(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の外来遺伝子を発現させる多分子発現カセットであって、プロモーター−（外来遺伝子）ｍ−（ｉｒｅｓ−外来遺伝子）ｎなる式で表されるＤＮＡ断片、ここで、外来遺伝子は任意の遺伝子、ｉｒｅｓは鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶと称する）に由来するインターナル・リボソーム・エントリーサイトを形成するＲＮＡに相補的なＤＮＡ断片であり、ｍは０又は１、ｎは１以上の整数値を表す、からなることを特徴とする多分子発現カセット。
【請求項２】
前記ＲＮＡがＩＢＤＶゲノムの５’非翻訳領域からなることを特徴とする請求項１に記載の多分子発現カセット。
【請求項３】
前記５’非翻訳領域がＩＢＤＶ分節Ａであることを特徴とする請求項２に記載の多分子発現カセット。
【請求項４】
前記５’非翻訳領域が配列表の配列番号：９に記載の塩基配列、又は該塩基配列に対し、１もしくは数個の塩基が置換、欠失あるいは付加された塩基配列を有し、該配列から転写されたＲＮＡがインターナル・リボソーム・エントリーサイトを形成することを特徴とする請求項２又は３に記載の多分子発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーターが動物細胞由来であることを特徴とする請求項１に記載の多分子発現カセット。
【請求項６】
前記動物細胞由来のプロモーターが鶏のβアクチンプロモーターであることを特徴とする請求項５に記載の多分子発現カセット。
【請求項７】
前記プロモーターがウイルス由来であることを特徴とする請求項１に記載の多分子発現カセット。
【請求項８】
前記ウイルス由来のプロモーターがマレック病１型ウイルス糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載の多分子発現カセット。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載の多分子発現カセットが組み込まれたことを特徴とする多分子発現ベクター。
【請求項１０】
前記多分子発現ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項９に記載の多分子発現ベクター。
【請求項１１】
前記多分子発現ベクターがウイルスゲノムであることを特徴とする請求項９に記載の多分子発現ベクター。
【請求項１２】
前記ウイルスゲノムがマレック病ウイルス由来であることを特徴とする請求項１１に記載の多分子発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の多分子発現ベクターをウイルスゲノムとする組換え体ウイルス。
【請求項１４】
前記組換え体ウイルスが鳥類又は鳥類細胞に感染性を有することを特徴とする請求項１３に記載の組換え体ウイルス。
【請求項１５】
前記鳥類がニワトリであることを特徴とする請求項１４に記載の組換え体ウイルス。
【請求項１６】
請求項１ないし８のいずれかに記載の多分子発現カセット、請求項９ないし１２のいずれかに記載の多分子発現ベクター、請求項１３ないし１５のいずれかに記載の組換え体ウイルスを含有することを特徴とする動物用ワクチン。
【請求項１７】
請求項１ないし８のいずれかに記載の多分子発現カセット、請求項９ないし１２のいずれかに記載の多分子発現ベクター、請求項１３ないし１５のいずれかに記載の組換え体ウイルスを用いることを特徴とするペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物細胞又は動物体内において２つ以上の外来遺伝子を発現させることができる新規な多分子発現カセット又は多分子発現ベクターに関する。本発明はまた、該多分子発現カセット、または該多分子発現ベクターから得られる組換え体ウイルスを用いた動物用多価ワクチンに関する。
【０００２】
【従来技術】
近年、養鶏規模の拡大に伴って飼育管理の省力化が進められており、その一環として、ワクチン接種に対する省力化が強く要望されている。これに応えて、数種のワクチンを混合することにより接種回数を減らすことを狙った混合ワクチンが既に開発され、野外で広く用いられている。しかしながらこの方法では、ウイルス種によっては異なる培養、精製を行う必要があり、煩雑な操作を強いられる場合がある。また、既存の混合ワクチンは基本的には不活化ワクチンであり、より自然感染に近い免疫を賦与する生ワクチンに関しては、ウイルス間の干渉や効果の持続等の問題により、省力的なワクチンは実現されていない。このような点を解決する一つの手段として、ウイルスベクターによる多価ワクチンの研究が盛んに行われている。
【０００３】
養鶏分野における多価生ワクチンを目的とするウイルスベクターに関しては、鶏痘ウイルスや七面鳥ヘルペスウイルスの応用研究が進んでいる。これらに対して本発明者らは、より効果的なベクターを開発すべく、鶏のヘルペスウイルスの一種であるマレック病ウイルス１型（ＭＤＶ１）のベクター化について検討を行い、その成果について数多くの報告を行ってきた。例えば、外来遺伝子を安定に保持し、かつマレック病（ＭＤ）に対するワクチン効果に大きなダメージを与えない外来遺伝子挿入可能部位として、ＵＳ１０遺伝子を同定している｛特願平４−２０５９３３（特開平６−２２７５７）フォース・インターナショナルシンポジウム・オンマレックスディジーズ（4th International Symposium on Marek's Disease（１９９２）、アムステルダム；Vaccine 1994 Vol.12 953-957｝。このＵＳ１０遺伝子にニューカッスル病ウイルスＦ蛋白（以下、ＮＤＶ−Ｆとも称する）遺伝子を挿入した組換え体ウイルスは、ＳＰＦ鶏において十分なワクチン効果を示し、その効果は少なくとも接種後２４週にわたって持続する（フォース・インターナショナルシンポジウム・オンマレックスディジーズ、１９９２、アムステルダム）。
【０００４】
本発明者らは、更に実用的なウイルスベクターワクチンとすべく、遺伝子発現プロモーターに着目し、ＭＤＶ１の糖蛋白Ｂ（ｇＢ）遺伝子プロモーターをＮＤＶ−Ｆ遺伝子の発現に応用した。その結果、移行抗体を保有する動物（ニワトリ）でのワクチン効果は極めて高く、市販雛に免疫した場合でもＭＤ及びニューカッスル病（ＮＤ）の両者に対し安定して９０％以上の防御効果を付与した。また、その効果は１年以上にわたって持続することを確認した（特願平７−１６０１０６号）。
このような研究成果を踏まえ、さらなる効果的かつ省力的なワクチンを開発するためには、ＮＤに加えて他疾病の感染防御抗原遺伝子をも組み込んだ組換え体ウイルスの構築が必要となる。
