(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとの複合体を蛍光分子で標識してなるリボヌクレオペプチド蛍光センサーであって、
上記ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列：ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は２０〜３０の整数である）を含み、
上記ペプチドサブユニットが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＲｅｖ蛋白質由来のアミノ酸配列を有し、
上記蛍光分子が、ピレン（pyrene）またはＮＢＤフルオリド（NBD fluoride）から選ばれ、かつ、上記ペプチドサブユニットのＮ末端アミノ基に結合されていることを特徴とするリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
【請求項２】
基質がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であることを特徴とする請求項１記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
【請求項３】
基質がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であり、(N)nが配列番号１又は２に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項２記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサーを用いて、その蛍光強度の変化によって基質分子を検出する方法。
【請求項５】
生体分子、又は環境中もしくは飲食物中の分子の検出に使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の方法に用いられ、１又は複数のリボヌクレオペプチド蛍光センサーと、その担体とを備えた分子センサー素子。
【請求項７】
請求項４又は５記載の方法に用いられ、１又は複数のリボヌクレオペプチド蛍光センサーと、その蛍光強度の変化を検出する検出手段とを備えた装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＮＡ−ペプチド複合体を用いた蛍光センサーに関する。本発明は、例えばセカンドメッセンジャー、神経伝達物質等の生体分子、環境中に存在する環境汚染物質や内分泌撹乱物質（環境ホルモン）、さらに飲食物中の物質など種々の分子に対するハイスループットな検出を可能とし、新たな分子検出技術として、各種生体分子の生体内動態の解析、医療分野における各種臨床検査や診断、環境調査（環境計測・環境モニタリング）、食品分析など広汎な産業分野への利用が期待できる。
【０００２】
【従来の技術】
ポストゲノム科学においては、細胞内情報伝達を担う分子など各種分子の生体内動態を解析し、その解析結果をゲノム情報と関連づけることにより革新的な発見が期待できる。しかしながら、従来そのための解析手法は非常に限られており、例えばシグナル伝達の全容解明のため、セカンドメッセンジャー等の動態を細胞内で観測できるような分子センサー、あるいはバイオセンサーの開発が急務とされていた。
【０００３】
これまでにも国内外で有機分子を用いてセカンドメッセンジャー等を捕捉する人工リセプターを合成しようとする研究は活発に行われてきた。しかし、選択性・親和性の両点から見て満足できるレベルに達しているものは殆どなく、また、人工リセプターを基にして分子センサー、バイオセンサーを作製する手法も確立されていない。
【０００４】
人工リセプターの作製方法について、本発明者は以前、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のRevペプチドとRRE（Rev Response Element）RNAとの複合体の三次元立体構造を基にして設計したリボヌクレオペプチドライブラリーからin vitroセレクション法を利用して、テーラーメードのリセプターが構築可能なことを報告している（下記の特許文献１並びに非特許文献１参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００３−３３１８６号公報
【非特許文献１】
Morii,T., Hagihara,M., Sato,S., and Makino,K. (2002) J.Am.Chem.Soc. 124, 4617-4622頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者が開発した上記リセプター作製法は、Structure-based Design手法とコンビナトリアル手法とを組み合わせた汎用性に富む手法であるため、数多く存在するセカンドメッセンジャーや神経伝達物質などに対する高選択的リボヌクレオペプチドリセプターを作製することが可能である。本発明者は、更にこの技術を応用発展させて、上記リセプター作製法により選択した人工リセプターをバイオセンサーへ変換することができないかと考えた。もしこれが実現すれば、種々の分子に対してテーラーメードの高選択的分子センサーの作製が可能となるため、その利用分野はシグナル伝達機構の研究解析への利用にとどまらず、医療分野、環境分野、食品衛生分野など産業上幅広い分野での利用が期待できる。
