(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノメートルサイズの直径の細孔を有する多孔性シリカの内部に下記の式（１）で表わされる界面活性物質が含有されていることを特徴とする複合構造体。
【化１】
0003898961.tif 000005
〔式（１）中、Ｘはカチオン性または非イオン性の親水部を表わし、Ｙは脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素から成る疎水部を表わし、Ａは下記の式（２）で表わされるアミノ酸残基またはその修飾体を表わす。〕
【化２】
0003898961.tif 000006
〔式（２）中、Ｒは−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−とともにアミノ酸残基を構成する官能基または原子団を表わし、ｎは１から１０の整数である。〕
【請求項２】
多孔性シリカがヘキサゴナル相を呈していることを特徴とする請求項１の複合構造体。
【請求項３】
Ｘが第４級アンモニウムイオンを含むカチオン性官能基または原子団を表わし、Ｙが炭素数１２〜１８のアルキル鎖を表わすことを特徴とする請求項２の複合構造体。
【請求項４】
請求項１の複合構造体を製造する方法であって、式（１）で表わされる界面活性物質、シリカ源、ゾルゲル反応触媒および水を含む反応溶液を調製してゾルゲル反応を行い、生じたゲルをろ過した後、乾燥することを特徴とする方法。
【請求項５】
界面活性物質として式（１）においてＸが第４級アンモニウムイオンを含むカチオン性官能基または原子団であり、Ｙが炭素数１２〜１８のアルキル鎖であるものを用い、シリカ源としてアルコキシドを用い、ゾルゲル反応触媒として塩酸を用いることを特徴とする請求項４の複合構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Biomineralizationによる無機有機複合構造体の技術分野に属し、特に、生体モデルの材料等として有用な新規な複合構造体とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
所謂Biomineralizationは、生体内の物質の機能を模擬して薬剤、試薬、または機能素子等として有用な材料を人工的に作り出す技術であり、この目的で各種のタンパク質材料やペプチド材料が案出されているが、未だ実現されていない分野も多い。
【０００３】
例えば、狂牛病などのプリオン病やアルツハイマー病などの原因として最近注目されているベータアミロイドは、タンパク質やペプチドの二次構造が変異して形成される平行ベータシート構造主体の不溶性繊維構造であり、したがって、ペプチドの平行ベータシート構造の人工モデルとなるような材料が得られれば、それらの疾病を解析し、診断や治療のための各種の試薬や薬剤などの開発に資することができるものと期待されるが、そのような材料は殆ど見当らない。
本発明の目的は、平行ベータシート型のペプチド等の生体モデル等として有用な材料となり得る新規な人工構造体を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、有機化合物を鋳型として無機有機複合構造体を合成する技術を利用し、これをさらに発展させることにより、上記のごとき目的を達成し得る本発明を導き出したものである。
【０００５】
かくして、本発明に従えば、ナノメートルサイズの直径の細孔を有する多孔性シリカの内部に下記の式（１）で表わされる界面活性物質が含有されていることを特徴とする複合構造体が提供される。
【０００６】
【化３】
0003898961.tif 000002
【０００７】
式（１）中、Ｘはカチオン性または非イオン性の親水部を表わし、Ｙは脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素から成る疎水部を表わし、Ａは下記の式（２）で表わされるアミノ酸残基またはその修飾体を表わす。
【０００８】
【化４】
0003898961.tif 000003
【０００９】
式（２）中、Ｒは−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−とともにアミノ酸残基を構成する官能基または原子団を表わし、ｎは１から１０の整数である。
本発明に従えば、さらに、上記の複合構造体を製造する方法であって、式（１）で表わされる界面活性物質、シリカ源、ゾルゲル反応触媒および水を含む反応溶液を調製してゾルゲル反応を行い、生じたゲルをろ過した後、乾燥することを特徴とする方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
