(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸物質から一本鎖核酸物質を分離して、一本鎖核酸物質を単離する方法であって、該方法は、
上記両方の混合物を、１〜１０Ｍの濃度のカオトロピック剤及びキレート剤を含み且つ２〜１０のｐＨを有する第１液体並びに核酸に可逆的に結合できる核酸結合第１固相と接触させ、ここで、該第１液体は、二本鎖核酸物質は前記第１固相に結合するが実質量の一本鎖核酸物質は結合しないような組成を有しており、及び
前記第１固相を前記第１液体から分離することを包含し、
該方法は、更に、前記の一本鎖核酸物質を含む上清を、カオトロピック剤を含む第２液体及び核酸に可逆的に結合できる核酸結合第２固相で処理することを含み、ここで、該第２液体は、前記上清と第２液体による混合物が、一本鎖核酸物質を第２固相に結合させ得るような組成を有し、それにより一本鎖核酸物質を単離することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
キレート剤が１０ｍＭ〜１Ｍの濃度で存在するＥＤＴＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１液体がカオトロピック剤、キレート剤、及び適切な濃度の２価陽イオンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２価陽イオンの濃度がキレート剤の濃度と同等である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
キレート剤がＥＤＴＡであり、イオンがＭｇ2+である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１液体が、１２０ｇのＧｕＳＣＮを０．２ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ＝８）１００ｍｌに溶解させることによって調製された緩衝液で構成される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第２液体が、１２０ｇのＧｕＳＣＮを０．３５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．４）１００ｍｌに溶解し、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２２ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ９．１ｇを加え、溶液を均質化し、最終濃度が約０．２５ＭとなるようにＭｇＣｌ2を加えることによって調製された緩衝液で構成される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１及び第２固相がケイ素を主成分とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
固相を遠心により上清から分離することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸の混合物に元々存在する一本鎖核酸物質を単離して増幅する方法であって、該方法は、
前記混合物を請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法に供した後の単離物質を、
一本鎖核酸をプライマーとハイブリダイズするステップ、及びハイブリダイズされた一本鎖物質を鋳型として用いてプライマー配列にヌクレオチドを付加する酵素でプライマーを伸長させるステップを含み、少なくとも１つの前記プライマーがランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含むことを特徴とする一本鎖核酸物質を増幅する工程に供することを含む、前記一本鎖核酸物質を単離して増幅する方法。
【請求項１１】
ランダムハイブリダイズ配列及び増幅配列を含む少なくとも一つのプライマーが、更に標識を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含む少なくとも一つのプライマーが、更に直接配列決定モチーフを含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
一本鎖核酸物質がｍＲＮＡからなることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換させることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゲル電気泳動ステップを含むことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
その後配列決定ステップを含むことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、核酸含有出発物質、特に生物学的材料（例えば尿、便、精液、唾液、全血、血清またはその他の体液、あるいは白血球分画（バフィーコート）、細胞培養物等のような前記体液の分画）、並びに環境（例えば土、水等）からの核酸の精製及び増幅の分野に関する。