【０００７】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＲＮＡ−ペプチド複合体（リボヌクレオペプチド）を用いた新たな分子センサーを開発すると共に、同センサーを利用した種々の分子に対する検出方法並びに装置システムを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み、ＲＮＡ−ペプチド複合体に蛍光分子を導入することで、基質分子との結合の際に蛍光強度が変化するバイオセンサーの構築が可能か鋭意検討した結果、生理活性分子の１つであるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に高選択的に結合するＲＮＡ−ペプチド複合体のペプチドサブユニットを蛍光分子で修飾することにより、ＡＴＰ結合時に蛍光強度が大きく変化するＡＴＰ蛍光バイオセンサーの作製に成功した。また、このようなセンサーを用いることでＡＴＰ等の基質分子をリアルタイムで蛍光により可視化し、かつ定量化できること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、医療上及び産業上有用な方法・物として、下記Ａ）〜Ｌ）の発明を含むものである。
Ａ）  ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとの複合体を蛍光分子で標識（ないしは修飾）してなるリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｂ）  複合体の基質結合領域又はその近傍を蛍光分子により標識してなる上記Ａ）記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｃ）  ペプチドサブユニットのＮ末端アミノ基を蛍光分子により標識してなる上記Ａ）又はＢ）記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｄ）  蛍光分子が、ピレン（pyrene）、ＮＢＤフルオリド（NBD fluoride）、クマリン（coumarin）及びダンシルクロリド（dansyl chloride）からなる群から選ばれる、上記Ａ）〜Ｃ）の何れかに記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｅ） ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列：ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は２０〜３０の整数である）を含むことを特徴とする、上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｆ）  ペプチドサブユニットが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＲｅｖ蛋白質由来のアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｇ）  基質がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であることを特徴とする、上記Ａ）〜Ｆ）の何れかに記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｈ）  基質がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であり、(N)nが配列番号１又は２に示される塩基配列からなることを特徴とする上記Ｅ）記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサー。
Ｉ）  上記Ａ）〜Ｈ）の何れかに記載のリボヌクレオペプチド蛍光センサーを用いて、その蛍光強度の変化によって基質分子を検出する方法。
Ｊ）  生体分子、又は環境中もしくは飲食物中の分子の検出に使用することを特徴とする上記Ｉ）記載の方法。
Ｋ）  上記Ｉ）又はＪ）記載の方法に用いられ、１又は複数のリボヌクレオペプチド蛍光センサーと、その担体とを備えた分子センサー素子。
Ｌ）  上記Ｉ）又はＪ）記載の方法に用いられ、１又は複数のリボヌクレオペプチド蛍光センサーと、その蛍光強度の変化を検出する検出手段とを備えた装置。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１１】
（１）  本発明のリボヌクレオペプチド蛍光センサー
図１は、本発明の実施の一形態であるＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーの作製法を概念的に説明する図である。同図に示すように、本作製法は、ＡＴＰ結合性のリボヌクレオペプチドリセプター（以下、「ＲＮＰリセプター」という場合がある。）のペプチドサブユニットを蛍光分子により標識して、リボヌクレオペプチドセンサー（以下、「ＲＮＰセンサー」という場合がある。）を作製する。ＲＮＰリセプターは、ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとから構成されるため、例えばそのうちの１つペプチドサブユニットを蛍光性ペプチドに置き換えることで比較的簡便にＲＮＰリセプターをＲＮＰセンサーへと機能改変することができる。
【００１２】
