(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミン含有試料に、下記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
（理化学的性質）
作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４−イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。
至適ｐＨ：９．０〜１１．５。
安定ｐＨ：３０℃、１５分処理のとき、ｐＨ８．０〜１１．５。
至適温度：６５〜７５℃。
温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０〜６０℃で安定。
分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，０００×２）。
【請求項２】
ヒスタミン含有試料に、下記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
（理化学的性質）
作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４−イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。
至適ｐＨ：９．０〜１１．５。
安定ｐＨ：３０℃、１５分処理のとき、ｐＨ８．０〜１１．５。
至適温度：６５〜７５℃。
温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０〜６０℃で安定。
分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，０００×２）。
【請求項３】
ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーおよび還元系発色試薬の存在下、下記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を定量することを特徴とするヒスタミンの定量法。
（理化学的性質）
作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４−イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。
至適ｐＨ：９．０〜１１．５。
安定ｐＨ：３０℃、１５分処理のとき、ｐＨ８．０〜１１．５。
至適温度：６５〜７５℃。
温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０〜６０℃で安定。
分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，０００×２）。
【請求項４】
電子キャリアーおよび還元系発色試薬がテトラゾリウム系の試薬である請求項３記載のヒスタミンの定量法。
【請求項５】
ヒスタミン含有試料が、飲食品又は体液である請求項１〜請求項４のいずれかに記載のヒスタミンの定量法。
【請求項６】
(ａ)下記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼ、（ｂ）電子キャリアー及び（ｃ）還元型電子キャリアー発色剤を含有するヒスタミン定量用試薬。
（理化学的性質）
作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４−イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。
至適ｐＨ：９．０〜１１．５。
安定ｐＨ：３０℃、１５分処理のとき、ｐＨ８．０〜１１．５。
至適温度：６５〜７５℃。
温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０〜６０℃で安定。
分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，０００×２）。
【請求項７】
電子キャリアーとしてテトラゾリウム系化合物を用い、また還元型電子キャリアー発色剤として還元型のテトラゾリウム系化合物を用いる請求項６記載のヒスタミン定量試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、食品産業、水産業、食品衛生、医療及び分析機器産業などの広い分野でヒスタミンの酵素的定量法に有効に利用される。
また特にヒスタミンに対して特異性が高いヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いることにより試料中から妨害物質（不純物）を除去する面倒な前処理操作を行うことなく、短時間に、簡単な装置を用いて、開放系で、しかも測定値の信頼性を損なうことなく、極微量の（すなわち感度よく）ヒスタミンを測定することを可能とする方法に関する。
また本発明は、ヒスタミンと他のアミン類が混在する試料から、ヒスタミンのみを精度よく定量することができ、しかも操作が簡単で、安価に、短時間にヒスタミンを定量することが可能な、ヒスタミンの定量法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒスタミンは、分子式Ｃ5Ｈ9Ｎ3、分子数１１１であり、下記（１）式で示される化学構造を有するアミンである。
そしてヒスタミンは、新鮮な魚介類や食肉には殆ど存在しないが、ヒスチジン脱炭酸酵素活性の強い微生物などに汚染されることにより、蛋白質組織中の遊離アミノ酸のヒスチジンから下記（１）式に示すような脱炭酸作用で生成する。
【０００３】
【化１】
0003926071.tif 000002
【０００４】
そしてまた、ヒスタミンは体内で起こるアレルギー反応の化学伝達物質である有毒な物質で、ヒスタミンを多量蓄積した食品を摂取するとアレルギー様中毒が起こる。その症状は食後数分から数時間で顔面などに発赤が生じ、続いてかゆみ、じん麻疹や湿疹が出、ひどい場合はじん麻疹が全身に広がり気管支炎や血圧降下を起こす危険性を有する。
そして、サバ、カツオ、マグロ、イワシ、アジなどの背の青い赤身の魚や牛肉などは遊離ヒスチジン含量が高く、ヒスタミン中毒を起こし易い食品と言われているが、これ以外の蛋白食品からもヒスタミン中毒が起こることが報じられている。なお、ヒスタミン中毒事故は、魚介類を多量摂取する地域に多く発生することが指摘されている。
【０００５】
この中毒事故防止には魚介類の品質、特に鮮度に注意が必要であるが、単なる官能的所見にはなんら異常が認められない場合でも１００〜５００ｍｇ／１００ｇという著量のヒスタミンが含まれていることがあり、その管理は極めて困難である。
【０００６】
