(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示す、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号３に示す、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａ  Ｂ遺伝子）の開始コドンから５’上流の非翻訳領域の１番目から３５５番目に相当する、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項５】
麹菌で機能するα−アミラーゼ遺伝子プロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子プロモーター、α−グルコシダーゼ遺伝子プロモーターの少なくともひとつに、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを、１個又は複数個導入したことを特徴とする、プロモーターＤＮＡ。
【請求項６】
麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターに、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを、１個又は複数個導入したことを特徴とする、プロモーターＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６に記載のＤＮＡから選ばれる少なくともひとつのＤＮＡを、プロモーターとして含むことを特徴とする、麹菌におけるタンパク質発現用プラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドを麹菌に形質転換してなる形質転換体。
【請求項９】
麹菌を固体培養することを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに示すＤＮＡを少なくとも含むＤＮＡを、プロモーターとして利用し、麹菌において同種又は異種遺伝子を発現させる発現方法。
【請求項１０】
麹菌を固体培養することを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに示すＤＮＡを少なくとも含むＤＮＡを、プロモーターとして利用し、麹菌において同種又は異種タンパク質を生産、回収することを特徴とする、同種又は異種タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のグルコアミラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）のプロモーター領域及びこれを利用した同種又は異種遺伝子発現システムに関する。更に詳細には、本発明は、麹菌（Aspergillus oryzae）の固体培養で特に多量に発現しているｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域を利用し、同種又は異種遺伝子を麹菌で効率的に発現させるシステムの構築に関するものであって、有用タンパク質の高生産を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用タンパク質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸菌を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また、酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既に、Mucor mieneiの酸性プロテアーゼが麹菌（A. oryzae）を宿主として工業生産されている。
【０００３】
異種タンパクを効率よく生産させるためには、まず高い発現能力を有するプロモーターを検索する必要がある。現在までにA. oryzaeから単離されたプロモーターでは、αアミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、αグルコシダーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのプロモーターを利用した異種タンパク生産についても研究されているが、その培養方法は液体培養で行われることがほとんどであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、本来麹菌は、液体培養に比べて固体培養の方がはるかに多量のタンパク質を分泌するため、固体培養での物質生産を行った方が高い生産性が期待できる。さらに固体培養で高発現するプロモーターが検索できれば、より一層生産量が上昇すると考えられる。このような観点から、本発明は麹菌における各種遺伝子の高発現システムを新たに開発する目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、固体培養において特異的に大量発現する新しいグルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢを発見し、そのプロモーター及び蛋白質コード領域の塩基配列を決定するのに成功し、既に特許出願を行った（特願平８−２６７７０１）。
【０００６】
このグルコアミラーゼＢ遺伝子ｇｌａＢは、既にA. oryzaeからクローニングされているグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）とは異なる新規遺伝子であって、レポーター遺伝子を用いたプロモーター解析の結果から、この新規ｇｌａＢ遺伝子のプロモーターは既知のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに比べて、固体培養において２００倍も強い発現能力を有することも発見し、この新知見についても、本発明者らは既に特許出願を行った（平成１０年２月２０日付「麹菌の培養方法」に関する特許出願）。
【０００７】
