(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド抗原単独により刺激されるそのような強力な抗原提示細胞により生成されるレベルよりも高いＴ細胞活性化レベルで、ポリペプチド抗原に対する多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するための、単離された強力な抗原提示細胞を含む治療的組成物であって、
該細胞は該ポリペプチド抗原に共有結合された顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含む単離された可溶性ポリペプチド複合体へのインビトロにおける曝露により刺激され、および
該ポリペプチド抗原は、（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外する組織特異的抗原、およびオンコジーン遺伝子産物からなる群より選択される、前記組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチド抗原が、腫瘍特異的抗原である前立腺酸性ホスファターゼである、請求項１に記載の治療的組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチド抗原が、Her2、p21RAS、およびp53からなる群より選択されるオンコジーン産物ペプチド抗原である、請求項１に記載の治療的組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチド複合体が、前記GM-CSFと前記ポリペプチド抗原との間に、リンカーペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療的組成物。
【請求項５】
前記強力な抗原提示細胞が、活性化された樹状細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療的組成物。
【請求項６】
インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化する方法であって、
該単離された抗原提示細胞を、（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外する組織特異的抗原およびオンコジーン産物ペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原に共有結合されたGM-CSFを含むポリペプチド複合体と接触させる工程を含み、
ここで、活性化される該抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド抗原が、組織特異的抗原である前立腺酸性ホスファターゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド複合体が、連続的ヌクレオチドコード領域の翻訳により得られる融合タンパク質である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離された抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物被験体において細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための、抗原提示細胞を含む医薬組成物であって、
単離された抗原提示細胞を、（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外する組織特異的抗原およびオンコジーン産物ペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原に共有結合されたGM-CSFを含むポリペプチド複合体と、該抗原提示細胞を活性化するに有効な期間接触させる工程、および
該抗原提示細胞を哺乳動物被験体中に注射する工程
を包む、前記医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
GM-CSFに共有結合された単離された組織特異的腫瘍抗原を含む、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドであって、ここで該組織特異的抗原は、（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外し；
（iii）該免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ（iv）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記ポリペプチド。
【請求項１３】
前記組織特異的抗原が、前立腺酸性ホスファターゼである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、連続的ヌクレオチドコード領域の翻訳により得られる融合タンパク質である、請求項１２又は１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記GM-CSFと前記組織特異的抗原との間に、リンカーペプチドをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
GM-CSFに共有結合された単離されたオンコジーン産物ペプチド抗原を含む、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドであって、
（i）該免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ（ii）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記ポリペプチド。
【請求項１７】
前記オンコジーン産物ペプチド抗原が、Her2、p21RAS、およびp53からなる群より選択される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、連続的ヌクレオチドコード領域の翻訳により得られる融合タンパク質である、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記GM-CSFと前記オンコジーン産物抗原との間に、リンカーペプチドをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
GM-CSF、ならびにオンコジーン産物ペプチド抗原および組織特異的抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原からなるポリペプチド複合体をコードする核酸分子を含む、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドを産生するための発現ベクターであって、該組織特異的抗原は（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外するとして特徴付けられ；
該核酸分子は該発現ベクター中に挿入され、および該核酸分子は選択される宿主細胞において転写を開始し得る選択されるプロモーターに作動可能に連結され；
（iii）該免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ（iv）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記発現ベクター。
【請求項２１】
前記ポリペプチド抗原が、組織特異的抗原である前立腺酸性ホスファターゼである、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ポリペプチド抗原が、オンコジーン産物ペプチド抗原であるHer2である、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
GM-CSFおよび前立腺酸性ホスファターゼからなる、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドをコードする、精製された核酸分子であって、
（i）核免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ（ii）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記核酸分子。
【請求項２４】
GM-CSFおよびHer2からなる、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドをコードする、精製された核酸分子であって、
（i）該免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ、（ii）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記核酸分子。
【請求項２５】
オンコジーン産物ペプチド抗原および組織特異的抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原に共有結合されたGM-CSFからなる、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化するための免疫刺激ポリペプチドを産生するための発現系であって、
該組織特異的抗原は（i）特定のタイプの腫瘍に共通である抗原を含み、かつ（ii）個々の腫瘍にのみ特異的である抗原を除外するとして特徴付けられ；
該発現系は、
該GM-CSFをコードする核酸配列、
該ポリペプチド抗原をコードする核酸配列、ここで各々の該核酸配列は発現ベクター中に挿入され、ここで該核酸配列は選択される宿主細胞において転写を開始し得るプロモーターに作動可能に連結され、および該発現ベクターは宿主細胞内に運ばれる、
を含み；
