(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸アルカリ金属塩またはアルギン酸プロピレングリコールエステルを活性成分として含有する抗アレルギー剤。
【請求項２】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸アルカリ金属塩を活性成分として含有する抗炎症剤。
【請求項３】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸アルカリ金属塩を活性成分として含有するヒアルロニダーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸ナトリウムを活性成分として含有するヒアルロニダーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸アルカリ金属塩またはアルギン酸プロピレングリコールエステルを活性成分として含有する肥満細胞脱顆粒阻害剤。
【請求項６】
分子量範囲が100000〜380000であるアルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸プロピレングリコールエステルを活性成分として含有する肥満細胞脱顆粒阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本明細書で開示する発明は、抗アレルギー剤、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤および肥満細胞脱顆粒阻害剤に関する。これらの組成物は、アルギン酸系化合物を活性成分として含有する点に特徴を有する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘビ毒や精液等に含まれているヒアルロニダーゼは、哺乳動物の結合組織に多量に分布するヒアルロン酸を加水分解する酵素である。ヒアルロニダーゼは起炎症作用を有することが確認されており、また、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することによってアレルギーや炎症を軽減しうることが知られている。このため、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤を開発して、有用な抗アレルギー剤や抗炎症剤を提供することが望まれている。また、ヒアルロン酸は乳液やクリームなどの化粧品に含まれていることが多いため、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤は化粧品中のヒアルロン酸の分解を防ぐために用いることもできる。
【０００３】
一方、肥満細胞は脱顆粒することによってヒスタミンを遊離し、喘息、枯草熱、アトピー性湿疹などの即時型アレルギー反応を誘起することが知られている。このため、肥満細胞の脱顆粒を阻害することによってアレルギーを軽減することができるものと考えられている。したがって、効果的な肥満細胞脱顆粒阻害剤を開発して、有用な抗アレルギー剤を提供することが望まれている。ヒアルロニダーゼ活性の阻害と肥満細胞脱顆粒阻害機構の間には、何らかの関係が存在するとの報告がなされているが［掛川ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．７，Ｓ−９６（１９８４）およびＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（１１）５０７９−５０８２（１９８５）］、両者の関係は完全に明らかにされているとはいえない。
【０００４】
本明細書で開示する組成物の活性成分であるアルギン酸は、昆布などの褐藻類に含まれている細胞膜または細胞間隙物質であり、化学的には、βー１，４結合するＤ−マンヌロン酸とαー１，４結合するＬ−グルロン酸の重合体である。アルギン酸は、増粘作用や水和作用を有することが知られており、すでに食品、化粧品や医薬品に安全に使用されている。しかしながら、その抗アレルギー作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用および肥満細胞脱顆粒阻害作用はいまだ検討されておらず、これらの作用の存在を示唆する研究も何ら公表されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、アルギン酸系化合物の生理活性を検討することによって、安全で容易に製造しうる新しい抗アレルギー剤、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤および肥満細胞脱顆粒阻害剤を提供することを課題として鋭意検討し、以下に開示する発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本明細書で開示する発明は、アルギン酸、アルギン酸アルカリ金属塩またはアルギン酸エステルを活性成分として含有する抗アレルギー剤である。この抗アレルギー剤には、１種類の活性成分が単独で含まれていてもよいし、２種類以上の活性成分が含まれていてもよい。
