(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性であって、かつ酢酸イソアミル成分を親株よりも１．６〜３．１倍生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母。
【請求項２】
請求項１に記載のサッカロミセス・セレビシエを用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法。
【請求項３】
酵母細胞の母集団から、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンに対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエを選択することを特徴とする請求項１に記載の新規酵母の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンに対して耐性を示す酵母及び該酵母を用いた香気の豊かな酒類、食品の製造方法に関する。
更に詳細には、本発明は、香気成分のうち酢酸イソアミルを多く生成する酵母を、多くの酵母細胞の中から容易に選択する方法に関し、更には選択した酵母を用いて、香気の豊かな酒類、食品を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酒類、特に清酒の製造において、フルーティな吟醸香成分の含量の高い清酒を製造するには、低精白米を使用し、１５℃前後で発酵させる普通酒仕込では困難である。従来、吟醸香に富んだ清酒を得るためには高度精白米を使用し、低温発酵を行っていた。しかしながら、この方法では時間とコストがかかる。
現状では、低精白米の加圧蒸しやリパーゼ処理等が行われるようになったが、低精白米の普通酒仕込から吟醸香に富んだ清酒を製造することは、困難であることより、酵母の育種という観点からの技術開発に依存する方向が進められ、これまでに、５′，５′，５′−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性を用いる方法（特開昭６２−６６６９号）、４−アザ−ＤＬ−ロイシン耐性を用いる方法（特開平１−２５７４２３号）、固形色素平板培地上で異なる色調を示す株を選択する方法（特開平２−１３３６８号）、及びモノフルオロ酢酸イソアミル耐性株の中から酢酸イソアミル低分解性株を選択する方法（特開平６−１６９７４７号）が公開されている。しかしながら、吟醸香を構成する成分を、その他の成分と官能的にバランスを保った形で高生成する酵母は少なく、そういった酵母の育種が待たれていた。
また、清酒以外の酒類では、焼酎の製造においても、香りの良い焼酎を製造するためには同様の問題点を有し、更には食品の製造においても、同様であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
香気成分の豊かな吟醸酒の場合、原料コストが高く、また製造日数も長くかかることから、安定に大量の吟醸酒を製造することは困難であった。また、低精白米を用いる普通酒仕込では、吟醸香に富んだ清酒を製造することは更に困難であった。
本発明の目的は、前記の従来技術の問題点を解決すべく、普通酒仕込で吟醸香の高い、あるいは新規な吟醸香を有する清酒を製造することにあり、そのための特に酢酸イソアミルの生成能の高い新規酵母菌を提供すること、及び該酵母を用いて低精白米から、安定にかつ大量に、吟醸香の豊かな酒類を製造する方法、更には該酵母を用いて吟醸香の豊かな食品を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、インドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性であって、かつ酢酸イソアミル成分を親株よりも１．６〜３．１倍生産するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) に属する新規酵母に関し、第２の発明は、本発明の第１の発明の当該酵母を用いることを特徴とする香気成分の豊かな酒類、食品の製造方法に関し、第３の発明は、酵母細胞の母集団から、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンに対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエを選択することを特徴とする本発明の第１の発明の新規酵母の製造方法に関する。
【０００５】
本発明者らは、清酒用泡なし酵母、日本醸造協会７０１号（以下、Ｋ−７０１と略述する）株の変異処理株を、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンを含む最少培地で生育させ、当該培地で生育できる株を分離し、清酒小仕込試験を重ねて清酒の官能試験、機器分析により、酢酸イソアミルの高生産株が選別できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における酢酸イソアミル高生産株とは、生成する酢酸イソアミルの基質であるイソアミルアルコールの生産量は親株とほぼ同等であることを特徴としている。
【０００７】
本発明では、抗炎症剤であるインドメタシンや三環系薬物のクロルプロマジンが用いられる。
酢酸イソアミル高生産株を効率的に選択、分離するためには、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンの中では、クロルプロマジンを含む最少培地で選択された株は酢酸イソアミルを特異的に高生産する頻度が多いことから、クロルプロマジンを含む選択培地を用いるのが好適である。
