(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号１の軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列と、配列ＩＤ番号９の重鎖のＦＲ及びＣＤＲのアミノ酸配列と、を含んでなるモノクローナル抗体。
【請求項２】
次の性質を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（１）ヒトαｖインテグリンのαｖ鎖とのみ反応する。
（２）インテグリン基質としてのビトロネクチン、フィブリノーゲンまたはフィブロネクチンへのαｖインテグリン保有細胞の付着を阻止する。
（３）αｖインテグリンによって生じた樹立細胞マトリックス相互作用の逆転を誘発する。
（４）腫瘍増殖を阻止する。
（５）細胞障害性活性を示さない。
【請求項３】
細胞増殖が阻止される腫瘍が黒色腫である請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の配列ＩＤ番号１のアミノ酸配列及び配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列を含み、請求項２または３に記載の性質を有するモノクローナル抗体フラグメント。
【請求項５】
２７２−１７Ｅ６と称し、アクセス番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２１６０の下で寄託した、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞系。
【請求項６】
２７２−１７Ｅ６と称し、アクセス番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２１６０の下で寄託したハイブリドーマ細胞系によって得られるモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列ＩＤ番号１の配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列ＩＤ番号９の配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】
配列ＩＤ番号１のアミノ酸配列の位置２１から３８１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１０】
配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列の位置２０から４１１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号１のＤＮＡ配列中の、請求項２に記載の性質を有するモノクローナル抗体の軽鎖可変部のＦＲおよびＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ。
【請求項１２】
配列ＩＤ番号９のＤＮＡ配列中の、請求項２に記載の性質を有するモノクローナル抗体の重鎖可変部のＦＲおよびＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号１の第１番目の塩基から第６０番目の塩基までのＤＮＡ配列からなるリーダー配列を更に含む請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号９の第１番目の塩基から第５７番目の塩基までのＤＮＡ配列からなるリーダー配列を更に含む請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１〜３及び６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または請求項４に記載のモノクローナル抗体フラグメントと、薬剤学的に容認し得る担体と、を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造法であって、
（１）精製αｖβ３インテグリンでマウスを免疫する工程と、
（２）前記免疫されたマウスの細胞を用いてハイブリドーマを生産する工程と、
（３）前記ハイブリドーマから以下の項目（３−１）〜（３−５）の選択を行い、選択されたクローンを得る工程と、
（３−１）上清のヒトαｖβ３との特異的反応が陽性であり、αｖインテグリン鎖の認識における反応パターンが一致するクローンを選択する工程、
（３−２）上清が、基質タンパク質へのαｖインテグリン鎖発現細胞の付着を阻止するクローンを選択する工程、
（３−３）上清が、腫瘍の増殖を阻止するクローンを選択する工程、
（３−４）上清が、細胞障害性活性を示さないクローンを選択する工程、及び
（３−５）上清が、αｖインテグリンにより仲介される細胞マトリクス相互作用の逆転を誘発するクローンを選択する工程、
（４）前記選択されたクローンから細胞系を生産する工程と、
（５）前記細胞系の生産するモノクローナル抗体を単離する工程と、
を有することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１７】
前記細胞系が、２７２−１７Ｅ６（アクセス番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２１６０）である請求項１６に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項４に記載のモノクローナル抗体フラグメントの製造方法であって、
（１）精製αｖβ３インテグリンでマウスを免疫する工程と、
（２）前記免疫されたマウスの細胞を用いてハイブリドーマを生産する工程と、
（３）前記ハイブリドーマから以下の項目（３−１）〜（３−５）の選択を行い、選択されたクローンを得る工程と、
（３−１）上清のヒトαｖβ３との特異的反応が陽性であり、αｖインテグリン鎖の認識における反応パターンが一致するクローンを選択する工程、
（３−２）上清が、基質タンパク質へのαｖインテグリン鎖発現細胞の付着を阻止するクローンを選択する工程、
（３−３）上清が、腫瘍の増殖を阻止するクローンを選択する工程、
（３−４）上清が、細胞障害性活性を示さないクローンを選択する工程、及び
（３−５）上清が、αｖインテグリンにより仲介される細胞マトリクス相互作用の逆転を誘発するクローンを選択する工程、
（４）前記選択されたクローンから細胞系を生産する工程と、
（５）前記細胞系の生産するモノクローナル抗体を単離する工程と、
（６）前記単離されたモノクローナル抗体からその抗体機能を維持したフラグメントを得る工程と、
を有することを特徴するモノクローナル抗体フラグメントの製造方法。
【請求項１９】
前記細胞系が、２７２−１７Ｅ６（アクセス番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２１６０）である請求項１８に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２０】
腫瘍に対する薬物の製造のため、または腫瘍増殖の診断的位置探索および評価のための、請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片の使用。
【請求項２１】
前記腫瘍が黒色腫である請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規のモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。モノクローナル抗体は、その好ましい実施態様を１７Ｅ６と称するが、次のような性質を有する。すなわち、
ヒトαｖインテグリンのαｖ鎖とのみ反応する。
【０００２】
インテグリン基質へのαｖインテグリン保有細胞の付着を阻止する。
【０００３】
αｖインテグリンによって生じた樹立細胞マトリックス相互作用の逆転を誘発する。
【０００４】
腫瘍発達を阻止する。
【０００５】
細胞障害性活性を示さない。
【０００６】
本発明の目的はしたがって、該性質を有するモノクローナル抗体である。
【０００７】
加えて、本発明の目的は２７２−１７Ｅ６と称し、アクセス番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０の下で寄託したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系、および上記の性質を有し、該ハイブリドーマ細胞系によって得られるモノクローナル抗体である。
【０００８】
さらに、本発明はＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に関する。ＤＮＡ配列は、抗体またはその部分をコードする。配列は第１７および１８図および添付した配列表に示す通りである。
【０００９】
本発明の目的は、最後に、上記のように定義した抗体を含んでなる薬剤組成物である。
【００１０】
【従来の技術】
インテグリンは、細胞の固体の細胞外環境周囲物との付着、すなわち細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への付着および他の細胞との付着の双方をコントロールする細胞表面接着受容体ファミリーの総称である。接着は細胞の重要な基本的性質であって、これは固定、移動制御および増殖および分化のための合図となる。インテグリンは、多くの正常および病理的状態に直接に関与し、それ自体、治療介入の重要なターゲットである。インテグリンは、複合性膜貫通性タンパク質、ヘテロ二量体であって、その結合特異性は約１４個のα鎖のどれが約８個のβ鎖のどれと組み合わされているか依存する。インテグリンは、β１、β２、β３またはαｖ鎖を含む四つの重複するサブファミリーに分類され、特定の細胞がそれぞれのサブファミリーからのいくつかの異なるインテグリンを発現すると考えられる。この十年、インテグリンは細胞接着に関与する主要な受容体であることが示されてきた。インテグリンに関する報告には、例えば、E. Ruoslahti（J. Clin. Invest., 1991, 87）およびR. O. Hynes（Cell, 1992, 69）によるものがあり、治療介入のための適当なターゲットであることが考えられる。
【００１１】
赤血球を除いて、ヒト細胞の全ては、一つまたはそれ以上のインテグリンを発現する。これらの機能は多くのレベルで調節されるが、本来、これらのリガンド特異性はヘテロ二量体中でどのα鎖がどのβ鎖と組合わさっているかおよびインテグリンの活性化状態によって決まる（Hynes, 1992; Diamond and Springer, 1994）。インテグリンが機能する細胞的背景（Chan and Hemler, 1993）および用いられるインテグリンのスプライス変異型（Delwel et al., 1993）もまた、特異性に影響するかも知れない。これらの複雑性をから、、インテグリン特異性の数少ない確実な指標の一つは直接にインテグリン機能を妨害して、どの細胞応答が影響されたかを分析することである。インテグリン研究の歴史は、インテグリンβ１鎖を最初に明らかにした機能阻止ＣＳＡＴ−抗体（Neff et al., 1982）からその後の多数の重要な例（例えば、Ｐ１Ｄ６、Ｐ１Ｂ５（Wayer and Carter, 1987）、Ｐ４Ｃ１０（Carter et al., 1990）、ＡＩＩＢ２（Hall et al., 1990）、３Ａ３（Tumer et al., 1989）、Ｇ０Ｈ３（Sonnenberg et al., 1987）およびＬＭ６０９（Cheresh and Spiro, 1987））まで、 インテグリン機能を特異的に阻止できる作用物質が機能分析における決定的要因であることを示しており、この分野はそのような作用物質に完全に依存している。
【００１２】
αｖシリーズのインテグリンは、今日、古典的および新規機能の双方を有する主要なサブファミリーであると見られる。古典的に細胞接着および拡散（Pytela et al., 1985, Cheresh, 1991）に介在するだけではなく、αｖインテグリンはまた、細胞移動（Seftor et al., 1992）において、受容体インターナリゼーション（Panetti and McKeown Longo, 1993a; Panetti and McKeown Longo, 1993b）において、ウイルス共受容体（Wickham et al., 1993）として、細胞外プロテアーゼカスケードの統御（de Boer et al., 1993）において、そして腫瘍進行のレギュレーター（Felding-Habermann et al., 1992）として関与してきた。公知の五つのαｖシリーズインテグリン、すなわちαｖβ１（Zhang et al., 1993）、αｖβ３（Pytela et al., 1985, Cheresh et al., 1987）、αｖβ５（Cheresh et al., 1989）、αｖβ６（Busk et al., 1992）およびαｖβ８（Moyle et al., 1991）の特異性は一部定義されて、それらはＲＧＤ−（ＮＨ2−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−ＣＯＯＨ）トリペプチド配列を有するリガンド、例えばビトロネクチン中の配列（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５）、フィブロネクチン中の配列（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６）およびフォンビルブラント因子、フィブリノーゲンおよびオステオポンチン（αｖβ３）を排他的に認識するようである（例えば、      1991; Busk et al., 1992; Zhang et al., 1993; Denhardt and Guo, 1993; Smith and Cheresh, 1990）。関連する特異性を有する二量体は同一の細胞上で共発現されるかもしれない（例えば、Ｍ２１細胞上のビトロネクチンのためのαｖβ３およびαｖβ５） （Wayner et al, 1991）が、独立した機能をコントロールするかもしれない。しかし、αｖファミリーそれ自体の間で、またαｖとβ１シリーズインテグリンとの間で重複するリガンド特異性は、特定の細胞環境内で定義された受容体に機能を帰することには問題があることを意味する。機能阻止抗体は、αｖβ３（Cheresh and Spiro, 1987; Chuntharapai et al., 1993）およびαｖβ５（Wayner et al., 1991）の機能を明確にするにはきわめて重要であった。しかし、他のαｖインテグリンに関しては、複合体を特定して機能を妨害するような抗体は知られていない。とくに、複合体のαｖ鎖を特定して全ファミリーのインテグリン機能を妨害するような作用物質はほとんど見つかっていない。Lehmannら（1994）は、細胞マトリックス相互作用の逆転および腫瘍発達阻止活性のいずれをも示さないαｖβｘ抗体を開示した。
【００１３】
したがって、腫瘍発達におけるαｖシリーズインテグリンの機能についての関心はつきない。ヒト悪性黒色腫は、ますます流行の度を増している旺盛な皮膚癌である。インテグリンレベルの上昇がα２β１（Danen et al., 1993; Etoh et al., 1992）、α３β１（Natali et al., 1993; Yoshinaga et al., 1993）、α４β１（Hart et al., 1991）およびα６β１（Hart et al., 1991）についてそれぞれ黒色腫の進行と関連づけされてきたが、最も確実な関連はαｖシリーズにおいて認められた。とくに、原発腫瘍からの浸潤および遠隔転移なともに、αｖβ３インテグリン、すなわち「ビトロネクチン受容体」の発現の増加によって組織学的に特徴づけられる。原発非浸潤性腫瘍および良性メラニン沈着性母斑では、健康成人組織には稀な受容体であるαｖβ３の発現はほとんど検出されない（Brooks et al., 1994; Buck et al., 1990; Pignatelli et al., 1992; Lessey et al., 1992; Korhonen et al., 1991; Nesbitt et al., 1993）。段階的な腫瘍および転移の免疫組織化学は、浸潤段階に伴ってαｖβ３の漸進的増加を示し（Albelda et al., 1990; Si and Hersey, 1994）、黒色腫系のスクリーニングはαｖシリーズインテグリンの高発現を一様に明確にし（Sanders et al., 1992; Gehlsen et al., 1992; Marshall et al., 1991）、加えて、新生毛細血管は腫瘍脈管形成中にαｖβ３を発現する（Brooks et al., 1994）。
