(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ第一テンプレートからの特異的核酸配列の増幅方法であって、
（Ａ）当該特異的核酸配列を含むＲＮＡ第一テンプレートが合成されるような条件下で、ＤＮＡ第一テンプレートを細胞性ＲＮＡを合成するクラスの原核性ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシド三リン酸と接触させる工程、
（Ｂ）細胞性ＲＮＡを合成するクラスの当該ＲＮＡポリメラーゼを不活性化する工程、
（Ｃ）ＲＮＡ第一テンプレートを
（１）第二ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターのプラス配列を含む第一オリゴヌクレオチドプライマー、
（２）第二オリゴヌクレオチドプライマー、
（３）リボヌクレオシド三リン酸、
（４）デオキシリボヌクレオシド三リン酸、
（５）前記プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第二ＲＮＡポリメラーゼ、
（６）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（７）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素および
（８）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素
と接触させる工程、および
（Ｄ）得られた反応混合物を、適当な条件下で前記特異的核酸配列または当該特異的核酸配列の相補鎖の所望の増幅が達せられるのに十分な時間維持する工程、を含む核酸配列の増幅方法。
【請求項２】
前記原核性ＲＮＡポリメラーゼが大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属バクテリアのＲＮＡポリメラーゼおよびＡｒｃｈａｅ属バクテリアのＲＮＡポリメラーゼから成る群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程Ｂが前記原核性ポリメラーゼの阻害剤を提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤がリファンピシンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（Ｃ）の前に前記試薬およびＲＮＡテンプレートを過熱することが工程（Ｂ）に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
当該反応媒体が約６５℃に加熱されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更にアルキル化スルホキシドおよびＢＳＡを提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルキル化スルホキシドがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記原核性ＲＮＡポリメラーゼが、０．０４から０．２Ｕ／μＬの温度で提供される大腸菌ＲＮＡポリメラーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤が１０から１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で与えられる請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
工程（Ａ）において、前記ＤＮＡ第一テンプレートが二本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（Ａ）において、前記ＤＮＡ第一テンプレートが一本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）細胞性ＲＮＡを合成する原核性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第一ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）リボヌクレオシド三リン酸、
（ｃ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸、
（ｄ）第二ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターのプラス配列を含む第一オリゴヌクレオチドプライマー、
（ｅ）第二オリゴヌクレオチドプライマー、
（ｆ）前記プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第二ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｇ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｈ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｉ）一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ
を含む１以上の容器を含む、核酸配列を増幅するためのキット。
【請求項１４】
前記第一ＲＮＡポリメラーゼが大腸菌ＲＮＡポリメラーゼである請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
更に大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を含む容器を含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
阻害剤がリファンピシンである請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
更にアルキル化スルホキサイドを含む容器およびＢＳＡを含む容器を含む請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、細胞性ＲＮＡを合成するクラスのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用した、特異的核酸シーケンス増幅方法の改良に関する。
発明の背景
サンプル中に核酸が存在する場合は、このサンプルが採取された採取源が疾病、不全もしくは異常状態である可能性がある。一定の診断によりサンプル中に核酸が存在するか否かが決定される。これらの診断はつねに核酸の増幅を使用とするが、その理由はコピー数の問題があるからである。
