(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)をフルクトシルリジン含有培地で培養することにより産生されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであって、下記の理化学的特性を有する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：
１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する反応を触媒し；
２）安定ｐＨは４.０〜１１.０、至適ｐＨは７.５であり；
３）安定温度は１５〜５０℃、至適温度は２５℃であり；
４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で測定した場合、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤａ）であり、
５）フルクトシルリジンおよびフルクトシルバリンに対して活性を有する。
【請求項２】
フルクトシルリジンと比較してフルクトシルバリンに対してより高い活性を有するものである、請求項１記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項３】
ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)。
【請求項４】
遊離又は保護基を有するアミノ酸の糖化物及び／又はタンパクの糖化物を含有する培地で、ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)を培養することによって該菌にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生させることを特徴とする、請求項１又は２に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
アマドリ化合物を含有する試料と、請求項１又は２に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを接触させ、酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法。
【請求項７】
試料が生体成分であり、アマドリ化合物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量によりなされることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有するアマドリ化合物の分析試薬又はキット。
【請求項９】
生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量のために用いられることを特徴とする請求項８記載の分析試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関し、さらに詳しくはペニシリウム属(Penicillium)の菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアマドリ化合物の分析法、および該酵素を含有する試薬及びキットに関する。
【０００２】
【従来技術】
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質としては、醤油等の食品、および血液等の体液がある。
例えば、生体では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成している。例えば、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、フルクトシルアミン誘導体のアルカリ溶液中における還元能はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の病状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
このように、アマドリ化合物の定量分析は医学および食品を含む広範な分野で有用である。
【０００３】
従来、アマドリ化合物の定量法としては、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法［Chromatogr.Sci.10:659(1979)］、ホウ酸を結合させた固体をつめたカラムを用いる方法［Clin.Chem.28:2088-2094(1982)］、電気泳動［Clin.Chem.26:1598-1602(1980)]、抗原−抗体反応を利用する方法［ＪＪＣＬＡ 18: 620(1993),機器・試薬 16: 33-37(1993)], フルクトサミンの測定法 [Clin.Chim.Acta 127: 87-95 (1982)], チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法[Clin.Chim.Acta 112: 197-204 (1981)]などが知られているが、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。
【０００４】
近年、酵素の有する特性（基質、反応、構造、位置などの特異性）に起因して、選択的に目的物質を迅速かつ正確に分析することができることから、酵素反応を利用する方法が臨床分析や食品分析の分野で普及してきた。
既に、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、その反応における酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、アマドリ化合物を定量する分析法が提案されている（例えば、特公平５−３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平３−１５５７８０号公報、特開平４−４８７４号公報、特開平５−１９２１９３号公報、特開平６−４６８４６号公報、特開平７−２８９２５３号公報）。さらに、糖尿病の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されている（特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平５−１９２１９３号公報、特開平６−４６８４６号公報、特開平７−２８９２５３号公報）。
【０００５】
アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解反応は下記の一般式で表すことができる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質またはペプチド残基を表す）
上記の反応を触媒する酵素として以下のものが知られている。
１.フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公平５−３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報)、アスペルギルス属（Aspergillus）（特開平３−１５５７８０号公報)
２．フルクトシルアミンデグリカーゼ：カンジダ属（Candida)（特開平６−４６８４６号公報）
３．フルクトシルアミノ酸分解酵素：ペニシリウム属（Penicillium）（特開平４−４８７４号公報)。
