子の変異型HSV-1ベクターは、アシクロビルに対する感受性は野生型のレベルを保持している[マーカート等、上記(1993)]。
γ34.5の変異株は、種々の研究者により、異なる技術を用いて、またHSV-1 17株の変異株1771(マッキー等、J. Gen. Virol.75:733(1994))と変異株17termA(ボロバン等、J. Virol. 68:48(1994))のような異なる株で構築された。
単純ヘルペスウイルスベクターの構築
HSV-1は、殆ど全ての脊椎動物細胞に感染する能力を有するヒト神経向性ウイルスである。自然感染は融解性複製サイクルになるか、または通常末梢神経節において潜伏が確立して、DNAがエピソーム状態に無期限に保持される。
本発明の複製可能組換え型単純ヘルペスウイルスベクターは、少なくとも一つの必須単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現に改変を含む。本発明のウイルスは、一つまたは複数の特異的HSV-1遺伝子の発現にさらなる改変を含むよう操作される。さらに改変を加えられる特異的HSV-1遺伝子は、(1)γ34.5遺伝子、および(2)リボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子である。特異的HSV-1遺伝子における改変は両遺伝子産物を非機能性にするか、または両遺伝子の発現を減少させることにより、変異型単純ヘルペスウイルスベクターが本発明の性質を有するようにする。このような改変を得る方法は、(a)この両方の遺伝子産物の発現を破壊する方法、または(b)発現したγ34.5遺伝子産物とリボヌクレオチドリダクターゼを非機能性にする方法を含む。
遺伝子発現を破壊することが分かっている沢山の方法が知られており、挿入および/または欠失および/または塩基置換による、HSV-1ゲノムの遺伝子またはプロモーター配列の改変を含む[ロイツマンとジェンキンス、Science 229:1208(1985)]。本発明の変異型単純ヘルペスウイルスベクターは、ゲノムが少なくとも一つの必須単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現における改変を有する複製可能な単純ヘルペスウイルスである。より具体的には、本発明の変異を有する単純ヘルペスウイルスは、必須のHSV遺伝子が腫瘍または組織または細胞特異的な転写調節配列により制御されているように、そのゲノムが少なくとも一つの必須単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現で改変されている複製可能な単純ヘルペスウイルスである。本発明の組換え単純ヘルペスウイルスベクターはγ34.5遺伝子またはリボヌクレオチドレダクターゼまたはこれら遺伝子の両方のいずれかの発現において、さらなる改変を含むように設計されうる。
必須のHSV遺伝子における改変はこれら遺伝子の転写調節配列での改変を含む。McKnightら、CANCER CELLS(癌細胞)4;DNA TUMOR VIRUSES(DNA腫瘍ウイルス), ColdSpring Harbor(1986)163〜173;Post,L.E.ら、Cell 24:555(1981)。γ34.5遺伝子とリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子の改変は、これらの遺伝子の構造配列または調節配列のどちらかの修飾を含む。遺伝的改変は標準的方法により確定でき、その方法には、制限酵素で切断したウイルスDNAとのサザーンブロットハイブリダイゼーション、ウイルスDNAの変異した部位の配列決定、(挿入には)リポーター遺伝子の存在、新しく生じた制限酵素サイト、リボヌクレオチドリダクターゼ活性の酵素アッセイ(ハスザーとバチェティー、J. Virol. 37:580(1981))、RRまたはγ34.5に対する抗体を用いた感染細胞蛋白質のウェスターンブロットまたはイライザ分析、および/またはγ34.5に関してはコンフリューエント一次細胞(ボロバン等、J. Virol. 68:48(1994)を参照せよ)、RR-に関してはマウス細胞(ジャコブソン等、Virology 173:276(1989))における複製の喪失、等がある。
次の単純ヘルペスウイルスの遺伝子操作は、変異型単純ヘルペスウイルスベクターの生産を説明するための例を提供する。本発明の単純ヘルペスウイルスベクターの技術操作は、生物学的に性質をよく調べられたウイルスに存在する、性質をよく調べられた遺伝子、即ち必須のごく初期の(IE)ICP4、γ34.5遺伝子およびリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子を利用する。
γ34.5遺伝子とリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子を変異させた単純ヘルペスウイルスベクターは、変異誘導後に単離でき、またはウイルスゲノムと遺伝子操作した配列との組換えにより構築できる。単純ヘルペスウイルスの組換え頻度が高いことと形質転換したウイルスDNAが感染性であるという事実が、遺伝子操作を非常に簡単なものにしている。これらの遺伝子改変した複製可能ウイルスは、後述する安全で効率良いアッセイに使用することができる。
HSV-1は、長さが153キロベースの二本鎖直線状ゲノムを含み、ゲノムはマックゲオッホにより完全に配列決定された[マックゲオッホ等、J. Gen. Virol. 69:1531(1988).マックゲオッホ等、Nucleic Acids Res 14:1727(1986);マックゲオッホ等、J. Mol. Biol. 181:1(1985);ペリーとマックゲオッホ、J. Gen. Virol. 69:2831(1988)]。DNA複製とウイルス粒子の集合は感染細胞の核で起きる。感染後期に、コンカテマー状(concatemeric)ウイルスDNAがゲノム長さの分子に切断されてウイルス粒子に包み込まれる。中枢神経系では、単純ヘルペスウイルスは、神経を貫通して拡散し、後退かまたは前進のどちらかの軸索内輸送により核へ移送され、そこで複製が起きる。
HSV-1ゲノムを使用して本明細書において説明した構築に基づいて、HSV-2を用いたDNA構築物は本発明に包含される。HSV-2は両方のRRサブユニットを含み、HSV-1 ICP6はHSV-2 ICP10に類似している[ニカス等、Proteins 1:376(1986);マックローランとクレメンツ、EMBO J. 2:1953(1983);スウェインとハロウェイ、J. Virol. 57:802(1986)]。γ34.5はHSV-2にも存在する[マックゲオッホ等、J. Gen. Virol. 72:3057(1991)]。
γ34.5またはリボヌクレオチドリダクターゼの調節配列の修飾による遺伝子発現の損傷
単純ヘルペスウイルスに、機能のあるγ34.5遺伝子産物とリボヌクレオチドリダクターゼを発現する能力を失わせるもう一つの方法は、その発現を損傷することである。γ34.5遺伝子とリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子の調節配列を改変することにより、この２つの遺伝子の発現を停止させることができる。
γ34.5および/またはリボヌクレオチドリダクターゼのための調節領域は、γ34.5遺伝子とリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子の発現を破壊する標準的技術により改変することができる。例えば、この調節配列は、コーデイング配列の改変のために前述した技術を使用して、ウイルスゲノム内で改変させられる。
γ34.5とリボヌクレオチドリダクターゼICP6のプロモーター領域はマップされている。γ34.5のプロモーターは「a」配列内の領域にマップされた。「a」配列は、HSV-1コンカテマーを単位長さのDNAに切断するための配列、HSV-1 DNAをキャプシッドに包み込むための配列、及びL成分とS成分の反転用の配列を含む。チョウとロイツマン、J. Virol. 57:629(1986)。ICP6のプロモーター領域は、ICP6構造遺伝子の5'上流配列にマップされた[ゴールドシュタインとウェーラー、J. Virol. 62:196(1988);ジーとヘルマン、Virus Res. 26:141(1992)]。RRの小サブユニット、即ちUL40の転写開始部位は、ICP6のコーディング領域内にある[マックローランとクレメンツ、J. Gen. Virol. 64:997(1983);マックゲオッホ等、J. Gen. Virol. 69:1531(1988)]。
