(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＴＸＡ遺伝子および不活化されたＲＴＸＣ遺伝子を含むオペロンを含むアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（ＡＰＰ）の遺伝的に修飾された株であって、ＲＴＸ構造ポリペプチドがＲＴＸＡ遺伝子によってコードされており、該ＲＴＸ構造ポリペプチドの活性化が分泌前に該不活化されたＲＴＸＣ遺伝子によって妨げられ、該ＲＴＸ構造ポリペプチドが非毒性の形態で分泌されて宿主でＲＴＸ毒素およびＡＰＰによる感染に対する防御免疫を誘発することを特徴とする、ＡＰＰの遺伝的に修飾された株。
【請求項２】
該ＲＴＸＣ遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している請求項１に記載のＡＰＰの遺伝的に修飾された株。
【請求項３】
該ＲＴＸＣ遺伝子が、単一または複数のヌクレオチドの置換、単一または複数のヌクレオチドの付加および／または該ＲＴＸＣ遺伝子の完全なまたは部分的な欠失を含めて単一または複数のヌクレオチドの欠失_を含む該ＲＴＸＣ遺伝子からのＤＮＡの導入および欠失、標的構築またはプラスミド分離を用いた相同組換え、および化学的に誘発された、放射線で誘発されたまたは部位特異的な突然変異誘発を含む組換えＤＮＡ技術によって不活性化されている、請求項１に記載のＡＰＰの遺伝的に修飾された株。
【請求項４】
該ＲＴＸ構造ポリペプチドがＡＰＸ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３よりなる群から選ばれる請求項１に記載のＡＰＰの遺伝的に修飾された株。
【請求項５】
請求項１に記載のＡＰＰの遺伝的に修飾された株を含む生物学的ベクター。
【請求項６】
該生物学的ベクターによって発現される生物学的に活性である分子をコードする遺伝子をさらに含み、該分子が宿主動物中で生物学的応答を増強することができるものであることを特徴とする、請求項５に記載の生物学的ベクター。
【請求項７】
該生物学的に活性である分子が_機能的な分子である請求項６に記載の生物学的ベクター。
【請求項８】
該機能的な分子が成長因子、ホルモン、酵素、抗原およびその抗原性の部分、およびサイトカインよりなる群から選ばれる請求項７に記載の生物学的ベクター。
【請求項９】
該サイトカインがインターロイキン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子よりなる群から選ばれる請求項８に記載の生物学的ベクター。
【請求項１０】
該ＡＰＰがＡＰＰに固有の２またはそれ以上の抗原エピトープに対する免疫応答を誘発することができる請求項５に記載の生物学的ベクター。
【請求項１１】
該免疫応答が該ＡＰＰのビルレント形態および該ＡＰＰによって発現される異種抗原に対して誘発される請求項１０に記載の生物学的ベクター。
【請求項１２】
該免疫応答が、ＲＴＸ構造ポリペプチドまたはＲＴＸ毒素、および病原性因子のパスツレラ種、ヘモフィルス種、セルプリナ・ヒョディセンテリエ、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、大腸菌、マイコバクテリウム種、またはＨＣＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ、ＴＧＥＶまたはＰＰＶを含むウイルス病原体の少なくとも１つの抗原エピトープに対して誘発される請求項１１記載の生物学的ベクター。
【請求項１３】
該免疫応答が、ＲＴＸ毒素およびアクチノバシラス種からの病原因子の少なくとも１つの抗原エピトープに対して誘発される、請求項１０に記載の生物学的ベクター。
【請求項１４】
ＲＴＸ構造ポリペプチドを産生し、該ＲＴＸ構造ポリペプチドが不活化されていることを特徴とする組換えにより修飾されたＡＰＰを産生する方法であって、活性なＲＴＸ構造ポリペプチドを産生するＡＰＰを提供し、ついでＲＴＸＣ遺伝子を不活性化することを含む方法。
【請求項１５】
該ＲＴＸＣ遺伝子が、単一または複数のヌクレオチドの置換、単一または複数のヌクレオチドの付加および／または該ＲＴＸＣ遺伝子の完全なまたは部分的な欠失を含めて単一または複数のヌクレオチドの欠失_を含む該ＲＴＸＣ遺伝子からのＤＮＡの導入および欠失、標的構築またはプラスミド分離を用いた遺伝子相同組換え、および化学的に誘発された、放射線で誘発されたまたは部位特異的な突然変異誘発を含む組換えＤＮＡ技術によって不活性化される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法によって調製された修飾されたＡＰＰ。
【請求項１７】
不活化されたＲＴＸ構造ポリペプチドまたは毒素を産生する方法であって、請求項１に記載のＡＰＰの遺伝的に修飾された株を培養し、ついで該ＡＰＰによって産生された完全に不活化された毒素を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は生ワクチンとしての使用に適する修飾した微生物に関する。本発明はまた、生物学的ベクターとしての修飾した微生物の使用に一般的に関する。本発明はさらに、ワクチン組成に関する。特に、本発明はＲＴＸ毒素には対する免疫応答を含むのに適している組成物に関する。
アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａctinovacillus pleuropneumoniae）（ＡＰＰ）はパスツレラ科の一員であり、ブタプリゥロニュウモニエ、出血、線維および壊死肺障害によって特徴付けられたブタの急性または慢性感染の病因的媒体である（ポール（Ｐohl）ら、１９８３；キリアン（Ｋilian）およびビバスタイン（Ｂibersten）、１９８４）。該疾患は非常に伝染性が高く、成長しつつあるブタのすべての年齢層と関連があるので、ブタ産業に対する重篤な経済的損失となる。ＡＰＰの伝達の直接的様式は、感染が、潜在的な感染源を低減させているブタにＡＰＰの宿主の範囲が幸運にも限定されている、強烈な交雑条件の下、一層普及する。現在、ＡＰＰの１２の血液型亜型が世界中で同定されており、血液型亜型１、７、１２はオーストラリア単離物のほぼ９０％を埋める（カンプ（Ｋamp）およびショープ（Ｓhope）、１９６４）。多数の潜在的なビルレンス因子が外膜タンパク質（マルクス（Ｍulks）およびタッカー（Ｔhacker）、１９８８；ラップ（Ｒapp）およびロス（Ｒoss）、１９８８）、リポ多糖（ウデゼ（Ｕdeze）ら、１９８７；フェンウィック（Ｆenwick）およびオズバーン（Ｏsburn）、１９８６）、カプセル（インザナ（Ｉnzana）ら、１９８８；ローゼンデール（Ｒosendale）およびマクルンネス（Ｍaclnnes）、１９９０；レンザー（Ｌenser）ら、１９８８）および分泌毒素（リクロフト（Ｒycroft）ら、１９９１；バーチア（Ｂhatia）ら、１９９１；フェドルカ−クレイ（Ｆedorka-Ｃrey）ら、１９９０）を含み同定されている。分泌毒素またはＡＰＸ毒素はＲＴＸ毒素ファミリーのメンバーである（フレイ（Ｆrey）ら、１９９３、１９９４）。
ＲＴＸ毒素はアクチノバシラス種（Ａctinobacillus）、プロテウス・ブルガリス（Ｐroteus vulgaris）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍorganella morganii）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂordetella pertussis）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐasteurella haemolytica）および大腸菌（Ｅ．coli）によって産生される群で最も特徴つけられるものを含む多数のグラム陰性細菌によって産生されるものである（ウェルチ（Ｗelch））。すべてのＲＴＸ毒素は標的細胞中に孔を産生することにより機能し、それによって浸透圧バランスを阻害し、標的細胞の破裂へと導く。
作用の様式はＲＴＸ毒素と同一であるが、その標的細胞は型および交差種特異性において非常に変化する。構造的に、この毒素のファミリーはカルシウムに結合する毒素内のグリシンリッチリピートの素材によって特徴付けられ、標的細胞認識、孔の形成、翻訳後の活性化の必要条件、および分泌のためのＣ末端シグナル配列への依存に関する疎水性ドメインの領域への結合に役割を果たす（概説：クーテ（Ｃoote）、１９９２）。
少なくとも３つの異なるＡＰＸ毒素はＡＰＰ、ＡＰＸ１と称されるもの、ＡＰＸ２およびＡＰＸ３によって産生される。ＡＰＸ１は強く、ＡＰＸ２は相対的に低く溶血活性を示し、両者は細胞毒性であり、異なる型および種の細胞の広範囲な領域に対して活性である（フレイ（Ｆrey）およびニコレット（Ｎicolet）、１９８８；ローゼンデールら、１９８８；カンプら、１９９１）。ＡＰＸ３は非溶血性であるが、細胞毒性が強く、宿主の範囲はブタ肺胞マクロファージおよびニュートロフィル（neutrophil）にわたる（チクロフトら、１９９１；カンプら、１９９１）。ＡＰＰの血液型亜型は３つのすべてのＡＰＸ毒素を産生するものは全くなく、該多数は２つ（ＡＰＸ１および２：血液型亜型１、５、９および１１；ＡＰＸ２および３：２、３、４、６および１１）、少数（ＡＰＸ１：１０、ＡＰＸ２：７および１２）は１つのＡＰＸのみ産生した（フレイおよびニコレット、１９９０；フレイら、１９９２、１９９３、１９９４；カンプら、１９９１；リクロフトら、１９９１）。ＡＰＸ産生のパターンはビルレンスおよび最もビルレントであるＡＰＸ１および２を産生するそれらの血液型亜型に関係している（フレイ（Ｆrey）ら、１９９４；コマル（Ｋomal）およびミッタル（Ｍittal）、１９９０）。活性化ＲＴＸ毒素の産生および分泌は少なくとも４つの遺伝子Ｃ、Ａ、ＢおよびＤの活性を必要とする。該Ａ遺伝子は構造毒素をコードし、Ｃ遺伝子は翻訳後アクチベーターをコードし、ＢおよびＤ遺伝子は活性化した毒素の分泌を必要とするタンパク質をコードする（イッサータル（Ｉssasrtel）ら、１９９１；ウェルチ、１９９１；フェルミー（Ｆelmee）ら、１９８５）。ＡＰＸおよび３は４つのコンティグの遺伝子（ＣＡＢＤ）からなるオペロンによってコードされるが、ＡＰＸ２オペロンはＣおよびＡ遺伝子のみを含み、ある場合においてはＢ遺伝子の残りを含む。ＡＰＸ２の分泌はＡＰＸ１ＢおよびＤ遺伝子産物の活性に依存する（フレイら、１９９４に概説）。
自発的なおよび化学的に誘発され、非溶血性の変異体のビルレンス分析は、ビルレンス中のＡＰＸ毒素の役割を示唆し、それは最近、トランスポゾン突然変異誘発を用いて確認されている（アンダーソン（Ａnderson）ら、１９９１；ゲーラチ（Ｇerlach）ら、１９９２；インザナ（Ｉnzana）ら、１９９１；リクロフトら、１９９１ａ、ｂ；タコン（Ｔacon）ら、１９９３、１９９４）。疾患および／またはキャリア状態からの完全な保護は化学的に不活性化された細菌または外膜タンパク質、リポ多糖またはカプセルを含む精製したサブユニットワクチンを含むワクチンを用いて得ることはできない。対して、マウス中における疾患からの完全な保護は、ホルマリン化（formalise）した細胞全体と組み合わせた精製したＡＰＸを有する以下のワクチンにより得られ、それは保護免疫におけるＡＰＸ毒素の役割を示唆している（バーチアら、１９９１）。
