(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小嚢形成性脂質と、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選択された親水性ポリマーに結合している小嚢形成性脂質とを含み、前記小嚢形成性脂質が、その極性頭基を介して前記親水性ポリマーに結合している、血流への化合物の持続的放出において使用するためのリポゾーム組成物。
【請求項２】
前記化合物が、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドである、請求項１に記載のリポゾーム組成物。
【請求項３】
前記化合物が、ペプチドホルモンである、請求項２に記載のリポゾーム組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が、スーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＴ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびメラノーマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）またはリボソーム阻止タンパク質である、請求項２に記載のリポゾーム組成物。
【請求項５】
前記化合物が抗生物質である、請求項１に記載のリポゾーム組成物。
【請求項６】
前記抗生物質が、ゲンタマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびストレプトマイシン、セフォタキシム、セフチゾキシムまたはセフトリアキソンである、請求項５に記載のリポゾーム組成物。
【請求項７】
前記化合物が、抗ウイルス剤である、請求項１に記載のリポゾーム組成物。
【請求項８】
前記抗ウイルス剤が、ジドビジン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ガンシクロビル、ジデヒドロキシデオキシチミジン、ホスフォノフォルメート、ルバビリンまたはアシクロビルである、請求項７に記載のリポゾーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、治療学的化合物を長期間に渡って血流に投与するためのリポゾームおよび方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオテクノロジーの最近の進歩に伴って、医薬用ペプチドまたはタンパク質の開発が薬理工業の必須部分となりつつある（Ｌｅｅ，１９８６，１９８８）。いくつかの治療用のタンパク質が組換ＤＮＡ技術により上首尾に製造されており、例えばヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、α−インターフェロン、インターロイキン−２、ＴＰＡおよび種々のタンパク質ワクチンであり、これらの全ては現在市販されている（Ｂａｎｇａ）。経口投与が一般に治療学的応答しないので、非経口経路が好ましい。しかしながら、非経口投与する際に、ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、血流中で極めて短時間の寿命、代表的には２時間未満の寿命しか有していないので、多量の投与および多数の一日の接種または注入を必要とする。屡、利用する治療学的摂取は、医薬に近い管理を必要とし、そして適用するほとんどの患者について異なっている。
【０００３】
リポゾームが静脈内（ＩＶ）投与された化合物のキャリヤーとして提案されている。しかしながら、リポゾーム包含部の血流へのゆっくりとした放出のためにリポゾームを使用することは、細網内系（ＲＥＳ）の細胞により血流からのリポゾームの迅速なクリアランスにより過酷に制限れている。代表的にはＲＥＳは、１時間以内でＩＶ接種リポゾームの８０〜９５％を除去し、そして４〜６時間以内で血流から循環するリポゾームを有効に除去する。
【０００４】
リポゾームのＲＥＳ取込み速度を影響する手記の因子が報告されている（例えば、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７４；Ｊｏｎａｈ；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７２；Ｊｕｌｉａｎｏ；Ａｌｌｅｎ，１９８３；Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，１９７６；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ；Ａｌｌｅｎ，１９８１；Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８０；Ｈｗａｎｇ；Ｐａｔｅｌ，１９８３；Ｓｅｎｉｏｒ，１９８５；Ａｌｌｅｎ，１９８３；Ｅｌｌｅｎｓ；Ｓｅｎｉｏｒ，１９８２；Ｈｗａｎｇ；Ａｓｈｗｅｌｌ；Ｈａｋｏｍｏｒｉ；Ｋａｅｌｓｓｏｎ；Ｓｃｈａｕｅｒ；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ；Ｃｚｏｐ；およびＯｋａｄａ）。要するに、リポゾームサイズ、チャージ、リポイド飽和の程度および表面部分が全てＲＥＳによってリポゾームクリアランスに関連している。しかしながら、今までに同定された単一因子が長い血液寿命を提供するのに有効でなく、そして特にＩＶ投与の後一日以上の血流で比較的に高いパーセンテージのリポゾームを提供するのに有効でない。
【０００５】
血流中の好適な長いリポゾーム寿命とする１つの因子は、小さいリポゾームサイズ、代表的には小さい非ラメラー小嚢（ＳＵＶ）の範囲、少なくとも０．０３ないし０．０７ミクロンである。しかしながら、ＳＵＶの静脈内容量は、治療有効投与範囲内でのペプチドまたはタンパク質での富化ＳＵＶが親投与に実際的でない範囲に制限されてしまう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、血流中で延長された期間の治療用化合物を投与するためのリポゾームおよび方法を提供することである。
【０００７】
本発明の一実施態様において、本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できかつ約４時間未満の寿命で血流中に遊離形態でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間に延長するリポゾーム組成物を包含する。かゝる組成物は、（ｉ）小嚢形成リポイド（脂質）および親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．１ないし約０．４ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびかゝる治療学的に有効量の少なくとも３倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物からなる。かゝる組成物は、遊離形態での化合物の治療学的に有効投与量の少なくとも３倍のリポゾーム−包含化合物の量を含有する投与量で静脈内投与するのに意図される。
【０００８】
一つの好ましい実施態様において、親水性ポリマーは、約１０００ないし５０００ドルトンの分子量を有するポリエチレングリコールであり、そしてポリマーは、ホスホリポイド、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の極性頭基で誘導される。変わりに、ポリマーは、その他の好適な生体適合性親水性ポリマー、例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸であることができる。
【０００９】
別の好ましい実施態様において、組成物は、治療学的有効量で静脈内投与することができる静脈内接種されたポリペプチドの治療活性を少なくとも４８時間に延長するのに有効である。このポリペプチドは、ペプチドまたはタンパク質、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、べータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＴ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびリボソーム禁止タンパク質等であることができ、そしてこのものは静脈内投与した際に、治療学的に活性である。バスコプレシンがそうであるようにポリペプチドがピコグラム／ナノグラムで活性であるが、組成物は、ペプチドの治療学的に有効量を５ないし１０日間の間血流中にデリバーリーするのに有効である。
【００１０】
さらに本発明の形成部分は、治療学的に活性量で静脈内投与し得、そして約４時間未満の半減期を有する治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間まで延長する方法である。この方法において、上記の種類のリポゾーム組成物を治療学的に有効量の少なくとも３倍である化合物の量を含有する投与量で対象物に静脈内投与する。
【００１１】
更に、治療学的に有効量で静脈内投与できる治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間延長するのに有効なリポゾーム組成物を記載する。かゝる組成物は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．０７ないし約０．１５ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびかゝる治療学的に有効量の少なくとも１０倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物からなる。かゝる組成物は、治療学的に有効量の少なくとも１０倍であるリポゾーム包含化合物の量を含有する投与量で皮下投与することを意図している。
【００１２】
かゝるリポゾーム組成物は、治療学的に活性量で治療学的化合物、好ましくはポリペプチドの放出期間を少なくとも２週間の間延長する方法に使用される。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、ポリ乳酸またはポリグリコール酸で誘導された小嚢形成性リポイドおよび極性頭基を有する小嚢形成性リポイド並びにリポイドの頭基に誘導されるポリ乳酸またはポリグリコール酸部分からなるリポイド組成物からなる。
【００１４】
本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、以下に詳述する本発明の明細書を添付図面を参照して読むと充分に明らかになるであろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できかつ約４時間未満の半減期で血流中に遊離形態でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間に延長するリポゾーム組成物を提供し、このリポゾーム組成物は、
（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．１ないし約０．４ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、および
かゝる治療学的に有効量の少なくとも３倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物、
を包含する。
【００１６】
１つの実施態様において、上記リポゾーム組成物は、親水性ポリマーが約１０００ないし５０００ドルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００１７】
好ましくは、上記リポゾーム組成物は、上記ポリマーをホスホリポイドに誘導する。
【００１８】
別の実施態様において、上記リポゾーム組成物は、上記ポリマーがポリ乳酸およびポリグリシル酸から成る群より選択される。
【００１９】
本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できかつ約４時間未満の半減期で血流中に遊離形態でクリアし得、そしてその治療有効血中濃度がピコグラム−ナノグラム／ｍｌ範囲である治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも４８時間に延長するリポゾーム組成物を提供し、このリポゾーム組成物は、
（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．１ないし約０．４ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、および
かゝる治療学的に有効量の少なくとも３倍である量のリポゾーム包含ポリペプチドを含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態のポリペプチド、を包含する。
【００２０】
１つの実施態様において、上記組成物は、親水性ポリマーが約１０００ないし５０００ドルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００２１】
別の実施態様において、上記組成物は、ポリペプチドがピコグラム／ｍｌ範囲の血漿濃度で治療活性であるペプチドホロモンであり、そしてリポゾーム組成物が該組成物の静脈内投与の後少なくとも５日の期間治療有効投与量でホルモンを放出する。
【００２２】
好ましくは、上記組成物は、ペプチドホルモンがバソプレシンである。
【００２３】
別の実施態様において、上記リポゾーム組成物は、化合物がスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびリボソーム阻止タンパク質からなる群から選択される。
【００２４】
好ましくは、上記リポゾーム組成物は、タンパク質がマクロファージコロニー刺激因子である。
【００２５】
本発明は、約４時間未満の半減期で血流中に遊離形態でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間に延長する方法を提供し、この方法は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．１ないし約０．４ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびリポゾーム包含形態で少なくとも７０％の化合物からなるリポゾーム化合物を用意し、そして治療学的有効量の少なくとも３倍である化合物の量を含有する投与量でかゝる組成物を対象物の静脈内に投与する工程を包含する。
【００２６】
１つの実施態様において、上記方法は、親水性ポリマーが約１０００ないし５０００ドルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００２７】
別の実施態様において、上記方法は、上記ポリマーがポリ乳酸およびポリグリコール酸から成る群より選択される。
【００２８】
別の実施態様において、上記方法は、化合物が治療有効がピコグラム〜ナノグラム／ｍｌ範囲の血漿濃度で治療学的に活性であるペプチドホルモンであり、そして該投与が少なくとも５日の期間治療有効投与量でホルモンを放出するのに有効である。
【００２９】
別の実施態様において、上記方法は、ペプチドホルモンがバソプレシンである。
【００３０】
別の実施態様において、上記方法は、化合物がスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびリボソーム阻止タンパク質からなる群から選択される。
