(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４４５アミノ酸からなるＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする、単離されたＤＮＡ分子であって、前記ＮＰＹ−Ｙ５受容体は、配列番号４もしくは配列番号６に示すアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を含む前記アミノ酸配列の変異体からなる、前記分子。
【請求項２】
前記ＮＰＹ−Ｙ５受容体が、配列番号４または配列番号６に示すアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、配列番号１のヌクレオチド６２９１から７６２５に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記ＤＮＡ分子。
【請求項５】
ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、配列番号３のヌクレオチド６３から１３９７に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記ＤＮＡ分子。
【請求項６】
ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、配列番号５のヌクレオチド１１５から１４４９に示す配列に一致するヌクレオチド配列からなる、前記ＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むプラスミドまたは発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が哺乳動物細胞、細菌細胞または昆虫Ｓｆ９細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または昆虫Ｓｆ９細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が細胞表面にＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
４４５アミノ酸から構成され、配列番号４もしくは配列番号６に示すアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を含む前記アミノ酸配列の変異体からなる、純粋な形態のＮＰＹ−Ｙ５受容体。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で形質転換された非ヒト動物。
【請求項１４】
ＮＰＹ−Ｙ５受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する方法であって、請求項１２に記載のＮＰＹ−Ｙ５受容体または請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換され、そして該分子を発現する細胞を、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の活性化を可能とする条件下で被験作用物質に接触させる工程、及びＮＰＹ−Ｙ５受容体活性の増大または減少を検出する工程を包含する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。さらに、本発明は組換え技術を用いたニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体の生産における上記分子の使用、およびニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングし、試験する方法に関する。
発展した豊かな国においては、肥満の蔓延は驚くほどである。肥満は社会的に不利であるばかりでなく、いまや罹病率および死亡率に大きく寄与している。腹部における脂肪沈積は、11型糖尿病および心臓血管性疾患の危険と関連して特に問題である。しかし最近まで、食欲、エネルギー消費および肥満をコントロールする分子的作用機序は驚くほど誤って理解されてきた。
肥満は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧症、脂血症、および冠状動脈性心臓疾患と関連していることは周知であり、またそれほど明白でないが変形性関節症等の疾患および種々の悪性疾患と関連を有する。肥満はまた、運動性の低下および生活の質の低下を通じて重要な問題を引き起こす。単一遺伝子の突然変異によって決定される齧歯動物の肥満の７つの形が同定されている。すなわち、マウスにおけるイエロー[Ay]、脂肪の多い（adipose）[Ad]、糖尿病[db]、太った[fat]、丸々と太った（tubby）[tub]および肥満[ob]、ならびにラットにおける脂肪質[fa]である。これらの突然変異によって引き起こされる肥満表現型は、発症年齢、重篤度およびインスリン依存性の程度において異なる。肥満したヒトにおいても類似の表現型が見られる。最近、これらの突然変異のいくつかについて分子的基礎が解明された。これらのうち、[ob]遺伝子産物である「レプチン（leptin）」は、最大の関心を呼び起こした。しかし、エネルギーバランスおよび身体の脂肪分布の調節には他の多くの因子もまた関与している。４つの因子が重要な役割を有している可能性が高いと思われる。その因子とは、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）／ＡＣＴＨ／グルココルチコイド、インスリンおよびガラニン（galanin）である。特にＮＹＰおよびその受容体は食欲の調節、およびそれに関連して肥満に重要な役割を果たす。
