(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ｑ−Ｄ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
（式中、Ｑは、式Ｑ’−Ｏ−ＣＯ−のアシル基（式中のＱ’は、１〜３個炭素原子のアルキル基を示す）を示し、Ｄ−Ｘａａは、３−シクロブチル-Ｄ-アラニン残基或いは３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン残基であり、Ｐｒｏは、Ｌ-プロリン残基であり、そして、Ａｒｇは、Ｌ-アルギニン残基である）のペプチジル−アルギニンアルデヒド誘導体、又はその有機酸或いは無機酸と形成される酸付加塩。
【請求項２】
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド又はその酸付加塩。
【請求項３】
メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド又はその酸付加塩。
【請求項４】
エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド又はその酸付加塩。
【請求項５】
メトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド又はその酸付加塩。
【請求項６】
請求項１に記載されたペプチジル-アルギニンアルデヒド誘導体又はその酸付加塩の少なくとも１つを活性成分として含み、製薬工業上で一般的に使用される担体および／或いは添加剤が混合されたことを特徴とする製薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１に記載されたペプチジル-アルギニンアルデヒド誘導体又はその酸付加塩の少なくとも１つを活性成分として含む製薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載されたペプチジル-アルギニンアルデヒド誘導体又はその酸付加塩の少なくとも１つを活性成分として含む、血栓症および／或いは血閉塞を治療および予防するための製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景技術
本発明は、一般式（Ｉ）；
Ｑ−Ｄ−Ｘａａ−ＰｒＯ−Ａｒｇ−Ｈ
（式中、Ｑは、式Ｑ’−Ｏ−ＣＯ−のアシル基（式中のＱ’は、１〜３個の炭素原子のアルキル基を示す）を示し、Ｄ−Ｘａａは、３-シクロブチル-Ｄ-アラニン残基或いは３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン残基であり、Ｐｒｏは、Ｌ-プロリン残基であり、そして、Ａｒｇは、Ｌ-アルギニン残基である）の新規なペプチジル-アルギニンアルデヒド誘導体、およびその有機酸或いは無機酸と形成される酸付加塩並びにそれを含有する製薬学的な組成物に関する。
一般式（Ｉ）の新規化合物は、特に、抗−凝固特性、抗−血小板特性および抗血栓症特性に、有効な治療効果を有する。
本発明の一般式（Ｉ）の化合物の好適な代表例は、次の誘導体である。
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド、
メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド、
エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド、
メトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド、
およびその有機酸或いは無機酸と形成される酸付加塩、好適には、ヘミスルフェートである。
定義：
アミノ酸、その置換基およびそれから作成されるペプチドの略称は、例えば、Biochem. J. 126, 773（1972）; Biohemistry 14, 449（1975）のような従来技術による。
アミノ酸：
Arg＝Ｌ-アルギニン［（２Ｒ）-２-アミノ-５-グアニジノ-ペンタン酸］、
Asp＝Ｌ-アスパラギン酸［（２Ｓ）-２-アミノ-３-カルボキシプロピオン酸］、
boroArg＝Ｌ-ボロアルギニン［（１Ｒ）-１-アミノ-４-グアニジノ-ブチルボリック酸］、
D-Cba=３-シクロブチル-Ｄ-アラニン［（２Ｒ）-２-アミノ-３-シクロブチルプロピオン酸］、
DL-Cbg＝ＤＬ-シクロブチル-グリシン［（２ＲＳ）-２-アミノ-２-シクロブチル酢酸］、
D-Chg=Ｄ−２-シクロヘキシル-グリシン［（２Ｒ）-２-アミノ-シクロヘキシル-酢酸］、
D-Cpa＝３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン［（２Ｒ）-２-アミノ-３-シクロペンチルプロピオン酸］、
Gla=ガンマ-カルボキシ-Ｌ-グルタミン酸［（２Ｓ）-２-アミノ-４，４-ジカルボキシブチル酸］、
Glu＝Ｌ-グルタミン酸［（２Ｓ）-２-アミノ-４-カルボキシブチル酸］、
Glp＝Ｌ-ピログルタミン酸［（５Ｓ）-２-ピロリドン-５-カルボン酸］、
Gly=グリシン（２-アミノ酢酸）、
D-MePhe＝Ｎ-メチル-３-フェニル-Ｄ-アラニン［（２Ｒ）-２-メチルアミノ-３-フェニルプロピオン酸］、
D-MePhg＝Ｄ-Ｎ-メチル-フェニルグリシン［（２Ｒ）-２-アミノ-２-フェニル酢酸］、
Nal（1）＝３-（ナフチ-１-イル）-Ｌ-アラニン［（２Ｓ）-２-アミノ-３-（ナフチ-１-イル）-プロピオン酸］、
D-Phe＝３-フェニル-Ｄ-アラニン［（２Ｒ）-２-アミノ-３-フェニルプロピオン酸］、
Pro＝Ｌ-プロリン［（２Ｓ）-ピロリジン-２-カルボン酸］
置換基:
Ac＝アセチル、Boc＝ｔ-ブトキシカルボニル、Bz＝ベンゾイル、Eoc＝エトキシカルボニル、Et＝エチル、iPoc＝イソプロポキシカルボニル、Me＝メチル、4MeP＝４-メチル-ペンタノイル、Moc＝メトキシカルボニル、pNA＝ｐ-ニトロフェニルアミノ、Poc＝プロポキシカルボニル、Tos＝ｐ-トルエン-スルフォニル、Z＝ベンジロキシカルボニル
ペプチドおよび誘導体
アミノ酸のみの略号は、各々Ｌ-アミノ酸を示す。Ｄ-アミノ酸は別々に、例えば、３-フェニル-Ｄ-アラニン＝D-Pheと表示される。アミノ酸略号の前及び後のハイフォンは、アミノ基からの無くなった水素或いはカルボキシ基から無くなったＯＨ基を示す。Eoc-D-Cba-Pro-Arg-Hは、エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドを示し、一方、Bz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNAは、ベンゾイル-Ｌ-イソロイシル-Ｌ-グルタミル-グリシル-Ｌ-アルギニンｐ-ニトロアニリドを示す。
既知技術の説明
血液凝固は、生体での保護機構の一部であり、器官壁の損傷が生じたときに、血液凝固が、形成し、死去への出血を予防するものである。更に、血管病気、止血及び凝固因子の病理学的活性化が、血液凝固を引き起こし得る。この場合、器官は、形成された脈管内の血栓及び血栓症進行により、完全に或いは部分的に妨害される。フィブリン溶解は、保護機構の他の部分を示す。ここに、過剰な血液凝固は、血栓症中の酵素沈殿と血栓の溶解によっても除去される。
血閉塞過程は、カスケード反応で、一連の触媒酵素反応であり、そこでは、血漿蛋白質、所謂、凝固因子が連続的に活性化される。その因子は、ローマ数字で示され、活性形は、”ａ”の文字で示される。慣用名も使用され、従って、フィルリノゲン＝因子Ｉ（fl）であり、フィブリン＝因子Ia（fla）である。血清プロテアーゼ（fXlla、fVlla、fXla、flXafXa、fXa及びトロンビン）、いくつかの促進共因子（fVa及びfVllla）及び凝固分子自体（フィブリン）が、すべて凝固過程間に形成され、fXa及びトロンビンは、プロテアーゼ形成の間の最後の２つの因子である。fXaの作用により形成されたトロンビンは、フィブリノゲンの開裂を開始し、フィブリン血栓になる。
血液凝固機構の初期の考え［R.G. MacFarlane, Nature, 202, 498（1964）; E.W. DavieとO.D. Ratnoff, Science, 145, 1310（1964）］に従って、fXは、２つの方法、内因性経路と外因性経路により活性化される。前者では、過程は、変換fXI→fXIaを伴う表面−活性化fXIII［fXIIa］により開始され、反応fIX→fIXaが生じる。fXは、flXaにより活性化される。外因性経路において、過程は、細胞表面レセパターの出現組織因子（TF）及び［fVII＋TF］或いは［fVII＋TF］コンプレックスの展開により開始され、fXは、［fVIIa＋TF］コンプレックスにより活性化される。
生態組織内での血餅の発見法によると、組合せ経路の両方の結果が見つけられる［E.W. Davie等，Biohemistry 43, 10363（1991）］の結果、主工程は、次のようなものである。
１．臓器壁損傷或いは病気の場合に、TFは、表面に移動し、血中を循環する因子VIIの一部を結合する。形成された［fVII＋TF］−コンプレックスは、プロテアーゼ（fXIIa、fXa、fIXa及びトロンビン）の適当な微量の作用により、小部分の血漿因子IX及びX（即ち、少量のfIXa及びfXaが形成される）を活性化する活性酵素コンプレックス［fVIIa+TF］に変換される。次に、TFPI（組織因子経路抑制剤、以前には、リポ蛋白質−付加の凝固抑制剤）の名前の、fXa及び［fVIIa+TF］の両方によりの共通抑制剤の作用により不活性化される［T.J. Girard等，Nature 338, 518〜520（1989）］。
２．因子Ｘと共因子VIIIAと共に生成したfIXaは、Ca++イオンの存在下で、ホスホリド表面（PL）上に、”テナーゼ”コンプレックス［flXa＋fVllla＋fX＋PL＋Ca++］を生成する。fＸは、fＸaに活性化される。
３．この点で生成されたfXaは、プロトロビン（fll）及び共因子Vaと共に、”プロトロンビナーゼコンプレックス”［fXa＋fVa＋fll＋PL＋Ca++］を生成し、それは、”テナーゼ”と同じ構造である。このコンプレックス内側では、プロトロンビンは、トロンビンに変換する。fV→fVa及びfVIII→fVIIIaの変換が、fXa或いはトロンビンのどちらかにより行われる。
