(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性肝炎タンパク質を産生する方法であって、制御因子及びＥ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム２タンパク質のアミノ酸１１２−６６０をコードするヌクレオチドから成る配列から成るＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を、５５ｋＤのタンパク質の産生を生じさせるために適した条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が、下記：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のヌクレオチド５４８０−７１２６；
（ｂ）前記（ａ）の配列に対して遺伝コードの結果として縮重したＤＮＡ配列；又は
（ｃ）結果として生じたタンパク質の一つ以上の残基が生物的に同等な残基で置換されており、前記結果として生じたタンパク質が抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に免疫原性である、（ａ）又は（ｂ）の結果として生じたタンパク質をコードするＤＮＡ配列
から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターであり、そして、宿主細胞が昆虫宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1992年9月18日提出の米国出願番号07/947263（係属中、今回放棄される）の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明は、肝炎ウィルス学の分野に関する。より厳密には、本発明はパキスタン産のE型肝炎の腸内伝染菌株SAR-55に由来する組み換えタンパク質、およびこれらのタンパク質を利用する診断法およびワクチンへの応用に関する。
背景技術
E型肝炎（腸内伝染性の非A/非B肝炎）の流行は、アジア、アフリカ、および中米で報告されている（Balayan,M.S(1987),Soviet Medical Reviews,SectionE,Virology Reviews,Zhdanov,O-V.M.(ed),Chur,Switzerland:Harwood AcademicPublishers,Vol.2,235-261;Purcell,R.G.,et at.(1988)in Zuckerman,A.J.(ed),"Viral Hepatitis and Liver Disease",New York:Alan R. Liss,131-137;Bradley,D.W.(1991)in Hollinger,F.B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(eds):"Viral Hepatitis and Liver Disease",Williams and Wilkins,Baltimore,501-513）。E型肝炎と考えられる散発性の肝炎の症例は、E型肝炎ウィルス（HEV）が地方病性である国において報告された肝炎の90%にものぼる。感染者の血清中の抗HEV抗体を検出するための血清学的な試験の開発の必要は、当該技術分野においては広く認識されているが、感染者または動物から排出されるHEVの濃度が非常に低いため、このようなHEVを血清学的な試験のために抗原の材料として利用することは不可能であり、細胞培養液中でのHEVの増殖に関しては小数の成功が報告されていたものの（Huang,R.T. et al.(1992),J.Gen.Virol.,73:1143-1148）、細胞培養液は血清学的な試験のために必要な量の抗原を産生するにはいまだ非効率的である。
最近、E型肝炎に関係するウィルスのゲノムDNAを同定しようという世界的な努力によって、HEVの一部の株のゲノムがクローニングされた（Tam,A.W.et al.(1991),Virology,185:120-131;Tsarev,S.A.et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563;Fry,K.E.et al.(1992),Virus Genes,6:173-185）。DNA配列の解析によって、HEVのゲノムは３つのオープンリーディングフレーム（ORF）を構成するという仮説、およびそれらのORFが天然のHEVタンパク質をコードするという仮説が研究者によってたてられた。
ビルマ（ミャンマー）産のHEV株のゲノムの部分的なDNA配列は、Reyes et al.,1990,Science,247:1335-1339に開示されている。HEVのビルマ株の完全なヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列は、Tam et al.,1991および1991年10月17日公表のReyes et al.,PCT特許出願WO91/15603に開示されている。これらの著者は、この株の配列には3つの順向きのオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれるという仮説をたてている。
Ichikawa et al.,1991,Microbiol.Immunol.,35:535-543には、HEV感染したカニクイザルの血清を用いたλgt11発現ライブラリーのスクリーニングからの、長さ240から320ヌクレオチドの一連のクローンの単離が開示されている。1つのクローンから発現された組み換えタンパク質がE.coli中で発現された。この融合タンパク質はHEVのミャンマー株の3'領域のORF2によってコードされる。
HEVのビルマ株およびメキシコ株のORF2の3'領域によってコードされるさらなるタンパク質の発現は、Yarbough et al.,1991 J.Virology,65:5790-5797に記載されている。この報告では、HEV由来の2つのcDNAクローンの単離が記載されている。これらのクローンは、ORF2の3'領域のタンパク質をコードしている。これらのクローンは、E.coli中で融合タンパク質として発現された。
Purdy et al.,1992,Archieves of Virology,123:335-349、およびFavorov et al.,1992,J. of Medical Virology,36:246-250には、ビルマ株由来のより大きなタンパク質断片のE.coli中での発現が開示されている。これらの参考文献は、以前に記した参考文献と同じく、細菌発現系を用いたORF2遺伝子の一部の発現を開示するにとどまる。全長のORF2タンパク質を首尾よく発現することは、本発明以前には開示されていない。
HEVのゲノム構造と形態構造を他のウィルスとの比較によって、HEVはカリチウィルスに最も近縁であることが示された。興味深いのは、カリチウィルスの構造タンパク質がそのゲノムの3'部分によってコードされることであり（Neil,J.D.et al.(1991)J.Virol.,65:5440-5447；およびCarter,M.J. et al.(1992),J.Arch.Virol.,122:223-235）、HEVゲノムの3'端部分もまた構造遺伝子をコードするという直接的な証拠はないものの、3'ゲノム領域のいくつかの小さな部分を細菌内で発現させることによって、ELISAおよびウェスタンブロットにおいて抗HEV血清と反応活性を有するタンパク質が産生した（Yarborough,et al.,(1991)；Ichikawa et al.(1991)；Favorov et al.(1992)およびDawson,G.J. et al.(1992)J.Virol.Meth.;38:175-186）。しかし、ORF2タンパク質の構造タンパク質としての機能は本発明以前には証明されていなかった。
ORF2遺伝子の一部によってコードされる小さいタンパク質が、動物血清中のHEVに対する抗体を検出するための免疫試験に利用された。細菌によって発現された小さいタンパク質を血清学的な免疫試験において抗原として利用することは、いくつかの欠点を有し得る。まず、これらの小さいタンパク質を細菌細胞内で発現させることによって、可溶性の問題、およびE.coliの粗溶解物を免疫試験における抗原として用いた場合には罹患者の血清のE.coliタンパク質に対する非特異的交差反応が生じる（Purdy et al.(1992)）。次に、慣用的な疫学によって抗HEV抗体に対する一時的な血清学試験としてウェスタンブロットを利用することは、時間および経費の制約のために非実用的である。HEVゲノムの3'末端部分由来の小さいペプチドを用いたELISAでは、既知のHEV感染者の41%しか検出できなかった。3番目には、カリチウィルス属に最も近いファミリーであるピコルナウィルス属を含む多くのウィルスにおいて、主要な抗原性および免疫原性エピトープは高度に類似的であることが示されている（Lemon,S.M.et al.(1991),in Hollinger,F.B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(eds):"Viral Hepatitis and Liver Disease",Williams and Wilkins, Baltimore,20-24）。以上の理由から、真核細胞系において天然のHEV遺伝子によってコードされる完全なORFを発現することによって、HEVウィルス様粒子を形成するタンパク質が産生されると考えられる。このような完全なORFタンパク質は、HEVの構造タンパク質を部分的にのみ代表する上に述べた小さいタンパク質よりも、天然のキャプシドタンパク質に近い免疫学的構造を有すると考えられる。すなわち、これらの完全なORFタンパク質は、現在利用されている小さいタンパク質よりもより代表的な抗原およびより効率的な免疫原として利用され得ると考えられる。
発明の概要
本発明は、ヒトE型肝炎ウィルス株SAR-55の単離された、実質的に純粋な試料に関する。
本発明はまた、ヒトE型肝炎ウィルス株SAR-55のゲノムRNAの単離された、実質的に純粋な試料に関する。
本発明はさらに、ヒトE型肝炎ウィルス株SAR-55のcDNAに関する。
本発明の一つの目的は、組み換えHEVタンパク質の産生を行うことができる合成核酸配列、および同等の天然の核酸配列を提供することである。このような天然の核酸配列は、HEVタンパク質の合成を行うことができる遺伝子を同定し単離し得るcDNAまたはゲノムライブラリーから単離され得る。この応用の目的には、核酸配列とはタンパク質をコードするRNA、DNA、cDNAまたはそれらの任意の合成変異型をさす。
本発明はさらに、SAR-55 cDNA由来のプライマーを利用したE型肝炎遺伝子断片の選択的な増幅に基づく、生物試料中のE型肝炎ウィルスの検出法に関する。
本発明はまた、SAR-55cDNA由来の一本鎖アンチセンスポリ-またはオリゴヌクレオチドの、E型肝炎遺伝子の発現を阻害するための利用に関する。
本発明はまた、SAR-55のHEVゲノムまたは合成核酸配列によってコードされる単離された、実質的に純粋なHEVタンパク質およびその変異型、および特にHEVの少なくとも一つの完全なオープンリーディングフレームによってコードされる組み換えタンパク質に関する。
本発明はまた、核酸のクローニング、cDNAの発現ベクターへの挿入、および組み換えタンパク質の宿主細胞での発現による、HEVゲノム配列に由来する組み換えHEVタンパク質の調製法に関する。
本発明はまた、産生した組み換えHEVタンパク質の診断薬およびワクチンとしての利用に関する。
本発明はまた、生物試料中のE型肝炎ウィルスに特異的な抗体の検出法を含む。このような方法は、HEVによって起こる感染および疾病の診断およびそのような疾病の進行の検査に有用である。このような方法はまた、哺乳類におけるHEVの感染および疾病の治療の過程において治療薬の有効性を検査するのにも有用である。
本発明はまた、哺乳類においてE型肝炎の予防または治療に利用される薬剤組成物に関する。
図面の説明
図1には、HEV株SAR-55のゲノムの完全なORF2タンパク質を発現するのに利用される組み換えベクターをしめす。
図2Aおよび2Bには、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）である。野生型バキュロウイルスまたは組み換えバキュロウイルス（ORF2をコードする遺伝子を含む）に感染した昆虫細胞の細胞溶解物をクマジーブルー染色（A）またはHEV感染チンパンジーの血清でウェスタンブロッティング（B）した。図2Aおよび2Bのどちらも、レーン1には非感染SF-9細胞の総細胞溶解物が含まれ；レーン2には野生型のバキュロウイルスに感染させた細胞の溶解物が含まれ；レーン3には組み換えバキュロウイルスに感染させた細胞の溶解物が含まれ、レーン4には分子量マーカーが含まれる。
図3Aから3A'''および3Bには、組み換え感染昆虫細胞でのORF2の発現によって形成された、それぞれ30および20nmのウィルス様粒子の免疫電子顕微鏡写真（IEM）をしめす。
図4には、抗原として完全なORF-2をコードする遺伝子を含む昆虫細胞によって発現された組み換えORF-2を用いたELISAの結果をしめす。血清中の抗HEV抗体のレベルはカニクイザルにメキシコ（Cyno-80A82、Cyno-9A97およびCyno83）またはパキスタン（Cyno-374）株HEVを接種した後の様々の時間に測定された。
図5AからDは、抗原として完全なORF-2をコードする遺伝子を含む昆虫細胞によって発現された組み換えORF-2を用いたELISAの結果をしめす。血清中の抗HEVIgGまたはIgMレベルは、2匹のチンパンジーにHEVを接種した後の時間に渡って測定された。
図6AからJには、抗原としてSAR-55由来の完全な組み換え体ORF-2タンパク質を用いた場合と、HEVのビルマ株（Genelabs）由来の部分的な組み換え体ORF-2タンパク質を用いた場合に得られたELISAのデータの比較をしめす。
