(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
0003908953.tif 000034
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
化粧料である請求項１記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項３】
一般式（１）
0003908953.tif 000035
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなる表皮透過バリア機能強化剤。
【請求項４】
一般式（１）
0003908953.tif 000036
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなるアンフィレグリン発現抑制剤。
【請求項５】
一般式（１）
0003908953.tif 000037
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなる表皮過増殖抑制剤。
【請求項６】
一般式（１）
0003908953.tif 000038
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなるヘパリン結合性表皮増殖因子様因子（ＨＢ−ＥＧＦ）発現誘導剤。
【請求項７】
一般式（１）
0003908953.tif 000039
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなる老化皮膚改善剤。
【請求項８】
一般式（１）
0003908953.tif 000040
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなるレチノイン酸又はその誘導体との併用剤。
【請求項９】
一般式（１）
0003908953.tif 000041
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなるレチノイン酸又はその誘導体による荒れ肌防止剤。
【請求項１０】
一般式（１）
0003908953.tif 000042
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体及びレチノイン酸又はその誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、化粧料、医薬品等の皮膚外用剤に関し、また、日焼け等の環境から受ける影響に対し表皮透過バリア機能を強化し、肌荒れ等の表皮透過バリア機能崩壊に対しても速やかに改善し、皮膚を皮膚科学的及び美容的に健やかな状態に保つ表皮透過バリア機能強化剤、アンフィレグリンの過剰発現を伴う各種疾患や荒れ肌の治療予防及び研究に有用なアンフィレグリン発現抑制剤並びに表皮過増殖抑制剤，老化に伴う皮膚の代謝低下や浅薄化の防止、シミの治療に有用な老化皮膚改善剤、及びレチノイン酸又はその誘導体による肌荒れ等の副作用を防止できるレチノイン酸又はその誘導体との併用剤に関する。
背景技術
ヒトを始めとするすべての生体は、生体を取り巻く周りの環境の影響を受けている。しかしながら、ほ乳類等の高等動物は、生命を維持するために、重要な各臓器及び器官に対する環境の影響を極力小さくするための器官を持っている。それが皮膚であり、最も重要な機能として物質の生体内への侵入と生体内部からの水分の過剰蒸散を防ぐ、表皮透過バリア機能を担っている。
表皮透過バリア機能は、疾患、有機溶媒、界面活性剤、紫外線等で一時的に崩壊し、皮膚内部環境を乱す。この状態が続くと、病原菌や有害な化学物質等が皮膚及び生体内部に侵入する危険性があり、速やかに表皮透過バリア機能を回復させる必要がある。また、表面皮膚透過バリア機能が崩壊している状態は、皮膚表面が乾燥し、鱗屑が表面を覆い、美容上も好ましくない状態となる。
表皮透過バリア機能は、表皮細胞のターンオーバーと角層付近での角化によって形成され、維持されている。表皮透過バリア機能の崩壊状態では、表皮細胞の過増殖が起きており、該過増殖の継続が正常な表皮細胞のターンオーバーと角化を阻害することによって、バリア機能の回復を遅らせていることが考えられる。
乾癬は、表皮細胞の過増殖と角化不全を伴う原因不明の疾患であり、その治療にはステロイドや免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ等の薬剤が用いられる。しかし、これらの薬剤は、長期連用や日常的な使用での危険性が指摘されており、より安全に表皮の過増殖を抑制し、正常化する薬剤の開発が求められていた。同様に、アトピー性皮膚炎等の表皮透過バリア機能の低下を伴う皮膚疾患に対する安全かつ有効な外用剤が望まれていた。
皮膚の外観は皮膚の全体的な代謝能や状態に大きく影響を受ける。例えば、表皮透過バリア機能が崩壊している状態は、皮膚表面が乾燥し、鱗屑が表面を覆い好ましくない状態となる。また、あるいは老化にともなった代謝低下では、表皮が薄くなって色合いが変化したり、くすみやシミ、シワが生じる等外観の美しさは損なわれていく。
