(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物に分極力を与え、最小エネルギ位置を示す最小フィールドを有するフィールドケージを形成するように、複数の電極(11a-11d,12a-12d,21a-21d,22a-22d,23a-23d,24a-24d,31-35)の間に形成された内部スペース中に生成される電界である基本的な高周波電位を与えられる前記複数の電極を備えた電極装置における予め定められた位置で１以上の対象物(13,25,37,38)の位置を制御する方法において、
基本的な高周波電位の少なくとも１つは、フィールドケージ中の対象物が位置されている最小フィールドの位置が予め定められた位置に関して変化するように、１以上の駆動電位によって変調されることを特徴とする制御方法。
【請求項２】
閉じたフィールドケージは基本的な高周波電位によって形成され、最小フィールドの位置の変化は時間および空間的に周期的である請求項１記載の方法。
【請求項３】
駆動電位は、基本的な高周波電位の振幅、位相および周波数の少なくとも１つの変調によって形成される請求項２記載の方法。
【請求項４】
最小フィールドは、対象物に関して閉じた軌道を形成している請求項３記載の方法。
【請求項５】
最小フィールドの位置の時間的変化は、基本的な高周波電位の周波数の逆数より実質的に長い時間において発生する請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
基本的な高周波電位は開いたフィールドケージを形成するように調節され、駆動電位は対象物が予め定められた通路に関して運動するように選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
駆動電位は、最小フィールドの位置を周期的に交互に変化させるために時間パターンを辿る請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
複数の対象物が電極装置中に配置されている請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
分極力の影響によって、最小エネルギ位置を示す最小フィールドを有するフィールドケージを形成するために、複数の電極(11a-11d,12a-12d,21a-21d,22a-22d,23a-23d,24a-24d,31-35)を備えた電極装置における予め定められた位置に１以上の対象物(13,25,37,38)を配置して、前記電極間に形成された内部スペース中に生成される電界である基本的な高周波電位を与えることができる発生器手段を備えた装置において、
予め定められた駆動電位にしたがって基本的な高周波電位を変調するスイッチング装置を具備していることを特徴とする装置。
【請求項１０】
スイッチング装置は、電極を選択的に駆動するマルチプレクサから形成されている請求項９記載の装置。
【発明の詳細な説明】
本発明は、フィールドケージにおける対象物の位置または運動を制御する方法、およびこのような方法のための装置に関する。
種々の生物学、医学、薬学および物理または化学工学プロセスにおいて、顕微鏡的粒子、とくに生体細胞またはそれらの構成、ラテックス粒子または別のマイクロビーズ(microbeads)の位置をできるだけ正確に保持し、あるいは一定の通路に沿ってそれらを運動させることに関心を有している。生体細胞を保持する１つの既知の方法は、固体の基体上でそれらを成長させ、その後、たとえば測定手段に関して要求されている正確度でこれらをセットすることである。この技術の欠点は、基体面との機械的な接触を生じさせ、一般にこの接触は、例えば測定を行った後では分離が困難なことである。さらに、この技術は対象物の保持に限られ、また、それらを一定の通路に沿って運動させるのに適していない。
別の既知の技術は、光学手段によって自由流体中の対象物の位置を決定することである。いわゆるレーザピンセット(tweezers)により、マイクロメータの正確さで自由溶液中に粒子を保持し、予め定められた方式でそれらをシフトする（A.Ashkin et al.“Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles”in Optics Lett.,vol.11,p 288(1986)）ことができる。このいわゆる光学トラップでは、トラップしたレーザビーム内の粒子が熱衝突（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ）にさらされ、それによって少量の位置のランダムシフトが生じるという欠点がある。