(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７に示されるアミノ酸配列から成る、精製されたＤＮＡの重合を触媒する熱安定性酵素。
【請求項２】
３’→５’エキソヌクレアーゼのエキソモチーフＩ内における連続したアミノ酸ＤＩＥがＡＩＡ、ＥＩＥ、ＥＩＤ、ＤＩＤまたはＤＩＡに置換されている請求項１に記載の酵素の誘導体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の熱安定性酵素をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターによって形質転換された微生物宿主。
【請求項６】
前記形質転換体が大腸菌ＮＥＢ＃９１５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７５８１８）である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換微生物宿主をポリメラーゼの発現に適した条件下に培養し、当該ポリメラーゼを回収する段階を含む請求項１または２に記載のポリメラーゼの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は超耐熱酵素に関する。より詳細には本発明は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ９°Ｎ−７及びその組換え形に関する。本発明は更に、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼのエキソモチーフＩの突然変異を誘発し、３’→５’エキソモチーフＩ  ＤＮＡセグメント中の天然型保存ＤＸＥをＤＸＤまたはＡＸＡに変異させる方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの修復及び複製に関与する酵素のファミリーである。大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)のような中温性微生物からＤＮＡポリメラーゼを単離する方法に関しては広汎な研究が進んでいる。例えば、Ｂｅｓｓｍａｎら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２３３:１７１−１７７(１９５７)及びＢｕｔｔｉｎとＫｏｒｎｂｅｒｇ、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２４１:５４１９−５４２７(１９６６)参照。
【０００３】
大腸菌から単離されたＤＮＡポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼがある。これらの酵素は、例えば、ニックトランスレーションによるＤＮＡの標識、ｃＤＮＡクローニングにおける二本鎖ｃＤＮＡの合成及びＤＮＡの配列決定のような組換えＤＮＡ技術において多様な用途を有している。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(１９８２)参照。
【０００４】
近年、米国特許第４,６８３,１９５号、第４,６８３,２０２号及び第４,８００,１５９号は、核酸配列の増幅、検出及び／またはクローニングのプロセスにおける上記酵素の使用を開示した。一般にポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)と呼ばれるこのプロセスでは、存在する核酸配列を増幅するために、ポリメラーゼ、プライマー及びヌクレオチド三リン酸が使用される。
【０００５】
上記のＤＮＡポリメラーゼのあるものは、合成が１塩基対の選択段階だけから成る場合よりもはるかに高い忠実度のＤＮＡ複製を行うプルーフリーディング機能を伴う３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有している。Ｂｒｕｔｌａｇ,Ｄ.及びＫｏｒｎｂｅｒｇ,Ａ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２４７:２４１−２４８(１９７２)。３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有しているＤＮＡポリメラーゼはプルーフリーディング機能をもたないエキソヌクレアーゼを有しているポリメラーゼに比較すると、塩基取込みの誤り率は実質的に低い。Ｃｈａｎｇ,Ｌ.Ｍ.Ｓ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５２:１８７３−１８８０(１９７７)。
【０００６】
また、サーマス・アクアティクス(Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ)のような好熱菌からＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製する方法の研究も進められている。Ｃｈｉｅｎ,Ａ.ら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.１２７:１５５０−１５５７(１９７６)は、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ菌ＹＴ１株から至適温度８０℃のＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製する方法を開示している。Ｃｈｉｅｎらの精製手順は４段階プロセスを含む。これらの段階は、粗抽出物の調製、ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー及びＤＮＡセルロース上のクロマトグラフィーから成る。Ｋａｌｅｄｉｎら、Ｂｉｏｋｈｙｍｉｙａｙ  ４５:６４４−６５１(１９８０)も、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ菌ＹＴ１株の細胞からＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製する方法を開示している。Ｋａｌｅｄｉｎらの精製手順は６段階プロセスを含む。これらの段階は、粗抽出物の単離、硫安沈殿、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト上の分別、ＤＥＡＥ−セルロース上の分別及び一本鎖ＤＮＡ−セルロース上のクロマトグラフィーから成る。
【０００７】
米国特許第４,８８９,８１８号は、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られた精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを開示している。これは、一本鎖ＤＮＡ−セルロース上のクロマトグラフィー段階に代えてホスホセルロースクロマトグラフィー段階を付加した以外はＫａｌｅｄｉｎのプロセスに実質的に等しいプロセスによって調製された分子量約８６,０００から９０,０００ダルトンのポリメラーゼである。更に、欧州特許出願第０２５８０１７号は、上記ＰＣＲプロセスに好ましく使用される酵素としてＴａｑポリメラーゼを挙げている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有しているが３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ機能を有していないことが研究によって判明した。Ｌａｗｙｅｒ,Ｆ.Ｃ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,２６４:１１,ｐ.６４２７−６４３７(１９８９)。Ｂｅｒｎａｒｄ,Ａ.ら、Ｃｅｌｌ  ５９:２１９(１９８９)。その結果として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは塩基取込みの誤りを生じ易く、いくつかの用途では使用が望ましくない。例えば、遺伝子の任意の１つのコピーがランダムな不正取込み事象に起因する誤りを含む可能性があるので、増幅された遺伝子をクローニングすることには問題がある。複製サイクル中(例えば早期複製サイクル中)の誤り発生場所次第では、増幅された全ＤＮＡが誤って取り込まれた塩基を含み、従って突然変異した遺伝子産物が生じることも有り得る。更に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性が１００℃で数分間以下であることも研究から判明した。
【０００９】
従って、自然科学の分野では、同等または改良された熱安定性及び／または３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する別のＤＮＡポリメラーゼが要望されている。(より詳細に後述する)このような酵素の一つとして、海底熱水孔近傍の１００℃近い温度で増殖する古細菌の一種であるサーモコッカス・リトラリス(Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ)から得られたＤＮＡポリメラーゼを大腸菌にクローニングした。しかしながら、２つの介在配列が存在していること、少なくともその一方を遺伝子操作技術によって除去する必要があること、双方の介在配列が大腸菌中でスプライシングによって除去されるエンドヌクレアーゼをコードしていること、などの理由により、この遺伝子から上記の組換え酵素タンパク質の量産を図ることは難しい。
【００１０】
(天然型または変調型の)３’→５’プルーフリーディング活性を有しており及び／または同等もしくは向上した熱安定性を有しており上記ＤＮＡポリメラーゼプロセスを改良するような別の古細菌由来の超耐熱ＤＮＡポリメラーゼの取得及び産生が強く要望されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの実施態様は、ＤＮＡの重合を触媒する単離物９°Ｎ−７から得られた熱安定酵素を提供することである。９°Ｎ(北緯９°)の東太平洋海洋台地の水深約２５００メートルの海底熱水孔から採取した古細菌の単離物９°Ｎ−７から得られたこの熱安定酵素は、分子量約９０−９５ｋＤａを有し且つ９５℃の予測半減期約５−６時間を有するＤＮＡポリメラーゼである。
【００１２】
９°Ｎ−７をコードするＤＮＡが単離されたが、このＤＮＡは熱安定ＤＮＡポリメラーゼを得るための好適な手段を提供する。
【００１３】
９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有している。本発明によれば、９°Ｎ−７のＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られるＤＮＡポリメラーゼの約５倍であることが知見された。その結果として、９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼのような３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ機能を有していない熱安定ポリメラーゼよりもはるかに高い忠実度を有している。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、突然変異誘発された３’→５’エキソモチーフＩ  ＤＮＡポリメラーゼを提供することである。この突然変異では、ポリメラーゼの保存領域ＤＸＥがＤＸＤに変異する。(Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｃｅｌｌ,５９:２１９−２２８(１９８１)参照。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする)。該突然変異によって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は野生型組換え９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの約１０％未満まで減少するが完全には消滅しない(図２０参照)。
【００１５】
例えば約０.１％から約１０％の範囲の変調エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、長鎖ＰＣＲ及び標準ＰＣＲを含む多くの用途に有用である。長鎖ＰＣＲにおいては、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する少量のＤＮＡポルをプルーフリーディング活性の欠如したＤＮＡポルと混合する結果としてより長いＤＮＡ断片が増幅される(Ｂａｒｎｅｓ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９１:２２１６−２２２０(１９９４)及びＣｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９１:５６９５−５６９９(１９９４))。二次的には、エキソヌクレアーゼ活性の減少は、プライマー、鋳型または産物を分解するなどのエキソ活性の不都合な影響を抑制しながらプルーフリーディング能力を維持するので、プライマー延長またはＰＣＲに有利に作用するであろう。このような突然変異ポリメラーゼは実施例において後述するように作製されてもよくまたはＢｅｒｎａｒｄら、前出、に記載のようにして作製されてもよい。
【００１６】
ＤＸＥ保存領域はすべての３’→５’エキソ型ＤＮＡポリメラーゼに共通であると考えられるので、かかるポリメラーゼの突然変異誘発にはＤＸＥからＤＸＤへの変換が有効であろう。突然変異した９°Ｎポリメラーゼは後述するように長鎖ＰＣＲにおいて特に有用であることが知見された。
【００１７】
【発明の実施の形態】
１つの実施態様によれば本発明は、９°Ｎ−７株から得られるＤＮＡポリメラーゼから成る熱安定酵素に関する。この菌株は、Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ.Ｈｏｌｇｅｒ  Ｊａｎｎａｓｃｈによって、９°Ｎの東太平洋海洋台地の水深約２５００Ｍの海底熱水孔から単離された。９°Ｎ−７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ定量によれば分子量約９０−９５ｋＤａを有する３’→５’エキソをもつＤＮＡポリメラーゼである。
【００１８】
しかしながら、超好熱菌に由来のタンパク質である９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼは、完全変性しないという特性またはその他の固有の諸特性によって異常な相対分子量に電気泳動し得る。本発明の熱安定酵素の正確な分子量は、９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコーディング配列から決定し得る。溶出産物の分子量は、任意の技術、例えばタンパク質分子量マーカーを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって測定し得る。
【００１９】
ポリメラーゼ活性は好ましくは、ＤＮアーゼ処理したＤＮＡまたは活性化したＤＮＡに取込まれた放射性標識デオキシヌクレオチドによって測定する。取込まれなかったデオキシヌクレオチドをＤＮＡ基質から分離した後のポリメラーゼ活性は、ＤＮＡを含む酸不溶性画分中の放射能の量に比例する。Ｌｅｈｍａｎ,Ｉ.Ｒ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.(１９５８)２３３:１６３参照。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。
【００２０】
本発明の組換えＤＮＡポリメラーゼの半減期は９５℃で約５−６時間であると予測されている。ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性または半減期は、ＢＳＡを含有する反応緩衝液の存在下に該当する温度で酵素をプレインキュベートすることによって測定し得る。１２時間以内の所定の時間間隔毎に少量のアリコートを取り出し、ＤＮＡ基質とｄＮＴＰとＢＳＡとを含有する反応緩衝液に添加し、上述の方法でポリメラーゼ活性を検定する。
【００２１】
本発明の熱安定酵素をコードする遺伝子が９°Ｎ−７ゲノムＤＮＡからクローニングされたので、この酵素を組換えＤＮＡ技術によって産生することもできる。９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの完全コーディング配列は大腸菌内のｐＵＣ１９中の約６.２ＫｂのＥｃｏＲＩ  ９°Ｎ−７ゲノムＤＮＡから誘導できる。部分的配列決定後、９°Ｎ−７  ＤＮＡポルのコーディング領域をｐＡＩＩ１７にサブクローニングしてＮＥＢ９１５を形成する。この大腸菌株はブダペスト条約の約定に従って１９９４年６月２２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ＡＴＣＣ)に寄託され、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.７５８１８として受託された。好ましいプロセスは、(１)標的古細菌からゲノムライブラリーを作製し、(２)適当な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、(３)(ｉ)形質転換もしくはトランスフェクトされた宿主細胞から得られたＤＮＡを、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブと反応させるか、または、(ｉｉ)形質転換もしくはトランスフェクトされた宿主細胞の抽出物を、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼと交差反応性の抗体プローブと反応させ、(４)ＤＮＡプローブにハイブリダイズするかまたはＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ特異的抗体と交差反応する段階(３)の形質転換もしくはトランスフェクト細胞の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を検定する段階から成る。
【００２２】
上記方法によれば、古細菌由来の組換えＤＮＡポリメラーゼを産生し、また、該ポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離することが可能である。
【００２３】
より詳細に後述するごとく、多くの古細菌類はＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ中に１つまたはそれ以上の介在配列を有しているため、かかる古細菌からの組換えＤＮＡポリメラーゼの発現は増進させる必要がある。上記に指摘したように、古細菌のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、標的組換えＤＮＡポリメラーゼの発現を錯綜させる１つまたはそれ以上の介在配列を有すると考えられている。介在配列が普通には宿主細胞中でのスプライシングによって除去されるとしても、発現系を構築する前にこれらの介在配列を検出して除去することができれば、標的ＤＮＡポリメラーゼの発現を増進させ得ることが知見された。より詳細に後述するように、介在配列は種々の方法によって同定及び除去し得る。特に、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの介在配列は、ピロコッカス(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ)のような別の古細菌属とＤＮＡレベルでかなりのホモロジーを有していることも知見された。このような知見が得られたことが、より詳細に後述する方法による介在配列の同定、位置決定及び除去を容易にしたのであろう。
【００２４】
本発明のいくつかの実施態様を行うためには、(ｉ)Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブを用いるか、または、(ｉｉ)Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼと交差反応する抗体を用いるのが好ましい。ＤＮＡプローブは好ましくは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列(図６(ＳＥＱ  ＩＤＮＯ:１)参照)に基づいて構築され、抗体プローブは好ましくは、精製Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ酵素自体から作製される。本発明の手順に従って他の古細菌ソースのＤＮＡポリメラーゼまたはそのＤＮＡに基づくプローブを構築することも勿論可能である。しかしながら、このようなプローブを構築するためには、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られたＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡを使用するのが好ましい。
【００２５】
天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの産生
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ菌ＮＳ−Ｃ株から得られる(ＤＳＭ  Ｎｏ.５４７３、このサンプルも１９９１年９月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.５５２３３で受託された)。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓは１９８５年にイタリア、ナポリ近傍の海底熱水孔から単離された。この微生物Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓはイオウを代謝する超好熱性古細菌であり５５℃から９８℃に増殖範囲を有している。Ｎｅｕｎｅｒら、Ａｒｃｈ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.(１９９０)１５３:２０５−２０７。
【００２６】
天然型タンパク質を回収するためには、Ｂｅｌｋｉｎら、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.(１９８５)１４２:１８１−１８６によって記載された技術のような適当な技術を用いてＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓを増殖させるとよい。該文献の記載内容は本発明に含まれるものとする。簡単に説明すると、ネジキャップの付いた１５ｍｌの試験管内で１０ｍｇ／ｍｌのイオウと０.０１Ｍのシステインとを含有する上記培地中で細胞を９５℃で２日間増殖させる。より多い量の細胞が必要な場合には、ネジキャップの付いた１リットルの瓶を使用し、滅菌後に新しい１０ｍｌの培養物を接種し、９０−９５℃で２日間増殖させる。
【００２７】
細胞の増殖後、酵素を単離及び精製する好ましい方法の１つとして、以下のような多段階プロセスがある。
【００２８】
先ず、細胞が凍結している場合には細胞を解凍し、緩衝液Ａ(１０ｍＭのＫＰＯ4緩衝液(ｐＨ７.４);１.０ｍＭのＥＤＴＡ、１.０ｍＭのβ−メルカプトエタノール)のような適当な緩衝液に懸濁させ、音波処理し、遠心する。次に、Ａｆｆｉｇｅｌブルーカラム(Ｂｉｏｒａｄ)のような核酸に結合するタンパク質に対して高い親和性を有するカラムに上清を導入する。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの上清溶液中に存在する核酸及び多くのタンパク質は、カラムを通過し、カラムの数倍容のｐＨ約７.０の低塩緩衝液でカラムを洗浄することによって除去される。洗浄後、酵素を例えば０.１−２.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)によって溶出させる。ＤＮＡポリメラーゼのピーク活性を透析し、ホスホセルロースカラムに導入する。カラムを洗浄し、酵素活性を例えば０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させる。ＤＮＡポリメラーゼのピーク活性を透析し、ＤＮＡセルロースカラムに導入する。カラムを洗浄し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させる。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む画分をプールし、緩衝液Ａに透析し、高速液体クロマトグラフィーカラム(ＨＰＬＣ)モノ−Ｑカラム(アニオン交換体)に導入する。酵素を例えば０.０５−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で再度溶出させる。熱安定ポリメラーゼ活性を有する画分をプールし、希釈し、ＨＰＬＣモノ−Ｓカラム(カチオン交換体)に導入する。酵素を例えば０.０５−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で再度溶出させる。この段階で酵素は約５０％純度である。５０ｍＭのＮａＣｌを補充した緩衝液Ａに対して繰り返し透析してより低い分子量の夾雑タンパク質を沈殿させることによって酵素を更に精製し得る。
【００２９】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られるＤＮＡポリメラーゼの見掛け分子量は、分子量９７,４００ダルトンのホスホリラーゼＢのような既知分子量のタンパク質標準に比較して約９０,０００から９５,０００ダルトンの範囲である。しかしながら、超好熱菌に由来のタンパク質であるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、完全に変性できないためまたはその他の固有の諸特性のために異常な相対分子量に電気泳動することも有り得ることは理解されよう。本発明の熱安定酵素の正確な分子量は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコーディング配列から決定され得る。溶出産物の分子量は、任意の技術、例えばタンパク質分子量マーカーを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって測定され得る。
【００３０】
ポリメラーゼ活性は好ましくは、ＤＮアーゼ処理したＤＮＡまたは活性化したＤＮＡに取込まれた放射性標識デオキシヌクレオチドによって測定する。取込まれなかったデオキシヌクレオチドをＤＮＡ基質から分離した後のポリメラーゼ活性はＤＮＡを含む酸不溶性画分中の放射能の量に比例する。Ｌｅｈｍａｎ,Ｉ.Ｒ.ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.(１９５８)２３３:１６３参照。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。
【００３１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの半減期は１００℃で約６０分である。ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性または半減期は、放射性標識された１つのデオキシヌクレオチドを除く全部のアッセイ成分(緩衝液、ＭｇＣｌ2、デオキシヌクレオチド及び活性化ＤＮＡ)の存在下に該当する温度で酵素をプレインキュベートすることによって測定する。４−１８０分の範囲の所定の時間間隔毎に少量のアリコートを取り出し、上述の方法を用いてポリメラーゼ活性を検定する。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼの１００℃の半減期はまた、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００(Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ  Ｃｏ.)という通称で知られた非イオン性界面活性剤オクトキシノールまたはタンパク質ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)のような安定剤の存在下に測定し得る。非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチル化(２０)ソルビタンモノラウレート(Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ.)及びエトキシル化アルキルフェノール(ノニル)(ＩＣＯＮＯＬ  ＮＰ−４０,ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ.)も使用し得る。安定剤は、反応混合物に添加された少量の酵素が試験管壁に付着することを防止し、また、酵素活性が低下するような何らかの変化が酵素の構造的コンホメーションに生じることを防止する。安定剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢＳＡの存在下ではＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られるＤＮＡポリメラーゼの１００℃の半減期は約９５分間である。
【００３３】
組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの調製
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子はＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのゲノムＤＮＡからクローニングされたので、この酵素を組換えＤＮＡ技術によって産生することも可能である。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの完全コーディング配列(図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１))は、バクテリオファージＮＥＢ＃６１９の約１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントから推定され得る。このファージは１９９０年４月２４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ＡＴＣＣ)に寄託され、ＡＴＣＣ
Ｎｏ.４０７９５で受託された。
【００３４】
組換え形のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、一般には以下の段階を含む方法によって産生される。先ず、活性形ポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離する。この活性形ポリメラーゼは、天然形態でもよくまたは別の配列との融合形態でもよい。この別の配列は、天然形ポリメラーゼから開裂されたものでもそうでないものでもよく、また、ポリメラーゼ活性に影響を与えるものでも与えないものでもよい。次に、原核細胞または真核細胞宿主／ベクター系中で発現させるために遺伝子を適当な調節配列に操作可能に結合させる。ベクターは適当な宿主中の形質転換及び維持に必要なすべての機能をコードしているのが好ましく、また、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ発現用の選択可能マーカー及び／または調節配列をコードしていてもよい。活性な組換え熱安定ポリメラーゼは、形質転換宿主培養物によって連続的に産生されることもできまたは発現の誘発後に産生されることもできる。活性な熱安定ポリメラーゼは、宿主細胞内部から回収することもできまたはタンパク質が細胞膜を介して分泌される場合には培養培地から回収できる。
【００３５】
上記段階の各々は多くの方法で実施できるが、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをクローニングする場合には、大腸菌中でポリメラーゼをそれ自体の調節配列から発現させると、ポリメラーゼ遺伝子が不安定になり、ポリメラーゼ遺伝子中に高頻度の突然変異が生じ、細胞増殖の減速及びある程度の細胞致死が生じることが知見された。
【００３６】
他の解釈の可能性も否定はしないが、この不安定性の原因の少なくとも一部は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を分断する１６１４ｂｐの介在配列、即ち図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１７７６−３３８９の配列、及び、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を分断する１１７０ｂｐの第二介在配列、即ちヌクレオチド３５３４−４７０３の配列存在に起因すると考えられる。後述するごとく、他の古細菌のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ中にも介在配列が存在すると考えられている。多数の古細菌の介在配列はまた、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ中に存在する介在配列と実質的なホモロジーを有していると考えられている。従って、そのような介在配列の同定、位置決定及び除去を容易にすることも本発明の目的の１つである。
【００３７】
イントロンは遺伝子のコーディング領域を分断する介在ＤＮＡストレッチである(タンパク質をコードする領域はエキソンと呼ばれる)。イントロンはナンセンス配列を含む場合もあり、タンパク質をコードしている場合もある。機能性タンパク質を作製するためには、成熟ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する前にプレ−ｍＲＮＡからスプライシングによってイントロンを除去する必要がある。イントロンは真核細胞中で初めて同定されたが、最近ではいくつかの原核細胞中で同定されたと記載されている(Ｋｒａｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ(１９８８)  Ｂ.Ｄ.Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄ.Ｍ.Ｇｌｏｖｅｒ,ｅｄｓ.ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ,Ｏｘｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ.Ｃ.  ｐｐ.１３１−２０６))。イントロンを含む遺伝子がｍＲＮＡに転写されたとき、成熟ｍＲＮＡを形成するためには、イントロンが自発的にスプライシングによって除去されるかまたは細胞性因子がイントロンをプレ−ｍＲＮＡから除去することが必要であろう(前出)。細菌性イントロンはしばしばスプライシングのために属特異的補因子を必要とする。例えば、バチルスイントロンは大腸菌中ではスプライシングされないであろう(前出)。
【００３８】
しかしながら、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の内部の介在ＤＮＡ配列が転写及び翻訳されること、また、該配列から産生されるペプチドはｍＲＮＡレベルでなくタンパク質レベルでスプライシングされることを示唆するいくつかの証拠が存在する。従って、スプライシング事象が何処で生じるかにかかわりなく、大腸菌中でＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを発現させるためには、大腸菌系中でポリメラーゼを発現させる前に介在配列を欠失させるのが好ましい。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターは、適当な介在配列スプライシング因子を有する系、例えばサーモコッカス(Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ)系中では発現可能であった。
【００３９】
