(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体組織または体液中の悪性腫瘍転移の検出に際し：
（ａ）前記体組織または体液の細胞由来の核酸を含む試料を、標的悪性腫瘍関連ｍＲＮＡ配列を特異的に増幅するための増幅用反応混合物中において前記標的悪性腫瘍関連配列を増幅する条件下で処理して、前記標的悪性腫瘍関連配列が存在する場合に増幅配列を与え、ここにおいて、前記標的悪性腫瘍関連配列は上皮または内分泌細胞により発現され、かつまた前記標的悪性腫瘍関連配列は、腫瘍が生じる健常細胞に加えて悪性腫瘍細胞において発現されるが試料体組織または体液中に通常に存在する常在性非悪性腫瘍細胞によって発現されない配列であり、これによって前記体組織または体液中の悪性腫瘍転移を指示する配列であって、かつ前記標的悪性腫瘍関連配列は、クロモグラニンＡ、シナプトフィジン、カルシトニン、ＣＧＲＰ及びＫＳ１／４をコードする核酸から選択される配列である；および、
（ｂ）増幅の生起の有無を検出する、
工程を含んでなる悪性腫瘍転移の検出方法。
【請求項２】
前記標的悪性腫瘍関連配列の増幅条件が、最初に前記ＲＮＡを、該ＲＮＡを逆転写する条件下で処理して前記増幅反応混合物中にｃＤＮＡを与えることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡを含む前記試料が、骨髄吸引液、骨髄生検材料、末梢血、リンパ節吸引液、リンパ節生検材料、腹水、胸膜滲出液、および脳脊髄液からなる群から選択される組織または液から調製される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応混合物が、ＰＣＲ混合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プライマ対が第１のプライマおよび第２のプライマを含み、前記第１および第２のプライマが、前記標的悪性腫瘍関連配列をコードする遺伝子の隣接エクソン内の核酸配列に相補的である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記悪性腫瘍細胞が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胸部癌、消化器系癌、尿生殖器系癌、睾丸腫瘍、内分泌系癌および黒色腫からなる細胞群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマ対が、ＣＭ５８／５９（配列番号１および２）、ＣＭ５８／６０（配列番号１および３）、ＣＭ６３／６４（配列番号４および５）、ＣＭ６３／６５（配列番号４および６）、ＣＭ７１／７２（配列番号１０および１１）、ＣＭ７１／７３（配列番号１０および１２）、ＣＭ７９／８０（配列番号１６および１７）、またはＣＭ７９／８１（配列番号１６および１８）から選択される請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
体組織または体液中の悪性腫瘍転移の検出におけるキットの使用方法であって、前記キットは少なくとも１種の標的悪性腫瘍関連配列を増幅するためのプライマ対を少なくとも１種有してなり、同配列は上皮または内分泌細胞により発現され、かつまた同配列は、腫瘍が生じる健常細胞に加えて悪性腫瘍細胞において発現されるが前記体組織または体液試料中に通常に存在する常在性非悪性腫瘍細胞においては発現されない配列であって、かつ前記標的悪性腫瘍関連配列は、クロモグラニンＡ、シナプトフィジン、カルシトニン、ＣＧＲＰ及びＫＳ１／４をコードする核酸から選択される配列であることを特徴とするキットの使用方法。
【請求項９】
前記キットが、前記標的配列のｃＤＮＡ生成物に対してハイブリッド可能なオリゴヌクレオチドプローブを更に含む請求項８に記載のキットの使用方法。
【請求項１０】
体組織または体液中の悪性腫瘍転移の検出用キットであって、前記キットは少なくとも１種の標的悪性腫瘍関連配列を増幅するためのプライマ対を少なくとも１種有してなり、前記標的配列は上皮または内分泌細胞により発現され、かつまた前記標的配列は、腫瘍が生じる健常細胞に加えて悪性腫瘍細胞において発現されるが前記体組織または体液試料中に通常に存在する常在性非悪性腫瘍細胞においては発現されない配列であって、かつ前記標的悪性腫瘍関連配列は、クロモグラニンＡ、シナプトフィジン、カルシトニン、ＣＧＲＰ及びＫＳ１／４をコードする核酸から選択される配列であり、前記プライマ対が、ＣＭ５８／５９（配列番号１および２）、ＣＭ５８／６０（配列番号１および３）、ＣＭ６３／６４（配列番号４および５）、ＣＭ６３／６５（配列番号４および６）、ＣＭ７１／７２（配列番号１０および１１）、ＣＭ７１／７３（配列番号１０および１２）、ＣＭ７９／８０（配列番号１６および１７）、またはＣＭ７９／８１（配列番号１６および１８）から選択され、場合により前記標的配列のｃＤＮＡ生成物に対してハイブリッド可能なオリゴヌクレオチドプローブを更に含む、悪性腫瘍転移の検出用キット。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＣＭ６１（配列番号１９）、ＣＭ６２（配列番号２０）、ＣＭ６６（配列番号２１）、ＣＭ７０（配列番号２２）、ＣＭ７４（配列番号２３）、ＣＭ７８（配列番号２４）、またはＣＭ８２（配列番号２５）から選択される請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸増幅による悪性腫瘍転移の検出方法に関するものである。好適な実施態様において、転移性悪性腫瘍細胞により発現される正常非造血性ＲＮＡの検出により、造血組織中において悪性腫瘍転移が同定される。非造血性ＲＮＡ配列の検出は、転移性疾患の存在を示す。この方法は、悪性腫瘍患者の診断、病期決定および監視において応用を有する。
【０００２】
癌治療の最近の発展は、適切な治療の開始を保証し、治療の終点を特定し、また新規な処置法の種類および計画を発展させ評価するために、より感度の高い病期決定および監視方法の必要性を示している。悪性腫瘍患者の管理において、適切な初期治療の選択は、疾患の病期の正確な評価に依存する。限定的または局所的な疾患を有する患者は、一般により良好な予後を有し、離れた転移を有する患者とは異なった処置がなされる（Ｍｉｎｎａらの、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，５９１−７０５頁）。しかしながら、これらの転移を検出する慣用方法はあまり感度の高いものではない。
【０００３】
例えば、肺癌の主要な組織学的下位集団（小細胞癌および非小細胞癌）の両者の予後および治療的管理は、診断時の疾患活性の病期に依存する（Ｇｒｅｅｎの、１９８９、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、５：１７８−１８５）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者は、肺癌の約７５％をしめる。肺癌のこの組織字的下位集団は、化学療法に対して比較的耐性であるものと考えられてきた。しかしながら、ＮＳＣＬＣは、潜伏する離れた転移癌を有さない病期Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩＡの患者においては、外科的切除（および場合により放射線療法）によりしばしば治癒し得る。
【０００４】
残念なことに、転移疾患検出のための従来の病期決定方法は、あまり感度が高くない。手術前の病期決定における標準的方法によっては同定されない転移を有しているために、病期ＩのＮＳＣＬＣ患者の約２５％〜３０％は、初期腫瘍切除で治癒しない。より感度が高い転移検出技術の開発は、局部的外科的腫瘍切除によって治癒しないが効果的全身療法の利益を受けるＮＳＣＬＣ患者の特定を可能とするであろう。同様に、他の型の悪性腫瘍について転移を検出するより高感度な方法は、局所療法的手段では治療せず、有効な全身療法がより適切である患者を同定するであろう。
【０００５】
現在の病期決定方法が不適当であることは、他の主要な肺癌の型である小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の管理にも不利に影響している。ＮＳＣＬＣとは対照的に、ＳＣＬＣは化学療法および放射線療法に対して極めて感受性であるが、一般にこれらの腫瘍は診断時には離れた部位に転移しているため、外科手術のみでは治癒しないと考えられている。治療により完全な小康状態に達した限られた疾患の患者の約２５％〜３５％が、永続的小康状態を有し、治療に続く２年間の何事も無い生存を得る。現在の病期決定方法は、初期に完全な小康状態を達成したにもかかわらず早期にぶり返すであろう患者を区別できない。完全な小康状態を達成したほとんどのＳＣＬＣ患者は、通常の方法では検出できない最小残留疾患（ＭＲＤ）を有している。転移検出のより高感度な方法が、腫瘍の早期再発の危険性が高く、付加的全身療法の利益を受けるであろう限られた疾患の患者を同定するために必要である。
【０００６】
免疫細胞学的方法が、通常の形態学的評価に基づいて疑われることなく末梢血および骨髄試料中の癌細胞の検出に使用されてきた（Ｓｏｂｏｌら、１９８２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２４：１３９−１４４、およびＳｏｂｏｌら、１９８５、Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２００５−２０１０）。免疫組織化学的および免疫蛍光技術が、悪性腫瘍細胞により発現され、造血組織によっては発現されない抗原の同定に使われてきた（Ｓｏｂａｌら、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６：４７４６−４７５０、およびＳｏｂｏｌら、１９８７、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０５：６９８−７００）。一部の研究者は、標準的な形態学的試験によっては同定されない悪性腫瘍患者において、骨髄転移検出のためにモノクローナル抗体の免疫細胞学を使用した（Ｃａｎｎｏｎら、１９８８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｌ．２４：１４７−１５０；Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎら、１９８８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４１：２７３−２７６；およびＳｔａｈｅｌら、１９８５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３：４５５−４６１）。しかしながら、免疫細胞学的および標準的形態学的評価は、正常造血細胞の混合母集団中の悪性細胞をわずか１％〜５％の信頼姓をもって検出できるにすぎない（Ｗｒｉｇｈｔら、１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５：７３５−７４１）。
