(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えにより産生されたＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）を適切な生物に免疫して得られた、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの１０−５０アミノ酸領域に結合し、天然のＮ末端ｐｒｏＢＮＰとの反応性を有する抗体であって、同時にＮ末端ｐｒｏＢＮＰに結合しうる、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの異なるエピトープを検出する少なくとも２種の抗体を用いて、サンドウィッチ型式で行なう、試料中におけるＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法。
【請求項２】
健常者から得られた試料とＮＹＨＡ−クラスＩ〜ＩＶの心不全患者から得られた試料との間の識別のための、請求項１記載の方法の使用。
【請求項３】
請求項１記載のＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法における標準としての組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰの使用。
【請求項４】
１９９９年１月２６日にＤＳＭＺに寄託された細胞株Ｍ１０．１．１１（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２３８６）又はＭ１３．４．１４（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２３８７）により生産される抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの異なるエピトープを検出する少なくとも２種の抗体を用い、試料中におけるＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法に関する。該方法は、健常者試料とＮＹＨＡクラスＩ〜ＩＶの患者試料とを識別または分類するのに使用される。さらに本発明は、組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰおよびそのＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法における標準としての使用、組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰを検出する抗体およびそれらの生産に関する。
【０００２】
心不全は、特に西洋諸国に広く見られる現象である。ロッシュ医学辞典（Roche medical dictionary）（1993, Urban & Schwarzenberg ）によると、心不全は、心臓が急性または慢性的に、運動中または安静時の代謝に必要とされる血流を生じたり、静脈逆流（後方心不全および前方心不全）を確実にすることができないことである。したがって心臓のポンプ機能は弱い。心不全の原因は、非常に複雑である。特に、心筋の炎症性変化および変性変化、冠状動脈灌流障害（coronary perfusion disorder ）、冠状動脈の梗塞および損傷がここで挙げられる。これは、末梢の血流の変化、呼吸障害、腎機能不全および電解質代謝不全（浮腫（oedeme））ならびに骨格の筋肉系の能力低下につながる。
【０００３】
ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association）（ＮＹＨＡ）によれば、心不全は、労働(koerperlichen) 後の身体検査を用いて以下のＮＹＨＡクラスに分類される。Ｉは、通常の肉体労働後に痛みが全くないことを意味し、ＩＩは、肉体的強靭さの制限が低いことを意味し、ＩＩＩは、肉体的強靭さの制限が高いことを意味し、ＩＶは、各肉体的活動とともに機能不全症状が増大し、これが多くの場合、安静時にも存在することを意味する。
【０００４】
グリコシド、血管拡張薬、ＡＣＥインヒビターおよび/ またはβ遮断薬による有効な心不全の薬物治療のためには、まず始めに、心不全を正確に診断し、可能であれば、重篤度に応じてそれを分類し、さらに治療の経過を監視することが必要である。
【０００５】
当該技術分野の水準に従って、例えばＡＮＰ（Ｎ末端心房性ナトリウム利尿ペプチドホルモン）およびｐｒｏＡＮＰ、ＣＮＰ（Ｃ−ナトリウム利尿ペプチド）、アドレノメジュリン（Adrenomedullin）、神経ペプチドＹ、エンドセリンおよびＢＮＰ（脳ナトリウム利尿ペプチド）などの、心不全の早期診断のためのいくつかの血清マーカーを論じる。ＡＮＰおよびｐｒｏＡＮＰは、一般に心不全の診断用マーカーとして好適であるが、それらは、あまり安定でないか、または血中で短い半減期しか有さず、診断測定に対して障害を示す（Clin. Sci. 95(3)(1998), 235-239; Clelandら、Heart 75 (1996), 410-413）。
【０００６】
頻繁に言及される重要なマーカーはＢＮＰ（脳ナトリウム利尿ペプチド）である。ＢＮＰは、最初にブタの脳で同定された。これは、構造的および機能的にＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）に類似する心臓ホルモンである（Sudoh ら、Nature 332 (1988), 78-81）。３２個のアミノ酸からなるヒトＢＮＰは、主に心臓の心室から分泌され、ヒト血漿中で循環する。診断用マーカーとしてのＢＮＰの使用は、例えばＥＰ−Ａ−０  ５４２  ２５５で知られている。ＢＮＰは、分子内ジスルフィド結合を有し、おそらく、速やかに分解されなければならないというホルモンとしてのその生理的機能のため、分析物としてあまり安定でない。したがって、その診断用マーカーとしての使用は、ごく限られている（Masutaら、Clin. Chem. Vol. 44 No.6 Supplement A (1998), 130; Tsujiら、Clin. Chem. 40 (1994), 672）。
【０００７】
ＢＮＰの前駆体分子、すなわちｐｒｏＢＮＰは、１０８個のアミノ酸からなり、そのうちＢＮＰと称する前記３２個のＣ末端アミノ酸（７７−１０８）が実際のホルモン性効果を発揮する。該前駆体から放出されるＮ末端アミノ酸１−７６をＮ末端ｐｒｏＢＮＰと称する。ＢＮＰ（７７−１０８）に加えて、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）もまた血漿中で循環し、さらに産物を分解するため（Huntら、Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995), 1175-1183 ）、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰもまた心不全のマーカーとして関連性がある。前駆体分子ｐｒｏＢＮＰもまた血漿中に存在するか否かは、完全に解明されていない。しかしながら、血漿中のｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の少量の放出が検出可能であるが、Ｎ末端で非常に早く部分分解するために、いくつかのアミノ酸が存在しないことが記載されている（Huntら、Peptides, Vol. 18, No. 10 (1997), 1475-1481 ）。この分子を、本明細書において高分子量ＢＮＰと称する。