【０００５】
一方、多価の発現系という観点では、ある種のｍＲＮＡ上のリボソーム結合部位に存在するインターナル・リボソーム・エントリーサイト（ＩＲＥＳと称する）を利用した発現系が試みられている。コザックらは、遺伝子の転写翻訳機構について研究する中で、鋳型のＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼにより転写されたｍＲＮＡは、その５’末端にキャップ構造を有しており、このキャップ構造を通してリボソーム複合体と会合し、ペプチドに翻訳されることを明らかにしている（Kozak, M. J.Cell Biol., 108,229-241,1989）。殆どの蛋白質は、このようなキャップ依存的な翻訳機構によって合成される。
【０００６】
これに対し、近年、一部のウイルスでは、その複製の際に合成されるウイルス蛋白質は、キャップ非依存的な翻訳機構によるとする例が報告された。すなわち、ある種のウイルスＲＮＡには、その５’末端側にＩＲＥＳと呼ばれる特殊な高次構造を有する領域が存在し、リボソーム複合体はこの特殊構造を認識してＲＮＡに結合し、キャップ非依存的に蛋白質の翻訳を開始することが明らかにされた。ＩＲＥＳは、これまでに脳心筋炎ウイルス（Jang, S. K. J. Virology, 62, 2636-2643, 1988）、ポリオウイルス（Pelletier, J. Nature, 334, 320-325, 1988）、Ｃ型肝炎ウイルス（Tsukiyama-Kohara, K.J. Virology, 66, 1476-1483, 1992）などのＲＮＡをゲノムとするウイルス及び免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（Macejak, D. G. Nature, 353, 90-94, 1991）などのいくつかの真核生物の細胞内ｍＲＮＡに存在することが報告されており、この発現システムをレトロウイルスベクター（細胞工学、第１５巻３号、ｐ３８６−３８７、１９９６）やアデノ随伴ウイルスベクター（第４３回日本ウイルス学会抄録、ｐ１２９、１９９５）に応用する試みも始まっている。
【０００７】
一般に、ウイルスゲノムに挿入可能な遺伝子サイズは、およそ当該ウイルスゲノムの数％とされており、挿入できる遺伝子断片のサイズに限りがある（組織培養  １４（４）  １０７−１１１、１９８８）。したがって、従来の多価生ワクチンを目的とした発現系では、プロモーターの下流に外来遺伝子を結合した遺伝子断片を１セットとし、これをウイルスベクター等に挿入したものを発現ベクターとするため、挿入する外来遺伝子を増やせば、それだけプロモーターの数も増えることになり、挿入できる外来遺伝子の数は制限される。
これに対し、ＩＲＥＳを用いる多価生ワクチン発現系は、上記の問題点を解決する有用な方法と考えられる。しかしながら、ＩＲＥＳは、ウイルス感染において対象組織あるいは対象宿主への特異性を担っている可能性が示唆されており（細胞工学、第１５巻８号、ｐ１１０６−１１１３、１９９６）、種を超えて該ＩＲＥＳを使用すれば発現効率が低下することが予測される。より効果的な多価発現系を構築するには、その対象動物に感染性を有するウイルス等に由来するＩＲＥＳを用いることが必要と考えられる。例えば、鶏のワクチンを対象とした場合には、鶏細胞で機能するＩＲＥＳを使用する必要があるが、鶏を始めとする鳥類細胞において効果的にＩＲＥＳ活性を示す核酸配列は未だに報告されていない。
【０００８】
そこで、本発明者等は、従来から養鶏産業では重要な病気の一つとして位置づけられいる鶏伝染性ファブリキウス嚢病に着目し、本発明を実施した。本感染症の感染因子である鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶと称する）は、ニワトリの免疫器官の１つであるファブリキウス嚢（以下、Ｆ嚢とも称す）を冒し、重篤な液性免疫不全を起こす（Cheville, Amer J. Pathol. 51, 527-551, 1967）ウイルスで、ビルナ科、ビルナ属に属し、２本鎖のＲＮＡゲノムを有する正二十面体の非エンベロープウイルス（Kibenge, F. S. B. J. Gen. Virol. 69, 1575-1775, 1988）である。ＩＢＤＶゲノムの塩基配列は、マント等（Mundt E., Virology, 209, 10-18 1995）及びハドソン等（Hudson P.J. et al., Nucleic Acid Research 14, 12,5001-5012, 1986）により報告され、その５’末端非翻訳領域にはパンハンドルと呼ばれる二次構造を取りうる配列が存在し、ウイルスＲＮＡ複製に関与する可能性が指摘されており、またリボソーム結合配列の存在が指摘されている（Munt E., Virology, 209, p10-18, 1996）。しかしながら同論文において、そのＩＲＥＳ活性は明らかにされていない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の鶏感染症に対する多価ワクチン発現系では、挿入できる外来遺伝子数の制限、又は発現効率の点で問題があった。
本発明の目的は、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域のＩＲＥＳを利用することにより、単一のプロモーターで複数の外来遺伝子を鶏又は鶏由来細胞に発現させるための多分子発現カセット又は多分子発現ベクターを提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、上記の多分子発現カセット又は多分子発現ベクターを含有する動物用多価ワクチン及び該ワクチンで家禽類を免役する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、上記の多分子発現カセット、多分子発現ベクター又は該多分子発現ベクターよって得られる組換え体ウイルスを用いたペプチドの製造方法を提供することにある
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＩＢＤＶの５’末端領域にＩＲＥＳ（ＩＲＥＳとしての活性を含むＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ断片をｉｒｅｓと称する）が存在することを明らかにし、更に、ＭＤＶ１のｇＢプロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子、及びｉｒｅｓを有するＩＢＤＶｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＭＤＶ１を作出したところ、同ウイルス感染細胞中に、ＮＤＶ−Ｆ蛋白質及びＩＢＤＶ蛋白質の両蛋白質が発現していることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