【００３１】
別の実施態様において、上記組成物は、タンパク質がマクロファージコロニー刺激因子である。
【００３２】
本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できる治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間に延長するリポゾーム組成物を提供し、この組成物は、
（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．０７ないし約０．１５ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、および
かゝる静脈内治療に有効量の少なくとも１０倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物を包含する。
【００３３】
１つの実施態様において、上記組成物は、化合物がスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ一アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびリボソーム阻止タンパク質からなる群から選択される。
【００３４】
別の実施態様において、上記組成物は、ペプチドホルモンがバソプレシンである。
【００３５】
本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できる治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間に延長する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．０７ないし約０．１５ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびリポゾーム包含形態で少なくとも７０％の化合物からなるリポゾーム化合物を用意し、そして静脈内治療有効量の少なくとも１０倍である化合物の量を含有する投与量でかゝる組成物を対象物に投与する工程を包含する。
【００３６】
１つの実施態様において、上記方法は、化合物がスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒細胞、マクロファージ）、ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびリボソーム阻止タンパク質からなる群から選択される。
【００３７】
１つの実施態様において、上記方法は、ポリペプチドがバスコプレシンである。
【００３８】
本発明は、小嚢形成性リポイドおよびポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選択された親水性ポリマーで誘導された小嚢形成性リポイドからなるリポゾームを提供する。
【００３９】
本発明は、極性頭基を有する小嚢形成性リポイドおよび上記頭基に誘導されるポリ乳酸部分からなるリポイド組成物を提供する。
【００４０】
本発明は、極性頭基を有する小嚢形成性リポイドおよび上記頭基に誘導されるポリグリコール酸部分からなるリポイド組成物を提供する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
（１．誘導リポイドの調製）
図１は、小嚢形成性リポイドアミンをポリアルキルエーテル（ＰＥＧ）、ポリ乳酸およびポリグリコール酸（これらの全ては速やかに水に溶解し、小嚢形成性リポイドと結合でき、そして毒性効果なしで生体内耐性を有する）で例示される生体適合性親水性ポリマーで誘導する一般的反応機構を示す。利用する親水性ポリマー、例えばＰＥＧはその末端でメトキシ、エトキシまたはその他の非反応性基でによりキャップされているのが好ましく、あるいは一端が他端より反応性であるもの、例えばポリ乳酸が好ましい。
【００４２】
このポリマーは、以下に記載するような好適な活性化剤、例えばシアヌル酸、ジイミダゾール、無水試薬等との反応により一端において活性化される。活性化された化合物をついで小嚢形成性リポイド、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と反応させて誘導リポイドを製造する。
【００４３】
別法として、小嚢形成性リポイドにおける極性基をポリマーとの反応について活性化させてもよくあるいは２つの基を公知のカップリング方に従って一致したカップリング反応で結合してもよい。メトキシまたはエトキシ基で一端においてキャップされたＰＥＧは、種々のポリマーサイズ、例えば５００ないし２０，０００ダルトン分子量で工業的に得ることができる。
【００４４】
小嚢形成性リポイドは、２個の炭化水素鎖、代表的にはアシル鎖および極性頭基を有するものが好ましい。この種に属するものは、ホスホリポイド、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＥ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフインゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＳＭ）であり、但し、２つの炭化水素が炭化水素鎖において代表的に約１４ないし２２炭素原子を有するものであり、そして種々の置換度を有している。また、この種に属するものは、グリコリポイド、例えばセレブロサイドおよびガングリオサイドである。
【００４５】
利用できる別の小嚢形成性リポイドは、コレステロールおよび関連ステロール類である。一般に、コレステロールは、リポイドバイレイヤー膜に固くアンカーすることができず、代表的に高分子量ポリアルキルエーテルで誘導された際に固くアンカーすることができず、従って血流中でＲＥＳのリポゾームリポゾーム回避を促進するのに有効でない。
【００４６】
より一般にそして本明細書で定義されるように、「小嚢形成性リポイド」は、疎水性および極性頭基部分を有し、そして（ａ）ホスホリポイドに例示されるようにそれ自身水中でバイレイヤー膜中で自然に形成することができ、あるいは（ｂ）ホスホリポイドリポイドと組み合わせて、その親水性部分がバイレイヤーの内部の疎水性領域に接触しそしてその極性部分が膜の外部の極性表面に配向してリポイドバイレイヤーに安定に取り込まれる両性リポイドを包含するつもりである。後者の種類の小嚢形成性リポイドの例は、コレステロールおよびコレステロール誘導体、例えばコレステロールスルフェートおよびコレステロールヘミサクシネートである。
【００４７】
本発明の一つの重要な特徴によると、小嚢形成性リポイドは、比較的に流動性のあるリポイドであり、これはリポイド相が比較的低い液／液結晶相移動温度例えば室温または比較的剛性にリポイドを有していることを意味し、かゝるリポイドが比較的に高い融点、例えば５０℃までを有していることを意味する。一般に、剛性であればあるほど、すなわち、飽和リポイドは、リポイドバイレイヤー構造における膜剛性により寄与し、そして血清におけるバイレイヤー安定性により寄与する。その他のリポイド、例えばコレステロールも、バイレイヤー構造における膜剛性および安定性に寄与することが知られている。アシル基が種々の程度の飽和度を有するホスフォリポイドが工業的に得ることができ、あるいは発行された方法に従って調製できる。
【００４８】
図２は、塩化シアヌル基によりＰＥＧをＰＥに誘導するＰＥ−ＰＥＧ−リポイドを製造する反応機構を示している。反応の詳細は、例１に与えられている。要約すると、メトキシキャップされたＰＥＧを、図に示された活性化ＰＥＧ化合物ＩＶを製造した条件下に炭酸ナトリウムの存在下に塩化シアヌルで活性化する。この物質は、精製されて未反応のシアヌル酸を除去する。活性化ＰＥＧ化合物をトリエチルアミンの存在下にＰＥと反応させて図中ＶＩＩで示された所望のＰＥ−ＰＥＧを製造する。収率は、ＰＥＧの最初の量に関して８〜１０％である。
【００４９】
最前に記載された方法をＰＥ、コレステリルアミンおよび蔗糖アミン基を有するグリコールリポイドを包含する種々のリポイドアミンに適用できる。
【００５０】
ポリアルキルエーテルをカップリングする第２の方法、例えばＰＥＧをリポイドアミンでキャップする方法を図３に記載する。ここで、キャップされたＰＥＧをジイミダゾールカップリング試薬で活性化して図３中Ｘで示される活性化されたイミダゾール化を形成する。リポイドアミン、例えばＰＥとの反応は図中ＸＩで示されるようなアミド結合によるリポイドヘカップリングするＰＥＧを導く。この反応の詳細は、例２に記載している。
【００５１】
キャップされたポリアルキルエーテルをリポイドアミンヘカップリングする方法を図４に示す。ここで、ＰＥＧをまずそのＯＨ末端においてトリメチルシラン基で保護する。末端保護反応は、図中Ａで示され、そしてトリメチルシリル黒とＰＥＧとのトリメチルアミンの存在下での反応を包含する。保護されたＰＥＧを次いでトリフルオロメチルスルホネートの無水物（図４中ＸＶＩ）と反応させてトリフルオロメチルスルホネートで活性化されたＰＥＧ化合物を形成する。この活性化した化合物とリポイドアミン、例えばＰＥとのトリメチルアミンの存在下での反応により、リポイドアミンがポリエーテルポリマー中の末端メチレン炭素によりポリエーテルにカップリングされた所望の誘導されたリポイド、例えばＰＥＧ−ＰＥ化合物が得られる。トリメチルシリル保護基は、図中Ｈ＋で示されるように酸処理によりあるいは第４アミンフロライド塩、例えばターシャリーブチルアミンとの反応により放出できる。
【００５２】
最前に記載したものに加えて種々の公知のカップリング反応がＰＥＧ等の親水性ポリマーで誘導された小嚢形成性リポイドを調製するのに好適であることが明らかであろう。例えば、図４に示したスルホネート無水物カップリング剤を使用して両性リポイドのヒドロキシル基、例えばコレステロールの５’−ＯＨにポリアルキルエーテルを接合することができる。その他の反応性リポイド基、例えば酸またはエステルリポイド基を公知のカップリング法に従ってカップリングに使用することもできる。例えばホスファチジン酸の酸基を活性化して好適な酸無水物、例えば無水酢酸により活性リポイド酸無水物を形成でき、次いで反応性リポイドをイソチオシアネート試薬の存在下での反応により保護されたポリアルキルアミンに接合できる。
【００５３】
別の実施態様において、誘導されたリポイド成分を調製して不安定なリポイド−ポリマー結合、例えばペプチドエステルまたはジサルファイド結合を包含することができ、そしてこのものは選択的生理学的条件下に、例えば血流中に存在するペプチダーゼまたはエステラーゼ酵素の存在下に分裂することができる。図５は、結合を含有する（Ａ）ペプチド、（Ｂ）エステルおよび（Ｃ）ジサルファイドにより結合された例示的なリポイドを示す。ペプチド結合化合物を、例えばまずポリアルキルエーテルを図示したトリペプチドのＮ−末端アミンと、例えば図３に示した反応によりカップリングすることによって調製できる。次いで、ペプチドカルボキシル基を従来のとおりカルボジイミドカップリング試薬によりリポイドアミン基にカップリングすることができる。エステル結合化合物を、例えば無水カップリング剤を介してアルコールを使用してリポイド酸、例えばホスファチジン酸をポリアルキルエーテルにカップリングすることによって調製できる。別法として、内部エステル結合および好適な末端基、例えば第１アミン基を含有する短結合フラグメントを使用してアミドまたはカルバメート結合を介してポリアルキルエーテルを両性リポイドにカップリングすることができる。同様にして、結合フラグメントは、図５中のＣで示される化合物を形成するのに使用される内部ジサルファイド結合を含有してもよい。
【００５４】
図６は、ＰＥによるポリ乳酸の誘導方法を示す。例４に記載の如くポリ乳酸を、ＰＥの存在下にジシクロヘキシルカルボイミド（ＤＣＣＩ）と反応させる。同様にして、ポリグリコール酸で誘導された小嚢形成性リポイドを、例４に詳述の通り好適なカップリング剤、例えばＤＣＣＩの存在下にポリグリコール酸またはグリコール酸とＰＥとの反応により形成することができる。ポリ乳酸またはポリグリコール酸のいずれかで誘導された小嚢形成性リポイド本発明の一部を形成する。本発明の形成部分はまた、１ないし２０モル％で誘導されたリポイドを含有するリポゾームである。
【００５５】
（ＩＩ．リポゾーム組成物の調製）
本発明のリポゾームを形成するのに衣装スルホン酸リポイド成分は種々の小嚢形成性リポイドから選択することができ、代表的にはホスホリポイドおよびステリールを包含する。明らかなとおり、本発明のリポゾームの一つの要件は、長い血液循環寿命である。従って、血液寿命に対するリポイド成分の効果を評価するのに使用できる標準化された尺度を確立することが有効である。
生体内リポゾーム循環時間を評価するのに使用される一つの方法は、血流中のＩＶ接種されたリポゾームの分散および接種後の選択された時間でのＲＥＳの一次器官を測定する。本明細書において使用される標準化モデルにおいて、ＲＥＳ取込みが血流中の全リポゾームとＲＥＳの主要器官である肝臓および脾臓における中の全リポゾームとの比率によって測定される。実際には、年令を性が合ったマウスを放射線標識されたリポゾーム組成物で尾静脈により静脈内接種（ＩＶ）し、各時間点を、全ての血液および肝臓および脾臓を一緒にした放射線標識カウントを例６に詳述するように測定することによって測定される。
【００５６】
肝臓および脾臓がＲＥＳによるリポゾームの最初の取込みの略１００％を示すので、最前に記載した血液／ＲＥＳ比は、生体内における血液からＲＥＳへの取込みの範囲の良好な近似値を提供する。例えば、約１またはそれ以上の比率は、血流中に存在する接種リポゾームの有為性を示し、そして約１未満の比率は、ＲＥＳ中のリポゾームの有為性を示す。興味あるリポイド組成物のほとんどに関して、血液／ＲＥＳ比は、１、２、３、４および２４時間において測定された。
【００５７】
本発明のリポゾームは、１ないし２０モル％の第Ｉ節に記載された親水性ポリマーで誘導された小嚢形成性リポイドを包含する。本発明の一実施態様によると、これらのリポゾームの血循環寿命は、ほとんどリポゾームを構成するホスホリポイドの飽和度に依存する。すなわち、ホスホリポイド成分は、主として流動性の比較的に不飽和アシル鎖またはより飽和された剛性化アシル鎖から構成することができる。本発明の特徴は、例７に記載されており、この例は種々の飽和度を有するＰＥＧ−ＰＥ、コレステロールおよびＰＣ（表４）を用いて形成されたリポゾームにおける血液／ＲＥＳ比を検査している。表５のデータから分かるように、高い血液／ＲＥＳ比がバルクＰＣ、ＰＣホスホリポイドのリポイド不飽和の範囲に無関係に実質的に全てのリポゾーム処方で達成されそしてリポイド飽和度の関数としての合成トレンドは観察されなかった。
【００５８】
従って、小嚢形成性リポイドを選択して選択された流動度または剛性を達成し、血清中のリポゾームの安定性および血清および／または腫瘍におけるリポゾームからの包含された薬剤の放出の割合を調節することができる。また、小嚢形成性リポイドをリポイド飽和特性において選択して所望のリポゾーム調剤性質を達成することができる。例えばより流動性のリポイドがより剛性のリポイド成分よりも排出またはホモジネーションにより配合およびダウンサイズし易いということが一般の場合である。一般に、より流動性のリポイド（低い移動温度）が血流における高い化合物放出割合ゆえに好ましい。
【００５９】
同様にして、リポゾーム中のコレステロールのパーセンテージが観察された血液／ＲＥＳ比に対する著しい影響なしに広い範囲にわたって変化できるということも見出した。例８Ａに提出した研究は、そこに記載の表６に関して、０ないし３０モル％のコレステロールの範囲において実質的に血液／ＲＥＳ比の変化を示さない。