【０００８】
国際公開第９３／２４５３１パンフレット（米国特許第５，７８６，１６３号明細書）には、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰを同定する免疫学的方法およびそれに使用される抗体が記載されている。これらの抗体を得るため、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの配列に由来する、合成により作製した一本鎖ペプチドがここで使用されている。ペプチド免疫感作による抗体の生産は、原理的には可能であるが、分子全体の親和性が低すぎるため試験手順において必要な感度に達しない。また、ペプチドを用いた場合、得られる抗体は、例えば該ペプチドのＣ末端を同定し得、したがって分子全体のこの断片にのみ結合しうるという危険がある。この結果から、これらの抗体は、分子全体に結合することができないか、または低い程度までしか結合できない。国際公開第９３／２４５３１パンフレットでは、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに由来する単一の一本鎖ペプチドに対するポリクローナル抗体が産生される。産生された抗体は、競合試験形式において免疫感作ペプチド（アミノ酸４７−６４）に結合することが示されている。しかしながら、該抗体が、試料中において分子全体として天然のＮ末端ｐｒｏＢＮＰに結合しうることは示されていない。また、試料中において、国際公開第９３／２４５３１パンフレットに記載されたサンドイッチ試験は、適切な標準物質がなく、２種の異なるエピトープに対する抗体もないため、記載のようには行い得ない。
【０００９】
当該技術分野の水準におけるさらなる問題は、試験の感度である。ウサギ血清由来のポリクローナル抗体への結合について、トレーサーとしての標識された形態のペプチド４７−６４が試料または非標識標準ペプチド４７−６４と競合する、国際公開第９３／２４５３１パンフレットにおいて行われた競合試験では、インキュベーションの４８時間後でごく普通の競合しか達成されず、これからは、約２５０ｆｍｏｌ／ｍｌの低い検出限界しか誘導されえない。これは、健康な個体と心不全を患う患者とを識別するのに不十分であり、患者試料を心不全の重篤度で識別分類するのにも不十分である。また、長時間のインキュベーションの競合試験は、自動化された研究所での試料の日常的な測定には許容されえない。
【００１０】
Huntら（Clinical Endocrinology 47 (1997), 287-296 ）にはまた、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの検出のための競合試験が記載されている。このためには、測定の前に血漿試料の複雑な抽出が必要であり、これは分析物の破壊および測定誤差につながりうる。使用された抗血清は、国際公開第９３／２４５３１パンフレットと同様にして、合成ペプチドでの免疫感作により産生される。Huntらは、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰアミノ酸１−１３による免疫感作により抗血清を産生させ、アミノ酸１−２１からなるペプチドを標準として使用する。この試験でも、長時間のインキュベーションが必要である。２４時間のインキュベーション後、１．３ｆｍｏｌ／ｍｌの下限検出限界が達成される。
【００１１】
したがって、当該技術分野の水準では、短時間のインキュベーションで、信頼性のある感度の高い天然Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの検出を可能にするＮ末端ｐｒｏＢＮＰの検出方法がない。
【００１２】
したがって、当該技術分野の現状における上記欠点を可能な限り回避しつつ、試料中のＮ末端ｐｒｏＢＮＰを同定する方法を提供することが目的であった。特に、健常者の患者試料とＮＹＨＡクラスＩ〜ＩＶの患者の試料とを識別(Differenzierung) するために、高い試験感度を達成すべきである。
【００１３】
この目的は、特許請求の範囲により詳細に説明された試料中のＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法を用いて達成されるこの方法は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの異なるエピトープを検出する少なくとも２種の抗体を使用することを特徴とする。
【００１４】
本発明の方法において重要なことは、天然Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰが試料中で検出されることである。これは、抗体が、試料中において、インタクトな分子とおそらく存在する未切断のｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、および可能であれば部分的にタンパク質分解により消化された断片をも同定し、特異的に結合することができなければならないことを意味する。本方法では、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの異なるエピトープに結合する少なくとも２種の異なる抗体が使用される。エピトープは、直鎖状または所謂コンホメーションエピトープであってもよい。好ましくは、エピトープは、両方の抗体を同時に且つ互いに離れ過ぎないように結合させるように配置されている。
【００１５】
本発明の方法は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰおよび親ペプチド（分解生成物）間の識別しないので、以下、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、試験手順で同定された全てのペプチド、特に公知のＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）を意味する。
【００１６】
本発明によれば、「エピトープ」という用語は、抗体が特異的に結合する抗原等の免疫学的な結合パートナー上の結合部位を意味する。通常、エピトープは、６−８アミノ酸によって明確に定義される。本発明によれば、結合パートナーとは、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰまたはその部分配列に相当する。抗体が結合するエピトープは、結合パートナーの部分領域を構成する。エピトープは、直鎖型またはコンホメーションエピトープとして存在しうる。
