(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水と実質的に混和しない有機溶媒中にシアン化水素を含有する反応溶液相であって、水又は水性緩衝液で飽和されているが相分離しない均一系である反応溶液相を調製した後、
水分含量１０重量％以上の、シアン化水素とカルボニル化合物からシアノヒドリンを合成する活性を有する酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを固定化してなる固定化酵素と、カルボニル化合物と、前記反応溶液相とを含む反応系を構築し、
前記反応系中で前記カルボニル化合物を対応する光学活性シアノヒドリンに変換する反応を行うことを特徴とする、光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【請求項２】
固定化酵素の担体として、水分を保持する能力を有する担体を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応の最中に固定化酵素から反応溶液相に水分が移行しないように、反応溶液相に飽和量の水分が含まれている条件で反応を行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応溶液相を、水と実質的に混和しない有機溶媒にシアン化水素を溶解させた後、得られたシアン化水素を含有する有機溶媒を水又は水性緩衝液で飽和させることにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化酵素を用いて有用物質を生産するための酵素反応方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機溶媒を反応溶媒として酵素反応を行うことは、水に難溶な基質や生成物の濃度を上げられるため有利であり、種々の酵素の反応系として使われてきている。しかし、酵素は水系環境では安定で活性も高いが、有機溶媒系では酵素タンパクの変性を起こしたりすることが多く、一般には不安定である。そこで、工業的に酵素反応を利用した有用物質の合成においては、反応系の構築は酵素の性質に左右され、高濃度反応をとるか、酵素の安定性を重視するかについてはケースによって異なっている。特に、ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒として、シアン化水素とカルボニル化合物を基質として光学活性なシアノヒドリンを合成する方法において、本酵素は比較的有機溶媒中での安定性は高いが、反応系に水が存在しない場合には反応速度が顕著に低下する。よって、従来知られている有機溶媒系でのヒドロキシニトリルリアーゼの反応は反応時間が長いという問題があった。また、本酵素の基質となる芳香族系のカルボニル化合物は、水に対する溶解度が低く、本反応を水系で実施するのは基質及び生産物濃度が低いため、実用的ではない。
【０００３】
これまで報告されている、ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒に用いた光学活性シアノヒドリンを合成する反応系としては、水系、即ち水又は水性緩衝液に酵素及び基質を溶解させて反応を行う系（特公平７−５３１１６号公報）、極性溶媒と水と混合した溶媒系(Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 29, 419-425, 1988)、水又は水性緩衝液を飽和させた有機溶媒系（特開昭６３−２１９３８８号公報）、有機溶媒と水又は水性緩衝液を体積比で１／５から５／１で混合した二相系（特開平５−３１７０６５号公報、Biocatal. Biotrans. Vol. 12, 255-266, 1995、特開平１１−２４３９８３号公報)などがある。
【０００４】
水系の反応系の場合、基質であるアルデヒドやケトン等のカルボニル化合物が一般に水溶性が低く、基質濃度と生産物濃度を上げられずに効率がよくないという問題がある。極性溶媒と水とを混合した溶媒系では、純粋な水系よりは基質の濃度をやや増加させられるが、充分ではなく、また、極性溶媒は酵素の安定性に対して悪影響を与えやすいという問題がある。水又は水性緩衝液を飽和させた有機溶媒を使う方法では、基質及び生産物濃度を高くすることができる反面、水分含量が少なすぎるために反応速度が遅いという問題がある。有機溶媒と水の二相系では、反応速度が速く、基質及び生産物濃度を上げられる点では好ましいが、実際には、有機溶媒と酵素が直接接触するため、酵素や夾雑タンパク質が有機溶媒によって変性しやすく、変性したタンパク質によって有機相と水相の界面が分離しにくくなり、場合によりエマルジョン化してしまい、二相分離が困難になるという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、充分な反応速度かつ高濃度で目的生産物を合成できる固定化酵素反応系を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、水分含量１０重量％以上の固定化酵素を用い、水又は水性緩衝液で飽和させた、基質を含む有機溶媒系で反応を行うことによって、反応速度が速く、かつ高濃度の反応が可能であり、しかも反応後の酵素と反応液の分離回収も極めて容易である反応系が構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）酵素として、水分含量１０重量％以上の固定化酵素を用い、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いて、溶液相が水又は水性緩衝液で飽和されているが相分離しない均一系となる条件で酵素反応を行うことを特徴とする酵素反応方法。
（２）固定化酵素として、シアン化水素とカルボニル化合物からシアノヒドリンを合成する活性を有する酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを固定化してなる固定化酵素を用い、カルボニル化合物を対応する光学活性シアノヒドリンに変換する反応を行う前記（１）に記載の方法。
【０００８】
（３）ヒドロキシニトリルリアーゼが（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ又は（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼであり、非対称カルボニル化合物を対応する光学活性シアノヒドリンに変換する反応を行う前記（２）に記載の方法。
