(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペチュニアにおける雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つの花型を改変するために用いるペチュニア由来のDNAであって、配列番号：１における1位〜７３１６位に記載される塩基配列からなるDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAまたは請求項２に記載のベクターを保持する形質転換ペチュニア細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換ペチュニア細胞を含む形質転換ペチュニア。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換ペチュニアの子孫またはクローンである、形質転換ペチュニア。
【請求項６】
野生型ペチュニアと比較して、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つの花型が改変されている、請求項４または５に記載のペチュニア。
【請求項７】
請求項４から６のいずれかに記載のペチュニアの繁殖材料。
【請求項８】
雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つの花型が改変されたペチュニアを製造する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のDNAまたは該DNAを含むベクターをペチュニア細胞に導入する工程、および
（ｂ）該ペチュニア細胞からペチュニアを再生させる工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学的手法を利用した植物の花型の改変に関する。
【０００２】
【従来の技術】
花弁が二重またはそれ以上になる多重咲きの形質は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つである。多重咲きなどの花の形態上の形質を、遺伝子工学の手法によって園芸品種に導入できれば、従来の交配育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品種を作製することができる。
【０００３】
MADSボックス遺伝子は、MADSボックスと呼ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子で、30以上の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成している。その多くは転写制御を介して植物の形態形成や器官形成を制御していることが判明している。花の器官形成に関与する3つのクラス（ABCモデル）のホメオティック遺伝子の多くは、MADSボックス遺伝子であり、詳細に研究されている（酒井一，花の形態形成の分子遺伝学，新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）150-163  (2000)、後藤弘爾，花の形態形成ー花開く植物分子遺伝学ー，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）52-61 (1994)、Weigel, D., and Meyerowitz, E. M. Cell 78, 203-209 (1994)）。
ペチュニアから単離されたMADSボックス型転写因子の一つであるpMADS3（ペチュニア由来のMADS3）は、花の器官の特異性決定に関与するホメオティック遺伝子である。その構造および発現パターンから花のABCモデルではCクラスに属するとされている。ペチュニアの植物体全体にpMADS3遺伝子を発現する形質転換体では、花弁の先端に葯が形成される（雄しべ化）、まれにがく片の先端に雌しべ様の構造が形成される、などのホメオティック変異が表れることが判明している。この事実もまたMADS3がCクラス遺伝子であることを示している（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化を制御する転写調節因子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）96-106 (1994)）。pMADS3に関しては、そのcDNA配列が文献（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-853.）に報告されている。
このようにMADSボックス型転写因子とその植物の花の器官形成における機能に関しては複数の報告がなされているものの、いまだMADSボックス型転写因子を標的として、多重咲きなど観賞価値の高い植物の作出に成功したとの報告はなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、MADSボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変することにより、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
pMADS3遺伝子は、その発現が雄しべと雌しべに特異的であることが判明している（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化を制御する転写調節因子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）96-106 (1994)）。そこで、本発明者らは、まず、このような組織特異性をもつpMADS3のプロモーター領域を含むゲノムDNAの単離を試み、ペチュニアのゲノムライブラリーから目的のDNAを単離した。次いで、単離したゲノムDNAの組織特異的プロモーター活性を検出するために、これをレポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、アグロバクテリウムを介してペチュニアに導入した。
【０００６】
その結果、驚くべきことに、この遺伝子導入により、ペチュニア植物体におけるpMADS3遺伝子のサイレンシングが生じ、該植物体の雄ずいが花弁様の構造に転換して二重咲きとなった。このような二重咲きの形質は12系統のうち5系統の形質転換体において認められた。また、該植物体は、二重咲きになると同時に、花弁化した雄ずいの内側の領域には未熟な二次花およびがく片様花弁様器官が生じた。即ち、本発明者らは、ペチュニア植物体への遺伝子導入により生じたpMADS3遺伝子のサイレンシングにより、偶然にも、多重咲きという観賞用植物として有用な形質を有するペチュニア植物体を作出することに成功した。以上の結果は、植物体におけるMADS3遺伝子の機能を抑制することにより、その花型を改良しうることを示すものである。
【０００７】
即ち、本発明は、MADS3遺伝子の機能の抑制による植物の花形の改変に関し、より詳しくは、
（１）  植物の花型を改変するために用いる、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）MADS3遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
（ｂ）MADS3遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
（ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、MADS3遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードし、MADS3遺伝子と90％以上の相同性を有するDNA。
（ｄ）植物細胞における内在性のMADS3タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA。
（２）  植物の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つである、（１）に記載のDNA、
（３）  （１）または（２）に記載のDNAを含むベクター、
（４）  （１）または（２）に記載のDNAまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
（５）  （４）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
（６）  （５）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（７）  野生型植物と比較して花型が改変されている、（５）または（６）に記載の植物体、
（８）  花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つである、（７）に記載の植物体、
（９）  （５）から（８）のいずれかに記載の植物体の繁殖材料、
（１０）  花型が改変された植物を製造する方法であって、
（ａ）（１）に記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、および
（ｂ）該植物細胞から植物体を再生させる工程、を含む方法、
（１１）  植物の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つである、（１０）に記載の方法、を提供するものである。
【０００８】
なお、本発明において「MADS3遺伝子」とは、ペチュニア由来のMADS3遺伝子（pMADS3遺伝子）および他の植物におけるその相同遺伝子を意味する。
本発明において「雄ずい」とは、種子植物の花の器官の１種で、雄性生殖器官であり、花糸の先端に葯がついた構造を有する器官を意味する。
本発明において、「花弁」とは、花冠(corolla)を構成している裸花葉を意味する。
本発明において、「二次花」とは、花の内部に生じ、本来の（外の）花と同様の構造をしている構造体を意味する。
本発明において、「がく片様花弁様構造」とは、一つの花器官の中にがく片の特徴を示す部分と花弁の特徴を示す部分とをモザイク状に含む構造体を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、植物の花型の改変の標的となるMADS3遺伝子としては、その遺伝子を保有する植物が花の器官形成を制御するものであれば特に制限はない。好ましくはペチュニア、トレニア、トルコギキョウなどの観賞用植物のMADS3遺伝子である。本発明において「花型が改変されている」とは、野生型植物の花型と比較して対象植物の花型が相違し、この相違が人為的に生じたものであることを意味する。本発明における花型の改変には、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成が含まれる。その中でも、花の美的価値の増加への効果が大きいという観点から、雄ずいの花弁への転化が好ましい。
【００１０】
本発明における植物の花型の改変は、MADS3遺伝子の機能を抑制することにより行なう。ここで「MADS3遺伝子の機能の抑制」とは、MADS3遺伝子の転写からMADS3タンパク質の機能の発現に至るいずれかの過程が阻害されることを意味し、MADS3遺伝子の発現（転写および翻訳）の抑制およびMADS3タンパク質の機能の抑制が含まれる。ここでいう「抑制」には、完全な抑制のみならず部分的な抑制も含まれる。
【００１１】
本発明における植物の花型の改変は、植物の内在性のMADS3遺伝子の発現を抑制することにより行うことができる。植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, (1986) Proc.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der Krolら (1988) Nature 333:866)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００１２】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。
【００１３】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索により決定することができる。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００１４】
なお、pMASD3遺伝子の機能を抑制するためのDNA構築物を作製するために参考となるペチュニア由来のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。cDNAの配列については文献（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化を制御する転写調節因子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）96-106 (1994)）に開示されている。
【００１５】
ペチュニア以外の植物由来のDNAについては、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M.: Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science, vol.230, 1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491, 1988）を利用して単離し、その配列を決定することができる。このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの効率的な単離を期待することができる。単離したDNAは公知の塩基配列決定法によりその塩基配列を解読することができる。
【００１６】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００１７】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。pMADS3遺伝子中には標的となりうる部位が複数存在する。
【００１８】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.Kikuchi およびN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