さらに、レーザビームの干渉により応用範囲が制限される。後者の制限は、分極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）力によって対象物を保持でき、あるいは運動させることのできる電気マイクロフィールドケージ中での粒子の操作［文献（G.Fuhr et al.“Radio-frequency microtools for particle and live cell manipulation”in Naturwissenschaften, vol 81,p 523 (1994)），またはＤＥ−ＯＳ１９５  ００  ６６０を参照されたい］で避けられる。しかしながら、この場合にもまた、保持され、あるいは運動させられた粒子の位置で熱的に関連したシフトが生じ、相関分光学［文献（M.Eigen et al.“Sorting single molecules,application to diagnostics and evolutionary biotechnology”in Proc.Nat.Acad.Sci.USA, volume 91,p 5740(1994)）を参照されたい］におけるような高解像度または高感度の測定を困難にし、あるいは不可能にする。
保持されるべき粒子を要求された位置で振動させる既知の原理が、熱衝突による妨害が減少された状態で局部的にトリガーされる測定を可能にする。このために、要求された位置においてある周期的な運動を生じさせるように、音（とくに、超音波）または溶液の周期的な運動によって要求された位置で保持された粒子を振動させるそれに対応して、変調された測定信号が改良された信号対雑音比を示す。
しかしながら、この振動技術には次の欠点がある。振動を生じさせる力は、保持された粒子にその周囲の流体を通して間接的に作用する。そのため、粒子だけでなく周囲の流体もまた運動させられ、それによって粒子の位置決定の再現性を低下させる。さらに、この力の間接的な作用の結果、制御し難い望ましくない回転運動が生じる可能性が高い。したがって、周囲の流体の移動が望ましくない用途に対して実施できない。最後に、機械的な応力が保持された粒子上で発生する可能性が高く、それは生体対象物に対しては特に問題である。
既知の技術では、要求された通路に沿った粒子の位置決定に影響を与えることができない。しかし、上述の振動技術で実現可能なものを上回る運動制御もまた要求されている。
したがって、本発明の目的は、電界ケージにより対象物の位置を決定する改良された方法を提供し、また、この方法を実施し、上述した振動技術が使用される可能性を拡大し、新しい方式で制御を行うことができる装置を提供することである。
この目的は、請求項１の特徴を有する方法および請求項９の特徴を有する装置によって達成される。本発明の有効な実施形態は、従属クレームに限定されている。
本発明は、振動を重畳することによって位置決定するときに流体の運動に間接的に作用する力を使用したり、あるいはその他の運動制御手段を使用したりするのではなく、周囲の流体（懸濁液、溶液）には作用せずに、保持された対象物に直接作用する力によりその対象物を非周期的にまたは周期的に運動させるという考えに基づいている。このために、開いたまたは閉じたフィールドケージを生成する多電極構造の電極上の電位は、特定の対象物が見出されることとなる最小のフィールドの位置が要求される対象物の位置に関して変化するように、駆動電位または制御電位と重畳される。要求された対象物の位置は、閉じたフィールドケージ内の定まった位置か、または開いたフィールドケージ内の通路（ダクト構造または類似の構造）のいずれかであることができる。位置の周期的な変化は、保持された粒子が要求された予め定められた対象物の位置の周囲の通路上に周期的に導かれることを意味する。この重畳された軌道の形状は所望に応じて選択でき、１、２または３個の空間軸、円形、楕円形、本質的に方形またはさらに複雑な通路に関連した振動運動から構成される。空間的に周期的な運動の時間パターンは、それ自身周期的な変調を示すことができる。位置の非周期的な変化は、保持された粒子がある通路上の予め定められた対象物の位置から逸脱させられることを意味する。
要求された対象物の位置が開いたフィールドケージ内の通路によって形成されている場合、要求された通路に沿った対象物の運動は、基本電位による電極の駆動の適切な選択によって、および流体の流れによって、あるいはそれらの少なくとも一方によって生成されることができる。
本発明による装置は、高周波発生器とスイッチング装置との組合せによって駆動されることができる電極構造を有している。そのスイッチング装置は、結果的に生じた総電位の振幅、周波数および位相の少なくとも１つが変化するように、１以上の電極の電位（基本電位）に駆動電位を重畳するように構成されている。
