(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列に対応する遺伝子の存在又は発現を調べるためのＰＣＲ用プライマーまたはハイブリダイゼーション用プローブ作製のためのプライマーとしての配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、及び配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡのセットからなる診断薬であって、腎臓癌、大腸癌、若しくは前立腺癌、または急性骨髄性白血病、若しくは慢性骨髄性白血病の診断用の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死を誘導する活性を有すると推定される蛋白質をコードする遺伝子、並びにそれらの蛋白質及び遺伝子の利用に関する。本発明の蛋白質及び遺伝子は、医薬・診断分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ヒトゲノムの解析が大きく進み遺伝子の全容が解明されつつある。しかし、ゲノム配列のみからは、その遺伝子がどのような機能を有しているかは判らず、どのようなアミノ酸配列をコードしているかさえ容易には解析できない。したがって、遺伝子の発現産物の構造、及び、その遺伝子の組織又は細胞特異的な発現パターンを調べることは重要である。
【０００３】
ところで、細胞死を誘導する蛋白質をコードする蛋白質として、DEDD［DED-containing DNA-binding protein］が知られている（Stegh AH, Schickling O, Ehret A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grummt I, Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel death effector domain-containing protein, targeted to the nucleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）。N末端側から、death effector領域［DED(death effector domains)］、核移行シグナル、及びDNAに結合すると考えられる領域の３つの領域を有している。これらの領域のうち、DEDは、細胞の死に関わる蛋白質によく見られる特徴的な配列を有している。
【０００４】
また、DEDDと構造が類似する蛋白質としてDEDD2が報告されている（Roth W., Stenner-Liewen F., Pawlowski, K., Godzik A and Reed JC. Identification and Characterization of DEDD2, a Death Effector Domain-containing Protein. The Journal of Biological Chemistry, 277(9) 7501-7508, (2002)）。DEDD2もDEDDと同様にdeath effector領域を有し、アポトーシス経路を介した核内事象の調節に関与していることが示唆されており、その構造も明らかにされている（前記Roth W.ら）。
【０００５】
しかし、DEDDに類似の構造を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が、腎臓癌、大腸癌および前立腺癌の組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の末梢血画分において、正常細胞に比べて低いことがあることは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、機能未知の遺伝子を同定し、同遺伝子の利用に関する技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトcDNAライブラリーからDEDDに類似の構造を有する蛋白質をコードする新規cDNAを見出し、同cDNAに対応する遺伝子の各種癌組織、及び白血病の末梢血画分における発現を調べた結果、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、又は慢性骨髄性白血病で正常細胞よりも発現が低いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１に記載の塩基配列に対応する遺伝子の存在又は発現を調べるためのＰＣＲ用プライマーまたはハイブリダイゼーション用プローブ作製のためのプライマー配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、及び配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡのセットからなる診断薬であって、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の診断薬である。
（Ａ）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に用いられること、
（Ｂ）急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の診断に用いられること。
上記の本発明の蛋白質は、細胞死を誘導する公知の蛋白質であるDEDDとの構造の類似性から、「DEDD2」と名付けられた。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有する蛋白質。
【００１０】
本発明のＤＮＡは、後述するように、ヒト白血病細胞株であるTF-1細胞（ATCC No.：CRL-2003）由来のmRNAからポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ、White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)）により増幅することによって得られる。また、本発明により、DEDD2遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、化学合成することによっても本発明のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ヒト染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、DEDD2をコードする染色体遺伝子が得られる。染色体由来のDEDD2遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡであっても、DEDD2をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１１】