（４）固定化酵素の担体として、水分を保持する能力を有する担体を用いる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）反応の最中に固定化酵素から反応溶液相に水分が移行しないように、反応溶液相に飽和量の水分が含まれている条件で反応を行う前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明は、反応系が有機溶媒の均一系であるため、基質及び生産物の濃度が上げられるばかりでなく、酵素は充分な水分を保持した固定化担体内に存在するため、酵素活性が充分発揮されて安定性も高い。更に、反応液との分離も、反応液がエマルジョン化することなく、清澄であり、固液分離を行うことによって非常に簡単になしうるところが特徴である。反応系内にわずかに水分を存在させた有機溶媒系での反応系は、一般に有機溶媒微水系の酵素反応と呼ばれているが、この場合の水分含量は通常数％以下である。これに対し、本発明では水分が固定化酵素の内部に存在し、反応溶液中に水の相として存在して二相を形成しなければ、反応系全体に対する水分含量の上限は特に限定せず、むしろ固定化酵素中１０重量％以上という、有機溶媒微水系に比べて多くの水分が存在する方が酵素反応に好ましいので、有機溶媒微水系とは全く異なっている。
【００１０】
更に、本発明はヒドロキシニトリルリアーゼを触媒としてカルボニル化合物とシアン化水素とから光学活性なシアノヒドリンを合成する反応において特に好適に用いることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる酵素としては、特に制限はなく、有機溶媒を反応溶媒として用いることにより、反応効率が向上できる反応系に用いるものであれば使用することができる。このような酵素としては、水に難溶又は不溶な化合物が基質となる反応系の酵素触媒で、例えば、芳香族化合物の酸化還元を行う、モノオキシゲナーゼなどの酸化又は還元酵素、エステル化合物の合成、置換を行うエステラーゼなどのエステル加水分解酵素、水に難溶又は不溶な化合物への配糖化反応を行うグルコシダ−ゼなどの糖転移酵素、ニトリル化合物を加水分解するニトリルヒドラターゼ、有機溶媒に易溶なカルボニル化合物を基質として光学活性シアノヒドリンを合成する反応を触媒するヒドロキシニトリルリアーゼなどが挙げられる。特に、ヒドロキシニトリルリアーゼによる光学活性シアノヒドリン合成反応に好ましく用いることができる。
【００１２】
前記ヒドロキシニトリルリアーゼとは、シアン化水素とカルボニル化合物とから光学活性なシアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味し、Ｒ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド(Prunus amygdalus)などのバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、アマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、Ｓ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ(Sorghum bicolor)などのイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ(Manihot esculenta)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)などのトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア(Ximenia americana)などのボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼなどが例示できる。
【００１３】
前記酵素は酵素を含む生物組織からの抽出によって調製することができるが、前記酵素の遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え生物によっても生産することができる。
【００１４】
本発明では、酵素及び水分を保持する場として固定化担体を使用する。この固定化担体としては、酵素及び水分を保持することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。好ましい担体としては、親水性、又は担体内部に水又は水性緩衝液を保持することができる担体であって、例えば、多孔性の無機担体、セルロースなどの繊維分を含み、水分を保持できる担体、高分子化合物からなる担体などが挙げられ、具体的には、多孔性のセラミック粒子、多孔性のシリカゲル粒子、ゼオライト系粒子などの無機担体、寒天、アルギン酸カルシウム、キトサンなどの天然高分子ゲル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成高分子ゲルなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明における酵素の固定化方法としては、特に制限はなく、例えば、担体に酵素液を吸収させる方法、酵素液と担体とを混合し、酵素を吸着固定する方法、酵素を包括固定化する方法、酵素を架橋剤で架橋する方法等が挙げられる。
本発明においては、固定化酵素の水分含量は、反応系（固定化酵素、水又は水性緩衝液、溶媒、基質及び生産物より構成される）全体に対する水分含量（％）が、基質及び／又は生産物を含んだ反応溶媒に溶解しうる飽和水分量（％）よりも多くなるようにすることが重要である。
【００１６】
前記の飽和水分量程度の水分では、酵素近傍の水分は実質的になく、反応速度が極めて遅くなる。一方、固定化酵素内部に保持できる水分量より大過剰の水分を投入してしまうと、溶液相が有機溶媒と水の二相系になり、固定化酵素の反応溶媒中での分散が悪くなり、反応効率が低下する。
実際には、用いる溶媒、温度条件、基質濃度条件によって溶媒に溶解する水の量は変動するので、用いる反応条件によって適宜選択することが好ましい。
【００１７】
本発明においては、反応原料の濃度を高め、生産性を高めるために、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いる。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、水に任意の割合で溶解する溶媒を除く有機溶媒を意味する。有機溶媒としては、水と実質的に混和せず、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、ヒドロキシニトリルリアーゼによる光学活性シアノヒドリンの合成においては、合成反応に用いる原料のアルデヒド又はケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていてもよい炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルムなど；ハロゲン化されていてもよいアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられ、これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いてもよい。
【００１９】
