(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、且つ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物：
（イ）ＧＣ含量が３８〜４０ｍｏｌ％、
（ロ）近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同定されない、ここで、該微生物はラクトバチルス イクイ（Lactobacillus equi）ＹＩＴ  ０４８３株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７７号）である。
【請求項２】
請求項１記載の微生物の培養物および／または該微生物菌体を有効成分として含有することを特徴とする飼料添加物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する新規微生物およびその微生物を含有する飼料添加物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、多くの家畜動物、例えば馬に対して生菌を添加した飼料が使用されており、病気の予防や治療、発育を促進するなど各種有用なものとして知られている。例えば、軽種馬生産現場における馬飼育管理の問題の一つには、種々のストレス状態から誘発される下痢等の身体症状が挙げられる。馬は豚や牛に比べてもともと腸内細菌が少ない動物（例えば豚１×１０１０個に対して馬は１×１０８個の比率）であり、そのうえ環境変化により極端に減少するので、腸内細菌の生態系を構成する腸内フローラが障害を受け、バランスを崩すことにより下痢症などが起こる。このような症状は、消化吸収能力の低下、成長および免疫力の低下といった生理学的機能に悪影響を及ぼすことから軽種馬生産現場に与える経済的損耗は大きい。このような症状を改善するために生菌、中でも乳酸菌を添加した飼料が使用されている。
しかし、従来の生菌（中でも乳酸菌）を添加した飼料は、馬の有用腸内フローラの形成促進には働かず症状の改善に至らないこともあり、効果を示すには早期に安定した腸内フローラを形成させることが望まれる。
【０００３】
また、本発明者らは、以前馬の胃粘膜上皮細胞には乳酸桿菌が層を成して付着して住み着いており、また、胃潰瘍の部分ではこれらの乳酸桿菌の層が消失し、かわってグラム陽性球菌が感染巣を形成していることを見出している（Appl. Environ. Microbiol.,６６：５０３０−５０３４、２０００）。これらのことから乳酸桿菌の胃粘膜上皮細胞に対する付着性は、胃潰瘍発生に対して防御的に働いていることが示唆された。
しかし、従来馬に投与される乳酸桿菌は、宿主である馬の胃粘膜上皮細胞への付着性やその定着性が低く、投与直後に流出してしまう問題が生じており、また投与した乳酸桿菌の宿主特異性が明らかにされたものではない。
また、そのような乳酸菌類が子馬の飼育時の疾病予防、伝染予防に必要な各種抗生物質に対しての感受性、耐性が十分であるとはいえないものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、例えば馬の胃粘膜上皮細胞に対する良好な付着性および定着性、下痢の発生予防効果、早期腸内フローラ形成促進効果、および各種抗生物質耐性を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物、およびその微生物を含有する飼料添加物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、馬の腸内に常在する乳酸桿菌の分布、構成を調べる過程で、優勢菌種として広く分布する一群の未同定菌株を分離し、鋭意探索した結果、ラクトバチルス属に属する微生物の中に、馬の胃粘膜上皮細胞に対して良好に付着し、下痢の発生予防効果があり、早期腸内フローラ形成促進効果に有効な新規微生物が存在することを見出し、上記目的を達成することができた。
【０００６】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に示す１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、且つ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物を提供するものである：
（イ）ＧＣ含量が３８〜４０ｍｏｌ％、
（ロ）近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同定されない。
【０００７】
