(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体及び該担体上に設けられたイオン交換官能基を用いた核酸混合物を分離するためのクロマトグラフィー材料において、前記担体がマイクロガラスファイバーから構成されていることを特徴とする、クロマトグラフィー材料。
【請求項２】
担体の比表面積が０．０５〜５０ｍ２／ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項３】
前記マイクロガラスファイバーがバルクの形で存在することを特徴とする、請求項１又は２項に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項４】
バルクが膜として形成されていることを特徴とする、請求項３に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項５】
膜が少なくとも０．０５ｍｍの厚さを有することを特徴とする、請求項４に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項６】
膜が単層で存在することを特徴とする、請求項５に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項７】
膜が多層で存在することを特徴とする、請求項４に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項８】
担体がシラン化試薬と反応させられていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項９】
アニオン交換基がシラン化試薬を介してカップリングされていることを特徴とする、請求項８に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項１０】
カチオン交換基がシラン化試薬を介してカップリングされていることを特徴とする、請求項８に記載のクロマトグラフィー材料。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー材料を使用して核酸混合物を分離する方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーによる分離を真空を適用することによって実施することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
クロマトグラフィーによる分離をカラム中又はマイクロタイタープレート上で実施することを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
分離を遠心力によって実施することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分離を遠心分離機中のスピンカップ内で実施することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフィーによる分離を段階的勾配で実施することを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡアーゼを使用しないことを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー材料を含む、核酸混合物の分離用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は核酸混合物を分離するためのクロマトグラフィー材料及び該クロマトグラフィー材料を使用して核酸混合物を分離する方法に関する。
【０００２】
クロマトグラフィーの使用並びにその際に使用されるクロマトグラフィー材料は生化学、医学、薬学及び遺伝子工学の分野では必須である。クロマトグラフィー材料を使用して、生体分子、例えば核酸及びタンパク質は迅速にかつ計画的に分離及び単離される。分子生物学においては、しばしば百を超える多様な成分からなる天然に存在する混合物から、この混合物中に０．１％未満の濃度で含まれている特定の核酸を単離しなければならない。従ってクロマトグラフィーによる方法及びそこで使用されるクロマトグラフィー材料への要求は、分子種としての核酸を引き続く分析のために均質になるまで精製するために、一方では核酸を定量的に単離することであり、他方では不純物を定量的に分離することである。
