(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号１に示されたヌクレオチド配列のコーディング領域からなる核酸分子、
からなる群より選ばれ、チファステロールからカスタステロンへの変換を触媒作用するシトクロムP450ヒドロキシラーゼのタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
(a)配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号１に示されたヌクレオチド配列のコーディング領域からなる核酸分子
からなる群より選ばれた核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物細胞であって、その核酸分子の発現が、配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドの細胞中の減少をアンチセンスによりもたらすことを特徴とするトランスジェニック植物細胞。
【請求項３】
(a)配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号１に示されたヌクレオチド配列のコーディング領域からなる核酸分子
からなる群より選ばれた核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物細胞であって、その核酸分子の発現が、配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドの細胞中の増大をセンスによりもたらすことを特徴とするトランスジェニック植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物中のブラシノステロイド（brassinosteroid）生合成を触媒作用するシトクロムP450ヒドロキシラーゼ（本明細書では、「シトクロムP450酵素」、「シトクロムP450」、「Ｐ450」とも言う）をコードする核酸分子、該核酸分子によりコードされた生物活性ポリペプチドを生成し、分析するための方法およびプロセス、ならびにブラシノステロイド生合成を調節するその他のシグナリング（signaling）タンパク質の同定および特性決定を提供するものである。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
光は実際に植物の生長プロセスおよび発育プロセスの全ての局面を調節し、その中でも幼植物発育が日照条件に最も感受性がある（ArnimおよびDeng, 1996; Chory, 2000）。それ故、植物は光シグナル感知および伝達のための巧妙な系を有する。光シグナルは赤色および遠赤色吸収性フィトクロム（Quail, 1997）、ブルー/UV-A光吸収性クリプトクロム/フォトトロピン（BriggsおよびHuala, 1999）、およびUV-B光吸収性受容体（SengerおよびSchmidt, 1994）を含む、種々の光受容体により感知される。光シグナルは続いて種々のシグナル変換体により伝達され、最後に植物の光形態形成に関係する遺伝子を調節する。光は独立に機能しないが、生長および発育の一時的かつ空間的調節のための内因性生長調節因子、例えば、生長ホルモンと統合される（Szekeresら, 1996; SchumacherおよびChory, 2000）。
【０００３】
光形態形成性突然変異体に関する最近の研究はブラシノステロイド(BR)、オーキシン、およびジベレリン(GA)が光形態形成プロセス、特に茎形態形成および葉の発育に関係していることを示唆している（Liら, 1996; Kimら, 1998; Friedborgら, 1999; Kamiyaら, 1999）。それらの中で、最も広範に研究されたことは光とBRの相互作用である（Szekeresら, 1996; ClouseおよびSasse, 1998; SchumacherおよびChory, 2000）。BR欠乏突然変異体は暗所中で光形態形成性の発育、例えば、葉緑素合成、頂端フックおよび子葉孔、ならびに厚い小発育の胚軸を示す（Fujiokaら, 1997）。明所では、それらは主として茎および花粉管における遅延された細胞伸長のために、小発育の茎および葉柄、ダークグリーンの葉、雄性不稔性、および遅延された老化を示す（Liら, 1996; Szekeresら, 1996）。これらの観察はBRホルモンが細胞伸長および分裂、黄化、生殖発育、および維管束分化を含む、植物生長プロセスおよび発育プロセスに必須の役割を有することを示す（ClouseおよびSasse, 1998）。
【０００４】
BRホルモンは植物中の一連の酵素により複数段階の生合成経路により合成される。生合成過程がCatharanthus roseusの培養細胞および幼植物を使用してBR欠乏突然変異体の飼養実験により解明されていた（ClouseおよびSasse, 1998; Fujiokaら, 2000）。今までに特性決定された酵素として、ステロールデサチュラーゼ(DWF7/STE1)（Choeら, 1999b）、オキシダーゼ(DWF1/DIM1/LKB)（Choeら, 1999a; Nomuraら, 1999）、レダクターゼ(DET2/LK)（Liら, 1996）、およびシトクロムP450ヒドロキシラーゼ(DWF4,CPD/DWF3,D)（Choeら, 1998; Bishopら, 1999）が挙げられる。Arabidopsis突然変異体bri1およびエンドウ豆突然変異体lkaがBRに対し不感受性であり、BR感知における突然変異を有する（LiおよびChory, 1997; Nomuraら, 1999）。BRI1遺伝子は細胞質セリン/スレオニンキナーゼドメインおよび外部の推定BR結合LRRドメインを有する、ロイシンに富む繰り返し体(LRR)受容体をコードする（LiおよびChory, 1997）。外部LRRドメインは最近BRに応答することが確認された（Heら, 2000）。エクスパンシン（Cosgrove, 1997）、エンド-1,4-β-D-グルカナーゼ（Nicolら, 1998）、およびキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（Xuら, 1995）といった幾つかのタンパク質がBRシグナルに応答する。重要なことに、BR応答性タンパク質が細胞伸長および関連プロセスにおいて細胞壁修飾を主として担うことが示唆されており、これらは光およびBRにより調節される主な発育プロセスである（Salchertら, 1998; Azpirozら,
1998）。
【０００５】
植物の光シグナル伝達経路においてグアノシントリホスファターゼ(GTPase)、Ca2+/カルモジュリン、ホスホリパーゼＣ、およびタンパク質キナーゼ/ホスファターゼを含め、種々のシグナリング媒介物質の役割が確認または示唆されていた（Roux, 1994）。ヘテロトリマーのGTPaseがcGMPおよび／またはCa2+との相互作用を通じ植物中の光シグナル伝達を調整する（Bowlerら, 1994; Hooley, 1998）。Rasスーパーファミリーに属するGTPaseの別のグループである、モノマーの小GTPaseは動物および植物中の多くの細胞プロセス、例えば、細胞生長および分化、細胞形態形成、および小胞輸送を調節する（Ma, 1994; Exon, 1998）。蓄積している証拠はそれらがまた植物での光シグナル伝達に役割を果たすことを支持する（Romeroら, 1991; SommerおよびSong, 1994; Naganoら, 1995）。エンドウ豆Pra2の小GTPaseが特に重要である。その発現は暗所誘導性であり、光によりダウンレギュレートされる（Yoshidaら, 1993）。かくして、pra2遺伝子の5'非翻訳領域は暗所誘導性要素、DE1を含み、これがリポーター遺伝子の光ダウンレギュレーションを与えることが注目される（Inabaら, 2000）。Pra2は暗所で上胚軸の迅速に伸びている上方領域中で専ら発現される（Naganoら, 1995）。興味深いのはこの植物部分は合計のフィトクロム含量が異なる植物部分の中で最も富んでいる部位であり（BriggsおよびSiegelman, 1965）、しかもBR欠乏小発育突然変異体中でBR処理に最も感受性のある部分である（Azpirozら, 1998）。これらの観察はPra2が黄化幼植物発育の調節のために植物生長ホルモン、おそらくBRホルモンによる光シグナルの統合に調節の役割を果たすことを提案する（ArnimおよびDeng, 1996）。