また本発明は、前記微生物が、ラクトバチルス イクイ（Lactobacillus equi）ＹＩＴ ０４８３株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６７７号）である前記の微生物を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、前記の微生物の培養物および／または該微生物菌体を有効成分として含有することを特徴とする飼料添加物を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物の分離：
本発明の微生物は、例えば以下に示すスクリーニング法により純粋分離することができる。
健康馬の新鮮糞便を採取し、直ちにAnaeroPack（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気条件とし、低温下（０〜４℃）で実験室に移送する。新鮮糞便をグローブボックス内で希釈液（組成：０．０２２５％リン酸水素二カリウム、０．０４５％塩化ナトリウム、０．０２２５％硫酸アンモニウム、０．００２３％塩化カルシウム、０．００２３％硫酸マグネシウム、０．０２２５％リン酸水素カリウム、０．０００１％レサズリン、０．３％炭酸ナトリウム、０．０５％システイン塩酸塩）を加えて均一化した後、さらに適宜希釈し、その一部をＬＢＳ寒天培地（組成：１％カゼイン水解物、０．５％イーストエキストラクト、０．６％リン酸カリウム、０．２％クエン酸アンモニウム、２％デキストロース、０．１％ポリソルベート８０、２．５％酢酸ナトリウム、０．０５７５％硫酸マグネシウム、０．０１２％硫酸マンガン、０．００３４％硫酸鉄、１．５％寒天；ｐＨ５．５（Becton Dickinson社製））に１００μｌ接種し、嫌気条件下で３７℃、３日間塗抹培養する。生育したコロニーから釣菌し、ＭＲＳ寒天培地（組成：１％バクトプロテオーゼペプトン Ｎｏ．３、１％バクトビーフエキストラクト、０．５％バクトイーストエキストラクト、２％バクトデキストロース、０．１％ポリソルベート８０、０．２％クエン酸アンモニウム、０．５％酢酸ナトリウム、０．０１％硫酸マンガン、０．００５％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸水素二カリウム、１．５％寒天；ｐＨ６．８（Difco社製））に塗抹培養（嫌気条件下で３７℃、３日間）を２〜３回繰返して、純粋培養を行うことができる。このようにして純粋培養した本発明の微生物を以下に述べるような方法で同定する。
【００１０】
本発明の微生物の分類学的性質：
本発明の微生物の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿状
（２）細菌の大きさ：０．６〜０．８×１．３〜３．５μｍ
（３）細菌の多形性：無
（４）運動性：無
（５）胞子：無
【００１１】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＭＲＳ寒天平板培養：３７℃、２日間培養によって、直径２ｍｍ程度の白色、スムースコロニーを生じる。
（２）ＭＲＳ液体培養：３７℃、２４時間の培養によって、良好な発育が見られ、静置しておくと沈殿を生じる。
【００１２】
図１は、本発明の微生物をＭＲＳ寒天培地で３７℃、２日間培養した時の生育状態を示した図である。
【００１３】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）硝酸塩の還元：陰性
（３）インドールの生成：陰性
（４）硫化水素の生成：陰性
（５）デンプンの加水分解：陰性
（６）色素の生成：陰性
（７）カタラーゼ反応：陰性
（８）酸素に対する態度：通性嫌気性
（９）乳酸発酵：ホモ型
（１０）グルコースからＤＬ乳酸の生成：陽性
（１１）糖類から酸およびガスの生成の有無
酸生成有り：ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンニトール、マルトース、ラクトース、メリビオース、シュクロース、ラフィノース。
酸生成無し：グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、ｂ−メチルＤ−キシロシド、ソルボース、ドルシトール、イノシトール、ａ−メチルＤ−マンノシド、ａ−メチルＤ−グルコシド、アミグダリン、セロビオース、トレハロース、メレジトース、スターチ、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコネート、２−ケト−グルコネート、５−ケト−グルコネート。
以上の糖発酵性状は、ＡＰＩ ５０ ＣＨ system（BioMerieux）を用いた。
【００１４】
（ｄ）化学分類学的性質
（ＧＣ含量の測定およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション）