また、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの熱安定性ポリメラーゼ発現は大腸菌中でのクローニング及び発現中に厳密に調節されるのが好ましい。本発明を実施するために有用なベクターは、以下の調節要素(ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ)のいくつかまたは全部を提供することによって様々な程度に調節されたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現を提供できるものでなければならない:(１)ポリメラーゼの開始点に直接隣接しているかまたは融合タンパク質から成る転写開始部位又はプロモーター、(２)遺伝子の発現をターンオンまたはターンオフするために使用され得るオペレータ、(３)翻訳を促進するリボソーム結合部位、(４)安定性を向上させる転写または翻訳終了部位。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのクローニング及び発現に使用される適正なベクターは、例えばファージ及びプラスミドである。ファージの例としては、λｇｔ１１(Ｐｒｏｍｅｇａ)、λＤａｓｈ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、λＺａｐＩＩ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)がある。プラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、ｐＳＰ７３(Ｐｒｏｍｅｇａ)、ｐＧＷ７(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.４０１６６)、ｐＥＴ３Ａ(Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ(１９８７)５６:１２５−１３５)及びｐＥＴ１１Ｃ(Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９９０)１８５:６０−８９)がある。
【００４０】
形質転換及び感染
形質転換、ファージ感染及び細胞培養には標準プロトコルが存在する。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(１９８２)。プラスミドの形質転換に使用され得る多数の大腸菌株のうち、好ましい菌株としては、ＪＭ１０１(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.３３８７６)、ＸＬ１(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)及びＲＲＩ(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.３１３４３)並びにＢＬ２１(ＤＥ３)ｐｌｙＳ(Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９９０)、前出)がある。大腸菌ＸＬ１株、ＥＲ１５７８株及びＥＲ１４５８株(Ｒａｌｅｉｇｈら、Ｎ.Ａ.Ｒｅｓｅａｒｃｈ(１９８８)１６:１５６３−１５７５)はλファージに使用され得る菌株に属し、Ｙ１０８９はλｇｔ１１溶原化に使用され得る菌株である。Ｙ１０８９中で過渡的な溶原体を調製するときには(Ａｒａｓｕら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ(１９８７)６４:２８１−２８９)、単一ファージを大用量で用いるかまたは溶菌宿主との同時培養によってλｇｔ１１組換えファージを培養物に感染させる。感染したＹ１０８９細胞を好ましくは誘導物質ＩＰＴＧの存在下に３７℃で増殖させると溶菌欠失宿主／ファージ系の内部に組換えタンパク質が蓄積する。
【００４１】
ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの構築及び熱安定ポリメラーゼのスクリーニング所望の遺伝子の最も常用のスクリーニング方法としては、(１)他の生物に由来の相同遺伝子へのハイブリダイゼーション、(２)宿主欠陥の相補性による活性の選択、(３)特異的抗体との反応性、または(４)酵素活性のスクリーニングがある。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの場合、最初に必要なのは完全活性酵素でなく酵素の一部分の発現だけであるから抗体検出が好ましい。大腸菌中のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子が不安定であるためより難しい別の方法でも成功が得られた。
【００４２】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡはゲノムライブラリーを構築するためにランダムフラグメントまたは制限酵素フラグメントとして使用され得る。後者のフラグメントとして使用する方法が好ましい。好ましくは、Ｍａｉｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(１９８２)に記載されたような標準ＤＮＡ制限技術を用いてＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムＤＮＡからＥｃｏＲＩ部分を調製する。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ＢａｍＨＩ、ＮｒｕＩ及びＸｂａＩのような別の制限酵素も使用し得る。
【００４３】
抗体を用いる方法はプラスミド及びファージのいずれのスクリーニングにも使用できるが(Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ,ＰＮＡＳ(１９８３)８０:１１９４−１１９８)、ファージ系のほうが操作し易く従って最初のライブラリーとしては好ましいことが知見された。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ調節領域が大腸菌中で機能するか否かは確認されていないので、λｇｔ１１及びλＺａｐＩＩのような必要な発現調節領域全部を供給するファージベクターが好ましい。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡをλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることによって、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼをβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させることもできまたはそれ自体の内在プロモーターから発現させることもできる。
【００４４】
形成した発現ライブラリーを、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ,ＰＮＡＳ(１９８３)、前出、に記載されたような標準抗体／プラーク手順を用いてマウス抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ抗血清によってスクリーニングする。
【００４５】
発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されるマウス抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ抗血清は、ＨａｒｌｏｗとＣａｎｅ,Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(１９８８)ＣＳＨＰｒｅｓｓに記載された技術のような標準技術を用いて調製され得る。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ほとんどの血清が大腸菌タンパク質と反応するので、発現ライブラリーをスクリーニングするときにはバックグラウンド反応性を低減するためにＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗血清を標準方法によって大腸菌タンパク質に予め吸収させるのが好ましい。抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗血清と反応するファージを選択し、プラーク精製する。ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ,ＰＮＡＳ(１９８３)、前出。
【００４６】
遺伝子の全部または一部をコードするＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡを次に、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、Ｍ１３またはｐＵＣ１９中でサブクローニングし得る。所望の場合、例えばＳａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法(Ｓａｎｇｅｒ,Ｆ.,Ｎｉｃｋｌｅｎ,Ｓ.  ＆  Ｃｏｕｌｓｏｎ,Ａ.Ｒ.,ＰＮＡＳ(１９７７)７４:５４６３−５４６７)によってＤＮＡ配列を決定し得る。
【００４７】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの発現
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列が得られたことを決定するためにいくつかの方法が存在する。これらの方法では例えば、組換えＤＮＡによって産生されたタンパク質の実際のもしくは推定されたアミノ末端配列を天然型タンパク質に比較するか、または、組換えＤＮＡが天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体に結合するタンパク質を産生するか否かを決定する。更に、Ｗａｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ(１９８９)３:２０、による研究は、ＤＮＡポリメラーゼ配列のいくつかの領域は多くの種において高度に保存されていることを示唆する。その結果として、クローニングされた遺伝子産物の予測アミノ酸配列をヒトＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのような既知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比較し、これらのホモロジーアイランドが同定されると、組換えＤＮＡが実際にＤＮＡポリメラーゼをコードしているという強力な証拠が得られる。同定されたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、例えばｐＥＴ３Ａ、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔまたはｐＵＣ１９のような大腸菌に由来のプラスミド、またはｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５及びｐＣ１９４のような枯草菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)に由来のプラスミド、ｐＳＨ１９及びｐＳＨ１５のような酵母由来のプラスミド、λファージのようなバクテリオファージ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ)のような細菌、レトロウイルスのような動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルスなどの適正な発現ベクターにクローニングし得る。
【００４８】
上記に指摘したように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡが２つの介在配列、即ち、(ｉ)１６１４ｂｐの介在配列、即ち図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１７７６−３３８９にわたる介在配列、及び、(ｉｉ)１１７０ｂｐの介在配列、即ち図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド３５３４−４７０３にわたる介在配列を含むことが知見された。この１１７０ｂｐの介在配列はエンドヌクレアーゼをコードしており、大腸菌中で自己スプライシングすることが知見されている。大腸菌のような宿主細胞中で超発現させる前に１６１４ｂｐの介在配列及び１１７０ｂｐの介在配列の双方をコードするＤＮＡ配列を欠失させるのが好ましい。１１７０ｂｐの介在配列は大腸菌からスプライシングされるとしても、この介在配列を含まない発現ベクターは所望のポリメラーゼの産生を増加させることが知見された。
【００４９】
一般に、ヌクレオチド配列内部の介在配列が同定及び位置決定されると、ＤＮＡ配列を欠失させ従って介在配列をｉｎ ｖｉｔｒｏスプライシングするために使用し得る多くの方法が当業界で公知である。１つの方法では、コーディング領域中にスプライス部位、即ち、欠失すべき領域に近傍の非反復制限酵素部位を同定する。２つの制限フラグメント間のギャップを架橋するために二重鎖オリゴマーを合成する。アミノ末端制限フラグメントと架橋用オリゴとカルボキシ末端制限フラグメントとから成る三部結合によって介在配列が欠失したインタクトな遺伝子が得られる。
【００５０】
別の方法は、上記方法の改変型方法である。介在配列の大部分は、介在配列内部でコーディング配列との境界の近傍に非反復部位をもつ制限酵素で切断することによって欠失する。介在配列の大部分が欠失した直鎖状プラスミドを互いに結合する。ｆ１ヘルパーファージＩＲ１で超感染することによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター組換え体から一本鎖ファージを作製する。所望の最終配列をもつ一本鎖オリゴマーを合成し、介在配列が部分的に欠失したファージＤＮＡにアニーリングする。このようにして介在配列の残部をループから除去する。大腸菌ＣＪ２３６株中の出発ファージを産生することによって、介在配列が完全に欠失した構築物を選択するためにＫｕｎｋｅｌの突然変異誘発方法(Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４:３６７(１９８７))を使用し得る。
【００５１】
介在配列を欠失させるために使用され得る更に別の方法では、ＤＮＡ増幅を使用する。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(１９８９)  Ｖｏｌ.２,  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ参照。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。簡単に説明すると、遺伝子のアミノ側半鎖とカルボキシ側半鎖とを増幅し次いで接合するためのプライマーを作製する。
【００５２】
上述の方法を用いて介在配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失させるとき、天然型スプライス部位は未知であろう。従って、当業者は、活性酵素の産生に帰着するいくつかの可能な人工的スプライス部位が存在すると予測した。
【００５３】
介在配列が欠失した後、例えば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をその内在調節因子から分離し、次いで極めて厳密に調節されたＴ７発現ベクターのようなプロモーターにポリメラーゼ遺伝子を作動可能に結合することによってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの過発現を達成し得る。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ(１９８７)５６:１２５−１３５参照。該文献は本明細書に含まれるものとする。強力なプロモーターを挿入するためには、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの両端の近傍の適当な制限標的とベクター上のプロモーター近傍の適合性制限標的とを同定するか、または部位特異的突然変異誘発(Ｋｕｎｋｅｌ(１９８４)、前出)を用いて制限標的を作製し、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を強力プロモーターの転写及び翻訳調節下に維持されるような配向でベクターに移入するとよい。
【００５４】
また、遺伝子の発現を増加させるためにＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子よりも上流に配置された強力なリボソーム結合部位を利用することによってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを過発現させてもよい。ＳｈｉｎｅとＤａｌｇａｒｎｏ,  Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ(１９７４)７１:１３４２−１３４６参照。該文献は本明細書に含まれるものとする。
【００５５】
形質転換及びファージ感染のための標準技術を使用して組換えベクターを適正宿主に導入する。例えば、大腸菌に対してはＣｏｈｅｎ,Ｓ.Ｎ.,ＰＮＡＳ(１９７２)６９:２１１０、に記載のような塩化カルシウム方法を使用する。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。バチルスの形質転換は、Ｃｈａｎｇ,Ｓ.ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ(１９７９)１６８:１１１、に記載の方法に従って行う。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。酵母の形質転換は、Ｐａｒｅｎｔら、Ｙｅａｓｔ(１９８５)１:８３−１３８、に記載の方法に従って行う。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ある種の植物細胞は、Ｓｈａｗ,Ｃ.Ｈ.ら、Ｇｅｎｅ(１９８３)２３:３１５、に記載の方法に従ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによって形質転換され得る。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。動物細胞の形質転換は、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  (１９７３)５２:４５６、に記載の方法に従って行う。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。バキュロウイルスによる昆虫細胞の形質転換は、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(１９８８)６:４７、に記載の方法に従って行う。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。
【００５６】
使用宿主細胞次第で該細胞に適正な標準方法を使用して形質転換体を培養する。例えば、大腸菌を培養するためには、細胞をＬＢ培地(Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出)中で３０℃から４２℃で中期対数期または定常期まで増殖させる。
【００５７】
例えば培養細胞または培養溶液からの抽出によって形質転換宿主細胞の培養物からＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製し得る。
【００５８】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを培養細胞から抽出する場合、例えば遠心のような当業界で公知の方法によって培養後の細胞を収集する。次に、収集した細胞を適正な緩衝液に懸濁させ、超音波処理、リゾチーム及び／または凍結−融解によって破壊する。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する粗抽出物が遠心及び／または濾過によって得られる。
【００５９】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼが単独でまたはマルトース結合タンパク質のような分泌タンパク質との融合タンパク質として培養溶液中に分泌されるときは、当業界で公知の方法によって細胞から上清を分離する。
【００６０】
培養上清または細胞抽出物中に含まれるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの分離及び精製は、上述の方法、または公知の分離方法及び精製方法の適正な組み合わせによって行うことができる。これらの方法としては例えば、塩沈殿及び溶媒沈殿のような溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の違いを利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の違いを利用する方法、等電点フォーカシング電気泳動のような等電点の違いを利用する方法がある。
【００６１】
組換え酵素を単離及び精製する好ましい方法の１つとして以下のような多段階プロセスがある。
【００６２】
先ず、細胞が凍結している場合には細胞を解凍し、緩衝液Ａ(１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)のような適当な緩衝液に懸濁させ、溶解し、遠心する。次に、清澄化した粗抽出物を７５℃に加熱して約３０分間維持する。変性したタンパク質を遠心によって除去する。次に上清を、Ａｆｆｉｇｅｌブルーカラム(Ｂｉｏｒａｄ)のような核酸に結合するタンパク質に対して高い親和性を有するカラムに通す。上清溶液中に存在する核酸及び多くのタンパク質は、カラムを通過し、カラムの数倍容のｐＨ約７.０の低塩緩衝液でカラムを洗浄することによって除去される。洗浄後、酵素を例えば０.１Ｍ−１.５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)によって溶出させる。活性画分をプールし、透析し、ホスホセルロースカラムに導入する。カラムを洗浄し、緩衝液Ｂ(１００ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＫＰＯ4、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００(ｐＨ６.８))中の０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配でＤＮＡポリメラーゼ活性を溶出させる。画分を収集し、各画分にＢＳＡを添加する。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する画分をプールする。得られたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを上述のような標準的物質精製技術を用いて更に精製し得る。
【００６３】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの安定化及び使用
長期保存のためには、本発明の熱安定酵素を、０.０５ＭのＮａＣｌ、０.０１ＭのＫＰＯ4(ｐＨ７.４)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ及び５０％のグリセロールから成る緩衝液中で−２０℃で保存する。
【００６４】
本発明におけるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、該酵素が必要とされるかまたは所望される任意の目的、例えば、ｃＤＮＡクローニングにおける二本鎖ｃＤＮＡの合成及びＤＮＡ配列決定のような組換えＤＮＡ技術に使用され得る。Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、参照。
【００６５】
本発明におけるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を失活させるために化学的または遺伝的に改変でき、このような改変酵素が所望の任意の目的、例えばＤＮＡ配列決定に使用され得る。
【００６６】
例えば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のランダム突然変異を誘発し、次いでポリメラーゼ活性を喪失することなくエキソヌクレアーゼ活性を喪失した突然変異体をスクリーニングすることによって、遺伝的に改変されたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを単離し得る。または、好ましくはＫｕｎｋｅｌ,Ｔ.Ａ.,ＰＮＡＳ(１９８５)８２:４８８−４９２に記載の部位特異的突然変異誘発技術を用いて、遺伝的に改変されたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを単離する。該文献の記載内容は本発明に含まれるものとする。
【００６７】
更に、本発明におけるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼはまた、例えば米国特許第４,６８３,１９５号、第４,６８３,２０２号及び第４,８００,１５９号に記載の手順によってＤＮＡを増幅させるために使用され得る。
【００６８】
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ以外の古細菌の熱安定ポリメラーゼのスクリーニング
本発明によれば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から調製されたＤＮＡプローブを用いる標的古細菌ゲノムＤＮＡライブラリーの交差ハイブリダイゼーション及び／またはマウス−抗Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ抗血清との交差反応性によって、新規に発見された本発明の９°Ｎのような古細菌並びにサーモコッカス及びピロコッカスのような別の古細菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の同定及び単離が可能である。(例えばＷｏｅｓｅ,Ｃ.,Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ,ｐｐ.２２１−２７０,１９８７年６月参照。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする)。
【００６９】
概して、別の古細菌のＤＮＡは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓに関して上述した方法を用いて単離し得る。単離された古細菌のＤＮＡを、ゲノムライブラリーを構築するためにランダムフラグメントまたは制限酵素フラグメントとして使用し得る。後者のフラグメントが好ましい。この方法は通常、標的ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素によって切断し、その結果形成されたフラグメントを例えばＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡプローブによってプロービングする処理を伴う。その後、単一ハイブリダイゼーションバンドを産生しかつ標的ＤＮＡポリメラーゼの分子量を少なくともコードするに十分な約４Ｋｂ以上のサイズを有している１つまたはそれ以上の酵素からライブラリーを形成する。
【００７０】
本発明によれば、抗体またはＤＮＡプローブを用いる方法(Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ,ＰＮＡＳ(１９８３)８０:１１９４−１１９８;Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)は、プラスミド及びファージのいずれのスクリーニングにも使用し得るが、ファージ系のほうが操作し易いので最初のライブラリーのためには好ましいことが知見された。
【００７１】
コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション手順(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)を用いるかまたは抗体プラークＤＮＡ手順を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション手順においては、近縁生物、例えばＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのポリメラーゼ遺伝子を標識することによってＤＮＡプローブを形成し得る。ゲノムライブラリーを所望の緊縮性に基づく条件下に標識プローブとハイブリダイズさせる。所望の緊縮性は、後述するような実験によって各場合毎に決定し得る。
【００７２】
詳細に説明すると、古細菌の各々は、標的ＤＮＡの検出適性を最大にするためにそれ自体のハイブリダイゼーション条件の組み合わせを必要とするであろうが、いくつかの基本的方法を使用し得る。例えば種々の温度における試験サザンブロットを行うことによって、標的古細菌の各々毎に最適のハイブリダイゼーション条件及びプローブを決定し得る。典型的にはハイブリダイゼーションを、４×ＳＥＴ、０.１Ｍのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)、０.１％のピロリン酸ナトリウム、０.１％のＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液(Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出)中で行う。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子(図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１))のサイズ及び領域次第でプローブ選択を変更し得る。大小のＤＮＡフラグメントまたはオリゴマーによって上述のような試験サザンブロットを行うことによって標的古細菌に対する最適プローブを決定し得る。例えば、標的古細菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中の介在配列をスクリーニングするために、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの介在配列の１つに完全に内包されるプローブを選択してもよく、または、成熟ポリメラーゼコーディング領域に限定したプローブを選択してもよい。
【００７３】
一般に、ＤＮＡプローブは、図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)の完全配列でもよく、またはその一部分でもよい。ＤＮＡプローブは少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有していなければならない。このようなＤＮＡプローブとして、１.３ｋｂフラグメント(図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１−１２７４)、１.６ｋｂフラグメント(図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１２６９−２８５６)及び１.９ｋｂフラグメント(図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド２８５１−４７７１)の３つが得られた。
【００７４】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの場合と同様に、標的古細菌のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを得るために抗体／プラーク手順を用いてもよい。抗体／プラーク手順を用いてゲノム発現ライブラリーをスクリーニングするとき、標的古細菌の調節領域が大腸菌中で機能するか否かは確認されていないので、抗体スクリーニングのためにはλｇｔ１１及びλＺａｐＩＩのような必要な発現調節領域全部を供給するファージベクターが好ましい。古細菌ＤＮＡをλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位のような適正部位にクローニングすることによって古細菌のＤＮＡポリメラーゼをλｇｔ１１及びλＺａｐＩＩ中のβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させてもよく、または、それ自体の内在プロモーターから発現させてもよい。
【００７５】
形成された発現ライブラリーを、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｄ,ＰＮＡＳ(１９８３)、前出、に記載のような標準抗体／プラーク手順を用い、標的古細菌の抗−古細菌ＤＮＡポリメラーゼ抗血清によってまたは極めて近縁の生物(例えばＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、別の超好熱菌)のＤＮＡポリメラーゼに対する抗体によってスクリーニングし得る。
【００７６】
いずれかの手順を用いて、遺伝子の一部または全部をコードする古細菌ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡを同定し、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、Ｍ１３またはｐＵＣ１９にサブクローニングし得る。所望の場合、例えばＳａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション方法(Ｓａｎｇｅｒ,Ｆ.,Ｎｉｃｋｌｅｎ,Ｓ.  ＆  Ｃｏｕｌｓｏｎ,Ａ.Ｒ.,ＰＮＡＳ(１９７７)７４:５４６３−５４６７)によってＤＮＡ配列を決定し得る。
【００７７】
ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定
ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを構築し、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓに由来のＤＮＡプローブを用いるかまたは抗体交差反応性を利用して古細菌のＤＮＡをコードする標的ＤＮＡを同定できれば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓに関して上述したようなＤＮＡポリメラーゼ配列が得られたことを確認し得る。得られたクローンをＳａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定のような標準方法によって配列決定し得る。
【００７８】
介在配列の同定、位置決定及び除去並びにＤＮＡポリメラーゼの過発現
ピロコッカスのような別の古細菌及びその他の未分類の海底噴水孔の古細菌類に由来のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡも、１つまたはそれ以上の介在ヌクレオチド配列を含むことが知見された。更に、このような介在配列は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ中に見出される介在配列と実質的な相同性を有しているだけでなく、同じ位置に存在していると考えられることが判明した。より詳細には、介在配列はＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中のＰｏｌ  α保存領域モチーフ中で同定された。別の解釈の可能性は否定しないが、その他の古細菌類も夫々のＤＮＡポリメラーゼコーディング領域内に１つまたはそれ以上の介在配列を有していると考えられる。これらの介在配列は、２つの方法で同定され得る。(１つ以上の)介在配列がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中で検出された(１つ以上の)介在配列に近縁であるとき、これらの介在配列は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の介在配列に由来のＤＮＡプローブに対する低緊縮性ハイブリダイゼーションによって同定できる。第二の方法では、古細菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を上述のように同定及び単離した後、そのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＤＮＡレベルで配列決定し、配列を、(１)非類似セグメントを同定するために別のＤＮＡポリメラーゼに比較するか、または、(２)１つまたはそれ以上の領域Ｉ−ＶＩの欠如を探すために保存モチーフに比較し、次いで欠如している(１つ以上の)領域内の中断点を同定し得る。