従って、本発明は、ＭＤＶ１のｇＢプロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びｉｒｅｓを有するＩＢＤＶｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片並びに該ＤＮＡ断片を含むプラスミド及びウイルスベクターを包含する。
【００１４】
また、本発明は、上記ＤＮＡ断片、プラスミド、ウイルスベクター又は該ウイルスベクターによって得られる組換え体ウイルスを主成分とするワクチンを包含する。
【００１５】
また、本発明は、上記、ＤＮＡ断片、プラスミド、ウイルスベクター又は該ウイルスベクターによって得られる組換え体ウイルスを用いたペプチドの製造方法を包含する。
以下に、本発明について更に詳述する。
【００１６】
本発明のベクター、ワクチン及び方法は、プロモーター−（外来遺伝子）ｍ−（ｉｒｅｓ−外来遺伝子）ｎなる式で表されるＤＮＡ断片からなる多分子発現カセット及び該発現カセットが組み込まれた多分子発現ベクターにより特徴づけられる。ここで、外来遺伝子は任意の遺伝子、ｉｒｅｓはＩＢＤＶゲノムの５’非翻訳領域の塩基配列に相補的なＤＮＡ断片であり、ｍは０又は１、ｎは１以上の整数値で、これらは連結したＤＮＡ断片の数を表す。上記多分子発現カセット及び多分子発現ベクターは培養細胞もしくは動物体内で複数の外来遺伝子を発現し得る。
【００１７】
本発明を構成する上記の遺伝子断片の作製及びベクターの構築は、サンブルック等が述べている、ＲＮＡの抽出、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの合成と増幅及び遺伝子のクローニング等の一般的な組換え技術により達成される（J.Sambrook, et al., Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）。また、遺伝子断片のクローニング及び発現には、市販のベクターを使用できる。
【００１８】
まず、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域にＩＲＥＳが存在するかを調べた。ＩＢＤＶは、通常のウイルス増殖方法に準じて調製される。具体的には、ＩＢＤＶ雛用生ワクチンとして使用されているＫ株を鶏胚繊維芽細胞（以下、ＣＥＦと称す）に接種後、この細胞を一般の動物細胞を培養するための合成培地中、３７℃で培養し、充分な細胞変性を呈した時点で培養上清を採取し、遠心分離等の方法によりウイルスを精製、回収する。また、野外分離株の場合は、接種後４日目のＦ嚢を培地で２０％乳剤としたものを出発材料として、同様な手法でウイルスを精製回収した。
【００１９】
回収したＩＢＤＶからのＲＮＡの抽出は、市販のＲＮＡ抽出キット、例えば、Ｃａｒｔｒｉｍｏｘ−１４  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＲＩＫ２．１１：ＷＡ００３（宝酒造株式会社）を用いて容易に行うことができる。次いで、ＩＢＤＶの目的とする領域のｃＤＮＡ断片の合成と増幅が、合成プライマー及びＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ：ＲＲ０１２Ａ（宝酒造株式会社）を用いて行われる。具体的には、配列番号：１及び２に記載のプライマーの組合せでＩＢＤＶの５’非翻訳領域の全長とＶＰ２遺伝子を含む約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片、配列番号：２及び３に記載のプライマーの組合せでＩＢＤＶの５’非翻訳領域の一部とＶＰ２遺伝子を含むｃＤＮＡ断片、配列番号：１及び４に記載のプライマーの組合せで非翻訳領域の全長とＶＰ２／４／３遺伝子を含む約３．２ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ得ることができる。
【００２０】
このようにして得られたｃＤＮＡ断片に終止コドンが存在しない場合には、その３’側に、終止コドンが付加される。具体的には、まず、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会社；ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式会社）を用いて、ＰＣＲにより得たｃＤＮＡ断片の末端を平滑化し、リン酸基を付加し、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造株式会社；ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２）を用いて、適当なベクター、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造株式会社）のマルチクローニングサイトＳｍａＩにクローニングする。次に、該断片が挿入されたｐＵＣ１１９をＸｈｏＩで切断し、上記と同様の方法で、その末端を平滑化した後、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２を用いてリンカーＥｃｏＲＩストップコドン（ニッポンジーン；Ｌｉｎｋｅｒ  ＥｃｏＲＩ  Ｓｔｏｐ  Ｃｏｄｏｎ）を挿入する方法が取られる。
【００２１】
ＩＢＤＶの５’非翻訳領域におけるＩＲＥＳの存在は、単一プロモーターの下流に、第１シストロンとして、終止コドンを持つＮＤＶ−Ｆ遺伝子を挿入し、その下流に第２シストロンとして、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域の全長とＶＰ２遺伝子を含む約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片を挿入したジシストロン性の発現カセットを組み込んだベクターを構築し、これを適当な動物細胞、例えば、ＣＯＳ細胞に導入し、ＶＰ２を検出することにより達成される。すなわち、第１シストロンのＮＤＶ−Ｆはキャップ構造に依存した翻訳が行われるが、第２シストロンのＶＰ２については、キャップ構造が形成されないため、ＩＲＥＳが存在しない限り蛋白質への翻訳は行われない。したがって、第２シストロンのＶＰ２の発現を確認することにより、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域に、ＩＲＥＳの存在が支持される。本発明において以下に開示するように、第２シストロンとしてＩＢＤＶの５’非翻訳領域の全長（１〜１３０ｂｐ）を有するＶＰ２遺伝子（ｃＤＮＡ断片）を挿入したところ、ＶＰ２遺伝子の発現が確認され、ＩＲＥＳ活性の存在が同定された。この時、５’非翻訳領域の１〜６４ｂｐを欠如した非翻訳領域を有するＶＰ２遺伝子を挿入した発現実験ではＶＰ２の発現が認められなかった。すなわち、配列番号：９に示した配列上ではリボソーム結合部位、ＣＵＣＣＵＣ（Munt E., Virology, 209,p10-18, 1996）が存在するにもかかわらず、ＩＲＥＳ活性の発現にはＩＢＤＶの５’非翻訳領域の前半部分の配列が必須であった。
