(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含むことを特徴とする、相互に相補的であって、一緒に２本鎖ＤＮＡ分子の別の鎖を形成する、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を増幅させる方法：
（１）第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を含むサンプルを用意する；
（２）第１のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第１のライゲーション結合において第１のヌクレオチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第１のオリゴヌクレオチドセットであって、第１のオリゴヌクレオチドセットの当該少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは第１のヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイゼーションし、かつ約５０〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有するものを用意する；
（３）第２のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第２のライゲーション結合において第２のヌクレオチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第２のオリゴヌクレオチドセットであって、第２のオリゴヌクレオチドセットの当該少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは第２のヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイゼーションし、かつ約５０〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有するものを用意する；
（４）約５０〜１０５℃の範囲の温度において、非可逆的に変性することなく、かつその触媒活性を失うことがなく、平滑末端に比べて３’単一塩基突出末端を低い効率で連結する熱安定性リガーゼを用意する；
（５）上記したサンプル、第１のセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、第２のセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチド及び熱安定性リガーゼをブレンドして、増幅混合物を形成させる；
（６）上記増幅混合物を、
（ａ）ライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドセットが第１のヌクレオチド配列から分離され、ライゲーションされた第２のオリゴヌクレオチドセットが第２のヌクレオチド配列から分離される変性処理、及び
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドセットが第１のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、そのオリゴヌクレオチドが互いにライゲーションする一方、第２のオリゴヌクレオチドセットが第２のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、そのオリゴヌクレオチドが互いにライゲーションする、５０〜８５℃の温度における熱ハイブリダイゼーション処理
を含む一連のサイクルに付することにより、ＤＮＡにおける第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を指数的に増幅させる；
ただし、第２のヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに対して相補的であって、当該第１のオリゴヌクレオチドセットからのオリゴヌクレオチドは、当該第２のオリゴヌクレオチドセットからの３’単一塩基突出部(single base overhang)を有するオリゴヌクレオチドと相補的である。
【請求項２】
次の工程を含むことを特徴とする、相互に相補的であり、かつ一緒に２本鎖ＤＮＡ分子の別の鎖を形成するヌクレオチド配列を、当該相補的ヌクレオチド配列の遺伝子的欠陥を有する１つの２本鎖ＤＮＡ分子と正規形を有する他の１つの２本鎖ＤＮＡ分子と共に増幅させる方法：
（１）遺伝子的欠陥を有するヌクレオチド配列を持った２本鎖ＤＮＡ分子と、当該ヌクレオチド配列の正規形を有する２本鎖ＤＮＡ分子を潜在的に含むサンプルを用意する；
（２）第１のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第１のライゲーション結合において正規形のヌクレオチド配列に対してではなく、遺伝子的欠陥を持ったヌクレオチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第１のオリゴヌクレオチドセットであって、第１セットのオリゴヌクレオチドは遺伝子的欠陥を持ったヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイゼーションし、約５０〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有するものを用意する；
（３）第２のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第２のライゲーション結合において遺伝子的欠陥を持ったヌクレオチド配列に対してではなく、正規形のヌクレオチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第２のオリゴヌクレオチドセットであって、第２セットのオリゴヌクレオチドは正規形のヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイゼーションし、約５０〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有するものを用意する；
（４）第３のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第３のライゲーション結合において第３のヌクレトチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第３のオリゴヌクレオチドセットであって、当該第３のヌクレオチド配列は第１のヌクレオチド配列に相補的であって、欠陥ＤＮＡ分子の第２の鎖中に存在するものを用意する；
（５）第４のライゲーション結合において一緒にライゲーションするに適しており、かつ第４のライゲーション結合において第４のヌクレトチド配列に対してミスマッチなしにハイブリダイゼーションするのに適した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成る第４のオリゴヌクレオチドセットであって、当該第４のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に相補的であって、正規形ＤＮＡ分子の第２の鎖中に存在するものを用意する；
（６）約５０〜１０５℃の範囲の温度において、非可逆的に変性することなく、かつその触媒活性を失うことがなく、平滑末端に比べて３’単一塩基突出末端を低い効率で連結する熱安定性リガーゼを用意する；
（７）上記したサンプル、第１セットのオリゴヌクレオチド、第３セットのオリゴヌクレオチド及び熱安定性リガーゼをブレンドして、第１の増幅混合物を形成させる；
（８）上記したサンプル、第２セットのオリゴヌクレオチド、第４セットのオリゴヌクレオチド及び熱安定性リガーゼをブレンドして、第２の増幅混合物を形成させる；
（９）上記第１の増幅混合物と第２の増幅混合物を、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットと第３のオリゴヌクレオチドセットがそれぞれ遺伝子的欠陥を持ったヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列から分離され、第２のオリゴヌクレオチドセットと第４のオリゴヌクレオチドセットがそれぞれ正規形のヌクレオチド配列と第４のヌクレオチド配列から分離される変性処理、及び
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドセットが遺伝子的欠陥を持ったヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、第２のオリゴヌクレオチドセットが正規形のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、第３のオリゴヌクレオチドセットが第３のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、第４のオリゴヌクレオチドセットが第４のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする一方、各セットのオリゴヌクレオチドは互いにライゲーションする、５０〜８５℃の温度における熱ハイブリダイゼーション処理
を含む、一連のサイクルに付することにより、第１の配列、第２の配列、第３の配列及び第４の配列を指数的に増幅させる；
ただし、第３のオリゴヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに対して相補的であって、当該第１のオリゴヌクレオチドセットからのオリゴヌクレオチドは、当該第３のオリゴヌクレオチドセットからの３’単一塩基突出部を有するオリゴヌクレオチドと相補的であり、第４のオリゴヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドセットの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに対して相補的であって、当該第２のオリゴヌクレオチドセットからのオリゴヌクレオチドは、当該第４のオリゴヌクレオチドセットからの３’単一塩基突出部を有するオリゴヌクレオチドと相補的である。
【発明の詳細な説明】
２０００以上の疾患が、子孫に影響を生じるリスクが数学的に予測できる遺伝子の一カ所だけの欠損として確認された。ヒトにおけるこれらの疾患には、ハンチントン舞踏病、膵膿疱性繊維症、α1−アンチトリプシン欠乏症、筋ジストロフィー、ハンター症候群、レッシュ・ナイハン症候群、ダウン症候群、テイ・サックス症、血友病、フェニルケトン尿症、サラセミア、および鎌状赤血球貧血等が含まれる。
これらの核酸塩基対の１カ所だけの変化、欠失、挿入、転位、またはその他の突然変異を直接検出するため、３種の重要な技術が最近開発された。しかしこれらの技術のうちの２つは自動化が容易にできなかった。そのような技術の第１は、患者の臨床試料に変異が存在し、または存在しないことを、サザン・ブロットを用いる患者のＤＮＡの制限消化の分析によって検出する方法である［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）参照］。しかしサザン・ブロット手法は、例えばα1−アンチトリプシン欠乏症のように、変異が制限部位を変化させない遺伝病には使用できない。第２の手法は、変異部位をとり巻く正常な配列と相補的な約１９塩基対のオリゴヌクレオチドの合成を含んだＤＮＡプローブの使用による方法である。プローブを標識し、プローブが正常な遺伝子へは安定にハイブリッド形成するが、塩基対の１カ所だけのミスマッチをもつ変異遺伝子へはハイブリッド形成しない水準でハイブリダイゼーションの緊縮を起こすことによって、変異遺伝子から正常遺伝子を区別するのに使用する［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、２７８頁（１９８３年）参照］。最初の方法は、さらにオリゴヌクレオチドを固定化し、標識したＰＣＲ増幅試料でプローブすることによって修飾された。この修飾では、固定化したオリゴヌクレオチドへ試料をハイブリッド形成し、ついで上述のようなハイブリダイゼーションの緊縮を起こすことによってこれを洗い落とす［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、６２３０頁（１９８９年）参照］。また蛍光ＰＣＲプライマーを使用して１カ所だけの変異または対立遺伝子を特異的に増幅する別の方法が開発された［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、９１７８頁（１９８９年）参照］。この方法では生産物をスピンカラムまたはゲル電気泳動によって、プライマーから分離する必要があり、したがって大規模な自動化へ移すことができない。第３の手法は、試料核酸が正確な標的配列を含んでいる場合だけ、診断プローブが、隣接プローブへの共有結合を実質上維持する条件下で、診断プローブおよび隣接プローブの両者の存在を利用する方法である。さらに診断オリゴヌクレオチドプローブは、手法の効率を増大する手段として（例えばストレプトアビジンによって）捕獲される「フック」（例えばビオチン化したオリゴヌクレオチド）を含み、隣接プローブは検出し得る部分または標識を含み得る［サイエンス、２４１巻、１０７７頁（１９８８年）、および米国特許第４８８３７５０号参照］。
必ずしも常に必要とは限らないが、ＤＮＡ中の１カ所だけの塩基対変異を検出するには、普通、ＤＮＡ試料物質量を増加（即ち、増幅）する技術が役立つ。核酸の増幅を実施する多くの技術がある。とりわけ、（１）Ｔａｑポリメラーゼを使用して、温度循環装置で２０〜３０反応サイクルを実施し、およそ数時間で１個のコピーからＤＮＡを１００万倍に増幅することができるポリメラーゼ連鎖反応［サイエンス、２３９巻、４８７頁（１９８８年）、および米国特許第４６８３１９５号、同第４６８３２０２号、同第４８００１５９号参照］、（２）自立的配列複製または３ＳＲは、３７℃の等温条件下で逆転写酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨを使用して、１時間を超えない時間で、１個のコピーからＤＮＡまたはＲＮＡを１０００万倍に増幅することができる［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）］、（３）Ｑβレプリカーゼは特別な３００ｂｐの認識配列を含んだ数千のＲＮＡ分子を３０分間で１０億倍に複製することができる。それ以外の技術も利用でき、その一つとして、この発明でクローン化した好熱性リガーゼによるリガーゼ連鎖反応を以下に説明する。
この発明を利用して診断し得る各種の疾患に加え、臨床試料中の原因微生物の特異的なＤＮＡ配列特性の存在によって、多くの感染疾患を診断することができる。これらは細菌、ウイルス、および寄生虫等である。そのような方法では、感染患者から得られる試料中に比較的少数の病原微生物が存在し得るが、これらの微生物から抽出したＤＮＡは、試料中の全ＤＮＡのごく小部分を構成するに過ぎない。しかし疑わしい病原菌に特異的な配列を固定化し検出する前に、ＤＮＡ試料のハイブリダイゼーションによって特異的に増幅することは、在来の方法の感度および特異性を著しく改善するはずである。しかもそのような分析が、本来、感度の低い非放射性検出手法を用いて少量の試料で実施しなければならない場合、または放射性手法を採用するが、迅速な検出が望ましい場合、増幅は特に有用である。
このような手法を利用し得るが、１ケ所だけの塩基対の突然変異を検出するには他の技術の探索が続けられる。サーマス・アクアチカスに由来する好熱性ＤＮＡリガーゼを利用するリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって標的ＤＮＡ配列を検出するＤＮＡ増幅および／または検出であるこの発明は、継続しつつある労作の一部である。
ＤＮＡ増幅のためにエシェリキア・コリまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼを利用する他の技術も試みられたが、これらは、この発明のリガーゼ連鎖反応では起こり得ない条件である高水準のバックグラウンド「ノイズ」（１０サイクルに達するまでに）のため、許容し得ないことが判明した．
またＤＮＡ増幅および／または検出に特異的なリガーゼの利用が試みられた。例えば７５サイクルを用い、各サイクル毎に使用したＴ４ ＤＮＡリガーゼをさらに補給し、５０００００コピーで出発して９５時間でＤＮＡを増幅できるリガーゼ増幅反応が報告された［ジーン、７６巻、２４５頁（１９８９年）参照］。しかしこの報告の技術は緩慢であり、各段階のあとでＴ４リガーゼの追加を要するので、この両者の必要性は、報告された技術の自動化を受け入れ難くする。この発明のリガーゼ連鎖反応は、３０サイクルを用いて２００コピーから３時間でＤＮＡの増幅ができ、各サイクルのあとでリガーゼの追加を必要としない。
以下のこの発明の説明を通じて、この技術分野の特別な術語を使用する。説明する内容に関して誤解を避けるため、また説明した内容に関して明瞭な理解を提供するため、以下の定義を用いる。
「増幅」とは、特定の核酸断片のコピー数を酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自立的配列複製のような）、またはその断片をクローン化したベクターの複製の何れかによって増加することを表わす。
「平滑末端ライゲーション」とは完全に平滑である（即ち、付着末端突出部をもたない）ＤＮＡの２つの末端の共有結合的な連結法をいう。
