(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）IkB-αを含む基質を、試験物質の存在下で、IkB-αに対しタンパク質分解活性を示す製剤で処理し、そして試験物質がIkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制するか否か、またどの程度なのかを測定し、
b）試験物質の存在下で、NF-KBの結合モチーフを含む調節配列のコントロール下にリポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子で形質転換されてなる高等真核生物細胞中でNF-KB活性化を誘発し、そしてリポーター遺伝子の発現を測定することにより、
試験物質をIkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制するそれらの能力につき試験することを特徴とするNF-KB活性化を抑制する物質の同定方法。
【請求項２】
無細胞系を工程a）で使用することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
固定担体に結合された組換えIkB-αを工程a）でIkB-αを含む基質として使用することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
溶液中の組換えIkB-αを工程a）でIkB-αを含む基質として使用することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項５】
ホスホリル化IkB-αを工程a）でIkB-αを含む基質として使用することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項６】
ホスホリル化IkB-αを使用し、これがNF-KB活性化を誘導する物質による細胞の処理そしてIkB-αのタンパク質分解を抑制し、IkB-αのホスホリル化形態の蓄積に影響する物質による細胞の処理から得られたことを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
IkB-αに対しタンパク質分解活性を示す製剤として、細胞の抽出物またはこのような抽出物のフラクションを使用し、該細胞がNF-KB活性化のインデューサーで処理されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
工程a）において無細胞系中で、組換えIkB-αを基質として使用し、そして工程b）において、NF-KBの結合モチーフを含む調節配列のコントロール下にルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ分子で形質転換されてなるヒト細胞であって、NF-KB活性化のインデューサーで刺激されたヒト細胞を試験物質で処理し、そしてルシフェラーゼ発現を測定することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項９】
ルシフェラーゼ遺伝子構築物が少なくとも２種のNFκB結合モチーフを含むことを特徴とする請求の範囲第８項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子の転写に影響を与えることに関する。
誘導遺伝子発現は、とりわけ、シス調節DNA要素と相互作用することにより転写を調節するタンパク質の誘導活性化に依存する。転写因子と称されるこれらのタンパク質の活性は、それらのde novo合成により調節し得る。この戦略は転写因子のために遺伝子に影響する付加的な因子を必要とする。一方、転写因子の活性化に関する翻訳後機構は転写レベルにおける機構よりも速いという利点を有する。転写因子の活性化の調節のために、とりわけ、抑制性タンパク質サブユニットが重要な役割を果たす。この例が、AP-1を抑制するロイシンジッパータンパク質であるIP-1である。この場合、抑制性サブユニットは、そのアクチベーターとの構造相同性に基いてトランス優性の負のレギュレーターの機能を果たす。NF-KB系は、抑制性サブユニットがDNA結合サブユニットと相同性を示さない系である。NF-KBの抑制性サブユニット及びその関連因子はIKBタンパク質と称され、DNAへの転写因子の結合を可逆的に抑制する（Baeuerle及びBaltimore，1988a,b）。
50kDa（p50）及び65kDa（p65）のDNA結合サブユニットからなるヘテロダイマー因子であるNF-KBは、細胞が一次または二次の病原性刺激に暴露される場合に防御遺伝子の所謂“即時−初期”活性化に寄与する（Baeuerle，1991、Baeuerle及びBaltimore，1991）。
転写因子NF-KB（Grimm及びBaeuerle，1993; Blankら，1992; Nolan及びBaltimore，1992）は、とりわけ、細胞をバクテリアの刺激（とりわけLPS）、ウイルス（とりわけHIVウイルス型１）、ウイルス産物、寄生虫、炎症性サイトカイン（とりわけTNF-α、TNF-β、IL-1、IL-2）、Ｔ細胞マイトジェン（とりわけレクチン）、タンパク質合成インヒビター（とりわけシクロヘキシミド）、物理的ストレス（紫外線、γ線）、酸化的ストレス（とりわけ水素スーパーオキサイド）及び腫瘍プロモーター（とりわけフォルボールエステル）（Baeuerle，1991）で処理することにより活性化される。
多数の病原性刺激に応答するNF-KBの活性化が、未だに完全に説明されていなかった機構により行われる。活性化に続いて、NF-KBが細胞核に導入され、そして標的遺伝子が活性NF-KBにより活性化される。反応性酸素化合物はNF-KBの活性化中にメッセンジャーとしての役割を果たすものと推定される（Schreckら，1991）。
NF-KBの活性化はDNA結合サブユニットp50及びRel-A（以前に、p65と称された）（Baeuerle及びBaltimore 1988 a,b）を含む細胞質複合体からの抑制性サブユニットIkBの放出と関連することが判明された。細胞抽出物を用いる実験の結果として、抑制性サブユニットIkB-αの放出及びNF-KBの活性化がタンパク質キナーゼＣ（PKC）及びその他のキナーゼによるホスホリル化のためであると推定された（Shirakawa及びMizel，1989; Ghosh及びBaltimore，1990; Kerrら，1991）。
下記の遺伝子クラスがNF-KBにより調節される。それらは全てNF-KBにより認識されるコンセンサス配列5'-GGGPuNNTPyCC-3'を有するデカマーDNAモチーフを含む：ウイルス遺伝子（HIV-1-ウイルス、サイトメガロウイルス、SV40-ウイルス、アデノウイルス）、免疫レセプター（とりわけ、光免疫グロブリン-k-鎖、Ｔ細胞レセプターＢ、付着分子１）、サイトカイン（IFN-β、GM-CSF、IL-2、IL-6、TNF-α、TNF-β）、急性期タンパク質（とりわけ、アンギオテンシノーゲン）、転写因子（とりわけ、“インターフェロン調節因子−１”、NF-KB前駆体p50）、ビメンチン（Baeuerle，1991）。
転写因子NF-KBによる遺伝子の活性化が関与する多数の病状に鑑みて、生物に有害な効果を有し得る遺伝子の転写を抑制するNF-KBインヒビターに対する要望がある。
NF-KBの転写調節のもとに遺伝子の発現を抑制するのに示唆された従来技術の解決策はNF-KB/IkB-α-複合体の解離の調節に基いている（WO 89/08147及びWO 92/20795）。
本発明はNF-KB活性化の機構を説明するという仕事をし、そしてこの機構に特に介入するインヒビターをこれに基いて提供する。
驚くことに、IkB-α（以前に、MAD-3と称された；Haskillら，1991）は活性NF-KBの出現と一致するプロセスであるフォルボールエステル、IL-1、LPSまたはTNF-αによる細胞の刺激後の数分以内に消失することがわかった。プロテアーゼインヒビターまたは酸化防止剤による細胞の処理がIkB-αの誘導枯渇を阻止するだけでなく、NF-KBの活性化を阻止する。本発明の一部として行われた実験は、PMAまたはその他の刺激によるNF-KBの活性化が明らかにキモトリプシン様プロテアーゼによるIkB-αの一時的に増大された分解のためであることを示した。更に、或る種のプロテアーゼインヒビターはIkB-αのホスホリル化形態の蓄積を生じることが示された。しかしながら、直接ホスホリル化そしてその後のPKCまたはその他のキナーゼによるIkB-αの不活化は、先の推定と対照的に、無傷細胞中でNF-KBを活性化するのに不十分である。
