(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キット。
【請求項２】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キット。
【請求項３】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段とを有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キット。
【請求項４】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の
試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段と有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キット。
【請求項５】
発色を蛍光とした請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項６】
第１の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項７】
第２の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項８】
第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項９】
微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項８記載の微生物検出キット。
【請求項１０】
特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１１】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも２種類以上を分離した状態で含有した請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１２】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持した担体を含有する検体接触手段を有する請求項１または２記載の微生物検出キット。
【請求項１３】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持した担体を含有する検出試薬含有部を有する請求項３または４記載の微生物検出キット。
【請求項１４】
検体接触手段の少なくとも検体接触部の大きさを、光学的な微生物計量装置の受光手段と同等の大きさとした請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１５】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を、検体との接触面に担持させた検体接触手段を有する請求項１または２記載の微生物検出キット。
【請求項１６】
微生物の培養成分を含んだ検体接触手段を有する請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１７】
少なくとも検体と接触させる表面に粘着性を持たせた検体接触手段を有する請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１８】
把手部を有する検体接触手段とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項１９】
特定の波長の光のみを透過させる分光部を設けた請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項２０】
検出試薬含有部に特定の波長の光のみを透過させる手段を有した請求項３乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項２１】
検体を液状の検体とし、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キット。
【請求項２２】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、前記発色した微生物の光を少なくとも一個の受光素子で受光する受光手段を有し、その光を一定時間内において、受光素子で検出された光量から微生物と判断し、積算計量するようにした微生物計量装置。
【請求項２３】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、前記発色した微生物の光を少なくとも一個の受光素子で受光する受光手段を有し、その光を一定時間内において、一個の受光素子で検出された光量が設定したしきい値内に収まる場合に微生物と判断し、積算計量するようにした微生物計量装置。
【請求項２４】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、前記発色した微生物の光を受光した光の中に存在する、照射した励起光によって発光した微生物を認識する受光素子を有し、微生物と認識した一受光素子の周辺に隣接する受光素子が微生物と認識した場合、前記一受光素子と隣接受光素子をまとめて一つの微生物群と判断し、積算計量するようにした微生物計量装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類や真菌類等の微生物が付着あるいは混入している可能性のある検体から、細胞を発色させ、生細胞および死細胞および特定の微生物を一度に計量できる微生物検出キットおよび発色した微生物を計量できる微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物を検出するキットに関するものは、特開平１０−７０９７５に記載されるように粘着性シートや一般的な付着細胞数を求める方法であるプレートカウント法が知られている。図１１にその検出キットの詳細を示す。粘着性シート１０１は粘着層１０２と支持体１０３で構成されている。検体中の微生物を粘着層１０２に接触させ、粘着層１０２表面に捕集し、検出対象の微生物に対する抗体または発色性基質の水溶液を粘着層１０２の表面に付着させ、粘着層１０２表面上の微生物の発色を目視や顕微鏡などで観察することにより、微生物の有無やその数を確認するものであった。
【０００３】
また、図には示していないが一般的な付着菌数を求める方法である培養法の一つとして
プレートカウント法を原理とした付着菌測定キットも知られている。付着菌測定キットは、培地表面を直接検体に接触させ、培地表面に微生物を捕集し、培地表面に付着した微生物をそのまま培養させ、目視や顕微鏡などで観察することにより、微生物の有無判定や数を観測するものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物検出キットは、被検体に粘着シートを接触させ、微生物を捕集後に試薬を塗布する行程を必要とするため、検査作業に時間と技術を有するものであった。また、抗体を用いて特定の微生物を検出する免疫法は、特異的に抗原と結合するため感度は高いが、抗体を使用することを必須としているため、その生産、管理、免疫反応検出手段など抗体の性状そのものに問題点が存在していた。また、免疫法は細胞の生死を判別できるものではない。また、抗体染色を用いると粘着層が染色した色に染まり、染色後、粘着層に付着した検体以外の色を除去する必要があった。また、抗体及び発色性基質を用い、検出部全体を染色するため、特定微生物は検出できるが、一般細菌と同時に検出することができなかった。
【０００５】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、検体接触部に一種類または複数種類の発色性化合物を混入し、細胞捕集と細胞検出を同時に行うことができ、試薬を塗布する行程を減らし、迅速に測定することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。また、特定微生物を検出する際も不純物となる特定微生物以外の微生物やタンパク質を除去する必要がなく、また、検体に混入している不純物や検出対象外の微生物を分離する必要がなく、迅速かつ同時に特定微生物を検出する微生物検出キットを提供することを目的とする。
【０００６】