【００６０】
しかしながら、コレステロールおよび関連コレステロール誘導体は、リポゾーム包含治療学的化合物の血流への放出の制御に重要である。例えば例１５および１６に報告した研究は、包含したポリペプチド（ペプチドまたはタンパク質）の生体外におけるリポゾームからヒト血清または生体内での放出の割合がコレステロール濃度に著しく依存することを示している。高いコレステロール（例えば、３０モル％またはそれ以上）を含有するＰＥＧ−リポゾームは生体外において血清中の非常に少量のペプチドまたはタンパク質を放出し、一方コレステロールの量が減少すると包含されたポリペプチドの損失の増加をもたらした。同様にして、そして以下に記載するように、静脈内投与されたＰＥＧ−リポゾームにおけるコレステロールの増加は、血流中への包含された化合物の放出の減少をもたらし（例１８）、そして生理学的効果の減少をもたらす（例１６）。従って、本発明の特徴によると、長い循環リポゾームからの化合物の放出の割合は、リポゾーム中に包含されるコレステロールパーセントにより制御できる。
【００６１】
また、本発明を支持するのに行われた研究において、血液／ＲＥＳ比が帯電リポゾーム成分、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の存在によって影響されないことを見出した。これは、４．７モル％ＰＧ（三角）または１４モル％ＰＧ（四角）を含有するＰＥＧ−ＰＥリポゾームに対する包含マーカーの損失％をプロットした図７から見出すことができる。２４時間の期間にわたる血流中のリポゾーム保持の相違が実質的に観察されなかった。
【００６２】
親水性ポリマーにより誘導された小嚢形成性リポイドは、小嚢形成性リポイドの全モル数の％として誘導されたリポイドのモル数に基づいて約１ないし２０モル％の量で存在するのが好ましい。より低いモル比、例えば０．１モル％が巨大分子量ポリマー、例えば１００キロドルトンを越える分子量を有するもので誘導されたリポイドに好適であることが分かる。第Ｉ節に記載した通り、誘導されたリポイドにおける親水性ポリマーは、約２００ないし２０，０００ドルトンの分子量を有することが好ましく、そしてより好ましくは約１，０００ないし５，０００ドルトンである。非常に短いエポキシエーテル部分の血液／ＲＥＳ比に対する効果を検査した例８Ｂは、約５以上の炭素原子のエーテルのポリエーテル部分が血液／ＲＥＳ比の著しい改良を達成するのに必要とされることを示している。
【００６３】
（Ｂ．リポゾーム組成物の調製）
リポゾームを、種々に技術、例えばＳｚｏｋａ等，１９８０年に記載の技術により調製することができる。薬剤−含有リポゾームを調製する一つの方法は、Ｓｚｏｋａ等によりまたは米国特許第４，２３５，８７１号明細書に記載された逆相蒸発法である。逆相蒸発小嚢（ＲＥＶ）は、約２ないし４の代表的粒子サイズを有しており、そして主としてオリゴラミラーであり、すなわち一つまたはいくつかのリポイドバイレイヤーシェルを含有する。この方法を例５Ａに詳述する。この方法は、一般に包含タンパク質を有するリポゾームを製造するのに好ましく、高い包含効率（５０％まで）が可能であり、従ってタンパク質損失または非包含タンパク質の回収および精製の問題が減少される。
【００６４】
マルチラメラー小嚢（ＭＬＶ）は、単純なリポイド−フィルムヒドレーション技術により形成できる。この操作において、上記に詳述した好適な溶剤に溶解された種類のリポゾーム形成リポイドを容器内で蒸発して薄膜を形成し、次いでこの薄膜を例５Ｂに詳述するように水性媒体により被覆する。リポイドフィルム水和物は、水和してＭＬＶを形成し、代表的には約０．１ないし１０ミクロンである。
【００６５】
本発明の一つの重要な実施態様において、約０．１ないし０．４、好ましくは０．１ないし０．２ミクロンサイズ範囲で選択されたサイズ範囲で実質的に均一なサイズを有する皮下接種用のリポゾームを調製する。このサイズ範囲のリポゾームは、投与すべき治療学的に活性量を運ぶのに充分高い包含容量を有している。より低いリポゾームサイズにおいて、リポゾーム包含化合物と遊離化合物との比率が低すぎて血流中の必須初期投与レベルを達成せず、あるいは溢出により循環を残すことができない。同時に、０．１ないし０．４ミクロンリポゾームは、以下に記載する通り長い血液循環を与えそして滅菌濾過による滅菌を認めるのに充分小さい。
【００６６】
ＲＥＶおよびＭＬＶのための一つの有効なサイジング法は、選択された均一な孔サイズ、代表的には０．４、０．２および／または０．１ミクロン孔サイズを有するポリカーボネート膜によるリポゾームの水性懸濁液を排出することを包含する。膜の孔サイズは、製造されるリポゾームの最大サイズに、特に製剤が同一サイズ膜により２倍またはそれ以上排出される場合比例する。このリポゾームサイジングの方法は、以下の例に記載する均一サイズＲＥＶおよびＭＬＶ組成物を調製するのに使用される。より最近の方法は、不斉セラミックフィルターによる排出を包含する。この方法は、１９８６年２月１３日に出願されたリポゾーム排出法と称する米国特許出願番号８２９，７１０号明細書に詳述されている。均一化法もリポゾームのダウンサイジングに有効である。
【００６７】
（Ｃ．化合物負荷）
一実施態様において、本発明の化合物は、血流または投与ＩＶした際に血流において治療学的に活性であるが遊離形態では短い血液半減期、代表的には４時間未満の半減期を有するポリペプチド中への徐放デリバリーに使用される。かゝるペプチドの例として、例えばバスコプレシン、カルシトニン、オキシトシン、ソマトトロピン、ヒト成長因子ホルモン、心房性ナチュレシック因子（ＡＮＦ）およびインスリン等のホルモン；およびスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ等の酵素；、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ベータ）およびコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒細胞）、ＧＭ−ＣＳＴ（顆粒細胞、マクロファージ）等の免疫調整剤；ＴＰＡプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ等の抗凝集剤；ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン等のワクチン；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）等のその他のポリペプチド（ペプチドおよびタンパク質）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）およびポークウィードアンチビラルタンパク質およびゲロニン等のリボソーム禁止タンパク質が挙げられる。
【００６８】
本発明に有効なポリペプチドは代表的には約２ないし４時間またはそれ以下のオーダーで比較的に短い血液半減期を有しており、そして血中でピコグラム／ｍｌないしナノグラム／ｍｌ濃度範囲で活性である。
【００６９】
上記の通り、別の方法、例えば溶剤注入またはリポイドヒドレーションも利用できるが、ポリペプチドは、リポゾームの逆相エマルジョン製法により受動的に負荷するのが好ましい。リポゾーム形成およびサイジングの後、遊離（未結合）薬剤を、種々の方法例えばゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはジアフィルタレーションにより除去することができる。代表的には、最終滅菌組成物中の遊離ペプチドの量は、約２０％未満であり、好ましくは組成物中の全ポリペプチドの１０％未満である。
【００７０】
同時に、包含された化合物は、選択されたリポゾーム投与においてＩＶ投与による遊離形態での治療学的投与として与えられる化合物の量の３ないし２０倍の量で存在するのが好ましい。従って、遊離形態でのペプチドの治療学的投与量がＩＶ投与に関して１μｇである場合、選択されたリポゾーム投与量は、３ないし２０μｇのペプチドを含有することが好ましい。１０〜２０％のこの化合物、例えば２〜４μｇを非包含形態で使用できるので、投与できるリポゾームの全量は、遊離化合物の最大許容投与量によって制限できることが明らかである。多量のリポゾームが包含化合物と非包含化合物との高い比率を達成することによって投与できることが明らかである。一般にはこの比率は、リポゾームが多くなり、リポゾーム組成物からの薬剤の遊離が完全になりそして保存の際のリポゾームの安定性が増すにつれて高くなる。
【００７１】
本発明による治療学的デリバリーに有効であるのは、抗バクテリア剤、例えばゲンタマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびストレプトマイシン、セフォタキシム、セフチゾキシムおよびセフトリアキソンおよび抗微生物剤、例えばＡＺＴ（ジドビジン）、ＤＤＩ（ジデオキシイノシン）、ＤＤＣ（ジデオキシシチジン）、ガンシクロビア、Ｄ４Ｔ（ジデヒドロキシデオキシチミジン）、ホスフォノフォルメート、ルバビリンおよびアシクロビアーである。
【００７２】
かゝる化合物は、上記の通り逆蒸発相、リポイドヒロレーション、溶剤注入またはその他のリポゾーム形成法によるリポゾーム形成の際に受動負荷により包含され、そしてゲル濾過等によるサイジングの後に除去される。
【００７３】
別法として、生理学的ｐＨにおいて弱塩基を形成する薬剤をリポゾーム中の高い薬剤濃度でリポゾーム中に活性負荷することができる。薬剤をリポゾーム中に活性負荷する一つの方法は、１９８８年９月２８日に出願した我々の米国特許出願番号第４１３，０３７号明細書に記載されている。この方法において、リポゾームは、比較的に高いアンモニウムイオン、例えば０．１２５Ｍアンモニウムスルフェートの存在下に調製される。リポゾームを所望のサイズにサイジングした後、リポゾーム懸濁液を処理してリポゾーム膜を横切るインサイド−アウトサイドアンモニウムイオン傾斜を構成する。この傾斜は、媒体、例えば等張グルコース媒体を含有する非アンモニウムによる透析によりあるいはゲル濾過、例えば０．１５Ｍ  ＮａＣｌまたはＫＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  カラムにより、外側相におけるアンモニウムイオンをナトリウムまたはカリウムに効率的に置換することによって構成できる。別法として、リポゾーム懸濁液を非アンモニウム溶液で希釈し、それによってアンモニウムイオンの外側相濃度を減じる。リポゾームの内側のアンモニウム濃度は、外側リポゾーム相のものの少なくとも１０倍、好ましい少なくともｌ００ないし１０００倍である。
【００７４】
リポゾームを横切るアンモニウムイオン傾斜は順にｐＨ傾斜を構成する。何故なら、アンモニアがリポゾーム膜を横切って放出されそしてプロトンが内部リポゾーム相で補足されるからである。選択された薬剤でリポゾームを負荷するためには、リポゾームの比較的に薄い懸濁液、例えば約５０ｍＭリポイドを薬剤の水溶液に混合し、そしてこの混合物を長時間、例えば２４時間にわたって室温で平衡化する。ある代表的な実施態様において、２５ｍｇ／ｍｌのリポイド濃度を有するリポゾームの懸濁液を等しい容量のアントラシクリン薬剤と約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で混合する。インキュベーション期間の終了の際に、この懸濁液を処理して遊離（未結合）薬剤を除去する。
【００７５】
（ＩＩＩ．皮下投与）
（Ａ．血流中での延長された寿命）
本発明による血流中への延長された化合物放出に対する一つの要件は、ＩＶリポゾーム投与における血流中での延長されたリポゾーム寿命である。血液／ＲＥＳ比における血流中でのリポゾーム寿命の一つの尺度は、上記の通りリポゾーム投与の後に選択された時間で測定した。種々のリポゾーム組成物に関する血液／ＲＥＳ比を例６の表３に記載した。ＰＥＧ−誘導リポイドの不存在下に、血液／ＲＥＳ比は、０．０３またはそれ以下であった。ＰＥＧ−誘導リポイドの存在下に、血液／ＲＥＳ比は、低分子量ＰＥＧについては０．２ないしいくつかの配合については１．７〜４の範囲であり、そのうちの１つはコレステロールを欠いておりそしてそのうちの３つはチャージしたホスホリポイドを欠いている（例えばＰＧ）。
【００７６】
例７の表５に記載したデータは、表３に記載したデータと一致する約１．２６ないし３．２７の範囲の血液／ＲＥＳ比（２つの低い回収率％を除く）。第ＩＩ節に記載した通り、血液寿命値は、リポゾームリポイドの飽和度、コレステロールの存在およびチャージしたリポイドの存在に実質的に無関係である。
【００７７】
上記に報告した血液／ＲＥＳ比を表３および５に記載したデータについて使用したものと等しい血液／ＲＥＳ比を使用した本発明者等の米国特許第４，９２０，０１６号明細書に報告された血液／ＲＥＳ比と比較できる。上記特許明細書に報告された最良の２４時間血液／ＲＥＳ比は、ＧＭ1、飽和ＰＣおよびコレステロールからなる配合について０．９であった。次善の配合物は、約０．５の２４時間血液／ＲＥＳ比であった。従って、代表的数多くの最近の処方で得られた代表的４時間血液／ＲＥＳ比は、現在のところ報告されている最良の処方の２倍以上であった。更にまた、ＧＭ1またはＨＰＩリポイドによる高い血液／ＲＥＳ比を達成する能力は、リポゾーム中の主として飽和されたリポイドの存在に依存していた。
【００７８】
血流中のリポゾームマーカーの血漿運動は、本発明のリポゾーム処方によって達成される高揚したリポゾーム寿命のその他の尺度を提供することができる。上記の図７および８は、代表的なＰＥＧ−リポゾーム処方における２４時間にわたるリポゾームマーカーの損失を示しており、マーカーがリポイドか包含された水溶性化合物であるかには無関係である（図８）。両方のプロットにおいて、リポゾーム接種の後２４時間に存在するリポゾームマーカーの量は、元々接種された材料の１０％以上である。
【００７９】
図９は、代表的ＰＥＧ−リポゾーム処方およびＰＥＧ−誘導リポイドの不存在下での同一のリポゾームに関する血流からのリポゾーム損失を示している。２４時間後、ＰＥＧ−リポゾームに残存するマーカー％は、約２０％以上であり、一方従来のリポゾームは、３時間後に５％未満の保持率であり、そして２４時間で実質的にマーカーが検出できなかった。
【００８０】
図７〜９から見出される結果は、種々のリポゾーム処方について測定された２４時間血液リポゾーム値と一致し、そして例６〜９の表３および５〜７に記載した。例６の表３から見出されるように、２４時間で残存する投与量％は、従来のリポゾームについては１％未満であり、これに対してＰＥＧ−リポゾームについては少なくとも５％であった。最良の処方において、約２０〜４０％の値が得られた。同様にして例７の表５において、２４時間後の血中のリポゾームレベル（ここで再び、二つの低い回収値を無視する）は、与えられた全投与量の１２ないし約２５％であった。同様な結果は、例８の表６および７に報告されている。
【００８１】
血液寿命に対するリポゾームの効果は、０．１ないし０．２５ミクロンの選択されたサイズを有する皮下接種されたリポゾームにおけるリポゾームマーカーの損失を比較することによって研究されていた。実験明細を例１０に示す。図１０に示した結果は、約１０％またはそれ以上のリポゾームマーカーが各リポゾーム処方について２４時間後に血中に存在することを示している。従って、全てのリポゾーム製剤が高い血液寿命を示すが、リポゾームサイズを選択して全薬剤放出時間の増加または減少を提供できることも明らかである。
【００８２】
