(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＦ／ｃｐｎ１０を認識する抗体の製造方法であって、下記の工程：
−ペプチドＡc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣ、ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣまたはＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＣで、ヒト以外の宿主を免疫すること、および
−得られる抗体を取得すること、
を含む方法。
【請求項２】
ＥＰＦ／ｃｐｎ１０を認識する抗体の製造方法であって、下記の工程：
−次の（ｉ）−（ｉｉｉ）よりなる群から選ばれるペプチドで、ヒト以外の宿主を免疫すること
（ｉ）ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉ）Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉｉ）ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ、および
−得られる抗体を取得すること、
を含む方法。
【請求項３】
次のいずれかのアミノ酸配列で表されるペプチドに対して産生された抗体：
Ａｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣ、ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣまたはＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＣ。
【請求項４】
次のいずれかのペプチドに対して産生された抗体：
（ｉ）ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉ）Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉｉ）ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ。
【請求項５】
細胞成長を抑制するか、または免疫学的活性を増強するための、下記からなる群から選ばれる抗体：
（ａ）ペプチドＡｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣ、ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣまたはＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＣに対して産生された抗体、
（ｂ）下記のペプチドに対して産生された抗体：
（ｉ）ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉ）Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ
（ｉｉｉ）ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ。
【請求項６】
妊娠を終了させるための、請求項５記載の抗体。
【請求項７】
腫瘍細胞の成長を抑制させるための、請求項５記載の抗体。
【請求項８】
細胞が白血球である、請求項７記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は「cpn１０」として知られるシャペロニン（Ｃhaperonin）１０のアンタゴニストに関する。
先行技術
シャペロニン類は、より広いクラスの分子シャペロン類に属し、翻訳後のひだ形成、ターゲッティングおよび他のタンパク質の集合に含まれる分子であるが、Ｅllisら，1991，Ａnnu.Ｒev.Ｂiochem．６０，321−347に論じられているように、それ自体は最終的な集合構造の部分を形成しない。大部分のシャペロン類は“熱ショック”または“ストレス”蛋白質（hsp）であり、すなわち、その生成は、種々の細胞傷害（例えば代謝性破壊、酸素ラジカル、炎症、感染および変形）により誘導または増大される。Ｌindquistら，1988，Ａnnu.Ｒev.Ｇenet.２２，631-677で評されているように、熱がよりよい研究ストレスの唯一のものである。特定のタンパク質レベルにおけるこれらの量的変化と同様に、上記のＬindquistらに言及されているように、ストレスは本質的に生成したストレスタンパク質の異なる細胞区分への移動を誘導し得る。熱ショック反応は最も高く維持されている遺伝系の一つであり、そして種々の熱ショックタンパク質が最も進化論的に安定なタンパク質の中に存在している。逆境条件の下で細胞が切り抜けられるように、これらの類のあるものは正常細胞内で基本的な機能を果す。
２つの型のcpn分子、すなわちcpn６０（単量体Ｍr〜６００００）とcpn１０（単量体Ｍr〜１００００）がある。cpn６０はよく研究されてきた。これはすべての細菌、ミトコンドリア、色素体で認められ、そして細胞質型、ＴＣＰ−１は真核細胞中に認められる。いくつかの細胞の表面上でのその存在が報告されている。しかし上記のＥllis文献やvan Ｅden, 1991, Ｉmmunol.Ｒeviews １２１，5−28では疑問視されて来た。非常に最近までcpn１０は細菌中でのみ認められていたが、構造的および機能的に同等なものが葉緑体中（Ｂertschら，1992，Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences ＵＳＡ ８９，8696-8700）、ラット中（Ｈartmanら，1992，Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences ＵＳＡ ８９，3394−3398）および牛肝ミトコンドリア中（Ｌubbenら，1990，Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences ＵＳＡ ８７，7683−7687）で見い出された。
ＡＴＰの存在下でcpn６０とcpn１０は機能的に相互作用をおこし、タンパク質の集合を仲介する。cpn６０から独立して働くcpn１０の例は報告されていないが、cpn６０は単独で働き、本質的に相違する事象に関係している。例えば、それは細菌感染における抗体とＴ細胞反応の免疫支配標的であり、しかし、タンパク質が高く保持されているので自己反応性が生成される。van Ｅden，1991，Ｉmmunol.Ｒeviews １２１，5−28で論じられているように、健常人は変形および感染自己細胞を排除するためにこの自己認識を用いることができ、かかる認識の調節を欠いている者は自己免疫疾患になり得る。当然のことであるが、cpn６０はリウマチ性関節炎などの状態に関係している。分子シャペロン類は、多様なポリペプチド類の構造と結合したりあるいは変化する能力があり、タンパク質生物発生以外の細胞機能において最も重要な役割をなし得る。Ｈartmanら，1993，Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences ＵＳＡ ９０，2276−2280を参照、これはcpn１０およびcpn６０を用いたタンパク質分子の安定化を記載している。
哺乳動物のcpn１０については、非常に近似した配列相同性であることが確証できた。例えば、ラットcpn１０分子（Ｈartmanら，1992）は、Ｊ.Ｅ.Ｗalker，ＭＲＣ Ｌab．of Ｍolecular Ｂiology，Ｈills Ｒoad，Ｃambridge，ＵＫ提供のＭＴ ＢＴＣ ＰＮ１０においてＥＭＢＬ Ｄata Ｂase Ｄirectryに報告されている中のcpn１０の構造と９９％以上の相同姓を有している。このことは、細菌cpn１０がラットシャペロニン１０とわずか３４％平均相同性しか有していないことと対称的である。
初期妊娠因子（ＥＰＦ）
ＥＰＦは最初、妊娠関連物質として言及され（Ｍortonら，1976，Ｐroc.Ｒ.Ｓoc.Ｂ．１９３，413-419）、この発見は受精から６−２４時間以内に妊娠の有無を検査できるので非常に興味を呼んだ。最初にＥＰＦは、リンパ球から免疫抑制因子を放出する能力により、免疫抑制剤としての役割が考えられた（Ｒolfeら，1988，Ｃlin.exp.Ｉmmunol ７３，219-225）。これらの抑制因子はマウスにおいて遅延型の過敏症を低下せしめ、よって、抗原的に異質の胎児に対する母体の免疫反応を抑制するのであろう。さらに最近の研究によると、ＥＰＦの生成は妊娠に限られていない。これは初期および新生細胞増殖の産物であり、これらの状態において成長因子として働く（Ｑuinnら，1990，Ｃlin.exp.Ｉmmunol．８０，100-108；Ｃancer Ｉmmunol.Ｉmmunother．1992，３４，265−271）。ＥＰＦは血小板活性化の産物でもあり、したがって、創傷治癒および皮膚再生に関係することが言われている（Ｃavanaghら，1991，Ｊournal Ｒeproduction and Ｆertility ９３，355−365）。