本発明者らは、このｇｌａＢ遺伝子が固体培養で高発現するためには、この遺伝子のプロモーター領域に高発現に必要な領域が存在すると考え、この観点から、上記した本発明の目的を達成するためには、上記領域をつきとめる必要を認めた。そこで本発明者らは、ｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域を種々の方法にて解析した結果、固体培養での高発現に必要な領域を特定するのに成功し、更に研究の結果、本発明の完成に至ったものである。
【０００８】
この領域は、固体培養において発現を誘導する正の転写因子と考えられ、この領域を利用すれば以下のことが可能となる。▲１▼この領域を他の遺伝子のプロモーター領域に挿入することにより、プロモーター活性（特に固体培養での）を上昇させることができる。▲２▼この領域を複数連結してｇｌａＢプロモーターに挿入することにより、ｇｌａＢプロモーターの発現量をさらに上昇させることができる。
以下、本発明について詳述する。
【０００９】
まず、プロモーター解析を行うについては、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。
【００１０】
具体的には、図１に示すような、形質転換用マーカーであるA. oryzae（硝酸還元酵素欠損変異株）のｎｉａＤ遺伝子（S. Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218,p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451, 1986）を含むベクターｐＮＧＵＳを作製した。そして、ｕｉｄＡ遺伝子の上流域に、ｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域あるいはその一部分を挿入して、プロモーター解析用プラスミドを構築した。
【００１１】
このプラスミドによりA. oryzae（Aspergillus oryzae GLB-01 : 本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８２６として寄託されている）のｎｉａＤ変異株（亜硝酸を資化できない変異株：Nitrate Reductase欠損株）を形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｉでｌコピーだけ導入された形質転換体を選択した。
【００１２】
これらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。まずプロモーター領域の上流から順次欠失したＤＮＡ断片を調製し、固体培養と液体培養でプロモーター活性を比較した。その結果、−３５６まで欠失しても、固体培養での高いプロモーター活性は変化がないが、さらに−２１３まで欠失させるとその活性は急激に低下した。したがってこの−３５５から−２１３の間に、固体培養での高発現に重要な領域が含まれていると考えられた。次にこの領域をｇｌａＡプロモーターに挿入し固体培養でのプロモーター活性を検討した。その結果、本来固体培養ではほとんど発現しないｇｌａＡプロモーターが、この領域を挿入することにより固体培養でｇｌａＢとほとんど同程度の発現量をしめすようになった。
【００１３】
そこで、さらにこの−３５５から−２１３の領域の中で、高発現に必要な領域の限定を試みた。その結果、−３５０から−３２４の２７塩基対の欠失だけでも固体培養での発現が大きく低下することが明らかとなった。また、この領域を含む−３５０から−２５４の９７塩基対及び−３５０から−２１３の１３８塩基対をｇｌａＡプロモーター領域に挿入した場合、いずれにおいても、固体培養での発現能力を飛躍的に上昇させることができた。したがって、上記２７塩基対はｇｌａＢプロモーターのコアサイトまたは少なくともコアサイト関連領域と認められ、このコアサイト領域を含む９７塩基対も高発現に関与する重要な領域と認められた。
【００１４】
以上のとおり、本発明者らは、ｇｌａＢプロモーター領域の中で、固体培養での高発現に重要な領域を限定することに成功した。この領域は麹菌での転写誘導を活性する因子であると考えられ、この領域を用いることにより高発現プロモーター構築が可能である。例えば、ｇｌａＡプロモーターにこの領域を挿入することにより、固体培養での発現能を１００倍以上に増加することができる。また、この領域をｇｌａＢプロモーターに挿入することにより、固体培養での発現能がさらに上昇する。したがって、このような改変プロモーターを利用することにより、A. oryzaeにおいて異種遺伝子タンパク（酵素、その他生理活性物質）を高生産させることができる。
【００１５】
このように、このｇｌａＢプロモーター内の転写活性を誘導する領域は、麹菌での高発現プロモーターの構築に有用で、広く外来遺伝子の発現に活用されうるものである。なお、本発明に係るコアサイト、この領域を含む９７塩基対及び１３８塩基対からなる重要領域は、実際の製麹に使用される野生株であるAspergillus oryzaeが有するｇｌａＢ遺伝子（特願平８−２６７７０１：その塩基配列を図５に示す）に含まれているので、そこから切り出して使用してもよいし（野生株の１例としては、A. oryzae GLB-01（FERM P-15826）が例示される）、常法にしたがって合成してもよい。また、該コアサイト及び／又は重要領域は、そのＤＮＡ塩基配列の一部について、塩基の置換、削除、挿入、転移等を行ってもよく、このようにして得られた各種の高発現ベクタープラスミド用ＤＮＡ断片も本発明に広く包含されるものである。
【００１６】
【実施例１】