４.ケトアミンオキシダーゼ：コリネバクテリウム属、フサリウム属、アクレモニウム属またはデブリオマイセス属（特開平５−１９２１９３号公報）
５．アルキルリジナーゼ：Ｊ.Biol.Chem.239巻、第 3790ー3796頁 (1964年）記載の方法で調製。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、これらの酵素による方法には、下記の問題点があった。
即ち、糖尿病の診断における指標は、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンおよびフルクトサミンである。糖化アルブミンは、タンパク分子中のリジン残基のε位にグルコースが結合して生成される[J.Biol.Chem.261:13542-13545(1986)]。糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリンにもグルコースが結合している[J.Biol.Chem.254:3892-3898(1979)]。従って、糖尿病の指標となる糖化タンパクの測定には、フルクトシルリジンおよびフルクトシルバリンに対する特異性の高い酵素を用いる必要があった。しかし、既存のコリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンには作用せず、アスペルギルス属由来の酵素は、糖化タンパク又はその加水分解物に対する作用については明らかにされていない。他方、特開平５−１９２１９３号公報記載のケトアミンオキシダーゼはフルクトシルバリンを分解し得る酵素であり、リジン残基に糖が結合している糖化タンパクを正確に測定することができない。フルクトシルアミンデグリガーゼは、ジフルクトシルリジンに高い活性があるので、リジン残基のε位の糖化物を特異的に測定することができず、また、バリン残基の糖化物を特異的に測定することもできない。さらに、アルキルリジナーゼを用いる方法は糖類以外がリジンに結合した物質に対しても作用し、糖化物に対する特異性が低いという問題があり、正確な測定が期待できなかった。特開平４−４８７４号記載のペニシリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルアラニンに作用する酵素である。
このように、従来の酵素は糖化タンパクの正確な定量には適さず、フルクトシルリジン及びフルクトシルバリンに対する特異性が高い酵素の開発が待たれていた。
【０００７】
一般的に、酵素を用いる分析法が正確かつ有用となるためには、分析の目的に最適な酵素を選択する必要がある。即ち、酵素の基質である被検物質の種類、測定試料の状態、測定条件など、種々の条件を考慮して適切な酵素を用いなければ、再現性のある正確な分析を行う事ができない恐れがある。そのような酵素を選択するためには、予め様々な酵素について、活性、基質特異性、温度安定性、ｐＨ安定性などが特定されていなければならない。従って、より多くのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを製造し、それらの特性を明らかにしておくことが望ましい。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、アマドリ化合物、特に糖化タンパクに特異的に作用する新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ペニシリウム属（Penicillium）の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎα−Ｚ−リジンの存在下で培養すると、目的の活性を有する酵素が誘導されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、ペニシリウム属（Penicillium）の菌を、フルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎα−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより産生されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供するものである。
【０００９】
本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生菌の培養に用いるフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎα−Ｚ−リジン含有培地は、グルコースと、リジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを温度１００〜１５０℃において３〜６０分間、オートクレーブ処理することにより得られるフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎα−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと略称することもある）を含有する。後述するように、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼはフルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンの両者に活性があるが、その活性は、前者に対する活性が後者に対するものよりも高いという特徴を有する。本明細書中では、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをＦＡＯＤと称することもある。
【００１０】
本発明の酵素は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生能を有するペニシリウム属の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより製造することができる。そのような菌として、ペニシリウムヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)、ペニシリウム・ヤンシネルム(IFO NO.4651,6581,7905)(Penicillium janthinellum)、ペニシリウム・オキサリクム(IFO NO.5748)(Penicillium oxalicum)、ペニシリウム・ヤバニクム(IFO NO.7994)(Penicillium javanicum)、ペニシリウム・クリソゲヌム(IFO NO.4897)(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シアネウム(IFO NO.5337)(Penicillium cyaneum)などの種を挙げることができる。
【００１１】
本発明のＦＡＯＤ類は、一般に、下記の理化学的特性を有する。
１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する反応を触媒し；
２）安定ｐＨは４.０〜１１.０、至適ｐＨは７.５であり；
３）安定温度は１５〜５０℃、至適温度は２５℃であり；
４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で測定した場合、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤａ）である。
【００１２】