反応に用いる有機溶媒を単に水又は水性緩衝液で飽和させたものを反応に用いても、基質を本溶液に溶解すると水の溶解度が増す場合があり、固定化酵素から水分を奪ってしまう。このため、前記のような性質を有する基質を反応に用いる場合の水又は水性緩衝液を飽和させる処理は、基質を有機溶媒に溶解してから行う方が好ましい。
【００２０】
例えば、青酸を基質として用いる光学活性シアノヒドリンの合成方法においては、基質の青酸を有機溶媒に溶解してから水又は水性緩衝液で飽和させる処理を行う方が好ましい。即ち、所定濃度で青酸を有機溶媒に溶解した後、飽和量の水又は水性緩衝液を加えて混合する方法によって実施できる。また、前記の基質を溶解した有機溶媒中に溶解する水分量を予め測定しておき、飽和処理を行っていない有機溶媒と基質を反応系に添加した後、飽和量の水又は水性緩衝液を添加してもよい。ここで用いる水性緩衝液としては、酵素反応の至適ｐＨ付近に調整されていれば、特に制限はないが、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸などの塩等によって構成されている緩衝液が挙げられる。
【００２１】
例えば、反応溶媒としてｔ−ブチルメチルエーテルを用い、基質としてベンズアルデヒド（１Ｍ）、青酸（シアン化水素酸）（１．５Ｍ）を用い、固定化ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒として、反応温度２０℃付近で光学活性シアノヒドリンの合成を実施する場合に、前記の反応系を構築するには、以下のような手法で系を構築することができる。
【００２２】
１．固定化酵素の調製
酵素液に固定化担体を投入し、酵素を吸着固定化するか、又は担体が吸収しうる水分量以下の酵素液を固定化担体と混合して水分を１０重量％以上含んだ固定化酵素を作成する。この際の水分含量は、固定化酵素内部に保持できる範囲、即ち、溶液相が有機溶媒の均一系になる範囲であれば、制限はなく、好ましくは１０〜６０重量％、更に好ましくは２０〜５０重量％である。また、酵素１単位（Ｕ；unit）に対する固定化酵素中の水分含量は、好ましくは０．１〜１００μＬ／Ｕ、更に好ましくは１〜５０μＬ／Ｕである。
【００２３】
２．反応系の構築
反応温度付近の温度で溶媒と青酸を予め混合した溶液に水又は水性緩衝液を加えて飽和させる。この条件での水の飽和溶解度はおよそ２重量％程度であるから、少なくともこの量以上の水又は水性緩衝液を反応液に含ませる方が好ましい。一方、固定化酵素は活性を発現するに充分であり、かつ、反応溶媒中で容易に分散させうる程度の水分を含んだ状態のものを使用する。水分が過剰な場合は、反応液中への水分の添加量を少なく調整することで目的を達することもできる。また、固定化担体の水分がやや少ない場合には、固定化酵素を含む反応系に、水又は水性緩衝液をそのまま添加することによっても調整が可能である。
【００２４】
３．反応
反応系において、回分式で反応を行う場合には、攪拌などにより、固定化酵素が反応系内に分散するようにする。カラムなどに固定化酵素を充填して反応を行う場合には、基質を含む溶液を適当な流速でカラムに流入させ、流出液を採取することで実施できる。回分反応の場合には、反応が完結した時点で混合を止め、固定化酵素を沈降させ、生産物が溶解している有機相を常法により取り出すことで生産物を回収できる。この固定化酵素は初回と同じ方法で調製した基質を含む溶液と混合することによって再使用することができる。
【００２５】
本発明によって合成できる光学活性シアノヒドリンの反応基質としてはカルボニル化合物及びシアン化水素を用いる。
ここでカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
【００２６】
【化１】
Ｒ1−ＣＯ−Ｒ2    （Ｉ）
（式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を表し、前記炭化水素基中、−ＣＨ2−並びに−ＣＨ3のＣＨ2はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ2は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ2−のＣ−Ｈ、−ＣＨ3のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ2のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ1及びＲ2は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。）
で示される。
【００２７】
前記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基としては、例えば、飽和な鎖状炭化水素基である、炭素数１以上の直鎖状アルキル基、炭素数３以上の分岐状アルキル基、不飽和な鎖状炭化水素基である、炭素数２以上の直鎖状アルケニル基、炭素数３以上の分岐状アルケニル基、炭素数３以上の直鎖状アルキニル基、炭素数４以上の分岐状アルキニル基、炭素数４以上の直鎖状アルカジエニル基、炭素数５以上の分岐状アルカジエニル基などを例示することができる。単環式炭化水素基としては、例えば、飽和な単環式炭化水素基である、炭素数３以上の側鎖のないシクロアルキル基、総炭素数４以上の側鎖のあるシクロアルキル基、不飽和な単環式炭化水素基である、炭素数４以上の側鎖のないシクロアルケニル基、総炭素数５以上の側鎖のあるシクロアルキニル基、炭素数５以上の側鎖のないシクロアルカジエニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルカジエニル基などを例示することができる。不飽和な単環式又は多環式炭化水素基としては、芳香族炭化水素基、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、９−アントリル基など総炭素数６〜２２の側鎖のない芳香族基、総炭素数７以上の側鎖のある芳香族基、更には、環集合構造の炭化水素基でもある、炭素数１２のフェニルフェニル基、総炭素数１３以上の側鎖のあるフェニルフェニル基を例示することができる。また、多環式炭化水素基としては、炭素数６以上の側鎖のない縮合環式炭化水素基、総炭素数７以上の側鎖のある縮合環式炭化水素基、炭素数７以上の側鎖のない架橋環式炭化水素基、総炭素数８以上の側鎖のある架橋環式炭化水素基、総炭素数９以上の側鎖のないスピロ炭化水素基、総炭素数１０以上の側鎖のあるスピロ炭化水素基などを例示することができる。なお、前記の側鎖のない縮合環式炭化水素基において、縮合する環の一つがベンゼン環である場合、その総炭素数が９以上となるものを挙げることができ、前記の側鎖のある縮合環式炭化水素基において、縮合する環の一つがベンゼン環である場合、その総炭素数が１０以上となるものを挙げることができる。