このような美しい肌の外観は、活発な表皮細胞のターンオーバーと正常な角層付近での角化によって維持されている。表皮細胞のターンオーバーが正常におきないことにより、角化がうまく行われず、肌荒れが起きたり、あるいは老化等によりターンオーバーが低下して肌のくすみが生じたり、メラニンが蓄積されてシミが生じる原因ともなっているとも考えられる。表皮のターンオーバーは基底層細胞の分裂速度によると考えられるが、老化に伴っては分裂速度の低下で、表皮の厚さが薄くなり、シワの原因にもなっていると考えられる。
この様な表皮細胞のターンオーバーは、アンフィレグリン、ヘパリン結合性表皮増殖因子様因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α等の表皮増殖因子ファミリーの発現により制御されていると考えられるが、特に基底層付近で発現するＨＢ−ＥＧＦが大きく関与していると考えられており、ＨＢ−ＥＧＦ発現を誘導することで表皮のターンオーバーは亢進すると考えられる。［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９８），１１１巻  ７１５〜７２１頁］。
レチノイン酸は、非常に有効な外用剤として知られ、また、ＨＢ−ＥＧＦ発現を誘導することも知られているが、レチノイン酸には肌荒れや一時的な黒化を引き起こす等の副作用があり、皮膚塗布薬として使用するには医師の綿密な観察が必要である等、日常的に予防、治療を行いたい患者からは、より安全な薬剤の開発及び副作用を防止する手段の提供が求められていた。
アンフィレグリンは、正常なターンオーバーが行われている皮膚では発現しておらず、過増殖を起こしている表皮あるいは培養中の表皮細胞に特異的であることが知られており、この発現を抑制することで特異的かつ有効に表皮の過増殖を抑制し皮膚の働きを正常化させることができると考えられている。また、アンフィレグリンの発現は過増殖を起こしている皮膚のみでなく、皮膚癌の進行にも関係があることが報告されている。しかしながら、特異的にアンフィレグリンの発現を抑制する物質は知られておらず、研究の進展のためにも、アンフィレグリン発現を抑制する薬剤の開発が強く望まれていた。
これまでに優れた表皮透過バリア機能を改善する物質として本発明者等は既にフマル酸ジメチルエステルやフマル酸ジエチルエステルが有用であることを見出している（特開平１２−１７８１１６号公報）。また、フマル酸やフマル酸のエステル類は、皮脂分泌促進作用が知られており（特開平４−１８０１７号公報）、フマル酸エステル類は、経口的に乾癬の治療に用いられることも知られている（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９８：１３８：４５６−４６０，１９９９：１４１：４２４−４２９）が、同時に、外用として用いた場合には、周辺にまで及ぶ皮膚刺激（Ｐｅｒｉｌｅｓｉｏｎａｌ  ｓｋｉｎｉｒｒｉｔａｉｏｎ）、斑状丘疹（Ｍａｓｃｕｌａｒ  ｐａｐｕｌａｒ  ｒａｓｈｅｓ）、蕁麻疹反応（Ｕｒｔｉｃａｒｉａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）を伴い、感作（Ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）及び接触性蕁麻疹（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ）の危険が知られている（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９４：１８８：１２６−１３０）。
斯かる状況下、本発明の目的は、安全性が高くかつ表皮透過バリア機能の崩壊を迅速に改善し、美容学的にも健やかな皮膚に保つ効果に優れた表皮バリア機能強化剤及び皮膚外用剤組成物、並びに表皮のターンオーバーを亢進するＨＢ−ＥＧＦ発現誘導剤、表皮の過増殖を抑制するアンフィレグリン発現抑制剤、レチノイン酸又はその誘導体に起因する荒れ肌を防止できるレチノイン酸又はその誘導体との併用剤及び老化に伴う皮膚の代謝低下や浅薄化等を改善できる老化皮膚改善剤を提供することにある。
本発明者等は、上述した現状から様々なフマル酸ジエステル誘導体の皮膚に対する効果、安全性について鋭意研究を行った結果、下記一般式（１）で示されるフマル酸ジエステル誘導体は安全性が高く（感作性を示さない）かつ優れた表皮透過バリア機能強化作用を有すること及び該誘導体を含有する皮膚外用剤組成物が表皮透過バリア機能を改善し、皮膚科学的及び美容的にも皮膚を健やかに保つ効果に優れること、更にＨＢ−ＥＧＦ発現誘導、アンフィレグリン発現抑制、老化による皮膚の浅薄化防正、レチノイン酸に起因する荒れ肌防止を確認して本発明を完成するに至った。
発明の開示
すなわち、本発明は、一般式（１）
0003908953.tif 000002
（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、ｎは２〜５の整数である。）