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」の語は互換的に用い得、そのような記載はすべて子孫を含む。したがって「形質転換体」または「形質転換細胞」の語は、伝達数に無関係に初代対象細胞およびそれに由来する培養を含む。またすべての子孫は意図的または偶発的な突然変異のためＤＮＡ含量が正確に同一ではあり得ないことはいうまでもない。ただしもとの形質転換細胞でスクリーニングしたのと同一の機能を有するすべての変異体子孫を包含する。
「クローン」とは、共通の祖先から無性的に由来した遺伝子的に同一である分子、細胞、または微生物群をいう。「クローニング」とはそのような同一である分子、細胞、または微生物を増殖させる操作である。組換えＤＮＡ技術により、個々の遺伝子をクローン化することが可能となる。これを「分子クローニング」という。
「共有結合的な付着」とは、２つの物質間の共有化学結合を生成することをいう。
「サイクル」とはＤＮＡの１回の融解および冷却操作をいう。例えば９４℃のような非常な温度では、実質上すべての２本鎖ＤＮＡ（鎖長に関係なく）は巻き戻され融解する。相補的なオリゴヌクレオチドの存在で温度を冷却すると（４５〜６５℃へ）、巻き戻され融解したＤＮＡのもとの正しい配列へハイブリッド形成することができる。融解し、相補的なオリゴヌクレオチドの存在で冷却したＤＮＡは、次のＤＮＡリガーゼ反応の基質となる（「Ｔｍ」の項を参照）。
「診断部分」とは、存在し、または存在しないことを検出すべきヌクレオチドの変化を含む標的配列部分をいう。「隣接部分」とは、診断に選ばれた配列部分のヌクレオチド配列の連続部分であるＤＮＡの配列を表わす。連続はどちらの方向をも含み得る。
その末端の一方に標的配列が存在し、または存在しないことを鑑別するヌクレオチド（複数もあり）を含んでいなければならないことを除き、診断部分を含んだ選ばれたオリゴヌクレオチドの正確な位置が任意であることは以下の説明から明らかであろう。即ち、隣接部分を含むオリゴヌクレオチドは、診断部分を含んだこの任意に選ばれたオリゴヌクレオチドの配列に連続しており、したがって診断ヌクレオチド（複数もあり）は２つのオリゴヌクレオチドの接続箇所にある。
「エンドヌクレアーゼ」とは、分子内の部位でＤＮＡを切断する酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ）をいう。
「発現系」とは、所望の暗号配列および制御配列で形質転換した宿主が暗号化したタンパク質を生産できるような態様で、これらの配列を実施可能な連鎖で含んでいるＤＮＡ配列をいう。形質転換を実施するため、発現系をベクター上に含み得、あるいはまた形質転換したベクターＤＮＡを宿主染色体へ組込み得る。
「遺伝子」とは、回収可能な生物活性を有するポリペプチドまたは前駆物質を暗号化しているＤＮＡ配列をいう。このポリペプチドは完全鎖長の遺伝子配列で暗号化でき、あるいは酵素活性を保有している限り、暗号配列の任意の部分で暗号化できる。
「遺伝子ライブラリー」または「ライブラリー」とは、与えられた種の完全なゲノムを実質上包含する無作為にクローン化された断片のコレクションをいう。またこの語はクローンバンクまたはショットガンコレクションを表わすのにも用いる。
「ゲノム」とは生物の全体のＤＮＡをいう。
「フック」とは、フックを「補捉する」ことによって、この修飾を含んでいるプローブを迅速、かつ都合よく単離することができるプローブの修飾をいう。フックと補捉手段との相互作用は、例えば共有結合、または十分な親和性を有するリガンド／受容体結合であり得る。そのようなフックは、抗体によって回収できる抗原、アビジンまたはストレプトアビジンによって回収できるビオチン、相補的な核酸、またはＤＮＡ結合タンパク質（リブレッサー）によって回収できる特異的なＤＮＡ配列、および他の好適な反応基によって回収できる特異的な反応性化学官能基等である。
プローブおよび変性融解したＤＮＡの記載に関連して用いられる「ハイブリダイゼーション」および「結合」の語は互換的に用いられる。変性したＤＮＡへハイブリッド形成し、または結合させたプローブは、ポリヌクレオチド中で相補的な配列へ対合させ、または「凝集」させた塩基である。特定のプローブが、ポリヌクレオチドと対合させた塩基、または凝集させた塩基を保有しているかいないかは、相補性の度合、プローブの鎖長、および結合条件の緊縮度によって決まる。緊縮度が高ければ高いほど、相補性の度合は高く、そして／またはプローブは長くなければならない。
「クレノー断片」とは、ＤＮＡポリメラーゼＩの部分的タンパク質分解消化によって得られた７６０００ダルトンのポリペプチドをいう。この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩの５'→３'ポリメラーゼおよび３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有していない。
「標識」とは、未標識核酸の存在で、標識した核酸を同定できるようにプローブ核酸へ修飾を加えることをいう。最も普通には１またはそれ以上の元素を放射性同位元素で置き換えることをいう。しかし同位元素の替わりに、例えば共有的に付着させた発色団、蛍光部分、酵素、抗原、特異的反応性を有する基、化学発光部分、および電気化学的に検出し得る部分のような他の標識で置き換え得る。
「リガーゼ」とは、２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖切断部位でリン酸ジエステル結合の生成を触媒する酵素をいう。またリガーゼ酵素は２本鎖ＤＮＡの共有結合、即ち、平滑末端を平滑末端へ、または１つの付着末端をもう１つの付着末端へ共有結合するのを触媒する。
「リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）」とは、オリゴヌクレオチドライゲーション生産物の増幅を表わす。例えば１サイクルのＤＮＡ生産物が次のサイクルのＤＮＡ基質となることができるようにオリゴヌクレオチドを設計すると、そのようなサイクルを反復することによってＤＮＡの指数的増幅（「連鎖反応」）が起こる。好熱性リガーゼ酵素は、多くのＤＮＡ融解および冷却サイクルの間、活性を保存することができるから、単一の反応容器中で、オリゴヌクレオチドライゲーション生産物を増幅する多くの熱反応サイクルを行なうＤＮＡ増幅を迅速に自動的に起こすことができる。
「リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）」とは、特異的な配列を検出するため、好熱性リガーゼの助けを借りる直線的な生産物増幅による隣接した２つのオリゴヌクレオチドの使用を表わす。
「リガーゼＤＮＡ配列」とは、この発明の好熱性リガーゼのためのサーマス・アクアチカスＨＢ８中のＤＮＡ配列をいう。この配列はリガーゼタンパク質のアミノ末端で下記の核酸配列を含む。
0003889807.tif 000002
0003889807.tif 000003
これに対応するアミノ酸は下記の配列である。
0003889807.tif 000004
0003889807.tif 000005
「連結（ライゲーション）する」とは、ポリヌクレオチド配列同士を互いに共有結合的に付着させて単一の配列を生成することをいう。標準的にはこの反応は一方の配列の５'末端と他方の配列の３'末端との間で、リン酸ジエステル結合の生成を触媒するリガーゼで処理することによって実施される。ただしこの発明の説明に関連して「連結（ライゲーション）する」の用語は、そのような配列を、例えば化学的手段によって共有結合的に付着させるその他の方法をも包含して使用される。「共有結合的に付着させる」および「連結（ライゲーション）する」の語は互換的に用いられ得る。
「ニック閉環活性」とはＤＮＡの隣接する鎖同士の共有結合的をいう。この活性は開環状ＤＮＡ（ＯＣＤＮＡ）を共有結合的に転換して、閉環状ＤＮＡ（ＣＣＣＤＮＡ）へ閉環し、試料ＤＮＡが、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上を移動する速度を測定することによるリガーゼ活性の検定に使用される（ＯＣＤＮＡはＣＣＣＤＮＡより一層遅く移動する）。
「オリゴヌクレオチド」とは、２種またはそれ以上、好ましくは３種以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子をいう。その正確な大きさはオリゴヌクレオチドの究極的な機能またはその使用によって左右される。オリゴヌクレオチドは合成的に、またはクローニングによって誘導され得る。
「実施可能に連結した」とは、構成要素の正常な機能が実施できるように並べて配置することをいう。即ち、制御配列へ「実施可能に連結した」暗号配列とは暗号配列が制御配列の制御下に発現できる配置であることを表わす。
「過剰生産株」とは、特定の酵素または化学物質を過剰に生産するように誘導し得る細菌またはその他の宿主細胞株をいう。
「ポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオチドをＤＮＡへ組立てる反応を触媒する酵素をいう。
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは、相手の鎖へハイブリッド形成し、標的ＤＮＡ内で、対象領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを利用することによる特異的なＤＮＡ断片の指数的増幅に関する特許方法（米国特許第４６８３２０２号および同第４６８３１９５号）をいう。この方法は、鋳型変性、プライマー・アニーリング、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってアニールさせたプライマーの伸長を含むサイクルを反復する一連の系からなる。
「プローブ」とは、変性した核酸内のプローブされるべき配列と十分に相補的である（その鎖長に関連して）ように設計され、選ばれた緊縮条件下で、これへ結合させるオリゴヌクレオチドをいう。「隣接プローブ」とは、隣接部分と相補的であるプローブを表わす。「診断プローブ」とは、診断部分と相補的であるプローブを表わす。「標的プローブ」とは、標的配列と相補的であり、診断プローブおよび隣接プローブを共有結合的に付着させる（ライゲーションする）ことによって作られるプローブをいう。
「リポーター基」とは、特定の部分の存在を知らせる基をいう（「標識」の項を参照）。
「制限エンドヌクレアーゼ」とは、分子の内側にある特異的な配列を認識することによってＤＮＡを切断し、その結果、認識配列の内部または外側の何れかの部位でＤＮＡの両方の鎖をともに切断する酵素をいう。
「粘着末端ライゲーション」とは、必ずしもそれだけに限らないが、通常、１〜５ヌクレオチドの鎖長である５'または３'の１本鎖突出部を相補的に含んでいるＤＮＡの２つの末端の共有結合をいう。
「緊縮」とは、２本鎖ＤＮＡが、それを構成する１本鎖へ解離を起こすように核酸に加える条件の組合せをいう。これらは、特に極端なｐＨ、高温、塩濃度である。「高度緊縮」とは、標準的なサザン・ハイブリダイゼーション・プロトコール［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）の報告のような］のもとにオリゴヌクレオチド・プローブ、またはそれとごく近縁の配列を使用して非反復配列を検出するのに十分な条件、具体的にはハイブリダイゼーションおよび洗浄条件をいう。
「Ｔｍ」とは、ＤＮＡの２つの相補鎖が巻き戻され、分離される温度を表わす。これは１本鎖ＤＮＡの鎖長およびその塩基組成の関数である。短い断片では、Ｔｍの近似値（℃）は４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）に等しい。例えば５Ｇ、７Ｃ、５Ａおよび４Ｔの塩基を有するオリゴヌクレオチドでは、４（５＋７）＋２（５＋４）の温度、即ち６６℃である。
「標的配列」とは、検出を所望する配列が存在し、または存在しない核酸配列をいう。この発明の方法の好ましい適用の説明に関連して用いる場合、この語は鎌状赤血球貧血のような遺伝病に関連する遺伝子中のコード領域の一部を構成する配列である。そのような多くの疾患では、遺伝子異常の存在は暗号配列の僅かな変化を特徴とする。最も多いのは、正常な個体では遺伝的「欠損」を有する個体に存在する対応する配列と１ヌクレオチドが異なる配列を有する。この発明の方法では正常な配列、または変化した配列のどちらでも、標的配列として使用できる。
「好熱性酵素」とは、５０〜９０℃の高温で作用する酵素をいう。これらの酵素の幾つかは、通常の酵素では変性され、したがって不活性となる９４〜１００℃の温度に短時間露出しても生存し得る。
「熱安定リガーゼ」とは、熱に安定であり、耐熱性であり、５０〜９０℃の高温で、隣接するオリゴヌクレオチドのライゲーションを好適な態様で触媒（促進）し、標的核酸鎖と相補的な生産物を生成する酵素をいう。一般にこの酵素は、１ヌクレオチドの５'末端を活性化して、これを隣接するＤＮＡ分子の３'鎖へ結合させる。ただしほかのメカニズムを用いて隣接するオリゴヌクレオチドを共有結合的に付着させる熱安定酵素もあり得る。熱安定リガーゼは、５０〜９０℃の高温で、適当な条件下に、ＤＮＡ内の「ニック」閉環、および粘着末端および平滑末端ライゲーションのように多数の異なった核酸基質を共有結合的に連結することができる。
この発明の熱安定酵素は、増幅反応に有効であるという唯一の基準を満たさなければならない。即ち、この酵素は、２本鎖核酸の変性を実施するのに必要な時間、上昇温度を加えても不可逆的に変性（不活性化）されてはならない。これに関連して用いられる「不可逆的な変性」の語は、永久的な完全な酵素活性の喪失をもたらす操作を意味する。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝塩濃度および変性される核酸の鎖長およびヌクレオチド組成によって定まるが、標準的には短いオリゴヌクレオチドでは約８５℃、主として温度および核酸鎖長によって定まる時間では約１０５℃の範囲で、短いオリゴヌクレオチドで標準的に約０．２５分間、長いＤＮＡ片では４．０分間である。一層高温でも、緩衝塩濃度および／または核酸のＧＣ構成を増大させることによって耐えられ得る。好ましくは酵素は、約９０〜１００℃でも不可逆的に変性されない。この発明の熱安定酵素は、酵素が機能する最適温度を有しており、その温度は約４５℃以上、恐らくは５０〜９０℃、最適には６０〜８０℃である。
遺伝病における１カ所だけの塩基対配列の違いを検出するための好熱性リガーゼによるＤＮＡ増幅方法において、好熱性リガーゼ配列のクローニング、およびこの酵素の使用に関して、さらに徹底的に完全な理解を得るため、以下に図面および実施例を挙げて説明する。これらは単にこの発明を説明するためのものであって、この発明の範囲を制限する目的をもつものではない。
第１図はプラスミドｐＤＺ１およびｐＤＺ７を図示したものである。
第２図はこの発明のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のフローチャートを示す。
第３図は、この発明のＬＤＲおよびＬＣＲ増幅条件下におけるサーマス・アクアチカスの好熱性リガーゼの特異性を説明するオートラジオグラムである。
第４図は、さまざまな標的濃度におけるＬＣＲ増幅を説明するオートラジオグラムである。
第５図は、ヒトゲノムＤＮＡを使用したβグロビン対立遺伝子の検出を説明するオートラジオグラムである。
第６図は、この発明によるオリゴヌクレオチド定量に基づくエリザ（ＥＬＩＳＡ）の概略図である。
第７図は、この発明による熱安定リガーゼのＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のさまざまな精製段階における写真による説明である。
第８図は、この発明による熱安定リガーゼのＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のさまざまな精製段階における第２の写真による説明である。
第９図は、この発明によって調製した３種のクローンを図示したものである。
第７図で、レーンＡおよびＧはマーカータンパク質を表わす（分子量はKdで示す）。Ｂは誘導後の全細胞、Ｃは音波処理後の粗上清、Ｄは熱処理後、プールしたＤＥＡＥ流動を示し、ＥおよびＦはホスホセルロース・クロマトグラフィー後の画分２３および２４を示す。第８図で、レーンＡおよびＨはマーカータンパク質を表わす（分子量はkdで示す）。Ｂは誘導後の全細胞、Ｃは音波処理後の粗上清、Ｄは熱処理後、プールしたＤＥＡＥ流動を示し、Ｅはホスホセルロース・クロマトグラフィー後の画分２３、ＦはＮＡＤの存在なしでリガーゼ緩衝液中でニック処理したＤＮＡとインキュベートした画分２３、Ｇはニック処理したＤＮＡの存在なしでリガーゼ緩衝液中でＮＡＤとインキュベートした画分２３を示す。第８図で、高分子量側のリガーゼ（約８１kd）はアデニル化された形であるが、低分子量側のリガーゼ（約７８kd）はアデニル化されない形である。
第１図に示したプラスミドを、ブダペスト条約の寄託規則に基づき収集機関へ寄託して受入れられた。プラスミドｐＤＺ１は宿主細菌（エシェリキア・コリＡＫ５３株）へ組込み、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託して、ＡＴＣＣ６８３０７の収集番号が与えられた。プラスミドｐＤＺ７は宿主細菌（エシェリキア・コリＡＫ５３株）へ組込み、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託して、ＡＴＣＣ６８３０８の収集番号が与えられた。
ほかの方法も用い得るが、一般にこの発明による好熱性リガーゼの生産は、標準的に下記の手順を含む組換え手段によって行なわれ得る。