（iii）該免疫刺激ポリペプチドは、活性化される該抗原提示細胞と接触され、かつ（iv）該活性化抗原提示細胞は、選択される該ポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するために有効である、前記発現系。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、インビボにおける特異的細胞性免疫応答の刺激のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、免疫刺激ポリペプチド複合体に曝露された抗原提示細胞への曝露によりインビボまたはインビトロにおいて活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）による腫瘍細胞の排除に関する。
発明の背景
哺乳動物免疫系の免疫応答は、２つの一般的な型に分けられる：体液性免疫（大部分は循環する抗体により媒介される）、および種々の形態のＴ細胞により媒介される細胞性免疫。細胞外抗原は体液性応答を刺激し、一方、ウイルスのような細胞内抗原は細胞性応答を刺激する。
ウイルス感染細胞および腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答は、大部分は細胞傷害性Ｔリンパ球（Tc、またはCTL）により媒介され、このとき細胞傷害性Ｔリンパ球は主要組織適合遺伝子複合体（MHC）、および、より特定すると、MHCクラスＩとして知られるMHCの一般的な形態の一部として宿主細胞表面に結合された外来抗原を認識する。対照的に、非ウイルス性病原体（細菌、真菌）由来の抗原は、一般に、MHCクラスII複合体の一部として発現される。エフェクターＴ細胞の異なる亜集団（細胞媒介性免疫細胞；CMI）はサイトカインを放出し、これはそのような病原体を破壊するように宿主細胞を活性化する。
実験系において、腫瘍抗原特異的CTLは、腫瘍の排除のための最も強力な免疫学的機構である。CTLは、インビボにおいてワクチンで誘導され得るか、またはインビトロにおいて生成され得るかのいずれかをして、次いで腫瘍保有生物中に際注入される。CTLのインビボ誘導は、代表的には生存ウイルスまたは細胞での免疫により達成される（Tanakaら、J.Immunol., (1991), 147, 3646-52, Wangら、J.Immunol., 4685-4692, Torre-Amioneら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1990), 87, 1486-90）。
SV-40ラージＴ抗原およびＢ型肝炎表面抗原のようなわずかな特別のウイルスタンパク質を除いて、単離されたまたは可溶性のタンパク質の注射はCTLの誘導を生じない（Schirmbeckら、Eur.J.Immunol., (1993), 23, 1528-34）。CTLは、タンパク質が抗原プロセシングのクラスＩ経路に入ると、誘導される。この経路に入るためには、タンパク質はAPCの細胞質ゾル中に存在しなければならない。そこでタンパク質はペプチドに分解され、次いで、このペプチドは小胞体中に輸送され、ここで、ペプチドは新生（nascent）HLAクラスＩ分子と会合する。次いで、これらのペプチドはクラスＩ分子と一緒に細胞表面上に提示され、そしてクラスＩ拘束性抗原特異的CTLのインデューサーおよび標的として作用し得る。生理学的には、APCにより内因性に合成されるタンパク質のみが、この経路に入る。
タンパク質のための非細胞性送達ビヒクル（例えば、pH感受性リポソーム）は、インビボにおける内因性合成についての要求を克服し得る（Nairら、J.Exp.Med., (1992), 175, 609-12, Nairら、J.Virol. (1993), 67, 4062-9）；しかし、これらの処理はまた、標的細胞に対して非常に有毒である。
インビトロにおける純粋な可溶性タンパク質による一次HLAクラスＩ拘束性CTLの誘導は、報告されていない。一次CTLのエクスビボ誘導のための最も一般的なツールは、小さい（８〜11マー）合成ペプチドである（Staussら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1992), 89, 7871-5, Carboneら、J.Exp.Med. (1988), 167, 1767-79）。これらの合成ペプチドは、内因性プロセシングについての要求なしに、細胞表面上のクラスＩ分子と会合する。適切なAPC（例えば、樹状細胞）の表面上に提示されると、次いで、それらは、一次CTL応答を誘導し得る。しかし頻繁にこれらのCTLは、それらの低いＴ細胞レセプターアビィティのために（Speiserら、J.Immunol. (1992),149, 972-80）、そしてそれらが標的抗原の単一のエピトープとの反応性を誘導するので、ペプチドが由来するタンパク質を内因性に合成する病原体でのチャレンジに対して防御しない。
GM-CSFは、造血および免疫の両方における多面的機能を有するサイトカインである。GM-CSFは、樹状細胞の分化および生存を促進することが示されている。GM-CSFは、全身的アジュバントとして使用され得る（Jonesら、Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. (1994), 13, S47-53）。
可溶性タンパク質での免疫が有意な抗体応答を生じ得ることは周知である。しかし、クラスII拘束性抗原提示または直接的Ｂ細胞刺激がこの効果を担うので、抗体誘導は、CTLのクラスＩ媒介性誘導の刺激についての予言的な値を有しない。インビボにおいて抗体を誘導する大部分のタンパク質は、CTLを誘導しない。
GM-CSF融合タンパク質は、リンパ腫マウスモデルにおいてインビボ抗体応答を誘導することが示された（Levy, R.およびTao, M.-H. (1993)Nature 362: 755-758; Chenら、J.Immunol. (1995), 3105-3117）。この研究において、GM-CSFに融合された腫瘍イディオタイプは、抗体応答の誘導について、両方の分子の混合物および他の従来のアジュバントに優ることが見出された。他の固形腫瘍とは対照的に、抗体応答は、リンパ腫においては、腫瘍防御および腫瘍治療についてのエフェクター機構であると考えられている。
さらに、免疫のインビトロ誘導は、一般に、細胞性応答および体液性応答の両方について、達成することがずっとより困難である。例えば、ウイルス抗原トランスフェクト線維芽細胞は、インビボにおいてはクラスＩ拘束性CTLをマウス中で誘導するが、インビトロにおいては誘導しない
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それゆえ、インビボにおけるGM-CSF融合タンパク質を用いる抗体誘導研究は、そのインビトロにおける有用性を何も暗示せず、そして特にインビトロまたはインビボにおけるCTL誘導に対して非予言的である。
一次タンパク質誘導性CTLのインビトロ誘導のために使用されてきた他の方法は、樹状細胞の浸透圧ショックおよびpH感受性リポソームの使用である（Nairら、J.Exp.Med. (1992), 175, 609-12）。しかし、そのような方法は、APCに対して本質的に無効でありそして毒性であることが示された。なぜなら、それらは、タンパク質抗原を細胞質中に放出するために、物理的および化学的な力により細胞膜を破壊するからである。
これらの制限は、本発明により包含される知見により克服される。Ｔ細胞応答、および、詳細には、MHCクラスＩ媒介性Ｔ細胞応答が、単離されたまたは可溶性のタンパク質により、それが樹状細胞結合タンパク質、およびより特定するとGM-CSFとの複合体の一部として免疫系に提示される場合に、刺激され得るということが、本発明の知見である。このような応答がインビトロにおいて刺激され得ることが、本発明のさらなる知見である。上記で論じたように、このような応答のインビトロ刺激は、以前には、完全長可溶性抗原を使用して実証されていなかった。本発明は、特異的抗原を抗原提示細胞（APC）（例えば、樹状細胞）に対して、免疫原性融合タンパク質の一部として提示することによる、インビトロにおける、細胞性免疫の、単離されたまたは可溶性のタンパク質による誘導を、提供する。
本発明の重要な局面は、融合パートナータンパク質：樹状細胞結合タンパク質（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激タンパク質（GM-CSF））の選択である。いかなる特定の機構的理論にも依存することなく、タンパク質抗原が、レセプター媒介性、非破壊的様式でAPCの形質膜を越えて輸送されると、考えられている。融合タンパク質の樹状細胞結合部分はAPCの生存性および機能性を保持するように作用すると、さらに考えられている。
本発明のさらなる局面は、標的抗原の選択に関する。いくつかの腫瘍関連抗原はインビボにおけるＴ細胞媒介性免疫のための標的として作用することが示されているが、単離された可溶性ポリペプチド抗原によるインビトロ誘導は実証されていない（Fiskら、J.Exp.Med. (1995), 181, 2109-2117）。本発明の支持において実施された実験において、CTLのための標的抗原であるとは以前には示されていなかった腫瘍関連タンパク質が、インビトロにおいてCTLをGM-CSF融合誘導体で感作することにより、そのような標的になり得ることが、今や実証された。
発明の要旨
１つの局面において、本発明は、細胞性免疫応答を刺激するための治療的組成物に関する。組成物は、選択される抗原に対する多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化し得る、単離された、刺激された強力な抗原提示細胞（例えば、活性化された樹状細胞）である。一般に、測定されるＴ細胞応答は、選択される抗原単独により刺激されるそのような強力な抗原提示細胞により生成されるＴ細胞応答よりも実質的に高い。本発明の好ましい実施態様において、強力な抗原提示細胞は、細胞を、インビトロにおいて、樹状細胞結合タンパク質およびポリペプチド抗原から本質的になるポリペプチド複合体に曝露することにより、刺激される。好ましくは、ポリペプチド抗原は、組織特異的腫瘍抗原またはオンコジーン遺伝子産物のいずれかである。しかし、他の抗原（例えば、ウイルス性抗原）が、免疫刺激応答を生成させるために、このような組み合わせにおいて使用され得ることが理解される。