【００１４】
インビボ研究もまた、黒色腫発達におけるαｖβ３の関与を示す。ネズミＢ１６−Ｆ１０黒色腫系において、実験的肺転移は高レベルのＲＧＤ−ペプチド（Hardan et al., 1993; Humphries et al., 1986）、すなわちαｖインテグリン機能の有効な阻止物質によって抑制され得た。より最近になって、Felding-Habermannおよびその共同研究者らは、αｖシリーズインテグリンが免疫不全マウスにおけるＭ２１ヒト黒色腫の皮下腫瘍増殖を促進することを示した。Ｍ２１系は単純で、異なるαｖシリーズインテグリンを発現する一群の細胞からなる（Kieffer et al., 1991; Felding-Habermann et al., 1992; Cheresh and Spiro, 1987）。親株のＭ２１はαｖβ３およびαｖβ５を発現する（Wayner et al., 1991）。これはビトロネクチンに付着して、皮下腫瘍として増殖する。Ｍ２１の体細胞変異株であるＭ２１−Ｌは検出可能なαｖを有しない（Cheresh and Spiro, 1987）。これはビトロネクチンと結合することができず、増殖の遅い腫瘍を発達させる。Ｍ２１−Ｌ４は、Ｍ２１−Ｌのトランスフェクタントであって、αｖ鎖の全長を安定して再発現する。これはビトロネクチンに結合して皮下腫瘍として急速に増殖する（Felding-Habermann et al., 1992）。このように、細胞表面αｖインテグリンの存在は、Ｍ２１皮下増殖と直接に関連している。
【００１５】
しかし、Ｍ２１は、変異系Ｍ２１−ＬおよびＭ２１−Ｌ４の系統樹立の間に極端な淘汰圧下にあった。本発明において、本来のＭ２１系細胞上のαｖインテグリン機能が阻止され得ることおよび細胞行動および腫瘍発達への驚くべき影響が見出され得ることが見出された。ペプチド性拮抗物質は容易に合成され得る。しかし、その使用はそれらの乏しい生物利用可能性、インビボにおける短い半減期および動物体からの迅速な排除のどの理由から制限される（Humphries et al., 1988）。同質遺伝的抗体は、興味深いペプチド代替物を提供する。これらはインビボで長い半減期を有し（Tao and Morrison, 1989; Haba et al., 1985）、それらの結合特異性は標準法によって明確に示すことができる。残念なことに、ＬＭ１４２（Cheresh and Spiro, 1987）などの優れたαｖ特異性抗体があるが、αｖインテグリン機能を効果的に阻止するものはほとんどない。
【００１６】
αｖファミリーの特異性および生物学的機能については多くの議論があるが、主にこれは全クラスの機能を阻止するような作用物質がまだ存在しないこと、すなわち有効なαｖ阻止抗体がまだ存在しないことによる。インテグリンファミリーの古典的接着受容体が後に見出された他の生物学的機能を支持するという新事実の発見によって、それらの分子的作用機序の探索がさかんになった。その結果、それらの活性化状態をアロステリック的に伝える、すなわち、連結された場合、それ自体インテグリン機能を活性化できるインテグリン上のいくつかの予知されなかった領域が明らかにされた。対照的に、インテグリン機能のインヒビターは一般に活性部位を遮る。その代表例として、多くのリガンドのαｖシリーズおよびα５β１のインテグリンのインテグリン認識部位を模写複製するＲＧＤペプチドがある。
【００１７】
本発明は、ヒトαｖインテグリン鎖に対するそのような新規の機能阻止抗体で、１７Ｅ６と称するものについて記述する。多くの報告において、αｖβ３とそのリガンド、例えばビトロネクチンなどとの間の相互作用の非可逆的性質について考察されてきた。ここで、１７Ｅ６がαｖシリーズインテグリンとそれらの基質との間のこのいわゆる非可逆的相互作用の逆転を速やかに誘起する可能性が明らかになった。これは治療的適用を示唆する。本発明は、１７Ｅ６の作用機序を分析し、ビトロネクチンおよびＲＧＤ基本の活性部位プローブが受容体に対して互いに強く競合するのに対し、１７Ｅ６がαｖβ３に結合するリガンドに向けてきわめて乏しい競合性しか示さないことを見出した。他の抗体は１７Ｅ６に向けて強い競合性を示す。このように、１７Ｅ６はアロステリックインヒビターの役目を果たす。架橋結合実験は、αｖβ３は１７Ｅ６が阻止できる前に二量体にする必要があることを明らかにするが、αｖβ１またはαｖβ５ではその必要はない。この発見は、インテグリン誘導シグナルトランスダクション経路の操作が関わる新規機序によって１７Ｅ６が機能することを明示する。本発明による抗体は、腫瘍発達を阻止し、かつ、細胞障害性を有しない。
一般説明、材料、図面、表、略号：
本出願に記述された微生物、細胞系、プラスミド、ファージミド、プロモーター、耐性マーカー、複製オリジンまたは他のベクターフラグメントは、通常に市販のものまたは一般に入手が可能のものである。場合によって、上記材料は直接購入ができない。しかし、それらはここでは本発明の性質または効果を説明するための例としてのみ使用されるものであって、開示の要求を満足するために必須の物ではない。通常、それらは他の適切な一般に入手可能な機器道具および生物学的材料によって置き換えることができる。
【００１８】
モノクローナル抗体１７Ｅ６は、２７２ー１７Ｅ６と称するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体である。この細胞系は、アクセス番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０の下でDeutsche Sammlung fuer Mikroorganismen, Braunschweig, FRGに寄託された。
【００１９】
本発明に必須の技術や方法は明細書に詳細に記述される。詳細に記述されない他の技術は、当業者によく知られた公知の標準法であるか、引用文献および特許明細書および標準的文献により詳細に記述があるものである。
【００２０】
ＤＮＡおよびアミノ酸配列はまた、化学的または物理的工程によって意図的にまたは無作為に得ることができる突然変異体および変異体などのわずかに変化したまたは置き換えられた配列をも含む。一般に、記述の性質および機能を示す突然変異体および変異体の全てが含まれる。
【００２１】
一般に、抗体という用語はまた、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2または一本鎖Ｆｖなどの抗体フラグメントを含む。これらのフラグメントは通常の標準法によって産生することができる。
略号：
αＩＩｂβ３            インテグリン
αｖβ１                インテグリン
αｖβ３                インテグリン
αｖβ５                インテグリン
αｖβ６                インテグリン
αｖβ８                インテグリン
１０Ｇ２                Ｍａｂ
１４．１８Ｇ２ａ        Ｍａｂ
１４Ｄ９．Ｆ８          Ｍａｂ
１４Ｅ２                Ｍａｂ
１７Ｅ６                Ｍａｂ
２０Ａ９                Ｍａｂ
２３Ｇ５                Ｍａｂ
３Ａ３                  Ｍａｂ
９．２．２７            Ｍａｂ
ＡＤＣＣ                抗体依存性細胞障害
ＡＥＣＭ                抗体およびエフェクター細胞依存性細胞分裂抑制
ＡＩＩＢ２              Ｍａｂ
ＡＰ３                  Ｍａｂ
ＡＴＣＣ                American Type Culture Collection
Ｂ１６Ｆ１０            細胞系
ＣＰ８                  Ｍａｂ
ＣＳＡＴ                Ｍａｂ
ｃＲＧＤｆＶ            環状ペプチド：Arg-Gly-Asp-DPhe-Val
ｃＲＧＤｆＫ            環状ペプチド：Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys
ＥＭＭ３１              細胞系
Ｇ０Ｈ３                Ｍａｂ
ＧＲＧＤＳＰＫ          ペプチド：Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
ＬＭ１４２              Ｍａｂ
ＬＭ６０９              Ｍａｂ
Ｍ２１                  細胞系
Ｍ２１−Ｌ              細胞系
Ｍ２１−Ｌ−ＩＩｂ      細胞系
Ｍ２１−Ｌ４            細胞系
Ｍａｂ                  モノクローナル抗体
ＭＴＴ                  ３−（４−５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２−５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド
ＮＢＴ−ＢＣＩＰ        ニトロブルーテトラゾリウム−燐酸ブロモクロロインドリル
ＮＰ１８                細胞系
ＯＧ                    オクチル−グルコシド−（洗剤）
ＰＩＤ６                Ｍａｂ
ＰＩＨ６                Ｍａｂ
Ｐ４Ｃ１０              Ｍａｂ
Ｐ５Ｈ９                Ｍａｂ
ＰＭＳＦ                フェニル−メチル−スルホニル−フルオリド
ＲＧＤ                  ペプチド：ＮＨ2−Arg-Gly-Asp−ＣＯＯＨ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ        ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＵＣＬＡＰ−３          細胞系
ＷＭ１６４              細胞系
ＷＭ７９３              細胞系
Ｖ＋Ｂ２                細胞系
表１
抗体はＥＬＩＳＡおよび細胞ＥＬＩＳＡにおいて比較された。作用物質および特異性は本文中で充分に検討される。＋＝陽性反応、−＝無反応
備考：
抗体−本研究において特徴づけられた抗体（太字）、標準作用物質（イタリック）。免疫原−αｖβ３＝固定化ヒト胎盤インテグリンαｖβ３。Ｍ２１＝天然のＭ２１細胞。精製αｖβ３およびαＩＩｂβ３をＥＬＩＳＡのために９５ウェルプレート上で固定化した。細胞系Ｍ２１、Ｍ２１−ＬおよびＭ２１−Ｌ−ＩＩｂおよびＵＣＬＡＰ３を増殖させて、プレート上に固定して、ＣＥＬＩＳＡにおいて抗体反応性について試験した。特異性−（本文を参照されたい）。αｖ＝哺乳動物インテグリンのαｖ鎖。２００ＫＤａ＝未知の２００、０００ＭＷ黒色腫細胞表面タンパク質。αｖβ５＝インテグリンαｖβ５。β１＝インテグリンβ１鎖。β３＝インテグリンβ３鎖。
表２
対照（二次抗体のみ）と比較した反応性レベルを次のように等級づけした。１〜２（−）、２〜４（＋）、４〜９（＋＋）、＞９（＋＋＋）。例えば、Ｍ２１において、典型的な相対的蛍光強度は対照で３０〜５０ユニット、ＬＭ１４２結合で３００〜５００ユニットであり、その場合の平均相対反応性は約１０となる（４００／４０）。
（*）Ｍ２１−Ｌは７０％エタノールを用いて−２０℃で透過性化させた。
（＠）Ｍ２１−ＬはＶＮＲインテグリンのβ３鎖の細胞内プールを有する。
表３
Ｍ２１およびＭ２１−Ｌ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて集めて、１７Ｅ６抗体または対照抗体とともにインキューベートして、洗浄して、ヌードマウスの尾静脈に注射した。７週間後に、動物を殺して、肺を表面腫瘍巣について調べた。１７Ｅ６との前処理は、発達する病巣数を減らした。Ｍ２１−Ｌ細胞（これは細胞表面のαｖを欠く）を注射したばあいに同様の数の病巣が発達した。
*＝対照との比較：非抗体依存性
第１図
Ｍ２１およびＭ２１Ｌヒト黒色腫細胞に対するアルファ−Ｖグループ抗体およびコントロールの蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析
細胞を１０μｇ／ｍｌの一次抗体とともにインキューベートして、蛍光標識した二次抗体で染色して、ヨウ化プロピジウムで逆染色して壊死細胞を遮断して、サンプル当たり１０、０００個の細胞を分析した。白抜きのピークは二次層抗体のみの強度を表す。黒塗りピークは特定した一次および二次抗体を合わせた強度を表す。縦軸はチャネル当たりの細胞を示し、横軸はそのチャネル中の対数蛍光強度を示す。Ｍ２１は表面αｖインテグリンを有し、Ｍ２１−Ｌは有しない。アルファＶグループ抗体の染色パターンは、ＬＭ１４２（αｖ特異性）およびＬＭ６０９（αｖβ３特異性）染色パターンとよく一致する。
とくに、これらはＭ２１と反応するが、Ｍ２１−Ｌとは最小に反応する。抗体９．２．２７は、表面プロテオグリカンと反応する。１４Ｅ２および２１Ｈ６は、未定義の２００ＫＤａ黒色腫表面タンパク質を認識する。これらの染色パターンは、アルファＶグループのものと合致しない。とくに、これらはＭ２１とＭ２１−Ｌの双方と同じように反応する。
第２図
アルファＶグループ抗体は同様のタンパク質を免疫沈殿させる。
【００２２】
Ｍ２１黒色腫（Ａ）の生細胞をビオチンで細胞表面標識して、洗剤で抽出して、免疫沈殿させて、非還元７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。標準物質をレーンａに泳動させて、質量をＫＤａで左方に示す。沈殿は、対照抗体ＬＭ１４２（抗体αｖ：レーンｂ）およびＬＭ６０９（抗αｖβ３：レーンｃ）、および２１Ｈ６（レーンｄ）、１０Ｇ２（レーンｅ）、２０Ａ９（レーンｆ）、２３Ｇ５（レーンｇ）、１７Ｅ６（レーンｈ）、１４Ｄ９（レーンｉ）および１４Ｅ２（レーンｊ）を用いた。ＬＭ１４２およびＬＭ６０９は同様のタンパク質パターンを１０Ｇ２、２０Ａ９、２３Ｇ５および１７Ｅ６に対して示し、２１Ｈ６および１４Ｅ２は約２００ＫＤａのバンドを沈殿させる。１４Ｄ９は両パターンを沈殿させる。Ｍ２１黒色腫（Ｂ）、Ｍ２１−Ｌαｖ欠損黒色腫（Ｃ）およびＵＣＬＡＰ−３細胞（Ｄ）をビオチンで細胞表面標識して、（Ａ）と同様にして免疫沈殿させた。沈殿は、対照抗体ＬＭ１４２（抗体αｖ：レーンｂ）、ＬＭ６０９（抗αｖβ３：レーンｃ）、１７Ｅ６（レーンｄ）、ＡＰ３（抗β３：レーンｅ）および２０Ａ９（レーンｆ）を用いた。分子量マーカーをレーンａに泳動させて、質量をＫＤａで左方に示す。αｖ、β１、β３、β５バンドの位置を示す。
第３図
１７Ｅ６はビトロネクチンに対する最初の細胞接着を阻害する。
【００２３】
