(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を行なう前のＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトを検出することから成るＴ細胞媒介疾患の治療の効力を検出又は監視する方法であって，
前記治療が，免疫寛容性担体内のｈｓｐ６０自己抗原のペプチドから成るワクチン投与であり，前記自己抗原がｐ２７７の配列に示す配列番号：３の配列であり，
前記検出方法が，治療対象動物の試料中のＴ細胞内の治療前におけるＴ細胞応答の性質を測定し，治療後に自己抗原に対するＴ細胞応答の性質を測定し，次いで，治療を行う前のＴＨ１−Ｔ細胞応答から，治療後のＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトの有無を検定し，このようなシフトが陽性であれば治療効果が得られた可能性があると判明することから成るＩ型糖尿病の治療の効力を検出又は監視する方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞応答の性質測定が，産生される抗体のアイソタイプを検定することから成る請求項１に記載のＩ型糖尿病の治療の効力を検出又は監視する方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞応答の性質測定が，前記Ｔ細胞の前記抗原との生体外でのインキュベーションに対するサイトカインの応答を測定することから成る請求項１又は２に記載のＩ型糖尿病の治療の効力を検出又は監視する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
この発明は，Ｔ細胞媒介疾患，例えば，Ｉ型糖尿病即ちインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られている疾患の治療方法及びその治療の効力を検出及び／又は監視する方法に関する。
発明の背景
Ｉ型糖尿病即ちＩＤＤＭは，膵島中に位置しているインシュリン産生細胞を攻撃し破壊するＴ細胞によって起こる自己免疫疾患である（ＣａｓｔａｎｏとＥｉｓｅｎｂａｒｔｈの１９９０年の報告）。最終的に，ＩＤＤＭになる自己免疫プロセスは，症状なしで始まり進行する。この疾患は，β−細胞の損失が累積して残りのβ細胞のインシュリンを供給する容量を超えたときに初めて臨床上発症する。実のところ，グルコースの恒常性の崩壊と臨床的ＩＤＤＭは，β−細胞の８０〜９０％が免疫系によって不活性化された後に初めて発症すると考えられている。従って，ＩＤＤＭにかかっていると確認できる患者は，β−細胞の自己免疫による破壊が進行した段階にある患者に限定される。更に，初期の前臨床糖尿病を，β−細胞の自己免疫の免疫学的マーカーの検出によって診断することは，自己免疫プロセスが発症した後しか行うことができない。従って，治療の目標は，すでに十分進行している自己免疫プロセスを排除するのに安全且つ特異的で有効な方法を見つけることである。
この発明の発明者らは，以前に，ＮＯＤ系のマウス（ヒトＩＤＤＭの忠実なモデルと考えられている）に発生する自然発症糖尿病を試験することによって上記問題を研究したことがある（ＣａｓｔａｎｏとＥｉｓｅｎｂａｒｔｈの１９９０年の報告）。ＮＯＤ系マウスが糖尿病になるこの自然発症自己免疫プロセスは，最初，約１ヶ月齢で始まる軽度のインシュリン炎として検出することができる。大部分の雌のマウスでは，このインシュリン炎が貫通性島内浸潤（ｐｅｎｅｔ−ｒａｔｉｎｇ  ｉｎｔｒａ−ｉｓｌｅｔ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）まで進行して，β−細胞が損傷し，約４〜５ヶ月齢で明白なインシュリン依存性糖尿病が発症する（Ｂａｃｈの１９９１年の報告）。インシュリン炎は，Ｔ細胞の自己反応性及び各種の自己抗原に対する自己抗体が関連している（Ｈａｒｒｉｓｏｎの１９９２年の報告）。これら自己抗原のうちの一つが，追加の二次自己抗原に対する自己免疫を活性化するインシュリン炎の一次標的であると考えられている。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対するＴ細胞の応答は，Ｔ細胞がｈｓｐ６０や他の抗原に応答する前に検出可能であることが報告されており（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告；Ｔｉｓｃｈらの１９９３年の報告），そして３日齢でＧＡＤを胸腺内注射して投与するか（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告）又は３週齢で静脈注射を行うことによって，ｈｓｐ６０をはじめとして他の自己抗原に対するＴ細胞の反応性が発生するのを阻害され糖尿病が防止されることが発見されている。これらの研究者らは，ＧＡＤに対する自己免疫が糖尿病をもたらす最初の現象であると結論した。しかし，インシュリン炎の過程で早期に，各種の外観上“非特異的”な処置を適用すると，糖尿病の後期発生（ｌａｔｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を防止し，又は遅らせることができる（Ｂｏｗｍａｎらの１９９４年の報告）。