これらの改変がγ34.5遺伝子とRR遺伝子の調節能力に及ぼす影響は、ICP6/lacZ融合のために記述されているように、プロモーターの下流にリポーター遺伝子を挿入することにより検出できる[ゴールドシュタインとウェーラー、J. Virol. 62:196(1988);ジーとヘルマン、Virus Res. 26:141(1992)]。単純ヘルペスウイルスの遺伝子は細胞のゲノムに存在するときは異なる様式で調節されるので、ICP4、γ34.5またはリボヌクレオチドリダクターゼの調節成分を含むHSV必須遺伝子における各改変の影響は、種々の哺乳動物の標的細胞で査定されるであろう[マックナイト等、in CANCER CELLS 4;DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor(1986)163-173]。
抗ウイルス剤に対する高感受性の賦与
神経膠芽腫に対する単純ヘルペスウイルスの治療的使用に関する安全性予備措置は、他の分裂細胞に感染する可能性をなくす手段を提供することを含む。臨床研究が、野生型HSV-1ウイルスでも通常最初の感染部位から遠くへは拡散しないか、または免疫能を有する人には重篤な全身性疾患の原因にならないということを示している[サックス等、Ann. Int'l Med. 111:893(1989)]。
注目することは、TK-ウイルスはある種の免疫力が弱い患者では進行性疾患に関連することがあったということと、HSV-1変異株dlsptkはアシクロビルに耐性であるということである[エーリッヒ等、New Engl. J. Med. 320:293(1989);コーエン等、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:4736(1989)]。抗ウイルス剤に対して親の野生型よりも感受性である変異型複製可能ウイルスベクターはどれも、抗ウイルス剤に対して高感受性であると思われ、変異型ウイルスの望まれない拡散を未然に防ぐための手段を提供する可能性がある。
インビボ使用のための単純ヘルペスウイルス変異株を構築するに当たり、予測しない毒性のある感染を制御するために、現行の抗ヘルペス剤治療に対する感受性につき変異株は試験される。現在、沢山の薬剤がヒトのヘルペス感染治療に使用でき、単純ヘルペスウイルスDNA複製を阻害するヌクレオシド類縁体が最も効果的である。単純ヘルペスウイルスの３種の遺伝子が、ヌクレオシド類縁体に対する感受性に関与することが分かっている。その３種は、単純ヘルペスウイルスDNAポリメレース(UL30, pol)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(UL23, tk)、及び蛋白質カイネースおよび細菌のフォスフォトランスフェラーゼにホモロジーを有するサイトメガロウイルスUL97である[ファーマン等、J. Virol. 32:77(1979);リトラー等、Nature 358:160(1992),サリバン等、Nature 358:162(1992)]。
ガンシクロビルに高感受性を示す単純ヘルペスウイルスDNAポリメレースの変異株が数多く存在し、これにはPAA'5及びAraA'9も含まれる[コーエン等、J. Virol. 53:477(1985)]。不運なことに、AraA'9を頭蓋内注射すると、早期に死んでしまい、皮下腫瘍の増殖になんら影響を及ぼさなかった[マーカート等、上記]。別の変異型単純ヘルペスウイルスであるdlsptkウイルスは、少なくともヌクレオシド類縁薬剤には、もはや薬剤感受性ではない、従って、インビボで制御できない可能性がある。
神経毒性の弱毒化
弱毒化した、または低下した普遍的神経毒性とは、本発明の二重変異型単純ヘルペスウイルスベクターの感染後に、生命を脅かす脳炎が起きないことを意味する。単純ヘルペスウイルスが誘導するヒトの脳炎は治療が非常に困難で、適当な薬剤処置をしても致死的になることもあるので、普遍的神経毒性を低下させることは本発明の重要な特徴である。本発明の変異型ウイルスは新生細胞においては複製できるが、周囲の非新生組織は見逃す。GCVに対する感受性亢進は、GCVに耐性でないのでtk-である本発明のHSV構築物に存在する必要はない。しかしながら、本明細書の範囲で当業者は、tk遺伝子とは異なるHSVゲノムのもうひとつの位置において、必須HSV遺伝子に結合した組織または細胞または腫瘍特異的なプロモーターを含む、挿入部を簡単に置き換えることができる。このようなベクターはG207のようにGCVに対しては感受性が亢進していると考えられる。
非分裂細胞で組換えHSV複製が望ましいような、複製細胞排除研究において、非分列細胞で増殖のために弱毒化されているのでtk-またはrr-が機能しないということは可能性が高い。このようなCNSでの排除において、弱毒化された神経毒性はまた、このベクターが標的組織で複製できないかもしれないので、問題となりうる。
所望の神経毒性の弱毒化が復帰すれば、細胞の特異的排除を行う神経特異的HSVベクターが正常な脳細胞、または他の脳の中でその他の望ましくない細胞へと広がっていく危険性は、初期遺伝子や後期遺伝子を欠損させるような、第２の遺伝子を欠損させたHSVを構築することにより低下しうる。または、神経毒性遺伝子は欠損されても、第２の細胞特異的なプロモーターの制御下に置かれてもよい。例えば、tk、rrまたはγ34.5は神経特異的プロモーターの制御下におかれてもよい(例、シナプシン、Phiel,G.ら、PNAS USA 88:3431(1991))、軽神経フィラメント)し、ICP4が標的とされるべき一群のニューロンに特異的な第２のプロモーターの制御下に置かれうる(例、カテコールアミン作用性細胞に対してチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、ノルアドレナリン作用性およびアドレナリン神経に対してドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、またはプルキンエ細胞に対するプルキンエ細胞蛋白質2(PCP-2))。それゆえ、本発明のベクターは第二の細胞特異的プロモーターを発現するのとは別の細胞で弱毒化した神経毒性を有するはずである。
単純ヘルペスウイルスの異なる株は神経毒性が様々であり、より弱毒化された株は神経毒性をさらに低下させるために二重変異株の構築用に使用してもよい。ATCCから入手できる他のHSV-1株は、HF(ATCC VR-260), MacIntyre(ATCC VR-539), MP(ATCC VR-735)であり、HSV-2ではG株(ATVV VR-734)及びMS株(ATCC VR-540)である。別法としては、単純ヘルペスウイルスの遺伝子の変異で、インビボでおよび/または特定の細胞集団でウイルスの複製を減少させる変異であればどれでも、本発明の変異型単純ヘルペスウイルスベクターに使用してよい。他の神経毒性遺伝子には、(i)デオキシユーテイーピーエース(ピレス等、J. Virol. 66:6706,(1992))、(ii)UL53(モヤル等、Virus Res. 26:99(1992))、(iii)α22(シールズ等、J. Virol. 55:338(1985))、(iv)US3(メイニール等、Virology 162:251(1988))がある。
臨床的見解では、単純ヘルペスウイルス脳炎は、合衆国において最も普遍的に報告される中枢神経系(CNS)のウイルス感染であり、人口百万人当たり2.3人の発病が推定される。単純ヘルペスウイルス脳炎は通常側頭葉と大脳辺縁系に局在し、剖検の組織試験がこれらの部位にウイルス抗原の存在を証明している。数多くの薬剤が感染を抑制でき、その中には、アシクロビル9-92-ヒドロキシエトキシ-メチル)グアニン、ゾビラックス(登録商標)、アデニンアラビノシド(ビダラビン(登録商標))、フォスカネット(フォスフォノフォルミックアシド, PFA)、ガンシクロビル9(1,3-デヒドロキシ-2-プロポキシ)メチルグアニン、DHPG、2'NDG、シトベン(登録商標)がある[ホワイトリー等、ロッペツ等(編)中、IMMUNOBIOLOGY AND PROPHYLAXIS OF HUMAN HERPESVIRUS INFECTIONS, page 243(1990, Plennm Press, N.Y.);ホワイトリー等、N. Engl. J. Med. 297:289(1977);オバーグ、Pharmacol. Ther. 19:387(1983);ダッカーモンド、Transplant. Proc. 23:171(1991)を参照せよ]。
異型発生に効果的な単純ヘルペスウイルスベクター
