(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡベクター。
【請求項２】
少なくとも１以上の外来遺伝子を請求項１記載のベクターに組み込んでなる組み換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
前記外来遺伝子が、病原体の抗原蛋白質をコードする遺伝子である請求項２に記載の組み換えＤＮＡベクター。
【請求項４】
前記病原体の抗原蛋白質をコードする遺伝子が、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質をコードする遺伝子、ニューカッスル病ウイルスのHNタンパク質をコードする遺伝子、Ｆタンパク質をコードする遺伝子、マレック病ウイルスの糖タンパク質gBをコードする遺伝子、及び伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの構造タンパクVP2をコードする遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である請求項３に記載の組み換えＤＮＡベクター。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチン。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載の組み換えＤＮＡベクターと弱毒ポックスウイルスとを含有するワクチン。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規ＤＮＡベクターに関し、さらに詳しくは動物細胞での高発現ベクター、あるいはワクチンとして有用な新規ＤＮＡベクターに関する。
従来の技術
遺伝子工学においては、外来遺伝子を細菌や細胞に導入して発現させることを目的とする場合が多い。この場合、目的とする特定の遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離精製し、それをそのまま細菌や細胞に入れて増やすことはできない。ＤＮＡ断片は、通常、自ら複製することはできないし、細胞に含まれる種々のＤＮＡ分解酵素で分解される恐れがあるからである。
したがって、遺伝子操作実験においては、宿主細胞に移入でき、且つ宿主細胞中で自律的に増殖できる運搬体（一般にこの運搬体はベクターと呼ばれる）に、目的の外来遺伝子を共有結合で結びつけて一緒に行動させる。ベクターは、宿主細胞との組み合わせに応じて様々なものが知られている。例えば、大腸菌や酵母などの微生物を宿主とする場合では、プラスミドと呼ばれるＤＮＡベクターが一般に使用される。この具体例としては、pBR322やpUC18など多くのものがあり、『遺伝子操作実験法』75頁〜128頁（高木康敬 著、講談社サイエンティフィク）にも詳しく記載されている。
一方、動物細胞などを宿主とする場合にも、目的や宿主細胞に応じて様々なウイルスがベクターとして用いられている。例えば、腫瘍ウイルスであるために最近ではあまり使われていないが、1970年代後半から使用されてきたSV40やポリオーマウイルス、あるいは1980年代以降よく使われてきた。ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターがある。
しかしながら、動物細胞を宿主とするウイルスベクターに共通する欠点は、組み換えウイルスを作製するのに手間がかかる点と必ずしも外来遺伝子の発現量が十分でない点である。発現量に関しては、ウイルスベクターはプラスミドベクターに比べてコピー数（宿主細胞当たりの複製されたベクターの割合）がかなり低く、強いプロモーターの利用で多少の改善はできるものの大幅な発現量の増加は期待できない。
このため、発現量の多いベクターが常にもとめられているのが現状であった。
発明の概要
本発明者らは、前記の欠点を克服した動物細胞を宿主とする新しいベクターを開発すべく鋭意研究した結果、動物細胞において、従来のウイルスベクターよりも極めて高いコピー数を与える新規なＤＮＡベクターを見出し、本発明を完成するに到った。また更に、組み換え新規ＤＮＡベクターをワクチンとして利用する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明の第一の態様は、ポックスウイルス感染細胞のみで複製される、鶏痘ウイルス由来の約５kbのＤＮＡベクターである。ここで、上記ＤＮＡベクターは、配列番号１記載の塩基配列を２回以上繰返した配列を含む逆位末端反復配列を含むことを特徴とする。また、上記ＤＮＡベクターは、調節遺伝子と、少なくとも３以上の蛋白質のコーディング領域とを含むことを特徴とする。
また、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡベクターである。
本発明の第二の態様は、少なくとも１以上の外来遺伝子を上記のＤＮＡベクターに組み込んでなる組み換えＤＮＡベクターである。ここで、上記少なくとも１以上の外来遺伝子は、外来の調節遺伝子の制御下にあることを特徴とする。また、上記外来遺伝子の組み込み部位が、非翻訳領域又は第４番目のコーディング領域内にあることを特徴とする。
上記外来遺伝子は、病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましく、上記病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子が、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質をコードする遺伝子、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質をコードする遺伝子、Ｆタンパク質をコードする遺伝子、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢをコードする遺伝子、及び伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの構造タンパクVP2をコードする遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることが好ましい。
また、上記調節遺伝子が、7.5kDaペプチドもしくは11Kポリペプチドをコードするワクシニアウイルス遺伝子のプロモーターまたはこれらの改変体、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列を有する合成プロモーター、および下記塩基配列（配列番号５）
0003924328.tif 000002
で表されるＤＮＡ配列を有するプロモーターからなる群から選ばれるプロモーターであることが好ましい。
本発明の第三の態様は、上記の組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンである。ここで、本発明のワクチンは、上記の組み換えＤＮＡベクターと弱毒ポックスウイルスとを含有していることが好ましい。
本発明の第四の態様は、外来遺伝子を含む組み換えＤＮＡベクターを含むプラスミドで大腸菌を形質転換し、当該形質転換体を培養して組み換えベクターを増幅する工程と、前記組み換えベクターをポックスウイルス感染細胞に導入してさらに増幅させる工程とを含む上記ワクチンの調製方法である。
ここで、上記組み換えＤＮＡベクターが、外来遺伝子と配列番号２記載の塩基配列で表されるＤＮＡとを含有してなるものであることが好ましい。
本発明の第五の態様は、上述したワクチンの使用である。
本発明の第六の態様は、10ng〜１μgの組み換えＤＮＡベクターを、オルソポックスウイルスおよび鶏痘ウイルスからなる群から選ばれるポックスウイルスと共に感染させる、感染症の予防及び／又は治療方法である。ここで、１×103〜１×105pfuの弱毒ポックスウイルスと10ng〜１μgの組み換えＤＮＡベクターとを含む上記のワクチンを、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、および腹腔内投与からなる群から選ばれる投与経路で投与することが好ましい。
かくして本発明によれば、（１）ポックスウイルス感染細胞のみで複製することができる新規ＤＮＡベクターが提供され、また（２）当該ＤＮＡベクターに外来遺伝子を挿入した組み換えＤＮＡベクターが提供され、更に（３）当該組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
図１に、実施例で使用するベクターpNZ66、pNZ76、及びpNZ76の構築を示す。BamHIで切断したpMA001の3.3kb断片をBamHIで切断したpUC19をライゲーションしてpNZ66を構築する。これをHincIIで切断し、pUWP-1からHpaIIとEcoRIとで切り出しＤＮＡポリメラーゼ処理した7.5Kプロモーター遺伝子とをライゲーションし、pNZ76を構築する。pNZ76をさらにBamHIで切断し、mp10-HN18RFから得たBamHI-BglII断片とをライゲーションさせてpNZ87を構築する。
図２に、新規ＤＮＡベクターの制限酵素地図とサブクローニングされた各クローンの位置関係を示す。ここで、鶏痘ウイルス泗水株から得た約５kbのＤＮＡの制限酵素切断部位と、市販のpUC18プラスミドにサブクローニングした各断片の位置とを示す。EcoRI切断断片の0.6kb、1.1kb、BglIIとXbaI二重切断断片の2.4kbの断片のサブクローンは、それぞれNo.17、No.16、No.72-2である。ＤＮＡポリメラーゼＩ処理した後、EcoRIで切断して出現した1.3kbと2.0kbの断片のサブクローンがNo.20およびNo.22である。No.22のサブクローンをHindIIIで切断して出現した0.94kb、0.5kb、0.5kbのサブクローンがNO.73-1、No.73-2、及びNo.73-3である。No.22のクローンをXbaIとStuIとで二重切断して出現した1.5kbの断片を含むサブクローンがNo.73-9である。No.20のクローンをStuIとHindIII、StuIとBglIIとでそれぞれ二重切断して出現した0.8kb、0.9kbのサブクローンがNo.73-10、No.73-12である。
図３に、pPAD01の構築方法を示す。No.20、No.22、No.72-2の３つのクローンをそれぞれ含むpUC18XGプラスミドを使って、図２に示す手順で5,243bp全長ＤＮＡを含むプラスミドを構築し、このプラスミドをpPAD01と命名した。
図４に、組み換えＤＮＡベクターを含むプラスミドpPADin(4541−4759)P7.5:lacZの構築方法を示す。pPAD01をEco81I/SpeIで切断してpPADdI(4541-4922)を構築した。また、pPAD01をEco81I/SpeIで切断し、合成ＤＮＡリンカーを用いてpPADrepL(4541-4922)を構築した。pPADrepL(4541-4922)をHindIII/BlnIで切断し、4.5kbの断片を得た。pNZ76をHindIII/SalIで切断して得た3kbの断片、およびpPAD01をHindIII/BlnIで切断して得た3.3kbの断片とともに、pPADin(4541-4759)P7.5:lacZを構築した。
