(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫反応に対する寛容を誘導するに有効な量の自己免疫抗原をトラップしたポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）の粒子の、自己免疫疾患治療のための医薬の製造のための使用であって、該抗原はタイプＩＩコラーゲン、Ｓ抗原、主要塩基性タンパク質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、またはそれらの免疫優性ペプチド断片であり、該粒子は５００ｎｍ未満の大きさを有する使用。
【請求項２】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ炎、コラーゲン誘導関節炎、多発性硬化症、実験的自己免疫脳脊髄膜炎、インスリン依存性糖尿病、実験的糖尿病およびブドウ膜炎から選択される１つである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ炎である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
単一用量の該粒子を自己免疫反応に対する寛容を誘導するために投与する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
自己免疫疾患治療のために使用する医薬組成物であって、該組成物は自己免疫反応に対する寛容を誘導するに有効な量の自己免疫抗原をトラップしたポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）の粒子を含んでなり、該抗原はタイプＩＩコラーゲン、Ｓ抗原、主要塩基性タンパク質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、またはそれらの免疫優性ペプチド断片であり、該粒子は５００ｎｍ未満の大きさを有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は免疫学的寛容−誘導物質(immunological tolerance-induction agent)に関するものである。より詳しくは、免疫学的寛容−誘導物質として生分解性(biodegradable)重合体の用途及び哺乳動物で自己免疫疾患を治療する方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
外来物質(「抗原」という)を脊髄動物に注入して抗原と相互作用する特定抗体の生産または作用Ｔリンパ球(effector T lymphocyte)の発生及び抗原と遭遇する位置で可溶性媒介物質の予防措置(precaution)を特徴とする免疫反応を誘導させることができる。抗体及びＴリンパ球が敵対抗原に対する防護において重要な役割を果たすが、これはまた有害なプロセスに関与し、宿主組織の破壊に至らしめ得る。これは自己の抗体及び／またはＴリンパ球が自己組織の抗原と反応し、上記組織を損傷させる自己免疫疾患の場合である。これはまた特定環境物質に対する過剰免疫反応を特徴とし、組織破壊に至らしめる炎症性反応を誘発させ得るアレルギー性反応の場合である。
【０００３】
自己免疫疾患などの望ましくない、すなわち組織損傷性(tissue damaging)免疫反応によって誘発される疾患を有効に治療する方法は、残余の免疫系には影響を及ぼさずに、有害な免疫プロセスの強度を許容可能な程度に特異的に抑制するか、減少させることである。免疫寛容は、所定の外来物質に対する有害な免疫学的反応を確実に欠如させる全てのメカニズムに関連する。
【０００４】
非−肥満性糖尿病にかかったマウス(１−４)中実験的アレルギー性脳脊髄炎(experimental allergic encephalomylitis(ＥＡＥ))、コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)、ブドウ膜炎、及び糖尿病を含む動物モデルで経口投与された自己抗原(autoantigen)は、自己免疫を抑制させる。経口寛容は応答不全(hyporesponsiveness)状態が予め反復的に投与された蛋白質を用いた免疫化から誘発されるという所見を説明する。最近まで、抗原−特異的寛容誘導を多様な自己免疫疾患に対する治療法として用いてきた。例えば、II型コラーゲン(type II collagen)(ＣＩＩ)または主要塩基性タンパク質(major  basic  protein(ＭＢＰ：myeline basic protein)の反復的な投与が、それぞれＣＩＡまたはＥＡＥの治療に効果的であると報告されている。同様に、Ｓ−抗原の経口投与は、実験ブドウ膜炎(１−４)の発生を抑制させることができる。経口寛容誘導は非−特異的免疫抑制より選択的に病原性免疫反応を抑制させることができるため、白血球減少症のような副作用、感染の増大した感受性または現在自己免疫疾患を治療するために用いられる他の薬物によって誘導され得る悪影響を誘導しない利点がある。しかし、経口寛容誘導の理想的な性質にかかわりなく、ヒト疾患で経口寛容の有効性に対してあまり報告された例がなく、結果でさえ完全に一致していない。
【０００５】
一部の因子が寛容誘導の有効性に影響を与え得る。抗原の性質(可溶性または粒子抗原(particulate  antigen))(５)、抗原投与量(６,７)、遺伝子情報(８)、消化フロラ(digestive  flora)の役割(９)、及び抗原吸収(１０)が寛容効果を決定する重要な因子であることが知られている。特に、経口寛容(oral tolerance)は活動している免疫学的に関連する抗原の存在と関係する。完全に吸収される抗原の量は、非常に変化し、投与量は０.００１％〜１％範囲の極少量であり、これは抗原が吸収される前、部分的に腔内消化されるためである(１０−１２)。これと関連し、ヒト自己免疫疾患の寛容治療法で経口投与された抗原の吸収率を増進させることが可能であると思われる。