４．形成されたトロンビンの少量が、fXIaの一部を酵素fXIaに変換し、因子VII及びVを活性化し、各々fVIIIa及びfVaの量を生成する。今まで、fXIaの因子を、酵素fIXaに変換できる。この工程で、Ｘアーゼ−コンプレックスで開始し、トロンビン形成で終了する鎖反応と概略される。この過程の繰り返すと、増加したトロンビン量が形成される。
５．適切な高いトロンビン濃度において、血漿中に溶解したフィブリノゲンは、部分的に蛋白分解を行う、フィブリンモノマーが、生成され、第１に可溶性フィビリンポリマーに付加され、次に、不可溶性フィブリンポリマーに変換される。ここでも、トロンビンは、fXIIIaとしての役目をし、因子達成重合が、その作用により行われる［L. LorandとK. Konishi, Arch. Biochem. Biophys., 105, 58（1964）］。
不溶性フイブリンポリマーは、血凝固と血栓の主成分であり、他は、トロンビン作用でも第一義的に生成される血液血漿凝集物である。血栓或いは形成の血凝固は、血栓の溶解間に溶液に入るときに、新しい共凝集過程を開始する過程の間に生成されるトロンビンの主成分を取り込むものである［A.K. Gash等，Am. J. Cardiol. 57, 175（1986）: R. Kumar等，Thrombi. Haemost. 72, 713（1994）］。
上記の特徴は、血栓形成中のトロンビンの重要な役目を示す。従って、トロンビンの機能および/或いは形成と関連する、すべての化合物が、血栓症の治療で非常に重要なものである。
病気予防のため、及びトロンボシスの処置のために、現在最も広く且つ成功して用いられる化合物は、ヘパリン類およびビタミンＫ拮抗物質クマリン（例えば、Syncumar及びWarfarin）を生成し、それは、直接のトロンビン抑制剤である。
ヘパリンは、トロンビンとその中性の抑制剤、アンチトロンビン-III（AT-III）の間の反応を触媒する。然し乍ら、ペパリンのこの作用は、AT-IIIの血漿濃度が、正常レベルの７５％以下になると、なくなる［R. Egbring等， Thromb. Haemost. 42. 225（1979）］。また、上記の血栓により結合されたトロンビンが、ヘパリン−AT-IIIコンプレックスに近付けないような間接的機構により、抑制ができないことが重要である［J.I. Weitz等,J. Clin. Invest. 86, 385（1990）］。更に、免疫病理学的な過程による、処置関連の出血及び血栓塞栓症のような副作用は、両方とも無視できない［J.M. Walenga等，Clin. Appl. Thrombosis/Haemostasis, 2（Suppl. 1）, S21〜S27（1996）］。
ビタミンＫ拮抗物質も、経口的に投与でき、その効果は、１６〜２４時間展開する。それは、何かGla−含有の凝固因子（即ち、プロトロンビン）の活性形の展開を抑制する。治療的な効果を部分的に抑制すること（６０〜７０％）が必要であり［M.P. EsnoufとC.V. Prowse, Biochim. Biophys. Acta 490, 471（1977）］、適当な薬剤投与により達成でき。ビタミンＫ抗拮抗物質は、然し乍ら、その狭い治療範囲と強いダイエット組成物への依存性（ビタミンＫ）と多種の個人的な感受性のために使用が困難である。
トロンビンを直接に抑制する第１の高い能力のある合成化合物は、トリペプチドアルデヒドD-Phe-Pro-Arg-H、試験管内でも生体内でも強い抗凝固活性を有する反転抑制剤であった［S. Bajusz等，ペプチド化学、構造と生物学（R. WalterとJ. Meienhofer, Eds.）, Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 603〜608（1975）; Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217（1978）］。D-Phe-Pro-Arg-Hに関連する一連の化合物が合成される。第１のものの１つは、Boc-D-Phe-Pro-Arg-H［S. Bajusz等，Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217（1978）］及び同類のクロロメチルケトン（D-Phe-Pro-Arg-CH2Cl）であり、それらは、非可逆性の抑制剤と証明されている［C. KettnerとE. Shaw, Thromb. Res. 14, 969（1979）］。更に、ペプチドとアシルペプチドは、ボロアルギニン類（D-Phe-及びBoc-D-Phe-乃至Ac-D-Phe-Pro-boroArg）であり、それらは、可能性のある逆転性のトロンビン抑制剤［C. Ketter等，J. Biol. Chem. 265, 18289（1990）］及びBoc-D-Chg-Pro-Arg-Hを含むBoc-D-Phe-Pro-Arg-Hの同類［P.D. Gesellchen及びR.T .Shuman.ヨーロッパ特許出願第0,479,489A2号］である。
水溶液において、D-Phe-Pro-Arg-Hは、同時変換ができると証明されるが、末端アミノ基をメチル化することにより得られ、母化合物の活性を有するが、適当な安定性があると証明されているD-MePhe-Pro-Arg-H（GYKI-14766）である［S. Bajusz等の米国特許第4,703,036号；J. Med. Chem. 33, 1729（1991）］。血液凝固及び血栓形成は、化合物により実験動物中で抑制される［D. Bagdy等，Thromb. Haemost, 67, 357及び68, 125（1992）;J.V. Jackson等，J. Pharm. Exp. Ther. 261, 546（1992）］;フィブリン溶解性の酵素への抑制作用は、無視できる、血栓崩壊剤と共投与すると、血栓の溶解を著しく促進した［C.V. Jackson等，J. Cardiovascular Pharmacol. 21, 587（1993）］、それは、ヘパリン-AT-IIIコンプレックスでは得られない。D-MePhe-Pro-Arg-Hに関連するいくつかの化合物を合成した。例えば、D-MePhe-Pro-Arg-H［R.T. Shuman等，J.Med. Chem. 36, 314（1993）］。
抗凝固活性（即ち、過程の蛋白分解反応の抑制）を、抗凝固性テスト、例えば、トロンビン時間（TT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）及びプロトロンビン時間（PT）テスト［E.J.W. Bovie等，Mayo Clinic Laboratory Manual of Haemostasis; W.B. Saunders Co., Philadelphia（1971）］により測定する。同時の凝固で抑制された血漿は、凝結され、そして、必要な凝結時間を測定する。抗凝固剤の作用の後に、凝固時間は、過程での反応の抑制性に比例して長くなる。抗凝固性効果は、参照物（IC50）に比較して、２倍の凝固時間に伸びるに必要な物質濃度により特徴ずけることができる。個々の凝固性のプロテアーゼへの抗凝固剤の効果は、アミド溶解法により測定される［R. Lottenberg等，Methods in Enzymol. 80, 341（1981）; G. Cleason, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411（1994）］。分離された活性因子（例えば、トロンビン、fXa）及びすのクロモゲン或いはフルオロゲンペプチド−アミド基体は、各々、抑制剤の存在下或いは不存在で、反応される。酵素抑制作用は、アミド分解中に測定された抑制定数（IC50）により特徴づけられる。
TTテストにおいて、凝固は、血漿クエン酸塩に添加されたトロンビンにより開始される。システム２２において、トロンビンのｐモル／mlは、官能的であり、その抑制性は、フィブリノゲン（トロンビンの天然基体の１つ）上で、血漿成分の存在下で測定される。APTT及びPTテストにおいて、完全凝固過程が生じる。活性化剤fXが、外因性或いは内因性の経路のいずれかにより、活性化される。生成したfXaは、プロトロンビンをトロンビンに変換し、そして、逆に、血漿凝固を開始させる。凝固時間は、それらの１つの酵素が、抑制剤により抑制されると、引き伸ばされる。APTTおよびPTテストにおいて、最も大きくて、４０pmol/mlのXaが生成され（これは、両システム中に存在する因子Ｘの全量である）るが、一方、150 pmol/ml（APTT）及び350 pmol/ml（PT）のトロンビンが生成される［B.Kaiser等，Thromb. Res. 65, 157（1992）］。
D-MePhe-Pro-Arg-H（C1）の場合、TT、APTT及びPTテストにおける凝固時間を２倍に伸ばす濃度は、各々、８７、622及び2948 nMになる。これらの値及びテストで同じ機能を果たすトロンビンの量（２２、150、350 pmol/ml）は、同様に上がり、C1は、APTT及びPTの両テストでトロンビン抑制子として機能し、fXaの操作に少ししか影響しないか或いは影響しないものである。これらの結果と良く一致して、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA基体上のトロンビンのアミド溶解効果は、C1により、IC50＝２nM値に抑制され、一方、相当するBz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNA基体上のfXaの効果は、IC50＝９．１nM値で少しの悪影響があるだけである［Bajusz等の刊行されていない］。
