(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）液状動物性脂肪中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）と、水酸化カリウム，水酸化ナトリウム及びそれらの混合物で構成されるグループから選ばれる水酸化アルカリ金属水溶液であって、水酸化アルカリ金属のＦＦＡに対するモル比が0.5−５：１である水酸化アルカリ金属水溶液との反応混合物を、温度約０−55℃で５−35分間、200−1800 rpmの多段翼ミキサーで混合して液状動物性脂肪中に存在するＦＦＡから可溶性の脂肪酸塩（ＳＦＡＳ）を形成させ；
（ｂ）当該ＳＦＡＳをアルカリ土類金属塩であって、そのＦＦＡに対するモル比が約0.25−10：１であるアルカリ土類金属塩と反応させ、段階（ａ）と同時又は段階（ａ）の後で、当該ＳＦＡＳに当該反応混合物の中で不溶性の脂肪酸塩（ＩＦＡＳ）を形成させ；
（ｃ）当該ＩＦＡＳを当該反応混合物から分離して加工動物油を形成させる、
工程からなる、液状動物性無水脂肪中に存在し、タンパク質を含まない純粋な脂質成分からなる遊離脂肪酸を減少させ、加工動物性脂肪を生成させるための方法。
【請求項２】
さらに当該動物性脂肪をβ-シクロデキストリンと混合して、当該動物性脂肪中に存在するコレステロールを除去する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに当該動物性脂肪をβ-シクロデキストリンと段階（ａ）及び（ｂ）の後、且つ当該ＩＦＡＳの分離前に混合する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該塩基が水酸化カリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
当該塩基が水酸化カリウムであり、ＦＦＡに対する水酸化カリウムのモル比が0.5−５：１であって、当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムであり、CaCl2のＦＦＡに対するモル比が約0.25−10：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
塩基のＦＦＡに対するモル比が約0.5−５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
当該ＩＦＡＳを遠心分離により分離する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
当該反応混合物に液状の植物油を添加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
当該反応混合物に液状の植物油を水に対して約0.15：１と１：２の間の重量比で添加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
当該塩基が水酸化カリウムであり、水酸化カリウムとＦＦＡのモル比が0.5−５：１であり、当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムであり、CaCl2とＦＦＡのモル比が約0.25−10：１であり、当該温度が約０−55℃であり、塩基のＦＦＡに対するモル比が約0.5−５であり、当該混合を５−35分間行い、当該ＩＦＡＳを遠心分離により分離する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
当該塩基が水酸化カリウムであり、水酸化カリウムのＦＦＡに対するモル比が0.5−５：１であり、当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムであり、CaCl2のＦＦＡに対するモル比が約0.25−10：１であり、当該温度が約０−55℃であり、塩基のＦＦＡに対するモル比が約0.5−10であり、当該混合を５−35分間行い、当該ＩＦＡＳを遠心分離により分離し、当該反応混合物に液状の植物油を添加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
シクロデキストリンのコレステロールに対するモル比が約4.7−6.4：１である、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
さらに当該動物性脂肪をシクロデキストリンと混合して当該動物性脂肪中に存在するコレステロールを除去し、当該ＩＦＡＳ及び当該コレステロール及びシクロデキストリンを遠心分離により分離する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
当該塩基が水酸化カリウムであり、水酸化カリウムのＦＦＡに対するモル比が0.5−５：１であり、当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムであり、CaCl2のＦＦＡに対するモル比が約0.25−10：１であり、当該温度が約０−55 ℃であり、塩基のＦＦＡに対するモル比が約0.5−５であり、当該混合を５−35分間行い、当該ＩＦＡＳを遠心分離で分離し、液状の植物油を当該反応混合物に添加し、当該動物性脂肪にβ-シクロデキストリンも混合して当該遠心分離中にコレステロールをＩＦＡＳと同時に除去し、β-シクロデキストリンのコレステロールに対するモル比が4.72−6.4：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
当該塩基が水酸化カリウムであり、水酸化カリウムのＦＦＡに対するモル比が0.5−５：１であり、当該アルカリ土類金属塩が塩化カルシウムであり、CaCl2のＦＦＡに対するモル比が約0.25−10：１であり、当該温度が約０−55 ℃であり、塩基のＦＦＡに対するモル比が約0.5−５であり、当該混合を約５−35分間行い、当該ＩＦＡＳを遠心分離により分離し、当該反応混合物に液状の植物油を添加し、当該動物性脂肪にβ-シクロデキストリンも添加して当該遠心分離中にコレステロールを除去し、β-シクロデキストリンのコレステロールに対するモル比が約4.72−6.4：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
当該加工動物性脂肪を、さらに低脂肪ミルク又は脂肪を含まないミルクの中でホモジナイズしてミルク全体を再構成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を減少させ、好ましくはコレステロールを減少させ、動物性脂肪，特に無水ミルク脂肪の融点を低下させるプロセスに関するものである。当該プロセスにはβ-シクロデキストリン及び中和剤である水酸化アルカリ金属（Na又はＫ），脂肪酸受容体であるアルカリ土類金属塩（Ca又はMg塩）、及び特に低融点の植物油で構成される水性液状処方を使用する。本発明は、特に動物性脂肪と液状処方との混合物を緩やかに加熱してＦＦＡを沈殿させ、融点を低下させ、コレステロールをβ-シクロデキストリンで包接し、次に当該混合物を遠心分離して脂肪酸及び包接化合物の不溶性塩を除去するプロセスに関するものである。本発明は特に選択的に当該ＦＦＡを、脂質物質（無水ミルク脂肪）を沈殿させずに、又は無水ミルク脂肪の素敵な揮発性の芳香成分（ラクトン）を損なうことなく、無水ミルク脂肪から除去する問題に対処するものである。
【０００２】
（従来技術の説明）
血清コレステロール濃度が非常に高く、血圧が高く、心電図（ＥＫＧ）に異常が存在すると、これらが心臓発作に寄与する重要因子となることは、ずっと前から知られている。これらの因子が、喫煙，肥満，運動不足の影響よりずっと前に、既に明らかにされていたことは注目すべき事実である。血清コレステロール濃度の重要性は、もう何年も前から強調されてきた。そして、心臓血管研究における最も一貫した発見の一つは、コレステロールの血漿濃度が高くなるとアテローム性動脈硬化症が起こり、冠心臓病（ＣＨＤ）のリスクが高まるという事実であった。この効果は、通常、血漿低密度タンパク質（ＬＤＬ；多くのアテローム性脂タンパク質はこれである）の仲介により起こる（Grundy, S.M., Am. J. Clin. Nutr. 45, 1168, (1987)）。
【０００３】
高血清コレステロール濃度の主な原因は、遺伝子疾患，異種家族性高コレステロール血症（ＦＨ），及び高飽和脂肪値，高カロリー，高コレステロール値の習慣性食餌である。
【０００４】
健康に関する専門家及び医師の一致した意見は、通常、高コレステロール血症の治療では、先ず食餌の管理を行うことがその第一歩となるということである。このことは、後で薬剤治療が必要な場合においても当てはまる。人が移住して食事が変化すると血清コレステロール及びＣＨＤが変化する。このことは、これらの値の変化に食事が大きな役割を演じていることの確かな証拠となっている（Dyerberg, J., Nutrition Review 44 (4), 125, (1986)）。
【０００５】