【００２２】
プロモーターは、動物細胞内でプロモーター活性を示すものであればどのようなものでもよく、ウイルス由来のＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期もしくはｇＢプロモーター又は動物細胞由来のβアクチンプロモーターなどから選択するすることができる。好ましくは、ニワトリに感染するウイルス由来のプロモーターが使用される。ＭＤＶをベクターとする組換え体ウイルスの場合には、ＭＤＶ１由来の糖蛋白質遺伝子プロモーター、好ましくは、ＭＤＶ１由来のｇＢプロモーターが使用される。
【００２３】
プロモーター又はＩＲＥＳの下流に組み込まれる外来遺伝子としては、ウイルス性疾病、細菌性疾病、寄生虫病等各種鶏感染症のワクチン抗原となりうる蛋白質をコードする種々の遺伝子又は抗原決定部分を保持するその遺伝子断片等が挙げられる。例えば鶏を対象とした多価ワクチンの調製においては、その組み込む外来遺伝子として、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原をコードする遺伝子（例えばＮＤＶ−Ｆ蛋白又はＨＮ蛋白をコードする遺伝子）、鶏伝染性咽頭気管炎ウイルスの糖蛋白をコードする遺伝子、ＩＢＤＶのウイルス構造蛋白をコードする遺伝子、鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白をコードする遺伝子、鶏貧血ウイルスのカプシド蛋白、特にＶＰ１及びＶＰ２をコードする遺伝子、鶏レオウイルスのカプシド蛋白、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）膜蛋白並びに鶏伝染性コリーザの原因菌であるヘモフィラス・パラガリナルム（Heamophilus paragallinarum）のＨＡ蛋白をはじめとする防御抗原をコードする遺伝子、キャンピロバクター、サルモネラ、大腸菌及びマイコプラズマの防御抗原遺伝子等が挙げられる。更に、鶏コクシジウム症の因子であるアイメリア・マキシマ、アイメリア・テネラ、アイメリア・ブルネッティー、アイメリア・アセルブリーナ、及びロイコチトゾーン症の因子であるロイコチトゾーン・カウレリイー等の原虫の防御抗原遺伝子が挙げられる。また、ウイルス性疾病を予防する抗原としては、インフルエンザでは各蛋白（ＮＰ）が血清型を超えて予防効果を示す重要な抗原であることが示されていることから、他のウイルスにおいても核蛋白遺伝子が重要な防御抗原遺伝子である可能性が考えられる。さらには、サイトカインやホルモン等の生理活性物質をコードする遺伝子も含まれる。
【００２４】
このようにして得られる発現カセットをウイルスベクターに組み込むことによって、多価ウイルスワクチンを作製することができる。ウイルスベクターにジシストロン性の発現カセットを組み込む場合には、更に、該発現カセットを親ウイルスゲノムに相同組換えによって挿入することによりベクターが構築される。
ウイルスベクターとしては、対象動物に対し、病原性を示さないかあるいは病原性の弱いウイルスが利用され、これらのウイルスゲノム上のウイルス複製に影響しない部位に、上記の発現カセットが挿入される。例えば、ニワトリ感染症に対しては、ＭＤＶ１のＵＳ１０遺伝子の間に上記の発現カセットを挿入したプラスミドが構築される。このプラスミドと親ウイルスであるＭＤＶ１ゲノム間で相同組換えを行うことにより、発現カセットが挿入された組換え体ウイルスを得ることができる（特願平７−１６０１０６号）。
【００２５】
動物細胞に前記ベクターを導入する際には、燐酸カルシウム共沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法など一般的な遺伝導入方法が利用できる。具体的には、ＣＥＦ細胞にＭＤＶ１を感染させ、これに前記ベクターをエレクトロポレーション法で導入し、生じたウイルスプラークに生産された外来遺伝子蛋白質を検出することにより、目的の組換え体ウイルスを作出することができる。外来遺伝子の発現は、通常使用される、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等によって確認される。上記方法に使用される抗体は、外来遺伝子がコードする蛋白質を認識する抗体であればどのようなものでも良い。
【００２６】
このようにして得られる組換え体ウイルスは、親ウイルス抗原とともに外来遺伝子がコードする蛋白質を発現するため、多価ワクチンの材料とすることができる。また、組換え体ウイルス又は該組換え体ウイルスが感染した細胞から得られるペプチドは、親ウイルス又は外来遺伝子がコードする蛋白質を構成成分の一つとするウイルスの検出並びに該ウイルスが産生する抗体の検出系に利用することができ、診断薬を構築するための材料となる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によると、多価ワクチンの材料となる複数の外来遺伝を発現する多分子発現カセット、多分子発現ベクター及び該ベクターによって得られる組換え体ウイルス、並びに、前記ベクター又は組換え体ウイルスによって構成されるワクチン及び外来遺伝子に由来するペプチドが提供される。
【００２８】
例えば、本発明を応用した組換え体ウイルスによれば、ワクチンの中で最も効果的な生ワクチンの形態をとりながら、一回の接種でより多く感染症に対するワクチネーションが可能な多価ワクチンが提供され、従来から養鶏分野において要請されている省力化を達成することが可能となる。また、今後の実用化が期待されるＤＮＡワクチンにおいても、従来技術では複数のプラスミドを混合せざるを得ないようなケースにおいても、本技術を用いることで同一プラスミド上に複数の防御抗原遺伝子をのせることが可能となり、製造コストの低減が可能となる。以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明する。
【００２９】
