(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端ドメイン、コイルドコイルドメインおよびフィブリノーゲン様ドメイン含むキメラTIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子であって、該ドメインのうちの少なくとも2つが、TIE-2 Ligand１、TIE-2 Ligand２、TIE-2 Ligand３およびTIE-2 Ligand４から選択される種々のTIE-2リガンドに由来する、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項1に記載の核酸分子であって、該核酸分子はキメラTIE-2リガンドをコードし、ここで、前記N末端ドメイン、コイルドコイルドメインおよびフィブリノーゲン様ドメインは、TIE-2 Ligand１由来およびTIE-2 Ligand２由来である、核酸分子。
【請求項３】
TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合しかつ該TIE-2レセプターを活性化するキメラTIE-2リガンドをコードする、請求項２に記載の核酸分子であって、TIE-2リガンド１のＮ末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のＮ末端ドメインをコードするヌクレオチド配列により置換される、核酸分子。
【請求項４】
TIE-2リガンド１のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列により置換される、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号２５に示されるヌクレオチド784〜786によりコードされるシステイン残基の代わりに別のアミノ酸をコードするように改変された、請求項３または４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記システイン残基の代わりにセリン残基がコードされるように改変される、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号２５に示されるヌクレオチド199〜201によりコードされるアルギニン残基の代わりに別のアミノ酸をコードするようにさらに改変されている、請求項５または６に記載の核酸分子。
【請求項８】
アルギニン残基の代わりにセリン残基がコードされるように改変されている、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するキメラTIE-2リガンドをコードする、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するキメラTIE-2リガンドをコードする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項１１】
TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合するが活性化しない改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子であって、TIE-2リガンド１のフィブリノーゲン様ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のフィブリノーゲン様ドメインをコードするヌクレオチド配列により置換されている、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１２】
TIE-2リガンド１のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列により置換されている、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するキメラTIE-2リガンド-2をコードする、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するキメラTIE-2リガンド-2をコードする、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされる、キメラTIE-2リガンド。
【請求項１６】
配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３または配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のキメラTIEリガンド。
【請求項１７】
配列番号２５に示される配列を有するがヌクレオチド784〜786によりコードされるシステイン残基の代わりに別のアミノ酸を有するように改変された、請求項１５に記載のキメラTIEリガンド。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１９】
前記核酸分子が、宿主細胞におけるその発現を指向し得る発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１８に記載のベクター、
【請求項２０】
プラスミドである、請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
宿主細胞および請求項１８、１９または２０のいずれか１項に記載のベクターを含む、請求項１５、１６または１７のいずれか１項に記載のキメラリガンドの産生のための宿主−ベクター系。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞である、請求項２１に記載の宿主−ベクター系。
【請求項２３】
請求項１５、１６または１７のいずれか１項に記載のリガンドを産生する方法であって、該方法は、リガンドの産生およびそのように産生されたリガンドの回収を可能にする条件下で、請求項２１または２２に記載の宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項１５、１６または１７のいずれか１項に記載のリガンドに特異的に１７結合し、かつネイティブのTIE-2リガンドに結合しない、抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項１５、１６または１７のいずれか１項に記載のリガンド、および該リガンドに結合した細胞傷害因子を含む、結合体。
【請求項２７】
前記細胞傷害性因子が放射性同位体または毒素である、請求項２６に記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1996年10月25日に出願された米国出願第08/740,223号、および1996年８月２日に出願された米国仮出願第60/022,999号の優先権を主張する。本出願を通して、種々の出版物が引用される。これらの出版物の開示の全てが、本出願中に参考として援用される。
緒言
本発明は、一般に遺伝子操作の分野に関し、そしてより詳細には、レセプターチロシンキナーゼおよびそれらの同族リガンドの遺伝子、組換えDNAベクターへのそれらの挿入、ならびに微生物のレシピエント株およびレシピエント真核生物細胞中におけるコードされるタンパク質の産生に関する。より詳細には、本発明は、TIE-2レセプターに結合する新規の改変TIE-2リガンド、ならびに改変リガンドを作製および使用する方法に関する。本発明はさらに、改変リガンドをコードする核酸配列、ならびに改変リガンドおよび遺伝子産物をコードする核酸の産生のための方法を提供する。改変TIE-2リガンド、ならびにそれをコードする核酸は、内皮細胞および関連するTIEレセプターに関する特定の疾患（例えば腫瘍血管形成を含む腫瘍性の疾患、創傷治癒、血栓塞栓性疾患（thromboembolic disease）、アテローム性動脈硬化症、および炎症性疾患）の診断および処置において有用であり得る。さらに、改変リガンドは、造血幹細胞の増殖および/または分化を促進するために用いられ得る。
より一般的には、本明細書中に記載されるレセプター活性化改変TIE-2リガンドは、TIEレセプターを発現する細胞の成長、生存、遊走および/または分化ならびに/あるいは安定化または不安定化を促進するのに用いられ得る。生物学的に活性な改変TIE-2リガンドは、TIEレセプター発現細胞の培養物中でのインビトロでの維持のために用いられ得る。TIEレセプターを発現する細胞および組織としては、例えば、心臓細胞および血管内皮細胞、水晶体上皮、ならびに心臓の心外膜ならびに初期造血幹細胞が挙げられる。あるいは、このようなヒトリガンドは、TIEレセプターを発現するように操作される細胞を支持するのに用いられ得る。さらに、改変TIE-2リガンドおよびその同族レセプターは、レセプターのさらなるアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのアッセイ系において用いられ得る。
発明の背景
分化した細胞および組織の発達、維持、および修復を担う細胞の挙動は、大部分において、増殖因子および類似したリガンドならびにそれらのレセプターを介して伝達される細胞内シグナルにより調節されている。レセプターは、応答細胞の細胞表面に位置され、そしてそれらは、増殖因子として知られるペプチドまたはポリペプチドならびに他のホルモン様リガンドに結合する。この相互作用の結果は、応答細胞における迅速な生化学的変化、ならびに細胞の遺伝子発現の迅速かつ長期にわたる再調整である。種々の細胞表面と会合するいくつかのレセプターは、特定の増殖因子に結合し得る。
チロシンキナーゼによるタンパク質でのチロシン残基のリン酸化は、それによってシグナルが、原形質膜を横断して伝達される重要な様式の一つである。現在知られているタンパク質チロシンキナーゼ遺伝子のいくつかは、上皮増殖因子（EGF）、インシュリン、インシュリン様増殖因子-I（IGF-I）、血小板由来増殖因子（PDGF-Aおよび-B）、および線維芽細胞増殖因子（FGF）のようなポリペプチド増殖因子およびホルモンに対する膜貫通レセプターをコードする（Heldinら、Cell Regulation, 1: 555-566（1990）; Ullrichら、Cell、61: 243-54（1990））。各々の場合、これらの増殖因子は、それらの同族レセプターの細胞外部分に結合することにより作用を示す。この作用は、レセプターの細胞質部分に存在する内因性チロシンキナーゼの活性化を導く。内皮細胞の増殖因子レセプターは、いくつかの重要な生理学的および病理学的プロセス（例えば、脈管形成、血管形成、アテローム性動脈硬化症、および炎症性疾患）における増殖因子のあり得る関与のために特に重要である（Folkmanら、Science, 235: 442-447（1987））。さらに、いくつかの造血増殖因子のレセプターは、チロシンキナーゼである；これらは、コロニー刺激因子１レセプターであるc-fms（Sherrら、Cell, 41: 665-676（1985））、およびHuangら、Cell, 63: 225-33（1990）に報告された原始の造血増殖因子レセプターであるc-kitを包含する。
レセプターチロシンキナーゼは、外部ドメインの特徴的構造に基づいて進化のサブファミリーに分類されている（Ullrichら、Cell, 61: 243-54（1990））。このようなサブファミリーには、EGFレセプター様キナーゼ（サブクラスI）およびインシュリンレセプター様キナーゼ（サブクラスII）が挙げられ、これらの各々は、それらの細胞外ドメイン中に繰り返し相同性システインリッチ配列を含有する。単一のシステインリッチ領域はまた、eph様キナーゼの細胞外ドメイン中に見出され得る。Hiraiら、Science, 238: 1717-1720（1987）; Lindbergら、Mol.Cell.Biol., 10: 6316-24（1990）; Lhotakら、Mol.Cell.Biol. 11:2496-2502（1991）。PDGFレセプターならびにc-fmsおよびc-kitレセプターチロシンキナーゼは、サブクラスIIIに分類され得る；一方、FGFレセプターは、サブクラスIVを形成する。これらのサブクラスの両方のメンバーに典型的であるのは、鎖内ジスルフィド結合により安定化される細胞外折りたたみ単位である。これらのいわゆる免疫グロブリン（Ig）様折りたたみは、細胞結合リガンドまたは可溶性リガンドのいずれかを有する広範な種々の他の細胞表面レセプターを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質中に見出される。Williamsら、Ann.Rev.Immunol., 6: 381-405（1988）。
レセプターチロシンキナーゼは、それらの特異性および親和性において異なる。一般に、レセプターチロシンキナーゼは、糖タンパク質である。これは、（１）特定の増殖因子（単数または複数）と結合し得る細胞外ドメイン；（２）通常はタンパク質のα-ヘリックス部分である膜貫通ドメイン；（３）レセプターが、例えばタンパク質リン酸化により調節され得る膜近傍ドメイン；（４）レセプターの酵素成分であるチロシンキナーゼドメイン；および（５）多くのレセプターにおいてチロシンキナーゼに対する基質の認識および結合に関与するカルボキシル末端尾部からなる。
オルタナティブ（alternative）エキソンスプライシングおよび遺伝子プロモーターまたはポリアデニル化部位の代替的な選択のようなプロセスは、同一の遺伝子からいくつかの異なるポリペプチドを産生し得ると報告されている。これらのポリペプチドは、上記に列挙された種々のドメインを含有するかもしれないか、または含有しないかもしれない。結果として、いくつかの細胞外ドメインは、異なる分泌タンパク質として発現され得、そしてレセプターのいくつかの形態は、チロシンキナーゼドメインを欠失し得、そして膜貫通ドメインおよび短いカルボキシル末端尾部により原形質膜中に挿入される細胞外ドメインのみを含有し得る。
内皮細胞膜貫通チロシンキナーゼをコードする遺伝子（当初は、ヒト白血病細胞由来の未知のチロシンキナーゼ相同性cDNAフラグメントとしてRT-PCRにより同定された）は、Partanenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87: 8913-8917（1990）に記載された。この遺伝子およびそれがコードするタンパク質は、「TIE」と呼ばれる。これは、「IgおよびEGF相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains）」の略語である。Partanenら、Mol.Cell.Biol. 12:1698-1707（1992）。
tie mRNAが、全てのヒト胎児およびマウス胎児組織内に存在することが報告されている。視察の結果、tieメッセージは、心臓細胞および血管内皮細胞に局在していた。特に、tie mRNAは、9.5〜18.5日齢マウス胎児の血管および心内膜の内皮に局在していた。増強されたtie発現は、卵胞および皮膚創傷における肉芽組織の発達に関連した新生血管形成の間に示された。Korhonenら、Blood 80: 2548-2555（1992）。従って、TIEは、血管形成においてある役割を演じると示唆されている。これは、固形腫瘍およびいくつかの他の血管形成依存性疾患（例えば、糖尿病性網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、および関節炎）の処置法を開発するのに重要である。
２つの構造的に関連したラットTIEレセプタータンパク質は、関連した発現のプロフィールを有する異なる遺伝子によりコードされることが報告されている。tie-1と呼ばれる１つの遺伝子は、ヒトtieのラット相同物である。Maisonpierreら、Oncogene 8: 1631-1637（1993）。他の遺伝子、tie-2は、マウスtek遺伝子のラット相同物であり得る。これは、tieのように、内皮細胞およびそれらの推定上の前駆体中で排他的にマウスにおいて発現されると報告されている。Dumontら、Oncogene 8: 1293-1301（1993）。tie-2のヒト相同物は、1995年９月５日に発行されたZiegler、米国特許第5,447,860号において記載され（ここでは、tie-2のヒト相同物は「ork」と呼ばれている）、本明細書中にその全体が援用される。
両方の遺伝子は、胎児組織および出生後の組織の内皮細胞において広範に発現されることが見出された。顕著なレベルのtie-2転写産物がまた、他の胎児細胞集団（水晶体上皮、心臓の心外膜、および間充織の領域を含む）中に存在した。Maisonpierreら、Oncogene 8: 1631-1637（1993）。
血管内皮におけるTIEレセプターの優勢な発現は、TIEが脈管系の発達および維持において役割を演じることを示唆する。これは、内皮細胞の決定、増殖、分化、ならびに血管要素中への細胞遊走およびパターニングにおける役割を包含し得る。TIE-2を欠損したマウス胎児の分析により、血管形成、特に内皮細胞における血管網形成についてのTIE-2の重要性が示されている。Sato, T.N.ら、Nature 376:70-74（1995）。成熟した脈管系では、TIEは、内皮細胞の生存、維持、および病原性の影響に対する応答において機能し得る。
TIEレセプターはまた、原始造血幹細胞、Ｂ細胞、および骨髄巨核細胞のサブセットにおいて発現され、従って、初期造血、Ｂ細胞の分化/または増殖、ならびに骨髄巨核球分化経路において、これらのレセプターに結合するリガンドの役割を示唆する。Iwamaら、Biochem.Biophys.Research Communications 195:301-309（1993）;Hashiyamaら、Blood 87:93-101（1996）、Batardら、Blood 87:2212-2220（1996）。
発明の要旨
本発明は、実質的に他のタンパク質を含まない改変TIE-2リガンドを含む組成物を提供する。本明細書中で使用される改変TIE-2リガンドとは、TIEファミリーのリガンドのリガンドをいう。これは代表的に、本明細書中に記載されるリガンドTL1、TL2、TL3、およびTL4を含み、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換により、またはタグ化（例えば、ヒトIgG-1のFc部位）により改変されるが、そのTIE-2レセプターに結合する能力は維持する。改変TIE-2リガンドはまた、少なくとも第一のTIE-2リガンドの一部および第一とは異なる第二のTIE-2リガンドの一部を含むキメラTIE-2リガンドを含む。非限定的な例として、第一のTIE-2リガンドはTL1であり、そして第二のTIE-2リガンドはTL2である。本発明により、さらなるTIE-2リガンドファミリーメンバーを使用する他の組合せが想像される。例えば、第一のリガンドは、TLl、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択され、第一のリガンドとは異なる第二のリガンドは、TL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択されるが、これらの組合せに限定されない組合せを含む、キメラTIE-2リガンドを作製するための他の組合せが可能である。
本発明はまた、改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。１つの実施態様において、単離された核酸分子は、TIEファミリーのリガンドのTIE-2リガンドをコードする。これは代表的に、本明細書中に記載されるリガンドTL1、TL2、TL3、およびTL4を含み、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換により、またはタグ化（例えば、ヒトIgG-1のFc部位）により改変されるが、そのTIE-2レセプターに結合する能力は維持する。別の実施態様において、単離された核酸分子は、少なくとも第一のTIE-2リガンドの一部および第一とは異なる第二のTIE-2リガンドの一部を含むキメラTIE-2リガンドである改変TIE-2リガンドをコードする。非限定的な例として、第一のTIE-2リガンドはTL1であり、そして第二のTIE-2リガンドはTL2である。本発明により、さらなるTIE-2リガンドファミリーメンバーを用いる他の組合せが想像される。例えば、単離された核酸分子が、TLl、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択される第一のリガンドの一部、ならびにTL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択される第二のリガンド（第一のリガンドとは異なる）の一部を含むキメラリガンドである改変TIE-2リガンドをコードするそれらの組合せを含むが、それらに限定されない他の組合せも可能である。
単離された核酸は、DNA、cDNA、またはRNAであり得る。本発明はまた、改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、改変TIE-2リガンドの生物学的活性を有するポリペプチドの適切な宿主細胞中での産生のためのTIE宿主−ベクター系を提供する。適切な宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物であり得る。本発明はまた、ポリペプチドの産生およびそのように産生されたポリペプチドの回収を可能にする条件下で、TIE宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程を包含する、改変TIE-2リガンドの生物学的活性を有するポリペプチドを産生する方法を提供する。
TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子について本明細書中に記載される本発明は、TIE-2レセプターを発現する細胞、組織、または器官に関する障害を患う患者の処置のための治療法として、リガンドの開発をさらに提供する。本発明はまた、このような治療分子に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明はまた、このようなモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、治療の経過をモニターする目的で、患者から採取したサンプル中の治療分子の量を測定する方法を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。従って、本発明はさらに、薬学的に受容可能なビヒクル中で、改変TIE-2リガンドに特異的に結合する抗体を含有する治療用組成物を提供する。本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクル中で改変TIE-2リガンドに特異的に結合する抗体を含有する治療用組成物の有効量を投与することにより、哺乳動物中の血管成長をブロックする方法を提供する。
本発明はさらに、薬学的に受容可能なビヒクル中に、改変TIE-2リガンドを含有する治療用組成物を提供する。本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクル中に、改変TIE-2リガンドを含有する治療用組成物の有効量を投与することにより、患者における新血管新生を促進する方法を提供する。１つの実施態様では、この方法は、創傷治癒を促進するのに用いられ得る。別の実施態様では、この方法は、虚血を処置するのに用いられ得る。さらに別の実施態様において、改変TIE-2リガンドは、造血幹細胞、Ｂ細胞、または骨髄巨核球細胞の増殖または分化を促進するために、単独または他の造血因子と組合わせて使用される。
あるいは、本発明は、改変TIE-2リガンドが、細胞傷害性因子およびそこから調製された治療組成物に結合し得ることを提供する。本発明はさらに、改変TIE-2リガンドに特異的に結合するレセプター体を提供する。本発明はさらに、薬学的に受容可能なビヒクル中に、改変TIE-2リガンドに特異的に結合するレセプター体を含有する治療組成物を提供する。本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクル中に、改変TIE-2リガンドに特異的に結合するレセプター体を含有する治療組成物の有効量を投与することにより、哺乳動物中の血管成長をブロックする方法を提供する。
本発明はまた、TIE-2レセプターアンタゴニスト、ならびにTIE-2アンタゴニストの有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物中の改変TIE-2リガンドの生物学的活性を阻害する方法を提供する。本発明によれば、アンタゴニストは、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンド（TIE-2レセプターに結合するが活性化しない）であり得る。
【図面の簡単な説明】
図1Aおよび1B−TIE-2レセプター体（TIE-2 RB）は、胚ニワトリ漿尿膜（CAM）中の血管の発達を阻害する。６μgのRBを浸漬した再吸収性ゼラチンフォーム（Gelfoam）の単一片を、１日齢ヒヨコ胚のCAMのすぐ下に挿入した。さらに３日間インキュベートした後、４日齢の胚および周囲のCAMを取り出し、そして検査した。図1A:EHK-1 RB（rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc）で処理した胚は、生存能力があり、そしてそれらの周囲のCAM中に正常に発達した血管を保有していた。図1B:TIE-2 RB（r TIE-2 ecto/h IgG1 Fc）で処理した胚は全て死亡し、サイズが減少しており、そして周囲の血管がほとんど完全に欠失していた。
図２−ベクターpJFE14。
図３−λgt10の制限地図。
図４−htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10からのヒトTIE-2リガンド１の核酸および推定アミノ酸（１文字コード）配列。
図５−T98GクローンからのヒトTIE-2リガンド１の核酸および推定アミノ酸（１文字コード）配列。
図６−ヒトTIE-2リガンド２をコードするクローンpBluescript KSからのヒトTIE-2リガンド２の核酸および推定アミノ酸（１文字コード）配列。
図７−TIE-2リガンド１（レーンL1）によるが、TIE-2リガンド２（レーンL2）またはコントロール（Mock）によらない、TIE-2レセプターの活性を示すウェスタンブロット。
図８−過剰なTIE-2リガンド２でのHAEC細胞の前処置（レーン２）が、MOCK培地でのHAEC細胞の前処置（レーン１）と比較した場合、希釈したTIE-2リガンド１のTIE-2リセプター（TIE2-R）を活性化する次の能力をアンタゴナイズすることを示すウェスタンブロット。
図９−ヒト細胞ハイブリッド株、EA.hy926を使用して、TIE-2レセプターのTL1活性を拮抗阻害する、TL2の能力を示すウェスタンブロット。
図10−C2C12 ras、Rat2 ras、SHEP、およびT98G濃縮（10×）馴化培地において、TIE-2リガンドにより表面固定化されたラットTIE-2 IgGに対する結合を示すヒストグラム。ラットTIE-2（rTIE2）特異的結合は、可溶性trkB RBの存在下での微量な減少と比較して、25μg/mlの可溶性ラットTIE-2 RBの存在下での結合活性における顕著な減少により示される。
