(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトロンビン複合体並びにプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液より選択されるプロトロンビン含有水溶液を、トロンボプラスチンの非存在下に、終濃度１０〜３０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールで処理することを特徴とする、プロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項２】
プロトロンビン複合体並びにプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液より選択されるプロトロンビン含有水溶液を、トロンボプラスチンの非存在下に、カルシウム塩の共存下、終濃度１０〜３０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールで処理することを特徴とする請求項１記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項３】
プロトロンビン複合体並びにプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液より選択されるプロトロンビン含有水溶液の、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩での処理の際に、反応液が付加的にグリセロールを含有することを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩での処理温度が４〜３７℃である請求項１から請求項３のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩での処理温度が１０〜２５℃である請求項４に記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項６】
使用するポリエチレングリコールの分子量が約２，０００〜６，０００である請求項１から請求項５のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項７】
共存させるカルシウム塩が塩化カルシウム、水酸化カルシウムおよび酢酸カルシウムより選択されるものである請求項２から請求項５のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項８】
カルシウム塩の濃度が終濃度１００ｍＭ以下である請求項２から請求項５のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項９】
カルシウム塩の濃度が終濃度２〜２０ｍＭである請求項８に記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化工程を含むことを特徴とするトロンビンの製造方法。
【請求項１１】
請求項１から請求項９のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化工程後に陽イオン交換体処理を行なう請求項１０に記載のトロンビンの製造方法。
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明はトロンビンの製造方法に関する。より詳細には、工業的規模でトロンビンを得る際に、トロンボプラスチンの非存在下にてもポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩による処理を施すことにより、プロトロンビンをトロンビンに活性化し得る方法および該活性化工程を含むトロンビンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
トロンビンは、分子量約３７,０００のセリンプロテアーゼであり、血液凝固反応の最終段階で働くタンパク質分解酵素である。トロンビンは、フィブリノゲンに作用してフィブリンを生成することにより血液を凝固させる。従って、トロンビンは、外科領域における局所止血剤として、また、内科領域における上部消化管出血などの止血剤として、臨床的に用いられている。また、さらに、フィブリン接着剤の１成分としても応用されている。
【０００３】
トロンビンは、循環血液中では前駆物質であるプロトロンビンの形態で存在しており、活性化第Ｘ因子によって限定分解を受けて生成される。従来、トロンビンの製造は、ヒトおよびウシなどの血漿を原料として、まず、プロトロンビンを抽出精製し、得られた精製プロトロンビンにトロンボプラスチンなどを作用させてトロンビンを得る方法が行なわれてきた。すなわち、トロンビンへの転化は精製されたプロトロンビンを対象にしていた。得られたトロンビンは、さらに、各種の数工程を経て精製される。また、この方法を基本とした改良方法として、「血漿を低温エタノール処理後陰イオン交換体処理し、得られた精製プロトロンビンをトロンビンに転化し、さらに陽イオン交換体処理により精製する方法（特開平３-１２８３９８号公報）」などが知られている。
【０００４】
トロンボプラスチンは、主にヒト胎盤から調製されたものが用いられているが、原料の調達が困難であり必ずしも充分量が入手できるとは言えない。また、製造工程で完全に除去することができず、最終製品に混入する可能性もある。
トロンビンへの転化方法としては、上記のトロンボプラスチンを用いる方法以外に、ヘビ毒を用いる方法、高濃度クエン酸塩を用いる方法（特開平４-３６５４８１号公報、特開平５-１９４２６１号公報）等が知られている。しかし、ヘビ毒を用いる場合も、トロンボプラスチン同様、原料の調達が困難であると同時に最終製品への混入が危惧される。また、高濃度クエン酸塩による自然転化法は、トロンボプラスチン等の組織タンパク質が付加的に混入しないという利点はあるものの、工業的製法としては十分な転化効率が保証されているとは言えない。
【０００５】
また、特開平５-１８６３６９号公報、特開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９５/３１５３６号公報には、塩化カルシウムにより、プロトロンビンをトロンビンに転化する方法が開示されている。