【０００６】
この研究において、本発明者らはPra2がBR生合成に関係する優れたシトクロムP450酵素と特異的に相互作用することを示す。P450は暗所誘導性であり、Pra2のように上胚軸の迅速に伸びている領域において主として発現される。Pra2およびシトクロムP450タンパク質は小胞体(ER)に同時局在化される。減少されたPra2を含むトランスジェニック植物は暗所で小発育の胚軸を示し、これはBRにより完全に救済されるが、その他の生長ホルモンによっては救済されない。シトクロムP450はBR生合成における多重C-2ヒドロキシル化を媒介する。驚くことに、シトクロムP450を過剰発現するトランスジェニック植物は明所でさえも細長い茎を示し、これが暗所生長の幼植物の胚軸を表現型模写する。これらの結果はPra2がシトクロムP450との相互作用により黄化幼植物中の胚軸伸長を調節する光調節性分子スイッチであることを示す。Pra2-P450相互作用は植物中の暗所発育プロセス（黄化）の基礎となる分子メカニズムであり得る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明はシトクロムP450ヒドロキシラーゼまたは植物中のブラシノステロイド生合成におけるC-2ヒドロキシル化によるチファステロール（typhasterol）からカスタステロン（castasterone）への変換を触媒作用するようなタンパク質の生物活性のある断片をコードする核酸分子に関する。このような核酸分子は上記シトクロムP450様ヒドロキシラーゼの酵素活性を有する配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を優先的にコードする。
【０００８】
また、本発明は高ストリンジェント条件下で配列番号１に示された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子に関する。“高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”という用語は、このような核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下で相補的な塩基対合によりハイブリダイズすることを意味する。
本発明は酵素分析のための前記核酸分子によりコードされたポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの生物活性のある断片に関する。前記核酸分子によりコードされたシトクロムP450ヒドロキシラーゼはチファステロール（typhasterol）からカスタステロン（castasterone）への変換および6-デオキソチファステロールから6-デオキソカタステロンへの変換に特異的であるC-2ヒドロキシラーゼ活性を示す。さらに、本発明はシトクロムP450ヒドロキシラーゼのポリペプチドまたはC-2ヒドロキシル化を示す細菌細胞中で発現されたこのようなポリペプチドの生物活性のある断片を記載する。上記核酸分子によりコードされたポリペプチドは共通の構造上の性質および機能的性質、例えば、分子量、電気泳動移動度、クロマトグラフィー挙動、酵素活性、ならびにプロリンに富む領域であるＮ末端の膜係留領域のための、および二酸素（dioxygen）、ヘム、およびステロイドの結合のための構造上および機能上のドメインを共有する。
【０００９】
また、本発明は本発明による上記核酸分子を含む遺伝子操作に使用されるベクター、発現カセット、およびプラスミドに関する。
一つの観点から、本発明は前記核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞および植物、ならびにブラシノステロイドシグナリングに関係するその他のタンパク質ならびに植物の生長および発育におけるブラシノステロイドと光の相互作用における分子的事象の解明のための実験方法に関する。本発明の核酸分子の提供は植物中の様々な生理変化、形態変化、および発育変化をもたらす、減少または増加されたブラシノステロイド生合成によるトランスジェニック植物を生み出す可能性を与える。方法に関する技術操作は当業者に公知である。
【００１０】
本発明により、ブラシノステロイド生合成酵素を器官特異的な様式で経済的に重要な作物中に導入することにより生長速度の向上および環境による損傷に対する耐性に関して植物の生長プロセスおよび発育プロセス、例えば、茎および葉の生長を操作することが可能である。
それ故、本発明は1.配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含み、植物のブラシノステロイド生合成経路におけるチファステロールからカスタステロンへの変換および6-デオキソチファステロールから6-デオキソカスタステロンへの変換を触媒作用するシトクロムP450ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子、および2.配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む、酵母ベクターpGAD4.2-1 (KCTC 0857BP)（これはブダペスト条約のもとに2000年８月28日に国際寄託当局としてのKCTC（Korean Collection forType Cultures）に寄託されている）を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ブラシノステロイドは必須の植物生長レギュレーターとして最近確認され、ブラシノステロイドの中で最も酸化され、かつ活性な形態であるブラシノリドの最初の単離以来、広範な生理学的研究および分子生物学的研究の結果としてその生合成経路および生合成酵素が特性決定されていたが、それらの生理学的機能およびその基礎となる分子メカニズムは充分に理解されていなかった。ブラシノステロイドは単独に作用しないが、植物の生長および発育の空間的かつ一時的な調節のために、その他の生長レギュレーターおよび環境因子、例えば、光およびストレスと協力する。それ故、ブラシノステロイドの役割および作用メカニズムならびにそれらが環境因子と相互作用する方法についての分子上の手がかりをさらに解明することが重要である。
【００１２】
よって、本発明は植物中のブラシノステロイド生合成においてC-2ヒドロキシル化によるチファステロールからカスタステロンへの変換および6-デオキソチファステロールから6-デオキソカスタステロンへの変換を触媒作用するシトクロムP450ヒドロキシラーゼまたはこのようなタンパク質の生物活性のある断片をコードする核酸分子を提供する。該核酸分子は上記シトクロムP450ヒドロキシラーゼの酵素活性を有する配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を優先的にコードする。配列番号１に示されたこのような核酸分子がさらに好ましい。さらに、本発明は原核細胞および真核細胞中の機能的発現のための配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでなるプラスミドおよび発現カセットに関する。該核酸分子は当業界で公知の技術である、種々の通常の方法、例えば、mRNAを使用する逆転写酵素媒介PCR(RT-PCR)により、または部分サイズのcDNAクローンをプローブとして使用するcDNAライブラリーのスクリーニングにより完全サイズのcDNAクローンとして単離し得る。RT-PCR方法については、ポリ(A)+mRNAが最初に逆転写酵素とプライマーとしてのオリゴ(dT)16-18を使用して一次cDNAに変換し得る。次いで中断されていない二本鎖cDNAが一対の特定プライマー（配列番号３および配列番号４）を使用するPCRにより合成し得る。