腫瘍細胞を死滅させる免疫応答を標的にするために、腫瘍特異的様式で外来遺伝子を発現させることによる特定の腫瘍に対する遺伝子治療に、本発明の変異型単純ヘルペスウイルスベクターを使用することができる[テッパー及びミューレ、Human Gene Therapy 5:153(1994)]。更に、本発明は、低下した神経毒性を有する複製可能単純ヘルペスウイルスベクターを腫瘍細胞調節物質または腫瘍細胞に対する免疫応答誘導物質として使用する。更に、本発明の変異型単純ヘルペスウイルスベクターは、腫瘍細胞に対する免疫応答を引き出すために、標的腫瘍細胞においてサイトカインを発現するように変えることができる。例えば、変異型単純ヘルペスウイルスベクターは、ウイルスが仲介する腫瘍細胞死滅を誘導することができ、その後死滅はサイトカインで強化された免疫応答により増強される。サイトトカインはベクター自身が発現する。変異型単純ヘルペスウイルスベクターからのサイトカインまたは他の遺伝子産物の発現は感染後数時間以内に起きるので、細胞が殺される以前に充分な遺伝子産物が合成されると考えられる。細胞死滅により抗腫瘍免疫応答の効果が高まることさえあるかもしれない[バーバ等、Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 91:4348(1994)]。
単純ヘルペスウイルスベクターを介した腫瘍細胞の破壊
本発明に従った治療候補の典型例は、(i)腫瘍および新生物に罹患したヒトおよびその他の動物の治療、(ii)神経系腫瘍、ならびに(iv)神経膠星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣腫、神経線維腫、神経線維肉腫、髄芽腫を含む悪性脳腫瘍を含むがこれに限定されない。
好ましくは、治療は腫瘍内直接接種により開始される。脳に存在する腫瘍には、MRIやCTや他の造影誘導定位技術を使用してウイルスを直接接種するか、または開頭時にウイルスを接種する。
本発明の薬学的組成物は、注射可能な混合物剤型で投与するのが便利であると思われる。この目的のための典型的混合物は、医薬として許容される基剤を含む。例えば、その混合物は食塩含有燐酸緩衝液中のヒト血清アルブミンを含むことができる。医薬として許容される他の基剤は、水溶液、無毒な賦形剤、包含塩類、保存剤、緩衝液、及び類似物を含む[REMMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (15th ed.)1405-1412 & 1461-1487, Mack Publishing Co.(1975)及びTHE NATIONAL FORMULARY XIV(14th ed.), American Pharmaceutical Association(1975)を参照]。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、及びエチルオレイン酸のような注射可能な有機エステルである。水溶液基剤は、水、水溶液、生理食塩水、食塩及びリンゲルデキストロース等のような非経口基剤を含む。静脈注射用基剤は輸液及び栄養補充液を含む。pH、及び医薬混合物の種々の成分の正確な濃度は当業者の常法に従って調製される[グッドマン及びギルマン、THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7th ed.)]。
典型的には、単純ヘルペスウイルスベクターは水溶液または懸濁液のどちらかの注射可能物として調製される。即ち、注射直前に溶液に溶解するかまたは懸濁するのに適す固形物も調製されてよい。調製品は乳濁化にしてもよい。抗原活性のある成分が、医薬として許容されかつ活性成分と適合する賦形剤に混ざっていることがよくある。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または類似物、およびこれらを組み合わせた物である。更に、必要に応じて、ベクターは、湿潤剤、または乳化剤、またはpH緩衝剤、またはアジュバント、またはベクターワクチンの効果を強化する免疫賦活剤のような補助物質を微量に含んでもよい。
他の投与形式に適する他の剤型は、経口投与を含む。経口剤型は、典型的な賦形剤、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、類似物をふくむ。混合物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤型または散剤という型をとり、活性成分を10〜95％,好ましくは25〜70％含む。
「単位投与量」という用語は、ヒトの使用に適する物理的に明確に区別される単位を表し、各単位は、希望する治療効果を得られるために必要な希釈剤、即ち運搬剤や基剤、および特定の治療レジメを勘案し計算により予め決定した活性物質の量を含む。投与量は、治療回数と量の両方に従って、治療される患者、及び患者の免疫系の抗体合成能力、及び望まれる保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の詳細な量は、実施する医者の判断に任され、各個人に特有である。しかし、投与量に適当な幅は、活性成分が個体当たり百乃至数百マイクログラム級にある。適当な初投与レジメ及びブースター注射も様々であるが、典型的には、初投与後1,2週間間隔で一回の注射または連続注射か、または他の投与法を施す。
インビボでの形質転換の動物実験
本発明に従い投与される薬学的組成物の投与量は簡単に決定されうる。一般的に本発明の調製では単位投与量あたり薬学的に許容できる担体中でHSVベクターの107と1010pfu/mlの間を含む投薬単位で、好ましくは必須の単純ヘルペスウイルス遺伝子に機能的に結合した腫瘍または組織特異的なプロモーターを含む複製可能な単純ヘルペスウイルスを、約105から109pfu/ml含むように調剤されるべきである。望ましいpfuが全量で0.3および2.0mlのリン酸緩衝塩液(PBS)に含まれており、様々な手法により投与される。
HSVベクターは腫瘍内、静脈ない、腹腔内、筋肉内、気管内、膀胱内、腸内、直腸内、口内、眼内、動脈内注入により、動物に導入されうる。膀胱内に導入するためには、ベクターは膀胱内注入により膀胱に滴注されうる。直腸に導入するためには、ベクターは部分的な洗腸を用いて滴注されうる。肺への導入には、ベクターはチューブを通しての滴注、注入、気管への吸入または気管への注入により導入されうる。
実施例１.  高度に弱毒化された二重HSV突然変異体の構築
ウイルスおよび細胞系
HSV-1野生型株(KOSまたは株F)およびHSV突然変異体(R3616、hrR3)は、好意的にも、D.M.コーエン、B.ロイツマン、J.チョウおよびS.K.ウェーラーの諸氏から提供して頂いた。HSV-1の株Fは、ATCC第VR-733号として入手でき、ベロ(Vero)細胞はATCC第CRL1587号として入手できる。HSV-1株Fから誘導されるR3616は、γ34.5遺伝子の両コピーに1キロ塩基対の欠失を有する。R3616は、チョウら[Science、250:1262(1990)]に記載のとおり構築した。
ウイルスの群体は、アフリカミドリザルの腎細胞(ベロ)の培養細胞中に、記載のとおり発生した。ウイルス群体は、コーエンら[J. Virol. 53:477(1985)]に記載のとおり調製した。
ヒト膠芽細胞腫の細胞であるU-87MG、T98G、U-138MGおよびA172は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(米国メリーランド州Rockville)から入手し、10％不活化ウシ胎児血清(IFCS)および抗生物質で補強したダルベッコ最少必須培地(DMEM)で培養した。
ウイルスDNAは、感染させた細胞からNP40で穏やかに溶解し、RNアーゼ、次いでSDSおよびプロテイナーゼKで処理し、最後にフェノール、クロロホルム/イソアミルアルコール、およびエーテルで抽出することにより単離した。該ウイルスDNAは、エタノールによる沈降、および水への再懸濁後のトランスフェクションに適している。組換えウイルスの生成のために、ウイルスゲノムに組換えようとするDNAの一片を、プラスミドから切採する。線状のDNAを、組換え子孫ウイルスの増殖を促進できる細胞に、ウイルスDNAとともに同時にトランスフェクションする。大規模な細胞変性効果が認められたとき、子孫ウイルスを採集する。次いで、選択できるか、またはふるい分けできる条件下で、許容される細胞に組換えウイルスを播種する。例えば、X-galを加えることによって、LacZ+組換えプラークを染色し、青いプラーク(LacZ+)を選択する。更にプラーク精製を実施(3回)してから、群体を作成する。
γ34.5遺伝子産物とリボヌクレオチド還元酵素とをともに発現できない単純ヘルペスウイルスの構築
ゴールドシュタインおよびウェーラーが記載したとおり、ウイルス組換え体の生成のための標準的手順を用いて、γ34.5とリボヌクレオチド還元酵素との双方の遺伝子が突然変異した単純ヘルペスウイルスの株を構築する。これらの遺伝子はともに、培養でのウイルス増殖に必須ではなく、そのため、ヌル変異体は、培養で生存できる。そのような二重変異体は、いずれの遺伝子への大腸菌LacZ遺伝子の挿入も包含するため、その部位での複製は、容易に検出できる。