【０００６】
増大した吸収率、生物学的適合性、持続型薬物放出などの利点のために、薬物伝達システム(drug carrier system)として生分解性微細粒子が研究された(１３−１５)。特に、粒子は長期間、あるエントラップ(entrapping)物質を周囲にゆっくり放出できるため、１日１回投与しても１〜３ケ月間多種類の薬物、ホルモン、及びワクチンを送達できる。最近、経口投与された粒子抗原が胃腸管の１次免疫システムのパイエル板(Peyer`s patch)によく吸収されると報告された(１６−１８)。また、粒子によりエントラップされた可溶性抗原は、酸性及び粘膜表面で見られる酵素的敵対環境から保護され得、パイエル板をオーバーレイしたＭ細胞及び粘膜上皮による抗原の吸収を促進させ、局所リンパ濾胞及び関連するリンパ節への抗原移動を増進させ、たぶん抗原を局所蓄積させることができる(１９−２２)。粒子抗原の性質のために、免疫学で粒子に対する研究は主にワクチン伝達システムに集中している。
【０００７】
パイエル板中粒子抗原の可能な蓄積及び肝臓及び脾臓のような別個の解剖学的区域へのそれに続く移動が粘膜及び全身免疫反応を調節できる。最近、さまざまな種類の重合体が病的免疫反応を抑制する潜在能を持っていると報告された。Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンより構成された合成アミノ酸共重合体のコポリマー１(Copolymer 1)はＥＡＥの自己抗原であるＭＢＰに対するＴ細胞免疫反応の下方調節と関連し、Ｔｈ２／３型調節細胞により媒介されるＥＡＥの発症に有益な効果を有する(２３)。ＣＩＡで、コポリマー１はまた競争的にＲＡ−関連ＨＬＡ−ＤＲ分子とＣＩＩの相互作用を抑制し、ＣＩＩ反応性Ｔ細胞反応を抑制する(２４)。他の直鎖両親性重合体のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)が、またＣＩＡで関節炎を予防することが証明された(２５)。それと反対に、シリコンポリマーグラフト澱粉微細粒子は、たとえ抗原の放出を遅延させなかったり、分解から抗原を保護しなかったりしても、粘膜の抗原性を増進させ、これは経口用ワクチン伝達のために有益な用途を示唆していると報告された(２６)。以前の全ての発見は、経口投与される粒子抗原に対する免疫原性は、生体内で粒子の類型及び大きさによって異なり得ることを示唆する。また、あるとすれば、寛容誘導における粒子抗原の運命及び役割は生体内で定義されたものである。
【０００８】
リウマチ関節炎(ＲＡ)は、ヒトの代表的な自己免疫疾患であり、破壊的な多発関節炎を特徴とする。ＲＡの病因体は不明確だが、免疫学的特殊組織である軟骨の過多、及び敏感な齧歯動物及び高等霊長類の免疫化後の破壊的な免疫−媒介性多発関節炎を誘導する能力のために、ＣＩＩが強力な候補である(２７,２８)。ＣＩＩに反応するリンパ球がＲＡを持つ患者の末梢血、または関節から確認されており、ＣＩＩに対する抗体またＲＡ(２９)を持つ患者の血清、関節液(ＳＦ)及び軟骨で証明され、これはＣＩＩがヒトＲＡで自己抗原として作用し得ることを示唆する。
【０００９】
ヒトＲＡでＣＩＩを用いて抗原−特異的免疫抑制を試験した。経口投与されたＣＩＩがＲＡの動物モデルで関節炎の有効な抑制を見せるが、上記実験はヒトＲＡでＣＩＩを用いた経口寛容と一致しない。Barnettらは経口ＣＩＩ治療法が大部分のＲＡ患者で有効だと立証した(３２)。反対に、Sieperらは、少数の患者のみが経口ＣＩＩを用いた治療に反応したと報告した(３３)。したがって、ＣＩＩを用いる経口寛容誘導がヒトＲＡ治療で有効な方法であるかは不明確である。
【００１０】
ヒト疾患で経口寛容治療法の争点となる効果も、また他の自己免疫疾患で注目される。これは経口寛容誘導の重要な手段である小腸内パイエル板内に不充分に抗原が伝達されるためかも知れない。あいにく、寛容誘導で腔内消化を克服し、抗原の速度及び量を増進させようとする試みはほとんどなかった。重合体及び蛋白質より構成された粒子が蛋白質伝達のために有用であることは立証されたが、寛容を誘導するＰＬＧＡまたは活性成分−エントラップＰＬＧＡの能力をテストしようとする試み、及び計画はなかった。
【００１１】
寛容治療法の有用性を決定する追加の変数はＣＩＩ、ＭＢＰ、Ｓ−抗原、及びグルタミン酸脱炭酸酵素(ＧＡＤ)を含む自己抗原の容易な入手可能性である。これらの抗原はこれをヒトに投与するために、生きている動物から精製しなければならないため、動物に含まれたウイルスをヒトに伝達する危険性を持っている。これと関連して、ヒト疾患の治療時この抗原の実際使用は制限される。最近、上記で言及された自己抗原の免疫優性部分(immunodominant   portion)を含む合成ペプチドもまた全(whole)抗原分子と全く同様に、自己免疫疾患の発生を抑制できると報告された(３４,３５,３６,３７,及び３８)。
【００１２】
合成ペプチドは動物から自己抗原を精製する場合の難点と関連する欠点がなく、ＲＡ、多発性硬化症、及びブドウ膜炎のような自己免疫疾患の治療に用いることができる。合成免疫優性ペプチドは容易、且つ経済的に製造でき、ウイルス疾患を伝達させる危険を持っていないために、合成の免疫優性ペプチドを用いる寛容誘導が将来有望なように思われる。
【００１３】
本発明者らは代表的な自己免疫疾患であるＲＡの動物実験モデルで、その中にエントラップされた自己免疫抗原またはその免疫優性ペプチド断片を含むか、含まない生分解性重合体粒子を用いて一連の経口寛容誘導を行い、免疫学的分析及び電子顕微鏡によって寛容を誘導する重合体粒子の能力及びそのメカニズムを試験した結果、重合体粒子は自己免疫疾患に対して経口寛容を誘導し、自己免疫抗原の経口寛容を増進させ得るとの知見を得た。
【００１４】
