(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンの不存在下、冷蔵することなく、乾燥組成物中において、第VIII因子を安定化するためのトレハロースの使用であって、この乾燥組成物は水又は水溶液によって再構成されて血友病患者への注射による投与のための溶液を形成するために適している、前記使用。
【請求項２】
前記組成物が第VIII因子の単位当たり０．１５〜２．５ｍｇのトレハロースを含有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
第VIII因子が組み換え体である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物が第VIII因子の単位当たり１．０〜１．５μｇのＣａ2+を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物が塩を含み、トレハロースと塩のモル比が１：１以上である、請求項１の使用。
【請求項６】
前記組成物が塩のモルあたり、２．５モルよりも多いトレハロースを含有する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記組成物が塩のモルあたり、１０モルより多いトレハロースを含有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
トレハロースは第VIII因子の溶液中に存在し、それから前記乾燥組成物を形成するために乾燥される、請求項１−７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記溶液は１−１０００単位／ｍｌの第VIII因子を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記乾燥組成物を形成するために、前記溶液が凍結乾燥される、請求項８または請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物がヒスチジンを含有する、請求項１−１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
水又は水溶液によって再構成されて血友病患者への注射による投与のための溶液を形成するために適している乾燥組成物であって、第VIII因子及びアルブミンの不存在下第VIII因子を安定化する量のトレハロースを含み、冷蔵することなく貯蔵される乾燥組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は水または水溶液を用いて再構成するための血液因子の乾燥組成物に関する。
血液因子、特に第VIII因子および第IX因子は現在、適当な因子欠乏により起こされる疾患、特に血友病の標準の治療法に使用される。血液因子は例えばＥＰ−Ａ−００８３４８３に開示されているように種々の抽出技術によりヒトの血液から、あるいは例えばＥＰ−Ａ−０１６０４５７およびＥＰ−Ａ−０１８２４４８に開示されているように遺伝学的に修飾された微生物における発現により、一般に誘導されて来た。
第VIII因子のような血液因子製品は高度にデリケートな不安定なたんぱく質である。それらは通常、適当な緩衝液中の凍結溶液の形でまたはより一般的には凍結乾燥粉末として供給される。その凍結乾燥粉末でさえ、貯蔵中冷所に保管されなければならない。その凍結乾燥物質を安定化させるために、市販の製品は安定化用たんぱく質、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有させている。ＨＳＡを存在させずに、周囲の温度でそして低温滅菌温度（例えば６０℃）で安定である乾燥血液因子組成物を造ることが可能であるとは考えられていなかった。しかしながら、ＨＳＡの存在は、該たんぱく質がウイルスに汚染されていないことが必須であるので、精製というかなりの問題をひきおこすことになる。これらの問題を克服するために組み換えＨＳＡを使用するとすれば費用がかかる。
トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）は、米国特許第４，８９１，３１９号に開示されているように、デリケートなたんぱく質のための高度に有効な安定剤であり、凍結以上の温度でたんぱく質を乾燥させることを可能ににすることが知られている。本発明者は、トレハロースを血液因子製品を安定化するために使用すると、その製品を凍結してまたは凍結せずに乾燥出来るばかりでなく、ＨＳＡの完全な不存在下に、長期間６０℃の温度で保管したときでさえ、その製品が安定であることを見い出した。それ故に本発明に従えば、本発明者はアルブミンの不存在下にトレハロースの安定化量を含有する安定な乾燥血液因子組成物を提供する。
一般に、任意の安定化量のトレハロースを使用することができて、一般に過剰は問題を生じない。事実、トレハロースの存在は再水和処理を助け、注射用に生理学的に許容出来、迅速に代謝されてグルコースとなる。一般に、第VIII因子の単位あたり０．２ｍｇ〜２．５ｍｇのトレハロースの割合、特に０．２〜１．５ｍｇ／単位が望ましい。本組成物は、第VIII因子の配合に特に適しており、適当な緩衝用およびイオン強化用塩、特にカルシウムの源をまた含有してもよい。一般に第VIII因子の単位当たり約１．０〜１．５μｇのカルシウムイオンの比が適当である。