まず成熟（ここで用いたこの用語はすべての突然変異タンパク質を含む）酵素を暗号化し、または制御された条件下で、その活性を破壊されない追加的な配列または切断可能な追加的な配列へ融合し、活性タンパク質を生じる好熱性リガーゼの融合体を暗号化しているＤＮＡを得る。その配列がイントロンによって中断されないなら、この配列は任意の宿主で発現するのに好適である。ただし配列は切断および回収可能な形であるべきである。ＰＣＲ手法を用いて、例えば酵素を暗号化している大部分のＤＮＡ配列を増幅し得、したがって「切断」した形で回収し得る。
ついで切断し、または回収した暗号配列を複製可能な発現ベクター内の好適な制御配列とともに実施可能な連鎖で配置し、これを使用して好適な宿主を形質転換する。ついで形質転換した宿主を好適な条件下で培養して組換え体好熱性リガーゼの生産を実施し、リガーゼを単離し、既知の手段により精製する。
上記の手順は、それぞれ種々の態様で達成され得る。例えば所望の暗号配列をゲノム断片から入手し得、好適な宿主でこれを直接使用し得る。好適なレプリコンおよび制御配列を使用して多くの宿主で実施可能な発現ベクターのための組立て物を作成する。普通では入手し得なくても、好適なベクターへ挿入し、切断可能な遺伝子を提供し得るように好適な制限部位を暗号配列の末端へ付加し得る。
制御配列、発現ベクター、および形質転換の方法は、遺伝子を発現するのに使用する宿主細胞の種類によって変わる。一般に細菌宿主が最も効果的で、組換えタンパク質の生産に都合がよく、したがってこの発明の好熱性リガーゼの発現に好ましい。ただし酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞のようなその他の宿主も、都合がよければ同様に使用し得る。この発明の目的には、ある宿主細胞の供給源は、任意の他の入手可能で好適な宿主細胞の供給源と対応物であるとみなし得る。
実施例１
サーマス・アクアチカスＨＢ８株の増殖およびＤＮＡの単離
サーマス・サーモフィラスＨＢ８株（ＡＴＣＣ Ｎo.２７６３４）からＤＮＡを単離した。この株は最近サーマス・アクアチカスＨＢ８株と再分類された［アーカイブ・オブ・マイクロバイオロジー、１１７巻、１８９頁（１９７８年）参照］。
温浴振とう器でＴＡＢブロス（１リットル辺り、バクト[商標]−トリプトン５ｇ、酵母抽出物３ｇ、ＮaＣl ２ｇ、デキストロース１ｇ含有、ＮaＯＨでｐＨ７．２〜７．５に調節）［ニュークレイック・アシッズ・リサーチ、６７９５〜６８０４頁（１９８１年）参照］中で細胞を７５℃で１夜増殖し、遠心によって回収し、８００mlの培地から３．１ｇ（湿潤重量）を得た。細胞を５０mM ＥＤＴＡおよび卵白リゾチーム１５mlを含有する５０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１５mlに再浮遊させた。１０％（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウム２mlを添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、−５０℃で凍結、３７℃で融解するサイクルを２回反復することにより、再浮遊細胞を溶解した。水溶液を等容量の水性フェノール（あらかじめホウ酸ナトリウムでｐＨ７．５に平衡化）、ついでフェノール／クロロホルム、最後にクロロホルムで逐次抽出した。核酸を９５％エタノール２容量と混合し、−５０℃へ１５分間冷却し、遠心によってペレット化することによりこれを沈殿させた。上清を除き、ペレットを乾燥したのち、核酸をＴＥ緩衝液［１mM ＥＤＴＡを含有する１０mMトリスＨＣl（ｐＨ８．０）］１mlへ再浮遊させた。浮遊液各１mlにＲＮアーゼＡ １００μgを添加することにより、ＲＮＡを消化し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容量および１００％エタノール３容量の添加により、ＤＮＡを沈殿させ、−５０℃で１５分間冷却し、遠心によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、最後に２mg／mlの最終濃度でＴＥ緩衝液に再浮遊させた。
上記の実施例で利用したＤＮＡはサーマス・アクアチカスから単離したが、生じたこの発明に必要な性質を有する好熱性リガーゼは、他のサーマス種、またはその他の好熱性細菌、ファージ、またはウイルスから単離したＤＮＡを最初の供給源としてもよい。
サーマス・アクアチカスＨＢ８株から単離したＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＴaqＩ（その認識配列はＴＣＧＡ）またはＥcoＲＩ（その認識配列はＧＡＡＴＴＣ）によって切断できない。ある配列を切断できないことは、アデニン残基のＮ６位における保護メチル化のためである［Ｈ．Ｏ．スミスおよびＳ．Ｖ．ケリー、「ＤＮＡ・メチレーション、バイオケミストリー・アンド・バイオロジカル・シグニフィカンス」、レージン、シーダーおよびリグズ編、３９〜７１頁、スプリング・フェアラグ社、ニューヨーク（１９８７年）参照］。これまでの研究者らは、Ｇ−６ＭｅＡＮＴＣおよびＣＴＧＣ−６ＭｅＡＧの形のアデニンメチル化ＤＮＡを制限するｍｒｒと呼ばれる遺伝子があることを報告している［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、３２４３頁（１９８７年）参照］。ＴaqＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングにおいて、数種のエシェリキア・コリ株が、本来（ただし間違って）、ｍrr遺伝子による影響であるＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを制限することが判っている［ジーン、５６巻、１３頁（１９８７年）、およびニュークレイック・アシツズ・リサーチ、１５巻、９７８１頁（１９８７年）参照］。最近、コーネル・ユニバーシティー・メジカル・カレッジで行なわれた研究で、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを制限するタンパク質を暗号化したｍrr以外にも、追加的な遺伝子が存在することが明らかになった。簡単に説明すると、ｍrr遺伝子を破壊するＴn５（ＫｍR）トランスポゾンを含んでいる株［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、３２４３頁（１９８７年）参照］をエシェリキア・コリの数種の株へのＫｍRマーカー導入に使用すると、生じた株はｍrr-（ｍrrタンパク質欠損）遺伝子型へ転換した［Ｊ．Ｈ．ミラー、「エキスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、２０１〜２０５頁（１９７２年）］。これらの形質導入株は何れもＴａｑメチラーゼ遺伝子に抵抗できなく、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡの制限に関わる第２の遺伝子があることを示している。即ち、この発明の構成に第１に必要な必要条件の一つ（この発明以前には明らかでなかった）は、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを強く制限しないエシェリキア・コリ株の選択であった。
この発明では、Ｔaqメチラーゼ遺伝子に抵抗でき、Ｔn１０（ＴcR）トランスポゾンを含んでいるエシェリキア・コリのＲＲＩ株の誘導体をligts７株［Ｎ３０９８、ウイルソンおよびマーレイ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（１９７９年）、およびジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、７７巻、５３１頁（１９７３年）参照］へ導入し、エシェリキア・コリＡＫ７６株を作り出した。この株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託し、ＡＴＣＣ５５０３２の収集番号が与えられた。この株は温度感受性リガーゼ遺伝子を含んでおり、したがって４２℃で発育できない。この株はＴaqメチラーゼ遺伝子、およびその他のメチル化ＤＮＡ、特にサーマス・アクアチカスから単離したＤＮＡに抵抗できる。またこの株は温度感受性リガーゼ遺伝子をもっているから、４２℃での増殖について選別することにより、機能的なサーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のクローニングのための宿主として使用することができた。
サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のクローニングは、ウイルソンおよびマーレイが報告したのと類似の陽性選択手法に基づいて実施した。その方法は好適なベクターへ挿入したサーマス・アクアチカスＤＮＡのライブラリーを組立てることである。ついでこれらのライブラリーを、サーマス・アクアチカスＤＮＡのメチル化を制限しないＡＫ７６株のようなligts７エシェリキア・コリ株へ形質転換により導入した。ついでこれらの細胞を非許容温度（即ち、４２℃）で発育させた。任意の生存株は、（ｉ）lig+表現型への復帰変異株、（ii）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生産物の発現を増大させる第２の部位復帰変異株、（iii）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生産物の発現を増大させるサーマス・アクアチカスＤＮＡのクローン片、または（iv）サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子を含んでいるサーマス・アクアチカスＤＮＡのクローン片であり得る。
所望の最後の別法を実施するには、（ｉ）全体のリガーゼ遺伝子をクローン化し、（ii）エシェリキア・コリでサーマス・アクアチカス・リガーゼを発現する機能のため、内在性の制御配列、または外来性ベクター制御配列の何れかをアミノ末端へ十分に近接させ、リガーゼ遺伝子をエシェリキア・コリ内で適切に発現できる正しい方向でクローン化し、（iii）サーマス・アクアチカス・リボソーム結合部位がエシェリキア・コリで作動し、（iv）サーマス・アクアチカス・リガーゼが４２℃でも十分に活性で、合成量が、エシェリキア・コリ内で他の操作で妨害されず、リガーゼ機能を十分に捕捉できることが必要である。
この発明で使用する好適なライブラリーの組立てには、所望の制御配列を含んでいる通常のベクター、標準的な制限エンドヌクレレアーゼ、およびライゲーション技術を利用する。精製したプラスミドＤＮＡ、サーマス・アクアチカスＤＮＡ配列、またはこの発明で使用するために合成したオリゴヌクレオチドを切断し、作り替え、通常の技術により、所望の形で再びライゲーションする。
この発明で使用する好適なベクターの選択は、これまでに存在し、使用された多数のベクターのうちから１つのベクターを単に選別するだけのことではない。ｐＵＣプラスミドの高コピー数の誘導体［例えばＣ．ヤニッシュ・ペロンら、ジーン、３３巻、１０３頁（１９８５年）、またはＪ．ビエイラら、ジーン、１９巻、２５９頁（１９８２年）参照］は４２℃で発育させると、実際には若干不安定である。ｐＢＲ３２２の誘導体ｐＦＢ１、２、１３、１４、および１５［Ｆ．バラニー、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２巻、４２０２頁（１９８５年）参照］のような低コピー数のプラスミドはリガーゼ欠損を補足するのに十分な酵素を生産し得ない。この発明を構成するため、３組の異なったベクターを使用して１８組の異なったライブラリーを組立てた。その他のベクターも利用し得るが、ベクターｐＴＺ１８Ｒ［Ｄ．Ａ．ミードら、プロテイン・エンジニアリング、１巻、６７頁（１９８６年）参照］から効果的なクローンが誘導された。
一般に当業界で広く知られている条件下で、これらの商業的に入手可能な制限酵素の製造業者が規定している個々の指示にしたがい、下記の実施例で一層詳細に説明したように、好適な制限酵素でＤＮＡを処理することにより部位特異的なＤＮＡ切断を実施する。一般に緩衝液約２０μl中で酵素２〜１０単位によりプラスミドまたはＤＮＡ配列約１μgを切断する。時間および温度の両者の変化には耐えられるが、約３７℃で約１〜２時間のインキュベーション時間が好ましい。各インキュベーションののち、フェノール／フロロホルムで抽出することによってタンパク質を除去し、さらに抽出を実施し得る。エタノール沈殿によって核酸を回収する。所望により標準的な手法を使用するポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動によって、切断した断片のサイズ分離を実施し得る。
実施例２
部位特異的切断
商業的に入手可能な制限エンドヌクレアーゼを使用して、標準的な緩衝液中でプラスミドおよびサーマス・アクアチカスＤＮＡの両者の部位特異的切断を実施した。
一般に好適な制限エンドヌクレアーゼ２０〜１００単位を添加し、混合物を３７℃で１〜２時間インキュベートすることにより、プラスミドまたはサーマス・アクアチカスＤＮＡ約１０μgを緩衝液１００μl中で切断した。
各インキュベーションののち、タンパク質をフェノール（２×）、ｎ−ブタノール（２×）で逐次抽出することによって除去し、エタノール沈殿により核酸を回収した。
所望の暗号配列および制御配列を含んでいる好適なベクターの組立てには、通常のライゲーションおよび制限技術を用いる。簡単に説明すると、単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成したオリゴヌクレオチドを切断し、作り替え、所望の形で再びライゲーションする。
実施例２で概略を説明した方法で用いる特異的なライブラリーの切断に利用する制限エンドヌクレアーゼは、ＢamＨＩ、ＳacＩ、ＫpnＩ（Ａsp７１８）、ＰstＩ、ＨindIII、およびＳmaＩであるが、ただし他のエンドヌクレアーゼ、または例えばＳauIIIＡによる部分消化も使用できる。アデノシンメチル化のために、共通的に利用される制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ、ＳalＩ、またはＸhoＩは、サーマス・アクアチカスＨＢ８株からのＤＮＡがこれらの酵素によって切断できなかったので使用しなかった。
実施例２で概略を説明した方法によって得られた５'突出部を含んだ制限断片は、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在で、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．６）［５０mM Ｎacl、１０mM ＭgＣl2、１０mM ＤＴＴおよび５０〜１００mMデオキシヌクレオチド三リン酸含有］中、３７℃で約１５〜３０分間のインキュベーション時間を用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノー断片）処理により平滑末端化し得る。クレノー断片は５'粘着末端で作用する。３'突出部が生じたら、緑豆ヌクレアーゼで切取って修復する。クレノーで処理したのち、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させる。ついで好適な条件下にＳ１ヌクレアーゼで処理すると、任意の１本鎖部分の加水分解を生じる。これらの通常の操作は任意の断片をベクター内の部位（平滑末端）へクローニングするのに使用し得る。
実施例３
ベクター組立て
ベクター組立てでは、直線化したベクターをホスファターゼ酵素（別法として別の近似した制限エンドヌクレアーゼ）で普通に処理し、挿入ＤＮＡの存在なしでベクターが再循環するのを防ぐ。例えばＢamＨＩ（５'突出部）またはＳacＩ（３'突出部）ＤＮＡ（９μg）の試料を、５０mMトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０mM ＭgＣl2および６mMメルカプトエタノール含有］１５０μl中、Ｎa+の存在でウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ、２２単位）で、３７℃、１５分間処理し、ついで５０℃で３０分間インキュベートして、５'または３'突出部の何れかからリン酸基を除いた。別法として１０mMトリスＨＣl １５０μl溶液中、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ、１０単位）をＮa+およびＭｇ++の存在で使用し、６０℃で約１時間インキュベートしてもよい。ついでＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを添加して２価カチオンをキレートし、６５℃で１５分間加熱することにより、ＣＩＡＰを変性し得る。ＣＩＡＰまたはＢＡＰのどちらのタンパク質でも、フェノール（２×）、ｎ−ブタノール（２×）で逐次抽出し、エタノール沈殿により核酸を抽出する。
挿入体ＤＮＡの存在または存在なしで、ベクターを再連結したときに生じる形質転換体数を比較することにより、ホスファターゼ段階の効果を検定する。挿入体ＤＮＡが存在すると、形質転換が１０〜１００倍多い標準的な結果により、ベクターＤＮＡが適正にホスファターゼ処理されたことが判る。
実施例４
ライゲーション
前記のようにして作成した直線化し、ホスファターゼ処理したベクター１〜２μgを使用して３０〜１００μl容量でライゲーションを実施した。５０mMトリスＨＣl緩衝液（ｐＨ８．０）［１０mM ＭgＣl2、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＡＴＰ、６mMメルカプトエタノール、およびＴ４リガーゼ３〜７（ワイス）単位含有］中で、サーマス・アクアチカスＤＮＡ ２〜４μgを４℃または１５℃の何れかで１夜インキュベートすることにより、制限エンドヌクレアーゼで切断し、ベクターと同一の末端を生じた。ライゲーションしたのち、ＥＤＴＡを加えて溶液を６５℃で１５分間加熱することにより、Ｔ４リガーゼを不活性化し、エタノール沈殿によって核酸を回収した。
