(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルセリンを含むリン脂質混合物をアルコール類に溶解した後、不溶性成分を除いた該溶解液中に金属塩をリン脂質１ｇあたり０．１５〜１０ミリモル添加することによりホスファチジルセリンを不溶化せしめ、該不溶部を分離することを特徴とするホスファチジルセリンの分画法。
【請求項２】
前記金属塩として、リチウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩から選ばれる１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１に記載のホスファチジルセリンの分画法。
【請求項３】
前記金属塩として、塩化リチウム、塩化カリウム又は塩化ナトリウムを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のホスファチジルセリンの分画法。
【請求項４】
前記アルコール類として、エチルアルコールを用いることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のホスファチジルセリンの分画法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リン脂質混合物からホスファチジルセリンを濃縮するための分画法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジルセリン（以下、「ＰＳ」と記載する。）は、痴呆症の予防や治療などを目的とした脳機能改善剤の他、免疫性疾患の治療剤や界面活性剤としての利用が期待されている。このＰＳは動物の脳や筋肉に含まれる他、化学合成法やホスホリパーゼＤを使用したホスファチジル基転移反応により人工的に製造することも可能である。
【０００３】
ＰＳは主に医薬や食品、化粧品として使用されていることから、前記天然物や反応物等からＰＳを分画し、ＰＳ含量を高めることが重要である。ところが、動物の脳や筋肉に含まれるＰＳ量は少なく、また化学合成法やホスファチジル基転移反応により製造した場合にも、ＰＳ含量の多い製品を安価に製造することは難しいことから、使用に際してはＰＳの濃縮（精製）が必要となる場合が多い。
【０００４】
ＰＳの濃縮（精製）法としては、従来、溶媒による分画やカラムクロマトグラフィーが用いられてきた。しかし、溶媒分画のみでは充分なＰＳ純度を得ることは困難であり、一方、クロマトグラフィーのような煩雑な操作は、コスト面、作業性の面で問題があった。このため、ＰＳを安価かつ簡便に濃縮する方法の開発が望まれている。
【０００５】
特に、ＰＳは他のリン脂質、すなわち、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）やホスファチジン酸（ＰＡ）等と分離することが困難であるため、これらを含むリン脂質混合物から、ＰＳを安価に濃縮する方法を確立することが望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＳを含むリン脂質混合物をアルコール類に溶解し、さらに金属塩あるいはその溶液を添加することによりＰＳを沈殿せしめ、沈殿部に濃縮できることを見出した。
【０００７】
本発明は、天然あるいは人工的に調製されたリン脂質混合物からＰＳを簡便に濃縮する分画法を得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係るＰＳの分画法は、スファチジルセリンを含むリン脂質混合物をアルコール類に溶解した後、不溶性成分を除いた該溶解液中に金属塩をリン脂質１ｇあたり０．１５〜１０ミリモル添加することによりホスファチジルセリンを不溶化せしめ、該不溶部を分離するものである。
【０００９】
請求項２に記載された発明に係るＰＳの分画法は、請求項１に記載の金属塩として、リチウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩から選ばれる１種又は２種以上を用いるものである。
【００１０】
請求項３に記載された発明に係るＰＳの分画法は、請求項１又は２に記載の金属塩として、塩化リチウム、塩化カリウム又は塩化ナトリウムを用いるものである。
