(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッド形成された核酸分子を変性させる方法であって、前記核酸分子を含有する液体を、電極の間に印加された電圧へと、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン  スルフォン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳ）、およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳＯ）からなる群から選ばれてなる緩衝剤の存在下に、前記分子の少なくとも一部を完全にあるいは部分的に変性させるような条件下に、供することを特徴とする方法。
【請求項２】
５ｍＭから１０ｍＭの前記緩衝剤濃度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電極が互いに０．５ｍｍ以内にまで接近している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
０．５〜３ボルトの電圧を前記電極の間に印加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１．５〜２．５ボルトの電圧を前記電極間に印加する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記分子の反復解離方法であって、前記分子を請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって解離させ、ここで前記電圧を最長２分間の持続時間を有する反復パルスとして印刷する方法。
【請求項７】
前記電圧を、最長１分間の持続時間を有する反復パルスとして印加する、請求項６に記載の反復解離方法。
【請求項８】
前記パルスの間に、前記電圧を印加していた時間に等しい時間の間、前記電圧を解除および／または反転させる、請求項６または７記載の反復解離方法。
【請求項９】
前記電圧を０．０１〜１０Ｈｚの周波数でパルスとして印加する、請求項８記載の反復解離方法。
【請求項１０】
第一の極性における電圧の印加期間、第一の極性に対して反対の極性の電圧の印加期間、および印加電圧を十分に減少させる期間が、あらゆる順番で設けられるように、電圧を印加する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サイクルの長さが１秒から５分である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記電圧を第一の極性で印加する前記期間と、前記電圧を第二の極性で印加する前記期間とが、それぞれ独立に、０．５秒から１分間である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記電圧を十分に減少させる前記期間が、それぞれ独立して０．５秒から３分間である、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
核酸の標的配列を増幅させる方法であって、核酸のハイブリッド形成、伸長および変性を含んでおり、前記核酸を、電極間に印加される電圧へと、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン  スルフォン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳ）、およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳＯ）からなる群から選ばれてなる緩衝剤の存在下に供することによって、前記変性を実施する方法。
【請求項１５】
前記変性を、請求項１から請求項１３までのいずれかに記載の脱ハイブリッド化方法によって実施する、請求項１４に記載された核酸の標的配列の増幅方法。
【請求項１６】
ＰＣＲ増幅法またはＬＣＲ増幅法である、請求項１４または１５記載の標的配列の増幅方法。
【請求項１７】
電極を有するセル、対抗電極、および必要に応じて参照電極を有し、さらに、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン  スルフォン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳ）、およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパン  スルフォン酸（ＣＡＰＳＯ）からなる群から選ばれてなる緩衝剤を有するものである、ハイブリッド形成された核酸分子を変性させる方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、相互作用する分子を処理して、これらの完全なまたは部分的な解離を実施する方法に関するものである。
良く知られた二重螺旋配置の二本鎖ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＤＮＡ／ＲＮＡ（リボ核酸）およびＲＮＡ／ＲＮＡ複合体は、一本鎖分子の安定な相互作用によって生成する。こうした複合体は、インビトロでは、その核酸の相補鎖を分離するのには攻撃的な条件を必要とする。鎖を分離するのに通常使用されている既知の方法には、少なくとも６０℃、しばしば１００℃の高温を使用するか、あるいはｐＨ１１以上のアルカリ性、もしくは低いｐＨを使用することが必要である。他の方法としては、未知の方法でＤＮＡの巻き戻しを触媒できる大腸菌のＲｅｐタンパク質のようなヘリカーゼ酵素を使用すること、あるいはＤＮＡの一本鎖形を安定化するように作用する大腸菌ファージＴ４の３２タンパク質のような結合タンパク質を使用することが挙げられる。既知の熱処理あるいはアルカリ処理法によって生成した変性一本鎖ＤＮＡは、通常、ハイブリッド形成研究に使用されているか、あるいは増幅サイクルに供されている。
