(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム・エスピー AB10121株(FERM P-17383として寄託)の細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをＤ-キロ−イノシトールへ変換させることを特徴とする、Ｄ-キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに該細菌を作用させ、ミオ−イノシトールの変換により培養液中でＤ-キロ−イノシトールを生成蓄積させる工程と培養液からＤ-キロ−イノシトールを回収する工程とを含む、請求項１記載のＤ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項３】
請求項1記載の細菌をミオ−イノシトールを含有する培地で培養して得られた菌体或いはその菌体の破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールと反応させ、前記の水溶液または緩衝液中にＤ-キロ−イノシトールを生成させる工程とＤ-キロ−イノシトールを回収する工程とを含む、請求項１記載のＤ-キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項４】
ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに選択的に変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17383の受託番号で寄託されたアグロバクテリウム・エスピー AB10121株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグロバクテリウム属細菌 AB10121株を新規な微生物として利用し、安価なミオ−イノシトール(myo-Inositol)から、利用価値の高いＤ-キロ−イノシトール(Ｄ-chiro-Inositol)を製造する新しい方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ-キロ−イノシトールは、９種類存在するイノシトール立体異性体の一つであり、その製造方法の代表例については次の (a) 〜 (d) の方法などが知られている。
(a) 抗生物質のカスガマイシンを加水分解して、その分子構成部分であるＤ−キロ−イノシトールを得る次の３つの方法、すなわち (ｉ) カスガマイシンの強酸による加水分解法(米国特許第5,091,596号）、（ii）カスガマイシンをアセチル化した後に加水分解する方法(米国特許第5,463,142号）、および（iii）強酸性イオン交換樹脂によるカスガマイシンの加水分解法(米国特許第5,714,643号）。
(b) グルクロン酸を原料として10段階以上の化学合成ステップを経て、Ｄ-キロ−イノシトールを合成する方法（米国特許第5,406,005号）。
(c)ブーゲンビリアなどの植物中に含まれるピニトールを、脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを調製する方法（米国特許第5,827,896号）。
(d) アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネスまたはアグロバクテリウム・ルビの細菌を、ミオ−イノシトールに作用させて、これから、Ｄ-キロ−イノシトール、Ｌ-キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシトールの混合物を製造する方法（特開平9-140,388号）。
【０００３】
しかしながら、上記 (a)〜(c) のＤ-キロ−イノシトールを製造する既知の方法は、いずれも工業的規模で製造する方法としては操作の煩雑さ、あるいはコスト面で問題があり、必ずしも満足し得るものではない。また 上記 (d)の方法では、４種のイノシトール立体異性体の混合物が生成するため、そして特にＤ体とＬ体との分離が困難であるので精製操作が煩雑であり、単離されたＤ-キロ−イノシトールの最終的な収率は１％以下の低収率であり、工業的には全く採算性がない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、光学純度の高いＤ-キロ−イノシトールを効率よく安価に製造する方法を提供することである。Ｄ-キロ−イノシトールは近年、インシュリン非依存性糖尿病（ＰＣＴ公開WO 90/10439号公報）あるいは多嚢胞性卵巣症候群の治療薬（The New England Journal of Medicine, 340巻1314-1320頁，1999年）の治療薬として有効であることが示され、注目されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、新たに土壌から分離され、本発明者らによってアグロバクテリウム属に属する細菌と同定され、AB10121の菌株番号を付与された新しい菌株の細菌をミオ−イノシトールに作用させると、ミオ−イノシトールからＤ-キロ−イノシトールを選択的に高収率で生成することを見出した。精製後、機器分析した結果、この物質は光学純度の高いＤ-キロ−イノシトールであることが判明した。
【０００６】
従って、本発明においては、ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム・エスピー AB10121株 (FERM P-17383として寄託)の細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをＤ-キロ−イノシトールへ変換させることを特徴とする、Ｄ-キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【０００７】