【００１７】
異なる特異性を有する２種の抗体を用いて、当該技術分野の現状の長い競合試験手順の代わりに、より迅速に分析対象物(analyten)を同定する方法を実行することが可能である。本発明の検出方法は、同質(homogener) もしくは異質(hetrogener)試験手順を用いて実施することができる。好ましくは、同質試験手順が用いられ、特に好ましくは当業者に公知であるサンドイッチ手法が用いられる。
【００１８】
好ましくは、このようなＮ末端ｐｒｏＢＮＰの測定方法は、以下のステップに沿って行われる：
ａ）固相に結合するのに適した基を有する第１のＮ末端ｐｒｏＢＮＰ特異的抗体と試料とを混合するステップ、または、固相に既に結合させている第１のＮ末端ｐｒｏＢＮＰ特異的抗体と試料とを混合するステップ、
ｂ）この溶液を、該第１の抗体(erste Antikoeper)のものとは異なるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのエピトープを同定し標識を有する第２の抗体(zweiten Antikoerper) と混合するステップ、
ｃ）ステップａ）で既に存在し得る、固相に、免疫複合体を結合させるステップ、
ｄ）該液相から該固相を分離するステップ、
ｅ）片方または両方の相において標識を検出するステップ。
【００１９】
定量測定において、規定量のＮ末端ｐｒｏＢＮＰを標準物として用いて同じ測定法を実行し、試料の測定の後、ステップｆ）、すなわち標準物の測定値と試料の測定値との比較が行われ、ついで定量化が行われる。
【００２０】
本発明によれば、「抗体」という用語は、遺伝子操作による修飾によって得られるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体等、ならびに当業者に公知であるＦ（ａｂ' ）2 、Ｆａｂ' またはＦａｂフラグメントなどの全てのフラグメントを意味する。Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰへの免疫特異的結合能だけは保証されなければならない。
【００２１】
Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに特異的な第１の抗体は、固相に直接結合されうるか、または特異的結合系を介して間接的に結合されうる。固相へのこの抗体の直接的な結合は、当業者に公知の方法、例えば、吸着法に従って行う。結合が特異的結合系を介する間接的なものである場合、第１の抗体は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに対する抗体と特異的結合系の反応パートナーとからなるコンジュゲートである。本明細書において、特異的結合系とは、互いに特異的に反応し合うことができる２種のパートナー（相手）を意味する。この結合能は、免疫学的反応または異なる特異的反応に基づきうる。好ましくは、ビオチンとアビジンとの組合せまたはビオチンとストレプトアビジンとの組合せが特異的結合系として用いられる。さらに好適な組合せは、ビオチンと抗ビオチン；ハプテンと抗ハプテン；抗体のＦｃフラグメントとこのＦｃフラグメントに対する抗体；または炭水化物とレクチンである。それにまた、特異的結合系の反応パートナーの一方は、そのコンジュゲートの一部である。
【００２２】
特異的結合系における第１の結合パートナーの他方の反応パートナーは、該固相の層である。好ましくはストレプトアビジンまたはアビジンが使用される。不溶性担体物質への特異的結合系の他方の反応パートナーの結合は、当業者に公知の通常の方法に従って実行することができる。ここでは、共有結合および吸着(adsorptive)結合が好適である。
【００２３】
固相としては、その内側表面が特異的結合系の反応パートナーでコーティングされた試験管であって、ポリスチレンまたは同様のプラスチックでできた試験管またはマイクロタイタープレートが適している。さらに、適切且つ特に好適な物質は、ラテックス粒子、磁性粒子、分子篩物質、ガラス小体、およびプラスチックチューブ等の粒子状物質等である。例えば、紙やニトロセルロースなどの多孔性の層状担体も、担体として使用することができる。特に好ましくは、上記特異的結合系の対応する結合パートナーでコーティングされた磁性ビーズが使用される。試験反応が完了した後、これらの微粒子を液相から分離して、例えば、濾過、遠心分離、または磁性粒子の場合は磁石により、検出反応過程にかけることができる。
【００２４】
第２の特異的抗体は、第１の抗体のものとは異なるＮ末端ｐｒｏＢＮＰのエピトープを同定する。その分子上の２種のエピトープの距離は、無条件に、これらの抗体がＮ末端ｐｒｏＢＮＰに同時に結合できる程の大きさでなければならない。そうでなければ、サンドイッチ複合体は構築されることができない。
【００２５】
Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに対する抗体とＮ末端ｐｒｏＢＮＰとの間の特異的結合反応の検出は、様々な方法で行うことができる。一般に、第２の抗体は標識される。一般的な標識は、色素団、蛍光団、化学発光もしくは電気化学発光に適した物質、放射性同位元素、ハプテン、酵素マーカー、または特異的結合カップル（例えばビオチン／ストレプトアビジン）を構築しうる物質である。ついで、標識から発せられるシグナルによって免疫複合体を検出する。第２の抗体は、例えば、ハプテンジゴキシゲニンで標識されうる。このハプテンは、さらなるジゴキシゲニン特異的抗体によって再び結合される。ジゴキシゲニンに特異的なこの抗体自体は、ペルオキシダーゼ等の酵素によって標識される。次に、特定の物質がこのペルオキシダーゼに加えられたときに生じる色の変化または吸光度によって最終的な検出が行われる。
【００２６】
当業者に公知の全ての生物学的液体は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法の手順において、試料として使用することができる。好適な試料は、全血、血清、血漿、尿または唾液などの体液である。血清および血漿の使用が特に好ましい。
【００２７】
液相中の試験試薬を使用する所謂湿式試験のほかに、抗原、ハプテン、ペプチド、タンパク質、抗体等の検出に適した全ての通常の乾式試験形式を用いることもできる。例えば、ＥＰ−Ａ−０  １８６  ７９９号に記載された、これらの乾式試験または試験片は、１つの担体上に、分析対象の試料以外の全ての試験成分を組み合わせる。検出反応は、試験片を液体試料に接触した場合に開始する。
【００２８】
本発明の方法は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰについての下限検出限界が、１ｆｍｏｌ／ｍｌ（１ｐｍｏｌ／ｌに相当する）未満であることを特徴とする。本発明による１ｆｍｏｌ／ｍｌ未満の高い感度は、長時間インキュベートを行うことなく達成される。マイクロタイター試験の総時間は、２時間未満、好ましくは電気化学発光等のより感度の高い検出方法では約１５分間である。検出される濃度の上限は、本検出方法の場合は実際には特に存在しない。技術的な上限は、一般には、使用する測定法によって決まる。この方法は主に、非常に高い濃度のＮ末端ｐｒｏＢＮＰも検出する。