他の緩衝用および変性用剤、例えばヒスチジンを、注射溶液に再構成するための乾燥物質中にまた存在させてもよい。しかしながら、本発明者は、存在する塩類、特に塩化ナトリウムのレベルが乾燥の際の保存に影響する可能性があることを見い出した。注射用の市販製品にとって等張塩濃度を有することが望ましいと考えられる。しかしながら凍結乾燥される処理用配合物は、典型的には約５００ｍＭのＮａＣｌ（等張ＮａＣｌ＝１５０ｍＭ）を含有する高張が望ましく、この理由はこれが血液因子を安定化するのを助けると考えられるからである。結果として、市販の凍結乾燥配合物は一般に高い塩含有量を有し、等張溶液を得るために適当な量の無菌水を用いて注射のために再構成されている。
塩含有量をかなり減少させることが本発明の乾燥物質のために好ましく、一般にｍｌ当たり約５００単位の第VIII因子を含む乾燥されるべき溶液は、好ましくは２００ｍＭ未満、例えば７５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、特に約１００ｍＭ、あるいはより低い、例えば２０〜５０ｍＭ、特に約２２〜３０ｍＭでさえあり得る。低い塩の製剤はより高い乾燥安定性を有している。乾燥製品は、慣用の水の代わりに食塩溶液を用いて所望の塩水準に再構成することが出来る。一般に、トレハロース対塩のモル比は約１：１以上、特に２．５：１以上、例えば１０：１以上、好ましくは１２．５：１以上であるべきである。
本乾燥組成物は正しい割合のトレハロースおよび他の所望の成分を含有する血液因子の適当な溶液を乾燥することによって得ることが出来る。一般に乾燥される溶液は、再構成された注射溶液において必要とされる全ての成分を単に含有すべきであるが、乾燥のための溶液が同じ希釈液であることは必ずしも必要ではない。典型的には乾燥のための溶液はｍｌ当たり１〜１０００単位の第VIII因子を含有する。乾燥の方法は、凍結乾燥、真空乾燥および噴霧乾燥を包含するであろう。本発明に従う特に好ましい方法は２５℃より高くない、好ましくは１０℃より高くない温度での真空乾燥であり、泡を形成し、かくして露出表面および乾燥効果を最大にする方法である。
以下の例は本発明をさらに例示する。
例  １：
組み換え第VIII因子を、その生産者の高い塩の緩衝液中に約２０００〜２５００単位／ｍｌを含有する深く凍結した溶液として受け取った。ｐＨ６．８での、５００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＣａＣｌ2および１０ｍＭのヒスチジンを含有する緩衝溶液に対して解凍した溶液を透析した。透析されたたんぱく質を同じ緩衝液中に希釈し、トレハロースを加え、ｐＨ６．８、最終濃度５００単位／ｍｌ、トレハロース１０重量％の溶液を得た。この溶液を１ｍｌの分別量で真空乾燥した。サンプルが凍結するのを避けるために、真空度を、大気圧から４パスカル（３０ミリトル）まで段階的に減少させた。サンプルの温度は泡の形成まで１２℃以上に上昇させず、その後に温度を３０℃以下に維持した。全乾燥時間は２４〜２８時間であった。
これらのサンプルは４０℃で、０ケ月、１．５ケ月、３ケ月および６ケ月間貯蔵し次に５ｍｌの分別量の無菌蒸留水で再構成した後に活性について試験した。結果を、ＨＳＡ含有の市販凍結乾燥製品と比較して次の表に示した。試験サンプルおよび市販のサンプルは共に高い塩含有量を有する。乾燥後の結果からトレハロースを用いて、ＨＳＡの不存在下に第VIII因子を首尾よく乾燥することが可能であることがわかるが、塩含有量が高いとＨＳＡの存在させたとしても長期間貯蔵するためには不満足な結果となる。
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例  ２：
１００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＣａＣｌ2、１５ｍＭのヒスチジンおよび１．２７モルのトレハロース（４３．５ｗ／ｖ）を用い例１に記載されたとおりにしてサンプルを乾燥し、６０℃で貯蔵した後に再構成した。結果を次の表において示し、表において活性はＡＣＬ１００自動コアギュロメーター（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）（イタリ、ミラノのＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ）上で測定した。低い塩含有量を有する試験サンプルは６０℃で４週間後でさえ、貯蔵の際に活性の重大な損失を示さなかった。
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例  ３：
下に示される通りの異なる塩濃度を含有する２種の配合物を造った。
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５００単位／小瓶の第VIII因子の濃度を与えるように、３０ｍｌの複数の小瓶に１０ｍｌづつの配合物を分配した。
Ｌａｃｏｎｃｏ（リフ−ロック１２ストッパーリング（Ｌｙｐｈ−ｌｏｃｋ  １２  ｓｔｏｐｐｅｒｉｎｇ）凍結乾燥器中で凍結乾燥を行った。始めにサンプルを−４０℃に冷却し、次に真空下に置き、その後に−３５℃に温めた。８０時間後、貯蔵温度が２５℃に到達するまで２．５℃／時間の速度でサンプルを温めた。次にサンプルを２時間２５℃に維持し、その後に真空下密封し乾燥器から取り出した。
乾燥後、サンプルを１０ｍｌの水で再水和しそして第VIII因子の濃度を２回（検定１および検定２）測定した。結果を次の表に示した。第VIII因子の濃度は（−７０℃で凍結された）プレフィル（ｐｒｅｆｉｌｌ）対照に関して濃度のパーセンテージとして示されている。示された結果から、ＨＳＡの不存在下にトレハロースをベースとする配合物中で首尾よく第VIII因子を乾燥できることが結論づけられる。
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