組換え技術において汎用される制限酵素消化、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿によるＤＮＡ断片の回収、ＤＮＡ断片の末端のリン酸化、脱リン酸化（以下ＢＡＰ処理とも称す）、大腸菌の形質転換法、大腸菌からのプラスミドの調製法、アガロース電気泳動法（本実施例においては、ＤＮＡ断片のサイズに応じて０．６〜１．２％アガロースを使用した）並びに電気溶出法は常法に従った。制限酵素は宝酒造株式会社又はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社より購入した。ＤＮＡ断片の末端の平滑化及びＤＮＡ断片の連結は、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会社：DNA Blunting kit）及びＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造株式会社）をそれぞれ用い、添付のプロトコールに従って行った。
【００３０】
【実施例】
実施例１：ＩＢＤＶｃＤＮＡ断片の作製 
（１）ウイルス株
ＩＢＤＶとして、極めて高い致死率を示す超強毒株のＫａ３６１株（Takase K. et al., J. Vet. Med. Sci. 55(1), 137-139, 1993）及びヒナ用生ワクチンとして使用されている弱毒株のＫ株（山田ら, 畜産の研究, 41, 494-500, 1987）を用いた。
【００３１】
（２）ＩＢＤＶ粒子の調製
ＩＢＤＶ−Ｋ株をＣＥＦに接種後、該ＣＥＦを牛胎児血清（以下、ＦＢＳと称す）を３％に含むイーグルＭＥＭ（日水株式会社：以下、Ｅ．ＭＥＭと称す）培地中、３７℃で培養し、細胞変性効果を強く呈した時点で培養上清を採取した。培養上清中に含まれる細胞断片等を微量高速遠心幾（トミーＭＲＸ−１５０）により１５Ｋｒｐｍ、５分間の遠心分離により除いた後、４０％シュクロース液をクッションとする２２Ｋｒｐｍ、２時間の超遠心（株式会社日立製作所、ＲＰＳ４０Ｔ）を行い、ＩＢＤＶ粒子を沈渣として得た。超強毒株については、４週齢鶏にＫａ３６１株を経口投与後４日目にＦ嚢を摘出し、Ｅ．ＭＥＭを４倍容加えた後破砕し２０％乳剤とした。このものを上記と同様に１５Ｋｒｐｍで５分間粗遠心後、その上清を超遠心にかけウイルス粒子を沈渣として回収した。
【００３２】
（３）ＩＢＤＶ ＲＮＡの調製
ＩＢＤＶ粒子中のＲＮＡは、Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＲＩＫ２．１１（宝酒造株式会社、ＷＡ００３）を用い、添付のプロトコールに従って調製した。
【００３３】
（４）ＩＢＤＶ ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ断片の増幅
ＩＢＤＶ ＲＮＡに相補的な４種のｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲにより増幅した（図１）。ＲＴ−ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）（宝酒造株式会社、ＲＲ０１２Ａ）及びプライマーとして配列表の配列番号：１〜４の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（宝酒造株式会社）を用い、添付のプロトコールに従って実施した。ＰＣＲは以下の条件、すなわち、９４℃２分の反応の後、９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の反応を３５サイクル行い、引き続き、７２℃１０分の反応条件で行った。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、引き続きエタノール沈殿で増幅産物を回収した。プライマーの塩基配列は、既報の塩基配列（Mundt E., Virology, 209, 10-18 1995及びHudson P.J. et al., Nucleic Acid Research 14, 12,5001-5012, 1986) から求めた。
ａ）５’非翻訳領域の全長とＶＰ２コード領域を含むｃＤＮＡの増幅
ＩＢＤＶのＫ株及びＫａ３６１株由来のＲＮＡを鋳型にし、配列番号：１及び２のプライマーを用いて、５’非翻訳領域の全長とＶＰ２コード領域 のｃＤＮＡを増幅した。ＩＢＤＶのＫ株及びＫａ３６１株由来のｃＤＮＡをそれぞれｉＫ１．５及びｉＫａ１．５と命名した。
ｂ）５’非翻訳領域の後半部とＶＰ２コード領域を含むｃＤＮＡの増幅
ＩＢＤＶのＫ株のＲＮＡを鋳型とし、配列番号：３及び２のプライマーを用いて５’非翻訳領域の一部を含むＶＰ２領域のｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡをＫ１．５と命名した。
ｃ）５’非翻訳領域の全長を含むＶＰ２／４／３領域ｃＤＮＡの増幅
ＩＢＤＶのＫ株のＲＮＡを鋳型とし、配列番号：１及び４を用いて５’非翻訳領域の全長を含むＶＰ２／４／３領域のｃＤＮＡ増幅した。得られたｃＤＮＡをｉＫＧと命名した。
【００３４】
（５）ｐＵＣ１１９へのクローニング
上記の各ＩＢＤＶｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造株式会社）のマルチクローニングサイトＳｍａＩ部位にクローニングした（図１）。まず、ＩＢＤＶｃＤＮＡ断片の末端を平滑化し、その５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式会社）でリン酸基を付加した。このｃＤＮＡ断片を、予めＳｍａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社）で５’末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９に、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２を用いて挿入し、このプラスミドで大腸菌を形質転換した。常法により、形質転換体から目的のプラスミドを保持する菌体をクローニングし、該プラスミドを回収した。ｉＫＧ断片が挿入されたプラスミドはｐｉＫＧと名付けた（図１）。
また、ｉＫａ１．５、ｉＫ１．５及びＫ１．５の各ｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドについては、これらをＸｈｏＩ消化し、末端平滑処理した後、その部位にリンカーＥｃｏＲＩ終止コドン（ニッポンジーン：Linker EcoRI Stop Codon）を挿入した。終止コドンが挿入されたプラスミドを含む形質転換体から該プラスミドを回収し、それぞれｐｉＫａ１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ、ｐＫ１．５Ｓと名付けた（図２）。