世界の主要国においては、食品中のヒスタミンに対する規制がなされており、ワインなどの飲料や液体食品については、５〜６ｍｇ／Ｌ、魚介類については１０〜２０ｍｇ／１００ｇの規制値が定められている。例えば、米国食品薬品局（ＦＤＡ）は、１９８２年、鮮度指標としてヒスタミンを採用し、蛍光分析法に基づく公定分析法を制定した。すなわち、マグロ缶詰の肉１００ｇ当り１０〜２０ｍｇのヒスタミンがあれば、何らかの不適当な取扱いがあった原料を使用したものとされ、さらにマグロ缶詰の肉１００ｇ当り５０ｍｇ以上のものは健康上有害とされている。更に、ＦＤＡは、コンプライアンス・ポリシー／ガイド（Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ｇｕｉｄｅ  ７１０８．２４）を改訂した（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．１４９，３９７５４−５（１９９５））。
また米国では、１９９７年１２月水産物に対しＨＡＣＣＰによる衛生管理システムを義務づけた。これにより米国に輸出される水産物についてもその対象となり、わが国でも対米向け輸出水産物はこの管理をとらなければならなくなった。ＦＤＡでは魚介類中のヒスタミンを重要管理点：ＣＣＰ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｏｉｎｔ）とし、そのガイダンス基準を５０ｐｐｍとしている。このような背景から日本でもヒスタミン測定の必要性が次第に大きくなっている。
【０００７】
一方、日本ではヒスタミンを原因とする食中毒が諸外国と比較して多く発生していると言われながら、食品中のヒスタミン量に関する法規制は現在のところない。
しかし、ＥＵ地域に輸出する水産品については、鮮度の化学指標としてヒスタミンの規制値１０〜２０ｍｇ／１００ｇが定められるに至っている。
【０００８】
以上の説明から明らかなように、ヒスタミンの定量の重要性は増大し、これに対応して食品加工工場や食品衛生監視機関、臨床検査室などにおいてヒスタミン量を簡易且つ迅速に測定することができるヒスタミンの定量法が強く求められていた。
【０００９】
ＦＤＡは、上述の通り、ヒスタミンの定量法として、蛍光測定に基づく公定分析法を制定している。蛍光分析法は、魚介類のヒスタミンの定量に最も適する方法とされ、ヨーロッパ地域でも類似の方法が用いられている。
蛍光分析法は、ヒスタミンと蛍光試薬のο−フタルアルデヒドとの縮合作用により蛍光色素をつくり、その蛍光の強さを蛍光分光光度計で測定するものである。
しかし、この方法は、縮合作用前に作用妨害成分を除去してサンプルをきれいにする必要があり、陽イオンあるいは陰イオン交換樹脂カラム処理などを行うための手段と時間を避けることができない手間のかかるものであった。
また、一般に魚肉が腐敗する際、ヒスタミンとほぼ同時に、カダベリンやプトレッシンといった生体アミンも生成するため、ヒスタミンの定量に際しては、ヒスタミン以外の生体アミンは分離除去しなければならない不便さを有する。
【００１０】
またクロマトグラフィーによるヒスタミン定量法の研究も多数行われているが、薄相クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーは、比較的安価な測定装置で多数の試料を同時に測定できるものの定量性が十分でなく、またガスクロマトグラフィーでは、ヒスタミンのような不揮発性アミンの直接定量は不可能であり、ヘプタフロロブチリル誘導体などに変換してから定量しなければならない不便さが指摘されている。
【００１１】
最近、日本においてもヒスタミンを食品の鮮度指標とすることが検討されており、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量が最もよい方法として食品分析の本にも記載されている。
例えば、山中らは、ＨＰＬＣ法による赤身魚のヒスタミン定量に関する研究を行っている（食衛誌，３０、３７７〜４００（１９８９）参照）。この研究では、同時に生成する７種のアミンの高感度な分離定量に成功した学術的に優れたものである。しかし、この方法は、煩雑な前処理操作が必要であったり、測定に高度な装置を必要とし、クロマトグラフィーの操作に３０〜６０分程度かかるため多数の試料分析には不向きである。
【００１２】
また、ヒスタミンの定量法として、モノアミンオキシダーゼ固定化膜を被服した酵素電極を、ヒスタミンその他腐敗性アミンを含有する肉抽出液浸して、溶存酸素の変化を測定し、ヒスタミンを定量する方法が提案されている（Ｋａｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｌ．  Ｖｏｌ．２，ｐｐ１１７−１２０，１９８０）。
しかし、この方法は、検液の局部的な溶存酸素濃度（ＤＯ）を測定する方法であるため、精度が高くない（相対誤差約８％）欠点を有する。
【００１３】
また、ヒスタミンの定量法として、ヒスタミン含有試料に、微生物由来のヒスタミンオキシダーゼ活性を有する酵素試薬を加えて生成する溶存酸素（ＤＯ）の減少量に基づき、ヒスタミンの定量を行う方法も知られている（特許２７１７７４５、「ヒスタミンを迅速に定量する方法」参照）。
この方法は、従来の蛍光分析法やＨＰＬＣ法に比較して、面倒な妨害物質除去操作や、ヒスタミン標準液を用いる校正操作を必要とせず、レスポンスタイムが１分半であることから、簡易で迅速な方法として、また高い精度（相対誤差が０．９８％）を有する優れた方法として既にＦＤＡからも良い内部評価を得ている（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ  ｐａｇｅ１９，ｌｉｎｅ５−１７，Ｓｅｐｔ．２６．１９９４）。
【００１４】
しかしながら、この方法も、酸素電極の出力電流および飽和溶存酸素濃度が、温度の影響を受けやすいこと（温度依存型）への配慮により、実施に当り、検液の空気飽和操作を含め全工程を一定温度（３７℃）の下に行わなければならない。そのため、作用セルの温度を一定に保持するためのサーモスタット付き温水ジャケットを備えた反応装置が必要で、装置が嵩張り、移動の困難性や消費電力に対応する電源確保の困難性などで問題を有していた。
またＤＯ電極の装着された作用セルは、そこに少しでも気泡（空気）が混入すると正確なＤＯの測定が困難となるため、定量操作の際は、必ず液密的に保持しなければならず、また作用セルは繰返して使用し、その都度洗浄しなければならない（すなわち使い捨て作用セルは使用できない）不便さを有していた。
【００１５】
