(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも７５の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードしている単離、濃縮または精製された核酸分子であって、前記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の全長タンパク質のシグナリング活性またはキナーゼ活性を有することを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子がヒト核酸である請求項第１項に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記分子が配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸をコードしている請求項第１項に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記分子が配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１００の連続したアミノ酸をコードしている請求項第１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記分子が配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも２００の連続したアミノ酸をコードしている請求項第１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記分子が配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも３００の連続したアミノ酸をコードしている請求項第１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項第１項−第６項のいずれかに記載の核酸を検出するための核酸プローブであって、前記核酸に相補的な少なくとも３６の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とするプローブ。
【請求項８】
請求項第１項−第６項のいずれかに記載の核酸分子、および宿主細胞内で転写を開始させるのに有効なプロモーターを含むベクター。
【請求項９】
配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも７５の連続したアミノ酸を含む、単離、濃縮または精製されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の全長タンパク質のシグナリング活性またはキナーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１０】
細胞内で機能的な転写領域、請求項第９項に記載のポリペプチドをコードしているＲＮＡ配列に相補的な配列、および細胞内で機能的な転写終止領域を含む組換え核酸分子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含む請求項第９項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む請求項第９項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１５０の連続したアミノ酸を含む請求項第９項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも２００の連続したアミノ酸を含む請求項第９項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも３００の連続したアミノ酸を含む請求項第９項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第９項または第１１項−第１５項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第９項または第１１項−第１５項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列のものである請求項第９項または第１１項−第１５項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列のものである請求項第９項または第１１項−第１５項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドに特異的結合親和性を有する抗体であって、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも７５の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする抗体。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含む請求項第２０項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む請求項第２０項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１５０の連続したアミノ酸を含む請求項第２０項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも２００の連続したアミノ酸を含む請求項第２０項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列の少なくとも２５０の連続したアミノ酸を含む請求項第２０項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第２０項−第２５項のいずれかに記載の抗体。
【請求項２７】
前記ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第２０項−第２５項のいずれかに記載の抗体。
【請求項２８】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列のものである請求項第２０項−第２５項のいずれかに記載の抗体。
【請求項２９】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列のものである請求項第２０項−第２５項のいずれかに記載の抗体。
【請求項３０】
請求項第２０項−第２９項のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第３０項に記載のハイブリドーマ。
【請求項３２】
前記ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第３０項に記載のハイブリドーマ。
【請求項３３】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：３に示されるアミノ酸配列のものである請求項第３０項に記載のハイブリドーマ。
【請求項３４】
前記連続したアミノ酸が配列ＩＤ番号：４に示されるアミノ酸配列のものである請求項第３０項に記載のハイブリドーマ。
【請求項３５】
請求項第７項に記載の核酸プローブを含む、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するための組成物。
【請求項３６】
配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のポリペプチドをコードする核酸を検出するためのキットであって、請求項第７項に記載の核酸プローブが中に入っている少なくとも１つの容器を含むキット。
【請求項３７】
請求項第２０項−第２９項のいずれかに記載の抗体を含む、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のポリペプチドを検出するための組成物。
【請求項３８】
配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のポリペプチドの存在を検出するためのキットであって，（ｉ）請求項第２０項−第２９項のいずれかに記載の抗体を含む第１の容器、および（ｉｉ）抗体の結合相手および標識からなる複合体を含む第２の容器を含むことを特徴とするキット。
【請求項３９】
請求項第９項に記載のポリペプチドに結合しうる化合物を検出する方法であって，化合物を前記ポリペプチドとともにインキュベートし、そして前記ポリペプチドに結合した化合物の存在を検出する、の各工程を含む方法。
【請求項４０】
配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のポリペプチドの作動薬または拮抗薬としての活性について化合物をアッセイする方法であって、請求項９記載のポリペプチドを化合物の存在下でインキュベートし、そして、前記ポリペプチドの活性のレベルの変化を検出する、の各工程を含む方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが細胞内にある、請求項第４０項に記載の方法。
【請求項４２】
前記活性が基質分子のリン酸化である、請求項第４０項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項第８項に記載のベクターを含む形質転換した細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はオーロラ（ＡＵＲＯＲＡ）１およびオーロラ２（”ＡＵＲ−１およびＡＵＲ−２”）と称される新規タンパク質、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２をコードしているヌクレオチド配列、ならびに種々のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２関連疾患および病態の診断および処置に有用な種々の生成物および方法に関している。
背景技術
発明の背景に関する以下の説明は、本発明の理解を手助けするために提供されているものであり、本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
細胞シグナル伝達は基本の機構であり、それにより、多様な細胞過程を制御する外部刺激が細胞の内部へ中継される。シグナル伝達の重要な生化学的機構の一つにタンパク質の可逆的リン酸化が含まれており、それはタンパク質の構造および機能を変化させることにより成熟タンパク質の活性の制御を可能にしている。
真核生物において最もよく特徴付けられたプロテインキナーゼはタンパク質のセリン、スレオニンおよびチロシン残基のアルコール基をリン酸化する。これらのキナーゼは、セリンおよびスレオニンを特異的にリン酸化するもの、およびチロシンを特異的にリン酸化するものの二つの群に大きく分けることができる。”二重特異性”キナーゼと称されているいくつかのキナーゼはチロシンならびにセリン／スレオニン残基をリン酸化することができる。
プロテインキナーゼは細胞内のそれらの位置によっても特徴付けることができる。いくつかのキナーゼはリガンドの結合のような外部環境に応答してそれらの触媒活性を直接的に変化できるトランスメンブラン受容体型タンパク質である。他のものはトランスメンブランドメインを欠く非受容体型タンパク質である。これらは細胞膜の内部表面から核までの種々の細胞区画に見いだすことができる。
多くのキナーゼは制御カスケードに関係しており、そのカスケードではそれらの基質にはその活性がリン酸化状態により制御されている他のキナーゼが含まれるであろ。最終的に、いくつかの下流エフェクターの活性はそのような経路の活性化により生じるリン酸化により調節されている。
セリン／スレオニンキナーゼファミリーは、細胞増殖、移動、ホルモンの分化および分泌、改変遺伝子発現により生じる転写因子のリン酸化、筋肉収縮、グルコース代謝、細胞タンパク質合成の調節および細胞周期の制御の調節に関与するシグナリングカスケードを含む種々のシグナリングカスケードのすべての過程に見いだされる。
発明の要約
本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含んでいる細胞、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを利用するアッセイおよび上記のことすべてに関連する方法に関している。本発明は、我々がＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２と命名した新規タンパク質の単離および特性付けに基づいている。本明細書に示された配列が与えられた場合、それらのポリペプチドおよび核酸はよく知られた標準的合成技術を用いて製造することができる。
ＡＵＲ−１およびＡＵＲ−２はセリン／スレオニンキナーゼに関連しており、短いＮ−末端伸張が行われている。ショウジョウバエおよび酵母同族体は有糸分裂制御に関係しているように思われる。ヒトタンパク質は癌および／または他の信号伝達障害に関係しているようである。ＡＵＲｌ  ＲＮＡは正常および腫瘍組織両方に由来する急速に分裂している細胞に広く発現されている。しかしながらＡＵＲ２  ＲＮＡはより限定されたパターンで発現され、ほとんどの正常組織で低いかまたは欠如しており、特に結腸直腸起源の腫瘍由来細胞株の一部にのみ豊富である。オーロラ１およびオーロラ２は両方とも胎児肝臓、成人精巣および胸腺での中間発現を示し、減数分裂におけるこれらのタンパク質の正常の役割を暗示している。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２両方とも核分裂を制御しているようであり、シグナリングの崩壊により倍数体細胞が生じる。この表現型は、その酵母同族体ＩＰＬ１で見られるような染色体誤分離によるようである。倍数性は腫瘍細胞およびｐ５３腫瘍サプレッサーが欠損した細胞を証明するものであるので、細胞形質転換におけるＡＵＲ１およびＡＵＲ２の役割を試験した。
ヒト遺伝子の一次配列分析により、それらは高度に保存されたＣ−末端プロテインキナーゼドメイン、および弱く保存された７４から１３０アミノ酸の、基質結合モチーフとして制御的役割または機能を果たすであろうＮ−末端ドメインを含んでいることが明らかにされた。ヒト遺伝子はまた、キナーゼドメインの活性化ループ中のｃＡＭＰ／ＰＫＡリン酸化部位Ｒ／ＫＲ／ＫＸＳ／Ｔも含んでおり、細胞周期により制御されるＣＤＣ２／ＣＤＫ関連タンパク質に類似した制御経路が示唆される。
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の独特なＮ−末端領域から誘導されたプローブを用いたサザン分析は、それらがヒト細胞内において単一コピー遺伝子として存在することを示している。しかしながら、低ストリンジェンシー条件下、我々はＡＵＲ１プローブに弱くハイブリダイズする１．３ｋｂおよび３．２ｋｂ  ＳａｃＩ断片を検出することができた。クローニングおよび配列分析により、この領域は多フレームシフトを持つイントロンを持たないＡＵＲ１関連偽遺伝子（ＡＵＲ３と名付けられた）をコードしていることが明らかにされた。さらに、ＡＵＲ３偽遺伝子のすぐ上流は非常に安定なヘアピンループを形成することが予測される複雑な逆方向反復を持つ領域である。ＡＵＲ３  ＤＮＡ配列はＡＵＲ１  ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドから始まるＡＵＲ１と相同的である。この部位のすぐ上流は、ＡＵＲ３の予測されるヘアピンループである。我々は現在、ＡＵＲ３への相同性がこのヌクレオチドから上流へ続いているか、およびＡＵＲ１  ｃＤＮＡが類似のヘアピンループを含んでいるかまたはそのループが先だって存在するかどうかを決定するためにＡＵＲ１ゲノムクローンの特性付けを行っている。
本発明の有用性として細胞増殖の阻害剤をスクリーニングする能力、および癌処置のための小分子治療術を開発する能力が挙げられる。
従って、本発明の第一の態様はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている単離、濃縮または精製された核酸を特色とする。
”ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド”とは配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示されている配列、またはそれらの断片と実質的に類似したアミノ酸配列を意味している。実質的に類似している配列は好適には配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の配列と少なくとも９０％の同一性（より好適には少なくとも９５％、および最も好適には９９−１００％）を持っているであろう。
”同一性”とはその類似性または相関性を測定する配列の性質を意味している。同一性は同一の残基の数を残基の総数で割り、それに１００を掛けることにより測定される。従って、正確に同一の配列の二つのコピーは１００％の同一性を持っているが、より少ない程度で保存されており、および欠失、付加または置換を持つ配列はより低い程度の同一性を持っている。当業者にはいくつかのコンピュータープログラムが配列同一性の決定に利用できることが認められるであろう。
核酸に関して”単離された”とは天然の供給源から単離されたまたは合成されたＤＮＡまたはＲＮＡを含む、お互いに結合された６つ（好適には２１、より好適には３９、最も好適には７５）のヌクレオチドのポリマーを意味している。本発明のある態様では、より長い核酸、例えば、３００、６００、９００またはより長いヌクレオチドの核酸および／または配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示された完全長配列と少なくとも５０％、６０％、７５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つ核酸が好適である。本発明の単離された核酸は、天然には純粋なまたは分離された状態では観察されないという点で独特である。用語”単離された”の使用は、天然に存在する配列がその正常な細胞（即ち、染色体）環境から除去されていることを示している。従って、そのような配列は細胞を含んでいない溶液中に存在しているか、または異なった細胞環境に置かれているであろう。本用語は、配列が存在しているヌクレオチド鎖のみであること、天然にそれに付随している非ヌクレオチド物質を本質的に含んでいないことを（少なくとも約９０−９５％の純度）示しているわけではなく、単離された染色体と区別されていることを意味している。