図7AからJには、SAR-55 HEVの10%糞懸濁液を10倍希釈列にした液を接種した（各パネルの上部に括弧でしめす）カニクイザルの抗HEV IgG ELISAおよびアラニンアミノトランスフェラーゼラ（ALT）値をしめす。ELISAに使用した組み換え体抗原は以下である：グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）；3-2エピトープ（Yarbough et al.,(1991)J.Virol.,65:5790-5797）とGSTの融合体である3-2（M）；ORF-2のC末端327アミノ酸とGSTの融合体であるSG3（B）（Yarbough et al.,(1993):Assay Development of diagnositc tests for Hepatitis E in "International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease.Scientific Program and Abstract Volume."Tokyo:VHFL p.87）；および昆虫細胞で直接発現させた55kDa ORF-2産物。
図8AからEには、10倍希釈列にした（各パネルの上部に括弧でしめす）SAR-55 HEVの10%糞懸濁液を接種した陽性のカニクイザルの抗HEV IgG ELISAおよびALT値をしめす。ELISAに用いた組み換え抗原は以下である：グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）；3-2エピトープ（Yarbough et al.,(1991)J.Virol.,65:5790-5797）とGSTの融合体である3-2（M）；ORF-2のC末端327アミノ酸とGSTの融合体であるSG3（B）（Yarbough et al.,(1993)）；および昆虫細胞で直接発現させた55kDa ORF-2産物。
図9には、SAR-55 HEVの10%糞懸濁液を10倍希釈列にしたもの（各レーンの上部にしめす）の抽出液から産生したPCR産物を分離した2%アガロースゲルのエチジウムブロマイド染色をしめす。PCR産物の予想される大きさは約640塩基対であり、（M）でしめすレーンはDNAサイズマーカーを含む。
図10には、酵母で完全なORF-2タンパク質またはより小さい分子量の断片を発現させるためのpPIC9ベクターをしめす。
発明の詳細な説明
本発明は、単離し実質的に精製したパキスタン産のE型肝炎ウィルス（HEV）の株SAR-55に関する。本発明はまた、HEVのタンパク質をコードするウィルス遺伝子のクローニング、および発現系を用いた組み換えタンパク質の発現に関する。特に本発明は、SAR-55由来のHEVのオープンリーディングフレーム（ORF）のクローニングおよび発現に関する。
本発明は、単離したHEVタンパク質に関する。好ましくは、本発明のHEVタンパク質は天然のHEVタンパク質と実質的に相同であり、最も好ましくは生物的に同等である。生物的に同等であるという語は、本明細書および請求の範囲を通じて、組成物がウィルス様の粒子を形成することができ、免疫原性を有することを意味する。本発明のHEVタンパク質はまた、哺乳類に注入することで野生型のHEVの攻撃に際して哺乳類を防御する防御的な抗体の産生を促進し得る。実質的に相同であるという語は、本明細書および請求の範囲を通じて、アミノ酸配列における天然のHEVタンパク質とのある程度の相同性を意味する。好ましくは、相同性の程度は70%以上であり、好ましくは90%以上であり、特に好ましいタンパク質のグループについては天然のHEVタンパク質と99%以上相同である。
好ましいHEVタンパク質は、ORF遺伝子によってコードされるタンパク質である。特に重要なのは、HEVのORF-2遺伝子によってコードされるタンパク質であり、さらに特にHEVのSAR-55株のORF-2遺伝子によってコードされるタンパク質である。ORF-2遺伝子によってコードされる本発明の好ましいタンパク質は、ウィルス様の粒子を形成する。ORF-1、ORF-2、およびORF-3タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、以下にSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3としてしめす：
0003889808.tif 000002
0003889808.tif 000003
0003889808.tif 000004
0003889808.tif 000005
0003889808.tif 000006
0003889808.tif 000007
0003889808.tif 000008
3文字の略号は、天然に存在する20のアミノ酸の慣用的なアミノ酸の省略形に従っている。
好ましい組み換えHEVタンパク質は、少なくとも一つのORFタンパク質からなる。タンパク質の生物特性を変えるために、同一のまたは別々のORFタンパク質の複数からなる他の組み換えタンパク質を作っても良い。特定のアミノ酸またはアミノ酸配列の非連続の付加、置換、または欠失によって、HEVタンパク質の生物活性が増強されると考えられる。
本発明はまた、上述のHEVタンパク質またはHEVタンパク質に実質的に相同なタンパク質の産生を行い得る核酸配列である。SAR-55と呼称するこの核酸配列は、SEQ ID NO.:4として以下にしめし、またAmerican Type Culture Collection(ATCC)に1992年9月17日付けで寄託した（ATCC登録番号75302）。
0003889808.tif 000009
0003889808.tif 000010
0003889808.tif 000011
0003889808.tif 000012
0003889808.tif 000013
0003889808.tif 000014
ヌクレオチドについて用いた略号は、当該技術分野において標準的に用いられるものである。
一方向の配列を慣用的に+鎖として表す。これは、RNAウィルスのタンパク質をコードする鎖であるからであり、上にSEQ ID NO.:4としてしめす配列である。
SAR-55のオープンリーディングフレームの予想されるアミノ酸配列は、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3を有する。ORF-1はSEQ ID NO.4のヌクレオチド28から始まり、長さは5078ヌクレオチドである；ORF-2はSEQ ID NO.4のヌクレオチド5147から始まり、長さは1979ヌクレオチドである；ORF-3はSEQ ID NO.4のヌクレオチド5106から始まり、長さは368ヌクレオチドである。
ORF-2タンパク質の類似分子の産生を行うことができるDNA配列を生ずる、DNA配列の変異が考えられる。ORF-2タンパク質の類似分子とは、本明細書および請求の範囲を通じて用いる場合、特に本明細書でしめす配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。このタンパク質においては本明細書でしめす配列中の一つ以上の残基が生物的に同等な残基で置換され、その結果生ずるタンパク質（すなわち類似分子）はウィルス粒子を形成することができ、免疫原性を有する。留意すべきなのは、上にしめしたDNA配列は本発明の好ましい態様の代表にすぎないことである。遺伝コードの縮重のために、ORFタンパク質またはその類似分子の産生を行い得るDNA配列を生ずるヌクレオチドの選択は様々であり得るということは理解されよう。故に、上にしめした配列と機能的に同等、または上にあげたアミノ酸配列に従って産生したORFタンパク質の類似分子の産生を行う配列と機能的に同等なDNA配列は本発明に含まれると考える。
本発明は、生物試料中のE型肝炎ウィルスを検出するための、E型肝炎遺伝子断片の選択的な増幅に基づく方法に関する。好ましくは、この方法にはDNA二本鎖断片の別々の鎖の非相同的な領域由来の一対の一本鎖プライマーが利用される。この二本鎖断片は、SEQ ID NO.:4にしめすSAR-55の配列に相同な領域を含むゲノムを有するE型肝炎ウィルス由来である。これらのプライマーは、選択された核酸配列を増幅するための米国特許第4683202号に定められた方法に従った方法で用いられ得る。
本発明はまた、E型肝炎遺伝子の発現を阻害するための、SAR-55 cDNAに相同な配列に由来する一本鎖アンチセンスポリ-またはオリゴヌクレオチドの利用に関する。これらのアンチセンスポリ-またはオリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAであり得る。標的配列は、典型的にはメッセンジャーRNAであり、より好ましくはRNAのプロセシングまたは翻訳に必要なシグナル配列である。Lemeitre,M.et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 84:648-652に開示されたように、アンチセンスポリ-またはオリゴヌクレオチドはポリリジンのようなポリカチオンと結合させ得、この結合物は、RNAとハイブリッド形成しその機能を阻害するのに十分量を哺乳類に投与され得る。
本発明には、HEVタンパク質（好ましくは少なくとも一つのORFタンパク質からなるタンパク質であり、最も好ましくは少なくとも一つのORF-2タンパク質である）の製造のための組み換えDNA技術が含まれる。組み換えORFタンパク質は、一つのORFタンパク質、または同一のまたは別々のORFタンパク質の組み合せからなり得る。天然または合成核酸配列は、HEVタンパク質の産生を行うために利用され得る。本発明の一つの態様においては、方法は以下の行程からなる：
（a）宿主生物にHEVのタンパク質の産生を行わせることができる核酸配列の調製；
（b）核酸配列のための制御因子を含み、宿主生物に導入できその中で複製され得るベクターへの核酸配列のクローニング；
（c）核酸および制御因子を含むベクターの、タンパク質を発現することができる宿主生物への導入；
（d）ベクターの増幅およびタンパク質の発現のために適した条件での宿主生物の培養；および
（e）タンパク質の回収。
本発明の別の態様においては、HEVの核酸によってコードされ、好ましくはHEVの少なくとも一つのORFによってコードされるタンパク質、または同一のまたは別々のORFタンパク質の組み合せ、最も好ましくは少なくとも一つのORF-2核酸配列によってコードされるタンパク質の組み換えDNA技術による合成の方法は以下の工程からなる：
（a）宿主生物にタンパク質の産生を行わせることができる核酸配列を含む形質転換またはトランスフェクションした宿主生物の、タンパク質が産生される条件下での培養；ただし上記のタンパク質は、HEVから単離された、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、またはSEQ ID NO.3のアミノ酸配列を有する天然のHEVタンパク質と実質的に相同できるか、またはこれらの組み合せを有する。
一つの態様においては、HEVのSAR-55株のウィルスゲノムのRNA配列は以下のように単離されcDNAにクローン化される。ウィルスRNAは、SAR-55に感染したカニクイザルから回収した生物試料から抽出され、ウィルスRNAは次に逆転写され、HEVのビルマ株のゲノム（Tam et al.(1991)）またはSAR-55ゲノムの+鎖または-鎖に相補的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。PCR断片はpBR322またはpGEM-32にサブクローン化され、二重鎖PCR断片が配列決定される。
本発明において利用することが考えられるベクターは、望ましいまたは必要な制御因子と共に上述の核酸配列を挿入することができ、次に宿主生物に導入し得、そのような生物の中で複製され得るいかなるベクターも含む。好ましいベクターは、制限酵素部位がよくわかっており、核酸配列の転写に望ましいまたは必要な制御因子を含むものである。
本明細書で言う制御因子とは、少なくとも一つのプロモーター、少なくとも一つのオペレーター、少なくとも一つのリーダー配列、少なくとも一つの終止コドン、およびベクターの核酸の適切な転写および続く翻訳に望ましいまたは必要な他のなんらかのDNA配列を含む。特に、そのようなベクターは宿主生物によって認識される少なくとも一つの複製起点、少なくとも選択マーカー、および核酸配列の転写を開始することができる少なくとも一つのプロモーター配列を含むことが考えられる。
本発明のクローニングベクターの構築にあたっては、多コピーの核酸配列および付随する制御因子が各ベクターに挿入され得ることにも留意すべきである。そのような態様においては、宿主生物はベクターあたりより大量の望ましいHEVタンパク質を産生すると考えられる。ベクターに挿入され得る多コピーのDNA配列の数は、生ずるベクターが適切な宿主微生物中に導入され、複製され、転写される能力（ベクターの大きさによって決る）によってのみ制限される。
他の態様では、HEVタンパク質のコード配列を含む制限酵素消化断片は、原核細胞または真核細胞で機能する適切な発現ベクターに挿入され得る。適切なという語は、ベクターがHEVタンパク質（好ましくは少なくとも一つの完全なORFタンパク質）をコードする完全な核酸配列を保持し発現できることを意味する。ORF-2の場合には、発現されたタンパク質はウィルス様粒子を形成しなくてはならない。好ましい発現ベクターは、真核細胞中で機能するものである。そのようなベクターの一部分の例には、酵母での発現に有用なベクター（例えばpPIC9ベクター（Invitrogen））、バクシニアウィルスベクター、アデノウィルスまたはヘルペスウィルス、好ましくはバキュロウィルス導入ベクター、pBlueBacが含まれる。好ましいベクターはp63-2（完全なORF-2遺伝子を含む）、p59-4（完全なORF-3およびORF-2遺伝子を含む）である。これらのベクターはAmerican TypeCulture Colection、12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852 USAに1992年9月10日に寄託され、寄託番号75299（p63-2）および75300（p59-4）を有する。実施例1にはp63-2を作製するためのORF-2遺伝子のpBlieBacへのクローニングを示す。この方法は、HEVのSAR-55株のゲノムを制限酵素NruIおよびBglIIで消化し、BlnIおよびBglII部位を含むポリリンカーをベクターの唯一のNheI部位に挿入し、NruI-BgklII ORF-2断片をアダプターを用いてBlnI-BglII pBlueBacに挿入することを含む。
さらに他の態様においては、選択された組み換え発現ベクターは組み換えタンパク質を発現する目的で次に適当な真核細胞系にトランスフェクションされる。このような真核細胞系には、一例として酵母、およびHela、MRC-5またはCv-1のような細胞系列が含まれる。好ましい真核細胞系の一つはSF9昆虫細胞である。好ましい方法の一つは、昆虫細胞系列SF9にCa沈澱法によって組み換えpBlueBacとAcMNPVバキュロウィルスDNAとを共トランスフェクションする場合におけるpBlueBac発現ベクターの利用を含む。