本発明の利点は、とくに、フィールドケージにおいて周囲の流体で自由に支持されている対象物の位置決定である。
対象物の位置決定または移動は機械的な接触なしに行われる。対象物は、妨害となる機械的応力を全く受けず、したがって、とくに、生体細胞等が損傷を受けない。保持された対象物をさらに操作または測定することに関する制限は全くない。一般的な光学測定方法は、干渉問題を回避しながら使用可能である。要求された位置に関する、または要求された通路上における対象物の移動は、高調波振動プロセスとは別の、複雑な再現可能な方法で生成されることができる。対象物の重畳された運動は、予め定められた方法で制御され、プログラムされることが可能である。駆動電位の形態と、生じた対象物の運動との間には固有の関係があり、したがって、制御のために、運動させられた対象物のフィードバックまたは観察は不要である。最後に、具体的な電極の構造または形状とは無関係に、本発明によれば、フィールドケージを生成するために任意の電極構造により使用可能である。
本発明による方法および装置の好ましい使用は、とくに、サブマイクロメータまたはマイクロメータの粒子およびセルまたはそれらの少なくとも一方の表面上の蛍光分子を検出するための相関分光学、薬学および医学上の診断用途、ならびに進化バイオテクノロジー等において行われる。とくに、蛍光相関分光方法（ＷＯ  ９４／１６３１３）、および特許公報ＷＯ  ９６／１３７４４および欧州特許出願第９６１１６３７３．０．号明細書に提案された別の、とくに共焦点蛍光技術の方法は検出手段として適している。この後者の特許出願明細書には、サンプル中の粒子によって放射、散乱および反射の少なくとも１つが発生した電磁放射線、とくに光の予め定められた時間インターバル当たりの光子の数を反復的に測定し、特定の時間インターバルにおける光子の数の分布を決定し、それによって粒子の分子強度の分布が光子の数の分布から得られるサンプル解析方法が示唆されている。
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態を説明する。
図１は、本発明の１実施形態による駆動回路のブロック図を伴った３次元フィールドケージの概略斜視図である。
図２は、本発明にしたがって修正された粒子通路を示すための開いたフィールドケージの概略斜視図である。
図３は、２つの隣接した開じたフィールドケージ用の電極構造の概略斜視図である。以下、本発明の実施形態を参照して説明する本発明による方法または駆動回路の個々の特徴は、これらの実施形態に制限されるものではない。当業者は、用途の機能に応じて、とくに電極の基本電位または駆動電位の振幅、周波数および位相に関して実施形態の修正を選択することができる。
本発明による方法を実施するために、電極構造は、半導体技術の方法によって生成されることが好ましいフィールドケージを生成するためにマイクロシステム技術から理解されるように使用される。２次元電極構造の場合、電極は、ｎｍ乃至μｍ領域の特性寸法でチップ面上に形成される。３次元電極構造は、ダクト、貯蔵容器その他の流動を許すスペースを形成するように構成されたスペーサを使用することによって接合された２個の平坦な２次元構造から構成されることができる。
基本電位は、マイクロ電極の間に形成された内部スペース中に電界が生成されるようにマイクロ電極（断面が５０ｎｍ乃至数μｍであり、長さが用途に依存する）に印加される。マイクロシステムとくに内部スペースはキャリア流体で満たされており、あるいはマイクロシステムを通ってキャリア流体が流れている。キャリア流体中に浮遊した粒子（保持または移動されるべき対象物）が存在している場合、それは電界の効果によって極性を与えられる。電極が高周波信号によって駆動された（ＭＨｚ範囲）場合、あるいは外部導電率（キャリア流体の）が粒子の平均内部導電率より高い場合、それらは電極から内部スペース中へ最小フィールドに駆動される。最小フィールドの領域において、粒子はキャリア流体（閉じたフィールドケージ）中において自由に浮遊し懸濁した状態で保持されている。電位壁が１方向だけに形成し、また粒子の移動がとくに流体の流れの作用によって別の方向において可能であるように電極が構成され、駆動された場合、フィールドケージ中の粒子は定まった方向に移動することができる（開いたフィールドケージ）。
