(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターであって、該ヌクレオチド配列は、
ａ）スプライシングドナーを含むＭＬＶ最小パッケージング配列、
ｂ）ポリプリントラクト、
ｃ）マルチクローニングサイト、および
ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなる異種の非コード配列、
を含み、
該異種の非コード配列は該マルチクローニングサイトの上流に位置し、
該異種の非コード配列はＥＦ１αの非コード配列であり、
該配列番号１の２０５番目および２０６番目のヌクレオチドは、ＣＣ（シトシン−シトシン）に突然変異した配列を含むレトロウイルスベクター。
【請求項２】
ベクターが１またはそれ以上の外来遺伝子を更に含む請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
該外来遺伝子がリポーター遺伝子である請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
該リポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
該外来遺伝子がＩＬ−１ｒａ遺伝子である請求項２に記載のベクター。
【請求項６】
該５’ＬＴＲが異種のプロモーターを含む請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
該異種のプロモーターがＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが該マルチクローニングサイトの下流に第１のヌクレオチド配列を更に含み、該第１のヌクレオチド配列は異種のプロモーターである請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
該異種のプロモーターはＳＶ４０プロモーターまたは内部リボソームエントリー部位である請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
１またはそれ以上の外来遺伝子を更に含む請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含む請求項１に記載のベクター。
【請求項１２】
該選択可能なマーカーがネオマイシン耐性遺伝子または多剤耐性遺伝子である請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１に記載のベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞。
【請求項１４】
該異種の非コード配列が配列番号１に記載の塩基配列である請求項１３に記載の哺乳動物宿主細胞（但し配列番号１の２０５および２０６番目のヌクレオチドはＣＣ（シトシン−シトシン）である）。
【請求項１５】
ベクターがプラスミド中にある請求項１に記載のベクター。
【請求項１６】
該異種の非コード配列が配列番号１に記載の塩基配列である請求項１５に記載のベクター（但し配列番号１の２０５および２０６番目のヌクレオチドはＣＣ（シトシン−シトシン）である）。
【請求項１７】
請求項１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１８】
ベクターがプラスミド中にある請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
細胞が細菌細胞である請求項１７に記載の細胞。
【請求項２０】
細胞がパッケージング細胞系である請求項１７に記載の細胞。
【請求項２１】
感染性のレトロウイルス粒子を製造する方法であって、適当な培地中で請求項２０に記載のパッケージング細胞系を培養し、培地を集め、集めた培地を濾過し、細胞を含まないウイルス上澄を得る方法。
【請求項２２】
ヒトを除く哺乳動物細胞を、請求項２１に記載の方法で得られた、細胞を含まないウイルス上澄と共にインキュベートすることを含む哺乳動物の細胞をトランスデュースする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のベクターおよび適当な担体を含む組成物。
【請求項２４】
該異種の非コード配列が配列番号１に記載の塩基配列である請求項２３に記載の組成物（但し配列番号１の２０５および２０６番目のヌクレオチドはＣＣ（シトシン−シトシン）である）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、変異した異種スプライシングアクセプター(mutated heterologous splicing acceptor)を含み、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)コード配列を欠くＭＬＶに由来する、高効率の安全な遺伝子治療用レトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
発明の背景
マウス白血病ウイルス(murine leukemia virus，MLV)に由来するレトロウイルスベクターは、全世界的に許可を受けて行われる遺伝子治療の臨床試験において５０％以上用いられている(Wiley-The Journal of Gene Medicine Website; http://www.wiley.co.uk/genetherapy)。しかし、このようなレトロウイルスベクターのより広範囲な使用を制限する主な要因の一つは、遺伝子の発現の強度が治療効果が明かである程度まで達していないことである。本発明者は、ウイルス由来のコード配列を含まずに細胞由来または他のウイルス遺伝子由来の異種スプライシングアクセプター配列を含むレトロウイルスベクターを既に製作している(韓国特許公開第２０００−６３３４号公報)。前記ベクターのうち一つは、ヒトＥＦ１α遺伝子に由来するスプライシングアクセプターを含む。このベクターは、このようなスプライシングアクセプター配列を欠いている対照群ベクターに比べて非常に高い遺伝子発現強度を示す。しかし、前記ベクターはウイルスの力価が、用いられるパッケージング菌株(packaging line)によって異なるという問題を有している。たとえば、NIH3T3−由来PG13菌株を使用する場合は、ウイルスの力価が約１０倍程度減少する。HT1080細胞由来FLYA13菌株を使用する場合は、３倍程度減少したウイルス力価を示す。ＲＮＡ分析結果は、このような低いウイルス力価がパッケージングシグナル配列(packaging signal sequence)を含むゲノムサイズの転写体(transcript)が高効率でスプライシングされることに基づくことを示している。
