(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織中にＥＢＶ遺伝子の一部が認められる胃癌組織を用いてＥＢＶ感染胃癌細胞株を樹立する方法で得られるＥＢＶ感染胃癌細胞株ＧＴＣ-4（受託番号：ＥＣＡＣＣ  ９９０１２７０５）。
【請求項２】
請求項１に記載のＥＢＶ感染胃癌細胞株を用いることを特徴とする抗癌剤のスクリーニング法。
【請求項３】
請求項１に記載のＥＢＶ感染胃癌細胞株を培養し、該細胞株の増殖を抑制する活性を測定することを特徴とする請求項２に記載の抗癌剤スクリーニング法。
【請求項４】
請求項１に記載のＥＢＶ感染胃癌細胞株を免疫不全マウスに移し、腫瘍の増殖・転移の抑制あるいはマウスの生存期間の延長する活性を測定することを特徴とする請求項２に記載の抗癌剤スクリーニング法。
【請求項５】
ＥＢＶ感染胃癌細胞株ＧＴＣ-4（受託番号：ＥＣＡＣＣ  ９９０１２７０５）を培養する工程を含むＥＢＶ関連抗原を生産する方法。
【請求項６】
ＥＢＶ感染胃癌細胞株ＧＴＣ-4（受託番号：ＥＣＡＣＣ  ９９０１２７０５）を用いることを特徴とするＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ及びc-ＤＮＡを生産する方法。
【請求項７】
ＥＢＶ関連抗原がＬＭＰである請求項６のＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ及びc-ＤＮＡを生産する方法。
【請求項８】
ＥＢＶ関連抗原がＶＣＡである請求項６のＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ及びc-ＤＮＡを生産する方法。
【請求項９】
ＥＢＶ関連抗原がＥＢＮＡである請求項６のＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ及びc-ＤＮＡを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＥＢＶに感染した胃癌組織よりＥＢＶ感染胃癌細胞株を樹立する方法、及び培養上皮系細胞に感染するＥＢＶに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＢＶ(Epstein-Barr Virus)はヒトヘルペスウイルス科に属するＤＮＡウイルスである。成人が初感染した場合には伝染性単核球症を発症するが、日本においては大部分が小児期において不顕性に初感染し、生涯を通じて潜伏感染を続ける。そのため種々の癌・自己免疫性疾患を含め、多くの疾患の原因ウイルスとして疑われてきたが、アフリカのバーキットリンパ腫(Epstein MA, Barr YM, Lancet Vol 1：252-253, 1964 ）・中国南部の上咽頭癌（Pathnabathan R et al., New Engl. J. Med. 333(11):693-698, 1995）でその関連が証明されたことを除くと、未だ解明されていないことが多い。
【０００３】
近年、胃癌細胞にＥＢＶ遺伝子が検出され（Shousha S et al., J. Clin. Pathol. 47:695-698, 1994 ）、更にＥＢＶ遺伝子が単クローン性に存在することが見出されて（Imai S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1931-1935, 1994）、ＥＢＶ遺伝子が発癌過程に関与する可能性が示唆されるに及んで、少なくとも胃癌の一部にはＥＢＶが関与していると考えられるようになった。
【０００４】
現時点では、ＥＢＶが癌化に関与したかどうかを、それぞれの胃癌患者について特定する診断法が確立していないことから、ＥＢＶにより癌化した胃癌がそれ以外の胃癌と比較して異なった特徴、例えば転移のしやすさ・進行の早さ・薬剤感受性等、を持つか否かは明らかになっていない。診断法の確立が待たれると同時に、ＥＢＶが関与した胃癌に対する治療法の確立、特に化学療法の開発が重要な課題である。そして、これら診断法の確立・化学療法の開発のためにはＥＢＶにより癌化した胃癌細胞株の樹立が必要不可欠である。