本発明は、NF-KBの活性化を抑制することにより高等真核生物細胞中の遺伝子の転写の抑制方法に関する。その方法は、細胞をIkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制する物質で処理することを特徴とする。
タンパク質分解の抑制は直接または間接であってもよい。IkB-αのタンパク質分解がp50/p65複合体からのその解離後に起こるか否か、またはIkB-αがヘテロダイマー複合体の一部としてタンパク質分解により分解されるのかは、重要ではない。
タンパク質分解を直接抑制する物質はプロテアーゼインヒビターである。
実験において、IkB-α及びNF-KB活性化に関するセリンプロテアーゼインヒビターの効果が注目された。試験した物質は毒性化合物であるので、これらの化合物は治療上使用し得ない。治療上の使用につき、IkB-αプロテアーゼの活性化をできるだけ特異的に抑制することにより、IkB-αのタンパク質分解の特異的抑制を行う物質が考えられる。
プロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼの基質としてIkB-αと競合することにより、その基質、即ち、IkB-αとのそれらの類似性に基いて機能し得る。
インヒビターがIkB-αのタンパク質分解を損ない得る更に別の機構は、プロテアーゼに対するIkB-αの接近可能性をブロックすることにより、例えば、配座変化を蓄積し、または生じることによるものである（アロステリック有効インヒビター）。
本発明に関して行われた実験からの結果は、IkB-αのみがホスホリル化により後翻訳修飾されることによりタンパク質分解に対し影響を受けやすくなることを示す。
本発明の一部として、実験は、キモトリプシン様特異性を有するプロテアーゼインヒビターZ-Ile-Glu（OtBu）-Ala-ロイシナール（以下、NBIGとも称される）（これはプロテアソームの成分を抑制することが知られている）を用いて行われた。NF-KBの活性化及びIkB-αの安定化に関するこのインヒビターの影響に関する実験は、それがTNF刺激後にヒーラ細胞中でNF-KBの活性化を阻止し、そのID50がこのインヒビターにより先に示されたプロテアソーム抑制と同じ大きさであることを示した。更に、インヒビターは、それがIkB-αの更に高度にホスホリル化された形態の蓄積を生じるという特別な特徴を有する。このホスホリル化された形態の出現及び安定化はNF-KBの活性化と同時に起こらず、これは無傷細胞中のホスホリル化がNF-KBの活性化に不十分であるという仮定を確かめる。これは、IkB-αの誘導ホスホリル化形態が依然としてNF-KBとの複合体中に含まれることを示す。従って、IkB-αのホスホリル化が、試験管内実験から初期に推定されたように、複合体からのIkB-αの分離を生じない。NBIGで得られた結果は、あらゆる点から見て、プロテアソームがIkB-αのホスホリル化された形態の選択的分解の原因であることを示す。
これらの結果から、ホスホリル化の機能のみがその後の迅速なタンパク質分解につきIkB-αをマークすべきであることが推定し得る。ホスホリル化された形態の活性の得られる欠如が、今までにNF-KBの無細胞活性化が観察されなかった理由を説明する。
更に、それ故、IkB-αがタンパク質分解に対し影響を受けやすい形態に変化される修飾を阻止することによりIkB-αのタンパク質分解を間接的に抑制する物質、即ち、ホスホリル化された形態そして特にこれの原因であるキナーゼを抑制する物質が、NF-KBの活性化のインヒビターと考えられる。
プロテアーゼ抑制の間接の機構に関する更に別の選択は、プロテアーゼの活性化を阻止するインヒビターであり、即ち、仮説のプロテアーゼインヒビターがIkB-αプロテアーゼから放出されることから阻止される。
本発明に使用されるインヒビターは、p50/Rel-A-ヘテロダイマーからのIkB-αの解離を抑制することにより、NF-KBの活性化を抑制する物質とはそれらの作用を異にする。
NF-KB活性化を消極的または積極的に影響する物質を検出するのに従来示唆された方法は、複合体を安定化し、またはその解離を促進する化学物質の能力につきそれらを試験することに基いていた（WO 92/20795，WO 89/08147）。
その他のスクリーニング操作は特に重要な遺伝子の転写を調節する物質の能力につき物質を試験することに基いており、転写の調節はDNA結合のレベルで行われる（WO 91/01379）。
本発明は、一方で、IkB-αのタンパク質分解を抑制する物質を記録することにより、NF-KB活性化に対し高い特異性を有する物質の検出を可能にする、NF-KB活性化の機構につき得られた知識に基いてスクリーニング方法を提供するという更に別の目的を有する。
本発明の更に別の局面は、NF-KB活性化を抑制する物質を同定するための方法に関する。その方法は、
a）IkB-αを含む基質を、試験物質の存在下で、IkB-αに対しタンパク質分解活性を示す製剤で処理し、そして試験物質がIkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制するか否か、またどの程度なのかを測定し、必要により
b）試験物質の存在下で、NF-KB活性化に応答してリポーター遺伝子構築物で形質転換された高等真核生物細胞、特に、ヒト細胞中でNF-KB活性化を誘発し、そしてリポーター遺伝子の発現を測定することにより、物質をIkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制するそれらの能力につき試験することを特徴とする。
その方法の好ましい実施態様において、精製IkB-αが所謂“無細胞”アッセイにおいて工程a）の基質として使用される。
これは、例えば、測定できるようにマークされた特定量の好ましくは組換えIkB-α（Henkelら，1992; Zabelら，1993）を固定担体に結合することにより行い得る。
IkB-αに対しタンパク質分解活性を示す製剤が試験物質の存在下で固定化IkB-αに適用される。この製剤は、それが入手されてまもなくの、所謂“活性化”細胞抽出物または組換え方法により産生されたIkB-αプロテアーゼであってもよい。IkB-αプロテアーゼがプロテアソームの一成分であるという仮定（Orlowski，1990;Rivett，1989）が正しい場合、これが精製形態またはその一部中でタンパク質分解活性として使用し得る。
IkB-α分解活性を示す活性化細胞抽出物が既知のNF-KBインインデューサー、例えば、LPS、フォルボールエステル、TNF、等で処理された細胞から得られる。NF-KB活性の誘発はIBK-αのタンパク質分解の原因である系の活性化に影響する。細胞抽出物はその活性化されていない状態でIkB-α分解活性を含まないことが好ましい。
活性化細胞抽出物はタンパク質IkB-α分解の直接インヒビター及び間接インヒビターを検出するのに使用し得る。精製IkB-αプロテアーゼを使用する場合、プロテアーゼに直接作用するインヒビターのみが記録される。
IkB-αに対しタンパク質分解活性を有する製剤として、誘導細胞の製剤が無細胞アッセイに更に使用されてもよく、IkB-αタンパク質分解活性が証明された活性化細胞抽出物のフラクションであることが好ましい。細胞抽出物を分別するためのタンパク質化学方法が当業者に知られている。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過及び／またはイオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、等の後に得られたフラクションがIkB-αをタンパク質分解するそれらの能力につき予備試験で試験され、そして夫々のフラクションがアッセイに使用され、分解が測定し得るような方法でその量が試験基質IkB-αで調整される。