【０００７】
ヌクレオチド増幅技術は、特定のヌクレオチド配列を検出するための迅速かつ高感度な方法を提供する（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６、Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３、およびＳａｉｋｉら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１）。細胞混合実験は、ポリメラーゼ連鎖反応が、標的遺伝子配列を含む１：１０４または１：１０５細胞程度の少ない細胞を同定し得ることを示した（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５６９８−５７０２およびＣｒｅｓｃｅｎｚｉら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４８６９−４８７３）。
【０００８】
ＰＣＲは、造血器官悪性疾患の患者において最小残留疾患活性検出のために使用された（Ｆｅｙら、１９９１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７：８９−９４および国際特許公開ＷＯ８９／０８７１７）。これらの方法は、血液悪性疾患を特徴付ける再発する染色体転座の結果である異常ヌクレオチド配列の同定に基づいている。染色体切断点の側方にあるプライマを、転座発生の結果として生じる異常ヌクレオチド配列の増幅に使用する。対照的に、再発する染色体転座は悪性腫瘍に共通する特徴ではない。ある種の悪性腫瘍は、異常オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子ヌクレオチド配列により特徴付けられる（Ｃｏｏｐｅｒ、１９９０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。しかしながら、これらの異常ヌクレオチド配列は、あまりに多様であって充分特徴付けられていないか、あるいは標的として機能するには低頻度であって、転移性悪性腫瘍の検出のために実際的に一般に適用される核酸増幅方法法には適当でない。転移性悪性腫瘍疾患活性を検出するための、核酸増幅方法の感度の開発のために新規な方法が必要とされる。本発明は、これらの必要性に合致するものである。
【０００９】
本発明は、体組織および体液中の悪性腫瘍転移の検出方法を提供するもので、（ａ）前記体組織または体液の細胞由来の核酸を含む試料を、標的悪性腫瘍関連配列を特異的に増幅するための増幅用反応混合物中において、前記標的悪性腫瘍関連配列を増幅する条件下で処理して、前記標的悪性腫瘍関連配列が存在する場合に増幅配列を与え、ここにおいて前記標的悪性腫瘍関連配列が前記体組織または体液中の悪性腫瘍転移の指示可能であり；および、（ｂ）増幅の生起の有無を検出する、工程を含んでなる。
【００１０】
別の側面において、本発明は、体組織または体液中の転移性疾患の増幅および検出用のプライマ類およびプローブ類を提供するもので、ここでプライマ類は、悪性腫瘍中で優先的に発現され、悪性腫瘍転移を検出すべく分析される前記体組織または体液中で発現されない、標的悪性腫瘍関連配列を増幅するために好適なプライマである。
【００１１】
別の側面において、本発明は、体組織または体液中の転移性疾患検出用のキットを提供するもので、該キットは、（ａ）悪性腫瘍細胞中で優先的に発現され、体組織または体液中に正常に存在する定留細胞中で発現されない少なくとも１種類の標的悪性腫瘍関連配列の増幅のための少なくとも１種類のプライマ対を含んでなる。
【００１２】
別の側面において、本発明は、体組織または体液中の悪性腫瘍転移検出のための癌マーカとして好適な悪性腫瘍関連ＲＮＡ配列の同定方法を提供するものであって、（ａ）非悪性腫瘍細胞から負の対照ｍＲＮＡを単離し；（ｂ）悪性腫瘍細胞から正の対照ｍＲＮＡを単離し；（ｃ）前記負および正の対照ｍＲＮＡを、上皮細胞により正常に発現されるが前記非悪性腫瘍細胞によって発現されない悪性腫瘍関連配列の候補に対する別個の増幅反応混合物中で、逆転写および増幅せしめ；ならびに（ｄ）前記正の対照試料中で増幅が起こり、また前記負の対照試料中で増幅が起こらないことを検出する工程を含んでなる。
【００１３】
本発明は、体組織または体液中における悪性腫瘍関連核酸の検出方法を提供するものである。本発明の好ましい実施態様において、検出されるべき核酸は、悪性腫瘍関連ＲＮＡである。
【００１４】
本発明は、悪性腫瘍患者を検出し、監視するために有用である。別の側面において、悪性腫瘍転移の検出は、自系骨髄移植を取入れる悪性腫瘍治療のための緩解骨髄検体の適合性を評価するために適用できる。転移性疾患検出のための本発明方法の利用可能性は、悪性腫瘍の病期決定基準の再定義において、および初期治療の最適な型の決定の補佐に有用である。この改良された転移検出方法は、完全な緩解および早期再発についてより厳密な記述を可能とする。この情報は、治療の継続、再開、または中止の決定をする場合に有用な指針を与え、腫瘍患者に対するより適切な全体的治療を与え得る。これらの新規方法は、悪性腫瘍のより効果的管理を指向する手段を提供する。
【００１５】
本発明方法によれば、ＲＮＡが例えば骨髄または末梢血等の造血組織等、体組織または体液中の細胞から抽出され、逆転写酵素およびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類と共にインキュベートされてｃＤＮＡを生じる。引続き、悪性腫瘍細胞により発現されるが体組織または体液試料中の正常に存在する定留非悪性腫瘍細胞によっては発現されない遺伝子配列を検出するために増幅工程が採用される。好ましい実施態様において、悪性腫瘍関連ｍＲＮＡのＰＣＲ分析が、骨髄検体中の悪性腫瘍細胞検出のために使用される。逆転写に引続き、ＤＮＡポリメラーゼおよび興味ある標的配列のための上流および下流プライマを反応混合物に加えて標的遺伝子配列を増幅する。一実施態様において、ＰＣＲ法を用いた２０−４０サイクルの増幅に続いて、該反応混合物をクロロホルムで抽出し、水性相をアガロースゲル中で電気泳動させる。該ゲルを、エチジウムブロマイドにより染色し、写真撮影して標的配列の存在を検出する。オリゴヌクレオチドプローブを、サザン法またはドットブロット法を使用して標的配列を明確に同定するため使用してもよい。
【００１６】
癌検出の従来方法とは対照的に、標的配列は、オンコジーンｍＲＮＡ生成物である必要はない。悪性腫瘍は、非−造血器癌であり、共通する再発的転座および均一遺伝子の迷入は、核酸増幅法によって再現性をもって同定される転移悪性腫瘍について同定されていない。慣用の方法は、分析される細胞の１−５％が癌細胞の細胞学的特徴を示す場合には転移の検出に有用である。
【００１７】
悪性腫瘍転移検出のための本発明は、癌マーカとして有用な悪性腫瘍関連核酸配列の同定方法も提供する。ここにおいて使用されるように、「悪性腫瘍」なる用語は、呼吸器系癌、消化器系癌、尿生殖器系癌、睾丸癌、胸部癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性疾患をさす。
【００１８】
ここにおいて使用されるように、「悪性腫瘍関連配列」または「悪性腫瘍関連ＲＮＡ配列」なる用語は、悪性腫瘍細胞によって発現され、体組織および体液試料中の正常に存在する定留細胞によっては発現されない核酸配列を指す。ここで使用されるように悪性腫瘍関連配列は、一般にはＲＮＡであるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明は、特定の標的核酸を同定し、これらの核酸を増幅する、造血組織（骨髄、末梢血、リンパ節）、および胸膜滲出液等の体組織または体液中の悪性腫瘍転移の検出方法を提供する。ここに記述される標的核酸は、腫瘍が発生する健常細胞に加えて癌細胞中で産生される悪性腫瘍関連ＲＮＡ転写物である。しかしながら、本発明によれば、転移性疾患は、正常には標的遺伝子を発現しない組織または体液の細胞内のこれらの標的核酸を増幅することによって検出される。本発明の好適な実施態様において、該標的遺伝子は、造血細胞内では通常発現されない。
【００２０】
特定の悪性腫瘍が転移したか否かを検出するために、特定の型の悪性腫瘍が検出されるべき適切な標的核酸を測定すべく考慮され得る。例えば、悪性腫瘍により発現される骨髄および末梢血中の転移を検出するために好適な遺伝子は、造血細胞によって発現されない上皮抗原または神経内分泌抗原等をコードする遺伝子を含む。ある種の標的核酸、特にはモノクローナル抗体ＫＳ１／４（Ｂｕｍｏｌら、１９８８、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ７（４）：４０７−４１５）によって認識される抗原等の上皮抗原をコードするものは、転移性悪性腫瘍を広いスペクトルで検出するために有用である。
【００２１】
分析のための標的遺伝子を選択する基準は、多くの割合を占める悪性腫瘍細胞による遺伝子発現および造血要素による発現の不在を含む。標的遺伝子は、限定されるものではないが、クロモグラニンＡ（ｃｈｒｏｍｏＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ、カルシトニン、ボンベシン、ニューロン細胞粘着分子（ＮＣＡＭ）、シナプトフィジン（Ｓｙｎａｐｔｏ）、Ｌ−ドーパデカルボキシラーゼ、ニューロフィジンＩおよびＩＩ（ｎｅｕｒｏＩ、ｎｅｕｒｏＩＩ）、上皮小体関連悪性ホルモン、モノクローナル抗体により定義される選択されたＳＣＬＣ抗原、およびモノクローナル抗体ＫＳ１／４により認識されるパン−悪性腫瘍抗原を含む。本発明方法で使用するための任意の特定標的遺伝子の妥当性が、使用される特定のプライマ、試料および条件に依存することは、当業者には自明であろう。癌マーカとしての標的遺伝子の妥当性の評価方法が、ここに開示されると共に例において例示される。
【００２２】
本発明方法の感度は、本発明を従来の転移癌細胞検出方法と区別する。先行技術の方法は、組織学的および血清化学的分析、物理的試験、骨走査、ならびにＸ−線を含む。ここに開示される例は、標的遺伝子生成物を検出するためのＰＣＲ増幅を例示する。しかしながら、多くの増幅方法のいずれもが、発明の実施について同様に適している。
【００２３】