発現された組み換えタンパク質は、実施例2にしめすように、クマジーブルー染色、および抗HEV抗体を含む血清を用いたウェスタンブロッティングを含む、当該技術分野で知られた方法によって検出し得る。他の方法は、実施例3にしめすように、免疫電子顕微鏡によるウィルス様粒子の検出である。
さらなる態様においては、SF9細胞によって発現された組み換えタンパク質は粗溶解液として得られ、または、当該技術分野において知られた標準的なタンパク質精製法（差異沈降、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、親和性、および免疫親和性クロマトグラフィーおよびその他を含む）によって精製できる。免疫親和性クロマトグラフィーの場合、組み換えタンパク質はORFタンパク質に特異的な抗原と結合したレジンを含むカラムに通過させることで精製され得る。組み換え技術を用いて発現したHEV ORFタンパク質の精製法の例は、実施例10に提供される。
他の態様においては、本発明の発現した組み換えタンパク質は、哺乳類（一例としてヒト、チンパンジー、東半球猿、西半球猿、他のサル、その他を含む）のE型肝炎の診断（ダイアグノーシス）または予知（プログノーシス）のための免疫試験に利用され得る。好ましい態様においては、免疫試験はヒトのE型肝炎感染を診断するために有用である。HEVタンパク質（特にORFタンパク質、さらに特にORF-2タンパク質）を用いた免疫試験によって、HEV感染の診断のための高度に特異的な、敏感な、再現性のある方法が提供される。本発明の免疫試験は、放射性免疫試験、ウェスタンブロット試験、蛍光免疫試験、酵素免疫試験、化学発光試験、免疫組織化学試験、その他であり得る。当該技術分野で知られたELISAの標準的な方法は、Methods in Immunodiagnosis,2nd Edition,Rose and Bigazzi,eds.,John Wiley and Sons,1980および、Campbell et al.,Methods of Immunology,W.A.Benjamin,Inc.,1964に記載されている（両者とも本明細書では参照として挙げる）。当該技術分野で記載される通り、このような試験は直接的、間接的、競合的、または非競合的免疫試験であり得る（Oellerich,M.1984 J.Clin.Chem.Clin. Biochem.22:895-904）。このような検出試験に適当な生物試料には、一例として組織生検抽出物、全血、血漿、血清、髄液、胸膜液、尿、その他が含まれる。
一つの態様においては、試験血清は抗原として表面に組み換えHEVタンパク質（好ましくはORFタンパク質またはORF-2とORF-3、ORF-1とORF-3のような別々のORFタンパク質の組み合わせ）を結合した固相試薬と反応される。より好ましくは、HEVタンパク質はウィルス様の粒子を形成するORF-2タンパク質である。固相試薬は、固体支持物質にタンパク質を結合するための既知の方法で調製され得る。これらの結合方法には、支持物質に対するタンパク質の非特異的吸着、または支持物質上の感応基に対するタンパク質の共有結合が含まれる。抗HEV抗体と抗原との反応後、結合してない血清の成分は洗浄によって除去され、抗原-抗体複合体は標識された抗ヒト抗体のような二次抗体と反応させられる。標識は、適当な蛍光または発色試薬の存在下で固相支持物質を反応させることによって検出される酵素であり得る。放射性標識、コロイド金粒子、その他の他の検出可能な標識もまた利用され得る。
好ましい態様においては、SAR-55の完全なORF-2配列を含む組み換えベクターpBlueBacによって発現されたタンパク質は、抗HEV抗体（好ましくはIgGまたはIgM抗体）を検出するための特異的な結合試薬として利用される。実施例4および5には、固相試薬が表面抗原として組み換えORF-2を有する場合のELISAの結果をしめす。完全なORF-2核酸配列によってコードされるこのタンパク質は、部分的なORF-2タンパク質よりも多くの異なったHEV感染した霊長類の抗血清と反応活性を有するため、部分的なORF-2タンパク質よりも優れている。本発明のタンパク質はまた、異なったHEV株に応答して産生した抗体を検出することができるが、A、B、C、またはD型肝炎に応答して産生した抗体は検出しない。
免疫試験のため、HEVタンパク質およびその類似分子は、キット、単独、または二次抗体のような他の試薬との組み合わせの形で調製され得る。
組み換えHEVタンパク質（好ましくはORFタンパク質または複数のORFタンパク質の組み合わせ、より好ましくはORF-2タンパク質および実質的に相同なタンパク質、および本発明の類似分子）は、E型肝炎の攻撃に対して哺乳類を防御するワクチンとして利用され得る。免疫原として働くワクチンは、細胞、組み換え発現ベクターをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液、または発現されたタンパク質を含む培養上清であり得る。または、免疫原は部分的または実質的に精製された組み換えタンパク質である。免疫原を純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することは可能であるが、薬剤組成物、調剤、または製剤として与えることが好ましい。
本発明の調剤は、動物およびヒトに対する利用のために、上に記載した通りの免疫原と、一つ以上の薬理的に受容可能な担体および付加的には他の薬剤成分からなる。担体は、調剤の他の成分と融和性であり被投与者に有害でないという意味において受容可能でなければならない。調剤は、簡便には投与単位形式で与えられ、薬理技術分野ではよく知られたなんらかの方法によって調製され得る。
全ての方法には、一つ以上の付加的な成分をなす担体と活性成分を混合させる段階が含まれる。総じて、液体担体または明確に分離した固体担体または両者を活性成分を混合し、次に必要であれば産物を望ましい調剤の形にすることによって、調剤が調製される。
静脈内、筋内、皮下、または腹膜内投与に適した調剤は、簡便には被投与者の血液と好ましくは等張の溶液による活性成分の無菌水溶液からなる。このような調剤は、固体活性成分を生理的に融和性の物質（塩化ナトリウム（例えば0.1から2.0M）、グリシン、その他など）を含む水に溶解させ、生理条件に合った緩衝液のpHを用いて水溶液を産性し、上記の溶液を滅菌することによって簡便に調製され得る。これらは、単位ごとまたは例えば密封したアンプルまたはガラス瓶のような多投与量容器の形で与えられ得る。
本発明の調剤は、安定化剤を含有し得る。安定化剤の一例は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらは単独または混合物として利用され得る。これらの安定化剤は好ましくは免疫原あたり質量で0.11から10000の割合で含有され得る。2つ以上の安定化剤が用いられる場合でも、その総量は上で特定した範囲内であることが好ましい。これらの安定化剤は、適切な濃度およびpHのもとで水溶液中で用いられる。このような水溶液の特定の浸透圧は総じて0.1から3.0オスモルであり、好ましくは0.1から1.2の範囲である。水溶液のpHは5.0から9.0の範囲内（好ましくは6から8の範囲内）であるように調節される。本発明の免疫原を調剤にするために、抗吸着剤が利用され得る。
作用期間を調節するために、付加的な薬理的方法が用いられ得る。調節された薬剤の放出は、タンパク質またはその誘導体と複合体形成または吸着するポリマーの利用によって達成され得る。調節された放出は、適切な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニール、ピロリドン、酢酸エチレンビニール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）、巨大分子の濃度、および放出を調節するための混合方法を選択することによって行われ得る。放出調節剤によって作用期間を調節するための他の可能な方法は、タンパク質、タンパク質類似体、またはその機能誘導体をポリマー物質（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、水性ゲル、ポリ乳酸、または酢酸エチレンビニール共多量体）の粒子に取り込むことである。または、これらの薬剤を多量体粒子に取り込ませるかわりに、これらの物質をミクロカプセル（例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンミクロカプセルのようなコアセルベート化技術、またはポリメチルメタ蟻酸ミクロカプセルのような界面多量体化によって調製される）またはコロイド薬剤放出系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、微小乳濁液、極微小粒子、および極微小カプセル）、または巨大乳濁液に収容することが可能である。
経口薬剤が望ましい場合は、組成物を典型的な担体（例えばラクトース、蔗糖、澱粉、ステアリン酸タルクマグネシウム、クリスタリンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、または特にアラビアゴム）と組み合わせ得る。
本発明のタンパク質はキット、単独、または上に記載した薬剤組成物の形で提供され得る。
予防接種は、慣用的な方法で行われる。例えば、免疫原は適当な希釈剤（例えば塩水または水、または完全なまたは不完全なアジュバント）中で利用され得る。さらに、免疫原はタンパク質を免疫原性にするために担体に結合しまたは結合しなくてもよい。このような担体分子の例には、一例として牛血清アルブミン（BSA）、カギアナカサガイ（キーホールリンペット）のヘモシアミン（KLH）、破傷風変性毒素、その他が含まれる。免疫原は、抗体産生に適当ないかなる経路（例えば静脈内、腹膜内、筋内、皮下、その他）によっても投与され得る。免疫原は、有意な抗HEV抗体の力価が産生されるまで一回のみまたは定期的に投与され得る。血清中の抗体は、免疫試験を用いて検出され得る。
さらに他の態様においては、免疫原は宿主にHEV ORFタンパク質の産生を行わせることのできる核酸配列であり得る。このような核酸配列は、当該業者に既知の方法で適当な発現ベクターに挿入され得る。生体内への高効率の遺伝子導入を実現するのに適した発現ベクターには、一例としてレトロウィルス、アデノウィルス、およびバクシニアウィルスベクターが含まれる。このような発現ベクターの制御因子は、本明細書に以前に記載されており、当該業者には既知である。このような発現ベクターは、静脈内、筋内、皮下、腹膜内または経口投与することができる。
また別の態様においては、例えば宿主にHEV ORFタンパク質の産生を行わせることのできる核酸配列を含むプラスミド由来の真核生物発現ベクターの筋内注射によって、直接的な遺伝子導入が実現され得る。このような方法は、以前にはE型肝炎表面抗原を生体内で発現するために用いられており、表面抗原に対する抗体応答を引き起こした（DAvis,H.L. et al.(1993)Human Molecular Genetics,2:1847-1851；また、Davis et al.(1993)Human Gene Therapy,4:151-159および733-740参照）。
免疫原が部分的または実質的に精製された組み換えHEV ORFタンパク質である場合、HEVに対する防御性抗体応答を引き起こすのに有効な投与量は、2μgから100μgの範囲である。より好ましい範囲は、約5μgから約70μgであり、もっとも好ましい範囲は約10μgから約60μgである。
HEVに対する防御性抗体応答を引き起こすのに有効なHEV ORFをコードする核酸の投与量は、1μgから5000μgの範囲である。より好ましい範囲は、約300μgから約1000μgである。
宿主にHEV ORFタンパク質の産生を行わせることのできる核酸配列を含む発現ベクターは、キット、単独、または上に記載した薬剤組成物の形で提供され得る。
本発明の免疫原の投与は、予防または治療目的のいずれにもなされ得る。予防的に投与される場合、免疫原はHEVに対するなんらかの接触に先立って、またはHEV感染によるなんらかの兆候に先立って提供される。免疫原の予防的な投与は、哺乳動物のその後のHEV感染をなくし、または和らげるのに役立つ。治療的に提供される場合、免疫原は感染の最初（またはその直後）、またはHEVの引き起こすなんらかの兆候または疾病の最初に提供される。免疫原の治療的な投与は、兆候または疾病を和らげるのに役立つ。
好ましい態様の一つは、HEVのSAR-55株のORF-2配列によって発現された組み換えORF-2タンパク質およびその同等分子を用いて調製されたワクチンである。組み換えORF-2タンパク質は様々のHEV陽性血清と反応することがすでにしめされているため、様々のHEV株に対する防御におけるこれらの有用性が示唆される。
ワクチンとしての利用に加えて、これらの組成物はHEVウィルス様粒子に対する抗体の調製に用いることができる。これらの抗体は、抗ウィルス剤として直接用いることができる。ワクチンとしての抗体を調製するために、宿主動物をウィルス粒子を用いて免疫化し、または代わりにウィルス粒子由来の非粒子抗原を上に記載したように担体に結合させる。ウィルス粒子と反応する抗体を含む組成物を提供するために適当な期間をおいて宿主の血清または血漿を回収する。例えば、飽和硫酸アンモニウムまたはDEAEセファデックス、または当業者に既知の他の方法で、ガンマグロブリン画分またはIgG抗体が得られる。これらの抗体は、薬剤のような他の抗ウィルス剤による負の副作用の多くを有さない。
抗体組成物は、負の免疫系応答の可能性を最小限にすることによって宿主系とさらにより相容性を有するようにすることができる。これは、他の種の抗体のFc画分の全てまたは一部を除去すること、または宿主動物と同種の抗体を用いること（例えば、ヒト/ヒトのハイブリドーマ由来の抗体の利用）によって達成される。ヒト化した（すなわちヒトにおいて非免疫原性である）抗体は、例えば抗体の免疫原性部位を対応する非免疫原性部位と置換することによって産生され得る（すなわち、キメラ抗体）。このようなキメラ抗体は、ある種からの抗体の反応性のすなわち抗原に結合する部位、および別の種からの抗体のFc部位（非免疫原性）を含む。キメラ抗体の例には、一例として非ヒト哺乳動物-ヒトキメラ、ネズミ-ヒトキメラ、ハツカネズミ-ヒトキメラ、およびラット-ヒトキメラが含まれる（Robinson et al.、国際特許出願184187；Taniguchi M.,欧州特許出願171496；Morrison et al.,欧州特許出願173494；Neuberger et al.,PCT出願WO86/01533；Cabilly et al.,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439；Nishimuraet al.,1987 Canc.Res. 47:999；Wood et al.,1985 Nature 314:446；Shaw etal.,1988 J.Natl.Cancer Inst. 80:15553、全て本明細書中では参照として挙げる）。