また、検体接触部と別に発色性化合物を混入した検出試薬含有部を備えることで、検体へ直接、試薬を付着させることなく、検出試薬を検体接触部に添加することによって検出でき、また、検体接触部及び検体試薬含有部に作業者が直接触れることがないため、安全に微生物を検出することができ、微生物検査の作業性を向上させることができ、また、特定微生物を同時に検出することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【０００７】
また、発色を蛍光とすることで、励起光と励起光により発する特定の波長を有する蛍光を制御することができ、検出対象の細胞を容易にかつ簡単に分別することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
また、生死細胞や死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルで生死細胞や死細胞の個数を計量することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【０００９】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることで、生きている微生物のみの個数を計量できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１０】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、感度よく判定できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１１】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、より高い感度で特定微生物の有無を判断することができ、さらに、経時的測定によってその反応性より生死を判定することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１２】
また、反応により発色する化合物を分離することで、それぞれの化合物による発色を目視にて確認できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１３】
また、化合物を担体に担持することで、保存の簡易化が可能となり、検体との接触面積の広大化により検出感度を向上することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１４】
また、化合物を担体に担持することで、保存の簡易化が可能となり、検体との接触面積の広大化により検出感度を向上することができるが、さらに、反応により発色する化合物担持担体を分離することで、それぞれの化合物による発色を目視にて確認できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１５】
また、検体接触手段の少なくとも検体接触部の大きさを、光学的な微生物計量装置の受光手段と同等の大きさを有するものとすることで、検体接触手段上を走査する必要を省くことができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１６】
また、検体接触部の表面上に少なくとも１種類以上の化合物を担持させることで、検体中に含まれる微生物との反応性を向上することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１７】
また、検体接触手段が培養成分を含有することで、捕集した細胞の活性低下を防止することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１８】
また、検体接触部に粘着性を持たせることで、さらに微生物捕集効果を高め、検体に付着した微生物を正確に計量することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００１９】
また、検体の凹凸に対応して、粘着層を加圧することができるため、検体の形状に問わず微生物を捕集することができ、さらに、作業者が検体あるいは検体付着後の検体接触部へ接触することを防止できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００２０】
また、微生物検出キット自体に分光機能を有することで、別途分光手段を必要とせず、発色確認を簡易化できる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００２１】
また、検出試薬含有部に分光機能を備えることで、別途分光手段を必要とせず、発色の確認を簡易化でき、他波長の分光手段への切り替えも容易にすることができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００２２】
また、液状の検体についても、液状の検体が一定の厚みとなるようにした保持槽を有することで、液体の検体にも対応でき、厚みの違いによる誤差を防止することができる微生物検出キットを提供することを目的とする。
【００２３】
また、存在する微生物から生じた発色発光を少なくとも一個の受光素子で受光することで発色発光を認識することができ、その発光を一定時間内で検出することで、発光体の消光による誤差を抑え、正確に微生物数を計量することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００２４】
また、存在する微生物から生じた発色発光の光量が、予め設定したしきい値内に収まった場合に微生物と判断することで、異物の発色発光による誤認識を防止し、正確に微生物数を計量することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００２５】
また、存在する微生物から生じた発色発光を微生物と認識した受光素子周辺に隣接する受光素子に微生物由来の発光が確認された場合、前記受光素子と隣接受光素子をまとめて一つの微生物群と判断することで、隣接した微生物の成長に伴ってコロニーが融合し、一つのコロニーとして認識することにより従来法との相関性を向上することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物検出キットは、上記目標を達成するため、請求項１記載の通り、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出することを特徴とする。そして、本発明によれば検体接触部に一種類または複数種類の発色性基質の試薬を混入し、細胞捕集と細胞検出を同時に行うことができ、試薬の塗布や洗い流す行程を減らし、迅速に測定することができるとともに、特定微生物を検出する際も不純物となる特定微生物以外の微生物やタンパク質を除去、あるいは、分離する必要がないため、さらに迅速に特定微生物を検出できる微生物検出キットが得られる。
【００２７】
また、請求項２記載の微生物検出キットは、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出することを特徴とする。そして、本発明によれば存在する細胞数と特定微生物を同時に測定できる微生物検出キットが得られる。
【００２８】
また、請求項３記載の微生物検出キットは、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段とを有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出することを特徴とする。そして、本発明によれば、検体接触部と別に発色性基質を備えた検出試薬含有部を備えることで、検体接触部にのみ検出試薬を塗布でき、また、検出試薬含有部の形状によっては、直接、検体接触部に検体試薬含有部が触れなくても、検体接触部に検出試薬を迅速に接触させることができる。すなわち、発色性の試薬を検体接触部に残存することを防止し検体接触部に触れることなく作業をすることができ、さらに室内の浮遊菌の混入をも防止することができる微生物検出キットが得られる。
【００２９】
また、請求項４記載の微生物検出キットは、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞の
いずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段と有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出することを特徴とする。そして、本発明によれば、発色性の試薬を検体接触部に残存することを防止し検体接触部に触れることなく作業をすることができ、さらに一般細菌と特定微生物を同時に検出でき、微生物の混入を防止できる微生物検出キットが得られる。
【００３０】