本発明の微生物のＧＣ含量の測定、および本発明の微生物と近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、以下の方法に従って行うことができる。
ＧＣ含量の測定方法は、常法の高速液体クロマトグラフィーを用いた Ezakiらの方法（文献名：FEMS Microbiol Lett ５５，１２７−１３０、１９９０）により行うことができる。測定されたＧＣ含量は、３８〜４０ｍｏｌ％である。
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、常法の蛍光標識マイクロプレート法（Int J Syst Bacteriol ３９，２２４−２２９、１９８９）により行うことができる。以下の２０株の近縁菌種の基準株（全てラクトバチルス（Lactobacillus）属）を、本発明の微生物と比較するのに使用できる。
【００１５】
L. acidophilus YIT 0070 (ATCC 4356T)、 L. agilis YIT 0253 (JCM 1187T)、 L. amylovorus YIT 0211 (JCM 1126T)、 L. animalis YIT 0256 (JCM 5670T)、 L. brevis YIT 0076 (ATCC 14869T)、 L. buchneri YIT 0077 (ATCC 4005T)、 L. casei YIT 0180 (ATCC 334T)、 L. coryniformis subsp. coryniformis YIT 0237 (JCM 1164T)、 L. crispatus YIT 0212 (JCM 1185T)、 L. fermentum YIT 0081 (ATCC 14931T)、 L. gasseri YIT 0192 (DSM 20243T)、 L. graminis YIT 0260 (NRIC 1775T)、 L. johnsonii YIT 0219 (JCM 2012T)、 L. murinus YIT 0239 (JCM 1717T)、 L. plantarum YIT 0102 (ATCC 14917T)、 L. reuteri YIT 0197 (JCM 1112T)、 L. rhamnosus YIT 0105 (ATCC 7469T)、 L. ruminis YIT 0221 (JCM 1152T)、 L. salivarius subsp. salicinius YIT 0089 (ATCC 11742T)および L. salivarius subsp. salivarius YIT 0104 (ATCC 11741T)。
【００１６】
本発明の微生物は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで同定されないことから、さらに、常法によりの本発明の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定を行う。
【００１７】
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
本発明の微生物は、ＰＣＲによる遺伝子の増幅および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定を、常法（Microbiol Immunol ４２，６６１−６６７、１９９８）に従って行うことができる。決定した本発明の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物と考えられる。
【００１８】
（系統解析）
本発明の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、DNA Data Bank of Japanから得た既知の近縁菌（ラクトバチルス属微生物）の塩基配列情報を用いて、解析ソフトCLUSTAL W（Thompson et al., 1994）で系統解析し、本発明の微生物と近縁菌との相同性を調べた。
【００１９】
（近縁菌との相同性）
L. cypricasei CCUG 42961：９１．７％
L. salivarius-salicinius DSM 20554：９３．８％
L. aviarius DSM 20655：９１．４％
L. ruminis DSM 20403：９３．４％
L. agilis DSM 20509：９４．７％
L. mali DSM 20444：９２．１％
L. animalis DSM 20602：９０．７％
L. murinus DSM 20452：９０．１％