別の好ましい実施態様において、免疫刺激ポリペプチド複合体の部分を形成する樹状細胞結合タンパク質は、GM-CSFである。さらに好ましい実施態様において、複合体の部分を形成するポリペプチド抗原は、組織特異的抗原である前立腺酸性ホスファターゼである。なおさらなる好ましい実施態様において、ポリペプチド抗原は、オンコジーン産物ペプチド抗原Her2、p21RAS、およびp53のいずれかであり得る。ポリペプチド複合体はまた、樹状細胞結合タンパク質とポリペプチド抗原との間に、リンカーペプチドを含み得る。
関連する局面において、本発明は、インビトロにおいて単離された抗原提示細胞を活性化する方法を含む。この方法によれば、活性化は、単離された抗原提示細胞をポリペプチド複合体と接触させることを含む。この方法において使用されるポリペプチド複合体は、上記のとおりである；すなわち、ポリペプチド複合体は、上記の任意の実施態様において、ポリペプチド抗原に共有結合された樹状細胞結合タンパク質から本質的になる。この方法によれば、活性化される抗原提示細胞は、選択されるポリペプチド抗原単独と接触される抗原提示細胞により生成される応答よりも実質的に高い多価細胞性免疫応答を生成させるようにＴ細胞を活性化するに有効である。好ましい実施態様において、抗原提示細胞は、本明細書において記載のように単離された、樹状細胞である。
なお別の関連する局面において、本発明は、脊椎動物被験体において細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法を含む。本発明のこの局面によれば、単離された樹状細胞は、上記の任意の実施態様による免疫刺激ポリペプチドと、提示細胞を活性化するに有効な期間接触される。次いで、抗原提示細胞は哺乳動物被験体中に注射される。好ましい実施態様において、活性化され、そして注射される抗原提示細胞は、樹状細胞である。
さらなる関連する局面において、本発明はまた、上記のように形成されたポリペプチド複合体を含む。上記のように、このようなポリペプチド複合体は、好ましくは、樹状細胞結合タンパク質（好ましくは、GM-CSF）およびポリペプチド抗原から形成される。好ましくは、ポリペプチド抗原は、組織特異的腫瘍抗原（例えば、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP））またはオンコジーン産物（例えば、Her2、p21RAS、およびp53）である；しかし、他の実施態様（例えば、ウイルス性抗原抗原）もまた本発明の意図内である。
さらなる関連する局面において、本発明はまた、上記の免疫刺激融合タンパク質を産生するための発現ベクターおよび発現系、ならびにそのような融合タンパク質をコードする実質的に精製された核酸分子を含む。好ましい実施態様において、核酸分子は、GM-CSFおよび前立腺酸性ホスファターゼまたはGM-CSFおよびHer2から本質的になる融合タンパク質をコードする。
本発明はまた、新規な前立腺ガン細胞株であるHLA A2.1細胞（これは、本明細書中に記載のように、腫瘍細胞傷害を試験するための標的細胞として使用され得る）を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、Bam HIリンカー（下線）から得られるペプチドリンカーとしてgly-serを有するPAP-GM-CSF融合タンパク質の核酸（配列番号１）および推定アミノ酸配列（アミノ酸配列２）を示す；
図２は、融合タンパク質ヒト前立腺酸性ホスファターゼ/ヒトGM-CSFのアミノ酸配列を示す。ここで、成熟タンパク質中に存在しないPAPシグナル配列は小文字で示され、可能性のあるN-グリコシル化部位は「C」でマークされ、そして可能性のあるジスルフィド架橋は「S-S」でマークされる；
図３Aおよび３Bは、哺乳動物（293細胞）および昆虫（SF21）細胞株でそれぞれ使用される、PAP-GM発現ベクターpCEP4 PAPGM(3A)およびPAPHGM-BAC(3B)の模式図を示す；
図４は、哺乳動物およびバキュロウイルス由来PAP-GM-CSF融合タンパク質のGM-CSF生物活性のグラフを示す；
図５は、PAP-GM-CSF融合タンパク質の酸性ホスファターゼ生物活性のグラフを示す；
図６は、PAP-GM-CSFで感作従ってCTLおよびPAP-GM-CSFでパルスされた抗原提示細胞で刺激したCTLによる、前立腺癌細胞の溶解のグラフを示す；
図７は、PAP-GM-CSFで感作されたCTLによる前立腺癌細胞の溶解の、HLAクラスIブロッキング抗体による遮断を示す棒グラフを示す；
図８は、本発明に従うGM-CSF-Her2融合タンパク質の核酸（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）配列を示す；
図９は、組換えマウスGM-CSFおよび結果として起こる齧歯類GM-CSF依存性細胞株GM-NFS-60の増殖性応答と比較した場合の、ラットPAPまたはラットPAP-マウスGM-CSF感染Sf21培養物由来の粗製バキュロウイルス昆虫細胞（BVIC）培養上清中のGM-CSF活性の力価を示す；
図10は、ラットPAP-ラットGM-CSFでパルスされた精製樹状細胞でのCOPラットの免疫のスキームを示す；
図11は、p53-GM-CSF融合遺伝子の核酸および推定アミノ酸配列を示し、ここでセリンおよびアルギニンをコードするXbaIリンカーは囲まれている；および
図12は、p53-GM-CSF融合タンパク質のアミノ酸配列を示し、ここで合成セリン−アルギニンリンカーは太字で印刷されかつ下線を引かれている。
発明の詳細な説明
I.  定義
本明細書で用いられる用語「組織特異的抗原」は、組織のタイプ（特異的腫瘍組織を含む）に特徴的である抗原をいう。腫瘍組織により発現される組織特異的抗原の一つの例は、抗原前立腺酸性ホスファターゼであり、これは全前立腺腫瘍の90％を超えて存在する。対照的に、B細胞リンパ腫は個々の腫瘍に特定の免疫グロブリン抗原を産生する。このような特定の腫瘍抗原は、用語「腫瘍特異的抗原」の定義内に入らないと考えられる。
用語「オンコジーン産物」は、細胞形質転換に関連する遺伝子によりコードされた任意のタンパク質をいう。オンコジーン産物の例は、例えば、Her2、p21RAS、およびp53を含む。
「抗原提示細胞」（APC）は、T細胞を活性化し得る細胞であり、そして特定のマクロファージ、B細胞、および樹状細胞を含むが、これらに限定されない。
「強力な抗原提示（PAP）細胞」は、抗原でパルスされた後に、一次免疫応答においてナイーブなCD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を活性化し得る細胞である。
用語「樹状細胞」は、リンパ系のまたは非リンパ系の組織中に見出される形態学的に類似の細胞タイプの多様な集団の任意のメンバーをいう。これらの細胞は、これらの特有の形態、高レベルの表面MHCクラスII発現により特徴付けられる（Steinmanら、Ann.Rev.Immunol.9:271(1991)；このような細胞の説明のために本明細書中で参考として援用される）。これらの細胞は、本明細書中に記載されるように、多数の組織供給源から、および都合の良いことには末梢血から単離され得る。
用語「樹状細胞結合タンパク質」は、そのレセプターが樹状細胞上に発現される任意のタンパク質をいう。例は、GM-CSF、IL-1、TNF、IL-4、CD40L、CTLA4、CD28、およびFLT-3リガンドを含む。
II.免疫刺激ポリペプチド複合体
A.ポリペプチド複合体の成分の選択
本発明に従って形成された免疫原性ポリペプチドは、一般的に、樹状細胞結合タンパク質に共有結合する単離されたポリペプチド抗原として特徴付けられる。
1.ポリペプチド抗原
上述したように、単離されたポリペプチド抗原は、一般に、インビボまたはインビトロでT細胞の活性化を刺激しない。ポリペプチド抗原の特定のタイプが、樹状細胞結合タンパク質（例えば、以下で議論するそれら）にカップリングした場合に、T細胞活性化を刺激することが、本発明の発見である。
本発明は、この能力において特に有用であるとして、(1)組織特異的腫瘍抗原および(2)オンコジーン産物ペプチド抗原を同定する。本発明の状況において、用語「組織特異的腫瘍抗原」は特異的な腫瘍タイプに共通の抗原をいう。対照的に、特定の個々の腫瘍に特異的な抗原（例えば、B細胞リンパ腫腫瘍関連イディオタイプ抗原）は、それらが固体毎に変化する特徴的なエピトープを有するという点で組織特異的腫瘍抗原から区別可能である。免疫刺激試薬は、個々の腫瘍に合わせて仕立てられるので、このような抗原は、本発明の状況においてあまり有用ではなく、そして結果的に本発明の一部を形成しない。
悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として作用し得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫中のMART-1、チロシナーゼ、およびGP100、ならびに前立腺癌中の前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）および前立腺特異的抗原（PSA）のような腫瘍特異的抗原を含むが、これらに限定されない。他の標的分子は、形質転換関連分子（例えば、オンコジーンHER-2/Neu/ErbB-2）の群に属する。けれども、標的抗原の別の群は、癌胎児性抗原（例えば、癌胎児性抗原（CEA））である。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に独特な、真に腫瘍特異的な免疫グロブリンを構成する。B細胞分化抗原（例えば、CD19、CD20、およびCD37）は、B細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原（CEA、HER-2、CD19、CD20、イディオタイプ）のいくつかは、成功が限られてはいるが、モノクローナル抗体での受動的免疫療法のための標的として使用される。
従って、組織特異的腫瘍抗原の例は、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP；前立腺癌に関連する）、Melan-A/MART-1（黒色腫に関連する；Coulieら、1994,J.Exp.Med. 180:35,Hawakamiら、1994,PNAS 91:3515,Bakkerら、1994,J.Exp.Med. 179:1005）、チロシナーゼ／アルビノ（黒色腫に関連する；Kawakamiら、1994,J.Exp.Med.）、CD19、CD20、およびCD37（リンパ腫に関連する）を含むが、これらに限定されない。
