(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チョングッチャン（清麹醤）から分離された下記特徴を有するバチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var.chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）。
i)平均分子量約1,300万のポリ-γ-グルタミン酸を生産する。
ii)耐塩性
iii)胞子形成がむずかしい。
iv)菌株自体にプラスミドを含有しない。
ｖ)硝酸塩還元力が陰性
【請求項２】
前記バチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var. chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）を利用することを特徴とするポリ-γ-グルタミン酸の製造方法。
【請求項３】
下記の段階を含む請求項２記載のポリ-γ-グルタミン酸の製造方法。
（ａ）前記バチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var. chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）を、グルタミン酸を含有する培地を用いて培養し、培地中にポリ-γ-グルタミン酸を生成させる段階
（ｂ）上記ポリ-γ-グルタミン酸含有液中の多糖類を除去し、溶媒抽出して遠心分離し、ポリ-γ-グルタミン酸沈殿物を収得する段階
（ｃ）上記ポリ-γ-グルタミン酸沈殿を溶解させた後、タンパク質分解酵素で処理し、細胞外性タンパク質を分解させる段階
（ｄ）透析し、遊離グルタミン酸を除去した後、濃縮する段階
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は稲わらを利用した韓国の伝統大豆発酵食品であるチョングッチャン（清麹醤）から分離した耐塩性バチルスズブチリス（枯草菌）チョングッチャン株（Bacillus subtilis var. chungkookjang、KCTC 0697BP）及び前記菌株を用いたポリ-γ-グルタミン酸の製造方法に関するものである。より詳細には、本発明はD-アミノ酸のアミノ基をケト酸に転移させる酵素であるD-アミノ酸アミノ転移酵素（D-aminoacid aminotransferase：EC2.6.1.21）（以下、D-AATと略称する）、アラニン及びグルタミン酸の異性質体形成を触媒する酵素であるグルタミン酸ラセミ化酵素（Glutamate racemase：EC5.1.1.3：以下GluRAと略称する）やアラニンラセミ化酵素（Alanine racemase：以下AlaRAと略称する）、及びポリ-γ-グルタミン酸合成酵素（Poly-γ-glutamae synthetase）等の細胞内酵素複合体により細胞外にポリ-γ-グルタミン酸を生産する新菌株及び前記菌株を用いた高分子量のポリ-γ-グルタミン酸の製造方法に関するものである。図１に図示した様に、ポリ-γ-グルタミン酸の合成には多くの酵素が関与している。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ-γ-グルタミン酸はD,L-グルタミン酸がポリ-γ-グルタミル（γ-glutamyl）結合した重合体であり、粘液性物質として、稲わらを利用した韓国の伝統大豆発酵食品である“チョングッチャン”（消麹醤）、日本の伝統大豆発酵食品である“納豆”、ネパールの伝統豆発酵食品である“キネマ”等から分離したバチルス属菌株から生産される。前記バチルス属菌株から生産されるポリ-γ-グルタミン酸は食用、水溶性、陰イオン性、生分解性高分子物質（分子量：100,000〜2,000,000）で吸湿剤、保湿剤及び化粧品の原料、エステル誘導体の合成による自然分解性プラスチック製造のための素材物質に利用が可能である。
【０００３】
最近、ポリ-γ-グルタミン酸の生産や利用に関して難分解性重合体の代替商品素材、エステル化反応による耐熱性プラスチックの開発と水溶性繊維及び膜生産等に関心を持った研究が先進工業国を中心に活発に進行している。また、ポリ-γ-グルタミン酸にガンマ線照射時に引き起こされる物性変化研究及び架橋結合剤によるハイドロゲル（hydrogel）の開発及び産業化研究が推進されている。例をあげると、ポリ-γ-グルタミン酸の組成、ポリ-γ-グルタミン酸生産に及ぼすマンガンイオンの影響、超音波分解による水溶性重合体への利用に対する研究及びエステル誘導体の合成による低水溶性プラスチックの開発に関する研究（Biosci．Biotechnol．Biochem．，60（8）：1239-1242，1996）やバチルス ズブチリスによるポリ-γ-グルタミン酸生産及びカルシウム溶解剤としての骨そしょう症治療効果をもつ健康食品への活用（特開平6-32742号）等に見られる。