図５に、組み換えＤＮＡベクターを含むプラスミドpPADin(377)P7.5:HNの構築方法を示す。pNZ87をHindIII/BamHIで切断し、S1ヌクレアーゼで処理して得た1.9kbの断片と、pPAD01をBssHIIで切断し、S1ヌクレアーゼとBAPで処理した断片とを用いて、pPADin(377)P7.5:HNを構築した。
図６に、実施例で使用するfNZ1029を得るために使用するpNZ1029の構築を示す。アビポックスウイルスをEcoRIで切断して得た7.3kbの断片と、EcoRIで切断し次いでアルカリホスファターゼで処理したpUC18とをライゲーションしてpNZ133を構築する。これをEcoRVで部分消化し、pNZ76から切り出したHindIII-SmaI断片をＤＮＡポリメラーゼで処理し、ライゲーションしてpNZ1029を構築する。
図７に、実施例で使用するpNZ2237の構築を示す。アビポックスウイルスをEcoRIで処理して得た7.3kbの断片と、EcoRIとアルカリフォスファターゼで処理したpUC18とをライゲーションしてpNZ136を構築し、HindIIIとEcoRVとで部分消化した断片をpVC18とライゲーションしてpNZ136Sを得る。これをさらに処理してpNZ136SLを構築しHindIIIとBamHIとで処理し、pNZ87等から得たHNを含む断片とライゲーションしてpNZ2237を構築する。
発明の好適な実施態様
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）ＤＮＡベクター
本発明のＤＮＡベクター（以下、単にＤＮＡベクターという）は、鶏痘ウイルスに由来する約５kbのＤＮＡベクターであるが、ポックスウイルス未感染細胞では複製できず、ポックスウイルス感染細胞では０複製することができることから随伴性ＤＮＡベクターである。
このＤＮＡベクターは、直鎖状ＤＮＡであり、その配列中に配列番号１記載の塩基配列を２回以上含むものである。
ここで本発明のベクターの末端構造は、配列番号１記載の塩基配列を一単位とし、この配列を連続して２回以上、好ましくは３回含むが、5'側と3'側とでは塩基配列が逆向きになっている、逆位末端反復配列(Inverted Terminal Repeat;以下、ＩＴＲということがある)となっていることが好ましい。
本発明のＤＮＡベクターは、より好ましくは、配列番号２記載の塩基配列を有するものである。すなわち、本発明のアデニン及びチミジン含量（ＡＴ含量）が高く、上記の逆位末端反復配列以外に、少なくとも３つのタンパク質コーディング領域（Open Reading Frame:以下ＯＲＦという）、及びプロモーターその他の配列を含むものが好適である。
ここで、ＡＴ含量は60〜65％であることが好ましい。本発明のＤＮＡベクターにおいては少なくとも３つ以上のＯＲＦが存在し、４つのＯＲＦを有することが好ましく、ＯＲＦが４つ存在する場合には、以下の塩基配列を有するものであることが好ましい。具体的には、ORF1は、配列番号２の塩基配列の第1,207〜671番目、ORF2は同じく第1,257〜1,776番目、ORF3は同じく第1,806〜4,397番目、ORF4は同じく第4,991〜4,422番目の塩基配列である。ここで、ORF1およびORF4の翻訳方向は逆向きである。
本発明のＤＮＡベクターにおいては、上記４つのＯＲＦのうち、ORF1〜ORF3のいずれかのＯＲＦが一部でも欠損するとこのベクターＤＮＡは増殖できなくなるが、ORF4については一部欠損又はこのＯＲＦ自体が欠損してもＤＮＡベクターの増殖には影響しない。
また、ＯＲＦの翻訳開始コドンの前には、ＯＲＦが翻訳されて発現するために、それぞれプロモーターが存在することが好ましい。
プロモーターその他の配列としては、ワクシニアウイルスの7.5kDaプロモーター、ワクシニアウイルスの11kDaプロモーター、Mossらの合成プロモーター(Moss et al., J. Mol. Biol., 215:749-769(1989))やこれらの改変体などが挙げられる。
上記のような構造を有する本発明のベクターは、ポックスウイルス感染細胞中で高い複製効率を有するものであり、その複製効率は、天然のポックスウイルスのコピー数の約30倍以上であることが好ましい。
本発明のＤＮＡベクターにおいては、上記の複製効率を維持できるものであれば、その塩基配列中で、１以上の塩基が自然発生的な突然変異等によりまたは変異原物質や制限酵素を用いる公知の技術により人工的に、置換・欠失・付加・挿入などの変異が生じていてもよい。
特に、上述したようにORF4(配列番号２の第4,991〜4,422番目の塩基配列)では、その一部欠損などが生じた場合でもベクターとしての機能は損なわれないため、ORF4中に欠損を生じさせたり、後述する外来遺伝子等を組み込むといった種々の変異を生じさせることができる。また、非翻訳領域において上記のような変異が生じても本発明のベクターとしての機能は損なわれないため、これらの領域にも同様の変異を生じさせることができる。非翻訳領域における変異部位としては、例えば、配列番号２の第377番目の制限酵素BssHII部位の変異などが挙げられる。
このようなＤＮＡベクターは、家畜衛生菌株である鶏痘ウイルス泗水株（菌株番号：VA0101／社団法人動物用生物学的製剤協会）、同じく鶏痘ウイルスNishigahara株（菌株番号：VA0104／同協会）などの入手容易な鶏痘ウイルス株から取得することができる。
すなわち、これらの保存株を鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞）に常法に従って感染させ、約37℃で1週間培養し、その後、感染細胞の細胞質に存在するＤＮＡを回収し、アガロースゲル電気泳動等によって分画し、これによって確認される鶏痘ウイルスのゲノムＤＮＡ以外の約５kbのＤＮＡ断片を取得すればよい。
本発明のＤＮＡベクターは、ポックスウイルス未感染細胞に導入しても複製されないが、ポックスウイルス感染細胞に導入した場合には複製される、随伴性のものである。
本発明のＤＮＡベクターとしては、具体的には、配列番号２に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを配列含むものが好ましい。
ここでいうポックスウイルスとしては、ワクシニアウイルスなどに代表されるオルソポックスウイルスや鶏痘ウイルスなどに代表されるアビポックスウイルスなどが挙げられる。本発明で用いるアビポックスウイルスの具体例としては、鶏痘ウイルスでは、ATCC VR-251、ATCC VR-250、ATCC VR-229、ATCC VR-249、ATCC VR-288、Nishigahara株、泗水株、及び鶏痘生ワクチン株として市販されているCEVA株などのウイルスが例示される。これらは、寄託機関であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)などの機関から、あるいはIntervet Inc.などの製造元から市販ワクチンとして入手可能である。
これらのポックスウイルスを人工的に感染させた細胞、またはこれらのウイルスに自然に感染した細胞をポックスウイルス感染細胞という。
ポックスウイルスが感染しやすい細胞としては、以下のものが挙げられる。例えば、アビポックスウイルスが感染しやすい例としては、ＣＥＦ細胞のような発育鶏卵から調製される初代培養細胞や発育鶏卵の漿尿膜などが挙げられる。また、ワクシニアウイルスが感染しやすい細胞としては、Vero細胞やRK13細胞などの動物由来の株化培養細胞、あるいは、培養細胞ではなく動物個体の表皮細胞や筋肉細胞などが挙げられる。
これらの細胞に前記ポックスウイルスを感染させる方法は、通常のウイルスを細胞に感染させる方法でよい。具体的には、例えば、Eagle's MEM、D-MEM等の培地中でＣＥＦ細胞をサブコンフレントまで増殖させ、培地を捨てて上記のポックスウイルスをm.o.i.=0.1〜10となるように感染させる。
例えば、本発明のＤＮＡベクターとして配列番号２に表されるＤＮＡ配列をを用いる場合には、ＣＥＦ細胞をMEM培地中でサブコンフレントまで増殖させ、ここに上記のアビポックスウイルスをm.o.i.=0.5で感染させ、感染数時間後に本発明のＤＮＡベクターを培養細胞に加えて増殖させればよい。
本発明のＤＮＡベクターは、ポックスウイルス感染細胞内での複製効率が極めて高く、当該ＤＮＡベクターに外来遺伝子を挿入すると外来遺伝子も極めて効率よく複製されるという利点がある。具体的には、その複製効率は、アビポックスウイルス泗水株ゲノムのコピー数の約30倍以上、細胞あたりに換算して10,000コピー以上である。
本発明のＤＮＡベクターを適当なベクターに常法に従って挿入して(Molecular Cloning; A Laboratory Manual(1982), Cold Spring Harbor Laboratory)組み換えベクターを得ることができ、この組み換えベクターを用いれば、ポックスウイルス非感染細胞であっても当該ＤＮＡベクター（遺伝子）を複製させることが可能である。
本発明のＤＮＡベクターを組み込むベクターは、目的に応じて任意に選択することができる。このようなベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC7、pUC8、pUC18、pUCBM-20等のプラスミド、Ｍ13ファージなどのファージ、pHC79等のコスミドが挙げられる。必要に応じて、これらのベクターにβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子などのマーカーとして用いられる遺伝子等を組み込んだ改変ベクターも用いることができる。これらのベクターを適当な制限酵素で処理し、常法に従って本発明のＤＮＡベクターを組み込めばよい。
本発明のＤＮＡベクターを組み込んだ組み換えベクターは、TG1、JM103などの各種大腸菌その他の細菌を宿主として複製させることが可能である。
（２）組み換えＤＮＡベクター
本発明の組み換えＤＮＡベクターは、上記（１）で説明したＤＮＡベクター、外来遺伝子、およびプロモーターその他の調節遺伝子等を含むものである。
以下に、本発明の実施例で使用した各ベクターの構築について説明する。
（２−１）pNZ76の構築
pNZ76は、出開平第1-157381号公報(米国特許第5,286,639号)及び特開平第1-168279号公報(米国特許第5,387,519号)に記載したように構築する（図１参照）。
（２−１−１）pUWP-1の作製
ワクシニアウイルスWR株の7.5KDaペプチドをコードするＤＮＡのプロモーターを含む、約0.26kbのSalI-RsaI断片(Cell, 125:805-813(1981))をpUC9のSalI-SmaI部分に組み込んだプラスミドpUWP-1が得られる。
（２−１−２）pNZ66の構築