血液凝固機構の固有の特徴は、その処理法が、直接のトロンビン抑制子でのみ抑制されるばかりでなく、因子妨害トロンビン形成、即ち、fXa抑制子によっても抑制されることである。tik、TAP（チック抗凝固ペプチド）から分離された６０−員のポリペプチド［L. Waksman等，Science 248, 593（1990）; A.B. Kelly等，Circulation 86, 1411（1992）］及びDX-9065a（C2）、合成非ペプチド、（＋）-（２Ｓ）-２-［４［［（３Ｓ）-１-アセチミドイル-３-ピロリジニル］オキシ］フェニル］-３-［７［アミジノ-２-ナフチル］-プロピオニック酸塩酸塩６水和物［T. Hara等，Thromb. Haemost. 71, 314（1994）; T. Yokohama等，Circulation 92, 485（1995）］は、血液凝固及び血栓形成の強い抑制子である。fXa及び血漿凝固の両方のアミド溶解効果は、これらの化合物により、PT及びAPTTテストにおいて、強く抑制される。即ち、遊離及びコンプレックス−結合のXa因子は、均一に良く抑制され、一方、その特質に従って、特定のfXa抑制子として、トロンビンは、ほとんど抑制されなく、即ち、TTテスト中での活性を達することができない。4-MeP-Asp-Pro-Arg-H（C3）（国際特許出願第93/15756号）およびBoc-D-Phe-Nal（1）-Arg-H（C4）（国際特許出願第95/13693号）は、fXaの合成ペプチドである。
記号C3およびC4に従って、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA基体上のfXaのアミド溶解活性を各々IC50＝５７と３０nMに抑制する。抗凝固性についてのデータは入手できない。このテストでは、C3とC4は、Bz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNA基体上に著しい抑制効果があるが、一方、抗凝固活性は、血漿凝固テストでは無視できることが証明される。合成のfXa抑制子の文献の（C2）及び測定された（C3−4）の活性が、抗トロンビン化合物C1と比べて、表１に示される。
表１のデータでは、C1の場合、抗凝固効果が、トロンビンの抑制性によるが、C2の場合には、fXaの抑制性によることが示される。C3、C4の著しいfXa抑制効果は、著しい抗凝固効果を伴わない。プロトロンビナーゼコンプレックスでのfXa活性中心は、C3、C4をアクセスしないらしく、これらのペプチドは、溶液中の遊離ｆＸａのみを抑制できる。
0003970935.tif 000002
最近の刊行物［N.A. Prager等，Circulation 92, 962（1992）］によると、トロンビンのみならず、血栓/血液凝固中にトラップされ及び溶解中に遊離された因子Xaも、各々、因子Ｖ及びVIIIの［fVII＋TF］−コンプレックスの活性化による新規な凝固過程を開始し、そして維持することに貢献する。従って、抗凝固子がトロンビンの抑制に加えて因子Xaを抑制できる場合、特にこの抑制性が凝固−結合のトロンビンおよび因子Xaまで広がる場合には、有利である。
本発明の簡単な説明
本発明の目的は、経口投与で抗凝固活性を示す既知の化合物に比べて改良された抗凝固活性のある新規なペプチド誘導体を製造することである。
TT及びAPTTテストでのBOC-D-Phe-Pro-Arg-H（C5）の抗凝固効果は、トリペプチドアルデヒドC1よりも小さいが、PTテストでは、より良く、C1よりも１０倍低いIC50で因子Xa抑制することが観察される。C5でのBOC基での置換基は、トリペプチドアルデヒドC1よりも小さいが、PTテストでは、いくらか良好であり、C1よりも１０倍低いIC50を有する因子Xaを抑制することが観察された。得られたEoc-D-Phe-Pro-Arg-Hが、３つのテストすべてで、C5よりも高い効果を有するので、C5でのBOC-基のためのEoc-基の置換が、ペプチドの抗凝固効果を変えることが、予想以上に見い出された。更に、その活性は、PTテストのみならず、APTTテストでも、同様に、より高いもので、一方、そのfXa抑制効果は、BOC-ペプチドC5と同様である。Moc-D-Phe-Pro-Arg-H（C7）の抗凝固効果も、C6Eoc-化合物と同様であるが、そのfXa抑制効果は、少し高い。これらの発見したことは、表２に示される。
0003970935.tif 000003
Ｎ-末端アミノ酸が、フェニルアラニンから、３-シクロブチル-アラニンに変化する場合に、より効果的な抗凝固性化合物が得られるが、一方、均一のシクロブチル-グリシンが、Ｎ-末端位置に入り、活性が減少する。３-シクロブチルアラニンとは別に、３-シクロペンチルアラニンで置換することは、効果的なペプチジルアルギニンアルデヒドが得られる。メトキシカルボニル或いはプロポキシカルボニル基が、Ｎ-末端のエトキシカルボニル基を置換すると、活性スペクトル即ち、個々のテストでの測定活性の比率を変えることが観察された。
本発明の詳細な説明
本発明は、一般式（Ｉ）；
Ｑ−Ｄ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
（式中、Ｑは、式Ｑ’−Ｏ−ＣＯ−のアシル基（式中のＱ’は、１〜３個の炭素原子のアルキル基を示す）を示し、Ｄ−Ｘａａは、３-シクロブチル-Ｄ-アラニン残基或いは３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン残基であり、
Ｐｒｏは、Ｌ-プロリン残基であり、そして、
Ａｒｇは、Ｌ-アルギニン残基である）の新規なペプチドアルデヒド誘導体、およびその有機酸或いは無機酸と形成される酸付加塩並びにそれを含有する製薬学的な組成物に関する。
一般式（Ｉ）の化合物（式中、Ｑ、Ｑ’、Ｘａａ、Ｐｒｏ及びＡｒｇは上記の定義である）が、グアニジノ基をベンジロキシカルボニル基で保護して、アシルペプチドＱ-Ｄ-Ｘａａ-Ｐｒｏを、Ｌ-アルギニンラクタムと縮合させ、次に、得られた保護されたトリペプチドラクタムを、式Ｑ-Ｄ-Ｘａａ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ（Ｚ）-Ｈの保護されたトリペプチドアルデヒドに還元し、そして、一般式（Ｉ）のペプチド誘導体を、有機或いは無機の酸と形成させた付加塩として、単離することにより、製造される。
出発原料として用いる、アシル−ジペプチド、Ｑ-Ｄ-Ｘａａ-Ｐｒｏが、例えば、塩基性媒体中で、Ｄ−Ｘａａアミノ酸を、クロロ蟻酸のＱ’アルキルエステルとアシル化することにより、製造され、このように得られたＱ-Ｄ-Ｘａａアシルアミノ酸を、Ｌ-プロリンに結合させる。
プロリンに結合させるために必要なＱ-Ｄ-Ｘａａは、ラセミ体ＤＬ-Ｘａａ化合物をアシル化し、ＤＬ-アシルアミノ酸を、そのメチルエステルに変換し、Ｑ-ＤＬ-Ｘａａ-ＯＭｅラセミ体エステルを分割することにより、製造される。このようにして得たＱ-Ｄ-Ｘａａ-ＯＭｅを、次に、鹸化し、必要なＱ-Ｄ-Ｘａａアシルアミノ酸にする。
本発明の一般式（Ｉ）の化合物（式中、Ｑ、Ｘａａ、Ｐｒｏ、Ａｒｇは上記の同じ意義である）は、試験管内でも生体内でも強い抗凝固活性を示し、著しく高い生体適用性を有する。
一般式（Ｉ）の化合物の試験管中の抗凝固性効果は、プロトロンビン時間（PT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）及びトロンビン時間（TT）テストにより測定された［D. Bagdy等，Thromb. Haemost. 67, 326（1992）］。化合物のfXa−抑制効果は、Bz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNAクロモゲン基体（方法Ｍ６参照）を用いることにより測定された。
得られた結果は、表３に示される。C1トロンビン抑制子、C6 Eoc-D-Phe-化合物およびC8 Eoc-DL-Cba-同類の相当するデータが、参照として役立つ。表において、化合物は、PT活性の減少オーダーで並べられる。データは、Pheと比べて、そして、同類のシクロブチルグリシン（ＤＬ-系のC8、C9及びC10の化合物を参照）と比較して、末端Cba-及びCpa-部分の長所の効果を正確に示す（化合物１、４および６参照）。
0003970935.tif 000004
組織プラスミノゲン活性子（tPA）及びウロキナーゼ（UK）により誘導された、プラスミン（PL）上及びプラスミン形成上の本発明の新規化合物の抑制効果を、フィブリン−血小板法［D. Bagdy等，Thromb. Haemost. 67, 326（1992）］により検査する。化合物C1とC5は、参照；対照としての役目をする。C1の抗フィブリン溶解効果は、生体内で著しくない、そして、実験的な血栓を溶解するための補助薬として用いられ、一方、C5の抗フィブリン溶解活性は、生体内で良く検出できる［C.V. Jackson等，J. Cardiovasc. Phamacol. 21, 587（1993）］。表４において、新規化合物１および２で得られた結果は、C1とC5とのものと比べて、実施例として示される。
IC50値（欄Ａ）に加え、C1に関連した化合物の効率が、上げられる（欄Ｂ）。後者のデータは、化合物C1と同様に、新規化合物C1、C2の抗フィブリノ溶解活性は、中和され；３つの酵素に対するその活性は、化合物C5に対して３．２〜４．５〜３９倍低いことを示している。
0003970935.tif 000005
凝固−結合のfXa及びトロンビン並びにフィブリンゲル−結合のトロンビンへの一般式（Ｉ）の新規化合物の抑制効果が、化合物１〜３とともに、表５に示され：C1の各値は、参照として用いられる。血漿−凝固は、血小板−富裕のヒト血漿を再石灰化することにより得られ、そして、フィブリンゲルは、ヒトフィブリノゲンをヒトトロンビンにより凝固することにより得られる。fXa及びトロンビンの活性測定のために、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA或いはTos-Gly-Pro-Arg-pNA基体は、方法M1〜M3と一致させて使用された。
0003970935.tif 000006
これらのデータは、Eoc-化合物１と３が、IC50により、１マイクロモルの濃度以下に、トロンビンのみならず血漿凝固−結合のfXaでも抑制する。
一般式（Ｉ）の化合物の抗凝固性及び血小板凝固抑制効果が、ニュージーランド白ウサギで、Ｄ．バグデイ等［Thromb. Haemost. 67, 357（1992）］の方法により生体外で研究した。化合物は、緩衝された等方性の生理的食塩水中に溶解され、静脈注射（０．４〜５．０mg/kg）で投与され、或いは、輸液（0.25〜５．０mg/kg/h）により、或いは皮下注射（０．５〜６．０mg/kg）により、或いは経口（２．５〜２０mg/kg）で投与される。この化合物の効果は、既に３０分間内に検出でき、経口投与法で行われ、ピーク値は、６０〜180分後に達し、治療レベルが、３〜＞６時間にわたり投与量に依存して維持される。
