(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０００ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上の比活性を有する組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子と、安定剤として０．０１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの濃度を有する非イオン系界面活性剤と、ヒスチジンと、塩化ナトリウム又は塩化カリウムと、カルシウム塩とから成り、該第ＶＩＩＩ因子がアルブミンを添加せずに安定していることを特徴とする組成物。
【請求項２】
組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子が組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子のＳＱ誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第ＶＩＩＩ因子の比活性が５０００〜１０００００ＩＵ／ｍｇである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
非イオン系界面活性剤が臨界ミセル濃度の量で存在することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
非イオン系界面活性剤がエチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体又はポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルから選択されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルが少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの量であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
０．５ｍＭ以上の量のカルシウム塩を含むことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
単糖または二糖類または砂糖アルコールを含むことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｌ−ヒスチジンおよびスクロースを含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
塩化ナトリウム対Ｌ−ヒスチジンのモル比が１対１以上であることを特徴とする請求項７または９に記載の組成物。
【請求項１３】
１０−１０００００ＩＵ／ｍｌの組み換え第ＶＩＩＩ因子と、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルと、０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウムと、
０．５ｍＭ以上の量のカルシウム塩と、
１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンとを含むことを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が乾燥されていることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が直ちに使用可能な水溶液であることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）の比活性が１４０００ＩＵ／ｍｇ以上であることを特徴とする請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
第ＶＩＩＩ因子をＬ−ヒスチジン、ナトリウム塩、スクロースおよびカルシウム塩と共に、水溶液内で非イオン系界面活性剤と混合させることを特徴とする請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１９】
Ｌ−ヒスチジン、ナトリウム塩、スクロースおよびカルシウム塩と共に非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液により水溶液内で最後の精製段階から第ＶＩＩＩ因子を溶出させることを特徴とする請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項２０】
５０００ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上の比活性を有する組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子と、安定剤として０．０１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの濃度を有する非イオン系界面活性剤と、ヒスチジンと、塩化ナトリウム又は塩化カリウムと、カルシウム塩とから成る組成物において、該第ＶＩＩＩ因子がアルブミンを添加せずに安定している組成物のための安定剤として、０．０１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの濃度におけるエチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体またはポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルから選択した非イオン系界面活性剤を使用する非イオン系界面活性剤の使用方法。