【００７９】
(１つ以上の)介在配列が同定されると、この介在配列を例えばＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中の２つの介在配列を除去するための上記及び実施例に記載の技術によってｉｎ ｖｉｔｒｏ除去し得る。
【００８０】
本発明の別の実施態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソモチーフＩのエキソヌクレアーゼの突然変異を誘発し、Ｅｘｏ  Ｉセグメント中の天然型保存ＤＸＥをＤＸＤまたはＡＸＡに突然変異させる方法が提供される。Ｂｅｒｎａｒｄら、前出、２２０頁参照。エキソ活性に関与する活性部位残基を同定するために、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソドメイン中で多数の突然変異を作製した。ほとんどの突然変異は活性を全く生じないことが判明し、この結果、残基が活性に必要であることが確認され、従って金属もしくは基質結合または触媒作用が必要であろうと考えられる。３’→５’エキソモチーフＩ中のＤＸＥがＤＸＤに変異した突然変異体がこれまでに報告されたことはない。例えば９°Ｎ−７中にこの単一の点突然変異が存在するとき３’→５’エキソヌクレアーゼは完全には失活しない。エキソヌクレアーゼ活性は野生型組換え酵素の１０％未満まで変調される。
【００８１】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の除去と対照的に、変調は、標的ＤＮＡまたはプライマーの集結性(ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ)を妨害することなく校正（プルーフリーディング）するために十分な活性を維持しているという利点を有する。また、減少レベルのエキソヌクレアーゼの存在が長鎖ＰＣＲを増進することも判明した(Ｂａｒｎｅｓ、前出、及び、Ｃｈｅｎｇら、前出)。
【００８２】
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様の現況を示すために与えたものである。これらの実施例は単なる代表例であり、本発明は特許請求の範囲以外によって限定されると考えるべきでないことは理解されよう。
【００８３】
【実施例】
実施例Ｉ
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓの熱安定ＤＮＡポリメラーゼの精製
１００リットルの発酵槽を用い、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ菌  ＮＳ−Ｃ(ＤＳＭＮｏ.５４７３)株を、１０ｇ／リットルの元素イオウを含有するＢｅｌｋｉｎら、前出、に記載の培地中で約８０℃の最高維持温度で２日間増殖させた。細胞を室温に冷却し、傾瀉によって未使用のイオウから分離し、遠心によって収集し、−７０℃で保存した。細胞の収量は１リットルあたり０.８ｇであった。
【００８４】
上述のようにして得られた１８３ｇの細胞を、０.１ＭのＮａＣｌを含有する５５０ｍｌの緩衝液Ａ(１０ｍＭのＫＰＯ4緩衝液(ｐＨ７.４)；１.０ｍＭのＥＤＴＡ、１.０ｍＭのβ−メルカプトエタノール)に懸濁させ、４℃で５分間超音波処理した。溶菌液を１５,０００ｇで４℃で３０分間遠心した。上清溶液を４７０ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌブルーカラム(Ｂｉｏｒａｄ)に通した。次にカラムを０.１ＭのＮａＣｌを含有する１０００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。カラムを２０００ｍｌの０.１−２.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。ＤＮＡポリメラーゼが約１.３ＭのＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の８０％を表す。ＤＮＡポリメラーゼ(４３５ｍｌ)のピーク活性を４リットルの緩衝液Ａに透析し、次に８０ｍｌのホスホセルロースカラムに導入して、０.１ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａによって平衡させた。カラムを０.１ＭのＮａＣｌを含有する１６０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、酵素活性を１０００ｍｌの０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。酵素活性が約０.６ＭのＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の７４％を表す。プールした活性(１５０ｍｌ)を９００ｍｌの緩衝液Ａに透析し、４２ｍｌのＤＮＡ−セルロースカラムに導入した。カラム活性を０.１ＭのＮａＣｌを含有する８４ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、酵素活性を０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。ＤＮＡポリメラーゼ活性が０.３ＭのＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の８０％を表す。活性をプールした(９３ｍｌ)。プールした分画を、０.０５ＭのＮａＣｌを含有する２リットルの緩衝液Ａに透析し、次いで１.０ｍｌのＨＰＬＣモノ−Ｑ−カラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)に導入した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を１００ｍｌの０.０５−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。ＤＮＡポリメラーゼ活性が０.１ＭのＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の１６％を表す。プールした分画(３.０ｍｌ)を、緩衝液Ａで６ｍｌに希釈し、１.０ｍｌのＨＰＬＣモノ−Ｓカラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)に導入し、１００ｍｌの０.０５−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。活性が０.１９ＭのＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の７５％を表す。
【００８５】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)及びクーマシーブルーよりも感受性のコロイド染料(ＩＳＳ  Ｐｒｏｂｌｕｅ)を用いたタンパク質の染色を順次行うことによって(Ｎｅｕｈｏｆｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ(１９８８)９:２５５−２６２)、ＤＮＡポリメラーゼ調製物が純度約５０％であることを測定した。２つの主要バンドが存在し、一方は９０,０００から９５,０００ダルトンに存在し、他方は１８,０００ダルトンにダブレットとして存在した。図１Ａ。約８０,０００から８５,０００ダルトンに極めて小さいバンドが観察された。この精製レベルでポリメラーゼは、ポリメラーゼタンパク質１ｍｇあたりポリメラーゼ活性３０,０００から５０,０００単位の比活性を有していた。精製したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼを含有するゲルレーンを１８スライスに切断し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で個々のスライスの９０,０００から９５,０００ダルトンの染色バンドが一致することを確認した。０.１％のＳＤＳと１００μｇ／ｍｌのＢＳＡとを含有する緩衝液中でゲルスライスを破砕することによって包埋タンパク質をゲルから溶出させた。溶出タンパク質をグアニジンＨＣｌに接触させることによって変性し、次にＨａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ,  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９８０)１０９:７６−８６に記載されたように変性剤を希釈して再度正常に戻した。ポリメラーゼ活性は、(前述のように)酸不溶性ＤＮＡによる放射性標識32Ｐ−ｄＣＴＰの取込みによって測定し、エキソヌクレアーゼ活性は、(実施例Ｖに記載のように)3Ｈ−標識ＤＮＡの遊離による酸可溶形を測定することによって検定した。図１Ｂに示すように、９０,０００から９５,０００ダルトンのバンドだけが有意なポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を示した。
【００８６】
ＤＮＡポリメラーゼ調製物を０.０５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａに透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると、多量の１８,０００ダルトンのタンパク質が溶液から沈殿した。タンパク質定量分析によれば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの収量は０.５ｍｇであり、これは出発粗抽出物中に存在する総活性の６.５％を表す。
【００８７】
精製したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼを電気泳動させ、クーマシーブルーまたは前述のようなコロイド染料(ＩＳＳ  Ｐｒｏｂｌｕｅ)で染色してタンパク質を検出した。濃く染色された１つのタンパク質バンドが約９０,０００から９５,０００ダルトンに観察された。この分子量は、同じゲル上で泳動させた以下のマーカータンパク質(Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ):ミオシン、２００,０００ダルトン;ホスホリラーゼＢ、９７,４００ダルトン;ＢＳＡ、６８,０００ダルトン;オボアルブミン、４３,０００ダルトン;カルボニックアンヒドラーゼ、２９,０００ダルトン;βラクトグロブリン、１８,４００ダルトン;リゾチーム、１４,３００ダルトン:との比較によって定量した。
【００８８】
実施例ＩＩ
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ａ.  マウス抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ坑血清の産生
マウスの免疫感作
(実施例Ｉの方法によって得られた)０.４ｍｇのポリメラーゼタンパク質を含有する３ｍｌの溶液を４℃で約０.３ｍｌに濃縮し、これを２匹のマウスに接種した。精製Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ調製物は、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約８５−９５、７５−８５及び１０−２５ｋＤａｌのダブレットの４つのバンドから構成されていた。実施例Ｉで示したようにＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは約９０−９５ｋＤａｌである。２匹のマウスから得られたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清はいずれも、免疫原中に存在する４つのタンパク質全部を認識する。
【００８９】
以下の免疫感作スケジュールを使用した。マウス１に対して、フロインド完全アジュバント(ＦＣＡ)中で上述のごとく調製した２０μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼを腹腔内投与(ＩＰ)して免疫した。７日後、双方のマウスに対して、ＦＣＡ中の５０μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼをＩＰ投与して免疫した。２７日後、フロインド不完全アジュバント中のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼをマウス１には３０μｇ、マウス２には５０μｇ夫々ＩＰ投与して免疫した。マウス１を２週間後に採血し、マウス２を２０日後に採血した。標準方法(Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ,  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ,１９８８)によって血液から血清を調製した。
【００９０】
抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清を、１％のＢＳＡ、０.１％のナトリウムアジド、０.１％のＰＭＳＦを含有するＴＢＳＴＴ(２０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０.２％のＴｗｅｅｎ２０及び０.０５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００)に希釈した。
【００９１】
大腸菌溶解物に対する抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清の予吸収多くの血清が大腸菌タンパク質と反応するので、ライブラリーまたは組換え抗原をスクリーニングするときのバックグラウンド反応性を減少させるために、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清を以下の方法を用いて大腸菌タンパク質に予め吸収させた。大腸菌細胞ペーストを解凍し、超音波処理によって溶菌し、可溶性タンパク質を製造業者の指示通りにＡｆｆｉｇｅｌ  １０(Ｂｉｏｒａｄ)に結合させた。４ｍｌの大腸菌樹脂をＴＢＳ(界面活性剤非含有のＴＢＳＴＴ)で２回洗浄した。０.３５ｍｌの血清をＴＢＳＴＴ、１％のＢＳＡ、０.１％のナトリウムアジド中で約１から５倍に希釈し、４℃で一夜樹脂と混合した。樹脂を遠心によってペレット化して洗浄した。回収した予吸収血清を１から１７倍に希釈し使用するまで−２℃で保存した。
【００９２】
スクリーニングのためには、予吸収した血清を上述のようにして最終濃度１:２００に希釈した。
【００９３】
Ｂ.  Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子用プローブの同定
λｇｔ１１発現ライブラリーの構築
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子のプローブは、λｇｔ１１発現ライブラリーの免疫スクリーニングによって得られた。
【００９４】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡを以下のごとく部分消化した。４μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ緩衝液(ＥｃｏＲＩ緩衝液＝５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＢＭＥ)を用いた４０μｌの反応液中で５単位のＥｃｏＲＩによって３７℃で消化した。３μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡを３０、４５及び６０分後に１５μｌのサンプルに添加した。２μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ緩衝液の２０μｌの反応液を２０単位のＥｃｏＲＩによって３７℃で９０分間消化し、２μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって反応を停止させた。消化の程度をモニターするために０.２μｇの各消化物をアガロースゲル上で電気泳動にかけた。約３μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分(６０分消化物から１４μｌ及び９０分消化物から１９μｌ)をプールして“ＥｃｏＲＩプール”を形成し、６５℃で１５分間加熱した。
【００９５】
標準結合緩衝液(結合緩衝液＝６６ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１５ｍＭのＤＴＴ及び２ｍｇ／ｍｌのゼラチン)及び０.５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎｏ.２０２)を用いた５μｌの反応液中で、０.５μｌのＥｃｏＲＩプールを、ＥｃｏＲＩ切断し細菌性アルカリホスファターゼ処理した０.２８μｇのλｇｔ１１  ＤＮＡに結合した。１６℃で一夜維持することによって結合させた。４μｌのこの結合反応物をＧｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ  (Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)を製造業者の指示通りに用いてパッケージした。室温で２時間インキュベーション後、パッケージしたファージを５００μｌのＳＭ(ＳＭ＝１００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ4、５０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、０.０１％のゼラチン)に３滴のクロロホルムを加えた液に希釈した。パッケージしたＥｃｏＲＩライブラリーをサンプルＶ６−１と命名したが、これは１.１×１０5の個別ファージから構成されていた。ファージ感染のために大腸菌ＥＲ１５７８株を用いた。
【００９６】
λｇｔ１１発現ライブラリーの免疫スクリーニング
出発ファージライブラリー(Ｙｏｕｎｇ,Ｒ.Ａ.  ａｎｄ  Ｒ.Ｗ.Ｄａｖｉｓ,Ｓｃｉｅｎｃｅ,(１９８３)２２２:７７８−７８２)を、上記のごとく産生した坑血清の１：２００希釈物でスクリーニングした。抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ坑血清と反応した３６のファージ(Ｖ１０−２２からＶ１０−５５)を選択し、１６のファージをプラーク精製した。
【００９７】
１６の抗体陽性ファージを大腸菌Ｋ−１２株Ｙ１０８９の溶原化に用いた。溶原体の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性をスクリーニングしたが活性は全く検出されなかった。
【００９８】
これらの１６の溶菌液から得られたウエスタンブロット(Ｔｏｗｂｉｎら、ＰＮＡＳ(１９７９)７６：４３５０−４３５４)を、抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清でプローブした。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清と反応したこれらの溶菌液の全部のタンパク質は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼよりも小さく、またβ−ガラクトシダーゼよりも小さかったが、これはβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質が存在しないことを示す。
【００９９】
１６の抗体陽性ファージのうちの８個を、全坑血清からエピトープ特異的抗体をアフィニティ精製するために用いた(Ｂｅａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ(１９８６)８６：２１７−２２３)。
【０１００】
アフィニティ精製した８個の血清を、精製Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ粗溶解物の両方のウエスタンブロットをプローブするために用いた。ＮＥＢ６１８プラークから精製した抗体は、精製Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ粗溶解物の双方と特異的に反応した。これは、ファージＮＥＢ６１８がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端の約３８ｋＤａｌをコードすることを示す有力な証拠である。
【０１０１】
ファージＮＥＢ６１８のキャラクタリゼーション及びＥｃｏＲＩインサートのサブクローニング
ウエスタンブロット分析は、ファージＮＥＢ６１８がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ坑血清に結合した約１５−４０ｋＤａｌの範囲のサイズの複数のペプチドを合成したことを示した。ファージＮＥＢ６１８のＤＮＡを標準手順(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)によって液体培養物から精製した。ＮＥＢ６１８  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化すると、１.３及び１.７ｋｂのフラグメントが得られた。ＮＥＢ６１８  ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物をＥｃｏＲＩ切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＤＮＡに結合した。２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋を、４０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の４０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で３時間消化し、次いで６５℃で１５分間消化した。１０μｇのＮＥＢ６１８  ＤＮＡを４０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の４０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で７５分間消化し、次いで６５℃で１５分間消化した。ＥｃｏＲＩ切断した１.７５μｇのＮＥＢ６１８  ＤＮＡを、１０μｌの結合緩衝液中の１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎｏ.２０２)によって、ＥｃｏＲＩ切断した２０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に結合した。１６℃で一夜維持することによって結合させた。ＪＭ１０１  ＣａＣｌコンピテント細胞(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)を５μｌの結合混合物で形質転換した。試験した２４の組換え体のうちで１つを除く全部が１.７ｋｂのフラグメントを含んでいた。クローンＶ２７−５.４は１.３ｋｂのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡフラグメントを含んでいた。
【０１０２】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼマウス坑血清から得られた抗体を、(１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをコードする)Ｖ２７−５.４及び(ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の１.７ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをコードする)Ｖ２７−５.７の溶菌液で上述のようにアフィニティ精製し、精製したまたは粗のままのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼを含むウエスタンブロットストリップと反応させた。Ｖ２７−５.４の溶菌液で選択された抗体は粗調製物及び精製調製物中のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼと反応した。更に、天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのＮ−末端タンパク質配列の最初の３つのアミノ酸(メチオニン−イソロイシン−ロイシン)はＶ２７−５.４クローン中の予測読み取り枠(ＯＲＦ)と同じである。
【０１０３】
これらの結果から、Ｖ２７−５.４がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端をコードしているという結論が得られた。Ｖ２７−５.４の１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは、図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１−１２７４を含む。インサートＤＮＡはこのクローンによって合成された最大ペプチドをコードすべく十分な大きさであったが全Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼをコードすべく十分な大きさではなかった。
【０１０４】
Ｃ.  Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ二次ライブラリーの構築及びスクリーニング
上述の抗体スクリーニングは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端側半鎖をコードするＤＮＡフラグメントを同定した。全遺伝子をコードすべく十分に大きいフラグメントを見出すために、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡの制限消化物をクローンＶ２７−５.４に含まれたポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端半鎖でプローブした。１.２μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡを３９μｌの制限酵素緩衝液(ＲＥＢ、制限酵素緩衝液＝５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＢＭＥ)中に含むマスターミックスを用いて個別の管で制限消化を行った。制限酵素緩衝液には１.５−２００Ｕの酵素を以下のごとく添加した。１.５ＵのＡｖｒＩＩ、９ＵのＥａｅｌ、１０ＵのＮｈｅＩ、２０ＵのＮｏｔＩ、９ＵのＳｐｅＩ、２０ＵのＸｈｏＩ、３０ＵのＸｂａＩ、２０ＵのＳａｃＩ、１０ＵのＢａｍＨＩ、２０ＵのＣｌａＩ、２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ、２０ＵのＰｓｔＩ、１２ＵのＮａｅＩ、１０ＵのＳｃａＩ、１２ＵのＸｍｎＩ、２０ＵのＥｃｏＲＶ、２０ＵのＳａｌ、２０ＵのＥｃｏＲＩ、２００ＵのＥａｇＩ、２０ＵのＤｒａＩ、５ＵのＨａｐＩ、８ＵのＮｒｕＩ、４ＵのＳｎａＢＩ、８ＵのＳｔｕＩ、１０ＵのＢｃｌＩ、８ＵのＢｇｌＩＩ、１０ＵのＲｓａＩ、１０ＵのＨａｅＩＩＩ、８ＵのＡｌｕＩ、４ＵのＨｉｎｃＩＩ、１０ＵのＰｖｕＩＩ、６ＵのＳｓｐＩ。１μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡをＨｉｎｃＩＩ消化物に添加した。緩衝液中のＮａＣｌを０ｍＭにした以外は上記と同様にしてＢａｌＩ消化物を調製した。ＢｃｌＩ以外の全部の消化物を３７℃で一夜インキュベートし、ＢｃｌＩは５０℃でインキュベートした。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、ＮＣ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.(１９７５)９８:５０３−５１７)に移した。放射性標識Ｖ２７−５.４ＤＮＡでフィルターをプローブし、ハイブリダイゼーションをオートラジオグラフィーによって検出した。ＢａｍＨＩ(約１４ｋｂ)、ＥｃｏＲＩ(１.３ｋｂ)、ＨｉｎｄＩＩＩ(約２.４、５.４ｋｂ)、ＸｂａＩ(約８ｋｂ)、ＣｌａＩ(約４.４、５.５ｋｂ)、ＢａｌＩ(約８.５ｋｂ)、ＨｉｎｃＩＩ(約２.１、約２.４ｋｂ)、ＮｒｕＩ(約５.５ｋｂ)、ＢｇｌＩＩ(約２.９ｋｂ)、ＨａｅＩＩＩ(約１.３、約１.４ｋｂ)及び多数の小バンドを与えたＲｓａＩ以外のほとんどの消化物中で、Ｖ２７−５.４  ＤＮＡは、２０ｋｂよりも大きいフラグメントとハイブリダイズした。
【０１０５】
天然型タンパク質のサイズに基づいて２.４−３ｋｂであると推定される全ポリメラーゼ遺伝子をコードすべく十分に大きい単一フラグメントを生じた消化物は、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＮｒｕＩであった。
【０１０６】
ＢａｍＨＩライブラリー
λＤａｓｈＩＩを用いてＢａｍＨＩゲノムライブラリーを構築した。λＤａｓｈＩＩは、１０−２０ｋｂのＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントをクローニングするために使用できるＢａｍＨＩ置換ベクターである。上述のごとくＢａｍＨＩで消化した２５−７５ナノグラムのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムＤＮＡを０.５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎｏ.２０２)を含む５μｌの標準結合緩衝液中のＢａｍＨＩ消化した仔ウシ腸ホスファターゼ処理した０.５μｇのλＤａｓｈＩＩ  ＤＮＡに結合した。３μｌの結合反応物を上述のごとくパッケージした(Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｐｌｕｓ,  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)。λＤａｓｈＩＩライブラリーからの８,０００プラークのプラークリフトを、クローンＶ２７−５.４(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)から得られた標識しゲル精製した１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントでプローブした。２.５％のファージが１.３ｋｂのＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、その内の２つをプラーク精製した(クローンλＮＥＢ６１９及びλＶ５６−９)。双方のファージは１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズし、約８ｋｂのＸｂａＩフラグメント及び約５.５ｋｂのＮｒｕＩフラグメントを含む１２−１５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを含んでいた。ＢａｍＨＩインサートをｐＢＲ３２２にサブクローニングした。このフラグメントを含むコロニーは極めて増殖し難く、上述のポリメラーゼアッセイに基づくと、検出可能レベルの熱安定ＤＮＡポリメラーゼを産生できなかった。
【０１０７】
ＸｂａＩライブラリー
ＸｂａＩで消化したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡをｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にクローニングした。放射性標識したＶ２７−５.４  ＤＮＡでコロニーリフトをプローブした。陽性クローンは全く検出されなかった。
【０１０８】
λＮＥＢ６１９(上記ＢａｍＨＩライブラリー)中のＢａｍＨＩインサートからのＸｂａＩフラグメントを、ｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にサブクローニングした。２０μｌの標準結合緩衝液中の２μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎｏ.２０２)を用い、ＢａｍＨＩで消化した約０.３μｇのＮＥＢ６１９  ＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化した０.１μｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡに結合した。結合物を１６℃で一夜インキュベートした。ＣａＣｌ2コンピテントＪＭ１０１及びＸＬ−１細胞を５μｌの結合ミックスで形質転換し、３７℃で一夜インキュベートした(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)。コロニーリフトを、Ｖ２７−５.４  ＤＮＡから得られた放射性標識し精製した１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントによってプローブした。陽性コロニーは全く検出されなかった。コンピテントＲＲＩ細胞を１０μｌの結合ミックスで形質転換し、３０℃で一夜インキュベートした。マイクロコロニーを選択し、ミニプラスミド調製物(沸騰法、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)を分析した。これらのクローンの殆どが約８ｋｂのＸｂａＩフラグメントを含んでいた。この後者の実験は、ＢａｍＨＩクローンが増殖し難かったので、同じくゆっくりと増殖するＸｂａＩコロニーからＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを単離する機会を増加させた理由を説明する。また、より低温でインキュベーションを行う結果として細胞あたりのｐＵＣ１９プラスミドのコピー数が減少している。これらの結果は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子が大腸菌に毒性であることを証明した。上述のポリメラーゼ活性アッセイを用いると、これらのクローン中で熱安定ポリメラーゼ活性は全く検出されなかった。制限分析は、ＸｂａＩクローンが全ポリメラーゼ遺伝子を含むことを示した。図２参照。
【０１０９】
ＮｒｕＩライブラリー
ＸｂａＩライブラリーに関する記載と全く同様にして、ＮｒｕＩで切断した約０.３μｇのＮＥＢ６１９  ＤＮＡ(上記ＢａｍＨＩライブラリー)を、ＨｉｎｃＩＩで切断した０.１μｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡに結合した。この場合にもまた、細胞を３７℃でインキュベートしたときはハイブリダイゼーションによる陽性クローンは全く検出されなかったが、形質転換体を３０℃でインキュベートすると多くのマイクロコロニーが観察された。これらのマイクロコロニーの殆どが約５.５ｋｂのＮｒｕＩインサートを含んでいた。上述のポリメラーゼ活性アッセイを用いると、これらのコロニー中で熱安定ポリメラーゼ活性は全く検出されなかった。これらのコロニーの分析によれば、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ転写の方向がｐＵＣ１９中のｌａｃＺと同じであるときは、コロニーは３７℃で増殖せず、極めて不安定であることが判明した。しかしながら、クローンＮｒｕ２１中の場合と同様にＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ転写の方向がｐＵＣ１９中のｌａｃＺの逆であったコロニーは、より安定であった。これは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの転写が大腸菌に有害であることを示しており、全遺伝子のクローニングがそんなにも難しい理由の論拠となるであろう。制限マッピング分析は、ＮｒｕＩクローンが全ポリメラーゼ遺伝子を含むことを示した。図２参照。