ＲＮＰセンサーは、基質分子との結合によってその蛍光強度が変化する必要がある。本実施形態のＲＮＰセンサーは、図１に示すように、基質結合領域の近傍に位置すると予想されるペプチドサブユニットのN末端アミノ基（-NH2）をアミン反応基を有する蛍光分子により標識した。その結果、ＡＴＰの結合に伴い、蛍光分子の周辺環境が変化することに起因すると考えられる蛍光強度の変化（増加）が観測されるＲＮＰセンサーの作製に成功した（詳細は後述の実施例において説明する）。
【００１３】
このように、蛍光分子はペプチドサブユニットのN末端アミノ基、もしくはＮ末端側のアミノ酸残基の側鎖に導入されることが好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、ペプチドサブユニットではなく、ＲＮＡサブユニットを蛍光分子により修飾したものであってもよい。また、蛍光分子は、基質結合領域またはその近傍に導入されることが好ましいが、基質との結合により結果的にＲＮＰセンサーの蛍光強度の変化が計測される限りにおいて、基質結合領域とは離れた部位に導入されるものであってもよい。
【００１４】
蛍光分子は、適当な光エネルギー（励起波長）によって励起され、発光する分子であって、その発光変化の測定が装置により比較的容易であり、かつ、ペプチドサブユニットまたはＲＮＡサブユニットと反応して直接これと結合し、または他の物質を介して間接的に結合可能なものであれば、特に限定されるものではない。後述の実施例では、３種類の蛍光分子、即ち、ピレン（pyrene：１-ピレンスルホニルクロリド（1-pyrenesulfonyl chloride））、ＮＢＤフルオリド（NBD fluoride：４-フルオロ-７-ニトロベンズ-２-オキサ-1,3-ジアゾール（4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole））、及びダンシルクロリド（dansyl chloride：５-ジメチルアミノナフタレン-１-スルホニルクロリド（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride））を使用してＡＴＰ検出用ＲＮＰセンサーを作製した。勿論、蛍光分子はこれら以外のものを使用してもよい。基質の結合による蛍光変化は、蛍光分子の導入位置だけではなく蛍光分子の種類によっても異なると考えられるので、種々の蛍光分子の中から適切なものを選択すればよい。
【００１５】
蛍光分子の導入位置、および蛍光分子の種類の最適化を図る方法の一例として、次のような方法を挙げることができる。即ち、複数の種類の蛍光分子を使用し、それぞれの蛍光分子のペプチドサブユニットへの修飾位置が様々に異なるペプチドライブラリーを作製し、それとリセプターのＲＮＡサブユニットとを組み合わせることにより、複数の蛍光標識ＲＮＰセンサーを作製する。そして、この中から、それぞれの基質に対して最も効率よく応答する光学センサーを選出すればよい。
【００１６】
本発明のＲＮＰセンサーは、ＲＮＰリセプターと同様に任意の分子に対してこれを基質とするＲＮＰセンサーを設計し、作製することができ、その作製方法についても、蛍光分子による標識工程を除いては、基本的に特開２００３−３３１８６号公報に記載されるＲＮＰリセプターの作製方法と同じである。即ち、ペプチド結合領域とランダムな塩基配列を有する基質結合領域とが結合したＲＮＡサブユニットを作製し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法によって、該複合体と目的の基質を反応させた後に該基質に対する結合能を有する複合体を選択する。次に、選択された複合体からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡを逆転写反応によりＤＮＡに変換し、これをＰＣＲにより増幅させた後に新たなＲＮＡサブユニットを作製し、該ＲＮＡサブユニットに基づき、再び、ペプチドサブユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法によって該基質に対する結合能を有する複合体を選択する操作を繰り返すことによって、該基質に対するより高い親和性を有するＲＮＡ−ペプチド複合体を選出する。
【００１７】
つまり、ランダムなＲＮＡ塩基配列部分により多様性のあるリボヌクレオペプチドのライブラリーの中から、インビトロセレクション法を用いて、例えばＡＴＰのような、目的の基質に対し結合能を有するリボヌクレオペプチド分子を選択し、これらを増幅することで新たなリボヌクレオペプチドライブラリーを作製する。このようにして、多種類の分子種から選択を繰り返すことで合目的に、目的の基質に対してより選択的に結合する結合能の高いＲＮＡ−ペプチド複合体を作製することができる。
【００１８】
ペプチドサブユニットの好適例として、ＨＩＶのＲｅｖ蛋白質由来のアミノ酸配列を有するもの、ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域の好適例として、Ｒｅｖ応答エレメント（Rev Response Element：ＲＲＥ）を有するもの、を挙げることができる。特に、ＲＮＡサブユニットは、以下の塩基配列：ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は２０〜３０の整数である）を含むＲＮＡを好適なものとして挙げることができる。また、ペプチドサブユニットは、以下の１７個のアミノ酸配列：ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６（アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択されるアミノ酸を示す）を含むペプチドが好ましく、以下のアミノ酸配列：ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲを有するペプチドサブユニットが特に好ましい。