さらに、上記相同性の結果に基づいて系統樹を作成した。図２は、既知のラクトバチルス属微生物と本発明の微生物との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値である。
【００２０】
以上の分類学的性質により、本発明の微生物は、いままでに報告されていない新規な乳酸桿菌であると判断され、ラクトバチルス イクイ（Lactobacillus equi）と命名した。また、ラクトバチルス イクイ（Lactobacillus equi） ＹＩＴ ０４８３株を独立行政法人産業技術総合研究所に、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８６７７号」として寄託した。
【００２１】
本発明の微生物の調製方法は特に限定されず、常法により行えばよい。例えば、ラクトバチルス属微生物の増殖可能なＭＲＳ broth（Difco Laboratories社製）、ＧＡＭ broth（日水社製）培地に接種し、３７℃で１〜２日間培養して得られる。その後、遠心分離等の手段を用いて、菌体を回収すればよいが、培養液をそのまま使用してもよい。
【００２２】
本発明の微生物は、馬の胃粘膜上皮細胞に対する良好な付着性および定着性を示すことができる。本発明の微生物の培養物および／または該微生物菌体を、定期的に馬に投与することで、胃潰瘍の発生予防に有用である。微生物の培養物および／または該微生物菌体をそのまま使用してもよいが、下記に説明する菌体を含む飼料添加物として使用してもよい。
【００２３】
飼料添加物の製法：
本発明は、本発明の微生物の菌体を飼料添加物として、飼料に添加して使用することができ、特に馬用の飼料添加物とすることが好ましい。該菌体を含む飼料添加物は、下痢の発生予防効果、早期腸内フローラ形成促進効果等の生理効果を与えるものであり、当該効果は、馬に対し特に顕著である。
【００２４】
飼料添加物の製造には、本発明の微生物を培養して回収した菌体および／または培養物を使用することができる。前記培養物は、液体培地で培養した菌体を含む液体培養物であることができる。菌数が多いほど上記の生理効果を高められるが、菌体の培養管理等の作業性、コスト面、投与の簡便さ等を考慮すれば、菌体の投与量は、例えば馬一頭に対し、１日に１×１０１０〜１×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０１０〜１×１０１１ｃｆｕ程度が好ましい。菌体は生菌体をそのまま用いてもよく、または凍結乾燥等の処理を行った保存性の高い菌体を用いてもよく、またはブドウ糖、ショ糖、乳糖、グルタミン酸、アスコルビン酸、脱脂乳、卵アルブミン、澱粉、カゼイン、シュークロース等の賦形剤と共に用いてもよい。なお、死菌体では上記の生理効果が低いため生菌体を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明の飼料添加物は、これを単独で経口投与してもよいが、各種糖質、タンパク質、脂質、繊維質、ビタミン類、ミネラル類等と共に、散剤もしくはペレット状の飼料形態として用いれば、上記のような効果が得られやすく好ましい。特に、脂質、繊維質を含有する飼料と共に用いれば、飼料効率を向上させ、軽種馬経営状好ましい。このとき、用いる脂質や繊維質の種類は、特に限定されず、大豆粕、アルファルファミール、ふすま等の馬用飼料として使用可能なものであればいずれを用いてもよい。
また、飼料の製造は、常法により行えばよく、具体的には製造時定量となるように混合すればよい。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］
（生菌体製法）
ＭＲＳ培地（Difco Laboratories社製）５Ｌを１０Ｌ容フラスコに入れ、ｐＨを６．８に調整して高圧加熱滅菌し、ラクトバチルス イクイ ＹＩＴ ０４８３株を１０７個植菌し、３７℃、２４時間静置培養して培養液を得た。この培養液を１，５００×Ｇで遠心分離し、集菌して得られた菌体は５ｇ／Ｌであった。
【００２８】
［実施例２］
（馬の胃粘膜上皮細胞に対する菌の付着性試験）
実施例１で得られた培養液を１，５００×Ｇで遠心分離し、菌体を回収し、緩衝液（組成：０．８％ＮａＣｌ；０．１２１％Ｋ２ＨＰＯ４；０．０３４％ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．２）で洗浄した菌体（菌数約３×１０８個／ｍｌ）と、出生直後に死亡した新生仔馬から採取した無菌の非腺胃部組織片（大きさ：１ｃｍ×１ｃｍ）とを試験管の中で混合し、３７℃、３０分間培養した後、非腺胃部組織片を緩衝液で洗浄した。次いで、該非腺胃部組織片から胃粘膜上皮細胞を掻き取り、ギムザ染色し、顕微鏡下で一つの胃粘膜上皮細胞に付着した菌数を測定した。また、このような付着性に対する宿主特異性を調べるために無菌ラットの非腺胃部組織片を用いて、前記と同様に一つの胃粘膜上皮細胞に付着した菌数を測定した。また、本菌株の他に６種のラクトバチルス属菌株も同様の方法で測定した。表１に胃粘膜上皮細胞に対する菌の付着性を示した。
