(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記理化学的性質を有する新規なβ−アガラーゼＢ。
(a) 分子量；約９８０００
(b) 等電点；約３．４
(c) 溶解性；水溶性
(d) 作用；  少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解して、主として２糖類に低分子化する反応を触媒する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分解しない。
(e) 至適温度；５５℃
(f) 至適ｐＨ；ｐＨ６．５
(g) ｐＨ安定性；ｐＨ４．０〜１０．０
【請求項２】
ビブリオｓｐ．ＰＯ−３０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９０５）より得られたことを特徴とする請求項１に記載の新規なβ−アガラーゼＢ。
【請求項３】
前記β−アガラーゼＢを産生する能力を有するビブリオ属の微生物を寒天を炭素源として培養し、その培養上清液から分離して精製することを特徴とする請求項１又は２に記載のアガラーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のβ−アガラーゼＢを、アガロースを基質とし、作用させることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のβ−アガラーゼＢを海藻に作用させることを特徴とする海藻細胞のプロトプラストの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は例えばβ−アガラーゼ活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新規微生物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いたオリゴ糖，プロトプラストの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
寒天やポルフィランはある主の紅藻の細胞壁に含まれる海藻特有の多糖類である。現在、この寒天やポルフィランのオリゴ糖は研究用試薬としてのみならず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌作用を有することが知られている。特に、ポルフィランのオリゴ糖は硫酸根を有しているため、ナトリウムイオンを吸収し、体外に排出するという点で塩分の取りすぎ防止に有効である。
【０００３】
寒天の化学成分は、アガロース(agarose) とアガロペクチン(agaropectin) との２種類からなっている。図１はアガロース構成ユニットの構成を示す説明図である。図１に示す通り、アガロースは、ゲル化する性質を有する中性多糖類であり、アガロビオース(agarobiose)（即ち、4-O-β-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro-L-galactose ）と、ネオアガロビオース(neoagarobiose) （即ち、 3-O-(3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl)-D-galactose）とが交互に直線状に繋って形成されている。
【０００４】
一方、アガロペクチンの化学構造は、複雑であり、未だ明確に解明されていないが、D-ガラクトース(D-galactose) ，3,6-アンハイドロ−Ｌ−ガラクトース（3,6-anhydro-L-garactose ）とともに、少量の硫酸塩、グルクロン酸、ピルビン酸などから構成されている。ピルビン酸はアガロビオースユニット中のD-ガラクトース残基のＣ−４及びＣ−６とケタール結合している。このことはアガロビオースが、アガロペクチンの重要な構成成分であることを示唆している。
【０００５】
一方、ポルフィランは、紅藻アマノリ属のものを熱水抽出したときに得られる多糖類で硫酸エステル化した直鎖のガラクタンで、3-β-D-galactosyl 及び4-α-L-galactosyl ユニットを主構成分としている。我国や中国で、ゲル化材として僅かに生産されている。
【０００６】
近年、海洋生物資源としての海藻類の有効利用の観点から、また、生理活性物質としてのアガロオリゴ糖の製造方法の観点から、新規なアガロース分解酵素やアガロース産生能を有する新規な微生物の探索が行われている（特開平１−２２８４６５号）。特に、アガロースのネオアガロースオリゴ糖への分解活性については、ネオアガロテトラオース（４糖類）の分解能を有するものは殆ど知られていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋性細菌が海藻多糖の成分であるアガロースやポルフェランを効率よく分解し、更に、従来のアガラーゼでは分解が困難であったネオアガロテトラオースをも効率よく分解する酵素の生産菌であることを発見し、更に該生産菌から２種類のβ−アガラーゼを単離精製し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、活性が優れた、特にネオアガロテトラオースやポルフィランの分解活性を有する新規なβ−アガラーゼを得ることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
β−アガラーゼＡは、アガロースを分解し、主にネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオアガロヘキサオース（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述する。
【００１０】
また、本請求項１に記載された発明に係る新規なβ−アガラーゼＢは、アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素である。この具体的な理化学的性質に付いても後に詳述する。
【００１１】
更に、本請求項２に記載された発明に係る新規なβ−アガラーゼＢは、ビブリオｓｐ．ＰＯ−３０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９０５）より得られたものである。
【００１２】
また、本請求項３に記載された発明に係るアガラーゼの製造方法では、請求項１又は２に記載のβ−アガラーゼＢを製造する方法であって、