pMA001(Shirakawa et al., Gene, 28:127-(1984))をBamHIで消化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により開裂したpMA001を回収する。5'-末端のリン酸をアルカリフォスファターゼ処理によって除去し、ＤＮＡを再びフェノール：クロロホルム抽出した後に、エタノール沈殿によって、約3.3kbのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)を回収する。
一方、pUC19をBamHIで消化し、上記同様にフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収する。このpUC19からの回収断片とlacZとをリガーゼによってライゲーションさせ、プラスミドpNZ66を得る。
（２−１−３）pNZ76の構築
pUWP-1をHapIIとEcoRIとで消化し、低融点アガロース電気泳動により7.5Kプロモーターを含む断片を分離する。上記と同様にして、付着末端を有するＤＮＡ断片を回収する。このＤＮＡ断片の付着末端をＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端とする。
pNZ66をHincIIで消化し、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿によって回収する。この回収したＤＮＡと平滑末端とした7.5Kプロモーターを含む上記の断片とをリガーゼによってライゲーションして、pNZ76を得る。
（２−２）pNZ87の構築
（２−２−１）mp10-mpaの構築
M13-mp10RFDNA（Amersham社製）をBamHIとXbaIとで消化した後、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により、開裂されたM13-mp10 RF DNAを回収する。
一方、下記の塩基配列（配列番号８）からなり、一部一本鎖を有する40bpのオリゴデオキシヌクレオチドからなるアダプターをGenet AIII（日本ゼオン製）を用いて化学合成する。
0003924328.tif 000003
このアダプターには、XbaIサイト、BglIIサイト、KpnIサイト、XhoIサイト、BamHIサイトの各切断部位が含まれている。
このアダプターと、上記開裂されたM13-mp10 RF DNAとを混合し、リガーゼでライゲーションし、常法(Methods in Enzymology, vol. 101)に従って、コンピテントな大腸菌に形質導入する。この形質転換体を、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、イソプロピル-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド含有２×ＹＴ寒天培地で培養し、ファージRF DNAを回収し、BglIIで切断して、アガロース電気泳動によりアダプターＤＮＡが挿入されたファージmp10-mpaを得る。
（２−２−２）mp10-HN180の構築
NDVのHN遺伝子を含むプラスミドXLIII-10H(Virus Research, 7:241-255(1987))を東京大学教養学部の川喜多正夫助教授より分与された。
XLIII-10HをAvaIIで消化し、アガロースゲル電気泳動より抽出し、エタノール沈殿により、開裂されたmp10-mpaを回収する。
上記（２−２−１）で作製したハイブリッドファージmp10-mpaRF DNAをKpnIで消化した後、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収する。
開裂されたmp10-mpaRF DNAと、上記HN遺伝子ＤＮＡのAvaIIとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼで付着末端を平滑末端とし、フェノール：クロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿により回収する。回収されたＤＮＡをリガーゼでライゲーションし、上記と同様にコンピテントな大腸菌に形質導入し、２×ＹＴ寒天培地で生育させる。
形成されたプラークからファージRF DNAを回収し、XbaIとXhoIとで切断し、アガロースゲル電気泳動により、ＨＮ遺伝子断片約1.8kbを含むmp10-HN180を得る。
（２−３）pNZ87の構築
pNZ76をBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動により、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含まない約2.9kbの断片を回収する。一方、ハイブリッドファージmp10-HN180をBalIIとBamHIとで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約1.8kbのHN遺伝子のＤＮＡ断片を回収する。両者をリガーゼによりライゲーションし、コンピテントな大腸菌を形質転換し、ビルンボイムとドーリーの方法(Nucleic Acid Research, 7:1513-(1979))に従ってプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動によってＨＮ遺伝子を含むプラスミドpNZ87を得る。
（３）本発明のＤＮＡベクターからのサブクローンの構築
（３−１）本発明のＤＮＡベクターの精製
サブコンフレントまで培養した鶏胚繊維芽細胞（以下、ＣＥＦということがある）に、アビポックスウイルスを感染させ、一定時間増幅させた後に細胞をはがし、遠心して集め、リシスバッファーによって細胞を溶解させ、再度遠心して沈殿を得る。フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させて本発明のＤＮＡベクターを得る。
上記のようにして得た本発明のＤＮＡベクターを、各種の制限酵素で切断し、以下のサブクローンを得る（図２及び図３参照）。
（３−２）サブクローンNo.16、No.17、No.72-2の構築
EcoRIによる切断断片及びBglIIとXbaIとによる切断断片を得て、pUC18XGにライゲーションすることにより、No.16、No.17、No.72-2が得られる（図１）。
（３−３）サブクローンNo.20、No.22、No.73-1、No.73-2、No.73-3、No.73-9、No.73-10及びNo.73-12の構築
本発明のＤＮＡベクターをＤＮＡポリメラーゼで処理し、EcoRIで切断した断片を、SmaIとEcoRIとで処理したpUC18XGにライゲーションして、サブクローンNo.20とNo.22とが得られる。
No.22をHindIIIで切断し、HindIIIで処理したpUC18にライゲーションすることにより、サブクローンNo.73-1、No.73-2、No.73-3が得られる。
No.22をXbaIとStuIとで切断し、pUC18にライゲーションすることにより、サブクローンNo.73-9が得られる。
No.20をStuIとHindIIIとで切断しpUC18XGとライゲーションするサブクローンNo.73-10が、また、No.20をStuIとBglIIとで切断しpUC18XGとライゲーションするとサブクローンNo.73-12が得られる。
（４）本発明の組み換えベクターの構築
上記（１）〜（３）で構築したベクターおよびサブクローンを用いて、本発明の組み換えベクターを以下のように構築する（図３〜図５参照）。
（４−１）pPAD01の構築
サブクローンNo.20をBalIIで切断した。サブクローンNo.22とNo.72-2とをXbaIとBamHIとで切断してこれらの断片をライゲーションし、サブクローンNo.72-22を得る。ついで、No.72-22をBglIIで切断してBAPで処理した断片と、サブクローンNo.20のBglII断片とをライゲーションすると、pPAD01が得られる（図２）。
（４−２）pPADd1(4541-4922)の構築
上記（４−１）で得たpPAD01をEco81IとSpeIとで切断し、ＤＮＡポリメラーゼで処理して経かつ末端とし、自己ライゲーションさせて大腸菌を形質転換し、選択するとpPADd1(4541-4922)を得ることができる。
（４−３）pPADrepl(4541-4922)の構築
上記（４−１）で得たpPAD01をEco81IとSpeIとで切断し、配列番号４の合成ＤＮＡリンカーとライゲーションして大腸菌を形質転換し、選択するとpPADrepl(4541-4922)を得ることができる。
（４−４）pPADin(4541-4922)p7.5:lacZの構築
上記（４−１）で得たpPAD01をHindIIIとBlnIとで切断し回収した断片と、上記（４−３）で得たpPADrepl(4541-4922)をHindIIIとBlnIとで切断し回収した断片と、上記（１）で構築したpNZ76をHindIIIとSalIとで切断した断片とをライゲーションして大腸菌を形質転換し、選択すると、pPADin(4541-4922)p7.5:lacZを構築した（図４）。
（４−４）pPADin(377)p7.5:HNの構築
上記（２）で構築したpNZ87をHindIIIとBamHIとで切断してS1ヌクレアーゼで処理して断片を回収した。また、上記（３）で構築したpPAD01をBssHIIで切断し、S1ヌクレアーゼとBAPとで処理して、先に回収したpNZ87からの断片とライゲーションし、大腸菌を形質転換して選択すると、pPADin(377)p7.5:HNを得ることができる（図５）。
以上のようにして得られたベクターに、後述する外来遺伝子とプロモーターとを組み込むこともできる。
（５）発現量比較用fNZ1029の構築
組み換えウイルス鶏痘ベクターと外来遺伝子の発現量を比較するために、特開平第1-168279号公報に記載のようにして、fNZ1029を構築する（図６）。
（５−１）pNZ133の作製
pUC18（ファルマシア社製）をEcoRIとHindIIIで消化した後、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により開裂したpUC18を回収した。5'−末端リン酸をアルカリフォスファターゼ処理によって除去し、ＤＮＡを再びフェノール：クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によって回収する。開裂したpUC18と精製アビポックスウイルス（ＮＰ株）ＤＮＡのEcoRI断片ををリガーゼによってライゲーションし、コンピテントな大腸菌を形質転換し、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド、イソプロピル−β−D−ガラクトピラノシド、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養する。