ヒト化キメラ抗体の総説は、Morrison S.,1985 Science 229:1202およびOi et al.,1986 Biotechniques 4:214によって提供される。
適切なヒト化抗体はまた、CDRまたはCEA置換によって産生される（Jones et al.,1986 Nature 321:552；Verhoeyan et al.,1988 Science 239:1534；Biedleret et al.,1988 J.Immunol. 141:4053、全て本明細書中では参照として挙げる）。
抗体または抗原結合断片はまた、遺伝子工学によって産生され得る。重鎖および軽鎖の両者をE.coli中で発現させる技術は、PCT特許出願対象である；公表番号WO 901443、およびWO 9014424およびHuse et al.,1989 Science 246:1275-1281。
これらの抗体はまた、免疫応答を増強する手段としても利用できる。抗体を、抗体の他の治療投与と類似の量で投与できる。例えば、保存したガンマグロブリンを他のウィルス病（例えば狂犬病、風疹およびB型肝炎）の潜伏期間の初期に0.02から0.1ml/lb体重で投与して、細胞内へのウィルスの侵入を阻害する。そして、抗ウィルス剤の効果を増強するために、単独でまたは他の抗ウィルス剤とともに、HEVウィルス粒子と反応する抗体をHEVに感染した宿主に受動的に投与できる。
または、抗HEV抗体は抗イディオタイプ抗体を免疫原として投与することによって誘導される。簡便には、上に記載したように調製された精製抗HEV抗体製剤は、宿主動物中に抗イディオタイプ抗体を誘導するために利用される。この組成物を適当な希釈剤中で宿主動物に投与する。投与後（通常は繰返し投与した後）、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Fc抗原に対する免疫応答を除外するために、同種の宿主によって産生された抗体を用いることができ、または投与される抗体のFc領域を除去できる。宿主動物中に抗イディオタイプ抗体を誘導した後、抗体組成物を提供するために血清または血漿を取り出す。抗HEV抗体について上に記載したように、または親和性基質に結合した抗HEV抗体を用いた親和性クロマトグラフィーによって組成物を精製できる。産生した抗イディオタイプ抗体は、元来のHEV抗原と類似の構造を有し、HEV粒子抗原の代わりにHEVワクチンを調製するために用いられ得る。
抗HEVウィルス抗体を動物中に誘導する手段として用いた場合、抗体の注射方法はワクチン産生の場合と同じである。すなわち、筋肉、腹膜内、皮下、またはその他にアジュバントの存在下または非存在下の生理的に適当な希釈剤中の効果的な濃度において行う。一つまたは複数の補助剤の注射が望ましい場合があり得る。
本発明のHEV由来タンパク質はまた、感染前または後の予防のために設計された抗血清を産生するために利用されることが考えられる。ここではHEVタンパク質、またはタンパク質の混合物が適当なアジュバントとともに調剤になり、ヒト抗血清を産生するための既知の方法に従ってヒト志願者に注射によって投与された。注射されたタンパク質に対する抗体応答は、本明細書で記載する免疫試験を用いて抗HEV血清抗体の存在を検出するために定期的に血清採取することによって、免疫化後の数週間に渡って測定された。
免疫化したヒトの抗血清は、感染し得る可能性のある個人の感染前予防措置として投与され得る。抗血清はまた、感染後の個人を治療するのに有用であり、これはB型肝炎ウィルスに対する高力価抗血清を感染後予防に利用することと類似である。もちろん、標準的な技術を用いて免疫化した個人の血清から精製した免疫グロブリン（HEV免疫グロブリン）が感染前予防または感染後の個人の治療に利用され得るということは、当該技術者には容易に理解されるであろう。
HEVウィルス様粒子およびタンパク質に対する抗体、および抗イディオタイプ抗体の生体内利用、および診断利用の両者にとって、単クローン抗体を用いることが好ましい場合があり得る。単クローン抗ウィルス粒子抗体または抗イディオタイプ抗体は、以下のように産生され得る。免疫化した動物の脾臓またはリンパ球を単離し、不死化し、または当該技術者に既知の方法でハイブリドーマを調製するために用いる（Goding,J.W.,1983.Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Pladermic Press,Inc.NY,NY,pp.56-97）。ヒト-ヒトハイブリドーマを産生するために、ヒトリンパ球供与者が選択される。HEVに感染していることがわかっている供与者（例えば、血液中の抗ウィルス抗体の存在またはウィルス培養液によって感染がしめされる）は、適当なリンパ球として利用される。リンパ球は、末梢血試料から単離され、または供与者の脾臓組織採取が行われる場合は脾臓細胞が利用され得る。ヒトリンパ球を不死化するためにEpstein-Barrウィルス（EBV）が利用され得、またはヒト-ヒトハイブリドーマを産生するためにヒト融合用細胞が用いられ得る。タンパク質による一次試験管内免疫化がまた、ヒト単クローン抗体を産生するために利用され得る。
不死化細胞によって分泌された抗体は、望ましい特異性を有する抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーニングされる。単クローン抗ウィルス粒子抗体としては、抗体はHEVウィルス粒子に結合しなくてはならない。望ましい特異性を有する抗体を分泌する細胞が選択される。
上に記載した抗体およびその抗原結合断片は、単独のキット形式で、または生体内利用のための薬剤組成物として提供され得る。抗体は、治療用、免疫試験における診断用、またはORFタンパク質を精製するための免疫親和性試薬として本明細書に記載するように利用され得る。
材料
実施例で用いた材料は以下の通りである：
霊長類：チンパンジー（Chimp）（Pan troglodytes）。東洋球猿：カニクイザル（cyno）（Macaca fascicularis）、アカゲザル（Rhesus）（M.mulatta）、ブタオザル（PT）（M.nemestrina）、およびアフリカミドリザル（AGM）（Cercopithecus aethiops）。西半球猿：ヒゲタマリン（Tam）（Saguinus mystax）、リスザル（SQM）（Saimiri sciureus）、およびヨザル（OWL）（Aotus trivigatus）。霊長類は生物汚染封じ込め条件下で個別に飼育した。動物の飼育、維持、および世話は霊長類飼育の必要条件に見合うかまたはそれ以上のものであった。
多くの動物は静脈内にHEV SAR-55株を含む0.5mlの糞懸濁液の牛胎児血清による希釈液を、Tsarev,S.A. et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563；およびTsarev,S.A. et al.(1993),J.Infect.Dis.(167:1302-1306)に記載されたように接種された。Chimp-1313および1310は、7人のパキスタン産E型肝炎罹患者から回収した糞の混合物を接種された。
血清試料は一週間に約2回、接種前および後に回収した。肝臓の酸素である、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ICD）、およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）を商業的に入手可能な試験法で測定した（Medpath Inc.,Rockville,MD）。血清学試験は、上に記載したように行った。
実施例1 HEV SAR-55株のゲノムのDNA配列の同定
PCRのためのウィルスRNA鋳型の調製：HEV感染したカニクイザルの胆汁（10μl）、20%（wt/vol）SDS（最終濃度1%）、プロテイネースK（10mg/ml；最終濃度1mg/ml）、tRNA（10mg/ml）1μl、および0.5M EDTA 3μlを最終体積250μlに混合し、55℃で30分間保温した。総核酸を65℃で二回フェノール/クロロホルム（1:1（vol/vol））で、クロロホルムで一回胆汁から抽出し、エタノールで沈澱させ、95%エタノールで洗い、RT-PCRに用いた。糞、および特に血清由来のHEV RNAのRT%-PCR増幅は、RNAがより高度に精製された場合により効率的である。血清（100μl）または10%糞懸濁液（200μl）を上のようにプロテイネースKで処理した。30分間保温した後、CHAOS緩衝液300μl（4.2Mチオシアン酸グアニジン/0.5Nラウロイルサルコシン/0.025Mトリス-塩酸（pH8.0））を加えた。核酸を65℃で二回フェノール/クロロホルム抽出し、次に室温でクロロホルム抽出を行った。次に7.5M酢酸アンモニウム（225μl）を上層に加え、0.68mlの2-プロパノールで核酸を沈澱させた。沈澱物を300μlのCHAOS緩衝液に溶解させ、100μlのH2Oを加えた。クロロホルム抽出および2-プロパノール沈澱を繰り返した。核酸を水に溶解させ、エタノールで沈澱させ、95%エタノールで洗い、RT-PCRに用いた。
プライマー：21から40ヌクレオチド（nt）の長さで、ビルマ産HEV株（BUR-121）（Tam,A.W. et al.(1991),Virology,185:120-131）のゲノムまたはSAR-55のゲノムの＋鎖または−鎖に相補的な、94個のプライマーがApplied Biosystemsモデル391 DNA合成機を用いて合成された。
これら94個のプライマーの配列を、SEQ.ID NO.5〜SEQ.ID NO.98にしめす：
HEVプライマー一覧表
0003889808.tif 000015
0003889808.tif 000016
0003889808.tif 000017
0003889808.tif 000018
0003889808.tif 000019
0003889808.tif 000020
配列の左にしめす略号は以下を表す：RおよびDはそれぞれ逆向きおよび順向きのプライマーを表す；BおよびSはそれぞれE型肝炎のビルマ121株由来の配列およびSAR-55の配列を表す；5'NCおよび3'NCはそれぞれ、HEVゲノムの5'末端および3'末端の非コーディング領域を表す；1、2、および3はそれぞれオープンリーディングフレーム1、2、3由来の配列を表す。いくつかの配列の右にある括弧つきの表記は、それらの配列に人工的な制限酵素部位を挿入したことを示す。
PCR断片のクローニングのため、3から7ntを5'端につけたEcoRI、BamHI、またはBglII制限酵素部位をプライマーの5'末端に加えた。
RT-PCR：通常の100μlのRT-PCR混合液は、鋳型、10mMトリス塩酸（pH8.4）、50mM KCl、2.5mM MgCl2、4種類のdNTP全て（それぞれ0.2mM）、50pmolの順向きプライマー、50pmolの逆向きプライマー、RNasin（Promega）40ユニット、鳥骨髄芽球腫ウィルス逆転写酵素（Promega）、AmpliTaq（Cetus）4ユニット、上層として軽鉱油を含む。混合液を42℃で1時間保温し、次に35サイクルのPCR（94℃1分、45℃1分、72℃1分）で増幅した。PCR産物を1%アガロースゲルで解析した。
PCR断片のクローニング：末端に制限酵素部位を含むPCR産物をEcoRIおよびBamHI、またはEcoRIおよびBglII制限酵素で消化し、EcoRI/BamHI消化したpBR322またはpGEM-3Z（Promega）にクローーン化した。または、TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてPCR断片をpCR1000（Invitrogen）にクローーン化した。
PCR断片およびプラスミドの配列決定：PCR産物を1%アガロースゲルから切り出し、Geneclean（Bio 101,La Jolla,CA）によって精製した。二重鎖PCR断片は、Winship,P.R.(1984),Nucleic Acids Rev. 17:1266に記載されているようにSequenase（United States Biochemical）を用いて配列決定した。CsCl勾配遠心によって精製した二重鎖プラスミドは、Sequenaseキット（United States Biochemical）を用いて配列決定した。
配列のコンピューター解析：各HEV株の核酸配列を、Genetics Computer Group（Madison,WI）のソフトを用いて比較した（Devereaux,J. et al.(1984),Nucleic Acids Rev.12:387-395、version 7.5、VAX8650コンピューター（国立ガン研究所,Frederick,MD）による）。
実施例2 組み換え発現ベクターp63-2の構築
NruI-BglIIの制限酵素消化断片を得るために、HEV SAR-55株のゲノムの完全なORF-2を含むプラスミドを用いた（Tsarev,S.A. et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563）。NruIはHEV cDNAをORF-2のATG開始コドンの5ヌクレオチド上流で切断する。人工的なBglII部位がすでにHEVゲノムのポリA配列の直前に付加されていた（Tsarev,S.A. et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563）。この断片をpBlueBac導入ベクター（Invitrogen）に挿入するために、合成ポリリンカーがベクターの唯一のNheI部位に導入された。このポリリンカーには、HEV cDNAおよびpBlueBac配列には存在しないBlnIおよびBglII部位が含まれる。NruI-BglII ORF-2断片はBlnI-BglII pBlueBacに図1にしめすアダプターを用いて挿入された。
実施例3 p63-2のSF9昆虫細胞内での発現