【０００３】
本発明は、このようなレトロウイルスベクターのスプライシングアクセプターの周辺領域に突然変異を導入することにより、さらに改善されたレトロウイルスベクターに関する。このような突然変異の導入はレトロウイルスベクターが対照群ベクターのウイルス力価と同等な水準のウイルス力価を示し、かつ高水準で遺伝子を発現させる。したがって、本発明のレトロウイルスベクターは遺伝子治療に用いられる他のレトロウイルスベクターより遥かに効果的である。
【０００４】
発明の要約
したがって、本発明の目的は、ＰＣＲ生産による危険性がほとんどなく、外来遺伝子を効率的に発現できる高効率で安全な遺伝子治療用レトロウイルスベクターを提供することである。
【０００５】
本発明の一実施態様によって、本発明では、
１)多重クローニング部位(multi-cloning site)の上流に異種遺伝子由来の非翻訳配列として伸長因子ＥＦ１αの非翻訳配列(non-coding sequence)部位；および
２)ＥＦ１αの非翻訳配列内のスプライシングアクセプターの下流に導入された突然変異を含む、
マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)由来のレトロウイルスベクターが提供される。
【０００６】
発明の詳細な記載
本発明は、いずれのウイルス−コード配列も含まないが、スプライシングアクセプターを提供するために多重クローニング部位の上流に伸長因子ＥＦ１αの非翻訳配列の一部を含み、前記ＥＦ１αの非翻訳配列内のスプライシングアクセプター(splicing acceptor)の下流に突然変異が導入されたことを特徴とするＭＬＶ由来のレトロウイルスベクターを提供する。
【０００７】
本発明において、「非翻訳配列(non-coding sequence)」とは、イントロンおよび翻訳されないが転写され得るエクソン部位を含む遺伝子部位をいう。
【０００８】
具体的に、本発明のレトロウイルスベクターにおいてＥＦ１αの非翻訳配列は、ヒト細胞に由来し、イントロンおよびエクソン２の一部塩基配列、好ましくはエクソン２の翻訳開始コドン直前までの塩基配列であり、さらに好ましくはヒトＥＦ１α遺伝子のイントロン３'末端からエクソン２の翻訳開始直前までの塩基配列に相当する配列番号１の塩基配列(ＥＦ１α遺伝子の転写開始地点を＋１としたとき、＋７７３〜＋１００６の配列に相当)であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明のレトロウイルスベクターは、遺伝子発現、スプライシングおよび翻訳効率間の最適の均衡を得るために異種遺伝子由来の非翻訳配列内に突然変異が導入されることを特徴とする。
【００１０】
前記突然変異はスプライシングアクセプターの下流に、特にスプライシングアクセプター直後の配列に導入されることが好ましい。本発明の結果は、スプライシングアクセプター周辺の配列、特にスプライシングアクセプターに隣接したエクソン部位の配列がスプライシングの効率に影響を及ぼすことを示すもので、スプライシングの効率に重要な役割を果たすことを示す。たとえば、前記突然変異は配列番号１の塩基配列において２０５番目と２０６番目(各々＋９７７および＋９７８の位置に相当)のＧＴ(guanine-thymine)塩基対がＣＣ(cytosine-cytosine)塩基対で置換されたものが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明のレトロウイルスベクターは２種以上の外来遺伝子を効率的に発現させるために多重クローニング部位の下流に異種プロモーターまたはＩＲＥＳ(internal ribosomal entry site：内部リボソーム挿入部位)をさらに含み得る。
【００１２】
また、本発明のレトロウイルスベクターのＭＬＶ由来の５’ＬＴＲにおいて、Ｕ３またはその一部は異種プロモーターで置換され得るが、前記異種プロモーターとしてはHCMV IE(human cytomegalovirus immediately-early)プロモーターであることが好ましい。
【００１３】
その他にも、前記レトロウイルスベクターはさらにＮＥＯ(neomycin resistance：ネオマイシン耐性)またはＭＤＲ(multidrug resistance：多剤耐性)遺伝子のような選別標識遺伝子(selectable marker gene)を含み得る。選別標識遺伝子としてヒトＭＤＲ遺伝子を用いる場合、生産細胞株の製造が容易であり、ＣＴＬ(cytotoxic T lymphocytes：細胞毒性Ｔリンパ球)反応のような副作用を防止できるという長所がある。
【００１４】
本発明において「野生型(wile-type)」または「野生型ベクター(wile-type vector)」とは、突然変異が導入された本発明のレトロウイルスベクターと対比される対照群のことである。前記野生型ベクターは、スプライシング能力を提供することにより、遺伝子発現効率を増加させるために多重クローニング部位の上流に変形されていないＥＦ１α非翻訳配列の一部を含む。本発明では、図１に示す配列を有する野生型ＭＴ４を対照群として用いた。
【００１５】
本発明において提供されるレトロウイルスベクターの好ましい例の一つは、
１)ＭＬＶベクター由来の５’ＬＴＲ、gag遺伝子の上流にスプライシング供与体を含む最少パッケージング配列(minimal packaging sequence)、ポリプリントラック(poly-purine track)および３’ＬＴＲをコードする塩基配列；
２)多重クローニング部位；
３)前記最少パッケージング配列と多重クローニング部位の間に位置したＥＦ１αのイントロン３’末端からエクソン２の翻訳開始コドン直前までの塩基配列；および
４)２番目の目的遺伝子発現が要求される場合には、多重クローニング部位の下流にＳＶ４０最少プロモーターまたは内部リボソーム挿入部位(IRES)
