(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色されたセルロース布帛の表面の色彩密度の局在化バリエーションを形成する方法であって、布帛を6.5〜９の範囲のpHを有し、且つ
（ａ）ｐ−ニトロフェニル−β−１，４−セロビオシドを加水分解でき、且つバチルスの株に由来するファミリー５のアルカリ性セルラーゼ、又は
（ｂ）Ｈ．インソレンス株DSM 1800に由来のエンドグルカナーゼEGIであるか、又はこのEGIと90％以上の相同性を有するセルラーゼである、ファミリー７のセルラーゼ
のいずれかの第一成分と、
（ａ）機械的磨耗剤又は
（ｂ）磨耗性を有するセルラーゼ
のいずれかの第二成分とを含む水性媒体の中で撹拌することを含んで成り、ここで各セルラーゼがpH７でその最大活性の30％以上を示すものである、前記方法。
【請求項２】
前記布帛がインジゴ染色されたデニムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一成分が細菌株に由来するセルロース結合性ドメインをもたないファミリー５のセルラーゼである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ファミリー５のセルラーゼがバチルス株KSM-64，1139，KSM-635，NCIMB 40482及びバチルス・ロータスNCIMB 40250より成る群から選ばれるバチルス株に由来するものであるか、又はかかるセルラーゼと90％以上の相同性を有するセルラーゼである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第一成分がヒュミコラの株に由来するファミリー７のセルラーゼである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記第一成分がＨ．インソレンスに由来するファミリー７のセルラーゼである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記第一成分が0.1〜0.5mg／ｌの量又は100〜1000ECU／ｌの濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記第二成分が機械的磨耗剤及び磨耗性セルラーゼの双方を含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記第二成分が菌類株に由来する、セルロース結合性ドメインを有するファミリー４５のセルラーゼである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記菌類株がＨ．インソレンスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ファミリー４５のセルラーゼがＨ．インソレンス株DSM 1800に由来するエンドグルカナーゼEGVであるか、又はこのEGVと90％以上の相同性を有する請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記第一及び第二成分以外に本質的にセルラーゼがない、請求項１〜11のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は染色されたセルロース布帛の表面の色彩密度の局在バリエーションを形成する方法、及びこの方法において使用するための組成物に関する。
背景技術
染色済みのセルロース布帛からの衣料、例えばインジゴ染色デニムからのブルージーンズの製造において、デニムに「ストーンウォッシュ」外観（デニム表面における色彩の局在化磨耗）を供するよう処理することは一般的である。これはデニムを機械的磨耗剤、例えば軽石、磨耗性セルラーゼ又はそれらの組合せを含む水性媒体の中で撹拌することにより達成し得る。このプロセスは中性pH付近で実施することが好ましく、従ってこのpH域において高い活性を有するセルラーゼを使用することが好ましい。過去において、セルラーゼ調製品は一般に天然微生物の培養により製造され、そしてかかる調製品は必ず多種多様なセルラーゼ成分の混合物を含んでいた。かかる混合セルラーゼ調製品を使用するプロセスは米国特許第4,832,864号（Ecolab）に記載されている。