【０００５】
最近、本発明者らは胃癌患者の胃正常組織より、ＥＢＶに感染した上皮系細胞ＧＴ38・ＧＴ39を確立したことを報告した（Tajima M et al., Jpn. J. Cancer Res. 89:262-268, 1998 ）。リンパ系細胞のＢ細胞を自然の宿主とするＥＢＶが上皮系細胞に感染し産生量が低いながらもＥＢＶ関連抗原を産生することは驚きであったが、診断法の確立・化学療法の開発のためには、正常組織ではなく癌組織から樹立した、すなわちin vivo で癌化が起こったことが確実な胃癌細胞株の樹立が望まれた。
また、ＥＢＶ遺伝子産物により癌化が起こるのであれば、癌化の機構を阻害する新しいタイプの抗癌剤を開発することが可能である。そして、ＥＢＶによる胃癌発癌の機構を解析するためには、上皮系細胞にＥＢＶを感染させ、ＥＢＶのどの遺伝子が癌化に関与しているかを解析することが必要である。
【０００６】
しかし、in vivo ではＥＢＶ遺伝子が胃癌細胞等の上皮系細胞にも見出されＥＢＶと胃癌の関係が類推される（Shousha S et al., J. Clin. Pathol. 47:695-698, 1994 ）ものの、in  vitro においては培養上皮系細胞に効率よく感染させることはできなかった。これまでに、ＥＢＶを培養上皮系細胞に感染させるため遺伝子組換ＥＢＶを作製した報告（Borza CM et al.,J. Virol. 72(9):7577-82, 1998 、Imai S. et al., J. Virol. 72(5):4381-8, 1998）がなされている。これらの報告では薬剤耐性遺伝子（Neor）を挿入したＥＢＶを感染させ薬剤（Neomycin）で選択をかけるという、非常に希にしか起きない現象を増幅して捉える方法が用いられている。例えばImaiの1998年の報告では培養上清を感染させた場合細胞400,000 個に感染させて最大32個の細胞に感染が起こったことが報告されており、このような希な現象が自然界で起こっているＥＢＶ感染を反映しているという保証はない。これまでに、遺伝子を組換えていないＥＢＶが効率よく上皮系細胞に感染したという報告はなく、生体（in vivo)で実際に起こっているＥＢＶによる癌化の機構を解析するためには、遺伝子に修飾が加えられていないＥＢＶの上皮系細胞への感染系が必要である。
【０００７】
疫学的調査において、胃癌患者でＥＢＶ関連抗原viral capcid antigen（ＶＣＡ）およびlatent membrane protein(ＬＭＰ）に対する抗体価が健常人と比較して高値であることが見出され（田島マサ子他, 臨床とウイルス Vol 25, No.3:169-176, 1997)、胃癌とＥＢＶの関連が裏付けられると共に、ＥＢＶ関連抗原に対する抗体価の診断的価値が注目を集めるに到った。
【０００８】
ＥＢＶ関連抗原を胃癌の診断に利用するためには、ＥＢＶ関連抗原の安定的な供給が不可欠である。蛋白質の翻訳後修飾を考慮すると、ＥＢＶ関連抗原産生細胞は上皮系細胞、更には胃癌細胞であることが望ましい。しかし、一般的に知られているＢ95-8・Daudi 等のＥＢＶ感染細胞はリンパ系の細胞であり、ＶＣＡ・ＬＭＰの産生量が低いという欠点を有していた。また最近本発明者らが報告した、胃癌患者正常組織より樹立したＧＴ38・ＧＴ39（Tajima M et al., Jpn. J. Cancer Res. 89:262-268, 1998)も同様にＶＣＡ・ＬＭＰの産生量が低いという欠点を有していた。更に、これらの細胞には、培養条件により分化誘導が起こりＥＢＶ関連抗原の産生が安定しないという欠点があった。癌化の最終段階にあって形質が安定していると考えられる胃癌組織より、ＥＢＶ関連抗原を安定的に産生する胃癌細胞株を確立することが期待された。