(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンズイミダゾール又はベンズイミダゾールのベンゼン環若しくは５員環がアルキル基若しくはハロゲン原子で置換された化合物とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体とからなる複合体を有効成分として含む、核酸合成反応促進剤。
【請求項２】
ベンズイミダゾール又はベンズイミダゾールのベンゼン環若しくは５員環がアルキル基若しくはハロゲン原子で置換された化合物とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体とからなる複合体の存在下に、ヌクレオシドホスホロアミダイト又はヌクレオシドホスホノアミダイトとヌクレオシドとを反応させることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベンズイミダゾール(benzimidazole)又はその類縁体(benzimidazoles)とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体からなる複合体及びそれを用いた核酸化合物、特にオリゴヌクレオチドの合成方法に関するもので、化学、医薬及び農薬の分野等で幅広く利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴヌクレオチドなどの核酸化合物を合成するためのヌクレオシドの縮合方法としては、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法(丹羽峰雄著、ＤＮＡの化学合成法(化学と生物：実験ライン２２)、広川書店(1992年))及びチオホスファイト法(T. Yoshida、K. Kimura、United States Patent 4,808,708(1989年))が知られている。
【０００３】
このうち、ホスホロアミダイト法は、自動合成機を用いて行う合成方法として広く用いられており、また、この合成方法においては、合成反応促進剤として1H-テトラゾールが通常用いられている。
【０００４】
しかし、アンチセンス核酸法など最近の核酸化学の進歩にともない、修飾核酸を用いるホスホロアミダイト法による合成反応において、1H-テトラゾールを用いるのでは充分に反応を促進できない場合が増えてきている。
【０００５】
このため、1H-テトラゾールにかわる反応促進剤として、5-(p-ニトロフェニル)-1H-テトラゾール（NPTと略する）(B. C. Froehler,M. D. Matteucci,Tetrahedron Lett.,24 巻,3171,1983年)、5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETTと略する）(R. Vinayak,Nucleic Acids Symp.,Series,31 巻,165,1994年)などがこれまでに報告されている。
【０００６】
これらの試薬は、1H-テトラゾールの５位の炭素に電子吸引基を導入することでアゾール環の電子密度を低下させ、アゾールの酸性度を高めるように設計されたものであるが、経済性や有機溶媒に対する溶解性において問題を残しているものである。
【０００７】
さらに、比較的活性が高く、溶解性、経済性に優れた三フッ化ホウ素−ベンズイミダゾール錯体（日本化学会第69春季年会、演題番号4 G5 25(1994年)）が本発明者等により呈示されたが、このものは上記のような優れた特性を有する反面、固相合成への適用は難しく、さらに、アリール化したデオキシリボヌクレオシドホスホロジイソプロピルアミダイトやデオキシリボヌクレオシドホスホロモルホリダイト、及び立体障害の大きい保護基や置換基を２’水酸基に有するリボヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトなどの反応性の低いヌクレオシドホスホロアミダイトに対しては、反応を十分に促進するという点では未だ完全に満足できるものではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホスホロアミダイト法における反応促進剤としての活性が1H-テトラゾールよりも高く、特に反応性の低いヌクレオシドホスホロアミダイトに対しても有効であり、かつ経済性及び簡便性を兼ね備えた、新しい核酸合成反応促進剤、特にホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成方法のための反応促進剤を開発し、該促進剤を用いた核酸合成法、特にホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ベンズイミダゾール又はその類縁体とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体からなる新規な複合体、特にベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸又はベンズイミダゾールとメタンスルホン酸からなる新規な複合体がホスホロアミダイト法の反応促進剤として優れていることを見出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のものに関する。
［１］ベンズイミダゾール又はその類縁体とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体からなる複合体、
［２］［１］記載の複合体を有効成分として含む核酸合成反応促進剤、及び