コレステロールの消費がＣＨＤの主な要因であるとは思えない。しかし、Khosla, P.及びHays, K.C., Biochim Biophys Acta 1210, 13, (1993)は、過剰のコレステロールを食餌から摂取すると、C16:0に富む脂肪の代謝に相乗的な効果が現れ、高コレステロール血症の原因となることを報告している。食餌の中にコレステロールが存在しない場合、脂タンパク質プロフィールが正常な個人においては、C16:0は全血漿コレステロール濃度又はＬＤＬ値の上昇原因とはならないのが普通である（Hayes, K.C., Food Technology Journal 50 (4), 92-97, (1996）。さらにコレステロールの酸化物は有毒であり、組織培養液中の大動脈平滑筋細胞の変質原因となり、これがアテローム硬化を進行させることも報告されている。
【０００６】
ミルク脂肪は酸化に対して安定であり、他の脂肪には無い独特の心地よい芳香を有している。ミルク脂肪は商業的に重要であり、そのために多くの人達の注目を集めてきた。ミルク脂肪を食品に添加すると、加工性に影響を及ぼすような独特の性質を与える。ミルク脂肪は良好な必須脂肪酸源であり、高濃度の短鎖脂肪酸を含み、これが消化を容易にする働きを有している（Kennedy, J., Food Technol. 11:76, (1991)）。さらにミルク脂肪は共役リノール酸（ＣＬＡ）を含有し、その癌抑制に対する潜在能力が認識されている（Yeongら, J. Agric. Food Chem. 37, 75-81, (1989)）。ＣＬＡは、反芻動物製品中に豊富に含まれ、この点で特異な存在である。ＣＬＡは、雌ウシのコブ胃中における多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生物水素化過程で形成され、その後ミルクの中へ入り込む（Gurr, M.I., Advanced Dairy Chemistry, Lipids; Fox, P.F.編, p.349, Chapman & Hall社 (ロンドン), (1994)）。ある疫学的研究において、デンマーク コペンハーゲンの都市部とフィンランドの田舎における食習慣を比較した（MacLennan, R.ら, Am. J. Clin. Nutr. 31:S239, (1978)。フィンランドの田舎では、結腸癌の発生率が４分の１しか無いのである。結腸癌の発生率が低いこの地域では、高発生グループと比較して大量のジャガイモ及び全ミルクを消費し、これに対して白パン及び肉の消費量が低かった。ミルク脂肪には高比率の飽和脂肪酸，主にC16:0（26.3%）及びコレステロール（0.2−0.4%）が含まれており、結腸癌の発生率が高い地域では、これらの消費量が少ない結果となっていた。これは、ミルク脂肪はダイエットに悪いという認識があったためである。
【０００７】
多くの天然脂肪の中で、ミルク脂肪はその化学特性及び機能特性において最も変化に富む脂肪である。ミルク脂肪の融点はその飽和度が上がると高くなり、その脂肪酸成分の鎖長が上がっても高くなる（Walstra, P.ら, Advanced Dairy Chemistry, Lipids (Fox, P.F.編), 第５章, pp. 179-212, Chapman & Hall社 (ロンドン), (1994)）。ミルク脂肪の融点は、グリセリン分子上における脂肪酸残基の位置によっても影響を受ける（Walstraら, 同書）。その天然形において、ミルク脂肪は、種々の食物処方に必ずしも適している訳ではない。例えば、ミルク脂肪の融点範囲は広く、-40−40 ℃にも及んでいる（Walstraら, 同書）。このために冷蔵庫温度において展延性に富むバターを造ることは困難である。最近の消費者は、バターのこの性質は好ましくないと考えている。従って、ミルク脂肪の限られた機能性（注入性及び展延性）故に、現在その新しい使用分野が検討されているところである。
【０００８】
最適な脂肪が常に自然界から得られるとは限らない。動物性脂肪は、その自然状態から見ると、その用途は限られている。しかし、動物性脂肪から望ましい健康特性を有する脂肪を製造することはできる。そのための原材料として動物性脂肪を見た場合には、当該脂肪は経済的に優れた特性を有していると言える。
【０００９】
油脂産業は、脂肪分子を改変する新しい技術を探し求めている。最大の挑戦は、栄養面から、その機能的ニーズを再検討することである。物理的及び栄養的な性能面から、ミルク脂肪同士又はミルク脂肪と植物油の間でエステル交換反応を行わせると、望ましい融点を持つ製品を得ることができる。ミルク脂肪をエステル交換させると、トリアシルグリセリン中における脂肪酸の分布状態が変化し、従って、溶融挙動，結晶化及び可塑性など、その物理的性質が変化する。Christophe, A.M.らArch. Int. Physiol., Biochem. 86:413 (1978）は、ミルク脂肪を化学触媒を使用してエステル交換反応させることにより、ヒトの血漿コレステロール濃度を低下させることを示した。エステル交換を行わせたミルク脂肪は、その膵臓リパーゼによる生体外加水分解速度が、天然のミルク脂肪より速まるようである（Christophe, A.M.ら, Arch Int. Physiol. Biochem. 89, B156, (1981)）。
【００１０】
エステル交換反応は、脂肪或いは脂肪と油のブレンド物を、化学触媒の存在下に比較的低温（50 ℃）で30分間加熱することにより行わせることができる（Eckey, E.W., Ind. and Eng. Chem. 40:1183, (1948)）。触媒は、当該反応を低温，短時間で完結させるために一般に使用されている。アルカリ金属及びアルカリ金属アルキレートが有効な低温触媒であり、その中でもメトキシ化ナトリウムが最も広く使用されている。脂肪をその融点よりほんの少し低い温度で加熱して行う指向性エステル交換反応は、飽和脂肪酸を脂肪から結晶化した三飽和グリセリドの沈殿として除去し（Eckey, E.W., Ind. and Eng. Chem. 40:1183, (1948)）、従って栄養学的な性質（飽和：不飽和の脂肪酸比）を改良する手法として有用である。Eckeyは、25%の飽和脂肪酸を含有する綿実油から、19%の三飽和グリセリドを除去することに成功した。当産業界においては、指向性エステル交換反応を用いてラードの品質を改良することが広く行われてきた（Hawley, H.K.及びHolman, J., Am. Oil Chem. Soc. 33:29, (1956)）。
【００１１】
それにも拘わらず、エステル交換反応がミルク脂肪産業に適用されたことはこれ迄には無かった。ミルク脂肪の風味並びにミルク脂肪中のＦＦＡを除去して精製及び脱臭を行う上において有害であるということから、その可能性が限定されていたからである（Frede, 1991; Bulletin of the International Dairy Federation No. 260/1991）。ＦＦＡが一旦生成すると、これが活性触媒を消費又は不活性化する。Sreenivasan, B., J. Am. Oil Soc. 55:796, (1978）は、酸価（A.V.）0.1は、1000ポンドの油に含まれるメトキシ化ナトリウム0.1ポンドを毒する可能性があることを報告している。このように、ＦＦＡを無水ミルク脂肪から除去する段階は、エステル交換反応を行わせる前の重要な段階である。さらに、ＦＦＡはエステル化された脂肪酸より酸化され易く、従ってミルク脂肪が「苦み」のある無風味な酸化臭を持ち易くなってしまう可能性がある。
【００１２】
米国特許第5,382,442号（Perlmanら, 1995）には、ブレンド工程により植物油，魚油又は動物性脂肪の酸化安定性を改良する方法が述べられている。当該脂肪ブレンド物は、植物油又は魚油及びコレステロール分を低減させた動物性脂肪から成っており、ミリスチン酸１部に対して約２部及び約９部のリノール酸で構成されている。
【００１３】
油脂の精製及び脱臭は、油脂産業において、ＦＦＡ除去の目的で非常に広く使用されている手法である。欧米において多くの精製業者が使用しているアルカリ精製法（Braae, B., J. Am. Oil Chem. Soc. 53:353, 1976; Carr, R.A., J. Am. Oil Chem. Soc. 53:347, (1976)）は、脂肪又は油を75−90 ℃に加熱し、次にこれを油の種類（綿実油，大豆油，トウモロコシ油，椰子油，紅花油，落花生油）により12−18度Be'の水酸化ナトリウム濃縮カセイ溶液で30秒間（短時間混合プロセス）又は28度Be'の水酸化ナトリウムで0.2秒間（超短時間混合プロセス）で処理することから成っている。これらのプロセスをミルク脂肪に使用した場合、ミルク脂肪の主要芳香成分であるラクトンに対して非常に有害である。ラクトン（γ又はδ）はγ又はδ-ヒドロキシ酸の環状エステルであり、濃カセイ溶液の存在下に速やかに加水分解されてヒドロキシ酸の開放鎖塩を生成する。その結果、反応時間が短く、カセイ溶液の濃度が高く、反応温度の高い従来技術によるプロセスをミルク脂肪に適用することはできない。
【００１４】