「増幅反応系」なる用語は、核酸の標的配列の複写物を増大させるための任意のインビトロ手段をさす。このような方法は、限定されるものではないが、ポリメラーゼ（ＰＣＲ）、ＤＮＡリガーゼ（ＬＣＲ）、ＱＲＮＡレプリカーゼ、およびＲＮＡ−転写に基づく（ＴＡＳおよび３ＳＲ）増幅系を含む。
【００２４】
典型的には標的核酸の「指数的」増大をさす「増幅」なる用語は、核酸の選択された標的配列の数の線形的および指数的増大の両者を記述するために使用される。
【００２５】
「増幅反応混合物」なる用語は、標的核酸増幅のために使用される種々の試薬を含む水性溶液をさす。これらは、酵素類、水性緩衝溶液、塩類、増幅プライマ類、標的核酸、およびヌクレオシドトリホスフェート類を含む。内容物に依存して、該混合物は、完全または不完全な増幅反応混合物のいずれであってもよい。
【００２６】
下記の系は、関連技術の当業者によって、定法として実施される。それらは、他に詳細に記述され、また以下に要約される。この発明は、いずれの特定の増幅系に限定されるものではない。別の系が開発されれば、このような系は本発明の実施により利益を与えるであろう。増幅系に関する最近の調査は、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９０−２９３（１９９０年４月）にて発行されている。増幅系についてなじみが無い場合のために以下に４種類の系を記述し、また本発明の広がりについて理解を提供する。
【００２７】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号に開示されている。熱安定性酵素を用いたＰＣＲによる核酸の増幅および検出方法は、米国特許第４，９６５，１８８号に開示されている。
【００２８】
ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの加熱変性、増幅すべきＤＮＡ分節の両端を決める２種類のオリゴヌクレオチドプライマの配列へのアニール化、および該アニール化プライマのＤＮＡポリメラーゼによる伸長の反復するサイクルを含む。該プライマ類は、標的配列の逆の鎖にハイブリッドし、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がプライマ間の領域を交差して進行し、効果的にＤＮＡ分節の量を倍増するように配向される。更に、伸長生成物もまたプライマ類に相補的で結合可能であり、各々の引続くサイクルは、先のサイクルにて合成されるＤＮＡの量を基本的に倍増する。このことは、特定標的断片を、ｎをサイクル数として、サイクルあたり約２ｎの速度で指数的に蓄積する。
【００２９】
開示される実施態様において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが好適であるが、本発明の本質的な面ではない。熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼは、高温度で活性である。Ｔａｑの調製方法は、米国特許第４，８８９，８１８号に開示されている。しかしながら、他のＴｈｅｒｍｕｓ種または非Ｔｈｅｒｍｕｓ種（例えばＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）に加え、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、またはＥ．Ｃｏｌｉのクレナウ断片等の非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもＰＣＲにおいて使用し得る。
【００３０】
伸長工程において使用されるヌクレオシド−５′−トリホスフェート、典型的にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰは、伸長反応の間、典型的には０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭの範囲の全濃度、好ましくは０．１ｍＭ〜０．２ｍＭの間の濃度で存在する。
【００３１】
ここにおいて使用される「プライマ」なる用語は、プライマ伸長生成物の合成が開始される条件、すなわち、適切な緩衝溶液（緩衝溶液はｐＨ、イオン強度、補因子等を含む）中に４種類の異なるヌクレオチドトリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、適切な温度において、核酸テンプレートにアニール化した場合に、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドをさす。
【００３２】
ＰＣＲにおいて使用するプライマの選択は、増幅反応の特異性を決定する。本発明において使用するプライマは、オリゴヌクレオチドであって、通常数個のヌクレオチド長のデオキシリボヌクレオチドであり、ポリメラーゼ連鎖反応によりテンプレート特異的な様式で伸長され得る。該プライマは、重合のための試薬の存在下、伸長生成物の合成を開始させるに充分な長さであり、該方法の成功裏の応用には臨界的ではないが、典型的には１０−３０個のヌクレオチドを含む。短いプライマ分子は、一般にテンプレートとの充分安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低温度を必要とする。
【００３３】
合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法を使用して調製され得る。別法として、例えばシアノエチルホスホルアミダイト化学を用いるＢｉｏｓｅｒｃｈ  ８７００ＤＮＡ合成装置における自動合成が好適であり得る。
【００３４】
プライマ伸長を起こさせるには、このプライマは、核酸テンプレートにアニール化しなければならない。プライマのすべてのヌクレオチドが、伸長生起のためにテンプレートとアニール化する必要はない。該プライマは、テンプレートの正確な配列を反映するものである必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片をプライマの５′末端に結合し、プライマ配列の残部がテンプレートに相補的であってもよい。別法として、プライマ配列がアニール化を起こして相補的ＤＮＡ鎖合成を許容するために充分にテンプレートに相補的な配列を有する限り、該プライマ中に非相補的塩基を散在させてもよい。
【００３５】
ＰＣＲ工程によって膨大な増幅が可能であるため、高ＤＮＡ水準の試料、正の対照テンプレートまたは先行する増幅からの微量のＤＮＡの持越しは、テンプレートＤＮＡを添加しない場合にもＰＣＲ生成物を生じ得る。可能であれば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物分析および試料調製から分離された領域において組上げられる。専用の、あるいは使い捨ての容器、溶液およびピペット（好ましくは正の移送ピペット）の、ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応物の混合および試料分析への使用は、交差夾雑を最小化するであろう。ＨｉｇｕｃｈｉおよびＫｗｏｋ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：２３７−２３８ならびにＫｗｏｋおよびＯｒｒｅｇｏの、Ｉｎｎｉｓら編、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ参照。
【００３６】
核酸増幅の交差的夾雑の影響を最少化する一特定方法は、増幅生成物への非慣用的ヌクレオチド塩基、例えばｄＵＴＰの導入、および持越し生成物の生成ＤＮＡを続く増幅のためのテンプレートとして機能できないようにする酵素的および／または物理的化学的処理に曝すことを含む。例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、この塩基を含むＰＣＲ生成物からウラシル残基を除去するであろう。該酵素処理は、夾雑する持越しＰＣＲ生成物の分解を生じ、増幅反応物の「滅菌」の作用をする。
【００３７】
ＰＣＲ等の増幅系は、標的の増幅に使用される酵素に適合する緩衝溶液中の標的核酸を必要とする。該標的核酸は、組織、体液、排泄物、たん、唾液等を含む種々の生物学的材料から単離され得る。本発明の好ましい実施態様において、標的核酸は悪性腫瘍関連ＲＮＡ配列であり、該標的核酸の存在を試験すべき試料は、例えば骨髄吸引生検試料、末梢血、リンパ節細胞生検または吸引試料等の造血組織試料に含まれる。分析に適した他の試料は、限定されるものではないが、胸膜滲出液、復水および脳脊髄液を含む。
【００３８】
試料中の標的核酸配列の増幅のために、該配列は増幅系の成分に接近可能でなければならない。一般に、この接近可能性は、核酸を不純な生物学的試料から単離することによって確実になる。核酸を生物学的試料から抽出する種々の方法が、この分野において知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ、１９８９；Ａｒｒａｎｄ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  １８−３０頁、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡＣｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；またはＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１８−２０章、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０参照
【００３９】
一般に試料中の核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列である。ＲＮＡは、多くの方法のいずれかにより調製され、その選択は、試料の供給源および利用可能性に依存する。ＲＮＡの調製方法は、Ｄａｉｖｉｓら、１９８６、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，１１章；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；ＫａｗａｓａｋｉおよびＷａｎｇ、１９８９、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ；Ｋａｗａｓａｋｉ、１９９０、ＰＣＲ  ＰｒｏｔｏＣｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；ならびに、ＷａｎｇおよびＭａｒｋ、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１ｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記述されている。ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９は、酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出を用いたＲＮＡ単離の一工程法を提供している。当業者は、核酸の性質にかかわらず、使用される方法に、適切かつ良く認識された修飾を単に行なうだけで、核酸が増幅され得ることを認識するであろう。
