(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の１７位のＬｅｕから１００６位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１の１位のＭｅｔから１００６位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかをコードしている塩基配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列表の配列番号２の７９９位のＡから３８１６位のＣまでの塩基配列を含む請求項３記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１または２のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒト受容体型チロシンキナーゼ様構造を有する新規な受容体に関する。詳細には、Ｅｐｈファミリー型構造を有する受容体型チロシンキナーゼ様タンパク質に関する。
背景技術
細胞が周囲の環境から刺激を受ける手段として細胞間シグナル伝達機構が提唱されている。この機構のおかげで、細胞は互いに連絡をとり合い、生物体全体の利益になるように各細胞のふるまいを統合できる。つまり、細胞間シグナル伝達は、細胞の分化、増殖、接着、代謝および分泌のような多様な細胞プロセスの正確な調節に必須である。シグナル伝達の一般的な原理としては例えば、シグナルを与えるシグナル産生細胞からホルモン、成長因子、神経伝達物質などのシグナル伝達分子が分泌され、それに対して、シグナルを受け取る標的細胞が受容体と呼ばれる特定のタンパク質で応答する、という機構が挙げられる。これらのシグナル伝達分子の受容体への結合は、もとの刺激の増幅および多様な細胞プロセスの同調的調節の両者を引き起こす反応カスケードの引き金となり得る。
シグナル伝達プロセスの中心的特徴の１つは、ある種のタンパク質の可逆的リン酸化である。タンパク質内のアミノ酸残基のリン酸化または脱リン酸化は、調節されるタンパク質のコンホメーション変化の引き金となり、そのタンパク質の生物学的特性を変える。タンパク質のリン酸化はプロテインキナーゼにより行われる。プロテインキナーゼはそれが働くアミノ酸残基に応じて分類され、１つのクラスはセリン−スレオニンキナーゼであり、これはセリンおよびスレオニン残基に働き、そして他のクラスはチロシンキナーゼであり、これはチロシン残基に働く。多くの癌遺伝子産物および成長因子受容体が内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を有していることが発見されて以来、チロシン残基におけるタンパク質のリン酸化は大きな関心を持たれ始めた。今日では、成長因子のシグナル伝達、細胞周期進行および悪性形質転換におけるチロシン残基のリン酸化の重要性は十分に認識されており、そして発癌性タンパク質の大きなグループを構成するチロシンキナーゼの活性化あるいは過剰発現が正常な成長制御の経路を破壊し、発癌をもたらすことも分かっている[Hunter, 1991]。チロシンキナーゼをはじめとしたプロテインキナーゼは受容体であると規定することも、即ち、膜貫通型のリガンド結合性タンパク質であると、あるいは非受容体であると規定することもできる。
上記のように、受容体型チロシンキナーゼは種々の細胞型の細胞増殖および細胞分化において重要な役割を果たしている[Aaronson, 1991 ; Schlessinger & Ullrich, 1992]。受容体型チロシンキナーゼとして、これまでに上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン等と結合する数多くの受容体が報告されている。受容体型チロシンキナーゼは細胞外領域のドメイン構成や細胞内チロシンキナーゼ構造の相同性から、いくつかのサブファミリーに分類される。Ｅｐｈファミリーはこれらのサブファミリーの１つであり、細胞外領域に１個のシステインリッチドメインと２個のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインを有していることを特徴とし、Ｅｐｈ、Ｅｃｋ、Ｅｌｋ、Ｃｅｋ５、Ｃｅｋ７など多くの受容体がこのファミリーのメンバーに含まれる[Tuzi & Gullick, 1994]。
発明の概要
Ｅｐｈファミリー受容体のいくつか（Ｅｌｋ、Ｍｅｋ４、Ｓｅｋ、Ｃｅｋ５、Ｅｈｋ１、Ｅｈｋ２）は脳に特に高発現しているため、神経細胞の生存・維持や軸索の伸展などへの関与が示唆されており、また多くのＥｐｈファミリー受容体は初期胚において高い発現がみられることから初期胚発生過程における重要な役割も示唆されており、Ｅｐｈファミリー受容体は非常に興味深いタンパク質である。そこで、本発明者らは、Ｅｐｈファミリー受容体のメンバーであるＨｔｋ遺伝子のキナーゼドメインをプローブに用い、新たなＥｐｈファミリー受容体の遺伝子を単離することを試みた。その結果、ヒト正常組織に発現している特異なＥｐｈファミリー受容体遺伝子を発見し、この遺伝子によりコードされるタンパク質をＨＥＰ（Human Eph-like Protein）受容体と命名した。ＨＥＰ受容体は以下に詳細に述べるようにキナーゼ活性に必須でありすべてのチロシンキナーゼで不変とされる１０個のアミノ酸残基のうち６つが別の残基と置換されていることから特異な機能を有していると予想される。
即ち、本発明は、ＨＥＰ受容体を始めとした、特異な構造を有しているＥｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼ様タンパク質に関する。好ましくは、本発明のタンパク質は、Ｅｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼにおけるＡＴＰ結合部位にある不変リジン残基およびリン酸転送部位にある不変アスパラギン酸残基がそれぞれグルタミン残基およびセリン残基に置換されている。また、この２つの置換に加えてさらに、Ｅｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼにおけるサブドメインＩＩＩ内の不変グルタミン酸残基およびキナーゼサブドメインＶＩ内の不変アスパラギン残基がそれぞれアルギニンおよびセリンに置換され、かつキナーゼサブドメインＶＩＩ内のＡｓｐ−Ｐｈｅ−ＧｌｙのトリプレットがＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのトリプレットに置き換わっているタンパク質も好ましい。特に好ましいタンパク質は、配列表の配列番号１の１７位のＬｅｕから１００６位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むタンパク質であり、これがＨＥＰ受容体である。なお、シグナル配列を包含する１位のＭｅｔから１００６位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明の範囲内に包含される。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質をコードしている塩基配列を含むＤＮＡ分子も提供する。好ましいＤＮＡ分子は、配列表の配列番号２の７９９位のＡ（アデニン）から３８１６位のＣ（シトシン）までの塩基配列を含むＤＮＡ分子である。