トロンビンへの変換処理に付されるプロトロンビンとして、精製されたプロトロンビンではなくプロトロンビン複合体を対象とする方法も、特開平７-３３７９９号公報に開示されている。これらの方法は、限られた条件下で有効な製造方法となり得るが、依然、簡便かつ有効な方法とは言えない。
【０００６】
このような状況下、本願発明の課題は、トロンビンの工業的規模での効率的製造方法を確立することである。すなわち、本願発明の目的は、工業的規模でトロンビンを得る際に原材料の入手が容易で、かつ効率よくプロトロンビンからトロンビンへと転化する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本願発明者等は上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、効率的なトロンビンの製造方法をもたらす本願発明を完成した。以下、本願発明をさらに詳細に説明する。
本願発明は、トロンボプラスチンの非存在下にてもプロトロンビンからトロンビンへの変換を達成し得る活性化方法および該活性化工程を含むトロンビンの製造方法である。本願発明の方法における好ましい態様として、トロンビンへの変換処理に付される対象物は、「プロトロンビン複合体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液」である。ここで用いられるプロトロンビン複合体は、血液凝固因子の一つであるプロトロンビン（血液凝固第II因子）とともに、その他の血液凝固に関係する因子を含んだものである。プロトロンビンとともに含まれる成分としては、血液凝固第VII因子、第IX因子、第Ｘ因子などが挙げられる。上記のトロンビンへの変換処理に付される対象物は高純度精製品である必要はなく、粗製品であってもよい。
「プロトロンビン複合体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液」の調製方法としては、血漿を陰イオン交換体で処理してプロトロンビン複合体を調製する方法、血漿からクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製する方法等が挙げられる。原料となる血漿の由来も特に問わず、例えば、ウシ由来のものヒト由来のもの等が挙げられるが、好ましくはヒト由来のものである。
【０００８】
上述のようにして得た「プロトロンビン複合体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液」を、４〜３７℃、好ましくは１０〜２５℃で、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩で処理することにより、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反応を行なう。反応液中のプロトロンビン濃度としては、２０〜１２０単位/ｍｌ程度が例示される。本願発明で言及するポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩での処理とは、プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液にポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシウム塩を添加・混合してトロンビンへの活性化反応を行なうものである。具体的には、ポリエチレングリコール溶液またはポリエチレングリコール溶液およびカルシウム塩溶液をプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する方法や、ポリエチレングリコール固形物またはポリエチレングリコール固形物およびカルシウム塩固形物を直接プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する方法が挙げられるが、溶液を添加する前者の方法が好ましい
。
【０００９】
ポリエチレングリコールは、分子量約２,０００〜６,０００の製品が好適に用いられ、その処理濃度は１〜３０％（ｗ/ｖ）程度である。本願発明において使用されるポリエチレングリコールは、タンパク質の沈殿剤として広く使用されている高分子量の重合体である。このポリエチレングリコールは無毒でなければならず、平均分子量約４,０００のＰＥＧ４,０００は、ポリエチレングリコール類の好ましい製品である。また、カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム等が例示される。カルシウム塩の処理濃度は１００ｍＭ以下であるが、２〜２０ｍＭ程度が好ましい。処理時間は１〜７日程度が例示されるが、反応溶液中の組成の変動により増減する。反応液は、好ましい態様として付加的にグリセロールが添加される。高濃度のグリセロールは、活性化反応で形成されたトロンビンを安定化し自己分解による失活を抑制することにより、トロンビンの収量増加に寄与する。
【００１０】
カルシウム塩で処理しプロトロンビンをトロンビンに転化することを特徴とするトロンビンの製造方法は、前述のごとく特開平５-１８６３６９号公報、特開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９５/３１５３６号公報に開示されている。しかし、カルシウム塩の存在下でポリエチレングリコール処理を行なうことで、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反応が大きく促進されることを示唆する知見は全くなかった。さらに、カルシウム塩の非存在下においても、ポリエチレングリコール処理によりプロトロンビンからトロンビンへの活性化反応が進行することは、完全なる新規な発明である。  従って、本願発明は、前述の先行技術とは、方法および効果のいずれの観点についても異なる新規な知見を与えていると言うことができる。また、本願発明によれば、「工業的規模でトロンビンを得る際に原材料の入手が容易で、かつ効率よくプロトロンビンからトロンビンへと転化する」という目的を達することができる。
【００１１】