試験物質の不在下（対照）、またはタンパク質分解活性に抑制効果を有しない試験物質を用いて、固定化IkB-αがタンパク質分解される。これは、IkB-αのマークされた形態（例えば、放射性マーカーまたは蛍光マーカー）が担体から上澄みに（IkB-αの完全分解または部分分解中）完全にまたは一部流入する。担体から上澄みに変化したマーカーの割合はIkB-αのタンパク質分解に比例する。試験物質の存在下で、IkB-αのタンパク質分解を抑制すると、固定化IkB-αが分解されず、マーキングが担体に残存し、しずれもが上澄みに流入しない。
また、規定量のマークされたIkB-αが工程a）中に担体に固定化されるのに代えて可溶性形態で存在してもよいが、その他の試験パラメーターは上記の試験手はずと同じである。タンパク質分解活性を有する製剤を適用する場合、その溶液のIkB-αが更に小さい種に分解される。次いでその溶液の成分が、例えば、透析またはゲル濾過により分離され、その膜または樹脂の細孔サイズが選択され、その結果、無傷IkB-αがタンパク質分解フラグメントから分離される。マークされたフラグメントまたは分解されなかったマークされたIkB-α基質が今や溶離液中にあり、フラグメントと全体の割合がIkB-αのタンパク質分解に比例する。タンパク質分解を抑制する試験物質の存在下で、溶液中に含まれたIkB-αが分解されず、その結果、マークされたフラグメントが検出し得ない。
工程a）における無細胞アッセイの更に別法はp50及び／またはp65とのIkB-α複合体の生成であり、これらの成分は、これが完全に利用できるとまもなくの、組換え起源のものであることが好ましく、IkB-αはこの複合体を試験物質の存在下でタンパク質分解活性を有する製剤で処理するための測定可能なマーカーを有する。タンパク質分解が起こる場合（これは試験物質がこの活性を抑制できない場合である）、IkB-αは複合体により消化され、そのマーカーがタンパク質分解フラグメントにあり、これがこの場合にもまた濾過後に溶離液中で検出できるであろう。タンパク質分解活性に関する試験物質の抑制効果の場合、IkB-αは複合体と会合されて残り、マーカーは溶離液に流入しない。原則として、IkB-αのタンパク質分解はまた構造変化に応じて複合体の蛍光の変化により観察し得る。
プロテアーゼインヒビターNBIGがIkB-αのホスホリル化形態の蓄積に影響するという本発明の知見は、IkB-αのホスホリル化形態がプロテアーゼの基質として使用し得る別の無細胞アッセイを可能にする。IkB-α抗体を用いるウェスタンブロッティングまたはELISAによりプロテアーゼ、例えば、精製プロテアソームまたはプロテアーゼを含む細胞フラクションを添加して最初に試験した後、ホスホリル化IkB-αが実際に分解のためのプロテアーゼ（構成的）により不活化された基質の形態であるかを問わないで、この基質が以下のように生成し得る。
NF-KB及びIkB-αを発現する適当なヒト細胞、例えば、ヒーラ細胞または293細胞（ATCC CRL 1573）がプロテアーゼインヒビターで処理され、これが予備試験において、例えば、75μmの濃度のNBIGによりIkB-αのホスホリル化形態の蓄積を生じた。次いで細胞がこの活性化に必要とされる期間にわたって、例えば、15分間にわたってTNF-αにより、またはPMAもしくはIL-1によりNF-KB活性化のインデューサーで刺激される。ホスホリル化形態のIkB-αを含む処理細胞の細胞質抽出物からのNF-KB-IkB-α複合体が、必要により、例えば、グリセリン勾配、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより蓄積され、そして残りのNBIGから、またこの不活性内生プロテアーゼから分離される。IkB-αをそのホスホリル化形態に完全に変換するために、ホスファターゼインヒビター、例えば、オカダイック酸（okadaic acid）が適当な濃度、例えば、100nモルで添加されることが好ましい。
プロテアーゼの基質であり、NF-KBの活性化をもたらす、こうして得られたホスホリレートIkB-αが、NF-KBの活性化のインヒビターを見出すために上記のアッセイに使用されてもよい（また、IkB-αは、組換えIkB-αを試験管内でホスホリル化することによりホスホリル化形態で用意されてもよい）。そのアッセイの原理は同じままである。プロテアーゼインヒビターを用いないで（試験物質を添加しないで、または抑制効果を有しない試験物質の存在下で）、ホスホリル化基質が分解される。インヒビターの存在下で、NF-KB-IkB-α複合体のホスホリル化形態が検出可能に残る。
IkB-αのタンパク質分解のための試験物質の特異性に関して工程a）の陽性の結果を少なくするために、追加の対照が必要とされる。
例えば、工程a）で見出されたインヒビターが、それがその他のプロテアーゼの活性に影響するか否かを測定するために試験される。これは、IkB-αに対し異なる基質を有するプロテアーゼの活性に関するインヒビターの効果が分析されるような方法で行われる。
インヒビターが間接的に、即ち、IkB-α基質に対し反応するか否かを立証するために、既知のプロテアーゼ、例えば、キモトリプシンとのインヒビターの効果が試験される（予備試験は、そのインヒビターがこの対照プロテアーゼの活性に直接影響しないことを立証したはずである）。
本発明から得られた結果、IkB-αプロテアーゼがキモトリプシン様セリンプロテアーゼであることを示唆する。インヒビターTPCKによる無細胞系におけるこれらの知見の確認後に、本発明のスクリーニング方法はセリンプロテアーゼインヒビターの主誘導体を試験することにより延長し得る。対照として、一方で、セリンプロテアーゼ、例えば、キモトリプシンに対し、また他方でIkB-αプロテアーゼに対する確立されたインヒビターの効果が試験される。（予想とは逆に、これらの知見が確認されない場合には、IkB-αプロテアーゼが明確に帰属し得るプロテアーゼクラスのインヒビターの主誘導体を試験し、そして夫々の対照を実施することにより同様に進めることができる。）
最も好適なアッセイ変化の選択が予備試験によりなされ、例えば、IkB-αそれ自体、またはホスホリル化形態もしくはその複合体パートナーp50及び／またはp65と会合したIkB-αが試験基質、並びに特定のアッセイ条件として利用できるか否かによりその選択がなされる。
その他のアッセイ条件、例えば、その方法及びインデューサーの濃度、誘導の期間及び条件、細胞崩壊、IkB-αの量またはおそらく存在する複合体パートナーの量、IkB-αの担体及びバインダーまたは担体への複合体パートナーのバインダー（２価の架橋剤、例えば、グルタルジアルデヒドを使用してミクロタイタ・プレートに結合し、また臭化シアン、等によりセファロースに結合する）、マーカー（カップリングされた酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ケミルミネセンス物質またはバイオルミネセンス物質、等）、治療の期間、対照の準備及び数、等が予備試験により最適にされる。
工程a）におけるアッセイ条件は、そのアッセイが自動化し得るように選択されることが好ましい。
細胞抽出物を使用して行われるアッセイ内のインヒビターの特異性がIkB-αプロテアーゼの抑制に関して完全には明らかではなかった場合、所謂細胞アッセイ（工程b）は無細胞アッセイ後に、またはそれと平行して行われ、この場合、無傷細胞中のNF-KBの活性化に関する試験物質の効果が証明される。工程b）がいずれの場合にも行われて無細胞アッセイに見られる無傷細胞中の試験物質の抑制効果を確かめることが好ましい。
b）で使用される試験細胞が形質転換されるリポーター遺伝子構築物は、以下、“センサーDNA”と称される。これは、調節配列により調節され、そしてNF-KBに対する少なくとも一つの結合配列を含むことによりNF-KBの活性化に応答するリポーター遺伝子を含むDNA構築物を表す。NF-KBの活性化中に、NF-KBが認識配列に結合し、その後、リポーター遺伝子の発現が開始されて、測定可能なシグナルを生じる。
センサーDNAは、適当な宿主生物、好ましくはE.coli中に高度に再生でき、そして哺乳類細胞へのトランスフェクション及び宿主ゲノムへの組み込む後に調節要素の制御のもとにリポーター遺伝子の発現を促進するプラスミドに配置される。これにつき、リポーター遺伝子（センサーDNA）のための発現カセット及び哺乳類細胞のための選択可能なマーカー並びに少なくとも一つの複製源及びE.coli中の選択のためのマーカーを含むシャトルベクターが選択されることが好ましい。