用語の説明
上記のアミノ酸残基の前に冠した「不変」なる用語は、６５種のプロテインキナーゼのアミノ酸配列を並べてその配列の共通性を調査したHanksら(1988)により初めて見出された、種々のプロテインキナーゼが共通して有しているキナーゼ活性に必須と考えられる構成アミノ酸残基を示すものである。Hanksらによれば、この不変アミノ酸残基は１０ヶ所あり、ウシアデノシン３’，５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットのα型（ｃＡＰＫ−α）の配列を用いて示せば次の通りである：
Gly52、Ala70、Lys72、Glu91、Asp166、Asn171、Asp184、Gly186、Glu208、Arg280。
また、「キナーゼサブドメイン」とは、同じくHanksらにより見出された、プロテインキナーゼが細胞内領域に有している、高い保存性を有する配列と低い保存性を有する配列との繰り返し構造におけるその高い保存性の配列である[Hanks, 1988]。キナーゼサブドメインは１１個からなり、それぞれギリシャ数字を付して区別される。
「ＡＴＰ結合部位」とはサブドメインＩＩ内にある、ＡＴＰとの結合に関与する部位である。「リン酸転送部位」とはサブドメインＶＩ内にある、ＡＴＰのリン酸基と相互作用する部位である。
発明の開示
特異な構造を有する本発明のＥｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼ様タンパク質について、ＨＥＰ受容体を中心にさらに詳細に説明する。
ＨＥＰ受容体をコードするＤＮＡ分子の単離
ヒトＨｔｋ（Hepatoma transmembrane kinase)のキナーゼドメインに相当するプローブを作成し、それを用いてヒト脳および血液細胞ｃＤＮＡライブラリーを、比較的弱いストリンジェンシー条件下、クロスハイブリダイゼーション法によりスクリーニングする。これにより、特異な構造を有するＨＥＰ受容体をコードするＤＮＡ分子が単離される。ＰＣＲ法も多くのキナーゼタンパク質に共通する配列をプライマーとして相同遺伝子を単離するために一般的に用いられているが、本発明のようなコンセンサス配列に置換がみられるタンパク質をコードするＤＮＡ分子のクローニングには不利である。
ＨＥＰ受容体の一次構造
単離したＨＥＰ受容体をコードするＤＮＡ分子からそのアミノ酸配列を推定した。１位のメチオニン残基（配列表２の７９９位から８０１位のＡＴＧコドンに相当）は翻訳開始部位に典型的な保存配列に囲まれている[Kozak、1984]（図２参照）。その後にはシグナルペプチドに特徴的な疎水性アミノ酸配列[Von Heijne、1986]が後続している。もう１つの疎水性アミノ酸配列（アミノ酸５７８−６０３）は膜貫通ドメインとして機能しているようである。このドメイン（ＴＭ）はＨＥＰ受容体分子を細胞外領域（ＥＣＤ）と細胞内領域（ＩＣＤ）とに分割している（図１参照）。
図１は、ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡクローンの構造模式図およびそのハイドロホビシティー分析（Kyte and Doolittle）の結果を示す。ハイドロホビシティー分析における正の値は疎水性の残基であることを示す。図中、Ｓは推定シグナルペプチドを、ＴＭは推定膜貫通ドメインを、ＵＴＲは非翻訳領域を、ＳｍはＳｍａＩ制限酵素部位を、ＳａはＳａｃＩ制限酵素部位を、ＳｔはＳｔｕＩ制限酵素部位を、そしてＨはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位をそれぞれ示している。
既知Ｅｐｈファミリー受容体とＨＥＰ受容体との相同性
コンピューター分析により、ＨＥＰ受容体のアミノ酸配列はＥｐｈファミリー受容体チロシンキナーゼと高い相同性を有していることが判明した。鳥類Ｅｐｈファミリーの１つであるニワトリ胚キナーゼ９（Ｃｅｋ９）と最も高い相同性が見られ、次いでラットＥｐｈ様キナーゼ（Ｅｌｋ）およびヒトＥｐｈ関連キナーゼ（Ｅｒｋ）およびその鳥類相同物Ｃｅｋ５との相同性が高い。ＨＥＰ受容体のアミノ酸配列はＣｅｋ９、Ｅｌｋ、ＥｒｋおよびＣｅｋ５と比較して全体としてそれぞれ５９％、４８％、４７％および４７％の相同性を有し、細胞外では５７％、４４％、４４％および４２％、細胞内では６０％、５４％、５０％および５３％の相同性をそれぞれ有している。
これらの相同性の理解の便のため、図２を示す。図２は、ＨＥＰ受容体の推定アミノ酸配列をＣｅｋ９およびＥｌｋのアミノ酸配列と平行して並べて（アライメントさせて）示すものである。推定シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインは四角で囲っている。Ｃｅｋ９およびＥｌｋの列における点「．」はＨＥＰ受容体のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基であることを示し、「−」は残基が存在しないことを示す。黒塗り逆三角「▼」は保存システイン残基を示す。細胞外領域における２個のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインにはそれぞれ実線を施している。細胞内領域におけるキナーゼサブドメインにはギリシャ数字Ｉ−ＸＩを付している。また、細胞内領域における保存チロシン残基には星印を付している。ｐｐ６０c-srcのＴｙｒ416に対応する、主要な自己リン酸化部位の１つであるチロシン残基には２つの星印を付している。矢印はイントロンが存在する位置を示す。また、白抜き文字のアミノ酸残基はＨＥＰ受容体では置換されているがすべてのチロシンキナーゼでは不変である不変アミノ酸残基を示す。
ＨＥＰ受容体の細胞外領域における配列上の特徴
ＨＥＰ受容体における５７７個のアミノ酸の細胞外領域はＥｐｈファミリーと幾つかの構造的特徴を共有しており、その特徴には例えば、２０個の保存システイン残基を含有する１つのシステインリッチな領域および２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの存在がある（図２）。従って、本発明のＨＥＰ受容体はＥｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼと判断される。