本発明のＦＡＯＤの製造に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬは、グルコース０.０１〜５０重量％とリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％とを溶液中で、１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理する方法で製造される。具体的には、全量１０００ｍｌの溶液中にグルコース２００ｇ、Ｎα−Ｚ−リジン１０ｇを溶解させ、通常１２０℃、２０分間オートクレーブ処理することによって製造することができる。
また、本発明のＦＡＯＤの製造に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培地（以下、ＦＺＬ培地と称する）は、上記の方法で得られたフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを通常の培地に添加するか、例えば、グルコース０.０１〜５０重量％、リジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１重量％、ＮａＨ2ＰＯ4 ０.１重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５重量％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０１重量％および酵母エキス０.２重量％を含有する混合物（好ましくはｐＨ５.６−６.０）を１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理することによって得ることができる。
【００１３】
本発明のＦＡＯＤの製造に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有する通常の合成あるいは天然の培地であってよく、炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、グリセリン等、窒素源としては、ペプトン、カゼイン消化物、酵母エキス、等を用いることができる。さらに無機物としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン、マグネシウム、コバルト等、通常の培地に含有されるものを用いることができる。
本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを含有する培地で培養したとき、最もよく誘導される。好ましい培地の例として、上記の方法で得られるＦＺＬを単一の窒素源とし、炭素源としてグルコースを用いるＦＺＬ培地（１.０％グルコース、０.５％ＦＺＬ、１.０％Ｋ2ＨＰＯ4、０.１％ＮａＨ2ＰＯ4、０.０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.０１％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏおよび０.０１％ビタミン混合物）を挙げることができる。特に好ましい培地は、全量１，０００ml中にグルコース２０ｇ（２％）、ＦＺＬ １０ｇ（１％）、Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ（０.１％）、ＮａＨ2ＰＯ4１.０ｇ（０.１％）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０  ０.５ｇ（０.０５％）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.１ｇ（０.０１％）および酵母エキス２.０ｇ（０.２％）を含有する培地（ｐＨ５.６−６.０）である。ＦＺＬ培地は、通常の培地にＦＺＬを添加するか、グルコースとＮα−Ｚ−リジンとを含有する培地をオートクレーブ処理することによって調製することができる。
いずれの方法によっても得られる培地はフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬの存在によって褐色を呈しており、ＦＺＬ褐変化培地又はＧＬ（グリケーテッドリジン及び／又はグリケーテッドＮα−Ｚ−リジン）褐変化培地と呼称される。
【００１４】
培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは２８℃で行われる。培地のｐＨは４.０〜８.０の範囲であり、好ましくは５.５〜６.０である。しかしながら、これらの条件はそれぞれの菌の状態に応じて適宜調整されるものであり、上記に限定されない。例えば、ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３株をこの条件下、２０〜４８時間、好ましくは３６時間培養すると、ＦＡＯＤが培養培地に蓄積される（図１）。このようにして得られた培養物は、常法に従い、核酸、細胞壁断片等を除去し、酵素標品を得ることができる。
本発明のＦＡＯＤの酵素活性は菌体中に蓄積されるので、培養物中の菌を破砕し、酵素を抽出する。
細胞の破砕は、機械的手段または溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧などのいずれでもよい。
酵素の分離精製方法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて精製する。
例えば、培養物を、遠心または吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）に懸濁し、ダイノミルによって菌糸体を破砕する。次いで、遠心分離した上清を無細胞抽出液として、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィーで処理することにより精製する。
【００１５】
しかしながら、本発明の目的から、ＦＡＯＤは、その精製度にかかわらず、アマドリ化合物の酸化反応を触媒することができる限り、培養液をはじめとする、あらゆる精製段階の酵素含有物及び溶液を包含する。また、酵素分子の内、触媒活性に関与する部位のみでも、本発明目的を達成することができることから、任意の、アマドリ化合物酸化活性を有するフラグメントをも包含するものとする。このようにして得られたＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量、特に糖尿病の診断のための糖化タンパクの定量に有用である。
従って、本発明は、ペニシリウム属に属し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生することができる菌株をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎα−Ｚ−リジン含有培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
【００１６】
本発明のＦＡＯＤを産生する菌の内、ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)（以下、Ｓ−３４１３株と称する）は本発明者らが土壌中より新規に単離した菌株である。本菌株について、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク 1993）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、以下の根拠よりペニシリウム・ヤンシネルム(Penicillium janthinellum)と同定した。
なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM BP-5475の下で寄託されている。
（１）子のう世代を形成しない。
（２）ペニシリ(penicillus)形成が認められた。
（３）フィアライド(phialide)はとっくり型で、急に細まり長い先端となる。
（４）ペニシリは不規則に分枝し、散開型である。
（５）菌核を形成しない。
（６）分生子連鎖が著しく散開である。
さらに、
（７）培地における生育状況
Czapek寒天培地上で速やかに生育する。２５℃の恒温器で１０日間培養すると、羊毛状に広がり、淡黄色または灰緑色を呈する。また、放射状に深いしわを形成する。
【００１７】
以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説明する。
１．一般的な誘導特性
本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン(ＦＺＬ)によって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、ペニシリウム属のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生菌株を培養することにより産生される。
ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを別々にオートクレーブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。
【００１８】
２．反応特異性および基質特異性
本発明のＦＡＯＤは、式：
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ →
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
で示される反応における触媒活性を有する。上記の反応式において、Ｒ1が−ＯＨ、−（ＣＨ2）n−、または−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ2が−ＣＨＲ3−［ＣＯＮＨＲ3］mＣＯＯＨ（式中、Ｒ3はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ3がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。
【００１９】
本発明のＦＡＯＤの各基質に対する活性を、以下の表１に示す。
表１  精製されたペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由来のＦＡＯＤの基質特異性
【表１】
0004004081.tif 000002
＊１：検出されず
＊２：フルクトシルヒト血清アルブミン
表１から、本発明のＦＡＯＤはフルクトシルＮα−Ｚ−リジン及びフルクトシルバリンに対して高い特異性を有する。
ペニシリウム属のＦＡＯＤ産生能力を有する菌株を下記表２に例示する。
表２  ＦＺＬ褐変化培地で培養したペニシリウム属の菌から抽出したＦＡＯＤの基質特異性
【表２】
0004004081.tif 000003
１）：検出されず
【００２０】
表２に示されているように、本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルリジンと比較してフルクトシルバリンに対して高い活性を有しており、このことは該ＦＡＯＤが糖化ヘモグロビンの測定に有用であることを示唆するものである。
【００２１】
３．ｐＨおよび温度の条件
ｐＨ条件の測定
０.１Ｍ酢酸（Ａｃ）、リン酸カリウム（Ｋ−Ｐ）緩衝液、トリス-塩酸緩衝液およびグリシン（Ｇｌｙ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４.０〜１１.０）にＦＡＯＤを加え、２５℃、１０分間インキュベートした後、 通常の条件（２５℃、ｐＨ８.０）で活性を測定した。
上記方法で測定したとき、本発明のＦＡＯＤの安定なｐＨ域は、約ｐＨ４.０〜１１.０、好ましくはｐＨ６.０〜９.０であり、至適ｐＨは約７.５であった（図２参照）。
温度条件の測定
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）中で１５〜６０℃の温度条件にＦＡＯＤを加え、１０分インキュベートした後、通常の条件で活性を測定した。安定な温度領域は１５〜５０℃、好ましくは１５〜４５℃、より好ましくは１５℃であり、酵素反応は、１５〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５℃で効率良く進行する。（図３参照）
【００２２】
４．力価の測定
酵素の力価測定は下記の方法で行った。
（１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方法。
Ａ.速度法
１００ｍＭ フルクトシルバリン（ＦＶ）溶液はあらかじめ得られたＦＶを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ  フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、および酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で２.９５ｍｌとする。２５℃で平衡化した後、１００ｍＭ ＦＶ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
【００２３】
Ｂ.終末法
上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間２５℃でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成した検量線から生成した過酸化水素量を算出することにより、酵素活性を測定する。
（２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法
０.１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌと酵素溶液５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。２５℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ ＦＶ １００μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収された酸素量を求め、これを酵素単位とする。
【００２４】
５．酵素の阻害、活性化および安定化
（１）金属の影響
０.１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）の条件で、終濃度１ｍＭの各種金属イオンを添加し、５分間３０℃でインキュベートした後、活性を測定した。結果を下記の表３に示す。
表３  金属イオンのペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由来ＦＡＯＤ活性への影響
【表３】
0004004081.tif 000004