図11−COS細胞上清において、ヒトTIE-2レセプター体（RB）固定化表面への組換えヒトTIE-2リガンド１（hTL1）およびヒトTIE-2リガンド２（hTL2）の結合。ヒトTIE特異的結合は、サンプルを25μg/mlの可溶性ヒトTIE-2 RBまたはtrkB RBのいずれかとインキュベートすることにより、決定した;結合活性における有意な減少は、ヒトTIE-2 RBとインキュベートすたサンプルについてのみ観察される。
図12−TIE-2レセプター体（TIE-2 RBまたはここでは、TIE2-Fcと示される）が、HUVEC細胞においてTIE-2リガンド１によりTIE-2レセプターの活性をブロックすることを示すウェスタンブロット。ここで、関係のないレセプター体（TRKB-Fc）はこの活性をブロックしない。
図13−E14.5マウス胎児肝臓（レーン１−全体、レーン３−間質豊富、およびレーン４−c-kit+TER119造血前駆細胞）およびE14.5マウス胎児胸腺（レーン２−全体）から得られたTL1およびTL2 RT-PCR産物の段階希釈［未希釈から10-4まで］を示すアガロースゲル。
図14−E17.5マウス胎児胸腺皮質間質細胞（レーン１−CDR1+/A2B5-）および延髄間質細胞（レーンCDR1-/A2B5+）から得られたTL1およびTL2 RT-PCR産物の連続希釈［未希釈から10-3まで］を示すアガロースゲル。
図15-血管形成におけるTIE-2/TIEリガンドの仮定の役割を示すスキーム。TL1は（●）により示され、TL2は（★）により示され、TIE-2は（Ｔ）により示され、VEGFは（［］）により示され、flk-1（VEGFレセプター）は（Ｙ）により示される。
図16−妊娠雌馬血清で処置されたラット卵巣の濾胞発達および黄体形成に関連した血管形成の間の、TIE-2、TL1、TL2、およびVEGFの経時的発現パターンを示すインサイチュハイブリダイゼーションスライドを示す。カラム１：排卵前濾胞初期；カラム２：排卵前濾胞；カラム３：黄体初期；およびカラム４：閉鎖症濾胞；Ａ列：明視野；Ｂ列：VEGF；Ｃ列：TL2；Ｄ列：TL1、およびＥ列：TIE-2レセプター。
図17−成熟TL1タンパク質および成熟TL2タンパク質のアミノ酸配列の比較。TL1配列は、推定リーダー配列が除去されていることを除いて、図４に示されるものと同じである。同様に、TL2配列は、推定リーダー配列が除去されていることを除いて、図６に示されるものを同じである。矢印は、TL1の残基Arg49、Cys245、およびArg264を示す。これは、図4に示すように、それぞれTL1のアミノ酸69位、265位、および284位での残基に対応する。
図18−TL1およびTL2の共有結合多量体構造（パネルＡ）、ならびに１つのシステインの変異によるTL1とTL2との相互変換（パネルＢ）のウェスタンブロット。
図19−定量的な非細胞含有結合アッセイにおける固定化されたTL1へのTIE-2-IgG結合の代表的な曲線。
図20−定量的非細胞含有結合アッセイにおける固定化されたTIE-2外部ドメインへのIgG（TL1-fFc）結合のFcドメインに結合するリガンドのフィブリノーゲン様ドメインを含むTIE-2リガンド１リガンド体を示す代表的な曲線。
図21−TIEリガンド-3のヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。コード配列は、47位で開始する。フィブリノーゲン様ドメインは、929位で開始する。
図22−TIEリガンドファミリーメンバーのアミノ酸配列の比較。mTL3＝マウスTIEリガンド-3；hTL1＝ヒトTIE-2リガンド１；chTL1＝ニワトリTIE-2リガンド１；mTL1＝マウスTIE-2リガンド１；mTL2＝マウスTIE-2リガンド２；hTL2＝ヒトTIE-2リガンド２。四角で囲った領域は、ファミリーメンバーの間の相同の保存された領域を示す。
図23−TIEリガンド-4のヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。矢印はヌクレオチド569位を示す。
図24−1N1C2F（キメラ１）と称されるキメラTIEリガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。推定リーダー配列は、ヌクレオチド１〜60によりコードされる。
図25−2N2C1F（キメラ２）と称されるキメラTIEリガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。推定リーダー配列は、ヌクレオチド１〜48によりコードされる。
図26−1N2C2F（キメラ３）と称されるキメラTIEリガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。推定リーダー配列は、ヌクレオチド１〜60によりコードされる。
図27−2N1C1F（キメラ４）と称されるキメラTIEリガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸（１文字コード）配列。推定リーダー配列は、ヌクレオチド１〜48によりコードされる。
発明の詳細な説明
以下により詳細に記載されるように、本出願人らは、TIE-2レセプターに結合する新規の改変TIE-2リガンドを作製した。本発明は、実質的に他のタンパク質を含まない改変TIE-2リガンドを含む組成物を提供する。本明細書中で使用される改変TIE-2リガンドとは、代表的に、本明細書中で記載されるリガンドTL1、TL2、TL3、およびTL4を含むTIEファミリーのリガンドのリガンドをいい、これは、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換により、またはタグ化（例えば、ヒトIgG-1のFc部位）により改変されるが、そのTIE-2レセプターに結合する能力は維持する。改変TIE-2リガンドはまた、少なくとも第一のTIE-2リガンドの一部および第一とは異なる第二のTIE-2リガンドの一部を含むキメラTIE-2リガンドを含む。非限定的な例として、第一のTIE-2リガンドはTL1であり、そして第二のTIE-2リガンドはTL2である。本発明により、さらなるTIE-2リガンドファミリーメンバーを使用する他の組合せが想像される。例えば、キメラTIE-2リガンドを作製するための組合せが可能であり、ここで、第一のリガンドは、TL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択され、第一のリガンドとは異なる第二のリガンドは、TL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択されるが、これらの組合せに限定されない組合せを含む。
本発明はまた、改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。１つの実施態様において、単離された核酸分子は、TIEファミリーのリガンドのTIE-2リガンドをコードする。これは代表的に、本明細書中に記載されるリガンドTL1、TL2、TL3、およびTL4を含み、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換により、またはタグ化（例えば、ヒトIgG-1のFc部位）により改変されるが、そのTIE-2レセプターに結合する能力は維持する。別の実施態様において、単離された核酸分子は、少なくとも第一のTIE-2リガンドの一部および第一とは異なる第二のTIE-2リガンドの一部を含むキメラTIE-2リガンドである改変TIE-2リガンドをコードする。非限定的な意味で、第一のTIE-2リガンドはTL1であり、そして第二のTIE-2リガンドはTL2である。本発明により、さらなるTIE-2リガンドファミリーメンバーを用いる他の組合せが想像される。例えば、単離された核酸分子が、TL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択される第一のリガンドの一部、ならびにTL1、TL2、TL3、およびTL4からなる群から選択される第二のリガンド（第一のリガンドとは異なる）の一部を含むキメラリガンドである改変TIE-2リガンドをコードするそれらの組合せを含むが、それらに限定されない他の組合せが可能である。
本発明は、改変TIE-2リガンドおよびそれらのアミノ酸配列、ならびに機能的に等価なその変異物、ならびに、TIE-2レセプターに結合し、そしてそのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、記載された配列の置換、欠失、または挿入変異を含むタンパク質またはペプチドを包含する。このような変異物には、アミノ酸残基が、サイレントな変化をもたらす配列内の残基に関して置換された変異物が含まれる。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似した極性を有する別のアミノ酸（単数または複数）により置換され得、サイレントな変化を生じる。配列内のアミノ酸に対する置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸のクラスは、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを包含する。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。
本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドと同じかまたは類似した生物学的活性を示すタンパク質あるいはフラグメントまたはその誘導体、および翻訳中または翻訳後に（例えば、グリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞のリガンドなどへの結合などにより）差別的に改変される誘導体がまた、本発明の範囲に含まれる。機能的に等価な分子にはまた、特定の組換え宿主における発現から生じるN-末端の修飾を含む修飾（例えば、特定の細菌（例えば、E.coli）発現系において生じるN-末端のメチル化のような）を含む分子が含まれる。
本発明はまた、改変TIE-2リガンドとして本明細書に記載されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列および改変TIE-2リガンドとして本明細書に記載されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに、このタンパク質を生成するように、例えば、適切な発現ベクター中に本明細書に記載の改変TIE-2リガンドをコードする核酸のトランスフェクション、形質導入、感染、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションにより、遺伝子操作されている宿主細胞（酵母、細菌、ウイルス、および哺乳動物細胞を含む）を包含する。本発明はまた、例えば、FinkelおよびEpstein FASEB J. 9:843-851（1995）; Guzmanら、PNAS（USA）91:10732-10736（1994）に記載される遺伝子治療技術による、改変TIE-2リガンドをコードする核酸の導入を包含する。
当業者はまた、本発明が、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版、第１巻、101-104頁、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に規定される中程度のストリンジェンシーの条件下で、改変TIE-2リガンドコードヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNAおよびRNA配列を包含することを理解する。従って、本発明によって意図される核酸分子は、本明細書中に記載されるように調製された改変TIE-2リガンドのアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列を有する核酸分子、ならびにこのようなヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドの配列を有する分子、および遺伝コードの結果として上記配列が縮重しているが、TIE-2レセプターに結合するリガンドをコードし、そして、本明細書中に記載の改変TIE-2リガンドの生物学的活性と同じ生物学的活性を分子に供与するために、本明細書中に記載の改変TIE-2リガンドを十分に複製する、アミノ酸配列ならびに他の１次、２次、および３次特性を有するヌクレオチド配列をまた有する分子を包含する。
本発明は、TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合および活性化する改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、TIE-2リガンド１のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列により置換される。本発明はまた、TIE-2リガンド１のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列により置換されるようなさらなる改変を有するような核酸分子を提供する。
本発明はまた、TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合および活性化する改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、TIE-2リガンド１のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列により置換され、そしてこれはさらに図27に示されるようなヌクレオチド784-787によりコードされるシステイン残基の代わりに別のアミノ酸をコードするようにさらに改変される。セリン残基は、好ましくはシステイン残基に置換される。別の実施態様において、核酸分子は、図27に示されるようにヌクレオチド199-201によりコードされるアルギニン残基の代わりに別のアミノ酸をコードするようにさらに改変される。セリン残基は、好ましくはアルギニン残基に置換される。
本発明はまた、アミノ酸245位のシステイン残基の代わりに別のアミノ酸をコードするように改変されたTIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合およびそれを活性化する改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。セリン残基は好ましくはシステイン残基に置換される。
本発明は、さらに、TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合するが活性化しない改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、TIE-2リガンド１のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が欠失している。本発明はまた、TIE-2リガンド１のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が欠失し、およびフィブリノーゲン様ドメインをコードする部分が、ヒト免疫グロブリンγ-1定常領域（IgG1 Fc）をコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合されるようにさらに改変されるような核酸分子を提供する。
本発明は、さらに、TIE-2リガンド２をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合するが活性化しない改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、TIE-2リガンド２のN末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が欠失される。本発明はまた、TIE-2リガンド２のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が欠失され、およびフィブリノーゲン様ドメインをコードする部分が、ヒト免疫グロブリンγ-1定常領域（IgG1 Fc）をコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合されるようにさらに改変されるような核酸分子を提供する。
本発明は、さらに、TIE-2リガンド１をコードするヌクレオチド配列を含むTIE-2レセプターに結合するが活性化しない改変TIE-2リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、TIE-2リガンド１のフィブリノーゲン様ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分が、TIE-2リガンド２のフィブリノーゲン様ドメインをコードするヌクレオチド配列により置換される。本発明はまた、TIE-2リガンド１のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列の部分がTIE-2リガンド２のコイルドコイルドメインをコードするヌクレオチド配列により置換されるようにさらに改変されるような核酸分子を提供する。
本発明はさらに、本発明の任意の核酸分子によりコードされる改変TIE-2リガンドを提供する。
本発明はまた、少なくとも第一のTIE-2リガンドの一部および第一と異なる第二のTIE-2リガンドの一部を含むキメラTIE-2リガンドを提供する。ここで、第一および第二のTIE-2リガンドは、TIE-2 Ligand-1、TIE-2 Ligand-2、TIE Ligand-3、およびTIE Ligand-4からなる群から選択される。好ましくは、キメラTIEリガンドは、少なくともTIE-2 Ligand-1の一部およびTIE-2 Ligand-2の一部を含む。
本発明はまた、図24、25、26、または27に記載されるキメラTIEリガンドをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、図24、25、26、または27に記載されるキメラTIEリガンドを提供する。本発明は、さらに、ヌクレオチド784-787によりコードされるシステイン残基の代わりに別のアミノ酸を有するように改変された、図27に記載されるキメラTIEリガンドを提供する。
DNAフラグメントのベクターへの挿入に関して当業者に公知の任意の方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を用いて、改変TIE-2リガンドをコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝的組換え）を包含し得る。改変TIE-2リガンドまたはそのペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、TIEリガンドタンパク質またはペプチドが組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現されるように、改変TIE-2リガンドコード配列に作動可能に連結された第２の核酸配列により調節され得る。例えば、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントにより制御され得る。リガンドの発現を制御するのに用いられ得るプロモーターは、Squintoら、（Cell 65: 1-20（1991））に記載されるような長末端反復；SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, Nature 290:304-310）、CMVプロモーター、M-MuLV5'末端反復、Rous肉腫ウイルスの3'の長末端反復中に含まれるプロモーター（Yamamotoら、Cell 22:787-797（1980））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78: 144-1445（1981））、アデノウイルスプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、Nature 296:39-42（1982））；β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクター（Villa-Kamaroffら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 75:3727-3731（1978））、またはtacプロモーター（DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80: 21-25（1983））、さらに「組換え細菌由来の有用なタンパク質」Scientific American, 242:74-94（1980）を参照のこと；Gal 4プロモーター、ADH（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、および以下の動物の転写制御領域（これは組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている）；膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら、Cell 38:639-646（1984）; Ornitzら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409（1986）; MacDonald, Hepatology 7:425-515（1987））；膵臓β細胞において活性であるインシュリン遺伝子制御領域［Hanahan, Nature 315:115-122（1985）］；リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、1984, Cell 38: 647-658; Adamesら、1985, Nature 318: 533-538; Alexanderら、1987, Mol.Cell.Biol. 7:1436-1444）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Lederら、1986, Cell 45:485-495）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓において活性であるα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら、1985, Mol.Cell.Biol. 5:1639-1648; Hammerら、1987, Science 235:53-58）；肝臓において活性であるα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞において活性であるβ-グロビン遺伝子制御領域（Mogramら、1985. Nature 315:338-340; Kolliasら、1986. Cell 46:89-94）；脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら、1987, Cell 48:703-712）；骨格筋において活性であるミオシ���軽鎖-2遺伝子制御領域（Shani, 1985, Nature 314:283-286）、および視床下部において活性である性腺刺激ホルモン（gonadotropic）放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、1986, Science 234: 1372-1378）。本発明はさらに、改変TIE-2リガンドの発現を調節するために、改変TIE-2リガンドをコードするRNAの配列と特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物の産生を包含する（1992年11月24日に発行されたEcker、米国特許第5,166,195号）。
従って、本発明によれば、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドをコードする核酸を含有する、細菌または真核生物の宿主内で複製され得る発現ベクターが、宿主をトランスフェクトするのに用いられ、そしてそれにより、改変TIE-2リガンドを産生するこのような核酸の発現を指揮するのに用いられる。次いで、これは生物学的に活性な形態で回収され得る。本明細書で用いられる、生物学的に活性な形態は、TIEレセプターに結合し、そして生物学的応答（例えば、分化した機能）を引き起こし得るか、またはレセプターを発現する細胞の表現型に影響し得る形態を包含する。このような生物学的に活性な形態は、例えば、TIEレセプターのチロシンキナーゼドメインのリン酸化を誘導する。あるいは、生物学的活性は、TIEレセプターに対するアンタゴニストとしての効果であり得る。別の実施態様において、改変TIE-2リガンドの活性形態は、TIEレセプターを認識し、それにより診断および治療の両方での使用のための、レセプターに対する標的薬剤として作用し得るものである。このような実施態様において、活性形態は、TIEを発現する任意の細胞に、表現型上のいかなる変化も付与する必要はない。
遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、４つの一般的なアプローチにより同定され得る：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（b）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、（c）挿入配列の発現、および（d）PCR検出。第１のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は、挿入された改変TIE-2リガンドコード遺伝子に相同な配列を含有するプローブを用いて、DNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出され得る。第２のアプローチでは、組換えベクター/宿主系は、ベクターおける外来遺伝子の挿入により引き起こされる、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体（occlusion body）など）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。例えば、改変TIE-2リガンドをコードする核酸が、ベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入される場合、挿入物を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。第３のアプローチでは、組換え発現ベクターは、組換え体により発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより同定され得る。このようなアッセイは、例えば、改変TIE-2リガンド遺伝子産物の物理的特性または機能的特性（例えば、リガンドの、例えば、検出可能な抗体またはその一部で標識され得るTIEレセプターまたはその一部への結合によるか、あるいは改変TIE-2リガンドタンパク質またはその一部に対して産生された抗体への結合による）に基づき得る。本発明の細胞は、一時的、または好ましくは、構成的および永続的に、本明細書に記載される改変TIE-2リガンドを発現し得る。第４のアプローチでは、DNAヌクレオチドプライマーは、tie特異的DNA配列に対応するように調製され得る。次いで、これらのプライマーは、tie遺伝子フラグメントをPCRするのに用いられ得る（PCR Protocols : A Guide To Methods and Applications, Michael A. Innisら編、Academic Press（1990））。