［３］［１］記載の複合体の存在下にヌクレオシドホスホロアミダイト又はヌクレオシドホスホノアミダイトとヌクレオシドとを反応させることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の、ベンズイミダゾール又はその類縁体とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体からなる複合体としては、例えばベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸、又はベンズイミダゾールとメタンスルホン酸からなる新規な複合体を挙げることができ、それぞれ下記構造式（１）又は（２）で表すことができる化合物（それぞれ化合物（１）及び化合物（２））で、ルイス塩基であるベンズイミダゾールの窒素上の孤立電子対に水素イオンが結合した陽イオンと、トリフルオロメタンスルホン酸又はメタンスルホン酸の陰イオンとがイオン結合で複合体を形成している化合物であり、ベンズイミダゾールの解離可能な水素の酸性度が水素イオンの付加により増大しているのが特徴である。
【００１３】
【化１】
0003985103.tif 000002
【００１４】
【化２】
0003985103.tif 000003
本発明の複合体は、例えばベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸又はメタンスルホン酸とを等モルずつ、室温下、ジクロロメタン中で混ぜ、エーテル中より再結晶する方法等により、容易に得ることができる。
【００１５】
この際、ジクロロメタンの他に、クロロホルム、四塩化炭素、1,2-ジクロロエタンなどを用いることができる。また、エーテル（ジエチルエーテル）の他に、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどを用いることができる。
【００１６】
このようにして得られた複合体は、酸素及び湿気に対して安定であり、室温保存が可能であるうえ、アセトニトリルに対する溶解性が高く、例えばベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸との複合体のアセトニトリルに対する溶解性は０．４モル／ｌ、ベンズイミダゾールとメタンスルホン酸との複合体については０．１モル／ｌである。
【００１７】
本発明におけるアルカンスルホン酸としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸など、アルカンスルホン酸であればいかなるものでもよいが、低級アルカンのものが好ましく、特にメタンスルホン酸が好適に用いられる。また、本発明においては、ベンズイミダゾールに代えてベンズイミダゾール類縁体を、アルカンスルホン酸に代えてハロゲン化アルカンスルホン酸を用いることができる。ベンズイミダゾール類縁体としては、ベンズイミダゾール骨格を有するものが広く用いられるが、ベンズイミダゾールのベンゼン環又は５員環がアルキル基やハロゲンなどで置換されている化合物などが挙げられる。例えば、２−クロロベンズイミダゾール、２−ブロモベンズイミダゾール、２−メチルベンズイミダゾール、２−フェニルベンズイミダゾール、１−メチルベンズイミダゾールなどが好適に用いられる。ハロゲン化アルカンスルホン酸としては、アルキル基の１又は複数の水素がハロゲン原子で置換されているいかなるものでもよく、置換ハロゲン原子としてはフッ素、塩素などいかなるものでもよいがフッ素が好ましく、特にフッ化メタンスルホン酸、その中でもトリフルオロメタンスルホン酸が好適に用いられる。
【００１８】
本発明の複合体、特にベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸、又はベンズイミダゾールとメタンスルホン酸からなる複合体は、ホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドを合成する際の反応促進剤として有効なものである。
【００１９】
本発明の複合体を用いて、ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドを反応させる縮合反応について説明する。
【００２０】
ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドを反応させる縮合反応、すなわちホスホロアミダイト法オリゴヌクレオチド合成反応は前述のように公知の方法であり、一般的には以下の構造式（３）に示される、必要に応じて保護基で保護されたヌクレオシドのアミダイト試薬（化合物（３））と、構造式（４）で示される、必要に応じて保護基で保護されたヌクレオシド（化合物（４））とを有機溶媒中で反応させる方法である。
【００２１】
【化３】
0003985103.tif 000004
【００２２】
【化４】
0003985103.tif 000005
上記構造式（３）及び（４）で示される、必要に応じて保護基で保護されたヌクレオシドのアミダイト試薬及びヌクレオシドとしては、ホスホロアミダイト法オリゴヌクレオチド合成反応で用いられている公知のものがそのまま例示されるが、それらの一部を具体的に示すと以下のようなものである。
【００２３】
すなわち、構造式（３）と（４）におけるＢ1及びＢ2は、核酸塩基又は必要に応じて保護基で保護をした核酸塩基から、ピリミジン塩基の場合には１位の水素が、またプリン塩基の場合には９位の水素が除去されたものであり、核酸塩基としては、例えば、チミン及びウラシルが、また保護基で保護する必要のある核酸塩基としては、例えば、シトシン、アデニン、及びグアニンなどホスホロアミダイト法で通常使用されるものを挙げることができる。ここで、核酸塩基の保護基としては、シトシンの４位やアデニンの６位のＮに結合させたアリルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、ベンジル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、第三ブチルフェノキシアセチル基、グアニンの２位のＮに結合させたイソブチリル基、アリルオキシカルボニル基、フェノキシアセチル基、第三ブチルフェノキシアセチル基など、ホスホロアミダイト法で通常使用されるものを挙げることができる。
【００２４】
Ｒ1〜Ｒ6についても、下記に例示されるようなホスホロアミダイト法で通常使用されるものが適用される。
【００２５】