表３から明らかに、本発明のＦＡＯＤの活性に対し、銅イオン、バリウムイオンが阻害的であり、コバルトイオン、亜鉛イオン、銀イオンおよび水銀イオンは強く阻害する。
【００２５】
（２）各種阻害物質の影響
上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方法で試験した。ただし、パラクロロ安息香酸第二水銀（ＰＣＭＢ）は終濃度０.１ｍＭ、それ以外は１ｍＭとした。結果を表４に示す。安定化の検討は、５０mＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.５)に０.１ｍＭのジチオスイトール（ＤＴＴ）を添加したものに対して一晩透析を行った後、活性を測定することにより行った。
表４  各種物質のＦＡＯＤ活性への影響
【表４】
0004004081.tif 000005
＊１：ＰＣＭＢ，パラクロロ安息香酸第二水銀
＊２：ＤＮＴＢ，５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
＊３：ＥＤＴＡ，エチレンジアミン四酢酸
表４から明らかに、ＦＡＯＤ活性はＰＣＭＢ、ＤＮＴＢ、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、ヒドロキシルアミンにより、強く阻害され、酵素反応にはＳＨ基およびカルボニル基が重要な働きをしていることが予想される。
他方、ジチオスレイトールによって安定化され、保存に適した溶媒はジチオスレイトール０.１ｍＭを添加した５０mＭ リン酸カリウム緩衝液（pＨ７.５）である。
【００２６】
６．分子量
スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過法で求めた結果、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤａ）であった（図４)。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）はデービスの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで、３時間泳動し、タンパク染色は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で行った。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを同様に泳動し、検量線を用いて分子量測定を行った結果、サブユニットの分子量は約４８,７００（４８.７ｋＤａ）であることが示された（図５）。従って、本発明のＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００２７】
７．既知の酵素との比較
既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本発明のＦＡＯＤとを比較した。
表５  種々の微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの比較
【表５】
0004004081.tif 000006
１）：ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Chem., 53(1), 103-110 (1989)
２）：ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Chem., 55(2), 333-338 (1991)
３）：フルクトシルＮα−Ｚ−リジンに対する比活性
４）：Ｎε−Ｄ−フルクトシルＮα−ホルミルリジンに対する比活性
表５から、本発明のＦＡＯＤと他の２種の菌株由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの間に、下記の相違点が認められる。
（１）分子量の相違：本発明のＦＡＯＤは単量体であるのに対し、他の２種の酵素は２量体であり、明らかに異なる。
（２）補酵素：ＦＡＯＤは補酵素として共有結合的に結合したＦＡＤを有するのに対し、他の酵素はいずれも非共有結合的に結合したＦＡＤを有する。
（３）至適ｐＨ、至適温度、およびＳＨ試薬による阻害等の差異はＦＡＯＤと他の２酵素との相違を示している。
【００２８】
さらに、特開平４−４８７４号公報記載のペニシリウム属由来フルクトシルアミノ酸分解酵素と、本発明のＦＡＯＤとを比較すると、下記の相違点が認められる。
（１）基質特異性：特開平４−４８７４号公報記載のフルクトシルアミノ酸分解酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルアラニンに活性を有するのに対し、本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジンとフルクトシルバリンに活性を有し、活性はフルクトシルバリンに対する方が強い。
（２）誘導条件：特開平４−４８７４号公報記載のフルクトシルアミノ酸分解酵素はフルクトシルアミノ酸を含まない培地でも産生されるが、本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジンを含有する培地で培養することによって誘導される。
（３）製造方法：本発明のＦＡＯＤは褐変化培地を用いて培養し、製造する。
【００２９】
既述のごとく、本発明の酵素ＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量に有用である。従って、本発明はまた、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明のＦＡＯＤとを接触させ、酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供するものである。本発明の分析法は、生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量に基づいて行われる。
ＦＡＯＤの酵素活性は下記の反応に基づいて測定される。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ  →
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質またはペプチド残基を表す）
被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿または血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。
【００３０】
本発明のＦＡＯＤをアマドリ化合物含有溶液に、適当な緩衝液中で作用させる。反応溶液のｐＨ、温度は、上記の条件を満たす範囲、即ち、ｐＨ６.０〜９.０、好ましくは７.５、温度は１５〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃である。緩衝液としてはリン酸カリウム等を用いる。ＦＡＯＤの使用量は、終点分析法においては通常、０.１ユニット／ml以上、好ましくは１〜１００ユニット／mlである。
【００３１】
本発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の定量法を用いる。
（１）過酸化水素発生量に基づく方法