油脂産業において非常に広く使用されている脱臭操作は、スチームを高真空（３−10 torr）下で200−275 ℃の高温油に吹き込む工程から成っている。脱臭プロセスにより、同時にＦＦＡ，可溶性ビタミン（Ａ，Ｅ，Ｄ，Ｋ），モノグリセリド，ステロール，及びカラテノイドなど幾つかの着色成分が除去される。その用語が示すように、脱臭操作により油脂が持つ芳香及び風味が完全に除去され、何の刺激も無い最終製品が出来上がってしまう。この状態はミルク脂肪としては極端に好ましからざる状態である。従って、水酸化アルカリの濃厚溶液を使用するミルク脂肪の精製及び脱臭は、ＦＦＡ含有量を低下させ、ミルク脂肪の素敵な揮発性の風味，芳香，及びビタミンを失わせる。こうなっては折角のミルク脂肪も、他の安っぽい原材料と同じ類に成り下がってしまう。
【００１５】
米国特許第3,560,219号（Attebery）には、アルカリ性の条件下で金属塩を使用し、チーズ乳漿などの水性食品中で溶解脂質を沈殿させる方法について述べられている。しかし、このプロセスでは、食品中に存在する全脂質が沈殿してしまうので、この方法により遊離脂肪酸だけを選び出すことはできない。従って、このプロセスを無水ミルク脂肪などの純脂質から成る食品に使用することはできない。
【００１６】
このように従来技術において、ミルク脂肪自体を沈殿させること無く又は素敵な揮発性ミルク脂肪の芳香成分を損なうこと無く、ミルク脂肪からＦＦＡを除去する必要性が認識された。ヒトの食餌に関してそのコレステロール含有量に対する関心が高まりつつあるが、これにより、食品加工業者がミルク脂肪からコレステロールを低減させる幾つかの手法を開発するに至った。
【００１７】
（ミルク脂肪中のコレステロールを酵素により低減する方法）
NADPHの存在下にコレステロール レダクターゼの触媒作用により、コレステロールをコプロスタノールに変換することができる。コプロスタノールは、吸収されること無く身体の中を通過する（MacDonald, I.A.ら, J. Lipid Res. 24:675, (1983); 「今日に至るまで、大きな成功は得られていない」）。37 ℃においてコレステロール オキシダーゼでミルクを処理したところ、３時間以内にコレステロール濃度が78%に低下した（Smith, M.ら, Journal of Agricultural and Food Chemistry 39:2158, (1991)）。しかし、この方法で生成するコレステロールの酸化物には毒性があることが報告されている（Peng, S.K.及びMorin, R.J.,「コレステロール酸化物の生物学的影響」, CRC Press社 (Boca Raton, Ann Arbor, London, 1991）。無水ミルク脂肪にこれらのプロセスを適用するのは、余り実際的な方法とは言えない。
【００１８】
（短絡蒸留〔ＳＰＤ〕）
ＳＰＤは、事実上ガスが存在しない空間（例えば真空中）へ分子を蒸発させるプロセスである。その制御因子は、分子が蒸留液体の加熱表面から逃散して氷冷されたコンデンサー表面により受け取られる速度である。ビタミンＡ及びＥ、ステロール並びに揮発性成分を天然油から除去し、モノグリセリド及びジグリセリドを脂肪酸から分離する操作は、化学薬品及び医薬品分野以外では食品関連用途で行われている。Arulら（J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1642, 1988）は、温度245 ℃及び265 ℃、圧力220及び100 mm Hgにおいて、ＳＰＤによりミルク脂肪を４分画に分別した。室温において、その中の２分画が液体，１分画が半固体，１分画が固体であった。天然のミルク脂肪にはコレステロールが2.6 mg/g脂肪の濃度で含まれ、当該液体分画にはコレステロールが16.6 mg/g-脂肪の濃度で含まれていた。これに対して固体分画のコレステロール含有量は0.2 mg/g脂肪であった。ミルク脂肪のＳＰＤは、ミルク脂肪から化学的及び物理的性質の異なる分画を得る機会を提供する。しかし、この手法には大きな欠点も存在する。即ち、（１）コレステロール低減が観察された低収量の分画が固体であること；（２）高温を使用するので、例え真空下で蒸留しても、トリアシルグリセリン，特に不飽和度の高いトリアシルグリセリンが分解又は重合してしまう可能性があること；及び（３）資本投資額が大きいことなどである。
【００１９】
（超臨界流体抽出〔ＳＦＥ〕）
このプロセスにおいては、製品を高密度，低粘度，及び低表面張力のガス（通常は二酸化炭素）を使用し、高温高圧下で処理する。この手法は、タンパク質から脂質を除去し、種々の食品に含まれるコレステロールの量を低減させ、コーヒー及び紅茶からカフェインを除去し、ホップから苦味のある芳香性化合物を除去する目的で使用されてきた。この手順には、潜在的毒性を有する溶剤を使用せず、毒性のある副産物が生成しないという利点がある（Friedrich, J.P.及びPryde, E.H., J. Am. Oil Chem. Soc. 61:223 (1984)）。ArulらJ. Food Sci. 52:1231-1236 (1987）は、10−35 MPa及び50−70 ℃において、ミルク脂肪を８つの異なる分画に分別した。彼らは、コレステロールが低融点及び中間融点分画に濃縮される傾向にあることを見いだした。Lim, S.及びRizvi, S.S.H., J. Food Science 61 (4):817-821, (1996)は、工程収率88.5%で、92.6%の全コレステロールの低減を達成した。この場合、抽出は40 ℃, 24.1−27.5 MPaで行った。超臨界二酸化炭素を溶媒として使用すると、これが無差別な溶解性を示し、トリアシルグリセリンの中にもコレステロールとともに抽出されるものがあり、そのために、ミルク脂肪の正常な芳香バランスが攪乱される可能性がある。コレステロール濃度の低減操作においては、これが主な欠点となる。
【００２０】
（真空水蒸気蒸留）
ヨーロッパでは、油の脱酸性及び脱臭を行う目的で真空水蒸気蒸留が長年に亘り行われてきた。この手法は、超過熱状態の水蒸気を高真空下で200−275 ℃に加熱した油の中に吹き込む操作である。General Mills, Inc.（米国ミネアポリス）は、バター油のコレステロール低減及び脱酸性化を、真空水蒸気蒸留により同時に行うプロセスについて開示している（Manchester及びFine, 米国特許第4,804,555号, 1989）。この手法により達成されるコレステロールの除去率は90%であり、収率は95%であった。この手法の主な欠点は、過熱水蒸気がミルク脂肪中に含まれる揮発性の芳香性化合物を、コレステロール及びＦＦＡとともに完全に取り去ってしまうことである。バターの素敵な風味が無くなると、ミルク脂肪の品位は他の安物脂肪と同じ水準に落ち込んでしまう。
【００２１】
（錯体の形成）
この手法は、ミルク及び酪農製品中のコレステロールを、コレステロール及びそのβ-シクロデキストリン（β−ＣＤ）などのエステルを錯体化剤と錯体化して低減させる目的で使用されている。
【００２２】
シクロデキストリンは、澱粉の酵素分解により得られる環状のオリゴ多糖類である。シクロデキストリンは、ドーナツ型に環状配列された６個，７個又は８個のグルコース単量体から成っており、これらはそれぞれα，β又はγシクロデキストリンと呼ばれている。β−ＣＤに吸湿性は無いが、温度30 ℃，相対湿度（ＲＨ）86%においては13.6%の水分を含有している（Szejtli, J.ら, Inclusion Compound 3:331, (1984)）。シクロデキストリンは、分子の外縁に存在する遊離ヒドロキシル基のために水に溶解する（Szejtli, J.ら, Inclusion Compound 3, 331, (1984)）。シクロデキストリンの溶解度は温度の関数である。温度が高ければ高い程、シクロデキストリンの溶解度は高くなる。β−ＣＤの溶解度は0.5 ℃においては0.8%であるが、90 ℃においては39.7%まで増加する。内部空洞が疎水性であるために、シクロデキストリンは芳香族アルコール，脂肪酸及びそのエステル並びにコレステロールなどの分子と錯体を形成することができる。β−ＣＤはミルク脂肪中のコレステロールを低減させる用途に使用されてきたが、それには幾つかの理由がある。
【００２３】
１−β−ＣＤ内部空洞の相対的サイズ及び形状により、遊離コレステロール及びエステル化コレステロールと良好な状態で錯体化できること；
２−β−ＣＤの工業規模の生産が実現したこと；
３−過去10年間にβ−ＣＤの毒性に関して集中的に研究が行われ、これによりその食品添加剤としての安全性が保証されたこと。
【００２４】
現在、シクロデキストリンが使用されている用途は下記の通りである。即ち、
（１）病原菌，昆虫，及び雑草を駆除する農業用化合物の揮発性を制御する；
（２）医薬品（医薬，ビタミン），芳香剤，及びスキンケア ローションに添加し、これらの薬品を包み込んでその安定性を改良する；（３）清涼飲料水及び加工食品の色，臭い，及び香りの安定性を高める（Szejtli, J., Inclusion Compound 3:311 (1984)）。
【００２５】