ＨＥＰ受容体の細胞内領域における配列上の特徴
１）キナーゼサブドメイン
Hanksら(1988)により見出された、すべてのプロテインキナーゼがその細胞内領域に有しているキナーゼサブドメインは１１個からなる。ＨＥＰ受容体はその１１個すべてのキナーゼサブドメインを細胞内領域に有している。
２）保存チロシン残基
ＨＥＰ受容体はチロシンキナーゼタンパク質が有すべき保存チロシン残基を保持している。
３）その他の保存部分の特徴
プロテインキナーゼのみならず、多くのヌクレオチド結合タンパク質において見出されている配列として、キナーゼサブドメインＩ内に保存配列：Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ[Hanks, 1988]がある。ＨＥＰ受容体は６６２−６６７位にこの保存配列：Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−ＧｌｙとしてＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを含んでいる。
さらに、ＨＥＰ受容体は、Hanksら(1988)の図から明らかな７０位の不変アラニンに相当する不変アラニンを６８５位に有している。
４）不変アミノ酸の置換
ＨＥＰ受容体はキナーゼドメインにおいてすべてのプロテインキナーゼで不変とされるアミノ酸残基のうち６ヶ所が置換されている。
第１に、ＨＥＰ受容体のアミノ酸配列は、ウシアデノシン３’，５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットのα型（ｃＡＰＫ−α）[Hanksら、1988]内のＬｙｓ72に相当する、ＡＴＰ結合部位内の不変リジンがグルタミンに置換されている（ＨＥＰ受容体の６８７位、図２参照）。第２に、キナーゼサブドメインＶＩのリン酸転送部位の不変アスパラギン酸（ｃＡＰＫ−αではＡｓｐ166に対応）がＨＥＰ受容体ではセリン（７８０位）に置き換わっている。ただし、その周囲の残基は良好に保存されている。第３に、キナーゼサブドメインＩＩＩ内の不変グルタミン酸（ｃＡＰＫ−αではＧｌｕ91に対応）がアルギニン（７０４位）に置き換わっている。第４に、キナーゼサブドメインＶＩ内の不変アスパラギン（ｃＡＰＫ−αではＡｓｎ171に対応）がセリン（７８５位）に置き換わっている。さらに、ほぼ大部分のチロシンキナーゼで保存されているｃＡＰＫ−αではＡｓｐ184、Ｐｈｅ185およびＧｌｙ186に相当するトリプレットはＨＥＰ受容体ではそれぞれＡｒｇ798、Ｌｅｕ799およびＧｌｙ800となっており、前の２つが変化している。
これら６つの置換は正常なヒト脳および血液細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンのみならず、正常なヒト膵ｃＤＮＡから単離されたクローンにおいても観察された。なお、これらのライブラリーは由来する個体が相互に異なっている。さらに、ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡ配列に従って作成したプライマーを用いるＰＣＲにより、これらの置換が正常なヒトゲノムＤＮＡクローンにおいても確認された。これらの実験結果は、上記６つの置換が、遺伝子の転写および複製時の誤りによる変異でなく、またｃＤＮＡ作成時のエラーによる人工的な変異でもなく、そして個体差に由来する遺伝子多型に基づくものでなく、むしろ本来的な置換であることを明らかに示している。
５）欠損部分の特徴
ＨＥＰ受容体は、ｐｐ６０c-srcのＴｙｒ416に相当する主要な自己リン酸化部位である、サブドメインＶＩＩ内の高度に保存された１４個のアミノ酸配列を欠いている[Schlessinger & Ullrich、1992]。これらのアミノ酸残基は細胞内シグナル分子との結合にとって重要であると考えられる［Kavanaughら, 1995］。ＨＥＰ受容体遺伝子のヒトゲノムＤＮＡ断片のヌクレオチド配列分析により、サブドメインＩおよびＩＸ間には２つのイントロンが存在していることが見出された。３’側イントロン（０．7kb）が、ちょうどこの１４個の欠損アミノ酸配列の部位に位置していた。しかし、３つの可能性ある解読枠のいずれをとっても、イントロン中にはこの欠損アミノ酸配列に対応する配列が見出されなかった。従って、スプライシングの異常によりこの欠損が生じているのでないことが分かる。
ＨＥＰ受容体の組織分布
ＲＮＡブロット分析により、ＨＥＰ受容体の組織分布を調べると、脳および膵にて非常に強い発現があり、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋および腎臓などの他の組織では弱い発現パターンを示すことが判明した（図３）。また、ＨＥＰ受容体タンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法およびイムノブロッティング法により、正常ヒト脳、正常ヒト末梢血単核細胞、ヒト白血病細胞（ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞）より、ＨＥＰ受容体タンパク質を検出した。
このように、ＨＥＰ受容体は広く正常組織にて発現していることが判明した。上記のようにＨＥＰ受容体が特異な構造を有していることを考えると、正常組織に広く分布している事実は特記すべき事項であり、これはＨＥＰ受容体が細胞の正常な機能に何らかの寄与をなしている裏付けになるものである。
なお、ＨＥＰ受容体遺伝子座のヒト染色体マッピングを行い、ＨＥＰ受容体遺伝子がヒト染色体領域７ｑ３３→ｑ３５に位置していることを確認した。
ＨＥＰ受容体における機能の考察
上記のように、ＨＥＰ受容体遺伝子の推定アミノ酸配列はチロシンキナーゼに共通する構造上の特徴、即ちキナーゼサブドメイン、保存チロシン残基を有しており、さらにＥｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼのアミノ酸配列と非常に高い相同性を示す。そして、推定アミノ酸配列から判断すると、ＨＥＰ受容体は膜結合型受容体であり、従って細胞増殖、分化を特異的に制御していると想像される。従って、ＨＥＰ受容体のリガンドが特定できれば、そのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに応用できる。