これらのうち、ｐｉＫ１．５Ｓに含まれる５’非翻訳領域の塩基配列の決定を宝酒造株式会社遺伝子解析センターに依頼した。オートシークエンサーを用いて決定された塩基配列のうち、ＩＲＥＳ活性にとって重要な領域、すなわち、５’非翻訳領域の前半部分を配列表の配列番号：９に示す。
【００３５】
実施例２：単一プロモーターにより２種のタンパク質を発現するプラスミドの構築
（１）挿入断片ｉＫａ１．５Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ１．５Ｓの作製
ｐｉＫａ１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ、ｐＫ１．５Ｓを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、末端平滑処理することによりｉＫａ１．５、ｉＫ１．５及びＫ１．５の各ｃＤＮＡ断片に終止コドンが付加した断片、ｉＫａ１．５Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ１．５Ｓを得た（図３）。
【００３６】
（２）発現プラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）の構築
ＳＶ４０後期プロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びｉＫａ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）を構築した。まず、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含むプラスミドＸＬIII１０Ｈ（Sato et al. Ｖirus Research 7, p241-255,1987）を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、アガロース電気泳動、クロロホルム処理及びエタノール沈殿により、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。該ＮＤＶ−Ｆ遺伝子断片をｐＵＣ１１９のＳａｌＩサイトにクローニングした。更にこのプラスミドをＢｓｍＩとＢｂｅＩで部分消化し、上記手順によりＮＤＶ−Ｆ遺伝子を回収し、平滑末端処理後、ｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）のＳｍａＩサイトにクローニングし、ｐＦを構築した（図４）。本プラスミドをＫｐｎＩとＸｂａＩで消化後、上記手順によってＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含む断片を回収し、平滑末端処理後、発現ベクターｐＳＶＬ（ファルマシア社）のＳｍａＩサイトに挿入してｐＳＦを得た（図５）。次いで、これをＳａｃＩ消化、末端平滑処理及び脱リン酸化した後、ｉＫａ１．５Ｓ断片を挿入し、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流にｉＫａ１．５Ｓが結合したプラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）を回収した（図６）。
【００３７】
（３）発現プラスミドｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）、ｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）の構築
ニワトリβアクチンプロモーターの下流に、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びｉＫａ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）並びにＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びＫ１．５Ｓを連結した発現プラスミドｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）を構築した（図７、８）。まず、実施例２−（２）で得たｐＦをＸｂａＩで消化し、末端を平滑化した後、ｉＫ１．５Ｓ又はＫ１．５Ｓ断片を挿入した。これらをＫｐｎＩ、ＳａｌＩ及びＦｓｐＩ（ＦｓｐＩによる消化は、目的のＤＮＡ断片とベクターとのサイズの差を生じさせるために用いた）で消化して、ＮＤＶ−Ｆ及びｉＫ１．５Ｓを含む断片ＦｉＫ１．５Ｓ並びにＮＤＶ−Ｆ及びＫ１．５Ｓを含む断片ＦＫ１．５Ｓを得た（図７）。次に、βアクチンプロモーターを有する発現ベクターｐＣＡＧｎ−ｍｃｓ−ｐｏｌｙＡ（特開平８−２７１３６９）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端平滑化した後、上記の各断片を挿入した。このようにして得られたＦｉＫ１．５Ｓを含むプラスミドをｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）、ＦＫ１．５Ｓを含むプラスミドをｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）と名付けた（図８）。
【００３８】
（４）ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）、ｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）の発現
カバーグラス３枚（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，Ｎｏ．１，１８ｘ１８）の入った直径５ｃｍシャーレに約１００万個のＣＯＳ細胞を播き、ＦＢＳを１０％含むダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地（以下１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭとも称す）中で３７℃４時間培養した。次いで無血清のＤＭＥＭで２回洗浄後、無血清ＤＭＥＭを２ｍｌを添加した。該ＣＯＳ細胞に、ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）、ｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）又はｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）の１μｇを含む無血清ＤＭＥＭ１００μｌとＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｒａｅｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）１０μｌを含む無血清ＤＭＥＭ１００μｌとを混和して１５分間室温に放置したものを添加し、３７℃１６時間培養した。次いで、培地を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに交換してさらに３７℃で４８時間培養した。
