(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NRRLに寄託されNRRL  B-21386の受託番号を有するEMCC0122株であるバシラス・スリンジエンシスの組込み体またはその胞子。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載の組込み体またはその胞子と、（ｂ）農薬的に許容される担体とを含む農薬組成物。
【請求項３】
（ａ）請求項１に記載の組込み体またはその胞子と、（ｂ）農薬的に許容される担体とを含む農薬組成物の、有害生物防除に有効な量を、該有害生物にさらすことを含む、有害生物の防除方法。
【請求項４】
有害生物が害虫である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
害虫が鱗翅目に属する請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の組込み体（integrant）の入手方法に関する。本発明はさらに、そのような組込み体またはその胞子、そのような組込み体を含む組成物、およびこれらの組成物を使用して有害生物を防除する方法に関する。
発明の背景
有害生物は、化学農薬または生物農薬を使用して防除することができる。しかしながら、化学農薬は、その活性スペクトルが広いため、益虫や、有害生物の寄生生物および捕食者などの標的でない生物を殺してしまうことがある。また、化学農薬は、動物やヒトに有毒なことが多い。さらに、標的有害生物は、そのような物質に繰返しさらされると、抵抗性を発達させることが多い。
生物農薬は、天然に存在する病原体を利用して、作物に昆虫、真菌および雑草が発生するのを防除する。生物農薬の一例としては、発生した有害生物に有毒な物質を産生する細菌が挙げられる。生物農薬は化学農薬と比べて、一般に、標的でない生物や環境に対する害が全体的に少ない。
最も広く用いられている生物農薬は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）は、天然、特に土壌中や有害生物が豊富にいる環境に広く分布する運動性で桿状のグラム陽性細菌である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）は、胞子形成期に、パラ胞子（parasporal）結晶性封入体を産生し、これが感受性の幼生に摂食されて毒性を示す。その封入体の形状、数および組成は様々であることが可能である。それは、27〜140kDaの範囲のサイズとなりうるδ−内毒素と称される１以上のタンパク質よりなる。δ−内毒素は、一般に、幼生の腸内のプロテアーゼにより、より小さな（トランケート化）毒性ポリペプチドに変換され、中腸の破壊を引き起こし、最終的にその有害生物を死に至らしめる
0003889048.tif 000002
δ−内毒素は、cry（結晶性タンパク質）遺伝子にコードされる。cry遺伝子は、相対的なアミノ酸相向性および農薬的特異性に基づき、６つのクラスおよびいくつかのサブクラスに分類されている。その６つの主要クラスとしては、鱗翅類（チョウ目）特異的（cryI）、鱗翅類および双翅類（ハエ目）特異的（cryII）、甲虫類（コウチュウ目）特異的（cryIII）、双翅類特異的（cryIV）
0003889048.tif 000003
甲虫類および鱗翅類特異的（Tailorら, 1992, Mol. Microbiol. 6:1211-1217ではcryV遺伝子と称されている）、および線虫特異的（Feitelsonら, 1992, Bio/Technology 10:271-275ではcryVおよびcryVI遺伝子と称されている）なものが挙げられる。いくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）結晶性δ−内毒素は、ダニ類）膜翅類、フシラプテラ（Phthiraptera）、扁形動物、同翅類、ゴキブリ亜目および原生動物にも殺生物性であると報告されている。
δ−内毒素は組換えDNA法により製造されている。組換えDNA法により製造されたδ−内毒素は、結晶形態であることもあるし、そうでないこともある。種々のcry遺伝子が、クローニングされ、配列決定され、種々の宿主、例えば大腸菌（E. coli）（Schnepfら, 1987, J. Bacteriol. 169:4110-4118）およびバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）（Shivakumarら, 1986. J. Bacteriol. 166:194-204）中で発現されている。
cry遺伝子の増幅が、バシラス・サブチリス（Bacillus subtllis）中で達成されている。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）HD73のδ−内毒素遺伝子が、組込みプラスミドを使用してバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）中にクローニングされ、増幅されている（Calogeroら, 1989, Appl .Environ. Microbiol. 55:446-453）。しかしながら、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. knrstaki）HD73と比べて、結晶サイズの増加は何ら認められなかった。さらに、農薬活性の相違は何ら報告されていない。
δ−内毒素遺伝子の発現レベルは、使用する宿主細胞によって左右されるようである（Skivakumarら, 1989, Gene 79:21-31）。例えば、Skivakumarらは、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）のcryIAおよびcryIIAのδ−内毒素遺伝子の発現が、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）中とバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）中とで有意に異なることを見出した。cryIA遺伝子は、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）中では多コピーベクター上に存在する場合に発現されたが、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）中では発現されなかった。cryIIA遺伝子は両宿主中で発現されたが、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）中で、より高レベルであった。これらのδ−内毒素遺伝子を発現するバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞の切片を電子顕微鏡で調べたところ、これらの細胞中に大きな両錐形結晶の存在が検出された。しかしながら、これらの結晶が、これらの遺伝子を通常含有しているバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）で見出される結晶より大きいことは何ら示されなかった。これらのδ−内毒素遺伝子を発現するバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞のバイオアッセイの結果は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）と比べて農薬活性が増加しなかったことを示している。それどころか、同じ殺虫効果を得るのに、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）の５倍の濃度を要したのである。
先行技術の方法では、δ−内毒素をコードするDNA配列とDNA複製配列とを保持する組換えDNAベクターで宿主細胞を形質転換する。δ−内毒素の発現は、宿主中での組換えDNAベクターの複製によって左右される。所望のポリペプチドを組換えDNA法により製造するために、δ−内毒素をコードする挿入された遺伝情報を保持する組換えプラスミドベクターで細菌細胞を形質転換する場合には、そのようなプラスミドは、該細胞中で本来安定に受け継がれうるものであったとしても、不安定になることがしばしば認められている。この不安定性は、その細胞中での該プラスミドの不安定な維持の形態を取ることがあり、その結果、該プラスミドが細胞集団から最終的に失われたり、あるいは問題のタンパク質をコードするDNAが該プラスミドから欠失されたりすることがある。前者の問題を解決する古典的な方法は、形質転換細胞を選択圧下、すなわち典型的には、抗生物質の存在下で増殖させるものであるが、これは、その抗生物質に対する耐性を媒介する産物をコードする遺伝子が、該細胞を形質転換するプラスミド上に存在していることにより、問題の細胞が該抗生物質に対して耐性になっていることを利用するものである。しかしながら、このアプローチは、問題の抗生物質が高くつくため、大規模生産では経済的に実施不可能であり、環境的な理由からも望ましくない。また、培地中で抗生物質を使用すると、健康関連省庁などから製造承認を得るのが一層難しくなる。
