(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
0003889045.tif 000013
または、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の末端に、１若しくは数個のアミノ酸が付加された配列からなるポリペプチドであって、かつＨＩＶ−１サブタイプＯに対する抗体に特異的に結合することができるポリペプチド。
【請求項２】
（１）下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
0003889045.tif 000014
または、
（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列の末端に、１若しくは数個のアミノ酸が付加された配列からなるポリペプチドであって、かつＨＩＶ−１サブタイプＯに対する抗体に特異的に結合することができるポリペプチド。
【請求項３】
（１）下記の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
0003889045.tif 000015
または、
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列の末端に、１若しくは数個のアミノ酸が付加された配列からなるポリペプチドであって、かつＨＩＶ−１サブタイプＯに対する抗体に特異的に結合することができるポリペプチド。
【請求項４】
テスト試料とＨＩＶ−１ポリペプチドを接触させること及び前記抗体の存在を検出することを含むテスト試料中のＨＩＶ抗体を検出するためのイムノアッセイであって、請求項１〜３のいずれか一つのポリペプチドを用いることを含むことを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項５】
ＨＩＶ抗体を検出し得る診断用テストキットであって、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列からなるポリペプチドを含む容器を含有する前記診断用テストキット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は概してＨＩＶ−１抗体の検出に有用なペプチドに関し、より具体的には、ＨＩＶ−１サブタイプＢのｇｐ１６０配列の６０４位及び６１０位（該ナンバリングはＭｙｅｒｓら，下記で公表されたＨＩＶ−１のＬＡＩ株による）における２つの点変異を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１免疫優性領域〔ＩＤＲ（immunodominant region）〕のアミノ酸配列を用いたＨＩＶ−１サブタイプＯ抗体の検出に関する。
現在、ＨＩＶ−１には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦと称される６種の認識されたサブタイプ（いわゆる「系統分岐」）が存在し、これらは、Ｍｙｅｒｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９３：Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ）（１９９３）に記載されている。最近、さらなるサブタイプＧ及びＨが記載された。例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０：８７７（１９９４）；及びＭｙｅｒｓら，前掲を参照されたい。新しいサブタイプのうちで特に重要なのは「Ｏ」と称される著しく分岐した（divergent）ＨＩＶ−１配列群の認識である。ＨＩＶ−１サブタイプＯは、先ず１９８７年に記載され、該サブタイプがｅｎｖ遺伝子の核酸レベルで他のＨＩＶ−１サブタイプと約５０％の配列同一性しか有していないことが判明したために、「遠縁体（outlier）」の名を取って「Ｏ」と称された。上記の他のサブタイプは、ｅｎｖ遺伝子の核酸レベルで互いに約７５％の配列同一性を含んでいる。Ｏ型ウイルスの配列に関する最も初期の報告では、系統樹において、ＳＩＶＣＰＺＧＡＢはＯ群より他のＨＩＶ−１に近縁であること、即ち、このチンパンジーウイルスがＭ群とＯ群の間に位置することが示された。これを正確に述べる必要があるか否かについて助言を賜りたい。例えば、Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１５８１−１５８５（１９９４）；Ｖａｎｄｅｎ  Ｈａｅｓｅｖｅｌｄｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１５８６−１５９６（１９９４）；Ｄｅ  Ｌｅｙｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４：１２０７−１２１６（１９９０）；Ｄｅｌｅｙｓら，米国特許第５，３０４，４６６号；Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｅ．Ｐ．Ｏ．公開第０５９１９１４Ａ２号を参照されたい。Ｏ群の配列は今日までに記載されたもののうちで最も分岐したＨＩＶ−１の配列であり、サブタイプＢはＨＩＶ−１の最も一般的なサブタイプである。