ｇｌａＢ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から５′上流の非翻訳領域の１１２８塩基対を、プロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳ（図１）のＰｓｔＩ、Ｓａ１Ｉサイトに挿入した。次に、この１１２８塩基対の５′上流側から、順次欠失したＤＮＡ断片を調製し、それぞれ同様にｐＮＧＵＳに挿入した。得られたプラスミドにてA. oryzaeを形質転換後、導入したプラスミドが宿主染色体上で単一コピーで相同組換えした形質転換体を選択した。これらの形質転換体を、デンプンを炭素源としたツァペック−ドックス培地による液体培養と７０％精白米を用いた固体培養（米麹培養）を行い、生産されるＧＵＳ活性を測定した（図２）。その結果、１１２８塩基対すべてを含むものと比べて、５′側上流３５６塩基対まで欠失させても、固体培養でのＧＵＳ活性はほとんど低下しなかった。しかし、−２７２まで欠失したものでは、固体培養でのＧＵＳ活性が大きく減少した。したがって、この−３５５から−２７２の間に、固体培養での高発現に関与する領域が存在すると考えられた。
【００１７】
【実施例２】
ｇｌａＢプロモーターの中で−３５５〜２７２ｂｐ付近に、固体培養での高発現に必要な領域があることを確認するため、さらに、部位特異的欠失プロモーターでの解析を行った。ｇｌａＢプロモーター領域（１１２８塩基対）のなかから、ある一定の領域だけを欠失した変異プロモーターを調製し、液体培養と固体培養での発現能を検討した（図３）。ｇｌａＢプロモーターの中で、−９３４〜−７０５の領域、−７０４〜−５７２の領域、−５７１〜３５６の領域、いずれの領域を欠失させても、固体培養での発現能は低下しなかった。ところが−３５５〜２１３の領域を欠失させると、固体培養での発現がほとんど確認することができなかった。以上の結果より、この−３５５〜−２１３の領域に固体培養での高発現に必要な領域が存在することが確認された。
【００１８】
【実施例３】
次に−３５０から−２５４の領域をｇｌａＡプロモーターに挿入し、その固体培養での発現能を検討した（表１）。ｇｌａＡのプロモーターの−２０５の５′末端側に、ＰＣＲ法にて調製したｇｌａＢプロモーター（−３５０〜−２５４）領域を挿入し、キメラプロモーターを調整後、ｇｌａＡおよびｇｌａＢプロモーターとその発現能を比較した。ｇｌａＡプロモーターは固体培養でほとんどプロモーター活性が検出されないが、先のｇｌａＢプロモーター領域（−３５０−２５４）を挿入することで、固体培養での活性が４０倍に上昇した。このようにこのプロモーター領域（−３５０〜−２５４）は、プロモーターから欠失させると転写誘導活性が低下させるだけでなく、この領域の付加により固体培養での転写誘導活性を付与することも可能であることが判明した。したがって、−３５０〜−２５４の領域（９７ｂｐ）は重要領域ということができる。その配列を配列番号２に示す。また、この領域を包含する−３５０〜−２１３の領域（１３８ｂｐ）も重要領域であり、その配列を配列番号３に示す。
【００１９】
【表１】
0003877861.tif 000002
【００２０】
【実施例４】
ｇｌａＢプロモーター中の固体培養での高発現に関与する領域をさらに限定させるため、（−３５０〜−２１３）に対してさらに詳細な欠失変異プロモーターを作成した。その結果、−３５０から−３２４のわずか２７塩基対の欠失で、固体培養での発現が大きく低下することが明らかとなった（図４）。したがって、この２７塩基対の配列およびその近傍に、転写活性因子が存在すると考えられた。
【００２１】
このｇｌａＢプロモーターのコアサイトと認められる２７ｂｐの塩基配列は、配列番号１に示され、次のとおりである。
ＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＧＣ
【００２２】
【実施例５】
上記−３５０〜−３２４の領域（２７ｂｐ）をｇｌａＢプロモーターに挿入し、この領域のコピー数が増加した変異プロモーターを作成した。ｇｌａＢプロモーターの−３５０の５′側に、この２７塩基対のＤＮＡ断片を挿入した変異プロモーターの、プロモーター活性を比較した（表２）。挿入しないプロモーターに対して、２７塩基対を挿入した変異プロモーターは固体培養での発現能が１．５倍に上昇した。このようにこの２７塩基対の領域を利用することにより、強力なプロモーターを構築できることが確認された。
【００２３】
【表２】
0003877861.tif 000003
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、麹菌のｇｌａＢプロモーター由来のＤＮＡを利用することにより、同種遺伝子はもとより異種遺伝子のきわめて効率的な発現システムが構築された。
【００２５】
【配列表】
アスペルギルス・オリゼー由来の新規グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のｇｌａＢプロモーター由来の２７塩基対の塩基配列を配列番号１に示し、それを包含する９７塩基対及び１３８塩基対の塩基配列を配列番号２及び３に示す。
下記表３〜５に、配列番号１〜３で示される各配列を示す。
【００２６】
【表３】
0003877861.tif 000004
【００２７】
【表４】
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【００２８】
【表５】
0003877861.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＮＧＵＳの制限酵素地図を示す。
【図２】実施例１におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図３】実施例２におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図４】実施例４におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図５】アスペルギルス・オリゼーの新規グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）の塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0003877861.tif 000009
【図４】
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【図５】
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