界面活性物質（界面活性剤）の集合構造（例えば、棒状ミセル）を鋳型として、その周囲（表面）で適当なシリカ源を原料としてゾルゲル反応を行わせてシリカを合成し、その後に鋳型と成る界面活性物質を焼成などの手法によって除くと、ナノメートルサイズから数十ナノメートルサイズの直径を持つ細孔が規則的に並んだ多孔性シリカ、所謂メソポーラスシリカを作製できることが知られている（例えば、C.T. Kresge他、Nature, 359, 710 (1992)）（図１参照）。
【００１１】
しかしながら、従来の多孔性シリカ作製法では、界面活性剤の持つ機能構造をそのまま保持して利用するものはほとんどない。特に、アミノ酸やペプチドのような生体由来の残基が集積して形成する特異集合構造を細孔内に固定化したものは見られない。これは、従来のメソポーラスシリカの作製においては、界面活性物質は、専ら、最終的に得られるシリカの構造を制御するための鋳型としてのみ留意され、したがって、単純な親水頭部と疎水尾部とから成る非常に簡単な構造の界面活性物質が用いられ、付加価値のないものとして除去されていたからである。
【００１２】
本発明は、既述の式（１）で表わされる新規な界面活性剤を内包することにより、平行ベータシート型ペプチドのモデル等として有用な機能が付与された多孔性シリカから成る機能性ナノ無機有機複合体である。
【００１３】
式（１）から理解されるように、本発明において用いられる界面活性物質は、親水部（親水頭部）Ｘと疎水部（疎水尾部）Ｙとの間にアミノ酸関連残基Ａが導入された構造から成る。ここで、アミノ酸関連残基とは、既述の式（２）から明らかなようにアミノ酸残基、またはその修飾体である。修飾体とは、生体内でよく見られるようなタンパク質の変化を引き起こすような各種の反応に因りアミノ酸が変化したものであり、例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化等に因るものが挙げられる。本発明に従えば、目的とする生体モデルに応じて、（１）式で表わされる界面活性物質に導入されているアミノ酸としてそのような修飾体を用いることもできる。
【００１４】
式（２）において、Ｒは、以上の説明からも既に明らかなように、式（２）に示す−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−とともにアミノ酸残基を構成する官能基または原子団を表わす。すなわち、Ｒは、例えば、ＣＨ3（アラニンの場合）、ＣＨ2Ｐｈ（フェニルアラニンの場合：Ｐｈはフェニル基）、(ＣＨ3)2ＣＨ（バリンの場合）、(ＣＨ3)2ＣＨＣＨ2（ロイシンの場合）、ＣＨ2ＯＨ（セリンの場合）、ＣＨ3(ＯＨ)ＣＨ（トレオニンの場合）、ＣＨ2−ＳＨ（システインの場合）等を表わす。アミノ酸（アミノ酸残基）の数を定めるｎは、原理的には特に制限はないが、得られるモデル材料の安定性の点から、一般に１〜１０が好ましく、１〜６が特に好ましい。なお、導入されるアミノ酸（アミノ酸残基）は、必ずしも同一のアミノ酸でなく、複数種のアミノ酸であってもよく、式（２）はそのような態様も含むものとして表現している。さらに、人工の生体モデル系を提供する本発明の構造体においては、導入するアミノ酸は、目的に応じてＬ体またはＤ体のいずれでもよく、Ｌ体およびＤ体を混合して導入してもよい（後述の実施例４参照）。
【００１５】
本発明で用いられる界面活性物質を表わす式（１）において、Ｘは、カチオン性または非イオン（ノニオン）性親水部を表わすが、安定な構造体を得る点からはカチオン性の官能基または原子団から成るものが好ましい。図２に、式（１）で表わされる本発明で用いられる界面活性物質の親水部を構成するのに好ましい官能基または原子団の例を示しているが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明で用いられる式（１）の界面活性剤において、Ｙは、界面活性物質の構成成分として従来より知られた各種の脂肪族炭化水素基または芳香族炭化水素基から成る疎水部を表わす。図３に、本発明で使用される界面活性物質の疎水部を構成するのに好ましい官能基または原子団の例を示しているが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の複合構造体を構成する界面活性物質は、既知の合成反応を工夫することにより得られる。すなわち、概説すれば、式（１）の界面活性物質（界面活性剤）は、一般に、次のように合成される。まず、所望のアミノ酸のＣ末端を長鎖アルコールとの反応で長鎖アルキル基を持つエステルとする（Ｙ部の導入）。次に、このアミノ酸のＮ末端に所望のアミノ酸を定法のペプチド伸張反応によって逐次的にアミノ酸を縮合してゆく、この反応により、所望の長さと組み合わせのペプチド鎖が形成される（Ａ部の形成）。さらにペプチド鎖のＮ末端をブロモ酢酸ブロミドのような試薬との反応でアミド化しブロモ基を導入する。最後に、ジメチルアリルアミンなどの適当なアミンによる四級化反応を行い、親水部Ｘを導入して、式（１）の界面活性剤を合成することができる。ただし、界面活性剤の合成法はこれに限定されるものではなく、Ｘ、Ａ、Ｙの組み合わせに応じた手法がとられる。