発明の要約
本発明は、自己免疫疾患の哺乳動物に生分解性重合体粒子、特にポリ(ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド)を有効量で経口投与し、自己免疫反応に対する寛容を誘導することを含む、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、また自己免疫疾患の哺乳動物に自己免疫抗原をエントラップする生分解性重合体の粒子を有効量で経口投与し、自己免疫反応に対する寛容を誘導することを含む、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに自己免疫疾患に対する経口寛容のための誘導剤または増進剤として生分解性重合体の用途を提供する。
【００１７】
当業界の通常の技術者は、本発明の上記及び他の目的、性質及び適用を下記詳細な説明によって理解するだろう。
【００１８】
発明の詳細な記載
本発明は、特に、自己免疫疾患のための経口免疫学的寛容−誘導物質として生分解性重合体粒子、特にポリラクチド−ポリグリコリド(ＰＬＧＡ)粒子の用途を提供する。
【００１９】
生分解性重合体は、哺乳動物で経口寛容を増進させるために、その中にエントラップされた自己免疫抗原を含むことができる。
【００２０】
本明細書で使われる用語“自己免疫抗原”は、自己免疫攻撃(attack)の対象が自身である組織−特異的抗原を意味し、とりわけＥＡＥ、ＣＩＡ、ブドウ膜炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)などの抗原を含むことができる。具体的には、II型コラーゲン、メジャーベーシックプロテイン(ＭＢＰ)、グルタミン酸脱炭酸酵素(ＧＡＤ)、Ｓ抗原等及びその免疫優性ペプチド断片を含む。免疫優性ペプチド断片は、本分野の技術者に公知であり、下記SEQ IN NO. 1〜SEQ IN NO. 11を含み、免疫学的性質を維持するかぎりその同等物も含まれ得る。
【００２１】
1)リウマチ様関節炎(３５)
CII(74-93) ; ARGFPGTPGLPGGVKGHRGYP (SEQ. ID. NO.1)
CII(254-273) ; TGGKPGIAGFKGEQGPKGEP (SEQ. ID. NO. 2)
CII(924-943) ; PGERGLKGHRGFTGLQGLPG (SEQ. ID. NO. 3)
CII(255-270) ; CGEBGIAGFKGEQGPK (SEQ. ID. NO. 4)
【００２２】
0003926626.tif 000002
【００２３】
0003926626.tif 000003
【００２４】
免疫優性ペプチド断片の配列はその起源によってわずかに変化し得、その起源に関係なくペプチド断片をエントラップするポリマー粒子が生体内で寛容誘導性を表すかぎり、本発明はそれを含む。合成及び自然発生のペプチド断片、いずれも本発明によって用いることができ、合成ペプチド断片は低費用で容易に生産されるために有利に用いられる。
【００２５】
本明細書で使われる用語“自己免疫疾患”は、免疫系が自己の身体組織を外来のものとして誤って認識し、それに対する正常でない免疫反応を誘発する異常を意味し、実験アレルギー性脳脊髄炎(experimental allergia  encephalomylitis(ＥＡＥ))、コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)、リウマチ関節炎(ＲＡ)、ブドウ膜炎(uveitis)、多発性硬化症、ＩＤＤＭ、非−肥満糖尿病などを含むことができる。本発明によってリウマチ関節炎が有利に治療され得る。特に、抗原のない重合体粒子を有利に用いて、Ｔｈ１−媒介またはＴ細胞−媒介自己免疫疾患、例えば、リウマチ関節炎、ＩＤＤＭ、ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎(例：グレーブス病(バセドウ病)、橋本甲状腺炎)、自己免疫肝炎、間質性肺炎または糸球体腎炎、及びそれに動物モデルにおけるそれらに対応する疾患などが治療され得る。
【００２６】
本明細書を通じて、用語“重合体”または“ＰＬＧＡ”、または式“ＰＬＧＡ-ＣＩＩ”で‘ＰＬＧＡ’部位(または‘ＣＩＩをエントラップするＰＬＧＡ’)、または“ＰＬＧＡ-ＣＩＩ”(アミノ酸番号)は、化合物それ自体を表すために意図的に用いられない限り、所望の大きさを持つ粒子をいうことを理解するべきである。また、用語“粒子(複数)”は、特に断らない限り、重合体粒子及び抗原−エントラップ重合体粒子の両方を含むものとして用いられる。
【００２７】
生分解性重合体によりエントラップされる自己免疫抗原は治療される自己免疫疾患の種類によって困難なく本分野の技術者により選択され得る。例えば、ヒトのＲＡ及び動物モデル(ラット、マウス、サル等)のコラーゲン誘発性関節炎治療のためにＣＩＩまたはその免疫優性ペプチド；ヒトの多発性硬化症及び動物モデル(ラット、マウス等)の実験自己免疫脳脊髄炎治療のためにメジャーベーシックプロテイン及びその免疫優性ペプチド；ヒトのＩＤＤＭ及び動物モデル(ラット、マウス等)の実験糖尿病治療のためにＧＡＤ；及びヒトの自己免疫ブドウ膜炎及び動物モデル(ラット、マウス等)の自己免疫ブドウ膜炎治療のためにＳ抗原がエントラップされる。
【００２８】
本発明が適用され得る哺乳動物は、これに制限されないが、ラット、マウス、サル、多様な実験動物モデル、及びヒトを含むことができる。
【００２９】
本発明によって用いられる生分解性及び生体適合性(biocompatible)重合体はこれに制限されないが、ポリ(ＤＬ−ラクチド)、ポリグリコール酸、ポリ(ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド)(‘ＰＬＧＡ’)、ポリ(イプシロン−カプロラクトン)などを含む。ＰＬＧＡは生体内でその安全性が十分立証されているために、本発明に係る用途として望ましい。粒子製造のための重合体物質は市販されている。この生分解性重合体は重合体結合の加水分解によって分解され、水に暴露時ＰＬＧＡに対して乳酸及びグリコール酸のような生体適合性生成物を生成する。