また、請求項５記載の微生物検出キットは、請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、発色を蛍光としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、それぞれの試薬の蛍光波長が異なるため容易に微生物を認識することができる微生物検出キットが得られる。
【００３１】
また、請求項６記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、生死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる微生物検出キットが得られる。
【００３２】
また、請求項７記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる微生物検出キットが得られる。
【００３３】
また、請求項８記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、前記第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、その発色量の相違により、生きている微生物のみを計量することができる微生物検出キットが得られる。
【００３４】
また、請求項９記載の微生物検出キットは、請求項８記載の微生物検出キットにおいて、前記微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、微生物由来物質を酵素タンパク質と限定することで、その反応性から生死を判別できる微生物検出キットが得られる。
【００３５】
また、請求項１０記載の微生物検出キットは、請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、特定微生物由来物質を酵素タンパク質と限定することで、その反応性から生死を判別できる微生物検出キットが得られる。
【００３６】
また、請求項１１記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５記載の微生物検出キットにおいて、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも２種類以上を分離した状態で含有したことを特徴とする。そして本発明によれば、近接した波長の発色の場合でも、目視で判別ができる微生物検出キットが得られる。
【００３７】
また、請求項１２記載の微生物検出キットは、請求項１または２記載の微生物検出キットにおいて、第１の試薬と第２の試薬と第３の試薬と第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検体接触手段としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、担体に担持することで、微生物検出キットの保存を簡易化でき、さらに、検体との接触面積の広大化により、より高い検出能を有する微生物検出キットが得られる。
【００３８】
また、請求項１３記載の微生物検出キットは、請求項３または４記載の微生物検出キットにおいて、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検出試薬含有部としたことを特徴とする。そして、本発明によれば担体に担持することで、微生物検出キットの保存を簡易化し、検体との接触面積の広大化により、より高い検出能を保持し、近接した波長の発色の場合でも、目視で判別ができる微生物検出キットが得られる。
【００３９】
また、請求項１４記載の微生物検出キットは、請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、検体接触手段の少なくとも検体接触部の大きさを、前記検体接触手段から発する光を受光する受光手段と同等の大きさとしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、走査を必要としない微生物検出キットが得られる。
【００４０】
また、請求項１５記載の微生物検出キットは、請求項１または２記載の微生物検出キットにおいて、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を検体と接触させる表面に担持させた検体接触手段としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、検体上の細胞と反応する試薬の量を最小限にすることができる微生物検出キットが得られる。
【００４１】
また、請求項１６記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、微生物を培養させる培地を含有する検体接触手段としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、検体接触後の付着した微生物の活性の低下を防止できる微生物検出キットが得られる。
【００４２】
また、請求項１７記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、検体と接触させる表面に粘着性を持たせた検体接触手段としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、検体に付着した細胞を確実に捕集することができる微生物検出キットが得られる。
【００４３】
また、請求項１８記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、把手部を設けた検体接触手段としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、検体の形状が凹凸であっても、検体表面に粘着層を密着することができる。さらに作業者が検体あるいは検体付着後の検体接触部に接触することを防止できる微生物検出キットが得られる。
【００４４】
また、請求項１９記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、微生物検出キット自体に特定の波長のみを透過させる機能を有したことを特徴とする。そして、本発明によれば、別途分光する必要がないため、発色の確認を簡易化することができる微生物検出キットが得られる。
【００４５】
また、請求項２０記載の微生物検出キットは、請求項３乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、特定の波長のみを透過させる機能を有した検出試薬含有部としたことを特徴とする。そして、本発明によれば、別途分光する必要がないため、発色の確認を簡易化することができ、他波長の分光手段への切り替えも容易に実施することができる微生物検出キットが得られる。
【００４６】
また、請求項２１記載の微生物検出キットは、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットにおいて、検体を液状の検体とし、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、検体が液体の場合でも保持槽に検体を導入、保持することができ、その厚みを一定とすることで、厚みの差による誤差を低減することができる微生物検出キットが得られる。
【００４７】
また、本発明の微生物計量装置は、請求項２２記載の通り、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、前記発光した光を少なくとも一個の受光素子で受光する受光手段と、その光を一定時間内において、受光素子で検出された光量から微生物と判断し、積算計量するようにしたことを特徴とする。そして本発明によれば、受光素子で受光することで発光を認識することができ、その発光を一定時間内で検出することで発光体の消光による誤差を抑え、正確に微生物数を計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００４８】
また、請求項２３記載の微生物検出装置は、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、発色発光した後、前記受光手段で認識した時の光の光量が、予め設定したしきい値内に収まった場合に微生物と判断できることを特徴とする。そして、本発明によれば異物の過大な発光や過少な発光を認識せず、正確に微生物数を計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００４９】