ＧＡＤ抗原に加えて，ｈｓｐ６０に対する自己免疫が，ＮＯＤ糖尿病において機能的役割をもっていることが発表されている（ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９０／１０４４９号）。ｈｓｐ６０ペプチドのｐ２７７に応答するＴ細胞は，糖尿病を養子移入することが可能であり，又は弱毒化すれば，マウスに対し糖尿病の予防接種を行うことができ（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告），そして自己免疫プロセスの早期（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告）又は非常に後期（Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告）に，ペプチドｐ２７７を含有する油を皮下に一回投与すると糖尿病の進行を止めることができる。
ＣＤ４“ヘルパー”型のＴ細胞は，活性化されたときに分泌する独特のサイトカイン類によって二つのグループに分割されている（Ｍｏｓｍａｎｎらの１９８９年の報告）。ＴＨ１細胞は，Ｔ細胞の増殖を誘発するＩＬ−２及び組織の炎症を媒介するＩＦＮγなどのサイトカイン類を分泌し，対照的に，ＴＨ２細胞はＩＬ−４とＩＬ−１０を分泌する。ＩＬ−４はβ−細胞が特定のＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌するのを助け，ＴＨ１炎症サイトカインの産生を抑制する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕらの１９９４年の報告）。ＩＬ−１０は，マクロファージによる抗原提示と炎症サイトカインの産生に作用することによってＴＨ１の活性化を間接的に阻害する（Ｍｏｏｒｅらの１９９３年の報告）。
油中のペプチドｐ２７７を投与することによるＩＤＤＭにおける自己免疫プロセスの治療が，いくつもの異なる抗原に対するＴＨ１型自己免疫を抑制し，代わりにｐ２７７自己免疫を活性化してＴＨ２モードにするこの治療の効果によって成功することがこの発明者らの研究所によって発見されたのである。従って，自己反応性のスペクトルを有する疾患は，Ｔ細胞サイトカインのシフトを誘発できる単一のペプチドで抑制することができる。
発明の概要
この発明の目的は，適当な動物モデルで，Ｔ細胞の時間経過の応答におけるＴＨ１細胞からＴＨ２への応答のシフトについて試験することによって，Ｔ細胞媒介疾患の治療の効力を測定又は監視することである。このことは，ＩｇＧ２ａからＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのアイソタイプ抗体への抗体アイソタイプのシフトを検出するか，又は増大するサイトカイン類がＩＬ−２とＩＦＮγからＩＬ−４とＩＬ−１０へシフトするのを検出することによって達成される。
この発明の他の目的は，ＴＨ１−Ｔ細胞のサイトカイン応答をＴＨ２−Ｔ細胞サイトカイン応答への最適のシフトについて測定することによって，最適のワクチン投与量とワクチン処方を決定することである。
【図面の簡単な説明】
図１は，ＧＡＤとｈｓｐ６０のペプチドに対するＴ細胞の増殖応答がｐ２７７で治療することによって特異的に減少することを示すグラフである。右側のパネルは，鉱油中に乳化されたペプチド２７７で治療されたＮＯＤマウスを示し，左側のパネルは，鉱油中に乳化されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で治療したＮＯＤマウスを示す。このグラフの各種のバーは，Ｔ細胞ミトゲンＣｏｎＡ（白バー），ｐ２７７（垂直縞バー），ＧＡＤｐ３４（水平縞バー）及びＭＴ−ｐ２７８（点彩バー）へのそれぞれに対するＴ細胞増殖応答を示す。アステリスクは，スチューデントのＴ検定法でｐ＜０．０１であることを示す。
図２は，ｐ２７７による治療が，ｐ２７７に対する抗体を誘発し且つＧＡＤ，インシュリン及び無傷のｈｓｐ６０に対する抗体を減少させることを示すグラフである。右側のパネルは，ＮＯＤマウスを油中ｐ２７７で治療した結果を示し，左側のパネルはＮＯＤマウスを油中のＰＢＳで治療した対照を示す。グラフのバーは，組み換えＧＡＤ６５（点彩バー），組み換えヒトｈｓｐ６０（斜め縞），ウシインシュリン（白バー）又はペプチドｐ２７７（垂直縞）に対する抗体の発生率を示す。アステリスクはカイ二乗検定法によってｐ＜０．０１であること示す。
図３Ａと３Ｂは，ｐ２７７による治療の前後の抗体アイソタイプを示すグラフである。図３Ａは，治療前のＮＯＤマウスの無傷ｈｓｐ６０（黒丸）又はＧＡＤ（白丸）に対する抗体のアイソタイプを検定した結果を示す。ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のの対照の血清は×印で示す。図３Ｂは，治療してから５週間後の，対照の治療マウス（白丸）又はｐ２７７で治療したマウス（黒丸）のｐ２７７に対する抗体のアイソタイプの検定結果を示す。各試験のコラムは，同数のマウスから得た試験結果を示し，丸印の数が見掛け上減少しているのは重なっているためである。
図４Ａ〜４Ｄは，ｐ２７７ペプチドで治療する前後のＴ細胞のサイトカインのプロフィルを示すグラフである。３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，油中ｐ２７７（黒バー）又は油中ＰＢＳ（白バー）で治療した。これらのマウス由来の脾臓細胞をＣｏｎＡ，ｐ２７７又はＭＴ２７８とともにインキュベートした結果，誘発された特定のサイトカインの量を示す。図４Ａは，２４時間インキュベートした結果，分泌されたＩＬ−２の量を示す。図４Ｂは，４８時間インキュベートした結果，分泌されたＩＦＮｒの量を示す。図４Ｃは，４８時間インキュベートした結果，分泌されたＩＬ−１０の量を示す。図４Ｄは，２４時間インキュベートした結果，分泌されたＩＬ−４の量を示す。アステリスクはスチューデントのＴ検定法によってｐ＜０．０１であることを示す。