【００４０】
本質的ではないが、プライマおよびテンプレートの両者を反応混合物に添加した後に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加することが好ましい。別法として、例えば酵素およびプライマが最後に添加されるか、またはＭｇＣｌ２もしくはテンプレートとＭｇＣｌ２とが最後に添加される。一般に、プライマおよびテンプレートが両者ともに存在し、酵素が所望のプライマ／テンプレート基質に結合し、伸長し得るまで、重合のために基本的な少なくとし１種類の成分が存在しないことが望ましい。ＰＣＲのこの修飾法は「ホットスタート」と称されている。
【００４１】
当業者は、ＰＣＲ法が最も普通には熱安定性酵素を用いた自動化工程として行なわれることを知るであろう。この方法において、反応混合物は、変性温度範囲、プライマアニール化温度範囲および伸長温度範囲を通したサイクルに付される。一般にアニール化および伸長温度範囲は重複しており、従ってＰＣＲは、しばしば変性工程およびアニール化／伸長工程の２工程サイクル反応として実施される。熱安定性酵素を用いるために特に適合する装置は、ヨーロッパ特許公開２３６，０６９号により完全に開示されている。
【００４２】
リガーゼ連鎖反応は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ８９／０９８３５号に記述されている。該工程は、標的核酸にアニール化するオリゴヌクレオチド分節間を結合するリガーゼの使用を含む。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、元の標的分子の増幅をもたらし、生成ＤＮＡの数百万の複写物を与え得る。従って、ＬＣＲは、二重鎖ＤＮＡの正味の増大をもたらす。本発明の検出方法は、ＰＣＲに加えてＬＣＲにも適用可能である。ＬＣＲは、生成ＤＮＡ検出のためにオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
【００４３】
別の増幅スキームは、ＲＮＡバクテリオファージＱｂ由来のレプリカーゼを有効に利用している。この増幅スキームにおいて、標的配列に特異的な配列を有する修飾組換えバクテリオファージゲノムが、最初に試験すべき核酸にハイブリッドされる。試料中に、該バクテリオファージプローブと核酸との間に形成される二重体が増大した後に、Ｑｂレプリカーゼが添加され、これが保持された組換えゲノムを認識し、多数の複写物の生成を開始する。
【００４４】
Ｑｂ系は、プライマ配列を必要とせず、またＰＣＲおよびＬＣＲ増幅系のような加熱変性工程が無い。反応は一温度、典型的には３７℃にて起こる。好ましいテンプレートは、Ｑｂレプリカーゼの基質であるｍｉｄｖａｒｉａｎｔ−１  ＲＮＡである。この系の使用により、テンプレートにおける多大な増加が達成される。この増幅系の概説は、国際特許公開ＷＯ８７／０６２７０およびＬｉｚａｒｄｉら、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２に見出される。
【００４５】
３ＳＲ系は、インビトロ転写の変法に基づく増幅系である。転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）は、標的鎖のＤＮＡ複写物を生成するためのプロモータをコードするプライマの使用、およびＲＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ複写物からのＲＮＡ複写物の生成を含む。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号およびＥＰ第３１０，２２９号の例９Ｂ参照。３ＳＲ系は、標的核酸の等温転写を実施するための３種類の酵素を使用する系である。
【００４６】
該系は、Ｔ７  ＲＮＡ  ＤＮＡプライマが結合する単鎖ＲＮＡの標的から開始される。逆転写酵素によるプライマの伸長により、ｃＤＮＡが形成され、ＲＮＡｅｓＨ処理で異種二重体からｃＤＮＡを遊離させる。第２のプライマをｃＤＮＡに結合させ、二重鎖ｃＤＮＡが、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）処理により形成される。一方（または両方）のプライマは、プロモータ、すなわちＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータをコードし、しかして二重鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの転写テンプレートである。
【００４７】
転写適合性ｃＤＮＡは、元の標的のアンチセンスＲＮＡ複写物を産生する。次いで、該転写物は、逆転写酵素によって二重鎖プロモータを含む二重鎖ｃＤＮＡに転換され、場合により両端においており返す反復配向をもって転換される。これらのＤＮＡは、再度サイクルに入り得るＲＮＡを生じる。３ＳＲ系のより完全な記述は、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８およびＥＰ第３２９，８２２号に見出される。ＴＡＳ系もＧｉｎｇｅｒａｓらの、Ｉｎｎｉｓら編、１９９０、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記述されている。
【００４８】
ここに記述される方法において、試料は特定の興味あるオリゴヌクレオチド配列、すなわち「標的核酸」を含むか、または含むと予想されるものとして与えられる。該標的は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってよい。該標的は、単鎖または二重鎖であってよい。本発明によれば、標的核酸は、悪性腫瘍関連配列である。例えば、本発明の一側面において、悪性腫瘍は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）等の完全ウイルスに帰因し、頸部癌細胞はＨＰＶ  ＤＮＡ配列を含有するであろう。非−頸部細胞、例えば骨髄中における、本発明方法によるＨＰＶ  ＤＮＡ配列の検出は、転移性疾患の証拠を与えるであろう。標的の調製は、遂行される特定の増幅に適切な様式で行なわれるであろう。例えば標的核酸がｍＲＮＡ等の単鎖である場合のＰＣＲ法において、該標的は増幅に先立って最初にｃＤＮＡに逆転写される。
【００４９】
上述のＰＣＲ法は、二重鎖の標的を仮定しているが、このことは必須ではない。単鎖ＤＮＡ標的の最初の増幅サイクル後、該反応混合物は単鎖標的および新たに合成された相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡ分子を含有する。同様にＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の最初の増幅サイクル後、該反応混合物は、二重鎖ｃＤＮＡ分子および元のＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の複製物を含有する。この点において、増幅の引続くサイクルは、上述したように進行する。本発明方法において、増幅の標的は単鎖ＲＮＡであり、最初の増幅サイクルは逆転写工程である。
【００５０】
ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前出文献に記述されている。別法として、逆転写の好適な方法は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日出願のＷＯ９０／０７６４１に記述されている。
【００５１】
標的遺伝子は、上皮組織内で優先的に発現されるが、造血組織内で発現されないものから選択される。増幅プライマは、隣在エクソンにハイブリッドするように設計することが好ましい。このようにして、ゲノム配列の背景的増幅が最小化され、標的の増幅とは大きさにより容易に区別される。
【００５２】
本発明によれば、癌マーカとして適当な標的遺伝子を選択するために、プライマ類は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能な性質が特定された悪性腫瘍細胞を正の対照とし、また、悪性腫瘍を有していない個体からの骨髄吸引液等の代表的体組織および体液を負の対照として、増幅反応にて試験される。例えば、シュードジーンの存在で、ゲノムＤＮＡが標的試料に夾雑する場合にも偽陽性の結果を得ないように決定される。ゲノムのシュードジーンが存在する場合には、シュードジーンの増幅回避の方法は、例えば増幅すべき異なった標的配列領域の選択、またはプライマ長もしくはサイクルパラメタの変更によって反応の特異性を変更する等により、当業者には自明であろう。
【００５３】
標的悪性腫瘍関連ＲＮＡ配列は、上皮組織にて優先的に発現されるものではあるが、評価されるべき体液または組織も低い基底水準で標的配列を発現し得る。ＰＣＲ法の感度故に、基底水準の発現であっても試験に累を及ぼす（Ｃｈｅｌｌｙら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：８５８−８６０）。従って、選択された体組織または体液中の悪性腫瘍転移検出のための悪性腫瘍関連配列の同定は、（１）悪性腫瘍転移を試験すべき体組織または体液の代表試料に由来する標的悪性腫瘍関連配列および非悪性細胞が不在であること（増幅および検出されないこと）、ならびに（２）標的悪性腫瘍関連配列および代表悪性腫瘍細胞の存在（増幅および検出可能であること）を確認するために、好ましくはスクリーニングの増幅および検出評価を含む。従って、正常骨髄試料および造血器癌をもった患者の試料ならびに正常末梢血試料を、転移性悪性腫瘍検出のための好ましいプライマの決定のために分析することが好ましい。必要に応じて、当業者は、非悪性腫瘍細胞内の低い基底水準の発現と、悪性腫瘍細胞の試料由来の正の増幅とを区別するために、増幅および／または検出方法の修飾を容易に行なうことができる。例えば、試料の量、サイクルパラメタおよび検出スキームは、偽陽性らしきものを減少させるために必要に応じて修飾される。
【００５４】