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）は、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）と共に１つのファミリー（膵臓ポリペプチドファミリーと呼ばれる）を形成する。これらのポリペプチドは全て３６個のアミノ酸から成り、そして共通の三次構造を有する。ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、哺乳動物の神経系に最も豊富に存在するペプチドの１つによって活性化され、そして精神運動活性、中枢内分泌物分泌、不安、生殖への作用、心臓血管系への血管作用性作用、および最も重要なものとして食欲への強力な作用を含めて、多様な範囲の重要な生理学的パラメーターに影響を及ぼす。多数のニューロペプチドおよび古典的神経伝達物質（ノルアドレナリンおよびセロトニンを含む）は、食物摂取挙動を変調する。しかし、ＮＰＹは肥満を引き起こすことができるという点で食物摂取に対する実験的効果において多くの神経伝達物質からきわ立っている。室傍核（paraventricular nucleus）（ＰＶＮ）にＮＰＹを注射すると、用量依存的にラットの食物および飲物摂取挙動を増大させることが示された。ＮＰＹの１回の注射が数時間にわたって食物摂取を数倍増大させることが可能であり、そしてラットが通常は殆ど食物をとらない明期においても、またすでに飽食するまで食べたラットにおいても、効果的である。したがって、ＮＰＹペプチドは食物を剥奪された動物においても飽食した動物においても公知の最も強力な食欲促進物質の１つである。ＰＶＮに繰り返しＮＰＹを注射すると、大量でかつ持続的な食物摂取応答をもたらし、最終的にラットは体脂肪含有量の真の増加を伴う肥満となる。食欲／肥満調節の媒介物としてのＮＰＹの重要性は、obese遺伝子産物であるレプチンがＮＰＹの合成および放出を阻害するというごく最近の報告によってさらに強められる。
室傍核へのＮＰＹの注射は、血漿ＡＣＴＨレベルの迅速でかつ強い上昇を引き起こす。そして、ＮＰＹに誘導されるＡＣＴＨ分泌は副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）によって媒介されるという明白な証拠が存在する。しかし、脳内におけるＮＰＹの作用機構およびＣＲＦとの相互作用は、他のホルモン（例えばインスリン）との相互関係と同様、殆ど分かっていない。しかし、食欲を増進させ、グルココルチコイドレベルを上昇させる作用物質は、主要な肥満を発生させる上で重要であろう。
したがって、ＮＰＹの特異的アゴニストおよびアンタゴニストは、広範な臨床障害の療法にとって実質的に有益であると思われる。ＮＰＹはコンパクトな三次構造を有し、また異なるサブタイプの受容体との相互作用には分子の異なる部分が必要とされるので、アゴニストおよびアンタゴニスト両者の理論的開発は特異的な受容体構造の利用可能性および知識に決定的に依存する。
ＮＰＹは少なくとも５つの受容体、すなわちＹ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４およびＹ１様（または「非定型Ｙ１」）受容体と特異的に結合することが現在知られている。ＮＰＹ受容体はアデニル酸シクラーゼ二次メッセンジャー系とカップリングすることが示されているが、ホスファチジルイノシトール代謝回転、カチオンおよびアラキドン酸もまたＮＰＹの二次メッセンジャーとして機能しうるという証拠があるので、さらなるＮＰＹ受容体サブタイプが存在する可能性が残っている。
ＮＰＹアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば可能性のある抗高血圧剤、心臓血管薬、神経成長因子、抗精神病薬、抗肥満剤および抗糖尿病剤として商業的価値を有し得るので、組換えＤＮＡ技術によってＮＰＹ受容体を生産できることは好都合であろう。この目的のため、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４をコードするＤＮＡ分子が以前に単離された。
本発明者らはこの度、ヒト、マウスおよびラットＹ１様（以後ＮＰＹ−Ｙ５と称する）受容体をコードする新規なＤＮＡ分子を単離した。ヒトおよびラットＮＰＹ−Ｙ５をコードする類似のＤＮＡ分子が国際（ＰＣＴ）特許明細書WO 96/16542に記載されているが、これらはヒトＮＰＹ−Ｙ５の場合であればＮ末端に付加的な10アミノ酸を、ラットＮＰＹ−Ｙ５の場合であればＮ末端に付加的な11アミノ酸を有する受容体をコードしている。数個のｃＤＮＡクローンの分析ならびにイントロンおよびエキソン配列に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行なった結果、本発明者らはヒト、マウスおよびラットのＮＰＹ−Ｙ５受容体はこれらの付加的10/11アミノ酸を含まないことを確認した。したがって、WO 96/16542に記載のＤＮＡ分子は、本発明ＤＮＡ分子よりも低い発現率を示すであろう。さらに、WO 96/16542に記載のＤＮＡ分子によってコードされる受容体は、より低い、そして恐らく変更された活性を示すであろう。
