(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＸ４０Ｌ遺伝子をＴ細胞特異的ｌｃｋプロモーターの下流に組み込んだＯＸ４０Ｌ発現ベクターを、マウスの受精卵に導入し、該マウスをＣ５７ＢＬ／６系マウスに戻し交配した、ＯＸ４０ＬをＴ細胞で恒常的に発現している、間質性肺炎及び炎症性腸炎を自然発症するトランスジェニックマウスの間質性肺炎又は炎症性腸炎のモデル動物としての使用方法。
【請求項２】
ＯＸ４０Ｌ遺伝子が、配列番号１に示されるＤＮＡ配列からなることを特徴とする請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
炎症性腸炎が、腸基底膜における中程度から重度のリンパ系組織の過形成、基底膜における粘膜上皮の過形成、リンパ球の浸潤又は粘膜下リンパ濾胞の増生を発症していることを特徴とする請求項１又は２記載の使用方法。
【請求項４】
戻し交配を、少なくても１２世代行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自己免疫疾患モデル非ヒト哺乳動物、詳しくはＯＸ４０Ｌ遺伝子を導入した自己免疫疾患モデルトランスジェニック非ヒト哺乳動物、及びその自己免疫疾患治療薬のスクリーニングへの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する分子で、活性化Ｔ細胞に一過性に発現する。一方、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）は、活性化Ｂ細胞、活性化樹状細胞などのＡＰＣ（抗原提示細胞）に発現する。Ｔ−ＡＰＣ細胞の相互作用を通じて共刺激を加える場合のＴＮＦファミリーメンバーの影響については、多くの報告がなされており、その因果関係として、自己免疫疾患の原因という点において、それらが果たす役割が重要視されている。これらの報告では、ＯＸ４０Ｌ遺伝子欠損マウスや限定的に発現するＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスが作製されている。
以下に、Ｔ−ＡＰＣ相互作用を通じて共刺激を加える場合のＴＮＦファミリーメンバーの影響に関する従来の報告について詳述する。
【０００３】
ナイーブＴ細胞を充分に活性化するには、ＴＣＲ（Ｔ  cell  receptor）のペプチド／ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子）複合体との相互作用だけではなく、ＡＰＣ（抗原提示細胞）上で発現する付随分子による共刺激も必要である。ＣＤ８０及びＣＤ８６という、ともにＴ細胞上のＣＤ２８に結合する周知のアクセサリー分子以外に、ＯＸ４０L（ＯＸ４０リガンド）、ＣＤ７０、４−１ＢＢL及びRRANCEを含む、数種の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーが、Ｔ細胞上の同系のレセプターとの結合の際に共刺激シグナルを誘導することが知られており、また、Ｔ細胞上に発現する別のメンバーであるＣＤ４０Ｌも、ＡＰＣ上でレセプターに結合する際のＡＰＣの活性化に不可欠であることが知られている（Grewal and Flavell, 1998, Annu.Rev.Immunol.,16,111）。
【０００４】
こうした観察結果は、Ｔ−ＡＰＣ相互作用においてＴＮＦ／ＴＮＦレセプターファミリーメンバーが共刺激を与える役割を果たしていることを示唆している。
当初、その発現がヒトＴ細胞白血病ウィルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＴａｘにより誘導されるヒトｇｐ３４と同定されていた分子であるＯＸ４０Ｌ（Miura et al., 1991, Mol.Cell. Biol., 11,1313）は、Ｂ細胞、樹状細胞、及び内皮細胞中で発現し（Ohshima et al., J Immunol. 1997 Oct 15;159(8):3838-48; Kawamata et al., 1998; Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）、そのレセプターであるＯＸ４０は、元来、活性化されたＴ細胞マーカーであるとされていた（Paterson et al., 1987; Mallet et al., 1990）。Ｔ細胞とＡＰＣとの間のＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用が、最適のＣＤ４+Ｔ細胞反応に大きく係わっていることを示す証拠が次々と現れている。
【０００５】
本発明者らは他者と協力してＯＸ４０Ｌ欠損マウスを作製した。かかるマウスは抗原を与えられた際にＡＰＣ機能のかなりの欠損を示し、そうした欠損によりＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの双方について、その産生及び増殖におけるＴ細胞反応が減少していた（Chen et al., 1999, Immunity, 11,689; Pippig et al., 1999, J.Immunol., 163,652; Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）。同様のＡＰＣ機能の欠損は、抗ＯＸ４０Ｌ ｍＡｂｓ（モノクロナール抗体）を用いてインビボでＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用を妨害することでも誘導される（Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）。ＯＸ４０Ｌ及びそのレセプターであるＯＸ４０を欠損したマウスは、ＣＤ４+Ｔ細胞反応が低下していることも知られている（Kopf et al., Immunity. 1999 Dec;11(6):699-708）。Ｔｈ１及びＴｈ２反応の両方に強い共刺激をもたらす以外に、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用は、ある種の実験条件下（Flynn et al., J Exp Med. 1998 Jul 20;188(2):297-304; Oshima et al., 1998; Jember et al., J Exp Med. 2001 Feb 5;193(3):387-92）、抗体反応を変化させる場合（Chen et al., 1999, Immunity, 11,689; Pippig et al., 1999, J.Immunol., 163,652; Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365; Morimoto et al.,  J Immunol. 2000 Apr 15;164(8):4097-104）、及びＴ細胞の遊走時（Higgins et al., 1999, J.Immunol.,162, 486; Nohara et al., J Immunol. 2001 Feb 1;166(3):2108-15）において、Ｔｈ２に偏った反応を制御することも示されている。
【０００６】
ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌが用いるのは、記憶Ｔ細胞の発生と生存の調節という、直接的かつ重要な手段である（Gramaglia et al.,1998, J.Immunol.,161,6510及び 2000, J.Immunol.,165,3043）。脳炎誘発性野生型Ｔ細胞をＯＸ４０Ｌ欠損マウスに養子移入すると、それらのマウスでは病状の持続的進行が不可能になるらしいことが、最近、本発明者らにより示された（Ndhlovu et al.,2001, J.Immunol.,167,2991）。さらに、ＯＸ４０の刺激が寛容誘導を妨げるとの報告もなされており（Pakala et al., Nat Med. 2001 Aug;7(8):907-12）、これは、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０システムが自己免疫疾患の制御に関与している可能性を示している。確かに、ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌは、実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＥ）、同種異系の宿主対移植片病（GVH病：ＧＶＨＤ）、増殖性狼瘡性腎炎及び関節炎など、数種の炎症性障害の組織中に検出される（Weinberg et al., 1999, J.Immunol.,162, 1818; Tittle et al., 1997, Blood, 89,4652; Stuber et al., 1998, Gastroenterology, 115, 1205; Nakajima et al., J Immunol. 2001 Feb 1;166(3):2108-15)。