一連の黒色腫系（Ｍｅｌｓ．）および癌腫細胞系（Ｃａｒｓ．）を、１７Ｅ６Ｍａｂとの反応性に関してＦＡＣＳによってスクリーニングした。ＦＡＣＳ強度は表２に示す通りであった。次いで細胞を、１７Ｅ６（白抜き）または１４Ｅ２（黒塗り）からのハイブリドーマ上清の存在下でビトロネクチン被覆基質（０．５μｇ／ｍｌ被覆）に接着させた。洗浄後、接着した細胞を材料と方法の部で記述したようにして計数して、データを抗体の非存在下での接着に正規化する。Ｂ１６Ｆ１０（ネズミ黒色腫）を除いて、全細胞はヒト由来であることに注目されたい。ＭＡＬＭＥ３は繊維芽系である。抗体の非存在下で接着した細胞の絶対百分率は、Ｍ２１（７０％）、ＷＭ１６４（６８％）、Ａ３７５（７５％）、ＥＭＭ３１（６７％）、ＷＭ７９３（６５％）、ＭＡＬＭＥ３（６７％）、Ｂ１６Ｆ１０（７０％）、ＵＣＬＡ−Ｐ３（７６％）、ＮＰ−１８（６５％）、ＳＷ１１１６（６８％）、ＨＴ２９（６５％）であった。横軸：細胞接着の対照に対する割合（％）。
第４図
１７Ｅ６はαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの双方によって媒介される接着を妨害する。
【００２４】
精製モノクローナル抗体（Ｍａｂ）またはマウス腹水をビトロネクチン被覆基質（５ｍｇ／ｍｌ）への細胞接着中に共インキューベートした。細胞系：（Ａ、Ｂ）Ｍ２１、（Ｃ、Ｄ）ＵＣＬＡＰ−３、（Ｅ、Ｆ）ＷＭ−７９３。符号は次の抗体（特異性）を表す。（●）＝１７Ｅ６（αｖ）、（▲）＝ＬＭ６０９（αｖβ３）、（◆）＝１４Ｄ９．Ｆ８（αｖ）、（○）＝Ｐ４Ｃ１０（β１）、（□）＝Ｐ５Ｈ９（αｖβ５）、（▽）＝Ｐ５Ｈ９＋ＬＭ６０９［希釈開始：１０μｇ／ｍｌ］（αＶβ３＋αｖβ５）。縦軸：接着細胞（％）。横軸：左図−Ｍａｂ（μｇ／ｍｌ）、右図−腹水希釈（１／ｘ）。
第５図
１７Ｅ６はビトロネクチンへの接着を妨害するが他のマトリックス物質への接着は妨害しない。
【００２５】
１７Ｅ６（αｖ、●）およびＰ４Ｃ１０（β１、○）のビトロネクチン（Ａ）、ラミニン（Ｂ）またはコラーゲンタイプＩ（Ｃ）への細胞接着への影響を調べた。１７Ｅ６はＶＮ被覆表面αｖβ３上でのみ細胞接着を阻止した。Ｐ４Ｃ１０はコラーゲンタイプＩおよびラミニンに関してのみ細胞接着を阻止した。横軸：Ｐ４Ｃ１０希釈（１／ｘ）（上軸）、Ｍａｂ（μｇ／ｍｌ）（下軸）。縦軸：結合細胞（％）。
第６図
１７Ｅ６は樹立細胞−ビトロネクチン接触を逆動させる。
【００２６】
Ｍ２１黒色腫をビトロネクチン（ＶＮ−上列）またはフィブロネクチン（ＦＮ−下列）で被覆した表面に２４時間接着させた。細胞は３０分以内に接着し、よく分散しており、培地に１７Ｅ６を加える（ｂ、ｆ）２４時間まで増殖した（ａ、ｅ）。３０分後、ビトロネクチン上（ｂ）では細胞は丸くなり、フィブロネクチン上（ｆ）では広がった状態を保った。ＬＭ６０９（ｃ、ｇ）および１４Ｅ２（ｄ、ｈ）は、いずれの基質上でもほとんど影響はなかった。抗体濃度：（ｂ）−０．１μｇ／ｍｌ、（ｃ、ｄ、ｆ−ｈ）−１００μｇ／ｍｌ。
第７図
ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＭ２１ヒト黒色腫の発達はαｖインテグリンによって調節される。
ＡおよびＢ：１７Ｅ６の皮下Ｍ２１発達に及ぼす影響。０．５×１０6個のＭ２１（Ａ）またはＭ２１−Ｌ（Ｂ）を緩衝液（○）、１７Ｅ６（●）または１４Ｅ２（△）抗体とともにインキューベートして、ヌードマウスに皮下注射した。経時的に、腫瘍サイズを測定して、量をプロットした。代表的な実験結果を示す。誤差棒はグループ当たり８動物からのｓ．ｅ．ｍ．（平均の標準誤差）を示す。縦軸：腫瘍量（ｍｍ3）、横軸：注射後日数。
Ｃ：Ｍ２１実験的転移へのαｖの影響
０．３２×１０6個（◆、■）または１×１０6個（◇、□）のＭ２１（◆、◇）またはＭ２１−Ｌ（■、□）細胞をヌードマウスの尾静脈に注射した。表示した時間に、動物群を殺して、肺を腫瘍瘤塊について検査した。全てのＭ２１マウスを４２日目に殺した。Ｍ２１−Ｌマウスについては、３〜６匹を各時点で殺した。Ｍ２１マウスについては６週後の腫瘍瘤塊は多すぎて計数ができない（肺当たり>>２５０）ので、＜０．００１レベル（**）または＜０．０２レベル（*）でＭ２１−Ｌ群は４２日目における対照Ｍ２１群と同一の集団からのものであるという仮定に基づくＴ統計を示した。高レベルおよび低レベル注射したグループの双方で同じ有意性が得られたが、その一つを示す。横棒は各群の平均腫瘍数を示す。縦軸：転移腫数／肺、横軸：注射後日数。
第８図
１７Ｅ６は細胞障害性ではない。
Ａ：１７Ｅ６のＭ２１細胞増殖に及ぼす影響
５×１０4個のＭ２１をＤＭＥＭ／ＦＣＳ中に担体（○）とともに、または５０μｇ／ｍｌの１７Ｅ６（●）または１４Ｅ２（△）抗体とともに接種して、細胞数を毎日数えた。増殖の反応動力学および飽和密度は抗体の影響を受けない。縦軸：細胞数、横軸：日数。
Ｂ：小グリア細胞によるＭ２１細胞の１７Ｅ６依存生溶解
チミジン標識したＭ２１細胞をＢＡＬＢ／Ｃ由来の小グリア脳マクロファージとともに混合して、連続希釈した抗体を加えて、インキューベートした後にチミジン放出を測定した。対照群：（△）Ｍ２１細胞のみ、（◆）Ｍ２１＋１７Ｅ６（１００ｎＭ）、（◇）Ｍ２１＋１４．１８Ｇ２ａ、（▲）Ｍ２１＋小グリア細胞。平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝６）。試験群：（●）Ｍ２１＋小グリア細胞＋１７Ｅ６、（□）Ｍ２１＋小グリア細胞＋１４．１８Ｇ２ａ。１７Ｅ６は抗体依存性細胞溶解を誘導しなかった。平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）。縦軸：細胞障害性（％）、横軸：抗体濃度（Ｍ）。
Ｃ：小グリア細胞によるＭ２１細胞の１７依存性細胞増殖阻止
Ｍ２１細胞を小グリア細胞および連続希釈抗体とともにインキュベートして、次いで［Ｈ3］−チミジンでパルス標識して、ＤＮＡ合成を測定した。チミジン取り込み（［Ｈ3］−ｔｈｙ）を測定した。符号はＢに記述した通りである。エフェクター細胞のみの細胞増殖阻止活性に留意されたい（▲）。アッセイの顕微鏡観察は、均質の小グリア細胞の１４．１８Ｇ２ａ≧１０-10Ｍの領域では、Ｍ２１細胞は生存できなかったことを示した。縦軸：［Ｈ3］−チミジン取り込み（ｃｐｍ×１０-3）、横軸：抗体濃度（Ｍ）。
第９図
１７Ｅ６はＭ２１細胞によるＤＮＡ合成に影響を及ぼさない。
【００２７】
細胞系（Ａ）Ｍ２１、（Ｂ）Ｍ２１−Ｌ、（Ｃ）Ｍ２１−Ｌ４、（Ｄ）Ｍ２１−ＬＧｐＩＩｂを培養して、緩衝液（○）または表示した濃度の抗体１７Ｅ６（●）、ＬＭ６０９（▲）または１４Ｅ２（△）を加えた。（Ｂ）および（Ｄ）において、ルーチン陽性対照のタクソール（◇）を示す。４８時間後、細胞を［Ｈ３］−チミジンでパルス標識して、取り込まれた放射能活性を測定した。抗体はＤＮＡ合成に影響を及ぼさなかった。タクソールは完全に合成を阻止する。第８図を参照：９０μｇ／ｍｌ Ｍａｂ＝６００ｎＭ。縦軸：［Ｈ3］−チミジン取り込み（ｃｐｍ×１０-3）、横軸：Ｍａｂ濃度（μｇ／ｍｌ）。
第１０図
１７Ｅ６およびフラグメントの精製αｖβ３上のＥＬＩＳＡ。
【００２８】
表示した濃度の天然の１７Ｅ６（△）、そのＦ（ａｂ´）2（○）またはＦ（ａｂ´）（□）フラグメントを１ｍｇ／ｍｌのαｖβ３で被覆したプレートに結合させて、結合した抗体を検出した。縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）、横軸：抗体（ｌｏｇ10μｇ／ｍｌ）。
第１１図
αｖβ１およびαｖβ５によって媒介された細胞接着は１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）によって阻止されるが、αｖβ３の媒介による接着は阻害されなかった。表示した細胞をビトロネクチンの５ｍｇ／ｍｌの被覆に表示した濃度の１７Ｅ６、そのＦ（ａｂ´）2またはＦ（ａｂ´）フラグメントの存在下で接着させた。１００％接着は、加えた全細胞の約８５％（ＷＭ１６４）から約５０％（Ｖ＋Ｂ２）と異なった。縦軸：％最大細胞接着、横軸：抗体濃度（μｇ／ｍｌ）。
第１２図
ビトロネクチンへのＭ２１接着は１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）を架橋結合することによって阻止される。
【００２９】
ビトロネクチンへのＭ２１細胞接着中に（第４、１１図）、０（○）、０．１（▽）、１．０（□）または１０μｇ／μｌ（△）の１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）フラグメントまたは天然ＡＰ３抗体を、表示した濃度の架橋結合抗マウス二次層抗体とともに共インキューベートした。架橋結合物は、１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）およびＡＰ３に関して同一のＥＬＩＳＡ親和性を示した（無表示）。縦軸：４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）、横軸：ヤギ抗マウス抗体濃度（μｇ／ｍｌ）。
第１３図
直接競合アッセイにおいてリガンド活性部位類似体とビトロネクチンは互いにαｖβ３との結合を競合する。
【００３０】
漸増する濃度のビトロネクチン（▽）またはペプチドＧＲＧＤＳＰＫ（○、●）またはｃＲＧＤｆＶ（◆、◇）を、αｖβ３被覆プレート上でビオチン化ビトロネクチン（１μｇ／ｍｌ≡１．５ｎＭ）またはビオチン化ｃＲＧＤｆＶ誘導体（ｃＲＧＤｆＫ−ｂｉｏ：５０ｎＭ）と共インキューベートした。結合したビオチンを抗ビオチン抗体を用いて検出した。第１３図において１価多量体ビトロネクチンの平均Ｍrは０．６５ＭＤａと想定される。縦軸：結合したリガンド（％）、横軸：ペプチド／ＶＮ（ｌｏｇ［（μＭ］）。
第１４図
直接競合アッセイにおいて１７Ｅ６はαｖβ３への結合をビトロネクチンと競合しない。
【００３１】
漸増する濃度の１７Ｅ６（●）、他の抗αｖβ３抗体（□、◇、▽、△）、またはリガンド類似体ｃＲＧＤｆＶ（◆）をαｖβ３被覆プレート上でビオチン化ビトロネクチン（１μｇ／ｍｌ）と共インキューベートした。結合したビオチンを抗ビオチン抗体を用いて検出した（１７Ｅ６のための同一αｖβ３被覆条件下での飽和プロフィール（第１０図）を参照されたい）。縦軸：結合したＶＮ（％）、横軸：［Ｍａｂ］μｇ／ｍｌ、［ｃＲＧＤ］μＭ。
第１５図
阻止前競合アッセイにおいてリガンドおよび活性部位類似体はαｖβ３への結合を抗体と競合しない。
【００３２】
漸増する濃度のビトロネクチン（ＶＮ、○）、フィブリノーゲン（ＦＧ、▽）、フィブロネクチン（ＦＮ、□）、ｃＲＧＤｆＶ（６６２０３、▲）または表示の抗体（◆）をαｖβ３被覆プレート上で１時間予備インキューベートして、次いでビオチン化抗体（１μｇ／ｍｌ）の添加（無洗浄）によって図示するように調べた。結合したビオチンを検出した。抗体結合値１００％とは、表示濃度のチャレンジ物質の存在下での抗体結合が競合物のない対照と同じであることを意味する。リガンドは抗体結合に影響しない。縦軸：結合したプローブ抗体（％）、横軸（左および右側）：リガンド濃度（μｇ／ｍｌ）。
第１６図
阻止前競合アッセイにおいて抗体はαｖβ３への結合を相互に競合する。
【００３３】
表示したように漸増する濃度の抗体１７Ｅ６（●）、ＬＭ６０９（▽）、ＡＰ３（□）または１４Ｄ９．Ｆ８（△）をαｖβ３被覆プレート上で１時間予備インキューベートして、次いでビオチン化抗体（１μｇ／ｍｌ）の添加（無洗浄）によって各図に示すように調べた。結合したビオチンを検出した。抗体結合値１００％とは、表示濃度のチャレンジ物質の存在下で抗体結合が競合物のない対照と同じであることを意味する。抗体は、交差競合グループ内で相互に競合する。縦軸：結合したプローブ抗体（％）、横軸（左および右側）：抗体濃度（μｇ／ｍｌ）。
第１７、１８図
Ｍａｂ１７Ｅ６可変（Ｆｖ）部のｃＤＮＡ配列
軽鎖ＶＬ１７Ｅ６（ａ）および重鎖ＶＨ１７Ｅ６（ｂ）
可変部（リーダー配列を含む）の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。リーダー配列は太字で、ＣＤＲ配列はイタリック体で示す。Kabato分類によれば、重鎖はグループＩＩＢの特徴的構造を有し、軽鎖はカッパグループＶの特徴的構造を有する。
第１９図
クローニングプロセスの模式的説明図
１７Ｅ６抗体の重鎖および軽鎖のＦｖドメインをコードするｍＲＮＡを１７Ｅ６ハイブリドーマ細胞から抽出して、ｃＤＮＡに転写して、ＰＣＲを可変部を増幅するために用いた。これらを、次いでクローニングして配列決定した。
参考文献
【００３４】
【表１】
0003898245.tif 000002
【００３５】
【表２】
0003898245.tif 000003
【００３６】
【表３】
0003898245.tif 000004
【００３７】
【表４】
0003898245.tif 000005
アルファＶグループモノクローナル抗体はインテグリンαｖ鎖と反応する
精製αｖβ３およびαＩＩｂβ３上でのＥＬＩＳＡを用いた抗体スクリーニングによって、αｖβ３と特異的に反応した五つのクローン、１７Ｅ６、２０Ａ９、２３Ｇ５、１４Ｄ９．Ｆ８、１０Ｇ２が明らかになった（表１）。これらのＭａｂを「アルファＶグループ」と称する。全てはＩｇＧ１イソタイプであった。同じＥＬＩＳＡアッセイにおいて、αｖβ３複合体（ＬＭ６０９）、αｖ鎖（ＬＭ１４２）、αｖβ５複合体（Ｐ５Ｈ９）、αＩＩｂβ３複合体（ＣＰ８）、β３鎖（ＡＰ３）およびβ１鎖（Ｐ４Ｃ１０）に対する公知特異性を有する抗インテグリン抗体は、文献から予期されるように反応した（表１）。固定細胞上でのＥＬＩＳＡ（「ＣＥＬＩＳＡ」）において、αｖβ３およびαｖβ５を発現する細胞（Ｍ２１）、αｖβ５は発現するがαｖβ３は発現しない細胞（ＵＣＬＡＰ３）、αｖβ３およびαｖβ５のいずれも発現しない細胞（Ｍ２１−Ｌ）およびαＩＩｂβ３を発現する細胞（Ｍ２１−Ｌ−ＩＩｂ）を用いた場合、アルファＶグループはαｖインテグリン鎖のそれらの認識と一致するが、β３、β５、β１または他のα鎖との反応とは明らかに異なる応パターンを示した（表１）。結果は、精製受容体を用いたＥＬＩＳＡデータを確証した。β３およびＧｐＩＩｂに関する特異性を有するＭａｂはまたスクリーンにおいて得られ（データ無表示）、これらはアルファＶグループとは明らかに区別される反応パターンを示した。１７Ｅ６、１４Ｄ９．Ｆ８、２０Ａ９および２３Ｇ５は、同様の明らかな親和性でαｖβ３と結合した。５０％の結合が、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌ（約５０〜１００ｐＭ、ＬＭ６０９と同様）で達成された。１０Ｇ２は、ＬＭ１４２と同様に約１０倍低い親和性で結合した。αＩＩｂβ３に対するＣＰ８および１４Ｅ２（以下を参照されたい）は、αｖβ３への最小結合を１００ｎＭの濃度まで示した。
【００３８】
アルファＶグループの天然αｖインテグリン認識能を、ＦＡＣＳ（第１図、表２）および表面標識細胞からの免疫沈殿（第２図）によって試験した。ＦＡＣＳ分析（第１図）において、αｖ発現系（Ｍ２１）は、１７Ｅ６、１４Ｄ９．Ｆ８、２０Ａ９、２３Ｇ５およびαｖ同定抗体ＬＭ１４２およびＬＭ６０９と強く反応し、１０Ｇ２と中程度に反応し、また対照Ｍａｂ１４Ｅ２および２１Ｈ６およびＭａｂ９．２．２７とも反応した。これに対して、αｖ欠損変異体（Ｍ２１−Ｌ）は、アルファＶグループおよびＬＭ１４２およびＬＭ６０９と弱く反応したが、Ｍ２１と同様の反応性を１４Ｅ２、２１Ｈ６および９．２．２７について示した。Ｍ２１−Ｌは、細胞が透過性化された場合にのみＦＡＣＳにおいて検出されたβ３サブユニットの細胞内プールを有する（表２）。Ｍ２１−Ｌ４（αｖ再トランスフェクトしたＭ２１−Ｌ細胞（Felding-Habermann et al., 1992））のＦＡＣＳ分析において、アルファＶグループはＭ２１の場合と同様の反応パターンを示した。対照ベクタートランスフェクタントのＭ２１−Ｌ１２およびＧｐＩＩｂトランスフェクタントであるＭ２１−Ｌ−ＩＩｂ（Kieffer et al., 1991）は、アルファＶグループとは反応を示さなかった（表１）。ＵＣＬＡＰ腺癌腫はアルファＶグループ、ＬＭ１４２およびＰ５Ｈ９と反応したが、ＬＭ６０９とは反応しなかった。ＵＣＬＡＰ−３は、β３を発現しない（緒言を参照されたい）。黒色腫ＶＭ７９３はＭ２１と同一の反応パターンを示した。Ｍ２１細胞の免疫沈殿スクリーニングにおいて、アルファＶグループはＬＭ１４２（抗αｖ）およびＬＭ６０９（抗αｖβ３）と同じ免疫沈殿パターンを示した（第２ａ図）。濃い広いバンドが約９２ＫＤａの位置に、より薄いバンドが約１４５ＫＤａの位置にそれぞれ見られ、約１００ＫＤａの位置に弱い随伴バンドが認められ、パターンは表面標識αｖβ３およびαｖβ５インテグリン（Wayner et al., 1991）に特徴的である。Ｍ２１−Ｌ上の沈殿パターンと比較した場合、アルファＶグループのいずれも沈殿せず（１７Ｅ６および２０Ａ９からのデータを示す）、ＬＭ１４２またはＬＭ６０９のいずれも沈殿しなかった（第２ｃ図）。β１特異性抗体は、両細胞系から同様の沈殿パターンを示した。Ｍ２１−Ｌにおいて、抗β３抗体との沈殿は、透過性（おそらく壊死）細胞中の細胞内β３標識    によって約９２ＫＤａの位置にバンドを生じた。ＵＣＬＡＰ３（第２ｄ図）はＬＭ６０９とは沈殿を生じなかったが、約９５ＫＤａ／１４５ＫＤａ複合体はアルファＶグループおよびＬＭ１４２によって沈殿した（第２ｄ図）。要約すると、ＥＬＩＳＡ、ＣＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および免疫沈殿は、同一の反応パターンを示し。これはアルファＶグループのＭａｂがヒトαｖインテグリン鎖上の細胞外ドメインと反応することを強く示唆した。
