(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α１，６フコース転移酵素測定試薬を含有する慢性肝炎及び／又は肝硬変の診断薬。
【請求項２】
α１，６フコース転移酵素測定試薬が、フコース受容体及びフコース供与体を含有するものである請求項１記載の診断薬。
【請求項３】
α１，６フコース転移酵素測定試薬が、フコース受容体、標識フコースヌクレオチド、並びにフコース受容体の非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）又は／及びフコース受容体とフコースヌクレオチドとの反応によって生じる糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）を含有するものである請求項１記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は慢性肝炎、肝硬変等の肝臓疾患を適確に診断するための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性肝炎、肝硬変等の肝臓疾患の診断には、従来よりＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）活性値及びＧＰＴ（グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）活性値が用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、肝細胞の変性・壊死を伴なう肝硬変であるにもかかわらず、ＧＯＴ値及びＧＰＴ値が正常範囲内となってしまうこともあり、必ずしも従来の検査法で十分とはいえなかった。
従って、本発明は、さらに新しい機序に基づく肝臓疾患診断薬を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、肝臓の糖鎖抗原の合成能に着目し、種々検討してきた結果、全く意外にも血漿のα１，６フコース転移酵素活性が健常者に比べて肝臓疾患患者では明確に高くなり、適確な肝臓疾患の診断が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明はα１，６フコース転移酵素測定試薬を含有する慢性肝炎及び／又は肝硬変の診断薬を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明診断薬に用いられるα１，６フコース転移酵素測定試薬としては、血清、血漿等の血液中のα１，６フコース転移酵素活性を測定できる試薬であれば特に制限されず、例えばフコース受容体及びフコース供与体を含有するものである。
【０００７】
ここで、フコース供与体としては、フコースヌクレオチドが好ましく、例えばＧＤＰフコースが特に好ましい。フコース供与体は、標識体を用いるのが好ましく、標識は例えば、3Ｈ、14Ｃなどの放射性同位元素を用いるのが好ましい。
【０００８】
フコース受容体としては、オリゴ糖、糖脂質、糖蛋白等が挙げられる。具体的にはＮ−グリコシド結合由来アシアロ・アガラクト下記式（１）の２本鎖オリゴ糖
【０００９】
【化１】
0003892943.tif 000002
【００１０】
等が挙げられる。
【００１１】
このうち、標識フコース供与体として標識ＧＤＰフコースを、フコース受容体として上記（１）の２本鎖オリゴ糖を用いるのが特に好ましい。
【００１２】
被検体とフコース供与体とフコース受容体との反応は、通常の酵素反応条件、例えば室温から３７℃、１〜１２時間程度行えばよい。
【００１３】
これらのフコース供与体とフコース受容体にα１，６転移酵素を作用させた反応生成物の例としては、フコシル化アシアロ・アガラクトオリゴ糖、次の式（２）の化合物
【００１４】
【化２】
0003892943.tif 000003
【００１５】
等が挙げられる。
【００１６】
上記反応終了後の反応混合物中には、上記の目的とする反応生成物の他に、未反応の標識フコース供与体、未反応のフコース受容体、標識フコース供与体分解物、フコース受容体分解物等が含まれている。これらの測定結果に悪影響を及ぼす可能性のある成分を除去する目的で、反応混合物を、フコース受容体の非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）と反応させる。このレクチン（Ａ）と結合し得る成分としては、上記成分のうち未反応のフコース受容体とフコース受容体分解物があるが、これらは標識物質を含まないので、測定結果には影響しない。従って、レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を洗浄等により除去した後、レクチン（Ａ）に結合した成分の標識量を定量すれば、正確に目的とするα１，６フコース転移酵素活性が測定できる。
【００１７】
また、反応混合物と上記レクチン（Ａ）を反応させ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を除去した後、該レクチン（Ａ）に結合した成分を、フコース受容体とフコース供与体との反応によって生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）と反応させ、該レクチン（Ｂ）に結合した反応生成物の標識量を測定すれば、さらに本発明の測定値の精度は向上する。