同様に、特異的腫瘍タイプに共通であるオンコジーン産物ペプチド抗原が、同定されている。これらのポリペプチドは、このような抗原を保有する腫瘍に反応するために有効なT細胞応答を刺激するために一般的に使用され得る試薬として、本発明のポリペプチド複合体に組み込まれ得る。オンコジーン産物ペプチド抗原は、ヒト乳癌および婦人科の癌に関連するHER-2/neu（Beckmannら、1992,Eur.J.Cancer 28:322）および膵臓の癌に関連する癌胎児性抗原（CEA）を含むが、これらに限定されない。
種々の腫瘍マーカーが当該分野で公知であるか、または市販され、そして以下を含む組織特異的抗原を含むが、これらに限定されない：サイトケラチン、前立腺特異的抗原（Wangら、1977）、黒色腫に関連するgp75/brown（Brichardら、1993,J.Exp.Med. 178:489）、メラノトランスフェリン（melanotransferrin）（Realら、1984,J.Exp.Med. 160:1219）、膵臓癌および乳癌に関連するMUC1（Barnd、1989,PNAS USA 86:7159およびVijayasaradhiら、1990,J.Exp.Med. 171:1375）；EGF-R(Osborneら、1980）、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、網膜芽細胞腫遺伝子産物、肺癌に関連するmyc、ras、p53、乳癌に関連する非変異体（nonmutant）、黒色腫、肺癌、および他の癌に関連するMAGE-1,3（van der Bruggenら、1991,Science 254:1643およびGauglerら、1994,J.Exp.Med. 179:921）を含むオンコジーン／腫瘍サプレッサー遺伝子。
単離されたウイルス抗原は、HIV抗原gp120、gp41、gag、RT、NEF、VIF；インフルエンザ抗原HA、コアおよびマトリクス；EBV抗原：EBNA、BFLF1、BOLF1、BGLF2、LMP2a、LMP2b、BBRF1、BBRF2、およびP11L27；ならびにヒトパピローマウイルスを含み得る。
上記のようなポリペプチド抗原は、当該分野で公知の方法に従って、単離されるか、合成されるか、または組み換え的に発現され得る。大部分の場合において、DNAコード配列が、これらの分子について同定されている。さらに、いわゆる「腫瘍マーカー」の多くは、市販されている。このような単離された抗原が、以下で議論されるように、樹状細胞結合タンパク質と化学的に複合体化され得るか、または融合タンパク質構築物が、当該分野に周知の方法に従って組換え的に産生され得る。
前述の例のように、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）は、偏在性酵素酸性ホスファターゼの前立腺特異的アイソザイムである。PAPは、前立腺癌に特異的な血清腫瘍マーカーとして同定されている分泌分子である（Vihkoら、FEBS Lett.(1988),236,275-281,Solinら、Biochem.Biophys.Acta(1990),1048,72-77）。PAP自体がCTLのインデューサーおよび標的として作用し得るという文献からの証拠は存在しない。以下で実証されるように、本発明は、PAPが、樹状細胞結合タンパク質GM-CSFと組み合わせられ、そして次いでCTLを感作するために使用される抗原提示細胞（樹状細胞により例証される）を刺激するために使用される場合に、CTLのインデューサーおよび前立腺癌細胞における標的の両方として作用し得ることを示す。
2.樹状細胞結合タンパク質
本発明のポリペプチド複合体の第二の成分は、樹状細胞結合タンパク質である。上述のように、任意の特定の機構理論に基づくことなく、タンパク質抗原との共有結合的な複合体中のこのような分子の存在が、レセプター媒介性の非破壊的な方法で、抗原提示細胞（およびより特に、樹状細胞）の原形質膜を越える抗原の輸送を容易にすると考えられている。さらに、融合タンパク質の樹状細胞結合部分が、APCの生存度および機能性を維持するように作用すると考えられている。
樹状細胞結合タンパク質の一つの例は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）である。この糖タンパク質（SDS-PAGEによる約23,000-33,000の見かけ分子量を有する）は、造血ならびに免疫学の両方における多面的な機能を有するサイトカインである。ヒトおよびマウスのGM-CSFの両方は、分泌の間にタンパク質分解的に切断される17アミノ酸の疎水性リーダー配列とともに合成される。成熟タンパク質は127（ヒト）または124（マウス）のアミノ酸であり、そしてそれぞれ14,700および14,400のコアポリペプチド分子量を有するが、52％のみのアミノ酸の同一性を共有する。樹状細胞の分化および生存において刺激性の役割を演じる因子が見出されており、そしてそれはグリコシル化形態および脱グリコシル化形態の両方において活性である。
ヒトおよびマウスのGM-CSFは、単球−マクロファージ、好中球、および好酸球の細胞系統の細胞上の高親和性（KD=20-60pM）結合部位および低親和性（KD=1-6nM）結合部位の両方に結合することが示されている。造血性コロニー刺激因子の別のメンバー（Multi-CSF）による結合の競合は、結合が37℃で行われる場合に示されている。GM-CSFの高親和性レセプターへの結合は、GM-CSFの迅速なインターナリゼーションおよび分解を生じる（Metcalf,D.およびNicola,N.A.(1995)The Hemopoietic Colony-Stimulating Factors,Cambridge University Press,NY.）。これらの特性は、本発明に従って免疫刺激ポリペプチド複合体を形成するにおいて有用な、さらなる樹状細胞結合タンパク質の選択の指針として役立つように使用され得る。
B.ポリペプチド複合体の形成
ポリペプチド複合体は、化学的手段により（例えば、当該分野で公知の従来のカップリング技術により）形成され得る。例えば、ペプチドは、脱水剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCI））を用いてカップリングされて、２つのペプチド間にペプチド結合を形成し得る。あるいは、連結が、スルフヒドリル基、εアミノ基、カルボキシル基、またはポリペプチド中に存在する他の反応基を介して、市販の試薬を使用して形成され得る。（Pierce CO.,Rockford,IL）。
ポリペプチド複合体はまた、当該分野で公知の方法に従って、融合タンパク質として組換え的に形成され得る。実施例１は、本発明に従ってGM-CSF-PAP融合タンパク質を産生するために使用される方法を詳述する。簡単には、ヒトPAPを、当該分野で公知の方法に従って、前立腺癌細胞株からクローニングした。配列の3'末端の停止コドンを変異させて除き（mutated away）、そしてその位置にBam HI部位を挿入して、PAP cDNAをGM-CSF DNAに融合した。GM-CSF DNAを、標準的な方法に従って、PBMNCライブラリーからクローニングした。Bam HI部位をDNAの5'末端に挿入し、そしてXbaIクローニング部位をインフレーム停止コドンと共に3'末端に挿入した。PCR産生cDNAを適切な制限酵素で切断し、そして特定の哺乳動物細胞株または昆虫細胞株へのトランスフェクションのために制限ベクターにクローニングした。図１は、gly-serペプチドリンカーを有するPAP-GM-CSF融合ポリペプチドの核酸および推定アミノ酸配列を示す。図２は、さらに、「C」として示される、可能性のあるグリコシル化部位、および「S-S」で示される、推定のジスルフィド架橋を有する、融合タンパク質配列を図示する。図３Aおよび３Bは、それぞれ哺乳動物(293)および昆虫(SF21)の細胞株にトランスフェクトするために使用されるPAP-GM-CSF発現ベクターの模式図を示す。
融合発現ベクターを、COS細胞（一過性発現）ならびに哺乳動物293-EBNA細胞（Invitrogen）および昆虫SF21細胞（Clontech, Palo Alto, CA）をトランスフェクトするために使用した。融合タンパク質産物を組織培養上清から回収し、そして抗ヒトPAPモノクローナル抗体免疫アフェニティーカラムの通過によりアフィニティー精製した。SDS-PAGEによる分析は、哺乳動物および昆虫の細胞由来の産物としてそれぞれ、75kDおよび64kDで移動するタンパク質のバンドを明らかにした。75kDのバンドは、55.5kDであるPAP-GM-CSFポリペプチド骨格の予測されたサイズよりも約19.5kD大きいサイズに相当する。これは、配列中の５つの可能性のあるN-グリコシル化部位の存在により説明され得、そこでのグリコシル化はタンパク質の見かけのMrを増加させ、そして293-EBNA細胞が完全に機能的なヒトのグリコシル化機構を含むという事実と一致する。昆虫細胞由来融合タンパク質は、PAP-GM-CSFペプチド骨格よりも約8.5Kd大きかった。これらのデータは、N-グリコシル化部位を利用することが報告されているが、単一のマンノース残基の付加で代表的に終了する切断された炭水化物を付加しているのみである、Sf21細胞における公知のグリコシル化パターンと一致する。
融合分子を適切なアッセイにおいてPAPおよびGM-CSFの生物活性について試験した（実施例２に詳述する）。昆虫および哺乳動物由来融合タンパク質の両方が、GM-CSF依存性細胞株の増殖を支持するその能力により証明されるようにGM-CSF活性を示した（図４）。同様に、両産物が、PAP活性を示した（図５）。
オンコジーン産物抗原を組み込むように構築される融合タンパク質は、オンコジーン産物Her2の組み込みにより例証される。Her2は、EGF-Rレセプターファミリーに属する増殖因子レセプターである。それは、乳癌細胞、卵巣癌細胞、および種々の他の癌細胞により過剰発現される。Her2の細胞外ドメインをコードするcDNAは、基本的に、上述でぱPAP-GM-CSFについて詳述されるように、乳癌細胞株からクローニングされ、そしてGM-CSF cDNAに融合される。可溶性タンパク質の産生は、当該分野で周知の方法に従って、ELISA試験においてHer2特異的モノクローナル抗体を使用して検証され得る。融合タンパク質は、Her2(GenBank)およびGM-CSF（図８）の細胞外ドメイン（アミノ酸1-652）の配列を含む。この特定の融合タンパク質においては、２つのタンパク質が、Xho I部位の挿入により生成されるロイシン／グルタミン酸リンカーにより連結されている。