組換えリガンドは、安定な、生物学的に活性なタンパク質の引き続く形成を可能にする任意の技術により精製され得る。好ましくは、リガンドは、培養培地中に分泌され、そこから回収される。あるいは、リガンドは、可溶性タンパク質または封入体のいずれかとして細胞から回収され得、そしてそれらから８M塩酸グアニジウムおよび透析により、周知の方法論に従って、定量的に抽出され得る。リガンドをさらに精製するために、アフィニティークロマトグラフィー、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはゲル濾過が用いられ得る。
本発明のさらなる実施態様では、実施例により詳細に記載されるように、組換え改変TIE-2リガンドコード遺伝子は、相同的組換えにより内因性遺伝子を不活化または「ノックアウト」するのに用いられ得、そしてそれにより、TIEリガンドを欠失した細胞、組織、または動物を作製する。例えば（限定されることを意図しないが）、組換えTIEリガンド-4コード遺伝子は、挿入性の変異（例えば、天然のTIEリガンド-4コード遺伝子を不活化するneo遺伝子）を含有するように操作され得る。このような構築物は、適切なプロモーターの制御下で、トランスフェクション、形質導入、またはインジェクションのような技術により、細胞（例えば、胚幹細胞）中に導入され得る。次いで、この構築物を含有する細胞は、G418耐性により選択され得る。次いで、インタクトなTIEリガンド-4コード遺伝子を欠失する細胞は、例えば、サザンブロッティング、PCR検出、ノーザンブロッティング、または発現のアッセイにより同定され得る。次いで、インタクトなTIEリガンド-4コード遺伝子を欠失する細胞は、初期の胚細胞に融合され、このようなリガンドを欠失するトランスジェニック動物を産生し得る。このような動物は、通常リガンドに依存した特定のインビボプロセスを規定するのに用いられ得る。
本発明はまた、本明細書に記載される改変TIE-2リガンドに対する抗体を提供する。これは、例えば、診断適用における、リガンドの検出に有用である。改変TIE-2リガンドに対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の持続した細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が用いられ得る。例えば、KohlerおよびMilsteinにより初めて開発されたハイブリドーマ技術（1975, Nature 256: 495-497）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983, Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、1985, 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」Alan R.Liss, Inc. 77-96頁）などが本発明の範囲内にある。
モノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト-マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で公知の多数の技術のいずれかにより作製され得る（例えば、Tengら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozborら、1983 Immunology Today 4:72-79; Olssonら、1982, Meth.Enzymol. 92:3-16）。キメラ抗体分子は、ヒト定常領域を有するマウス抗原結合ドメインを含有するように調製され得る（Morrisonら、1984, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81:6851, Takedaら、1985, Nature 314:452）。
当該分野で公知の種々の手順が、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドのエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に用いられ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、およびラットを包含するが、これらに限定されない）が、改変TIE-2リガンド、あるいはそのフラグメントまたは誘導体を注射することにより免疫化され得る。種々のアジュバントが、免疫学的応答を増加するのに用いられ得、これは、宿主の種に依存し、そしてFreundの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、ならびにBCG（Bacille Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントを包含するが、これらに限定されない。
選択された改変TIE-2リガンドエピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技術により調製され得る。組換えDNA方法論（例えば、Maniatisら、1982、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと）は、モノクローナル抗体分子、またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するのに用いられ得る。
本発明は、抗体分子ならびにこのような抗体分子のフラグメントを提供する。分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、公知の技術により生成され得る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産生され得るF（ab'）2フラグメント；F（ab'）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元させることにより生成され得るFab'フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成され得るFabフラグメントを包含するが、これらに限定されない。抗体分子は、公知の技術（例えば、免疫吸着または免疫アフィニティークロマトグラフィー、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフィー法、またはそれらの組合せ）により精製され得る。
本発明はさらに、以下の工程により生物学的サンプル中の改変TIE-2リガンドの量を測定するためのイムノアッセイを包含する：
ａ）生物学的サンプルと改変TIE-2リガンドに特異的に結合する少なくとも１つの抗体とを接触させ、その結果、抗体がサンプル中に存在するいかなる改変TIE-2リガンドとも複合体を形成する工程；および
ｂ）複合体の量を測定し、そしてそれにより生物学的サンプル中の改変TIE-2リガンドの量を測定する工程。
本発明はさらに、以下の工程により生物学的サンプル中のTIEレセプターの量を測定するためのアッセイを包含する：
ａ）生物学的サンプルと本発明の少なくとも１つのリガンドとを接触させ、その結果、リガンドがTIEレセプターと複合体を形成する工程；および
ｂ）複合体の量を測定し、そしてそれにより生物学的サンプル中のTIEレセプターの量を測定する工程。
本発明はまた、TIE-2レセプター発現細胞の生存および／または増殖および／または遊走（migration）および／または分化を維持するための本発明に記載のようにTIE-2レセプターを活性化する改変TIE-2リガンドの利用を提供する。従って、このリガンドは、例えば、培養中の内皮細胞を維持するための補充物として用いられ得る。
さらに、本出願人によるTIE-2レセプターに対するの改変TIE-2リガンドの作製発見は、TIEレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストの同定のために有用なアッセイ系の利用を可能にする。このようなアッセイ系は、血管形成を促進または阻害し得る分子を同定するのに有用である。例えば、１つの実施態様では、TIE-2レセプターのアンタゴニストは、TIE-2レセプターと改変TIE-2リガンドとの相互作用を妨害し得る試験分子として同定され得る。このようなアンタゴニストは、１）生物学的に活性な改変TIE-2リガンドのレセプターへの結合（例えば、BIAcoreバイオセンサー技術（BIAcore ; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を用いて測定される）をブロックする；または２）生物学的に活性な改変TIE-2リガンドが生物学的応答を引き起こす能力をブロックする、それらの能力により同定される。このような生物学的応答は、TIEレセプターまたはTIEシグナル伝達経路の下流成分のリン酸化、またはTIEレセプター保有細胞の生存、増殖、または分化を包含するが、これらに限定されない。
１つの実施態様では、TIEレセプターを発現するように操作された細胞は、増殖について改変TIE-2リガンドの添加に依存性であり得る。このような細胞は、TIEレセプターのさらなるアゴニスト、またはこのような細胞上で改変TIE-2リガンドの活性を妨害し得るアンタゴニストを同定するための有用なアッセイ系を提供する。あるいは、改変TIE-2リガンドおよびレセプターの両方を同時発現し得るように操作された自己分泌細胞は、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストをアッセイするための有用な系を提供し得る。
従って、本発明は、TIE-2レセプターを通常発現しない細胞中へのこのレセプターの導入を提供し、それゆえこれらの細胞が、このレセプターと結合するリガンドに対して絶大でかつ容易に識別可能な応答を示すことを可能にする。惹起された応答のタイプは、用いられる細胞に依存し、細胞中に導入される特定のレセプターに依存するわけではない。チロシンキナーゼレセプター上で作用し得る分子のアッセイおよび発見について最大効果の応答を生じるように、適切な細胞株が選択され得る。分子は、記載される系においてレセプター特異的様式で作用する任意のタイプの分子であり得る。このような分子は、ペプチドおよび非ペプチド分子を包含するが、これらに限定されない。
利用されるより有用な系の１つは、TIEレセプター（または別のレセプターチロシンキナーゼ（例えば、trkC）の細胞外ドメインおよびTIEレセプターの細胞内ドメインを含むキメラレセプター）の線維芽細胞株（例えば、NIH3T3細胞）への導入を包含する。従って、通常は増殖性応答または他の応答を媒介しないこのようなレセプターが、線維芽細胞への導入後、それにも関わらず、線維芽細胞増殖因子の効果を定量するために種々の十分に確立された方法によりアッセイされ得る（例えば、チミジン取り込みまたは他のタイプの増殖アッセイ；van Zoelen、1990「The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors」、Progress Factor Research、第２巻、131〜152頁；ZhanおよびM. Goldfarb、1986、Mol. Cell. Biol., 第６巻、3541〜3544頁を参照のこと）。これらのアッセイは、任意の調製物が、導入されたレセプターを有する細胞株およびレセプターを欠く親細胞株の両方においてアッセイされ得るというさらなる利点を有する。レセプターを有する細胞株における特異的な効果のみが、導入されたレセプターによって媒介されたと判断される。このような細胞は、改変TIE-2リガンドを発現するようにさらに操作され得、従って、この相互作用のアンタゴニスト／アゴニストとして作用する分子についてアッセイするために有用である自己分泌系を作出する。従って、本発明は、改変TIE-2リガンドをコードする核酸およびTIEレセプターをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
TIEレセプター／改変TIE-2リガンド相互作用はまた、TIEレセプターの小分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するための有用な系を提供する。例えば、TIEレセプターに結合するが任意の他の生物学的活性を誘導しない、改変TIE-2リガンドのフラグメント、変異体、または誘導体が同定され得る。あるいは、改変TIE-2リガンドの特徴付けは、分子の活性部分のさらなる特徴付けを可能にする。さらに、リガンドの同定は、レセプター／リガンド複合体のＸ線結晶構造の決定を可能にし、従って、レセプター上の結合部位の同定を可能にする。結合部位の知見は、新規なアゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計への有用な洞察を提供する。
試験分子のTIEレセプターへの特異的結合は、多くの方法で測定され得る。例えば、試験分子のTIE発現細胞への実際の結合は、（i）無傷細胞の表面に結合した試験分子；（ii）細胞溶解物中のTIEタンパク質に架橋した試験分子；または（iii）インビトロでTIEに結合した試験分子を検出または測定することにより、検出または測定され得る。試験分子とTIEとの間の特異的相互作用は、その相互作用の独特の特性を示す試薬を用いることにより評価され得る。
特定の限定的でない例として、本発明の方法は、以下のようにして用いられ得る。サンプル中の改変TIE-2リガンドが測定されるべきである場合を考慮する。種々の希釈度のサンプル（試験分子）が、改変TIE-2リガンド活性を含まないネガティブコントロール（NC）および既知量の改変TIE-2リガンドを含むポジティブコントロール（PC）と並行して、検出可能に標識された改変TIE-2リガンド（本実施例においては、放射性ヨード化リガンド）の存在下でTIEを発現する細胞に曝され得る。試験サンプル中の改変TIE-2リガンドの量は、コントロールおよび各希釈物において結合する125Ｉ標識改変TIE-2リガンドの量を決定し、そして次いでサンプル値を標準曲線と比較することにより評価され得る。サンプル中に多くの改変TIE-2リガンドが存在するほど、TIEに結合する125Ｉリガンドは少なくなる。
結合した125Ｉリガンドの量は、細胞当たりの放射能の量を測定することによるか、またはMeakinおよびShooter, 1991, Neuron 6:153-163に記載のようにDSSを用いて改変TIE-2リガンドを細胞表面タンパク質に架橋させ、そして細胞抽出物中の標識タンパク質の量を検出する（例えば、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（これは、TIEレセプター／改変TIE-2リガンドに相当する大きさを有する標識タンパク質を示し得る）を用いて）ことにより、決定され得る。特異的な試験分子／TIEの相互作用は、このアッセイに非標識コントロールリガンド（このリガンドはTIEレセプターに結合せず、従ってTIE結合についての標識改変TIE-2リガンドと試験分子との間の競合に実質的な影響を有さないはずである）の種々の希釈物を添加することにより、さらに試験され得る。あるいは、TIEレセプター／改変TIE-2リガンドを破壊し得ることが知られる分子（例えば、抗TIE抗体、または本明細書中で記載されるTIEレセプター体であるが、これらに限定されない）は、TIEレセプター結合について125Ｉ-改変TIE-2リガンドと試験分子との間の競合を妨害することが予想され得る。
検出可能に標識された改変TIE-2リガンドは、放射性物質、蛍光物質、酵素活性を有する物質、酵素に対する基質として働き得る物質（比色的に検出可能な反応と関連した酵素および基質が好ましい）、または好ましくは検出可能に標識された抗体分子である抗体分子により認識され得る物質に共有結合的または非共有結合的に結合された改変TIE-2リガンドを包含するが、これらに限定されない。
あるいは、試験分子のTIEへの特異的結合は、改変TIE-2リガンド／TIEレセプター結合の二次的な生物学的効果を評価することにより測定され得る。このような効果は、細胞増殖および／または分化または即時型遺伝子発現またはTIEのリン酸化を包含するが、これらに限定されない。例えば、試験分子が分化を誘導する能力は、tieを欠損する細胞およびtieを発現する同等の細胞において試験され得る。tieを欠損する同等の細胞ではなくtie発現細胞における分化は、特定の試験分子／TIE相互作用を示す。同様の分析が、tieマイナス細胞およびtieプラス細胞における即時型遺伝子（例えばfosおよびjun）誘導を検出することによるか、または当該分野で公知の標準的なリン酸化アッセイを用いてTIEのリン酸化を検出することにより実施され得る。このような分析は、TIEに競合的に結合しないアゴニストまたはアンタゴニストを同定することにおいて有用であり得る。
同様に、本発明は、改変TIE-2リガンドの生物学的活性を有する分子を同定する方法を提供する。この方法は、（i）tieを発現する細胞を試験分子に曝す工程および（ii）試験分子のTIEレセプターへの特異的結合を検出する工程を包含し、ここでTIEへの特異的結合は、TIE様活性と正に相関する。特異的結合は、上述したように、直接結合または結合の二次的な生物学的効果についてのアッセイのいずれかにより検出され得る。このような方法は、TIEリガンドファミリーの新規なメンバーの同定において、または製薬産業において、TIE関連生物学的活性について多数のペプチド分子および非ペプチド分子（例えば、ペプチド模倣物）をスクリーニングすることにおいて特に有用であり得る。本発明の好ましい特定の限定されない実施態様では、tieマイナスであるか、またはtieプラスのいずれかに操作されたPC12（または線維芽細胞、以下を参照のこと）細胞を交互に含有する大きなグリッドの培養ウェルが調製され得る。次いで、種々の試験分子が、グリッドの各カラムまたはそれらの一部が異なる試験分子を含有するように添加され得る。次いで、各ウェルで、増殖および／または分化の存在または非存在について評価され得る。非常に多くの試験分子が、この様式でこのような活性についてスクリーニングされ得る。
さらなる実施態様では、本発明は、TIEリガンド様活性を検出または測定する方法、またはこのような活性を有する分子を同定する方法を提供する。この方法は、（i）結合を生じることが可能な条件下で試験分子をTIEレセプタータンパク質にインビトロで曝す工程、および（ii）試験分子のTIEレセプタータンパク質への結合を検出する工程を包含し、ここで試験分子のTIEレセプターへの結合がTIEリガンド様活性と相関する。このような方法によれば、TIEレセプターは、実質的に精製されてもよく精製されていなくてもよく、（例えば、アフィニティーカラムまたはELISAアッセイとして）固体支持体に固定され得るか、または人工膜中に取り込まれ得る。試験分子のTIEレセプターへの結合は、当該分野で公知の任意の方法によっても評価され得る。好ましい実施態様では、試験分子の結合は、TIEレセプター結合について検出可能に標識された既知のTIEリガンドと競合するその能力を評価することにより、検出または測定され得る。
本発明はまた、試験分子がTIEリガンド様活性のアンタゴニストとして機能する能力を検出する方法を提供する。この方法は、分子が、このレセプターを発現する細胞におけるTIEレセプターへのTIEリガンド結合の効果を阻害する能力を検出する工程を包含する。このようなアンタゴニストはTIEレセプター／改変TIE-2リガンド結合を妨害してもよく、またはしなくてもよい。TIEレセプターへの改変TIE-2リガンド結合の効果は、好ましくは、生物学的効果または生化学的効果であり、細胞生存もしくは増殖、細胞形質転換、即時型遺伝子誘導、またはTIEリン酸化を包含するが、これらに限定されない。
本発明は、リガンドを中和し得るかもしくはレセプターへの結合をブロックし得る抗体または他の分子を同定する方法、ならびにその方法により同定される分子の両方をさらに提供する。限定されない例として、この方法は、概念上ELISAアッセイに類似するアッセイを介して実施され得る。例えば、TIEレセプター体を固体支持体（例えばプラスチックマルチウェルプレート）に結合させ得る。次いで、コントロールとして、Mycタグ化改変TIE-2リガンドの既知量をウェルに入れ得、そして次いで、レセプター体に結合する任意のタグ化改変TIE-2リガンドをMycタグに対するレポーター抗体によって同定し得る。次いで、このアッセイ系を用いて、試験サンプルを、i）タグ化リガンドに結合し得るか、またはii）レセプター体に結合し、それによりタグ化リガンドによるレセプター体への結合をブロックし得る分子についてスクリーニングし得る。例えば、既知量のタグ化リガンドとともに目的の推定分子を含有する試験サンプルをウェル中に入れ得、そしてレセプター体に結合するタグ化リガンドの量を測定し得る。結合したタグ化リガンドの試験サンプル中の量とコントロール中の量とを比較することにより、レセプターへのリガンド結合をブロックし得る分子を含有するサンプルが同定され得る。このようにして同定された目的の分子は、当業者に周知の方法を用いて単離され得る。
一旦リガンド結合のブロッカーが見出されると、そのブロッカーがレセプターに結合するかまたはリガンドに結合するかを決定するために二次的なアッセイを、ならびにそのブロッカー分子がリガンドの生物学的活性を中和し得るかどうかを決定するためのアッセイを実施することを、当業者は理解する。例えば、TIEレセプター体または改変TIE-2リガンドもしくはリガンド体のいずれかが固体支持体（例えば、金表面上のカルボキシメチルデキストラン）に共有結合されている、BIAcoreバイオセンサー技術（または同等の技術）を用いる結合アッセイを用いることにより、当業者は、ブロッカー分子がリガンド、リガンド体、またはレセプター体に特異的に結合するかどうかを決定し得る。ブロッカー分子がリガンドの生物学的活性を中和し得るかどうかを決定するために、当業者は、リン酸化アッセイ（実施例５を参照のこと）または代替的に機能的バイオアッセイ（例えば、生存アッセイ）を、例えば、内皮細胞の初代培養物を使用することにより実施し得る。あるいは、レセプター体に結合するブロッカー分子はアゴニストであり得、そして当業者は、TIEレセプターのさらなるアゴニストを同定するための適切なアッセイを実施することにより、このことをどのようにして決定するかを理解し得る。
さらに、本発明は、TIEリガンドが本明細書中に記載されるTIE-2リガンドのレセプター結合ドメインである組成物をさらに意図する。例えば、TIE-2リガンド１は、「超らせん」ドメイン（5'末端から始まり、図４の約1160位および図５の約1157位のヌクレオチドに及ぶ）およびフィブリノーゲン様ドメイン（図４のヌクレオチド配列によってコードされ、図５の約1161位および約1158位で始まる）を含む。TIE-2リガンド２のフィブリノーゲン様ドメインは、図６の1197付近から始まるヌクレオチドによってコードされるリガンド１（FRDCA）と同じアミノ酸配列からまたはその付近から始まると考えられる。TIEリガンド-3のフィブリノーゲン様ドメインは、アミノ酸配列上でまたはその付近で始まると考えられ、これは図21の929位付近から始まるヌクレオチドによりコードされる。リガンドの生成の間の超らせんドメインの多量体化は、精製を阻害する。しかし、実施例19に記載のように、本出願人らは、フィブリノーゲン様ドメインが、TIE-2レセプター結合ドメインを含むことを発見した。しかし、単量体型のフィブリノーゲン様ドメインは、このレセプターに結合しないようである。mycでタグ化したフィブリノーゲン様ドメイン（これは、抗myc抗体を用いて「クラスター化」されている）を利用する研究では、TIE-2レセプターに結合する。（「クラスター化したリガンドおよびリガンド体」の作製方法は、Davisら、Science 266:816-819（1994）に記載される）。これらの知見に基づいて、本出願人らは、IgGのFcドメインにカップリングされた、TIE-2リガンドのフィブリノーゲン様ドメイン（「fFc's」）を含む「リガンド体」を作製した。２量体を形成するこれらのリガンド体は、TIE-2レセプターに効果的に結合した。従って、本発明は、診断的適用または治療的適用において標的薬剤（例えば、TIEアンタゴニストの必要が示される腫瘍および／または関連した脈管構造に対する標的薬剤）として使用され得る改変TIEリガンド体の作製を意図する。
本明細書中の発明は、TIEレセプターを発現する細胞、組織、または器官が関与する疾患に苦しむ患者の処置のための治療剤として、リガンド、そのフラグメントまたは誘導体、あるいはレセプターアゴニストまたはアンタゴニストである別の分子の開発をさらに提供する。このような分子は、ヒトまたは動物の身体の処置方法、または診断方法に用いられ得る。
TIEレセプターが内皮細胞に関連して同定されており、そして本明細書中で示されるように、TIE-2リガンド１をブロックすることが血管新生を防止するようであるので、本出願人は、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドが、このような血管新生が徴候となる疾患または病気における血管新生の誘導のために有用であり得ることを予測した。このような疾患または病気は、創傷治癒、虚血、および糖尿病を含む。このリガンドを、動物モデルで試験し得、そして他の因子（例えば、血管内皮成長因子（VEGF）、脈管形成性である別の内皮細胞特異的因子）について記載されたように、治療的に用い得る。1994年７月26日に発行されたFerraraら、米国特許第5,332,671号。Ferraraの参考文献、ならびに他の研究は、虚血心筋への血流の増加、創傷治癒の促進、および新脈管形成（neoangiogenesis）が所望される他の治療環境において、脈管形成性因子の効果を実証するために用いられ得るインビトロおよびインビボでの研究を記載する。（Sudoら、欧州特許出願公開公報第0 550 296 A2号（1993年７月７日公開）；Banaiら、Circu1ation 89:2183-2189（1994）; Ungerら、Am. J. Physiol. 266:H1588-H1595（1994）; Lazarousら、Circulation 91:145-153（1995））。本発明によれば、改変TIE-2リガンドは、単独で、または１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物（例えば、VEGFまたは塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、ならびにサイトカイン、ニューロトロフィンなど）と組み合わせて用いられ得る。
逆に、TIEレセプターのアンタゴニスト（例えば、本明細書中に記載される、レセプターに結合するが、活性化しない改変TIE-2リガンド、本明細書中の実施例２および３に記載されるレセプター体、および実施例９に記載されるTIE-2リガンド２）は、血管新生を防止または減弱するのに有用であり得、従って、例えば、腫瘍増殖を防止または減弱する。これらの薬剤は、単独で、または治療的意図が脈管形成をブロックすることである状態を処置するのに有用であることが示されている他の組成物（例えば、抗VEGF抗体）と組み合わせて用いられ得る。出願人は、本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドがまた、サイトカインアンタゴニスト（例えば、IL-6アンタゴニスト）のような、炎症をブロックすることが知られている薬剤と組み合わせて用いられ得ることを予測する。