で表されるフマル酸ジエステル誘導体からなる、表皮透過バリア機能強化剤、アンフィレグリン発現抑制剤、表皮過増殖抑制剤、ヘパリン結合性表皮増殖因子様因子（ＨＢ−ＥＧＦ）発現誘導剤、老化皮膚改善剤、レチノイン酸又はその誘導体との併用剤及びレチノイン酸による荒れ肌防止剤、並びに該誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物、該誘導体及びレチノイン酸又はその誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物にある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を詳述する。
本発明に用いる前記一般式（１）で表されるフマル酸ジエステル誘導体は、具体的には、例えば、下記一般式（２）で表されるビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート、
0003908953.tif 000003
ビス（トリエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート、ビス（ジエチレングリコールモノメチルエーテル）フマレート、ビス（トリエチレングリコールモノメチルエーテル）フマレート、ビス（ジエチレングリコールモノブチルエーテル）フマレート、ビス（ジプロピレングリコールモノエチルエーテル）フマレート等を挙げることができる。これらの物質はすべて一般的な公知の物質である。ｎは、２〜３のものが親油親水性バランスの面より特に好ましい。
本発明に用いる前記一般式（１）で示されるフマル酸ジエステル誘導体は、例えば特開平９−２５５６２２号公報に記載された公知の方法によって製造することができる。
本発明に用いるフマル酸ジエステル誘導体は、前記一般式（１）で示されるものであるが、式中、炭素数１〜４のアルキレン基（Ｒ１）は同種であっても異種が混在していても良く、また、例えばＣ２Ｈ４とＣ３Ｈ８のような、異種が混在している場合にはブロック結合体であってもランダム結合体であっても良い。炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基（Ｒ２及びＲ３）は同種であっても異種であっても良い。
本発明に用いるフマル酸ジエステル誘導体の皮膚外用剤組成物への配合量は、皮膚外用剤組成物の総量を基準として、それぞれ０．００１〜１５．０質量％（以下、単に％と略記する）が好ましく、そして更には０．１〜１０．０％が好ましい。０．００１％未満の配合量では、本発明の目的とする効果が十分でない場合があり、一方、１５．０％を越えて配合してもその増加分に見合った効果の向上がなく好ましくない場合がある。
本発明の表皮透過バリア機能強化剤、アンフィレグリン発現抑制剤、表皮過増殖抑制剤、ヘパリン結合性表皮増殖因子様因子（ＨＢ−ＥＧＦ）発現誘導剤、老化皮膚改善剤、レチノイン酸又はその誘導体との併用剤及びレチノイン酸又はその誘導体による荒れ肌防止剤は、通常使用される外用基剤や他の薬効成分を配合することができる。外用基剤としては、油性基剤をベースとするもの、油中水型や水中油型の乳化系基剤をベースとするもの、及び水をベースとするもののいずれであっても良い。油性基剤としては、例えば、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、及び天然又は合成のグリセライド等が挙げられ、特に制限は無い。薬効成分としては、特に制限はなく、例えば、鎮痛消炎剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤、ビタミン類等を必要に応じて適宜使用することができる。また、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料、植物エキス等を任意に組み合わせて配合することができる。一般式（１）で示されるフマル酸ジエステル誘導体は、水溶性であり、製剤化において有用である。
本発明のレチノイン酸又はその誘導体との併用剤は、レチノイン酸又はその誘導体を投与している際に、外用及び内服、注射等の方法で投与可能であるが、外用投与が好ましい。投与形態の一つとしての皮膚外用剤組成物には、前記一般式（１）で示されるフマル酸ジエステル誘導体以外に、レチノイン酸又はその誘導体をも同時配合し投与することもできる。
また、レチノイン酸以外に、レチノイン酸と同等の生理活性を有するレチノイン酸誘導体を用いることも可能である。
また、レチノイン酸又はその誘導体を前記一般式（１）で示されるフマル酸ジエステル誘導体と同時に併用して用いる場合は、レチノイン酸またはその誘導体の配合量は、特に限定をするものではないが、好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．０１〜０．５質量％が望ましい。
