(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドであって、
ヘアピン型ポリアミドが下記構造式
【化１】
0003898532.tif 000015
で示される化合物であるヘアピン型ポリアミド。
【請求項２】
ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドであって、
ヘアピン型ポリアミドが下記構造式
【化２】
0003898532.tif 000016
で示される化合物であるヘアピン型ポリアミド。
【請求項３】
ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドであって、
ヘアピン型ポリアミドが下記構造式
【化３】
0003898532.tif 000017
で示される化合物であるヘアピン型ポリアミド。
【請求項４】
ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドであって、
ヘアピン型ポリアミドが下記構造式
【化４】
0003898532.tif 000018
で示される化合物であるヘアピン型ポリアミド。
【請求項５】
ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドであって、
ヘアピン型ポリアミドが下記構造式
【化５】
0003898532.tif 000019
で示される化合物であるヘアピン型ポリアミド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載のヘアピン型ポリアミドを含んでなる、特定遺伝子の発現を抑制するための薬剤。
【請求項７】
特定遺伝子が異常遺伝子である請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
請求項１〜５の何れかに記載のヘアピン型ポリアミドを含んでなる、抗ガン剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の遺伝子の発現を抑制し、高い抗ガン作用を有する新規で且つ極めて有用なヘアピン型ピロール−イミダゾールポリアミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの遺伝子配列の解明がほぼ完了した現在、ある特定の塩基配列に対して特異的な機能を有する分子に多くの研究者の注目が集まっている。例えばＤｅｒｖａｎらは逆平行に配向したピロール（Ｐｙ）−イミダゾール（Ｉｍ）ポリアミドが塩基配列特異的にＤＮＡのマイナーグルーブに結合することを見い出した（Bioorg. Med. Chem. 2001, 9, 2215；Curr. Opin. Str. Biol. 1997, 7, 355；J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7636 等）。これらの分子は転写因子などに匹敵する結合定数と特異性を有しているので（J. Am Chem. Soc. 1998, 120, 3534；J. Am Chem. Soc. 1998, 120, 6219 等）、実際これらの分子を用いて遺伝子の発現の制御が既に検討されている（Nature, 1997, 387, 202；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12890等）。しかしながら遺伝子の発現の制御は転写因子の結合を阻害することによって行われているため、ポリアミドが結合するターゲット配列は限られている（J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4856）。
本発明者らはＰｙ−ＩｍポリアミドにデュオカルマイシンＡのアルキル化部位であるセグメントＡ（Ｄｕ）を結合したハイブリット分子１を先に開発し特許出願している（ＷＯ00／15641号公報）。そのハイブリット分子１はＰｙ−Ｉｍポリアミドによる配列認識能と４５０塩基対のＤＮＡフラグメントの１ケ所をアルキル化する（J. Am Chem. Soc. 1999, 121, 4961）。しかしながら、１によるＤＮＡの配列特異的アルキル化反応は、完了するのに１週間以上要し、反応の効率も７％と低かった。
【化９】
0003898532.tif 000002
本発明者らは、また、アルキル化反応部位とＰｙ−Ｉｍポリアミドとの間にビニルリンカーを挿入したＩｍＰｙＬＤｕ８６（Ｌはビニルリンカーを示す。以下同じ。）が２量体となって選択的にＰｙＧ（Ａ／Ｔ）ＣＰｕという配列において５塩基離れた両方の鎖で反応することを見い出している（特開２０００−２８１６７９号公報；J. Am Chem. Soc. 2000, 122, 1602）。この際、アルキル化部分の安定性を高めるためにサイクロプロピルインドール（ＣＰＩ）であるＤｕ８６のセグメントＡに変更した。この化合物は２５ｎＭという低濃度においても、用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の７０％がアルキル化を引き起こし、リンカー部の導入により反応性と効率が劇的に向上することが判明した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列に対して、従来のこの種の機能分子よりも更に高いＤＮＡアルキル化能と配列認識能を兼ね備えたピロール−イミダゾールポリアミド系の機能分子を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ピロール−イミダゾールポリアミドの末端にビニールリンカーを介してアルキル化反応部位を有するヘアピン型ポリアミドに関する。
【０００５】
また、本発明は、上記ヘアピン型ポリアミドを含んでなる、特定遺伝子の発現を抑制する薬剤に関する。
【０００６】
更に、本発明は、上記ヘアピン型ポリアミドを含んでなる、抗ガン性を有する薬剤に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上記本発明のヘアピン型ポリアミドとしては、例えば下記一般式［１］
【化１０】
0003898532.tif 000003
（式中、Ｒ１はアルキル化反応部位を表し、Ｒ２は水素原子、アルキル基又はアセトアミド基を表し、ｋ，ｐ，ｑ，ｍ及びｎはそれぞれ独立して自然数を表す。）
で示される化合物が挙げられる。
【０００８】
上記一般式［１］において、Ｒ１で表されるアルキル化反応部位としては、ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列に対して、アルキル化能と配列認識能を兼ね備えた基であればどのような基でも良いが、例えば、下記構造式
【化１１】
0003898532.tif 000004
で示されるＣＰＩであるＤＵ−８６のセグメントＡ（Ｄｕ８６）の残基や、下記構造式
【化１２】
0003898532.tif 000005
で示されるＣＢＩである１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オンの残基等が挙げられる。
【０００９】
一般式［１］において、Ｒ２で表されるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６の直鎖状又は分枝状の低級アルキル基が挙げられ、具体例としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
また、ｋ，ｐ，ｑ，ｍ，ｎで表される自然数としては、通常１〜１０位，好ましくは１〜５位の自然数が挙げられる。
【００１０】
一般式［１］で示される化合物の例としては、例えば下記一般式［２］
【化１３】
0003898532.tif 000006
（式中、Ｒ２は水素原子、アルキル基又はアセトアミド基を表し、ｋ，ｐ，ｑ，ｍ及びｎはそれぞれ独立して自然数を表す。）
で示される化合物が挙げられる。
【００１１】
一般式［２］で示される化合物の具体例としては、例えば下記構造式
【化１４】
0003898532.tif 000007
で示されるヘアピン型ポリアミド、下記構造式
【化１５】
0003898532.tif 000008
で示されるヘアピン型ポリアミド、下記構造式
【化１６】
0003898532.tif 000009
で示されるヘアピン型ポリアミド。下記構造式
【化１７】
0003898532.tif 000010
で示されるヘアピン型ポリアミド等が挙げられる。
【００１２】
一般式［１］で示される化合物の他の例としては、例えば下記一般式［３］
【化１８】
0003898532.tif 000011
（式中、Ｒ２は水素原子、アルキル基又はアセトアミド基を表し、ｋ，ｐ，ｑ，ｍ及びｎはそれぞれ独立して自然数を表す。）
で示される化合物が挙げられる。
【００１３】
一般式［３］で示される化合物の具体例としては、例えば下記構造式
【化１９】
0003898532.tif 000012