核酸に関して、用語”濃縮された”とは正常または病的細胞中、またはその配列が取り出された細胞中よりも問題とする細胞または溶液中において、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が全ＤＮＡまたはＲＮＡ中の有意により高い割合（２−５倍）を構成することを意味している。このことは、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡ量の優先的減少、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列量の優先的増加またはこれら二つの組み合わせにより生じうる。しかしながら、濃縮されたとは他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを示しているわけではなく、ただ問題とする配列の相対量が有意に増加していることであることに注意されたい。本明細書において用語”有意に”とは増加のレベルがそのような増加を行っている人に有用であることを示すために使用されており、一般的には他の核酸と比較して少なくとも２倍、より好適には少なくとも５から１０倍またはそれ以上を意味している。本用語はまた他起源のＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを示しているわけではない。他起源ＤＮＡには例えば、酵母または細菌ゲノム、またはｐＵＣ１９のようなクローニングベクターからのＤＮＡが含まれるであろう。この用語は、一つのｍＲＮＡレベルが他のｍＲＮＡに比べて自然に増加するウイルス感染または腫瘍型増殖のような天然に起こる出来事とは区別される。すなわち、本用語は所望の核酸の比率を上昇させるために人が介在したような状況のみを含むことを意味している。
ヌクレオチド配列が精製された形であることはまたいくつかの目的に有利である。核酸に関して用語”精製された”とは絶対的な純度（均一試料のような）を要求してはいない；それよりも、配列が天然の環境にあるよりも相対的に純粋であるという指標を表している（天然のレベルと比較して、このレベルは少なくとも２−５倍以上でなければならない、例えば、ｍｇ／ｍｌで）。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは電気泳動的に均一になるまで精製されるであろう。これらのクローンから得られ、特許請求されるＤＮＡ分子は、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは天然には存在しないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築には、合成物質（ｃＤＮＡ）の作成が含まれ、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを運んでいる細胞のクローン選択により合成ライブラリーから単離できる。従って、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築および別々のｃＤＮＡクローンの単離を含むプロセスにより天然のｍＲＮＡを約１０6倍に精製することができる。少なくとも１桁、好適には２または３桁、およびより好適には４または５桁程度の精製は明白に企図される。
”ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド”とは、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の完全長アミノ酸配列に示した、２５（好適には３０、より好適には３５、最も好適には４０）またはそれ以上の連続したアミノ酸配列、または本明細書に記載したようなそれらの機能性誘導体を意味している。ある態様では、１００、２００、３００またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドが好適である。ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドは、完全長核酸配列、またはポリペプチドの機能性活性が保持されている限り完全長核酸配列の任意の一部によりコードされることができる。
好適な態様において、単離された核酸は配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の完全長アミノ酸配列に示した核酸配列、その機能性誘導体、またはその少なくとも２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００または３００の連続したアミノ酸をコードする核酸配列を含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る；本ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドは、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２の少なくとも２５、３０、３５または４０の連続するアミノ酸を含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。核酸はｃＤＮＡクローニングまたは減法ハイブリダイゼーションにより天然の供給源から単離することができる；天然の供給源は哺乳類（ヒト）の血液、精液または組織であることができ、核酸はトリエステル法または自動化ＤＮＡ合成機により合成することができる。さらに別の態様において、本核酸は保存されたまたは特有の領域であり、例えば、追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブの設計に、追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプローブの設計に、およびポリペプチド領域に対する抗体を得るために有用なものである。本発明のアミノ酸配列の例としては以下のアミノ酸配列が含まれる（それらをコードしている単離された、精製されたまたは濃縮された核酸もまた本発明の範囲内である）：
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”保存された核酸領域”とは、低ストリンジェンシー条件下、特定の核酸配列がハイブリダイズできる、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている二つまたはそれ以上の核酸上に存在する領域を意味している。ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条件はＡｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９：１３３６１（１９９２）に提供されている（図を含む全文のまま本明細書において援用される）。好適には、保存された領域は２０ヌクレオチドのうち５つ以上は異ならない。
”特有な核酸領域”とは、他の天然に存在するポリペプチドをコードしている配列中には存在しないが、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている完全長核酸には存在している配列を意味している。そのような領域は好適にはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている完全長核酸に存在する３０または４５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特に、特有な核酸領域は好ましくは哺乳類起源である。
本発明はまた、試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドまたはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている核酸を検出するための核酸プローブも特色としている。本核酸プローブは配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示した配列またはそれらの機能性誘導体にハイブリダイズするであろう核酸を含んでいる。
好適な態様において本核酸プローブは、配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示した完全長配列の少なくとも１２、７５、９０、１０５、１２０、１５０、２００、２５０、３００または３５０の連続するアミノ酸をコードしている核酸またはその機能性誘導体にハイブリダイズする。所望される特異性および選択性に依存して、種々の低または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が使用されるであろう。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下では高度に相補的である核酸配列のみがハイブリダイズする。好適には、そのような条件は２０の連続するヌクレオチドの内、１または２の不適正な組み合わせを持つ核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
本プローブの使用法として、ハイブリダイゼーションが起こる条件下、試料と核酸プローブを接触させ、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２  ＲＮＡへ結合したプローブの存在または量を検出することによる、試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２  ＲＮＡの存在または量を検出することが挙げられる。プローブとＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている核酸配列との間に形成された核酸デュープレックスは検出された核酸の配列同定に使用される（例えば、Ｎｅｌｓｏｎらによる、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐ．２７５  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，１９９２）、図を含む全文のまま本明細書において援用される、を参照されたい）。そのような方法を実施するためのキットは、核酸プローブが中に配備された容器を含むように構築されるであろう。
本発明はまた、好適には細胞または生物体中の組換え体核酸を特色としている。組換え体核酸は配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示した配列またはその機能性誘導体、および宿主細胞中で転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターを含んでいるであろう。組換え体核酸は代わりに、細胞中で機能的である転写開始領域、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしているＲＮＡ配列と相補的な配列および細胞中で機能的である転写終止領域を含むこともできる。
本発明の別の態様は、単離された、濃縮された、または精製されたＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドを特色としている。
ポリペプチドに関して”単離された”とは、２（好適には７、より好適には１３、最も好適には２５）またはそれ以上のアミノ酸がお互いに結合されたポリマーを意味し、天然の供給源から単離されたまたは合成されたポリペプチドを含む。ある態様においては、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示した４０２、４０７、４１３または４２５の連続したアミノ酸のようなより長いポリペプチドが好適である。本発明の単離されたポリペプチドは、天然には純粋なまたは分離された状態では観察されないという点において独特である。用語”単離された”の使用は、天然に存在する配列がその正常な細胞環境から除去されていることを示している。従って、そのような配列は細胞を含んでいない溶液中に存在しているか、または異なった細胞環境に置かれているであろう。本用語は、配列が存在しているアミノ酸鎖のみであること、天然にそれに付随している非ヌクレオチド物質を本質的に含んでいないことを（少なくとも約９０−９５％の純度）示しているわけではない。
ポリペプチドに関して、用語”濃縮された”とは正常または病的細胞中、またはその配列が取り出された細胞中よりも問題とする細胞または溶液中において、特定のアミノ酸配列が全アミノ酸中の有意により高い割合（２−５倍）を構成することを意味している。このことは、存在する他のアミノ酸量の優先的減少、または特定のアミノ酸配列量の優先的増加またはこれら二つの組み合わせにより生じうる。しかしながら、濃縮されたとは他のアミノ酸配列が存在しないことを示しているわけではなく、ただ問題とする配列の相対量が有意に増加していることであることに注意されたい。本明細書において用語”有意に”とは増加のレベルがそのような増加を行っている人に有用であることを示すために使用されており、一般的には他のアミノ酸と比較して少なくとも２倍、より好適には少なくとも５から１０倍またはそれ以上を意味している。本用語はまた他起源のアミノ酸が存在しないことを示しているわけではない。他起源アミノ酸には例えば、酵母または細菌ゲノム、またはｐＵＣ１９のようなクローニングベクターによりコードされているアミノ酸が含まれるであろう。本用語は所望の核酸の比率を上昇させるために人が介在したような状況のみを含むことを意味している。
アミノ酸配列が精製された形であることはまたいくつかの目的に有利である。ポリペプチドに関して用語”精製された”とは絶対的な純度（均一試料のような）を要求してはいない；それよりも、配列は天然の環境にあるよりも相対的に純粋であるという指標を表している（天然のレベルと比較して、このレベルは少なくとも２−５倍以上でなければならない、例えば、ｍｇ／ｍｌで）。少なくとも１桁、好適には２または３桁、およびより好適には４または５桁程度の精製は明白に企図される。本物質は好適には機能的に有意なレベルで夾雑物を含んでいない、例えば、９０％、９５％または９９％の純度である。
好適な態様において、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドは配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示した完全長配列またはその機能性誘導体の少なくとも２５、３０、３５、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０の連続したアミノ酸を含んでいる。
本発明のさらに別の態様は、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに対して特異的結合親和性を持つ抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を特色としている。本抗体はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに特異的に結合できるアミノ酸の配列を含んでいる。”特異的結合親和性”とは、特定の条件下、抗体が他のポリペプチドに結合するよりもより高い親和性でＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに結合することを意味している。
ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドへの特異的結合親和性を持つ抗体は、免疫複合体が形成される条件下で試料と抗体を接触させ、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより、試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドの存在および／または量を検出するための方法に使用することができる。そのような方法を実施するための診断キットは、本抗体を包含する第一の容器および抗体の結合相手と標識との複合体を包含する第二の容器を含むように構築されるであろう。
本発明の別の態様は、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドへの特異的結合親和性を持つ抗体を産生するハイブリドーマを特色としている。”ハイブリドーマ”とは抗体（例えば、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２抗体）を分泌できる不死化細胞株を意味している。好適な態様において、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２抗体はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドを特異的に結合できるアミノ酸の配列を含む。
別の態様において、本発明は組換えＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドまたはその特有の断片を含んでいるポリペプチドを記載している。”特有の断片”とは他の天然にポリペプチドには存在しない完全長ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を意味している。好適には、そのような配列は全配列中に存在する６つの連続したアミノ酸から成っている。より好適には、そのような配列は全配列中に存在する１２の連続したアミノ酸から成っている。さらにより好適には、そのような配列は全配列中に存在する１８の連続したアミノ酸から成っている
”組換えＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド”とは、その位置（例えば、天然に観察されるものと異なった細胞または組織に存在する）、純度または構造の点において天然に存在するポリペプチドとは性質が異なるように組換えＤＮＡ技術により産生されたポリペプチドを含んでいることを意味している。一般的に、そのような組換えポリペプチドは通常天然に観察される量とは異なった量で細胞内に存在するであろう。
別の態様において、本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている精製された核酸を含む組換え細胞または組織を記載している。そのような細胞において、核酸はそのゲノム制御要素の調節下にあるか、または外因性プロモーターを含む外因性制御要素の調節下にあるであろう。”外因性”とは、インビボにおいてＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドのコード配列と通常は転写的に結合されていないプロモーターを意味している。