したがって、本発明はその第１の局面において、約445アミノ酸を有するＮＰＹ−Ｙ５受容体または機能的に等価なその断片をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。
好ましくは、この単離されたＤＮＡ分子はヒト、マウスまたはラットのＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする。
最も好ましくは、この単離されたＤＮＡ分子は下記に示すヌクレオチド配列と実質的に一致した、または少なくとも＞80%（より好ましくは＞95%）相同のヌクレオチド配列を有する：
（i）図１のヌクレオチド6291から7625、
（ii）図２のヌクレオチド63から1397、
（iii）図３のヌクレオチド115から1449、または
（iv）図４のヌクレオチド73から1470。
この単離されたＤＮＡ分子をプラスミドまたは発現ベクターに組み込み、次にこれを適切な細菌、酵母および哺乳動物宿主細胞に導入することができる。このような宿主細胞を用いて、その単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現させることができる。
したがって、第２の局面において、本発明は第１の局面のＤＮＡ分子によって形質転換された哺乳動物、酵母または細菌宿主細胞を提供する。
第３の局面において、本発明はそのＤＮＡ分子の発現を可能とする条件下で第２の局面の宿主細胞を培養する工程、及び必要に応じてＮＰＹ−Ｙ５受容体を回収する工程を包含する、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の生産方法を提供する。
好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞または細菌細胞である。細胞が哺乳動物細胞である場合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓293細胞または昆虫Ｓｆ９細胞であることが好ましい。
好ましい実施態様においては、ＮＰＹ−Ｙ５受容体は宿主細胞の表面に発現される。
本発明のＤＮＡ分子はＮＰＹ受容体を表す。この受容体は身体の多数の領域において発現され、そしてＮＰＹは多くの系に影響を及ぼすので、その受容体は臨床的にも商業的にも興味がもたれ得る。
本発明の核酸分子を用いることにより、ニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体タンパク質を実質的に純粋な形で得ることが可能である。
したがって第４の局面として、本発明はＮＰＹ−Ｙ５受容体を実質的に純粋な形で提供する。
好ましくは、精製されたＮＰＹ−Ｙ５は図５に示すアミノ酸配列のいずれか１つに実質的に一致するアミノ酸配列を有する。
第５の局面において、本発明はＮＰＹ−Ｙ５受容体に特異的に結合することができる抗体を提供する。
第６の局面において、本発明は本発明の第１の局面のＤＮＡ分子によって形質転換された非ヒト動物を提供する。
第７の局面において本発明は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の活性化を可能とする条件下でＮＰＹ−Ｙ５受容体、または第１の局面のＤＮＡ分子によって形質転換されこれを発現する細胞を試験作用物質と接触させる工程、及びＮＰＹ−Ｙ５受容体活性の増大または減少を検出する工程を包含する、ＮＰＹ−Ｙ５受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する方法を提供する。
さらなる局面において本発明は、第１の局面のＤＮＡ分子内の独特な配列に特異的にハイブリダイズすることができる、10個以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する。
さらなる局面において本発明は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズして該ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止することができるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸分子を提供する。このようなアンチセンス核酸分子は、自らがそこにハイブリダイズするｍＲＮＡを触媒的に不活性化するリボザイム領域を含むことができる。
図１および２に示すヌクレオチド配列に関連して本明細書に使用する「実質的に一致する」という表現は、遺伝暗号の縮重によってコードされるタンパク質には変化をもたらさない、ヌクレオチド配列における重要でない変異を包含することを意図している。さらに、この表現は特定の系において発現を促進させるために必要とされうるが、コードされるタンパク質の生物活性の低下をもたらさない、その配列における他の重要でない変異を包含することを意図している。