【００３０】
本明細書で使われる用語“ＰＬＧＡ”は、乳酸及びグリコール酸の多様な共重合体をいい、これは下記一般式で表すことができる:
【化１】
0003926626.tif 000004
【００３１】
重合体の分子量は約２５,０００ドルトンないし約１２０,０００ドルトンの範囲である。ラクチドユニット：グリコリドユニットの比は１００：０〜５０：５０範囲である。例えば、Birmingham Polymers, Incorporateから入手できる、ラクチドユニット：グリコリドユニット＝８５：１の比を有するＰＬＧＡは０.５８ｄＬ／ｇの固有粘性を有し、約９０,９００ドルトンの分子量を有する。表面積、空隙率及び分子量によって、約１０ケ月以下の生分解時間であると報告されている。一方、５０：５０ＰＬＧＡ重合体は２ケ月の分解時間であると報告されている。
【００３２】
生分解性重合体の粒子(以下、単に‘粒子’という)は１００ナノメーターないし数千ナノメーター、好ましくは５００ｎｍ未満、及びより好ましくは、約１００〜約３００ｎｍ範囲の直径を持つ。粒子は通常の方法、例えば、重合体の有機溶液を水溶液に分散させた後、溶媒を蒸発させて製造され得る。
【００３３】
自己免疫抗原をエントラップする粒子は通常の水中油中水(water-in-oil-in water)型乳剤溶媒蒸発方法によって製造され得る。例えば、適切な水性溶媒中生物学的活性成分をメチレンクロライドのような有機溶媒中生分解性重合体溶液と乳化させて水中油(ｏ／ｗ)型乳剤を形成させる。ついで、ｏ／ｗ型乳剤を水溶性重合体(例：ポリビニールアルコール)水溶液と乳化させてｗ／ｏ／ｗ型乳剤を得る。ついで、生成したｗ／ｏ／ｗ型乳剤を蒸発させ有機溶媒を除去する。免疫優性ペプチド断片を自己免疫抗原として用いる場合、好適には粒子からの放出速度を調節するために予めＰＥＧ(ＭＷ  ２,０００以上)またはポリペプチドのような適切な重合体とカップリングさせる。ＰＥＧは上記目的のために有利に用いられ得る。
【００３４】
粒子は好ましくは５００ｎｍ未満、より好ましくは、２００ｎｍないし３００ｎｍの大きさを持つ。抗原の添加量は約０.５％ないし約１００％の範囲で変化し得る。所望の大きさの粒子を、使用する各溶液の容量及び濃度、界面活性剤物質、及びエネルギー入力期間、水／オイル／水型乳剤を形成するための超音波粉碎機、ホモジナイザーまたはボルテックスのようなエネルギー源などの種々の剤形化変数を最適化して得た。
【００３５】
自己免疫疾患の治療目的のために、その中にエントラップされた抗原を持つか、または持たない粒子をヒト、ネコ、イヌ、ラット、マウス、サル等に経口投与することができる。
【００３６】
経口投与用粒子の投与量は疾患の種類及び重症度及び患者の症状によって異なり、本分野の技術者によって決定され得る。例えば、ＲＡを治療するための投与量は０.１〜１０００ｍｇ(ＰＬＧＡ)／ｋｇ(体重)、及び好ましくは１〜１００ｍｇ(ＰＬＧＡ)／ｋｇ(体重)、より好ましくは１０〜４０ｍｇ(ＰＬＧＡ)／ｋｇ(体重)範囲であり得る。
【００３７】
ＣＩＩまたはその免疫優性ペプチド断片をエントラップする粒子を用いる場合、抗原の投与量は１〜１００００μｇ、好ましくは１０〜１０００μｇ、及びより好ましくは２０〜１６０μｇであり得る。
【００３８】
エントラップされた抗原を持つか、または持たない粒子を経口投与でき、その単一投与は哺乳動物で自己免疫反応を顕著、且つ満足に抑制することができる。
【００３９】
実施例
本発明は、多様な実施例によってより詳細に説明され得るが、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【００４０】
材料及び方法
動物
Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から入手したＤＢＡ１を３〜５群に分けてポリカーボネートケージ内で飼育し、標準マウス食物及び水を制限なく与えた。環境はJackson Laboratoriesから入手したマウスについて具体的な病原体未感染であった。発明者の設備内でマウスを飼育して新生マウスを得た。前記(２５,２７,２８)と同様にマウスを８〜１２週目に免疫化した。
【００４１】
II型コラーゲンの製造
無処置のウシＣＩＩを、前記(３９)と同様にして子ウシの関節軟骨から抽出、精製した。下記段階を行った：中性の４ＭグアニジンＨＣlに暴露し、０.８６Ｍ  NaClで０.５Ｍ酢酸からの反復沈澱、及び０.０２Ｍ  Ｎa２ＨＰＯ４−に対する透析によってプロテオグリカンを除去した後、軟骨スライスからのペプシンに可溶化し；ＤＥＡＥクロマトグラフィーによってペプシン及びプロテオグリカンを除去し；中性ｐＨで別の塩沈澱によってＩ型コラーゲンを除去する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を確認した。凍結された未変性ウシＣＩＩを１ｍｇ／ｍｌで０.１Ｎ酢酸に溶解させて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ,０.２Ｍ  NaClに対して透析させた後、０.２μｍミクロポアフィルタを通じてろ過し、滅菌した。
【００４２】
ＣＩＩをエントラップするＰＬＧＡの製造