また、請求項２４記載の微生物検出装置は、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を発色させ、前記微生物の発光を受光した受光素子と、その隣接する受光素子に入ってきた光を微生物と認識した場合に、まとめて一つの微生物群と判断することを特徴とする。そして、本発明によれば、微生物を培養した場合に隣接した微生物の成長に伴って、形成されたコロニーが融合し、一つのコロニーとして認識する従来法との相関性を維持することができる微生物計量装置が得られる。
【００５０】
【発明の実施の形態】
生死細胞を発色させる第１の試薬と、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検体接触手段を有した微生物検出キットであり、検体接触手段は、例えば、検出試薬を保持し、検体から微生物を捕集する粘着層と、粘着層を支える支持体と、支持体に隣接するように接している把手で構成されている。そして、生死細胞の核酸と生死細胞を発色させる化合物とが結合することで、生死細胞のみが発色し、生死細胞の有無若しくは、生死細胞数を計量することができるという作用を有する。粘着層には、ペプトン、塩化ナトリウム等を寒天懸濁液と混合した溶液と、生死細胞を発色させる化合物として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩を用い、溶液と生死細胞を発色させる化合物を混合し、滅菌後、発色させる試薬を含んだ前記溶液を容器に入れ、固化したものなどが挙げられる。検体を壁面とすると、把手を用いて壁面に粘着層表面を接触させることで、化合物を含んだ培地表面へ壁面に付着していた生死細胞が付着する。
【００５１】
生死細胞を発色させる第１の試薬と、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入された検体接触手段を有した微生物検出キットであり、例えば、従来、食品衛生での微生物検査の場合、一般細菌数の計量と大腸菌群の有無を確認している。このような場合は、培地上で培養できる微生物数すなわち生細胞計数と、大腸菌群という特定微生物由来物質と反応できる化合物が混入された培地を用いることで、簡単に一般細菌の計数と大腸菌群の有無を同時にかつ迅速に確認できるという作用を有する。
【００５２】
生死細胞を発色させる第１の試薬と、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と、検体接触手段とを有した微生物検出キットである。これにより付着した生死細胞が発色し、生死細胞の存在の判定若しくは、生死細胞数を計量できる。さらに本操作により検出試薬を検体表面に残すことを防止できるという作用を有する。検体接触手段は、例えば、検体から微生物を捕集する粘着層と粘着層を支える支持体と、支持体に隣接するように接している把手で構成される。検出試薬含有部は、例えば、検出試薬を含んだフィルム若しくは面状の層と支持体で構成される。検体接触手段と検出試薬含有部は、検体接触手段の粘着層と検出試薬含有部のフィルム若しくは面状の層が互いに内面となり接触するように、例えば、蝶番で連結される。両者が分離した状態に構成されていてもよい。例えば、検体接触部を一般に市販されている普通寒天培地（ニッスイ製薬製）を粘着層とし、粘着層を支持する支持体で積層され、支持体に隣接するように把手が付けられている構造である。検出試薬含有部は生死細胞を発色させる化合物として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩を保持したフィルムと支持体で構成され、検体接触手段である粘着層表面に把手を用いて検体を接触させ、粘着層表面に検体に付着している細胞を捕集する。捕集後、検出試薬含有部の化合物が保持されているフィルムを粘着層上の細胞付着面に貼り付け、検出試薬含有部が保持していた検出試薬成分を粘着層上に移動させるという手段から構成されている。
【００５３】
生死細胞を発色させる第１の試薬と、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４試薬が混入された検出試薬含有部と検体接触手段とを有した微生物検出キットである。これにより付着した生死細胞が発色し、生死細胞の存在の判定若しくは、生死細胞数を計量できる。さらに同時に大腸菌群の存在の有無も確認できる。すなわち、一般細菌の数と大腸菌群の有無を容易かつ迅速に確認できる。さらに本操作により検出試薬を検体表面に残すことを防止できるという作用を有する。一般細菌数の計量と大腸菌群の有無を確認する場合、一般に市販されている普通寒天培地の培地を用いて検体接触手段が構成され、生死細胞を発色させる試薬として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と大腸菌群由来物質に反応する試薬を保持したフィルムを用いて検出試薬含有部が構成されている。普通寒天培地表面に検体を接触させ、検体に付着している細胞を捕集する。捕集後、各試薬が保持されているフィルムを普通寒天培地上の細胞付着面に貼り付け、保持していた検出試薬成分を普通寒天培地表面に移動させるという手段から構成されている。
【００５４】
発色を蛍光とした前記請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物検出キットであり、蛍光発色により培地表面を覆う検出試薬の色と発色する色が異なるため、発色波長の干渉を防止し、目視でも簡単に識別することができ、さらに正確に計量することができるという作用を有する。
【００５５】
前記第１の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出できる。これにより生死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。
【００５６】
前記第２の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、細胞内に存在する核酸の染色を指標としているため、染色後、一細胞レベルで検出でき、これにより死細胞の数をさらに高精度に計量することができるという作用を有する。
【００５７】
前記第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、生細胞の代謝物と反応するため、その反応性より生死を判定できるという作用を有する。
【００５８】
前記微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項８記載の微生物検出キットであり、その反応性より生細胞の生死を判定できるという作用を有する。
【００５９】
前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物検出キットであり、その反応性より特定微生物の生死を判定できるという作用を有する。
【００６０】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも２種類以上を分離した状態で含有した請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、各化合物を分離することで、反応により近接した波長の発色を有する試薬も目視にて確認できるという作用を有する。
【００６１】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検体接触手段とした請求項１または２記載の微生物検出キットであり、担体に担持することで保存を容易化し、検体との接触面積の広大化により検出感度を高めることができるという作用を有する。
【００６２】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検出試薬含有部を有した請求項３または４記載の微生物検出キットであり、担体に担持することで、保存を容易化し、検体との接触面積の広大化により検出感度を高めることができ、各試薬を担持した担体を分離することで、反応により近接
した波長の発色を有する化合物も目視にて確認できるという作用を有する。
【００６３】
検体接触部の大きさが受光手段と同等の大きさを有する請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物検出キットであり、受光手段と同等の大きさを有することで走査の過程を省き、より迅速に検出できるという作用を有する。
【００６４】