【００１３】
また、本発明は高ストリンジェント条件下で配列番号１に示された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子に関する。“高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”という用語は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２編, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に記載されたように、このような核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下で相補的塩基対合によりハイブリダイズすることを意味する。上記核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は一般にあらゆる植物、好ましくは農業、林業、および園芸上重要な植物、例えば、米、大麦、小麦、油料ナタネ、ジャガイモ、トマト、キャベツ、レタス、ホウレンソウ、メロン、スイカ、ラッキョウ、ハツカダイコン、カリフラワー、サトウキビ、キュウリ、およびテンサイからのものを含む。木本もまた好ましい入手源である。配列番号１に示された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を単離するために、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーが上記核酸分子をプローブとして使用してスクリーニングされ、これは当業界で公知の分子生物学技術である。
【００１４】
本発明によれば、“縮退”という用語は核酸分子のヌクレオチド配列が一つ以上の塩基位置で上記核酸分子と異なり、しかも前記核酸分子に高度に相同的であることを意味する。“相同性”とは少なくとも70％、特に80％以上のアミノ酸配列同一性を示す。また、その用語は挿入、欠失、塩基置換、および組換えによる上記の核酸分子の誘導体をも含む。また、“相同性”により核酸分子または前記核酸分子によりコードされたポリペプチドが構造上も機能上も均等であることを記載する。
【００１５】
さらに、本発明は酵素分析および生化学アッセイにおける使用のための前記核酸分子によりコードされたポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの生物活性を有する断片に関する。このようなポリペプチドを得るのに有効な一つの方法は組換え発現系を使用することである。それを行なうためには、前記核酸分子によりコードされるポリペプチドの有効な発現に必要とされる調節要素、例えば、プロモーター、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルを含む発現ベクターに核酸分子が最初に挿入される。次いで発現カセットが適当な宿主細胞にトランスフェクトされる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってもよい。宿主細胞培養物から発現されたポリペプチドの効率的な単離のために、アフィニティー標識がポリペプチドに結合される。その標識は当業界で最近良く確立された技能である酵素方法または生化学方法により単離後に融合タンパク質から容易に除去し得る。
【００１６】
前記核酸分子によりコードされたシトクロムP450ヒドロキシラーゼの酵素活性は一般のヒドロキシル化基質、例えば、ブラシノステロイドの化学構造と同様の化学構造を有するテストステロンもしくはその誘導体、またはブラシノステロイドを使用してアッセイし得る。次いで反応混合物が薄層クロマトグラフィー(TLC)またはHPLCで分析される。本発明のシトクロムP450は、ブラシノステロイド生合成において初期C-6酸化経路におけるチファステロールからカスタステロンへの変換および後期C-6酸化経路における6-デオキソチファステロールから6-デオキソカスタステロンへの変換でC-2ヒドロキシラーゼ活性を有する。上記核酸分子によりコードされたポリペプチドはシトクロムP450酵素と共通の構造的性質および機能的性質、例えば、分子量、電気泳動移動度、クロマトグラフィー挙動、酵素活性、ならびにプロリンに富む領域であるＮ末端の膜係留領域のため、および二酸素、ヘム、およびステロイドの結合のための構造ドメインおよび機能ドメインを共有するが、異なる基質特異性を示す。
【００１７】
また、本発明は本発明の上記核酸分子を含む、遺伝子操作に使用されるベクター、発現カセット、およびプラスミドに関する。
一の観点から、本発明の前記核酸分子によりコードされるシトクロムP450ヒドロキシラーゼは特性決定されたその他のGTPase-エフェクター相互作用のようにGTP依存の様式で、Rasスーパーファミリーに属する、Pisum sativumから単離されたPra2である小分子量GTP-結合タンパク質と特異的に相互作用する。上記ポリペプチドは小胞体(ER)に局在化される。逆に、ERへのPra2局在化はGTP依存性である。GTPが結合した活性形態のみがERと会合する。ERへの２種のタンパク質の同時局在化は蛍光タンパク質をその２種のタンパク質に結合して、融合タンパク質を得て、融合構築物をトランスジェニック植物中で発現し、蛍光顕微鏡で調べることにより試験し得る。
【００１８】
本発明は前記核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞および植物を生成するのに利用でき、またブラシノステロイド・シグナリングに関係するその他のタンパク質および光とのブラシノステロイドの相互作用における分子的事象の解明のためのプロセスおよび方法に利用し得る。本発明の核酸分子の提供は様々な生理学的変化、形態学的変化、および発育変化をもたらす減少または増大されたブラシノステロイド生合成を有するトランスジェニック植物を生じる可能性を与える。トランスジェニック植物細胞および植物の発生に関する技術操作は当業界で公知である。
【００１９】
植物組織培養および遺伝子物質の操作における最近の技術進歩により、現在では新しい所望の遺伝子を経済的に重要な植物に導入して植物生産性および品質を改良することはルーチン操作である。本発明の核酸分子はこのような目的のための潜在的な標的遺伝子であり得る。例えば、それは生長速度および環境による損傷に対する耐性の改良に関して、植物生長プロセスおよび発育プロセス、例えば、茎および葉の生長を操作するのに利用し得る。本発明の実施態様に所望されるプラント植物として、農業、林業、および園芸に有益なあらゆる植物、例えば、イネ、トウモロコシ、サトウキビ、芝草、メロン、スイカ、キュウリ、コショウ、およびポピュラーツリーが挙げられる。茎の生長を操作することにより品質が改良し得る園芸植物もまた本発明の実施態様の良好な標的植物である。
【００２０】
【実施例】
植物物質および生育条件