DEDD2をコードするｃＤＮＡを取得するための材料としては、DEDD2を産生するヒトの臓器、又は株化した細胞であればすべて利用できるが、具体的には脾臓（spleen）等の臓器、ヒト白血病細胞株等の細胞が挙げられる。これらの組織の細胞から常法［J. Sambrookら著、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、１９８９年］によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製する。
【００１２】
DEDD2の５’側プライマーと３’側プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成して、これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を調製する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのプライマーを用いてヒト組織又は細胞由来のmRNAまたはcDNAライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うと、配列番号１に示す配列に加え、5' 末端に配列番号９に示す塩基配列を、3' 末端側に配列番号１０に示す塩基配列が付加されたＤＮＡが得られる。
【００１３】
また、増幅断片を適当な市販のプラスミドベクター、例えばpME18SFL3（東洋紡(株)）、pCR2.1、pCRII（いずれもInvitrogen社）、pUC118（宝酒造社製）等に挿入し、大腸菌、例えばDH5alpha、INValphaF'（Invitrogen社）、HB101（宝酒造社製）を形質転換し、プラスミドを精製し、のち塩基配列を決定することもできる。
【００１４】
本発明のＤＮＡの塩基配列を、常法により決定した結果を、配列番号１に示し、これがコードしているアミノ酸配列を配列番号２に示した。このアミノ酸配列について、Steghら（The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）がDEDDについて示した結果と比較して解析したところ、配列番号２において、アミノ酸番号２３〜９９はDED（death effector領域）、アミノ酸番号１０４〜１０８、１３１〜１３４、及び１６９〜１７３は核移行シグナル、アミノ酸番号２９０〜３１０はDNAに結合すると考えられる領域であると推定される。
【００１５】
本発明において、DEDD2は、DEDD2としての活性、すなわち細胞死を誘導する活性を実質的に損なわない限り、１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよい。これらのいずれのDEDD2をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。このようなＤＮＡ断片として具体的には、配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明に含まれる。
【００１６】
上記のようなDEDD2と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、DEDD2をコードするＤＮＡを変異剤等で処理することによって、ランダムに変異を導入することによっても得ることができる。このようにして変異が導入されたＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の細胞死を誘導する活性を調べることにより、DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有する、DEDD2をコードするＤＮＡを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞死を誘導する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４２℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００１７】
次に、DEDD2の製造法について説明する。DEDD2は、例えば、上記ＤＮＡを通常の方法により、プロモーター配列、マーカー遺伝子、複製起点等を有する適当な発現ベクターに挿入して、微生物、培養細胞又は動植物に導入して発現させることにより、大量に調製することが可能である。このような発現ベクターは、種々のものが市販されており、本発明に使用することができる。発現されたDEDD2が、顆粒体として菌体内に蓄積される場合は、これを８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸溶液等で可溶化し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、リフォールディングして天然と同一又は近似の構造を有するDEDD2を製造することができる。
【００１８】
また、例えば、アデノウイルスプロモーター、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、DEDD2をコードするＤＮＡを結合して挿入し、これをリン酸カルシウム法等によりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細胞（チャイニーズ・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入し、ＭＴＸ（メトトレキセート）培地中で細胞培養することによりDEDD2が発現する。
【００１９】
本発明のＤＮＡによりコードされるDEDD2の活性は、同ＤＮＡを前記と同様に動物細胞に遺伝子導入して発現させ、対照細胞と比較し、DEDD2による細胞死を観察することによって、確認することができる（Stegh AH et al., The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）。
【００２０】
後記実施例に示すように、DEDD2をコードする遺伝子の発現は、腎臓癌、大腸癌および前立腺癌の組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の末梢血画分において、正常細胞に比べて低い。従って、DEDD2遺伝子は、これらの癌又は白血病の診断に有用と考えられる。DEDD2遺伝子の発現を調べるためのＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブ、例えば、配列番号１に記載の塩基配列又は同配列に相補的な配列、もしくはそれらの部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを用いて、DEDD2遺伝子の発現を調べることによって、上記癌又は白血病を診断することができる。具体的には、被検者の組織から抽出したmRNAを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲ、又は前記プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、DEDD2遺伝子の発現を調べることができる。
【００２１】
