(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オタネニンジンの不定胚形成組織を、炭素源濃度4〜20g/Lに調整した固形培地で培養することにより不定胚を増殖する工程と、不定胚を液体培地で、0.1〜3リットル空気／リットル液体培地／分の条件で空気を供給して発芽させる発芽工程と、発芽胚を固形培地に移植して発根伸長させ発根苗を生成する発根工程と、発根苗を馴化させる馴化工程とを有するオタネニンジン苗の大量増殖方法。
【請求項２】
発芽工程において、１０００ルックス以上の光を１日あたり８時間以上照射しながら培養する請求項１に記載のオタネニンジン苗の大量繁殖方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は組織培養によって、薬用ニンジンであるオタネニンジン苗を大量に得るための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オタネニンジン（Panax ginseng C. A. Meyer ）は、重要な薬用植物として栽培され、通常は種子により繁殖されている。古くから漢方薬、民間薬として広く用いられてきた生薬の一種で、最近では健康食品にも利用されるようになり、需要はますます伸びる一方である。しかし、生薬原料として用いられる薬用ニンジンは、通常収穫までに４〜７年を要し、天候によっても生育が左右されやすく、また病害（ネグサレ病、タチガレ病、ハンテン病など）や害虫（ウドコブゾウムシ、ズイムシなど）による被害も多いため栽培には多大な労力を要している。したがって、優良な品種の安定な保存と供給が望まれていたが、オタネニンジンは自殖性であり種子の採取までに最低３年を要するため、優良品種の苗を大量に得ることは困難なものとされていた。
【０００３】
そこで上記の問題を解決するために、オタネニンジンの根、茎、葉などの組織からオーキシン類およびサイトカイニン類を含有するカルス誘導培地を用いてカルスを誘導し、該カルスを増殖し、次いで該カルスを光照射下で再分化させる方法（特開昭６１−２１６６１９）が提案されたが、地上部を誘導した後に根を誘導する過程が必要であるため手間がかかり、また発根の効率や幼苗の圃場での活着にも問題がある。さらに、再分化して得られる幼苗の数がカルスの量に依存し、またカルスは継代を繰り返すとかなりの割合で変異するので、１個体の植物から得られる正常なクローン苗の量に限界があるという欠点がある。
【０００４】
一方、これまでに食用ニンジンなど多くの植物において、種子と同様の形態変化の過程をとって成長する不定胚を誘導して幼苗を得る技術が多数報告されているが、薬用ニンジンにおいては既に根や子葉などからカルスを誘導し、さらに不定胚を誘導してこれを再分化させ幼苗を得る方法（W.C.Chang et al; Theoretical and Applied Genetics,57,133(1980)、特開昭６２−１５１１１７、特開昭６３−２４８３２１）が提案されている。しかしこの方法では不定胚の誘導効率に問題があり、また培養開始から幼苗を得るまでに長期間を要するという欠点がある。
【０００５】
そこでこれらの欠点を解決するために、花芽を材料に不定胚を誘導する方法（特公平２−５１５７３）、および不定胚からシュートを誘導し、これをマルチプルシュート化して増殖させる方法（特公平３−４４７２５）などが提案されている。しかし、これらの方法も前述のカルスから光照射で再分化させる方法と同様カルスを経由するために、継代培養を繰り返すうちに不定胚形成能や再分化能が失われ、加えて変異が発生する可能性がある。
【０００６】
そこで、不定胚形成能や再分化能が安定に保持し継代培養できる、再分化組織より高温処理により直接的に不定胚を誘導する方法が提案された（特開平４−３７００４７）。
【０００７】
ところで、通常不定胚は雑多な組織中において徐々に分化してくるため、他の組織から成熟不定胚だけを分離しなければ効率よく苗を生産することはできない。したがって、不定胚からの苗の大量生産を行うためには、１培養周期内でできるかぎり大量に、かつ同調的に成熟胚を得ることが必要である。既に食用ニンジンにおいては細胞塊の大きさをメッシュによって揃える方法（鎌田  博，原田  宏，植物細胞組織培養（理工学社）p.94(1979)）や、細胞塊の培地中の密度を調整する方法（第１２回植物組織培養学会講演要旨集，p.53(1991)）などが同調的に不定胚を誘導する方法として提案されているが、薬用ニンジンに関してはそのような同調化の方法はまだ確立されていない。
【０００８】
また食用ニンジンなどでは、芽生えの茎頂を高濃度のサッカロースやマンニトールを含む培地で一時的に高浸透圧処理することにより、不定胚が誘導できるとの報告（H.Kamada et al; In Vitro Cell. Dev. Biol.,25,1163(1989) ）があるが、薬用ニンジンではそのような方法、および条件は知られていなかった。
【０００９】
そこで、炭素源濃度を４〜２０ｇ炭素源物質／リットルに調整された培地で不定胚形成組織を培養することにより不定胚を連続的に大量に増殖させる方法が提案され（特開平５−１６８３５９）、これらの方法によって質の高い不定胚は量産できるようになった。
【００１０】