アミノ酸配列との関連において本明細書に使用する「実質的に一致する」という表現は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の生物活性の低下をもたらさない、アミノ酸配列における重要でない変異を包含することを意図している。これらの変異はアミノ酸の保存的置換を含みうる。想定される置換は：
Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；
Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；およびＰ、Ｎα-アルカルアミノ酸（alkalamino acid）
である。
下記の非限定的実施例およびさらに添付の図に言及しながら本発明を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図２は、ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図３は、ラットＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図４は、マウスＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。
図５は、ヒト、マウスおよびラットＮＰＹ−Ｙ５受容体タンパク質の予測されるアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
図６a〜fは、ＮＰＹ−Ｙ５を発現するＣＨＯ細胞を用いて実施した結合アッセイの結果を示すグラフである。アッセイしたＹ５リガンドは、ＮＰＹ、Leu 31 Pro 34 NPY、ＰＰ、ＰＹＹ、NPY 2-36およびPYY 13-36であった。
図７は、ＮＰＹ−Ｙ５を発現するＣＨＯ細胞において、リガンドＮＰＹ、Leu 31 Pro 34 NPY、ＰＰ、ＰＹＹおよびNPY 2-36を用いて実施したｃＡＭＰアッセイの結果を示すグラフである。
実施例
実験手順
ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニング
ヒトＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｃに隣接する632 bpの32Ｐ標識化EcoRI/Pst1断片を用いて、ヒトゲノムＰ１ ＤＮＡライブラリー（Genome-Systems）、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（P. Seeburg, University of Heidelberg）およびラット視床下部ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）をスクリーニングした。6xSSC、5xデンハート溶液、0.1% SDSおよび100mg/mlの変性し、剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、上記プローブとのハイブリダイゼーションを60℃で16時間実施した。2xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間２回洗浄し、次に0.1xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間洗浄し、増感板を用いて70℃で16時間Ｘ線フィルム（Kodak，X-Omat）に暴露した。陽性クローン由来のＰ１ ＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがって単離した。次いで、このＤＮＡをEcoRI、HindIII、BamHIおよびPstIで消化し、ヒトＹ１およびＹ５遺伝子のすべてをカバーするクローンを生じるように、Bluescript SKベクター（Stratagene）にサブクローン化した。
ヌクレオチド配列の決定
スーパーコイルプラスミドＤＮＡをアルカリ変性し、T7ポリメラーゼ（Promega）を用いてジデオキシチェーンターミネーション法（Sambrookら，1992）により配列決定した。オリゴヌクレオチドプライマーは、最初はベクターの両側の領域に相補的なものを用い、次いで配列分析を完成させるために得られた配列に基づいたものを用いた。
制限酵素地図の決定
制限酵素EcoRI、BamHI、HindIIIを単独および可能なあらゆる組合せで用いてＰ１ ＤＮＡを消化し、0.8%アガロースゲルを用いて電気泳動にかけ、アルカリ変性し（0.4M NaOH）、0.4M NaOHを用いてHybond N+メンブレーンに毛管転写し、数個の特定のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよび上記のサブクローン化によって得たゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。
In situハイブリダイゼーション分析