図５Ａ〜５Ｂは，ｐ２７７／イントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）ペプチドによる治療の前後のＴ細胞のサイカインのプロフィルを示すグラフである。３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，イントラリピド中のｐ２７７（黒バー）又はイントラリピド中のＰＢＳ（白バー）で治療した。これらマウス由来の脾臓細胞をｐ２７７（図５Ａ）又はＣｏｎＡ（図５Ｂ）とともにインキュベートした結果，誘発されたＩＬ−２，ＩＦＮγ，ＩＬ−４及びＩＬ−１０の量を示す。アステリスクはＰ＜０．０１であることを示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
ＮＯＤマウスは，小島のインシュリン産生β−細胞を攻撃する自己免疫Ｔ細胞によって起こるＩ型糖尿病を自然発症する。この自己免疫攻撃は，６０ＫＤａの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のペプチドとグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）のペプチドを含む各種の自己抗原に対するＴ細胞の反応性に関連がある。この発明の発明者らの研究所は，ｐ２７７と命名されたｈｓｐ６０のペプチドが，インシュリン炎が進行して明白な糖尿病が発生した後でさえも，自己免疫プロセスを抑制又は逆転させるのに利用できることを最近発表した。ここで，ｐ２７７−ペプチドで治療すると，ｈｓｐ６０とＧＡＤの両者のエピトープに対する自然発生のＴ細胞増殖応答が下方へ調節されて，ｈｓｐ６０，ＧＡＤ及びインシュリンに対する自己抗体の産生を消失させることが発見されたのである。上記疾患のプロセスの抑制は，Ｔ細胞の免疫寛容又はアネルギーには関連がなく，ｐ２７７に反応性の自己免疫Ｔ細胞によって産生されるサイトカイン類のＴＨ１様プロフィル（ＩＬ−２，ＩＦＮγ）からＴＨ２様プロフィル（ＩＬ−４，ＩＬ−１０）へのシフトに関連している。そのモジュレーションは免疫学的に特異的である。即ち，治療されたマウスの細菌ｈｓｐ６０ペプチドに対する自然発生Ｔ細胞応答はＴＨ１モードのままである。従って，いくつもの自己抗原に対する自己免疫が特徴である糖尿病誘発プロセスは，抗原の一種であるｐ２７７を用いて治療することができる。
自己反応性のスペクトルを有する疾患がＴ細胞サイトカインのシフトを誘発できる単一のペプチドによって抑制できるという現象の発見によってこの発明が生まれたものであり，この発明は，破壊的な自己免疫を制御できるペプチドを見つける新しい手段を提供し，且つその原理は，あらゆる自己免疫疾患と，Ｔ細胞の活性，特に，ＴＨ１細胞の活性で媒介される疾患に広く利用できる。
この発明の方法は，すべて，器官特異的自己免疫疾患にはほとんど例外なしに見られるＴＨ１−Ｔ細胞応答から，時間の経過とともに起こるＴＨ２−Ｔ細胞サイトカイン応答へのシフトを検出又は監視する。このサイトカインシフトが，予防接種用ペプチドに対して応答性のＴＨ２細胞の相対的増加を反映しているのかどうか，又はＴＨ１型の抗−抗原細胞のクローンがそのクローンレベルでその挙動を変えるかどうかは重要でない。出願人はいかなる特定の理論にも限定されたくないが，かようなシフトを起こす抗原はＴＨ２細胞の産生を誘発し，このような優勢なＴＨ２細胞が産生するサイトカインによって，炎症の発作を起こした既存のＴＨ１細胞が抑制される可能性が高いと考えられる。
いずれの場合も，自己免疫疾患にかかっている動物に，かようなシフトを起こす治療法は好ましい治療法である。このような性能の検出，又は所定の自己免疫疾患に対するかようなペプチドの効果の監視は，自己免疫疾患又は他のＴ細胞媒介炎症症状，好ましくはヒト自己免疫疾患の容認されている実験室モデルが見られる動物に対し，提案された治療法を適用し，次に，治療された動物を，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトの徴候について試験することにより，この発明に従って容易に達成することができる。
ＴＨ１→ＴＨ２のシフトが存在していることとその程度は，その治療が有効で且つ有利な応答を誘発した証拠として利用できる。換言すれば，ＴＨ１→ＴＨ２のシフトは，治療に対する応答の代理マーカーとして利用できる。例えば，このシフトがなければ，第２の治療を行う必要があることを示している。
かような応答シフトのマーカーの例としては，Ｔ細胞によって誘発された抗体応答の確認，又は，Ｔ細胞によって産生されるサイトカイン類の確認がある。例えば，ＴＨ１型Ｔ細胞はＩｇＧ２ａクラスの抗体の産生を誘発するが，一方，ＴＨ２型の抗体はＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのクラスの抗体の産生を誘発することが知られている。従って，投与された抗原に対する抗体のアイソタイプについて，治療の前後に検定することによって，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトの程度を監視することができる。
同様に，ＴＨ１細胞が，Ｔ細胞の増殖を誘発するＩＬ−２及び組織の炎症を媒介するＩＦＮγのようなサイトカイン類を分泌することが知られている。一方，ＴＨ２細胞は，β−細胞がＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂクラスの抗体を分泌してＴＨ１炎症サイトカイン類の産生を抑制するのを助けるＩＬ−４，並びにマクロファージによる抗原提示及び免疫サイトカイン産生に作用することによってＴＨ１の活性化を間接的に阻害するＩＬ−１０を分泌する。従って，治療された動物のＴ細胞のサイトカインプロフィルの測定値は，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトの指標にもなる。従って，例えば，治療された動物から脾臓細胞を取り出し，抗原を投与し，ともにインキュベートしてサイトカイン類の分泌を誘発することができる。次に，培養物の上澄み液中のサイトカイン類は，例えば，標準のサイトカインＥＬＩＳＡ法のプロトコルを用いＥＬＩＳＡ法によって定量することができる。