【０００７】
ＯＸ４０を発現する自己反応性Ｔ細胞は、ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）に罹患したラットから検出され、ＯＸ４０抗毒素を投与すると、ＥＡＥの症状が改善された。加えて、ＯＸ４０Ｌのアンタゴニストである可溶性ＯＸ４０融合蛋白質も、進行中のＥＡＥ（Weinberg et al., 1999, J.Immunol.,162, 1818）及びＧＶＨＤ（Stuber et al., 1998, Gastroenterology, 115, 1205）を抑制するだけでなく、炎症性腸炎（ＩＢＤ）のモデルマウスにおける進行中の大腸炎（Higgins et al., 1999, J.Immunol.,162, 486）、喘息（Jember et al., J Exp Med. 2001 Feb 5;193(3):387-92）、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）（Nakajima et al., J Immunol. 2001 Feb 1;166(3):2108-15）の症状を改善させるとされている。こうしたデータから、各種自己免疫疾患の免疫制御にＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０相互作用が重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０００８】
ＡＰＣ上のＯＸ４０Ｌの発現とは無関係の過剰なＯＸ４０Ｌシグナリングにより、本発明者らは免疫制御に対するＯＸ４０Ｌの影響の重大性をよりくわしく評価する手段を得た。LaneらはＣＤ１１ｃプロモーターのもとでＯＸ４０Ｌトランスジェニック（ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ）マウスを作製したが、ＯＸ４０Ｌの発現が限定的だったため、Ｔ細胞の機能におけるＯＸ４０刺激の機能的重要性をはっきり示すことはできなかった。ＯＸ４０Ｌの発現は、通常の活性化Ｔ細胞上で必ずしもすぐに検出できるわけではない（Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）。長期間培養された通常ヒトＴ細胞クローンが、免疫染色で検出されたとおり、ＯＸ４０Ｌを発現することが、本発明者らによって最近明らかにされた（Takasawa et al., 2001, Jpn.J.Cancer Res., 92,377）。さらに、ＯＸ４０欠損マウス由来の活性化Ｔ細胞が細胞表面上のＯＸ４０Ｌにより検出可能であることも明らかにされており（Kopf et al., Immunity. 1999 Dec;11(6):699-708）、これはＴ細胞がＯＸ４０Ｌを発現している可能性があることを示している。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、自己免疫疾患モデル非ヒト哺乳動物及びその利用、詳しくはＯＸ４０Ｌ遺伝子を導入した自己免疫疾患モデルトランスジェニック非ヒト哺乳動物、及びその自己免疫疾患治療薬のスクリーニングへの利用方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ｔ−ＡＰＣ細胞の相互作用を通じて共刺激を加える場合のＴＮＦファミリーメンバーの影響についての研究において、ＴＮＦファミリー分子の１つであるＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）を、T細胞で恒常的に発現するトランスジェニックマウスを作成したところ、これらのマウスが自己免疫疾患を発症し、自己免疫疾患モデルとして有用であることを見い出し本発明をなした。
本発明の自己免疫疾患を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＯＸ４０Ｌ遺伝子を、Ｔ細胞特異的ｌｃｋプロモーター制御下のＯＸ４０ＬｃＤＮＡで構成されている発現プラスミドＤＮＡを用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に導入することによって作製することが出来る。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、間質性肺炎、炎症性腸炎、巨脾症若しくはリンパ腺症、又は高免疫グロブリン血症等の自己免疫疾患を発症し、これらの自己免疫疾患治療薬のスクリーニングに有効に利用することができる。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）ＯＸ４０Ｌ遺伝子をＴ細胞特異的ｌｃｋプロモーターの下流に組み込んだＯＸ４０Ｌ発現ベクターを、マウスの受精卵に導入し、該マウスをＣ５７ＢＬ／６系マウスに戻し交配した、ＯＸ４０ＬをＴ細胞で恒常的に発現している、間質性肺炎及び炎症性腸炎を自然発症するトランスジェニックマウスの間質性肺炎又は炎症性腸炎のモデル動物としての使用方法からなる。
【００１２】
また本発明は、（２）ＯＸ４０Ｌ遺伝子が、配列番号１に示されるＤＮＡ配列からなることを特徴とする上記（１）記載の使用方法からなる。
【００１３】
さらに、本発明は、（３）炎症性腸炎が、腸基底膜における中程度から重度のリンパ系組織の過形成、基底膜における粘膜上皮の過形成、リンパ球の浸潤又は粘膜下リンパ濾胞の増生を発症していることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の使用方法や、（４）戻し交配を、少なくても１２世代行うことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の使用方法からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）を、T細胞で恒常的に発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためには、適宜の非ヒト哺乳動物を用いることができるが、自己免疫疾患治療薬のスクリーニング等に有効に利用するためには、マウスを用いるのが好ましい。トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのマウスとしては、種々のものが利用できるが、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２などが挙げられる。ＯＸ４０ＬｃＤＮＡで構成された発現ベクターを、例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１受精卵に導入することにより、トランスジェニックマウスを作製することができる。ＯＸ４０Ｌ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスは、遺伝子が導入されていることが確認されたＦ１マウスを親のマウスと戻し交配し、導入された遺伝子の純化を図る。本発明においては、例えば親のマウスのＣ５７ＢＬ／６を背景に少なくとも１２世代の戻し交配が行われる。
【００１５】
本発明で用いるＯＸ４０Ｌ遺伝子は、公知のものであり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１２７６３として登録されている。ＯＸ４０Ｌ遺伝子の導入に用いる発現ベクターとしては、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターに用いるプロモーターとしては、ＯＸ４０ＬをＴ細胞において恒常的に発現する機能を有するベクターであれば、適宜のプロモーターを用いることができるが、好適なプロモーターとして、Ｔ細胞特異的ｌｃｋプロモーターを例示することができる。
【００１６】
本発明のＯＸ４０Ｌ遺伝子を導入した自己免疫疾患モデルトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、自己免疫疾患治療薬のスクリーニングに利用することができる。