【００３９】
Ｍａｂ１７Ｅ６は有力な機能阻止抗体である。
１７Ｅ６はαｖリガンドへの最初の細胞接着を修飾することができる
αｖインテグリンはビトロネクチンの受容体として機能することができるので、アルファＶグループをビトロネクチン基質への細胞接着への可能な影響に関してスクリーニングした。ＦＡＣＳによるインテグリン分析の後、細胞を接着アッセイにおいて試験した（表２、第３図）。ＦＡＣＳにおいて、ヒト黒色腫および癌腫細胞系はアルファＶグループと同様に反応した。１７Ｅ６との反応を要約した（第３図）。ＦＡＣＳにおいて１７Ｅ６と反応している細胞のビトロネクチンへの最初の接着はその抗体によって強く阻止されたが、対照抗体１４Ｅ２の影響はごくわずかだった（第３図）。他のアルファＶグループでは有効性が低かった（データ無表示）。ネズミ細胞Ｂ１６Ｆ１０のビトロネクチンへの強い接着は１７Ｅ６によって影響されず、Ｂ１６Ｆ１０はＦＡＣＳにおいて１７Ｅ６と反応しなかった。予示されたように（Cheresh and Harper, 1987）、ビトロネクチンへのＢ１６Ｆ１０の接着は、ＲＧＤペプチドはミクロモル濃度で感受性で、これは機能性表面αｖβ３の存在を示唆する（SLG and B. Diefenbach）。このように、１７Ｅ６およびアルファＶグループはヒトαｖと反応したが、マウスαｖとは反応しなかった。
【００４０】
１７Ｅ６の細胞接着に及ぼす影響を調べた。１７Ｅ６は、ビトロネクチンへのＭ２１接着を約０．１μｇ／ｍｌのＩＣ50で阻止した（約８６％）（第４ａ）。本発明は、Ｍ２１接着がαｖβ３（ＬＭ６０９）またはαｖβ５（Ｐ５Ｈ９）に対する抗体のみによっては十分に阻止されないが、それらを一緒に加えた場合には強く阻止されることを示すことによって以前の研究（Wayner et al., 1991)を確実にする（第４ａ、ｂ図）。抗β１インテグリン抗体（Ｐ４Ｃ１０）はビトロネクチンへのＭ２１接着には影響を及ぼさなかった（第４ｂ図）。ＵＣＬＡＰ３系およびＷＭ７９３系はビトロネクチンに接着し、この接着は１７Ｅ６によって、また相補的αｖβ５特異性抗体（Ｐ５Ｈ９／ＵＣＬＡＰ３）またはαｖβ３特異性抗体（ＬＭ６０９／ＷＭ７９３）によって阻止された（第４ｃ〜ｆ図）。αｖβ５（ＵＣＬＡＰ３）上で、１７Ｅ６は約３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ50を有した。ＷＭ７９３上でそれは約６０ｎｇ／ｍｌであり、ＬＭ６０９に関してはＩＣ50は約６００ｎｇ／ｍｌであった。ＵＣＬＡＰ３はαｖβ５を発現するがαｖβ３は発現しない（Wayner et al., 1991）。一方、ＷＭ７９３は高レベルでαｖβ３を発現する（表１）。１７Ｅ６の阻止特異性は、他のマトリックス基質への細胞接着への影響の欠損によって確認された（第５図）。Ｐ４Ｃ１０（抗β１）は、ラミニンおよびコラーゲンへのＭ２１接着を壊減させた。これら二つの基質への細胞接着はβ１シリーズのインテグリンによって媒介することができる（Sonnenberg et al., 1988; Takada et al., 1987）。
【００４１】
生化学的なデータと合わせて、これらの結果は１７Ｅ６が種々のインテグリン複合体のαｖ鎖を結合させて、それらのリガンドとの相互作用を妨害するという説と一致する。
１７Ｅ６は、αｖインテグリンによって媒介された樹立細胞マトリックス相互作用の逆転を誘発する：
次に、１７Ｅ６が樹立細胞−マトリックス相互作用に影響するかどうかを調べた。低濃度（約０．１μｇ／ｍｌ）の１７Ｅ６をＭ２１細胞に加えた場合、２４時間接着後でさえ、Ｍ２１培養物中で３７℃で０．５〜１時間後に広範囲な細胞の円形化が生じた（第６図）。この変化は完全に可逆的で、細胞を洗浄した後に４８時間以内に細胞は広がった状態に戻った。これに対して、抗体ＬＭ６０９および１４Ｅ２は、高濃度（１００μｇ／ｍｌ）でさえも形態学的に僅かな影響を及ぼしただけだった。抗体は、フィブロネクチン被覆基質には１００μｇ／ｍｌの濃度でさえも形態学影響を及ぼさなかった（第６図）。Ｍ２１−Ｌ４（およびαｖを介して接着した他の細胞）は、１７Ｅ６によってビトロネクチン表面に同様に影響したが、フィブロネクチン、コラーゲンまたはラミニンには影響を及ぼさなかった。
１７Ｅ６は、ヌードマウスにおけるＭ２１腫瘍発達を阻止する：
本発明は、ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるαｖ阻止抗体１７Ｅ６の２１腫瘍の皮下発達への影響を調べた（第７図）。動物モデルにおいて、ヌードマウスにおけるＭ２１腫瘍の発達はαｖシリーズインテグリンの細胞表面発現と相関された（緒言を参照されたい）。Ｍ２１細胞を皮下に内毒素を含まない抗体とともに皮下注射した。１７Ｅ６は、Ｍ２１腫瘍の皮下発達を常に（４／４実験）阻止した（第７ａ図）。１７Ｅ６の存在下で腫瘍はいずれも根づかず（０／３２）、６ヶ月の越える現在でも動物は無腫瘍の状態でいる。対照腫瘍の根づきは７５〜９０％に認められた。αｖ鎖それ自体に対する非阻止抗体および黒色腫細胞表面に対する対照抗体は、腫瘍発達に種々の一致しない影響を示した。１４Ｅ２処理した対照において、腫瘍の根づきは実験によって差があるが３０〜６０％減少したが、残りの腫瘍は未処理の対照と同様に増殖し、対照と同じく、これら動物の肺を組織培養すると肺への小転移が明らかになった（無表示）。これに対して、１７Ｅ６処理動物では、６ヵ月目の解剖で、皮下腫瘍も、肺、肝臓、腎臓、脾臓、結腸、胃、それに胸腔または腹腔中の転移のいずれも認められなかった。αｖβ３欠損系Ｍ２１−Ｌは、Ｍ２１よりも緩やかに皮下増殖し、１７Ｅ６によって影響されなかった。１４Ｅ２で処理したＭ２１−Ｌ対照は、Ｍ２１細胞に見られたと同様に非処理動物と較べて軽減された根づきを有した（第７ｂ図）。
【００４２】
Ｍ２１およびＭ２１−Ｌの増殖および抗体１７Ｅ６の影響を、「実験的転移」尾静脈注射モデルにおいて比較した。Ｍ２１−Ｌが有意に少いコロニーを形成したのに対してＭ２１は多くのコロニーを投与量依存的に形成したが、高投与量を注射した場合には肺瘤塊を形成した（第７ｃ図）。言い換えると、肺の腫瘍増殖はまた細胞表面αｖインテグリンの存在によって促進され、Ｍ２１の１７Ｅ６との前培養は形成される腫瘍コロニー数を減らした（９０％減）。興味深いことに、腫瘍形成のレベルは、同一実験におけるＭ２１−Ｌ細胞によって達成されたもとと同様であった。抗体は、腫瘍の増殖した動物数には影響しなかった（表３）。
【００４３】
要約すると、細胞表面のαｖの存在によって、皮下および実験的転移モデルの双方においてＭ２１腫瘍形成が促進され、αｖ阻止および抗体１７Ｅ６逆転はＭ２１の増殖を著しく抑制した。Ｍ２１細胞を用いた実験的転移モデルにおいて、Ｍ２１の活発な増殖およびＭ２１−Ｌの不活発な増殖パターンは、腫瘍の皮下増殖パターンと近似し、Ｍ２１増殖はまた１７Ｅ６による前処理によって抑制された。このデータによって、αｖインテグリンとヒト黒色腫発達との相関が強められる。
細胞障害性によらない１７Ｅ６の影響
接着、形態学および腫瘍発達に及ぼす１７Ｅ６の有力な影響を観察した後、その作用の機序を見出す試みがなされた。１７Ｅ６を細胞障害性に関して試験した（第８図）。細胞増殖の反応動力学および達成される最終飽和密度は、１７Ｅ６または対照抗体の存在によって大きく影響されなかった（第８ａ図）。
【００４４】
ヌードマウスは免疫的欠陥動物である。残る免疫能力を有する二、三の細胞のうち、マクロファージが細胞障害性抗体介在応答をつかさどる可能性が最も大きい。抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）の可能性を試験するために、抗体と同質遺伝的なネズミマクロファージをＭ２１細胞に対するＡＤＣＣに関して試験した。エフェクター細胞のように、ネズミ脳マクロファージ（小グリア）はとくに有効なＡＤＣＣのメディエーターである（Sutter et al., 1991）。陽性対照のＭａｂ１４．１８Ｇ２ａはほぼ完全なＭ２１溶解を＜１０-9Ｍで起こしたのに対して、１７Ｅ６は１０-7ＭまでＡＤＣＣを媒介しなかった（第８ｂ図）。
【００４５】
１７Ｅ６がエフェクター細胞の存在下で細胞分裂抑制活性を発揮するかどうかを評価するために、Ｍ２１小グリア共培養物のＤＮＡ合成を抗体の存在下で測定した（第８ｃ図）。１０-10Ｍの１４．１８Ｇ２ａは、［3Ｈ］−チミジン取り込みにおいて≧９０％の阻害を起こした。
【００４６】
細胞増殖、ＡＤＣＣおよびＡＥＣＭへの影響を調べた後、Ｍ２１細胞におけるＤＮＡ合成のレベルがＭａｂによって影響されたかどうかを調べた。０．５μＭの１７Ｅ６、１４Ｅ２およびＬＭ６０９はチミジン取り込みに影響しなかった（第９図）。Ｍ２１−Ｌ、Ｍ２１−Ｌ４およびＭ２１−Ｌ−ＩＩｂ細胞におけるＤＮＡ合成もまた、抗体による影響を受けなかった。Ｍ２１−ＬおよびＭ２１−Ｌ−ＩＩｂは、１７Ｅ６およびＬＭ６０９のいずれとも反応しないが、１４Ｅ２とは反応する（第１図）。多くの他の黒色腫細胞系についても試験したが、それらのＤＮＡ合成はアルファＶグループによって明らかな影響を受けないことが示された（無表示）。
【００４７】
１７Ｅ６および１４Ｅ２はＩｇＧ１イソタイプであって、Ｍ２１細胞の補体介在分解には影響しなかった（無表示）。１７Ｅ６の影響はαｖインテグリンに特異的であって、他の細胞体系に劇的な障害を及ぼさないと結論できる。
１７Ｅ６作用には細胞性αｖβ３に関しては受容体架橋結合が要求されるが、αｖβ１またはαｖβ５ではその必要がない：
多くの生物学的体系において、膜貫通シグナルが受容体の二量体化によって始まる。実際、αｖβ３の多量体化は、ＨＵＶＥＣにおけるホスホチロシン化パターンを変化させる（Bhattacharya et al., 1995）。したがって、受容体凝集が１７Ｅ６作用中に関与するかどうかを調べた。
【００４８】
１７Ｅ６は細胞性インテグリンαｖβ３、αｖβ５およびαｖβ１を阻害した（第４図）。天然の１７Ｅ６およびそのＦ（ａｂ´）2およびＦ（ａｂ´）フラグメントは、分離したαｖβ３上でのＥＬＩＳＡにおいて同様の結合特性を有し（第１０図）、５０％飽和が約１ｎｇ／ｍｌ（約７ｐＭ天然Ｍａｂ）で達成された。同様のＥＬＩＳＡ滴定曲線は、１７Ｅ６とＥＬＩＳＡプレート間の一価相互作用を示唆した。しかし、細胞接着アッセイにおいて、フラグメントは異なる行動を示した。Ｆ（ａｂ´）2および天然１７Ｅ６は、αｖβ１（Ｖ＋Ｂ２細胞）およびαｖβ５（ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞）（ＩＣ50：約０．１μｇ／ｍｌ、約３ｎＭ）が介在する細胞接着を阻止し、Ｆ（ａｂ´）フラグメントはαｖβ１およびαｖβ５上の二量体抗体のように活性であった（第１１図）。しかし、Ｆ（ａｂ´）フラグメントはαｖβ１およびαｖβ５の双方でαｖβ３の場合の少なくとも１×１０4倍の活性を示した。この場合、２５＋１０％が試験した最高濃度（５０μｇ／ｍｌ：−ＩＣ50≫５０μｇ／ｍｌ：≫４００ｎＭ）で阻止されたのみで、これらのレベルでは関連しない抗体もまた同程度に阻止する（無表示）ことから、この限界の影響は非特異的であると示唆される。
【００４９】
結合能を有するＦ（ａｂ´）抗体フラグメント（１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）、（第１０図））の生物活性の欠如は、二量体化が抗体介在機能に必要であることを示す適切な例である。架橋結合がαｖβ３上の１７Ｅ６作用に必須であることを確認するために、１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）をポリクローナル抗Ｆ（ａｂ´）抗体添加によって細胞接着アッセイ中に架橋結合させた。代表的阻止帯様の影響が一次および二次抗体の双方の決定的濃度において観察され、その場合にのみ、細胞接着の強い阻害が観察された。大量の二次層抗体のみまたはＦ（ａｂ´）のみでは細胞接着に影響を及ぼさなかった。さらに、影響は架橋結合αｖβ３インテグリン、すなわち結合によるαｖβ３の架橋結合の非特異的結果ではなかったが、非阻害性抗体ＡＰ３は細胞接着に影響を及ぼさなかった（第１２図）。架橋結合実験における二次抗体の添加後の活性Ｆ（ａｂ´）の濃度は、αｖβ３介在接着における天然１７Ｅ６のＩＣ50と一致する（第１１図を参照されたい）。
【００５０】
合わせて、これらのデータはαｖβ３インテグリンの架橋結合は同種のリガンドのＷＭ１６４およびＭ２１接着を阻害するために必要であり、一方、αｖβ５およびαｖβ１は不活化に架橋結合を要求しない。
、１７Ｅ６は、単離受容体アッセイにおいて不十分な受容体機能遮断剤である：αｖβ３に関する１７Ｅ６機能の例外的性質を単離受容体アッセイにおいて詳細に調べた。古典的活性部位阻害剤と１７Ｅ６との違いは明確である。αｖβ３に結合するビトロネクチンは約５μｇ／ｍｌ（約１０ｎＭ：平均ビトロネクチン多量体サイズを１０モノマーと仮定する）で飽和し（第１３図）、この結合は古典的線状リガンド類似体ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＫ、ＩＣ50：約２μＭ）および環状ペプチド（ｃＲＧＤｆＶ、ＩＣ50：約５ｎＭ）の双方と特異的に競合する。ｃＲＧＤｆＶのビオチン標識変異体であるｃＲＧＤｆＫ−ビオチンを用いて、インヒビターがビトロネクチン結合を競合するということだけでなく、ビトロネクチンがインヒビター結合を競合するということを直接に示すことが可能であった（第１３図）。すなわち、系は対称的であった。実際、ビトロネクチン、ＧＲＧＤＳＰＫおよびｃＲＧＤｆＶはそれぞれ、互いに競合し、それは「合理的」かつ「対称的」であって、競合のＩＣ50は、αｖβ３複合体へのビトロネクチン結合の阻害のＩＣ50と鏡像関係にあった（第１３図）。
【００５１】
１７Ｅ６結合はαｖβ３を０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ（７００〜７０ｐＭ）で飽和する（第１０図を参照されたい）。しかし、抗体はリガンド結合の弱いインヒビターでしかない。７０ｎＭの抗体濃度でさえも、ビトロネクチン結合の阻害は３０（＋１０）％以下であった。ＬＭ６０９は同様に作用したが、αｖβ３結合非阻害性抗体（１４Ｄ９．Ｆ８、２０Ａ９およびＷＡＭ２−４）は作用しなかった。リガンド類似体環状ペプチドｃＲＧＤｆＶは受容体−リガンド相互作用を効果的に阻止した（ＩＣ50：約１０ｎＭ）（第１４図）が、１７Ｅ６結合には影響しない。天然または一価の１７Ｅ６のいずれも阻害しなかった（無表示）。１７Ｅ６は飽和量の対抗リガンドの存在下でαｖβ３に結合する：
１７Ｅ６が単離受容体アッセイにおいてリガンドに対する競合性が弱いことおよびｃＲＧＤｆＶのような競合性の強いインヒビターが存在することから、１７Ｅ６がαｖ機能にどう影響するかという疑問が起きた。αｖβ３インテグリンに関する細胞接着アッセイでは１７Ｅ６およびそのフラグメントの阻止活性には架橋結合が必要で、これは競合による阻害と必ずしも一致しない。次に、αｖβ３のリガンドが直接に１７Ｅ６結合を阻害するかどうかを調べた。