【００１９】
図２〜図４には、上記のインビトロセレクション法を用いた選別方法により実際に得られた、ＡＴＰとの結合能の高いＲＮＡ−ペプチド複合体中のＲＮＡサブユニット基質結合領域の塩基配列が示される。得られたＲＮＡ配列は相同性の観点から３種類に分類された。また、今回実施した方法ではランダムな塩基配列部分を３０塩基に設定したため、基質結合領域として得られたＲＮＡ配列の長さもほぼ３０塩基となっている。
【００２０】
後述の実施例では、図４の４３０及び４２８の配列をそれぞれ基質結合領域として有するＲＮＡサブユニット（４３０ＲＮＡ・４２８ＲＮＡ）と、ペプチドサブユニット（Ｒｅｖペプチド）との複合体に蛍光分子を導入することにより、ＡＴＰ検出用ＲＮＰセンサーを得た。上記４３０ＲＮＡは、基質結合領域を含む塩基配列として下記（ａ）の配列を有し、上記４２８ＲＮＡは、基質結合領域を含む塩基配列として下記（ｂ）の配列を有する。また、ペプチドサブユニットは、下記（ｃ）のアミノ酸配列を有する。
（ａ）ggucugggcgca-uauaccguagugguuuguguguggguugg-ugacgguacaggcc（配列番号３）
（ｂ）ggucugggcgca-agggcuuggugugccgauuucggggcauuu-ugacgguacaggcc（配列番号４）
（ｃ）ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号５）
【００２１】
後述の実施例では、インビトロセレクション法によって最終的にＡＴＰとの結合能の高いＲＮＡサブユニット（４３０ＲＮＡ・４２８ＲＮＡ）が得られた後、この４３０ＲＮＡまたは４２８ＲＮＡと、ペプチドサブユニット（Ｒｅｖペプチド）を蛍光分子で修飾した蛍光修飾ペプチドとの複合体を形成させ、ＡＴＰ検出用ＲＮＰセンサーを作製している。これ以外の方法として、例えば、予めペプチドサブユニット又はＲＮＡサブユニットを蛍光分子で標識し、このように蛍光標識されたペプチドサブユニット又はＲＮＡサブユニットを使用してインビトロセレクション法を行い、本発明のＲＮＰセンサーを作製してもよい。
【００２２】
（２）  本発明の有用性（利用分野）
本発明のＲＮＰセンサーは、以上のように、任意の分子に対するセンサーとしてテーラーメードに設計・作製することができ、汎用性に優れ、例えば以下のような利用が可能である。
【００２３】
(A) 本発明のＲＮＰセンサーを特定のセカンドメッセンジャーと特異的に結合するよう設計・作製し、これをマイクロインジェクション等によって細胞内に導入することで、様々な生理条件下でのセカンドメッセンジャーの細胞内動態をリアルタイムで光学的に検出・計測し、定量化することができる。このように、本発明のＲＮＰセンサーは、生体内の有機小分子に対するセンサーとして、その生体内動態の解析に有用である。
【００２４】
(B) 本発明のＲＮＰセンサーは、ＡＴＰ等の生理活性物質、セカンドメッセンジャー、神経伝達物質など様々な生体分子に対する分子センサーとして利用することができるが、その利用は生体分子の検出にとどまるものではなく、環境中に存在する環境汚染物質や内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の検出、さらに飲食物中の特定物質の検出など種々の物質検出に利用できる。このように、本発明を利用することができる産業分野は極めて広汎であり、例えば、医療分野における各種臨床検査や診断、環境調査（環境計測・環境モニタリング）、食品分析などへの利用が期待できる。
【００２５】
(C) また、マイクロアレイ作製技術等を応用して、本発明のＲＮＰセンサーをアレイ状に高密度に配置し、沢山の分子をハイスループットに同時検出する分子センサー素子（分子センサーチップ等）を作製することが可能である。このような分子センサー素子も本発明に含まれる。本発明の分子センサー素子は、基本的に、１又は複数のＲＮＰセンサーと、その担体（ＲＮＰセンサーを固定ないし保持する基板など）とを備え、これにより、１又は複数の物質を検出するものであればよい。複数の物質を検出する場合は、目的の物質に応じて、それぞれのＲＮＰセンサーを異なる蛍光分子で標識してもよい。また、本発明のＲＮＰセンサーは、比較的分子量の大きな物質（オリゴペプチド等）の検出にも利用できる可能性があり、本発明の分子センサー素子は、次世代チップテクノロジーの中で有望視される「プロテインチップ」へも応用可能である。
勿論、本発明の分子センサー素子は、上記(B)で述べた種々の分野に利用することができ、例えば臨床診断用チップや環境汚染検出チップなど様々な用途に利用可能である。
【００２６】
(D) 本発明のＲＮＰセンサー、又は本発明の分子センサー素子を利用した新たな分子間相互作用解析装置や物質検出装置が実現可能であり、このような装置も本発明に含まれる。当該装置は、基本的に、１又は複数のＲＮＰセンサーと、その蛍光強度の変化を検出する検出手段とを備えた構成であればよい。例えば、（１）生体試料等の試料に本発明のＲＮＰセンサー（又は本発明の分子センサー素子）を導入、添加もしくは混合する手段と、その後、試料中または試料中から取り出したＲＮＰセンサー（又は本発明の分子センサー素子）の蛍光を計測する手段とを備えた構成、あるいは、（２）本発明のＲＮＰセンサー（又は本発明の分子センサー素子）が固定され、その表面に試料を案内する手段と、その後、ＲＮＰセンサー（又は分子センサー素子）の蛍光を計測する手段とを備えた構成、などが挙げられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
