(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.)菌株またはそれに由来するδ内毒素を、イネミズゾウムシを防除するのに効果的な用量、イネミズゾウムシに投与することを含む、イネミズゾウムシを防除する方法。
【請求項２】
バチルス・チューリンギエンシスのδ内毒素が、全長のCryIII毒素もしくはcyt毒素であるかまたはゾウムシに活性なそれらの断片である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
MR506、KB92、PS201T6、PS101Z2、PS50B、PS33F2、PS204G4、PS204G6、PS167P、PS192N1、PS201L1、PS169E、PS177G、PS196S1およびPS73Eからなる群より選択される菌株に由来するバチルス・チューリンギエンシスの毒素にゾウムシを接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
バチルス・チューリンギエンシスのδ内毒素が、PS73E、PS192N1およびPS201T6からなる群より選択されるB.t.菌株から得られる毒素である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
バチルス・チューリンギエンシスの毒素が201T6活性毒素である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
バチルス・チューリンギエンシスのδ内毒素がバチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株（Bacillus thuringiensis var. israelensis）の毒素である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
天然の化合物または培養液中に産生される化合物の作用により毒素の活性化が促進されるような条件下でバチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株を増殖させることと、B.t.i.培養物または活性毒素を含む組成物をゾウムシに投与することとを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株の毒素を短縮することによって活性化される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
毒素に直接作用するかまたは別の化合物の作用を促進させることにより化合物が毒素の活性化に関与している、バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株の培養液またはその上清に化合物を加えることを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
添加化合物がプロテアーゼである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
添加化合物がバチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株の培養液またはその上清のpHを上昇させる、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
バチルス・チューリンギエンシスδ内毒素を含む葉面噴霧液をイネ植物体に噴霧することによって、イネミズゾウムシにB.t.δ内毒素が投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
イネミズゾウムシが食害する植物組織中でバチルス・チューリンギエンシスδ内毒素が発現されるように、B.t.殺虫性構造遺伝子をイネ植物ゲノムの中に挿入することによって、該イネミズゾウムシに植物体中からB.t.δ内毒素が投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
バチルス・チューリンギエンシスの殺虫性構造遺伝子の発現が、葉に特異的なプロモーターによって制御されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
バチルス・チューリンギエンシスの殺虫性構造遺伝子の発現が、根に特異的なプロモーターによって制御されている、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
イネミズゾウムシに用いるため特に調整された処方剤に関連した、バチルス・チューリンギエンシスの菌株または胞子、結晶、もしくはB.t.菌株由来毒素を含む物質の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ゾウムシを防除する方法に関する。特に、イネミズゾウムシ、アルファルファゾウムシ、ワタミゾウムシを防除するために、バチルス・チューリンギエンシス（B.t.）のδ内毒素が発見されている。
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.)は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子型（parasporal）の結晶蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で観察することができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離されて配列が決定されており、組み換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である(ガートナー(Gaertner), F.H., L.キム(Kim) [1988] TIBTECH 6:S4〜S7)。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。
10年前まで、B.t農薬の商業的な利用は、鱗翅目(毛虫)の害虫に対してだけという、狭い範囲に非常に制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ変異株（Bacillus thuringiensis var. kurstaki）から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目(毛虫)用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変異株（B. thuringiensis var. kurstaki HD-1）は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すδ内毒素と呼ばれる結晶を産生する。