そして、これらの薬剤は、皮膚化粧料の他に一般的な化粧料や入浴剤等にも配合することができる。剤型的には例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、粉末、顆粒等とすることができる。そして適用する皮膚としては頭皮を含む人体上の皮膚全てであり、頭皮に適用した場合はフケ防止、養毛効果が期待できる。
また、本発明において皮膚外用剤組成物とは、乾癬やアトピー性皮膚炎を始めとする疾患に対する医薬品、医薬部外品、化粧料の区別無く皮膚に外用するもの全てを指す。化粧料としては、皮膚化粧料、メイクアップ化粧料、下地用化粧料、頭髪化粧料等の一般的な化粧料の他に入浴剤等をも包含する。化粧料の中で、本発明の効果を最大限に生かせる上で、皮膚化粧料とすることが好ましい。剤型的には例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、粉末、顆粒、ジェル、軟膏等種々のものとすることができる。
尚、本発明の各種薬剤及び皮膚外用剤組成物には、上記の他に医薬品、医薬部外品、化粧品に許容される賦形剤、界面活性剤、抗酸化剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宣配合することができる。
実施例
以下、試験例、実施例及び比較例に基いて本発明を詳説する。
・試験１（表皮透過バリア機能改善試験）
本発明を表皮透過バリア機能を崩壊させた皮膚に適用したときの表皮透過バリア機能改善効果を次の試験方法により調べた。
１．使用した実験動物
試験開始時１０週齢の雄ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：Ｈｒ−１）１群５匹を用いた。
２．表皮透過バリア状態の測定
２−１．測定装置及び条件
経皮水分蒸散量（以下、ＴＥＷＬと略記する。）は、連続発汗測定装置ハイドログラフＡＭＵ−１００（ケイアンドエス社製）を用いて次の通りに測定した。１平方センチメートルのカプセルを皮膚に密着させ、カプセル内に窒素ガスを導入（３００ｍＬ／分）し、カプセルに送り出す前とカプセルから回収した後の窒素ガス中の水蒸気量を測定した。この値の差から、１分当たり皮膚１平方センチメートルから蒸散した水分量（ｍｇ）を算出し、ＴＥＷＬとした。
２−２．試料と実験方法
５０％エタノール水溶液（基剤）に、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート等の化合物を下記表１に記載した通り配合した試料を調製した。まず、ヘアレスマウス背部皮膚のＴＥＷＬを測定し、試験開始時ＴＥＷＬとした。次に各試料０．０５ｍＬをヘアレスマウスの背部皮膚（直径約２．５ｃｍ）に１日１回、月〜金にかけて毎日塗布を行った（事前塗布）。その後、事前塗布の最終塗布日から３日目に紫外線Ｂ波長（ＵＶＢ）を０．１５Ｊ／ｃｍ２、１回照射した。その紫外線照射直後から事前塗布と同様の量、頻度で照射後３日まで各試料を塗布した。そして、照射後３日及び４日後のＴＥＷＬを測定し、試験開始時のＴＥＷＬを基準にして、ＵＶＢによりＴＥＷＬがどれだけ変動したかを示す相対値であるＴＥＷＬ変動率（＝照射後３日又は４日目のＴＥＷＬ値／試験開始時のＴＥＷＬ値）を算出し、基剤群と各群の平均値を比較した。
２−３．効果の判定方法
ＴＥＷＬは、表皮透過バリア機能崩壊の程度に応じて変動し、ＴＥＷＬ変動率も値が大きくなるほど表皮透過バリア機能崩壊の程度が大きいことを表している。また、基剤のみの塗布では、無塗布と同様なＵＶＢによる表皮透過バリア機能崩壊を起こす。したがって、自然な表皮透過バリア機能崩壊の状態である基剤塗布群と比較してＴＥＷＬ変動率が低値であった場合を表皮透過バリア機能改善効果ありと判定した。
各試料の塗布によるヘアレスマウスのＴＥＷＬ変動率を併せて表１に示す。
0003908953.tif 000004
本試験の結果から、本発明に係るフマル酸ジエステル誘導体であるビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートは、基剤のみ及びジフェニルエチルフマレートと比して、明らかにＵＶＢによる表皮透過バリアの崩壊が小さく、表皮透過バリア機能が改善され、その効果は感作性を有するジメチルフマレートと同程度の強い表皮透過バリア機能改善効果を有していた。
次に、上記同様の方法で、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを下記表２記載の種々の濃度で用いた試験を行なった。
0003908953.tif 000005
・試験２［安全性（感作性）試験］
１．試験方法
マキシミゼーションテストにより安全性（感作性）を評価した。体重３５０〜４００ｇのハートレイ系モルモット（メス）の肩甲骨上の４×６ｃｍ２の皮膚を刈毛し、１列に３つの皮内注射を次の順序に従って２列に行った。
▲１▼  フロイント  コンプリート  アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄｓ′  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｊｕｖａｎｔ：以下ＦＣＡ溶液と略記する）を左右２ヶ所に０．０５ｍＬずつ皮内注射する。▲２▼  試験試料であるフマル酸ジエステル誘導体の３％エタノール溶液を左右２ヶ所に０．０５ｍＬずつ皮内注射する。