このようにヒスタミンの定量法として、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いるヒスタミンの定量法は知られていない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述した欠点、問題点および不便さを有しないヒスタミンの定量法及び定量用試薬を提供すること、すなわち、試料中よりヒスタミンの分画、あるいは面倒な妨害物質（不純物）を除去する前処理操作を要せず、定量に要する時間も短く、極めて高精度で定量することができるものであって、さらに簡便な装置を用いて測定することができる、作用セルは液密的条件下で操作する必要がない（すなわち開放系で操作することが可能である）、という利点を有するヒスタミンの定量法および定量用試薬を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ヒスタミン含有試料に、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を測定することにより、ヒスタミンを定量し得ることを知った。また、ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを測定することによりヒスタミンを精度よく定量できるこを知った。またこれらのヒスタミンの定量法において、ヒスタミンに特異的に作用するヒスタミンデヒドロゲナーゼを使用するときは、ヒスタミンと他のアミン類が混在する試料から、ヒスタミンのみを精度よく定量することができることを知った。また、鮮度が低下した魚介、畜肉類中のヒスタミンを、酵素的に定量する際、該酵素として「ヒスタミンには特異的に作用するが、不純物のカダベリン及びプトレッシンには作用しないヒスタミンデヒドロゲナーゼ」を使用するときは、該不純物を分画（分離）除去することなく、これら魚介、畜肉類のヒスタミンを定量できることを知った。そして、上記ヒスタミンデヒドロゲナーゼとして、下記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼが好ましいことを知った。そして、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
（理化学的性質）
作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４−イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。
至適ｐＨ：９．０〜１１．５。
安定ｐＨ：３０℃、１５分処理のとき、ｐＨ８．０〜１１．５。
至適温度：６５〜７５℃。
温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０〜６０℃で安定。
分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，０００×２）。
【００１８】
すなわち本発明の第１は、ヒスタミン含有試料に、上記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を測定することを特徴とするヒスタミンの定量法である。
【００１９】
本発明の第２は、ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーおよび還元系発色試薬の存在下、上記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を定量することを特徴とするヒスタミンの定量法である。
【００２０】
本発明の第３は、ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーおよび還元系発色試薬の存在下、上記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を定量することを特徴とするヒスタミンの定量法である。
【００２１】
本発明の第４は、（ａ）上記の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼ、（ｂ）電子キャリアー及び（ｃ）還元型電子キャリアー発色剤を含有するヒスタミン定量用試薬である。
【００２２】
【発明の実施の形態】
先ず本発明のヒスタミンの定量法において用いるヒスタミンデヒドロゲナーゼとしては、１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ作用により１モルの４―イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する活性を有する酵素が挙げられる。
ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を測定すると、ヒスタミンを効率よく定量し得る。
【００２３】
また、ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを測定すると、ヒスタミンを精度よく定量できる。
【００２４】
また、ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーおよび還元系発色試薬の存在下、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を定量すると、ヒスタミンを非常に簡単に精度よく定量できる。
【００２５】
また、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いるヒスタミンの定量法において、ヒスタミンに特異的に作用するヒスタミンデヒドロゲナーゼを使用すると、ヒスタミンと他のアミン類が混在する試料から、ヒスタミンのみを精度よく定量することができる。
【００２６】
また、魚肉などの食品が腐敗する（鮮度が低下する）と、ヒスタミンとほぼ同時にカダベリン及びプトレッシンが同時に生成、蓄積する。このような食品中に含まれるヒスタミンの定量において、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しないヒスタミンデヒドロゲナーゼを使用するときは、カダベリン及びプトレッシンを分画（分離）除去することなくヒスタミンの定量を行うことができる。
ここにおいて使用される酵素としては、例えば、本発明者らが開発した以下の理化学的性質を有する新規なヒスタミンデヒドロゲナーゼ（以下「本酵素」ということもある）を挙げることができる。
【００２７】
本酵素の理化学的性質の詳細は以下の通りである。
（作用）
１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的脱アミノ反応により１モルの４―イミダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。
【００２８】
この結果より次の反応式で示される反応を触媒することが認められた。
【００２９】
【化２】
0003926071.tif 000003
【００３０】
（基質特異性）
ヒスタミンに特異的に作用する。すなわち、ヒスタミンに特異的に作用するが、他のアミンに対しては全く作用しないか、又は弱く作用する。
そして特に、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しない特徴を有する。
本酵素の各種基質に対する相対活性を調べた結果を表１に示す。
【００３１】
0003926071.tif 000004
【００３２】
（至適ｐＨ）