組換DNA技術における急速な進歩は一成分酵素を高収率で生産することを可能にし、従って単一成分セルラーゼを使用するプロセスへの関心が高まっている。従って、WO 91/17243号及びWO 95/09225号（Novo Nordisk）には中性pH付近に至適活性を有するヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）株DSM 1800に由来する約43KDの分子量を有するEGVと称される単一成分エンドグルカナーゼを使用するプロセスが記載されている。WO 94/21801号（Genecor）には5.5〜6.0の至適pHを有するものと報告されたトリコデルマ・ロンジブラチアトウム（Trichoderma longibrachiatum）由来のEaIIIと称される単一成分セルラーゼの「ストーンウォッシング」における利用が記載されている。WO 95/16782号（Genecor International）には「ストーンウォッシング」におけるトリコデルマ由来のその他の単一成分セルラーゼの利用が示唆されているが、これらのセルラーゼは酸性であり、そして本質的に中性pHでは活性をもたない。
公知の「ストーンウォッシング」法における一般的な問題はもどり染色、即ち、磨耗により既に除去された染料が布帛又は衣料の一部に付着し、色彩密度の所望のバリエーションを均一にしてまうら、又は衣料の任意の淡色部を変色させてしまう点にある。
発明の記述
我々は驚くべきことに、所定のタイプのセルラーゼ（以降、第一成分と称す）の添加がもどり染色を抑制することを見い出した。注目のセルラーゼはそれ自体有意義な磨耗効果を有さない。従って、本発明は染色されたセルロース布帛の表面の色彩密度の局在化バリエーションを形成する方法であって、前記布帛を、6.5〜９のpH域を有し、かつ
（ａ）セロトリオース及び／又はｐ−ニトロフェニル−ｂ−１，４−セロビオシドを加水分解できる第５科（family）のセルラーゼ、又は
（ｂ）第７科のセルラーゼ
のいづれかである第一成分と、
（ａ）機械的磨耗剤又は
（ｂ）磨耗活性を有するセルラーゼ
のいずれかである第二成分とを含む（ここで各セルラーゼはpH７においてその最大活性の30％以上を発揮するものである）水性媒体の中で撹拌することを含んで成る方法を提供する。
本発明の別の観点は前記方法において使用するための組成物であって、前記第一及び第二成分を含んで成るものの提供にある。
定義
本明細書と請求の範囲において、下記の定義が適用される：
「セルラーゼ」なる語はセルロースの加水分解を担う酵素、例えばセロビオヒドロラーゼ（酵素命名E.C. 3.2.1.91、エンドグルカナーゼ（以降「EG」と称する：E.C.3.2.1.4）又はｂ−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.21）を意味する。
セルラーゼはHerissat, B．らBiochem, J.,（1991）, 280, p.309-16及びHenrissat, B．らBiochem. J.,（1993）, 293, p.781-788に記載の分類方式に従ってアミノ酸配列類似性に基づき科へと分類される。
本発明において利用されるセルラーゼは好ましくは単一成分であり、即ち、本発明において使用される水性媒体は特定したもの以外のセルラーゼ成分を含まないべきである。単一成分酵素は組換DNA工学により経済的に生産し得、即ち、それらは単一成分をコードするDNA配列をクローニングし、次いでこのDNA配列で適当な宿主細胞を形質転換し、そしてその成分を宿主内で発現させることにより生産し得る。
従って、有用なセルラーゼをコードするDNA配列は、
−適当なベクターの中で、例えば本明細書において後述する微生物のいづれかに由来するDNAライブラリーをクローニングする；
−適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで軽質転換する；
−前記宿主細胞を前記DNAライブラリー内のクローンによりコードされる任意の注目の酵素が発現されるのに適切な条件下で培養する；
−かかるクローンにより生産される酵素の任意のセルラーゼ活性を決定することにより陽性クローンについてスクリーニングする；そして
−かかるクローンから当該酵素をコードするDNAを単離する；
ことを含む一般的な方法により単離し得る。
この一般的な方法は、その内容を引用することで本明細書に組入れるWO 94/14953号（Novo Nordisk）に更に開示されている。
有用なセルラーゼをコードするDNA配列は例えば注目の微生物のcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適当な酵素活性（即ち、セルラーゼ活性）を示すクローンについて選別することにより単離し得る。
相同性酵素をコードするDNA配列、即ち類似DNA配列はその他の微生物からも入手し得る。例えば、このDNA配列はその他の菌類、例えばアスペルギルス（Aspergillus）種の株、特にＡ．アキュレアトゥス（A．aculeatus）又はＡ．ニガー（Ａ．ニガー）の株、トリコデルマ種の株、特にＴ．リーセイ（T．reesei）、Ｔ．ビリデ（T．viride）、Ｔ．ロンジブラチアトウム（T．longibrachiatum）、Ｔ．ハルジアヌム（T．harzianum）又はＴ．コニンジイ（T．koningii）の株、又はネオカリマスティックス（Neocallimastix）種、ピロマイセス（Piromyces）種、ペニシリウム（Penicllium）種、アガリカス（Agaricus）種、又はファネロシェテ（Phanerochaete）種の株のcDNAライブラリーを同様にスクリーニグすることにより由来し得る。