【００１８】
ここで、フコース受容体の非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）としては、反応部位と異なる部位を認識するレクチンであればよく、例えば式（１）のフコース受容体を用いた場合は、（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチン、例えばムジナタケレクチン（PVL）等が挙げられる。
【００１９】
一方、フコース受容体とフコース供与体との反応によって生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）は、フコース受容体とフコース供与体とがα１，６フコース転移酵素の作用により生じた糖鎖構造を認識するレクチンであり、例えば式（１）のフコース受容体と標識フコースヌクレオチドを用いてα１，６フコース転移酵素を測定しようとする場合のレクチン（Ｂ）は、Fucα1,6GlcNAc 構造を認識するレクチンであり、特にヒイロチャワンタケレクチン（AAL）が好ましい。
【００２０】
これらのレクチン（Ａ）及びレクチン（Ｂ）は、それぞれ不溶性担体に固定化して用いるのが好ましい。かかる不溶性担体としては、アガロース、アクリルアミド、セルロース等が挙げられる。担体の形状としては、粒子、球、容器の型等が使用できる。これらのレクチン（Ａ）固定化担体及びレクチン（Ｂ）固定化担体は、それぞれこれらの固定化担体を充填したカラムの形態にして用いるのがより好ましい。
【００２１】
レクチン（Ａ）固定化カラムを用いた場合の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）固定化カラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を洗浄して除去した後、カラムから結合した成分を溶出させ、溶出液中の標識量を測定すればよい。またレクチン（Ａ）固定化カラムとレクチン（Ｂ）固定化カラムを用いた場合の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）固定化カラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を洗浄して除去し、該カラムから結合した成分を溶出させ、次いでレクチン（Ｂ）固定化カラムにかけ、該レクチン（Ｂ）に結合しなかった成分を洗浄して除去し、該カラムから結合した成分を溶出させ、得られた溶出液中の標識量を測定すればよい。
【００２２】
本発明においては、フコース供与体としてＧＤＰフコースを、フコース受容体として式（１）の２本鎖オリゴ糖を、レクチン（Ａ）として（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチンを、所望によりレクチン（Ｂ）としてFucα1,6GlcNAc構造を認識するレクチンを用いるα１，６フコース転移酵素活性測定試薬が特に好ましい。
【００２３】
本発明に用いられる被検体としては血清、血漿等が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、上記手段により被検者の体液中のα１，６フコース転移酵素活性を測定し、健常者のそれと対比し、有意に高ければ肝臓疾患と診断できる。本発明において診断される肝臓疾患としては慢性肝炎及び肝硬変が好ましい。
【００２５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２６】
実施例１
次の手順により、健常者２３名の血漿中のα１，６フコース転移酵素活性を測定した。
（１）酵素受容体の調製
卵黄から大量分離・精製された下記式で表されるジシアリシル２本鎖１１糖オリゴ糖（YDS；Koketsu, M., Juneja, LR, Kim, M., Ohta, M., Matsuura, F. and Yamamoto, T. Sialyloligosaccharides of delipidated egg yolk fraction, J. Food Sci., 58(4)：743-747, 1993）を原料として用いた。
【００２７】
【化３】
0003892943.tif 000004
【００２８】
このＹＤＳ（２０mg）及びArthrobactor ureafaciens（ナカライテスク）のシアリダーゼ０．２Ｕを０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー４００μｌ中で３７℃４８時間作用させて、下記式で表されるAsialo-YDSを得た。
【００２９】
【化４】
0003892943.tif 000005
【００３０】
得られたAsialo-YDSを分離することなく、蒸留水で２倍に希釈した（８００μｌ）この液とStreprococcal 6646K（生化学工業）のβガラクトシダーゼ５ｍＵを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH６．０）１．６ml中で、３７℃４８時間作用させて、