別の態様において、本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドへ結合できるＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド結合剤を特色としている。結合剤は好適にはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド上に存在するエピトープを認識する精製抗体である。他の結合剤としては本ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドへ結合する分子およびＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドへ結合する類似の分子が含まれる。そのような結合剤はＰＤＧＦＲ活性を測定するアッセイのような、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２結合パートナー活性を測定するアッセイを用いて同定されるであろう。
抗体に関して”精製された”とは、抗体が精製された形であるような、天然に存在する抗体とは異なった抗体を意味している。好適には、抗体は標準技術により均一な調製試料として提供される。クローン化ポリペプチドの抗体の使用には、治療術または診断手段としての使用が含まれる。
本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドまたは等価な配列を含むヒト細胞をスクリーニングするための方法を特色としている。本方法は、本明細書においてＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を同定するために記載されている技術のような本分野では日常および標準の技術を用いて、ヒト細胞中の新規ポリペプチドを同定することを含んでいる（例えば、クローニング、サザンまたはノーザンブロット分析、インシチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅など）。
本発明はまたヒト細胞について、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドの結合パートナーをスクリーニングする方法、および他の生物体のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２または対応する結合パートナーをスクリーニングする方法を特色としている。本発明はまた、上記の方法により同定されたペプチドの精製された、単離された、または濃縮されたものも特色としている。
別の態様において、本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２およびＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２結合パートナー間の相互作用を妨害できる試薬を同定するアッセイを提供する。そのようなアッセイはインビトロまたはインビボで実施され、本明細書にも詳しく説明されており、あるいは、１９９５年６月７日に出願された米国特許出願第０８／４８７，０８８号（図を含み本明細書において援用される）に記載されている増殖アッセイまたは１９９５年１０月１３日に出願された米国特許出願第６０／００５，１６７号（図を含み本明細書において援用される）に記載されているアッセイのような現存するアッセイを修正することにより得ることもできる。本発明の遺伝子を使用するように改変しうる別のアッセイは１９９４年１０月１３日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／２３０３９号に記載されている。他の可能性としては、自己リン酸化アッセイにおけるキナーゼ活性の検出、またはヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、ガンマチューブリンまたは中心体タンパク質のような標準基質に対するキナーゼ活性の試験が挙げられる。結合パートナーはツーハイブリッドスクリーン内へタンパク質のＮ−末端部分を加えることにより、または二重特異性キナーゼのホスホチロシンを検出することにより同定されるであろう（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、米国特許第５，２８３，１７３号（１９９４年２月１日公開）、本明細書において援用される）。
オーロラ活性の阻害剤が決定されるであろう一つの手段は、ＣｈａｎおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３５：６７７−６９１，１９９３）により記載されているような温度感受性酵母突然変異体を用いるスクリーニング系である；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４  （７）：４７３１−４７４０，１９９４、もまた参照されたい、これらは両方とも図を含んで全文のまま本明細書において援用される。簡単に記すと、２６℃で生存可能でオーロラの酵母同族体（ｉｐｌ１）の温度感受性形を発現する酵母株ＣＣＹ７２−３Ｄ−１（ｉｐｌ  １−２）は３７℃では増殖できない。この株を推定基質相互作用ドメインを含むｉｐｌ１のＮ−末端部分および触媒ドメインを含むオーロラ１または２のＣ−末端部分から成るハイブリッドオーロラ遺伝子を含んでいる発現プラスミドでトランスフェクションすると、増殖温度に対する感受性が克服される。オーロラ発現酵母株は次に試験物質存在下、３７℃で増殖させる。オーロラ触媒機能を阻害する物質存在下では増殖は明らかに起こらないであろう。可能性のある阻害剤としては真菌、海洋生物、植物などのような種々の生物体から単離された低分子量化学物質および／または天然物が含まれる。
上記の本発明の要約は本発明を制限するものではなく、本発明の他の特色および利点は、以下に記載の好適な態様および請求の範囲から明らかになるであろう。
好適な態様の説明
本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含む細胞、組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを使用するアッセイおよび上記すべてに関連する方法に関している。
Ｉ．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしている核酸
本明細書に記載された単離核酸分子の機能的均等物は本発明の範囲内に含まれている。遺伝子コードの縮重は、同一のアミノ酸を特定し、従って同一のタンパク質を与える他のコドンによるある種のコドンの置換を可能にする。メチオニンおよびトリプトファンを除いて既知のアミノ酸は２つ以上のコドンでコードできるので、核酸配列は実質上変化可能である。従って、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子の一部またはすべてが配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示された配列とかなり異なった形の核酸配列を与えるように合成できる。しかしながら、コードされたアミノ酸配列は保存されているであろう。
加えて、核酸配列は配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示された核酸式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端への少なくとも一つのヌクレオチドの付加、欠失または置換により生じたヌクレオチド配列を含んでいてもよい。付加、欠失または置換がヌクレオチド配列によりコードされている配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４のアミノ酸配列を変化させないならば、この点において任意のヌクレオチドまたはポリペプチドを使用してもよい。例えば、本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧが付加された、または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡが付加された核酸配列を含むことを本発明は意図している。さらに、本発明の核酸分子は必要性に応じてその５’−末端および／または３’−末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位が加えられている。
与えられた核酸配列のそのような機能性改変は、それらに融合された外来核酸配列によりコードされている異種タンパク質の分泌および／またはプロセッシングを促進する機会を授ける。従って、遺伝子コードにより許されたＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子およびそれらの断片のヌクレオチド配列のすべての改変は本発明に包含されている。
さらに、非改変核酸分子により産生されるポリペプチドと実質的に同じ効用または活性を持つ構造的に改造されたポリペプチドを製造するために、コドンを欠落させるまたは縮重コドン以外のコドンによる一つまたはそれ以上のコドンを置換することが可能である。本分野で認められているように、産生のもとになる二つの核酸分子において核酸分子間の相違が遺伝子コードの縮重と関連していなくても、二つのポリペプチドは機能的に等価である。
II．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２検出のための核酸プローブ
本発明の核酸プローブは、本発明の別の核酸分子を得るため、通常のハイブリダイゼーション法により適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリーの探査に使用される。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは本分野で認められている方法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９参照）に従って適当な細胞から調製されるであろう。
もしくは、問題とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ−末端およびＣ−末端部分に対応するヌクレオチド配列を持つ核酸プローブを得るために化学合成が実施される。例えば、本発明の断片を得るため、適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリーを利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコール（”Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｍｉｃｈａｅｌら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）に本質的に従った認知されているＰＣＲ技術に従って実施されるＰＣＲにおいて、合成された核酸プローブがプライマーとして使用されるであろう。
当業者は本分野では既知のコンピューターアラインメントおよび配列分析（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９参照）の方法を用い、本明細書に開示されている配列に基づいてそのようなプローブを容易に設計することができる。本発明のハイブリダイゼーションプローブは放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光などの標準標識技術により標識できる。ハイブリダイゼーション後、プローブは既知の方法を使用して可視化されるであろう。
本発明の核酸プローブにはＲＮＡならびにＤＮＡプローブが含まれ、そのようなプローブは本分野では既知の方法を用いて発生される。核酸プローブは固形支持体上に固定されていてもよい。そのような固形支持体の例としては、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースおよびセファロースのような複合炭水化物およびポリアクリルアミドおよびラテックスビーズのようなアクリル性樹脂が挙げられる。そのような固形支持体へ核酸プローブを結合させる技術は本分野ではよく知られている。
本発明の核酸探査法に適した試験試料には、例えば、細胞または細胞の核酸抽出物、または生物体液が含まれる。上記の方法に使用される試料はアッセイ形式、検出法およびアッセイされる組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化するであろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は本分野ではよく知られており、利用される方法に合致した試料を得るために容易に適応させることができる。
III．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を検出するためのプローブに基づいた方法およびキット
試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２の存在を検出する一つの方法は（ａ）ハイブリダイゼーションが起こる条件下、該試料と上記の核酸プローブを接触させ、および（ｂ）該核酸分子へ結合した該プローブの存在を検出することを含む。当業者は上記のような本分野では既知の技術に従って核酸プローブを選択するであろう。試験される試料としてヒト組織のＲＮＡ試料が挙げられるが、それに制限されるべきではない。
試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２の存在を検出するためのキットは、上記の核酸プローブが配備された少なくとも一つの容器を含む。キットはさらに一つまたはそれ以上の下記のものを含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合核酸プローブの存在を検出できる試薬。検出試薬の例として、放射性標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）およびアフィニティー標識プローブ（ビオチン、アビジンまたはステプタビジン）が挙げられるが、それらに制限されるわけではない。
詳しく説明すると、区分化されたキットとしては試薬が別々の容器に含まれている任意のキットが挙げられる。そのような容器としては小さなガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックまたは紙の細長い小片が挙げられる。そのような容器は、試料および試薬が交差混入しないように、および各々の容器の試薬または溶液が一つの区画から他の区画へ定量的様式で加えられるように、一つの区画から他の区画への試薬の効率的な移動を可能にしている。そのような容器には、試験試料を受け入れるであろう容器、アッセイで使用されるプローブまたはプライマーを含む容器、洗浄試薬（リン酸緩衝液、トリス緩衝液などのような）を含む容器、およびハイブリダイズしたプローブ、結合された抗体、増幅された生成物などを検出するのに使用される試薬を含む容器が含まれるであろう。当業者は、本発明に記載されている核酸プローブは本分野でよく知られている確立されたキット様式の一つに容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
IV．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２核酸分子から成るＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含んでいる細胞。
本発明はまた、５’から３’へ、宿主細胞中で転写を開始させるのに有効なプロモーターおよび上記の核酸分子から成る組換え体ＤＮＡ分子にも関している。加えて、本発明はベクターおよび上記の核酸分子からなる組換えＤＮＡ分子にも関している。本発明はまた細胞中で機能的な転写領域、上記のポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードしているＲＮＡ配列に相補的な配列、および該細胞中で機能的な転写終止領域から成る核酸分子にも関している。上記の分子とは単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子であろう。
本発明はまた上記の核酸分子を含んでおり、それによりペプチドを発現することができる細胞または組織にも関している。通常は産生されないまたは通常は低レベルでしか産生されないタンパク質を遺伝子操作により細胞が産生するようにされた場合、細胞は”所望のポリペプチドを発現するように改変された”と称される。当業者は真核生物かまたは原核生物細胞内へゲノム、ｃＤＮＡまたは合成配列を導入および発現するための方法を容易に適応させることができる。
もしもＤＮＡのような核酸分子が転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含んでおり、およびそのような配列がポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に”作動可能なように結合されて”いるならば、ポリペプチドを”発現可能”であると称される。作動可能な結合とは、制御ＤＮＡ配列および発現されると考えられるＤＮＡ配列が遺伝子配列発現を可能にする様式で連結されている結合である。遺伝子配列発現に必要とされる制御領域の厳密な性質は生物体
間で異なるであろうが、原核生物においては、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始に関する）並びにＤＮＡ配列（ＲＮＡに転写された時、合成開始の信号を発するであろう）の両方を含むプロモーター領域を一般的に包含しているであろう。そのような領域は通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような転写および翻訳の開始に関係している５’−非コード配列を含んでいるであろう。
必要なら、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子をコードしている配列の３’側の非コード領域が上記の方法により得られる。この領域は終止およびポリアデニル化のようなその転写終止制御配列を保持しているであろう。従って、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子をコードしているＤＮＡ配列に天然で連続している３’−領域を保持することにより、転写終止信号が提供されるであろう。転写終止信号が発現宿主細胞中で満足できるほど機能しない場合は、宿主細胞中で機能的な３’領域に置換されるであろう。
二つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列およびＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２配列）は、もし二つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生ぜず、（２）ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子配列の転写に関するプロモーター領域配列の能力を妨害せず、または（３）プロモーター領域配列により転写されるべきＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子配列の能力を妨害しないならば、作動可能なように結合されていると称される。従って、もしプロモーターがＤＮＡ配列の転写を達成できたのであれば、プロモーター領域はそのＤＮＡ配列に作動可能なように結合されているであろう。従って、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子を発現するには、適した宿主に認識される転写および翻訳信号が必要とされる。
本発明は原核生物または真核生物細胞両方におけるＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子（またはそれらの機能性誘導体）の発現を包含している。原核生物宿主は一般的に組換えタンパク質の生産が非常に効率的で都合がよく、それ故、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子のための好適な発現系の一つの型である。最もしばしば原核生物は大腸菌の種々の株で代表される。しかしながら、他の細菌株を含む他の微生物株もまた使用できる。
原核生物系においては、宿主と一致する種から誘導された複製部位および調節配列を含むプラスミドベクターが使用されるであろう。適したプラスミドベクターの例としてはｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１１８などが含まれ；適したファージまたはバクテリオファージの例にはγｇｔ１０およびγｇｔ１１などが含まれ；適したウイルスベクターの例にはｐＭＡＭ−ｎｅｏおよびｐＫＲＣなどが含まれるであろう。好適には、本発明で選択されたベクターは選択された宿主細胞中で複製する能力を持っている。
認められている原核生物宿主には、大腸菌、バシラス、ストレプトミセス、シュードモナス、サルモネラ、セラチアなどのような細菌が含まれている。しかしながら、そのような条件下ではペプチドはグリコシル化されていないであろう。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび調節配列と一致していなければならない。
原核生物細胞中でＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２（またはそれらの機能性誘導体）を発現するには、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２配列を機能性原核生物プロモーターに作動可能なように連結する必要がある。そのようなプロモーターは構成的またはより好適には制御可能（即ち、誘導可能または脱抑制可能）であろう。構成的プロモーターの例にはバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーターなどが含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例にはバクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰLおよびＰR）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、λａｃＺ、λａｃＩおよびｇａｌプロモーター、枯草菌のα−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））およびζ−２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ３２：１１−２０（１９８９））、バシラスのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、およびストレプトミセスプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８（１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターはＧｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７））；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６（１９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４））による総説がある。
原核生物細胞における適切な発現にはまた、遺伝子配列コード配列の上流のリボソーム結合部位の存在を必要とする。そのようなリボソーム結合部位は例えば、Ｇｏｌｄらにより（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４（１９８１））記載されている。調節配列、発現ベクターおよび形質転換法などの選択は、遺伝子を発現するために使用された宿主細胞の型に依存している。本明細書において使用される場合、”細胞”、”細胞株”および”細胞培養”は互換性を持って使用され、すべてのそのような呼称は子孫を含んでいる。従って、用語”形質転換体”または”形質転換された細胞”には一次対照細胞、および継代の数にかかわらずそれらから誘導された培養物が含まれる。故意のまたは偶然の突然変異のためＤＮＡ含有物において全ての子孫は正確に同一ではないであろうことが理解される。しかしながら、定義したように、突然変異体の子孫はもともと形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を持っている。
本発明の発現系で使用されるであろう宿主細胞は、もしそれらが問題とするＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ペプチド発現での使用に適していれば厳密には制限されない。適した宿主としてしばしば真核生物細胞が挙げられる。好適な真核生物宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞、インビボまたは組織培養された哺乳類細胞が挙げられる。宿主として有用であろう哺乳類細胞には、ヒーラー細胞、ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１のような線維芽細胞起源の細胞、またはリンパ起源の細胞またはそれらの誘導体が挙げられる。好適な哺乳類宿主細胞にはＳＰ／２およびＪ５５８Ｌ、ならびに正しい翻訳後プロセッシングのより優れた能力を提供するＩＭＲ３３２のような神経芽細胞腫細胞株が含まれる。
加えて、植物細胞もまた宿主として利用可能であり、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化信号配列のような植物細胞に合致する調節配列も利用可能である。別の好適な宿主は昆虫細胞である、例えば、ショウジョウバエ幼虫。宿主として昆虫細胞を使用すると、ショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが使用できる。Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４５３−１４５９（１９８８）。もしくは、昆虫細胞中で大量のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を発現させるためにバキュロウイルスベクターが遺伝子操作できる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１６５３（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６），Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ら編，Ｐｌｅｎｕｍ，第８章，ｐｐ．２７７−２９７）。
酵母をグルコースの豊富な培地で増殖させた場合に多量に産生され、解糖系酵素をコードしている活性に発現された遺伝子配列からのプロモーターおよび終止要素を取り込んだ一連の酵母遺伝子配列発現系が利用できる。既知の解糖系遺伝子配列もまた非常に能率的な転写調節信号を提供できる。酵母は翻訳後ペプチド修飾も実施できるという本質的な利点を提供する。酵母において所望のタンパク質の産生に利用できる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する多数の組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母はクローン化哺乳類遺伝子配列生成物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を運ぶペプチド（すなわち、プレペプチド）を分泌する。哺乳類宿主に対し、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２発現のためにいくつかの可能なベクター系が利用可能である。
宿主の性質に依存して、広範囲の転写および翻訳制御配列が用いられるであろう。転写および翻訳制御信号は、制御信号が高レベルの発現を持つ特定の遺伝子配列に付随しているアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルスなどのようなウイルス源から誘導されるであろう。もしくは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどのような哺乳類発現生成物からのプロモーターが使用されるであろう。遺伝子配列の発現を変えることができるように、抑制または活性化が可能な転写開始制御信号が選択されるであろう。温度を変化させることにより発現が抑制または開始できるように温度感受性であるか、または化学物質（代謝物のような）制御を受ける制御信号が興味を引かれる。
真核生物宿主におけるＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２の発現は真核生物制御領域の使用を必要とする。そのような領域は一般的に、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含んでいるであろう。好適な真核生物プロモーターには例えば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３ー２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；酵母ｇａ１４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４）が含まれる。
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は第一のメチオニンをコードしているコドンで開始される。このため、真核生物プロモーターとＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２（またはそれらの機能性誘導体）をコードしているＤＮＡ配列間の結合がメチオニンをコードできる妨害コドン（すなわち、ＡＵＧ）を含まないことを確実にすることが好適である。そのようなコドンの存在は融合タンパク質の形成（もし、ＡＵＧコドンがＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２コード配列と同じ読み枠内に存在すれば）またはフレームシフト突然変異（もし、ＡＵＧコドンがＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２コード配列と同じ読み枠内に存在しなければ）を生じる。
ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２核酸分子および作動可能に連結されたプロモーターは受容体原核または真核細胞内へ非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）として導入され、それは線状分子であってもよいが、より好適には閉じた共有結合による環状分子であろう。そのような分子は自律性複製ができないので、遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現を通して起こるであろう。もしくは、宿主染色体内へ、導入されたＤＮＡ配列を組み込むことにより永続的発現が起こるであろう。
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体内へ組む込むことができるベクターを用いてもよい。導入されたＤＮＡが染色体内へ安定に組み込まれた細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上のマーカーも導入することにより選択できる。マーカーは自己栄養性宿主へ原栄養性、生命破壊剤耐性（例えば、抗生物質）または銅のような重金属などを提供する。選択可能マーカー遺伝子配列は発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列へ直接結合することもできるし、共トランスフェクションにより同一細胞内へ導入することもできる。一本鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの最適の合成には追加の要素も必要とされる。これらの要素にはスプライス信号、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止信号が含まれる。そのような要素を取り込んでいるｃＤＮＡ発現ベクターにはＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３）により記載されているようなベクターが挙げられる。
導入された核酸分子は、受容体宿主中で自律性複製ができるプラスミドまたはウイルスベクター内へ取り込ませることができる。この目的には広範囲のベクターが用いられるであろう。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要な因子として：ベクターを含んでいる受容体細胞が認識されるおよびベクターを含んでいない受容体細胞からそれらが選択される容易さ；特定の宿主中に望まれるベクターのコピーの数；および異なった種の宿主間でベクターを”往復する”ことが可能であることが望まれているかどうかが挙げられる。
好適な原核生物ベクターには大腸菌中で複製できるようなプラスミドが含まれる（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、ΠＶＸのような）。そのようなプラスミドは例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋにより記載されている（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）参照）。バシラスプラスミドとしてはｐＣ１９４、ｐＣ２２２、ｐＴ１２７などが含まれる。そのようなプラスミドはＧｒｙｃｚａｎにより記載されている（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２），ｐｐ．３０７−３２９）。適したストレプトミセスプラスミドにはｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８７）およびφＣ３１のようなストレプトミセスバクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５−５４）が含まれる。シュードモナスプラスミドはＪｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９８７））により概説されている。
好適な真核生物プラスミドには、例えば、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなどまたはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラスミドは本分野ではよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉａｍｉ  Ｗｎｔｒ．  Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，”Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ  ２８：２０３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｔｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０））。
構築物を含んでいるベクターまたは核酸分子が調製されたら、ＤＮＡ構築物は種々の適した手段の一つにより適当な宿主細胞内へ導入される、すなわち、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質体融合、エレクトロプレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接的マイクロインジェクションなど。ベクター導入後、受容体細胞をベクター含有細胞の増殖で選択する選択培地中で増殖させる。クローン化遺伝子分子の発現はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２またはそれらの断片の生成を生じる。これは形質転換された細胞それ自体で、または分化するようにこれらの細胞を誘導した後に起こる（例えば、神経芽細胞腫ヘブロモデオキシウラシルを投与することにより）。本発明のペプチドを形成させるために種々のインキュベーション条件が使用できる。最も好適な条件は生理的条件を模倣した条件である。