最近まで、上記した複合混合物から核酸を単離及び／または精製する方法は複数の工程を含む労力を要する方法であった。ＥＰ  ０３８９０６３（参考文献として本明細書に援用する）には、複合混合物から核酸物質を簡単に且つ迅速に精製する方法が開示されている。この方法は、全血のような複合混合物を核酸結合シリカ固相材料の存在下、すべての核酸物質が前記固相に結合し得る条件下でカオトロピック剤で処理し、前記混合物から前記固相を分離することからなる。この文献は、混合物中に一本鎖核酸と二本鎖核酸の両方が存在するならば、その両方が固相に結合することを示している。前記文献は、混合物中に存在すると疑われる公知配列を有するある種の核酸の増幅（ＰＣＲ）をも開示している。
従って、前記文献から、サンプル中に存在すると疑われる公知核酸を簡単に且つ迅速に検出する方法が教示される。
標的核酸（一本鎖または二本鎖）の種類が前もって明らかで、なかったり、分析しなければならない標的が多種類であることはしばしばである。これらの場合、上記した迅速であるがむしろおおざっぱな方法では十分に洗練され得ず、粗な物質を更に精製することが望まれ得る。二本鎖（ｄｓ）及び一本鎖（ｓｓ）核酸（ＮＡ）の混合物を一本鎖及び二本鎖形態に分画することは、例えばｄｓ−ハイブリッドから標識ｓｓ−ＮＡプローブを分離する際に、ｄｓ−ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写物を分離する際に、またｍＲＮＡからゲノムＤＮＡを分離する際にしばしば必要とされている。現在、各種核酸の分離は、幾つかの方法で行われている。サイズ及び形に違いがあることから、電気泳動が各種形態の核酸を分画するために使用され得る（１−３）。遠心は密度の違いを利用している（４）。より最近では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を分離、精製するために使用されてきた（５−８）。
現在最も広く使用されている方法（９）により真核細胞から精製したＲＮＡは有意な量のゲノムＤＮＡを含んでいると考えられ、ｓｓ−ＲＮＡ分画のゲノムＤＮＡ汚染を減らす改変方法が最近発表された（１０）。
ＥＰ  ０３８９０６３の方法により一本鎖及び／または二本鎖物質を別々に調べることは不可能である。なぜならば、該方法は両者を区別しないからである。
よって、本発明は、一本鎖核酸物質を二本鎖核酸物質から分離する方法を提供する。この方法は、一本鎖核酸物質及び二本鎖核酸物質を含む混合物を、カオトロピック剤及び核酸結合固相を含み、二本鎖核酸物質は固相に結合するが実質量の一本鎖核酸物質は結合しないような組成を有する液体と接触させ、前記固相を前記液体から分離することからなる。前記分離を達成するための適当な条件は当業者により決定され得る。
二本鎖核酸物質は固相に結合するが一本鎖核酸物質は結合しない条件はさまざまであるが、上記した特異的な結合を得るための重要なパラメーターはカオトロピック剤の濃度［おおよそ１〜１０Ｍでなければならず、好ましくは３〜６Ｍ、特に約５Ｍである］、キレート剤の濃度［キレート剤がＥＤＴＡの場合、１０ｍＭ以上でなければならず、好ましくは１Ｍ以下である］、分離が行われる水溶液のｐＨ［カオトロピック剤としてチオシアネートを使用する場合には、２以上、１０以下でなければならなず、そうでなければｄｓ物質がｓｓになる危険性があるからである］である。方法を実施する際の温度はあまり重要でないようであるが、好ましくは４〜６０℃の温度に維持するのが最良である。本発明では、分離中ｄｓ物質が二本鎖を保つことが重要であることは勿論である。ｄｓ核酸が４０％ＧＣ塩基対で少なくとも５０ｂｐである場合、ｄｓ物質は通常上記した条件下で二本鎖を保つ。前記した長さがＧＣ含量の増減によりどのように変化するか当業者は知っている。Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら（２６）及び／またはＴｈｏｍｐｓｏｎら（２７）に、全方法が上記したａ．ｏ．因子間の複雑な相互作用に依存することが示されている。こうした開示内容及び上記引用文献から、当業者ならば特定の方法に対する条件を調節することができる。
カオトロピック剤は本発明の非常に重要な要素である。カオトロピック剤は、核酸の二次、三次及び／または四次構造を変更し得る物質と定義される。カオトロピック剤は核酸の一次構造に対して実質的な影響を持つものであってはならない。核酸がタンパク質のような他の分子に結合して存在する場合、同じまたは別のカオトロピック剤によりその結合を変化させることもできる。多くのカオトロピック剤、例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素またはグアニジニウム塩、またはその組み合わせが本発明での使用に適している。本発明で使用するのに好ましいカオトロピック剤はグアニジニウム塩であり、チオシアン酸グアニジニウムが最も好ましい。