【００２９】
【表１】
0003908049.tif 000002
【００３０】
その結果、本菌ラクトバチルス イクイ ＹＩＴ ０４８３（Ｈ−１１６）株は、馬の胃粘膜上皮細胞に対する良好な付着性を示した。また本菌（Ｈ−１１６）株は、ラットの胃粘膜上皮細胞に付着せず、このような胃粘膜上皮細胞に対する菌の付着性は宿主特異性があることが示された。
【００３１】
［実施例３］
（抗生物質耐性試験）
表２に示した各抗生物質を濃度が１００、１０、１、０．１および０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加してＭＲＳ寒天培地（Difco Laboratories社製）を作製した。この抗生物質含有ＭＲＳ寒天培地に、実施例１で得られたラクトバチルス イクイ ＹＩＴ ０４８３株の培養液をそれぞれ１０μｌずつ接種し、嫌気条件下で、３７℃、４８時間塗抹培養した。増殖した菌を肉眼で判定し、各抗生物質に対する最小発育濃度（μｇ／ｍｌ）を求め、表２に示した。
【００３２】
【表２】
0003908049.tif 000003
【００３３】
［実施例４］
（飼料添加物製法）
飼料添加用の凍結乾燥菌末を以下のように製造した。実施例１により得られた培養液を、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．８から７．０に調整した。１，５００×Ｇで遠心して上清を除去後、分散媒（組成：１０％プロテアーゼ処理スキムミルク、０．５％グルタミン酸ナトリウム、０．５％アスコルビン酸）を７％の割合で添加して均一化した。−３０度、２時間の予備凍結の後、常法に従い、凍結乾燥処理をした。凍結乾燥後の重量を測定し、等量の乾燥でんぷん（日本薬局方）を加えて保存した。
【００３４】
［実施例５］
（早期腸内フローラ形成促進効果）
出生後２４時間内の１６頭の仔馬に、実施例４の飼料添加物（ラクトバチルスイクイ ＹＩＴ ０４８３株凍結乾燥菌体１ｇ（菌数は約１×１０１０））を経口投与した。出生後３、７、１４、３０、６０日毎に糞便を採取し、希釈液を加えて均一化した後、さらに適宜希釈し、ＬＢＳ寒天培地（乳酸桿菌選択培地、Becton Dickinson社製）に接種し、嫌気条件下で３７℃、３日間培養し、増殖したコロニー数と希釈率から糞便中の乳酸桿菌数を算出した。コントロールとして実施例４の飼料添加物を投与していない２７頭の仔馬からも同様に糞便を採取し、培養して乳酸桿菌数を算出した。投与後経過日数ごとに、菌体の検出率および糞便１ｇ当たりの平均菌数を表３に示した。なお。検出率（％）は、（乳酸桿菌が検出された仔馬数）／（調べた全ての仔馬数）×１００から算出したものである。
【００３５】
【表３】
0003908049.tif 000004
【００３６】
コントロール群では、全ての仔馬の腸内に乳酸桿菌が定着するのに２週間を要したが、本菌投与群では３日後の検査で全ての仔馬の腸内に乳酸桿菌の定着が検出され、その菌数も高かったことから出生直後に早期腸内フローラ形成促進効果が確認された。
【００３７】
（下痢の発生予防効果）
また、上記の試験において、出生６０日目までの下痢の発生を観察した。コントロール群では１２頭に延べ５８回の下痢が発生したが、本菌投与群では２頭に延べ４回見られただけで、有意な下痢予防効果が観察された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、例えば馬の胃粘膜上皮細胞に対する良好な付着性および定着性、下痢の発生予防効果、早期腸内フローラ形成促進効果、および各種抗生物質耐性を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物、およびその微生物を含有する飼料添加物が提供される。
【００３９】
【配列表】
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0003908049.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微生物をＭＲＳ寒天培地で３７℃、２日間培養した時の生育状態を示した図である。
【図２】既知のラクトバチルス属微生物と本発明の微生物との関係を示した系統樹の図である。
【図１】
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【図２】
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