Ｖ．精製されたＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチド
本分野では既知の種々の方法論が本発明のペプチドを得るために利用できる。ペプチドは天然にこのペプチドを産生する組織または細胞から精製されるであろう。もしくは、上記のように単離された核酸断片が生物体でのＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２タンパク質の発現に使用できた。本発明の試料には、細胞、細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物、または生物体液が含まれる。試料はアッセイ形式、検出方法および試料として使用された細胞または抽出物に基づいて変化するであろう。
供給源生物体が本発明のペプチドを天然に含んでいる限り、任意の真核生物体が本発明のペプチドのための供給源として使用できる。本明細書で使用される場合、”供給源生物体”とは、生物体が本サブユニットを最終的に単離された形で発現するかどうかにかかわらず、本サブユニットのアミノ酸配列が誘導される原生物体を意味している。
当業者は、天然の夾雑物を含まないペプチドを得るためにタンパク質を単離する既知の方法を容易に追従できる。これらには、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらのみに制限されるわけではない。
VI．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに結合親和性を持っている抗体およびその抗体を含んでいるハイブリドーマ。
本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに結合親和性を持っている抗体に関している。該ポリペプチドは配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示したまたはそれらの機能性誘導体のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸の少なくとも９つの連続したアミノ酸（好適には、少なくとも２０、３０、３５または４０のそれらの連続したアミノ酸）を持っているであろう。
本発明はまたＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに特異的結合親和性を持っている抗体にも関している。そのような抗体はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドに対するその結合親和性と別のペプチドに対するその結合親和性を比較することにより単離されるであろう。ＡＵＲ−１およびＡＵＲ−２へ選択的に結合する抗体がＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２および他のポリペプチド間の区別が必要とされる方法で使用するために選択されるであろう。そのような方法には、他のポリペプチドを含んでいる組織においての改変ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２発現の分析が含まれるが、それに制限されるわけではない。
本発明のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２タンパク質は、抗体の発生、医薬組成物同定での使用およびＤＮＡ／タンパク質相互作用の研究のような種々の操作および方法で使用できる。
本発明のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ペプチドは抗体またはハイブリドーマの生成に使用できる。抗体が所望される場合、そのようなペプチドは本明細書に記載したように発生され、免疫原として使用されることを当業者は認識するであろう。本発明の抗体はモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の断片、およびヒト化した形を含んでいる。本発明の抗体のヒト化した形はキメラ化またはＣＤＲ移植のような本分野では既知の方法の一つを用いて発生されるであろう。本発明はまた上記のモノクローナル抗体またはその結合断片を産生するハイブリドーマにも関している。ハイブリドーマは特異的モノクローナル抗体を分泌できる不死化細胞株である。
一般に、モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する技術は本分野でよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１（１９８０））。抗体を産生することが知られている任意の動物（マウス、ウサギなど）が選択されたポリペプチドで免疫できる。免疫化の方法は本分野ではよく知られている。そのような方法にはポリペプチドの皮下または腹腔内注射が含まれている。当業者は免疫化に使用されるポリペプチドの量が免疫される動物、ポリペプチドの免疫原性および注射部位に基づいて変化するであろうことを認識するであろう。
ポリペプチドはペプチド免疫原性を増加させるために修飾されるかまたはアジュバントを加えて投与される。ポリペプチドの免疫原性を増加させる方法は本分野ではよく知られている。そのような方法には、抗原と非相同タンパク質（グロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼのような）との結合または免疫化の間のアジュバントの封入などが含まれる。
モノクローナル抗体については、免疫化動物の脾臓細胞が取り出され、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞のような骨髄腫細胞と融合され、モノクローナル抗体産生細胞になるようにされる。本分野ではよく知られた多くの方法の一つが、所望の特性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定に使用できる。これらの方法には、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット分析またはラジオイムノアッセイ（Ｌｕｔｚ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））が含まれる。所望の抗体を分泌しているハイブリドーマはクローン化され、本分野では既知の方法（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、上記文献、（１９８４））を使用して綱および亜綱が決定される。
ポリクローナル抗体については、免疫化動物から抗血清を含んでいる抗体が単離され、上記の方法の一つを用いて所望の特異性を持つ抗体の存在がスクリーニングされる。上記の抗体は検出可能なように標識されるであろう。抗体は放射性同位元素、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンなどのような）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどのような）および蛍光標識（ＦＩＴＣまたはローダミンのような）、常磁性原子などを使用して検出可能なように標識できる。そのような標識を達成するための方法は本分野ではよく知られており、例えば、Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｅｎｇｖａｌｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）を参照されたい。本発明の標識抗体は特定のペプチドを発現している細胞または組織を同定するインビトロ、インビボおよびインシチュアッセイで使用できる。
上記の抗体はまた固形支持体上に固定化してもよい。そのような固形支持体の例には、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースおよびセファロースのような複合炭化水素、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズのようなアクリル性樹脂が含まれる。そのような固形支持体へ抗体を結合させる技術は本分野ではよく知られている（Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，第４版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，第１０章（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定化抗体は免疫クロマトグラフィー同様にインビトロ、インビボおよびインシチュアッセイで使用できる。
さらに、当業者は推論により設計された抗ペプチドペプチドを発生させるため、特異的ペプチド配列へ結合できるペプチドを発生させるための現在利用可能な方法、並びに、抗体に関して前に開示した技術、方法およびキットを容易に適用できる、例えば、Ｈｕｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８７−３０７（１９９２）およびＫａｓｐｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９２３９−８（１９８９）を参照されたい。
抗ペプチドペプチドはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ペプチド配列に観察される塩基性アミノ酸残基を、疎水性および非荷電極性基を保ったまま酸性基で置換することにより発生できる。例えば、リジン、アルギニンおよび／またはヒスチジン残基はアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され、およびグルタミン酸残基はリジン、アルギニンまたはヒスチジンで置換される。
VII．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を検出するための抗体に基づいた方法およびキット
本発明は、（ａ）免疫複合体が形成する条件下、試料と上記抗体を接触させ、および（ｂ）ポリペプチドへ結合した該抗体の存在を検出することから成る試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドを検出する方法を含んでいる。詳しく説明すると、本方法は試験試料と一つまたはそれ以上の本発明の抗体をインキュベートし、抗体が試験試料に結合したかどうかをアッセイする。正常レベルと比較して試料中のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２レベルが変化していると疾患が示唆されるであろう。
抗体と試験試料をインキュベートする条件は色々である。インキュベーション条件はアッセイで用いられる様式、用いられる検出法およびアッセイで使用される抗体の型および性質に依存している。当業者は通常利用可能な免疫学的アッセイ様式の一つ（ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、拡散に基づくオークターロニーまたはロケット免疫蛍光アッセイのような）が本発明の抗体の使用に容易に適用できることを認識するであろう。そのようなアッセイの例はＣｈａｒｄ，”Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ａｃａｄｅｎｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ  第１巻（１９８２），第２巻（１９８３），第３巻（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，”Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）にみることができる。
本発明の免疫学的アッセイ試験試料には、細胞、細胞のタンパク質膜抽出液、血液、血清、血漿または尿のような体液が含まれる。上記の方法で使用される試験試料はアッセイ様式、検出方法の性質およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化するであろう。タンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は本分野ではよく知られており、利用されるシステムに使用できる試料を得るために容易に適用できる。
キットは前に説明した検出法を実施するのにすべての必要な試薬を含んでいる。キットは（ｉ）上記の抗体を含んでいる第一の容器、および（ｉｉ）抗体の結合相手および標識から成る複合体を含んでいる第二の容器から成っているであろう。別の好適な態様において、キットはさらに一つまたはそれ以上の以下のものから成る一つまたはそれ以上の容器を含んでいる：洗浄試薬および結合された抗体を検出できる試薬。
検出試薬の例としては標識された第二抗体、または代わるものとして、もし第一抗体が標識されているならば、標識抗体と反応できる発色的、酵素的または抗体結合試薬が挙げられるが、それらに制限されるわけではない。区画化されたキットは核酸プローブキットのために前に説明したようなものでもよい。当業者は本発明で説明された抗体が本分野ではよく知られている確立されたキット様式の一つと容易に組み合わせることができることを容易に認識するであろう。
VIII．ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２と相互作用する化合物の単離。
本発明はまた、化合物をＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２とインキュベートし、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２へ結合した化合物の存在を検出することから成るＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２へ結合できる化合物を検出する方法にも関している。化合物は例えば、血清、体液または細胞抽出物のような複雑な混合物内に存在しているであろう。
本発明はまた、化合物存在下にＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を産生する細胞をインキュベートし、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２活性またはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２結合パートナー活性のレベルの変化を検出することから成るＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２活性またはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２結合パートナー活性の作動薬または拮抗薬を検出する方法にも関している。そのようにして同定された化合物は化合物の存在の指標である活性の変化を起こすであろう。化合物は例えば、血清、体液または細胞抽出物のような複雑な混合物内に存在しているであろう。化合物が一度同定されたら、それは本分野でよく知られた技術を用いて単離できる。
本発明はまた、哺乳類にＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２に対する作動薬または拮抗薬を作動作用または拮抗作用を達成するのに十分な量で投与することから成る、哺乳類におけるＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２関連活性を作動させる（刺激する）または拮抗させる方法も包含している。ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２関連機能を作動させるまたは拮抗するのに十分な量を哺乳類に作動薬または拮抗薬を投与することから成る、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２関連活性の作動薬または拮抗薬で哺乳類における疾患を処置する方法もまた本出願に包含されている。
IX．トランスジェニック動物。
本発明と関係があるトランスジェニック動物を産生するために種々の方法が利用可能である。オスおよびメス前核の融合前に授精卵の前核内へＤＮＡが注入でき、または胚細胞の核内へ注入され（例えば、二細胞胚の核）、続いて細胞分割が開始される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２（１９８５））。胚はウイルス（特にレトロウイルス）で感染でき、本発明の無機イオン受容体ヌクレオチド配列を運ぶように改変される。
胚の内部細胞塊から誘導され、培養で安定化された多能性幹細胞は本発明のヌクレオチド配列を取り込むように培養中に操作できる。そだての母親内へ移植されている胚盤胞内へ移植し、妊娠期間を終結させることにより、そのような細胞からトランスジェニック動物が産生できる。トランスジェニック実験に適した動物はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）などのような普通の商業的供給元から得ることができる。
齧歯類胚の操作法および接合体の前核内へのＤＮＡのマイクロインジェクション法は当業者にはよく知られている（Ｈｏｇａｎら、上記文献）。サカナ、両生類卵およびトリのためのマイクロインジェクション法はＨｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４７：８９７−９０５（１９９１）に詳述されている。動物の組織内へＤＮＡを導入するための他の方法は米国特許第４，９４５，０５０号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら、１９９０年７月３０日）に記載されている。
例示のために説明すると、トランスジェニックマウスを作るためメスマウスに過排卵を誘導する。メスをオスと一緒にし、つがいをつくったメスをＣＯ2窒息または断頭により殺し、胚を切り出した卵管から回収する。取り巻いている卵丘細胞を除去する。前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。ランダムな周期を持つ成体メスマウスを精管切除したオスと対にする。受容体メスはドナーメスとして同時につがわせる。次に胚が手術により移される。トランスジェニックラットを発生させる方法はマウスと同様の方法である。Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ．ａ１．，Ｃｅｌｌ  ６３：１０９９−１１１２（１９９０）を参照されたい。