細胞分裂の際にプラスミドが後代細胞に均等に分配されるのを保証する分配機能をコードするDNA配列をプラスミド中に挿入することにより、プラスミドを安定化することができることが既に示唆されている。クローニングされたDNA配列の安定な遺伝を達成するもう１つの方法は、そのようなDNA配列を宿主細菌のゲノム内に組込むことである。プラスミドベクター上に存在するDNA配列の組込みは、例えばA. Campbell, Advances Genet. 11, 1962, pp.101-145に記載されているいわゆる「交差」法により行なうことができる。この方法では、プラスミドベクターに、該細菌ゲノム上の領域と相同なDNA配列、あるいは、組込まれる異種DNA配列のいずれかの側にある２つの相同配列を配置させる。後続の組換え事象において、該ベクター上の相同配列および隣接配列が宿主ゲノム内に相同領域にて組込まれる。
しかしながら、場合によっては、組込まれたDNA配列が、選択圧の不存在下で細胞から欠失することが判明しており、これは、例えば、該DNAの組換えを引き起こすものと同様のタイプの相同組換え事象により生じる。特に、相同DNA配列間での組換えが、宿主細胞ゲノム内に組込まれたDNA上またはその付近の複製DNAの近傍で刺激されることが既に認められている。Ph. Noirotら, J. Mol. Biol. 196, 1987, pp.3948;およびM. YoungおよびS.D. Ehrlich, J. Bacteriol. 171（5）, 1989年5月, pp.2653-2656を参照されたい。
したがって、本発明の目的は、細菌、特にバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）宿主細胞のゲノムDNA（例えば染色体）内へのDNA配列の安定な組込みを得ることである。本発明のもう１つの目的は、十分な量のδ−内毒素を産生するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株の組込み体を製造することである。そのような組込み体は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の宿主域を広げたり、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）のより効果的な製剤を得たりするのに有用であろう。
発明の概要
本発明は、少なくとも１つの異種結晶性δ−内毒素を産生するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の組込み体の製造法に関する。該組込み体は、
（ａ）宿主バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株の細胞内に、（ｉ）第１複製起点と、該第１複製起点からのプラスミド複製に必要な少なくとも１つの因子をコードする少なくとも１つの機能的遺伝子とを含む第１DNAベクター、ならびに（ii）第２複製起点、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素をコードするDNA配列、該宿主株のゲノムの領域と相同なDNA配列、および選択マーカーを含むが、該第２複製起点からのプラスミド複製に必要な因子をコードする機能的遺伝子を欠く第２DNAベクターを導入し、
（ｂ）該第１DNAベクターの喪失と、相同組換えによる該宿主細胞のゲノム内への該第２DNAベクターの組込みとにつながる選択条件下で、工程（ａ）の細胞を培養することにより製造する。
特定の実施態様では、宿主バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株は、cry-株である。
本発明はさらに、前記組込み体に関する。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素をコードするDNA配列は、異種DNA配列であることが可能である。１つの実施態様では、該組込み体は、異種結晶性δ−内毒素を含むだけでなく、該宿主バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株により内因的に産生されるδ−内毒素である同種結晶性δ−内毒素を含むことも可能である。もう１つの実施態様では、該組込み体は、１個を超える異種バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素を産生することが可能である。もう１つの実施態様では、遺伝子増幅または過剰発現の結果、対応する親株と比べて、より高い農薬活性と、所望により、より大きな結晶サイズとを有する、より多量の結晶性δ−内毒素が産生される。
本発明はまた、そのような組込み体と、農薬的に許容される担体とを含んでなる農薬組成物、およびそのような組成物を使用して有害生物を防除する方法に関する。
定義
本発明で定義する「組込み体」は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株のゲノム内に相同組換えにより挿入された追加的なDNAセグメント（一般には、cry遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、およびプラスミド関連DNA）を含有するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株である。
本発明で定義する「異種DNA配列」は、宿主バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞中に天然には存在しないDNA配列である。
本発明で定義する「ゲノム」は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞中の、染色体およびプラスミドの両方の全DNAである。
本発明で定義する「親株」は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素をコードする異種DNA配列の起源株である。
本発明で定義する「より高い農薬活性」は、有害生物を殺したりその成長を阻害する対有害生物活性が、対応する親株より少なくとも1.25倍高いことを意味する。好ましい実施態様では、該組込み体の農薬活性は、対応する親バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株の農薬活性より約1.5〜約10倍高い。
本発明で定義する「より多量」は、該組込み体が産生する結晶性δ−内毒素の量が、親株が産生する結晶性δ−内毒素の量の少なくとも1.25倍であることを意味する。
本発明で定義する「より大きな結晶サイズ」は、該組込み体の結晶の最大面が、親株の結晶の表面積または体積の少なくとも1.2倍であることを意味する。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドpDN3000の地図を示す。
図２は、プラスミドpE194tsの地図を示す。
図３は、プラスミドpPL1975の地図を示す。
図４は、プラスミドpET235の地図を示す。
図５は、プラスミドpCP115の地図を示す。
発明の詳細な説明
組込み体の入手方法
本発明の組込み体は、「二プラスミド」組込み系により得ることができる。この系は、複製起点と、プラスミド複製に必要な少なくとも１つの因子（例えば、トランスで機能する温度感受性複製タンパク質）をコードする少なくとも１つの機能的遺伝子とを含む第１またはヘルパープラスミド、および該ヘルパープラスミドの不存在下では複製不可能な第２ベクターまたは組込みプラスミドに基づくものである。本発明の組込みプラスミドは、（ｉ）cry遺伝子、（ii）宿主ゲノムと相同な領域（例えば、16SrRNA遺伝子またはホスホリパーゼC遺伝子またはcry遺伝子自体）、および（iii）選択マーカーを含む。第１プラスミドは、該ヘルパープラスミドがコードするものとは異なる選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）をコードするDNA配列を含むことも可能である。該ヘルパープラスミドは、該組込みプラスミドの前またはそれと同時に加えることが可能である。