第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を検体と接触させる表面上に含有させた検体接触手段とした請求項１または２記載の微生物検出キットであり、検体接触部のみに担持させることで、検体中に含まれる微生物との反応性を向上できるという作用を有する。
【００６５】
微生物を培養させる培地を含有する検体接触手段とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、細胞の活性を維持、あるいは活性が低下した細胞の活性を向上させ、反応性を向上できるという作用を有する。
【００６６】
検体と接触させる面に粘着性を持たせた検体接触手段とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、検体接触部に粘性を持たせることで、細胞を確実に捕集することができるという作用を有する。
【００６７】
把手部を設けた検体接触手段とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、検体の形状を問わず微生物を捕集することができ、さらに、作業者の検体あるいは検体付着後の検体接触部への接触を防止できるという作用を有する。
【００６８】
微生物検出キット自体に特定の波長のみを透過させる機能を有した請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、別途分光手段を必要とせず、発色の確認を簡易化できるという作用を有する。
【００６９】
特定の波長のみを透過させる機能を有した検出試薬含有部を含む請求項３乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、検出試薬含有部に分光機能を有することで、別途分光手段を必要とせず、発色の確認を簡易化でき、他波長の分光手段への切り替えも容易に実施することができるという作用を有する。
【００７０】
検体を液状の検体とし、前記検体接触手段をその検体を保管する保管槽とし、保管槽に貯蔵された液状の検体が一定の厚みとなるようにした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出キットであり、液状の検体も一定条件下に保存できる機能を有することで、検出を簡易化することができ、さらに、液状検体を一定の厚みとなるように設定することで厚みの違いによる誤認識を防止し、正確な検出を実施することができるという作用を有する。
【００７１】
発色発光を利用して微生物を計量する微生物計量装置であって、受光した光を受光素子で受光し、その光の一定時間内における光量から、微生物数を判断する微生物計量装置であり、前記発色発光した光を受光する受光手段を有することで、発光体を認識することができる。さらに、その光を一定時間内に受光素子で検出された光量に制限を設けることで、発色発光中の微生物が消光した場合に生じる誤認識を防止し、正確な発色発光を認識し、それを積算計量することで微生物数を正確に認識することができるという作用を有する。
【００７２】
発色発光を利用して微生物を計量する微生物計量装置であって、前記発色を受光手段で受光した発光強度に予め設定したしきい値を設け、前記しきい値範囲内に収まった場合に微生物と判断する微生物計量装置である。これにより、異物による過剰若しくは過少な発色を微生物と区別することができ、しきい値内の発光を積算計量することで微生物数を正確に認識することができるという作用を有する。
【００７３】
発色発光を利用して微生物を計量する微生物計量装置であって、微生物の発光を認識した受光素子とその隣接する受光素子に入ってきた光を微生物と認識した場合に、まとめて一つの微生物群と判断する微生物計量装置である。これにより、従来法の一つであるプレートカウント法において、隣接した微生物がその成長に伴ってコロニーを形成する際に、隣接したそれぞれのコロニーが融合して一つのコロニーとして認識される場合と相関性を維持することができるという作用を有する。
【００７４】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００７５】
本発明の微生物検出キットを図１に示す。図１において、検出キット１は生死細胞を発色させる第１の試薬として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（誘導体であってもよい）２と、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬としてプロピデュームイオダイド（誘導体であってもよい）３と、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬として６−カルボキシフルオレセインジアセテート（誘導体であってもよい）４と特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する第４の試薬として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（誘導体であってもよい）５とが混入された粘着層１０２と、支持体１０３と、把手部６で構成されている。粘着層１０２には肉エキスとぺプトンと塩化ナトリウムと寒天を含んだ寒天培地成分を含み、前記試薬２、３、４、５を混合し、滅菌後、固化したものである。なお、図１においては前記試薬２、３、４、５を全て混入したが、いずれか１種類の試薬を混入するだけでもよいし、２種類の化合物を混入するものであってもよいし、３種類の試薬を混入するものであってもよい。
【００７６】
細胞、微生物の検査方法は、検体に付着した細胞、微生物を前記試薬の含有した寒天培地成分の粘着層１０２に付着させるため、把手部６を用いて検体の凹凸面と粘着層１０２を加圧し、検体と寒天培地成分の粘着層１０２を固定した支持体１０３で密着させる。
【００７７】
検体に付着している細胞、微生物が寒天培地成分の粘着層１０２に付着後、寒天培地に含有した前記試薬２、３、４、５が細胞、微生物と反応し、含有試薬ごとに結合し発色する。発色する細胞を計量することで、存在する生死細胞、死細胞、生細胞を確認することができる。
【００７８】
生死細胞を発色させる４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と死細胞を発色させるプロピデュームイオダイドは細胞膜を通過して核酸と結合する。
【００７９】
結合後、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して蛍光波長４６１ｎｍの光を発し、生死細胞のみ発色させる。また、プロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長を吸収して蛍光波長６１７ｎｍの光を発し、死細胞のみ発色させる。
【００８０】
さらに、６−カルボキシフルオレセインジアセテートは、細胞により生産されたエステラーゼにより分解されフルオレセインとなり励起光に対し蛍光を発する。
【００８１】
また、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドは、大腸菌群が生産するβ−ガラクトシダーゼと反応し、４−メチルウンベリフェロンとなり励起光に対し蛍光を発する。
【００８２】
また、実使用例として、普通寒天培地に検出試薬である４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩とプロピデュームイオダイドと６−カルボキシフルオレセインジアセテートと４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含んだ滅菌された寒天を粘着層としたものに直接、空調機の排水槽の壁面に把手を用い接触させ、励起光を発する顕微鏡の上に置き、粘着表面に励起光の照射した。照射された細胞は各波長で発色し、蛍光を分光する分光フィルムを通して蛍光を発している各細胞数を目視で計量した。検体から菌を捕集してから、２〜３分で測定した。また比較のため、排水槽の壁面の微生物を一般細菌用の標準寒天フードスタンプ（ニッスイ製）と大腸菌群検出用のデトキシコレートフードスタンプ（ニッスイ製）で捕集、培養し、検出した細胞数も計量した。しかし、フードスタンプは生死細胞、死細胞が検出できなく、また、好熱菌や特別な細菌の培養ができないため、細胞数は本発明の微生物検出キットよりも少なく検出された。また大腸菌群は、本発明の微生物検出キットを使用した検出数と同等の大腸菌群生菌数が検出された。
【００８３】
以上のように本発明は発色した蛍光波長や発光量の違いにより生死細胞と死細胞から発せられる光量をそれぞれ計量し、生細胞、死細胞の数を計量する。さらに、大腸菌群や生細胞の存在の有無を確認することができる。