例えば、本出願人らは、TIEリガンドが腫瘍内の細胞、または腫瘍に密接に関連する細胞内で発現されることを決定している。例えば、TIE-2リガンド２は、腫瘍内皮細胞に緊密に関連しているようである。従って、これおよび他のTIEアンタゴニストはまた、例えば腫瘍成長を防止または減弱することにおいて有用であり得る。さらに、TIEリガンドまたはリガンド体は、レセプター保有細胞への毒素の送達のために有用であり得る。あるいは、増殖因子、サイトカイン、または栄養素のような他の分子は、TIEリガンドまたはリガンド体を介してTIEレセプター保有細胞に送達され得る。本明細書中に記載される改変TIE-2リガンドのようなTIEリガンドまたはリガンド体はまた、TIEレセプターの診断試薬として用いて、インビボまたはインビトロにおいてレセプターを検出し得る。TIEレセプターが疾患状態と関連している場合、改変TIE-2リガンドのようなTIEリガンドまたはリガンド体は、例えば、組織染色または全身イメージングによって、疾患を検出するための診断試薬として有用であり得る。このような試薬には、放射性同位元素、蛍光色素、色素、酵素、およびビオチンが挙げられる。このような診断剤または標的化剤は、Alitaloら、WO95/26364（1995年10月５日公開）、およびBurrows, F.およびP. Thorpe、PNAS（USA）90:8996-9000（1993）（これは、その全体が、本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。
他の実施態様において、本明細書中に記載のTIEリガンド、改変TIE-2を活性化するレセプターリガンドは、造血因子として使用される。種々の造血因子およびそれらのレセプターは、血液内に含まれる種々の細胞型の増殖および／または分化および／または遊走に関与する。TIEレセプターは、初期の造血細胞で発現されるので、TIEリガンドは、これらの細胞の増殖または分化または遊走において匹敵する役割を果たすことが予期される。従って、例えば、TIEを含有する組成物は、インビトロおよびインビボの生物学的な系において調製され、アッセイされ、試験され得、そして以下のいずれかに記載されるように、治療的に使用され得る：Sousa、米国特許第4,810,643号、Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-4364（1985）、Wongら、Science, 228:810-814（1985）; Yokotaら、Proc. Natl. Acad. Sci（USA）81:1070（1984）; Bosselmanら、WO9105795（1991年５月２日公開）「幹細胞因子」、およびKirknessら、WO95/19985（1995年７月27日公開）「造血成熟因子」。従って、改変TIE-2を活性化するレセプターを用いて、正常な造血が抑制される状態（貧血、血小板減少症、白血球減少症、および顆粒球減少症が含まれるが、これらに限定されない）を診断または処置し得る。好ましい実施態様において、改変TIE-2を活性化するレセプターを用いて、患者が疾患を有する状況（例えば、正常な血液細胞レベルの減少を生じた後天性免疫不全症候群（AIDS））において、または造血性集団の増加が所望される臨床的背景（例えば、骨髄移植とともに）において、または放射線照射、化学薬品処置、または化学療法によって生じた形成不全または骨髄抑制（myelosuppression）の処置において、血液細胞前駆体の分化を刺激し得る。
本発明の改変TIE-2を活性化するレセプターはまた、単独で、または他の薬学的に活性な薬剤（例えば、サイトカイン、ニューロトロフィン、インターロイキンなど）と組み合わせて用いられ得る。好ましい実施態様において、リガンドは、幹細胞または他の造血前駆体の増殖を誘導することが知られている多くの上記の因子のいずれか、または造血経路の後期細胞において作用する因子（造血成熟因子、トロンボポイエチン、幹細胞因子、エリスロポイエチン、G-CSF、GM-CSFなどを含むが、これらに限定されない）と組み合わせて用いられ得る。
別の実施態様において、TIEレセプターアンタゴニストを用いて、所望される結果が造血経路の阻害である患者を診断または処置する（例えば、骨髄増殖または血液形成器官の他の増殖性疾患（例えば、血小板血症、真性赤血球増加症、および白血病）を処置するために）。このような実施態様において、処置は、治療的有効量の本明細書中に記載の改変TIEリガンド-2リガンド、TIE抗体、TIEレセプター体、改変TIE-2リガンドの結合体、またはリガンド体もしくはfFCの使用を包含し得る。
本発明はまた、薬理学的に受容可能なビヒクル中に、本明細書中に記載の改変TIE-2リガンドもしくはリガンド体、そのペプチドフラグメント、または誘導体を含有する薬学的組成物を提供する。改変TIEリガンド-2リガンドタンパク質、ペプチドフラグメント、または誘導体は、全身投与または局所投与され得る。当該分野で公知の任意の適切な投与様式が用いられ得る。このような投与様式は、静脈内投与、くも膜下腔内投与、動脈内投与、鼻腔内投与、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、あるいは局所注入または外科移植による投与を包含するが、これらに限定されない。持続放出処方物もまた提供される。
本発明はまた、このような治療用分子に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明はまた、治療経過をモニターすることを目的として、患者から採取したサンプル中の治療用分子の量を測定するために、このようなモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する方法を提供する。
本発明は、改変TIE-2リガンドまたはリガンド体およびそれらに結合した細胞傷害性因子を含む治療用組成物をさらに提供する。１つの実施態様では、細胞傷害性因子は、放射性同位体または毒素であり得る。
本発明はまた、改変TIE-2リガンドに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。
本発明は、以下の工程を包含する、改変TIE-2リガンドを精製する方法をさらに提供する：
ａ）少なくとも１つのTIE結合基質を固体マトリックスに結合させる工程；
ｂ）ａ）の基質を細胞溶解物とともに、その基質が細胞溶解物中のいずれのヒト改変TIE-2リガンドと複合体を形成するようにインキュベートする工程；
ｃ）固体マトリックスを洗浄する工程；および
ｄ）改変TIE-2リガンドを結合基質から溶出する工程。
基質は、改変TIE-2リガンドと特異的に結合する任意の物質であり得る。１つの実施態様では、基質は、抗改変TIE-2リガンド抗体、TIEレセプター、およびTIEレセプター体からなる群から選択される。本発明は、改変TIE-2リガンドと特異的に結合するレセプター体、ならびに薬学的に受容可能なビヒクル中にレセプター体を含む治療用組成物、およびヒトにおいて血管成長をブロックする方法（有効量の治療用組成物を投与することを包含する）をさらに提供する。
本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクル中に改変TIE-2リガンドまたはリガンド体を活性化するレセプターを含む治療用組成物、ならびに有効量の治療用組成物を患者に投与することを包含する、患者の新生血管形成を促進する方法を提供する。
さらに、本発明は、TIEレセプターを発現する細胞を同定する方法を提供する。この方法は、細胞と検出可能に標識されたTIEリガンド-2またはリガンド体とを、検出可能に標識されたリガンドをTIEレセプターに結合させることが可能である条件下で接触させる工程、および検出可能に標識されたリガンドがTIEレセプターに結合されるか否かを決定し、それにより細胞をTIEレセプターを発現する細胞であると同定する工程を包含する。本発明はまた、改変TIE-2リガンドまたはリガンド体およびそれに結合された細胞傷害性因子を含む治療用組成物を提供する。細胞傷害性因子は放射性同位体または毒素であり得る。
本発明はまた、細胞による改変TIE-2リガンドの発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞からmRNAを得る工程、そのようにして得られたmRNAと改変TIE-2リガンドをコードする標識核酸分子とを、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、標識分子にハイブリダイズしたmRNAの存在を決定する工程、およびそれにより細胞における改変TIE-2リガンドの発現を検出する工程を包含する。
本発明は、組織切片において改変TIE-2リガンドの発現を検出する方法をさらに提供する。この方法は、組織切片と改変TIE-2リガンドをコードする標識核酸分子とを、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、標識分子にハイブリダイズしたmRNAの存在を測定する工程、およびそれにより組織切片における改変TIE-2リガンドの発現を検出する工程を包含する。
実施例１-  TIE-2レセプターに対するレポーター細胞としてのABAE細胞株の同定
成体BAE細胞は、ECACC#92010601でEuropean Cell Culture Repositoryに登録されている。（PNAS 75:2621（1978）を参照のこと）。ノーザン（RNA）分析は、ABAE（成体ウシ動脈内皮）細胞株において中程度のtie-2転写レベルを示したが、これは血管内皮細胞へのtie-2 RNAのほぼ独占的な局在化を示したインサイチュでのハイブリダイゼーションの結果と一致する。従って、本発明者らは、TIE-2タンパク質の存在、ならびにこのTIE-2タンパク質が正常対血清欠乏増殖条件下でチロシン-リン酸化される程度について、ABAE細胞溶解物を試験した。ABAE細胞溶解物を採集し、そして免疫沈降に供し、続いて免疫沈降したタンパク質を、TIE-2特異的抗血清およびホスホチロシン特異的抗血清を用いてウエスタンブロット分析に供した。TIE-2免疫沈降の間の特異的ブロック分子としてのTIE-2ペプチドを省くことまたは含ませることにより、約150kDの適度に検出可能なタンパク質として、TIE-2が明白に同定され得、この定常状態ホスホチロシンレベルは、前の細胞の血清飢餓によりほぼ検出不能なレベルまで低下する。
ABAE細胞の培養および細胞溶解物の採集を、以下のように行った。低継代数（low-passage-number）のABAE細胞を、２×106細胞／150mmプラスチックペトリ皿（Falcon）の密度で単層としてプレートし、そして５％CO2雰囲気中、10％仔ウシ血清（10％BCS）、2mM L-グルタミン（Q）ならびに各１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（P-S）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養した。細胞溶解物の採集前に、細胞をDMEM/Q/P-S中で24時間血清飢餓させ、続いて培地を吸引し、そしてオルトバナジウム酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、およびベンズアミジンナトリウムを補充した氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）でプレートをリンスした。細胞を、１％NP40界面活性剤およびプロテアーゼインヒビター（PMSFおよびアプロチニン）を補充した少量のこのリンス緩衝液中に溶解した。不溶性のデブリを、４℃にて10分間、14,000×Gで遠心分離することにより細胞溶解物から取り除き、そして約20μg/mlの溶解物に添加されたブロックペプチドの存在または非存在下で、上清を、TIE-2レセプターに対して特異的な抗血清を用いて免疫沈降に供した。免疫沈降したタンパク質を、PAGE（7.5％Laemmliゲル）により解析し、次いでPVDF膜に電気移動し、そして種々のTIE-2またはホスホチロシン特異的抗血清のいずれかとインキュベートした。HRP結合２次抗血清と共に膜をインキュベートし、続いてECL試薬（Amersham）で処理することにより、TIE-2タンパク質を可視化した。
実施例２-  TIE-2リガンド相互作用の親和性に基づく研究のためのTIE-2レセプター体のクローニングおよび発現
ヒト免疫グロブリンγ-1定常領域（IgG1 Fc）に融合した、ラットTIE-2レセプターの全細胞外部分からなる分泌タンパク質を産生する発現構築物を作製した。この融合タンパク質は、TIE-2「レセプター体」（RB）と呼ばれ、そして個々のIgG1 Fcテール間のジスルフィド結合の形成に基づいて、溶液中でダイマーとして存在することが通常予想される。TIE-2 RBのFc部分を、以下のように調製した。タンパク質のヒンジ領域からカルボキシ末端まで広がる、ヒトIgG1のFc部分をコードするDNAフラグメントを、ヒトIgG1の公開された配列に対応するオリゴヌクレオチドを用いるPCRにより、ヒト胎盤cDNAから増殖し；得られたDNAフラグメントを、プラスミドベクターにクローン化した。完全長TIE-2レセプターをコードするプラスミド由来およびヒトIgG1 Fcプラスミド由来の適切なDNA制限フラグメントを、インフレームでTIE-2およびヒトIgG1 Fcタンパク質コード配列に融合するように設計した短いPCR由来フラグメントのいずれかの側に連結した。このように、得られたTIE-2外表ドメイン（ectodomain）-Fc融合タンパク質は、TIE-2膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに広がる領域の代わりに、IgG1 Fcを正確に置換した。RBの別の調製方法は、Goodwinら、Cell 73:447-456（1993）に記載されている。
TIE-2 RB DNAフラグメントをpVL1393バキュロウイルスベクターにクローニングし、続いてSpodoptera frugiperda SF-21AE昆虫細胞株を感染させることにより、ミリグラム量のTIE-2 RBを得た。あるいは細胞株SF-9（ATCC受託番号CRL-1711）または細胞株BTI-TN-5b1-4を使用し得る。TIE-2 RBをコードするDNAを、Eco RI-NotIフラグメントとして、バキュロウイルス転移プラスミドpVL1393にクローン化した。３μgのプラスミドDNAを0.5μgのBaculo-Gold DNA（Pharminigen）と混合し、続いて30μgのLipofectin（GIBCO-BRL）を用いてリポソームに導入することにより、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製したプラスミドDNAを、ウイルスDNA中に組み換えた。DNA-リポソーム混合物を、27℃にて５時間、TMN-FH培地（改変Grace's昆虫細胞培地（GIBCO-BRL））中のSF-21AE細胞（２×106細胞／60mm皿）に添加し、続いて５％ウシ胎児血清を補充したTMN-FH培地中で、27℃にて５日間インキュベートした。組織培養培地を、組換えウイルスのプラーク精製のために採集し、この精製は、アガロース重層が125μg/mLのX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド；GIBCO-BRL）を含んでいたこと以外は、前記の方法（0'Reilly,D.R.、L.K.Miller、およびV.A.Luckow、Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual. 1992、New York:W.H.Freeman）を用いて行った。27℃にて５日間のインキュベーション後、非組換えプラークを、X-gal基質に対する陽性色素反応により記録し、そしてそれらの位置に印を付けた。次いで、組換えプラークを、100μg/mLのMTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］2,5,ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；Sigma）を含む第２の重層の添加により可視化した。推定組換えウイルスプラークを、プラグ吸引（plug aspiration）により採集し、そして多回ラウンドのプラーク単離により精製し、均質性を確実にした。ウイルスストックを、プラーク精製ウイルスの連続した低多重度の継代（serial, low-multiplicity passage）により作製した。１つのウイルスクローン（vTIE-2レセプター体）の低継代ストックが産生された。
SF-21AE細胞を、１×抗生物質／抗真菌剤溶液（Gibco BRL）および25mg/Lゲンタマイシン（Gibco BRL）を含有する無血清培地（SF-900 II、Gibco BRL）中で培養した。Pluronic F-68を、界面活性剤として１g/Lの最終濃度まで添加した。培養物（４L）を、感染前に少なくとも３日間バイオリアクター（Artisan Cell Station System）中で培養した。27℃で、80mL/分のガス流速にて、50％の溶存酸素までガスを通気しながら（スパージリング（sparge ring）にて通気）、細胞を増殖させた。100rpmの速度にて、攪拌翼（marine impeller）により攪拌した。細胞を中間対数増殖期（約２×106細胞/mL）で採集し、遠心分離により濃縮し、そして１細胞あたりvTIE-2レセプター体の５プラーク形成単位で感染させた。細胞および接種物を、新鮮な培地で400mLにし、そしてウイルスを、スピンナーフラスコ（spinner flask）中、27℃にて２時間吸着させた。次いで、培養物を、新鮮な無血清培地を含む８Lの最終容量に再懸濁し、そして細胞を、前記の条件を用いてバイオリアクター中でインキュベートした。
vTIE-2レセプター体感染SF21AE細胞由来の培養培地を、感染72時間後で遠心分離（500×g、10分）により採取した。細胞上清をNaOHでpH8にした。EDTAを10mMの最終濃度まで添加し、そして上清のpHを８に再調整した。上清を濾過（0.45μm、Millipore）し、そしてプロテインＡカラム（プロテインＡセファロース４ファストフローまたはHiTrapプロテインＡ、両方ともPharmaciaから入手）にロードした。280nmでの吸光度がベースラインまで低下するまで、カラムを、0.5M NaClを含有するPBSで洗浄した。カラムをPBSで洗浄し、そして0.5M酢酸で溶出した。カラム画分を、１M Tris（pH9）を含有するチューブ中に溶出することにより、直ちに中和した。TIE-2レセプター体を含有するピーク画分をプールし、そしてPBSに対して透析した。
実施例３-  TIE-2が血管の発達に重要な役割を有することの実証
「過剰」の可溶性TIE-2レセプター体（TIE-2 RB）を発達系に導入することにより、TIE-2の機能への洞察が得られた。TIE-2 RBが利用可能なTIE-2リガンドへ結合し、それゆえ中和するという潜在的な能力を有することにより、正常な血管発達の観察可能な崩壊およびリガンドの特徴づけが可能となる。TIE-2 RBが、初期トリ胚において血管発達を崩壊させるのに使用され得るかどうかを試験するために、生体再吸収性フォームの小片を、TIE-2 RBで浸漬し、そして初期胚に対してちょうど横の位置で、漿尿膜の直下に挿入した。
初期ニワトリ胚は、漿尿膜（CAM）により覆われる細胞の小さなディスクから卵黄の頂上に発達する。胚において血管系を裏打ちする内皮細胞は、胚外細胞源および胚内細胞源の両方から生じる。胚外由来の内皮細胞（これは、胚における内皮細胞のための主要な発達源を提供する）は、胚固有（embryo-proper）の側面周囲（CAMの直下）に位置する間葉の付着成長から生じる。これらの間葉細胞が成熟すると、内皮細胞系および造血細胞系の両方の共通の始原細胞（血管芽細胞（hemangioblast）と呼ばれる）を生じる。今度は、血管芽細胞は、血管芽細胞（angioblast）（内皮細胞始原細胞）および血球芽細胞（多能性造血前駆体）の混合集団を生じる。循環系の原基痕跡の形成は、内皮細胞子孫が分離して、初期血液細胞を取り囲む１細胞厚の小胞を形成するとき開始する。これらの細胞成分の増殖および遊走により、最後には胚に入り、限定された胚内由来の血管成分と結合する、CAM下の血液充填毛細血管の巨大な網が最終的に生成される。
Spafas,Inc.（Boston,MA）から得た新たに受精させたニワトリ卵を、99.5°F、55％ RHにてインキュベートした。発達約24時間で、卵殻を70％エタノールで拭き、そして歯科医のドリルを用いて各卵の鈍頂に1.5cmの穴を開けた。殻膜を取り除くと、胚の直上に気室が現れた。滅菌Gelfoam（Upjohn）の長方形の小片を外科用メスで切り取り、そして等濃度のTIE-2レセプター体またはEHK-1レセプター体のいずれかに浸漬した。EHK-1レセプター体を、TIE-2細胞外ドメインの代わりにEHK-1細胞外ドメインを用いて、実施例２に示すように作製した（Maisonpierreら、Oncogene 8:3277-3288（1993））。各Gelfoam片は、30μl中の約６μgのタンパク質を吸収した。滅菌時計工ピンセットを用いて、初期胚に対して数ミリメートル横の位置で、CAMに小さな裂け目を作製した。RB浸漬したGelfoam片の大部分を、CAM下に挿入し、そして卵殻を一片の接着テープでシールした。他の同様の期の卵を、無関係のニューロン発現レセプターチロシンキナーゼ（EHK-1（Maisonpierreら、Oncogene 8:3277-3288（1993））のRBと平行して処理した。４日間発達を進行させ、次いで胚を視覚検査により試験した。加温PBS皿中で殻を注意深く割り、そして周囲のCAMと共に胚を注意深く切り出すことにより胚を取り出した。それぞれRBで処理した12の卵のうち、６つのTIE-2 RBおよび５つのEHK-1 RB処理胚は、実験開始時に観察された期を過ぎても発達した。図1Aおよび1Bに示すように、これらの発達した胚間に劇的な差が見られた。EHK-1 RBで処理した胚は、比較的正常に発達したようであった。５つのEHK-1胚のうち４つは、心臓の鼓動の存在により判定されるように生存可能であった。さらに、胚外血管（これは、赤血球の存在により視覚的に明らかである）は、豊富であり、そしてCAM下で数センチメートル横に延びていた。対照的に、TIE-2 RBで処理した胚は、重度に発育不全であり、EHK-1 RB胚では直径が10mmを超えることと比較して、直径が２〜５mmの範囲内であった。TIE-2 RB処理した胚は全て死滅し、そしてそれらのCAMには血管がない。TIE-2 RBがニワトリにおいて血管発達をブロックする能力は、TIE-2リガンドが血管系の発達にとって必要であることを実証する。
実施例４：rasオンコジーン形質転換C2C12マウス筋芽細胞株からの条件付培地中のTIE-2特異的結合活性の同定
可溶性、TIE-2-特異的結合活性（BIAcore ; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）の存在についての種々の細胞株からの10倍濃縮の細胞条件付培地（10×CCM）のスクリーニングにより、オンコジーンras形質転換C2C12細胞（C2C12-ras）、RAT 2-ras（これは、ras形質転換線維芽細胞株）、ヒト神経膠芽腫T98GおよびSHEP-1として公知のヒト神経芽腫細胞株から、無血清培地中の結合活性が明らかになった。
C2C12-ras 10×CCMは、標準的なリン酸カルシウムに基づく方法によりH-rasのT-24変異体でのトランスフェクションによりオンコジーン的に形質転換された安定にトランスフェクトしたC2C12筋芽細胞株に由来した。SV40に基づくネオマイシン耐性発現プラスミドを、トランスフェクトしたクローンの選択を可能にするために、物理的にras発現プラスミドに連結させた。得られたG418耐性ras-C2C12細胞は、日常的にプラスチックディッシュ上の単層として10％の仔ウシ胎児血清（FCS）を補充したDMEM/グルタミン/ペニシリン−ストレプトマイシン中で維持した。無血清C2C12-ras 10×CCMを、無血清規定培地で12時間、細胞を60％のコンフルエンスでプレートすることにより作製した（ZhanおよびGoldfarb, Mol. Cell.Biol. 6:3541-3544（1986）; Zhanら、Oncogene 1:369-376（1987））。培地を捨て、そして新鮮なDMEM/Q/P-Sで24時間置換した。この培地を採集し、そして細胞に新鮮なDMEM/Q/P-Sを再供給し、これもまたさらなる24時間後に採集した。これらのCCMにプロテアーゼインヒヒビターPMSF（1mM）およびアプロチニン（10μg/ml）を補充し、そして滅菌サイズ除外メンブレン（Amicon）上で10倍に濃縮したTIE-2結合活性は、過剰のTIE-2 RBとの培地のインキュベーションにより中和され得るが、BIAcore分析前のEHK-1 RBとのインキュベーションによっては中和され得ない。
10×CCMの結合活性を、バイオセンサー技術を用いて測定した（BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）。これは、表面プラスモン共鳴を介してリアルタイムに生体分子相互作用をモニターする。精製TIE-2 RBは、第一級アミンを介してCM5研究用センサーチップ（Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）のカルボキシメチルデキストラン層に共有結合した。センサーチップ表面は、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）とN-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）との混合物を用いて活性化し、続いてTIE-2 RB（25μg/mL、pH4.5）を不動化し、そして1.0Mエタノールアミン（pH8.5）で未反応部位を不活化した。EHK-1レセプター体のネガティブコントロール表面を同様の様式で調製した。
系で使用したランニング緩衝液はHBS（10mM Hepes, 3.4mM EDTA, 150mM NaCl, 0.005% P20界面活性剤、pH7.4）であった。10×CCMサンプルを４℃で15分間遠心分離し、そしてさらに、無菌の低タンパク質結合0.45μmフィルター（Millipore ; Bedford、MA）を用いて明澄化した。デキストラン（2mg/ml）およびP20界面活性剤（0.005％）を各CCMサンプルに添加した。40μLのアリコートを不動化表面（TIE-2またはEHK-1）を横切って、５μL/分の低速で注射し、そしてレセプター結合を８分間モニターした。結合活性（共鳴単位、RU）をサンプル注射の30秒前に決定した基底値と注射後30秒でとった測定との間の差違として測定した。表面の再生を１つの3M MgCl2の12μLパルスで達成した。