かかるスクリーニング方法としては、例えば、自己免疫疾患を発生したモデルマウスに被検物質を投与し、該モデルマウスにおける自己免疫疾患の病徴を評価・測定することにより行うことができる。自己免疫疾患の病徴を評価・測定する方法としては、被検物質を投与されたマウスから病理組織を採取し、該組織像を解析・評価する方法を例示することができる。又、自己免疫疾患の病徴の発生及び／又は進行の程度を測定・評価するに際しては、自己免疫疾患発生のモデルマウスと同種の野生型マウスを同時に用いることが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法により得られる自己免疫疾患の治療剤は、自己免疫疾患として発症する、間質性肺炎、炎症性腸炎、巨脾症若しくはリンパ腺症、又は高免疫グロブリン血症等の治療に有効に適用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの作製）
ＯＸ４０Ｌトランスジェニック（ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ）マウスを、マウスＯＸ４０リガンドをコードする発現プラスミドＤＮＡの前核注入により作製した。かかるマウスＯＸ４０Ｌ発現ベクターの構築物は、Ｔ細胞特異的ｌｃｋプロモーターの制御下にマウスＯＸ４０Ｌ ｃＤＮＡが構成されていた（図１Ａ）。ＯＸ４０Ｌ発現プラスミドＤＮＡを注入したＦ１受精卵（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）を用いて３匹の初代マウスを作製し、それらをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。フローサイトメトリー分析により、３匹のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ系統マウス由来の胸腺細胞群にはＯＸ４０Ｌの発現が同様に見られたが、野生型マウス由来のものではかかる発現が見られないことがわかった（図１Ｂ）。３匹のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ系統マウスのうち２匹のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ（ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１及びＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２）マウスでは、脾臓細胞においてかなりのＯＸ４０Ｌを発現していたが、残りの１匹のマウス（ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ３）においては、ＯＸ４０Ｌの弱い発現が見られるにとどまっていた（図１Ｂ）。そこで、これら３系統のトランスジェニックマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスと少なくとも１２回戻し交配した。
【００１９】
実施例２（ＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるＴ細胞の自発的活性化）
まず、ＯＸ４０Ｌ導入遺伝子が結果として、胸腺、脾臓、及びリンパ節におけるリンパ球細胞群のすべてにおいて、なんらかの内因性変化をもたらすかどうかをフローサイトメトリーを用いて調べてみた。ＣＤ４+及びＣＤ８+発現により調査した、胸腺Ｔ細胞数及び部分母群については、３匹のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ系統は見たところ異常を示さなかった。しかし、脾臓及びリンパ節における全リンパ球の数は、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス及びＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２マウスにおいてのみ、かなりの増加が示された。特にＣＤ４+Ｔ細胞は二倍に増加したが、ＣＤ８+Ｔ細胞では、これら２匹のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ系統においても検出されなかった（図２Ａ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ３の脾臓あるいはリンパ節におけるリンパ球の数的変化は、ごくわずか認められたに過ぎなかった。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスにおけるＣＤ４+Ｔ細胞群の増加を考慮して、次にマウスが活性化表現型を持つＴ細胞を保持しているかどうかを調べた。活性化Ｔ細胞マーカーであるＣＤ２５やＣＤ６９を発現する細胞群は、野生型マウスとは対照的にＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス由来の脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞においてはかなり増加していた（図２Ｂ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２マウスを用いた場合でも、同様の結果が得られた。これらのことから、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスでは多くのＣＤ４+Ｔ細胞が自発的に活性化されていることがわかった。Ｂ細胞群では、脾臓におけるＩｇＭ+又はＢ２２０+Ｂ細胞数が、導入遺伝子ＯＸ４０Ｌによって増加することはほとんどなかった。
【００２０】
ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０システムは記憶Ｔ細胞の生存及び維持に関与しているとの報告があるため（Gramaglia et al.,1998, J.Immunol.,161,6510及び 2000, J.Immunol.,165,3043）、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス中の記憶Ｔ細胞群を評価し、野生型マウス及びＯＸ４０Ｌ欠損マウス（Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）の場合と比較した。その結果、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウス由来の記憶Ｔ細胞では、ＣＤ４４の発現が増加し、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＢの発現が減少していた。ＣＤ６２ＬlowＣＤ４４high及びＣＤ４５ＲＢlowの記憶Ｔ細胞の割合（％）及び数は、野生型マウスと比較して、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞でかなり増加していたが、ＯＸ４０Ｌ欠損マウスでは減少していることがわかった（図３Ａ及びＢ）。野生型マウスに認められた年齢依存的なＴ細胞の増加は、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスでは見られなかった。記憶Ｔ細胞の数的増加は、これらのマウスにおいて早くも４週齢で認められ、この持続的な増加は年齢依存的なものではないことが示された（図３Ａ）。これらのことから、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおける記憶細胞の出現促進が明らかになった。次に、抗原投与後のこれらマウスにおけるサイトカイン産生量を測定してみた。その結果、ナイーブＴ細胞及び記憶Ｔ細胞の機能解析を行った。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス又は野生型マウス由来のナイーブ（ＣＤ６２ＬhighＣＤ４４low）ＣＤ４+Ｔ細胞若しくは（ＣＤ６２ＬlowＣＤ４４high）ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激した。その後、免疫染色により、細胞質ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＩＬ−４を検出した。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス由来のものは、ＩＬ−２陽性細胞群、ＩＦＮγ陽性細胞群及びＩＬ−４陽性細胞群のすべてに関して、記憶Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞の両方で、野生型マウス由来のものよりも大きな増加を示しており（図３C）、これは、ＯＸ４０陽性ＣＤ４+Ｔ細胞が、インビボでも表現型を活性化する傾向にあることを示している。脾臓Ｔ細胞のＶβを使用してさらに解析することで、かかる記憶Ｔ細胞の増加を確認した。これらの結果により、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇの末梢Ｔ細胞の大半が活性化状態及び記憶状態にあることがわかった。