ＥＰＦは、Ｍortonら、Ｅarly Ｐregnancy Ｆactor, Ｓeminars Ｒeproduction Ｅndocrinology １０，72-82 1992で詳細に再検討された。ＥＰＦ生成の場所および調節が記載され、さらに血小板からのＥＰＦの精製および精製物と他の源から導かれたＥＰＦとの関係についても述べている。この再検討は、精製工程のモニタリングおよび生成源の研究を含み、ＥＰＦの生物検定法（すなわち、ロゼット阻害試験）についても論じている。ＥＰＦの生物活性が論じられ、ＥＰＦとそのアンタゴニストの可能な臨床適用が記載されている。
Ｍortonら，1992，Ｒepord.Ｆertil.Ｄev.４，411−422は、ＥＰＦの免疫抑制および成長因子の性質に関して以前なされた発表を再検討している。前胚保持におけるＥＰＦの役割についても、この文献で論じられている。
今まで、ロゼット阻害試験が複合生物学的混合物中のＥＰＦを検出する唯一の手段であった（Ｍortonら，1976，Ｐroc.Ｒ.Ｓoc.Ｂ. 413−419）。この検定法は、免疫抑制の抗リンパ球血清（ＡＬＳ）がリンパ球と非定型赤血球とのインビトロ自発性ロゼット形成を阻止し得るとのBachおよびＡntoine，1968，Ｎature（Ｌond）２１７，658−659の最初の知見に基づいている。ＥＰＦを検出するために修正法が導入された。まず、ＥＰＦ中でプレインキュベーションしたリンパ球が同じ提供者のＥＰＦ未処理のリンパ球に比してＡＬＳで有意に高いロゼット阻害価（ＲＩＴ）を有していることが上記の1976文献で示された。この試験は、詳細に、上記の1976文献およびＭortonら，1987，“Ｉn Ｃurrent Ｔopics in Ｄevelopmental Ｂiology”Vol.２３，73−92，Ａcademic Ｐress，Ｓan Ｄirgoに記載されており、簡単には、ＥＰＦがリンパ球に結合し、続いて抑制因子の放出を誘導する一連の流れに関している（Ｒolfeら，1988，Ｃlin.exp.Ｉmmunol. ７３，219-225）（Ｒolfeら，1989，Ｉmmunol.Ｃell Ｂiol. ６７，205−208）。
Ａthanasas-Ｐlatsisら，1989，Ｊornal Ｒeproduction and Ｆertility ８７，495−502およびＡthanasas-Ｐlatsisら，1991，Ｊornal Ｒeproduction and Ｆertility ９２，443−451に、ＥＰＦに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の生成および胚生存の欠如をもたらすこれらの抗体による妊娠ラットの受動免疫法について記載されている。これらの研究で妊娠がうまく成立するためにＥＰＦが必要であることがはっきりした。
Ｑuinnら，1990，Ｃlin.exp. Ｉmmunol. ８０，100−108に、ＥＰＦが培養腫瘍および変形細胞の成長調節物であることが示されている。これらの細胞は継続成長のためにＥＰＦに依存しており、すなわち、ＥＰＦがオートクリンモードで働く。
腫瘍細胞の成長が抗ＥＰＦmＡbsでかなり遅延されることから、ＥＰＦが腫瘍の成長促進に役割を演じていることが確証されている。さらに、高い親和力の抗ＥＰＦ抗体を生成するハイブリドーマは本来、不安定であろうことをこの文献は示している。
Ｑuinnら，1992，Ｃancer Ｉmmunol. Ｉmmunother，３４ 265−271に、移植可能マウス腫瘍のインビボ成長に対する抗ＥＰＦのモノクローナル抗体（mAbs）の作用が記載されている。この文献の要点は、ＥＰＦの中和がインビボ腫瘍の成長を遅らすことにある。
癌が非常に初期段階にあるとき、抗ＥＰＦmＡbによるＥＰＦの中和が、癌の拡大を止めることはQuinnら、1992の文献により明らかである。しかし、癌が大きくなってしまうと、これらのmAbsでの処置は癌の成長を止めるが完全に破壊しない。
腫瘍成長におけるＥＰＦの役割に関する他の文献として、Ｑuinn，1991，Ｉmmunol.Ｃell.Ｂiol．６９，1−6およびＱuinn.Ｋ.Ａ.の１９９１年オーストラリアのクイーンズランド大学での“初期妊娠因子：細胞増殖に関する新因子”なる博士論文がある。
上記のことから、ＥＰＦは、胚の存在の指標でありまた必要であり、免疫抑制作用を有していると評価される。最近の研究は、変形、新生および正常細胞の成長調節剤としてのＥＰＦの重要性を示唆しており、血小板中でのその存在は炎症および創傷治癒において役割を演じる。
この特異な結合作用を保持する分子は大きい意義を有しているが、今まで、この分子の構造は明らかでなかった。
意外にも、哺乳動物のシャペロン１０が初期妊娠因子（ＥＰＦ）と同じアミノ酸配列を有することが確証された。
発明の要約
本発明は、一面において、cpn１０、cpn１０誘導体またはcpn１０から誘導されたペプチドの生産を提供するものである。
他の一面において、本発明は、抗cpn１０抗体又は他のアンタゴニストの使用に関する。抗cpn１０抗体又は他のアンタゴニストの使用は、生長抑制作用又は免疫上昇作用を含むことができる。
本発明は、その範囲に、（ｉ）原核性、真核性、組換え又は合成cpn１０或いはそれらの修飾体又は断片に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体若しくはそれら抗体の活性部位又は中心に基づく人為的加工構成体、又は（ii）その分子又は断片の構造の修飾に基づくcpn１０のアンタゴニストの使用を含む。
実験
Ａ．  cpn１０の精製と抗体の生産
（ｉ）ヒト血小板からのヒトＥＰＦの精製（図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）
抽 出
臨床的に７日まで経過の濃縮血小板（血液銀行より）をチロード（Tyrodes）緩衝液で洗い、Ｍethod in Ｅnzymology, 1989, １６７, 7−11に記載の技法を用い、液体Ｎ2で凍らせて−７０℃で保存した。
精製の直前に、約１００洗浄血小板単位を水浴で溶かし、７５−８５℃で１５分間断続的に緩やかに撹拌した。氷冷した後、細胞片を遠心分離（8000ｇ、２０分、４℃）で除き、ペレットを０.０５Ｍ酢酸／０.１Ｍ  ＮaＣl／０.１mg／mlナトリウムアジド  pＨ３.０で均等化により２度抽出し、次いで遠心分離した（8000ｇ、１５分、４℃）。この３上清液をためて、全抽出量が５００−６００mlとなった。
イオン交換クロマトグラフィー
１００血小板単位からの抽出液を濃塩酸でpＨ３.０に調整し、０.０５Ｍ酢酸／０.１Ｍ ＮaＣl pＨ３.０であらかじめ平衡化した２５０ml ＳＰ−Ｓephadex Ｃ−２５（Ｐharmacia−ＬＫＢ）と共に緩やかに一晩、４℃で撹拌した。ゲルを同じ緩衝液２０volで洗ったカラムに入れ、０.５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０.０５Ｍ ＮaＣl  pＨ７.５で溶出した。次いで、ゲルを、捨てた。
親和性クロマトグラフィー
ＳＰ−Sephadex溶出物を、濃塩酸でpＨ６.３−６.４に調整し、０.０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０.０５Ｍ ＮaＣl pＨ６.３であらかじめ平衡化したＨeparin−Ｓepharose ＣＬ−６Ｂのカラム（２.５×７.５cm；Ｐharmacia−ＬＫＢ）にかけた。カラムを同じ緩衝液５volで洗い、０.０５Ｍトリス−ＨＣl／５mＭ  ＣaＣl2／０.２Ｍ ＮaＣl pＨ７.５の５volで溶出し、サンプル適用のために用いるカラムに逆方向でかけた。
高性能疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−h.p.l.c.）
固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4をＨeparin−Ｓepharose溶出液に最終濃度が２Ｍになるまで加え、０.４５μmフィルターを通して後、０.１Ｍトリス−ＨＣl pＨ７.０／５mＭ ＣaＣl2／２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4であらかじめ平衡化したＴＳＫ Ｐhenyl ５ＰＷカラム（７.５×７５mm、Ｐharmacia−ＬＫＢ）上の専用溶媒ラインを通してサンプルをポンプで送った。このカラムを同じ緩衝液１０volで洗い、この緩衝液から０.１Ｍ トリス−ＨＣl pＨ７.５／５mＭ ＣaＣl2／１０％アセトニトリルの５０分直線勾配溶出を行った（図１a）。
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１
活性ＨＩＣ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.フラクションをプールし、Ａ、０.０４Ｍ トリス／ＨＣl pＨ７.０／５mＭ−ＣaＣl2およびＢ、０.０４Ｍ トリス／ＨＣl pＨ７.０／５mＭ ＣaＣl2／８０％（v/v）アセトニトリルからなる溶媒を用いてＣ3カラム（Ｕltrapore ＲＰＳＣ，Ｂeckman Ｉnstitute）上で分画した。カラムをサンプル適用する前に溶媒Ａで平衡化し、その後溶媒Ａ５volで洗い、この溶媒から３０分７５％溶媒Ｂまでの直線勾配で溶出を行った（図１ｂ）。