【０００４】
その他、水系のリン含有量を減少させて水質汚染を減少させる効果（ユーロ特許第838160号）や、放射線照射による高ゲル化性、吸水性を持つ生分解性吸着性樹脂を製造しおむつ等の衛生用品、食品、園芸産業への応用（特開平10-251402号）及び活用（特開平7-300522号、特開平6-322358号）等に関する報告がある。また、ポリ-γ-グルタミン酸の溶解、沈殿及び乾燥による固形化生分解性繊維やフィルム及びフィルム形成剤としての利用（特開平7-138364号、特開平5-117388号）、薬物担体用ポリマー（特開平6-92870号、特開平6-256220号）等に対する報告もある。
【０００５】
一方、韓国ではポリ-γ-グルタミン酸の効率的生産（大韓民国特許出願 第1997-3404号、大韓民国特許出願第1997-67605号）や特性改善等の様な基礎研究と共に、株式会社太平洋によりバチルス納豆菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸を化粧品の原料物質に利用しようとする応用研究がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のバチルス属菌株を用いた方法で得られるポリ-γ-グルタミン酸の分子量は100,000〜2,000,000であり、吸湿剤、保湿剤や自然分解性プラスチック製造のために、より高分子のポリ-γ-グルタミン酸を生産する方法と、より生産性の高い方法が求められていた。
【０００７】
したがって本発明は、より高分子量のポリ-γ-グルタミン酸をより大量に生産する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、韓国の伝統大豆発酵食品のチョングッチャン（清麹醤）から分離した耐塩性菌株バチルスズブチリス チョングッチャン株が、高分子量のポリ-γ-グルタミン酸を高濃度で生産することを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の一つは、チョングッチャン（清麹醤）から分離された下記特徴を有するバチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var.chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）を提供するものである。
i)平均分子量約1,300万のポリ-γ-グルタミン酸を生産する。
ii)耐塩性
iii)胞子形成がむずかしい。
iv)菌株自体にプラスミドを含有しない。
ｖ)硝酸塩還元力が陰性
【００１０】
また、本発明のもう一つは、前記バチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var. chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）を利用することを特徴とするポリ-γ-グルタミン酸の製造方法を提供するものである。
【００１１】
上記製造方法においては、下記の段階を含むことが好ましい。
（ａ）前記バチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var. chungkookjang、寄託番号KCTC0697BP）を、グルタミン酸を含有する培地を用いて培養し、培地中にポリ-γ-グルタミン酸を生成させる段階
（ｂ）上記ポリ-γ-グルタミン酸含有液中の多糖類を除去し、溶媒抽出して遠心分離し、ポリ-γ-グルタミン酸沈殿物を収得する段階
（ｃ）上記ポリ-γ-グルタミン酸沈殿を溶解させた後、タンパク質分解酵素で処理し、細胞外性タンパク質を分解させる段階
（ｄ）透析し、遊離グルタミン酸を除去した後、濃縮する段階
【００１２】
本発明によれば、従来よりも高分子量のポリ-γ-グルタミン酸を効率よく生産する菌株と該菌株を用いた高分子量のポリ-γ-グルタミン酸の製造方法を提供することができる。本発明で得られるポリ-γ-グルタミン酸は、従来のバチルス属菌株により生産されたポリ-γ-グルタミン酸よりも高分子量であり、吸湿剤、保湿剤や自然分解性プラスチック製造に好適に利用することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１４】
（菌株の分離及び同定）