【００５２】
リガンドを受容体に予め結合させて、低濃度の直接標識１７Ｅ６を加えた（第１５図）。１７Ｅ６の結合は高濃度のビトロネクチン、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲン（全てαｖβ３の天然リガンド（Cheresh and Spiro, 1987））、すなわちαｖβ３上の特異的結合部位の飽和に必要な量の１００倍過剰量によってっも影響されなかった（＜１０％阻止）。これに対して、予め結合させた１７Ｅ６は、続いて加えた標識１７Ｅ６の結合を強く競合し（第１５、１６図）、αｖβ３の天然リガンドもまた相互によく競合した（無表示）。これは、１７Ｅ６がαｖβ３活性部位に対してビトロネクチンと競合したという本発明者らの仮定に反した。さらに、２００μＭの環状ペプチドｃＲＧＤｆＶのような強力な活性部位競合物もまた１７Ｅ６結合に影響しないが、それでも２ｎＭのＩＣ50でαｖβ３へのビトロネクチン結合を阻止する（第１３図）。
【００５３】
ＥＬＩＳＡデータ（第１０図）は１７Ｅ６−αｖβ３相互作用が一価であることを示し、これによって、きわめて高い抗体親和性と低リガンド親和性との組み合わせによる人為的競合が観察されたという可能性が少なくなる。しかし、他のαｖおよびβ３特異性抗体を標識して、これらを抗体自体（第１６図）を含む前結合リガンド（第１５図）へのチャレンジに用いた。抗体は相互によく競合して、明らかに交差競合グループに入った（第１６図）。β３特異性抗体ＡＰ３はそれ自体の結合を競合したが、αｖβ３複合体（ＬＭ６０９）またはαｖ鎖単独（１７Ｅ６、１４Ｄ９．Ｆ８）のいずれかに特異的な抗体の結合に影響しなかったし、それらによって影響されることもなかった。ＬＭ６０９、１７Ｅ６および１４Ｄ９．Ｆ８は、いずれも強く交差競合した。これに対して、前結合リガンドはαｖβへの１７Ｅ６結合に影響しなかった。１７Ｅ６の機能はリガンド結合部位に対する直接的競合によるものではなかったと結論づけることができる。
１７Ｅ６可変部のクローニングおよび配列決定：
免疫グロブリン可変部のＰＣＲ増幅のために作製されたプライマーライブラリーを用いて、ハイブリドーマ１７Ｅ６の重鎖および軽鎖領域のための免疫グロブリン富化ｃＤＮＡライブラリーをクローニングした。冗長の可変部プライマーはリーダー配列の開始点で終結した。定常部逆プライマーは定常部に３０塩基対入ったところで終結した。プライマーを、クローニングのための末端ＳａｌＩまたはＸｍａＩ制限部位を用いて作製した。期待した大きさ（４２０〜４５０塩基対（Jones and Bendig, 1991））のＰＣＲ産物を得て、クローニングして、配列決定した（第１７図）。１７Ｅ６免疫グロブリン軽鎖可変部のＶＬ１７Ｅ４の長さは３８１塩基対であった。１７Ｅ６免疫グロブリン重鎖可変部のＶＨ１７Ｅ４の長さは４１１塩基対であった。重鎖可変配列は、KabatグループＩＩｂ免疫グロブリンの特性を示し、軽鎖配列はKabatグループＶの特性を示した（Kabat et al., 1987）。クローニング工程を模式的に示す（第１９図）。
【００５４】
腫瘍の進行および転移は、古典的には、細胞が正常に増殖および接着調整ができずに、侵入移動し、不適切な部位に付着して増殖する疾患である。今日、インテグリンは多くの細胞接着をコントロールすることが知られており、一方、接着は増殖、分化、細胞移動およびプロテアーゼネットワーク活性を含む機械学的に連関する活動、転移カスケードにおいて反復される発達的活動（Liotta et al., 1991; Stetler Stevenson et al., 1993; Fidler, 1988）を調節することができる。この研究において、抗体はヒトαｖシリーズインテグリンに対するものであって、その一つである１７Ｅ６は最初の細胞接着を妨害し、安定したαｖ−リガンド相互作用を壊して、インビトロ動物モデルにおいてヒト黒色腫発達を阻害する（Fidler, 1986）。生物化学的分析において、アルファＶグループ抗体はＬＭ１４２（ヒトαｖに対するよく同定された抗体）と近似する反応パターンを示したが、αｖβ３特異性抗体（ＬＭ６０９）、αｖβ５特異性抗体（Ｐ５Ｈ９）および他の定義された抗インテグリン抗体とは明らかに異なる反応パターンを示した。このように、アルファＶグループ抗体はヒトαｖインテグリン鎖を認識するようである。１７Ｅ６免疫グロブリン転写のｃＤＮＡクローニングによって、独自の明瞭な配列が明らかになった。重鎖可変部配列はKabatグループＩＩｂ免疫グロブリンの特徴を有し、軽鎖配列はKabatグループＶの特徴を有する（Kabat et al., 1987）。このように、抗体は、独自に定義される。
【００５５】
１７Ｅ６はαｖが介在する細胞相互作用を強く妨害した。インテグリン機能を理解する上で機能妨害性抗体は重要であるが、αｖ分野には重要なクラス特異性阻止抗体が欠けていた。１７Ｅ６はαｖ介在細胞接着を約０．３〜１ｎＭのＩＣ50で阻止する（抗体分子量：１５０、０００）。比較してみると、ペプチド遮断剤のＧＲＧＤＳＰＫは約５μＭのＩＣ50を有する。主にαｖβ３（ＷＭ７９３）またはαｖβ５（ＵＣＬＡＰ３）を発現する細胞系は、主にαｖβ１を発現する細胞と同様に１７Ｅ６によって阻止される。このように、１７Ｅ６はαｖインテグリンの一般的インヒビターである。
【００５６】
１７Ｅ６はαｖインテグリンのそれらのリガンドとの最初の相互作用を阻害するだけではなく、よく確立された相互作用を逆転し、ビトロネクチン上に接着した細胞を迅速に離脱させる。αｖβ３とビトロネクチンの相互作用は、最初の阻止可相互作用とすぐにそれに続く安定化反応の二つのステップからなり、「分離不可能」と記述されてきた（Orlando and Cheresh, 1991）。これに対して、１７Ｅ６は、ビトロネクチン基質からのＭ２１および他の細胞の遊離および部分的脱離を起こした（未公開知見）。細胞球形化は、抗体を除去するともとに戻った。１７Ｅ６によるビトロネクチン上のＭ２１の初期接着は完全には阻止できない（約９０％）が、細胞球形化は全ての接着細胞で起きる。ビトロネクチンへのＭ２１初期接着が抗αｖβ３および抗αｖβ５抗体の混合物によっておよびＲＧＤＳペプチドによって完全に阻止されるという以前の研究が確認され、これはαｖβ３とαｖβ５の双方の関与を意味する（Wayner et al., 1991）。この研究で示されるように、１７Ｅ６はいくつかのαｖ受容体を阻止して、それらが介在する安定した相互作用を逆転することができる。１７Ｅ６が接着した細胞と接着しつつある細胞の活性の違いは、αｖβ３およびαｖβ５の機能と位置の違いによると考えられる。接着しつつある細胞上では、双方は広く分布し、接着した細胞ではαｖβ３は中心局限性の接点に見出され、αｖβ５は広く分布している（Wayner et al., 1991; Zambruno et al., 1993）。さらに、１７Ｅ６がこれら接触の一つを選択的に妨害するかどうかを調べた。
【００５７】
ヌードマウスにおけるＭ２１腫瘍の増殖は、αｖインテグリンに強く依存している（Felding-Habermann et al., 1992; Sanders et al., 1992）。１７Ｅ６は安定したαｖ−リガンド相互作用を調整し、長期に影響するので、腫瘍発達への影響を試験した。１７Ｅ６がヌードマウスにおいて皮下のＭ２１腫瘍の発達を阻止することが見出され、これはFelding-Habermannらの研究を強く支持する。加えて、実験的肺転移のように、αｖはまたＭ２１の発達を促進し、１７Ｅ６はそれを阻害することが示された。このように、本発明は、重要な初期の研究を独立して確認し、１７Ｅ６を用いる共働的抗体介在「治療」を用いてこれを発展させた。これらの結果は、Ｍ２１腫瘍の発達におけるαｖインテグリンの重要性を強調し、以前の結果がクローニングの選択による人為的なものであるという可能性を除去する。
【００５８】
インビトロ１７Ｅ６効果は、洗浄除去後２４時間以上続いた。マウス容量を２０ｍｌとすると、インビボの初期抗体濃度は約１０ｎＭであり、これは培養中の細胞−リガンド相互作用を逆転するＩＣ50を越える数値である。１７Ｅ６は処理動物（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ）に関して共働的に作用し、ネズミＩｇＧ１の半減期は２０〜２００時間である（Tao and Morrison, 1989; Haba et al., 1985）。したがって、Ｍ２１−リガンド相互反応の逆転のためのＩＣ50は、少なくともこのモデルでは１００時間を越えることができた（５半減期）。１７Ｅ６をＲＧＤペプチドと比較することは興味深い。Ｂ１６Ｆ１０−Ｃ５７ｂｌｋ６ネズミ黒色腫モデルにおいて、共注射ペプチドはＢ１６−Ｆ１０肺腫瘍の発達を阻害した（Humphries et al., 1986; Hardan et al., 1993）。１７Ｅ６について同じ仮定で、約１００μＭのＲＧＤペプチドが存在した（Hardan et al., 1993）。これはビトロネクチンへの細胞接着の阻止に要求される投与量を二桁の範囲で越える値である。しかし、ＲＧＤＳは血清半減期８分を有する（Humphries et al., 1988）。一般的治療目標としては、腫瘍発達の抑制には長命の遮断剤ーが好ましい。
【００５９】
１７Ｅ６は腫瘍発達にどのように影響するのか？１７Ｅ６はネズミ細胞と反応しないことから、この抗体の影響は腫瘍細胞上に限定され、腫瘍脈管形成への影響は明らかに除外できる（Brooks et al., 1994）。１７Ｅ６の確認可能な優れた効果は、ａ）αｖインテグリンの細胞外ドメインへの結合、ｂ）αｖ介在細胞相互作用を妨害する能力による。ヌードマウスを殺すような抗体介在のもののほとんどが除去されたと想定することができる。１７Ｅ６はＭ２１細胞増殖および生存性に慢性的または急性的な影響を示さず、補体固定を媒介せず、ＤＮＡ合成に影響せず、同質遺伝子的マクロファージ介在細胞障害性を媒介しなかった。Ｍａｂ１４．１８Ｇ２ａの存在下で小グリア細胞によって効果的に死滅させられたことから、Ｍ２１細胞はＡＤＣＣに対して感受性であった。ＩｇＧ１Ｍａｂは（１７Ｅ６のように）、ネズミマクロファージＡＤＣＣを効果的に媒介する（Herlyn et al., 1985）。発現されるαｖβ３部位の細胞当たりの数は、ＡＤＣＣが起きる限界閾以下であるかもしれない。以前の研究は、ＡＤＣＣの有効性は、標的抗原密度に相関することを示した（Rodeck et al., 1985）。他の骨髄またはリンパ球エフェクター細胞と対照的に、マクロファージはＦｃγ受容体の全ての三クラスを発現する。データは、ＡＤＣＣを１７Ｅ６を用いてインビボ観察された腫瘍増殖の阻害を説明する機序とすることに反する。この抗体は内毒素を有しない。ＮＫ細胞介在死滅を１７Ｅ６が活性化することは除外できないが、もし、そうであっても、実際に用いた同質遺伝子的イソタイプをマッチさせた対照抗体によってもずっと活性化は弱い。
【００６０】
このように、おそらく１７Ｅ６は、αｖインテグリンの機能を損なうことによって作用すると思われる。１７Ｅ６が阻止し、αｖが関与すると思われる機能には、細胞接着、可溶性マトリックス組成物との相互作用（Seftor et al., 1992）、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターネットワークの調整（Gehlsen et al., 1992; de Boer et al., 1993; Preissner, 1991）、細胞運動の刺激（Seftor et al., 1992; Gehlsen et al., 1992）または受容体インターナリゼーションの影響（Wickham et al., 1993; Panetti and McKeown Longo, 1993a; Panetti and McKeown Longo, 1993b）などが含まれるが、その他にもさらなる実験作業が必要である。
【００６１】
１７Ｅ６のαｖβ３に対する阻止効果には標的の二量体化が求められるが、αｖｂｂ１およびαｖβ５ではその必要がない。一価および二価の１７Ｅ６抗体フラグメントは、ＥＬＩＳＡにおけるαｖβ３インテグリンの結合およびαｖβ１およびαｖβ５の介在する細胞接着の阻止において同様に活性であるが、一価フラグメントはαｖβ３に対して本来不活性である。さらに、架橋結合抗体を一価フラグメントに加えると、それらはαｖβ３介在接着を阻止する能力を回復して、古典的阻止帯効果を示す。しかし、架橋結合ＡＰ３がαｖβ３介在接着に影響しないことから、αｖβ３の単純な架橋結合は活性阻止するに充分ではない。ＡＰ３はβ３鎖に結合する（第２Ｂ：ｅ図を参照されたい）。
【００６２】
一価から二価相互作用への変化によって、抗体の標的への親和性が急激に増加する（Lane and Harlow, 1988）。分離αｖβ３についての１７Ｅ６のＥＬＩＳＡ滴定ではこの変化を示すことができないことから、１７Ｅ６の一価および二価エレメントの双方との一価相互反応がこの構成で起きることを示す。同じＥＬＩＳＡ構成を用いるリガンド結合受容体アッセイにおいて、ＥＭＤ６６２０３：ｃＲＧＤｆＶのようなペプチドリガンド類似体と比較して、１７Ｅ６は驚くほど弱い遮断剤である。より具体的には、ｃＲＧＤｆＶは細胞から分離した受容体アッセイに移すことによって２〜３桁の活性増加（ＩＣ50：約１μＭから約１ｎＭに）を得るのに対して、１７Ｅ６は少なくとも３桁の規模で明らかに活性を失って（ＩＣ50：約１００ｎｇ／ｍｌから＞１００μｇ／ｍｌに）、実質的に不活性となる。
【００６３】
この変則性および細胞抗体架橋結合データの関連性は、競合性実験によって解明された。これらは、１７Ｅ６がペプチド性阻止剤とは対照的に直接にリガンド結合部位を妨害していなかったことを示した。直接証明のない状態で、阻止剤がリガンド−受容体相互作用部位の立体的閉塞によって機能すると考えるのは普通である。この見解はインテグリン分野でＲＧＤ含有ペプチドのようなリガンド活性部位類似体（Hynes, 1992）およびビトロネクチンのこの部位の指向性突然変異原性によって起きるリガンド不活化（Cherney et al., 1993）によって促進される。本発明者らのデータは有効な阻害抗体１７Ｅ６に関してはそうではないことを強く示す。要約すると、αｖβ３インテグリンにおいて、ａ）リガンド類似ペプチドは相互およびリガンド自体を競合する、ｂ）リガンドはペプチドを競合する、ｃ）ペプチドおよびリガンドのいずれも１７Ｅ６結合を競合しない、ｄ）１７Ｅ６はリガンドおよびリガンド類似体結合のいずれをも競合しない、ｅ）１７Ｅ６はそれ自体および他のαｖ結合抗体によって充分に競合できる。
【００６４】
１７Ｅ６はαｖβ３へのリガンド結合に関してはきわめて弱い競合体である。他方、ビトロネクチンおよびＲＧＤに基づく活性部位プローブは受容体において相互に強く競合する。そして、他の抗体は１７Ｅ６を強く競合する。このように、１７Ｅ６はアロステリックインヒビターとして作用する。架橋結合実験によって、１７Ｅ６が阻止できる前にαｖβ３は二量体化されねばならないことが明らかになる。αｖβ１およびαｖβ５はその必要がない。この発見は、１７Ｅ６がインテグリン誘導シグナルトランスダクション経路の操作に関わる新規の機序によって機能し、単にインテグリン−リガンド相互作用を拮抗するのではないことを明らかにした。
【００６５】