偶然にも、本発明者らは、ｓｓ−核酸は緩衝液Ｌ１１の存在下でシリカ粒子またはケイソウ土に結合せず（実施例参照）、ｄｓ核酸は結合することを知見した。異なる条件下での実験から、非結合分画にＭｇ2+または他の二価陽イオンを添加することが非常に要であることが判明した。キレート剤（ＥＤＴＡ）の濃度とほぼ同等の濃度の二価イオン（Ｍｇ2+）で最良の結果が得られた。
使用される固相はあまり重要でない。固相が可逆的に核酸を結合することが重要である。
固相材料は公知であり、その多くはシリカを主成分とするもの、例えばアルミニウムシリケート等であり、好ましくはシリカである。シリカには、ＳｉＯ2結晶及び他の形態の酸化ケイ素（例えば、ケイソウ土スケルトン、ガラス粉末及び／または粒子、無定形酸化ケイ素）が包含される。固相は任意の形態で、存在し得、核酸混合物を収容する容器またはその容器の一部であってもよい。また、固相はフィルターーまたは他の適当な構造であり得る。ケイ素を主成分とする物質以外に、他の材料、例えばニトロセルロース（フィルター）、ラテックス粒子及び他のポリマー物質も適当である。固相の好ましい形態は、結合物質と遊離物質を例えば遠心により容易に分離し得る粒状である。固相の粒度は臨界的でない。適当な平均粒度は約０．０５〜５００μｍである。好ましくは、粒度は、粒子の少なくとも、８０％、好ましくは９０％が上記した範囲のサイズを有するように選択される。このことは、０．１〜２００μｍ、好ましくは１〜２００μｍの好ましい平均粒度に対しても当てはまる。所与の重量の粒子の結合性は粒度が小さくなるほど優れているが、粒子はその粒度が小さすぎると例えば遠心により分離後容易に再分散され得なくなる。こうした現象は、出発物質が高分子量の核酸を多く含む核酸に富む場合に生ずるであろう。このような場合、粒子及び核酸は凝集物を形成する。当業者は、予想される特定用途に適した粒度を選択することができる。凝集物の形成は、多くの用途で分別されたシリカまたはケイソウ土を使用することにより避けることができる。
本発明の別の態様は、一本鎖核酸物質を核酸物質混合物から単離する方法であり、該方法は前記混合物を上記した方法にかけるステップ及び一本鎖核酸物質を含む上清を、カオトロピック剤及び第２の核酸結合固相を含む第２液体で処理するステップを含み、第２液体は上清と第２液体の混合物により一本鎖核酸物質が第２固相に結合し得るような組成を有する。
この方法で、二本鎖核酸物質は粗製混合物から除去され、一本鎖核酸は残りの依然として粗製の混合物から別の１ステップで精製される。二本鎖物質及び一本鎖物質は可逆的に各固相に結合し、それにより固相から容易に溶出されて更に分析または他の処理を受ける。非常に有用な別の処理は（二本鎖または一本鎖）核酸物質の増幅である。
両方の物質を増幅することも、または両方の物質を増幅するために他方の物質に変換させることもできる。本発明は更に、一本鎖核酸物質を増幅させる方法を提供し、該方法は、一本鎖核酸物質をプライマーとハイブリダイズするステップ及びハイブリダイズされた一本鎖物質を鋳型として用い、プライマー配列にヌクレオチドを付加する酵素を用いてプローブを伸長させるステップからなり、少なくとも１つのプライマーはランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含む。
本発明により精製された一本鎖核酸を、第１及び第２鎖合成のためのランダム３’末端を有するプライマー（タグプライマー）を用いるｃＤＮＡ合成反応用インプットとして使用した（図７に示す概略を参照されたい）。
次いで、上記したタグ付きｃＤＮＡを、両タグプライマー中に存在するＰＣＲモチーフと相同のＰＣＲプライマーを１つだけ用いることにより増幅させる。第１鎖合成に使用されるタグプライマー（ＴＡＧ２０）は、生じたＰＣＲ産物のその後の直接配列決定を容易にすべく特に設計されたものである。
多くの他のプロトコル（１６−２２）とは対照的に、上記した方法は配列データを全く必要とせず、増幅された産物の大部分は、臭化エチジウム染色アガロースゲル上に別個のバンドとして可視化され得、増幅されたｃＤＮＡの単離及び直接配列決定が容易となる。増幅基準は当業界で公知である。適当なプライマーの長さ、適当な緩衝液、鎖を分離するための適当な融解温度、適当なハイブリダイズ条件はすべて、当分野の一般的なハンドブックを用いて決定され得る。
勿論、例示した配列は本発明を逸脱せずに変更可能である。ハイブリダイゼーション及び伸長の目的に適している限り、増幅モチーフとしていずれの配列を使用するかは殆ど重要でない。適当な制限は、当業者により変更し得る条件に依存する。通常、プライマーは少なくとも１０塩基長を有し、１００塩基を大きく越えない長さを有する。
本発明の増幅の態様を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて例示する。勿論、他の増幅方法も同等に適当である。
プライマーに対する標識（即ち、タグ）の例がＤＩＧ（ジゴキシゲニン）である。しかしながら、他の標識も使用可能であり、当業界で公知である。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