与えられた分子が錯体を形成できるかどうかを決める最も重要な変数は、シクロデキストリンの空洞に対するその相対的な疎水性，相対サイズ及び形状である（Szejtli, J., Inclusion Compound 3, 331, (1984)）。水に溶解させた場合、シクロデキストリンの分子は自分より小さな宿借分子、又は水より親水性の低い分子の官能基を、その内部空洞の中に取り込むことができる（Szejtli, J., Inclusion Compound 3, 311, (1984)）。水溶液においては、極性がやや低いシクロデキストリンの空洞が水分子により一旦占拠される。しかし、この反応はエネルギー的には起こりにくい反応である（極性−非極性相互作用）。従って、これらの水分子は、例えば「コレステロール又はＦＦＡ及びそのエステル」（水と比較してこれらの極性は低い）のような適切な宿借分子により容易に置換される（Szejtli, J., Inclusion Compound 3:311, (1984)）。
【００２６】
ラットに対して最高1.6 g/kg-体重/日、イヌに対して最高0.6 g/kg-体重/日のβ−ＣＤを与え、６カ月間に亘りその経口慢性毒性を試験した（Szejtli, J., Inclusion Compound 3:311, (1984)）。体重増加，食物消費，及び臨床−生化学的測定値に対する影響は認められなかった。又、β−ＣＤは胚毒性効果を示さなかった。このように、経口投与した場合において、β−ＣＤは無毒物質であると考えることができる（Szejtli, J., Inclusion Compound 3:311, (1984)）。
【００２７】
米国特許第4,880,573号（Courregelongueら, 1989）は、10% β−ＣＤを使用して、無水ミルク脂肪から41%のステロールを除去する方法について述べている。EP-A1-0 326 469（Bayolら, 1989; ヨーロッパ特許）は、80%のΔ4-コレステン-3-オンを無水ミルク脂肪から除去できることを指摘している。米国特許第5,232,725号（Roderbourgら, 1993）は、錯体化剤としてβ−ＣＤを使用し、動物性脂肪から単一操作で37%以上のコレステロールを遊離脂肪酸とともに除去するプロセスについて述べている。米国特許第5,264,241号（Grailleら, 1993）は、β−ＣＤを使用して、クリームから50%のコレステロール及び52%のＦＦＡを同時に除去する方法について報告している。米国特許第5,223,295号（Maffrandら）は、ステロイド化合物を水性媒体中で５時間攪拌してシクロデキストリンにより錯体化させることにより、動物性脂肪からコレステロールを除去するプロセスについて述べている。このプロセスは比較的長時間を要するだけでなく、単一操作によるコレステロール含有量の減少幅も小さい。米国特許第4,980,180（Cullyら, 1990）は、β-アミラーゼを使用して、β−ＣＤを卵原料から除去する方法について述べている。この特許は、シクロデキストリンの除去が不完全であることに問題があることを認めている。オーストラリアにおいては、Okenfullら (1991; PCT W091/11114) がSIDOAKと呼ばれる酪農製品のコレステロール低減プロセスを発明している。このプロセスは、ミルクにβ−ＣＤを添加して10 ℃より低い温度で混合するプロセスから成っている。コレステロールとβ−ＣＤの不溶性錯体は、遠心分離によりこれを除去している。得られたコレステロールの最大減少幅は80−90%であった。Yen, C.G.及びTsai, L.J.（J. Food Sci. 60:561, 1995）は、10% β−ＣＤを使用することにより、95%のコレステロールが50%のＦＦＡと同時にラードから除去されることを示した。米国特許第5,484,624号（Awadら, 1996）では、β−ＣＤを使用して、卵黄に含まれるコレステロール濃度を96%低下させている。このプロセスにおいては、希釈した卵黄（９＜ｐＨ＜10.5）をβ−ＣＤとともに50 ℃で10分間混合する。β−ＣＤとコレステロールの錯体は媒体から遠心分離によりこれを除去する。
【００２８】
動物性脂肪中のコレステロール及びＦＦＡを減少させるために開発された全てのβ-ＣＤプロセスから得られる総括的な結論は、このプロセスには今だにその改良余地が存在するということである。エステル交換反応により無水ミルク脂肪を修飾して、その栄養学的及び機能的な性質を改良する方法においては、ＦＦＡ含有量が高いためにこれが触媒を毒してしまい、これが今だに当該方法の制約となっている。
【００２９】
従来の技術において、このようにミルク脂肪をエステル交換反応法又はブレンド法によりそのコレステロール含有量を減少させる場合、少なくともミルク脂肪に含まれる揮発性の芳香成分（特にラクトン）を損なうこと無くコレステロールとＦＦＡを同時に減少させるプロセスを開発することが必要であり、それが無い限り脂肪製品の製造において競争力を持ち得ないであろうことが認識されている。ミルク脂肪の溶融範囲が-40−40 ℃（Walstraら, 同書）と広いことが、冷蔵庫温度で展延性を有するバターの製造を困難にしている。冷蔵庫温度における展延性は、バターが持つべき好ましい性質として、近年多くの消費者がこれを求めている。従って、ミルク脂肪の新しい用途分野は、その機能性（注入性及び展延性）に問題が残されているために、依然として制約を受けたままの状態が続いている。ミルク脂肪を物理的に分別して種々の分画に分けることにより、その溶融性は適度に改良された。しかし、この公知プロセスには長時間を要し、コストが嵩む飽き飽きするようなプロセスである。分画法のもう一つの欠点は、ミルク脂肪の正常な芳香バランスが乱されることである。従って従来技術には、融点が低く軟らかで、冷蔵庫温度でも展延性のあるミルク脂肪を造れるようなプロセスの出現が必要であり、このことは広く認識されている。
【００３０】
（目的）
動物性脂肪，特にミルク脂肪から遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を除去できるような改良プロセスを提供することが、本発明の目的である。さらに、動物性脂肪からコレステロールが除去されるようなプロセスを提供することも、本発明の目的である。さらに、動物性脂肪の融点を低下させるようなプロセスを提供することも、本発明の目的である。さらに、安価に実施でき、芳香を逃がすことなく動物性脂肪の中に保存することができ、従来から存在する設備をそのまま使用して容易にその大容積を完全シールできるようなプロセスを提供することが、本発明の目的でもある。下記の記述及び図面を参照することにより、本発明のこれら目的及びその他目的が、次第に明らかとなるであろう。
【００３１】
（発明の要約）
本発明は、無水液状動物性脂肪中に存在する遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を減少させ、加工動物性脂肪を生成させるプロセスに関するものであり、下記の反応ステップで構成される：（ａ）液状動物性脂肪中の遊離脂肪酸と、水酸化カリウム，水酸化ナトリウム及びこれらの混合物から成るグループから選ばれた水酸化アルカリ金属の水溶液とを高温で混合して反応させ、液状動物性脂肪中に存在するＦＦＡを可溶性の脂肪酸塩（ＳＦＡＳ）に変えた反応混合物を提供し；
（ｂ）当該ＳＦＡＳを当該反応混合物中でステップ（ａ）と同時又はステップ（ａ）の後でアルカリ土類金属塩と反応させて、当該ＳＦＡＳに不溶性の脂肪酸塩（ＩＦＡＳ）を形成させ；
（ｃ）当該ＩＦＡＳを当該反応混合物から分離して加工動物性脂肪を形成させる。
【００３２】
特に、本発明はβ-シクロデキストリンを使用してコレステロールを遊離脂肪酸とともに除去する方法に関するものでもある。さらに本発明は、植物油を加工動物性脂肪とともにブレンド物に添加し、ブレンド物の融点を低下させる方法に関するものでもある。
【００３３】
（好ましい態様の説明）
本発明は、水性液状処方のβ-シクロデキストリンを使用して、ＦＦＡ，並びに好ましくは融点を低下させ、且つ無水ミルク脂肪中のコレステロール量を減少させるプロセスを提供するものでもある。当該水性液状処方は、水酸化アルカリ金属（Na, Ｋ），アルカリ土類金属（Ca及びMg），及び低融点植物油の混合物から成っている。当該液状処方は、単一操作で目標を達成する目的で特に設計され、このことが本発明に対して、従来技術によるプロセスに比べて多くの利点を与えるものである。本プロセスにおいては、ミルク脂肪の芳香を損なわないように、非常に温和な実験条件下に、脂肪受容体として非常に希薄な濃度（0.023−0.058%）の水酸化アルカリ金属（Na又はＫ）並びにカルシウム又はマグネシウム塩を滴加し、無水ミルク脂肪中のＦＦＡを選択的に沈殿させる。また本プロセスでは、ミルク脂肪中に存在する遊離脂肪酸に対して化学量論量の水酸化アルカリ金属を使用し、ミルク脂肪自体を沈殿させ又は損なってしまうこと無く、遊離脂肪酸を選択的に除去する。本プロセスでは、ミルク脂肪の損失を抑え、収率を向上させ、コレステロールの減少幅を増加させる目的でアルカリ土類金属を使用する。本プロセスにおいては、低温で比較的長時間の反応を行わせてＦＦＡを減少させる。この条件がミルク脂肪の芳香成分であるラクトンを逃がすことなく、これを有効に保護してくれる。本プロセスはコレステロールの錯体化剤としてβ-ＣＤを使用し、同時に無水ミルク脂肪中のコレステロール量を減少させ、その融点を下げ、ＦＦＡ量を低下させることができる。本プロセスは、商業的に可能な時間範囲内において、動物性脂肪中に含まれるコレステロール量，ＦＦＡ量及び融点を著しく低下させる。