【００２９】
本発明の方法のさらなる利点は、得られた測定値による、心不全に罹った患者または患っていない患者の試料の良好な識別である。本検出方法は、非常に感度が高いため、冠状動脈疾患を患っていない個体と、ＮＹＨＡクラスＩおよびＩＩの心疾患を軽度に患うまたはゆっくりと発症している患者との識別も可能である。初期の心不全のこのような早期確立は、薬物による早期治療を始めることのの決定に影響を及ぼし得、したがって、患者の生存率を長めることができることは明白である。
【００３０】
本発明の他の主題は、組換え法により生産されたＮ末端ｐｒｏＢＮＰである。Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰは、１−７６アミノ酸からなるＮ末端部分であり、１０８アミノ酸からなる前駆体分子であるｐｒｏＢＮＰから放出される。
【００３１】
また、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰは、この分子の分解反応によって血液中で生じるその一部も含む。
【００３２】
これまでのところ、当該技術分野では組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰは知られていなかった。なぜなら、その生産は、アミノ酸配列が短いため、容易に可能とはならないからである。３０個を超えるアミノ酸からなるペプチドの化学合成は、生じるエラー配列および１回の合成サイクルあたりの収量が非常に少ないことにより、宿主生物の組換え生産に匹敵する方法ではない。
【００３３】
しかしながら、診断検出方法では、標準物質または対照物質は、一方では分析物の定量測定を行うために、他方ではその試験の機能的能力をチェックするために、常に必要である。定量化が望ましい場合、標準物のシリーズを用いて規定の定量較正を行わなければならない。しかし、このような較正は、標準物として使用する物質がその免疫学的試験において分析物と同じまたは同様の動きを示す場合にのみ有用である。検出抗体への標準物の結合が、試料中の天然分子のそれに似ているように、その標準物が分析物に構造的、特に免疫学的に十分に類似していることが重要である。
【００３４】
Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの検出方法のためのこのような標準物質は、当該技術分野の現状によっては提供されていない。短い合成ペプチドのみが記載されている。本発明によれば、遺伝的合成法によってＮ末端ｐｒｏＢＮＰをコードするＤＮＡ配列を生産すること、および大腸菌中でＮ末端ｐｒｏＢＮＰの組換え発現を行うことが、今回始めて可能となった。実施例１は、続く１つ１つのステップを説明する。
【００３５】
したがって、本発明のさらなる主題は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの異なるエピトープを認識する少なくとも２種の抗体を用いる、試料中のＮ末端ｐｒｏＢＮＰの同定方法における標準物としての、組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰの使用である。
【００３６】
免疫化の理由で、Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰから合成した短いペプチドのみが当該技術分野において使用されていた。ペプチド免疫化の欠点は、大抵の場合は非常に親和性の低い抗体のみが得られるか、または得られる抗体が試料中で直鎖状エピトープとのみ反応し、天然の折畳み状抗原(nativ gefaltete Antigen) には結合することができないことである（実施例３を参照されたい）。
【００３７】
したがって、抗体の産生のためには、検出対象の分析物との十分な類似性を有する免疫原を使用することが重要である。こうすることによってのみ、試料中の天然分析物に抗体が高い親和性で結合するよう保証することができる。
【００３８】
したがって、本発明の主題は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに対する抗体を産生するための免疫原としての組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰの使用も含む。
【００３９】
本発明のさらなる主題は、組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰに対する抗体である。抗体という用語の定義は、試験手順に関するパラグラフで記載した定義と一致する。好ましくは、本発明の抗体は、７６アミノ酸長のＮ末端ｐｒｏＢＮＰのＮ末端部分（好ましくは１０−６６アミノ酸領域、特に好ましくは１０−５０もしくは１０−３８アミノ酸領域）の中のエピトープを特異的に同定する。前記抗体によって同定されるエピトープの有用な配置は、試料中でタンパク質分解によりその末端が予め消化されたＮ末端ｐｒｏＢＮＰでもこれらのエピトープを含むときに、達成される。このように、試料中の分析物の安定性は、多かれ少なかれ、２番目に重要である。Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの該好適な領域の中のエピトープは、直鎖状で存在するか、またはコンホメーションエピトープとして存在し得る。
【００４０】
したがって、本発明の好適な主題は、１９９９年１月２６日にＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Braunschweig Deutschland) に寄託され、受理された、細胞株  Ｍ１０．１．１１およびＭ１３．４．１４によって生産されるモノクローナル抗体である。これらの２つの細胞株によって生産された抗体は、ＩｇＧ−タイプの抗体である。細胞株Ｍ １０．１．１１およびＭ１３．４．１４も、本発明の主題である。
【００４１】
本発明のさらなる主題は、同等の様式で生産され、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰへの特異的結合に適した細胞株Ｍ１０．１．１１およびＭ１３．４．１４の抗体と同様の抗体である。「同等の様式で生産された抗体」という表現は、それらの抗体が組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰを用いた免疫化によって得られることを意味する。
【００４２】
また、本発明の主題は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体の生産方法も含む。
【００４３】