▲３▼  試験試料であるフマル酸ジエステル誘導体の６％含有ＦＣＡ溶液に、同量の滅菌水を加え、乳化した溶液を左右２ヶ所に０．０５ｍＬずつ皮内注射する。
これらの操作１週間後に同じ部位を刈毛し、１０％ラウリル硫酸ソーダ含有ワセリンを塗布し、軽度の炎症を起こさせた。塗布２４時間後に同部位に試験試料であるフマル酸ジエステル誘導体の３％エタノール溶液０．２ｍＬをガーゼに塗布して、４８時間閉塞貼付した。皮内注射後２１日目に腹側部を刈毛し、試験試料であるフマル酸ジエステル誘導体のエタノール溶液を２４時間閉塞貼付した。４８時間後に、下記の評価基準に従って肉眼判定により評価を行った。
症状                    評価点
反応なし                  ０
軽度又は散在性の紅斑      １
中等度、微慢性の紅斑      ２
強い紅斑又は浮腫          ３
２．試験結果
各フマル酸ジエステル誘導体の４８時間後の感作性試験結果を下記に示す。試験結果に示した様に本発明のフマル酸ジエステルであるビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートには感作性のないことが確認された。しかしながら、一般式（１）においてｎ＝１に該当するビス（エチレングリコールモノメチルエーテル）フマレートではジエチルフマレート同様に感作性が確認された。
試験試料                                                    陽性率
フマル酸ジエチルエステル                                  ９０％
ビス（エチレングリコールモノメチルエーテル）フマレート    ９０％
ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート    ０％
・試験３（ヒト荒れ肌改善試験）
下記の組成のスキンローションを後記の調製法にしたがって製造し、それを試料として次の操作によって、１０名の健常人（男性、２５〜５２歳）の上腕内側部の皮膚に塗布し、次の操作でヒト荒れ肌改善試験（表皮透過バリア機能回復試験）を行った。尚、対照としては、下記処方中、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを除いたものを用いた。
0003908953.tif 000006
調製法
Ａ，Ｂ成分を各々均一に溶解した後、混合、攪拌分散し、容器に充填した。尚、使用時には内容物を均一に振盪分散して使用した。
各試料を入浴後に１日１回、毎日２ヵ月間（６１日）連続で試験部位（各試料毎に４ｃｍ２、２×２ｃｍ）に０．１ｍＬずつ塗布した。次に塗布開始から６２日目にアセトンを用いて、ＴＥＷＬが０．１５ｍｇ／ｃｍ２／分になるまで皮膚表面を拭き、肌荒れ状態とした。次に、処理前と同様に試料の塗布を再び行い、その後どれだけ表皮透過バリア機能が回復したかを調べるとともに、皮膚表面状態、発赤やかゆみ等の副作用について判定を行った。
本発明である上記組成のスキンローションは、対照と比較して明らかな荒れ肌改善効果を示し、発赤や乾燥等の皮膚の異常は認められなかった。
・試験例４（ＨＢ−ＥＧＦ発現量確認試験）
本発明に係る化合物を表皮細胞に適用したときのＨＢ−ＥＧＦ発現量を以下の試験方法により調べた。
１．本試験で使用した表皮細胞
クラボウ社より販売されているヒト表皮由来の培養表皮細胞を用いた。
２．表皮細胞でのＨＢ−ＥＧＦ発現の測定
（１）実験方法
表皮細胞を増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インシュリン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ハイドロコーチゾンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて４００×１０４個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、１日ごとに培地を交換しつつ、３７℃で３日間静置培養しコンフルエントの状態にした。
培養上清を吸引除去し、最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートあるいは３００μｍｏｌ／Ｌのビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを添加したＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ  キットにより総ｍＲＮＡを抽出しノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当りのＨＢ−ＥＧＦの発現量及びＧ３ＰＤＨの発現量を調べて、対照として無添加時の各ｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ当りの発現量を求め、薬剤添加時のｍＲＮＡ発現量を％対照で示した。