ＨＩＶ血清学は大部分が発現されたウイルスタンパク質（抗原）のアミノ酸配列、特にコア及びエンベロープを含むものによって特性決定されている。構造及び機能は類似しているがアミノ酸配列が異なる抗原は、類似であっても抗原に対する特異性が異なる抗体を誘発する。１つの例は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２におけるｇｐ４１のＩＤＲの抗原の違いであり、この違いを利用して、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２に露呈された個体を多様な方法で血清学的に区別することができる。例えば、Ｈｕｎｔら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：８８３−８９８（１９９０）；Ｇｎａａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１３４６−１３４９（１９８７）；Ｃｏｔら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ４：２３９−２４１（１９８８）；Ｈｕｎｔら，米国特許（４６５６．ＵＳ．Ｃ１）参照。同様に、ＨＩＶ−１のＯ群ウイルスは抗原的及び血清学的に他のＨＩＶ−１サブタイプと区別し得る。Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：１３９３−１３９４（１９９４）；Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１５８１−１５８５（１９９４）；Ｖａｎｄｅｎ  Ｈａｅｓｅｖｅｌｄｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１５８６−１５９６（１９９４）；Ｄｅ  Ｌｅｙｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４（前掲）；米国特許第５，３０４，４６６号；Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｅ．Ｐ．Ｏ．公開第０５９１９１４Ａ２号参照。
ＨＩＶ−１のサブタイプＯを検出する能力が血液バンクコミューニティーにおける重要な関心事となっている。ある実験では、ＨＩＶ−１サブタイプＢを検出し得る市販のアッセイは、ＨＩＶ−１サブタイプＯに対して陽性の９種の試料パネルを検出することができなかったことが報告された〔Ｉ．Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：１３９３−１３９４（１９９４）〕。実際に確認されたＨＩＶ−１サブタイプＯによる感染例の数及び地域は限られているが、このサブタイプが該ウイルスの発生地であるカメルーンから赤道ギニアのような近隣諸国に広がり始めているという徴候がある。
テスト試料中のＨＩＶ−１サブタイプＯ抗体の存在を検出するアッセイに用い得る試薬を開発することが有益であろう。
発明の要旨
本発明は、ＨＩＶ−１サブタイプＢのＩＤＲの６０４位に点変異を有するポリペプチドを提供する。より特定的には、該ポリペプチドの６０４位のアミノ酸はリシン（Ｋ）である。該ポリペプチドは配列番号２で表される。本発明はさらに、ＨＩＶ−１サブタイプＢのＩＤＲの６１０位に点変異を有するポリペプチドを提供する。より具体的には、該ポリペプチドの６１０位のアミノ酸はチロシン（Ｙ）である。該ポリペプチドは配列番号３で表される。ＨＩＶ−１サブタイプＢのＩＤＲの６０４位及び６１０位に２つの単一の点変異を有するポリペプチドも提供する。該ポリペプチドの６０４位の点変異はリシン（Ｋ）であり、６１０位の点位置はチロシン（Ｙ）である。該ポリペプチドは配列番号４で表される。配列番号２、配列番号３及び配列番号４のポリペプチドも提供する。
本発明は、テスト試料中のＨＩＶ抗体の存在を検出するイムノアッセイを提供し、該アッセイは、テスト試料と５９３位から６１１位の間に点変異を有するＨＩＶ−１ポリペプチドに結合した固相とを接触させ、ポリペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件でインキュベートするステップ；該ポリペプチド／抗体複合体と測定可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合したＨＩＶ抗体の特異的結合対のメンバー（構成員）を含む指示薬とを接触させ、ポリペプチド／抗体／指示薬複合体の形成に十分な時間及び条件でインキュベートするステップ；及び測定可能なシグナルを検出してＨＩＶ抗体の存在を決定するステップを含む。点変異は６０４位又は６１０位に存在する。あるいは、点変異は６０４位及び６１０位の両方に存在する。固相は、反応トレイのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース細片、膜、ラテックス粒子のような微粒子、ヒツジ（又は他の動物）の赤血球及びデュラサイト（duracyte）からなる群から選択される。指示薬のシグナル生成化合物は、色素原、酵素、発光化合物、化学発光化合物、放射性元素及び直視標識からなる群から選択される。指示薬の特異的結合対のメンバーとして好ましいのは抗ヒトＩｇＧである。
本発明はテスト試料中のＨＩＶ抗体を検出するための改良型イムノアッセイを提供し、該イムノアッセイは、テスト試料とＨＩＶ−１ポリペプチドを接触させるステップ及び抗体の存在を検出するステップを含み、改良点は、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０配列の５９３位から６１１位の間に点変異を有するポリペプチドを使用又は利用することである。
さらに、ＨＩＶ抗体を検出し得る診断用テストキットも提供され、該テストキットは、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含有する容器を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＬＩＳＡによる、試料＃１９３に対する配列番号１（▼）、配列番号２（■）、配列番号３（●）及び配列番号４（▲）の相対反応性を示す。
図２は、ＥＬＩＳＡによる、試料＃２６７に対する配列番号１（▼）、配列番号２（■）、配列番号３（●）及び配列番号４（▲）の相対反応性を示す。
図３は、ＥＬＩＳＡによる、試料＃３４１に対する配列番号１（▼）、配列番号２（■）、配列番号３（●）及び配列番号４（▲）の相対反応性を示す。
図４は、ＥＬＩＳＡによる、試料＃６５５に対する配列番号１（▼）、配列番号２（■）、配列番号３（●）及び配列番号４（▲）の相対反応性を示す。