装置のノイズレベルは20RUであり；従って、20RUを超えるシグナルを有する任意の結合活性が、レセプターとの実際の相互作用と解釈され得る。C2C12-ras条件付培地については、結合活性は、TIE-2 RB不動化表面について60〜90RUの範囲内であった。EHK-1 RB不動化表面上でアッセイした同一のサンプルについて、測定された活性は、35RU未満であった。TIE-2レセプター体に対する特異的な結合を、サンプルを結合活性のアッセイ前に過剰の可溶性TIE-2またはEHK-1 RBのいずれかとのサンプルのインキュベートすることにより評価した。可溶性EHK-1 RBの添加は、いずれのサンプルのTIE-2結合活性にも影響しなかったが、可溶性TIE-2の存在下、表面に対する結合は、TIE-2の非存在下において測定された活性より２／３、より少なかった。＞50×に濃縮したC2C12-ras CCMを用いる反復アッセイは、TIE-2特異的結合シグナルのバックグラウンドに対して４倍の増強を生じた。
実施例５
C2C12-ras CCMは、TIE-2レセプターのチロシンリン酸化を誘導する活性を含む
C2C12-ras 10×CCMを、ABAE細胞におけるTIE-2のチロシンリン酸化を誘導する能力について試験した。血清飢餓ABAE細胞を、上記のように手短にC2C12-ras CCMとインキュベートし、細胞溶解し、そして免疫沈降およびウェスタン分析に供した。血清飢餓ABAE細胞の無血清C2C12-ras 10×CCMでの刺激は、以下のように行った。上記のように飢餓にさせたABAE細胞の培地を除去し、そして37℃に予め温めた規定培地または10×CCMのいずれかで置換した。10分後、培地を除去し、そして細胞を氷上でオルトバナデート/NaF/ベンザミジンを補充した過剰の冷PBSで２回リンスした。細胞溶解物およびTIE-2特異的免疫沈降を以下のように行った。
規定培地と10分間インキュベートしたABAE細胞は、TIE-2チロシンリン酸化の誘導を示さなかったが、C2C12-ras CCMとのインキュベーションは、TIE-2リン酸化において少なくとも100×の増加を刺激した。この活性は、室温で90分間、プロテインＧ−Sepharoseビーズに結合した13μgのTIE-2 RBとのC2C12-ras 10×CCMのプレインキュベーションにより、ほとんどすべて枯渇された。プロテインＧ−Sepharose単独とインキュベートした培地では、このリン酸化活性が枯渇化されていなかった。
実施例６  TIE-2リガンドの発現クローニング
COS-7細胞を、10％の仔ウシ血清（FBS）、各１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（P/S）ならびに２mMグルタミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中で、５％CO2雰囲気中で培養した。マウス筋芽細胞C2C12-ras細胞株を、10％のFBS（P/S）および２mMグルタミンを含むイーグル最小必須培地（EMEM）で培養した。全長マウスTIE-2リガンドcDNAクローンを、COS細胞で発現させたpJFE14ベクターにおいてC2C12ras cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得た。このベクターは、図２に示されるように、ベクターpSRαの改変版である（Takebeら、1988、Mol.Cell.Biol.８ : 466-472）。ライブラリーをpJFE14ベクターの２つのBSTX1制限部位を使用して作製した。
COS-7細胞を、pJFE14ライブラリーまたはコントロールベクターのいずれかでDEAEデキストランスフェクションプロトコルにより一過的にトランスフェクトした。手短には、COS-7細胞を、1.0×106細胞／100mmプレートの密度で、トランスフェクションの24時間前、プレートした。トランスフェクションについて、細胞を、400μg/mlのDEAEデキストラン、１μMクロロキン、および2mMグルタミンを含有する無血清DMEM、ならびに１μgの適切なDNA中で、３〜４時間、37℃にて、５％CO2雰囲気中で培養した。トランスフェクション培地を吸引し、そして10％DMSOを含むPBSで２〜３分間で置換した。このDMSO「ショック」に続き、COS-7細胞を、10％FBS、各１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２mMグルタミンを含むDMEM中で４８時間プレートした。
TIE-2リガンドは分泌されるので、細胞を透過させてリガンドに対するレセプター体プローブの結合を検出することが必要であった。トランスフェクションの２日後、細胞をPBSでリンスし、次いで、1.8％のホルムアルデヒドを含むPBSと15〜30分間室温でインキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、そして15分間0.1％Triton X-100および10％仔ウシ血清を含むPBSとインキュベートし、細胞を透過させ、そして非特異的な結合部位をブロックした。
スクリーニングを、TIE-2レセプター体（RB）を用いて染色の直接局在化により実施した。これは、IgG1定常領域に融合させたTIE-2の細胞外ドメインからなる。このレセプター体は、実施例２に示されるように調製した。トランスフェクトされ、固定化され、そして透過されたCOS細胞の100mmディッシュを、TIE-2 RBと30分間それらをインキュベートすることによりプローブした。次いで、これらの細胞をPBSで二回洗浄し、そしてPBS／10％仔ウシ血清／抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ結合体とさらに30分間、インキュベートした。3回のPBSでの洗浄後、細胞をアルカリホスファターゼ基質中で30〜60分間インキュベートした。次いで、ディッシュを染色された細胞の存在について顕微鏡で検査した。各々の染色された細胞について、染色された細胞を含む複数の細胞の小領域を、プラスチックのピペットチップでディッシュから掻き取り、次いでプラスミドDNAをレスキューし、そしてこれを使用して細菌細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから得られた単一の細菌コロニーを選択し、そしてこれらのコロニーから調製したプラスミドDNAを使用して、COS-7細胞をトランスフェクトした。これを、TIE-2レセプター体に対して結合することにより証拠づけられるように、TIE-2リガンド発現についてプローブした。これは、TIE-2リガンドをコードする単一クローンの同定を可能にした。TIE-2リガンド発現の検証は、実施例５に示した方法を用いてTIE-2レセプターのリン酸化により得られた。TIE-2リガンドをコードするプラスミドクローンを、ATCCに1994年10月７日に寄託し、そして「TIE-2リガンドをコードするpJFE14」（ATCC受託番号第75910号）と指定された。
実施例７−ヒトTIE-2リガンドをコードする全長cDNAクローンの単離および配列決定
λgt-10中のヒト胎児肺cDNAライブラリー（図３を参照のこと）は、Clontech Laboratories, Inc.（Palo Alto, CA）から得られた。プラークを1.25×106/20×20cmプレートの密度でプレートし、レプリカフィルターを標準的な手順（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、8.46頁、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprign Harbor, New York）に従って採った。
ヒトtie-2リガンドクローンの単離は、以下のように実施した。寄託されたtie-2リガンドクローン（ATCC NO. 75910−上記実施例６を参照のこと）からの2.2kb XhoIフラグメントをランダムプライミングにより約５×108cpm/ngの比活性で標識した。ハイブリダイゼーションを65℃で、0.5mg/mlのサケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中で実施した。フィルターを65℃で、２×SSC、0.1％SDS中で洗浄し、そしてKodak XAR-5フィルムに一晩−70℃で曝露させた。ポジティブファージをプラーク精製した。精製ファージの高い力価のファージ溶解物を、Qiagenカラムを介して標準的な技術を使用するDNAの単離に使用した（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995カタログ、36頁）。ファージDNAをEcoRIで消化し、クローン化したcDNAフラグメントを引き続くサブクローニングのために放出させた。ヒトtie-2リガンドDNAを含むλファージベクターをATCCに1994年10月26日に、名称htie-2リガンド１をコードするλgt10（ATCC受託番号第75928号）で寄託した。ファージDNAは、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sangerら、1977、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467）によりDNA配列分析に直接供し得る。
ヒトtie-2リガンドDNAの哺乳動物発現ベクターへのサブクローニングは、以下のように達成され得る。htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10は、ヒトTIE-2リガンドのコード配列の開始から490塩基対下流に位置するEcoRI部位を含有する。コード領域は、それぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流の独特の制限部位を使用して、切り出され得る。例えば、SpeI部位（開始コドンから70bp 5'に位置する）およびBpu1102i（これはまた、BlpIとして知られる）部位（終止コドンから265bp 3'に位置する）を使用して、完全なコード領域を切り出し得る。次いで、これを、XbaI（SpeIオーバーハングと適合性）およびPstI部位（Pst1およびBpu1102i部位は、ともに平滑末端となる）を使用して、pJFE14クローニングベクターにサブクローン化し得る。
htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10からのコード領域を、ABI 373A DNA配列決定器およびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA）を用いて、配列決定した。htie-2リガンド１をコードするクローンλg10からのヒトTIE-2リガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は図４に示される。
さらに、全長ヒトtie-2リガンドcDNAクローンを、pJFE14ベクター中のヒト神経膠芽腫T98G cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより得た。ヒトTIE-2リガンドをコードするクローンは、寄託されたTie-2リガンドクローン（ATCC第75910号）からの2.2kb XhoIフラグメントをプローブとして用いて、DNAハイブリダイゼーションにより同定された（上記実施例６を参照のこと）。コード領域を、ABI 373A DNA配列決定器およびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA）を用いて、配列決定した。この配列は、htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10の配列とほとんど同一であった。図４に示されるように、htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10は、さらなるグリシン残基を含む。これは、ヌクレオチド1114〜1116でコードされる。T98Gクローンのコード領域は、このグリシン残基を含まないが、それ以外は、htie-2リガンド１をコードするクローンλgt10のコード配列と同一であった。図５は、T98GクローンからのヒトTIE-2リガンドのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
実施例８−ヒトTIE-2リガンドをコードする第二の全長cDNAクローンＡの単離および配列決定
λgt-10中のヒト胎児肺cDNAライブラリー（図３を参照のこと）を、Clontech Laboratories, Inc.（Palo Alto, CA）から得た。プラークを1.25×106/20×20cmプレートの密度でプレートし、レプリカフィルターを標準的な手順（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、8.46頁、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）に従って採った。複製のフィルターを低ストリンジェンシー（２×SSC、55℃）で、ヒトTIE-2リガンド１配列に対して作製されたプローブでスクリーニングした。複製フィルターの一つを5'プローブ（図４に示したヒトTIE-2リガンド１配列のアミノ酸25〜265をコードする）でプローブした。第二の複製フィルターをヒトTIE-2リガンド１配列のアミノ酸282〜498をコードする（図４を参照のこと）3'プローブでプローブした。両方のプローブを55℃で、0.5mg/mlのサケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイズした。フィルターを55℃で、２×SSC中で洗浄し、そしてＸ線フィルムに一晩曝露させた。さらに、複製フィルターはまた、マウスのTIE-2リガンド１の完全長コードプローブ（F3-15、XhoIインサート）に対して通常のストリンジェンシー（２×SSC、65℃）でハイブリダイズした。以下の規準を満たす３つのポジティブクローンを選択した：i.通常のストリンジェンシーで全長（マウス）プローブに対してハイブリダイゼーションが見られなかった、そしてii.5'プローブおよび3'プローブの両方に対して低ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションが見られる。これらのクローンから得られたファージDNAのEcoRI消化は、約2.2kbおよび約1.8kbのインサートサイズを有する２つの独立したクローンを示した。2.2kb EcoRIインサートを、pBluescript KS（Stratagene）およびCOS細胞における使用に適した哺乳動物発現ベクターの両方のEcoRI部位にサブクローン化した。２つの方向を哺乳動物発現ベクターについて同定した。pBluescript KS中の2.2kbインサートは、ATCCに、1994年12月９日に寄託され、そしてヒトTIE 2リガンド２をコードするpBluescript KSと指定された。TIE-2リガンド２コード配列の開始部位は、pBluescriptのEcoRI部位の約355塩基対下流である。
COS-7細胞を、DEAE-デキストラントランスフェクションプロトコルによって、発現ベクターまたはコントロールベクターのいずれかで一過性にトランスフェクトした。手短には、COS-7細胞を、トランスフェクションの24時間前、1.0×106細胞／100mmプレートの密度にてプレートした。トランスフェクションのために、細胞を、400μg/mlのDEAE-デキストラン、１μMのクロロキン、および２mMのグルタミンを含む無血清DMEM、ならびに１μgの適切なDNA中で、５％CO2の雰囲気において37℃にて３〜４時間培養した。トランスフェクション培地を吸引し、そして10％DMSOを含むリン酸緩衝化生理食塩水で２〜３分間置換した。このDMSO「ショック」後、COS-7細胞を、10％FBS、各々１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２mMのグルタミンを含むDMEM中に48時間置いた。
TIE-2リガンドは分泌されるため、レセプター体プローブのリガンドへの結合を検出するために細胞を透過性にすることが必要であった。トランスフェクトしたCOS-7細胞を、1.0×106細胞／100mmプレートの密度にてプレートした。細胞を、PBSでリンスし、次いで1.8％のホルムアルデヒドを含むPBSとともに室温にて15〜30分間インキュベートした。次いで、細胞を、PBSで洗浄し、そして0.1％Triton X-100および10％仔ウシ血清を含むPBSとともに15分間インキュベートし、細胞を透過性にし、そして非特異的結合部位をブロックした。IgG1定常領域に融合したTIE-2の細胞外ドメインからなるTIE-2レセプター体を用いた染色の直接局在化によって、スクリーニングを実施した。このレセプター体を実施例２に示すように調製した。トランスフェクトしたCOS細胞を、それらをTIE-2レセプター体とともに30分間インキュベートすることによってプローブした。次いで、細胞を、PBSで２回洗浄し、メタノールで固定し、次いでPB/10％仔ウシ血清/抗ヒトIgG-アルカリホスファターゼ結合体とともにさらに30分間インキュベートした。３回のPBS洗浄の後、細胞をアルカリホスファターゼ基質中で30〜60分間インキュベートした。次いで、ディッシュを染色された細胞の存在について微視的に調べた。他方の方向ではなく、一方の方向のクローンを発現する細胞は、TIE-2レセプター体に結合するのが見られた。
当業者は、記載される方法が、TIEリガンドファミリーの他の関連するメンバーをさらに同定するために使用され得ることを容易に理解する。
ヒトTIE-2リガンド２をコードするクローンpBluescript KS由来のコード領域を、ABI 373A DNAシークエンサーおよびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を用いて配列決定した。ヒトTIE-2リガンド２をコードするクローンpBluescript KS由来のヒトTIE-2リガンドのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、図６に示す。
実施例９-  TIE-2リガンド２はレセプターアンタゴニストである
TIE-2リガンド２（TL2）またはTIE-2リガンド１（TL1）のいずれかを発現するCOS細胞由来の馴化培地を、ヒト内皮細胞株中に天然に存在するTIE-2レセプターを活性化するそれらの能力について比較した。
リポフェクトアミン試薬（GIBCO-BRL, Inc.）および推奨されるプロトコルを使用して、pJFE14発現ベクター単独、ヒトTIE-2リガンド１cDNAを含むpJFE14ベクター、またはヒトTIE-2リガンド２cDNAを含むpMT21発現ベクター（Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693）のいずれかで、COS-7細胞をトランスフェクトした。分泌されたリガンドを含むCOS培地を、３日後収集し、そしてダイアフィルトレーション（DIAFLO限外濾過膜、Amicon, Inc.）によって20倍に濃縮した。これらの培地中に存在する活性なTIE-2リガンド１およびTIE-2リガンド２の量を決定し、そしてBIAcore結合アッセイによって測定されるTIE-2レセプター特異的結合活性の量として（共鳴単位R.U.で）表した。
ノーザン（RNA）分析は、HAEC（ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cell））ヒト初代内皮細胞（Clonetics, Inc.）におけるTIE-2転写物の有意なレベルを示した。従って、これらの細胞を使用して、TIE-2リガンドを含むCOS培地に曝露された場合、TIE-2レセプターがチロシン-リン酸化されるか否かを調べた。HAEC細胞を、５％のウシ胎児血清、可溶性ウシ脳抽出物、10ng/mlのヒトEGF、１mg/mlのヒドロコルチゾン、50mg/mlのゲンタマイシン、および50ng/mlのアンホテリシン-Bを含む完全内皮細胞増殖培地（Clonetics, Inc.）中に維持した。TL1およびTL2がHAEC細胞においてTIE-2レセプターを活性化し得るか否かの評価を以下のように実施した。半コンフルエントのHAEC細胞を、添加したL-グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを有する高グルコースダルベッコMEM中で、37℃にて２時間血清飢餓にし、次いで飢餓培地を、リガンド含有馴化COS培地で５％CO2インキュベーター中で37℃にて７分間置換した。次いで、正確に実施例１において記載されるように、細胞を溶解し、そしてTIE-2レセプタータンパク質をTIE-2ペプチド抗血清での溶解物の免疫沈降によって回収し、次いで抗ホスホチロシン抗血清を用いたウエスタンブロッティングを行った。結果を図７に示す。TIE-2レセプター（TIE-2-R）に対するホスホチロシンレベルは、TIE-2リガンド２（レーンL2）馴化COS培地によっては誘導されなかったが、TIE-2リガンド１（レーンL1）でのHEAC細胞の処理によって誘導された。MOCKは、JFE14空ベクターでトランスフェクトされたCOS由来の馴化培地である。
TL1およびTL2の両方がTIE-2レセプターに特異的に結合するという証拠を、BIAcoreを用いて、トランスフェクトしたCOS培地におけるTIE-2レセプター特異的結合活性をアッセイすることによって、ならびにTIE-2レセプター体でのTL1-およびTL2-発現COS細胞の免疫染色によって実証した。
TL2はTIE-2レセプターを活性化しなかったため、本出願人らは、TL2がTL1活性のアンタゴニストとして作用し得るか否かを決定するための設計をした。HAECリン酸化アッセイを実施し、ここで細胞をまず「過剰」のTL2とともにインキュベートし、次いで希釈TL1を添加した。高レベルのTL2に起因するTIE-2レセプターの先の占有は、限界濃度にて存在するTL1への曝露後のレセプターのその後の刺激を妨げ得ると論証した。
半コンフルエントのHAEC細胞を上記のように血清飢餓にし、次いで１〜２mlの20×COS/JFE14-TL2馴化培地とともに、37℃にて３分間インキュベートした。コントロールプレートを20×COS/JFE14単独培地（MOCK）で処理した。プレートをインキュベーターから取り出し、次いで種々の希釈のCOS/JFE14-TL1培地を添加し、次いで37℃にて５〜７分間プレートをさらにインキュベートした。次いで、細胞をリンスし、溶解し、そして溶解物におけるTIE-2特異的チロシンリン酸化を、上記のように、レセプター免疫沈降およびウエスタンブロッティングによって調べた。TL1希釈物を、20×COS/JFE14単独培地の添加によって、２×、0.5×、0.1×、または0.02×に希釈した20×COS/JFE14-TL1培地を用いて作製した。BIAcoreバイオセンサー技術を用いた一次の20×TL1および20×TL2 COS培地のアッセイは、それらが類似の量のTIE-2-特異的結合活性（すなわち、TL1およびTL2についてそれぞれ445R.U.および511R.U.）を含むことを示した。図８に示す抗ホスホチロシンウエスタンブロットの結果は、MOCK培地でのHAEC細胞の前処理（レーン１）と比較した場合、過剰のTIE-2リガンド２でのHAEC細胞の前処理（レーン２）が、TIE-2レセプター（TIE-2-R）を活性化する希釈TIE-2リガンド１のその後の能力に拮抗することを示す。
TIE-2-RのTL1活性化を競合的に阻害するTL2の能力を、ヒト細胞ハイブリッド株、EA.hy926（この細胞株およびその維持の詳細な記載については実施例21を参照のこと）を用いてさらに実証した。TL1を含む非濃縮COS細胞培地を、変化する希釈にてMOCK-またはTL2-のいずれかの馴化培地と混合し、そして血清飢餓EA.hy926細胞単層上に37℃にて５分間置く実験を実施した。次いで培地を除去し、細胞を溶解によって収集し、そしてTIE-2-特異的チロシンリン酸化を、上記のように、ウエスタンブロッティングによって調べた。図９は、左から右に見て、３つの群の処理を含む実験を示す。左側の４つのレーンにおいて示されるように、１×COS-TL1単独でのEA.hy926細胞の処理はこれらの細胞中の内因性TIE-2-Rを強固に活性化したが、一方１×TL2 COS培地は不活性であった。しかし、MOCKまたはTL2のいずれかとのTL1の混合は、TL2が用量依存性様式でTL1の活性をブロックし得ることを実証した。中央の３つの対のレーンにおいて、TL2（またはMOCK）の比が減少され、対応して、混合物中のTL1の量は0.1×から0.3×に増加された。これらの混合比のいずれにおいても、TL1：TL2レーンは、対応するTL1：MOCKレーンのものと比較してTIE-2-Rリン酸化の減少したレベルを示した。しかし、TL1の量を定常に保持し、そしてTL2（またはMOCK）の量を減少した場合（右側の３つの対のレーンに示す）、サンプル中のTL2が薄すぎてTL1活性を有効に阻害し得ないという点を達成した。これらの馴化COS培地中に存在する各リガンドの相対的な量を、BIAcoreアッセイによって測定されるようなそれらの結合単位から、およびリガンド特異的抗体を有するCOS培地のウエスタンブロットから見積り得た。結果的に、数倍のみのモル過剰のTL2が、インビトロでのTL1の活性を有効にブロックするために必要とされることを、本発明者らは推測し得る。このことは重要である。なぜなら、本発明者らは、TL2 mRNAがTL1のものと比較してかなりの豊富さを達成するインビボでの別の例（実施例17および図16を参照のこと）を観察したからである。従って、TL2は、これらの部位でのTIE-2-Rによるシグナリングを有効にブロックする際に重要な生理学的役割を果たし得る。
合わせると、これらのデータは、TL1と異なり、TL2が内皮細胞上の内因的に発現されたTIE-2-Rを刺激し得ないことを確証する。さらに、数倍のモル過剰にてTL2は、TIE-2レセプターのTL1刺激をブロックし得、このことは、TL2が天然に存在するTIE-2レセプターのアンタゴニストであることを示す。
実施例10-  馴化培地およびCOS細胞上清におけるTIE-2特異的結合活性の同定
ヒトTIE-2リガンド１（hTL1）またはヒトTIE-2リガンド２（hTL2）のいずれかでのトランスフェクション後、細胞株C2C12-ras、Rat2ras、SHEP、およびT98G、またはCOS細胞上清由来の10×CCMの結合活性を、表面プラズモン共鳴（SPR）を介してリアルタイムで生体分子相互作用をモニターするバイオセンサー技術（BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を用いて測定した。精製したラットまたはヒトTIE-2 RBを、CM5研究グレードセンサーチップ（Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ）のカルボキシメチルデキストラン層に、一級アミンを介して共有結合させた。センサーチップ表面を、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）およびN-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の混合物を用いて活性化し、次いでTIE-2 RB（25μg/mL, pH 4.5）の固定化、および1.0Mエタノールアミン（pH 8.5）での未反応部位の不活性化をした。一般に、9000〜10000RUの各レセプター体をセンサーチップに結合させた。