【００１９】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、C.A.GrosshansおよびR.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、K.Tairaら (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２０】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7:R793, 1997; Curr. Biol. 6:810, 1996)。例えば、MADS3遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、MADS3遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から目的の表現型を有する植物、例えば、雄ずいが花弁化した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、塩基レベルで、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。
【００２１】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J.Mol.Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２２】
さらに、本発明における内在性遺伝子の機能の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA」とは、該DNAを発現させることによって、植物体が本来持つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするDNAのことを指す。例えば、本発明のタンパク質の転写活性化ドメインが欠失し、DNA結合能を有するペプチドをコードするDNAである。
【００２３】
MADS3遺伝子の機能が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、MADS3遺伝子の機能を抑制するための上記DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。また、組織特異的プロモーター、例えば、pMADS3プロモーターを用いることも好適である。
【００２４】
本発明においてベクターの導入される植物細胞は、植物体を再生しうる限りその形態に特に制限はない。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、ペチュニアにおいては、オーキシン（IAA：indole acetic acid）およびサイトカイニン（BAP:benzylaminopurine）を含む培地上でシュートを再生させた後、IBA（indole butyric acid）を含む培地上で発根させて生育させる(van der Meer, I.M. (1999), Methods Mol Biol 111, 327-334.)。トレニア、タバコ、ガーベラ(Elomaa, P., Mehto, M., Kotilainen, M., Helariutta, Y., Nevalainen, L., and Teeri, T. H. (1998), Plant J 16, 93-109.)でも類似の方法で植物体を再生させることができる。
【００２５】
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。本発明の植物体は、花の器官形成を行なう植物であれば特に制限はないが、特に観賞用植物であることが好ましい。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例を制限するものではない。
【００２７】
[実施例１]  pMADS3ゲノムDNAの単離
pMADS3遺伝子のcDNAを通常のランダムプライム法(Sambrook, J., et al., (1989). Molecular Cloning, 2 Edition (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press))を用いて[32P]dCTPで標識して放射性標識DNAプローブを作製し、これを用いてEMBL3ベクター（Stratagene）中に作製したペチュニア（Petunia hybrida var. Mitchell）のゲノミックライブラリーをスクリーニングした。その結果得られたクローンに含まれる約8.9kbのゲノムDNA断片をpBluescriptベクター（Stratagene）のSal I-Spe Iサイトにサブクローニングし(pBS/pMADS3)、DNA塩基配列を決定した後（配列番号：１）、報告されているcDNA配列(Tsuchimoto, S.et al.,(1993). Plant Cell 5, 843-853)からオープンリーディングフレームを推定した（図1a）。
【００２８】
[実施例２]  pMADS3をコードするポリヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築
内在性のpMADS3遺伝子をサイレンシングする作用を示すpMADS3-GUS遺伝子を作製するには、以下の手順にしたがって、推定された転写開始点の約2.6kb上流からMADS3の第3イントロン開始点のすぐ下流までのDNA断片（約7.2kb）をGUSコード領域の上流に連結した。まず、pBS/pMADS3を鋳型とし、プライマー1(5'-GTGTGGATCCACTAGACCATAAAAATGTT-3' ：配列番号：２)およびプライマー2(AGTTGCAAGATGTACGTGGT：配列番号：３)を用いて96℃／45秒の後、96℃／45秒、55℃／45秒、72℃／4分を30サイクルした後、72℃／10分の条件でPCR反応を行った（酵素はPfu polymerase）。これによって得られたDNA断片はイントロン2中からエクソン3の5'末端近傍までの領域に対応し、3'下流末端近傍にBamHI配列を持つ。このDNA断片を、NsiIおよびBamHIで切断した後pBS/pMADS3のNsiI/BamHIサイトに挿入してpMADS3遺伝子の一部を再構成し、pBS/pMADS3-Bを得た。DNA塩基配列を確認したのち、SalIおよびBamHIを用いて約7.2kbのpMADS3配列をpBS/pMADS3-Bから切り出し、pBINPLUS-GUSプラスミド中のβ-D-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子コード領域の上流（SalIIおよびBamHIサイト）に挿入した。なお、pBINPLUS-GUSは、pBINPLUS(van Engelen, F. A.et al., (1995). Transgenic Res 4, 288-290.)のXbaIおよびEcoRIサイトの間に、pBI221(クロンテック社から購入）から切り出したGUSコード領域およびノパリン合成酵素(NOS)のターミネーターを含むXbaI-EcoRI断片を挿入したものである。構築されたpMADS3-GUS遺伝子は、図1bから明らかなように、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)の35Ｓプロモーター領域（P35S; 0.9kb)、本発明のpMADS3遺伝子の一部を含むポリヌクレオチド（pMADS3; 7.2kb)およびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Tnos; 0.3kb)から構成されている。図1b中のPnosは、ノパリン合成酵素のプロモーター領域、NPTIIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子を示す。