食用、水溶性、陰イオン性及び生分解性のポリ-γ-グルタミン酸を高い収率で生産し、耐塩性をもった本発明の新規菌株であるバチルスズブチリス チョングッチャンの分離及び同定の方法は次のとおりである。
【００１５】
大韓民国内で生産され、稲わらを利用した伝統大豆発酵食品である清麹醤20種類の試料からポリ-γ-グルタミン酸高生産性を持つ菌株を分離するために、各種清麹醤試料を蒸留水に懸濁した後、60℃の恒温水槽で20分間熱処理する。前記熱処理させた懸濁液少量を1.5％のL-グルタミン酸を含有するポリ-γ-グルタミン酸生産寒天平板培地（GS）に塗抹した後、37℃恒温器で3日間培養して高い粘性を表す菌のコロニーを純粋分離する。これら分離菌を対象として上記のような同一培地を利用して2度反復して継代培養した後、ポリ-γ-グルタミン酸の生産によって高粘性を出す菌コロニーの中で菌体増殖が最も活発な菌株を分離する。前記分離したポリ-γ-グルタミン酸高生産性菌株は2％寒天を含有するLB平板培地から乳白色の菌コロニーを形成するが、これを速続希薄法により37℃で20時間培養し菌体の成長が最も活発となる菌株を分離する。
【００１６】
上記の方法により分離された本発明菌株の形態学的及び生理学的特性は次のとおりである。
【００１７】
本発明菌株はLB寒天平板培地で培養する時、乳白色の菌コロニー形成し、37℃以上の好気的条件で菌体の成長が活発なそのグラム陽性菌として55℃以上の培養温度では菌体増殖が鈍化される特性がある。また、本発明菌株は一般的なバチルスズブチリスが持つ食塩耐性濃度より高い9.0％の食塩（NaCl）濃度でも生産が可能な耐塩性菌株で、本発明分離菌株の16S rDNA塩基配列を従来バチルス中菌株16S rDNA塩基配列と比較分析した結果、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis）と非常に高い16S rDNA塩基配列の相同性（99.0％）を表した。
【００１８】
しかし、上記のような高い相同性にもかかわらず、本発明新規の分離菌中のバチルスズブチリス チョングッチャンは従来ポリ-γ-グルタミン酸生産に利用できる通常のバチルス属菌株とは異なりプラスミドを含有しておらず、遺伝子操作を通じた組換えタンパク質の高発現システムに適合した菌株にも利用することができるものである。本発明による分離菌株は食用可能な安全な微生物である。従って例えば、前記菌株を宿主としてワクチンを発現させ（例えば豚下痢症ウイルスの抗原部分を発現させ）菌株自体を下痢病治療又は防止用飼料添加剤に使用することができる。
【００１９】
即ち、本発明の菌株を利用して経口ワクチン開発が可能となるものである。
【００２０】
また、他のバチルス属菌株とは異なり、本発明の分離菌株は硝酸塩還元力が陰性であり、胞子形成が容易に起こらなく、マンガンイオンによっても容易に誘導されない特性を持つ。前記の結果から本発明の菌株をバチルスズブチリスに分類し、バチルス ズブチリス チョングッチャン（Bacillus subtilis var．chungkookjang）と命名し、便宜上前記菌株の名称を‘バチルス属BS-4’（Bacillus sp．BS-4）とし、1999年11月18日付で生命工学研究所遺伝子銀行（KCTC，大田広域市儒域区魚隠洞52所在）にKCTC0697BPの受託番号として寄託した。
【００２１】
（ポリ-γ-グルタミン酸の分析及び関与酵素の活性測定）
前記菌株により生産されるポリ-γ-グルタミン酸の定量と重合体のD,L-グルタミン酸組成の確認は下記のとおり実施する。
【００２２】
バチルス ズブチリス チョングッチャンを培養した後、培地を遠心分離し、ポリ-γ-グルタミン酸が含有された液を分離し、ここに高濃度塩酸を加えて高温で加水分解した後、光学活性HPLCカラムを利用してD,L-グルタミン酸を分離する。標準曲線を求めるため、精製したポリ-γ-グルタミン酸試料も同一な方法で分析した。カラムを通過した物質をD,L-グルタミン酸標準曲線に準じて定性及び定量した後、初期培地に加えた遊離L-グルタミン酸に対する補正値を計算して純粋に生産されたポリ-γ-グルタミン酸の含有量を計算する。
【００２３】
また、生分解性ポリ-γ-グルタミン酸の生産に直接関与する細胞内酵素D-AAT，GluRA及びAlaRA活性の測定のために、本発明菌株を5mlのLB液体培地に接種し、37℃で10時間の間培養した次に、菌体を回収し超音波破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離し粗酵素液を得る。D-AATの活性定量は0.1Mトリス緩衡液（Tris-HCl，pH8.5）中にD-アラニン及びα-ケトグルタミン酸と上記で得た粗酵素液を反応させ酵素反応により生産される反応産物であるピルビン酸の量を測定することによってその活性を定量することができ、GluRAは50mMトリス緩衡液（Tris-HCl,pH8.5）中に粗酵素液をD-グルタミン酸，α-グルタミン酸及びPLPと反応させた後酵素反応により生産されたL-グルタミン酸を光学活性HPLCカラムで分析し、その活性を定量することができる。AlaRAはD-アラニンを基質としてアラニン脱水素酵素により生産されたピルビン酸を340nmで吸光度を測定して、その活性を定量する。