【００２１】
実施例３（ＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるＴ細胞活性化の増大）
ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける記憶Ｔ細胞の機能的能力を調べるため、Ｔ細胞の、各種刺激に反応した増殖能力及びサイトカイン産生能を測定するいくつかの実験を行った。まず、免疫していない野生型マウス及びＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス由来の脾臓Ｔ細胞に関して、抗ＣＤ３抗体、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、又はイオノマイシンを加えたホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による増殖反応について調べてみた。これらの刺激のすべてに対して、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１のＴ細胞は、野生型Ｔ細胞よりもかなり高い増殖性反応を示した（図４Ａ）。抗ＣＤ３抗体で刺激されたＴ細胞のサイトカイン産生能も、免疫染色で確認することができた。ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０をそれぞれ産生するＴ細胞群は、野生型マウスよりＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおいてかなり増加していることが示された（図４Ｂ）。
【００２２】
次に、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス及び野生型マウス由来のＴ細胞について、抗原特異的リコール増殖アッセイを行った。上記Ｔ細胞はどちらもインビボにおいて、完全フロイントアジュバントによるスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）で処理した。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスのＴ細胞は、野生型マウスよりもかなり大きな増殖反応を示した（図４Ｃ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスのＴ細胞からのＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０等のすべてのサイトカイン産生も、野生型マウスと比較してかなり増大していることがわかった（図４Ｄ）。これらの結果は、ＭＯＧ刺激による、本発明者らの以前の報告（Ndhlovu et al.,2001, J.Immunol.,167,2991）と一致するものであり、ＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスのＴ細胞が野生型マウスのものよりも効率的に抗原と反応することを示している。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおける記憶Ｔ細胞の増加についてさらに調べるため、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス及び野生型マウスのＴ細胞について、インビボでの生存能を比較した。Ｔ細胞のインビボでの生存能を、Ｖβ３を発現するＴ細胞を活性化するＳＥＡと細胞死誘導活性阻害物質として知られるＬＰＳとを接種したマウスを用いて分析した（Maxwell et al.,2000, J.Immunol.,164,107）。Ｖβ３を発現するＣＤ４+Ｔ細胞の減少は、野生型と比較してＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスではかなり少なく（図４Ｅ）、これは、Ｔ細胞上のＯＸ４０Ｌの発現が、インビボにおけるＴ細胞死誘導活性の抑制に関わっていることを示している。
【００２３】
実施例４（ＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるポリクローナルＢ細胞活性化）
ＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおいてＢ細胞数の増加は認められなかったが、Ｂ細胞がインビボにおいて活性化されているかどうかを調べるために、血清免疫グロブリンアイソタイプの濃度を測定した。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスは野生型マウスと比較してＩｇＧ１は１０倍、ＩｇＥは２２倍、ＩｇＡは２５倍というレベルの上昇を示したが、その一方、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂの増加は少なく、それぞれＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの血清中で３倍、４倍、４倍であった。また、ＩｇＧ３のレベルについては、野生型マウスよりもＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの血清のほうが高いということはなかった（図５Ａ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスに見られるこのような偏ったＩｇアイソタイプの産生は、上述したようにそのＴ細胞のサイトカイン分泌レベルの上昇により説明ができる。また、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対する血清抗ＤＮＡ抗体レベルがかなり増大したことが、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの血清において確認された（図５Ｃ）。以上の結果から、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスがＢ細胞のポリクローナル抗体を活性化し、自己免疫の産生につながったことがわかる。さらに、マウスにおける各種サイトカインの血清レベルを分析した。ＩＬ−５とＩＬ−１３のレベルは、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの血清では、野生型マウスと比較してかなり上昇していたが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＩＦＮγなどその他のサイトカインは、ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスと野生型マウスのどちらにおいても検出できなかった（図５Ｂ）。ＩＬ−５は、本発明者らが観察したＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける血清ＩｇＡレベルの上昇に関与し、その原因となっていると思われる。
【００２４】
実施例５（ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける自己免疫炎症性疾患の発生）
組織学的測定により、ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの各器官に自己免疫的徴候が現れていることがわかった。月齢９ヶ月のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスの肺において、気管支及び血管周縁部にはリンパ球の著しい浸潤が、肺胞には多数の好酸性泡沫細胞を含んだコレステリン様結晶が認められ、重度の間質性肺炎を起こしていた（図６Ａ；参考写真１参照）。間質性肺炎は、生後３ヶ月という早い時期にＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスとＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２マウスの双方で認められ（表１）、間質性肺炎の発生が年齢依存的である可能性を示唆された。
【００２５】
【表１】
0003926596.tif 000002
【００２６】