【００２９】
[実施例３]  各融合遺伝子のペチュニア細胞への導入
（１）アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404株（Clontechから購入）を250μg/mlのストレプトマイシンと50μg/mlのリファンピシンを含むＬ培地中、28℃で培養した。Nagelら(1990)(Microbiol. Lett., 67:325)の方法に従って、細胞懸濁液を調製し、実施例2で構築したプラスミドベクターをエレクトロポレーションにより、上記菌株に導入した。
（２）各融合遺伝子をコードするポリヌクレオチドのペチュニア細胞への導入
上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404株をYEB培地（DNA Cloning第２巻、78頁）で振とう培養（28℃、200rpm)した後、滅菌水で20倍に希釈し、ペチュニア（Surfinia)の葉片と共存培養した。2〜3日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を除去し、2週間ごとに選択培地で継代し、上記２種類の融合遺伝子と共に導入されたpBINPLUS由来のNPTII遺伝子発現によるカナマイシン抵抗性の有無で形質転換されたペチュニア細胞を選抜し、常法によりカルスを誘導した後、植物体に再分化した(Jorgensen, R. A..et al., (1996). Plant Mol. Biol. 31, 957-73.)。
【００３０】
[実施例４]  pMADS3-GUS遺伝子を導入した形質転換ペチュニアにおける内在性pMADS3遺伝子の発現
pMADS3-GUS遺伝子を導入した形質転換ペチュニアにおける内在性pMADS3遺伝子の発現を調べるため、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション分析を行った。DIG標識プローブRNAを作製するには、pMADS3 cDNA(Tsuchimoto, S.et al.,(1993). Plant Cell 5, 843-853)のPstI-EcoRI断片（塩基番号517-1214）をpBluescriptベクターにサブクローニングし、BglII(塩基番号572)で切断した後、T7RNAポリメラーゼを用いてDIG標識UTP存在化に転写反応を行わせた。ハイブリダイゼーションは、反応後のフィルターの洗浄を68℃で４時間行った以外はBoeringer社のマニュアルに従って行った。
【００３１】
内在性のpMADS3遺伝子の発現は本来雄ずいおよび雌ずいに局在している。ところが、pMADS3-GUS形質転換体の各花器官からの総RNAを用いてハイブリダイゼーションを行った結果、12系統のうち5系統の形質転換体において、雄ずいおよび雌ずいにおける内在性pMADS3遺伝子の発現が検出されず、pMADS3遺伝子のサイレンシングが起こっていることが判明した。そのうちの一系統についての結果を図2に示す。
【００３２】
なお、ここで観察された遺伝子サイレンシングの分子機構としては、転写後の（post-transcriptional）サイレンシングと転写時の（transcriptional）サイレンシングの2種類が知られている。本実験において観察された遺伝子サイレンシングは、pMADS3からのDNA断片がどの系統の形質転換体においても全くプロモーター活性を示さない（サイレンシングが起こっていない系統でも）などの理由から、一旦転写が起こることが必須条件である転写後のサイレンシングではなく、転写時のサイレンシングである可能性が高い。
【００３３】
[実施例５]  pMADS3-GUS遺伝子を導入した形質転換ペチュニアにおける花器官のホメオティック変化
内在性pMADS3遺伝子のサイレンシングが起こった系統の形質転換体では以下のような共通の表現型が表れた。図3に示すように、これらの系統の個体では、雄ずいが花弁化に転換している。その程度には様々で、弱い表現型の系統では葯の先端のみが小さな花弁に転換し、花糸(filament)にはほとんど変化が認められないのに対し、強い表現型の系統では雄ずい全体が花弁化していた。強い表現型の系統でも雄ずいの花弁化は完全ではなく、葯の構造は残って花粉も形成される。この時、雌ずいはほとんど正常な外見を呈していた。花弁化した雄ずいと雌ずいとの間に相当する同心円状領域には、花弁様がく片様構造物および二次花のつぼみが1個ないし数個形成された。それらの構造物の数は不定であり（1〜4個）、系統間のばらつきおよび同一の個体中の花によるばらつきが見られた。二次花においても、本来雄ずいになるべき部分の器官が花弁に転換しており、一次化と同様のホメオティックな変化が生じていることが判明した。なお二次花は小さなつぼみの段階で生長を停止するので花の外からは見えない。
【００３４】
pMADS3遺伝子は、アラビドプシスのCクラス遺伝子であるAGAMOUSと構造的類似性を示す。また、第3および第4輪生（whorl）に特異的に発現しており、CaMV35Sプロモーターによってエクトピックに発現させると花弁が雄ずい化する。これらのことからpMADS3はペチュニアのCクラス遺伝子であるといえる。しかしながら、AGAMOUS遺伝子の機能消失（loss-of-function）変異は、第3輪生（雄ずいが生じるべき領域）に花弁が生じ、さらに内側に向かってがく片および花弁からなる輪生が繰り返すという表現型を示すことが報告されている(Yanofsky, M. F.et al., (1990). Nature 346, 35-39)。本実験によって明らかになったpMADS3遺伝子の機能消失表現型はAGAMOUS遺伝子のそれとは明らかに異なっており、Cクラス遺伝子に分類されても果たす機能が異なることを示している。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、MADSボックス遺伝子の機能喪失により花型を改変された植物および該植物を作出するための方法が提供された。これにより、従来の交配育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品種を作製することが可能となった。本発明によれば、植物に多重咲きの形質を付与することができ、これにより観賞価値のい園芸植物を作出することが可能である。MADS3遺伝子の機能を抑制する分子は、この目的のための薬剤となる。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pMADS3遺伝子の構造およびpMADS3-GUS遺伝子の構造を示す図である。ａは、pMADS3遺伝子のゲノム構造を示す。エキソンを箱で示した。ｂはpMADS3-GUS遺伝子導入のための構築物を示す。エキソン3の5'末端近傍におけるGUS遺伝子との連結点の配列を示した。
【図２】  pMADS3-GUS遺伝子導入による内在性pMADS3遺伝子のサイレンシングの結果を示す写真である。
【図３】  pMADS3遺伝子のサイレンシングによる雄しべの花弁化と二次花の形成の様子を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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