ＰＬＧＡ内ＣＩＩのエントラップを上記(４０)と同様に行った。プローブ細胞粉碎機を用いて０.５Ｍ酢酸中ウシＣＩＩ(１０w/v％)溶液(内部水性相)をメチレンクロライド中ＰＬＧＡ(３w/v％)溶液(油相)と乳化させ油中水(ｗ／ｏ)型乳剤を製造した。生成した乳剤を５％(w/v)ＰＶＡ溶液(外部水性相)に加え、２次乳化を行って水中油中水(ｗ／ｏ／ｗ)型乳剤を得た。室温で一晩中ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を磁石攪拌プレート上で攪拌し、メチレンクロライドを蒸発させた。蒸発時揮発性有機溶媒を除去して、粒子の水性懸濁液を得た。以後、適切な大きさを持つ粒子を超遠心分離法(ultracentrifugation)によって回収した。粒子を水で２回洗浄して凍結前に水中に再懸濁させた。粒子を簡略化のために‘ＰＬＧＡ-ＣＩＩ’という。図１は約３００ｎｍ大きさを持つＰＬＧＡ粒子の顕微鏡図である。
【００４３】
ペプチド合成及びＰＬＧＡとペプチドのエントラップ
ウシＣＩＩの免疫優性ペプチド断片(255-270)：CGEBGIAGFKGEQGPK (SEQ. ID. NO. 4)を合成した後、有機溶媒蒸発法によってＰＬＧＡでエントラップした(４０)。合成ペプチドは短く、粒子を製造するために用いられる有機溶媒のメチレンクロライドに不溶性であるために、これをポリエチレングリコール(ＰＥＧ、ＭＷ５０００)と結合させた。ペプチドとＰＥＧの結合(メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２)は下記に記載する。ＳＰＤＰ(Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート)のリンカーをペプチドとＰＥＧの結合に用いた。３０ｍｇのＰＥＧを０.２ｍｌのリン酸緩衝液(２０ｍＭ,ｐＨ７.５)及び０.２ｍｌのＤＭＳＯ中５ｍｇのＳＰＤＰに溶解させた。二溶液を混合して１時間室温でインキュベートした。反応後、ＳＰＤＰ−結合されたＰＥＧを０.５ｍｌ／分の流速で蒸留水で溶離されるゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって分離し、分離画分を凍結乾燥させた。生成したＰＥＧ−ＳＰＤＰを０.５ｍｌのリン酸緩衝液(２０ｍＭ,ｐＨ７.５)中ペプチド(１０ｍｇ)に溶解させ、一晩室温でインキュベートさせた。同じ流速(０.５ｍｌ／分)で蒸留水で溶離される同じゲルろ過クロマトグラフィーにＰＥＧ−結合ペプチドをかけた。精製画分を凍結乾燥させて−２０℃で保存した。
【００４４】
ＰＬＧＡ-ＣＩＩの製造について記載された方法と同様の方法で、ペプチドをエントラップするＰＬＧＡを製造した。メチレンクロライド(１.５ｍｌ)中ＰＥＧ−ペプチド(２.５ｍｇ)及びＰＬＧＡ(５０ｍｇ)溶液を、２０秒間プローブ超音波粉碎機を用いて５％ＰＶＡ溶液と乳化した。５時間室温で乳剤を磁石攪拌プレート上で攪拌して有機溶媒を蒸発させた。蒸発させた後、懸濁液を５分間５００×ｇで遠心分離して粒子を除去した。生成した粒子を超遠心分離法によって２回洗滌して再懸濁させ、凍結させた。粒子を簡略化のために‘ＰＬＧＡ-ＣＩＩ(２５５−２７０)’という。
【００４５】
ＣＩＡの誘導及び関節炎の臨床評価
マウスを８〜１２週目に未変性(native)ＣＩＩで免疫化させた。４℃で０.１Ｎ酢酸(２ｍｇ／ｍｌ)中、溶解されたＣＩＩをＣＦＡ(フロイント完全アジュバント(Complete Freunds Adjuvant)と乳化(１：１比)させた。１次免疫化として１００μｇのＣＩＩを含有する０.１ｍｌ乳剤をマウスの尾の基底部に投与した。１４日目フットパッド(footpad)に追加免疫注射(５０μｇ  ＣＩＩ)を行った。１次免疫化後１２週間の間、関節炎症の開始、経過及び重症度に対して週当たり２〜３回マウスを観察した。各四肢を下記基準によって０−〜４−ポイント等級で評価した：０＝正常；１＝単一部位(すなわち、中足部位、足首または足の指)の軽い炎症；２＝足の指及び足首または中足部位を含む適切に激しい関節炎；３＝全足を含む激しい関節炎；及び４＝硬直症及び関節運動喪失を誘発する激しい関節炎。追加免疫注射のために用いた左足を評価から除外したため、可能な最大関節炎スコアは１２であった。平均関節炎指数、関節炎発生率(％)、及び関節炎性四肢パーセントを使用して比較し、下記のように計算した：
0003926626.tif 000005
【００４６】
寛容誘導
０日目ＣＦＡ中ＣＩＩで１次免疫化したものに関し、−１７,−１５,−１３,−１１,−９,−７,−５,−３日目に５μｇのＣＩＩをマウスに８回投与した。対照マウスには０.１Ｎ酢酸を８回投与した。ＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＣＩＩ４０μｇ(マウスにＣＩＩが反復投与されたＣＩＩの累積投与量)、またはＰＬＧＡ−ＣＩＩ(２５５−２７０)４μｇを−１７日に１回だけ投与した。
【００４７】
Ｔ細胞増殖の評価
免疫化後14日目に排膿または腸間膜リンパ節、及び脾臓を動物から除去して分離し、ＲＰＭＩ  １６４０中で洗滌した。リンパ節及び脾臓をＲＰＭＩ  １６４０中単細胞懸濁液で細切し、３回洗滌した。細胞(５×１０５／ウエル)を３７℃で４日間５％湿潤化ＣＯ２で、０.５％マウス血清で補足された０.３ｍｌのクリック培地中１００μｇ／のＣＩＩを含むか、または含まない１９６−ウエル微量測定板(microtiter plate)(Nunc, Roskilde, Denmark)で培養した。培養終了８時間前、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンを各ウエルに加えた。細胞をガラス繊維フィルタ上に回収してマトリックス９６ディレクトイオン化β−計数器(Matrix 96 direct ionizationβ-counter)；(Packard Instrument Co, Meridan, CT)上で計数した。結果を刺激指数(ＳＩ)として表し、抗原不存在下のｃｐｍに対する抗原存在下のｃｐｍの比で計算した。
【００４８】
ウシの未変性(native)II型コラーゲンに対するＩｇＧ抗体分析