他方、有用なセルラーゼをコードするDNAは、公知の手順に従い、適当な起源、例えば任意の上記の生物から、公知のDNA配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドプローブの利用を介して簡単に単離できうる。
このDNA配列を次に組換発現ベクターの中に挿入してよい。これは組換DNA手順に簡単に重ねることができうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選定は往々にしてそれを導入すべき宿主細胞に依存するであろう。即ち、このベクターは、自己複製式ベクターであり、即ち、染色体外質として存在し得、その複製が染色体の複製とは独立したもの、例えばプラスミドであってもよい。他方、このベクターは、宿主細胞に導入したときに宿主細胞ゲノムに組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と共に複製するものであってよい。
ベクターにおいて、セルラーゼをコードするDNA配列は適当なプロモーター及びターミネーター配列に作用可能式に連続されているべきである。このプロモーターは選定の宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そして宿主細胞と相同又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。セルラーゼをコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーターのそれぞれをライゲーションする、並びにそれらを適当なベクターに挿入する手順は当業者に公知である（例えば、SambrookらMolecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと）。
当該DNA配列で形質転換された宿主細胞は好ましくは真粒細胞、特に菌類細胞、例えば酵母又は糸状菌細胞である。詳しくは、この細胞はアスペルギルス又はトリコデルマの種に属し得、最も好ましくはアスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーである。菌類細胞は周知の態様におけるプロトプラストの形成及びプロトプラストの形質転換、それに続く細胞壁の再生を包括するプロセスにより形質転換し得る。宿主微生物としてのアスペルギルスの利用は、その内容を引用することで本明細書に組入れるEP 238,023号（Novo Nordisk A/S）に記載してある。この宿主細胞は酵母細胞、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）の株、特にサッカロマイセス・セレビジエ（S．cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（S．Kluyveri）又はサッカロマイセス・ウバルム（S．uvarum）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種の株、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（S．pombe）、ハンセヌラ（Hansenula）種、ピチア（Pichia）種、セロウィア（Yarrowia）種、例えばセロウィア・リポリチカ（Y．lipolytica）、又はクルイベロマイセス（Kluyveromyces）種、例えばクルイベロマイセス・ラクチス（K．lactis）の株であってもよい。
これとの関連において、「相同性」又は「相同配列」なる語は、以降に示す配列表のそれぞれにおいて示されているものそれぞれと１又は複数個のアミノ酸残基で相違するアミノ酸配列を意味するつもりである。相同配列はこれらの配列表の中に示すアミノ酸配列の、例えばアミノ酸配列内の１もしくは複数の異なる箇所での１もしくは複数個のアミノ酸残基の置換、酵素の片側もしくは両側もしくはアミノ酸配列内での１もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、又はアミノ酸配列内の１もしくは複数の箇所での１もしくは複数個のアミノ酸残基の挿入を包括する修飾に由来しうるものでありうる。