【００８４】
また、付着菌の計量方法としては、顕微鏡等の拡大レンズで、２００乃至１０００倍にて検出することができる。
【００８５】
なお、寒天培地は、滅菌後、冷却固化を行ったが、寒天を除いて、液体培地でも、生細胞の有無を確認することができる。
【００８６】
なお、特定微生物を大腸菌群としたが、黄色ブドウ球菌や腸炎ビブリオ等の微生物を対象とすることができる。
【００８７】
なお、検体接触手段を寒天培地としたが、アラビアゴム、ゼラチンなどの水溶性高分子やビニルアルコール、アクリルなどの水溶性モノマーを重合したポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、さら水溶性モノマーの二分子以上の重合体など、検体より細胞を付着することができるものであればよい。
【００８８】
以下実施例２について説明する。図２に構成図を示す。検出キット１は、生死細胞を発色させる第１の試薬として、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩２と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬としてプロピデュームイオダイド３と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬として、６−カルボキシフルオレセインジアセテート４と特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する第４の試薬として、大腸菌群を測定できる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド５が試薬含有容器７を混入している。試薬含有容器７は接続管８により検体接触容器９に連結して構成されている。また、図には示していないが、検体接触容器９には、生理食塩水等の水溶液が満たされている場合もある。なお、図２においては前記試薬２、３、４、５を全て混入したが、いずれか１種類の試薬を混入するだけでもよいし、２種類の試薬を混入するものであってもよいし、３種類の試薬を混入するものであってもよい。
【００８９】
上記検査キット１は、細胞、微生物が含まれる水溶液若しくは綿棒などで検体から採取された微生物を検体接触容器９に注ぎ、または、検体接触容器９内の水溶液に溶かす。そして、試薬含有容器７に入った４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩２やプロピデュームイオダイド３、６−カルボキシフルオレセインジアセテート４や大腸
菌群を測定できる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド５を接続管８を通して検体接触手段としての検体接触容器９に入った細胞と混合し、各試薬の発色から死細胞、生死細胞、生細胞、特定の微生物数を計量する。
【００９０】
また、図３に示すように、試薬含有容器の代わりに試薬含有シート１０を使用し、検体接触容器の代わりに検体保有容器１１を使用して構成しても、同様な効果を生ずる。
【００９１】
また、実使用例として、検体接触手段として普通寒天培地層を用い、検出試薬含有部として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩とプロピデュームイオダイドと６−カルボキシフルオレセインジアセテートと４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含んだ溶液を保持したフィルムで構成された検出キットを使用した。検体接触手段である普通寒天培地を空調機の排水槽の壁面に接触させ、接触後、検出試薬を含有したフィルムを、壁面に接触させた普通寒天培地表面に密着させた。検出接触手段と検出試薬含有部を密着させたまま、励起光を発する顕微鏡の上に置き、励起光を照射する。照射された細胞は各波長で発色し、蛍光を分光する分光フィルムを通して蛍光を発している各細胞数を目視で計量した。検体から菌を捕集してから、２乃至３分で測定した。また比較のため、排水槽の壁面の微生物を一般細菌用の標準寒天フードスタンプ（ニッスイ製）と大腸菌群検出用のデトキシコレートフードスタンプ（ニッスイ製）で捕集、培養し、検出した細胞数も計量した。しかし、フードスタンプは生死細胞、死細胞が検出できなく、また、好熱菌や特別な細菌の培養ができないため、細胞数は本発明の微生物検出キットよりも少なく検出された。また大腸菌群は、本発明の微生物検出キットを使用した検出数と同等の大腸菌群生菌数が検出された。
【００９２】
上記構成により、検体に直接化合物を接触することによる化合物の検体への移動を防止することができ、検体中に存在する微生物を検出することができる。
【００９３】
以下実施例３について説明する。図４に構成図を示す。検出キット１は生死細胞を発色させる第１の試薬として、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩２を細孔を有する活性炭を原料とした担体１２に担持したものが表面に保持された試薬含有シート１０と検体接触手段である粘着層１０２と粘着層１０２を保持する支持体１０３と、検体を密着させるための把手６で構成されている。
【００９４】
上記構成により、細孔を有する担体１２の細孔内に担持された４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩２は、自然放置による温熱や自然光に含まれる紫外線もしくは空気による酸化から保護され、検出キット１を長時間保管することができる。
【００９５】
なお、死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬としてプロピデュームイオダイドや、生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬として、６−カルボキシフルオレセインジアセテートや、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する第４の試薬として、大腸菌群を測定できる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドも細孔を有する担体１２のような細孔を持つ担体に担持することで、保存を容易化し、検体との接触面積の広大化により検出感度を向上することができる。
【００９６】
なお、実施例では、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩を細孔を有する活性炭を原料とした担体１２に担持したが、プロピデュームイオダイドと６−カルボキシフルオレセインジアセテートと大腸菌群を測定できる４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを混合し、活性炭１０に担持しても、同様な効果を得ることができる。
【００９７】
また、担体１２は細孔を有する担体としたが、ゼオライト、シリカゲルのような細孔を持つ担体であれば、同様な効果を得ることができる。
【００９８】
以下実施例４について説明する。図５に構成図を示す。
【００９９】
検出キット１は生死細胞を発色させる第１の試薬として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩２を細孔を有する活性炭を原料とした担体１２に担持したものと、生細胞を発色させる試薬として６−カルボキシフルオレセインジアセテート４を細孔を有する活性炭を原料とした担体１２に担持したものとを、表面を分割して保持した試薬保持層１０と、粘着層１０２と、粘着層１０２を保持する支持体１０３と、検体を密着させるための把手６で構成されている。
【０１００】
上記構成により、検体より粘着層１０２へ付着した生死細胞や死細胞、あるいは、大腸菌群や生細胞に、試薬保持層１０に含有される担体１２から蛍光試薬が移動し、各種細胞を染色する。その際、試薬保持層１０を二分割し、各々に前記組み合わせの試薬を保持した担体１２を保持し、検出の際にそれぞれの分割面へ蛍光試薬特有の波長を照射し、目的の細胞を発色させる。
【０１０１】
これにより、一度に大腸菌群の有無、若しくは、全菌数、生菌数、死菌数を検出することが可能となり、検体の状態を短時間に把握できる。
【０１０２】
なお、担体は、活性炭のみとは限らない。
【０１０３】
なお、試薬の担持は１種類でも有効な効果を得ることができる。
【０１０４】
以下実施例５について説明する。図６（ａ）に構成図を示す。
【０１０５】
