(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化タンパク質をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を用いて測定する方法であって、前記測定の前処理として、金属ポルフィリン、シトクロムおよびジアホラーゼからなる群から選択された少なくとも一つの物質の存在下で前記糖化タンパク質のプロテアーゼ処理を行う糖化タンパク質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれる糖化タンパク質の測定を酵素を用いて行う測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の糖化アルブミン等の糖化タンパク質は、血液中のグルコースとアルブミン等のタンパク質とが、非酵素的に共有結合により結合したもので、前記共有結合に関与するのは、グルコース側がアルデヒド基であり、タンパク質側がアミノ基である。血液中の糖化アルブミン等は、過去の一定期間の血糖値を反映するため、その測定値は、糖尿病の診断および病状管理の重要な指標として、最近注目されている。
【０００３】
糖化タンパク質の測定方法としては、高速液体クロマトフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、化学（ＮＢＴ）法、色素結合法および酵素法等があげられる。このなかで、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法は、他の測定方法に比べ、正確かつ迅速に糖化タンパク質を測定できる方法である。
【０００４】
このＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質の測定方法は、例えば、つぎのようにして実施される。すなわち、まず、糖化タンパク質をプロテアーゼで処理し、糖化タンパク質をペプチド鎖やアミノ酸に分解する。これは、ＦＡＯＤがタンパク質や長いペプチド鎖には作用しにくいからである。そして、この分解物をＦＡＯＤで処理する。
【０００５】
そして、この処理において生成する過酸化水素を、電気的手法や酵素的手法で測定することにより、糖化タンパク質の濃度を知ることができる。
【０００６】
前記過酸化水素の酵素的測定方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と酸化すると発色する基質とを用い、前記基質の発色程度を測定する方法があげられる。
【０００７】
このＦＡＯＤを用いた測定方法において、事前に糖化タンパク質をプロテアーゼで処理しても、ＦＡＯＤの基質となりうる短いペプチド鎖の生成が不十分であるという問題がある。特に、血液中に存在する糖化タンパク質に対しては、プロテアーゼが作用しにくい。この問題に対し、ＦＡＯＤでの処理の前に、ＰＯＤの存在下で糖化タンパク質をプロテアーゼで処理するという改良方法が提案されている（ＷＯ  ９６／３４９７７号公報）。この改良方法によれば、ＦＡＯＤの基質となりうる短いペプチドが十分に生成する。なお、前記プロテアーゼ処理時にＰＯＤを共存させると、糖化タンパク質がよく分解することについての理由は不明である。
【０００８】
しかしながら、この改良方法には、つぎのような問題がある。まず、ＰＯＤ自身も糖化タンパク質であり、プロテアーゼの分解を受けてＦＡＯＤの基質が生成するため、いわゆるバックグラウンド発色が生じる。また、このバックグラウンド発色は、ＰＯＤの作製方法や製造ロットによって変化するという問題がある。したがって、この改良方法では、測定値の信頼性において問題がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、十分に信頼性がある測定値を得ることができる糖化タンパク質の測定方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の糖化タンパク質の測定方法は、糖化タンパク質をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を用いて測定する方法であって、前記測定の前処理として、金属ポルフィリン、シトクロムおよびジアホラーゼからなる群から選択された少なくとも一つの物質の存在下で前記糖化タンパク質のプロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。
【００１１】
すなわち、本発明の測定方法では、ＰＯＤに代えて前記所定の物質の存在下で糖化タンパク質のプロテアーゼ処理を行うことにより、糖化タンパク質の断片化を促進させる。これらの物質は、糖化タンパク質ではないため、プロテアーゼ処理を受けても、ＦＡＯＤの基質を生成することはなく、したがって、ＦＡＯＤの酸化還元反応に影響を及ぼすことはない。
【００１２】