を含んで構成されることを特徴とする。
【００１６】
より好ましくは、本発明は、
１)ＭＬＶベクター由来の５’ＬＴＲ、gag遺伝子の上流にスプライシング供与体を含む最少パッケージング配列、ポリプリントラックおよび３’ＬＴＲをコードする塩基配列；
２)多重クローニング部位；
３)前記最少パッケージング配列と多重クローニング部位の間に挿入されたＥＦ１αのイントロン３’末端からエクソン２の翻訳開始コドン直前までの塩基配列の一部分；
４)多重クローニング部位の下流に位置する内部リボソーム挿入部位(IRES)；
および
５)スプライシングアクセプターの下流＋９７７〜＋９７８位置のＧＴ塩基対を置換して存在するＣＣ塩基対
であることを特徴とする、レトロウイルスベクターＭＴ５を提供する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
１.ウイルスコード配列の全てが除去され、ヒトＥＦ１α遺伝子の非翻訳配列を含むＭＬＶ−由来レトロウイルスベクターＭＩＮ−ＥＩの製造
本発明に用いられるgag、polおよびenv遺伝子配列が全て除去されたＭＬＶ−由来のレトロウイルスベクターＭＩＮの製造方法、および前記ＭＩＮベクターの多重クローニング部位の上流にヒトＥＦ１α遺伝子の非翻訳配列を含むＭＩＮ−ＥＩの製造方法は、本発明者らの韓国特許公開第２０００−６３３４号公報に詳細に記載されている。
【００１８】
前記ＭＩＮベクターとＭＩＮ−ＥＩベクターの構造上の特徴は各々次の通りである：
ＭＩＮベクターは、１)ＭＬＶゲノムの５’ＬＴＲとスプライシングアクセプターを含むgagコード領域直前までの非翻訳配列；２)多重クローニング部位；３)ＩＲＥＳ−ｎｅｏカセットおよび４)ＭＬＶゲノムの３’非解読領域；ポリプリントラックおよび３’ＬＴＲをこの順番で含んでいる。
【００１９】
一方、ＭＩＮ−ＥＩベクターは、前記ＭＩＮベクターの多重クローニング部位の上流にヒトＥＦ１α遺伝子のイントロンとエクソン２の翻訳開始コドン直前までの配列に相当する配列番号１の塩基配列を含んでいる。
【００２０】
２.種々のパッケージング細胞におけるＥＦ１α遺伝子の非翻訳配列を有するレトロウイルスベクターの効率
最適のレトロウイルスベクターを製造するためには、目的とする細胞内で治療遺伝子の効率的な発現のための外来遺伝子の転写とスプライシング間の適切な均衡が要求される。Phoenix、293T、FlyA13、およびPG13のようなパッケージング細胞株におけるレトロウイルスベクターＭＩＮ−ＥＩ遺伝子の発現強度(level of gene expression)はＭＩＮベクター(韓国特許公開公報第２０００−６３６４号)の発現強度より３〜５倍高い。しかし、ＭＩＮ−ＥＩベクターはFlyA13またはPG13細胞株において低いウイルス力価を示すが、これはスプライシング効率は高く保持されるが、FlyA13またはPG13細胞株の全般的な転写活性が低下するためであると判断される。したがって、高い遺伝子発現強度と向上したウイルス力価を示すレトロウイルスベクターの開発が望まれていた。
【００２１】
３.変異したＥＦ１α遺伝子の非翻訳配列を含むレトロウイルスベクターの構築
前記の要求を満たすために、本発明者らはＭＩＮ−ＥＩのＥＦ１α遺伝子のイントロンおよびスプライシングアクセプターの周辺に突然変異を導入することにより、変異レトロウイルスベクターを構築した。
【００２２】
本発明で構築された５つの突然変異体ベクターは
スプライシングアクセプターに突然変異が導入されず、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ１；
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入され、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ２；
スプライシングアクセプターの上流に突然変異が導入され、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ３；
スプライシングアクセプターに突然変異のない野生型のＭＴ４；および
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入されたＭＴ５である。
【００２３】
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子を使用する場合、変異ベクターＭＴ１、２および３は野生型ＭＴ４ベクターに比べて低いウイルス力価を示すが、一方、ＭＴ５ベクターは野生型ＭＴ４ベクターより２〜３倍高いウイルス力価を示す。ベクターＭＴ５のスプライシング効率は野生型ＭＴ４ベクターよりやや、約７０〜８０％程度低いが、向上したウイルス力価のため発現された遺伝子の総量は増加した。総形質導入効率におけるこのような増加はレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子の代りにヒトインターロイキン−１受容体拮抗剤(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1ra)を含むベクターＭＴ５からも観察された。
【００２４】
したがって、本発明のベクターＭＴ５は高いウイルス力価だけでなく、高い水準の遺伝子発現を提供する、新規で安全なベクターであることが判明した。前記ベクターＭＴ５で形質転換された大腸菌菌株JM109を、ＭＴ５(ＪＭ)と命名し、韓国微生物培養センター(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)に２００２年７月２８日付で寄託した(寄託番号：KCCM-10205)。
【００２５】
４.変異したＥＦ１α非翻訳配列とＭＤＲ選別標識遺伝子を含むベクターMTM５の構築
選別標識遺伝子としてヒトＭＤＲ遺伝子を含むベクターを構築し、これをベクターMTM５と命名した。前記ベクターMTM５は向上したウイルス力価のため優れた形質導入効率を示す。
【００２６】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明はこれに限定されない。
【００２７】
実施例１：種々のパッケージング細胞株におけるベクターMIN-EIの効率
