(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物より採取された歯肉溝液中の、肝機能パラメータであるアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の数値を生化学的に決定する工程を含む、肝機能パラメータの測定方法。
【請求項２】
請求項１の測定方法に使用する、下記要素を含む肝機能パラメータ測定用キット；
[１]歯肉溝液採取用器具：[２]採取された歯肉溝液中の肝機能パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬。
【請求項３】
請求項１の測定方法に使用する、下記要素を含む肝機能パラメータ測定用キット；
[１]歯肉溝液採取用器具：[２]採取された歯肉溝液中の肝機能パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬：[３]採取された歯肉溝液中の唾液パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬。
【請求項４】
歯肉溝液採取用器具が、溝のあるプラスチックフィルム１枚及び担持体を、界面活性剤でコートした溝のないプラスチックフィルム２枚ではさみ込むことにより製造される器具である、請求項２又は３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯溝肉液中の内臓機能パラメータの測定方法、該測定方法に適用されるキット、歯肉溝液採取用器具を含有する該キット等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の内臓機能パラメータを測定することは、その哺乳動物の内臓機能を判定するのに有用である。例えば、肝機能パラメータは、肝炎，肝硬変，肝臓がん、肝細胞がん等の各種肝臓機能異常を判定する際の指標となるものであり、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ等の血液中に存在する酵素の活性が肝機能パラメータとして使用することができる。
【０００３】
しかしながら、従来より、血液中に存在する内臓機能パラメータを測定するためには哺乳動物から採血する必要があり、採血時に該哺乳動物へ病原体を感染させる危険及び肉体的又は精神的なストレスを与える可能性が潜在的に存在する。また、採血は一定の専門技術を必要とする。ヒトの場合、採血は基本的に医療施設においてのみ行われるので医療従事者及び被採血者への負荷が大きく、適切な時期に適切ば内臓機能パラメータを測定して治療や健康管理に応用することは必ずしも容易でない。
【０００４】
本発明者らは、血液より採取の容易な体液試料として、歯と歯の間隙すなわち歯肉溝から漏出する歯肉溝液に着目した。歯肉溝液は血液と類似した成分を含有すると考えられており（Brill N.and Krasse, B., Acta Odont.Scandinav., vol.16, pages233-245(1958)）、歯肉溝液を用いて内臓機能パラメータを測定することが可能であれば、上述のような採血にかかる諸問題を解決し得るものと期待された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、健常人及び肝臓病患者より歯肉溝液（gingival crevicular fluid：以下、「ＧＣＦ」という。）並びに血液を採取し、肝機能パラメータであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Asparate Aminotransferase：以下、「ＡＳＴ」という。）活性、及び、アラニンアミノトランスフェラーゼ（Alanine Aminotransferase：以下、「ＡＬＴ」という。）活性を測定したところ、ＧＳＴ中のＡＳＴ活性及びＡＬＴ活性の数値が、血清中のＡＳＴ活性及びＡＬＴ活性の数値とそれぞれ相関することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１．哺乳動物より採取された歯肉溝液中の、肝機能パラメータであるアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の数値を生化学的に決定する工程を含む、肝機能パラメータの測定方法。
２．前項１の測定方法に使用する、下記要素を含む肝機能パラメータ測定用キット；
[１]歯肉溝液採取用器具：[２]採取された歯肉溝液中の肝機能パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬。