しかし、近年になって、研究者らは、はるかに広範囲の害虫に特異性を有するB.t.農薬を発見した。例えば、別のB.t.株、すなわちB.t.イスラエレンシス変異株（B.t. var. israelensis）およびB.t.テネブリオニス変異株（B.t. var. tenebrionis）(M-7、B.t.サンディエゴ(san diego)としても知られている)が、それぞれ、双翅目および鞘翅目の昆虫を抑制するために商業的に用いられている(ガートナー(Gaertner), 1989)。また、「カウチ(Couch), 1980」および「ビーグル(Beegle), 1978」を参照のこと。「クリーグ(Krieg)ら、1983」は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変異株（Bacillus thuringiensis var. tene brionis）が鞘翅目の２種の甲虫に対して有効であると記述している。これらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）および甲虫アゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。
最近、B.t.の新しい亜種が同定され、活性δ内毒素蛋白質をコードする遺伝子が単離された(ヘフテ(Hofte)およびウィトリー(Whiteley),1989)。ヘフテ（Hofte）およびウィトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI(鱗翅目特異的)、CryII(鱗翅目および双翅目特異的)、CryIII(鞘翅目特異的)、およびCryIV(双翅目特異的)である。プレフォンテイン(Prefontaine)ら(1987)により、鱗翅目に有効な遺伝子を分類する上で有用なプローブが開示されている。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている(フェイテルソン(Feitelson)ら、1992)。
B.t.結晶毒素は、一般にプロ毒素であり、活性のある毒素を生成するするためには、一定の物理化学的な条件(すなわち、pH、酸化還元、イオン強度)、一定のプロテアーゼの作用、または、その両者が必要だと考えられている(ヘフテ(Hofte)およびウィトリー(Whiteley), 1989)。ほとんどの場合は、昆虫により毒素を活性化する条件が提供されるが、至適な活性(ジャケット(Jacquet)ら、1987)を得るためまたは活性を検出する(ヘフテ(Hofte)ら、1992)ために、予め可溶化または蛋白分解されていることが必要な場合も報告されている。
B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている(シュネフ(Schnepf)およびウィトリー(Whiteley), 1981])。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現について開示している。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号には、さまざまな環境で鞘翅目害虫を抑制するために用いることができるB.チューリンギエンシス（B. thuringiensis）のテネブリオニス変異株(tenebrionis)(M-7、B.t.サンディエゴ(san diego)としても知られている)が開示されている。米国特許第4,918,006号には、双翅目害虫に対して活性を有するバチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株（B.t. var. israelensis）の毒素が開示されている。この特許により、約27kDの蛋白質およびその断片が双翅目に対する効果に関与していることが報告されている。米国特許第4,849,217号には、アルファルファ・ゾウムシ(alfalfa weevil)に対して活性を有するB.t.菌株が開示されている。米国特許第5,151,363号および米国特許第4,948,734号には、線虫に対する活性を有するある種のB.t.菌株が開示されている。多くの研究および資源の投入の結果、新しいB.t.菌株およびB.t.菌株の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB.t.菌株の発見および既知のB.t.菌株の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術のままである。
アルファルファゾウムシ、ヒペラ・ポスティカ（Hypera postica）と、その近縁種であるエジプトアルファルファゾウムシ、ヒペラ・ブルネイペニス（Hypera brunneipennis）は、米国で栽培されているアルファルファの最も重要な昆虫害虫であり、1984年には290万エーカーが食害された。エジプトアルファルファゾウムシは、米国南西部において優勢な種で、暑い夏期には何カ月間か夏眠する（つまり、休眠状態になる）。これ以外の点ではすべて、米国の残りの地域で優性なアルファルファゾウムシと同じである。
ゾウムシの生活環の中では、幼虫期が最も有害である。幼虫は、アルファルファの成長している葉先を食害して、葉を穴だらけにして成長を阻害し、植物体が大きくなるのを阻害するため、最終的には、収量を低下させる。ひどく蔓延すると、干し草の刈り取りが全くなくなってしまう。成虫も葉を食害するため、被害を大きくはするが、それほど重要ではない。
イネミズゾウムシ、リソロプトラス・オリゾフィラス（Lissorhoptrus oryzophilus）は、北米と東南アジアにおける、イネの主要害虫である。スミス、エム・シー（Smith, M.C.）（1983）「「イネミズゾウムシ、リソロプトラス・オリゾフィラス・クシェル（The Rice Water Weevil, Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）」、外来植物の防疫害虫および植物材料を導入する可能性(Exotic Plant Quarantine Pests and Possibilities for Introduction of Plant Materials)」、3〜9頁を参照のこと。イネミズゾウムシは、適当な殺虫剤で処理しないと、平均収量を10％以上減少させる直接の原因となる。イネミズゾウムシの幼虫は、栽培イネの根系に重大な損害を与える。イネミズゾウムシの成虫は、小さくて黒い楕円形（長さ2.8〜3.2 mm X 幅1.2〜1.8 mm）で、鱗のようなものを有するゾウムシである。成虫は葉の表皮を噛りとって食害し、上位葉の葉身に沿って細長い穴を開けて行く。ゾウムシの成虫は、７週齢の植物体よりも２週齢の植物体を好むようである。また、窒素肥料の濃度を増加させて行くと、それにつれて食害の程度がひどくなる。成虫は、出穂したイネの穀粒の部分を食害し、成長中の穀粒の花器または胚乳を食い荒らす。ゾウムシは真性の休眠に入り、７月になると、冬眠場所に飛んで行き叢状草、サルオガセモドキ、および地面に残っている収穫残渣の中で越冬する。春になって現れ始めると、湛水した水田に移動して、そこで交尾する。イネ植物体の下位部分の沈水した葉鞘の中に卵を産みつけ、４〜９日で艀化する。