【請求項２１】
組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子が組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）であることを特徴とする請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は凝固第VIII因子と、非イオン系界面活性剤、例えば、ポロクサマーのようなブロック共重合体又は例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０のようなポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルとから成る組成物に関する。この組成物は塩化ナトリウム、塩化カルシウム、Ｌ−ヒスチジン及び／又は砂糖及び／又は砂糖アルコールを含むことができる。
血友病は、数世紀前から知られた遺伝病であるが、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃと区別することが可能であることが判明したのは、ここ３０年前にしか過ぎない。血友病Ａは、最も多く発生する種類である。これは、１０，０００人の出生男子当たり１又は２人の発生率で男性にしか発生しない。この病気は血漿中に通常存在する蛋白質である生物学的に活性の凝固第VIII因子（抗血友病因子）の量が極めて低レベルであるか、又は全く存在しないことに起因している。血友病Ａの臨床的病状は、出血傾向が強く、第VIII因子濃縮剤による治療が導入される以前には、これらの患者の平均寿命は、２０才以下であった。血漿から得られた第VIII因子の濃縮剤は、約３０年前から利用可能となっている。これは、血友病の治療効果を著しく向上させ、患者が通常の寿命まで生きることを可能にした。
現在、治療薬としての第VIII因子濃縮剤は、血漿を分画することによって製造されている。しかし、例えば、ジェー・ギィチェイヤー氏等著のネイチャー、第３１２巻、第３３０頁乃至第３３７頁、１９８４年（Ｊ  Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，３３０−３７，１９８４）及び欧州特許第１６０４５７号明細書に示されたようなＤＮＡ組み換え技術を利用して、細胞培養で第VIII因子を製造する方法が利用可能になっている。
人間の血漿から得られた第VIII因子濃縮剤は、完全に活性な第VIII因子の形態の幾つかの分画成分を含んでいる（アンダーソン氏等によって１９８６年５月に米国で発行されたプレシーディング  ナショナル  アカデミック  サイエンス、第８３巻、第２９７９頁乃至第２９８３頁「Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８３，２９７９−８３，Ｍａｙ  １９８６」）。その最小の活性形態は１７０ｋＤａの分子量を有し、金属イオン架橋により相互に保持された９０ｋＤａ、８０ｋＤａの２つの鎖から成っている（欧州特許第１９７９０１号明細書参照）。カビ・ファーマシア（Ｋａｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は治療薬としての第VIII因子濃縮剤中の１７０ｋＤａ血漿第VIII因子形態に対応する組み換え第VIII因子製品を開発した。この截形組み換え第VIII因子は、ｒ−VIIIＳＱと称され、制限接種における、血漿の存在しない媒体中で細胞培養方法において中国ネズミの卵巣（ＣＨＯ）の細胞により製造されている。
ｒ−VIIIＳＱの比活性は、１２，０００ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上であり、１４，０００ＩＵ／ｍｇ以上であることが望ましい。約１５，０００ＩＵ／ｍｇの活性が測定されている。以前のｒ−VIIIＳＱは、ｍｇ蛋白質当たり約１０，０００ＩＵVIII：Ｃであった。
組み換え第VIII因子ＳＱは、古典的な血友病の治療に提案されている。その投与量は、血漿第VIII因子濃縮剤の投与量と同様である。現在、極めて高濃度の濃縮剤を得ることが可能であるため、注射する量は、極く少量で済む。
一般に、組み換え第VIII因子製品の構造及び生化学はカーフマン・ティベテック、第９巻、１９９１年及び血液学、第６３巻、第１５５頁乃至第１６５頁、１９９１年（Ｋａｕｆａｎ  Ｔｉｂｔｅｃｈ，ｖｏｌ．９，１９９１  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，１５５−６５，１９９１）に記載されている。ｒ−VIIIＳＱの構造及び生化学は国際特許出願公開第９１／０９１２２号公報に記載されている。
蛋白質の安定性は、一般に、製薬業界における問題である。これは冷凍乾燥のような異なる乾燥法において蛋白質を乾燥させることにより解決されていた。その後、蛋白質は乾燥形態で販売され且つ貯蔵されている。乾燥又は冷凍乾燥前の溶液と、乾燥材料と、組み換え製品の全ては安定した状態に保持しなければならないので、乾燥工程、貯蔵又は取り扱い中にその活性が過度に失われないようにしなければならない。
血漿から分画された第VIII因子は通常水で液状に戻すことを要する凍結乾燥粉末として販売されている。