【００３４】
（材料及び方法）
商業グレードの無塩バター，牛脂及びラードは、地域の食品店から入手した。55 ℃で溶かし、5000 x g，室温で10分間遠心分離し、最上部の脂肪層をホワットマン１号濾紙を通して濾過して、無塩バターを無水ミルク脂肪（ＡＭＦ）に変換した。当該ＡＭＦを-20 ℃で保存し、その後にこれを使用に供した。
【００３５】
ＡＯＡＣ公式分析法 (公式分析化学者協会：Association of Official Analytical Chemists，ワシントンＤＣ), 第16版, 994.10, 1995の手順に従って、全コレステロールを抽出してこれを定量した。ヒューレット パッカード社（ペンシルバニア州アボンダール）製5890A ガスクロマトグラフ（ＧＣ）に水素炎イオン化検出器，及び0.1 μm厚のＤＢ−１（100% メチルポリシロキサン）フィルムをコーティングして調製した溶融シリカ キャピラリカラム（15 m x 0.25 mm； J & W Scientific社, カリホルニア州フォルソム）を装備し、これを使用して、全コレステロールを誘導体化せずにそのままの形で定量した。
【００３６】
ＦＦＡは、ＡＯＡＣ公式分析法 (公式分析化学者協会，ワシントンＤＣ), 第16版, 996.17, 1995の手順に従ってこれを定量した。
【００３７】
統計学的解析は、第二水準モデル対応のソフトウェア パッケージ〔SAS Institute, Inc.（ノースカロライナ州ケーリー）〕, ＳＡＳユーザーガイド第５版（1985），及びジェネレート レスポンス サーフェス プロット（Sigma社, 199?）を使用してこれを実施した。各応答（Ｙ）に対して提案されたモデルは、下式の通りであった。
Ｙ＝Ｂo ＋ ΣＢiＸi ＋ ΣＢiiＸi2 ＋ ΣＢijＸiＸj
ここに、Ｂo, Ｂi, Ｂii, Ｂijは定数であり、本モデルの回帰変数である。Ｘiはコード化独立変数である。ある変数を完全回帰から除外する場合、Ｒ2値及びｆ−テストの有意性に基づきこれを実施した。
【００３８】
（プロセスの開発）
ＦＦＡの除去プロセス
無水ミルク脂肪（ＡＭＦ）からＦＦＡを除去する優先的プロセスの概要を、図１に示す。このプロセスは、低濃度のアルカリ溶液及び低温（40−50 ℃）を使用し、反応に比較的長時間をかけて実施される。この点、本発明は、（綿実油、トウモロコシ、大豆及びヤシ油における）従来技術とは対照的である。従来技術においては、濃アルカリ溶液（12−28度Be'），高温（75−95 ℃），及び短時間反応（0.2−30秒）を使用する。次に、各ステップに関する理論について記す。本発明プロセスにおける精製用溶液は、本プロセスにおいて精製ステップを成功させる場合の鍵となる重要因子である。当該精製用溶液は、水酸化アルカリ金属（Na又はＫ）及びCa又はMgの塩化物から成る水性混合物である。
【００３９】
（例１）
水酸化アルカリ金属の希薄溶液（ＫＯＨ：ＦＦＡモル比＝１）をＦＦＡ（１）又はそのエステル（２）と反応させると、下記の反応が起こる。
ＲＣＯＯＨ  ＋  ＫＯＨ  ＝  ＲＣＯＯＫ  ＋  Ｈ2Ｏ    （１）
ＲＣＯＯＲ’＋  ＫＯＨ  ＝  ＲＣＯＯＫ  ＋  Ｒ'ＯＨ  （２）
ＫＯＨの量は、ＡＭＦに含まれるＦＦＡ量の関数である。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比を１にすることにより、図１に示した実験条件下において、当該媒体中に存在する全てのＦＦＡを充分に中和することができる。アルカリ溶液を過剰に使用すると、中性脂肪まで鹸化して損ねてしまい、収率にとって非常に有害である。アルカリ溶液を過剰に使用すると、過剰のＯＨ-が下記２つの反応によりラクトンを加水分解させて対応するヒドロキシ酸に変えてしまうので、芳香に対しても非常に有害である。
0003943836.tif 000002
【００４０】
ＫＯＨ：ＦＦＡモル比がＦＦＡ及び収率の減少に対して与える影響を、図２に示す。
【００４１】
（比較例２）
図１に示したプロセス概要に従い、ＦＦＡ0.293%を含む無水ミルク脂肪10 (g)を、先ずCaCl2 0.763%を含むｄＨ2Ｏ10 mLと混合した。CaCl2溶液のｐＨは、水酸化カリウムでアルカリ側（ｐＨ＝7.5−8.5）に調節した。アルカリ側のｐＨで得られた遊離脂肪酸の減少量は20%を下回っており、水酸化カリウムをCaCl2より後で添加することは適切でないことが分かる。
【００４２】
（比較例３）
図１のプロセス概要に従い、ＦＦＡ0.293%を含む無水ミルク脂肪10 (g)を、CaCl2 0.763%を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液10 mLと混合した。緩衝液のｐＨは、7.5から8.5まで変化させた。アルカリ性ｐＨにおいて得られた遊離脂肪酸の減少量は35%を下回っていた。この結果は、例２と同様である。
【００４３】
（例４）
CaCl2：ＦＦＡのモル比がＦＦＡ量の減少及び収率に及ぼす影響を、図３に示す。Ca又はMgの塩化物をカルボキシレートの受容体として使用した。これらの塩化物が持つ下記能力を利用するために、これら塩化物を精製用溶液に添加する必要があった。即ち、
（１）カルボキシレートと反応して不溶性塩（石灰石と類似の塩）を生成し、従ってその媒体から遠心分離により効率的にこれを分離することができるようになる；
（２）可溶性のＫ又はNa石鹸と反応して不溶性石鹸を形成し、乳化による中性脂肪の損失を最低限に抑え、従って収率を向上させる；
（３）ＦＦＡ及びＫＯＨの減少幅を相乗的に増加させる；
（４）下記反応の発生を抑制することによりＦＦＡ量を減少させる。
ＲＣＯＯ- ＋ Ｈ2Ｏ−−−→ ＲＣＯＯＨ ＋ ＯＨ-
←−−−
カセイ溶液はその過剰ヒドロキシル基が収率及び芳香に対して有害作用を及ぼすので、カセイ溶液ではなくCaCl2又はMgCl2による過剰カチオンの存在が必要である。
【００４４】
（例５）
精製用溶液のＡＭＦに対する重量比は、乳化による損失が発生するために、収率にとって重要である。しかし、図１に示した実験条件下においては、ＡＭＦに対する精製用溶液の重量比を種々に変化させても、図４に示すように、収率の著しい低下は起こらなかった。
【００４５】
（例６）
混合速度がＦＦＡの減少及び収率の低下に及ぼす影響を、図５に示す。精製用溶液をＡＭＦに添加した後で混合物を完全に混合して、精製用溶液中の溶質とＦＦＡとを確実に接触させるべきである。この工程で使用したミキサーは、LIGHTNIN LAB MASTER, モデルL1U03, インペラー型 A100（直径：１インチ）であった。
【００４６】
（例７）
図６に示すように、全てのヒドロキシル基（OH-）がＦＦＡにより消費され、中和された。混合時間及び混合温度は、収率にとって非常に重要である。濃厚なカセイ溶液の存在下，高温で長時間混合すると、過剰のカセイ化合物が中性油を鹸化してしまうので、当該鹸化による損失量が増大する。油用に使用される従来プロセスにおいては、高カセイ濃度及び高温において、鹸化による損失を防ぐために非常に短時間の混合を行ってきた。しかし、本発明においては、非常に希薄なカセイ溶液（ＦＦＡ：ＫＯＨのモル比＝１）の濃度，及びＡＭＦを精製用溶液で完全に溶融させて微細なエマルションを創るのに充分な低温を使用し、広範囲の混合時間（１−10分間）について試験を行った。しかし、収率への影響は認められなかった。
【００４７】
（例８）
先ず、試験に使用した遠心分離力について、その範囲を図７に示す。得られた石鹸を、遠心分離により媒体から分離した。ＡＭＦが結晶化して石鹸の分離度が低下しないように、当該混合物は直ちにこれを遠心分離することが好ましい。遠心分離は迅速且つ高効率でこれを行うことができた。
【００４８】
（例９）
ＦＦＡ 2.07%を含む牛脂10 (g)を精製用溶液（ＫＯＨ 0.412%及びCaCl2 5.409%）10 mL及びLIGHTNIN LAB MASTER（ＳＩ）ミキサー モデル L1U03, インペラー型 A100（直径：１インチ）を使用し、1800 rpmの混合速度で、温度が70 ℃に達するまで混合した。温度が70 ℃に達した後、混合速度はそのまま（1800 rpm）にして、直ちにミキサーのタイマーを１分に設定した。得られた石鹸を、8700 x g，室温，10分間の条件で、直ちに遠心分離した。ＦＦＡ量が低下した牛脂を上澄相から回収した。精製牛脂のＦＦＡ含有量は0.08% であった。96.01%のＦＦＡ量低下が達成された。
【００４９】
（例１０）
ＦＦＡ0.122%を含むラード10 (g)を精製用溶液（ＫＯＨ 0.024%及びCaCl2 0.326%）10 mLと、LIGHTNIN LAB MASTER（ＳＩ）ミキサー, モデル L1U03, インペラー型 A100（直径：１インチ）を使用して、混合速度1800 rpmで温度が50 ℃に達するまで混合した。温度が50 ℃に達した後、混合速度を同じ値（1800 rpm）に据え置いたまま、直ちにミキサーを１分に設定した。得られた石鹸を、8700 x gで10分間，室温で直ちに遠心分離した。ＦＦＡ量を低下させたラードを上澄相から回収した。精製ラードのＦＦＡ含有量は0.02%であった。83.60%のＦＦＡ量低下が達成された。
【００５０】