なお、ＨＥＰ受容体は特異な構造を有していることから、その機能について以下の考察が可能である。即ち、正常ヒト脳、膵および血液細胞由来の複数の独立したＨＥＰ受容体ｃＤＮＡクローンについて注意深く行った塩基配列解析から、ＨＥＰ受容体は、すべての既知のチロシンキナーゼにおいて保存されているキナーゼ活性にとって重要なキナーゼドメイン内のアミノ酸１０ヶ所のうち６ヶ所が置換されていることが示された。特に、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）結合部位のリジンおよびリン酸転送部位のアスパラギン酸の２ヶ所がそれぞれグルタミンおよびセリンに置き換わっている。このことから、ＨＥＰ受容体はキナーゼ活性を欠いている可能性が示され、以下の実施例により実際にキナーゼ活性を欠くことが判明した。
受容体型チロシンキナーゼの高度に保存されたアミノ酸残基における点突然変異によって、幾つかのヒト疾患およびマウスの変異種が引き起こされることが分かっている。例えば、糖尿病患者の中には、インスリン受容体におけるキナーゼドメイン内の保存アミノ酸残基に点突然変異が認められるものがある[Moller & Flier、1991]。そして、ＨＥＰ受容体においてグルタミンに置換されたＡＴＰ結合部位の不変リジンは、キナーゼ活性に必須の残基であることが示されている[Hanksら、1988]。ｖ−Ｓｒｃ、ｖ−Ｍｏｓ、ｖ−Ｆｐｓ、ＥＧＦ受容体、インスリン受容体およびＰＤＧＦβ−受容体のＡＴＰ結合部位のリジン残基に対して部位特異的突然変異を導入すると、得られたすべての突然変異体は内因性チロシンキナーゼ活性を喪失することが示された[Hanksら、1988 ; Escobedoら、1988]。同様に、ＨＥＰ受容体ではセリンに置き換わっているキナーゼサブドメインＶＩのリン酸転送部位のアスパラギン酸は既知のすべてのプロテインキナーゼにて不変とされている[Hanksら、1988]。このリン酸転送部位のアスパラギン酸がアスパラギンに置き換わっている他の受容体型チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔのネズミＷ42型突然変異体においては、ホモ接合体では致死的であり、ヘテロ接合体では重症貧血を引き起こす[Tanら、1990]。この変異はｃ−ｋｉｔ受容体のリガンド依存性自己リン酸化を廃絶させたのである。ｖ−ｆｐｓ、ｃ−ｆｍｓおよびマウスｆｌｋ２／ｆｌｔ３の上記と同じアスパラギン酸に“Ｗ42”型の変異を導入すると、自身の受容体型チロシンキナーゼのキナーゼ活性が喪失した[Moranら、1988 ; Reithら、1993 ; Marocら、1993]。最近、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである、キナーゼドメインの不変アミノ酸残基のうちの３つが置換しているｅｒｂＢ３も内因性キナーゼ活性を喪失していることが示された[Guyら、1994]。これらの報告は、上記のような変異を有している本発明のＨＥＰ受容体がキナーゼ活性を欠くということを支持している。
以下の実施例にて示しているように、ＨＥＰ受容体タンパク質の内因性チロシンキナーゼ活性の有無について検討した。簡単に説明すれば、まず、ＨＥＰ受容体に特異的なリガンドがまだ同定されていないため、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｃ−ＦＭＳ）受容体（ＦＭＳ）のリガンド結合部位をもつキメラ受容体、即ちＦＭＳ受容体の細胞外領域とＨＥＰ受容体の細胞内領域からなるキメラ受容体（以下、ＦＭＳ／ＨＥＰ受容体と称す）およびＦＭＳ受容体の細胞外領域とＨＴＫ（Hepatoma transmembrane kinase）受容体の細胞内領域からなるキメラ受容体（以下、ＦＭＳ／ＨＴＫ受容体と称す）を作製し、これらの受容体タンパク質を用いてin vitro kinase assayを行う。その結果、ＦＭＳ／ＨＴＫ、ＦＭＳ受容体では明らかなチロシン残基のリン酸化がみられたが、ＦＭＳ／ＨＥＰ受容体ではチロシン残基のリン酸化は見られなかった。従って、ＨＥＰ受容体は内因性チロシンキナーゼ活性を欠如していると考えられる。
成長因子受容体のキナーゼ活性欠損型の大部分は病原受容体として記載されている。例えば、キナーゼ活性欠損型インスリン受容体は真性糖尿病を引き起こし、キナーゼ活性欠損型ｃ−ｋｉｔ受容体はヒトあるいはＷマウスの限局性白斑症を引き起こす［Mollerら, 1991; Giebelら, 1991; Tanら, 1990］。人為的にＦＧＦ受容体あるいはＴｅｋ受容体の変異型を構築すると、それぞれ原腸形成（嚢胚形成）あるいは脈管形成の不全がみられる［Amayaら, 1991; Dumontら, 1994］。内因性チロシンキナーゼ活性が欠損しているｅｒｂＢ３は正常ヒト上皮組織や脳で発現しているが、いくつかのヒト悪性疾患においてむしろ過剰に発現している［Krausら, 1989; Altiokら, 1995; Moscosoら, 1995］。そして、それが腫瘍形成においてかぎとなる役割をはたしていると考えられる［Krausら, 1993; Alimandiら, 1995］。最近になって、２種のＦｌｔ／Ｆｌｋ様受容体遺伝子Ｋｌｇ（kinase-like gene）およびＣｃｋ−４（colon carcinoma kinase-4）もまた、キナーゼ領域の保存アミノ酸配列内の置換によってキナーゼ活性を欠いていることが発見された[Chou＆Hayman、1991 ; Mossieら、1995]。これらの遺伝子はまた、トランスフォームした細胞あるいは腫瘍細胞に選択的に発現しており、正常ヒト組織には殆ど発現していないことが報告されている。ＨＥＰ受容体は脳を含む正常ヒト組織において豊富に発現しており、他の多くのＥｐｈファミリーチロシンキナーゼ受容体も同時に発現している。従って、このようなＨＥＰ受容体の生理機能を明確にすることは非常に重要である。
キナーゼ活性を欠く変異型受容体は正常型受容体とヘテロダイマーを形成し、ドミナントネガティブ（変異型の優性）に働き得る。例えば、ヒトにおける白斑と白髪を特徴とする限局性白斑症という先天性疾患と同様の症状を呈するＷマウスの幾つかの表現型は、すべてのチロシンキナーゼにて不変とされるアミノ酸残基のうち１ヶ所が置換されている変異型ｃ−ｋｉｔ受容体のドミナントネガティブ効果に起因することが示されている[Tanら、1990]。他にも、ｃ−ｆｍｓ−、ＰＤＧＦβ−、インスリン−およびＴｅｋ−変異型受容体では、ＨＥＰ受容体で見られたＡＴＰ結合部位のリジン残基やリン酸転移部位のアスパラギン酸残基におけるアミノ酸置換によって充分にドミナントネガティブ型の受容体となっている[Rayら、1991 ; Reithら、1993 ; Uenoら、1993 ; Grakoら、1994 ; Domontら、1994]。これらの先行する観察結果は、同様の構造的変異を有するＨＥＰ受容体がＥｐｈファミリー受容体のシグナル伝達にドミナントネガティブ型の受容体として参加するかもしれないことを示唆している。