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（１）の生体内効果が、表６、７に詳細に示される。C1の相当する値は、参照として挙げられる。化合物は、５mg/kgの投与量で経口投与される。３０〜６０分毎に心臓動脈から採取された血液試料が分析される。全血液凝固時間（WBCT）及びトロンビン誘導血液血小板凝集（PAI）の抑制が測定された。血液試料から得た血漿クエン酸塩における、活性化部分的トロンボプラスチン時間（APTT）及びトロンビン時間（TT）が測定された。APTT及びTT値が表６に挙げられ、そして、WBCT及びPAI値が表７に示される。
表６と７のデータは、新規な化合物１が、参照剤C1よりも、長く利く抗凝固剤および抗凝集効果を有することを示す。
0003970935.tif 000007
0003970935.tif 000008
一般式（Ｉ）の本発明の化合物は、次の病気の処置と予防に用いられる：血栓及び／或いは高凝固性が含まれ、深い動脈血栓、脈動塞栓症、静脈血栓、不安定狭心症、心筋梗塞、心房細動、及び血栓ベースの発作を含む：アテローム硬化症において、高いリスクの患者の外科予防法或いは他の外科予防法として、冠状動脈の病気、大脳静脈の血栓病を予防するために使用される。ネフローゼの場合、高凝固性の病気の場合;悪性腫瘍及び炎症の場合、また、糖尿病の場合に、補助薬治療のために、再閉塞の予防のために、経皮的な透過性の血管再建の血栓に適用できる。他の抗凝固剤の投与が、攻撃できない場合、或いは、禁忌の場合、即ち、抗トロンビンIIIがない場合、ヘパリン或いはヘパリン誘導性の血小板減少症（HIT）の場合に、クマリンの場合の妊娠の場合に適用できる。
本発明の化合物とその製薬上許容される塩は、治療目的のみ用いられ、好適には、製薬学的処方物の形で用いられる。本発明はまたそれらの処方物に関する。
製薬学的処方物は、一般式（Ｉ）の本発明の化合物或いはその製薬上許容される塩の効果量および既知の製薬上容認される担体、充填材料、希釈剤及び／或いは他の製薬学的な賦形剤を有する。
前記の担体、希釈剤或いは充填材料は、水、アルコール、ゼラチン、ラクトース、サックロース、スターチ、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルカム、動物或いは植物源の油、更に、グリコール、例えば、プロピレングリコール、或いはポリエチレングリコールを用いる。製薬学的賦形剤は、保存剤、種々の天然或いは合成のエマルジョン化剤、分散剤或いは濡れ剤、色彩材料、香料、集積促進剤および他の活性成分の生適用性を改良する薬剤を用いることができる。
本発明の製薬学的組成物は、通常の処方物で製造でき、例えば、経口組成物（口から投与される、例えば、錠剤、カプセル、粉末、ピル、糖剤或いは粒状剤）にでき、そして、非経口組成物（注射、輸液、坐薬、硬膏或いは軟膏のような、胃腸内服システムを避けた投与薬剤）として製造できる。
本発明の化合物の治療投与量レベルは、個々の健康状態及び患者の年齢による、そして、それに従って、変化でき、そのレベルは、医者の意図する処置により決められる。機能の抑制及び／或いはトロンビン形成が、予防法のために、治療目的のために、必要である病気の場合に、日当り経口的或いは非経口的（例えば、静脈注射）の0.01〜1000 mg/kg体重の投与量を投与し、好適には、0.25〜２０mg/kg体重の投与量を投与する。
本発明の一般式（Ｉ）の化合物を、血栓剤（例えば、tPA或いはウロキナーゼ）と一緒に投与され、動脈或いは静脈中で形成されたトロンビの溶解を促進し、その再形成を効率的に予防する。このような場合、本発明の化合物を、血栓薬剤と同時に、或いは血栓装置の直後に、投与することが好適である。
以下の実施例が説明されるが、それは、本発明の保護範囲を制限するものではない。実施例に記録されるＲf値は、吸着剤としてシリカゲル（DC-Aluflien Kieselgel 60 F254、メルク、ダルムスタット）を用い、次の展開溶媒での薄膜クロマトグラフィにより測定される。
１．エチルアセテート
２．エチルアセテート−ピリジン−酢酸−水（480：２０：６：１１）
５．エチルアセテート−ピリジン−酢酸−水（４５：２０：６：１１）
６．エチルアセテート−ピリジン−酢酸−水（240：２０：６：１１）
７．エチルアセテート−ピリジン−酢酸−水（480：１０：３：５．５）
９．エチルアセテート−ピリジン−酢酸−水（120：２０：６：１１）
１３．エチルアセテート−ｎ−ブタノール−酢酸−水（１：１：１：１）
実施例で特定された容量因子（ｋ’）を、次のような装置”Pharmacia LKB Analytical HPLS System Two”により測定した。
カラム：”VYDAC C-18逆転層：１０mm、300Ａ、４×250mm”
緩衝液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水
緩衝液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル
１ml／分流速にされる勾配：
Ｉ：０〜５分、０〜２５％Ｂ、次に、イソクラテック２５％Ｂ；
III：０〜３０分、０〜６０％Ｂ
溶離液のペプチド含有量の検出は、214 nmでの紫外線により測定した。試料濃度は、１mg/ml緩衝液Ａ、注入容量２５μｌであった。
HPLC分析（Ｉ或いはII）中に適用された勾配は、実施例の個々の工程での短縮の後のブラケットで特定される。
アシルアルギニンアルデヒドは、平衡構造中に、存在して、即ち、アルデヒド、アルデヒドハイドライトおよび２つのアミノシクロール形にある。HPLC分析中に、アルデヒドハイドライトおよび両アミノシクロール形が、分離ピークとして現れ、従って、実施例で説明されるアシルアルギニンアルデヒドは、２つ或いは３つのｋ’値により、特定される。
質量スペクトル:FAB正イオン化測定が、フィニガン（Finnigan）MAT 8430装置中で行われる。試料は、ｍ-ニトロベンジルアルコールマトリックス中に溶解され、イオン源中に直接に導入される。ペプチジル-アルギニンアルデヒドのスペクトルにおいて、付加的な分子−イオンが検出可能であり、ｍ-ニトロベンジル-アルコール（NBA）:［Ｍ＋Ｈ］+および［Ｍ＋Ｈ＋ＮＢＡ］+と形成された付加化合物．実施例において、従って、FABスペクトルデータが特定される。
ESI正イオン化測定は、VGクアトロQuattro:（Fisons）装置中で行われる。試料は、１％（v/v）の蟻酸含有のアセトニトリル−水（１：１）の混合物中に溶解させ、１０mlの試料−ループ形で、１５〜２５ml／分の流速でイオン源中に導入される。
特定の旋性（［α］D）は、２０℃で測定された。
実施例１ エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロピル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG−ベンジロキシ-カルボニル-Ｌ-アルギニン-ラクタム
3.28ｇ（８．４ミリモル）のt-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニン-ラクタム［S. Bajuszと共同研究者：J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］を、８mlのクロロホルム中に懸濁し、次に、HClガス（0.11〜0.15ｇ／ml）で飽和された１０mlのエチルアセテートを一定に攪拌し、氷で冷却しがら添加する。反応物は、［Rf（9）＝0.91（Boc-化合物）：0.07（遊離化合物）］の薄層クロマトグラフィにかける。最後に、反応混合物を、１８mlのジエチルエーテルで希釈し、形成された結晶質を濾過し、５mlのアセトン、５mlのジエチルエーテルで洗浄し、水酸化カリウムペレット上の真空デシケータ上で乾燥する。得られたＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム塩化水素を、８mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、−２０℃に冷却し、以下の製造された混合無水塩に添加する。
２．５ｇ（８ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（実施例１、工程Ｅ）を、−２０℃に冷却した８mlのジメチルホルムアミドに溶解する。一定攪拌しながら、０．９ml（８ミリモル）のＮ-メチル−モルフォリンと1.05ml（８ミリモル）のイソブチルクロロホルムを導入し、次に、１０分間攪拌した後、上記のＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-−アルギニンラクタム塩化水素溶液と、2.35ml（16.8ミリモル）のトリエチルアミンを導入する。反応混合物を、３０分間、−１０℃で攪拌し、次に、０℃で１時間攪拌する。その塩を、濾過し、廃棄し、ロ液を、４０mlのベンゼンで希釈する。溶液を、３×１０mlの水で洗浄し、１０mlの１MのKHSO4−溶液で、そして再び、３×１０mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を、２．０〜２．５kPaの圧力で蒸発せしめる。得られた生成物を、７０ｇキーゼルゲル６０で作られたカラム上に適用し、エチルアセテートで溶離する。純粋物質［Rf（1）＝0.50］を含有する部分を注入し、溶媒を、２．０〜２．５kPaの圧力で蒸発せしめる。油状残渣は、石油系エーテルで、摩擦し、濾過し、乾燥する。
収率：３．０ｇ（６４％）
Rf（1）＝0.50
［α］D＝−47.4°（ｃ＝１、THF中）
FABマススペクトルデータは、期待の構造（585［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程２：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシ-カルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