蛋白質の量の少ない調合物は、一般に、精製中、滅菌製造中、包装中、及び投与中にその活性を失ってしまう。この問題は、通常、活性蛋白質の活性の低下を著しく軽減する人間のアルブミンを添加することにより、解決している。人間のアルブミンは、精製中、滅菌製造中及び冷凍乾燥中に一般な安定剤として機能する（ワング氏等著のパレンテラ  サイエンス  アンド  テクニック、第４２巻、第２Ｓ号、補足、１９８８年「Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．ａｎｄ  ｔｅｃｈ．Ｖｏｌ．４２，Ｎｕｍｂｅｒ  ２Ｓ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１９８８」参照）。人間のアルブミンは、冷凍乾燥用の調合物における良好な固形物形成剤でもある。第VIII因子を安定させるために、アルブミンを使用することは公知であり、アルブミンは現在、市販されている極めて純粋な第VIII因子製品に使用されている。しかし、ＤＮＡ組み換え技術により製造された治療用蛋白質に人間のアルブミンを添加することは望ましくない。更に、人間のアルブミンを成形添加剤として使用することは、蛋白質の特性のための非常に有効でかつ敏感な分析方法の使用を制限する。
溶液中で及び水に戻した後の溶液として乾燥又は冷凍乾燥中において安定している第VIII因子、特に、組み換え第VIII因子を含む、アルブミンの存在しない調合物が必要とされている。
異なる蛋白質を安定させるための幾つかの解決方法が提案された。
カッター氏の発明に係る欧州特許第３５２０４号明細書には、ポリオールの存在下で蛋白質組成物に熱的安定性を付与する方法が開示されている。
コルイント氏の発明に係る欧州特許第３８１３４５号明細書には、カルボキシメチルセルロースの存在におけるデスモプレッシンのペプチドの水溶性液体が開示されている。
ジェネンテック社名義の国際特許出願公開第８９／０９６１４号公報において、グリシンと、マンニトールと、緩衝剤とから成るヒト成長ホルモンの安定化調合物が開示されており、その好適な実施例において、ポリソルベート８０のような非イオン系界面活性剤が添加されている。この非イオン系界面活性剤は凝集を軽減し、変性を軽減するために添加されるものである。この調合物は、凍結乾燥中の安定性及び水に戻したときの安定性が増す。
セタス氏の発明に係る欧州特許第２６８１１０号明細書には、溶融剤／安定剤として非イオン系高分子洗剤を含む不活性担体媒体中に溶解されている特定の蛋白質、即ちインターロイキン−２を含む溶液が開示されている。その好適な洗剤は、オクチフェノオキシ  ポリエキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノシレート化合物、及びポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。
ホチェスト氏の発明に係る米国特許第４，７８３，４４１号明細書には、インシュリンのような蛋白質と界面活性剤とを含む水溶性溶液が開示されている。
コーバル氏の発明に係る米国特許第４，１６５，３７０号明細書には、ガンマ  グロビリン溶液及びその製造方法が開示されている。この溶液は、ポリエチレン  グリコール（ＰＥＧ）を含む。この溶液に非イオン系界面活性剤を添加することができる。
グリーン  クロス氏の発明に係る欧州特許第７７，８７０号明細書には、第VIII因子を含む溶液の安定性を増すために、アミノ酸、単糖類、オリゴ糖又は砂糖アルコール又は炭化水素カルボオキシ酸を添加することが開示されており、そして欧州特許第１１７，０６４号（グリーン  クロス）明細書には、熱処理中の安定性を増すために、第VIII因子の水溶性溶液に砂糖アルコール、又は二糖類を添加することが開示されている。
オクトファーマ氏の発明に係る国際特許出願公開第９１／１０４３９号明細書の特許請求の範囲には、二糖類、望ましくはサッカローゼ及び１つ又は複数のアミノ酸を含む第VIII因子、又は第IX因子の注射可能な安定溶液が記載されている。
ローラ氏の発明に係る欧州特許第３１５，９６８号及び同第３１４，０９５号明細書の特許請求の範囲には、イオン強度の異なる第VIII因子の安定調合物が記載されている。
蛋白質は物理−化学的性質に関して異なっている。物理−化学的に許容可能であり、長期に亘り安定している医薬製剤を製造するとき、蛋白質の物理−化学的性質のみならず、工業的製造、患者の取り扱いの容易性、及び患者の安全性といったその他の特性も考慮しなければならない。異なる調合物を試験するときには、これらの特性の結果を予測することはできず、従って、各蛋白質毎に独自の解決手段が採用されることが多い。
血漿内で、循環する第VIII因子は、その担体蛋白質、即ちＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）と関係することにより安定化されている。血漿内及び従来の中程度の純度の第VIII因子濃縮剤において、ｖＷＦ対第VIII因子の比は、重量比で少なくとも５０：１である。極めて高純度の第VIII因子濃縮剤においてｍｇ蛋白質当たり２，０００ＩＵ以上の場合活性を有する、ｖＷＦ対第VIII因子の比は、約１：１（ｗ／ｗ）であり、全ての第VIII因子がｖＷＦに結合されている。この安定性にも拘わらず、凍結乾燥及び貯蔵中の許容可能な安定性を実現するためには、アルブミンを添加することが必要である。
市販されている超純度の調合剤は、アルブミン（ヒト血漿アルブミン）で安定させてある。
現在、アルブミンを使用せず、添加剤の量が最小である注射可能な第VIII因子の開発が要求されている。
本発明において第VIII因子に対する上述の問題を解決する新たな調合物が開発されるに至った。
非常に驚いたことに、極めて敏感な蛋白質である第VIII因子は、非イオン系界面活性剤を添加したとき、アルブミンを使用せずに、安定させ得ることを確認した。