あらゆる自己免疫疾患又は他のＴ細胞媒介疾患もしくはその症状の治療方法はこの発明に従って検出又は監視することができる。これら疾患としては，限定されないが，ＩＤＤＭ，多発生硬化症，重症筋無力症，強皮症，多発生筋炎，移植片宿主相関病，移植片拒否反応，グレーヴス病，アジソン病，自己免疫ユベオレチニチス（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ），自己免疫甲状腺炎，尋常性天疱瘡，リウマチ様関節炎，強直性脊椎炎，Ｔ細胞媒介アレルギー性応答などがある。しかし，好ましくは，かような疾患は，ＴＨ１細胞が媒介する疾患である。
多くのこれらの疾患の公知の容認されている動物モデルは容易に入手できる。これらの動物としては，例えば，糖尿病のモデルとしてのＮＯＤマウス，多発性硬化症のモデルとして実験的に誘発される実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するマウス，自己免疫甲状腺炎のモデルとして実験的自己免疫甲状腺炎（ＥＡＴ）を有するマウス，リウマチ様関節炎のモデルとしてアジュバント関節炎（ＡＡ）を有するマウスなどがある。
推定自己抗原（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）を含有するワクチンは，自己免疫プロセスをそれ以上悪化させることを回避するため，免疫寛容原性の担体を用いて投与しなければならない。このような担体としては，不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）のような鉱油の担体がある。ＩＦＡは鉱油の乳濁液である。ＣＦＡは，マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の死菌を各種の量，含有している鉱油の製剤である。しかし，ＩＦＡとＣＦＡは，鉱油が代謝不能なので身体が分解できないからヒトには使用できない。ヒト患者の静脈内栄養補給に永年にわたって使用されてきた特定の脂肪乳濁液が，この発明のペプチドを使用するペプチド療法の賦形剤としての役割も果たすことができることが最近発見された。このような乳濁液の２つの例は，イントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）及びリポフンジン（Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ）として知られている市販の脂肪乳濁液である。“イントラリピド”は，静脈内栄養補給用の脂肪乳濁液に対するスウェーデン所在Ｋａｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の登録商標であり，この乳濁液については米国特許第３１６９０９４号に記載されている。“リポフンジン”は，ドイツのＢ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｇｅｎの登録商標である。両者ともに脂肪として大豆油を含有している（それぞれ１０００ｍｌの蒸留水中１００ｇ又は２００ｇ即ち１０％又は２０％含有）。イントラリピドの乳化剤としては卵黄のリン脂質が用いられ（１２ｇ／ｌ蒸留水），リポフンジンの乳化剤としては卵黄のレシチンが用いられている（１２ｇ／ｌ蒸留水）。グリセリンを添加することによって（２５ｇ／ｌ），イントラリピドとリポフンジンの両者に等張性が得られる。
これらの賦形剤は，推定自己抗原と複合体を形成すると，自己免疫Ｔ細胞のＴＨ１→ＴＨ２シフトを促進する。実際に生物学的に活性の担体であると考えられる。従って，ヒトに使用することがある自己抗原を試験する場合，かような賦形剤を使用することが好ましい。このような賦形剤として好ましいのは，植物及び／又は動物が起源のトリグリセリド１０〜２０％，植物及び／又は動物が起源のリン脂質１．２〜２．４％，浸透圧調節剤２．２５〜４．５％及び酸化防止剤０〜０．０５％を含有し，滅菌水で１００％にした脂肪乳濁液である。かような賦形剤としては，イントラリピド又はリポフンジンが最も好ましい。かような賦形剤を使用することは，この発明の原イスラエル特許願（出願人の引用文献９５３６に挙げてある）の出願日と同じ日に，本願と同じ出願人（譲受人）が出願したイスラエル特許願（出願人の引用文献９５２３に挙げてある）に記載されており，この特許願の全内容は本明細書に援用するものである。
しかし，この発明の方法は，使用される補助剤には依存せず，あらゆる抗原−補助剤の複合体が，この発明によって試験できる。実験的動物モデルの自己抗原に対するＴ細胞の応答が，この発明の試験法によって測定されたとき，ＴＨ１からＴＨ２の応答へシフトしていたならば，対応するヒトの疾患を治療する可能性のある有用な方法が確認されたわけである。
この発明の方法は，治療すべき疾患又は症状の発生機序に関連する炎症ＴＨ１細胞が認識する抗原と併用し，又は複合させて投与するとＴＨ１→ＴＨ２シフトを媒介する，生物学的効果を有する免疫寛容性助剤を選別するのにも使用できる。従って，例えば，ｐ２７７を適当な抗原と併用すると，ＴＨ１→ＴＨ２シフトがこの発明の実施例に開示されている方法で検出できることが分かっている。ｐ２７７と併用した場合，かようなＴＨ１→ＴＨ２シフトを媒介する性能について他の補助剤を選別するため，このような提案された助剤は，本願実施例の鉱油又はイントラリピドの代わりに用いて，ＴＨ１→ＴＨ２のシフトの存在を判定することができる。このようなシフトが見出されたならば，その補助剤は，ＴＨ１媒介疾患にかかっている患者を治療するのに用いるワクチン中に，該疾患の発生機序と関連するＴＨ１細胞が認識する抗原と併用して使用できる生物学的に活性の免疫寛容性補助剤として分類することができる。この発明の方法を用いて見出されたかような補助剤は，この発明の一部と見なされる。鉱油又はイントラリピドとともに投与すると，ＴＨ１→ＴＨ２シフトを媒介することが分かっている他の抗原も，この試験のために使用することができる。