ＨＥＰ受容体の機能に関してさらにもう１つの可能性がＥＧＦ受容体ファミリーのｅｒｂＢ３に関する最近の報告から考えられる[Carraway & Cantley、1994]。ｅｒｂＢ３は、キナーゼ活性の正常な他のＥＧＦ受容体ファミリーとヘテロダイマー化しリン酸化され、他のＥＧＦ受容体ファミリーの自己リン酸化では集まらないタイプのＳＨ２タンパク質のための結合部位を提供する、と考えられている。それゆえに、ｅｒｂＢ３はＥｐｈファミリー受容体に増幅／修飾的に作用すると考えられる[Alimandiら、1995]。ｅｒｂＢ３はキナーゼドメイン内の不変アミノ酸残基のうち３ヶ所が置換されており、内因性チロシンキナーゼ活性を欠いていることから、ＨＥＰ受容体も同様に他のＥｐｈファミリー受容体に増幅／修飾的に作用する可能性がある。
最近、大部分のＥｐｈファミリーのリガンドとその受容体は、リガンド結合の特異性の観点から２つの主要なサブクラスに分類されることが示された［Galeら, 1996］。Ｅｐｈファミリーのリガンドはいずれも、同じサブクラスに属する複数の受容体アイソフォームと結合できる[Brambillaら、1995]。従って、ＨＥＰ受容体の細胞外領域のアミノ酸配列がＥｌｋ、Ｅｒｋ／Ｃｅｋ５、Ｃｅｋ９などの他のＥｐｈファミリー受容体との間でよく保存されていることから、ＨＥＰ受容体のリガンドはこれらの受容体と結合するかもしれない。
キナーゼ活性を欠如しているＥｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼ様タンパク質の製造
上記のＨＥＰ受容体をコードしているＤＮＡ分子が得られれば、遺伝子工学の手法を用いてＨＥＰ受容体を発現させることができる。例えば、得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、常法に従って宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を適当な条件にて培養する。宿主細胞としては、動物細胞、昆虫細胞のみならず、大腸菌、酵母などでもよい。動物細胞としてはＣＨＯ−Ｋ１細胞等が挙げられる。
また、別の本発明タンパク質は、ＨＥＰ受容体のアミノ酸配列に置換、欠失、付加などの変異を導入することで製造することができる。変異を導入する手法としては、合成オリゴヌクレオチドやＰＣＲ法による部位特異的突然変異誘発法、および他の当業者に周知の方法が挙げられる。
実施例
実施例１
ＨＥＰ受容体をコードするＤＮＡ分子のクローニング
文献[Itoら., 1993]に記載されているようにしてヒト脳および血液細胞からλｇｔ１０ファージｃＤＮＡライブラリーを作成し、１×１０6個の独立したクローンを得た。得られたクローンをニトロースフィルターに写し、アルカリによりＤＮＡを変性した。次いで、ヒトＨｔｋ（Hepatoma transmembrane kinase）[Bennetら、1994]のキナーゼドメイン（ヌクレオチド１８０３−２９０７）[Bennettら、1994]に相当する32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、λファージクローン２７個を単離した。このスクリーニングでは、３５％w/vホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）、１×Denhardt's溶液、５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％ＳＤＳおよび１００ｍｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中、４２℃にて１８時間、ハイブリダイズした[Matsuiら、1989]。２７個すべてのλファージクローンに挿入されているｃＤＮＡのサイズを電気泳動により測定し、この中でサイズが明らかに異なる５つのクローンのヌクレオチド配列の両鎖をSequenase Version ２．０[United States Biochemical、クリーブランド、ＯＨ]によって配列決定した。次いで、得られた配列をＢＬＡＳＴプログラム[京都大学化学研究所]を用いて配列分析した。得られた結果を図１に示す。このヌクレオチド配列分析により、クローンφ４９は、７９８個のヌクレオチドの５’側-非翻訳領域と１９１個のヌクレオチドの３’側-非翻訳領域を伴う、１００６個のアミノ酸をコードする３０１８個ヌクレオチドのオープン解読枠を含有していることが判明した。別の４つのクローンは、重複領域ではクローンφ４９と同一の制限酵素部位およびヌクレオチド配列を有していた（図１）。
実施例２
ＨＥＰ受容体ヒト遺伝子および膵由来ｃＤＮＡの単離
φ４９クローンの膜近傍(juxtamembrane)ドメインおよびキナーゼサブドメインＸをブランキングする以下のプライマーを用い、ヒトゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った：
0003987115.tif 000002
ＰＣＲでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ[Promega社]を用い、９５℃；５分、９４℃；３０秒、６０℃；３０秒、７２℃；２分のサイクルを９５回行った。この同じプライマーを用いてヒト膵ＲＮＡに対し、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。逆転写酵素はギブコ−ＢＲＬ社製のものを用い、他のＰＣＲの条件は先のＰＣＲ条件と同じである。次いで、ヒトゲノムＤＮＡおよび膵ＲＮＡから逆転写酵素を用い作製したｃＤＮＡ断片を既述のようにして配列決定した。これらの配列は実施例１にて入手したｃＤＮＡの配列と同一であった。
実施例３
ＨＥＰ受容体の組織分布
心臓、脳、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎、および膵の８つの組織由来のポリアデニル化ＲＮＡ２μｇを前もってブロットしておいたヒト多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット[Clontech Laboratories, Palo Alto, Ca]を、製造元の教示に従って32Ｐ標識ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。また、対照として、ＨｔｋｃＤＮＡプローブおよびヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブともハイブリダイズした。