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−２
いくつかの１００単位血小板のＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１からの活性フラクションをプールし、ＥＤＴＡとＤＴＴをそれぞれの最終濃度が２０mＭと１mＭになるように加え、この混合物を０.５−１時間４℃で放置した。溶媒Ａの２volで希釈した後、Ｃ3カラムにかけ、この工程および次の工程を行い、ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１に記載されたように、しかしＣaＣl2を除き、分画した（図１ｃ）。
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−３
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−２からの活性フラクションをプールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度が０.１％になるように加え、０.１％ＴＦＡ２volで希釈し、０.１％ＴＦＡであらかじめ平衡化したＣ3カラムに混合物をかけた。この溶媒と６０％（v/v）アセトニトリル／０.１％ＴＦＡの３０分直線勾配溶出を、次いで９０％（v/v）アセトニトリル／０.１％ＴＦＡの３分直線勾配溶出を行った。活性フラクションをプールした（図１ｄ）。
１単位は約５００mlである単一の血液提供からの血小板を表す。“活性フラクション”はロゼット阻害試験における活性フラクションであった。
他の供給源からのＥＰＦの精製
Ｃavanagh ＆ Ｍorton，1994，Ｅur.Ｊ.Ｂiochem．２２２，551−560に論じられたように、種々の供給源からＥＰＦを精製した。
すべての例において、生物活性はヒト血小板について述べられている複合精製スキームを通して同じパターンであった。さらに、すべての供給源からの最終活性フラクションは固定化モノクローナル−抗ＥＰＦにより特に結合され、定量的に回収し得る（図１ｅ）。
これらの研究は次の理由により重要である：
Ａ．すべての材料で観察された生化学的および免疫的類似性は、生物検定法が種々の生物的状況において作用する単一の物質または近接する類の物質を検出することの証拠である。
Ｂ．これらの材料から精製された活性体は、ＥＰＦであるとして上記Ｍortonら、1992参照おいて以前に報告されたすべての物質よりも多くの程度より強力である。これは、上に論じたＥＰＦの生物検定法の詳細な分析を基に、恐らくＥＰＦに関している活性が非常に少量の不純物の存在を反映しているに違いないとの推測を確認している。
Ｃ．（活性の妨害として）タンパク質レベルで研究するのに充分なＥＰＦを提供する唯一の供給源材料は血小板と再生肝であり、量はそれぞれ平均１００単位当たり１５μg（〜５０リットル血に相当）および４０ｇ組織当たり５μg（６匹ラットよりの摘出肝）。ＥＰＦは細胞外に表れるよりも細胞中に多く存在している。しかし、蓄積されたＥＰＦ生物学的知識（上記のＭortonら、1992参照）はこの細胞外での出現が偶然のものでないことを示している。
ヒト血小板誘導ＥＰＦは、最も豊富であり、かなり詳細に研究されてきた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｍrの単一バンド約８５００として表れ、生物活性に一致した（図２ａ）；再生ラット肝臓由来のＥＰＦは同様の行動を示した。質量分析計により血小板資料について分子量１０８４３．５±２Ｄaが明確かつ精密に決定され、この高いレベルでの同質性の明白な証拠であった（図２ｂ）。エドマン分解法の後、分子がＮ−ブロックされていることを示すが、約４nmol  ＥＰＦのタンパク質分解分裂が行われた。得たペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣで分離し、エドマン分解法で配列を決めた。１２（フラグメント１）、２７（フラグメント２）および３３（フラグメント３）の残基を含む３配列領域は、ラットのミトコンドリアcpn１０における残基７−１８、２７−５３および６９−１０１（Ｃ末端）に対応することが判明した。フラグメント２の残基５２は異なっていた（cpn１０中のＳ、ラットcpn１０中のＧ；この相違のみでラットcpn１０よりcpn１０が３０Ｄa大きいことが説明できよう）。他のすべての残基は同一で、シャペロニン類の高く保持された本質に一致した（図２ｃ参照）。
ＥＰＦとcpn１０の配列の同一性が確認されて以来、ラットミトコンドリアcpn１０、Ｅ.coli  cpn１０（groＥＳとして知られる）およびＥ.coli  cpn６０（groＥＬ）を用いて、機能的な関係についていくつかの研究がなされてきた。最初に、cpn１０がＥＰＦとして働くことが証明されている。ラットcpn１０がＥＰＦ生物検定法で検討され、予測された希釈範囲以上にポジティブであることが見いだされた。この活性はＥＰＦに対するモノクローナル抗体で中和され得た（表１）。興味あることに、ラットcpn１０と〜４０％の相同性を有するＥ.coli  cpn１０は生物検定で活性を示さなかった。これは、すべての哺乳動物の細胞系および酵母細胞が活性であるのに対し、Ｅ.coliの培地は活性ではないとの知見に一致している。cpn６０は生物検定で不活性であり、ＥＰＦ活性に作用しなかった。ＥＰＦはcpn１０のように働き得ることを示していた。ＥＰＦをＡＴＰの存在下または非存在下でcpn６０と混合し、この混合物をＴＳＫ Ｇ3000ＳＷゲル浸透カラムで分析した。得られたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。cpn６０はデカテトラマー（decatetramer）であり、このカラムの排除体積中に溶出する（排除限界  ３０００００）。ＡＴＰの存在下では、ＥＰＦもこの分画に存在し、cpn６０と安定な複合物の形成を示す。ＡＴＰの非存在下ではそうでない。このフラクションは生物検定において活性であったがＡＴＰ非存在下の実験での同様のフラクション（ＥＰＦがcpn６０と結合していなかった）は活性でない（図３ａ参照）。このようにＥＰＦおよびcpn１０活性は同じ分子に属する。
これらの研究者は、血小板誘導ＥＰＦがcpn１０と構造的および機能的に相同体であるとの明白な証拠を提供する。cpn１０とロゼット阻害試験における活性との関係が試験された（図３ｂ）。ＡＴＰの存在下において、ＡＴＰの非存在下ではそうでないのであるが、固定化cpn６０は原型源資料、妊娠血清からすべての活性を除去し得た。そして固定化複合物からＡＴＰを取り除くと活性は回復し得た。図３ａに記載した実験のように、このＡＴＰの必要性はcpn６０と活性分子との相互関係の特殊性を示している。cpn１０はＥＰＦ生物検定法において反応を司る分子単位である。
cpn１０とのＥＰＦの同一性の確認は本主題についての研究を進める主段階であり、今日までなされた多くの知見を説明する助けとなった。ＥＰＦ生成がこのように多様な生物的状態、例えば、着床前−後妊娠初期および主要細胞増殖および血小板活性において生じるとの主張に対して批判があった。hsp（heat stress protein：熱ストレスタンパク質）としてのその役割において、ＥＰＦ生成の速い開始が期待されるすべての条件がある。細胞の生存に必須であるhspの機能は、上記のＬinquistらに示されているように細胞内である。逆に、今日まで記載のＥＰＦ活性は細胞外である。例えば、Ｍortonら，1987，Ｃurrent Ｔopics in Ｄevelopment Ｂiology，Ｖol.２３，73−92に論じられているように、交配後４−６時間のマウス血清およびＱuinn博士論文（1991）に示されているようにラットの部分的肝切除後４−８時間にその活性が表れる。上述のＱuinnら1990文献に論じられたようにオートクリン相または上述のＲolfeら1988で論じられた外分泌相において、ＥＰＦが働き得ることを我々は示して来た。これらはhspについて以前に記された役割ではない。
ＥＰＦの構造が知られたので、組換えＤＮＡ技法または化学合成などの適当な技術によって商業的な量でＥＰＦを製造し得ることが評価される。
（ii）ＡＮＴＩ−ＣＰＮ１０誘導ペプチドの生産
抗cpn１０誘導ペプチドの生産に使用された方法と得られた結果について記載する。cpn１０のペプチドは、次のアミノ酸配列を含むことができる：
（ｉ）ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
（ii）Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
（iii）ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ
（iv）Ａ1ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ2；