動物性脂肪中のＦＦＡ量を低下させるプロセスは、中和剤として水酸化アルキル金属を使用し、脂肪酸受容体としてCa又はMgの塩を使用するプロセスである。この反応を、希薄な精製用溶液，低温及び比較的に長い反応時間を使用して行わせるというのが、このプロセスの概念である。油の精製に使用される従来技術によるプロセスと比較して、このプロセスには、大きな実用上の利点に繋がるような多くの特徴がある。このプロセスは従来技術によるプロセスに比べて効率が高く、ＡＭＦ中のＦＦＡ量を0.02%まで単一工程で低下させることができ、特に脱臭を行う必要も無かった。このプロセスでは温和な実験条件を使用するので、ＡＭＦの素敵な芳香成分，即ちラクトンが失われることも無い。
【００５１】
（ＦＦＡ及びコレステロールを除去するプロセス）
図８に、ＡＭＦ中のコレステロール及びＦＦＡの量を低下させるために開発したプロセスについて、その概要を示す。
【００５２】
（例１１）
コレステロール0.395%及びＦＦＡ0.293%を含むＡＭＦ10 (g)を、1000 rpmで温度が50 ℃に達するまで、精製用溶液（ＫＯＨ0.0583%及びCaCl2 0.763%）10 mLと混合した。50 ℃において、当該混合物を同じ速度でさらに10分間攪拌しながら、これにβ-シクロデキストリン650 mg（β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比＝5.58）を添加した。得られた石鹸及びβ-シクロデキストリン：コレステロール錯体を、8700 x gで10分間、室温で直ちに遠心分離した。ＡＭＦ中で減少したコレステロール及びＦＦＡを、上澄相から回収した。達成されたコレステロール及びＦＦＡの低下幅は，それぞれ54及び92%であった。
【００５３】
（例１２）
コレステロール0.395%及びＦＦＡ0.293%を含むＡＭＦ10 (g)を、蒸留水10 mLと、回転速度1000 rpmで、温度が50 ℃に達するまで混合した。50 ℃において、当該混合物に、同じ速度でさらに10分間，室温で混合しながらβ-シクロデキストリン650 mg（β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比＝5.58）を添加した。得られたβ-シクロデキストリン：コレステロール及びβ-シクロデキストリン：ＦＦＡの錯体を、8700 x gで10分間，室温で直ちに遠心分離した。ＡＭＦ中で減少したコレステロール及びＦＦＡを、上澄相から回収した。達成されたコレステロール及びＦＦＡの減少幅は、それぞれ54及び49.65%であった。ＡＭＦ中のＦＦＡが42.35%も減少したことから、この実験結果は、ＡＭＦ中のＦＦＡ減少量を改良する上で精製用溶液が重要な役割を果していることを示している。さらに、コレステロールの減少幅が一定値に保たれたことから、当該精製用溶液は、コレステロールとβ-シクロデキストリンの間で錯体を形成する反応には影響を与えなかったことが分かる。
【００５４】
（例１３）
希望する反応に対して影響を与える因子及び相互作用が数多く存在する場合、当該プロセスの最適化には、応答表面法（response surface methodology：ＲＳＭ）を有効なツールとして使用することができる（Hunter, 1959）。このように応答表面法を使用することにより、独立変数（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，CaCl2：ＦＦＡのモル比，混合時間，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比，及び混合速度）の組合せを最適化し、これから得られるコレステロール及びＦＦＡ量の低下幅を最大化することができた。この場合、２種類の応答について測定を行った。即ち比較対照中コレステロール量に対するサンプル中全コレステロール量の比率を求め、これに100を掛けてコレステロール減少率（%, Ｙ1）とした。また比較対照中ＦＦＡ量に対するサンプル中ＦＦＡ量の比率を求め、これに100を掛けてＦＦＡ減少率（%, Ｙ2）とした。予備実験の結果に基づき、５個の独立変数（表１に示す）をＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，CaCl2：ＦＦＡのモル比，混合時間，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比，混合時間とした。その他の重要な独立変数，即ち温度及び遠心分離の条件（8700 x g, 10分, 室温）についてはこれを固定した。実験設計においては、５個の因子（５水準の中央複合値）を採用した（John L. Gill,「動物実験及び医療科学実験の設計及び解析」, 第(2)巻, 第９章, ミシガン州立大学, 1993）。独立変数のコード化値を-２（最低水準），-1.0（中央水準），1.0 及び２（最高水準）とした。試験で使用した各独立変数に対しては、図８記載の予備試験の結果に基づき、その中央値（０）を選んだ。表２に示した完全設計は32個の実験点から成っており、その中に中央値の応答が６個含まれていた（０，０，０，０，０）。
0003943836.tif 000003
0003943836.tif 000004
【００５５】
適合性テストを行うために、回帰変動解析（ANOVA）を実施した。各応答値の変動解析結果並びに対応多重決定係数（Ｒ2）及び変動係数（ＣＶ）を、表３に示す。Ｆ値及びＲ2値の解析結果から、５個の独立変数中４個（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，混合時間，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比，及び混合時間）だけがコレステロールの減少率（Ｙ1）に影響を与えているように思われた。事実、塩化カルシウムを当該モデルから除外したにも拘わらず、Ｒ2は高い値（0.95）を保ち、Ｆ−テストの有意性も＜0.001に維持されていた。当該４個の選択因子の（Ｙ1）に対する推定回帰係数及び当該係数に関する有意性テストの結果を、表４に示す。また、Ｆ値及びＲ2値の解析結果から、５個の独立変数中３個（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，CaCl2：ＦＦＡのモル比，及び混合速度）だけが、ＦＦＡ量の減少率（Ｙ2）に影響を与えているように思われた。混合時間，β-シクロデキストリンを除外しても、Ｒ2は高い値（0.96）を保ち、またＦ−テストにおける有意性は＜0.001の水準を維持していたので、当該モデルへの影響は無かったものと考えられる。これら３個の選択因子係数に関して（Ｙ2）の推定回帰係数を求め、有意性テストを実施した。その結果を表５に示す。当該モデルの中で、適合性の欠如を示した因子は存在しなかった。両モデルとも満足なＲ2値を示し、Ｆ−テストにおいても＜0.001の水準で有意性を示したので、これらのモデルは適切且つ使用可能であると考えられた。このモデルを使用して予測したＹ1値，Ｙ2値，及び残差値を、表６及び７に示した。
【００５６】
〔Ｙ1値（コレステロール減少率）に基づく最適化〕
モデルＹ1は、コレステロール減少率を最大化するために変数変更の方向性を定める場合に有用である。回帰係数（表４）が有意であることから判断して、コレステロールの減少率に影響を与える最も重要な因子はＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，混合時間，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比，及び混合速度であると考えられる。これらの因子は、いずれも一次有意性，二次有意性及び二因子相関性を示した。
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【００５７】
（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比）
ＫＯＨを使用してＦＦＡを中和し、これを媒体から除去した。検討したＫＯＨ：ＦＦＡモル比の範囲を表２に示す。勾配が負〔ｂ1＝-3.99（表４）〕であることから、ＫＯＨ量を増やすとコレステロール量の低下幅が、いずれの混合時間又は混合速度においても減少したことが分かった（図９及び１０）。ＫＯＨ量がコレステロール量の減少に及ぼす負の効果は、媒体中に存在するＦＦＡを石鹸分子に変化させるＫＯＨの能力に起因するものと考えられる。当該石鹸分子の媒体中濃度（10.39 mM）が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回っているので、当該石鹸分子は凝集してミセルを形成する。オレイン酸ナトリウムでは、当該ＣＭＣは1.5 mMであると報告されている（Small, D.M., Molecular Biology and Biotechnology, Meyers, R.A.編, 503-511, VCH Publishers, Inc. USA, 1995）。負に帯電したカルボキシル酸エステル基がミセル表面に突き刺さり、β-シクロデキストリン分子の外縁に存在するヒドロキシル基と水素結合を形成し、コレステロールとβ-シクロデキストリン分子を奪い合う。
【００５８】