【００１１】
請求項４に記載された発明に係るＰＳの分画法は、請求項１〜３の何れかに記載のアルコール類として、エチルアルコールを用いるものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ＰＳを含むリン脂質混合物をアルコール類に溶解した後、該溶解液中に金属塩を添加するという簡略な操作によって、ＰＳを不溶化（沈殿、凝集等）させることにより、不溶物（沈殿部、凝集部等）を分離・濃縮する。これにより、天然あるいは人工的に調製されたリン脂質混合物からＰＳを簡便に濃縮することができる。
【００１３】
本発明に用いられるＰＳを含むリン脂質混合物としては、天然物、天然物からの抽出物又は該抽出物を精製したもの、或いは合成リン脂質等ＰＳを含む混合物であれば、いずれを用いてもよい。具体的には、大豆レシチン、菜種レシチン、卵黄レシチン、トウモロコシレシチン或いは綿実レシチンや、化学合成法やホスファチジル基転移反応により調製したリン脂質混合物、牛脳の溶媒抽出物等が挙げられる。中でも、ホスファチジル基転移反応により調製したＰＳを含むリン脂質混合物を用いれば、金属塩を添加した場合の濃縮効果が高く、原料の確保のしやすさやコスト面からも好ましい。
【００１４】
また、本発明に用いられる金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩、あるいはこれらを豊富に含む天然物、例えば、食塩、苦汁、かん水、ドロマイト、食用真珠層粉等いずれを用いても良いが、リチウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩を用いることが濃縮効率の点から好ましく、特に塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが好ましい。これらの金属塩は、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１５】
これら金属塩の添加量は、ＰＳを沈殿させ得る量であれば特に限定されないが、リン脂質１ｇあたり、０．１５〜１０ミリモル、特に０．５〜５ミリモルであることが、ＰＳの回収率および沈殿中のＰＳ含量が高い点から好ましい。
【００１６】
また、本発明に用いられるアルコール類としては、リン脂質混合物を溶解可能なアルコール類であればいずれも好適に用いられるが、中でもメチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール類が好ましい。また、これらの混合物を利用することもできるが、エチルアルコールは食品へ利用し易く、安全面での問題も少ないため、これを用いることが特に好ましい。
【００１７】
リン脂質混合物をアルコール類に溶解する際の濃度は特に限定されないが、この混合物が完全に溶解できる以上の量とすることが好ましく、アルコール類の重量に対し１〜５０％、特に２〜２０％とすることが、ＰＳ濃縮効率や操作性の点から好ましい。
【００１８】
本発明において、リン脂質混合物からのＰＳの分画は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、ホスファチジル基転移反応法等により調製され、ＰＣ、ＰＥ又はＰＡ等ＰＳ以外のリン脂質を成分中に含むリン脂質混合物を、エチルアルコール等のアルコール類に溶解する。この時、溶解温度等の溶解の条件は特に限定されず、混合物の成分の種類、それらの量等に合わせ好適な条件を選択し用いればよい。
【００１９】
こうして得られる溶液中では、ＰＳやＰＣ、ＰＡ等のリン脂質は溶媒層に抽出されるが、場合によっては一部の不溶性成分が生成する。このため、遠心分離、ろ過等の手段により溶媒から不溶性成分（沈殿物、凝集物等）を除いてから金属塩の添加を行う。不溶性成分中にも少量のＰＳが残存している場合には、前記アルコール類による抽出処理は、数度繰り返し行ってもよい。
【００２０】