環集合構造の炭化水素基としては、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキルシクロアルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキルシクロアルキル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキリデンシクロアルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキリデンシクロアルキル基などを例示することができる。なお、これらの環式炭化水素において、側鎖のあるとは、環上に鎖状炭化水素基が置換していることを意味する。前述する環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基としては、総炭素数７以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数８以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数９以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数１０以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数８以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数９以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数９以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数１０以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数８以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数９以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数１０以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数１１以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数１０以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルカジエニル基、総炭素数１１以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルカジエニル基、総炭素数１１以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数１２以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数４以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数５以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数５以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数５以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数７以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数８以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数８以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数９以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルカジエニル基などを例示することができる。
【００２８】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基などを併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００２９】
前記炭化水素基中、−ＣＨ2−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ3の−ＣＨ2−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換わると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ2が＝Ｏ又は＝Ｓに置き換わると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ2−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ3のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ2が導入され、＝ＣＨ2のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ3、−ＣＨ2−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置き換えられると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ2並びにＣ−Ｈにおける置き換えは、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置き換えを行った後、なお当該炭素上にＣＨ2又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置き換えがなされてもよい。更には、前記の置き換えにより、−ＣＨ2−ＣＨ3の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換などもなされる。
【００３０】
本明細書において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
従って、前記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基など環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基など、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基など、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