細胞の腫瘍サプレッサー遺伝子p53は、実施例７に記載されるように、クローニングされ、そしてGM-CSFに融合される。組換え融合遺伝子の配列は図11に示され、そして産生されるポリペプチドp53-GM-CSFの配列は図12に示される。p53-GM-CSF融合タンパク質は、PAP-GM-CSFによる抗PAP免疫の誘導について実施例３、４、および６に記載されるように、抗p53免疫の生成のために使用される。
他のオンコジーン産物抗原は同様に、公開された配列を使用して、本明細書中に記載される方法に従って、融合タンパク質に組み入れられる。さらに、他の抗原（例えば、ウイルス抗原）は、本明細書中の方法に従って、融合構築物の一部となり得る。
前記の説明は本発明の特定の実施態様を記載しているが、当業者は、公知の方法に従って、異なる抗原、ベクター、および発現細胞株を置換して、上記の原理に従う免疫刺激ポリペプチド複合体組成物を調製し得ることが理解される。さらに、本発明はまた、当該分野で公知の組換え方法に従って、樹状細胞結合タンパク質とポリペプチド抗原、リンカーペプチド、またはユビキチンのようなタンパク質との間に挿入されることにより実施され得ることが理解される。
III.T細胞の刺激
本発明の重要な局面は、抗原タンパク質のパートナーを上記の抗原提示細胞（APC）（例えば、「樹状細胞」として公知の細胞タイプ）に標的化するための方法における、上記のポリペプチド複合体構築物の有用性である。本発明によれば、標的化は、抗原プロセッシングのクラスI経路への侵入を生じる様式で起こる。次いで、APCは、以下で議論する方法に従って、エキソビボおよびインビボでCTLを感作するために使用される。
樹状細胞は非常に強力な抗原提示細胞（APC）であり、そしてそれらはナイーブなCTLを感作し得るAPCのみである。ヒト血液中に存在する樹状細胞前駆体は抗原を取り込み得るが、それらは強力なAPCとして機能しない。一方、成熟樹状細胞は最も強力なAPCであるが、インビボで自発的に抗原を取り込まない。従来、物理的な力（リポソーム、浸透圧ショック）を用いて成熟樹状細胞を処理すること、または外因性小（８〜11アミノ酸長；一般には９-mer）ペプチド抗原でそれらをコートしてそれらがAPCとして作用することを可能にすることが、必要であった。
本発明は、成熟樹状細胞のクラスI経路に外因的に添加されたタンパク質の導入を可能にする。このような導入は、APC（例えば、樹状細胞）を単離すること、延長された時間の間ポリペプチド複合体で「パルス」することまたはそれらと接触させること、次いで、インビトロまたはインビボで自己Ｔ細胞を刺激するためにパルスされたAPCを使用することによってインビボで達成され得る。後者の場合は、パルスされたAPCが被験体に投与される（約107細胞／注射）。被験体の応答は、細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、および末梢血単核細胞中の抗原に対する抗体応答の誘導を当該分野で周知の方法によってモニターすることにより測定される。複数の用量が、十分な応答を産生するために投与され得る。
GM-CSF融合抗原刺激樹状細胞の使用は、他のアプローチ（例えば、ペプチドをパルスされた樹状細胞調製物）に対して優れた結果を生じる。すなわち、８〜11-merのペプチドでパルスされた樹状細胞は免疫を誘導し得るが、このような免疫は単一のＴ細胞エピトープを指向する。リポソームに取り込まれたか、または浸透圧ショックによって樹状細胞に送達されたタンパク質は、複数のＴ細胞エピトープに対する反応性を誘導する；しかし、このプロセスは樹状細胞に対するこれらの処理が本質的に毒性であるために比較的効果的ではない。
対照的に、本発明のGM-CSF融合抗原は、複数のエピトープに対する免疫を誘導し、そして同時に樹状細胞の生存性および機能を提示および増強する。実際、本発明の組成物は、細胞性（Ｔ細胞）活性化を誘導することが見出されており、これは多面的であり、そして選択された抗原のみによって産生される活性化の誘導よりも実質的に高い。
本発明を支持するために行われる実験において、以前の節で記載したPAPおよびGM-CSFからなる融合タンパク質は、実施例４に詳述するように、樹状細胞へのインビボでの導入、および続く細胞溶解性Ｔ細胞の活性化のために使用した。簡潔には、HLA-A2.1ポジティブPBMNCを標準的な方法によって単離し、そして２〜５日間融合タンパク質で感作した。細胞混合物はCD4+Ｔ細胞を涸渇し、高密度および低密度画分に分離し、そして分離した培養物を自己PAP-CSFパルスAPCで週毎に再刺激した。画分中に提示されるＴ細胞の溶解能力は、標的としてHLA-A2.1トランスジェニック前立腺ガン細胞株を使用して、標準的なクロム放出アッセイを用いて評価した。この新規の細胞株は、本明細書中の実施例３に詳述される方法に従って構築した。この方法は、HLAクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球のスクリーニングおよび分析に有用である。
溶解アッセイの結果を図６に示す。示すように、試験した４つの異なるＴ細胞培養物のうち、３つが、前立腺ガン標的に対して実質的な用量依存性の細胞傷害性を示した。最も高い細胞傷害性の程度は、５日間に高密度ペレット画分中に分画された細胞によって達成された（○、５-日Ｐ）。２日間感作した高密度（□、２-日Ｐ）および低密度（■、２-日IF）細胞は、ほぼ同等な力を示した。５日目の低密度界面画分由来の細胞培養物（●、５-日IF）は、わずかに細胞傷害性を示したか、または全く示さなかった。
図７は、腫瘍特異的細胞溶解が、10：１のエフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比で、HLAクラスＩ特異的ブロッキング抗体W6/32の存在下で実質的に減少したこと、および3.3／１のＥ／Ｔ比では抗体によって完全に排除されることを示す。コントロール抗体CA141は、Ｔ細胞媒介性傷害を減少しなかった。これらの実験は、標的細胞との相互作用が、古典Ｔ細胞レセプター／HLAクラスＩ拘束性抗原特異的経路を介して媒介されることを示す。
上記の結果は、融合ポリペプチド複合体の効率が、本発明に従ってインビトロでＴ細胞応答を刺激することにおいて形成されることを示す。これらの応答は、抗原のみ（樹状細胞結合タンパク質の非存在下）によって刺激される応答と比較され得る。さらに、それらの多面的な特性は、標準的な方法によって試験され得る。
IV.治療的適用
Ａ．インビトロ／エクスビボ治療
本発明は、免疫原性融合タンパク質の一部として、樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）に特異的な抗原を提示することにより、単離されたかまたは可溶性のインビトロで細胞性免疫のタンパク質による導入を提供する。上記で議論したように、このような導入は、一般に導入物質として可溶性の完全な抗原を使用するインビトロでは観察されない。
実際、樹状細胞は、公知の方法、好ましくは実施例５に記載のように、個体から単離される。樹状細胞（または他のAPC）は、実施例４に記載のように、10ng/mlのGM-CSF融合抗原の等価物と混合される。次いで、細胞調製物は、固相免疫吸着によってCD4+Ｔ細胞を涸渇され、そして細胞傷害性活性を有する細胞について富化するためにさらに分画され得る。次いで、約107細胞の用量が、確立された手順（例えば、30分〜60分にわたる注射）に従って静脈内または中枢神経系注射によって被験体に投与される。この処置に対する被験体の感受性は、細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、および末梢血単核細胞中の抗原に対する抗体応答の誘導を当該分野で周知の方法によってモニターすることにより測定される。
上記の直接的なインビボ投与のレジメンに加えて、APC細胞が、例えばエクスビボの全身性治療、インビボの移植可能なデバイス、およびエクスビボの体外デバイスにおいて使用され得る。これらはまた、腫瘍特異的抗原およびウイルス特異的抗原由来のペプチドエピトープの抗原性および免疫原性のスクリーニングにおいて使用され得る。
特定の場合において、１つの個体から得られる細胞を使用して第２の個体の症状を処置することが利点であり得る。例えば、AIDSを発症したHIV感染個体は、しばしば抗ウイルスＴ細胞応答をマウントし得ない。このような場合、CTLは健全なHLA適合個体（例えば、兄弟）から単離され得、抗原パルスDCを用いてインビトロで刺激されるかまたは感作され、拡張され、そしてHIV感染個体に投与されて戻される。
Ｂ．インビボ治療
本明細書中で記載される融合タンパク質組成物はまた、インビボで個体の細胞性免疫経路を刺激するためにワクチンとして個体に直接投与され得る。ここでは、約５〜200μg/kgの融合タンパク質の用量が投与され、好ましくは、０、14、および28日間に投与され、６ヶ月目に適切な追加免疫用量が投与される。被験体の応答は、細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、および末梢血単核細胞中の抗原に対する抗体応答の誘導を当該分野で周知の方法によってモニターすることにより測定される。
Ｃ．免疫刺激の実験用モデルからの結果
実施例６Ａは、免疫刺激の実験用ラットモデルにおいて使用された融合抗原の構築および注射プロトコルの詳細を提供する。ratPAPおよびratGM-CSFから作製した融合タンパク質を直接ラットに注射（インビボ刺激）するか、または後の注射のためにラットの樹状細胞を刺激するために注射（エクスビボ誘導）した。ヒトエフェクター細胞は、通常他の種では機能せず、さらに他の種（例えば、ラットにおいて抗原性であるので、ラット分子および細胞を使用することが不可欠である。さらに、標的抗原（PAP）はヒトと他の種との間では異なり、そしてヒトGM-CSFは他の種において同じタイプの効果を産生することが期待されていなかった。それにも関わらず、ラット中でのラット細胞の使用は、ヒトにおけるヒト細胞およびタンパク質の使用についてのモデル系を提供するはずであることが理解される。