たとえばウイルスまたは細胞では、通常特定の遺伝子のコピーは一つである。遺伝子の特異的な核酸を増幅しなければ、核酸が存在することを検知することはむずかしい。
核酸増幅方法は多数ある。そのような方法の二つを挙げると、米国特許第5,130,238号公報(マレクら(Malek et al.))および米国特許第5,409,818号公報(マレクら(Malek et al.))に記載されている方法がある。マレクらの増幅方法はユーザーが関与し操作しなければならないことがより少なくてすむ。増幅サイクルは比較的一定した周囲温度で起こり、試薬を連続的に添加しなくてもよい。鋳型(テンプレート)核酸配列は、増幅方法の各サイクルにおいて一つの基質から二以上の生成物を生成する。これらの増幅方法は出発鋳型としてＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを使用する。
一本鎖または二本鎖ＤＮＡが出発鋳型の場合、マレクの方法は熱またはアルカリ変性してから増幅サイクルを行う必要がある。
一本鎖ＤＮＡが出発テンプレートの場合、第一プライマーがＤＮＡとハイブリッドを形成する。ついで、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡ生成物を生成する。
この重合の結果物は、ついで、熱またはアルカリ変性されてから一本鎖ＤＮＡがサイクルに入る。
二本鎖ＤＮＡが出発テンプレートの場合、この二本鎖ＤＮＡはまず熱またはアルカリ変性を受ける。第一プライマーは、ついでＤＮＡの両一本鎖のうちの一方とハイブリッドを形成する。ついで、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡを生成する。ついで、この重合の生成物は第二の熱またはアルカリ変性を受けてから一本鎖ＤＮＡがサイクルに入る。
熱変性は問題が多いが、これは増幅サイクルに入るのは等温過程ではないからである。アルカリ変性も問題が多いが、これは増幅工程においてユーザーが関与し、操作することが必要であるためである。熱変性はマレク（Malek）の方法だけでなく、他の増幅方法においても用いることができる(たとえば、ＰＣＲおよびＬＣＲ)。
従って、核酸の増幅を改良して(1)当該方法に含まれる工程数を減らすこと、(2)ユーザーによる関与と操作を減らすこと、(3)増幅サイクルに入る際の加熱行程を省略すること,および(4)加熱が起きる際の温度を低下させることが必要である。
本願発明では、「特異的核酸配列」という用語は、一本鎖または二本鎖の核酸の配列または増幅したいと思う配列に相補的な配列を意味する。「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」は分子生物学的反応に使用するのに適した品質のポリメラーゼを意味する。第一ＲＮＡポリメラーゼの１「単位」は、３７℃１０分間に１ナノモルの放射性標識リボヌクレオシド・トリホスフェートをＲＮＡ第一テンプレートに導入する反応を触媒するＲＮＡポリメラーゼの量を意味する。
発明の開示
本発明は、核酸の増幅を便利にするものであり,従来の増幅方法よりも関与することが少なく、操作も少なくてすむ。ある場合には,増幅は,いずれの増幅サイクルに入る場合も含め,比較的一定した周囲温度で起きる。サイクルに入るのに連続行程は必要とされない。
本発明は,細胞性ＲＮＡを合成するクラスの真核性または原核性の、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを特定の核酸配列の増幅方法に使用することに関する。ある場合には、このポリメラーゼは大腸菌（Escherichia coli）のＲＮＡポリメラーゼである。上述の使用法においては、そのようなポリメラーゼの阻害剤を使用することも含まれる。
本発明は、また、特異的核酸配列の増幅方法に関する。ある場合には、この方法は２つの工程(Ａ)-(Ｂ)を含む。
工程(Ａ)-工程(Ａ)では、ＤＮＡ第一テンプレート;細胞性ＲＮＡを合成するクラスの真核性または原核性ＲＮＡポリメラーゼである第一ＲＮＡポリメラーゼ;リボヌクレオシド・トリホスフェート;デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート;第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識されたプロモーターのプラス配列を持つ第一オリゴヌクレオシド・プライマー;第二オリボヌクレオチド・プライマー;プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第二ＲＮＡポリメラーゼ;ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ;ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ;ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解せずに、加水分解するリボヌクレアーゼを含む試薬を入れた一つまたは二つ以上の反応容器を用意する.試薬は種々の方法で組み合わせて一種または二種以上の反応媒体を用意してもよい。これらの反応には単一の反応容器を使用してもよい。
本発明方法では、(1)第一ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ第一テンプレートを使用して、特異的核酸配列またはこの特異的核酸配列に相補的な配列を含むＲＮＡ第一テンプレートを合成し、(2)第一オリゴヌクレオチド・プライマーがＲＮＡ第一テンプレートと結合してハイブリッドを形成し,(3)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ第一テンプレートを用いて、第一オリゴヌクレオチド・プライマーを延長することによりＤＮＡ第二テンプレートを合成し、それによりＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し,(4)リボヌクレアーゼがＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体のＲＮＡを加水分解し,(5)第二オリゴヌクレオチド・プライマーがＤＮＡ第二テンプレートにハイブリダイズし,(6)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが第二オリゴヌクレオチド・プライマーとＤＮＡ第二テンプレートを用いて第二ＲＮＡポリメラーゼによって認識される機能性プロモーターを合成し,そして(7)第二ＲＮＡポリメラーゼが機能性プロモーターを認識し、かつＤＮＡ第二テンプレートを転写し,それによりＲＮＡ第二テンプレートのコピーが提供される.