こうした分離は、インビトロでの核酸の操作を含む多数のプロトコルの前提条件であり、この一例は、ＤＮＡの標的配列の複製を多数生成させ、熱安定性のポリメラーゼ酵素を採用した反応である（米国特許第４，６８３，２０２号、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ他）。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）として知られているこの開発は、商業的に極めて重要であり、鎖の分離は試料を約９５℃で加熱することによって通常実施している。試料を加熱する必要性を取り除くことによって、多数の利益が得られるであろう。例えば、これによって小型で容易に調整可能な機器を設計でき、一層適合度が高い中温菌酵素を利用できる。
ＷＯ９２／０４４７０号で開示する方法では、核酸の鎖に電場を印加することによって分離する。こうした電気的方法の利点が、ＰＣＲやリガーゼ連鎖反応のような増幅反応におけるその方法の適用と共に、一層詳細に議論されている。この反応を実施するための電気化学セルの形態が記載されており、また変性の効率を向上させる「プロモーター」化合物の使用も記載されている。
ＷＯ９２／０４４７０号に先立って、多数の他の研究者が、電気化学セルにおけるＤＮＡの変性について記述してきた。しかしながら、これらのケースのいずれにおいても、一本鎖産物は溶液中に有用な量で遊離して残っていなかった。むしろ、ＤＮＡは電極の表面へと不可逆的に結合し始めたようであり、この条件下ではＤＮＡはＰＣＲのようなプロセスにさらに加わることはできなかった。ＷＯ９２／０４４７０号に記載された電気的変性法においては、一本鎖が溶液中に蓄積し、それらの有用性と完全性とは、引き続いてＰＣＲを行うことによって確認されている。
ＷＯ９２／０４４７０号においては、ＤＮＡの電気的変性を行うのに使用する電極は、グラッシーカーボン製の中央ロッドからなり、ロッドはその末端を除いてテフロン製スリーブ内に収容されている。作用極は、テフロン製スリーブに対向して設置された白金製のメッシュであった。カロメル参照極が使用されており、主要セルに対して毛細管によって結合された側面チャンバー内に配置されている（Stanley C．J．他「J．Immunol．Meth．1988年112、153〜161頁参照）。この機器を使用すると、参照極に対して−１Ｖの電位差の作用極を用いて、最速で１５分間以内に変性が達成される。反応内にＮａＣｌが存在していると、変性が遅れる。
ＷＯ９２／０４４７０号では、ＰＣＲ反応は増幅工程を介在させると共に、上記電気化学セルを使用して行われる変性操作が繰り返されることで実施される。複数の変性工程が、それぞれ５分間以上の時間にわたって実施されており、したがってＰＣＲ反応の全時間は非常に長くなっている。さらに、ＷＯ９２／０４４７０号でＰＣＲ反応を実施する条件は、通常のＰＣＲ緩衝系を使用できないことが判明した点で通常のＰＣＲプロセスの条件とは異なっている。変性を得るために、こうした緩衝系と適合するであろうイオン強度よりもはるかに低いイオン強度でこのプロセスを実施することが必要であった。プロモーターであるメチルビオロゲンを除くと、このプロセスは基本的に蒸留水中で実施された。
ＷＯ９５／２５１７７号において、我々は、ＷＯ９２／０４４７０号に開示されているよりもはるかに速く電気化学的な変性を実施できることを示し、ここに開示されているよりもはるかに速く増幅プロセスを実施できることを示した。
ＷＯ９２／０４４７０号における二つの作用極の間隔は明記されていないけれども、実際には数ミリメートルであった。
改善された方法がＷＯ９５／２５１７７号に記載されており、ここでは前記核酸を含有する溶液に対して、複数の電極間に電圧を印加し、電極は前記溶液中で互いに１．５ｍｍ以内まで近づいている。これによって、ＷＯ９２／０４４７０号に記載の電極配置を採用すると、変性時間が少なくとも２５分間であるのに対して、ＷＯ９５／２５１７７号内の実施例では１〜２分間以内にＤＮＡの完全な変性を完了しているように、これにより、変性速度の著しい上昇がもたらされている。
ＷＯ９５／２５１７７号に示されているように、これに記載されている機器を使用してＰＣＲ反応を実施する際に、単に電場をオン、オフするよりも、むしろ必要に応じて電場を反転させることができる。ＷＯ９５／２５１７７号では，この電場の反転は、単に電場をオフにするのに等価なものと見られている。ＧＢ９６１３９８０３号出願においては、ゼロ電位の期間をこうした電場の反転と組み合わせることによって、このプロセスをさらに改善している。
ＷＯ９２／０４４７０号出願のプロセスは、電極と、適切な緩衝剤を含有する水中に溶解した核酸だけを含む溶液中で起こりえるものであるけれども、このプロセスは、核酸を含有する溶液中で、プロモーター化合物を存在させることによって促進されることがある。メチルビオロゲンまたはその塩が、好ましいプロモーター化合物として開示されていた。
正に荷電したビオロゲン分子が、負に荷電したＤＮＡおよび負に荷電した陰極との間で相互作用し、これらの間の静電反発を減少させ、これによって電場が最も強い電極表面へとＤＮＡの接近を促進するものと考えられる。したがって、我々は、ＷＯ９２／０４４７０号において、プロモーターとして、間隔を有し、正に荷電した複数の中心を有するプロモーター化合物、例えば双極正荷電化合物を採用することが好ましいと記載した。好ましくは、正に荷電した複数の中心間の間隔は、ビオロゲンにおける間隔と同様であるべきものとされていた。