実施例６に詳述するように、ラット前立腺酸性ホスファターゼ（ratPAP）を組換え的に調製し、そしてratGM-CSFに融合した。ラット脾臓組織由来の樹状細胞を、ratPAP-ratGM-CSFでパルスし、そして正常なラットに注射した。さらに、自己PAP指向性免疫が以前に生じていないために、別の送達系を試験して本発明者らの知見を最善のものにした。
本発明の支持のために行われ、そして実施例６Ｂに詳述される研究において、ラットを、（i）ratPAP-ratGM-CSFパルス樹状細胞、（ii）ratPAP-ratGM-CSFのみ、または（iii）従来のDFAアジュバント中のrat PAPのいずれかで免疫した。ラットの臓器（前立腺、および６つの主要な臓器系）を、自己PAP指向性免疫によって呼び起こされた免疫病理学について後に試験した。ラットモデル系に従って、良好な免疫応答がPAP発現臓器（特に、前立腺）を標的する免疫を生じることが期待された。
表１に示すように、組織病理学的研究は、rat PAP-rat GM-CSFパルス樹状細胞を用いるか、またはrat PAP rat GM-CSF融合タンパク質を用いる免疫が、前立腺に限定されるが、臓器特異的自己免疫を誘導することを示す。対照的に、ratPAP/CFAタンパク質を用いる免疫は、この結果を生じなかった。この結果は、PAP-GM-CSFそれ自体、およびPAP-GM-CSFパルス樹状細胞が、より有意な抗原特異的自己免疫を生じ、そして実際、従来のアジュバントと会合された抗原のみでは生じ得ないことを示す。
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以下の実施例は本発明を例示するが、いかなるようにも本発明を限定することを意図しない。
実施例１
PAP/GM-CSF融合タンパク質の構築
他に記載しない限り、一般的なクローニング手順を、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（1989）に記載されるような標準的な技術に従って行った。
ヒトPAPを、前立腺ガン細胞株LuCaP.FGC（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockland Maryland；「ATCC」）からクローン化した。配列CGGCTCTCCTCAACATGAGAGCを含む合成オリゴヌクレオチドプライマーを、Keystone Labs（Menlo Park, CA）による標準的な方法に従ってカスタム合成した。これらのプライマーは、GenBankデータベースに公開されている既知のPAP cDNA配列の5'末端に相同である。
使用される特定の発現ベクターの必要性により、HindIII、MunI、またはXhoI制限部位が付加された。3'末端では、配列CACAGGATCCATCTGTACTGTCCTCAGTACCのオリゴヌクレオチドが、PAP配列の終止コドン387を除いて、それをアミノ酸グリシンおよびセリンをコードするBamHI部位と置換するように変異させた。BamHI部位を、GenBankに公開されている配列に基づいて末梢血単核細胞（PBMNC）からクローン化したGM-CSF cDNAにPAP cDNAを融合させるために使用した。GM-CSFの5'末端で、BamHI部位を、オリゴヌクレオチドGACTGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCC（この配列はGM-CSF配列中のアミノ酸18〜23をコードするヌクレオチドに相同である）に付加した。GM-CSFの3'末端を、オリゴヌクレオチドGATCTCTAGAGCTTGGCCAGCCTCATCTGG（これはGM-CSFのインフレームの停止後に終結し、そしてXbaIクローニング部位を作製する）を用いて作製した。Poly AおよびRNAを、細胞株LnCaP.FGCおよびPBMNCから、Micro Fastトラックキット（Invitrogen）を用いて製造者によって供給されたマニュアルに従って単離した。次いで、Poly AおよびRNAを、添付のマニュアルに記載される手順に従って、cDNAサイクルキット（Invitrogen）を用いて逆転写した。次いで、第１ストランドcDNAを、上記のプライマーを用いる25サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供した。Perkin-Elmer thermal cycler 9600における条件は以下の通りであった。25サイクルの増幅を：変性94℃、15秒；アニーリング55℃、15秒；伸長72℃、60秒。この25サイクルに、72℃で420秒間の最終伸長が続いた。PCR産物をアガロースゲル上で分析した。これらを適切な制限酵素で消化し、そしてベクターpCR3（Invitrogen）にクローン化してpCR3-PAP-GMを作製し（データは示さず）、pCEP4（Invitrogen）にクローン化してpCEP4-PAP（図3A）を作製し、そしてpBacPac8（Clontech）にクローン化してPAPHGMBAC（図3B）を作製した。クローン化した構築物のDNA配列を、蛍光シーケンサーABI 373A型（Applied Biosystems, Foster City, CA）において標準的な方法を用いて確認した。ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を、図１の配列番号１および配列番号２としてそれぞれ示す。
pCR3 PAP-GMを、一過性発現実験のためにCOS-7細胞（ATCC）にエレクトロポレーションした。予想される大きさのタンパク質を確認した後、免疫学的同一性および機能を、COS-7細胞および293-EBNA細胞（Invitrogen）中で一過的に発現させ得、安定なトランスフェクタントを、エピソーム発現ベクターpCEP4（Invitrogen、San Diego、CA）を用いて、ヒト胎児腎臓細胞株293-EBNAにおいて作製した。エレクトロポレーションおよびハイグロマイシン中での選択後、組換えクローンを、限界希釈条件下での細胞プレーティング、および細胞性組織培養上清中でのPAP生物活性についてのスクリーニングによって作製した。最も高い産生性のクローンをタンパク質非含有培地に順応させ、そしてCellMax中空線維バイオリアクター（Gibco、Gaithersberg、MD）中で増殖させた。培養物由来の成分の無くなった培地（spent medium）を回収し、プールし、そして遠心分離によって明澄化した。次いで、これらをヒトPAP特異的モノクローナル抗体ATCC HB8526（ATCC）をセファロース樹脂に結合させることによって作製したイムノアフィニティーカラムを通過させた。洗浄後、結合した物質を低いpHで溶出し、中和し、そして生理学的緩衝液に対して透析した。溶出した画分を、還元条件下での変性SDS-PAGE電気泳動によって分析した。得られたゲルは、75kDの単一のタンパク質バンドを示した。これは、完全にグリコシル化されたPAP-GM-CSFの予想される大きさに対応する。
PAPHGM-BACをまた使用して、PAPHGM-BACとBacPAK6ウイルスDNA（Clontech、Palo Alto、CA）との相同組換えによって組換えAutographa califomia核多角体ウイルス（AcNPV、バキュロウイルス）を作製した。BacPAKバキュロウイルス発現系（Clontech）由来の試薬を使用し、そして本質的に製造者のマニュアルに記載されるように手順を行った。PAPHGM-BACおよびBacPAK6を、リポフェクションによってSF21細胞（Clontech）に同時トランスフェクトした。成分の無くなった組織培養上清を５日目に回収した。新鮮なSF21細胞について力価測定した。次いでこれをさらに４日間半固形培地で増殖させた。単層をニュートラルレッドで染色した後、ウイルスプラークを同定し、Pasteurピペットを用いてかきとった。プラーク精製した組換えウイルスを新鮮な培地に溶出し、次いで新鮮なSF21細胞中のPAP-GM-CSFの産生についてスクリーニングするために使用した。ポジティブなプラークを同定し、そして新鮮なSF21細胞を感染させる続く過程において、ウイルスストックおよび組換えタンパク質を作製するために使用した。産生培養物の培地を感染の３日後に回収した。次いで、これらを、293-EBNA細胞由来のPAP-GM-CSFについて記載したように処理した。イムノアフィニティー精製タンパク質の分析は、SDS-PAGEゲルの銀染色後に、64kDに単一のタンパク質バンドを示した。
実施例２
PAP-GM-CSF融合タンパク質の生物活性
実施例１に記載のすべての発現系由来のPAP-GM-CSF融合タンパク質を、GM-CSF依存性細胞株の増殖を支持するそれらの能力について分析した。それらをまた、酵素活性について、酸性ホスファターゼアッセイにおいて分析した。標準的バイオアッセイを使用して、GM-CSF生物活性を測定した。
GM-CSF活性。GM-CSF依存性ヒト赤白血球病細胞株TF-1（ATCC，Rockville，MD）および急性単球性白血病細胞株AML-193（ATCC）を使用して、GM-CSFがその生物活性をPAPへの融合後に保持するかどうかを分析した。GM-CSF含有培地中で慣例的に培養されている細胞株を、規定培地（regular media）中でアッセイの前に24時間枯渇させた。これらを、１ウェル当たり1500細胞で、３連で、組織培養培地中でプレートした。試験上清またはポジティブコントロールとしての組換えGM-CSFを細胞に添加した。細胞を72時間培養し、次いで４時間１ウェル当たり１マイクロキューリーのトリチウム化チミジンでパルスして、DNA合成の速度を測定した。図４は、哺乳動物由来PAP-GM-CSFおよび昆虫細胞由来PAP-GM-CSFの両方が、GM-CSF依存性細胞株の増殖を支持することを示す。PAP-GM-CSFの算出した相対的生物活性は、モル濃度ベースで、コントロール組換えGM-CSF依存性細胞株の活性の20％である。