【０１１０】
ポリメラーゼの直接クローニングに関する結論
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓは、全遺伝子をコードするために約２.４−３.０ｋｂのＤＮＡを要する約９０−９５ｋＤａｌである。ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＮｒｕＩクローン内部に見出されるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端をコードする１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの上述のような制限マッピング分析は、３つのクローン全部がポリメラーゼの全遺伝子を含んでいることを示す。これらのより大きいクローン全部が大腸菌中で不安定であった。従って、以下に記載するような代替的なポリメラーゼクローニング方法を試験した。
【０１１１】
Ｄ.  Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子の第二の半鎖のクローニング
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの全遺伝子をその内在調節下に大腸菌中でクローニングしたとき、遺伝子内で突然変異が生じると考えられる。不活性の突然変異体が選択されることを防止するために、各々が個々に不活性であり従って選択されない２つまたはそれ以上の断片中でＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムからポリメラーゼ遺伝子をクローニングした。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムの制限マッピングを使用して、どの制限酵素がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子の第二の半鎖のクローニングに適したフラグメントを産生するかを決定した。上記データは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現が大腸菌に毒性であることを示すが、コーディング領域の内部または外部のＤＮＡ配列自体が毒性であるということも考えられる。従って、全遺伝子をコードする最小サイズのフラグメントが最も好ましいサイズであると判断した。制限分析によれば、アミノ末端の１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの３'末端に隣接して約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント(図２参照)が存在することが判明し、このフラグメントが恐らくはポリメラーゼ遺伝子を完成させると考えられる。
【０１１２】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の第二の半鎖のハイブリダイゼーションプローブ
上記のクローンはいずれも熱安定ポリメラーゼ活性を発現しなかったので、これらのクローンではコーディング領域に突然変異が蓄えられ従って遺伝子の第二の半鎖の適当なソースにはなり得ないであろうと考えられた。従って、ゲノムよりも下流のフラグメントをクローニングするためのハイブリダイゼーションプローブが必要であった。クローンＮｒｕ２１(Ｎｒｕ２１クローンはポリメラーゼ遺伝子の起点よりも約３００ｂｐ上流で始まる約５.５ｋｂのインサートを含む)から得られた約３.２ｋｂのＮｄｅＩ／ＣｌａＩフラグメントをｐＳＰ７３(Ｐｒｏｍｅｇａ)にサブクローニングしてクローンＮＣ１１を作製した。ＣａＣｌ2コンピテントＲＲＩ細胞を結合混合物によって上述のごとく形質転換した。形質転換体のミニプラスミド調製物をＮｄｅＩ及びＣｌａＩで消化することによって分析し、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの３.２ｋｂのＮｄＩ／ＣｌａＩフラグメントを含むクローンＮＣ１１を同定した。このクローンは大腸菌中で安定であった。ＮＣ１１インサートを配列決定した(Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ(１９７７)７４:５４６３−５４６７)。ＣｌａＩ末端はＶ２７−５.４配列(Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端をコードする１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント)と一致した。１.３ｋｂのＥｃｏＲＩ部位及びそれ以後を、１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント配列に由来のプライマーを用いて配列決定した。ＮｄｅＩ末端をベクター内部のプライマーから配列決定した。
【０１１３】
ＥｃｏＲＩゲノムライブラリーのスクリーニング
１０μｇのＮＣ１１を１００μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の３０ＵのＥｃｏＲＩで３７℃で２時間消化した。約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを電気泳動後にＤＥ−８１ペーパー(Ｗｈａｔｍａｎ)で精製した。約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを放射性標識し、出発ＥｃｏＲＩ  λｇｔ１１ライブラリーをプローブするために使用した。上記と同様にして感染及びプラークリフトを行った。３つの陽性プラークを同定しプラーク精製した。全部のプラークが約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいたが、いくつかのプラークはその他のインサートも含んでいた。
【０１１４】
λＺａｐＩＩ中でもＥｃｏＲＩライブラリーを構築した。２μｇのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡを、２０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の２０ＵのＥｃｏＲＩによって３７℃で５時間消化し次に６５℃で１５分間熱処理した。約１５ナノグラムのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡ／ＥｃｏＲＩを、ＥｃｏＲＩ切断しホスファターゼ処理した０.５μｇのλＺａｐＩＩ  ＤＮＡ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)に、５μｌの結合緩衝液中の０.５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎｏ.２０２)によって１６℃で一夜結合させた。４μｌの結合ＤＮＡをパッケージした(ＧｉｇａＰａｃｋ  Ｇｏｌｄ,  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)。感染及びプラークリフトを上述のように行った。放射性標識した約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントによって約１,５００のファージを上記のようにプローブした。５つのハイブリダイゼーション陽性プラークを選択し、３つをプラーク精製した。２つのファージ(ＮＥＢ６２０及びＶ１０９−２)を製造業者(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)の指示通りのｉｎ  ｖｉｖｏ切除によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ組換え体(Ｖ１１７−１及びＶ１１７−２)として救出(ｒｅｓｃｕｅ)した。双方の組換え体は約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントと種々の二次的フラグメントとを含んでいた。５'末端を配列決定すると、この５'末端はＮＣ１１から決定された配列(ＣｌａＩ／ＮｄｅＩフラグメント)に対応した。図２参照。このＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｗａｎｇら、前出、によって記載されたようなＴ４  ＤＮＡポリメラーゼファミリーホモロジーアイランドの３／６を含む。１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド１２６９−２８５６を含む。
【０１１５】
１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＣｌａＩ／ＮｄｅＩフラグメントの配列は、ポリメラーゼ遺伝子を完成するために１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントが必要であることを示した。１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含むλＺａｐＩＩファージ、Ｖ１１０−１からＶ１１０−７を、標識プローブを用いＮＥＢ６２０に関して前述したように同定した。２つのファージ(Ｖ１１０−２及びＶ１１０−４)を製造業者の指示(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)通りのｉｎ  ｖｉｖｏ切除によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ組換え体(Ｖ１５３−２及びＶ１５３−４)として救出した。双方の組換え体が約１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントと種々の二次的フラグメントとを含んでいた。１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントはＮＣ１１中のオーバーラップ領域と配列一致を有していた。１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)のヌクレオチド２８５１−４７７１を含む。
【０１１６】
全Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子を、活性酵素を検出できない不安定なＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＮｒｕＩフラグメントとしてクローニングした。また、遺伝子を４つの断片(１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約１.６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約１.９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及び停止コドンを含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント)中でクローニングした。１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントはポリメラーゼのアミノ末端部分を安定に発現する。
【０１１７】
実施例ＩＩＩ
活性Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのクローニング
バクテリオファージＮＥＢ６１９(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.４０７９５)の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメント中に見出されたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子を、Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ(１９７７)７４:５４６３−５４６７の方法を用いて配列決定した。５８３７ｂｐの連続ＤＮＡ配列(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)を、１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの５’末端(位置ＮＴ１)を起点として決定した。図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)参照。
【０１１８】
ＤＮＡ配列の分析によって、ポリメラーゼ遺伝子が１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントのＮＴ２９１を起点とすることが判明した。ＮＴ５３９７を起点とする翻訳終了部位も検出した。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの見掛け分子量が約９０−９５Ｋｄａｌだったので、遺伝子は２９００ｂｐ以下であると予測された。しかしながら、１７０２アミノ酸(ａａ)即ち１８５Ｋｄａｌ以下のコーディング容量の５１０６ｂｐの読み取り枠(ＯＲＦ)が同定された。
【０１１９】
図７に一例を示す別のＤＮＡポリメラーゼとの配列ホモロジーによって、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子が１つの介在配列即ちＤＮＡポリメラーゼコンセンサスホモロジー領域ＩＩＩ中の介在配列(以後“ＩＶＳ１”と呼ぶ)によって分断されていることが知見された(Ｗａｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ(１９８９)３:１４−２１。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする)。コンセンサスＤＮＡポリメラーゼホモロジー領域ＩＩＩの保存アミノ酸を図７に示す。この図においては保存アミノ酸を下線を付けて示す。  図７から分かるように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓホモロジーアイランドＩＩＩの左側(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２)はＮＴ１７３７を起点とし、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基以後はコンセンサス配列とのホモロジーが消滅する。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓホモロジーアイランドＩＩＩの右側(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３)をＮＴ３３８４のＡｓｎ及びＳｅｒ残基で選択し得る。２つのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼアミノ酸配列を図７に示すようにＡｓｎ残基とＳｅｒ残基とをオーバーラップさせて配置したとき、ＤＮＡポリメラーゼホモロジー領域ＩＩＩに対する十分な適合性が存在することが明らかであった。
【０１２０】
このようにホモロジーデータを用いると、ＤＮＡポリメラーゼホモロジー領域ＩＩＩの左側半鎖と右側半鎖とを分割する介在配列がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡ中に存在すると予測された。
【０１２１】
１つの好ましい実施態様においては、介在配列のスプライス部位の近傍のコーディング領域中の非反復制限酵素部位を同定することによって介在配列を欠失させた。合成二重鎖オリゴヌクレオチドを合成し、これを用いて２つの制限フラグメント間のギャップを架橋した。カルボキシ末端制限フラグメントと、架橋用オリゴヌクレオチドと、アミノ末端制限フラグメントと、発現ベクターとを用いた多数部分の順次結合の結果として、介在配列が欠失しインタクトなポリメラーゼ遺伝子を含む発現ベクターが形成された。
【０１２２】
より詳細には、介在配列が欠失しＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む本発明の発現ベクターを構築するために以下のＤＮＡフラグメントまたは配列を使用した。
【０１２３】
１.  プラスミドＶ２７−５.４(実施例ＩＩ、Ｂ項)中でオリゴヌクレオチド特異的突然変異を誘発(Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９８７)１５４:３６７−３８２)することによって、ポリメラーゼコーディング領域の開始コドンがＮｄｅＩ部位に内在するようなＮｄｅＩ部位を作製した。
【０１２４】
初期配列...ＴＴＴ  ＡＴＧ...
(ヌクレオチド２８８−２９３)
新規配列...ＣＡＴ  ＡＴＧ...
新しく作製されたＮｄｅＩ部位からＣｌａＩ部位までの配列(約５２８塩基対)を発現ベクターの構築に使用した。
【０１２５】
２.  ＮＣ１１(実施例ＩＩ、Ｄ項)のＣｌａＩ部位とＰｖｕＩ部位との間の約８９９ｂｐの配列。
【０１２６】
３.  図１２に示すような別のフラグメントに由来するＰｖｕＩ部位とＢｓｕ３６１部位とを結合する介在配列にわたる合成二重鎖。
【０１２７】
図１２において、第一の線はスプライス部位の５'末端の初期配列(ヌクレオチド１７２１−１７８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)を示し、第二の線はスプライス部位の３'末端の初期配列(ヌクレオチド３３７５−３４１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)を示し、第三及び第四の線は合成二重鎖オリゴヌクレオチドの配列を示す。
【０１２８】
４.  バクテリオファージＮＥＢ６１９(実施例ＩＩ、Ｃ項)に由来の約２５００塩基対のＢｓｕ３６１−ＢａｍＨＩフラグメント。
【０１２９】
５.  ｐＥＴ１１ｃ(Ｓｔｕｄｉｅｒ,  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９９０)１８５:６６−８９)に由来し、
(ａ)Ｔ７ファイ１０プロモーター及び遺伝子１０タンパク質用リボソーム結合部位
(ｂ)アンピシリン耐性遺伝子
(ｃ)ｌａｃＩq遺伝子
(ｄ)プラスミド複製起点
(ｅ)リボソーム転写ターミネーター(ｒｒｎｂ)の４重に折り畳まれたくり返し配列、Ｓｉｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ(１９８７)５３:８５−９６
を含むベクター主鎖を表す約６２００塩基対のＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩフラグメント。
【０１３０】
上記のＤＮＡフラグメント１−５をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて適正条件下に順次結合した。正しい構築物を制限分析によって同定し、ｐＰＲ９６９と命名した。図８参照。ｐＰＲ９６９を使用して大腸菌ＲＲＩ株を形質転換し、菌株を作製してＮＥＢ６８７と命名した。ＮＥＢ６８７のサンプルを１９９０年１２月７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８４８７として受託された。
【０１３１】
別の好ましい実施態様においては、介在配列の欠失したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子をＳｔｕｄｉｅｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターｐＥＴ１１ｃ(Ｓｔｕｄｉｅｒ(１９９０)、前出)の誘導体にクローニングした。組換えプラスミドＶ１７４−１Ｂ１を用いて大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ株を形質転換し、菌株１７５−１Ｂ１を作製してＮＥＢ６７１と命名した。図５及び１０参照。
【０１３２】
ＮＥＢ６７１のサンプルを１９９０年１０月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８４４７として受託された。
【０１３３】
ポリメラーゼの予測分子量と観察分子量とを比較すると、ＩＶＳ１欠失の場合であっても不一致が判明した。領域ＩＩＩのＩＶＳ１除去後のポリメラーゼの予測分子量は１３２ｋＤであるが、天然型(実施例Ｉ参照)または組換え型(実施例ＩＶ参照)のポリメラーゼの観察分子量は約９５ｋＤである。分子量の不一致は、ホモロジー領域Ｉの介在配列(以後“ＩＶＳ２”と呼ぶ)に起因する。この知見は以下の観察に基づく。即ち、ホモロジー領域ＩＩＩとＩとの間の間隔は、ポルαファミリー(Ｗａｎｇ(１９８９)、前出)の成員中では１５−１３５アミノ酸の範囲の値である。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓにおいては、これらの領域間の間隔は４０７アミノ酸即ち４４ｋＤ以下である。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、保存ホモロジー領域ＩとＩＩＩとの間の類似性が全く存在しない３６０個のアミノ酸以外はヒトポルαに極めて類似している。最後に、コンセンサス領域Ｉは全く観察されない。
【０１３４】
さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると、本発明のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼクローンによって約４２−４７ｋＤの熱安定エンドヌクレアーゼも産生される(実施例Ｘ参照)。このエンドヌクレアーゼを標準イオン交換クロマトグラフィーによって均質になるまで精製し、そのアミノ末端配列を決定した。エンドヌクレアーゼの最初の３０個のアミノ酸は、ポリメラーゼクローンのヌクレオチド３５３４を起点としてコードされたアミノ酸に対応する(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)。これは、他の公知のポリメラーゼとのホモロジーが欠如したポリメラーゼの部分に対応する。このエンドヌクレアーゼは抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ坑血清と反応しない。エンドヌクレアーゼがスプライシングによってポリメラーゼから除去される正確なメカニズムは解っていないが、このような除去は大腸菌及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの双方において自発的に生じる。
【０１３５】
実施例ＩＶ
組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの精製
１００リットルの発酵槽を用い、１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母抽出物、５ｇ／リットルのＮａＣｌ及び１００ｍｇ／リットルのアンピシリン含有の培地中で大腸菌ＮＥＢ６７１(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８４４７)を３５℃で増殖させ、中期対数増殖期に０.３ｍＭのＩＰＴＧで誘発し、さらに４時間インキュベートした。遠心によって細胞を採集し、−７０℃で保存した。
【０１３６】
５８０ｇの細胞を解凍し、緩衝液Ａ(１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＫＰＯ4(ｐＨ７.０)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％のグリセロール)に総容量２４００ｍｌまで懸濁させた。細胞をＧａｕｌｉｎホモジナイザーに通して溶解した。粗抽出物を遠心によって清澄化した。清澄化した粗抽出物の容量を上記緩衝液で２２００ｍｌに調整し、７５℃で３０分間加熱した。粒状物質を遠心によって除去すると、残りの上清は約３１２０ｍｇの可溶性タンパク質を含んでいた。
【０１３７】
ホスホセルロースカラム(５×１１ｃｍ;ベッドボリューム２１６ｍｌ)に直列に接続したＤＥＡＥ−セファロースカラム(５×１３ｃｍ;ベッドボリューム２２５ｍｌ)に上清を導入した。ＤＥＡＥ−セファロースカラムを素通りした大量の酵素を含む画分を直ちにホスホセルロースカラムに通した。双方のカラムを３００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、２つのカラムを分離し、ホスホセルロースカラムのタンパク質を２リットルの０.１Ｍ−１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中に形成)で溶出させた。
【０１３８】
カラム画分のＤＮＡポリメラーゼ活性を検定した。簡単に説明すると、各３０μＭのｄＮＴＰと3Ｈ−標識ＴＴＰと０.２ｍｇ／ｍｌの活性仔ウシ胸腺ＤＮＡと１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡとを含む５０μｌの１×Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液(１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２４℃のｐＨ８.８)、１０ｍＭの(ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ4及び０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)中で１−４μｌの画分を７５℃で５−１０分間インキュベートした。但し、非アセチル化ＢＳＡが好ましいことは判っていた。混合物をＷｈａｔｍａｎ  ３ｍｍフィルターに通し、フィルターを１０％のＴＣＡで３回洗浄し、次いで低温イソプロパノールで２回洗浄した。フィルターの乾燥後、ＤＮＡ内に取込まれた3Ｈ−ＴＴＰを表す結合放射能を測定した。活性画分をプールし、上記アッセイ条件のｄＮＴＰレベルを２００μＭの各ｄＮＴＰにまで増加させて各プール中の酵素活性レベルを評価した。これらの条件下で、７５℃で３０分間で１０ナノモルのｄＮＴＰを酸不溶性物質に取込ませる酵素の量を酵素活性１単位と定義した。
【０１３９】
６６ｍｇのタンパク質を含有する３００ｍｌ容量から成る活性画分を、緩衝液Ｂ(４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＰＯ4(ｐＨ７.０)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％のグリセロール)で平衡させたヒドロキシルアパタイトカラム(２.５×５ｃｍ;ベッドボリューム２５ｍｌ)に導入した。タンパク質を２５０ｍｌの１０ｍＭ−５００ｍＭ  ＫＰＯ4の直線勾配(緩衝液Ｂ中に形成)で溶出させた。２７ｍｇのタンパク質を含有する５９ｍｌ容量からなる活性画分をプールし、緩衝液Ｃ(２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％のグリセロール)に透析した。
【０１４０】
透析液をヘパリン−セファロースカラム(１.４×４ｃｍ;ベッドボリューム６ｍｌ)に導入し、２０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄した。１００ｍｌの２００ｍＭ−７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ｃ中に形成)でカラムを処理した。１６ｍｇのタンパク質を含有する４０ｍｌ容量から成る活性画分をプールし、緩衝液Ｃに透析した。
【０１４１】
透析液をＡｆｆｉ−ｇｅｌブルークロマトグラフイーカラム(１.４×４ｃｍ;ベッドボリューム６ｍｌ)に導入し、２０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、タンパク質を９５ｍｌの０.２Ｍ−２Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ｃ中に形成)で溶出させた。１１ｍｇのタンパク質を含有する３０ｍｌ容量から成る活性画分を２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ｍＭのＤＴＴ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ及び５０％のグリセロールを含む保存用緩衝液に透析した。
【０１４２】
上記のごとく得られたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼは比活性２０,０００−４０,０００単位／ｍｇを有していた。
【０１４３】
組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのキャラクタリゼーション
組換え型及び天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは、５−１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル中で電気泳動にかけると同じ見掛け分子量を有していた。組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは天然型酵素の熱安定性を維持している。組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼと同じ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有している。天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼもｄＮＴＰによる阻害に感受性である。
【０１４４】
実施例Ｖ
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の超発現
ＩＶＳ１が欠失したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、例えば実施例ＩＩＩで得られたＶ１７４−１Ｂ１は、クローニングされたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの最大発現を得るために多数の方法またはその組み合わせで使用され得る。
【０１４５】
このような方法の１つでは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をその内在調節因子から分離し、次いでポリメラーゼ遺伝子をＴ７発現ベクター(Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ  ５６:１２５−１３５(１９８７)のような極めて厳密に調節されたプロモーターに操作可能に結合する。強力なプロモーターの挿入を行うためには、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の両端の近傍の適当な制限標的及びベクター上のプロモーター近傍の適合性制限標的を同定するか、または、部位特異的突然変異誘発(Ｋｕｎｋｅｌ(１９８４)、前出)を用いて制限標的を作製し、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を強力プロモーターの転写及び翻訳調節下に維持されるような配向でベクター内に移入することによって達成される。
【０１４６】
また、遺伝子の発現を増加させるために、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流に配置された強力なリボソーム結合部位を利用することによってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを超発現させ得る。Ｓｈｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄａｌｇａｒｎｏ、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ７１:１３４２−１３４６(１９７４)参照。該文献は本明細書に含まれるものとする。
【０１４７】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を増加させる別の方法では、部位特異的突然変異誘発または再合成によって遺伝子のＤＮＡ配列を、大腸菌よりも効率的に利用される開始コドンを含むように変更する。
【０１４８】
最後に、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは酵母及びバキュロウイルスのような真核細胞系中でより安定であろう。
【０１４９】
発酵槽を用い、適当な抗生物質を含有する富化培地中でＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むクローンを増殖させることによってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを産生してもよい。その後に遠心によって細胞を採集し、超音波処理によって破壊して、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
【０１５０】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む粗抽出物を実施例Ｉに記載の方法で精製するかまたはアフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーのような標準物質精製技術によって精製する。
【０１５１】
実施例ＶＩ
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ突然変異体の産生
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の欠如したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを、Ａｓｐ１４１及びＧｌｕ１４３のコドンをアラニンのコドンに変異させる部位特異的突然変異誘発を用いて構築した。部位特異的突然変異誘発は、ファイ２９(Ｃｅｌｌ  ５９:２１９−２２８(１９８９))、ＤＮＡポリメラーゼＩ(Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０:１９９−２０１(１９８８))及びＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ(米国特許第４,９４２,１３０号)などのエキソヌクレアーゼ活性の低減が報告されているＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製するために使用されてきた。
【０１５２】