悪性腫瘍転移を検出するために好適な体組織および体液は、限定されるものではないが、標準的な、より低感度の細胞学的方法により転移性疾患を検出すべく同時的に評価されるもので、骨髄吸引液および生検試料、胸膜滲出液、腹水、脳脊髄液、リンバ節吸引液および生検試料、ならびに末梢血を含む。
【００５５】
候補としての悪性腫瘍関連配列は、限定されるものではないが、慣用の蛋白質検出アッセイによって、悪性腫瘍細胞により優先的に発現され、かつ悪性腫瘍転移について評価されるであろう体組織または体液の細胞によって発現されないことが既に示されている蛋白質をコードするＲＮＡを含む。転移性悪性腫瘍検出のための標的配列は、以下に概略が記述される。いずれの特定の標的配列についても、ここに与えられる方法の記述に従って増幅用プライマが選択されることは、当業者には自明であろう。
【００５６】
ＫＳ１／４全−悪性腫瘍抗原は、小細胞および非小細胞肺癌を含むほとんどの悪性腫瘍により発現される抗原によって定義されるモノクローナ凡抗体である（ＰｅｒｅｚおよびＷａｌｋｅｒ、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３６６２−３６６７、およびＢｕｍａｌ、１９８８、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ７（４）：４０７−４１５）。ＳＣＬＣまたはＫＳ１／４における発現の頻度は、約８０％である。この遺伝子は、他の悪性腫瘍においても高度に発現される。
【００５７】
シナプトフィジンおよびボンベシン／胃分泌ペプチド（ＧＲＰ）は、両者共に神経内分泌ペプチドであり、共に小細胞癌によって高頻度で発現される（約６０％−８０％）（Ｅｄｂｒｏｏｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７１５−７２４；Ｋａｙｅｒら、１９８８、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  １８３（４）：４１２−４１７；およびＳｐｉｎｄｅｌら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：１９−２３）。Ｌ−ドーパデカルボキシラーゼも、小細胞肺癌細胞によって高頻度で発現される（約８０％）（Ｇａｚｄｅｒら、１９８８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：４０７８−４０８２）。
【００５８】
ニューロン特異的エノラーゼは、小細胞肺癌により高い割合で発現される（６０％ー８０％）（Ｋａｙｓｅｒら、１９８８、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  １４３：４１２−４１７）。本発明の実施のために、好ましくはこの遺伝子のプライマは、非神経内分泌組織によって高頻度で発現される別の形態のエノラーゼとの配列の相同性を回避すべきである。
【００５９】
上皮小体関連ホルモン（ＰＲＨ）は、他の数種の悪性腫瘍に加えて５０％以上の小細胞肺癌により発現される。ＰＲＨは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染に伴う造血器悪性疾患によっても発現される。本発明の好ましい実施態様において、アミノ酸３５−１３９に対応するプライマが、上皮小体ホルモンと相同な領域を避け、かつＰＲＨのすべての既知の形態を包含するために選択された（Ｓｕｖａ、１９８９、Ｇｅｎｅ  ７７（１）：９５−１０５；およびＭａｒｔｉｎら、１９８９、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５：４６７−５０６）。
【００６０】
カルシトニンは、小細胞癌によって、より変化を伴って発現される（Ｊｏｎａｓら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１９９４−１９９８、およびＲｕｓｓｅｌｌら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．７１（１）：１−１２）。カルシトニンおよび／またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、小細胞肺癌の４０％−６０％により発現される。開示される例において、プライマは癌検出の収率を向上するために、カルシトニンおよびＣＧＲＰ配列の両者を増幅すべく共通プライマとして設計されている。
【００６１】
クロモグラニンＡは、正常神経内分泌細胞および神経内分泌腫瘍中に見出される分泌性顆粒にに伴われる（Ｋｏｎｅｃｋｉら、１９８７、ＪＢＣ  ２６２：１７０２６−１７０３０、およびＳｏｌｏｌ、１９８６：Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０５（５）：６９８−７００）。該蛋白質は、小細胞肺癌細胞の４０％ー６０％により発現される。好ましい実施態様によれば、プライマは、該分子の中間領域から選択される。アミノおよびカルボキシ末端は、クロモグラニンＢおよびＣと相同性を共有し、神経内分泌細胞に対する特異性が低い。
【００６２】
ニューロフィジンは、小細胞癌の３０％−５０％により発現されるオキシトシンおよびバソプレシンの前駆体である（Ｍｏｈｒら、１９８５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９３：１２−１６；Ｎｏｒｔｈら、１９８８、Ｃａｎｃｅｒ  ６２（７）：１３４３−１３４７およびＫｉｂｂｅｌａａｒら、１９８９、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５９：２３−２８）。ニューロフィジンＩおよびＩＩの両者を増幅するための共通プライマが、検出される小細胞肺癌の収率を向上するために使用され得る。
【００６３】
他の候補としての標的配列は、限定されるものではないが、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Ｙｕら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１（２）：４６８−４７５）；プロスタン酸ホスフェート（Ｔａｉｌｏｒら、１９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１６）：４９２８）；前立腺特異的抗原（ＨｅｎｔｔｕおよびＶｉｈｋｏ、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０（２）：９０３−９１０）；黒色種関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔｉｔ．８１（６）：４４５−４４６）；黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｉら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７１（４）：１３７５−１３８０）および高分子量黒色腫抗原（Ｎａｔａｌｉら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  ５９：５５−６３）を含む。
【００６４】
正の対照細胞が、標的遺伝子増幅の初期評価において必要であることは、当業者には自明であろう。いずれの特定の悪性腫瘍の研究のためにも、多くの細胞株が文献中に記載され、またＡＴＣＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを通して入手可能である。転移性疾患を検出するための本発明の開示される例においては、正の対照として次の細胞株が例示されている：ＢＥＮ／Ｍ１０３（混合された小細胞および非小細胞の特徴をもって発現する気管支原性肺悪性腫瘍細胞株であって、カルシトニン、クロモグラニンＡ、およびＰＲＨに対する正の対照として有用である）；ＮＣＩ−Ｈ６９（ＫＳ１／４、ボンベシン／ＧＲＰ、Ｌ−ドーパデカルボキシラーゼ、およびニューロン特異的エノラーゼを発現する）；および７２７（ＳＣＬＣ正細胞株、Ｍｉｎｎａらの前出文献参照）。
【００６５】
一旦、標的の候補が選択され、適切なプライマが調製された場合、それらは、ここに記述されるようにインビトロ系にて評価される。種々の濃度の正の対照である特徴付けられた悪性腫瘍細胞株が、各プライマ対の悪性腫瘍検出限界を決定するために、末梢血、骨髄試料、または造血性細胞株のいずれかに添加される。表１は、造血組織における悪性腫瘍転移の増幅のためのＰＣＲプライマ対を与える。表１は、増幅生成物検出のためのオリゴヌクレオチドプローブも含んでいる。
【００６６】
【表１】
0003898233.tif 000002
【表２】
0003898233.tif 000003
【００６７】
便宜のため、プローブ類は、ここで記述されるように例えばＴＭＢ等、ストレプトアビジン／パーオキシダーゼまたはホスファターゼ型の発光または色検出系にて使用され得るように、それらの５′末端をビオチニル化して合成されてもよい。
【００６８】
増幅に引続き、各試料の反応混合物は、増幅が起きたか否かを決定するために分析に付される。例えば、該増幅反応混合物は、ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析される。別法として、各ＰＣＲ生成物に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、該方法の特異性および感度を更に増大するために、サザンブロット法またはドットアッセイにおいて使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前出文献参照）。
【００６９】
増幅生成物の検出は、既知の多くの方法により行なわれ得る。このような手段は、限定されるものではないが、例えばドットブロットまたは電気泳動的様式において、同位体的または非同位体的に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションを含む。検出系は、個体支持基質およびアビジン−ビオチン標識系等の捕捉工程を含んでもよい。ヨーロッパ特許公開第２３７，３６２号は、“逆”ドットブロットと称されるＰＣＲに基づく検出法が記述され、ここにおいて増幅ＤＮＡに代えてプローブが膜に固定される。この方法に従えば、プローブではなく、標的がハイブリダイゼーションのために標識される。
【００７０】
核酸ポリメラーゼの５′−３′ヌクレアーゼ活性を使用する方法によると、標識オリゴヌクレオチドおよび標的オリゴヌクレオチドからなるハイブリッド化二重体における標識核酸プローブが分解される。標識断片が、次いで検出される。検出は、例えば感染または治療法に対する応答の進行を監視するために定量分析を含んでもよい。