至適ｐＨは、緩衝液としてブリットン―ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ２〜１１．５）を用い、３０℃で各ｐＨにおける本酵素活性の測定を行って求めた。
酵素活性の測定は、各緩衝液２．４ｍｌ、０．３ｍＭ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ
ＰＭＳ  ０．１ｍｌ、１ｍＭ  ＷＳＴ―８  ０．３ｍｌを混和し、３０℃でプレインキュベーションした後、１０ｍＭ  ヒスタミン溶液  ０．１ｍｌ及び本酵素液０．１ｍｌを加え、３０℃で反応を行い、６０分間に生成した還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳの増加量を測定することにより行った。
すなわち、還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳと反応して生じるＷＳＴ―８の発色を４６０ｎｍ の吸光度で測定し、還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳの増加量を測定して求めた。
図１は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであって、この図に示す通り本酵素の至適ｐＨは、９．０〜１１．５である。
【００３３】
（安定ｐＨ範囲）
安定ｐＨ範囲は、緩衝液としてブリットン―ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ２〜１１．５）を用い、各ｐＨにおいて、３０℃で１５分間処理し、各ｐＨにおける本酵素の残存活性を測定して求めた。
図２は、本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフであって、この図に示す通り、本酵素の安定ｐＨ範囲は７．０〜１１．５である。
そして、特にｐＨ４以下ではほぼ完全に失活する。
【００３４】
（至適温度）
後述する力価の測定法における同一の基質・酵素混合液を用い、種々の温度（３０〜８０℃）にて本酵素の酵素活性の測定を行った。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．４ｍｌ、０．３ｍＭ  １―Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ水溶液０．１ｍｌ、１ｍＭ  ＷＳＴ―８  ０．３ｍｌ及び１０ｍＭ  ヒスタミン溶液
０．１ｍｌを混合し、所定温度でプレインキュベーションした後、０．１ｍｌの本酵素液を加え、所定温度で反応させ、６０分間に生成した還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳの増加量を測定することにより本酵素の活性測定を行った。
図３は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであって、この図に示す通り、本酵素の作用適温の範囲は、６５〜７５℃である。
【００３５】
（温度による失活の条件）
後述する力価の測定法における基質・酵素混合液を用い、種々の温度にて１５分間処理（ｐＨ８．０）し、本酵素の残存活性を測定して求めた。
図４は、本酵素の熱安定性を示すグラフであって、この図に示す通り、本酵素は６０℃近辺まで安定。
それ以上では、急激に失活する。
【００３６】
（分子量）
本酵素の分子量を、ＴＳＫ−ＧｅｌＧ３０００ＳＷカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定した。その結果分子量は約１５０，０００と推定された。またＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により、本酵素のサブユニットは約７１，０００と推定された。
【００３７】
（Ｋｍ値）
ラインウエバー・バークのプロットからＫｍ値は０．０６７ｍＭ（ｐＨ８．０）（ヒスタミンに対して）である。
【００３８】
（力価の測定法）
酵素の力価の測定は以下の方法で行い、１分間に１μｍｏｌの４―イミダゾリルアセトアルデヒドを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．４ｍｌ、０．３ｍＭ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ水溶液   ０．１ｍｌ、１ｍＭ  ＷＳＴ―８水溶液  ０．３ｍｌ、１０ｍＭ  ヒスタミン溶液  ０．１ｍｌ及び本酵素液０．１ｍｌを加え、３０℃で３０〜６０分間反応を行った。なお、本酵素の活性は本酵素反応において生成した還元型１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳと反応して生じるＷＳＴ−８の発色を４６０ｎｍの吸光度にて測定した。
【００３９】
（精製方法）
本酵素の単離、精製は常法に従って行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などを単独又は適宜組み合わせて用いられる。
【００４０】
以上本発明の用いる本酵素について述べたが、本酵素は前記した作用、基質特異性などの主要な理化学的性質を有するものであればよく、その他の理化学的性質が多少の相違を示すものであっても、本発明の酵素として包含される。
【００４１】
本酵素は、魚肉の鮮度測定などをする場合に、該測定対象の魚肉中のヒスタミンの定量や、人の血清や尿などの体液中に含まれる微量のヒスタミンの定量に極めて有用である。そして本酵素を用いることにより、測定対象の魚肉あるいは体液中に含まれる種々のアミンのうち、検出する必要のないカダベリンやプトレッシンなどには作用せず、目的とするヒスタミンにみによく作用して、これを精度よく定量することが可能となる。
【００４２】
次に、ヒスタミンに特異的に作用するヒスタミンデヒドロゲナーゼの製造法について説明する。
ここに使用される微生物としては、本酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌でもよく、またこの菌の変種又は変異株でもよい。そして、この微生物の具体例としては、リゾビウム属に属する任意の微生物が挙げられる。例えばリゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）４−９（以下、「本菌株」ということがある）が挙げられ、該菌株の変種又は変異株も用いることができる。このリゾビウム・エスピー  ４−９は、本発明者らが千葉県内の土壌より分離して得た菌株であり、その菌学的性質は以下に示すとおりである。
なお、菌学的性質の同定のための実験は、主として長谷川武治編著、「微生物の分類と同定」、東京大学出版会（１９７５年）によって行った。また、分類同定の基準として「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、第８版（１９７４年）を参考にした。  また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統解析には、日本ＤＮＡデータバンクのＤＮＡデータベースを用いた。