寒天培地上に生育した白コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地で培養し、ビルンボイムとドーリーの方法(Nucleic Acid Research, 7:1513-(1979))でプラスミドを抽出し、EcoRIとHindIIIとで消化後、アガロースゲル電気泳動によって、もとのアビポックスウイルスＤＮＡのEcoRI−HindIII断片と同じ長さの断片を持つハイブリッドプラスミドを検出し、これをpNZ133とする。
（５−２）pNZ1029の構築
pNZ76をHindIII、SmaIで消化した後、低融点アガロースゲル電気泳動で断片を分離し、エチジウムブロマイド染色でＤＮＡ断片を確認し、ゲルを切り出してフェノール処理した後エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収する。
一方、（５−１）で構築したpNZ133をEcoRVで部分的に消化し、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収した。開裂されたpNZ133のＤＮＡと前記の断片（7.5Kプロモーター遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の連結断片）とを混合し、ＤＮＡポリメラーゼで付着末端を平滑末端とし、フェノール：クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により回収する。
回収したＤＮＡをリガーゼによってライゲーションし、コンピテントな大腸菌を形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で生育させた。
生育した大腸菌から、ビルンボイムとドーリーの方法(Nucleic Acid Research, 7:1513-(1979))でプラスミドを回収し、BamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を含むハイブリッドプラスミドを選択し、これをpNZ1029と命名した。
以上のようにして得たpNZ1029を用いて、アビポックスウイルス（鳩痘中野株（ＮＰ株ともいう））に7.5Kプロモーター遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを含むＤＮＡ断片を、常法により相同組み換えによって挿入し、fNZ1029を得る。
（６）pNZ2237の構築
pNZ2237の構築は、特開平第1-157381号公報に記載に従って、以下のように行う（図７）。
（６−１）pNZ87-22及びpNZ87-37の構築
pNZ87をXbaIとHindIIIとで切断し、XbaI−HindIII断片(A)を回収する。同様にpNZ87をXbaIとAvaIIとで切断し、XbaI−AvaII断片(B)を回収する。さらに、pNZ87をHindIIIとHinfIIIとで切断し、HindIII−HinfIII断片(C)を得る。
上記のようにして得た各断片に、以下の配列からなる合成ＤＮＡ（配列番号９）
0003924328.tif 000004
または下記の配列からなる合成ＤＮＡ（配列番号10）
0003924328.tif 000005
を加えて、リガーゼによりライゲーションし、ビルンボイムらの方法（前出）によってプラスミドを抽出すると、２種類のプラスミド、pNZ87−22とpNZ87−37とが得られる。
（６−２）pNZ136Sの構築
（６−２−１）pUC18（ファルマシア社製）をEcoRIとHindIIIで消化した後、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により開裂したpUC18を回収する。5'−末端リン酸をアルカリフォスファターゼ処理によって除去し、ＤＮＡを再びフェノール：クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によって回収する。開裂したpUC18と精製アビポックスウイルス（ＮＰ株）ＤＮＡのEcoRI断片をリガーゼでライゲーションし、コンピテントな大腸菌を形質転換し、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド、イソプロピル−β−D−ガラクトピラノシド、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養する。
寒天培地上に生育した形質転換大腸菌のうち白コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地で培養し、ビルンボイムとドーリーの方法(前出)でプラスミドを抽出し、EcoRIとHindIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動によって、もとのアビポックスウイルスＤＮＡのEcoRI−HindIII断片と同じ長さの断片を持つハイブリッドプラスミドを検出し、これをpNZ136とする。
（６−２−２）pNZ136Sの構築
上記（６−２−１）のようにして得たpNZ136をHindIIIで切断した後、EcoRVで部分消化し、アガロースゲル電気泳動によってEcoRV−EcoRV断片とEcoRV−HindIIIとが隣接した断片を回収する。
一方、pUC18をHindIIIとEcoRIとで切断し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により開裂したpUC18をアガロースゲルより回収する。EcoRV−HindIII断片をＤＮＡポリメラーゼ処理し、リガーゼによってライゲーションし、コンピテントな大腸菌を形質転換する。
アンピシリン含有培地で選択すると、EcoRV−HindIIIを含むpNZ136Sを得ることができる。
（６−３）pNZ2237の構築
上記（６−２−２）で得たプラスミドpNZ136SをHindIIIとでBamHIとで切断し、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収する。
pNZ87、pNZ87−22及びpNZ87−37をそれぞれHindIIIとBamHIとで切断し、アガロースゲル電気泳動に供し、ワクシニアウイルスの7.5Kプロモーター遺伝子とHN遺伝子ＤＮＡとを含むHindIII−BamHI断片を回収する。
両者をリガーゼによってライゲーションし上述のように選択することにより、pNZ2237を得ることができる。
ここで、本発明の組み換えＤＮＡベクターに組み込まれる外来遺伝子は特に限定されない。
こうした外来遺伝子としては、例えば、各種の酵素タンパク質や抗原タンパク質、ペプチドをコードする構造遺伝子や遺伝子発現を調節する調節遺伝子などが好ましい例として挙げられる。
より具体的な例としては、酵素タンパク質としては、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、ヒト組織プラスミノーゲン(tPA)などの酵素タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
また、抗原遺伝子としては、哺乳類細胞、哺乳類感染性病原体、鳥類細胞、鳥類感染性病原体、魚類細胞、魚類病原体などに由来するものを挙げることができる。例えば、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質をコードする遺伝子（米国特許番号第5,021,347号）、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質をコードする遺伝子(Millerら,J.Gen.Virol.,67,1917-1927(1986))、Ｆタンパク質をコードする遺伝子(McGinnesら,Virus Res.,5343-5356(1986))、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢをコードする遺伝子(Rossら,J.Gen.Virol.,70,1789-1804(1988))、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子(Bayliss et al., J.Gen.Virol., 71,1303-1312(1990))等の感染防御に関与した抗原をコードした遺伝子（以下、単に抗原遺伝子という）などの構造遺伝子が挙げられる。
調節遺伝子の具体例としては、7.5kDaペプチドや11Kポリペプチドなどをコードするワクシニアウイルス遺伝子のプロモーターなどが例示されるほか、プロモーターとして機能する限りにおいては、これらのプロモーターの一部が削除された改変体等であってもよい。また、合成プロモーター、例えば、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列を有する合成プロモーター(J. Mol. Biol.,215, 749-769(1989), ibid, 215, 771-781(1989))やその一部をプロモーター活性が喪失しない範囲で、削除、塩基の修飾・置換等を行った改変体、例えば、塩基配列が、下記の配列（配列番号５）
0003924328.tif 000006
で示されるもの等の遺伝子組み換え技術で使用する、遺伝子の発現を調節する調節遺伝子等が挙げられる。
上述した外来遺伝子は、単独でまたは必要に応じて２種類以上を組み込むことができる。本発明のＤＮＡベクターに外来遺伝子を挿入する場合、本発明のＤＮＡベクターがポックスウイルス感染細胞で複製できる性質を失わない限り、これらの遺伝子の挿入部位は特に限定されない。しかし、そのような領域としては、非翻訳領域やORF4の領域が好ましく、より好ましくは、配列番号２の第395番目の制限酵素BssHII部位や第4,541〜4,922番目の領域などを挙げることができる。
本発明の新規ＤＮＡベクターを含む組み換えＤＮＡベクターの作製方法は、特に限定されない。一例としては、本発明のＤＮＡベクターをプラスミド中に組み込み、このＤＮＡベクター配列中の挿入可能部位に外来遺伝子を常法に従って組み込んで組み換えプラスミドを作製する。この組み換えプラスミドを大腸菌などの適当な細胞内に導入して当該組み換えプラスミドを増殖させ、精製した後に、適当な制限酵素、例えば、BamHIにより組み換えプラスミドから外来遺伝子を含む組み換えＤＮＡベクターを切り離して、組み換えＤＮＡベクターを得る方法が挙げられる。
元々大量にＤＮＡベクターを用意することができれば、特に組み換えプラスミドを作製して増殖させる必要はない。
ポックスウイルスと本発明の組み換えＤＮＡベクターとを細胞に導入することによって、組み換えＤＮＡベクターに挿入された外来遺伝子を発現させることが可能である。
組み換えＤＮＡベクターとポックスウイルスを細胞に導入する方法も、特に限定されない。例えば、まず、上述のようにして得た組み換えＤＮＡベクターを適当なベクターに組み込んだ組み換えベクターで大腸菌を形質転換して増殖させてこの組み換えベクターを大量に調製する。ついで、予めポックスウイルスを感染させた細胞にエレクトロポレーション法、リポフェクション法などの方法で前記組み換えベクターを直接又は組み換えベクターから常法に従って切り出し、これを導入してもよい。この際、細胞にポックスウイルスを感染させる方法も特に制限されず、所望のm.o.i.でウイルスと細胞とを接触させるといった周知の方法で行えばよい。