本発明において、前記金属ポルフィリンとは、ポルフィリンと金属イオンとのキレート化合物であり、具体的には、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+等の金属イオンとポルフィリンがキレート結合したものである。前記金属ポルフィリンとしては、例えば、ヘミン等があげられる。前記シトクロムとしては、シトクロムａ、シトクロムｂ、シトクロムｃ等があげられる。前記ジアホラーゼは、ジヒドロポリアミドデヒドロゲナーゼともいう。これらの三種類の物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上併用してもよい。
【００１３】
本発明の測定方法において、前記前処理と同時にまたはその後に、例えば、ＦＡＯＤの酵素反応を行い、これにより発生する過酸化水素量または消費される酸素量を測定し、検量式や検量線等を用いて、糖化タンパク質の量や濃度を測定することができる。前記過酸化水素量や酸素量の測定には、従来公知の方法を採用することができ、特に制限されない。
【００１４】
本発明の測定方法において、その測定対象の糖化タンパク質は、血液中の糖化アルブミンおよび糖化グロブリンの少なくとも一方であることが好ましい。これらの糖化タンパク質は、糖尿病の診断や病状管理の重要な指標物質だからである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１６】
本発明の測定方法は、例えば、糖化タンパク質のプロテアーゼ処理工程、前記プロテアーゼ処理物のＦＡＯＤ処理工程および前記ＦＡＯＤの酸化還元反応の測定工程という三工程を有する。なお、これらの工程は、別々に行なってもよいが、後述するように、前記プロテアーゼ処理物のＦＡＯＤ処理工程および前記ＦＡＯＤの酸化還元反応の測定工程を同時に行なってもよい。
【００１７】
本発明の分析対象となる糖化タンパク質は、特に制限されず、例えば、糖化アルブミン、糖化グロブリン、糖化ヘモグロビン、糖化カゼイン等があげられる。また、本発明の分析対象となる検体としては、例えば、血液、血清、血漿、牛乳、味噌や醤油等の醸造食品等があげられる。
【００１８】
前記プロテアーゼ処理に用いるプロテアーゼの種類は特に制限されず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ等が使用できる。また、プロテアーゼ処理は、緩衝液中で行うことが好ましく、その条件は、使用するプロテアーゼの種類、糖化タンパク質の種類や濃度等により適宜決定される。例えば、プロテアーゼＫで血清を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度０．２〜１重量％、反応液中の血清濃度１〜１０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間５〜１２０分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００１９】
また、このプロテアーゼ処理は、前記金属ポルフィリン、シトクロムおよびジアホラーゼの少なくとも一つの存在下で行なう。これらの物質の反応液中の濃度は、その種類等によって適宜決定される。
【００２０】
前記プロテアーゼ処理で得られた分解物に対し、前記ＦＡＯＤ処理を行う。この処理において、ＦＡＯＤは、以下の式（化１）に示す反応を触媒する。なお、下記の式（化１）において、Ｒ1 は、糖のアルドース残基を示し、Ｒ2 は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸残基を示す。
【００２１】
（化１）
0003987900.tif 000002
【００２２】
ＦＡＯＤの種類は、前記式で示される反応を触媒するものであれば、特に制限されない。
【００２３】
この処理は、緩衝液中で行うことが好ましく、その条件は、前記分解物の濃度等により適宜決定される。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００２４】
つぎに、前記ＦＡＯＤによる酸化還元反応を測定するが、通常、水と酸素の存在下で前記ＦＡＯＤ処理が行われるため、前記式（化１）で示すように、この処理において酸素が消費されて過酸化水素が生成する。したがって、この過酸化水素濃度や酸素濃度を測定すれば、前記ＦＡＯＤによる酸化還元反応を測定することができる。
【００２５】
前記過酸化水素濃度により酸化還元反応を測定する方法としては、例えば、ＰＯＤと認識可能な生成物を生成する基質とを用いた方法があげられる。前記基質としては、酸化により発色する基質（以下、「発色性基質」という）があり、例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ、吸収光波長４９２ｎｍ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンの組み合わせ、ＤＡ−６４等があげられる。これらの発色性基質を用いた場合、反応液の吸光度を分光光度計等で測定すれば、過酸化水素濃度を測定することができる。そして、予め検量線や検量式を作成していれば、過酸化水素の濃度値から、糖化タンパク質濃度を算出することができる。
【００２６】