Nicotiana tabacum (Petit Havana SR1)の種子を無菌条件で25℃で16時間の光周期で発芽させ、生育させた。Arabidopsis thaliana生態型Columbia (Col-0)を１％寒天およびSucを含む0.5X MurashigeおよびSkoog培地で発芽させ、生育させた。全てのArabidopsis培養物は調節された環境培養室中で22℃で70％の湿度および12時間の光周期で管理された。また、飼養実験も同じ培養条件で行なった。
酵母ツー・ハイブリッドスクリーニング
製造業者（Clontech, Palo Alto, CA）により記載されたようにマッチメーカーツー・ハイブリッド系（MATCHMAKER Two-Hybrid System）を使用して、酵母ツー・ハイブリッドスクリーニングを行なった。完全サイズpra2遺伝子を囮（bait）プラスミドpGBT9にクローン化した。エンドウ豆cDNAライブラリーを生後６日の暗所生長幼植物から構築し、ファージミドベクターpAD-GAL4-2.1にクローン化した。囮プラスミド構築物を最初にエレクトロポレーションにより酵母株HF7cに形質転換し、続いてこれをcDNAライブラリーファージミド構築物で形質転換した。最終の陽性形質転換体（his3+およびLacZ+）を20mMアミノトリアゾールの存在下で選択して偽陽性物を排除した。陽性クローンをE. coli株XL1-Blueへの逆形質転換により単離した。
【００２１】
組換えタンパク質の発現および精製
pra2遺伝子配列を、5'末端がグルタチオン-S-トランスフェラーゼをコードするベクター配列とインフレーム融合されるような方法でpGEX-4T-2ベクター（Amersham-Phamacia, Buckinghamshire, UK）にクローン化した。ABI PRISM 310遺伝子アナライザー（Perkin Elmer, Foster City, USA）を使用して、全てのベクター構築物をDNA配列決定により確認した。クイックチェンジキット（Quick Change Kit, Promega, Madison, WI）を製造業者により記載されたようにしてpra2遺伝子のインビトロ突然変異誘発に使用した。発現構築物をE. coli株BL21に形質転換し、100μg/mlアンピシリンで選択した。E. coli細胞をLB培地5ml中で37℃で一夜増殖させ、培養液3mlをRB培地（0.5％酵母エキス、１％トリプトン、0.5％NaCl、0.2％グルコース、pH 7.5）250ml中に移し、OD600が0.55〜0.6に達するまで30℃で振盪した。次いで培養液を30分間にわたって30℃に調節し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を最終濃度1mMまで添加し、さらに４時間振盪することにより発現を誘発した。Pra2-GST融合タンパク質をグルタチオンセファロース4Bをベースとするアフィニティークロマトグラフィー(Promega)により精製した。
【００２２】
DDWF1タンパク質をインテインをベースとする発現ベクターpTYB2 (NEB, Beverly, MA, USA)によりE. coli細胞中で可溶性形態として発現させた。ddwf1遺伝子を、コーディング配列のＣ末端がインテインポリペプチドをコードするベクター配列にインフレーム融合されるような方法でpTYB2ベクターに挿入した。発現構築物をE. coli株ER2566に形質転換した。細胞をPra2タンパク質と同じ方法で増殖させた。DDWF1-インテイン融合タンパク質を供給業者により示唆されたようにキチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、カラム中で一夜にわたって４℃で1mM DTTにより開裂してDDWF1ポリペプチドを放出させた。この発現スキームでは、２種の付加的なアミノ酸残基（ProおよびGly）をクローニング操作の結果としてDDWF1のＣ末端に結合した。
組換えタンパク質によるインビトロ結合アッセイ
ddwf1遺伝子をpGEM3Z(+)にクローン化し、TNTクイック結合型転写/翻訳系(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System;  Promega)を使用してインビトロ翻訳した。ベクターDNA鋳型約１μgおよび20μCiの〔35S〕-メチオニン(Amersham, カタログ番号AG1094)を反応容積50μl中で使用した。反応混合物を30℃で90分間インキュベートし、使用まで-70℃で迅速凍結した。最初にPra2-GST融合タンパク質２μgをエッペンドルフ管中で0.5mM GTPの存在下または不在下でグルタチオンセファロース4B樹脂に結合させた。インビトロ翻訳された混合物５μlを添加し、混合物を30℃で30分間インキュベートした。次いで樹脂をPBS緩衝液で３回充分に洗浄し、結合されたDDWF1を溶離し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。
【００２３】
細胞下の同時局在化分析
GFPおよびRFP(Clontech)をそれぞれPra2のＮ末端およびDDWF1のＣ末端にインフレーム融合した。融合構築物をpBI221二成分ベクター(Clontech)にサブクローニングした。ベクター構築物を粒子衝撃によるトランスフェクション後にタマネギ表皮細胞中で一時的に発現させた。24時間のインキュベーション後に、融合タンパク質の細胞下分布を蛍光顕微鏡により調べた。ER会合の対照として、ERシグナルペプチドをＮ末端に含むER-GFPを使用した。また、GFPおよびRFPを細胞質および核内の非特異的分布の対照として入れた。
植物形質転換
ddwf1遺伝子をpBI121ベクターにクローン化した。植物発現構築物を実質的に既に記載されたようにして葉盤のAgrobacterium tumefaciens感染によりタバコ植物に形質転換した(Horschら, 1985)。カナマイシンおよびセフォタキシムをそれぞれ200mg/mlおよび500mg/mlで形質転換体の選択に使用した。Arabidopsis植物のAgrobacterium媒介形質転換を簡易化フローラルディップ（floral dip）方法（CloughおよびBent, 1998）により行なった。
RNA抽出およびノーザンハイブリダイゼーション
Rnasey Plant Total RNA単離キット（Qiagen, Valencia, CA）を使用して製造業者により提供された操作に従って、全RNAサンプルを適当な植物材料から単離した。RNAサンプルを、50％(v/v)ホルムアミドおよび2.2Mホルムアルデヒドを補給したMOPS緩衝液（20mM MOPS、8mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA）中で65℃で10分間にわたって変性し、同一緩衝液中で調製された１％アガロースで分別した。プローブをα-〔P32〕dATPの存在下でランダムプライミングにより調製した。Hybond-N膜への転移およびその後のプロセッシングを既に記載されたようにして行なった（Sambrookら, 1989）。
【００２４】
BRホルモンおよびその他の生長レギュレーターとの相補性
試験した植物生長レギュレーターはBR、GA、オーキシン、サイトキニン、アブシジン酸、およびサリチル酸であった。BRホルモンは最も酸化されたブラシノリド（BL、10-8M）および種々の中間体、例えば、カンペスタノール（CN、10-6M）、6-オキソカンペスタノール（6-オキソCN、10-6M）、6-デオキソカタステロン（6-デオキソCT、10-6M）、カタステロン（CT、10-6M）、6-デオキソテアステロン（6-デオキソTE、10-6M）、テアステロン（TE、10-6M）、6-デオキソチファステロール（6-デオキソTY、10-7M）、チファステロール（TY、10-7M）、6-デオキソカスタステロン（6-デオキソCS、10-8M）、6α-ヒドロキシカスタステロン（6-OHCS、10-8M）、およびカスタステロン（CS、10-8M）を含んでいた。それぞれのBR中間体を括弧中に示された濃度で使用した。使用した濃度は野生型植物が所定の濃度で抑制効果を全く示さないように一連の滴定により決定された。植物をそれぞれのBR中間体の存在下で4-7日間にわたって明所または完全な暗闇中で発芽させ、生育させた。それぞれの処理における30-50個の植物の胚軸の長さを測定し、平均した。