【００３１】
【化５】
0003892943.tif 000006
【００３２】
を得た。このオリゴ糖は、HiLoad Superdex pg（ファルマシア）及びSuperdex Peptide HR（ファルマシア）によるゲルろ過で分離、精製した。
【００３３】
（２）レクチン固定化ゲルの作成
ムジナタケレクチン（PVL）を精製し、保護基となるハプテン（GlcNAc）を加えたのち、バイオラッドのマニュアルに従い、Affi-Gel 10（バイオラッド）に固定した。
一方、ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）を精製し、保護基となるハプテン（Fuc）を加えたのち、バイオラッドのマニュアルに従い、Affi-Gel 10（バイオラッド）に固定した。
【００３４】
（３）酵素反応
酵素反応液組成：
HEPES-NaOH, pH7.0 ４μmol、（１）で調製したASAG-YDS ２０nmol、GDP-[3H ]フコース１０nmol及び被検血漿２０μｌをとり、全量５０μｌとした。この反応液を３７℃、４時間保温して、エタノールを等量加えて反応を止めた。
【００３５】
（４）活性の測定
（３）の反応液の遠心上清を５mlのPVL-Affi-Gel １０を充填したカラムにかける。なお、カラムは予め、５Ｍ  CaCl2 を含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）生理食塩水（Ca-TBS）で平衡化しておく。次に、室温で３０分放置、洗浄液Ca-TBS １５mlで洗浄する。次に、GlcNAc５０mMを含むCa-TBS３mlを流す。さらに、GlcNAc５０mMを含むCa-TBS７mlを加えて、その溶出液を集める。溶出液は直ちにAAL-Affi-Gel １０を充填したカラムにかける。なお、カラムは予め、０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）生理食塩水（PBS）で平衡化しておく。カラムをPBS １５mlで洗浄する。次に、Fuc ２０mMを含むPBS ３mlを流す。さらに、Fuc ２０mMを含むPBS ７mlを加えて、その溶出液を集め、シンチレーターを加えた後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定する。
【００３６】
（５）測定結果
（ｉ）上記（４）において、PVL-Affi-Gel １０を充填したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの結果を図１に示す。図１中、黒丸は糖受容体を加えた場合を、黒四角は糖受容体を加えなかった場合を示す。図１の結果から明らかなように、フコシル化糖受容体がPVL 固定化カラムに選択的に結合し、GluNAcで特異的に溶出されていることがわかる。
（ii）上記（４）において、AAL-Affi-Gel １０を充填したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの結果を図２に示す。図から明らかなように、PVL 溶出分画は全てAAL 固定化カラムに結合し、Fuc で特異的に溶出された。このことから、PVL-Affi-Gel １０を充填したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーのみで、正確に測定できることがわかる。
（iii）健常者２３名の結果を表１に示す。酵素活性は単位時間（ｈ）、血漿１ml当たり基質（ASAG-YDS）に取り込まれたフコース量（pmole）として計算した。
【００３７】
【表１】
0003892943.tif 000007
【００３８】
また、上記（４）においてPVL-Affi-Gel １０を充填したカラムの溶出液の標識量を測定したところ、表１とほぼ同様の結果が得られた。
【００３９】
実施例２
実施例１と同様にして、肝硬変（n=13）、慢性肝炎（n=10）患者血漿中のα１，６フコース転移酵素活性を測定した。
【００４０】
【表２】
0003892943.tif 000008
【００４１】
その結果、表１及び表２から明らかなように、血漿中のα１，６フコース転移酵素活性と肝臓疾患との間には明らかな相関関係が認められ、α１，６フコース転移酵素活性の測定が肝臓疾患の診断法として有用であることが判明した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば慢性肝炎、肝硬変等の肝臓疾患を適確に診断できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  PVL-Affi-Gel １０充填カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】  AAL-Affi-Gel １０充填カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図１】
0003892943.tif 000009
【図２】
0003892943.tif 000010