腸組織の分析により、ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの炎症性腸炎が明らかになった。月齢９ヶ月のＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスにおいて、腸基底膜における中〜重度のリンパ組織の過形成、基底膜における粘膜上皮の過形成、リンパ球の浸潤及び粘膜下リンパ濾胞の増殖が認められた（図６Ａ）。こうした炎症性腸炎は、生後わずか３ヶ月でＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウスとＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２マウスの双方で観察された（表１）。
【００２７】
巨脾症及びリンパ腺症がＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスに認められた。そのリンパ節では形質細胞の増加とラッセル小体の形成が見られた。ラッセル小体は形質細胞における好酸性細胞内沈着物、及び抗体の産生異常を反映しており、よく高免疫グロブリン血症を併発する（図６Ａ）。心臓、腎臓、肝臓などのＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスのその他の組織は、組織学的に正常であり、尿中にはブドウ糖及び蛋白質が存在せず、腎臓あるいは膵臓の機能不全を示す証拠は見られなかった。
【００２８】
実施例６（ＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスのＣＤ４+Ｔ細胞の導入による、ＲＡＧ−２欠損マウスにおける自己免疫疾患の誘導）
ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスの間質性肺炎が感染性物質によるものではないことを確認するため、かかるマウスのＳＰＦ状況を確認する多くの実験を行った。マウスの肺炎や腸炎が伝染性の微生物によってもたらされたという証拠は発見できなかった。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおいて病原性自己反応性Ｔ細胞が発生しているかどうかを調べるため、Ｔ細胞及びＢ細胞を欠損したＣ５７ＢＬ／６ ＲＡＧ−２欠損マウスにＴｇマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞の移入を行った。ＲＡＧ−２欠損マウスは、ＣＤ４+Ｔ細胞においては、接種の三週間後にまず体重減少及び下痢様症状を示したが、ＣＤ８+Ｔ細胞においては何も示されなかった（表１）。ＣＤ４+Ｔ細胞移入の２週間後から４週間後の組織学的分析で、重度のリンパ球性間質性肺炎及び大腸の炎症性腸炎が認められた（図７Ａ；参考写真２参照）。野生型マウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞のどちらを接種した場合でも、ＲＡＧ−２欠損マウスにおいては自己免疫は発生していなかった。これらの結果により、ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞は、ＲＡＧ−２欠損マウスにおける自己免疫疾患の誘導に関する重要なエフェクター細胞であることがわかる。かかる細胞を移入されたＲＡＧ−２欠損マウスのＣＤ４+Ｔ細胞は、ＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスのＣＤ４+Ｔ細胞と同様に高レベルのＩＬ−５及びＩＬ−１３を分泌していた。マウスＯＸ４０Ｌに対して特異的に阻害するモノクローナル抗体であるＭＧＰ３４の投与、及びＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスからＲＡＧ−２欠損マウスへのＣＤ４+Ｔ細胞移入により、肺及び大腸での自己免疫疾患の誘導が阻害された（図７Ｂ；参考写真２参照）。これらの結果から、リンパ球性間質性肺炎及び大腸の炎症性腸炎の発生には、Ｔ細胞におけるＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用が必要とされることがわかった。
【００２９】
評価
数種のＴＮＦファミリーメンバー間での発現の変化によりリンパ球の反応が変化することは立証されている。Ｆａｓ又はそのリガンドであるＦａｓリガンドが存在していない場合には重篤な自己免疫疾患が発生する（Watanabe-Fukunaga et al.,1992, Nature, 356,314;Takahashi et al., 1994, Cell, 76,969）。また、ＣＤ３０リガンドは自己免疫性糖尿病を予防する働きがあると考えられている。逆に、ＢＡＦＦ又はＣＤ４０リガンドの発現増加はそれぞれ、顕著な自己免疫や炎症の発生につながる（Mackaw et al.,1999, J.Exp.Med., 190,1697; Mehling et al., 2001, J.Exp.Med., 194,615）。本実施例により示された結果から、ＯＸ４０の刺激が自己免疫抗体を分泌させ、肺及び大腸に炎症性の浸潤を発生させることが、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用によって明らかになった。
【００３０】
本発明者らは、当初ＯＸ４０Ｌ（ヒトｇｐ３４）がヒトＴ細胞白血病ウィルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＴａｘ遺伝子により誘導される分子として同定しているが（Miura et al., 1991, Mol.Cell. Biol., 11,1313）、培養された正常ヒトＴ細胞クローンがＯＸ４０Ｌを発現することから、同様にＯＸ４０シグナリングに関与する、Ｔ細胞上で過剰発現しているＯＸ４０Ｌの免疫的因果関係の調査に着手した。本発明者らは、ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの脾臓Ｔ細胞及びリンパ節Ｔ細胞が高レベルでＣＤ６９及びＣＤ２５を発現し、６０％を超えるＣＤ４+Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌlow、ＣＤ４４high及びＣＤ４５ＲＢlowであることを見い出した。このことから、これらのＴ細胞群が活性化記憶表現型であることを示唆される。これらＴ細胞をさらに分析した結果、興味深いことに、Ｔ細胞の記憶表現型への転換が年齢依存性ではないことを見い出し、また、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウス由来の記憶Ｔ細胞が、野生型マウスの場合と比較すると、刺激後リコールサイトカイン反応の増大とともに抗原依存型反応を増強させることがわかった。こうした初期の知見は、エフェクター記憶Ｔ細胞反応（ＥＡＥその他）の持続によるＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの役割を明確にする上での以前の疑問点と一致するものであった。また、スーパー抗原に刺激された末梢Ｔ細胞の長い生存期間は、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおいてさらに長くなることがわかった（図４Ｅ）。ＯＸ４０による刺激は、ＳＥＡとＬＰＳによる刺激の後で初期増加と持続性の増強を引き起こす（Maxwell et al., 2000. J.Immunol., 164,107）。一次的なポリクローナル拡張の調節により、ＯＸ４０の自発的な刺激がＴ細胞の記憶の抗原依存的形成を増強することが明らかになった。本実施例による結果から、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナリングが記憶Ｔ細胞群のインビボでの保全と生存に関与していることが明らかになった。
【００３１】