系において使用したランニング緩衝液はHBS（10mM Hepes, 150mM NaCl, 0.005％P20界面活性剤（pH 7.4））であった。サンプルを４℃にて15分間遠心分離し、さらに滅菌した低タンパク質結合0.45μmフィルター（Millipore; Bedford, MA）を用いて澄明化した。デキストラン（２mg/ml）およびP20界面活性剤（0.005％）を各サンプルに添加した。40μLのアリコートを、固定化した表面（ラットまたはヒトのいずれかのTIE-2）を通して５μL/分の流速で注入し、そしてレセプター結合を８分間モニターした。結合活性（共鳴単位、RU）を、サンプル注入の30秒前に決定したベースライン値と注入30秒後に取った測定値との間の差として測定した。表面の再生を、１回の15μLの3M MgCl2のパルスを用いて達成した。
CCMサンプル（C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP, T98G）を、ラットTIE-2 RB固定化表面上で試験し、一方で組換えhTL1およびhTL2をヒトTIE-2 RB固定化表面上で試験した。各場合において、TIE-2レセプター体への特異的な結合を、結合活性をアッセイする前に、25μg/mlの可溶性TIE-2（ラットもしくはヒト）RBまたはtrk RBのいずれかとともにサンプルをインキュベートすることによって評価した。図10および11において示されるように、可溶性trkB RBの添加は、TIE-2結合活性におけるわずかな減少を引き起こし、一方可溶性TIE-2 RBの添加は、TIE-2 RBの非存在下で測定したものと比較した場合、結合活性を有意に減少する。
実施例11-  TIE-2 RBは、TIE-2リガンド１によるTIE-2レセプターの活性を特異的にブロックする
本出願人らは、可溶性TIE-2 RBが、TIE-2リガンド１（TL1）によるTIE-2レセプターの活性化をブロックするための競合的インヒビターとして作用し得るか否かを決定することを試みた。これをするため、TL-1含有COS培地を、TIE-2-またはTrkB-RBのいずれかとともにプレインキュベートし、次いでヒト内皮細胞株中に天然に存在するTIE-2レセプターを活性化するそれらの能力について比較した。
馴化COS培地を、pJFE14発現ベクター単独（MOCK）またはヒトTIE-2リガンド１cDNAを含むpJFE14ベクター（TL1）のいずれかでトランスフェクトしたCOS-7細胞から生成し、そして、培地を滅菌濾過したが濃縮しなかったことを除いて、本明細書中上記の実施例９に記載されるように収集した。TL1の量を決定し、そしてBIAcore結合アッセイによって測定されるTIE-2レセプター-特異的結合活性の量（共鳴単位、R.U.で）として表した。
ノーザン（RNA）分析は、HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell））ヒト初代内皮細胞（Clonetics, Inc.）におけるtie-2転写物の有意なレベルを示した。従って、これら細胞を使用して、TIE-2レセプターが、TIE-2-またはTrkB-RBの存在下でTL1を含むCOS培地に曝露された場合、チロシン-リン酸化され得るか否かを調べた。HUVEC細胞を、５％ウシ胎児血清、10μg/mlのヘパリンでの可溶性ウシ脳抽出物、10ng/mlのヒトEGF、１μg/mlのヒドロコルチゾン、50μg/mlのゲンタマイシン、および50ng/mlのアンホテリシン-Bを含む完全内皮細胞増殖培地（Clonetics, Inc.）中に、37℃、５％CO2にて維持した。TL1がHUVEC細胞においてTIE-2レセプターを活性化し得るか否かの評価を以下のように実施した。HUVEC細胞のコンフルエントなディッシュを、低グルコースダルベッコMEM中で37℃、５％CO2にて２〜４時間血清飢餓にし、次いで0.lmMのオルトバナジン酸ナトリウム（ホスホチロシンホスファターゼの強力なインヒビター）を含む飢餓培地において10分インキュベートした。その間、馴化COS培地を、50μg/mlに添加したTIE-2-またはTrkB-RBのいずれかとともに、室温にて30分プレインキュベートした。次いで、飢餓培地をHUVECディッシュから取り出し、そしてRB含有COS培地とともに37℃にて７分間インキュベートした。次いで、HUVEC細胞を溶解し、そしてTIE-2レセプタータンパク質を、TIE-2ペプチド抗血清での免疫沈降によって回収し、次いで実施例１に記載されるように、抗ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図12に示す。TIE-2レセプターに対するホスホチロシンレベルは、コントロール培地（MOCK）に関して見られるものに比例してTIE-2リガンド１（TL1）でのHUVEC細胞の処理によって誘導され、そしてこの誘導は、Trk-RB（TrkB-Fc）とのインキュベーションによってはブロックされないが、TIE-2-RB（TIE-2-Fc）との先のインキュベーションによってブロックされる。これらのデータは、可溶性TIE-2 RBが、TIE-2リガンド１によるTIE-2レセプターの活性をブロックするための選択的インヒビターとして作用し得ることを示す。
実施例12-  TIE-2リガンド体の構築
ヒト免疫グロブリンγ-1定常領域（IgG1 Fc）に融合したヒトTIE-2リガンド1（TL1）またはTIE-2リガンド２（TL2）の完全なコード配列からなる分泌タンパク質を生じる発現構築物を作製した。これらの融合タンパク質を、TIE-2「リガンド体」（TL1-FcまたはTL2-Fc）と呼ぶ。TL1-FcおよびTL2-FcのFc部分を、以下のように調製した。ヒトIgG1のFc部分（このタンパク質のヒンジ領域からカルボキシ末端におよぶ）をコードするDNAフラグメントを、ヒトIgG1の開示された配列に対応するオリゴヌクレオチドを用いるPCRにより、ヒト胎盤cDNAから増幅した；得られたDNAフラグメントを、プラスミドベクター中にクローン化した。完全長TL1またはTL2をコードするプラスミド由来の適切なDNA制限フラグメントおよびヒトIgG1 Fcプラスミド由来の適切なDNA制限フラグメントを、TL1またはTL2とヒトIgG1 Fcタンパク質コード配列とをインフレームで融合するように設計された短いPCR由来フラグメントのいずれかの側に連結した。
ミリグラム量のTL2-Fcを、TL2-Fc DNAフラグメントをpVL1393バキュロウイルスベクター中にクローニングし、続いてSpodoptera frugiperda SF-21AE昆虫細胞株に感染させることにより得た。あるいは、細胞株SF-9（ATCC受託番号CRL-1711）または細胞株BTI-TN-5b1-4が用いられ得る。TL2-FcをコードするDNAを、Eco RI-NotIフラグメントとしてバキュロウイルストランスファープラスミドpVL1393中にクローン化した。プラスミドDNAを、３μgのプラスミドDNAを0.5μgのBaculo-Gold DNA（Pharminigen）と混合し、その後30μgのLipofectin（GIBCO-BRL）を用いてリポソーム中に導入することにより、ウイルスDNA中に組み換えた。DNA-リポソーム混合物を、TMN-FH培地（改変Grace昆虫細胞培地（GIBCO-BRL））中のSF-21AE細胞（２×106細胞/60mmディッシュ）に27℃にて５時間添加し、次いで５％ウシ胎児血清を補充したTMN-FH培地中で27℃にて５日間インキュベートした。組織培養培地を、組換えウイルスのプラーク精製のために回収した。これは、アガロースの上層が125mg/mL X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラノシド；GIBCO-BRL）を含有したこと以外は、以前に記載された方法（O'Reilly, D.R., L.K.MillerおよびV.A.Luckow, Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual. 1992, New York: W.H. Freeman）を用いて行った。27℃での５日間のインキュベーション後、非組換えプラークを、X-gal基質に対するポジティブな色素生産性反応により数え、そしてそれらの位置をマークした。次いで、組換えプラークを、100mg/mL MTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］2,5,ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Sigma）を含有する第２の上層の添加により可視化した。推定の組換えウイルスプラークをプラグ吸引（plug aspiration）により採取し、そして均一性が保証されるまで多数回のプラーク単離により精製した。ウイルスストックを、プラーク精製ウイルスの一連の低多重度継代により作製した。１つのウイルスクローン（vTL2-Fcクローン番号７）の低継代ストックを産生した。
SF-21AE細胞を、１×抗生物質／抗真菌剤溶液（Gibco BRL）および25mg/Lゲンタマイシン（Gibco BRL）を含有する無血清培地（SF-900 II, Gibco BRL）中で培養した。Pluronic F-68を、界面活性剤として１g/Lの最終濃度で添加した。培養物（４L）を、感染の少なくとも３日前にバイオリアクター（Artisan Cell Station System）中で培養した。細胞を、50％の溶存酸素まで80mL/分のガス流速（散布リングで通気）でガスを通しながら、27℃にて増殖させた。撹拌は、100rpmの速度で船舶用回転翼を使用した。細胞を、対数増殖期の中期（約２×106細胞/mL）に回収し、遠心分離によって濃縮し、そして細胞あたり５プラーク形成単位のvTL2-FCで感染させた。細胞および接種物を新鮮培地で400mLにし、そしてウイルスを27℃にて２時間、回転式フラスコ中で吸着させた。次いで、培養物を、新鮮な無血清培地で８Lの最終容量に再懸濁し、そして細胞を、先に記載した条件を用いてバイオリアクター中でインキュベートした。
vTL2-Fc感染SF21AE細胞由来の培養培地を、遠心分離（500×g、10分間）により感染後72時間で回収した。細胞上清を、NaOHを用いてpH８にした。EDTAを、10mMの最終濃度で添加し、そして上清のpHを再び８に調整した。上清を濾過（0.45μm、Millipore）し、そしてプロテインＡカラム（protein A sepharose 4 fast flowまたはHiTrap protein A，両方ともPharmaciaによる）にロードした。カラムを、280nmでの吸光度がベースラインに減少するまで、0.5M NaClを含有するPBSで洗浄した。カラムをPBS中で洗浄し、そして0.5M酢酸で溶出した。カラム画分を、１M Tris（pH９）を含有するチューブ中に溶出することによりすぐに中和した。TL2-Fcを含有するピーク画分をプールし、そしてPBSに対して透析した。
実施例13-  腎細胞ガンにおけるTIE-1、TIE-2、TL1、およびTL2の発現
インサイチュハイブリダイゼーション実験を、TIE-1、TIE-2、TL1、およびTL2 cDNAプローブを使用してヒト腎細胞ガンの腫瘍組織について行った。TIE-2、TIE-1、TL-1、およびTL-2の発現は、腫瘍の脈管構造において全てアップレギュレートされていた。リガンドの発現は、脈管内皮細胞（TL2）または間葉中の脈管内皮細胞のごく近傍（TL1）のいずれかに局在化されているようであった。VEGFはこの腫瘍組織中で劇的にアップレギュレートされることが見出されている。Brownら、Am. J. Pathol. 143:1255-1262（1993）。
実施例14-  創傷治癒におけるTIE-1、TIE-2、TL1、およびTL2の発現
インサイチュハイブリダイゼーション実験を、TIE-1、TIE-2、TL1、およびTL2 cDNAプローブを使用して、ラットの皮膚創傷モデルから得た横断面の組織スライスについて行った。創傷治癒モデルは、ラットの皮膚に小さなコルク穴あけを押し付けること、および皮膚の小さな円筒状の栓を取り出すことを含む。治癒は創傷の基部で開始するので、組織の垂直のスライスを採取し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションに使用する。試験した組織サンプルにおいて、TL1およびTL2は損傷後４日までに僅かにアップレギュレートされるようであった。この組織でのTL1およびTL2の僅かにアップレギュレートされた発現とは対照的に、TL1およびTL2の発現に先行し得るVEGFの発現は、劇的にアップレギュレートされる。
実施例15-  胎児の肝臓および胸腺におけるTIEリガンドの発現
逆転写PCR（RT-PCR）を、マウスのE14.5胎児肝臓およびマウスのE17.5胎児胸腺について行った。RT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動によって、マウスの胎児肝臓では、TIE-2リガンド１（TL1）RNAは間質領域で富化されているが、c-kit+TER119造血前駆細胞中には存在しないことが明らかになった。この同じ組織中で、TIE-2リガンド２（TL2）RNAは間質細胞中で富化されているが、造血前駆細胞中には存在しない（図13）。マウス胎児胸腺では、TL2は間質細胞中で富化されている（図14）。
実施例16-  血管形成におけるTIEレセプター／リガンド系
TIE-2/TIEリガンド系は内皮細胞の生態において重要な役割を果たしているようであるが、血管新生の初期段階から中間段階（例えば、血管芽細胞または内皮細胞の増殖および遊走、小管形成、および血管モデリングにおける他の初期の段階の事象）において、重要で、活性な役割を果たすことは示されていない。血管発達のこれらの局面を媒介することが知られているレセプターおよび因子とは対照的に、血管新生の過程におけるTIE-2およびTL1の発現の時間的に遅延したパターンは、この系が、新しい血管の構造的および機能的な分化および安定化を含む血管の発達のより後期の段階で、異なる役割を果たすことを示唆する。TIE-2/TL1の発現パターンはまた、確立された脈管構造の構造的完全性および／または生理学的特性の維持における継続的な役割と一致する。
TIEリガンド２（TL2）は、TL1の競合インヒビターであるようである。TL2発現の空間時間的特性は、この単一の阻害分子が、適切な血管の発達またはリモデリング（例えば、既存の脈管構造からの新しい血管の形成、不適切な血管形成の阻害、および成熟血管の退行／退縮を可能にする、成熟内皮細胞の不安定化／脱分化）に不可欠な、多くの状況依存性の役割を果たし得ることを示唆する。図15は、血管形成におけるTIE-2/TIEリガンドの仮説的な役割の模式図である。この図において、TL1を（・）で示し、TL2を（*）で示し、TIE-2を（Ｔ）で示し、VEGFを（[]）で示し、そしてflk-1（VEGFレセプター）を（Ｙ）で示す。
実施例17-  雌の生殖系におけるTIEリガンドの発現：卵巣における発現
雌の生殖系におけるTIEレセプターおよびリガンドの発現を試験する実験において行った予備観察は、TL1が新生血管形成において、VEGFの役割に時間的に追随して、役割を果たすという仮説と一致する。TL2の発現パターンもまた、TL1の作用の拮抗、および血管の退行における特異的な役割と一致する。このことを確認するために、関連のmRNAの発現を、卵胞および黄体の発達の実験的誘導に続いて試験し得る。その結果、新生血管形成／血管退行の種々の局面に対するそれらの時間的な関係がより明らかに規定され得る（例えば、内皮細胞の染色、血管の充填に関連して）。成体の雌ラットの段階付けられた（staged）卵巣における、または前成熟期の動物における誘導性排卵後の卵胞の発達および黄体形成に関連する血管形成を、インサイチュハイブリダイゼーションを使用して追跡した。図16は、インサイチュハイブリダイゼーションのスライドの写真を含み、これは卵巣周期の間のTIE-2、TL1、TL2、およびVEGFの時間的な発現パターンを示す［カラム１：初期の前排卵性卵胞；カラム２：前排卵性卵胞；カラム３：初期黄体；およびカラム４：退縮卵胞；Ａ列：明視野；Ｂ列：VEGF；Ｃ列：TL2；Ｄ列：TL1、およびＥ列：TIE-2レセプター］。これらの研究は、VEGF、TL1、およびTL2が、卵巣における脈管構造の発達および退行に関して（特に、卵胞の黄体（CL）への転換の過程で生成される血管系の確立に関して）、時間的および空間的に同等の様式で発現されることを明らかにした。
簡潔には、VEGFの発現は、黄体形成のプロセスの間のその血管新生の前に、卵胞の顆粒層で増大する。CL形成のプロセスの間に、最高レベルのVEGFの発現が、まだ血管新生していない黄体形成中の細胞の近傍の発達しつつあるCLの中心において明らかである。VEGFのレベルは中程度に高く維持され、そして発達したCL中で拡散して分布されている。対照的に、顕著に増強されたTIE-2リガンド１の発現は、最初の脈管叢が確立された後のCL形成プロセスの後期にのみ生じる。その後、TL1の発現は、CLの最終的な毛細血管網が確立される時に、CLを通じて明らかである。
TL2は、VEGFまたはTL1のいずれよりもさらに複雑な発現パターンを示す。発達しつつあるCLにおいて、TL2は、CLの中心の無血管領域（ここで、VEGFの発現は最も高い）とCLの最も末梢の部分（ここで、TL1の発現は優性であり、そして黄体形成プロセスは完了しており、そして血管系は最も成熟している）との間の、発達しつつある毛細血管叢の前部で最高レベルで発現される。TL2はまた、閉鎖を経ている大きな卵胞の卵胞層中で高レベルで発現されるようである。TL1もまた退縮卵胞中において明らかであるが、VEGFは発現されない。
上記の発現のパターンは、血管形成の開始におけるVEGFの役割と最も一致し、TL1は、このプロセスの後期に（例えば、最終的な血管網のモデリングおよび／または安定化において）作用する。対照的に、TL2は、新たに形成される血管網（CL形成の間）の活発な拡大の領域、および新たな脈管構造の確立ができず、そして血管の退行が進行する領域（退縮卵胞）の両方に存在する。このことは、TL2のより活動的および複雑な役割を示唆し、これはおそらく、既存の脈管構造の不安定化（退行に必要である）または発達しつつある脈管構造の不安定化（新たに形成される血管の活動的モデリングに必要である）を含む。
実施例18-  レセプター体結合アッセイならびにリガンド結合および競合アッセイ
２つの代替形式を用いる無細胞結合定量アッセイを、TIE-2レセプター体結合またはリガンド結合および競合のいずれかを検出するために開発した。レセプター体結合バージョンのアッセイにおいては、TIE-2リガンド（精製されたかまたは部分的に精製された；TL1またはTL2のいずれか）をELISAプレート上でコートする。次いで、種々の濃度でレセプター体を添加する。レセプター体は用量依存性の様式で固定化されたリガンドに結合する。２時間後に、過剰のレセプター体を洗浄により取り除き、次いで、プレートに結合した量をアルカリホスファターゼがタグされた特異的抗ヒトFc抗体を用いて記録する。過剰のレポーター抗体を洗浄により取り除き、次いでAP反応を着色基質を用いて発色させる。アッセイを、分光光度計を用いて定量する。図19は、代表的なTIE-2-IgG結合曲線を示す。このアッセイを、ラットおよびマウスへの注入後のTIE-2-IgGの完全性（integrity）を評価するために使用した。リガンド競合アッセイとしてのこの形式で当該アッセイがまた使用され得、このアッセイにおいて精製されたTIEリガンドまたは部分的に精製されたTIEリガンドが、レセプター体に対して固定化されたリガンドと競合する。リガンド結合および競合バージョンの結合アッセイにおいて、TIE-2外ドメイン（ectodomain）をELISAプレート上でコートする。次いで、TIEリガンドのFcでタグしたフィブリノーゲン様ドメインフラグメント（TL-1-fFcおよびTL2-fFc）は外ドメインに結合し、そして上記と同じ抗ヒトFc抗体を用いて検出され得る。図20は、TIE-2外ドメインに結合するTL-1-fFcの例を示す。このバージョンのアッセイは、血清または他のサンプル中のTL1-fFcレベルを定量するためにもまた使用され得る。タグされていない（さらに、精製されたかまたは未精製のいずれかの）リガンドをTL1-fFcとして同時に添加する場合、競合は、タグされたリガンドフラグメントと完全長のリガンドとの間で生じる。完全長のリガンドは、Fcでタグされたフラグメントを置換し得、そして競合曲線が作製される。
実施例19-  EA.hy926細胞株はTIEリガンド活性についてレポーター細胞株として使用され得る
EA.hy926は、HUVECとヒト肺ガン由来株であるA549（Edgellら、Proc. Natl. Acad. Sci. （USA）80, 3734-3737（1983））との融合により確立された細胞ハイブリッド株である。EA.hy926細胞は、低基底のホスホチロシンレベルを伴って、有意なレベルのTIE-2レセプタータンパク質を発現することが見出されている。EA.hy926細胞の、それらをレセプターアッセイに使用する前の継代培養時の密度、およびアッセイ時のそれらの集密の程度は、TIE-2レセプターの豊富さおよびリガンドを用いる処理に反応する相対的な誘導性に影響し得る。これらの細胞の増殖についての以下のレジメを採用することにより、EA.hy926細胞株を、TIE-2リガンド活性のアッセイについての信頼性のある系として使用し得る。
EA.hy926細胞を、T-75フラスコ（Falconware）中に1.5×106細胞で播種し、そして１日おきに高グルコースダルベッコMEM、10%ウシ胎児血清、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、および１×ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT、Gibco/BRL）で再び栄養補充する。増殖の３〜４日後、細胞を、T-75フラスコあたり1.5×106細胞で再び継代培養し、そしてさらに３〜４日培養する。リン酸化アッセイのために、上記のように調製した細胞を、高グルコースDMEMで培養培地を置換し、そして２〜３時間37℃でインキュベーションすることにより血清枯渇させた。この培地をフラスコから吸引し、そして馴化培地のサンプルまたは精製したリガンドを、1.5mlの総容量でフラスコに添加した後、37℃で５分間インキュベーションした。フラスコをインキュベーターから取り出し、そして氷床においた。培地を取り除き、そして、１% nonidet P-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、20mM Tris、pH7.6中の0.1%SDS、150mM NaCl、50mM NaF、１mMオルトバナジウム酸ナトリウム、５mMベンズアミジン、ならびにプロテアーゼインヒビターPMSF、アプロチニン、およびロイペプチン含有１mM EDTAを含有する1.25mlのLysis Bufferで置換した。氷上で10分置いて膜を可溶化した後、プレートを擦り、そして細胞溶解物をトップスピードで10分間、４℃でのマイクロ遠心分離により明澄化した。TIE-2レセプターを浄化した上清から、抗TIE-2ポリクローナル抗血清およびProtein G-結合Sepharoseビーズとともに冷却してインキュベートすることにより免疫沈降した。ビーズを細胞溶解冷却緩衝液で３回洗浄し、そしてLaemmliサンプル緩衝液中で５分間煮沸した。次いで、これを7.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードした。分解したタンパク質をPVDF（Lamblia-P）膜にエレクトロトランスファーし、次いで抗ホスホチロシン抗体およびECL-試薬を用いてウェスタンブロット分析に供した。同じブロットにおける総TIE-2タンパク質レベルのその後の比較を、抗ホスホチロシン抗体をストリップし、そしてTIE-2の外ドメインに特異的なポリクローナル抗血清で再インキュベートすることにより行った。
実施例20-  哺乳動物TIEリガンド-3をコードする全長cDNAクローンの単離および配列決定
TIEリガンド-3（TL3）を、これらの遺伝子の全体のコード配列に対応するマウスTL1またはマウスTL2プローブのいずれかとライブラリー複製物とをハイブリダイズさせることによって、マウスBACゲノムライブラリー（Research Genetics）からクローン化した。ライブラリーの各コピーを、55℃で一晩リン酸緩衝液を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、2×SSC、0.1％SDSを用いて60℃で洗浄し、続いてフィルターにＸ線フィルムを曝した。マウスTL1およびマウスTL2に対応する強いハイブリダイゼーションシグナルを同定した。さらに、マウスTL1およびマウスTL2の両方に弱くハイブリダイズするシグナルを同定した。これらのクローンに対応するDNAを精製し、次いで制限酵素で消化し、そして本来のプローブにハイブリダイズする２つのフラグメントを、細菌プラスミドにサブクローン化し、そして配列決定した。このフラグメントの配列は、マウスTL1およびマウスTL2の両方に相同性を有する２つのエクソンを含んでいた。これらの配列に特異的なプライマーをPCRプライマーとして用いて、TL3に対応する転写産物を含む組織を同定した。TL3に対応するPCRバンドを、λgt-11中のマウス子宮cDNAライブラリーにおいて同定した。（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）。
プラークを、1.25×106/20×20cmプレートの密度でプレーティングし、そしてレプリカフィルターを以下の標準的な手順で作製した（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版、8.46頁、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。複製したフィルターを、マウスTL3配列に対して作製した200bpのPCR放射活性プローブを用いて、「通常」のストリンジェンシー（2×SSC、65℃）でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、0.5mg/mlサケ精子DNAを含有する溶液中で65℃で行った。フィルターを、65℃で２×SSC中で洗浄し、そしてＸ線フィルムに６時間曝した。２重でハイブリダイズした２つの陽性クローンを選択した。これらのクローンから得られたファージDNAのEcoRI消化は、約1.2kbおよび約2.2kbの挿入物サイズを有する２つの個々のクローンを示した。2.2kbのEcoRI挿入物を、pBluescript KS（Stratagene）のEcoRI部位にサブクローン化した。配列分析は、より長いクローンが開始メチオニンおよびシグナルペプチドを欠失しているが、マウスTL1およびマウスTL2の両方に相同なプローブをコードすることを示した。
次いで、２つのTL3特異的PCRプライマーを以下のように合成した：
0003977434.tif 000002
以下のPCR反応を、マウス細胞株C2C12rasおよびMG87由来の発現ライブラリーを用いて行った。最初のPCR反応において、特定のプライマーUS2をベクター特異的オリゴと組み合わせて使用し、いずれかの方向での増幅を可能にした。PCRを、94℃１分；42℃または48℃１分；72℃１分の35サイクルを用いて100mlの総容量で行った。第２のPCR反応は、第２の特異的プライマー、US1を含んでいた。これは、同じベクターオリゴと組み合わせて、最初のPCR産物内に含まれる。第２の反応を、以前と同じ温度および時間を用いて、30サイクル行った。PCR産物をゲル単離し、配列分析にかけた。２つの異なるcDNAライブラリーを用いた４つの独立したPCR反応の全体から得られた配列に基づいて、TL3配列の5'末端を推定した。ノーザン分析は、マウス胎盤中の中程度から低いレベルのマウスTL3転写産物を明らかにした。マウスTL3の発現は、約３kbの転写産物からなる。全長TL3コード配列を図21に示す。