ところで、当業者に明らかな通り、アミン酸変化はささいなものであることが好ましく、即ち、タンパク質のフォルディング又は活性に有意な影響を及ぼすことのない保存性アミノ酸置換、ささいな欠失、一般には約１〜約30個のアミノ酸欠失；ささいなアミノ又はカルボキシ末端伸長、例えばアミノ末端カチオン残基、約20〜25残基までの小型なリンカーペプチド、又は精製を促進する伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ、又は結合性ドメインの伸長である。一般にはFordらのProtein Expression and Purification ２；95-107, 1991を参照のこと。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸群内（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸群内（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸群内（例えばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸群内（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸群内（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小型アミノ酸群内（例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）である。
当業者にとって明らかな通り、かかる置換は分子の機能に必須の領域外で施され、活性ポリペプチドを保ち続けるものでありうる。本発明のDNA構築体によりコードされるポリペプチドの活性にとって必須であり、それ故好ましくは置換に委ねられないアミノ酸は当業者公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085, 1989）に従って固定し得る。後者の技術においては、突然変異は分子内の全ての残基に導入してよく、そして得られる突然変異分子を分子の活性に必須であるアミノ酸残基を固定するために生物（即ちセルラーゼ）活性について試験する。基質−酵素相互作用部位は核磁気共鳴、結晶グラフ又は光親和ラベリングの如き技術により決定される結晶構造の分析によっても決定し得る。例えば、de VosらScience 255：306-312, 1992；SmithらJ. Mol. Biol. 224：899-904, 1992；WlodaverらFEBS Lett. 309：59-64, 1992参照のこと。
アミノ酸配列の修飾は酵素をコードするDNA配列を例えば部位特異的もしくはランダム突然変異誘発、又は公知の手順に従うこれらの技術の組合せによる修飾により適切に実施し得る。他方、この相同配列は以降に示す配列表のそれぞれに示しているアミノ酸配列に対応するセルラーゼとは別の起源に由来する酵素の一つであってよい。即ち、「相同」とは、例えば、一定の特定条件（例えば、５ＸのSSCの中での予備浸漬及び20％のホルムアルデヒド、５Ｘのデンハーツ溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50mgの変性音波処理牛胸腺DNAの溶液中での約40℃で１ｈのプレハイブリダイゼーションし、その後の100mMのATPの添加された前記溶液中での約40℃で18ｈにわたるハイブリダイゼーション）下で注目のアミノ酸配列を有するセルラーゼをコードするDNAと同一のプローブにハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドを意味しうる。相同配列は通常以降に示す配列表それぞれに示すアミノ酸配列と50％以上、例えば60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％又は95％以上の相同性（同一性）の度合いを示すであろう。
上記の相同性は２本の配列間での第一配列の第二配列からの変異を示す同一性の度合いとして決定される。相同性は当業者公知のコンピュータープログラム、例えばGCGプログラムパッケージにおいて供されるGAP（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. Journal of Molecular Biology, 48：443-453, 1970）により適当に決定し得る。
［発明の詳細な説明］
染色されたセルロース布帛
本発明の方法は表面に色彩密度の局在化バリエーションを形成することが所望される任意のタイプの染色セルロース布帛に適用し得る。特定の商業的関心の例はデニム、特にブルージーンズ等に使用するためのインジゴ染色デニムである。
この布帛は縫いのない布帛又はかかる布帛より作られた縫われた衣料の形態で処理してよい。特に注目されるのは新品できれいな布帛又は衣料への本発明のプロセスの適用である。
成分１
第一成分は第５又は７科のセルラーゼであり、これはpH７でのその至適活性の30％以上を示す。それはもどり染色を防ぐのに有効な量、一般には0.05〜５mg／ｌ（純粋酵素タンパク質として）、特に0.1〜0.5mg／ｌで存在し；一般には10〜1000ECU／ｌ、特に100〜1000ECU／ｌの活性；又は0.5〜100ECU／ｌｇの布帛の活性に相当する。