胚幹（ＥＳ）細胞の培養方法および続いてのエレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱および直接注入のような方法を用いるＥＳ細胞内へのＤＮＡの導入によるトランスジェニック動物の製造もまた当業者にはよく知られている。例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照されたい。
無作為遺伝子組込みを含む場合、本発明の配列を含んでいるクローンは耐性をコードしている遺伝子と同時にトランスフェクトされる。もしくは、ネオマイシン耐性をコードしている遺伝子が本発明の配列に物理的に連結される。トランスフェクションおよび所望のクローンの単離は当業者にはよく知られたいくつかの方法の一つにより実施される（Ｅ．Ｌ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、上記文献）。
ＥＳ細胞内へ導入されたＤＮＡ分子もまた相同的組換え法により染色体内へ組み込むことができる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２（１９８９）。組み込みの陽性選択のための方法（すなわち、ｎｅｏ耐性）および二重陽性−陰性選択（すなわち、ｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）および続いてのＰＣＲによる所望のクローンの同定はＣａｐｅｃｃｈｉ（上記文献）およびＪｏｙｎｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５３−１５６（１９８９））により記載されており、それらの教えは本明細書において援用される。方法の最後の段階は胚盤胞内への標的化ＥＳ細胞の注入および胚盤胞の偽妊娠メス内への移植である。得られたキメラ動物を繁殖させ、トランスジーンを運ぶ個体を同定するためサザンブロッティングにより子孫を分析する。非齧歯類の哺乳類および他の動物製造のための方法は他で議論されている。ＨｏｕｄｅｂｉｎｅおよびＣｈｏｕｒｒｏｕｔ、上記文献；Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８１−１２８８（１９８９）；およびＳｉｍｍｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９−１８３（１９８８）を参照されたい。
従って、本発明はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしているトランスジーンまたはＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドの発現を達成する遺伝子を含んでいるトランスジェニック、非ヒト哺乳類を提供する。そのようなトランスジェニック、非ヒト哺乳類はＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドを導入した、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドの発現を制御した（すなわち、追加の遺伝子、アンチセンス核酸またはリボザイムの導入により）効果を研究するインビボ試験系として特に有用である。
”トランスジェニック動物”とは、人工的に細胞内へ挿入されたＤＮＡを含む細胞を持つ動物であり、そのＤＮＡはその細胞から発育した動物のゲノムの一部となっている。好適なトランスジェニック動物は霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡはヒトＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ポリペプチドをコードしているであろう。動物における天然の発現は、受容体の発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより減少しているであろう。
Ｘ．遺伝子治療
ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２またはその遺伝子配列はまた遺伝子療法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）に概説されている）に有用であろう。Ｍｉｌｌｅｒは陽性の最初の結果を示したヒト遺伝子治療への実際的な方法で進歩がもたらされたことを述べている。遺伝子治療の科学的基礎はＭｉｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３１（１９９３）に記載されている。
一つの好適な態様において、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２コード配列を含んでいる発現ベクターが細胞内に挿入され、細胞はインビトロで増殖され、次に患者へ多量に注入される。別の好適な態様において、選択されたプロモーター（例えば、強力なプロモーター）を含んでいるＤＮＡセグメントが、プロモーターセグメントが内因性ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子の発現を促進するように内因性ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２を含んでいる細胞内へ導入される（例えば、プロモーターセグメントが内因性ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２遺伝子に直接結合されるようにプロモーターセグメントが細胞内へ導入される）。
遺伝子治療は腫瘍を標的としたＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ｃＤＮＡ含有アデノウイルスの使用、遺伝子工学処理した細胞の移植による全身性ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２増加、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２ウイルスの注入、または適当な組織への裸のＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２の注入を含んでいる。
タンパク質複合体の活性を調節するため、そのような複合体の一つまたはそれ以上の成分の改変形を導入することにより、標的細胞集団が修飾される。例えば、標的細胞内の複合体成分活性を減少または阻害することにより異常な信号伝達が起こると、状態が悪化し、阻害されまたは転換される。タンパク質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持しているが信号伝達で機能できない一つの成分の欠失またはミスセンス突然変異体が異常で有害な信号伝達を阻害するために使用されるであろう。
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、いくつかのＲＮＡウイルスまたはウシパピローマウイルスのようなウイルスから誘導される発現ベクターが、組換え体ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２タンパク質をコードしているヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば、腫瘍細胞）内へ送達するために使用されるであろう。コード配列含有組換え体ウイルスベクターの構築に、当業者にはよく知られている方法が使用できる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａ１．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている技術を参照されたい。もしくは、タンパク質配列をコードしている組換え体核酸分子は標的細胞に送達するために裸のＤＮＡまたは再構築系（例えば、リポソームまたは他の脂質系）で使用できる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３８７−８，１９８９を参照されたい）。ヒト遺伝子治療で使用するため、細胞内へプラスミドＤＮＡを直接導入するいくつかの他の方法が存在し、タンパク質へのプラスミドの複合体形成による細胞上の受容体へのＤＮＡの標的化が含まれる。Ｍｉｌｌｅｒ、上記文献を参照されたい。
その最も単純な様式において、遺伝子導入はマイクロインジェクション法により細胞の核内へ微量のＤＮＡを単純に注入することにより実施できる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−８８（１９８０）。一度組換え体遺伝子が細胞内に導入されたら、それらは転写および翻訳のための細胞の普通の機構により認識され、遺伝子産物が発現されるであろう。多数の細胞にＤＮＡを導入するための別の方法も試みられてきた。これらの方法には：ＤＮＡがＣａＰＯ4で沈澱されピノサイトーシスにより細胞内へ取り込まれるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２（１９８７））；膜に穴を誘導するために細胞を高電圧パルスに暴露するエレクトロポレーション（Ｃｈｕ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：１３１１−２６（１９８７））；ＤＮＡが脂溶性担体内に包まれ、それが標的細胞と融合するリポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７（１９８７））；および小さな弾丸へ結合されたＤＮＡを用いる粒子衝撃法（Ｙａｎｇ  ＮＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：９５６８−７２（１９９０））が含まれる。細胞内へＤＮＡを導入するための別の方法は、ＤＮＡを化学的に修飾したタンパク質と結合させることである。
アデノウイルスタンパク質はエンドソームを不安定化でき、細胞内へのＤＮＡの取り込みを促進することが示されている。ＤＮＡ複合体含有溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋試薬を用いたアデノウイルスへ共有結合で結合されているポリリジンへのＤＮＡの結合は、組換え遺伝子の取り込みおよび発現を本質的に改良する。Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ  ｅｔ．ａ１．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２４７−５２（１９９２）。
本明細書で使用される場合、”遺伝子導入”とは外来核酸分子を細胞内へ導入する過程を意味している。遺伝子導入は遺伝子によりコードされている特定の産物の発現を可能にするために普通行われる。産物にはタンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺伝子導入は培養細胞でまたは動物への直接投与により実施できる。一般的に、遺伝子導入には非特異的または受容体仲介相互作用により核酸が標的細胞と接触する過程、膜を通してまたはエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込み、および原形質膜またはエンドソームからの細胞質内への核酸の放出が含まれる。加えて、発現には細胞の核内への核酸の移動および転写のための適当な核因子への結合が必要であろう。
本明細書で使用される場合、”遺伝子治療”とは遺伝子導入の一つの形であり、本明細書で使用される遺伝子導入の定義に含まれており、インビボまたはインビトロで、特に細胞から治療用生成物を発現させるための遺伝子導入を意味している。遺伝子導入は生体外で細胞に実施でき（それは次に患者に移植される）、または患者に核酸または核酸−タンパク質複合体を直接投与しても実施できる。
別の好適な態様において、ＡＵＲ−１および／またはＡＵＲ−２をコードしている核酸配列を持つベクターが提供され、核酸配列は特定の組織で発現される。組織特異的遺伝子発現の方法は１９９２年１１月３日に出願され、１９９３年５月１３日に公開された国際特許出願第ＷＯ  ９３／０９２３６号に示されている。
前に示したすべての前記ベクターにおいて、本発明のさらなる特色は、ベクターに含まれている核酸配列が、前に定義したように核酸の配列の多少またはすべてに付加、欠失または修飾を含んでいることである。
別の好適な態様において、遺伝子置換の方法が示されている。本明細書で使用される場合、”遺伝子置換”とは動物においてインビボで発現されることができる核酸配列を供給することを意味しており、それにより動物において失われたまたは欠陥のある内因性遺伝子の機能を提供または増大させる。
実施例
以下の実施例は本発明を制限するものではなく、単に本発明の種々の態様および特色を表すものである。以下の実施例は新規タンパク質ＡＵＲ−１およびＡＵＲ−２の単離および特性付けを示している。
プロテインキナーゼは数百の既知の構成酵素を持つ、真核生物タンパク質の最も大きなファミリーの一つである。これらのタンパク質は、共通触媒コア構造から成る１２の異なったサブドメインへ副分割できる２５０−３００のアミノ酸ドメインを共有している。これらの保存タンパク質モチーフはＰＣＲに基づいたクローニング法を用いて利用され、既知のキナーゼの著しい拡大を導いた。プロテインキナーゼの触媒ドメインにおける配列の多アラインメントおよび続いての系統的分析は系統樹へのそれらの分離を可能にした。このようにして、関連するキナーゼはチロシンキナーゼ、サイクリック−ヌクレオチド依存性キナーゼ、カルシウム／カルモデュリンキナーゼ、サイクリン−依存性キナーゼおよびＭＡＰ−キナーゼ、ならびにいくつかの他の定義があいまいなサブファミリーを含む異なった枝またはサブファミリーにまとめられる。
最初に、チロシンキナーゼの異なったファミリーを示す受容体であるＣＣＫ４の同族体の同定に着手した。多アラインメントはＣＣＫ４は受容体チロシンキナーゼのＲＯＳおよびＴＲＦ−ファミリーに最も密接に関係していることを示した。我々はこれらの受容体のキナーゼサブドメインＩおよびIX内の保存配列に対する縮重したプライマーを設計した。サブドメインＩはキナーゼドメインのＮ−末端にあり、保存モチーフＧＸＧＸＸＧＸＶを含んでおり、それはすべての種類のキナーゼの触媒ユニットへＡＴＰをつなぎ止めることに関係している。サブドメインIXはほとんど不変のＡｓｐを含んでおり、それはサブドメインVIＢ中の残基へ結合することにより触媒ループを安定化するために働いている。この不変Ａｓｐおよび隣接するアミノ酸はセリン／スレオニンキナーゼ（ＤＸＷＡ／ＳＸＧＩ／Ｖ）からチロシンキナーゼ（ＤＶＷＳＹ／ＦＧＩ／Ｖ）を区別するものとしてＰＣＲ−クローニング法でしばしば使用される。すべての既知のプロテインキナーゼの比較に基づいて、ＰＣＲでＣＣＫ４およびそのニワトリ同族体ＫＬＧのみを拾い出すであろうサブドメインＩおよびIXに対する縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
我々は、ポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた新規キナーゼの同定に使用するため、ＣＣＫ４のキナーゼドメイン内の保存残基に基づいた縮重プライマーＡおよびＤＶＷを設計した。鋳型としてＨＥＰＭ細胞ｓｓｃＤＮＡに適用した場合、ＣＣＫ４の多コピーならびに他のキナーゼに相同性を持つ５６７ｂｐの新規ＤＮＡ断片（４３−４３）が単離された。新規配列はショウジョウバエオーロラキナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号＃Ｘ８３４６５）に最も類似しており、そのクローンはヒトオーロラ１と名付けられた。この断片をプローブとして用い、多数の結腸癌細胞株からのＲＮＡをスクリーニングしたところ、腫瘍細胞のオーロラ１発現における明かな選択性を示した。
オーロラ１プローブはまた、オーロラ１の完全読み取り枠に拡がる重複クローンを単離するため、ヒト膵臓癌細胞株ｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにも使用された。単離された複数のクローンの内、７つがヒトオーロラ１に対応していた。このスクリーニングの間にさらに二つの微かにハイブリダイズするクローンも単離され、配列分析によりそれらは関連する、しかし異なったキナーゼに対応していることが明らかにされ、ヒトオーロラ２と名付けられた。
ＣＯＳ細胞中で発現された組換え体オーロラ１およびオーロラ２は３９，０００および４６，０００の明らかなＭｒで移動し、それらの一次アミノ酸配列に基づいて予期される３９２６４および４６７００の分子量と一致した。この分析は、組換えタンパク質が哺乳類細胞で安定に産生できることを確立した。この推定キナーゼの標的特異性を決定するためのリン酸化アッセイは進行中である。
細胞内の内因性および組換えオーロラの発現を局所に制限するためＡＵＲ１およびＡＵＲ２のＮ−末端ドメインからのペプチド配列に対する特異的免疫試薬がウサギで発生された。さらに、これらの試薬はオーロラの正常な生物学的役割をよりよく理解するため、オーロラの基質を同定する試みに使用できる。
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の優先陰性および構成的活性形は、これらの推定セリン／スレオニンキナーゼのオブレーションまたは過剰発現の生物学的結果を詳細に叙述するために有用であろう。改変ＤＮＡ構築物を用いた最初の研究は、ＡＵＲ１およびＡＵＲ２レトロウイルス保存物でＮＩＨ３Ｔ３またはＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を感染させたちょうど２時間後に細胞が多核化していることを示している。この表現型は持続し、感染２日後にはいくつかの細胞は２０ほどの核を持っていることが観察された。多核化細胞は典型的には増加した細胞質および広がった細胞境界を持っていた。アクチンおよびＤＡＰＩ両方での免疫染色により、これらの核はすべて一つの細胞内に含まれており、およびアクチン細胞骨格は明らかに正常であることが確認された。進行中の実験で核内の染色体含量および無損傷、中心体の数および位置、および微小管ネットワークの一般的構成について取りかかっている。