Ｒ1としては、フェニル、フェノキシ、2-クロロフェノキシ、アリルオキシ、2-シアノエトキシ、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、2-(2-ピリジル)エチル、3-(3-ピリジル)プロポキシ、3-(4-ピリジル)プロポキシ、4-(2-ピリジル)ブトキシ、5-(2-ピリジル)ペントキシ、2-(2,2'-ビピリジル)エトキシなどである。
【００２６】
Ｒ2としては、二つあるそれぞれが同じであっても異なっていてもよく、例えば、イソプロピル、メチル、エチル、プロピル、フェニルなどである。またＲ2としては、それが環状であってもよく、例えば、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2）2、（ＣＨ2）4、（ＣＨ2）5、（ＣＨ2）7などである。
【００２７】
Ｒ3は、Ｈ又はＯＲ7で、Ｒ7としては、アリルオキシカルボニル、第三ブチルジメチルシリル、トリエチルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジイソプロピルフェニルシリル、メチル、フェニル、テトラヒドロピラニル、1-(メトキシ)-4-オキサシクロヘキシル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、p-トルエンスルホニルなどである。
【００２８】
Ｒ4としては、第三ブチルジメチルシリル、トリエチルシリル、ジフェニルメ チルシリル、ジイソプロピルフェニルシリル、メチル、フェニル、テトラヒドロピラニル、1-(メトキシ)-4-オキサシクロヘキシル、アセチル、ベンゾイル、ピ バロイル、p-トルエンスルホニルなどである。
【００２９】
Ｒ5としては、アリルオキシカルボニル、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、第三ブチルジメチルシリル、トリエチルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジイソプロピルフェニルシリル、メチル、フェニル、テトラヒドロピラニル、1-(メトキシ)-4-オキサシクロヘキシル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、p-トルエンスルホニルなどである。
【００３０】
Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8で、Ｒ8としては、アリルオキシカルボニル、第三ブチルジメチルシリル、トリエチルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジイソプロピルフェニルシリル、メチル、フェニル、テトラヒドロピラニル、1-(メトキシ)-4-オキサシクロヘキシル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、p-トルエンスルホニルなどである。
【００３１】
ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドを反応させる縮合反応、すなわちホスホロアミダイト法オリゴヌクレオチド合成反応は一般に有機溶媒中で行われており、使用される溶媒としては、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル等のアルキルニトリル類、ジクロロメタン、1,1-ジクロロエタン、1,2-ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化アルカン、テトラヒドロフラン等のエーテル類などであり、本発明においても同様にこれらの溶媒を用いて反応させることができる。
【００３２】
反応は、１０℃から４０℃、好ましくは１５℃から３５℃、さらに好ましくは２０℃から３０℃の温度下で行われる。
【００３３】
反応させる際のヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドのモル比は、ヌクレオシドを１とすると、ヌクレオシドホスホロアミダイトは１〜１０、好ましくは１.２〜２.０、さらに好ましくは１.２であり、本発明の複合体の使用量は、モル比で、ヌクレオシドを１として、１〜３０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１．２〜１．５である。
【００３４】
ホスホロアミダイトとヌクレオシドの縮合反応(０.１Ｍ溶液、室温）における反応促進能力を、公知の1H-テトラゾール又はNPTと比較すると、例えば、以下の構造式（５）
【００３５】
【化５】
0003985103.tif 000006
に示す反応性が低いヌクレオシド３’−ホスホロモルホリダイト（化合物（５））と以下の構造式（６）
【００３６】
【化６】
0003985103.tif 000007
に示す５’−ＯＨ体のヌクレオシド（化合物（６））との反応を同一の条件下で行った場合（アミダイト：ヌクレオシド：促進剤＝１．５：１：３、アセトニトリル中、２５℃、５分）、1H-テトラゾール又はNPTを促進剤として用いた場合の反応収率はそれぞれ５２％又は８４％であるのに対し、ベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸の複合体を用いた場合には９８％であった。アミダイトの塩基を他の塩基にかえた場合、及びアミダイトの種類やヌクレオシドの種類を他のものにかえた場合にもほぼ同様の結果が得られ、本発明の促進剤は非常に優れた反応促進作用を示す。とくに、本発明の促進剤は、一般的なホスホロアミダイトに対して有効なだけではなく、化学的要因や立体的要因から反応性が低くなっているホスホロアミダイト等を用いた縮合反応においても優れた反応促進作用を示すものである。
【００３７】
【実施例】
以下実施例に基づいてより詳細に説明する。
【００３８】
［実施例１］ ベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸の複合体（化合物（１））の合成
ベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸とを０．０４モルずつジクロロメタン（５０mL）溶液に０℃で混ぜ、３０分間攪拌した。次いでジクロロメタンを１０mLまで減圧留去させた後、複合体に２０mLのエーテルを加え、これから再結晶して、目的物を得た。
【００３９】
融点：１８８−１９０℃
ＦＴＩＲ（ＫＢｒ）：３１４６、１６２２、１５３５、１４５６、１２９９、１０３０、９５１、９３６、８４１、７６２、６４２cm-1
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：７．５３−７．５５（m,2H,H-7）、７．７４−７．７６（m,2H,H-6）、９．２４（S,1H,H-2）ppm
元素分析：Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ8Ｈ7Ｆ3Ｎ2Ｏ3Ｓ：Ｃ，３５．８３；Ｈ，２．６３；Ｎ，１０．４４
Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，３５．８３；Ｈ，２．５９；Ｎ，１０．４０
溶解性(対アセトニトリル)：０．４モル／L
［実施例２］ ベンズイミダゾールとメタンスルホン酸の複合体（化合物（２））の合成
ベンズイミダゾールとメタンスルホン酸とを０．０４モルずつジクロロメタン（５０mL）溶液に０℃で混ぜ、３０分間攪拌した。反応溶液に２０mLのエーテルを加え、これから再結晶して、目的物を得た。
【００４０】
融点：２１４−２１５℃
ＦＴＩＲ（ＫＢｒ）：３１４６、１６２２、１５３５、１４５６、１４１４、１２９９、１０３０、９５１、９３６、８４１、７６２、６４０cm-1
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：７．６４−７．６８（m,2H,H-7）、７．８９−７．９２（m,2H,H-6）、９．４２（S,1H,H-2）ppm
元素分析：Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ8Ｈ10Ｎ2Ｏ3Ｓ：Ｃ，４４．８５；Ｈ，４．７０；Ｎ，１３．０８
Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４４．８４；Ｈ，４．７８；Ｎ，１３．０７
溶解性(対アセトニトリル)：０．１モル／L以下
［実施例３］ホスホロアミダイト類の合成
a)  5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-チミジン 3'-(2-クロロフェニル) モルホリノホスホロアミダイト（化合物（７ｄ））の合成
下記構造式（７ｄ）で示される標記ホスホロアミダイトを以下の手順で合成した。なお、下記構造式においてＤＭＴrはジメトキシトリチル基、Ｔhはチミジン構造であることを示す。
【００４１】
【化７】
0003985103.tif 000008
1H-テトラゾール(５６８mg、８.１mmol)、モルホリン(０.７８mL、８.９mmol)、2-クロロフェノール(１.６８mL)のアセトニトリル(１０mL)溶液に5'-O-p,p'- ジメトキシトリチル-チミジン 3'-ビスモルホリダイト(１２.１mg、１６.２mmol) のアセトニトリル(１０mL)溶液をキャニュラーを通して加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(１５０mL)で希釈し、飽和食塩水(１００mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗生成物(１３g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１５０g、ヘキサン／酢酸エチル／モルホリン＝１／２／痕跡量)で精製し、目的とする5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-チミジン 3'-(2-クロロフェニル) モルホリノホスホロアミダイト１１.２５g(１４.３mmol／収率８８％）を得た。
【００４２】
5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-チミジン 3'-(2-クロロフェニル) モルホリノホスホロアミダイト（化合物（７ｄ））の特性
形状：無色アモルファス
ＦＴＩＲ（ＫＢr)：３１６７、３０６１、２９５５、２８３９、１６９１、１６０８、１５８４、１５１０、１４７６、１３６８、１２５４、１１７７、１１１１、１０３４cm-1
ＵＶ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax ２３７nm(sh)、２６９nm(ε=18800)
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：１.４３(s,3H,CH3)、２.３１−２.４１(m,1H,H-2')、２.４８−２.６６(m,1H,H-2')、３.１０−３.２６(m,4H,N(CH2CH2)2O)、３.３４(dd,J=3.7,10.6Hz,1H,H-5')、３.４２−３.６３(m,5H,H-5',N(CH2CH2)2O) 、３.７６(s,6H,OCH2x2)、４.１７−４.３０(m,1H,H-4')、４.８２−５.０１(m,1H,H-3')、６.３９−６.４８(m,1H,H-1')、６.６５−６.８６(m,4H,DMTrのOCH3のオルト位プロトン)、６.９５−７.４０(m,13H,芳香環プロトン)、７.５８
、７.６３(2本のシングレット,1H,H-6) 、８.１−８.９(br s,1H,NHCO)ppm
31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：１４０.９、１４１.４ppm
なお、化合物（７ａ）、（７ｂ）、及び（７ｃ）についても化合物（７ｄ）を合成した方法と同様な方法で合成した。
【００４３】