ゲノム中に組み込まれた安定なセンサーDNAを含む永久細胞系を生産するために、そのベクターは優性選択マーカーを含む。特定の選択マーカーの使用は重要ではなく、これに関して、例えば、抗生物質ゲネチシン（G-418）に対する耐性を与えるネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（neo）の遺伝子（Southern及びBerg，1982）、DHF欠陥細胞のDHFR遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）の遺伝子（Mulligan及びBerg，1981）またはハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph; Gritz及びDavies，1983）が好適である。選択マーカー遺伝子を誘導するプロモーターの例はSV40初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（CMVプロモーター）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（TKプロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）長い末端の繰り返し配列（LTR）である。プラスミドは、個々の重要な要素、例えば、リポーター遺伝子、リポーター遺伝子のプロモーターまたは選択マーカーの調節配列が、例えば、異なる細胞系の使用のために、特別な適用から生じる可能な変化した要件に応答するように交換または変化し得る。このような手段は、例えば、一種以上のプロモーターまたはリポーター遺伝子の前にマルチクローニング部位を配置して調節配列のクローニングを促進して、種々のリポーター遺伝子からプロモーターを調節することである。
好適なリポーター遺伝子を選択する場合、高感受性の非放射性の自動化できるアッセイが用意されることが好ましいと推定される。
原則として、これらの前提条件を満足する全てのリポーター遺伝子が本発明に使用し得る。
アルカリ性ホスファターゼは高感受性を有するケミルミネセンス基質を使用する場合に測定し得るが、それは、この酵素が多くの哺乳類細胞により比較的強く発現されるという欠点を有する。従って、それは、それを発現しないか、またはそれをごく限られた程度に発現する細胞系のみに適する。
β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現産物が、蛍光基を形成する間に夫々のメチルウンベリフェリル−ガラクトシドまたはグルクロニドを開裂し得る。これらの酵素反応は、確立された蛍光アッセイを使用することにより観察される（Wielandら，1985; Kricka，1988）。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現は相対的な感受性で検出し得るが、そのアッセイは、とりわけ、それが放射性であり、また自動化し難いという欠点を有する（Hartmann，1991）。
本発明の状況内で、フォチヌスピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼをコードする遺伝子（De Wetら，1987）がリポーター遺伝子として使用される。この酵素は、この基質ルシフェロンと一緒に、ATPが添加される場合にそれが高レベルのバイオルミネセンス（これは確立された自動化できる方法で測定し得る）を生じ、またこの酵素が哺乳類細胞により内因的に産生されないという利点を有する。また、ルシフェラーゼは比較的短い生体内の半減期を有し、しかも高濃度でさえも無毒性である（Hartmann，1991; Brasierら，1989）。バイオルミネセンスを使用するホタルルシフェラーゼの活性の測定が、酵素を検出するのに最も感度の良い方法の一つである。従って、また正常な哺乳類細胞中のルシフェラーゼ活性の不在のために、この酵素がリポーター遺伝子として特に適している（Subramani及びDeLuca，1987）。
また、腔腸動物アエクオリア・ビクトリア（aequoria victoria）の酵素アポアエクオリン（apoaequorine）をコードする遺伝子（Tanahashiら，1990）がリポーター遺伝子として使用し得る。この酵素は、それがカルシウムイオンを結合した後にそのコファクターコエンテラジンと一緒に多量のバイオケミルミネセンスを生じ、これが確立された自動化できる方法で測定し得るという利点を有する。別の利点は、この酵素が哺乳類細胞により内因的に発現されないことである。
リポーター遺伝子がプロモーター、例えば、チミジンキナーゼプロモーターにより誘導され、これはその他の因子と独立であり、そして遺伝子発現の誘導を明らかに目視できるようにする。プロモーターはそれが正しくかつ測定できる方法で誘導するリポーター遺伝子を転写する必要がある。最小のプロモーター、例えば、最小TKプロモーター及び最小β−グロビンプロモーターが利用できる。本発明の一部として行われる細胞アッセイにつき、比較的高い基本活性を有し、かつ容易に刺激される-105 - +52TKプロモーターが使用された。予備試験において、-30TKプロモーター及び-87最小TKプロモーターが好適であることが判明された。
原則として、コンセンサス配列5'-GGGPuNNTPyCC-3'がNF-KBの結合モチーフ、例えば、配列5'-GGGACTTTCC-3'を有する光免疫グロブリンＫ鎖の良く特性決定されたモチーフが使用し得る。NF-KB結合モチーフがこの目的のために短い距離内で少なくとも２回現れる（約10のヌクレオチド）。実験のために、６種のKBモチーフが使用された。
原則として、NF-KB結合配列がNF-KBにより調節されるあらゆる遺伝子から使用し得る（Baeuerle，1991）。遺伝子がまたNF-KB結合配列は別としてその他の転写因子を含む場合、これらが除去されることが好ましい。
対照細胞はそれらのリポーター遺伝子中にNF-KBのDNA結合モチーフを含まない細胞であることが好ましい。対照細胞は遺伝子発現につき物質の非特異的効果の検出を促進する。例えば、対照細胞中に含まれたシグナルは基準転写に由来し、それ故、試験細胞中に含まれたシグナルから差し引かれるべきである。
試験細胞は、内生NF-KBがそれらの内部で容易に活性化し得るという条件を満足する必要がある。NF-KBはこれらの細胞中で構成的であるべきではない。
細胞はまたNF-KBを活性化する物質、例えば、PMA、LPS、H2O2、UVで誘導性であるべきである。
細胞は、それらをセンサーDNAで形質転換することにより試験細胞としてのそれらの適性につき試験でき、そしてリポーター遺伝子発現の誘導の速度論が細胞インデューサーの濃度依存性を決定する。
自動化方法につき、細胞はできるだけ付着性であるべきである。
本発明の方法において、IkB-αのタンパク質分解、ひいてはNF-KBの活性化を直接または間接に抑制する物質だけでなく、IkB-αのホスホリル化を抑制する物質が検出される。プロテアーゼそれ自体がIkB-αに特異性であるか否かは抑制効果に重要ではなく、活性化に対する特異性が必須である。
更に別の局面において、本発明は、転写因子NF-KBにより調節される遺伝子の発現が寄与する病状の治療のために、IkB-αのタンパク質分解を特異的に抑制する物質に関する。
NF-KB活性化により遺伝子発現の副作用により生じた病状として、とりわけ、Ｔ細胞、マクロファージまたはＢ細胞の活性化から生じる炎症性疾患、毒物ショック、KBモチーフを含むウイルスによる感染後の疾患、ＵＶ損傷（日焼け）、放射線損傷、火傷、移植体拒絶、再潅流損傷が挙げられる。
治療用に関して、本発明の方法により同定された物質が製剤化され、次いでこれらが、好適な医薬上許される担体及び補助物質による送出に応じて、治療有効物質の生物利用能を補償し、生物に対し損傷効果を有しないで、それらの薬理学的特性に関して通常の方法、例えば、二次スクリーニング及び動物試験で医薬の開発につき更に詳細に特性決定される。医薬製剤の製剤化の方法が、通常の書籍、例えば、レミントン医薬科学、1980に見られる。