次いで、アルコール溶液に対して、金属塩を添加し、溶媒層に抽出されたＰＳを分画する。すなわち、溶媒層中のＰＳ以外のリン脂質の大部分は、金属塩の添加によっても沈殿しないが、ＰＳはその大部分が沈殿するため、これを回収することによりＰＳの濃縮を行うことができる。このとき、金属塩は粉末のまま加えても、水やアルコール等の溶媒に溶かしてから加えてもよい。その際の各種条件も特に限定されず、混合物の成分の種類、それらの量等に合わせ好適な条件を選択すればよい。具体的には１０℃〜３０℃で３０分以上保持してＰＳを不溶化させればよい。
【００２１】
金属塩の添加により不溶化されたＰＳは、遠心分離、ろ過、静置分離等の手段により、回収することができる。また、公知の精製手段、例えばカラムクロマトグラフィー等の手段により、更に精製することも可能である。本発明のＰＳ濃縮物は他のリン脂質等の含量が顕著に低下しているため、このような精製手段も比較的簡便に行うことができる。
【００２２】
本発明のＰＳ濃縮物は、医薬品、食品、化粧品等の形態で投与することができる。例えばリン脂質の生理効果を訴求する医薬品や栄養補助食品等の形態で用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。また、経口投与剤でなくとも、注射剤、皮膚外用剤、直腸投与剤等非経口形態で投与することも可能である。
【００２３】
各製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、モノグリセリド、蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤や、その他、医薬・食品として許容され得る成分を適宜使用すればよい。
【００２４】
また、同様の生理効果を期待して一般食品形態（「明らか食品」の形態）で用いる場合には、本発明の方法により得られたＰＳ濃縮物をそのまま或いは適宜精製処理したものを油脂、錠菓、発酵乳、飴、調味料、ふりかけ等の飲食品に添加し、常法を用いて製造すればよい。
【００２５】
これら医薬品、食品等の形態での使用に際しては、本発明の方法により得られたＰＳが濃縮されたリン脂質組成物を適宜配合することができる。また、ＰＳの生理効果を訴求する場合であれば、その効果を得られかつ過剰摂取等の問題が生じない程度の量、５０ｍｇ〜１０００ｍｇ／日程度の摂取が見込まれる量を適宜配合しておけばよい。
【００２６】
更に、本発明のリン脂質は乳化剤として用いてもよく、その際には、医薬品、食品、化粧品等へ０．０１〜１０％添加するのが好ましい。
【００２７】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
大豆レシチン（ＰＣ８０：クロクラーン社製）１０．０ｇと大豆油２．０ｇを１００ｃｃメジウム瓶に取り、ここに９０．０ｇ（１００ｍＬ）の酢酸エチルを加えてスターラーで撹拌しながら加温溶解した。Ｌ−セリン１．２ｇとＰＬＤ−Ｙ１（（株）ヤクルト本社製）１，５００単位を秤り取り、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５．８ｍＬを加えて溶解した。
【００２９】
ＰＣ８０溶液全量の入ったメジウム瓶を５０℃に保温しておき、ここに５０℃に保温した（Ｌ−セリン＋ＰＬＤ−Ｙ１）溶液の全量を加えて反応を開始し、スターラーで緩やかに攪拌しながら５０℃で５時間反応させた。３０分間氷冷してリン脂質を沈殿させて回収した後、熱湯中に２０分放置して酵素を失活させた。
【００３０】
回収したリン脂質層にエタノール４０ｍＬを加えて良く混合し、４℃に一晩放置することにより沈殿を形成させ、上清を回収した。沈殿部にはさらにエタノール１２ｍＬを加えて良く混合後３０分間放置し、遠心分離により上清を集め、先の上清と混合することにより大豆転移レシチン／エタノール溶液を得た。
【００３１】
このようにして得た大豆転移レシチン／エタノール溶液２．０ｍＬ（固形分約０．３３ｇ，リン脂質中のＰＳ含量＝３２．５％）に０．１Ｍ酢酸ナトリウム／エタノール溶液を１．０ｍＬ加えて−２０℃で１時間放置し、生じた沈殿（６０ｍｇ）を遠心操作により分離してエタノールで洗浄した（ＰｐｔＮａ−１）。上清を−２０℃で数日間保存した結果、さらに沈澱（７ｍｇ）を生じたので遠心操作により上清（ＳｕｐＮａ，乾固重量＝２２７ｍｇ）と分離し、エタノールで洗浄した（ＰｐｔＮａ−２）。
【００３２】