【０００３】
公知のクロマトグラフィー法の場合には、特定の粒度及び孔径を有する無機の粒状クロマトグラフィー材料が使用され、その表面は固定相の製造のためにシラン化試薬によって変性されている。アニオン交換体又はカチオン交換体を形成する試薬と反応させることにより、完成されたクロマトグラフィー材料が得られる。
【０００４】
ＷＯ９１／０５６０６には、種々の核酸種の分離のために適当なクロマトグラフィーのための担体材料が記載されている。担体としては、シリカゲル、酸化アルミニウム、二酸化チタン、多孔質ガラス又は樹脂が挙げられる。担体材料は孔径約１０〜１０００ｎｍ及び比表面積５〜８００ｍ２／ｇで３〜５００μｍの粒度を有する。この粒状担体の表面はアルコキシシランでシラン化される。さらに、アルコキシシランを第２級ヒドロキシルアミンと一緒に反応させることによって得られる、アニオン交換基を有するシリカゲルベースのクロマトグラフィー担体材料も記載されている。
【０００５】
また、欧州特許第０１０４２１０号には、空隙サイズ１０〜１０００ｎｍ及び比表面積５〜８００ｍ２／ｇで、粒度３〜１００μｍを有するシリカゲル材料が記載されている。次いで、これをシラン化剤によって表面処理し、かつイオン交換官能基を利用することにより、クロマトグラフィーにおける核酸の分離のために使用される。
【０００６】
最後に、欧州特許第０７４４０２５号からは、シリカゲルからなる担体をシラン化試薬と反応させたクロマトグラフィー材料が公知であり、その際、孔径４〜６ｎｍを有する担体材料が選択される。該担体の粒度は１〜５００μｍである。
【０００７】
慣用の粒状クロマトグラフィー材料を使用して核酸混合物をクロマトグラフィーによって分離する場合には、その都度多大な時間の消費を伴って分離を実施せねばならないことは明らかであった。例えば、クロマトグラフィーのために変性されたシリカゲルを担体として有する特定のカラムを使用する場合には、重力流条件下に、担体上への核酸吸着時間として少なくとも２０分間を許容しなければならなかった。
【０００８】
さらに、従来公知のクロマトグラフィー材料は特定の多孔性を有する。これは、大多数の意見によると、多孔性の担体、すなわち大きな表面積を有する担体だけがイオン交換体の十分な負荷を保証するからである。しかしながら、この多孔性は核酸の分離特性が最適でないという欠点を有する。分離の間に、混合物中に存在する別の物質、例えばＲＮＡ及びタンパク質が細孔中に拡散し、それによって分離工程に不利な影響を及ぼすことになる。
【０００９】
従って本発明の根底をなす課題は、最短時間で核酸混合物の分離を実施でき、その際同時に、核酸混合物の優れた分離度及びこの分離度と関連した単離すべき核酸の純度を達成できるクロマトグラフィー材料を提供することである。
【００１０】
さらに、本発明の課題は、最短時間で、核酸混合物を個々の成分の非常に高い分離度及び純度で分離できる方法を提供することである。
【００１１】
前記の課題は、請求項１及び請求項１２の特徴によって解決される。
【００１２】
本発明は担体及び該担体上に設けられたイオン交換官能基によって核酸混合物を分離するためのクロマトグラフィー材料において、前記の担体がマイクロファイバーを含むクロマトグラフィー材料に関する。
【００１３】
従属形式の請求項は、本発明によるクロマトグラフィー材料の好ましい実施形態に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明によるクロマトグラフィー材料を使用して核酸混合物を分離するにあたり、核酸のクロマトグラフィーによる分離を力の作用によって実施する方法に関する。
【００１５】
従属形式の請求項は、本発明による方法の好ましい実施形態に関する。
【００１６】
最後に、本発明は、本発明によるクロマトグラフィー材料を有する核酸混合物の分離用キットに関する。このキットは、所望の装置中でこのクロマトグラフィー材料による核酸混合物のクロマトグラフィーによる分離を実施のために、対応するバッファーと共に、本発明によるクロマトグラフィー材料を含んでいる。
【００１７】
次に、図面を用いて本発明を説明する。
【００１８】