プリゥロニュウモニエ、ブタのＡＰＰ感染から起こるが、これに対するワクチンは該細菌の多様な要素に基づく細菌ワクチンまたはワクチンサブユニットを利用して明らかにし、不活性化ワクチンで得られた、結果はせいぜいワクチン物質を調製するのに使用される血液型亜型に対する同種保護を提供する。多彩なビルレンスをもつＡＰＰの既知の１２の血液型亜型が存在し、各々は異なるワクチン調製を必要とする。市販されているワクチンを決定するため、多数の血液型亜型を含むよう製剤され、遺伝子位置において最も頻繁に観察された血液型亜型に対する保護を提供する。不活性化ワクチンに対照的に、任意の１つの血液型亜型での天然の感染は任意の他の血液型亜型での感染に対する保護を提供し、そのことは生ワクチンのＡＰＰ血液型亜型に対する交差保護を提供する可能性を示唆している。
本発明の目的は、先行技術の問題を１またはそれ以上緩和することである。
従って本発明の１つの局面において該ＲＴＸ毒素が部分的または完全に不活性化されるＲＴＸ毒素を産生する修飾した微生物を提供する。
「修飾した」なる後には、組換えＤＮＡ技術または他の、例えば化学的または放射線誘発突然変異誘発などの技術による修飾を含む。
組換えＤＮＡ技術が、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入に関する場合、該ＤＮＡは任意の適当な方法により導入されることができる。適当な方法には、コンピテント細胞の形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションおよびエレクトロポレーションを含む。
本発明のさらなる態様において、ＲＴＸ構造遺伝子および／または生物体の翻訳後アクチベーターを含むＲＴＸ毒素遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されることが提供されている。
本明細書および請求の範囲で使用する「ＲＴＸ毒素遺伝子」は、ＲＴＸ毒素遺伝子の産物であるＲＴＸ毒素の発現に関する遺伝子を含むよう意図されている。該ＲＴＸ毒素遺伝子に含まれている遺伝子には、翻訳後アクチベーター遺伝子（Ｃ）、構造遺伝子（ａ）、および活性化されたＲＴＸ毒素の分泌に必要であるタンパク質をコードするＢおよびＤ遺伝子を含む。
本明細書および請求の範囲で使用する「部分的にまたは完全に不活性化された」なる語には、標的構築またはプラスミド分離を用いて、該遺伝子の完全または部分的なる欠失を含む、単独または多数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失を含む遺伝子からのＤＮＡの導入および欠失を含む組換えＤＮＡ技術によって遺伝子の修飾を含む。
本出願人らはＲＴＸ毒素の前駆体が毒素活性を低減することを見いだした。驚くべきことに、本出願人らはまたＲＴＸ毒素前駆体は、ＲＴＸ毒素を産生する微生物で異種挑戦に対する交差保護を付与する動物中における免疫応答を誘発することができる。
従って、本発明の好ましい態様において、不活性化したＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。該前駆体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であることができる。該ＲＴＸ構造遺伝子はＲＴＸ Ａ遺伝子であることができる。
しかしながら、好ましい態様において、該微生物は本来ＲＴＸ毒素を産生するものである。本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物はアクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌およびパスツレラ・ヘモリチカから選択されることができる。好ましい態様において微生物は、アクチノバシラス種である。該アクチノバシラス種は、アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（ＡＰＰ）であってよく、ついで該ＲＴＸ毒素はＡＰＸ毒素である。ＡＰＸ毒素はＡＰＸ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３であることができる。
本出願人は、本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、操作されることによって、前駆体産物の翻訳後アクチベーターを排除することによって不活性化ＲＴＸ毒素前駆体を産生する。従って、好ましい態様に置いて、微生物はＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生することまたはＲＴＸ毒素前駆体のは不活性化した翻訳後アクチベーターを産生することができない。翻訳後アクチベーターはＲＴＸ Ｃ遺伝子の産物であることができる。
好ましい態様において、該微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子は不活性化されるかまたは部分的にまたは完全に欠失している。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は部位特異的突然変異誘発により不活性化されることができる。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は単一または多数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失によって不活性化されることができる。好ましくは、該ＲＴＸ Ｃ遺伝子は標的構築を用いて異種の組合せによって不活性化される。該標的構築物は望ましい挿入部位をフランキングする配列に類似の配列によってフランキングされる選択マーカーを含むことができる。該選択可能なマーカーは、水銀などの毒性物質に耐性を付与する遺伝子であってよく、または抗生物質耐性決定因子であることができる。該抗生物質耐性決定遺伝子はアンピシリン耐性ンカナマイシン耐性またはストレプトマイシン耐性をコードする遺伝子である。
ある場合においては、修飾した微生物に包含された機能的な抗生物質耐性遺伝子を有することは望ましくないかもしれない。従って、本発明は繰り返し配列などの遺伝子要素を含む標的構築物を考え、そしてそれは抗生物質耐性遺伝子の切り出しを容易にし、一度標的構築物は、宿主染色体を有する同種組合せを経験する。
本発明はまた、選択可能なマーカーを含まない標的構築物をも考える。例えば、標的構築物は欠失を含むＲＴＸ Ｃのセグメントを含むことができる。宿主の染色体を有する標的構築物の同種組合せは、染色体ＲＴＸ Ｃに欠失を導入することになる。ついで組換え体の選択は、ＲＴＸ毒素の産生の不在に基づくことができる。
標的構築物は、線形形態において宿主細胞に直接導入されることができる。別法として、標的構築物は自殺または非複製ベクターを介して導入されることができる。自殺ベクターは宿主微生物中において複製しない任意のプラスミドであることができる。本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、しばしばｐＥＰベクターの任意ではない（non-permissive）宿主である。従って、ｐＥＰベクターは本発明において使用されることができる自殺ベクターの例である。該自殺ベクターはｐＥＰ−Ｃ-Ａｍｐrであってよい。
他の態様において、部位特異的突然変異誘発はプラスミド分離の技術によって達成されることができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子によって邪魔されるＲＴＸ Ｃ遺伝子の断片を含むプラスミドは微生物に導入されることができる。該微生物は第２の選択可能なマーカー遺伝子を含む第２プラスミドで引き続き、形質転換される。ついで両者のプラスミドを含む宿主細胞は、第２プラスミドのみを選択する培地を介して継代培養することができる。第２プラスミドの選択は第１プラスミドの維持に対して作用することができる。それゆえ、第１プラスミドは消滅するが、ある場合、染色体中に選択可能なマーカーを含む邪魔されたＲＴＸ Ｃ遺伝子断片の組合せは存在する。それゆえ、このプロセスは邪魔されたＲＴＸ Ｃ遺伝子の組合せを染色体ＲＴＸ Ｃ遺伝子へと促進させる。
本発明のさらなる局面において、ＲＴＸ毒素が部分的にまたは完全に不活性化され、該ＲＴＸ毒素遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されるＲＴＸ構造および／または翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＲＴＸ毒素遺伝子をコードする、ＲＴＸ毒素をコードする発現ベクターを提供する。
本明細書および請求の範囲において「発現ベクター」なる語には、外在ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を発現することができる染色体または染色体外要素を含む。
ＲＴＸ Ａ遺伝子産物は染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子は染色体上のそのままの位置に存在し、またはそのままの位置以外の位置にで染色体に挿入されることができる。さらに、ＲＴＸ遺伝子産物はプラスミドなどの染色体外要素上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。それゆえ、ある１つの態様において、ＲＴＡ Ａ遺伝子を含む染色体外要素は機能的な染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子および不活性化した染色体ＲＴＸ Ｃ遺伝子を有する微生物に導入されることができる。染色体外要素から発現されるＲＴＸ Ａ産物は染色体遺伝子から発現したＲＴＸ Ａ産物を補うことができる。
従って、該ＲＴＸ Ａ遺伝子産物はプラスミドなどの染色体外要素に位置する１つまたは複数のＲＴＸ Ａ遺伝子から完全に発現される。染色体外要素に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子は、染色体外要素の選択の存在下または不在下にて発現されることができる。従って、１つの態様においてＲＴＸ Ａ遺伝子を含む染色体外要素は機能的な染色体ＲＴＸ ＡおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を欠如する微生物に導入されることができる。機能的なＲＴＸ ＡおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を欠如する微生物は微生物の突然変異誘発によって産生される。突然変異誘発はＲＴＸ ＡおよびＲＴＸ Ｃまたはその一部のみの欠失となる。
染色体外要素はＲＴＸ Ａ遺伝子を含む組換え発現ベクターであってよい。好ましくは組換え発現ベクターは本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物中でのＲＴＸ Ａの遺伝子発現を可能にする。該組換え発現ベクターはアクチノバシラスまたは関連生物中のＲＴＸ Ａ遺伝子の発現を可能にする。該組換え発現ベクターはｐｌＧプラスミド由来であってよい。該組換えプラスミドはｐｌＧ３Ｂ由来であってよい。該組換えプラスミドはｐｌＧ３−ＴＩＫである。
ＡＰＰ８Ｐｈ）に基づく細菌ベクター系は「そのままのＤＮＡ」ワクチン分子を宿主細胞へと運搬することを別に意図する。そのようなそのままのＤＮＡワクチン／発現系は、細菌系において複製可能なプラスミドまたは関心のある外在／組換え遺伝子の発現をコントロールする真核生物プロモーターであった。