ライゲーション混合物を通常の形質転換方法によってエシェリキア・コリＲＲ１株、ＡＫ５３株、またはＡＫ７６株（最後の株はlig+表現型の迅速陽性選別に好適である）のような好適な宿主へ導入した［ハナハン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１６６巻、３２４３頁（１９８７年）参照］。アンピシリン（または使用したプラスミドによって、テトラサイクリンまたはカナマイシンのような他の薬剤）を含有するプレート上に植付けることにより、形質転換体を選別した。ｌｉｇ+表現型陽性の選別にはＡＫ７６形質転換体を０．２％マルトース、０．２mg／ml ＩＰＴＧ（lacプロモーターを誘導する）、５０μg／mlアンピシリン（プラスミド含有細胞を選別する）を含有するＳＯＢプレート（加圧前にＮａＯＨでｐＨ７．５に調節し、ついで１Ｍ ＭgＳＯ4 ２０mlを添加した蒸留水１リットル中、バクト（商標）−トリプトン２０ｇ、バクト（商標）−酵母抽出物５ｇ、ＮaＣl ０．５ｇ、バクト（商標）−寒天１６ｇ含有溶液を加圧滅菌して調製）上に植付け、４２℃〜４２．５℃で１夜増殖させた。
ライブラリーのサイズは約５０００〜２７０００クローンであった。細菌染色体が約２０００〜４０００キロ塩基を含んでおり、平均挿入体が５〜１０kbである全般的判定が得られれば、数組のライブラリーが重複したクローンを含んでいることが判る。
通常の手法を用いて６組のライブラリーから混合プラスミド生産物を作成し［メソッズ・イン・エンジモロジー、１００巻、２４３頁（１９８３年）参照］、これを新たなＡＫ７６細胞へ導入した。各ライブラリーから形質転換体を６枚のＳＯＢプレートへ植付け（各プレートは３００００〜７００００個のクローンを接種された）、４２℃でインキュベートした。１組のライブラリーは１プレート当たり極めて小型のコロニー１１〜１９個を生じた。残りのライブラリーはときおり大型のコロニーを生じた。
個々のクローンを拾い、通常の技術を用いてプラスミドＤＮＡを作成し［アナリティカル・バイオケミストリー、１１４巻、１９３頁（１９８１年）参照］、制限消化によって分析した。１２個の小型のコロニーはいずれもpＴＺ１８ＲのＢamＨＩ部位内にクローン化した２個のＢamＨＩ断片（それぞれ１．８および２．１kb）を含む６．８kbのプラスミドを生産した。ｐＤＺ１と命名したそのようなプラスミドの１つを第１図に示した。もとのライブラリー（５２００クローン）から逆算して、すべてのpＤＺ１プラスミドは単一のクローンに由来したと考えられる。大型のコロニーはもとのベクターのサイズに近似したプラスミドを含んでいた。したがってこれらの大型のコロニーは、恐らく単にアンピシリン耐性を付与するなんらかのプラスミドを含む染色体ligts７遺伝子の復帰変位体であろう。
プラスミドpＤＺ１をＡＫ７６細胞へ再び形質転換し、実施例４で報告したようにマルトース、ＩＰＴＧ、およびアンピシリンを含有するＳＯＢプレート上で４２℃で選別して、再び小型のコロニーを得た。アンピシリンを含有するトリプトン酵母寒天上に新しい形質転換体を植付けると、コロニーを生じなかった。この結果は、プラスミド樹立中にlacフロモーターを誘導することが、遺伝的欠損を補足するサーマス・アクアチカス・リガーゼの十分量の生産に必要であることを示唆している。プラスミドがＡＫ７６細胞で樹立したら、そのようなクローンをアンピシリン含有トリプトン酵母寒天上へ画線接種し、４２℃で増殖させると、極めて小型のコロニーが得られる。
pＤＺ１をＢamＨＩで消化し、これを再ライゲーションすると、断片が混乱する。そのようなライゲーション混合物をＡＫ７６へ形質転換し、３７℃（即ち、非選択条件下）で接種し、４２℃（即ち、選択条件下）で接種したものと比較すると、非選択条件下の方が１０００倍多いコロニーを生産した。初めのｐＤＺ１プラスミドでは、選択条件下より非選択条件下の方が僅かに２倍だけ多いコロニーを生産した。この知見は、両断片の存在およびそれらをクローン化する方向が、サーマス・アクアチカス・リガーゼの適切な発現に必要であることを強く示唆している。
pＤＺ１は数ケ所のＳacＩおよびＳmaＩ部位を含んでいるが、ＰstＩ、ＫpnＩまたはＨindIII部位はただ１ケ所（ベクター誘導）しか含んでいない。即ち、多数のリガーゼのクローンがＰstＩ、ＫpnＩまたはＨindIII消化ライブラリーから単離されたであろうと予想された。しかしＢamＨＩ部分消化ライブラリーからは１個のリガーゼのクローンしか誘導されなかった。なぜこのことが起こるのかは明らかでないが、考えられる一つの説明として、他のクローンは、プラスミド樹立中に十分なリガーゼタンパク質を発現するリガーゼ遺伝子の開始点と十分に近接したlacプロモーター制御要素を保有していなかったと推測される。
上記のこの発明のサーマス・アクアチカス・リガーゼのクローニングによって、当業者は追加的な研究により、原核、古細菌、真核、またはファージ起源の何れであれ、任意の好熱性または熱安定リガーゼをクローン化することができるであろう。したがってそのようなリガーゼのクローニングはこの発明の範囲に包含される。
そのようなクローニングへの追加的な研究は、例えば、（ｉ）サーマス・アクアチカスＤＮＡをｒｅｄ-λベクターへクローニングし、ＡＫ７６のようなｌｉｇｔｓ７株で３９℃でプラークを生成する組換えファージλの生産能についてスクリーニングする［主としてジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１３２巻、４７１頁（１９７９年）に全般的に報告されたように］、（ii）リガーゼ遺伝子の部分を発現するλｇｔ１１ファージの利用、ついで精製したサーマス・アクアチカス・リガーゼに対して発生させた抗体でスクリーニングし、陽性のλｇｔ１１クローンを使用して、他のプラスミドまたはファージ・ライブラリーへハイブリッド形成することにより、主としてサーマス・アクアチカス・ポリメラーゼのクローニングで報告したように完全鎖長の遺伝子を同定し得る［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６４巻、６４２７頁（１９８９年）参照］、（iii）リガーゼＤＮＡ配列に基づいて、ハイブリッド形成し、多くの種で、他の熱安定リガーゼを暗号化した配列を同定し、検索することを助けるプローブを作成できる。したがってサーマス・アクアチカス・リガーゼから少なくとも５個のアミノ酸を暗号化したＤＮＡの部分を、ＰＣＲ手法を用いて複製し、増幅することができ、変性した形、即ち１本鎖の形をプローブとして使用して、好熱性または熱安定リガーゼを暗号化した追加的なＤＮＡを検索し得る。別法として少なくとも５個のアミノ酸を暗号化しているオリゴヌクレオチド・プローブを合成し、これらを使用して、好熱性または熱安定リガーゼを暗号化した追加的なＤＮＡを検索し得る。
少なくとも５個のアミノ酸を暗号化しているＤＮＡの１部の選別は、オリゴヌクレオチドがゲノム内で唯一の相補的な配列を見出すためにもつべき統計的に最小の鎖長以上である１５個の核酸塩基を含んでいる部分に基づいている。ただしそれよりも僅かに小さい（エシェリキア・コリにおける最小数は例えば１２個であり、４個のアミノ酸の暗号化を許容し得る最小の部分を示している）か、または大きい（一層高等な動物での最小数は１９個程度であり、少なくとも７個のアミノ酸を暗号化している部分が必要であり得ることを示している）［オリゴヌクレオチズ：アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エキスプレッション、１２巻、１３７〜１４０頁、マックミラン・プレス社、ロンドン（１９８９年）参照］部分が、類似の結果を得るのに使用され得る。ただし種間に対応する部分でヌクレオチド配列間に明瞭な対合はあり得ないから、約１５個のヌクレオチドを含んでいるオリゴマーは、偽陽性をなくすのに十分な緊縮条件下でハイブリダイゼーションを達成するための好ましい最小単位である。５個のアミノ酸を暗号化している配列であれば、そのようなプローブ生成のために十分な情報を供給し得るであろう。
これを例示すれば、サーマス・アクアチカス・リガーゼとエシェリキア・コリのアミノ酸配列を比較すると、アミノ酸３４−４０（Ａｓｐ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｔｙｒ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ）の間に統計的に許容し得る水準で同一性が見出される。好ましい６アミノ酸配列を使用し、ＧＡ（Ｃ／Ｔ）-ＧＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）-ＧＡ（Ｇ／Ａ）-ＴＡ（Ｃ／Ｔ）-ＧＡ（Ｃ／Ｔ）-（Ｃ／Ａ）Ｇ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）-（Ｃ／Ｔ）Ｔの形の縮重プローブを上記のリガーゼの確認および検索に使用できた。この発明のサーモフィラス・リガーゼとエシェリキア・コリ・リガーゼの間の配列同一性の区域は、下記の位置でアミノ酸を含んでいる。
0003889807.tif 000006
総合的に、この発明のリガーゼに含まれている６７６個のアミノ酸のうちで、サーモフィラス・リガーゼおよびエシェリキア・コリ・リガーゼの百分率類似性は６６％であり、百分率同一性は４７％である。
クローン化し、適切な方向をもった遺伝子からの過剰生産株の組立ては、技術上、通常の方法を用いることにより達成され得る。そのような組立ての一般的な原理は、遺伝子の効果的な転写および翻訳に影響を与えることができる配列を遺伝子の開始コドンに極めて近接して配置することである。遺伝子を作動させるため効果的に使用された多くのプロモーターシステム（リボソーム結合部位［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、７８巻、５５４３頁（１９８１年）］を含む）があり、例えばlacプロモーター、trpプロモーター［ジーン、２０巻、２３１頁（１９８２年）］、λファージＰLプロモーター［ネーチャー、２９２巻、１２８頁（１９８１年）］、tac融合プロモーター［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、２１頁（１９８３年）］、およびＴ７ファージ・プロモータープロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２巻、１０７４頁（１９８５年）］等がある。
プラスミドpＤＺ１は、開始ベクターに存在するlacおよびＴ７プラスミドの両者から下流でサーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子を含んでいる。Ｂal３１［ニュークレイック・アシッズ・リサーチ、５巻、１４４５頁（１９７８年）参照］およびＥxoIIIおよび緑豆またはＳ1ヌクレアーゼ［メソッズ・イン・エンジモロジー、１５５巻、１５６頁（１９８７年）参照］を含み、プロモーターおよび遺伝子間の過剰のＤＮＡ配列を除去する幾つかの方法がある。しかしこの例の場合は、サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のアミノ末端を２つのプロモーターへさらに接近させるため、実施例Ｖで報告したようにさらに一層簡単な方法を使用した。
実施例５
（プロモーターおよび遺伝子間からの過剰なＤＮＡの除去）
プラスミドpＤＺ１を制限エンドヌクレアーゼＨinＰＩ（Ｇ ＣＧＣ）により不規則に線形化し、クレノウまたは別法としてＣviＪＩ（ＰuＧ ＣＰy）により平滑末端化した［「ＤＮＡ・アンド・プロテイン・エンジニアリング・テクニクス」１：２９（１９８８）参照］。
ＤＮＡをフェノール（２x）、n−ブタノール（２x）による連続抽出により精製し、核酸をエタノール沈澱により回収した。次いで、これらの不規則に線形化されたプラスミドを、２つのプロモーターの下流にあるポリリンカー部位を直接開裂するＡsp７１８により処理し、クレノウにより平滑末端化した。生成したフラグメントを低融点アガロース中での電気泳動により分解し、連続したスライス（完全長線形および漸進的に小さくなるＤＮＡフラグメント）を切り取り、ＤＮＡを回収した。続いてＤＮＡフラグメントを平滑末端ライゲーションにより再び環状にした。これは、１０ミリモルのＭgＣl2、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのＡＴＰ、６ミリモルのメルカプトエタノールおよび３〜７バイス単位のＴ４リガーゼを含む５０ミリモルのトリスＨＣl（pＨ８．０）緩衝液１００μl中４℃で一夜のインキュベーションを要した。ライゲーション後、ＥＤＴＡを加え、Ｔリガーゼを加熱（６５℃で１５分間）により不活化し、核酸をエタノール沈澱により回収した。
製造されたライゲーション混合物を、慣用的技術を用いてＡＫ７６細胞へ導入し、前述の麦芽糖、ＩＰＴＧおよびアンピシリンを含むＳＯＢプレート上４２℃でlig＋表現型を選択した。
先の試験結果に基づくと、プロモーターおよびテルムス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子の出発点間に欠失を含むプラスミドは、これらの条件下で生存能力を付与することが予想される。ベクター（プロモーター領域）またはリガーゼ遺伝子の本質的部分を欠失すると、当然生存能力は付与されない。従って、個々のクローンを抜粋し、慣用的方法［「アナリティカル・バイオケミストリー」、１１４：１９３（１９８１）参照]を用いてプラスミドＤＮＡを製造し、制限消化により分析した。この試験結果から、プラスミドpＤＺ２、pＤＺ３、pＤＺ６およびpＤＺ７は、１．８kbのＢamＨＩフラグメントを欠き、代わりに各々１．３、１．４、１．２または１．２kbのフラグメントを含むことが見出された。これらのプラスミドは全て、適切な平滑末端充填およびライゲーションから予想される通りＡsp７１８部位を再作製した。慣用的技術[「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、１３：１１０３（１９８５）、および「プロテイン・エンジニアリング」、１：６４（１９８６）参照]を用いてこれらのプラスミドから１本鎖ＤＮＡを製造し、普遍的「リバースプライマー」オリゴヌクレオチド５'d（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）３'およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ［「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８４：４７６７（１９８７）参照]を用いてこれらの配列決定をした。
ＤＮＡ配列の分析結果は２つのＡＴＧ開始コドンを示しており、第１の転写解読枠は長さ３コドンであり、第２のリガーゼＤＮＡ配列は長い解読枠を与えている。第１図と結びつけると、プラスミドpＤＺ６およびpＤＺ７に由来するこの配列（部分的リガーゼＤＮＡ配列を含む）は次の通りである。
0003889807.tif 000007
0003889807.tif 000008
本発明の熱安定リガーゼの核酸配列は下記アミノ酸配列に対応する。
0003889807.tif 000009
0003889807.tif 000010
この転写解読枠（耐熱性リガーゼ）の最初の６０アミノ酸の翻訳は、エシェリヒア・コリ・リガーゼに対して５０％を越える相同性を示すことから（「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス」、２０４：１（１９８６）参照）、この長い転写解読枠はテルムス・アクアティクス遺伝子の開始を表すことが示唆される。ＢamＨＩフラグメントによる遺伝子結果から、このリガーゼのサイズは４００ないし１１００アミノ酸長であるという結論に到達し得る。精製蛋白質は、約７９０００の分子量を有することが報告されており［「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２５９：１００４１（１９８４）参照］、これは本発明において見出された遺伝子結果の限界内に含まれる。クローンpＤＺ７が機能的テルムス・アクアティクス・リガーゼを生産し（すなわち、それが遺伝子を完全な状態でコードする）、アミノ末端のＤＮＡ配列が与えられると、文献に記載された手動的またはオートメーション化された方法を用いて[例えば、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」、８４：４７６７（１９８７）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」、８６：４０７６（１９８９）、「サイエンス」、２３９：４８７（１９８７）、「ネイチャー」、３２１：６７４（１９８６）、「バイオテクニクス」、８：１８４（１９９０）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５：５６１０（１９８８）、および「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５：９４３６（１９８８）参照］、遺伝子の全ＤＮＡ配列が決定された。