前記シフトは，ワクチンを投与した後，例えば，２〜１２週間にわたって測定されなければならない。治療の効力は，関連するＴＨ１→ＴＨ２サイトカイン応答について定期的に試験することによって，一層長期間にわたって監視できる。
抗体のアイソタイプや各種のサイトカイン類の存在をそれぞれ検定する具体的な方法は，それ自体，この発明の新規な部分ではない。抗体のアイソタイプ又はＴＨ１とＴＨ２のＴ細胞が産生する各種サイトカインを検定する各種の方法は，当該技術分野の当業者がよく知っている方法である。このような方法は，ＴＨ１からＴＨ２へのシフトを検出するこの発明の過程で使用できる。本明細書で提供する諸実施例は，この発明を実施する実施例を開示するが，この発明をそれに限定されるものではない。例えば，脾臓細胞を用いずに，末梢循環Ｔ細胞を患者から入手してサイトカインの応答を試験してもよい。
〔実施例〕
実施例１
ＧＡＤとｈｓｐ６０のペプチドに対する自然発生Ｔ細胞増殖応答のｐ２７７療法による特異的な減少
この実験は，ｐ２７７療法による自己免疫プロセスの治癒に関連する免疫学的機序を決定するために行った。進行したインシュリン炎にかかっている１２週齢の雌のＮＯＤ／Ｌｔマウス１３３頭（Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告）を，Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告に記載されているように，鉱油（米国ミシガン州デトロイト所在のＤｉｆｃｏ社から購入したＩＦＡ）中に乳化したｐ２７７（８１頭のマウス）又は鉱油中に乳化した対照のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（５２頭のマウス）で治療した。対照の治療を行ったマウスのほとんどすべてが糖尿病を発症し（９２％），２５週齢でほとんどが抑制されていない高血糖症で死んだ（５８％）（Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告）。対照的にｐ２７７で治療したマウスは，２８％だけが糖尿病を発症し，死んだのは１７％に過ぎなかった（ｐ＜０．０１）。１７週齢（治療してから５週間後）で平行群のマウスから脾臓細胞を採取し試験して，ｈｓｐ６０のペプチドｐ２７７（１０μｇ／ｍｌ），ＧＡＤのペプチドｐ３４（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告）（１０μｇ／ｍｌ），又はマイコバクテリアのｈｓｐ６０のペプチドＭＴ−ｐ２７８（１０μｇ／ｍｌ）に対する該脾臓細胞のＴ細胞増殖応答を，標準の検定法（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告）を用いて生体外で検定した。
この発明の発明者らの研究室のＮＯＤマウスはペプチドＭＴ−ｐ２７８に対する自然発生Ｔ細胞反応性を示すので，このペプチドは便利なＴ細胞特異性の対照として利用できる。また，Ｔ細胞培養物はＴ細胞ミトゲンＣｏｎＡ（１．２５μｇ／ｍｌ）で活性化された。
これらのペプチドは，Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告に記載されているように自動ＡＢＩＭＥＤ合成機（ドイツ）を用い標準Ｆｍｏｃで合成した。これらペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製し，アミノ酸を分析することによってその組成を確認した。ＧＡＤペプチド３４の配列（残基５０９〜５２８；ＧＡＤｐ３４）は，Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号：１）であった（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告）。ＭＴ−ｐ２７８の配列は，Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号：２）であった。本明細書に報告されたすべての実験に使用されたｐ２７７の配列は，Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（配列番号：３）であった。
このペプチドは，６位と１１位が，未変性配列のシステイン（Ｃｙｓ）の代わりにバリン（Ｖａｌ）で置換されている。上記２つのＣｙｓ残基がＶａｌで置換されたことによって，その免疫活性に影響することなしに該ペプチドの安定性が著しく増強される。Ｖａｌで置換されたペプチドは，Ｔ細胞と抗体の検定法によってその未変性のペプチドと完全に交差反応性であるので療法のペプチドは糖尿病に対して同じ治療効果を有している（１９９４年１２月２１日に出願されたイスラエル特許願第１１２，０９１号，及びこの発明の原イスラエル特許願（出願人の引用文献９５３６として挙げてある）の出願日と同じ日に出願された別のイスラエル特許願（出願人の引用文献９４５１Ａとして挙げてある）参照。なお，これらの両出願は全体を本明細書に援用するものである）。本明細書で示すすべての効果はｐ２７７の変異体でも再現されている。
