(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアルカンスルホン酸と反応する官能基をもつ高分子粒子に、アミノアルカンスルホン酸を反応させて、該粒子にスルホン酸基を導入することを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の製造方法によって得られた充填剤を用いることを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィーによる試料の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法及び該充填剤を用いる試料の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン性を有する物質の分離に汎用されている。そのうち、カチオン交換クロマトグラフィーは、一定条件下でアニオン性を有する官能基をもつ充填剤を用いて、主にカチオン性物質の分離を行うものである。上記カチオン交換クロマトグラフィーによる測定対象となるカチオン性の物質としては、例えば、タンパク質や核酸などの生体試料；各種イオン類；各種薬物など多岐に渡っている。
【０００３】
上記カチオン交換クロマトグラフィーに用いられる充填剤の官能基としては、カルボキシル基及びスルホン酸基が挙げられる。このうち、スルホン酸基を有する充填剤は、カルボキシル基を有する充填剤に比較し広いｐＨ範囲で解離して測定を行える利点がある。
【０００４】
スルホン酸基を有する充填剤の調製方法としては、（ａ）スルホン酸基を有さない粒子をまず調製し、その後該粒子とスルホン酸基あるいは類似基を有する化合物を反応させて、粒子にスルホン酸基を導入する方法；（ｂ）スルホン酸基を有する素材自体を粒子の構成素材として選択し、粒子調製と同時に、スルホン酸基を導入する方法；（ｃ）化学反応によりスルホン酸基を生成し得る官能基を粒子の構成素材として選択し、粒子調製後、化学反応により、該官能基をスルホン酸基に変換する方法などが挙げられる。
【０００５】
上記（ａ）の例としては、特開平1-262468号公報に開示された方法が挙げられる。上記公報の方法は、グリシジル基を有する架橋重合体粒子からなり、該粒子表面のグリシジル基に基づくエポキシ基が加水分解によって水酸基に開環変性され、かつ該粒子内部のグリシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋されているクロマトグラフィー用担体の前記水酸基に、有機溶媒中でアルカリ金属の水酸化物を触媒として、プロパンスルトン又は１，４−ブタンスルトンを反応させる方法である。しかし、この製造方法は、工程が非常に多くなるため煩雑である。また、測定対象試料によっては、試料の分離に要する時間が長くなる場合があるという問題もある。
【０００６】
上記（ｂ）の例としては、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのようなスルホン酸基含有単量体と架橋性単量体などとの混合物を、重合開始剤存在下に重合することにより調製され得る。しかしながら、このような単量体は極めて種類が少なく、入手が難かしい。もっとも、このような単量体を、充填剤を使用する者自身において調製することは、不可能ではないが、操作が非常に煩雑である。
【０００７】
上記（ｃ）の例としては、スルホン酸エステル含有単量体と架橋性単量体などとの混合物を重合開始剤存在下に重合し、重合後に加水分解等でエステルを分解することにより調製され得る。この場合も該当する単量体が非常に少ないため、測定試料に対する充填剤の最適化がしにくいという問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来のスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を改良し、より簡便な方法を提供すること、及び該充填剤を用いる測定方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、アミノアルカンスルホン酸と反応する官能基をもつ高分子粒子に、アミノアルカンスルホン酸を反応させて、該粒子にスルホン酸基を導入することを特徴とする。
【００１０】
以下、上記の製造方法について説明する。
【００１１】
本発明においては、まず、アミノアルカンスルホン酸と反応する官能基をもつ高分子粒子を用意する。このような高分子粒子は公知の任意の素材及び方法を用いて調製し得る。
【００１２】
上記高分子粒子の素材としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００１３】
上記高分子粒子としては、導入されるスルホン酸基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましく、また、耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００１４】
高分子粒子がシリカ粒子の場合、該シリカ粒子は、例えばアルコキシラン誘導体をアルコール／水の混合溶媒に添加し、触媒存在下に重合することにより得ることができる。さらに必要に応じて、官能基含有シランカップリング剤を反応させることにより、適当な官能基を導入することもできる。
【００１５】
高分子粒子がセルロース粒子の場合、該セルロース粒子は、例えば、三酢酸セルロースを有機溶媒に溶解し、さらにゼラチン水溶液を添加して有機溶媒を除去後、アルカリ性下で加水分解することにより得ることができる。
【００１６】
高分子粒子がポリアミノ酸粒子の場合、該ポリアミノ酸粒子は、例えば、Ｎ−カルボン酸無水物を重合することにより得ることができる。
【００１７】
高分子粒子が合成高分子粒子の場合、該合成高分子粒子は、例えば、スチレン、ジビルベンゼン、ジビニルトルエン；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの単量体を、重合開始剤存在下で重合することにより得ることができる。