３．前項１の測定方法に使用する、下記要素を含む肝機能パラメータ測定用キット；
[１]歯肉溝液採取用器具：[２]採取された歯肉溝液中の肝機能パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬：[３]採取された歯肉溝液中の唾液パラメータの数値を生化学的に決定する工程に使用される試薬。
４．歯肉溝液採取用器具が、溝のあるプラスチックフィルム１枚及び担持体を、界面活性剤でコートした溝のないプラスチックフィルム２枚ではさみ込むことにより製造される器具である、前項２又は３に記載のキット、に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＧＣＦ中の内臓機能パラメータの測定方法を提供する。該測定方法は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物よりＧＣＦを採取する工程、及び、採取されたＧＣＦ中のの内臓機能パラメータを測定する工程を含み、好適には採取されたＧＣＦへの唾液の混入を考慮して内臓機能パラメータの測定値を補正する工程も含む。
【０００８】
本発明において、ＧＣＦとは歯と歯の間隙に存在する液体であり、好適には口腔内の残留物及び唾液を含有しない。口腔内の残留物は歯磨きと濯ぎにより除去することができ、唾液は脱脂綿又は他の体液を採取するための器具を用いて除去することができる。そのようにして口腔内の残留物及び唾液を除去した後、体液を採取する器具を用いてＧＣＦを採取することができる。
【０００９】
ＧＣＦを採取するための器具としては、小さな間隙に挿入することができ、且つ液体を吸引し得る器具であれば特に限定されるものではないが、例えば、脱脂綿、ろ紙、スポイト、注射器、歯肉溝に挿入し得る形状をとり且つ毛細管現象によりＧＣＦを吸引し得る器具（以下、「ＧＣＦ採取用器具」という。）等を挙げることができる。
【００１０】
本発明のＧＣＦ採取用器具は、ポリエステル等の合成樹脂により製造される本体部分（以下、「本体部分」という。）、及び、毛細管現象を誘起する担持体、脱脂綿等の素材により製造される試料吸引部分（以下、「吸引部分」という。）とから構成される。
【００１１】
本体部分の形状は、その先端が歯肉溝に挿入し得る形状であれば特に限定されないが、その内部の特定の位置に吸引部分を挿入し固定し得るような形状であることが好ましい。そのような本体部分は、前述の素材により一体として製造するか、又は、予め複数の部品として製造されたものを接合により一体化せしめるが、吸引部分を挿入し固定するためには、予め複数の部品として製造されたものを接合により一体化せしめることが好ましい。
【００１２】
本体部分を予め複数の部品として製造する場合、当該部品は平板状であることが好ましい。平板状の部品は、ポリエステル等の合成樹脂製の薄い平板を打ち抜くことにより得ることができる。一つの本体部分に使用する平板状の当該部品は、好適には、全て同じ形状に打ち抜く。部品の打ち抜きは、トムソン型等の金型、レーザ加工、ワイヤカット、超音波カット等を用いて行うことができる。そのように打ち抜かれた平板状の部品を形状が一致するように重ねた後、超音波接着等により接合形成することにより、本体部分を得ることができる。平板状の部品は、１枚当たりの厚さが１０乃至２００μｍであり、且つ、全部品の厚さの総計が２００μｍ以下であることが好ましい。合成樹脂製の平板としては、ポリエステルフィルム（帝人（株）製）等を例示することができる。
【００１３】
また、本体部分の先端より歯肉溝液を吸引するには、当該先端から吸引部分の固定位置へ至る部分を細い管状に形成しておくことが好ましい。本体部分を平板状の部品より製造する場合、少なくとも１つの部品においてその先端部分から吸引部分の固定位置又はそれに対応する位置に溝を形成しておくことにより、その溝を有する面が他の部品と接するように全ての部品を接合形成すれば、所望の管を形成することができる。
【００１４】
さらに、予め、そのような管の一部又は全部を担う本体部分又はその部品の表面に界面活性剤を塗布しておくことにより、本体部分の素材が有する撥水性を軽減することができ、それにより毛細管現象が起こりやすくなり、試料を容易に吸引することができる。そのような前処理に供する界面活性剤としては生体及び環境に対して安全なものが好適であり、脂肪酸エステル（CAS No.25339-99-5：第一工業製薬（株）製）等を例示することができる。
【００１５】