特定の実施態様では、該ヘルパープラスミドを所望の宿主中にエレクトロポレーションにより導入し、該温度感受性Repタンパク質の適切な機能発現を許容する温度（例えば、30℃）で選択剤（例えば、エリスロマイシンなどの抗生物質）の添加により維持する。そのような宿主には、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）、バシラス・スリンジエンシス亜種ガレリアエ（Bacillus thuringiensis subsp. ganeriae）、バシラス・スリンジエンシス亜種エントモシダス（Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus）、バシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis）、バシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種アレスチ（Bacillus thuringiensis subsp. alesti）、バシラス・スリンジエンシス亜種カナデイエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ダームスタデイエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. damstadiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種デンドロリムス（Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus）、バシラス・スリンジエンシス亜種フイニチムス（Bacillus thuringiensis subsp. finitimus）、バシラス・スリンジエンシス亜種ケニアエ（Bacillus thuringiensis subsp. kenyae）、バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ（Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni）、バシラス・スリンジエンシス亜種スブトキシクス（Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ（Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ（Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi）、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンディチェリエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シャンドジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ソット（Bacillus thuringiensis subsp. sotto）、バシラス・スリンジエンシス亜種ニジェリアエ（Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae）、バシラス・スリンジエンシス亜種ユンナネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ダコタ（Bacillus thuringiensis subsp. dakota）、バシラス・スリンジエンシス亜種インディアナ（Bacillus thuringiensis subsp. indiana）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウホクエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種クマモトエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種トチギエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種トンプソニ（Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni）、バシラス・スリンジエンシス亜種ウハネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種キュウシュウエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種オストリニアエ（Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae）、バシラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ（Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi）、バシラス・スリンジエンシス亜種パキスタニ（Bacillus thuringiensis subsp. pakistani）、バシラス・スリンジエンシス亜種ジャボネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. japonensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種コルメリ（Bacillus thuringiensis subsp. colmeri）、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンディチェリエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シャンドンジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ネオレオネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種コレアネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シロ（Bacillus thuringiensis subsp. silo）、バシラス・スリンジエンシス亜種メキシカネンシス（Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis）およびバシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ついで、機能的複製タンパク質（例えば、Repタンパク質）を欠く組込みプラスミドを、同じ宿主株中に導入し、選択剤（例えば、クロラムフェニコール）での選択により維持する。該組込みプラスミドはヘルパープラスミドなしでは存在しえないため、両プラスミドを維持するためには、クロラムフェニコール単独での選択で十分である。より高温（例えば、37℃）で増殖させると、該ヘルパープラスミドは複製不可能になる。該ヘルパープラスミドの不存在下では、クロラムフェニコール耐性をコードする組込みプラスミドも複製不可能である。したがって、宿主細胞がクロラムフェニコールに対する耐性を維持しうる唯一の方法は、該組込みプラスミドが、それがバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）ゲノムと共有する相同領域でキャンベル組換え事象により組込まれることによるものである。その結果、該DNAが、該宿主株のゲノム内に組込まれる。特定の実施態様では、該宿主株はcry-株である。最も具体的な実施態様では、該宿主株は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）株である。
δ−内毒素をコードするDNA配列は、cryI、cryII、cryIII、cryIV、cryV、またはcryVI遺伝子（これらに限定されるものではない）を含む群から選択することができる。１つの実施態様では、δ−内毒素をコードするDNA配列は、cryIC遺伝子を含む。cryIC遺伝子は、鱗翅目の有害生物に特異的なδ−内毒素をコードする。cryIC遺伝子を含むDNA配列は、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）株から得ることができる。最も具体的な実施態様では、cryIC DNA配列は、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）株EMCC0087から得る。