【００２４】
以下、実施例を通して本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
（実施例１）ポリ-γ-グルタミン酸を生産する微生物の分解及び同定
１．微生物の分離
稲わらを媒体とする伝統的な発酵法により生産された伝統大豆発酵食品である清麹醤を全国各地で入手し、試料として使用した。各試料を減菌蒸留水に少量加えて懸濁した次に、60℃恒温水槽で20分間熱処理しバチルス菌が持つ内生胞子形成化過程をたどった後、懸濁液を2％寒天を含有するGS平板培地（1.5％L-グルタミン酸，5.0％砂糖，0.27％KH２PO４，0.42％Na２HPO４，0.05％NaCl，0.05％MgSO４及び0.05％ビオケン）に塗抹して、37℃培養器に3日間培養した。培養後、ポリ-γ-グルタミン酸生産により示される粘液性菌コロニーを形成する菌体を分離した。
【００２６】
分離菌は粘液性高分子ポリ-γ-グルタミン酸生産により混合培養できる可能性を考慮し、重合体を生産しない一般培地であるLB培地上で連続希薄法に準じて塗抹した後、菌体増殖が最も旺盛な菌だけを純粋分離しポリ-γ-グルタミン酸生産菌株と選定し、前記菌株の形態学的及び生化学的特性は粘液性の重合体生産がない一般培地を利用して究明した。
【００２７】
本発明により得られたポリ-γ-グルタミン酸生産菌株の重合体生産に関与する酵素複合体の構成酵素活性を調査するために、分離された菌株を5mlのLB液体培地に接種し10時間の間培養した。前記培養液を遠心分離し菌体を回収し、超音波破砕機で菌体を破砕し粗酵素液を得た後、これをポリ-γ-グルタミン酸生産に関与するD-AAT，GluRA及びAlaRA酵素活性測定に使用した。
【００２８】
２．微生物の各種形態学的及び生化学的特性
（１）微生物の成長・形態特性
上記段階で分離された食用、水溶性、生分解性、陰イオン性ポリ-γ-グルタミン酸高生産活性菌株は、ポリ-γ-グルタミン酸生産培地であるGS寒天平板地では高い粘液性を出す菌のコロニーを形成したが、粘液性重合成を生産しないLB寒天平板培地では乳白色の菌コロニーを形成し、菌体の多くは棒状の形態を示した。菌体増殖に及ぼす温度影響では30℃以上55℃以下の範囲で成長が養護され、60℃以上では菌体増殖が確認することができなかった。
【００２９】
LB液体培地を利用した菌体増殖の対数期で顕微鏡観察したところ、比較菌株のバチルスズブチリスと類似していた（図示省略）。グラム陽性であり、細胞の大きさは概略0.7〜0.8×2.0〜3.0μmであった。反面、又他の比較菌株であるリチニポミスは対数期の菌体外形が細い棒状の模様を表し、本発明の分離菌株とは相異なった菌体外形を表した。
【００３０】
（２）塩化ナトリウム耐性
本発明による菌株及びバチルス ズブチリス納豆（B．subtilis natto）菌株を各濃度のNaClが添加されたLB培地で24時間の間培養した後、660nmで吸光度を測定して各菌株の成長程度を測定した（図２）。図で見られるように、本発明による菌株は成長が可能な濃度範囲（12％）からバチルス ズブチリス納豆に比べ約2倍の生存率、すなわち塩化ナトリウムに対する耐性であるのがわかる。
【００３１】
（３）プラスミド含有特性
本発明による菌株、バチルス ズブチリスのタイプストレインであるバチルスズブチリス168及びバチルス ズブチリス納豆IFO3336からプラスミドを分離し、その含有可否を確認した（図３）。図３で、Ｍは1kb ラダ-マーカー、Ａはバチルス ズブチリス168、Ｂは本発明による菌株、Ｃはバチルス ズブチリス納豆IFO3336を表している。
【００３２】
図でみられるように、本発明による菌株はポリ-γ-グルタミン酸を生産する菌株であるにもかかわらず納豆IFO3336のようなプラスミドを含有していないことがわかる。そしてポリ-γ-グルタミン酸を生産することができない菌株であるバチルス ズブチリス168と同一である特徴が見られるものである。
【００３３】
詳述した場合のように、本発明による菌株はプラスミドを含有しておらずそのため遺伝子操作をした組換えタンパク質の高発現システム（分泌生産）に適合した宿主にも利用できるものである。
【００３４】
（４）  胞子形成特性