【００１８】
本発明は、以上のような界面活性物質を鋳型として、その周囲（表面）でゾルゲル反応によりシリカが生成することにより、多孔性シリカの内部に界面活性物質が含有された複合構造体である。ここで、骨格と成る多孔性シリカ（メソポーラスシリカ）の構造は、界面活性物質の集合構造により制御される。
【００１９】
本発明の原理は、使用する界面活性物質の種類や作製条件に応じて、棒状ミセル、層状二分子膜構造、球状ミセル等の界面活性物質の各種の集合構造を鋳型とし、それに応じて各種の構造の多孔性シリカを作製するのに適用できるが、特に、シリンダー状の細孔が蜂の巣状に配列した所謂ヘキサゴナル（六方晶）相の多孔性シリカを得るのに好適である。図４には、後述の実施例にも記すように、本発明に従いヘキサゴナル相を呈する多孔性シリカを得るのに好適な界面活性物質の例を示している。すなわち、図４に示すように、本発明で用いられるのに好適な界面活性物質として好ましい例は、式（１）において、Ｘが第４級アンモニウムイオンを含むカチオン性官能基または原子団から成り、Ｙが炭素数１２〜１８のアルキル鎖から成るものである。
【００２０】
本発明の複合構造体は、如上の式（１）で表わされる界面活性物質、シリカ源、ゾルゲル反応触媒および水を含む反応溶液を調製してゾルゲル反応を行わせるという簡単な方法により製造することができる。シリカ源としては、アルコキシド、
水溶性珪酸塩、コロイダルシリカなどの種々のものが使用可能であるが、ヘキサゴナル相の多孔性シリカを得るのに好ましいのは、テトラエトキシシラン（オルト珪酸テトラエチル：ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン、メチルトリエトキシシランなどのアルコキシドである。ゾルゲル反応触媒とは、アルコキシド等のシリカ源を加水分解し、重縮合させる反応の触媒であり、酸、アルカリ、アミン等があるが、ヘキサゴナル相の多孔性シリカを得るために既述したような界面活性物質と組合せて用いられるのに好適な触媒は塩酸である。反応溶液には、必要に応じて混合を円滑にするため有機溶媒を添加してもよい。
ゾルゲル反応は、軽く加熱した後、冷却してゲル生成を促進するように行ってもよいが、一般的には、２０〜３０℃の常温下に実施することができる。反応時間は、一般に、２〜１０時間程度である。
【００２１】
本発明の方法においては、界面活性物質、シリカ源、ゾルゲル反応触媒、および水を混合するだけで、該溶液中で、界面活性物質が自己組織化して棒状ミセルのような集合構造を形成し、この界面活性物質の集合構造を鋳型として、その周囲（表面）上で如上のゾルゲル反応が進行し、シリカ源が加水分解、重縮合しゲル化することにより、界面活性物質を内包したシリカの構造体が形成するものと考えられる。
【００２２】
本発明の方法に従えば、以上のようなゾルゲル反応が終了した後、生成したゲルをろ過し、乾燥に供することにより、多孔性シリカの内部に界面活性物質が含有された目的の構造体が得られる。すなわち、本発明においては、従来の手法のように鋳型の界面活性物質を取り除かずに、界面活性物質と多孔性シリカとから成る複合構造体として単離する。乾燥手段は、特に限定されず、真空乾燥の他、常温常圧下の自然乾燥でもよい。乾燥後に、白色粉末として複合構造体が得られる。
【００２３】
以上のようにして得られる本発明の構造体では、ナノメートルサイズから数十ナノメートルサイズ（一般に２〜５０ｎｍ）の直径の細孔を有する多孔性シリカの内部に、界面活性物質がその分子間の相互作用を介して集合しており、アミノ酸関連部分〔式（１）のＡ〕としてオリゴペプチドを用いれば、この部分は平行ベータシート型の集合構造をとる。図５は、ヘキサゴナル相を呈する多孔性シリカの内部で界面活性物質（界面活性剤）が集合している本発明の複合構造体を模式的に示すものである。このような構造や特性は、Ｘ線回折分析（ＸＲＤ）、赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）、電子顕微鏡、ＮＭＲなどの手段を用いて解析することにより確認することができる（後述の実施例参照）。
【００２４】
かくして、本発明は、これまで人工的な材料では困難であった平行ベータシート型のモデル等の生体モデルの構築を可能にしたものである。したがって、本発明の構造体は、例えば、平行ベータシート構造主体の不溶性繊維構造であるベータアミロイドに起因する疾病の診断試薬や薬剤をスクリーニングするのに有用である。すなわち、ベータアミロイド構造に特異的に結合したり吸着するような物質、あるいはベータアミロイド構造を壊すような物質を開発するに当たって、本発明の構造体をベータアミロイド構造のモデル物質として、これと候補物質とを混合し、その結果を適当な手段で分析することにより当該試薬や薬剤の一次的なスクリーニングを行うことができる。
【００２５】
【実施例】
以下に、本発明の特徴および効果をさらに具体的に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