図５は、ＥＬＩＳＡによる、試料Ｍに対する配列番号２（■）及び配列番号３（●）の相対反応性を示す。
発明の詳細な説明
本発明者は、特定のアミノ酸の置換がＨＩＶ−１サブタイプＯの存在の検出に重要であるＨＩＶ−１サブタイプＢのｇｐ４１免疫優性領域（ＩＤＲ）の２つのアミノ酸位置を同定し、これら２つの残基の少なくとも一方の改変をＨＩＶ−１サブタイプＢ特性を有するペプチド配列に組み込んだハイブリッドペプチドを設計・合成した。これらのハイブリッドペプチドは、確認されたＨＩＶ−１サブタイプＯのテスト試料パネル中に存在する抗ＨＩＶ−１サブタイプＯ抗体と反応し得るが、一部の試料は、改変されていないサブタイプＢ配列（配列番号１）を用いた場合には反応しなかった。これらのペプチドは、配列番号２、配列番号３及び配列番号４として配列表に示されている。これらの配列はＨＩＶ−１サブタイプＢのｇｐ４１の１９アミノ酸配列の６０４位及び６１０位（該ナンバリングはＬＡＩ株、前掲による）の一方又は両方に点変異を有している。
特に断りのない限り、下記の用語は下記の意味を有する。
用語「テスト試料」とは、（検出対象の抗体又は抗原のような）分析物源である個体の１構成成分を指す。これらの成分は当業界では周知である。該テスト試料には、本明細書に記載の方法によりテストし得る生物学的試料、及び全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液や、気道、腸管及び尿生殖路の種々の外分泌液、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などのようなヒト及び動物の体液、並びに細胞培養上清、固定化組織標本及び固定化細胞標本が含まれる。
本明細書に用いられている「分析物」とは、テスト試料中に存在し得る検出対象物質である。分析物は、その天然の特異的結合メンバー（例えば抗体）が存在するか、又はその特異的結合メンバーを生成し得るならいずれの物質であってもよい。従って、分析物はアッセイにおいて１種以上の特異的結合メンバーに結合し得る物質である。「分析物」にはさらに、任意の抗原物質、ハプテン、抗体及びその組み合わせも含まれる。分析物は、特異的結合対のメンバーとして、ビタミンＢ１２を定量する場合には特異的結合対のメンバーとしての固有のタンパク性因子の使用、炭水化物を定量する場合には特異的結合対のメンバーとしてのレクチンの使用のような天然の特異的結合相手（対）を用いて検出することができる。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、標的ヌクレオチドなどを含み得る。
本発明は特異的結合メンバーを用いるアッセイを提供する。本明細書に用いられている「特異的結合メンバー」とは特異的結合対のメンバーである。即ち、一方の分子が化学的又は物理的手段により第２の分子に特異的に結合する２つの異なる分子である。従って、一般的なイムノアッセイの抗原抗体特異的結合対の他に、他の特異的結合対として、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などを含み得る。さらに、特異的結合対には、元の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば分析物類似体が含まれ得る。葉酸の定量には葉酸結合タンパク質の免疫反応性特異的結合、又は炭水化物の定量には特異的結合対のメンバーとしてのレクチンを用いる。特異的結合対メンバーには、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、標的ヌクレオチドなどが含まれ得る。さらに、特異的結合対には、元の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば分析物類似体が含まれ得る。免疫反応性特異的結合メンバーには、組換えＤＮＡ分子により形成されたものを含めた、抗原、抗原のフラグメント、モノクローナル及びポリクローナル抗体、該抗体のフラグメント並びにその複合体が含まれる。本明細書に用いられている用語「ハプテン」とは、抗体には結合し得るが担体タンパク質に結合しない限り抗体の形成を誘発し得ない部分抗原又は非タンパク質結合メンバーを指す。
「指示薬」は、ＨＩＶに対する特異的結合メンバーに結合（付着）した外部手段により検出し得る測定可能なシグナルを生成し得る（生成する）「シグナル生成化合物」（標識）を含む。本明細書に用いられている「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対のメンバーを意味する。即ち、一方の分子が化学的又は物理的手段により第２の分子に特異的に結合する２つの異なる分子である。指示薬は、ＨＩＶに対する特異的結合対の抗体メンバー以外にも、ビオチン又は抗ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子又はレセプター分子、酵素補因子又は酵素、酵素阻害剤又は酵素などのようなハプテン−抗ハプテン系を含めたいずれの特異的結合対のメンバーであってもよい。免疫反応性特異的結合メンバーは、抗体、抗原、又はサンドイッチアッセイではＨＩＶに、競合アッセイでは捕獲試薬に、若しくは間接アッセイでは補助特異的結合メンバーに結合し得る抗体／抗原複合体であってよい。
考えられる種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、色素原、酵素のような触媒、蛍光及びローダミンのような発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのような化学発光化合物、放射性元素並びに直視標識が含まれる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。どの標識を選択するかは重要ではないが、標識は、それ自体で又は１種又は複数種の追加物質と一緒になってシグナルを生成し得る。