2mMのCoSO4が添加されたLB培地に本発明による菌株を接種して、37℃で4日間培養した後、胞子を染色し観察した(図示 省略)。本発明による菌株は同じポリ-γ-グルタミン酸生産菌株であるバチルス ズブチリス納豆に比べて胞子形成能力が顕著に低いのが確認できた。
【００３５】
（５）  その他生理化学的特性
API50CHBとAPI20Eキットを使用して本発明による菌株の生化学的特性等を調査した。
【００３６】
本発明による菌株はグラム陽性菌であり、硝酸塩の還元力がなくインドールを生産しない。ゼラチンと澱粉を分解し、β-グリコシダーゼとβ-ガラクトシダーゼを生産し、オキシダーゼを生産する。また、ウレアーゼを生産し、好気的、嫌気的条件において全て成長することができる。グリセロール、ガラクトース、グルコース、シュークロース、マルトース、澱粉を利用することができるものとして表した。
【００３７】
本発明により選別された微生物の詳細な形態学的及び生化学的特性は表１に表したとおりである。
【００３８】
【表１】
0003999514.tif 000002
【００３９】
（６）塩基配列分析
本発明で得られた分離菌株をより正確に同定するために、16S rDNAの遺伝子塩基配列分析を実施した。
【００４０】
まず、N-末端プライマー（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）とC-末端プライマー（5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’）を使用し16S rDNA遺伝子をPCRにて増幅した後、プラスミドpT7Blueにクローニングし全塩基配列を決定した。選別された微生物の16S rDNA塩基配列を従来報告されている多くの微生物の16S rDNA塩基配列と相同性を比較した結果、バチルスズブチリスと99.0％相同性を表わし、図４に図示されたような系統に位置するものとして判断できた。
【００４１】
（７）  分離した菌株の同定
しかし、上記のように高い相同性にもかかわらず、本発明の分離菌株は従来ポリ-γ-グルタミン酸生産に利用できる通常的なバチルス属菌株とは異なりプラスミドを含有しない特性を示す。このような特性は本発明による菌株が遺伝子操作を通じた組換えタンパク質の高発現システムに適合した宿主に利用できるということを示している。また、バチルス属菌株とは異なり本発明の分離菌株は硝酸塩還元力が陰性で、胞子形成が容易に行なわれず、マンガンイオンに対しても容易に誘導しない特性を持つ。
【００４２】
以上のような菌株自体の特性及びこの菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸の特性（下記実施例で説明できる）について本発明の菌株をバチルスズブチリスに属する新菌株に分類しバチルス ズブチリス チョングッチャン（Bacillus subtilis var．chungkookjang）と命名し、便宜上前記菌株の名称をバチルス属BS-4’（Bacillus sp．BS-4）とし1999年11月18日付で生命工学研究所遺伝子銀行（KCTC，韓国大田広域市儒域区魚陰洞52所在）に寄託し寄託番号KCTC0697BPを付与された。
【００４３】
（実施例２）ポリ-γ-グルタミン酸の生成
本発明の分離菌株をポリ-γ-グルタミン酸生産培地に接種して37℃で72時間の間培養した後、2N塩酸溶液を加えてpHが3.0になるように調節することによりポリ-γ-グルタミン酸含有試料液を収得した。前記試料液を4℃で10時間の間静置させ発酵液内の多糖類を除去して、そこにエタノールを前記発酵液の2倍の体積となるように加えて十分に混合した。混合液を4℃で10時間の間静置させた後、遠心分離しポリ-γ-グルタミン酸沈殿物を得た。前記沈殿物に蒸留水を加えて溶解させ、タンパク質分解酵素を100μg/mlになるように加え37℃の恒温器で6時間の間静置反応させポリ-γ-グルタミン酸試料に存在する細胞外タンパク質を分解させた。これを十分な量の蒸留水で透析し遊離したグルタミン酸を除去した後濃縮し純粋なポリ-γ-グルタミン酸を得た。これら精製されたポリ-γ-グルタミン酸は酸加水分解を行ない、得られたD,L-グルタミン酸の組成と生産量を測定した。
【００４４】
