(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記表１に示される理化学的性質を有するＷＢ２６６３Ｂ物質を有効成分とする臓器及び／又は組織移植の際の拒絶反応抑制剤。
【表１】
0004004567.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載のＷＢ２６６３Ｂ物質を有効成分とする骨髄移植による移植片対宿主反応抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬用途に関するものであり、更に詳細には、本発明は、ＷＢ２６６３Ｂ物質を有効成分とする免疫抑制剤等の新規な医薬用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明で使用されるＷＢ２６６３Ｂ物質は、公知物質であって、既に特許出願もなされ（特願平３−１６９１０４号）、国際出願公開ＷＯ９２／２２５６２号明細書に開示されている。
ＷＢ２６６３Ｂ物質は、シュードモナス・スピーシース  Ｎｏ．２６６３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４２１)(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｎｏ．２６６３）といったシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物の培養物から分離することができ、抗腫瘍作用を有することが明らかにされている。
しかしながら、ＷＢ２６６３Ｂ物質の抗腫瘍作用以外の薬理作用は、未だ見出されていない。
【０００３】
一方、安全性が高い免疫抑制剤の新規開発が強く希求されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した技術の現状に鑑み、安全性が高く広範囲且つ強力な薬理作用を有する免疫抑制剤を開発する目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものである。
【０００６】
そこで本発明者らは、安全性の面から天然物に着目し、微生物の発酵生産物に注目するに至り、各方面から検討を行い、シュードモナス  スピーシーズＮｏ．２６６３菌が産生するＷＢ２６６３Ｂ物質が抗腫瘍性を有することから、更に検討の結果、ＷＢ２６６３Ｂ物質が免疫抑制作用その他すぐれた薬理作用を有することを新たに見出し、本発明の完成に至ったものである。
【０００７】
すなわち本発明は、ＷＢ２６６３Ｂ物質の新規医薬用途に関するものである。
以下、本発明について詳しく述べる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるＷＢ２６６３Ｂ物質は、先の国際出願公開明細書に記載したところにしたがい、シュードモナス属に属する該物質生産菌（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｎｏ．２６６３）を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好気条件下で培養することにより（例えば、振とう培養、通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。
【０００９】
発酵終了後、培養物から目的とする本物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すればよい。
【００１０】
回収、精製方法としては、例えば、水、有機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独であるいは組合わせて使用できる。
【００１１】
本物質の単離、精製は、上記のように既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにして有効成分の内の３成分をそれぞれ単離、精製してもよい。まず、培養物の有機溶媒（例えば酢酸エチル）抽出液をシリカゲルカラムに通し、展開溶媒を変え、必要あれば更にカラム処理、各種展開溶媒処理を行って、該物質生産菌が同時に生産するＷＢ２６６３Ａ物質及びＷＢ２６６３Ｃ物質と分離、精製する。すなわち、ＷＢ２６６３Ａ物質に富む画分、ＷＢ２６６３Ｂ物質に富む画分、ＷＢ２６６３Ｃ物質に富む画分をそれぞれ得た後、ＷＢ２６６３Ｂ物質に富む画分を更に精製する。例えば、該画分を溶媒単独または混合溶媒で抽出し、抽出液を蒸発又は蒸留して濃縮する。濃縮残渣をクロマトグラフィー又は再結晶処理して、必要あれば更に凍結乾燥して、更に精製したＷＢ２６６３Ｂ物質を得ることもできる。