好ましい態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌を促進する機能的タンパク質を産生することができる。該微生物は機能的なＲＴＸ Ｂおよび／またはＲＴＸ Ｄ遺伝子を有することができる。他の態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つのタンパク質を産生することまたはＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つの不活性化タンパク質を産生することができない。該微生物は不活性化したＲＴＸ  Ｂおよび／またはＲＴＸ  Ｄ遺伝子を有することができる。従って。該微生物は活性化または不活性化ＲＴＸ毒素分子を分泌することができないかもしれない。
本発明のさらなる態様において、アクチノバシラスまたは関連生物中の異種タンパク質の発現のための組換えプラスミドベクターを提供する。好ましい態様において、該組換えプラスミドベクターはアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ中に天然に存在するプラスミド由来である。該組換えプラスミドはＲＴＸ毒素前駆体をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。該組換えプラスミドはＲＴＸ Ａ遺伝子を含むことができる。別法として、該組換えプラスミドはＲＴＸ Ｃ遺伝子またはその断片を含むことができる。該ＲＴＸ Ｃ遺伝子または遺伝子断片は介在ＤＮＡ配列によって邪魔されることができる。該介在ＤＮＡ配列は抗生物質耐性遺伝子などの選択可能なマーカーをコードすることができる。天然に存在するプラスミドはｐＩＧ３である。好ましい態様において、組換えプラスミドベクターはさらに大腸菌へとＤＮＡをトランスファーすることを容易にするヌクレオチド配列をさらに含む。該ヌクレオチド配列は少なくともマルチプル・クローニング・サイト（multiple cloning  site）およびlac遺伝子またはその一部をさらに含むことができる。該組換えプラスミドベクターがｐＩＧ３１７、ｐＩＧ３ＢまたはｐＩＧ３Ｂ−Ｔ１Ｋから選択されることができる。
本発明の他の局面において、ＲＴＸ毒素前駆体を含む組成物を接種された宿主動物における免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。該ＲＴＸ毒素前駆体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であってよい。ＲＴＸ構造遺伝子はＲＴＸ Ａ遺伝子であってよい。
本発明はさらに該ワクチン組成物を接種した宿主動物細胞における免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供し、該ワクチン組成物は、該ＲＴＸ毒素は部分的にまたは完全に不活性化したＲＴＸ毒素を産生する修飾した微生物を含む。好ましくは、該不活性化したＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。該前駆体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であってよい。ＲＴＸ構造遺伝子はＲＴＸ Ａ遺伝子であってよい。好ましくは、該微生物は本来ＲＴＸ毒素を産生するものである。好ましくは該微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子は不活性化されているか、または欠失している。
好ましい態様において、修飾した微生物を含むワクチン組成物は生ワクチンである。
本発明のワクチン組成物は付加アジュバントまたは免疫刺激分子によるかまたはよらずに任意の製薬学的担体と組み合わされる。
該アジュバントは任意の適当なタイプであってよい。該アジュバントは植物油またはそのエマルジョン、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノエステル、オクタデシルアミン、イソレシチン、ジメチル−ジオクタデシル−アンモニウムブロミド、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ'Ｎ'ビス（２−ヒドロキシエチル−プロペンジアミン）、メトキシヘキサデシルクリセロールおよびプロニックポリポール；例えば、ピラン、デキストダンサルフェート、ポリＩＣなどのポリアミン、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフトシン（tufutsin）などのペプチド；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；オイルエマルジョン；ミネラルゲルおよび懸濁液などから選択されてよい。アルム（almum）、すなわち水酸化アルミニウム（Ａl（ＯＨ）3）、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムが好ましい。アジュバントは、ワクチン組成物の総重量に基づき、約１〜７５重量％の量で存在する。
本発明によりＲＴＸ毒素前駆体を産生することができるＲＴＸ毒素前駆体または微生物を含むワクチンは、対応するＲＴＸ毒素を産生する微生物の血液型亜型の範囲に対する保護を提供する可能性を有する。
本発明の他の局面において、微生物は活性化ＲＴＸ毒素を産生することができないように修飾され、ＲＴＸ毒素を本来産生する微生物を含む生物学的ベクターを提供する。
本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリン、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツッシスおよび大腸菌から選択することができる。好ましい態様において、該微生物はアクチノバシラス種である。アクチノバシラス種はアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（ＡＰＰ）であってよく、該ＲＴＸ毒素はＡＰＸ毒素であってよい。ＡＰＸ毒素はＡＰＸ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３であってよい。好ましくは、修飾した微生物は不活性化ＲＴＸ毒素を産生する。好ましくは不活性化毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。好ましくは活性化ＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。ＲＴＸ毒素の前駆体はＲＴＸ Ａ遺伝子の産物である。
好ましい態様において、修飾した微生物はＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生すること、または不活性化したＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生することができない。翻訳後アクチベーターはＲＴＸ Ｃ遺伝子の産物であってよい。好ましい態様において、修飾した微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子は不活性化されるかまたは欠失している。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は任意の単一または多数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失により不活性化されることができる。
該ＲＴＸ Ｃ遺伝子は部位特異的組換えによりＲＴＸ Ｃ染色体遺伝子に選択可能なマーカーを含む標的構築物の誘発によって不活性化されることができる。標的構築物は繰り返し単位などのような遺伝的要素を含み、それは一旦標的構築物が宿主染色体との同種組合せを経験すると抗生物質耐性遺伝子の切り出しを容易にする。別法として、選択可能なマーカーを含まない標的構築物は、ＲＴＸ Ｃ染色体遺伝子における欠失を導入するために使用することができる。
ＲＴＸ Ａ遺伝子産物は染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子は染色体上の本来の位置に存在することができるかまたはその本来の位置以外の部位にて染色体へ挿入されることができる。さらに、ＲＴＸ遺伝子産物はプラスミドなどの染色体外要素上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。
別法として、ＲＴＸ Ａ産物はプラスミドなどの染色体外上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子または複数の遺伝子から完全に発現されることができる。
好ましい態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌を容易にする１またはそれ以上の機能的タンパク質を産生することができる。該微生物は機能的なＲＴＸ Ｂおよび／またはＲＴＸ Ｄ遺伝子を有することができる。別の態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つのタンパク質を産生すること、またはＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つの不活性化タンパク質を産生することができない。
「生物学的ベクター」なる語は、最も広範な意味において、生物学的に活性な分子の発現に適当な生物学的な手段を含む。該生物学的な手段は、死亡した生物体も使用することができるが、好ましくは生存している微生物である。該生物学的ベクターは非病原性であり、または、ビルレントではないようにするかまたは非病原性かまたはビルレントでない有効量にて与えられることができる。「生物学的に活性な因子」には成長因子、酵素、抗原またはその抗原の一部、インターロイキン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子などのサイトカインなどの機能的因子を含む。該分子は本来生物学的ベクターによって発現されるものである。別法として、該分子は生物学的に活性である分子をコードする遺伝子または複数の遺伝子を運搬するプラスミドで生物学的ベクターを形質転換することによって発現された組換え分子であってよく、またはそれが発現される；または該プラスミドおよび／または遺伝子および／またはその一部は宿主ゲノムに組み込まれ、染色体および／または天然に存在するかまたは天然に不在の染色体外要素を含み、該遺伝子または複数の遺伝子またはその一部が発現される。
本発明の生物学的ベクターは１またはそれ以上の有用なタンパク質を宿主動物に提供するのに使用されることができる。該タンパク質は宿主動物中に増強された応答をもたらすのに相乗的に作用する。例えば、生物学的ベクターは抗原に対する宿主動物中の免疫応答を増強する分子と組み合わせて抗原を産生することができる。免疫応答を増強する分子はサイトカインであってよい。
