(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の感染が原因となる疾病に対し、感染の危険がある人々を防護するためのワクチン組成物であって、
前記感染の危険がある人々の少なくとも７０％に当たる人数範囲まで、防護をもたらすに相当する相対的用量に選択して、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の、百日咳トキソイド、糸状赤血球凝集素、ペルタクチンならびに凝集原を精製された形状で含み、前記凝集原は、凝集原１（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ  １）を実質的に含まず、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を含み、
線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）の線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）に対する重量比が、１．５：１から２：１までである
ことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
人への単回投与量の中に、前記百日咳トキソイドは、蛋白窒素５〜３０μｇの量で含まれ、前記糸状赤血球凝集素は、蛋白窒素５〜３０μｇの量で含まれ、前記ペルタクチンは、蛋白窒素３〜１５μｇの量で含まれ、ならびに前記凝集原は、蛋白窒素１〜１０μｇの量で含まれていることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
少なくとも２１日間にわたる痙攣性咳き込み、ならびに確認された細菌感染の見られる百日咳の症例について、該防護の範囲が少なくとも８０％となることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
少なくとも１日間にわたる咳き込みの見られる温和な百日咳の症例について、該防護の範囲が少なくとも７０％となることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
少なくとも２１日間にわたる痙攣性咳き込み、ならびに確認された細菌感染の見られる百日咳の症例について、該防護の範囲が少なくとも８５％となることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
更に、破傷風トキソイドおよびジフテリヤトキソイドを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
該ワクチンは、
（ａ）  人への単回投与量の中に、前記百日咳トキソイドは、蛋白窒素１０μｇの量で含まれ、前記糸状赤血球凝集素は、蛋白窒素５μｇの量で含まれ、前記ペルタクチンは、蛋白窒素３μｇの量で含まれ、ならびに前記凝集原は、蛋白窒素５μｇの量で含まれている；あるいは、
（ｂ）  人への単回投与量の中に、前記百日咳トキソイドは、蛋白窒素２０μｇの量で含まれ、前記糸状赤血球凝集素は、蛋白窒素２０μｇの量で含まれ、前記ペルタクチンは、蛋白窒素３μｇの量で含まれ、ならびに前記凝集原は、蛋白窒素５μｇの量で含まれている
のいずれかであることを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
人への単回投与量の中に、前記ジフテリヤトキソイドは、１５Ｌｆの量が含まれ、前記破傷風トキソイドは、５Ｌｆの量が含まれていることを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
更に、アジュバントを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
アジュバントは、水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウムであることを特徴とする請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の感染が原因となる疾病に対し、感染の危険がある人々を防護するためのワクチン製剤の調製方法であって、
感染の危険がある人々へ投与用の該ワクチン製剤は、精製された形の百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）免疫原として、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の、百日咳トキソイドの精製済調製物、糸状赤血球凝集素の精製済調製物、ペルタクチンの精製済調製物、線毛性凝集原の精製済調製物を利用して、調製され、
該百日咳トキソイドの調製物、該糸状赤血球凝集素の調製物、該ペルタクチンの調製物、該線毛性凝集原の調製物を、前記感染の危険がある人々の少なくとも７０％に当たる人数範囲まで、防護をもたらすに相当する相対的用量に選択して、配合し、
前記凝集原は、凝集原１（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ  １）を実質的に含まず、線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）を含み、
線毛性凝集原２（Ａｇｇ  ２）の線毛性凝集原３（Ａｇｇ  ３）に対する重量比が、１．５：１から２：１までである
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記防護の範囲は、
（ａ）  少なくとも２１日間にわたる痙攣性咳き込み、ならびに確認された細菌感染の見られる百日咳の症例について、少なくとも８０％となる；あるいは
（ｂ）  少なくとも１日間にわたる咳き込みの見られる温和な百日咳の症例について、少なくとも７０％となる
のいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチン製剤は、
人への単回投与量の中に、該百日咳トキソイド調製物を、蛋白窒素５〜３０μｇの量で、該糸状赤血球凝集素調製物を、蛋白窒素５〜３０μｇの量で、該ペルタクチン調製物を、蛋白窒素３〜１５μｇの量で、ならびに該凝集原調製物は、蛋白窒素１〜１０μｇの量で含んでいることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチン製剤は、更に、破傷風トキソイド調製物およびジフテリヤトキソイド調製物を含むことを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
該ワクチン製剤は、
（ａ）  人への単回投与量の中に、該百日咳トキソイド調製物を、蛋白窒素１０μｇの量で、該糸状赤血球凝集素調製物を、蛋白窒素５μｇの量で、該ペルタクチン調製物を、蛋白窒素３μｇの量で、ならびに該凝集原調製物を、蛋白窒素５μｇの量で含んでいる；あるいは、
（ｂ）  人への単回投与量の中に、該百日咳トキソイド調製物を、蛋白窒素２０μｇの量で、該糸状赤血球凝集素調製物を、蛋白窒素２０μｇの量で、該ペルタクチン調製物を、蛋白窒素３μｇの量で、ならびに該凝集原調製物を、蛋白窒素５μｇの量で含んでいるのいずれかであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ワクチン製剤は、
人への単回投与量の中に、前記ジフテリヤトキソイド調製物を、１５Ｌｆの量で、前記破傷風トキソイド調製物を、５Ｌｆの量で含んでいることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
該ワクチン製剤は、更に、アジュバントを含むことを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
該アジュバントは、水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウムであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、非細胞性の百日咳ワクチン、それらの各成分及びそれらの製造に関する。
関連出願の引照
この出願は、それ自身が１９９５年５月４日に出願された共出願中の米国特許出願第０８／４３３，６４６号の部分継続出願である、１９９５年７月１２日に出願された共出願中の米国特許出願第０８／５０１，７４３号の部分継続出願である。
発明の背景
百日咳は百日咳菌（Bordetella pertussis）により引き起こされる強い伝染性の激しい上気道感染症である。世界保健機関は、年間６千万の百日咳症例があり、そしてそれに伴う５０万ないし１００万の死亡があると見積もっている（参考文献１−本明細書の全体を通じて、本発明の該当する技術の現状をより完全に記述するために各参照文献は括弧の中に入れて引用されている。各引用文献の文献情報はこの明細書の最後に、請求の範囲にすぐ続いてあげている。これら参照文献の各開示は本願の開示の中に参照のために採用される）。ワクチン非投与の集団においては５才以下の児童において８０％程度の百日咳発症が観測されている（参照文献２）。百日咳は小児病と考えられているけれども、青年期及び成人における臨床的及び無症候性の疾病の証拠がますます多く存在している（参照文献３、４及び５）。
１９４０年代における化学的及び熱的に失活させた百日咳菌（B. pertussis）微生物の全細胞ワクチンの導入は、百日咳菌（B. pertussis）により引き起こされる百白咳の発症の劇的な低下の原因となった。全細胞ワクチンについての効力率は症例の定義に依存するが、９５％までに見積もられている（参照文献６）。百日咳菌（B. pertussis）による感染は生涯免疫をもたらすが、全細胞ワクチンによる免疫感作の後で防護の減少することについての増大する証拠が存在する（参照文献３）。全細胞百日咳ワクチン接種と、反応原性と、及び重大な副作用との間の関係をあげているいくつかの報告はワクチンの受容能の低下とそれに従う更新された流行病とに導いた（参照文献７）。比較的最近において、特定的成分のいくつかの百日咳ワクチンが開発された。
特定的百日咳ワクチンの抗原類
種々の非細胞性百日咳ワクチンが開発されており、そして種々の百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原、百日咳毒素（ＰＴ）、糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、69kDaの外層膜蛋白質（ペルタクチン）及び線毛性凝集原を含む（下記第１表参照。−各表はこの明細書の末尾に現れる）。
百日咳毒素
百日咳毒素は外毒素であり、これはＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するバクテリア性毒素のＡ／Ｂ族の１員である（参照文献８）。これらの毒素のＡ−部分はＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示し、そしてそのＢ部分はその毒素の宿主細胞受容器への結合、及びＡのその活性部位への転座を媒介する。ＰＴも百日咳菌（B. pertussis）の線毛性外被細胞への付着を促進し（参照文献９）、そしてまた百日咳菌（B. pertussis）によるマクロファージの攻撃に或る役割をも演ずる（参照文献１０）。全ての非細胞性百日咳ワクチンはＰＴを含み、これは主要なビルーレンスファクター及び防護性抗原として提案されている（参照文献１１、１２）。百日咳菌（B. pertussis）による自然感染はＰＴに対する体液性及び細胞性応答の両方を惹起する（参照文献１３ないし１７）。幼児は経胎盤的に導かれる抗ＰＴ抗体を有し（参照文献１６、１８）、そして抗ＰＴ抗体を含む人初乳はマウスのアエロゾル感染に対する受動防護に有効であった（参照文献１９）。ＰＴサブユニットに対する細胞性免疫（ＣＭＩ）応答が、非細胞性ワクチンによる免疫感作の後で示されており（参照文献２０）、そしてＰＴに対するＣＭＩ応答が全細胞ワクチン接種の後で発現された（参照文献１３）。全細胞ワクチン又は成分ワクチンにおける化学的にしっかつさせたＰＴはいくつかの動物モデル及び人において防護性である（参照文献２１）。更に、サブユニットＳ１に特異的なモノクローナル抗体は百日咳菌（B. pertussis）の感染に対して防護する（参照文献２２及び２３）。