プラスミドは、当該技術分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション、細胞のプロトプラスト化、トランスダクション、化学的形質変換および再生により、宿主バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株中に導入することができる（MacalusoおよびMettus, 1991, J. Bacteriol. 173:1353-1356;Crawfordら, 1987, J. Bacteriol. 169:5423-5428;およびBattistiら, 1985, J. Bacteriol. 162:543-550）。適当な温度（例えば、37℃以上）および抗生物質圧での同時増殖により、宿主細胞のゲノムの相同領域との組換えによる宿主細胞ゲノム内へのプラスミドの組込みに関して選択される。組込まれたDNAコンストラクトをゲノム内に保持する細胞を、選択マーカーに関して選択する選択剤の含有量を増加させてゆく培地（例えば、抗生物質を含有する培地）中で増殖させる。それにより、選択マーカー、および必然的にcry遺伝子も増幅されることになる（AlbertiniおよびGalizzi, 1985, J. Bacteriol. 162:1203-1211）。
好ましい実施態様では、δ−内毒素をコードするDNAを、該組込み体内で増幅する。特定の実施態様では、そのような増幅は、選択マーカーに関して選択する、より多量の選択剤を含む培地へ該組込み体を導入することにより行なう。この工程は、選択マーカーに関して選択する選択剤を増量させながら、数回繰り返すことができる。
本発明の組込み体は、当該技術分野で公知の培地および発酵技術を用いて培養することができる（例えば、Rogoffら, 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129;Dulmageら, 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358:Dulmageら, Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges（編）, Academic Press, New York, 1980を参照されたい）。発酵サイクルが完了したら、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）結晶性δ−内毒素および胞子を、当該技術分野でよく知られている手段（例えば、遠心分離）により発酵ブロスから収穫することができる。
本発明の組込み株により産生された胞子およびδ−内毒素の精製は、限外濾過、分画抽出、密度勾配遠心分離、クロマトグラフィー、またはタンパク質および／または粒子の精製のための他の技術（これらに限定されるものではない）を含む当該技術分野で公知の種々の方法により行なうことができる。
本発明の組込み株の結晶性δ−内毒素または胞子の、種々の有害生物に対する活性は、人工昆虫飼料への混合、人工飼料への重層、葉への塗布、葉の浸漬、葉面散布、水生（aquatic）アッセイなどの当該技術分野で公知の方法によりバイオアッセイすることができる。
組成物
本発明の組込み体バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株、結晶性δ−内毒素および／または胞子は、農薬組成物、すなわち例えば、懸濁剤、分散液、水性乳濁液、散粉剤（dusting powder）、分散性粉剤、乳剤、エーロゾル、微粒子またはマイクロカプセル化顆粒、あるいはバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の徐放性を与える他の任意の製剤に製剤化することができる。そのような組成物は、界面活性剤、例えば、分散剤、乳化剤もしくは湿潤剤、または不活性担体、あるいは取り扱いおよび特定の標的有害生物への適用を容易にする他の成分を加えることにより得ることができる。
適当な界面活性剤には、アニオン化合物、例えばカルボキシラート（例えば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシラート）;N−アシルサルコシナート;脂肪族アルコールエトキシラートとリン酸とのモノまたはジ−エステルまたはそのようなエステルの塩;脂肪族アルコールスルファート、例えばドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸チトリウムまたはセチル硫酸ナトリウム;エトキシ化脂肪族アルコールスルファート;エトキシ化アルキルフェノールスルファート;リグニンスルホナート;石油スルホナート;アルキルアリールスルホナート、例えばアルキル−ベンゼンスルホナートまたは低級アルキルナフタレンスルホナート、例えばブチル−ナフタレンスルホナート;塩またはスルホン化ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物、またはポリアクリル酸の塩;スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩;またはより複雑なスルホナート、例えばアミドスルホナート、例えばオレイン酸とＮ−メチルタウリンとのスルホン化縮合生成物、またはジアルキルスルホスクシナート、例えばスルホン酸ナトリウムまたはコハク酸ジオクチルが含まれる。非イオン界面活性剤には、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アミドまたは脂肪族アルキル−もしくはアルケニル−置換フェノールとエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドとの縮合生成物、多価アルコールエーテルの脂肪酸エステル、例えばソルビタン脂肪酸エステル、そのようなエステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロック共重合体、アセチレングリコール、例えば2,4,7,9−テトラエチル−5−デシン−4,7−ジオール、またはエトキシ化アセチレングリコールが含まれる。カチオン界面活性剤には、例えば、脂肪族モノ−、ジ−またはポリアミン（アセタート、ナフテナートまたはオレアートとして）;酸素含有アミン、例えばポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシド;カルボン酸とジ−またはポリアミンとの縮合により製造されるアミド結合アミン;または第四級アンモニウム塩が含まれる。
不活性物質には、例えば、フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩などの無機物質;糖、デンプン、シクロデキストリンなどの有機物質;またはトウモロコシ穂軸の粉末、もみ殻、落花生殻、クルミ殻、トウモロコシ粉、ペレット化穀粒、およびセルロース繊維などの植物物質が含まれる。
本発明の組成物は、直接施用に適した形態であってもよいし、施用前に適量の水または他の希釈剤による希釈を要する濃縮物または一次組成物であってもよい。農薬成分の濃度は、個々の製剤の性質、特に、ぞれが濃縮物であるか直接使用できるかよって異なる。該組成物は、0.1％〜99％、好ましくは0.1％〜95％の本発明の組込み体、突然変異体または変異体、１〜98％の固体または液体の不活性担体、および０〜50％、好ましくは0.1〜50％の界面活性剤を含有する。これらの組成物は、乾燥形態では１エーカー当たり約0.01lb〜5.0lb、液体形態では１エーカー当たり約0.01pt〜10ptで投与する。