本発明の生物学的ベクターは、多価ワクチンを提供するために使用することができることを認識することができる。「多価ワクチン」なる語はその最も一般的な意味において使用され、２またはそれ以上の異なる抗原エピトープに対する免疫応答を含むことができる修飾した微生物、または２またはそれ以上のエピトープが修飾した微生物に固有である修飾した微生物によって発現される。しかしながら一層一般的には、多価ワクチンは該微生物のビルレント形態ならびに該微生物によって発現された異種抗原に対する免疫応答を含むことができる（トランスダクション、コンジュゲーションまたは形質転換によって導入されるものなど）ものを含み、それらは該微生物に固有のものではない。この点において多価ワクチンは、２またはそれ以上の病原体媒介物にむける。好ましい多価ワクチンはＲＴＸ毒素に対する免疫応答を誘発することができ、１またはそれ以上の病原体からの少なくとも１つの抗原エピトープに対する免疫応答を誘発することができる。病原体媒介物は、ヘモフィルス種、セルプリナ・ヒオジセンテリエ（Ｓerpulina hyosenteriae）、パスツレラ種、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂordetella bronchiseptica）、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種、大腸菌、マイコプラズマ・ヒョニュウモニエ、エリシペロスリクス・ルシオパチエ（Ｅrysipelothrix rhusiopathiae）から選択されることができる。別法として、病原媒介物はＨＣＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ、ＴＧＥＶ、ＰＰＶなどのウイルス病原体から選択されることができる。
本発明はさらに、部分的にかまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素を産生する修飾された生物体を産生する方法を提供し、その方法は活性化ＲＴＸ毒素を産生する微生物を提供することおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を不活性化するかまたは欠失させることを含む。
本発明はさらに部分的にかまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素を産生する修飾された生物体を産生する方法を提供し、その方法は活性なＲＴＸ毒素を産生することができない微生物を提供することおよび機能的なＲＴＸ Ａ遺伝子を該微生物に導入することを含む。
さらに別の局面において本発明は微生物を産生するＲＴＸ毒素に対する動物をワクチン接種する方法を提供し、該方法は本発明により、該動物に免疫学的に有効な量のワクチンを投与することを含む。
ワクチン接種の方法は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの産生動物の処理に利用することができる。ワクチン接種の方法はマタ、ウマ、イヌおよびネコなどの伴侶動物の治療に使用できる。ワクチン接種の方法はまた、ヒトの治療に使用できる。好ましい態様において、ワクチン接種の方法はブタの処理に利用できる。好ましいワクチン接種の方法は、ブタ・プリゥロニュウモニエの処理において利用できる。
本発明により、ワクチンまたはワクチンベクターの投与は経口または非経口投与などの任意の適当な経路である。該投与は鼻腔または膣粘膜による。別法として、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内投与であってよい。該調製は乾燥または液体形態であることができる。選択された投与経路はまたプロテアーゼインヒビター、抗炎症剤などのさらなる要素を必要とすることができる。
さらなる局面において本発明は病原生物体に対する動物をワクチン接種する方法を提供し、該方法は本発明により、該動物にワクチンベクターの有効量を投与することを含み、該ワクチンベクターは該病原生物体の抗原の免疫学的な有効量を合成する。
さらに別の局面において、本発明により修飾された微生物を培養し、ついで該微生物によって産生された不活性化毒素を回収することを含む不活性化ＲＴＸ毒素を産生する方法を提供する。本方法により産生された不活性化ＲＴＸ毒素は、例えばＲＴＸ毒素に対する保護免疫応答を刺激するためのワクチン中における活性化免疫原として使用することができる。
本明細書の記載および請求の範囲を通して、「含む」なる語およびその変形である「含んでいる」、「含む」などの語句は他の添加剤、要素、完全体または工程を排除することを意図していない。
本発明が一層容易に理解されるために、本発明者らは以下の非制限的な例を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＡＰＰのオーストラリア株から単離されたストレプトマイシン耐性のものをコードする４．２kbプラスミドｐＩＧ３（図１Ａ）の部分的な制限酵素地図である。２．３kbのＰstＩ断片（ｐＩＧ３１７；図１Ｂ）はプラスミド複製をコードし、自己ライゲーションする場合にストレプトマイシン耐性を与えるのに十分であることがわかり、ＡＰＰの大腸菌に形質転換する。マルチプル・クローニング／サイト（ＭＣＳ）およびlac遺伝子の一部を含むｐＩＧ３ＢプラスミドベクターはｐＩＣ１９ＲのＨaeII断片をｐＩＧ３１７（図１Ｃ）の単独のＥcoＲＩ部サイトに導入することによって構築された。単独制限酵素サイトはｐＩＧ３Ｂ（図１Ｃ）を示唆する。（ＭＣＳおよびプラスミド骨格中において切断するＰstＩを除く）。
図２は、ＡＰＰにおけるＡＰＸ１Ａ発現カセットの構築である。ＡＰＸ１Ａ発現カセットはカナマイシン耐性遺伝子に結合し、ｐＱＷ−Ｔ１Ｋ由来であり、これはＳal Ｉ制限酵素断片として単離され、ついでｐＩＧ３Ｂの単独Ｓal Ｉ部位にクローニングされることができる。
図３は、大腸菌のＡＰＸ１発現カセットの構造である。完全なＡＰＸ１Ａ遺伝子は融合ＰＣＲ由来（■）物質により産生され、ついでゲノムクローン
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はＨindIIIサイトで産生される。完全遺伝子はｐＱＥにクローニングサれ、ポリＨＩＳリーダー配列でイン・フレームでクローニングされ、ＡＰＸ１Ａ精製を可能にする。ｐＵＣ４Ｋからのカナマイシン耐性遺伝子は、ｐＱＥ−Ｔ１プロモーター／レギュレーター配列の５'側の単独ＸhoＩ制限部位にクローニングされる。得られたプラスミドｐＱＥ−Ｔ１Ｋは、制御された発現下で、カナマイシン耐性遺伝子に結合したＡＰＸ１Ａ遺伝子を含む。
図４は、ＡＰＰ組換え体のウエスタンブロット分析である。ＡＰＰox-株でＡＰＸＡ発現カセットを有する（Ｔox-／３１７−ＱＥＴ１）および有さない（ＨＳ９３Ｔox-）もののサンプルを親株ＨＳ９３に沿ったウエスタンブロットによって調べる。該ブロッティングはウサギ抗血清でプロービングし、本発明者らの研究室で産生され、ＡＰＸ毒素に対する。図からＴox-株は抗ＡＰＸ血清と反応しないが、親株であるＨＳ９３およびＡＰＸＡ発現カセットを含むＴox-株の両者は該血清に特異的に反応する一本鎖ポリペプチドを産生する。
図５は、ＡＰＰ染色体の操作に使用する組換えカセットの構造である。
図５Ａ  ＡＰＸ１Ｂ遺伝子はｐＩＧ−ＢＫrプラスミドを用いるＡＰＰ染色体上で不活性化される。ＥcoＲＩ制限断片はＡＰＸ１ＢおよびＤ遺伝子の一部を含み、ｐＩＣ１９Ｒにクローニングされる。カナマイシン遺伝子はＡＰＸ１Ｂ遺伝子のＢamＨＩサイトに挿入される。内部カナマイシン遺伝子を有するＡＰＸ１Ｂ遺伝子は組換えカセットｐＩＧ−３ＢＫrを形成するＥcoＲＩ断片としてｐＩＧ３１７にサブクローニングする。分泌欠損変異体を特徴付けるのに使用されたオリゴヌクレオチドの結合部位が示されている（Ｂ5およびＢ3）。ＥcoＲＩ断片の外部に結合するこれらの両者のオリゴヌクレオチドは組換え体カセットにおいて使用される。
図５Ｂ  ＡＰＸ２Ｃ遺伝子がＡＰＸ２Ｃ遺伝子を含むプラスミドベクターＥＰ２Ｃ-ＡmprＡ ＰＣＲ断片を用いて染色体上に不活性化され、ＡＰＸ２Ａ遺伝子がクローニングされ、Ａmpr遺伝子がＡＰＸ２Ｃ遺伝子内の単独ＸbaＩサイトに挿入される。得られたＥcoＲＩ断片をｐＥＰ２にサブクローニングして自殺カセットｐＥＰ２Ｃ-Ａｍｐrを形成する。
図６  ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて染色体変異体ＨＳ２２Ｂ-Ｋａｎr（図６Ａ）およびＨＳ９３Ｃ-Ａｍｐr（図６Ｂ）を特徴付ける。該変異体からのゲノムＤＮＡは単離され、鋳型としてＰＣＲに使用される。挿入（図５）をスパニングするオリゴヌクレオチドは親株およびゲノム変異体の各々の予想された大きさに一致する単独バンドを産生した。該変異体の各々は親株より一層大きなＰＣＲ産物を産生し、挿入された抗生物質耐性遺伝子に等しい大きさ増加した。得られたＰＣＲ産物はサザンブロッティングされ、挿入のための標的化したＡＰＸ遺伝子または選択のために利用された抗生物質耐性遺伝子でプロービングされる。
図７  ＡＰＰＴox-株（ＨＳ９３Ｃ-Ａ-）およびＨＳ９３Ｃ-Ａｍｐr変異体の分泌タンパク質（sup）、総培養タンパク質（son）は、親株ＨＳ９３とともにウエスタン・ブロッテイングによって試験された。該ブロットは本発明者らの研究室内にてＡＰＸ毒素に対してウサギ抗血清でプロービングした。図からＴox-株が抗ＡＰＸ血清と反応しないが、両親株であるＨＳ９３およびＨＳ９３ＣＡmpr組換え体は、分泌され、該血清に特異的に反応する一本鎖ポリペプチドを産生する。
図８  ＡＰＰにおける外来タンパク質の発現のためのｐＩＧに基づいたカセット。
ｐＩＧに基づく発現カセットのシリーズはＡＰＰからの外来タンパク質の発現のために構築される。外来タンパク質をコードする遺伝子ＩＬ６（図８Ａ）およびＣＡＴ（図８Ｂ）は適当なプロモーターによりｐＩＧに基づいたプラスミドにクローニングされ、ＡＰＰにおける発現を可能にすることができる。
図９  ＡＰＰからのブタＩＬ６の発現。ブタＩＬ５を適当なプラスミドベクター（ｐＩＧ−ＩＬ６）にクローニングして大腸菌（Ｅ．coli／ｐＩＧ３−ＩＬ６）およびＡＰＰ（ＨＳ９３／ｐＩＧ−ＩＬ６）における発現を得る。ＡＰＰＨＳ９３（１）、ＡＰＰＨＳ９３／ｐＩＧ−ＩＬ６（２）、Ｅ．coli／ｐＩＧ−ＩＬ６（３および４）、精製ＩＬ６（５および６）とともにＥ．coli陰性コントロール（７）の一夜培養のサンプルをＩＬ６に特異的なモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットにより分析する。
実施例１
材料と方法
細菌株と増殖条件
本実験において使用するＡＰＰ細菌株パト・ビアッカリ（Ｐat Ｂiackali）博士によって親切にも供給された（アニマル・リサーチ・インスチチュート（Ａnimal Ｒesearch Ｉnstitute）、ムーローカ（Ｍoorooka）、クイーンズランド（ＱＬＤ）、オーストラリア）。ＡＰＰの株はニコチナミドジヌクレオチドを最終濃度１０μｇ／ｍｌにて補った脳心臓浸出物ブロスにおいて増殖させ（シグマ・ケミカル・コ（Ｓgma Ｃhemical Ｃo．）、セントルイス、ミズーリ）、３７℃で持続的振盪させた。血液アガーを５％滅菌脱フィブリン化ウマ赤血球細胞をＢＨＩアガーに加えることによって調製した。抗生物質を最終濃度がカナマイシン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌまたはアンピシリン５μｇ／ｍｌにて特別に記載しない限り使用した。大腸菌株ＤＨ５αをサンブルック（Ｓambrook）ら（１９８９）に概説されているような標準的技術を使用して、本実験を通して使用した。
ＡＰＰゲノムＤＮＡの単離
ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩ中で増殖させたＡＰＰＨＳ２５の一夜培養の１ｍｌ中に存在する細菌を遠心によって回収し、ついでその上清を捨てた。そのペレットをライソザイム（７．５ｍｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ８．５／１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、ついで持続的に５０℃で一晩インキュベーションした。その翌日に、該調製物を０．５Ｍ ＮaＣlと合わせてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００：９９：１、ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出し、ついで該ＤＮＡを０．６容量のイソプロパノールを加えて沈殿した。
ＡＰＸ１Ａ遺伝子の単離およびクローニング
ＡＰＸ１Ａ遺伝子の増幅をポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて行った。反応を５０μｇのＡＰＰゲノムＤＮＡ（ＨＳ２５）、３μｇのオリゴヌクレオチドプライマー、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴris-ＨＣl（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２００ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および１単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・セタス（Ｐerkin Ｅlmer Ｃetsu）、米国）を含む５０μｌ容量にて行った。反応液を等容量のパラフィンオイルの上に静置し、９４℃で１分間加熱し、５５℃で２分間冷却し、ついで７２℃で５分間加熱した。このサイクルを３５回パーキン−エルマー−セタスＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐerkin-Ｅlmer-Ｃetus ＤＮＡ thermal Ｃycler）を用いて繰り返した。特異的なオリゴヌクレオチドがＡＰＸ１遺伝子（フレイ（Ｆrey）ら、１９９１）の公開された配列に基づき設計された。２つのオリゴヌクレオチド配列は
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であり、クローニングが容易にできるように５'でＢamＨＩおよび３'末端でＳmaＩ部位でＰＣＲ産物を産生すうように設計された。該オリゴヌクレオチドは遺伝子アセンブラー・プラス・ＤＮＡ・シンセサイザー（Ａssembler Ｐlus ＤＮＡ Ｓnythesiser）（ファルマシア（Ｐharmacia）、スウェーデン）を用いて合成した。ＰＣＲ反応物の産物でＡＰＸ１遺伝子の予測される分子量に一致するものが、ジーン・クリーニング（ＢＲＥＳＡＴech）、オーストラリア）によってアガロースゲルから単離し、ＢamＨＩおよびＳmaＩで制限酵素消化し、ついでｐＵＣ１８のＢanＨＩおよびＳmaＩ部位にクローニングした（ヤニッシュ（Ｙanish）−ペロン（Ｐerron）ら、１９８５）。ＡＰＸ１遺伝子を含むクローンは２本鎖シークエンシングによって達成された。（結果は示さず）。ＡＰＰの染色体からのＡＰＸ１Ａ遺伝子の単離
公開されたデータに基づき、３．２ｋｂのＡＰＸ１Ｓ遺伝子が約５ｋｂ（フレイら、１９９３）のＨindIII断片上にコードされる。この断片を単離するために、ＡＰＰ ＨＳ２５ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨindIIIで枯渇するまで消化し、ついでアガロースゲル上でサイズ分画した。消化したＤＮＡをエチジウムブロミド染色によって可視化し、ついでＤＮＡ分子量標準（プロゲン（Ｐrogen）、オーストラリア）を用いて推定するように、約５ｋｂに対応する領域を切り出し、ジーン・クリーンを用いて該ＤＮＡを精製した。そのサイズを選択したゲノムＤＮＡをｐＵＣ１８にクローニングし、ついで大腸菌に形質転換した。得たＤＮＡライブラリーをＡＰＸ１Ａ ＰＣＲ断片でプロービングし、ついで陽性クローンを選択した。制限酵素消化を使用して、ハイブリダイゼーションによって同定されたクローンの確実性を確認した。
プラスミドベクターでのＡＰＰの形質転換
エレクトロコンポネント（electrocomponent）ＡＰＰの調製およびプラスミドＤＮＡのこれらの細胞へのエレクトロポレーション（０．２ｃｍキュベット、４００ＳＬ、１．２５ｋＶおよび２５μＦ）の導入の条件は、エレクトロポレーションに使用した要素細胞のアリコートが２００μｌであることを除いて、フレイ（１９９２）によって記載された通りである。プラスミドＤＮＡをＡＰＰの一夜培養物から単離し、抗生物質選択下でマジック・ミニプレップ（magic miniprep）を用いて増殖させた。
ＡＰＰ染色体のＰＣＲ
ＡＰＰ染色体の領域の増幅をポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて行った。反応を５０μｇのゲノムＤＮＡ、３μｇのオリゴヌクレオチドプライマー、５０ｍＭ ＫＣl、１０ｍＭ Ｔris-ＨＣl（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭのＭgＣl2、２００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２００ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰおよび１単位のＴaqＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・セタス、米国）を含む５０μｌ容量にて行った。ＡＰＰゲノムＤＮＡの調製をプリドー（Ｐrideaux）に記載されるようにＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを用いて行った。反応液を等容量のパラフィンオイルの上に静置し、９４℃で１分間加熱し、５５℃で２分間冷却し、ついで７２℃で５分間加熱した。特異的オリゴヌクレオチドを遺伝子アセンブラー・ブラス・ＤＮＡ・シンセサイザー（ファルマシア、スウェーデン）を用いて合成した。ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル上で分解してエチジウムブロミドで染色して可視化した。
ＡＰＸ１Ｂ遺伝子内のＡＰＰ染色体の突然変異誘発
ＡＰＸ１Ｂ遺伝素の不活性化のために設計された組換えプラスミドｐＩＧ３−ＢＫrをプリドーら（１９９７）によって記載されるようにＡＰＰ ＨＳ２２にエレクトロポレーションし、ついでカナマイシンを含むＢＨＩ／ＮＡＤアガー上でトランスフォーマントを選択した。組換えプラスミドを含むＡＰＰトランスフォーマントをＡＰＰから単離されたｐＩＧ３−Ａmprでエレクトロポレーションし、そのトランスフォーマントをカナマイシンおよびアンピシリンを含むＢＨＩ／ＮＡＤプレート上で選択した。両方のプラスミドの存在を、マジック・ミニプレッププロトコール（プロメガ）を用いて再度単離したプラスミドによって確認し、制限酵素分析を行った。両方のプラスミドを含むトランスフォーマントをアンピシリンおよびカナマイシンを含むＢＨＩ／ＮＡＤ中で一夜振盪して増殖させた。その培養物をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＢＨＩ／ＮＡＤ中で１：１００に希釈し、一夜振盪した。そのサブカルチャー手法を、培養物の希釈がカナマイシン含有ＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガー上にプレーティングした後、総計６回繰り返した。血液アガープレート上の溶血のゾーンを産生しないコロニーを同定し、さらなる特徴付けのために単離した。
ＰＣＲプロトコールのためのサザンブロット分析
ＰＣＲ反応の産物を１％アガロースゲル上で分解し、エチジウムブロミドで染色した後ＤＮＡ分子量マーカー（プロゲン、オーストラリア）と共に流して大きさの推定を行う。分画したＤＮＡを、製造者の指示によりバキュームブロットシステム（ファルマシア）を用いて、Ｈybond-Ｎメンブレン（アマシャム（Ａmersham）にトランスファーした。メンブレンを５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：０．１８ＭのＮaＣl、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７））、５×デンハルト液（１×デンハルト：０．０２％ＢＳＡ、０．０２％フィコールおよび０．０２％ポリビニルピロリドン）および０．５％ＳＤＳを含むバッファー中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのためのプローブを、製造者の指示に従って、ランダムヘキサマープライマーシステム（ブレザテク（ＢＲＥＳＡｔｅｃｈ）、アデレード、オーストラリア）を用いて標識したハイブリダイゼーションの後、メンブレンを０．１％ＳＤＳ／０．１×ＳＳＰＥの最終ストリンジェンシーになるまで６５℃で１０分間洗浄し、Ｘ線フィルム（フジ（ＲＸ）にさらした。
抗血清の産生
ＡＰＰ ＨＳ２５の一夜培養を１：２０に希釈して、３７℃でＯＤ600が０．８に達するまで振盪した。この点にて培養液を、４℃で１２，０００回転で１２分間遠心し、その上清タンパク質をフェドルカ（Ｆedorka）−クレイ（Ｃray）ら（１９９０）を用いて精製した。ウサギを２週間隔で精製したタンパク質（１００μｇ）の３投与量を与え、最初はフロインド完全アジュバント中で、続いてフロインド不完全アジュバント中でワクチン接種した。血清を最終ブーストの後２週間後に使用するべく回収した。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット（免疫ブロット）をサンブルックら（１９８９）の方法に従って行っている。ＡＰＰ ＨＰ２５の培養上清タンパク質に対して産生されたウサギ血清をＡＰＸタンパク質の検出のために１：５０希釈にて使用した。ウサギ血清を交差反応を除去するためにＡＰＰＴox-に対して前吸収（pre-absorbed）し、使用前の非ＡＰＸ抗体を除去した。１：１０００希釈にて使用したコンジュゲートを基質としてテトラメチルベンジジン（マッキム−ブレシュキン（ＭcＫimm-Ｂreschkin）、１９９０）で抗血清（サイレヌス（Ｓilenus））をコンジュゲートした単離したＨＲＰによりヒツジ抗ウサギＩｇアフィニティーである。ウエスタンブロット分析のための細菌サンプルを適当な増殖培地中に１：２０にて一夜培養物を希釈することによって調製し、３７℃でＯＤ600が０．８に達するまで勢いよく振盪する。この点にて総培養物の２０μｌを含むサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ついでタンパク質をバイオラド・トランスブロット細胞（Ｂio-Ｒad Ｔransblot Ｃell）を使用することによって、製造者の指示書に記載されるようにしてニトロセルロース（バイオ−ラド）にトランスファーする。
マウスのワクチン接種および攻撃
ウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスチチュート・オブ・メディカル・リサーチ（Ｗalter and Ｅlisa Ｈall Ｉnstitute of Ｍedical Ｒesearch）（パークビル（Ｐarkville）、ビクトリア）から得た６週齢の雌性Ｂalb-Ｃマウスを水および食物を任意に与えるＰＣ２の施設のためにしたでＣＳＩＲＯ・ディビジョン・オブ・アニマル・ヘルス（ＣＳＩＲＯ Ｄivision Ａnimal Ｈealth）（パークビル、ビクトリア、オーストラリア）にて維持する。マウスは０日および１４日に２００μｌのＡＰＰ調製物を腹腔内（ＩＰ）注入され、２８日にＩＰ攻撃を受ける。コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスＩＰを受ける。攻撃の２４時間後生存しているマウスの数を記録し、ついで攻撃から保護されているかまたはサブ致死量の量（sublethal dose）から保護されていると見なした。
抗体アッセイ
すべてのマウスをワクチン接種およびブーステイングまたは攻撃の前に尾から出血させた。ＡＰＸ１Ａまたは２Ａに対する抗体応答を、プリドー（Ｐrideaux）ら（１９９５）に記載のように、１ウエル当たり０．５μｇのポリ−Ｈis精製ＡＰＸにて間接的な固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。力価は、非処理マウスからの血清よりさらに高い吸光度を与える最大の希釈として発現されている。
実施例２
ＡＰＰのためのプラスミドベクターの開発
１４のＡＰＰ株の調査（パット・ブラックオール（Ｐat Ｂlackall）博士によって提供された；アニマル・リサーチ・インスティテュート、ムールーカ（Ｍoorooka）、クイーンズランド、オーストラリア）はマジック・ミニプレップ・プラスミド単離（プロメガ（Ｐromega）とアガロースゲル／エチジウムブロミド検出（結果は示さず）を用いて検出されることができるプラスミドを有する２つの株を同定した。これらのうちの１つの株であるＨＳ２０５は、ストレプトマイシン耐性であり、この細菌から単離されたプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーションによって導入される場合、大腸菌（Ｅ．coli）およびＡＰＰの両者にストレプトマイシン耐性を付与することが見いだされた。
ＨＳ２０５から単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌から単離され、ストレプトマイシンで選択されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析は、独自の複製およびストレプトマイシン耐性をコードする４．２kbプラスミド（ｐｌＧ３）を同定した。（図１Ａ）。ｐｌＧ３のために生産された制限酵素地図および制限酵素消化およびライゲーションのプロセスによって、２．３kbのｐＩＧ３のＰst Ｉ０サブフラグメントが自己ライゲーションし、大腸菌に形質転換する場合、その結果得られるトランスフォーマントがストレプトマイシン耐性であることが見出された（図１Ｂ）。
大腸菌およびＡＰＰの両者に外来ＤＮＡを運搬するプラスミドの多芸性（versality）を高めるために、マルチプル・クローニング・サイトおよびｌａｃ遺伝子を含む（マーシュ（Ｍarsh）ら、１９８４）ｐＩＣ１９Ｒからの４５０ｂｐのＨaeII断片をＰstＩ部位（pＩＧ３Ｂ；図１Ｂ）の３００bp下流に位置するpＩＧ３１７の唯一のＥcoＲＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミド、ｐＩＧ３Ｂ（図１Ｃ）を外来ＤＮＡをプラスミドに挿入するのに適当なマルチプル・クローニング・サイトおよび大腸菌中でのＸ−ｇａｌの存在下で青／白選択に基づく外来ＤＮＡを運搬するプラスミドの迅速な選択を可能にするlac遺伝子を有する。
実施例  ３
大腸菌中のＡＰＸ１Ａの発現
ＰＣＲ中のＡＰＸ１Ａのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に導入されるであろう任意の過誤を最少にして発現ベクター内のＯＲＦの正確なアラインメントを可能にするため、そのゲノム断片をＰＣＲ断片とともに使用して図２に概説された発現プラスミドｐＱＥ−ＴＩを構築した。この方策はＡＰＸ１ＡＯＲＦをｐＱＥ３０（キアゲン・インク（ＱＩＡＧＥＮ Ｉnc．）、チャタワース、カリフォルニア、米国）にポリ−Ｈis精製シグナルとイン・フレームで挿入して多数のゲノムＤＮＡを含ませることができる。
ｐＱＥ−Ｔ１からのＡＰＸ１Ａの発現は調節可能なプロモーター／オペレーター要素の調節下であり、大腸菌ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。ｐＱＥ−ＴＩからのＡＰＸ１Ａの最適な発現は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下での発現ベクターを含む大腸菌の一夜培養を増殖させることがによって達成された。翌日、５０倍希釈の培養物を作成し、ついでＯＤ600が０．８を達成するまで激しく振盪して、３７℃でインキュベートした。この時点で、毒素の誘発は、ＩＰＴＧがさらに５時間増殖させ、大腸菌を８，０００rpmで１２分間遠心することによって回収した後、培養物の最終濃度２ｍＭに加えることによって達成した。
ＡＰＸ１Ａの精製を、製造者の指示書（キアゲン・インク、カリフォルニア、米国）により、変性条件の下で不動化Ｎｉキレート・クロマトグラフィーを用いて達成した。この系はｐＱＥ系を用いて発現されたタンパク質上に存在する６−Ｈisタグを利用することができる。
実施例４
ＡＰＰのためのＡＰＸ１Ａ発現カセットの構築
ＡＰＸ１発現カセットに基づくｐＩＧの構築を容易にするために、カナマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア）から単離し、図３で概説するようにｐＱＥ−Ｔｉにクローニングする前にｐＩＣ２０Ｒを通して輸送（shuttle）した。得られたプラスミドｐＱＥＴ１Ｋはカナマイシン耐性遺伝子を含み、ついでＡＰＸ１Ａ遺伝子はＴ５プロモーターに結合し、ＳalＩ制限酵素部位によって両方をフランキングした。ＳalＩ断片を単離し、ＳalＩで前に消化したｐＩＧ３Ｂでライゲーションして、大腸菌に形質転換した。望ましいクローンを、カナマイシン耐性でＸ−Ｇａｌの存在下で白コロニーを産生するトランスフォーマントを選択することによって同定した。プラスミドＤＮＡを単離して制限酵素分析を使用してｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの予測外形を確認した（図３）。
実施例５
ＡＰＰワクチン株の構築
ＨＳ９３ＡＰＰ（血液型亜型７；ＡＰＸ２のみ産生）染色体の部位特異的突然変異誘発のプロセスの間、ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の小部位を欠失させるように設計し、単離したものを溶血（haemolysis）区域を血液アガープレート上に産生することに失敗した単離体を得た。この単離体（ＡＰＰＴox-）のさらなる特徴付けは、欠失の同定された部位の周辺の染色体の大部分を失っていることを示した。得られたＡＰＰＴox-株はＡＰＸ構造遺伝子または活性化遺伝子を全く含まないが、ＡＰＸ選択に必要である必要タンパク質を産生するのは、これらの遺伝子はＡＰＰ染色体のどこか他に位置するからである。
ＡＰＰＴox-株を物質および方法の項にて記載されるように、カナマイシン選択ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫで形質転換した。プラスミドＤＮＡをカナマイシン耐性コローニから単離して、制限酵素消化により分析してｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの予想された外形を確認した。
実施例６
ＡＰＰワクチン株の特徴付け
ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫを含むＡＰＰＴox-株の一夜培養ならびにＡＰＰＴox-株およびＨＳ９３を選択されたＨＳ２５（すなわちＡＰＸ１および２）に対するウサギ抗体において作製された高血清を用いてウエスタン・ブロットによって試験した。ウエスタンブロットから（図４）ＡＰＰＴox-株が血清中に存在する任意の抗体に結合せず、野生型ＨＳ９３およびＡＰＰＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの両者はシングルバンドであることが分かるであろう。Ｔox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫで検出したバンドは、Ｔox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫはＡＰＸ１（見かけの分子量１０５−１１０ｋＤａ）を産生するが、その親株ＨＳ９３はＡＰＸ２（見かけの分子量２０３−１０５ｋＤａ）で見られるものより大きい。
実施例７
マウス中でのＡＰＰの病原性の比較
ＡＰＰ ＨＳ９３、ＨＳ２５およびＴox-の一夜培養はＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩブロス中で３７℃で激しく振盪して増殖させた。翌日２０倍希釈した培養物を作製し、ついで新しい培養液をＯＤ600が０．８に達するまでインキュベートし、このＯＤ600値でＡＰＰの生存数は１ｍｌ当たり１×１０9である（データ示さず）。培養液の多彩な希釈をＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩブロス中で調製し、ついで２００μｌをマウスＩＰに投与した。攻撃後、マウスを観察し、ついで２４時間後の総死亡数を記録した。本発明者らの条件下では、この期間の後にＡＰＰ注入のために死亡したマウスは全くなく、その結果を表１に示した。各血液型亜型で得られた死亡数の比較は、血液型亜型１に属し、ＡＰＸ１と２の両方を産生するＨＳ２５は最も病原性を有するＡＰＰ株（１×１０7で１００％死亡）であり、血液型亜型７に属し、ＡＰＸ２のみを産生するＨＳ９３（２×１０8で１００％死亡）が続くが、Ｔox-（血液型亜型７）株は最も高い用量においてでさえ、いかなるマウスも死亡させることができないことを示した。この結果は最も重篤な発病が、ＡＰＸ１およびＡＰＸ２を産生するＡＰＰ血液型亜型に関連するブタのプリゥロニュウモニエからの観察と合致する。
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表１．マウスに多様なレベルのＡＰＰ株であるＨＳ２５、ＨＳ９３またはＴox-株を含む２００μｌの細菌懸濁液を注入する。死亡率を２４時間後記録し、ついで総集団のパーセンテージとして表す。
実施例８
致死ＡＰＰ攻撃からのマウスの保護