本発明の例示的な変異単純ヘルペスウイルスベクターは、R3616ウイルスから単離したDNA、およびpKX2-βG3の5.3kBのHindIII-XbaI断片を用いる相同的組換えによって、構築できる。本発明の範囲内のそのような変異体の一例を「G207」と呼ぶ。図４は、G207の構築を説明する。5種類の単離株を純化し、G207-1、-2、-3、-4、-5と呼ぶ。
HSV-1野生型株Fから誘導したHSV-1変異体R3616は、γ34.5遺伝子の両コピーに1kBの欠失を有する。R3616ウイルスDNAへのICP6のlacZの挿入を構築するため、ICP6遺伝子の2.3kBのXhoI断片中にlacZの挿入を含む、pKX2-βG3の5.3kBのHindIII-XbaI断片をウサギ皮膚(RS)細胞に、R3616の伝染性ウイルスDNAと同時移入し、相同的組換えによってウイルスDNAに導入した。ICP6遺伝子(KOS)の2.3KBのXhoI断片中にlacZ遺伝子の挿入を含むプラスミドpKX2-βG3は、好意的にも、S.K.ウェーラー博士(コネチカット大学)によって提供された[ゴールドシュタインおよびウェーラー、J. Virol.、62:196(1988)]。プラスミドpKpX2'は、BamHIによるpKX2-βG3の部分的消化、lacZ遺伝子の除去、および再結合によって構築した。γ34.5遺伝子のNcoI-SphI断片を含むプラスミドpRB4081は、好意的にも、B.ロイツマン氏によって提供された[チョウら、Science、25:1262(199O)]。すべての組換えプラスミドは、標準的手順によって増殖させた。すべてのプラスミドおよびウイルスは、本出願を鑑みて入手可能な材料を用いて構築することができる。
200〜1000感染単位のR3616ウイルスDNA(約1μg)を、XbaIおよびHindIIIによる切断によって切り出したpKX2-βG3の10倍のモル過剰量の5.3kB挿入断片とともに、RS細胞に同時移入する。広範囲に拡散した細胞変性効果が観察されたとき、後代を採集し、ベロ細胞で力価を決定した。
感染後2または3日目に、X-gal溶液でプラークを染色した。X-galで陽性に染まるプラークによって、組換えウイルスを同定した。組換えウイルスプラーク(γ34.5-/ICP6-およびLacZ+)は、X-galの存在下で青色に染まる。青いプラークからの組換えウイルスを精製し、制限エンドヌクレアーゼによる地図作成によってDNA解析して、変異ウイルスのDNA構造を確認する。青いプラークを、限界希釈法でのベロ細胞の継代によって3回精製してから、保存株を作成した。
G207-1およびG207-2のプラークの形態的性状とともに、プラークの形態的性状に対する様々な濃度のIFCS含有培地の効果を解析した。感染ベロ細胞の単層を、0.5％、1％、2.5％および5％IFCSを含有する培地で37℃で培養し、感染後36〜48時間で固定し、X-galで染色してβ-ga1活性を検出し、次いで、ニュートラルレッドで対比染色した。
G207-1変異体は、非シンシチウム性プラークを形成したのに対して、G207-2変異体は、シンシチウム性プラークを形成し、大規模な細胞-細胞融合が特徴的であった。
表４は、G207-1およびG207-2についての、増強された細胞増殖の条件下でのプラーク直径の増加を文書化している。プラークの直径は、40倍の倍率の倒立位相差顕微鏡下で、マイクロメーターを用いて測定した。値はそれぞれ、15プラークの平均直径を表す。
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その野生型株Fのバックグラウンドと比較した、G207ウイルスの遺伝子配列および遺伝子配置を図５に示す。図５の上端の線上のボックスは、細い線で表した単純ヘルペスウイルスゲノムの長大成分(UL)や短小(US)成分に隣接する逆方向反復塩基配列を表す。長い独自の領域を拡大したドメインは、ICP6遺伝子の位置を示す。太い線は、ICP6の転写される配列を示す。変異体G207は、ICP6遺伝子のBamHI部位に挿入されたlacZの構造遺伝子を含む。反復領域を拡大したドメインは、γ34.5遺伝子の位置を示す。変異体G207は、γ34.5遺伝子の両コピーでの1kBの欠失を含む。
変異ウイルスDNAの解析
適正に変化させた単純ヘルペスウイルスベクターの構造を確認するために、本発明の変異体に対してサザンブロット分析を実施した。部分的に精製したビリオンから、ウイルスDNAを調製した。総ウイルスDNA(KOS、hrR3、株F、R3616およびG207)を制限エンドヌクレアーゼで消化し、トリスホウ酸EDTA緩衝液中でアガロースゲル電気泳動によって分離し、サザンの方法で転移した。ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いた組換えDNAを、ECL標識化キット(Amarsham)を用い、供給者が指示するとおりに標識した。ウイルス変異体が適切な位置にlacZ遺伝子を含むことを確認するために、総DNAをXhoIで消化し、二重にサザンブロットハイブリダイゼーションに付した。フィルターを、ICP6遺伝子の野生型配列を有する標識化pkpX2'とハイブリダイズした。HSV-1野生型のKOSは、野生型の2.3kBXhoI断片を含むのに対して、hrR3(ICP6遺伝子でのKOS誘導体かつlacZ挿入変異体)は、lacZ遺伝子が挿入されたならば期待される、5.3kB断片を含む。HSV-1の株Fは、単純ヘルペスウイルス野生型株の間の多型性のため、約6.0kBのXhoI断片を含む。G207は、株Fのこの6.0kB断片にlacZ遺伝子が挿入されたならば期待される、9.0kBの断片を含む。フィルターをlacZ遺伝子のプローブのみとハイブリダイズしたときは、hrR3の5.3kB断片、およびG207の9.0kB断片だけが検出された。これらの結果は、lacZ遺伝子の断片が、ゲノムの適切な部位に挿入されていることを立証する。
G207がγ34.5遺伝子に欠失を有することを確認するために、株F、R3616、G207のウイルスDNAをBamHIで消化し、サザンブロットハイブリダイゼーションに付した。γ34.5遺伝子の野生型配列を有するプラスミドpRB4081を、プローブとして用いた。γ34.5遺伝子は、BamHIのSPおよびS断片に地図上位置する。株Fは、これらの断片の野生型BamHIのSPおよびSバージョンを含むのに対して、R3616およびG207は、これらの断片の欠失バージョンを含む。これらの結果は、両γ34.5遺伝子とも、R3616およびG207のウイルスDNAでは欠失していることを立証する。
特異的細胞型を標的とする単純ヘルペスウイルス変異体
pERCAT2からの2.2kBのEGFRプロモーター断片[ジョンソンら、J. Biol. Chem.、263:5693(1988)参照]、およびpF2. ICATからの2.1kBのBFGFプロモーター断片[シバタら、Growth Factor、4:277(1991)参照]を含むプラスミドを用いて、マーカータンパク質(β-ガラクトシダーゼ)の一過性の発現を特徴付ける。これらの構築体の細胞特異性を、BFGFについてはヒトU-87MG膠芽細胞腫細胞で[タカハシら、FEBS Letters、288:65(1991)]、またEGFRについてはA431ヒト類表皮癌細胞で[リーベルマンら、Nature、313:144(1985)]確認する。A431細胞は、ATCC第CRL1555号として入手でき、U-87MGのMG細胞は、ATCC第HTB14号として入手できる。
例えば、腫瘍細胞特異的プロモーターを、ICP4コード領域の上流でICP4プラスミドにクローニングする。ICP4プラスミドの例は、pGH108またはpXhoIを包含する[C.ロバーツら、J. Virol.、62:4307(1988)]。次いで、このプラスミドを単純ヘルペスウイルスICP4-へと組換える。単純ヘルペスウイルスICP-は、欠失、またはICP4コード領域への挿入によって構築できる[デルカら、J. Virol.、56:558(1985);デルカおよびシャファー、Nucleic Acids Res.、15:4491(1987);パターソンおよびエベレット、J. Gen. Virol.、71:1775(1990)]。本発明のベクターも、欠失、またはICP4コード領域への挿入によって、ICP4-にすることができる。そのようなICP4-ベクターを、ICP4発現細胞上に単離する[デルカら、前出;デルカおよびシャファー、前出;パターソンおよびエベレット、前出]。あるいはまた、単純ヘルペスウイルスベクターのICP4調節領域を、腫瘍細胞特異的プロモーターで置き換えると、置き換えたプロモーターを発現できる細胞でのみICP4が生産される。腫瘍細胞特異的プロモーターの調節下にあるそのICP4遺伝子を有する単純ヘルペスウイルス変異体を、特異的腫瘍細胞に感染し、これを死滅できるその能力について試験する。