（３）組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチン
本発明の組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンは、外来遺伝子として抗原遺伝子を挿入した組み換えＤＮＡベクターをポックスウイルスの生ワクチン株を感染させた細胞に導入して、そこから継代・純化を繰返すことにより調製される。
挿入される抗原遺伝子は上記（２）で記載したように、特に限定されない。使用するポックスウイルスも生ワクチン株として認められた株であれば特に限定されず、例えば、現在も広く使用されているアビポックスウイルスの鶏痘生ワクチン株などが好ましい例として挙げられる。
継代・純化の際の選択方法は特に限定されるものではないが、組み換えＤＮＡベクターに挿入した外来遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法でポジシグナルを示すかどうか、又は、外来遺伝子がコードしている抗原に対する抗体を用いて、抗原が発現しているかどうかを確認する方法によることが好ましい。そして、ポックスウイルスのプラークを形成させて、全てのプラークで組み換えＤＮＡベクターに挿入した外来遺伝子の存在または抗原の発現を確認できるようになるまで、選択したプラークを継代して選択する純化作業を繰返すことがより好ましい。
上述のようにして得られた組み換えＤＮＡベクターとポックスウイルスとを含む調製液を、通常のポックスウイルス生ワクチンを調製する方法と同じようにして、本発明のワクチン液を得ることができる。この調製方法は一般的な方法であり、特に限定されない。
例えば、本発明の組み換えＤＮＡベクターが増殖できる細胞にポックスウイルスと同時に感染させてこの細胞を培養し、その細胞を回収して破砕した後に遠心分離して、高力価の組み換えＤＮＡベクターとポックスウイルスを含んだ遠心上清と沈澱物とに分離する。本質的に宿主細胞及び／又はその破砕片を含まず、細胞培養培地、組み換えＤＮＡベクター、およびポックスウイルスとを含んだこの遠心上清は、本発明のワクチンとして使用できる。
また、上記のようにして調製した組み換えＤＮＡベクターとポックスウイルスとを含む調製液に、弱毒ポックスウイルスを適宜加えてワクチンとして使用してもよい。弱毒ポックスウイルスは特に限定されないが、アビポックスウイルス、オルソポックスウイルス等を好適に使用することができる。アビポックスウイルスの具体例としては、鶏痘ウイルスでは、ATCC VR-251、ATCC VR-250、ATCC VR-229、ATCC VR-249、ATCC VR-288、Nishigahara株、泗水株、及び鶏痘ワクチン株として市販されているCEVA株などのウイルスが例示される。また、ワクシニアウイルスとしては、リスター株LC16m0株、WR株、ニューヨーク・ボード・オブ・ヘルス株などを挙げることができる。これらのウイルスは、必要に応じて種々の方法で弱毒化することができるが、特に、ファウルポックスウイルス（FPV）を使用すると、ワクチンの有効性を高める上で好ましい。
さらに、この上清をそのまま、あるいは必要に応じて希釈または濃縮して凍結保存するか、凍結乾燥して保存することができる。凍結乾燥した場合には、薬理学的に許容される生理食塩水、蒸留水などで再構成して使用してもよい。
本発明のワクチンは、上述した組み換えＤＮＡベクターが動物体内で発現して、外来遺伝子がコードする抗原蛋白質を生合成させるような方法であれば、どのような方法で投与してもよい。
例えば、皮膚にひっかき傷をつけてそこにワクチンを接種したり、注射針やその他の器具などによって、接種対象動物の皮下に接種することができる。また、ワクチンを接種対象動物の飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混入させて経口投与することも可能である。さらに、エアロゾルやスプレーなどによりワクチンを吸入させる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法などを用いることもできる。
接種量は、例えば、組み換えＤＮＡベクターを、それを増殖させるのに用いたポックスウイルスと共にそのままワクチンとして使用する場合、ポックスウイルス量が１羽あたり通常103〜106pfu（プラーク形成単位）／組み換えＤＮＡベクター量で10ng〜１μgとなるようにすることが望ましい。より好ましくは1羽あたり104pfuである。注射する場合には、生理食塩水などの生理学的に許容される液体で希釈し、１羽あたり0.1mL程度を接種すればよい。単離された組み換えＤＮＡベクターを、適当なポックスウイルスと混在し、ワクチンを調製する場合であっても、上述の場合と同様になるように調製する。
本発明のワクチンは普通のポックスウイルス生ワクチンと同等の条件下で保存、使用することが可能である。例えば、本発明のワクチンを凍結乾燥すれば、室温（20〜22℃程度）で長期保存、取り扱い、輸送することができる。また、本発明のワクチンは、懸濁液を-20℃〜-70℃で凍結させて保存することも可能である。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
（実施例１）ＤＮＡベクターの取得およびコピー数の検討
（１）ＤＮＡベクターの作製
バイアル１本の鶏痘ウイルス泗水株（社団法人動物用生物学的製剤協会(Japanese Association of Veterinary Biologics)が管理している家畜衛生菌株(Cultures for Animal Hygiene)；鶏痘ウイルス泗水株(菌株番号VA0101))を、直径1.5cmの培養ディッシュでサブコンフレントまで培養した鶏胚繊維芽細胞に、バイアル１本感染させた。感染後、37℃のCO2インキュベーター中で１週間培養し、スクレーパーでディッシュから細胞をはがし、はがした細胞を集めて1,000×g、４℃で５分間遠心分離した。
この感染細胞を生理的平衡溶液(以下、ＰＢＳという)5mLで2回洗浄した後、1.2mLのＰＢＳに再懸濁し、ここにリシスバッファー(1.25％のTriton-X100、250mMの2-メルカプトエタノール、50mMのEDTAを加えたＰＢＳ溶液)0.8mLを加えた。ボルテックスミキサーで攪拌した後に、室温に５分間放置し、2,000×gで５分間遠心分離し、細胞残骸を取り除いた。
この上澄をエッペンドルフチューブ２本に移し、４℃にて10,000×gで20分間遠心し、鶏痘ウイルスを含む沈殿物を回収した。
この沈殿物に1μg/mLのDNase、1μg/mLのRNase A、0.6mM NaClを含む12.5mMトリス塩酸(pH7.5)を1mL加えて、37℃にて30分間静置した。その後、0.5M EDTAを25μL、10％ＳＤＳを125μL、滅菌蒸留水を87μL、10mg/mLのプロテアーゼKを12.5μL、2-メルカプトエタノールを0.5μL加えて、55℃で30分間静置した。
その溶液をエッペンドルフチューブ３本に400μLずつ分注し、各エッペンドルフチューブをそれぞれ等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1(v/v/v))混合液で２回抽出処理した。
20,000×gで、４℃にて２分間の遠心により分離された水層を別のエッペンドルフチューブに移した。ここに、5MのNaClを16μL加え、さらに-20℃で冷やした100％エタノールを１mL加えて-20℃に30分間放置した。ついで、４℃、20,000×gで10分間遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。この沈殿物を70％エタノールで洗浄後、乾燥させた。
（２）コピー数の検討
このＤＮＡを適当量の1mM EDTA含有10mMトリス塩酸(pH8.0)溶液（以下、TE溶液という）で溶解して使用した。
上記ＤＮＡをTE溶液に溶かし、その0.6μg相当のＤＮＡを、0.8％アガロースゲルを担体とする電気泳動にかけ、100V、２時間の条件で電気泳動した。
その結果、分子量マーカーであるλHindIII切断ＤＮＡの最大長のバンド(23kbp)より分子量の大きい位置に一本、５kb付近に１本の合計２本のバンドが確認された。23kbの大きいバンドは鶏痘ウイルスのゲノムＤＮＡであるが、５kbの小さいバンドのＤＮＡは文献などでも今までに報告されていないものである。
アガロースゲル上におけるこの５kbpのＤＮＡのバンドのＵＶ吸収（260nm）の強さは、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡ（約300kb）の約半分程度であった。したがって、ゲノムの大きさが約60:1(300kbp:5kbp)であるにもかかわらず、UV吸収の強度が約半分程度ということは、この５kbのＤＮＡの細胞当たりのコピー数が多いことを示し、そのコピー数は鶏痘ウイルスの約30倍と推計された。
この場合、マーカーに用いたλHindIII切断ＤＮＡの量及びサンプルＤＮＡの量とサンプルを調製した細胞数から計算すると、この５kbのＤＮＡのコピー数は細胞あたり10,000以上であった。
（実施例２）ＤＮＡベクターのサブクローニング
実施例１で見出された５kbのＤＮＡを解析する第一歩として、このＤＮＡのサブクローニングと制限酵素地図の作成を行った。尚、サブクローニングに用いたプラスミドベクターは、市販のpUC18プラスミドのSphI制限酵素切断部位（以下、制限酵素切断部位をサイトという）にBglIIサイトを合成ＤＮＡを使って導入したプラスミドpUCXGを用いた。
実施例１の手順で調製したＤＮＡ溶液（ＤＮＡ濃度10〜100μg/mL）を１〜10ユニット/mLの制限酵素EcoRI、BglII、XbaIを単独もしくは、２種類組み合わせて切断した。EcoRI単独の切断で0.6kb、1.0kb、1.2kb、2.2kbの４断片、BglIIの単独切断で1.0kb、4.1kbの２断片、XbaIの単独切断で3.5kbと1.7kbの２断片、BglIIとXbaIの二重切断で1.0kb、2.4kb, 1.7kbの３断片となった。
これらのＤＮＡをアガロースゲルから回収してpUC18XGプラスミドにサブクローニングしたところ、EcoRI切断断片の0.6kb、1.1kb、BglIIとXbaI二重切断断片の2.4kbの断片がサブクローニングでき、これらサブクローンをそれぞれNo.17、No.16、No.72-2と命名した（図２参照）。
末端を含む領域をサブクローニングするため、実施例１で見出された５kbのＤＮＡ（10μg）をＤＮＡポリメラーゼＩ（10ユニット/mL）処理した後、EcoRIで切断して1.3kbの断片と2.0kbの断片とを得た。これら２つの断片を、それぞれSmaIとEcoRIで二重切断したpUC18XGプラスミドにサブクローニングしたところ、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを得ることができた。それらの各クローンをNo.20、No.22と命名した（図２参照）。