本発明の菌株と比較に用いられた菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸の生産性は表２に表したように、液体培地により、本発明の分離菌株は16g/Lの生産性を示した。納豆から分離されたバチルス ズブチリス納豆IFO3336aとリチエポミスATCC9945aでは各々10g/Lと9g/Lのポリ-γ-グルタミン酸生産性を示した。固体培地においてポリ-γ-グルタミン酸の生産性を比較する為に、2％寒天を含むポリ-γ-グルタミン酸生産培地である平板培地に菌を接種し、37℃で3日間培養した後、上記の精製方法と同一にポリ-γ-グルタミン酸を精製し本発明分離菌株と比較菌株の生産性の差を調査した。試験結果、本発明の分離菌株は12mg/平板培地、バチルス ズブチリス納豆IFO3336aは8mg/平板培地、リチエポミスATCC9945aは6mg/平板培地の生産性を表し、本発明分離菌株が比較菌株に比べて約2倍の生産性を持つことを確認した。また、図５のゲル写真でみられるように各々0.3mgの菌株あたり生産されたポリ-γ-グルタミン酸の量を比較した結果、本発明の分離菌株が既存のポリ-γ-グルタミン酸生産菌株であるバチルス ズブチリス納豆IFO3336aより極めて多くの量のポリ-γ-グルタミン酸を生産することを確認することができる。
【００４５】
【表２】
0003999514.tif 000003
【００４６】
（実施例３）ポリ-γ-グルタミン酸のD,L-グルタミン酸の立体特異性調査
本発明の分離菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸の生産量とポリ-γ-グルタミン酸の構成成分であるD,L-グルタミン酸の組成を調べた。
【００４７】
本発明の分離菌株が生産する高分子量のポリ-γ-グルタミン酸の単量体であるD,L-グルタミン酸の構成比を調べるため、GS生産培地が含有した500mlの三角フラスコを利用して150rpm，37℃恒温器で72時間の間培養し、上記の精製方法と同様の方法で精製し得た純粋なポリ-γ-グルタミン酸試料に6N塩酸を加えて脱気させた後、105℃で10時間の間加水分解した。
【００４８】
上記加水分解産物のアミノ酸組成分析は5％メタノールを含有する50mMリン酸緩衡液（pH7.0）とメタノールを利用した濃度勾配を利用してHPLCカラム（RexchromeS5-100-ODS，Regis Chem社，4.6mm×25cm×5m，米国）により分析した。立体異性体の分離はｏ-フタルアルデヒドを利用してD,L-グルタミン酸のアミノ末端部位を誘導体化させた後、蛍光検出器により452nm（Em）と342nm（Ex）においてD,L-グルタミン酸の標準曲線に準じポリ-γ-グルタミン酸の構成成分であるD,L-グルタミン酸を定量とした。
【００４９】
生産されたポリ-γ-グルタミン酸を構成する単量体であるD,L-グルタミン酸の含有量を調べた結果は表２に表したように、本発明分離菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸からはD/L-グルタミン酸の比率は約40/60であり、比較菌株であるバチルス ズブチリス納豆IFO3336aとリチエポミスATCC9945aではD/L-グルタミン酸の比率が50/50であり分離菌とは違う単量体構成比をみられた。
【００５０】
（ポリ-γ-グルタミン酸生産に関与する酵素活性の定量）
本発明分離菌株のポリ-γ-グルタミン酸生産に関与する酵素活性を測定するために、粘液性重合剤を生産しないLB液体培地を用いて37℃恒温器で菌体を培養した後遠心分離し、これを前述した方法により粗酵素液を調製した後次に、粗酵素液に含まれる酵素活性を測定した。
【００５１】
D-AATの活性は0.1Mトリス緩衡液（Tris-HCl，pH8.5）中にD-アラニン及びα-ケトグルタル酸と粗酵素液を反応させ酵素反応により生産された反応産物であるピルビン酸の量を測定することにより定量し（Berntsson S，Anal．Chem．，27：1659-1660，1995）、GluRAの活性は50mMトリス緩衡液（Tris-HCl，pH8.5）中で粗酵素液をD-グルタミン酸、α-ケトグルタル酸及びPLPと反応させた後、酵素反応により生産されたL-グルタミン酸を光学活性HPLCカラムで分析し定量した。アラニンラセミ化酵素活性測定（Biochemistry，25：3261-3267，1986）はD-アラニンを基質として生産されたL-アラニンにアラニン脱水素酵素を反応させ生成されたピルビン酸を吸光度測定し定量した。タンパク質含有量はブラッドフォード方法（Bradford，M.,Anal.Biochem．，72：248-254，1976）で測定した。
【００５２】
本発明の分離菌株を三角フラスコで培養した後、生産されるポリ-γ-グルタミン酸の量、分子量及びD,L-グルタミン酸比率と酵素（D-AAT，GluRA，AlaRA）の活性測定結果を表２と表３に示した。本発明分離菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸の特性を比較するために、日本の納豆から分離したポリ-γ-グルタミン酸生産菌株として知られるバチルス ズブチリス及びリチエポミスのポリ-γ-グルタミン酸生産量と酵素活性度を比較し表示した。