分離／単離
材料及び方法
核酸ソース
ファージＭＳ−２  ｓｓ−ＲＮＡ（３５６９ｎｔ）、大腸菌ｒＲＮＡ（１６及び２３Ｓ、それぞれ１．７ｋｂ及び３．５ｋｂ）、ファージＭ１３  ｓｓ−ＤＮＡ（７５９９ｎｔ）及びＨｉｎｄIII消化λファージｄｓ−ＤＮＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツのマンハイムに所在）から購入した。ロタウイルスｄｓ−ＲＮＡは、感染者の便からプロトコルＹ／ＳＣ（１１）により精製した。プラスミドＤＮＡは、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｒｋｅ（１３）に記載されている大腸菌ＨＢ１０１から、セファロースＣＬ２Ｂ（スウェーデンのウプサラに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。総ＮＡは大腸菌からプロトコルＹ／Ｄ（１１）により精製した。
化学薬品
チオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）は、Ｆｌｕｋａ（スイスのＢｕｃｈｓに所在）から入手した。
ＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ）及びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏは、Ｍｅｒｃｋ（ドイツのダルムシュタットに所在）から入手した。ＴＲＩＳは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツのマンハイムに所在）から入手した。粒度分別したシリカ粒子（粗シリカ、ＳＣ）及びケイソウ土（ｄｉａｔｏｍ）懸濁液の調製は（１１）に記載されている。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、Ｐａｃｋａｒｄ（イリノイ州ダウナーズグローブに所在のＰａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）から入手した。
緩衝液の組成
溶解／結合緩衝液Ｌ６、洗浄緩衝液Ｌ２及びＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ＝８．０）は（１１）に記載されている。０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）は、ＥＤＴＡ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）３７．２ｇ及びＮａＯＨ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）４．４ｇを全容量が５００ｍｌになるように水に溶解して調製した。溶解／結合緩衝液Ｌ１１は、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）１００ｍｌ中にＧｕＳＣＮ１２０ｇを溶解して調製した。結合緩衝液Ｌ１０は、０．３５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．４）１００ｍｌ中にＧｕＳＣＮ  １２０ｇを溶解し、続いて０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２２ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ９．１ｇを添加し、溶液を均質化し、最後に固体ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  １１ｇを添加して調製した。Ｌ１０中のＭｇＣｌ2の最終濃度は約０．２５Ｍである。Ｌ１０は、暗所で室温で保存したとき少なくとも１ヶ月間安定である。
プロトコルＲによるｄｓ−ＮＡ及びｓｓ−ＮＡの分画
手順の概略を図１に示す。サンプル（ＴＥ緩衝液中に種々のＮＡの混合物を含む）５０μｌをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チユーブ中のＬ１１  ９００μｌ及びＳＣ  ４０μｌの混合物に添加後、渦状に混合して均質化した。室温で１０分結合後、チユーブを遠心すると（２分間、約１０，０００×ｇ）、シリカ／ｄｓ−ＮＡペレット（「初期シリカペレット」）及びｓｓ−ＮＡ含有上清が生じた。
ｓｓ−ＮＡ形態（プロトコルＲ−上清）を回収するために、上清９００μｌをＬ１０  ４００μｌ及びＳＣ  ４０μｌの混合物に添加し、ｓｓ−ＮＡを室温で１０分間のインキュベーションして結合させた。その後チューブを遠心し（１５秒間、約１０，０００×ｇ）、上清を（吸引により）除去した。生じたペレットをその後１ｍｌのＬ２で２回、１ｍｌのエタノール７０％（容量／容量）で２回、１ｍｌのアセトンで１回洗浄した。シリカペレットを乾燥し（エツペンドルフ加熱ブロックにおいて蓋を開いて、５６℃で１０分間）、ＴＥ緩衝液５０μｌに溶出させた（蓋を閉じて、５６℃で１０分間）。遠心（２分間、約１０，０００×ｇ）後の上清はｓｓ−ＮＡ分画を含む。