【００１２】
このようにして得たＷＢ２６６３Ｂ物質は、下記表２、表３、表４に示す理化学的性質を有する。
【００１３】
【表２】
0004004567.tif 000002
【００１４】
【表３】
0004004567.tif 000003
【００１５】
【表４】
0004004567.tif 000004
【００１６】
本発明に係る医薬は、ＷＢ２６６３Ｂ物質を有効成分としてこれに常用される無機又は有機の担体ないし医薬用賦形剤を加えて、固体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤に製剤化する。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、例えば固形、半固形、または液状の医薬製剤の形態で使用されることができ、この医薬製剤は、外用（局所）、インハレーション、経鼻、経腸、経口、静脈内、筋肉内、または非経口的使用に適する有機、或いは無機の担体または賦形剤との混合物中に、本発明のＷＢ２６６３Ｂ物質を有効成分として含有するものである。
【００１８】
有効成分は、軟膏、クリーム、硬膏剤、錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、液剤（例えば、食塩水）、乳剤、懸濁剤（例えば、オリーブ油）、およびその他の使用に適する剤形とするための、通常の無毒性で医薬上許容される担体と共に、製剤化することができる。
【００１９】
使用することのできる担体は、水、ろう、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉ペースト、トリケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、パラフィン、コロイド状シリカ、馬鈴薯澱粉、尿素、およびその他の製剤を調製する際に適する固形、半固形、または液状の担体があり、さらに、安定化剤、増粘剤、着色料、および香料を使用してもよい。有効成分となる化合物は、疾病の進行、または病状に対し、所望の効果を得るのに充分な有効量を医薬組成物に含有させる。
【００２０】
本発明により治療を施すことができる哺乳動物には、ウシ、ウマ等のような家畜、イヌ、ネコ、ラット等のような屋内にいる動物、およびヒトが含まれ、好ましくは、ヒトである。
【００２１】
本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（本物質）を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与する。
【００２２】
本発明に係る医薬製剤は、ＷＢ２６６３Ｂ物質が優れた免疫抑制作用を有し、従って、（ａ）心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸、手足、筋肉、神経、椎間板、気管等の臓器または組織の移植の際の拒絶反応；（ｂ）骨髄移植による移植片対宿主反応；（ｃ）慢性関節リウマチ、全身性紅斑狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病等の自己免疫疾患；に有用である。
【００２３】
更に、本発明に係る医薬製剤は、下記する少なくともひとつの疾患の治療及び／又は予防に有用である。
【００２４】
（ａ）炎症性及び増殖亢進性皮膚病、及び／又は免疫学的仲介皮膚疾患
例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、水疱瘡類天疱瘡、表皮水疱症、じん麻疹、血管性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、紅斑性狼瘡、座瘡及び円形脱毛症；
【００２５】
（ｂ）自己免疫疾患の眼疾患
例えば、角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病関連のブドウ膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円錐形角膜炎、角膜上皮異栄養症、角膜白斑、眼天疱瘡、モーア潰瘍、強膜炎、グレープス眼障害、フォークト−小柳−原田症候群、類肉腫症等；
【００２６】
（ｃ）可逆的閉塞性気道疾患