「固相」（「固体支持体」）は当業者には公知であり、反応トレイのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース細片、膜、ラテックス粒子のような微粒子、ヒツジ（又は他の動物）の赤血球、デュラサイトなどが含まれる。どの「固相」を用いるかは重要ではなく、当業者が選択し得る。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気又は非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラス又はシリコンチップ、ヒツジ（又は他の動物）の赤血球及びデュラサイトは全て適当な例である。ペプチドを固相上に固定する適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用などが含まれる。本明細書に用いられている「固相」とは、不溶性であるか又は後続反応により不溶性とされ得る任意の物質を指す。固相は、捕獲試薬を誘引して固定化するその固有の能力に基づいて選択し得る。あるいは、固相は、捕獲試薬を誘引して固定化する能力を有する追加の受容体を有していてもよい。追加の受容体には、捕獲試薬自体の電荷又は捕獲試薬に結合した荷電物質と反対の電荷を帯びた荷電物質が含まれ得る。あるいは、受容体分子は、固相上に固定され（固相に結合し）且つ特異的結合反応により捕獲試薬を固定化する能力を有する任意の特異的結合メンバーであってよい。受容体分子は、アッセイ実施前又はアッセイ実施中に捕獲試薬と固相物質とを間接結合させ得る。従って、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気又は非磁気金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターウエル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（又は他の適当な動物）の赤血球、デュラサイト及び当業者には公知の他の構造であってよい。
固相がさらに抗体の検出を可能にするに十分な多孔度及び抗体が結合するのに適当な表面親和性を有する適当な多孔質物質を含み得ることも考慮され、これも本発明の範囲内に包含される。一般的には微孔質構造が好ましいが、水和状態でゲル構造を有する物質を用いてもよい。これらの物質は、フィルム、シート又はプレートのような適当な形態で用いてもよいし、紙、ガラス、プラスチックフイルム又は繊維のような適切な不活性担体上にコーティングするか、該担体に付着若しくは積層させてもよい。
種々の他の固相を利用する他の実施態様も考慮され、これらも本発明の範囲内に包含される。例えば、ＥＰ公開第０３２６１００号に対応する同時係属の米国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許出願第３７５，０２９号（ＥＰ公開第０４０６４７３号）に記載されている、負に帯電したポリマーとの固定化可能な反応複合体を固定化するためのイオン捕獲手順を本発明に従って用い、迅速な液相免疫化学反応を行うことができる。固定化し得る免疫複合体を、負に帯電したポリアニオン／免疫複合体と前もって処理しておいた正に帯電した多孔質マトリックスとのイオン相互作用により反応混合物の残分から分離し、ＥＰＯ公開第０，２７３，１１５号に対応する同時係属の米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光シグナルの測定に記載のものを含めた既に記載されている種々のシグナル生成系を用いて検出することができる。
また、本発明の方法を、固相が（磁気又は非磁気）微粒子を含む自動化又は半自動化系を含めた微粒子技術を用いる系に使用するように適合させることもできる。そのような系には、それぞれ、公開されたＥＰＯ出願、同ＥＰ０４２５６３３号及びＥＰ０４２４６３４号に対応する、係属中の米国特許出願第４２５，６５１号及び同第４２５，６４３号に記載のものが含まれる。
イムノアッセイに走査プローブ顕微鏡検査法（ＳＰＭ）を用いるのも本発明のペプチドが容易に適合し得る技術である。走査プローブ顕微鏡検査法、特に原子力顕微鏡検査法では、捕獲相、例えば本明細書に開示されている少なくとも１種のペプチドを固相に付着させ、検出対象の抗体を含む疑いのあるテスト試料を固相と接触させ、走査プローブ顕微鏡を用いて固相表面上に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。通常多くのイムノアッセイ系では抗原／抗体複合体の検出に標識を用いなければならないが、走査トンネル顕微鏡検査法を用いるとその必要がなくなる。そのようなシステムが係属中の米国特許出願第６６２，１４７号に記載されている。特異的結合反応のモニターにＳＰＭを用いることは多くの方法で生じ得る。ある方法では、特異的結合相手（本明細書に開示されているペプチドである分析物特異的物質）の一方のメンバーを走査に適当な表面に結合させる。分析物特異的物質は、当業者には公知の方法に従ってプラスチック又は金属表面を有する固相を含む試験片に吸着により付着させる。あるいは、特異的結合相手（分析物特異的物質）を誘導体化プラスチック、金属、シリコン又はガラスの固相を含む試験片に共有結合させる方法を用いてもよい。共有結合法は当業者には公知である。また、１９８８年１月２９日に出願された係属中の米国特許出願第１５０，２７８号及び１９８９年７月７日に出願された同第３７５，０２９号に記載の技術及び化学を用いて、高分子電解質相互作用を用いて特異的結合相手を試験片の表面上に固定してもよい。特異的結合メンバーを結合させた後、該表面をさらに血清、タンパク質又は他のブロッキング剤で処理して、非特異的結合を最小限にし得る。さらに該表面を製造現場又は使用箇所で走査してアッセイに対するその適合性を検証し得る。走査プロセスによって試験片の特異的結合特性が変わることはないと考えられる。