このように、本発明は、凝固第VIII因子と、安定剤として非イオン系界面活性剤とを含む組成物に関する。この第VIII因子は、極めて高純度であり、即ち、５，０００ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上の比活性を有し、そしてその組成物がアルブミンを添加せずに安定となる。この第VIII因子を組み換えたとき、この因子は安全な形状の誘導体又はＳＱ誘導体のような欠失誘導体とすることができる。
第VIII因子の量は、１０乃至１００，０００ＩＵ／ｍｌ、望ましくは、５０乃至１０，０００ＩＵ／ｍｌである。
非イオン系界面活性剤はポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）のようなブロック共重合体又はポリソルベート２０又はポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０のようなポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルから選択することが望ましい。ポリソルベート８０として、ツイン８０（登録商標）が使用されている。非イオン系界面活性剤は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の量で存在しなければならない（ワン  アンド  リー著の、薬物化学ジャーナル、第６３巻、第１３６頁、１９７４年「Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６３，１３６，１９７４」参照）。
このように、ポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルは、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの量であることが望ましい。その量は、例えば、０．０２乃至１ｍｇ／ｍｌの範囲でもよい。この組成物は望ましくは０．１Ｍ以上の量のナトリウム又は塩化カリウムを含むこともできる。
この組成物は、望ましくは、０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウム又はグルコン酸塩カルシウムのようなカルシウム塩と、１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンのようなアミン酸を含有することが望ましい。この量は、例えば、０．０５乃至５００ｍＭの範囲としてもよい。例えば、１乃至３００ｍｇ／ｍｌの量のスクロース又は砂糖アルコールのような単糖又は二糖類を添加してもよい。
この組成物は、Ｌ−ヒスチジン及びスクロースを含有することが望ましい。この組成物中の塩化ナトリウムとＬ−ヒスチジンのモル比は１：１以上であることが望ましい。この組成物は、以下のものを含有することができる。
ｉ）１０−１００，０００ＩＵ／ｍｌの組み換え第VIII因子。
ii）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステル。
iii）望ましくは０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウム。
iv）望ましくは０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウム又はグルコン酸塩カルシウムのようなカルシウム塩。
ｖ）１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンのようなアミノ酸。
この組成物には、単糖又は二糖類又は砂糖アルコール、望ましくはスクロースを添加してもよい。この組成物は、乾燥形態とし、望ましくは凍結乾燥させ、又は乾燥前又は乾燥後に水溶液であることが望ましい。乾燥製品は、注射用無菌水又は緩衝溶液で液体に戻す。
上記の組成物は直ちに使用可能にするため安定した水溶液にしてもよい。
本発明は、ｒ−VIIIＳＱの比活性が１２，０００ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、望ましくは、１４，０００ＩＵ／ｍｇ以上である組成物に関する。
上記の組成物は、好ましくは、Ｌ−ヒスチジンのようなアミノ酸、ナトリウム塩、スクロース及びカルシウム塩と共に、第VIII因子を水溶液中で非イオン系界面活性剤と混合させることにより、又は望ましくは、Ｌ−ヒスチジンのようなアミノ酸、ナトリウム塩、スクロース及びカルシウム塩と共に、非イオン系界面活性剤を含む緩衝液により、水溶液中において最後の精製段階から第VIII因子を溶出させることによって製造することができる。
本発明は、凝固第VIII因子を含む組成物の安定剤として、望ましくはポロキサマー（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のようなブロック共重合体又は、望ましくはポリソルベート２０又はポリソルベート８０のようなポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルから選択された非イオン系界面活性剤を使用する使用方法に関する。
アミノ酸はその系の緩衝のために使用され、又該アミノ酸は非結晶相で蛋白質を保護する。適当な緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン、リジン及び／又はアルギニンとすることができる。Ｌ−ヒスチジンは、主として、ｐＨ７付近でＬ−ヒスチジンの良好な緩衝機能を果たすために選択されるものである。
蛋白質を保護するため、スクロース又は砂糖アルコールを添加してもよい。