しかし、不定胚から苗を量産するためには、不定胚から迅速に発芽させ、さらに圃場へ移植する前の馴化工程を効率よく行う必要があるが、オタネニンジンは乾燥した環境で生育するため、この工程に長時間を要していた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述の課題を解決しようとするものであり、不定胚から迅速に発芽させ、さらに圃場へ移植する前の馴化工程を効率よく行う方法の提供を目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、オタネニンジンの組織から誘導した不定胚を液体培養で培養し発芽させ発芽胚を生成する発芽工程と、発芽胚を固形培地に移植して発根伸長させ発根苗を生成する発根工程と、発根苗を馴化させる馴化工程とを有するオタネニンジン苗の大量繁殖方法である。
【００１３】
本発明でいう不定胚とは、受精卵と同様な形態変化の過程をとって植物の体細胞から生ずる一種の胚で、完全な植物体にまで発育しうる能力を有するものであり、胚様体（embryoid）ともいわれる（生物学辞典第３版（岩波書店）１１２３項（１９８３年）参照）。
【００１４】
本発明の材料となる不定胚を誘導する方法は、従来知られている前述のいずれの方法によっても可能であるが、不定胚増殖の効率と、不定胚形成組織の安定した維持の面から、不定胚増殖には、炭素源濃度を４〜２０ｇ炭素源物質／リットルに調整した培地で培養することにより連続的に大量生産する方法を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の発芽工程に用いられる液体培養法としては、静置培養、振とう培養、タンク培養のいずれの方法によっても可能であるが、不定胚へのせん断ストレスを防止する面から、静置培養、エアーリフト方式によるタンク培養が好ましい。また、静置培養を行う際には、組織への酸素を供給するため該液体培地に０．１リットル空気／リットル液体培地／分以上の空気を供給することが好ましい。
【００１６】
本発明の発芽工程においては、いずれの光条件下においても不定胚の発芽を誘発することができるが、１０００ルックス以上の光を１日あたり８時間以上照射しながら培養することが発芽効率の向上の面から好ましい。
【００１７】
本発明の発根工程において用いる固形培地の支持材は、寒天や、ゲランガムのようなゲル性支持材と、セラミックファイバー、ロックウール、その他園芸用の植え込み材等いずれの支持材を用いても可能である。培地には特に植物ホルモンの添加を必要としないが、発根が芳しくない場合は、オーキシンを５ｐｐｍ以下の濃度添加しても支障ない。
【００１８】
本発明の馴化工程においては、一般の園芸用植え込み材のいずれを用いても馴化が可能であるが、オートクレーブや乾熱滅菌による滅菌を行うか、薬剤による消毒殺菌によって予め土壌細菌を除去しておく必要がある。
【００１９】
【作用】
本発明の一連のプロセスの、オタネニンジン苗の生産性向上に対して及ぼす詳細な相互作用は明らかではないが、組織の観察によれば液体培地による発芽工程を加えることにより、胚への栄養供給が促進されるため従来よりも発芽時間が短縮され、また正常な苗の歩留まりが向上する。しかし、液体培地からそのまま馴化工程に移行した場合、苗の水分含有率が高いため正常に土壌に活着させるためには長時間を要する。そこで固形培地による発根工程を加えることにより苗の水分含有率を低下させると同時に、毛根の発達が促進され速やかに馴化でき、これら２工程の組み合わせが、苗の生産性向上に寄与するものと推測される。
【００２０】
【実施例】
オタネニンジンの５年根から、サッカロース３０ｇ／リットル、カイネチン１ｐｐｍを添加し、寒天９ｇ／リットルを支持材としたムラシゲ・スクーグ固形培地により２０℃、５０００ルックス、１日あたり１４時間の光照射下でマルチプルシュートを誘導した。
【００２１】
このマルチプルシュートの１００ｍｌフラスコ２本分を、３５℃、２４時間の高温処理後、２０℃、５０００ルックス、１日あたり１４時間の光照射下で６週間培養を続け不定胚を誘導した。
【００２２】
高温処理した不定胚形成組織を、植物ホルモンを添加せずサッカロース濃度を８ｇ／リットルに調整したゲランガムを支持材としたムラシゲ・スクーグ固形培地１００ｍｌが入った３００ｍｌフラスコに置床し、２０℃、５０００ルックス、１日あたり１４時間の光照射下で６週間培養を続け不定胚を量産した。
【００２３】
量産された不定胚を、植物ホルモンを添加せずサッカロース濃度を３ｇ／リットルに調整したムラシゲ・スクーグ液体培地５００ｍｌが入った２リットルのボトルに移植し、０．５〜３リットル空気／リットル液体培地／分の通気条件で３週間培養し約１００個の発芽胚を得た。
【００２４】
この発芽胚のうち３０個を、植物ホルモンを添加せずサッカロース濃度を３０ｇ／リットルに調整した、ゲランガム３ｇ／リットルを支持材としたムラシゲ・スクーグ固形培地に移植し、２０℃、５０００ルックス、１日あたり１４時間の条件で３週間培養し発根苗を得た。この苗をオートクレーブで滅菌した園芸用培養土が入ったポットに移植し、シャーレの蓋をのせて乾燥を防止し６週間育成したところ、活着苗が２８本得られた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、効率よくオタネニンジン苗を大量に生産できるという優れた効果を有する他、従来よりも迅速に効率よく活着苗が得られるという格別な効果を有する。また、液体培養工程においては機械化および自動化が容易であり、省人化も可能である。