まず、後述の各実施例に使用した材料及び方法について説明する。
〔試薬〕
側鎖を保護したFmoc(9-fluorenylmethoxycaebonyl)アミノ酸はNovabiochem社から、Fmoc-PAL-PEG樹脂、HATUはApplied Biosystems社から、ペプチド合成用DMFは和光純薬から購入した。蛍光導入試薬（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride （dansyl chloride）、4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole（NBD fluoride）、1-pyrenesulfonyl chloride）はMolecular Probe社から購入した。ATPアガロース樹脂、ヌクレオチド(ATP、ADP、AMP、dATP、UTP、CTP、GTP、8-bromo-ATP)はSigma-Aldrich社から購入した。Klenow DNA Polymerase、制限酵素（BamHI、EcoRI）、T4 RNA LigaseはNew England Biolab社から購入した。Pyrobest DNA Polymerase、TaKaRa Ligation Kit Ver.2 はTaKaRa社から購入した。ライブラリー作成用DH5αコンピーテントセルはInvitrogen社から購入した。逆転写酵素（AMV (Avian Myeloblastosis Virus) Reverse Transcriptase）はPromega社から購入した。RNA転写キット（AmpliScribe T7 High Yield Transcription Kit）はEpicentre社から購入した。BactoTrypton、Yeast Extract、BactoAgarはDifco社より購入した。DNAライブラリー、PCRプライマー用のDNAの合成はAmersham Pharmacia社に依頼した。QIAprep Spin Miniprep KitはQiagen社から購入した。その他の試薬は分子生物学用、および特級グレードのものを使用した。
PCRはBIO-RAD社 iCycler Thermal Cycler あるいはTaKaRa社 PCR Thermal Cycler PERSONALを用い、標準的なPCR反応は、TaKaRa社のPyrobest DNA Polymeraseを用いて、添付のPyrobest Buffer II反応液中0.2mMのプライマーDNAを用い0.2mMのdNTPの条件で行った。
【００２９】
〔DNAライブラリーの作製〕
30塩基のランダム配列を含む鋳型DNA（RREN30）（5'-GGAATAGGTCTGGGCGCA-N30-TGACGGTACAGGCCGAAAG-3'）に鋳型DNAの3'末端領域に相補的なプライマーREV01（5'-CTTTCGGCCTGTACCGTCA-3'）を99℃から室温まで2時間かけてアニーリングさせた後、Klenow DNA Polymeraseにより25℃、15分間の反応により2本鎖DNAを合成した。続いて、T7プロモーターを含むプライマー（5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAATAGGTCTGGGCGCA-3'）及び鋳型DNAの3'末端領域に相補的なプライマーを用いて、Pyrobest DNA Polymeraseにより変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、伸長反応を72℃で1分、の条件によりPCR反応を行うことで2本鎖のランダムな30塩基を含むDNAライブラリーを構築した。
【００３０】
〔RNAライブラリーの作製〕
1mgの2本鎖DNA を鋳型として用い、20mlの容量で37℃、3時間の反応条件でRNAを転写した（Epicentre社Ampli Scribe T7 Transcription Kitsのプロトコールに従った）。転写反応終了後、1UのDNaseを加え37℃で15分間反応を行い、鋳型DNAを分解した。転写したRNAは酢酸ナトリウム存在下エタノール沈殿を行った。RNAサンプルは80%フォルムアミド水溶液に溶解後、80℃で5分間の熱処理を行った後、氷上で急冷して変性させ、6M尿素を含んだ8%ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。TLC板の上でUVにより検出したRNAを切り出し、TE緩衝液（10mM Tris-HCl (pH7.6)、1mM EDTA）で抽出した。抽出したRNAは酢酸ナトリウム存在下エタノール沈殿を行った。精製したRNAは10mMとなるように10mM Tris-HCl (pH7.6)、150mM NaClを含んだバッファーに希釈し80℃3分加熱後徐冷し室温まで2時間かけて適切な2次構造を形成するようにした。
【００３１】
〔Revペプチドの合成〕