バイオテクノロジー研究における熟練者であれば誰でも知っている方法を用いて、プラスミドpＤＺ２、pＤＺ３、pＤＺ６またはpＤＺ７を使用することにより、さらに別の過剰生産性ベクターが構築され得る。この場合、上記のプロモーターおよびリボソーム結合部位の使用が含まれ得る。例えば、プラスミドpＤＺ７（第１図参照）では、その特有のＡsp７１８部位が線形化され得、テルムス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子の正面の過剰ヌクレオチドは、上記のＢal３１またはＥxoIIIおよびムング・ビーンの組み合わせまたはＳ1ヌクレアーゼの使用によりＡＴＧ開始コドン近くでトリミングされ得る。次いで、これは、同様の方法で生成された天然機能付与性配列（プロモーターおよび翻訳開始配列）へ、またはこの目的のために製造された合成機能付与性配列により平滑末端ライゲーションされ得る。さらに、テルムス・アクアティクス遺伝子に対して外部または内部にある配列を修飾することにより、転写または翻訳を阻止し得る潜在的ＲＮＡ構造が除去され得る。これらの方法は、可溶性エシェリヒア・コリ蛋白質の３０％を越える割合にまで耐熱性制限エンドヌクレアーゼＴaqＩの過剰生産に作用することが先に報告されている[「ジーン」、６５：１６６（１９８８）参照]。別法として、合成オリゴヌクレオチドは、テルムス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子の開始点が、ＰＣＲ方法を用いて機能付与性配列へ直接融合される形で合成され得る[例えば、「バイオテクニクス」、８：１７８（１９９０）、「ジーン」、７７：５１（１９８９）、および「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、１７：７２３（１９８９）参照]。
先行配列から、アミノ酸残基３１−３３をコードするヌクレオチドに対応するＢgl II部位の存在することが判る。この情報により、最適なシャイン-ダルガノ配列を伴う強力なプロモーターは、ＰＣＲを用いてこの遺伝子の正面に挿入され得る。２つの小さな注意点:（１）全遺伝子（３kb、高いＧＣ含有率）をＰＣＲコピーする試みは必ずしも成功するわけではなかったこと、および（２）プラスミドpＤＺ７は、リガーゼ遺伝子内に一つずつ、２つのＢamＨＩおよびＢglＩＩ部位を有していたことを考慮する必要がある。
プラスミドpＤＺ７をＢamＨＩおよびＢglIIにより部分消化し、正確なサイズの小さい方の線形フラグメントを電気泳動により完全長線形フラグメントから分離し、切り取り、前記と同様に精製した。ＢamＨＩおよびＢglＩＩは同じオーバーハング（５'ＧＡＴＣ）を製造するため、線形フラグメントはＴ４リガーゼにより再び環状にされ、形質転換によりエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ導入され得た。幾つかのクローンでは０．５kbのＢamＨＩ／ＢglIIフラグメントを欠失した結果、５．７kbのプラスミドが生成され、その一クローンはpＤＺ１２と命名された。合成オリゴヌクレオチド＃６６、＃７８、＃８５および＃９２を合成し、ＰＣＲを用いて、リガーゼ遺伝子の出発点に対しphoＡプロモーター[プラスミドpＦＢＴ６４から、「ジーン」、５６：１３（１９８７）参照]およびリボソーム結合性配列を融合させた[「バイオテクニクス」、８：１７８（１９９０）、「ジーン」、７７：５１（１９８９）、「ジーン」、７７：６１（１９８９）、および「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、１７：７２３（１９８９）参照]。これらのクローンは図９に描かれており、次の通りである。
＃６６  １９量体；ＰvuII部位〜Ｔ７プロモーターないしphoＡプロモーター、プラスミドpＦＢＴ６４の上部鎖（Ｔaqlエンドヌクレアーゼ遺伝子の指示）：
0003889807.tif 000011
＃７８  ３２量体;テルムス・リガーゼ遺伝子の出発点に相補的な５'末端、phoＡプロモーターのシャイン-ダルガノ側に相補的な３'末端、プラスミドpＦＢＴ６４の下部鎖：
0003889807.tif 000012
＃８５  ３３量体;phoＡプロモーターのシャイン-ダルガノ側に相補的な５'末端、テルムス・リガーゼ遺伝子の出発点に相補的な３'末端、プラスミドpＤＺ７の上部鎖（リガーゼ遺伝子の指示）：
0003889807.tif 000013
＃９４  １８量体;リガーゼ遺伝子のアミノ酸残基４０〜３５の非翻訳鎖に対応するプラスミドpＤＺ７の下部鎖、アミノ酸残基３３〜３１にあるＢglII部位の下流：
0003889807.tif 000014
簡単に述べると、これは、単一反応管中、４００ngのプライマー＃６６および＃７８を、１００μlのＰＣＲ緩衝液中dＡＴＰ、cＣＴＰ、cＧＴＰおよびdＴＴＰを各々５０マイクロモル、および２．５単位のＡmplitaqを含む２００ngのＰstＩ／ＰvuII消化pＦＢＴ６４に加え、製造者（シータス、エモリービル、カリフォルニア）のプロトコールに従い９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間１サイクル当たり３秒伸ばしながら２５サイクル循環させることにより行なわれた。第２の反応管は、同じ反応緩衝液および酵素中、４００ngのプライマー＃８５および＃９４、２００ngのＥcoＲＩ／ＢamＨＩ消化pＤＺ７を含んでおり、これを上記と同様にインキュベーションした。これらの反応の生成物は、ゲル電気泳動で分析された通り正確な長さであることが示された。第３の反応管は、各生成物から２μl、同じ反応緩衝液および酵素中４００ngのプライマー＃６６および＃９４を含んでおり、これを上記と同様にインキュベーションした。２生成物間の重複部分が組み合わせた長さの融合生成物のＰＣＲ合成を可能にするようにプライマーを設計した。生成したフラグメントをフェノール、n−ブタノールおよびエタノールで抽出し、沈澱によりＴaqポリメラーゼを除去した。ＰＣＲフラグメント生成物を、上記と同様ＢglIIおよびＥcoＲＩで処理し、低融点アガロース中で電気泳動させ、精製した。同時に、pＤＺ１２からの２．７kbＰstＩ-Ｂgl
IIリガーゼ遺伝子含有フラグメントおよびpＦＢＴ６４からの２．４kbＰstＩ-ＥcoＲＩ β−ラクタマーゼ遺伝子および開始点含有フラグメントを精製した。３フラグメントを全て３方向ライゲーションで合わせ、形質転換によりエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ導入した。幾つかのクローンは、phoＡプロモーター制御下でリガーゼを過剰生産する５．５kbプラスミドを含んでいた。それらのうちの一プラスミドをpＤＺ１３と命名した。
可溶性エシェリヒア・コリ蛋白質の３０％を越える割合に達する耐熱性制限エンドヌクレアーゼＴaq1の過剰生産において報告された試験では［「ジーン」、６５：１６６（１９８８）参照]、β−ラクタマーゼ遺伝子を逆にすることにより、phoＡプロモーターとは反対方向で転写が行なわれる場合、エンドヌクレアーゼ収率は幾分優れていることが認められた。本発明に従いリガーゼ遺伝子を伴う類似構造を作製するため、プラスミドpＦＢＬＴ６９（逆配向でβ−ラクタマーゼを含む）からの２．３kbＰstＩ-ＰvuIIフラグメントを、プラスミドpＤＺ１３の３．２kbＰstＩ-ＰvuIIリガーゼ遺伝子含有フラグメントにライゲーションした。このライゲーション混合物をエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ形質転換し、幾つかの形質転換体を制限消化物により分析すると、β−ラクタマーゼ遺伝子の配向が確認された。それらのうちの一クローンをpＤＺ１５と命名した。pＤＺ１５におけるリガーゼの生産性は、pＤＺ１３と比べて少しも優れていない場合でも、同程度には良好である。リガーゼ酵素はプロテアーゼに対して幾分感受性を示すと思われるため、誘導後細胞を９時間だけ生長させるべきである。リガーゼ遺伝子の蛋白質加水分解生成物はまだ熱安定性リガーゼ活性を有し得る（これはＴaqポリメラーゼに関して立証された）。
耐熱性蛋白質は、実質的に修飾され、依然として本発明での使用に充分な活性を保持し得る。例えば、Ｔaqポリメラーゼのアミノ末端における暗号化配列の約３分の１の欠失により、ポリメラーゼ活性で活性を示す遺伝子産物が生成されることが示された［「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２６４:６４２７（１９８９）参照］。別法として、アミノ酸をアミノ末端（＋７）、カルボキシ末端（＋３８）または内部のある位置（＋２から＋３４まで）に付加した場合、別の耐熱性蛋白質、制限エンドヌクレアーゼＴaqlは、本質的に充分な活性を保持することが示された［「ジーン」、６５:１６６（１９８８）参照］。すなわち、翻訳中に配列へ組み込まれたアミノ酸の欠失、n−末端付加、c−末端付加、内部付加もしくは重複または改変による一次構造の修飾は、蛋白質の活性または熱安定性を破壊することなく行なわれ得る。さらに、これらの配列をコードするＤＮＡの利用可能性により、コドン配列を修飾して同じくリガーゼ活性を有する突然変異蛋白質形態を生成させる機会が提供される。それらの置換または他の改変の結果、本発明の範囲内に含まれるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する新規蛋白質が生成される。
また、他のライゲーション蛋白質は、これらの実施例で立証されている通り本発明方法により分離され得る。異なるセルラインは、本発明の製造法で使用されるテルムス・アクアティクスＨＢ８株から分離されたものとは異なる物理特性を有するリガーゼを製造するものと予想され得る。さらに、酵素またはその前駆体が遺伝子的多形性または細胞仲介による修飾を呈することから変形が存在し得る。さらに、そうして分離されたリガーゼのアミノ酸配列は、遺伝子技術により修飾され、改変された生物活性および特性を有するリガーゼを製造し得る。次いで、生成したＤＮＡ配列は、テルムス・アクアティクスＨＢ８リガーゼと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、それより高または低レベルの活性を呈する蛋白質をコードし得る可能性がある。それらのライゲーション蛋白質もまた当然本発明の範囲内に含まれるものと考えるべきである。
実施例６
（リガーゼ酵素の精製）
プラスミドpＤＺ６およびpＧＰ１−２（ラムダＰLプロモーターの後ろにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含み、温度感受性ラムダ・レプレッサーＣ1587の制御下にある）［「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８２:１０７４（１９８５）およびアメリカ合衆国特許４７９５６９９参照］を含むエシェリヒア・コリ細胞ＡＫ５３を、両プラスミドの持続を確実にするため５０μg／mlのアンピシリンおよび５０μg／mlのカナマイシンを含むＴＹプレートにおいて３２℃で一夜生長させた。新鮮なコロニーを、pＨ７．６で６gのＮaＣl、２５gのバクト（商標）トリプトン、７．５gの酵母抽出物、１gのグルコース、１．６gのカゼインアミノ酸加水分解物、５０μg／mlのカナマイシンおよび５０μg／mlのアンピシリンを含む５０ミリモルのトリスＨＣl緩衝液１リットルに再懸濁し、２００rpmで振動している２リットルのフラスコ中３２℃で生長させた。Ｏ．Ｄ．（光学密度）550が０．８ないし１．０間に到達すると、細胞を３０〜４０分間４２℃にシフトすることにより、Ｔ７ ポリメラーゼの合成を誘導した。メタノールに溶かした２０mg／mlのリファンピシン５mlを加えて最終濃度を１００μg／mlにすることにより、エシェリヒア・コリ蛋白質のそれ以上の合成を阻止した。これらの条件下では、Ｔ７ プロモーターの後ろの遺伝子のみが当然転写され、従って翻訳される。細胞を４２℃でさらに５時間インキュベーションした。
別法として、プラスミドpＤＺ１５（phoＡプロモーター制御下にあるリガーゼ）を含むエシェリヒア・コリ細胞ＡＫ５３を、５０μg／mlのアンピシリンを含有するＴＹプレートにおいて３７℃で一夜生長させた。新鮮なコロニーを、５０μg／mlのアンピシリンを含む強化ブロス５０mlに再懸濁し、Ｇ７６ベンチトップシェーカー中２００rpmで振動している５００mlのフラスコにおいて３７℃で生長させた。Ｏ．Ｄ．500が０．６５ないし０．８５に達すると、２０mlを０．２ミリモルＫ2ＨＰＯ4含有ＭＯＰＳ培地［「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」、１１９:７３６（１９７４）参照］１リットル中へ希釈することにより、phoＡプロモーターを誘導した。細胞を、さらに９時間Ｇ２５フロアシェーカー中２００rpmで振動している２リットルのフラスコにおいて３７℃で生長させた。
インキュベーション後、細胞を氷中で冷やし、遠心分離（５０００rpmで１５分間）により採取し、２０mlの水に再懸濁し、３５mlの遠心分離管に移し、再遠心分離（７０００rpmで６分間）し、蛋白質分離の準備ができるまで沈澱物を凍結させた。解凍後、沈澱物を、１０ミリモルの２−メルカプトエタノールおよび０．１５ミリモルのＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（pＨ７．６で１ミリモルのＥＤＴＡを含む２０ミリモルのトリスＨＣl緩衝液）２０mlに再懸濁した。音波処理（４℃５０％パワーで５×１分間）後、溶液を３９０００×gで６０分間の遠心分離にかけた。
９２５００ダルトンの分子量と定められたホスホリラーゼＢ標準と比較すると、この酵素は７５０００〜８５０００ダルトンの推定分子量を有していた。
別法として、pＤＺ１５誘導細胞２リットルを、上記と同様に採取し、音波処理し、屑を遠心分離により一掃した。
上清（４０ml）を３００ミリモルのＫＣlに加え、５mlＤＥＡＥセファセル・カラムに通し、０．３モルＫＣl含有緩衝液Ａ７０mlを用いて外来ＤＮＡを除去した。リガーゼ含有フロースルー・フラクションを合わせ、６５℃で２０分間処理することにより、エンドまたはエキソヌクレアーゼを含む多くのエシェリヒア・コリ酵素の不可逆的熱変性を誘発した。次いで、変性した蛋白質を１５分間３９０００×gの遠心分離により除去し、室温で３０分間等容量の飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えることによりリガーゼ酵素を上清から沈澱させた。臨床用遠心機中８０００rpmでの遠心分離により硫酸アンモニウム沈澱物を回収し、４mlの蒸留水に再懸濁した。試料を緩衝液Ａ、次いで５０ミリモルＫＣl含有緩衝液Ａに対して透析した。透析された蛋白質溶液を、５０ミリモルＫＣl含有緩衝液Ａで平衡状態にした４０mlホスホセルロース・カラムに適用した。同緩衝液８０mlにより洗浄後、緩衝液Ａ中ＫＣl（０．０５〜０．５モル）の１２０ml一次勾配によりカラムを溶離した。酵素は、０．２５〜０．３５モルのＫＣlからより鋭いピークとして溶離した。この蛋白質は、見かけ上の分子量約８１０００（アデニル化形態）および７８０００（非アデニル化形態）の２つの帯として移動し、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのモニターによると純度約９８−９９％である。６５℃で３０分間ＮＡＤ不含有（非アデニル化形態が生じる）のニックさけ精液ＤＮＡ２５μgを含むリガーゼ緩衝液、または１０ミリモルのＮＡＤを含む（アデニル化形態が生じる）リガーゼ緩衝液中１５０μgの蛋白質をインキュベーションすることにより、これら２形態は互いに変換され得る。１ミリモルのＥＤＴＡ、２ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２００μg／mlの牛血清アルブミン（フラクション５）を含む１００％グリセリン中２０ミリモルのトリスＨＣl（pＨ８．０）等容量を加え（最終グリセリン濃度は５０％である）、酵素を−７０℃または−２０℃で貯蔵した。２リットルの細胞から、１マイクロリットル当たり６２５ニック・クロージング単位で、１６mlの貯蔵緩衝液中６mgのリガーゼの最終収量が得られた。これは、合計１０００００００単位の酵素、および１６６６６６７単位／mgの比活性に対応する。
耐熱性蛋白質は、それらの中温性対応物質よりも疎水性が幾分高くなる傾向を示すことが知られているため、非イオン性デタージェントまたは他の安定剤の添加は、長期貯蔵に有用であり得る。従って、貯蔵緩衝液は、追加成分、例えばグリセリン（５０％）、しょ糖（２５％）、プロテアーゼ阻害剤（０．５−１．０ミリモルのＰＭＳＦ、１０-7モルのペプスタチンＡ）、塩（ＫＣl、好ましくは１００−５００ミリモル）、ＥＤＴＡ（０．１−１．０ミリモル）、牛血清アルブミン（１００−５００μ／ml）、ゼラチン、ジチオトレイトール（１−１０ミリモル）およびメルカプトエタノール（１−１０ミリモル）を含み得る。さらに、貯蔵緩衝液は少なくとも１種の非イオン性ポリマー性デタージェントを含むのが好ましい。それらのデタージェントを一部列挙した場合、エトキシル化脂肪族アルコールエーテルおよびラウリルエーテル類、エトキシル化アルキルフェノール類、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、さらに特定すればトリトンＸ−１００、ＮＰ−４０およびトウィーン２０が０．１−０．５％容量／容量で含まれる。
リガーゼ活性について検定するためには、基質の溶融温度（Ｔm）により歪曲されない方法を使用することが重要である。例えば、４塩基突出末端ライゲーションは、Ｔ４リガーゼに最適な温度（３７℃である）よりもかなり低く、確実には耐熱性リガーゼの最適温度よりも下の低温、例えば４℃で最も有効である。一貫性を示すべき一検定方法は、環状プラスミドがデオキシリボヌクレアーゼＩにより幾つかの箇所で不規則にニックされるニック-クロージング検定である。リガーゼがこれらの全ニックを閉じ、共有結合的閉環状ＤＮＡを生成させる能力は、臭化エチジウム含有アガロースゲル中での電気泳動によって開環状ＤＮＡからニック環状を分離することにより検定され得る。例えば、プラスミドpＵＣ４ＫＩＸＸの共有結合的閉環状形態［「ジーン」、３７:１１１（１９８５）参照］は、同緩衝液中１５０Ｖで１．５時間実施された、０．２モルのグリシンＮaＯＨ、pＨ８．５、０．１ミリモルのＥＤＴＡおよび１μg／mlの臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル電気泳動において線形態よりも迅速に、そしてニック形態よりもかなり迅速に移動する。