ぜん息（例えば、気管支ぜん息、アレルギー性ぜん息、内因性ぜん息、外因性ぜん息及び塵埃性ぜん息）、特に慢性または難治性ぜん息（例えば、遅発型ぜん息及び気道反応性亢進）、及び気管支炎等；
【００２７】
（ｄ）粘膜及び血管の炎症
例えば、胃潰瘍、虚血症及び血栓症による血管損傷、虚血性腸疾患、腸炎、壊死性全腸炎、火傷による腸損傷、ロイコトリエンＢ4−仲介疾患；
（ｅ）腸の炎症／アレルギー
例えば、小児脂肪便症、直腸炎、好酸性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病及び潰瘍性大腸炎；
（ｆ）胃腸管から遠隔の部位に症候性症状発現をする食物関連アレルギー疾患
例えば、偏頭痛、鼻炎及び湿疹；
（ｇ）腎症及び／又は腎炎
例えば、間質性腎炎、グッドバスチャー症候群、溶血性尿毒症症候群及び糖尿病性腎症；
（ｈ）神経性疾患
例えば、多発性筋炎、ギラン−バレー症候群、メニエール病及び神経根障害；
（ｉ）内分泌疾患
例えば、甲状腺機能亢進症及びバセドウ病；
【００２８】
（ｊ）血液疾患
例えば、純赤芽球病、再生不良性貧血、形成不良性貧血、特発性血小板減少紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽球性貧血及び赤血球形成不全症；
【００２９】
（ｋ）骨疾患
例えば、骨粗しょう症；
（ｌ）呼吸器系統疾患
例えば、サルコーイドシス（類肉腫症）、肺繊維症及び特発性間質性肺炎；
（ｍ）皮膚疾患
例えば、皮膚筋炎、尋常性白斑症、尋常性魚鱗癬、光線過敏症及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫；
（ｎ）循環器系統疾患及び／又は虚血性脳疾患
例えば、動脈硬化症、アテローム硬化症、大動脈炎症候群、結節性多発性動脈炎及び心筋症；
（ｏ）膠原病
例えば、強皮症、ウェゲナー肉芽腫及びシェーグレン症候群；
【００３０】
（ｐ）脂肪過多症
（ｑ）好酸球性筋膜炎
（ｒ）歯周病
例えば、歯肉、歯周、歯槽骨、（歯の）セメント質の損傷；
（ｓ）ネフローゼ症候群
例えば、糸球体腎炎；
（ｔ）男性型脱毛症または老人性脱毛症
（ｕ）筋ジストロフィー
（ｖ）膿皮症及びセザリー症候群
（ｗ）アジソン病
【００３１】
（ｘ）活性酸素仲介疾患
例えば、
ｉ）臓器損傷（保存、移植または虚血性疾患（血栓症、心筋梗塞）の際に生ずる（心臓、肝臓、腎臓、消化器管等の）臓器の虚血性血流損傷）：
ii）腸疾患
例えば、エンドトキシンショック、偽膜性大腸炎、薬剤または放射線による大腸炎：
iii）腎性疾患
例えば、虚血性急性腎不全、慢性腎不全：
iv）肺疾患
例えば、肺中酸素または薬剤（例えば、パラコート、ブレオマイシン）による中毒、肺癌、肺気腫：
ｖ）眼病
例えば、白内障、鉄沈着症（眼球鉄錆症）、網膜炎、色素沈着症、老人性斑点変質、ガラス体はん痕、アルカリ火傷角膜：
vi）皮膚炎
例えば、多形性紅斑、綿状免疫グロブリンＡ皮膚炎、セメント皮膚炎：
vii)その他の疾患
例えば、歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、又は、環境汚染（例えば、大気汚染）、老化、発癌物質、癌転移、高山病による疾患；
【００３２】
（ｙ）ヒスタミンまたはロイコトイリエンＣ4遊離による疾患等。
【００３３】
更に、本発明に係る医薬製剤は、ＷＢ２６６３Ｂ物質の優れた薬理作用により、肝疾患の治療及び／又は予防に有用である。
【００３４】
肝疾患としては、例えば、（ａ）免疫原性疾患（自己免疫性肝臓病、原発性胆汁性肝硬変または硬化性胆管炎のような慢性自己免疫性肝臓病）、（ｂ）部分的肝臓切除、急性肝臓壊死（例えば、毒物、ウイルス性肝炎、ショックまたは無酸素症による壊死）、（ｃ）Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ型肝炎、肝硬変及び肝機能不全（例えば、劇症肝炎、遅発性肝炎及び急性から慢性へ移行した肝機能不全）等が挙げられる。
【００３５】
更にまた、本発明に係る医薬製剤は、ＷＢ２６６３Ｂ物質が化学療法作用の増強作用、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス感染の予防及び／又は治療作用、抗炎症作用等の優れた薬理作用を有し、したがってこれらの作用を利用して各種の疾患の治療及び／又は予防にきわめて有用である。
【００３６】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００３７】