Fmoc固相合成法により化学合成した。樹脂はFmoc-PAL-PEG resin(0.41mmol/g)を用いた。縮合は、樹脂に対して5当量のFmocアミノ酸、5当量のHATUを5 %のジイソプロピルエチルアミンを含むDMFに溶解したものを加え、30分から60分攪拌することで行った。N-末端のアミノ酸のFmoc基を除去した後、Nメチルイミダゾール、無水酢酸を用いてペプチドのN末端をアセチル化した。樹脂からの切り出しおよび側鎖の脱保護は、氷上、窒素雰囲気化にてフェノール(0.75g)、チオアニソール（0.5ml)、エタンジチオール(0.25ml)、water(0.5ml)、TFA(10ml）の混合溶液を乾燥させた樹脂に加え、窒素雰囲気下、氷上にて6時間攪拌することにより行った。反応終了後氷上にて水を加え30分間攪拌し、エーテルで抽出精製した後、5%酢酸水溶液を溶離液としてゲル濾過(Sephadex G-10)を行った後、逆相HPLCにより精製した。
【００３２】
〔ＡＴＰ結合性リボヌクレオペプチド選択方法〕
結合実験には4% beadedアガロース固定されたATP樹脂（2.0 mmolATP/ml樹脂容量）を用いた。樹脂はあらかじめ、結合バッファー（10mM Tris-HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2）により、樹脂容量の3倍量の結合バッファーで3回洗浄することにより平衡化した。50ml容量の樹脂に対して、100mlの容量で1mMのRNA、1.5mMのRevペプチドを加え氷上で30分時々攪拌しながら結合させた。反応後、300mlの結合バッファーで樹脂を3回洗浄した。樹脂に結合したRNAは、4mMATPを含んだバッファー100mlで溶出させ、これを3回繰り返した。酢酸アンモニウム存在下エタノール沈殿を行いRNAを回収し、RNAは10mlTE（10mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM EDTA）に溶解し、1.5mlのRNAを鋳型として、Promega社のキット（Reverse Transcription System）のプロトコールに従い、前記REV01プライマー存在下42℃で30分間逆転写反応を行った。反応液を99℃で5分間加熱処理し逆転写酵素を失活させた後、反応液の一部について前記REV01プライマー、及びFOR01プライマー（5'-GAATTCTAATACGACTCACTATAGG-3'）を用いて、変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、伸長反応を72℃で1分の条件でPCRを行った。5サイクル毎に反応液を分取し、8%ポリアクリルアミド電気泳動により増幅DNAを分析した。ポリアクリルアミド電気泳動での分析により、指数的にDNAの増幅が確認される最小のサイクル数でPCRを行い、新たなDNAライブラリーを調製した。PCR産物は、酢酸アンモニウム存在下2-プロパノール沈殿により精製し、次のセレクションに供した。
【００３３】
〔N末端に蛍光分子を導入したRevペプチドの合成〕
RevペプチドはFmoc固相合成法により前述の方法で合成した、N末端をFmoc基で保護した状態のペプチドが固定化された樹脂を、30%ピペリジンを含むDMFにより５分×3回処理することでFmoc基を除去した。樹脂はDMFで充分洗浄した後、5%DIEAを含むDMFに溶解した10当量の蛍光分子とともに室温条件下3時間反応させた。未反応蛍光分子はDMFで充分洗浄除去した後、メタノール、エーテル洗浄後充分乾燥させた。乾燥した樹脂に対し、フェノール(0.75g)、チオアニソール（0.5ml)、エタンジチオール(0.25ml)、water(0.5ml)、TFA(10ml）の混合溶液で室温条件下６時間反応させ、樹脂から切り出すと同時に脱保護を行った。反応終了後氷上にて水を加え、エーテルで抽出精製した後、5%酢酸水溶液を溶離液としてゲル濾過(Sephadex G-10)を行った後、逆相HPLCにより精製した。ペプチドの同定にはMALDI-TOFマススペクトルにより解析した。ペプチド濃度はアミノ酸組成分析により行った。
Dansyl-Rev calculated for [M+] 2478.8, found 2480.5;
Pyrene-Rev calculated for [M+] 2593.0, found 2594.6;   NBD-Revペプチドについてはレーザー照射により分解が認められたためマススペクトルによる同定は行えなかったがHPLCにおいて単一のピークであることを確認した。
【００３４】
〔ＡＴＰ結合性リボヌクレオペプチドのRNA配列解析〕
10回選択を行ったDNAライブラリーについて、制限酵素の切断領域を付加するために、制限酵素切断領域を有するFOR02プライマー（5'-CGgaattcTAATACGACTCACTATAGG-3'、小文字表記はEcoRI認識配列）、REV02プライマー（5'-GCGggatccTTTCGGCCTGTACCGTCA-3'、小文字表記はBamHI認識配列）を用いてPCRを行った。PCRは100mlの反応容量で鋳型DNA100ngを用いて変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、伸長反応を72℃で1分の条件で4サイクル行った。PCR産物は、酢酸アンモニウム存在下2-プロパノール沈殿により精製した後、BamHI、EcoRIにより37℃3時間酵素反応を行った。酵素消化後、フェノール、クロロフォルム処理を行い、酢酸ナトリウム存在下エタノール沈殿により精製した。