得られたブロットを、２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ中にて２０分間、室温で２回洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて２０分間、５０℃にて２回洗浄し[Matsuiら、1989]、オートラジオグラフィーにかけた。得られた結果を図３に示す。
８つのヒト成人正常組織から得たポリアデニル化ＲＮＡをＲＮＡブロット分析すると、サイズがφ４９ｃＤＮＡクローンに相当する４．０ｋｂの単一のバンドがすべての組織において見出された。しかし、これは脳および膵にて非常に強い発現パターンであり（図３、レーン２および８）、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋および腎臓などの他の組織では弱い発現パターンであった（図３、レーン１、３、４、５、６および７）。このように、本遺伝子がヒト正常組織において広く発現していることは、本遺伝子産物が正常組織で機能していることを示唆するものである。なお、ＨＥＰ受容体のクローニングに使用したＨｔｋ遺伝子はＨＥＰ遺伝子とは異なる発現パターンを示した。
同様にして、▲１▼胎児の大脳、▲２▼網膜、▲３▼甲状腺、▲４▼副腎、▲５▼睾丸、▲６▼気管、▲７▼唾液腺、▲８▼小腸、▲９▼胸腺、▲１０▼ヒト末梢血白血球、▲１１▼骨髄細胞、および▲１２▼ＣＤ３４陰性造血幹細胞、▲１３▼ＣＤ３４陽性造血幹細胞の各組織についてノーザンブロット行なった。結果を図４に示す（上記において各組織に付した番号が、図４のレーン番号である）。
図４は、ＨＥＰ受容体が胸腺に強く発現し、他方小腸には殆ど発現していないことを示している。このことは、ＨＥＰ受容体が中枢神経系のみならず免疫系、特にＴリンパ球の発生・分化においても重要な役割を果し、神経−免疫ネットワークにも関与している可能性を示唆している。
実施例４
染色体ハイブリダイゼーション
標準的な方法に幾つかの改変を加え[Takaiら、1994]、Ｒ−バンド染色体を調製した。健常男性から得た末梢血リンパ球をフィトヘモグルチニン[ウェルカム、HA15]で刺激し、ＴＣ１９９培地[ギブコ−ＢＲＬ]にて培養した。４８時間後、チミジン（３００μｇ/ｍｌ、シグマ）を加えた。１５．５時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ブロモデオキシウリジン（２５μｇ／ｍｌ）で６．５時間処理した。染色体の調製は標準的な方法に従った[Takai, Sら、(1994) Hum. Genet., 93, 198-200]。スライドをヘキスト３３２５８（１μｇ／ｍｌ）で染色し、３分間加熱し、７５℃にて２０Ｗブラックライト[東芝 FL20SBLB, 日本]に６分間暴露した。この暴露したスライドを蒸留水ですすぎ、使用するまで−８０℃で保存した。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における蛍光用プローブとしてφ８クローンから誘導した２．２ｋｂＨＥＰ受容体ｃＤＮＡプローブを使用した。プローブの標識はビオチン１６−ｄＵＴＰ[ベーリンガー・マンハイム社]を用いたニックトランスレーションによって行った。次いで、ハイブリダイゼーションは文献[Takaiら、1994]に記載されているようにして行った。文献[Takaiら、1994]に記載されているフルオレセイン・アビジンＤＣＳ(Cell Sorting grade)[ベクター・ラボラトリー社]およびビオチニル化抗-アビジン山羊抗体［ベクター・ラボラトリー社]を用い、シグナル増幅の操作を行った。得られたスライドをプロピジウム・ヨウダイド（０．５μｇ／ｍｌ）で染色した。ニコンＯＰＴＩＰＨＯＴ−２−ＥＦＤ２顕微鏡（Ｂ−２Ａフィルター）を用いて観察した。染色体の顕微鏡写真撮影にはコダックＥｋｔａｃｈｒｏｍｅフィルム（ＡＳＡ１００）を用いた。上記の２．２ｋｂＨＥＰ受容体ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした５０個のヒト中期（初期）細胞のうち、３２個の細胞が少なくとも１つの第７染色体のバンドｑ３３→ｑ３５上に対称性二重スポット（symmetrical double spots）を示した。３つの細胞はそれぞれ、同じ領域の両第７染色体に対称性二重スポットを示した。他の領域には同時に対称性二重スポットは検出されなかった。従って、ＨＥＰ受容体の遺伝子はヒト染色体領域７ｑ３３→ｑ３５に位置していると結論づけられる。
実施例５
ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＨＥＰ受容体タンパク質の発現
ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡの全コード領域を含む３．３ｋｂのフラグメント（塩基配列６５８−４０２２位）をｐＨβＡＰｒｌｎｅｏ発現ベクター［Gunningら, 1987］に導入した。直径６ｃｍの培養皿上の約３０，０００個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Chen−Okayama法［Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987)］に従って１０μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換した。次いで、７００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）の存在下でＧ４１８耐性細胞を選択した［Itoら, 1993］。
実施例６
免疫沈降法およびイムノブロット分析によるヒト正常組織におけるＨＥＰ受容体タンパク質の発現の確認
ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡより予想されるＣ末端アミノ酸配列に基づいたペプチド（LHHIQLLQQHLRQQGSVEV）をグルタルアルデヒドを用いてkeyhole limpetのヘモシアニンと結合させたものや、ＨＥＰ受容体細胞内領域（配列番号１の５７７番目のアルギニンから１００６番目のバリン）ｃＤＮＡを用い大腸菌に発現させたタンパクを家兎に免疫して家兎抗血清を作製した。