【実施例１】
【００３８】
（１）Ｎｏ．２６６３株の培養
ポリペプトン（日本製薬株式会社製）１％、酵母エキス（日本製薬株式会社製）０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％の組成の培地を５００ｍｌ容三角フラスコに各１６０ｍｌずつ分注し、１２０℃、３０分間滅菌した。これにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｎｏ．２６６３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４２１）の斜面培養物を一白耳ずつ植菌し、３０℃、２４時間ロータリー・シェーカー（毎分２２０回転）で培養を行ない、種培養液とした。別に、変性デンプン１％、グリセリン１％、グルコース０．５％、脱脂大豆粉１％、コーン・スチープ・リカー０．５％、（ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．００６％、ＣａＣＯ3 ０．２％、アデカノール（ＬＧ−１０９、旭電化工業株式会社）０．０５％、シリコン（ＫＭ−７０、信越化学工業株式会社）０．０５％、ｐＨ７．０からなる培地２０Ｌを３０Ｌ容ジャー・ファーメンターに注入し、１２０℃、３０分間滅菌後、上記種培養液を４８０ｍｌ加え、通気量２０Ｌ／分、内圧１ｋｇ／ｃｍ2、２００回転／分とし、２５℃で２日間培養した。
【００３９】
（２）Ｎｏ．２６６３株の生産する物質の単離・精製
培養終了後、３０Ｌ容ジャー・ファーメンター２０基分の培養液４００ＬをｐＨ７．０に調製した後、１．５倍容（６００Ｌ）の酢酸エチルで２回抽出し、抽出液を合わせて減圧濃縮した。この濃縮液に無水硫酸ナトリウムを加え脱水後、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（７０〜２３０ｍｅｓｈ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製）１．７Ｌを加え、減圧下で乾燥した。得られた粉末をあらかじめｎ−ヘキサンでつめたｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ（同上）カラム４Ｌの上にのせ、カラムクロマトグラフィを行った。すなわち、ｎ−ヘキサン１７Ｌ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（３：１）１７Ｌ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）１７Ｌ、酢酸エチル１７Ｌ、酢酸エチル：アセトン（１：１）１７Ｌで順次溶出したところ、ＷＢ２６６３Ａ物質は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）画分に、ＷＢ２６６３Ｂ物質およびＷＢ２６６３Ｃ物質は、酢酸エチル画分に溶出された。
【００４０】
（３）ＷＢ２６６３Ｂ物質の精製
上記で得た酢酸エチル画分を減圧濃縮し、得られたオイル状物質（６２．９ｇ）を、ｎ−ヘキサン：クロロホルム（４：７）１．１Ｌに溶解し、あらかじめ、ｎ−：クロロホルム（１：１）でつめたｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ（同上）１．２Ｌに付した。カラムをクロロホルム：アセトン（１：０；１００：１；５０：１；２５：１および１０：１）各３．６Ｌで順次溶出したところ、活性は、クロロホルム：アセトン（１００：１）および（５０：１）に認められた。活性画分を合わせて減圧濃縮し、得られたオイル状物質（７．２ｇ）を２０％アセトニトリル水溶液２Ｌに溶解し、あらかじめ２０％アセトニトリル水溶液でプレパックしたＯＤＳ  ｇｅｌ（同上）カラム２００ｍｌに付し、逆相クロマトグラフィを行った。カラムを２５％および２７％アセトニトリル水溶液各６００ｍｌで順次溶出したところ、活性は、２７％アセトニトリル水溶液画分に認められた。活性画分を減圧濃縮し、アセトニトリルを除去後、等容の酢酸エチルで２回抽出し、抽出液を合わせて、減圧濃縮し、ＷＢ２６６３Ｂ物質の白色粉末８１９ｍｇを取得した。
【００４１】
【実施例２：皮膚移植モデルにおける本物質の作用（１）−マウス−ラット間の異種皮膚移植−】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）の耳皮膚片（耳外側）を、あらかじめ腹部表皮を切り取ったＷＫＡラット（ＲＴ−１k）に移植し、マウス−ラット間の異種皮膚移植を行った。