2.27ｇ（４．６ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（実施例１、工程１）を、１５mlのテトラヒドロフラン中に溶解させ、そこに、テトラヒドロフラン中に溶解した３．６ミリモルのリチウムアルミニウムハイドライドを、−５０℃以下の温度で一定攪拌で添加する。反応の進行は、溶媒システム（6）中の薄層クロマトグラフィにより監視され、そして、更に、リチウムアルミニウムハイドライドを、必要のときに添加する。冷却された０．５M硫酸溶液を反応混合物に一定攪拌下で添加し、溶液がｐＨ３になるまで冷却する。得られた溶液は、２×１５mlのｎ-ヘキサンで洗浄し、次に、３×２０mlの塩化メチレンで洗浄する。塩化メチレン抽出液を注入し、３×１５mlの水で洗浄し、１５mlの冷却５％NaHCO3−溶液液で、そして再び、１５mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして、溶媒を、２．０〜２．５kPaの圧力で蒸発せしめる。残渣は、１０mlのベンゼンに溶解し、そして、シクロヘキサンで沈殿化せしめる。濾過、乾燥した後の重量は、１．８ｇ（６５％）である。
Rf（6）＝0.30
［α］D＝−30.8°（ｃ＝１、テトラヒルドフラン中）
FABマススペクトルは、仮定の構造（587［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程３：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニン-アルデヒドヘミスルフェート
1.58ｇ（２．７ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニン-アルデヒド（実施例１、工程２）、１４mlのエタノール、２．７mlの０．５Mの硫酸、３．２mlの水に溶解し、そして、６mlのエタノール中に懸濁された0.17ｇのＰｄ／Ｃ触媒を添加し、そのシステムを、１０℃で水素化する。反応の進行は、薄層クロマトグラフィで監視し、１５分間で完了する。触媒は、濾別され、溶液は、２．０〜２．５kPaの圧力で、７〜９mlの容量に濃縮化される。残渣を、２０mlの水で希釈し、６mlの塩化エチレンで抽出し、水溶液を、室温で、２４時間放置する。そのｐＨは、ＯＨ−サイクル中のダウエックスDowex AG 1-X8樹脂で、３．５に調整され、溶液は、冷凍乾燥される。収率：１．０ｇ（７８％）
Rf（5）＝0.44
［α］D＝−75.5°（ｃ＝１、水中）
HPLC（１）：ｋ’＝5.53；6.20及び7.17
FABマススペクトルは、仮説の構造（453［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
出発物質は、次のように製造できる。
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（Eoc-D-Cba-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン
１０ｇ（７０ミリモル）の３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン［A. Burger等，J. Med. Chem. 6, 221（1963）］を、７０mlの２MのNaOH溶液中に溶解し、＋５℃に冷却し、11.1ml（116.2ミリモル）のエチルクロロホルメートを、一定攪拌下で滴加する。攪拌は、２時間、この温度で継続し、更に、室温で２時間継続する。反応混合物を、次に２０mlのジエチルエーテルで洗浄し、酸性化した後に、ｐＨ１の溶液を、３×２０mlの酢酸エチルで抽出する。注入された抽出液を、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。得られた油は、純粋生成物［収率：13.1ｇ（８７％）、Rf（7）＝０．８］とされ、次の工程には更なる処理をせずに使用する。
工程Ｂ：メチルエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニネート１１ｇ（５１ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン（実施例１、工程Ａ）を、100mlのメタノールに溶解し、−１５℃に冷却し、次に、１０ml（137ミリモル）の塩化チオニルを一定攪拌下で添加する。更に冷却することなく攪拌を続ける。反応混合物が室温になってから、攪拌を更に２時間継続する。
次に、溶液を２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣油を、４０mlの酢酸エチル中に溶解せしめ、１０mlの１NのHCl、２×１０mlの５％NaHCO3および２×１０mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発乾固する。残渣は、純粋であると考えられる［収率：10.8ｇ（９２％）、Rf（1）＝0.85、Rf（6）＝0.65］とされ、次の工程には更なる処理をせずに使用する。
工程Ｃ：メチルエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニネート
アシルアミノ酸メチルエステルの酵素加水分解は、自動滴定器中で、ｐＨ＝７．５で行われ、それは、２つの反応容器を有する（その１つは、100mlの容量を有し、他は、250mlの容量である）。試薬は、１MのNaOH溶液である。
10.8ｇ（４７ミリモル）のメチルエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニネート（工程Ｂで合成された）を、250mlの容積の滴定器中の２０mlのベンゼン中に溶解する。100mlの水を添加し、溶液のｐＨを、１MのNaOHで攪拌下で７．５に調整する。４０mgの酵素［Subtilisin Carlsberg, Protease, Type VIII（Sigma）］を添加し、７．５に調整されたｐＨは、滴定中は、この値に保持される。酵素加水分解は、３時間で完了される。相を分離する。水性相から、純粋のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｌ-アラニンが単離される。ベンゼン相は、２×１０mlの５％NaHCO3で、２×１０mlの水で洗浄され、無水硫化ナトリウム上で乾燥され、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめられる。得られた黄帯色油は、純粋で考えられ、次の工程には更なる処理をせずに使用される。
工程Ｄ：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン
工程Ｃの油状生成物を、２０mlのエタノール中に溶解し、そして、１０mlの２．５MのNaOH溶液を添加する。混合物を、室温で２時間攪拌し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣を、３０mlの水に溶解し、１０mlのジエチルエーテルで洗浄し、３Mの塩化水素酸でｐＨ＝１に酸性化し、３×１０mlの酢酸エチルで抽出される。注入された有機抽出物を、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発する。収率：４．３ｇ（９０％）の油状生成物［Rf（2）＝０．８］での大部分は、次の工程で使用され、残りは、次のように、結晶質塩に変換される。
0.43ｇ（２ミリモル）の油状のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン（実施例１、工程Ｄ）を、１０mlのジエチルエーテル中に溶解し、0.23ml（２．１ミリモル）のシクロヘキシルアミンを添加する。分離した結晶は、濾過され、ジエチルエーテルで洗浄され、真空デシケータで乾燥される。収率：0.57ｇ（９０％）
融点：129〜131℃
［α］D＝3.93°（ｃ＝１、メタノール中）
元素分析の結果：式Ｃ16Ｈ30Ｎ2Ｏ4（314.42）
計算値：Ｃ 61.12％、Ｈ 9.62％、Ｎ 8.91％
測定値：Ｃ 61.30%、Ｈ 9.80％、Ｎ 8.60％
工程Ｅ：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
３．７ｇ（17.2ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン（実施例１、工程Ｄ）を、６０mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、０℃に冷却し、次に、4.85ｇ（24.5ミリモル）の２，４，５-トリクロロフェノールと5.06ｇ（24.5ミリモル）のジシクロヘキシル-カルボジイミドを添加する。反応混合物を、室温で２時間攪拌し、分離したジシクロヘキシルウレアから濾過し、次に、テトラヒドロフランで洗浄する。ロ液および洗浄液を注ぎ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣を、２５mlのジエチルエーテル−石油エーテル混合物（１：１）中に溶解し、不溶性のジシクロヘキシルウレアは、濾別され、ロ液は、再び蒸発せしめる［濾過されたジシクロヘキシルウレアは、各々、４．９ｇ（８９％）になり、そして、０．６ｇ（１１％）になる］。油状の２，４，５-トリクロロフェニルエトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニネートを、４０mlのピリジン中に溶解し、2.12ｇ（18.4ミリモル）の微粉末Ｌ-プロリンを、3.43ml（24.6ミリモル）のトリエチルアミンと共に、添加する。反応混合物を、室温で３時間攪拌し、次に、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣を、５０mlの酢酸エチルと５０mlの１MのHClの間に分散せしめる。第１に、有機相を、１０mlの１M HClで洗浄し、２×１０mlの水で洗浄し、５％NaHCO3の３×100mlで抽出せしめる。合わされた重炭酸塩抽出物を、６M HClで、ｐＨ３に酸性化し、次に、ジエチルエーテルの３×２０mlで抽出せしめる。エーテル抽出物を合わせ、水で酸がないように洗浄し、無水硫化ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固する。
収率：３．２ｇ（６０％）油
Rf（6）＝0.4.