ポリクローナル抗体の産生は、好ましくは以下のステップに従って行われる：適切な生物の免疫化、例えば、組換えにより産生されたＮ末端ｐｒｏＢＮＰを用いたヒツジの免疫化；抗体の単離；最も反応性の高いエピトープのスクリーニング；および適切なペプチドでの免疫吸着による抗体の精製。このような方法は、実施例２に記載されている。
【００４４】
モノクローナル抗体の産生は、好ましくは以下のステップに従って行われる：適切な生物の免疫化、例えば、組換えにより産生されたＮ末端ｐｒｏＢＮＰを用いたマウスの免疫化；および患者の血清の種々のプールの中の天然Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰとの該抗体の反応性に関してクローンを選択すること。このような方法は、実施例３に記載されている。
【００４５】
以下の実施例において、本発明をさらに詳しく記載する。
【００４６】
実施例１
組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）の産生方法
１．  組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰのクローニング
Ｎ末端ｐｒｏＢＭＰのヌクレオチド配列（アミノ酸配列１−７６）を、遺伝的合成手段によって産生した。大腸菌中で該遺伝子の最適な発現を得るために、そのＤＮＡ配列を大腸菌中で最も良く使用されるコドンに合わせた。該遺伝子の産生に使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
【００４７】
0003987284.tif 000002
【００４８】
遺伝子の産生は、これらのプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で行う。増幅した遺伝子を、例えばベクターｐＵＣ１９等の適当なベクター中でクローニングしてから配列決定する。発現ベクターｐＱＥ８中で該遺伝子をクローニングするために、該遺伝子を、制限酵素切断部位Ｂａｍ  ＨｉおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩでベクターｐＵＣ１９から切り出し、Ｎ末端がヒスチジンでタグ付けされたタンパク質を発現させるベクターｐＱＥ８の中で連結させ、大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］中に形質転換させる。
【００４９】
２．  大腸菌中でのＮ末端ｐｒｏＢＮＰの発現
大腸菌中で該遺伝子を発現させるため、組換え大腸菌クローンの一晩培養物をルリア液（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン）中で１／６０にトランスフェクトし、ＩＰＴＧ（イソｐｒｏピルチオガラクトシド；最終濃度１  ｍＭ）と共にＯＤ５５０  ｏｆ  １にて誘導した。誘導後、この培養物を３７℃にて４時間さらにインキュベートした。次に培養物を遠心分離にかけ、細胞ペレットを５０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート緩衝液（ｐＨ８．０；３００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に集めた。超音波で細胞懸濁液を分解した後、この懸濁液を遠心分離にかけ、上清をＮｉ−ＮＴＡ（ニトリロ３酢酸）カラムに加えた。５０ｍＭ  Ｎａホスフェート緩衝液（ｐＨ８．０；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭイミダゾール）を用いた洗浄ステップの後、ヒスチジンでタグ付けされたＮ末端ｐｒｏＢＮＰを５０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート緩衝液（ｐＨ８．０；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出した画分を集め、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に対して透析した。不純物を分離するために、透析物をＱ−セファロースカラムに加えた。精製したＮ末端ｐｒｏＢＮＰの塊を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって測定した。
【００５０】
実施例２
Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰに対するポリクローナル抗体の生産
１．免疫化
ヒツジを完全フロイントアジュバント中の組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）で免疫した。用量は動物当たり０．１ｍｇとした。免疫化は１０カ月の期間で４週ごとに繰り返した。最初の免疫化から６週目以降、１カ月に１回、血清試料を採取し、それらの感度と力価を試験した。
【００５１】
２．ヒツジ血清からのポリクローナル抗体の精製
組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰで免疫したヒツジの生血清から開始し、脂質成分をアエロシル（Aerosil)（１．５％）で脱脂して除去した。その後、免疫グロブリンを硫酸アンモニウム（２Ｍ）で分離した。溶解した沈澱を１５ｍＭ  ＫＰＯ4 、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０に対し透析し、ＤＥＡＥセファロースを介してクロマトグラフィーを行った。ＩｇＧ画分、ＰＡＢ＜ｒｅｃ．ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＤＥ）は溶出液に存在した。
【００５２】
３．ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ特異的ポリクローナル抗体の生産のための連続アフィニティークロマトグラフィー
アミノ酸１−２１、ＰＡＢ＜ｒｅｃ．ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｍ−ＩｇＧ（ＩＳ、１−２１）に対するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的ポリクローナル抗体の精製のために、Ｃ−末端ビオチニル化ペプチドHPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi（１−２１−Ｂｉ、配列番号：７）を用いた。１ｍｇのペプチド（１−２１−Ｂｉ）と共に１０ｍｌのストレプトアビジンでコートしたメタクリレートポリマー粒子（Boehringer Mannheim, Ref. 1529188）をロードしてアフィニティーマトリックスを作製した。
【００５３】