１次免疫化後、２８日目に血清を回収して分析するまで、−２０℃で保存した。血清中ＩｇＧ抗−ＣＩＩ濃度を酵素免疫測定(enzyme-linked immunosorbent assay)キット(Chondrex Remond,  WA)によって測定した。連続２倍希釈標準血清の光学密度を製造社の指示に基づいて、それぞれ１００,５０,２５,１２.５,６.２５,３.１２５調整単位(arbitray unit)(a. u.)で示した。連続希釈標準血清で測定された光学密度と調整単位との関係は、全ての測定(ｒ＞０.９８、図示されていないデータ)で良好な線形関係を示した。１：４０００に希釈された血清中ＩｇＧ抗−ＣＩＩの濃度を連続希釈標準血清の光学密度と比較した相対値(a. u.)で表す。
【００４９】
パイエル板中ＣＩＩの免疫組織化学的染色
ＰＬＧＡ内にエントラップされたＣＩＩが長期間、小腸内に続けて存在しているかを測定するために、パイエル板でＣＩＩの免疫組織化学的染色を行った。要約すると、投与後１４日及び３５日目ＣＩＩをエントラップしたＰＬＧＡを経口投与されたマウスからパイエル板を得た。繰り返してＣＩＩまたは酢酸が投与されたマウス由来のパイエル板を対照組織として用いた。一夜、４℃で過ヨウ素酸塩−リジンパラホルムアルデヒド溶液で固定させた後、組織をアルコールで脱水した。洗滌後、組織のワックス(ポリエチレングリコール４００ジステアレート)包埋及びマイクロセクション(５μｇ)を行った。組織内ペルオキシダーゼの活性を除去するために、メタノール性Ｈ２Ｏ２を加えた後、組織を１時間標準血清で遮断した。組織をウシＣＩＩに対するヤギモノクロナール抗体とインキュベートさせた後、組織にDr. Andrew H Kangからの多大な好意による、ＤＡＧ(ペルオキシダーゼ結合F(ab`)2, Donkey anti-goat IgG, Jackson Immunoresearch  Labortories)を加えた。以後、ビオチン化された抗体を組織に加え、顕微鏡上でジアミノ−ベンジジン(ＤＡＢ)で着色反応を検出した。
【００５０】
ＰＬＧＡからエントラップされた抗原のインビトロ放出
３７℃の生理的条件下でＰＬＧＡ粒子からＣＩＩのインビトロ放出を４週間評価した。インビトロ放出試験にＦＩＴＣ−標識コラーゲンを用いて感度を増加させた。ＦＩＴＣでコラーゲンを標識した後、粒子を上記と同様に製造した。以後、粒子をリン酸緩衝液(ｐＨ７.４,０.１Ｍ)中に分散させて軽く攪拌しながら３７℃で維持した。上記条件下でサンプルを維持しながら、分取量のサンプルを採取してその蛍光を定期的に蛍光分析器で測定した。
【００５１】
電子顕微鏡による粒子の特徴化
走査型電子顕微鏡法(ＳＥＭ)を行って粒子表面の局所形態を測定した。２００秒間４０ミリアンペアの電流及び５０ミリトール圧力でスパッタゴールドコーター(sputter gold coater)(Denton Vacuum Inc, Cherry Hill, NJ)を使用して粒子を３００ナ金メッキした。拡大時、電子ビーム露出(日立S570, Cherry Hill, NJ)による融解を避けるためにＳＥＭ観察に先立って金メッキされた粒子のサンプルをドライアイスで冷却した。インビボでＬＧＡ粒子を分析し、ＰＬＧＡ粒子が長期間、小腸内に存在しているかを測定するために、ＰＬＧＡ−ＣＩＩ投与後１４日及び３５日目にパイエル板の極薄片凍結断片を得た後、ＰＬＧＡ粒子の存在を電子顕微鏡上で確認した。
【００５２】
統計
各群間の数値データ比較をstudent's  Ｔ−検定及びＡＮＯＶＡによって行い、分類データのためにカイ２乗検定 (chi-square test)またはFisherの正確検定(Fisher's exact test)を行った。０.５５未満のＰ値を有意とみなした。
【００５３】
結果
１.ＰＬＧＡ粒子の分析
水／オイル／水型乳剤を生成させるために用いられる種々の剤形化変数及びエネルギー源入力を最適化して所望の大きさの粒子を得た。ＳＥＭ分析からわかるように、ナノ粒子は所望の大きさの範囲内に８０％以上の粒子がある平坦で均一な表面を持つ球形であった。それぞれの球形粒子の平均直径は、２９９.７±４.０ｎｍであった(図１)。コラーゲン坦持粒子を探すために、計量した粒子を０.４Ｎ  ＮａＯＨ、１０  ＳＤＳ(ｗ／ｖ)溶液中に溶解させた。以後、溶液をLowry方法によってコラーゲンについて分析した。総重量の１.２％がコラーゲンで構成されていた。カプセル化効率は約６.５％であった。
【００５４】
この研究は、ＰＬＧＡ粒子は２日以内に１０〜２０％のカプセル化されたＣＩＩの１次バースト(burst)放出を生じさせることを証明した。２０日日までＣＩＩが連続してさらに低速で放出され、その間に１０％〜２０％のＣＩＩが放出された。低速放出相の後１５日から３０日まで重合体マトリックスの疎水性侵食による２次バースト放出が生じた(図２)。
【００５５】
２.コラーゲン誘発関節炎の評価
図３(ａ)及び３(ｂ)はそれぞれ、時間の経過にともなうコラーゲン誘発関節炎の発生率及び重症度を表す。
【００５６】
図４(ａ)及び４(ｂ)に示すように、酢酸を投与してＣＩＩ及びＣＦＡを注射したマウス(ｎ＝９)で、ＣＩＡは３週目から発生した。関節炎の重症度及び発生率は５週目にそれぞれ５.１の平均関節炎指数(最大１２)及び１００％発生率に到達しながら最大値に至っており、以後時間経過にともなって減少し、これは先に報告されたものと一致した(２５,２７,２８)。
【００５７】
３.ＣＩＩをエントラップするＰＬＧＡによる寛容誘導