【００４３】
リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）４−９の菌学的性質
（Ａ）形態的性質
顕微鏡観察［ベンネット培地（ｐＨ８．０）、３０℃、２４〜４８時間培養］
ａ）細胞の形及び大きさ：０．５〜０．６×１．２〜２．３μｍの直状桿菌である。
ｂ）細胞の多形性の有無：無し。
ｃ）運動性の有無：有り。２〜４の鞭毛が認められる。
ｄ）胞子の有無：無し。
ｅ）グラム染色性：陰性。
ｆ）抗酸性：陰性。
【００４４】
（Ｂ）各培地における生育状態
ａ）ベンネット寒天培養：３０℃、６０時間の静置培養で、直径１．５〜２．５ｍｍの円形コロニーを形成する。コロニーは白っぽいクリーム色を呈し、表面は中央がやや隆起し、光沢があり、粘性物質を生成する。色素の生産は観察されない。
ｂ）ベンネット液体培養：３０℃、２４時間の静置培養では、わずかに濁り、底に糸状の生育が見られる。振盪培養では、培地全体が混濁する。
ｃ）肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔に沿って生育するが、ゼラチンは液化しない。
ｄ）リトマスミルク培養：無変化である。
【００４５】
（Ｃ）生理学的性質
ａ）硝酸塩の還元：還元する。
ｂ）脱窒反応：無し。
ｃ）ＭＲテスト：陰性。
ｄ）ＶＰテスト：陽性。
ｅ）インドールの生成：生成しない。
ｆ）硫化水素の生成：生成しない。
ｇ）デンプンの加水分解：加水分解しない。
ｈ）クエン酸の利用：利用する。
ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用するが、アンモニウム塩は利用しない。
ｊ）色素の生成：生成しない。
ｋ）ウレアーゼ：陽性。
ｌ）オキシダーゼ：陰性。
ｍ）カタラーゼ：弱陽性。
ｎ）生育の範囲：温度４〜４０℃、ｐＨ５.５〜９.０。
ｏ）酸素に対する態度：好気的。
ｐ）Ｏ―Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法）：酸化。
ｑ）エスクリンの分解：分解する。
ｒ）デオキシリボヌクレアーゼ：陰性。
ｓ）チロシン分解：分解しない。
ｔ）カゼイン分解：分解しない。
ｕ）フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性。
ｖ）トリプトファンデアミナーゼ：陰性。
ｗ）糖類からの酸及びガスの生成：表２のとおり、Ｄ―メレジトース以外の糖類からの酸生成が認められる。ガスの生成はみとめられない。
【００４６】
0003926071.tif 000005
【００４７】
本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有することから、リゾビウム属に属するものと判定された。また、本菌の分類学的位置を推定するために、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統解析を行ったところ、本菌株はリゾビウム属の細菌であることが確認された。
また、本菌株は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍと同一のクラスターに位置していた。
しかし、このクラスターの中で本菌株は単独の系統枝を形成しており、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列からは近縁種の推定はできなかった。また、本菌株の性状試験の結果をこれらリゾビウム属に属する細菌と比較したところ、本菌株は、いずれの種とも性状が異なっていた。このような理由から、本菌株をリゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）４−９と命名した。
なお、本菌株は工業技術院生命工学技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番）に、平成１０年（１９９８）９月１４日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１６９９２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８６１）として寄託されている。
【００４８】
次に、本酵素の製造法について説明する。
本酵素は、本酵素生産のための微生物の種類、培養法及びその条件には、本発明の目的を特に阻害しない限りにおいて制約されない。すなわち、本酵素生産能を有する微生物、例えばリゾビウム属に属し本酵素生産能を有する微生物の生育及び本酵素の生産が可能な環境を与えるいかなる培養方法及びいかなる培養条件が採用され得る。
培養法としては、通常の固体培養でもよいが、液体培養法が好ましい。
そしてその培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適度に含有するものであれば、合成培地、天然培地又は半合成培地のいずれでも使用できる。
【００４９】
上記炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばマルトース、グルコース、グリセリン、フラクトースなどが使用される。
また窒素源としては、本酵素は、ヒスタミンにより誘導生成されるためヒスタミン又はヒスタミン塩が望ましいが、本酵素を発現する窒素源であれば任意のものが利用できる。例えば酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウムなどが使用される。
【００５０】
本酵素は、培地中に窒素源として、ヒスタミン又はヒスタミン塩を添加すると、酵素の生産蓄積量を著しく増大できる。このヒスタミン塩としてはヒスタミン塩酸塩及びヒスタミンリン酸塩などが好ましい。
【００５１】
また無機物としては、食塩、塩化カリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウムなどの種々の塩類が好ましい。
【００５２】
またその他の栄養素としては、各種ビタミン類などが使用できる。これらの栄養源はそれぞれ単独で用いることもでき、また組み合わせて用いることもできる。なお、このほか必要により消泡剤などを添加してもよい。
【００５３】
このようにして調製した液体培地を用いて本酵素を製造するには、通気撹拌深部培養又は振盪培養などにより好気的に培養するのが好ましい。
その際に、培地の初発ｐＨを６．０〜７．０程度に調整し、２５〜３７℃、好ましくは３０℃前後の温度で２４〜９６時間、好ましくは４８時間前後培養する。かかる培養により、培養物中に本酵素が生成し、蓄積される。
【００５４】
この培養物から本酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