本発明のポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ,Ｔ.Ａ.,  ＰＮＡＳ,８２:４８８−４９２(１９８５)に記載の方法に修正を加えて行った。該文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする。部位特異的突然変異体を構築するためにＶ２７−５.４プラスミド(実施例ＩＩ、Ｂ項参照)を使用した。Ｖ２７−５.４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋中の１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをコードしている。デオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを取込んでいる大腸菌ＣＪ２３６株(Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４:３６７−３８２(１９８７))のＶ２７−５.４プラスミドを含んでいる菌株に、ｆ１ヘルパーファージＩＲ１(Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２２:２２２−２２６(１９８２))を超感染してプラスミドの一本鎖変異体を作製した。
【０１５３】
簡単に説明すると、以下の方法を用いて部位特異的突然変異体を構築した。先ず、標準手順を用いて長さ３５塩基の突然変異オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドを延長した。得られた二重鎖ＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼで処理することによって閉環状ｄｓＤＮＡに変換した。所望の突然変異を含むプラスミドを、下記のような変異塩基にオーバーラップするＰｖｕＩ部位の作製によって同定した。このようなプラスミドの１つを同定し、ｐＡＪＧ２と命名した。
【０１５４】
アミノ酸残基１４１、１４２及び１４３の初期配列及び変異配列を以下に示す。
【０１５５】
0004004078.tif 000002
変異をスクリーニングするために、新しく作製されたＰｖｕＩ部位に下線を付けて示す。中央のコドンは変異したが、この新しいコドンによってコードされるアミノ酸は元のアミノ酸に等しいことに注目されたい。
【０１５６】
Ｖ１７４−１Ｂ１(実施例ＩＩＩ参照)の約１２０ｂｐのＣｌａＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、ｐＡＪＧ２の上記置換を含む対応フラグメントによって置換してｐＣＡＳ４(図９参照)を作製した。従ってｐＣＡＳ４はＶ１７４−１Ｂ１に対して上記のような４塩基対の違いを有している。
【０１５７】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐｌｙｓＳ(Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,１８５:６０−８９(１９９０))を、ｐＣＡＳ４で形質転換させＮＥＢ６８１株を作製した。突然変異Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現をＩＰＴＧの添加によって誘発した。
【０１５８】
ＮＥＢ６８１のサンプルを、１９９０年１１月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８４７３で受託された。
【０１５９】
天然型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＮＥＢ６８１株から単離されたエキソヌクレアーゼ欠失変異体の相対エキソヌクレアーゼ活性を、均一に〔3Ｈ〕標識した大腸菌ＤＮＡ基質を用いて定量した。野生型Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ,Ｉｎｃ.から市販されている高度に精製されたロットから入手した。エキソヌクレアーゼアッセイを妨害する夾雑物を除去するために、エキソヌクレアーゼ欠失変異体をＤＥＡＥセファロースカラム及びホスホセルロースカラムで部分精製した。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液〔２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃のｐＨ８.８)、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの(ＮＨ4)2ＳＯ4、５ｍＭのＭｇＳＯ4、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕、０.１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び３μｇ／ｍｌのＤＮＡ基質(比活性２００,０００ｃｐｍ／μｇ)を含む０.１ｍｌの反応液に、指定単位数のポリメラーゼを添加し、反応液の蒸発を防止するために反応液を鉱油で被覆した。同じ反応液は更に、野生型酵素のエキソヌクレアーゼ活性を阻害することが予め判っている２０μＭのｄＮＴＰを含んでいた。完成した反応混合物を７０℃で６０分間インキュベートし、次いで０.０８ｍｌを取り出して０.０２ｍｌの０.５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したニシン精子ＤＮＡ(インタクトなＤＮＡの沈殿を助成するため)及び０.２ｍｌの１０％トリクロロ酢酸と４℃で混合した。混合後、反応液を氷上で５分間インキュベートし、次いでエッペンドルフ遠心管でＤＮＡを４℃で５分間ペレット化した。０.２５ｍｌの上清をシンチレーション流体と混合してカウントした。バックグラウンドで補正したサンプルカウント結果を図１１に示す。
【０１６０】
図１１に示すように、エキソヌクレアーゼ欠失変異体は、天然型ポリメラーゼが明らかにエキソヌクレアーゼ活性を示す条件下でｄＮＴＰの存在下及び非存在下にエキソヌクレアーゼ活性を実質的に有していなかった。結果を控え目に見積もってバックグラウンドの２倍の活性レベルが検出されたとしても、この変異体ではエキソヌクレアーゼ活性が少なくとも１／６０以下に減少していることが判明した。
【０１６１】
実施例ＶＩＩ
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの半減期の決定
実施例Ｉに記載のごとく精製したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性、即ち半減期を以下の方法によって決定した。精製したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ(２５単位)を以下の緩衝液:７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃のｐＨ８.８)、１７ｍＭの硫酸アンモニウム、７ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００μＭの各デオキシヌクレオチド及び２００μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ処理したＤＮＡ中で１００℃でプレインキュベートした。初期サンプルを時点０で採取し、酵素混合物の５％相当の少量のアリコートを１０、２０、４０、６０、９０、１２０、１５０及び１８０分後に取り出した。前述のようにＤＮＡに取込まれたデオキシヌクレオチドを測定することによってポリメラーゼ活性を測定した。
【０１６２】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのサンプルを上記アッセイで処理した。初期サンプルを時点０で採取し、酵素混合物の５％相当の少量のアリコートを４、７及び１０分後に取り出した。図３に示すように、１００℃のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの半減期は６０分であったが、１００℃のＴａｑポリメラーゼの半減期は４.５分であった。
【０１６３】
図３Ａに示すように、安定剤非存在下の１００℃のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの半減期は６０分であったが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００(０.１５％)またはＢＳＡ(１００μｇ／ｍｌ)のような安定剤の存在下の半減期は９５分であった。これは、安定剤の存在下または非存在下に１００℃の半減期４.５分を示したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと著しい対照を示した。
【０１６４】
実施例ＩＶに記載のごとく精製した組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性すなわち半減期は、約９０℃を上回る温度では二相性の熱失活曲線を有することが知見された。これらの２つの相の特徴は、半減期約５分及び７時間を有することである(図３Ｂ)。極度の高温における挙動をいっそう安定させるために、熱感受性が高いほうの成分をポリメラーゼから除去する付加的な精製段階を使用してもよい。
【０１６５】
詳細には、実施例ＩＶの最終酵素調製物を１００℃で１５分間加熱し、次いで氷上で３０分間冷却した。沈殿したタンパク質を１２,０００×ｇで４℃で１０分間遠心して除去した。この手順でポリメラーゼの初期活性の約２０％が失われた。残りのＤＮＡポリメラーゼは、９５℃の半減期約７時間の単相性の熱失活曲線を示した。得られたポリメラーゼはまた７５℃で天然型酵素及び実施例ＩＶに従って調製された組換え酵素と同様の動力学的特性を示した。
【０１６６】
実施例ＶＩＩＩ
３'→５'プルーフリーディング活性の定量
１.  デオキシヌクレオチドの存在の有無に対するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの応答
ポリメラーゼに関連したエキソヌクレアーゼ活性のレベルはデオキシヌクレオチドに対して極めて多様な応答を示す。プルーフリーディングでない５'→３'エキソヌクレアーゼは、デオキシヌクレオチドの存在による付随的重合によって１０倍またはそれ以上の刺激を受けるが、プルーフリーディングな３'→５'エキソヌクレアーゼは付随的重合によって完全に阻害されている。Ｌｅｈｍａｎ,  Ｉ.Ｒ.ＡＲＢ  ３６:６４５(１９６７)。
【０１６７】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼまたは十分に特性決定されたエキソヌクレアーゼ機能を有するポリメラーゼ類(Ｔ４ポリメラーゼ、クレノウフラグメント)を、１μｇの3Ｈ−チミジン標識二重鎖ＤＮＡ(１０5ＣＰＭ／μｇ)と共に、重合緩衝液(７０ｍＭのＴｒｉｓ(２４℃のｐＨ８.８)、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０.１％のＴｒｉｔｏｎ及び１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン)中でインキュベートした。７０℃(好熱性ポリメラーゼ)または３７℃(中温性ポリメラーゼ)で３時間(実験１)または４時間(実験２)のインキユベーション期間後、酸可溶性の放射性標識塩基を測定することによってエキソヌクレアーゼで加水分解された塩基を定量した。
【０１６８】
表１に示すように、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドが３０ｕＭ存在するときにエキソヌクレアーゼ活性の刺激を示す。しかしながら、Ｔ４ポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのような３'→５'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ類は逆に、デオキシヌクレオチドの存在に対して阻害応答を示した。
【０１６９】
デオキシヌクレオチドの存在または非存在に対するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼと十分に特性決定された大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントとの応答の類似性を更に図４に示す。２０単位のいずれかのポリメラーゼを９μｇの3Ｈ−チミジン標識二重鎖ＤＮＡ(１０5ＣＰＭ／μｇ)と共に、上述のような３５０μｌ中で３０μＭのデオキシヌクレオチドの存在下または非存在下にインキュベートした。各時点毎に５０μｌを取り出し、酸可溶性放射性標識塩基のレベルを測定した。図４に示すように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ及び十分に特性決定された３'→５'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を含む大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントの挙動は極めて類似している。
【０１７０】
２.  デオキシヌクレオチドの漸増濃度に対するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの応答
重合中に存在するデオキシヌクレオチドのレベルが重合に影響を与える場合には、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性はこのレベルによって影響される。デオキシヌクレオチドレベルが酵素のＫｍ(ミカエリス定数)に向かって増加するときは重合速度が促進される。重合速度に感受性のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能に関しては、エキソヌクレアーゼ活性がデオキシヌクレオチド濃度の増加と平行に変化する。重合速度の増加はプルーフリーディングな３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を劇的に減少させ、これに伴って重合依存性５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が増加する。
【０１７１】
デオキシヌクレオチド濃度が１０ｕＭから１００ｕＭまで増加するときのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能を、十分に特性決定された他のポリメラーゼ類のエキソヌクレアーゼ機能と比較した。インキュベーション期間３０分間のエキソヌクレアーゼ活性を前項(１)に記載のように測定した。表２に要約するように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、３'→５'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼを有することが判っているポリメラーゼ(大腸菌ＤＮＡ  Ｐｏｌ.Ｉのクレノウフラグメント)と同様にデオキシヌクレオチドレベルの増加に応答した。この応答は、プルーフリーディング機能を有していないことが判っているポリメラーゼ即ちＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの応答と相反していた。このポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドレベルの増加に応答し、それに伴って５'→３'エキソヌクレアーゼ活性によるエキソヌクレアーゼ機能の増加が生じた。
【０１７２】
【表１】
0004004078.tif 000003
【０１７３】
【表２】
0004004078.tif 000004
３.  デオキシヌクレオチドの平衡状態から不平衡状態への変化に対するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの応答
重合は、４つのデオキシヌクレオチド全部が等しいレベルでＤＮＡ合成中に存在することに依存する。デオキシヌクレオチドレベルが等しくない場合、ポリメラーゼは重合速度を低下させ、不正な塩基の挿入が生じ易い。このような条件はプルーフリーディングな３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を大幅に増加させるが、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を減少させる。Ｌｅｈｍａｎ,Ｉ.Ｒ.,  ＡＲＢ(１９６７)３６:６４５。
【０１７４】
デオキシヌクレオチドの平衡レベル(３０ｕＭ)及びｄＣＴＰを他の３つのデオキシヌクレオチドの１／１０または１／１００で存在させた２つの不平衡レベルでＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした。次に、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの応答を、３'→５'または５'→３'エキソヌクレアーゼ機能を有している３つのポリメラーゼの応答と比較した。全部のアッセイを次表のｄＣＴＰ濃度以外は前項(１)に記載のように行った。以下の表３に示すように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディングな３'→５'エキソヌクレアーゼを含有するポリメラーゼに関して予測された通りの挙動を示した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにおいても同様にデオキシヌクレオチドプールの不平衡はエキソヌクレアーゼ活性を増加させた。この応答と対照的に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、重合阻害点に達するまでは不平衡の影響を受けなかった。
【０１７５】
【表３】
0004004078.tif 000005
４.  エキソヌクレアーゼ活性の指向性
プルーフリーディングなエキソヌクレアーゼはＤＮＡ上で３'→５'指向性を有しているが、ＤＮＡポリメラーゼに関してプルーフリーディングでないエキソヌクレアーゼは５'→３'指向性を有している。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の方向を認識するために、アデノウイルスの５'ブロックしたＤＮＡを使用した。このＤＮＡの５'末端がタンパク質によってブロックされているので、５'→３'指向性の酵素活性はこの二重鎖ＤＮＡを消化することができない。しかしながら、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ含有ポリメラーゼのような３'→５'の酵素活性はアデノウイルスＤＮＡを消化し得る。
【０１７６】
２５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩまたは２０単位のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ(十分に特性決定された３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有している)、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(この活性が欠如している)を、５μｇのアデノウイルスＤＮＡと共に、７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃のｐＨ８.８)、２ｍＭのＭｇＣｌ2及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下に、３７℃(Ｔ４ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ)または７０℃(Ｔａｑポリメラーゼ及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ)で、３０分までの期間インキュベートした。各インキュベーション期間の終わりに、酵素活性をアデノウイルスＤＮＡのフェノール抽出によって停止させ、次いで２０ｍＭのＴｒｉｓ(２５℃のｐＨ７.９)、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム及び１ｍＭのＤＴＴ中でＨｐａＩによって３７℃で１時間消化した。ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動にかけ、得られた時間依存性分解のパターン及びその後の二重鎖ＤＮＡフラグメントの減量を評価した。
【０１７７】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼＩＩＩの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性は、アデノウイルスＤＮＡのブロックされた５'末端を起点とする二重鎖ＤＮＡフラグメントの消滅を誘起し、３'末端が傷つき易いことを示す。対照的に、５'→３'重合依存性エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡフラグメントの消滅を全く示さなかった。
【０１７８】
実施例ＩＸ
ＰＣＲプロセスにおけるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの性能
複製連鎖反応(ＰＣＲ)を実行させるＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの能力も試験した。実施例ＩＶに記載の緩衝液を含む１００μｌの反応容量中に、ＣｌａＩ消化によって切断されて４３５５ｂｐ及び２８９５ｂｐの２つのフラグメントを生じる種々の量のＭ１３ｍｐ１８  ＤＮＡを、非特異的吸着作用を減少させるキャリヤーＤＮＡとして存在する２００ｎｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡと共にインキュベートした。順方向及び逆方向プライマーが１μＭで存在した(順方向プライマー＝５'ｄ(ＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡ  ＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴ)３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９)及び逆方向プライマー＝５'ｄ(ＣＧＣＣＡＧ  ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ)３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０))。これらのプライマーは、上記の４３５５ｂｐフラグメント中の１ｋｂのＤＮＡ配列に結合(ｆｌａｎｋ)し、この配列は全Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡの１４％を表す。更に、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０％のＤＭＳＯ及び２.５単位のＴ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ(０.５％のＮＰ４０及び０.０５％のＴｗｅｅｎ２０の存在下または非存在下)、または、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ(０.１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下または非存在下)も存在した。初期サイクルは、９５℃で５分間、５０℃で５分間(この間にポリメラーゼ及びＢＳＡを添加した)及び７０℃で５分間から成る。以後の各ＰＣＲサイクルの区分は以下のごとく行った。９３℃で１分間、５０℃で１分間及び７０℃で５分間。０、１３、２３及び４０サイクル後に、１００μｌ容量中の２０μｌを取り出し、１ｋｂのＤＮＡ配列の増幅を定量するために、臭化エチジウムの共存下にアガロースゲルで電気泳動処理した。
【０１７９】
この標的ＤＮＡ配列を２８ｎｇ及び２.８ｎｇの存在量で用いた初期実験は、複製連鎖反応を触媒するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの能力を立証した。収量はＴ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼで観察された結果と同等であるかまたは２倍以下であった。
【０１８０】
しかしながら、標的ＤＮＡ配列のより低いレベルにあたる２.８ｆｅｍｔｏｇｒａｍｓを用いた場合、ポリメラーゼ機能の違いが最も明白であった。各サイクル中の最大ポリメラーゼ安定度及び／またはＤＮＡ延長効率を要するこれらの条件下で、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼは２３サイクル以内にＴ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの４倍以上の増幅ＤＮＡを産生した。
【０１８１】
多数の増幅サイクルは、ＰＣＲプロセス中に望ましくない人工物を発生させる機会を与えるので、より少ないサイクルで極めて少量のＤＮＡを増幅させるこの能力は多くのＰＣＲ用途に重要である。
【０１８２】
実施例Ｘ
組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのイントロンにコードされたエンドヌクレアーゼの精製
実施例ＩＶに記載のごとく増殖させた大腸菌ＮＥＢ６７１(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８４４７)を解凍し(７０ｇ)、１ｍｌあたり２００μｇのリゾチームを含有する緩衝液Ａに最終容量３００ｍｌまで懸濁させた。混合物を３７℃で２分間インキュベートし、次いで７５℃で３０分間インキュベートした。加熱した混合物を２２,０００×ｇで３０分間遠心し、熱安定エンドヌクレアーゼを更に精製するために上清を集めた。大腸菌に由来のヌクレアーゼ全部が熱処理によって失活したので、この段階の調製物を使用して、介在配列がコードしたエンドヌクレアーゼのキャリクタリゼーションが可能であった。同じく７５℃上清溶液中に存在する組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼからこの酵素を分離するために、溶液をＤＥＡＥ−セファロースカラム(５ｃｍ×５ｃｍ;ベッドボリューム１００ｍｌ)に通し、２００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。本質的に全部のＤＮＡポリメラーゼ活性がカラムを素通りするが、エンドヌクレアーゼ活性はカラムに付着する。エンドヌクレアーゼ活性を１リットルの０.１Ｍ−０.８Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中に形成)で溶出させた。エンドヌクレアーゼ活性は約０.４Ｍ  ＮａＣｌに溶出し、０.０５ｍｌの反応混合物あたり１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２４℃でｐＨ８.８)、１０ｍＭの(ＮＨ4)2ＳＯ4、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１μｇのｐＢＲ３２２  ＤＮＡを含む緩衝液中で検定した。反応混合物を７５℃でインキュベートし、ＤＮＡ開裂の程度をアガロースゲル電気泳動によって測定した。より低い温度ではエンドヌクレアーゼ活性はほとんどまたは全く検出されなかった。ピーク活性を含む管をプールし、緩衝液Ａに一夜透析し、次いでホスホセルロースカラム(２.５ｃｍ×６.５ｃｍ;ベッドボリューム３２ｍｌ)に導入し、緩衝液Ａで洗浄し、０.１Ｍ−１.５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中に形成)によってエンドヌクレアーゼ活性を溶出させた。酵素は約０.８Ｍ  ＮａＣｌに溶出した。活性分画をプールし、緩衝液Ａに一夜透析し、次いでＨＰＬＣモノ−Ｓカラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)に通し、０.０５Ｍ−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配によって溶出させた。活性は単一ピークとして溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると均一であった。単一の４２−４７ｋｄバンドをクーマシーブルー染色によって検出し、このバンドをゲルから溶出させて再変性させると、ゲルで検出されるエンドヌクレアーゼ活性だけを含んでいた。
【０１８３】
酵素は種々のＤＮＡ上に好ましい切断部位を有している。Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液(ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ,  Ｂｅｖｅｒｌｙ,  ＭＡ)中で極めて過剰に使用するとき、酵素はラムダＤＮＡ上に切断部位及びｐＢＲ３２２上に３つの部位を有している。ｐＢＲ３２２上の高速部位の２つを配列決定した。
【０１８４】
１６４位に切断部位を含む領域:
0004004078.tif 000006
２４１１位に切断部位を含む領域:
0004004078.tif 000007
ｐＰＲ９６９からＩＶＳ２が欠失すると、得られたプラスミドｐＡＫＫ４(実施例ＸＩ)はエキソン接合に極めて感受性の高速部位を含む。
【０１８５】
ＩＶＳ２接合に切断部位を含む領域:
0004004078.tif 000008
星印(＊)は、ＩＶＳ２の欠失によって互いに連結された左側エキソンと右側エキソンとの境界を示す。５０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.９)、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを５０℃で用いる反応条件下で、Ｉ−Ｔｌｉ  Ｉホーミング部位での開裂は“星印”部位の開裂の１００倍の速度で生じる。これらの条件下で、酵素は大腸菌ＤＮＡを６−１０回切断した。“星印”の開裂はＮＨ4(１０ｍＭ)、より高い温度(７０−８０℃)及びより高いｐＨ(８.８−１０)で増進される。
【０１８６】
このように、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのエキソヌクレアーゼは、４塩基の３'延長部が切断部位にしばしば存在し且つ認識配列に縮重が存在しうるという点で、介在配列がコードした他のエンドヌクレアーゼに類似している。
【０１８７】
介在配列が除去された遺伝子中の切断部位は、介在配列がコードしたエンドヌクレアーゼのホーミング部位と言うことができる。介在配列がコードしたエンドヌクレアーゼは介在配列が欠失した遺伝子中にその切断部位を認識し、且つエンドヌクレアーゼによるこのＤＮＡの切断の結果としてホーミング部位に介在配列が挿入されると当業界では考えられている。
【０１８８】
本発明の熱安定エンドヌクレアーゼは、その活性が必要とされる遺伝子操作技術において使用され得る。
【０１８９】
実施例ＸＩ
ＩＶＳ２の欠失したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの発現ベクターの構築
別のαクラスのＤＮＡポリメラーゼ及び１１７０ｂｐの介在配列中のエンドヌクレアーゼとの比較によってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ遺伝子中の推定アミノ酸配列を解析すると、この介在配列がαポリメラーゼ領域Ｉを分断していることが示唆された。エンドヌクレアーゼに先行する最初の３つのアミノ酸(Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ)をａａ  １４７２のＴｈｒに接合すると、すぐれたコンセンサス領域Ｉが成立する(下線を付けた残基は一致を示す):
領域I        :TYR GLY ASP THR ASP SER(SEQ ID NO:14)
左側接合     :TYR ALA ASP SER VAL SER(SEQ ID NO:15)
右側接合     :VAL HIS ASN THR ASP GLY(SEQ ID NO:16)
Ventポル領域I:TYR ALA ASP THR ASP GLY(SEQ ID NO:17)
この構築を容易にするために、Ｌｙｓ  １０７６及びＶａｌ  １０７７のコドン使用を以下のように変異させることによってＰＣＲプライマー中にＳｃａＩ部位を作製した:
アミノ酸:PHE LYS VAL LEU TYR ALA ASP(SEQ ID NO:18)
初期配列:TTT AAG GTT CTT(SEQ ID NO:19)
変異配列:TTT AAA GTA CTT(SEQ ID NO:20)
ScaI部位:      A CTA  CT(SEQ ID NO:21)
以下の成分から誘導された三方向結合で発現プラスミドｐＡＫＫ４を作製した。
【０１９０】
(１)ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで開裂することによってｐＰＲ９６９の約７９５９ｂｐのフラグメントを誘導した。９μｇのｐＰＲ９６９  ＤＮＡを、１×ＮＥＢ緩衝液２を用いて総量０.１ｍｌとし、４０単位のＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ及び４０単位のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼと共に３７℃で１時間インキュベートした。開裂産物をＴｒｉｓ  Ｂｏｒａｔｅ  ＥＤＴＡ緩衝液中の０.７％ＧＴＧグレードのアガロースゲル(ＦＭＣ)処理によって分離した。約８ｋｂｐの適正バンドをＥｌｕｔｒａｐ溶出装置(Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ)を製造業者の勧告通りの使用条件で用いた電気溶出によって単離した。溶出後、フラグメントをエタノール沈殿によって濃縮し、アガロースゲル電気泳動における既知重量の標準との比較によって回収量を測定した。
【０１９１】
(２)ＳｃａＩ末端及びＥｃｏＲＩ末端を有する約６３８ｂｐのフラグメントをＰＣＲ産物から誘導した。反応混合物は１×ＮＥＢ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液、０.ｌｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０.２ｍＭのｄＮＴＰ(等モル、各ヌクレオチド)、０.９μｇ／ｍｌのｐＶ１７４.１Ｂ１プラスミドＤＮＡ鋳型及び０.０１  Ａ260Ｕ／ｍｌのプライマー７２−１５０(５'ＡＴＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡ３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２２)及びプライマー“ＪＡＣＫ”(５’ＣＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＡＣ３’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２３)を含んでいた。０.１ｍｌの反応ミックスを５つの管の各々に導入し、サンプルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーモサイクラー中で９５℃で３−５分間加熱した。１ＵのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを各反応管に添加し、サーモサイクラーで９４℃−０.５分、５０℃−０.５分及び７２℃−２分から成るサイクルを１５回行って処理した。サンプルをプールし、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。サンプルを５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁させ、４０μｌのｄＨ2Ｏ、１０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液３、６０単位のＳｃａＩエンドヌクレアーゼ及び６０単位のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼと混合した。３７℃で１.７５時間インキュベーション後、反応産物を１.５％アガロースゲルで分離し、約６３８ｂｐのフラグメントを電気溶出させ、上記のごとく定量した。
【０１９２】