培養３日目の最後の１８時間で，４個の培養物のウェルに〔3Ｈ〕チミジンを添加して組み込むことによってＴ細胞応答を検出した。刺激指数（ＳＩ）を，抗原を含有するウェル：抗原又はＣｏｎＡなしで培養した対照のウェルのｃｐｍ平均値の比率として算出した。ｃｐｍ平均値からの標準偏差は常に１０％未満であった。抗原なしの場合のバックグラウンドのｃｐｍは８００〜１５００ｃｐｍであった。
図１に示す結果は，油中ＰＢＳの乳濁液を注射した対照のＮＯＤマウスは，３種のペプチドすべてとＣｏｎＡに対して自然発生反応性を明示したことを示している。未治療の対照のマウスは類似の自然発生Ｔ細胞反応性を明示した（図示せず）。対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ｈｓｐ６０とＧＡＤのペプチドに対する該マウスの自己免疫Ｔ細胞増殖応答が特異的に低下することを示したが，ＭＴ−２７８とＣｏｎＡに対するコントロール応答は元のままであった。従って，ｈｓｐ６０のペプチドｐ２７７で治療すると，糖尿病の進行が阻止されるが，これはｈｓｐ６０とＧＡＤのペプチドの両者に対するＴ細胞応答が特異的に減少したことが関連していたのである。しかし自己反応性のこの低下は，ある種の他の機序とは対照的にＴ細胞の免疫寛容とアネルギーが原因である可能性を否定できない。
実施例２
ｐ２７７で治療した後の，ｐ２７７に対する抗体の誘発，並びにＧＡＤ，インシュリン及び無傷のｈｓｐ６０に対する抗体の減少
Ｔ細胞の反応性に加えて，ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生も，例えば，ｈｓｐ６０（Ｅｌｉａｓらの１９９０年の報告），ＧＡＤ（Ｔｉｓｃｈらの１９９３年の報告）及びインシュリン（Ｅｌｉａｓらの１９９０年の報告）などの自己抗原に対する自己抗体の自然出現と関連があった。この実施例では，かような抗体類の発生に対するｐ２７７による治療の効果を試験する。
３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群と，実施例１に記載したようにして，油中ｐ２７７又は油中ＰＢＳで治療した。５週間後，これらマウスから個々に血液を採取し，その血清を１：５０の比率で希釈して，組換えＧＡＤ６５（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告），組換えヒトｈｓｐ６０（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告），ウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ社），又はペプチドｐ２７７それぞれに対する抗体について，Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告に記載されているようにしてＥＬＩＳＡ検定法で試験した。簡単に述べると，各種の抗原１０μｇを検定プレートに塗布して（ｐ２７７が結合するのに適しているのでＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃプレートを使用した）試験血清とともにインキュベートした。粘着抗原に対する抗体の結合は，アルカリ性ホスファターゼを接合した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（米国ペンシルベニア州ウエストグローブ所在のＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて検出した。抗体の有意な量はＯＤ４０５ｎｍの読取り値が０．２５１より大きい量と定義した。この値は，１０頭の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの血清について得られたＥＬＩＳＡ法読取り値の平均値より３ＳＤ値だけ大きい値である。試験結果は，各種抗原に対する抗体について陽性のマウスの発生率として図２に示す。実際のＯＤ４０５ｎｍの読取り値は図３に示してある。
図２は，対照治療及びｐ２７７による治療の群におけるこれら自己抗体を有するマウスの発生率を示す。対照治療がなされたＮＯＤマウスは，ＧＡＤ（８０％）とｈｓｐ６０（９０％）に対する抗体の高い発生率を示し，抗インシュリン抗体（５０％）の中位の発生率を示したがペプチドｐ２７７に対する抗体は全くないことが分かる。類似の結果が未治療の対照マウスで得られた（図示せず）。これとは対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ＧＡＤ，ｈｓｐ６０及びインシュリンに対する自己抗体の発生率が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。従って，自己免疫糖尿病誘発プロセスのｐ２７７ペプチド療法は，ｈｓｐ６０とＧＡＤのタンパク質に対する自然発生Ｔ細胞増殖が特異的に低下することと，ＧＡＤ，ｈｓｐ６０及びインシュリンの分子に対する自己抗体が消失することが特徴である。しかしｐ２７７に対するＴ細胞の免疫寛容又はアネルギーはこのような自己免疫の低下の原因ではない。というのは，ｐ２７７で治療されたマウスが，ｐ２７７に対する抗体の発生率の著しい増大（８０％）を示した（ｐ＜０．０１）からである。ｐ２７７療法が抗体に対するＴ細胞の増殖からｐ２７７に対する反応性への切換えに関連していることは，その治療効果が，治療されたマウス中で自己免疫Ｔ細胞が産生する支配的なサイトカイン類のシフトによってもたらされることを示唆している。
実施例３
ｐ２７７による治療の前後に産生される抗体のアイソタイプの分析