（２）結果
各試料添加によるＨＢ−ＥＧＦ及びＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量を以下に示す。
0003908953.tif 000007
上記結果より、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートは、感作性を有するジメチルフマレートと同等にＨＢ−ＥＧＦ発現を強く誘導したことがわかる。
・試験例５（表皮厚低下抑制試験）
本発明に係る化合物を老齢皮膚に塗布した際の表皮厚の低下抑制を次の試験方法を用いて調べた。
・表皮厚の低下抑制試験
１．本試験で使用した実験動物
試験開始時３３週齢の加齢（老齢）ヘアレスマウス１群５匹を２群と、試験開始時９週齢のヘアレスマウス１群５匹を用いた。
２．表皮厚の測定
（１）試料と実験方法
５０％エタノール水溶液（基剤）に、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを０．５％濃度配合した試料を調製した。この試料０．０５ｍＬをヘアレスマウスの背部皮膚（直径約２．５ｃｍ）に１日１回、週に５日間連続塗布後、２日間塗布なしのスケジュールで４週間の塗布を行った。その後、表皮を採取して凍結切片標本を作成し、顕微鏡観察により表皮の厚さを測定した。各試料の塗布後のヘアレスマウスの表皮厚値を以下に示す。
0003908953.tif 000008
本試験の結果から、ビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートの配合によって、無処理と比較して、明らかに老化に伴って生ずる表皮の浅薄化が改善されたことが示された。
・試験例６（アンフィレグリン発現抑制確認試験）
表皮細胞におけるアンフィレグリン発現量を次の試験方法により調べた。
１．本試験で使用した表皮細胞
クラボウ社より販売されているヒト表皮由来の培養表皮細胞を用いた。
２．表皮細胞でのアンフィレグリン発現の測定
（１）実験方法
表皮細胞を増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インシュリン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ハイドロコーチゾンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて１５０×１０４個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日間静置培養した。
培養上清を吸引除去し、最終濃度３００μｍｏｌ／Ｌのビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート又は７０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートを含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ  キットにより総ｍＲＮＡを抽出しノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当りのアンフィレグリンの発現量及びＧ３ＰＤＨの発現量を調べて、対照としては薬剤無添加時の各ｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ当りの発現量を求め、薬剤添加時のｍＲＮＡ発現量を％対照で示した。
（２）結果
各薬剤添加によるアンフィレグリン及びＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量を以下に示す。
0003908953.tif 000009
本発明に係るフマル酸ジエステル誘導体は感作性を有するジメチルフマレートと同等にアンフィレグリン発現を抑制することがわかる。また、コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ量が変化しないことから、フマル酸ジエステル誘導体によるｍＲＮＡの発現抑制作用がアンフィレグリンに特異的であることがわかった。
・試験例７（レチノイン酸併用時のアンフィレグリン発現抑制確認試験）
レチノイン酸使用時の表皮細胞におけるアンフィレグリン発現量を次の試験方法により調べた。
１．本試験で使用した表皮細胞
クラボウ社より販売されているヒト表皮由来の培養表皮細胞を用いた。
２．表皮細胞でのアンフィレグリン発現の測定
（１）実験方法
表皮細胞を増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インシュリン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ハイドロコーチゾンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて４００×１０４個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、１日ごとに培地を交換しつつ、３７℃で３日間静置培養しコンフルエントの状態にした。