イネミズゾウムシの幼虫は４齢まである。各齢期の長さは気温に依存するが、通常の野外条件下での幼虫期は最大約２７日間である。幼虫には、気門の機能の一部を担う、一対の胸部気管の鈎状器官（dorsal tracheal hooks）がある。この鈎状器官の頂端部分は非常に硬くなっており、これを用いて根を貫通し、空気を取り込んでおく。このため、幼虫は水面下で生きて行くことができる。蛹は、楕円形で、防水性の泥でできた入れ物の入っている。大きさおよび形は成虫に似ているが、色が白い。蛹期の長さは、27℃で７日間である。一シーズンで２、３世代現れることが報告されている。
イネミズゾウムシは、地上、水中、および土中に生息するため、これらを防除するのは難しい。かつては化学殺虫剤が使われてきたが、限定的な成功しか収めなかった。在来の抵抗性の栽培イネ品種が探索されているが、中度から低度の抵抗性系統しか見つかっていない。
国際イネ研究通信（International Rice Research Newsletter）（1983）第８巻６号16〜17頁で、イネミズゾウムシを防御するための病原菌およびネマトーダが報告されている。イネミズゾウムシを防御するための、さまざまな菌類の菌株（Beauveria bassiana and Metarrhizium anisopliae）およびネマトーダが明らかにされた。B.t.の生物調製物を、35日目のイネに0.6、1.2または2.4 kg/haになるよう葉面噴霧したところ、いずれもイネミズゾウムシを防御しなかった。
B.t.の生物調製物がイネミズゾウムシの防除に効果がないという出版物の報告に反して、予想外にもB.t.δ内毒素はこの害虫の防御に効果があった。
発明の簡単な概要
本発明は、害虫ゾウムシを防御するための、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）菌株およびそれから採取したδ内毒素の使用に関する。本明細書において特別に例示されているのは、アルファルファゾウムシ、ワタミゾウムシおよびイネミズゾウムシを制御するためにB.t.菌株および毒素を用いることである。
本発明の一つの好ましい態様において、イネミズゾウムシを防除するために、B.t.δ内毒素が用いられる。このB.t.δ内毒素は、イネミズゾウムシが毒素を摂食するように、イネミズゾウムシに毒素を投与する。成虫が食害するイネの葉面に、B.t.δ内毒素を噴霧して散布してもよい。また、植物体全体で、または、成虫と幼虫の両方の防除ができるような特定の植物組織で、δ内毒素が産生されるように、B.t.の構造遺伝子をイネの植物ゲノムに挿入してもよい。
本発明の一つの好ましい態様において、CryIII分類のB.t.毒素がゾウムシ害虫の防除に用いられる。例えば、CryIIIB.t.菌株HD511は、イネミズゾウムシに対して非常に優れた活性を示した。
本明細書で、さらに例示されているのは、ゾウムシを防除するためのB.t.菌株、PS50C、PS201T6、KB92、PS86B1、PS201T6、PS101Z2、PS50B、PS204G4、PS204G6、PS167P、PS192N1、PS201L1、PS169E、PS177G、PS196S1およびPS73Eである。
本発明の別の態様において、本明細書に記載されている材料および方法は、特に、バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis var. israelensis）変異株、または、それからの毒素に関するもので、ゾウムシを防除するためのものである。関連する態様は、ゾウムシを防除するために、B.t.菌株PS201T6由来の活性毒素を使用することに関する。
本明細書で説明されているように、イネミズゾウムシを防除するためには、B.t.菌株HD511、PS73E、PS192N1およびPS201T6（活性毒素）に由来する毒素が特に効果的である。また、PS201T6の活性毒素は、ワタミゾウムシに対しても高い活性がある。
また本発明には、例示されたB.t.菌株の変異株で、例示された菌株と実質的に同じ農薬特性を有するものの使用も含まれる。これらの変異株には、突然変異株も含まれる。突然変異株を作出するための方法は、微生物学の技術分野でよく知られている。紫外線およびニトロソグアニジンなどの化学変異原が、この目的のために広範に用いられている。
また、本発明にしたがって、B.t.毒素を発現するよう形質転換された組換え宿主を用いることもできる。これらの組換え宿主は、例えば、微生物または植物である。本明細書において特別に例示されているのは、MR506と命名された組換え微生物である。
本発明に従って、菌株そのもの、菌株の変異株、該菌株から採取したδ内毒素、これらの菌株の培養液からの市販の調製物、または、これらの菌株のDNAなどによって産生される毒素を用いてゾウムシを防御することができる。一つの態様において、別の宿主で形質転換させたDNAによって、毒素を産生させてもよい。さらに、本発明は、標的害虫の周囲に散布したときに、B.t.菌株またはB.t.菌株に由来するDNAを含む組換え細胞で、実質的に無処理の細胞が、その農薬活性を長く維持できるように、実質的に無処理の細胞を処理することを含む。
本発明の詳細な開示
本発明は、ゾウムシを防御するための新しい方法で、ゾウムシをバチルス・チューリンギエンシス（B.t.）菌株またはそのδ内毒素と接触させることを含む方法の発見に関する。ゾウムシに対して優れた活性を有するB.t.菌株のいくつかが、本明細書において説明されている。