正常、構成的活性および優先陰性の長期のＡＵＲ１およびＡＵＲ２発現の結果、および特にこれらが逆の細胞形質転換を誘導するかどうかの特性付けは検討中である。これらの組換えタンパク質を発現する安定なクローンは単離されている。これらは増殖速度、ＤＮＡ合成、細胞接触阻害（細胞増殖巣形成）、固着−非依存性増殖（軟寒天アッセイ）、およびヌードマウスにおける腫瘍形成性について特性付けされるであろう。
オーロラは哺乳類中心体複製および分離において如何なる役割を果たしているのであろうか？  そのような機能の破壊または下方制御は、酵母、ショウジョウバエおよび両生類において中心体誤分離、単極紡錘体および非対照核分裂を起こすことが知られている。ヒトオーロラおよび酵母ＩＰＬ１およびショウジョウバエオーロラ間の相同性は印象的である。それ故、ヒトオーロラが酵母ＩＰＬ１の機能的均等物であるかどうかを評価することが望まれた。酵母ＩＰＬ１遺伝子はサッカロミセス  セレビジエにおいて高い適合度の染色体分離を要求し（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４７３１−４７４０，１９９４）、温度感受性突然変異体が単離されている。ヒトオーロラの種々の完全長およびキメラ体が酵母においてこの温度感受性突然変異体を補足できるかどうかを決定することが計画された。ＩＰＬ１のＮ−末端ドメインおよびヒトオーロラのキナーゼドメインを含むキメラ構築物は、あまりよくは保存されていないＮ−末端ドメインにより仲介される潜在的制御または細胞内局在化の役割を避けながら、本キナーゼが機能的均等物であるかどうかを決定することを可能にするであろう。もしヒト遺伝子がＩＰＬ１機能の喪失を補償するならば、そのような株をヒトオーロラキナーゼの小分子阻害剤のスクリーニングに使用できる。
実施例１：分子クローニング
正常ヒト前立腺、十二指腸、卵巣、肝臓、脳下垂体、脳、胸腺および唾液腺から、ヒトＨＥＰＭ細胞（口蓋間葉）から、原発ヒトウィルム腫瘍および卵巣癌腫から、および結腸／直腸（ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＳＷ１４６３、ＳＷ１４１７ＳＷ８３７、ＳＷ９４８、ＳＷ６２０、ＳＷ４０３、ＳＷ１１１６、Ｔ８４、ＨＴＣ１５、ＬＳ１２３およびＣａｃｏ−２）、腎臓（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２）、肝臓（ＳＫ−ＨＥＰ−１）、膵臓（ＨＳ７６６Ｔ，ＡＳＰＣ，Ｃａｐａｎ−１）、および乳房（ＭＣＦ７）起源のヒト腫瘍細胞株からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉのグアニジン塩／フェノール抽出プロトコール（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７））を用いて全ＲＮＡが単離された。
これらのＲＮＡはＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），ＦＯＣＵＳ  １１，６６）から購入されたＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓキットのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、使用説明書に推奨されている条件下で一本鎖ｃＤＮＡを発生させるための鋳型として使用された。典型的な反応では、１０μｇの全ＲＮＡまたは２μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡと１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）、12-18が６０μｌの反応液容量で使用された。生成物はＲＮａｓｅＨで処理し、Ｈ2Ｏで１００μｌに希釈された。続いてのＰＣＲ増幅のためには、これらのｓｓｃＤＮＡの１−４μｌが各々の反応に使用された。
オリゴヌクレオチドは確立されたホスホロアミダイト化学を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  ＤＮＡ合成機で合成され、エタノールによる沈澱後、精製しないで使用された。縮重オリゴヌクレオチドプライマーは：Ａ  ＝  ５’−ＧＡＲＴＴＹＧＧＮＧＡＲＧＴＮＴＴＹＹＴＮＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：１６）（センス）および
ＤＶＷ  ＝  ５’−ＡＧＮＡＣＮＣＣＲＡＡＮＧＣＣＣＡＣＡＣＲＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１７）（アンチセンス）である。
これらのプライマーは各々ペプチド配列ＥＦＧＥＶＦＬＡ（配列ＩＤ番号：１８）（キナーゼサブドメインＩからのセンス鎖）およびＤＶＷ（Ａ／Ｓ）ＦＧＶＬ（キナーゼサブドメインIXからのアンチセンス鎖）から誘導された。縮重したヌクレオチド残基名称はＮ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；およびＹ＝ＣまたはＴである。鋳型としてＣＣＫ４を用い、これらのプライマーは５６７ｂｐの生成物を産生する。
上に掲げた一本鎖に適用されたプライマーＡおよびＤＶＷを用いて、ＰＣＲ反応が実施された。１０ｍＭ  トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭの各々のデオキシヌクレオシド三リン酸、０．００１％ゼラチン、および１．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）、および１−４μｌ  ｃＤＮＡを含有する混合物に、各々５μＭの最終濃度になるようにプライマーが加えられた。３分の９５℃での変性に続いて、循環条件は最初の３サイクルが９４℃で３０秒、３７℃で１分、７２℃へ２分で上昇、７２℃で１分であり、続いての３５サイクルは９４℃で３０秒、５０℃で１分、および７２℃で１分４５秒であった。５００−６００ｂｐ間に移動したＰＣＲ断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離し、使用説明書に従ってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）内へＴ−Ａクローン化した。
Ｑｉａｇｅｎカラムを用いてミニプラスミドＤＮＡ調製試料のためにコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡはＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むサイクルシークエンシング色素−ターミネーターキットを用いて配列決定した。配列決定反応生成物はＡＢＩＰｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーにかけ、ＢＬＡＳＴアラインメント互除法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて分析した。新規クローン（＃４３−４３）は鋳型としてヒト胚口蓋間葉（ＨＥＰＭまたはＣＲＬ１４８６）からの一本鎖ｃＤＮＡに対するプライマーＡおよびＤＶＷでのＰＣＲにより単離された。このクローンはその後ヒトオーロラ１の断片であることが示された。
ラムダＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ｃＤＮＡライブラリーは第一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として膵臓癌腫細胞株のプールからのｍＲＮＡを用いて構築された。０．１ｍｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡを加えた、６ｘＳＳＣ、１ｘデンハルト試薬、０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、ヒトオーロラ１をコードしているｐ４３−４３からのランダムプライム32Ｐ−標識挿入物（２ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌ）でファージをニトロセルロースフィルター上でスクリーニングした。６５℃で一夜ハイブリダイゼーション後、フィルターを６５℃にて０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。完全長ｃＤＮＡクローンは両方の鎖について、Ｔ７ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーでの手による配列決定（Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４７６７−７１）を用いて配列決定された。
実施例２：ノーザンブロット分析
荷電修飾ナイロン膜上の、１６の異なった成人ヒト組織（脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸粘膜、心臓、脳、胎盤、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓および末梢血白血球）、４つの異なったヒト胎児組織（脳、肺臓、肝臓および腎臓）、および８つのヒト癌細胞株（ＨＬ６０、ヒーラー、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０およびＧ３６１）からのノーザンブロット（レーン当たり２μｇのポリＡ+ＲＮＡを含んでいる）はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から入手した。追加のノーザンブロットはヒト腫瘍細胞株から単離された１０μｇの全ＲＮＡを変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に移すことにより調製された。
ヒトオーロラ１クローン４３−４３からの５２７ｂｐ挿入物かまたはｐＳＧ２０からの１１６２ｂｐＥｃｏＲＩ断片、およびヒトオーロラ２クローン１１−１Ａの１ｋｂＥｃｏＲＩ断片かまたはｐＳ６２１からの１２５７ｂｐＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片から合成された無作為開始［32Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブでフィルターをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１ｘデンハルト試薬、１００ｍｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中、１−２ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ−標識ＤＮＡプローブを加え、６０℃にて一夜実施された。フィルターは６５℃にて０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−２フィルムに一夜暴露した。
約１．４ｋｂの単一のＡＵＲ１  ｍＲＮＡ転写体が同定され、胸腺および小腸に最も豊富にあり、睾丸、卵巣、結腸、胎盤および脾臓は弱い信号を与えることが観察された。前立腺および末梢血白血球は陰性であった。ヒト胎児肝臓および腎臓もまた陽性であり、より弱い信号が胎児肺で観察され、胎児脳での発現は観察されなかった（表）。
ヒトＡＵＲ２発現の同様な分析はより制限された発現プロフィールを示した。単一の２．４ｋｂ  ＡＵＲ２転写体が成人睾丸および胸腺で検出され、［心臓、胎盤、骨格筋］および胎児肝臓および腎臓では弱く、一方、他の正常組織では陰性であった（表参照）。
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ＡＵＲ１キナーゼドメイン中の配列からのプライマーを用いるノーザン分析および半定量的ＰＣＲアッセイにより、いくつかの原発腫瘍および多様な新生物起源の多数の細胞株でＡＵＲ１  ｍＲＮＡ発現プロフィールが決定された。結果は表に含まれている。ＡＵＲ１転写体はアッセイされたすべての腫瘍株で検出され、いくつかのヒト結腸癌細胞株（ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ３２０、ＳＷ６２０、ＳＷ１４１７、Ｃａｃｏ２、ＳＷ１２４１７）および肺癌腫（Ｃａｌｕ３）、乳癌腫（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７）、メラノーマ（Ａ３７５）、腎臓癌腫（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２）、肝臓癌腫（ＳＫ−ＨＥＰ−１）および神経腫瘍（ＳＦ７６７、Ｔ９８Ｇ）で最も高く発現されていた。ＡＵＲ−１のより低い発現は他の結腸癌腫（ＨＴＣ１５、Ｔ８４、ＳＷ９４８、ＳＷ１１１６、ＨＴ２９）、神経腫瘍（Ｄａｏｙ）、卵巣癌腫（Ｏｖｃａｒ３、原発腫瘍）、膵臓癌腫（ＨＳ７６６Ｔ）および原発腎臓癌腫で観察された。
腫瘍細胞株におけるＡＵＲ２発現プロファイルは、ＡＵＲ１よりも著しくより限られていた。ＡＵＲ２の強い発現は結腸癌腫細胞株（Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８０、ＳＷ１４１７、ＳＷ６２０）に限られる一方、弱い信号は他の結腸（ＨＴＣ１５、Ｃｏｌｏ３２０）、乳房（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７）および肺（Ｃａｌｕ３）腫瘍細胞株で観察された。いくつかの他の腫瘍株は検出可能なＡＵＲ２転写体を持っていなかった。
実施例３：オーロラ１の半定量的ＰＣＲ検出
ＲＮＡは種々のヒト細胞株、新鮮な凍結組織および原発腫瘍から単離された。一本鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用し、上記のように１０ｍｇの各々のＲＮＡから合成された。これらの一本鎖鋳型は次に二つのオーロラ１−特異的オリゴヌクレオチド（３４７６：５’−ＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号：１９）および３５０６：５’−ＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：２０））とともに３５サイクルのＰＣＲ反応で使用した。反応生成物は２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色してＵＶ光箱上で写真に撮った。各々の試料に対して〜４７５ｂｐオーロラ１特異的バンドの相対強度が見積もられた。
実施例４：サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡは標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら）を使用して種々の形質転換されたヒト細胞株（ＣａＣＯ２、ＨＴＣ１５、ＬＳ１４７Ｔ、ＳＫＣＯ４、ＳＷ４８０、ＳＷ４０３、ＳＷ６２０、ＳＷ９４８、ＳＷ１４１７、ＳＷ１１１６、ＭＣＦ７、ＢＴ４７４）から単離された。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄して消化緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）に〜１０8細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞は５０℃で１２時間のインキュベーションにより溶解し、続いてフェノール／クロロホルムで抽出し、等量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１００％ＥｔＯＨで沈澱させた。ＤＮＡはＴＥ緩衝液に再懸濁した。約２０マイクログラムのゲノムＤＮＡは、ＨｉｎｄIIIまたはＸｈｏIIにより３７℃で少なくとも４時間消化した後、１％アガロースゲルで分画した。ＤＮＡ断片をキャピラリー移動法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ９８：５０３，１９７５）によりニトロセルロース膜に移し、上記ノーザンブロット分析で説明したようにヒトオーロラ１およびオーロラ２−特異的プローブとハイブリダイズさせた。
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２  ｃＤＮＡは両方ともＨｉｎｄIII制限酵素で認識される一つの部位を含んでいるので、ＤＮＡはＨｉｎｄIIIで制限分解された。ＡＵＲ１はすべての起源のものから等しい強度の単一４．３ｋｂバンドを示し、それはアッセイされた多数の腫瘍型中の単一コピー、非転位遺伝子であることを示唆している。しかしながら、低ストリンジェンシー条件下では、ＡＵＲ１プローブへ弱くハイブリダイズする１．３ｋｂおよび３．２ｋｂ  ＳａｃＩ断片が検出できた。クローニングおよび配列決定により、この領域は多数のフレームシフトを持つ、イントロン無しのＡＵＲ１関連偽遺伝子（ＡＵＲ３と名付けられた）をコードしていることが明らかにされた。さらに、ＡＵＲ３偽遺伝子のすぐ上流は非常に安定なヘアピンループを形成することが予測される複雑な逆方向反復を持つ領域である。ＡＵＲ３  ＤＮＡ配列はＡＵＲ１と相同であり、ＡＵＲ１  ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドから始まっている。この部位のすぐ上流はＡＵＲ３の予測されるヘアピンループである。ＡＵＲ３への相同性がこのヌクレオチドから上流に続くのかどうか、およびＡＵＲ１  ｃＤＮＡが同様のヘアピンループを含んでいるのかまたはそれが前に置かれているのかどうかを決定するために、現在ＡＵＲ１ゲノムクローンの特性付けを行っている。ＡＵＲ２は７．０ｋｂおよび４．３ｋｂにバンド、およびすべての起源のものから〜１０ｋｂに微かではあるがより高分子量のバンドを示した。これらのデータはＡＵＲ２もまた単一コピー遺伝子であることを示唆している。ＡＵＲ２で探索したブロットで観察された多数のバンドは、完全長ｃＤＮＡプローブが使用されたことによるものであろう。
実施例５：ヒトオーロラ１およびオーロラ２をコードしているｃＤＮＡクローンの配列分析
ヒト膵臓癌腫ライブラリーから、正常ヒト十二指腸から各々単離された完全長クローンから、およびＨＥＰＭ細胞から単離された部分ヒトオーロラ１から、ヒトオーロラ１およびオーロラ２の全配列が決定された。
１，２４４ｂｐヒトオーロラ１（ＡＵＲ１＿ｈ）ヌクレオチド配列が配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示されており、３４４アミノ酸のポリペプチドをコードしている一つの読み取り枠を含んでいる。ＡＵＲ１＿ｈコード領域には５４ヌクレオチドの５’−非翻訳領域および１３２ヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部で終わる３’−非翻訳領域が隣接している。