b)  5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-チミジン 3'-(2-シアノエチル) N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（８））の合成
下記構造式（８）で示される標記ホスホロアミダイトを以下の手順で合成した。
なお、下記構造式においてＤＭＴrはジメトキシトリチル基、Ｔhはチミジン構造であることを示す。
【００４４】
【化８】
0003985103.tif 000009
5'-O-p,p'-ジメトキシトリチルチミジン(２４５mg、０.４５mmol)の塩化メチ レン(５mL)懸濁液にジイソプロピルエチルアミン(０.３５mL、２mmol)及びクロロ(2-シアノエチルアルコキシ)ジイソプロピルアミノホスフィンを加え、室温で１２分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタン(５０mL)で希釈し、飽和食塩水(２０mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗生成物(３５０mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(６g、ヘキサン／酢酸エチル／ジイソプロピルアミン＝１／１／痕跡量)で精製し、目的とする5'-O-p,p'-ジメ トキシトリチル-チミジン 3'-(2-エチルアルコキシ) N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトを収率８５％で得た。
【００４５】
5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-チミジン 3'-(2-シアノエチル) N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（８））の特性
形状：無色アモルファス
（８）は、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて亜リン酸の２−シアノエチル部位の２種のメチレン水素とジイソプロピルアミノ基のメチル水素及びメチン水素に帰属されるピークが観察されること、31Ｐ  ＮＭＲスペクトルにおいてホスホロアミダイトのリン原子の化学シフトとして適切な領域である１４７．４ppmにピークが観察されることよりその構造を確認した。
【００４６】
C)  N6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-アデノシン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（９））の合成
下記構造式（９）で示される標記ホスホロアミダイトを以下の手順で合成した。
なお、下記構造式においてＴＢＤＭＳはt-ブチルジメチルシリル基、ＤＭＴrは ジメトキシトリチル基、ＡｄAOCはN6-アリルオキシカルボニルアデノシン構造であることを示す。
【００４７】
【化９】
0003985103.tif 000010
2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチル-アデノシン（３.０g、４.３９mmol）のテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(２０mL)溶液にトリメチルシリルイミダゾール(１.２７mL、６.５９mmol)を加え、室温で１０分攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(１５０mL)で希釈し、飽和食塩水(１００mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後得られたトリメチルシリル体のＴＨＦ(２０mL)溶液に１.６２N塩化tert-ブチルマグネシウム(５.５mL、８.７８mmol)ＴＨＦ溶液を滴下し、室温で３０分攪拌した。アリルオキシカルボニル-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１.３４g、６.９５mmol)ＴＨＦ溶液を滴下し室温で３０分攪拌した。反応容器にメタノール(５mL)を加え、酢酸エチル(１５０mL)で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液(１００mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００mL)、飽和食塩水(１００mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗アリルオキシカルボニル体(４.２g)を１Mクエン酸メタノール溶液(２０mL、２０mmol)で３０分処理し、反応溶液に水(５０mL)を加え、酢酸エチル(１５０mL)で抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液(１００mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００mL)、飽和食塩水(１００mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗生成物(３.８g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(８０g、ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１／２／痕跡量)で精製し、目的とする無色アモルファスのN6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチル-アデノシン１.６０g（２.５０mmol／収率５７％）を得た。
【００４８】
N6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチル-アデノシンの特性
ＴＬＣ：Ｒf=０.４３(ヘキサン／酢酸エチル＝１／５)
ＦＴＩＲ（ＫＢr)：３２６６、２９３２、２８５９、２０４７、１７６１、１６１３、１５１０、１４６６、１３０４、１２５４cm-1