本発明の一つの特異的な態様において、穀類のイネでイネミズゾウムシを防除するために、一種類以上のB.t.δ内毒素をこの害虫に投与する。このB.t.δ内毒素は、ゾウムシが毒素を摂食すると、中腸壁の上皮細胞が破壊されるように投与される。当業者が認識するところによると、投与方法はそれほど重要ではない。例えば、イネの葉の上にB.t.δ内毒素を噴霧して投与することができる。この投与方法は、イネの葉を食害するゾウムシの成虫の防除には効果的である。別の投与方法としては、B.t.の殺虫活性を有する構造遺伝子をイネの植物ゲノムに挿入し、それによって、植物体の中でδ内毒素がインビボで産生されるようにしたものでもよい。都合の良いことに、ゾウムシによって一番食害されそうな組織中で毒素が発現するように、組織特異的なプロモーターを用いて、B.t.遺伝子の発現を操作することができる。例えば、幼虫の防除ができるように根特異的なプロモーターを用いることができ、ゾウムシの成虫を防除するために、葉特異的なプロモーターを用いることができる。
本発明の一つの態様において、用いられるB.t.菌株は、B.t.イスラエレンシス(israelensis)変異株またはその毒素である。イスラエレンシス変異株は、当業者によく知られており、容易に認識することができる。B.t.のイスラエレンシス分類に一般的に関連する特徴は、双翅目に対する活性、H14血清型、ならびに蛋白質パターンとして、約28〜33kDの蛋白質と、一般的に、約70 kDおよび130 kDの付加的な蛋白質とを含むということである。イスラエレンシス型の毒素を発現するB.t.の別の変異株も、本発明で用いることができる。このような毒素は、B.t.i.が産生する毒素と同じ大きさで、同じ活性プロフィールを有すると考えられる。例えば、B.t.菌株のモリソーニ（morrisoni）変異株血清型8a、8bが、B.t.i.型毒素を発現することが報告されている。このような菌株の例がPS71M3である。本明細書で、「バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株毒素」という語が用いられるとき、B.t.の異なった変異株によって偶然発現された毒素で、B.t.i.によって発現される毒素に類似しているかまたはそれに関連する毒素が含まれる。
一つの好ましい態様において、ゾウムシを著しく防除するために、B.t.変異株PS201T6から採取した活性毒素が用いられる。同様に、例えば、天然に存在する化合物または培養液中に産生された化合物の作用によって、該毒素の活性化が促進される条件下で、バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株を増殖させることによって、B.t.i.から採取した毒素を活性化させてもよい。バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変異株の培養液またはその上清に化合物を加えて活性化させてもよい。ここで、この化合物は、該毒素に対する作用を通して、または、第二の化合物の作用を促進することによって、該毒素の活性化に寄与する。この添加化合物は、例えば、プロテアーゼまたは培養液もしくは上清のpHを上げる化合物などが挙げられる。
本明細書で開示されている培養菌は、合衆国イリノイ州61604ピオリア市ノース大学通り1815、北部地域研究センター、農業研究サービス特許培養物コレクション(NRRL)に寄託されている。
0003987912.tif 000002
本培養菌は、特許庁長官によって、37 CFR 1.14および35 U.S.C. 122により権利付与されるべきと決定された者に対して、この特許出願の係属する期間、培養菌の入手が可能なことが保証されている条件の下に寄託されている。本特許出願に相当する出願またはその継続出願が提出されている外国の特許法で要求されているところにしたがい、寄託菌を入手することが可能である。しかし、寄託菌を入手できることが、行政行為によって付与された特許権を逸脱して、本発明を実施する許可を与えるものではないことを理解すべきである。
さらに、本寄託培養物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項、すなわち、寄託された試料の供給の請求が最後になされてから5年間以上、またいずれの場合も寄託された日付から30年間以上、または、培養物の開示を行いうる特許の実施期間中は、汚染されることなく生存を図るために必要な注意をできる限り払って貯蔵されるべきであるという条項に従って、貯蔵され、一般に入手可能な状態に置かれる。寄託者は、寄託物の条件が原因で、請求があっても受託者が試料を供給できないときには、寄託物を交換する義務があることを承認している。本寄託培養物を一般的に利用することに対するあらゆる制約は、それらを開示する特許の認可によって、取り消されることなく解除される。
本発明に係る有用な、一定のB.t.菌株、遺伝子および毒素は、発行済みの米国特許、または、公開された国際特許文書において、以前から説明されている。これらの菌株およびその以前の使途を以下の表に示す。
0003987912.tif 000003
本明細書において説明されている特殊な活性は、これらの文書のいずれの中においても、説明されたり、示唆されたりしていない。これらの特許の開示文書は、本明細書において、参考文献として包含される。これらの特許は、例えば、表示された菌株の毒素および遺伝子の説明を含んでいる。当業者は、ゾウムシ害虫を防御するために、本明細書が提供する指示とともに、これらの毒素および遺伝子を用いることができる。
遺伝子および毒素
本発明の一つの好ましい態様において、ゾウムシ害虫に対して毒素活性のあるB.t.をコードする遺伝子が、適当な宿主を形質転換させるのに用いられる。本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示された全長配列だけでなく、特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持している、これらの配列の断片、異型、変異体および融合蛋白質も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異型」または「変異」という語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、または同等の殺虫効果を有する毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように、「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じまたは本質的に同じ生物学的活性を有する毒素を意味する。
いくつかの方法を用いて、ゾウムシに有効な毒素をコードする遺伝子を同定できることは、当業者に明らかであると考えられる。遺伝子は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている菌株から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、Bal31のような酵素または部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すことができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。