第５科セルラーゼ
本発明において利用される第５科のセルラーゼはセロトリオース及び／又はｐ−ニトロフェニル−ｂ−１，４−セロビオシド（PNP-Cel）を加水分解することができる；このセルラーゼはセロトリオースに対して間接的な作用を有し得、任意のグルコース形成することなくセロビオースを形成するようにそれを加水分解する。PNP-Celを加水分解するセルラーゼの能力は下記のアッセイ方法により決定でき、そしてこのセルラーゼはもしそのアッセイがECU当り１分間につき0.1マイクロモルより多くのPNPを供するならこの条件に合致するものと考えられる。
第５科セルラーゼは好ましくはセルロース結合性ドメインを全く有さない。第５科セルラーゼはバチルス又はクロストリジウムの如き細菌株に由来するアルカリ性セルラーゼ（例えばエンドグルカナーゼ）でありうる。
一のかかる第５科セルラーゼはバチルス株KSM-64（FERM BP-2886）に由来するエンドグルカナーゼである。セルラーゼ及びそのアミノ酸配列は日本国特許出願JP-A 4-190793（Kao）及びSumitomoら、Biosci. Biotech. Biochem., 56（6）, 872-877（1992）に記載されている。
他の第５科セルラーゼは株KSM-635（FERM BP-1485）に由来するエンドグルカナーゼである。このセルラーゼ及びそのアミノ酸配列は日本国特許出願JP-A 1-281096（Kao）、米国特許US4,945,053及びY. OzakiらJournal of General Microbiology, 1990, Vol.136, p.1973-1979に記載されている。これはPNP-Celに対して上記のアッセイにおいて0.18マイクロモルのPNP/min/ECUの活性を有する。
第三の第５科セルラーゼは株1139に由来するエンドグルカナーゼである。このセルラーゼ及びそのアミノ酸配列はFukumoriら、J.Gen Microbiol., 132：2329-2335（1986）及び日本国特許出願JP-A 62-232386（Riken）に記載されている。
第四の第５科セルラーゼはWO 91/10732（Novo Nordisk）に記載のバチルス・ロータスNCIMB 40250に由来するエンドグルカナーゼEndo 3Aである。この明細書に記載のアミノ酸配列はその後不正確であることが見い出され、そして正しい配列をSEQ IDNO:1に示す。このセルラーゼはPNP-Celに対して0.44マイクロモルのPNP/min/ECUの活性を有する。
第五の第５科セルラーゼはバチルス種NCIMB 40482に由来し、約45kDの見かけ上の分子量を有し、WO 94/01532（Novo Nordisk）に記載されている。PNP-Celに対するその活性は0.22マイクロモルのPNP/min/ECUである。
第六の第５科セルラーゼはＦ. FaureらGene, 84（1）,39-46（1989）及びFierobe H-PらJ. Bacteriol., 173（24）, 7956-7962（1991）に記載のクロストリジウム・セルロリチカム（Clostridium cellulolyticum）に由来するエンドグルカナーゼＡである。
第７科セルラーゼ
本発明において利用する第７科のセルラーゼは菌類株に由来し得、そして一般的にはセロトリオースをセロビオース及びグルコースへと直接加水分解でき、そして例えば以下に記載のアッセイ方法により決定される通り、PNP-Celを加水分解できる。
第７科セルラーゼはヒュミコラの株、好ましくはＨ．インソレンスに由来しうる。その例はWO 91/17244（Novo Nordisk）に記載のＨ．インソレンス株DSM 1800に由来するエンドグルカナーゼEG Iである。その成熟セルラーゼはその中のFig.14の位置21-435の415個のアミノ酸配列を有し、そして200ECU／mgの比活性を有する（純粋酵素、タンパク質に基づく）。このセルラーゼは更に397個以上のアミノ酸を含むように18個以下のアミノ酸によりＣ末端が切断されていてよい。例えばセルラーゼは402, 406,408又は412個のアミノ酸にまで切断されうる。その他の例はWO 95/24471（Novo Nordisk）に記載のエンドグルカナーゼEG I*と表示されたその変異体であり、そしてその中のFig.３に示す402個のアミノ酸配列を有する。
他方、第７科のセルラーゼはマイセリオフトラ（Myceliophthora）の株、好ましくはＭ．サーモフィラ（M. thermophila）、最も好ましくは株CBS 117.65に由来し得る。その例はWO 95/24471（Novo Nordisk）に記載のエンドグルカナーゼであり、その中のFig.６に示す配列のアミノ酸21〜420、そして任意的にアミノ酸１〜20及び／又は421〜456も含んで成る。