p63-2およびAcMNPVバキュロウィルスDNA（Invitrogen）をCa沈澱法を用いてInvitrogenの手引に従ってSF9細胞（Invitrogen）に共トランスフェクションした。方法は以下の通りである；AcMNPVバキュロウィルスDNAはp63-2を包んで組み換えバキュロウィルスを形成できる完全な天然のバキュロウィルスを産生することができる。この組み換えバキュロウィルスは4回プラーク精製された。生ずる組み換えバキュロウィルス63-2-IV-2はSF9細胞をトランスフェクションするのに用いた。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット：昆虫細胞を泳動用緩衝液（50mMトリス塩酸（PH6.8）、100mM DTT、2%SDS、0.1%ブロモフェノールブルー、10%グリセロール）に再懸濁し、記載されたように（Laemmlil,U.K.(1970),Nature,227:680）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをクマジーブルーで染色し、またはタンパク質をBA-85ニトロセルロース膜（Schlecher&Schuell）に電気吸着した。吸着後、ニトロセルロース膜を10%牛胎児血清および0.5%ゼラチンを含むPBSでブロッキングした。一次抗体として、1:1000に希釈したチンパンジー-1313の高免疫血清が用いられた。二次抗体として、ヒトIgG（Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.）に対するホスファターゼ標識した親和性精製したヤギ抗体を1:2000に希釈したものが用いられた。膜をWestern blueで安定化した基質（Promega）中で露光した。全ての反応はブロッキング溶液中で行い、洗浄は0.05%Tween-20（Sigma）を含むPBSで行った。
HEV ORF-2の発現：組み換えバキュロウィルス63-2-IV-2を感染させたSF9細胞によって合成される主要なタンパク質は、見かけ上74kDの分子量を有するタンパク質である（図2A、レーン3）。この大きさはORF-2全長から予想されるもの（71kD）よりも少し大きい。大きさの差異はタンパク質のグリコシル化に起因し得る。なぜなら、N末端に少なくとも一つのグリコシル化され得る部位があるからである（Asn-Leu-Ser）。このタンパク質は非感染細胞（図2A、レーン1）または野性型非組み換えバキュロウィルスに感染した細胞（図2A、レーン2）では検出されない。後者においては、検出される主要なタンパク質は多面体タンパク質である。同じ溶解液をchimp-1313（HEVに高免疫化されたもの）の血清を用いてウェスタンブロットで解析した場合（図2B）、組み換え細胞溶解液中のタンパク質のみが反応し（レーン3）、主要なバンドは同じく74kDであった（図2B）。クマジー染色したゲルに存在した約25、29、35、40から45、および55から70kDの主要でないバンドもまたウェスタンブロットにおいて血清と反応した（図2B、レーン3）。74kD以上の分子量を有するいくつかのバンドは、異なったグリコシル化の程度に起因し、小さい分子量のバンドはプロセシングおよび/または分解を意味し得る。HEVの投与に先立ってChimp-1313から採取した血清は、ウェスタンブロットにおいていずれのタンパク質とも反応しなかった。
実施例4 組み換え感染SF9細胞の免疫電子顕微鏡観察
5×106の組み換え感染SF9細胞を、10mMトリス塩酸（pH7.4）、0.3%サルコシルを含むCsCl（1.30g/ml）中で超音波破砕し、68時間40000rpmで遠心した（SW60Ti）。もっとも高いELISA応答を有する、浮力密度1.30g/mlの50μlの画分を1mlのPBSで希釈し、5μlのchimp-1313高免疫血清を加えた。高免疫血清は、あらかじめ感染したチンパンジーをE型肝炎の二次株（メキシコ産HEV）で再攻撃することによって調製された。試料を1時間室温で、次に一晩4℃で保温した。免疫複合体をSW60Ti遠心機を用いて30000rpm、4℃、2時間遠心沈澱させた。沈澱物を滅菌水に再懸濁し、3%PTAでネガティブ染色し、カーボン網に載せ、40000倍の倍率で電子顕微鏡EM-10（Carl Zeiss,Oberkochen,Germany）で観察した。
VLPの検出：野性型または組み換えバキュロウィルス63-2-IV-2に感染した昆虫細胞由来の細胞溶解液をCsCl密度勾配遠心によって画分化した。組み換え感染細胞由来のCsCl密度勾配の画分をChimp-1313高免疫血清と保温した場合、1.30g/mlの浮力密度の画分中に抗体で覆われた2種類のウィルス様粒子（VLP）が観察された：まず（図3Aから3A'''）、抗体で覆われたHEVに類似の大きさ（30nm）および構造形態を有する個々の粒子、次に（図3B）、抗体で覆われた、HEVよりも小さい（約20nm）がその他は類似の粒子の集合体である。直接的なEMによって、それぞれ直径30および20nmの物体を含む非常に不均一な物体の一群の存在が観察された。これらの物体はウィルス粒子のように見えたが、抗体がない場合はHEVとして確認することはできない。多くのIEM実験によって、少なくともHEVゲノムのORF-2領域から合成されたタンパク質のいくつかが集合して特定の構造をとることが示唆された。感染の後期にある昆虫細胞は、小さいタンパク質の割合が高い場合、ELISAで常に優秀な結果をしめすことが観察された。そのため、以下の試験においては感染の後期にある組み換え昆虫細胞由来の画分化していない溶解液がELISAにおける抗原として利用された。
実施例5 完全なORF-2を発現する昆虫細胞由来の抗原に基づく、別々のHEV株びよる感染後のELISAによる抗HEVの検出
63-2-IV-2ウィルスに感染した5×106のSF9細胞を1mlの10mMトリス塩酸（pH7.5）、0.15M NaClに再懸濁し、3回凍結・融解した。この懸濁液の10μlを10mlのカルボン酸緩衝液（pH9.6）に溶解し、1つの可塑性微小力価試験プレート（Falcon）に広げるのに用いた。血清試料を1:20、1:400、および1:800、または1:100、1:1000、および1:10000に希釈した。ウェスタンブロットについて記載したのと同じブロッキングおよび洗浄液をELISAに用いた。二次抗体として、ヒトIgGに体するペルオキシダーゼを結合したヤギIgG断片またはセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した抗東または抗西半球猿免疫グロブリンを用いた。結果は、405nmの光学濃度（O.D.）を測定することによって決定した。
HEVのパキスタン株を代表する昆虫細胞由来抗原がHEVメキシコ株に感染したカニクイザル中の抗HEV抗体を検出できるか調べるため、3匹のサルを検査した（図4）。cyco-80A82およびcyco-9A97の2匹のサルは、メキシコ86年型HEV株（Ticehurst,J. et al.(1992),J.Infect.Dis.,165:835-845）を含む糞に感染させ、3番目のサルcyco-83は同じ株の2番目の糞に感染させた。対照として、HEVパキスタン株SAR-55に感染させたcyco-374由来の血清試料を同じ実験で検査した。メキシコ株に感染させた3匹のサル全ては抗HEVに血清変換した。１番目の糞で免疫化した動物は、15週目に血清変換し、2番目のものは5週目に血清変換した。興味深いことに、4匹の動物中でもっとも高い抗HEV力価は、メキシコ株の2番目の糞を接種したcyco-83において観察された。メキシコ株の1番目の糞を接種したカニクイザルは、もっとも低い力価をしめし、パキスタン株の1番目の糞を接種したものは中程度の力価をしめした。
実施例6 完全なORF-2を発現する昆虫細胞由来の抗原に基づく抗HEV ELISAの特異性
本明細書で記載するELISAが抗HEVを検出するが他の型の肝炎に関わる抗体は検出しないことを検査するために、他の既知の肝炎ウィルス（Garci,P. et al.(1992),J.Infect.Dis.,165:1006-1011；Farci,P. et al.(1992),Science（印刷中）；Ponzetto,A. et al.(1987),J.Infect.Dis.,155:72-77；Rizzetto,M. et al.(1981),Hepatology 1:567-574；chimp-1413、1373、1442、1551（HAV）；およびchimp-982、1442、1420、1410（HBV）；に関する参照は、Purcell et alからの未発表データである）に感染したチンパンジーの血清試料を4匹ずつ解析した（表1）。接種前および接種後5週目及び15週目の血清試料は、1:100、1:1000、1:10000の血清希釈度でHEV ELISAによって解析された。HAV、HBV、HCV、HDVに感染した動物由来の血清のいずれも、ELISAにおいてはHEV抗体として反応しなかったが、HEVを接種した4匹のチンパンジー全ては抗HEVのIgMおよびIgGクラスを産生した。
0003889808.tif 000021
0003889808.tif 000022
実施例7 非ヒト霊長類におけるHEV株SAR-55の宿主の範囲の決定
別々の霊長類種にHEVの標準糞懸濁液を静脈内接種し、感染を検査するために連続的に血清試料を採取した。血清ALTレベルを肝炎の指標として測定し、血清変換を抗HEVの上昇として測定した。結果を、カニクイザルおよびチンパンジーについて得られたものと比較した。
HEVを接種したアカゲザルのどちらも、非常に突出したアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の最大値と、強い抗HEV応答をしめした（表2）。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の最大値は、2匹の動物においていずれも35日目に観察され、血清変換は21日目に起こった。抗HEVの最大力価は、29日目に達成された。この研究に用いたアフリカミドリザルのどちらも、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性および抗HEVの上昇をしめした（表2）。アフリカミドリザル230は接種後7週間で死亡したが、感染の証拠はそれ以前に得られた。サル74のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の最大値は、接種前血清の平均値よりも3倍大きく、サル230においては約5倍大きかった。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の最大値および血清変換は、サル74および230においてはそれぞれ28日目および21日目に同時に観察された。
0003889808.tif 000023
0003889808.tif 000024
ブタオザル99は、接種前血清の平均値よりも3SD以上のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇をしめしたが、ブタオザル98はしめさなかった。しかし、2匹とも21日目に血清変換し、抗HEV力価はチンパンジーおよび東半球猿のものと同等であった。マカクザルではアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の最大値が低いため、HEV感染の替わりに免疫化が起こった可能性は完全には除外されない。しかし、免疫化はいくつかの理由から考えにくい。まず、ブタオザルの1/4の大きさにすぎないが、等量の接種を施された2匹のタマリンのいずれにおいても、免疫化は観察されなかった。次に、糞中に排出されるHEVの量は通常は非常に低いことがよく知られており、特に静脈内接種の場合には、この研究で用いた糞の10%懸濁液0.5mlに動物を免疫化するために十分量の抗原が含まれていることは考えにくい。
この研究の接種を受けたタマリンのいずれも、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の顕著な上昇または抗HEVの産生をしめさなかった（表2）。このため、これらの動物は感染していないと考えられた。リスザルは抗HEVは産生したが、チンパンジーまたは東半球猿よりも著しく低いレベルであった（表2）。さらに、血清変換は他の動物ではさらに後で起こった。リスザル868は41日目に血清変換し、869は35日目に変換した。抗HEV力価は、測定した3カ月以上の間のいずれの時期にも1:20以上ではなく、47から54日目に最大値に達した後は両方の動物で明らかに弱まった。しかし、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇は両方の動物において比較的顕著であり、時間的には血清変換の時期と相関していた。
ヨザルは、東半球種とだいたい同じ程度にHEV感染に反応した（表2）。2匹のヨザルは21日目に血清変換し、28日目には抗HEV力価は1:8000に達した。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性はヨザル924においては35日目に最大値に達したが、925においては49日目であった。
実施例8 チンパンジー中の抗HEV IgMおよびIgGの検出
両方のチンパンジー血清ALTレベルは、接種後約4週間で上昇した（表2、図5）。どちらのチンパンジーもALT酵素の上昇と同時またはそれよりも早くに血清変換した（図5A、図5C）。抗HEV IgMのレベルはまた、チンパンジーに関しても決定された。chimp-1374においては、抗HEV IgMの力価（図5B）はIgG力価（図5A）ほどは高くなく、2週間で減少した。IgGとIgM抗体のどちらも、この動物では20日目に始めて検出されたが、抗HEV IgM力価はその日にもっとも高く、抗HEV IgG力価はその日にもっとも低く、その後上昇して3カ月以上ほぼ同じレベルに留まった。chimp-1375においては、抗HEV IgMのみが20日目に検出された（図5D）。力価はchimp-1374よりも高く、抗HEV IgMは測定全期間を通して検出された。抗HEV IgGはこの動物においては27日目に始めて観察され（図5C）、実験を通してほぼ同じレベルに留まった。
実施例9 昆虫細胞で発現された完全なORF-2タンパク質に基づくELISAと、E.coliで発現された構造タンパク質の断片に基づくELISAとの比較
真核細胞内でHEVゲノムの完全なORF-2領域を発現させることが、E.coliで構造タンパク質の断片を発現させることに比べて有利であるかどうかを検証するため、ELISAで前述の抗原を用いて、すでに解析されていたカニクイザル血清（Tsarev,S.A et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563：およびTsarev,S.A. et al.(1993)J.Infect.Dis. 167:1302-1306）を細菌で発現させた抗原断片を用いて再検査した（表3）。