【００５３】
【表３】
0003999514.tif 000004
【００５４】
以上の酵素活性を比較して検討した結果、本発明の分離菌株はAlaRA、GluRA活性を利用して細胞成長とポリ-γ-グルタミン酸の生産に必要なD-AlaとD-Gluを合成し、バチルス ズブチリス納豆及びリチエポミスより3倍程度高いD-AATの活性を利用してD-AlaからD-Gluを大量に合成し、ポリ-γ-グルタミン酸の生産に直接的に利用する経路を持つものとして予想でき、バチルスズブチリス納豆及びリチエポミスは表２，３及び図1に見られるように、高いGluRA活性を利用して細胞成長とポリ-γ-グルタミン酸の合成に必要なグルタミン酸を合成する経路を持つものとして予想でき、本発明の分離菌株はバチルスズブチリス納豆IFO3336a及びリチエポミスATCC9945aとはお互い異なるアミノ酸合成経路を持つものとして考えられた（図６）。図６で１はグルタミン：2-オキソグルタレードアミノ転位酵素、２はグルタミン合成酵素、３はL-グルタミン酸：ピルビン酸アミノ転位酵素、４はアラニンラセミ化酵素、５はD-アミノ酸アミノ転位酵素、６はポリ-γ-グルタミン酸合成酵素であり、TCAはトリカルボン酸回路を表す。
【００５５】
すなわち、バチルス ズブチリス納豆菌株の場合、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に利用できるD-グルタミン酸が細胞内にグルタミン酸ラセミ化酵素の作用によりL-グルタミン酸がD-グルタミン酸に転換されて作られる反面、本発明の分離菌株ではD-グルタミン酸がアラニンラセミ化酵素とD-アミノ酸アミノ転位酵素の作用によりL-グルタミン酸から生産される。
【００５６】
（実施例４）ポリ-γ-グルタミン酸の分子量の比較
（１）電気泳導による分子量測定
本発明の分離菌株とバチルス内の標準菌株であるバチルス ズブチリス168そして、比較菌株であるバチルス ズブチリス納豆IFO3336が生産するポリ-γ-グルタミン酸の分子量を比較するために濃度勾配SDS-PAGEを実施した。
【００５７】
各々の菌体から生産されたポリ-γ-グルタミン酸を前記実施例２に詳述した精製方法で精製した後、約200μg/mlの溶液を調製した。各々のポリ-γ-グルタミン酸溶液80μlを染色薬が添加された5×緩衡液20μlと混合した後5〜20％の濃度勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行なった。電気泳動完了後各々をクマシー染色試薬及びメチレンブルーで標準タンパク質及びポリ-γ-グルタミン酸を染色した（図５）。図５でＭは標準タンパク質、１はバチルスズブチリス168、２はバチルス ズブチリス納豆IFO3336、３は本発明による菌株を表した。
【００５８】
図５の様に、本発明の分離菌株はバチルス ズブチリス納豆が生産するポリ-γ-グルタミン酸の分子量（約1,000KDa〜2,000KDa）よりはるかに大きい分子量のポリ-γ-グルタミン酸を生産するのを確認することができた。
【００５９】
（２）ゲル濾過クロマトグラフ（GPC）による分子量測定
本発明の分離菌株をGS固体培地で5日間培養した後、前記の方法でポリ-γ-グルタミン酸を精製しゲル透過クロマトグラフ（Asahipak GS-620H＋Tosoh TSK gel）を利用して分子量を分析した。
【００６０】
ゲル濾過クロマトグラフは50mM食塩：アセトニトリル（4：1）溶液を溶媒に、溶媒の流速は毎分0.7mlで25℃のカラムオーブンで実施した。標準物質ではポリエチレンオキサイドを使用し、示差屈折計を利用してポリ-γ-グルタミン酸の分子量を測定した。
【００６１】
試験結果のクロマトグラフを図７に図示した。これを分析した結果、本発明による分離菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸はMw（平均分子量、weight-average molecular weight）が約1,300万、分子量分布度（polydispersity）が約8.0であることがわかる。
【００６２】
これは本発明による菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸は他の菌株が生産する物に比べて極めて分子量が大きいのみだけでなくその分子量分布が均一であることを証明するものである。従って、本発明の菌株から生産されるポリ-γ-グルタミン酸は水和ゲル製造用として非常に有用に活用することができるものである。
【００６３】