【０００８】
選択される酵母細胞の母集団は、変異処理株のほかに野生株、馴養株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株をも含む。
【０００９】
ここに得られるインドメタシン及び／又はクロルプロマジンに対する耐性株は、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、アルコール酵母、及びパン酵母のいずれでも、酢酸イソアミルを多く生成するので、これらの酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー等の酒類、又はパン等の食品を製造すれば、香気の豊かな製品を製造することができる。更に、これらの酵母を用いて芳香性の香気液を製造することも可能である。
【００１０】
清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー、香味液、パンなどの製造方法は特に限定するものではなく、一般的な方法に従って製造することができる。
【００１１】
以下にその分離方法の１例を示す。
（酵母の変異処理方法）
Ｋ−７０１株の酢酸イソアミル高生産株を取得するために、例として以下の工程で変異処理を行った。Ｋ−７０１株をＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）５ｍｌで３０℃にて一夜振とう培養した。遠心分離で菌体を集菌した後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。洗浄菌体を４．６ｍｌの０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）で懸濁し、４０ｗ／ｖ％グルコース溶液を０．２５ｍｌ添加してよくかくはんした後、０．１５ｍｌの３ｗ／ｖ％エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）水溶液を添加し、３０℃にて１時間穏やかに振とうした。その０．２ｍｌを９．８ｍｌの６ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液に加えて、室温で１０〜１５分維持し、そのうちの０．２ｍｌを１９．８ｍｌの滅菌水に添加し、集菌、洗浄後、１ｍｌの滅菌水に懸濁し、０．１ｍｌずつ、７５μｇ／ｍｌのインドメタシン及び／又は５００μｇ／ｍｌのクロルプロマジンを含有するＳＤ培地〔イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％〕の平板寒天培地１０枚に塗布し、３０℃で３日間培養した。インドメタシンを含む選択培地で生育してきた株（７Ｉ３）、及びクロルプロマジンを含む選択培地で生育してきた株（７Ｃ３、７Ｃ５）を、それぞれインドメタシン耐性株、クロルプロマジン耐性株として選択した。
【００１２】
（酢酸イソアミル生成の高い菌株の分離方法）
インドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性の変異株（７Ｉ３、７Ｃ３、７Ｃ５）について、表１に示す仕込配合で清酒の小仕込試験を行った。
【００１３】
【表１】
0003865324.tif 000002
【００１４】
掛米は精米歩合７７％（ｗ／ｗ）のα米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７２％（ｗ／ｗ）の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０9 個含むものを添加した。発酵温度は１５℃一定で行った。留後１３日目の醪の上槽液について、ガスクロマトグラフィーで低沸点香気成分の定量を行った結果、いずれのインドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性変異株も親株（Ｋ−７０１株）の１．６〜３．１倍の酢酸イソアミルを生成することを認めた。以上の酢酸イソアミル高生産という形質は、当該変異株がＫ−７０１株とは異なる新規酵母菌であることを示すものである。
【００１５】
上記のように、本発明による菌株｛変異株：７Ｉ３、７Ｃ３、７Ｃ５｝は、Ｋ−７０１株の変異株であるが、その菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．５μｍ
２．胞子形成：有り
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％、寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養し、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して、当該３菌株を接種し、３０℃で７日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース  （−）                  メリビオース  （−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により、３０℃、１４日後の生育を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
５．高泡の形成