種々のパッケージング細胞株においてＥＦ１α遺伝子のイントロンと非翻訳塩基配列を含むMIN-EIベクターの効率を調査するために、遺伝子発現強度とウイルス力価を通常用いられているパッケージング細胞株であるPhoenix (ATCC SD3443, MD, USA)、FlyA13 (Cosset et al., J. Virol. 69: 7430-7436, 1995)、およびPG13 (ATCC CRL10686, MD, USA)細胞株を用いて調査した。
【００２８】
MIN-CATとMFG-CAT (Byun et al., Gene Ther. 3: 780-788, 1996)を対照群として用いた。MIN-EI-CATとMIN-CATベクターはCAT (chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子を含むプラスミドpCRII-CAT (韓国特許出願第１９９８−２４４７８号)のBamHI切片を前記MIN-EIおよびMINベクターのBamHI部位に挿入して構築した。MFG-CATベクターはpCRII-CATのNcoI-BamHI切片をＭＦＧベクター(Byun et al., Gene Ther. 3: 780-788, 1996)のNcoI-BamHI部位に挿入して構築した。
【００２９】
Phoenix細胞とFlyA13細胞にベクターMIN-EI-CAT、MIN-CATまたはMFG-CATを各々形質移入(transfection)させ、４８時間培養した後、細胞から抽出したタンパク質を回収して遺伝子発現強度の測定に用いた。無細胞ウイルス(cell-free virus)は細胞培養上澄液を０.４５μｍの濾紙で濾過して製造した。２セットのNIH3T3細胞を前記無細胞ウイルス上澄液で形質導入(transduction)し、４８時間培養した後、１セットのNIH3T3細胞をＣＡＴ活性の測定に用いた。残りの１セットのNIH3T3細胞はG418耐性コロニーの数を数えることにより、ウイルス力価と形質導入効率を決定するのに用いた(表１および２参照)。
【００３０】
ＰＧ１３細胞の場合、一時的形質移入方法を用いて高いウイルス力価を有するウイルスを製造することが不可能なため、生産細胞株を製造した。すなわち、Phoenix細胞を用いて得られた無細胞ウイルス約０.１m.o.iをPG13細胞に感染させ、G418で２週間処理してG418耐性細胞株を選別した。これから製造された無細胞ウイルス上澄液で２セットのHT1080細胞を形質導入し、４８時間培養した後、各々の細胞をＣＡＴ活性とウイルス力価の測定に用いた(表３参照)。
【００３１】
ＣＡＴ活性は次のような方法で測定した：まず、形質導入細胞を回収してＰＢＳ(phosphate-buffered saline)１ｍｌで１回洗浄した後、０.２５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝溶液(ｐＨ７.５)に懸濁させた。前記懸濁液をドライアイスで冷凍、３７℃水浴で解凍の手順を３回繰り返して細胞を破壊した。次いで、細胞抽出物を６０℃で７分間熱処理して脱アセチル酵素(deacetylase)を不活性化した後、12,000rpmで１０分間遠心分離して上澄液のみを取った。抽出した溶液はブラッドフォード(Bradford)らの方法を用いてタンパク質濃度を定量した。以後、実験群別に同量のタンパク質を１μｌの１４Ｃで標識されたクロラムフェニコール(14C-chloroamphenicol；60 mCi/mmol, 0.1 mCi/ml)、２μｌのアセチル・コエンザイムＡ(acetyl-coenzyme A，40 mM)、および適量の０.２５M  Tris緩衝溶液(ｐH７.５)と混合した後、３７℃でインキュベートした。反応後酢酸エチルでクロラムフェニコールを抽出した後、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル１５μｌに懸濁させた後、薄膜クロマトグラフィー(ＴＬＣ)板にかけ、ＴＬＣ展開溶媒(９５％クロロホルム、５％メタノール)で展開した。展開後ＴＬＣ板を乾燥した後Ｘ線フィルムにさらすか、ホスホイメージ分析器(phosphoimage analyzer)にかけ、クロラムフェニコールのアセチル化度を測定した。ＣＡＴ活性を全クロラムフェニコールに対するアセチル化されたクロラムフェニコールの放射活性を算出することにより測定した。
【００３２】
【表１】
Phoenix細胞におけるレトロウイルスベクターの効率比較
0003921445.tif 000002
*: MINベクターのCAT活性度(アセチル化クロラムフェニコールの放射活性／クロラムフェニコールの放射活性)を基準とする。
【００３３】
前記表１から分かるように、Phoenix細胞をパッケージング細胞株として用いた場合には、MIN-EIのＣＡＴ活性がＭＩＮまたはＭＦＧに比べて３〜４倍高かった。このような結果は、ＭＩＮ−ＥＩの遺伝子発現効率が他のベクターより優れていることを示す。ウイルス力価はこれらのベクターのいずれにおいても大きな変化はなく、したがって、形質導入されたNIH3T3細胞から測定されたＣＡＴ活性は遺伝子発現効率をそのまま反映するとみられる。
【００３４】
【表２】
FlyA13細胞におけるレトロウイルスベクターの効率比較
0003921445.tif 000003
【００３５】
【表３】
PG13細胞におけるレトロウイルスベクターの効率比較
0003921445.tif 000004
【００３６】
しかし、FlyA13(表２)またはPG13(表３)細胞をパッケージング細胞株として用いた場合は、MIN-EIのウイルス力価が非常に低く、ＭＩＮまたはＭＦＧの１／３〜１／１０程度に大きく低下したことを観察した。
【００３７】
実施例２：MIN-EIのウイルス生産性
パッケージング細胞株によってウイルス力価が多様に変化する理由を検討するためにノーザンブロット分析を行った。まず、ＭＦＧとMIN-EIで形質移入されたPhoenix細胞とＭＦＧおよびMIN-EIを各々生産するPG13細胞株から下記のようなグアニジンチオシアネート−セシウム(Guanidine thiocyanate-cesium)方法を用いて細胞質ＲＮＡを抽出した：１００ｍｍ皿で培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、グアニジン緩衝液３ｍｌを添加した。添加した溶液が透明になってから混合液を注射器を用いて均質化し、均質化した溶液を５.７Ｍ  ＣｓＣｌ２溶液２ｍｌを含むポリアロマチューブ(polyaloma tube，Beckman)に入れた後、２０℃で29,000rpmで１６時間超遠心分離してＲＮＡペレットを得た。前記ＲＮＡペレットをＤＥＰＣを含む蒸留水１５０μｌに溶解し、エタノール沈殿によってＲＮＡ溶液５０μｌを得た。