酸性ホスファターゼ活性。融合タンパク質の第２の成分の生物活性を、酵素アッセイにおいて、酸性ホスファターゼ活性について測定した。酸性ホスファターゼを、酸性pHにおいてパラ-ニトロフェニルホスフェート（pNPP）を加水分解するタンパク質の能力として測定した。簡潔に記載すると、試験液体を50 mMクエン酸ナトリウム（pH 4.8）中で希釈した。pNPPを２mg/mlの最終濃度まで添加する。30分間の37℃でのインキュベーション後、等容量の１ＭNaOHを反応物に添加した。これらの条件下で加水分解されたpNPPは黄色を有し、これは405 nmにおいて分光光度計を用いて定量され得る。図５は、哺乳動物由来GM-CSFおよび昆虫細胞由来PAP-GM-CSFの両方がpNPPを酸性条件下で加水分解したことを示す。
従って、PAPおよびGM-CSFの両方のもとの生物学的活性がPAP-GM-CSF融合タンパク質において保存されていることは明らかである。
実施例３
HLAクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球のための標的細胞株の生成
他に記載しない場合、すべての組織培養技術、細胞操作およびアッセイを、標準的な技術に従って実施した。
規定されたバックグラウンドの標的細胞として使用され得る前立腺ガン細胞株を生成するために、HLA A2.1トランスジェニック前立腺ガン細胞株を生成した。HLA A2.1は最も良く研究されたヒトHLAクラスＩ拘束性免疫応答における拘束エレメントであり、そして白人における最も頻度の高い対立遺伝子である。HLA A2.1の公開された配列（GenBank）をコードするcDNAをリンパ芽球様細胞株JYから単離しそしてクローン化した。HLA A2.1重鎖cDNAを、センスプライマー5-AgACgCCgAggATggCC-3'およびアンチセンスプライマー5-CCTCTCTggAACAggAAAgATg-3'を用いて増幅した。方法および条件は、細胞株JY（Ed Engleman博士，Stanford University Blood Bank，Stanford，CAから入手した）を出発材料として使用した以外は、PAPおよびGM-CSFについて記載したとおりであった。得られた遺伝子フラグメントをTA-クローニングキット（Invitrogen）を使用してpCR3ベクター中にクローン化した。前立腺ガン細胞株LnCaP.FGC（ATCC）を、HLA A2.1の発現を与えるこの発現プラスミドでトランスフェクトした。親細胞株はA2.1対立遺伝子を発現しない。G418（Gibco）中での薬剤選択後、得られたトランスフェクタントをHLA A2.1特異的モノクローナル抗体（BB7.1、ATCC）を用いる固相免疫吸着（「パンニング」）によりHLA A2.1発現について選択した。得られた細胞株は一様にHLA-A2.1を発現したが、その親はネガティブのままであった。この新規のトランスジェニック細胞株は、HLAクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球のスクリーニングおよび分析において独特に有用である。
実施例４
PAP-GM-CSFによる前立腺ガン特異的CTLの誘導
Ｔ細胞インビトロ感作および拡大系を使用して、HLAクラスＩ拘束性CTLの生成におけるPAP-GM-CSFの有用性を確立した。
HLA-A2.1ポジティブPBMNCを1.077 g/mlの密度を有する密度勾配（FICOLL-HYPAQUE，Phamacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ）上で、標準的な方法により単離した。細胞をPAP-GM-CSFの10 ng/ml等価物で２日または５日間感作した（GM-CSF効力等価物を、実施例３において詳細に記載したようにGM-CSF依存性細胞株に対して測定した；PAP-GM-CSFの異なる大きさおよび比活性のために使用した実際の重量は20倍高かった）。次いで、細胞調製物から固相免疫吸着によりCD4+Ｔ細胞を枯渇させ、そして細胞調製物を1.068 g/ml密度勾配上で低密度細胞および高密度細胞に分離した。次いで、異なる画分を別々にrIL-2（20 U/ml）を補充したAIM V培地（Gibco，Gaithersberg，MD）中で培養した。Aim V培地中20 ng/ml PAP-GM-CSF中で培養した自己PBMNCを、再刺激のための抗原提示細胞として１週間隔で使用した。細胞の溶解能力を、標的としてHLA-A2-1トランスジェニック前立腺ガン細胞株LnCaP.FGCを用いる標準的な４時間クロム放出アッセイにおいて評価した。
図６は、PAP-GM-CSFパルス抗原提示細胞による前立腺ガンLnCaP.FGC/A2.1特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を示す。HLA-A2.1ポジティブPBLをPAP-GM-CSFの10 ng/ml GM-CSF等価物で２または５日間感作した。培養物からCD4+Ｔ細胞を枯渇させ、そして培養物を1.068 g/mlの密度を有するNycodenz密度勾配上で低（IF）および高（Ｐ）密度画分に分けた。
観察された細胞傷害性がHLAクラスＩ拘束性CD8+細胞傷害性Ｔ細胞媒介性現象であったかどうかを研究するために、単形性HLAクラスＩ特異的モノクローナル抗体であるW6/32（ATCC）抗体を用いるブロッキングアッセイを実施した。W6/32は、標準的なアッセイにおいてHLAクラスＩ媒介性傷害をブロックするが、コントロール抗体であるCA141はHLAクラスII（DR）に特異的であり、そしてクラスＩ拘束性傷害を干渉しない。最高の細胞傷害性を示した５日ペレット画分（上記）に由来したＴ細胞培養物を、この実験のために使用した。実験において使用したＴ細胞株は、38％のCD3/CD8ポジティブＴ細胞を含んだ。それらの溶解能力を、標的としてHLA-A2-1トランスジェニック前立腺ガン細胞株LnCaP.FGCを用いる標準的な４時間クロム放出アッセイにおいて評価した。図７は腫瘍特異的細胞溶解が、10：１のエフェクター:標的（E/T）比でのHLAクラスＩブロッキング抗体W6/32の存在下において実質的に減少され、そして3.3/1のE/T比での抗体により完全に排除されることを示す。コントロール抗体CA 141は、Ｔ細胞媒介性傷害を減少しなかった。これらの実験は、標的細胞との相互作用が、古典Ｔ細胞レセプター/HLAクラスＩ拘束性抗原特異的経路を介して媒介されることを実証する。
実施例５
樹状細胞の調製
HLA-A0201ポジティブボランティア健常ドナー由来の１単位の血液から調製したバフィコートを、Stanford University Blood Center（Stanford，CA）から入手する。細胞をleukopacから回収し、Ca++/Mg++非含有リン酸緩衝化生理食塩水（D-PBS；Gibco Laboratories，Grand Island，NY）を使用して60 mLに希釈し、そして50 mL遠心分離チューブ（好ましくは細胞トラップチューブ）中のオルガノシラン化コロイドシリカ（organosilanized colloidal silica）（OCS）分離媒体の２つの15 mLカラム（Dorn、米国特許第4,927,749号（本明細書中に参考として援用される）に記載のように調製する、密度1.0720 g/ml、pH 7.4、280 mOsm/kg H2O）上に重層する。OCS媒質を、好ましくは、コロイドシリカ（直径約10〜20 nm粒子）のシアノール基をアルキルトリメトキシシラン試薬と反応させ従ってブロックすることにより調製する。
関連するコロイドシリカおよびその産生のための方法は、Dornの米国特許第4,927,749号に開示されている。好ましい実施態様において、OCS密度勾配材料を、ポリビニルピロリドン（PVP）（例えば、Sigma Chemical Co.（St. Louis，MO）から入手可能なPVP-10）を補充した生理学的食塩溶液中で適切な特定の密度に希釈する。
チューブを、1000×gで35分間室温で遠心分離する。遠心分離走行をブレーキなしで停止させ、そして末梢血単核球（PBMC）（界面に存在する）を回収する。
PBMCをD-PBS中で再懸濁し、650×gで10分間で１回および200×gで５分間さらに２回遠心分離して血小板を除去する。血小板枯渇PBMCを60 mLのD-PBS中に再懸濁し、遠心分離チューブ中の15 mLのOCS（密度1.0610 g/mL、280 mOsm/kg H2O）の２つのカラムの上部に重層し、そして650×gで25分間４℃でブレーキなしで遠心分離する。得られる界面（主に単球）およびペレット細胞（主にリンパ球）を回収し、そして室温での遠心分離（650×gで10分間を１回およびその後200×gで５分間を２回）によりD-PBSで洗浄する。
樹状細胞を、その抗原提示機能を解明する目的のためにペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を生成させるために使用する場合、界面画分（大部分は単球）を冷プールヒトAB血清（Irvine Scientific，Santa Ana，CA）中に再懸濁し、これに等容量の80％AB血清20％ジメチルスルホキシド（DMSO）（Sigma Chemical Company，St. Louis，MO）を滴下する。得られる細胞懸濁物をクリオバイアル（cryovial）中に小分けし、そして液体窒素中で凍結する。単球を、拡大のためのCTLの再刺激のために使用し得る。
ペレット画分を100 mLのAB Culture Medium中に再懸濁し、２つのT-75組織培養フラスコ中に接種し、そして加湿５％C02インキュベーター中で40時間培養する。インキュベーション後、非接着細胞を穏やかなピペッティングにより回収し、洗浄し、そして２〜５×106細胞/mLの濃度でAB Culture Medium中に再懸濁する。細胞懸濁物を、AB Culture Medium中のOCS分離媒質（密度1.0565 g/mL、pH 7.4、280 mOsm/kg H2O）4.O mLの４つのカラム上に重層し、そして650×gで20分間室温でブレーキなしで遠心分離した。
界面およびペレット細胞を回収し、そしてAB Culture Medium（Basal RPMI-1640 medium，Gibco Laboratories，Grand Island，NY）中で、650×gで10分間を１回およびその後200×gで５分間を２回（各々室温）の遠心分離により洗浄する。両方の細胞画分の収量および生存率を、トリパンブルー排除を使用する血球計算板上での計数により評価する。