予めBamHI、EcoRI反応により切断したpUC19プラスミドDNAに対し、3倍モル量のPCR産物を加え、TaKaRa Ligation Kit ver.2により16℃1時間のライゲーション反応を行った。ライゲーションサンプルをそのままDH5コンピーテントセルに加え形質転換を行い、LBアンピシリン培地上で一晩培養した。形質転換した大腸菌は、アンピシリンを含んだ５mlの液体LB培地にて培養した。16時間培養した培養液を3,000rpm、10分間遠心分離し大腸菌を回収した。回収した大腸菌はQiagen MiniPrepKitのプロトコールに従いアルカリ法により、プラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNA（200ng）、M13RVプライマー（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'、1.6pmol）、BigDyeTerminator プレミックス液 4mlを反応容量10mlとなるように調製し、変性を96℃で30秒、アニーリングを50℃で15秒、伸長反応を60℃で4分の条件で25サイクル反応を行った。反応終了後、酢酸ナトリウム溶液存在下エタノール沈殿により精製した。シークエンス用ローディング溶液に溶解させ、99℃で2分処理した後、氷上で急冷し、半分量を解析に使用した。DNA配列解析はApplied Biosystem社の自動DNA配列解析装置（ABI Model 377）を用いてメーカーのプロトコールに従って行った。
【００３５】
〔配列解析を行ったプラスミドDNAからRNAの調製〕
配列確認を行ったプラスミドDNA10ngを用い100mlの容量で、FOR03プライマー（5'-GAATTCTAATACGACTCACTATAGG-3'）、REV04プライマー（5'-GGAATAGGCCTGTACCGTC-3'）を用いて変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、伸長反応を72℃で1分の条件で20サイクル反応を行った。PCR産物は酢酸アンモニウム存在下2-プロパノール沈殿を行った。精製したDNAはTEに溶解し、前述した方法によりRNAを転写した後、変性ゲルを用いて精製した。
【００３６】
〔ＡＴＰ蛍光センサーを用いた測定〕
蛍光スペクトル測定には日立分光蛍光光度計F-4500を用いて行った。反応条件中（10mM Tris-HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2）上記精製RNA、蛍光修飾ペプチド0.5〜1mMの複合体を形成させたのち、各種ヌクレオチドを添加して室温30分間インキュベーションし蛍光を測定した。NBD-Revペプチドについては470nm、Dansyl-Revペプチドについては340nm、Pyrene-Revペプチドについては360nmの励起波長で測定した。励起波長、蛍光波長のスリット幅はそれぞれ5nmで、20℃で測定した。
【００３７】
〔実施例１：ATP結合性リボヌクレオペプチドリセプターの構築〕
まず、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に対してリボヌクレオペプチドリセプターを作製した。RNAプールとしては前述したようにランダムな３０塩基を含む配列を用い、Revペプチドと１：１で混合することにより得られたリボヌクレオペプチドプールを作製した。インビトロセレクション法により2’、3’リボースで固定化されたATP樹脂を用いて得たリボヌクレオペプチドリセプター中の基質結合領域のRNA配列を図２〜図４に示す。
【００３８】
〔実施例２：ATP結合性リボヌクレオペプチドリセプターのＲＮＡサブユニットの構築〕
図４の428の配列及び430の配列をそれぞれ有するＲＮＡサブユニット（428RNA・430RNA）について、NBD-, Dansyl-, 及びPyrene-Revペプチドとそれぞれ複合体を形成させATPの滴定を行い、その親和性を調べた。RNAは完全に5’, 3’が相補鎖を形成するように設計したプライマーを用いて作製した。428RNA及び430RNAの基質結合領域の塩基配列は以下のとおりである。
430 UAUACCGUAGUGGUUUGUGUGUGGGUUGG（配列番号１）
428 AGGGCUUGGUGUGCCGAUUUCGGGGCAUUU（配列番号２）
【００３９】
〔実施例３：Pyreneペプチド、NBDペプチドまたはDansylペプチドと428RNAまたは430RNAとを用いて作製したＲＮＰセンサーのATP検出性能評価〕
反応条件中（10mM Tris-HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2）RNA（428RNA又は430RNA）と蛍光修飾ペプチドとの１：１複合体を形成させたのち（Pyrene-Revペプチド0.5μM、NBD-Revペプチド0.5μM、Dansyl-Revペプチド1.0μM）ATPを添加して室温30分間インキュベーションし蛍光を測定した。NBD-Revペプチドについては470nm、Dansyl-Revペプチドについては340nm、Pyrene-Revペプチドについては360nmの励起波長で測定した。このように428RNA又は430RNAを用いて各種ペプチドとの複合体を形成させてRNPセンサーを作製し、ATP添加に伴う蛍光変化を評価した。その結果を図５に示す。図中、（ａ）〜（ｃ）は428RNA、（ｄ）〜（ｆ）は430RNAをそれぞれ用いて作製したもの、また、（ａ）（ｄ）はピレン、（ｂ）（ｅ）はNBD、（ｃ）（ｆ）はダンシルをそれぞれ蛍光分子に使用して作製したRNAセンサーのATP添加（0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 μM）に伴う蛍光強度変化の結果を示す。各グラフの縦軸は蛍光強度、横軸は波長（nm）を示す。