次に、ＷＯ９３／１５２２４号は、この系内において、多価無機陽イオン、好ましくはＭｇ2+も、メチルビオロゲンとほぼ同様の効率でプロモーターとして作用し得るという発見に基づいていた。
Ｍｇ2+のような大きな陽イオンは、陰極と、二本鎖核酸の負に荷電した領域との間のブリッジとして作用し得るものと考えられる。
ＧＢ９６１４５４４．６号に記載されているように、リチウムイオンも変性を促進し得ることも発見された。
前記プロモーター陽イオンの濃度は、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭまでであり、より好ましくは５ｍＭから２０ｍＭまでであり、例えば約１０ｍＭである。
こうした電気化学装置中で達成可能な変性の速度および程度は、核酸が存在する培地を含む多数の因子に依存している。核酸ハイブリッド形成アッセイやＰＣＲのような増幅手順といった、分子生物学において使用されるプロセスは、行われる反応の最適ｐＨを維持するために、緩衝剤を含む培地中で実施されている。しかしながら、こうした緩衝剤の存在は、一般的に、核酸の電気化学的な脱ハイブリッド形成に反するものである。これは、ある程度は、前記したように、適切なプロモーターを選択することによって克服できるが、しかし緩衝剤が存在しても、脱ハイブリッド形成プロセスに対するその悪影響が顕著に低減されているような系を開発することが、非常に望まれている。
こうして、イオン強度が増加すると分子間の相互作用が安定化する傾向があり、したがって培地のイオン強度に寄与するイオン源となる緩衝剤が存在しないと、解離が一層容易に生ずることが、通常見いだされているけれども、我々が今回発見したところでは、この明細書で「解離許容性緩衝剤」と呼ぶ特定の緩衝剤は、マグネシウムやリチイオンイオン、あるいはビオロゲンのような解離を促進する薬剤を添加することなしに、解離を進行させる。
トリス−ＨＣｌ（ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）は、適当なプロモーターが存在しているときに使用できる型の緩衝剤の例である。以下に示すように、ここで提案する緩衝剤は、トリス−ＨＣｌに比べて、解離を進行させる能力に優れている。
さらに、この緩衝剤は、他の相互作用する分子、特に生体分子を、電圧の影響下において解離させるのに利用できる。これら分子間の相互作用の型は、特には水素結合であってよい。
この発明にしたがって使用する緩衝剤が、解離を可能とし、促進する機構は、現在のところ十分には理解されていない。電極が浸漬されている溶液中におけるｐＨの局所的な変化によって解離が引き起こされ、このような変化が電極の表面に隣接する微細層中で生じており、正の陽極では酸性条件を作りだし、負の陰極ではアルカリ性条件をつくり出しているかもしれない。これは、ＤＮＡに、酸性ｐＨとアルカリ性ｐＨとの双方で変性が引き起こされ得るという事実と整合しているであろう。比較的に低いｐＨを一時的かつ局所的に発生させ得る緩衝剤、即ちそれ自体が比較的に高いｐＫａを有する緩衝剤は、より低いｐＫａを有する他の緩衝剤がそれを阻止する場合でも、上述した必要なｐＨの変化を生じさせ得る。
溶液のｐＨが緩衝剤のｐＫａと同じであるときに、緩衝剤は最大の緩衝性能をし、溶液のｐＨがｐＫａから離れるのにつれて、緩衝性能は減少する。したがって、ｐＨ７．５〜８．０では、ＣＨＥＳの溶液（ｐＫａ９．４）の緩衝性能は弱く、溶液のｐＨは容易に下方へと変化する。我々は、電気化学セルの陽極で生成した水素イオンが、緩衝作用を克服するのに十分であり、培地のｐＨの局所的な低下をもたらし、これが続いて二本鎖核酸の変性を引き起こすことを示唆する。
電場を解除したときには、緩衝剤の作用によって、培地はその最初のｐＨに向かって安定化する。
電場に応答してｐＨを可逆的に「急変（flip）」させる緩衝剤のこの能力は、そのｐＫａ値に関連しているかもしれない。
または、二本鎖核酸の変性を促進し、可能としている原因は、緩衝剤の核酸二重螺旋中へのインターカレーション（intercalation）であるかもしれず、この明細書に記載する好適な緩衝剤が、複数の電荷間の間隔あるいはシクロヘキシル環の存在のいずれかによって、特にこの装置中での使用に適している可能性がある。これらの機構の組み合わせが、同時に作用している可能性がある。
したがって、この発明によって提供する相互作用する分子の解離方法は、前記分子を含有する液体を、複数の電極の間に印加された電圧へと、トリス−ＨＣｌよりも一層解離許容性が高い電気的解離許容性の緩衝剤の存在下に、前記分子の少なくとも一部を完全にあるいは部分的に解離させるような条件下に供することを含む。
前記分子は生体分子であってよく、特にハイブリッド形成によって会合した核酸分子であってよく（したがって前記解離がこのハイブリッド形成した核酸分子の変性を構成する）、あるいは相互作用する生体分子の一方が、生体分子の他方の免疫学的な結合パートナーであってよい。さらにまた、相互作用する生体分子の一方はリガンドであってよく、他方はこのリガンドの受容体であってよい。この分子は巨大分子であってよく、その一方または双方は、例えばＤＮＡの二重螺旋におけるように荷電していてよい。
前記緩衝剤は、好ましくは８．５以上のｐＫａを有しており、さらに好ましくは９．０以上のｐＫａを有しており、最も好ましくは９．２以上のｐＫａを有している。