アッセイに用いられる試薬は、それぞれが別々の試薬、例えばペプチド若しくはペプチド混合物又はアッセイに用いられる指示薬を含有するバイアル又はビンのような１個以上の容器を含むテストキットの形態で提供し得るものと考えられる。そのようなテストキットには、緩衝液、対照などのような当業者には公知の他の成分が含まれ得る。
イムノアッセイにおける抗原として抗体を産生させる免疫原などを含む、本明細書に詳述されているペプチドを用いるアッセイフォーマットを設計し得る。ヒトテスト試料中の特異的分析物（例えばＨＩＶ−１）に対する抗体の存在を検出するアッセイフォーマットの場合、ヒトテスト試料を、本明細書に開示されている少なくとも１種のＨＩＶ−１ペプチドで被覆した固相と接触させて、インキュベートする。分析物特異的抗体がテスト試料中に存在すると、該抗体はペプチドとの複合体を形成して固相に固定される。複合体形成後、固相を洗浄して結合しなかった物質及び試薬を除去する。次いで、これらの複合体を指示薬と接触・反応させて、第２の複合体が形成されるような時間及び条件でインキュベートする。ペプチドに対するテスト試料中の抗体の存在は、生成されたシグナルを検出して決定する。生成されたシグナルがカットオフ値以上であれば、テスト試料中に存在する分析物に対する抗体の存在を示す。酵素のような多くの指示薬を用いる場合、存在する抗体の量は生成されるシグナルに比例する。テスト試料のタイプに応じて、テスト試料を適当な緩衝試薬で稀釈し、濃縮するか、又は何ら処理せずに（「ニート」）固相と接触させ得る。例えば、通常、前もって稀釈しておいた血清若しくは血漿試料又は尿のような濃縮標本をアッセイして抗体の存在及び／又は存在する抗体の量を測定するのが好ましい。
さらに、実験中の感染物質のウイルスゲノムの種々の抗原エピトープに対するペプチドを用いることにより、上記のアッセイフォーマットで１種以上のペプチドを用いて特異的感染物質に対する抗体の存在をテストすることができる。従って、特異的ウイルス抗原領域内のエピトープ並びに該ウイルスのゲノム以外の他の抗原領域からのエピトープを含むペプチドを用いて１つのエピトープからのペプチドを用いるものより感度及び恐らく特異性が高められたアッセイを提供するのが好ましい。そのようなアッセイは確認（confirmatory）アッセイとして用い得る。この特定のアッセイフォーマットの場合、既知量のテスト試料と、本明細書に開示されているペプチドの少なくとも１種で被覆された既知量の少なくとも１種の固体支持体とを、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件で接触させる。次いで、該複合体と既知量の適切な指示薬とを、反応の生起に適当な時間及び条件で接触させる。シグナルを生成させ、得られたシグナルを陰性テスト試料と比較して、テスト試料中の分析物に対する抗体の存在を決定する。さらに、微粒子のような特定の固相を用いると、アッセイに用いられる各ペプチドが別々の微粒子に結合し、被覆された種々の微粒子が一緒になって、それぞれのアッセイに最適化され得る微粒子混合物が形成され得るとも考えられる。
上記アッセイフォーマットの変形には、一方の分析物に対する抗体の存在を検出するために、本明細書に開示されている合成ペプチド１種以上と、同一又は異なる固相に結合した異なる分析物に特異的な組換えタンパク質又は合成ペプチド（例えば、異なる感染因子の特定の抗原領域に特異的な組換えタンパク質を含む同一又は異なる固相上に被覆されたＨＩＶ−１の特定の抗原領域に特異的な、本明細書に開示されている合成ペプチド）を組み込んで、感染性因子のどちらか（又は両方）の存在を検出するものが含まれる。
さらに別のアッセイフォーマットにおいては、抗原性エピトープを含むペプチドは中和アッセイのような競合的アッセイに有用である。中和アッセイを実施するためには、ＨＩＶ−１の抗原性領域のエピトープを表すペプチドを可溶化し、最終濃度０．５〜５０．０μｇ／ｍｌになるように試料稀釈液と混合する。稀釈するか又は稀釈していない既知量（例えば１０μｌ）のテスト試料を反応ウエルに加え、次いで、例えば４００μｌの本明細書に開示のペプチドを含む試料稀釈液を加える。所望なら、混合物を約１５分〜２時間予備インキュベートしてもよい。次いで本明細書に開示のペプチドで被覆した固相を反応ウエルに加え、約４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、既知量の指示薬、例えば結合体用稀釈液中のペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ２００μｌを加え、４０℃で約１時間インキュベートする。記載のような酵素結合体を用いる場合には、洗浄後、混合物にＯＰＤ基質のような酵素基質を加え、室温で３０分間インキュベートする。反応ウエルに１Ｎ  硫酸のような停止試薬を加えて反応を停止させる。４９２ｎｍで吸光度を読み取る。特異的ペプチドに対する抗体を含むテスト試料は、溶液中でのこれらの抗体に対するペプチドの競合的結合により、生成されるシグナルが低減する。競合的結合の割合（％）は、同一稀釈度でペプチド存在下の試料の吸光度値とペプチド不在下に測定した試料の吸光度値とを比較して計算し得る。従って、ペプチド存在下の試料及びペプチド不在下の試料により生成されたシグナルの差が抗体の存在又は不在の決定に用いられる尺度である。