ＰＴの主要な病理生理学的効果は、このもののＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性に基づくものである。ＰＴはＮＡＤからのＡＤＰ−リボースのＧ1グアニンヌクレオチド−結合蛋白質への転位を接触し、そのようにして細胞性アデニル酸シクラーゼ調節系を崩壊させる（参照文献２４）。ＰＴはまた、マクロファージ及びリンパ球の炎症部位への移動をも阻害し、そして好中球に媒介される食細胞活動及びバクテリアの斃殺をも阻害する（参照文献２５）。Ｓ１及び／又はＰＴの酵素活性を評価するために多数の試験管内及び生体内評価法が用いられているが、それらはうしトランスデューシンのＡＤＰ−リボシル化（参照文献２６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の集落形成アッセイ（参照文献２７）、ヒスタミン感作（参照文献２８）、白血球増多症及びＮＡＤグリコヒドロラーゼを含む。ＰＴに暴露されたときにＣＨＯ細胞は或る特性的な集落形成した形態を発現する。この現象はＰＴの結合に依存性であり、そしてそれに続くＳ１の転座及びＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性、また従ってＣＨＯ細胞の集落形成アッセイがＰＴ正規毒素の完全性を試験するのに広く用いられている。
糸状赤血球凝集素
糸状赤血球凝集素は大型（２２０kDa）の非毒性のポリペプチドであって、これは百日咳菌（B. pertussis）のバクテリアコロニー化の間に上気道の繊毛のある細胞への付着を媒介する（参照文献９、２９）。自然感染は抗ＦＨＡ抗体及び細胞性免疫を誘起する（参照文献１３、１５、１７、３０及び３１）。種々の抗ＦＨＡ抗体が人の初乳の中に見出され、そして経胎盤的にも伝達される（参照文献１７、１８及び１９）。全細胞性又は非細胞性百自咳ワクチンによるワクチン接種は抗ＦＨＡ抗体を発現さ、そしてＦＨＡを含む非細胞性ワクチン類もＦＨＡに対するＣＭＩ応答を誘起させる(参照文献２０、３２)。ＦＨＡは能動的及び受動的免疫感作の後でのマウスの呼吸器感染試験モデルにおける防護的抗原の１つである（参照文献３３、３４）。しかしながら単独ではＦＨＡはマウスにおける脳内感染試験耐力評価法において防護を与えない（参照文献２８）。
69kDaの外層膜蛋白質（ペルタクチン）
この69kDaの蛋白質は外層膜蛋白質の１つであって、これは最初、ボルデテラ・ブロンキセプチカから確認された（参照文献３５）。これはボルデテラ・ブロンキセプチカに対する防護性抗原の１つであることが示され、そして次いで、百日咳菌（B. pertussis及びパラ百日咳菌（B. parapertussis））の両者においても確認された。この69kDa蛋白質は真核生物細胞に直接結合しており（参照文献３６）、そして百日咳菌（B. pertussis）による自然感染は抗Ｐ．６９体液性応答を誘起させ（参照文献１４）、そしてＰ．６９も細胞性免疫応答を誘起させる（参照文献１７、３７、３８）。全細胞性又は非細胞性のワクチンによるワクチン接種は抗Ｐ．６９抗体を誘発させ（参照文献３２、３９）、そして非細胞性ワクチンはＰ．６９ＣＭＩを誘発させる（参照文献３９）。ペルタクチンはマウスを百日咳菌（B. pertussis）によるアエロゾル感染試験に対して防護し（参照文献４０）、そしてＦＨＡとの組み合わせにおいて百日咳菌（B. pertussis）に対する脳内感染試験において防護をもたらす（参照文献４１）。ポリクローナル又はモノクローナル抗Ｐ．６９抗体の受身伝達もマウスをアエロゾル感染試験に対して防護する（参照文献４２）。
凝集原類
百日咳菌（B. pertussis）の種々の血清型はそれらの凝集性の線毛によって定義される。ＷＨＯは、各全細胞ワクチンがＩ、II及びIII型の各凝集原（Ａgg）を含むことを推奨しており、と言うのはそれらが交叉防護性でないからである（参照文献４３）。Ａgg１は非線毛性であり、そして全ての百日咳菌（B. pertussis）株について見出されているが、一方II及びIII型のＡggは線毛性である。自然感染又は全細胞性又は非細胞性の種々のワクチンによる免疫感作は抗Ａgg抗体を誘発させる（参照文献１５、３２）。マウスにおいて、アエロゾル接種の後でＡgg２及びＡgg３により特異的な細胞性免疫応答を発現させることができる（参照文献１７）。Ａgg２および３はマウスにおいて呼吸器感染試験に対して防護性であって種々の抗凝集原を含む人の初乳もこのアッセイにおいて防護作用を示す（参照文献１９、４４、４５）。
非細胞性ワクチン類
最初に開発された非細胞性ワクチンはSato等の２成分型のＰＴ＋ＦＨＡワクチン（ＪＮＩＨ６）であった（参照文献４６）。このワクチンは百日咳菌（B. pertussis）Tohama株の培養上澄液からＰＴ及びＦＨＡの各抗体を共精製し、引き続いてホルマリンによりトキソイド化することによって作られた。種々の製造業者からの種々の組成の非細胞性ワクチン類がこれまで成功の裡に日本国の児童を１９８１年以来百日咳に対して免疫化するのに使用されて疾病の発祥の劇的な低下をもたらしている（参照文献４７）。ＪＮＩＨ６ワクチン及び単一成分のＰＴトキソイドワクチン（ＪＮＩＨ７）は１９８６年にスウェーデン国において大規模臨床試験において試験された。最初の結果は、報告されている全細胞ワクチンの効力よりも低い効力を示したけれども、追跡試験はこれが血清学的な種々の方法により診断された比較的温和な疾病に対してはより有効であることを示した（参照文献４８、４９、５０、５１）。しかしながらこれらのワクチンにおいてはホルマリン失活させたＰＴの毒性について復帰の証拠が存在した。これらワクチンはまた感染以外の疾病に対しても防護することが見出された。
多数の新しい非細胞性百日咳ワクチン類が一般的に評価されているが、それらはＰＴ、ＦＨＡ、Ｐ．６９および／または凝集原を種々の組み合わせで含んでおり、そして、第１表にこれらをあげてある。化学的脱毒のいくつかの技術がＰＴについて用いられており、これらはホルマリン（参照文猷４６）、グルタルアルデヒド（参照文献５２）、過酸化水素（参照文献５３）及びテトラニトロメタン（参照文献５４）による失活を含む。
このように、通常市販で入手できる非細胞性百日咳ワクチンは百日咳に感染性の人々における所望の効力水準に達するために任意の免疫原的形態で任意の抗原の任意の配合を含むことはできない。
選ばれた抗原各種を選ばれた相対的量で含む効果的な非細胞性百日咳ワクチン類、およびそれらを製造する方法を提供することは望ましいであろう。
発明の要約
本発明は、非細胞性百日咳ワクチンの調剤、このものの種々の成分、そのようなワクチン類及びそれらの成分の調製方法及びこのものの使用方法を対象とするものである。
本発明のもう一つのアスペクトにおいて、ここで提供される線毛性凝集原配合物を含む免疫原性組成物が提供される。この免疫原性組成物は、それにより免疫感作された宿主をボルデテラ属菌（Bordetella）によってもたらされる疾病から防護するために生体内で使用するためのワクチンとして調剤することができ、そして少なくとも１つの他のボルデテラ属菌（Bordetella）抗原を含むことができる。この少なくとも１つの他のボルデテラ属菌（Bordetella）抗原は、遺伝的に脱毒された類似体を含めて、糸状赤血球凝集素、69kDaの外層膜蛋白質アデニル酸シクラーゼ、Bordatellaリポオリゴ糖、種々の外層膜蛋白質及び百日咳毒素又はそのトキソイドであることができる。
本発明の更に別なアスペクトの１つにおいて、ここで提供される免疫原性組成物は少なくとも１つの非-ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原を含むことができる。そのような非ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ヘモフィルスの莢膜多糖、ヘモフィルスの外層膜蛋白質、ＨＢs抗原、ポリオ、ムンプス、麻疹および／または風疹であってもよい。
ここに提供される免疫原性組成物は、更にアジュバントを含むでもよく、そしてそのようなアジュバントは燐酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、QuilＡ、ＱＳ21、燐酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル又はリポ蛋白質であることができる。
本発明のアスペクトの１つによれば、百日咳菌（B. pertussis）による感染によって引き起こされる疾病の症例に危険のある人々を防護するためのワクチン組成物が提供され、このものは百日咳トキソイド、糸状赤血球凝集素、ペルタクチン及び種々の凝集原を選ばれた相対的量で精製された形で含み、それら危険のある人々の少なくとも約７０％の範囲までに防護をもたらす。
このようなワクチン組成物は、百日咳トキソイドの約５ないし約３０μｇの窒素、糸状赤血球凝集素の約５ないし約３０μｇの窒素、ペルタクチンの約３ないし約１５μｇの窒素及び凝集原の約１ないし約１０μｇの窒素を含むことができる。
特別な具体例の１つにおいて、このワクチンはボルデテラ属菌（Bordetella）の百日咳トキソイド、糸状赤血球凝集素、69kDa蛋白質及び各種糸状赤血球凝集原を人への単一投与量の中での約１０μｇの百日咳トキソイド、約５μｇの糸状赤血球凝集素、約５μｇの69kDa蛋白質及び約３μｇの線毛性凝集原によって提供されて、約１０：５：５：３の重量比で含むことができる。更にもう１つの特別な具体例においてこのワクチンは、百日咳トキソイド、糸状赤血球凝集素、69kDa蛋白質及び線毛性凝集原を、人への単一投与量の中で約２０μｇの百日咳トキソイド、約２０μｇの糸状赤血球凝集素、約５μｇの69kDa蛋白質及び約３μｇの線毛性凝集原により提供されて約２０：２０：５：３の重量比で含むことができる。更に別なもう１つの特別な具体例において、このワクチンは、百日咳トキソイド、糸状赤血球凝集素、69kDa蛋白質及び線毛性凝集原を約２０：１０：１０：６の重量比で含むことができ、人への単一投与量の中では、約２０μｇの百日咳トキソイド、約１０μｇの糸状赤血球凝集素、約１０μｇの69kDa蛋白質及び約６μｇの線毛性凝集原により提供される。
本発明のワクチン組成物により、危険のある人々にもたらされる防護の範囲は少なくとも２１日間の長さの痙攣咳き込み及び培養によって確認されたバクテリア感染の場合について少なくとも約８０％、好ましくは約８５％であることができる。危険のある人々に対するこの防護の範囲は、少なくとも１日間にわたる咳き込みを有する温和な百日咳の場合について少なくとも約７０％であることができる。
このワクチンの凝集原成分は、凝集原１を実質的に含まず、好ましくは線毛性凝集原２（Ａgg２）及び線毛性凝集咸３（Ａgg３）を含む。このＡgg２のＡgg３に対する重量比は約１．５：１から約２：１までであることができる。