【００７１】
プローブが試料中のＤＮＡ配列にハイブリッドしたことを検出するためには多くの方法がある。典型的には、該プローブは、検出可能な様式で標識される。標識ＤＮＡ（すなわちＰＣＲ−反応緩衝溶液中の増幅ＤＮＡ）が、固体支持体に結合され、ハイブリダイゼーションの生起の測定は、標識が固体担体上に存在するか否かの測定を含む。この方法は、変更することができるが、標的が標識され、プローブが固体支持体に結合される場合に可能である。
【００７２】
プローブまたは標的のいずれであろうと、核酸の標識方法はこの分野で多数知られており、本発明の目的に適している。適当な標識は、蛍光、放射能、色測定、Ｘ−線回折または吸収、磁性、酵素活性等によって検出可能な信号を与える。適当な標識は、蛍光体、発色団、放射性同位体（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、高電子密度試薬、酵素および特異的な結合相手を有するリガンドを含む。酵素類は、典型的にはそれらの活性によって検出される。例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、そのジアミノベンジジンを青色染料に変換する能力によって検出され得る。ＨＲＰに基づく検出の好適な方法は、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１３６８に記述されているようにテトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）を使用する。別法としての検出系は、Ａｍｅｒｓｈａｍから商業的に入手可能なＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（ＥＣＬ）検出キットである。このキットは、製造者の指示書に従って使用される。
【００７３】
プローブを使用しない増幅核酸の検出方法によれば、均質アッセイ系は、増幅が例えばエチジウムブロマイド等の検出可能なＤＮＡ結合試薬の存在下に起こることが必要である。増幅混合物の蛍光が、標的が増幅され、該反応混合物中に存在する二重鎖ＤＮＡの量の増大と共に増大する。
【００７４】
本発明の別の側面において、選択された体組織および体液中の悪性腫瘍転移は、免疫細胞学および核酸増幅技術の優位点の結合により検出される。この接近法において、選択される体組織または体液中に正常に存在する悪性細胞によって発現されない悪性腫瘍抗原に対して特異的なモノクローナル抗体が、常法により免疫磁性ビーズに結合される（Ｌｅａら、１９８６、Ｓｃａｎｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５０９、およびＬｅａら、１９８８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．１：９）。次いで、免疫磁性ビーズは、選択された体組織または体液試料から得た細胞とインキュベートされる。Ｌｅａらの１９８６年および１９８９年の前出文献中に記載されているように標準的な磁気的分離技術が、標的抗原を発現する悪性腫瘍細胞について試料を富有化させるために使用される。分離された磁性ビーズおよび結合された悪性腫瘍細胞は、ＲＮＡを単離するために適当な抽出緩衝溶液中に置かれる。次いで、抽出された核酸は、悪性腫瘍関連ｍＲＮＡを検出すべく適当な核酸増幅アッセイで使われる。
【００７５】
腫瘍細胞個体数の免疫磁性的増大は、出発反応混合物中の標的核酸配列の割合を増大することによって核酸増幅アッセイの感度を向上する。この富有化方法の肺悪性腫瘍の検出に有用な一実施態様において、商業的に入手可能な磁性粒子が、ヒツジ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０、Ｄｙｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により被覆され、それぞれＥＡ−１（抗−ＮＳＣＬＣ）およびＮＣＡＭ（抗−ＳＣＬＣ）に特異的なモノクローナル抗体（ｍｇ粒子あたり１０ｇの抗体、４℃にて一夜）と共にインキュベートされる。次いで、抗体被覆ビーズを、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて５回洗浄する。次いで、該免疫磁性ビーズを、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を含むＢＳＡ２ｍｌ中に懸濁する。末梢血の骨髄中の悪性腫瘍細胞検出のため、骨髄または末梢血試料からフィコル−ハイパック（ｆｉｃｏｌｌーｈｙｐａｑｕｅ）で精製された単核細胞を、０．０１％ＥＤＴＡを含む２５ｍｌのＲＭＰＩ４０培地を入れたＴ７５フラスコ中にて、免疫磁性ビーズと１：１０の割合で混合する。該細胞および免疫磁性ビーズを、ロッカプラットホーム上で４℃にて一夜インキュベートする。該フラスコを、次いで１０サマリウム・コバルト磁石を有する軟鉄板上に５分間置く。
【００７６】
免疫磁性ビーズに結合した細胞は、磁石に曝されたフラスコ底部に付着する。付着しない細胞を、フラスコからデカントして除く。次いで、残留する細胞をＲＭＰＩ１６４０培地に再懸濁し、更に非付着細胞を除去するためにこの工程を５回反復する。該免疫磁性ビーズおよび結合細胞を、標準細胞溶解緩衝溶液と共にインキュベートして全ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出する。該抽出ＲＮＡおよびＤＮＡは、悪性腫瘍関連ＲＮＡを検出するために上述のＰＣＲアッセイにて使用される。
【００７７】
造血組織中の悪性腫瘍転移検出のための本方法は、従来慣用の診断方法により約１，０００倍感度が高い。従って、これらの方法の疾患診断および介在に対する有用性は、かなりなものである。例えば、診断時および引続く初期治療時に試験される末梢血または骨髄は、従来の病期決定基準で“局所的”疾患の患者と同定されるが、増幅悪性腫瘍関連ＲＮＡ配列の検出に基づくと“全身的”疾患であることもある。更に、従来の診断方法によって“完全小康”の多くの患者も、本発明方法によって疾患の活動の証拠を有することもあり得る。該方法によるＭＲＤ検出は、患者における臨床処置に関連して評価される。一般に、初期治療の完了時、臨床的に疾患のない追跡時の６ケ月毎、および臨床的再発時の診断時に試料が評価される。開示される発明による、ＭＲＤ検出は、疾患のない存命（従来方法により評価される）および全体の存命の持続期間に関連する。更に、本方法は、悪性腫瘍に対する自家的な骨髄移植療法において使用される骨髄自家移植のＭＲＤの検出に有用である。本方法は、移植に先立って残留腫瘍細胞を髄から除去する方法の適正の評価、および骨髄がこの形態の癌療法に最も適するか否かの同定に有用である。
【００７８】
別の側面において、本発明は選択された体組織および体液の転移性悪性腫瘍を検出するためのキット形態によっても提供される。このようなキットは、悪性腫瘍細胞内で優先的に発現され、選択される体組織または体液に元来定留して存在する細胞によって発現されない標的悪性腫瘍関連核酸配列を増幅するためのプライマ対を含む。キットは、また、以下のいずれを含んでもよい：増幅標的の存在検出用プローブ、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを与える酵素、標的ＤＮＡの増幅用ＤＮＡポリメラーゼ、適当な増幅緩衝溶液およびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類。
【００７９】
【実施例】
例１
【００８０】
代表的腫瘍細胞の標的悪性腫瘍関連ｍＲＮＡの存在に関して、表１に記されたＲＮＡ  ＰＣＲプライマ類を、肺癌転移の検出のための遺伝子発現のＲＣＲ分析の利用可能性を示すために使用した。各プライマ対について、期待されるＰＣＲ生成物の大きさも表１に記載されている。使用された悪性腫瘍試料は次のとおりである：細胞株４７８（ＳＣＬＣ細胞株）、約１５×１０６個の細胞；Ｍ１０３（肺癌細胞株）約２５×１０６個の細胞；および骨髄（〔ＡＬＬ〕急性リンパ球白血病患者）。
【００８１】
ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの前出文献に記述されたＲＮＡＺＯＬ法により、Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘａｘ、ＵＳＡから購入したキットの形で使用して単離した。ＲＮＡをエタノールから２回沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）中に９５℃で１０分間加熱することにより溶解させた。試料１０３は、大量のＤＮＡ沈殿を含んでおり、１０単位のＤＮａｓｅ（ＲＮａＳｅ非含有、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）および５００リットルＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ＰＨ８．４、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）により３７℃で３０分間処理した。該試料を、フェノールクロロホルムで２回抽出し、エタノールで３回沈殿させ、そしてＴＥ中に９５℃で１０分間加熱することにより溶解させた。該ＲＮＡ溶液を希釈し、各試料の核酸濃度を計算して決定するために２６０ｎｍの吸光度を測定した。該細胞株４７８試料は、２００リットル中に８１．６ｇ（４０８μｇ／ｍｌ）を含み、Ｍ１０３試料は、５００リットル中に５９８ｇ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含み、また骨髄試料は、４００μｌ中に８３．２μｇ（２０８μｇ／ｍｌ）を含んでいた。
【００８２】
逆転写マスターミクスを、１反応物あたり２０μｌとして３０反応物について調製した。該ＲＴマスターミクスは、６０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液（１×緩衝溶液は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、４０５μｌの滅菌蒸留Ｈ２Ｏ、６０μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、１５μｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、４０単位／μｌ）、３０μｌのＥＫ２９３（１００ｐｍｏｌ／ｖｌ）、および３０μｌの逆転酵素（ＢＲＬ、２００単位／μｌ）を含む。ＥＫ２９３は、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎの、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：２６６−２６７に記載されているようにｃＤＮＡのプライミングのための無作為（ランダム）ヘキサデオキシリボヌクレオチド類の混合物である。