また、No.22のクローンをHindIIIで切断して出現した0.94kb、0.5kb、0.5kbの断片をそれぞれNo.73-1、No.73-2、No.73-3クローンと命名し、これらをHindIIIで切断したpUC18にサブクローニングした。同じくNo.22のクローンをXbaIとStuIとで二重切断して出現した1.5kbの断片をNo.73-9と命名し、XbaIとSmaIとで二重切断したpUC18XGにサブクローニングした。
更に、No.20のクローンをStuIとHindIII、StuIとBglIIとでそれぞれ二重切断して出現した0.8kb、0.9kbの断片をNo.73-10、No.73-12と命名し、それぞれSmaIとHindIII、SmaIとBglIIとで二重切断したpUC18XGにサブクローニングした。
実施例２のサブクローンの位置関係とＤＮＡベクターの制限酵素マップを図２にまとめて表示した。
（実施例３）ＤＮＡベクターの塩基配列解析
実施例２で作製した各サブクローンの塩基配列を、塩基配列解析キット(ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)とABI全自動シークエンサーで解読した。
テンプレートとして各サブクローンの入ったプラスミドを、プライマーとして東洋紡（株）から市販されているＰ７、Ｐ８オリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐ７及びＰ８プライマーでは読めない領域は、読み終えた箇所の配列を元に作製した合成ヌクレオチドを新たなプライマーにして、同じく塩基配列を解読した。これらのプライマーの配列を配列番号６〜７に示す。
一連の解析データを繋ぎあわせて解読したこのＤＮＡベクターの全塩基配列を配列番号２に記載する。
シークエンスの結果、このＤＮＡには以下のような特徴があることがわかった。
▲１▼全長は5,243bpでAT含量が63.5％と多い。
▲２▼217bpの逆位末端反復配列が両末端に存在し、それらのITR内には配列番号１で示す30bpの繰り返し配列が１塩基の空きもなくタンデムに３回連続している。
▲３▼４つの蛋白翻訳領域が存在し、これらの翻訳領域は、それぞれ179aa、173aa、864aa、190aaのアミノ酸をコードしている。また、そのＯＲＦの翻訳開始コドンの上流にはワクシニアウイルスの転写後期プロモーターのコンセンサス配列TAAATが存在する。
▲４▼配列番号１の塩基配列を使ってＤＮＡ配列のデータベース(GeneBank R92.0)のホモロジーサーチを行ったが、類似したものは見つからなかった。
▲５▼４つのＯＲＦがコードするそれぞれのアミノ酸配列でタンパク質データベース(PIR R46.0、SWISS-PROT R32.0、PROSITE R13.0)のホモロジーサーチをしたが、類似性の高いものは見つからなかった。
このことより、配列番号２で示されるＤＮＡは今までに報告されていない新規なＤＮＡであることがわかった。
（実施例４）ＤＮＡベクターを含むプラスミドの作製と細胞への導入（図３参照）
（１）ＤＮＡベクターを含むプラスミドの作製
実施例３で得たNo.20、No.22、No.72-2の３つのクローンをそれぞれ含むpUC18XGプラスミドを使って、図３に示す手順で5,243bp全長ＤＮＡを含むプラスミドを構築し、このプラスミドをpPAD01と命名した。すなわち、No.72-2とNo.22とをXbaIとBamHIとでそれぞれ二重切断して5.1kbと1.8kbのＤＮＡ断片を回収し、ライゲーションしてNo.72-22を構築した。No.20をBglIIで切断して得られる1.1kbの断片と、No.72-22をBglIIとBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase;宝酒造製）とで切断して得られた6.9kbの断片をライゲーションし、pPAD01を構築した。
pPDA01で常法に従って大腸菌TG1を形質転換した。
このpPAD01で形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性で選択することができ、pUC18などの通常使用されるプラスミドと同様に大腸菌から容易に調製することができる。その上、このpPAD01を制限酵素BamHIで切断するだけで5,243bpの直鎖状ＤＮＡ断片を切り出すことができる。
pPAD01で形質転換した大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地中で37℃で16時間、培養して大量に増やし、そこから常法に従ってpPAD01プラスミドを調製した。このpPAD01プラスミド５μgをBamHIで切断した後、T4ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションさせたＤＮＡを予め用意した。
鶏痘生ワクチン株の一つであるCEVA株（米国農務省認可）を感染させたＣＥＦ細胞からは本発明のＤＮＡベクターは検出されなかったので、このCEVA株を感染させたＣＥＦ細胞に、上記のpPAD01から切り出しセルフライゲーションしたＤＮＡをエレクトロポレーションで導入した。
具体的には、直径1.5cmのディッシュにEagle's MEM培地中で培養したＣＥＦ細胞に鶏痘ウイルスCEVA株をm.o.i.（感染価）＝１で感染させた。感染４時間後にＰＢＳで細胞を２回洗浄し、トリプシン処理をして細胞をディシュ底面からはがし、血清（5％CS）入りのMEM培地を加えてトリプシン消化を止めるとともに、細胞を50mL用ファルコンチューブに集めた。1,000×gで５分間の遠心分離を行い、遠心上澄を捨てたのち、Saline G緩衝液（8.0g NaCl、0.4g KCl、0.395g Na2HPO4・12H2O、0.2g KH2PO4、0.1g MgCl2・6H2O、0.1g CaCl2・6H2O、1.1gグルコース/L）で細胞を洗浄した。
もう一度、0.8mLのSaline Gで細胞を懸濁し、この0.7mLをエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に移した。ここに、予め用意したセルフライゲーションしたＤＮＡを加えて、1.2ｋV、25μFの条件でエレクトロポレーションした。その後、室温に10分静置して25cm2フラスコに細胞を移し、MEM培地を5mL添加し、37℃のCO2インキュベーター中で６日間培養した。
６日後、フラスコごと培養液を凍結融解した。凍結融解を３回繰り返した後、この培養液をファルコンチューブに移し、４℃、5,000×gで５分間遠心して細胞の残骸を除いて上澄み液を回収した。この液中には鶏痘ウイルスCEVA株と複製したＤＮＡベクターとが入っている。
直径９cmデッィシュ中MEM培地でサブコンフレントまで培養した別のＣＥＦ細胞にこの液を1/10量添加し、１週間培養した。１週間後に、実施例１で示した方法によって感染細胞からＤＮＡを回収した。0.8％アガロースゲル電気泳動で見てみると、約５kbのＤＮＡが大量に確認された。
一方、５kbのＤＮＡを鶏痘ウイルス未感染細胞に導入した場合には、ＤＮＡベクターは検出されず、このＤＮＡベクターが鶏痘ウイルス感染細胞のみで複製することが示された。
（実施例５）組み換えＤＮＡベクターの構築
（１）pPADd1(4541-4922)の構築（図４参照）
pPAD01を制限酵素Eco81IとSpeIとで二重切断し、反応緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼＩ（10ユニット/mL）により平滑末端にした。その後、T4ＤＮＡリガーゼで環状にして大腸菌TG1を形質転換し、7.5kbのプラスミド断片の末端をアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。
出現したアンピシリン耐性コロニーをいくつか拾い、常法に従ってそれらの形質転換体からプラスミドを回収し、全長が7.5kbで、BamHIで切断した時4.8kbの断片が切り出されるプラスミドを選択した。このプラスミドは配列番号２の4,541〜4,922番目までのＤＮＡ領域が欠損したものを含むプラスミドであり、pPADd1(4541-4922)と命名した。
（２）pPADrepL(4541-4922)の構築（図４参照）
pPAD01を制限酵素Eco81IとSpeIとで二重切断して7.5kbのプラスミド断片を回収し、配列番号３で示すＤＮＡ配列と、これと対を形成するＤＮＡ断片（配列番号４）とからなる合成ＤＮＡアダプターとをT4ＤＮＡライゲースを使ってライゲーションして、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の配列番号２の4,541〜4,922番目までのＤＮＡ領域が合成アダプターと置換されたプラスミドを構築した。
この合成アダプターにはNheI、BlnI、SalI、XhoI、SacIサイトの塩基配列があり、この場所に外来遺伝子を挿入しやすくしたものである。このプラスミドをpPADrepL(4541-4922)と命名した。
（３）pPADin(4541-4759)P7.5:lacZの構築（図１及び４参照）
（３−１）pNZ76の構築（図１参照）
ワクシニアウイルスWR株の7.5KダルトンのペプチドをコードするＤＮＡのプロモーターを含む約0.26KbpのSalI〜RsaI断片(Cell, 125:805-813(1983))を、pUC9のSalI〜SmaI部分に組込み、プラスミドpUWP-1を構築した。
10μｇのpMA001(Shirakawaら、Gene, 28:127-,(1984))をBamHIで消化した。２μgのpUC18(ファルマシア社製)をBamHIで消化した後、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿により、開裂したpUC18を回収した。5'-末端リン酸をアルカリホスファターゼで処理して除去し、ＤＮＡを再びフェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノールで沈殿させて回収した。
開裂した0.2μgのpUC18と、BamHIとHindIIIとで消化した１μgの精製APV(ＮＰ株)ＤＮＡとをリガーゼによって連結し、これによってコンピテントな大腸菌JM103を形質転換し、形質転換体を得た。
この形質転換体を、0.03％の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、0.03mMのイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド、40μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で、15時間、37℃にて培養した。寒天培地上に生育した形質体のうち、白色コロニーをとり、40μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で、15時間、37℃にて培養した。形質転換体を回収し、ビルンボイムとドーリーの方法（Nucleic Acid Research, 7:1513-,(1979)）に従ってプラスミドを抽出し、EcoRIとHindIIIとで二重消化した。この二重消化断片を0.6％アガロース電気泳動によって、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（約3.3Kbp）を回収した。