【００３８】
前記方法で得られたＲＮＡ２０μｇにホルムアミド２０μｌ、３７％ホルムアルデヒド１０μｌおよび１０ｘＭＯＰＳ  １０μｌを添加した。この混合溶液を７０℃で１０分間加熱し、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で５０ｍＡの条件で電気泳動した。次いで、ゲルを５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に１０分間、次いで２０倍のＳＳＣ溶液(3M NaCl, 0.3 M sodium citrate)に４５分間浸漬した。このように処理したＲＮＡを分離し、ニトロセルロース膜に毛細管作用を用いて移動させた後、８０℃で１時間固定した。前記のニトロセルロース膜をハイブリダイゼーション溶液(ExpressHyb hybridization solution, Clontech, USA)と６５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションさせた後、同位元素で標識されたＣＡＴ  ＤＡＮ切片を用いてハイブリダイゼーション反応を行った。その後、ニトロセルロース膜を緩衝溶液で２回洗浄した後、Ｘ線フィルムにさらしてＲＮＡサイズの差によってゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡが区分されて現れたバンドをホスホイメージ分析器を用いて定量化した。
【００３９】
【表４】
パッケージング細胞株によるＲＮＡ組成比較
0003921445.tif 000005
*： ( )中は全ＲＮＡ量に対して各々のゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡが占める比率を示す。
【００４０】
前記表４から分かるように、MIN-EIのスプライシング効率は細胞株によって大差がない。Phoenix細胞株の場合、MIN-EIはＭＦＧに比べて相当多量のサブゲノムＲＮＡを合成し、一般的に高い転写強度を示した。このような結果は、MIN-EIが高い遺伝子発現強度を示す理由を説明してくれる。しかし、PG13細胞の場合には、MIN-EIの転写活性がかなり減少したが、一方、スプライシング効率はPhoenix細胞とほとんど同程度であった。したがって、ゲノムＲＮＡの絶対量の減少がウイルス力価の減少をもたらしたことが分かる。
【００４１】
すなわち、Phoenix細胞株の場合、ＥＦ１α遺伝子のイントロンと非翻訳塩基配列の作用によって効率的なスプライシングが起こり、ゲノムＲＮＡよりサブゲノムＲＮＡが多く合成されて遺伝子発現強度が増加する。さらに、高い転写活性によってゲノムＲＮＡの合成が容易になるので、ウイルス力価もまた高く維持される。しかし、FlyA13およびPG13細胞株の場合には、スプライシングが効率的に進行し、相対的に多量のサブゲノムＲＮＡを生産するが、ゲノムＲＮＡの総量は著しく減少し、その結果低いウイルス力価を示す。
【００４２】
実施例３：ＥＦ1α遺伝子のイントロンと非翻訳塩基配列の両方に突然変異が導入されたレトロウイルスベクターの構築
ウイルス力価が減少することなく高い水準の遺伝子発現を示す、改良されたレトロウイルスベクターを開発するために、突然変異を導入してスプライシング効率とウイルス力価の間に微妙な均衡を保持したレトロウイルスベクターを製造した。MIN-EIのＥＦ１α遺伝子のイントロンとスプライシングアクセプターの周辺に突然変異を導入することにより次の５つの突然変異体を構築した(図１)。
【００４３】
スプライシングアクセプターに突然変異が導入されず、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ１；
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入され、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ２；
スプライシングアクセプターの上流に突然変異が導入され、ＥＦ１αのエクソン２に相当する部位が除去されたＭＴ３；
スプライシングアクセプターに突然変異のない野生型のＭＴ４；および
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入されたＭＴ５。
【００４４】
(３−１)ＭＴ１の構築
ＭＴ１を製造するために、pMIN-EI (韓国特許出願第１９９９−２３３９８号)をＰＣＲの鋳型として用い、配列番号２(EI5')と配列番号３(EI3'-1s)の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
【００４５】
前記ＰＣＲは２００ｎｇの鋳型プラスミドＤＮＡと１μｌずつのプライマー(10 pmol／μl)のＰＣＲ溶液１００μｌで、９４℃で１分(変性)、５０℃で１分(アニーリング)、７２℃で１分３０秒間(重合)反応させるＰＣＲ増幅反応サイクルを３０回繰り返した。
【００４６】
ＥＦ１αイントロンの増幅された切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターにクローニングした後、MluI-BamHI切片を切断し、pMINのMluI-BamHI部位に挿入してMT1ベクターを製造した(図２)。
【００４７】
(３−２)ＭＴ２の構築
ＭＴ２は、pMIN-EIプラスミドをＰＣＲ鋳型として用い、配列番号２(EI5')と配列番号４(EI3'-2s)の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて前記実施例(３−１)と同様な方法でＰＣＲを行って構築した。
【００４８】
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入されたＥＦ１αイントロンのＰＣＲ増幅された切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターにクローニングした後、MluI-BamHI切片を切断し、これをpMINのMluI-BamHI部位に挿入してMT2ベクターを製造した(図３)。