0003889808.tif 000025
ELISAで検査した6匹の猿のうち3匹において、昆虫で発現させた抗原はE.coliで発現させた抗原よりも早く血清変換を検出した。昆虫細胞由来抗原を用いて、6匹の猿全てから得た血清中の抗HEV抗体を、用いたもっとも高い希釈度（1:8000）で検出することができた。E.coli細胞由来の抗原（ビルマ株）では、全ての血清は1:100の希釈度のみで検査したため、抗HEV力価に関するいかなる情報も得られなかった（Tsarev,S.A. et al.(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563；Tsarev et al.(1993)J.Infect.Dis. 167:1302-1306）。
他の研究においては、E型肝炎ウィルスSAR-55株を10の乗数で順次希釈し、ウィルスの力価を測定するために10-1から10-5の希釈液を一対のカニクイザルに接種した。肝炎を観察するために血清ALTレベルを測定し、HEVに対する血清中の抗体を本発明のELISA法（データは図中）によって、またはGenelab's ELISA（3つのELISA、それぞれYarbrough et al.(1991)J.Virol.,65:5790-5797で4-2、3-2、612と呼称される抗原の一つ）によって（データは陽性（＋）または陰性（−）検査として図6aからgにしめす）測定した。全ての試料は暗号で検査した。
本発明のELISA法は接種された全てのカニクイザル中の全てのウィルス希釈度における抗HEV IgGへの血清変換を検出した。
対照的に、Genelabsの結果は下に要約するように顕著に変動した。
0003889808.tif 000026
cyno385（10-5）はGenelabsおよび本発明によるELISA試験のどちらでも陽性であったため、10-4（さらに10倍のウィルス濃度にしたもの）および10-3（さらに100倍のウィルス濃度にしたもの）もまた陽性であると考えられていた。cyno383および393のALTレベルからは肝炎陽性であると考えられた10-3および10-4希釈での陽性を検出できなかったGenelab's ELISA試験とは対照的に、本発明はそれらを陽性と測定した。すなわち、これらのデータによって、本発明のELISA法が従来の当該技術分野の方法よりもHEVに対する抗体を検出するのに有利であることが支持された。
実施例10 パキスタン株SAR-55の完全なORF-2領域から発現された55kDaタンパク質、または細菌で融合タンパク質として発現されたより短い領域のどちらかを含む組み換えORF-2抗原に基づくEKISAの比較
実施例3に記載され、図2Aおよび2Bにしめされた通り、様々の分子量の多数のタンパク質が完全なORF-2を含む組み換えバキュロウィルスに感染した昆虫細胞で発現される。約55kDaの分子量のタンパク質を、接種後7日目に回収した5×108のSF9細胞から以下のように部分的に精製した：感染細胞を遠心し、40μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma,St.Louis,Missouri）を含む10mlの10mMトリス塩酸（pH8.0）、50mM NaClに再懸濁し、細胞を超音波破砕し、溶解液を90000g、4℃で30分遠心した。上清を10mMトリス塩酸（pH8.0）、50mM NaClで平衡化したDEAEセファロースCL-6B（Pharmacia,Uppsala,Sweden）カラムに積載した。カラムを開始緩衝液で2回洗い、55kDaタンパク質を10mMトリス塩酸（pH8.0）、250mM NaClで溶出した。55kDaタンパク質を含む画分を集積し、3gの（NH4）2SO4を10mlのタンパク質溶液に加えてタンパク質を沈澱させた。沈澱したタンパク質を10mMトリス塩酸（pH8.0）、50mM NaClに溶解した。次に55kDaタンパク質をELISAにおける昆虫細胞発現HEV抗原として、細菌で発現させた2つのHEV抗原（3-2（メキシコ産）（Goldsmith et al.(1992)Lancet,339:328-331）またはSG3（Yarbough et al.,(1993)Assay development of diagnostics tests for hepatitis E."International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease.Scientific program and abstract volume."Tokyo:VHFL,p87,Abstract#687より））のいずれかに基づいたELISAとの比較試験に用いた。これらの細菌産抗原は、26kDaのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）と、ORF-2末端の6アミノ酸上流にある42アミノ酸からなる抗原性配列3-2（M）（Yarbough et al.,(1991)J.Virol.,65:5790-5797）またはORF-2の327 C末端アミノ酸（Yarbough et al.,(1993)）との融合タンパク質である。
カルボン酸（pH9.6）中の、１穴当たり60ngの55kDaタンパク質または200ngの融合抗原をポリエステル微量タイター試験プレート（Dynateck,S.Windham,ME）の穴中で2時間、37℃で保温した。プレートは、10%牛胎児血清および0.5%ゼラチンを含むPBSでブロッキングした。表5および図7Aから7J、8Aから8Dにしめすように10-1から10-8の範囲の糞（HEVのSAR-55株を含む）希釈液を静脈内接種したカニクイザル（注意：cyno387および392は経口接種した）由来の血清試料を、ブロッキング用液で1:100に希釈した。1:1000または1:2000に希釈した、ペンオキシダーゼを結合した抗ヒトヤギIgM（Zymed,San Francisco,CA）、または1:1000に希釈した、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトヤギ免疫グロブリ）を検出抗体として用いた。
経口接種した2匹のサル（cyno-387およびcyno-392）のELISAを除く全てのELISA試験において、55kDaおよび融合抗原は同じ研究室で同時に検査された（すなわち、変数は利用した抗原のみである）。55kDa抗原を用いて抗HEVELISAで陽性反応を測定するための基準は、0.2以上であり、同じ動物に関して接種前血清試料の2倍以上大きい光学濃度値である。さらに、細菌で発現されたどちらの抗原もGSTとの融合タンパク質であるので、陽性と判断されるためには、これらの抗原で試験した試料の光学濃度は非融合GSTについて得られるものの3倍大きくなければならない（Goldsmith et al.,(1992)）。
結果
標準HEV糞懸濁液の10-1希釈液を接種したカニクイザル（377、378）の両者とも、接種後4から5週目にALT活性の明白な上昇をしめし、肝炎の兆候をしめした（表5、図7Aおよび7B）。
0003889808.tif 000027
0003889808.tif 000028
試験した3つの抗原の全ては、接種ご3週目のcyno-377から採取した試料中の抗HEV IgMを検出した（表5、図8A）が、２番目の動物cyno-378由来のどの試料においても抗HEV IgMは検出されなかった。抗HEV IgGは、55kDaに基づくELISAではどちらの動物においても検出されたが、融合抗原に基づくELISAではcyno-377のみで検出された。抗HEV IgGのOD値は、抗HEV IgMよりも有意に大きかった。55kDa抗原に関して得られたELISA値はまた、2つの融合抗原のどちらかによって得られたものよりも大きかった（図7Aおよび7B）。2つの材料由来の抗原によるELISAで観察されたOD値のパターンもまた、有意に異なっていた。融合抗原に基づくELISAの場合は、陽性シグナルは血清変換の直後に最大になり、次に15週間の実験の間に減少した。55kDa抗原に基づくELISAにおいては、陽性シグナルは実験を通じて（15週間）ほぼ同じ高レベルに留まった。
標準HEV糞懸濁液の10-2希釈液を接種した両方のサル（394および395）におけるALT活性の上昇は、その10倍の投与量を接種した動物よりも、肝炎の予想される時期において有意に低かった（表5、図7Cおよび7D）。cyno-395は実際は接種前と接種後15週目に最大のALT活性をしめした。後者は、HEV感染のためではないと考えられる。抗HEV IgMの弱い陽性反応は、cyno-394でのみ（図8B）、55kDa抗原に基づくELISAによってのみ検出された。しかし、どちらの動物においても抗HEV IgG血清変換が検出されたため、どちらの動物も感染していた。cyno-394においては、抗HEV IgGは55kDa抗原によって3週目に、3-2（M）抗原によってその1週間後に始めて検出された。SG3（B）抗原はcyno-395における血清変換を検出せず、抗HEV IgGは55kDa抗原によってのみ検出された。抗HEVはこの動物においては時間とともに減少する傾向があった。
cyno-380およびcyno-383を、標準HEV糞懸濁液の10-3希釈液を接種した（表5、図7E、7F、8C）。cyno-380のALT活性は、接種前と後で変動した；すなわち、この動物においてはE型肝炎の証拠としてALTレベルを利用できない。cyno-380においては、血清変換と同時にALT生活の僅かな上昇が観察され（図7F）、軽度のE型肝炎によると考えられた。抗HEV IgMは、3つのどの抗原を用いてもcyno-380では検出されなかった。cyno-380は、SG3（B）を用いたELISAで試験した場合は抗HEV IgGに血清変換していたが、3-2（M）抗原を用いた場合には血清変換していなかった。この動物には55kDa抗原で試験した場合は抗HEV IgGがすでに存在していたが、5週目からの大きい上昇が見られた（図7E）。既存の抗体の同定は、他のカニクイザルにおいては以前に報告された（Ticehurst et al.,(1992)J.Infect.Dis.,165:835-845；Tsarev et al.,(1993)J.Infect.Dis.,168:369-378）。血清変換は予測された時期に起こったが、cyno-383由来の試料中のHEV IgGのレベルは低いままであり、55kDa抗原によってのみ検出された。
cyno-389およびcyno-393に標準HEV糞懸濁液の10-4希釈液を接種した（表5、図7G、7H、8D）。どちらの動物もALT活性の顕著な上昇は示さなかったが、5週目のcyno-393の血清中のALT活性の小さいが明確なピークによって（図7H）、肝炎の境界例であることが示唆された。SG3（B）および3-2（M）抗原は、両方の動物をHEV感染陰性であると測定した。対照的に、55kDa抗原は接種後6から8週目のcyno-389の血清中の抗HEV IgMを検出し（図8D）、両方の動物において6から15週目に抗HEV IgGを検出した。
標準HEV糞懸濁液の10-5希釈液を接種した動物のどちらも、ALT活性の明確な上昇をしめした（図7I、7J、表5）が、cyno-386においては、抗HEV IgMおよびIgGはそれぞれ8から13週目および8から15週目に55kDa抗原も用いて検出された（図7J、8E）。cyno-385抗HEV IgGは、55kDaおよび3-2（M）抗原によって検出されたが、SG3（B）抗原によっては検出されなかった。前述の例とは対照的に、抗HEV IgGは融合抗原によって4週間早く、55kDa抗原よりも高いレベルで検出された。
標準HEV糞懸濁液の10-6から10-8の範囲の希釈液を接種した動物のいずれも、3つのHEV抗原のいずれに対する抗体も産生しなかった。cyno-400における9週目の比較的明確なピークを除いては、これらの動物においてはALT活性の上昇は観察されなかった（表5）。しかし、この動物において血清変換が起こらなかったことから、このピークが恐らくHEV感染によるものではないことが示唆される。
10%糞懸濁液の10-1の希釈液を経口接種した2匹のサル（387および392）に関しては、ALTレベルは上昇せず、3-2（M）および55kDa抗原を用いて行ったELISAがHEVへの血清変換を検出しなかったため（表5）、どちらのサルも感染しなかった。
最後に、HEV感染の血清学的証拠が、糞懸濁液の10-5までの10の乗数の希釈液を接種した全ての動物で観察された；それ以上の希釈液を接種した動物のいずれも、そのような証拠は示さなかった。ALTの上昇によって定義される明確な肝炎は、10-1希釈液を接種した2匹のサルにおいてのみ観察された。それよりも有意に低いALT活性の上昇は、さらに大きい希釈度の糞懸濁液を接種したいくつかの動物において観察されたが、他の動物においては上昇は観察されなかった。それだけを考えると、これらの低いALTの上昇は肝炎の兆候とはならない。しかし、血清変換とこれからのALTピークの出現が同時期に起こることから、これらの動物の軽度の肝炎感染が示唆される。抗HEV IgG血清変換は、標準HEV糞懸濁液の10-1から10-5の範囲の希釈液を接種した全ての動物において検出された。原液をさらに希釈したものを接種した動物においては、抗HEV IgGの低いレベルの傾向および血清変換の遅延が観察された。
まとめると、HEVのパキスタン株に感染したカニクイザル中の抗HEV IgMおよびIgGを検出するために、55kDaのパキスタン株のORF-2抗原は、3-2（M）またはSG3（B）抗原よりも効率的である。例えば、cino-385由来のものを除く全ての血清について、ELISAによる抗HEV IgMまたはIgGの検出は、3-2（M）またはSG3（B）抗原を用いるよりも55kDa抗原を用いた方が効率的である。55kDa抗原を用いたELISAは、本質的に同一の、再現性のある結果を与え、糞懸濁液の10-5以下の希釈液を接種した10匹の全ての動物において抗HEV IgGを検出した。ELISAシグナルの強度はまた、接種原が希釈されるにつれて減少した。融合抗原は対の動物の間で同一の結果を与えなかった。10-1、10-2、10-3、10-5の希釈液を接種した動物の対の一つのみについて、抗HEV IgGへの血清変換が見られ、これらの抗原を用いては抗HEV IgMへの血清変換は一つのみ検出された。接種原液の10-4の希釈液を接種したどの動物も、２つの融合抗原のいずれに対しても血清変換しなかったが、1匹の動物（cyno-393）由来の血清は、55kDa抗原で試験した場合に高レベルの抗HEV IgGを保持した。上に述べた通り、抗HEV IgMに対するELISAはカニクイザル抗HEV IgGに対するELISAよりも敏感ではないが、55kDa抗原は、3-2（M）またはSG3（B）抗原よりも多くの動物において抗HEVIgMを検出することができた。まとめると、本研究で用いたパキスタンウィルス接種原の感染力価についての明確な結論は、3-2（M）およびSG3（B）に基づくELISAからのデータを合わせても得られず、パキスタン産55kDa抗原のELISAによってのみ得られた。