αｖβ３リガンドは活性型ではホモポリマーであり、モノマーでは不活性である（Preissner, KT., 1991; Stockmann, A., et al., 1993）ことから、基質によるインテグリンの多量体化がその機能に必須であるかもしれない。実際、リガンドによる増殖因子受容体ファミリーの受容体チロシンキナーゼの二量体化は、シグナルトランスダクション開始における重要な鍵である（Dougall WC., et al., 1994）。基質ポリマーの立体化学が膜中のインテグリンの配向およびシグナル複合体の形成指令にきわめて重要になることは自明である。実際、細胞接着のための多量体ビトロネクチンの生物学的「論理」は、この制約から生じるかもしれない。ビトロネクチン多量体は３〜１６ユニットの大きさ（Stockmann, A., et al., 1993）で、細胞表面に規則正しく並んだインテグリンおよび多量体相互作用による必要な強化親和性を生ずることが予知できる。単量体ビトロネクチン−αｖβ３相互作用のそれぞれの寿命は短く、親和性も低いが、一方、膜面上の非結合インテグリンの回転は速く、抗体親和性および作用率も高い。このように、細胞表面で一つのインテグリンと結合した二量体の抗体が回転中に解離したインテグリンを捕獲して、リガンド結合不能の構造体中に捉えると予想できる。これによって、αｖβ３の分子列とビトロネクチンの連結が次第に弱まり、分子付着テープが剥がれるようにして細胞−ビトロネクチン相互作用が不安定になる。これは、二価結合を可能にするに必要な配向に受容体が回転できない（ＥＬＩＳＡデータによって裏付けられる）受容体アッセイにおける１７Ｅ６の機能の欠如および細胞アッセイにおけるその効率性を説明し、細胞アッセイにおいて観察された活性部位競合の不必要性を説明し、さらにαｖβ３介在細胞接着の阻止におけるＦ（ａｂ´）フラグメントの非効率性を説明する。
【００６６】
また、αｖβ５およびαｖβ１（およびαｖβ６、αｖβ８およびα５β１）が重複するリガンドスペクトルをαｖβ３と共有することから、ＲＴＫ増殖因子受容体ファミリーにおける受容体のヘテロ二量体化による交差調節（Dougall, WC., et al., 1994）と全く同じようにこれらが相互の機能を交差調節することが当然考えられる。例えば、ビトロネクチンに対してαｖβ３よりも親和性の高いαｖβ５は、この基質の各多量体上のαｖβ３結合部位を競合することができた。すなわち、シグナルを発して細胞接着保持するのに必要なαｖβ３のホモ二量体を活動停止させて、αｖβ５−αｖβ３ヘテロ二量体で置き換える。他のαｖインテグリンは、同様のタイプの交差調節によって機能するかもしれないが、これらの仮説を確認するための確かなデータに欠けている。
【００６７】
結論として、ヒトαｖインテグリン鎖に対する一組のモノクローナル抗体を開発した。その一つの１７Ｅ６は、インビボでαｖ介在プロセスを阻止し、かつ逆転する。興味深いことに、これはまた、ヌードマウスにおいてαｖ依存性黒色腫の発達を阻止する。これは、αｖインテグリンが腫瘍治療のために有効である可能性を示唆している。本発明出願の準備中に、Lehmannら（Lehmann et al., 1994）は１７Ｅ６と関連するいくつかの性質を有するαｖ特異性抗体に関して報告した。これがまたαｖ介在相互作用を逆転し、黒色腫発達を妨害することができるかどうかを知ることは興味深い。
治療的および診断的使用
本発明の抗体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、上記および請求項に記載の少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントを活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬物調製物を提供することにある。
【００６８】
通常、本発明の抗体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、抗体（またはそのフラグメント）の投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られる範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００６９】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。本発明の抗体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物において使用することができる。適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００７０】
抗体（またはそのフラグメント）はまた、それらの細胞障害性を支持するためにＩＬ−２のようなサイトカインに公知の方法で抱合させることもできる。
【００７１】
本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠腫および癌腫、さらに循環系の腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【００７２】
診断目的のためには、抗体は、例えば放射線不透過性染料と抱合させるかまたは放射性標識することができる。好ましい標識法は、ロドゲン法である。好ましくは、抗体は診断目的のための一本鎖Ｆｖフラグメントとして投与される。これによってバックグランド差し引きが不要になるような優れた結果が得られる。
。
表１  ＥＬＩＳＡおよびＣＥＬＩＳＡにおけるＭａｂの反応パターン
【００７３】
【表５】
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表２  フローサイトメトリーにおけるモノクローナル抗体反応性の要約
【００７４】
【表６】
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表３  ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス肺定着「実験的転移」アッセイにおける１７Ｅ６ＭａｂによるＭ２１腫瘍巣の発達の阻害
【００７５】
【表７】
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【００７６】
【実施例】
［実施例１］
材料：
動物  抗体産生のためのマウス（雌ＢＡＬＢ／Ｃ、８週令）および腫瘍モデルのためのマウス（「ヌードマウス」、雌ホモ接合体胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ、４〜５週令）はCriffa（スペイン、バルセロナ）からのものを使用した。ヌードマウスは滅菌室でミクロアイソレーターケージ中で維持し、滅菌した餌および水を自由摂取させた。全ての操作は層流フード中で行った。
タンパク質  フィブロネクチン（Ruoslahti et al., 1982）、ビトロネクチン（Yatohgo et al., 1988）を新鮮凍結ヒト血漿から精製し、フィブリノーゲン（Kazal et al., 1963）を全血から精製した。ラミニンはEngelbreth-Holm-Swarmネズミ腫瘍（Paulsson et al., 1987）から精製した。とくに記述がなければ、全ての操作は２０℃で行い、全ての洗浄はカルシウム−マグネシウムを含まないＰＢＳ（「ＰＢＳ」：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）を用いて行った。ＰＢＳ＋＋は、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および１ｍＭ ＣａＣｌ2を添加したＰＢＳである。とくに記述がなければ、化学物質（Merck KGaA、Darmstadt）は、入手可能な最高純粋物を用いた。ｃＲＧＤｆＶおよびｃＲＧＤｆＫのような環状ペプチドは、公知の標準法（例えば、FEBS Let. 291, p. 50-54, 1991）によって合成した。比較化合物として使用する線状ペプチドＧＲＧＤＳＰＫは、市販のものである（例えば、スイスBachem製）。
腫瘍細胞系および培養  American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からＳＷ１１１６、ＨＴ２９ヒト癌腫およびＡ３７５ヒト黒色腫を得た。次のヒト細胞系は研究者らから供与された。Ｍ２１黒色腫、その変異体Ｍ２１−ＬおよびＭ２１−Ｌ４（Cheresh and Spiro, 1987）、Ｍ２１−Ｌ−ＩＩｂ（Kieffer et al., 1991の方法によって調製）、およびＵＣＬＡ−Ｐ３ヒト肺腺癌腫（Cheresh et al., 1989）（Dr. D.A. Cheresh; Scripps）、ＷＭ７９３およびＷＭ１６４黒色腫（Dr. M. Herlyn; Wistar）（Herlyn et al., 1990）、ＮＰ１８、膵臓癌腫（Dr. G. Cappellae, Hospital Sant Pau, Barcelona）。Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫はもとはDr. I. Fidler（Poste et al., 1980）（Dr. S. Alino, University of Valencia）からのものであった。ＥＭＭ３１は、標準組織学的基準によって原発性黒色腫（Jaeggleら、未発表知見）であると同定された腫瘍標本から本発明者らのグループ内で系統樹立した。全ての細胞は３７℃で７．５％ＣＯ2／９２．５％空気中で９０％ＲＰＭＩ１６４０（１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン）中で培養した。また、いずれもマイコプラズマを含まないことが適否試験（Mycotect Ket、ギブコ社製）によって確認された。
抗体  モノクローナル抗体（Ｍａｂ）融合、ＥＬＩＳＡスクリーニング、サブクローニングおよび培養の維持は、とくに記述がない限り、全て標準法（Harlow and Lane, 1988）を用いて行った。
［実施例２］
免疫  αｖβ３に対するＭａｂを、セファロース上に固定化した精製胎盤αｖβ３（２００μｌＰＢＳ中の８０μｌセファロース上に８０μｇのαｖβ３）またはＭ２１生細胞（０．５ｍｌのＰＢＳに１×１０6細胞）を２週間毎に１２週にわたって腹腔内（ｉｐ）注射することによって産生させた。最後の注射の５日後に、ＰＥＧ誘導融合を、Friendly Myeloma（フレンドリー骨髄、Ventrex）を対手として用いて行った。２００ＫＤａ黒色腫関連表面タンパク質に対する抗体は、天然Ｍ２１細胞（０．５ｍｌのＰＢＳ中に１×１０6細胞）で免疫することによって産生した。
スクリーニング  受容体および固定Ｍ２１細胞上のＥＬＩＳＡを用いた。受容体ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Dynatech）を精製αｖβ３で被覆して（１μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液、１６時間、４℃）、ブロックして（１．５％脱脂乳ＰＢＳ溶液、１時間、４℃）、ハイブリドーマ上清液とともにインキューベートした。結合した免疫グロブリンを、ｐ−ニトロフェニル−燐酸塩を基質として用いるアルカリホスファターゼ抱合抗マウスＩｇ（Dako）を用いて検出した。細胞ＥＬＩＳＡのために、Ｍ２１またはＭ２１−Ｌ、Ｍ２１−ＬＩＩｂまたはＵＣＬＡＰ−３細胞を９６ウェル組織培養プレート上に固定して（４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液、１５分間、２０℃）、ブロック（３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液、１時間、４℃）した後、ハイブリドーマ上清とともにインキュベートして、受容体ＥＬＩＳＡと同様に検出した。陽性ハイブリドを制限希釈によって３回サブクローニングして、ＲＰＭＩ培地に適応させた。免疫グロブリンイソタイプを、サブクラス特異性重鎖抗体（Zymed）または軽鎖抗体（Promega）を用いて決定した。
【００７７】
研究に用いられた他のネズミＭａｂは、次のように研究者らから供与を受けた。αｖβ３に対するＬＭ６０９およびαｖに対するＬＭ１４２（Cheresh and Spiro, 1987）（Dr. D.A. Cheresh; Scripps）、β１インテグリンに対するＰ４Ｃ１０（Carter et al., 1990）（Telios）およびαｖβ５インテグリン複合体に対するＰ５Ｈ９（Wayner et al., 1991）（Dr. E. Wayner, University of Minnesota）、αＩＩｂβ３複合体に対するＣＰ８（Dr. Ruggieri; Scripps）、β３鎖に対するＡＰ３（Furihata et al., 1987）（ＡＴＣＣ）、黒色腫細胞表面プロテオグリカンに対する９．２．２７（Harel et al., 1990）（Dr. R. Reisfeld; Scripps）およびガングリオシドＧＤ２に対する１４．１８Ｇ２ａ（Mujoo et al., 1989）。
［実施例３］
抗体精製および大量培養  大規模精製のために、回転瓶中で増殖させた対数増殖期培養物から抗体上清を集めた。プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）上で精製した抗体を、ＰＢＳに対して透析してから、濾過滅菌（０．４５μｍ）して、−７０℃で保存した（Harlow and Lane, 1988）。精製した抗体を、Kurimover-IIカラム（Kurita-Vater、東京）上を通すことによって内毒素を除いた。これによって、内毒素レベルは、リトマスアッセイ（Melvaer and Fystro, 1982）において＞２５０ＩＵ内毒素／ｍｇ抗体から＜０．２ＩＵ／ｍｇに低下した。１７Ｅ６のＦ（ａｂ´）2およびＦ（ａｂ´）フラグメント（ネズミＩｇＧ１）をペプシン切断の標準法およびプロテインＡカラム（ファルマシア）上での分離、それに続くパパイン切断およびゲル濾過による分離（Harlow and Lane, 1988）によって調製した。
αｖβ３およびαＩＩｂβ３インテグリン精製
αｖβ３はヒト胎盤から調製した（Smith and Cheresh, 1988）。満期胎盤を細切して、約２容量の冷緩衝液Ａ（０．０５％ｗ／ｖジギトニン、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）で洗浄して、次いで濾過した。保持された物質を約４容量の氷冷緩衝液Ｂ（１００ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド［ＯＧ］、１ｍＭ ＣａＣｌ2、２ｍＭ ＰＭＳＦ、ＰＢＳ溶液）中で抽出して、遠心分離した（１２０００ｇｍａｘ、４５分間、４℃）。上清をＬＭ６０９抗体カラムに再循環させた（１６時間、４℃）。緩衝液Ｃ（０．１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ溶液、約１０カラム容量）および緩衝液Ｄ（０．１％ＮＰ−４０、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、約１０カラム容量）で洗浄後、結合した物質を緩衝液Ｅ（ｐＨ３．１に調整した緩衝液Ｄ）で抽出した。溶出された液を３Ｍトリス（ｐＨ８．８）で中和して、緩衝液Ｃで透析して、AquacideII（Calbiochem）を用いて約１０倍に濃縮した。精製受容体を−７０℃で保存した。
【００７８】
αＩＩｂβ３をヒト血小板から調製した（Pytela et al., 1986）。古くなった血小板濃縮物を１容量のTyrodes緩衝液と混合して、ペレット化（１２００ｇｍａｘ）して、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＯＧ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１μＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）でペレットを抽出した（１時間、２０℃）。遠心分離（３２０００ｇｍａｘ、３０分、４℃）の後、上清をＧＲＧＤＳＰＫ抱合したＣＬ−４Ｂセファロースカラム中で再循環させた（１６時間、４℃）。カラムを溶解緩衝液（約１０カラム容量）洗浄して、ＧＲＧＤＳＰＫ（３ｍｇ／ｍｌの９０％溶解緩衝液溶液、１０％ＤＭＳＯ）で溶出した。ピーク画分を約５倍に濃縮して、修飾溶解緩衝液（ＯＧの代わりに０．１％ＮＰ−４０を含む）に対して透析して、−７０℃で保存した。インテグリン調製物は、αおよびβ鎖特異性モノクローナル抗体を用いる抗インテグリンＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、純度約９５％と評価された。