ＣＩＡを抑制させる単一投与されたＰＬＧＡ−ＣＩＩの能力を試験するために、１次免疫化後５週目ＰＬＧＡ−ＣＩＩを１回投与したマウス(ｎ＝８)及びＣＩＩ(ｎ＝８)または酢酸(ｎ＝８)を８回投与したマウス間の平均関節炎指数、発生率、及び関節炎性四肢の数を比較した。図５に示すように、ＰＬＧＡ−ＣＩＩを投与したマウス及びＣＩＩを投与したマウスは酢酸を投与したものと比較して、格段に低い水準の平均関節炎指数(ＰＬＧＡ−ＣＩＩ  ０.９±０.３,ＣＩＩ  ２.８±０.９,酢酸  ４.５±１.１,ｐ＜０.００１)、発生率(ＰＬＧＡ−ＣＩＩ  ０％,ＣＩＩ  ５０％,酢酸  １００％,ｐ＜０.００１)、及び関節炎性四肢の数(ＰＬＧＡ-ＣＩＩ  ０／２４［０％］,  ＣＩＩ  ５／２４［２０.８％］,酢酸  １４／２４［５８.３％］,ｐ＜０.００１)であった。ＰＬＧＡ−ＣＩＩ及びＣＩＩ投与マウスの臨床変数の比較はＰＬＧＡ−ＣＩＩを投与したマウスは、ＣＩＩを投与したマウスと比較してより一層低い水準の平均関節炎指数(ｐ＜０.００１)、発生率(ｐ＝０.０２)、及び関節炎性四肢の数(ｐ＝０.００８)であった。この所見は、ＰＬＧＡ−ＣＩＩの単一投与が関節炎の発生率を成功裡に抑制し、重症度を緩和させ、ＣＩＩの同一の累積投与量で反復的に投与したものと比較して、寛容を誘導するのにさらに有効であることを証明した。図５は酢酸を投与したマウスと比較して、ＣＩＩまたはＰＬＧＡ−ＣＩＩを投与した寛容化マウスでの足腫脹の顕著な減少を示す。
【００５８】
４.ＣＩＩ(２５５−２７４)をエントラップするＰＬＧＡを使用した寛容誘導
１次免疫化後５週目酢酸(ｎ＝４)を投与したマウスと比較して、ＰＬＧＡ−ＣＩＩ(２５５−２７４)を投与したマウス(ｎ＝４)で平均関節炎指数、発生率、及び関節炎性四肢の数はさらに低かった。平均関節炎指数；３.５(０.６対１.０(０.８,ｐ＝０.００２))、発生率；２５対１００％、関節炎性四肢の数(１／１２［８.３％］対４／１２［３３.３％］(図６)。このデータはＰＬＧＡ−ＣＩＩ(２５５−２７０0)がＲＡを治療するために用い得ることを示唆する。また、合成免疫優性ペプチドの反復経口投与が疾患の重症度を抑制させるのに有効であると知られている多発性硬化症、自己免疫性ブドウ膜炎、及びインスリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)などの他の自己免疫疾患の治療に合成ペプチドをエントラップするＰＬＧＡの単一投与を適用できる。これと関連して、ＰＬＧＡ内にエントラップされ得る、自己抗原の免疫優性部位を含む代表的な合成ペプチドは上記に挙げられている。
【００５９】
５.寛容を誘導するＰＬＧＡ能力評価
エントラップされた蛋白質を低速で放出させる性質に加えて、数種類の粒子抗原はそれ自体免疫原性を調節する潜在能を持っていると報告されている。寛容を誘導するＰＬＧＡそれ自体の能力を評価するために、本発明者はＰＬＧＡを投与したマウスで一連のＣＩＡ誘導を行った。その結果、１次免疫化後５週目に評価したとき、ＰＬＧＡを１回投与したマウス(ｎ＝８)は酢酸を投与したマウス(ｎ＝７)のものよりさらに低い水準の平均関節炎指数及び関節炎性四肢(％)を有した(平均関節炎指数；１.８±０.８対３.９±１.９,ｐ＝０.０１９,  関節炎性四肢(％)；１０／２１［１２.９％］対３／２４［４２.９9％］,ｐ＝０.０１)(図７(ａ))。
【００６０】
関節炎発生率はまた酢酸を投与したマウスのものよりＰＬＧＡを投与したマウスでさらに低い傾向を示した(ｐ＝ＮＳ)。５週目にＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ−ＣＩＩ投与されたマウス間の臨床変数の比較は、ＰＬＧＡのみを投与したマウスよりＰＬＧＡ−ＣＩＩを投与したマウスで関節炎発生率が格段に低いことを示した(０％対５０％,ｐ＝０.０３)。平均関節炎指数と関節炎性四肢(％)もＰＬＧＡ−ＣＩＩを投与したマウスで、さらに低い傾向を示したが、これは統計学的有意差には到達しなかった(図7(ｂ))。これらのデータはＰＬＧＡ単独でＣＩＡを抑制させ得るが、ＣＩＩエントラップによってその効果を一層増大させ得ることを証明した。この所見は、ＰＬＧＡそれ自体の免疫抑制的効果のメカニズム(寛容誘導効果)及び伝達システムとしてＰＬＧＡ−ＣＩＩによる小腸内免疫細胞の反復刺激(寛容増大効果)によってＰＬＧＡによる寛容原性(tolerogenecity)が達成されるという強力な証拠である。
【００６１】
６.ＣＩＩに対する自己免疫反応に対するＰＬＧＡ−ＣＩＩの効果
酢酸投与したマウス(ｎ＝９)と比較し、ＣＩＩを投与したマウス(ｎ＝９)及びＰＬＧＡ-ＣＩＩを投与したマウス(ｎ＝９)で、ＣＩＩに対する循環ＩｇＧ抗体は格段に低かった(ＰＬＧＡ−ＣＩＩ；６.４±７.７,ＣＩＩ；１５.２±１８.９,酢酸；１.８±１.８,ｐ＜０.０１)。ＰＬＧＡを投与したマウスはＣＩＩを投与したマウスと比較し、さらに低い水準のＣＩＩに対するＩｇＧ抗体を持つ傾向を示した(ｐ＝ＮＳ)。排膿(draining)または腸間膜リンパ節でＣＩＩに対するＴ細胞増殖反応に対する分析はＰＬＧＡ-ＣＩＩ、ＰＬＧＡ、及びＣＩＩを投与したマウスでさらに低い水準のＣＩＩに対するＴ細胞増殖反応を持つということを示した(図8(ａ)及び8(ｂ))。この所見はＰＬＧＡ−ＣＩＩまたはＰＬＧＡそれ自体は全身系で体液性及び細胞性自己免疫反応のいずれも抑制させることができ、ＣＩＩに反応するＴ細胞及びＣＩＩに対するＩｇＧ抗体が敏感な動物の関節炎誘導で重要な役割を果たすことが知られているため、寛容を誘導するＰＬＧＡの重要なメカニズムを構成していることを示す。
【００６２】
７.パイエル板内ＰＬＧＡ粒子の確認
インビボでのＰＬＧＡ粒子の分析およびＰＬＧＡ粒子が長期間、小腸内に続けて存在しているかを測定するために、小腸内で可溶性抗原が検出され得ない時期のＰＬＧＡ投与後、１４日及び３５日目に、電子顕微鏡でパイエル板内ＰＬＧＡ粒子の存在を確認した。図９(ｂ)に示したように、約３００ｎｍの大きさを持つＰＬＧＡ粒子が凝集した状態でパイエル板の樹状細胞中に観察された。それらは無傷の形態で細胞質上及び分解された形態でリゾチーム顆粒上に位置した。驚くべきことに、ＰＬＧＡ粒子を貪食する樹状細胞がリゾチーム顆粒の増加量を示し、これが細胞の活性を表す。
【００６３】