（実施例５）本発明による菌株のポリ-γ-グルタミン酸分解活性測定
GPCを活用して培養時間経過に従った本発明による菌株のポリ-γ-グルタミン酸分子量変化を調べた。
【００６４】
本発明の分離菌株をGS固体培地で培養しながら各々1、3、5日経過時に前記の方法でポリ-γ-グルタミン酸を精製しGPCを用いて分子量と分子量分布を調査した（表４）。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
表４でみられるように、本発明による菌株により合成されたポリ-γ-グルタミン酸は培養時間が経過しても平均分子量と分子量分布がほとんど変わらないことがわかる。従って本発明による菌株バチルスズブチリス チョングッチャンはポリ-γ-グルタミン酸分解活性が無いかもしくはほとんど無いものと判断できる。
【００６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャン株（Bacillus subtilis var．chungkookjang、KCTC0697BP）は、一般的なバチルス属菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸よりも分子量が大きいポリ-γ-グルタミン酸を生産し、その生産量が優れている。したがって、本発明の菌株により生産されるポリ-γ-グルタミン酸は誘導体の合成と化学的処理により高付加価値の化粧品素材、吸湿剤、生分解性プラスチック用材等の製品開発に有用に利用することができる。
【００６８】
【配列表】
<110> Bioleaders Corporation
<120> Bacillus subtilis var. chungkookjang Producing High
Molecular Weight Poly-gamma-glutamic Acid
<130> E01-009
<150> KR2001-1481
<160> 2
<170> Kopatent In 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single stranded oligonucleotide primer
<400> 1
agagtttgat cctggctcag
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single stranded oligonucleotide primer
<400> 2
agaaggagg tgatccagcc
【図面の簡単な説明】
【図１】  細胞内の各種酵素による細胞壁及びポリ-γ-グルタミン酸の構成成分合成経路を表す図である。
【図２】  本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャンとバチルス ズブチリス納豆の塩化ナトリウム耐性を比較するグラフである。
【図３】  本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャンと他の比較菌株のプラスミド存在可否を示すゲル電気泳動写真である。Ｍは1kb ラダ-マーカー、Ａはバチルス ズブチリス168、Ｂは本発明による菌株、Ｃはバチルス ズブチリス納豆IFO3336を表している。
【図４】  16S rDNA塩基配列に基づく、本発明菌株のバチルスズブチリス チョングッチャンの系統図である。
【図５】  本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャンと他の比較菌株により生産されたポリ-γ-グルタミン酸の濃度勾配SDS-PAGEゲル電気泳動写真である。Ｍは標準タンパク質マーカー、１はバチルスズブチリス168、２はバチルス ズブチリス納豆IFO3336、３は本発明による菌株を表した。
【図６】  本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャンのポリ-γ-グルタミン酸生合成経路を仮説的に表した図である。１はグルタミン：2-オキソグルタレードアミノ転位酵素、２はグルタミン合成酵素、３はL-グルタミン酸：ピルビン酸アミノ転位酵素、４はアラニンラセミ化酵素、５はD-アミノ酸アミノ転位酵素、６はポリ-γ-グルタミン酸合成酵素であり、TCAはトリカルボン酸回路を表す。
【図７】  本発明のバチルス ズブチリス チョングッチャンの生産したポリ-γ-グルタミン酸のゲルクロマトグラフ結果を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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