ここで提供されるワクチンは破傷風トキソイド及びジフテリヤトキソイドと組み合わせてＤＴＰワクチンを提供することができる。具体例の１つにおいてこのワクチンは約１５Lfのジフテリヤトキソイド及び約５Lfの破傷風トキソイドを含む。
加えて、このワクチンはまた、アジュバント、特にアラムをも含むことができる。
本発明の更にもう１つのアスペクトにおいて、百日咳菌（B. pertussis）による感染によって惹起される疾病に対して危険のある人々を免疫感作する方法が提供され、これはそれら危険のある人々に、ここで提供されるワクチン組成物の免疫有効量を投与してそれら危険のある人々の少なくとも約７０％の範囲までに防護をもたらすことを含む。
本発明の利点は、高められた効力の改善された非細胞性百日咳ワクチン組成物を含む。
本発明は更にもう１つのアスペクトにおいて、危険のある人々に投与するためのワクチン組成物の製造において用いたときに上記危険のある人々の少なくとも約７０％の範囲までに防護をもたらす、百日咳菌（B. pertussis）の百日咳毒素、糸状赤血球凝集素、ペルタクチン及び線毛性凝集原の各精製された形を提供する。
そのような利用において、人への単一投与量のワクチン組成物を製造する際にペルタクチンの窒素の約３０μｇ及び線毛性凝集原の窒素の約１ないし約１０μｇを使用することができる。中でも、ここで提供されるワクチン組成物は、人への効力の二重盲臨床試験において評価するために米国政府のNational Institute of Allergy and Infections Diseases（ＮＩＡＩＤ）によって選ばれており、それによってこの技術に特に習熟した者に対してこれらの組成物が上述した疾病（百日咳）を防ぐのに或る程度有効であろうと言うことの充分な基礎を確立している。その試験の対象物（ここで提供されるワクチンである）は実用を合理的に予定させるべき要件に合致している。
【図面の簡単な説明】
本発明は添付の図面を参照してあげる以下の詳細な記述から更に理解されるであろうが、その際
第１図はBordetella株の１つからの凝集原の調剤の分離のための操作の図式的フローシートである。
発明の詳細な説明
第１図を参照するならば、ボルデテラ属菌（Bordetella）株から凝集原調剤を調製する方法をフローシートにて示している。第１図に見られるように、凝集原を細胞ペーストから選択的に抽出するため、凝集原を含むボルデテラ属菌（Bordetella）の細胞ペースト、例えば百日咳菌（B. pertussis）細胞ペーストを、例えば尿素含有緩衝液、例えば１０ｍＭ燐酸カリウム、１５０ｍＭ  NaCl及び４Ｍ尿素を用いて抽出し、それにより凝集原と第１残留沈殿（ppt１）を含む第１上澄液（sp１）を作り出す。この第１上澄液（sp１）を例えば遠心分離によってその第１残留沈殿（ppt１）から分離する。その残留沈殿（ppt１）は棄てる。次にその透明化した上澄液（sp１）を濃縮し、そして例えば100ないし300kDa NMWL膜フィルタを用いて、例えば１０ｍＭ燐酸カリウム／１５０ｍＭ NaCl／０．１％トリトンX-100に対して透析濾過することができる。
次にその第１上澄液を各凝集原と、非凝集原性の不純物を含む第２廃棄用沈殿（ppt２）とを含む透明化された上澄液（sp２）を作り出すために或る温度においてある時間にわたりインキュベートする。適当な温度は約７５°ないし約８５℃を含めて、約５０℃ないし約１００℃を含み、そして適当なインキュベーション時間は約１ないし約６０分間を含む。次にその透明化された上澄液を、例えば約８，０００の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）の添加により約４．５±０．２％の最終濃度まで濃縮し、そして最低約１０分間にわたり温和に撹拌して第３の沈殿（ppt３）を生じさせ、このものは遠心分離により捕集することができる。残りの上澄液（sp３）は棄てる。
この第３の沈殿（ppt３）を、例えば１０ｍＭの燐酸カリウム／１５０ｍＭ NaClを含む緩衝液で抽出して粗製の線毛性凝集夏原含有溶液を提供する。この粗製の線毛性溶液に１Ｍの燐酸カリウムを加えてこれを、燐酸カリウムについて約１００ｍＭにすることができる。これと異なって、その透明化させた熱処理された線毛性凝集原の上澄液は沈殿させることなく、例えばセファローズCL6Bを用いてゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる。次にこの粗製の溶液の中の線毛性凝集原を、例えばＰＥＩシリカカラムを通過させることによりカラムクロマトグラフィーにより精製してその透過液の中の線毛性凝集原調剤を作り出す。
透過液を含むこの線毛性凝集原は更に濃縮し、そして100-300kDaのNMWL膜を用いて、例えば１００ｍＭ燐酸カリウム／１５０ｍＭ NaClを含む緩衝液に対して透析濾過することができる。この凝集原調剤は≦０．２２μｍの膜フィルタを通して濾過することにより滅菌して線毛性凝集原２及び３を含む最終的に精製された線毛性凝集原調剤をもたらす。
ボルデテラ属菌（Bordetella）株の１つから作られた凝集原は、実質的に凝集原１を含まず、線毛性凝集原２（Ａgg２）及び線毛凝集原３（Ａgg３）を含むことができる。Ａgg２のＡgg３に対する重量比は、約１．５：１から約２：１までであることができる。そのような線毛性凝集原調剤は上に詳細に記述し、ここで提供される方法により作ることができる。本発明はまた、上に記述した線毛性凝集原調剤を含む免疫原性粗製物（ワクチン類を含む）に拡張される。このようなワクチン類は、糸状赤血球凝集素、69kDa外層膜蛋白質及び百日咳毒素又はそのトキソイドを含めて、例えば参照文献６８に記述されているような、遺伝的に脱毒されたＰＴの類似体を含めて他のボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原を含む。
そのようなワクチン類は、ジフテリヤトキソイド、破傷風トキソイド、ヘモフィルスの莢膜多糖、ヘモフィルスの外層膜蛋白質、Ｂ型肝炎表面抗原、ポリオ、ムンプス、麻疹及び風疹を含む非-ボルデテラ属菌（Bordetella）の種々の免疫原を含むことができる。
それらボルデテラ属菌（Bordetella）抗原のそれぞれは個別のアジュバント（例えばアラム）に吸収させてワクチンの中に選ばれた相対的量の種々の抗原を含むワクチンの、簡便で迅速な製造をもたらし、それにより危険のある人々の少なくとも約７０％、好ましくはそのような人々の約８０％の範囲までに防護を与える。
選ばれたいくつかの具体例において本発明は下記の諸特性を有するいくつかのワクチンを提供する（ここで用いるμｇ蛋白質は精製した濃縮物について実施したケルダール試験の結果に基づき、そして蛋白質窒素のμｇとしいあげてある）が、それらは全て筋肉内投与により投与することができる。
（ａ）ＣＰ10/5/5/3ＤＴ
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた成分百日咳ワクチンの１つの調剤をＣＰ10/5/5/3ＤＴで表わした。人へのそれぞれ０．５ｍｌのＣＰ10/5/5/3ＤＴの投与量をほぼ下記が含まれるように配合した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）              １０    μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）              ５    μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）        ５    μｇ
69kDa外層膜蛋白質                       ３    μｇ
ジフテリヤトキソイド                  １５    Lf
破傷風トキソイド                        ５    Lf
燐酸アルミニウム                        １．５ｍｇ
保存材として２−フェノキシエタノール    ０．６％
（ｂ）ＣＰ20/20/5/3ＤＴ
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせたもう１つの成分百日咳ワクチンの調剤をＣＰ20/20/5/3ＤＴで表わした。人へのそれぞれ０．５ｍｌのＣＰ20/20/5/3ＤＴの投与量をほぼ下記が含まれるように配合した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）              ２０    μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）            ２５    μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）        ５    μｇ
69kDa外層膜蛋白質                       ３    μｇ
ジフテリヤトキソイド                  １５    Lf
破傷風トキソイド                        ５    Lf
燐酸アルミニウム                        １．５ｍｇ
保存材として２−フェノキシエタノール    ０．６％
（ｃ）ＣＰ10/5/5ＤＴ
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた成分百日咳ワクチンの１つの調剤をＣＰ10/5/5ＤＴで表わした。人へのそれぞれ０．５ｍｌのＣＰ10/5/5ＤＴの投与量を、ほぼ下記が含まれるように配合した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）              １０    μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）              ５    μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）        ５    μｇ
ジフテリヤトキソイド                  １５    Lf
破傷風トキソイド                        ５    Lf
燐酸アルミニウム                        １．５ｍｇ
保存材として２−フェノキシエタノール    ０．６％
（ｄ）ＣＰ20/10/10/6ＤＴ
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた更にもう１つの成分百日咳ワクチンの調剤をＣＰ20/10/10/6ＤＴで表わした。人へのそれぞれ０．５ｍｌのＣＰ20/10/10/6ＤＴの投与量を、ほぼ下記が含まれるように配合した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）              ２０    μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）            １０    μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）      １０    μｇ
69kDa外層膜蛋白質                       ６    μｇ
ジフテリヤトキソイド                  １５    Lf