で示されるヘアピン型ポリアミド等が挙げられる。
【００１４】
本発明のヘアピン型ポリアミドの合成法の概略を化合物１３及び１４を例にして反応スキーム１に示す。
なお、反応スキーム１には、比較のために使用した既存のタイプのヘアピン型ポリアミド（化合物１２）の合成法も併せて示した。
【００１５】
【化２０】
0003898532.tif 000013
【００１６】
即ち２と３のカップリングを市販のＦＤＰＰを用いて行いトリアミド４を合成した。その加水分解により得られるカルボン酸５を１２−１４のＮ末端側の半分にあたる共通のパーツとして利用した。８ａ−ｃと５をカップリングすることによりヘアピンエステル９ａ−ｃを合成した。アルキル化部分としては、ポリアミド部分とのカップリング条件でより安定なＤＵ８６のセグメントＡを用い、１２−１４をそれぞれ合成した。最終化合物はＨＰＬＣにより分取、精製をおこない、ＮＭＲ及びエレクトロスプレーマスにより構造確認した。
【００１７】
長鎖ＤＮＡ（４００ｂｐ）に対するアルキル化能
ヘアピンポリアミド１、１２−１４のＤＮＡとの反応について長鎖ＤＮＡ（ｐＵＣ−Ｉ’）を用いて検討した。アルキル化反応を２４時間行いシークエンスゲル電気泳動を用いて解析した結果を図１に示す。
比較の対象として用いたＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＤｕ（１）はサイト３の５'−ＧＴＣＡＧ−３'配列のＧで選択的に反応した。一方で、ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＤｕ８６（１２）のアルキル化は１００ｎＭ−１２．５ｎＭでは観察できなかった（レーン５−８）。更に１０μＭまで濃度をあげてもＤＮＡは全く消失せず、アルキル化は起こらなかった。この事実はＤｕの方がＤｕ８６よりも高い反応性を有していることを示している。一方、ピロールを１つ除きビニルリンカーを挿入したＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＤｕ８６（１３）は１より優れたアルキル化能を示し、サイト３のＧＴＣＡＧ配列のＡ（レーン９−１２）で反応した上、１００ｎＭの条件ではほとんどの出発ＤＮＡが消失した（レーン９）。加えてＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙにビニルリンカーを挿入したＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＤｕ８６（１４）は１３と比較すれば若干反応性が低下しているものの、優先的にアルキル化する塩基配列がサイト３のＧＴＣＡＧ配列のＧと異なるマッチサイトであるサイト７やサイト４、ミスマッチサイトであるサイト２でもアルキル化が進行し、１とは配列特異性が異なっていたことが明らかとなった（レーン１３−１６）。これらの結果はＤｕ８６の近傍の自由度が増したためと考えられる。なお、上記及び以下の記載において、−γ−はγ−アミノ酪酸残基を表す。
【００１８】
更に１と１３の反応性の差を詳細に調べるために、短い反応時間でのアルキル化を解析した。その結果、興味深いことに１３は５分という短時間での反応でもアルキル化が見られたが、１は１時間でもまだ反応していないことが明らかになった。これらのことは１３は１に比べてＤＮＡに対して劇的に配列特異的アルキル化のスピードが向上している事実を示している（図２）
【００１９】
短鎖ＤＮＡ（１０ｂｐ）に対するアルキル化
アルキル化サイトの反応塩基部を明確に確認するために、ポリアミド１２、１３、１４によるアルキル化についてＤＮＡオリゴマー５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧ／５'−ＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧを基質としてＨＰＬＣを用いて検討した。結果を図３に示す。ポリアミドによって反応性に著しい違いがあったが、すべての場合において反応の進行に伴いアルキル化体と考えられるピークが観測された。更に加熱により分解し、先に本発明者らが論文に示した方法（Tetrahedron Lett. 1990, 31, 7197；Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2179 等）によりオリゴマーの分解生成物を調べることにより、矢印のところでアルキル化反応が起こっていることが確認された。オリゴマーに対する反応性においても１２の反応性は１と比較しても非常に悪いことが確認された（１７ｈで１３％、図３）。この事実は長鎖ＤＮＡに対する反応性と同様ＤｕとＤｕ８６の反応性の差から起因していると思われる。また逆に１３は劇的な反応性の向上が見られた（５分で７５％）。このことはアルキル化部位（Ｄｕ８６）の反応性よりもＤＮＡマイナーグルーブ内における位置がＤＮＡアルキル化能に重要な影響を与えていることを示している。１４は短鎖ＤＮＡに対する反応性だけで見ると１とほぼ同等（２ｈで４６％）であるが、１３と比べると反応性が劣っている。
以上の結果から、１３のような分子設計、即ちイミダゾール−ピロールヘアピン型ポリアミドとＣＰＩアルキレーターの間にビニル基を配置したこと、それが、ＤＮＡアルキル化能の劇的な向上に大きく寄与していることが明らかになった。また、ＤＮＡアルキル化剤の塩基配列認識でもビニル基とセグメントＡとの組み合わせは効果的に機能することが判明した。ここで合成したヘアピン型ポリアミド１３及び１４は、高いＤＮＡアルキル化能を有した塩基配列特異的アルキル化剤であり、遺伝子発現制御やがん細胞に対する抗細胞増殖阻害活性の結果については後述する。
【００２０】
認識塩基配列を拡張した配列特異的アルキル化剤の分子設計
更に認識配列を拡張した機能分子として、１４のＮ末端にイミダゾール環を付けたＡｃＩｍＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＤｕ８６（１５）を設計した。更に、Ｎ末端のアルキル化能に与える影響も確認するために、アセチル基を削除したＩｍＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＤｕ８６（１６）を設計した。合成方法はスキーム１と同様の方法で、カルボン酸１７，１８とアミン体１９とをＦＤＰＰによりカップリングを行い２０を合成し、８ｃとのカップリング後、１５，１６へと導いた。最終化合物はＨＰＬＣにより分取、精製をおこない、ＮＭＲ及びエレクトロスプレーマスにより構造確認した（スキーム２）。
【００２１】
【化２１】
0003898532.tif 000014
【００２２】
ヘアピンポリアミド１４，１５，１６を比較するために長鎖ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＩＩ）を用いるＤＮＡアルキル化反応を行った。反応時間を２４時間行い、シークエンスゲル電気泳動を用いて解析した結果、それぞれｎＭ濃度下での５'−ＴＧＡＣＣＡ−３'における配列特異的なアルキル化を観察することができた（図４）。
興味深いことに、１４もマッチ配列である５'−ＴＧＡＣＣＡ−３'でアルキル化が観察されているが、その反応性は１５，１６と比べると低く、ミスマッチ配列でのアルキル化も観察されている。明らかにＤｕ８６の近傍の自由度があることがその配列認識能の低下を引き起こしている。また、Ｎ末端のアセチル基を外すことによる影響は、ほとんどなかった。１５，１６のような分子設計は、Ｉｍ−Ｐｙ認識則に従った配列認識能を有しており、認識塩基配列をイミダゾール−ピロールの配置によって、変えることができる。このような塩基配列認識能を有しながら高いＤＮＡアルキル化能を兼ね備えた配列特異的アルキル化剤は前例がないものである。
【００２３】
より実用性を重視した配列特異的アルキル化剤の分子設計
ここまで述べてきた本発明者らが開発した機能分子１３，１４，１５，１６は、非常に優れた塩基配列認識能と、ｎＭ濃度で発現するＤＮＡアルキル化能を兼ね備えた理想的な配列特異的アルキル化剤である。その上、イミダゾール−ピロールの配置を変えることで、認識配列を変えることも可能にしている。しかしながら、これらの化合物は何れもＤＮＡアルキル化部分に天然物であるデュオカルマイシンＢ２由来のセグメントＡを使用しているので大量生産という点で若干問題が残る。
この点については、本発明者らは、既にＢｏｇｅｒらによって合成法が報告されている（J. Org. Chem. 1992, 57, 2873；J. Org. Chem. 1995, 60, 1271 等）、ＣＢＩ：１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オン（２２）をＤｕ８６の代わりに使用することでこの問題が解決できると考えた。ＣＢＩを使う上での利点として１，３−ジヒドロキシナフタレンという市販品を出発原料として用いることができる点、また両エナンチオマーも光学分割によって供給可能になる点などが挙げられる。そこで、本発明者らは、１６のＤｕ８６部をＣＢＩに置き換えた化合物２３を新しく合成した。そしてそのＤＮＡアルキル化能評価を長鎖ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＩＩ）を用いて行った。結果を図５に示す。