このプロセスは、好ましくは、７から９のｐＨで実施する。選択された緩衝剤は、ある程度、解離反応を行えるｐＨを規定する。解離が、ポリメラーゼのような酵素を含有する溶液と接触する核酸鎖の脱ハイブリッド形成である場合には、ｐＨは、酵素の活性が最適化されるように選択できる。このように、緩衝剤と酵素との選択は関連するであろう。例えば、緩衝剤ＣＨＥＳは、「ベント」ポリメラーゼと共に使用するには特に好適であるが、ＣＡＰＳまたはＣＡＰＳＯのように、より高いｐＫａを有する緩衝剤は、より高い至適ｐＨを有する酵素、例えばバシラス  ステアロサーモフィラスから得られたＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ｐＨ８〜９）、ピロコッカス種から得られた「ディープ  ベント」（ニューイングランド  バイオラボ社）（ｐＨ８．８）、テルムス  ブロキアヌスから得られた「ダイナザイム（Dynazyme）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム  オイ社）（ｐＨ８．５）、テルムス  アクアティクスから得られたＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび誘導体（ｐＨ８．８）、あるいはバクテリオファージ  Ｔ４から得られたＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ｐＨ８．８）について、一層適切な選択であり得る。
緩衝剤は、好ましくは、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、またはＣＡＰＳＯである。これらの緩衝剤のｐＫａ値は、文献に実効値（working values）として、あるいは後補正した熱力学値として引用されており、後者が少し高い。上記で引用したｐＫａの好適範囲に関連して、これらの熱力学値を考慮しなければならず、これはＣＨＥＳは９．４１であり、ＣＡＰＳは１０．５１であり、ＣＡＰＳＯは９．７１という値である。
ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯの化学式を下に示す。
ＣＡＰＳ
0004004548.tif 000002
ＣＡＰＳＯ
0004004548.tif 000003
ＣＨＥＳ
0004004548.tif 000004
好ましくは、緩衝剤は、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳまたはＣＡＰＳＯ分子におけるこのような電荷間の距離の０．７５倍から１．５倍の距離、正の電荷から離れた負の電荷を有する分子からなる。また、好ましくは、この緩衝剤は、二本鎖核酸中へとインターカレート（intercalate）できる部分、例えばシクロヘキシル置換基を有している。
この方法は、好ましくは、前記緩衝剤の濃度が５〜１０ｍＭで実施する。
核酸または他の分子は、緩衝剤を含有する溶液中に溶解する必要はなく、溶液中に浸漬された固相に対して固定化できることが理解されるであろう。したがって、好ましくは、本発明によれば、生成した一本鎖核酸または他の放出された分子は、電極から遊離しており、例えば溶液中に溶解している。しかし、核酸は、電極上、または細胞内の他の表面上、または電極上の被膜上に、二本鎖または一本鎖形で電位差の印加に先立って固定化することができ、例えば核酸鎖の末端あるいは複数の末端間の小部分によって結合させ、あるいはリンカー分子を通して結合させ、これによってこの核酸分子の実質的な鎖の部分が、変性の前後に電極の表面から自由にぶら下がるように残す。核酸のうち核酸を結合させるための部分は、好ましくは、使用者の目的に応じて選択する。
前記電極と対向極とに加えて、参照極を前記溶液と接触させることができ、電圧を前記電極と前記対向極との間に印加することによって、前記電極と前記参照極との間における電圧の所望の調節を達成できる。これらの電極は、電気化学分野において知られているようなポテンシオスタット回路によって接続できる。
好ましくは、−０．５から−１．５ボルトの電位差を、前記参照極に対して前記作用極へと印加し、一層好ましくは−０．８から−１．１ボルトであり、例えば約−１．０ボルトである。
作用極の参照極に対する電圧は、終始、カロメル参照電極に対して測定したかのよう、あるいはカロメル参照電極に対して実際に測定して設定する（ＢＤＨ  Ｎｏ．３０９．１０３０．０２）。
したがって、必要に応じて、この方法は、ＷＯ９２／０４４７０号に記載されている種類の三電極装置を使用して実施できるが、しかし一般的には、好ましくは、本発明により採用する溶液の容量は少なく、例えば１ｍｌ以下であり、好ましくは非常に少なく、例えば１００μｌ以下であり、例えば２５〜４０μｌである。このように非常に少量の反応容積を採用したときには、一般的には、三電極装置を使用することは実際的ではない。したがって、典型的には、電圧を二つの電極の間に印加し、直接に測定できる。二電極装置用にここで与える電圧は、このようにして印加されるので、カロメル電極に対して参照されない。
さらに他の好適形態のセルは、エラストマーシートによって分離された一対の白金板電極を備えており、エラストマーシートは、セルキャビティを区画する切り込みを備えている。好ましくは、このエラストマーは、１００μｍから１ｍｍの厚さを有しており、さらに好ましくは２００μｍから８００μｍの厚さを有しており、最も好ましくは３００μｍから５００μｍの厚さを有している。
好ましくは、電極間に０．５から３ボルトの電位差を印加する。３ボルトを越える電位差は、変性を阻止し、劣化を促進するように思われるが、それに関与する機構は現在のところ未知である。
好ましくは、この方法は、電極間の電位差として測定したときに、１．５から２．５ボルトの電圧で実施する。
電極上にコーティングがある場合には、印加した電圧は、一般的には、コーティングを横切るときの電圧降下を補償するために、上昇させる必要があろう。
必要に応じて、電圧を制御するよりも、むしろ定電流電源を使用して変性や解離を実施することができ、これは相異なる変性や解離操作の間の電極の幾何学的設定の変動を補償するように働く。