図１１に示すように、ＫＯＨの負の効果に対抗させるためにβ-シクロデキストリン：ＦＦＡのモル比を増大させる方法は、経済的に成り立たない。応答表面の形状（図１１）及び２因子相互作用項の勾配（Ｂ1Ｂ4＝12.86）が、これら２つの変数間に強い相互作用が存在することを示している。カルシウム塩は、カルボキシル酸エステルの受容体として作用する。カルシウム塩の添加により、実験#18及び#19（表２）に示す通り、コレステロール量の低下幅が少なくとも約15%増加した。カルシウム塩は可溶性のカリウム石鹸と反応して不溶性のカルシウム石鹸を形成し、これにより石鹸のミセルが破壊され、従って石鹸ミセルがコレステロール量の低下に及ぼす有害作用を消してくれる。本実験範囲内で使用したCaCl2：ＦＦＡのモル比は、本モデルに対して著しい影響を与えなかった。検討したCaCl2：ＦＦＡモル比の範囲を、表２に示す。
【００５９】
（混合時間）
コレステロール量の減少率Ｙ1は、混合時間に対して強い依存性を示した。正の勾配Ｂ3＝10.76は、β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比又は混合速度を増加した状態でさらに混合時間を延長すると、コレステロール量の低下幅が増加したことを示している（図１２及び１３）。検討した混合時間の範囲を、表２に示す。
【００６０】
（β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比）
理論的に言って、錯体を形成するβ-シクロデキストリンと化合物のモル比は、通常１：１である（Szejtli, J., Inclusion Compound 3:331, (1984)）。但し、化合物の分子量が特に大きい場合には、２個のシクロデキストリン分子と錯体を形成する場合も存在する（Szejtli 1984, 同書）。検討したβ-シクロデキストリン：コレステロールのモル比範囲を、表２に示す。コレステロール量の低下はβ-シクロデキストリン：コレステロールのモル比に強い依存性を示した。正の勾配Ｂ4＝4.97は、β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比の増加とともに、コレステロール量の低下幅が増加したことを示している（図１４）。
【００６１】
（混合速度）
β-シクロデキストリンとコレステロールを確実に接触させ、水中油エマルションを安定化させるためには、混合速度が重要因子の一つであると考えられる。温度が50 ℃に到達したら、直ちにβ-シクロデキストリンを添加し、LIGHTNIN LAB MASTER（ＭＳ）ミキサー モデルL1U03，及びA100型インペラー（直径：１インチ）を使用して10分間混合した。コレステロール量の低下は、混合速度に強い依存性を示した。正の勾配Ｂ5＝30.44は、コレステロール量の低下幅が、全てのβ-シクロデキストリン：コレステロールのモル比において、混合速度の増加とともに著しく増加したことを示している。応答表面の形状（図１４）は、β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比と混合速度の間に強い相互作用が存在することを示している。検討した混合速度の範囲を、表２に示す。
【００６２】
〔Ｙ2（ＦＦＡの減少率）に基づく最適化〕
モデルＹ2は、ＦＦＡの減少率を最大化するための方向性を示す指標として有用である。有意回帰係数（表５）から判断して、ＦＦＡ量の低下に対して影響を与える最も重要な因子は、ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比，CaCl2：ＦＦＡのモル比，及び混合速度である。これらの因子は、有意な一次項、二次項，及び２因子相互作用項の存在を示している。
【００６３】
（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比）
強度を正確に測定した水酸化アルカリ金属の非常に希薄な溶液をＦＦＡと反応させる（ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比：１）場合、下記の反応式に従って反応が進行する。
ＲＣＯＯＨ  ＋  ＫＯＨ  →  ＲＣＯＯＫ  ＋  Ｈ2Ｏ
ＫＯＨの量は、ＡＭＦ中に存在するＦＦＡ量の関数である。媒体中に存在する全てのＦＦＡを図８記載の適切な実験条件下で中和するには、ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比＝１で充分である。過剰のアルカリ溶液を使用すると、中性脂肪が鹸化して失われるために、収率にとって非常に有害である。また、過剰のアルカリ溶液を使用すると、過剰の（ＯＨ-）がラクトンを加水分解して対応するヒドロキシ酸に変えてしまうために、芳香を著しく損ねてしまう。ＦＦＡ量の低下はＫＯＨ：ＦＦＡのモル比に対して強い依存性を示した。正の勾配Ｂ1＝24.58は、ＦＦＡ量の低下幅が、全ての混合速度においてＫＯＨ：ＦＦＡモル比の増加とともに増加したことをを示している（図１５）。検討したＫＯＨ：ＦＦＡモル比の範囲を、表２に示す。
【００６４】
（塩化カルシウム：ＦＦＡのモル比）
カルボキシル酸エステルの受容体として塩化カルシウムを使用した。精製用溶液に塩化カルシウムを添加することは、下記の理由により非常に重要な意味を持っている。即ち、塩化カルシウムが（１）カルボキシル酸エステルと反応して不溶性の塩（石灰石類似の塩）を形成し、これにより、遠心分離により媒体から効率良く分離できるようになり；（２）可溶性のＫ又はNa石鹸と反応して不溶性の石鹸を形成させ、中性脂肪の乳化による損失を最小限に抑え、従って収率が向上し；（３）石鹸のミセルを破壊し、β-シクロデキストリンが負に帯電したミセル表面上で凝集を起こす現象を最小限に抑え、従ってコレステロールの低下幅を改善することができ；（４）相乗的にＫＯＨととともにＦＦＡの減少率を増加させ；（５）カチオンで媒体を飽和させ、下記反応を抑制することによりＦＦＡ量の減少幅を改善する。
ＲＣＯＯ- ＋  Ｈ2Ｏ  −−−−→  ＲＣＯＯＨ  ＋  ＯＨ-
←−−−−
【００６５】
ヒドロキシル基が過剰に存在すると収率及び芳香に対して有害作用を及ぼすので、過剰のカチオンはカセイ溶液ではなくCa塩によりこれを供給する。検討したCaCl2：ＦＦＡのモル比の範囲を、表２に示す。塩化カルシウムがＦＦＡ量の低下に及ぼす効果は、β-シクロデキストリン自体にＦＦＡ量を減少させる能力があるので、媒体中に存在するβ-シクロデキストリンによりこれを推定した。
【００６６】
（混合速度）
精製用溶液の溶質とＦＦＡを充分に接触させるには、混合速度が重要な因子である。本実験範囲内において使用した混合速度は、ＦＦＡ量の低下幅に対して軽度の影響を及ぼすに止まった（図１５）。正の勾配Ｂ5＝5.28（図５）は、ＦＦＡ量の低下幅が混合速度の増加とともに増加することを示している。検討した混合速度の範囲を、表２に示す。
【００６７】
（例１４）
Ｙ1のモデルにおいては、β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比を上げ，混合時間を延長し，混合速度を上げると、コレステロールの低下幅が増加することを示している。また、表２の＃４及び＃26で使用したこれら３個の独立変数の効果を組み合わせることにより、ＡＭＦ中のコレステロールを、それぞれ77.30%及び73.70%減少させることができた。さらにこれらの処理条件を最適化することにより、コレステロール量の減少率を改善することができる。表２における実験＃４で使用したβ-シクロデキストリンの量は、実験＃26で使用した量よりも多かった。
【００６８】
当該プロセスの経済性を考慮に入れ、表２における実験＃26について、さらに最適化を実施した。β-シクロデキストリンの量を増加する方法は経済的に不利である。混合速度を上げると媒体の粘度が上がり、これにより遠心分離時に収率の問題が起こる可能性がある。そこで、＃26を混合時間に関して最適化した。検討を行った２個の応答を考慮に入れて混合時間を延長したところ、コレステロール量の減少率をさらに改善できることが明らかになった。事実、コレステロール量の低下に関する理論的な数学モデルから、約30−35分の混合時間で、コレステロールを完全に除去できることが判明した。
【００６９】
本発明の主目標は、動物性脂肪中のコレステロール及び遊離脂肪酸の量を単一操作で減らし，融点を下げ，冷蔵庫温度で展延できる健康的な脂肪を製造することにある。これらの目標は、図１６にその概要を示した最終最適化プロセスを使用することにより達成することができる。
【００７０】
（例１５）
コレステロール0.283%及びＦＦＡ0.3%を含むＡＭＦ10 (g)を、混合速度1400 rpmで、水：トウモロコシ油の重量比がそれぞれ10：０，11.5：1.5, 13：３，16：６及び20：10の「液状処方」10, 13, 16, 22, 30 (g)と、温度が50 ℃になるまで混合した。当該「液状処方」はこれを全実験に使用した。その組成はＫＯＨ，CaCl2,  ｄＨ2Ｏ及びトウモロコシ油から成っていた。種々の成分の比率は下記の通りであった：ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比＝１：１（固定），ＦＦＡ：CaCl2のモル比＝１：５（固定）及び種々の比率のＨ2Ｏ：トウモロコシ油（上記の通り変動）。50 ℃において、β-シクロデキストリン650 mgを当該混合物に同じ速度（1400 rpm）で30分間攪拌しながら添加した。得られた石鹸及びβ-シクロデキストリン：コレステロール錯体を、直ちに8700 x g，室温で10分間遠心分離した。当該修飾無水ミルク脂肪を上澄相から回収した。コレステロール量及びＦＦＡの融点低下として、表８記載の値が達成された。