本酵素は、主に菌体内に存在する酵素であるため、培養物から、例えば濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から本酵素を採取するのが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることができるが、例えば超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミルなどの種々の機械的破砕手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独又は組み合わせて採用することができる。
次いで、これを濾過又は遠心分離などによって不溶物を除き、本酵素の粗酵素液を得る。
【００５５】
このようにして得られた粗酵素液から本酵素を単離精製するには、前記精製方法が適用できる。
本酵素の単離、精製は常法にしたがって行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などを単独又は適宜組み合わせて用いられる。
【００５６】
次に、本発明のヒスタミン定量用試薬は、（ａ）ヒスタミンに特異的に作用するヒスタミンデヒドロゲナーゼ、（ｂ）電子キャリアー及び（ｃ）還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒド及びアンモニアからなる群の少なくとも１つを測定するための試薬、を含むものである。
【００５７】
ヒスタミンを定量するための有利な系としては、例えば反応試薬としては、▲１▼０．０３〜０．３Ｕ／ｍｌのヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系、▲２▼０．０３〜３．０ｍＭの電子キャリアー（例えば１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ）及び１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系及び▲３▼０．１〜１０ｍＭのＷＳＴ−８及びを含有する１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系の組合せが挙げられる。
【００５８】
これらの系に用いられる緩衝剤としては、例えばリン酸カリウムなどのリン酸塩、トリス―塩酸塩、酢酸塩などが挙げられる。
このような系に、前記成分以外に、本発明の目的を損なわない範囲で、必要に応じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤などを添加することもできる。このような具体例としては、界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ツイーン８０、コール酸など）、還元剤（メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｌ−システインなど）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、ショ糖など）などを添加することもできる。
これらの成分は、前記の系を調製する適当な段階で添加し、１種又は２種以上を組合わせて用いることもできる。
【００５９】
本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した状態のものを用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート含浸性の紙などに含浸させてもよい。
また、使用酵素は、常法により固定化させて反復使用してもよい。
このような本発明の試薬を用いることにより、各種の試料中に含有されるヒスタミンを簡単な操作で精度よく定量することができる。
【００６０】
次に、本発明のヒスタミンの定量法は、前記の如く、ヒスタミン含有試料に、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しないヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加、作用させて、生成する生成物を測定することにより行うものであるが、ヒスタミン含有試料としては、ヒスタミン（その塩でもよい）を含有するものであれば、如何なるものでもよく、例えば液状および固形状の食品、尿や血漿などの生体内物質や生体組織などが挙げられる。
そして、該試料は、そのまま又は水、緩衝液などで抽出、ろ過した後、ヒスタミンが適当な濃度になるように濃縮又は水、アルコール、緩衝液などで希釈して定量に供してもよい。
定量に際しては、これらの試料のｐＨは、無調整でもよいが、適当なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど酸やアルカリを用いてｐＨ８〜１０に調整するのが望ましい。
【００６１】
また、ヒスタミン含有試料に作用させる本酵素の添加量は、該試料中に含まれるヒスタミン含有量、酵素作用条件などにより適宜選択されるが、通常、本酵素を終濃度０．０３〜３Ｕ／ｍｌになるように添加する。
【００６２】
ヒスタミン含有試料に本酵素を作用させ、生成する作用生成物を測定する手段は、任意の手段を採用することができるが、ヒスタミン含有試料に本酵素及び電子キャリアーを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアなどを測定する方法が好ましい。
この場合、本酵素を作用させるときの温度は、２０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃である。このときの作用時間はヒスタミン含有試料の該ヒスタミンを分解するに十分な時間であればよく、１〜６０分間、好ましくは２〜２０分間である。
【００６３】
作用終了後、作用液中の生成する還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒド、アンモニアなどの含有量の定量方法は、特に制限されず、公知の測定手段を用いて行う。そして、あらかじめ同方法で定量して作成したヒスタミンの検量線を用いて、試料中のヒスタミンの定量を行う。
【００６４】
還元型電子キャリアーの定量方法としては、例えばヒスタミン含有試料に、フェナジンメトサルフェートやメルドラブルーなどのテトラゾリウム系の電子キャリアーおよびＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＷＳＴ−８などのテトラゾリウム系の還元系発色試薬の存在下、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を定量する方法が挙げられる。
【００６５】