本発明方法は、具体的には以下に簡略に示す実施法（Ａ）及び実施法（Ｂ）の２つの方法で行うことができる。
【０００８】
実施法（Ａ）は、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに該細菌を作用させ、ミオ−イノシトールの変換により培養液中でＤ-キロ−イノシトールを生成蓄積させる工程と培養液からＤ-キロ−イノシトールを回収する工程を含む方法である。
【０００９】
実施法(Ｂ)は、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株の細菌をミオ−イノシトールを含有する培地で培養して得られた菌体あるいはその菌体の破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中で前記ミオ−イノシトールと反応させ、前記の水溶液または緩衝液中にＤ−キロ−イノシトールを生成させる工程とＤ-キロ−イノシトールを回収する工程とを含む方法である。
【００１０】
なお、一般的に微生物は、細菌を含めて、薬剤や紫外線等の処理により突然変異を誘発しやすく、容易に変異株を取得でき、変換活性の向上した株を選抜することが出来るから、上記のAB10121株の変異株の使用は全て、本発明に含まれる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明によるＤ-キロ−イノシトールの製造方法について具体的に説明する。
本発明において使用する細菌は、ミオ−イノシトールをＤ-キロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を広く自然界から探索した結果、神奈川県厚木市の土壌から分離され、AB10121の菌株番号を付与された新規な分離株である。
本AB10121菌株の菌学的性質を示すと下記の通りである。
なお、本菌株の同定に当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、実験結果をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1
(1984) を参考にして同定した。
【００１２】
AB10121株の菌学的性質は下記に示す。
（a）形態的特徴
(1) 細胞形態：桿菌で大きさは0.5〜0.7 × 0.9〜2.8μm。多形性は無い。
(2) 運動性：懸滴法及びSIM培地での本菌株の観察の結果、運動性は認められなかった。
(3) 普通寒天培地上での生育状態：生育は中程度。コロニー形態は円形、平滑で光沢を帯びる。
【００１３】
0003944333.tif 000002
【００１４】
0003944333.tif 000003
【００１５】
0003944333.tif 000004
【００１７】
0003944333.tif 000005
【００１８】
0003944333.tif 000006
【００１９】
以上の通り、AB10121株の主性状は、グラム陰性の桿菌で、その大きさは0.5〜0.7×0.9〜2.8μmであり、グルコースを好気的に分解し、酸を生成する。カタラーゼ、オキシダーゼ、３-ケトラクトン酸テストに陽性であった。これらの菌学的性質を総合して検索した結果、本菌株はアグロバクテリウム属に属する菌株であると判断した。Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1 (1984) 244頁〜254頁によると、アグロバクテリウム属細菌は４種(特開平9-140388号公報参照)に分類されているが、AB10121株はそれら既知のいずれの種とも、その菌学的性質において完全には合致しなかった。従って、本菌株を公知のものと区別するため、アグロバクテリウム・エスピー AB10121と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17383として寄託した(寄託日：平成11年5月7日）。
【００２０】
本発明方法は２つの実施法を包含し、すなわち前記の実施法(Ａ）および(Ｂ）を包含するが、これらについて更に詳しく説明する。
【００２１】
まづ、実施法（Ａ）を具体的に説明する。
実施法（Ａ）では、ミオ−イノシトールを炭素源として含む液体培地に、
AB10121株の細菌を接種して好気的に培養することにより、該細菌をミオ−イノシトールに作用させ、Ｄ-キロ−イノシトールを効率よく生成させ、培養液中に蓄積させることができる。
【００２２】
液体培地の組成は、目的を達する限り何ら特別の制限がなく、炭素源としてのミオ−イノシトールおよび窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、ミオ−イノシトールが単独に存在するのが好ましく、ミオ−イノシトールを0.1％〜８％、より好ましくは２〜４％ 添加する。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を 0.01％〜4.0％、好ましくは0.05 ％〜2.0 ％添加するのが望ましい。有機栄養源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等を適当量（0.05％から５％）添加するのが望ましい。
【００２３】
その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、ニッケル、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液中の水素イオン濃度をpH ４〜10、好ましくはpH ７〜９に調整して培養すると、効率よくＤ-キロ−イノシトールを得ることができる。