(３)ＨｉｎｄＩＩＩ末端及びＳｃａＩ末端を有する約３５８ｂｐのフラグメントをＰＣＲ産物から誘導した。反応混合物は１×ＮＥＢ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液、０.ｌｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０.２ｍＭのｄＮＴＰ(等モル、各ヌクレオチド)、０.９μｇ／ｍｌのｐＶ１７４.１Ｂ１プラスミドＤＮＡ鋳型及び０.０２  Ａ260Ｕ／ｍｌのプライマー６９８(５'ＧＡＧＡＣＴＣＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴ３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２４)及びプライマー７３−１４３(５'ＴＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣ３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２５)を含んでいた。０.１ｍｌの反応ミックスを５つの管の各々に導入し、サンプルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  サーモサイクラー中で９５℃で３−５分間加熱した。１ＵのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを各反応管に添加し、サーモサイクラーで９４℃−０.５分、５０℃−０.５分及び７２℃−１分から成るサイクルを２０回行って処理した。サンプルをプールし、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。サンプルを５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁させ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｃａＩエンドヌクレアーゼで開裂した。反応産物を１.５％アガロースゲルで分離し、３５８ｂｐのフラグメントを電気溶出させ、上記のごとく定量した。
【０１９３】
結合反応液は、約１μｇ／ｍｌの上記のｐＰＲ９６９フラグメントと、０.８ｍｇ／ｍｌの上記の６３８ｂｐフラグメントと、０.４μｇ／ｍｌの上記の３５８ｂｐのフラグメントと、１×ＮＥＢ結合緩衝液と、１００,０００単位／ｍｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼとを含んでいた。１６℃で５時間結合させ、正しく構築された組換え体をＳｃａＩ消化パターンによって同定し、上述のように誘導活性をスクリーニングするためにＢＬ２１(ＤＥ３)ｐｌｙｓＳを形質転換させた。２つのこのような単離物即ちｐＡＫＫ４及びｐＡＫＫ１５を以後の試験に使用した。これらの２つの単離物は個別の単離物から単離されたが同じであると考えられる。
【０１９４】
新しい構築物ｐＡＫＫ４からの発現は、１１７０ｂｐの介在配列からのエンドヌクレアーゼの発現を伴わずにｐＰＲ９６９の３−１０倍のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を生じると考えられる。
【０１９５】
ｐＡＫＫ１５の１４１７ｂｐのＣｌａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、エキソヌクレアーゼ欠失Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ構築物の原形であるｐＣＢＡ１の同様の１４１７ｂｐのフラグメントで置換することによって、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失変異体を産生する発現ベクターを構築した。このような組換え体の１つをｐＡＫＭ８と命名し、更に特性決定した。
【０１９６】
実施例ＸＩＩ
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓの熱安定ＤＮＡポリメラーゼの精製
８個の１リットル培養瓶を用い、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.ＧＢ−Ｄ株(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.５５２３９)を、１０ｇ／リットルの元素イオウを含むＢｅｌｋｉｎらによる記載の培地中、前出、で９４℃で２日間増殖させた。細胞を室温に冷却し、傾瀉によって未使用のイオウを分離し、遠心によって収集し、−７０℃で保存した。細胞収量は１リットルあたり１.４ｇであった。
【０１９７】
上述のごとく得られた１１.５ｇの細胞を、０.１ＭのＮａＣｌを含む２８ｍｌの緩衝液Ａ(１０ｍＭのＫＰＯ4緩衝液(ｐＨ７.４);０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１.０ｍＭのβ−メルカプトエタノール)に懸濁させ、４℃で５分間超音波処理した。溶菌液を１５,０００ｇで４℃で３０分間遠心した。上清溶液を１８ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌブルーカラム(Ｂｉｏｒａｄ)に通した。次にカラムを０.１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。カラムを３００ｍｌの０.１−２.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。ＤＮＡポリメラーゼは約１.３Ｍ  ＮａＣｌに単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の９０％を表す。ＤＮＡポリメラーゼ(２５ｍｌ)のピーク活性を、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１リットルの緩衝液Ａに透析し、１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡させた１５ｍｌのホスホセルロースカラムに導入した。カラムを１００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、酵素活性を２００ｍｌの０.１−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。活性は０.６Ｍ  ＮａＣｌに単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の７０％を表す。プールした活性(４２ｍｌ)を５００ｍｌの緩衝液Ａに透析し、２５ｍｌのＤＥＡＥカラムに導入した。０.１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄すると、酵素活性の２／３がカラムを素通りした。活性分画をプール(３０ｍｌ)し、１.０ｍｌのＨＰＬＣモノ−Ｓカラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)に導入し、１００ｍｌの０.０５−１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中)で溶出させた。活性は０.２２Ｍ  ＮａＣｌに単一ピークとして溶出し、これは導入した活性の８０％を表す。
【０１９８】
精製したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.ポリメラーゼをＳＤＳ  １０−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、タンパク質を検出するために上記のようにクーマシーブルーまたはコロイド染料(ＩＳＳ  Ｐｒｏｂｌｕｅ)で染色した。かすかに染色されたタンパク質バンドが約９２,０００から９７,０００ダルトンに観察された。この分子量決定は、同じゲル上の以下のマーカータンパク質(Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)の泳動に比較することによって得られた:ミオシン、２００,０００ダルトン;ホスホリラーゼＢ、９７,４００ダルトン;ＢＳＡ、６８,０００ダルトン;オボアルブミン、４３,０００ダルトン;カルボニックアンヒドラーゼ、２９,０００ダルトン;β−ラクトグロブリン、１８,４００ダルトン;リゾチーム、１４,３００ダルトン。
【０１９９】
実施例ＸＩＩＩ
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓのＤＮＡのポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から調製した放射性プローブを用いたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムＤＮＡライブラリーの交差ハイブリダイゼーションによって、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定及び単離が可能であった。これは以下のごとく行った。
【０２００】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムライブラリーの調製にどの制限酵素が最も有用であるかを決定するために、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって完全に切断した。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ(図１３Ａ)、以下のごとく調製したＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション処理(図１３Ｂ)した。市販のランダムプライミングキット(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ,  Ｉｎｃ.)中のＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の最初のＥｃｏＲＩフラグメント(ｂｐ  １−１２７４、バクテリオファージＮＥＢ＃６１８、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.４０７９４から得られたもの)１μｇを鋳型として含む反応混合物を３７℃で１時間インキュベートして高い比活性のＤＮＡプローブを産生させた。プローブを、上述のように調製したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡと中程度の緊縮性条件下にハイブリダイズした(ハイブリダイゼーション:５０℃で一夜、４×ＳＥＴ、０.１Ｍのリン酸ナトリウム(ｐＨ７)、０.１％のピロリン酸ナトリウム、０.１％のＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液;洗浄条件:３×２０−３０分、４５℃、０.１×ＳＥＴ、０.１Ｍのリン酸ナトリウム(ｐＨ７)、０.１％のピロリン酸ナトリウム、０.１％のＳＤＳ。Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)。ＢａｍＨＩ切断したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＤＮＡにおいて約５Ｋｂに単一主要バンドを検出した。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩはこのプローブによって多数バンドを与え、これはこれらの酵素がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓポリメラーゼ遺伝子の内部を切断したことを示す。
【０２０１】
これらの結果に基づいて、ファージベクターλＤＡＳＨ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)を用いてＢａｍＨＩゲノムライブラリーを構築した。ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓのＤＮＡのＢａｍＨＩ部分消化物及び完全消化物を調製した。ＢａｍＨＩで部分消化及び完全消化したＤＮＡの混合物をλＤＡＳＨのＢａｍＨＩ部位に結合した。Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)を製造業者の指示に従って用いて結合混合物をパッケージし、大腸菌ＥＲ１４５８株に平板培養した。パッケージしたファージライブラリーは１ｍｌあたり１×１０6ファージを含んでいた。
【０２０２】
(ＮＥＢ＃６１９、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.４０７９５から得られる)Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３つのフラグメント(ｂｐ  １−１２７４、１６５６−２６６０及び３０６９−３７３７)の32Ｐ−標識ＤＮＡプローブをランダムプライマーキット(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ,  Ｉｎｃ.)を用いて調製した。プローブをＢｅｎｔｏｎ  ＆  Ｄａｖｉｓの方法(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)に従って使用して、上述のハイブリダイゼーション条件を用いてＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムライブラリーをスクリーニングした。約１％のプラークが陽性であり、１０個の陽性プラークを選択し、感染及び平板培養を３回繰り返すことによって(各単離物あたり９０−１００％のプラークが陽性になるまで)精製した。各単離物から大量のファージを調製し、大腸菌培養物を感染させるために使用した。詳細には、ファージのプレート溶解物(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)を各単離物から調製し、大腸菌細胞を感染させるために使用した。０.１ｍｌの各プレート溶解物を０.２ｍｌの細胞(ＯＤ600＝２)の濃度で大腸菌に混合した。溶菌の直前に細菌細胞を採集し、０.０５ＭのＮａＣｌ、０.０１ＭのＴｒｉｓ(ｐＨ８.０)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２００μｇ／ｍｌのリゾチーム(細胞容量の３倍容)に懸濁させ、３７℃で１分間または細胞溶解が生じるまで加熱した。溶解した抽出物を直ちに７５℃で３０分間加熱し、遠心し、上清溶液の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を上述の方法で検定した。１０個の単離物のうちの３つが有意なポリメラーゼ活性を示したので、最大活性を示したクローン(Ｂ９)を更に試験した。
【０２０３】
ファージＤＮＡをＢ９から単離し、インサートＤＮＡを制限酵素消化によって試験した。ＳａｌＩによる消化は、予想されたλＤＡＳＨの２つのアームと１５Ｋｂのインサートとを与えた。ＢａｍＨＩによる消化は、λＤＡＳＨの２つのアームと７、４.８及び３Ｋｂの３つのインサートフラグメントとを与えた。これらのフラグメントの各々をアガロースゲル電気泳動によって精製し、溶出させ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に結合した。結合混合物を使用して大腸菌ＥＲ２２０７株を形質転換させると、指示寒天培地(ＩＰＴＧを添加したＸ−ｇａｌ)上で、プラスミドがインサートを含むときは白色コロニーが生じ、インサートを含まないときは青色コロニーが生じた。７Ｋｂのフラグメントでは白色形質転換体は全く得られなかった。４.８Ｋｂのフラグメントでは３つの白色形質転換体と２７個の青色形質転換体が得られた。３Ｋｂのフラグメントでは２０個の白色形質転換体と２１個の青色形質転換体が得られた。４.８Ｋｂで得られた３つの白色コロニー形質転換体の全部が熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現した。３Ｋｂフラグメントで得られた形質転換体はいずれも熱安定ポリメラーゼ活性を発現しなかった。４.８ＫｂのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓのＤＮＡフラグメントを担う３つのクローンはいずれも熱安定ＤＮＡポリメラーゼのほぼ同じ比活性を有していたので、そのうちの１つ(ＮＥＢ＃７２０)を選択して以後の試験に使用した。ＮＥＢ＃７２０と命名したこのクローンを１９９１年１０月１日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ  Ｎｏ.６８７２３として受託された。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む４.８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントの制限エンドヌクレアーゼマップを図１４に示す。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼをコードする部分的ＤＮＡヌクレオチド配列(ＮＥＢ７２０)を図１８(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６)に示す。この配列は、ｂｐ３６３にポリメラーゼ遺伝子の起点を含み、介在ヌクレオチド配列の一部分(ｂｐ１８３９−３４２０)を含む。ＮＥＢ＃７２０は、細胞１ｇあたり１７００単位のＤＮＡポリメラーゼ活性を生じ、この酵素の大規模生産に使用した。
【０２０４】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼクローンの一部分を配列決定した(図１８(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６、ｂｐ  １−３４２０)。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼの配列は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ及びタンパク質レベルの双方で極めて類似している(類似性は、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２:４８２(１９８１)を用いて計算した)。総体的には遺伝子が６６％一致し、成熟ＤＮＡポリメラーゼアミノ末端領域(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼのｂｐ  ３６３−１８３８)では６９％の一致、現在までに配列決定されたＩＶＳ１の部分(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼのｂｐ  １８３９−３４２０)では６３％の一致を示した。上流領域(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼのｂｐ  １−３６２、図１８(ＳＥＱＩＤ  ＮＯ:６)及びＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのｂｐ  １−２９０、図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１))はＢｅｓｔｆｉｔ  Ｐｒｏｇｒａｍによる類似性を全く示さなかった。
【０２０５】
タンパク質レベルの類似性はより高い値である。１０１９アミノ酸から成るＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼコーディング領域において、２つのポリメラーゼは８３％の類似及び６８％の一致を有している(図１９(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８))。成熟ポリメラーゼアミノ末端とＩＶＳ１とに分割すると、ポリメラーゼコーディングエキソンは介在配列よりも類似性が高く、成熟ポリメラーゼアミノ末端(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼのａａ  １−４９２)は８９％類似及び７８％一致を示し、ＩＶＳ１(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＰ.のＤＮＡポリメラーゼのａａ  ４９３−１０１９)は７８％類似及び６０％一致を示す。
【０２０６】
実施例ＸＩＶ
古細菌ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡレベルにおける類似
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と、３つの別の好熱性古細菌及びＴａｑ  ＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子との間の交差ハイブリダイゼーションの程度をサザンブロットハイブリダイゼーション(Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出)によって評価した。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.(ＧＢ−Ｄ株)、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ及び別の２つのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株、Ｇ−１−Ｊ及びＧ−１−Ｈに由来の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩによって開裂した。５μｇの各ＤＮＡを、総量６０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液(ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼにはＥｃｏＲＩ緩衝液及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼにはＢａｍＨＩ緩衝液＋１×ＢＳＡ)中で２０単位のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼまたは２０単位のＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼと共に３７℃で２時間インキュベートした。４つの開裂ＤＮＡの各々の０.７５μｇの４重(ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ)サンプルをＴｒｉｓ  Ａｃｅｔａｔｅ  ＥＤＴＡ緩衝液(Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出)中の１％アガロース(Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥ)ゲルに充填し処理した。ゲルを臭化エチジウム(１μｇ／ｍｌ)で室温で２０分間染色し、ゲルに定規を並べた状態で写真撮影した。
【０２０７】
サザンによって開発された方法(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)を用いてＤＮＡをゲルからニトロセルロース紙に移した。ニトロセルロース濾紙(０.４５μｍ)をゲルのサイズに裁断し、２００ｍｌの６×ＳＳＣ(０.９ＭのＮａＣｌ、０.０９Ｍのクエン酸ナトリウム)に３７℃で１時間以上浸漬させた。その間に、ゲルを２００ｍｌの０.２５Ｍの塩酸中で室温で１５分間インキュベートし、次いで蒸留水で洗浄した。次に、ゲルを２００ｍｌの０.５Ｍの水酸化ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム中で室温で３０分間インキュベートし、次いで蒸留水で洗浄した。次にゲルを各２００ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)及び３Ｍの塩化ナトリウム中で室温で３０分間インキュベートした。ゲルからニトロセルロースにＤＮＡを移すためには、１８×ＳＳＣ(２.７Ｍの塩化ナトリウム、０.２７Ｍのクエン酸ナトリウム)、１Ｍの酢酸アンモニウム中で４℃に維持した。６時間後、ニトロセルロースを取り出し、１×ＳＳＣ(０.１５Ｍの塩化ナトリウム及び０.０１５Ｍのクエン酸ナトリウム)中で３０秒間洗浄した。ニトロセルロースフィルターを風乾し、次いで８０℃で更に２時間減圧乾燥し、室温で保存した。
【０２０８】
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡのゲル精製した４つのフラグメント(５'ポリメラーゼコーディング領域を表すｂｐ  １−１２７４に由来の１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント;３'ポリメラーゼコーディング領域を表すｂｐ  ４７１８−５４３７;ＩＶＳ１の部分を表すｂｐ  ２４４８−２８８２;及びＩＶＳ２の部分を表すｂｐ  ３６６６−４２４２、図６及び１５参照)を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのランダムプライマーキットを用いて放射性標識した。各３５.５μｌ容量中の１００ｎｇの上記鋳型ＤＮＡを沸騰水浴中で５分間煮沸し、次いで氷上で５分間冷却し、遠心分離した。鋳型ＤＮＡを、１×標識緩衝液(ランダムヘキサヌクレオチド含有)、１／１０容量のｄＮＴＰミックス、２０μＣｉのα32Ｐ  ｄＣＴＰ及び５単位のＤＮＡポリメラーゼＩ−クレノウフラグメントで総容量５０μｌにして３７℃で１時間インキュベートした。０.０１８ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。Ｅｌｕｔｉｐミニカラム(Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ)を製造業者の勧める溶出条件で用いてプローブを精製した。全部の精製プローブについて総カウント数を計算した。１.３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントプローブ(ｂｐ  １−１２７４)は、２４×１０6ｃｐｍ、３'ポリメラーゼプローブ(ｂｐ  ４７１８−５４３６)は２２×１０6ｃｐｍ、ＩＶＳ１プローブは５４×１０6ｃｐｍ及びＩＶＳ２プローブは４７×１０6ｃｐｍを生じた。
【０２０９】
ハイブリダイゼーションを以下の手順(Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出)で行った。ニトロセルロースフィルターを５ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液(０.７５Ｍの塩化ナトリウム、０.１５ＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のピロリン酸ナトリウム、０.１％のラウリル硫酸ナトリウム、０.２％のウシ血清アルブミン、０.２％のＦｉｃｏｌｌ  ４００、０.２％のＰＶＰ及び１００μｇ／ｍｌの煮沸仔ウシ胸腺ＤＮＡ)中で５０℃で３０分間インキュベートした。次に各ニトロセルロースフィルターを５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液(０.０３％のウシ血清アルブミン、０.０３％のＦｉｃｏｌｌ  ４００及び０.０３％のＰＶＰとする以外は上記の緩衝液と同じ)と共に個別の袋に導入した。各セクションを２２−２５×１０6ｃｐｍの変性プローブと共に５０℃で一夜ハイブリダイズした。
【０２１０】
ニトロセルロースフィルターを袋から取り出し、０.１×ＳＥＴ洗浄液(１５ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＴＲｉｓ塩基、０.２ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のＳＤＳ、０.１％のピロリン酸ナトリウム及び０.１Ｍのリン酸塩緩衝液)と共に４５℃で３×３０分間インキュベートした。フィルターを湿潤状態に維持し、サランラップで包装し、４時間から３日の範囲の種々の時間Ｘ線フイルムに露光した。
【０２１１】
結果を図１６に示す。図１６のＡからＤは、４重サザンブロットのオートラジオグラフを示す。レーン１−５は、ＥｃｏＲＩで切断されたＤＮＡを示す。レーン６−１０は、ＢａｍＨＩで切断されたＤＮＡを示す。レーン１及び６は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−ＪのＤＮＡ、レーン２及び７は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−ＨのＤＮＡ、レーン３及び８は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡ、レーン４及び９は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＧＢ−ＤのＤＮＡ、レーン５及び１０は、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡを示す。ハイブリダイゼーションプローブは以下の通りである。図１６Ａは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５'コーディング領域を表すｂｐ  １−１２７４;図１６Ｂは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３'コーディング領域を表すｂｐ  ４７１８−５４３７;図１６Ｃは、部分的ＩＶＳ２プローブを表すｂｐ  ３６６６−４２４２;図１６Ｄは、部分的ＩＶＳ１プローブを表すｂｐ  ２４４８−２８８２を示す。図１６のＣ及びＤの上部及び下部のパネルは同じブロットの短時間露光及び長時間露光を夫々示す。
【０２１２】
４つのプローブはいずれもＴａｑ  ＤＮＡにハイブリダイズしなかった。双方のポリメラーゼコーディング領域プローブは、すべてのサーモコッカス及びピロコッカスのＤＮＡの特異的バンドにハイブリダイズするが、Ｔａｑ  ＤＮＡにはハイブリダイズしない。双方のプローブについて、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのコーディング領域のアミノ末端及びカルボキシ末端の双方の強力な保存を示す十分なシグナルが得られた。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＧＢ−Ｄのアミノ末端領域は、約６９％一致(例えば図６(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１)と１８(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６)との参照)を示し、タンパク質レベルが極めて類似している(図１９(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８)参照)。ＩＶＳ１プローブは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＧＢ−ＤのＤＮＡに強力にハイブリダイズし(１５８２ｂｐ領域で約６３％一致)、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−ＨのＤＮＡに弱くハイブリダイズした。ＩＳＶ２プローブは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡに強力にハイブリダイズし、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−ＨのＤＮＡに弱くハイブリダイズした。
【０２１３】
実施例ＸＶ
抗体レベルにおける古細菌ＤＮＡポリメラーゼの類似
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓの菌株の１ｍｌの培養物のペレットを、１００μｌの尿素溶菌緩衝液(４Ｍの尿素、０.１２ＭのＴｒｉｓ、４％のラウリル硫酸ナトリウム、１０％のβ−メルカプトエタノール、２０％のグリセロール及び０.００２％のブロモフェノールブルー)に再懸濁させ、３分間煮沸した。サンプルの粘度を低下させるために、２５Ｇ５／８ニードルで煮沸サンプルに切込みを入れた。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ菌のＧ−１−Ｊ及びＧ−１−Ｈ株の１０μｌの重複サンプル及び精製Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.(ＧＢ−Ｄ)の精製ＤＮＡポリメラーゼのサンプルを、１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填し、タンパク質処理緩衝液(０.１％のラウリル硫酸ナトリウム、０.１９Ｍのグリシン及び０.０２５ＭのＴｒｉｓ塩基)中で処理した。ニトロセルロースフィルター(４５μｍ)を蒸留水に５分間浸漬し、次いで転移緩衝液(０.１５％のエタノールアミン、２０ｍＭのグリシン及び２０％のメタノール)に３０分間浸漬した。ゲル上のタンパク質を転移緩衝液(Ｔｏｗｂｉｎら、ＰＮＡＳ  ７６:４３５０−４３５４(１９７９))中のニトロセルロースフィルターに電気溶出(３０ボルト、４℃で一夜)させた。
【０２１４】
ニトロセルロースを取り出し、ボールペンでマークし、ＴＢＳＴＴ(２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０.２％のＴｗｅｅｎ２０及び０.０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)中で５分間洗浄した。フィルターをＴＢＳＴＴ＋３％無脂肪ドライミルク(Ｃａｒｎａｔｉｏｎ)中で３０分間ブロックし、ＴＢＳＴＴ中で３×３分間洗浄した。抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ坑血清を部分精製天然型ＤＮＡポリメラーゼ調製物に対して造った。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ特異的血清を精製天然型酵素のウエスタンブロットストリップ(Ｂｅａｌｌら、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８６:２１７−２３３(１９８３))上のアフィニティ精製によって調製した。アフィニティ精製した抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼマウス抗体(Ｖ７６−２＋３)及びモノクローナル抗−Ｔａｑポリメラーゼ抗体(ＴＢＳＴＴで１:１００に希釈)を各ニトロセルロースフィルターに室温５時間で個別に添加した。フィルターをＴＢＳＴＴで３×３分間洗浄し、次いでアルカリホスファターゼ(Ｐｒｏｍｅｇａ)にコンジュゲートしＴＢＳＴＴで１:７５００に希釈した抗マウス第二抗体と室温で１時間反応させた。ニトロセルロースフィルターを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰによって製造業者(Ｐｒｏｍｅｇａ)の指示通りに現像した。Ｔａｑモノクローナルを用いた結果を図１７に示す。図１７のＡは、アフィニティ精製した抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体、Ｂは、抗−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼモノクローナル抗体と反応させたＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ(Ｖ)、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−Ｊ(Ｊ)及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  Ｇ−１−Ｈ(Ｈ)の粗溶解物又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＧＢ−Ｄ(ＤＶ)、Ｔ.ａｑｕａｔｉｃｕｓ(Ｔ)もしくは大腸菌(Ｅ)の精製ポリメラーゼのウエスタンブロットである。矢印は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼタンパク質の位置を示す。Ｂの反応性は、バックグラウンドタンパク質に対する反応性であり、Ａに見られるようなＤＮＡポリメラーゼに対する反応性ではない。