初期シリカペレットからｄｓ−ＮＡ形態（プロトコルＲ−ペレット）を回収するために、残りの上清を捨て、シリカペレットをＬ１１で２回洗浄して非結合ｓｓ−ＮＡを除去した。その後、生じたシリカペレットをＬ２で２回、エタノール７０％で２回、アセトンで１回洗浄し、上記したように乾燥し、溶出させた。遠心（２分間、約１０，０００×ｇ）後の上清はｄｓ−ＮＡ分画を含む。
プロトコルＲによりＮＡを分画するための完全手順（約１時間を要する）では、２つのエッペンドルフチューブを使用するのみである。
ゲノムＤＮＡ及びｓｓ−ＮＡの分画
ｓｓ−ＮＡが高分子量ゲノムＤＮＡに捕捉されるために、上記したプロトコルＲではｓｓ−ＮＡは低収率でしか得られない。この問題は、ｓｓ−ＮＡの捕捉を防止するに十分なだけ高分子量ゲノムＤＮＡを剪断させるプロトコルＹ／Ｄ（１１）により総ＮＡをまず単離することにより避けられ得る。こうして精製した総ＮＡはその後プロトコルＲ用インプットとして使用され得る。
ゲル電気泳動
すべての実験で、ＮＡを、Ａａｉｊ及びＢｏｒｓｔ（１４）に記載されている緩衝液系中に臭化エチジウム（１μｇ／ｍｌ）を含む中性アガローススラブゲル（酢酸を用いてｐＨ７．７に調節した４０ｍＭ  トリス−２０ｍＭ  酢酸ナトリウム−２ｍＭ  ＥＤＴＡ；臭化エチジウムを緩衝液１ｍｌあたり１μｇの濃度に添加した。）を用いる電気泳動にかけた（８〜１０Ｖ／ｃｍ）。
ハイブリダイゼーション
ＤＮＡ断片を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１５）の方法によりニトロセルロースフィルターに移し、ランダム標識化（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ドイツ）により作成した［α−32ｐ］ｄＣＴＰ標識ｐＨＣ６２４（１６）とハイブリダイズした。ハイブリダイズ条件は（１２）に既に記載されている通りである。
結果
各種ＮＡのシリカ粒子に対する結合について各種ＧｕＳＣＮ含有溶解緩衝液を比較したところ、結合緩衝液としてＬ１１（ＥＤＴＡにつき約１００ｍＭ）を用いたときに二本鎖形態のみが結合した。一方、一本鎖形態及び二本鎖形態の両方が結合緩衝液Ｌ６（ＥＤＴＡにつき約２０ｍＭ）において結合した（表１）。これらの所見に基づいて、一本鎖核酸及び二本鎖核酸を分画するためのプロトコル（プロトコルＲ）を開発した（図１）。
二本鎖核酸をＬ１１中のシリカ粒子により結合させたら、簡単に遠心してシリカ／ｄｓ−ＮＡペレットを一本鎖形態を含有する上清から分離させる。この上清をシリカ粒子及び結合緩衝液Ｌ１０（Ｍｇ2+につき約２５０ｍＭ）の混合物に添加し、一本鎖核酸のシリカ粒子への結合を回復させる。続いて、シリカ−ＮＡ複合体を洗浄及び溶出させて二本鎖形態及び一本鎖形態は精製され得る（プロトコルＲ）。二本鎖核酸は初期シリカ−ペレット（プロトコルＲ−ペレット）から回収される。一方、一本鎖形態は初期上清（プロトコルＲ−上清）から回収される。
プロトコルＲを最適化するために、予め精製または市販されている核酸を混合し、次いでプロトコルＲにより分画する再構築実験を実施した。
二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡの混合物の分画
ｄｓ／ＤＮＡ／ｓｓ−ＤＮＡ混合物の二本鎖形態及び一本鎖形態への分画を図２に示す。臭化エチジウム染色ゲルのバンド強度から推定したｓｓ−ＤＮＡの回収率は約５０％であった。５００ｂｐ〜４．６ｋｂの範囲のｄｓ−ＤＮＡの回収率は８０〜９０％であった［同程度の回収率が１００〜５００ｂｐの範囲のｄｓ−ＤＮＡ断片でも得られた（示さず）］。より大きな断片は（１１）に記載されているようにかなり剪断された。ＵＶ照射による検出レベルで、ｄｓ−形態及びｓｓ−形態への分画は完全であった。
二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡの混合物の分画
図３に、ｄｓ−ＲＮＡ（ヒトロタウィルスゲノムセグメント１−１１、詳細は１４参照）及びｓｓ−ＲＮＡ（ファージＭＳ２ＲＮＡ）の混合物の二本鎖形態及び一本鎖形態への分画を示す。ｄｓ−ＲＮＡ及びｓｓ−ＲＮＡの推定回収率は少なくとも８０％であった。ＵＶ照射による検出レベルで、ｄｓ−形態及びｓｓ−形態への分画は完全であった。
二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡの混合物の分画
図４に、ｄｓ−ＤＮＡがｓｓ−ＲＮＡから効率的に分離され得ることを示す。
上記両分画の回収率は少なくとも８０％である。大腸菌ｒＲＮＡ（２３Ｓ及び１６Ｓ）をｓｓ−ＲＮＡインプットとして使用したときにも同様の結果が得られた（示さず）。