しかし、これらの知見は、ＣＩＩまたは酢酸を反復投与したマウスからのパイエル板では得られなかった(図9(ａ))。樹状細胞を免疫賦活性抗原提示細胞として一般的に認められている見解に対して、最近樹状細胞の増殖または活性化が寛容誘発で重要な役割を果たしていると報告された。本データはインビトロ放出試験から得た結果と同様に、ＰＬＧＡ粒子は少なくとも３５日まで徐々に分解されながらパイエル板の樹状細胞に存在し、樹状細胞を活性化することができるということを明確に表しており、これはＰＬＧＡ粒子のＣＩＩに対する全身性自己免疫反応の抑制方法及び関節炎の発生率及び重症度を説明できる。これはＰＬＧＡ粒子が寛容誘導に寄与する(寛容誘導効果)メカニズムの可能性の１つであり得る。
【００６４】
８.ＰＬＧＡ-ＣＩＩを単一投与したマウスからのパイエル板内ＣＩＩの存続
パイエル板のＣＩＩ特異免疫組織化学的染色時、本発明者は小腸内で可溶性抗原が通常は検出され得ない時期である１４日及び３５日目にＰＬＧＡ−ＣＩＩが投与されたマウスからＣＩＩが樹状細胞周辺で濃く染色されているのを観察した。これはインビトロ放出試験での所見と一致した(結果１、図３)。しかし、この所見は、ＣＩＩまたは酢酸を反復投与したマウスでは観察されなかった(図１０)。この所見はＣＩＩが酸及び酵素的に敵対環境から保護され、ＰＬＧＡから徐々に放出されるということを証明した。これはまたＰＬＧＡ−ＣＩＩは長期持続型のＣＩＩによって誘発される、小腸の免疫細胞を慢性的に抗原刺激する方法で寛容誘導をもたらすという説得力ある証拠である。
【００６５】
本発明の好ましい具体例が上記に詳細に記載されているが、本分野の技術者に明白である本明細書で教示された本発明の基本概念の多様な変形及び/または修正が、添付の請求範囲に記載されている本発明の主旨及び範囲に含まれることを理解されるべきである。
【００６６】
引用文献
0003926626.tif 000006
0003926626.tif 000007
0003926626.tif 000008
0003926626.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】  II型コラーゲンをエントラップするＰＬＧＡ粒子(ＰＬＧＡ-ＣＩＩ)を示したＳＥＭ(走査型電子顕微鏡(Scanning Electron microscopy))分析であり、ここで矢印は粒子径、約３００ｎｍを表す；
【図２】  ４週間の低速放出グラフ及び通常の二相性パターン(biphasic  pattern)を表す、ＰＬＧＡ粒子からＣＩＩのインビトロ放出である；
【図３】  図３(ａ)及び図３(ｂ)はコラーゲン−誘発性関節炎を持つマウス  における時間の経過に伴う関節炎の重症度及び発生率を示すグラフである；
【図４】  ＰＬＧＡ-ＣＩＩ、原(native)ＣＩＩまたは酢酸を投与した後、連続してＣＩＩ及びＣＦＡで試験感染(challenge)させたマウスにおける関節炎の臨床評価である。データは平均関節炎指数(図４(ａ))、関節炎を病むマウスの発生率(図４(ｂ))、関節炎性四肢(％)(図4(ｃ))で示した。図４(ｂ)及び4(ｃ)で、-●-はＰＬＧＡ-ＣＩＩ(４０μｇ,１回)、-■-はＣＩＩ(５μｇ,８回)、-▲-は酢酸(コントロール)を投与したマウスを表す。Ｐ値：＊＜０.０５、＊＊＜０.０１、及び＊＊＊＜０.００１である；
【図４ｃ】  ＰＬＧＡ-ＣＩＩ、原(native)ＣＩＩまたは酢酸を投与した後、連続してＣＩＩ及びＣＦＡで試験感染(challenge)させたマウスにおける関節炎の臨床評価である。データは平均関節炎指数(図４(ａ))、関節炎を病むマウスの発生率(図４(ｂ))、関節炎性四肢(％)(図4(ｃ))で示した。図４(ｂ)及び4(ｃ)で、-●-はＰＬＧＡ-ＣＩＩ(４０μｇ,１回)、-■-はＣＩＩ(５μｇ,８回)、-▲-は酢酸(コントロール)を投与したマウスを表す。Ｐ値：＊＜０.０５、＊＊＜０.０１、及び＊＊＊＜０.００１である；
【図５】  ＣＩＩまたはＰＬＧＡ-IIを投与したマウス中関節炎性四肢の足腫脹(左側)及び酢酸を投与したこと(右側)を表す；
【図６】  図６(a)及び6(ｂ)はＣＩＩの免疫優性ペプチド断片(‘ＣＩＩ(２５５−２７４)’)をエントラップするＰＬＧＡの寛容効果を表す；
【図７】  臨床的症状によるＰＬＧＡそれ自体の寛容効果を表す。データは平均関節炎指数(図7(ａ))、関節炎を病むマウスの発生率(図7(ｂ)左側)、及び関節炎性四肢(％)(図７(ｂ)右側)で示した；
【図８】  図８(ａ)はＣＩＩに対するＩｇＧ抗体に対するＰＬＧＡ-ＣＩＩまたはＣＩＩの免疫抑制性効果を表し、８(ｂ)はＣＩＩに対するＴ細胞増殖性反応に対するＰＬＧＡ-ＣＩＩの効果を表す；
【図９】  図９(ａ)及び9(ｂ)はパイエル板内ＰＬＧＡ粒子を確認する電子顕微鏡写真であり、ここで、(ａ)は１次投与後１４日及び３５日目ＣＩＩ(５μｇ,８回)を投与したマウスのパイエル板内樹状細胞であり、(ｂ)は投与後１４日及び３５日目ＰＬＧＡ-ＣＩＩ(４０μｇ,１回)を投与したマウスのパイエル板内樹状細胞である。図9で、黒色矢印は細胞質内約３００ｎｍ大きさの損傷されない形態のＰＬＧＡ粒子を表し、白色矢印は樹状細胞のリゾチーム顆粒内分解された形態のＰＬＧＡ粒子を表す；
【図１０】  図１０はパイエル板のＣＩＩ−特異免疫組織化学的染色である。矢印は染色されたＣＩＩを表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４ｃ】
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【図５】
0003926626.tif 000018
【図６】
0003926626.tif 000019
【図７】
0003926626.tif 000020
【図８】
0003926626.tif 000021
【図９ａ】
0003926626.tif 000022
【図９ｂ】
0003926626.tif 000023
【図１０】
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