FABマススペクトルは、仮説の構造（313［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
実施例２ メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（MOC-D-Cba-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
1.64ｇ（４．２ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び1.25ｇ（４．０ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（実施例２、工程Ｃ）を用いて、これらの結合と最終生成物のクロマトグラフィ精製を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。純粋な最終生成物［Rf（1）＝０］を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣を、石油系エーテルで摩擦し、濾過し、パラフィンターニングと五酸化燐の上のデシケータ中で乾燥せしめる。
収率：1.15ｇ（５０％）
Rf（2）＝0.45〜0.47
［α］D＝−43.5°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（571［Ｍ＋Ｈ］+、724［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程２：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
1.06ｇ（１．８ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンラクタム（実施例２、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元せしめる。
収率：0.76ｇ（７３％）
Rf（9）＝0.47
［α］D＝-37.5°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（573［Ｍ＋Ｈ］+、726［Ｍ＋Ｈ＋ＮＢＡ］+）を確認する。
工程３：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
0.69ｇ（１．２ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（実施例２、工程２）を、実施例１、工程３に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、水素化分解せしめる。
収率：0.53ｇ（９１％）
HPLC（II）：ｋ’＝4.74；5.47及び5.82
［α］D＝-60.9°（ｃ＝１、水中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（439［Ｍ＋Ｈ］+、592［Ｍ＋Ｈ＋ＮＢＡ］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（MOC-D-Cba-Pro）
工程Ａ：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン
４．３ｇ（３０ミリモル）の３-シクロブチル−ＤＬ-アラニン［A. Burger等，J. Med. Chem. ６, 221（1963）］を、１５mlの２M NaOH溶液中に溶解し、０℃に冷却し、同時に、16.5mlの２M NaOH溶液と2.55ml（３３ミリモル）のメチルクロロホルメートを、強く攪拌しながら、添加する。攪拌は、この温度で３０分間継続し、そして、室温で２時間継続する。反応混合物を、４０mlの水で希釈し、１０mlのジエチルエーテルで抽出し、３M HClでｐＨ３に酸性化する。生成物を、酢酸エチル（４×２０ml）で洗浄し、抽出物を合わせ、２０mlの水で洗浄し、無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。油状残渣［５．３ｇ（８８％）、Rf（7）＝0.61］を、次の工程に、更なる精製なしで使用する。
工程Ｂ：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン
5.03g（２５ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン（実施例２、工程Ａ）を、実施例１、工程Ｂ〜Ｄに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：2.22ｇ（１１ミリモル）油状生成物
［Rf（7）＝0.61］
工程Ｃ：メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
1.21ｇ（６ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン（実施例２、工程Ｂ）を、実施例１、工程Ｅに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。収率：１．６ｇ（５．４ミリモル、９０％）油状生成物、［Rf（9）＝0.48］とされ、その大部分を工程１に直接使用し、その残りは、次のようにして結晶質に変換する。
0.30ｇ（１ミリモル）の油状メトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリンを、５mlのジエチルエーテル中に溶解し、0.21ml（1.05ミリモル）のジシクロヘキシルアミンを添加する。分離した結晶を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：0.43ｇ（９０％）
融点：149.5〜164℃
元素分析の結果：式Ｃ24Ｈ45Ｎ3Ｏ5（479.64）
計算値：Ｃ 65.10％、Ｈ 9.46％、Ｎ 8.76％
測定値：Ｃ 60.4％、Ｈ 8.98％、Ｎ 10.47％
実施例３ イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（iPoc-D-Cba-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
0.43ｇ（１．１ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び0.33ｇ（１ミリモル）のイソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（実施例３、工程Ｃ）を用いて、これら成分の結合とその生成物のクロマトグラフィ精製を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。純粋な最終生成物［Rf（1）＝0.55］を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣を、石油系エーテルでもみ、濾過し、デシケータ中で乾燥せしめる。
収率：０．３ｇ（５０％）
Rf（1）＝0.55
FABマススペクトルは、仮説の構造（599［Ｍ＋Ｈ］+、752［Ｍ＋Ｈ＋ＮＢＡ］+）を確認する。
工程２：イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
0.26ｇ（0.43ミリモル）のイソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニン-ラクタム（実施例２、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、水素化分解せしめる。
収率：0.15ｇ
Rf（6）＝0.30
FABマススペクトルは、仮説の構造（601［Ｍ＋Ｈ］+、754［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程３：イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
0.13ｇ（０．２ミリモル）のイソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（実施例２、工程２）を、実施例１、工程３の記載の方法により、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理される。
収率：0.07ｇ（７５％）．
HPLC（１）：ｋ’＝3.69；4.15及び5.04
FBAマススペクトルは、仮説の構造（467［Ｍ＋Ｈ］+；620［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（iPoc-D-Cba-Pro）
工程Ａ：３-シクロブチル-Ｄ-アラニン
１．０ｇ（５ミリモル）のメトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン（実施例２、工程２）に対して、１０mlの６M HClを添加し、３時間、環流加熱する。この溶液を、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめ、その残渣を、５mlの水に溶解し、蒸発乾固し、そして、この処理法を繰り返す。微量の水を、エタノール−ベンゼン混合物による共沸点蒸留法により除去する。残りの油を、１０mlのエタノールに溶解し、５ミリモルの１，２-エポキシ-プロパンを添加する。冷却後、沈殿物を濾過し、固体を、ジエチルエーテルにより洗浄し、乾燥する。
収率：0.65ｇ（９０％）の３-シクロブチル-Ｄ-アラニン
Rf（13）＝0.65
［α］D＝−34.7°（ｃ＝１、１M HCl中）
元素分析の結果：式Ｃ7Ｈ13ＮＯ2
計算値：Ｃ 58.71％、Ｈ 9.15％、Ｎ 9.78％
測定値：Ｃ 58.70％、Ｈ 9.30％、Ｎ 9.50％
工程Ｂ：イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン
0.57ｇ（４ミリモル）の３-シクロブチル-Ｄ-アラニンを、１M NaOH溶液とジオキサンの１：１混合物８ml中に溶解する。この混合物を、０℃に冷却し、同時に、４mlの１M NaOH溶液と４mlのイソプロピルクロロホルメート（トルエン中の濃縮１M）を、強く攪拌しながら、添加する。反応混合物を、１時間この温度で攪拌し、そして、更に、室温で５時間攪拌する。ジオキサンとトルエンを２．０〜２．５kPaの圧力で、分留する。残りの水溶液を、５mlのジエチルエーテルで洗浄し、次に、１M KHSO4によりｐＨ３に酸性化する。乳濁液を、３×５mlの酢酸エチルで抽出し、合わせた抽出物を水で洗浄し、無水硫化ナトリウム上で乾燥する。２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめた後には、収率:0.83ｇ（９０％）である。
Rf（6）＝0.60；
［α］D＝＋９．５°（ｃ＝０．５、メタノール中）
工程Ｃ：イソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
0.46ｇ（２ミリモル）のイソプロポキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニン（実施例３、工程Ｂ）を、実施例１、工程Ｅに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：１．３ｇ（4.35ミリモル、８７％）油
Rf（2）＝0.40
FABマススペクトルは、仮定の構造（327［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
実施例４ エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-D-Cpa-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
2.93ｇ（７．５ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び２．３ｇ（７．１ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（実施例４、工程Ｃ）を用いて、これら成分の結合とその生成物のクロマトグラフィ精製を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて行う。純粋な最終生成物［Rf（1）＝0.55］を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣油を、ｎ-ヘキサンでもみ、濾別し、ｎ-ヘキサンで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥せしめる。
収率：２．５ｇ（５９％）
Rf（1）＝0.55
［α］D＝−48.6°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（599［Ｍ＋Ｈ］+、752［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程２：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
2.34ｇ（３．９ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（実施例４、工程１）を実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元せしめる。
収率：1.75ｇ（７４．７％）
Rf（6）＝0.42
［α］D＝−34.4°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（601［Ｍ＋Ｈ］+、754［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程３：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
1.59ｇ（2.65ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（実施例４、工程２）を、実施例１、工程３に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、水素化分解せしめる。
収率：1.13ｇ（８３％）
Rf（3）＝0.37
［α］D＝−34.4°（ｃ＝１、水中）
HPLC（１）：ｋ’＝4.76；5.40及び7.32
FABマススペクトルは、仮説の構造（467［Ｍ＋Ｈ］+、620［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（Eoc-D-Cpa-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニン
7.87ｇ（５０ミリモル）の３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニン［P.R. Pal等，J. Am. Chem. Soc., 78, 5116（1956）］を、実施例１、工程Ａに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。但し、反応混合物からの生成物は、２×５０mlのジエチルエーテルで抽出し、無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。収率：10.55ｇ（９８％）の白色で非晶質粉末は、［Rf（2）＝0.84］で、次の工程に精製なしで使用される。
工程Ｂ：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン
７．８ｇ（３４ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニン（実施例４、工程Ａ）を、実施例１、工程Ｂ、Ｃ、Ｄに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。油［Rf（6）＝0.062］の［収率:3.45ｇ（88.6％）］の大部分は、直接に、工程Ｃに使用される。残りは、次のようにして結晶塩に変換される。
0.46ｇ（２ミリモル）の油状のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニンを、１０mlのジエチルエーテル中に溶解し、0.42ml（２．１ミリモル）のジシクロヘキシルアミンを添加する。沈殿物を濾別し、ジエチルエーテルにより洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：0.74ｇ（９０％）結晶塩:
融点：138〜140℃
［α］D＝−１．５°（ｃ＝１、メタノール中）
元素分析の結果：式Ｃ23Ｈ42Ｎ2Ｏ4（410.58）
計算値：Ｃ 67.28％、Ｈ 10.31％、Ｎ 6.81％
測定値：Ｃ 67.40％、Ｈ 10.40％、Ｎ 6.80％
工程Ｃ：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
2.43ｇ（10.5ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-Ｄ-アラニン（実施例４、工程Ｂ）を、実施例１、工程Ｅに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。得られた２，４，５−トリクロロフェニルエステルを、1.15ｇ（１０ミリモル）のＬ-プロリンと結合すると、油状生成物の生成物の収率：２．３ｇ（７１％）である。
Rf（6）＝0.53
FABマススペクトルは、仮説の構造（327［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
参照化合物の合成
合成１
エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
２．３ｇ（５．８ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び1.67ｇ（５ミリモル）のエトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（合成例１、工程Ｃ）を用いて、これら成分の結合とその生成物の精製を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。純粋な最終生成物［Rf（1）＝0.37］を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣を、真空デシケータ中で乾燥せしめる。
収率：1.18ｇ（６０％）の油
FABマススペクトルは、仮説の構造（607［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程２：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
０．９ｇ（１．５ミリモル）のエトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（合成例１、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元せしめる。
収率：0.33ｇ（３６％）
Rf（1）＝0.16
工程３：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
0.33ｇ（０．５４ミリモル）のエトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（合成例１、工程２）を、実施例１、工程３に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：0.26ｇ（９２％）
HPLC（１）：ｋ’＝4.00；4.45及び5.45
FABマススペクトルは、仮説の構造（475［Ｍ＋Ｈ］+、628［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（Eoc-D-Phe-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニン
16.5ｇ（０．１モル）の３−フェニル-Ｄ-アラニンを、実施例１、工程Ａに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。但し、最終生成物の酢酸エチル溶液から溶媒を蒸発した後、得られた油状物は、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：14.6ｇ（５５％）
Rf（9）＝0.70
工程Ｂ：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニンＮ-ヒドロキシ-サクシンイミデート
14.5ｇ（55.4ミリモル）のエトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニン（合成例１、工程Ａ）と、６．４ｇ（５６ミリモル）のＮ-ヒドロキシ-サクシンイミドを、６０mlのテトラヒドロフランに溶解する。溶液を０℃に冷却し、11.5ｇ（５６ミリモル）のジシクロヘキシル-カルボジイミドを攪拌しなら、添加する。攪拌を、この温度で１０時間行い、次に、混合物を濾過し、ロ液を２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣をベンゼンから結晶化する。その結晶を濾過し、ベンゼンとジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：11.3ｇ（６０％）
Rf（10）＝0.53
［α］D＝＋58.1°（ｃ＝１、ジメチルホルムアミド中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（335［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
元素分析の結果：式Ｃ16Ｈ18Ｏ6（334.33）
計算値：Ｃ 57.48％、Ｈ 5.42％、Ｎ 8.30％
測定値：Ｃ 57.40％、Ｈ 5.40％、Ｎ 8.30％
工程Ｃ：エトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
3.34ｇ（１０ミリモル）のエトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニンヒドロキシサクシンイミデート（合成例１、工程Ｂ）を、１５mlのピリジン中に溶解し、1.15ｇ（１０ミリモル）のＬ-プロリンと１．４ml（１０ミリモル）のトリエチルアミンを添加する。反応混合物を室温で１０時間攪拌し、次に、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣を３０mlの５％NaCO3溶液と１０mlのジエチルエーテルの間に分配せしめる。水性相を、３×５mlのジエチルエーテルで洗浄し、合わせた有機洗浄物を、５mlの５％NaHCO3-溶液で抽出する。重炭酸相を合わせて、１M KHSO4溶液でｐＨ３に酸性化し、３×１０mlの酢酸エチルにより抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。油状残渣を、ジエチルエーテルで結晶化し、結晶を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥せしめる。
収率：２．６ｇ（７７％）
融点：141〜143℃
Rf（6）＝0.40
FABマススペクトル（335［Ｍ＋Ｈ］+）は、仮説の構造を確認する。
元素分析の結果：式Ｃ17Ｈ22Ｎ2Ｏ5（334.33）
計算値：Ｃ 61.06％、Ｈ 6.63％、Ｎ 8.38％
測定値：Ｃ 61.10％、Ｈ 6.70％、Ｎ 8.1％
合成例２
メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Moc-D-Phe-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
４．１ｇ（10.5ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び2.88ｇ（９ミリモル）のメトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（合成例１、工程Ｃ）を用いて、これら成分の結合を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。粗生成物を、シクロヘキサンからの結晶化により精製する。
収率：4.65ｇ（８６％）
融点：７２〜82.7℃
Rf（2）＝0.56
［α］D＝＋72.9°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FABマススペクトルは、仮説の構造（593［Ｍ＋Ｈ］+、746［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程２：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
4.13ｇ（７ミリモル）のメトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（合成例２、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元する。但し、塩化メチレン溶媒を蒸発させた後に、油状最終生成物を、ジエチルエーテルで結晶化する。結晶を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：3.06ｇ（７４％）
融点：103〜107℃
Rf（6）＝0.44
［α］D＝−６９°（ｃ＝１、テトラヒドロフラン中）
FBAマススペクトルは、仮説の構造（595［Ｍ＋Ｈ］+、748［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
工程３：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
2.68ｇ（４．５ミリモル）のメトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（合成例２、工程２）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：2.15ｇ（９４％）
［α］D＝−87.6°（ｃ＝１、水中）
HPLC（１）：ｋ’＝３．３；3.57及び4.09
FBAマススペクトルは、仮説の構造（461［Ｍ＋Ｈ］+、614［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン（Moc-D-Phe-Pro）
工程Ａ：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニンジシクロヘキシルアミン塩
５ｇ（３０ミリモル）のＤ-フェニルアラニンを、１５mlの２MのNaOH溶液に溶解し、０℃に冷却し、同時に16.5mlの２MのNaOH溶液と2.55ml（３３ミリモル）のメチルクロロホルメートを添加する。混合物をこの温度で３０分間攪拌し、次に、室温で、２時間攪拌する。４０mlの水で希釈し、その混合物を、１０mlのジエチルエーテルで洗浄し、３M HClによりｐＨ３に酸性化し、４×２０mlの酢酸エチルにより抽出する。合わせた有機抽出物を水（２０ml）で洗浄し、無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣を、６０mlのジイソプロピルエーテル中に溶解し、６ml（３０ミリモル）のジシクロヘキシルアミンを添加する。分離した結晶を濾別し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、空気中で乾燥する。
収率：11.5ｇ（28.5％）
Rf（2）＝0.56
融点：167〜170℃
［α］D＝−37.9°（ｃ＝０．５，エタノール中）
元素分析の結果：式Ｃ23Ｈ36Ｎ2Ｏ4（404.53）
計算値：Ｃ 68.28％、Ｈ 8.97％、Ｎ 6.92％
測定値：Ｃ 68.30％、Ｈ 9.15％、Ｎ 6.75％
工程Ｂ：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニン２，４，５−トリクロロフェニルエステル
11.3ｇ（２８ミリモル）のメトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニンジシクロヘキシルアンモニウム塩（合成例２、工程Ａ）を、７５mlの酢酸エチルと30.5mlの１M KSO4に分配する。相を分離し、有機抽出物を水で中和洗浄し、無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、１５ml量に濃縮する。冷却した（約０℃）残渣に対して、５．５ｇ（２８ミリモル）の２，４，５-トリクロロフェノール及び5.75ｇ（２８ミリモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、そして、反応混合物を一昼夜放置する。分離したジシクロヘキシルウレアを濾別し、ロ液を蒸発せしめる。油状残渣をエタノールから結晶化する。結晶を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：6.86ｇ（６１％）
融点：109〜110℃
RF（4）＝0.84
元素分析の結果：式Ｃ17Ｈ14ＮＯ4Cl3
計算値：Ｃ 50.70％、Ｈ 3.50％、Ｎ 3.48％、Ｃl 26.42％
測定値：Ｃ 50.80％、Ｈ 3.20％、Ｎ 3.40％、Ｃl 26.60％
工程Ｃ：メトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-Ｌ-プロリン