【００１８】
上述のように、本発明で用いられる高分子粒子は、アミノアルカンスルホン酸と反応する官能基（以下、反応性官能基という）をもつ必要がある。
【００１９】
上記反応性官能基の具体例としては、例えば、水酸基、各種アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、メルカプト基、各種エステル基などが挙げられる。
【００２０】
上記反応性官能基をもつ高分子粒子は、例えば、上記の高分子粒子の調製に際して、単量体として該反応性官能基をもつものを用いて重合（共重合も含む）させる方法；高分子粒子の調製後、化学反応により該反応性官能基を導入する方法；高分子粒子の調製後、高分子粒子の表面を化学的に変性させて該反応性官能基をもつようにする方法などが挙げられる。
【００２１】
上記の反応性官能基をもつ単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸などの酸類；（メタ）アクリル酸エステル、酢酸ビニル、グリシジル（メタ）アクリレート、２−アミノヘキシル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなどのエステル類が挙げられる。
【００２２】
本発明の製造方法は、上記のような、アミノアルカンスルホン酸と反応する官能基をもつ高分子粒子に、アミノアルカンスルホン酸を反応させて、該粒子にスルホン酸基を導入する。
【００２３】
本発明で言うアミノアルカンスルホン酸とは、アルカンの炭素鎖の両末端に含窒素基及びスルホン酸基を有する化合物を指す。この場合、含窒素基とは、第１級、第２級もしくは第３級アミノ基、又は第４級アンモニウム基を指す。上記アミノアルカンスルホン酸において、アルカンは炭素数１０以内の直鎖又は枝状のアルカンが好ましい。
【００２４】
アミノアルカンスルホン酸の具体例としては、例えば、アミノメタンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、２−アミノプロパンスルホン酸などのアミノアルカンスルホン酸類；ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（以下、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓという）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下、ＴＥＳという）などのＧｏｏｄの緩衝液に用いられる化合物などが挙げられる。
【００２５】
反応性官能基をもつ高分子粒子にアミノアルカンスルホン酸を反応させて、該粒子にスルホン酸基を導入するには、高分子粒子上の反応性官能基と、アミノアルカンスルホン酸の含窒素基とを反応させて結合させる。反応方法は公知の技術で行える。
【００２６】
例えば、反応性官能基がカルボキシル基の場合、該カルボキシル基をハロゲン化した後、アミノアルカンスルホン酸を添加して加熱する；カルボジイミド存在下にアミノアルカンスルホン酸を添加して加熱する；カルボキシル基をエステル化した後、アミノアルカンスルホン酸を触媒存在下に添加して加熱するなどの方法が挙げられる。
【００２７】
例えば、反応性官能基が水酸基の場合、臭化シアンによる活性化処理後、アミノアルカンスルホン酸を添加して加熱する方法が挙げられる。
【００２８】
例えば、反応性官能基がアミノ基の場合、チオシアナート誘導体化又はイソシアナート誘導体化した後、アミノアルカンスルホン酸を作用させる方法が挙げられる。
【００２９】
例えば、反応官能基がエステル基の場合、ヒドラジン及び亜硝酸塩により酸アジドを生成させた後、アミノアルカンスルホン酸を作用させる方法が挙げられる。
【００３０】
本発明の製造方法によって得られる充填剤は、少なくともアミノアルカンスルホン酸由来のスルホン酸基をもつ粒子であるが、スルホン酸基以外の官能基を有していてもよい。
【００３１】
本発明の製造方法によって得られる充填剤の粒子形状は、より真球状が好ましい。上記充填剤の粒径は、特に制限されないが、好ましくは０．５〜２０μｍである。上記充填剤の粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均粒径×１００）として、２０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。
【００３２】
次に、本発明の測定方法について説明する。本発明の測定方法は、本発明の製造方法によって得られた充填剤を用いることを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィーによる試料の測定方法である。
【００３３】
本発明の測定方法の実施に際して、充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に利用される。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されず、内径０．５〜１０ｍｍ、長さ５〜３００ｍｍのものが好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００３４】
本発明の測定方法の対象となる試料は、従来のカチオン交換クロマトグラフィーで測定可能なもののすべてが可能であり、特に限定されない。例えば、タンパク質、核酸などの生体試料；薬物類；糖類；界面活性剤；各種イオンなどが挙げられる。
【００３５】
上記測定に使用される液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００３６】