別のアッセイフォーマットでは、本発明のペプチドをイムノブロットアッセイ系に用いることができる。イムノブロットアッセイ系はニトロセルロース固体支持体上に列をなして置かれた精製組換えポリペプチド又は合成ペプチドのパネルを用いる。調製された固体支持体を、テスト試料並びに組換えタンパク質及び／又は合成ペプチド（特異的結合メンバー）に対する捕獲特異的抗体（他の特異的結合メンバー）と接触させて、特異的結合メンバー対を形成する。指示薬と反応させて捕獲された抗体を検出する。結合体特異的反応は、１９８８年８月２日に出願された米国特許出願第０７／２２７，４０８号に記載されている装置内の反射光学アセンブリーを用いて定量するのが好ましい。関連米国特許出願第０７／２２７，５８６号及び同第０７／２２７，５９０号（どちらも１９８８年８月２日に出願）、並びに米国特許第５，０７５，０７７号（１９８８年８月２日に出願された米国特許出願第０７／２２７，２７２号）（いずれも同一所有権者が享受するものであり、本明細書に参照として組み込むものとする）には、イムノブロットアッセイの実施に有用な特定の方法及び装置が詳細に記載されている。要約すれば、ニトロセルロースベースのテストカートリッジを複数の抗原性ペプチドで処理する。各ペプチドはテストカートリッジ上のそれぞれ特定の反応領域内に包含されている。全ての抗原性ポリペプチドをニトロセルロース上に置いた後で、該ニトロセルロース上の過剰な結合部位をブロックする。次いで、テスト試料が適切な抗体を含んでいる場合には各反応ゾーン中の各抗原性ペプチドが該抗体と反応するようにテストカートリッジをテスト試料と接触させる。反応後、テストカートリッジを洗浄し、周知の適当な試薬を用いて抗原抗体反応を同定する。上記にリストした特許及び特許出願明細書に記載されているように、全過程を自動化することができる。イムノブロットアッセイを実施するための方法及び装置に関連するこれらの特許出願明細書は本明細書に参照として組み込むものとする。
本明細書に開示されているペプチドは、テスト試料中の分析物特異的抗原に対する抗体を検出するための以下の様な第１及び第２の固体支持体を用いるアッセイに使用し得る。このアッセイフォーマットでは、テスト試料の第１のアリコートと、分析物に特異的な第１のペプチドで被覆した第１の固体支持体とを、ペプチド／分析物抗体複合体の形成に十分な時間及び条件で接触させる。次いで、これらの複合体をペプチドに特異的な指示薬と接触させる。指示薬から生成されたシグナルを検出して、テスト試料中に存在するペプチドに対する抗体の存在（もし存在すれば）を決定する。この後、テスト試料の第２のアリコートと、第２の抗体として合成ペプチド又は組換えタンパク質で被覆した第２の固体支持体とを組換えタンパク質又は合成ペプチド／第２抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下に接触させて、同一分析物の異なる抗原決定基の存在を決定する。該複合体をその抗体に特異的な第２の指示薬と接触させる。指示薬から生成されたシグナルを検出して、テスト試料中の抗体の存在を決定するが、分析物の一方又は両方に対する抗体の存在は、テスト試料中の抗分析物の存在を示している。さらに、固体支持体を同時にテストし得ることも考えられる。
ハプテンを用いてシグナルの生成を増強させ、それによってアッセイの感度を高めることができる。ハプテンの使用は当業界では公知である。アッセイの性能を高めるために、本明細書に開示されているペプチドを用いるアッセイにハプテンを用いることも意図している。
本発明によるテスト試料中の抗体を検出するための別のアッセイ法には、フローサイトメトリー法及び粒子計数法が含まれる。例えば、粒子計数法では、特異的抗体を含む疑いのあるテスト試料のアリコートと、特異的結合対の他方のメンバーとして検出対象抗体に結合し得る本明細書に開示の少なくとも１種のペプチドのような抗体に特異的な捕獲試薬で被覆された微粒子とを混合することにより、特異的結合対の抗体メンバーである分析物を定量する。テスト試料中に抗体が存在する場合、抗体は捕獲試薬で被覆された一部の微粒子に結合して、凝集体を形成する。分析物の濃度は凝集しなかった粒子数に反比例する。例えば、Ｒｏｓｅら編，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，第８章，４３−４８ページ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８６）を参照されたい。
照射された細胞又は粒子からの電子及び光シグナルを検出するフローサイトメトリーにより、細胞の表面特性、量及び細胞のサイズを測定する。例えば、テスト試料中に存在する抗体は本明細書に開示のペプチドに結合し、ペプチドに直接結合するか又は二次反応を介して付加された蛍光染料により検出される。１つの試料から１種以上の分析物を検出し得るように、異なる波長で励起され得る異なる染料を異なる分析物に特異的な１種以上のペプチドと共に用いることができる。蛍光フローサイトメトリーでは、テスト試料中の粒子（典型的には細胞）の懸濁液を、試料中の個々の粒子に１種以上の集光ビームを照射するフローセルを介して輸送する。１個以上の検出器がフローセルを通って流れる標識粒子と光ビームとの相互作用を検出する。一般に、ある種の検出器は蛍光の放出を測定するように設計されているが、他の検出器は散乱強度又はパルスの持続時間を測定する。従って、フローセルを通過する各粒子は、その軸が検出器により測定される放出色、光強度又は他の特性、即ち散乱である特徴スペースにマッピングされ得る。ある場合には、試料中の異なる粒子を特徴スペースのオーバーラップしていない別個の領域にマッピングして、各粒子をその特徴スペース中のマッピングに基づいて分析し得る。フローサイトメトリー分析用のテスト試料を調製するには、オペレーターが手動で一定量のテスト試料を試料管から分析管にピペット装入する。一定量の蛍光色原体で標識した所望のペプチドを加える。次いで、試料／ペプチド混合物を抗体／ペプチド結合が生起し得るに十分な時間及び条件でインキュベートする。必要なら、インキュベーション後に、オペレーターは一定量のＲＮＳ溶解物を加えて試料中のＲＢＣを破壊する。溶解後、試料を遠心、洗浄して、溶解ステップからの残留物を除去する。遠心／洗浄ステップは数回繰り返してよい。試料を一定量の固定液に再懸濁し、次いで蛍光フローサイトメトリー装置に通す。流動自動化分析を実施するための方法及び装置は共同所有になる米国特許出願第０８／２８３，３７９号（本明細書に参照として組み込むものとする）に記載されている。本明細書に記載の方法に中心体を用い、タッグを付けるか標識して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断に用い得ることも本発明の範囲内である。細菌、ウイルス、デュラサイトなどを含めた他の細胞又は粒子に、本発明に記載されているＰＮＡ又はモルホリノ化合物でタッグを付けるか又は標識して、フローサイトメトリーに用い得ることも本発明の範囲内である。