活性化反応で得られたトロンビンは、公知の方法により精製される。精製方法としては、陽イオン交換体処理が例示されるが、他の公知の方法によりさらに精製することもできる。当該トロンビンは、当業者において広く知られている手法により製剤化される。この際、必要に応じて、医薬上許容される担体、添加剤などの添加および除菌濾過、分注、凍結乾燥、加熱などが通常の方法に準じて行われる。
【００１２】
【発明の効果】
本願発明により、入手が容易な原材料を用い工業的規模で効率よくトロンビンを調製することが可能となる。以下に、試験例並びに実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何等限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
調製例１
ヒト血漿から得たクリオ上清を、陰イオン交換樹脂に吸着させた。プロトロンビンおよび第Ｘ因子を含有する画分を、０.７Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出・回収し、１０％ポリエチレングリコール４,０００（ＰＥＧ４,０００）に不溶な物質を除去するＰＥＧ分画によりプロトロンビンおよび凝固第Ｘ因子を精製した。
【００１４】
調製例２
調製例１に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因子を、Ｑ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーにより精製した。得られたプロトロンビンの純度は、約４血漿単位/Ａ280であった。
【００１５】
調製例３
調製例１に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因子を、ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ並びにｈｅｐａｒｉｎ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたクロマトグラフィーによりさらに精製し、プロトロンビンと第Ｘ因子を分離した。得られたプロトロンビンの純度は、約６.５血漿単位/Ａ280であった。
【００１６】
試験例１
調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。生成したトロンビンの活性は、各処理時間において、テストチーム発色基質Ｓ-２２３８（CHROMOGENIX AB, Sweden）を用いて測定された。ここで用いられているトロンビン活性の単位は、アメリカ標準品（U.S. Standard Thrombin、旧ＮＩＨ標準品）の単位に合わせたＮＩＨ単位で表わされている。また、活性化率は、プロトロンビン１血漿単位（正常人血漿１ｍｌ中に含まれるプロトロンビン活性）当たり得られたトロンビン活性（ＮＩＨ単位）を表す。
結果は図１に示した通りであり、１５％以上のＰＥＧ濃度でプロトロンビンの活性化反応が促進された。
【００１７】
試験例２
調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カルシウムおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、図２に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１％以上ではＰＥＧ非添加に対し活性化反応の促進効果が確認され、さらに５％以上の濃度では有意な促進効果が示された。処理時間１日では１２〜１４％ＰＥＧ添加サンプルの活性上昇が高かったが、処理時間４日では１８〜２０％ＰＥＧ添加サンプルの活性が急激に上昇していた。
【００１８】
試験例３
ＰＥＧ処理時の塩化カルシウム濃度とトロンビン転化効率の関係を調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として１４％および２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）および各種濃度の塩化カルシウムを混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、図３および図４に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１４％では有意なカルシウム濃度依存性が認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭであった。ＰＥＧ処理濃度２０％でもカルシウム濃度依存性が弱いものの認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭであった。
【００１９】
試験例４
ＰＥＧ処理時の温度条件とトロンビン転化効率の関係を調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として１４％および２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、４、１０、２５および３７℃の反応温度を設定し、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、図５〜図８に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１４％では、２５℃および１０℃で速やかなトロンビン生成が認められた。ＰＥＧ処理濃度２０％でも２５℃および１０℃におけるトロンビン生成が認められたが、その速度はＰＥＧ処理濃度１４％に比べて遅延していた。
【００２０】
試験例５
ＰＥＧ処理の効果を他のポリオールの添加効果と比較した。ポリオールの処理濃度として０、５、１０、２０および３０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。処理時間７日におけるトロンビンへの活性化率は、図９に示した通りである。
ＰＥＧ以外のポリオールでは活性化反応の促進効果は認められず、高濃度ではむしろ阻害していた。
【００２１】
試験例６
ＰＥＧ処理に用いるＰＥＧの分子量とトロンビン転化効率の関係を調べた。分子量の異なるＰＥＧ（ＰＥＧ１,０００、ＰＥＧ２,０００、ＰＥＧ４,０００およびＰＥＧ６,０００）について、それぞれＰＥＧの処理濃度として１０、１５、および２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、図１０〜図１２に示した通りである。