ＴＨ１からＴＨ２様挙動へのシフトの起こる可能性が，ｐ２７７による治療の前後に産生される抗体のアイソタイプを分析することによって裏付けられた。図３Ａは，ｐ２７７による治療を行う前に存在するＧＡＤと無傷のｈｓｐ６０に対する自然発生自己抗体が，ＩｇＧ２ａのクラスの抗体で且つＩＦＮγを分泌するＴＨ１タイプのＴ細胞に依存する抗体（ＳｎａｐｐｅｒとＭｏｎｄの１９９３年の報告）であることを示している。これらのＩｇＧ２ａの自己抗体は，ｐ２７７による治療後５週間以内に消失した。これとは対照的に，治療後に発生する抗ｐ２７７抗体の抗体アイソタイプを分析したところ，これら抗体アイソタイプが，もっぱらＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのクラスのものであり，ＩＬ−４を産生するＴＨ１−Ｔ細胞（ＳｎａｐｐｅｒとＭｏｎｄの１９９３年の報告）及びおそらくはＴＧＦβ（Ｓｎａｐｐｅｒらの１９９３年の報告）に依存していることが分かった。ｐ２７７による治療によって誘発されるＴＨ１型のＩｇＧ２ａの抗体は全くなかった（図３Ｂ）。
実施例４
ペプチドｐ２７７による治療の前後でのサイトカインプロフィルの測定
サイトカイン切り換えの概念を確認するため，ｐ２７７で治療したマウス及び対照のマウス中の，ｐ２７７とＭＴ−ｐ２７８のペプチドに対して反応性のＴ細胞が産生したサイトカイン類を検定した。３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，油中ｐ２７７又は油中ＰＢＳで治療した（実施例１参照）。３週間後，これらマウスの脾臓を取り出して脾臓細胞を集めた。これら脾臓細胞を３組ずつ，ＣｏｎＡ，ｐ２７７又はＭＴ−ｐ２７８とともに，２４時間（ＩＬ−２とＩＬ−４の分泌のため）又は４８時間（ＩＬ−１０とＩＦＮγの分泌のため）インキュベートした。培養物の上澄み液中のサイトカイン類の存在を，ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのサイトカインＥＬＩＳＡのプロトコルに従いＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのペアード抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの組換えマウスサイトカイン類を，校正曲線用の標準として使用した。簡単に述べると，平底９６−ウェルの微量滴定プレートを，ラット抗マウスサイトカインｍＡｂｓでコートし，４℃で１８時間後に，上記培養物の上澄み液即ち組換えマウスのサイトカイン類を添加し，４℃で１８時間後にプレートを洗浄した。次に，ビオチニル化ラット抗マウスサイトカインｍＡｂを添加し，室温で４５分後，十分に洗浄してアビジン−アルカリ性ホスファターゼを添加した。３０分後，プレートを洗浄し，色素原基質を添加して試料をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍにおいて読み取りを行った。サイトカイン類の濃度は，標準として組換えサイトカイン類を使用し校正曲線から得た単位／ｍｌの平均値として示してある。試験結果を図４Ａ〜４Ｄに示す。
図４Ａと４Ｂは，対照マウスの脾臓細胞が，ｐ２７７，ＭＴ−ｐ２７８又はＴ細胞ミトゲンＣｏｎＡのいずれか一方で培養された時に，ＩＬ−２とＩＦＮγの両者を分泌したことを示している。対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ペプチドｐ２７７とのインキュベーションに応答して，有意に少ない量（ｐ＜０．０１）のＩＬ−２とＩＦＮγを産生した。ＴＨ１サイトカイン類のこの減少は特異的であり，ｐ２７７で治療したマウスは，ＭＴ−ｐ２７８に対するそれらのＩＬ−２とＴＦＮγのサイトカイン応答を維持した。
図４Ｃと４Ｄは，マウスの脾臓細胞が産生したＩＬ−１０とＩＬ−４の量を示す。対象のマウスは，ｐ２７７，ＭＴ−ｐ２７８又はＣｏｎＡに応答してＩＬ−４をほとんど産生せず，そして，ｐ２７７に応答してＩＬ−１０をごく少量産生した。対照的に，ｐ２７７にのみ応答し且つｐ２７７で治療したマウスにのみＩＬ−１０とＩＬ−４が有意に増大した（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１０とＩＬ−４の増加とあいまってＩＬ−２とＩＦＮγが減少することは，ＴＨ１様挙動からＴＨ２様挙動へのシフトを裏付けている。このようなシフトは，ｐ２７７に対するＴ細胞の増殖の減少及びｐ２７７に対するＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂの抗体の出現の両者を説明できる。従って，ｐ２７７ペプチド療法の有利な効果は，自己免疫応答を不活性化することによっては起こらず，自己免疫を活性化して異なるサイトカイン挙動モードにすることによって起こる（Ｃｏｈｅｎの１９９５年の報告；Ｌｉｂｌａｕらの１９９５年の報告）。
実施例５
脂質乳濁液中のｐ２７７を用いるＩ型糖尿病のペプチド療法
（ｉ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；並びに（ii）１０％の大豆油，１．２％の卵リン脂質及び２．２５％のグリセリンで構成された１０％脂質乳濁液（イントラリピド，スウェーデン所在のＫａｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ）の各々０．１ｍｌにペプチドｐ２７７，１００μｇを含有させて１頭のマウスの皮下に投与することによって雌のＮＯＤマウスを治療した。
６ヶ月齢での糖尿病の発生率と抗ｐ２７７抗体の産生を追跡した。