ＨＳ９３およびＴox-の一夜培養を調製し、その翌日に２０倍希釈の培養を作製し、ＯＤ600が０．８になるまで増殖させた。各細菌の希釈は、２００μｌのワクチン接種が２×１０7のＨＳ９３または２×１０8のＴox-のいずれかを含むよう、これらの値が、最大化するワクチン接種の用量を選択し、致死量より低い攻撃を維持し、コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスを受けた。マウスは、０日および１４日でＩＰでワクチン接種され、ついで２８日に１×１０8ＨＳ２５または５×１０8ＨＳ９３で攻撃し、ついで２４時間後に死亡数を記録した（表２）。これらから、ＨＳ９３とＴox-の両方は類似攻撃に対して完全な保護を提供し、ＨＳ９３は異種攻撃にいくぶんの保護を与えた。Ｔox-株は異種攻撃に対して全く保護を提供せず、それはまた不活性化したワクチンに基づく細菌（bacterin）で観察され、そのことは血清型間の保護抗原としてＡＰＸ毒素の役割を示唆する。
プラスミドからのＡＰＸ１の不活性化された形態を発現するＡＰＰＴox-の、ＡＰＰ致死異種攻撃に対するマウスを保護するための能力を査定するため、マウスを以下のスケジュールによりＡＰＰＴox-またはＡＰＰＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫでワクチン接種した。第１日に、マウスの尾から出血させ、ついでＩＰで２００μｌの２×１０8Ｔox-またはＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫを含むＢＨＩをワクチン接種した。その手法は１４日および２８日に繰り返されてマウスは尾から出血させられ、ついで５×１０8または１×１０8のＡＰＰ ＨＳ２５で攻撃された。マウスから回収された血清をＥＬＩＳＡに用いて材料および方法において概説されているようにＡＰＸ１に対する抗体を測定した。コントロール血清は２週間隔でＩＰによりＨＳ９３（２×１０8）またはＨＳ２５（２×１０6）の２用量を受けた。
ＥＬＩＳＡの結果は表３に示し、Ｔox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの単一用量はマウスにおいての抗体応答のよい反応を産生するのに十分であり、減弱レベルにおいて、ＨＳ２５の２用量の後に得られたものに等しかった。その抗ＡＰＸ１応答をＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫで第２回ワクチン接種後に相当にブーストしたが、ＨＳ９３またはＴox-での多数のワクチン接種はバックグランドより高い抗体価を産生しなかった。ＡＰＸ２を産生するＨＳ９３で多数のワクチン接種した後ＡＰＸ１を認識する抗体を検出できない能力はＡＰＸと交差反応するＡＰＸ２に対する抗体の不能性を指示するであろうし、これは異種攻撃に対する保護の程度を提供するためのＡＰＸ２を発現しているＨＳ９３の能力に対照的に、Ａｇを発現する大腸菌と由来するＡＰＰの間の差異を反映するであろう。
ＨＳ２５の１０ＩＤ50でのマウスの攻撃は、Ｔox-でのワクチン接種後の保護は全くないが、Ｔox-／３Ｂ−ＴＩＫでワクチン接種したものは６０％の保護を証明したことを示す。攻撃のレベルがＨＳ２５の５ＩＤ50に減じられた場合、再び、Ｔox-単独では全く保護は観察されず、一方プラスミド（Ｔox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫ）からのＡＰＸ１Ａ遺伝子を発現するＴox-は、１００％の保護を証明した。
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表２．マウスに２週間隔で２×１０8ＡＰＰＴox-、または本株ＨＳ９３の２×１０7で腹腔内ワクチン接種し、ついでＨＳ９３（同種）またはＨＳ２５（異種）で２週間後に攻撃した。コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスを受けた。攻撃後の死亡は、２４時間内に死亡した各群内のマウスのパーセンテージとして記録された。
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表３．マウスは２×１０8Ｔox-またはＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫ ＩＰで、２週間隔で２回ワクチン接種され、血清はブーストの前および２週後に収集した。コントロールマウスは２×１０7ＨＳ９３または２×１０6ＨＳ２５の２回の用量を受けた。ＡＰＸ１Ａ特異的抗体は、ＥＬＩＳＡで測定され、ついでバックグランドより高い値の吸光度を与える、最終の希釈の相互性として力価は発現する。
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表４．マウスは２週間隔でＡＰＰのＴox-株でまたはなしで、ＡＰＸ１Ａタンパク質の発現をコードするプラスミドｐＩＧ３Ｂ−Ｔ１Ｋで腹腔内投与でワクチン接種した。コントロールマウスはＢＨＩブロスの投与を２回受けた。最終のワクチン接種２週間後、マウスに異種ＡＰＰ−ＨＳ２５の攻撃を与えた。
実施例９
ＡＰＸ１Ｂ遺伝子の突然変異誘発
組換えプラスミドの構築
組換えカセットはＡＰＸ１Ｂ遺伝子の部位特異的突然変異誘発を可能にするよう設計されたものは、ＡＰＸＢ（フレイ（Ｆrey）ら、１９９３）遺伝子を運搬する２．４ｋｂＥcoＲＩ断片をｐＩＣ１９Ｒ（マーシュ（Ｍarsh）ら、１９８４）にクローニングすることによって構築された。ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア）からのカナマイシン耐性（Kanr）遺伝子を運搬する１．２kbＢamＨＩ断片は、ＢamＨＩで欠失したＡＰＸ１Ｂ遺伝子にクローニングした（図５Ａ）。ＡＰＸ１Ｂ遺伝子は、内部のＫanr遺伝子はＥcoＲＩ断片として単離されて、プラスミドベクターｐＩＧ３１７（プリドーら、１９９５）のＥcoＲＩ部位にクローニングして組換えカセットpＩＧ３−ＢＫrを形成する。
プラスミドpＩＧ３−ＡＭＰrをプラスミド分離に使用して、ｐＩＧ３−ＢＫrおよびＡＰＰ染色体の間の組換えを容易にする。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr）（マーフィー（Ｍurphy）ら）をｐＩＧ３１７のマルチプル・クローニング・サイトにクローニングすることによって構築した。
組換えｐＩＧ３−ＢＫrを利用したＡＰＸ１Ｂの突然変異誘発はＫanr遺伝子マーカーによって邪魔されたＡＰＸ１Ｂ遺伝子のＥcoＲＩ断片をＡＰＰプラスミドベクターｐＩＧ３１７（図５Ａ）に含む。野生型ＡＰＰ ＨＳ２２（血液型亜型１：ＡＰＸ１およびＡＰＸ２）をｐＩＧ３−ＢＫrで、ついでｐＩＧ３１７（ｐＩＧ３−Ａｍｐr）のアンピシリン耐性誘導体で形質転換する。両方のプラスミドで形質転換した細胞をアンピシリンおよびカナマイシンの両方を含む配置で選択した。ｐＩＧ３−Ａｍｐrを維持およびプラスミド分離を通してｐＩＧ３−ＢＫrの損失を促進するため、両プラスミドをアンピシリンのみを含む培地を通して継代培養する。ｐＩＧ３−ＢＫrとＡＰＰ染色体間の組換えが起こる細胞を同定するために、培養をカナマイシン含有ＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガープレートにプレーティングした。血液アガープレート上の溶血地帯を製造できなかった任意の細菌コロニーはカナマイシン含有新鮮血液アガープレート上にパッチングした。カナマイシン耐性でありかつ溶血地帯を製造しなかった１つのコロニーを同定した（ＨＳ２２Ｂ-）。カナマイシンおよび前記のように調製したゲノムＤＮＡ（プリドーら、１９９７）を含むＢＨＩ／ＮＡＤブロスにおいて増殖させた。
ゲノムＤＮＡをＨＳ２２Ｂ-から単離し、ついでｐＩＧ３−ＢＫrを含むＨＳ２２宿主株を組換えカセット内に含まれる領域のＡＰＰゲノムの外側にアニーリングするよう設計された通常のオリゴヌクレオチド
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を用いてＰＣＲによって試験する（図５Ａ）。ＰＣＲ反応の産物をサザンブロット分析によって材料および方法において記載したように、単離したＫanrまたはＡＰＸ１Ｂ遺伝子をプローブとして（図６Ａ）使用して分析した。図６ＡからＡＰＸ１Ｂ遺伝子（ＰＣＲによって増幅した）を含むＡＰＰ染色体の領域は非溶血性／カナマイシン耐性組換えＨＳ２２Ｂ-中において、ＨＳ２２親株においてより大きく約１．２kbである。サザンブロットによるＰＣＲ産物の分析は、その産物はＡＰＸ１Ｂ遺伝子を含むＡＰＰ染色体の領域を増幅して表し、ついでＨＳ２２-の場合には、この拡大化した領域もまたＫanr遺伝子に特異的にハイブリダイズもすることを確認した。これらの結果は、類似の組換えがＡＰＰ染色体とｐＩＧ３−ＢＫr間で起こり、その結果Ｋanr遺伝子のＡＰＰ染色体に部位特異的にトランスファーすることになる。
実施例１０
ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の突然変異誘発
プラスミドｐＥＰ−Ｃ-Ａｍｐr（図５Ｂ）ばＡＰＰＡＰＸ２Ｃ遺伝子の部位特異的突然変異において使用するために構築した。ＡＰＸ２Ｃを含む３．４ｋｂ断片、ＡＰＸ２Ａ遺伝子の最初の７００ｂｐ、ならびにＡＰＸ２オペロンの即時５'領域はＰＣＲを用いて単離され、オリゴをファルマシア・ジーン・アセンブラー・プラス・ＤＮＡ・シンセサイザー（Ｐharmacia Ｇnen Ａssembler Ｐlus ＤＮＡ Ｓynthesiser）を用いて、
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公開された配列に基づいて合成した。ＰＣＲ断片をマイコバクテリウム（Ｍycobacterium）／大腸菌シャトルベクターｐＥＰ２（ラドフォード（Ｒadford）およびホドグソン（Ｈodgson）、１９９１）にクローニングした。得られたプラスミドｐＥＰ−ＣＡはＡＰＸＣオペロン・リーディング・フレームのほぼ中間に存在した唯一のＸbaＩ制限部位を含み、そこには組換えプラスミドｐＥＰ−Ｃ-Ａｍｐrを産生するためにアンピシリン耐性遺伝子を挿入する。
ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の部位特異的突然変異誘発は組換えカセットｐＥＰ−Ｃ-Ａｍｐr（図５Ｂ）を利用し、そのカセットはコリネバクテリウム（Ｃorynebacterium）−大腸菌シャトルベクターｐＥＰ２に基づくものである。本出願人の研究室内においても多数の試みがなされたが、ｐＥＰ２でＡＰＰを形質転換することに失敗し、それにより、ＡＰＰはプラスミドベクターの非維持宿主であり、それゆえＡＰＰ内で使用する為に適当な自殺ベクターであると結論づけた。塩化カルシウム精製したｐＥＰ−Ｃ-ＡｍｐrＤＮＡを大腸菌から単離し、ついでＣlaＩで線形化した。消化後、そのＤＮＡをフェニール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。線形化したＤＮＡの総量３μｇを以前にプライドー（Ｐrideaux）ら、（１９９７）によって記載されたプロモトールを用いて、エレクトロポレーションし、ついでエレクトロポレーション産物をアンピシリンを１μｇ／ｍｌの濃度でＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガープレートに播種した。両アンピシリン耐性である一つのコロニーを単離し、ついで血液アガープレートに溶血ゾーンを産生することを失敗させた。
ゲノムＤＮＡを非ゾーン形成／アンピシリン耐性突然変異ＨＳ９３Ｃ-Ａr、および親株ＨＳ９３から抽出した。ポリメラーゼチェーンリアクションを使用して、ＡＰＸ２Ｃ遺伝子を含むＡＰＰ染色体の領域を試験し、図５Ｂに示される領域のＡＰＸ２オペロン
