(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行なわせる反応工程を備えた、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物の製造方法であって、
前記反応工程は、反応液中の原料乳糖濃度を経時的に測定する乳糖測定工程と、
この測定結果に基づき、原料乳糖濃度が初期濃度の４０〜６０％の範囲内にある時点で反応停止させる反応停止工程と、
を含むことを特徴とする３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法。
【請求項２】
ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いることを特徴とする請求項１に記載の３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ガラクトシダーゼによるガラクトース転移反応によって、乳糖からガラクトオリゴ糖、特に３’ガラクトオリゴ糖（Gal-Gal 結合がβ（１→３）結合様式のガラクトオリゴ糖）を豊富に含む組成物を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（式中、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１から３の整数を表す）で示されるガラクトオリゴ糖は、腸内でビフィズス菌の増殖促進物質として機能し、整腸作用などが期待できることから、機能性食品の素材として、種々の利用が行われている。
【０００３】
ガラクトオリゴ糖は、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行なわせることによって得られる。その結合様式としては、β（１→２）、β（１→３）、β（１→４）、β（１→６）などの存在が知られており、使用するβ−ガラクトシダーゼの由来の相違による特異性に依存して、各結合様式の異なるオリゴ糖の生成比率に差があるが、一般には、種々の結合様式のものが混合物として得られている。
【０００４】
しかしながら、ヒトの腸内ビフィズス菌に対する増殖促進作用としては、結合様式の違いにあまり依存しないこともあり、それぞれの結合様式別に、或は特定の結合様式のもののみを分離する試みなどは殆ど行われていなかった。
【０００５】
一方、最近、稀少動物の人工飼育技術の研究のなかで、オーストラリア産のある種の有袋類や単孔類に属する動物、例えば、ワラビー、カンガルー、ハリモグラなどでは、母乳中の糖成分において、ヒトなどの真獣類の母乳と異なり、ラクトースよりオリゴ糖の方が含有量が多く、各結合様式の異なるオリゴ糖の成分比にも各々特徴があることが明らかとなっている（参照；研究のスポット，化学と生物，p816,vol.33,12,1995 , Michael Messer) 。
【０００６】
なかでも、ワラビーなど特定の動物では、母乳中の主要なオリゴ糖がβ（１→３）系統の結合様式を有するガラクトオリゴ糖であることが明らかとなっている。従って、これら希少動物の人工飼育を目的としたより天然に近い人工乳を製造するためには、その母乳中に主要に含まれる特定の結合様式のガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物が不可欠である。さらに、最近ヒトの母乳や馬乳、牛乳中にも３’ガラクトオリゴ糖が含まれていることが明らかになっており、その機能を究明する上でも、３’ガラクトオリゴ糖は有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の如き、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトオリゴ糖を製造する従来の方法では、得られる反応生成物は種々の結合様式のものの混合物である。この混合物中から、特定の結合様式を持つガラクトオリゴ糖のみを分離精製することは、困難であり、また、製造工程としては非常に煩雑なものとなるため、実用的ではない。
【０００８】
本発明は、上記問題点を鑑み、今回、特に３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物を特異的に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、請求項１に記載の発明に係る３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法では、原料乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行なわせる反応工程を備えた、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物の製造方法であって、前記反応工程は、反応液中の原料乳糖濃度を経時的に測定する乳糖測定工程と、この測定結果に基づき、原料乳糖濃度が初期濃度の４０〜６０％の範囲内にある時点で反応停止させる反応停止工程と、を含むものである。
【００１０】
また、請求項２に記載の発明に係る３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法では、請求項１に記載の３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法において、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いるものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、種々検討を行なった結果、β−ガラクトシダーゼを用いて乳糖を処理し、この反応を原料乳糖が約５０％消費された時点で反応を停止し、反応混合物中から３糖以上の画分を分離したところ、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物が得られることを見出し、本発明に至ったものである。