なお、本明細書および図面中の化学構造式においては、慣用的な表現法に従い、炭素原子や水素原子を省略して示していることもある。
実施例１
図４に示す界面活性物質３を次のように合成した。まず、Ｌ−アラニンを1当量のヘキサデシルアルコールと1.2当量のｐ−トルエンスルホン酸存在下にトルエン中で数時間環流することにより、アラニンのヘキサデシルエステルを得た。この化合物をジクロロメタンに溶解させ、２当量のトリエチルアミン存在下で1当量のブロモ酢酸ブロミドと室温下にて反応させ、Ｎ−ブロモアセチルアラニンヘキサデシルエステルを得た。この化合物をエタノールに溶解させ、室温下で過剰量（３〜５当量）のジメチルアリルアミンと１昼夜反応させることにより、界面活性剤３を得た。各段階の収率は90％前後である。界面活性剤の構造の同定は、ＮＭＲ法などによって行った。界面活性剤３の分析データは次の通りである。
Mp:123.5−124.0℃.TLC: Rf 0(EtOAc).1H NMR(500 MHz, DMSO−d6):δ9.00(NH, d, J= 6.5 Hz, 1H), 4.30(α-CH, m, 1H), 4.12(N＋CH2, s, 2H), 4.05(COOCH2, m, 2H), 3.21(N＋CH3, s, 9H), 1.55(COOCH2CH2, m, 2H), 1.31(CH3 in Ala, d, J = 7.5 Hz, 3H), 1.23(CH2 in aliphatic chain, m, 26H), 0.84(CH3 in aliphatic chain, t, J = 7.0 Hz, 3H)。
次に、この界面活性物質３、水、濃塩酸、オルト珪酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）をそれぞれ、0.12mmol、121mmol、8.2mmol、0.96mmol混合し、室温下で4時間反応させて白色粉末を得た。この粉末をろ過後乾燥して、アラニン残基を充填した多孔性シリカを得た。さらに、このアラニン充填シリカを550℃で6時間焼結（焼成）し、アラニン残基を取り除いた多孔性シリカも比較試料として合成した。これらの２つの物質をＸＲＤおよびＦＴ−ＩＲにて分析した。その結果を図６および図７に示した。ＸＲＤの結果（図６）から、焼結処理の有無にかかわらず、ヘキサゴナルに孔が配列したことを示すピークが見られた。焼結操作によって、孔径等に若干の変化が得られるものの、ヘキサゴナルに配列したシリカの多孔骨格が安定に得られていることが確認された。ＦＴ−ＩＲ（図７）では、焼結前の物質について、アルキル鎖部分のピークの他に、アミノ酸の存在を示すアミドのピークが強く観測された。これは、焼結前の物質はアミノ酸（アラニン）を高濃度で含むことを示している。焼結操作によってこのピークは消失することから、他の混入物のゴーストピークではなく、シリカに担持された物質のピークが焼結前に観測されたことがわかった。以上から、上記操作によりアラニン残基を充填した多孔性シリカが得られることが明かとなった。
【００２６】
実施例２
図４に示す他の界面活性物質についても同様な実験を行い、アミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された多孔性シリカを合成した。そのＸＲＤおよびＦＴ−ＩＲの結果を表1にまとめた。得られた結果は界面活性剤３を用いたものと同様であり、様々な側鎖や長さのアミノ酸関連残基やオリゴペプチドを充填した多孔性シリカが本発明の方法で合成されることが明らかとなった。図８にはシリカの孔径を示す指標であるＸＲＤの（100）ピークの値をアラニン型のアミノ酸残基数に対してプロットしたものを示したが、アミノ酸残基数に応じた孔径のシリカが合成されていることがわかった。
【００２７】
【表１】
0003898961.tif 000004
【００２８】
実施例３
実施例２で得られたアミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された多孔性シリカの構造の特異性を検証するため、界面活性物質３，４または５単独の粉末物質と界面活性物質充填多孔性シリカのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した。
図９は、アルキル鎖部分の振動ピーク波数（メチレン基の非対称伸縮ピーク）をアラニン残基数に対してプロットしたものである。界面活性物質単独の粉末物質のピーク波数は、2920cm-1以下であり、粉末固体はアルキル鎖が結晶状態にあることが明かである。一方、アミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された多孔性シリカの場合には、メチレン基の非対称伸縮ピーク波数は、2920cm-1以上でありアルキル鎖がゴーシュコンフォメーションを含む非結晶状態にあることが示された。これは、界面活性物質が多孔性シリカのマトリックスに固定化されているため、単独粉末とは異なる固体状態をとるためと理解される。