ＵＶ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax ２３５nm(ε=21200) 、２６７nm(ε=15700)
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：０.０３(s,3H,(CH3)2Si)、０.１０(s,3H,(CH3)2Si)、０.９０(s,9H,(CH3)3C)、３.２７(dd,J=3.7,10.6Hz,1H,H-5')、３.５３(dd,J=3.7,10.9Hz,1H,H-5')、３.７９(s,6H,OCH3x2)、４.１５−４.３８(m,2H,H-3'及びH-4')、４.７１(d,J=5.7Hz,2H,CH2=CHCH2)、４.９５(t,J=4.9Hz,1H,H-2')、５.３０(dd,J=1.0,10.2Hz,1H,cis-CH2=CHCH2)、５.４２(dd,J=1.0,17.2Hz,1H,トランス-CH2=CHCH2)、５.８２−６.０３(m,3H,H-1'及びCH2=CHCH2)、６.７３(d,J=7.6Hz,4H,DMTrのOCH3のオルト位プロトン)、７.１５−７.４５(m,9H,DMTrの芳香環プロトン)、８.０５(s,1H,H-2)、８.６１(s,1H,H-8)ppm
N6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチル-アデノシン(３１３mg、０.４８８mmol)のアセトニトリル(２mL)溶液に1H-テトラゾール(１７mg、０.２４４mmol)、ジイソプロピルアミン(３８μL、０.２６９mmol)を加え、室温で１０分攪拌した後、アリルオキシビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(２２５μL)を加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(１００mL)で希釈し、飽和食塩水(２０mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗生成物(４４０mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１０g、ヘキサン／酢酸エチル／ジイソプロピルアミン＝２／１／痕跡量)で精製し、目的とするN6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-アデノシン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト４０４mg(０.４９mmol／収率８８％)を得た。
【００４９】
N6-アリルオキシカルボニル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチル-アデノシン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（９））の 特性
形状：無色アモルファス
ＴＬＣ：Ｒf=０.４８(ヘキサン／酢酸エチル＝１／１)
ＦＴＩＲ（ＫＢr)：２９６４、２０４７、１７６５、１６１１、１５１０、１４６４、１３６４、１３０４、１２５２cm-1
ＵＶ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax ２３６nm(ε=16500) 、２６７nm(ε=14100)
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：０.０４(s,3H,(CH3)2Si)、０.１１(s,3H,(CH3)2Si)、０.９１(s,9H,(CH3)3C)、１.２３−１.５１(m,12H,CH(CH3)2x2) 、３.５３−３.６２(m,1H,H-5')、３.７２−３.９０(m,3H,H-5',CH(CH3)2x2)、３.９２(s,6H,OCH3x2)、４.１０−４.４６(m,2H,CH2=CHCH2O)、４.５７−４.７１(m,2H,H-3'及びH-4') 、４.７１(d,J=5.7Hz,2H,CH2=CHCH2)、４.９８(t,J=4.9Hz,1H,H-2')、５.１７−５.５５(m,5H,CH2=CHCH2OCO,cis-CH2=CHCH2OCO,CH2=CHCH2O)、５.６３(dd,J=1.0,17.4Hz,1H,トランス-CH2=CHCH2OCO)、５.８２−６.３４(m,3H,H-1'及びCH2=CHCH2x2)、７.０１(d,J=7.6Hz,4H,DMTrのOCH3のオルト位プロトン)、７.４１−７.７３(m,9H,DMTrの芳香環プロトン)、８.３７、８.３９(2本のシングレット,1H,H-2)、８.４５(br s,1H,NHCO)、８.８５、８.８７(2本のシングレット,1H,H-8)ppm
31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：１４８.９、１５１.１ppm
d)  2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチルウリジン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（１０））の合成
下記構造式（１０）で示される標記ホスホロアミダイトを以下の手順で合成した。なお、下記構造式においてＴＢＤＭＳはt-ブチルジメチルシリル基、ＤＭＴrはジメトキシトリチル基、Ｕrはウリジン構造であることを示す。
【００５０】
【化１０】
0003985103.tif 000011