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＥＢＶにより癌化した胃癌の診断法及び化学療法を開発するために、化学療法剤をスクリーニングするため及び診断薬に用いるＥＢＶ関連抗原の安定した生産のためのＥＢＶ感染胃癌細胞株を確立すること、及び上皮系細胞に効率よく感染するＥＢＶ株を確立することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＥＢＶにより癌化した胃癌に対する化学療法剤のスクリーニングのため、及びＥＢＶ関連抗原を安定して産生する細胞株を確立するために、生体内（in vivo)で起こった癌化を反映し、更に癌としての形質が安定している胃癌組織より細胞株を確立することができるのではないかと考えた。
そこで、癌病巣摘出により得られた胃癌組織を抗生物質で処理した後、ＭＥＭと等量の keratinocyte-ＳＦＭを混合し非働化した牛胎児血清を10％加えた培養液中で培養を行って、鋭意研究の結果、胃癌細胞株ＧＴＣ-4の確立に成功し本発明を完成した。
【００１１】
確立したＧＴＣ-4細胞は安定してＥＢＶ関連抗原を産生すると共に、免疫不全マウスに腫瘍を形成し、その上リンパ節への転移を引き起こすことから、ＥＢＶ感染胃癌細胞を標的としたin vitro及びin vivo の抗癌剤スクリーニングに適用が可能である。
更に、ＧＴＣ-4培養上清を上皮系細胞に感染させると、ＥＢＶ関連抗原ＶＣＡの発現が認められ、同時に細胞変性も引き起こすことから、ＧＴＣ-4が上皮系細胞に感染するＥＢＶを産生することが確認された。該ＥＢＶは、ＥＢＶによる癌化機構の解析、該癌化機構を阻害して癌細胞の増殖を抑制する薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。
またＧＴＣ-4細胞はＥＢＶ関連抗原を安定して大量に産生することから、ＥＢＶで癌化した胃癌の診断薬に用いるＥＢＶ関連抗原生産用の細胞、及び遺伝子組換えの手法によりＥＢＶ関連抗原を生産する場合の、ＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ・c-ＤＮＡを取得するための細胞として用いることが可能である。
【００１２】
すなわち本発明は、ＥＢＶ感染胃癌組織を用いてＥＢＶ感染胃癌細胞株を樹立する方法、及びその方法で得られるＥＢＶ感染胃癌細胞株、該ＥＢＶ感染胃癌細胞株ＧＴＣ-4、該ＥＢＶ感染胃癌細胞株を用いる抗癌剤のスクリーニング法に関する。更に本発明は、上皮系細胞に感染するＥＢＶ、上皮系細胞から分離される該ＥＢＶ、ＧＴＣ-4から分離される該ＥＢＶ、該ＥＢＶを用いる抗ウイルス剤のスクリーニング法、該ＥＢＶに感染した上皮系細胞を用いる抗癌剤のスクリーニング法に関する。
また本発明は、該ＥＢＶ感染胃癌細胞株より得られるＥＢＶ関連抗原を用いることを特徴とする胃癌の診断薬、該ＥＢＶ感染胃癌細胞株を培養する工程を含むことを特徴とするＥＢＶ関連抗原を生産する方法、及びその生産方法で得られるＥＢＶ関連抗原に関する。更に、本発明は該ＥＢＶ感染胃癌細胞株よりＥＢＶ関連抗原をコードするm-ＲＮＡ、次いでc-ＤＮＡを生産する方法に関する。ＥＢＶ関連抗原として、latent membrane protein(ＬＭＰ）、viral capcid antigen（ＶＣＡ）及びＥＢＶ nuclear antigen（ＥＢＮＡ）が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ＥＢＶ感染胃癌細胞株の確立法は、ＥＢＶ関連抗原、例えばＶＣＡに対する抗体価が高く、更に癌組織中にＥＢＶ遺伝子の一部が認められる胃癌患者より摘出した胃癌病巣を、抗生物質で処理した後に細切し、ＭＥＭと等量のkeratinocyte-ＳＦＭを混合し非働化した牛胎児血清を10％加えた培養液中で培養を行う。次いで、増殖してきた細胞をlimiting dilution 等の方法によりcloning を行うことで、均一で発現形質の安定した細胞株を得ることができる。得られた細胞株を培養し、ＥＢＶ関連抗原、例えばＬＭＰ・ＶＣＡ・ＥＢＮＡ等の産生量を蛍光抗体法等により測定することにより、ＥＢＶ関連抗原を安定して高産生するclone を選択することができる。
【００１４】