（v）ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ2；
（vi）Ａ1ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
（vii）Ａc−Ａ1ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ2；
（viii）Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ2；
（ix）Ａc−Ａ1ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
（ｘ）Ａ1ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ2；
（xi）ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ2；
（xii）Ａ1ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ；
これらの式中、Ａ1とＡ2は分子（ｉ）〜（xii）の一つ又は各の末端に追加されてもよいアミノ酸配列であり、Ａcはアセチルである。
抗cpn１０誘導ペプチド抗体は、上記アミノ酸配列（ｉ）〜（xii）のいずれか一つに対する抗体を含むことが出来る。例えば、抗体は、Ｎ末端断片（Ａc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣ）と内部断片（ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＣ）に対して産生された。
上記ペプチドについて、それが一個のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含むことが出来、本発明にはそのようなペプチドに対して産生された抗体も含まれることが理解されてよい。
方 法
cpn１０誘導ペプチドの合成
ペプチドは、cpn１０のＮ末端フラグメント（Ｎ−ペプチド、即ちＡc−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＣ）および内部フラグメント（Ｉ−ペプチド、即ちＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＣ）と一致するように合成した。
卵白アルブミンに対するペプチドの結合
ペプチドを、異種２機能性試薬ＳＰＤＰにより、製造者（Ｐharmacia ＬＫＢ．Ｂiotechnolkogy，Ｕppsala，Ｓweden）の指示に従って、卵白アルブミンに結合された。
免疫化スケジュール
成熟非近交系ニュージーランドウサギを、接合体の一つを週４回注射し、続いて数カ月追加免疫することにより免疫化した。
注射のために、抗原を０.９％食塩水（Ｍr１２−１５０００除去透析管、Ｖisking，Ｕnion Ｃarbide，ＩＬ，ＵＳＡ）で透析し、等量のフロインドアジュバント（一回目は完全、それ以降不完全）に乳濁化した。免疫化はs.c.経路経由であった。注射された抗原の量を第１表に示す。
抗血清のスクリーニング
抗血清を、適切な抗原（即ち、Ｉ−ペプチドまたはＮ−ペプチド；卵白アルブミン）（５mg／ml）に対してＥＬＩＳＡで試験した。結合ＩgＧは、ｏ−フェニレンジアミンを基質として、ビオチン−ストレプトアビジン系（Ａmersham）で検出した。吸光度は４９２nmで読んだ。
抗Ｎ−ペプチドＡbsもまた、血小板誘導ＥＰＦ（１mg/ml）（Ｃavanagh et al.,1994, Ｅur.Ｊ.Ｂiochem., ２２２, 551-560）とＮ−ペプチド（５mg/ml）に対して、抗ＥＰＦAbs♯８１０及び♯８１６（Ａthanasis-Ｐlatsis et al., 1989, Ｊ.Ｒeprod.Ｆert.87, 495-502）と平行して試験された。
抗体の精製
ＩgＧを親和性クロマトグラフィーにより血清から精製した。製造者の指示に従って、Ｎ及びＩペプチドと卵白アルブミンを別々にＨiＴrap（商標）親和性カラム（ＨiＴrap ＮＨＳ−活性化1ml, Ｐharmacia−ＬＫＢ）にかけた。各カラムを０.０５ＮaＰi−０.５Ｍ ＮaＣl（pＨ７.４）で平衡化し、適切な抗血清を製造者の指示に従って適用した。平衡バッファーでよく洗浄した後、結合ウサギＩgＧを０.２Ｍグリシン（pＨ２.５）で溶出した。溶出液のpＨは、２Ｍトリスで約７.４に調節した。
溶出液中のＡbs純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定し、最強のフラクションをプールした。
タンパク質の評価
タンパク質（ＩgＧ）は、商業用に調整されたＦolin−Ｃiocalteu試薬（Ｓtansens，Ｑld，Ａustralia）を使用して、Ｌowryの方法（Ｌowry et al., 1951, Ｊ.Ｂiol.Ｃhem., １９３, 265-275）により決定した。標準曲線は、精製ウサギＩgＧ製剤（２０mg/ml；Ｓilenus, Ｈawthorne, Ａustralia）で作成した。
結 果
抗体のＥＬＩＳＡスクリーニングは、若干の興味ある結果を与えた。
抗ペプチドＡbsタイターは、追加免疫（boosting）を行っても低下したが（図４ａ，４ｂ）、抗卵白アルブミンコントロールＡｂｓの産生は正規のレスポンスを示した（図４ｃ）。ペプチド結合体で免疫したウサギにおける抗卵白アルブミンＡbsのタイターも同様に減少した（図４ａ，４ｂ）ことが注目される。
交差反応性の検討は、図５に示される。
親和性精製Ａbsのタイターは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した免疫ペプチドに対するＥＬＩＳＡによって決定された。この試験は、また、方法の効率をも証明した。結果は、第２表に示される。
これらのＡb製剤は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で約９５％の純度であることが示された。
結 論
免疫スケジュールの間のＡbsの減少タイターは、Ｂ細胞クローンの増殖におけるcpn１０に対する役割を示唆する。抗ＥＰＦ抗体を生産する抗体産生Ｂ細胞クローンの不安定性は、先に記載された。抗ＥＰＦ抗体産生のパターンは、上記したように、最初の免疫後５週間で最高のタイターとなり、その後、追加免疫を繰り返しても低下する。イン・ビトロにおいて、抗ＥＰＦ抗体を産生するハイブリドーマは、本来不安定であった（Ｑuinn et al., 1990, Ｃlin.Ｅxp.Ｉmmunol.,８０, 100-108）。抗ＥＰＦ／cpn１０抗体を生産するハイブリドーマの安定なセルラインを作り出すことの困難性は、細胞増殖におけるＥＰＦ／cpn１０のオートクリン作用、すなわち、抗体が増殖細胞によってそれら自身の利益のための生産されるＥＰＦ／cpn１０を中和することによるものであろう。
（iii）組換えＣＰＮ１０に対する抗体の生産
cpn１０をコードするヒトcＤＮＡのクローニングおよびcpn１０の製造
商業的使用のための製造は、哺乳動物cpn１０遺伝子、望ましくはヒドｃＤＮＡcpn１０遺伝子をｐＧＥＸ系、ｐＥＴ系からのプラスミドのような適当なベクターに挿入し、コードされた哺乳動物cpn１０を発現し、組換えcpn１０を精製することにより達成され得る。
略号：
ＡＮＧＩＳ        オーストラリア国立遺伝情報サービス
bp                塩基対
ＢＳＡ            牛血清アルブミン
cＤＮＡ           相補的ＤＮＡ
cpn１０           シャペロニン１０
ＤＮＡ            デオキシリボ核酸
Ｅ.coli           大腸菌
ＧＳＨ            グルタチオン（還元型）
ＧＳＴ            グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
ＬＢ              ルリア−ベルタニブロス
Ｍ                モル
ＯＲＦ            オープンリーディングフレーム（翻訳領域）
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
rＥＰＦ           組換え初期妊娠因子
ＲＳＰ            逆配列プライマー
ＳＤＳ            ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｔris             トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＵＳＰ            正配列プライマー
材料および方法
ヒトcpn１０オープンリーディングフレームのクローニング