次いで、マウスTL3配列を、ヒトゲノムまたはcDNAのライブラリーのいずれかと、以前に記載されている（例えば、前出の実施例８）ようなマウスTL3に対応するプローブとをハイブリダイズさせることによって、そのヒトTL3のコード配列を含むヒトクローンを得るために使用し得る。
実施例21−ヒトTIEリガンド-4をコードする全長ゲノムクローンの単離
TIEリガンド-4（TL4）を、ライブラリー複製物と、TL1の完全なフィブリノーゲンコード配列に対応するヒトTL1放射活性プローブ（ヌクレオチド1153〜1806）またはマウスTL3のフィブリノーゲン領域に由来する186ヌクレオチドのセグメント（図21のヌクレオチド1307〜1492）に対応するマウスTL3放射活性プローブのいずれかとをハイブリダイズさせることによってマウスBACゲノムライブラリー（BAC HUMAN（II）, Genome Systems Inc.）からクローン化した。各プローブを、正確なオリゴヌクレオチドおよび標準的なPCR条件（dCTPをP32dCTPに置換したこと以外は）を用いてPCRによって標識した。次いで、PCR混合物をゲル濾過カラムに通して、プローブを遊離P32 dCTPから分離した。ライブラリーの各コピーを、標準的なハイブリダイゼーション条件を使用して、リン酸緩衝液および放射活性プローブを用いて55℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、55℃で２×SSC、0.1％SDSを用いて洗浄し、続いてＸ線フィルムに曝した。ヒトTL1に対応する強いハイブリダイゼーションシグナルを観察した。さらに、ヒトTL1およびマウスTL3の両方に弱くハイブリダイズするシグナルを同定した。これらのクローンに対応するDNAを、標準的な手順を用いて精製し、次いで制限酵素で消化し、そして本来のプローブにハイブリダイズする１つのフラグメントを細菌プラスミドにサブクローン化し、そして配列決定した。このフラグメントの配列は、ヒトTL1およびマウスTL3の両方ならびにTIEリガンドファミリーの他のメンバーと相同性を有する１つのエキソンを含んでいた。これらの配列に特異的なプライマーは、TL4に対応する転写産物を含有する組織を同定するためのPCRプライマーとして用いられ得る。
ヒトTL4の完全な配列は、寄託された細菌細胞に含まれる全長BACクローンを配列決定することによって得られ得る。エキソンは、TL1、TL2およびTL3のようなTIE-リガンドファミリーの公知のメンバーに対する相同性によって同定し得る。次いで、TL4の全長コード配列は、TL4ゲノムクローンからエキソンをスプライシングすることによって決定され得、次いで、TL4タンパク質を産生するために使用され得る。あるいは、エキソンは、全長cDNAクローンを得るためのプローブとして使用され得、これは次いでTL4タンパク質を産生するために使用され得る。エキソンはまた、フィブリノーゲンドメインのようなタンパク質ドメイン、超らせんドメイン、またはシグナルペプチド配列のようなタンパク質シグナルに対する相同性によってBACクローン配列から同定され得る。BACクローンからの喪失したエキソンは、連続的なBACクローンの同定（例えば、本明細書中で用いられるような、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして寄託されたBACクローンの末端を用いることによるか、cDNAライブラリーをスクリーニングするためのBACクローン中に含まれるエキソン配列を用いることによるか、またはTL4エキソン配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる5'または3'RACE手順のいずれかを行うことによる）によって得られ得る。
さらなるTIEリガンドファミリーメンバーの同定
新規のTIEリガンド-4配列は、公知のファミリーメンバー間の保存されたセグメントのの強力な相同性の存在を利用するアプローチを使用してTIEリガンドファミリーのさらなるメンバーの合理的検索に使用され得る。例えば、TIEリガンドのアミノ酸配列のアラインメントにより、いくつかの領域の保存された配列が示される（図22の囲った領域を参照のこと）。以前に公知または新規のいずれかのTIEリガンドの相同性セグメントと組み合わせたこれらの囲みに本質的に基づく縮重オリゴヌクレオチドが、新規のTIEリガンドを同定するために用いられ得る。
TL1、TL2およびTL3の間の高度に保存された領域は、cDNAを用いるPCR反応を開始する縮合オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられ得る。cDNAテンプレートは、オリゴd（T）または他の適切なプライマーを用いる、組織RNAの逆転写によって産生され得る。次いで、PCR反応のアリコートを、アガロースゲル上での電気泳動に供し得る。得られる増幅されたDNAフラグメントは、プラスミドへの挿入によってクローン化され得、配列決定されて、そのDNA配列は、全ての公知のTIEリガンドの配列と比較される。
これらのPCR反応に由来するサイズ選択した増幅DNAフラグメントを、プラスミドにクローン化し、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして形質転換体を選択アガー上にプレーティングし得る。PCR形質転換由来の細菌のクローンを、標準的なプラスミド手順によって精製されるプラスミドDNAの配列決定によって分析し得る。
新規のTIEリガンドのセグメントを含有するクローン化フラグメントを、cDNAライブラリーから全長cDNAクローンを得るためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。例えば、ヒトTL4ゲノム配列を、ヒトcDNAライブラリーと以前に記載されているヒトTL4に対応するプローブとをハイブリダイズさせることによってヒトTL4の完全なコード配列を含有するヒトcDNAクローンを得るために使用し得る。
実施例22−hTL4の全長コード配列のクローニング
ヒトTIEリガンド-4（hTL-4 ATCC受託番号第98095号）をコードするゲノムヒトTL-4クローンに由来する5'および3'コード配列の両方を、制限酵素消化、サザンブロッティングおよびマウスTL3由来のコード配列へのhTL-4クローンのハイブリダイゼーション、それに続くハイブリダイズしたフラグメントのサブクローニングおよび配列決定によって取得した。hTL4のＮ末端およびＣ末端のアミノ酸に対応するコード配列を用いてPCRプライマー（以下に示す）を設計し、次いでこれをヒト卵巣cDNAからのTL4のPCR増幅のために使用した。ABI 373A DNAシーケンサーおよびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を用いるDNA配列決定によって、PCRバンドがヒトTL4に対応することを同定した。次いで、PCRバンドを、ベクターpCR-scriptにサブクローニングし、そしていくつかのプラスミドクローンを配列決定によって分析した。次いで、完全なヒトTL4コード配列を編集し、そして図23に示す。本発明の別の実施態様において、569位のヌクレオチドをAからGに変化させる。これによってQからRへのアミノ酸変化が生じる。
上記で用いたPCRプライマーを以下のように設計した：
0003977434.tif 000003
小文字は、増幅されたPCRフラグメントのクローニングを容易にするためにPCRプライマーに付加された「尾部」配列を示す。
実施例23  改変TIEリガンドの構築および特徴付け
多くの観察された特性に洞察を得るために、TIE-2リガンド１およびTIE-2リガンド（TL1およびTL2）の遺伝子分析を行った。TL1およびTL2は、同様な構造的相同性を共有するが、これらは異なる物理学的および生物学的特性を示す。この２つのリガンドを区別する最も顕著な特徴は、これらは共にTIE-2レセプターに結合するが、TL1はアゴニストであり、一方、TL2はアンタゴニストであることである。非還元電気泳動条件下、両タンパク質は、共有結合的な多量体構造を示す。TL1は、ジスルフィド架橋した多量体（主に、三量体およびより高次の種）の混合物として産生され、二量体種はない。しかし、TL2は、ほぼ専ら、二量体種として産生される。また、TL2はほとんどの発現系で良く産生されるが、TL1はほとんど発現されず、大量に産生することは困難である。最後に、産生および精製の条件もまた、TL1に、アミノ末端の近くの部位でのタンパク質分解的切断による不活化傾向を与えるようである。
これらの差異を研究するため、いくつかの改変リガンドを以下の通りに構築した。
23.1. システイン置換  どの因子が、２つの分子の異なる物理学的および生物学的特性に寄与し得るかの探求により、TL1には、TL1中のフィブリノーゲン様ドメインに先行するシステイン残基（図４のCYS265；図17のCYS245）が存在するが、TL2には存在しないこと（すなわち、TL2には対応するシステイン残基が存在しない）ことが明らかになった。TL1中のCYS265残基はTGCによってコードされ、そして超らせんドメインとフィブリノーゲン様ドメインとの間のほぼ接合部のヌクレオチド1102〜1104あたり（図４を参照のこと）に位置決めされる。システイン残基は一般にジスルフィド結合の形成に関与する（ジスルフィド結合の存在は、分子の三次構造および生物学的特性の両方に寄与し得る）ので、おそらく、TL1中のCYS265残基の存在は、少なくとも部分的に、２つの分子の異なる特性の原因であり得ると考えられる。
この仮説を検定するために、TL1に変異を含む発現プラスミドを構築した。このTL1において、CYS（図４の残基265；図17の残基245）が、ジスルフィド結合を形成しないアミノ酸（セリン）と置換された。このTL1/CYS-変異体に加えて、TL2のほぼ対応する位置（図17のMet247）を変異した（その結果、この残基は今やシステインである）第２の発現プラスミドを構築した。TL1およびTL2の非変異および変異の両方の発現プラスミドを、COS7に一過性にトランスフェクトし、組換えタンパク質を含む細胞上清を採集し、そしてサンプルを還元SDS/PAGE電気泳動および非還元SDS/PAGE電気泳動の両方ならびに後続のウエスタンブロッティングにかけた。
図18は、非変異および変異の両方のTL1およびTL2タンパク質の非還元条件下でのウエスタンブロットを示す。これは、TL1/CYS-変異体がTL2に近い二量体として泳動し、TL2/CYS+変異体が、むしろTL1に近い三量体およびより高次の多量体を形成し得ることを明らかにした。TIE-2発現細胞においてリン酸化を引き起こす能力について２つの変異体タンパク質を試験した場合、TL1/CYS-変異体は、TIE-2レセプターを活性化し得、一方、TL2/CYS+変異体は活性化し得なかった。
したがって、TL1のシステイン残基（図４の残基265；図17の残基245）をセリンに遺伝子的に変化させた場合、TL1の共有的構造がTL2の構造（すなわち、主として二量体）と同様になることが見出された。改変TL1分子はなお、アゴニストとして振る舞い、したがって三量体構造またはより高次の多量体構造は、TL1に活性化する能力を与える決定的因子ではなかった。システインの除去はより望ましい特性を有する分子を確かに作成するが、これは、TL1の産生レベルを改善しない。
23.2. ドメイン欠失  TL1およびTL2をコードするヌクレオチド配列は、成熟タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、３つのドメインに分割され得る遺伝子構造を共有する。各成熟タンパク質の最後のおよそ215アミノ酸残基は、６つのシステインを含み、そしてフィブリノーゲンのドメインに対して強い類似性を有する。したがって、この領域は、「フィブリノーゲン様」ドメインまたは「Ｆドメイン」と呼ばれた。およそ205残基を含む、成熟タンパク質の中央領域は、「超らせん」構造を仮定される高い確率を有し、そして「超らせん」ドメインまたは「Ｃドメイン」と呼ばれた。成熟タンパク質のアミノ末端側のおよそ55残基は、２つのシステインを含み、そして超らせん構造を有する確率は低い。この領域は、「Ｎ末端」ドメインまたは「Ｎドメイン」と呼ばれた。本明細書中に記載される改変リガンドは、用語法を用いて呼称される。ここで、Ｎ＝Ｎ末端ドメイン、Ｃ＝超らせんドメイン、Ｆ＝フィブリノーゲン様ドメイン、そして番号１および２は、それぞれTL1およびTL2をいう。したがって、1NはTL1由来のＮ末端ドメインを示し、2FはTL2のフィブリノーゲン様ドメインを示す、などである。
TIE-2リガンドのフィブリノーゲン様ドメイン（Ｆドメイン）がTIE-2活性化活性を含むかどうかを試験するために、超らせんドメインおよびＮ末端ドメインが欠失し、ＦドメインをコードするDNA配列の部分（TL1については、図４においてヌクレオチド1159（アミノ酸残基ARG284）あたりから始まる；TL2については、図６においてヌクレオチド1200（アミノ酸残基282）あたりに対応する）のみが残った発現プラスミドを構築した。次いで、この変異体構築物を一過性にCOS細胞にトランスフェクトした。組換えタンパク質を含む上清を採集した。TL1/Ｆドメイン変異体を、TIE-2レセプターと結合する能力について試験した。結果は、単量体として、TL1/Ｆドメイン変異体は検出可能なレベルでTIE-2と結合し得ないことを示した。
しかし、TL1/Ｆドメイン単量体をmycでタグ化し、続いてmycタグに対する抗体でクラスター化した場合、TL1/Ｆドメイン単量体は、TIE-2と検出可能な結合を示した。しかし、抗体でクラスター化したTL1/Ｆドメイン変異体はTIE-2発現細胞株においてリン酸化を誘導し得なかった。
したがって、TIE-2リガンドのＦドメインが、レセプターとの結合に関与するが、Ｆドメイン単独のみからなる短縮体は、レセプター結合に十分ではないことを決定した。このことにより、超らせんドメインが、いくつかのフィブリノーゲン様ドメインを共に保持すること（これが、レセプター結合に必須であり得る）を担っている可能性が生じた。この仮説を確認する試みにおいて、Ｆドメインを、ヒト抗体IgG1のFcセクションと融合した。哺乳動物細胞による発現の際にFcセクションは二量体化するので、Ｆドメインの理論的な形状を模倣するこれらの組換えタンパク質は、二量体化するネイティブなリガンドであった。このＦドメイン−Fc構築物は、レセプターと結合したが、レセプターを活性化できなかった。明らかに、リガンドの他の領域により引き起こされた多量体化は、リガンドをTIE-2レセプターに結合させ得ることが必要である。さらに、Ｆドメインの外側のいくつかの他の因子が、レセプターのリン酸化に寄与しているに違いない。
次いで、フィブリノーゲン様ドメインがなく、したがってＮ末端および超らせんドメインのみを含む変異体を構築した。これらはレセプターに結合し得た。レセプター結合および活性化におけるＮ末端ドメインの役割を評価するために、リガンドをＣおよびＦドメインのみ短縮し、そしてFLAGタグを用いてＮ末端にタグを付し、FLAG-1C1FおよびFLAG-2C2Fと呼ばれる構築物を作製した。これらの分子は、TIE-2レセプターを発現するために一過性にトランスフェクトしたCOS7細胞において豊富に染色されたが、これらは、リン酸化アッセイにおいて応答できなかった。したがって、Ｎドメインは、レセプター活性化の必須因子を確かに含みが、下記に開示されるように、キメラ分子2N2C1Fがレセプターを活性化する能力は、不活性リガンドのＮドメインでさえ、その役割を満たすことを示す。
前述の、mycタグ化Ｆドメイン短縮体とFcタグ化Ｆドメイン短縮体との間の挙動の差異は、TIEリガンドが二量体形態またはより高次の多量体形態でのみ結合し得ることを示唆した。確かに、非還元SDS-PAGEは、TIEリガンドが、二量体形態、三量体形態、および多量体形態で天然に存在することを示した。FLAG-1C1FおよびFLAG-2C2F短縮体は、合成タグ（例えばFc）によって二量体することなく、TIE-2レセプターと結合し得るが、Ｆ短縮体は結合し得ないことは、Ｃ領域が、Ｆドメインの凝集を少なくとも部分的に担っていることを示唆する。
23.3. 交換構築物（キメラ）
出願人らは、COS7細胞におけるTL1の産生レベルが、Tl2の産生より約10倍低いことに気づいた。したがって、この差異を説明する試み、そしてまたTL2のアンタゴニスト活性と比較してTL1のアゴニスト活性をさらに特徴付ける試みおいて、TL1とTL2とのキメラを構築した。
Ｎ末端ドメインまたはフィブリノーゲンドメインのいずれかが、TL1とTL2との間で交換された４つのキメラを構築した。そして、これらのキメラは、前記の用語法を使用して呼称された。その結果、例えば、1N1C2Fは、TL1のＮ末端ドメインおよび超らせんドメインを、TL2由来のフィブリノーゲン様ドメインと共に有するキメラをいう。４つのキメラを以下の通りに構築した：
キメラ１−    1N1C2F
キメラ２−    2N2C1F
キメラ３−    1N2C2F
キメラ４−    2N1C1F
キメラ１〜４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ図24〜27に示す。
各キメラを別個の発現ベクターpJFE14に挿入した。次いで、キメラを、コントロールとして空のpJFE14ベクター、ネイティブなTL1およびネイティブなTL2と共にCOS7細胞にトランスフェクトし、そして培養上清を回収した。
交換がリガンドの発現レベルにどのように影響するかを決定するために、1:5希釈および1:50希釈のCOS7上清をニトロセルロース上にドットブロットした。次いで、TL1 Ｎドメインを含む３つのリガンド（すなわち、ネイティブなTL1、1N2C2Fおよび1N1C2F）を、TL1のＮ末端に特異的なウサギ抗体でプローブした。TL2 Ｎドメインを含む３つのリガンド（すなわち、ネイティブなTL2、2N1C1Fおよび2N2C1F）を、TL2のＮ末端に特異的なウサギ抗体でプローブした。結果は、COS7細胞が、タンパク質の残りの構成にかかわらず、TL1 Ｎドメインを含むいずれの分子のおよそ10倍のレベルで、TL2のＮドメインを含むいずれの分子をも発現していることを示した。この結論は、Ｎドメインが主に、リガンドの発現レベルを制御しているに違いないということであった。
取り組んだ次の疑問は、TIE-2レセプターを活性化するキメラの能力または不能であった。EAhy926細胞を、４つのキメラ、ならびにリン酸化のポジティブコントロールとしてTL1、およびリン酸化のネガティブコントロールとしてTL2または空のpJFE14トランスフェクトCOS7細胞上清でチャレンジした。細胞を溶解させ、そしてTIE-2レセプターを細胞溶解物から免疫沈降させ、そしてSDS-PAGEで泳動させた。サンプルをウエスタンブロットし、そして抗ホスホチロシン抗体でプローブして、リン酸化されたレセプターを検出した。驚くべきことに、TL1のフィブリノーゲン様ドメインを含む構築物（2N1C1Fおよび2N2C1F）のみが、TIE-2レセプターをリン酸化し得た。したがって、TL1のＮ末端領域は活性化に必須であるが、これはTL2のＮ末端領域によって置換され得る。すなわち、リガンドがアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを決定する情報は、実際には、フィブリノーゲン様ドメインに含まれている。
したがって、Ｆドメインは、TIE-2レセプターに結合することに加え、TL1のリン酸化活性を担っていることが決定された。さらに、TL2（そうでなければ、不活性分子である）は、そのＦドメインをTL1のＦドメインで置換することによって改変される場合、改変されたTL2はアゴニストとして作用した。
しかし、2N1C1F構築物はいくらかより強力であった。キメラ2N1C1Fにより引き起こされたシグナルは、キメラ2N2C1Fのシグナルよりわずかに強いようであった。このことは、TL1のＣドメインが、リン酸化に決定的に重要なのではなく、TL1の効力を増強し得るという推測を導く。しかし、リン酸化アッセイに使用したサンプルは、リガンドの濃度に関して規格化されなかったので、より強いリン酸化シグナルが、単に、より多くのリガンドの存在を示している可能性があった。したがって、リン酸化アッセイを種々の量のリガンドで繰り返して、活性なキメラが異なる効力を示すかどうかを決定した。リガンドトランスフェクションのCOS7上清におけるリガンドの濃度を、以前に記載された方法（Stitt,T.N.ら（1995）Cell 80: 661-670）に従って、BIAcoreバイオセンサー技術により測定した。BIAcoreは、TIE-2レセプターに対する上清の結合活性を、共鳴単位（RU）と呼ばれる任意の単位で測定した。RUとリガンド濃度との間のかなり良好な相関関係が、概して観察された。400RUの活性は、１mLの上清あたり約１μgのタンパク質に対応する。サンプルを、それぞれ、100RU、20RU、および５RUの濃度に希釈し、そしてリン酸化アッセイを繰り返した。結果は、キメラ2N2C1Fが、同じ濃度のネイティブなTL1またはキメラ1N1C2Fのいずれよりも明らかに強力であることを示した。
これらの交換構築物の別の興味深い局面は、それらの発現レベルである。４つのキメラの各々をCOS細胞におけるその生成レベル、TIE2に結合するその能力、およびTIE2をリン酸化するその能力ついて試験した。これらの実験の結果は、キメラ１およびキメラ３はTL1に匹敵するレベルで生成され、一方キメラ２およびキメラ４はTL2に匹敵するレベルで生成されたことを示した。従って、高レベルのタンパク質生成はTL2 Ｎ末端ドメインと関連した。さらに、内皮EAhy926細胞で試験した場合、キメラ２およびキメラ４は活性であり、一方１および３は活性ではなかった。従って、活性（レセプターのリン酸化）は、TL1フィブリーノゲン様ドメインと関連する。従って、キメラ２およびキメラ４は、それぞれ、高い生成レベルならびにアゴニスト活性という望ましい特性を有した。
23.4.  タンパク分解耐性構築物−TL1調製物のラージフラクション（large fraction）が、しばしば、Ｎ末端近くでタンパク分解性に切断されるという観察に基づいて、成熟タンパク質の49位に位置するアルギニン残基（図17を参照のこと）が、インビボにおけるタンパク質の活性の調節に関与し得る候補切断部位であること、およびアルギニンをセリンと置換すること（R49-->S）が、必然的にその活性に影響を与えることなしに、タンパク質の安定性を増大し得ることを提案した。TL1のこのような変異体が構築され、そして天然のTL1とほぼ同程度に活性であることが見出されたが、タンパク分解性切断に対する耐性を示さなかった。
23.5.  組み合わせ変異体−最も強力なキメラ構築物である2N1C1Fを、図27に示すヌクレオチド784〜787によってコードされるシステインをセリンに変換するように、さらに改変した。この分子（2N1C1F（C246S）と命名）は良好に発現され、レセプターを強力に活性化し、タンパク分解性切断に耐性であり、そして高次なマルチマーよりもむしろ、主にダイマーであった。従って、2Nドメインは分子にプロテアーゼ耐性を与えるようであった。最後に、この分子は、図27に示すヌクレオチド199〜201によってコードされる潜在的なプロテアーゼ感受性部位を除去するように、さらに改変され、活性であり、良好に発現され、ダイマーであり、そしてプロテアーゼ耐性であると予想された分子（2N1C1F（R51->S，C246->S）と命名）が得られた。
表１は、作製された改変TIE-2リガンド構築物を要約し、そしてそれらの各々をTIE-2レセプターに結合する能力、TIE-2レセプターを活性化する能力、形成された構造の型（モノマー、ダイマーなど）、およびそれらの相対的な生成レベルの観点から特徴づける。３つのドメインを有する非改変TL-1（模様なし）および非改変TL-2（しま模様）を、囲み（box）として示す。従って、しま模様の囲みは、TL-2由来のドメインを示す。成熟TL-1タンパク質の245位に位置するシステインを「Ｃ」によって示す。「Ｃ」の上の「×」は、システイン残基が、例えば、TL1 CYS-変異体の場合のように、別のアミノ酸によって置換されたことを示す。同様に、最後の構築物における「Ｒ」の上の「×」は、成熟TL1タンパク質の49位のArg残基の置換を示す。TL2 CYS+変異体を示す１つの改変TL2構築物において、「Ｃ」が存在する。Fcテールまたはフラッグタグ（flag tagging)を有する構築物もまた示す。
本明細書中の教示に基づいて、当業者は、さらなる構築物が、変更された特性を有する、さらなる改変およびキメラTIE-2リガンドを作製するために作製され得ることを容易に理解し得る。例えば、当業者は、TL-2のＮ末端ドメインおよびヒト抗体IgG1のFc部分と融合したTL1のＦドメインから構成される構築物を作製し得る。この構築物はTIE-2レセプターに結合し、そして活性化することが予想される。同様に、他の構築物が本明細書中の教示を使用して作製され得、従って本発明の範囲内にあると考えられる。
23.6.  材料および方法
キメラの構築
交換構築物を、XbaI部位がAscI部位に変えられたpJFE14ベクター中に挿入した。次いで、このベクターをAscIおよびNotIで消化し、AscI-NotI骨格を作製した。キメラについてのDNAフラグメントを、適切なオリゴヌクレオチドを使用してPCRによって生成した。
FLAG-1C1FおよびFLAG-2C2F挿入物を、EcoRIおよびNotIで消化したpMT21ベクター骨格にサブクローン化した。「CF」短縮物をPCRによって得、そしてFLAGタグおよび先行するトリプシンシグナル配列を、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって構築した。
トランスフェクション
全ての構築物を、標準的なプロトコールに従って、DEAE-DextranまたはLipofectAMINEのいずれかを使用してCOS7細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞培養物をトランスフェクションの３日後に回収し、そして1000rpmで１分間遠心沈澱し、そして上清を新鮮なチューブに移し、そして-20℃で保存した。
FLAG-1C1Fトランスフェクト細胞およびFLAG-2C2Fトランスフェクト細胞の染色
COS7細胞の６ウェルディッシュをTIE-2レセプターで一過性にトランスフェクトした。種々のリガンドトランスフェクション後のCOS7上清を30分間細胞上でインキュベートし、続いてマグネシウムまたはカルシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で２回洗浄した。細胞を-20℃のメタノールで３分間固定し、PBSで１回洗浄し、そしてPBS/10%ウシ胎仔血清（BCS）中の抗FLAG M2抗体とともに30分間インキュベートした。細胞をPBSで１回洗浄し、そしてPBS/10% BCS中のヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ（AP）結合抗体（Promega;1:1000）とインキュベートした。細胞をPBSで２回洗浄し、そしてリン酸基質、BCIP/NBT、１mMレバミソールとインキュベートした。
リン酸化アッセイ