【０００７】
活性成分として用いうるアルギン酸の種類は特に限定されない。したがって、由来する植物や植物部位、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の存在比、化学構造、分子量、分散度、粘度などは特に限定されない。一般には、ダックアルギンTM（紀文フードケミファ製）などの商業的に入手しうるアルギン酸を使用するのが簡便であるが、海藻などの植物から分離したものや発酵や合成を経ることによって得たアルギン酸を用いても構わない。アルギン酸は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用を示すことから、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤および抗炎症剤としても有用である。アルギン酸は通常は緩衝液に溶解して用いるが、溶液中では大部分がアルギン酸塩になっていると考えられる。
【０００８】
アルギン酸アルカリ金属塩には、少なくともアルギン酸ナトリウムおよびアルギン酸カリウムが含まれる。より好ましいのは、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸の場合と同様に、アルギン酸アルカリ金属塩のアルギン酸部分の構造等は特に限定されない。アルギン酸アルカリ金属塩としては、商業的に入手しうるもの、海藻などの植物から分離したものや発酵や合成を経ることによって得たものを用いることができる。アルギン酸アルカリ金属塩は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用と肥満細胞脱顆粒阻害活性を有することから、抗アレルギー剤のみならず、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、肥満細胞脱顆粒阻害剤としても有用である。
【０００９】
アルギン酸やアルギン酸アルカリ金属塩の分子量は、所期の活性を奏する限り広範な範囲の中から適宜選択することができる。アルギン酸やアルギン酸アルカリ金属塩をヒアルロニダーゼ阻害活性剤または抗炎症剤として用いる場合、分子量は５，０００以上であるのが好ましい。また、上限は５００，０００以下であるのが好ましい。さらに、分子量の範囲として好ましいのは、１００，０００〜３８０，０００である。アルギン酸やアルギン酸アルカリ金属塩を肥満細胞脱顆粒阻害剤として用いる場合、分子量は１０，０００以上であるのが好ましい。より好ましくは２０，０００以上であり、さらに好ましい範囲は２０，０００〜４００，０００である。さらに好ましい範囲は、１５０，０００以上であり、より好ましくは１５０，０００〜５００，０００、さらにより好ましくは２００，０００〜４００，０００、さらにより好ましくは２５０，０００〜３８０，０００である。
【００１０】
アルギン酸エステルには、少なくともアルギン酸グリコールエステルが含まれる。例えば、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アルギン酸エチレングリコールエステル等が包含される。この他のアルギン酸エステルとして、アルギン酸アルキルエステル、アルギン酸アルケニルエステル、アルギン酸アルキニルエステル、アルギン酸アリールエステルなどを例示することができる。アルギン酸エステルのアルギン酸部分の構造等は特に限定されない。アルギン酸エステルとしては、商業的に入手しうるダックロイドTM（紀文フードケミファ製）などを使用するのが簡便であるが、海藻などの植物から分離したものや発酵や合成を経ることによって得たものを用いても構わない。アルギン酸エステルは肥満細胞脱顆粒阻害作用を有することから、抗アレルギー剤のみならず肥満細胞脱顆粒阻害剤としても有用である。１％水溶液の好ましい粘度範囲は０．１〜２００ｃｐｓであり、より好ましくは１〜１００ｃｐｓである。
【００１１】
組成物には、活性成分の他にゼラチン、乳糖、脂肪、油脂などの担体を含ませることができる。また、水やアルコールなどの溶媒や、カルボキシメチルセルロースなどの希釈剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤などを組み合わせて使用してもよい。さらに、組成物にはアルギン酸、アルギン酸アルカリ金属塩、アルギン酸エステル以外の活性成分を含有させてもよい。これらの組成物中のアルギン酸系化合物の濃度は、使用目的や使用対象に応じて変化させることができる。化粧品に含ませる場合の含有量は、広範な濃度範囲の中から適宜選択しうるが、例えば１〜１００ｐｐｍにすることができる。また、人体に投与する場合は、広範な濃度範囲の中から所期の効果を奏するような量を適宜選択しうるが、例えば１日あたり０．５μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重として、１回から数回に分けて投与することができる。剤形は、投与目的や投与経路等に応じて、錠剤、カプセル剤、注射剤、散剤、座剤、顆粒剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤などにすることができる。
【００１２】
アルギン酸、アルギン酸アルカリ金属塩、アルギン酸エステルは抗アレルギー作用を有することから、これらを食品に混合して、抗アレルギー機能性食品を製造することもできる。対象となる食品の種類は、これらの活性成分の抗アレルギー作用が阻害されないものであれば特に限定されない。例えば、ジュース、清涼飲料水、紅茶などの飲料や、あめ、パン、もちなどの加工食品、カップラーメンなどのインスタント食品などの広範囲な食品に含ませることができる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
【００１４】
分子量の異なるアルギン酸、アルギン酸アルカリ金属塩およびアルギン酸エステルを用いて、ヒアルロニダーゼ阻害活性測定試験および肥満細胞脱顆粒阻害活性測定試験を行った。
【００１５】
サンプル
試験は、以下の１２種類のサンプルに対して行った。
【００１６】
サンプル１−４は、商業的に入手しうるアルギン酸ナトリウムである。分子量はサンプル番号が増えるにしたがって減少するように並べた。
【００１７】
サンプル５−１０は、固形分６０％のアルギン酸に以下の処理を施して調製した。すなわち、固形分６０％のアルギン酸をジャケット加熱機に入れて、８０−９０℃の加熱下で０、２、３、５、７、９時間加熱した後、冷却して減圧乾燥することによって調製した。なお、サンプル５については水酸化ナトリウムを用いて中和して溶解し、アルギン酸ナトリウムとした。
【００１８】
サンプル１１および１２は、商業的に入手しうるアルギン酸プロピレングリコールエステルである。高粘度のものをサンプル１１とし、低粘度のものをサンプル１２とした。
【００１９】
各サンプルの詳細は以下の表に示すとおりである。なお、表中に記載される分子量は重量平均分子量を表し、粘度は１％水溶液の粘度であってｃｐｓ単位で表してある。また、記載される商品はすべて紀文フードケミファ製であり、商品名はすべて商標名である。なお、分子量は液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて以下の条件下で測定したものである。
【００２０】
0004012977.tif 000002
【００２１】
【表１】
0004012977.tif 000003
【００２２】
ヒアルロニダーゼ阻害活性測定試験法
以下の予備溶液Ａ〜Ｆを調製した。
【００２３】
（予備溶液Ａ）ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）２．８３ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１ｍｌに溶解した溶液
（予備溶液Ｂ）０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液
（予備溶液Ｃ）雄鷄とさか由来のヒアルロン酸カリウム塩（シグマ社製）１．８３ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１ｍｌに溶解した溶液
（予備溶液Ｄ）０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
（予備溶液Ｅ）０．８Ｍホウ酸ナトリウム溶液（Ｎａ2Ｂ4Ｏ7）
（予備溶液Ｆ）パラ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１０ｇに、１０Ｎ 塩酸１２．５ｍｌ及び酢酸８７．５ｍｌを添加して溶解した後、
酢酸で１０倍に希釈した溶液
【００２４】
予備溶液Ａ ０．０２５ｍｌを、予備溶液Ｂ ０．２ｍｌと混合して、３７℃で２０分間保温した。これに、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７；ＫＨ2ＰＯ4，Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ含有）に溶解したサンプル０．１ｍｌ（終濃度２２．３μｇ／ｍｌになるように調製）を添加して、３７℃で２０分間保温した。さらに予備溶液Ｃ ０．２ｍｌを加えて、３７℃で２０分間保温した。その後、予備溶液Ｄ ０．１ｍｌ及び予備溶液Ｅ ０．１ｍｌを添加して、３分間煮沸し、冷却後さらに予備溶液Ｆ ３．０ｍｌを添加した。その後、さらに３７℃で２０分間保温して５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にしたがってヒアルロニダーゼ活性阻害率を求めて活性を評価した。