DDWF1活性のアッセイ
〔4-14C〕テストステロン（Amersham-Pharmacia、カタログ番号CFA129、193μCi/mg）40μlを小分けにし、溶媒をN2ガスの穏やかな流れのもとに蒸発させた。酵母ミクロソームフラクションを記載されたようにして調製した（Pomponら, 1996）。ミクロソームフラクション30μg、Pra2タンパク質５μg、および種々の量の組換えDDWF1をそれぞれ反応緩衝液（1M HEPES, pH 7.4、0.1mM EDTA、0.5mM GTP、10mM MgCl2）175μlとともにそれぞれの反応に使用した。混合物を凍結乾燥したテストステロンを含む管に移し、37℃で10分間インキュベートした。同一反応緩衝液中で調製された、NADPH溶液25μlをその後に1mMの最終濃度で混合物に添加した。さらに全混合物を37℃で30分間インキュベートし、酢酸エチル1mlを添加し、30秒間激しく撹拌することにより反応を停止した。15,000Xgで４分間の遠心分離後に、上層を回収し、化学フード中で一夜にわたって蒸発させた。乾燥ペレットを酢酸エチル20μlに溶解し、シリカゲル60F254（20X20cm、Merck、Darmstadt、ドイツ）によるTLCにスポットし、記載されたようにしてジクロロメタン/アセトン（4:1の容積比）次いでクロロホルム/酢酸エチル/エタノール（4:1:0.7の容積比）中で展開した（Waxman, 1991）。
【００２５】
HPLC分析のために、BR中間体をテストステロンと同様にDDWF1とともにインキュベートし、混合物をウォーターズ626LC系およびフォトダイオードアレイ検出器（Waters, Milford, MA）で分析した。逆相Supelcosil  LC-18（250X4.6mm、Supelco, PA, USA）を2ml/分の流量で使用した。使用した溶媒は最初の20分間について45％アセトニトリル、次の20分間について45％から100％までの勾配、そして最後の10分間について純粋なアセトニトリルであった。
結果
Pra2は暗所誘導シトクロムP450と相互作用する
上胚軸の急速に伸びている上部領域（そこでは、Pra2がまた最も高度に発現される）中の内因性BRおよび全フィトクロムの優勢な分布はPra2がフィトクロム媒介光シグナルとBRホルモンとの相互作用に調節的役割を有し得ることを示唆する。囮としての完全サイズpra2遺伝子およびエンドウ豆cDNAライブラリーを使用して、酵母ツー・ハイブリッドスクリーンを行なってPra2と特異的に相互作用する一種以上の機能性標的タンパク質を同定した。両方のリポーター遺伝子（his3+およびlacZ+）を発現する17個の陽性クローンを6.3X106のクローンのスクリーニングから単離した。配列分析はそれらのうちの４種が1.2kbpから1.65kbpまでの長さの範囲の同一配列を持つcDNAインサートを有することを示した。最大のcDNAクローン（クローン1023）を更なる配列分析に選んだ。そのcDNAインサートは57.2kDaの計算分子量を有する495アミノ酸のポリペプチドをコードする中断されていないオープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいた。データベース検索はそのポリペプチドが貴重なシトクロムP450であることを明らかにした。それはＮ末端の膜係留配列、プロリンに富む領域、およびジオキシゲン、ステロイド、およびヘムのための結合モチーフを含め、異なるシトクロムP450タンパク質（Szekeresら, 1996）中に保存された全ての構造モチーフおよび機能性モチーフを含む（図1A）。一つの構造上の特異性は中央領域（アミノ酸160-290）がその他の既知のシトクロムP450タンパク質とは異なる配列を示すことである。
【００２６】
シトクロムP450は暗所中で上胚軸の急速に伸びている領域中で主として発現される
ノーザンブロット分析は支配的な1.8kbメッセージを検出し、これはORFの予想サイズと一致した（図1C）。その発現パターンはそれが主としてエンドウ豆上胚軸の急速に伸びている上部領域中で発現される点で既知のシトクロムP450遺伝子（Mizutaniら, 1998）の中では特異である。発現レベルはその他の植物部分、例えば、頂芽および頂端フックならびに根中で比較できるほどに非常に低い（図1Bおよび1C）。それはまた光生育幼植物の根中で若干のレベルまで発現され、これは光刺激された根毛の生長と関係しているであろう（Bibikovaら, 1999）。加えて、その発現は暗所誘導され、光照射後に著しく低下する。それ故、本発明者らはシトクロムP450をDDWF1（暗所誘導されたDWF様タンパク質１（Dark-induced DWF-like protein 1））と命名した。ddwf1遺伝子の暗所誘導かつ器官特異的な発現パターンはpra2遺伝子（Naganoら, 1995）の発現と顕著に一致しており、これは黄化幼植物生長の調節におけるPra2-DDWF1相互作用に関する役割を意味する。
Pra2-DDWF1相互作用はGTP依存性である
Pra2とDDWF1との相互作用をインビトロのプル-ダウンアッセイ（pull-down assay）によりさらに研究した。Pra2タンパク質の優性陰性形態(T34N)および構成的活性形態(Q79L)をインビトロの突然変異誘発（図2A）により生成し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合としてE. coli細胞中で発現した。T34NおよびQ79L Pra2タンパク質はそれぞれインビボでGDP結合コンホメーションおよびGTP結合コンホメーションにあると推定されている（Higashijimaら, 1987）。ddwf1遺伝子をS35-Metの存在下でインビトロ翻訳して、DDWF1の予想サイズに近似する57kDaの分子量を有するポリペプチドを得た。DDWF1ポリペプチドはQ79L Pra2と強く結合し、野生型Pra2とは弱く結合した（図2B）。しかしながら、それはT34N Pra2と結合しなかった。加えて、Pra2-DDWF1相互作用はその他の小さいGTPase-エフェクター相互作用（Higashijimaら, 1987）で観察されたようにマグネシウムイオン依存性である。Q79L Pra2でさえもが20mM MgCl2の存在下でDDWF1のみと結合した。DDWF1はPra2に特異性であると考えられる。それがエンドウ豆Pra3小GTPase（これはPra2に対しその全配列にわたって約65％配列同一性を有し、またその発現も光によりダウンレギュレートされる）（Naganoら, 1995）と相互作用しなかったからである。相互作用はDDWF1とPra3小GTPaseとの間でインビトロプル-ダウンアッセイから検出されなかった（データは示されていない）。
【００２７】