本発明によれば意外にも、表面積が拡大されていないか又はほとんど拡大されていないマイクロファイバーをクロマトグラフィー材料として含む場合に、実質的に改善された分離能が達成されることが判明した。大多数の意見に反して、本発明によるクロマトグラフィー材料に相当量の官能性のイオン交換基を負荷して、優れた分離能を保証することができる。
【００１９】
担体の比表面積は０．０５〜５０ｍ２／ｇ、有利には１〜１０ｍ２／ｇ、特に１〜５ｍ２／ｇの範囲にある。
【００２０】
イオン交換官能基による表面の変性に適当した材料が、担体として用意され得る。担体に適した一つの材料は、例えばマイクロファイバーであり、その際にはマイクロガラスファイバーが好ましい。このような材料は無孔性の表面を有する。
【００２１】
好ましい実施形態において、マイクロファイバーは、担体としての使用前に酸処理又はアルカリ処理を行うことができる。
【００２２】
この繊維担体は、直接クロマトグラフィーに使用できるバルクとして存在してよい。もちろん、このバルクを分離のために適した形状に再加工してもよい。
【００２３】
多様な適用のために、本発明によるクロマトグラフィー材料は、膜の形に構成された担体を含むのが有利である。クロマトグラフィー材料の適当な能力のためには、膜が全表面積と無関係に少なくとも０．０５ｍｍの厚さを有することが好ましい。
【００２４】
本発明によるクロマトグラフィー材料の好ましい実施形態において、上記の膜は単層で存在する。勿論、膜は所望の分離能力に応じて多層で設けてもよい。
【００２５】
本発明によるクロマトグラフィー材料の担体は、シラン化試薬と反応させられる。シラン化試薬としては、例えばＷＯ９１／０５６０６に記載されているようなシラン化試薬を使用しればよい。同様に、公知の方法によって、固定相にアニオン交換基又はカチオン交換基を取り付けてもよい。そのための例はＷＯ９１／０５６０６号に記載されている。
【００２６】
本発明によるクロマトグラフィー材料は、この材料を用いて、最短時間で核酸混合物の分離工程を実施できるという利点を有する。その理由は、強力な力、例えば真空の存在下であっても、従来のクロマトグラフィー材料よりも高い材料密度を有する本発明によるクロマトグラフィー材料では、核酸の分離のために十分な滞留時間が与えられることにあると考えられる。達成され得る高い材料密度に基づいて、核酸の分離を非常に僅かな床容量で実施できる。それに相応して洗浄容量及び溶離容量も少ない。
【００２７】
本発明によるクロマトグラフィー材料を使用して、得られるべきフラクションの非常に高い精度及び純度で、核酸混合物の分離が実施される。このことは、特に従来の粒状クロマトグラフィー材料と比較すれば明らかである。この目的のために、ＲＮＡ及びＤＮＡに分離する前の核酸混合物、並びに本発明によるクロマトグラフィー材料及び２種の従来のクロマトグラフィー材料で分離した後の核酸混合物を、アガロースゲル上で展開した。
【００２８】
図２は、本発明によるクロマトグラフィー材料による核酸混合物成分の分離を示している。個々のレーンは以下のカラムを通してのラン示している：
レーンＬ：分離前の透明溶解液
レーンＤ：カラム通過液
レーンＷ１：第１の洗浄液
レーンＷ２：第２の洗浄液
レーンＥ：溶離液
同じ実験を、従来のクロマトグラフィー材料を使用して実施した。それに関しては図３及び図４に示されている。これらのレーンには同じカラムランを適用した。
【００２９】
図２から、レーンＥの溶離液において、プラスミドＤＮＡからＲＮＡが完全に分離されていることが認められる。さらに、個々のランは、溶離の前のＤＮＡ損失を伴わないことが明らかに認められる。
【００３０】
図３及び図４は、従来の粒状クロマトグラフィー材料を使用した核酸混合物成分の分離を示している。特に図３の精製の場合に、レーンＥにおいて著しいＤＮＡ損失が見られる。さらに、ＲＮＡの減少が乏しく、これはレーンＷ２で確認され、そこでは第２の洗浄ラン中になおも明らかな量のＲＮＡが存在する。
【００３１】
この乏しい減少は、図４における、他の従来のクロマトグラフィー材料の使用においても認められる。レーンＷ２は、第２の洗浄においても未だかなりのＲＮＡを示す。
【００３２】
従来の粒状クロマトグラフィー材料と比較したさらなる利点は、溶離液Ｅにおいて、クロマトグラフィー材料の粒子（微細成分）を全く含まないことにある。これは得られる核酸の品質の著しい改善をもたらす。