βアガラーゼＢを産生する能力を有するビブリオ属の微生物を寒天を炭素源として培養し、その培養上清液から分離して精製するものである。
【００１３】
更に、本請求項４に記載された発明に係るオリゴ糖の製造方法では、請求項１又は２に記載のβ−アガラーゼＢを、アガロースを基質とし、作用させるものである。
【００１４】
また、本請求項６に記載された発明に係る海藻細胞のプロトプラストの製造方法では、請求項１又は２記載のβ−アガラーゼＢを海藻に作用させるものである。
【００１５】
【作用】
本発明におけるβ−アガラーゼＡは、アガロースを分解し、主にネオアガロテトラオース（４糖類）とネオアガロヘキサオース（６糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する特徴を有する酵素であって、下記理化学的性質を有する。
【００１６】
(a) 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定の結果は、約９００００である。尚、既知のアガラーゼに、この分子量に該当する分子量を有するものは報告されていない。
(b) 等電点
等電点電気泳動の結果は、約６．６である。既知のアガラーゼにこの値に該当する等電点を有するものは報告されていない。
(c) 溶解性
水溶性である。
(d) 作用
少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解して、主として４糖類と６糖類に低分子化する反応を触媒する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分解しない。
(e) 至適温度
４５℃
(f) 至適ｐＨ
ｐＨ７．５
(g) ｐＨ安定性
ｐＨ５．０〜９．０
(h) 熱安定性
４０℃まで安定
【００１７】
本発明におけるβ−アガラーゼＢは、アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記理化学的性質を有する。
【００１８】
(a) 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定の結果は、約９８０００である。尚、既知のβ−アガラーゼに、この分子量に該当する分子量を有するものは報告されていない。
(b) 等電点
等電点電気泳動の結果は、約３．４である。既知のβ−アガラーゼに、この値に該当する等電点を有するものは報告されていない。
(c) 溶解性
水溶性である。
(d) 作用
少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解して、主として２糖類に低分子化する反応を触媒する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分解しない。
(e) 至適温度
５５℃
(f) 至適ｐＨ
ｐＨ６．５
(g) ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜１０．０
(h) 熱安定性
４０℃まで安定
【００１９】
本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢは微生物を用いて生産される。各酵素を生産する微生物を培養して、微生物の内部又は培養上清からβ−アガラーゼＡまたはＢを分離することができる。この何れかの酵素の生産菌としては、例えば、本発明では、新たに海底泥中から分離されたビブリオｓｐ．ＰＯ−３０３を用いることができる。この微生物ビブリ・ｓｐ．ＰＯ−３０３は、上記の２つの酵素を産生することができる。尚、本菌株は生工研菌寄第１４９０５号（平成０７年０４月２１日寄託）として既に寄託されている。
【００２０】
尚、本発明に用いる微生物としては、本菌株とその変種、変位株に限定されるものではなく、前記β−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢ生産能を有するものであれば良い。
【００２１】
具体的なβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源として培養し、その培養上清液から分離して精製するものである。この培地は、炭素源として寒天を含む他に、窒素源、無機化合物等の栄養素を適当量含有するものであれば、天然培地，合成培地の何れも使用することができる。
【００２２】
具体的な寒天を含む炭素源としては、市販の寒天粉末は勿論のこと、アガロース，アガロペクチン，寒天の部分加水分解物等の加工物、及び、加工される前のアガロースを含むテングサ，オゴノリ等の紅藻類を単独又は併用して用いることもできる。また、寒天の他にも炭素源として、グルコース等の糖類を併用することもできる。
【００２３】
また、窒素源としては、通常の培地の組成で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス，ペプトン，酵母エキス，乾燥酵母，カザミノ酸，各種アミノ酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニウム塩，硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２種以上を用いることができる。
【００２４】
更に、無機化合物としては、培養される微生物の必須無機塩として、ナトリウム，マグネシウム，カルシウム，鉄，マンガン等のリン酸塩，塩酸塩，硫酸塩，炭酸塩，酢酸塩等を１種以上用いることができる。
【００２５】
培養は、目的のβ−アガラーゼＡ又はＢを産生する微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選択される。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養，通気攪拌培養等が大量に培養することができ良好である。
【００２６】
微生物の培養によって産生されたβ−アガラーゼＡ又はＢは、通常の方法によって、分離・精製される。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌体を通常用いられている手段によって破砕してβ−アガラーゼＡ又はＢを抽出して精製される。また、培養液中に産生されたβ−アガラーゼＡ又はＢは、微生物を濾過・遠心分離等の方法で除去して精製される。
【００２７】