本発明の一部として、IkB-αのタンパク質分解に関するプロテアーゼインヒビターの効果が測定された。NF-KB応答性ルシフェラーゼ遺伝子構築物を含む誘導試験細胞におけるNF-KB活性化の抑制が確認されただけでなく、IL-6及びIL-8のNF-KB調節発現の抑制が確認された。本発明の一部として、NF-KB特異性抑制サブユニットIkB-αの運命が、NF-KB活性化刺激による細胞の処理後に観察された。この目的のために、高度に精製された組換えヒトIkB-αがウサギ抗血清を生じるのに使用された。特異性IgGは固定化IkB-αによりアフィニティー精製された。IkB-α特異性ポリクローナルIgGはウェスタンブロットにおいてマウス70Z/3プレＢ細胞の全細胞抽出物中でIkB-αに関して正確なサイズで単一の38Kバンドを認識した（図1A、レーン１）。このバンドは対照抗体（抗ウサギIgG抗体）により認識されなかった（図1A、レーン２）。70Z/3細胞培養液へのフォルボール−12−ミリスチル−13−アセテート（PMA）の添加後の２〜５分の間に、IkB-αバンドが細胞からほぼ完全に消失した（図1B、レーン３及びレーン４を比較のこと）。次いで細胞は刺激後40分までIkB-α免疫反応性を示さなかった（図1B、レーン７）。同細胞抽出物のアリコートが、KB特異性DNA結合活性につき電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を使用して分析された。図1C（レーン２及び３を比較のこと）は別として、IkB-αの消失がNF-KB-DNA結合活性の出現と正確に一致し、これらの二つのイベント間の因果関係を示唆した。
また、NF-KBはIL-1β及びLPSによる処理により70Z/3細胞中で活性化されてもよい。TNF-αによるNF-KBの活性化はヒーラ細胞中で研究し得る。図２に示されるように、IL-1β、LPS及びTNF-αは全て70Z/3細胞またはヒーラ細胞中でIkB-αの崩壊を誘導した。しかしながら、IkB-αの消失の開始に関して速度の差はなかった。IkB-αの殆どがPMA（図1B）による70Z/3細胞の刺激後またはTNF-α（図２）によるヒーラ細胞の刺激後５分間で既に崩壊していた。70Z/3細胞をIL-1βで刺激した時、崩壊が若干後に開始した。刺激の５分後に、PMAまたはTNF-αで処理された細胞中で観察されたのよりも多いIkB-αが残存した。LPSにより刺激された70Z/3細胞中で、IkB-αの殆どが誘導から30分前に分解されなかった（図２）。再度、全ての３種のインデューサーにつき、IkB-αの消失が細胞中のNF-KB-DNA結合活性の出現と一致した。これらの観察は、NF-KBの４種の異なるインデューサーがNF-KB不活化の相互の機構を使用して、IkB-αの崩壊に寄与することを示す。分解の変化する速度論は、インデューサーがNF-KB活性化の前に異なるシグナル導入経路を使用することを示唆する。ポリクローナル抗体が使用されたという事実に基いて、IkB-αのエピトープのみが刺激後に消失または修飾されたことはありそうもない。更におそらく、IkB-α免疫反応性の欠如は免疫学上検出できない分解生成物をもたらすタンパク質の迅速かつ完全な崩壊のためである。PMA、IL-1B、LPSまたはTNF-αによる刺激後に、SDSゲル中のIkB-αの電気泳動移動度の変化が目視されず、この分解の前のIkB-αの後翻訳修飾を示す。
タンパク質合成インヒビターシクロヘキシミド及びアニソマイシンは、70Z/3細胞中でNF-KBを活性化することが知られている（Sen及びBaltimore，1986）。本発明の状況内で行われたシクロヘキシミドによる70Z/3細胞の１時間の処理はDNAへのNF-KBの結合をほんのわずかに誘導した（図3A、レーン１、上のパネル）。これらの細胞中で、多量のIkB-αが依然としてウェスタンブロッティングにより検出し得た（図3A、レーン１、下のパネル）。これは、正常なIkB-α形質転換の抑制がNF-KBの有効かつ迅速な活性化に不十分であるという結論を導く。シクロヘキシミドで前処理された細胞がPMAで誘導された場合、IkB-αの迅速な崩壊ひいてはDNAへのNF-KBの結合の誘導が観察し得る（図3A）。確立されたIkB-α減少の初期速度論はPMA単独で観察されたものと区別し得なかった（図3Aを図1Bと比較のこと）。しかしながら、そのタンパク質合成インヒビターシクロヘキシミドはIkB-αの再発を阻止し、これがPMAのみによる処理の40分後に観察され（図3Aを図1Bと比較のこと）、このIkB-αがおそらくNF-KBそれ自体の転写調節のもとに新たに合成されたことを示唆する。
更に、タンパク質合成停止細胞中のIkB-αの半減期が細胞のその後のPMA刺激を伴わないで、または刺激を伴って測定された。シクロヘキシミド処理された70Z/3細胞中のIkB-αの半減期は、定量ウェスタンブロッティングにより分析されたように約138分であった（図1B）。IkB-αの半減期がその迅速な分解の期間中、PMA刺激の２〜５分後にほんの1.5分に減少された。これは、PMAがIkB-αの約90倍の分解を誘導することを示す。
IkB-αの誘導分解がNF-KBの活性化に必要な工程であるか否かを測定するために、細胞培養液がプロテアーゼインヒビターで処理された。活性であることがわかった種々の物質のうち、キモトリプシンインヒビターｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）が種々の細胞型中のNF-KB活性化の最も強力なインヒビターであった。25μMのTPCKによる70Z/3細胞の１時間の処理はその後のPMA処理においてNF-KB-DNA結合活性を完全に抑制するのに充分であった（図４、上のパネル）。TPCKのID50は約８μモルであった。核因子oct-1を含む構成的DNA結合活性は殆ど影響されなかった（図4A）。ウェスタンブロットにより示されるように、プロテアーゼインヒビターはPMA処理細胞中のIkB-αの分解を完全に阻止できなかった（図4A、下のパネル）。TPCKは、PMAと同時に添加された場合でさえも抑制効果を有し、同時に70Z/3細胞中でIL-IB及びLPSにより、また種々のその他の細胞系中でTNF-αによりNF-KBの活性化を防止するのに有効であった（図4A、レーン６及び７）。PMA、IL-1またはLPSによる刺激後にプロテアーゼインヒビターによる細胞の処理はNF-KB活性化を殆ど損なわなかったが、更なる活性化を停止したはずである（図4A、レーン10−12）。これは、TPCKがNF-KBのDNA結合を単に損なわず、またはNF-KBの分解をもたらさなかったことを示し、そのプロセスは細胞溶解中に起こっていた。TPCKがPKCを抑制したことは同様にありそうもない。何となれば、IL-1B及びTNF-αはPMA誘導PKCイソ酵素から独立にNF-KBを活性化することが示されたからである（Bomsztykら，1991;Meichleら，1990）。
ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（TLCK）がトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターであり、かつ構造及び化学活性においてTPCKと非常に似ている。TLCKは25μMの濃度で70Z/3細胞中でNF-KBの活性化を阻止できなかった（図4B、レーン３）。しかしながら、100μMのTLCKの濃度で、NF-KB活性化の部分抑制が観察された。種々のその他のプロテアーゼインヒビターは高濃度であろうとも有効であった。TPCKの選択的かつ強い抑制効果は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼがNF-KB活性化の一部であることを示唆する。このプロテアーゼが、以下IkB-αプロテアーゼと称される。
最近、反応性酸素化合物が多くの誘導因子によりNF-KBの活性化中にメッセンジャー物質としての役割を果たし得ることが報告された（Schreckら，1991;Schreckら，1992 a,b）。この仮定は、酸化防止剤、例えば、チオール化合物、ジチオカーバメート及び遊離イオンのキレート剤が無傷細胞中がNF-KBの活性化を抑制するという事実に一部基いていた。NF-KB活性化の非常に強い酸化防止剤インヒビターはピロリジンジチオカーバメートであった（PDTC; Schreckら，1992b）。IkB-αの分解がNF-KBの活性化に重要な役割を果たす場合、PDTCは、TPCKと同様に、IkB-αの消失を防止すべきであるが、この抑制はIkB-αプロテアーゼの前に作用する機構のために作用することができた。100μMのPDTCがPMA処理70Z/3細胞中でNF-KB結合活性の活性化を有効に抑制した（図５）。予想されたように、IkB-αタンパク質の有意な分解がウェスタンブロットにより示されなかった。最近、PDTCはPMA誘導膜会合及びPKCのキナーゼ活性を干渉しないことが示され、無傷細胞中のIkB-αに対するPKCの直接効果に反論した。