等価的毒素、および/または、これらの等価的毒素をコードする遺伝子は、B.t.菌株および/またはDNAライブラリーから、本明細書によって提供される指示に従って得ることができる。本発明の殺虫毒素を得るための多くの方法がある。例えば、本明細書において開示され、請求されている殺虫毒素に対する抗体を用いて、蛋白質の混合物の中から別の毒素を同定、分離することができる。特に、最も定常的で他のB.t.毒素から最も異なった毒素部位に対して抗体を作製することができる。そして、これらの抗体を用いて、免疫沈降、酵素結合免疫測定法(ELISA)、またはウェスタン・ブロットによって、特徴的な活性を有する等価的毒素を特異的に同定することができる。本明細書において開示される毒素もしくは等価的毒素、またはこれらの毒素の断片に対する抗体は、当業における標準的な手法を用いて容易に調製することができる。そして、これらの毒素をコードする遺伝子を微生物から得ることができる。
例示された毒素の殺虫効果を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまに異なったDNA配列に、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードさせることも可能である。同じ毒素または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有し、殺虫効果に実質的に影響しない配列を意味する。
本発明の毒素および遺伝子を同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによる。これらのプローブは、検出方法を有するヌクレオチド配列である。当業者によく知られているように、プローブ分子と核酸試料部分とが、二分子間で強い結合を形成することによりハイブリダイズすれば、プローブと試料部分とは、実質的に相同であると合理的に推定できる。プローブによる検出方法により、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法が提供される。このようなプローブ解析により、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法が提供される。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド部分は、標準的な方法により、DNA合成機を用いて合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。
組み換え宿主
本明細書に開示されている菌株に含まれる毒素をコードする遺伝子を、広範囲の微生物宿主または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させることにより、直接的または間接的に毒素が産生される。例えば、シュードモナスなどの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に散布し、そこで増殖させ、害虫に摂取させることができる。その結果、害虫を制御できる。または、毒素遺伝子を有する微生物を、毒素活性を持続させ細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理した細胞は、毒素活性を維持しているため、標的害虫の周囲に散布することができる。
B.t.毒素遺伝子を適当なベクターによって微生物宿主に導入し、該宿主を生きたままの状態で周囲に散布する際には、一定の宿主微生物を用いるのが有利である。例えば、微生物宿主は、害虫の棲息場所に居住することが知られている微生物宿主から選択される。また、微生物宿主は、特定のゾウムシの種と共生するものであってもよい。これらの微生物は、特定の環境の中で、野生型の微生物とうまく競合でき、ポリペプチド殺虫因子を発現する遺伝子を安定的に維持し発現させ、そして、好ましくは、周囲の環境の作用による分解および不活化から殺虫因子をよりよく保護できるように選択される。
遺伝子の維持および発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を、微生物の宿主に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。
さらに、殺虫活性のある毒素を産生する能力を植物に付与するため、植物の中にB.t.遺伝子を導入するための材料および方法は、当業において周知である。好ましい態様において、選ばれた植物宿主の中で、B.t.遺伝子が一番安定的に発現できるよう、B.t.遺伝子を改変する。これに関し、米国特許第5,380,831号が参考文献として本明細書に包含される。
細胞の処理
上述したように、細胞内微小カプセルを形成させることにより、毒素活性の持続期間を延ばし細胞を安定化させるために、B.t.またはB.t.毒素を発現する組み換え細胞を処理することができる。生成される殺虫因子の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素を含む。細胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の周囲に散布されたとき毒素を保護する。適当な宿主細胞には原核生物も真核生物も含まれるが、通常、哺乳類などの高等生物に毒性がある物質を産生しない細胞に制限される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または適用されるレベルが非常に低いため哺乳類宿主に対して毒性を有する可能性がない場合には、高等生物に毒性がある物質を産生する生物が用いられることもある。宿主として、特に重要なのは原核生物、および菌類のような下等真核生物である。
処理を行うとき、場合によっては胞子を用いることもあるが、細胞は通常、胞子状態ではなく、完全な状態で実質的に増殖形態にある細胞である。