検出キット１は、検体に直接接触し、検体に付着している細胞を採取するための粘着層１０２と、粘着層１０２を支持するための支持体１０３と、検出キットの操作性を向上するための把手６と、細胞の存在によって発色する試薬を細孔内に含有した担体１２と、その担体１２を保持するための試薬含有シート１０と、照射した励起光を目的の波長の光に分光する分光フィルム１３で構成されている。
【０１０６】
上記構成により、粘着層１０２に付着した生死細胞や死細胞、特定微生物を担体１２内に担持した発色試薬で染色し、そこに分光フィルム１３を介して励起光を照射するものである。励起光は、分光フィルム１３を介して粘着層１０２に付着している細胞を発光させるため、光源の波長が幅広いものであっても、検出キットのみで検出、計量できる。
【０１０７】
なお、分光フィルム１３は、励起光を分光する場合だけでなく、蛍光をも分光する場合も可能である。
【０１０８】
なお、分光フィルム１３は、励起光を分光するフィルムと蛍光を分光するフィルムを重ね合わせることで、励起光の分光とそれによって生じる蛍光の分光を一度に行うことも可能である。
【０１０９】
なお、図６（ｂ）に示すように、分光フィルム１３を支持体１０３に設けることも可能である。
【０１１０】
以下実施例６について説明する。図７に構成図を示す。
【０１１１】
液状検体検出キット１４は、液状検体を投入する投入口１５と過剰な液状検体や液状検体検出キット１４内に予め含まれる空気を排出するための排出口１６を有する。また、液状検体検出キット１４は、少なくとも検出部１７が存在する方向の面が光透過面１８となっており、検出部で検出できる構造となっている。さらに、光透過面１８と対面に存在している面１９は、平行な位置関係に有り、傾斜を生じない構成を有している。
【０１１２】
上記構成により、検体が液状の状態でも一定空間内に保持することができる。また、液状検体に含有される微生物が、液状検体検出キット１４内に導入された際、光透過面１８と対面に位置する面１９の間が一定の厚みに保持されているため、微生物が互いに重なり合うことなく、一定の範囲に拡散させることができる。これにより、重なり合いによる過少評価を防ぐことが可能となり、検出部１７に設置されている検出手段による正確な計量が可能となる。
【０１１３】
なお、異物を除去するために投入口１５の前にフィルタを設けることで微生物を検出するための感度を向上することができる。
【０１１４】
なお、光透過面１８の構成を紫外線等の励起光に影響しないものとすることでその妨害を防ぐことができる。
【０１１５】
なお、光透過面１８とその対面に位置する面１９の距離を０．５乃至１５μｍの範囲内とすることで微生物の重なりを防止し、正確な判別が可能となる。
【０１１６】
以下実施例７について説明する。図８は蛍光減衰曲線図である。
【０１１７】
蛍光色素に励起光を照射し続けた場合、励起光によって発光する蛍光強度は、退色のため、曲線２０に示すような減衰曲線を形成する。減衰曲線内に存在する最大蛍光強度を含むその周辺の強度を保持する一定時間２１を設けるという構成を有している。
【０１１８】
上記構成により、曲線２０に示すように減衰した蛍光強度は、減衰後に計量を実施した場合、計量されない場合でも、最大蛍光強度を含むその周辺の強度を保持する一定時間２１を設け、その時間内に積算計量を実施することで蛍光色素の退色による誤認識を防止し、正確な計量が可能となる。
【０１１９】
なお、一定時間２１は、色素固有のものとすることも可能であり、色素によって設定時間を変化させるということもできる。
【０１２０】
以下実施例８について説明する。図９は蛍光強度に伴うしきい値表示図である。
【０１２１】
検体接触手段上に存在する発色発光する微生物を検知した場合、図９に示すような蛍光強度２２を得ることができる。その蛍光強度に微生物の蛍光強度に由来した最大しきい値２３と最小しきい値２４を設け、その間に存在する蛍光強度２２を微生物由来の蛍光と認識し、積算計量するものである。
【０１２２】
上記構成により、異物が含まれる蛍光強度２２の中にあって、微生物の蛍光強度に由来した最大しきい値２３と最小しきい値２４の間に存在した蛍光強度を有するピークを微生物と認識し、それ以外を異物として計量しないことにより、正確な計量が可能となる。
【０１２３】
なお、しきい値は、色素によって異なる場合も可能であり、それぞれに適応した設定時間を設けることも可能である。
【０１２４】
以下実施例９について説明する。図１０に構成図を示す。
【０１２５】
検体接触手段上に存在する発色発光した微生物をＣＣＤ像２５に示した。ＣＣＤ素子２６で認識した場合、各ピクセル内に微生物由来の発光が認識される。その際、菌Ａ２７を認識したピクセル周辺に菌Ｂ２８を認識したピクセルや菌Ｃ２９を認識したピクセルが存在している場合、結像図３０に示すように菌Ａ２７、菌Ｂ２８、菌Ｃ２９を菌群３１として認識させるようにしたものである。また、菌Ｄ３２に示すような一つのピクセル内に認知された場合は、結像３０に示すように一つの菌Ｅ３３として認識させ、積算計量するものである。また、ＣＣＤ像２５にある位置状態の菌を培養した場合、培地３４に示すようなコロニーＡ３５やコロニーＢ３６を形成する。
【０１２６】
上記構成により、菌数が多い場合、隣接する菌を一つの菌群３１として認識させ、一つの輝点として積算計量することで、従来法の一つである培養法で実施した場合、菌群が一つのコロニーとして形成されることを考慮に入れ、従来法との相関性を持たせることが可能となる。
【０１２７】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キットにより、細胞捕集と細胞検出を同時に行うことができ、培養を伴わず生死細胞、死細胞、特定微生物をリアルタイムでモニタリングができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１２８】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入され微生物を捕集または付着するようにしてなる検体接触手段を有し、微生物の有無を検査する検体の表面に前記検体接触手段を接触させることで、微生物を前記検体接触手段に捕集または付着させ、前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キットにより、存在する細胞数と特定微生物を同時に測定でき、生死・生・死細胞と特定微生物を検出することができるため、抗菌効果の判定にも適用できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１２９】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段とを有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キットにより、検体試薬含有部が直接、検体接触部に触れなくても、
検体接触部に検出試薬を迅速に接触させることができ、発色性の試薬が検体接触部に残存することを防止し、検体に付着した細胞数、菌種を迅速かつ同時に計量することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３０】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と、死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬が混入された検出試薬含有部と、微生物の有無を検査する検体の表面に接触させることで、微生物を捕集または付着させる検体接触手段と有し、前記検出試薬含有部と前記検体接触手段を接触させるようにしてなることで前記検体接触手段に捕集または付着した微生物を検出する微生物検出キットにより、発色性の試薬を検体接触部に触れることなく検体接触部に残存するのを防止し、検体に付着した細胞や微生物が大量な場合でも、生死・生・死細胞と特定微生物を検出することができ、また特定微生物の生死の判別ができるため、汚染された食品などの評価に適用することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３１】
また、発色を蛍光とした微生物検出キットにより感度を高め、さらに異なる蛍光を発する検出試薬を使用することにより光の干渉による防止することで、作業者の誤認を防止できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３２】