当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化水素およびアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記４の力価の測定に準じる。ただし、ＦＡＯＤ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。過酸化水素発色系としては、パーオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により発色する系を用いることができる。色原体として、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、２,４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン等が挙げられる。又パーオキシダーゼの存在下で酸化発色を示すロイコ型発色試薬も用いることができ、そのようなロイコ型発色試薬は、当業者に既知であり、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３,３−ジアミノベンジジン、３,３,５,５−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３,７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。
（２）酸素の消費量に基づく方法
反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引いた値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記４の力価の測定に準じて行う。但し用いるＦＡＯＤ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添加し吸収される酸素量を求める。
【００３２】
本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行うこともできるが、対象となる糖化タンパクによっては、あらかじめ糖が結合したバリン及び／又はリジン残基を遊離させてから行うことが好ましい。
そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる場合（酵素法）と、塩酸等の化学物質を用いる場合（化学法）があるが、前者が好ましい。その場合、本発明方法には当業者に既知である、エンド型及びエキソ型のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を用いることができる。エンド型のプロテアーゼには、例えばトリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロティナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＩＶ、リジルエンドペプチダーゼ、プロレザー、ブロメラインＦ等がある。一方、エキソ型のプロテアーゼにはアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる。酵素処理の方法も既知であり、例えば下記実施例に記載の方法で行うことができる。
【００３３】
上記のごとく、本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルバリンに高い特異性を有することから、糖化ヘモグロビンの測定に有用である。また、糖化タンパクに含まれるフルクトシルリジンにも高い基質特異性を有するものであることから、血液試料中の糖化タンパクを測定することを含む、糖尿病の診断などに有用である。
なお、検体として血液試料（全血、血漿または血清）を用いる場合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の処理をした後用いる。
さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ、パーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いてもよいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例えば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の点でも好ましい。
さらには、酵素と発色色素とを適宜組み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なアマドリ化合物の分析のためのキットを得ることができる。
【００３４】
酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、などがある。結合は共有結合、イオン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方法で行う。
固定化酵素を用いる場合、分析はフロー又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に対する糖化タンパク質の濃度の比率（糖化率）又はフルクトシルアミン量で表される。全タンパク質濃度は、通常の方法（２８０ｎｍの吸光度、ブラッドフォード法、ビュレット法、Ｌowry法あるいは、アルブミンの自然蛍光、ヘモグロビンの吸光度など)で測定することができる。
【００３５】
本発明はまた、本発明のＦＡＯＤを含有するアマドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するものである。
本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬は、本発明のＦＡＯＤ、好ましくはｐＨ６.０〜９.０、より好ましくはｐＨ７.５の緩衝液からなる。該ＦＡＯＤが固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン酸である。
試薬中のＦＡＯＤの量は、終点分析を行う場合、試料あたり、通常１〜１００ユニット／ml、緩衝液はリン酸カリウム（ｐＨ７.５）が好ましい。
過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物を定量する場合、発色系としては、先述の「（１）過酸化水素発生量に基づく方法」に記載の酸化縮合により発色する系、並びにロイコ型発色試薬等を用いることができる。
本発明のアマドリ化合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとすることもできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査に有用であると考えられる。
上記の分析試薬及びキットは、生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンを定量するために用いられるものである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
【００３６】
【実施例】
実施例１  ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由来のＦＡＯＤの製造および精製
ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３（FERM BP-5475；Penicillium janthinellum S-3413）をＦＺＬ ０.５％、グルコース １.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム ０.１％、硫酸マグネシウム ０.０５％、塩化カルシウム ０.０１％, イーストエキス ０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０)１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、攪拌速度５００ｒｐｍの条件で２８℃、３６時間攪拌培養した。培養物は瀘過して集めた。
菌糸体４１０ｇ（湿重量）を、０.１ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５)８００mlに懸濁し、ダイノ・ミルにより菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液（無細胞抽出液）とし、以下の方法で精製した。
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、攪拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清に７５％飽和になるように硫安を加え、撹拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を０.１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５)(以下、緩衝液Ａと略す）に溶解した。得られた酵素溶液を緩衝液Ａに対し一晩透析した。外液の交換は２回行った。透析後の酵素溶液は緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファセルカラム（４.２×２６ｃｍ）にアプライした。活性画分は同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集め、０−５５％飽和の硫安分画に供した。次に２５％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロース６ＦＦ（Low Substitute）カラム（ＨＲ１０／１０）に吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度２５−０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分を集め、硫安濃縮後、得られた酵素溶液を０.１mＭ ＤＴＴを含む０.２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）にて平衡化したスーパーデックス２００ｐｇカラムによりゲル瀘過を行い、７０〜１００ユニットの精製酵素を得た。
【００３７】
精製酵素のＵＶ吸収スペクトルを図６に示す。図６は、本酵素がフラビン酵素であることを示している。
得られた精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分子量を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、デービスの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０でタンパク染色を行った。標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを同様に泳動し、検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分子量は約４８,７００（４８.７ｋＤａ）であることが示された（図５）。
また、スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過による分子量測定では、図４の検量線図から明らかなように、約３８,７００（３８.７ｋＤａ）であった。
本実施例で調製したＦＡＯＤの酵素活性、ｐＨおよび温度安定性、金属および阻害物質による影響などに関しては、前記の値または性質を示した。
【００３８】
実施例２  糖化ヘモグロビン量の測定
１) 試料の処理
０〜１５mgのグリコヘモグロビンコントロールＥ(シグマ社)を１００μlの蒸留水で溶解した。これらの試料に塩酸アセトン(１Ｎ塩酸／アセトン:１／１００)１mlを加え、１２０００回転で１０分間遠心分離した。沈澱物をジエチルエーテル５００μlで洗浄し、減圧乾固した。さらに８Ｍ尿素１００μlを加え、２０分間沸騰水中で加熱後冷却し、５．４ユニット／ml  トリプシン３００μlと混合、３７℃で３時間インキュベートした。その後、沸騰水中で５分間加熱し、試料を調製した。
２) 活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようして調製した。
３mＭ  Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４
−ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液          ３０μl
６０ユニット／ml  パーオキシダーゼ溶液                     ３０μl
０．１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０)                  ３００μl
２５ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液                               ５μl
蒸留水で全量を１mlとした。
２５ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを２５ユニット／mlになるよう、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液(pＨ７．５)で希釈して調製した。
このＦＡＯＤ反応液に上記の各処理基質を１５０μl加え、３０℃でインキュベートし、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの量と吸光度との関係を図７に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸は糖化ヘモグロビンの量を表す。図は、糖化ヘモグロビンの量と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００３９】
実施例３  糖化ヘモグロビン量の測定
１) 試料の処理
３０mgのグリコヘモグロビンコントロールＥ(シグマ社)を蒸留水２００μlで溶解し、８Ｍ尿素、０．２％ＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む５７０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ８．８)１mlと、２−メルカプトエタノール４０μlを添加し、窒素封入下で２時間静置した。その後、１Ｍのヨード酢酸ナトリウム４００μlを添加し、３０分間静置後、２−メルカプトエタノール４０μlを添加した。０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに対して透析した後、１０mg／ml  ＴＰＣＫ−トリプシン１０μlと混合し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、沸騰水中で５分間加熱し試料を調製した。