2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチルウリジン(１.６g、２.５２mmol)のアセトニトリル(２mL)溶液に1H-テトラゾール(８９mg、１.２７mmol)、ジイソプロピルアミン(２００μL、１.４０mmol)を加え、室温で１０分攪拌した後、アリルオキシビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(０.９４mL)を加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(１００mL)で希釈し、飽和食塩水(１００mL)で洗浄し、乾燥した。濃縮した後、得られた粗生成物(１.９g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(４０g、ヘキサン／酢酸エチル／ジイソプロピルアミン＝２／１／痕跡量)で精製し、目的とする2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチル-ウリジン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト１.７７g(２.０９mmol／収率８３％)を得た。
【００５１】
2'-O-t-ブチルジメチルシリル-5'-O-p-モノメトキシトリチルウリジン 3'-アリルN,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物（１０））の特性
形状：無色アモルファス
ＴＬＣ：Ｒf=０.４２(ヘキサン／酢酸エチル＝１／１)
ＦＴＩＲ（ＫＢr)：３１９２、３０６１、２９６５、２９３２、２８５８、１６９６、１６１１、１５１０、１４６０、１３７９、１３０２、１２５４、１１８２、１０３２cm-1
ＵＶ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax ２３１nm(ε=26500) 、２６３nm(ε=16900)
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：０.０５(s,3H,(CH3)2Si)、０.１２(s,3H,(CH3)2Si)、０.９１−１.１２(m,9H,(CH3)3C)、３.５３−３.６２(m,2H,H-5',5")、３.９ ２(s,6H,OCH3x2)、４.１０−４.４６(m,2H,CH2=CHCH2O)、４.５７−４.７１(m,2H,H-3'及びH-4') 、４.７１(d,J=5.7Hz,2H,CH2=CHCH2)、４.９８(t,J=4.9Hz,1H,H-2')、５.１７−５.５５(m,5H,CH2=CHCH2OCO,cis-CH2=CHCH2OCO,CH2=CHC2O)、 ５.６３(dd,J=1.0,17.4Hz,1H,トランス-CH2=CHCH2OCO)、５.８２−６.３４(m,3H,H-1,及びCH2=CHCH2x2)、７.０１(d,J=7.6Hz,4H,DMTrのOCH3のオルト位プロトン) 、７.４１−７.７３(m,9H,DMTrの芳香環プロトン)、８.３７、８.３９(2本のシングレット,1H,H-2)、８.４５(br s,1H,NHCO)、８.８５、８.８７(2本のシングレット,1H,H-8)ppm
31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：１４８.５、１４９.７ppm
同様の手順にて下記構造式（１１）で示されるホスホロアミダイト（化合物（１１））を収率８６％で合成した。
【００５２】
【化１１】
0003985103.tif 000012
同様の手順にて下記構造式（１２）で示されるホスホロアミダイト（化合物（１２））を収率８５％で合成した。
【００５３】
【化１２】
0003985103.tif 000013
［実施例４］ヌクレオシドの合成
前記構造式（６）で示される化合物（６）、下記構造式（１３）
【００５４】
【化１３】
0003985103.tif 000014
で示される化合物（１３）、及び下記構造式（１４）
【００５５】
【化１４】
0003985103.tif 000015
で示される化合物（１４）は、既知の方法（J.Am.Chem.Soc.112巻,1691-1696頁（1990年））に従い、または参考にして合成した。
【００５６】
［実施例５］ホスホロアミダイトとヌクレオシドの縮合反応
a)液相における縮合反応
上記のようにして得たホスホロアミダイトとヌクレオシドとを以下のようにして縮合反応させた。
【００５７】
ホスホロアミダイト(２．４mmol)、ヌクレオシド(２．０mmol)及び反応促進剤(２．４mmol)の混合物をアセトニトリル(６mL)に溶解し、室温で５分攪拌した後、１.０M t-ブチルハイドロパーオキサイドトルエン溶液(４mmol)を加え、５分攪拌した。
【００５８】
単離収率は、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(４０g、ヘキサン／酢酸エチル／ジイソプロピルアミン＝１／５／痕跡量)で精製単離し決定した。
【００５９】
以下の表１に示すデオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドの縮合反応について、反応促進剤としてベンズイミダゾール−トリフルオロメタンスルホン酸複合体（化合物（１））、及び公知の1H-テトラゾールとNPT（５−（ｐ−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾール）を用いて行い、これら促進剤の能力を比較したところ以下の通りであった。
【００６０】
【表１】
0003985103.tif 000016
表１における収率は、単離収率を表示したものであり、アミダイト、ヌクレオシド、及び生成物であるヌクレオシド２量体のうち、化合物（７ａ）、（７ｂ）、（７ｃ）、（７ｄ）、（６）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、及び（１４）は既に示した構造のものである。化合物（１５ａ）、（１５ｂ）、（１５ｃ）、（１５ｄ）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、及び（２０）は以下の構造式で示される。
【００６１】
【化１５】
0003985103.tif 000017
【００６２】
【化１６】
0003985103.tif 000018
【００６３】
【化１７】
0003985103.tif 000019