【００１４】
即ち、ガラクトース転移反応において、従来のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトオリゴ糖製造の場合のように、反応の定常状態まで原料乳糖の消費が進むと、その他の結合様式のガラクトオリゴ糖や単糖類が増加し、全糖中の３’ガラクトオリゴ糖自体の含有率が減少してしまうということである。
【００１５】
従って、ガラクトース転移反応において、３’ガラクトオリゴ糖自体の含有率がピークになった時点で反応を停止すれば、そこで得られる反応生成物としての糖組成物は、従来に比べて、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含むものである。
【００１６】
そこで、本発明においては、反応工程において原料乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行なわせ、反応停止工程として予め定められた時点で反応を停止するものである。この反応停止時点を、３’ガラクトオリゴ糖自体の含有率がピークである付近とすれば、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物が製造でき、この糖組成物を飼育動物用人工乳の材料として利用し、特殊動物の天然母乳により近いものを製造することも可能となる。
【００１７】
もちろん、反応工程後にさらに適当な精製工程、例えば活性炭カラムクロマトグラフィーやイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーなどにより、反応停止後に得られた反応液中の糖組成物から３糖以上のオリゴ糖画分を分離精製しても良い。また必要で有れば、さらに、精密に精製を繰り返すことにより、３’ガラクトオリゴ糖の純度を高めることができる。これらの場合でも、本発明による製造法では、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含むため、精製が容易である。
【００１８】
なお、本発明に用いるβ−ガラクトシダーゼとしては、３’ガラクトオリゴ糖を生産できるものであれば種々のものが使用可能である。β−ガラクトシダーゼは種々の細菌や酵母等の菌体内で生産されており、これらの菌体由来の酵素を利用できる。β−ガラクトシダーゼ産生菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ，ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・ブルガリカス，ストレプトコッカス・ラクチス，ラクトバチルス・サリバリウス，ラクトバチルス・ライヒマニー，ラクトバチルス・ヘルペティクス，バチルス・ブレビス，バチルス・ステアロサーモフィルス，ビフィドバクテリウム・ビフィダム，ビフィドバクテリウム・ブレーベ，ビフィドバクテリウム・ロンガム，ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス，クルイベロマイセス・フラジリス，クルイベロマイセス・ラクチス，カンジダ・シュードトロピカリス，大腸菌等が挙げられる。
【００１９】
これらの中で、特に３’ガラクトオリゴ糖の生産能が高いβーガラクトシダーゼ産生菌として、ラクトバチルス・ブルガリカス，ストレプトコッカス・サーモフィルス，ビフィドバクテリウム属，クルイベロマイセス・ラクチス等が好適である。
【００２０】
また、酵素の使用形態も特に制限はなく、菌体より抽出・精製されたものに限らず、菌体を破砕して不溶物を除いた程度の粗酵素、また従来から公知の、例えば、生菌体または殺菌した死菌体をそのまま使用する方法、菌体を界面活性剤で処理した菌体酵素として使用する方法、また、適当な担体で固定化して使用する方法などが適応できる。
【００２１】
なお、上記菌体のなかでも、請求項２に記載したように、ストレプトコッカス・サーモフィルス（以下、Ｓ．サーモフィルスと記す）由来のβ−ガラクトシダーゼを用いることが好ましい。これは、Ｓ．サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼのガラクトース転移反応における特異性は、受容体が乳糖の場合、β（１→３）結合性と考えられるからである。特に、３’ガラクトオリゴ糖が豊富な糖組成物の製造を目的とする本発明においては有効である。
【００２２】
また、従って受容体としての乳糖濃度が優勢な状況下では、３’ガラクトオリゴ糖の生成比率が優勢であると考えられる。一方、反応進行に伴い、加水分解物である単糖やその他のオリゴ糖が増えてくると、これらも受容体として機能するので、β（１→３）以外の結合性を有するオリゴ糖が生成し、結果的に選択性が低下してしまうと思われる。
【００２３】
請求項１に記載の発明では、反応工程において、反応液中の原料乳糖濃度が初期濃度の４０〜６０％の範囲内にある時点で反応停止を行なうものである。前述のように、β−ガラクトシダーゼによるガラクトース転移反応において受容体としての乳糖濃度が優勢な状況下では、３’ガラクトオリゴ糖の生成が優勢であると考えられ、また収量としての効率との関係から、乳糖約５０％前後消費の時点、即ち反応液中の残留乳糖濃度が４０〜６０％にある時に停止するのが現実的である。
【００２４】
この場合、反応工程は乳糖測定工程を含み、反応液中の原料乳糖濃度を経時的に測定し、反応液中の原料乳糖濃度が初期濃度の４０〜６０％になった時点で反応停止工程を行なう。
【００２５】