次いで本発明者らはインビトロでDDWF1活性を調べた。Ｎ末端の膜係留領域をコードする配列（18アミノ酸、図1Aおよび図2C）の殆どを除去することにより、DDWF1をE. coli細胞中で可溶性形態として発現させた。テストステロン（これはBRホルモンの化学構造と同様の化学構造を有する）を基質として選んだ。テストステロンそれ自体はDDWF1の基質ではなかったが、テストステロンに対し0.94の移動度を有する中間体を0.78の相対移動度を有する別の中間体に変換した（図2D）。その変換率は使用したDDWF1の量に比例し、その変換がDDWF1に特異的であることを示した（図2E）。テストステロン誘導体の良く証明された移動度プロフィール（Waxman, 1991）に対する相対移動度の比較はその変換がC-2ヒドロキシル化の結果としてある中間体（6-デヒドロテストステロン？）から2α-ヒドロキシテストステロン（それぞれ図2D中B1およびB2）へのものであることを示唆する。Pra2タンパク質を入れた場合、その変換効率はT34Nよりも野生型およびQ79Lについてわずかに高かった。これらの結果はPra2がGTP依存様式でDDWF1活性を調節することを支持する。Q79LとT34Nの間の変換率の相違はGTP依存性Pra2-DDWF1相互作用における相違ほど顕著ではなかったが、これはERと会合すると予想される完全サイズのものではなく、むしろＮ末端切頭型DDWF1が使用されたという事実により説明されるであろう。加えて、Pra2-DDWF1相互作用は本発明者らのインビトロ酵素アッセイ条件では存在していなかった付加的なコファクターを必要とすると考えられる。
【００２８】
Pra2およびDDWF1はERに同時局在化される
小GTPaseは多様な細胞下の所在位置を有する。さらに、所定の小GTPaseは外部シグナルおよび内部シグナルに応じて細胞下の分布を変更する（Scitaら, 2000）。Pra2およびDDWF1が機能性パートナーである場合、それらは同じ細胞下の所在位置を共有すると予想される。異なる２種の蛍光タンパク質をPra2タンパク質およびDDWF1タンパク質に融合し、タマネギ表皮細胞を使用して該融合タンパク質の細胞下の所在位置を一時的トランスフェクションアッセイで調べた。緑色蛍光タンパク質(GFP)をPra2のＮ末端に融合し、赤色蛍光タンパク質(RFP)をDDWF1のＣ末端に融合して、それぞれGFP-Pra2融合体およびDDWF1-RFP融合体を得た（図3A）。DDWF1-RFP融合タンパク質は予想されたようにERに、主として核のまわりに密に積み重ねられたER膜に蓄積した（図3B）。GFP-Pra2融合タンパク質の細胞下の分布はGTP依存性であった。野生型Pra2融合体はERに殆ど結合した。すなわちDDWF1の局在化パターンと実質的に同じ局在化パターンを示した。Q79L Pra2融合体は主として核のまわりのER膜に蓄積した。しかしながら、T34N Pra2融合体はERまたはその他の膜構造と会合せず、細胞質中に非特異的に分散していた。ER膜へのPra2およびDDWF1のこの同時局在化はPra2タンパク質およびDDWF1タンパク質が機能的に相互に関連していることをさらに支持する。
Pra2はDDWF1との相互作用を通じてBR生合成を調節する
植物の光形態形成におけるPra2-DDWF1相互作用に関する分子基盤を研究するために、pra2遺伝子をトランスジェニックタバコ植物に導入した。アンチセンスpra2遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物はそれらが明所で生育された場合に対照植物とは実質的に区別することができなかった。しかしながら、顕著な表現型変化が暗所で生育された場合に観察された（図4A）。それらはBR欠乏植物の良く特性決定された形質（Liら, 1996; ClouseおよびSasse, 1998）である小発育の厚い胚軸を示した。組織分析は小発育の胚軸が減少した細胞数のためではなく、低下した細胞伸長のためであることを実証した（データは示されていない）。しかしながら、pra2トランスジェニック植物はその他の光形態形成形質のいずれもが暗所中の７日までの生育期間中に観察されない点で既知のBR欠乏植物とは異なっていた。これらの結果は予想されないことではない。なぜならば、pra2遺伝子およびddwf1遺伝子の両方が黄化エンドウ豆幼植物の頂芽およびフックにおいてではなく上胚軸の迅速に伸びている領域中で高度に発現されるからである（図１）。また、センストランスジェニック植物も同様の光応答を示した（図4A）。これは同時抑制により説明し得る。センストランスジェニック植物の胚軸の長さはアンチセンストランスジェニック植物のそれよりも可変性であった（MatzkeおよびMatzke, 1995）。pra2センス導入遺伝子の転写レベルはトランスジェニック植物中のアンチセンス導入遺伝子のそれと較べて非常に低かった（データは示されていない）。
【００２９】
Pra2はBRおよびGA生合成に関係する酵素に対し高い相同性を有する酵素であるDDWF1と特異的に相互作用し、アンチセンスpra2トランスジェニック植物の暗所誘導される小発育胚軸は低下したBRおよび／またはGA生合成のためであるかもしれないことが予想された。この仮説を調べるために、トランスジェニック植物をBL、GA、オーキシン、サイトキニン、アブシジン酸、およびサリチル酸を含む、生理的濃度の種々の植物ホルモンの存在下で生育させた。試験した植物ホルモンの中で、BL（10-8M）のみが暗所特異的小発育胚軸を完全に救済した（図4A）。その他の生長ホルモンは何ら刺激効果を示さなかったが、GAが若干の効果を示した（BLによる効果の約20-30％）。BL効果はトランスジェニック植物が明所で生育された場合に予想通りに観察されなかった。これらの観察はアンチセンス抑制がトランスジェニック植物中でPra2同族体のレベルを低下させ、続いてこれがBR生合成をダウンレギュレートすることにより暗所中の胚軸伸長を抑制することを示す。
【００３０】
pra2トランスジェニック植物の小発育表現型は単に遅延された種子発芽によるものであるという可能性があった。この可能性を調べるために、幼植物生長の速度論をBLの不在下（図4B）または存在下（図4C）で分析した。胚軸の長さの相違は幼植物がBLの不在下で生長するにつれて増大し（図4B）、これは小発育表現型が単に遅延された種子発芽のためではないことを示した。トランスジェニック植物および対照植物の生長速度論はそれらがBLの存在下で生育された場合に同様になった（図4C）。
DDWF1はBR生合成におけるC-2ヒドロキシル化過程を媒介する
DWF4、CPD(CBB3/DWF3)、およびＤを含む、３種のシトクロムP450酵素がそれぞれ6-オキソカンペスタノール（6-オキソCN）からカタステロン(CT)への変換、CTからテアステロン(TE)への変換、および6-デオキソカスタステロン（6-デオキソCS）から6-ヒドロキシカスタステロン(6-OHCS)を経由してCSへの変換におけるBR生合成経路で今まで同定されていた（Szekeresら, 1996; Choeら, 1998; AsamiおよびYoshida, 1999; Bishopら, 1999）。また、DWF4およびCPDも後期C-6酸化経路における相当する過程を触媒作用する（図5A）。少なくとも３種のP450酵素がカンペスタノール(CN)から6-OHCNへの変換過程、TYからCSへの変換過程、CSからBLへの変換過程、および6-デオキソTYから6-デオキソCSへの変換過程を含む、BR生合成経路にかかわっていた（図5A）（AsamiおよびYoshida, 1999; SakuraiおよびFujioka, 1997）。
【００３１】
DDWF1により触媒作用され、pra2トランスジェニック植物中で中断された一つ以上の生合成過程を解明するために、pra2トランスジェニック植物を種々のBR中間体の存在下で生育した。試験したBR中間体はCN、6-デオキソCT、6-デオキソTE、6-デオキソTY、6-デオキソCS、6-オキソCN、CT、TE、6-OHCS、TY、CS、およびBLを含んでいた。これらの中で、CSおよびBLが小発育胚軸を完全に救済した（図5B）。また、6-OHCSおよび6-デオキソCSがそれぞれBL効果の約50％および60％の若干の刺激効果を示した（図5C）。これらの結果はDDWF1がTYからCSへの過程および6-デオキソTYから6-デオキソCSへの過程を触媒作用することを示す。