例えば、B.t.毒素遺伝子を含む微生物などの微生物細胞の処理は、毒素の性質を損なうような効果を与えたり、毒素を保護する細胞の能力を失わせたりしない限り、化学的方法、物理的方法、または、化学的および/もしくは物理的方法を組み合わせた方法により行うことができる。化学薬品の例はハロゲン化試薬で、特に原子番号17〜80のハロゲンである。より特定すると、ヨウ素を用いると、穏やかな条件の下で十分な時間をかければ、望ましい結果を得ることができる。他の適当な技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、塩化ゼフィラン、塩化セルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール類、ルゴールヨウ素、ブワン固定液、さまざまな酸、ヘリー固定液（Helly's fixatives）などの様々な組織固定剤(ヒューマソン(Humason), 1967)、または細胞が宿主環境に投与されたとき細胞で産生される毒素の活性を保護し活性を引き延ばす、物理的(熱による)薬剤と化学薬剤との組み合わせなどがある。物理的方法の例としては、ガンマ線照射およびX線照射などの短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理に関する方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは本明細書に参照として包含される。
細胞の増殖
実質的にすべての細胞またはすべての細胞がB.t.遺伝子を有するように選択される培地に備えて、B.t.殺虫因子遺伝子を有する細胞宿主は、DNA構築物が選択上の利点を有するようないかなる都合の良い栄養培地で増殖させてもよい。次に、これらの細胞を従来の方法に従って回収する。または、回収前に細胞を処理してもよい。
本発明のB.t.細胞は、標準的な人工培地および発酵技術を用いて培養することができる。発酵過程が終了したら、当業において周知の方法によって、まず発酵用培地からB.t.胞子および結晶を分離して回収することができる。回収されたB.t.胞子および結晶は、取り扱いやすくかつ特定の標的害虫に対して施用しやすくするために、界面活性剤、分散剤、不活性担体、または、他の成分を加えて、可溶性の粉末、濃縮液、顆粒、または、他の処方剤に処方することができる。これらの処方および施用方法は、当業において周知である。
処方  誘因剤とB.t.菌株の胞子および結晶とを含む毒餌顆粒処方剤、または、本明細書に開示されているB.t.菌株から取り出すことができる遺伝子を含む組み換え微生物を、ゾウムシの周囲に施用することができる。この毒素は、動物または人に影響しないため、自由に施用できる。また、産生物をスプレーまたは粉末に処方してもよい。また、B.t.菌株またはB.t.遺伝子を発現している組み換え宿主をゾウムシの餌または食糧源に混ぜることもできる。
当業者にはよく認識されているように、殺虫効果がある濃度は、それぞれの処方の性質によって大きく異なり、特に、濃縮して用いるか直接用いるかによって異なる。殺虫因子は、重量にして1％以上であるが、重量にして100％のこともある。乾燥処方剤では、殺虫因子が重量にして約1〜95％あるが、液体処方剤では、一般的に、水相中の固体の重量で1〜60％である。細胞を含む処方剤は、一般的に、約102〜約104細胞数/mgである。これらの処方剤を、１ヘクタール当たり約50 mg(液体または乾燥重で)〜1 kg以上散布する。
処方剤は、例えば植物の茎葉などのゾウムシの周囲に散布することができる。
変異体  当業において周知の方法によって、本明細書に記載した菌株から変異体を作成できる。例えば、新菌株をエチルメタンスルホン酸(EMS)突然変異誘発によって、胞子を形成しない変異体を得ることができる。当業において周知の方法によって、紫外光およびニトロソグアニジンを用いて変異体を作出できる。
胞子無形成変異体の一部は、発酵期間を延長してもそのままで溶菌しないため、これらの菌を非溶菌(-)と命名した。非溶菌菌株は、振とうフラスコ培地で胞子無形成変異体をスクリーニングし、発酵が終わってもそのままでかつ毒素結晶を含む変異体を、選抜し同定することができる。非溶菌菌株は、保護された被包性毒素蛋白質を取り出すための細胞処理を行うのに適している。
この胞子無形成変異体のファージ抵抗性変異体を調製するために、等量のファージ溶解液を栄養寒天培地に塗布して乾燥させる。そして、ファージ感受性菌株を、このファージ溶解液を乾燥させた培地に直接塗布して乾燥させる。このプレートを30℃でインキュベートする。プレートを2日間インキュベートすると、多くのコロニーが寒天培地上で増殖しているのが認められる。これらのコロニーのいくつかを選択し、栄養寒天培地上で継代培養する。これら外見上の抵抗性培養菌を、ファージ溶解液と交互に塗布して、抵抗性を検査する。ファージ溶解液を培地上に一直線に塗布して乾かす。そして、抵抗性培養菌をファージの線と交差するように塗布する。抵抗性の培養菌は、30℃で一晩インキュベートした後もファージの線を交差したいずれの部分でも溶菌を示さない。さらに、栄養寒天培地上に抵抗性の培養菌を一面に撒いて、ファージ抵抗性を再確認する。感受性菌株も同じように撒菌して、陽性対照として用いる。乾燥させた後、プレートの中央にファージ溶液を一滴撒いて乾かす。抵抗性培養菌は、30℃で24時間インキュベートした後も、ファージ溶解液を撒いたところで溶菌を示さない。
以下は、本発明を実施するための最良の態様を含む、実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。
実施例１-B.t.菌株の培養
B.t.菌株の継代培養液を、以下のペプトン、グルコース、および塩類培地に接種するのに用いることができる。
細菌培養用ペプトン        7.5 g/l
グルコース                1.0 g/l
KH2PO4                    3.4 g/l
K2HPO4                    4.35 g/l
塩類溶液                  5.0 ml/l
CaCl2溶液                 5.0 ml/l
塩類溶液(100 ml)
MgSO4・7H2O               2.46 g
MnSO4・H2O                0.04 g
ZnSO4・7H2O               0.28 g
FeSO4・7H2O               0.40 g
CaCl2溶液(100 ml)
CaCl2・2H2O               3.66 g
pH 7.2
塩類溶液およびCaCl2溶液は、濾過滅菌し、オートクレーブして調製した培地へ接種の際に加える。フラスコは、30℃、回転培養器中200 rpmで64時間インキュベートする。
上記の方法は、当業において周知の方法によって、大型発酵器に合わせて、容易に容量を増加させることができる。
上記の発酵によって得られたB.t.胞子および結晶は、当業において周知の方法によって分離することができる。頻繁に用いられる方法は、回収した発酵培地に分離技術、例えば、遠心分離を行うことである。