正常ヒト脳組織、正常ヒト末梢血単核細胞およびヒトＴ細胞性白血病細胞（ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞）をそれぞれＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で２回洗浄し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／２０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭフッ化ナトリウム／０．０２％アジ化ナトリウム／１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド／１６．５μｇ/ｍｌアプロチニン／１．０μｇ/ｍｌロイペプチン／１．２５μｇ/ｍｌペプスタチンを含む溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解物は遠心分離（１４，０００×ｇ、３０分）で非溶解物を取り除き、免疫前血清およびprotein-G-Sepharose（Pharmacia）で前処理した後、上記で作製した抗ＨＥＰ血清を用い免疫沈降を行った。
Protein-G-Sepharoseによる沈降物あるいは全細胞溶解物はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、Immobilon（Millipore）フィルターに転写し、125Ｉ−プロテインＡを用いたイムノブロット分析によって解析した。
まず、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図５中、ＣＨＯ−Ｋ１と示す）、完全長ＨＥＰ  ｃＤＮＡ発現ベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクタント（図５中、ＣＨＯ−ＨＥＰと示す）、および正常ヒト脳（図５中、Brain#1、Brain#2と示す）の細胞溶解物は、初めにＨＥＰ特異的ペプチド（Ｃ末側）に対する家兎抗ペプチド血清により免疫沈降した。同血清によるイムノブロッティングを、免疫原として使用されたペプチドの存在下（図５中、Blocking(+)と示す）ないしは非存在下（図５中、Blocking(-)と示す）で行った。
その結果、図５に示すように、抗血清によりＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクタントでは１３５ＫＤの位置（図５中、
0003987115.tif 000003
で示されるバンド）にＨＥＰ受容体タンパク質が検出されたが、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞では検出されなかった。また、ペプチドの存在下では１３５ＫＤのバンドは特異的に消失していた。さらに、該抗血清により正常ヒト脳から、同一の分子量をもつＨＥＰ受容体タンパク質が免疫沈降された。これらの結果はＨＥＰ受容体遺伝子産物がヒト正常組織において発現していることを強く支持するものである。
また、細胞内領域タンパク質を抗原とした家兎抗血清でもマウス脳組織、ヒト末梢血単核細胞およびヒト白血病細胞に発現する同一分子量１３５ＫＤのＨＥＰ受容体タンパク質をイムノブロッティングにより検出した。
また、更に、ＨＥＰ受容体の細胞外領域（配列番号１の２３番目のアスパラギン酸より５７６番目のグルタミン酸）に対するマウスモノクローナル抗体を作製し、これを用いたイムノブロッティングやフローサイトメトリーにより、正常マウス脳、正常ヒト末梢血単核細胞、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のＨＥＰ受容体タンパク質を検出した。
実施例７
ＨＥＰ受容体の内因性チロシンキナーゼ活性の有無の検討
（１）ＨＥＰ受容体とＨｔｋ受容体の細胞外領域がマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体（ＦＭＳ）のものに置換されたキメラ受容体、ＦＭＳ／ＨＥＰおよびＦＭＳ／ＨＴＫを作製した。
まず、ＦＭＳ／ＨＥＰキメラ受容体のｃＤＮＡを作製するために、ＰＣＲ法を用いてＦＭＳ受容体ｃＤＮＡ（Genbank accession No. X03663）の１８４２位の部分にＢｓｐＥＩサイトを導入した。次いで、ＢｓｐＥＩサイトの部分（ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡの２５２０位）でＨＥＰ受容体の細胞外領域をコードするフラグメントとＦＭＳ受容体の細胞外領域をコードするフラグメントとを置き換えた。同様に、ＥｃｏＲＩサイトをＦＭＳ受容体ｃＤＮＡの１８３４位とＨｔｋ受容体ｃＤＮＡ（Genbank accession No. U07695）の１６９０位の部分に導入し、Ｈｔｋ受容体の細胞外領域をコードするフラグメントとＦＭＳ受容体の細胞外領域をコードするフラグメントをＥｃｏＲＩサイトで置き換えた。さらに、インフルエンザウィルスのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ配列を、各々のキメラ受容体ｃＤＮＡのＣ末端に加えた。最後に、全てのＰＣＲ産物の塩基配列を確認した。キメラ受容体の塩基配列は、各々の対応する領域において、元の受容体のアミノ酸配列をコードしていた。また、キメラ受容体はＣＨＯ−Ｋ１細胞で等しく発現されていた。
（２）In Vitro Kinase Assays
上記（１）で作製したキメラ受容体のｃＤＮＡ、および完全長のＦＭＳ受容体ｃＤＮＡの発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入・発現してこれら受容体タンパク質を作製した。発現量を確認するために野生型のＣＨＯ−Ｋ１細胞（図６中、ＣＨＯ−Ｋ１と示す）とＣ末にＨＡアミノ酸配列をもつ２つのキメラ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターのトランスフェクタント（図６中、ＦＭＳ／ＨＥＰおよびＦＭＳ／ＨＴＫと示す）を、最初に抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５；Boehringer Mannheim社）で免疫沈降した。その免疫沈降物を電気泳動後、抗ＨＡモノクローナル抗体を用いたイムノブロット法にて検出した（図６左側のパネル）。
野生型のＣＨＯ−Ｋ１細胞と、ＦＭＳ受容体ｃＤＮＡのトランスフェクタント（図６中、ＦＭＳと示す）は、抗ＦＭＳ血清にてイムノブロットした（図６右側のパネル）。抗ＦＭＳ受容体血清は、ＦＭＳ受容体タンパク質（VAKIGDFGLARDIM）を家兎に免疫することにより作製した。
その結果、図６Ａに示すように、各キメラ受容体および完全長ＦＭＳ受容体はＣＨＯ−Ｋ１細胞中でよく発現していた。