また４―イミダゾリルアセトアルデヒドの定量方法としては、例えば４―イミダゾリルアセトアルデヒドにアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、この際の共役作用、すなわち、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）→還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）で生成したＮＡＤＨ量を３４０ｎｍにおける吸光度増加にて測定する方法などが挙げられる。
【００６６】
また、アンモニアの定量法に関してはニンヒドリン作用法、インドフェノールブルー吸光光度法、イオン電極法など既知の種々の方法を利用することができる。
【００６７】
次に、ヒスタミンの定量方法の１例を示す。
まず、ヒスタミンを含有する試料に、０．０３〜０．３Ｕ／ｍｌのヒスタミンデヒドロゲナーゼ、電子キャリアー及び緩衝剤１０〜２００ｍＭを加え、ｐＨ８〜１０、温度３０〜５０℃で酵素作用させる。このときの作用時間はヒスタミンを分解するに十分な時間であればよく、１〜６０分間、好ましくは２〜２０分間である。次いで、生成する還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒド、アンモニアなどの含有量を前記の方法によって定量し、あらかじめ同方法で定量して作成したヒスタミンの検量線を用いて、試料中のヒスタミンの定量値を算出する。
【００６８】
【発明の効果】
本発明は、ヒスタミン含有試料に、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を測定するものであるから、ヒスタミンの新しい酵素的定量法を提供することができる。
また、ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４―イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを測定するものであるから、ヒスタミンを精度よく定量できる。
また、これらのヒスタミンの定量法において、ヒスタミンに特異的に作用するヒスタミンデヒドロゲナーゼを使用するときは、ヒスタミンと他のアミン類が混在する試料から、ヒスタミンのみを精度よく定量することができる。
また、魚介、畜肉類など、食品が腐敗すると（鮮度が低下すると）、該食品中にヒスタミンとほぼ同時にカダベリン及びプトレッシンが同時に生成、蓄積する。このヒスタミンを定量する際、酵素として、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しないヒスタミンデヒドロゲナーゼを使用すると、これらのアミンを分画（分離）除去することなくヒスタミンの定量を行うことができる。そのほか、本発明によれば、試料中より面倒な妨害物質（不純物）を除去する前処理操作の要らない、定量に要する時間が短時間である、極めて高感度で定量することができる、簡便な装置を用いて測定することができる、作用セルは液密的条件下で操作する必要がない（すなわち開放系で操作することが可能である）、という特徴を有するヒスタミンの定量法及び定量用試薬を提供するができる。さらに多数の試料を同時に測定できるので産業上極めて有意義である。
【００６９】
以下に本発明で用いるヒスタミンデヒドロゲナーゼを製造法の一例を参考例として示す。
参考例１
（ヒスタミンデヒドロゲナーゼの製造法）
グルコース０．１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．２％（Ｗ／Ｖ）、ヒスタミン二塩酸塩０．１％（Ｗ／Ｖ）、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％（Ｗ／Ｖ）及び水道水からなる培地（ｐＨ ６．７５）１００ｍｌを坂口コルベンに入れて、１２０℃で１５分間殺菌し、培地を調製した。これを２本分調製した。
それぞれにリゾビウム・エスピー （Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）４−９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８６１）の保存スラントより１白金耳接種し、それぞれ３０℃で約７２時間、振盪数１４０ｒｐｍで振盪培養して種培養液を調製した。
【００７０】
次いで、前記と同様にして殺菌し、調製した培地２０リットル（Ｌ）を３０Ｌ容ジャーファーメンターへ入れ、これに前記の種培養液約２００ｍｌ（坂口コルベン２本分）を無菌的に接種し、３０℃、回転数２００rｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎの条件で４８時間通気撹拌培養した。培養終了後、培養液２０Ｌをマイクローザ（旭化成工業社製、限外濾過膜、登録商標名）を用いて菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて菌体を洗浄した後、菌体を同緩衝液約１Ｌに懸濁した。
【００７１】
次いで以下の方法により本酵素の精製を行なった。
ステップ１：
（粗酵素液の調製）：
前記菌体懸濁液に、トリトンＸ−１００、リゾチウム、ＥＤＴＡをそれぞれ０．５％、０．１％（Ｗ／Ｖ）、２０ｍＭ添加混合し、室温で一晩放置した。
その後遠心分離（８０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）して、上清を採取し、粗酵素液を調製した。
【００７２】
ステップ２：
（硫安分画）
粗酵素液に硫安を添加し、４０〜６０％飽和で沈澱するタンパクを遠心分離（８０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）によって回収した。
得られた沈殿物を１３％（Ｗ／Ｖ）硫安を含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。
【００７３】
ステップ３：
（ブチルトヨパール６５０・クロマトグラフィー）
上記の酵素溶解液をブチルトヨパール６５０カラム（２．５×３０ｃｍ）に吸着させたのち、１３％（Ｗ／Ｖ）硫安を含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、次に、１３％（Ｗ／Ｖ）硫安を含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、直線濃度勾配法により溶出させ、約７〜９％（Ｗ／Ｖ）硫安を含有するリン酸緩衝液にて溶出された活性画分を集めた。
これに６０％飽和となるように硫安を添加し、低温で一晩放置し、その後遠心分離（８０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により得られた沈殿物を２０ｍＭトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した。
この酵素溶解液を透析膜を用いて前記緩衝液に対して透析した。
【００７４】
ステップ４：
（ＤＥＡＥ−セファセル・クロマトグラフィー）