実施例２−201T6活性毒素（201T6-D）の産生
201T6毒素を短縮させるさまざまな方法によって、201T6活性毒素を産生することができる。これについて、国際公開公報第95/02693号を参考にすることができる。このような方法の一つにおいて、PS201T6の培養液を遠心分離して回収したものを、プロナーゼＥ（シグマ化学社（Sigma Chemical Company, P-5147ストレプトマイセス・グリセウス（Streptmyces griseus）に由来するXIV型細菌プロナーゼ））を0.5 mg/ml含む0.1 M Na2CO3/NaHCO3を用いpH11.0で、元の培養液容量の９分の１から25分の１に再懸濁した。この再懸濁液を、混合しながら、37℃で一晩インキュベートした。この懸濁液を、50倍から100倍容量の滅菌水または0.1M Na2CO3/NaHCO3 pH9.5に対して２回透析を行って、「透析懸濁物」を得た。
0.1 M Na2CO3/NaHCO3 pH9.5に対して透析を行なって得た懸濁液を遠心分離にかけて、細胞、胞子、および残渣を取り除いた。ワットマン（Whatman）のガラス・マイクロファイバーフィルターの、0.8ミクロンの酢酸セルロースのフィルターと0.2ミクロンの酢酸セルロースのフィルターとを用いた濾過によって、さらに、小さな胞子および残渣を取り除くための精製を行って、「濾過済み懸濁液」を得ることができる。
濾過の前または後に、50倍から100倍容量の滅菌水に対して２回透析を行なってから凍結乾燥させて、処理済みの毒素の乾燥調製物を調製した（プロナーゼ処理済み凍結乾燥毒素）。
実施例３−201T6活性毒素を産生するための別の方法
PS201T6の培養液を遠心分離して回収し、0.1 M Na2CO3/NaHCO3、0.5％ 2-メルカプトエタノール、pH11.0で、元の培養液容量の９分の１から25分の１に再懸濁した。この懸濁液を室温で約２時間インキュベートした。細胞、胞子、および残渣を取り除くために、この懸濁液を遠心分離した。ワットマン（Whatman）のガラス・マイクロファイバーフィルターの、0.8ミクロンの酢酸セルロースのフィルターと0.2ミクロンの酢酸セルロースのフィルターとを用いた濾過によって、さらに、小さな胞子および残渣を取り除くための精製を行って、「濾過済み懸濁液」を得ることができる。濾過の前または後に、50倍から100倍容量の滅菌水に対して２回透析を行なってから凍結乾燥させて、処理済みの毒素の乾燥調製物を調製した（プロナーゼ処理済み凍結乾燥毒素）。この手順にしたがって調製した材料を、本明細書においては、201T6-Dと呼ぶことにする。
実施例４−第２齢のアルファルファゾウムシ、ヒペラ・ポスティカ（Hypera postica）に対するB.t.菌株の活性
人工培地でトップ-ロード・バイオ解析を行なって、第２齢のアルファルファゾウムシに対する効果を調べた。寒天で作った食餌を、96穴の平底プレートの各ウェルに分注し、食餌の表面に懸濁液を塗布する前に固化させた。回転式の振とう機でゆっくりとトレイを回しながら、懸濁液が確実に表面全体を覆うようにした。層流フードの下で、食餌の表面の毒素懸濁液を風乾した。幼虫を一匹ずつ各ウェルに入れてから、温度感受性のポリエステルフィルムでシールした。この解析用トレイを23℃、70％ RH、昼夜の周期を8：16にして、６日間保持した。解剖顕微鏡下で、死亡しているかを観察した。表３では、PS201T6はすべて凍結乾燥した培地で、PS201T6-Dは、実施例３で説明した通りに調製されている。
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実施例５−イネミズゾウムシに対するB.t.菌株の活性
イネミズゾウムシの成虫に対するB.t.菌株の殺虫活性に関する評価を行なった。これらの実験で用いた昆虫は、ルイジアナ州アケーディア・パリッシュのイネ研究所のイネから採集したものである。ゾウムシを実験室に運び、濡れた紙タオルで内側を覆ったプラスチック製の保管箱に入れて、明期16時間で27℃に維持した。ゾウムシには、過剰量のイネの葉（品種キプロス）を与え、一日置きに補充した。ゾウムシを採集するイネには、生長期の間中、殺虫剤を散布しなかった。
実験で用いた植物体は、温室で栽培したキプロスイネである。16時間の明期は、金属ハロゲンランプによって提供した。温室の温度は、夜間27℃から昼間32℃以上に変動させた。
ボンド（Bond）・アジュバントの0.1 ％水溶液、１ mlを入れた２ mlの微量遠心用チューブに10 mgのB.t.菌株を加えて、B.t.処方剤を作製した。微量遠心用チューブをシールして、15秒間超音波破砕し、懸濁液の形にして、バイオアッセイに用いるまで４℃で保存した。
温室で栽培したキプロスイネの最も新らしい展開葉を切り取り、湿らせた紙タオルで包んでバイオアッセイを行なった。切り取った葉を実験室に持って行き、2.5〜3.5 cmの切片に切り分ける前に、0.1 ％のボンド・アジュバンド溶液に浸した綿球で静かに拭いた。それぞれの葉先と葉の基部の３ cmは除去した。B.t.菌株懸濁液の一つを入れた微量遠心用チューブの中に、葉切片を一枚ずつ入れた。葉切片を菌株懸濁液で均一に覆うため、チューブに蓋をして、3〜5秒間ボルテックスした。8〜10滴の水道水で濡らした円形の濾紙を２枚入れた５cmのペトリ皿の中に葉切片を一枚ずつ入れた。各ペトリ皿に、イネミズゾウムシの成虫を一匹ずつ加えてから、蓋をして「パラフィルム」という商品名のフィルムでシールした。このペトリ皿を、16時間明期、27℃で保持した。24時間毎にペトリ皿を開けて、ゾウムシが死んでいないか、また、どの程度食餌をとったかを判定した。
各菌株によって起こる死亡率の一覧表を下に示す。陰性対照を除くすべての処理において、ゾウムシが死ぬ結果となった。MR508組換え大腸菌は、B.t.菌株PS33F2から採取できる毒素を発現する。
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実施例６
本発明によると、特に関心がもたれるのは、ゾウムシを防除するためにCryIIIB.t.毒素およびcyt毒素を使用することである。表５に示すように、ゾウムシを効果的に防除するために、CryIII毒素の下位分類に由来する毒素およびcyt毒素を用いることができる。CryIII毒素は、当業者には周知である。本発明において特に関心が持たれるのは、CryIIIA、HD511、50CおよびK92からなる群より選択される毒素と、アミノ酸配列が少なくとも50％しか一致しない毒素である。好ましくは、配列の同一性は75％である。cyt毒素もよく知られており、具体的には、例えばcytA、cytB、および、201T6毒素がある。もう一度いうと、これらの毒素と50％または75％以上、配列が一致するのが好ましい。