実施例2.安全性および効果の研究
これらの変異体の抗神経膠腫剤としてのインビトロでの効果は、長期ヒト神経膠腫細胞系であるU-87MG、および初期継代ヒト膠芽細胞腫の培養に対する神経膠腫の細胞障害性のアッセイを用いて決定できる。インビボでの腫瘍抑制を評価するために、ヌードマウスの皮下U-87MG異種移植片を、各ウイルス変異体または賦形剤の接種で別個に処理し、腫瘍の成長速度を分析した。生存に対する単純ヘルペスウイルス変異体の潜在的効果を調べるために、頭蓋内U-87MG異種移植片を有するヌードマウスを、ウイルスまたは賦形剤の接種で処理し、全体的な生存を比較する。
長期生存を達成するのに必要な投与量で用いたときの、腫瘍根絶の程度とともに、ウイルスの保持され得る神経毒性を評価するために、頭蓋内異種移植片を有する長期生存者の脳の切片を作成し、染色し、顕微鏡で検査する。効果的なインビボでの腫瘍抑制および延命には、本明細書に記載のアッセイを用いた、変異体の注意深い選択が不可欠である。下記の方法は、腫瘍の成長を抑制し、延命するのにインビボで効果的である変異ウイルスベクターをスクリーニングするための明瞭な指針を、当業者に提供する。潜在的抗神経膠腫薬としてのこれらのウイルスの相対的安全性を確定するために、一般的な抗ヘルペス薬であるガンシクロビルに対するそれらの感受性を調べる。最後に、この変異ウイルスベクターの脳内接種の安全性を確定するために、該変異ウイルスの脳内接種物を動物に与え、その後、脳炎について査定する。
インビトロでの細胞変性的致死
本発明の単純ヘルペスウイルスベクターが腫瘍細胞を死滅できる能力を、初めに細胞培養で試験する。ウイルスに関する作業はすべて、承認された指定されたウイルスベクター室で実施した。ウイルスは、マルツザら[Science、252:854(1991)]に記載のとおり、ベロ細胞で初めに増殖させる。ウイルス変異体の力価を最高にするために、最初のウイルス懸濁液を、4℃、34,500Gで2時間遠心分離し、次いで、ペレットを培地に懸濁させ、再度力価測定した。ウイルスは、101〜10-4の変動幅の感染多重度(MOI)で適用する。MOI値は、細胞数から算出した。適切な数のウイルスpfuを適用し、均等に散布した[コーエンら、J. Virol.、53:477(1985)]。ウイルスに感染したすべての細胞培養を対照培養(DMEM+のみ、ウイルスなし)と比較した。細胞を維持し、顕微鏡で観察した。円形化し、正常な形態的性状を失い、プレートから浮揚している細胞は死亡したとみなした。99％またはそれ以上の細胞が、そのような細胞変性効果を示したとき、単層は完全に破壊されたとみなした。
変異体またはその野生型の親のいずれかを、ヒト神経膠腫系(U-87MG)およびアフリカミドリザルの腎(ベロ)細胞に、DME+(1〜5％熱不活化ウシ胎児血清を有するダルベッコ改良イーグル培地((IFCS)および抗生物質)中で10-4〜101の感染多重度(MOI)で適用した。悪性のヒト神経膠腫系U-87MGは、米国組織細胞コレクション(メリーランド州Rockville)から得た。加えて、2例の原発性ヒト悪性神経膠腫を、外科手術による腫瘍標本として得た[マルツザら、前出(1991)]。細胞はすべて、10％ウシ胎児血清および抗生物質を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM+)で増殖させた。
U-87MGおよびベロ細胞のサブコンフルエント単層を、本発明の変異ウイルスベクターに様々なMOIで感染させた。感染した細胞は、1〜5％IFCS含有培地で34.5℃で培養する。生存可能細胞を、トリパンブルー排除試験で同定した。U-87MGで、MOIに比例する細胞変性効果を24時間で発現し、＞99％の細胞変性効果を10日後に発現している変異体は、インビトロで神経膠腫細胞を死滅できる能力を保有すると考える。U-87MG細胞の単層全体を破壊する拡散性感染を持続できる、変異ウイルスの最低接種量は、インビボで変異体が評価される投与量のうち1種類を与えると思われる。変異ウイルスベクターを、異なるヒト神経膠腫系(T98G)に対しても、様々なMOIで試験し、10日以内に単層破壊を生じ得るその能力を査定する。
外科手術で得た3例の悪性ヒト神経膠腫(未分化型星状細胞腫1例および膠芽細胞腫2例)をDME+に体外移植することによって、膠芽細胞腫の短期培養を確立し、第二継代で研究した。変異体を、それらの細胞変性効果について様々なMOIで試験する。この単純ヘルペスウイルス変異体、および3例の原発性悪性神経膠腫のすべてで細胞変性的である投与量は、インビボで、広範囲のヒト脳腫瘍細胞を死滅できると思われる。
神経膠腫培養に加え、ウイルス変異体を、細胞培養での3例のヒト悪性髄膜腫、１例の異型性髄膜腫、5例の神経線維肉腫、および2例の髄芽細胞腫を死滅できるそれらの能力について、細胞培養かつインビボモデルで試験する。101〜10-4の範囲のMOIでウイルス変異体を試験する。変異ウイルスによる有意な腫瘍抑制は、ウイルス変異体がヒト脳腫瘍細胞を死滅させるのに有効である広範囲の神経系腫瘍を明らかにする。
図６は、U-87MG細胞に対するG207-1およびG207-2のインビトロ細胞変性の効果を文書化している。U-87MG細胞のサブコンフルエント単層をG207-1またはG207-2に感染させる(MOI＝0.01または1)一方で、対照を模擬感染させ、10％IFCS含有培地によって34.5℃で培養した。トリパンブルー排除試験によって、生存可能細胞を同定した。模擬感染した対照培養中の細胞数(100％)と比較しての、生存細胞数を査定した。各データ点は、三重試験の平均を表す。縦の棒は、三重試験の標準偏差を示す。各ウイルス変異体は、感染後6日目までに腫瘍細胞をすべて死滅させた。細胞変性効果は、1.0のMOIについては感染後1日目に出現し、1.0のMOIについては感染後3日目までに、また0.01MOIについては6日目までに、＞99％の細胞毒性が明らかであった。これらの変異体の細胞変性の効果は、ヒト神経膠腫細胞系T98G、U138MGおよびA172に対しても試験できる。
本発明の単純ヘルペスウイルスベクターは、その他のヒト腫瘍の破壊を媒介するのに用いることができる。本発明に影響され得る可能性があるその他のヒト腫瘍の例は、黒色腫、前立腺の癌腫、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、リンパ腫、肝癌および中皮腫を包含する。ヒト腫瘍細胞は、記載の原発性腫瘍から培養できる[フォーおよびトゥレンペ、「HUMAN TUMOR CELLS IN VITRO」、Plenum Press、米国ニューヨーク(1975)、p115;Wilson、「ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH」第8章、、IRL Press(1986)]。本発明者らは、ヒト黒色腫細胞系のSK-MEL-31(ATCC第HTB73号);ヒト前立腺癌腫細胞系のDul45(ATCC第HTB81号)およびPC3(ATCC第CRL1435号);ヒト類表皮癌腫細胞のA431(ATCC第CRL1555号);ならびにヒト肺癌腫細胞のCalu-1(ATCC第HTB54号)が、HSV-1の弱毒化変異体による感染に感受性であることを示している。
抗ウイルス薬感受性
抗ウイルス薬に対する先行技術のいくつかの単純ヘルペスウイルス変異体の不感性を克服するために、もう一つの薬剤標的(例えば自殺遺伝子)をこのウイルスに挿入する。例えば、CMVのUL97遺伝子(gans;pGMT7-UL97)をTK-というHSV-1変異体に挿入し、TK. HSV-1が血清飢餓細胞で複製できないことを補足でき、かつこの組換え体にガンシクロビル感受性を付与できる、その能力について試験する。自殺遺伝子を有するウイルスベクターをガンシクロビル感受性について試験した後、自殺(遺伝子)含有ウイルスベクターと、自殺(遺伝子)不在のもの(例えばHSV-1変異体TK-／UL97およびdlsptk)とのED50(インビトロ)および平均生存時間の比較を、ガンシクロビルの存在下で実施する。
ガンシクロビル感受性アッセイ