本発明の結果から、PMA、IL-1β、LPS及びTNF-αに応答するIkB-αのタンパク質分解がNF-KB活性化の方法に必要な工程であると結論し得る。これはNF-KB活性化によるIkB-α分解のほぼ同時のカップリングから明らかであるだけでなく、また更に重要なことに、良く特性決定されたプロテアーゼインヒビターTPCKの低濃度で観察された選択的な良く効果から明らかである。誘導分解がタンパク質の安定性の著しい低下により生じたが、de novo合成をブロックすることにより生じたのではなかった。抑制性サブユニットの通常の半減期がタンパク質合成インヒビターによるNF-KBの弱い活性化を説明できたが、これはIkB-αの迅速かつ完全な枯渇を誘導し、またPMA及びその他の刺激により示されるようにNF-KBを潜在的に活性化するのに明らかに不十分である。
IkBの増大された分解は種々の機構により調節できた。第一に、IkBタンパク質の新規な修飾が構成的プロテアーゼによりインヒビターを分解に対し一層感受性にすることができた。第二に、IkBを選択的に分解するプロテアーゼが活性化し得た。この可能性の重要な局面は、IkB-αプロテアーゼまたはプロテアーゼインヒビターがメッセンジャー物質、例えば、タンパク質キナーゼに関して直接上流の標的であり得ることである。第三に、IkBの修飾またはプロテアーゼ活性の誘導が必要とされ得る。現在まで利用できる結果はこれらの可能性の間で決定的に区別し得ない。
また、本発明は、IkBの直接のホスホリル化が無傷の細胞中のIkBの放出及びNF-KBの活性化にどの程度寄与するのかという質問を出す。今までに行われた研究に基いて、IkB-αの誘導ホスホリル化を示唆する無傷の細胞からのホスホリル化データが利用できないが、IkB-αの構成的ホスホリル化が観察された。本結果は、分解がホスホリル化により放出されたIkBを迅速に排除するのに必要とされるという仮定のもとに試験管内ホスホリル化データ（Shirakawa及びMizel，1989;Ghosh及びBaltimore，1990; Kerrら，1991）と一致するだけである。分解は、一旦ホスホリル化されたIkBを新規なNF-KBを抑制することから阻止するのに必要とされ得た。しかしながら、プロテアーゼインヒビターTPCKの強い抑制効果に鑑みて、IkB-αのホスホリル化はまたあまりに一時的であり、NF-KBを活性化できず、また細胞核へのそれの輸送を可能にできず、または通常の方法により検出し得ないはずである。
IkBの調節されたタンパク質分解はNF-KBの活性化を不可逆にするのに優れた機構であろう。活性化されたNF-KBを抑制するのに唯一の選択はこの場合には新たに合成されたIkBであろう。重要な質問は、IkB-αプロテアーゼがNF-KBとの細胞質複合体中でIkB-αを攻撃するか否か、またはNF-KBからのIkBの先の放出が必要とされるか否かである。実験は、過剰発現されたIkB-αがTNF-α刺激により著しく分解されないことを示したが、これは内生の特別な型の場合である。これは、NF-KBと会合されたIkBのみがIkB-αプロテアーゼの基質であり、直接のホスホリル化によるIkB-αの修飾ではなく、同定の要件を一般に使用されなくする。転写レギュレーターのサブユニットに関する特定の構造が酵母からのα２リプレッサーにつき既に確立された（Hochstrasser及びVarshavsky，1990）。
IkB-αプロテアーゼの特定のインヒビターは、種々の病状の原因であるNF-KBの活性化を阻止するための医薬物質として好適である。NF-KBが即時−初期遺伝子のシグナル伝達因子及びアクチベーターとしてかなり寄与する多数の生物医学上重要な条件の例は、エイズの進行、免疫応答中のＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの活性化、所謂急性期応答、毒素ショック、移植体拒絶並びにγ線及び紫外線に対する細胞の応答である。IkB-αプロテアーゼの特定のインヒビターは抗炎症薬及び免疫抑制薬として有効である。
【図面の簡単な説明】
図１：刺激された70Z/3プレＢ細胞中のIkB-αの運命
図２：NF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するIL-1β、LPS及びTNF-αの効果
図３：70Z/3細胞中のIkB-αの安定性及びNF-KBの活性化に関するタンパク質合成インヒビターの効果
図４：70Z/3細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するプロテアーゼインヒビターTPCK及びTLCKの効果
図５：70Z/3細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するPDTCの効果
図６：ヒーラ細胞中のNF-KBによるリポーター遺伝子の活性化に関するプロテアーゼインヒビターTPCKの効果
図７：ヒーラ細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するプロテアーゼインヒビターZ-Ile-Glu（Ot-Bu）-Ala-ロイシナール及びZ-Leu-ロイシナールの効果
図８：プロテアーゼインヒビターZ-Ile-Glu（Ot-Bu）-Ala-ロイシナール及びZ-Leu-ロイシナールの試験；TNF-αにより誘導されたIkB-αのタンパク質分解の抑制効果
図９：TNF-αを使用するNF-KB活性化の誘導の状況及びホスホリル化IkB-αの出現
実施例１
刺激された70Z/3プレＢ細胞中のIkB-αの運命
70Z/3細胞（ATCC No. TIB 158）を、10％のFCS（ギブコBRL）及び50μMの２−メルカプトエタノールにより補給されたRPMI-1640培地（ギブコBRL）中で培養した。約2-3 x 106の懸濁細胞を含むアリコート２mlを種々の期間にわたって50ng/mlのPMA（シグマ）で処理した。その処理を即時の遠心分離（エッペンドルフ・ミクロフュージ（Eppendorf Microfuge）中５秒）そして氷による冷却により中断した。細胞ペレットを、ノニオン性洗剤ノニデットP-40（Baeuerle及びBaltimore，1988b）を含む高塩抽出緩衝液60μlで溶解した。エッペンドルフ・ミクロフュージ中13,000rpmにおける15分間の遠心分離の上澄みをウェスタンブロッティング及びEMSA（電気泳動移動度シフトアッセイ）により分析した。SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングに関して、抽出物のアリコート30μlをSDS試料緩衝液（Laemmli，1970）15μlと混合し、沸騰させ、そして12.5％のポリアクリルアミドミニゲル（バイオラド）によるSDS-PAGEにかけた。所謂半乾燥ブロッティング装置（バイオラド；15V/2.5mA/cm2で１時間）を使用してタンパク質をゲルからイモビロン−Ｐ−フィルター（0.45μm;ミリポア）に移した。ブロットの効率を、ポンソーＳ（セルバ）によるフィルターのタンパク質染色によりチェックした。フィルターを、0.1％（v/v）のトウィーン-20（TBST）、５％の低脂肪ミルク粉末（ネッスル）及び１％のBSAを含む食塩加トリス緩衝液中で一夜ブロックした。次いでフィルターをIkB-αアフィニティーカラムの透析溶離液中の抗IkB-αIgGと共に周囲温度で１時間インキュベートし、ブロッティング緩衝液中で1:100に希釈した。TBST中で30分間洗浄した後、フィルターをブロッティング緩衝液中でヤギ抗ウサギIgG/ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ接合体（バイオラド）の1:4000の溶液中でインキュベートした。TBST中で30分間洗浄した後、フィルターをECL検出試薬（アメーシャム）で処理し、露出した（コダックXRフィルム、１分未満）。EMSAにつき、抽出物のアリコート２μlを結合混合物に添加し、100nMのKCl、20nMのHEPES、pH7.9、2.5nMのジチオスレイトール、0.5nMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.2％のノニデットP-40、５％のフィコール、20μgのBSA、３μgのポリ（dl-dC）及び10.000cpm（セレンコフ計数法）の32P標識二本鎖KB-オリゴヌクレオチドプローブ（ギブコBRL）の最終濃度を生じた。タンパク質DNA複合体の特異性を競合実験により確認し、そしてポリクローナル抗体で超シフトし、Rel-A（p65）のＣ末端100アミノ酸を認識した。氷による20分間のインキュベーション後に、試料を天然の４％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ、0.5 x TBE中で運転した。乾燥ゲルを露出した（コダックXRフィルム、-70℃、一夜）。