【００３１】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基など、シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基など、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基など、ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）など、シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基などが挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基などが挙げられる。
【００３２】
前記炭化水素基中のＣＨ2がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置き換えられた基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）などの構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置き換わるものを意味し、更には、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。前記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニ��基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基などが挙げられる。
【００３３】
Ｒ1及びＲ2で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。前記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００３４】
前記のアルデヒド又はケトンを光学活性シアノヒドリンに変換するためには、シアン化水素を原料として用いるが、シアン化水素の供給方法としては液体として供給する方法、気体として供給する方法のいずれをも採用することができる。またシアン化水素だけではなく、シアン化水素の水溶液である、シアン化水素酸（即ち青酸）も全く同様に用いることができる。更に、反応系へ添加することによってシアン化物イオン（ＣＮ-）を生じる物質であれば用いることができ、例えば、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素酸の塩、アセトンシアンヒドリンなどのシアノヒドリン類などが挙げられる。
【００３５】
本発明に用いるヒドロキシニトリルリアーゼ酵素の調製は、酵素を含む植物組織からの抽出、酵素遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え生物を培養した培養物からの抽出によって行える。抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはヒドロキシニトリルリアーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。こうして調製したヒドロキシニトリルリアーゼ酵素を固定化することによって固定化酵素を得る。
【００３６】
固定化酵素の水分含量の測定は、乾燥状態の固定化担体と酵素固定化後の固定化酵素との重量の比率から求めることもできるが、カールフィッシャー水分計などを使用しても測定することができる。
【００３７】
固定化酵素及び基質の使用量、反応温度は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、固定化酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物５０mmolに対して１〜１０００単位、好ましくは１０〜５００単位である。基質の濃度は、カルボニル化合物の場合は通常０.１〜１０mol/Lの範囲に設定し、シアン化水素は用いるカルボニル化合物に対して１〜５倍モル、好ましくは１.１〜３倍モルの濃度で添加する。本反応は基質濃度によって酵素活性及び反応速度が変化するので、用いるカルボニル化合物の種類に応じて適宜決定する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が８０％以上、好ましくは９０％以上に達するまでの時間が適当であるが、この限りではない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であればよく、通常０〜４０℃、好ましくは４〜３０℃である。
【００３８】
本発明方法によって生成された光学活性シアノヒドリンなどの生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定、定量することができ、必要に応じて、抽出、減圧蒸留、カラム分離などの通常の手段によって分離精製することができ、長時間保存する場合には安定剤を添加してもよい。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
（調製例１）（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）アーモンド種子粉砕物１００ｇにアセトン２００ｍｌを混合し、２時間攪拌した後、濾過し、固形分を回収した。この固形分を乾燥したものに水６００ｇを加え、アンモニア水でｐＨ７．５に調整した後、攪拌混合を一晩行った。次いで、このスラリーを遠心分離し、上澄液を回収した。この上澄液のｐＨを５．５に調整した後、遠心分離し、不溶分を除去した液を回収した。
【００４０】
（２）前記（１）で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を測定した。酵素活性はＤＬ−マンデロニトリルを基質として基質が酵素によって分解されベンズアルデヒドが生成される速度を２４９．６ｎｍの吸光度変化を測定することによって測定し、活性を算出した。ここで、１単位（Ｕ；unit）は１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義した。この方法で前記（１）で調製した酵素液の酵素活性を測定したところ、６０．５７Ｕ／ｍｌの活性で酵素を２．５万単位回収することができたことがわかった。
【００４１】
（調製例２）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酵母サッカロマイセス・セレビシエを宿主として、キャッサバ由来の当該遺伝子をクローニングしたものを当該酵母へ遺伝子組換えして得た遺伝子組換え酵母を培養することによって調製した。当該遺伝子組換え酵母をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）１Ｌで２４時間当該遺伝子組換え酵母を培養し、回収した菌体を破砕して不溶分を除去した液を回収した。
（２）前記（１）で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を調製例１（２）と同様の方法で測定したところ、４０Ｕ／ｍｌの活性があることがわかり、９０００単位の酵素を回収することができた。