各試料を乾固した後、希釈溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル：イソプロパノール＝２：２：１）に溶解し、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール：酢酸＝１３：５：２）で展開してから、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬によりリン脂質を発色させ、ゲルパターン画像解析システムによりリン脂質含量を定量した。結果を次の表１に示す。
【００３３】
表１に示す通り、リン脂質中のＰＳ含量（モル％）は分画前は３２．５％であったのに対して、分画後のＰｐｔＮａでは８１．９％、ＳｕｐＮａでは５．６％であることがわかり、ＰＳが効率よく濃縮できることが確認された。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
実施例２
実施例１で調製した大豆転移レシチン／エタノール溶液を減圧乾燥し、そのうちの９００ｍｇを５０ｃｃメジウム瓶に取り、クロロホルム２２．５ｍＬとメタノール１５ｍＬの混合液に溶解させた。こうして調製した大豆転移レシチン／クロメタ溶液を４．０ｍＬずつ６．０ｃｃメジウム瓶に分注し、ここに１Ｍ塩類溶液（ａ．塩化リチウム、ｂ．塩化カリウム、ｃ．塩化ナトリウム、ｄ．塩化マグネシウム、ｅ．塩化カルシウム、ｆ．塩化アンモニウム、ｇ．硫酸アンモニウム）を０．８ｍＬ加えた。瓶を振って数回混合した後、静置してクロロホルム層を回収し、その内の１．０ｍＬを秤量した試験管に取り窒素下に乾燥した。
【００３６】
こうして得られた乾燥物（約５０ｍｇ，リン脂質含量＝約２５ｍｇ）に対して０．１０ｍｌのジエチルエーテルを加えて溶解し、ここに１．０ｍＬのエタノールを徐々に加えて沈澱を形成させ、懸濁液全体を遠心分離して上清と沈澱とを分けた。
【００３７】
エタノール抽出液は２．５倍希釈液を５μＬ、沈澱は全体を２．５ｍＬのクロロホルムに溶解したもの５μＬを薄層板にアプライし、実施例１の条件で展開後、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬によりリン脂質を発色させゲルパターン画像解析システムによりリン脂質含量を定量した。結果を次の表２に示す。
【００３８】
表２に示すように、使用した８種類の塩の中で塩化リチウムが最も成績が良く、１回のエタノール沈澱により純度８０％のＰＳ標品を得ることができた。さらに、塩化リチウムでは全ＰＡのうちの約４分の３がエタノール上清に分画されており、ＰＡの除去効率が際立って良いことがわかった。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
【表３】
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【００４１】
なお、全体的な傾向としては陽イオンの原子番号が小さいほどＰＡの除去効率が良く、２価の陽イオンではＰＣも沈澱することがわかった。また、アンモニウム塩の場合にはＰＳを含む大部分のリン脂質が沈殿せず分離には適さなかった。沈殿の成績のよい塩化リチウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムに関して、エタノール沈澱および上清画分中のリン脂質含量を表３に示す。
【００４２】
実施例３
実施例１で調製した大豆転移レシチン／エタノール溶液を減圧乾燥し、そのうちの９００ｍｇを５０ｃｃメジウム瓶に取り、クロロホルム２２．５ｍＬとメタノール１５ｍＬの混合液に溶解させた。こうして調製した大豆転移レシチン／クロロホルム−メタノール溶液に１Ｍ塩化リチウム溶液を８．０ｍＬ加え、瓶を振って数回混合した後、静置してクロロホルム層を回収し減圧乾固した。
【００４３】
得られた乾燥物に５．０ｍLのジエチルエーテルを加えて溶解し、ここに４０ｍＬのエタノールを徐々に加えて溶解し（２０℃）、懸濁液全体を遠心分離して上清（Ｓ１）と沈澱（Ｐ１）とを分離した。Ｐ１に再び５．０ｍLのジエチルエーテルを加えて溶解し、ここに５０ｍＬのエタノールを徐々に加えて溶解し（２０℃）、懸濁液全体を遠心分離して上清（Ｓ２）と沈澱（Ｐ２）とを分けた。