吸引部分は本体部分中で毛細管現象を誘起し得、且つ本体部分中に挿入され固定され得る形状であれば特に限定されないが、平板状の本体部分に挿入され固定される場合は、吸引部分も同様に平板状であることが好ましい。吸引部分として用いる担持体としては、ろ紙４Ｃｈｒ（コード番号３００４−９１７：ワットマン社製）、カルボキシメチルセルロース等を例示することができる。
【００１６】
本発明において、内臓機能パラメータとは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の内臓の状態又は機能を判定に用いる指標として公知であり、且つ、哺乳動物の血液、血清、リンパ液等の体液、尿等の排泄物を試料として生化学的手法により通常測定される指標であれば特に限定されない。本発明において測定される内臓機能パラメータの対象臓器は特に限定されるものではないが、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺臓、心臓、膀胱、副腎、脳、胸腺等を例示することができ、好適には肝臓又は腎臓である。肝機能パラメータとしてはＡＬＴ活性及びＡＳＴ活性が好適であり、腎機能パラメータとしては、ＢＵＤが好適である。それらの内臓機能パラメータは公知の方法により測定することができ、例えば、ＡＬＴ及びＡＳＴはＵＶ法（巽典之  編著、正常値ハンドブック、９５乃至９６頁、南江堂刊（１９９３年））により測定することができる。本発明においては、好適な被検試料としてＧＣＦを使用することができる。
【００１７】
測定された内臓機能パラメータの数値は、内部標準等により補正された後、単独で又は他の内臓機能パラメータの数値と併せて、内臓の状態又は機能の判定に供することができる。当該補正は、被検試料が他の物質の混入により希釈されている可能性、被検者の臨床的背景等を考慮し、適宜行うことが可能である。例えば、好適な被検試料であるＧＣＦは唾液を混入し易いが、唾液中には比較的多量に存在するがＧＣＦ中にはほとんど存在しない物質又はその活性（以下、「唾液パラメータ」という）を測定し、次いでＧＣＦ中に含有される唾液の量を算出することにより、被検試料における唾液の混入割合を算出し、内臓機能パラメータの数値を適切に補正することができる。唾液パラメータとしては、生化学的な手法で測定し得るものであれば特定限定されないが、リゾチーム、カタラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ等の酵素、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等の電解質、各種タンパク質等を例示することができる。また、例えば、被験者が歯周病に罹患しているとＡＳＴ値が上昇するので、ＧＣＦを用いてＡＳＴ活性を測定する場合には、予め健常人、歯周病患者及び／又は肝機能障害患者のＡＳＴ活性を測定し、補正係数を算出しておくことにより、ＡＳＴ活性を適切に補正することができる。
【００１８】
また、内臓機能パラメータの数値及びそれらの比率は個体差が大きく、且つ内臓の状態又は機能の変化により変動することが知られており、臨床においては被験者の内臓機能パラメータを定期的且つ長期的に測定することが重要である。そこで、医学的に既に確立された内臓機能パラメータ測定方法と本発明の測定方法を組合せることにより、簡便且つ正確に内臓機能パラメータの数値を測定することができる。好適な肝機能パラメータであるＡＬＴ活性及びＡＳＴ活性を測定する場合、予め被験者より血液及びＧＣＦを同時に採取して血清中及びＧＣＦ中の当該活性を測定し（以下、１回目の測定」という。）、次いで血清とＧＣＦの当該活性値又はＡＳＴ活性／ＡＬＴ活性の比率を比較することによりＧＣＦの当該活性値又はＡＳＴ活性／ＡＬＴ活性の比率の補正係数を算出しておき、２回目以降はＧＣＦについてのみ当該測定を行い、１回目の測定値に基いて算出された補正係数を用いて適切な補正を行うことができる。
【００１９】
本発明は、本発明の測定方法に適用されるキットを提供する。そのようなキットを構成する要素に特に限定はないが、例えば、前述のＧＣＦ採取用器具、採取されたＧＣＦを保存する容器、ＧＣＦ中の内臓機能パラメータの測定に好適なチューブあるいはプレート、内臓機能パラメータの数値を測定する工程に必要な各種試薬等を挙げることができる。さらに、本発明のキットは、ＧＣＦ中の唾液パラメータを測定にする工程に使用される各種試薬、唾液及び／又は血液の採取用器具、それらを保存する容器等を要素として適宜含んでもよい。
以下、実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【００２０】
【実施例】
実施例１．ＧＣＦ採取用器具の作製