【００７１】
（例１６）
コレステロール0.0796%及びＦＦＡ0.547%を含む牛脂10 (g)を、「液状処方」〔ＫＯＨ 0.108%, CaCl2 1.42%, 及び水：トウモロコシ油（重量比＝10：０）〕10 (g)と、混合速度1400 rpmで温度が50 ℃に達するまで混合した。温度50 ℃において、β-シクロデキストリン650 mgを、さらに30分間同じ速度で混合しながら、当該混合物に添加した。次に、石鹸とβ-シクロデキストリン：コレステロール錯体の分離状態を改善するために、当該混合物を55 ℃まで加熱した。得られた石鹸及びβ-シクロデキストリン：コレステロール錯体を、8700 x gで５分間，室温で直ちに遠心分離した。遠心分離機のローターを加熱水浴中で50 ℃に加熱した。コレステロール及びＦＦＡの含有量が低下した牛脂を上澄相から回収した。コレステロール及びＦＦＡの達成減少率は、それぞれ100%及び98.16%であった。
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【００７２】
（例１７）
コレステロール0.071%及びＦＦＡ0.122%を含むラード10 (g)を「液状処方」〔ＫＯＨ0.024%及びCaCl2 0.326%及び水：トウモロコシ油（重量比＝10：０）〕10 (g)と、混合速度1400 rpmで温度が50 ℃に達するまで混合した。温度50 ℃において、β-シクロデキストリン650 mgを同じ速度でさらに30分間混合しながら当該混合物に添加した。得られた石鹸及びβ-シクロデキストリン：コレステロール錯体を、8700 x gで10分間，室温で直ちに遠心分離した。コレステロール及びＦＦＡの量を低下させた当該ラードを、上澄相から回収した。コレステロール及びＦＦＡの達成減少率は、それぞれ100%及び95.5%であった。
【００７３】
本発明のプロセスは、中和剤として水酸化アルカリ金属，カルボキシル酸エステルの受容体としてカルシウム塩，錯体化剤としてβ-シクロデキストリン，及び低融点植物油を使用して、動物性脂肪のＦＦＡ量，コレステロール量，及び融点を低下させ、コレステロールを含有せず、冷蔵庫温度において展延性を有する無水ミルク脂肪を製造するプロセスである。本プロセスの概念においては、希薄な「水性処方」，低温，及び比較的に長い反応時間を使用する。当該プロセスは、ミルク脂肪中のコレステロール量及びＦＦＡ量を低下させるために使用する従来技術プロセスに比して、実際的な側面で大きなメリットが得られるような多くの属性を有している。当該プロセスではコレステロールを単一操作により完全に除去することができるので、その効率は高い。達成されたコレステロール低下率は、従来技術による減少率に比して少なくとも約20%高かった。観察されたＦＦＡの減少率は92.40%を上回った。この値は、従来技術のプロセスより45%以上高い。当該プロセスは、我々の目標全てを単一操作で達成することができるので、経済性が高く能率的である。このことは、従来技術プロセスに比して優れた多くのメリットを当該プロセスに与えている。当該プロセスは、ＡＭＦが空気に触れて酸化劣化を起こすことが無いように、密閉系でこれを実施することができるであろう。当該プロセスにおいては、高価な特定資本設備を使用する必要は無い。当該プロセスでは、加熱及び混合を行った後で遠心分離を行うだけである。
【００７４】
ＦＦＡ又はコレステロールを含まない当該加工動物性脂肪は、低脂肪又は脂肪を含まないミルクの中でこれをホモジナイズし、全ミルクに再構成することができる。当該製品は、チーズ又はアイスクリームの製造にこれを使用することができる。
【００７５】
前記の記述は、単に本発明に関して説明を行う目的で行ったものである。本発明の範囲を限定するものは、付属の「特許請求の範囲」のみである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  無水動物性脂肪（ＡＭＦ）からＦＦＡを除去する優先的プロセスを示すフローチャートである。精製用溶液は、蒸留水，ＫＯＨ及びCaCl2から成っている。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１：１である。CaCl2：ＦＦＡのモル比は５：１である。
【図２】  ＫＯＨ：ＦＦＡモル比がＦＦＡ量の低下並びに収率に及ぼす影響を示すグラフである。CaCl2：ＦＦＡのモル比は５，精製用溶液：ＡＭＦ（重量比）は１，混合時間は１分，混合速度は1800 rpm, 温度は50 ℃であり、遠心分離は1085 x gで10分間, 室温で行った。
【図３】  CaCl2：ＦＦＡのモル比がＦＦＡ量の低下及び収率に及ぼす影響を示すグラフである。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１，精製用溶液：ＡＭＦ（重量比）は１，混合時間は１分，混合速度は1800 rpm, 温度は50 ℃であり、遠心分離は1085 x gで10分間, 室温で行った。
【図４】  ＡＭＦ：精製用溶液（重量比）がＦＦＡ量の低下及び収率に及ぼす影響を示すグラフである。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１，CaCl2：ＦＦＡのモル比は５，混合時間は１分，温度は50 ℃, 混合速度は1800 rpmであり、遠心分離は1085 x gで10分間, 室温で行った。
【図５】  混合速度がＦＦＡ量の低下及び収率に及ぼす影響を示すグラフである。精製用溶液：ＡＭＦの重量比は１，混合時間は10分，温度は50 ℃, ＦＦＡ：ＫＯＨのモル比は１，CaCl2：ＦＦＡのモル比は５であり、遠心分離は1085 x gで10分間, 室温で行った。
【図６】  混合時間がＦＦＡ量の低下及び収率に及ぼす影響を示すグラフである。ＦＦＡ：ＫＯＨのモル比は１，CaCl2：ＦＦＡのモル比は５，精製用溶液：ＡＭＦの重量比は１，混合速度は1800 rpm，温度は50 ℃であり、遠心分離は8700 x gで10分間, 室温で行った。
【図７】  遠心分離力がＦＦＡ量の低下及び収率に及ぼす影響を示すグラフである。ＦＦＡ：ＫＯＨのモル比は１，CaCl2：ＦＦＡのモル比は５，精製用溶液：ＡＭＦの重量比は１，混合速度は1800 rpm，温度は50 ℃，混合時間は10分であり、遠心分離は室温で10分間行った。
【図８】  ＦＦＡ及びＡＭＦの優先的精製プロセスを示すフローチャートである。精製用溶液は蒸留水，ＫＯＨ及びCaCl2から成っている。ＦＦＡ：ＫＯＨのモル比は１：１である。CaCl2：ＦＦＡのモル比は５：１である。
【図９】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。混合速度は1000 rpm, β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比は5.58である。
【図１０】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。混合時間は10分，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比は5.58である。
【図１１】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。混合時間は10分，混合速度は1000 rpmである。
【図１２】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１，混合速度は1000 rpmである。
【図１３】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１，β-シクロデキストリン：コレステロールのモル比は5.58である。
【図１４】  ＡＭＦのコレステロール量低下率（Ｙ1, %）に対する応答表面を示すグラフである。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１，混合時間は10分である。
【図１５】  ＡＭＦのＦＦＡ量の低下率（Ｙ2, %）に対する応答表面を示すグラフである。
【図１６】  その他無水動物性脂肪（ＡＭＦ）からコレステロール及びＦＦＡを除去し、融点を低下させるプロセスを示すフローチャートである。当該液状処方は、蒸留水，トウモロコシ油，ＫＯＨ及びCaCl2から成っている。ＫＯＨ：ＦＦＡのモル比は１：１である。CaCl2：ＦＦＡのモル比は５：１である。水：トウモロコシ油の重量比は11.5：1.5である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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