破傷風トキソイド                        ５    Lf
燐酸アルミニウム                        １．５ｍｇ
保存材として２−フェノキシエタノール    ０．６％
その他のボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原、百日咳毒素（例えばKlein等の米国特許第５，０８５，８６２号に記述され、本願の譲受人に譲渡されてそれへの参照文献としてここに採用される、遺伝的に脱毒されたこのものの類似体を含む）、ＦＨＡおよび69kDa蛋白質は、以下に記述するような、多くの方法を用いて製造することができる：
ＰＴの精製
ＰＴは通常の種々の方法を用いて百日咳菌（B. pertussis）の１つの株の培養上澄液から分離することができる。例えば、Sekura等（参照文献６５）の方法を用いることができる。ＰＴは最初、培養上澄液を染料配位子ゲルマトリックスAffi-Gel Blue（カリフォルニヤ州リッチモンドのBio-Rad Laboratories）を含むカラムに吸着させることにより分離される。ＰＴはこのカラムから高濃度塩、例えば、０．７５Ｍ塩化マグネシュウムにより溶離させ、脱塩の後、臭化シアンで活性化したセファロースに結合したフェチュインよりなるフェチュイン−セファロース親和性マトリックスのカラムを通過させる。ＰＴはこのフェチュインカラムから４Ｍマグネシウム塩を用いて溶離させる。
これと異なって、Irons等の方法（参照文献５６）を用いることもできる。培養上澄液を、最初にハプトブロビンが共有結合的に結合されているCNBr-活性化されたセファローズ4Bのカラムの吸着させる。そのＰＴはpH6.5においてその吸着材に結合し、そして段階的にpH10まで変化させることにより0.1M Tris／0.5M NaCl緩衝液を用いてこのカラムから溶離される。
これと異なって、1987年11月10日にScott等に与えられてここで参照文献として採用される米国特許第4,705,686号に記述された方法を使用することもできる。この方法においては百日咳菌（B. pertussis）の培養上澄液又は細胞性抽出物を充分な要領のアニオン交換樹脂のカラムを通過させて菌体内毒素を吸着させるが、但しボルデテラ属菌（Bordetella）抗原類は流過することを許容させるか、又はさもなければこの菌体内毒素と分離する。
これと別に、ＰＴはその譲受人に譲渡されたヨーロッパ特許EP Patent No. 336,736に記述され、そしてここで参照文献として採用されるような、パーライトクロマトグラフィーを用いることによって精製することもできる。
ＰＴの脱毒
ＰＴはその最終的ワクチンの副反応をもたらすことがあるような望ましくない活性を除くために脱毒される。多くの通常的な化学的脱毒方法のいずれか、例えばホルムアルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタンまたはグルタルアルデヒドを用いた処理を使用することができる。
例えば、ＰＴはMunoz等（参照文献５７）に記述されている方法の変形態様のものを用いてグルタルアルデヒドで脱毒することができる。この脱毒方法において精製されたＰＴは0.01M燐酸塩緩衝された食塩溶液を含む溶液の中でインキュベートされる。この溶液をグルタルアルデヒドで0.05%にし、そしてその混合物を室温において２時間インキュベートし、次いでＬリシンにより0.02Mにする。この混合物を更に室温において２時間インキュベートし、そして次に0.01M PBSに対して２日間透析する。特別な具体例の１つにおいて、ヨーロッパ特許EP Parent No. 336,736号の脱毒方法を用いることもできる。簡単には、ＰＴはグルタルアルデヒドを用いて次のような脱毒することができる：
0.22Mの塩化ナトリウムを含むpH8.0の75mMの燐酸カリウムの中で精製したＰＴを等量のグリセロールで稀釈して約50ないし400μg/mlの蛋白質濃度にする。この溶液を37℃に加熱し、そしてグルタルアルデヒドを0.5%（W/V）の最終濃度にまで加えることによって脱毒する。この混合物を37℃において４時間保ち、そして次にアスパラギン酸（1.5M）を加えて最少濃度0.25Mにする。この混合物を室温において１時間インキュベートし、そして次に0.15Mの塩化ナトリウム及び５％グリセロールを含むpH8.0の10mM燐酸カリウムの１０体積で透析濾過してそのグリセロールを減少させ、そしてグルタルアルデヒドを除去する。このＰＴトキソイドを0.2μmの膜を通して滅菌濾過する。
トキソイド化分子として使用するための、毒性を示さないか又は僅かしか示さないＰＴ突然変異分子を調製するために組換え技術を用いる場合には化学的脱毒は不必要である。
ＦＨＡの精製
ＦＨＡは本質的にCowell等により記述された（参照文献５８）ような培養上澄液から精製することができる。メチレート化β-シクロデキスチリンのような成長促進剤を培養上澄液の中のＦＨＡの収率の上昇のために使用することができる。この培養上澄液をヒドロキシルアパタイトのカラムに加える。ＦＨＡはこのカラムに吸着されるがＰＴは吸着されない。このカラムをトリトンX-100を用いて強く洗浄して菌内毒素を除去する。次にＦＨＡを0.1Mの燐酸ナトリウムの中の0.5M NaClを用いて溶離させ、そして必要の場合、フェチュイン−セファロースカラムを通過させて、残余のＰＴを除去する。追加的な精製は、セファローズCL-6Bカラムの通過を含むこともできる。
これと異なって、ＦＨＡはその抗原に対するモノクローナル抗体を使用し、その際それら抗体をCNBr-活性化された親和性カラムに固定させて精製することもできる（参照文献５９）。
これと別に、ＦＨＡは前述したヨーロッパ特許EP 336,736に記述されているようなパーライトクロマトグラフィーを用いることによって精製することもできる。
69kDaの外層膜蛋白質（ペルタクチン）の精製
69kDaの外層膜蛋白質（６９Ｋ又はペルタクチン）は、公開されたEP 484,621に記述され、そしてここに参照文献として採用されるように、まず、例えばチメロサールのような静菌剤を用いてその細胞を失活させることによりバクテリア細胞から回収することができる。この失活した細胞を、例えばPBS（pH7ないし8）のような水性培地の中に懸濁させ、そして高められた温度（45ないし60℃）において繰り返し抽出し、引き続いて室温又は４℃に冷却する。この抽出は細胞から６９Ｋ蛋白質を解放させる。この６９Ｋ蛋白質を含む物質を沈殿により捕集し、そしてAffi-Gel Blueカラムを通過させる。この６９Ｋ蛋白質は例えば0.5M塩化マグネシウムのような高濃度塩を用いて溶離させる。透析の後でこのものをクロマトフォーカシング支持材を通過させる。
これと異なって、69kDa蛋白質は、公開された国際ＰＣＴ出願WO 91/15505に、その譲受人の名義で記述され、そしてここで参照文献として採用されるように、百日咳菌（B. pertussis）培養の培養上澄液から精製することもできる。
百日咳菌（B. pertussis）からの69kDaの外層膜蛋白質を精製する他の適当な方法は、1984年１月４日にGotto等に与えられた米国特許No. 5,276,142及び1992年３月31日にBurnsに与えられた米国特許No. 5,101,014に記述されている。
百日咳に対して防護するための成分ワクチンの安全性、非反応原性及び有用性を確立するために、人において多数の臨床試験がここに記述したように実施された。中でも、それらワクチン（例えば下記第３表に示すような）の中に含まれる各種抗原のそれぞれに対する免疫応答が得られた。非細胞性百日咳ワクチンの特別な１つＣＰ10/5/5/3ＤＴが、このワクチンの典型的な百日咳に対する効力を評価するために危険のある人々のおいて大型のプラシーボ制御された多重中心の２重不規則化された臨床試験において分析された。
典型的な百日咳症についての症例定義は：
２１日間又はそれ以上の痙攣性咳き込み、及び
培養により確認された百日咳菌（B. pertussis）か、又は
対の血清の中のＦＨＡ又はＰＴについてのＥＬＩＳＡにおけるIgＧ又はIgＡ抗体の１００％の上昇によって示されるボルデテラ属菌（Bordetella）特異的感染の血清学的証拠か、或いは
血清学的データが存在しないときは
その被検児童が被検児童の咳き込みの発症の前又は後の２８日以内において家族の中の咳き込みの発症とともに培養によっ確認された百日咳菌（B. pertussis）の患者と接触してしまったこと
である。
この研究の結果は、上に記述した典型的な百日咳症についての症例定義において定義された百日咳の防護においてＣＰ10/5/5/3ＤＴが約８５％有効であることを示した。同じ研究においてＰＴ及びＦＨＡのみを含む２成分非細胞性百日咳ワクチンは約５８％有効であり、そして全細胞百日咳ワクチンは約４８％有効であった（下記第４表参照）。加えて、このＣＰ10/5/5/3ＤＴは少なくとも１日間の長さの咳き込みとして定義される温和な百日咳を約７７％の有効度にまで防護した。中でも、その得られた免疫応答の様相は百日咳に対して高度に有効であると報告されている全細胞百日咳ワクチンを用いての免疫感作により得られたものと実質的に同一であった。
ワクチンの調製及び使用
すなわち、ワクチンとして使用するのに好適ないくつかの免疫原性粗製物をここに開示されたボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原から調製することができる。このワクチンは対象体の中でオプソン化性であるか、又は殺菌性であることができるような種々の抗体を作り出す免疫応答を惹起する。そのワクチン接種された対象体に百日咳菌（B. pertussis）による感染試験が行なわれるべき場合は、そのような各抗体はそのバクテリアに結合してこれを失活させる。更に、オプソン化性又は殺菌性の各種抗体はまた、別の種々の機構によっても防護をもたらすことができる。
種々のワクチンを含む免疫原性組成物は注射可能液として、液体の溶液として又はエマルジョンとして調製することができる。各ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原は、それら免疫原と相容性のある、薬学的に受容可能な種々の薬と混合することができる。このような薬は水、食塩水、テキストローズ、グリセロール、エタノール及びそれらの混合物を含むことができる。それら免疫原性組成物及びワクチン類は更に補助物質、例えば湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤或いはその効力を高めるアジュバントを含むことができる。各免疫原性組成物及びワクチン類は非経口的に、皮下注射により、又は筋肉内注射によって投与することができる。それら免疫原性配合物及びワクチン類はその投与調剤と相容的にかつ治療的に有効な免疫原的かつ防護的な量で投与される。投与されるべき量はその処置されるべき対象に依存し、例えばその固体の各種抗体を合成し、そして必要の場合には細胞性免疫応答を作り出すための免疫系の容量を含む。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。しかしながら、好適な投与量範囲は当業者によって容易に決定することができ、そしてそれら免疫原の数μｇのオーダーであることができる。初期投与及び追加投与のための適当な処方も可変であるけれども、初期投与に続いて次のいくつかの投与を含むことができる。投与量も投与の経路に依存し、そして宿主の大きさによって変化することができる。