また、反応停止時点の決定は、反応工程の前に、反応工程と同条件での予備反応工程を設け、この予備反応工程においてオリゴ糖測定工程として反応液中の３’ガラクトオリゴ糖濃度を経時的に測定し、反応停止時間決定工程としてこの測定結果に基づいて前記反応工程における反応停止までの時間を決定する方法によれば、その反応条件における最も３’ガラクトオリゴ糖が高い率で生成された時点を反応停止時点として決定することができる。
【００２６】
反応を停止した反応液から、適当な精製方法、例えば活性炭カラムクロマトグラフィーやイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーにより３糖以上の画分を分離することにより、本発明の目的とする３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物が得られる。また、必要であれば、さらに、精密に制せを繰返すことによって３’ガラクトオリゴ糖の純度を高めることができる。
【００２７】
なお、本発明に用いる原料乳糖は、精製されたものに限らず、乳糖を主成分として含むような素材でも、β−ガラクトシダーゼによるガラクトース転移反応を阻害するような因子を含まなければ特に制限はなく、例えば乳ホエーなども利用可能である。この原料乳糖は、反応工程においては通常、適当な濃度、例えば乳糖濃度で５〜６０％の水溶液とし、必要で有れば、ｐＨを調整したのち、β−ガラクトシダーゼ処理に付す。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をもって詳細に説明する。
（実施例１）
本発明の第１の実施例として、乳糖にβ−ガラクトシダーゼとしてＳ・サーモフィルスの菌体をショ糖脂肪酸エステルで処理して得られる菌体酵素を作用させて３’ガラクトオリゴ糖を含有する糖組成物を製造する場合を以下に示す。
【００２９】
菌体酵素の調整は、特開平２−３０３４８６号公報に記載されている方法を用いることができる。即ち、まずＳ・サーモフィルスを、ホエーパウダーに酵母エキス０．５％を含む培地で培養し、β−ガラクトシダーゼを蓄積された菌体の培養液を遠心分離して菌体を集め、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液を加えて菌体懸濁液とする。
【００３０】
この菌体懸濁液に界面活性剤であるショ糖脂肪酸エステルを０．３〜３％となるように加え、５０℃前後で約１５分〜２時間加温処理を行なった。処理後回収した菌体酵素を、ｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液に懸濁して菌体酵素溶液を調製し、３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物製造のための反応工程に供した。
【００３１】
なお、菌体酵素のβ−ガラクトシダーゼ活性測定は、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質として４０℃で１０分間反応し、、１分間に１μmol のＯ−ニトロフェノールを生成するのに要する酵素量を１unitとした。
【００３２】
原料乳糖は、メルク社製の乳糖をリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．２）に加熱溶解し、各々濃度５ｗｔ％，２０ｗｔ％，５０ｗｔ％の乳糖溶液を調整した。これら各濃度の乳糖溶液に、乳糖１ｇ当り１０ unit β−ガラクトシダーゼとなるように菌体酵素溶液を添加し、５０℃で反応させた。
【００３３】
反応開始後、２０分，４０分，６０分，９０分，１５０分，２４０分，３６０分および６４０分の時点で反応液をサンプリングし、各々酵素を失活させたうえで反応液中の糖の組成をゲルろ過高速液体クロマトグラム法により定量した。その結果を図１に示す。
【００３４】
なお、それぞれ（ａ）は乳糖初期濃度５％の場合、（ｂ）は乳糖初期濃度２０％の場合、（ｃ）は乳糖初期濃度５０％の場合を示しており、また測定した糖はそれぞれＧａｌ（×）およびＧｌｃ（＊）の単糖、主に乳糖を含む２糖（丸印）、３糖（逆三角印）、４糖（四角印）、５糖（菱形印）である。また、反応液中の糖のうち、３糖の反応液中全固形分における含有率をピリジルアミノ誘導体化法（特開平６−１１８０７２号公報参照）により測定し、以下の表１に示す。
【００３５】
【表１】
0003871371.tif 000002
【００３６】
まず、図１から明らかなように、いずれの乳糖初期濃度に拘わらず、乳糖の濃度が、初期濃度の６０％〜４０％にまで消費された時点、ここでは反応開始から約１５０分経過後に、３糖の生成量が最大値となっていた。さらに反応を継続すると徐々に３糖類の量が減少している。
【００３７】
また、表１で明らかなように、この時点での、３糖中の３’ガラクトオリゴ糖の量は、６０％以上であることが判る。また、さらに反応を継続した場合、８時間後には、３糖中の３’ガラクトオリゴ糖は主成分とは言えなくなっていることが判る。
【００３８】
以上の結果から、β−ガラクトシダーゼとしてＳ・サーモフィルス由来の菌体酵素を用いてガラクトオリゴ糖製造のための反応工程を行なう場合、乳糖が初期濃度の６０％〜４０％となった時点で反応を停止させれば、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物を得ることができる。
【００３９】
また、上記の結果に基づいて、反応開始から約１５０分経過時点を反応停止時と定め、実際の反応工程においてこの予め定めた時間が経過した時点で反応を停止することにより反応中最も３糖の生成量が最大値であり、またその３糖中、３’ガラクトオリゴ糖が主成分である状態の糖組成物が得られる。
【００４０】
（実施例２）