その後、サイクルは続く。このサイクルでは、(1)第二オリゴヌクレオチド・プライマーがＲＮＡ第二テンプレートに結合してハイブリッドを形成し、(2)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ第二テンプレートを使用して、第二オリゴヌクレオチド・プライマーを延長することにより、ＤＮＡ第三テンプレートを合成し、それによりＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し、(3)リボヌクレアーゼがＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体のＲＮＡを加水分解し、(4)第一オリゴヌクレオチド・プライマーがＤＮＡ第三テンプレートにハイブリダイズし、(5)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、第一オリゴヌクレオチド・プライマーをテンプレートとして用いて、ＤＮＡ第三テンプレートを延長することにより、第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを合成し、そして(6)第二ＲＮＡポリメラーゼが機能性プロモーターを認識し、かつＤＮＡ第三テンプレートを転写し,それによりＲＮＡ第二テンプレートのコピーが提供される。
工程(Ｂ)-工程(Ｂ)では、特異的核酸配列またはこの特異的核酸配列に相補的な配列の所望の増幅が達成されるのに十分な時間、上述の条件が維持される。
他の場合、本発明の方法は三つの工程(Ａ)-(Ｃ)を含む。この方法(工程(Ａ)-(Ｃ)のすべて)を一つまたは二つ以上の反応容器中で行ってもよい。
工程(Ａ)-工程(Ａ)では、(i)ＤＮＡ第一テンプレート,(ii)細胞性ＲＮＡを合成する真核性または原核性ＲＮＡポリメラーゼである第一ＲＮＡポリメラーゼ、および(iii)リボヌクレオシド・トリホスフェートを含む試薬が用意される。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ第一テンプレートを用いて特異的核酸配列を含むＲＮＡ第一テンプレートを合成する。ＤＮＡ第一テンプレートは二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡであってもよい。第一ＲＮＡポリメラーゼはEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、0.04-0.2単位/μlの範囲内であってもよいが、これに限定されない。
工程(Ｂ)-工程(Ｂ)では、(i)第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターのプラス配列を持つ第一オリゴヌクレオチド・プライマー、(ii)第二オリゴヌクレオチド・プライマー,(iii)プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第二ＲＮＡポリメラーゼ、(iv)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ,(v)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ,(vi)一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解せずに、ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、(vii)リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート、および(viii)ＲＮＡ第一テンプレートを含む試薬が、(1)第一オリゴヌクレオチド・プライマーがＲＮＡ第一テンプレートと結合してハイブリッドを形成し,(2)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ第一テンプレートを用いて、第一オリゴヌクレオチド・プライマーを延長することにより、ＤＮＡ第二テンプレートを合成し、それによりＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し,(3)リボヌクレアーゼが、ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体のＲＮＡを加水分解し、(4)第二オリゴヌクレオチド・プライマーがＤＮＡ第二テンプレートと結合してハイブリッドを形成し、(5)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが第二オリゴヌクレオチド・プライマーとＤＮＡ第二テンプレートを用いて第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを合成し、そして(6)第二ＲＮＡポリメラーゼが機能性プロモーターを認識し、かつＤＮＡ第二テンプレートを転写し,それによりＲＮＡ第二テンプレートが提供されるような条件下で、提供される。