本発明に従う免疫原性組成物の中の各免疫原の濃度は一般に約１ないし約９５％である。ただ１つの病原体のみの抗原性物質を含むワクチンは１価ワクチンである。いくつかの病原体の抗原性物質を含むワクチンは組み合わせワクチンであり、そしてこれらも本発明に従属する。それぞれの組み合わせワクチンは例えば種々の病原体から、又は同一の病原体の種々の株からの物質或いは種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。
それら各抗原を通常、燐酸塩緩衝された食塩水の中の0.005ないし0.5%溶液として用いられる種々のアジュバントと一緒に共投与される場合に免疫原性を大きく改善することができる。アジュバント類は或る抗原の免疫原性を高めるけれども、それらはそれ自身免疫原性である必要はない。アジュバントは、その免疫系の細胞に対して抗原のゆっくりとした持続的放出を助けるデポット効果をもたらすように投与の部位の近傍にその抗原を局部的に保持することによって作用することができる。アジュバントはまた、その免疫系の各細胞を抗原集積位置へ引き寄せることができ、そしてそのような細胞を免疫応答を惹起するように刺激する。
種々の免疫刺激剤又はアジュバントが多年にわたり宿主の、例えば種々のワクチンに対する免疫応答を改善するために使用されてきた。通常は、例えばリポ多糖のような本来のアジュバントは、ワクチンとして用いられる死滅させ、又は減力させたバクテリアの成分である。外来性アジュバントは典型的には非共役結合的に抗原と結合し、そして宿主の免疫応答を高めるために配合される免疫モジュレーターである。すなわち、非経口的に与えられた種々の抗原に対する免疫応答を高める種々のアジュバントが確認されている。しかしながらこれらのアジュバントの若干のものは毒性であり、そして望ましくない副作用を引き起こすこともあり、ひとならびに多くの動物における使用には不適当とされる場合がある。実際に、水酸化アルミニウム及び燐酸アルミニウム（集合的に一般にアラムと呼ばれる）のみが人及び獣医用ワクチンにおいて常用されている。アラムのジフテリヤ及び破傷風のトキソイドに対する抗体応答の上昇の有効性はよく確立されており、そしてより最近になってＨＢsAgワクチンはアラムをアジュバントとして用いている。アラムの有用性は若干の用途について充分に確立されているけれども、これには限界がある。例えば、アラムはインフルエンザに対するワクチン接種には無効であり、そして細胞性免疫応答の誘発が一定しない。アラムのアジュバントとする抗原類により誘発される各抗体はマウスにおいて主としてＩｇＧアイソタイプであり、これらは若干のワクチン性薬剤による防護については最適でない場合がある。
外来的な広範囲の種々のアジュバントは種々の抗原に対して強い免疫応答を誘発することができる。これらは種々の膜蛋白質抗原（免疫刺激コンプレックス）に複合化されたサポニン類、鉱油を含むプルロニックポリマー類、鉱油の中の死滅させたマイコバクテリア、フロイントの完全アジュバント、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びリポ多糖（ＬＰＳ）のようなバクテリア性生成物並びにリピドＡ及び種々のリポソームを含む。
体液性免疫応答（ＨＩＲ）及び細胞性免疫（ＣＭＩ）を充分に誘発させるために種々の免疫原はしばしばアジュバントの中に乳化される。肉芽腫、急性及び慢性の炎症（フロイントの完全アジュバント：ＦＣＡ）、溶菌（サポニン類及びプルロニックポリマー類）、発熱原性、関節炎及び前部ブドウ膜炎（ＬＰＳ及びＭＤＰ）を含めて多くのアジュバントは毒性である。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究に広く用いられているけれどもこれは人や獣医用ワクチン接種にはこのものの毒性のために用いることが許可されていない。
理想的なアジュバントのの望ましい特性は下記を含む：
（１）  毒性がないこと、
（２）  長く継続する免疫応答を刺激する能力、
（３）  製造が簡単であって長期間の貯蔵において安定であること、
（４）  種々の経路から投与された各種抗原に対してＣＭＩ及びＨＩＲの両方を誘発させる能力、
（５）  他のアジュバントとの相乗作用、
（６）  抗原を与える細胞（ＡＰＣ）と選択的な相互作用をし得ること、
（７）  適当なＴH1又はＴH2細胞−特異的な免疫応答を特異的に発現する能力、及び
（８）  種々の抗原に対して適当な抗体アイソタイプ水準（例えばIgＡ）を選択的に上昇させる能力。
ここに参照文献として採用される、１９８９年８月８日にLokhoff等に与えられた米国特許第4,855,283号は、それぞれその糖残基の中でアミノ酸によって置換されているＮ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシル尿素及びＮ−グリコシルカルバメート類を免疫モジュレータ又はアジュバントとして含む種々の糖脂質類似体を教示している。すなわち、Lockhoff等（米国特許第4,855,283号及び参照文献６０）はグリコスフィンゴリピド及びグリコグリセロリピドのような天然産の糖脂質類に構造的な類似性を示すＮ−グリコリピド類似体がヘルペスシンプレックスウイルスワクチン及びシュードラピースウイルスワクチンの両者において強い免疫応答を惹起できることを報告した。若干の糖脂質類は長鎖状アリキルアミン類と、芳香族性炭素原子を介して糖と直接結合している脂肪酸類とから、天然産のリピド残基の機能を模倣するように合成されている。
Molonyに与えられ、本譲受人に譲渡されてここに参照文献として採用される米国特許第4,258,029号は、破傷風トキソイド、ならびにホルマリンで失活させたＩ、II及びIII型のポリオミエリティスウイルスワクチンと複合化させた際、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）がアジュバントとして機能することを教示している。また、Nixon-George等（参照文献６１）の組換えＨＢｓ抗原と複合化させた芳香族アミノ酸類のオクタデシルエステル類がＢ型肝炎ウイルスに対する宿主の免疫応答を高めたことを報告している。
実施例
以上の記述は本発明を一般的に説明するものである。より完全な理解は以下の特別ないくつかの例を参照することによって得ることができる。これらの例は説明の目的のためにのみ記述するものであって本発明の範囲を制限しようとするものではない。形態の変化や当量の置き換えは、条件が適当であることを示唆し、又は好適にするためのものである。ここでいくつかの特別な用語が用いられているけれどもこれらの語は記述を目的としたもので、限定を目的としたものではない。
この開示において明確に記述されることなく用いられている種々の蛋白質生化学、発酵学及び免疫学の方法、及びこれらの例は科学的な文献に充分に報告されており、従って当業者に充分理解できる範囲のものである。
例１
この例は百日咳菌（Bordetella pertussis）の育成を記述する。
マスターシード
百日咳菌（Bordetella pertussis）の１つの株のマスターシード培養物を冷凍乾燥したいくつかの種ロッドとして２℃ないし８℃に保った。
実用シード
この冷凍乾燥した培養物をHornibrook培地の中で復元させ、そしてBordet-Gengou寒天（ＢＧＡ）プレートに接種するために用いた。Hornobrook培地は下記の組成を有する：
成分                                    １リットルにつき
カゼイン加水分解物（木炭で処理した）      １０．０    ｇ
ニコチン酸                                  ０．００１ｇ
塩化カルシウム                              ０．００２ｇ
塩化ナトリウム                              ５．０    ｇ
塩化マグネシウム６水和物                    ０．０２５ｇ
塩化カリウム                                ０．２００ｇ
２塩基性燐酸カリウム                        ０．２５０ｇ
澱粉                                        １．０    ｇ
蒸留水                                  １．０リットルにする
ｐＨは１％炭酸ナトリウム溶液で6.9±0.1に調節する。この培地をいくつかのチューブの中に配置してオートクレーブの中で２０分間蒸煮し、そして１２１℃ないし124℃において２０分間にわたりオーシクレーブ処理することにより滅菌する。その種株を2回、まず最初はＢＧＡプレートの上で、次いで成分百日咳寒天（ＣＰＡ）の上で継代培養した。成分百日咳寒天（ＣＰＡ）は下記の組成を有する：
NaCl                       2.5g/L
KH2PO4                   0.5g/L
KCl                      0.2g/L
MgCl2（H2O）6            0.1g/L
Tris塩基                 1.5g/L
カザミノ酸              10.0g/Ｌ
NaH-グルタミン酸        10.0g/L
濃HCl                   pH７にする
寒天                    15.0g/L
成長因子（ＣＰＧＦ）    10.0ml/L
成分百日咳菌（Pertussis）成長因子（ＣＰＧＦ）-100Xは下記の組成を有する：
Ｌ−システインHCl                     4.0g/L
ニアシン                              0.4g/L
アスコルビン酸                       40.0g/L
還元したグルタチオン                 15.0g/L
Fe2SO4（H2O）7                        1.0g/L
ジメチル−β−シクロデキストリン    100  g/Ｌ
CaCl2（H2O）2                         20.g/L
その最終培養物を百日咳菌（Pertussis）種株懸濁緩衝液（ＣＰＳＢ）の中に懸濁させ、２ないし４ｍｌの部分量に分け、そして−６０℃ないし−８５℃において冷凍貯蔵した。
百日咳菌（Pertussis）種株懸濁緩衝液（ＰＳＳＢ）は下記の組成を有する：
カザミノ酸                 10.0g/L
Tris塩基                    1.5g/L
無水グリセリン            100  ml/L
濃HCl                     pH7.2とする
これらのグリセロール懸濁液が実用種株調製の出発物質を提供した。
培養方法
その実用種株の調製を成分百日咳寒天Ｒｏｕｘ瓶の中で３４℃ないし３８℃において４ないし７日間実施した。この培養に続いて各細胞を成分百日咳菌（Pertussis）ブイヨン（ＣＰＢ）で寒天から洗い出した。各試料はグラム染色によって培養物純度及び不透明度について観測した。
細胞をＣＰＢの含まれた４リットルのフラスコへ移し、そして３４℃ないし３８℃において２６時間震盪しながらインキュベートした。各試料をグラム染色よって観測して培養物純度をチェックした。各フラスコを保管しておき、そしてその懸濁液をＣＰＢ（ＯＤ6000.1-0.4において出発する10リットルの容積）に接種するのに用いた。この種株は５．０ないし１０．０の最終ＯＤ600に成育した。いくつかの試料を培養物純度についてグラム染色によって、抗原特異性ＥＬＩＳＡによって、そして滅菌性について試験した。
例２