透析液をＤＥＡＥ−セファセルの充填したカラム（２．５×３０ｃｍ ）の該セファセルに吸着させたのち、２０ｍＭトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄し、次に、０Ｍ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液にて直線濃度勾配法により溶出させ、約０．４Ｍ塩化カリウムを含有するリン酸緩衝液にて溶出された活性画分を集めた。
【００７５】
（酵素精製標品）
以上の精製操作により得た該活性画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりほぼ均一と判断され、精製標品であることが確認された。
この標品は、全タンパク量が１．０６ｍｇ、全活性が６．６４Ｕ、比活性が６．２６Ｕ／ｍｇであった。
【００７６】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００７７】
実施例１
（ヒスタミン定量用試薬の調製例）
精製水に以下の３の成分をそれぞれ以下の濃度又は単位で溶解し、３つの成分からなるヒスタミン定量用試薬を調製した。
【００７８】
0003926071.tif 000006
【００７９】
実施例２
（ヒスタミン含有試料に、酵素として「ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しないヒスタミンデヒドロゲナーゼ」を作用させ、生成する還元型電子キャリアーを測定するヒスタミンの定量法）
表３記載の３つの成分を測定直前に混合することにより、ヒスタミン定量用試薬（反応試薬液）を調製した。
このヒスタミン定量用試薬を用いて既知濃度のヒスタミン定量を行った。
先ず反応試薬液２．８ｍｌに各濃度のヒスタミン標準溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で５分間保温した。これを９６穴のマイクロプレートのウェルに２００μlずつ分注し、その後ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（０．０３Ｕ／ｍｌ）を１０μl添加し、３７℃で３０分間作用させた。
そして作用開始後、経時的にプレートリーダーにより、４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、該吸光度増加量（△ＯＤ）の値を求めた。
この値（Ｙ）とヒスタミン含有量（Ｘ）との関係から検量線を作成した。
その検量線を図５に示す。
該検量線の式は、ｙ＝０．４５７５ｘ−０．００１６（ｒ＝０．９９９）
となる。
これから、△ＯＤとヒスタミン含有量との間には直線的な相関があって、検量線として有効であることがわかり、しかも試料に含まれるヒスタミン濃度が０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ（即ち約５〜５０ｐｐｍ）の極微量のヒスタミンを迅速かつ高感度に定量できることが判る。
【００８０】
実施例３
（サバ水煮缶詰中の該サバ肉に含まれるヒスタミンの定量）
１）試料の調製
サバ水煮缶詰の該サバ肉を５ｇ定量し５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を３５ｍｌ加え、ストマッカーにて試料を細かくした後、電子レンジにて加熱させた。放冷後、同緩衝液にて５０ｍｌにメスアップし、これをＮｏ．２の濾紙および０．４５μｍのディスミックフィルターで濾過したものを分析試料とした。
【００８１】
２）ヒスタミンの定量用試薬の調製および定量法
ヒスタミンの定量用試薬の調製および定量法については実施例１及び実施例２と同様に行った。
分析試料のヒスタミン量については分析して得られた各△ＯＤを用い実施例２で求めた検量線の式から算出した。
【００８２】
比較例
比較のため、同一の分析試料に含まれるヒスタミンを、従来ヒスタミンの定量法において測定値の信頼性が高いと言われるＨＰＬＣ法（従来法）にて定量した。
【００８３】
本発明法（実施例３）と従来法の測定値の相関関係を調べた。
その結果を図６に示す。
図６の結果から本発明法（実施例３）と従来法との間には、直線的な相関があり、相関を示す式はｙ＝１．００４５ｘ−４．６６５６（ｒ＝０．９９８）となる。そして本発明の定量法は、従来のＨＰＬＣ法と非常に良好な相関性を示すことが判明した。このことから、本発明のヒスタミンの定量法は、測定値の信頼性が高いことが判る。また、試料中より面倒な妨害物質（不純物）を除去する前処理操作の要らない、定量に要する時間が短時間である、極めて高感度で定量することができる、簡便な装置を用いて測定することができる、作用セルは液密的条件下で操作する必要がない（すなわち開放系で操作することが可能である）ことが判る。
【００８４】
実施例４
（ヒスタミンと他のアミン（カダベリンおよびプトレッシン）が混在する試料の、該ヒスタミンの定量）
上記実施例２のヒスタミンの定量法において、「各濃度のヒスタミン標準溶液」に代えて、「各濃度のヒスタミン標準溶液に該ヒスタミンと同濃度のカダベリン及びプトレッシンが混在する試料液」を用いる以外は、全く同様にして、ヒスタミンの定量を行った。
また、比較のため、上記と同一の試料液についてＨＰＬＣ法（従来法）によりヒスタミンを定量した。
これらの測定値の相関関係を調べたところ、図６と同じ結果が得られた。即ち、「各濃度のヒスタミン標準溶液に該ヒスタミンと同濃度のカダベリン及びプトレッシンが混在する試料液」を用いた場合、ヒスタミンの標準溶液を用いた場合と比べ、反応液の発色量に差が全くみられなかった。
従って本発明によるヒスタミンの定量法は、他のアミン類には影響されずにヒスタミンだけを効率よく定量できることが判る。特にカダベリン及びプトレッシンは、魚肉が腐敗する際、ヒスタミンとほぼ同時に生成するアミンであり、従来法ではこれらを何らかの方法で、分画（分離）除去する必要があったのに対し、本発明では、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しない基質特異性を有する酵素を用いることにより、面倒で時間を要する分離操作は全く行うことなくヒスタミンの選択的定量を行うことができることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。
【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。
【図３】本酵素の作用適温の範囲を示すグラフ。
【図４】本酵素の熱安定性を示すグラフ。
【図５】本発明の定量法の検量線を示すグラフ。
【図６】サバ水煮缶詰の該サバ肉に含まれるヒスタミン量を本発明の定量法と従来のＨＰＬＣ法とで分析したときの相関関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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