電極の基本電位は、粒子がフィールドケージにおける予め定められた位置に配置されるように選択される。この予め定められた位置は、閉じたフィールドケージにおける最小フィールドの位置または開いたフィールドケージにおける通路（軌道）である。本発明によると、実際の最小フィールドは、基本電位上への駆動電位の周期的で順序付けられた重畳（または駆動電位に従った基本電位の変化）によって予め定められた位置から変位される。この変位は、μ秒乃至分の特性時間により発生する可能性が高い。対象物の慣性および溶液の粘度に応じて、保持された粒子は、最小フィールドを追跡し、それによって要求された位置または軌道に関連した予め定められた通路上を移動する。
電極の個数、およびそれらがどのようにして駆動されるかに応じて、重畳された運動は１軸上での簡単な振動であるか、あるいは空間におけるもっと複雑な通路であることができる。本発明は、全方向における運動を可能にする。本発明はまた、補償電位を与えることによって粒子のランダムなまたは望ましくない回転運動を補償することを可能にする。補償電位は、高周波電界を適切に回転または移動させる。
電極は、基本電位を生成するようにＲＦ発生器によって駆動される。この発生器の出力信号は、減衰、位相のシフトおよび周波数の周期的または非周期的な変化の少なくとも１つを行う（とくに、ある対象物の位置を示す動作信号に応答して）。これらの変化によって、保持された粒子の重畳された運動が発生した影響に基づいて特定の駆動電位が判断され決定される。駆動電位は、振幅、位相または周波数で変調されることができる。これらの変調モードの組合せもまた可能である。
電極は、高速スイッチング装置、とくにマルチプレクサ装置によって駆動される。複雑な運動パターンを実施するために、マルチプレクサ装置はコンピュータ制御され、プログラム可能であることが好ましい。
一例として、図１は、立方体の形態の８個の電極11a乃至11dおよび12a乃至12dを備えた四重極装置を示す。立方体の中央に最小フィールドを有する電界は、高周波交流電圧を電極に印加することによって既知の方法で形成される。フィールドケージの限界は、電極間のラインによって概略的に示されている。電極装置の内部空間において、浮遊した誘電性粒子13（たとえば、直径数μｍのラテックス粒子または生体細胞）を有するキャリア流体が存在する。誘電性粒子は、負の影響電荷が次の負の電極に向かう（および、その逆）ように極性を与えられる。このようにして、八重極が粒子に影響を与え、この粒子は最小フィールドにシフトされる。
図１の右側には、電極用の駆動回路のブロック図が示されている。この駆動回路は１以上のＲＦ発生器を具備し、このＲＦ発生器は高速スイッチング装置として動作するマルチプレクサ装置16に接続されている。ここに示したケースでは、２個のＲＦ発生器14a，14bが存在する。ＲＦ発生器の個数は、用途に応じて、すなわち電極を駆動するために使用される位相または周波数オフセット信号が２つ、３つ、４つまたはそれ以上であるかに応じて選択される。マルチプレクサ装置16と電極との間には、各電位の振幅、周波数および位相の少なくとも１つを高速で変化させるためにマルチプレクサと共に動作する較正素子17が存在する。このマルチプレクサ装置16および較正素子17は、コンピュータによって制御されるか、あるいはそれらを予め定められた方法で設定できることが好まい。ＲＦ発生器14a，14bの信号は、フィールドケージが電極11a乃至11d，12a乃至12dの間に生成されるように、表１を参照して説明した方法でマルチプレクサ装置16および較正素子17によって分割される。
表１は、定まった振幅（０．１乃至１００Ｖの範囲）および定まった周波数（ＭＨｚ範囲）の基本電位による八重極の電極の駆動を表す。閉じたフィールドケージを形成するために、個々の電極の基本電位は、逆位相によって異なっている。２相交流フィールドおよび４相回転フィールドが形成され、相対位相は本質的に表１に示されている値に対応している。
本発明によると、表１にしたがって電極を駆動することによってフィールドケージの重心で生成された最小フィールドは、最小フィールド中の粒子をたとえば軌道（ａ）または（ｂ）（図１を参照されたい）を辿るように運動させる。軌道（ａ）は空間的な方向の振動（１周期当たり２つの運動）であり、一方軌道（ｂ）はフィールドケージ中の複雑な星形の通路（１周期当たり８つの運動）である。その他任意の軌道が電極がどのようにして駆動されるかに応じて実現することが可能である。
上述の最小フィールドの運動は、駆動電位を重畳することによって生じる。表２には、表１による基本電位でのパラメータの例が一覧にされている。
表２の最初の６行は図１に示された軌道（ａ）を示す。それぞれの場合において、２行が振動の方向が逆の２つの運動１，２を示し、駆動の３つの可能性、すなわち、振幅、周波数または位相に影響を与えることがこれを生じさせる。第３の可能性の位相φ１，φ２（５行目、６行目）は、固定した差を与えるための随意の選択である。この差は、φ１−φ２＝１８０°であることが好ましいが、その他の差もまた可能である。これは、振幅および周波数による駆動にも同様に適用される。１行、２行、３行および４行は各例を示す。