次いで、上記抗ＨＡモノクローナル抗体による免疫沈降物（ＦＭＳ／ＨＥＰキメラ受容体タンパク質、およびＦＭＳ／ＨＴＫキメラ受容体タンパク質）および抗ＦＭＳモノクローナル抗体（３−４Ａ４；Santa Cruz Biotechnology社）による免疫沈降物（ＦＭＳ受容体タンパク質）を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）／１ｍＭジチオスレイトール／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2／１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2を含むキナーゼ緩衝液中で２回洗浄した。ペレットを、２０μＭ  ＡＴＰを加えたあるいは加えていないキナーゼ緩衝液４０μｌ中でインキュベートした。ヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下あるいは非存在下で、３０℃で１０分間インキュベートした後、２×Laemmli緩衝液４０μｌ中で３分間煮沸することによって反応を止め、イムノブロット分析に付した。チロシン−リン酸化受容体は、Tsukamoto, T. ら, J. Biol. Chem., 266: 10143-10147, 1991に記載されているように、抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体ＰＹ−２０（ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA）で検出した。
その結果、図６Ｂに示すように、ＡＴＰ存在下でのＦＭＳ／ＨＴＫ受容体とＦＭＳ受容体のチロシンリン酸化は観察されたが、ＦＭＳ／ＨＥＰ受容体のチロシンリン酸化は検出されなかった。チロシンリン酸化のリガンド依存的増加はＦＭＳ／ＨＥＰ受容体やＦＭＳ／ＨＴＫ受容体において引き起こされず、ＦＭＳ受容体において引き起こされ。これらの結果は、Ｅｐｈファミリー受容体に含まれるＨｔｋ受容体に対する可溶性リガンドが、天然の膜結合リガンドのように、受容体自己リン酸化を十分には引き起こすことができないという以前の報告［Bennettら, 1995; Brambillaら, 1995］と一致するものである。結局、ＨＥＰ受容体は内因性チロシンキナーゼ活性を欠如していると考えられる。
発明の効果
本発明のヒト正常組織にて高度に発現されるキナーゼ活性欠損受容体タンパク質の発見は、Ｅｐｈファミリー受容体型チロシンキナーゼによる正常な細胞機能制御のメカニズムに対して新たな展望をもたらすものである。
また、上記のように、ＨＥＰ受容体は膜結合型受容体であり、細胞機能を特異的に制御していると想像される。従って、ＨＥＰ受容体のリガンドが特定できれば、そのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに応用できる。
さらに、ＨＥＰ受容体をコードするＤＮＡ分子は、プローブとして利用することができる。従って、本願のＤＮＡ分子を利用すれば、ＰＣＲ法によってもＨＥＰ受容体のような特異な構造を有する受容体を見出すことが可能となる。
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配列表
配列番号：1
配列の長さ：1006
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0003987115.tif 000004
0003987115.tif 000005
0003987115.tif 000006
0003987115.tif 000007
0003987115.tif 000008
配列番号：2
配列の長さ：4022
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
0003987115.tif 000009
0003987115.tif 000010
0003987115.tif 000011
配列番号：3
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
0003987115.tif 000012
配列番号：4
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
0003987115.tif 000013
【図面の簡単な説明】
図１  ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡクローンの構造模式図およびそのハイドロホビシティー分析の結果を示すグラフである。
図２  ＨＥＰ受容体の推定アミノ酸配列をＣｅｋ９およびＥｌｋのアミノ酸配列とアラインメントさせて表示するものである。
図３  ＨＥＰ受容体遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す図面に代わる写真である。
図４  ＨＥＰ受容体遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す図面に代わる写真である
図５  野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図中、ＣＨＯ−Ｋ１）、完全長ＨＥＰ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクタント（図中、ＣＨＯ−ＨＥＰ）および正常ヒト脳（図中、Brain#1, Brain#2）の、抗ＨＥＰ血清を用いたイムノブロッティングの結果を示す図面に代わる写真である。
図６  Ａ．野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図中、ＣＨＯ−Ｋ１）、ＦＭＳ／ＨＥＰキメラ受容体およびＦＭＳ／ＨＴＫキメラ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞トランスフェクタント（図中、ＦＭＳ／ＨＥＰおよびＦＭＳ／ＨＴＫ）の、抗ＨＡモノクローナル抗体によるイムノブロッティング、および野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞とＦＭＳ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞トランスフェクタント（図中、ＦＭＳ）の、抗ＦＭＳ血清によるイムノブロッティングの結果を示す図面に代わる写真である。
Ｂ．ＦＭＳ／ＨＥＰ受容体タンパク質、ＦＭＳ／ＨＴＫ受容体タンパク質およびＦＭＳ受容体タンパク質のin vitro kinase assayの結果を示す図面に代わる写真である。
【図１】
0003987115.tif 000014
【図２−１】
0003987115.tif 000015
【図２−２】
0003987115.tif 000016
【図２−３】
0003987115.tif 000017
【図３】
0003987115.tif 000018
【図４】
0003987115.tif 000019
【図５】
0003987115.tif 000020
【図６】
0003987115.tif 000021