図１０には、界面活性物質の単独粉末固体のＦＴ−ＩＲスペクトルのアミドカルボニルピーク部分を示す。アラニン残基の数の増加に伴い低波数ピークが見られ、水素結合性が強くなっていることが理解される。しかし、界面活性物質単独の粉末結晶では分子の配向が全く未知であるため、これらの水素結合が平行型ベータシート構造、逆平行型ベータシート構造、あるいは他の集合構造であるのかは、確定できない。
一方、アミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された多孔性シリカの場合には、多孔性シリカ内壁に対して界面活性物質の分子が平行に並んで配向するため、アミノ酸関連残基の部分は、必然的に平行ベータシート型の集積構造となり、したがって、これらの界面活性物質充填多孔性シリカは、平行ベータシート構造の水素結合性を検討する適切なモデルになり得る。界面活性物質３，４，５から作製されたアミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された多孔性シリカのＦＴ−ＩＲスペクトルのアミドカルボニルピーク部分を図１１に示す。アラニン残基数が増えるにしたがって、ピークが低波数にシフトしており、水素結合性が強くなっていることが理解される。この結果は、アミノ酸残基が増えると平行ベータシート型の二次構造中の水素結合が強固になっていくことを示し、本発明に従い界面活性物質が充填されている多孔性シリカが平行ベータシート型水素結合構造を検討するための良好なモデル物質になることを明示している。
【００２９】
実施例４
この実施例は、アミノ酸関連残基を有する界面活性物質が充填された本発明の構造体が、アミロイド構造の変化を模擬するように設計できることを示すものである。ペプチドのＤ−アミノ酸導入がアミロイド構造形成に大きな影響を与えることが知られている。本実施例では、アミノ酸関連残基としてトリアラニンを有する界面活性物質５の４種類の異性体（不斉構造が、ＬＬＬ、ＤＬＬ、ＬＤＬ、ＬＬＤのもの）を用いて界面活性物質充填多孔性シリカを合成した。それらのＦＴ−ＩＲスペクトルのアミドカルボニルピーク部分を図１２に示す。図に示されるように、Ｄ異性体が導入された界面活性物質を充填したシリカでは、低波数側の1542cm-1のピークが消失しており、Ｄ異性体を導入することにより、ベータシート構造がより不安定になることが理解される。すなわち、トリアラニンの一残基をＤ置換することにより、部分的に破壊されたアミロイドを模擬できることがわかる。以上の結果は、アミノ酸関連残基を有する界面活性物質を内包している多孔性シリカから成る本発明の複合構造体がベータアミロイド構造形成の検証のモデルになり得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来から知られた多孔性シリカ（メソポーラスシリカ）の製造方法を模式的に示す。
【図２】本発明で用いられる界面活性物質の親水部を構成するのに好ましい官能基または原子団の例の化学構造式を示す。
【図３】本発明で使用される界面活性物質の疎水部を構成するのに好ましい官能基または原子団の例の化学構造式を示す。
【図４】本発明で使用される界面活性物質の好適な例として実施例で用いられたものの化学構造式を示す。
【図５】多孔性シリカの内部に界面活性物質が含有されている本発明の複合構造体を模式的に示す。
【図６】本発明の複合構造体の１例についてのＸ線回折分析（ＸＲＤ）データを示す。
【図７】本発明の複合構造体の１例についての赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）データを示す。
【図８】本発明の複合構造体の１例についてＸＲＤピークのアミノ酸残基数依存性を示す。
【図９】本発明の複合構造体のいくつかについてアルキル鎖の振動ピーク波数のアミノ酸残基依存性を示す。
【図１０】本発明の複合構造体に用いられた界面活性物質の幾つかについてアミドカルボニルのＦＴ−ＩＲピークを示す。
【図１１】本発明の複合構造体のいくつかについてアミドカルボニルのＦＴ−ＩＲピークを示す。
【図１２】トリアラニン型界面活性物質を含有する本発明の複合構造体についてアミドカルボニルのＦＴ−ＩＲピークを示す。
【図１】
0003898961.tif 000007
【図２】
0003898961.tif 000008
【図３】
0003898961.tif 000009
【図４】
0003898961.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003898961.tif 000014
【図９】
0003898961.tif 000015
【図１０】
0003898961.tif 000016
【図１１】
0003898961.tif 000017
【図１２】
0003898961.tif 000018