【００２４】
その結果、ＣＢＩはＤｕ８６のセグメントＡと比べても遜色なく配列特異的にアルキル化を行うことができることを見い出した。このＣＢＩへの変換は、本発明者らが開発してきた配列特異的アルキル化剤に適用可能であると考えられる。
本発明者らのこの新しい発見は、既存のＩｍ−ＰｙヘアピンポリアミドとＣＢＩをビニルリンカーで結合させたことである。このビニルリンカーでの結合による分子設計の最適化が、配列特異的アルキル化剤実現の重要な因子であった。この発見によって、本発明者らが開発した配列特異的アルキル化剤の実用化、汎用化の可能性が一段と大きくなった。
【００２５】
塩基配列特異的アルキル化剤としてのＰｙ−Ｉｍポリアミドの応用例
（ｉ）遺伝子発現制御ツールとしての可能性―新しいジーンノックアウト法の開発に向けて
特定の遺伝子の発現を人為的にコントロールする方法としては、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡに対する相補的なＤＮＡ誘導体を投与し、タンパク質への翻訳を阻害するアンチセンス法や、ｍＲＮＡを配列選択的に切断するリボザイム法などがあり、前者はＨＩＶ患者に対するサイトメガロウイルスに対する点眼薬として既に実用化されている。遺伝子の転写の段階を抑える方法としてはオリゴヌクレオチド誘導体を標的とする２本鎖ＤＮＡに三重鎖を形成させるアンチジーン法が提案されており、米国ではベンチャービジネスも数社設立された。しかし、この方法はターゲットとなる塩基配列がＡとＧの連続した部分に限られていることや、またオリゴヌクレオチドの核への透過の困難さから、実用化の段階には達していない。
【００２６】
これに比べ、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは標的となる塩基配列を自由に選択でき、更に細胞膜や核膜の透過性も非常にすぐれているため、遺伝子の発現をコントロールする分子として大きく発展する可能性を秘めている。実際、Ｄｅｒｖａｎらによってピロール（Ｐｙ）−イミダゾール（Ｉｍ）ポリアミドを用いて遺伝子の発現の制御の報告がなされている。しかしながら、Ｄｅｒｖａｎらの遺伝子発現の制御は転写因子の結合を阻害することによって行われるため、ポリアミドが結合するターゲット配列は限られているのが現状である。アルキル化能をもつＰｙ−ＩｍポリアミドはＤＮＡに配列特異的に結合するので、特定の遺伝子の発現を制御領域のみでなく、蛋白をコードしている領域でも効果的に制御することが可能であると考えられる。従ってこれらの分子は、ポストゲノム時代に必要とされているノックアウトジーン法として未知遺伝子の機能解析や、更にはテーラーメード医薬としてもさまざまな利用が考えられる。アルキル化能をもつＰｙ−ＩｍポリアミドはＤＮＡに配列特異的に共有結合するので、特定遺伝子のタンパクの発現をコードする領域でも効果的に制御することが可能であると考えられる（図６）。このことはターゲットが似ている配列が多い調節領域にとどまらず、任意の配列をターゲットに選べることを意味している。
【００２７】
この利点は、病気の分子生物学的知見に基づいた新しい抗がん剤として有望であると考えられる。即ち抗がん剤として細胞において重要な役割を果たしていることが知られている遺伝子、例えばｒａｓオンコジーン、細胞周期を調節するＥ２Ｆ遺伝子、テロメア領域やテロメアーゼ遺伝子などをターゲットとする方法があげられる。
現在、まだ初期的な実験として、Ｔ７プロモーターとＴ７ポリメラーゼを用い、ＧＦＰプロテイン発現コード領域を使った実験を進めているが、そのコード領域中の３８７ｎｔ位のアデニンに対する化合物１３の配列特異的なアルキル化に由来したポリメラーゼの転写阻害から生成したｍＲＮＡを観察することができている（図７）。まだ、実験条件が整っていない段階であり、更に詳細な転写阻害機構を解析していく必要がある。しかしながら、この結果は、配列特異的アルキル化剤がコード領域中で特異的に転写を阻害する能力を有していたことを世界で初めて示した実験であり、その意義は大きいと考えられる。新しいノックアウトジーン法の開発に向けてのブレイクスルーになるものである。
【００２８】
（ii）配列特異的アルキル化剤が抗細胞増殖阻害活性に与える効果
・・・・・・テーラーメード抗がん剤の開発に向けて
本発明者らが合成した多くの配列特異的アルキル化能をもつＰｙ−Ｉｍポリアミドについて３９種類のヒト培養がん細胞に対する抗細胞活性を検討した結果（３９種類のヒト培養がん細胞に対する抗細胞活性評価は、全て(財)癌研究会癌化学療法センター、矢守隆夫氏に依頼した。）、いくつか興味深い事実が明らかになってきた。ひとつは、ＤＮＡアルキル化能と抗細胞活性の間に比例関係がみられたことである（図８）。例えば、平均ＩＣ５０値はそれぞれＩｍＰｙＤｕ（−４．５９）、ＩｍＰｙＤｕ８６（−５．９５）、ＩｍＰｙＬＤｕ８６（−８．２５）のようにＤＮＡアルキル化能の増大に伴い、小さくなっていく。特に、ビニルリンカーをイミダゾール−ピロールポリアミドとＤｕ８６の間に配置したことによる劇的な抗細胞活性の向上が、同系列の配列特異的アルキル化剤（ＰｙＰｙＬＤｕ８６、ＰｙＰｙＰｙＬＤｕ８６、ＩｍＰｙＰｙＬＤｕ８６）でも観察されていることは特筆すべき事実である。
【００２９】
更に興味深い結果が、ヘアピン型配列特異的アルキル化剤、ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＤｕ３６（１３）とＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＤｕ３６（１４）の場合について抗細胞活性を示すフィンガープリントパターンを比較したときに得られた（図９）。一般に、作用機序が類似した薬剤間でフィンガープリントパターンを比較した場合、高い相関係数（ｒ＝０．７５〜１．０）が得られてくることが知られており、実際、ＤＮＡインターカレーター、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン間では非常に高い類似性が見られる。しかし、１３と１４は、同じＤＮＡマイナーグループでアデニン、グアニンのＮ３位をアルキル化する反応機序であるにもかかわらず、両者のフィンガープリントパターンの相関性はかなり低いものであった（ｒ＝０．６０）。この１３と１４のように、構造が類似していながら塩基配列認識能の違いだけで、抗細胞活性に影響を与えられたことは、これまで前例がなく、非常に重要な知見になった。これらの結果はアルキル化剤に配列選択性を付与することで抗細胞増殖阻害活性を変えることが可能であることを意味しており、新しい抗ガン剤や遺伝子治療薬への道を拓くものであることを示唆している。
【００３０】
ＤＮＡアルキル化剤は第一世代の抗がん剤と言われマイトマイシン、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、サイクロフォスファミドなど様々な薬物が開発され、現在でも臨床で用いられている。しかし、正常細胞に対する重い副作用など克服が難しい問題があり、開発はその後頭打ちになっている。そのため、メトトキセートや５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤や、カンプトテシンなどのトポイソメラーゼの阻害剤、タキソールなどのチュブリンをターゲットとするＤＮＡ以外を標的とした抗がん剤の開発が主流になっている。ＤＮＡアルキル化剤にＤＮＡの塩基配列特異性を付与することによって、特定の遺伝子の発現を選択的にコントロールすることにより、副作用のないテーラーメード抗がん剤を開発する糸口になると考えられる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  ５'−テキサスレッドラベルした４５０塩基対ＤＮＡの合成
ＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−Ｉ'）は、５'−テキサスレッドでラベルした２０塩基対プライマー：５'−ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ−３’（ｐＵＣ１８ ｆｏｒｗａｒｄ，７８０−７９９）、２０塩基対プライマー：５’−ＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ−３'（ｐＵＣ１８ ｒｅｖｅｒｓｅ，１４５９−１４７８）を用いてｐＵＣ１８を鋳型としてＰＣＲ法によって合成した。得られたＤＮＡフラグメントはＳｕｐｒｅｃ−０２にてろ過精製した後、ＵＶ吸収を測定してその濃度を決定した。
ＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−ＩＩ）は、５'−テキサスレッドでラベルした２１塩基対プライマー：５'−ＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧ−３'（ｐＵＣ１８ ｒｅｖｅｒｓｅ，１８６１−１８８１）、１８塩基対プライマー：５'−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３'（ｐＵＣ１８ ｆｏｒｗａｒｄ，３７８−３９５）を用いてｐＵＣ１８を鋳型としてＰＣＲ法によって合成した。得られたＤＮＡフラグメントはＳｕｐｒｅｃ−０２にてろ過精製した後、ＵＶ吸収を測定してその濃度を決定した。
【００３３】
実施例２  ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５'末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−Ｉ'）１０ｎＭ、ＤＭＦ１０％（ｖ／ｖ）と図１に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（エッペンドルフ）に入れて２３℃下で２４時間静置した。
［レーン１−４，１００，５０，２５，１２．５ｎＭ（１）；レーン５−８，１００，５０，２５，１２．５ｎＭ（１２）；レーン９−１２，１００，５０，２５，１２．５ｎＭ（１３）；レーン１３−１６，１００，５０，２５，１２．５ｎＭ（１４）；レーン１７，ＤＮＡコントロール］
子牛胸腺ＤＮＡ（１ｍＭ，１μＬ）を加えクェンチングを行い、９０℃にて５分間振動させた。遠心減圧下得られたＤＮＡにローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌを加え溶解させた後、９４℃にて２０分間振動させた。直ちに０℃にて急冷した後、その２μｌについて、ＨＩＴＡＣＨＩ ５５００−Ｓ  ＤＮＡシーケンサーシステムを用いた６％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。結果を図１に示す。
【００３４】
実施例３  ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５'末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−Ｉ’）１０ｎＭ、ＤＭＦ１０％（ｖ／ｖ）と図２に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（エッペンドルフ）に入れて２３℃下で５分、１時間、２時間、それぞれ静置した。
［レーン１，ＤＮＡコントロール；レーン２−４，１００，５０，２５ｎＭ  （１３）；レーン５−７，１００，５０，２５ｎＭ（１３）；レーン８−１０，１００，５０，２５ｎＭ（１３）；レーン１１−１３，１００，５０，２５ｎＭ（１）；］
各反応時間後、子牛胸腺ＤＮＡ（１ｍＭ，１μＬ）を加えクェンチングを行い、９０℃にて５分間振動させた。遠心減圧下得られたＤＮＡにローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌを加え溶解させた後、９４℃にて２０分間振動させた。直ちに０℃にて急冷した後、その２μｌについて、ＨＩＴＡＣＨＩ ５５００−Ｓ ＤＮＡシーケンサーシステムを用いた６％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。結果を図２に示す。
【００３５】
実施例４  ＤＮＡオリゴマーに対するアルキル化反応の解析
ＤＮＡオリゴマーはＤＮＡ合成機で合成したものを用いた。全量５０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍＭ中に二本鎖ＤＮＡフラグメント１５０μＭ、ＤＭＦ１０％（ｖ／ｖ）とそれぞれの試薬１，１２，１３，又は１４（１５０μＭ）を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（エッペンドルフ）に入れて２３℃下で静置した
反応の進行をケムコボンド ５−ＯＤＳ−Ｈ カラム（４．６×１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにて測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に表記する。
［５０ｍＭギ酸アンモニウム及び０−５０％アセトニトリル リニアグラジエント（０−４０ｍｉｎ）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２５４ｎｍ］
結果を図３に示す。
【００３６】
実施例５  ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５'末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−ＩＩ）１０ｎＭ、ＤＭＦ１０％（ｖ／ｖ）と図４に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（エッペンドルフ）に入れて２３℃下で２４時間静置した。
［レーン１，ＤＮＡコントロール；レーン２−７，５０，２５，１２．５，１０，７．５，５，２．５ｎＭ（１５）；レーン８−１３，５０，２５，１２．５，１０，７．５，５，２．５ｎＭ（１６）；レーン１４−１９，５０，２５，１２．５，１０，７．５，５，２．５ｎＭ（１４）］
子牛胸腺ＤＮＡ（１ｍＭ，１μＬ）を加えクェンチングを行い、９０℃にて５分間振動させた。遠心減圧下得られたＤＮＡにローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌを加え溶解させた後、９４℃にて２０分間振動させた。直ちに０℃にて急冷した後、その２μｌについて、ＨＩＴＡＣＨＩ ５５００−Ｓ ＤＮＡシーケンサーシステムを用いた６％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。結果を図４に示す。
【００３７】
実施例６  ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５'末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ｐＵＣ−ＩＩ）１０ｎＭ、ＤＭＦ１０％（ｖ／ｖ）と図５に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（エッペンドルフ）に入れて２３℃下で２４時間静置した。
［レーン１−５，５０，２５，１２．５，６．３ｎＭ（１６）；レーン６−１０，５０，２５，１２．５，６．３ｎＭ（２３）］
子牛胸腺ＤＮＡ（１ｍＭ，１μＬ）を加えクェンチングを行い、９０℃にて５分間振動させた。遠心減圧下得られたＤＮＡにローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌを加え溶解させた後、９４℃にて２０分間振動させた。直ちに０℃にて急冷した後、その２μｌについて、ＨＩＴＡＣＨＩ ５５００−Ｓ ＤＮＡシーケンサーシステムを用いた６％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。結果を図５に示す。
【００３８】
実施例７〜９  化合物１２，１３及び１４の合成
反応スキーム１に従って、化合物１２，１３及び１４を合成した。
（１）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＣＯ２ＣＨ３ (４)の合成
化合物２（１．０ｇ，３．７２ｍｍｏｌ）のメタノール−酢酸エチル混合溶液（１：１，３０ｍＬ）に１０％パラジウム−炭素（２２０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温にて３時間撹拌した。触媒成分をセライトろ過により除去した後、ろ液を濃縮してクルードのアミン体を得て（８５９ｍｇ）、更なる精製をすることなく、これを次の反応に用いた。クルードのアミン体（８５９ｍｇ，３．５９ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＭＦに溶かし、化合物３（８２０ｍｇ，２．６９ｍｍｏｌ）とＦＤＰＰ：ペンタフルオロフェニルジフェニルフォスフィネート（１．７０ｇ，４．４２ｍｍｏｌ）を加え、続いてｉＰｒ２ＮＥｔ：ジイソプロピルエチルアミン（１．５４ｍＬ，８．８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製することにより化合物４（１．３３ｇ）を収率９４％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.23 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.27 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.17 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.12 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.16 (dt, J= 6.0, 7.0 Hz,2H), 2.34 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.74 (qu, J= 7.0 Hz, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ２４Ｈ３１Ｎ８Ｏ６ (M+H) 527.2, found 527.1。