一方、0.3μgのpUC19をBamHIで消化し、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿により回収した。この回収pUC19とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とをリガーゼでライゲーションし、組換えプラスミドpNZ66を作製した。
一方、40μgのpUWP-1をHpaIIとEcoRIとで二重消化し、15％の低融点アガロース電気泳動（70V、６時間）にかけて7.5Kプロモーターを含む約0.26kbpの断片を分離し、アガロースゲルを細かく砕いてTE緩衝液（10mMトリス塩酸、１mM EDTA、pH 8.0）でＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片は付着末端を有するため、ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、7.5Kプロモーター遺伝子を得た。
0.3μgのpNZ66をHincIIで消化し、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿により回収した。このHincII消化pNZ66（β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む）と上記のようにして得た7.5Kプロモーター遺伝子とをリガーゼを用いてライゲーションし、プラスミドpNZ76を得た。
（３−２）pPADin(4541-4759)P7.5:lacZの構築（図４参照）
上記（３−１）のようにして得たpNZ76をHindIIIとSalIとで切断し、ワクシニアウイルスの7.5Kプロモーター遺伝子と、その直後に大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子とが繋がった約3kbpのＤＮＡ断片を切り出し、0.8％アガロースゲル電気泳動（100V、40分）した後にアガロースゲルから回収した。
また、pPAD01をHindIII/BlnIで切断して出現する3.3kbのＤＮＡ断片、及びpPADrepL(4541-4922)をSalI／BlnIで切断して出現する4.5kbのＤＮＡ断片も同じく回収した。
回収した３断片を、T4ＤＮＡライゲースでライゲーションして大腸菌TG1を形質転換した。形質転換により出現したアンピシリン耐性形質転換体の中から、lacZ遺伝子を含む約３kbのＤＮＡ断片が、配列番号２の4,541番目〜4,759番目のＤＮＡ領域に挿入された全長約10.8kbのプラスミドを持つものを選択した。
このプラスミドをpPADin(4541-4759)P7.5:lacZと命名した。
（実施例６）  組み換えＤＮＡベクターの細胞への導入と外来遺伝子の発現
（１）配列番号２の4,541〜4,922の塩基配列が欠損した組み換えＤＮＡベクターの細胞への導入
実施例４のpPAD01の代わりに実施例５の（１）で構築したpPADd1(4541-4922)を用いること以外は全く同様にして、配列番号２の4,541〜4,922番目の塩基配列が欠損した組み換えＤＮＡベクターが細胞へ導入できないかどうかを調べた。
その結果、鶏痘ウイルス感染細胞にエレクトロポレーションで導入した場合、4.8kbのＤＮＡベクターが複製されることが判明した。
（２）配列番号２の4,541〜4,922の塩基配列が32bpのマルチクローニングサイトと置換されている組み換えＤＮＡベクターの細胞への導入
実施例４のpPAD01の代わりに実施例５の（２）で構築したpPADrepL(4541-4922)を用いること以外は全く同様にして、配列番号２の4,541〜4,922の塩基配列が32bpのマルチクローニングサイトと置換されている組み換えＤＮＡベクターが細胞へ導入できないかどうかを調べた。
その結果、やはり鶏痘ウイルス感染細胞にエレクトロポレーションで導入した場合に、4.8kbのＤＮＡベクターが複製された。
（３）配列番号２の4,541〜4,759の塩基配列領域にワクシニアウイルス7.5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とが挿入された組み換えＤＮＡベクターの細胞への導入とβ−ガラクトシダーゼの発現
（３−１）上記組み換えＤＮＡベクターの細胞への導入
pPADin(4541−4759)P7.5:lacZで形質転換した大腸菌TG1をMEM中、37℃で40mL培養し、その菌体からプラスミドpPADin(4541−4759)P7.5:lacZを約50μg調製した。
鶏痘ウイルスCEVA株をm.o.i.=0.2で感染させて４時間後のＣＥＦ細胞（１×107細胞）をトリプシン処理で回収し、実施例４で示すようにSaline Gで懸濁した0.7mLにpPADin(4541−4759)P7.5:lacZをエレクトロポレーションで導入した。
その後、室温に10分静置して25cm2フラスコに細胞を移し、MEM培地を５mL添加した。６日後、フラスコごと培養液をドライアイス−エタノールと水浴とで凍結融解させた。
凍結融解を３回繰り返した後の培養液を15mLのファルコンチューブに移し、5,000×gで５分間の遠心条件で細胞残骸を除いたFPVと組み換えＤＮＡベクターとを含む調製液を回収した。
（３−２）β−ガラクトシダーゼの発現
この液をMEM培地で10倍ずつ４回段階希釈して、その１mLを直径９cmのディッシュ中で37℃でサブコンフレントになるように培養した別のＣＥＦ細胞に添加し、１時間後に上清を捨てた後、0.8％の寒天を含むMEM培地を重層して約６日間培養した。
500μg/mLのブルオガル（Halogenated indolyl-β-D-galactoside;GIBCO BRL社の商品名Bluo-gal）を添加した0.8％の寒天培地を更に重層し、37℃のCO2インキュベーター中に静置したところ、３時間後にはディッシュ中に青いプラークが多数見出された。これらのプラークはβ−ガラクトシダーゼが発現したことを示している。
（実施例７）組み換えＤＮＡベクターと組み換え鶏痘ウイルスベクターの外来遺伝子との発現量の比較
実施例６の最後の所で得られた青色プラークをパスツールピペットで抜き取り、１mLのMEM培地に懸濁し、10〜1,000倍に段階希釈して直径９cmのディッシュでMEM培地にて培養されたＣＥＦ細胞（１×107個）に添加し、１時間後に上清を捨てた。この後に、0.8％寒天培地を重層して37℃で約６日間培養した。
500μg/mLのブルオガル(Halogenated indolyl-β-D-galactoside;GIBCO BRL社の商品名Bluo-gal)を添加した0.8％寒天培地を更に重層し、37℃のCO2インキュベーター中に静置した。
約３時間後には青色プラークが多数出現したので、できるだけ他のプラークと離れた青プラークを選択して、それをパスツールピペットで抜き取り、１mLのMEM培地に懸濁した。
この懸濁液を1.5cmのディッシュ中MEM培地で培養されたＣＥＦ細胞（１×106個）に添加し、１時間後に上清を捨て、20mLの新鮮なMEM培地を添加して１週間培養した。
実施例４と同様に、培養細胞から凍結融解によって鶏痘ウイルスと組み換え新規ＤＮＡベクターとを含む調製液を回収した。そして、この液に含まれる鶏痘ウイルスのウイルス量を測定した。
培養したＣＥＦ細胞が入った直径９cmデッシュ６枚に、鶏痘ウイルスがm.o.i.=１となる様にこの液を適当に希釈して加えた。添加後０時間、５時間、10時間、24時間、48時間、72時間後にそれぞれ１枚のディッシュの感染細胞を集め、ＰＢＳで細胞を洗浄して、0.5mLのＰＢＳに懸濁させた後、このサンプルを−20℃で凍結した。
予定したサンプルが全て揃った後にサンプルを融解させ、クロロホルムを２滴添加し、その10μLを酵素反応溶液(60mM Na2HPO4・7H2O、40mM NaH2PO4・H2O、10mM KCl、1mM MgSO4・7H2O、50mM β−メルカプトエタノール）990μLに加えた。
この反応液を28℃でインキュベートし、酵素反応液で4mg/mLの濃度に溶かした基質ONPG（o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド(シグマ社製；製品番号N1127）を0.2mL加えて酵素反応を開始し、適当な時間で1M K2CO3で酵素反応を止め、420nmの吸光度を測定した。
また対照サンプルとして、fNZ1029を同様にm.o.i.=１でＣＥＦ細胞に感染させ、β−ガラクトシダーゼの発現量を調べた。fNZ1029は特開平第1-168279号公報（米国特許第5,387,519号）で開示されているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入された組み換え鶏痘ウイルスである（図６）。
尚、定量に当たってシグマ社より市販されているβ−ガラクトシダーゼ（製品番号G6512）を酵素標品とした。
その結果を表１に示すが、明らかに組み換え新規ＤＮＡベクターによるβ−ガラクトシダーゼ発現量の方が組み換え鶏痘ウイルスベクターよりも大きく、数10倍以上となっている。組み換えベクター及び組み換え鶏痘ウイルスの挿入遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）やそのプロモーターは同じであるので、この発現量の差はベクターの細胞内でのコピー数によるものと考えられる。
0003924328.tif 000007
（実施例８）
社団法人動物用生物学的製剤協会(Japanese Association of Veterinary Biologics)が管理している家畜衛生菌株(Cultures for Animal Hygiene)のうち、鶏痘ウイルスNishigahara株（菌株番号VA0104）を同協会より入手した。
実施例１の泗水株の代わりにこの株を使用して同様の操作により感染細胞からやはり、５kbのＤＮＡが得られた。このＤＮＡは泗水株から得られた新規ＤＮＡベクターをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うとハイブリダイズした。
この時、対照として用いた鶏痘ウイルスのＤＮＡは全くハイブリダイズしなかったので、この５kbのＤＮＡは、鶏痘ウイルスゲノム由来のＤＮＡではないことが示された。
また調べた限りにおいては、Nishigahara株から調製された５kbのＤＮＡの制限酵素パターンは図１に示したものと同じであった。
（実施例９）抗原遺伝子を挿入した組み換えＤＮＡベクターの作製
（１）pNZ87の構築（図１参照）
pNZ76をBamHIで消化し、0.8％アガロースゲルで電気泳動して、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含まない約2.9kbの断片を回収した。