【００４４】
大豆転移レシチンは１０ｍｇ／ｍＬ、Ｐ２（湿潤状態）は２０ｍｇ／ｍＬのクロロホルムに溶解したものを５μＬ，Ｓ１はクロロホルムで２．５倍に希釈したものを５μＬ、そしてＳ２は原液１０μＬを薄層板にアプライし、実施例１の条件で展開後、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬によりリン脂質を発色させゲルパターン画像解析システムによりリン脂質含量を定量した。
【００４５】
エタノール沈澱物をもう一度エタノールで洗浄して得たＰ２画分中のＰＳ含量は９６．９％であった。ＣＭセルロースを用いたイオン交換法における回収率は２０％程度（参考例参照）であったが、本発明による分画法における回収率は約９０％と高く、高純度品を用いた効力評価や作用機構の解明、あるいは医薬品開発に際しての有用な精製手段となり得る。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
実施例４
実施例１で調製した大豆転移レシチン／エタノール溶液を減圧乾燥し、そのうちの９００ｍｇを５０ｃｃメジウム瓶に取り、クロロホルム２２．５ｍＬとメタノール１５ｍＬの混合液に溶解させた。こうして調製した大豆転移レシチン／クロロホルム−メタノール溶液を４．０ｍＬずつ６．０ｃｃメジウム瓶に分注し、ここに種々のｐＨのクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．８，３．６，４．１，４．６，５．０）に溶解した２Ｍ食塩水を０．８ｍＬ加えた。瓶を振って数回混合した後、静置してクロロホルム層を回収し、その内の２．５ｍＬを秤量した試験管に取り窒素下に乾燥した。
【００４８】
乾燥物（約１２０ｍｇ）に対して０．２ｍＬのジエチルエーテルを加えて溶解し、ここに２．０ｍＬのエタノールを徐々に加えて溶解し、懸濁液全体を遠心分離して上清と沈澱とを分離した。エタノール抽出液は１０倍希釈液を１０μＬ、沈澱は全体を１０．０ｍＬのクロロホルムに溶解したものを５μＬ、薄層板にアプライし、実施例１の条件で展開後Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬によりリン脂質を発色させ、ゲルパターン画像解析システムによりリン脂質含量を定量した。
【００４９】
ｐＨ３．６以上の条件ではＰＳもＰＡも共に沈澱画分に回収され（ＰＡ／ＰＳ＝０．２３）、両者を分離することはできなかった。これに対してｐＨ２．８では沈澱に含まれるＰＡ量が相対的に低く（ＰＡ／ＰＳ＝０．１５）、この条件でのエタノール処理を繰り返せばナトリウム塩の状態でＰＳを分画できる可能性が示された。
【００５０】
実施例５
ＰＣ含量４０％の大豆レシチン２００ｇにセリン水溶液１９０ｇ（セリン７０ｇ＋水１２０ｇ）とホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ−Ｙ１、（株）ヤクルト本社製）の水溶液（２４ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＬ練り込んで５５℃で５時間反応させた結果、リン脂質中のＰＳ含量が４６．７％の反応生成物が得られた。
【００５１】
反応生成物５．０ｇにエチルアルコール２０ｍＬを加え４５℃で抽出後、残渣（沈殿）をさらにエチルアルコール５ｍＬで２回抽出した。３回の抽出液を混合し、そのうちの５ｍＬに２５％食塩水０．２０ｍＬを加え、４５℃に加温後、室温に放置して沈殿を形成させた。その結果、上清中のＰＳ含量は乾燥固形分中３．３％であったのに対して、沈殿物では６２．１％であり、ＰＳは沈殿部に効率よく濃縮されることがわかった。
【００５２】
実施例６
実施例５で調製した抽出液の混合物５ｍＬに酢酸ナトリウム粉末５０ｍｇを加え４５℃に加温後、室温に放置して沈殿を形成させた。その結果、上清中のＰＳ含量は乾燥固形分中３．５％であったのに対して、沈殿物では６１．８％であり、食塩水を用いた場合と同じく、ＰＳは沈殿部に効率よく濃縮されることがわかった。
【００５３】
実施例７