表２の下半分の８行は、駆動電位が振幅で影響を受けたときに、星形の軌道（ｂ）を形成するための８つの運動の時間順のシーケンスを示す。ここに述べられている振幅は単なる例である。
当業者は、本発明の方法が表２における駆動電位の発生の例に制限されないことを認識するであろう。それどころか、振幅、周波数および位相において影響を与えられた駆動電位の組合せが可能である。いずれの場合においても、要求される対象物の位置に関連した重畳された運動を生じさせるために、フィールドケージは電位壁がある方向において減少された形態で形成され、それによってフィールドケージのこの弱化方向が要求された対象物の位置または通路に関連して周期的に変化するように、駆動電位およびそれらのシーケンスを選択することが重要な問題である。
図１によるフィールドケージ中の最小フィールドは、表１による基本電位に表２による駆動電位を重畳することによって形成される電位により電極装置を駆動することによって移動される。捕捉された粒子は、最小エネルギの位置をとろうとするためこの運動に追従する。
図１において概略的に述べた制御装置15は、最も簡単な場合において、上方の電極レベル12および下方の電極レベル11の振幅を交互に半分にするマルチバイブレータによって置換できる。これによって軌道（ａ）が生成される。
駆動電位（表２の信号変調）または重畳運動の周期は、μ秒乃至分の桁の特性時定数を示す。最小フィールドをシフトすることによって生成される通路直径または偏向は、５０ｎｍ乃至数μｍの範囲であることができる。適切な駆動電位によって軌道（ａ）および（ｂ）より複雑な軌道を生成することができる。
図２は、一列に並んだいくつかの四重極21a乃至21d、22a乃至22d、23a乃至23d、24a乃至24dから構成される開いたフィールドケージの一例である。電極装置は、粒子25が流体の流れ26によって導かれるダクトを形成する。例示されている粒子の軌道（ａ）および（ｂ）は、電極を適切に駆動することによって生成されることができる。表３は、太字実線で示された軌道（ａ）のために電極がどのようにして駆動されるかを示す。第１のステップ（１行目）において、電極は、フィールドケージが電極21aおよび21bによって形成される平面の方向における電極21a乃至dの領域での弱化を示すように駆動される。
このために、後者の電極の電位が低下される。第２のステップにおいて、反対側のフィールドケージを弱めること（電極22cおよび22dの電位の低下）によって運動が逆にされる。これは同様の方式で連続する。
粒子が位置される箇所を知ることは重要でない点が有効である。表３において例として与えられている信号シーケンスの周期的な繰返しが、要求される運動を生じさせることができる。この繰返しは周波数であり、その周波数の逆数が粒子が四重極装置を通過するために要する時間の約１／１０以上であることが好ましい。
図３による電極装置は、粒子を粒子流に結合し、およびそれから結合するためのものである。単一またはグループで駆動される電極31乃至36は数行に配列され、自由懸濁液がそれらの間を任意の方向に流れることができるが、この方向は電極の行に平行であることが好ましい。
軌道（ａ）および（ｂ）は、上記に説明した例に類似した形態のプロトコルを駆動することによって生成されることができる。ジグザグ（スタガー）に配置された接続手段（マルチダクト接続）を追加することによって、粒子を分離および分類することができる。
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１個の最小フィールドを有する閉じたフィールドケージを形成するために基本電位により図１による８個の電極を駆動するときの位相（基本設定）
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軌道（ａ）および（ｂ）を発生するための図１による電極の駆動
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１個の最小フィールドを有する閉じたフィールドケージを形成するために基本電位により図１による８個の電極を駆動するときの位相（基本設定）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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