さらに別の実施態様では、本発明の組込み体を製剤化前に処理して、該細胞を標的有害生物の環境に施用した際の農薬活性を持続させるようにすることができる。そのような処理は、該組成物の特性に悪影響を及ぼさない限り、化学的および／または物理的手段により行うことができる。化学試薬には、例えば、ハロゲン化剤;アルデヒド、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド;抗感染薬、例えば塩化ゼフィラン（zephiran chloride）;アルコール、例えばイソプロパノール、エタノール;組織学的固定液、例えばブアン（Bouin′s）固定液、ヘリー（Helly′s）固定液（例えば、Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co., 1967を参照されたい）;保存剤;UVサンスクリーン;噴霧補助剤（保湿剤）;泡止め剤;および固着剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、例えば、有害生物が植物上に出現し始めた時点で、あるいは防護手段として有害生物の出現前に、噴霧または散粉により植物に直接施用することができる。本発明の範囲内の防護すべき植物には、穀類（小麦、大麦、ライ麦、エンバク、イネ、モロコシ類および関連作物）、ビート（テンサイおよび飼料ビート）、石果、ナシ状果、小果樹類（リンゴ、セイヨウナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクラ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー、トマト）、マメ科植物（インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、油料植物（アブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマ、カカオマメ、ラッカセイ）、キュウリ類（キュウリ、ペポカボチャ（marrows）、メロン）、繊維植物（木綿、アマ、アサ、ジュート）、柑橘果樹類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）、野菜（ホウレンゾウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよび他のアブラナ属の植物、ニンジン、タマネギ、ジャガイモ、パプリカ）、クスノキ科植物（アボガド、セイロンニッケイ、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ、イチイ、オーク、ハンノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マツ）、またはトウモロコシ、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナなどの植物、天然ゴム植物、および鑑賞植物が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい施用方法は、葉面散布である。植物の成長の初期段階は該植物が最も著しく被害を受け得る時であるため、植物の成長の初期段階で有効な有害生物防除を行うことが一般に重要である。必要と考えられる場合には、散布液または粉剤に別の殺虫剤または農薬（例えば、殺真菌剤、除草剤または肥料）を含有させるのが便利なこともある。好ましい実施態様では、本発明の組成物は、植物に直接施用される。
本発明の組成物は、鱗翅目、例えばアクロイア・グリセラ（Achroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、アラバマ・アルジラセア（Alabama argillacea）、アルソフイラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンセラエ・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルキプス種（Archips sp.）、アルジロタエニア種（Argyrotaenia sp.）、アセチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ブカラトリクス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ種（Choristoneura sp.）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes）、コリアス・ユリセメ（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シジア・ラチフェレアヌス（Cydia latiferreanus）、シジア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリクス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フネラリス（Desmia funeralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エンノモス・スブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、チャマダラメイガ（Ephestia elutella）、エラニス・チリアリア（Erannis tiliaria）、エスチグメネ・アクレ（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポコエリア・アンビグエァ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、ユープロクチス・クリソロェ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーキソア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘミレウカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムデイナ・フィスセラリア・フィスセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ラムディナ・フィスセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・シルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソマ種（Malacosoma sp.）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンジュカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、ナミスジフユナミシャク（Operophtera bmata）、オルギア種（Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ・ベ��ナタ（Paleacrita veraata）、パピリオ・クレスフォンテス（Papilio cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia califoraica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（pieris napi）、ピエリス・ラパエ（pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルジュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロディア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、コナガ（Plutella xylostella）、ポンチア・プロトディセ（Pontia protodice）、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、スポドプテラ種（Spodoptera sp.）、シングラファ・ファルシフェラ（Syngrapha falcifera）、サウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ビスセリエラ（Tineola bisselliella）、トリチョプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアリス（Xylomyges curialis）、イボノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）などの有害生物に対して有効と考えられる。また、本発明の組成物はコウチュウ目、例えばレプチノタルサ種（Leptinotarsa sp.）、インゲンマメゾウムシ（Acanthoscelides obtectus）、アズキゾウムシ（Callosobruchus chinensis）、エピラチナ・バリベスチス（Epilachna varivestis）、ピルハルタ・ルテオラ（Pyrrhalta luteola）、アリモドキゾウムシ（Cylasformicarius elegantulus）、リストロノツス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィルス種（Sitophilus sp.）