メラノーマ細胞系Ａ２０５８cＤＮＡラムダライブラリー（Ｓtratagene）からヒトcpn１０cＤＮＡのＯＲＦ（２７４bp）部分を最初に増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた。変性cpn１０アンプリマー（Ｐ１）は、ヒトcpn１０のアミノ酸残基８３−９１に対応するアミノ酸配列ＶＬＤＤＫＤＹＦＬからつくられた。プライマーＰ１は配列５’ＡＲＲＡＡＲＴＡＲＴＣＹＴＴＲＴＣＲＴＣ３’を有し、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴである。逆配列プライマーは、ＰＣＲ増幅（非特異的プライマー）および配列ＤＮＡ構築に用いられ、配列５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３’を有する。正配列プライマーは配列５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’を有している。ファージ・ライブラリーのＰＣＲ増幅は、非特異的上流アンプリマー（ＲＳＰ）およびＰ１を、それぞれ０.５μＭ最終濃度、１.５mＭ ＭgＣl2（Ｐharmacia Ｂiotech）、１Ｘポリメラーゼ緩衝液（Ｂoehringer Ｍannheim）、テルムスアクアティカス（Ｔhermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂoehringer Ｍannheim）５単位および最終容量の５０μＬ中で用いて、達成された。３０サイクルについてのパラメーターは、９４℃、１分間での変性、４０℃、３０秒間のアニーリングおよび７２℃、３分間のエクステンションであった。７２℃で７分間の最終エクステンションが４℃１０分間のソークサイクルに続いて、なされた。１μＬのアリコートがコピー数を増すために同じ条件で増幅された。
オープンリーディングフレイムを有する２つのcpn１０特異アンプリマーが作られた。上流プライマーＰ２、５’−ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧ−３’が最初のＰＣＲフラグメントの配列から作られた。下流プライマーＰ３、５’−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＴＴＣＣ−３’は、Ｅxpressed Ｓequence Ｔag database via ＡＮＧＩＳ（Ａccession No.ＨＵＭ00ＴＢ037）から得られる配列から作られた。アニーリング温度を５０℃にした以外は上述と同じ反応およびサイクリングの条件を用いてファージ・ライブラリーからＡ３１９bpフラグメントが増幅された。
ＤＮＡ構築および分析
Ｂoehringer Ｍannheimから得た制限酵素およびバッファーを用いて、Ｓambrookら（Ｓambrookら，1989，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual. ２nd Ｅd. Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress, Ｃold Ｓpring Ｈarbor, ＮＹ）に従って、ＰＣＲ生成物およびベクターのすべての制限酵素による切断を行った。最初ＰＣＲフラグメントをＥcoＲ１で消化し、プラスミドpＲＭ１を形成するpＢluescript ＫＳ（＋）（Ｓtratagene）のＥcoＲ１とＳma Ｉ位でライゲートした（Ｓambrook et al., 1989, Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual. ２nd Ｅd.Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress, Ｃold Ｓpring Ｈarbor, ＮＹ）（図６ａ；部分cpn１０挿入２７４bp）。３１９bp生成物をＢamＨＩおよびＥcoＲ１で消化し、プラスミドpＲＭ２を形成する発現プラスミドpＧＥＸ−２Ｔ（Ｐharmacia Ｂiotech）に最初にクローン化した（図６ｂ）。この同一性を確認するために、ＢamＨＩ−ＥcoＲ１フラグメントをpＢluescript（ＳＫ＋）にサブクローン化し（pＲＭ３；図６ｃ）、配列決定した。ＤＮＡを、エチディウムブロマイドを含む０.８−１.０％（w/v）アガローズゲルで分析し、電気泳動の後、ＵＶイルミネーションで観測した。
Ｅ．coliの形質転換
適格なＥ．coli ＤＨ５αの細胞（１００μＬ）をプラスミドで熱律動法（Ｓambrookら，1989，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual. ２nd Ｅd. Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress, Ｃold Ｓpring Ｈarbor, ＮＹ）により形質転換した。細胞とＤＮＡの混合物（１０−１００ng）を３０分間氷の上におき、正確に２分間４２℃で熱律動せしめ、２分間氷の上にもどした。ＬＢの０.９mＬを加えた後１時間後振り、３７℃で細胞を回収した。１００μＬの部分標本を最終濃度１００μg／mＬでアンピシリンを補ってＬＢ寒天プレート上に置いた。３７℃で一夜、培養した後、ランダムコロニーを次の実験に選択した。
ＤＮＡ配列決定
ＰＣＲ生成物の制限フラグメントをpＢluescript中にクローンし、製造業者（Ｐharmacia Ｂiotech）の指示に従ってＴ７ポリメラーゼキットを用いてジデオキシチェインターミネーション法によって両定位に配列した。約２μgのプラスミドＤＮＡを変性し、エタノール沈殿し、ＵＳＰ、ＲＳＰまたはＰ３のいずれかにアニーリングした。配列反応を８％アクリルアミド／４６％ウレア  ゲル上で電気泳動した。固定し乾燥した後、Ｘ−線フィルムをゲルに一夜さらし、そして現像した。
Ｅ．coliにおける組換えcpn１０の発現および精製
Ｓmithら（Ｓmithら，1988，Ｇene ６７（1）31−40）に記載された方法により小培地スケール（２ml）でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の発現のためにpＲＭ２で組換えたクローンをスクリーニングした。一夜置いた培地を希釈し、０.１mＭ ＩＰＴＧを加え、３７℃で数時間おいて融合タンパク質を発現せしめた。細胞をペレット化し、ＰＢＳ／０.１％Ｔriton Ｘ−１００に溶解し、溶解質を５０％グルタチオン−アガローゼ  ビーズ（Ｓigma Ｃhemical Ｃompany）と混合した。組換え融合タンパク質をＳＤＳバッファー中で煮沸することにより親和性ビーズから溶出した。サンプルのアリコートを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルを固定し、コーマッシーブルー（Ｃoomassie blue）で着色した。融合タンパク質の発現を確認した後ＧＳＴ分子からのrcpn１０の精製がより大きい規模で行われた。
上述のように細胞を生長、誘導せしめて、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁し、超音波処理し（output level ４，５０％ duty cycle，２×３０ sec）そして細胞溶解質を−３０℃で保存した。１０リットル細胞培地からの溶媒質を解凍し、rＬＩＦの分離のためにＧearingら（Ｇearingら., 1989, Ｂiotechnology ７, 1157−1161）が用いたと同じ方法によりrcpn１０を分離した。直ちに、ＴritonＸ−１００を最終濃度０.１％になるまで加え、そして細胞切片を遠心分離で除いた（１５分、15000rpm、４℃）。１０mlのグルタチオン−セファローズ４Ｂゲル（Ｐharmacia−ＬＫＢ Ｂiotechnology）を上清に加え、スラリーを４℃で２時間混合した。ゲルをペレットし、５０mlのＰＢＳ／０.１％ ＴritonＸ−１００で５回、５０mlの０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣlで１回および０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣl／２.５mＭ ＣaＣl2で１回洗った。ゲルを４mlの０.０５Ｍ トリス−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣl ／２.５mＭ ＣaＣl2バッファー中に懸濁し、１０００単位のトロンビン（ＳigmaＴ６８８４）を加え、スラリーを振動水浴中、３７℃で１時間混合した。ゲルをペレットし、上清を保持し、ゲルを３回４ml０.０５Ｍ トリス−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣlで洗った。rcpn１０を包有するものである、これらの洗液と上清をプールすると４−５mgの組換えタンパク質が得られた。ゲルと非特異的に結合している追加のrcpn１０は次のように回収された。４mlの０.０５Ｍ Tris−ＨＣl pＨ８.０／２Ｍ ＮaＣlを加え、そしてスラリーを４℃で２時間混合した。
ペレットした後、ゲルを３回、２mlのこの０.０５Ｍ Tris−ＨＣl pＨ８.０／２Ｍ ＮaＣl bufferで洗い、洗液を最初の上清をプールして、さらに約１mgのrcpn１０が得られた。タンパク質濃度はＬawryらの方法（Ｌawryら., 1951, Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.１９３, 265−275）によって測定された。１５％Ｔris−Ｔricineゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質が分析された（Ｓchagger et al., 1987, Ａnal.Ｂiochem.１６６, 368−379）。