【００８３】
ランダムヘキサデオキシリボヌクレオチドは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから商業的に入手可能である。各試料について、２００μｌのＲＴマスターミクスを次のようにＲＮＡに加えた：４７８、１０μｌのＲＮＡ；Ｍ１０３、５μｌのＲＮＡ；骨髄、２０μｌのＲＮＡ。ＴＥを最終体積２２０μｌとなるように加えた。
【００８４】
各反応物を室温にて１５分間静置し、次いで４５℃にて３０分間インキュベートした。１０〜２０μｌをＰＣＲのために取出した。
【００８５】
３０の反応物のためのＰＣＲマスターミクスを次のように調製した。２７０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、２４２４μｌの滅菌蒸留Ｈ２Ｏ、および６μｌ（５単位／μｌ）のＴａｑポリメラーゼを合せた。各ＰＣＲ反応物には、１００μｌの鉱油を反応物の上に覆せた。反応物は、下記のとおりに組上げられた。
【００８６】
【表３】
0003898233.tif 000004
【００８７】
試験管番号１−９は、細胞株４７８ｃＤＮＡを含む。試験管番号１０−１８は、細胞株Ｍ１０３ｃＤＮＡを含む。試験管番号１９−２７は、骨髄ｃＤＮＡを含む。各反応について、１０μｌのｃＤＮＡおよび９０μｌのＰＣＲマスターミクスを使用した。各増幅反応について、２５ｐｍｏｌの各プライマを含ませた。β−アクチンを正の対照として含ませ、また「プライマ無」の試料を負の対照として機能させた。
【００８８】
ＰＣＲのために、試料を９５℃にて２分間、熱変性させ、３５回のＰＣＲサイクルを走らせた。サーモサイクルの様式は次のとおりである：９４℃にて１分間、５５℃まで１分間の傾斜、５５℃にて１分間、７２℃まで３０秒間の傾斜後３０秒間、９４℃までの３０秒間の傾斜。３５回のサイクル後、７２℃にて１０分間の伸長工程を含め、反応を１５℃にて冷却した。各反応物を２００μｌのＴＥ飽和クロロホルムにて１回抽出した。５μｌを、２％ＮｕＳｅｉｖｅ−１％アガロース組成ゲルにて分析し、エチジウムブロマイドにより染色し、写真撮影した。
【００８９】
結果は、各プライマ対が期待された大きさの特異的ＰＣＲ生成物を生成し得ることを示した。しかしながら、ｍＲＮＡ配列のすべてが各肺癌細胞株に存在するのではなかった。カルシトニンは、４７８株には存在せず、一方ＧＲＰおよびニューロフィジンは、Ｍ１０３細胞株には存在しないものと思われる。ＡＬＬ患者由来の骨髄ＲＮＡにおいて、いずれのプライマも正しい大きさのＰＣＲ生成物を増幅しなかった。これらの結果は、肺癌細胞と骨髄とを区別できるのみならず、種々の標的ｍＲＮＡの異なった発現によって異なる癌をも識別できることを示している。
【００９０】
例２
代表的体組織または体液における標的悪性腫瘍関連ｍＲＮＡの不在に関し、例１に記載された骨髄ＲＮＡおよびＰＢＬ  ＲＮＡを、ｃＤＮＡのテンプレートとし、例１に記述された増幅反応を、本方法が悪性腫瘍を持たない患者由来の試料について適合することを示すために使用した。ＰＢＬ  ＲＮＡを、骨髄吸引液のフィコールーハイパック分離の後に上述したように調製した。逆転写酵素マスターミクスを、２０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、３３０μｌの滅菌蒸留Ｈ２Ｏ、２０μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１０μｌのＲＮａｓｉｎ（４０単位／μｌ）、１０μｌのＥＫ２９３（１００ｐｍｏ１／μｌ）、および１０μｌ逆転写酵素（２００単位／μｌ）を含めて調製した。逆転写酵素反応のため、２００μｌのＲＴマスターミクスを、１０μｌの骨髄ＲＮＡ（２０８μｇ／ｍｌ）またはＰＢＬ  ＲＮＡ（３２０μｇ／ｍｌ）と合せた。該反応物を室温にて１５分間、次いで４５℃にて３０分間インキュベートした。次いで逆転写酵素を、９５℃にて１０分間インキュベートすることにより加熱失活させた。１０μｌの逆転写酵素反応物をＰＣＲに使用した。
【００９１】
ＰＣＲマスターミクスを、１８０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、１６１５μｌの滅菌蒸留水および５μｌのＴａｑポリメラーゼ（２５単位）を含めて調製した。９０μｌのＰＣＲマスターミクスをＰＣＲチューブに分取した。１μｌの各プライマ（各２５ｐｍｏｌ）および１０μｌのｃＤＮＡを以下のように各チューブに加えた。
【００９２】
【表４】
0003898233.tif 000005
【００９３】
該ＰＣＲ反応物を９５℃にて２分間加熱し、次いで以下のサーモサイクルパラメタを用いて３５回の増幅サイクルに付した：９４℃にて１分間、次いで５５℃まで１分間の傾斜後３０秒間、７２℃まで３０秒間の傾斜後３０秒間、および９４℃まで３０秒間の傾斜。増幅に引続き、反応を７２℃にて１０分間延長し、次いで氷上で冷却した。各反応物を２００μｌのクロロホルムにて抽出し、ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。
【００９４】
ゲル分析は、エチジウムブロマイド染色によって正常ＰＢＬ  ＲＮＡおよび白血病骨髄試料が、いずれの肺癌ＲＮＡも含まないことを示した。ＧＲＰ増幅で期待される大きさのｍＲＮＡバンドより一つは少し小さく、また一つは少し大きいバンドが、ＰＢＬ  ＲＮＡ試料について現れた。しかしながら、予想される大きさのＰＣＲ生成物のバンドは、これらの負の対照試料中には現れなかった。
【００９５】
例３
シュードジーンのスクリーニングに関して、例１に記載された実験を、加工されたシュードジーンがゲノム中に存在するか否かを検出するためにＰＢＬ  ＤＮＡを使用して反復した。ＤＮＡを、フィコール−ハイパック精製単核細胞から標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前出文献）により単離した。従って、逆転写酵素工程は省略した。この分析は、ゲノムＤＮＡ配列が所望の分析に干渉するような増幅を生じるか否かの決定にも寄与する。反応は次のとおりに設定された：
【００９６】
【表５】
0003898233.tif 000006
【００９７】
該反応を、１００ｎｇのＰＢＬ  ＤＮＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む１００リットルの１×ＰＣＲ緩衝溶液中で走らせた。１００μｌの鉱油を、蒸発防止のために各ＰＣＲ反応物に覆せた。反応物を９５℃にて２分間加熱し、次いで例１に記載したと同様に３５サイクルを行なった。増幅に引続いて反応物をクロロホルムにより抽出し、各５μｌを例１に記載されるようにゲル電気泳動により分析した。試験管番号１５−１８は、例１と同様に正および負の対照として機能させた。
【００９８】
結果は、試験したいずれのプライマ対も表１に特定されるような予想される大きさのｍＲＮＡバンドを増幅しないことを示した。従って、いずれの標的遺伝子にも密接に関連する加工されたシュードジーンは存在しない。従って、夾雑するゲノムＤＮＡは、このアッセイに干渉しない。
【００９９】
例４
感度の分析のため、正の対照および負の対照の２種類の細胞株を、本方法の感度を確認するための混合実験において使用した。Ｔ−細胞株である細胞株８４０２、および小細胞肺癌細胞である細胞株７２７は、負および正の細胞試料として作用する。７２７由来の細胞を、８４０２中に以下の割合で希釈した：１：１００；１：１，０００；１：１０，０００；および１：１００，０００。各希釈物は、２×１０６個の８４０２細胞に加えて７２７細胞を、およそ示した割合、すなわち１：１００，０００においては、２８個の７２７細胞に加えて２百万個の８４０２細胞がある。次いで、ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの前出文献に従って単離した。
【０１００】
ＲＮＡ−ＰＣＲを、先の例で記述したように、ＫＳ１／４プライマ対ＣＭ７１／７２（配列番号１０および１１）を用いて行なった。１ｇのＲＮＡを、各ＲＴ反応で使用した。完全なＲＴ反応をＰＣＲ工程中で使用した。サイクルパラメタは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７３℃で２分間にて３５回のサイクル、およびＰＣＲの最後に７２℃にて１０分間とした。ＰＣＲ生成物（１００リットルＰＣＲ反応物中の２０リットル）を、１％アガロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影した。
【０１０１】
すべての希釈物は、１：１０５反応物を含めて期待される１７７塩基対のバンドについて正であった。７２７細胞を添加しないＴ−細胞を、負の対照として含め、ＰＣＲ生成物は検出されなかった。しかしながら、正の対照としてのＣＡＢＬ  ＲＮＡは、７２７および８４０２細胞の両者において増幅され、該試料の適合性が示された。
かくしてこの実験は、ＫＳ１／４ｍＲＮＡが、正細胞の１〜１００，０００希釈の１μｇのＲＮＡ中に検出されることを示している。
【０１０２】
例５
この例は、頸部癌を有するおよび有さない正常および白血病患者由来の骨髄およびＰＢＬの評価に関する。この実験は、ＡＬＬ患者および正常者から単離されたＰＢＬ  ＲＮＡを使用して標的遺伝子配列の増幅を比較している。該反応は、例１に記載された骨髄試料および追加のＡＬＬ患者から単離された骨髄試料を含む２種類の骨髄試料を含んでいた。かくして試料は次の通りである：ＰＢＬＮｏ．１は、正常個体由来であってｍｌあたり３２０ｕｇのＲＮＡを含む；ＰＢＬ  Ｎｏ．２は、ＡＬＬ個体由来のＲＮＡであって、ｍｌあたり５６０μｇのＲＮＡを含む；骨髄Ｎｏ．１は、ＡＬＬ個体由来であって、２００μｇ  ＲＮＡ／ｍｌを含む；骨髄Ｎｏ．２は、ＰＢＬ  Ｎｏ．２と同じＡＬＬ個体由来であって、ＲＮＡ濃度は測定していない。骨髄Ｎｏ．１のＡＬＬ患者の医学的経歴は、該患者が頸部癌にもかかっていることを示していた。ＲＮＡは、先の例において記述したように調製された。
【０１０３】