、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロセファラ・イマクラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチルス・スブスピノサス（Macrodactylus subspinosus）、ポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）、リゾトログス・マジャリス（Rhizotrogus majalis）、ガイマイゴミムシダマシ（Alphitobius diaperinus）、ヒメコクヌストモドキ（Palorus ratzeburgi）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）、コメノゴミムシダマシ（Tenebrio obscurus）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）、ヒラタコクヌスモドキ（Tribolium confusum）、トリボリウス・デストラクター（Tribolius destructor）;双翅目、例えばアエデス種（Aedes sp.）、アンデス・ビッタツス（Andes vittatus）、アナストレファ・ルーデンス（Anastrepha ludens）、アナストレファ・サスペンサ（Anastrepha suspensa）、アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフェレス・クアドリマクラツス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミゲレス・スバルバツス（Armigeres subalbatus）、カリフォラ・スチジアン（Calliphora stygian）、カリフォラ・ビシナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタタ（Ceratitis capitata）、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）、クリソミア・ルフィファシェス（Chrysomya rufifacies）、コクリオミイア・マセラリア（Cochliomyia macellaria）、キュレックス種（Culex sp.）、キュリセタ・イノルナタ（Culiseta inornata）、ダキュス・オレアエ（Dacus oleae）、タマネギバエ（Delia antiqua）、タネバエ（Delia platura）、��リア・ラディキュム（Delia radicum）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ユーペオデス・コロラェ（Eupeodes corollae）、グロシナ・オーステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブレビパルピス（Glossina brevipalpis）、グリシナ・フシペス（Glossina fuscipes）、グロシナ・モルシタンス・セントラリス（Glossina morsitans centralis）、グロシナ・モルシタンス・モルシタンス（Glossina morsitans morsitans）、グロシナ・モリスタンス・スブモルシタンス（Glossina morsitans submorsitans）、グロシナ・パリディペス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパリス・ガンピエンシス（Glossina palpalis gambiensis）、グロシナ・パルパリス・パルパリス（Glossina palpalis palpalis）、グロシナ・タチノイデス（Glossina tachinoides）、ハエマゴグス・エクイヌス（Haemagogus equinus）、ハエマトビア・イリタンス（Haematobia irritans）、ヒポデルマ・ボビス（Hypoderma bovis）、ヒポデルマ・リネアツム（Hypoderma lineatum）、リューコピス・ニナエ（Leucopis ninae）、ルシリア・キュブリナ（Lucilia cuprina）、ルシリア・セリカタ（Lucilia sericata）、ルツオミイア・ロングルパイピス（Lutzomyia longlpaipis）、ルツオミイア・シャンノニ（Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mali）、メイエチオラ・デストラクター（Mayetiola destructor）、ムスカ・アウツムナーリス（Musca autumnalis）、イエバエ（Musca domestica）、ネオベリエリア種（Neobellieria sp.）、ネフロトマ・スツラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・アエネセンス（Ophyra aenescens）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia sericata）、フレボトムス種（Phlebotomus sp.）、フォルミア・レジナ（Phormia regina）、サベセス・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルコファガ・ブラタ（Sarcophaga bullata）、スカトファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercoraria）、ストマキシス・カルシトランス（Stomaxys calcitrans）、トクソルヒンチテス・アンボイネンシス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・バンブサ（Tripteroides bambusa）;ダニ目（Acari）、例えばオリゴニクス・プラテンシス（Oligonychus pratensis）、リンゴハダニ（Panonychus ulmi）、ナミハダニ（Tetranychus urticae）;膜翅目、例えばイリドミルメックス・フミリス（Iridomyrmex humilis）、ソレノプシス・インビクタ（Solenopsis invicta）;シロアリ目、例えばレチクリテルメス・ヘスペルス（Reticulitermes hesperus）、レチクリテルメス・フラビペス（Reticulitermes flavipes）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・アングスチコリス（Zootermopsis angusticollis）、ネオテルメス・コンネクサス（Neotermes connexus）、インシシテルメス・ミノル（Incisitermes minor）、インシシテルメス・イミグランス（Incisitermes immigrans）;ノミ目（Siphonaptera）、例えばセラトフィルス・ガリナエ（Ceratophyllus gallinae）、セラトフィルス・ニガー（Ceratophyllus niger）、ノソプシルス・ファスシアツス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトプシラ・セグニス（Leptopsylla segnis）、クテノセファリデス・カニス（Ctenocephalides canis）、クテノセファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）、エチクノファガ・ガリナセア（Echicnophaga gallinacea）、プレックス・イリタンス（Pulex irritans）キセノプシラ・チェオピス（Xenopsylla cheopis）、キセノプシラ・ベクサビリス（Xenopsylla  vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tunga penetrans）;およびハリセンチュウ（Tylenchida）目、例えばサツマイモネコブ��ンチュウ（Melodidogyne incognita）、キタネグサレセンチュウ（Pratylenchus penetrans）などの害虫に対して有効と考えられる。
以下に記載する実施例は例示にすぎず、限定的なものではない。
実施例
実施例１:細菌株およびプラスミド
バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087は、NRRLに寄託されており、受託番号NRRL B-21147が付与されている。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D7および4D9（cry-HD-1）は、オハイオ州立大学のBacillus Genetic Stock Centerから入手する。大腸菌（Escherichia. coli）GM48 dam-dcm-は、Yanish-Perronら, 1985, Gene 33:103-119に開示されている。大腸菌（E. coli）GM272（Raleighら, 1988, Nucl. Acids Res. 16:1563-1575;dam-dcm-hsd-）は、New England Biolabsから入手する。プラスミドpBR322は、市販元を通じて入手することができる。プラスミドpMI1101Dは、Youngmanら, 1984, Plasmid 12:1-9に開示されている。プラスミドpE194tsは図２に示しており、また、Villafaneら, 1987, J. Bact. 169:4822-4829にも開示されている。プラスミドpCP115は、PriceおよびDoi, 1985, Mol. Gen. Genet. 201:88-95に開示されており、図５に示している。
プラスミドpPL1975は、図３に示している。以下の方法を用いて、pPL1975を構築する。pUC19（Yanisch-Perronら, 1985, Gene 33:103-119）をEcoRIで制限酵素処理し、該線状化pUC19中に以下のオリゴヌクレオチド配列（BeaucageおよびCaruthers, 1981, Tetrehedron Let. 22:1859-1869に記載されているホスホアミジット法により自動DNAシンセサイザー上で調製したもの）（配列番号１および２）を挿入し、ついで連結することにより、プラスミドpDN3000を構築する。
0003889048.tif 000004
ついで該連結混合物を使用して、コンピテント大腸菌（E. coli）SJ6細胞を形質転換し、形質転換体を、100ug/mlアンピシリンを含有するLBプレート上で選択する。pDN3000中に挿入されたリンカーの配向は、図１における制限部位の配向により示されるとおりである。
プラスミドpPL1975は、pE195tsから、１〜1585位のDNAを含有するMboI制限断片を、pDN3000のBglI部位中に挿入することにより構築する。ついで該連結混合物を使用して、コンピテント大腸菌（E. coli）SJ6細胞を形質転換し、形質転換体を、100ug/mlアンピシリンを含有するLBプレート上で選択する。これらの２つの断片の配向は、図３に示すとおりである。したがって、pPL1975は、大腸菌（E. coli）複製起点と、無傷のプラス起点（+ori pE194ts）およびトランケート化repF遺伝子（repF′）（Villafaneら, 1987, J. Bact. 169:4822-4829）を含むpE194ts DNA断片とを含有している。
実施例２:ゲノムDNAの調製
バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087からのゲノムDNAを、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）コロニーを15×1.5cmのねじ蓋式試験管中の2ml LBプレート（Luria-Bertaniブロス）に接種することにより調製する。振
とうすることなく37℃で一晩インキュベートした後、試験管中の全内容物を、250ml LBを含有する１Lフラスコに移し、300rpmで振とうしながら37℃で６時間増殖させる。フラスコ内容物を、GSAローター中、8000rpmで収穫し、得られたペレットを、25ml Corex遠心管中の20ml TE緩衝液（10mM Tris, pH7.9、１mM EDTA）に再懸濁する。約20mgの固体リゾチームを加え、該管内容物を、穏やかに反転させることにより混合する。37℃で10分間のインキュベーションの後、１mlの0.5M EDTAおよび0.5mlの２M Tris（pH7.9）を加える。該管内容物を、再び、穏やかに反転させることにより混合し、さらに1.5分間インキュベートする。ついで、200μl RNアーゼA（10mg/ml）を加え、ついで37℃で15分間インキュベートし、2.3mlの10％SDSを加える。プロテイナーゼK（２mg）を加え、該管内容物を50℃で２時間インキュベートし、２本のCorex管中に分割し、フェノーレで少なくとも２回、フェノール／クロロホルムで２回抽出する。ゲノムDNAを1／10倍容量の酢酸ナトリウムおよび2.5倍容量95％エタノールで沈殿させ、約５mlのTE緩衝液で再懸濁させる。
実施例３:プラスミドpET235の構築
バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087 DNA断片のサイズ選択（size-selected）ライブラリーを、EcoRIでのゲノムDNAの消化、ゲル電気泳動、６kb以上の断片の切り出し、および電気溶出によるアガロースからの遊離により作製する。該断片をpBR322のEcoRI部位中に連結し、大腸菌（E. coli）株XL-1ブルーMRF′（Stratagene Cloning Systems;Jerpsethら, 1992, Strategies 5[3]:81）中に形質転換した後、cryIC遺伝子を保持する８kbのEcoRI断片を、既に記載されているとおりに（Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY）、コロニーブロットハイブリダイゼーションによりクローニングする。この時、5′末端に４つのヌクレオチド（CGGG）を加えながらcryIC遺伝子のヌクレオチド869〜1175に対応するDNA断片でプローブして
0003889048.tif 000005
機能的BamHI部位を作製する。このプローブは、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087ゲノムDNAのPCR増幅により得、これを配列番号３として以下に示す。
0003889048.tif 000006
バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D7のホスホリパーゼC（plc）遺伝子を、BamHI部位を含有するプライマーを使用してPCR増幅する。これらのプイマーを以下に示す。
0003889048.tif 000007
増幅された断片をBamHIで消化し、pCP115のBamHI部位中に挿入する。ついで、plc遺伝子の3′側半分を含有する850bpのEcoRI-BamHI断片を、PL1975のEcoRI部位とBamHI部位との間に挿入する。cryIC遺伝子を保持する８kbのEcoRI断片をpNNB11のEcoRI部位中に挿入することにより、プラスミドpET231を構築する。catを保持する、pMI1101Dの1.5kbのBamHI断片を、pET231のBamHI部位中に挿入することにより、プラスミドpET235（図１を参照されたい）を構築する。
実施例４:プラスミドpET235の組込みおよび増幅
Bio-Rad Gene Pulserを製造業者の説明に従い使用して、大腸菌（E. coli）細胞にエレクトロポレーションする。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D9細胞を、MacalusoおよびMettusの方法（1991, J. Bacteriol. 173:1353-1356）によりエレクトロポレーションするために調製する。ただし、彼らの方法とは異なり、Gene Pulserには電気的な修飾を何ら施さず、その代わりに、細胞を0.2cmキュベット中に入れ、800オーム、25uFおよび1600ボルト（8000ボルト/cm）でエレクトロポレーションする。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の形質転換に関して、GM48（dam-dcm-）から調製されたプラスミドDNAより高い効率を一般に与える、エレクトロポレーション用のプラスミドDNAを、大腸菌（E. coli）GM272（dam-dcm-hsd-）中で調製する。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D9をpE194tsで形質転換し、１ml当たり5μgのエリスロマイシンを含有するLBプレート上でコロニーを選択する。ヘルパープラスミドpE194tsを保持するバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D9をpET235で形質転換し、１ml当たり10μgのクロラムフェニコールを含有するLBプレート上でコロニーを選択する。該形質転換体を37℃でインキュベートして、該形質転換体からpE194tsを除去することにより、組込み体を形成させる。エリスロマイシン感受性コロニーを、30および60μg/mlのクロラムフェニコール濃度で順次プレーティングする。前記のとおり位相差光学顕微鏡により測定した結晶サイズに基づき、組込み体EMCC0122を選択する。