２種類のその他の生体適合性親水性ポリマー、すなわち、ポリ乳酸およびポリグリコール酸で達成されるリポゾーム血液循環の高揚を図１１に示す。同図は、皮下リポゾーム接種後２４時間の期間の相第のリポゾームマーカーの損失を示す。２４時間で残存するマーカの％は、ポリ乳酸に関しては４．３％（黒四角）であり、そしてポリグリコール酸については約６％（白四角）である。これらの値は、２４時間後の従来のリポゾームにおいて見出される０．１〜１％保持率（白三角）と比較する。
【００８３】
血液／ＲＥＳ比とモデルアニマル系から得られた血流中のリポゾーム保持時間の両方に関連するデータは、興味あるヒトおよび家畜に外挿入するのは道理にかなっている。何故なら、肝臓および脾臓によるリポゾームの取込みがマウス、ラット、モンキーおよびヒトを含むいくつかの哺乳動物種において同様な速度で生じることが見出されているからである（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７４；Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，１９７６；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒｉｃｈａｒｄｏｓｏｎ；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ）。この結果は、同様にしてＲＥＳによるリポゾーム取込みに最も重要であるらしい生物学的因子（血清リポタンパクによるオプシニゼーション、サイズ−依存取込み効果および表面部分による細胞シールドを包含する）が検査された全ての哺乳動物種の共通の特徴であるということを反映している。
【００８４】
（Ｂ．血流中の化合物放出）
長時間の長い循環半減期に加えて、本発明のリポゾームのその他の重要な性質は、血流中における治療学的有効投与割合で包含された化合物。を放出する能力である。
【００８５】
上記の通り、０．１ないし０．４ミクロンのリポゾームサイズは、血流中の比較的に低いリポゾーム濃度でさえも血流中のリポゾームの％として有効化合物放出に関してリポゾームにおいて負荷する比較的に高い化合物を認める。投与できるリポゾームの全量が接種組成物中のいくつかの遊離化合物の不可避の存在により制限されるので、このことは重要な内容である。
【００８６】
その他の内容は、血液循環の際のリポゾームから放出される包含された化合物の能力である。この特徴は、以下の例１５に記載した研究に説明されている。ここで、包含されたバスロプレシン（１キロドルトンペプチド）を含有するＰＥＧ−リポゾームを、約０ないし約３０モル％のコレステロールの濃度を増加して調製した。血清中のリポゾームからのペプチド放出に対する生体外尺度は、コレステロールの量が増加するに従って実質的に少ないペプチド放出を示した。生体内におけるペプチドホルモンの放出速度を、リポゾームの皮下接種につづいて１〜８時間での減少した尿アウトプットにより測定されたジウレチック効果により測定した。研究の明細を例１５に示す。図１４に示されるように、尿放出に対する短時間効果は、コレステロール含有率、ＰＥＧ−リポゾームに依存し、最高のコレステロールが最高のホルモン効果をもたらした。同様にして、リポゾームのＩＶ投与に続いて２〜８時間の間において、最低のコレステロール濃度を有する２種類のＰＥＧ−リポゾーム処方は最大ホルモン効果を与え、リポゾームからのより高い放出割合を示す。
【００８７】
例１６に報告された研究は、長い循環リポゾームからの巨大タンパク質の放出割合を制御する能力を示している。ここで、包含されたＭ−ＣＳＦ（５５キロドルトンペプチド）を含有するＰＥＧ−リポゾームをリポイドおよびタンパク質の両方の血流中の保持％について検査した。図１５にプロットしたデータは、３０モル％コレステロールを含有するＰＥＧ−リポゾーム処方に関するＩＶ接種後２４時間のリポゾームリポイド（黒三角）およびタンパク質（黒丸）運動を示す。このデータは、例１６に記載の通り２４時間にわたり約２０％の包含材料の損失を示す。
【００８８】
図１７は、コレステロールなしでのＰＥＧ−リポゾームに関する同様なプロットを示す。このデータはここで、２４時間後Ｍ−ＣＳＦの４０〜５０％ロスを示す。通常化されたリポイドおよびタンパク質マーカーを２４時間にわたり選択された時間で比較すると、コレステロールからのタンパク質の放出（黒三角）およびコレステロールのない（黒三角）ＰＥＧ−リポゾームのプロットが得られる。このプロットは、リポゾームのコレステロール含有率を変化させることによって長い循環リポゾームで得られる著しく異なるタンパク質放出運動を示す。図１７に示した別の特徴は、両処方における２４時間での放出された最初に接種されたタンパク質の比較的に高い割合（少なくとも３％）である。
【００８９】
（ＩＶ．皮下リポゾーム処理）
本発明は、一実施態様において治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間まで延長する方法を包含する。この化合物は、治療学的活性量で皮下投与できそして遊離形態で約４時間の半減期を有するものである。
【００９０】
この方法の実施に当たって、リポゾーム包含形態で化合物を含有する上記の通りのリポゾーム組成物が提供される。
【００９１】
この組成物は、治療学的有効量の少なくとも３倍、代表的には５〜２０倍の化合物の量を含有する有効投与量で対象物に皮下投与される。従って、例えば化合物の治療学的有効量が１０μｇ／ｋｇ体重である場合、リポゾーム組成物は、少なくとも３０μｇ化合物／ｋｇ体重、代表的には５０〜２００μｇ化合物／ｋｇ体重のリポゾーム投与量で接種される。上記の通り、５〜２０％またはそれ以上の化合物が組成物を投与する際に遊離形態であるので、接種できる化合物の量は一般に、遊離化合物の最大許容投与量により制限される。従って、例えば遊離形態での化合物の最大許容量が２μｇ／ｋｇ体重であり、そしてリポゾーム組成物が１０％の非包含化合物を含有する場合、与えられるリポゾーム化合物の最大投与量は、２０μｇ／ｋｇ体重である。
【００９２】
遊離形態およびＰＥＧ−リポゾームに包含された形態でのシトシナラビノサイド（ａｒａＣ）によるマウスにおけるＬ１２１０白血病の処理に関する研究は、リポゾーム組成物が、遊離形態での薬物に関して生存の約１２０％増加に比較してＰＥＧ−リポゾーム形態で投与した際に生存の２５０〜３５０％増加をもたらしたことを示している。
【００９３】
本発明の方法による数日のオーダーで長い薬物放出時間を達成する能力を例１３〜１５に報告したＩＶバスコプレシン投与に対する研究により説明する。この研究は、バスコブレシン疾患による一般的糖尿病であるＢｒａｔｔｌｅｂｏｒｏラットについて行った。図１３は、遊離バスコブレシンの０．２μｇ（黒四角）、０．８μｇ（黒三角）および２．０μｇ（黒丸）の投与レベルでのＩＶ接種の予備投与尿放出％で測定した効果を示す。尿の放出の減少は、最大１日後であるが２日までに対照レベル（黒四角）にまで戻る。
【００９４】
図１４は、外科手術および２μｇ（黒四角）、８μｇのバスコプレシンおよび３３％（黒丸）、１６％（黒三角）および０％（黒四角）のリポゾーム中のコレステロールのモルパーセントを含有するＰＥＧ−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。尿放出の際立った減少が１日以内に観察され、２日までに若干の対照値までのリバウンドがあり、同様にして一部のリポゾーム処方における遊離ペプチドによるものである。加えて、尿放出の際立った減少がＩＶ投与後少なくとも７日の間観察された。長時間の治療学的効果が８μｇ投与で飽和し２４μｇでさらなる効果が見出せなかったことを記載する。バスコプレシンの同一の長期間の治療学的効果が図１４に示しそして上記の通りに種々の量のコレステロールを含有するＰＥＧ−リポゾームにおいて観察された。この図におけるデータは、最高ペプチド放出割合を有する低いコレステロールリポゾームで見出された増加短期間（１〜２日）および減少長期間（２〜８日）効果を説明している。
【００９５】
より一般的には、ピコグラム〜ナノグラム／ｍｌ範囲で活性な種々のポリペプチドを本発明の方法により数日の期間にわたって投与することができることが明らかである。図１５〜１７に示したデータは、例えば（ａ）巨大タンパク質を延長された期間に治療学的量での徐放に関して血流中で差し押さえることができ、そして（ｂ）タンパク質の血流への放出の割合をリポゾーム組成物により選択的に制御できることを示している。
【００９６】
（Ｖ．皮下リポゾーム処理）
本発明の別の実施態様によると、本発明の長時間の生存するリポゾーム組成物がリポゾーム包含化の皮下（ＳｕｂＱ）部分から血流への徐放にも有効であることが見出されている。特に、３週間またはそれ以上までの治療効果が本発明のリポゾーム組成物の単一皮下接種により達成できることを見出している。
【００９７】
この方法を示すのに使用した実験モデルは、上記のそして例１７に詳述したバスコプレシンモデルである。簡単に説明すると、遊離バスコプレシンの皮下接種を包含する処理法が、生理学的効果の期間に関してＰＥＧ−リポゾーム中で皮下投与されたバスコプレシンと比較する。図１８Ａは、２μｇ（黒四角）、２５μｇ（黒丸）、５０μｇ（黒四角）および１００μｇ（黒ダイアモンド）の投与量での遊離バスコプレシンの皮下接種で観察された尿製造の抑制を示している。投与量が高くなると、一日での尿製造の著しい減少が観察され、四日で対照レベル（白丸）へのレバウンドが観察された。
【００９８】
図１８Ｂは、ＰＥＧリポゾーム中のペプチドの皮下投与の効果を示す。最小投与量、すなわち２５μｇ（黒三角）は約８日まで若干の活性の延長を与えた。１００μｇ（黒四角）のバスコプレシン投与量は、約２０日までの著しい尿アウトプットの減少を示す。少なくとも２４日までのいくぶんか長い効果が４００μｇ（黒四角）の投与量で観察された。
【００９９】
バスコプレシンを利用する処理法は、皮下部位からのバスコプレシンの長時間投与によるダイエット療法の処理に意図されている。より一般的には、この方法は、治療学的有効量で皮下投与できる治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間のまで延長することを意図している。この方法は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ｉｉ）約０．０７ないし約０．１５ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾームを利用する。
【０１００】
リポゾーム組成物は、かゝる治療学的に有効量の少なくとも１０倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与量で皮下投与される。
【０１０１】
例えば種々のペプチドおよびタンパク質等のピコグラムないしナノグラム／ｍｌ濃度で血流中で活性であるバスコプレシン等の化合物に関して、この方法を数週間にわたって化合物の治療学的デリバリーに使用できる。
【０１０２】
本発明のリポゾーム組成物の皮下部位から長期間の治療学的効果を提供する能力は、リンパ球によりこの部位から取り込まれたリポゾームがクファー（Ｋｕｐｆｅｒ９細胞を包含する通常のリンパクリアランス機構を上首尾に避けることができることを提案している。この機構は、ＰＥＧ−リポゾームによるインターパーリショナル（ＩＰ）経路によりａｒａＣ投与に対する研究により支持される。要約すると、包含されたａｒａＣを含有しそしてＩＰ経路により投与されたＰＥＧ−リポゾームがＩＰ経路により与えられた遊離薬剤を用いて生存の約１２０％の増加と比較して２５０〜３００％の生存の増加をもたらすことを見出した。この結果は、ＰＥＧ−リポゾームがリンパ球により血流に腹膜から移動することができることを提案している。
【０１０３】
以下の実施例は、説明する目的のためであるが、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【０１０４】
【実施例】
（材料）
コレステロール（ＣＨＯＬ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られた。シンゴマイシン（ＳＭ９、卵ホスファチジルコリン（レクチンまたはＰＣ）、ＩＶ３０、ＩＶ２０、ＩＶ１０およびＩＶ１を有する部分的に水素化されたＰＣ、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＰＥ）、ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ）、ジオレイルＰＣ（ＤＯＰＣ）およびジステアロイルＰＣ（ＤＳＰＣ９は、Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）またはＡｕｓｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（Ｃｈｉｃａｇｏ．Ｉｌ）から得られた。
【０１０５】
［125Ｉ］−チラミニルイヌリンを出版法に従って作製した。67ガリウムトレートをＮＥＭ  Ｎｅｏｓｃａｎ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より供給した。バスコプレシンおよびマクロファージ刺激因子は、各々Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＣｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａ）から得られた。
【０１０６】
（実施例１）
（塩化シアヌルにより結合されたＰＥＧ−ＰＥの調製）
（Ａ．活性化ＰＥＧの調製）
先にＰＥＧと称した２−０−メトキシプロピレングリコール１９００−４，６−ジクロロ−１．３．５−トリアジンをＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：３５８２（１９７７）に記載したとおりに以下の改良を用いて製造した。
【０１０７】
塩化シアヌル（５．５ｇ；０．０３モル）を１０ｇの無水炭酸ナトリウムを含有する無水ベンゼン２００ｍｌに溶解し、そしてＰＥＧ−１９００（１９ｇ；０．０１モル）を添加し、そしてこの混合物を室温で一晩攪拌した。この溶液を濾過し、そして６００ｍｌの石油エーテル（沸点範囲、３５〜６０℃）を攪拌しながらゆっくりと添加した。微粉砕された沈澱をフィルター上に回収しそして４００ｍｌのベンゼンに再溶解した。５ｍ“ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ”（Ｅ．Ｍｅｒｋ）のカラム（２５０×３．２ｍｍ）上でヘキサンで展開しそして紫外線検出器で検出する高圧液体クロマトグラフィーにより測定して石油エーテルが残留塩化シアヌルがなくなるまで沈澱および濾過を繰り返した。室温でのｐＨ１０．０で緩衝液中の一晩の加水分解後の活性化ＰＥＧ−１９００の硝酸銀による滴定より１．７モルの遊離クロライド／ＰＥＧモルが得られた。
【０１０８】
生成物のＴＬＣ分析をＢａｋｅｒから得られた逆相プレートを用いて、展開剤としてメタノール：水，４：１（ｖ／ｖ）を用いてそして可視化のために沃素蒸気に曝して行った。これらの条件下に、出発メトキシポリグリコール１９００は、Ｒf＝０．５４ないし０．６０であった。活性化ＰＥＧはＲf＝０．４１であった。未反応塩化シアヌルはＲf＝０．８８であり、そしてこれを除去した。
【０１０９】
活性化ＰＥＧを窒素について分析し、そして適当な補正を更に合成段階に使用する量の試薬を選定するのに適用した。従って、生成物が理論量のほんの２０％の窒素しか含まなかった場合、次の合成段階に使用する材料の量は、１００／２０または５倍にまで増加した。生成物は理論量のほんの５０％の窒素を含有した場合、ほんの１００／５０または２倍増加が必要とされた。
【０１１０】
（Ｂ．Ｎ−（４−クロロポリグリコール１９００）−１，３，５−卵ホスファチジルエタノールアミンの調製）