本発明を以下の実施例により説明するが、該実施例は例示を目的とし、本発明の思想及び範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：  ペプチドの合成
全てのペプチドは、ＦＭＯＣ化学、標準サイクル及びＤＣＣ−ＨＯＢｔ活性化を用い、ＡＢＩ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａで合成した。切断及び脱保護条件は以下の通りである：２０ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．３ｍｌの水、０．２ｍｌのエタンジチオール、０．２ｍｌのチオアニソール及び１００ｍｇのフェノールに樹脂を加え、室温で１．５時間攪拌した。次いで、樹脂を吸引濾過し、ＴＦＡ溶液をエーテルで沈降させ、次いで濾過してペプチドを得た。各ペプチドを水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配を用いる逆相分取ＨＰＬＣにかけて精製し、凍結乾燥した。生成物を質量分光法により確認した。
以下の自動酸化条件を用いてジスルフィド結合を形成した。ペプチドを最少量のＤＭＳＯ（約１０ｍｌ）に溶解し、次いで緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．２）を加えて濃度を０．３〜０．８ｍｇ／ｍｌとした。ジスルフィド結合が完全に形成されるまで反応混合物をＨＰＬＣでモニターし、次いで、水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配を用いる逆相分取ＨＰＬＣにかけ、凍結乾燥した。次いで生成物を質量分光法により確認した。全てのペプチドは２個のシステイン（Ｃ）残基間に形成されたジスルフィドループを含んでいた。
実施例２：  ＥＩＡ
Ａ．試料の調達．  サブタイプＯ試料「Ｍ」及び「Ｅ」は９種の確認されたサブタイプＯ試料のオリジナルフランスパネルに属するものであった。該試料「Ｍ」及び「Ｅ」はぞれぞれ試料＃７及び＃２〔Ｉ．Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：１３９３−１３９４（１９９４）〕と同一である。試料ＤＵＲ、ＦＡＮ及びＭＡＡはフランス政府から調達した他のサブタイプＯ試料であった。
試料＃２９０１及びＨＡ１１２はそれぞれ、ドイツ、ミュンヘンのＬｕｔｚ  Ｇｕｒｔｌｅｒ博士、ベルリンのＨａｒｔｍｕｔ  Ｈａｍｐｌ博士から得た。試料＃１９３、＃２６７、＃３４１及び＃６５５は赤道ギニアから得たものであり、ＰＣＲにより真のサブタイプＯ試料であることが確認されている。
Ｂ．ＥＩＡ．  先ず、合成ペプチドを０．１Ｍ  モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．５）に２０μＭの濃度に溶解した。コーティングステップでは、各ペプチドの２０μＭ溶液（０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中，ｐＨ５．５）の種々の稀釈液（０〜５倍）２００μｌをＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒTM（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４  ポリスチレン）プレートのウエルに加えた。室温で一晩インキュベートした後、プレートを、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ，０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１５Ｍ  ＮａＣ１，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０▲Ｒ▼，ｐＨ８）中０．５％脱脂粉乳を含む洗浄溶液で洗浄した。ブロッキングステップでは、各ウエルにＴＢＳＴ溶液中１０％脱脂粉乳３００μｌを添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄溶液で洗浄し、各ウエルに１０％粉乳−ＴＢＳＴに１５０倍稀釈した血清／血漿試料１５０μｌを加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを再び洗浄溶液で洗浄し、次いで、各ウエルに、１０％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中の結合体〔ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ），１ｍｇ／ｍｌ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ〕の１６，０００倍稀釈液１００μｌを加えた。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄溶液で洗浄した。各ウエルに過酸化水素中のｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の溶液１００μｌを加え、１０分間インキュベートして発色を得た。１Ｎ  硫酸１００μｌを加えて発色反応を停止し、４９０ｎｍ及び６３０ｎｍの波長のＤｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００プレート読み取り装置で吸光度を測定した。ウエルのＡ490−Ａ630の相対強度は、特定のペプチドが特定の血清／血漿試料と反応した効力に比例していた。
実施例３：
ＳからＫへの置換及びＴからＹへの置換の比較分析