厚さ３８μｍのポリエステルフィルム（帝人（株）製）２枚及び厚さ１００μｍのポリエステルフィルム（帝人（株）製）１枚を重ね、トムソン型で図１に記載の形状に打ち抜き加工し，厚さ１００μｍのポリエステルフィルム上にその末端部から中央部へ至る直線的な溝を形成せしめた（以下、「中板」という。：図１参照）。他の２枚にエタノールで５％（要量／容量）濃度に希釈した界面活性剤（CAS No.25339-99-5：第一工業製（株）製）を塗布し、室温で乾燥させた（以下、「上板」又は「下板」という。）。
【００２１】
次いで、上板及び中板上の、溝の一部と対応する位置を、直径１．２ｍｍの正円形にそれぞれ打ち抜いた（図１参照）。
【００２２】
次いで、厚さ０．２ｍｍのろ紙４Ｃｈｒ（コード番号３００４−９１７：ワットマン社製）を直径１．５ｍｍの正円形に切り抜いた。
【００２３】
これらの部品を、下板、中板、ろ紙、上板の順に重ねた。その際、ろ紙の円心が、上板及び中板上の、正円形に切り抜いた部分の円心と重なるように置いた。そのように重ねた部品を、超音波接着で接合形成させた。
実施例２．ＧＣＦ及び血液中の肝機能パラメータの測定
１）ＧＣＦの採取
肝機能が正常な健常者及び肝機能障を持つ患者の口腔から、予め、歯磨き及び濯ぎにより残留物を除去し、次いで歯科用綿（ロールワッテ製：直径８×長さ２５ｍｍ）を用いて余分な水分を除去した。
【００２４】
歯肉溝が比較的深い上顎の犬歯及び犬歯に隣接する歯の間隙より、実施例１で作製したＧＣＦ採取用器具を用いて、ＧＣＦを採取した。
【００２５】
健常者及び患者の臨床背景を表１に示す。
【００２６】
【表１】
健常者及び患者の臨床背景
0003956344.tif 000002
２）唾液の採取
１）でＧＣＦを採取した健常者及び患者から、歯科用綿（ロールワッテ製：直径８×長さ２５ｍｍ）又は実施例１で作製した歯肉溝液採取用器具を用いて、唾液を採取した。採取した試料を生理食塩水（大塚製薬（株）製）で２０倍に希釈した。
３）血液の採取
１）でＧＣＦを採取した健常者及び患者から静脈血を採取した後、遠心分離を行い、上清画分すなわち血清を採取した。
４）ＡＬＴ活性の測定
ＡＬＴ活性の測定はＵＶ法（巽典之  編著、正常値ハンドブック、９５乃至９６頁、南江堂刊（１９９３年））により行った。
【００２７】
１）乃至３）において得られた試料につき、ＵＶ検査用試薬（ＬタイプワコーＧＰＴ・ＪＰ：ワコー純薬工業（株）製）及び臨床全自動分析器（ＭＩＲＡＣＬＥ  ＡＣＥ９１９：ニプロ（株）製）を用い、波長３４０ｎｍの紫外吸収を測定した。
【００２８】
ＡＬＴ活性は、３７℃にて１分間に１μモルのＬ−アラニンのアミノ基を転移させる活性をを１単位（国際単位：ＩＵ／Ｌ）として算出した。測定は１試料につき３回測定を行い、平均値を求めた。
５）ＡＳＴ活性の測定
ＡＳＴ活性の測定はＵＶ法（巽典之  編著、正常値ハンドブック、９５乃至９６頁、南江堂刊（１９９３年））により行った。
【００２９】
１）乃至３）において得られた試料につき、ＵＶ検査用試薬（ＬタイプワコーＧＯＴ・ＪＰ：ワコー純薬工業（株）製）及び臨床全自動分析器（ＭＩＲＡＣＬＥ  ＡＣＥ９１９：ニプロ（株）製）を用い、波長３４０ｎｍの紫外吸収を測定した。
【００３０】
ＡＳＴ活性は、３７℃にて１分間に１μモルのＬ−アスパラギン酸のアミノ基を転移させる活性をを１単位（国際単位：ＩＵ／Ｌ）として算出した。測定は１試料につき３回測定を行い、平均値を求めた。
６）各試料のＡＬＴ活性及びＡＳＴ活性の比較
４）及び５）の測定結果を表２及び３に示す。
【００３１】
【表２】
ＡＬＴ活性＊１
0003956344.tif 000003
表２に示す通り、ＧＣＦのＡＬＴ活性は血清のそれと相関したのに対し、唾液は相関しなかった。また、患者２はＣ型慢性肝炎を発症しているが肝機能は有意に改善しており、ＧＣＦのＡＬＴ活性はそれを反映した。これらの結果より、ＧＣＦのＡＬＴ活性が２００を超えた被検者は肝機能障害を有する可能性があり、該活性が２００以下の被験者は健常の可能性が高いと判定することができる。
【００３２】
【表３】
ＡＳＴ活性＊１
0003956344.tif 000004
表３に示す通り、ＧＣＦのＡＳＴ活性は唾液のそれと比較して有意に高い値を示し、ＧＣＦはＡＳＴ活性測定に供する試料として好適であることが示された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、ＧＣＦは肝機能パラメータ測定試料として使用し得ることが示された。ＧＣＦは採取の容易な試料であり、臨床検査において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＧＣＦ採取容器具の構成を示す図。該器具は図１に示す上板、中板、下板及びろ紙からなる。
【図１】
0003956344.tif 000005