上記プライマーとしては、例えば配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これ以外にも、配列番号１に示す配列の任意の部分より、作製することができる。
【００２２】
また、DEDD2は、細胞死を誘導する蛋白質として知られているDEDD（Stegh AH, Schickling O, Ehret A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grummt I, Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel death effector domain-containing protein, targeted to the nucleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）と構造の類似性が見出されたことから、同様に細胞死を誘導する活性を有することが強く示唆される。したがって、DEDD2又はそれをコードするＤＮＡは、上記癌又は白血病の治療においても、同ＤＮＡ又は同ＤＮＡを組み込んだベクターを含む遺伝子治療薬として、有用である可能性がある。さらに、DEDD2蛋白質自体も、上記癌又は白血病の治療に用いられ得る。
【００２３】
また、本発明により、DEDD2のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が明らかになったので、それらの情報に基づいて他の動物のDEDD2遺伝子ホモログを容易に取得することができる。本発明のDEDD2遺伝子又はそのホモログを用いて、DEDD2遺伝子を欠損したモデル動物を作製することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２５】
＜１＞cDNAライブラリーの作製
ヒト白血病細胞株であるTF-1細胞（ATCC No.：CRL-2003）よりmRNAを抽出し、オリゴキャッピング法（Maruyama K, Sugano S. Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eucaryotic mRNAs with oligoribonucleotides. Gene, 138, 171-174, 1994; Suzuki Y, Yoshimoto K, Maruyama K, Suyama A, Sugano S. Construction and characterization of a full length-enriched and a 5’-end-enriched cDNA library. Gene, 200, 149-156, 1997）によりcDNAライブラリーを作製した。具体的には、鈴木穣ら、実験医学別冊 新訂新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、「完全長cDNAライブラリーの作製」の項（285〜292頁）に従って行なった。
【００２６】
得られたcDNAはベクターpME18SFL3（東洋紡(株)）に挿入し、大腸菌株DH5alphaを用い、常法によりクローン化した。プラスミドDNAはQIAGEN社Plasmid Mini Kitを用い、同社プロトコールに従って調製した。
【００２７】
得られたプラスミドDNAの配列は、Applied Biosystems社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitを用いて、添付のプロトコールに従い、ベクターの配列に由来するプライマー（配列番号３、４）を用いて反応を行い、その後、同社373S DNA sequencerにて電気泳動を行なって決定した。
【００２８】
＜２＞新規遺伝子の探索と同定
上記cDNAライブラリーより無作為に選択したcDNAクローンの塩基配列を上述の方法により決定し、その中に、これまでに報告の無い塩基配列を持つcDNA（クローン#tf59）を見出した。上記のプライマーを用いて3'末端側および5'末端側の配列を決定し、この配列を元に、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するプライマーを作製し、更に内部の塩基配列を決定することで、前記クローンの全塩基配列を決定した。こうして単離された遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列によりコードされると予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２９】
上記アミノ酸配列と相同性を示す既知の蛋白質をデータベースから検索した。データベースは、米国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）の既知蛋白質データベースであり、相同性検索のプログラムにはblastp（Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402, 1997）を用いた。その結果、アミノ酸レベルでの相同性が最も高い蛋白質として、DEDD（Stegh AH, Schickling O, Ehret A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grummt I, Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel death effector domain-containing protein, targeted to the nucleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）が見出された。単離されたcDNAがコードする蛋白質（DEDD2）とDEDDとの相同性は、アミノ酸レベルで約45％であった。同cDNAがコードするアミノ酸配列は、上記文献中でSteghらが指摘しているDEDDの特徴的な構造を全て有している。即ち、蛋白質のN末端側から、death effector領域、核移行シグナル、及びDNAに結合すると考えられる領域を備えている。これらの領域の内、death effector領域は、細胞の死に関わる蛋白質によく見られる特徴的な配列である（上記Steghら）。したがって、DEDDと類似の構造を持つ上記cDNAがコードする蛋白質も、DEDDと同様に細胞死を誘導する分子であることが強く示唆される。そこで、上記cDNAがコードする蛋白質を、DEDD2と名付けた。
尚、塩基配列レベルの検索では、本発明のＤＮＡと有意な相同性を有するものは見い出されなかった（１０％以下）。
【００３０】
＜３＞DEDD2遺伝子の発現解析
上述した通り、DEDD2は細胞の死を誘導する機能があると考えられる。細胞死はアポトーシス（プログラムされた細胞死）に代表されるように、正常な細胞であれば必ず一定の確率で起きている現象であることは広く知られている。癌細胞では、これら細胞死がしばしば、正常に起きていないことも広く知られている。そこで、上記DEDD2遺伝子が癌化と関連があるかの検索を試みた。
【００３１】