【００４９】
(３−３)ＭＴ３の構築
ＭＴ３は、pMIN-EIプラスミドをＰＣＲ鋳型として用い、、配列番号５(EI5'm)と配列番号３(EI3'-1s)の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて前記実施例(３−１)と同様な方法でＰＣＲを行って構築した。
【００５０】
スプライシングアクセプターの下流に突然変異が導入されたＥＦ１αイントロンのＰＣＲ増幅された切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターにクローニングした後、MluI-BamHI切片を切断し、これをpMINのMluI-BamHI部位に挿入してMT3ベクターを製造した(図４)。
【００５１】
(３−４)ＭＴ４の製造
野生型ベクターＭＴ４は、pMIN-EIプラスミドをＰＣＲ鋳型として用い、配列番号２(EI5')と配列番号６(EI3'-11)の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて前記実施例(３−１)と同様な方法でＰＣＲを行って構築した。
【００５２】
ＥＦ１αイントロンのＰＣＲ増幅切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターにクローニングした後、MluI-HincII切片を切断し、これをpMIN-EIのMluI-PmeI部位に挿入してMT4ベクターを製造した(図５)。
【００５３】
(３−５)ＭＴ５の製造
ＭＴ５は、pMIN-EIプラスミドをＰＣＲ鋳型として用い、配列番号２(EI5')と配列番号７(EI3'-21)の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて前記実施例(３−１)と同様な方法でＰＣＲを行って構築した。
【００５４】
ＥＦ１αイントロンのＰＣＲ増幅切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターにクローニングした後、MluI-SacII切片を切断し、これをpMIN-EIのMluI-PmeI部位に挿入してMT5ベクターを製造した(図６)。
【００５５】
実施例４：ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターの効率
(４−１)ルシフェラーゼ(Luc)遺伝子のクローニング
Luc遺伝子は、pGL2 controlベクター(Promega, WI, USA)を鋳型として用い、配列番号８(Luc 5')と配列番号９(Luc 3')の二つの合成ヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって増幅した。前記増幅された切片をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターに挿入してpGEM T easy-Lucベクターを製造した(図７)。pGEM T easyベクターをBamHI/BglIIで処理して得られたルシフェラーゼ遺伝子を含む切片を各々実施例３で製造されたベクターのBamHI部位に挿入して図７に示すルシフェラーゼ発現ベクターを製造した。
【００５６】
(４−２)ルシフェラーゼの活性測定
ルシフェラーゼ遺伝子を含むＭＴ１、２、３、４および５ベクターを各々パッケージング細胞株であるPhoenixに形質移入させ、４８時間培養した。前記細胞培養液から得られた無細胞ウイルス上澄液をNIH3T3細胞の形質導入に用いた。形質移入された細胞と形質導入された細胞の各々のルシフェラーゼ活性を測定した。また、G418耐性を有する安定な細胞株のルシフェラーゼ活性とウイルス力価を測定した(表５)。表５に示すように、各レトロウイルスベクターのルシフェラーゼ活性は野生型ベクターであるＭＴ４ベクターの活性に基づいて相対的な数値として示した。
【００５７】
ルシフェラーゼ活性は次のような方法で測定した：収穫した細胞をＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した。ＰＢＳを完全に除去した後、細胞を適量の１ｘレポーター加水分解緩衝液(reporter lysis buffer；Promega, WL, USA)に懸濁させた後、室温で５分間反応させた。反応混合物を12,000rpmで１分間遠心分離し、上澄液のみを分離した。抽出物中のタンパク質濃度はブラッドフォード(Bradford)の方法を用いて定量した。その後、実験群別に同量のタンパク質をルシフェラーゼ分析試薬(Promega, WI, USA)１００μｌとよく混合した後、反応溶液を９６ウェルプレートに入れ、照度計(luminometer)を用いてLuc活性を測定した(表５)。
【００５８】
【表５】
突然変異ベクターの効率比較
0003921445.tif 000006
【００５９】
前記表５から分かるように、ＭＴ１、２および３の遺伝子発現強度とウイルス力価はすべて野生型のＥＦ1αイントロンとスプライシングアクセプター塩基配列を含む対照群ＭＴ４より低かった。Phoenix細胞株においてＭＴ５の遺伝子発現強度はＭＴ４の５０〜７０％水準であったが、ウイルス力価は約２倍増加し、形質導入されたNIH3T3細胞におけるルシフェラーゼ活性も増加した。すなわち、ＭＴ５のスプライシング効率がＭＴ４の場合よりやや減少するにつれてサブゲノムＲＮＡの量が減少した。したがって、ＭＴ５の遺伝子発現はやや低くなるが、相対的にウイルス力価はかえって高くなり、その全体的な形質導入効率は増加する。このような結果はスプライシングアクセプターの下流に導入された突然変異がスプライシング効率と遺伝子発現強度間の均衡を最適化する役割を果たすことを示す。
【００６０】
実施例５：IL-1ra遺伝子を含むベクターの効率およびＲＮＡ組成分析
(５−１)IL-1ra遺伝子を用いたベクターの効率比較
前記実施例４で観察したＭＴ５ベクターの改善された活性が他の外来遺伝子にも適用できる一般的な現象であるかを調査するために、Luc遺伝子の代りにヒトIL-1ra遺伝子を用いて実施例４と同様の実験を行った(表６)。