この例は百日咳菌（Bordetella pertussis）細胞培養物からの各抗原の精製を記述する。
ブイヨンのと細胞濃厚物の調製
バクテリア懸濁液を３０℃ないし３７℃において３５ないし５０時間にわたり２つの製造培養槽の中で成育させた。これらの培養槽から培地の滅菌度の試験のために試料採取した。この懸濁液を連続流積層円盤遠心分離機（12,000×g）に供給してそのブイヨンから細胞を分離した。この細胞を集めて線毛成分の抽出に待機させた。その透明になった液体を0.22μｍの膜フィルターを通過させた。この濾過した液を10ないし30kDaの公称分子量限定（NMWL）膜を用いて限外濾過することにより濃縮した。その濃厚液を百日咳（Pertussis）毒素（ＰＴ）、糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）及び69kDa（ペルタクチン）の各成分の分離と精製とのために貯蔵して待機させた。
ブイヨンの各成分の分離
そのブイヨンの各成分（69kDa、ＰＴ及びＦＨＡ）を、上述のように本質的にヨーロッパ特許EP Patent No. 336,736及び出願人の公開された国際ＰＣＴ出願WO 91/15505に記述されているように、パーライトクロマトギラフィー及び選択的な溶離段階によって調製し、精製した。この実施した特別な操作は以下に記述する。
百日咳（Pertussis）毒素（ＰＴ）
パーライトカラムを５０ｍＭトリス／０．５％トリトンX-100及び５０ｍＭのトリス緩衝液で洗浄した。ＰＴフラクションを５０ｍＭトリス／０．１２Ｍ NaCl緩衝液でこのパーライトカラムから溶離させた。
このパーライトクロマトグラフィーからのＰＴフラクションをヒドロキシアパタイトカラムに吸着させ、次いで３０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴは７５ｍＭ燐酸カリウム／２２５ｍＭ NaCl緩衝液で溶離させた。このカラムを２００ｍＭ燐酸カリウム／０．５Ｍ NaClで洗浄してＦＨＡフラクションを得たが、これは捨てた。その精製したＰＴにグリセロールを５０％まで加え、そしてこの混合物を２℃ないし８℃において１週間以内での脱毒まで貯蔵した。
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）
ＦＨＡフラクションは５０ｍＭトリス／０．６Ｍ NaClによりそのパーライトカラムから溶離した。糸状赤血球凝集素はヒドロキシルアパタイトの上のクロマトグラフィーによって精製した。パータイトカラムからのＦＨＡフラクションをヒドロキシルアパタイトのカラム上に吸着させ、次いで０．５％のトリトンX-100を含む３０ｍＭの燐酸カリウムで洗浄し、次いで３０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液で洗浄した。そのＰＴフラクションは８５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液を用いて溶離させ、そして捨てた。次にそのＦＨＡフラクションを２００ｍＭ燐酸カリウム／０．６Ｍ NaClにより溶離させて２℃ないし８℃において１週間以内における脱毒まで貯蔵した。
69kDa（ペルタクチン）
ブイヨン濃厚液を注射用水（ＷＦＩ）で稀釈して３ないし４ｍＳ／ｃｍの電気伝導度までにし、そして１ｍｌのパーライト当り０．５ないし３．５ｍｇの蛋白質の吸着量でパーライトカラムに吸着させた。透過液（69kDa成分フラクション）は10ないし30kDa NMWL膜を用いて限外濾過により濃縮した。その透過濃厚液に３５％±３％（ｗ／ｖ）まで硫酸アンモニウムを加え、そして得られた混合物を２℃ないし８℃において４±２日間にわたり貯蔵するか、又は直後に遠心分離（７，０００×ｇ）した。過剰の上澄液は傾瀉し、そして沈殿は遠心分離（７，０００×ｇ）により捕集した。69kDaのペレットを−２０ないし−３０℃において凍結貯蔵するか、又はトリス又はりん酸塩緩衝液の中に溶解して直ちに使用した。
濃縮されたパーライト透過液の３５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム沈殿によって得られた69kDa外層膜蛋白質は精製のために用いた。この69kDaフラクションに硫酸アンモニウム（１リットル当り１００±５ｇ）を加え、そしてこの混合物を２℃ないし８℃において少なくとも２時間撹拌した。この混合物を遠心分離（７，０００×ｇ）して、上澄液を回収した。硫酸アンモニウム（１リットル当り１００ないし１５０ｇ）をこの上澄液に加え、そしてこの混合物を２℃ないし８℃において少なくとも２時間撹拌した。この混合物を遠心分離（７，０００×ｇ）してペレットを回収し、このものを１０ｍＭのトリス、ＨＣｌ、ｐＨ８の中に溶解させた。この溶液のイオン強度を、１５ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリスHCl（ｐＨ８）に相当するように調節した。
この69kDa蛋白質をＱ−セファローズカラムと直列に連結したヒドロキシルアパタイトのカラムに加えた。その69kDa蛋白質をその透過液の中に捕集し、このカラムから１５ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリスHCl（ｐＨ８）で洗い出し、そしてその流出液の中の69kDa蛋白質とともに貯蔵した。この68kDa蛋白質の貯蔵物を０．１５ＭのHClを含む１００ｍＭの燐酸カリウム（ｐＨ８）の６ないし１０体積を用いて100ないし300kDa NMWL膜の上で透析濾過した。この限外濾液を捕集し、そしてその限外濾液の中の69kDa蛋白質を濃縮した。
この69kDa蛋白質を１９ｍＭトリスHCl（ｐＨ８）の中に溶媒交換させ、そしてＱ−セファローズの上に吸着させ、１０ｍＭトリスHCl（ｐＨ８）／５ｍＭ流損アンモニウムで洗浄した。この69kDa蛋白質を５０ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ８）で溶離させた。この69kDa蛋白質を０．１５ＭのNaClを含む１０ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ８）の６ないし１０体積により10ないし30kDa NMWL膜の上で透析濾過した。この69kDa蛋白質を≦0.22μｍフィルタを通して滅菌濾過した。この滅菌した液を２℃ないし８℃において貯蔵し、そして３カ月以内に吸着を実施した。
線毛性凝集原
凝集原各種は、ブイヨンから分離した後の細胞ペーストから精製した。この細胞ペーストは、１０ｍＭの燐酸カリウム、１５０ｍＭのNaCl及び４Ｍの尿素を含む緩衝液中に０．０５容積割合の細胞にまで稀釈して、そして３０分間混合した。この溶菌液を遠心分離（１２，０００×ｇ）により透明化し、次いで１００ないし３００kDa NMWL膜フィルタを用いて１０ｍＭ燐酸カリウム／150ｍＭ NaCl／０．１％トリトンX-100に対して透析濾過した。
その濃縮物を８０℃において３０分間加熱処理し、次いで遠心分離（９，０００×ｇ）により再び透明化させた。この透明化した上澄液にＰＥＧ８０００を、４．５％±０．２％の最終濃度にまで加え、そして最小限３０分間にわたり温和に撹拌した。生じた沈殿を遠心分離（１７，０００×ｇ）により捕集し、そしてそのペレットを１０ｍＭ燐酸カリウム／１５０ｍＭ NaCl緩衝液で抽出して粗製の線毛性凝集原の溶液を得た。
このカラムからの流出液を濃縮し、そして１００ないし３００kDa NMWL膜フィルタを用いて１０ｍＭ燐酸カリウム／１５０ｍＭ NaCl緩衝液に対して透析濾過した。この滅菌した液を２ないし８℃において貯蔵し、そして３ケ月以内に吸着を実施した。この線毛性凝集原調合液は、線毛性Ａgg２及び線毛性Ａgg３を約１．５ないし約２：１の重量比で含んでおり、そして実質的にＡgg１を含まないことが見出された。
例３
この例はその精製された百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原、ＰＴ及びＦＨＡのトキソイドを記述する。
例２に記述した純粋な形で得られたＰＴをそのＰＴ溶液の中のグルタルアルデヒド濃度を０．５％±０．１％に調節し、そして３７℃±３℃において４時間インキュベートすることによってトキソイド化した。０．２１±０．０２ＭまでＬ−アスパラギン酸を加えることによって反応を停止させた。次にこの混合物を室温において１±０．１時間にわたり保持し、次いで２℃ないし８℃において１ないし７日間保った。
得られた混合物を３０kDa NMQL膜フィルターの上で１０ｍＭ燐酸カリウム／０．１５Ｍ NaCl／５％グリセロール緩衝液に対して透析濾過し、次いで≦0.22μｍの膜フイルタを通過させることによって滅菌した。この滅菌したものを２℃ないし８℃において貯蔵し、そして３ケ月以内に吸着を実施した。
例２に記述したように純粋な形で調製されたそのＦＨＡフラクションを、そのＬ−リシン及びホルムアルデヒド濃度を４７±５ｍＭ及び０．２４±０．０５％にそれぞれ調節し、そして３５℃ないし３８℃において６週間インキュベートすることによりトキソイド化した。この混合物を次に３０kDa NMWL膜フィルタを用いて１０ｍＭ燐酸カリウム／０．５Ｍ NaClに対して透析濾過し、そして膜フイルタを通過させることにより滅菌した。この滅菌物を２℃ないし８℃において貯蔵し、そして３ケ月以内に吸着を実施した。
例４
この例は精製した各種百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原の吸着を記述する。
燐酸アルミニウム（アラム）の上の個々のＰＴ、ＦＨＡ、Ａgg及び69kDaの吸着のために、燐酸アルミニウムのストック溶液を１８．７５±１ｍｇ／ｍｌの濃度で作った。適当な容器を準備し、そして各抗原のいずれか１つを滅菌的にその容器の中へ配量した。２−フェノキシエタノールを滅菌的に加えて０．６％±０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度にし、そして均一になるまで撹拌した。適当な容積の燐酸アルミニウムをその溶液の中に滅菌的に加えた。適当な容積の滅菌蒸留水を加えて３ｍｇ燐酸アルミニウム／ｍｌの最終濃度にした。いくつかの容器を密封し、そしてラベルを添付して室温において４日間撹拌した。次にその容器を最終的な調剤に待機させるために貯蔵した。
例５
この例はジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた成分成分百日咳ワクチンの調製を記述する。
先行の各例に記述したように調製した各百日咳菌（B.pertussis）抗原をジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドとともに調合していくつかの成分百日咳菌（Pertussis）（ＣＰ）ワクチンを作った。
各百日咳菌（Pertussis）の成分は上記例１ないし４に詳細に記述したように、液中培養で成育させた百日咳菌（Bordetella pertussis）から作った。成育の完了の後でその培養液及びバクテリヤ細胞を遠心分離によって分離した。各抗原を個別に精製した。百日咳毒素（ＰＴ）及び糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）はその培養液からパーライト及びヒドロキシルアパタイトの上での順次のクロマトグラフィーによって精製した。ＰＴをグルタルアルデヒドにより脱毒し、そしてそのＦＨＡフラクションの中に存在する全ての残留ＰＴ（約１％）はホルムアルデヒドで脱毒した。線毛性凝集原（２＋３）（Ａgg）をそのバクテリア細胞から作った。それら細胞を尿素で崩壊させ、そして熱処理し、そしてそれら線毛性凝集原をポリエチレングリコールによる沈殿及びポリエチレンイミンシリカの上でのクロマトグラフィーによって精製した。69kDa蛋白質（ペルタクチン）成分は、硫酸アンモニウム沈澱によってパーライトクロマトグラフィー段階（例２）からの流出液より分離し、順次ヒドロキシルアパタイトおよびＱ−セファロース上のクロマトグラフィーによって精製した。全ての成分は０．２２μｍ膜フィルタを通して濾過することにより滅菌した。