【０２１５】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体は、ピロコッカス及びサーモコッカスの試験した菌株と交差反応しない。
【０２１６】
しかしながら、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの９０−９５,０００ダルトンのＤＮＡポリメラーゼタンパク質及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓの３種の菌株は、アフィニティ精製した抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体と反応した。Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓとＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＧＢ−ＤとのＤＮＡポリメラーゼ(図１９(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８))間の類似及び一致の程度を考慮したとき、この反応は意外ではない。
【０２１７】
図１９(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８)は、組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓの推定アミノ酸配列の一部分と組換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼの部分配列との比較である。ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸を上列に示し、組換えＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸配列を下列に示す。一致を垂直の線で示し、類似を１または２個の点で示す。非保存置換を２つの配列間の空白で示す。
【０２１８】
実施例ＸＶＩ
標的古細菌から組換え熱安定ＤＮＡポリメラーゼを得るために、標的ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングするいくつかの基本的方法を使用し得る。最初の試みは、本発明の実施例ＸＶ(図１７)に記載したように、抗−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ血清を用いた精製ポリメラーゼ(粗ポリメラーゼ溶解物の作用感度は低いかもしれない)のウエスタンブロット分析によって新しいポリメラーゼがＰｏｌ  αまたはＰｏｌＩのファミリーであるか否かを免疫学的に決定することである。新しいポリメラーゼが抗−Ｔａｑポリメラーゼモノクローナルと反応するならば、このポリメラーゼは恐らくＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼから作製された試薬を用いて容易にクローニングすることはできない。新しいポリメラーゼが抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ血清と交差反応するならば、該ポリメラーゼを以下の手順でクローニングすることができよう。新しいポリメラーゼがどの血清とも反応しないときは、この実験で結論を得ることはできないと考えられるので、次の段階即ちＤＮＡ交差ハイブリダイゼーションに進まなければならない。
【０２１９】
最適のプローブ及びＤＮＡハイブリダイゼーション条件は新しい生物毎に実験的に決定する必要がある。同時に、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのプローブにハイブリダイズし新しいポリメラーゼをコードする十分な大きさのフラグメントを生じる酵素を見出すために新しい生物のＤＮＡの種々の制限消化物を試験する。
【０２２０】
プローブ選択はＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のサイズ及び領域に関して変更し得る。大小のＤＮＡフラグメントまたはオリゴマーで以下に記載のような試験サザンブロットを行うことによって最適プローブを決定し得る。新しい古細菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中のＩＶＳの存在を探索するためにＩＶＳ配列の完全に内部にあるプローブを選択することもでき、または、プローブを成熟ポリメラーゼコーディング領域に限定することもできよう。全Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  全ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子領域をプローブとして用いることにはいくつかの利点もあり欠点もある。主な欠点は、プローブが大きくなると極めて低い緊縮性では不要な(ｓｐｕｒｉｏｕｓ)ハイブリダイゼーションが生じ易いことである。大きいプローブを使用する利点は、(１)ポリメラーゼの小さい一部分に存在するＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から著しく離れた別のポリメラーゼとの交差ハイブリダイゼーションが生じ易いこと、(２)プローブがＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端及びカルボキシ末端に及んでいるので新しいポリメラーゼ遺伝子中の内部制限部位を検出し易いことである。プロービングの初期段階で、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼプローブにハイブリダイズし且つ新しいポリメラーゼをコードするのに十分に大きい好ましくは１つまたは可能には２つのバンドを生じ得る１つまたはそれ以上の酵素を見出すために、新しい古細菌からのＤＮＡを開裂するいくつかの制限酵素を使用することは重要である。新しいポリメラーゼに必要な最小コーディング配列はウエスタンブロット(所望の場合、ＩＶＳに関するファクターも想定する)によって決定される新しいポリメラーゼのサイズから判断することができ、または最初の近似値として４ＫＢを上回る値を想定することで判断できる。
【０２２１】
最適ハイブリダイゼーション条件は種々の洗浄温度で試験サザンブロットを行うことによって実験的に決定される。ハイブリダイゼーションを、４×ＳＥＴ、０.１Ｍのリン酸ナトリウム(ｐＨ７)、０.１％のピロリン酸ナトリウム、０.１％のＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液中で５０℃で行うが、低緊縮性のハイブリダイゼーション条件も適当であろう(Ｍａｎｉａｔｉｓ)。洗浄条件は、０.１×ＳＥＴ洗浄液(１５ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＴｒｉｓ塩基、０.２ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のＳＤＳ、０.１％のピロリン酸ナトリウム及び０.１Ｍのリン酸塩緩衝液)を用いて、３７−５５℃、３×３０分の範囲である。標準的な低緊縮性洗浄条件も使用し得る。実験のこの部分の要点は、非特異的交差ハイブリダイゼーションをも包含するあるレベルの交差ハイブリダイゼーションを確保するような低い緊縮性でプローブをハイブリダイズしサザンブロットを洗浄することである。次に、例えば洗浄温度を３−５℃ずつ上昇させることによって洗浄緊縮性を増加させ、次いでオートラジオグラフィー上のシグナルの減少によって測定されるハイブリダイズプローブの消滅をモニターする。最初は、低緊縮性で多数のバンドがプローブにハイブリダイズするのを観察できよう。洗浄緊縮性を増加させるに伴って、弱くハイブリダイズした配列は溶け去ってオートラジオグラフから消滅する。洗浄緊縮性を増加させるに伴って、唯１つのバンドまたは少数のバンドがプローブとハイブリダイズする条件が成立する。これらが将来の実験に使用すべき条件となる。緊縮性がこの点を超過すると、すべてのハイブリダイゼーションシグナルが消滅する。到達すべき目標は、すべてのハイブリダイゼーションシグナルが消滅する前の、消化物あたり１つまたは少数のバンドがプローブとハイブリダイズする最も緊縮性の条件を決定することである。
【０２２２】
大きいＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子フラグメントによる最初のプロービングが、いかなるハイブリダイゼーション条件を使用しても明白なパターンを与えるのに成功しなかった場合、より小さいプローブを用いてプローブサイズとハイブリダイゼーション条件との良好な組み合わせが成立するまで試験しうる。あるいは、本発明の実施例ＸＩＶは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の異なる領域に及ぶいくつかのフラグメント(アミノ末端、ＩＶＳ１、ＩＶＳ２及びカルボキシ末端、図１５及び１６)を個別のサザンブロットに使用でき、しかも並列試験できることを示している。
【０２２３】
最適制限消化物を用いてライブラリーを構築し、最適化したプローブとハイブリダイズさせる。並列方法では、発現ベクター中でクローニングし、抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ血清で直接スクリーニングする。最初の方法で活性または不活性の産物が産生する。活性ポリメラーゼが全く検出されないとき、クローンのインサートサイズ及び抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ血清に対する反応性を検査する。抗−Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ血清に対する反応性が全くない場合、ポリメラーゼは大腸菌中でそれ自体の調節配列から発現されないと考えられ、新しいポリメラーゼを大腸菌プロモーター及び恐らくは翻訳シグナルに操作可能に連結するためにプラスミドインサートを配列決定しなければならない。
【０２２４】
本発明において、介在配列、即ちＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子におけるＰｏｌ  α保存領域モチーフ中の介在配列が同定された。従って、別のＡｒｃｈａｅ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子も保存モチーフ中に介在配列を有するであろうと予測された。新しいポリメラーゼクローンが不活性の場合、介在配列の存在を検査しなければならない。これらの介在配列は２つの方法で同定できる。これらの介在配列がＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中に見出される介在配列に近縁の場合、これらの介在配列は、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の介在配列に由来のＤＮＡプローブに対する低緊縮性ハイブリダイゼーションによって同定できる。ＩＶＳが検出される場合、ＩＶＳの除去戦略を開発するためにクローンを配列決定する。クローンが不活性で交差ハイブリダイズするＩＶＳが全く検出されない場合、新しいＩＶＳを探すためにプラスミドを配列決定する。古細菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＤＮＡレベルで配列決定し、得られた配列を、(１)非類似セグメントを同定するために別のＤＮＡポリメラーゼに比較し、また、(２)領域Ｉ−ＶＩの非存在を調べるために保存モチーフに比較し、次いで、存在しない領域中の遮断点（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）を同定する。この同定の後、当業界で公知の任意の技術によって介在配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏ除去し得る。これらの技術のいくつかは本出願において、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からＩＶＳ１及びＩＶＳ２を除去する手順を説明するときに記載した。
【０２２５】
一次ライブラリースクリーニングで活性の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを合成するクローンの産生に成功しなかったが、(１)ＤＮＡレベルの交差ハイブリダイゼーション、(２)抗体レベルの交差反応性及び(３)ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列レベルでの他のＤＮＡポリメラーゼに対する類似性、によって部分遺伝子クローンが生じたと判断された場合には、次のライブラリーを作製するために選択される制限酵素を同定すべく、よりゲノム的なサザンブロットを最初のクローンでプローブする。二次ライブラリーは、全ポリメラーゼ遺伝子をコードし得るようなより大きいフラグメントを含んでいなければならない。ライブラリーを抗体によってスクリーニングするか、または、好ましくは最初の新しいポリメラーゼのクローニング配列でスクリーニングする。得られた陽性クローンの熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を検査する。この第二ラウンドで活性の熱安定ＤＮＡポリメラーゼが検出されない場合、介在配列を交差ハイブリダイゼーション及びＤＮＡ配列決定によってスクリーニングしうる。ＤＮＡ配列決定はまた、すべての保存ポリメラーゼモチーフ及びポリメラーゼ読み取り枠中の停止コドンの存在を確認することによって、クローニングされた遺伝子が完全であるか否かを示しうる。活性の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを最終的にクローニングする前に数ラウンドのスクリーニング及び再スクリーニングが必要であるかもしれない。
【０２２６】
また、遺伝子中に毒性因子が存在するので新しい熱安定ポリメラーゼ遺伝子をクローニングするために上記のスクリーニング及び再スクリーニング手順では十分でないことも有りうることに注目されたい。この場合、ＤＮＡまたはタンパク質レベルの交差反応性は、最初は部分的な不活性の産物だけがクローニングされその後に完全遺伝子をクローニングできるので、優れたクローニング方法である。上記に概説した戦略を用いて完全遺伝子が容易に得られない場合、クローニングのときに極めて毒性であるＩＶＳ２のような介在配列の存在を探す必要がある。このためには、ポリメラーゼクローン中の欠失及び転位を探すかまたは既知の毒性Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＩＶＳ配列をプロービングする。ポリメラーゼコーディング領域の近傍の毒性ＩＶＳを検出するために、重複サザンブロットをポリメラーゼコーディング領域及びＩＶＳ配列によってプローブする。転位または毒性ＩＶＳが検出されたとき、適正な戦略としては、先ずポリメラーゼのアミノ末端を本出願に記載されたような極めて厳密に調節された発現系に操作可能に結合する。その後、ポリメラーゼ遺伝子の残りをクローニングし、アミノ末端に結合して、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＩＶＳ２配列のような毒性因子の発現を低減させる。または、ポリメラーゼ遺伝子の交差ハイブリダイズするサブフラグメントを単離し、ハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定によってＩＶＳを検査し、これらの領域から当業界で公知の方法によってＩＶＳを除去しうる。次に、毒性因子を除去したサブフラグメントを結合することによって完全ポリメラーゼ遺伝子を構築しうる。
【０２２７】
実施例ＸＶＩＩ
９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と新規な超好熱菌９°Ｎ−７(ＮＥＢ＃９１９)のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子との間の交差ハイブリダイゼーションの程度をサザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。実施例ＸＩＶに記載した方法を以下のごとく修正した方法を用いた。
【０２２８】
１.５μｇの９°ＮゲノムＤＮＡを５０μｌ容量中で切断し、０.３μｇの４重サンプルを１％アガロースゲルに充填し処理した。実施例ＸＩＶ(前述)と同様の手順を用い、移入期間を一夜としてＤＮＡをゲルからニトロセルロース紙に移した。
【０２２９】
４つのＤＮＡプローブを調製し、実施例ＸＩＶに記載したようにニトロセルロース紙にハイブリダイズさせ、洗浄し、前述のようにＸ線フィルムに露光した。
【０２３０】
これらの条件下で、２つのＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＩＶＳプローブは９°Ｎ−７ゲノムＤＮＡに全くハイブリダイズしなかった。これはＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＩＶＳ様領域が存在しないことを示す。しかしながら、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼコーディング領域のアミノ末端及びカルボキシ末端の双方にハイブリダイズし、ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡでは５.５−６.５ｋｂのバンド及びＢａｍＨＩ切断ＤＮＡでは約２０ｋｂのバンドを与えた。
【０２３１】
これらの結果に基づいて、９°Ｎ−７のＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡライブラリーを実施例ＸＩＩＩに記載の手順を以下のごとく修正した方法で構築した。
【０２３２】
ＥｃｏＲＩで部分消化及び完全消化した９°Ｎ−７  ＤＮＡの混合物をλＤＡＳＨのＥｃｏＲＩ部位に結合した。結合混合物を菌株ＢＨＢ２６９０及びＢＨＢ２６８８を用いてＭａｎｉａｔｉｓに記載の方法でパッケージし、大腸菌ＥＲ１４５８株に平板培養した。実施例ＸＩＶに記載のごとく調製したＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓのアミノ末端及びカルボキシ末端のプローブで９°Ｎ−７ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。プローブをＢｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓの方法(Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出)によって調製したニトロセルロースフィルターに、実施例ＸＩＶに記載のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。
【０２３３】
陽性プラークを選択し、実施例ＸＩＩＩに記載のごとく精製した。ファージＤＮＡをこのクローンから単離し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢＲ３２２にクローニングした。４８個のコロニーをＧｒｕｎｓｔｅｉｎの方法(Ｍａｎｉａｔｉｓら)によってニトロセルロースに移し、上述のようにＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端及びカルボキシ末端のプローブでスクリーニングした。１つの陽性クローンは熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現することが知見され、約６.２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいた。ＤＮＡポリメラーゼを含む６.２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＢＲ３２２からｐＵＣ１９に標準方法によってサブクローニングすると、やはり熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すことが判明した。(前述のように)酸不溶性ＤＮＡに取込まれた放射性標識32Ｐ−ｄＣＴＰによってポリメラーゼ活性を測定した。
【０２３４】
実施例ＸＶＩＩＩ
９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の超発現
遺伝子を超発現させるため及び９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ酵素のエキソ突然変異体を構築するために遺伝子の起点周辺及びＤＸＥモチーフ周辺の配列を決定することが必要であった。ＤＩＥアミノ酸配列がＡＩＡに変異すると３'→５'エキソヌクレアーゼ活性が除去される(実施例ＶＩ参照)。
【０２３５】
ＰＣＲによってＥｃｏＲＩフラグメント中のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の位置を検出するために、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼに由来の以下のプライマー、７８３(５'−ＧＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＧＴＴＡＡＧ−３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２６)及び７６８(５'−ＣＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧ−３'(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２７)を、ｐＵＣ１９プライマーＮＥＢ１２２４及びＮＥＢ１２３３と組み合わせた。クローン３３−８中で、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はｐＵＣ１９中のｌａｃプロモーター方向に読み取るように配置され、遺伝子の末端はｐＵＣポリリンカーから約０.９ｋｂを隔てていた。ＮＥＢエキソサイズキットを使用しエキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失によって配列決定用クローンを作製した。ｐＵＣクローン３３−８をＫｐｎＩ／ＡｆｌＩＩまたはＫｐｎＩ／ＮｒｕＩで切断し、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼでエキソサイズマニュアル(ＮＥＢ)に記載のごとく処理した。５つの欠失クローンを検出し、これらのクローンを次にＤＮＡ配列決定に使用した。クローンＥ１Δは約０.６ｋｂ欠失し、クローンＡ１Δは約１.７ｋｂ欠失し、クローンＮ１４Δは２.２ｋｂ欠失し、クローンＣ２Δは２.７ｋｂ欠失し、クローンＮ２０Δは３.０ｋｂ欠失していた。クローンＮ２０Δからの配列データは、遺伝子の起点を示し、クローンＣ２ΔからのデータはＤＩＥモチーフ周辺の配列を与えた。
【０２３６】
開始コドンの周辺のクローンＮ２０Δ配列の部分(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２８):
CCGTATCGGT TTTAGGATTC GTCCAGAGTT GTTTTACGAG GTTATGGGTG
GTGAGTTCTC ATGATTCTCG ATACCGACTA ACATCACCGA GAACGGGAAG
CCCGTGATAA GGGTCTTCAA GAAGGAGAAC GGCGAGTTTA AAATCGGAGT
Ｎ２０Δ配列中のＡＴＧはＤＮＡポリメラーゼの開始コドンを示す。
【０２３７】
ＤＩＥモチーフ周辺のクローンＣ２Δ配列の部分(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２９):
CGCTAACCTC ATCGACAAGG GCCTGATTCC GATGGAGGGC GACGAGGAGC
TTACGATGCT CGCCTTCGAC ATCGAAACG CTCTATCACGA GGGCGAGGAG
TTCGGAACCG GGCCGATTCT CATGATAAGC TACGCCGACG GGAGCGAGGC
Ｃ２Δ配列中のＧＡＣ  ＡＴＣＧＡＡは、ＤＩＥモチーフ(ＧＡＣ−アスパラギン酸、Ｄ、ＡＴＣ−イソロイシン、Ｉ及びＧＡＡ−グルタミン酸、Ｅ)をコードするＤＮＡ配列を表す。
【０２３８】
実施例Ｖに記載のごとく、厳密に調節されたプロモーター、この場合にはＴ７プロモーターに遺伝子を操作可能に結合させることによって９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの発現を増加させた。
【０２３９】
１.３５ｋｂのフラグメントを２つのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
【０２４０】
9°N-7FOR  5'-TGGTGGAAGCTTCATATGATTCTCGATACCG-3'(SEQ ID NO:30)、及び、
9°N-7REV  5'-GCCGGGGGGATCCCTGCAGAACTTGTGTCC-3'(SEQ ID NO:31)
９°Ｎ−７ＦＯＲプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位(ＡＡＧＣＴＴ)、ＮｄｅＩ部(ＣＡＴＡＴＧ)を含み、９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の起点(ＡＴＧＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＣＣＧ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３２)にＮｄｅＩ部位を導入する。９°Ｎ−７ＲＥＶプライマーはＢａｍＨＩ部位(ＧＧＡＴＣＣ)、ＰｓｔＩ部位(ＣＴＧＣＡＧ)及び９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部分(ＴＧＣＡＧＡＡＣＴＴＧＴＧＴＣＣ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３３)を含む。
【０２４１】
Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ(２Ｕ)を、Ｉ×Ｖｅｎｔ緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１００ｎｇのクローン３３−８のプラスミドＤＮＡ及び各１００ｎｇのプライマー９°Ｎ−７ＦＯＲ及び９°Ｎ−７ＲＥＶを１００μｌの総容量中に含む反応ミックスに添加した。反応条件としては、９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間及び７２℃で２分間を１５サイクル行った。１.３５ｋｂのバンドを単離し、標準方法でゲル精製した。ＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＬＩＴＭＵＳ３８(ＮＥＢ)をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ゲル精製した。精製したフラグメントを結合し、ＲＲＩを形質転換した。制限消化分析によって１６／１８のクローンが正しいインサートを含むことが判明した。ｐＬＩＴＭＵＳ３８／９°Ｎ−７クローン４を下記のごときサブクローニングに使用した。
【０２４２】
９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を３方向結合によってＴ７ベクターｐＡＩＩ１７にクローニングした。ｐＬＩＴＭＵＳ３８／９°Ｎクローン４をＮｄｅＩ／ＳｔｕＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５'末端を含む約０.９ｋｂのフラグメントを得た。ｐＥ１ΔをＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩによって切断して、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３'末端を含む約１.７ｋｂのフラグメントを得た。ｐＡＩＩ１７をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩによって切断して約６.２ｋｂのフラグメントを得た。３つのフラグメント全部をゲル精製し、結合した。親クローンのバックグラウンドを低減するために、結合反応物をＮｈｅＩ／ＨｉｎＩＩＩで切断し、ＲＲＩを形質転換した。コロニーＰＣＲ及び制限消化によってスクリーニングすると１／２４のクローンが正しいことが判明した。ｐＡＩＩ１７／９°Ｎ−７クローン３０(ＮＥＢ９１５)を誘導すると、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性及び３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を示すことが判明した。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実施例ＸＩＸと同様に試験した。
【０２４３】
実施例ＸＸＩに記載の手順で酵素を精製した。
【０２４４】
実施例ＸＩＸ
調節された３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの産生
実施例ＶＩの手順を以下のように修正して３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を除去した。
【０２４５】
ＤＩＥモチーフを突然変異させるために３０ｂｐのオリゴヌクレオチド:
9°N-7MUT1 5'CTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCAC-3'(SEQ UD NO:34)
を使用した。オリゴヌクレオチドは、(アミノ酸ＤＩＥをコードする)野生型ＤＮＡ配列のＧＡＣＡＴＣＧＡＡを(アミノ酸ＡＩＡをコードする)ＤＮＡ配列ＧＣＧＡＴＣＧＣＡに変異させるＰｖｕＩ部位(ＣＧＡＴＣＧ)を変異領域(実施例ＶＩ参照)に取込む。
【０２４６】
Ｋｕｎｋｅｌの方法(Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.８２:４８８(１９８５)及びＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,１５４:３６７(１９８７))によって部位特異的突然変異誘発を行った。プラスミドｐＬＩＴＭＵＳ３８／９°Ｎで菌株ＣＪ２３６を形質転換し、ｓｓＤＮＡを調製した。２００ｎｇの上記オリゴヌクレオチド、９°Ｎ−７ＭＵＴ１を、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液(ＮＥＢ)及び１ｍＭのＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(１０Ｕ)でリン酸化した。反応混合物を３７℃で４５分間インキュベートし、６５℃で１０分間不活性化した。５０ｎｇのリン酸化したオリゴヌクレオチド９°Ｎ−７ＭＵＴ１を、２０ｍＭのＴｒｉｓ.Ｃｌ(ｐＨ７.５)、２０ｍＭのＭｇＣｌ2及び５０ｍＭのＮａＣｌ中で、５００ｎｇのｐＬＩＴＭＵＳ３８／９°Ｎ  ｓｓＤＮＡにアニーリングした。反応混合物を８５℃に加熱し、室温まで徐冷した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、１×Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液(ＮＥＢ)、０.５ｍＭのＡＴＰ、０.５ｍＭのｄＮＴＰミックス(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む)及び４００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む反応混合物中で３ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって延長した。混合物を０℃で１０分間、室温で１０分間次いで３７℃で２.５時間インキュベートし、１μｌでＲＲ１を形質転換した。制限消化分析によって４／９クローンが正しく突然変異した配列を含むことが判明した。ｐＬＩＴＭＵＳ３８／９°Ｎ−７ＭＵＴ１(ｅｘｏ-)クローン１を、更にＤＮＡ配列決定によって確認した。突然変異したＮｄｅＩ／ＳｔｕＩフラグメントを、上記の３方向結合によってｐＡＩＩ１７にクローニングした。コロニーＰＣＲ分析(Ｇｕｓｓｏｗａｎｄ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ,  ＮＡＲ１７,  ｐ４０００、前出)によって１４／２４が正しいクローンであることを同定した。ｐＡＩＩ１７／９°Ｎ−７ＭＵＴ１(ｅｘｏ-)クローン２(ＮＥＢ９１７)は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが検出可能な３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有していないことが判明した。
【０２４７】
２つのアミノ酸の一方だけ即ちアスパラギン酸(Ｄ)もしくはグルタミン酸(Ｅ)を突然変異させるか、またはより保存性の置換を生じさせることによって、(ＤＩＥからＡＩＡへの突然変異のように)エキソヌクレアーゼ活性を除去するのでなく、調節することが可能であるかもしれない。このために、各々に１つの制限部位が導入された５つの新しいオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２４８】
0004004078.tif 000009
９°Ｎ−７ＭＵＴ２及び９°Ｎ−７ＭＵＴ３ではアスパラギン酸(Ｄ)がアラニン(Ａ)またはグルタミン酸(Ｅ)に変異し、９°Ｎ−７ＭＵＴ５及び９°Ｎ−７ＭＵＴ６ではグルタミン酸がアスパラギン酸またはアラニンに変異し、９°Ｎ−７ＭＵＴ４ではアスパラギン酸がグルタミン酸に変異しかつグルタミン酸がアスパラギン酸に変異している。
【０２４９】
各突然変異体の構築に使用した方法は、９°Ｎ−７ＭＵＴ１(ｅｘｏ-)突然変異体の構築に関して前述した方法である。突然変異した配列をｐＡＩＩ１７にサブクローニングする方法も前述した。
【０２５０】
全部の構築物の相対的エキソヌクレアーゼ活性を実施例ＶＩに記載の手順に以下の修正を加えた手順で検定した。全部の試験抽出物を３ｍｌの誘導培養物から調製した。サンプルをペレット化し、５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ.Ｃｌ、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００μｇ／ｍｌのリゾチームに再懸濁させ、室温で１０分間次いで３７℃で１０分間インキュベートし、７２℃で２０分間熱処理した。変性したタンパク質をペレット化し、部分精製されたＤＮＡポリメラーゼを含む透明な溶菌液の３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を検定した。１０μｌの各サンプルを、２０ｍＭのＴｒｉｓ.Ｃｌ(ｐＨ８.８)、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの(ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭのＭｎＣｌ2、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び3Ｈ標識大腸菌ＤＮＡ基質(２００,０００ｃｐｍ／μｇ、２５μｇ／ｍｌ)を含む２９０μｌの反応ミックスに添加した。基質は、二重鎖または一本鎖の3Ｈ標識大腸菌ＤＮＡであった。サンプルを７２℃に加熱し、０、１.５、３及び１８時間後に、５０μｌのアリコートを採取した。各アリコートを、１００μｌの２ｍｇ／ｍｌの超音波処理したニシン精子ＤＮＡ及び１５０μｌの２０％ＴＣＡと混合した。ＴＣＡ沈殿後、１５０μｌをシンチレーション液と混合し、ＴＣＡ可溶性放射能をカウントした。結果を図２０に示す。