２) 活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
３mＭ  Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４−
ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液            ３０μl
６０ユニット／ml  パーオキシダーゼ溶液                     ３０μl
０．１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０)                  ３００μl
２５ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液                             １０μl
処理試料                                            ０〜１３．２mg
蒸留水で全量を９００μlとした。
２５ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを２５ユニット／mlになるよう、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液(pＨ７．５)で希釈して調製した。
このＦＡＯＤ反応液を３０℃でインキュベートし、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの量と吸光度との関係を図８に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸は糖化ヘモグロビンの量を表す。図は、糖化ヘモグロビンの量と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００４０】
実施例４  ヘモグロビンＡ１c値の測定
ヘモグロビンＡ０試薬(シグマ社)を蒸留水で２．３mＭになるように溶解した。この溶液を自動グリコヘモグロビン測定装置(京都第一科学)を用いて分画し、ヘモグロビンＡ１c画分とヘモグロビンＡ０画分を分取、精製した。両画分を比率混合することにより、ヘモグロビンＡ１c値０％〜５２．０％の基質試料を得た。
１) 試料の処理
基質試料                                              ２５０μg
５００ユニット／ml  アミノペプチダーゼ溶液                ５μl
１．０Ｍ  トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０)                 １５μl
これらを混合し、蒸留水で全量を２００μlとした。
この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０％トリクロロ酢酸を２００μl加えて撹拌し、０℃で２０分間静置した後１２０００回転で１０分間遠心分離を行った。得られた上清に５Ｎ  ＮaＯＨを約４０μl加え、中性溶液にした。
２) 活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようして調製した。
３mＭ  Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４−
ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液          １００μl
６０ユニット／ml  パーオキシダーゼ溶液                   １００μl
０．１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０)                １０００μl
１６ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液                             １５μl
蒸留水で全量を２．６mlとした。
１６ユニット／ml  ＦＡＯＤ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを１６ユニット／mlになるよう、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液(pＨ７．５)で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各処理基質を４００μl加え、さらに３０分インキュベートした後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる基質のヘモグロビンＡ１c値と吸光度との関係を図９に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸はヘモグロビンＡ１c値を表す。図は、ヘモグロビンＡ１c値と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンのいずれにも特異的に作用する。従って、新たな臨床分析および食品分析法の開発に有用であり、糖尿病の診断や食品の品質管理の面で寄与するところが大きい。特に、血中の糖化タンパク量及び／又は糖化率又はフルクトシルアミン量を指標として、糖尿病の病状の診断に役立つと考えられる。また、本発明のＦＡＯＤを用いるアマドリ化合物の分析試薬および分析方法によって、正確に糖化タンパクを定量することができ、糖尿病の診断、症状管理に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＦＡＯＤの培養培地での産生量と培養時間の関係を示すグラフ。
【図２】  ＦＡＯＤの溶媒中での活性と至適ｐＨの関係を示すグラフ。
【図３】  ＦＡＯＤの溶媒中での活性と至適温度の関係を示すグラフ。
【図４】  スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による分子量測定の結果を示すグラフ。
【図５】  ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由来の精製ＦＡＯＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけて得た移動パターンを示す写真。
【図６】  精製Ｓ−３４１３由来ＦＡＯＤの吸収スペクトル。
【図７】  糖化ヘモグロビン量とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図８】  糖化ヘモグロビン量とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図９】  ヘモグロビンＡ１c値とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図１】
0004004081.tif 000007
【図２】
0004004081.tif 000008
【図３】
0004004081.tif 000009
【図４】
0004004081.tif 000010
【図５】
0004004081.tif 000011
【図６】
0004004081.tif 000012
【図７】
0004004081.tif 000013
【図８】
0004004081.tif 000014
【図９】
0004004081.tif 000015