また、前記第１の試薬を核酸結合性の試薬とした微生物検出キットにより一細胞レベルで正確に検出することができるため、生死細胞数を計量できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３３】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬とした微生物検出キットにより、一死細胞レベルで正確に検出することができるため、死細胞数を計量できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３４】
また、前記第３の試薬を微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした微生物検出キットにより、生きた微生物量を把握し、生きた微生物の汚染度を把握することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３５】
また、前記微生物由来物質を酵素タンパク質とした微生物検出キットにより、生きた微生物量を感度よく把握し、生きた微生物の汚染度を感度よく把握することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３６】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした微生物検出キットにより、病原菌などの微生物の存在をさらに精度良く把握することができ、医療などの現場において環境調査や汚染状況の迅速把握に適用できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３７】
また、第１の試薬と第２の試薬と第３の試薬と第４の試薬の中で少なくとも２種類以上を分離した状態で含有した微生物検出キットにより、反応により近接した波長を発する試薬でも、目視にて容易に検出できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３８】
また、第１の試薬と第２の試薬と第３の試薬と第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検体接触手段を有した微生物検出キットにより、検出キットを容易に保存することができ、検体との接触面積の広大化により、より高い感度で検出でき
るという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１３９】
また、第１の試薬と第２の試薬と第３の試薬と第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を担持する担体を含有する検出試薬含有部とした微生物検出キットにより検出キットを容易に保存することができ、検体との接触面積の広大化により、より高い感度で検出できるという効果がある。さらに、反応により近接した波長を発する化合物でも、目視にて容易に検出できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４０】
また、前記検体接触手段から発する光を受光する受光手段と同等の大きさの検体接触手段を設けた微生物検出キットにより、走査を必要とせず細胞を検出できるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４１】
また、第１の試薬と第２の試薬と第３の試薬と第４の試薬の中で少なくとも１種類以上を検体と接触させる表面に担持させた検体接触手段とした微生物検出キットにより試薬の量を最小に抑えることができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４２】
また、微生物を培養する培地を含有する検体接触手段とした微生物検出キットにより、微生物の活性維持や、微生物の活性低下防止が可能となり、より高感度に検出することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４３】
また、検体と接触させる表面に粘着性を持たせた検体接触手段とした微生物検出キットにより、検体に存在する微生物を正確に捕集することができるため、検体の微生物汚染状態を確実に把握することができるという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４４】
また、把手部を設けた検体接触手段とした微生物検出キットにより、作業者が検体若しくは検体と接触した検体接触部に触れることを防止するという効果のある微生物検出キットを提供できる。
【０１４５】
また、微生物検出キット自体に特定の波長のみを透過させる機能を有した微生物検出キットにより、別途分光する必要がないため、発色の確認を簡易化することができる微生物検出キットを提供できる。
【０１４６】
また、特定の波長のみを透過させる機能を有した検出試薬含有部とした微生物検出キットにより、別途分光する必要がないため、発色の確認を簡易化することができ、他波長の分光手段への切り替えも容易に実施することができる微生物検出キットを提供できる。
【０１４７】
また、液体の検体についても、検体が一定の厚みに保つことができる保持槽を有する微生物検出キットにより、検体が液体の場合であっても保持槽内において、その中に含有される微生物を一定の状態に保持でき、かつ、厚みを一定とすることで厚みの差による誤差を低減することができる微生物検出キットを提供できる。
【０１４８】
また、発色発光を利用して微生物を計量する上で、その発光した光を少なくとも一つの受光素子で受光する手段と、その光を一定時間内において受光し、微生物と判断することで、発光した光を受光素子で認識することができ、その発光を一定時間内で検出することで発光体の消光による誤差を抑え、正確に微生物数を計量することができるという微生物計量装置を提供できる。
【０１４９】
また、発色発光して認識した発光強度を予め設定したしきい値内に収まった場合に微生物と判断することで、異物と微生物を分別し、正確に微生物数を計量できるという微生物計量装置を提供できる。
【０１５０】
また、微生物の発光を認識した受光素子とその隣接する受光素子に入ってきた光を微生物と認識した場合、まとめて一つの微生物群と判断することで、微生物を培養した場合に隣接した微生物の成長に伴ってコロニーが融合し、一つのコロニーとして認識する従来法の一つである培養法との相関性を維持することができるという微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例１の微生物検出キットの構成図
【図２】  同実施例２の試薬含有容器と検体接触容器を有する検出キットの構成図
【図３】  同試薬含有シートを備えた検出キットの構成図
【図４】  同実施例３の試薬含有シートに担体を保有した検出キットの構成図
【図５】  同実施例４の試薬含有シートに試薬を担持した担体を分離して保有した検出キットの構成図
【図６】  （ａ）同実施例５の分光フィルムを備えた検出キットの構成図
（ｂ）同分光フィルムを支持体に設けた検出キットの構成図
【図７】  同実施例６の液状検体検出キットの構成図
【図８】  同実施例７の蛍光減衰曲線図
【図９】  同実施例８の蛍光強度に伴うしきい値表示図
【図１０】  同実施例９の菌認識手段の構成図
【図１１】  従来例の検出キットの構成図
【符号の説明】
１ 検査キット
２ ４’，６−ジアミジノ−２−フェニインドール二塩酸塩若しくはその誘導体
３ プロピデュームイオダイド若しくはその誘導体
４ ６−カルボキシフルオレセインジアセテート若しくはその誘導体
５ ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド若しくはその誘導体
６ 把手
７ 試薬含有容器
８ 接続管
９ 検体接触容器
１０ 試薬含有シート
１１ 検体保有容器
１２ 細孔を有する担体
１３ 分光フィルム
１４ 液状検体検出キット
１５ 投入口
１６ 排出口
１７ 検出部
１８ 光透過面
１９ 面
２０ 曲線
２１ 一定時間
２２ 蛍光強度
２３ 最大しきい値
２４ 最小しきい値
２５ ＣＣＤ像
２６ ＣＣＤ素子
２７ 菌Ａ
２８ 菌Ｂ
２９ 菌Ｃ
３０ 結像
３１ 菌群
３２ 菌Ｄ
３３ 菌Ｅ
３４ 培地
３５ コロニーＡ
３６ コロニーＢ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004004740.tif 000008
【図８】
0004004740.tif 000009
【図９】
0004004740.tif 000010
【図１０】
0004004740.tif 000011
【図１１】
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