【００４２】
（調製例３）固定化（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例１の方法で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液を硫安沈澱処理し、酵素を濃縮し、１０００Ｕ／ｍｌの酵素液を調製した。この酵素液１ｍｌに対して１ｇの固定化担体（多孔性シリカゲル、microbead silicagel 300A、富士シリシア化学製）を混合した。これをこのまま合成反応に用いることにした。この固定化酵素の水分含量は５０重量％であった。
【００４３】
（調製例４）固定化（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例２の方法で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液に、酵素活性３００単位に対して調製例３と同じ固定化担体１ｇを添加し、緩やかに一晩混合した。次いで、濾過して固定化酵素を回収し、これを以降の反応に用いた。こうして調製した固定化酵素の水分含量をカールフィッシャー水分計で測定したところ、水分含量５０重量％であることがわかった。
【００４４】
（実施例１）（Ｒ）−シアノヒドリンの合成
アーモンド由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液１０００Ｕ／ｍｌ  ６ｍｌと多孔性シリカゲルmicrobead silicagel 300A（富士シリシア化学製）６ｇを混合し、固定化酵素を調製した。水分量と反応効率の関係を調べるために、同様の操作によって調製した固定化酵素をエバポレーターで３時間減圧乾燥した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を添加して水分含量を調整したものを作成した。表１に示した条件４においては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５.５）で酵素濃度を１／２に希釈して、酵素量は同じであるが酵素液量を２倍にした酵素液を、他の条件の２倍量の固定化担体に固定化した固定化酵素を用いた。
【００４５】
検討に用いた未処理ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）中の水分含量は０．０３重量％であり、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で飽和させたものの水分含量は１．３４重量％であった。この溶媒を前記緩衝液で飽和させた条件及び飽和処理しない条件を設定し、反応系全体の水分含量を変化させた。
【００４６】
いずれの条件においても、基質である２−クロロベンズアルデヒド（ｏ−クロロベンズアルデヒド）と青酸の濃度はそれぞれ１Ｍ及び１．５Ｍと一定にした。前記において調製した固定化酵素６００単位分を、それぞれ１０ｍｌの反応容器に入れ、次いで溶媒４.１４３ｍｌ、青酸０.２９２ｍｌを添加した。ここへ、２−クロロベンズアルデヒド０.５６５ｍｌを添加することによって反応を開始した。反応は、２５℃で反応容器をボトルローラーで緩やかに撹拌することで実施した。条件及び結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0003905690.tif 000002
【００４８】
この結果から、緩衝液で飽和させた溶媒を用いても、反応効率が低く、溶媒の飽和水分量に対して過剰の水分を含んだ反応系において高い反応効率が得られた。条件３及び４では、反応溶媒が含有しうる水分量に比べ大過剰の水分を加えているにもかかわらず、反応溶液相は二相分離せず、有機溶媒相の単一相で形成されていた。
【００４９】
（実施例２）
調製例１で使用した固定化担体の水分保持量は重量のほぼ１倍であったので、酵素量は同じにし、担体量を変化させることで反応系内の水分含量を変化させた条件を設定し、水分含量と反応効率との関係を調べた。調製例３の方法で調製した固定化酵素を減圧乾燥し、水分を除去したものに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加えて水分量を調整した固定化酵素を作成し、水分含量と反応効率との関係を調べた。
【００５０】
６００単位の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを固定化し、水分含量の異なる固定化酵素を調製した。一方、青酸をｔ−ブチルメチルエーテルに溶解し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を飽和量添加した。次いで、固定化酵素に前記の原料液を添加した後、２−クロロベンズアルデヒドを添加した。この反応系の有機相は５ｍｌであり、青酸の濃度は１．５Ｍ、２−クロロベンズアルデヒドの濃度は１Ｍであった。この混合物を２５℃で緩やかに混合することで反応を行い、５時間後の２−クロロベンズアルデヒドの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルへの転換率を測定したところ、図１に示す結果が得られた。この結果、固定化酵素の水分含量が高いほど、反応効率が高いことがわかった。
【００５１】
（実施例３）
ｔ−ブチルメチルエーテル６１０ｇに青酸４１ｇを添加した溶液に０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）を４０ｍｌ加えて攪拌し、静置後、有機相を回収した。この有機相に調製例４の方法で調製した固定化酵素（６万単位）を添加した。この時の固定化酵素の水分含量は５０重量％であった。次いで、ベンズアルデヒドを１０６ｇ添加後、反応混合物を攪拌し、反応を開始した。反応温度は２０℃に設定した。ＨＰＬＣで反応液の分析を行ったところ、１時間後に（Ｓ）−マンデロニトリルが１２６ｇ生成していることがわかった。この時のアルデヒドの転換率は９３％、（Ｓ）−マンデロニトリルの光学純度は９９％ｅｅであった。次いで、反応終了後、固定化酵素を回収し、同様の条件で繰り返して反応を行ったところ、１６回の反応において平均転換率９４．２％で光学純度９９％ｅｅ以上の（Ｓ）−マンデロニトリルを合成することができた。この結果から、固定化酵素に水分を保持させて反応を行うことによって、非常に効率よく、かつ安定に光学活性シアノヒドリンの合成が行えることがわかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、非常に効率よく、かつ安定に目的生産物を合成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固定化酵素の水分含量と反応効率との関係を示す図である。
【図１】
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