ヒトIkB-αをE.coli中で産生し、Zabelら，1993により記載されたようにして精製した。IkB-αの抗血清をウサギ中で産生し、血清２ml中の特異性IgGをIkB-αセファロース（Henkelら，1992）に対しアフィニティー精製した。6 x His標識したアフィニティー精製ヒトIkB-α２mgを製造業者の指示に従って臭化シアン活性化セファロース4CL-B（ファーマシア）0.5mlにカップリングした。PBS及び２カラム容積の0.1Mのグリシン-HCl、pH2.7で充分に洗浄した後、特異性抗体を２容積の4Mのグアニジン塩酸塩で溶離した。溶離液をTBSTで充分に透析した。
実験の結果を図１にリストする。A：ウェスタンブロットにおけるアフェニティー精製ポリクローナルウサギ抗IkB-α抗体の特異性。上記のように、タンパク質をナトリウムドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による高塩全細胞抽出物中の刺激されなかった70Z/3細胞により分離し、膜フィルターに移した。フィルターのストリップを抗IkB-α及びペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGと共にインキュベートした（レーン１）。二重フィルターを二次抗体と共にそのままインキューベートした。図はケミルミネセンス標識フィルターのフルオログラムを示す。分子量がkDaで記載される。矢印は単一38Kバンドの位置を示す。ホスホリラーゼ（97）、ウシ血清アルブミン（BSA、67）、卵白アルブミン（45）及びカルボアンヒドラーゼ（30）を分子量標準物質として使用した。B:  IkB-αに関するPMAによる細胞の処理の効果。細胞を図に示された期間（分）にわたってPMAで処理した（レーン２−９）。ゼロ値（レーン１）が未処理の細胞から生じる。処理後に、細胞抽出物を記載されたようにしてSDS-PAGEにかけ、抗IkB-αIgGを使用することによりIkB-αにつきウェスタンブロット試験した。矢印はIkB-αの位置に示す。図はフルオログラムの抽出物を示す。C:NF-KBのDNA結合活性に関するPMAによる細胞の処理の効果。対照細胞（レーン１）及びPMA処理細胞（レーン２−６；処理期間が上に分で示される；図の下の数はレーンを示す）からの抽出物のアリコートを遺伝子のエンハンサー“マウスｋＬ鎖エンハンサー”（Sen及びBaltimoro，1986）のNF-KB結合モチーフを含む32P標識DNAプローブで上記のようにインキュベートし、その後、DNA結合活性の分析を、ゲル電気泳動を使用することにより行った。図は天然ゲルのフルオログラムを示す。黒の矢尻はNF-KB-DNA複合体の部分を示し、白の矢尻は複合体形成されなかったDNAプローブの位置を示す。
実施例２
NF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するIL-1β、LPS及びTNF-αの効果
70Z/3細胞の培養及び細胞抽出物の生成のためにこの実施例で使用した方法を実施例１に記載されたようにして行った。70Z/3細胞をIL-1β（ベーリンガー・マンハイム）50E/mlまたはLPS（シグマ）15μg/mlで処理した。ヒトヒーラ細胞を10％のFCS及び１％のＬ−グルタミンを補給したDMEM中で培養し、ヒト組換えTFN-α（ゲンザイム）200E/mlで処理した。
図２は、個々に記載された異なる期間（分）につきIL-1β（レーン２−４）及びLPS（レーン６−８）による上部パネル及び中央パネル中の70Z/3細胞の処理、続いてEMSAまたはウェスタンブロッティングを使用するNF-KB及びIkB-α免疫反応性のDNA結合活性に関する全細胞抽出物の試験を示す。下部パネルはTNF-αによるヒーラ細胞の処理の結果を示す（レーン10−13）。この図はウェスタンブロットの部分及び天然ゲルのフルオログラムの部分を示す。EMSA中のNF-KB DNA複合体の位置が黒の矢尻により示される。ウェスタンブロットにおけるIkB-αバンドの位置が矢印により示される。
実施例３
70Z/3細胞中のIkB-αの安定性及びNF-KBの活性化に関するタンパク質合成インヒビターの効果
70Z/3細胞を25μg/mlのシクロヘキシミド（シグマ）で処理した（Wallら，1986により測定されたように、10μg/mlの濃度で既にタンパク質合成が70Z/3細胞中で90％抑制される）。細胞培養、抽出物生成、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを実施例１に従って行った。次いでデンシトメトリー試験をハウテク・スキャンマスター（Howtek Scanmaster）3により行った。データをクォンティ・ワン・バージョン2.2ソフトウェアで評価した。
実験の結果を図３に示す。A: NF-KBのDNA結合及びIkB-αの細胞濃度に関するシクロヘキシミドの効果。細胞をシクロヘキシミドで１時間前処理し、続いて明記された期間（分）にわたってPMAで刺激した。上のパネルはEMSAを使用するNF-KBのDNA結合活性に関する細胞抽出物の試験を示し、天然ゲルのフルオログラムの部分を示す。黒の矢尻はNF-KB-DNA複合体の位置を示す。下のパネルはウェスタンブロッティングを使用するIkB-αに関する細胞抽出物アリコートの試験を示す。38K  IkB-αバンドの位置が矢印により示される。B:PMAを用いず、またその存在下のIkB-αの安定性。左のパネルはシクロヘキシミドのみによる細胞の処理を示す。右のパネルは１時間のシクロヘキシミド前処理後のPMAによる細胞の処理（処理期間が図に明記される）を示す。（高塩濃度の全細胞抽出物を細胞培養アリコートから生成し、同じタンパク質の量をSDS-PAGEにかけた。IkB-α濃度をウェスタンブロッティング及びフルオログラム中の38Kバンドのデンシトメトリー定量化により測定した。）左のパネルはシクロヘキシミド処理の開始時の証明されたIkB-α（％）を示し、右はPMA処理の開始時のものを示す。
実施例４
70Z/3細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するプロテアーゼインヒビターの効果
細胞培養、抽出物生成、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを実施例１に従って行った。細胞を25μmのTPCKまたはTLCK（両方ともシグマから）に溶解し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中で前処理した。対照培養液は等しい量のDMSOを収容した。