【００３２】
DDWF1の基質特異性を確かめるために、TY、CS、およびBLを組換えDDWF1で処理し、反応混合物をHPLCで分析した（Noguchiら, 1999）。TYのみがCSに変換された（図5C）。しかしながら、CSはDDWF1の基質ではなかった。これらの結果は、BR飼養結果と合わせてDDWF1がC-2ヒドロキシル化を触媒作用することを示し、BR飼養データの結果（図5B）と一致する。また、異なるP450がCSからBLへの変換を媒介することが明らかである。加えて、本発明者らのデータは初期C-6酸化経路がArabidopsisで観察されたように暗所生育タバコ植物で支配的であることを示唆し、この場合、初期C-6酸化経路は暗所で支配的であり、後期C-6酸化経路は明所で支配的である（Fujiokaら, 1997）。
DDWF1は専ら胚軸伸長に機能を果たす
本発明者らの観察はDDWF1がBR生合成を調節し、その活性が暗所でPra2によりさらに誘導されることを示す。胚軸生長におけるDDWF1の調節的役割についての更なる識見を得るために、ddwf1遺伝子をトランスジェニックArabidopsis植物に導入した。DDWF1を過剰発現するトランスジェニック植物は明所および暗所の両方で対照植物の胚軸より極めて長い胚軸を示した（図６）。逆に、その他の植物部分は有意に影響されなかった。これらの観察はDDWF1が胚軸生長のみに機能的であり、その他の植物部分中ではそうではないことを明らかにし、これはPra2およびDDWF1の発現パターンならびにそれらの器官特異的な分布と一致する。また、DDWF1は胚軸または茎に特異的である一種以上のコファクターを必要とすることが明らかである。さらに、DDWF1は二つの調節経路によりモジュレートされることが明らかである。明所で、DDWF1は基礎レベルに維持され、これは依然として光形態形成性の茎生長には充分である（図6Bおよび6C）。暗所では、DDWF1はPra2によりさらにアップレギュレートされる（図6A）。一緒にすれば、これらはDDWF1-Pra2相互作用が幼植物の暗所発育プロセス、とりわけ胚軸生長に関する分子メカニズムであることを示し、これは植物が光源に有効に到達するのに重要なメカニズムである（ArnimおよびDeng, 1996）。しかしながら、Pra2-DDwf1相互作用は明所生育植物では重要な調節因子ではないと考えられる。
植物中の小GTPase-シトクロムP450相互作用
本発明者らは本発明者らの実験からDDWF1がPra2小GTPaseの機能性エフェクターであり、Pra2-DDWF1相互作用が植物中の暗所発育経路におけるBRシグナルと光との統合に関する直接の分子上の手がかりであると結論する。シトクロムP450酵素は完全活性のためにER膜上の他の補足タンパク質とともに多成分複合体を形成する（Diekmannら, 1994）。Pra2はDDWF1酵素を直接活性化し、またはER膜の機能性酵素複合体の形成を誘発することができた。あるいは、それはDDWF1酵素複合体に膜輸送を介して一種以上の必須コファクターをもたらすであろう。DDWF1を過剰発現するトランスジェニックArabidopsis植物は明所でさえも増進された茎生長を示すが、その他の植物部分では有意な表現型変化を伴わない。この特徴は黄化幼植物中の胚軸生長に似ている。それ故、ER膜に結合したもしくはサイトゾルの、またはその両方の胚軸（または茎）特異的コファクターがPra2-DDWF1相互作用に必要とされることが予想される。加えて、GTPaseはGTP結合活性形態とGDP結合不活性形態の間でサイクルする分子スイッチである。GTP結合Pra2はER膜に局在化され、そこでDDWF1と会合する。一緒に考えると、おそらくPra2はDDWF1を直接活性化するのではなくER膜の機能性DDWF1酵素複合体の形成を誘発する。
【００３３】
シトクロムP450酵素は植物中で多数の生合成プロセスを行なう（Lesterら, 1997; Rouleauら, 1999）。Pra2-DDWF1相互作用は植物で報告された最初のシトクロムP450-小GTPase相互作用である。しかしながら、動物系では良く特性決定された先例がある。シトクロムB558-Rac小GTPase相互作用が広範に研究されていた（Diekmannら, 1994; Nisimotoら, 1997; WittstockおよびHalkier, 2000）。原形質膜結合シトクロムB558は、微生物感染により刺激されると、２種のサイトゾルパートナー、p67phoxおよびp47phoxと会合して多成分NADPHオキシダーゼ複合体を組み立てる。Rac小GTPaseはまたp67phoxとそしておそらくシトクロムB558との直接的相互作用による機能性酵素複合体の形成に必要とされる（Nisimotoら, 1997）。同様のメカニズムがPra2-DDWF1相互作用に関係しているであろう。この仮説によれば、小GTPaseが植物中の内因性BRホルモンの最も豊富な供給源の一つである、植物中の花粉管の伸長に調節的役割を果たすことが最近示されたことは注目される（Kostら, 1999b; Liら, 1999）。花粉管発育はまたBR欠乏によりひどく影響され、花粉管の遅延された生長のために雄性不稔性をもたらす。伸びている根毛は実質的に同じ分子プロセスにより調節されるであろう（Kostら, 1999a）。これはまた根中のddwf1遺伝子の発現レベルが暗所生育植物よりも明所生育植物中で高いという本発明者らの観察（図1C）と関連し、これは根毛中の細胞伸長に対するDDWF1の役割を示唆した。
【００３４】
Pra2小GTPaseおよびPra3小GTPaseは全配列にわたって65％の配列相同性を有する。両方とも暗所誘導され、上胚軸中でのみ発現される。しかしながら、DDWF1は専らPra2と会合し、Pra3とは会合しない。このことは植物中のそれぞれの小GTPaseが植物中の様々な細胞プロセスに異なる役割を有し得ることを示唆する。それはまた今までに同定された小GTPaseと相互作用するエフェクターが広範な構造上および機能上の多様性を示すという事実（Echardら, 1998; Uedaら, 2000）と矛盾しない。
Pra2およびDDWF1発現の調節：非依存性または相互作用性？
本発明者らの結果に基づいて、本発明者らは図７に示されたPra2-DDWF1相互作用に関する研究モデルを支持する。暗所では、Pra2が誘導され、GTP会合後にERに局在化される。ER結合Pra2は機能性酵素複合体の形成を誘発することにより、または一種以上のサイトゾル・コファクター（図７中の因子Ｘ）をDDWF1に動員することによりDDWF1を活性化する。本発明者らの観察はPra2局在化が二つのその後の過程、即ち、暗所誘発発現による過程とGTP会合による別の過程により調節されることを示す。逆に、DDWF1はそれが発現されるとERに会合する運命にあると考えられる。これらはPra2活性がまたその他の因子、例えば、環境ストレスだけでなく、GTP-GDPサイクルを通して光によりモジュレートされ得ることを示唆する。一緒にして考えると、本発明者らの観察はPra2およびDDWF1が二つの別個の光調節経路により調節されることを強く示唆する。しかしながら、それらは完全には非依存性ではないが、シグナリングカスケードにおいて共通の過程を共有するであろう。
【００３５】