カバーグラスを取り出し、20分間室温でアセトン固定し、間接蛍光抗体法に供した。ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の発現確認には、一次抗体としてＮＤＶのＦ蛋白に対するモノクローナル抗体＃３１３（Y.Umino et al. J.gen.virol. 71,p1199,1990）を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を用いた。また、ＩＢＤＶ遺伝子の発現確認には、一次抗体としてＩＢＤＶ免疫ＳＰＦニワトリ血清を、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。
すなわち、上記アセトン固定した細胞とＦＢＳを５％含むＰＢＳ緩衝液で１００倍希釈した各一次抗体とを４℃で一晩反応させ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、ＦＢＳを５％含むＰＢＳ緩衝液で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈した二次抗体を３７℃で２時間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。その結果、ｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）又はｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）を導入したＣＯＳ細胞は、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子及びＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子の両方を発現していたのに対し、ｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）を導入したＣＯＳ細胞では、ＶＰ２は発現されていなかった。これは、ＩＢＤＶの５’非翻訳領域にＩＲＥＳとしての機能が存在することを示唆する。
【００３９】
実施例３：組換え体ウイルスの作出
（１）ＦｉＫＧ断片の作製
まず、実施例１−（５）で作製したｐｉＫＧを制限酵素ＫｐｎＩ、Ｓｓｅ８３８７１及びＦｓｐＩで消化し、上記手順によりｉＫＧを含む断片を回収後、末端平滑化した。次に、実施例２−（３）で得たｐＦをＸｂａＩで消化し、脱リン酸化した後、上記のｉＫＧを挿入した。得られたプラスミドをＫｐｎＩ及びＳｓｅ８３８７１で消化し、末端を平滑化することにより、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子とＩＢＤＶのｉＫＧｃＤＮＡ断片が結合したＦｉＫＧ断片を作製した（図９）。
【００４０】
（２）ｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）プラスミドの構築
ＭＤＶ１のｇＢプロモーター（特願平７−１６０１０６、ＷＯ９６／３８５６５）の下流に、ＮＤＶ−Ｆ及びｉＫ１．５Ｓ又はＮＤＶ−Ｆ及びｉＫＧを連結し、更に該ＤＮＡ断片をＭＤＶゲノムの遺伝子断片間に挿入したプラスミドｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）を構築した。
まず、ＭＤＶ１のｇＢプロモーターの下流にＮＤＶ−Ｆを結合させた断片ＰＦを作製した（図１０）。実施例２−（２）で構築したｐＳＦをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより部分消化して３５０ｂｐの塩基配列部分を除去し、配列表の配列番号：５及び６に記載の塩基配列から構成されるリンカー、すなわち、ＥｃｏＲＩ、ＦｓｐＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を含むＤＮＡ断片（ＥＦＨ）を挿入した。得られたプラスミドを更にＢｓａＢＩ及びＳａｌＩで消化して４５０ｂｐ塩基配列部分を除去し、配列表の配列番号：７及び８に記載の塩基配列から構成され、ＢｓａＢＩ、ＮｒｕＩ、ＳｎａＢＩ、ＦｓｐＩ及びＳａｌＩ制限酵素認識配列を持つリンカー（ＢＮＳＦ）を挿入した。さらに、該プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで消化してＳＶ４０後期プロモーターを除いた後、末端平滑化及び脱リン酸化を行い,ここにＭＤＶ１のｇＢプロモーター断片を挿入した。このようにして得られたプラスミドをＦｓｐＩで消化し、アガロース電気泳動により、ｇＢプロモーターとＮＤＶ−Ｆが結合した約２．５Ｋｂの断片ＰＦを得た。
【００４１】
次に、ＭＤＶ１ゲノムをＨｉｎｄＩＩＩ消化して得られるＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ断片を、さらにＥｃｏＲＩで消化することによって得られる２．８ＫｂｐのＤＮＡ断片Ａ４（図１１）をｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入したしたプラスミド（ｐＡ４）をＢａｌＩで消化した後、脱リン酸化した。これに上記のＰＦ断片を挿入した（図１１）。得られたプラスミド（ｐＡ４ＰＦ）をＸｂａＩ及びＳｎａＢＩで消化して、ＮＤＶ−Ｆ及びＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナルを除いた後、末端平滑化及び脱リン酸化を行った。ここに、実施例２−（３）で作製したＦｉＫ１．５Ｓ又は実施例３−（１）で作製したＦｉＫＧを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）とそれぞれ名付けた（図１２）。
【００４２】
（３）組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫＧ）の作出