ここでは、カルシウム（又は、二価金属イオン）が塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）として添加されているが、グリコン酸塩カルシウム、グルビオネートカルシウム又はグルセプテートカルシウムのようなその他の塩を使用してもよく、これらは、第VIII因子の重鎖及び軽鎖が関係する状態を維持するのに必要である。
下記の実施例に示したデータは、ｒ−VIIIＳＱが５±３℃の温度で貯蔵したとき、少なくとも１２ヵ月間、安定していることを示す。
以下の実施例は、本発明を説明し、そして異なる調合物の安定性に関するデータを示し、その保護範囲はこれら実施例にのみ限定するものではない。
実験例
材料及び方法
組み換え第VIII因子ＳＱ（ｒ−VIIIＳＱ）の製造は国際特許出願公開第９１／０９１２２号公報に記載の実施例１乃至３に述べられた方法と略同一の方法で行った。ＤＨＦＲ遺伝子欠失ＣＨＯ細胞系（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）をｒ−VIIIＳＱ遺伝子を含む発現ベクターとジヒドロフォーレートレダクターゼ遺伝子を含む発現ベクターとで電気的に分極させた。選択可能な媒体を選択した後、メトトレキサートの量を段階的に増すことにより、生存するコロニーを成長させて増殖させたその結果、得られたコロニーからの浮遊物を第VIII：Ｃ活性について個々に選別した。製造クローンが選択され、その後、このクローンを特定の媒体中で血清無しの懸濁成長に適合させ、最終的に、大規模な発酵過程を生じさせた。一定時間の経過後、浮遊物を集め、以下に説明するように、更に精製した。
上澄みの調整媒体はそのｐＨが調節され、Ｓ−セファローゼＦＦカラムエに添加された。洗浄後、５ｍＭのＣａＣｌ2を含む塩緩衝液により第VIII因子を溶出させた。
免疫親和性樹脂を利用して免疫性吸着を行い、リガンドは第VIII因子の重鎖に向けられたモノクローン抗体（８Ａ４）であった。カラムに装填する前に、Ｓ−溶出物は０．３％のＴＮＢＰ及び１％のオクトキシノール９で処理した。カラムは、平衡状態にし、洗浄し、そして０．０５ＭＣａＣｌ2及び５０％エチレングリコールを含む緩衝液で第VIII因子を溶出させた。
ｍＡｂ−溶出物は免疫親和性工程中に溶出緩衝液によって平衡状態にされたＱ−セファローゼＦＦカラムに装填した。洗浄後、第VIII因子は、０．０５ＭＬ−ヒスチジン、４ｍＭＣａＣｌ2，０．６ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．８で溶出させた。
Ｑ−溶出液はゲルろ過カラム（スーパーデックス２００ｐ．ｇ．）に添加された。塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、塩化カルシウム及びポリソルベート８０を含む調合物で平衡状態化及び溶出を行った。
蛋白質ピークを集め、そしてその溶液を冷凍乾燥する前に調合した。
VIII：Ｃの活性及び不活性成分の濃度を適当な緩衝液で希釈することにより調節した。次に、その溶液を無菌ろ過し、（０．２２μｍ）、分散させ且つ冷凍乾燥した。各組成物からの標本を凍結して、−７０℃で保存した。これらの標本VIII：Ｃの分析中に溶かして基準液として使用した。
VIII：Ｃの凝固機能は色原体基質分析（コーテスト第VIII価因子、スウェーデン国、モォーンダァール所在、クロモジェニックスアクチボラーク）により評価された。活性因子Ｘ（Ｘａ）は、内在的経路を介して発生させ、第VIII：Ｃ因子は共同因子として作用する。次に、トロンビンによる基質の加水分解を防止するため、トロンビン抑制剤Ｉ−２５８１の存在下において合成色原体基質Ｓ−２２２２を使用してＸａ因子を決定した。この反応は酸により停止させ、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）の放出に比例するVIII：Ｃは試薬ブランクに対して４５０ｎｍで測光方法により決定した。VIII：Ｃの単位はＷＨＯが制定した現在の国際濃縮物標準（ＩＳ）により規定される国際単位（ＩＵ）で表現する。
VIII：Ｃの回復は希釈のため適当な調節を有する凍結乾燥用に凍結させ且つ溶融させた溶液中の第VIII：Ｃにより分割された水を加えて元に戻した溶液中のVIII：Ｃのパーセンテージとして計算する。
可溶性の凝集体は、ゲルろ過により決定した。予め充填したスーパーデックス２００ＨＲ１０／３０カラム（ファーマシア）を蛍光検出器（励起波長２８０ｎｍ、放出波長３４０ｎｍ）と共に使用した。水を加えて元に戻した調整液を分析した。クロマトグラムを肉眼で検査するか、又は凝集体が検出されるか否かピーク領域を積分することにより、ゲルろ過による結果の評価を行った。
冷凍乾燥中の回復は冷凍基準液の％収率で表示されている。
実施例１．アルブミンと非イオン系界面活性剤との比較
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。
その組成物は次の通りであった。
0003905921.tif 000002
この実施例は非イオン系界面活性剤又はアルブミンを使用した場合、VIII：Ｃの回復率には、何ら差が無いことを示す。
実施例２．強度の異なる非イオン系界面活性剤の比較
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため２ｍｌの無菌水で液体に戻した。
その組成物は次の通りであった。
0003905921.tif 000003
非イオン系界面活性剤を使用したとき、第VIII因子に対して驚くほど優れた安定化作用を明確に示している。
実施例３．各種の非イオン系界面活性剤の濃度
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。