［実施例４］
表面標識および免疫的特徴づけ：
細胞表面ビオチン化および抽出  対数増殖期の細胞をＥＤＴＡで集めて、洗浄して、ＰＢＳ（１ｍｌ）に懸濁した５×１０6個の細胞を上下回転子上でビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）を用いて表面標識（２時間２０℃）して、洗浄して、５×１０6細胞／ｍｌを抽出緩衝液（１００ｍＭ ＯＧ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および１ｍＭ ＰＭＳＦＰＢＳ溶液）中で２０℃で１時間溶解した。遠心分離（１２０００ｇ、２０分）の後、上清を免疫沈殿に用いた。
免疫沈殿  ビオチン化した細胞抽出物を、Affigel−１０ビーズ（Biorad）にカップリングしたまたはプロテイン−Ｇセファロース（ファルマシア）と結合した精製抗インテグリンＭａｂを用いて免疫沈殿させた。１０ｍｇのカップリングＭａｂを、ビオチン化細胞抽出物に相当する５Ｅ６細胞とともに一晩４℃でインキューベートした。洗浄したビーズを、非還元ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸して、遠心分離して、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ニトロセルロースへの電気泳動移動（Towbin et al., 1979）の後、バンドをヤギ抗ビオチンアルカリホスファターゼ抱合体（Dako）を用い、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ(Biorad）を基質として用いて可視化した。
フローサイトメトリー  細胞をＥＤＴＡで集めて、洗浄して、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中の１０6個の細胞をＭａｂ（１０μｇ／ｍｌ、２０分、４℃）とともにインキューベートした。洗浄して、ヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（Becton Dickinson）を用いて標識（２０分間、４℃）した後、細胞をフローサイトメトリー分析（EPICS Profile II、Coulter）前にヨウ化プロピジウムとともにインキューベートした。生細胞を側部および前部スキャター上の適当なゲートによって選択した。フルオレセインを４８８ｎｍでアルゴンイオン照射を用いて励起させて、発した蛍光（５２５ｎｍ）を記録した。ある実験においては、Ｍ２１−Ｌ細胞を簡単な固定および透過性化工程（７０％エタノール、５分×、−２０℃）後に染色した。
補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）  Ｍ２１細胞（１０、０００個）を９６ウェルプレート中に５０μｌの完全培地および２０μｌの抗体とともにプレートした。ウサギ血清（５０μｌ、１：５、Behring）を補体源として加えて、プレートをインキュベートした（３７℃、６０分）。分解をＭＴＴ法（Mosmann, 1983）によって定量した。分解の割合（％）を、１％ツイーン２０を含むウェルを１００％分解対照として、抗体を含まないウェルを０％分解対照として用いて算出した。「実施例５］
細胞増殖、生存率および活性化
増殖アッセイ：長期の抗体の影響を試験するために、１０6個の細胞をＭａｂ（７０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ、１時間、２０℃）の存在下で上下回転子上でのインキューベートして、洗浄して、次いで再懸濁して、さらにＲＰＭＩ培地中で培養した。増殖および生存率をトリパンブルー染料排除試験によって推定した。活性化を、上記のようにしてＭＴＴアッセイによって測定して、細胞数を細胞カウンター（Coulter Electronics）を用いて毎日計数した。
【００７９】
付着性の黒色腫細胞を分離させた（０．０５％トリプシン／０．２％ＥＤＴＡ）。洗浄した細胞を９６ウェル平底ミクロテストプレート中に接種して（１×１０4細胞／ウェル）、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中で連続希釈した抗体の非存在（対照）または存在下で培養した。４８時間後に、細胞を１８時間パルス標識して（１８．５ｋＢｅｑ［3Ｈ］−チミジン／ウェル）、集めた。取り込まれた放射活性を測定して、カウント／分で表した。
［実施例６］
抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ  ＢＡＬＢ／Ｃ小グリア細胞の調製ならびにＡＤＣＣおよび抗体エフェクター細胞介在細胞増殖阻止（ＡＥＣＭ）のための条件は本質的には記述のようにして行った（Sutter et al., 1991）。Ｍ２１細胞を［3Ｈ］−チミジン（１８ｋＢｑ／４×１０3細胞／ウェル）を用いて１８時間パルス標識して、抗体の存在下で９６ウェルプレート上で２００μｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳ（１０％）中のＢＡＬＢ／Ｃ小グリア（５×１０4細胞／ウェル）とともにインキューベートした。４８時間後、標識細胞の核区分内に保持された［3Ｈ］標識を測定した。Ｍａｂ依存性細胞障害を式：［（実験ｃｃｐｍ−対照ｃｃｐｍ）／最大ｃｃｐｍ−対照ｃｃｐｍ）］×１００を用いて算出した。
［実施例７］
抗体およびエフェクター細胞依存性細胞増殖阻止（ＡＥＣＭ）  ＡＤＣＣと同様であるが、パルス標識細胞の代わりに新鮮継代非標識Ｍ２１細胞を用いた。２４時間後に、エフェクター標的細胞共培養物を「3Ｈ］−チミジン（１８ｋＢｑ／ウェル）を用いてさらに２４時間パルス標識して、取り込まれた核［3Ｈ］ラベルを測定した。
細胞接着アッセイ  既述の方法（Goodman et al., 1991）でヘキソースアミニダーゼ活性（Landegren, 1984）を用いて接着細胞を検出した。希釈および細胞懸濁液を接着緩衝液（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で行った。マトリックスタンパク質を９６または４８ウェルプレート上に被覆して、ウェルをＢＳＡでブロックして、連続希釈Ｍａｂをウェルに加えて、次いで細胞（２．５×１０4〜５×１０4）を加えた。３７℃で１時間保持後、非接着細胞を洗浄除去して、平行して得た標準曲線から接着細胞を計数した。接着の阻害はＭａｂを含まないウェルを参照に用いて算出した。一般に、加えた細胞の７０％以上が１時間でビトロネクチンに接着していた。ＢＳＡのみで被覆したウェルの細胞接着は、常に特異的接着細胞の５％以下であった。
表面架橋結合アッセイ  細胞接着アッセイと同様に、連続希釈した１７Ｅ６またはそのＦ（ａｂ´）2またはＦ（ａｂ´）フラグメントおよび架橋結合作用剤としての漸増量のヤギ抗マウスＦ（ａｂ´）の存在下で、細胞をマトリックス被覆プレートに接着させた。洗浄および接着細胞の検出は、ふつうの細胞接着アッセイと同様にして行った。
接着逆転アッセイ  細胞吸着アッセイと同様にして被覆ブロックされたウェルに細胞を接種して、３７℃でインキューベートした。伸展増殖後（６０〜７５分）、連続希釈したＭａｂを加えて、細胞をインキュベーターに戻した。別に、抗体添加前に細胞を２４時間吸着させた。抗体の存在下で２〜３時間保持した後、上清を丁寧に除去して、新鮮な、予め加温した接着緩衝液によって５回置き換えて、最終希釈で＞１×１０5とした。
インビボ腫瘍発達  対数増殖期の腫瘍細胞をＥＤＴＡを用いて集めて、洗浄して、トリパンブルー染料排除法によって生存率を調べた。生存率は９６〜９９％であった。原発性腫瘍の増殖のために、細胞（０．５×１０6細胞の０．２ｍｌのＰＢＳ＋＋懸濁液）をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖をカリパスを用いて腫瘍直径を測定して行い、腫瘍容量を扁長楕円のための次の近似計算式を用いて算出した。
【００８０】
容量＝［（ａ・ｂ2）／２］
式中、ａは腫瘍の最長軸であり、ｂは最短軸である。最低８動物を１グループ当たり使用した。
【００８１】
実験的肺転移のために、細胞を集めて（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ）、ヌードマウスの尾静脈中に注射した（０．５×１０6細胞の０．２ｍｌのＰＢＳ＋＋懸濁液）。７週間後、動物を殺して、肺を除去して、Bouinの溶液中で固定して、肺表面の腫瘍巣を数えた。抗体処理のために、集めて洗浄した細胞を、Ｍａｂを含まない精製内毒素（７０μｇ／１０6細胞、０．５ｍｌ ＰＢＳ＋＋）とともに２０℃で３０分間上下回転子中でインキューベートして、０．２ｍｌのＰＢＳ中に０．５×１０6細胞になるように希釈して、注射した。細胞生存率をトリパンブルー染料排除法によって注射スケジュール完了の前と後に評価したが、有意の差は見出せなかった（注射前の生存率＝注射後の生存率±５％）。腫瘍阻害データは両側検定ステューデントＴ試験を用いて評価した。
［実施例８］
分子生物学的方法：
とくに記述がなければ、全ての分子生物学的な方法技術は以前に詳記されたものを用いた（Sambrook et al., 1989）。
ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製  全ＲＮＡをチオシアン酸グアニジウム抽出によって１７細胞から分離し、ＲＮＡを塩化セシウム密度勾配超遠心によって分離した（Chirgwin et al., 1979）。第一鎖ｃＤＮＡを市販のキット（ファルマシア）を用いて合成した。合成は１５μｌの容量で５μｇのＲＮＡを用いて３０℃で１時間行った。第一鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅に直接用いた。
ＰＣＲ増幅  マウス軽鎖可変部および重鎖可変部をネズミＩｇリーダー配列をハイブリダイズするように作製された冗長の半縮退したＰＣＲプライマーを用いて増幅した（Jones and Bendig, 1991）。６１個のオリゴヌクレオチドの混合物を重鎖可変部のための５´プライマーとして用い、４０５個のオリゴヌクレオチドをカッパ鎖可変部のための５´プライマーとして用いた。３´プライマーは、定常部においてアニーリングするように作製され、特異的ＩｇＧ１およびカッパマウスプライマーが用いられた。
【００８２】
増幅のために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとともに、２５μｌ反応混合液（１μｌのｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド、２５０ｎＭの適当な５´および３´プライマー混合物、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2（軽鎖用）、２ｍＭＭｇＣｌ2（重鎖用）および１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Cetus）を含む）をミネラル油で覆って、開始６０℃から５５℃のアニーリング温度の熱処理をした。３０サイクル（１分×５５℃、１．５分×７２℃、４５秒×９２℃）の後、ＰＣＲ反応物の１０分の１を１％アガロースＴＡＥゲル電気泳動にかけて、得られるＰＣＲ産物を可視化するために臭化エチジウム染色した。
分子クローニングおよび配列決定  １μｌの各ＰＣＲ産物を、ＴＡベクター（Invitorogen、サンジエゴ）に連結させた。重鎖および軽鎖可変部のための二つのＤＮＡ連結反応は、コンピテント大腸菌（E. coli）株ＴＧ１細胞をヒートショックによって形質転換して、二つのライブラリーが作られた。すなわち、一つは１７Ｅ６Ｍａｂの軽鎖可変部であり、もう一つは１７Ｅ６Ｍａｂの重鎖可変部であった。ＬＢプレート上のコロニーを１００μｌ／ｍｌのカルベニシリンを用いて選択して、さらなる分析のために取り出した。陽性コロニーをＰＣＲスクリーニングまたはプラスミド消化（Gussow and Clackson, 1989）を用いて検出した。二本鎖プラスミドＤＮＡを形質転換体から配列決定によって調製した（Wizard調製物、Promega Coorp.）。ジオキシヌクレオチド鎖終結法を用いる熱循環配列決定をＴａｑポリメラーゼを用いて行った。ＴＡベクターに相補的な上流および下流配列決定プライマーを用いた。
インテグリンリガンド結合および競合アッセイ  リガンドのビオチン化：ＰＢＳ中のリガンドを５倍濃縮連結反応緩衝液（最終濃度：１ｍｇ／ｍｌタンパク質、１ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．２）によって最終容量１ｍｌに希釈した。新鮮調製したＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン溶液（１００μｌ、１ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液）を混合しながら加えて、反応を上下回転しながら２０℃で２時間続けた。徹底した透析（４℃、ＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ3）の後、タンパク質濃度を決定して、ビオチン化リガンドを４℃で保存して、２１日以内に使用した。ビオチン化ペプチドｃＲＧＤｆＫ（環状-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys＝Ｎ−ビオチン−アミノヘキサノン酸）の合成は従来技術に記述の方法または標準法にしたがって達成することができる。
直接競合アッセイ  アッセイは既知の方法（Smith et al., 1990）を部分修飾した方法に基づいて行った。αｖβ３を緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０μＭ ＭｎＣｌ2、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）中で１μｇ／ｍｌに希釈して、１００ｍｌを４℃で一晩９６ウェルのマイクロタイタープレートに用いた。プレートを緩衝液Ｂ（３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０μＭ ＭｎＣｌ2、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）を用いて１回洗浄して、同緩衝液中で２０℃で２時間インキューベートした。
【００８３】
緩衝液Ｃ（ＢＳＡを０．１％（ｗ／ｖ）濃度で含む緩衝液Ｂ）を用いてリンスした後、ビオチン化リガンド（最終濃度１μｇ／ｍｌ）および連続希釈試験ペプチドまたはタンパク質を含む緩衝液Ｃを加えた。インキュベーション（３０℃、３時間）の後、結合しなかったリガンドを緩衝液Ｃで３回リンスしてプレートから洗浄除去して、抗ビオチンアルカリフォスファターゼ抱合抗体（１：１００００緩衝液Ｃ溶液）（シグマ）とともにさらに１時間インキュベーションを続けた。次いでＰＢＳ洗浄して、基質としてＮＢＴ−ＢＣＩＰ（Biorad）を用いて結合した抗体を検出した。ＥＣＭ分子および抗体のビオチン化を常に行って、そのようなアッセイ構成において用いた。
【００８４】
アッセイは常に３回または４回反復して行って、非荷重シグモイド曲線にそったＩＣ50が得られるまで少なくとも３回繰り返した。結果を外的対照ペプチドに対して一般化して、アッセイ間比較を可能にした。線状ＲＧＤペプチドのＧＲＧＤＳＰＫおよび環状ペプチドｃＲＧＤｆＶを常に外的標準物として滴定に含んだ。対照ウェルも同様にして、ブロックされたかインテグリンを含まないウェルへのビオチン化リガンドの結合およびリガンド無しのインテグリンへの抗ビオチン抗体の阻止されているがインテグリンを含まないウェルへの結合および抗ビオチン抗体のリガンドを含まなインテグリンへの結合を測定した。対照ウェルからのシグナルは、特異的リガンド結合の＜７．５％だった。