cyno-385については、2つの試験における抗HEV IgGの検出結果の差異は4週間であった。これらのデータによって、大きい55kDaおよびSG3（B）抗原には存在しない、この動物によって認識される3-2（M）抗原上の異なったエピトープの存在が示唆される。完全なORF-2（75kDa）および55kDaタンパク質の両者を含む総昆虫細胞溶解液を、これらの試料を再検査するための抗原として用いた場合、結果は55kDaを単独で用いた場合と同じであった。個の知見から、55kDaタンパク質は3-2エピトープのアミノ酸を欠如しているのではなく、むしろ3-2エピトープ配列の立体構造が本研究で用いた3つの抗原の間で異なっているということが示唆される。最後に、SG3（B）抗原にはORF-2のより長い部分が含まれ、3-2エピトープの完全な配列が含まれるという事実にも関わらず、3-2（M）よりも多くの陽性血清を検出しなかったということに留意すると、非常に興味深い。
実施例11  抗HEV SAR-55ウィルス原液の感染力価の、PCRによる測定
接種原の感染力価を知ることは、動物モデル系の感染実験によって得られた多くのデータを解釈する上で重要である。しかし、今までは、HEVウィルス原液の感染力価は報告されていなかった。HEVのSAR-55株を含む糞懸濁液の10倍希釈液を抽出し、HEVゲノムを感染し得るもっとも高い希釈度を決定するために以下のようにRT-PCR増幅を行った。200μlの糞懸濁液を15%のポリエチレングリコール（PEG）6000を含む0.4mlの1.5MNaClと混合し、4℃で一晩静置した。微量遠心機（Beckman,Palo Alto,CA）で3分間の16000gの遠心によって沈澱物を回収し、4.2Mグアニジンチオシアン酸、0.5% N-ラウロイルサルコシン、0.25Mトリス塩酸（pH8.0）、0.15Mジチオスレイトール（DTT）、および1.0μgのtRNAを含む溶液475μlに溶解した。50μlの1Mトリス塩酸（pH8.0）、100mM EDTA、10%SDSを次に加えた。RNAを65℃で2回フェノール/クロロホルム（1:1）抽出し、続いて室温でクロロホルム抽出した。上層に、250μlの7.5M酢酸アンモニアを加え、核酸を0.6mlの2-プロパノールで沈澱させ、75%エタノールで洗い、100%エタノールで洗い、逆転写（TR）PCRに用いた。
HEVゲノムの検出のために、SAR-55ゲノムの3'領域（ORF-2）由来の配列である2組みの内部プライマーを用いた。逆転写および最初のPCRのためのプライマーはそれぞれ、SEQ ID NO:99：GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTCおよびSEQ ID NO:100：TACAGATCTATACAACTTAACAGTCGGでしめす。2番目のPCRのためのプライマーはそれぞれ、SEQ ID NO:101：GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTACおよびSEQID NO:102：TAACCTGGATCCTTATGCCGCCCCTCTTAGでしめす。RNA沈澱物を20μlの0.05Mトリス塩酸（pH7.6）、0.06M KCl、0.01M MgCl2、0.001M DTT、RNasin 40単位（Promega Biotec,Madison,WI）、16単位の鳥骨髄芽球種ウィルス逆転写酵素（Promega Biotec）、および10pmolの逆向きプライマーに溶解し、42℃で1時間保温した。20μlの逆転写混合液に、100μlの0.01Mトリス塩酸（pH8.4）、0.05M KCl、0.0025M MgCl2、0.0002Mの各dNTP、50pmolの順向きプライマー、50pmolの逆向きプライマー、および4単位のAmpliTaq（Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT）を加え、その上に100μlの軽鉱油を搭載した。HEV cDNAを35サイクルのPCRによって増幅した：94℃1分、55℃1分、72℃1分。PCR産物を1%アガロースゲルで解析した。次にこの混合物5μlを同じ条件の2回目の増幅に用いた（伸長時間は3分に増やした）。
標準HEV糞懸濁液の10-1から10-5の範囲の希釈液から産生したRT-PCR産物を2%アガロスゲルで分解し、ゲルをエチジウムブロマイド染色して検出した。高い希釈度での特異的なPCR産物の量の減少が観察され、HEVゲノムが検出された10%糞懸濁液のもっとも高い希釈度は10-5であった。すなわち、希釈度の因子を考慮すると、HEVゲノムの力価は糞1グラム当たりおよそ106.7である。
さらに、RT-PCRによってHEVゲノムを含むことがしめされた希釈液のみが、カニクイザルに対して感染性であった。すなわち、標準糞懸濁液の感染力価と、RT-PCRによって検出されるそのゲノム力価とはほぼ同じであった。RT-PCRと感染力価の同様の相関が、C型肝炎ウィルスの一つの株についてもみいだされている（Cristiano et al.,(1991)Hepatology,14:51-55；Farci et al.,(1991)N.Engl.J.Med.,25:98-104；Bukh et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,89:187-191）。
実施例12
ORF-2蛋白質のワクチンとしての使用による積極的免疫化、および、抗HEV抗体陽性回復期血漿による受動的免疫化
55kDa ORF-2蛋白質に基づくELISAにおいて、HEV抗体陰性（<1:10）を示したカニクイザル（Macaca fascicularis）を、BL-2バイオハザード・コンテインメントにおいて個別に飼育し、かつ、パキスタンHEV株SAR-55を含む便（胎児牛血清中）の懸濁物を、10,000または1,000 CID50を含むように希釈したものを、動物の静脈への接種に用いた。
積極的免疫化の研究のため、バキュロウィルスの組み換え発現された55kDa ORF-2蛋白質は、実施例10に記載されたように、接種7日後に得られた5x108のSF-9細胞より精製された。3mgの精製55kDa ORF-2蛋白質は、明礬により沈澱させ、かつ、8個体のカニクイザルを、50μgの明礬沈澱55kDa蛋白質を含む、0.5mlのワクチンの筋内注射により免疫化した。4個体のサルは、1回の接種を受け、かつ、4個体のサルは、4週間おきに2回の接種を受けた。これらのサルは、最後の免疫化の4週間後に、1,000-10,000 CID50のHEVの静脈接種による攻撃を受けた。
4個体のカニクイザルが、積極的免疫化の研究における対照として用いられた。cyno-412および413は、1回の偽薬（0.5mlのリン酸緩衝塩）の接種を受け、かつ、cyno-397および849は、2回の偽薬の接種を受けた。対照個体は、1,000-10,000 CID50のHEVの攻撃を受けた。
受動的免疫化の研究のため、cyno-384を、2つの中国由来HEV単離物KS1-1987およびKS2-1987を含む0.5mlの10%プール便懸濁物により感染させ、かつ、回復期の間、この個体から繰返し血漿を回収した（Yin et al.(1993)J. Med. Virol.,41: 230-240;）。cyno-396およびcyno-399の血液の約1%、およびcyno-401およびcyno-402の血液の10%を、HEV抗体力価1:10,000を有するcyno-384の回復期血漿で置換した。これらの個体は、血漿輸液2日後に、1000 CID50のHEVの攻撃を受けた。対照として、cyno-405の血液の10%を、HEV感染前のcyno-384から得られた抗HEV抗体陰性血漿と置換した。次に、cyno-405は、1000 CID50のHEVの攻撃を受けた。
受動的免疫化、および積極的免疫化の双方の研究のため、肝臓の皮下針による生検試料、および、血清および便の試料を、接種前および、接種後15週間の間毎週回収した。血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）のレベルを、市販品として入手可能な検査法（Metpath Inc.,Rockville, MD）により定量し、かつ、2倍またはそれ以上のALTレベルの上昇を、肝炎の生化学的症状と定義した。肝臓生検試料は、盲検法により検査し、そして抗HEV ELISAは、実施例10に記載された方法を用いた。RNA抽出およびRT-PCRは、血清100μl由来、または100μlの10%便懸濁液由来のRNAを、TRIzol試薬（Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland）で業者のプロトコールに従って抽出したことを除いて、実施例11のように行われた。定量化のため、各動物個体由来の、PCR陽性の一連の血清または便は、混合され、ウシ血清により、10倍づつ増加する一連の倍率で希釈された。各希釈液のうち100μlは、本実施例ですでに述べたRNA抽出およびRT-PCRに用いられた。本研究で用いられたPCRプロトコールは、血清1ml当たり10 CID50、および、便1g当たり100 CID50まで低レベルのHEVを検出することができた。
接種前5週間、および接種後15週間の週間血清試料のALTのピーク値は、各個体について比（後／前）で表現された。対照グループの個体から得られた比の幾何学的平均は、受動的または積極的免疫化を受けた動物から得られた値と、Simes試験（Simes, R.J.(1986)Biometrika,73: 751-754）を用いることにより比較された。
対照グループの個体における、ウイルス血症および便へのウイルス排泄の持続時間、およびHEVウイルス力価は、受動的または積極的免疫化を受けた個体から得られた値と、Wilcoxon試験（Noether, G.(1967)Elements of nonparametric statistics(John Wiley & Sons Inc.,New York), pp.31-36より。）を用いることにより比較された。同一の試験は、受動的および積極的免疫化を受けた個体の間で、上記のパラメータを比較する際にも用いた。
統計学的解析のため、血清1ml中に10より少ないHEVゲノムを有する血清試料は、力価1:1に割り当てられ、かつ、便1g中に100より少ないHEVゲノムを有する便試料は、力価1:10に割り当てられた。
結果
免疫化されていない個体におけるE型肝炎の感染の経過
HEVの攻撃を受けた、5個体の免疫化されていない動物のうち3個体において、少なくとも2倍の血清ALT値の増加という肝炎の生化学的症状が得られた。2個体においては、ALT活性の顕著な増加は見られなかった。しかし、組織病理学的データにより、5つ全ての個体において、表6に示すような肝炎の症状が得られた。
0003889808.tif 000029
懐死炎症性の変化は、1+から4+の尺度において1+および2+の間の範囲であり、ALT活性増加の見られた固体においてはその活性の増加と時間的に関連した。
全ての対照個体は、攻撃後3-5週間でHEVへの血清変換を生じ、かつ、最大で1:1,000から1:32,000の範囲のHEV抗体力価を得た。感染、肝炎の重症度、および抗HEV応答レベルの間には、有意な関連が見られた。cyno-405は、肝炎の最も高い累積スコアを有するが、最も長いウイルス血症期およびウイルス排泄期、および最も高い抗HEVレベルをも有していた（表6）。便へのウイルス排泄の持続時間は、ウイルス血症の持続時間と同じ長さであるか、またはそれより長かった。全ての対照個体においては血清中のHEVゲノムの力価（10-3-10-4.7）は、便における力価（10-5.7-10-7）より低かった。これらの5個全体において、ウイルス血症および便へのウイルス排泄は、4-11週間、および血清変換後平均4.2週間（2-9週間の範囲）検出された。
受動的免疫化。cyno-396および399は、その約1%の血液が、抗HEV陽性回復期血漿に置換されており、輸液2日後（攻撃時）に測定したところ、1:40のHEV抗体力価を有していた。（表6）。抗HEV力価の2分の1の減少が、輸液1週間後の双方の個体で見られ、かつ、HEV抗体レベルは、輸液2週間後までには検出下限より低くなった（<1:10）。抗HEV抗体は、cyno-396では攻撃5週間後において、およびcyno-399では攻撃4週間後において再び検出され、このことは、HEVの感染が生じたことを示した。攻撃後9-10週間において、HEV抗体力価は最大（1:8,000）に達した。いずれのカニクイザルとも、攻撃後のALT活性の有意な上昇は示さなかった。しかし、cyno-396においては肝炎の組織学的症状が検出され、かつ、双方の個体から得られた血清中および便中において、HEVゲノムが検出された。
cyno-401および402は、それらの血液の約10%が、回復期血漿に置換されていた。輸液2日後、すなわち攻撃時において、双方のカニクイザルのHEV抗体力価は、1:200であった（表7）。
0003889808.tif 000030
cyno-401では、1:4,000であったが、cyno-402では1:80でしかなかった。いずれの個体においても、生化学的、組織学的解析による肝炎は見られなかった。しかし、双方の個体においては、HEVウイルス血症、および便へのウイルスの発散が観察され、このことは、感染が生じたことを示した（表6）。従って、抗体のより高い力価を達成した受動的免疫予防は、HEVの攻撃後にカニクイザルを肝炎から防御したのである。