得られた細胞株は、継代培養し、ＥＢＶ感染により引き起こされた胃癌に対する化学療法剤のスクリーニングに供する事ができる。具体的には、該細胞株を被検薬剤の存在下に一定期間培養し、例えばＭＴＴ法(Carmichael et al., Cancer Res. 47:936-942, 1987）により生細胞数を評価することにより、該細胞株の増殖を選択的に抑制する薬剤を選び出すことができる。また、被検薬剤の存在下に一定期間培養した該細胞株の、ＥＢＶ遺伝子産物、例えばＬＭＰ・ＶＣＡ・ＥＢＮＡ更にはＥＢＶ由来ＩＬ-10 の産生量を免疫化学的方法により測定し、ＥＢＶ遺伝子産物の産生を抑制する薬剤を選び出すことも可能である。
加えて、該細胞株を免疫不全マウス例えばサイクロスポリン処理したヌードマウスに移植した後、一定期間被検薬剤を投与して、腫瘍の大きさ、転移巣の数・大きさ、マウスの生死等を観察することにより薬剤の効果を判定することが可能である。
【００１５】
該細胞株は、上皮系細胞に感染するＥＢＶの産生細胞として用い、上皮系細胞におけるＥＢＶの増殖を抑制する抗ウイルス剤のスクリーニングに使用することが可能である。具体的には上皮系細胞、例えばHeLa細胞に該細胞株の培養上清を重層してＥＢＶを感染させた後、被検薬剤の存在下で一定期間培養して、発現する細胞変性を顕微鏡観察する、或いは発現するＥＢＶ関連抗原を蛍光抗体・ＥＬＩＳＡ等の免疫化学的方法により検出する、或いはＰＣＲ等によりＥＢＶ遺伝子を検出することによりウイルス増殖を定量化し、上皮細胞におけるＥＢＶの増殖を抑制する薬剤を選択することができる。
【００１６】
また該細胞株を、上皮系細胞に感染するＥＢＶの産生細胞として用い、ＥＢＶにより癌化した上皮系細胞に対する抗癌剤のスクリーニングに使用することが可能である。具体的には上皮系細胞、例えばＶＥＲＯ細胞に該細胞株の培養上清を重層してＥＢＶを感染させた後、軟寒天中でもコロニー形成する細胞を選択し増殖させる。選択した細胞株を被検薬剤の存在下に一定期間培養し、例えばＭＴＴ法（Carmichael et al., Cancer Res.47:936-942, 1987）により生細胞数を評価することにより、その細胞株の増殖を選択的に抑制する薬剤を選び出すことができる。
【００１７】
該細胞株及び該細胞株を培養して得られるＥＢＶ関連抗原、例えばＬＭＰ・ＶＣＡ・ＥＢＮＡは、血清中のＥＢＶ関連抗原に対する抗体を検査するために使用することができる。例えば、１）細胞を蛍光抗体法あるいは酵素抗体法により染色し、顕微鏡観察することにより、２）細胞を可溶化し電気泳動後にwestern blottingすることにより、３）細胞より精製あるいは部分精製した抗原を用いたＥＬＩＳＡにより、血清中のＥＢＶ関連抗原に対する抗体を検査することができる。それぞれの操作の具体的な例を以下に記載した。
【００１８】
１）蛍光抗体法あるいは酵素抗体法：得られた細胞株をそのままエタノールまたはホルマリンで固定し、適当に希釈した被検血清を加え反応させて充分に洗浄する。蛍光標識した抗ヒトＩｇ抗体あるいは酵素標識した抗ヒトＩｇ抗体を反応させ、蛍光顕微鏡であるいは基質を加えて反応させた後に顕微鏡で観察して、細胞株に表現されたＥＢＶ関連抗原が染色されているかどうかを判定する。
【００１９】
２）western blotting：得られた細胞株をＳＤＳを含むsample buffer に可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動された抗原をニトロセルロースなどの膜に転写する。膜を適当に希釈した被検血清と反応させて充分に洗浄し、酵素標識した抗ヒトＩｇ抗体を反応させた後、基質を加えて発色させる。ＥＢＶ関連抗原の分子量に相当するbandが染色されているかどうかを判定する。
【００２０】