DIG ＲＮＡラベリングキット（SP6/T7）（Boehringer Mannheim）を用いてヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体に対するセンスおよびアンチセンスリボプローブを合成した。ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体のコード領域に対応するｃＤＮＡを線状化し、T7（アンチセンスリボプローブ用）またはSP6（センスリボプローブ用）ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを製造者の指示にしたがって用いて、ジゴキシゲニン標識化dUTPを用いて転写した。
神経性疾患をもたない若い成人男性から死後脳組織を得た。特定の脳領域を解剖し、ホルマリンに36時間浸漬することにより固定し、パラフィンに包埋した。６mmの連続した切片をスライド上に集め、クロムミョウバンを塗り、使用時まで４℃で保存した。Histoclear（National Diagnostics）中で切片を５分間脱ワックスし、100%、70%および50%アルコール中で各２分間再水和化し、次にリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いて５分間洗浄した。
５mg/mlプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）を用いて、50mM Tris，pH7.5，５mM EDTA中で切片を室温で10分間前処理した。次に、切片を0.1Mグリシン（PBSに溶解）を用いて２分間２回洗浄し、PBSで１回洗浄し、次にハイブリダイゼーション緩衝液[2xSSPE、50%ホルムアミド、5%デキストラン硫酸、1xデンハート試薬、100mg/ml tRNA型X-SA（Sigma）]中で室温で１時間インキュベートした。75μlのハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したセンスおよびアンチセンスＤＮＡに対するジゴキシゲニン標識化リボプローブ（500ng）を上記切片に加え、42℃で18時間、湿環境下で、Hybaid Omnislide PCR Thermal Cycler（Integrated Sciences）を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を室温で洗浄し、2xクエン酸ナトリウム生理食塩水（SSC）緩衝液（0.15M NaCl/0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）を用いて10分間室温で洗浄し、次に0.2xSSCを用いて30分間洗浄した。その後、10mM Tris，pH7.5，15mM NaClに溶解した20mg/ml ＲＮase（Sigma）を用いて切片を室温で15分間処理した。ＲＮase処理後、2xSSCを用いて室温で５分間スライドを洗浄し、次に0.2xSSCを用いて37℃で30分間洗浄した。
組織を緩衝液Ａ（100mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl）で10分間洗浄し、2%ブロッキング溶液（Boehringer Mannheim）、0.3% Triton X-100と共に緩衝液Ａ中で30分間インキュベートすることにより、免疫学的検出のために処理した。次に、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗血清（Boehringer Mannheim、緩衝液Ａおよび0.5%ブロッキング試薬を用いて1/500に希釈）と共に切片を２時間インキュベートし、緩衝液Ａを用いて各５分間２回洗浄し、その後100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl2で２分間洗浄した。基質としてニトロブルーテトラゾリウムおよびブロモクロロインドイルホスフェートを用いて、標識化プローブを18時間暗中で可視化した。10mM Tris-HCl，pH8.0，１mM EDTAを用いて切片を10分間洗浄し、次に蒸留水を用いて３回素早く洗浄し、Aquamount[Gurr]を用いてマウントし、Nomarsky光学素子を備えたZeiss Axiophot顕微鏡でブルーのフィルターを用いて検査した。
ＮＰＹ Ｙ５の発現
ラットＹ５受容体タンパク質を以下のように発現させた。すなわち、ラットＮＰＹ Ｙ５ ｃＤＮＡの全コード領域および全３’非翻訳領域の殆どを含む1.9kb断片をpPRC/CMVベクター（Invitrogen）にサブクローン化することにより、哺乳動物用発現構築物rpHz17を作製した。この構築物は、CMVプロモーターの制御下にあり、そして選択のためネオマイシン遺伝子を含む。改変したリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、この発現構築物rpHz17を哺乳動物細胞系CHO-K1およびHEKにトランスフェクトした。
ＮＰＹ−Ｙ５結合アッセイ