【００２５】
【数１】
0004012977.tif 000004
Ａ＝ヒアルロニダーゼもサンプルも含まない場合の吸光度
Ｂ＝サンプルもヒアルロニダーゼも含む場合の吸光度
Ｃ＝サンプルは含まないがヒアルロニダーゼを含む場合の吸光度
【００２６】
肥満細胞脱顆粒阻害活性測定試験法
タイロード液２０ｍｌをウイスター系ラット腹腔内に注入し、ピペットを用いて腹水を取り出した。この腹水を４℃で遠心分離（１００ｘｇ、１２分間）することによって、沈殿した細胞を収集した。この細胞をタイロード液２ｍｌに懸濁し、牛血清アルブミン生理食塩水（比重１．０６８）４ｍｌに重層した。４℃で再度遠心分離（１００ｘｇ、１２分間）して、沈殿した肥満細胞を収集した。抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ抗体を用いて３７℃で１時間処理することによって、肥満細胞にＩｇＥを結合させて感作状態にした。タイロード液で数回洗浄した後、０．２％牛血清アルブミン含有タイロード液に肥満細胞を懸濁させて、肥満細胞濃度が１ｘ１０6細胞／ｍｌのＩｇＥ感作肥満細胞懸濁液を調製した。ＮａＣｌ ８．００ｇ／ｌ，ＫＣｌ ０．２０ｇ／ｌ，Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １．１５ｇ／ｌ，ＫＨ2ＰＯ4 ０．２ｇ／ｌを含有する生理的塩類混合溶液（ＰＢＳ溶液）にサンプルを１．２５ｍｇ／ｍｌで溶解し、この溶液を上記懸濁液にサンプル濃度２５０μｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ）（最終濃度として２００ｎｇ／ｍｌ）およびホスファチジルセリン（最終濃度として１０μｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ溶液を脱顆粒誘発剤として添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。遠心分離（１５００ｘｇ、５分間）して得られた上清中のヒスタミン量を、オルトフタルアルデヒドでポストカラムラベルしてＨＰＬＣにより定量した。以下の式にしたがってヒスタミン遊離阻害率を求めて活性を評価した。
【００２７】
【数２】
0004012977.tif 000005
Ａ＝細胞をＰＢＳ溶液だけとインキュベートした際に遊離するヒスタミンの量
Ｂ＝サンプル存在下で細胞を脱顆粒誘発剤とインキュベートした際に遊離するヒスタミンの量
Ｃ＝サンプル非存在下で細胞を脱顆粒誘発剤とインキュベートした際に遊離するヒスタミンの量
【００２８】
結果
終濃度２２．３μｇ／ｍｌになるように調製したサンプル１−１２のヒアルロニダーゼ阻害活性測定試験の結果、および終濃度２５０μｇ／ｍｌになるように調製したサンプル１〜４、７、９、１１、１２の肥満細胞脱顆粒阻害活性測定試験の結果は、それぞれ図１および図２に示すとおりであった。
【００２９】
図から明らかなように、アルギン酸およびアルギン酸アルカリ金属塩には、良好なヒアルロニダーゼ活性阻害作用が認められた。特にアルギン酸ナトリウムや分子量が高いアルギン酸の効果が優れていることが確認された。また、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムおよびアルギン酸プロピレングリコールエステルには、良好な肥満細胞脱顆粒阻害作用の存在が認められ、特にアルギン酸プロピレングリコールエステルの効果がかなり優れていることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
本明細書で開示するアルギン酸またはアルギン酸アルカリ金属塩を活性成分とする組成物は、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤として有用である。また、アルギン酸、アルギン酸アルカリ金属塩およびアルギン酸エステルを活性成分とする組成物は、肥満細胞脱顆粒阻害剤として優れた効果を奏する。アルギン酸系化合物の中には、すでに食品添加物として用いられているものもあることから、本明細書で開示する組成物は、安全性が高くて副作用のおそれが少ない有用な阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒアルロニダーゼ阻害活性測定試験の結果を示すグラフである。
【図２】肥満細胞脱顆粒阻害活性測定試験の結果を示すグラフである。
【図１】
0004012977.tif 000006
【図２】
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