【０２５１】
５つの突然変異体のうち、唯１つだけが１％を上回る３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を示し、残りの４つは検出可能な活性を有していなかった。ｐＡＩＩ１７／９°Ｎ−ＭＵＴ５(ＮＥＢ９１６)(ＤＩＥがＤＩＤに変異したアミノ酸配列)は、野生型３'−５'エキソヌクレアーゼ活性のほぼ５％を示した(図２０)。
【０２５２】
実施例ＸＸ
５つの追加単離菌からのＤＮＡポリメラーゼのクローニング
更に５つの熱安定ＤＮＡポリメラーゼを海底熱水孔の超好熱菌、即ちＭＡＲ−１３(Ｃａｖａｎａｕｇｈら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ.  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,  ５８(１２):３７９９−３８０３(１９９２))、７Ｃ、ＧＢ−Ｃ、ＧＩ−Ｈ及びＧＩ−Ｊ(Ｈｏｌｇｅｒ  Ｊａｎａｓｃｈ,  ＷＨＯＩから得られた単離菌)からクローニングした。５つのポリメラーゼ全部が、サザンブロット分析によってＴ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端及びカルボシ末端のプローブにハイブリダイズすることが判明した。ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ消化を使用してこれらの単離菌からのＤＮＡポリメラーゼをλＤＡＳＨファージにクローニングし、前述のようにスクリーニングした。陽性ファージをプラーク精製し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。５つのクローンのうちの４つ(ＭＡＲ−１３、ＧＢ−Ｃ、ＧＩ−Ｈ及びＧＩ−Ｊ)で熱安定ポリメラーゼ活性が観察された。クローンｐＵＣ１９／７Ｃは、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡのアミノ末端及びカルボキシ末端のプローブに対するハイブリダイゼーションによって確認されたが、大腸菌宿主の増殖は極めて少なかった。
【０２５３】
実施例ＸＸＩ
組換え９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの精製
１００リットルの発酵槽を用い、１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母抽出物、５ｇ／リットルのＮａＣｌ及び１００ｍｇ／リットルのアンピシリンを含む培地中で３７℃で大腸菌ＮＥＢ９１５(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.７５８１８)を増殖させ、中期対数増殖期に０.３ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、一夜インキュベートした。細胞を遠心によって採集し、−７０℃で保存した。
【０２５４】
４３２ｇの細胞を解凍し、緩衝液Ａ(７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＰＯ4(ｐＨ６.８)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び１０％のグリセロール)に総容量１７００ｍｌに懸濁させた。細胞をＧａｕｌｉｎホモジナイザーに多数回通して溶菌した。粗抽出物を遠心によって清澄化した。清澄化した粗抽出物の容量を上記緩衝液で１６００ｍｌに調整し、７５℃で５分間加熱した。粒状物質を遠心によって除去すると、残りの上清は約４２００ｍｇの可溶性タンパク質を含んでいた。
【０２５５】
上清を、ホスホセルロースカラム(５×１０.５ｃｍ;ベッドボリューム２０６ｍｌ)に直列に接続したＤＥＡＥ−セファロースカラム(５×８.５ｃｍ;ベッドボリューム１７０ｍｌ)に導入した。ＤＥＡＥ−セファロースを素通りした酵素の大部分を含む分画を直ちにホスホセルロースカラムに導入した。双方のカラムを緩衝液Ａで洗浄し、２つのカラムを分離し、ホスホセルロースカラムのタンパク質を、２リットルの０.０７５Ｍ−０.８Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ａ中に形成)で溶出させた。
【０２５６】
カラム分画のＤＮＡポリメラーゼ活性を検定した。簡単に説明すると、１μｌの分画を、３０μＭの各ｄＮＴＰと、3Ｈ標識ＴＴＰと、０.２ｍｇ／ｍｌの活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡとを含む５０μｌの１×Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液(１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(２４℃でｐＨ８.８)、１０ｍＭの(ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ4及び０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)中で３７℃で２分間インキュベートした。混合物をＷｈａｔｍａｎ  ３ｍｍフィルターで処理し、フィルターを１０％のＴＣＡで３回、次いで低温イソプロパノールで２回洗浄した。フィルターの乾燥後、ＤＮＡに取込まれた3Ｈ−ＴＴＰを表す結合放射能を測定した。活性分画をプールし、上記アッセイ条件のｄＮＴＰレベルを各ｄＮＴＰを２００μＭに上げるように修正して各プール中の酵素活性レベルを評価した。これらの条件下に７５℃で３０分間に１０ナノモルのｄＮＴＰを酸不溶性物質に取込ませる酵素の量を、１単位の酵素活性と定義した。
【０２５７】
１３５０ｍｇのタンパク質を含む容量４００ｍｌの活性分画を、緩衝液Ｂ(１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び１０％のグリセロール)に透析し、緩衝液Ｂで平衡させたＤＥＡＥ−セファロースカラム(２.５×８ｃｍ;ベッドボリューム３９ｍｌ)に導入した。タンパク質は通過分画中に存在していた。この一回限りのクロマトグラフィー処理段階を４℃でなく室温(２５℃)で行った。この段階は夾雑ＤＮＡを最大限除去するために行った。１２００ｍｇのタンパク質を含む容量６４０ｍｌの通過プールを、ヘパリン−セファロースカラム(２.５×１１ｃｍ;ベッドボリューム５４ｍｌ)に導入し、２０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。５４０ｍｌの１００ｍＭ−８００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配(緩衝液Ｂ中に形成)でカラムを処理した。４００ｍｇのタンパク質を含む容量７０ｍｌの活性分画をプールし、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ｍＭのＤＴＴ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び５０％のグリセロールを含む保存用緩衝液に透析した。
【０２５８】
上述のごとく得られた９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの比活性は、仔ウシ胸腺ＤＮＡ基質に対しては５５００単位／ｍｇ、プライムしたＭ１３基質に対しては３９,０００単位／ｍｇであった。
【０２５９】
【配列表】
(2)配列情報SEQ ID NO:1:
(i)配列特性:
(A)長さ:5837塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:二重鎖
(D)形態:無意味
(xi)配列記述:SEQ ID NO:1:
【０２６０】
【表４】
0004004078.tif 000010
【０２６１】
【表５】
0004004078.tif 000011
【０２６２】
【表６】
0004004078.tif 000012
【０２６３】
【表７】
0004004078.tif 000013
(2)配列情報SEQ ID NO:2:
(i)配列特性:
(A)長さ:64塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:2:
CGAAAAGAAA ATGCTCGATT ATAGGCAAAG GGCTATTAAA TTGCTTGCAA ACAGCATCTT    60
ACCC                                                                 64
(2)配列情報SEQ ID NO:3:
(i)配列特性:
(A)長さ:41塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:3:
TATGCTCACA ACAGCTATTA CGGCTATATG GGGTATCCTA A  41
(2)配列情報SEQ ID NO:4:
(i)配列特性:
(A)長さ:78塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:4:
CGAAAAGAAA ATGCTCGATT ATAGGCAAAG GGCTATTAAA TTGCTAGCAA ACAGCTATTA  60
CGGCTATATG GGGTACCC                                                78
(2)配列情報SEQ ID NO:5:
(i)配列特性:
(A)長さ:83塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:5:
ATCGAAAAGA AAATGCTCGA TTATAGGCAA AGGGCTATTA AATTGCTAGC AAACAGCTAT  60
TACGGCTATA TGGGGTACCC TAA                                          83
(2)配列情報SEQ ID NO:6:
(i)配列特性:
(A)長さ:3240塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:二重鎖
(D)形態:無意味
(xi)配列記述:SEQ ID NO:6:
【０２６４】
【表８】
0004004078.tif 000014
【０２６５】
【表９】
0004004078.tif 000015
【０２６６】
【表１０】
0004004078.tif 000016
(2)配列情報SEQ ID NO:7:
(i)配列特性:
(A)長さ:1019アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:ペプチド
(xi)配列記述:SEQ ID NO:7:
【０２６７】
【表１１】
0004004078.tif 000017
【０２６８】
【表１２】
0004004078.tif 000018
【０２６９】
【表１３】
0004004078.tif 000019
【０２７０】
【表１４】
0004004078.tif 000020
(2)配列情報SEQ ID NO:8:
(i)配列特性:
(A)長さ:1022アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:8:
【０２７１】
【表１５】
0004004078.tif 000021
【０２７２】
【表１６】
0004004078.tif 000022
【０２７３】
【表１７】
0004004078.tif 000023
【０２７４】
【表１８】
0004004078.tif 000024
【０２７５】
【表１９】
0004004078.tif 000025
(2)配列情報SEQ ID NO:9:
(i)配列特性:
(A)長さ:24塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:9:
CCAGCAAGGC CGATAGTTTG AGTT  24
(2)配列情報SEQ ID NO:10:
(i)配列特性:
(A)長さ:24塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:10:
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC  24
(2)配列情報SEQ ID NO:11:
(i)配列特性:
(A)長さ:28塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:11:
TTGGTTATGC CGGTACTGCC GGCCTCTT  28
(2)配列情報SEQ ID NO:12:
(i)配列特性:
(A)長さ:28塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:二重鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:12:
TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAG  28
(2)配列情報SEQ ID NO:13:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:二重鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:13:
GGTTCTTTAT GCGGACAYGA CGGCTTTATG  30
(2)配列情報SEQ ID NO:14:
(i)配列特性:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:14:
Tyr Gly Asp Thr Asp Ser
1               5
(2)配列情報SEQ ID NO:15:
(i)配列特性:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:15:
Tyr Ala Asp Ser Val Ser
1               5
(2)配列情報SEQ ID NO:16:
(i)配列特性:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:16:
Val His Asn Thr Asp Gly
1               5
(2)配列情報SEQ ID NO:17:
(i)配列特性:
(A)長さ:6アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:17:
Tyr Ala Asp Thr Asp Gly
1               5
(2)配列情報SEQ ID NO:18:
(i)配列特性:
(A)長さ:7アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:18:
Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp
1               5
(2)配列情報SEQ ID NO:19:
(i)配列特性:
(A)長さ:12塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:19:
TTTAAGGTTC TT               12
(2)配列情報SEQ ID NO:20:
(i)配列特性:
(A)長さ:12塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:20:
TTTAAAGTAC TT               12
(2)配列情報SEQ ID NO:21:
(i)配列特性:
(A)長さ:6塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:21:
AGTACT                      6
(2)配列情報SEQ ID NO:22:
(i)配列特性:
(A)長さ:32塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:22:
ATAAAGTACT TTAAAGCCGA ACTTTTCCTC TA  32
(2)配列情報SEQ ID NO:23:
(i)配列特性:
(A)長さ:29塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:23:
CGGCGCATAT GATACTGGAC ACTGATTAC      29
(2)配列情報SEQ ID NO:24:
(i)配列特性:
(A)長さ:24塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:24:
GAGACTCGCG GAGAAACTTG GACT           24
(2)配列情報SEQ ID NO:25:
(i)配列特性:
(A)長さ:39塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:25:
TACAGTACTT TATGCGGACA CTGACGGCTT TTATGCCAC  39
(2)配列情報SEQ ID NO:26:
(i)配列特性:
(A)長さ:18塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:26:
GCTGGGGGAT ACGTTAAG                         18
(2)配列情報SEQ ID NO:27:
(i)配列特性:
(A)長さ:19塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:27:
CGGCTTACCA TCCTCGGTG                        19
(2)配列情報SEQ ID NO:28:
(i)配列特性:
(A)長さ:150塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:28:
CCGTATCGGT TTTAGGATTC GTCCAGAGTT GTTTTACGAG GTTATGGGTG GTGAGTTCTC   60
ATGATTCTCG ATACCGACTA ACATCACCGA GAACGGGAAG CCCGTGATAA GGGTCTTCAA  120
GAAGGAGAAC GGCGAGTTTA AAATCGGAGT                                   150
(2)配列情報SEQ ID NO:29:
(i)配列特性:
(A)長さ:150塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:29:
CGCTAACCTC ATCGACAAGG GCCTGATTCC GATGGAGGGC GACGAGGAGC TTACGATGCT   60
CGCCTTCGAC ATCGAAACGC TCTATCACGA GGGCGAGGAG TTCGGAACCG GGCCGATTCT  120
CATGATAAGC TACGCCGACG GGAGCGAGGC                                   150
(2)配列情報SEQ ID NO:30:
(i)配列特性:
(A)長さ:31塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:30:
TGGTGGAAGC TTCATATGAT TCTCGATACC G  31
(2)配列情報SEQ ID NO:31:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:31:
GCCGGGGGGA TCCCTGCAGA ACTTGTGTCC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:32:
(i)配列特性:
(A)長さ:16塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:32:
ATGATTCTCG ATACCG                   16
(2)配列情報SEQ ID NO:33:
(i)配列特性:
(A)長さ:16塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:33:
TGCAGAACTT GTGTCC                   16
(2)配列情報SEQ ID NO:34:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:34:
CTCGCCTTCG CGATCGCAAC GCTCTATCAC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:35:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:35:
CTCGCCTTCG CGATCGAAAC GCTCTATCAC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:36:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:36:
CTCGCCTTCG AAATCGAAAC GCTCTATCAC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:37:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:37:
CTCGCCTTCG AAATCGACAC GCTCTATCAC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:38:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:38:
TTCGACATCG ACACGTTGTA TCACGAGGGC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:39:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列記述:SEQ ID NO:39:
TTCGACATCG CAACGTTGTA TCACGAGGGC    30
(2)配列情報SEQ ID NO:40:
(i)配列特性:
(A)長さ:14アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称/キー:タンパク質
(B)位置:10
(C)その他の情報:/注＝“X＝任意アミノ酸”
(xi)配列記述:SEQ ID NO:40:
Asp Gln Ala Lys Asn Ser Tyr Gly Gly Xaa Ala Thr Gly Arg
1               5                   10
(2)配列情報SEQ ID NO:41:
(i)配列特性:
(A)長さ:18アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(xi)配列記述:SEQ ID NO:41:
Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Ile Leu Pro
1               5                   10                  15
Asn Glu
(2)配列情報SEQ ID NO:42:
(i)配列特性:
(A)長さ:23アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
(C)鎖:未確認
(D)形態:未確認
(ii)分子の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称/キー:タンパク質
(B)位置:14
(C)その他の情報:/注＝“X＝任意アミノ酸”
(xi)配列記述:SEQ ID NO:42:
0004004078.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】実施例１のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図１Ｂ】図１Ａのゲルのレーン２から溶出したタンパク質のポリメラーゼ活性及びエキソヌクレアーゼ活性を示すグラフである。
【図２】バクテリオファージＮＥＢ６１９のＢａｍＨＩフラグメントに完全に内包されたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＸｂａフラグメントの制限部位マップである。
【図３Ａ】天然型Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡの半減期を示すグラフである。
【図３Ｂ】組換え型Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡの半減期を示すグラフである。
【図４】デオキシヌクレオチドの存在または非存在に対するＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ及びクレノウフラグメントの応答を示すグラフである。
【図５】天然型ＤＮＡ（ＮＥＢ６１９のＢａｍＨＩフラグメント）及び大腸菌ＮＥＢ６７１及びＮＥＢ６８７中のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の編制を示す制限部位マップである。
【図６−１】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの部分を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントの部分的ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。
【図６−２】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの部分を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントの部分的ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図６−１につづく配列）である。
【図６−３】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの部分を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントの部分的ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図６−２につづく配列）である。
【図６−４】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの部分を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントの部分的ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図６−３につづく配列）である。
【図６−５】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの部分を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントの部分的ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図６−４につづく配列）である。
【図７】ＤＮＡポリメラーゼコンセンサス相同領域ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）中のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）とＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ相同アイランドＩＩＩのアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）との比較である。
【図８】ベクターｐＰＲ９６９の概略図である。
【図９】ベクターｐＣＡＳ４の概略図である。
【図１０】ベクターＶ１７４−１Ｂ１の概略図である。
【図１１】実施例ＶＩで構築されたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体が検出可能な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないことを示すグラフである。
【図１２】実施例ＩＩＩで使用したプライマーのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）である。
【図１３Ａ】ＥｃｏＲＩ（レーン３）、ＢａｍＨＩ（レーン４）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン５）で切断したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲルの電気泳動の写真を示し、レーン１はマーカーとして用いたＨｉｎｄＩＩＩ切断ＧＤＮＡ、レーン２はマーカーとして用いたｐＢＲ３２２を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａと同じゲルのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーを示す電気泳動の写真である。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端部分をコードする１．３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントから３２Ｐ−ＤＮＡプローブを調製した。ＢａｍＨＩ切断したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡがプローブによって約４−５Ｋｄの単一バンドを与えることに注目されたい。ＨｉｎｄＩＩＩ切断したＧＤＮＡの２３Ｋｄバンドがフィルム上で検出される理由は、該バンド中に存在する大量のＤＮＡに非特異的ハイブリダイゼーションが生じたためである。プラスミドｐＢＲ３２２が検出される理由はプローブ中に相同な配列が存在するためである。
【図１４】大腸菌２２０７（ＮＥＢ＃７２０）のＰＵＣ１９プラスミド中にＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼを含む遺伝子を包含する４．８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントの制限部位マップである。
【図１５】別の標的古細菌に対するＤＮＡの類似性を分析するために使用されたＶＥＮＴポリメラーゼプローブを示す。
【図１６Ａ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示すがＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示さない実施例ＸＩＶに記載のサザンブロットのオートラジオグラフである電気泳動の写真を示す。
【図１６Ｂ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示すがＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示さない実施例ＸＩＶに記載のサザンブロットのオートラジオグラフである電気泳動の写真を示す。
【図１６Ｃ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示すがＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示さない実施例ＸＩＶに記載のサザンブロットのオートラジオグラフである電気泳動の写真を示す。
【図１６Ｄ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示すがＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡに対してはプローブのハイブリダイゼーションを示さない実施例ＸＩＶに記載のサザンブロットのオートラジオグラフである電気泳動の写真を示す。
【図１７】Ａはアフィニティ精製抗−Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体と反応させた場合、Ｂは抗−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体と反応させた場合のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｖ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｇ−Ｉ−Ｊ（Ｊ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｇ−Ｉ−Ｈ（Ｈ）の粗溶解物、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．  ＧＢ−Ｄ（ＤＶ）、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔ）または大腸菌（Ｅ）の精製ポリメラーゼのウエスタンブロットを示す電気泳動の写真である。Ｍはマーカータンパク質を示す。矢印はＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼタンパク質の位置を示す。Ｂの反応性はバックグラウンドタンパク質に対する値であって、Ａで観察されたＤＮＡポリメラーゼに対する値ではない。
【図１８Ａ】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の部分ＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。
【図１８Ｂ】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の部分ＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（図１８Ａにつづく配列）である。
【図１９Ａ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に対するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の比較である。
【図１９Ｂ】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に対するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡポリメラーゼの推定アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（図１９Ａにつづく配列）の比較である。
【図２０】９°ＮのＤＸＥ野生型ＤＮＡポリメラーゼに対するＤＸＤ変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の減少を示すグラフである。グラフはまた、ＤＸＥモチーフの他の５つの変異体中に検出可能な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が全く存在しないことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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