積極的免疫化。1回の50μgの55kDa蛋白質の接種により免疫化された4個体は、1:100から1:10,000の範囲の力価の、組み換え蛋白質に対する抗体を産生した（表7）。1個体（cyno 013）は、麻酔上の事故により、攻撃9週間後に死亡し、かつ、これは解析に含めた（表6）。2回の抗原接種を受けた4個体は、1:10,000の力価のHEV抗体を産生した。4個体のうち2個体は、続いて行われたHEVの静脈注射の攻撃により死亡した。このことも、麻酔上の事故の結果である可能性があったが、正確な原因は決定できなかった。これらの2個体は、さらなる解析から除外された。残りの6個体は、いずれも、攻撃に続くALTの異常なレベルや、肝炎の組織学的症状を示さなかった（表6）。55kDa蛋白質の1回または2回の接種を受けることにより免疫化されたカニクイザルは、ウイルス血症を生じなかった。しかし、1回の免疫原接種を受けた4個体のうち3個体は、便中にウイルスを排泄した。対照的に、2回のワクチン接種を受けてから攻撃を受けた2個体はいずれにおいても、ウイルスの排泄は観察されなかった。
積極的免疫化個体の多くは、受動的免疫個体に比べて、より高いHEV抗体力価を産生した。しかし、抗HEV血漿により受動的に免疫化された2個体が1:200の力価を有したのと対照的に、cyno-013は攻撃時に1:100のHEV抗体力価を有した。ところが、cyno-013は、受動的免疫化個体に比べ、HEV感染に対する、より高い抵抗性を示した。cyno-009は、攻撃時に1:1,000のHEV抗体力価を有し、肝炎およびHEV感染から完全に防御された（表6）。対照的に、cyno-003は、攻撃時に1:10,000のHEV抗体力価を有していたにもかかわらず、感染と、便へのHEVの排泄を示した。しかし、この個体、または1回の免疫原接種を受け、かつ1:10,000またはそれ以上のHEV抗体力価を有する他のカニクイザルにおいては、肝炎またはウイルス血症のいずれも検出されなかった。
対照および免疫化個体における、HEV感染の経過の比較。
組織病理学的診断によれば、受動的に免疫化されたサルのうちの1個体を除き、全ての免疫化された個体は、静脈注射によるHEV攻撃後の肝炎から防御された。対照グループ、および、受動的および積極的に免疫化された個体の間の、肝炎の重症度およびウイルス複製レベルの平均値の比較により以下のことが示唆された。すなわち、一般的に、感染の重症度は、攻撃時のHEV抗体力価に反比例し、かつ、非免疫化>受動的免疫化(1%)>受動的免疫化(10%)>積極的免疫化(1回接種)>積極的免疫化(2回接種)の順に減少した（表6,8）。しかし、受動的および積極的免疫化個体の2つのサブグループのいずれにおいても、個体数は統計学的解析を行うには十分でなかった。従って、統計学的解析は、受動的免疫化個体の合計、および積極的免疫化個体の合計のそれぞれについて、対照グループの合計と比較することにより行った。この解析の結果は、表8に示されている。
0003889808.tif 000031
かつ、それらは、対照グループにおける組織病理学的スコア、および組織学的変化の持続時間は、受動的または積極的免疫化個体のものと統計的に異なることを示した。受動的または積極的免疫化個体と比較した場合の、対照グループにおけるALTピーク値のより高い接種後／接種前  比は、双方の免疫化個体のグループにおける、肝炎の生化学的顕示に対する防御を示唆する。対照グループと比べて、免疫化個体の両グループにおいては、ウイルス血症の持続時間、および便中のHEV力価は有意に低かった。しかし、対照グループおよび受動的免疫化グループの間では、ウイルス排泄の持続時間、および血清中のHEV力価の相違は統計学的に有意でなかった。とはいえ、これらのパラメーターは、対照グループを積極的免疫化グループと比較した場合には、有意に異なっていた。受動的および積極的免疫化グループの間においても、HEV力価だけでなく、ウイルス血症の持続時間および便中への排出に関して、やはり有意な差が見いだされた。
要約すると、表6-8に示された結果は、受動的および積極的に獲得された抗体のいずれも、病原性HEVの攻撃に続く肝炎に対して、カニクイザルを防御することを示している。免疫化されていない5個体のカニクイザルすべてが、1,000-10,000 CID50のSAR-55に攻撃された場合に肝炎の組織学的症状を示すのに対して、1:200の力価の受動的獲得抗体を有するいずれの個体も、肝炎から防御され、かつ、1:40の抗体力価しか示さない2個体のうちの1個体も、肝炎を生じなかった。
しかし、積極的免疫化個体は、受動的免疫化個体に比べて、肝炎に対する完全な防御、およびHEV感染に対するより効率的な抵抗性を示すことを特筆すべきである。例えば、受動的免疫化個体から得られた結果と対照的に、HEVによる攻撃後に、積極的免疫化個体においてウイルス血症は検出されなかった。組み換え55kDa蛋白質による1回または2回の免疫化の後、カニクイザルにおいて1:10,000という高いHEV抗体力価を達成することができた。1個体のサル（013)においては、積極的免疫化後に1:100の力価が産生されたが、このレベルにおいても、肝炎およびウイルス血症を防止できた。
積極的免疫化に関する研究において、1回のワクチン接種はHEVウイルス血症を防止するものの、ウイルス排泄は依然として検出されることが示された。しかし、2回のワクチン接種は、肝炎およびHEV感染の全ての兆候を防止することが観察された。従って、これらの結果は、例えば、外国旅行前にヒトに1回のワクチン接種をすることで、高い危険性のある環境においてE型肝炎を防止することができることを示唆する。
最後に、本明細書中に記載された結果は、A型肝炎に対する非ヒト霊長類の、受動的および積極的免疫予防に関して報告されている結果と、非常に類似していることを特筆すべきである。すなわち、受動的免疫予防は、肝炎を防止するが、感染を防止しない一方で、ワクチン接種は、肝炎だけでなく、HAVの感染をも防止する（Purcell, R.H. et al. (1992)Vaccine, 10: 5184-5149）。防御する抗体の力価（<1:100）の決定、および病原性ウイルスの静脈注射攻撃に続く結果の双方において、本明細書中に記載されたHEVに対する免疫予防に関する研究が、HAVに対する免疫予防に関する最近の研究と平行しているのは興味深い。他の研究において、ヒトで受動的および積極的に獲得された、比較できる抗HAV力価の効果が示され、かつ、肝炎研究において、霊長類を用いた研究が、予測としての価値を有することが確認されたため（Stapleton,J.,et al.(1985)Gastroenterology 89:637-642;Innis,B.L.,et al.(1992)Vaccine, 10: S159）、これらのカニクイザルにおける結果が、ヒトの防御に関する予測となることが大いに期待される。
実施例13  酵母における、完全なORF-2蛋白質および低分子量断片の直接発現
1.  完全なORF-2蛋白質（1-660アミノ酸、分子量70979）、断片1778-1703。
（ここで、断片の番号は、下記に示したプライマー番号を表す。）
2.  34番目のアミノ酸から開始されるORF-2蛋白質（34-660アミノ酸、分子量67206）、断片1779-1703
3.  96番目のアミノ酸から開始されるORF-2蛋白質（96-660アミノ酸、分子量60782）、断片1780-1703
4.  124番目のアミノ酸から開始されるORF-2蛋白質（124-660アミノ酸、分子量58050）、断片1781-1703
をコードする4つのcDNA ORF-2断片が、鋳型としてのP63-2プラスミド、および、以下に示す合成オリゴヌクレオチドを用いたPCRを用いて得られた。
SEQ ID NO.:103（reverse primer #1703）
GCACAACCTAGGTTACTATAACTCCCGAGTTTTACC、
SEQ ID NO.:104（direct primer #1778）
GGGTTCCCTAGGATGCGCCCTCGGCCTATTTTG、
SEQ ID NO.:105（direct primer #1779）
CGTGGCCTAGGAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGT、
SEQ ID NO.:106（direct primer #1780）
GCTTGGCCTAGGCAGGCCCAGCGCCCCGCCGCT、および、
SEQ ID NO.:107（direct primer #1781）
CCGCCACCTAGGGATGTTGACTCCCGCGGCGCC。
SEQ ID NO.:107で示した全ての配列は、それらの5'末端に、4ヌクレオチドに先導されたCCTAGG人工配列を含む。この人工配列は、Avr II（Bln I）制限酵素の認識配列であった。合成されたPCR断片は、Bln Iにより切断され、かつ、pPIC9ベクターのAvr II領域にクローニングされた（図10）（Invitrogen）。断片の方向が正しいことは、ORF-2配列およびベクターに存在する非対称なEcoRI領域を用いた、制限解析により確認された。精製された組み換えプラスミドpPIC9-1778（断片1778-1703を含む）、pPIC9-1779（断片1779-1703を含む）、pPIC9-1780（断片1780-1703を含む）、および、pPIC9-1781（断片1781-1703を含む）は、Invitrogenプロトコールにより、酵母スフェロプラスト（Picha株）の形質転換に用いられた。組み換えクローンのスクリーニング、および、発現の解析は、同一のプロトコールを用いて行われた。これらの発現された蛋白質は、本出願に記載されたように、ワクチンにおける免疫原、および、免疫学的検定における抗原として用いられる。最後に、当業者は、上述の例で用いられたベクターおよび酵母株は、他のベクター（例えばpHIL-F1;Invitrogen）または酵母株（例えばSaccharomyces Cerevisiae）と置換可能であると認識するものである。
実施例14  組み換えバキュロウイルス63-2-IV-2に感染させたSF-9昆虫細胞において合成されたHEV ORF-2遺伝子産物の、精製およびアミノ末端配列解析。
実施例10に記載されたように、SF-9細胞を組換えバキュロウイルス63-2-IV-2に感染させ、接種7日後に回収した。昆虫細胞溶解物のSDS-PAGEにおける主要な蛋白質バンドは、分子量にして、約55kDaであった。この55kDaバンドのさらなる精製は、150-450mM NaCl勾配によるDEAE-sepharoseを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーにより遂行された。DEAE画分における55kDaバンドの存在は、SDS-PAGEに続くクーマシーブルー染色により検定された。次に、ピーク画分は、SDS非存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により、55kDa、61kDa、および中間の分子量のバンドの3つのバンドに分離された。ポリアクリルアミドゲルの各蛋白質バンドについて、ミクロ蛋白質アミノ末端配列決定の分析を行った結果、55および61kDaの蛋白質は、SEQ ID NO:2のAla-112の特有のN末端を共有していることが判明した。2つのORF-2切断産物のサイズの相違は、異なる糖鎖付加パターン、または、より大型の産物のCOOH末端の切断を反映しているものと信じられる。
ポリアクリルアミドゲル上の第3の中間分子量蛋白質は、バキュロウイルスのキチナーゼ蛋白質であることが示された。55および61kDa ORF-2蛋白質は、ピークDEAE画分を、NaClおよびアセトニトリル溶媒によるミクロポアシステムを用いた逆相HPLCにかけることにより、キチナーゼを含まない単一の対称的なピーク画分に分離された。
実施例15  55および61kDa切断産物の直接発現
112番目のアミノ酸から始まるORF-2蛋白質をコードする、cDNA ORF-2断片は、p63-2プラスミドを鋳型として用いるPCRにより得られた。次に、このcDNA断片は、pBlueBac-3TransferベクターのBamHI-PstI領域に挿入された。SF9昆虫細胞は、このベクターから生成された組み換えバキュロウイルスに感染させられ、かつ、昆虫細胞溶解物における55および61kDa ORF-2蛋白質の存在は、ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色により分析される。直接発現された蛋白質は、本明細書中に記載されているように、ワクチンにおける免疫原、および、免疫学的検定における抗原として用いられるであろう。
【図１】
0003889808.tif 000032
【図２Ａ】
0003889808.tif 000033
【図２Ｂ】
0003889808.tif 000034
【図３Ａ】
0003889808.tif 000035
0003889808.tif 000036
0003889808.tif 000037
0003889808.tif 000038
【図３Ｂ】
0003889808.tif 000039
【図４】
0003889808.tif 000040
【図５Ａ】
0003889808.tif 000041
【図５Ｂ】
0003889808.tif 000042
【図５Ｃ】
0003889808.tif 000043
【図５Ｄ】
0003889808.tif 000044
【図６Ａ】
0003889808.tif 000045
【図６Ｂ】
0003889808.tif 000046
【図６Ｃ】
0003889808.tif 000047
【図６Ｄ】
0003889808.tif 000048
【図６Ｅ】
0003889808.tif 000049
【図６Ｆ】
0003889808.tif 000050
【図６Ｇ】
0003889808.tif 000051
【図６Ｈ】
0003889808.tif 000052
【図６Ｉ】
0003889808.tif 000053
【図６Ｊ】
0003889808.tif 000054
【図７Ａ】
0003889808.tif 000055
【図７Ｂ】
0003889808.tif 000056
【図７Ｃ】
0003889808.tif 000057
【図７Ｄ】
0003889808.tif 000058
【図７Ｅ】
0003889808.tif 000059
【図７Ｆ】
0003889808.tif 000060
【図７Ｇ】
0003889808.tif 000061
【図７Ｈ】
0003889808.tif 000062
【図７Ｉ】
0003889808.tif 000063
【図７Ｊ】
0003889808.tif 000064
【図８Ａ】
0003889808.tif 000065
【図８Ｂ】
0003889808.tif 000066
【図８Ｃ】
0003889808.tif 000067
【図８Ｄ】
0003889808.tif 000068
【図８Ｅ】
0003889808.tif 000069
【図９】
0003889808.tif 000070
【図１０】
0003889808.tif 000071