【００３３】
本発明によるクロマトグラフィー材料を使用した本発明による核酸混合物の分離のための方法は、これを力の作用下に実施することを特徴としている。
【００３４】
好ましい実施形態において、該方法は真空を適用して実施される。
【００３５】
例えば、本発明によるクロマトグラフィー材料上に核酸混合物試料を適用した後に、約２０秒以内の分離をもたらす真空を適用する。これは、少なくとも１０倍の床容量での重力流において、少なくとも２０分間の分離時間を必要とする従来のシリカゲルカラムとは大きく異なる。
【００３６】
本発明によるクロマトグラフィー材料は、実際上全てのクロマトグラフィー法で使用できる。これには、カラムクロマトグラフィー、スピンカラム及びスピンカップでの分離、或いは、クロマトグラフィー材料が懸濁物の形で存在するか、又は反応容器、マイクロタイタープレート、ピペット先端、攪拌棒又は試験ストリップに固定されているバッチ法における分離が含まれる。
【００３７】
スピンカップでのクロマトグラフィーによる分離の場合には遠心力が使用され、スピンカップ中に充填された試料を、遠心分離機中でクロマトグラフィーにより分離する。
【００３８】
本発明によるクロマトグラフィー材料は、核酸混合物を極めて効果的に分離できる。従って、大量のＲＮＡの他に非常に少量のＤＮＡを含有する混合物からＤＮＡを最高の純度で単離することができる。この場合、毒性物質、例えばフェノール、クロロホルム又はエチジウムブロミドの使用を完全に排除できる。さらに、ＲＮＡアーゼを完全に使用しないで実施できる。
【００３９】
図１においては、本発明によるクロマトグラフィー材料を備えたカラムの例が示されている。真空の適用のために下方に向かって細くなった出口を有する慣用のプラスチックカラム（Ｉ）において、１ｍｍの厚さを有する下方フリット（２）が設けられ、このフリットは出口のところまで充填されている。その上に、本発明によるクロマトグラフィー材料（３）を、２ｍｍの厚さを有するマイクロガラスファイバー膜の形で設置する。シールするために、その上に１ｍｍの厚さを有する上方フリット（４）を設ける。
【００４０】
例えばスピンカップ中、及びマイクロタイタープレート（９６ウェルプレート）上における全ての他のクロマトグラフィー法においても、類似の装置が使用される。
【００４１】
本発明によるクロマトグラフィー材料を使用して核酸混合物を分離するための本発明による方法は、簡単な段階的勾配において、核酸混合物を負荷した装置を洗浄し、次いで適切な緩衝塩溶液により所望の核酸を溶離することによって実施される。本発明によるクロマトグラフィー材料にＤＮＡが結合している間に、大部分のＲＮＡを分離し、その際まだ残留しているＲＮＡを洗浄工程の細に洗流する。従って、ＲＮＡアーゼによる処理は不必要である。
【００４２】
クロマトグラフィー分離を、例えばカラム又はマイクロタイタープレートにおいて実施する場合に、真空を適用しながら最短時間、すなわち約２０秒間で前記の構成要素の装置で分離を実施する。同様に、遠心分離機中で使用されるスピンカップにおいても優れた効率が達成され、その際、遠心力によって短時間、例えば２０秒間の分離が実施される。
【００４３】
本発明によるクロマトグラフィー材料は、種々の様式で市販することができる。例えば、本発明によるクロマトグラフィー材料は、所望の装置中で、クロマトグラフィーのために必要な備品、例えばバッファーと一緒にキットとして提供することができる。もちろん他の市販形も排除するものではない。
【００４４】
本発明を以下の実施例を用いて説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
【００４５】
実施例
例１：細菌培養体の培養
プラスミドの調製のために、通常の微生物学的実施に従ってＥ．ｃｏｌｉを培養する。１日目に深冷凍結された保存培養から、選択培地（例えば抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢアガー）上に画線塗抹を実施する。３７℃で一晩インキュベーションした後、２日目によく増殖した単一コロニーを、対応の抗生物質が添加されている５０〜３００ｍｌの液体培地（例えばＬＢ）に播種する。振盪器（２００〜３００ｒｐｍ）上で３７℃でよく通気させ、さらに一晩インキュベーションした後、場合によりさらに大量の培養容量に増やすか、又は増殖した培養を直接回収する。増やす場合には、抗生物質が添加された相応量の新鮮な液体培地に、その１％の容量で前日の培養を播種し、さらに３７℃で一晩、インキュベーション用の２００〜３００ｒｐｍ振盪器上でインキュベートした。