また、このＰＯＤでの処理は、緩衝液中で行うことが好ましく、その条件は、通常、反応液中のＰＯＤ濃度１〜１００００Ｕ／ｌ、前記発色性基質濃度０．１〜５ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、反応液ｐＨ６〜９である。前記緩衝液の種類としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
【００２７】
本発明の測定方法は、前記三つの工程を別々に行ってもよいが、以下に示すように、ＰＯＤを用いて過酸化水素を測定する場合は、ＦＡＯＤ処理とＰＯＤ処理とを同時に行なってもよい。
【００２８】
すなわち、ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび発色性基質を、プロテアーゼ処理物が存在する緩衝液中に添加して一定時間反応を行ない、その後、その吸光度を測定すればよい。その他、プロテアーゼ処理と同時にＦＡＯＤ処理を行うことも可能である。
【００２９】
【実施例】
つぎに、実施例について説明する。なお、以下の実施例において、ＦＡＯＤは、特開平７−２８９２５３号公報に開示されているＦＡＯＤ−Ｓを用いた。
【００３０】
（実施例１）
以下の反応液組成により、健康な成人から採取した血清を、プロテアーゼ（商品名：スミチームＭＰ、新日本化学工業社製）で処理した。処理の条件は、反応温度３７℃、反応時間２時間である。なお、血清濃度は、０（ｖ／ｖ）％、１．２５（ｖ／ｖ）％、２．５（ｖ／ｖ）％の３種類であり、ヘミン濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）％である。また、この実施例および他の実施例において、緩衝液としては、すべて、２００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した。また、特に示さない場合は、溶媒として精製水を使用した。
【００３１】
（プロテアーゼ反応液組成）
血清溶液                                            ０．０５ｍｌ
緩衝液                                              ０．５５ｍｌ
ヘミン（シグマ社製）                                ０．２０ｍｌ
１％プロテアーゼ溶液（溶媒：緩衝液）                ０．３０ｍｌ
３０ｍｍｏｌ／ｌ過酸化水素液                        ０．１０ｍｌ
【００３２】
つぎに、前記プロテアーゼ処理物（溶液）に、ＰＯＤと発色性基質との混合液０．７ｍｌおよびＦＡＯＤ溶液（１００ＫＵ／ｌ、溶媒：緩衝液）０．１０ｍｌを添加し、２５℃で５分間のＦＡＯＤ処理を行なった。なお、前記ＰＯＤと発色性基質との混合液は、０．２９ｍｍｏｌ／ｌ発色性基質（ＤＡ−６４、和光純薬社製）と２９ＫＵ／ｌＰＯＤとを緩衝液に溶解した溶液である。
【００３３】
そして、前記反応液の７２６ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。その結果を、図１のグラフに示す。
【００３４】
図１のグラフから、血清濃度が上昇するにしたがい、吸光度も上昇したことがわかる。
【００３５】
（実施例２）
ヘミンに代えて、０．５（ｗ／ｖ）％シトクロムｃを用いた他は、実施例１と同様の処理および操作を行ない、吸光度を測定した。その結果を、図２のグラフに示す。
【００３６】
図２のグラフから、血清濃度が上昇するにしたがい、吸光度も上昇したことがわかる。
【００３７】
（実施例３）
ヘミンに代えて、０．５（ｗ／ｖ）％および１．０（ｗ／ｖ）％の２種類の濃度のジアホラーゼを用いた他は、実施例１と同様の処理および操作を行ない、吸光度を測定した。その結果を、図３のグラフに示す。
【００３８】
図３のグラフから、血清濃度が上昇するにしたがい、吸光度も上昇したことがわかる。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように、本発明の糖化タンパク質の分析方法によれば、信頼性に優れた測定値を得ることができる。したがって、本発明の測定方法を、例えば、糖尿病の診断や病状管理等に適用すれば、重要な指標物質である糖化アルブミンや糖化グロブリンの血清中濃度を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘミンを用いた本発明の一実施例における血清濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図２】シトクロムｃを用いた本発明の一実施例における血清濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図３】ジアホラーゼを用いた本発明の一実施例における血清濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図１】
0003987900.tif 000003
【図２】
0003987900.tif 000004
【図３】
0003987900.tif 000005