精製方法としては、通常用いられる精製方法を利用することができる。例えば、塩析，溶媒沈殿により、β−アガラーゼＡ又はＢを沈殿させて溶媒中から分離して、精製することができる。また、沈殿させたものを更にイオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグラフィ、等電点電気泳動等により、更に精製することもできる。
【００２８】
得られたβ−アガラーゼＡ又はＢは、アガロースを基質として作用させることにより、オリゴ糖を製造することができる。このアガロースから得られるオリゴ糖は研究用試薬としてのみならず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌作用を有することは、前述の通りである。
【００２９】
また、得られたβ−アガラーゼＡ又はＢは、海藻に作用させることにより、容易に海藻細胞のプロトプラストを作成することができる。また、寒天組成中のアガロースを分解する酵素であるため、例えば、アガロース電気泳動により、目的の部位に保持された遺伝子を回りの寒天を溶かすことにより、容易に入手することもできる。
【００３０】
【実施例】
１．海洋泥中よりのビブリオ菌の採取
海洋泥中に生息する微生物からβ−アガラーゼ活性の高い微生物を分離選択した。具体的には、海洋泥に生息する海洋性微生物を単離し、個々の微生物を寒天を炭素源とする培地中で培養し、β−アガラーゼ活性を測定したところ、β−アガラーゼ活性の最も高い微生物を得た。
【００３１】
尚、本実施例におけるβ−アガラーゼ活性の測定は次のように行われた。０．５％の寒天を含む１００mM  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５の０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加え、３８℃で１０ｍｉｎ反応させ、生じた還元糖の増加をソモジ・ネルソン(Somogyi-Nelson)法で測定した。酵素活性の１unitは上記反応条件で、１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する還元力を生ずる酵素量と定義した。
【００３２】
２．菌学的性質
このβ−アガラーゼ活性の最も高い微生物は、Bergeys' Manual Systematic Bacteriology の記載に準拠して同定を行ったところ、次に示す結果からビブリオ（Vibrio）に属していることが判明した。この微生物の形態は、次の表１に示すものである。また、表２に生理学的試験結果を示す。この表１及び表２の結果より、本微生物は海洋性細菌ビブリオ（vibrio）sp. であることが確認された。尚、本細菌をビブリオ（Vibrio）sp.PO-303 と命名した。
【００３３】
【表１】
0003865801.tif 000002
【００３４】
【表２】
0003865801.tif 000003
【００３５】
ビブリオ（Vibrio）sp.PO-303 の生育温度，酵素生成，生育ＮａＣｌ濃度，炭素源としての糖やアミノ酸の利用性等を調べた。結果を次の表３〜表６に示す。
【００３６】
【表３】
0003865801.tif 000004
【００３７】
【表４】
0003865801.tif 000005
【００３８】
【表５】
0003865801.tif 000006
【００３９】
【表６】
0003865801.tif 000007
【００４０】
即ち、グラム陰性で単極毛を有し、ＯＦテスト発酵性であり、カタラーゼならびにオキシダーゼテスト陽性、グルコース培地から酸生成、ガス非産生、ビブリオスタティックエイジェント（０／１２９）に感受性あり、ＧＣ含量４４％であった。
【００４１】
３．培養
本細菌（ビブリオ（Vibrio）sp.PO-303 ）は、酵素産生のための誘導物質として、寒天を必要とし、その濃度を０．３％とし、その他、０．３％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、３％塩化ナトリウム、０．５％塩化マグネシウム、０．２％リン酸水素二カリウム、０．０４％リン酸二水素カリウムの組成からなる培地を用いて、２５℃、４日間、振盪培養した場合、１，０００ｍｌの培地から６６ｕｎｉｔｓのアガラーゼを得ることができた。
【００４２】
４．β−アガラーゼの精製
産生されたβ−アガラーゼを精製した。即ち、本細菌を上記の条件で大量培養し、遠心分離して得られた培養上清液に７５％飽和になるように固形硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、生じた沈殿を少量の５０mMＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用いた。
【００４３】
塩析酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE-Toyopearl 65M）、ゲル濾過クロマトグラフィー（Toyopearl 55）、疎水クロマトグラフィー（Ether-Toyopearl 650S）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Mono Q HR 5/5 ）で分画したところ、その分子量と等電点の相違により、２種類のβ−アガラーゼが得られた。
【００４４】
５．アガラーゼの酵素特性
得られた２種類のβ−アガラーゼの分子量，等電点，溶解性，至適ｐＨ，ｐＨ安定性，至適温度を測定した。結果を次の表７に示す。尚、２種類のβ−アガラーゼのうち、分子量９０，０００のものをβ−アガラーゼＡ，９８，０００のものをβ−アガラーゼＢと命名した。
【００４５】
【表７】
0003865801.tif 000008
【００４６】
また、これら２つの酵素画分はディスク電気泳動的に均一であることから純粋に精製されていることが確認された。精製β−アガラーゼＡ及びＢの寒天，アガロース，ポルフィラン，ネオアガロビオース，ネオアガロテトラオース，ネオアガロヘキサオースに対する作用様式を調べた。その結果を表８に示す。
【００４７】
【表８】
0003865801.tif 000009
【００４８】
表７及び表８に示したように、本細菌は寒天，アガロース，ポルフィランに作用し、主な分解産物として、ネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオアガロヘキサオース（６糖類）を生じる酵素β−アガラーゼＡと、主な精製物としてネオアガロビオース（２糖類）を生じる酵素β−アガラーゼＢとの２種類の作用様式の異なるアガラーゼを産生することが判明した。
【００４９】