【００３９】
（２）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＣＯ２Ｈ （５）の合成
化合物４（１．３３ｇ，２．５２ｍｍｏｌ）を蒸留水５０ｍｌで懸濁し、水酸化ナトリウム（８００ｍｇ，２０ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温にて２４時間撹拌したのち、１０％ＨＣｌ水溶液を０℃下で加えて酸性（ｐＨ２）にした。生じた沈殿物をろ取し、水洗してから乾燥し、化合物５（１．１０ｇ）を収率８５％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.26 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.17 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.11 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 6.86 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.17 (dt, J= 6.0, 7.0 Hz, 2H), 2.24 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.79 (qu, J= 7.0 Hz, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ２３Ｈ２９Ｎ８Ｏ６ (M+H) 513.2, found 513.3。
【００４０】
（３）ＮＯ２ＩｍＰｙＰｙＬＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３（８ｃ）の合成
化合物６（５００ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）のメタノール−酢酸エチル混合溶液（１：１，２０ｍＬ）に１０％パラジウム−炭素（２００ｍｇ）を加えた。更に水素化ほう素ナトリウム（１７０ｍｇ，４．４７ｍｍｏｌ）を蒸留水（１ｍｌ）で懸濁したものを、０℃下で滴下した後、反応混合物を窒素雰囲気下、室温にて２０分間撹拌した。触媒成分をシリカゲルろ過にて除去した後、ろ液を濃縮してクルードのアミン体を得て（４１８ｍｇ）、更なる精製をすることなく、これを次の反応に用いた。クルードのアミン体（４１８ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ）を１４ｍｌのＤＭＦに溶かし、化合物７（３３０ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）とＦＤＰＰ：ペンタフルオロフェニルジフェニルフォスフィネート（１．３ｇ，３．３９ｍｍｏｌ）を加え、続いてｉＰｒ２ＮＥｔ：ジイソプロピルエチルアミン（１．１８ｍＬ，６．７８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０時間撹拌した後、反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製することにより化合物８ｃ（３５９ｍｇ）を収率８３％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.86 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.51 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.22 (s, 1H),6.74 (s, 1H), 6.07 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 4.14 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 4.05 (s,3H), 3.85 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 1.23 (t, J= 7.0 Hz, 3H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ２１Ｈ２４Ｎ７Ｏ６ (M+H) 470.2, found 470.1。
【００４１】
（４）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＣＯ２ＣＨ３（９ａ）の合成
化合物８ａ（２００ｍｇ，０．４６６ｍｍｏｌ）のメタノール−酢酸エチル混合溶液（１：１，８ｍＬ）に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温にて５時間撹拌した。触媒成分をセライトろ過により除去した後、ろ液を濃縮してクルードのアミン体を得て（１７８ｍｇ）、更なる精製をすることなく、これを次の反応に用いた。クルードのアミン体（１７８ｍｇ，０４４６ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに溶かし、化合物５（１９０ｍｇ，０．３７３ｍｍｏｌ）とＦＤＰＰ：ペンタフルオロフェニルジフェニルフォスフィネート（２６８ｍｇ，０．６９９ｍｍｏｌ）を加え、続いてｉＰｒ２ＮＥｔ：ジイソプロピルエチルアミン（０．２４３ｍＬ，１．３９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にて１６時間撹拌した後、反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製することにより化合物９ａ（１５４．５ｍｇ）を収率４９％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.26 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.99 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.42 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.94 (s, 6H), 3.84 (s, 3H), 3.83 (s, 3H),3.82 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.78 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４１Ｈ４８Ｎ１５Ｏ９ (M+H) 894.4, found 894.3。
【００４２】
（５）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３（９ｂ）の合成
化合物８ｂ（６８ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）のメタノール−酢酸エチル混合溶液（１：１，４ｍＬ）に１０％パラジウム−炭素（３０ｍｇ）を加えた。更に水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を蒸留水（０．２ｍｌ）で懸濁したものを、０℃下で滴下した後、反応混合物を窒素雰囲気下、室温にて２０分間撹拌した。触媒成分をシリカゲルろ過にて除去した後、ろ液を濃縮してクルードのアミン体を得て（６０ｍｇ）、更なる精製をすることなく、これを次の反応に用いた。クルードのアミン体（６０ｍｇ，０．１８９ｍｍｏｌ）を０．６ｍｌのＤＭＦに溶かし、化合物５（９７ｍｇ，０１８９ｍｍｏｌ）とＦＤＰＰ：ペンタフルオロフェニルジフェニルフォスフィネート（１０９ｍｇ，０．２８４ｍｍｏｌ）を加え、続いてｉＰｒ２ＮＥｔ：ジイソプロピルエチルアミン（９９μＬ，０．