具体的には、DEDD2の遺伝子発現が癌患者の腫瘍組織とそれに対応する正常組織で異なるか否かを、Clontech社のMatched Tumor/Normal Expression Array（#7840-1）を用いてサザン・ハイブリダイゼーション法により検討した。同Arrayは、癌患者由来の腫瘍組織（腎臓、乳房、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸、大腸、肺、胃、直腸）とその患者の腫瘍組織に対応する正常組織よりRNAを抽出した後、そのRNAよりcDNAを作製し、同一のメンブレン上にスポットしてあるものである。同様に、Clontech社のBlood Disease Profiling Array (#7842-1)を用いて、血液腫瘍（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキン病、von Willebrand病）患者の末梢血画分におけるDEDD2遺伝子の発現を正常ドナーと比較した。方法は、購入した同Arrayに添付のプロトコールに従って行なったが、概要は以下の通りである。
【００３２】
先ず、DEDD2遺伝子cDNAのコード領域を全て含むcDNAプローブを作製した。このために、配列番号７及び８に示すプライマーを作製した。このプライマーを用い、前記で得られたDEDD2遺伝子をコードするクローン（#tf59）のプラスミドDNAを鋳型とするPCRにより、DEDD2のcDNA断片を増幅した。PCRは、Clontech Advantage 2 PCR Kit（#K1910）を用い、添付のプロトコールに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を用いて常法により行なった。得られるcDNAは、配列番号１に示す配列に加え、5'末端に配列番号９に示す塩基配列を、3'末端側に配列番号１０に示す塩基配列を持つものである。このcDNAの塩基配列は、検索の結果（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/、プログラムはblastn (Altschul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25(17)3389-3402, 1997参照)）、DEDDの塩基配列とは有意な相同性は認められなかった。従って、上記cDNAを標識して得られるプローブでは、DEDDを検出しないことが明らかである。
【００３３】
上記cDNAを、32Pで標識されたdCTP（Amersham Pharmacia Biotech社、#PB10205）および同社MegaPrime DNA Labelling System（#RPN1606）を用い、同社プロトコールに従って標識した。この標識プローブと、Matched Tumor/Normal Expression Array及びBlood Disease Profiling Arrayを用い、サザン・ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションはClontech社ExpressHyb Hybridization Solution（#8015）を用い、65℃で一晩行なった。洗浄は1% SDSを含む2×SSC溶液にて65℃、30分間を４回繰り返し行ない、その後、0.5% SDSを含む0.1×SSC溶液にて65℃、30分間、最後に2×SSC溶液にて室温で５分間、行なった。
【００３４】
上記の実験の結果を図１に示す。また、これらの結果のうち、腎臓、大腸、及び前立腺の結果を抽出して図２に示す。これらの図に示されるように、特に腎臓癌および大腸癌患者の大多数において、癌組織におけるDEDD2遺伝子の発現が正常組織における発現より低いことが明らかである。詳細には、腎臓癌の症例１４例中２例を除き、また、大腸癌の症例１１例中１例を除き、この差が認められた。その他、少数の症例ではあるが、前立腺癌においても同様の差が認められた。また、血液腫瘍患者検体についての結果を図３に示す。この図に示されるように、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病患者の大多数において、特に、白血球全体を正常ドナーと比較した場合、著しくDEDD2遺伝子の発現が低いことが明らかである。
癌組織と正常組織での発現の差があるとする報告は、DEDD2と類似の構造を持つDEDDではこれまでに無いものである。
【００３５】
上記の実験結果より、DEDD2遺伝子は癌、特に腎臓癌、大腸癌および前立腺癌、又は白血病、特に急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の診断に有用と考えられる。また、DEDD2遺伝子は、これら癌の治療においても、その遺伝子配列を組み込んだベクターによる遺伝子治療を行なう上で有用であると考えられる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、細胞死を誘導する活性を有する新規蛋白質DEDD2、及びそれをコードするＤＮＡが提供される。DEDD2及びそれをコードするＤＮＡは、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の治療及び診断に有用である。
【００３７】
【配列表】
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【００３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  DNAアレイを用いた癌組織におけるDEDD2の発現の結果を示すオートラジオグラフ（写真）。normal：正常、tumor：腫瘍、kidney：腎臓、breast：乳房、prostate：前立腺、uterus：子宮、ovary：卵巣、cervix：子宮頸、colon：大腸、lung：肺、stomach：胃、rectum：直腸
【図２】  図１に示す結果のうち、腎臓、大腸、及び前立腺の結果のみを示すオートラジオグラフ（写真）。
【図３】  DNAアレイを用いた血液腫瘍患者由来血液細胞画分におけるDEDD2の発現の結果を示すオートラジオグラフ（写真）。Normal donor：正常ドナー、von Willebrand disease：von Willebrand病、AML：急性骨髄性白血病、CML：慢性骨髄性白血病、Hodgkin's disease：ホジキン病、non-Hodgkin's disease：非ホジキン病。CD14-positive cells：CD14抗原発現細胞、CD19-positive cells：CD19抗原発現細胞、CD3-positive cells：CD3抗原発現細胞、mononuclear cells：単核細胞、polymorphonuclear cells：多形核細胞、total leukocytes：白血球全体。XはcDNAがスポットされていない箇所を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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