２，１９８ｂｐヒトオーロラ２（ＡＵＲ２＿ｈ）ヌクレオチド配列が配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に示されており、４０３アミノ酸のポリペプチドをコードしている一つの読み取り枠を含んでいる。ＡＵＲ２＿ｈコード領域には２００ヌクレオチドの５’−非翻訳領域および７６８ヌクレオチドの３’−非翻訳領域が隣接している。
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２  ｃＤＮＡの配列はヒト膵臓腫瘍および正常ヒト十二指腸の両方で配列決定され、いくつかの多形らしい部位を除いて配列の相違はなかった。これらのあいまい性には以下の点が含まれている：
0003944241.tif 000006
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２のＣ−末端は真核生物プロテインキナーゼに特徴的な１２のサブドメインすべてを保存している。このＡＵＲ１およびＡＵＲ２キナーゼドメインにはＮ−末端が先立っており、各々７４および１３０のアミノ酸である。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２ヌクレオチドおよび演繹されるアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４）と利用可能なＤＮＡおよびタンパク質配列データベースの比較は、いくつかの高い配列同一性を共有するＥＳＴ配列を除いて独特であることを示している。しかしながら、それらはＮ−末端および触媒ドメインの両方でショウジョウバエオーロラおよびサッカロミセス  セレビジエＩＰＬ１遺伝子と著しい相同性を持っている。さらに、二つの出版されていないデータベース記載事項はアフリカツメガエルからの同族体に近いようである（ｐ４６ＡＰＫ−ＧＢ寄託番号＃Ｚ１７２０６およびｐ４６ＢＰＫ−ＧＢ寄託番号＃Ｚ１７２０７）。
ヒト、カエル、ショウジョウバエおよび酵母からのオーロラのＮ−末端ドメインは限られた配列同一性を共有している。必要とされるＡＵＲ２は豊富なグルタミン酸を持っており、一つの残基で分離された対としてしばしば存在している。
これらのタンパク質の触媒ドメインの比較は、ＡＵＲ１はＡＵＲ２と７０％のアミノ酸同一性を共有し、ショウジョウバエオーロラとは６１％および酵母ＩＰＬ１遺伝子とは４５％を共有している。ＡＵＲ２は、ショウジョウバエオーロラとは６０％および酵母ＩＰＬ１遺伝子とは４５％を共有している。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は両方とも他の既知のすべての哺乳類キナーゼとは４５％未満の相同性しか共有せず（最も近いのはｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼである）、これらショウジョウバエおよび酵母キナーゼの同族体であることを示唆している。
ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は両方とも、ショウジョウバエおよび酵母キナーゼの同族体で保持されており、およびサイクリン依存性キナーゼｐ３４ｃｄｃ２中の既知の制御部位であるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を含んでいる（ＡＵＲ１のＴＨＲ２３２およびＡＵＲ２のＴＨＲ２８８）。ＡＵＲ２は追加のＰＫＡ部位をＳＥＲ３４２に含んでいる。両方のタンパク質はまた多数のカゼインキナーゼII（ＡＵＲ１およびＡＵＲ２に対し５および６）およびプロテインキナーゼＣ（ＡＵＲ１およびＡＵＲ２に対し４および１０）リン酸化部位を持っている。ＡＵＲ２はまたＴＹＲ３４４にチロシンリン酸化共通部位も持っており、それはまたショウジョウバエオーロラでは保存されているが、ＡＵＲ１または酵母ＩＰＬ１には存在しない。
興味をそそることに、ショウジョウバエオーロラＡＵＲ＿ｄｍおよび酵母ＩＰＬ１遺伝子の天然の突然変異体は、非対照核分裂を生じ、中心体誤分離および異型性単極紡錘体を導く。この表現型は中心体分離の失敗から生じるようである。関連する微小管構築は影響されないようである。ショウジョウバエおよび酵母両方の天然の突然変異体はヒトオーロラとの間で厳密に保存されているアミノ酸残基を標的としており、さらにこれらが機能的同族体であることを支持している。ＡＵＲ＿ｄｍまたはＩＰＬ１の天然の突然変異体で観察されるＡＵＲ１中の対応する残基はＧＬＵ１２５、ＴＨＲ２３２、ＰＲＯ３１２、ＨＩＳ３２４である。これらの突然変異のすべてが触媒ドメイン内に存在し、および、とりわけ一つは保存ＰＫＡリン酸化部位を示している。ＡＳＰ４７でのＡＵＲ＿ｄｍ中の別の突然変異はＮ−末端ドメインの非保存残基に存在している。
これらの発見は、この触媒活性が実際に、下等生物体の中心体複製または分離の生物学に中心的役割を果たすであろうことを示唆し、およびヒトオーロラは哺乳類細胞において補足的な役割を果たすであろうことを示唆している。
実施例６：オーロラの組換え体発現およびオーロラ２発現ベクター構築
発現構築物がＰＣＲ補助突然変異発生により発生され、そこでオーロラ１およびオーロラ２の全コードドメインはそのカルボキシ末端がインフルエンザ菌ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ（配列ＩＤ番号：２１）（Ｐａｔｉ，１９９２）で標識された。これらの構築物は二つの哺乳類発現ベクター内へ導入された：ウイルス産生株の発生のためのｐＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．＆  Ｒｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７，９８０−９８８，１９８９）；および過渡的発現分析のためのｐＲＫ５。挿入物は特異的ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位が隣接するように設計され、５’−ＢａｍＨＩおよび３’−ＮｏｔＩ部位でｐＬＸＳＮまたはｐＲＫ５内へ直接クローン化された。
ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ完全長ＡＵＲ１およびＡＵＲ２構築物はまたｐＲＳ３１６（Ｌｉｕ，ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３２：６６５−６７３，１９９２）内にも結合された。このベクターはサッカロミセス  セレビジエでの発現のための動原体シャトルベクター中にガラクトース誘導可能プロモーターを含んでいる。これらはヒト遺伝子が関連する温度感受性酵母ＩＰＬ１突然変異体（ＡＵＲ１に密接に関連している）を補足するかどうかを評価するものである。加えて、ＡＵＲ１およびＡＵＲ２のＣ−末端キナーゼドメインへ融合された酵母ＩＰＬ１のＮ−末端ドメインを含んでいる融合構築物を発生させた。これらはキナーゼのキナーゼドメインの５’末端にある人工的ＣｌａＩ部位を保存Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ配列に挿入して生成させた。
優性陰性ＡＵＲ１およびＡＵＲ２構築物はまたＰＣＲ突然変異発生により不変Ｌｙｓ（ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の各々アミノ酸位置１０６および１６２）からＭｅｔへの突然変異によりｐＬＸＳＮおよびｐＲＫ５の両方で作製された。構築物はＡＵＲ１ＫＭおよびＡＵＲ２ＫＭと名付けられた。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の構成的活性形はリン酸化部位（２３２および２８８）をコードしているＤＮＡの先頭に立つＤＮＡをＡｓｐに突然変異させることにより発生され、ＡＵＲ１ＴＤおよびＡＵＲ２ＴＤが得られた。
ｐＬＸＳＮおよびｐＲＫ５両方の発現ベクターはまた、ただＮ−末端ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の非触媒ドメインを含むようにしても作製された。これらは親構築物からＰＣＲにより発生され、ＡＵＲ１のＮ−末端の７７アミノ酸およびＡＵＲ２の１３２のアミノ酸を含んでいる。
開始メチオニンを除いた全ＡＵＲ１およびＡＵＲ２読み取り枠（ＨＡ標識なし）はＰＣＲにより発生され、抗体産生のため、ウサギの免疫化のためのＧＳＴ融合タンパク質の細菌産生のため、ｐＧＥＸベクター内へ結合された。
実施例７：ウイルス産生オーロラ細胞株の発生
高力価ウイルス貯蔵物を作るため、ＡＵＲ１かまたはＡＵＲ２を含んでいるｐＬＸＳＮ組換え構築物がＣａＣｌ2媒介トランスフェクションを用いて両栄養性ヘルパー細胞株ＰＡ３１７内へトランスフェクトされた。Ｇ４１８上での選択後、細胞はＧ４１８を含んでいない通常培地に播種された（５００μｇ／ｍｌ）。耐性細胞からの上清液が環境栄養性ヘルパー細胞株ＧＰ＋Ｅ８６を感染させるのに使用され、細胞は再びＧ４１８上で選択された。耐性細胞は再びＧ４１８を除き、上清液を８−１２時間毎に採取してウイルス貯蔵物としてプールした（Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ｎ．，Ｈｏｌｔｚｍａｎｎ，Ｂ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．Ｆ．，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．，＆  Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４９１−４９８，１９９２）。ウイルス貯蔵物力価は典型的には〜１０6／ｍｌであった。
実施例８：オーロラを含むＮＩＨ−３Ｔ３細胞のレトロウイルス感染
ＮＩＨ−３Ｔ３およびＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞は１００ｍｍのプレート中、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。細胞は、約３ｍｌのウイルス上清液を１５ｍｌの培養培地に約２４時間加えることによりＡＵＲ１およびＡＵＲ２レトロウイルスで重感染させた。レトロウイルス構築物を発現している細胞は、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで増殖させることにより選択された。
実施例９：オーロラ特異性免疫試薬の発生
オーロラ特異性免疫試薬は、ＡＵＲ２のＮ−末端領域（104ＳＡＰＥＮＮＰＥＥＱＬＡＳＫ117）（配列ＩＤ番号：２２）および（90ＲＰＬＮＮＴＱＫＳＫＱＰＬ102）（配列ＩＤ番号：２３）またはヒトＡＵＲ１のＮ−末端またはＮ−末端ドメイン（1ＭＡＱＫＥＮＳＹＰＷＰＹＧ13）（配列ＩＤ番号：２４）および（53ＰＧＱＫＶＭＥＮＳＳＧＴＰ65）（配列ＩＤ番号：２５）に対応するＫＬＨ−結合合成ペプチドに対してウサギで上昇させた。別の免疫試薬は細菌で発現された完全長ＡＵＲ１およびＡＵＲ２  ＧＳＴ−融合タンパク質でウサギを免疫することにより発生させた。
実施例１０：哺乳類細胞におけるオーロラの過渡的発現
ＨＡ−標識ＡＵＲ１およびＡＵＲ２遺伝子を含むｐＲＫ５発現プラスミド（１０μｇＤＮＡ／１００ｍｍプレート）がリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲ  Ｌ）でＣＯＳおよび２９３細胞内へ導入された。７２時間後、細胞を０．５ｍｌの可溶化緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭフェニルメチルスルホニル  フルオリド、１μｇ／ｍｌアプロチニン）に採取した。試料の一部を１５％アクリルアミド／０．５％ビス−アクリルアミドゲルでのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分け、電気泳動的にニトロセルロースに移した。非特異的結合はＢｌｏｔｔｏ（５％ｗ／ｖ脱脂乾燥ミルクおよび０．２％ｖ／ｖノニデットＰ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝液）中でブロットを前もってインキュベートすることにより阻止し、組換えタンパク質はＨＡデカペプチド標識に対するマウスＭａｂを用いて検出した。もしくは、組換えタンパク質は種々のＡＵＲ１−またはＡＵＲ２−特異的抗血清を用いて検出できる。
実施例１１：ミエリン塩基性タンパク質はオーロラ１およびオーロラ２キナーゼの人工基質である
方法
ヒト結腸直腸腺癌ＳＷ４８０細胞は１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０で培養された。ＳＷ４８０細胞のコンフルエント培養物は氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、１ｍｌの氷冷ＰＢＳ内へこすり落とした。細胞は４℃、１，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＰＢＳを吸引して除き、得られたペレットは−８０℃で保存した。３つの１５ｃｍプレートからのペレットを氷上で融解し、総計で１ｍｌのキナーゼ溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ3、０．５％ＮＰ４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン）に再懸濁し、４℃で２０分間穏やかに回転させた。試料は次に４℃にて１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離し、得られた上清をきれいな１．５ｍｌ遠心管へ移し、氷上に保った。タンパク質濃度はブラッドフォード分析により決定した。１ミリグラムのタンパク質を総タンパク質は４℃にて１５分間、１０μｌのプロテインＡ−セファロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で前もってじゃまものを取り除き、続いて２μｌのウサギ前免疫血清、アフィニティー精製オーロラ１ペプチド抗血清、アフィニティー精製オーロラ１ペプチド抗血清と６μｇの競合オーロラ１ペプチド、アフィニティー精製オーロラ２ペプチド抗血清、または、アフィニティー精製オーロラ１ペプチド抗血清と６μｇの競合オーロラ２ペプチドを加え４℃にて３０分インキュベートした。その後、１０μｌのプロテインＡ−セファロースを加えてインキュベーションをさらに４℃で４５分間続けた。遠心管は手短に遠心して抗体−プロテインＡ−セファロース複合体をペレット化し、生じた上清は吸引して取り除いた。抗体−プロテインＡ−セファロースペレットは２回０．５ｍｌのキナーゼ溶解緩衝液で洗浄し、続いて０．５ｍｌのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ3および１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄した。抗体−プロテインＡ−セファロースペレットは５μＣｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよび０．５ｍｇ／ｍｌのミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ）を含む２０μｌのキナーゼ緩衝液に再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした後、１０μｌのタンパク質試料緩衝液（２００ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ６．８、４０％グリセロール、７３０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．４％ＳＤＳおよび０．０５％ブロモフェノールブルー）を加えた。遠心管はよく混合し、１００℃で５分間インキュベートした。試料は１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより可視化された。
結果
オーロラ１およびオーロラ２免疫複合体はミエリン塩基性タンパク質をリン酸化することができた。免疫沈降に競合ペプチドが使用された場合、オーロラ１またはオーロラ２抗血清免疫複合体は前免疫血清対照より以上にミエリン塩基性タンパク質をリン酸化することはできなかった。このことは、観察された活性はオーロラ１およびオーロラ２によるものであり、免疫複合体に存在する他のタンパク質によるものではないことを示唆している。
この観察の結果、キナーゼ活性を追うための基質としてミエリン塩基性タンパク質を使用することにより活性オーロラ１および２キナーゼの精製が可能になるであろう。また、組換えオーロラ１および２タンパク質を用いたインビトロキナーゼアッセイの開発が可能になるであろう。さらに、オーロラ１および２インビトロキナーゼアッセイは、ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化の阻害を測定することにより、オーロラ１および２キナーゼの阻害剤についての小分子の採集物のスクリーニングが可能になるであろう。
本明細書に例示的に説明されている本発明は、本明細書では特には記載されていない要素、制限なしでも適切に実施されるであろう。用いられてきた用語および表現は記述の言葉として使用されており、制限するものではなく、およびそのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴の均等物またはそれらの一部を除外することを意図しているものではないが、しかし、種々の変形が特許請求された本発明の範囲内で可能であることを認識されたい。それ故、本発明は好適な態様および随意の特徴により明確に説明されてきたが、ここに説明された概念の変形および変更は当業者に助けを求められるであろうこと、およびそのような変形および変更は、付随する請求の範囲に定義されているような本発明の範囲内にあると考えられることを理解しなければならない。
前に本明細書において援用されていない参照文献（特許および非特許参照文献の両方を含む）は実際上、明白に本明細書において援用されている。他の態様は以下の請求の範囲内に含まれている。
【配列表】
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