実施例５:バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thurigiensis subsp. kurstaki）4D9 cryIC組込み体EMCC0122の結晶サイズの測定
結晶の測定は、胞子／結晶調製物をZeiss Axioscopeで写真撮影し、ついで約2000倍の最終倍率でネガを焼きつけることにより行なう。該結晶を定規でミリメートル単位で測定し、ついで各写真中の胞子の平均長に対して正規化して、写真の引き伸ばしの際の相違を補償する。成熟内生胞子の最長径が約１μmだとすると、該結晶は、表１に示す寸法を有する。
結果を以下の表１に示す。
0003889048.tif 000008
実施例６:バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thurigiensis subsp. kurstaki）4D9 cryIC組込み体EMCC0122の培養
−80℃で保存された40％グリセロールストックとして維持したバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）4D9 cryIC組込み体EMCC0122の継代培養を使用して、以下の組成を有する50mlのP/Y培地を含有する250mlの邪魔板振とう（baffled shake）フラスコに接種する。
クエン酸                        1.0g/l
KH2PO4                          1.3g/l
CaCl2・H2O                      0.33g/l
MgSO4・7H2O                       0.67g/l
マルトリン（Maltrin-100）         20g/l
酵母エキス                      10g/l
ペプトン                        15.3g/l
微量金属                        0.3ml/l
培地のpHは、10N NaOHを使用して7.0に調整する。
接種後、250rpmで72時間振とうしながら、振とうフラスコをロータリーシェーカー上30℃でイノキュレートする。培養１ml当たり10mgのソルビン酸カリウム、３mgの安息香酸ナトリウムおよび0.5mgのメチルパラベンを加えることにより、全培養を安定化させ、30％H3PO4でpH4.5に調整し、５℃で保存する。
実施例７:バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thurigiensis subsp. kurstaki）4D9 cryIC組込み体EMCC0122からの結晶性δ−内毒素の、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対するバイオアッセイ
３齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫を用いる飼料混入バイオアッセイにより、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）cryIC組込み体EMCC0122の効力を測定する。
実施例６からのバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）組込み体EMCC0122の全ブロスを系列希釈して、効力の範囲を明らかにする。また、実施例６に記載のとおりに培養したバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087を、参考標準として使用する。
水、寒天、糖、カゼイン、小麦胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、あまに油、セルロース、塩およびビタミンよりなる標準人工飼料を、20Lのやかん中で調製する。これにより、７つの異なる試験物質濃度を有する10〜12個のサンプルを試験するのに十分な飼料が得られる。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）組込み体EMCC0122の全ブロス調製物を系列希釈して、16mlのアリコートを得る。各アリコートを184gの溶融飼料に加える。次に該混合物をホモジナイズし、ついで40個のウェルを有するプラスチックトレーに注ぐ。各飼料バッチについて３個の対照トレーを調製する。該飼料が冷えて固化したら、３齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫１匹を各ウェルに加え、該トレーを透明なマイラーの多孔シートで覆う。該トレーを棚上に置き、28℃、相対湿度65％で４日間インキュベートする。
４日後、昆虫の死亡率を評価する。各トレーが載るテーブルの上面板を鋭く強打し、動かない幼虫は死亡しているとみなす。死亡率（％）を算出し、該データを平行プロビット分析により分析する。LC50値、LC90値、回帰直線の勾配、変動係数（CV）、およびスポドプテラ単位（Spodoptera Units）（SU）単位の効力を求める。サンプルは、最低３回、あるいは各サンプルの算出平均の20％以内に３つの効力が収まるようになるまで実験に付す。
結果を以下の表２に示す。EMCC0122の効力は、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）EMCC0087の効力の約２倍である。
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微生物の寄託
バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の以下の株は、Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory（NRRL）（1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA）に寄託されている。
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これらの株は、本特許出願の係属中は、該培養を入手する権利を有すると特許商標庁長官が認めた者でなければ該培養を入手できないことを米国特許法施行規則第1.14条および米国特許法第122条に基づき保証されることを条件として、寄託されている。該寄託は、各寄託株が実質的に純粋な培養であることを表すものである。該寄託物は、本出願またはその子出願の対応出願が出願されている国の国内特許法の規定に従い入手することができる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により付与された特許権の信用を失わせるように本発明を実施することを許可するものではないと理解されるべきである。
さらに、本培養寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従い、保管され、公に入手可能となる。すなわち、それは、それを汚染させることなく生存させておくために必要なあらゆる注意を払いつつ、該寄託物の試料の分譲に係る最新の請求後少なくとも５年間、そしていかなる場合にも、寄託の日後少なくとも30年間または該培養を開示する発行されうるいずれかの特許の存続期間の間は保管される。試料の分譲の請求があった場合であっても寄託物の状態により受託機関が試料を分譲できない場合には、寄託者は寄託物を交換する義務があることを承認する。本培養寄託物の、公に対する入手可能性のあらゆる制限は、それを開示する特許の付与に際して、取り消し不可能に解除される。
本明細書に開示している特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を例示するものであるため、本明細書に記載し特許請求している発明の範囲は、これらの実施態様により限定されるものではない。等価な実施態様はいずれも、本発明の範囲内にあると意図される。実際、本明細書に示し記載しているものに加え、本発明の種々の修飾が、これまでの記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も、添付する請求の範囲の範囲内にあると意図される。
本明細書中には種々の参照文献が引用されているが、それらの開示の全体を参考として本明細書に組み入れることとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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