３）ＥＬＩＳＡ：得られた細胞株を培養し、例えば界面活性剤を用いて可溶化した後、種々のクロマトグラフィー、電気泳動法、ゲル濾過などの常法を適宜組み合わせてＥＢＶ関連抗原を精製する。好ましくは抗体アフィニティクロマトグラフィーなどを用いることが望ましい。精製あるいは部分精製したＥＢＶ関連抗原をカップあるいはビーズにコートし、適当に希釈した被検血清を加えて反応させる。酵素標識した抗ヒトＩｇ抗体を反応させた後、基質を加えて発色させ発色の程度により抗体価を判定する。酵素標識抗体の代わりにＲＩ標識抗体を用いて放射活性により抗体価を測定しても良い。抗原の精製が難しい場合、ＥＢＶ関連抗原に対するマウスモノクローナル抗体を用いたantigen capture の方法等を用いることもできる。
【００２１】
更に、得られた細胞株より、例えば成書Molecular Cloning 2nd J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 に記載の方法によりm-ＲＮＡを抽出できる。そのm-ＲＮＡより、ＥＢＶ関連抗原をコードするc-ＤＮＡは、当業者に公知の方法により、例えばArrand,J.R. et al., Nucleic Acids Res. 9 (13):2999-3014 (1981)に記載のＥＢＶ遺伝子の塩基配列情報をもとにプライマーを設定して、ＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。
更に、ＥＢＶ関連抗原をコードするc-ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたＥＢＶ関連抗原を精製することにより調製することが可能である。c-ＤＮＡが挿入されるベクターとしては特に制限はなく、例えば、クローニング用ベクターであれば、ｐBlueScript、ｐＧＥＭなどが挙げられ、また哺乳動物細胞発現用ベクターであれば、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＳＲα、ｐＣＭＶなどが挙げられる。
【００２２】
ベクターが導入される宿主細胞としては、ＥＢＶ関連抗原の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、種々の動物細胞としては、例えば、天然の細胞の他、ＣＯＳ細胞、ＰＣ12細胞などの株化された細胞などが挙げられ、その他に細菌、酵母、昆虫細胞なども使用することができる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory,Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載の方法に従って行うことが可能である。
【００２３】
形質転換体内で発現したＥＢＶ関連抗原は、種々のクロマトグラフィー、電気泳動法、ゲル濾過などの常法を適宜組み合わせて精製することが可能である。また、例えば、ＥＢＶ関連抗原をＧＳＴやHisbとの融合タンパク質として発現させる場合には、それぞれグルタチオンセファロースカラム、ニッケルセファロースカラムを用いて精製することも可能である。
【００２４】
なお、本発明に係わるＧＴＣ-4細胞は−80℃以下で長期保存可能であって、帝京大学医学部付属病院中央検査部で保管されており、頒布可能な状態にある。また、本発明に係わるＧＴＣ-4細胞は、ＥＣＡＣＣ(European Collection of CellCulture) に寄託し、受託番号はＥＣＡＣＣ  ９９０１２７０５である。
【００２５】
【発明の効果】
癌病巣摘出により得られた胃癌組織より、ＥＢＶ感染胃癌細胞株ＧＴＣ-4を確立し、ＥＢＶ関連抗原を安定して産生する細胞株が得られた。本発明によりＥＢＶ感染胃癌細胞を用いた抗癌剤のスクリーニングが可能となったのと同時に、ＥＢＶ関連抗原を用いた胃癌の血清診断薬の開発が可能となった。
【００２６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  ＧＴＣ-4細胞の確立
低分化腺癌で癌組織中にＥＢＶ−ＬＭＰとＥＢＶ遺伝子の断片が認められ、ＥＢＶ−ＶＣＡ抗体価 640倍を保有した70歳男性より摘出した癌病巣を抗生物質で処理した後、ＭＥＭと等量の keratinocyte-ＳＦＭを混合し非働化した牛胎児血清を10％加えた培養液中で培養を行って、ＥＢＶ関連抗原産生胃癌細胞株ＧＴＣ-4を確立した。