実施例７
（好熱性リガーゼ分析）
ニックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸ ＤＮＡを、１０ｍＭ ＭgＣl2、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび６ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリスＨＣl ｐＨ８．０緩衝液５０μl中ＤＮＡ５μgに希釈直後の１μl／ｍｌ ＤＮアーゼ３μlを加えて製造した。混合物を室温で５分間インキュベートし、ＤＮアーゼは６５℃１０分間の熱で失活させ、試料を使用するまで−２０℃で凍結し保管した。それらの条件下、ＤＮＡの約９０％は、ニックをもつ環状であり、約５％は直線状および５％は共有結合で閉じた環状であった。
上記で製造した好熱性リガーゼを、５０ｍＭ ＫＣl、１０ｍＭ ＭgＣl2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮＡＤ、１０ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭ トリスＨＣlｐＨ７．６緩衝液２０μl中に入れたニックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸ０．５μgにリガーゼの段階希釈を加え、鉱油１滴で液面を覆い、６５℃１５分間インキュベートして分析した。対照として、Ｔ４リガーゼを１０ｍＭ ＭgＣl2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＡＴＰ、６ｍＭ メルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリスＨＣl ｐＨ８．０緩衝液０．５μgにリガーゼの段階希釈を加え、３７℃１５分間インキュベートして分析した。
反応を０．２Ｍ ＥＤＴＡ、５０％グリセリン、１％ＳＤＳおよび０．１％ブロムフェノールブルーを含む４μl終止緩衝液を加えて終結させ、生成物を上記のゲル電気泳動法により分析した。
リガーゼの１ニッククロージングユニットを、緩衝液および時間についての上記の実施例の記載の条件下でニックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸ ＤＮＡ０．５μgを環化するが別のリガーゼの添加がさらにＤＮＡを環化しないリガーゼの量と定義する。
最縮小製造法として、プラスミドpＤＺ１５（phoＡプロモーター制御下、とあるリガーゼ）を含むエシエリキア・コリ細胞ＡＫ５３を５０μg／ｍｌでアンピシリンを含むＴＹプレート上で一夜３７℃で発育させた。新鮮なコロニーを５０μg／ｍｌアンピシリンを含む強化ブイヨン５ｍｌ中に懸濁し、成育させた。Ｏ．Ｄ．550が０．６５〜０．８５に達したとき、０．１２ｍｌを０．２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4を含むＭＯＰＳ培地６ｍｌ中に希釈し、ｐｈｏＡプロモーターを誘発した。細胞を一夜３７℃でインキュベートした（インキュベーション延長後に起こる蛋白分解に注意し、誘発された細胞が成育し過ぎないようにする）。細胞を１．５ml超遠心分離管中に採取し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．６緩衝液０．３ｍｌ中で懸濁し、２×１０秒音波処理した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ／分）により破片を除去した後、上清を６５℃２０分間処理し、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む複数のエシエリキア・コリ酵素を非可逆的に熱変性した。熱変性残分を遠心分離により除去し、上清を上記と同様に分析した。上清１ｍｌは約６２５ニッククロージングユニットの活性を含有した。
上記の実施例に記載のＴ．アクアティクスリガーゼ製品および市販品のＴ４リガーゼは約１２５ニッククロージングユニット／ｍｌを含むことを示した。従って、本発明の製造法は、Ｔ．アクアティクスを過剰に製造するエシエリキア・コリ１ｌから、約１０００００（８００×１２５）ニッククロージングユニットの酵素を精製した。
上記により製造された好熱性リガーゼは、ＤＮＡを増幅すると共にＤＮＡ配列中単一塩基置換を識別する分析法として特に有効である多くの有益な性質を有する。それらに使用される本リガーゼの唯一最も重要な性質は、リガーゼが熱変性／再生サイクルを反復する間活性を維持するので、リガーゼを繰返し添加する必要がなくＤＮＡ増幅をもたらすということである。さらに、本発明のリガーゼはＴｍ温度６５℃でまたはその付近で複合ゲノムにおいて独自性を確かにするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドを連結し、また正確に相補的なオリゴヌクレオチド配列と単一塩基ミスマッチオリゴヌクレオチド配列を正確に識別する。
リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）と称する好熱性リガーゼＤＮＡ配列のクローニングの結果として発展した２つの製造のより簡便な方法において、２種のオリゴヌクレオチドプローブを１方の３'末端が他方の５'末端にすぐに隣接するように熱変性ＤＮＡにハイブリダイズする。各々がヒトゲノム中その独特な位置に選択的にハイブリダイズするように十分に長いオリゴヌクレオチドが選択される。好熱性リガーゼは、連結のヌクレオチドが標的に対して完全に相補的であるならばついで２種のオリゴヌクレオチド間で共有結合のリン酸二エステル結合を形成する。ニッククロージング反応の特異性は、それらの標的の２種のオリゴヌクレオチドのＴｍまたはその付近で連結することにより著しく増大する。即ち、連結点での単一塩基ミスマッチが不完全な二重らせんを形成するだけでなく、比較的高い温度でのハイブリッドを不安定にする。従って、好熱性リガーゼは、正確な塩基対を作ったオリゴヌクレオチドを有効に連結し、不完全マッチ配列の存在下でほぼ０のバックグランド連結を与える。ＬＤＲを使用すると、連結反応で得られた化合物の量は反復される熱サイクルにより直線的に増加し得る。
本発明の好熱性リガーゼ連鎖反応において、両鎖は共にハイブリダイゼーションの標的として役立つ。反対鎖に相補的な２種のオリゴヌクレオチドを更に使用すると、１サイクルの連結生成物は、第２図において一般的に示されるように連結の次ぎのサイクルの標的となる。各隣接オリゴヌクレオチド対において、特徴的なヌクレオチドは連結点の３’末端側にある。従って、相補的なオリゴヌクレトチドが異常な標的独立連結をすることはＴｍ付近の温度の使用、および単一塩基３’突出部の有利なまたは乏しい連結効果を利用することにより回避される。連結鎖反応をすると、熱サイクルの反復により、生成物を指数的に増加し得る。
好熱性リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の能力を試験するために、ヒトβグロビンをコード化する遺伝子を初期モデル系として選択し、本発明の技術を試験した。従来の研究から、正常βA対立遺伝子と鎌状βS遺伝子はβグロビン遺伝子の６番目のコドンにおいて２番目のヌクレオチド１個がＡ→Ｔに塩基転換し、第１表に記載のヘモグロビンβ鎖中グルタミン酸残基がバリンへ変化した点で異なることが明らかにされている。
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下記の第１表のつづきにおいて、それらの慣用される５'→３'配向で上記の部分に掲げるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
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各対立遺伝子にユニークな３'ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、５'末端の長さが異なるように合成した（第１表、参照）。不変系である32Ｐ放射能標識化隣接オリゴヌクレオチドへ連結すると、個々の生成物をポリアクリルアミド変性ゲルで分離し、オートラジオグラフィーで検出することができた。オートラジオグラフィーによる最初の発見に基づき、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを捕獲のために５'ビオチニル化し、変異系オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンで３'に継いだ自動、非放射性検出反応法を使用して配列分析を行った。ついでアルカリホスファターゼに抱合された抗ジゴキゲニンおよび酵素の比色法基質を使用してＥＬＩＳＡ型式で視覚化した。
第１表に記載のように、ヌクレオチド配列およびβAおよびβSグロビン遺伝子を検出するのに使用される対応するオリゴヌクレオチドの翻訳された配列を記載する。オリゴヌクレオチド１０１および１０４はβA標的を検出し、同時に１０２および１０５は、標識化オリゴヌクレオチド１０７および１０４にそれぞれ連結すると、βS標的を検出する。オリゴヌクレオチド１０３および１０６は、βAまたはβSグロビン遺伝子標的をそれぞれ使用してＧ：ＴまたはＧ：ＡおよびＣ：ＡまたはＣ：Ｔのミスマッチ連結の効率を分析するために設計された。種々の生成物を変性したポリアクリルアミドゲルで分離したとき、様々な生成物を容易に識別させるためにオリゴヌクレオチドは僅かに長さを変えて設計された。標的配列に非相補的な末端は「リポーターグループ」であると考え得ることができる。従って、オリゴヌクレオチド１０７へのオリゴヌクレオチド１０１、１０２または１０３の連結は、それぞれ４５、４７または４９ヌクレオチドの長さを与える。相補鎖ではオリゴヌクレオチド１０９へのオリゴヌクレオチド１０４、１０５または１０６の連結は、それぞれ４６、４８または５０のヌクレオチドの長さを与える。オリゴヌクレオチドは計算Ｔｍ値が連結温度と同じかまたはそれより僅かに高い６６〜７０℃になるように設計された。
連結生成物を検出するために、オリゴヌクレオチド１０７および１０９は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して32Ｐおよび以下の実施例に記載のように−32Ｐで５'末端を標識した。
実施例８
（放射性標識化）
オリゴヌクレオチド１０７（０．１μg）を２０ｍＭトリシン、１０ｍＭ ＭgＣl2、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイオトール、および［32Ｐ］ＡＴＰを含むｐＨ８．０の３０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液２０μl中Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１５ユニットを加えて５'末端に標識した。３７℃で４５分間インキュベーション後、非標識化ＡＴＰを１ｍＭに加えて、インキュベーションをさらに２分間３７℃で行った。反応は０．５Ｍ ＥＤＴＡ０．５μlを加えて終結し、キナーゼを６５℃１０分間熱不活化した。取り込まれない32Ｐ標識をＴＥ緩衝液でまえもって平衡化しセファデックスＧ−２５でクロマトグラフにかけて除去した。特異的活性はオリゴヌクレオチド７×１０8〜１０×１０8ｃｐｍ／μgの範囲であった。
相補的対ミスマッチ標的に対する本発明のＴ．アクアチクス好熱性リガーゼ特異性をＬＤＲおよびＬＣＲ両条件で比較した（第３図および以下の第ＩＩ図、参照）。ＬＤＲ系において、２種の隣接したオリゴヌクレオチドを変性標的ＤＮＡおよびリガーゼとインキュベートし、そこで非標識化オリゴヌクレオチドの最終ヌクレオチドを標的ＤＮＡに対して相補性またはミスマッチした。オリゴヌクレオチドを末端の長さが僅かに異なるように設計し、様々な生成物の識別を容易にさせ、変性ゲルで分離できるようにした。従って、以前に開示されたように、標識化オリゴヌクレオチド１０７に対するオリゴヌクレオチド１０１（βA対立遺伝子）、１０２（βS）または１０３の連結は各々４５、４７または４９ヌクレオチドの長さを与える。相補的な鎖において、標識化オリゴヌクレオチド１０９に対するオリゴヌクレオチド１０４（βA対立遺伝子）、１０５（βS）または１０６の連結は各々４６、４８または５０ヌクレオチドの長さを与える。オリゴヌクレオチドを連結温度またはそれより僅かに高い６６℃〜７０℃の計算Ｔｍ値をもつように設計した。従って、完全な相補性（Ａ：Ｔ）で標的ＤＮＡにハイブリダイズする２種のオリゴヌクレオチドの連結の特異性は、各々可能なミスマッチ（Ａ：Ａ、Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ａ、またはＣ：Ｔ）と直接的に比較され得た。βAまたはβSグロビン遺伝子標的の存在下におけるそれらのオリゴヌクレオチドの連結の特異性を測定する方法を以下の実施例と同様に決定した。
実施例９
（好熱性リガーゼの特異性の測定）
標識化オリゴヌクレオチド（２０００００ｃｐｍ；０．２８ｎｇ；４０フェムトモル）および非標識化オリゴヌクレオチド（２７ｎｇ；４０フェムトモル）をｐＨ７．６で１００ｍＭ ＫＣl、１０ｍＭ ＭgＣl2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＮＡＤ、１０ｍＭジチオスレイトール、４μgサケ精子ＤＮＡ、および好熱性リガーゼ１５ニッククロージングユニットを含む２０ｍＭトリスＨＣl緩衝液１０μl中標的ＤＮＡの存在下に、鉱油１滴で液面を覆ってインキュベートした。反応物を９４℃１分間、ついで４分間インキュベートし、このサイクルを５〜３０回反復した。反応をＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、キシレンシアノール（０．２％）およびブロモフェノールブルー（０．２％）を含むギ酸８μlを加えて終結した。試料（４μl）をゲルに入れる（４００００cpm／lane）前に煮沸させて熱変性した。
生成物を、試料を８グループに分け、ゲル中で移動させ、ついで次ぎのセットを入れるという電気泳動により分離し、それによって第３図のオートラジオグラムの右側のややゆっくりとした移動性のバンドが明らかになった。電気泳動はｐＨ８．９の１００ｍＭトリスホウ酸緩衝液および１ｍＭ ＥＤＴＡ中７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクルリルアミドゲル中２時間６０Ｗの一定電力で行った。
１０分間１０％酢酸に浸し、ついで５分間水に浸して尿素を除去後、ゲルをワットワン紙３ｍｍで乾燥し、一夜−７０℃でコダックＸＡＲ−５フィルムで（デュポンクロネック照明と増強スリーンを使用または使用しないで）オートラジオグラムにかけた。２０サイクルからのバンドをゲルから切除し、放射能を分析した。結果を第２表に示す。
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このように、ＬＤＲ検定において、好熱性Ｔ．アクアティクスリガーゼが、全ての可能な不適正塩基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配列から相補的配列を判別することが示された。競合的及び個別的ライゲーション実験（相異なる塩濃度において）の両方において、最低の場合の不適正ライゲーションは１．５ないし１．０％（第２表、Ｇ：Ｔ及びＴ：Ｔを参照されたい）、一方他の場合は０．４％ないし＜０．１％（第２表、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｔ、Ｇ：Ａ及びＣ：Ａ）の生成物が相補的塩基対（Ａ：Ｔ）と共に形成された。これは大腸菌の中温生物Ｔ４リガーゼ［ジーン７６巻２４５頁（１９８９）参照］についての報告（放射活性検出を使用）より実質上良好である。
一連のＬＣＲ増幅／検出実験において、２つの隣接するオリゴヌクレオチドを、変性した標的ＤＮＡ及びリガーゼ、並びに相補的な組のオリゴヌクレオチドとインキュベートした。これらの条件の下では、非標識診断オリゴヌクレオチドの３'ヌクレオチドは、標的ＤＮＡと相補的または不適合のいずれかであるが、標識されていない対応物とは常に相補的である（即ち１０１及び１０４に対するＡ：Ｔ、１０２及び１０５に対するＴ：Ａ、並びに１０３及び１０６に対するＧ：Ｃ）。したがって、不適正オリゴヌクレオチドの最初の「正しくない」ライゲーションは、正しいライゲーションと同じ効率で順次増幅される。試料は、非標識オリゴヌクレオチドの対（βA対立遺伝子特異的１０１及び１０４、βS対立遺伝子特異的１０２及び１０５、または１０３及び１０６）を、標識オリゴヌクレオチドの相補的且つ隣接する対、１０７及び１０９と共に含んでいた。これらの標識及び非標識オリゴヌクレオチドを、リガーゼ及び１０アットモルの標的ＤＮＡ（ＬＤＲに対するより１００倍少ない標的ＤＮＡ）の存在下で実施例９のように２０または３０サイクルインキュベートした。得られたバンドを第３図の左部分及び第２表の下半分に示す。