スクリューキャップ試験管中に、０．７４ｍｌのクロロホルム中１００ｍｇ／ｍｌ（０．１００ｍモル）卵ホスファチジルエタノールアミンストック溶液を、窒素気流中で蒸発乾固し、そして第Ａ節に記載した活性化ＰＥＧの残留物に２０５ｍｇ（０．１００ｍモル）を提供する量で添加した。２７ｍｌ（０．２００ｍモル）トリエチルアミンをこの混合物に添加し、そして空気を窒素ガスで置換した。
【０１１１】
次いでこの混合物を真空下に蒸発乾固し、そして結晶固形分のペースト状の塊が得られた。この４容量のアセトンと１容量の酢酸との混合物５ｍｌに溶解した。得られた混合物をシルカゲル（Ｍｅｒｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０，７０〜２３０メッシュ）を充填した２１ｍｍ×２４０ｍｍクロマトグラフィー吸収カラムの頂部に配置した。シリカゲルはまずアセトン酢酸８０／２０；ｖ／ｖで湿らせておいた。
【０１１２】
カラムクロマトグラフィーを同一溶剤混合物で添加し、そして別々の２０〜５０ｍｌアリコートの溶出液を回収した。溶出液の各部分を展開剤として２−ブタノン／酢酸／水；４０／２５／５，ｖ／ｖ／ｖを用いてそして可視化のために沃素蒸気に曝してシリカゲル被覆プレート上でＴＬＣにより分析した。Ｒf＝約０．７９の材料だけを含有するフラクションを一緒にしそして真空下に蒸発乾固した。高真空下での一定重量までの乾燥により８６mg（３１．２ｍモル）のほぼ無色の含有−燐Ｎ−（４−クロロポリグリコール  １９００）−１，３，５−卵ホスファチジルエタノールアミンが得られた。
【０１１３】
固形化を２４ｍｌエタノール／クロロホルム；５０／５０クロロホルムに採り、遠心分離して不溶性材料を除去した。透明溶液の真空下での蒸発乾固により２１ｍｇ（７．６２マイクロモル）の無色液体が得られた。
【０１１４】
（実施例２）
（カルバメート結合ＰＥＧ−ＰＥの調製）
（Ａ．ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のイミダゾールカルバメートの調製）
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から得られた９．５ｇ（５ｍモル）のを分子篩上で乾燥した４５ｍｌのベンゼンに溶解した。０．８９ｇ（５．５ｍモル）の純粋なカルボニルジイミダゾールを添加した。純度を赤外線スペクトルによりチェックした。反応容器内の空気を窒素で置換した。容器を閉じ、そしてサンドバスで７５℃にて１６時間加熱した。
【０１１５】
この反応混合物を冷却し、そして室温で透明な溶液を形成した。この溶液を５０．０ｍｌにドライベンゼンで希釈し、そしてＰＥＧエーテル１９００のイミダゾールカルバメートの１００マイクロモル／ｍｌストック溶液として冷蔵庫で保存した。
【０１１６】
（Ｂ．ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のホスファチジルエタノールアミンカルバメートの調製）
１０．０ｍｌ（１ｍモル）の１００ｍモル／ｍｌＰＥＧエーテル１９００のイミダゾールカルバメートのストック溶液（化合物Ｘ）を１０ｍｌナス型フラスコにピペットで移した。溶剤を真空下に除去した。クロロホルム中で３．７ｍｌの卵ホスファチジルエタノールアミン（Ｖ）１００ｍｇ／ｍｌ溶液（０．５ｍモル）を添加した。溶剤を真空下に除去した。２ｍｌの１，１，２，２−テトラクロロエチレンおよび１３９マイクロリットル（１．０ｍモル）のトリエチルアミンＩＶを添加した。溶液を閉鎖しそしてサンドバス中で９５℃にて６時間加熱した。この際に、フラクションについて行ってブタン／酢酸／水；４０・５・５；ｖ／ｖ／ｖを展開剤として使用してＳｉＯ2被覆ＴＬＣ上での範囲を測定する薄膜クロマトグラフィーを蒸気混合物を行った。Ｉ2蒸気可視化によりほとんどのＲf＝０．６８の遊離ホスファチジルエタノールアミンが反応し、そしてＲf＝０．７８〜０．８０の含燐リポイドに置換されていることを確認した。
【０１１７】
残留反応混合物からの溶剤を真空下に除去した。残留物を１０ｍｌ塩化メチレンに採り、そしてＭｅｒｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０，７０〜２３０メッシュ）を充填した２１ｍｍ×２４０ｍｍクロマトグラフィー吸収カラムの頂部に配置した。この混合物を以下の溶剤を使用して順にカラムに通した。
【０１１８】
【表１】
0003921050.tif 000002
【０１１９】
溶出液の５０ｍｌ部分を回収し、そして各部分をクロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム；１３０・７０・８・０．５％；ｖ／ｖ／ｖ／ｖでの展開の後に可視化用のＩ2蒸気吸収を用いてＳｉＯ2上のＴＬＣＸにより検定した。ほとんどのホスフェートは、フラクション１１、１２、１３および１４に見出された。
【０１２０】
これらのフラクションを一緒にし、真空下に蒸発乾固し、そして高真空下に一定重量にまで乾燥した。これによりポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のホスファチジルエタノールアミンカルバメートの無色ワックス６６９ｍｇが得られた。これは、２６３マイクロモルを表しそしてホスファチジルエタノールアミンに基づいて５２．６％の収率である。デウテロクロロホルムに溶解した生成物のＮＭＲスペクトルは、デルタ＝３．４ｐｐｍにおけるエチレンオキサイド鎖のメチレン基による強いシングレットと一緒に卵ＰＥに関するスペクトルに対応するピークを表した。エチレンオキサイドからのメチレンプロトンとＰＥアシル基の末端メチルプロンとの比率は、所望の生成物であるポリエチレングリコール接合ホスファチジルエタノールアミンカルバメート，Ｍ．Ｗ．２，６５４の分子のポリエチレンオキサイド部分に関して約２０００の分子量を確認するのに充分な大きさであった。
【０１２１】
（実施例３）
（エチレン−結合ＰＥＧ−ＰＥの調製）
（Ａ．Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールの調製を反応機構３Ａに示す）
１５．０ｇ（１０ｍモル）のポリエチレングリコールＭ．Ｗｔ１５００（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃｌ）を８０ｍｌのベンゼンに溶解した。１．４０ｍｌ（１１ｍモル）のクロロトリメチルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃｌ）および１．５３ｍｌ（１ｍモル）のトリエチルアミンを添加した。この混合物を室温で不活性雰囲気下に５時間攪拌した。
【０１２２】
この混合物を吸引濾過してトリエチルアンモニウムクロライドを分離し、そして結晶を５ｍｌのベンゼンで洗浄した。この溶液を真空下に蒸発乾固して放置すると固化する無色のオイル１５．８３ｇを製造した。
【０１２３】
展開剤として４容量のエタノールと１容量の水の混合物および沃素蒸気可視化を使用したＳｉ−Ｃ18逆そうプレート上での生成物のＴＬＣは全てのポリグリコール（Ｒｆ＝０．９３）が消費されそしてＲｆ＝０．８２の物質で置換されたことを表している。赤外線スペクトルは、ポリグリコールだけの吸収特性を表した。
【０１２４】
I−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールＭ．Ｗｔ１５００の収率は略定量であった。
【０１２５】
（Ｂ．Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルの調製）
上記の通りに得られた１５．７４ｇ（１０ｍモル）の結晶Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールを４０ｍｌの無水ベンゼンに溶解し、解砕氷のバス中で冷却した。１．５３ｍｌ（１１ｍモル）トリエチルアミンおよびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃｌから得られた１．８５ｍｌ（１１ｍモル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を添加し、そしてこの混合物を不活性雰囲気下に一晩反応混合物が褐色に変化するまで攪拌した。
【０１２６】
次いで溶剤を減圧下に蒸発させそして残留シロップ状ペーストを１００．０ｍｌに塩化メチレンで希釈した。トリフルオロスルホン酸エステルの反応性が高いので、Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルを更に精製する必要がなかった。
【０１２７】
（Ｃ．Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥの調製）
I−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルのストック溶液１０ｍｌを真空下に蒸発乾固して１．２ｇの残留物（約０．７モル）を得た。この残留物に３７２ｍｇ（０．５ｍモル）の卵ＰＥを含有する３．７２ｍｌのクロロホルム溶液を添加した。得られた溶液に、１３９マイクロリットル（１.０ｍモル）のトリエチルアミンを添加し、そして溶剤を真空下に蒸発した。得られた在留物に、５ｍｌのドライジメチルホルムアミドおよび７０マイクロリットル（０．５０ｍモル）トリエチルアミン（ＩＶ）を添加した。反応容器からの空気を窒素で置換した。容器を閉鎖しそしてサンドバス中で１１０℃にて２２時間加熱した。溶剤を真空下に蒸発して１．５８ｇの褐色オイルを得た。
【０１２８】
Ｋｉｅｓｅｇｅｌ  ６０シリカ７０〜２３０メッシュを充填した２１×２６０ｍｍクロマトグラフィー吸収カラムを調製し、そして４０容量のブタン、２５容量の酢酸および５容量の水からなる溶剤で濯いだ。粗製生成物を３ｍｌの同一溶剤に溶解し、そしてクロマトグラフィーカラムに移動した。クロマトグラムを同一溶剤で展開し、そして連続的３０ｍｌ部分の溶出液を各々ＴＬＣにより分析した。
【０１２９】
ＴＬＣ検定系は、ブタン／酢酸／水；４０／２５／５；ｖ／ｖ／ｖの溶剤組み合わせを用いてシリカゲル被覆ガラスプレートを使用した。沃素蒸気は可視化の役割をした。この溶剤系において、Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥはＲｆ＝０．７８を示した。未変化ＰＥはＲｆ＝０．６８であった。
【０１３０】
所望のＮ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥは１７０〜３００ｍｌ部分のカラム溶出液に主として一致した。真空下に蒸発乾固すると、これらの部分は、１１１ｍｇの淡黄色の化合物を与えた。
【０１３１】
（Ｄ．Ｎ−プロピレングリコール１５００：ホスファチジルエタノールアミン酢酸脱保護の調製）
一度クロマトグラフしたＰＥ化合物を２ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した。これに、６ｍｌの酢酸および２ｍｌの水を添加した。得られた溶液を３日間２３℃で放置した。反応混合物からの溶剤を真空下に蒸発し、そして一定重量にまで乾燥して７５ｍｇの淡黄色のワックスを得た。Ｓｉ−ｃ１８逆相プレート上での４容量のエタノール、１容量の水の混合物で展開するＴＬＣは、いくつかの遊離ＰＥおよびいくつかのポリグリコール状の物資が加水分解の際に形成したことを示した。
【０１３２】
残留物を０．５ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、そして３ｍｌのエタノール溶液；８０：２０；ｖ／ｖに溶解した。この混合物を、オクタデシル結合シリカゲルを充填した１０ｍｍ×２５０ｍｍクロマトグラフィーカラムに適用し、そしてカラムをエタノール水８０：２０容量％で展開し、連続的２０ｍｌ部分の溶出液を補正した。この溶出液を逆そうＴＬＣにより検定した。生成物Ｒｆ＝０．０８ないし０．１５の生成物だけを含有するフラクションを一緒にした。これは、代表的には２０〜１００ｍｌ部分のフラクションである。真空下に蒸発乾固すると、これらの部分は出発ホスファチジルエタノールアミンに基づいてほんの３％にしか相当しない３３ｍｇの無色ワックスＰＥＧ−ＰＥを与える。
【０１３３】
ＮＭＲ分析は、生成物がＰＥ残基およびポリエチレングリコール残基の両方を取込んだが、好適に出現する元素分析にもかかわらずポリグリコール鎖の鎖長が３ないし４エチレンオキサイド残基の還元されていたことを示した。調製された生成物をＰＥＧ−ＰＥリポゾームの調製に使用した。
【０１３４】
（Ｅ．Ｎ−ポリエチレングリコール１５００Ｐ．Ｅ．の弗素脱保護による調製）
５００ｍｇの粗製Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールＰＥを５ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、そして１８９ｍｇ（０．６００ミリモル）のターシャリーブチルアンモニウムフルオライドを添加し、そして溶解するまで攪拌した。反応対を一晩２０℃で放置した。
【０１３５】
溶剤を減圧下に蒸発させそして残留物を１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、２回連続して１０ｍｌ部分の水で洗浄し、そして遠心分離してクロロホルムおよび水相を分離した。クロロホルム相を真空下に蒸発させて３９０mgの橙褐色のワックスを得、これを不純Ｎ−ポリエチレングリコール１５００Ｐ．Ｅ．化合物と測定した。
【０１３６】
このワックスをｍｌのクロロホルムに再溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲルの２１×２７０ｍｍカラムの頂部に移した。カラムを１００ｍｌの溶剤をカラムに通過させることによって展開した。表２は溶剤使用順序を示す。
【０１３７】
【表２】
0003921050.tif 000003
【０１３８】
カラム溶出液の分離された５０ｍｌフラクションを用意した。カラムのフラクションをＳｉ−Ｃ１８逆相プレート上のＴＬＣで分離した。ＴＬＣプレートを１容量の水と混合した４容量のエタノールで展開した。可視化を沃素蒸気への暴露により行った。Ｒｆ＝約０．２０の沃素吸収リポイドを含有するフラクションだけを一緒にし、そして真空下に蒸発乾固し、高真空下に一定重量のまで乾燥した。この方法で９４ｍｇのワックス状結晶固体がＭ．Ｗ．２２２６で得られた。デウテロクロロホルムに溶解したこの物質のプロトンＮＭＲスペクトルは、いくつかのポリエチレングリコールに起因するメチレンプロトンと一緒にホスファチジルエタノールアミンによる期待されたピークを示した。（デルタ＝３．７）。
【０１３９】
（実施例４）
（ＰＥ−親水性ポリマーの調製）
（Ａ．ＰＥポリ乳酸の調製）
２００ｍｇ（０．１ｍモル）ポリ（乳酸）、ｍ．ｗｔ．＝２０００（ＩＣＮ，Ｃｌｅｖｅｄ，Ｏｈｉｏ）を２．０ｍｌのジメチルスルホキシドにこの物質を完全に溶解するように攪拌しながら加熱することによって溶解した。次いで、この溶液を直ちに６５℃にまで冷却し、そして７５ｍｇ（０．１ｍモル）のジステアリルホスファチジルエタノールアミン（Ｃａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）および４１ｍｇ（０．２ｍモル）のジシクロヘキシルカルノジイミド（ＤＣＣＩ）の混合物に注いだ。次いで、２８ｍｌ（０．２ｍモル）のトリエチルアミンを添加し、空気を窒素ガスにより管から除去し、この管をキャップし、そして６５℃で４８時間加熱した。
【０１４０】