ＯＸ４０は、リウマチ性関節炎、ＧＶＨＤ、ループス腎炎などの自己免疫疾患患者及び多発性硬化症やＥＡＥのモデルマウスの自己反応性Ｔ細胞に発現すると報告されている（Weinberg et al., 1999, J.Immunol.,162, 1818; Tittle et al., 1997, Blood, 89,4652; Stuber et al., 1998, Gastroenterology, 115, 1205; Higgins et al., 1999, J.Immunol.,162, 486）。加えて、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナリングを消滅させる可溶性ＯＸ４０融合蛋白質（ＯＸ４０Ｌのアンタゴニスト）は、進行中のＥＡＥ（Weinberg et al., 1999, J.Immunol.,162, 1818;Ndhlovu et al., 2001, J.Immunol.,167, 2991）、半同種異系の宿主対移植片病（ＧＶＨＤ）（Stuber et al., 1998, Gastroenterology, 115, 1205）を抑制し、炎症性腸炎モデルマウスにおいて進行中の大腸炎（ＩＢＤ）（Higgins et al., 1999, J.Immunol.,162, 486）を改善することが記されている。上記結果から、各種自己免疫疾患の免疫調節にＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用が非常に重要な役割を果たしていることが考えられる。かかるトランスジェニックマウスの組織学的測定において予想外の発見だったのは、肺及び大腸において炎症性疾患の発生であった。Ｔｇマウスの肺の間質性組織及び腸基底膜において、ＣＤ４+Ｔ細胞については著しい浸潤が観察されたが、ＣＤ８+Ｔ細胞については観察されなかった（図６Ｂ；参考写真１参照）。これらマウスの自己免疫疾患の発生原因因子について調査した。ＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスからＲＡＧ−２欠損マウスへのＣＤ４+Ｔ細胞の再構築によって間質性肺炎及び炎症性腸炎が発生しており、これはＣＤ４+Ｔ細胞が重要なエフェクター細胞であることを示している。ＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスからＲＡＧ−２欠損マウスへのＣＤ４+Ｔ細胞移入に伴い、マウスＯＸ４０Ｌ対して特異的に阻害するモノクローナル抗体ＭＧＰ３４を投与し、以前肺に認められた組織学的変化を予防した（図７Ｂ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおける間質性肺炎の症状は、ヒトのリンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）の組織学的特徴と同様である。興味深いことに、肺の異常は、ヒトＴ細胞白血病ウィルスタイプ１（ＨＴＬＶ−１）関連ミエロパシー（ＨＡＭ／ＴＳＰ）やＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎の患者や、ＨＴＬＶ−１患者において認められた（Sugimoto et al., 1987, Lancet, 2,1220; Maruyama et al., 1989, Medical Immunil., 18,763; Setoguchi et al., 1991, Am. Rev.Res.Dis. 144, 1361; Sugimoto et al., 1997, 日本胸部臨床, 35,184; Sugisaki et al.,1998,  Am. J. Trop. Med. Hyg, 58,721）。ＯＸ４０Ｌの発現に関しては、当初ＨＴＬＶ−１感染ヒトＴ細胞株に関するものが記載され（Tanaka et al., 1985,Int.J.Cancer,36,549; Miura et al., 1991, Mol.Cell.Biol.11,1313）、最近、EBウイルス感染B細胞株に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球クローンに関するものが発見されている（Takasawa et al., 2001, Jpn.J.Cancer Res., 92,377）。ＯＸ４０Ｌの発現は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌにおける役割をＴ細胞間の相互作用を介して示唆するものであり、これら患者に見られる肺疾患の発生に関与している。そのためこれらのマウスは間質性肺炎のモデルマウスとして有用である。
【００３２】
炎症性腸炎（クローン病及び潰瘍性大腸炎）患者の大腸及び空腸におけるＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの発現はすでに知られている。Higginsらは、ＯＸ４０ＬをＯＸ４０−ＩｇＧ融合蛋白質で阻害すると、ハプテン誘導性大腸炎の症状あるいは特発性大腸炎を患ったＩＬ−２ノックアウトマウスの症状が改善することを示した。ハプテン誘導性大腸炎は、ヒト炎症性大腸炎のモデルとしてよく使用される。大腸炎の誘導についてのハプテンの直接的影響を否定することはできないが、このモデルではヒトの炎症性腸炎の病原を示すのは不可能である。
【００３３】
ＩＬ−２-/-マウス、ＩＬ−２Ｒα-/-マウス、ＩＬ−１０-/-マウス、ＴＧＦβ１-/-マウス、ＴＣＲα-/-マウス、Ｇαｉ２-/-マウス、ヒトＣＤ３ε遺伝子に対してトランスジェニックであるＴ細胞再構築ｔｇε２６マウス、ＩＬ−７ＴｇマウスＣ．Ｂ−１７ｓｃｉｄマウスなどその他のモデルマウスには、炎症性腸炎が発生する（Sadlack B. et al., 1993、Cell, 75, 253; Kuhn R. et al., 1993,Cell, 75,263; Mombaerts P et al., 1993, Cell, 75,275; Rudolph U et al., 1995, Nat. Genet. 10,143; Hollander GA et al.,1995Immunity, 3,27; Watanabe et al., 1998, J.Exp.Med.,187,389; Sundberg JP., 1994, Gastroenterology, 107,1726; Powrie F et al., 1993, Int. Immunol.,5,1461）。炎症性腸炎は免疫制御の不良による結果であり、かかる疾患は主にＣＤ４+Ｔ細胞の活性化により仲介される。マウスの自然発症性大腸炎の発生にＣＤ４+Ｔ細胞が重要な役割を果たすことが、本発明者らが今回得た結果によって確認されている。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスにおける炎症性腸炎の自発的発生によって、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用が炎症性腸炎の病因に関与している可能性が明らかになり、胃腸管疾患の免疫療法における実現可能な目標がもたらされることとなった。
【００３４】
Ｔｇマウスに見られる自己免疫の基礎的機構と考えられるものは、アゴニストのＯＸ４０抗体がＴ細胞の寛容を破壊できると示した近年の研究によって説明がつくだろうが、サイトカインの役割は、未だに解明されていない。自然発症性肺炎や腸炎を患ったＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスは、血清中のＴｈ−２サイトカイン、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のレベルが上昇していた（図５Ｃ）。ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞を再構築したＲａｇ−２欠損マウスにも、同様のサイトカインの上昇が認められた。ＯＸ４０Ｌ−ＴｇマウスはＴｈ−２ドミナントであることがわかった。Ｔｈ−１／Ｔｈ−２サイトカインの間質性肺炎の発生への関与が示唆されている。ＩＬ−４トランスジェニックマウス及びＩＬ−１３トランスジェニックマウスは、肺の単核細胞、気道上皮の肥厚、粘液分泌過多及び杯状細胞の過形成を特徴とする炎症性の反応を引き起こす（Zhu et al.,1999, J. Clin. Inv. 103, 779）。気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５は、肺炎患者において高いレベルを示した（Taniguchi et al., 2000, Eur. Respir.J., 16, 959）。ＩＬ−１３及びＩＬ−５マウスの高い産生は、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスの間質性肺炎の発生に直接関与している場合がある。ＣＤ４ＴｇＴリンパ球をＲａｇ−２欠損マウスに移入することにより、リンパ球性間質性肺炎及び大腸の炎症性腸炎を誘導することが可能になり、これがＣＤ４+Ｔ細胞依存物質に仲介された疾患であることを示している。
【００３５】