５６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間撹拌した後、反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製することにより化合物９ｂ（１０７ｍｇ）を収率６９％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.27 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.95 (s,1H), 9.89 (s, 2H), 8.01 (brt, 1H), 7.51 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.43 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.27 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 7.17(d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.12 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 6.83 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 6.11 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 4.15 (q, J= 7.0 Hz, 2H),3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.20 (dt, J= 5.5, 7.0 Hz, 2H), 2.36 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.79(q, J= 7.0 Hz, 2H), 1.24 (t, J= 7.0 Hz, 3H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ３８Ｈ４６Ｎ１３Ｏ８ (M+H) 812.4, found 812.3。
【００４３】
なお、上記（３）において原料として用いた化合物７及び８、及び上記（４）において原料として用いた化合物８ａ、並びに上記（５）において原料として用いた化合物８ｂは、J. Am Chem. Soc. 1999, 121, 4961 及び J. Am Chem. Soc.2000, 122, 1602 等に記載の方法により合成したものを使用した。
【００４４】
（６）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３（９ｃ）の合成
化合物９ｃは、化合物９ｂと同様の合成手順により収率２８％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.26 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.97 (s,1H), 9.95 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.52 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.27 (s, 2H),7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.08 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 4.15 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.21 (m, 2H), 2.36 (m, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 1.24 (t, J= 7.0 Hz, 3H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４４Ｈ５２Ｎ１５Ｏ９ (M+H) 934.4, found 934.4。
【００４５】
（７）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＣＯ２Ｈ（１０ａ）の合成
化合物９ａ（１５４．５ｍｇ，０．１８１ｍｍｏｌ）を０．６ｍｌの蒸留水で懸濁したものに、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（０．２ｍｌ，１．３４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を２時間撹拌し、１％ＨＣｌ水溶液を０℃下で加えて酸性（ｐＨ２）にした。生じた沈殿物をろ取し、水洗した後、乾燥し、化合物１０ａ（１３１．５ｍｇ）を収率８６％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.25 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.12 (s, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 3.94 (s, 6H), 3.84 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.81 (s, 3H),3.79 (s, 3H), 3.18 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.78 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４０Ｈ４６Ｎ１５Ｏ９ (M+H) 880.4, found 880.4。
【００４６】
（８）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＣＯ２Ｈ（１０ｂ）の合成
化合物９ｂ（１４３ｍｇ，０．１７６ｍｍｏｌ）を０．６ｍｌの蒸留水で懸濁したものに、ＤＢＵ（０．６ｍｌ，４．０１ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を６時間撹拌した後、溶媒を留去して得た残留物をジエチルエーテルと酢酸エチルを用いて洗浄した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−２０％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製した後、粗結晶のカルボン酸塩を１％酢酸で酸性にさせた。生じた沈殿物をろ取、水洗、乾燥して化合物１０ｂ（７０ｍｇ）を収率５１％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.27 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.89 (s, 2H), 8.02 (brt, 1H), 7.46 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.27 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.13 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 2.0 Hz, 1H),6.03 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80(s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.21 (m, 2H), 2.36 (m, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.79 (m,2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ３６Ｈ４２Ｎ１３Ｏ８ (M+H) 784.3, found 784.3。
【００４７】
（９）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＯ２Ｈ（１０ｃ）の合成
化合物１０ｃは、化合物９ｂの代わりに化合物９ｃを用い、化合物１０ｂと同様の合成手順により収率５０％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.93 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.01 (brt, 1H), 7.45 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.26 (s, 2H),7.16 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 5.99 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 3.94 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 3.79 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.78 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４２Ｈ４８Ｎ１５Ｏ９ (M+H) 906.4, found 906.3。