組換えcpn１０は、そのＮ末端に二つの追加のアミノ酸を有している。組換えタンパク質のＮ末端は、Ｇly−Ｓer−Ａlaであるのに対し、天然タンパク質のＮ末端はＡc−Ａlaである。組換えcpn１０のアミノ酸配列は、次の通りである：
0003987104.tif 000002
抗体は、ＧＳＴ：rcpn１０融合タンパク質に対して産生された。
組換えタンパク質に対する抗体は、抗ペプチド抗体を生産する為に記載されたのと同じスケジュールを使用し、ウサギで産生された。各注射に対し、約１０μgのタンパク質が使用された。ウサギ血清は、プレートを最初cpn１０（５μg／ml）で被覆した以外は、抗ペプチド抗体をスクリーニングするために記載された方法を使用し、ＥＬＩＳＡによって抗cpn抗体に対してスクリーニングされた。cpn１０に対する及びウサギ♯４２の血清中の全融合タンパク質に対する（この場合は、ＧＳＴ：rcpn１０，５μg／mlをプレートに結合させた。）抗体（Ａb）タイターは、図７に示される。第４回のブースター後にこのウサギから採取されたcpn１０に対する血清試料の滴定を図８に説明する。
Ｂ．  妊娠の終結
本発明の他の一面において、妊娠患者に対してcpn１０特異性抗体を投与することにより、妊娠を終わらせることが出来る。抗体は、cpn１０又はその誘導体に対して産生させ得る。これらの抗体の投与は、好ましくは、前着床段階（１〜２細胞段階）又は近着床段階において行われる。抗cpn１０抗体による妊娠の終結は、マウスモデル系を例として以下のように証明される。このマウスモデル系は、単なる例示であって、この方法がマウスに限定されるものではない。この方法は、ヒトを含むいかなる適当な哺乳類種に対しても適用されてよい。
（ｉ）ＣＰＮ１０ペプチドに対して産生された抗体による前着床段階での妊娠の終結
抗cpn１０抗体
これらの抗体の製法及び特性は、既に記載されたとおりである。これらの実験において、使用された抗体は、Ｎ−末端ペプチド（cpnＮ）及び内部ペプチド（cpnＩ）に対して製造されたものである；cpnＮとcpnＩはロゼット阻止試験において活性である。ＩgＧは、抗血清から、４５％硫酸アンモニウムによって沈殿したものであり、濃度はＬowryとゲル電気泳動によって決定された。ＩgＧ製剤は、ウシ血清アルブミンに結合した免疫ペプチドに対するＥＬＩＳＡで試験された。製剤はまた、マウス妊娠血清において活性を中和するそれらの活性について試験された。種々の濃度の抗体を等容量のマウス血清と共に培養し、次いでその混合物をロゼット阻止試験における活性について試験した。ＥＰＦ活性を安全に中和できた抗体の最低濃度を決定した（Ｃavanagh et al., 1994, Ｅur.Ｊ.Ｂiochem., ２２２, 551-560参照）。１０pgの抗Ｎ−ペプチドＡbは、妊娠血清１mlの活性を中和したが、４ngの抗Ｉ−ペプチドが完全な中和に必要であった。
受動免疫化
成熟非近交系雄および雌カッケンブッシュマウスを、７：３０a.m.に対でケージに入れ、８：３０p.m.に離した。膣栓のある雌マウスに、妊娠１日目（交配の日）および２日目の９：００a.m.および５：００p.m.に、抗−Ｎ−ペプチド／卵白アルブミン、抗−Ｉ−ペプチド／卵白アルブミンまたは抗−卵白アルブミンＩgＧ製剤を注射した。２用量レジメにおける特異的ＩgＧの注射量は、約１mg／マウス／日と概算した。７日目に、マウスをＣＯ2で安楽死させ、着床胚および計数した黄体（ＣＬ）について子宮を試験した。それぞれの群において、試験ＩgＧで処理したマウスの胚／ＣＬの数を、同量の対照ＩgＧを投与したものの数と比較した（χ2試験）。
結 果
第３表に示した結果は、妊娠血清における活性の中和が妊娠の早期段階において、胎児の生存能力に逆に影響することを明らかに証明する。ロゼット阻止試験においてcpn１０活性を中和する抗体の能力は、妊娠に逆に影響するそれらのイン・ビボ能力のイン・ビトロモニターである。
Ｃ．  ガンと腫瘍
本発明の更に他の局面は、患者に対するcpn１０のアンタゴニストの投与による異常細胞の生長の抑制である。上記の異常細胞や正常細胞の異常生長は腫瘍やガンを含むものである；正常細胞の異常生長は、乾癬やレイター氏症候群のような疾病を含む。腫瘍細胞には、良性の生長を示すものと悪性の生長を示すものの両方が含まれる。固形腫瘍や血液ガンのような悪性疾病の細胞も含まれる。腫瘍細胞成長の抑制効果の例は、ネズミＢ１６メラノーマやＭＣＡ−２繊維芽肉腫細胞を使用する実験によって証明される。
（ｉ）抗ＣＰＮ１０誘導ペプチド抗体（Ａbs）のイン・ビトロ腫瘍細胞の成長に対する効果
導 入
次の研究は、イン・ビトロで腫瘍細胞によって生産されたcpn１０が当該細胞の継続生長にも必要である可能性を調査したものである。
方 法
細胞培養
セルラインを、標準条件下、基礎培地としてのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＩＣ  Ｂiochemicals Ａustralia Ｐty. Ｌtd., Ａustralia）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＮ，ＩＣＮ）、２０mMグルタミン（ＩＣＮ）及び抗生物質［１００μg／mlストレプトマイシン（ＩＣＮ）、１００Ｕ／mlペニシリン（ＣＳＬ，Ｍelbourne, Ａustralia）］を補充した培地中、３７℃において、空気中に５％ＣＯ2を含む湿気含有雰囲気下に培養した。
細胞は、成長の対数期に維持した。単層を、血清フリー培地中で洗浄してから、３７℃で０.１％w/vトリプシンと０.０２％w/vバーセンのカルシウムとマグネシウムフリーの平衡塩溶液に短時間暴露することにより、解離された。トリプシンの作用を２％v/vＦＣＳ含有培地の添加によって中和し、細胞を２００gに５分間遠心分離して回収し、血清フリー培地で２回洗浄し、その後、培養皿又は９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ）に接種した。
セルラインのストックは、常に液安中で凍結して保持した。
共培養実験用抗ペプチドＡbsの調整
親和性精製抗ＮＡbs、抗ＩＡbs及び抗卵白アルブミン抗体（コントロール抗体）をＤＭＥＭに交換し、最終濃度１mg／mlに調節した。この製剤を、０.２μＭカットオフフィルター（Ｍinisart, Ｓartorius Ｇmbh, Ｇottingen, Ｇermany）を通過させて、殺菌した。コントロール培地として、ＤＥＭＥ単独を同様に処理した。
腫瘍細胞と抗ペプチドＡbsとの共培養
ネズミＢ１６メラノーマ及びＭＣＡ−２繊維芽肉腫セルラインについて研究した。細胞（１０3）を、抗体ペプチドＡbs又はコントロールＡｂの６２.５〜５００μgＡb／ml（最終濃度）用量を含む０.２ml培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（熱不活化））中に、３回接種した。細胞は、同様に、抗体を含まない濾過培地に接種した。培地を９６時間培養後、試験した。生存度をトリパンブルー排除で評価し、メチル−［3Ｈ］チミジン５’−トリホスフェート（［3Ｈ］チミジン；Ａmersham Ｉnternational, Ａmersham, ＵＫ）の取り込みを細胞分割速度をモニターするために使用した。各抗体用量に対する相対的［3Ｈ］チミジンの取り込みは、配合した平均cpm（３倍のウエルから）を抗体不含有ウエル中に配合された平均cpmの百分率として表すことにより計算した。
細胞生存能の決定
トリプシンによって解離された細胞を等容量の０.１％w/vトリパンブルーＰＢＳ溶液と混合し、ヘキサイトメーター（ｈaemocytometer）上に広げた。細胞生存能は、染料除外細胞の百分率として計算した。
［3Ｈ］チミジン取り込みの決定
８０時間培養後、細胞をさらに１６時間、ウエル当たり０.５μＣi［3Ｈ］チミジンと共に培養した。培養後、粘着性細胞の上澄培地を除去し、各ウエルを温ＤＭＥＭで２回にわたり洗浄した。酸沈殿性物質を、各ウエルに対して２５０μl氷冷５％w/v三塩化酢酸（ＴＣＡ，ＢＤＨ Ｃhemicals, Ａustralia Ｐty Ｌed. Ｋilsyth, Ｖictoria, Ａustralia）を添加することにより、分離した（Ｐlate, 1974, Ｊ.Ｅxp.Ｍed., １３９, 851−861）。沈殿物をＴＣＡで２回にわたり洗浄し、０.３ml ０.２５Ｎ ＮaＯＨ中で溶解化し、この調製物２５０μlを２のmlシンチレーションカクテル（Ｅmulsifier safe, Ｐackard Ｉnstruments Ｃo., Ｍeriden, ＣＴ, ＵＳＡ）と混合し、酸沈殿性物質中に配合されたcpmを各ウエルにつきベータ計数によって決定した。
免疫細胞化学