0003905921.tif 000004
この実施例の結果は元に戻した後の第VIII因子（VIII：Ｃ）の回復が極めて良好であり、使用した全ての濃度のポリソルベート８０に対して良好であることを示す。
実施例４．各種の塩化ナトリウムの濃度
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
異なる温度で６ヵ月以内、貯蔵した２ｍｌの溶液を凍結乾燥し、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で元に戻した。
0003905921.tif 000005
０．３又は０．６Ｍの塩化ナトリウムは極めて優れた安定性を示した。双方の調合物は、３７℃で６ヵ月間、極めて安定していた。
実施例５．各種のＬ−ヒスチジンの濃度
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
３ヵ月以内異なる温度で貯蔵した２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥し、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で元に戻した。
0003905921.tif 000006
この実験結果はこれらの異なる量のＬ−ヒスチジンが安定性に影響しないことを示す。
実施例６．
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
0003905921.tif 000007
これら溶液は凍結／溶解を１回、５回及び１０回行い、その回復は次の通りであった。
0003905921.tif 000008
これらの研究はVIII：Ｃが凍結溶解を反復した後でも安定しており、又、極低温保護剤として機能すると考えられているＰＥＧ４，０００がこの調合物には不要であることを示した。
実施例７．各種のｐＨ
組み換え第VIII因子は、実験例で説明した方法に従って調製した。
２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。
0003905921.tif 000009
この実験例は６．０乃至約７．５の範囲内では、ｐＨがさほど重要でないことを示す。
実施例８．スクロースの添加
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。
0003905921.tif 000010
凍結乾燥前の最後の精製段階の後に、スクロースを溶液Ｂに添加した。
凍結乾燥後の回復率は、Ａの場合７６％、Ｂの場合８７％であった。室温で元に戻して４時間、貯蔵後の活性は、同一であることが確認された。
この研究はスクロースを添加することが凍結乾燥中のVIII：Ｃの回復に望ましいことを示した。
実施例９．各種のカルシウム塩
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。
0003905921.tif 000011
この実験はＣａＣｌ2に代えて、グルコン酸塩カルシウムを使用することが可能であることを示す。
実施例１０．
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。VIII：Ｃの元に戻した調合剤のバイアル当たりの量は約１，００００ＩＵ
であった。
0003905921.tif 000012
Ｌ−ヒスチジンの一部をスクロースで元に戻したとき、回復率は良好であった。
これらの調合物は、それぞれ２５℃、３０℃で５ヵ月間貯蔵した後、ゲルろ過により検査し、その結果は図１及び図２に示してある。観察された唯一のピークは、第VIII：Ｃ因子を示す４２におけるピーク及びヒスチジンである７０におけるピークである。凝集体は４０よりも前に観察される。図１から１０Ａの場合、２５℃で５ヵ月間の貯蔵の後、何ら検出可能な凝集体は観察されないことが判明した。図２は、１０Ｂの場合、３０℃で５ヵ月後、２％以下の少量の凝集体が生ずることを示す。
実施例１１．
組み換え第VIII因子は、実験例で説明した方法に従って調製した。
２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの無菌水で液体に戻した。VIII：Ｃの元に戻した調合剤のバイアル当たりの量は約５００ＩＵであった。
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双方の調合物共に安定性は良好である。これらの調合物はゲルろ過により測定し、その結果は図１及び図２に示すように同様であった。
これらの調合物をそれぞれ２５℃、３０℃で５ヵ月間、貯蔵したとき、凝集体は、形成されなかった。
実施例１２．
組み換え第VIII因子は実験例で説明した方法に従って調製した。
２ｍｌの溶液を凍結乾燥し、５ヵ月以内、異なる温度で貯蔵し、その後、注射のため４ｍｌの無菌水で元に戻した。元に戻した調合剤のバイアル当たりのVIII：Ｃは約５００ＩＵであった。
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７℃で５ヵ月貯蔵した後、安定性は許容し得るものであった。
【図面の簡単な説明】
図１は２５℃で５ヵ月間貯蔵した実施例１０ＡのＨＰＬＣのゲルろ過のグラフ図である。
図２は３０℃で５ヵ月間貯蔵した実施例１０ＢのＨＰＬＣのゲルろ過のグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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