上記した実験で、ｄｓ−形態及びｓｓ−形態の分画は（臭化エチジニウ染色及びＵＶ照射後のバンド強度の肉眼検査で判断して）完全であると考えられる。ｄｓ−ＤＮＡ及びｓｓ−ＲＮＡの混合物のｓｓ−形態及びｄｓ−形態への分画方法の遂行を確認するために、前記混合物からプロトコルＲ−上清により精製したＮＡを、サザンプロッティング及び分画用インプットとして使用したｄｓ−ＤＮＡと相同の32Ｐ−標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより調べた。この実験で、ｓｓ−ＮＡ分画に含まれるｄｓ−ＤＮＡインプットの量は０．１％未満であることが判明した（図５）。
ゲノムＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡの混合物の分画
大腸菌をプロトコルＲ用インプットとして用い、直接分画による高分子量（ゲノム）ｄｓ−ＤＮＡ及びｓｓ−ＲＮＡの分離を調べると、ｄｓ−ＤＮＡ分画はｒＲＮＡでかなり汚染され（図６、レーン６及び７）、ｓｓ−ＲＮＡ回収率は低かった（図６、レーン８及び９）。これは、シリカ／ＮＡ複合体が形成されたときＲＮＡが高分子量（ゲノム）ｄｓ−ＤＮＡに捕捉されるためであろう。一方、ｓｓ−ＲＮＡ分画にはゲノムＤＮＡは観察されなかった。まず標準プロトコルＹ／Ｄ（１１）を用いて単離し、その後プロトコルＲにおいてインプット材料として使用した総核酸から、ｓｓ−ＲＮＡ分画の回収率が優位に高いことが判明した（図６、レーン２及び５）。
増幅
材料及び方法
核酸ソース
ＨＩＶ−１  ＲＮＡはウイルス培養物から単離した（２３）。ファージＭＳ−２  ＲＮＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツのマンハイムに所在）から購入した。マーカーとして使用した７．５Ｋｂ  ボリ（Ａ）テイルＲＮＡ及び１００ｂｐ  ラダーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在）から購入した。ＰＣＲ  ＴＡ３クローニングベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ（米国マディソンに所在）から入手した。プラスミドの５’ＮＯＴ  Ｈｘｂ2ＥＮＮ（２４）（ヌクレオチド６３８−４６４７由来のＨＩＶ−１のＧＡＧ遺伝子及びＰＯＬ遺伝子含有）及び１６８．１  ＲＴＮ（２４）（ヌクレオチド５６７４−８４７４由来のＨＩＶ−１のＥＮＶ遺伝子含有）は、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｒｋｅ（１３）に記載されているように精製し、その後実施例に記載されているプロトコルＲ−ペレットにより精製した。ＰＣＲ実験でポジティブコントロールとして使用したプラスミドｐＨＣｒｅｃは、ＰＣＲプライマーＲＢ  ８（下記する）を用い、λＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に対する低アニーリングＰＣＲにより作成した。別個のＰＣＲ産物をプロトコルＹ／Ｄ（１１）を用いて精製し、次いでＰＣＲ  IIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。その後、約６００ｂＰインサートを有する露出（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）プラスミドｐＨＣｒｅｃを、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｒｋｅ（１３）に記載されている大腸菌ＨＢ１０１から、セファロースＣＬ２Ｂ（スウェーデンのウプサラに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。
化学薬品及び酵素
ＥＤＴＡ、ＫＣｌ、ＭｇＣ１2・６Ｈ2Ｏ、ＮａＣｌ及びクエン酸トリナトリウム２水和物は、Ｍｅｒｃｋ（ドイツのダルムシュタットに所在）から入手した。ＴＲＩＳ及びＢＳＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツのマンハイムに所在）から入手した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、Ｐａｃｋａｒｄ（米国イリノイ州ダウナーズに所在のＰａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、Ｓｅｒｖａ（ドイツのハイデルベルグに所在）から入手した。
ｄＮＴＰ類及び硫酸デキストランは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデンのウプサラに所在）から入手した。
プロトコルＲで使用した化学物質は本明細書に記載した通りである。
逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  IIは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在）から購入した。ＤＮＡポリメラーゼＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ２は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（英国に所在）から入手した。Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国ノーウォークに所在）から入手した。ＲＮａｓｅ  Ｈは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツのマンハイムに所在）から入手した。サケ精子ＤＮＡは、Ｓｉｇｍａ（米国セントルイスに所在）から入手した。
緩衝液及び溶液の組成
プロトコルＲで使用した緩衝液の調製は本明細書に記載した通りである。ただし、核酸の単離のためのプロトコルＲで使用した溶解緩衝液及び洗浄緩衝液（Ｌ１０、Ｌ１１及びＬ２）は、該溶解緩衝液及び洗浄緩衝液中の内在性核酸を除去するためにケイソウ土（１１）を充填したカラムを通して濾過した。
１０×逆転写緩衝液（ＣＭＢ１）は、１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる。
１０×ＰＣＲ緩衝液は、５００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２００ｍＭ  ＫＣｌ及び１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡからなる。
溶出緩衝液トリス／ＥＤＴＡ（ＴＥ、ｐＨ８．０）は、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）からなる。
オリゴヌクレオチド
第１鎖プライマーＴＡＧ  ２０は次の通り
0003943597.tif 000002
第２鎖プライマーＴＡＧ  ７は次の通り
0003943597.tif 000003
ＰＣＲプライマーＲＢ８は次の通り
0003943597.tif 000004
下線はＰＣＲモチーフである。
太字は直接配列決定のためのモチーフである。
Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ。
第１鎖合成のプロトコール
市販されている逆転写酵素中に存在するｓｓ−ＲＮＡは、第１鎖合成に使用したときに望ましくない副生成物を生ずると考えられた。この問題を解決するために、逆転写酵素を、外部から添加されるプライマーを欠いているｃＤＮＡ合成用混合物中で予め処理した。
１μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  II（２００Ｕ／μｌ）
１μｌ  ＣＭＢ１（１０×）
０．５μｌ  ＭｇＣｌ2（１００ｍＭ）
０．４μｌ  ｄＮＴＰ類（各２５μＭ）
７．１μｌ  Ｈ2Ｏ
３７℃で１５分間インキュベートした。
プロトコルＲ−上清により精製した核酸（２０μｌ）を６０℃で５分間インキュベートした後、氷で急冷した。続いて、以下の混合物を添加した。
３μｌ  ＣＭＢ１（１０×）
１μＬ  ＴＡＧ２０（１００ｎｇ／μｌ）
１．５μｌ  ＭｇＣｌ2（１００ｍＭ）
１．２μｌ  ｄＮＴＰ類（各２５ｍＭ）
３．３μｌ  Ｈ2Ｏ
最後に、プレインキュベートしたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（ＳＳ  II）１０μｌを添加し、生じた混合物を４２℃で３０分間インキュベートした。
逆転写反応後、混合物を８０℃で５分間インキュベートすることによりＳＳ  IIを不活化し、その後混合物を室温まで冷却した。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを一本鎖ｃＤＮＡに変換するために、混合物にＲＮＡｓｅ  Ｈを２０単位添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、一本鎖ｃＤＮＡをプロトコルＲ−上清を用いて単離した。一本鎖ｃＤＮＡをＴＥ４０μｌ中に溶出させ、２０μｌを第２鎖合成用インプットとして使用した。
第２鎖合成のプロトコル
一本鎖ｃＤＮＡ  ２０μｌに、以下の混合物を添加した（氷上）。
４μｌ  ＣＭＢ１（１０×）
１μＬ  ＴＡＧ  ７−ＤＩＧ*（１００ｎｇ／μｌ）
２μ１  ＭｇＣｌ2（１００ｍＭ）
１．６μｌ  ｄＮＴＰ類（各２５ｍＭ）
０．２μｌ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ２（１３Ｕ／μｌ）
１１．２μｌ  Ｈ2Ｏ
混合物を氷上で１０分間インキュベートし、その後３７℃で６０分間インキュベートした。第２鎖合成後、二本鎖ｃＤＮＡをプロトコールＲ−ペレットを用いて単離した。二本鎖ｃＤＮＡをＴＥ  ４０μｌ中に溶出させた。２０μｌを採取し、２μｌをＰＣＲ用インプットとして使用した。残りの１８μｌは−２０℃で保存した。
ポリメラーゼ連鎖反応のためのプロトコル
二本鎖ｃＤＮＡ  ２μｌを、以下の組成のＰＣＲ混合物４８μｌに添加した。
１８μｌ  ＴＥ（ｐＨ８．０）
１μｌ  ＲＢ  ８（１００ｎｇ／μｌ）
５μｌ  ＰＣＲ緩衝液（１０×）
０．９μｌ  ＭｇＣｌ2（１００ｍＭ）