【００４６】
小規模調製のために、高コピープラスミドに関しては１〜３ｍｌの量の培養体、又は低コピープラスミドに関しては５〜２０ｍｌの量の培養体を使用する。中規模または大規模調製おいては、対応して更に大量を使用する。
【００４７】
例２：細菌からのＤＮＡの単離
小規模調製ために、例１に挙げた量の細菌培養体を、適当な遠心分離容器中において１３０００×ｇで３分間遠心分離し、かつ上澄みの培地を完全に廃棄する。場合により、遠心分離容器の縁部から流れ戻る培地をピペットで除去し、同様に廃棄する。
【００４８】
ピペッティングされた細菌を、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭのＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌのＲＮＡアーゼからなる０．４ｍｌのバッファー中で、ヴォルテックスによって完全に再懸濁させる。細胞塊又は細胞集塊はもはや確認されてはならない。
【００４９】
懸濁された細胞を、２００ｍＭのＮａＯＨ／０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳからなる０．４ｍｌのバッファーを添加することによって溶解させる。懸濁された細胞を、この溶菌バッファーを使用して何度も反転させることにより、均質相が生じるまで混合する。この相は流出した細菌のゲノムＤＮＡによって非常に粘性である。室温で最大５分間インキュベートする。
【００５０】
この溶菌混合物を、３．１〜３．４Ｍの酢酸カリウム（酢酸によってｐＨ５．５）からなる０．４ｍｌのバッファーの添加によって中和する。バッファーの添加の後に、再び何度も反転させることによって均質相が生じるまで混合する。この相は再び低い粘度を有する。細胞溶解物の粘性残留物が存在してはならない。
【００５１】
中和において沈殿した細菌性タンパク質及び細胞残骸からなる沈殿物を、室温において≧１３０００×ｇで１０分間の遠心分離によって遠心除去し、澄明な上澄み（「透明溶解液」）をピペットで分離する。
【００５２】
例３：本発明によるクロマトグラフィー材料を有するカラムの製造
５ｍ２／ｇの比表面積を有する５ｇの無孔性のガラス繊維を、７５０ｍｌの無水キシレン中において、６０ｇの３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン及び０．１３ｍｌのトリエチルアミンと混合する。反応混合物を、３回の真空適用及びその後の窒素通気により脱気し、かつ空気及び湿気の排除下に１３０℃で４時間加熱する。これを濾別し、かつキシレン及びテトラヒドロフランで洗浄する。変性されたガラス繊維を５０℃で真空中に乾燥させる。
【００５３】
次いで、生成物を７５０ｍｌ及び４２ｇのジエチルアミンと混合し、還流下に１８時間加熱する。該生成物をジオキサン及びメタノールで洗浄し、かつ７０℃において真空中で乾燥させる。こうして変性されたアニオン交換官能基を有するガラス繊維バルクを再加工して、アニオン交換膜にする。この場合には、前記ガラス繊維バルクをアセトン中に懸濁し、かつ圧延又はキャスティングして対応する形状にし、次いで乾燥させる。カラム直径に合わせて膜を切り取り、かつ図１による装置中で使用する。
【００５４】
例４：細菌ＤＮＡの分離
例３によるカラムを、適当な真空チャンバ（例えばＶａｃＭａｎ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）に取り付ける。イオン交換膜を、１００ｍＭのＮａＡｃ／ＨＡｃ（ｐＨ５．０）／６００ｍＭのＮａＣｌからなる２ｍｌのバッファーで平衡化する。このために、バッファーをカラム中にピペットで添加し、かつ水流真空の適用によって膜に完全に浸透させる。真空ポンプは、もはや膜から液体の吸引が確認できなくなるまで作動させておく。次いで真空を停止する。
【００５５】