界面画分中の樹状細胞の純度をフローサイトメーター（FACS）での分析後に定量する。樹状細胞は、HLA-DR（FITCチャンネル）およびCD3、CD14、CD16、CD20（PEチャンネル）の混合物（cocktail）での二重染色を使用して、細胞表現型マーカーCD3（Ｔリンパ球）、CD14（単球）、CD16（NK細胞）、およびCD20（Ｂ細胞）についてネガティブ、ならびにHLAクラスII発現についてポジティブとして特徴付けられる。FITCチャンネルおよびPEチャンネルの両方でのIgG2aでの二重染色を、イソ型コントロールとして使用し得る。
細胞の形態もまた、顕微鏡写真を使用して評価し得る。DC富化画分は、細胞表面から伸長する細胞質突起（DCに特徴的な性質）を有する大きなサイズの不明瞭な（veiled）細胞を含む。
実施例６
PAP-G-CSFパルス樹状細胞のインビボ効力
Ａ．組換えratPAPおよびGM-CSF融合タンパク質の構築、発現および生物活性
組換えratPAP-rat-GM-CSFを以下のように構築した：rPAP cDNAを、ラット前立腺（Harlan）から単離したmRNAから作製した第１ストランドcDNAから、ヌクレオチド15〜1177（Genbank Acc. M32397）を含むフラグメントを規定し、そしてpBacPAK8ベクター中への挿入を容易にするための5'末端における内因性Xho I制限部位ならびに3'末端における内因性BamHIおよびBln I部位を付加するプライマーを使用して増幅した。GM融合体の非存在下においては、Bln I部位はインフレームの終止コドンをコードする。成熟rat GM-CSF cDNAを、ConA刺激ラット脾臓細胞から単離したmRNAから作製した第１ストランドcDNAから、ヌクレオチド１〜384（Genbank Acc.U00620）を規定し、そして5'末端における内因性BamHI部位および3'末端における内因性Xba I部位を付加するプライマーを使用してPCRにより増幅した。
ratPAPおよびratPAP-ratGM-CSFプラスミドを各々直鎖化BVウイルスゲノムプラスミドと混合し、そして混合物をSF21細胞中に組換えBVトランスフェクションキット（Clontech）中に供給されるLipofectinを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後に、培養上清を採集し、そしてアガロース下のSf21単層上で力価測定してウイルスプラークを形成させた。４日後、細胞をニュートラルレッドで染色し、そして候補ウイルスプラークをひろい、そしてSf21細胞上で拡大して、PAP酵素活性を指標（readout）として使用して組換えBVについてスクリーニングした。PAP+ BVクローンを選択し、そしてSF21大規模懸濁培養においてウイルスストックのため、および続くタンパク質非含有Sf900 II培地（Gibco/BRL）を使用するタンパク質産生のために拡大した。
すべてのタンパク質は、PNPP（標準的な酸性ホスファターゼアッセイにおいて使用される基質）の加水分解により示されるPAP酵素活性を示し、そしてGM-CSF融合タンパク質の場合、GM-NFS-60細胞に対するバイオアッセイにより示されるGM-CSF生物活性を示した。代表的融合タンパク質の例であるratPAP-ratGM-CSF（図９）のGM-CSF生物活性を、GM-CSF依存性細胞株GM-NFS-60を使用して実施したGM-CSFラット細胞増殖アッセイにおいて測定した。指定された量のサイトカインを含む200μlの培地中１ウェル当たり五千の細胞をプレートした。増殖を、48時間アッセイの最後の４時間、１ウェル当たり１μCi[3H]チミジンでパルスすることにより測定した。粗バキュロウイルス培養上清または10 ng/mlの市販の組換えマウスGM-CSF（rmGM）を希釈し、そして示すように培養細胞に添加し、そして増殖を測定した。
ratPAPを、そのＣ末端に結合された６ヒスチジン残基のテイルを有する融合タンパク質（ratPAP（His6））として発現させた。これを標準的な方法に従って、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（Ni-NTAカラム）により精製した。代表的な精製は、＞90％純粋組換えタンパク質をもたらした。ratPAP-ratGM-CSFの精製を、イオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィーの組み合わせにより実施した。この手順は代表的には＞50％純粋rat PAP-GM-CSFを生じる。
Ｂ．動物の免疫
雄性近交系ラットを、ratPAPのインビボにおける免疫原性に取り組むために設計した全ての研究において使用した。このような研究のゴールは、自己抗原であるrat PAPに対する免疫が誘起され得るかどうかを決定することであった。
正常８週齢雄性ラット（WistarまたはCOP）をCFA中のPAP（約200μg）またはPAP-GM-CSF融合タンパク質（200μg）で免疫した。免疫の終結後、ラットを安楽死させ、そしてそれらの前立腺を組織学的に検討した。ラットのさらなる群をratPAP-ratGM-CSFパルス樹状細胞で処置した。ラット脾臓由来の樹状細胞を図10に略述するように単離し、ratPAP-ratGM-CSF（これは、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびアニオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによりバキュロウイルス培養上清から精製した）で一晩パルスした。細胞（５〜10×106細胞／ラット）を同系宿主中に注射し戻した。第３の免疫の２週間後に、動物を屠殺し、そして前立腺、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓および結腸を獣医組織病理学者が分析し、そして免疫していないコントロール動物由来の組織と比較した。
ラット樹状細胞の表現型をフローサイトメトリーを使用して決定した。それらの抗原提示能を決定するために、細胞を同種異系混合リンパ球反応においてスティミュレーターとして使用し、全脾臓細胞に対するおよび接着脾臓細胞に対するアロ刺激能力を比較した。この方法により得られる樹状細胞純度についての代表的な範囲は、一般に30％と80％の間である。ラット由来の樹状細胞の抗原提示能力を、それらをSDラット脾臓細胞をレスポンダーとして用いる同種異系混合リンパ球反応におけるスティミュレーターとして使用することにより分析した。それらのアロ刺激能力を、COP系統およびSD系統の両方由来の全脾臓細胞に対しておよび接着脾臓細胞に対して比較した。
SD脾臓細胞は、同系SD脾臓細胞、接着脾臓細胞または樹状細胞により刺激されなかった。同種異系COPスティミュレーターを使用する場合、樹状細胞画分は、COPラット由来の脾臓細胞または接着脾臓細胞より数桁強く刺激する。
免疫されたラットの組織病理学。組織病理学は、顧問獣医組織病理学者が標準的手順に従って実施した。動物を、組織学的変化について、前立腺、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、および結腸に対して、表１に要約するように、調査した。コントロール動物（1C、2C、3C、4C）における全ての臓器は、有意な変化を示さなかった。処置した動物における前立腺以外の全ての臓器は、有意な変化を示さなかった。rat PAP rat GM-CSFパルス樹状細胞で処置した全ての動物は、間隙性前立腺炎を患った。強度は変動した：１匹の動物（７Ｔ）は１級（＝微少）の病変を有し、２匹の動物（６Ｔおよび８Ｔ）は２級の病変（＝軽度）を有し、そして１匹の動物（５Ｔ）は３級（中度）の病変を有した。CFA中のrat PAPで免疫した動物（1CFA、2CFA）は、前立腺のいかなる組織病理学も示さなかった。rat PAP rat GM-CSFタンパク質で免疫した動物（1 PAP GM、2 PAP GM）は、１級の間隙性リンパ球性前立腺炎を有した。
実施例７
p53-GM CSF融合タンパク質の構築および発現
細胞性腫瘍サプレッサー遺伝子p53を公知の配列（Genbankデータベースリリース91、エントリーHSP53）に従って、センスプライマーCgCggATCCTCACTgCCATggAggAgCおよびアンチセンスプライマーCTAgTCTAgACTCTgAgTCAggCCCTTCTgTC（これは、セリン-アルギニンリンカーをコードするXBA I部位を含む）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によりクローン化した。GM-CSFを、プライマーCTAgTCTAgATCTgCACCCgCCCgCTCgCCC（センス）およびCCggAATTCTCAgTgATggTgATggTgATgCgATCCTCTCATCTCCTggACTggCTCCCAgC（アンチセンス）を使用した以外、実施例１に記載のようにクローン化した。アンチセンスプライマーは、配列MetArgGlySerHisHisHisHisHisHis（これは、GM-CSFのＣ末端に結合され、そして融合タンパク質の検出および金属キレートアフィニティークロマトグラフィー精製のために使用され得る）をコードする。得られる配列を図11および12に示す。組換えバキュロウィルス移入ベクターおよび組換えバキュロウイルスを、実施例１に記載のように生成した。実施例１において詳細に記載したようにSF21昆虫細胞において発現させた場合、このバキュロウイルスはP53-GM-CS融合タンパク質を産生する。これを、実施例３、４および６においてPAP-GM-CSFによる抗PAP免疫の誘導について記載したように、抗p53免疫を生成させるために使用する。組換え融合遺伝子の配列を図11に示す。産生されるポリペプチドであるP53-GM-CSFの配列を図12に示す。
本発明は特定の方法および実施態様を参照して記載されたが、種々の改変および変更が本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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