実験の結果を図４に示す。A:  PMAによる誘導に関するTPCKの効果。細胞を明記された期間にわたってPMAを用いないで（左のパネル）、またはPMAと共にTPCKの存在下で処理した。細胞抽出物を、EMSAを使用してNF-KBのDNA結合活性につき試験し（上のパネル）、またウェスタンブロッティングを使用してIkB-αタンパク質の量につき試験した（下のパネル）。天然ゲルのフルオログラムの部分中のNF-KB-DNA複合体の位置を黒の矢尻により示す。矢印はウェスタンブロット中の38K  IkB-αバンドの位置を示す。弱い下のバンドは非特異的である。その量は抗体のアフィニティー精製後に非常に減少された。B:  70Z/3細胞中;対照細胞（Co）中のIL-1β（I）、LPS（L）及びPMA（P）によるNF-KBの活性化に関するTPCKの効果。細胞を刺激前に10分間（レーン６−８）または刺激後に更に10分間（レーン10−12; IL-1β及びPMAで30分間またはLPSで60分間）にわたってTPCKで処理した。対照細胞（レーン１−４）の全細胞抽出物及びTPCKで処理された細胞（レーン５−12）を、EMSAを使用してNF-KBのDNA結合活性につき試験した。天然ゲルのフルオログラムの部分を示す。黒の矢尻はNF-KB-DNA複合体の位置を示す。C:  PMAによるNF-KBの活性化に関するTLCKの効果。70Z/3細胞を未処理で残し（レーン１）、または25μmのTPCK（レーン２）または25μmのTLCK（レーン３）で10分間処理し、続いてPMAを添加した。全細胞抽出物を、EMSAを使用してNF-KBのDNA結合活性につき試験した。図はフルオログラムの部分を示す。NF-KB-DNA複合体の位置を黒の矢尻により再度示す。
実施例５
70Z/3細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するPDTCの効果
細胞培養、抽出物生成、EMSA、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを先の実施例に従って行った。100μMのPDTCのアンモニウム塩による細胞培養液の処理をSchreckら，1992により記載されたようにして行った。
実験の結果を図５に示す。細胞をPDTCを用いないで（左上のパネル）またはPDTCの存在下でインキュベーションの１時間前に（右のパネル）PMAで明記された時間（分）中に処理した。全細胞抽出物を、EMSAを使用してNF-KBのDNA結合活性（上のパネル）につき、またウェスタンブロッティングを使用してIkB-αタンパク質含量（下のパネル）につき試験し、この場合、上記の図のように、天然ゲルのフルオログラムの部分を示し、NF-KB-DNA複合体の位置を黒の矢尻により示す。ウェスタンブロットの部分を示し、この場合、38K  IkB-αバンドの位置を矢印により示す。
実施例６
ヒーラ細胞細胞中のNF-KBによるリポーター遺伝子の活性化に関するプロテアーゼインヒビターTPCKの効果
細胞培養を実施例１のようにして行った。細胞をリン酸カルシウム法（Wiglerら，1978）によりトランスフェクトした。トレイ当たり105の細胞に1.5μgの対照プラスミド、1.5μgのpUC-TK-Lucまたは1.5μgのpUC-KB-TK-Lucを移入した。プラスミドpUC19（ATCC no.37254、ニューイングランド．バイオラブズ）を対照プラスミドとして使用した。プラスミドpUC TK-Lucは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターの-105 - +52領域の調節のもとにルシフェラーゼをコードした配列（De Wetら，1987）を含む。プラスミドpUC-KB-TK-Lucは、夫々二つのKB結合位置によりTKプロモーター領域の前に夫々28塩基対の３つのHIV-LTRフラグメントを含む（Nabelら，1988）。細胞を刺激の20分前にTPCK（シグマ）で処理した。細胞の溶解及びルシフェラーゼアッセイをBrasierら，1989に従って行った。結果を相対光単位（RLU）で示す。
行われた実験の結果を図６に示す。製剤１、２及び３は、刺激されなかった細胞中のルシフェラーゼの基本的な発現を示す。製剤４、５及び６は３時間にわたる200U/mlのヒトTNF-αによる細胞の刺激後のルシフェラーゼの発現を示す。製剤７、８及び９はTBF-α刺激後のルシフェラーゼ発現に関する25μMのTPCK（DMSO中）の効果を示す。製剤10はルシフェラーゼ活性に関するTPCKの試験管内の効果を示す。この目的のため、250μMのTPCK（製剤９及び10を比較のこと）を細胞抽出物に添加した。
実施例７
ヒーラ細胞中のNF-KBの活性化及びIkB-αの安定性に関するプロテアーゼインヒビターZ-Ile-Glu（Ot-Bu）-Ala-ロイシナール（NBIG）及びZ-Leu-ロイシナールの効果
この実施例の試験手はずは実施例４の試験手はずに合致した。ヒーラ細胞を実施例２に記載されたようにして培養し、TNF-αをNF-KB活性化のインデューサーとして使用した。プロテアーゼインヒビターとして、Z-Ile-Glu（Ot-Bu）-Ala-ロイシナール（NBIG）化学的に関連した物質Z-Leu-ロイシナール（Cbz-L-L）を使用した（Ｚはベンジルオキシカルボニルを表す）。
a）電気泳動移動度シフトアッセイを、ヒーラ細胞からの全細胞抽出物に対しNF-KB結合部位を有する32P標識オリゴヌクレオチドを使用することにより行った。図7aはTNF-α刺激後のNF-KBの活性化の阻止を示す。５分と10分後の比較は60μMのNBIGの存在下のTNF-αによる刺激後に、対照細胞中よりもかなり少ないNF-KB-DNA複合体が生成されることを明らかに示す（レーン３及び４をレーン８及び９と比較のこと；図７及び８中の“n.s.”は“非特異的”を表す）。Cbz-L-Lでは、この効果が生じなかった（レーン11〜15）。NBIGに関するID50値は約50μMであった（図7B）。
b）ウェスタンブロットは、TNF-αがIkB-αのタンパク質分解を誘導することを示した（図８、レーン３〜５）。60μMのNBIGの存在下で、この分解が大幅に減少される（図８、レーン４及び９、10分の値を比較のこと）。従って、TNF-αによる刺激後のNF-KB活性化の抑制はまたIkB-αの分解の抑制を生じる（図8A）。プロテアーゼインヒビターTPCK（実施例４を参照のこと）とは対照的に、60μmの濃度におけるNBIGは、SDSゲル中で遅く流れるIkB-αの修飾形態の蓄積を生じるという特別な特徴を有していた（図8a、レーン４及び９を比較のこと）。インヒビターCbz-L-L（50μm）はこれらの効果を示す（図8B）。図中、IkB-αの遅く移動する形態がアステリスクで表示される。
ジャガイモからの酸性ホスファターゼと一緒の細胞フラクションのインキュベーションは、速く移動する形態に逆に形質転換されるIkB-αの遅く移動する形態を生じる。この知見は、IkB-αの遅く移動する形態（これはTNF-αによる刺激後にNBIGの作用のもとに蓄積される）はIkB-αのホスホリル化形態であることを示す。
別の実験において、NBIGをホスフェートインヒビターオカダイック酸（100nM）と一緒に使用した。オカダイック酸の存在は、IkB-αの迅速に移動するホスホリル化されていない形態を完全に消失させた。
IkB-αのホスホリル化はNBIGによる処理により誘導されず（図９、レーン８〜14）、125μMの濃度でさえも誘導されない（レーン14）。こうして、IkB-αのホスホリル化形態は、細胞がTNF-αで誘導される時にのみ生成され（図９、レーン２〜７）、修飾IkB-αの量はNBIGの濃度と共に上昇する。IkB-αのホスホリル化の出現及び安定化はNF-KBの活性化と同時ではないという観察（図8A、レーン６〜９を図7A、レーン６〜９と比較のこと）は、無傷の細胞中のIkB-αのホスホリル化がNF-KBの活性化に不十分であるという仮定を強くする。
実施例８
プロテアーゼインヒビターNBIGによるヒーラ細胞中のNF-KB調節サイトカインIL-6及びIL-8の発現の抑制
試験手はずの原理は先の実施例の原理に合致した。
細胞を−100μモルのNBIGによる30分の前処理を用いて、または用いないで−TNF（200E/ml）またはPMA（50ng/ml）で刺激し、IL-6またはIL-8の濃度を、ELISA（ブリティッシュ・バイオテクノロジー・プロダクツ社）を使用して種々の間隔で細胞上澄み中で測定した。発現値を表にリストする。これらの値は、プロテアーゼインヒビターの存在下の刺激の120分後に、IL-6の産生が79％または73％抑制され（TNF刺激）、またIL-8の産生が90％または98％抑制される（PMA刺激）ことを示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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