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実施例７−ワタミゾウムシに対する、バチルス・チューリンギエンシスの活性
ワタミゾウムシに対する活性について、B.t.菌株を調べた。B.t.菌株は、粉末状で供給された。粉末の重さを量り、滅菌水に懸濁し、ボルテックスにかけてから、滅菌水で必要な濃度に希釈した。
ミシシッピ州ストーンビルにあるUSDAワタミゾウムシ飼育実験施設から、ワタミゾウムシの卵を、餌の上においた状態で受け取ったので、培養箱中、30℃で保持し、艀化するまで12：12（明：暗）の光周期を維持した。125 mlフラスコの中で55℃に保温している修正VA+SB食餌の中に、１mlの滅菌水に懸濁したB.t.菌株を混ぜた。食餌／B.t.混合液を、15 X 100 mmのプラスチック製ペトリ皿の中に注いだ。直後に、プラスチック製のグリッドを各食餌皿の中に入れた。皿一枚につき21匹の幼虫を入れた。食餌とB.t.および幼虫が入ったペトリ皿をパラフィルムで覆い、上記のようにして培養箱の中に置いた。24時間後、48時間後および72時間後に死亡率を評価した。72時間目に写真を撮り、虫が穴を掘り、餌を食べた量を定量的に評価した。72時間目に、ラクダの毛のブラシで触っても幼虫が反応しなければ、死んだものと判断した。
B.t.菌株PS201T6で、特に優れた活性が観察されたので、この菌株から毒素を採取した。好ましい態様においては、実施例２および３で説明されている方法を用いて201T6蛋白質を処理する。
B.t.菌株ブイブイ（KB92）についても、ワタミゾウムシに対する活性が観察された。
実施例８−毒素遺伝子の植物への挿入
本発明の一つの局面は、ゾウムシに対して活性のある毒素をコードする遺伝子によって植物を形質転換させることである。
当業においてよく知られた多様な技術を用いて、本明細書で開示されているような、ゾウムシに対して活性のある毒素をコードする遺伝子を植物細胞に挿入することができる。これらの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換因子に用いたT-DNAによる形質転換、（細胞）融合、マイクロインジェクション、パーティクルガン、化学薬品（PEG）を補助剤とするDNAの取り込み、エレクトロポレーション、そして、その他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリアを形質転換に用いるときは、特定のプラスミド、すなわち、中間ベクターまたはバイナリーベクターの中に、挿入すべきDNAをクローニングしなければならない。中間ベクターは、T-DNA中の配列と相同な配列によって起こる相同的組換えによって、TiプラスミドまたはRiプラスミドの中に取り込まれうる。また、TiプラスミドまたはRiプラスミドには、T-DNAの導入に必要とされるvir領域も含まれる。中間ベクターは、それ自身では、アグロバクテリアの中で複製することはできない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドという方法（接合）によって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の中に導入されうる。バイナリーベクターは、大腸菌とアグロバクテリアの両方の中で複製することができる。これらは、選抜マーカー遺伝子、およびT-DNAの左右の境界領域を両端に有するリンカーまたはポリリンカーを含む。これらは、アグロバクテリアの中に直接形質転換される（ホルスター(Holster)ら、[1978] Mol. Gen.Genet. 163: 181〜187)。宿主細胞として用いるアグロバクテリウムは、vir領域を有するプラスミドを含んでいなければならない。植物細胞の中にT-DNAを導入するためには、vir領域が必要である。
植物細胞の形質転換にT-DNAを用いることが、集中的に研究され、「欧州特許第120 516号；ホエケマ(Hoekema)[1985]、植物バイナリーベクター・システム、Offset-durkkerij Kanter B.V.,Alblasserdam, 第５章；フレイリー(Fraley)ら、Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1〜46；アン(An)ら、(1985) EMBO J. 4: 277〜287」などにおいて、十分に説明されている。
挿入されたDNAがゲノムの中にいったん取り込まれると、原則として、DNAは比較的安定的に存在し、二度と飛び出してくることはない。挿入されたDNAには、特に、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、または、クロラムフェニコールなどの殺生物剤または抗生物質に対する耐性を、形質転換された植物細胞に付与する選抜マーカーが含まれている。したがって、個々の場合に用いられるマーカーは、挿入DNAを持たない細胞を選抜するものではなく、形質転換された細胞を選抜することができるものでなければならない。
このようにして形質転換されたバクテリアを用いて、植物細胞の形質転換を行なった。植物細胞の中にDNAを導入するには、都合のよいことに、植物の外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）とともに栽培することが可能である。そして、選抜用の抗生物質または殺生剤を含む適当な培地の中で、形質転換された植物材料（例えば、葉片、茎の一部、根、または、プロトプラストもしくは懸濁培養細胞）から植物体全体を再生することができる。次に、このようにして得た植物体に挿入DNAがあるか否かを調べる。マイクロインジェクションおよびエレクトロボレーションを用いる場合には、プラスミドの作製に特別必要とされるものはない。普通のプラスミド、例えば、PUC由来のプラスミドを用いることができる。
形質転換された細胞は、普通の場合と同じように、植物体の中で増殖する。それらは、生殖細胞を形成し、形質転換した形質を後代の植物体に伝達する。このような植物体を通常の条件で栽培して、形質転換された同じ遺伝因子または別の遺伝因子を有する植物体と交配させることができる。その結果できる雑種個体は、それに対応する形質特性を有する。
本明細書に開示された実施例および態様は、具体例を示すことのみを目的とするものと理解されるべきで、当業者は、このことを考慮することによりさまざまな修正または変更を思いつくと考えられるが、それらも本願の精神および範囲に含まれ、添付の請求の範囲に含まれるものと理解されるべきである。