【００２４】
培養条件は、菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は５〜40℃、好ましくは20〜37℃であり、培養期間は１〜14日、好ましくは３〜10日である。また培養方法は、液体培地を振とうするか、或いは液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行えば良い。
【００２５】
培養液から目的のＤ-キロ−イノシトールを回収し、採取するには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除いて得られた培養濾液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、Ｄ-キロ−イノシトール以外の不純物を培養濾液からほとんど除くことができる。こうして得られたＤ-キロ−イノシトールの溶液から、その後再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。実施法（Ａ）の一例を実施例１に示した。
【００２６】
次に、本法の実施法（Ｂ）を更に具体的に説明する。
実施法（Ｂ）では、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株をミオ−イノシトールを含有する培地で培養して得られた菌体或いは菌体破砕物を、ミオ−イノシトールとその水溶液または緩衝液中で反応させ、前記水溶液または緩衝液中にＤ-キロ−イノシトールを生成させるものである。
【００２７】
菌体としては、実施法（Ａ）により得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、前記細菌を別途適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。集菌は培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。また、菌体は適当な固体担体に担持させて用いることもできる。
【００２８】
また、菌体の破砕物を用いる場合は、菌体を超音波処理やアルミナと一緒に乳鉢ですりつぶす等の一般に用いられている方法で破砕して得られた菌体破砕物を用いればよい。
【００２９】
ミオ−イノシトールを含む上記の水溶液としては、液体培地あるいは緩衝液などが用いられる。液体培地としては、実施法（Ａ）におけるものと同様のものを用いてもよい。また別途、前記の細菌を培養した液体培地をそのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド(Good’s）のCHES緩衝液等を10〜 500 ｍＭ、好ましくは、20〜100 ｍＭの濃度で用いればよい。溶液中のミオ−イノシトールの初期濃度は0.1〜10％程度とするのが好ましい。反応条件は、用いる菌株や水溶液、液体培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は10〜60℃、好ましくは20〜45℃であり、反応時間は１〜50時間、好ましくは３〜48時間であり、水溶液、液体培地または緩衝液のpHは４〜９、好ましくはpH ６〜8.5である。
【００３０】
反応終了後の反応液からの目的物質を単離する方法は実施法（Ａ）と同様に行えばよい。実施法（Ｂ）の一例を後記の実施例２に示した。
【００３１】
本発明の別の要旨では、ミオ−イノシトールをＤ-キロ−イノシトールに変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17383の受託番号で寄託されたアグロバクテリウム・エスピー AB10121株が新規微生物として提供される。
【００３２】
【発明の効果】
本発明方法によれば、医薬として有用な光学純度の高いＤ-キロ−イノシトールをミオ−イノシトールから効率よく、しかも安価に製造することができる。
以下に本発明の実施例を説明する。
【００３３】
実施例１
実施法（Ａ）によるＤ−キロ−イノシトールの製造例
(１) Ｄ-キロ−イノシトールの生成
ミオ−イノシトール 4.0％（120 ｇ）、酵母エキス 0.1％、(NH4)2SO4 0.1％、 K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％、ZnSO4・7H2O 0.002％、NiCl2・6H2O 0.00025％、CaCl2・2H2O 0.0005％を含む液体培地 3 リットルを、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。 各々の三角フラスコにアグロバクテリウム・エスピー AB10121株（FERM P-17383として寄託）を接種し、33℃で７日間振とう培養した。培養液を遠心分離（8,000 rpm、20分間）し、得られた上清を培養上清液（2900 ml）とした。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＤ-キロ−イノシトールが 3.0 mg/mlの濃度(反応収率 7.5％)で生成していることがわかった。
【００３４】
なお、上記のＤ−キロ−イノシトールの反応収率は、次式により求めた。
【数１】
0003944333.tif 000007
【００３５】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム： Wakosil 5NH２    （4.6 × 250 mm）
カラム温度  ：  40℃
検出器  ：  RI DETECTER ERC-7515A (ERMA CR. INC.）
注入量  ：  20 μｌ
流速  ：  ２ ml/min.