12穴プレートでのベロ細胞のコンフルエント単層を、MOIは0.0005未満のままで、100pfuのR3616またはG207に感染させる。ウイルス接種物を除去した後、1％不活化ウシ胎児血清、および様々な濃度のガンシクロビルを含有する1000倍希釈したヒト免疫グロブリン(Armour Pharmaceutical Company;米国イリノイ州Kankakee)を加えたDMEMを三重の培養に加え、細胞を37℃でインキュベートする。プラークをギムザ染色によって可視化し、感染後3日目に計数する。R3616、G207-1およびG207-2のガンシクロビル(GCV)感受性を図4に示すが、これは、G207-1およびG207-2が、R3616より10倍もガンシクロビルに感受性であることを明らかにしている。R3616のガンシクロビル感受性は、野生型に類似している。各データ点は、三重試験の平均を表す。ガンシクロビルの非存在下でのプラーク数が100％を表す。点線はED50を示す。
変異ウイルスベクターの温度感受性
脳炎および熱の存在下でウイルス複製を更に和解させる追加的安全性の特徴を与えるために、宿主の基礎体温を上回る温度に対する変異ウイルスベクターの感受性を確かめる。表2は、上昇した温度でのG207-1およびG207-2のプラーク形成効率の低下を立証している。プラーク効率は、ベロ細胞単層に対するウイルス保存株の力価を測定することによって決定した。感染ベロ細胞単層を、1％IFCS培地を用いて37℃または39.5℃で培養し、感染後48時間で固定する。ギムザ染色後にプラークを計数する。力価はpfu/mlとして表す。以前に報告されたとおり[ゴールドシュタインおよびウェーラー、Virology、166:41(1988)]、hrR3変異体は、親株のKOSに匹敵する温度感受性を示した。HSV-1野生型株Fは、R3616、G207-1およびG207-2の親株であるが、やはり温度感受性である。R3616、G207-1およびG207-2変異体は、それらの親株と同様に温度感受性のままである。
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実施例3.インビボの頭蓋外モデル
皮下神経膠腫異種移植片の移植および治療方法
ヒト脳腫瘍に対するインビボでの変異単純ヘルペスウイルスの感染の効果を、ヒトの腫瘍の成長を可能にする無胸腺マウスで査定した。皮下異種移植片の移植は、以前に記載のとおり実施した[マルツザら、Science、252:854(1991)、およびマーカートら、Neurosurg.、32:597(1993)]。ヒト神経膠腫に対する単純ヘルペスウイルス変異体のインビボでの効果を試験するために、1mm3に刻んだ神経膠腫片(培養U-87MG細胞とともに予め皮下注射したヌードマウスから得た)をヌードマウスに皮下移植する。ヌードマウスは、84％静菌性生理食塩水、10％ペントバルビトールナトリウム(1mg/ml)および6％エチルアルコールからなる溶液0.25mlで麻酔する。いかなる手順でも48時間以内に死亡した動物は、手術による死とみなし、分析から除外する。皮下腫瘍の実験での死は、分析から除外する(ウイルス投与群と対応するそれらの対照との間で、発生した死の有意差は皆無であった)。
4〜5週で、腫瘍(直径≧8mm)を成長させている動物を、１群あたり7〜10匹の2群に分ける。対照にはDMEM+50〜60μlの新生物内注射を与え;投与動物にはDMEM+に懸濁させたウイルスの同様の新生物内注射を与える。各ウイルスについての投与量には、106〜108プラーク形成単位の変動幅がある。腫瘍全体にウイルスを分布させるよう注意を払う。二回投与の実験については、後続のDMEM+またはウイルスの注射は、14日目に実施する。ウイルス変異体のそれぞれについて、様々な投与量での同様な実験を実施する。
腫瘍は、毎週または週2回カリパスで測定した。皮下異種移植片の成長は、マルツザら[前出(1991)に記載の公式:([1xWxh]／2)／([1xWxh]day0／2)による腫瘍成長比率として記録した。最初の投与後28日目に、成長比率の比較を実施した。片側ウィルコクソン順位検定の使用によって、成長比率の潜在的差異を査定した。
G207を用いた皮下神経膠腫異種移植片療法
皮下腫瘍を保有するマウス(直径約6mm)を無作為に分割し(１群あたりn＝6)、ウイルス緩衝液0.05mlに懸濁させた5x107 pfuのG207ウイルス、または緩衝液のみのいずれかを新生物内投与した。腫瘍直径を、外側カリパス測定によって測定した。病理学的研究のために、1x107 pfuのG207を担腫瘍マウス(直径＞10mm)に投与し、注射後8、15日目に屠殺した。腫瘍を摘出し、固定液中に1時間定置し、冷リン酸緩衝生理食塩水中に沈めた。次いで、腫瘍をX-gal溶液中に終夜定置した。
図8は、5x107 pfuのG207-1(黒い円)もしくはG207-2(黒い正方形)、または対照培地のみ(白い円)を0日目に投与したBalb/c(nu／nu)マウスでの、皮下U-87MG腫瘍の成長比率を示すグラフである。腫瘍は、週2回カリパスで測定し、腫瘍の体積を最初の接種の日の腫瘍の体積で除することによって、成長比率を算出した。棒は、各群についての平均±標準誤差を表す。G207を投与した腫瘍では、培地のみを投与した対照腫瘍と比較して、平均腫瘍成長率が有意に抑制された。
腎下カプセルモデル
腎下カプセルは、他の神経系腫瘍の成長をモニターするのに用いられる部位である[リーら、Neurosurg.、26:598(1990);メドゥコーら、J. Neurosurg.、71:545(1989)]ことから、ヌードマウスの腎下カプセル内で増殖させたU-87MG細胞に対するG207の効果も試験した。U-87MG細胞(1.5x106)を、ヌードマウスの腎下カプセル内に移植した。10日後、腫瘍を測定し、様々なpfuのG207を添加したDME+1μl、またはDME+1μlのみを接種する。接種後14日目および26日目にすべてのマウスを再検査して、腫瘍の大きさを測定した。対照腫瘍より小さいウイルス投与腫瘍は、変異ウイルスが、インビボで腫瘍細胞を死滅できることを示す。
実施例4.インビボでの頭蓋内腫瘍の致死
脳内神経膠腫を治療する際の、複製能を有する単純ヘルペスウイルスベクターのインビボでの効果を評価するために、ヌードマウスに、1.6x105のU-87MG細胞を立体定位で右前頭葉に接種することにした。試験的研究では、類似の細胞接種物が1.5ケ月以内に100％の致死率を生じた。
腫瘍移植の10日後に、動物を無作為に投与群に分割して、腫瘍移植物に用いた同じ立体定位の座標で、下記の治療法を施した:(1)対照群には、上記のDME+6μlの頭蓋内接種を施すことにし、(2)第2群には、複製能を有する103 pfu(低投与量)の変異ウイルスベクターの頭蓋内接種を施すことにし、(3)第3群には、105 pfu(中投与量)の試験ウイルスの頭蓋内接種を施すことにし、(4)第4群には、107 pfu(高投与量)の試験ウイルスの頭蓋内接種を施すことにし、試験ウイルスは、それぞれ、DME+6μlに懸濁させた。接種は、U-87MG細胞を注射するのに最初に用いた立体定位の座標で、DME+2μlとなるようにした。7週までに、対照動物はすべて、過去の評価でそうであったとおり、死亡した。本発明の変異ウイルスベクターは、投与後7週までに、有意数のマウスを生存させれば、脳内脳腫瘍を死滅させる。有意差は、片側フィッシャー直接確率計算法で実験群対対照群をプロットすることによって決定される。
インビボでの神経病理学
19週に健康かつ神経学的に正常なままである動物を屠殺する。脳全体を固定し、7μmの間隔で連続切片化し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、脳炎および／または腫瘍の証拠について顕微鏡検査することにする。脳炎の証拠の不在は、低下または弱毒化した汎神経毒性の特徴をウイルスベクターが保有することを明らかにすると考えられる。腫瘍の証拠がなければ、ウイルスベクターが、ヒト脳腫瘍細胞をインビボで死滅させるのに有効であることが明らかになると考えられる。
インビボでの治療は、低下した神経毒性の低下を示すが、神経膠腫細胞での細胞変性効果は保持する、単純ヘルペスウイルス変異体にとって、より効果的であるが、それは、そのようなベクターは、より高いウイルス投与量での投与を可能にすると考えられるからである。
免疫適格動物モデルでの単純ヘルペスウイルス変異体の研究
適格免疫系の存在下で、単純ヘルペスウイルス変異体がヒト腫瘍細胞を死滅させる効果を試験するために、GL261マウス上衣芽細胞腫モデルをその同系宿主のC57BL／6マウスで利用した。GL261細胞系を、C57BL／6マウスに皮下または頭蓋内移植した。皮下のGL261腫瘍を保有する動物を、無作為に分割し、ヌードマウスモデルで上記のとおり、新生物内投与した。そうして、ウィルコクソン順位検定で査定した限りで有意な成長抑制を示すウイルス投与群を、頭蓋内での研究でアッセイした。
頭蓋内での実験のために、104のGL261細胞をマウスの右前頭葉に注射することにした。7日後、変異ウイルスまたは培地のみのいずれかを、動物に新生物内接種した。培地を投与したマウスはすべて、以前の研究でそうであったとおり、死亡した。マウスの生存を腫瘍細胞の移植後40日またはそれ以上延長できると考えれれるウイルス変異体は、インビボで、ヒト脳腫瘍細胞を死滅させるのに有効であると思われる。