この時間の後、管を室温にまで冷却し、そして６ｍｌのクロロホルムを添加した。クロロホルム溶液を三回連続して６ｍｌ容量の水で洗浄し、各洗浄の後に遠心分離し、そして相をパスツーリュピペットで分離した。残存するクロロホルム相を吸引下に濾過して懸濁したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを除去した。濾液を真空下に乾燥して２１２ｍｇのセミ結晶固形分を得た。
【０１４１】
この固形分を４様容量のエタノールと１容量の水との混合物１５ｍｌに溶解し、Ｈ+Ｄｏｗｅｘ  ５０カチオン交換樹脂の５０ｍｍ深さおよび２１ｍｍ直径ベットに通過させ、そして１００ｍｌの同一溶剤で洗浄した。
【０１４２】
濾液を蒸発簡乾固して１３１ｍｇの無色ワックスを得た。２９１ｍｇのかゝるワックスを２．５ｍｌのクロロホルムに溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲルの２１ｍｍ×２８０ｍｍ×カラムの頂部に移した。クロマトグラムをカラムに連続して各々１００ｍｌの
１００％        クロロホルム，  ０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
９０％          クロロホルム  １０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
８５％          クロロホルム  １５％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
８０％          クロロホルム  ２０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
７０％          クロロホルム  ３０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
を通過させることによって展開した。
【０１４３】
各２５ｍｌ部分の溶出液を保存し、そしてＳＦ2−被覆プレート上でＣＨＣｌ3、ＣＨ3ＯＨ、Ｈ2Ｏ、濃ＮＨ4ＯＨ：１３０：７０：８：０．５を展開剤として使用し、そして可視化のためにＩ2蒸気吸収を使用してＴＬＣにより検定した。２７５〜３２５ｍｌ部分のカラム溶出液は、Ｒｆ＝０．８９のＰＯ4＋単一物質を含有していた。一緒にしそして蒸発乾固すると、３１９ｍｇの無色ワックスがえられた。
【０１４４】
ホスフェート分析は、おそらく１１５０００の分子量と一致した。明らかに、ポリ（乳酸）の重合がこれがホスファチジルエタノールアミンと反応した割合に匹敵する割合で生じた。
【０１４５】
（Ｂ．ＤＳＰＥのポリ（グリコール酸）アミドの調製）
２６６ｍｇ（３．５０ｍモル９グリコール酸、７４５ｍｇ（３．６０ｍモル）ジシクロヘキシルカルボジイミド、７５ｍｇ（０．１０ｍモル）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、３２マイクロリットル（０．２３ｍモル）トリエチルアミンおよび５．０ｍｌ乾燥ジメチルスルホキシドの混合物を７５℃で窒素雰囲気下に加熱し、室温に冷却し、次いで等量のクロロホルムで希釈し、次いで三回連続して等量の水で洗浄してジメチルスルホキシドを除去した。遠心分離およびパスツールピペットによる分離を各々行った。
【０１４６】
クロロホルム相を吸引濾過して少量の懸濁物質を除去し、そして濾液を真空蒸発乾固して５２７ｍｇの淡琥珀色ワックスを得た。
【０１４７】
この物質を２．５ｍｌのクロロホルムに再溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｈｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０）の２１ｍｍ×２７０ｍｍカラムの頂部に移した。
【０１４８】
クロロホルムをカラムに連続して各々１００ｍｌの
１００％        クロロホルム，  ０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
９０％          クロロホルム  １０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
８５％          クロロホルム  １５％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
８０％          クロロホルム  ２０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
７０％          クロロホルム  ３０％（メタノール中１％ＮＨ4ＯＨ）
を通過させることによって展開した。
【０１４９】
各２５ｍｌ部分の溶出液を回収し、そしてＳＦ2−被覆プレート上でＣＨＣｌ3、ＣＨ3ＯＨ、Ｈ2Ｏ、濃ＮＨ4ＯＨ：１３０：７０：８：０．５を展開剤として使用し、そして可視化のためにＩ2蒸気吸収を使用してＴＬＣにより検定した。
【０１５０】
実質的に全てのＰＯ4＋物質が溶出液の２７５〜３００ｍｌ部分であろう。これを減圧下に下に蒸発乾固し、次いで高真空乾燥することによって２８２ｍｇの無色ワックスが得られる。
【０１５１】
ホスフェート分析は、９２４０００の分子量を提案している。
【０１５２】
反応の際の溶剤容量のマニプレーションおよびグリコール酸とジシクロヘキシルカルボジイミドの比率は、おそらくその他のサイズの分子となったであろう。
【０１５３】
（実施例５）
（ＲＥＣおよびＭＬＶの調製）
（Ａ．サイズされたＲＥＶ）
以下に記載する例に表示されたモル比での全量１５μモルの選択されたリポイド成分をクロロホルムに溶解し、そしてロータリーエバポレーションにより薄膜として乾燥した。このリポイドフィルムを１ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、蒸留水で洗浄した。このリポイド溶液に０．３４ｍｌの５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．ｌｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を添加し、そしてこの混合物を溶液の温度を室温またはそれ以下に保持した１分間の音波処理により乳化した。リポゾームが包含［１２５Ｉ］トリアミニルイヌリンを含有するように調製されたが、これは約４μＣｉ／ｍｌ緩衝液の濃度で燐酸緩衝液を包含していた。
【０１５４】
エーテル溶液を減圧下に下に室温で除去し、そして得られたゲルを０．１ｍｌの上記緩衝液中に採り、そして激しく震盪した。得られたＲＥＶ懸濁液は、顕微鏡観察により測定すると約０．１ないし２０ミクロンの粒子サイズを有しており、そして主として１またはほんの少しのバイレイヤーラメラーを有する比較的に巨大な（１ミクロン以上）小嚢から構成されていた。
【０１５５】
リポゾームを二度０．４ミクロンまたは０．２ミクロンの選択された孔サイズを有するポリカーボネートフィルター（Ｓｚｏｋａ，１９７８）を通して排出した。０．４ミクロンフィルターを通して排出されたリポゾームは、平均して０．１７±（０．０５）ミクロン直径を有しており、そして０．２ミクロンフィルターを通して排出されたリポゾームは、０．１６（０．０５）ミクロン直径を有していた。非包含［１２５Ｉ］トリアミニルイヌリンを排出リポゾームをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させることによって除去した。
【０１５６】
（Ｂ．サイズされたＭＬＶ）
マルチラメラー小嚢（ＭＬＶ）リポゾームを標準法に従って主としてＣＨＣｌ3を含有する有機溶剤中にリポイドの混合物を溶解し、減圧下にローテーションにより薄膜として乾燥することによって調製した。数例において、リポイド相について放射線標識を乾燥する前にリポイド溶液に添加した。リポイドフィルムを所望の水性相の添加およびホスホリポイド成分の相転移点以上の温度で少なくとも１時間攪拌するにより水和した。数例において水性相に関する放射線標識を緩衝液中に含めた。数例において水和リポイドを繰り返し三度凍結・乾燥して以下の包含段階を容易にした。
【０１５７】
リポゾームサンプルのサイズを定義された孔ポリカーボネートフィルターを、圧縮窒素ガスを使用して通して排出することによって制御した。一つの方法において、リポゾームを一度０．４μｍの孔を有するフィルターに通過させ、次いで１０度０．１μｍの孔を有するフィルターに通過させた。別の方法において、リポゾームを三度０．２μｍの孔を有するフィルターに通過させ、続いて粒子の平均直径がＤＬＳで測定して１００ｎｍ未満になるまで０．０５μｍ孔による排出を繰り返した。非包含水性成分を、排出サンプルを包含された容量で小分子から空隙容量においてリポゾームを分離するゲル透過カラムに通過させることによって除去した。
【０１５８】
（Ｃ．67ＧａのＤＦ−含有リポゾームヘの負荷）
公知の方法（Ｇａｂｉｚｏｎ）に適用するような67Ｇａ−ＤＦ標識リポゾームの調製に関するプロトコール。要するに、リポゾームを内部水性相に包含されたキレーターデスフェラルメシレートを用いて調製してヒドロキシキノリン（オキシン）によるバイレイヤーにより移動された不可逆Ｇａを結合した。
【０１５９】
（Ｄ．ダイナミック光散乱）
リポゾーム粒子サイズ分布尺度をＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＢＩ−２０３０ＡＴオートコレクターを付したＮＩＣＯＭＰ  ２００を用いてＤＬＳにより得られた。この装置は、製造者指示に従って操作した。ＮＩＣＯＭＰ結果は、平均直径および相対容量による小嚢のＧａｕｓｓｉａｎ分布の標準偏差として表現された。
【０１６０】
（実施例６）
（リポゾーム血液寿命測定）
（Ａ．血液循環時間および血液／ＲＥＳ比の測定）
リポゾームの生体内研究を２種類の異なる動物モデル、すなわち、各々２５ｇでのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスおよび各々２００〜３００ｇの実験室ラットに関して行った。マウスの研究は、１μＭホスホリポイドでのリポゾームサンプルの尾静脈接種並びに引き続いての規定時間後の動物殺傷並びにガンマカウントによる標識定量のための組織除去を包含した。体重および各即死における接種投与量の％を測定した。ラットにおける研究は、３〜４μＭホスホリポイド／ラットで別の大腿骨動脈中のカテーテル中のリポゾームサンプルの接種後の規定時間における血液サンプルの除去のための大腿骨静脈中の慢性カレーテルの構築を包含する。２４時間までの数時間の点における血液に残存する接種投与量の％を測定した。
【０１６１】
（Ｂ．血流中のリポゾーム保持の時間）
メトキシＰＥＧ、分子量１９００および１−パルミトイル−２−オレイル−ＰＥ（ＰＯＰＥ）からなるＰＥＧ−ＰＥを、約０．１：２のリポイド：リポイドモル比の部分的に加水分解された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）と一緒にし、そしてリポイド混合物を水和し例４に記載したような０．１ミクロンポリカーボネート膜により排出して約０．１ミクロンの平均サイズを有するＭＬＶを製造した。このＭＬＶリポイドは、少量の放射線標識マーカー14Ｃ−コレステリルオレエートおよび包含されたマーカー3Ｈ−イヌリンを包含した。
【０１６２】
リポゾーム組成物を接種し、そしてマウスヘの初期投与％を接種後１、２、３、４および２４で例４に記載のとうりに測定した。放射線標識物質の損失時間を図７に示す。この図は、包含イヌリン（黒丸）、１００％の初期接種点に補正されたイヌリンマーカー（白丸）およびリポイドマーカー（黒三角）についての接種％を接種後２４時間にわたってプロットしたものである。同図からわかるように、リポイドおよび包含マーカーの両方が２４時間後元の接種投与量の１０％以上を示した。
【０１６３】
（Ｃ．２４時間血液リポゾームレベル）
静脈内接種後２４時間の血液中の接種投与量％および血液／ＲＥＳ比を測定する研究を上記の通りに行った。表３の左欄に示した組成を有するリポゾーム処方を上記の通りに調製した。他に断りのない限り、リポイド−誘導ＰＥＧはＰＥＧ１９００であり、そしてリポゾームサイズは、０．１ミクロンである。静脈接種後２４時間の血液中に残存する投与量％および測定した血液／ＲＥＳ比を各々中央欄および右欄に示す。
【０１６４】
【表３】
0003921050.tif 000004
【０１６５】
＊全ての処方は３３％コレステロールおよび７．５％チャージ成分を含有し、そして記載のない限り１００ｎｍ平均直径であった。ＰＥＧ−ＤＳＰＥは記載のない限りＰＥＧ1900から構成された。
【０１６６】
上記の通り、接種後２４時間の血中に残存する投与量％は、ＰＥＧ−誘導リポイドについては５ないし４０％の範囲内であった。これに対して、ＰＥＧ−誘導リポイドを欠くリポゾーム処方においては、両方とも１％未満のリポゾームマーカーしか２４時間後に残存しなかった。さらに表３に示すとおり、血液／ＲＥＳ比は対照リポゾームにおける０．０１〜０．０３からＰＥＧ−誘導リポイドを含有するリポゾームにおいて少なくとも０．２そして４．０までも増加した。
【０１６７】
（実施例７）
（ＰＥＧ−ＰＥリポゾームにおける血液／ＲＥＳ比に対すホスホリポイドアシル鎖の飽和の効果）
メトキシＰＥＧ、分子量１９００およびジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）からなるＰＥＧ−ＰＥを、例２の通りに調製した。ＰＥＧ−ＰＥリポイドを、スピンゴミエリン（ＳＭ）、充分に水素化された大豆ＰＣ（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、部分的に水素化された大豆ＰＣ（ＰＨＰＣ）および表４においてＰＣＩＶ１、ＩＶ１０、ＩＶ１０、ＩＶ３０および１Ｖ４０と同定された部分的に水素化されたＰＣリポイドから選択して配合した。リポイド成分を表５の左欄に示した比率で混合し、そして例４に記載した通り０．１ミクロンのサイズとなるように形成した。
【０１６８】
【表４】
0003921050.tif 000005
【０１６９】
【表５】
0003921050.tif 000006
【０１７０】
接種後２４時間に、血液中におよび肝臓（Ｌ）および脾臓（Ｓ）中に残存する接種材料％（67−Ｇａ−デスフェラールの％により測定）を測定し、そしてこれらの値を表４の左欄に２つのデータで示した。血液およびＬ＋Ｓ（ＲＥＳ）値を使用して血液／ＲＥＳ値を各組成物について計算した。表４の右欄は、回収された放射線活性の全量を示す。同表における二つの低い回収値は、異常なクリアランス挙動を示した。
【０１７１】
同表からの結果は、血液／ＲＥＳ比が流動度、リポゾームを形成するホスホリポイド成分の飽和度にほとんど無関係であることを示している。特に、高度に飽和されたＰＣ成分（例えばＩＶ１およびＩＶ１０ＰＣ）を、高度に不飽和のＰＣ成分（例えばＩＶ４０）をおよび中間飽和成分（例えばＩＶ２０）を含有するリポゾームから観察された血液／ＲＥＳ比の調和のある変化はなかった。
【０１７２】
加えて、比較的に飽和されたＰＥＧ−ＤＳＰＥ化合物および比較的に不飽和のＰＥＧ−ＰＯＤＥ化合物（例５）を使用して得られた血液／ＲＥＳ比の比較は、誘導されたリポイドの飽和度自身がＲＥＳによる取込みを避ける能力に臨界的でないことを示している。
【０１７３】
（実施例８）
（Ａ．ＰＥＧ−ＰＥリポゾームにおける血液／ＲＥＳ比に対するコレステロールおよびエトキシ化コレステロールの効果）