定電流設計（regime）を採用した場合には、一般的には、８０〜１６０μＡ、例えば約１００〜１２５μＡの電流を使用することが好ましいであろう。
ＧＢ９６１４５４４．６号のリチウムプロモーターに加えて、ＷＯ９２／０４４７０号に記載のメチルビオロゲンのようなプロモーター化合物を、一層急速な解離や変性を生じさせるために採用してもよい。他のプロモーターは、ＷＯ９３／１５２２４号に記載されており、即ちマグネシウムのような多価陽イオンである。有効で使用可能な他の多価陽イオンとしては、ランタン（Ｌａ3+）が挙げられる。プロモーターとして使用する陽イオンには、無機または有機配位子と錯体化した無機陽イオン、例えばＰｔ（ＮＨ3）64+およびＣｒ（ＮＨ3）62+が含まれる。
核酸の変性に対しては、このようなプロモーターは、二重螺旋の変性の速度あるいは程度を上昇させる、あらゆる無機および有機分子であってよい。これは、選択した反応培地中に可溶性でなければならない。好ましくは、これは、溶液中に存在しているかもしれないＤＮＡや他の化合物、例えば酵素やオリゴヌクレオチドプローブに影響せず、干渉しない。あるいは、このプロモーターは、電極の構成材料中に固定化し、または含有させることができる。
他のプロモーターは、ビピリジル系列の水溶性化合物、特にメチルビオロゲンのようなビオロゲン類やその塩であってよい。こうしたプロモーター類の作用機構は、現在のところ確実には知られていないけれども、正に荷電したビオロゲン分子が、負に荷電したＤＮＡのような核酸と、負に荷電した陰極との間で相互作用することによって、これら間の静電反発を減少させ、これによって電場が最も高い電極の表面へのＤＮＡの接近を促進するものと考えられる。したがって、一つの好適な選択肢は、正に荷電した互いに離れた複数の中心を有する化合物、例えば双極性の正に荷電した化合物をプロモーターとして使用することである。好ましくは、こうした正に荷電した複数の中心間の間隔は、ビオロゲンにおけるそれに近似している。他の好適なビオロゲンとしては、エチルビオロゲン、イソプロピルビオロゲンおよびベンジルビオロゲンが挙げられる。
この溶液のイオン強度は、好ましくは２５０ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下である。このイオン強度が減少するのにつれて変性速度が増大することが発見されているので、前記イオン強度はさらに５０ｍＭ以下であることがさらに好ましく、例えば２５ｍＭ以下、あるいはさらに５ｍＭ以下でさえも好ましい。一般には、イオン強度が低いほど、変性が急速である。しかし、これらの目的のためにイオン強度を算出するのに際しては、上記したプロモーターとして作用するあらゆる成分のイオン強度の寄与をも、無視することが適切であるかもしれない。
前記電極はいわゆる「修正電極（modified electrode）」であってよく、ここでは変性を促進する化合物が、電極の構造上へと被覆されており、あるいは電極構造上に吸着されており、あるいは電極構造中に含有されている。この電極構造は、不活性ではあるが導電性であるものでもよい。
下記の本発明で使用する第一の好適な形態の電気化学セルは、ウエルを含有するカーボンブロック中へと浸漬されているカーボンロッド電極を採用している。他の電気化学セルの構成においては、作用、対向、および必要に応じて参照極は、一つの表面上、例えば平坦な表面上へと、厚膜スクリーン印刷法、インクジェット印刷法のようなあらゆる印刷法によって、あるいはフェトレジストを用い、続いてエッチングすることによって、形成してよい。また、対向極と参照極とを平坦な表面上で組み合わせることで、二電極配置をもたらすことができる。あるいは、電極は、液体を保持するのに適合したウエルの内側面上に形成することができ、こうしたウエルは周知の９６ウエルあるいはマイクロタイタープレートであってよく、また試験管や他の容器であってよい。マイクロタイタープレートや他の注型されたもしくは熱成形されたプラスチック材料中の電極アレーを、多重核酸変性実験や他の解離反応に対応して設けることができる。この反応は、緩衝多孔質部材、例えばフィルターペーパー上で実施できる。
核酸鎖の分離は、水性媒体中で、あるいは水とジメチルホルムアミドのような有機溶媒との混合物中で実施できる。また、水以外の極性溶媒や非極性溶媒の使用も許容されるが、しかし好ましくはない。この方法は、常温で実施でき、あるいは所望であれば核酸の溶融前温度に近い温度までの温度で実施できる。
この発明によって核酸について実施される変性方法は、多数の一層複雑なプロセス、例えば核酸の分析および／または増幅を含む手順においける、一工程として包含させることができる。このような適用例の幾つかについては後述する。
本発明は、試料中における所定の核酸配列の存在または不在を検出する方法を含んでおり、この方法は、二本鎖核酸の試料を電極によって変性させ、この変性した核酸をオリゴヌクレオチドプローブによって前記配列に対してハイブリッド形成させ、および前記ハイブリッド形成が生じたかどうかを測定することを含んでおり、ここで変性の間、前記溶液が前記緩衝剤を含有している。
このように、本発明の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッド形成という用途があり、これは特定の遺伝子配列が同定されることで、例えば特定の有機体に特異的な、または特定の遺伝性疾患に特異的なものである。ここで、遺伝子疾患の一例としては、鎌状赤血球性貧血を挙げることができる。特定配列を検出するためには、最初に未変成である二本鎖形のＤＮＡの試料、好ましくは精製ＤＮＡの試料を調製することが必要であり、その方法は既知である。次いで、二本鎖ＤＮＡを一本鎖形へと変換することが必要であり、その後に前記ＤＮＡ試料に対して相補性の配列を有する標識ヌクレオチドプローブによるハイブリッド形成工程を実施することができる。本発明の変性方法を使用し、この目的のため、好適な形態においては、次の各工程を実施できる。