一方、ハイブリッドファージmp10-HN180をBglIIとBamHIとで二重消化し、0.8％アガロースゲルで電気泳動して、約1.8kbのNDVのHN遺伝子断片を回収した。
両者をリガーゼによって連結し、コンピテントな大腸菌TG1株を形質転換した。この形質転換体を、0.03％の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、0.03mMのイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド、40μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で、15時間、37℃にて培養した。寒天培地上に生育した形質体のうち、白色コロニーをとり、40μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で、15時間、37℃にて培養した。形質転換体を回収し、ビルンボイムとドーリーの方法（Nucleic Acid Research, 7:1513-,(1979)）に従ってプラスミドを抽出した。このようにしてHN遺伝子を含むプラスミドpNZ87を得た。
（２）抗原遺伝子を挿入した組み換えＤＮＡベクターの作製（図５参照）
上記のプラスミドpNZ87を制限酵素HindIIIとBamHIとで二重切断し、Ｓ１ヌクレア−ゼでその切断末端を平滑にした後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(体積比で25:24:1)の混合液で２回抽出処理してS1ヌクレアーゼを失活させた。ついで、アガロースゲル電気泳動（0.8％アガロースゲル、100V、40分）によって、ワクシニウイルスの7.5ｋDaプロモーターとニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を含む約1.9kbの断片を分離、回収した。
また、pPAD01をBssHIIで切断して、切断末端をS1ヌクレアーゼにより平滑にした後、BAPで末端を脱リン酸化し、フェノール処理した。この処理pAD01と先に回収した約1.9kbの断片とをライゲーションして大腸菌TG1を形質転換した。
翌日、アンピシリン耐性となった形質転換体のコロニーを選択し、形質転換体を常法に従って破砕して遠心し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをBamHIで切断し、上記のように0.8％アガロースゲル電気泳動（100V、40分）にかけて分離した。
以上の操作によって、HN遺伝子を含む約1.9kbのＤＮＡ断片が配列番号２の第377番目の位置に挿入されている全長約9.8kbのプラスミドをもつものを選択した
この目的のプラスミドをpPADin(377)P7.5:HNと命名した。
（実施例10）組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンの調製
実施例９で作製したプラスミドpPADin(377)P7.5:HNを持つ大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地40mL中で、37℃にて培養し、そこからpPADin(377)P7.5:HNを調製した。そのプラスミド５μｇをBamHIで切断後、T4ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションしたＤＮＡを予め用意した。
上記のセルフライゲーションしたＤＮＡをリポフェクチン試薬（ベーリンガーマンハイム社製、商品名Dosper Liposomal Transfection Reagent, Cat. No.1781995）を使って、鶏痘生ワクチンとして使用されているCEVA株（米国農務省認可）を感染させたＣＥＦ細胞に導入した。
具体的には、６ウエルプレートにてMEM培地で培養したＣＥＦ細胞に鶏痘ウイルスCEVA株をm.o.i.=0.2で感染させ、４時間後にMEM培地で３回洗浄し、0.5mLのMEM培地を加えた。
セルフライゲーションしたＤＮＡは、エタノール沈殿後、ＨＢＳ緩衝液(2.0mM HEPES, 150mM NaCl(pH7.4))50μLに溶解した。
この溶液を溶液Ａとし、試薬のDOSPER液10μLをＨＢＳ緩衝液40μLで希釈した溶液を溶液Ｂとした。溶液Ａと溶液Ｂを穏やかに混合して室温で15分放置した。
この混合液100μLを、0.5mLのMEM培地培養液に浸っている感染細胞にすこしずつ滴下した。37℃で１時間置いた後、1.5mLの培養液を追加して、更に37℃で６日間培養した。
感染細胞を培養液ごと集めて、凍結融解を３回繰返した後、5,000×gで５分間の遠心条件で細胞残骸を除いて上澄み液を回収した。この液中には鶏痘ウイルスCEVA株と組み換えＤＮＡベクターが含まれている。
この液を６回10倍希釈し、各濃度の液1mlを直径９cmディッシュで培養したＣＥＦ細胞に感染させ、0.8％の寒天を含むMEM培地10mLを重層してCO2インキュベーター中にて37℃で培養した。約６日後に、鶏痘ウイルスによるプラークがはっきり見えてきたら、パスツールピペットでプラークのウイルス24個を抜きとり、そのウイルスを24ウエルプレートで培養した新鮮なＣＥＦ細胞に各々感染させた。
24ウェルプレート中、37℃で約１週間培養し、各ウエルの培養上清を保存しておき、感染細胞に0.2％ＳＤＳの入ったＰＢＳを0.4mL加えて細胞を溶かし、その各ウエルの溶解液10μLをニトロセルロースメンブレンにブロットした。
その後、アルカリ変性液（1.5M NaCl, 0.5N NaOH）でＤＮＡを変性させた後、20×ＳＳＣ液（175.3gのNaCl、88.2gのクエン酸ナトリウム(pH8.0)/L）で中和してから風乾し、80℃で１時間放置してベーキングした。
ベーキングしたメンブレンはプレハイブリダイゼーション洗浄液（５×ＳＳＣ，0.5％ＳＤＳ，1mM EDTA）に浸して42℃で15分間洗浄した。
その後、ハイブリダイゼーション液（6×ＳＳＣ，0.5％ＳＤＳ、3％スキムミルク）中に移して68℃で１時間放置し、その後、HN遺伝子を放射性同位元素α-32P-dCTPで標識したＤＮＡプローブを加えたハイブリダイゼーション液に移して、68℃で３時間置いた。
ついで、メンブレンを２×ＳＳＣ液で２回、１×ＳＳＣ液で１回、0.2×ＳＳＣ液で１回洗浄し、風乾し、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
翌日、Ｘ線フィルムを現像して、黒くなったスポットに対応するウエルの保存上清を、再び10倍ずつ段階希釈し、９cmディッシュに培養した新鮮なＣＥＦ細胞に感染させ、0.8％の寒天を含むMEM培地10mLを重層して、5％CO2インキュベーター中にて37℃で培養した。
プラークが形成されたら、パスツールピペットで前と同じように24個のプラークからパスツールピペットでウイルスを抜き取り、24ウエルプレートのＣＥＦ細胞に各々感染させた。前と同じ操作を繰返し、すべてのウエルのスポットがすべてＤＮＡプローブと反応するまで行った。
すべてのプラークに組み換えＤＮＡベクターを含むことが確認できたところで、それをＣＥＦ細胞で培養して鶏痘ワクチンを作製するのと同じ方法でワクチン液を調製した。
こうして作製したワクチン液には、組み換えＤＮＡベクター数が鶏痘ウイルスワクチン株のＤＮＡより約20倍多い割合で含まれていた。
（実施例11）組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンによる鶏の免疫の効果
実施例10で調製したワクチン液を、鶏痘ウイルスの力価で106pfu/mlになるように適当にＰＢＳで希釈し、0.01mLを７日齢のＳＰＦ鶏の右側翼膜に接種した。免疫２週間後に採血し、血清中のニューカッスル病の赤血球凝集抑制抗体（以下ND-HI抗体と称す）を測定した。
具体的には、以下のように行った。被検血清を２倍段階希釈した25μLの液に、４赤血球凝集単位のＮＤＶ抗原25μLを加えて混和し、10分間静置して感作した。その後、0.5％の鶏赤血球液50μLを加えて室温で45分間静置し、赤血球凝集を観察した。
ND-HI抗体価は赤血球凝集抑制が認められた血清の最高希釈倍数で表した。
また比較対照実験として、米国特許第5,286,639号の実施例９で用いたpNZ2237株（図７参照）でも同様に免疫し、ND-HI抗体価を測定したところ、本発明の組み換えＤＮＡベクターを有効成分とするワクチンは従来の組み換え鶏痘ウイルスワクチンよりも約２倍高いHI抗体を誘導していることがわかった。
産業上の有用性
本発明によれば、動物細胞において、ウイルスベクターの数10倍ものコピー数となる新規なＤＮＡベクター、及びこのベクターを用いて外来遺伝子を高発現させる方法が得られ、動物細胞発現用ベクターとして、あるいはワクチンとして利用できる。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：30塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列
0003924328.tif 000008
配列番号：2
配列の長さ：5243塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列
0003924328.tif 000009
0003924328.tif 000010
0003924328.tif 000011
0003924328.tif 000012
配列番号：3
配列の長さ：31塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA他の核酸  合成DNA
配列
0003924328.tif 000013
配列番号：4
配列の長さ：32塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003924328.tif 000014
配列番号：5
配列の長さ：84塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003924328.tif 000015
配列番号：6
配列の長さ：18塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：7
配列の長さ：18塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003924328.tif 000017
配列番号：8
配列の長さ：41塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：9
配列の長さ：塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：10
配列の長さ：塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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