用量応答研究についてのCOS7上清の希釈を、空のベクターpJFE14でトランスフェクトしたCOS7細胞の上清中で行った。天然にTIE-2レセプターを発現するEA細胞を、無血清培地中で>2時間枯渇させ、続いて５％ CO2の雰囲気下にて37℃で10分間適切なCOS7上清でチャレンジした。次いで、細胞を氷冷PBSでリンスし、そしてプロテアーゼインヒビター（10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン、１mM PMSF）を含む１％ NP40溶解緩衝液で溶解し、続いてTIE-2レセプターに特異的な抗体で免疫沈降した。次いで、サンプルを抗pTyr抗体を使用して免疫ブロット分析に供した。
ドットブロット
サンプルをニトロセルロースメンブレンに適用し、これをブロックし、そして適切な抗体で調べた。
23.7  CHOおよびバキュロウイルス感染昆虫細胞からのキメラTie-2リガンドの生成
ウイルス生成
キメラリガンドの遺伝子（2N1C1F（C246S）と命名）をバキュロウイルス発現プラスミド中へ操作し、そして以前に記載（O'Reilly, D.R., L.K. Miller、およびV.A. Luckow、Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual 1992, New York: W.H. Freeman）された方法を使用して、ウイルスDNAと組換えて組換えバキュロウイルスを生成し、増幅し、そして回収した。Invitrogenから得られたSF21昆虫細胞（Spodoptera frugiperda）を順応させ、そしてGibco SF900 II無血清培地中にて27℃で拡大した。非感染細胞を１×106細胞/mlの密度まで増殖させた。細胞密度を血球計数器を使用して生存可能な細胞を数えることによって決定した。リガンドのウイルスストックを、低多重度0.01〜0.1PFU/細胞でバイリアクターに添加し、感染を開始した。感染プロセスを、３〜４日間続けた。これは、実質的な細胞溶解を招くことなく、最大のウイルス複製を可能にした。細胞懸濁液を滅菌遠心分離ボトルに無菌的にアリコートし、そして細胞を遠心分離（1600RPM, 30分）によって除去した。無細胞上清を滅菌ボトルに回収し、そしてさらなる使用まで遮光で４℃にて保存した。
ウイルス力価を、O'Reilly、Miller、およびLuckowによって記載されるようにプラークアッセイによって決定した。この方法を1.5×106個の細胞が播種された60mm組織培養ディッシュ中で行う。ウイルスストックの連続希釈物を接着細胞に添加し、そして混合物を振盪しながらインキュベートし、ウイルスを個々の細胞に吸着させた。寒天オーバーレイを添加し、そしてプレートを27℃で５日間インキュベートした。生存可能な細胞をニュートラルレッドで染色した。これは円形のプラークを示す。そして円形プラークを数え、１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（PFU/mL）で発現したウイルス力価を得た。
タンパク質生成のための細胞の感染
非感染SF21細胞を組織培養プレートで増殖させ、そしてキメラリガンド遺伝子を含むウイルスを１〜10pfu/細胞の多重度で添加した。ウイルスを27℃で90分間穏やかに振盪しながら吸着させ、その後細胞に新鮮な多量のSf-900 II無血清培地を与えた。27℃での３日の増殖の後、組織培養液を回収し、そしてリガンドを免疫ブロッティングによって検出した。
Tie-2リガンドキメラのCHO発現
Tie-2リガンドキメラを任意のいくつかの哺乳動物細胞発現ベクターにクローン化した。これには、pJFE、pcDNA3、pMT21、pEDなどが挙げられる（しかしこれらに限定されない）。プラスミドを、CHO DG44細胞（Urlaub, G.およびChasin, L.A. 1980..Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216-4220; Urlaub, G.,Kas, E., Carothers, A.M.およびChasin, L.A. 1983. Deletion of the diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells. Cell 33:405-412）にリン酸カルシウム沈澱またはカチオン性リポソームによってトランスフェクトした。dhfr選択マーカーを欠失するベクターの場合、プラスミドpSV2 dhfrを、TIEリガンドキメラを含有するプラスミドに対して20％のモル比で同時トランスフェクトした。DHFR+細胞を選択培地（ヌクレオシドおよびヌクレオチドを欠き、10％透析ウシ胎仔血清を含有する培地）での増殖によって選択し、そしてクローンを、TIE2レセプター体を用いる免疫ブロッティングによってキメラTIEリガンドの生成についてスクリーニングした。所望のタンパク質を発現するクローンを、選択培地中でメトトレキセートの段階的な濃度を使用して数回の遺伝子増幅に供した。高発現クローンを、類似の免疫ブロッティング技術によって遺伝子増幅後に同定した。
キメラTIEリガンドを発現する細胞株を、単層、懸濁フラスコ、ローラーボトル、およびバイオリアクター中で選択培地または選択を欠く培地にて培養し、そして無血清培地処方物中で増殖し得た。
0003977434.tif 000004
寄託
以下のものが、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852にブダペスト条約に従って寄託された。TIE-2リガンドをコードするプラスミドクローンが、1994年10月７日にATCCに寄託され、そしてATCC受託番号75910の下で「TIE-2リガンドをコードするpJFE14」と命名された。TIE-2レセプター体をコードする組換えAutographa californicaバキュロウイルスが1994年10月７日にATCCに寄託され、そしてATCC受託番号VR2484の下で「vTIE-2レセプター体」と命名された。ヒトtie-2リガンドDNAを含むλファージベクターが1994年10月26日にATCCに寄託され、そしてATCC受託番号75928の下で「htie-2リガンド１をコードするIgt10」と命名された。第２のTIE-2リガンドをコードするプラスミドクローンが1994年12月９日にATCCに寄託され、そしてATCC受託番号75963の下で「ヒトTIE 2リガンド２をコードするpBluescript KS」として命名された。ヒトTIEリガンド-4をコードするヒトTL-4遺伝子挿入物を有するプラスミドpBeLoBacllを含むE. coli株DH10Bが1996年７月２日にATCCに寄託され、そしてATCC受託番号98095の下で「hTL-4」と命名された。
本発明は、本明細書中で記載される特定の実施態様による範囲で限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるそれらに加えて本発明の種々の改変は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかである。このような改変は添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：
（A）名称：リジェネロン  ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：新規改変リガンド
（iii）配列数：28
（iv）通信住所：
（A）名称：リジェネロン  ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
（B）番地：オールド  ソー  ミル  ロード  777
（C）市：タリータウン
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：10591
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：ディスケット
（B）コンピューター：IBM互換用
（C）OS：DOS
（D）ソフトウェア：FastSEQバージョン2.0
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：未知
（B）出願日：ここに記載
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：USSN 08/740,223
（B）出願日：1996年10月25日
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：USSN 60/022/999
（B）出願日：1996年８月２日
（viii）代理人/事務所情報：
（A）名称：コバート，ロバート  ジェイ
（B）登録番号：36,108
（C）照会/記録番号：REG 333
（ix）通信情報
（A）電話：914-345-7400
（B）テレファックス：914-345-7721
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2149塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：310...1803
（D）他の情報
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 1
（B）存在位置：1...2149
（D）他の情報：htie-2リガンド1をコードするクローンλgt10由来
（xi）配列：配列番号１：
0003977434.tif 000005
0003977434.tif 000006
0003977434.tif 000007
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：498アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 1
（B）存在位置：1...498
（D）他の情報：htie-2リガンド1をコードするクローンλgt10由来
（xi）配列：配列番号２：
0003977434.tif 000008
0003977434.tif 000009
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2146塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：310...1800
（D）他の情報
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 1
（B）存在位置：1...2146
（D）他の情報：T98Gクローン由来
（xi）配列：配列番号３：
0003977434.tif 000010
0003977434.tif 000011
0003977434.tif 000012
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：497アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 1
（B）存在位置：1...2146
（D）他の情報：T98Gクローン由来
（xi）配列：配列番号４：
0003977434.tif 000013
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2282塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：357...1844
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 2
（B）存在位置：1...2282
（D）他の情報：ヒトTIE 2リガンド2をコードするクローンpBluescript KS由来
（xi）配列：配列番号５：
0003977434.tif 000014
0003977434.tif 000015
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：496アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Human TIE-2 ligand 2
（B）存在位置：1...496
（D）他の情報：ヒトTIE 2リガンド2をコードするクローンpBluescript KS由来
（xi）配列：配列番号６：
0003977434.tif 000016
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：478アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：成熟TL1タンパク質
（B）存在位置：1...478
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号７：
0003977434.tif 000017
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：480アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：成熟TL2タンパク質
（B）存在位置：1...480
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号８：
0003977434.tif 000018
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1849塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：47...1573
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：TIE ligand-3
（B）存在位置：1...1849
（D）他の情報：フラグメント様ドメインは929位で開始する。
（xi）配列：配列番号９：
0003977434.tif 000019
0003977434.tif 000020
（2）配列番号10の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：509アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：TIE ligand-3
（B）存在位置：1...509
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号10：
0003977434.tif 000021
（2）配列番号11の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：503アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：mTL3
（B）存在位置：1...503
（D）他の情報：マウスTIEリガンド-3
（xi）配列：配列番号11：
0003977434.tif 000022
（2）配列番号12の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：490アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：hTL1
（B）存在位置：1...490
（D）他の情報：ヒトTIE-2リガンド1
（xi）配列：配列番号12：
0003977434.tif 000023
（2）配列番号13の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：491アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：chTL1
（B）存在位置：1...491
（D）他の情報：ニワトリTIE-2リガンド1
（xi）配列：配列番号13：
0003977434.tif 000024
（2）配列番号14の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：497アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：mTL1
（B）存在位置：1...497
（D）他の情報：マウスTIE-2リガンド1
（xi）配列：配列番号14：
0003977434.tif 000025
（2）配列番号15の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：496アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：mTL2
（B）存在位置：1...496
（D）他の情報：マウスTIE-2リガンド2
（xi）配列：配列番号15：
0003977434.tif 000026
（2）配列番号16の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：496アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：hTL2
（B）存在位置：1...496
（D）他の情報：ヒトTIE-2リガンド2
（xi）配列：配列番号16：
0003977434.tif 000027
（2）配列番号17の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1512塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：1...1509
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：TIE lgand-4
（B）存在位置：1...1512
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号17：
0003977434.tif 000028
0003977434.tif 000029
（2）配列番号18の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：503アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：TIE ligand-4
（B）存在位置：1...503
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号18：
0003977434.tif 000030
（2）配列番号19の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1497塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：1...1494
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：1N1C2F（chimera 1）
（B）存在位置：1...1497
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...60
（D）他の情報：推定リーダー配列はヌクレオチド1-60によりコードされる。
（xi）配列：配列番号19：
0003977434.tif 000031
0003977434.tif 000032
（2）配列番号20の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：498アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：1N1C2F（chimera 1）
（B）存在位置：1...498
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号20：
0003977434.tif 000033
（2）配列番号21の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1491塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：1...1488
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：2N2C1F（chimera 2）
（B）存在位置：1...1491
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...48
（D）他の情報：推定リーダー配列はヌクレオチド1-48によりコードされる。
（xi）配列：配列番号21：
0003977434.tif 000034
0003977434.tif 000035
（2）配列番号22の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：496アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：2N2C1F（chimera 2）
（B）存在位置：1...496
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号22：
0003977434.tif 000036
（2）配列番号23の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1500塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：1...1497
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：1N2C2F（chimera 3）
（B）存在位置：1...1500
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...60
（D）他の情報：推定リーダー配列はヌクレオチド1-60によりコードされる。
（xi）配列：配列番号23：
0003977434.tif 000037
0003977434.tif 000038
0003977434.tif 000039
（2）配列番号24の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：499アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：1N12C2F（chimera 3）
（xi）配列：配列番号24：
0003977434.tif 000040
（2）配列番号25の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1488塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：コーディング配列
（B）存在位置：1...1485
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：2N1C1F（chimera 4）
（B）存在位置：1...1488
（D）他の情報：
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...48
（D）他の情報：推定リーダー配列
（xi）配列：配列番号25：
0003977434.tif 000041
0003977434.tif 000042
0003977434.tif 000043
（2）配列番号26の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）フラグメント型：内部
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：2N1C1F（chimera 4）
（B）存在位置：1...495
（D）他の情報：
（xi）配列：配列番号26：
0003977434.tif 000044
（2）配列番号27の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：47塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：hTL4atg
（B）存在位置：1...47
（D）他の情報：PCRプライマー
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...20
（D）他の情報："tail"配列をPCRプライマーに加えて、増幅したPCRフラグメントのクローニングを促進した。
（xi）配列：配列番号27：
0003977434.tif 000045
（2）配列番号28の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：55塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：hTL4not
（B）存在位置：1...55
（D）他の情報：PCRプライマー
（A）特徴を表す記号：Other
（B）存在位置：1...28
（D）他の情報："tail"配列をPCRプライマーに加えて、増幅したPCRフラグメントのクローニングを促進した。
（xi）配列：配列番号28：
0003977434.tif 000046
【図１Ａ】
0003977434.tif 000047
【図１Ｂ】
0003977434.tif 000048
【図２】
0003977434.tif 000049
【図３】
0003977434.tif 000050
【図４】
0003977434.tif 000051
0003977434.tif 000052
【図５】
0003977434.tif 000053
0003977434.tif 000054
【図６】
0003977434.tif 000055
0003977434.tif 000056
【図７】
0003977434.tif 000057
【図８】
0003977434.tif 000058
【図９】
0003977434.tif 000059
【図１０】
0003977434.tif 000060
【図１１】
0003977434.tif 000061
【図１２】
0003977434.tif 000062
【図１３】
0003977434.tif 000063
【図１４】
0003977434.tif 000064
【図１５】
0003977434.tif 000065
【図１６】
0003977434.tif 000066
【図１７】
0003977434.tif 000067
【図１８】
0003977434.tif 000068
【図１９】
0003977434.tif 000069
【図２０】
0003977434.tif 000070
【図２１】
0003977434.tif 000071
0003977434.tif 000072
0003977434.tif 000073
【図２２】
0003977434.tif 000074
0003977434.tif 000075
【図２３】
0003977434.tif 000076
0003977434.tif 000077
0003977434.tif 000078
【図２４】
0003977434.tif 000079
0003977434.tif 000080
0003977434.tif 000081
【図２５】
0003977434.tif 000082
0003977434.tif 000083
0003977434.tif 000084
【図２６】
0003977434.tif 000085
0003977434.tif 000086
0003977434.tif 000087
【図２７】
0003977434.tif 000088
0003977434.tif 000089
0003977434.tif 000090