１０ｍｌのアフィニティーマトリックスをカラムに充填し、５０ｍＭ  ＫＰＯ4 、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で平衡化した。連続アフィニティークロマトグラフィーの第１ステップのために、８５０ｍｇのＰＡＢ＜ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＤＥ）をカラムに結合させた。溶出液を第２ステップのために保存した（以下参照）。カラムを、ＰＢＳおよび２０ｍＭ  ＫＰＯ4 、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  デオキシコール酸Ｎａ  ｐＨ７．５で洗浄した。アフィニティーマトリックスに特異的に結合したＩｇＧをＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂエリューションバッファー（Pierce、製品Ｎ゜21013）で溶出した。アフィニティーマトリックスを１Ｍプロピオン酸で再生し、ＰＢＳ／ＮａＮ3 中で保存した。
【００５４】
上記と同様にして、ペプチドBi-ELQVEQTSL（Ｂｉ−３０−３８  配列番号：８）をアミノ酸３０−３８に対するＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ−特異的免疫グロブリンの精製のためのアフィニティーマトリックスの作製に用いた。ＰＡＢ＜ｒｅｃ．ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｍ−ＩｇＧ（ＩＳ、３０−３８）を第１アフィニティー精製の溶出液から集めた。
【００５５】
４．ＰＡＢ＜ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＩＳ、１−２１）のビオチニル化
アフィニティー精製した抗体をビオチニル化緩衝液（１００ｍＭ  ＫＰＯ4 、７０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）に対して透析し、その後、溶液を１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整する。Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＤＭＳＯに溶解し、１：７．５のモル関係で抗体溶液に添加する。反応をＬ−リジンを添加して停止し、過剰の標識試薬を透析により除去する。
【００５６】
５．ＰＡＢ＜ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＩＳ、３０−３８）のジゴキシゲニル化
アフィニティー精製抗体をジゴキシゲニル化緩衝液（１００ｍＭ  ＫＰＯ4 、７０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６）に対し透析し、次いで溶液を１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整する。ジゴキシゲニン−３−ＣＭＥ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＤＭＳＯに溶解し、１：５のモル関係で抗体溶液に添加する。反応をＬ−リジンを添加して停止し、過剰の標識試薬を透析により除去する。
【００５７】
実施例３
Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）に対するモノクローナル抗体の生産とスクリーニング
１．ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）に対するモノクローナル抗体の取得
８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを完全フロイントアジュバントと共に１００μｇの組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰ抗原を用いて腹腔内免疫に供する。６週間後、３回のさらなる免疫化を４週ごとに実施する。最終の免疫化から１週間後、血液を採取し、抗体力価を試験動物の血清において測定した。陽性反応を示したマウスの脾臓からＢリンパ球を得、永久骨髄腫細胞株との融合に供する。融合はケーラー（Koehler)とミルシュタイン（Millstein)（Nature 256, 1975, p.495-497)の周知の方法に従って行う。ここで構築されたハイブリッド細胞の一次培養物を慣用の方法、たとえば、市販のセルソーターを用いて、または「限界希釈法」によりクローニングする。適切な試験法においては、組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰと陽性反応を示し、患者血清で天然のＮ−末端ｐｒｏＢＮＰを同定するクローン培養物のみを処理する（ポイント２参照）。このようにして、本発明のモノクローナル抗体を産生するいくつかのハイブリドーマ細胞株を集める。
【００５８】
腹水の調製のために、５×１０6 個のハイブリドーマ細胞を、予め０．５ｍｌのプリスタン（Pristan）で１〜２回処理したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて腹腔内に注射する。２〜３週間後、腹水液をマウスの腹部領域から得ることができる。これから、慣用の方法で抗体を単離することができる。これらのモノクローナル抗体はヒトＮ−末端ｐｒｏＢＮＰに対し特異的である。以下において、それらを、ＭＡＢ  Ｍ  １０．１．１１またはＭＡＢ  Ｍ  １３．４．１４と呼ぶ。両モノクローナル抗体はサブクラスＩｇＧ１、カッパに属する。
【００５９】
この方法により、上記のようにＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞株クローンＭ  １０．１．１１およびＭ  １３．４．１４の両方を単離することができた。
【００６０】
２．ｐｒｏＢＮＰペプチドおよび組換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する抗体のスクリーニング試験
免疫化マウスの血清中におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する抗体の存在および特異性を同定するため、ハイブリッド細胞の培養液上清または腹水液において、以下の試験方針に従ってクローンを評価した：
【００６１】
ａ）組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰとの反応性