実施例５で調製した抽出液の混合物に対して２５％食塩水を加えてＰＳの不溶物を形成させ、沈殿リン脂質中のＰＳ含量と、沈殿部に回収されるＰＳ量とを測定した。その結果として、食塩添加量と沈殿へのＰＳ回収率及びリン脂質中のＰＳ含量との関係を表５に示す。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
表５に示す通り、何れの条件でもＰＳは沈殿画分に濃縮されたが、特に抽出液混合物中のリン脂質１ｇあたりに加える食塩の量が１０ミリモル以下の範囲において、沈殿リン脂質中のＰＳ含量は５５％以上であり、沈殿部にＰＳが効率よく濃縮されていた。一方、食塩添加量が０．０５ミリモル以下の場合には、沈殿へのＰＳの回収率は６０％以下であり、４０％以上が上清部に存在していた。以上の結果から、何れの添加量でもＰＳを沈殿に濃縮することが可能であるが、アルコールに溶解したリン脂質１ｇに対する食塩の添加量が０．１５〜１０ミリモルの範囲が特に実用に適した添加量と考えられた。
【００５６】
参考例  ＣＭ−セルロース・カラムクロマトグラフィーによる精製
牛脳からのＰＳの精製例（新生化学実験講座４、脂質IIリン脂質、ｐ．１２７）に準じて実施例１で得た大豆転移レシチンからＰＳを精製することを試みた。
【００５７】
（１）  Ｎａ＋型ＣＭ−セルロースの調製：ＣＭ−５２（Ｗｈａｔｍａｎｎ社、膨潤型）５０ｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウム５００ｍＬ中に徐々に加えて約３０分間静置した後に吸引瀘過した。瀘液が中性になるまで蒸留水で洗浄（５００ｍＬ×２回）した後、０．５Ｎ塩酸５００ｍＬを流し蒸留水で瀘液が中性になるまで再度洗浄（５００ｍＬ×２回）した。このゲルを０．５Ｎ水酸化ナトリウム５００ｍＬ中にかきまぜながら加え３０分間静置したのち、蒸留水で中性になるまで洗浄（５００ｍＬ×１回）し、さらにメタノール５００ｍＬで洗浄後、最終的にメタノール懸濁液として室温に保存した。
【００５８】
（２）  クロマトグラフィー：（１）で調整したＣＭ−５２を内径３０ｍｍのカラムに充填（ベッド体積７０ｍＬ）し、クロロホルムを５００ｍＬ流してコンディショニングした後、実施例１の大豆転移レシチン１．０ｇを１０ｍＬのクロロホルムに溶解して沈澱を除いた溶液をカラムにアプライした後、クロロホルムで溶出させ、２００ｍＬのクロロホルム溶出画分（Ｆｒ．１）を得た。
【００５９】
更に、クロロホルム−メタノール（８５：１５，ｖ／ｖ）４００ｍＬ（Ｆｒ．２＋３）、クロロホルム−メタノール（７５：２５，ｖ／ｖ）４００ｍＬ（Ｆｒ．４＋５）、クロロホルム−メタノール（６５：３５，ｖ／ｖ）４００ｍＬ（Ｆｒ．６＋７）、クロロホルム−メタノール（５０：５０，ｖ／ｖ）４００ｍＬ（Ｆｒ．８＋９）を流して２００ｍＬずつを分画し、シリカゲル薄層クロマトグラフィーによりリン脂質を分析した。
【００６０】
その結果、クロロホルム溶出画分（Ｆｒ．１）にはほとんどリン脂質が検出されなかったが、クロロホルム−メタノール（８５：１５，ｖ／ｖ）画分の前半（Ｆｒ．２）には白濁状態でアプライしたエタノール沈澱物とほぼ同じ組成の物が０．２９ｇ（乾燥重量）溶出された。クロロホルム−メタノール（７５：２５，ｖ／ｖ）画分（Ｆｒ．４＋５）にはＰＣは含まれなかったがＰＳとＰＡの両方が含まれており、特にＰＡが多く溶出されていた。そして、クロロホルム−メタノール（６５：３５，ｖ／ｖ）画分の前半（Ｆｒ．６）にはまだ８．０％のＰＡが含まれていたが、後半（Ｆｒ．７）以降にはＰＡが含まれておらず、ＰＳ以外には原点にわずかの発色が見られるのみで純度は９７．７％であった。なお、クロロホルム−メタノール（５０：５０，ｖ／ｖ）画分の前半（Ｆｒ．８）には相当量のＰＳが含まれていたが、後半（Ｆｒ．９）にはほとんど溶出物がなかった。
【００６１】
以上の結果から、大豆転移レシチンからも牛脳分画物とほぼ同様の条件の陽イオン交換クロマトによりＰＳを精製できることが明らかになったが、回収率は極めて低く（Ｆｒ．７以降のみを回収した場合，２０％程度）、大量の精製ＰＳを得るには適さない方法であることがわかった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、天然あるいは人工的に調製されたリン脂質混合物からＰＳを簡便に濃縮する分画法を得ることができるという効果がある。