第３図及び第２表でわかるように、本発明に係る好熱性リガーゼは、ＬＣＲ検定における全ての可能な不適正塩基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配列から相補的配列を判別することができた。競合及び個々のライゲーション実験の両方において、より悪い場合の不適正ライゲーションは１．３％ないし０．６％（Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ａ及びＡ：Ａ、Ｔ：Ｔ）、一方他の場合は＜０．２％（Ｔ：Ｔ、Ａ：Ａ及びＧ：Ａ、Ｃ：Ｔ）の生成物が相補的塩基対（Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ）と共に形成された。このように、本発明に係る好熱性リガーゼを用いるＬＣＲは、高い信号−雑音比で単一の塩基不適合を増幅し且つ検出できる唯一の方法である［ゲノミクス第４巻５６０頁（１９８９）］参照。したがって、ＬＣＲを利用することにより、βA及びβS間に存在するような単一の塩基不適合間の差異を検出することができ、また、この検定の結果を正常な、キャリアの、または罹患している患者の診断として使用することができる。
ＫＣｌ１００ｍＭの代わりに１５０ｍＭを含む緩衝液を使用して上記一連の実験全体を反復すると、結果は第３図及び第２表に作表されたものと本質的に同一であって、ＬＤＲに対する不適正オリゴヌクレオチドのライゲーションは正確に相補的な生成物の０．６％ないし＜０．３％の範囲、ＬＣＲに対しては１．７％ないし＜０．３％の範囲であった。このように、適合及び不適合オリゴヌクレオチド間の鋭敏な判別は、塩の条件に決定的に依存する訳ではないように思われる。
別法として、ホスファターゼに基づく別の方法を使用することもできる。ＬＣＲまたはＬＤＲ反応は、鉱油の下で１０μｌ容で実施できる。ここに細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）０．５単位を含有する１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０μｌ及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を加え、６５℃で２時間インキュベーションを続けた（リガーゼ酵素はこの条件下で死滅しないことに留意されたい）。共有結合で連結されるようになったオリゴヌクレオチドの５'末端の標識はもはやＢＡＰに対する感受性を持たない。担体としての１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理鮭精子ＤＮＡ２０μｌの添加によりライゲーション産物を一燐酸塩から分離し、５０％ＴＣＡ２０μｌで沈澱化する。１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後上清を除去すると、ペレット対ペレット＋上清の割合は、形成された生成物の百分率を与える。同様の検定をＴａｑＩエンドヌクレアーゼを用いて使用すると、正及び負の対照に対する実験誤差は１−２％前後である。
本発明に係る好熱性リガーゼの使用により、中温生物のリガーゼに対して求められる塩及び酵素の濃度の注意深い滴定の必要性が回避できる。この一連の実験からのデータを以下の第３表に示す。
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ＬＣＲ及びＬＤＲの特異性を、同一の標識オリゴヌクレオチドに対するライゲーションについての直接的競合においてβA及びβS特異的両ヌクレオチドを使用して試験した。１フェムトモルないし１アットモルの範囲の標的ＤＮＡ（βA、βS、及びβA及びβSの等モル比物）を使用する時、好熱性リガーゼは各場合において正しい生成物を特異的に形成し、ただ一つの標的対立遺伝子が存在する場合はバックグラウンドである正しくないライゲーション生成物は観察されなかった。）しかしながら、βS特異的生成物の形成効率はβA生成物の形成より幾分低く、２０サイクルの増幅の後、放射活性用に切り取った生成物を検定することにより定量したこのβS特異的生成物はβA特異的生成物のおよそ三分の一であった。よって、各々の標的配列の対立遺伝子の相対的初期濃度を定量するために、二つのオリゴヌクレオチドを区別をつけて標識する（例えば蛍光原子団を用いて）、直接的競合検定は、各々の対立遺伝子を注意深く滴定する必要がある。
さらに、アットモル以下の量の標的ＤＮＡを用いるＬＣＲ  ＤＮＡ増幅の特異性を調べた。管当り１００アットモル（６ｘ１０7分子）から１分子以下までの範囲の標的ＤＮＡの存在下におけるＬＣＲ  ＤＮＡ増幅の程度を調べた。反応物を２０または３０サイクルインキュベートし、生成物を第４図および以下の第４表に示されるように分離、定量した。
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第４図に示されるように、標的の不在下では、担体の鮭精子ＤＮＡ（４μｇ）が存在する場合、バックグラウンドの信号は検出されなかった。最初の標的濃度が高い場合ＤＮＡ増幅は２０サイクル後に本質上完結したが、最初の標的濃度が低い場合には、実質的により多くの生成物が、さらなる増幅サイクルで形成される。これらの条件の下では、最初の標的ＤＮＡ２００分子が３０サイクル後に容易に検出できるであろう。
この酵素の熱安定性は第４図で容易に明らかとなっている。２０サイクル後に形成された生成物の量を３０サイクル後に形成された量と比較することにより、低濃度の標的ＤＮＡの下では、追加の生成物がより多いサイクルの後に形成されることが明らかである（特に２ｘ１０4ないし２ｘ１０2標的ＤＮＡ分子）。換言すると、この酵素は９４℃１分間に続く６５℃４分間を２０サイクル行なった後にも尚活性を有している。
このようにＴ．アクアティクスリガーゼは、ＤＮＡを変性させる温度、即ち約１０５℃で約０．２５分間ないし約４分間の範囲に繰り返し暴露させた後、約５０℃ないし約８５℃の範囲の温度において、相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズした二つの隣接するオリゴヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する能力を保持している。
故に、ＬＣＲを用いる既知のヌクレオチド配列の核酸被験物質の特異的増幅は、（１）標的配列の核酸に対し相補的且つモル過剰であって、その隣接するオリゴヌクレオチドの連結部において該標的配列核酸との不適合が無い、二つの隣接するオリゴヌクレオチド；（２）標的配列の核酸に対し相補的且つモル過剰であって、この隣接するオリゴヌクレオチドの第二組の連結部において該標的配列核酸との不適合が無い、第一組の隣接するオリゴヌクレオチドに相補的な第二組の隣接するオリゴヌクレオチド；（３）約５０℃ないし約１０５℃の温度に付す時、不可逆的な変性をせず、その触媒能を失わない熱安定性リガーゼ；及び、（４）ＤＮＡを変性させる第一の温度（約９０℃ないし約１０５℃の範囲）及びハイブリダイゼーション／ライゲーションをさせる第二の温度（約５０℃ないし約８５℃）からなる反復する温度サイクルにこのリガーゼ混合物を付すこと、を必要とする。上記のβAグロビン対立遺伝子の増幅の場合、構成因子は、（１）オリゴヌクレオチド１０１及び１０７；（２）オリゴヌクレオチド１０４及び１０９；（３）Ｔ．アクアティクスリガーゼ；及び（４）９４℃１分間、続いて６５℃４分間の温度サイクル３０回、であった。
第４図において、４５及び４６ヌクレオチドのバンドはコード化及び相補的βAグロビンオリゴヌクレオチドのライゲーション産物に対応している。より低い分子量の産物は、最初のライゲーション反応に存在する除去オリゴヌクレオチドのライゲーションに相当する。試料は８個の群でロードしたため、オートラジオグラムの右側はゆっくりとした移動が現われている。
リガーゼが相補的及び不適正オリゴヌクレオチドを判別する能力をさらに試験するため、Ｇ−Ｔ及びＣ−Ａ不適合を与えるオリゴヌクレオチドの存在下及び不在下で、以下の実施例に従ってＬＣＲ実験を実施したが、この実施例はＤＮＡ増幅を示すのみならず実施例９に見いだされる酵素の熱安定性を支持するものである。
実施例１０
実験の一組は非標識１０１及び１０４オリゴヌクレオチド各４０ｆモルを含み、第二組はさらに４０ｆモルの非標識１０３及び１０６オリゴヌクレオチドを有していた。どちらの組も標識１０７及び１０９各４０ｆモルを含んでいた。標識されたオリゴヌクレオチド（２０００００ｃｐｍ；２８ｎｇ；４０ｆモル）及び非標識オリゴヌクレオチド（．２７ｎｇ；４０ｆモル）を、標的ＤＮＡ、即ち１００アットモル（６ｘ１０7分子）ないし０．０１アットモル（６ｘ１０3分子）の範囲のＴａｑＩ消化βAまたはβSグロビンプラスミドの存在下でインキュベートした。インキュベーションは、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、４μｇの鮭精子ＤＮＡ、及び１５ニック閉鎖単位のＴ．アクアティクスリガーゼを含む２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）１０μｌ中で実施し、鉱油一滴で覆った。反応物は９４℃で１分間、次に６５℃で４分間インキュベートし、このサイクルを２０または３０回反復した。
得られた試料を電気泳動し、クロネックス強化スクリーンを用いて一夜ゲルオートラジオグラフィーに付し、バンドを計数した。オートラジオグラフィー処理したゲルからのバンドを図４に示し、ＬＣＲ増幅の定量を以下の第Ｖ表に作表した。
0003889807.tif 000020
高い標的濃度においては、充分な不適正生成物が産生、視覚化され（図４のように）、不適正生成物の量は相補的生成物の１．８％ないし０．５％の範囲である。過剰の不適正標的ＤＮＡの使用（βAグロビンの代わりに管当り６ｘ１０7分子のβSグロビンＤＮＡ）はわずか２．１％及び１．５％の生成物を与えるのみであった。同じ量の生成物が、３０００ないし１００００倍少ない相補的標的ＤＮＡを使用する時に形成され得る。これに基づくと、正しく対になったライゲーション生成物からの信号は、競合または個別的ＬＣＲライゲーション条件の下では不適正生成物の５０ないし５００倍大きい。
低い標的濃度においては、ＤＮＡ増幅の程度は３．７ｘ１０4ないし１．７ｘ１０5の範囲であった（第４表及び第５表参照）。ライゲーションの効率が各サイクルで同一であると仮定すると、サイクル当りの平均増幅は４０及び５０％の間である。
無論、サイクル当りの効率は、緩衝剤の条件、酵素濃度、または温度サイクルの回数及び温度を変えることにより向上させ得る可能性があり、これらは全て当業者の能力の範囲内にある。例えば、好熱性リガーゼ（及び他のリガーゼ）のライゲーション効率が、ＮＨ4Ｃｌ、ＨＥＰＥＳ、スペルミジンのようなポリアミン類、またはポリエチレングリコールの使用といったような緩衝剤の組成を変えることにより向上させ得るということが示されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２５９巻１００４１頁（１９８４）、及びジャーナル・オブ・バイオケミストリー１００巻１２３頁（１９８６）参照］。現在使用されている緩衝剤中の各成分の量を変え、そして１またはそれ以上の成分を補足しまたは上に列挙した化学的及び生物学的成分（但しこれらに限定されない）と交換する事は、当業者にとっては容易なＬＣＲ改良方法の一つである。さらに当業者はサイクル回数及び温度を容易に変えることができる。例えば、後の時点において、存在する標的の大多数は前のＬＣＲ反応からのオリゴヌクレオチド生成物である。これらのオリゴヌクレオチドは短く（好ましくは４０ないし６０量体であるがこれに限定されない）、より速やかに融解し、より迅速な循環を可能とする。本発明において、成功したリガーゼ鎖反応は、９４℃０．５分間、続いて６５℃２分間の循環条件下で（好ましいリガーゼ鎖反応条件では９４℃で１分間の半分の時間、そして６５℃で４分間の循環時間）３０及び４０サイクルで完了した。ライゲーション温度及びＤＮＡ変性温度は共に実際の程度、持続時間、及び反復されるサイクルの回数の点で変えることができる。最適の条件は、完全に相補的な標的ＤＮＡの存在下で形成される生成物の量を最大とし、一方不適正な標的ＤＮＡの存在下または相補的標的ＤＮＡの不在下で形成される正しくない生成物の量を最小としなくてはならない。
これらの発見を利用して、臨床上の試料中の特異的オリゴヌクレオチド配列を検出する方法が開発された。試料の供給源は核酸を含む任意の材料または物質であってよい。この核酸は天然に存在する核酸である必要はなく、化学的、酵素的、または生物学的手段により合成されることができ、また、天然に存在するプリン類及びピリミジン類以外を有することができる。臨床的試料の供給源は細胞または非細胞であってよく、また、血液、血清、血漿、乳汁、便、膿、掻爬組織、洗液、尿等のような生理学的媒質から導かれ得る。さらに、この試料は、新生物細胞、リンパ球（例えばＴ細胞またはＢ細胞、単球、好中球等）のような一組のまたは１サブセットの細胞に関連していてよく；ウイルス、細菌、マイコプラズマ、真菌、原生動物等を含む病原体を包含し；構造物等、またはメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、ウイルス等のようなＲＮＡを含み得；そして構造遺伝子、非翻訳領域、調節領域、イントロン、エクソン等を含み得る。加えて、この検出は非常に様々な目的、例えば植物または動物種における可能性あるまたは実際の病態の診断、並びに病原体の組（セット）またはサブセットの検出、遺伝子工学の監視等のような目的のためのものであり得る。このような本発明が使用できる（そして前もってＰＣＲ増幅を行なう必要の無い、血液試料からの直接的ＬＣＲ対立遺伝子検出の実行可能性を明白に証明している）一つの方法は、例えば、ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立遺伝子の検出において具現される。高レベルのＤＮＡ増幅に基づき、正常（βAβA）、キャリア（βAβS）、及び鎌状赤血球（βSβS）のヒトから採集した血液からＤＮＡの対立遺伝子特異的ＬＣＲ検出を調べ、これをより詳細に以下の実施例に記載する。
実施例１１
（ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立遺伝子の検出）
全血０．５ｍｌからヒトゲノムＤＮＡを単離した［ＰＣＲテクノロジー、Ｈ．Ａ．アーリッヒ編、ストックトン・プレス（１９８９）、３６頁参照］。全血（０．５ｍl）を同容量のリシス緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．３２Ｍシュクロース含有）と混合した。短時間の遠心（エッペンドルフ卓上遠心機中１２０００ｒｐｍで１分間）の後、上清０．１５ないし０．２ｍｌ及びゆるくペレット化した核を残して上清を極めて注意深く除去した。このペレットを、さらに０．５ｍｌのリシス緩衝液中に攪拌しつつ再懸濁し、上記のように核をペレット化し、上清を除去した。この工程を、上清が透明または僅かに桃色となるまで３回または４回繰り返した。最後の上清を除いた後（やはり約０．１５ないし０．２ｍｌを残す）、非イオン性洗浄剤を含むＬＣＲ  ＤＮＡ緩衝液０．２５ｍｌ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び非イオン性洗浄剤ＮＰ４０及びトゥイーン２０各０．４５％を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６）を加えた。過剰のＲＮＡがあればそれを４ｍｇ／ｍｌの熱処理ＲＮアーゼＡ２μｌの添加により３７℃で１５分間消化した。蛋白があればそれを１０ｍｇ／ｍｌの新たに作成したプロテイナーゼＫ５μｌの添加及び５０℃で１ないし２時間のインキュベーションによって消化した。プロテイナーゼＫ及びＲＮアーゼＡをフェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルム、ｎ−ブタノール（２ｘ）による連続的抽出により除去し、エタノールを用いた沈澱化により核酸を回収した。試料はＬＣＲ検定への使用前に５分間煮沸した。
単離された各々のヒトゲノムＤＮＡを二つの反応混合物、即ち一方は正常なβA対立遺伝子の存在を試験し、二つ目は鎌状βS対立遺伝子の存在を試験する反応混合物中で試験した。第一の反応混合物は、βA試験オリゴヌクレオチド１０１及び１０４（各々０．２７ｎｇまたは４０ｆモル）、標識されたオリゴヌクレオチド（１０７及び１０９；２０００００ｃｐｍ（各々０．２８ｎｇまたは４０ｆモル）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、及び１５ニック閉鎖単位のＴ．アクアティクスリガーゼを含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）１０μｌに入れたゲノムＤＮＡ（血液１０μｌ、または約６ｘ１０4の凝集させた細胞に相当）を含み、鉱油一滴で覆った。第二の反応混合物は、βS試験オリゴヌクレオチド１０２及び１０５（各々０．２７ｎｇまたは４０ｆモル）、標識されたオリゴヌクレオチド１０７及び１０９（２０００００ｃｐｍまたは各々０．２８ｎｇまたは４０ｆモル）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、及び１５ニック閉鎖単位のＴ．アクアティクスリガーゼを含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）１０μｌに入れたゲノムＤＮＡ（血液１０μｌ、または約６ｘ１０4の凝集させた細胞に相当）を含み、鉱油一滴で覆った。
両反応混合物を９４℃で１分間、次いで６５℃で４分間インキュベートし、このサイクルを２０ないし３０回反復した。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、キシレンシアノール（０．２％）、及びブロムフェノールブルー（０．２％）を含有するホルムアミド８μｌの添加により反応を停止させた。