カラムに例２の「透明溶解液」を負荷し、かつ水流真空の適応によって膜に完全に浸透させる。真空ポンプは再度、もはや膜から液体の吸引が確認できなくなるまで作動させておく。次いで真空を停止する。
【００５６】
非特異的に結合した成分の除去のために、カラムを、１００ｍＭのＮａＡｃ／ＨＡｃ（ｐＨ５．０）／６００ｍＭのＮａＣｌからなる２．５ｍｌのバッファーで洗浄する。このために、バッファーをカラムにピペットで添加し、かつ水流真空を適用することによって膜に完全に浸透させる。真空ポンプは、もはや基材から液体の吸引が確認できなくなるまで作動させておく。次いで真空を停止する。この洗浄工程は、小規模調製及び中規模調製の場合にはもう一度繰り返す。
【００５７】
カラムを真空チャンバから取り外し、かつ膜に結合されたプラスミドＤＮＡを、０．８ｍｌのバッファー１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）／１２５０ｍＭのＮａＣｌの添加によって適当な容器中に直接溶離させる。このためにバッファーをカラムにピペットで添加し、かつ適合するピストンを用いて、このバッファーが膜を通過するように手動で押し込む。この場合、溶離バッファーを早い滴下間隔で押し込むのが好ましいが、連続的な流れとなるようには押し込まない。個々の液滴は肉眼で確認できなければならない。
【００５８】
この溶離液を０．７容量のイソプロパノール（室温）と混合し、かつよく混合する。こうして沈殿されたプラスミドＤＮＡを、少なくとも３０分間、≧１３０００×ｇ及び４℃で遠心分離し、上澄みを廃棄する。ピペットで添加したＤＮＡをもう一度８０％エタノールで洗浄し、再び遠心分離し、次いで乾燥させ（室温での静置又は真空中のいずれか）、乾燥させたＤＮＡを最後に適当な量のＴＥバッファー又は水中で３７℃で１０分間で溶解させる。
【００５９】
溶解されたプラスミドＤＮＡを分光分析で測定し、かつアガロースゲル上で分析する。
【００６０】
図２はＴＡＥバッファー（ｐＨ８．３）を使用したときの、１％アガロースゲル上での混合成分の分離を示している。個々のレーンに以下の成分を適用した：
レーンＬ：分離前の透明溶解液
レーンＤ：カラム通過液
レーンＷ１：第１の洗浄液
レーンＷ２：第２の洗浄液
レーンＥ：溶離液
レーンＬ、Ｄ及びＷ１においては、調製物中に依然としてＲＮＡが含まれていることが明らかに確認される。しかしながら、レーンＥでの溶離液では、明らかに完全な核酸混合成分の分離が確認され、これはＲＮＡによる汚染を伴わないプラスミドＤＮＡのみを示している。
【００６１】
例５：細菌ＤＮＡの分離
例２と同じ細菌ＤＮＡを、従来のクロマトグラフィー材料を含有するマヒェレイ−ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）社のカラム（ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ  Ｋｉｔｓ）上に添加し、かつ製造元の指示に従って分離した。この結果を図３に示す。
【００６２】
例６：細菌ＤＮＡの分離
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社の従来のクロマトグラフィー材料（キアゲンプラスミドキット（ＱｉｅｇｅｎＰｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔｓ））を使用して、例２の細菌を分離した。その際に、製造元の指示に従って作業した。この結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明によるクロマトグラフィー材料を有したカラムに関する例を示す。
【図２】  本発明によるクロマトグラフィー材料を使用したアガロースゲル上での核酸混合物成分の分離を示す。
【図３】  先行技術のクロマトグラフィー材料を使用したアガロースゲル上での核酸混合物成分の分離を示す。
【図４】  先行技術のクロマトグラフィー材料を使用したアガロースゲル上での核酸混合物成分の分離を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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