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に結合するオリゴヌクレオチドを利用した。ＰＣＲ反応の産物を材料および方法に記載のようにＡｍｐrまたはＡＰＸ２Ｃ遺伝子をプローブとして用いて（図６Ｂ）サザンブロットハイブリダイゼーションによとて特徴付けた。図６Ｂにおいて示された結果はＨＳ９３Ｃ-Ａr変異体が親株ＨＳ９３より大きい約１．５ｋｂ（Ａｍｐｒ遺伝子の大きさ）であるＰＣＲ産物を産生することを示す。両細菌からのＰＣＲ産物はＡＰＸ２Ｃ遺伝子にハイブリダイズするが、突然変異体の産物のみがＡｍｐr遺伝子にハイブリダイズする。これらの結果は類似の組換えがＡＰＰ ＨＳ９３染色体と自殺プラスミドベクターｐＥＰ−Ｃ−Ａr間に起こり、その結果、特異的方法でＡｍｐr遺伝子のＡＰＰ染色体上でのトランスファーとなる。
各突然変異株の対数的（Ｌogarithmic）培養およびその親株は、材料と方法の項目に記載のように、ＡＰＰ ＨＳ２５（すなわち血液型亜型Ｉ：ＡＰＸ１および２）の分泌タンパク質に対するウサギで作製された抗血清を用いてウエスタンブロットによって試験した。
実施例１１
マウスのＡＰＰ株の病原性の比較
ＡＰＰ ＨＳ９３、ＨＳ２２の一夜培養物およびその突然変異株を一夜ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩブロス中で３７℃にて激しく振盪して装飾させた。その翌日２０倍希釈したその培養物を作成し、ついで新しい培養物をＯＤ600が０．８に達するまでインキュベートし、ついでこのＯＤ600値でのＡＰＰの生存数は１×１０9ｃｆ．ｕ．／ｍｌ（データ示さず）である。培養物の多様な希釈をＢＨＩブロス中で調製し、ついで２００μｌを６週齢マウスに腹腔内投与した。マウスをそれから２４時間観察し、その後の死亡数を記録した。本発明者らの条件下では、この期間の後のＡＰＰ注入で死亡したマウスは１匹もおらず、得られた結果を表５に示す。
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マウスにＡＰＰ親株および変異株を多様なレベルで腹腔内接種した。２４時間以内に負けなかったマウスはサブ致死量投与を受けたとみなされる。結果を感染に倒れなかった集団のパーセンテージとして記録した。
実施例１２
ＡＰＰでの異種攻撃に対するブタの保護
６週齢のブタを実験群に組み入れる前に、前以て交配させて、ＡＰＰ ＨＳ９３（血液型亜型７）およびＡＰＸに対する既存の抗体のスクリーニングをした。６週齢のブタ９匹は０日に、鼻腔内エアロゾル接種を介して１ｍｌの培地中でＡ×１０9ｃ．ｆ．ｕ．のＡＰＰ ＨＳ９３Ｃ-Ａrを受けた。そのワクチンを１つのコロニーのＨＳ９３-Ａrでの１０ｍｌのＢＨＩ／ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）接種により調製し、ついでＯＤ600が０．８に達するまで３７℃で激しく振盪して増殖させた。そのワクチン接種スケジュールを１４日に０日として繰り返した。
第２８日にブタを群（以下に概説される）に再分類し、ついで鼻腔内経路を介して２ｍｌの増殖培地中に２×１０9ＡＰＰＨＳ２５（血液型亜型１）で攻撃するか、または同様の方法にて与えられた２ｍｌのＢＨＩブロスで攻撃した。高激化部をＨＳ２５の単一コロニーをＢＨＩ／ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）ブロスに接種することによって調製し、ついでＯＤ600が０．８に達するまで増殖させた。その時刻は生存数が１×１０9ｃ．ｆ．ｕ．／ｍｌであった。
各群のブタの数およびサクチン接種／攻撃の外形は以下である：
グループ１
ワクチン接種なしおよび攻撃なし                    ３頭
グループ２
ワクチン接種ありおよび攻撃なし                    ３頭
グループ３
ワクチン接種なしおよび攻撃あり                    ６頭
グループ４
ワクチン接種ありおよび攻撃あり                    ６頭
攻撃５日後、検死された各群において存在する肺傷害の数および重篤度は表６に示す。これらの結果は明らかにＨＳ９３Ｃ-Ａrでのワクチン接種がＡＰＰ、ＨＳ２５の異種株での攻撃からブタを保護する。ワクチン接種も攻撃もない３頭は剖検で存在する検出可能な肺傷害は全く有さず、そのことは他のグループのブタにおいて存在する肺傷害が剖検の時に、ワクチン接種試行の開始後の処理から生じるものであることを示している。ワクチン接種され、かつ攻撃されない３頭のブタもまた剖検の差異に全く傷害がなく、そのことはブタにおける肺傷害を誘発せず、接種後２週間での証拠である。以前に、本発明者らはＡＰＰの毒素欠損株をブタに投与し、本実験で使用した攻撃したものと同様の用量であり、５日で剖検したブタと傷害は全く観察されなかった。ＨＳ２５で攻撃した６頭のワクチン接種しなかったブタすべては、剖検で多数の肺傷害を示した。ＨＳ２５で攻撃した６頭のワクチン接種していないブタは、すべて、剖検で多数の肺傷害を示し、それは本実験で使用された攻撃レベルが脱保護動物における傷害を誘発するのに十分であることを示した。６頭のワクチン接種していないコントロールにおいて、攻撃前にＨＳ９３Ｃ-Ａrでワクチン接種した６頭のブタのうち、１頭だけか剖検で全く傷害のサインを有さなかった。これは単一の接着の形態において、１頭のブタにおいて肺と助骨ケージ間に一層密な検査においてこの接着は攻撃以来５日より古いものであったようである。細菌はこの接着から単離され、ＡＰＰ（すなわち増殖にＮＡＤを必要としていなかった）であるとは分かっていない。この傷害がＡＰＰＨＳ２５での攻撃から生じるか否かにもかかわらず、この結果は明らかにＨＳ９３Ｃ-Ａrが病原性ＡＰＰの異種攻撃に対するブタの保護の可能性を証明する。
議論
ＡＰＰ血液型亜型７株ＨＳ９３は、部位特異的突然変異誘発によってＡＰＸＣ遺伝子を不活性化し、Ａｍｐ遺伝子の挿入を通して、ＡＰＸ Ａ、ＢまたはＤの発現を邪魔せずにワクチン株ＨＳ９３Ｃ-Ａrを産生する。マウスにおけるワクチン株の評価は親株ＨＳ９３（表５）に比較して低減した病原性であることを示した。ワクチンの唯一の真実の評価は、標的種における疾患に対する保護できる能力である。これを示すため、本発明者らはブタに鼻腔内経路を介してＢＳ０３Ｃ-Ａrでワクチン接種し、交差血液型亜型攻撃を行った。使用された攻撃株はＨＳ２５であり、それは血液型亜型１に属し、ついでＡＰＸ１およびＡＰＸ２を産生した。このＡＰＸの組合せはプリゥロニュウモニエの最も重篤な激増と関連することが知られている。ワクチン接種されていないブタは、肺接着および存在する傷害の両方で剖検に関するＡＰＰ感染の多数のサインを有している（表６）。対して６頭のワクチン接接種したブタのうちのただ１頭は、単独の肺接着で、全く感染のサインがなく、そのことは攻撃の結果であることは稀である。この結果は明らかにブタプリゥロニュウモニエに対する生ワクチンとして使用されるべきＨＳ９３Ｃ-Ａr株の安定性を証明している。そのワクチンの鼻腔内経路を介して由来するべき能力は、また証明され、交差血液型亜型の攻撃に対するブタの保護能力と一緒である。これはブタにおいて、交差血液型亜型保護を提供するため使用するのに適しているＡＰＰの生ワクチン株の最初の報告である。
実施例１３
ＡＰＰベクターからの外来タンパク質の発現
ＡＰＰからの外来遺伝子の発現の可能性はＡＰＸ１がＡＰＰ，ＨＳ２５の血液型亜型１株からの単離およびＡＰＰ、ＨＳ９３Ｔoxin-の修飾した血液型亜型７株におけるプラスミドから発現される本明細書において前に証明した。ＡＰＰの血液型亜型７株はＡＰＸ１遺伝子をコードせず、ついでそのＴox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの構築およびその査定は、ＡＰＰからの外来遺伝子発現を表す（図４）。この株はさらに特徴付けられ、ついで野生型ＨＳ９３または修飾したＨＳ９３Ｔoxin-（表３）に比較して、マウス中の抗ＡＰＸ１抗体を誘発することができることが示されている。Ｔox-株からのＡＰＸ１遺伝子の発現はまた、また親Ｔox-株（表４）に比較して、ＡＰＰの異種攻撃に対してマウスを保護できることを示している生ワクチンを産生する。
細菌ベクターとしてＡＰＰが作用する可能性をさらに証明するために、一連のｐＩＧに基づく発現カセットは、図８に概説したようにＡＰＰから外来タンパク質の数の発現のために構築される。外来タンパク質をコートする遺伝子は適当なプロモーターの傍らに共にｐＩＧに基づくプラスミドにクローニングされ、ＡＰＰ中で発現を可能にする。大腸菌中の構築および特徴付けの後、発現プラスミドは材料と方法において記載されるようにＡＰＰに形質転換した。プラスミドＤＮＡを抗生物質耐性コロニーから単離され、予測された外形を確認するための制限酵素消化によって分析した。
サイトカインは、感染およびワクチン接種の後に免疫応答の有効性をコントロールおよび決定する免疫系のホルモンである。サイトカインは保護免疫を誘発するのに最も適した（体液性または細胞性）方向での免疫応答を指令するため、与えられた抗原に対する免疫応答を増加させるために使用されることができる。ＡＰＰベクターからのサイトカインの発現は、ＡＰＰおよび任意の付加的な同時発現する（co-expressed）外来抗原に対する免疫応答を最適化する手段を提供することができる。ブタＩＬ６遺伝子はＣＳＩＲＯ・ディビジョン・オブ・アニマル・ヘルス（ＣＳＩＲＯ Ｄivision of Ａnimal Ｈealth）のデービッド・ストロム（Ｄavid Ｓtrom）博士から入手し、ついで適当なプラスミドベクターにクローニング（図８、ｐＩＧ−ＩＬ６）してＡＰＰ内の発現を得た（ＨＳ９３／ｐＩＧ−ＩＬ６）。ブタＩＬ６の場合、ＡＰＰベクターからの発現はモノクローナル抗体（デービッド・ストロム博士、ＣＳＩＲＯ・ディビジョン・オブ・アニマル・ヘルスにより提供された）を用いて検出した。図９からそのモノクローナル抗体は、ＡＰＰ／３Ｂ−ＩＬ６において期待された大きさ（２２ｋダルトン）でらりかつ大腸菌由来物質い大きさが同一である単一のタンパク質と反応することが分かる。対して発現カセットなしのＨＳ９３はそのモノクローナル抗体と反応しない。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子は抗生物質クロラムフェニコールに耐性を付与する酵素をコードし、および酵素反応において容易に定量化される。プラスミドが構築されて高レベルのＡＰＰからのＣＡＴ発現を達成し（図８Ｂ）、ついでこのクロラムフェニコールに対するプラスミド耐性を有するＡＰＰ株を提供する。
細菌ベクターとしてのＡＰＰの開発はブタの軌道への商業的に有意義な分子を運搬するための手段を提供するであろう。これらの分子のサイトカインを誘発し、免疫系を調節し、多病原性ワクチンを構築する手段を提供する。そのようなワクチンは以下の１回のワクチン接種の後に１より多くの疾患に対する保護を提供する可能性を有する。
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最終的に、本発明の精神および目的から逸脱せずに、多様な変更、修飾および／または付加が構築物および以前に記載された部分のとりきめに導入されることができる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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