【００４８】
（１０）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＣＯＩｍ（１１ａ）の合成
化合物１０ａ（１０ｍｇ，１１．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍｌ）で溶かしたものに、１，１’−カルボニルジイミダゾール（３．５ｍｇ，２２．０μｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温にて５時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（５ｍｌ）で３回洗浄して化合物１１ａ（１０ｍｇ）を収率９５％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.25 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 10.06 (s,1H), 10.03 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.01 (brt,1H), 7.77 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.26 (s, 2H), 7.20 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.13 (s, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.89 (s, 1H),3.94 (s, 6H), 3.90 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.78 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４３Ｈ４８Ｎ１７Ｏ８ (M+H) 930.4, found 930.3。
【００４９】
（１１）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＣＯＩｍ（１１ｂ）の合成
化合物１１ｂは、化合物１０ａの代わりに化合物１０ｂを用い、化合物１１ａと同様の合成手順により収率９４％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.26 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 10.08 (s,1H), 9.95 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.87 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.47 (s, 1H),7.42 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.14 (d, J= 15.0Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.86 (s,3H), 3.81 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.21 (m, 2H), 2.37 (m, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.80 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ３９Ｈ４４Ｎ１５Ｏ７ (M+H) 834.4, found 834.3。
【００５０】
（１２）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＯＩｍ（１１ｃ）の合成
化合物１１ｃは、化合物１０ａの代わりに化合物１０ｃを用い、化合物１１ａと同様の合成手順により収率９４％で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 10.24 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 10.04 (s, 1H), 9.99 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.01 (brt, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.87 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.47 (s, 1H),7.45 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 7.13 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.79 (s,3H), 3.77 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.79 (m, 2H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ４５Ｈ５０Ｎ１７Ｏ８ (M+H) 956.4, found 956.5.
【００５１】
（１３）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＣＰＩ（１２）の合成
水素化ナトリウム（３．０ｍｇ，７５μｍｏｌ，６０％ミネラルオイル懸濁液）の無水ＤＭＦ（０．１ｍｌ）溶液中にＤＵ８６のセグメントＡ（３．７ｍｇ，１４．５μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．１ｍｌ）溶液を加えた後、化合物１１ａ（１０ｍｇ，１０．７μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で添加し、反応混合物を０℃にて１時間撹拌した。そこに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（２ｍＬ，ｐＨ６．８６）を０℃下で加えてクエンチングした後、減圧下溶媒を留去して黄色残留物を得た。この粗結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、０−５％ＭｅＯＨ/ＣＨＣｌ３、グラジエント溶離）にて精製し、化合物１２（５．７ｍｇ）を収率４９％で得た。更なる精製をケムコボンド ５−ＯＤＳ−Ｈ カラムを用いたＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ/ＣＨ３ＣＮ ０−５０％リニアグラジエント、３５．１ｍｉｎ/４０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で行い、得られた化合物１２を前述したＤＮＡアルキル化反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ12.37 (brs, 1H), 10.25 (s, 1H), 10.22 (s,1H), 9.96 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.93 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.01 (brt, 1H), 7.44 (s, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.25 (s, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 4.22 (m, 1H),4.08 (m, 1H), 3.94 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 3.79 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.21 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.34 (m, 2H), 2.17(m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.78 (m, 2H), 1.41 (m, 1H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ５４Ｈ５８Ｎ１７Ｏ１１ (M+H) 1120.4, found 1120.5.