攪拌下、室温で１時間、１００μｌ／ウェルのロード用緩衝液（Boehringer、０．２Ｍ  炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．３〜９．５、Ｃａｔ．Ｎｏ．７２６  ５５９）中で抗原として２．５μｇ／ｍｌの組換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをマイクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb）に結合する。ポストローディング（Nachbeladung）をＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、Oxid、Code-BR 14a）および１％  Ｂｙｃｏ  Ｃ中で３０分間実施する。次いで、洗浄を洗浄用緩衝液（０．９塩化ナトリウム溶液、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で行う。抗体試料のインキュベーションを攪拌下、室温で１時間、１００μｌ／ウェルで実施する。次いで、洗浄用溶液を用いるさらなる洗浄ステップを２回行う。その後、攪拌下、室温で１時間、１００ｍＵ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの検出用抗体ＰＡＢ＜Ｍ−Ｆｃｙ＞Ｓ−Ｆａｂ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Boehringer Mannheim 、cat. No.１５００  ６８６）との、さらなるインキュベーションを実施する。洗浄用緩衝液を用いるさらなる洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ活性を慣用の方法で顕現させる（たとえば、ＡＢＴＳ（登録商標）と共に室温で３０分間、吸光度差をＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍでｍＵ単位で読む。
【００６２】
ｂ）Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰペプチドとの反応性：
この場合、攪拌下、室温で１時間、０．５％  Ｂｙｃｏ  Ｃを含むＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、Oxid、Code-BR 14a)１００μｌ／ウェル中で抗原として２５０ｎｇ／ｍｌの、配列１−１０、８−１８、１−２１、１６−３０、３０−３８、３９−５０、５０−６３または６４−７６のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−ペプチド  ビオチンコンジュゲートをストレプトアビジンをロードしたマイクロタイタープレートに結合する。次いで、洗浄を洗浄用緩衝液（０．９塩化ナトリウム溶液、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて行う。抗体試料のインキュベーションと検出反応をａ）に記載のようにして実施する。特定のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰペプチドとの反応性により、エピトープの位置を決定できる。
【００６３】
ｃ）患者試料中の天然のＮ−末端ｐｒｏＢＮＰとの反応性
攪拌下、室温で１時間、１００μｌ／ウェルのロード用緩衝液（Boehringer、０．２Ｍ  炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．３〜９．５、Ｃａｔ．Ｎｏ．７２８  ５５９）中で５μｇ／ｍｌのＰＡＢ＜ヒトｐｒｏＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＩＳ、（１−２１）または（３０−３８）Ｓ−ＩｇＧをマイクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb）に結合させる。ポストローディングをＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、Oxid、Code-BR 14a）および１％  Ｂｙｃｏ  Ｃ中で３０分間実施する。次いで、洗浄を洗浄用緩衝液（０．９塩化ナトリウム溶液、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で行う。ＰＢＳ緩衝液で希釈した患者血漿中の天然の抗原とのインキュベーションを、攪拌下、室温で１時間、１００μｌ／ウェルで実施する。さらなる洗浄ステップの後、抗体試料のインキュベーションを、攪拌下、室温で１時間、１００μｌ／ウェルで実施する。次いで、洗浄用液を用いて２回洗浄を行い、攪拌下、室温で１時間、１００ｍＵ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの検出用抗体ＰＡＢ＜Ｍ−Ｆｃｙ＞Ｓ−Ｆａｂ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Boehringer Mannheim GmbH、cat. No.１５００  ６８６）との、さらなるインキュベーションを実施する。洗浄用緩衝液を用いるさらなる洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ活性を慣用の方法で顕現させる（たとえば、ＡＢＴＳ（登録商標）と共に室温で３０分間、吸光度差をＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍでｍＵ単位で読む）。
【００６４】
３．結果：Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の反応パターン
ａ）Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰペプチドによる免疫化由来のＭＡＢ（ｃ＝５μｇ／ｍｌ）の反応性：
【００６５】
【表１】
0003987284.tif 000003
【００６６】
異なるペプチドによる免疫化で得られたモノクローナル抗体は対応するペプチドと非常に強力に反応する。組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰとの反応性は２種のモノクローナル抗体でのみ認めることができるが、患者プールの天然のＮ−末端ｐｒｏＢＮＰとの反応は生じない（表１参照）。
【００６７】
ｂ）組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰによる免疫化由来のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）の反応性：
【００６８】
【表２】
0003987284.tif 000004
【００６９】
組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰによる免疫化で得られたモノクローナル抗体はペプチドと部分的にのみ反応するが、組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰまたは患者プールの天然のＮ−末端ｐｒｏＢＮＰと非常に強力に反応する。ペプチドと単一のモノクローナル抗体との無反応はいわゆるコンホメーションエピトープの同定を示す（表２参照）。
【００７０】
ｃ）組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰによる免疫化由来のＰＡＢの反応性：
【００７１】
【表３】