メトキシＰＥＧ、分子量１９００およびＤＳＰＥからなるＰＥＧ−ＰＥ化合物を例６の通りに誘導した。ＰＥＧ−ＰＥリポイドを以下の表５の左欄に示したスピンゴミエリン（ＳＭ）、充分に水素化された大豆ＰＣ（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）から選択して処方した。同表に示す３種類の処方は、約３０、１５および０モル％コレステロールを含有した。ＲＥＶ（０．３ミクロンサイズ）およびＲＥＶ（０．１ミクロンサイズ）の両方を包含された三重水素標識されたイヌリンを用いて例４の実質的に同様にして調製した。
【０１７４】
表６の右欄に示した投与後２および２４時間後に血液に残存する包含イヌリン％は、０〜３０モル％の範囲でコレステロールの測定可能な効果を示さなかった。
【０１７５】
【表６】
0003921050.tif 000007
【０１７６】
（Ｂ．エトキシ化コレステロールの効果）
メトキシ−エトキシコレステロールを、メトキシエタノールをコレステロールに第Ｉ節に記載したトリフルオロスルホネートカップリング法を介してカップリングすることによって調製した。メトキシＰＥＧ、分子量１９００および誘導ＤＳＰＥからなるＰＥＧ−ＰＥを例６に記載の通りに誘導した。ＰＥＧ−ＰＥリポイドを、表７の右欄に記載の通りジステアリルＰＣ（ＤＳＰＣ）、部分的に水素化された大豆ＰＣ（ＰＨＳＰＣ）、コレステロールエチルおよびエトキシ化コレステロールから選択して配合した。データは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＥと組み合わせてエトキシ化コレステロールがＰＥＧ−ＰＥ単独とほぼ等しい血中におけるリポゾーム寿命の増加度を与えることを示している。それ自身、エトキシ化コレステロールは、リポゾーム寿命の穏やかな程度の高揚を提供するが、ＰＥＧ−ＰＥによて提供されたものより実質的に少ない。
【０１７７】
【表７】
0003921050.tif 000008
【０１７８】
（実施例９）
（チャージされたリポイド化のＰＥＧ−ＰＥリポゾームにおける血液／ＲＥＳ比に対する効果）
メトキシＰＥＧ、分子量１９００および誘導ＤＳＰＥからなるＰＥＧ−ＰＥを例６に記載の通りに誘導した。ＰＥＧ−ＰＥリポイドを、図６に記載された卵ＰＧ（ＰＧ）、部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）から選択されたリポイドを用いて配合した。リポイドを例４の通りの０．１ミクロンのサイズを有するＭＬＶとして製造した。
【０１７９】
（実施例１０）
（血液寿命に対するリポゾームサイズの効果）
ＰＥＧ−ＤＳＰＥをＰＥＧ−１９００、部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を０．１５：１．８５：１のモル比で配合した。リポゾームを０．２５、０．１５または０．１ミクロンポリカーボネートフィルターを通して排出することによってサイジングして各々約０．４、０．２および０．１ミクロンのリポゾームサイズをもたらした。非−包含3Ｈ−イヌリンをゲル濾過により除去した。
【０１８０】
各３種類のリポゾームを静脈内接種し、そして血中の接種されたリポゾームマーカーの存在を、１、２、３、４および２４時間後に測定し、結果を図１０に示す。全ての３種類のリポゾームは、２４時間後に残存する少なくとも約１０％リポゾームマーカーで証拠だてられるように長い血液半減期を示した。０．１ミクロン配合（黒四角）は、０．２ミクロン配合（黒丸）より長時間生存し、後者は順に０．４ミクロン配合物より長時間生存した。
【０１８１】
（実施例１１）
（血液寿命に対するその他の親水性ポリマーの効果）
上記の通りにして調製されたポリ乳酸−ＰＳＰＥまたはポリグリコール酸−ＰＳＰＥを、水素化大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）と２：３．５：１または１：３．５：１のいずれかの比率で配合した。リポゾームを０．１ミクロンポリカーボネートフィルターを通して排出することによってサイジングした。リポゾームを例５に記載の通りにＧａ−ＤＦにより標識した。
【０１８２】
これらのリポゾーム配合物を静脈内接種し、そして血中の接種されたリポゾームマーカーの存在を、１、２、３、４および２４時間後に測定し、結果を図ｌｌに示す。１５分間正常化すると、約３．９％のリポゾームマーカーがポリ乳酸−ＤＳＰＥ（黒四角）で２４時間後に存在した。約６％のリポゾームマーカーの平均値がポリグリコール酸−ＰＳＰＥ（白三角）で２４時間後に存在した。
【０１８３】
（実施例１２）
（ＰＥＧ−被覆または未被覆リポゾームの血漿運動）
ＰＥＧ分子量１９００およびジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）からなるＰＥＧ−ＰＥを例２に記載の通りに調製した。ＰＥＧ−ＰＥリポイドを、ＰＨＲＰＣおよびコレステロールと０．１５：１．８５：１のモル比で配合した。第２のリポイド混合物はＰＥＧ−ＰＥがない以外が同一のリポイドを含有した。リポゾームを、ＤＦの存在下でのリポイド水和および引続いてのゲル濾過による非包含ＤＦの除去並びに例５のとおりの標識化により例５に記載のとおりに２種類のリポイド混合物から調製した。両方の組成物は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  デスフェラール中１０μＭ  リポイド／ｍｌを含有していた。
【０１８４】
２種類のリポゾーム組成物（０．４ｍｌ）を例６に記載の通り動物にＩＶ接種した。０．２５、１、３または５および２４時間接種後に、血液サンプルを除去し、そして接種の直後に測定した量の％として表して血中に残存するイヌリン量について検定した。結果を図９に示す。図示されるように、ＰＥＧ−被覆リポゾームは、約１１時間の血液半減期を有しており、そしてほぼ３０％の接種材料が２４時間後の血液に存在した。これに対して、未被覆リポゾームは、１時間未満の血中の半減期を示した。２４時間において、接種材料の量は、測定不能であった。
【０１８５】
（実施例１３）
（遊離バスコプレシンでの処理）
ＶＰについて先天的疾患のＢｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ株の雄性成年ラット（ＶａｌｔｉｎおよびＳｃｈｒｏｅｄｅｒ，１９６４）を処理前に少なくとも３日間ケージを代謝するために順応させた。ほとんどの実験において、酸化窒素２１００ｃｃ／分、酸素４００ｃｃ／分、および５％イソフルエン（Ａｅｒｒａｎｅ）の混合物を用いて麻酔を行った。麻酔をイソフルエンの％を２％に減少する以外同一のガス混合物を用いて外科手術中保持した。別の実験において、インハールドエチルエーテルを麻酔に使用した。
【０１８６】
（Ａ．外科手術）
首および両後肢の腹側を剃った。少しの切込みを耳と首との間の中間点で行い排管を取り外した。ラットを腹這いにし安定化した。鼠茎領域における腹側後肢において切込みを行いそして包帯を取り去り大腿部静脈コンプレックスを曝した。更に、鈍い切開部を大腿部静脈または動脈を切り離した。静脈に関して、血流を３〜０シルクタイ（Ｄａｖｉｓ−Ｇｅｃｋ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）を容器の抹消の上に通過させそしてボールドッグクランプで容器を好適にクランプしながら静脈に張力をかけることによって閉塞した。これは静脈を拡張しそして容易に切開することを認める。小さい鋏を使用して、静脈をニックし、そして通常の生理食塩水（９％）または５％デキストロースを満たしたポリエチレン製カテーテル管の傾斜６インチ部分を静脈に挿入した。正確な配置を、１ｃｃ注射を使用して静脈欠陥およびフラッシュにより確認した。カテーテルを容器の下にお小さなタイを通過させそしてこれを鼠茎のまらりにノッキングすることによってゆるく静脈に留めた。
【０１８７】
（Ｂ．投与）
一度動物を外科的に調製したら、１５０〜１０００μｌの試験溶液を静脈内投与した。投与容量を調節してバスコプレシンの所望の容量、例えば０．２、０．８および３μｇの水性バスコプレシンを与えた。静脈カテーテルを外し、そして腹側静脈を外し、そして両方の膝切開部を閉じた。動物の意識を回復させる。
【０１８８】
（Ｃ．尿製造研究）
ラットをダイエット養生を示しそして尿容量を充分に確立した対照期間の後、動物の体重を測定し、そしてインハルド麻酔で麻酔した。腹側静脈をキャヌレートし、そして上記の外科的方法で投薬単位を投与した。動物を代謝ケージで保持し、そして尿を投与後数日間にわたって回収した。尿容量を投与後直ちにそしてその後少なくとも一日２回測定した。
【０１８９】
図１２は、生理食塩水（白丸）、０．２μｇ（黒四角）、０．８μｇ（黒三角）および２μｇ（黒丸）の全投与量でのバスコプレシンの水溶液の投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。薬剤投与後１日において、尿製造は、投与量依存降下を示した。第２日およびその後は尿製造は実質的に対照レベルに戻った。
【０１９０】
（実施例１４）
巨大ユニラメラーリポゾームを逆相蒸発法に従って製造した（ＳｚｏｋａおよびＰａｒａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９７８）。リポゾームの製造に使用されたリポイド組成物は、０．２：１：１：１のモル比のＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＣ、シンゴマイレンおよびコレステロールであった。１０μモル／ｍｌのホスホルポを有する１ｍｌ最終容量のリポゾームのためのリポイド混合物をクロロホルムに溶解し、そして減圧下に蒸発乾固した。残留溶剤を１時間高真空下に除去した後、混合物をｐＨ７における燐酸緩衝液で新しく洗浄したエチルエーテルに溶解した。次いで、著しいアルギニンバスコプレシンを含有する０．３４ｍｌの水性緩衝液（５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）をエーテル中のリポイドに添加した。痕跡量の3Ｈ−標識されたバスコプレシンをタンパク質濃度について測定するバスコプレシン溶液に添加した。次いで、エーテルを制御されたロート蒸発により除去し、そして付加的な薬剤のない緩衝液を添加してゲル抑制の直前に１ｍｌ溶液を得た。得られたリポゾームのバスコプレシン含有率をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ１５上のゲル濾過によりリポゾーム結合から分離することによって測定した。
【０１９１】
リポゾームを、０．４ミクロンＮｕｃｌｅｐｏｒｅフィルターにより排出し（Ｏｌｓｅｎ等，１９７９年）、そして粒子サイズ分布をＮｉｃｏｍ  ｍｏｄｅｌ２００を用いてダイナミック光散乱により測定した。平均直径は、０．２μｍないし０．５μｍの範囲内にあり、そして低いポリ分散性を示した。未結合バスコプレシンを透析により除去し、そして上記の通りにゲルクロマトグラフィーにより監視した。
【０１９２】
上記からのＰＥＧ−リポゾーム調剤を例１３の通りにして調製されたラットにリポゾーム投与量２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および２４μｇ（黒丸）バスコプレシン溶液で静脈内投与した。予備投与尿流出％を上記の通りにして測定し、図１４に示した。このデータは、薬剤投与後第１日における尿製造における実質的に同一の依存抑制を示し、主としてリポゾーム配合物中の非包含バスコプレシンから得られるものであろう。遊離ペプチド投与と比較して全ての３つの製造は、対照（白丸）に関してリポゾーム投与後２〜８日の間にわたって尿製造の著しい抑制を示した。
【０１９３】
（実施例１５）
（ＰＥＧ−リポゾームバスコプレシンでの処理：）
（リポゾームコレステロール濃度の効果）
３３、１６または０モル％コレステロールを含有するリポゾームを用いて例１４の通りに巨大ユニラメラーリポゾームを製造した。バスコプレシン包含、リポゾームサイジングおよび遊離ペプチド除去を例１４の通りに行った。
【０１９４】
３種類のＰＥＧ−リポゾーム調剤を８μｇバスコプレシンを与えるリポゾーム投与量で例１３の通りに製造されたラットに静脈内投与し、そして投与後９日間にわたって予備投与尿製造を測定した。生理食塩水（白丸）および０（黒四角）、１６（黒三角）および３３（黒丸）モル％コレステロールを有するＰＥＧ−リポゾームについての結果を図１５に示す。
【０１９５】
日１応答は、コレステロールの％に著しく依存し、尿に対する最大の効果がコレステロールの最低モル比を有するリポゾームにおいて製造された。この結果は、血清中へのＰＥＧ−リポゾームのバスコプレシン放出の生体外安定性研究と一致した。血清の存在下に、バスコプレシンの透く開法が３０モル％以上のコレステロールを含有するリポゾームにおいて観察された。これに対して、減少量のコレステロールを含有するリポゾームは、包含ペプチドの著しく高い放出を示した。従って、低いコレステロールを有するかコレステロールを有していない一日後に見られる著しく高いジウレチィック効果が血清中にリポゾームから放出された遊離ペプチドによるものであることが明らかであろう。
【０１９６】
興味深いことには、全ての３種類の配合が例１４に記載の方法に見出されるように際立ってそして実質的に同様なジウレティック効果をリポゾーム薬剤投与後２〜８日にわたって製造した。
【０１９７】
（実施例１６）
（ＰＥＧ−リポゾームからのＭ−ＣＳＦの血液クリアランス運動）
ＰＥＧ−ＰＥ、ＰＨＥＰＣ  ＩＶ−４０、コレステロールおよびα−トコフェロールを５：６１：３３：１のモル比で含有するリポイドフィルムを蒸留水で水和し、そして得られたＭＬＶを３０分間音波処理してＳＵＶを形成した。Ｍ−ＣＳＦを濃縮し、そしてタンパク質の部分をＵ１２５Ｉ−沃素で標識した。
【０１９８】
等量（２ｍｌ）のタンパク質溶液およびＳＵＢを混合し、そしてこの混合物をアセトン／ドライバス中で凍結し、そして一晩親液化した。乾燥材料を０．８ｍｌの蒸留水中で再水和し、そして得られたリポゾーム懸濁液を１度０．４μポリカーボネートフィルターにそして３度０．２μフィルターに通過させた。サイジングされたリポゾームを蒸留水中１０ｍｌに希釈し、二度高速遠心で洗浄し、そして洗浄ペレットを０．９μｌの滅菌緩衝液に４０μモルリポイド／ｍｌおよび０．５ないし１．２５ｍｇタンパク質／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。
【０１９９】
上記からのＰＥＧ−リポゾーム調剤を例６のとおりに動物に静脈内投与し、そしてＭ−ＣＳＦの血液レベルをラットを例１４の通りにして調製した後に２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および２４μｇ（白丸）のバスコプレシンのリポゾーム投与量で１、２、４および２４日において測定した。同様な測定を溶液形態で投与された等量のＭ−ＣＳＦについて行った。３０モル％コレステロールを含有するＰＥＧ−リポゾーム配合物に関する血漿運動を図１５に示す。このデータは、リポゾーム関連タンパク質についての約８％（黒丸）と比較して２４時間での血液中に残存する１％未満のタンパク質を有する遊離タンパク質（黒三角）の速やかなクリアランスを示している。リポイドマーカー％により判断された血流中に残存するリポゾーム％は、１０％より若干大きかった。リポイドおよびタンパク質マーカーの速度のクリアランスの比較は、約２０％のタンパク質マーカーが接種後２４時間までにリポゾームから放出されたことを示している。
【０２００】
コレステロール遊離ＰＥＧ−リポゾームを用いて得られた血漿運動を図１６に示す。２４時間後に残存するリポゾーム％をリポゾーム関連Ｍ−ＣＳＦについて約４．５％と比較して約８．５（黒三角）であった。この結果は、約４０〜５０％の元の包含タンパク質がリポゾームから接種後２４時間に放出したことを示す。
【０２０１】