培養上清を吸引除去し、最終濃度３００μｍｏｌ／Ｌのビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート又は７０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートと、必要に応じ１μｍｏｌ／Ｌのレチノイン酸とを含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮＲＮＡ  キットにより総ｍＲＮＡを抽出しノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当りのアンフィレグリンの発現量及びＧ３ＰＤＨの発現量を調べて、対照としては薬剤無添加時の各ｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ当りの発現量を求め、薬剤添加時のｍＲＮＡ発現量を％対照で示した。
（２）結果
各薬剤添加によるアンフィレグリン及びＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量を以下に示す。
0003908953.tif 000010
0003908953.tif 000011
比較例３よりレチノイン酸により強くアンフィレグリンの誘導が引き起こされることがわかり、この誘導されたアンフィレグリンがレチノイン酸の荒れ肌形成に深く関わっていると考えられる。実施例２より、本発明に係るフマル酸ジエステル誘導体は、レチノイン酸添加により誘導されたアンフィレグリンの発現を感作性を有するジメチルフマレートより強く抑制することがわかった。コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ量が変化しないことから、フマル酸ジエステル誘導体によるｍＲＮＡの発現抑制作用がアンフィレグリンに特異的であることがわかった。
・試験例８（荒れ肌抑制試験）
レチノイン酸誘導性の荒れ肌が引き起こされた皮膚に塗布した際の荒れ肌抑制効果を次の試験方法を用いて調べた。
１．本試験で使用した実験動物
試験開始時１０週齢のヘアレスマウス１群５匹を用いた。
２．ＴＥＷＬの測定
（１）試料と実験方法
５０％エタノール水溶液（基剤）に、ジメチルフマレート又はビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを０．５％濃度配合した試料を調製した。レチノイン酸塗布より５日前から毎日、この試料０．０５ｍＬをヘアレスマウスの背部皮膚（直径約２．５ｃｍ）に１日１回、５日間連続の塗布を行った（事前塗布）。その後、０．０５％レチノイン酸５０％エタノール水溶液を１日１回０．０５ｍＬ４日間塗布した。この４日間の塗布は、午前中にレチノイン酸塗布を行い、午後には試料塗布を行う形で時間を空けて塗布した。そして、塗布終了後ハイドログラフＡＭＵ−１００（ケイアンドエス社製）によりＴＥＷＬ値の測定を行った。尚、事前塗布及び試料は基剤のみとし、レチノイン酸のみを同様に塗布した群を比較例５とした。また、基剤のみを全く同様に塗布した群を比較例６とした。
各試料の塗布後のヘアレスマウスのＴＥＷＬ値を以下に示す。
0003908953.tif 000012
上記の通り、比較例５は比較例６の基剤のみの塗布と比してレチノイン酸によるＴＥＷＬの上昇が観られたが、実施例３は、本発明に係るフマル酸ジエステル誘導体の配合によって、比較例５と比較して、明らかにレチノイン酸誘導によるＴＥＷＬ上昇が少なく荒れ肌が抑制され、ＴＥＷＬ値は感作性を有するジメチルフマレートと同等であった。
・試験例９（紫外線起因表皮過増殖抑制試験）
本発明を紫外線により表皮過増殖が引き起こされた皮膚に塗布した際の表皮過増殖抑制を次の試験方法を用いて調べた。
１．本試験例で使用した実験動物
試験開始時１０週齢のヘアレスマウス１群５匹を用いた。
２．表皮厚の測定
（１）試料と実験方法
５０％エタノール水溶液（基剤）に、ジメチルフマレート及びビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを０．５％濃度配合した試料を調製した。まず、この試料０．０５ｍＬをヘアレスマウスの背部皮膚（直径約２．５ｃｍ）に１日１回、一週間に５回の頻度で４週間連続の塗布を行った（事前塗布）。その後、事前塗布の最終塗布から３日目に紫外線Ｂ波長（ＵＶＢ）を０．１５Ｊ／ｃｍ２、１回照射した。そして、照射後４日目に動物を屠殺し皮膚切片を切り出し、ＨＥ染色を行い組織切片標本を作成した。作成した標本を光学顕微鏡を用いて写真撮影を行い、その写真をもとに表皮の厚さを測定し、試験開始時の表皮厚を基準にして、基剤群と各群の平均値を比較した。
各試料の塗布によるヘアレスマウスの表皮厚を以下に示す。