・ＤＮＡの試料を、溶液中の前記緩衝剤と接触している前記ＤＮＡの試料に対して電極によって電圧を印加することで変性する工程；
・この変性したＤＮＡを、目的とする配列に対して相補的な、直接に標識されたあるいは間接的に標識されたヌクレオチドプローブによってハイブリッド形成する工程；および
・前記ハイブリッド形成が生じたかどうかを測定する工程。この測定は、前記プローブの存在を検出することによるものであってよく、このプローブは、直接的に放射線標識、蛍光標識、化学発光標識または酵素標識されており、あるいはプローブはビオチンを担持する間接的に標識されたプローブであり、例えばビオチンに対して標識アビジンまたはアビジン型分子を後で結合させることができる。
典型的なＤＮＡプローブアッセイにおいては、試料ＤＮＡを膜の表面に対して固定化することが通常であり、膜は中性のあるいは荷電したナイロンまたはニトロセルロースから形成されていてもよい。この固定化は、荷電相互作用によって、あるいはオーブン中でＤＮＡを含有する膜を焼成することによって、達成できる。この試料ＤＮＡを高温に加熱することによって、膜への結合前に一本鎖形へと確実に変換させてよく、あるいは膜上でいったんアルカリ処理することによって一本鎖形へと確実に変換させることができる。この方法の不利益は、
・高温へ加熱して一本鎖ＤＮＡを生じさせると、試料ＤＮＡそれ自体に対して損傷を与えることがあること、
・アルカリを使用すると、標識プローブによるハイブリッド形成を生じさせる前に、中和工程がさらに必要になること
である。
ＤＮＡプローブによるハイブリッド形成アッセイを実施する一つの改良法は、いわゆる「サンドイッチ」技術であり、特定のオリゴヌクレオチドを表面上に固定化する。次いで、この特定のオリゴヌクレオチドを上に備えた表面を、一本鎖形の標的ＤＮＡを含有する溶液とハイブリッド形成させ、この後に続いて第二の標識オリゴヌクレオチドを添加し、これも標的ＤＮＡとハイブリッド形成させる。次いで、この表面を洗浄し、未結合の標識オリゴヌクレオチドを除去し、この後に表面上の標識ＤＮＡへと結合したあらゆる標識を、後で検出することができる。
この手順は、二本鎖ＤＮＡを、その必要とされる一本鎖ＤＮＡへと変性させる本発明の解離方法を採用することによって、単純化できる。作用極、対向極および必要に応じて参照極および／またはプロモーターを、前記ＤＮＡプローブアッセイが実施される試験管またはウエル中へと含有させることができる。次いで、ＤＮＡ試料、既に存在していない場合にはプロモーターおよびオリゴヌクレオチドプローブを添加でき、電圧を印加してＤＮＡを変性させる。得られた一本鎖ＤＮＡを、前記表面上に固定化された特定のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させ、この後にサイドイッチアッセイの残りの工程を実施する。上記のすべての工程は、従来プロセスにおけるような高温やアルカリ試薬添加の必要なしに、生じ得る。
ＤＮＡの電気化学的な変性は、核酸を増幅する際に、例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応増幅手順または鎖置換増幅技術において採用できる。したがって、本発明によって提供する核酸の複製方法は：試料である二本鎖核酸の鎖を、前記緩衝剤を含有する溶液と接触させて、あるいはこの溶液中に溶解させて、前記溶液へと電極から印加された電庄の影響下に分離し；前記核酸の分離された鎖を、前記変性した核酸の鎖の少なくとも一方とハイブリッド形成する少なくとも一種のオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッド形成させ；前記核酸の各鎖に対して十分に相補的なあるプライマーまたは各プライマーの伸長産物を合成し、これとハイブリッド形成させ；および前記のあるいは各伸長産物を、これとハイブリッド形成している核酸鎖から分離して前記伸長産物を得ることを含んでいる。
こうしたポリメラーゼによって媒介された複製手順、例えばポリメラーゼ連鎖反応手順にいては、核酸の完全な一本鎖分子を精製させるところまで変性を実施することが、すべての場合において必要であるとは限らない。プライマーハイブリッド形成部位において、二重螺旋の十分な局所的および／または一時的な弱化あるいは分離を生じさせることによって、プライマーをその標的に結合させることで十分なことがある。いったんこのプライマーが第一の標的鎖上の位置にあると、このプライマー領域中の標的鎖の再ハイブリッド形成が防止され、他方の標的鎖は、このプライマーの伸長によって、あるいは更なる一時的な弱化または分離プロセスによって、連続的に置換することができる。
好ましくは、前記増幅プロセスは、さらに上で規定した手順を、循環的に、例えば１０回より多く、例えば最大２０から３０回まで繰り返すことを含む。この増幅プロセスにおいては、前記ハイブリッド形成工程は、好ましくは、核酸の相異なる鎖に対して相補的な二種類のプライマーを使用して実施する。
前記の伸長産物を得るための変性プロセスおよび標的核酸における最初の変性は、好ましくは、この核酸の溶液へと、複数の電極の間で電圧を印加することによって行われ、この溶液は、本明細書に記載したような緩衝剤を含有している。
この方法は、一種の核酸または核酸の混合物中に含有されている少なくとも一種の特定の核酸配列を増幅するための、標準的または古典的なＰＣＲプロセスであってよく、ここで各核酸は、同じ長さあるいは相異なる長さの、二種類の別個の相補的な鎖からなっており、この方法は、