ヒトＴ細胞白血病細胞Ｍolt４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８２）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で対数期に維持した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で３回にわたって洗浄し、１０μg（０.１ml中）の親和性精製抗ＮペプチドＡｂ、抗ＩペプチドＡｂまたはコントロール抗体（抗卵白アルブミンＡｂ）と共に培養した（１０6細胞）。コントロール試験は、１０6正常脾臓細胞を含んでいた。結合抗体を抗ウサギ、ビオチニル化ＩｇＧ、Ｆ（ab’2）断片（Ａrmsham）、次いで製造業者の指示書に従ってストレプタビジン−フルオレスセイン処理を行い、検出した。結合は、ＵＶ顕微鏡により可視化された。
結果
腫瘍細胞成長は、抗cpn１０誘導ペプチドＡbsとの共培養によって行う。
抗ペプチドＡbsの濃度を上昇させて行ったＢ１６メラノーマとＭＣＡ−２繊維芽肉腫細胞の培養は、９６時間後、細胞分割の顕著な減少と細胞死滅の増加をもたらした（図９a、９b、１０a、１０b）。コントロールＡｂの類似の濃度における細胞培養は、効果がなかった（図９c、１０c）。
抗Ｉペプチド抗体は、Ｍolt４細胞の表面中でcpn１０に結合した。Ｍolt４細胞上において、抗Ｎペプチドまたは抗卵白アルブミン抗体により、又は正常な脾臓細胞上において、上記抗体のいずれかにより、結合は検出されなかった。これは、細胞外cpn１０の最初の可視図である（図１１）。
結論
ここに記載された研究により、抗cpn１０誘導ペプチドＡbsは腫瘍細胞の成長を阻止することが確立された。抗ペプチドＡbsの用量を増加された場合の培養Ｂ１６およびＭＣＡ−２セルラインの抗増殖効果は、それらの細胞の成長がcpn１０の継続的存在に依存するものであることの証明である。これらの研究は、腫瘍細胞がイン・ビトロ増殖のためにcpn１０を必要とすることを確証した。
発明の他の局面
上記Ｎ末端フラグメントおよび内部フラグメントは、ロゼット阻止試験において活性であり、従って活性中心として機能する分子の領域である。
薬理学的アンタゴニストは、常套手段により、それら活性中心の構造を修飾し、標的部位、たとえば腫瘍細胞に対する結合が標的を賦活させることなく生ずるように、構成することができる。腫瘍細胞上の全体のcpn１０分子の作用を干渉することによって、これらのアンタゴニストは抗cpn１０抗体に対して記述した抗増殖効果と同様な効果を示す。
本発明は、またその範囲に、次の工程を含むことを特徴とする、試料中の抗cpn１０抗体を測定する方法を有する：（１）本質的に精製したcpn１０を当該試料と反応させること、（２）抗体とcpn１０の間の結合を決定することによって当該試料中の抗cpn１０抗体の量を決定すること。
本発明は、また上記のことから、抗ＥＰＦ抗体がマウスモデルの腫瘍の成長を抑制するのに有用であると言うデータが存在することを承知するであろう（たとえば、Ｑuinn et al., 1992, Ｃancer Ｉmmunol. Ｉmmunother. ３４, 265-271）。このようなデータは、抗ＥＰＦ抗体がイン・ビボまたはイン・ビトロにおける腫瘍の成長を抑制するであろうと言う主張を指示するものである。
アンタゴニストまたは抗体の投与において利用される投与量は、アンタゴニストに対しては体重のkg当たり１〜１,０００（好ましくは５０〜２００）μgの範囲であり、抗体に対しては体重のkg当たり１〜１,０００（好ましくは５０〜２００）mgの範囲である。これらの投与量はcpn１０と同じ分子量を有する分子に基づくものであり、従って用量を適宜に調節すべきである。
Ｃ．  ガンと腫瘍
本発明の更に他の局面は、患者に対するcpn１０のアンタゴニストの投与による異常細胞の生長の抑制である。上記の異常細胞や正常細胞の異常生長は腫瘍やガンを含むものである；正常細胞の異常生長は、乾癬やレイター氏症候群のような疾病を含む。腫瘍細胞には、良性の生長を示すものと悪性の生長を示すものの両方が含まれる。固形腫瘍や血液ガンのような悪性疾病の細胞も含まれる。腫瘍細胞成長の抑制効果の例は、ネズミＢ１６メラノーマやＭＣＡ−２繊維芽肉腫細胞を使用する実験によって証明される。
（ｉ）抗ＣＰＮ１０誘導ペプチド抗体（Ａbs）のイン・ビトロ腫瘍細胞の成長に対する効果
導 入
次の研究は、イン・ビトロで腫瘍細胞によって生産されたcpn１０が当該細胞の継続生長にも必要である可能性を調査したものである。
方 法
細胞培養
セルラインを、標準条件下、基礎培地としてのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＩＣ  Ｂiochemicals Ａustralia Ｐty. Ｌtd., Ａustralia）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＮ，ＩＣＮ）、２０mMグルタミン（ＩＣＮ）及び抗生物質［１００μg／mlストレプトマイシン（ＩＣＮ）、１００Ｕ／mlペニシリン（ＣＳＬ，Ｍelbourne, Ａustralia）］を補充した培地中、３７℃において、空気中に５％ＣＯ2を含む湿気含有雰囲気下に培養した。
細胞は、成長の対数期に維持した。単層を、血清フリー培地中で洗浄してから、３７℃で０.１％w/vトリプシンと０.０２％w/vバーセンのカルシウムとマグネシウムフリーの平衡塩溶液に短時間暴露することにより、解離させた。トリプシンの作用を２％v/vＦＣＳ含有培地の添加によって中和し、細胞を２００gに５分間遠心分離して回収し、血清フリー培地で２回洗浄し、その後、培養皿又は９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ）に接種した。
セルラインのストックは、常に液安中で凍結して保持した。
共培養実験用抗ペプチドＡbsの調製
親和性精製抗ＮＡbs、抗ＩＡbs及び抗卵白アルキレン抗体（コントロール抗体）をＤＭＥＭに交換し、最終濃度１mg／mlに調節した。この製剤を、０.２μＭカットオフフィルター（Ｍinisart, Ｓartorius Ｇmbh, Ｇottingen, Ｇermany）を通過させて、殺菌した。コントロール培地として、ＤＥＭＥ単独を同様に処理した。
腫瘍細胞と抗ペプチドＡbsとの共培養
ネズミＢ１６メラノーマ及びＭＣＡ−２繊維芽肉腫セルラインについて研究した。細胞（１０3）を、抗体ペプチドＡbs又はコントロールＡｂの６２.５〜５００μgＡb／ml（最終濃度）用量を含む０.２ml培養培地（ＤＭＲＭ＋１０％ＦＣＳ（熱不活化））中に、３回接種した。細胞は、同様に、抗体を含まない濾過培地に接種した。培地を９６時間培養後、試験した。生存度をトリパンブルー排除で評価し、メチル−［3Ｈ］チミジン５’−トリホスフェート（［3Ｈ］チミジン；Ａmersham Ｉnternational, Ａmersham, ＵＫ）の取り込みを細胞分割速度をモニターするために使用した。各抗体用量に対する相対的［3Ｈ］チミジンの取り込みは、配合した平均cpm（３倍のウエルから）を抗体不含有ウエル中に配合された平均cpmの百分率として表すことにより計算した。
細胞生存能の決定
トリプシンによって解離された細胞を等容量の０.１％w/vトリパンブルーＰＢＳ溶液と混合し、ヘモサイトメーター（ｈaemocytometer）上に広げた。細胞生存能は、染料除外細胞の百分率として計算した。
［3Ｈ］チミジン取り込みの決定
８０時間培養後、細胞をさらに１６時間、ウエル当たり０.５μＣi［3Ｈ］チミジンと共に培養した。培養後、粘着性細胞の上澄培地を除去し、各ウエルを温ＤＭＥＭで２回にわたり洗浄した。酸沈殿性物質を、各ウエルに対して２５０μl氷冷５％w/v三塩化酢酸（ＴＣＡ，ＢＤＨ Ｃhemicals, Ａustralia Ｐty Ｌtd. Ｋilsyth, Ｖictoria, Ａustralia）を添加することにより、分離した（Ｐlate, 1974, Ｊ.Ｅxp.Ｍed., １３９, 851−861）。沈殿物をＴＣＡで２回にわたり洗浄し、０.３ml ０.２５Ｎ ＮaＯＨ中で溶解化し、この調製物２５０μlを２のmlシンチレーションカクテル（Ｅmulsifier safe, Ｐackard Ｉnstruments Ｃo., Ｍeriden, ＣＴ, ＵＳＡ）と混合し、酸沈殿性物質中に配合されたcpmを各ウエルにつきベータ計数によって決定した。
免疫細胞化学
ヒトＴ細胞白血病細胞Ｍolt４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８２）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で対数期に維持した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で３回にわたって洗浄し、１０μg（０.１ml中）の親和性精製抗ＮペプチドＡｂ、抗ＩペプチドＡｂまたはコントロール抗体（抗卵白アルブミンＡｂ）と共に培養した（１０6細胞）。コントロール試験は、１０6正常脾臓細胞を含んでいた。結合抗体を抗ウサギ、ビオチニル化ＩｇＧ、Ｆ（ab’2）断片（Ａrmsham）、次いで製造業者の指示書に従ってストレプタビジンーフルオレスセイン処理を行い、検出した。結合は、ＵＶ顕微鏡により可視化された。
結果