同図に示すように、Dansylペプチドを用いたRNPセンサーでは変化は小さいものであったが、NBDペプチドおよび Pyreneペプチドを用いて作製したRNPセンサーでは428RNA、430RNAのいずれを用いて作製したRNPセンサーの場合でもATPの添加とともに蛍光強度は増加した。
【００４０】
〔実施例４：ＲＮＰセンサーの性能評価（塩基選択性評価）〕
塩基部分の認識を評価するために、ATP, UTP, CTP, GTPについてATPで評価した濃度範囲で蛍光変化を評価した。反応条件中（10mM Tris-HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2）RNA（428RNA）と蛍光修飾ペプチド（Pyrene-Revペプチド0.5μM）との１：１複合体を形成させたのち各種NTPを添加（0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 μM）して室温30分間インキュベーションし蛍光を360nmの励起波長で測定した。その結果を図６に示す。同図に示すようにUTP, CTP, GTPを添加した際には蛍光変化は認められず、RNPセンサーは高い塩基認識能を保持していることがわかった。図６の各グラフ中、縦軸は蛍光強度、横軸は波長（nm）を示す。
【００４１】
〔実施例５：ＲＮＰセンサーの選択性（dATP, AMP, ATPの比較）〕
選択性を確認するために428 RNA とPyrene-Revペプチドとの複合体についてリガンド（AMP, ATP,もしくは dATP）添加に伴う蛍光変化を測定し、相対蛍光強度（即ち、リガンド添加後の蛍光強度（Ｉ）をリガンド添加前の蛍光強度（Ｉ０）で割ったもの）を加えたリガンド濃度に対してプロットした。その結果を図７に示す。同図に示すように、AMPおよびdATPを加えた場合にもATPと同程度の蛍光強度変化、親和性を示したことからアデノシンの塩基部について正確な認識を行っていることがわかった。
【００４２】
〔実施例６：異なるＲＮＡサブユニットを用いたＲＮＰセンサー性能の比較〕
428RNAまたは430RNAをRNAサブユニットとして用い、ペプチドサブユニットとしてPyrene-Revペプチドを用いて作製したリボヌクレオペプチドセンサーのATP結合をリボヌクレオペプチドセンサーにATPを添加した際の蛍光変化から解析した。その結果を図８に示す。測定条件下（10mM Tris-HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2）でのATPとリボヌクレオペプチドセンサーの解離定数（Kd）は、428RNAの場合３９μＭであり、430RNAの場合８６μＭであった。図８のグラフ中、黒丸印は、428RNA-Pyrene-Rev複合体の測定結果を、黒三角印は、430RNA-Pyrene-Rev複合体の測定結果をそれぞれ示す。
【００４３】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、ＲＮＡ−ペプチド複合体を用いた蛍光センサーに関するものであり、前述したとおり、任意の分子に対するセンサーとしてテーラーメードに設計・作製することができ、汎用性に優れるため、医療分野や環境分野など幅広い産業分野での利用が期待できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態であるＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーの作製法を概念的に説明する図である。
【図２】上記の作製法により実際に得られた、ＡＴＰとの結合能の高いＲＮＡ配列群のうち、相同性のある１グループの配列を示す図である。
【図３】上記ＲＮＡ配列群のうち、相同性のある他のグループの配列を示す図である。
【図４】上記ＲＮＡ配列群のうち、相同性のあるさらに他のグループの配列を示す図である。
【図５】（ａ）〜（ｆ）は、複数種類のＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーについて、ＡＴＰ添加に伴う蛍光変化を評価した結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、１種類のＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーについて、各種ＮＴＰ添加に伴う蛍光変化を評価した結果を示すグラフである。
【図７】１種類のＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーについて、AMP, ATP, dATP添加に伴う相対蛍光強度変化を評価した結果を示すグラフである。
【図８】ＲＮＡサブユニットが互いに異なる２種類のＡＴＰ検出用リボヌクレオペプチドセンサーについて、ＡＴＰ添加に伴う蛍光変化割合を評価した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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