ＮＰＹ−Ｙ５受容体のコード領域をpRC/CMV発現ベクター中にサブクローン化し、改変したリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）K1細胞系にトランスフェクトした。CHO細胞を5%ＣＯ2のもとで、２mMグルタミンおよび10%ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（EMEM）/ハム（Ham）F-12培地（1:1）中で維持した。ネオマイシンを用いて安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、ＮＰＹ／ＰＹＹアナログに結合する能力を試験した。トランスフェクトされた細胞（1x106個）を0.5mlのアッセイ緩衝液[50mM Tris-HCl，pH7.4，2mM CaCl2，5mM KCl，120mM NaCl，1mM MgCl2，0.1%ウシ血清アルブミン]中で、0.05nM125I標識化ＮＰＹおよび徐々に濃度を上げたヒトＮＰＹおよび関連ペプチドの存在下で、インキュベートした。細胞は15℃で３時間インキュベートし、次に0.5mlのウマ血清上に重層してから４分間微小遠心機にかけペレット化した。γカウンターを用いて１分間放射能を測定した。ＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現するCHO細胞を用いた結合アッセイの結果を、特異的に結合した放射標識ＮＰＹの最大値に対する百分率として表１に示す。これらの結果は、３組の点をもつ３つの独立した結合曲線に由来するプールされたデータである。
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ｃＡＭＰアッセイ
ＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現するCHO細胞を増殖させ、150cm3のフラスコ中で、２mM L−グルタミンおよび10%（v/v）ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグル培地：ハムF-12培地（1:1 v/v）で、37℃で10%ＣＯ2雰囲気下で、湿潤空気中で維持した。細胞がコンフルエンスに達したならば、24ウエルクラスターディッシュを用いて実験をおこなった。
フォルスコリン（forskolin）刺激[3H]-ｃＡＭＰ蓄積の阻害
ウエルあたり１mlの、[3H]-アデニン（74kBq/ウエル）を含有するHEPES緩衝化ハンク溶液（HBH;20mM，pH7.4）中で細胞単一層を37℃で２時間インキュベートした。アゴニストの添加に先立って、ウエルあたり１mlの、ホスホジエステラーゼ阻害剤Ro 20-1724を含有するHBH中で細胞を30分間インキュベートした。フォルスコリン（10μM）の添加後、アゴニスト（10μlのHBHに溶解）をアッセイ系に添加し、インキュベーションを10分間継続した。これらの操作の間、インキュベーション培地の温度は37℃に維持した。各ウエルに50μlの濃塩酸を加えてインキュベーションを終止させ、細胞を溶解させた。各ウエル由来の上清緩衝液中の[3H]-ｃＡＭＰを連続イオン排除Dowex-アルミナクロマトグラフィーによって単離した。乳化剤シンチレーター（15ml）の添加後、液体シンチレーション計測によって放射能を測定した。結果を表２に示す。
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結果
ＮＰＹ−Ｙ５受容体遺伝子の同定
ヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体遺伝子の５’上流領域のクローン化および特徴付けは、Ｙ１遺伝子の数個の別個な５’エキソンの存在を確認（Ballら、1995）すると共に、エキソン１Ｃにおいて方向が逆向きの部分的オープンリーディングフレームを含む、Ｇタンパク質共役受容体と広範な相同性を有する領域を明らかにした。第３細胞内ループおよび膜貫通ドメインVIおよびVIIの部分を含むこの200アミノ酸配列をGenbankデータベースと比較した結果、37%同一性を有する最も密接に関連する受容体としてヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体が同定された。Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｃおよびエキソン１Ｂの間の全7kbの領域をサブクローン化し、配列決定することにより、Ｙ５と称する新規なＮＰＹ受容体サブタイプをコードする遺伝子の存在が確認された（図１）。632bpヒトゲノムＹ５断片を用いて高ストリンジェンシー条件下でヒト胎児脳およびラット視床下部ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、両方の種について全長ｃＤＮＡクローンが同定した。これらの配列は、長さが445アミノ酸のＹ５受容体をコードしていた（図２および３）。ヒトゲノム配列（図１）は２個のイニシエーターＡＴＧコドン候補を示しているが、数個のｃＤＮＡクローンの解析ならびにイントロンおよびエキソン配列に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、これらＡＴＧコドンの一方（他のＡＴＧの30ヌクレオチド上流に位置する）がイントロン内に位置することが立証された。この訂正を行なった後のヒトおよびラットＮＰＹ−Ｙ５受容体間の全般的同一性は89%である。図５はヒトおよびラットＮＰＹ−Ｙ５受容体の予想されるアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。