ジフテリヤトキソイドは標準方法によって液中培養で成育させたジフテリヤ菌（Corynebacterium diphtheriae）から作った。ジフテリヤトキソイドの製造は５段階に分け、すなわち実用株の維持、ジフテリヤ菌（Corynebacterium diphtheriae）の育成、ジフテリヤ毒素の回収、ジフテリヤ毒素の脱毒及びジフテリヤトキソイドの濃縮である。
ジフテリヤトキソイドの調製
（Ｉ）実用種株
Cornebacterium diphtheriaeの株を凍結乾燥した種株ロットとして維持した。その再構成した種株を３５℃±２℃において１８ないし２４時間にわたりレフラースロープの上で成育させ、次いでジフテリヤ培地のフラスコに移した。次に培養物をその純度とLf含有量について試験した。残余の種株は培養器に接種するのに用いた。
（II）ジフテリヤ菌（Corynebacterium diphtheriae）の育成
培養物を３５℃±２℃においてインキュベートし、そして培養器の中で撹拌した。予め定められた量の硫酸第１鉄、塩化カルシウム及び燐酸塩の溶液をその培養物に加えた。各溶液（燐酸塩、硫酸第１鉄、塩化カルシウム）の実際の濃度は培地の各ロットについて実験的に求めた。選んだ各水準は最高のLf含有量を与えるそれである。成育サイクル（３０−５０時間）の最後において各培養物から純度及びLf含有量のために試料採取した。ｐＨは重炭酸ナトリウムで調節し、そして培養物は０．４％トルエンにより３５℃±２℃の維持された温度において１時間にわたり失活させた。次に滅菌性の試験を行なって生存しているジフテリヤ菌（C.diphtheriae）の非存在を確認した。
（III）ジフテリヤ毒素の回収
１つ又はいくつかの培養器からのトルエン処理した培養物を大型タンクの中にプールした。約０．１２％の重炭酸ナトリウム、０．２５％の木炭、及び２３％の硫酸アンモニウムを加え、そしてそのｐＨを試験した。
この混合物を３０分間撹拌した。珪藻土を加え、そしてその混合物をデプスフィルタの中にポンプ給送した。濾液を透明になるまで再循環し、次いで捕集してLf濃度の試験のために試料採取した。４０％の濃度になるように追加的な硫酸アンモニウムをその濾液に加えた。珪藻土も加えた。この混合物を２℃ないし８℃において３ないし４日間保持してその沈殿を沈降させた。沈殿した毒素を捕集し、そして０．９％の塩水の中に溶解させた。珪藻土を濾過によって除去し、そしてその毒素は０．９％塩溶液に対して透析して硫酸アンモニウムを除いた。透析された毒素をプールし、そしてLf濃度及び純度の試験のために試料採取した。
（IV）ジフテリヤ毒素の脱毒
脱毒は透析に引き続いて直ちに行なう。脱毒にはその毒素を最終溶液が下記を含むように稀釈した：
ａ）  １，０００±１０％のLf/mlのジフテリヤ毒素
ｂ）  重炭酸ナトリウム０．５％
ｃ）  ホルマリン０．５％
ｄ）  Ｌ−リシンモノ塩化水素塩０．９％
この溶液は、食塩水で規定の容積とされ、そしてｐＨを７．６±０．１に調節した。
トキソイドをセルローズ珪藻土濾過パッド及び／又は膜プレフィルタと０．２μｍ膜フィルタとを通して捕集容器の中へ濾過し、そして３４℃において５ないし７週間インキュベートした。毒性試験のために試料を抜き出した。
（V）精製したトキソイドの濃縮
各トキソイドをプールし、次いで限外濾過によって濃縮し、そして適当な容器の中に集めた。Lf含有量及び純度の試験のためにいくつかの試料を採取した。保存剤（２−フェノキシウタノール）を加えて０．３７５％の最終濃度にし、そしてｐＨを６．６ないし７．６に調節した。
このトキソイドをプレフィルタ及び０．２μｍ膜フィルタ（又は相当物）を通して濾過することにより滅菌し、そして捕集した。この滅菌したトキソイドを次にトキソイドLf含有量の非可逆性、保存剤含有量、純度（窒素含有量）滅菌性及び毒性の試験のために試料採取した。この滅菌的に濃縮したトキソイドは２℃ないし８℃において最終的調剤まで貯蔵した。
破傷風トキソイドの調製
破傷風トキソイド（Ｔ）を液中培養において成育させた破傷風菌（Clostridium tetani）から作った。
破傷風トキソイドの製造は５段階に分けることができ、すなわち実用種株の維持、破傷風菌（Clostridium tetani）の成育、破傷風毒素の回収、破傷風毒素の脱毒及び気性風トキソイドの精製である。
（Ｉ）実用種株
破傷風毒素の破傷風トキソイドへの転化のために、破傷風毒素の製造に用いた破傷風菌（Clostridium tetani）の株を種株ロットの中で凍結乾燥した形で維持した。この種株をチオグリコレート培地の中に接種し、そして３５℃±２℃において約２４時間にわたり成育させた。培養物純度試験のために試料を採取した。
（II）破傷風菌（Clostridium tetani）の成育
破傷風培地を培養器の中に入れ、熱処理し、そして冷却した。次にこの培養器に株接種し、そしてその培養物を３４℃±２℃において４ないし９日間にわたり成育させた。培養物純度及びLf含有量の試験のために知りようを採取した。
（III）破傷風毒素の回収
この毒素はセルローズ珪藻土パッドを通して濾過することにより分離し、そして次にその透明化した毒素を膜フィルタを用いて濾過滅菌した。Lf含有量及び滅菌性の試験のためにいくつかの試料を採取した。この毒素を３０，０００Daの孔径を用いて限外濾過することにより濃縮した。
（IV）破傷風毒素の脱毒
脱毒に先立ってこの毒素からLf含有量の試験のために試料を採取した。その濃縮した毒素（４７５ないし５２５Lf/ml）を０．５％w/v重炭酸ナトリウム、０．３％v/vホルマリン及び０．９％w/v Ｌ−リシンモノ塩化素塩の添加により脱毒して塩水で規定容積にした。ｐＨを７．５±０．１に調節し、そしてこの混合物を３７℃において２０ないし３０日間にわたりインキュベートした。滅菌性及び毒性の試験のためにいくつかの試料を採取した。
（V）トキソイドの精製
濃縮したトキソイドをプレフィルタを通し、次いで０．２μｍの膜フィルタを通過させることにより滅菌した。滅菌性及びLf濃度の試験のためにいくつかの試料を採取した。
硫酸アンモニウムの最適濃度はそのトキソイドのいくつかの試料から求めた分画「Ｓ」曲線に基づいて決定した。その第１の濃度をそのトキソイド（１９００−２１００Lf/mlに稀釈された）に加えた。この混合物を２０℃ないし２５℃において少なくとも１時間にわたり保ち、そして上澄液を捕集し、ならびに高分子量フラクションを含む沈澱は捨てた。
硫酸アンモニウムの第２の濃度をその上澄液に第２分画のために加えて低分子量不純物を除去した。この混合物を２０℃ないし２５℃において少なくとも２時間保ち、そして次いで最高で３日間にわたり２℃ないし８℃において保つことができた。精製したトキソイドであるその沈殿物を遠心分離及び濾過によって捕集した。
ＰＢＳによってアミコン（又は相当物）限外濾過膜を用いて、硫酸アンモニウムがそのトキソイド溶液中に検出されなくなるまで透析濾過することにより、硫酸アンモニウムを精製したトクソイドから除去した。そのｐＨは６．６ないし７．６に調節し、そして２−フェノキシエタノールを０．３７５％の最終濃度になるまで加えた。このトキソイドを膜濾過によって滅菌し、そして試験（毒性の非可逆性、Lf含有量、ｐＨ、保存剤含有量、純度、滅菌性及び毒性）のためにいくつかの試料を採取した。
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた成分百日咳ワクチンの調合物の１つをＣＰ10/5/5/3ＤＴで表示した。ＣＰ10/5/5/3ＤＴの人への各０．５ｍｌの投与量を下記が含まれるように調製した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）  １０μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）  ５μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）  ５μｇ
69kDa外層膜蛋白質  ３μｇ
ジフテリヤトキソイド  １５Lf
破傷風トキソイド  ５Lf
燐酸アルミニウム  １．５ｍｇ
保存剤としての２−フェノキシエタノール  ０．６％
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせたもう１つの成分百日咳ワクチンの調合物をＣＰ10/5/5ＤＴで表示した。ＣＰ10/5/5ＤＴの人への各０．５ｍｌの投与量を下記が含まれるように調製した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）  １０μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）  ５μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）  ５μｇ
ジフテリヤトキソイド  １５Lf
破傷風トキソイド  ５Lf
燐酸アルミニウム  １．５ｍｇ
保存剤としての２−フェノキシエタノール  ０．６％
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせたもう１つの成分百日咳ワクチンの調合物をＣＰ20/20/5/3ＤＴで表示した。ＣＰ20/20/5/3ＤＴの人への各０．５ｍｌの投与量を下記が含まれるように調製した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）  ２０μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）  ２０μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）  ５μｇ
69kDa外層膜蛋白質  ３μｇ
ジフテリヤトキソイド  １５Lf
破傷風トキソイド  ５Lf
燐酸アルミニウム  １．５ｍｇ
保存剤としての２−フェノキシエタノール  ０．６％
ジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドと組み合わせた更にもう１つの成分百日咳ワクチンの調合物をＣＰ20/10/10/6ＤＴで表示した。ＣＰ20/10/10/6ＤＴの人への各０．５ｍｌの投与量を下記が含まれるように調製した：
百日咳トキソイド（ＰＴ）  ２０μｇ
糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）  １０μｇ
線毛性凝集原２及び３（ＦＩＭＢ）  １０μｇ
69kDa外層膜蛋白質  ６μｇ
ジフテリヤトキソイド  １５Lf
破傷風トキソイド  ５Lf
燐酸アルミニウム  １．５ｍｇ
保存剤としての２−フェノキシエタノール  ０．６％
例６
この例は本発明に従い作られたいくつかの成分非細胞性百日咳ワクチンの臨床表かを記述する。
（ａ）成人における試験
成人及び１６ないし２０ケ月齢の子供における試験は線毛性凝集原を含む多成分ワクチンが安全であって免疫原性であることを示した（第２表）。