特願平７−１６０１０６及び特願平４−２０５９３３号に記載の方法に従い、ＭＤＶ１のＵＳ１０遺伝子内にｇＢプロモーター、ＮＤＶ−Ｆ及びｉＫ１．５Ｓ断片を挿入した組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）並びにｇＢプロモーター、ＮＤＶ−Ｆ及びｉＫＧ断片を挿入した組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫＧ）を作出した。すなわち、ｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）をそれぞれＰｍａｃＩで消化して直鎖状とした後、これをエレクトロポレーション法によりＭＤＶ１感染ＣＥＦに導入し、ＦＢＳを１〜５％添加したＥ．ＭＥＭ培地中、３７℃で数日間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＢＳを５％含むＥ．ＭＥＭ培地で１００００倍希釈したモノクローナル抗体＃３１３とを室温で３０分間反応させた。洗浄した後、ＦＢＳを５％含むＥ．ＭＥＭ培地で３００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（バイオラッド社）を、室温で３０分間反応させ、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ、同仁化学）で発色し、ＮＤＶ−Ｆ蛋白を発現している組換え体ウイルスをクローニングした。
得られた組換え体ウイルスがＩＢＤＶ蛋白も発現していることを蛍光抗体法により確認した。すなわち、カバーグラス３枚の入った直径５ｃｍシャーレに、組換え体ウイルス１０，０００ＰＦＵを含むＣＥＦ細胞３００万個を播き、３７℃、４８時間培養し、実施例２−（４）に記載の方法に従い、ＩＢＤＶ蛋白を検出した。また、このようにして得た組換え体ウイルスｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びｒＭＤＶ１−ＵＳ１０Ｐ（ＦｉＫＧ）は 、ＭＤＶ１免疫ＳＰＦニワトリ血清とも特異的に反応した。
【００４３】
【配列表】
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【００４４】
【配列表】
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【００４５】
【配列表】
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【００４６】
【配列表】
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【００４７】
【配列表】
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【００４８】
【配列表】
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【００４９】
【配列表】
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【００５０】
【配列表】
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【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＵＣ１１９にＩＢＤＶ ｃＤＮＡ及びその断片を挿入したプラスミド（ｐｉＫａ１．５、ｐｉＫ１．５、ｐＫ１．５又はｐｉＫＧ）を構築する手順を示す図。
【図２】ｐｉＫａ１．５、ｐｉＫ１．５及びｐＫ１．５に終止コドンリンカーを挿入したプラスミド（ｐｉＫａ１．５Ｓ、ｐｉＫ１．５Ｓ及びｐＫ１．５Ｓ）を構築する手順を示す図。
【図３】図２に記載のプラスミドから終止コドンリンカーが付加されたＩＢＤＶ ｃＤＮＡ断片（ｉＫａ１．５Ｓ、ｉＫ１．５Ｓ及びＫ１．５Ｓ）を調製する手順を示す図。
【図４】プラスミドｐＵＣ１１８にプラスミドＸＬIII１０Ｈ中のＮＤＶ−Ｆ遺伝子を挿入したプラスミドｐＦを構築する手順を示す図。
【図５】ＳＶ４０プロモーターの下流に、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子を挿入したプラスミドｐＳＦを構築する手順を示す図。
【図６】ｐＳＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｉＫａ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＳ（ＦｉＫａ１．５Ｓ）を構築する手順を示す図。
【図７】ｐＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｉＫ１．５Ｓ又はＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドを構築し、該プラスミドからＮＤＶ−Ｆ遺伝子とｉＫ１．５Ｓが連結したＦｉＫ１．５Ｓ断片又はＮＤＶ−Ｆ遺伝子とＫ１．５Ｓ断片が連結したＦＫ１．５Ｓ断片を調製する手順を示す図。
【図８】ニワトリβアクチンプロモーターの下流に、ＦｉＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＣＡＧ（ＦｉＫ１．５Ｓ）又はＦＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＣＡＧ（ＦＫ１．５Ｓ）を構築する手順を示す図。
【図９】ｐＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の下流に、ｐｉＫＧのｉＫＧ断片を挿入したプラスミドｐＦｉＫＧを構築し、該プラスミドからＮＤＶ−Ｆ遺伝子とｉＫＧ断片が連結したＦｉＫＧ断片を調製する手順を示す図。
【図１０】ｐＳＦのＳＶ４０後期プロモーターを除去し、そこにＭＤＶ１由来のｇＢプロモーターを挿入したプラスミドを構築し、該プラスミドからｇＢプロモーターとＮＤＶ−Ｆ遺伝子が連結したＰＦ断片を調製する手順を示す図。
【図１１】ＭＤＶ１のＵＳ１０領域を含むＡ４断片がクローニングされたプラスミドｐＡ４に、ＰＦ断片を挿入したプラスミドｐＡ４ＰＦを構築する手順を示す図。
【図１２】ｐＡ４ＰＦのＮＤＶ−Ｆ遺伝子を除去し、そこにＦｉＫ１．５Ｓを挿入したプラスミドｐＡ４Ｐ（ＦｉＫ１．５Ｓ）及びＦｉＫＧを挿入したプラスミドｐＡ４Ｐ（ＦｉＫＧ）を構築する手順を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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