別の例として、第７科セルラーゼはフサリウム（Fusarium）の株、好ましくはＦ．オキシスポルム（F. oxysporum））に由来しうる。その例はWO 91/17244（Novo Nordisk）及びSheppard. P. 0．らGene 150：163-167, 1994に記載のＦ．オキシスポルムに由来するエンドグルカナーゼである。正しいアミノ酸配列は後者の文献に記載されている。このセルラーゼは350ECU／mgの比活性を有する。
成分２
第二成分は機械的磨耗剤及び／又は磨耗性セルラーゼである。本発明の好適な態様は機械的磨耗剤及び磨耗性セルラーゼの組合せを第二成分として使用する。
機械的磨耗剤は軽石、熱膨張パーライト及び磨耗素子（例えば磨耗ボール）である。
磨耗性セルラーゼは例えばEP220016（Novo Nordisk A/S）に記載の如き磨耗又は色彩明瞭化活性を及ぼし、そしてpH７でその至適活性の30％以上を示すものである。それはセルロース結合性ドメインを有する第12又は45科セルラーゼでありうる。
本発明において利用する第45科セルラーゼはヒュミコラの株、好ましくはＨ．インソレンスの株に由来しうる。その例はEGVと表示され、Ｈ．インソレンス株DSM 1800に由来し、約43KDの分子量を有するエンドグルカナーゼである。そのセルラーゼ及びそのアミノ酸配列はWO 91/17243（Novo Nordisk）に記載されている。それは430ECU／mgの比活性を有する。
本発明において利用する第12科セルラーゼはトリコデルマの株、好ましくはＴ．ロンジブラチアトウムに由来しうる。その例はWO 94/21801（Genencor）に記載され、その中に示されているアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼEG IIIである。
第二成分は色彩密度の局在化バリエーションを形成するよう磨耗に有効な量で存在する。もし第二成分が磨耗性セルラーゼなら、それは一般に0.05〜５mg／ｌ（純粋酵素、タンパク質として）、特に0.1〜0.5mg／ｌの量で存在する；それは10〜1000ECU／ｌ、特に100〜1000ECU／ｌの活性、又は0.1〜100ECU／ｌｇの布帛、特に0.5〜10ECU／ｇの活性に相当する。
プロセス条件
本発明のプロセスは慣用の条件においてストーンウォッシングに慣用的に用いられている洗濯機（例えばウォッシャー−エキストラクター）で実施し得る。典型的な条件は40〜60℃の温度、及び１：３〜１：20の布帛：液体比で15分〜２時間である。任意的に、慣用の添加剤、例えば緩衝剤、界面活性剤（アニオン性及び／もしくは非イオン性）並びに／又はポリマー（例えばPVP、ポリアクリレート及びポリアクリルアミド）が使用できうる。
セルラーゼ活性についてのアッセイ
セルラーゼエンド活性は振動式粘度計でのCMC（カルボキシ−メチルセルロース）の粘度の低下により決定する。IECU（エンドセルラーゼ単位）は34.Oｇ／ｌのCMC（商標名Aqualon 7LFD）の0.1Ｍリン酸緩衝溶液（pH７.5）１mlと40℃で30分インキュベーションしたときの粘度の10分の１低下を供する活性量である。
PNP-Celの加水分解についてのアッセイ
ｐ−ニトロフェニル−ｂ−１，４−セロビオース（PNP-Cel）を加水分解するセルラーゼの能力は405nmでの吸収による生成物ｐ−ニトロフェノール（PNP）の黄色の定常反応速度的直接検出により決定する。そのアッセイ条件は37℃、pH7.5（0.1Ｍのリン酸バッファー）とする。加水分解速度（１分当りのPNPで表示）をセルラーゼ活性（ECU）と対比し、そしてその結果を１ECUにつき１分間当りでのマイクロモルPNPとして表示する。
実施例
実施例１
インジゴ染色デニムを下記のセルラーゼの様々な組合せを利用して白色綿スウォッチと共に処理した：
pH      ７（水道水中のリン酸バッファー）
温度    55℃
装置    Launderometer（150mlの容器）
成分１  ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来のEGI
０〜2.3ECU／ml（下記表示）
成分２  ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来のEGV
０又は0.27ECU／ml
デニム  ５ｇ／容器
白色綿  ２枚のスウォッチ／容器
時間    ２時間
処理後、リントを回収し、そしてセルラーゼの磨耗作用の表示として測定した。この処理後の白色スウォッチの規約反射率を測定し（680nmでのＤ  Ｒ；セルラーゼを全く含まない実験との対比）そしてもどり染色の表示として解釈した。結果；
0003943132.tif 000002