フェーズＩ臨床試験を１７及び１８ケ月齢の子供においてアルバータ州カルガリーにおいて５成分百日咳ワクチン（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）により実施し、そして有害反応が報告された。３３人の子供にこのワクチンを投与し、そして追加的に３５人に69kDa蛋白質成分を含まない同じワクチンを投与した。
局所反応はまれであった。主として被刺激性よりなる全身的有害反応がどのワクチンを投与したかに関係なく被験者の約半数において存在した。重大な抗体の上昇が抗ＰＴ、抗ＦＨＡ、抗線毛性凝集原及び抗69kDa IgＧ抗体についてエンザイムイムノアッセイにより、そしてＣＨＯ細胞中和試験において抗ＰＴ抗体について観測された。４成分（ＣＰ10/5/5ＤＴ）又は５成分（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）の投与を受けたこともにおいて抗-69kDa抗体の場合を除き、抗体応答に変化は検出されなかった。69kDa蛋白質を含む５成分ワクチンの投与を受けた子供は重大に高い免疫感作後抗-69kDa抗体水準を有した。
カナダ国マニトバのWinnipegにおいて４成分ワクチンを用いる投与量応答試験を行なった。２つの成分ワクチン調剤、すなわちＣＰ10/5/5/3ＤＴ及びＣＰ20/10/10/6ＤＴを用いた。コントロールとして全細胞ＤＰＴワクチンも含まれた。
この試験は９１、１７ないし１８ケ月齢の幼児において、それらに追加百日咳投与を行なったときの二重盲試験であった。ＣＰ10/5/5/3ＤＴ及びＣＰ20/10/10/6ＤＴの両者はこれら子供たちによって充分耐えられた。なんらからの局部反応を有した子供の数においてなんらの変化も示されず、或いはまたいずれかの成分ワクチンの後で全身反応に変化が示されなかった。これに対して、全細胞ワクチン投与された重大に多数の子供がＣＰ20/10/10/6ＤＴ成分ワクチンを投与されたものよりも局所的及び全身的反応を有した。
幼児における試験
フェーズII
カナダ国アルバータ州、カルガリー及びブリティッシュコロンビヤにおいてＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンを用いて試験を行なった。この試験において４３２人の幼児にこの成分百日咳ワクチン又はコントロール用全細胞ワクチンＤＰＴを２、４及び６ケ月齢において投与した。ＣＰ10/5/5/3ＤＴワクチンはこれら幼児によって充分に耐えられた。局部反応は各投与の後で全細胞ワクチンよりも成分ワクチンを用いたときにより低率であった。
この成分百日咳ワクチンにより感作した後で全ての抗原に対する重大な抗体応答が示された。全細胞ワクチンを受けたものは線毛性凝集原Ｄ及びＴに対して激しい抗体応答を有した。６ケ月目に、成分ワクチンを受けたものの８２％ないし８９％、及び全細胞ワクチンを受けたものの９２％が線毛性凝集原に対して抗体力価の４倍又はそれ以上の上昇を有した。これに対して成分ワクチンにおいてはＦＨＡに対する抗体応答は全細胞を受けたものの３１％に比較して７５％ないし７８％であった。成分ワクチンの９０％ないし９３％において、そして全細胞を受けたものの７５％において抗69kDa抗体における４倍の上昇が見られた。成分ワクチンの４０％ないし４９％において、そして全細胞ワクチンの３２％においてエンザイムイムノアッセイによりＰＴに対する抗体の４倍の上昇が見られ、成分ワクチンの５５％ないし６９％において、ならびに全細胞ワクチンの６％において、ＰＴ抗体の４倍の上昇がＣＨＯ中和により見出された（第３表）。
フェーズIIB
ＣＰ20/20/5/3ＤＴ及びＣＰ10/10/5/3ＤＴの各ワクチンを２５Lfの調剤に比して１５Lfの低いジフテリヤ含有量を有するＤ15ＰＴコントロールに対して２、４及び６ケ月齢の幼児１００人の無作為的盲試験において評価した。有害反応の率においてそれら２つの配合物の間でなんらの差異も検出されず、両者は全細胞のコントロール群よりも重大に反応原性が低かった。エンザイムイムノアッセイ及びＣＨＯ中和によれば上昇した抗原含有量とともにＰＴに対するより高い抗体力価及びＦＨＡがＣＰ20/20/6/3ＤＴワクチンを受けたものにおいて達成された。７ケ月目にその抗−ＦＨＡの幾何平均力価はＣＰ20/20/5/3ＤＴワクチンを受けたものにおいて９５．０であり、ＣＰ10/10/5/3ＤＴを受けたものにおける４５．２はＤ15ＰＴを受けたものにおいては僅かに８．９であった。抗−ＰＴ力価はイムノアッセイにおいて１３３．３、５８．４及び１０．４であり、そしてＣＨＯ中和によってはそれぞれ８２．４、３２．７及び４．０であった（第２表）。
この試験はジフテリヤ及び破傷風のトキソイドと組み合わされた成分百日咳ワクチンが増大した抗原含有量を吸着し、幼児において安全であり、免疫原性であったこと、及びその上昇した抗原含有量が反応原性の上昇を伴わずににその調合された各抗体（ＰＴ及びＦＨＡ）に対する免疫応答を増大させたことを示した。
ＮＩＡＩＤ、フェーズII、米国比較試験
米国において非細胞性の百日咳ワクチンの大規模効力試験の序幕としてNational Institute of Allegy and Inhections Diseases（ＮＩＡＩＤ）の援助のもとにフェーズII試験が実施された。本発明の１成分百日咳ワクチンを吸着されたジフテリヤトキソイド及び破傷風トキソイドとの組み合わせ（ＣＰ10/5/5/3ＤＴ）においてその試験に他の１２個の非細胞性ワクチン及び２つの全細胞ワクチンとともに含まれた。２、４及び６ケ月齢においてＣＰ10/5/5/3ＤＴで免疫感作された１３７人の子供についての安全性の結果が報告された。
前の試験において見られたように、この成分ワクチンは安全であり、反応原性が低く、そして種々のワクチンによってよく許容されることが見出された。
７ケ月目に、抗ＰＴ抗体、抗ＦＨＡ抗体、抗体69kDa抗体及び抗線毛性凝集原抗体は全て、全細胞ワクチンの後で達成された水準割も高いか、又は同等であった（参照文献７１及び第２表）。二重盲試験を行なったが、この場合に子供たちをＣＰ20/20/5/3ＤＴか、又はＣＰ10/5/5/3ＤＴかのいずれかのワクチン調剤が投与されるように無作為に割り振った。全部で２０５０人の幼児を米国及びカナダ国において登録し、１９６１人の幼児が試験を完了した。両方のワクチン調剤とも安全であり、これらの幼児において反応原性は低く、そして免疫原性であった。免疫原性は２９２人の従属群において評価した。抗体の上昇は両方のワクチン調剤によってそのワクチンの中に含まれた全ての抗原に対して惹起された。ＣＰ20/20/5/3ＤＴの調剤はＦＨＡに対してより高い抗体力価を誘発させたけれども、ＰＴに対してはそうではなかった。ＣＰ10/5/5/3ＤＴ調剤は線毛に対してより高い力価を誘発させ、そしてより高い凝集原力価を誘発させた。
更に安全性及び免疫原性の試験をフランスにおいて実施した。この研究の計画は各ワクチンを２、３及び４ケ月齢において投与したことを除いて、上に記述した北アメリカの研究のそれと類似であった。局部反応及び全身反応は一般に僅かであった。全体としてこのワクチンはフランス国の被検者によってこの投与基準を用いてよく受容された。
１００人の幼児における２つの非細胞性百日咳ワクチン及び全細胞ワクチンのプラシーボ制御された効力試験
米国におけるＮＩＡＩＤフェーズII比較試験の結果に従って２成分及び５成分の非細胞性ワクチンを制御された多中心の二重盲プラシーボ制御効力試験のために選んだ。この臨床試験はスゥエーデンにおいて実施したが、ここでは百日咳の高い発症が存在する。その２成分ワクチンはグリセルアルデヒド及びホルマリンで失活させたＰＴ（２５μｇ）、ホルマリンで処理したＦＨＡ（２５μｇ）及びジフテリヤトキソイド１７Lf及び破傷風トキソイド１０Lfを含んでいた。その５成分百日咳ワクチンはＣＰ10/5/5/3ＤＴであった。試験のために、スゥエーデン国におけるこの年齢群の幼児の約１／２を代表する１０，０００人の幼児を、誕生日の登録を利用することにより、地理的に規定した１４個の研究地点において集めた。
１９９２年１月及び２月に生まれた子供を無作為に３枝試験に分けた。親の同意の後でそれら幼児の２／３にそれら２つのジフテリヤ−破傷風−非細胞性百日咳ワクチン調剤の内の１つを２、４及び６ケ月齢において投与したコントロール群にはＤＴのみをとうよした。１９９２年５月に、米国の承認された市販で入手できる全細胞ＤＴＰワクチンを導入し、そして１９９２年３月から１２月までに生まれた子供を４枝試験に無作為に分けた。親の承諾の後でそれら幼児の３／４に３つのＤＴＰの調剤のうちの１つを２、４及び６ケ月齢において投与した。コントロール群にはＤＴのみを投与した。
各ワクチンは約２５００人の子供に投与された。各ワクチンは３回の投与に分けて投与された。第１投与は２ケ月齢において、かつ３ケ月齢よりも遅くない時期に投与した。引き続く各投与は８週間の間隔で施した、各ワクチンは筋肉内注射により投与した。
それらの子供及び家族は３０ケ月にわたり追跡した。百日咳の疑いがあった場合には臨床データを集め、そして細菌学的な培養及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ診断のための鼻腔吸入によって研究室証明を試みた。急性及び予後の血液試料を血清学適診断のために集めた。
この研究の前には危険のある人々（特に新生児）における本発明の成分百日咳ワクチンにより許容されるペルタクチンの範囲は知られていなかった。特に、種々のボルデテラ属菌（Bordetella）の各成分及びそれらの百日咳ワクチンの中での選ばれた相対量での存在のそのワクチンの効力に対する貢献は知られていなかった。
この試験の主な目的は、種々の非細胞性百日咳ワクチン及び全細胞ワクチンのプラシーボと比較した典型的百日咳に対して防護する能力を評価することであった。
第２の目的は、種々の重度の確認された百日咳感染に対するワクチンの有効性を求めることであった。
ワクチンの効力はワクチンを受けたものの中でワクチン投与されていない子供と比較しての百日咳への罹患の確率における低下の％ととして定義される。
２つのワクチン群における百日咳の相対的危険はそれら２つの群における疾病の確率の比として表わされる。
百日咳にかかる確率は罹患率とも呼ばれるけれとも、これは種々の方法で評価することができる。サンプルの大きさの計算において、与えられた試験群の中で百日咳にかかる確率は百日咳にかかった子供の数とその試験群の中の試験の後追跡の終了時における残りの子供の数との商によって評価される。典型的な百日咳の防護におけるこの試験の中でのＣＰ10/5/5/3ＤＴの成分ワクチンの効力は第４表に示されており、そして約８５％であった。同じ試験においてＰＴ及びＦＨＡのみを含んでいる２成分非細胞性百日咳ワクチンは約５８％効果があり、そして全細胞ワクチンは約４８％有効であった。ＣＰ10/5/5/3ＤＴはまた、約７７％のひゅうかされた有効性において温和な百日咳防護するのにも有効であった。
開示の要約
この開示の要約において本発明は百日咳菌（Bordetella pertussis）の各線毛性凝集原の新規な調剤及びそれらの製造のための方法を提供する。それら線毛性凝集原は他のボルデテラ属菌（Bordetella）及び非−ボルデテラ属菌（Bordetella）の抗原とともに配合して多くの多成分百日咳ワクチンを作ることができる。そのようなワクチンは安全であり、非反応原性であり、そして人において防護性である。種々の修飾形態が本発明の範囲内で可能である。
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【図１】
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