【００６１】
IL-1ra遺伝子は正常人の末梢血液リンパ球からクローニングした。まず、正常人の血液からFicoll-hypaqueを用いて末梢血液リンパ球を得た後、ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲによってｃＤＮＡを得た。前記ｃＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１０(IRAP 5')と配列番号１１(IRAP 3')と記載される二つの合成ヌクレオチドをプライマーとして用いてIL-1ra遺伝子を含む切片をＰＣＲで増幅した。増幅したＰＣＲ産物をpGEM T easy(Promega, WI, USA)ベクターに挿入してpGEM T easy-IL-1raベクターを製造した。BamHI/BglIIで処理して得られたIL-1ra遺伝子を含む切片を各々実施例３で製造されたＭＴ４とＭＴ５ベクターのBamHI位置に挿入してIL-1ra発現ベクターを製造した。前記IL-1ra発現ベクターをMFG-IL-1raベクター(Yu et al., Gene Ther. 7:797-804, 2000)と比べた。
【００６２】
前記IL-1ra遺伝子を含むＭＴ４、ＭＴ５およびＭＦＧベクターを各々パッケージング細胞株であるPhoenix細胞に形質移入させ、４８時間培養した。前記細胞培養液から得られた無細胞ウイルス上澄液をNIH3T3細胞に形質導入した。形質移入された細胞と形質導入された細胞各々の培養上澄液中に分泌されたIL-1raの量をヒトIL-1ra  ＥＬＩＳＡキット(R&D system, USA)を用いて測定し、ウイルス力価はＧ４１８耐性細胞の数を数えて決定した(表６)。
【００６３】
【表６】
IL-1ra遺伝子を用いたベクターの効率比較
0003921445.tif 000007
【００６４】
表６の結果は、ＭＴ５ベクターの形質導入効率とウイルス生産性もまたIL-1ra遺伝子をレポーター遺伝子として用いた場合にも増加することを証明している。
【００６５】
(５−２)細胞質ＲＮＡ
前記実施例(５−１)で得られた結果がスプライシング効率の変化によるものであるか否かを調査するために、ノーザンブロット分析で細胞質ＲＮＡを分析した。すなわち、形質移入されたPhoenix細胞から細胞質ＲＮＡを抽出した後、ゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡの量を分析するためにIL-1ra遺伝子をプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーションしたＲＮＡバンドの強さをホスホイメージ分析器を用いて定量した(表７)。
【００６６】
【表７】
Phoenix細胞におけるＲＮＡ組成比較
0003921445.tif 000008
【００６７】
その結果、ＭＴ４のサブゲノムＲＮＡは全ＲＮＡの９５％を占め、ＭＴ５サブゲノムＲＮＡの相対的な比率はＭＴ４に比べて約９４％程度であった。一方、ＭＴ５から観察されたゲノムＲＮＡの量はサブゲノムＲＮＡの量より遥かに小さいが、ＭＴ４から観察されたゲノムＲＮＡの量より２倍程度高かった。このような結果はＭＴ５がＭＴ４に比べて高いウイルス力価を示す理由を説明してくれる。
【００６８】
(５−３)PG13細胞株におけるベクターの効率
実際の臨床実験に用いられる生産細胞株であるPG13細胞株において本発明のレトロウイルス効率を測定した。ＭＦＧ(対照群)ウイルスだけでなく、Phoenix細胞から得られた無細胞ウイルス培養液を各々PG13細胞に形質移入した後G418で２週間選別して各々のウイルスを生産する生産細胞株を得た。このPG13生産細胞株から得られたウイルス上澄液をHT1080細胞に形質導入し、形質導入された細胞のIL-1ra活性とウイルス力価を測定した(表８)。
【００６９】
【表８】
PG13細胞におけるベクターの効率比較
0003921445.tif 000009
【００７０】
前記表８から分かるように、PG13細胞株を用いる場合ＭＴ５のウイルス力価がＭＴ４に比べて３〜４倍程高かった。
【００７１】
実施例６：ＭＤＲを含むベクターの構築
ＭＴ５ベクターと同じく変異したＥＦ１αイントロンと非翻訳塩基配列構造を有するが、選別マーカーとしてヒトＭＤＲ遺伝子を有するベクターを構築し、これをMTM５ベクターと命名した。
【００７２】
(６−１)ＩＲＥＳ遺伝子のクローニング
ＩＲＥＳ(internal ribosomal entry site)の遺伝子切片を製造するために、鋳型としてＩＲＥＳを含むプラスミドpCBIN(韓国特許出願第１９９７−４８０９５号)を用い、５'プライマーとしてBamHI、NotIの制限酵素認識配列を有する配列番号１２のオリゴヌクレオチドを、３'プライマーとしてStuI、ClaI、BglIIの制限酵素認識配列を有する配列番号１３のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。
【００７３】
前記で得られたＰＣＲ産物をpCRIIベクター(Invitrogen, CA, USA)にクローニングした後、BamHI/BglII切片を製造し、これをＭＳＮ(韓国特許出願第１９９９−２３３９８号)のBamHI位置に挿入してMSN-IRESプラスミドを製造した(図８)。
【００７４】
(６−２)ＭＤＲ遺伝子のクローニングとＭＴＭプラスミドの製造
ＭＤＲの遺伝子断片を製造するために、鋳型としてスギモト博士(Cancer Chemotherapy center, Japanese Foundation for Cancer Research, Tokyo 170, Japan)から分譲されたＭＤＲを含むプラスミドを用い、５'プライマーとしてBamHI、ClaIの制限酵素認識配列を有する配列番号１４のオリゴヌクレオチドを、３'プライマーとしてSalIおよびBamHIの制限酵素認識配列を有する配列番号１５のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。
【００７５】
前記ＰＣＲ産物をpCRII(Invitrogen, CA, USA)にクローニングしてpCR-MDRを製造し、塩基配列分析を通じてＭＤＲ遺伝子が適切に挿入されたことを確認した。pCR-MDRベクターからBamHI/BgIII切片を切断し、MSN-IRESプラスミドからClaI/XhoI切片を除去した後MSN-IRESプラスミドに挿入してＭＴＭプラスミドを製造した(図９)。