近年、ＯＸ４０はＴ細胞を活性化できる主要な共刺激分子として強調されている。ＯＸ４０欠損マウスあるいはＯＸ４０Ｌ欠損マウスは、インビボでの強いＣＤ４+Ｔ細胞反応をサポートできなかった（Chen et al., 1999, Immunity, 11,689; Pippig et al., 1999, J.Immunol., 163,652; Murata et al.,2000, J.Exp.Med., 191, 365）。また、ＯＸ４０Ｌ欠損マウスに抗原を与えたところ、抗原提示細胞機能が欠失しているのが認められた（Murata et al., 2000, J.Exp.Med., 191, 365）。これらのデータから、インビボにおけるＴ−ＡＰＣ相互作用にＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用が不可欠であることがわかった。本発明者らは、Ｔ細胞上にＯＸ４０Ｌの構成性発現を示すマウスを作製してＯＸ４０を恒常的に刺激し、最終的には器官特異的自己免疫疾患となる一連の事象に至る、Ｔ細胞の記憶発生におけるＯＸ４０Ｌのさらなる重要性を明らかにした。
【００３６】
方法１（ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスの作製）
Ｔ細胞系特異的ベクターp1017（ｌｃｋプロモーターにヒト成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナルが組み込まれたベクター；Perlmuttaerから供与された）に、マウスＯＸ４０リガンドをコードするｃＤＮＡを導入した。かかる導入遺伝子をＦ１受精卵（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植することによって仔マウスを産生させた。得られた仔マウスの中から、上記導入遺伝子を有する初代マウスをＰＣＲにより同定し、さらなる実験のため、かかる初代マウスをＣ５７ＢＬ／６系統マウスと少なくとも１２回戻し交配した。なお、マウス受精卵の注入に先立ち、マウスの培養細胞に上記遺伝子を導入することにより能力を確認した。エレクトロポレーション法を用いてかかる導入遺伝子をＴ細胞系に導入したところ、高いレベルの表面ＯＸ４０リガンド蛋白質が検出された。
【００３７】
方法２（ＦＡＣＳ分析）
Ｆｃレセプターに結合するものを含む細胞群の中から、標識モノクローナル抗体に非特異的に会合する細胞を取り除くために正常ラット血清を用いてプレインキュベーションした後、標識モノクローナル抗体を用いて４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、試料を洗浄してFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson社製）で分析した。分析には、CELLquest（Becton Dickinson社製）分析ソフトウェアを使用した。ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２５、ＣＤ６９、Ｂ２２０、ＩｇＭ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮγは、Pharmingen社から購入した。上記により確立された細胞におけるマウスＯＸ４０Ｌに特異的なＭＧＰ３４（ＩｇＧ２ｃ）、及びマウスＯＸ４０に特異的なＭＯＸ４０（ＩｇＧ１）を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce Chemical Co.社製）と結合させた。ビオチン化モノクローナル抗体で標識した細胞をストレプトアビジン−ＡＰＣ（Pharmingen社製）で視覚化し、フローサイトメトリー分析にかけた。ＯＸ４０Ｌ又はＯＸ４０のネガティブコントロールに対しては、標識されていないＭＧＰ３４及びＭＯＸ４０をそれぞれ用いて上記細胞をプレインキュベーションし、ビオチン化抗体により特異的に染色したものを無効にした。
【００３８】
細胞内サイトカイン染色のため、脾臓あるいはリンパ節細胞の単細胞懸濁液を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma社製）及び１μＭのイオノマイシン（Sigma社製）で２時間刺激した後、Gorgi Stop（Pharmingen社製）を添加してさらに２時間培養した。刺激後、細胞をＡＰＣ標識ＣＤ４又はＣＤ８で染色し、続いてかかる細胞を固定し、Cytofix/Cytoperm kit（Pharmingen社製）で浸透処理した後、製造者のプロトコールに従ってＰＥ標識抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＬ−４抗体あるいは抗ＩＦＮ−γ抗体を用いて、製造者が推奨する方法で染色した。
【００３９】
方法３（細胞の精製及び培養）
磁気ビーズで濃縮した、又はAuto MACS（Miltenyi Biotec社製）で分別した脾臓細胞若しくはリンパ節細胞から、ＣＤ４+Ｔ細胞あるいはＣＤ８+Ｔ細胞を濃縮した。６週齢の野生型マウス又はＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウスから得られたＴ細胞（１ｘ１０5）を培地のみで、又はＴ細胞を増殖させるために、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加したＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、又は固定化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加した培地にてそれぞれ４８時間培養し、各3Ｈチミジンの摂取量を分析した。
【００４０】
方法４（インビボにおける蛋白質抗原刺激によるＴ細胞のプライミング反応及びリコール反応）
ＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス又は同腹子の野生型マウスに対して、１００μｇのＫＬＨを完全フロイントアジュバントとともに、それぞれの後肢の肉趾に注射して免疫した。９日後、リンパ節細胞を図に記載の濃度のＫＬＨとともに３７℃で３日間インキュベーションした。一方、リンパ節から精製したＣＤ４+Ｔ細胞を、ＫＬＨを用いてＡＰＣの存在下で同様に刺激した。かかるＡＰＣは、野生型同腹子の脾臓から単離し、放射線（３，０００ｒａｄ）で処理したものを用いた。上記培養した細胞を、文献（Takeshita et al., 1989. J.Exp.Med., 169, 1323; Nagata et al., 1999, J.Immunol.,162,1278）記載の方法と同様に、インビトロでＫＬＨに対する反応における3Ｈチミジンの取り込みやサイトカイン産生について分析した。サイトカイン産生においては、２度目のＫＬＨの添加から、ＩＬ−２又はＩＬ−４に関しては４８時間後に、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＩＦＮγに関しては９６時間後に培養液の上澄を回収した。かかる上澄をＥＬＩＳＡにそれぞれかけ、サイトカイン産生を測定した。
【００４１】
方法５（ＥＬＩＳＡ）
組織培養の上澄液又はマウス血清中のサイトカインレベルを、製造者のプロトコールに基づき、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はＩＦＮγ（Pharmingen社製）に対する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【００４２】
方法６（免疫グロブリンの分泌）
マウス血清中の各種免疫グロブリンサブクラスのレベルを分析した。１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を含んだ炭酸緩衝液で、ＥＬＩＳＡマイクロプレートの各ウェルを４℃で１晩インキュベーションすることによりコートした。プレートを洗浄した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳでヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を３７℃で１時間ブロックした。１％のＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した、ＯＸ４０Ｌ−Ｔｇマウス由来又は野生型マウス由来の血清をウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。その後プレートを洗浄した後、インキュベーションにより検出された抗体を、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）（Southern Biotechnology Associates社製）が結合したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＡ抗体と結合させ、１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＡＰ基質（Sigma Chemical社製）を含むジエタノールアミン緩衝液を用いて染色し、３ＭのＮａＯＨにより反応を停止させて、かかる溶液をＯＤ４０５ｎｍで評価した。