（ａ）  前記鎖を、二種類のオリゴヌクレオチドプライマーによって、適用される相異なる各特定配列について、増幅された相異なる各配列に対して、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長産物が合成されるような条件下で処理し、ここで前記プライマーを、各特定配列の相異なる鎖に対して実質的に相補的になるように選択し、一方のプライマーから合成した前記伸長産物が、その補体から分離したときに、他方のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として働くようにし；
（ｂ）前記プロモーターの存在下に、電極から電圧を前記反応混合物へと印加することによって、前記プライマー伸長産物を、伸長産物が合成された鋳型から分離して一本鎖分子を生成させ；
（ｃ）  工程（ｂ）から生成した前記一本鎖分子を、工程（ａ）の前記プライマーによって、工程（ｂ）で生成した前記一本鎖を鋳型として使用してプライマー伸長産物が合成されるような条件下で処理する
ことを含んでいる。
あるいは、この方法は、標準的または古典的なＰＣＲプロセスのあらゆる変種、例えばいわゆる「逆位（inverted）」または「逆転（inverse）」ＰＣＲプロセスや、「アンカー」ＰＣＲプロセスであってよい。
このように、本発明によって提供する上記の増幅プロセスにおいては、プライマーを環状核酸へとハイブリッド形成し、伸長して二重螺旋を生成させ、これを本発明の変性プロセスによって変性し、この増幅プロセスを必要に応じて一回以上の更なるサイクルを通して繰り返す。
さらに一般的には、本発明は、核酸の標的配列を複製する方法を含んでおり、この方法は核酸のハイブリッド形成、伸長および変性（例えばハイブリッド形成および変性の複数のサイクル）を含んでおり、ここで前記核酸を含有する溶液上で電極によって前記緩衝剤の存在下に操作することで前記変性を生じさせる。
本発明の方法は、リガーゼ連鎖反応法に適用可能である。したがって、本発明は、標的核酸を増幅する方法を含んでおり、この方法は：
（ａ）  試料の核酸を一本鎖核酸として提供し；
（ｂ）  前記試料中で少なくとも四種の核酸プローブを提供し、ここで
（ｉ）  第一および第二の前記プローブが一次プローブであり、第三および第四の前記プローブが二次核酸プローブであり；
（ii）第一のプローブが、前記標的核酸の一次鎖の第一のセグメントに対してハイブリッド形成可能な一本鎖であり；
（iii）第二のプローブが、前記標的核酸の前記一次鎖の第二のセグメントに対してハイブリッド形成可能な一本鎖であり；
（iv）前記標的の前記一次鎖の第一のセグメントの５’末端を、前記標的の前記一次鎖の第二セグメントの３’末端に対して配置することによって、第一のプローブの３’末端の第二のプローブの５’末端への結合を、これらのプローブを前記標的核酸の前記一次鎖へハイブリッド形成するときに可能とし；
（ｖ）  第三のプローブが第一のプローブに対してハイブリッド形成可能であり；および
（vi）第四のプローブが第二のプローブに対してハイブリッド形成可能であり；および
（ｃ）  繰り返し、あるいは連続的に、
（ｉ）  前記複数のプローブを前記試料中の核酸とハイブリッド形成し；
（ii）ハイブリッド形成された複数のプローブを連結して、再構成された融合プローブ配列を生成させ；および
（iii）電圧を電極から前記反応混合物へと前記緩衝剤の存在下に印加することによって、前記試料中のＤＮＡを変性させる
各工程を含んでいる。
上記したすべての増幅手順において、引き続いてプライマーによるハイブリッド形成を可能とするＤＮＡの変性は、適切な電位差を電極へと印加することによって実施できる。この方法は、ＰＣＲやＬＣＲの既存の熱的方法におけるように、変性や復元の継続的なサイクルを含むように段階的に実施することができるが、またしかし連続的に実施することもできる。なぜなら、酵素による鎖の伸長や連結のプロセスと、引き続く電気化学的プロセスによる鎖分離とは、同じ反応において連続させることができ、これは一本鎖形の核酸分子は、いったん電極による変性の影響を離れると、プライマーとのハイブリッド形成について自由になり得るからである。したがって、プライマーがＤＮＡとハイブリッド形成できるものと仮定すると、伸長または連結産物が合成されるであろう。この電気化学的ＤＮＡ増幅技術を分析的に使用することによって、非常に少量のＤＮＡ、例えば動物細胞の単一の複製遺伝子や細菌の単細胞を検出および分析できる。
変性を生じさせるのに必要な時間は、極端に短くでき、例えば０．５秒間未満であり、最長１．０秒であり得る。二本鎖核酸の変性を繰り返して変性させるプロセスを実施でき、ここで前記電圧を、最長２分間、例えば最長１分間以内の持続時間を有する反復パルスとして印加する。
前記パルスの間に、電圧を印加していた時間に等しい時間かあるいは近い時間の間、電圧を解除および／または逆転させることができ、例えば電圧を０．０１〜１０Ｈｚの周波数のパルスとして印加できる。一回の変性を、一回のパルスサイクルによって実施できる。
第一の極性における電圧の印加期間、第一の極性に対して反対の極性の電圧の印加期間、および印加電圧が十分に減少した期間が、他のあらゆる順番で設けられるように、電圧を印加できる。複数のサイクルは、長さが０．０１秒から５分以上であってよく、例えば長さが１秒から５分であってよい。
好ましくは、前記電圧を第一の極性で印加する期間と、前記電圧を第二の極性で印加する期間とは、それぞれ独立して、０．５秒から１分である。
好ましくは、前記電圧を十分に減少させる時間は、それぞれ独立して０．５秒から３分である。
本発明は、相互作用する分子を解離する方法に使用するためのキットを含んでおり、このキットは、電極、対向極および必要に応じて参照極、および前記緩衝剤を備えている。