【００７６】
(６−３)MTM4およびMTM５ベクターの構築
ＭＴ４およびＭＴ５ベクターから変異非翻訳配列を含むMluI/BamHI  ＤＮＡ切片を得、各々ＭＴＭベクターのMluI/BamHI部位に挿入してMTM4およびMTM５プラスミドを製造した(図１０)。したがって、MTM4およびMTM５ベクターからＭＤＲ遺伝子の発現はスプライシングされたｍＲＮＡから誘導される。
【００７７】
実施例７：ＭＴＭベクターの効率
前記実施例６で製作されたＭＴＭ、MTM4およびMTM５ベクターの効率を検査するために、これらのベクターのBamHI位置にIL-1ra遺伝子を各々挿入してMTM-IL-1ra、MTM-IL-1ra、およびMTM-IL-1raベクターを各々製造した。これらのベクターを各々２９３Ｔ細胞にgag/pol、env発現ベクターとともに形質移入させた後４８時間培養した。前記細胞培養液から得られた無細胞ウイルス上澄液をNIH3T3細胞に形質導入させ、４８時間培養した。その後、形質移入された細胞培養液と形質導入された細胞培養液におけるIL-1ra活性を測定し、ビンクリスチン(vincristine)に対して抵抗性を示す細胞の数を数えてウイルス力価を測定した。
【００７８】
【表９】
0003921445.tif 000010
【００７９】
その結果、前記表９から分かるように、MTM５の遺伝子発現強度は野生型であるMTM4の３０％程度であったが、ＭＴＭの場合よりは３倍程度高かった。また、MTM５のウイルス力価はＭＴＭのウイルス力価より非常に高いので、MTM4、MTM５は全体的な形質導入効率において最も優れている。
【００８０】
さらに、PG13細胞におけるレトロウイルスベクターの性能を比較するために、前記293Tから得られた無細胞ウイルス培養液を各々PG13細胞に形質導入した後２５ｎｇ/ｍｌのビンクリスチンで２週間選別して各々のウイルスを生産する生産細胞株を得た。このPG13生産細胞株から得られたウイルス上澄液をHT1080細胞に形質導入し、IL-1ra活性とウイルス力価を測定した。
【００８１】
【表１０】
0003921445.tif 000011
【００８２】
前記表１０の結果から分かるように、MTM５のウイルス力価はＭＴＭおよびMTM4のウイルス力価に比べて大きく増加し、これによりMTM５の全体的な形質導入効率も優れていることが確認できた。
【００８３】
産業上利用可能性
以上、述べたように、本発明は、遺伝子治療に有用である高効率で安全なレトロウイルスベクターを提供する。本発明のレトロウイルスベクターは次のような特徴を有する：
【００８４】
１．すべてのレトロウイルス由来のコード配列(ＭＬＶのgag、polおよびenv遺伝子)が完全に除去され、相同組換えによって自立複製可能なレトロウイルス(replication-competent retrovirus：RCR)の産生可能性が非常に低い。
【００８５】
２．異種イントロンを挿入して多重クローニング部位の上流に挿入されたスプライシングアクセプターおよび／または非翻訳配列の存在により、レトロウイルスベクター中の外来遺伝子が高効率で発現される。
【００８６】
３．異種スプライシングアクセプターの周辺に適当な突然変異を導入することによりスプライシング効率およびウイルス力価の間の適切な均衡が保持できる。
【００８７】
４．５'ＬＴＲのＵ３部位が特にヒト細胞において強力な転写活性を誘導する異種プロモーターで置換されたので、本発明のレトロウイルスベクターで形質移入されたヒト細胞由来のパッケージング細胞株は著しく増大したウイルス力価を示す。
【００８８】
ＩＲＥＳまたは異種プロモーターが二つ以上の外来遺伝子を高効率で発現させるために本発明のレトロウイルスベクターに導入され得る。このような場合、最少プロモーターが異種内部プロモーターによる干渉を最小化し、より大きなサイズの外来遺伝子をクローニングするために挿入され得る。
【００８９】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
下記国際寄託機関で定めた規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証
受領人：キム  ソンヨン
140-724大韓民国ソウル龍山区二村洞ハンガンAtp.18-302
0003921445.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】  pMIN-EIベクターに挿入されたヒトＥＦ1α遺伝子のイントロンとエクソン２の一部配列を含む非翻訳配列内に突然変異が導入されたＭＴ１、２、３、４および５ベクターの相当部位塩基配列である。
【図２】  ＭＴ１を製造する過程を示す模式図である。
【図３】  ＭＴ２を製造する過程を示す模式図である。
【図４】  ＭＴ３を製造する過程を示す模式図である。
【図５】  野生型ＭＴ４を製造する過程を示す模式図である。
【図６】  ＭＴ５を製造する過程を示す模式図である。
【図７】  ルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を含むベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図８】  ＩＲＥＳ遺伝子をクローニングする過程を示す模式図である。
【図９】  選別標識遺伝子としてＭＤＲ遺伝子を有するＭＴＭベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図１０】  選別標識遺伝子としてＭＤＲ遺伝子を有し、変異ＥＦ１α非翻訳配列を有するＭＴＭ４およびMTM５ベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図１】
0003921445.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0003921445.tif 000018
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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