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本試験の結果から、フマル酸ジエステル誘導体の配合によって、基剤や無塗布の群と比較して、明らかにＵＶＢによる表皮肥厚が小さく、表皮過増殖が抑制されたことが分かる。
応用例１（スキンクリーム）
フマル酸ジエステル誘導体を下記組成で配合しスキンクリームを調製した。
（１）組成
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（２）調製法
Ｃ成分のビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートをＢ成分に配合して、Ａ、Ｂ成分を各々８０℃に加熱溶解した後、混合して撹拌しつつ、３０℃まで冷却してスキンクリームを調製した。
応用例２（スキンローション）
フマル酸ジエステル誘導体を下記組成で配合しスキンローションを調製した。
（１）スキンローションの組成
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（２）調製法
Ｃ成分のビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートはＢ成分に配合して、Ａ、Ｂ成分を均一に溶解した後、Ａ成分とＢ成分を混合撹拌分散してローションを調製し、次いで容器に充填する。使用時には内容物を均一に振盪分散して使用する。
応用例３（入浴剤）
下記組成の入浴剤を常法により調製した。
0003908953.tif 000017
応用例４（スキンクリーム）
フマル酸ジエステル誘導体及びレチノイン酸を下記組成で配合しスキンクリームを調製した。
（１）組成
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（２）調製法
Ｃ成分のビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート、レチノイン酸をＢ成分に配合して、Ａ、Ｂ成分を各々８０℃に加熱溶解した後、混合して撹拌しつつ、３０℃まで冷却してスキンクリームを調製した。
応用例５（スキンローション）
フマル酸ジエステル誘導体、レチノイン酸を下記組成で配合しスキンローションを調製した。
（１）スキンローションの組成
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0003908953.tif 000021
（２）調製法
Ｃ成分のビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート、レチノイン酸はＢ成分に配合して、Ａ、Ｂ成分を均一に溶解した後、Ａ成分とＢ成分を混合撹拌分散してローションを調製し、次いで容器に充填する。使用時には内容物を均一に振盪分散して使用する。
応用例６（スキンローション）
フマル酸ジエステル誘導体を下記組成で配合しスキンローションを調製した。
（１）スキンローションの組成
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0003908953.tif 000023
（２）調製法
Ｃ成分のビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレート、レチノイン酸はＢ成分に配合して、Ａ、Ｂ成分を均一に溶解した後、Ａ成分とＢ成分を混合撹拌分散してローションを調製し、次いで容器に充填する。使用時には内容物を均一に振盪分散して使用する。
応用例７〜９（スキンクリーム）
下記処方にてスキンクリームを常法により調製した。
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応用例１０、１１（ローション）
下記処方にてローションを常法により調製した。
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応用例１２〜１４（ジェル）
下記処方にてジェルを常法により調製した。
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応用例１５〜１７（親油性クリーム）
下記処方にて親油性クリームを常法により調製した。
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応用例１８〜２０（サンスクリーン）
下記処方にてサンスクリーンを常法により調製した。
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産業上の利用分野
以上記載のごとく、本発明は、安全性が高くかつ表皮透過バリア機能の崩壊を迅速に改善し、美容学的にも健やかな皮膚に保つ効果に優れた表皮バリア機能強化剤及び皮膚外用剤組成物、並びに表皮のターンオーバーを亢進するＨＢ−ＥＧＦ発現誘導剤、表皮の過増殖を抑制するアンフィレグリン発現抑制剤及びレチノイン酸に起因する荒れ肌を防止できるレチノイン酸との併用剤及び老化に伴う皮膚の代謝低下や浅薄化等を改善できる老化皮膚改善剤を提供することができる。