ＰＥＧ１,０００を添加したサンプルは、いずれのＰＥＧ濃度においてもプロトロンビン活性化反応に対する有意な促進効果は認められなかった。ＰＥＧ２,０００を添加したサンプルは、ＰＥＧ処理濃度１０％ではトロンビン活性の上昇がＰＥＧ４,０００およびＰＥＧ６,０００に比べ遅れていたが、ＰＥＧ処理濃度１５％および２０％ではＰＥＧ４,０００およびＰＥＧ６,０００と同等の活性化速度を示した。ＰＥＧ４,０００およびＰＥＧ６,０００では、両者に有意な効果の差は認められなかった。
【００２２】
試験例７
ＰＥＧ処理によるトロンビン転化時のグリセロールの添加とトロンビン安定化効果の関係を調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として１４％および２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カルシウムおよび各種濃度のグリセロールを混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、図１３および図１４に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１４％では、グリセロール非添加に比べグリセロール５〜１０％の添加で、活性化率の最大到達値が高まり、処理時間の延長による活性低下も抑制された。ＰＥＧ処理濃度２０％では、グリセロール非添加に比べグリセロール５〜２０％の添加で活性化率の最大到達値が高まった。
【００２３】
実施例１
調製例２に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因子を限外濾過膜を用いて濃縮し、塩化カルシウムおよびＰＥＧをそれぞれ終濃度５ｍＭおよび１４％添加して、２５℃において７日間処理した。
得られたトロンビンは、４８.４（NIH単位/プロトロンビン１血漿単位）の活性化率を示した。
【００２４】
実施例２
実施例１で得られたトロンビンに対し、限外濾過膜を用いた限外濾過/透析濾過を行い溶媒を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ０.１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８.０に置換した。この溶液を、同緩衝液で平衡化したＳＰ-TOYOPEARL（東ソー社製）に吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質を除去した。トロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Ｎａ3クエン酸塩 ０.５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６.０で溶出させ、濃縮し、透析濾過した後、凍結乾燥および乾燥加熱処理を施した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  カルシウム塩非存在下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ４,０００の添加効果を示す図である。
【図２】  塩化カルシウムが５ｍＭの濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ４,０００の添加効果を示す図である。
【図３】  ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシウムの濃度の影響を示す図である。
【図４】  ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシウムの濃度の影響を示す図である。
【図５】  ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示す図である。
【図６】  ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を示す図である。
【図７】  ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示す図である。
【図８】  ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を示す図である。
【図９】  プロトロンビンの活性化に対する各種ポリオールの影響を処理時間７日における活性化率で示した図である。
【図１０】  各種分子量のＰＥＧが１０％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧの添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図である。
【図１１】  各種分子量のＰＥＧが１５％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧの添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図である。
【図１２】  各種分子量のＰＥＧが２０％の濃度で存在する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧの添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図である。
【図１３】  ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロトロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示す図である。
【図１４】  ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロトロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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