この実施例は、一部のＨＩＶ−１サブタイプＯ試料（＃２９０１、＃２６７及び＃６５５）の検出におけるＳからＫへの置換（配列番号２）の重要性、一部の他のＨＩＶ−１サブタイプＯ試料（＃１９３、「Ｅ」及びＨＡ１１２）の検出におけるＴからＹへの置換（配列番号３）の重要性、及び配列番号２及び配列番号３が共に配列番号１より性能が全般的に優れていることを示している。
実施例２に記載のようにアッセイを実施した。ウエルのコーティングに用いたペプチド濃度は２０μＭであり、血清／血漿試料の稀釈度は、＃１９３、＃２６７、＃３４１、＃６５５、ＨＡ１１２及びＤＵＲの場合は１５０倍、＃２９０１、試料「Ｅ」及びＦＡＮの場合は４５０倍、試料ＭＡＡの場合は７５０倍、試料「Ｍ」の場合は１，５００倍であったことに留意されたい。確認された陰性ヒトＨＩＶ試料をこの実験の陰性対照として用いた。
表１、２及び３に記載されている吸光度値はＡ490−Ａ630として計算した。
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実施例４：
ＳからＫへの置換及びＴからＹへの置換の比較分析
この実施例は、合計１１種のサブタイプＯ試料中１０種の検出において、ＳからＫ及びＴからＹへの２置換ペプチド（配列番号４）が配列番号１に比べて著しく性能が優れていることを示している。
実施例２に記載のようにアッセイを実施した。ウエルのコーティングに用いたペプチド濃度は２０μＭであり、血清／血漿試料の稀釈度は、＃１９３、＃２６７、＃３４１、＃６５５、ＨＡ１１２及びＤＵＲの場合は１５０倍、＃２９０１、試料「Ｅ」及びＦＡＮの場合は４５０倍、試料ＭＡＡの場合は７５０倍、試料「Ｍ」の場合は１，５００倍であったことに留意されたい。実施例３に記載のように、確認された陰性ヒトＨＩＶ試料をこの実験の陰性対照として用いた。
表４、５及び６に記載されている数値は吸光度値（Ａ490−Ａ630）であった。
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実施例５：滴定実験
Ａ．実験プロトコル．  実施例１に記載にように調製したそれぞれ１００μｌの以下の合成ペプチドで１６時間４℃で被覆した９６ウエルプレートを用いてＨＩＶ合成ペプチドの相対免疫反応性を測定した：共通のＢ（配列番号１）、Ｂ／Ｏ−７（配列番号２）、Ｂ／Ｏ−８１（配列番号３）及びＢ／Ｏ−２（配列番号４）。ペプチドを以下の濃度で評価した：５００μＭ、５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、０．０５μＭ及び０．００５μＭ。これらのペプチドの適用に用いた緩衝液は、１００ｍＭ  モルホリノ−エタンスルホン酸、ｐＨ５．５であった。次いで、ペプチドで被覆したウエルを、８ｍＭ  リン酸ナトリウム、２ｍＭ  リン酸カリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  塩化カリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４からなる洗浄緩衝液で３回洗浄した。
次いで、ウエルを、リン酸緩衝塩水：８ｍＭ  リン酸ナトリウム、２ｍＭ  リン酸カリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  塩化カリウム、ｐＨ７．４中９％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｎａｔｉｏｎ▲Ｒ▼粉末スキムミルクで１時間室温でブロックした。次いで、ウエルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ヒト血清試料（＃１９３、＃２６７、＃３４１、＃６５５及び「Ｍ」）をＰＢＳ中４．５％カーネーションスキムミルク（ｗ／ｖ）で１５０倍稀釈した。これらの試料１００μｌをウエル中３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウエルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ヤギ抗ヒトＩｇＧに結合した西洋ワサビペルオキシダー
ゼを用いてＨＩＶ抗体−ペプチド抗原複合体を含む抗体陽性試料を検出した。各ウェルに、洗浄緩衝液に１：５０００稀釈したＨＲＰＯ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ結合体１００μｌを加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウエルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅから入手したＡＢＴＳ溶液（２，２′−アジノビス−［３−エチルベンゾチゾリン−６−スルホン酸］ジアンモニウム塩）に露出した後、４０５ｎｍで吸光度を読み取ってＨＩＶ抗体の濃度を予測した。
Ｂ．データ分析．  ４０５ｎｍでの吸光度の読み取り値を配列番号４に対して標準化し、ウエルのコーティングに用いたペプチド濃度のｌｏｇに対して相対反応性をプロットした。データをＭｉｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．により記載されたＯｒｉｇｉｎプログラムに見られるようなＳ字形曲線を描く下記の式に当てはめた：
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（式中、ｘoは曲線の中心であり、ｐは速度、Ａ1はｙの初期値、Ａ2はｙの最終値である）。
Ｃ．結果．  図１、図２、図３及び図４は、２０μｍのペプチド濃度が飽和シグナルの生成に十分であり、従って実施例３及び４における先のデータを立証することを示している。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：２
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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