単純ヘルペスウイルスで免疫した動物での神経病理学および腫瘍致死
単純ヘルペスウイルスは、社会的には風土病であることから、効果的な治療方法は、HSV-1に接触していた患者を適応させた。したがって、本発明の変異単純ヘルペスウイルスベクターが、予め単純ヘルペスウイルスに免疫しておいた動物で、インサイチューで腫瘍細胞を破壊できるか否かを決定することが重要である。変異ウイルスベクターがインビボで腫瘍細胞を死滅できる能力に対する、単純ヘルペスウイルスによる免疫化の効果を、C57BL／6マウスでのGL261頭蓋内モデルで試験した。
C57BL／6マウスは、単純ヘルペスウイルスのKOS株に対して免疫し;もう一群のマウスは、ベクターが由来する野生型株で免疫し;もう一群は、生理食塩水で模擬免疫することにした。接種後2週間でプラーク減少アッセイによって抗体の高血清力価を示したマウスを、単純ヘルペスウイルスで免疫された動物として用いた。免疫化の4週間後に、上記のとおり腫瘍細胞を脳内注射することにした。1週間後に、腫瘍にベクターを同じ立体定位座標で接種し、負の対照群には培地のみを用いることにした。腫瘍細胞の増殖に対する前免疫化の効果、その後の動物の死亡、および単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞を死滅できる能力を、脳内モデルについて記載のとおりに査定した。
加えて、各群から数匹の動物を、急性期(2日)、亜急性期(1週間)および慢性期(1ケ月および3ケ月)のそれぞれの間に、神経病理学的研究のために屠殺した。下記の組織病理学的性状、すなわち腫瘍の大きさ、免疫細胞の浸潤、脳浮腫、壊死、ニューロンの変化、グリア、有髄化、出血、血管の新生または破壊、反応性星状細胞、正常なニューロンおよびグリア、虚血、グリオーシス、ならびにウイルスの拡散(ウイルスDNAまたはβ-ガラクトシダーゼに対するPCR)を査定した。これらの研究は、単純ヘルペスウイルスに対する前免疫化が、変異ウイルスベクターが腫瘍細胞を死滅できるか、または神経発病を誘発できる能力に対する何らかの効果を有するか否かを決定できると思われる。
ウイルスの位置の同定
大腸菌lacZ遺伝子を有し、ウイルス感染後にβ-ガラクトシダーゼを発現する単純ヘルペスウイルスは、標識されたウイルス動態および拡散を組織学的に決定するのに役立つマーカーである。ICP6遺伝子に挿入された大腸菌LacZ遺伝子をhrR3変異体が有するために、該ウイルスは、ウイルス複製の際にβ-ガラクトシダーゼを発現することから、感染細胞は、X-galで染色できる[ゴールドシュタインおよびウェーラー、前出(1988)]。
このマーカーは、hrR3による感染後の様々な時点で、マウスからの脳標本をX-galで染めることによって、検査することによって、インビボでのウイルスの拡散を追跡することが可能である[カプリットら、Mol. & Cell. Neurosci.、2:320(1991)]。固定した脳の切片中のウイルス感染細胞の存在を、PCRによって決定し、X-gal染色細胞の比率と比較する。腫瘍は、H＆Eによる対比染色後に、または腫瘍細胞もしくは種特異的マーカーで免疫組織化学的に、視認できる。このようにして、複製能を有するウイルスベクターを追跡し、拡散して主要な腫瘍塊から隔たって腫瘍細胞の堆積を形成するそれらの能力を査定することにした。組織学的研究によって、ウイルスが拡散して、遠隔の腫瘍堆積に到達できる最大距離が決定されうる。
脳切片中に単純ヘルペスウイルスまたは不完全な単純ヘルペスウイルスベクターの存在を同定する、もう一つの鋭敏な手法は、PCR法である。ウイルスDNAを定位するために、ただ1個の陽性細胞でさえ特異的PCRシグナルを発生するよう、固定および組織化学的検査後に、PCRのためのDNAを細胞から単離した。特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い、これらの細胞内に存在するウイルスベクターのDNAから、独自のPCR産物を生成した。カバーグラスをスライドから取り除き、組織の小片を切り出した。組織をプロテイナーゼK、トゥイーン20、オリゴヌクレオチドおよびPCR緩衝液とともに、65℃で90分間インキュベートし、次いで、95℃に上昇させて、プロテイナーゼKを不活化した。処理した試料をdNTP、PCR緩衝液およびTaqDNAポリメラーゼで希釈し、サーマルサイクラーにかけた。次いで、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によってサイズ分析した。加えて、利用可能なインサイチューPCRの手法を用いて、神経病理学的研究の際にウイルスDNAを定位できた[エンブレットソンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:357(1993)]。
複製能を有する単純ヘルペスウイルス変異体のマウスおよび非ヒト霊長類での安全性
単純ヘルペスウイルスベクターが、腫瘍細胞を死滅させるのに要する投与量では神経毒性を生じないことを確定するために、腫瘍致死量の変異単純ヘルペスウイルスベクターを動物に接種して、ベクターがインビボで単純ヘルペスウイルス脳炎を生じるか否かを決定する。G207-1、G207-2および株Fのアリコート(10μl)を、3週齢のマウスの右大脳半球内に接種し、感染後21日まで死亡を集計した。表3は、Balb/cマウスへの野生型親ウイルス(株F)の103 pfuでの脳内接種が、動物の半数を脳炎で死亡させたことを示す[チョウら、Science、250:1262(1990)]。株17についての公知のLD50も、103 pfu台である[マッキーら、J. Gen. Virol.、75:733(1994)]。対照的に、本発明者らが生起できた最高力価(10μl中に107 pfu)のG207-1またはG207-2の脳内接種後には、死亡率または疾病は全く観察されなかった。107 pfuという投与量は、図８に示したとおり、皮下U-87MG腫瘍成長モデルでインビボで腫瘍細胞を死滅させることが示された。
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単純ヘルペスウイルス脳炎に極めて感受性である霊長類の一種、アオツス・トリビガツス(Aotus trivigatus)を用いて、本発明の変異単純ヘルペスウイルスベクターの安全性を試験する[カッツィンら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、125:391(1967);メレンデスら、Lab. Anim. Care、19:38(1969)]。
磁気共映像法(MRI)走査または他の映像分析を用いて、脳炎を査定した。サルには、試行開始の前に脳MRIを、ガドリニウムとともに、またはそれなしに施した。
最初の試験は、マウスで安全である(LD10またはそれ以下)と決定された、特定の変異体について投与できる最高投与量で、実施した。例えば、試験しようとするG207欠失変異体については、107 pfuを脳内投与することにした。単純ヘルペスウイルスに高度に感受性であることが公知である種によって充分に忍容される投与量は、この投与がヒトに合理的に安全であると思われる最も強力な証拠を与える。脳炎の臨床的な、またはMRIでの証拠が1ケ月以内に全く示されなかったならば、それと同じか、または1対数だけ高い投与量で、もう1頭の動物を試験することにした。神経学的徴候および全身性疾病の徴候について、毎日動物を観察することにした。
この方法は、死亡、持続性の神経学的徴候、または進行性の疾病を生じることなく安全に頭蓋内投与することが可能な最高投与量を決定できる。12ケ月後に、動物を屠殺し、ニューロンの変化または喪失、グリア反応、有髄化、出血、血管の新生または崩壊、血管内のウイルスDNA(PCRによる)またはウイルス誘導β-ガラクトシダーゼ、虚血、壊死、グリオーシスおよび炎症反応について、脳を検査した。これらの研究は、このベクターによる感染の結果から、(あるとすれば)正常霊長類の脳内に生じると予測され得る、神経病理学的病変を解明できると思われる。
アオツス属(Aotus)は、アオツス・トリビガツス(Aotus trivigatus)をその唯一の代表として有する単一種属であると長い間考えられていた。しかし、研究によって、アオツス属は、染色体数が2n＝46〜2n＝56にわたる(アオツス・ナンシマイ(Aotus nancymai)、核型1のヨザル、2n＝54)種および亜種を有する多型属であることを証明した。単純ヘルペスウイルスに対するヨザルの感受性が1960年代に報告されたときは、アオツス・ナンシマイは、アオツス・トリビガツスから区別できなかった[マラガら、Lab. Anim. Sci.、41:143〜145(1991)]。しかし、最新の分類学的区分では、アオツス・ナンシマイは、アオツス・トリビガツスを表すとすでに考えられている[ヘルシュコビッツ、Amer. J. Primatol.、4:209(1983)]。