溶媒  ：  アセトニトリル−水＝ 4 : 1
溶出時間  ：  D−キロ−イノシトール  ；  8.5 分
【００３６】
(２) Ｄ-キロ−イノシトールの単離
上記の培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標) C-20（Ｈ+型）500 mlを充填したカラム(内径 5cm、長さ 30cm)に通過させ、その後このカラムに500 mlのイオン交換脱イオン水を通過させて洗浄した。このカラム通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標) A-113（OH-型）500 mlを充填したカラム(内径５cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに 1,000 mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
【００３７】
上記により得た通過液および洗浄液を、減圧下で約 200 mlまで濃縮した。その濃縮液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標) A-113(ホウ酸型) 500 mlを充填したカラム(内径 ５cm、長さ 30cm)に通過させた。このカラムを脱イオン水 1,000 mlで水洗後に、カラムを、0.5 Mホウ酸水溶液 1500 mlで溶出し、Ｄ-キロ−イノシトールを含む画分を集めた。この画分を減圧下に濃縮乾固した。得られた残さ固体に、ホウ酸を共沸除去するためにメタノールを添加して減圧下濃縮乾固する操作を数回繰り返した。得られた固体を少量の蒸留水に溶解した溶液を、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト(登録商標) CG-400(OH-型）2000 mlを充填したカラム(内径 5.5cm、長さ 85cm)に供し、さらに蒸留水で溶出し、溶出液を分画して集めた。Ｄ-キロ−イノシトール画分を集めて、これらを濃縮した。濃縮液40mlにエタノール360 mlを添加し、水−エタノール（１：９）の混合溶媒中で結晶化した。結晶を乾燥し、Ｄ-キロ−イノシトール 8.2ｇ（精製収率 94％）を得た。このようにして得られたＤ-キロ−イノシトールの物理化学的性質は以下のとおりであった。
【００３８】
比旋光度：[α]D25 ＋65°（ c = 1.0，H2O）
融点：  238℃
なお、上記 Ｄ-キロ−イノシトールの精製収率は次式により求めた。
【数２】
0003944333.tif 000008
【００３９】
実施例２
実施法（Ｂ）によるＤ-キロ−イノシトールの製造例
（１）AB10121株の菌体の生産
ミオ−イノシトール 4.0％、酵母エキス 0.4％、(NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.7 ％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含む液体培地２リットルを、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。
各々の三角フラスコにアグロバクテリウム・エスピー AB10121株を接種し、27℃で２日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌体を、0.05 Mリン酸緩衝液（pH 7.0）200 mlで洗浄した後、再度遠心分離し、洗浄菌体20 gを得た。
【００４０】
（２）Ｄ-キロ−イノシトールの製造
上記により得られた洗浄菌体20gを、ミオ−イノシトール４gを含有した 0.05Mリン酸緩衝液（pH 7.0）400 ml (ミオ−イノシトール濃度10 mg/ml)中に加えた。
緩衝液を30℃、48時間緩やかにスターラーで攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｄ-キロ−イノシトールが 0.4 mg/mlの濃度(反応収率４％)で生成され、蓄積していた。反応液からのＤ-キロ−イノシトールの単離は、実施例１に記載した方法に準じて行い、結晶としてＤ-キロ−イノシトールの 120 mg(精製収率 75％)を得た。
【００４１】
なお、Ｄ-キロ−イノシトールの上記の反応収率は、上記実施例１に準じて求めたが、精製収率は次式により求めた。
【数３】
0003944333.tif 000009