包含されたタンパク質中のリポゾームリポイドマーカー中の放射線活性カウントを１００％初期値に正常化し、そして時間にわたる血流中に放出された接種投薬％を、正常化されたタンパク質と正常化されたリポゾームマーカー放射線活性レベルとの相違から測定した。接種後１、２、４および２４時間において放出されたタンパク質％のケイ酸値のプロットを図１７に示す。
【０２０２】
コレステロール遊離配合（黒三角）に関するプロットは、２時間においてタンパク質放出ピークを示し、非コレステロール配合物（黒三角）における２〜２４時間の放出量においてゆるやかな傾斜であった。２４時間におけるリポゾームから放出されたタンパク質の量は、全投与の約３〜４％であった。
【０２０３】
３０モル％コレステロールを含有する配合物（黒丸）に関するプロットは、２４時間にわったて放出タンパク質放出割合が徐々に増加することを示した。２４時間におけるリポゾームから放出されたタンパク質の量は、比較的に高いレベル（３％またはそれ以上）であった。
【０２０４】
（実施例１７）
（皮下接種リポゾーム）
ＭＬＶを例５に記載の通りに薄膜水和により調製した。薄膜のリポイド組成は、０．１５：１．８５：１のモル比でのＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＨＥＰＣおよびコレステロールとした。この薄膜を７．５ｍｇ／ｍｌでバスコプレシンを含有する水性緩衝液（５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で水和した。ＭＬＶを０．１ミクロンポリカーボネート膜を、例１５の通りに通して繰り返し排出することによってサイジングし、そして遊離（非包含）ペプチドをゲル濾過により除去した。ＰＥＧ−リポゾームの懸濁液中の最終濃度は、１００μＭ／ｍｌとした。
【０２０５】
遊離形態でのバスコプレシンをＢｒａｔｔｌｅｂｒｏラットに例１３の通りに皮下接種した。皮下接種部位は、頸動脈部分とした。投与量は、２μｇ（黒三角）、２５μｇ（黒丸）、５０μｇ（黒四角）および１００μｇ（黒ダイアモンド）とした。
【０２０６】
上記の通りに製造したＰＥＧ−リポゾームに包含されたバスコプレシン動物に皮下投与した（１ｍｌ）。観察された予備投与尿放出の％を図１８Ａにプロットする。投与量は、２５μｇ（黒三角）、１００μｇ（黒丸）および４００μｇ（黒四角）とした。観察された予備投与尿放出の％を図１８Ｂにプロットする。
【０２０７】
本発明が特定のリポゾーム処方、リポゾーム包含化および処理方法に関して記載されてきたが、種々の関連組成物、化および処理方法が本発明の範囲を逸脱しないことは明らかである。
【０２０８】
【発明の効果】
本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できかつ遊離形態で約４時間未満の半減期で血液中でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を延長するに有効なリポゾーム組成物を提供する。
【０２０９】
（参考文献）
Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ.,（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６４０．３８５３７９．
Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｅｖｅｒｅｓｔ，Ｊ．(１９８３）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２２６，５３９−５４４．
Ａｓｈｅｗｌｌ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｅｌｌ，Ａ．Ｇ．（１９７４）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４１,９１−１２８．
Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Iｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，４８：１５（１９８８）．
Ｃｚｏｐ，Ｊ．Ｋ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３８３１．
Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｂｌｌｏｄ  ４５：１１
Ｅｌｌｅｎｓ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６７４：１０−１８
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｙｍａｎ，Ｂ．Ｅ．（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，４８５−４９１．
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｅｅｒｕｎｊｕｎ，Ｄ．（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，１７９−１８５．
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｊ．（１９８０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１１９，４３−４６．
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ（１９７９）Ｂｌｏｏｄ  ５３：９１６．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，７３３−７６４．
Ｈｗａｎｇ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０．
Ｊｏｎａｈ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４０１，３３６−３４８．
Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｔａｍｐ，Ｄ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３．６５１−６５８．
Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｋ．Ａ．（１９８２）Iｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖｏｌ．４，Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ（ｅｄ.）  ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ１−７４．
Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３６，２９４９−２９５７．
Ｌｅｅ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２５：８６（１９８０）．
Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｉｎｔ，７：２０８（１９８６）．
Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｍａｎｕｆ，１：２４（１９８８）．
Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４．３７５−３７８．
Ｏｋａｄａ，Ｎ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅｎ  ２９９：２６１．
Ｐｏｓｔｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，．ｉｎ“Ｌｉｐｏｓｅｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅ  ３，ｐａｇｅ  １（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９８４）．
Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｊｕｌｉｏａｎｏ，Ｒ．Ｌ．（１９８４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．３６．２７７−３０７．
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４０，３５４３．
Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５４２，２９６−３０７．
Ｓｅｎｉｏｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．（１９８２）ＦＲＢＳ  Ｌｅｔｔ．１４５，１０９−ｌ１４．
Ｓｅｎｉｏｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８３９，１−８．
Ｓｚｏｋａ，Ｆ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４．
Ｓｚｏｋａ，Ｆ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７．
Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（１９６９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９：５５１．
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、小嚢形成性リポイドアミンをポリアルキルエーテルで誘導する一般的反応機構を示す。
【図２】図２は、ポリエチレングリコールで塩化シアヌル結合剤を介して誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を調製する反応機構を示す。
【図３】図３は、ジイミダゾール活性化試薬によりポリエチレングリコールで誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を調製する反応機構を示す。
【図４】図４は、トリフルオロメタンスルホネート試薬によりポリエチレングリコールで誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を調製する反応機構を示す。
【図５】図５は、ペプチド（Ａ）、エステル（Ｂ）およびジサルファイド（Ｃ）結合によりポリエチレングリコールで誘導された小嚢形成性リポイドを示す。
【図６】図６は、ポリ乳酸で誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を調製する反応機構を示す。
【図７】図７は、異なる量のホスファチジルグリセロールを含有するＰＥＧ−ＰＥリポゾームに関するＩＶ接種後の時間の関数としてパーセント接種投与量に関して示される血液中のリポゾーム保持時間のプロットである。
【図８】図８は、支配的な不飽和ホスホリポイド成分からなるリポゾームの血液における保持時間を示す図７と同様なプロットである。
【図９】図９は、ＰＥＧ−リポゾーム（黒三角）および従来のリポゾーム（黒丸）の血液における保持時間を示す図７と同様なプロットである。
【図１０】図１０は、０．１ミクロン（黒四角）、０．２ミクロン（黒丸）および０．４ミクロン（黒三角）ポリカーボネート膜による排出によってサイジングされたＰＥＧ−リポゾームの血液寿命のプロットである。
【図１１】図１１は、ポリ乳酸（黒四角）およびポリグリコール酸（白三角）で誘導された小嚢形成性リポイドを含有するリポゾームおける保持時間のプロットである。
【図１２】図１２は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、０．２μｇ（黒四角）、０．８μｇ（黒三角）および２μｇ（黒丸）の全投与量でのバスコプレシンの水溶液の投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。
【図１３】図１３は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および２４μｇ（黒丸）全投与量で包含されたバスコプレシンを含有するＰＥＧ−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。
【図１４】図１４は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、２μｇ（黒四角）、８μｇのバスコプレシンおよび３３％（黒丸）、１６％（黒三角）および０％（黒四角）のリポゾーム中のコレステロールのモルパーセントを含有するＰＥＧ−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。
【図１５】図１５は、遊離マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（黒三角）、３０モル％のコレステロールを含有するＰＥＧ−リポゾーム（黒三角）およびＰＥＧ−リポゾームに関連するＭ−ＣＳＦの血液クリアランス運動を示す。
【図１６】図１６は、遊離Ｍ−ＣＳＦ（黒三角）、コレステロールのないＰＥＧ−リポゾーム（黒三角）およびＰＥＧ−リポゾームに関連するＭ−ＣＳＦの血液クリアランス運動を示す。
【図１７】図１７は、３０（黒丸）および０（黒三角）モル％コレステロールを含有するＰＥＧ−リポゾームからの血中へのＭ−ＣＳＦの放出％のプロットである。
【図１８Ａ】図１８Ａは外科手術および生理食塩水（対照、白丸）および２μｇ（黒三角）、２５μｇ（黒丸）および５０μｇ（黒ダイアモンド）の量での遊離バスコプレシンの皮下投与後の予備投与量のパーセンテージとしてのラットにおける尿放出量を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）および２５μｇ（黒三角）、１００μｇ（黒丸）および４００μｇ（黒ダイアモンド）の量でのＰＥＧ−リポゾームに包含されたバスコプレシンの皮下投与後の予備投与量のパーセンテージとしてのラットにおける尿放出量を示す。
【図１】
0003921050.tif 000009
【図２】
0003921050.tif 000010
【図３】
0003921050.tif 000011
【図４】
0003921050.tif 000012
【図５】
0003921050.tif 000013
【図６】
0003921050.tif 000014
【図７】
0003921050.tif 000015
【図８】
0003921050.tif 000016
【図９】
0003921050.tif 000017
【図１０】
0003921050.tif 000018
【図１１】
0003921050.tif 000019
【図１２】
0003921050.tif 000020
【図１３】
0003921050.tif 000021
【図１４】
0003921050.tif 000022
【図１５】
0003921050.tif 000023
【図１６】
0003921050.tif 000024
【図１７】
0003921050.tif 000025
【図１８Ａ】
0003921050.tif 000026
【図１８Ｂ】
0003921050.tif 000027