腫瘍細胞成長は、抗cpn１０誘導ペプチドＡbsとの共培養によって行う。
抗ペプチドＡbsの濃度を上昇させて行ったＢ１６メラノーマとＭＣＡ−２繊維芽肉腫細胞の培養は、９６時間後、細胞分割の顕著な減少と細胞死滅の増加をもたらした（図９a、９b、１０a、１０b）。コントロールＡｂの類似の濃度における細胞培養は、効果がなかった（図９c、１０c）。
抗Ｉペプチド抗体は、Ｍolt４細胞の表面中でcpn１０に結合した。Ｍolt４細胞上において、抗Ｎペプチドまたは抗卵白アルブミン抗体により、又は正常な脾臓細胞上において、上記抗体のいずれかにより、結合は検出されなかった。これは、細胞外cpn１０の最初の可視図である（図１１）。
結論
ここに記載された研究により、抗cpn１０誘導ペプチドＡbsは腫瘍細胞の成長を阻止することが確立された。抗ペプチドＡbsの用量を増加させた場合の培養Ｂ１６およびＭＣＡ−２セルラインの抗増殖効果は、それらの細胞の成長がcpn１０の継続的存在に依存するものであることの証明である。これらの研究は、腫瘍細胞がイン・ビトロ増殖のためにcpn１０を必要とすることを確証した。
発明の他の局面
上記Ｎ末端フラグメントおよび内部フラグメントは、ロゼット阻止試験において活性であり、従って活性中心として機能する分子の領域である。
薬理学的アンタゴニストは、常套手段により、それら活性中心の構造を修飾し、標的部位、たとえば腫瘍細胞に対する結合が標的を賦活させることなく生ずるように、構成することができる。腫瘍細胞上の全体のcpn１０分子の作用を干渉することによって、これらのアンタゴニストは抗cpn１０抗体に対して記述した抗増殖効果と同様な効果を示す。
本発明は、またその範囲に、次に工程を含むことを特徴とする、試料中の抗cpn１０抗体を測定する方法を有する：（１）本質的に精製したcpn１０を当該試料と反応させること、（２）抗体とcpn１０の間の結合を決定することによって当該試料中の抗cpn１０抗体の量を決定すること。
本発明は、また上記のことから、抗ＥＰＦ抗体がマウスモデルの腫瘍の成長を抑制するのに有用であると言うデータが存在することを承知するであろう（たとえば、Ｑuinn et al., 1992, Ｃancer Ｉmmunol. Ｉmmunother. ３４, 265-271）。このようなデータは、抗ＥＰＦ抗体がイン・ビボまたはイン・ビトロにおける腫瘍の成長を抑制するであろうと言う主張を指示するものである。
アンタゴニストまたは抗体の投与において利用される投与量は、アンタゴニストに対しては体重のkg当たり１〜１,０００（好ましくは５０〜２００）μgの範囲であり、抗体に対しては体重のkg当たり１〜１,０００（好ましくは５０〜２００）mgの範囲である。これらの投与量はcpn１０と同じ分子量を有する分子に基づくものであり、従って用量を適宜に調節すべきである。
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表の説明
表１
ウサギに投与した抗体調製物の注射当たりの抗原の量
表２
親和性精製抗−cpn１０ペプチド抗体および対照抗−卵白アルブミン抗体のタイター。
表３
確認交配マウスに、cpn１０由来ペプチドに対するを抗体１日および２日目のp.c.で受動免疫化した、p.c.７日目の着床胚および黄体の数における効果。
＊（ヘテロセダスティックｔ−検定）
図面の説明
図１ａ
ＥＰＦの精製。熱抽出ヒト血小板（１００単位）をＳＰ−セファデックスおよびヘパリンセファロースで分画し、次いで、ＴＳＫ−フェニル５ＰＷカラムにかけ、逆塩勾配で溶出した。フラクションはロゼット阻害試験で試験した（免疫抑制抗リンパ球血清のロゼット阻害活性を増大させるＥＰＦの能力を基本にして）。
図１ｂ
（ａ）の活性フラクション
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をＲＰ−ＨＰＬＣ−１で分画した。
図１ｃ
（ｂ）の活性フラクション
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をＲＰ−ＨＰＬＣ−２で分画した。
図１ｄ
（ｃ）の活性フラクション
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をＲＰ−ＨＰＬＣ−３で分画した。
図１ｅ
（ｄ）由来の活性フラクションを伴う固定化モノクローナル抗ＥＰＦ抗体５／３４１とヒト妊娠血清、妊娠６日（１０ml）；ヒト妊娠尿、妊娠１カ月まで（１０リットル）；プロラクチンで刺激した発情マウス卵巣（１００）により条件付した培地とマウス胚条件付培地（卵巣ＣＭ）；ウシ腎臓細胞系ＭＤＢＫ（ＭＤＢＫ−ＣＭ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２２、１０リットル）により条件付した無血清培地；部分的肝切除後２４時間に得たラット血清（ポスト−pＨ、１０ml）；ポスト−pＨ２４時間のラット肝臓（４０g）；（ａ）から（ｄ）の全フラクションの等価フラクションの相互作用。抗ＥＰＦ結合および非結合フラクションは、ロゼット阻害試験で試験し、活性が結合しない無関係抗体を使用した平衡実験と比較することにより特異性を証明した。
図２ａ
図１Ａのように３００単位ヒト血小板から精製したＥＰＦの分析。モノマーサイズの決定。ヨウ素化ＥＰＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥ29で分画し、ゲルスライス（２mm広さのスライス）し、放射活性および生物活性の分布を比較した。（挿入図）同様の調製物における直接クマーシーブルー染色。
図２ｂ
ＥＰＦのイオン噴霧マススペクトル、多重プロトン化分子イオンとして表示。（挿入図）分子質量のコンピューター復元。
図２ｃ
ラットcpn１０（下線）と比較した、ヒトＥＰＦ由来のペプチドのアミノ酸配列（１文字標記）。ＥＰＦをエンドプロテイナーゼlys Ｃおよびエンドプロテイナーゼglu Ｃで消化し、残ったペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分離し、配列決定した。この個々のフラグメントの配列を示す；７４−１０１以外は、lys消化由来である。
図３
ＥＰＦとcpn６０（groＥＬ）の相互作用。
図３ａ
cpn６０−ＥＰＦ混合物＋Ｍｇ2+ＡＴＰをかけた後のＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷゲル透過カラムの除去量におけるピークフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓchaggerら, 1987）で分析し、銀染色した（Ｍorrissey, 1981）。左レーン  ＋ＡＴＰ、右レーン  −ＡＴＰ。（cpn６０は１４量体、Ｍ  ８４００００、カラム溶出限界＞３０００００。ＳＤＳゲルの高い方のＭrバンドはgroＥＬの多量体形である）。
図３ｂ
固定化cpn６０をヒト妊娠血清（妊娠６日目）とＭｇ2+ＡＴＰ存在下または非存在下で混合した。非結合および結合フラクション（後者はゲルから、ＥＤＴＡによるＡＴＰの除去により回収した）を、次いで、ロゼット阻害試験で試験した。結果は限界量、ロゼット阻害試験で陽性結果となるサンプルの最も高い希釈として示す。
図４a，４b、４c
cpn１０−ペプチド／卵白アルブミン結合体に対するウサギ抗体。抗体を免疫抗原に対するＥＬＩＳＡで試験した。
図５
抗Ｎ−ペプチド、抗ＥＰＦ♯８１６、抗ＥＰＦ♯８１０及びコントロール抗卵白アルブミン抗体（１００ng／ml）を□Ｎ−ペプチド（５μg／ml）及び  ＥＰＦ／cpn１０（１μg／ml）に対するＥＬＩＳＡで試験した。結合ＩgＧは、基質としてｏ−フェニレンジアミンを使用するビオチンーストレプトビジン系（Ａmersham）により、検出した。吸光度は４９２nmで読み取った。
図６ａ
pＲＭ１
図６ｂ
pＲＭ２
図６ｃ
pＲＭ３
図７
cpn１０に対する抗体の調製。融合蛋白質（ＧＳＴ：rcpn１０）
図８
ＥＬＩＳＡによるウサギ血清中の抗cpn１０抗体の検出。血清は抗原の第４回の追加免疫後採取された。
図９
抗cpn１０誘導ペプチド抗体と共に９６時間培養後、Ｂ１６メラノーマ細胞の相対的［3Ｈ］チミジン取り込み（−■−）及び生存能（--□--）。増殖は、抗体と共に培養した細胞中への抗［3Ｈ］チミジンの取り込みによって評価し、抗体なしで培養された［3Ｈ］チミジンの百分率として表した。
＊ｐ＜０.０５，＊＊ｐ＜０.０１，＊＊＊ｐ＜０.００１，（学生のtテスト）ｎ＝３
図１０
抗cpn１０誘導ペプチド抗体を共に９６時間培養後、ＭＣＡ−２繊維芽肉腫の相対的［3Ｈ］チミジン取り込み（−■−）及び生存能（--□--）。増殖は、抗体と共に培養した細胞中への抗［3Ｈ］チミジンの取り込みによって評価し、抗体なしで培養された［3Ｈ］チミジンの百分率として表した。
＊ｐ＜０.０５，＊＊ｐ＜０.０１，＊＊＊ｐ＜０.００１，（学生のtテスト）ｎ＝３
図１１
抗cpn１０  Ｉ−ペプチドＡbsは、ヒトＭolt４白血病細胞の表面上のcpn１０を検出する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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