前ブロック競合アッセイ  受容体で被覆して直接競合アッセイのようにブロックしたプレートを２倍濃縮抗体、マトリックス分子または競合ペプチドとともに予備インキューベート（５０μｌ緩衝液Ｃ中、１時間、３０℃）して、ビオチン化プローブリガンドまたは抗体（５０μｌ、緩衝液Ｃ中）を加え、インキュベーションを続けて（３時間、３０℃）、洗浄および結合ビオチンの検出を直接競合アッセイと同様にして行った。
［配列表］
（１）一般的情報
（ｉ）出願者
（Ａ）名称：メルク・パテントＧｍｂＨ
（Ｂ）町名：フランクフルター・ストリート２５０
（Ｃ）都市：ダルムシュタット
（Ｅ）国名：ドイツ
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６４２７１
（Ｇ）電話：４９−６１５１−７２７０２２
（Ｈ）テレファックス：４９−６１５１−７２７１９１
（ｉｉ）発明の名称：抗αｖインテグリンモノクローナル抗体
（ｉｉｉ）配列の数：１７
（ｉｖ）コンピュータ解読型
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン#1.3（ＥＰＯ）
（２）配列ＩＤ番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｖ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：マウス
（Ｂ）系：ＢＡＬＢ／Ｃ
（Ｖｉｉ）直接材料
（Ｂ）クローン：７２−１７Ｅ６
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１..１２９
（Ｄ）他の情報：／機能＝「リーダーおよびＦＲ−１配列（リーダー：１−６０、ＦＲ−１：６１−１２９）」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１３０..１６２
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−１配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１６３..２０７
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−２配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２０８..２２８
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−２配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２２９..３２４
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−３配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３２５..３５１
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−３配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３５２..３８１
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−４配列」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１：
【００８５】
【表８】
0003898245.tif 000009
（２）配列ＩＤ番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号２：
【００８６】
【表９】
0003898245.tif 000010
（２）配列ＩＤ番号３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号３：
【００８７】
【表１０】
0003898245.tif 000011
（２）配列ＩＤ番号４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号４：
【００８８】
【表１１】
0003898245.tif 000012
（２）配列ＩＤ番号５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号５：
【００８９】
【表１２】
0003898245.tif 000013
（２）配列ＩＤ番号６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号６：
【００９０】
【表１３】
0003898245.tif 000014
（２）配列ＩＤ番号７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号７：
【００９１】
【表１４】
0003898245.tif 000015
（２）配列ＩＤ番号８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号８：
【００９２】
【表１５】
0003898245.tif 000016
（２）配列ＩＤ番号９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４１１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｖ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：マウス
（Ｂ）系：ＢＡＬＢ／Ｃ
（Ｖｉｉ）直接材料
（Ｂ）クローン：２７２−１７Ｅ６
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１..５７
（Ｄ）他の情報：／機能＝「リーダー配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：５８..１４７
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−１配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１４８..１６２
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−１配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１６３..２０４
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−２配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２０５..２５５
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−２配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２５６..３５１
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−３配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３５２..３７８
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＣＤＲ−３配列」
（ｉｘ）性質
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３７９..４１１
（Ｄ）他の情報：／機能＝「ＦＲ−４配列」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号９：
【００９３】
【表１６】
0003898245.tif 000017
（２）配列ＩＤ番号１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１０：
【００９４】
【表１７】
0003898245.tif 000018
（２）配列ＩＤ番号１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１１：
【００９５】
【表１８】
0003898245.tif 000019
（２）配列ＩＤ番号１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１２：
【００９６】
【表１９】
0003898245.tif 000020
（２）配列ＩＤ番号１３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１３：
【００９７】
【表２０】
0003898245.tif 000021
（２）配列ＩＤ番号１４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１４：
【００９８】
【表２１】
0003898245.tif 000022
（２）配列ＩＤ番号１５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１５：
【００９９】
【表２２】
0003898245.tif 000023
（２）配列ＩＤ番号１６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１６：
【０１００】
【表２３】
0003898245.tif 000024
（２）配列ＩＤ番号１７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１７：
【０１０１】
【表２４】
0003898245.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｍ２１およびＭ２１Ｌヒト黒色腫細胞に対するアルファ−Ｖグループ抗体およびコントロールの蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す図。白抜きのピークは二次層抗体黒塗りピークは特定した一次および二次抗体を合わせた強度を表す。縦軸はチャネル当たりの細胞を示し、横軸はそのチャネル中の対数蛍光強度を示す。
【図２】アルファＶグループ抗体は同様のタンパク質を免疫沈殿させる結果を示す図。分子量マーカーをレーンａに泳動させて、質量をＫＤａで左方に示す。αｖ、β１、β３、β５バンドの位置を示す。
【図３】１７Ｅ６はビトロネクチンに対する最初の細胞接着を阻害する結果を示す図。横軸：細胞接着の対照に対する割合（％）。
【図４】１７Ｅ６はαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの双方によって媒介される接着を妨害する結果を示す図。縦軸：接着細胞（％）。横軸：左図−Ｍａｂ（μｇ／ｍｌ）、右図−腹水希釈（１／ｘ）。
【図５】１７Ｅ６はビトロネクチンへの接着を妨害するが他のマトリックス物質への接着は妨害しない結果を示す図。横軸：Ｐ４Ｃ１０希釈（１／ｘ）（上軸）、Ｍａｂ（μｇ／ｍｌ）（下軸）。縦軸：結合細胞（％）。
【図６】１７Ｅ６は樹立細胞−ビトロネクチン接触を逆動させる結果を示す図。
【図７】ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＭ２１ヒト黒色腫の発達はαｖインテグリンによって調節される結果を示す図でありＡおよびＢは１７Ｅ６の皮下Ｍ２１発達に及ぼす影響を示し、縦軸は腫瘍量（ｍｍ3）、横軸は注射後日数であり、ＣはＭ２１実験的転移へのαｖの影響を示し、横棒は各群の平均腫瘍数を示し、縦軸は転移腫数／肺を、横軸は注射後日数である。
【図８】１７Ｅ６は細胞障害性ではない結果を示す図であり、Ａは１７Ｅ６のＭ２１細胞増殖に及ぼす影響を、縦軸が細胞数、横軸が日数で示し、Ｂは小グリア細胞によるＭ２１細胞の１７Ｅ６依存性溶解を縦軸が細胞障害性（％）、横軸で抗体濃度（Ｍ）を示し、Ｃは小グリア細胞によるＭ２１細胞の１７依存性細胞増殖阻止を、縦軸で［Ｈ3］−チミジン取り込み（ｃｐｍ×１０-3）、横軸で抗体濃度（Ｍ）により示す。
【図９】１７Ｅ６はＭ２１細胞によるＤＮＡ合成に影響を及ぼさない結果を示す図であり、縦軸は［Ｈ3］−チミジン取り込み（ｃｐｍ×１０-3）、横軸はＭａｂ濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【図１０】１７Ｅ６およびフラグメントの精製αｖβ３上のＥＬＩＳＡを示す図で、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）、横軸は抗体（ｌｏｇ10μｇ／ｍｌ）である。
【図１１】αｖβ１およびαｖβ５によって媒介された細胞接着は１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）によって阻止されるが、αｖβ３の媒介による接着は阻害されなかった結果を示す図。縦軸は％最大細胞接着、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【図１２】ビトロネクチンへのＭ２１接着は１７Ｅ６Ｆ（ａｂ´）を架橋結合することによって阻止される結果を示す図であり、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）、横軸はヤギ抗マウス抗体濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【図１３】直接競合アッセイにおいてリガンド活性部位類似体とビトロネクチンは互いにαｖβ３との結合を競合する結果を示す図であり、縦軸は結合したリガンド（％）、横軸はペプチド／ＶＮ（ｌｏｇ［（μＭ］）である。
【図１４】直接競合アッセイにおいて１７Ｅ６はαｖβ３への結合をビトロネクチンと競合しない結果を示す図であり、縦軸は結合したＶＮ（％）、横軸は［Ｍａｂ］μｇ／ｍｌ、［ｃＲＧＤ］μＭである。
【図１５】阻止前競合アッセイにおいてリガンドおよび活性部位類似体はαｖβ３への結合を抗体と競合しない結果を示す図であり、縦軸は結合したプローブ抗体（％）、横軸（左および右側）はリガンド濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【図１６】阻止前競合アッセイにおいて抗体はαｖβ３への結合を相互に競合する結果を示す図で、縦軸は結合したプローブ抗体（％）、横軸（左および右側）は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【図１７】Ｍａｂ１７Ｅ６可変（Ｆｖ）部のｃＤＮＡ配列を示す図であり、（ａ）は軽鎖ＶＬ１７Ｅ６であり、（ｂ）は重鎖ＶＨ１７Ｅ６である。
【図１８】Ｍａｂ１７Ｅ６可変（Ｆｖ）部のｃＤＮＡ配列を示す図であり、（ａ）は軽鎖ＶＬ１７Ｅ６であり、（ｂ）は重鎖ＶＨ１７Ｅ６である。
【図１９】クローニングプロセスの模式的説明図である。
【図１】
0003898245.tif 000026
【図２】
0003898245.tif 000027
【図３】
0003898245.tif 000028
【図４】
0003898245.tif 000029
【図５】
0003898245.tif 000030
【図６】
0003898245.tif 000031
【図７】
0003898245.tif 000032
【図８】
0003898245.tif 000033
【図９】
0003898245.tif 000034
【図１０】
0003898245.tif 000035
【図１１】
0003898245.tif 000036
【図１２】
0003898245.tif 000037
【図１３】
0003898245.tif 000038
【図１４】
0003898245.tif 000039
【図１５】
0003898245.tif 000040
【図１６】
0003898245.tif 000041
【図１７】
0003898245.tif 000042
【図１８】
0003898245.tif 000043
【図１９】
0003898245.tif 000044