試料（４μｌ）はロード（４００００ｃｐｍ／列）前に３分間煮沸することにより変性させた。電気泳動を、１００ｍＭトリスほう酸（ｐＨ８．９）の緩衝液中７Ｍ尿素及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて、６０ワットの一定電力で２時間行なった。尿素を除去（１０％酢酸に１０分間浸漬し、次いで水に５分間浸漬）した後、ゲルをファットマンの３ｍｍ濾紙上で乾燥し、デュポン・クロネックス強化スクリーンを用いてコダックＸＡＲ−５フィルム上で−７０℃で一夜オートラジオグラフィーに付した。ヌクレオチド４５及び４６、または４７及び４８のライゲーション生成物が、それぞれβAまたはβSグロビン遺伝子の存在を示す。プラスミド由来の標的ＤＮＡについて言及したように、ライゲーション（故に検出）の効率は、βA特異的オリゴヌクレオチドよりβSの方が幾分低い。
第５図は、前述の実施例に従って作成されたヒトゲノムＤＮＡ中のβグロビン対立遺伝子の検出を示すオートラジオグラムである。ヌクレオチド４５及び４６、または４７及び４８のライゲーション生成物は各々βAまたはβSグロビン遺伝子の存在を表わす。このように、血液１０μｌに相当する標的ＤＮＡにより、対立遺伝子特異的ＬＣＲを用いてβA及びβS対立遺伝子が容易に検出できる。
故に、既知の正常なヌクレオチド配列を有する、及び該配列中の少なくとも一つの標的ヌクレオチド位置に既知の変異を有する可能性のある、生物学的に誘導された核酸被験物質の検出の成功は、（１）互いに相補的であり、標的配列の核酸に対し相補的である二組の隣接するオリゴヌクレオチドを含む第一の反応混合物（ここで、その隣接するオリゴヌクレオチドの結合部において、変異標的配列核酸に対しては少なくとも一つの不適正塩基対があるが、正常な標的配列核酸にはない）；（２）互いに相補的であり、標的配列の核酸に対し相補的である二組の隣接するオリゴヌクレオチドを含む第二の反応混合物（ここで、その隣接するオリゴヌクレオチドの結合部において、正常な標的配列ＤＮＡに対しては少なくとも一つの不適正塩基対があるが、変異標的配列核酸にはない）；（３）約５０℃ないし約１０５℃の温度に付す時に不可逆的に変性せずその酵素的能力を失わない熱安定性リガーゼ；及び（４）これらのリガーゼ混合物を、ＤＮＡを変性させる第一の温度（約９０℃ないし約１０５℃の範囲）、及びハイブリダイゼーション／ライゲーションを可能にする第二の温度（約５０℃ないし約８５℃の範囲）（これは各反応混合物中の隣接するオリゴヌクレオチドが或いは共有結合により連結するようにもさせ得る）からなる反復する温度サイクルに付す事；（５）被験物質及び結合していない被験オリゴヌクレオチドがあればそれを、共有結合により結合したオリゴヌクレオチド生成物（もし形成されていれば）から分離する事；及び（６）各反応混合物中の共有結合により結合したオリゴヌクレオチドの存在または不在を検出する事（それにより、第一の反応混合物中の共有結合により結合したオリゴヌクレオチド生成物の存在は正常な標的配列の存在を表わし、そして第二の反応混合物中の共有結合により結合したオリゴヌクレオチド生成物の存在は変異標的配列の存在を表わす）を必要とする。上に述べたβA及びβSグロビン対立遺伝子の検出において、構成成分は、（１）オリゴヌクレオチド１０１、１０４、１０７及び１０９；（２）オリゴヌクレオチド１０２、１０５、１０７及び１０９；（３）Ｔ．アクアティクスリガーゼ；（４）９４℃１分間、続いて６５℃４分間の３０温度サイクル；（５）４５％ホルムアミド中で煮沸することによる核酸の変性及び配列決定用ゲル上に分離する事；及び（６）ゲルのオートラジオグラフィーである。
この事は、ＰＣＲ増幅を必要としない本発明による血液試料からの直接的ＬＣＲ対立遺伝子検出の実行可能性を明確に立証するものである。
プラスミド由来の標的ＤＮＡについて述べたように、ライゲーションの効率（及び、故に検出）はβA特異的オリゴヌクレオチドよりβSに対する方が幾分低い。３０サイクルの増幅の後、放射活性用に切り取った生成物の検定により定量されたβS特異的生成物はβA特異的生成物のおよそ三分の一であった。この相違は、ライゲーション連結部における正確なヌクレオチド配列の作用であるか、またはＬＣＲ実験に用いられた特定のオリゴヌクレオチド（異なった５'尾を有する）の作用であり得る。しかしながら、それでも尚本発明は、二つのオリゴヌクレオチドが区別されて標識されている（例えば蛍光原子団によって、またはこの場合は異なった長さの尾によって）場合の、反応混合物中のいずれかの対立遺伝子の存在または不在を決定するための直接的競合検定を可能にする。一般化した形式において、本発明に係る方法は、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部において少なくとも一つの不適正塩基対を変異標的配列核酸に対して含むが正常な標的配列核酸に対しては含まないオリゴヌクレオチドの組を、一組の標識により標識し、そして、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部において少なくとも一つの不適正塩基対を正常な標的配列核酸に対して含むが変異標的配列核酸に対しては含まないオリゴヌクレオチドを、別の標識により標識する場合、同一容器内の二つの対立遺伝子の検定を可能にする。
比較し得る非放射活性検定においては、第６図に示されるように、最小限二つのオリゴヌクレオチドプローブを合成し、ライゲーション検定の特定の機能のために修飾する。一つのプローブは、ライゲーションに従うオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にするフックを含んでいる。このようなフックの一例はビオチンであり、これは適当な支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンにより捕捉されることができる。他のプローブはリポーター基を有する。放射性同位体または非放射活性の両方の様々なリポーター基が入手でき、且つ発蛍光団または発光原子団のように本発明に係る検定に使用することができるが、現在好ましいリポーターはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）に参加し得るリポーターである。より詳細には、第６図が、ビオチニル化された（Ｂ）及びジゴキシゲニン標識された（Ｄ）オリゴヌクレオチドがリガーゼ（矢印）の存在下でＤＮＡ標的とハイブリダイズする、ＥＬＩＳＡを基礎とするオリゴヌクレオチドライゲーション検定の概略化した図式を示している。ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは、微量定量プレートのウェル内部に被覆されたストレプトアビジン（ＳＡ）上に捕捉される。このウェルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合させた抗ジゴキシゲニン抗体（Ｄ）をウェルに加える。インキュベーション及び洗浄サイクルの後、アルカリホスファターゼ基質（Ｓ）を加え、ジゴキシゲニンを着色生成物の生成により検出する。
本発明に係る非放射標識検定は、幾つかの工程、即ち（１）ＤＮＡ標的の調製；（２）修飾オリゴヌクレオチドプローブの変性及びハイブリダイゼーション；（３）ライゲーション；（４）ビオチニル化プローブの捕捉；（５）遊離の非ビオチニル化オリゴヌクレオチド及び標的を除去するための洗浄；（６）アルカリホスファターゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体の添加；（７）結合していない抗体を除去するための洗浄；（８）アルカリホスファターゼ基質の添加；及び（９）分光光度法による分析、から成り立っている。以下のフローチャートに、本発明に係る非放射標識検定を実施する一般的手順（これは改良バイオメック１０００ワークステーション機器上で自動化されている）を詳説する：
0003889807.tif 000021
微量定量プレートにウェル当り１０μｌの増幅された標的を分注
ＤＮＡ標的にビオチニル化及びリポーターオリゴヌクレオチドを添加
（１０μlの２ｘライゲーションミックス中各オリゴヌクレオチド２００ｆモル）
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９３℃で２分間標的オリゴヌクレオチドミックスを変性
0003889807.tif 000023
室温（２５℃）で１５分間ライゲーション
ライゲーション反応を停止し、０．３Ｎ  ＮaＯＨ１０μlの添加により生成物を変性
３Ｍ酢酸ナトリウム４μlの添加により反応物を中和
反応物をアビジン被覆しブロックした微量定量プレートに移す
（アビジン被覆−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）６０μl中アビジン６０μｇ／ウェルを３７℃で６０分間；ブロッキング−アビジンをプレートから除去し、１００ｍＭトリスＨＣl、１５０ｍＭ  ＮaＣl、０．０５％トゥイーン、０．５％ドライミルク、及び１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ２００μｌ／ウェルを添加）
室温で３０分間ビオチニル化オリゴヌクレオチドを捕捉
結合していないオリゴヌクレオチド及び標的を除去するために、（１）０．０５％トゥイーン中１５０ｍＭ  ＮaＣl中１００ｍＭトリスＨＣl（ｐＨ７．５）；（２）０．０５％トゥイーン中０．０１Ｎ  ＮaＯＨ；及び（３）０．０５％トゥイーン中１５０ｍＭ  ＮａＣl中１００ｍＭトリスＨＣl（ｐＨ７．５）でプレートを洗浄
リポーターオリゴヌクレオチドにアルカリホスファターゼ結合抗体を添加；１００ｍＭトリスＨＣl（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣl、０．５％ドライミルク及び０．０５％トゥイーン中３０μl／ウェル
抗体をリポーターに結合させるためプレートを室温で３０分間インキュベーション
プレートを０．０５％トゥイーン中１００ｍＭトリスＨＣl（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮaＣlで洗浄して非結合抗体を除去
基質を添加
適当な比色、化学ルミネセンス、または蛍光産物についてプレートを読み取る
この検定を開始するのに必要なゲノム配列は、ＬＣＲ、３ＳＲ、及びＰＣＲを含む幾つかの異なった方法によって増幅することができる。本発明者等は、ＰＣＲ増幅を使用して、以下の第６表に列挙される訴訟検定のプライマーのためのＤＮＡ標的を取得した。
0003889807.tif 000024
ＤＮＡ５μｌ（ゲノムＤＮＡについては２ｎｇ／μｌまたはこれに代わる供給源からの処理試料５μｌ）を、０．０５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μｇ／ｍｌのゼラチン、０．１％トリトンＸ−１００、及び各々１．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含有するＰＣＲ緩衝液中で、増幅すべきＤＮＡ領域に特異的な一対のプライマーオリゴヌクレオチド（各々０．５μＭ）と混合することにより、ＤＮＡ増幅を実施した。この試料を軽鉱油６０μｌで覆い、９３℃で５分間標的を変性させ、そして９３℃２０秒間、５５℃４０秒間、及び７２℃１分間より成るサイクルに４０回付した。温度循環に続き、この試料を１０分間７２℃に付してＤＮＡ試料の伸長を完結させた。
オリゴヌクレオチドをこのライゲーション検定における特定の機能のために合成し修飾する。この検定は最小限二つの修飾オリゴヌクレオチドを必要とする。一方のオリゴヌクレオチドは、ライゲーションに従うオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にするフックを有する。この一例は、ストレプトアビジンまたはアビジン支持体上に捕捉され得るビオチニル化オリゴヌクレオチドである。他方のオリゴヌクレオチドはリポーター基を有し、これは、発蛍光団リポーターの場合、異なった発光スペクトルを有する多数のリポーターを容易に単一の検定に組み入れることができる。
ＥＬＩＳＡを基礎とする系のためには、遺伝子の対立遺伝子型を判別するプローブを５'ビオチン基をもって合成する。リポータープローブは酵素的または化学的に５'−ホスホリル化し、ハプテンジゴキシゲニンによって標識する。オリゴヌクレオチド５００ｐＭを、１０ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＣｏＣｌ2、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｎＭジゴキシゲニンｄＵＴＰ、０．０５μＭ  ｄＡＴＰ、及び酵素ターミナルトランスフェラーゼ１００単位（総容量２０μｌ）中で３７℃で１時間テーリングする事により、ハプテンをリポータープローブの３'末端に付加する。標識後、３Ｍ酢酸ナトリウム２μｌ及び酵母ｔ−ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）１μｌ及び９５％エタノール６０μｌを加える。オリゴヌクレオチドを４℃で５分間沈澱化し、次いで６５００ｘｇで５分間の遠心によって集める。ペレットを蒸留水２０μｌに再懸濁し、この工程を反復する。この沈澱化は、結合していない過剰のジゴキシゲニンを標識されたプローブから除去する。３種の病理学的状態についての対立遺伝子を判別するオリゴヌクレオチドの例を以下の第７表に示す。
0003889807.tif 000025
前記のフローチャートに含まれる手順を使用して幾つかの実験を実施し、発色の後４９０ｍＮの波長においてデータを分光光度的に得た。このような試験についての典型的な結果を以下の第８表に作表した。
0003889807.tif 000026
Ｔ４またはＴａｑリガーゼのいずれかについて比較可能な検出レベルが得られた。さらに、他の幾つかの疾病関連多形性について幾つかのライゲーション反応を実施し、同様の結果を得た。加えて、ヒトＴ細胞レセプター座における８つの異なった多形性を調べ、類似の検出結果を得た。故に本発明は、単一の塩基の置換、ＤＮＡ欠失または挿入、またはＤＮＡ翻訳からなるＤＮＡ多形性の分析に一般に適用可能であると思われる。
さらに、幾つかのアルカリホスファターゼ基質が、感受性化学ルミネセント基質（１０アットモル検出）を含む本発明のＥｌＩＳＡ検定に使用できる。この検定のフォーマットは、適当な微量定量フォーマットにおいて読み取ることのできる、発蛍光団のような他のリポーターフォーマットに対して容易に適合する。適当な発蛍光団フォーマットを組み入れることにより、例えばライゲーションによる複合分析が可能となる。この計画において、異なった対立遺伝子及び／または異なった遺伝子を判別するオリゴヌクレオチドが単一の検定で評価できる。さらに、直列のライゲーション検定（鎖状態のオリゴヌクレオチドのライゲーション）を、主要組織適合複合体遺伝子に存在するような間隔の密なＤＮＡ多形性の評価に使用することもまた可能である。特に上に述べた検定に対するこのような修飾は、充分本発明の範囲内にあると考えられる。
本発明は、広範囲のＤＮＡ診断スクリーニングに使用できる。例えば、係るＤＮＡ診断スクリーニングは以下の要約に従ったスクリーニングを包含し得るが、本発明の範囲をこれに限定する事を意図する訳ではない：
Ａ．伝染性疾患
１．ウイルス疾患：ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、肺炎（非Ａ、非Ｂ）
（i）血液及び組織スクリーニング
（ii）迅速な同定
（iii）過去の暴露から慢性の感染を識別
（iv）混合感染中の耐性菌株を識別
２．細菌疾患：マイコバクテリア、梅毒、クラミジア、レジオネラ、カンピロバクター、ニューモノシティス、リステリア、ライム、癩
（i）ゆっくりと増殖する微生物の迅速な同定
（ii）免疫不全患者の同定
（iii）食物汚染の試験
３．寄生虫疾患：マラリア、トリパノソーム、リーシュマニア
（i）「第三世界」の血液疾患の迅速な同定
（ii）旅行者及び軍隊のスクリーニング
Ｂ．遺伝疾患
１．単対立遺伝子疾患：嚢胞性線維症、デュシェン筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、β−地中海貧血、血友病Ａ、ゴーシェー、テイサックス、アルスハイマー、神経線維腫症
２．癌：網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、大腸癌、乳癌、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制因子
３．複対立遺伝子疾患：冠動脈心疾患、糖尿病、高血圧、精神分裂病、躁鬱病、アルコール中毒
（i）疾病素因
（ii）予防的医薬、運動、食餌
（iii）遺伝的スクリーニングおよびカウンセリング
（iv）遺伝子治療
Ｃ．遺伝学的同定
１．人間：ＨＬＡ分類、法医学
（i）組織移植
（ii）遺伝子連鎖分析
（iii）ヒトゲノムプログラム
（iv）行方不明の子供の肯定的同定
２．動物：馬、乳牛、畜牛、家庭の愛玩動物
（i）純粋な遺伝的形質
（ii）血統の確認
（iii）動物の肯定的同定
３．植物：種
（i）遺伝的多様性の保証
（ii）干ばつ及び病気に対する耐性種の同定
このように本発明者等は本発明の好ましい態様を説明及び記載してきたが、この発明は変化及び修飾を施すことができ、故に本発明者等は開示された正確な用語に制限されることを望まず、本発明を様々な用途及び条件に適合させるためになされるこのような変化および変更を利用することを望むということが理解されるべきである。したがってこのような変化および変更は、正しくは同等物の範囲全体の中にあるよう、そして故に以下の請求項の範囲内にあるよう、意図されている。
本発明の属する、または本発明が最も密接に関連する分野における通常の知識を有するいかなる者も本発明を作成及び使用できるよう、本発明及び方法及びこれを作成及び使用する工程を、このように完全な、明快な、簡潔な且つ正確な用語で記載してきた
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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