さらに、このキットは、一種以上のオリゴヌクレオチドプローブ、ポリメラーゼのような酵素、一種以上のプライマー、または解離プロモーター、例えばリチウムイオン源のいずれかを、あるいはすべてを備えている。前記プローブが存在している場合には、上記したいずれの方法によっても標識できる。
分子の再会合、特に核酸鎖の再ハイブリッド形成は、逆電圧を印加することによって、解離に関連してこの明細書に記載したのと同様の緩衝剤と他の条件とを採用して、生じさせ、あるいは促進することができる。
ここで、本発明を次の図面と例とを参照しながら説明する。
図１は、ＤＮＡの変性に使用する電気化学セルの分解組み立て図である。
図２は、図１のセルの操作に使用するのに適した時間／電圧プロファイルを示す。
図３は、実施例１で得られたゲルを示す。
図４は、実施例２で得られたゲルを示す。
図１に示すセルは、一対の対向する白金箔電極１２、１３の外側で、一対の対向するガラス板１０、１１の間に形成されたサンドイッチを備えており、電極１２、１３はシリコーンエラストマー「シラスティック（silastic，登録商標）」のスペーサーシートのいずれかの側に横たわっている。一対のチャンバー１５、１６が、このシラスティック（silastic，登録商標）シート中に形成されている。各チャンバーは、直径約１０ｍｍの円形の切り込みと、このシートの縁部まで延びるリードインチャンネルとからなる。シラスティック（silastic，登録商標）シートの厚さは約４００μｍである。各電極には接続タッグ１７、１８が設けられており、これによって電極への電気的接続を行う。
シラスティック（silastic，登録商標）シート中に二つのキャビティを設けることによって、本発明による２つの反応を同時に実施することが可能となり、あるいはこうした反応一つを対照例と共に実施することが可能となる。
このように、図示した電気化学セルが二つの対向する平面状白金電極を備えていることを理解できる。これらの電極は、変形可能な絶縁材料のシート（この場合にはシリコーンエラストマー）によって分離されており、これは液体の漏れに対するシールを形成しており、切り欠くことによって電極チャンバーを形成している。これらの電極は平板によって裏付けられており、この全体が、約５００μｍの自由状態厚さからのエラストマーシートを備えた複数のアルミニウムブロック（図示せず）の間に一緒に把持されている。電極間の電位差と、経時による極性反転パターンとは、ＰＣ上に設定されており、これが電力を制御している。この電極アセンブリを適当な温度の加熱ブロック上に静置することによって、電極アセンブリを作動温度（適切には５５℃）に維持する。
図１に示すセルを、次の例で使用する。
（実施例１）
この例においては、電気的な変性を、電極間に電位差を印加することによって電気化学セル中で実施する。４５μｌの直線化されたｐＵＣ１８プラスミド（２８６８塩基対）を、水または緩衝液中、０．５μｇ／ｍｌでセル中に収容する。電極を横切るように電位差を所定時間の間印加し、多数の極性変化を伴わせるか、伴わいないようにした。典型的な「プロファイル」を図２に図示し、ここでｘは１．２Ｖであり、ｔ1は３秒であり、ｔ2は１秒である。次いで、この試料をセルから除去し、アガロースゲル電気泳動に供する。バンドの位置の下方へのシフトが観察された場合に、変性が生じたものと判定する。
図３は、図２の電気的プロファイルに曝露した後の、試験した緩衝剤の幾つかにおけるｐＵＣＤＮＡを含有する三種類のゲルを示す。ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯにおいて変性が成功しており、対照例の試料では熱によって変性した。トリス−ＨＣｌは拡散したバンドをもたらし、他の緩衝剤は有効ではなかった。ＣＡＰＳをｐＨ８．０で使用した他は、すべての緩衝剤を、５ｍＭおよび７．５のｐＨで使用した。
（実施例２）
これは、電気化学セル内で実施したＰＣＲ法であり、ここで変性因子として熱の代わりに電位差を印加する。４５μｌの反応混合物は、鋳型ＤＮＡ（０．５ｎｇの直線化されたｐＵＣ）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．２μＭのプライマー（３７５塩基対の複製物（amplicon）を与える）、０．５Ｕの「ベント」ポリメラーゼ（ニューイングランド  バイオラボ社）、０．１％の「トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００」、３ｍＭのＭｇＳＯ4を、１０ｍＭ、ｐＨ７．５のＣＨＥＳ緩衝剤中に含有していた。図２に示した電気的プロファイルを二十サイクル使用し、ここでｘは０．５ボルトであるが、しかし各サイクル後に０ボルトの期間を６０秒設けることによって、プライマーのアニーリングと鎖の伸長を可能とした。
増幅を達成し、図４に示し、４回の反復と対照例とを示す。電気化学的増幅において生成したバンドの同定は、
・臭化エチジウム染色ゲルでの視覚的評価、
・フェノール−クロロホルム−ＩＳＡによる試料の抽出、エタノールを含有する水相からの沈殿、およびゲル上で操作したときのバンドの再出現、
・アッセイによるビオチニル化された複製物の検出。ここで、複製物をストレプトアビジン板上に捕捉し、溶融させて一本鎖形とし、特異性のＤＩＧ標識プローブへとハイブリッド形成させ、これを色素生成酵素へと接合された抗ＤＩＧ抗体を添加することによって可視化する、
・電気的に生成した複製物をＤＮＡ分解酵素で処理した後に、バンドが（アガロースゲル中で）出現しないこと、
によって確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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