測定に用いられる溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーに用いられる公知の溶離液の中から選択される。具体的には、リン酸、ホウ酸及びその塩を含む無機系緩衝液；各種アミノ酸類、クエン酸、コハク酸、フタル酸及びその塩などを含む有機酸系緩衝液；ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどのＧｏｏｄの緩衝液類などが挙げられる。また、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの各種塩類；塩酸などの無機酸類；酢酸などの有機酸類；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基類；メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒類などを添加又は単独で使用してもよい。
【００３７】
溶離液の濃度は、他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の溶離液を複数混合して用いてもよい。また、溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。
【００３８】
（作用）
本発明のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、アミノアルカンスルホン酸を反応性官能基をもつ高分子粒子に結合させることを特徴とする。本発明の製造方法は従来法に比べ、操作が単純で容易に実施でき、反応後の夾雑物質の除去も容易に行え、反応収率も高い。また、反応の再現性も良いので、製造上、有利である。また、製造に際して有害な物質の使用や発生などが少ない。
【００３９】
また、既知のアミノアルカンスルホン酸化合物が多く存在するため、アミノアルカンスルホン酸の種類により、高分子粒子とスルホン酸基間の距離を調節できるので、測定対象試料に合わせて最適の化合物を選択できる。また、スルホン酸基以外の部分の構造が異なるアミノアルカンスルホン酸を適宜選択することにより、該部分の分離への寄与も期待できる。
【００４０】
また上記充填剤を使用することにより、従来の、カルボキシル基やスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤では、測定時間がかかりすぎたり、分離が不十分であった測定試料の分析において、より短時間に、かつ高精度に分離が可能となる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の非限定的な実施例を挙げることにより、本発明を更に明らかにする。
（実施例１）
（１）高分子粒子の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びグルシジルメタクリレート（日本油脂社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００４２】
（２）アミノアルカンスルホン酸の導入
上記（１）で得られた粒子１００ｇにＭＥＳ（和光純薬社製）の１０重量％水溶液を５００ｇ添加し、７０℃で２４時間反応させた。得られた粒子を精製水で洗浄し乾燥した。
【００４３】
（３）カラムへの充填
上記（２）で得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。上記粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００４４】
（４）ヘモグロビン（Ｈｂ）類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。測定条件
0003987627.tif 000002
【００４５】
測定試料
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ（糖負荷血）：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させたもの。
試料ｂ（カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させたもの。
試料ｃ（アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させたもの。
試料ｄ：上記試料ｂと試料ｃを等量混合したもの。
【００４６】
次いで、上記試料ａと試料ｄをそれぞれ以下のように処理して試料Ａと試料Ｄを作製し測定試料とした。
試料Ａ：上記試料ａを、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料Ａとした。
試料Ｄ：上記試料ｄを、溶血洗浄液Ｙ（溶血洗浄液Ｘにポリリン酸ナトリウム（太平化学社製）を０．０５重量％となるよう添加したもの）で１５０倍に溶血希釈し、３５℃で２分間加温して試料Ｄとした。
【００４７】
測定結果
上記測定条件により、試料Ａ及び試料Ｄを測定して得られたクロマトグラムを図１に示す。図１（イ）は試料Ａを測定した結果、図１（ロ）は試料Ｄを測定した結果を示す。ピーク１はヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）及びヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ピーク２はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、ピーク３は不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）、ピーク４は安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）、ピーク５はヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
（イ）図では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、（ロ）図ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００４８】