本発明の複製能を有するウイルスベクターを、単純ヘルペスウイルス誘発脳炎に感受性である霊長類、すなわちアオツス・ナンシマイおよび／またはアオツス・トリビガツスに単純ヘルペスウイルス脳炎を発生させられるそれらの能力について、試験することにした。アオツス・ナンシマイは、107 pfuのG207変異体を接種された3週間後に、依然として生存している。
実施例5.複製能を有するウイルスベクターによるヒト脳腫瘍の治療
標準的外科手術、放射線療法および化学療法に対して難治であった再発性の膠芽細胞腫の患者を、単純ヘルペスウイルス療法で治療した。MRIもしくはCT、または他の手法を用いて患者を走査し、腫瘍および正常な脳を立体定位空間に登録した。立体定位によって案内される神経外科的手法を用いて、ウイルスを投与した。コンピュータ断層撮影(CT)走査または磁気共鳴映像法(MRI)走査が、正確に1ケ所またはそれ以上の位置でウイルスを腫瘍に接種するのに用いられる、立体定位の枠組みを算定する。ウイルスは、＜2mmのカニューレを用いて、1接種あたり101〜107 pfuの投与量で接種した。接種する部位の数は、腫瘍の大きさに依存した。患者は、定期的なMRI走査、ならびに神経学的検査、血球数および肝機能検査で追跡した。
代替的な体制では、再発性腫瘍の多くを除去するように患者を手術し、部分切除した腫瘍床に、上記と類似の様式でウイルスを接種した。
実施例6.複製能を有する単純ヘルペスウイルスベクターのワクチン
本発明の単純ヘルペスウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスの感染に対して動物を防護する、ワクチンとして用いることができる。本明細書において、単純ヘルペスウイルスに対して患者を「防護すること」は、(1)予防ワクチン、すなわち、その後の単純ヘルペスウイルス感染を防ぐために用いられるワクチン、および(2)現存する単純ヘルペスウイルス感染を治療するための治療ワクチンの双方を包含する。
標準的方法体系を用いて、単純ヘルペスウイルスの試料を調製した。単純ヘルペスウイルスに感染したベロ細胞を、用いるまでは-70℃で凍結させた。この材料を解凍し、細胞砕片を遠心分離によってペレット化した。上清を棄却し、ペレットをその本来の体積に再懸濁した。この材料は、ワクチン製造に用いられるものに最も近いと思われる。この懸濁液を2回、20秒間超音波処理した。
単純ヘルペスウイルスのプラーク力価を、標準的手順によって決定を行った。例えば、6穴プレート中のベロ細胞の単層上で、三重に力価測定を行った。試料の2時間の吸着後、細胞を、0.6％アガロースを含有する培地で覆い、CO2に富む環境下で、37℃で48時間インキュベートした。ニュートラルレッドを加えた以外は上記と同じである、第二の被覆層を加え、更に24時間、細胞をインキュベートした。
濾過する前に、単純ヘルペスウイルスのプールを力価測定した。次いで、Nalgene 0.45μmフィルター越しにプールを濾過し、試料採取し、第二のフィルター越しに再濾過し、次いで、再度試料採取した。
実施例7.マウスモデルおよびサルモデルでの病原性についての単純ヘルペスウイルスワクチンの試験
生後＜24時間の乳のみマウスのCD-1系(Charles River、米国ノースカロライナ州Baliegh)で、単純ヘルペスウイルスワクチンの致死率を他の単純ヘルペスウイルスワクチンの致死率と比較した[メイニールら、J. Infect. Diseases、158:602(1988);ブルケ、Curr. Topics in Microbiology and Immunology、179:137(1992)]。単純ヘルペスウイルスベクターワクチンおよび野生型ワクチンの比較力価測定を、単純ヘルペスウイルスワクチンの最後の量を用いて、単一試験で実施した。
ワクチンの対数希釈物を調製した。5匹のマウスのうち2匹の同腹仔を、それぞれ、各希釈物に用いた。マウスには適切な希釈物0.03mlを脳内接種し、21日間観察した。マウスの致死率は、50％のマウスを死亡させたpfuでの投与量として算出した(例えば、ワクチン0.03mlあたりのpfuをワクチンのLD50で除する)。
また、研究では、4匹のサルに単純ヘルペスウイルスベクターを与えた。更に6匹のサルに、本発明の単純ヘルペスウイルスベクターによる免疫化の1年後に、ベクターを与えた。ワクチン候補の皮内または皮下投与が充分に忍容されるならば、該単純ヘルペスウイルスベクターワクチンは、単純ヘルペスウイルスに対する免疫防護剤として用いるのに安全であると思われる。
加えて、単純ヘルペスウイルスに特異的な血清抗体力価について、全てのサルを試験した。一次免疫化の後に、サルのセロコンバージョンをELISAによって測定した。すべてのサルがセロコンバージョンを生じるならば、該単純ヘルペスウイルスベクターワクチンは、単純ヘルペスウイルスに対する免疫防護剤としての効果を有すると考えられる。
実施例8.単純ヘルペスウイルスベクターワクチンによるヒトの臨床的研究
ワクチンとして用いるため、本発明の突然変異させた単純ヘルペスウイルスベクターを、皮下接種した。その後、単純ヘルペスウイルス特異的抗体力価、および単純ヘルペスウイルス特異的細胞性応答レベルを測定することにした[メイニールら、J. Infect. Diseases、162:313(1990);ブルケ、Curr. Topics in Microbiology and Immunology、179:137(1992)]。研究の予備段階は、文書化したHSV-1感染の4個体(第1群)の接種と、その後の、第1群が接種された21日後のHSV-1未感染の4個体(第2群)の接種とが含まれる。事前のHSV-1との接触は、医学的記録、または、臨床検査室で利用できるHSV-1免疫蛍光検定によって査定される限りでの、明白なHSV-1の出現によって文書化した。その後、単純ヘルペスウイルス未感染の24志願者(第3群)での無作為試験を実施することにした。重篤な副作用の治療のために、抗HSV-1免疫グロブリンおよび抗ヘルペス剤をその場で利用できるよう備えた。
第1、2、3および4群の患者を、接種の3日前に入院させ、接種の4日後まで入院患者として入院させた。次いで、患者を退院させ、起こりうる反応または併発症についての臨床検査を伴う通院ベースで、21日目まで査定した。熱、皮疹、嗜眠、壊死性皮膚病変または神経学的徴候を発症した患者は、その後毎日の臨床検査で追跡し、必要と思われたならば、入院させた。
第5群の志願者は、すべてHSV-1未感染であり、外来患者の患者としての利用力に応じて登録することにした。第5群志願者は、2下位群の一方に無作為に割り振ることにし、一方にはただ1回の注射を与え、他方にはブースターを与えることにした。
プロトコル参加の研究は、下記の定期検査を含む:白血球百分率および血小板計数を含むCBC、尿検査、血清化学、血清ウイルス、血清単純ヘルペスウイルス抗体、ならびに単純ヘルペスウイルス抗原に対するリンパ球の免疫応答。残余の血清試料は、-80〜-120℃で凍結させて維持し、追加の研究および／または選ばれた研究の必要に応じての反復に利用できるようにした。接種の部位または遠隔部位での小胞性もしくは水痘性病変内の流体は、採取し、ウイルス隔離輸送培地に入れて、ウイルスの回収を試みた。血清抗体の決定には、単純ヘルペスウイルスベクターに感染した細胞とのELISAでの反応性、HSV-1ベクターのHSV-1抗原およびプラーク減少による中和反応を含む。
単純ヘルペスウイルスベクターの臨床試験は、ワクチンが安全であり、ヒトに効果的であることを示すはずである。ワクチン受容者は、ELISAで測定される限りで、有意な体液性応答を生じることが期待される。陽性の応答は、中和抗体と非中和抗体との双方によって特徴付けられ、後者は、プラーク減少および中和アッセイによって測定される。加えて、ワクチン受容者からのリンパ球が、インビトロでの単純ヘルペスウイルス抗原との接触に際して増殖し、サイトカインを生産することを立証するために、正のリンパ球幼若化アッセイが期待される。
好ましい態様を示す一方、説明、特定の実施例およびデータは、図解および例示のために与えられおり、本発明の範囲を制限するものではないことを理解されるべきである。本発明の範囲内でさまざまな変化および改変が本明細書に含まれる議論および開示から当業者には明らかとなると思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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