確立したＧＴＣ-4をカバーグラス上に培養し、メタノールあるいはホルマリンで固定し、上皮系・あるいは単核球細胞のマーカーに対する抗体、ＥＢＶ関連抗原に対するモノクローナル抗体で染色した。
その結果ＧＴＣ-4細胞は、上皮系細胞のマーカーである cytokeratin, epithelial membrane antigen （ＥＭＡ）, carcinoembryonic antigen（ＣＥＡ）に対する抗体により染色されたが、単核球細胞のマーカーであるＣＤ45, ＣＤ49, ＣＤ３，Ｍ３Ｆに対する抗体では染色されなかった。これらマーカーの発現よりＧＴＣ-4は上皮系細胞由来であることがわかった。
またＧＴＣ-4細胞は、ＥＢＶ関連抗原ＬＭＰ-1, ＶＣＡ, ＥＢＮＡ-1に対するモノクローナル抗体で強く染色され、ＥＢＶ関連抗原を高率に産生していることが確認された。
【００２８】
更に、細胞をＳＤＳを含むsample buffer に溶解し、10−20％のlinear gradient gel を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後Immunoblottingを行った。その結果、ＧＴＣ-4細胞はＢ95-8, Raji, ＧＴ-39 と比較して、大量のＬＭＰ-1蛋白質を発現することがわかった。
【００２９】
実施例２  ＧＴＣ-4細胞の培養条件の検討
ＧＴＣ-4細胞を、ＲＰＭＩ1640培地・２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地・10％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地で培養した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、細胞増殖は10％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地より、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地の方が増殖が良く、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ1640培地でも増殖が認められた。しかし、増殖の良い２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地では、ＶＣＡ抗原産生量の低下が認められた。ＶＣＡ抗原は10％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地で最も良く産生され、その産生は安定していた。
【００３０】
実施例３  ＧＴＣ-4細胞のヌードマウスへの移植
ヌードマウス（BALB/c/nu/nu）に0.25 mg/mouse のサイクロスポリンを投与し２週間後に４×107 個のＧＴＣ-4細胞を移植した。２ヶ月後には移植部位に腫瘤を認め、４ヶ月後に解剖したところ腹膜に転移巣を認めた。転移した組織を同様にサイクロスポリンを投与した５週齢のヌードマウスに移植したところ、３ヶ月後にリンパ節に腫脹と腫瘤を認めた。
【００３１】
実施例４  ＧＴＣ-4細胞培養上清中ＥＢＶの上皮系細胞への感染
ＧＴＣ-4細胞をＴＰＡ, n-butylateで処理することによりＥＢＶ粒子の産生が認められた。この培養上清を上皮系細胞（ＶＥＲＯ細胞）に接種したところ、４日後に多数の細胞の核内に抗ＶＣＡ抗体で染色される特異的な陽性反応が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＧＴＣ-4細胞をＲＰＭＩ1640培地、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地及び10％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地で培養した時の細胞増殖の結果を示すグラフである。
【図１】
0003907338.tif 000002