【００４３】
方法７（組織学的及び免疫組織化学的分析）
動物から得られた組織を１０％の緩衝ホルマリン（Sigma社製）で固定し、パラフィン包埋し、常法により、５マイクロメーター切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。かかる組織サンプルを、ＯＣＴコンパウンドで包埋して凍結し、又は液体窒素により凍結し、−８０℃で保管した。その後、製造者のプロトコールに従って、抗マウスＣＤ４抗体（H129.19、Becton Dickinson社製）及び抗マウスＣＤ８抗体（53-6.7、Becton Dickinson社製）ならびにFITC 標識抗ラットIgG抗体（生化学工業社製）を用いて免疫組織化学染色を行った。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＯＸ４０リガンドをT細胞で恒常的に発現し、自己免疫疾患を発症するので、自己免疫疾患モデルとして有用である。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、自己免疫疾患治療薬のスクリーニングに有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるＯＸ４０Ｌの構築物とその発現を示す図である。
Ａ．マウスＯＸ４０Ｌの発現ベクターの構築物は、Ｔ細胞特異的ｌｃｋプロモーターによって制御されるマウスＯＸ４０ＬのｃＤＮＡとして構成されている。
Ｂ．作製した３匹の独立した初代マウス又は野生型マウスの胸腺又は脾臓におけるＯＸ４０Ｌの発現をフローサイトメトリック分析により調べた結果を示す図である。小さい点線は野生型マウス由来のものを、太線はＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ１マウス由来のものを、細線はＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ２マウス由来のものを、大きい点線はＯＸ４０Ｌ−Ｔｇ３マウス由来のものをそれぞれ示す。
【図２】本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの表現型を示す図である。
Ａ．野生型マウス（□）及びＯＸ４０ＬＴｇマウス（■）の脾臓における全細胞数、ＣＤ４+Ｔ細胞数及びＣＤ８+Ｔ細胞数をそれぞれ示す。
Ｂ．脾臓のＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＤ２５又はＣＤ６９の発現を示す。
【図３】本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける記憶Ｔ細胞群及び細胞質サイトカインを示す図である。
Ａ及びＢ．記憶Ｔ細胞には、ＣＤ４４の発現増大並びにＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＢの発現減少という特徴があった。
Ｃ．ナイーブ（ＣＤ６２ＬhighＣＤ４４low）ＣＤ４+Ｔ細胞及び記憶（ＣＤ６２ＬlowＣＤ４４high）ＣＤ４+Ｔ細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激し、その後、染色により、細胞質ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＩＬ−４を検出した。
【図４】本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける増殖Ｔ細胞の活性化を示す図である。
Ａ．抗ＣＤ3抗体、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、及びイオノマイシンを添加したホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）に対する野生型マウス由来の脾臓Ｔ細胞（□）及びＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス（■）の増殖反応を調べた結果を示す。
Ｂ．抗ＣＤ３抗体を用いて刺激したＴ細胞のサイトカイン産生量を調べた結果を示す。
Ｃ．野生型マウス（□）又はＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス（■）の脾臓Ｔ細胞を抗原（ＫＬＨ）特異的リコール増殖結果を示す。
Ｄ．ＫＬＨでＴ細胞を刺激した際のサイトカイン産生能を示す。
Ｅ．ＳＥＡ及び／又はＬＰＳを注入したマウスを用いて、インビボにおいてＴ細胞が生存できるか否かを調べた結果を示す。ＳＥＡを野生型（○）及びＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス（●）に注入し、ＬＰＳとＳＥＡを野生型マウス（□）及びＯＸ４０ＬＴランスジェニックマウス（■）に注入した。
【図５】本発明のＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるポリクローナルなＢ細胞活性化を示す図である。
Ａ．図中の「○」は野生型マウスにおける血清イムノグロブリンアイソタイプの濃度を、「●」はＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける血清免疫イムノグロブリンアイソタイプの濃度をそれぞれ示す。
Ｂ．図中の「○」は野生型マウスにおけるｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡに対する血清抗ＤＮＡ抗体のレベルを、「●」はＯＸ４０ＬトランスジェニックマウスにおけるｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡに対する血清抗ＤＮＡ抗体のレベルをそれぞれ示す。
Ｃ．図中の「○」は野生型マウスにおける血清ＩＬ−５又はＩＬ−１３のレベルを、「●」はＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスにおける血清ＩＬ−５又はＩＬ−１３のレベルを示す図である。
【図６】本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス及び野生型マウスの肺、大腸、及びリンパ節をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果（Ａ）、及び本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスの肺及び大腸におけるＣＤ４+細胞又はＣＤ８+細胞を蛍光顕微鏡により視覚化した結果（Ｂ）を示す図である。
Ａ．図上は肺の切片を２００倍に、図中は大腸の切片を1００倍に、図下はリンパ腺の切片を１０００倍にそれぞれ拡大したものである。
Ｂ．図上は肺を４００倍に、図下は大腸を２００倍にそれぞれ拡大したものである。
【図７】本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞を移入したｒａｇ−２欠損マウスにおける肺切片及び大腸切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果（Ａ）、及び本発明のＯＸ４０Ｌトランスジェニックマウスをラット免疫グロブリン又はＭＧＰ３４モノクローナル抗体で処理した後、かかるマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞を移入したｒａｇ−２欠損マウスにおける肺切片及び大腸切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果（Ｂ）を示す図である。
Ａ．図中の肺切片は２００倍に、大腸切片は１００倍にそれぞれ拡大したものである。
Ｂ．図中の肺切片は２００倍に、大腸切片は１００倍にそれぞれ拡大したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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