4.83ｇ（１２ミリモル）のメトキシカルボニル-３-フェニル-Ｄ-アラニル-２，４，５-トリクロロフェニルエステル（合成例２、工程Ｂ）を、１２mlのピリジン中に溶解し、次に、1.38ｇ（１２ミリモル）の微粉Ｌ-プロリンと1.68ml（１２ミリモル）のトリエチルアミンを攪拌しながら添加する。反応混合物を、１６時間攪拌し、次に、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣を、４０mlの５％NaHCO3に溶解し、その溶液を３×７mlのジエチルエーテルで抽出する。合わせたエーテル相を、７mlの５％NaHCO3で洗浄する。重炭酸洗浄液を合わせて、３Ｍ HClでｐＨ３に酸性化し、３×１０mlの酢酸エチルで抽出する。抽出物を無水硫化ナトリウム上で乾燥し、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。残渣をジエチルエーテルで結晶化し、結晶を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、そして、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：3.05ｇ（７９％）
融点：154〜157℃
Rf（2）＝0.47
FABマススペクトルは、仮説の構造（321［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
合成例３
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-DL-Cba-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
1.35ｇ（3.46ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等のJ. Med. Chem. 33. 1729（1990）］及び1.03ｇ（３．３ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン（合成例３、工程Ａ）を用いて、これら成分の結合とその最終生成物のクロマトグラフィ精製を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。純粋な最終生成物［Ｒｆ（1）＝0.50］を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめる。その残渣を、ｎ-ヘキサンで滴定し、濾過し、ｎ-ヘキサンで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥せしめる。
収率：１．０ｇ（５１％）
Rf（1）＝0.50
ESIマススペクトルは、仮説の構造（585［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程２：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
0.94ｇ（１．６ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（合成例３、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元する。
収率：0.64ｇ（６８％）
Rf（6）＝0.30
ESIマススペクトルは、仮説の構造（587［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程３：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
0.59ｇ（１．０ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（合成例３、工程２）を、実施例１、工程３に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：0.39ｇ（７８％）
HPLC（1）：ｋ’＝5.55；6.27及び7.09
FABマススペクトルは、仮説の構造（453［Ｍ＋Ｈ］+、606［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン（Eoc-DL-Cba-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン
1.15ｇ（5.25ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロブチル-ＤＬ-アラニン（実施例１、工程Ａ）を、実施例１、工程Ｅに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理すると、油状の２，４，５-トリクロロフェニルエステルが得られ、それを、0.58ｇ（５．０ミリモル）の微粉末Ｌ-プロリンと結合させる。
収率：１．１ｇ（７１％）の油
Rf（6）＝0.53
ESIマススペクトルは、仮説の構造（313［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
合成例４
エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-DL-Cpa-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
工程１：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム
３．７ｇ（９．５ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び2.94ｇ（９．０ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン（合成例４、工程Ａ）を用いて、これら化合物を、実施例１、工程１に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、行う。純粋な最終生成物を含有する部分を合わせ、２．０〜２．５kPaの圧力で、蒸発せしめ、その残渣を、ｎ-ヘキサンで滴定する。固体生成物を濾過し、ｎ-ヘキサンで洗浄し、真空デシケータ中で乾燥する。
収率：2.87ｇ（５４％）
Rf（1）＝0.55
ESIマススペクトルは、仮説の構造（599［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程２：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド
2.75ｇ（４．６ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム（合成例４、工程１）を、実施例１、工程２に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、還元する。
収率：1.74ｇ（６４％）
Rf（6）＝0..42
ESIマススペクトルは、仮説の構造（601［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
工程３：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒドヘミスルフェート
１．２ｇ（２．０ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（合成例４、工程２）を、実施例１、工程３に記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理する。
収率：０．８ｇ（７８％）
HPLC（1）：ｋ’＝3.96；４．４及び4.92
FBAマススペクトルは、仮説の構造（467［Ｍ＋Ｈ］+、620［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン（Eoc-DL-Cpa-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニル-Ｌ-プロリン
３．１ｇ（13.5ミリモル）のエトキシカルボニル-３-シクロペンチル-ＤＬ-アラニン（実施例４、工程Ａ）を、実施例１、工程Ｅに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、処理すると、油状の２，４，５-トリクロロフェニルエステルが得られ、それを、Ｌ-プロリンと結合する。
収率：３．１ｇ（７４％）
Rf（6）＝0.50
ESIマススペクトルは、仮説の構造（327［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
合成例５
エトキシカルボニル-ＤＬ-シクロブチル−グリシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニンアルデヒド（Eoc-DL-Cbg-Pro-Arg-H）ヘミスルフェート
１．２ｇ（３．０ミリモル）のｔ-ブトキシカルボニル-ＮG-ベンジロキシカルボニル-Ｌ-アルギニンラクタム［S. Bajusz等，J. Med. Chem. 33, 1729（1990）］及び0.69ｇ（２．３ミリモル）のエトキシカルボニル-ＤＬ-シクロブチル-グリシル-Ｌ-プロリン（合成例５、工程Ａ）を用いて、これら成分を各ブロック化トリペプチドラクタム［Ｒｆ（1）＝0.32］と結合し、ブロック化トリペプチドアルデヒド［Ｒｆ（9）＝0.53］に還元し、脱ブロック化することを、実施例１、工程１、２、３に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて行う。
収率：0.22ｇ
HPLC（1）：ｋ’＝2.74；2.96及び3.41
FBAマススペクトルは、仮説の構造（439［Ｍ＋Ｈ］+、592［Ｍ＋Ｈ＋NBA］+）を確認する。
出発物質は、次のようにして製造できる。
エトキシカルボニル-ＤＬ-シクロブチル-グリシル-Ｌ-プロリン（Eoc-DL-Cbg-Pro）
工程Ａ：エトキシカルボニル-ＤＬ-シクロブチル-グリシル-Ｌ-プロリン
0.78ｇ（６．０ミリモル）のＤＬ-シクロブチル-グリシン［T. H. Porter等のArch. Biochem. Biophys, 179, 266（1977）］を、アシル化し［Ｒｆ（7）＝0.60］、２，４，５-トリクロロフェノール［Rf（4）＝0.84］と反応させ、実施例１、工程ＡとＥに記載の方法に従って、試薬と溶媒の比率量を用いて、Ｌ-プロリンと結合する。
収率：3.68ｇ（５０％）の油
Rf（2）;0.17及び0.22
FBAマススペクトルは、仮説の構造（299［Ｍ＋Ｈ］+）を確認する。
方法
方法Ｍ１
ヒト血小板からの血餅の製造
ａ）血小板−富裕血漿が、ヒト血液と３．８％クエン酸ナトリウム溶液の９：１の混合物を５分間240×ｇで遠心分離処理にかけることにより製造される。
ｂ）200μｌの血小板−富裕血漿と８０μｌの４０mM CaCl2溶液を室温に１時間放置する。このように形成された血餅を、ゆっくりと攪拌しながら、６×２mlの０．９％NaCl溶液で洗浄し、残渣の酵素（トロンビン及び因子Xa）を除去する。洗浄媒体を、トロンビン様の活性のために次のようにアッセイ処理する。
ｃ）400μlの洗浄媒体に対して、100μlの１ mM Tos-Gly-Pro-Arg-pNA基体溶液を添加し、その混合物を、３０分間３７℃で培養し、次に、反応は、100μlの５０％酢酸により停止される。この混合物から、150μlのアリコートを、９６-井のマイクロ滴定皿上に適用し、吸光係数を、405 nmで測定した［ELISA READER SLIT Laborinstrument GmbH, オーストリア］。洗浄する効率の場合、吸光係数が、対照のものの５％より小さい。
方法Ｍ２
血餅結合因子Xaの抑制性の測定
ａ）０．１−１．０−１０及び100μg/mlの溶液が、0.02％ヒトアルブミンを含有する０．１Ｍトリス−緩衝液（ｐＨ＝８．５）中のペプチド抑制子から製造される。
ｂ）洗浄媒体（方法Ｍ１）を引き出した後に、400μlのペプチド溶液（各濃度で３つの試料）を、血餅に添加し、対照物としての400μlの緩衝液ともに、５分間、３７℃で培養する。次に、100μlの２mMのMoc-D-Chg-Gly-Arg-pNA基体を、各容器に添加し、更に、３０分間、３７℃で培養する。反応は、100μlの５０％AcOHで停止される。
ｃ）各反応溶液から、150μlを、９６-井のマイクロ滴定皿に適用し、吸光係数を、405nmで測定した（ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH、オーストリア）。ＩＣ50（５０％抑制に必要なペプチド濃度）を、参照と比較して平均吸光性からグラフ的に測定する。
方法Ｍ３
血餅結合の血栓症抑制性の測定
ａ）溶液は、方法Ｍ２/ａに従って、ペプチド抑制子から作成される。
ｂ）洗浄媒体を取り出した後に、血餅（方法Ｍ１）を、400μlのペプチド溶液（各濃度で３つの試料）と混合し、次に、試料を、参照としての別の400μlの緩衝液と一緒に、５分間、３７℃で培養する。次に、100μlの１ mMのTos-Gly-Pro-Arg-pNA基体溶液を添加し、培養を更に、３０分間３７℃で継続する。
実験は、Ｍ２/ｃに従って、継続される。
方法Ｍ４
フィブリン血餅の製造
ａ）各反応容器に、200μlのヒトフィブリノゲン（SIGMA）、25μlの２５NIH/E/mlヒトトロンビン（SIFMA）及び４０μlの100 mM CaCl2溶液を入れて、混合物を、１時間２０〜２２℃に放置する。フィブリン血餅を、ゆっくりと攪拌しながら、等浸透性のNaCl溶液（３×２ml）で洗浄し、微量のトロンビンおよび５分間で沈殿したものを除去する。洗浄の呼応率は、方法Ｍ１/ｃによりチェックする。
方法Ｍ５
フィブリン血餅結合性の抑制性の測定
ａ）０．１−１．０−１０及び100μg/mllの溶液を、ペプチド抑制子から、Hepes／Nacl緩衝液（0.001Ｍ Hepes及び０．１ＭのNacl、ｐＨ＝７．４）とともに作製する。
ｂ）測定は、Ｍ３/ｂにより継続される。
方法Ｍ６
９６-井微量滴定血小板上の溶解の因子Xa抑制性の測定
ａ）燐酸塩緩衝液（０．１Ｍ燐酸ナトリウム及び0.05Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．４）により、１．３Ｅ/ml溶液を、ヒト因子Xa（SIGMA）から製造され、そして、０．１−１．０−１０及び100μg/ml溶液は、ペプチド抑制子から製造される。Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA基体を、分留水溶液（0.33 nM）中で使用する。
ｂ）参照と各ペプチド抑制子溶液（各々の濃度で３つの試料）から、３０−３０μlの部分を、井の中に入れる。３０μlの因子Xa、９０μlの緩衝液及び150μlの基体を、ペプチド溶液に添加し、そして、その吸光係数を、１０分間、405 nmにおいて、測定する。その後は、工程は、Ｍ２/ｃと同じものである。