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【００７２】
得られたＰＡＢはペプチド１−２１および３０−３８と最も強力な反応を示した。この理由のため、これらのエピトープを選択し、ＰＡＢをこれらのペプチドの補助により積極的に免疫吸着させた。ペプチド１−２１で免疫吸着させたＰＡＢは領域８−２０と最も強い反応を示し、Ｎ−末端配列１−１０との反応は明白な低下を示す。このようにして免疫吸着させたＰＡＢは組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰと非常に強く反応し、ＰＡＢ／ＰＡＢサンドイッチ型で天然の試料と反応する（表３参照）。
【００７３】
実施例４
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定のための高感度イムノアッセイ
実施例２と３で生産した抗体を用い、高感度イムノアッセイを構築しうる。一般に、全ての試験形式では異なるエピトープ認識を有する２種の抗体を適用するのが好適である。例として、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡを記載する。
【００７４】
固相として、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を用いた。１０μｌの未処理試料またはキャリブレーターを、両エピトープ特異的抗体を含む１００μｌの緩衝液と共にＭＴＰカップにピペッティングし、次いで、室温で１時間インキュベートする。抗体として、１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＰＡＢ＜ｒｅｃ．ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＩＳ、１−２１）および０．５μｇ／ｍｌのジゴキシゲニル化ＰＡＢ＜ｒｅｃ．ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＞Ｓ−ＩｇＧ（ＩＳ、３０−３８）を用いた。その後、溶液を吸引除去し、３５０μｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。次いで、１００μｌのコンジュゲート溶液をピペットで添加し、室温で１時間再度インキュベートする。コンジュゲートとして、１００ｍＩＵ／ｍｌの濃度で抗ジゴキシン抗体−ＰＯＤコンジュゲートを用いる。次いで、コンジュゲート溶液を吸引除去し、３５０μｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。最後に、ＡＢＴＳ（登録商標）基質溶液をウェルにピペッティングし、室温で３０分間測定する。基質反応を３０分間行った後、マイクロタイタープレートを波長４０５ｎｍでＭＴＰリーダーにおいて直接測定し、参照に対し波長４９５ｎｍで測定する。
【００７５】
感度を測定するため、キャリブレーションカーブを作成し、０標準（ｎ＝２１）の精度を測定した。キャリブレーターとして、ヒトＥＤＴＡ血漿を用い、それは、次いで必要な濃度で組換えＮ−末端ｐｒｏＢＮＰを用いて強化（aufgestockt）した。ウシ血漿を０標準として用いた。結果を表４に示す。
【００７６】
【表４】
0003987284.tif 000006
【００７７】
２２．５ｍＵ×ｍｌ／ｆｍｏｌのキャリブレーションカーブの勾配および５．７ｍＵのＳＤに基づき、以下のような下限検出限界がカイザー式に従って与えられる：
ＬＤＬ＝３ＳＤ０標準／Ｃｃ勾配＝３×５．７／２２．５＝０．７６fmol/ml 。
【００７８】
実施例５
Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰの試料安定性の測定
実施例４に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰの解析物安定性を測定した。このために、ＮＹＨＡ−クラスＩＩ−ＩＩＩの４人の患者から血液をＥＤＴＡ含有コレクター試験管に採取し、３日間、室温で保存した。日毎に試料を採取し、Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰの濃度を測定した。参照試料ならびにＥＤＴＡ血漿における安定性の測定のための試料を直接４℃〜８℃にまで冷却し、１５分間内で遠心分離した。ＥＤＴＡ血漿を４℃および室温で保存し、次いで２４時間の付加継続時間内で異なる時間に測定した。結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
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【００８０】
これらのデータは、Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰが試験した時間内で完全に安定であり、それゆえ、通常のパラメータとして使用し得ることを証明する。この結果は文献〔Huntら，Clinical Endocrinology, 47, 287 (1997)〕とは一致せず、エピトープが外部末端にない解析物の安定性は２種の特異的抗体を用いるこの試験形式の選択と設計により影響を受け得る、という仮定を確認するものである。
【００８１】
実施例６
Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰアッセイの診断の感度の測定
診断の感度の測定のために、実施例４に記載の試験を再度用いた。このために、１１４人の健常者および１〜ＩＶのＮＹＨＡクラスの２３５人の患者を調べた。通常、ＮＹＨＡクラスＩの患者と健常者とを区別することは特に重要である。
【００８２】
この高感度アッセイを用い、メジアン値が６．６ｆｍｏｌ／ｍｌ  ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（標準偏差が７．３ｆｍｏｌ／ｍｌ）であることを１１０人の健常血液ドナーにおいて測定した。測定した最低濃度は０．２ｆｍｏｌ／ｍｌであった。これは、＜１．０ｆｍｏｌ／ｍｌの感度が正確に参照領域を検出するのに必要であることを明確に示す。この分布を用い、上限正常値領域（９７．５％パーセンタイル）は２６．６ｆｍｏｌ／ｍｌであると決定した。
【００８３】
参照領域が０〜２６．６ｆｍｏｌ／ｍｌであると仮定すると、ＮＹＨＡクラスＩ〜ＩＶの２３３人の患者の内、１６人の患者のみが標準領域の値を示した。これは臨床上の感度９３．３％に相当する。ＮＹＨＡクラスＩの患者のみを考慮すると、３７人の患者の内、３０人が陽性として検出され、それは８１．１％の感度に相当する。
【００８４】
この結果は、高感度Ｎ−末端ｐｒｏＢＮＰアッセイにより、ＮＹＨＡクラスＩ心不全を患う患者と健常者との間の明確な識別が可能であることを示す。これまでに利用可能であった従来のアッセイ（Dagubatti ら、Cardiovascular Research 36 (1997), 246）では、これは達成することはできなかった。