ヒトＹ５遺伝子の５’非翻訳領域をコードするエキソンは、2.7kbのイントロンによってエキソン２から隔てられ、ＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｂの約2.8kb上流に位置している。反対方向を向いた、これら２つの５’エキソンの顕著な近接性は、共通のプロモーター領域を介する両遺伝子の転写の同時調節の可能性を示唆している。
しかし、ヒトＹ５遺伝子の興味深い特徴は、ＮＰＹ−Ｙ５遺伝子のコード領域内にＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｃを担持していることである。長さ100bpのエキソン１Ｃは、その反対側の鎖において、受容体タンパク質の３番目の細胞内ループの殆どを含むＹ５配列の一部をコードする。この細胞質ループはＧタンパク質共役受容体の間で大きさが非常に異なり、異なるＧタンパク質複合体への結合の特異性の決定に関与していると考えられる。他の公知のＮＰＹ受容体サブタイプの全てと対照的に、Ｙ５受容体におけるこの領域は通常大きく、約150アミノ酸からなる。ＮＰＹ−Ｙ１遺伝子の対応する領域においては、５番目の膜貫通ドメインのすぐ後で、フレーム内停止コドンを含む小さい97bpのイントロンがコード領域を中断しており（図１）、この非コード領域が複製後２つの付加的機能を獲得したことを示唆している。１つは、Ｙ５タンパク質配列の一部をコードすることであり、もう１つはＹ１遺伝子の選択的にスプライシングされた５’エキソンとして組織特異的転写において調節機能を果たすことである。エキソン１Ｃの転写活性化はＹ５発現に確実に影響を及ぼし、ｍＲＮＡの産生を阻害する可能性が非常に高い。しかし、このような作用機構は、これら２つの受容体遺伝子間の調節相互作用の１側面しか表していないのかもしれない。Ｙ１遺伝子のエキソン１ＢおよびＹ５遺伝子のエキソン１の顕著な近接性は、一方または他方の遺伝子の特異的転写活性化のためのさらに別な制御機構を示唆している。
Ｙ５受容体の薬理学的特徴付け
ラットＹ５受容体サブタイプを安定に発現するCHO細胞系のＮＰＹ結合分析は、Ｙ１様の薬理学を有し、かつフィーディング（feeding）特異的リガンドＮＰＹ[2-36]に強く応答するＮＰＹ受容体を表す、リガンド特異性および効力の順位（ＮＰＹ＝ＮＰＹ＞ＰＹＹ[Leu31，Pro34]＝ＮＰＹ[2-36]＝ＰＰ＞＞ＰＹＹ[13-36]）を示す（図６ａ〜ｆ）。これらの異なるＮＰＹアナログに対する選択性と同一のプロフィールを、アデニル酸シクラーゼの活性阻害を測定する実験から得られた結果に見ることができる。
In situハイブリダイゼーション分析
ヒト視床下部の視床下部領域におけるＹ５受容体ｍＲＮＡの分布を総合的に試験した。Ｙ５に対するセンスプローブを用いたハイブリダイゼーションは特異的標識化を全く示さなかったが、アンチセンスプローブは室傍核の大きいニューロンに見いだされるＹ５受容体ｍＲＮＡの極めて高い発現を示した。背内側核、視索上核および乳頭体、ならびに正中線視床核においても高レベルが見いだされる。核内では、分布は必ずしも均一ではなかった。例えば、背内側核では、標識されたニューロンに混ざって明らかに標識されていない大きいピラミッド型ニューロンが見いだされ、機能的特殊化を示唆している。Ｙ１受容体に関する予備試験の結果は、ヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体がＹ５受容体と類似の分布を有することを示唆しているが、これら２つの遺伝子の同時調節的（co-regulatory）転写活性化という説を支持する同定可能な幾つかの相違点が存在する。
ＮＰＹ−Ｙ５の発現
発現されたＹ５受容体タンパク質は、ユニークな分布および異なるＮＰＹ／ＰＹＹ／ＰＰアナログに対する相対的親和性を有するように思われる。他のＮＰＹ受容体に比べてＹ５受容体は機能的にユニークであること、そして、例えば食欲／肥満障害、高血圧症、運動障害、記憶喪失、睡眠障害、偏頭痛、並びに胃腸（GI）および心臓血管性障害のような多くの障害に対する薬物の開発において非常に重要でありうることもまた予想される。
当業者には、実施例に示す本発明に、広く記述された本発明の精神または範囲から逸脱することなく多数の変更および／または改変が可能であることが理解されるであろう。それゆえ、本発明の実施態様はいずれの側面においても例示的なものであり、限定的なものではない。
参照文献
１．Ball, H.J., Shine, J.およびHerzog, H.（1995）、多重プロモーターはヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体遺伝子の組織特異的発現を調節する、J. Biol. Chem. 270, 27272-27276。
２．Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.（1992）, Molecule cloning（A Laboratory Manual），第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７】
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