次に、本発明の第２の実施例として、乳糖にβ−ガラクトシダーゼとしてＳ・サーモフィルス菌体を破砕した粗抽出酵素を作用させて３’ガラクトオリゴ糖を含有する糖組成物を製造する場合を以下に示す。
【００４１】
まず、Ｓ・サーモフィルスを、１％乳糖を炭素原として含む液体ロゴサ培地で培養し、β−ガラクトシダーゼが蓄積された菌体の培養液を遠心分離して得られた菌体を、フレンチプレスで破砕処理を行なった。その後、遠心分離することによって粗抽出酵素液を得た。この酵素液をｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液に懸濁して酵素溶液を調製し、３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物製造のための反応工程に供した。
【００４２】
原料乳糖は、メルク社製の乳糖をリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．２）に加熱溶解し、各々濃度５ｗｔ％，２０ｗｔ％，５０ｗｔ％の乳糖溶液を調整した。これら各濃度の乳糖溶液に、乳糖１ｇ当り１０ unit β−ガラクトシダーゼとなるように粗酵素溶液を添加し、５０℃で反応させた。
【００４３】
反応開始後、２０分，４０分，６０分，９０分，１５０分，２４０分，３６０分および６４０分の時点で反応液をサンプリングし、各々酵素を失活させたうえで反応液中の糖の組成をゲルろ過高速液体クロマトグラム法により定量した。その結果は図２に示す。それぞれ（ａ）は乳糖初期濃度５％の場合、（ｂ）は乳糖初期濃度２０％の場合、（ｃ）は乳糖初期濃度５０％の場合であり、また測定した糖はそれぞれＧａｌ（×）およびＧｌｃ（＊）の単糖、主に乳糖を含む２糖（丸印）、３糖（逆三角印）、４糖（四角印）、５糖（菱形印）である。また、３糖の反応液中の全固形分における含有率を以下の表２に示す。
【００４４】
【表２】
0003871371.tif 000003
【００４５】
図２および表２から明らかなように、いずれの乳糖初期濃度に拘わらず、乳糖の濃度が、初期濃度の６０％〜４０％にまで消費された時点、ここでは反応開始から約１５０分経過後に、３糖の生成量が最大値となっていた。さらに反応を継続すると徐々に３糖類の量が減少している。
【００４６】
従って、β−ガラクトシダーゼとしてＳ・サーモフィルス由来の粗抽出酵素を用いてガラクトオリゴ糖製造のための反応工程を行なう場合、乳糖が初期濃度の６０％〜４０％となった時点で反応を停止させれば、３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含む糖組成物を得ることができる。
【００４７】
なお、反応工程終了後、さらに、精製工程として、例えば活性炭カラムクロマトグラフィーやイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーなどにより、得られた反応液中の糖組成物から３糖以上のオリゴ糖画分を分離精製することにより、３’ガラクトオリゴ糖含量の高い糖組成物を得ることができる。また必要で有れば、さらに、精密に精製を繰り返すことにより、３’ガラクトオリゴ糖の純度を高めることができる。
【００４８】
（実施例３）
次に、本発明の第３の実施例として、反応工程終了後の反応液について、３糖以上のオリゴ糖画分を分離精製することにより、３’ガラクトオリゴ糖含量の高い糖組成物を得る場合を以下に示す。
【００４９】
２０％乳糖溶液に、実施例１で使用したものと同じＳ．サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼ菌体酵素を１０unit／乳糖１ｇで加え、５０℃で１５０分反応を行なった。反応液中の乳糖濃度を測定したところ、初期濃度の約５０％であったので、反応液を８０℃に加熱して反応を停止した。
【００５０】
反応液を活性炭カラムに展開し、まず、精製水で洗浄して単糖類と２糖類の殆どを溶出した。次いで、５０％エタノール／精製水で３糖以上の画分を溶出した。この３糖以上の画分について、ピリジルアミン誘導体化法により分析を行なった結果、３’ガラクトオリゴ糖が６０％以上含まれていた。以上のように、反応工程後さらに３糖以上の画分を分離精製することによって、３’ガラクトオリゴ糖含量の高い糖組成物を得ることができる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、原料乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させる反応工程において、予め定められた時点で反応を停止することによって、生物学的に重要な３’ガラクトオリゴ糖を豊富に含有する糖組成物を簡便な方法により製造することができる。という効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例による、３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物製造のための反応工程において経時的に反応液中の糖組成を測定した結果を示す線図であり、（ａ）は乳糖初期濃度５％の場合、（ｂ）は乳糖初期濃度２０％の場合、（ｃ）は乳糖初期濃度５０％の場合をそれぞれ示したものである。
【図２】本発明の第２実施例による、３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物製造のための反応工程において経時的に反応液中の糖組成を測定した結果を示す線図であり、（ａ）は乳糖初期濃度５％の場合、（ｂ）は乳糖初期濃度２０％の場合、（ｃ）は乳糖初期濃度５０％の場合をそれぞれ示したものである。
【図１】
0003871371.tif 000004
【図２】
0003871371.tif 000005