【００５２】
（１４）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＬＣＰＩ（１３）の合成
化合物１３は、化合物１１ａの代わりに化合物１１ｂを用い、化合物１２と同様の合成手順により収率５０％で得られた。更なる精製をケムコボンド ５−ＯＤＳ−Ｈ カラムを用いたＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ/ＣＨ３ＣＮ ０−５０％リニアグラジエント、３２．９ｍｉｎ/４０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で行い、得られた化合物１３を前述したＤＮＡアルキル化反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 12.18 (brs, 1H), 10.26 (s, 1H), 10.22 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.02 (brt, 1H), 7.57(d, J= 15.0 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.58 (d, J=15.0 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.95 (s, 6H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.54 (m, 1H), 3.20(m, 2H), 2.46 (s, 3H), 2.36 (m, 2H), 2.09 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 1.29 (m, 1H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ５０Ｈ５４Ｎ１５Ｏ１０ (M+H) 1024.4, found 1024.4.
【００５３】
（１５）ＡｃＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＰＩ（１４）の合成
化合物１４は、化合物１１ａの代わりに化合物１１ｃを用い、化合物１２と同様の合成手順により収率５１％で得られた。更なる精製をケムコボンド ５−ＯＤＳ−Ｈ カラムを用いたＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ/ＣＨ３ＣＮ ０−５０％リニアグラジエント、３６．８ｍｉｎ/４０ｍｉｎ，２５４ｎｍ）で行い、得られた化合物１４を前述したＤＮＡアルキル化反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６）δ12.37 (brs, 1H), 10.26 (s, 1H), 10.22 (s,1H), 10.19 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.02 (brt,1H), 7.58 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.39 (s, 1H),7.28 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.90 (s, 2H), 6.58 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s,3H), 3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.54 (m, 1H), 3.19 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.38 (m, 2H), 2.09 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.80 (m, 2H), 1.29 (m, 1H)。  ESMS m/e calcd for Ｃ５６Ｈ６０Ｎ１７Ｏ１１ (M+H) 1146.5, found 1146.5.
【００５４】
実施例１０〜１１  化合物１５及び１６の合成
反応スキーム１に記載の化合物１３および１４の合成方法に従って、スキーム２に示すように、化合物１５及び１６を合成した。
（１）ＡｃＩｍＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＰＩ (１５):
１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６) d 10.30 (s, 1H), 10.27 (s, 2H), 10.24 (s, 1H),9.94 (s, 1H), 9.90 (s, 2H), 9.31 (brs, 1H), 8.00 (brt, 1H), 7.57 (d, J= 14.5 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.37 (s, 1H),7.27 (s, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 2H), 6.89 (s, 2H), 6.55 (d, J= 14.5Hz, 1H), 6.48 (s, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.97 (s,3H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.50 (m, 1H), 3.16 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.35 (m, 2H), 2.15 (m, 1H),2.03 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 1.30 (m, 1H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ６１Ｈ６５Ｎ２０Ｏ１２ (M+H) 1269.5, found 1269.4。
【００５５】
（２）Ｈ−ＩｍＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＰＩ (１６):
１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６) d 12.34 (brs, 1H), 10.30 (s, 2H), 10.23 (s,1H), 9.94 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 8.00 (brt, 1H), 7.57 (d, J= 14.5 Hz, 1H), 7.55 (s, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.44 (s, 2H),  7.37 (s, 1H),7.27 (s, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.14 (s, 2H), 7.06 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.55 (d, J= 14.5 Hz, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 4.00 (s, 6H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.71 (s,3H), 3.45 (m, 1H), 3.15 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.35 (m, 2H), 2.17 (m, 1H), 1.78 (m, 2H), 1.30 (m, 1H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ５９Ｈ６２Ｎ１９Ｏ１１ (M+H) 1212.5, found 1212.5。
【００５６】
実施例１２  化合物２３の合成
最終工程で、ＤＵ−８６のセグメントＡ（Ｄｕ８６）の代わりに１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オンを用いた以外は反応スキーム１及び２に記載の化合物１３〜１６の合成法に従って化合物２３を合成した。
Ｈ−ＩｍＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙＬＣＢＩ (２３):
１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６) 10.30 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.96 (s, 1H),9.95 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 7.99 (brt, 1H), 7.98 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.61-6.89 (m, 17H), 6.57 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 4.33 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.00 (s, 6H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.80(s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.68 (m, 1H), 3.18 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 1.79 (m,2H), 1.70 (m, 1H), 1.55 (m, 1H)。
ESMS m/e calcd for Ｃ５８Ｈ５９Ｎ１８Ｏ９ (M+H) 1151.5, found 1151.5。
【００５７】
【発明の効果】
本発明はＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列に対して、高いＤＮＡアルキル化能と配列認識能を兼ね備えた機能分子の設計に関するものである。この機能分子は、分子内のイミダゾールーピロールの配置を変えることで、塩基配列認識能を変えることが可能である。このような特性を備えたアルキル化剤は本発明者らが開発したアルキル化剤の他には例がない。このことはヒトゲノム上での重要な遺伝子配列、或いはがんなどの病気に由来した遺伝子異常に対する有用なドラッグとして、はじめてのポストゲノム時代を担う遺伝子レベルでの創薬を実現するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、化合物１，１２−１４によるＤＮＡ塩基配列特異的なアルキル化反応の比較を示す。
【図２】図２は、化合物１と１３の速度論的ＤＮＡアルキル化能を評価結果を示す。
【図３】図３は、短鎖ＤＮＡに対する化合物１，１２−１４の配列特異的アルキル化能の評価結果を示す。
【図４】図４は、化合物１４−１６の５'-ＴＧＡＣＣＡ-３'配列に対する塩基配列特異的なＤＮＡアルキル化反応について解析した結果を示す。
【図５】図５は、化合物１６及び２３の塩基配列特異的ＤＮＡアルキル化能の比較を示す。
【図６】図６は、コード領域での遺伝子発現制御について調べた結果を示す。
【図７】図７は、化合物１３の配列特異的アルキル化によりコード領域でのｍＲＮＡ転写が阻害されている状態を示す。
【図８】図８は、ヒトがん細胞パネル（３９がん細胞ライン）による抗がん効果の評価結果を示す。
【図９】図９は、化合物１３と１４の３９種ヒトがん細胞に対する抗細胞増殖活性の評価結果を示す。
【図１】
0003898532.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003898532.tif 000026
【図８】
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【図９】
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