薬剤（上記実施例で得たＷＢ２６６３Ｂ物質）は、移植当日から１４日間、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内投与した。
拒絶反応は、移植片の壊死の状態を観察し、９０％以上の面積の壊死をもって拒絶とした。生着日数は、拒絶日の前日までとした。
得られた結果を下記表５に示すが、その結果から、ＷＢ２６６３Ｂ物質の投与群において、明らかな移植片生育日数の延長が認められた。
【００４２】
【表５】
0004004567.tif 000005
【００４３】
【実施例３：皮膚移植モデルにおける本物質の作用（２）−ラット同種皮膚移植−】
Ｆ３４４ラット（ＲＴ−１1v1）の耳皮膚片（耳外側）を、あらかじめ腹部表皮を切り取ったＷＫＡラット（ＲＴ−１k）に移植し、ラット同種皮膚移植を行った。
薬剤（上記実施例で得たＷＢ２６６３Ｂ物質）は、移植当日から１４日間、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内投与した。
拒絶反応は、移植片の壊死の状態を観察し、９０％以上の面積の壊死をもって拒絶とした。生着日数は、拒絶日の前日までとした。
得られた結果を下記表６に示すが、その結果から、ＷＢ２６６３Ｂ物質の投与群において、明らかな移植片生育日数の延長が認められた。
【００４４】
【表６】
0004004567.tif 000006
【００４５】
【実施例４】
ＷＢ２６６３Ｂ物質                                    １００ｍｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０（ＴＣ−５Ｒ）    １ｇ
ラクトース                                                  ２ｇ
クロスカルメロースナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ）          １ｇ
ＷＢ２６６３Ｂ物質（１００ｍｇ）をエタノール（１０ｍｌ）に溶解し、この溶液にヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０（ＴＣ−５Ｒ）（１ｇ）を加えて、懸濁液を調製した。この懸濁液にジクロロメタン（５ｍｌ）を加えて、均一な溶液を調製した。ラクトース（２ｇ）、およびクロスカルメロースナトリウム（商標名：Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ、旭化成工業社製）をこの溶液に均一に懸濁し、それから有機溶媒を蒸発させ除去した。残留生成物を真空乾燥器により減圧下で１０時間乾燥し、コーヒーミルにより２分間粉砕し、この後、ふるい（３２号ふるい）にかけ、ＷＢ２６６３Ｂ物質の固体分散組成物（５ｇ）を得た。この組成物を通常の方法によりカプセルに充填して、１カプセルにつきＷＢ２６６３Ｂ物質を１ｍｇ、または５ｍｇ含有するカプセル剤を得た。
【００４６】
【実施例５】
ＷＢ２６６３Ｂ物質                                      １０ｍｇ
ＨＣＯ−６０（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油  ６０）  ４００ｍｇ
エタノール                                            １ｍｌまで
上述した成分を含有する溶液は、通常の方法により、エタノール中にＷＢ２６６３Ｂ物質及びＨＣＯ−６０を溶解することにより調製される。この溶液は、適当な用量の生理食塩水で希釈することで静脈注射により投与することができる。
【００４７】
【実施例６】
ＷＢ２６６３Ｂ物質                                        ２ｍｇ
ポリソルベート                                          ５０ｍｇ
プロピレングリコール                                  １ｍｌまで
上記溶液は、実施例５と同様な方法で調製された。
【００４８】
【発明の効果】
ＷＢ２６６３Ｂ物質は、すぐれた免疫抑制作用等各種の薬理作用を有するだけでなく、急性毒性値も低くて（ＢＤＦ1マウス（雌性、７週令）、腹腔内投与において、３．２ｍｇ／ｋｇ）安全性が高く、したがって本物質は各種の医薬として有効に利用される。