逆転写反応のために、マスターミクスを、８０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、５６０μｌの滅菌蒸留水、８０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０μｌのＲＮａｓｉｎ（μｌあたり４０単位）、４０μｌのＥＫ２９３（μｌあたり１００ｐｍｏｌ）、および２０μｌの逆転写酵素（μｌあたり２００単位、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．）を含めて調製した。各ＲＮＡ試料について、１８０μｌのＲＴマスターミクスを以下のようにＲＮＡに加えた：ＰＢＬ  Ｎｏ．１、ＲＮＡ１８μｌ、ＰＢＬ  Ｎｏ．２、ＲＮＡ９μｌ、骨髄Ｎｏ．１、ＲＮＡ９μｌ、骨髄Ｎｏ．２、ＲＮＡ３６μｌ。各ＲＴ反応は、ＴＥを用いて最終体積２１６μｌで調製された。該反応物を室温にて１０分間、次いで４５℃にて３０分間インキュベートした。酵素を、９９℃にて５分間で加熱失活させ、次いで反応物を冷却した。
【０１０４】
ＰＣＲのために、マスターミクスを、４００μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、３５９０μｌの滅菌蒸留水、および１０μｌのＴａｑポリメラーゼ（μｌあたり５単位）を含ませて調製した。各反応について、９０μｌのＰＣＲマスターミクス、１μｌの各プライマ対（２５ｐｍｏ１／μｌ）、および１０μｌのｃＤＮＡ反応物を混合した。９種類のＰＣＲ反応物を、各々４種類のｃＤＮＡ反応物について次のように設定した。
【０１０５】
【表６】
0003898233.tif 000007
【０１０６】
ＥＫ４０５／４０７（配列番号２８および２９）は、ＲＮＡ試料が分解されていないことを示す対照として使用されるＣ−ＡＢＬプライマである。ＥＫ４０５／４０７（配列番号２８および２９）ＰＣＲが、負である場合、試料の信頼性がない。
【０１０７】
ＰＣＲ反応は、例３に記載されているのと同様に行なわれ、結果は、電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析された。ＰＢＬ  Ｎｏ．１および２において、肺特異的ｍＲＮＡは、正常またはＡＬＬ患者試料のいずれにも検出されなかった。ＡＬＬ患者由来の骨髄Ｎｏ．２試料の分析も負であった。肺特異的ｍＲＮＡは増幅されず、検出されなかった。しかしながら、頸部癌をもったＡＬＬ患者由来の骨髄Ｎｏ．１試料の分析は、ＮｅｕｒｏＩＩとＧＲＰとを除いて試験したすべての標的について正であった。この試料中の予想された大きさのバンドの存在は、頸部癌が転移したものであることを示唆している。
【０１０８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣ  ＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡ  ＴＧ
【０１０９】
配列番号：２
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣ  ＡＴＡＴＣＣＣＴＴＴ  ＴＣ
【０１１０】
配列番号：３
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡ  ＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴ  ＴＣ
【０１１１】
配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡ  ＴＣＴＣＣＧＡＣＡＣ  ＡＣ
【０１１２】
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴ  ＣＡＡＧＡＡＣＣＴＣ  ＴＧ
【０１１３】
配列番号：６
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＡＴＣＣＴＴＧＧＡ  ＴＧＡＴＧＧＣＴＣＴ  ＴＣ
【０１１４】
配列番号：７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧ  ＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴ  ＡＣ
【０１１５】
配列番号：８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴ  ＧＴＴＣＴＣＣＴＴＴ  ＧＣ
【０１１６】
配列番号：９
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧ  ＣＡＧＡＧＡＧＴＣＴ  ＡＣ
【０１１７】
配列番号：１０
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＴＣＴＧＴＧＡＡＡ  ＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴ  ＧＧ
【０１１８】
配列番号：１１
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＣＣＴＴＣＡＧＧＴ  ＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣ  ＴＣ
【０１１９】
配列番号：１２
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴ  ＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡ  ＣＣ
【０１２０】
配列番号：１３
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡ  ＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣ  ＴＧ
【０１２１】
配列番号：１４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣ  ＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣ  ＡＧ
【０１２２】
配列番号：１５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧ  ＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡ  ＣＧ
【０１２３】
配列番号：１６
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡ  ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡ  ＴＧ
【０１２４】
配列番号：１７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＴＡＣＴＣＧＡＡＣ  ＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡ  ＴＧ
【０１２５】
配列番号：１８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴ  ＴＣＧＧＣＴＧＡＣＧ  ＡＧ
【０１２６】
配列番号：１９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴ  ＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧ
【０１２７】
配列番号：２０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡ  ＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣ
【０１２８】
配列番号：２１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＣＡＣＴＣＣＧＡ  ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣ
【０１２９】
配列番号：２２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧ  ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧ
【０１３０】
配列番号：２３
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線伏
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡ  ＡＡＴＧＴＴＴＧＧＴ  Ｇ
【０１３１】
配列番号：２４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧ
【０１３２】
配列番号：２５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣ  ＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣ
【０１３３】
配列番号：２６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡ  ＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴ  Ｃ
【０１３４】
配列番号：２７
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣ  ＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡ  Ｃ
【０１３５】
配列番号：２８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＴＣＴＣＡＴＡＴＣ  ＡＡＣＣＣＧＡＧＴＧ  ＴＣＴＣ
【０１３６】
配列番号：２９
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴ  ＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡ  ＴＴＴＣ
【０１３７】
配列番号：３０
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧ  ＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣ  ＴＧ
【０１３８】
配列番号：３１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
配列：ＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡ  ＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴ  Ｃ