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＡｎａｌｙｚｅｒIIで２週間間隔で少なくとも２回測定して血糖濃度が２００ｍｇ／ｄｌを超えている持続性高血糖症を糖尿病と診断した。ペプチドによる治療の成功については，正常な血糖濃度（２００ｍｇ／ｄｌ未満）の維持，膵島の島内炎症（インシュリン炎）の軽減及びＴＨ２型免疫応答の指標としての治療ペプチドに対する抗体の誘発で検定した。試験結果を表１に示す。
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表１から分かるように，イントラリピド中に含有させて投与するｐ２７７による治療が糖尿病と死亡の発生率を減少させるのに有効であった。一方，ＰＢＳに含有させて投与する治療は効果がなかった。
実施例６
ペプチドｐ２７７／イントラリピド療法はサイトカインプロフィルの特異的切換えを誘発する
補助剤としてイントラリピドを用いると，ｐ２７７によってＴＨ１→ＴＨ２サイトカインの切換えが起こることを確認するため，ｐ２７７／イントラリピドで治療したマウスと対照のマウス中に，ｐ２７７に対し反応性のＴ細胞が産生したサイトカイン類を検定した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）すなわちＴ細胞ミトゲンを用いて，対照としての全脾臓Ｔ細胞を活性化した。
３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，イントラリピド中ｐ２７７又はイントラリピド中ＰＢＳで治療した（実施例１参照）。５週間後，マウスの脾臓を取り出し，脾臓細胞を集めた。その脾臓細胞をＣｏｎＡ又はｐ２７７と共に２４時間（ＩＬ−２とＩＬ−４の分泌のため）又は４８時間（ＩＬ−１０とＩＦＮγの分泌のため）インキュベートした。培養物の上澄み液中のサイトカイン類の存在は，ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのサイトカインＥＬＩＳＡ法のプロトコルに従いＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのペアード抗体を用い，ＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの組換えマウスサイトカイン類を校正曲線用の標準として使用した。簡単に述べると，平底９６ウェル微量滴定プレートをラット抗マウスサイトカインｍＡｂでコートし，４℃で１８時間後に，上記培養物上澄み液又は組換えマウスサイトカインを添加した。４℃で１８時間後，プレートを洗浄し，ビオチニル化ラット抗マウスサイトカインｍＡｂを添加した。室温で４５分後，十分に洗浄し，アビジン−アルカリ性ホスファターゼを添加した。これらプレートを洗浄し，色素原基質を加え，試料の４０５ｎｍにおける読取りをＥＬＩＳＡリーダーで行った。試験結果を図５Ａと５Ｂに示す。サイトカイン類の濃度は，ＯＤ読取り値で示してある。
図５Ａは，対照マウスの脾臓細胞をｐ２７７とともにインキュベートしたところＩＬ−２とＩＦＮγの両方を分泌したことを示している。これとは対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ペプチドｐ２７７とともにインキュベートしたのに応答して，ＩＬ−２とＩＦＮγの産生量は有意に少なかった（ｐ＜０．０１）。ＴＨ１サイトカイン類のこの減少は特異的であった。即ち，ｐ２７７で治療したマウスは，ＣｏｎＡに対するそのＩＬ−２とＩＦＮγのサイトカイン応答を維持した（図５Ｂ）。図５Ａと図５Ｂはマウスの脾臓細胞が産生したＩＬ−１０とＩＬ−４の量を示す。対照のマウスはｐ２７７又はＣｏｎＡに応答してＩＬ−４又はＩＬ−１０をほとんど産生しなかった。対照的に，ｐ２７７に対してのみ応答し且つｐ２７７／イントラリピドで治療したマウスにのみＩＬ−１０とＩＬ−４が有意に増大した（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１０とＩＬ−４が増大するのと相まってＩＬ−１０とＩＬ−４が減少しているのは，ＴＨ１様挙動からＴＨ２様挙動へのシフトを裏付けている。
本明細書に引用したすべての引用文献は，定期刊行物もしくは論文抄録，公開されたか，もしくは対応する米国もしくは外国の特許願，発行された米国もしくは外国の特許又はその外の引用文献を含めて，これら引用文献中に記載されているすべてのデータ，表，図及び本文を含む全体を本明細書に援用するものである。更に，本明細書に引用された引用文献中に引用された引用文献の全内容もすべて本明細書に援用するものである。
公知の方法のステップ，従来の方法のステップ，公知の方法又は従来の方法に言及していることは，いずれにしろ，この発明の態様，性状又は実施態様が関連技術分野で開示され教示され又は示唆されていると容認しているわけではない。
具体的実施態様の上記説明によって，この発明の一般的な性質は十分明らかになっているので，他人は，当該技術分野の技倆内の知識（本明細書に引用した引用文献の内容を含めて）を利用することによって，過度な実験を行うことなく且つこの発明の一般概念から逸脱することなしに，かような特定の実施態様を，容易に変形し及び／又は各種用途に採用することができる。それ故，このような採用及び変形は，本明細書に記載の教示とガイドラインに基づいて，開示された実施態様の均等物の意味と範囲内にあるとする。本明細書の表現法又は専門用語は説明を目的とするものであって限定を目的とするものではないと解すべきであるから，当該技術分野の当業者は，本明細書の専門用語と表現法を，当業者の知識と組み合わせで本明細書に記載の教示とガイドラインに照らして解すべきである。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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