０．２μｌ  ｄＮＴＰ類（１００μＭ）
０．１μｌ  ｄＵＴＰ*（２５μＭ）
０．３μｌ  Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）
２２．５μｌ  Ｈ2Ｏ
９５℃で５分間インキュベート後、ＤＮＡ熱サイクラー（タイプ４８０：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を用いてサンプルに４５回の増幅サイクルを加えた。１サイクルは、９５℃で１分間の変性、６３℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２分間の伸長とした。増幅サイクル後、サンプルを７２℃で８分間インキュベートし、その後温度を４℃に下げた。ＰＣＲ産物２５μｌについて、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により調べた。各実験において、ＴＥをネガティブ抽出コントロールとして及びネガティブＰＣＲコントロールとして使用した。
＊ｄＴＴＰをｄＵＴＰで部分的に置換することにより、従来のＰＣＲ反応により生じた産物は再増幅され得ないことを確認するための方法が得られる。ＰＣＲ増幅の産物は、ウラシル含有デオキシリボ核酸である。従来のＰＣＲ増幅による汚染物を含む可能性のあるＰＣＲ産物は、ＰＣＲ前に酵素ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を用いてウラシル塩基を切除することにより除去される。
ゲル電気泳動
すべての実験で、核酸を、Ａａｉｊ及びＢｏｒｓｔ（１４）に記載されている緩衝液系中に臭化エチジウムを含有する中性アガローススラブゲルを用いて電気泳動した（８〜１０Ｖ／ｃｍ）。
ハイブリダイゼーション
サザンブロッティング（１５）後、ＨＩＶ−１の全ＧＡＧ遺伝子、ＰＯＬ遺伝子及びＥＮＶ遺伝子を表す32Ｐ−標識プローブ［プラスミド５’ＮＯＴ  Ｈｘｂ2ＥＮＮ及びプラスミド１６８  １ＲＴＮ］（１０）とハイブリダイズしてＤＮＡ断片を検出した。
結果
同時に、１０5分子のＨＩＶ−１  ＲＮＡ（２３）及びネガティブコントロール（ＴＥ）を、プロトコルＲ−上清を用いて抽出した。生じた一本鎖核酸を上記した非選択的ＲＴ−ＰＣＲにより増幅させ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡについて別個の結合パターンを得た。ＴＥコントロール中には増幅産物はなかった（図８）。２回の変動は、方法の非選択性を反映する。方法のＰＣＲ部分の効率のためのコントロールとして、０、６、６０及び６００分子のプラスミドｐＨＣｒｅｃのインプットを使用した。
図８Ａにおいて目に見えるバンドがＨＩＶ−起源であることを確認するために、高緊縮条件下でＨＩＶ−１ゲノムのほぼ全体を包含する32Ｐ−標識プローブとのサザンブロットハイブリダイゼーションを実施した（図８Ｂ）。この実験から、ＵＶ照射により目に見えるバンドの多くはＨＩＶ−１プローブとハイブリダイズした。前記プローブとハイブリダイズしなかったバンドは、プローブ中に存在する部分以外のＨＩＶ−１ゲノムの部分と相同であるか、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ調製物（例えば、細胞ｍＲＮＡ）中に存在する一本鎖ＲＮＡまたはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−II中に存在するｓｓ−ＲＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  IIのプレインキュベーション中にｄｓ−ハイブリッドに変換されなかった）に由来するであろう。
Ｃ型肝炎ＲＮＡ、ファージＭＳ２  ＲＮＡおよび７．５ｋｂボリ−（Ａ）テイルＲＮＡのような他の一本鎖ＲＮＡでも同様の結果が得られた（結果示さず）。
結論として、上記した方法は（例えば血清中に存在する）一本鎖ＲＮＡ標的をアガロースゲルにおいて一連の別個のバンドに増幅するために使用し得る。別個のバンドはアガロースゲルから精製され、例えば細菌ベクター中でクローン化され得、その後クローンは配列決定され得る。タグプライマー（ＴＡＧ  ２０）の１つが配列モチーフを有しているという事実から、バンドをゲルから精製後、クローニングなしに別個のバンドの配列を決定することが可能である。本明細書に記載の方法は、臨床サンプル中に存在する未知の配列（例えば、ウイルス配列）を単離しキャラクタイゼーションする際に、また配列データを持たない転写物からｃＤＮＡを増幅するために有用である。
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シリカ粒子ではなくケイソウ土を使用して類似の結果が得られた（データ示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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