６．ネオアガロオリゴ糖の製造
6.1  寒天からのオリゴ糖の調製
従来からの寒天からオリゴ糖を調製する方法として酸による加水分解がある。しかしながら、酸加水分解法は１００℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、オリゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よくオリゴ糖を調製することが困難である。それに対して、前述のβ−アガラーゼＡ又はＢを用いる方法では室温で効率よくオリゴ糖を調製することが可能である。特に、ネオアガロテトラオースを分解するネオアガラーゼＢの使用は従来困難とされているネオアガロビオースの調製に優れた方法である。
【００５０】
具体的には、前記の方法で製造したβ−アガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したアガロース（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２０時間反応させた。その後、反応生成物をセファデックス（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用いて分離した。その結果、ネオアガロビオース（約２８％）が得られた。
【００５１】
6.2  ポルフィランからのオリゴ糖の調製
ところで、ポルフィランは寒天と類似した骨格に硫酸根を含有する多糖であるが、酸で加水分解する方法は上記の問題に加えて、硫酸根を分解するので硫酸根含有オリゴ糖を調製することは困難である。しかしながら、前述のβ−アガラーゼＡ又はＢはポルフィランも加水分解し、種々の硫酸根含有オリゴ糖を容易に産出することができる。
【００５２】
具体的には、前記の方法で製造したβ−アガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したポルフィラン（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２０時間反応させた。その後、反応生成物をセファデックス（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用いて分離した。その結果、ネオアガロビオース（約１６％）が得られた。
【００５３】
７．プロトプラストの製造
7.1  紅藻からのプロトプラストの調製
海藻の優良産業品種の開発を行う上で、細胞融合や遺伝子操作によるバイオテクノロジーは優れた手法である。バイオテクノロジーを行うためには酵素で細胞壁を溶解し、プロトプラストを作出する方法の開発が必要とされている。前記β−アガラーゼＡ又はＢを用いることにより、寒天ならびにポルフィランを含む紅藻から多量のプロトプラストを作出することが可能である。
【００５４】
具体的には、供試海藻（紅藻）１ｇを５％パパインと、０．７Ｍマンニトール含有２０mMＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５，３０ｍｌを入れた１００ｍｌ容ビーカに加え、２２℃，３０分間振盪した。０．７Ｍマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、４０μｍのナイロンメッシュで濾過洗浄し、洗浄した葉体をナイフで数ミリ片に裁断した。
【００５５】
裁断片の２００ｍｇを２ｕｎｉｔアガラーゼと市販のセルラーゼオノズカＲＳ（４％）ならびにマセロチームＲ−１０（１％）、それに０．７Ｍマンニトール含有２０mMＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０を入れた３０ｍｌ容三角フラスコに投入し、２２℃で５時間振盪した。その結果、紅藻ツルツル(Grateloupia turuturu)の１ｇから１０5 〜１０6 、また、紅藻オゴノリ(Gracilaria verrucosa)からは１０4 〜１０5 のプロトプラストが得られた。
【００５６】
８．アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出
本β−アガラーゼＡは高純度に精製してもアガロースを液化することが可能であるので、アガロースゲル電気泳動で分画されたＤＮＡ断片の回収に利用できる。即ち、泳動後のアガロースゲルを精製アガラーゼＡを加えて、溶解し、目的のＤＮＡ断片を抽出することができる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、β−アガラーゼＡは、アガロースを分解し、主にネオアガロテトラオース（４糖類）とネオアガロヘキサオース（６糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する特徴を有する酵素である。
【００５８】
また、本発明におけるβ−アガラーゼＢは、アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素である。
【００５９】
更に、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢは微生物を用いて生産される。この何れかの酵素の生産菌としては、各酵素を生産する微生物を培養して、微生物の内部又は培養上清から生成することができる。
【００６０】
また、β−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源として培養し、その培養上清液から分離して精製するものである。
【００６１】
更に、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢは、アガロースを基質として作用させることにより、オリゴ糖を製造することができる。このアガロースから得られるオリゴ糖は研究用試薬としてのみならず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌作用を有する。
【００６２】
また、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢは、海藻に作用させることにより、容易に海藻細胞のプロトプラストを作成することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】アガロース構成ユニットの構成を示す説明図である。
【図１】
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