【００６４】
【化１８】
0003985103.tif 000020
【００６５】
【化１９】
0003985103.tif 000021
【００６６】
【化２０】
0003985103.tif 000022
ここで、#1はホスホロアミダイト(０.０５mmol)、ヌクレオシド(０.０３３mmol)及び反応促進剤(０.０５mmol)の混合物をアセトニトリル(１mL)に溶解した場合の結果である。#2は縮合反応を１分とした場合の結果である。
【００６７】
o-クロロフェニル 5'-O-p,p'- ジメトキシトリチル-チミジル(3'→5')3'-第３ブチルジメチルシリルチミジン（化合物（１５ｄ））の特性
ＴＬＣ：Ｒf=０．４１（Hex：AcOEt=1:9）
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）：０．０８(s,6H,Si(CH3)2)、０．９０(s,9H,SiC(CH3)3)、１．４１(s,3H,5-CH3)、１．８５(s,3H,5-CH3)、２．０−２．８０(m,4H,21及び21)、３．２０−３．６０(m,2H,51)、３．８０(s,6H,OCH3及びOCH3)、３．９０−４．７０(m,5H,31,41,41及び51)、５．３０−５．５０(m,1H,31)、６．２９(t,1H,J=7.0Hz,11)、６．５０(t,1H,J=7.0Hz,11)、６．８０−７．００(m,4H,ph)、７．１０−７．８０(m,15H,6,6及びph)、９．７２(s,2H,NH及びNH)ppm
31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：−７．０、−７．１
表１から明らかなように、いずれの反応の場合にも、促進剤であるベンズイミダゾール−トリフルオロメタンスルホン酸複合体による反応促進能力が、1H-テトラゾール、又はNPTを用いた場合のそれらより優れていた。さらに、ETTを用いた場合よりも優れていることが別の実験より分かった。
【００６８】
促進剤として化合物（２）を用いた場合にも以下に示すように1H-テトラゾール、NPT、及びETTを用いた場合よりも優れていた。すなわち、化合物（７ｄ）と化合物（６）との縮合反応をアセトニトリルに溶解した0.4M促進剤を用いて行った場合、反応は45分で終了し、生成物として化合物（１５ｄ）が、９８％の収率で得られた。それに対し、1H-テトラゾール、NPT、又はETTを用いた場合、同様な条件下でそれぞれ９０分、３０分、又は４０分を要した。なお、促進剤として化合物（１）を用いた場合は１分以内に反応が終了し、生成物である化合物（１５ｄ）の収率は９８％であった。また、反応時間を１分として比較した場合、促進剤として化合物（２）を用いた場合の生成物（１５ｄ）の収率が３３％であるのに対し、1H-テトラゾール又はNPTを用いた場合、同様な条件下でそれぞれ１２％又は４７％であった。
【００６９】
以上の例で明かなようにベンズイミダゾール−トリフルオロメタンスルホン酸複合体及びベンズイミダゾール−メタンスルホン酸複合体の優位性は、反応性の低いモルホリダイト体やo-クロロフェニルエステル体、及び2'-O-t-ブチルジメチルシリル基の立体障害のために反応性の低下した化合物において顕著に現れている。
【００７０】
なお、ベンズイミダゾール−トリフルオロメタンスルホン酸複合体及びベンズイミダゾール−メタンスルホン酸複合体を用いた反応において脱トリチル化は起こらず、またデオキシアデノシン誘導体やデオキシグアノシン誘導体を用いた反応でのデプリネーションも認められなかった。
【００７１】
b)  固相での縮合反応
ABI社製381A機を用い、付属の標準プログラムで自動合成した。その合成サイクルは以下の表２に示したとおりであり、全て０．２μmolスケールで行った。
【００７２】
【表２】
0003985103.tif 000023
上記の方法によりＣＰＧ上に担持されたチミジン(０.２μmmol)(構造的には下記構造式で化合物（２１）として示される）を出発物質とし、シアノエチルホスホロアミダイト（化合物（８））をモノマー単位に用いて、促進剤としてベンズイミダゾール−トリフルオロメタンスルホン酸複合体（化合物（１））を用いて合成したところ、各ステップの平均縮合率99.1％、通算収率92.1％でＴ（ｐＴ）9を合成することができた。
【００７３】
【化２１】
0003985103.tif 000024
これらの収率は、トリチル発色定量法によって求めたものである。トリチル発色定量とは、脱トリチル化の操作の際、採取した反応溶液を濃縮し、過塩素酸−メタノール（３：１）溶液(２５mL)で希釈し、可視−紫外吸収スペクトルにおいて４９８nmの吸収を測定し、前のフラクションにおける同様の値との比により収率を求める方法である。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のベンズイミダゾール又はその類縁体とアルカンスルホン酸又はそのハロゲン置換体からなる複合体、特にベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸との複合体（化合物（１））又はベンズイミダゾールとメタンスルホン酸との複合体（化合物（２））である核酸合成反応促進剤は、従来用いられていた核酸合成反応促進剤に比較してはるかに優れた反応促進活性、特にホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成方法における反応促進活性に優れ、各種のオリゴヌクレオチド、特に化学的・立体的に反応性の低いオリゴヌクレオチドに対し、それらを高収率で効率よく合成することを可能とする優れた効果を奏するものであるばかりでなく、本発明の核酸合成反応促進剤は、酸素及び湿気に対して安定であり室温保存が可能である。さらにこれらは、アセトニトリルに対する溶解性があり、価格も高価ではないという特徴をも併せ持つものである。とくにベンズイミダゾールとトリフルオロメタンスルホン酸との複合体（化合物（１））は、液相合成・固相合成いずれにおいても使用できるという優れた特性をも有するものである。