良好な磨耗が成分２セルラーゼにより得られた。成分１セルラーゼの添加はもどり染色を著しく低めた。
実施例２
以下のセルラーゼを実施例１と同一の条件で試験した：
成分１  ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来のEGI又はEGI*
0.067又は1.33ECU／ml
成分２  ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来のEGV
0.7ECU／ml
磨耗処理毎のリントの量を測定することにより評価した。良好な磨耗が各実験で認められ、EGI又はEGI*の添加により若干の上昇があった。
もどり染色阻害は680nmでの濾液の吸収の上昇及び420nmでの白色布帛の規約反射率ほ上昇により決定した。その結果はEGI及びEGI*により本質的に同等のもどり染色阻害が得られたことを示す。
実施例３
第一工程において、デニム由来の青色液を、12枚（５×５cm）のブルーデニムを800mlのリン酸バッファー（pH7.0）及び0.8mlの非イオン界面活性剤と50℃で30分振盪し、次いで濾過することにより調製した。
第二工程において、５枚の白色綿を200mlのこの青色液と50℃で30分、０〜100ECU／ｌのセルラーゼと共にインキュベーションした。試験したセルラーゼは406，408及び412個のアミノ酸へと切断したヒュミコラ・インソレンスDSM 1800に由来するEGI混合物とした。
すすぎ及び乾燥の後、もどり染色阻害をDr. Lange Micro Color Date Stationにより測定する白色スウォッチの上昇ｆ明度（Ｌ*）から決定した。
結果（５枚のスウォッチの平均）：
0003943132.tif 000003
これらの結果はEGIが白色綿に対するブルーデニム由来のもどり染色を抑制するのに有効であることを示す。
実施例４
本発明に係る第５科のアルカリ性バチルスセルラーゼを実施例３と同じようにして試験した。その結果は下記の通りである：
0003943132.tif 000004
これらの結果はこのセルラーゼももどり染色を抑制するのに有効であることを示した。
実施例５
４枚（５×５cm）の糊抜きブルーデニム及び８枚（５×５cm）の白色シルケット加工綿を第５又は７セルラーゼと本発明に係る第45科セルラーゼ（200ECU／ｌづつのセルラーゼ）と共に含む50mMのリン酸バッファー（pH7.0）400mLの中で撹拌した。30分後、その布帛を水道水ですすぎ、そして風乾した。
第５科セルラーゼはアルカリ性バチルスセルラーゼとした。第７科セルラーゼは408個のアミノ酸に切断された。ヒュミコラ・インソレンスに由来する。第45科セルラーゼはヒュミコラ・インソレンスDSM 1800に由来するEGVとした。
２枚の布帛の明度（Ｌ*）及び上清液の680nmの吸収を測定した。
結果
0003943132.tif 000005
シルクット加工綿についての結果は明度の上昇を示し、即ち、本発明に従う第二成分セルラーゼの添加によるもどり染色の抑制を示した。
これらの結果はまたブルーデニムについての明度の上昇、即ち、もどり染色の抑制を示した。目視検査は本発明に従って処理したデニムが所望の通りに色彩密度の一層強調された局在化バリエーションを有することを示した。
上清液についてのデーターは、処理後の液体中により多くの色素が残ることを示した。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：Novo Nordisk A/S
（Ｂ）通り：Novo Alle
（Ｃ）市：Bagsvaerd
（Ｅ）国：Denmark
（Ｆ）郵便番号：DK-2880
（Ｇ）電話番号：+45-4444-8888
（Ｈ）ファックス番号：+45-4449-3256
（ii）発明の名称：ストーンウォッシングにおけるもどり染色の防止
（iii）配列の数：１
（iv）コンピューター読取フォーム
（Ａ）媒体タイプ：Floppy disk
（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible
（Ｃ）作動システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPO）
（２）SEQ ID NO：１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：551アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（vi）起源：
（Ａ）生物：バチルス・ロータス
（Ｂ）株：NCIMB 40250
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：
0003943132.tif 000006
0003943132.tif 000007
0003943132.tif 000008