別の疑問はどの光受容体がPra2-DDWF1相互作用を調節するのかということである。pra2遺伝子のDE1要素はフィトクロムおよび青色光の光受容体からの光シグナルに応答する（Inabaら, 1999; Inabaら, 2000）。それゆえ、光自体が波長にかかわらずPra2の発現を抑制することは明らかであり、これはまたPra2が植物における黄化プロセスをモジュレートする分子スイッチであるという仮説と一致する。ddwf1遺伝子はpra2遺伝子の場合と同様の様式で調節されるであろう。ddwf1遺伝子の5'非翻訳領域の分析がこの疑問を解明するであろう。核因子は、未だ単離されていないが、暗所中でDE1要素のみに特異的に結合したことが報告されており、それがpra2発現の正のレギュレーターであることを示した（Inabaら, 1999）。このトランス作用性因子がまたddwf1遺伝子のプロモーター領域に結合するか否かを調べることは重要であろう。
幼植物発育におけるPra2-DDWF1相互作用の役割
幼植物発育は光条件に最も応答的である発育プロセスの一つである。暗所生育幼植物は明所中または明暗サイクルの下に生育された幼植物とは顕著に異なる（ArnimおよびDeng, 1996）。暗所発育経路における幼植物（黄化された）は胚軸において促進された細胞伸長を示すが、光に到達する葉および根において生長が最小である。逆に、光調節された発育におけるもの（光形態形成性）は、独立栄養の光合成のために最適化された形態を形成する（ArnimおよびDeng, 1996）。こうして、幼植物の黄化は自然界で生き残るのに重要である活発かつ統合的な生理的プロセスと考えられるべきである。
【００３６】
本発明者らはここでPra2が媒介する光シグナルおよびBRシグナルの統合が黄化-脱黄化遷移の分子基盤であることを示す。Pra2は黄化の正のレギュレーターと見なされるが、また光形態形成には負のレギュレーターと見なし得る。Pra2は全BR生合成経路を調節しないことが明らかである。DDWF1はおそらく明所でさえもあるレベルで発現され、生涯期間にわたって機能的である。本発明者のデータはDDWF1が暗所で、特に幼植物発育中にPra2によりさらに誘導され、活性化されることを示す。ある種の植物では、BLではなく、CSが活性BRであると考えられる。それゆえ、Pra2がCSからBLへの変換ではなく、C-2ヒドロキシル化によるBR生合成を調節する光調節性の分子スイッチであることは妥当である。光媒介性C-2ヒドロキシル化は、全てではないとしても植物における暗所発育生長の普遍的な調節メカニズムであろう。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
【表２】
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【００３９】
【表３】
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【００４０】
【表４】
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【００４１】
【表５】
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【００４２】
【表６】
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【００４３】
【表７】
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  DDWF1タンパク質およびddwf1遺伝子の発現パターン。(A)DDWF1タンパク質（GenBank受理番号AF218296）の一次構造。Ｎ末端の膜係留領域（イタリック体）、プロリンに富む領域（ボックス）、ならびにジオキシゲン（細い下線）、ステロイド（太い下線）、およびヘム（ボールド体）に関する結合モチーフが示される。ヘムが共有結合されているシステイン残基が陰影を付されている。中央の可変領域が陰影付のボックスにされている。(B)生後６日の黄化エンドウ豆幼植物。エンドウ豆幼植物が番号により示されるように芽(1)、頂端フック(2)、および茎部分(3および4)、および根(5)に切開され、全RNAがそれぞれの部分から別々に抽出された。(C)ノーザンブロット分析。番号は(B)中の番号に等しい。下部パネルは標識リボソームDNAで探索された18SリボソームRNAを示す。
【図２】  Pra2-DDWF1相互作用。(A)Pra2突然変異体。Thr34およびGln79がそれぞれAsnおよびLeuで置換されて優性陰性形態(T34N)および構成的活性形態(Q79L)を生じた。(B)Pra2とDDWF1とのインビトロ結合。GSTが対照として使用された。20mMマグネシウムイオンが加えられ(+)、または省かれた(-)。同じ量のPra2タンパク質およびGSTタンパク質がそれぞれのアッセイに使用された（下部パネル）。(C)E. coli細胞中で発現された組換えDDWF1タンパク質。(DおよびE) DDWF1活性。全ての反応混合物がDDWF1以外は同じ成分を含んでいた。種々の量のDDWF1が(E)に示されるように含まれていた。B1およびB2はそれぞれ6-デヒドロテストステロンおよび2α-ヒドロキシテストステロン（Waxman, 1991）であると予想された。
【図３】  ERへのPra2およびDDWF1の同時局在化。(A)融合構築物。ER特異的シグナルペプチドがGFPに結合され、ER局在化の対照として使用された(ER-GFP)。GFPおよびRFPがまた対照として入れられた。青色ボックスは膜係留モチーフを示す。(B)Pra2およびDDWF1の同時局在化。融合構築物がタマネギ表皮細胞中で一時的に発現され、蛍光顕微鏡で調べられた。−；10μm。
【図４】  Pra2トランスジェニック植物。(A)トランスジェニックタバコ植物の暗所生育幼植物。幼植物が10-8Mブラシノリド（brassinolide）の不在下(-)または存在下(BL)で４日間(a)または７日間(b)にわたって暗所で生育された。それぞれのグループの２つの代表的な幼植物が示された。(BおよびC)BLの不在下(B)または存在下(C)の幼植物の生長速度論。センス(S1およびS2)トランスジェニック植物およびアンチセンス(AS1およびAS2)トランスジェニック植物の二つのホモ接合体系統が対照植物(C)と平行して調べられた。それぞれの系統の30-50個の幼植物の胚軸の長さが平均された。(A)中の−；5mm。
【図５】種々のBR中間体による飼養実験。(A)BR生合成経路。活性および基質特異性が確認されたCPD、DWF4、およびＤが示される。少なくとも３種のシトクロムP450酵素が“P450”により示されるように提案される。(B)および(C)BR飼養実験。アンチセンスpra2トランスジェニック植物が完全な暗闇(B)中でBR中間体の存在下で５日間にわたって生育され、30-50個の幼植物の胚軸の長さが測定され、平均された(C)。(D)DDWF1の基質特異性。BR中間体がDDWF1で処理され、HPLCで分析された。TY、CS、およびBLによる結果が示される。
【図６】  DDWF1トランスジェニックArabidopsis植物。ddwf1遺伝子がセンス配向でArabidopsis植物に導入された。トランスジェニック植物が完全な暗闇(A)中または光(B)中で６日間生育された。二つのホモ接合体系統（センス-1およびセンス-2）の２種の代表的な植物が示される。(C)光学顕微鏡で調べられた暗所生育トランスジェニック植物および対照植物の胚軸からの細胞。
【図７】  Pra2-DDWF1相互作用の研究モデル。Pra2 GTPaseは黄化エンドウ豆幼植物の上胚軸生長において光およびBRシグナルを統合する分子媒介物質（mediator）として機能する。Pra2はDDWF1を直接活性化するか、またはその他のER関連因子または細胞質因子（Ｘにより示される）を動員することによりER膜における多成分シトクロム複合体の形成を促進するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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