清酒の小仕込を行ったところ、いずれの変異株も高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母３菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、かつ清酒の小仕込試験において、高泡の形成も認められないことから、当該３菌株はＫ−７０１株の変異株であることを示すものである。
６．薬剤に対する耐性
それぞれの薬剤を含むＳＤ培地を用いて、３０℃で３日間培養した。その結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
0003865324.tif 000003
【００１７】
ａ）５′，５′，５′−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性
ｂ）４−アザ−ＤＬ−ロイシン耐性
ｃ）カナバニン耐性
ｄ）クロトリマゾール耐性
７．インドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性
それぞれの薬剤を含むＳＤ培地を用いて、３０℃で３日間培養した。その結果を表３に示す。
【００１８】
【表３】
0003865324.tif 000004
【００１９】
かくして、本発明により、Ｋ−７０１株を変異させた後、インドメタシン及び／又はクロルプロマジンを含む培地で選択することによって、酢酸イソアミルを高生成する、普通酒仕込に使用可能な香気高生成酵母が提供された。代表的な菌株である７Ｉ３株、７Ｃ５株は、それぞれ Saccharomyces cerevisiae ７Ｉ３、 Saccharomyces cerevisiae ７Ｃ５と表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１５４６５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４６６として寄託してある。
【００２０】
本発明の清酒、焼酎及びその他の酒類の製造方法は、これらの酵母菌株を用いることを特徴とし、醸造方法は特に限定するものではない。また、食品の製造においても同様に製造方法は特に限定するものではない。
【００２１】
【実施例】
次に、本発明の菌株を用いた酒類製造の具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２２】
実施例１
インドメタシン耐性変異株１株及びクロルプロマジン耐性２株について、表１に示す仕込配合で清酒の製造を行った。掛米は精米歩合７７％（ｗ／ｗ）のα米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７２％（ｗ／ｗ）の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０9 個含むものを添加した。発酵温度は１５℃一定で行った。対照株として親株のＫ−７０１株を用いた。上槽液の分析結果を表４に示す。
【００２３】
【表４】
0003865324.tif 000005
【００２４】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
この結果、７Ｉ３株、７Ｃ３株、７Ｃ５株の３株は、清酒の香気成分の中で、特に吟醸香に大きく寄与するとされている酢酸イソアミルを親株の約１．６〜３．１倍生成し、官能的にもバナナ様のフルーティな香りが強く認められた。
【００２５】
実施例２
インドメタシン及び／又はクロルプロマジン耐性変異株のうち、７Ｉ３株と７Ｃ５株の２株について、表５に示す仕込配合で焼酎の製造を行った。対照株として米焼酎によく用いられるＫ−７０１株を使用した。
【００２６】
【表５】
0003865324.tif 000006
【００２７】
掛米は精米歩合７０％（ｗ／ｗ）の低品位米を使用した。麹は、精米歩合７２％（ｗ／ｗ）の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に２×１０8 個含むものを添加した。酵素剤はスピターゼＭ〔ナガセ生化学工業（株）製〕を使用した。発酵温度は２０℃一定で行った。留後１４日目の醪を減圧度−７００ｍｍＨｇで減圧蒸留し、留出アルコール分２０ｖ／ｖ％までの垂口をアルコール２５．０ｖ／ｖ％に割水したものを分析した。その結果を表６に示す。
【００２８】
【表６】
0003865324.tif 000007
【００２９】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
この結果、７Ｉ３株又は７Ｃ５株を用いて製造した米焼酎は、吟醸香である酢酸イソアミル含量が共にＫ−７０１株に比べて多く、官能的にもバナナ様のフルーティな香が強く認められた新しいタイプの焼酎となった。
【００３０】
以上の結果は、７Ｉ３株、７Ｃ３株、及び７Ｃ５株の変異株３株が、Ｋ−７０１株にない有用な性質をもつ、すなわち香気エステルを多く生成する新規酵母菌であることを示すものである。
【００３１】
【発明の効果】
本発明による酵母の選択法を用いて得られるインドメタシン及び／又はクロルプロマジンに対して耐性を示す酵母を使用することにより、高精白米、低温長期仕込の吟醸仕込を行わなくとも、普通酒仕込あるいは低価格米による焼酎仕込において酢酸イソアミルを主とする香気エステルの豊かな、芳香性に富んだ清酒、焼酎及びその他の酒類の製造が、低コストで、しかも短期間で安定して行うことが可能となる。
食品の製造においても同様に、本発明による新規酵母菌を用いることにより、香気成分の豊かな食品を製造することが可能となる。