（５）核酸類の測定
上記のカラムを用いて、以下の測定条件で核酸類の測定を行った。
測定条件
0003987627.tif 000003
【００４９】
測定試料
チミン、グアニン、シトシン、アデニンの４種の核酸標準品（いずれもＳｉｇｍａ社製）を混合し、上記溶離液に溶解した溶液を試料とした。
【００５０】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。図２においてピーク８はチミン、ピーク９はグアニン、ピーク１０はシトシン、ピーク１１はアデニンを示す。いずれのピークも短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００５１】
（実施例２）
トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
得られた粒子１００ｇに、０．５重量％カルボジイミド水溶液１００ｍｌ及び２−アミノエタンスルホン酸（和光純薬社製）３０ｇを添加して６０℃で２４時間反応させた。得られた粒子を用い、実施例１に準じてＨｂ類及び核酸類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図１及び２と同様であった。
【００５２】
（比較例１）
実施例１の（１）と同様にして得られた高分子粒子を、１０重量％亜硫酸ナトリウム水溶液に分散し、７０℃で２４時間反応させた。この反応は、反応中に亜硫酸ガスが発生したため、排気装置を装備して行った。
【００５３】
得られた粒子を用い、実施例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、Ｈｂ類の測定を行ったところ、図３のクロマトグラムを得た。図３（イ）は試料Ａを測定した結果、図３（ロ）は試料Ｄを測定した結果を示す。図１に比較して、図３（イ）では、長時間を要しているにもかかわらず、ピーク３とピーク４の分離が悪い。図３（ロ）では、長時間を要しているにもかかわらずＡＨｂとＣＨｂの分離ができなかった。
【００５４】
また実施例１に準じて、核酸類の測定を行ない得られたクロマトグラムを図４に示す。測定に長時間を要していることが分かる。
【００５５】
（比較例２）
特開平１−２６２４６８号公報に記載の方法により、以下のようにしてスルホン酸基を有する充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート５０ｇ及びグルシジルメタクリレート３５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、得られた粒子１００ｇにキシレン３００ｇを添加し、さらにポリビニルアルコール４０ｇ及び硫酸１５ｇを加えて８０℃で１時間反応させた。粒子を洗浄後、１００ｍｌのジメチルスルホキシド中に懸濁し、１，３−プロパンスルトン５ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、３０℃で７時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。なお、この充填剤の調製操作は、操作が多いため非常に煩雑であった。
【００５６】
得られた粒子を用い、実施例１に準じてＨｂ類の測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは、図３と同様であった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明に係るカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、アミノアルカンスルホン酸を反応性官能基をもつ高分子粒子に結合させるので従来法に比べて簡便に行え、また有害な物質の使用や発生などが少ない。またアミノアルカンスルホン酸化合物には種々の化合物が存在するので、その種類を変えることにより、高分子粒子とスルホン酸基間の距離を調節できる。従って、測定対象試料に合わせて最適の充填剤を製造できる。また、スルホン酸基以外の部分の構造が異なるアミノアルカンスルホン酸を適宜選択することにより、該部分の分離への寄与も期待できる。
【００５８】
本発明に係る測定方法は、請求項１記載の製造方法によって得られた充填剤を用いるので、従来のカルボキシル基やスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いる場合に比べ、ヘモグロビン類などのタンパク質や核酸類をはじめとする、従来から測定されていた試料について、より短時間に、より高精度に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１によって得られた充填剤を用いて、核酸類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例１によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１によって得られた充填剤を用いて、核酸類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１  ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂのピーク
２  ＨｂＦのピーク
３  不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５  ＨｂＡ０のピーク
６  ＡＨｂのピーク
７  ＣＨｂのピーク
８  チミンのピーク
９  グアニンのピーク
１０  シトシンのピーク
１１  アデニンのピーク
【図１】
0003987627.tif 000004
【図２】
0003987627.tif 000005
【図３】
0003987627.tif 000006
【図４】
0003987627.tif 000007