その後、サイクルは続く。このサイクルでは、(1)第二オリゴヌクレオチド・プライマーがＲＮＡ第二テンプレートと結合してハイブリッドを形成し、(2)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ第二テンプレートを用いて、第二オリゴヌクレオチド・プライマーを延長することにより、ＤＮＡ第三テンプレートを合成し、それによりＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し、(3)リボヌクレアーがＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体のＲＮＡを加水分解し、(4)第一オリゴヌクレオチド・プライマーがＤＮＡ第三テンプレートと結合してハイブリッドを形成し、(5)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが第一オリゴヌクレオチド・プライマーをテンプレートとして用いて、ＤＮＡ第三テンプレートを延長することにより,第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを合成し、そして（６）第二ＲＮＡポリメラーゼが機能性プロモーターを認識し、かつＤＮＡ第三テンプレートを転写し,それによりＲＮＡ第二テンプレートのコピーが提供される。
工程(Ｃ)  その後,工程(Ｃ)で,特異的核酸配列またはこの特異的核酸配列に相補的な配列の所望の増幅が達成されるのに十分な時間、上述の条件が維持される。たとえば、30分と4時間の間の時間の条件を維持してもよい。
工程(Ａ)では、デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェートを用意してもよい。そのような状況では、デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェートとリボヌクレオシド・トリホスフェートは第二反応媒体に添加する必要はない。
工程(Ｂ)では、第一ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を用意してもよい。ある場合には、阻害剤はリファンピシンであり、10-100mg/mlの濃度範囲で提供されるが、これに限定されない。
あるいは，第一ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を用いる代わりに、工程(Ａ)の後に第一反応媒体を約65℃に加熱してから工程(Ｂ)を行ってもよい。
工程(Ａ)または(Ｂ)では、また、アルキル化スルホキシドと適切な担体タンパクを用意してもよい。アルキルスルホキシドはジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)であってもよく、そして担体タンパクはウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)であってもよい。
第一オリゴヌクレオチド・プライマーは、第二ＲＮＡポリメラーゼのための転写開始部位のプラス配列を含んでいてもよい。転写開始部位のプラス配列は、通常、プロモーターのプラス配列に作用的に（operatively）リンクされている。第一ＲＮＡポリメラーゼは任意の原核性ＲＮＡポリメラーゼ、たとえばE.coli ＲＮＡポリメラーゼ、Bacillus属バクテリアのＲＮＡポリメラーゼまたはArchae属バクテリアのＲＮＡポリメラーゼであってもよい。第一ＲＮＡポリメラーゼは任意の真核性ＲＮＡポリメラーゼ,たとえばＲＮＡポリメラーゼI,ＲＮＡポリメラーゼII,またはＲＮＡポリメラーゼIIIであってもよい。
第二ＲＮＡポリメラーゼはバクテリオファージＴ7のＲＮＡポリメラーゼであってもよい。その場合、転写開始部位のプラス配列とプロモーターのプラス配列とはともに以下のヌクレオチド・配列である:
0003881009.tif 000002
本発明の方法は、第一プライマー,第二ブライマー,リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド・トリホスフェートのいずれかが消費されているか、またはサイクルのいずれかの生成物が蓄積しているかについて、反応媒体をモニタする工程をさらに含んでいてもよい。このモニタ工程は、(1)核酸プローブ,または制限エンドヌクレアーゼおよび電気泳動による分離を用いてサイクルの核酸生成物を検出すること、(2)ＲＮＡ第二テンプレートの蓄積をモニタすること、(3)第一オリゴヌクレオチド・プライマーの蓄積をモニタすること、(4)ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを含有するＤＮＡをモニタすること、(5)ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体の蓄積をモニタすること、(6)第一プライマー,第二プライマー,リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド・トリホスフェートのいずれかの消費、またはサイクルの生成物のいずれかの蓄積をモニタすることであってもよく、数値は、特異的核酸配列が存在しない場合の、第二反応媒体中の試薬の消費または生成物の蓄積を表わす。この方法では,リボヌクレアーゼはEscherichia coliリボヌクレアーゼＨまたはウシ胸腺リボヌクレアーゼＨであってもよい。第一オリゴヌクレオチド・プライマーまたは第二オリゴヌクレオチド・プライマーは固定化支持体に可逆的に結合される。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ,バクテリオファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ,バクテリオファージＴ3ポリメラーゼ,バクテリオファージΦIIポリメラーゼ．Salmonellaバクテリオファージsp6ポリメラーゼ,またはPseudomonasバクテリオファージgh-1ポリメラーゼであってもよい。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、トリ・ミエロブラストーシス・ウイルス・ポリメラーゼまたはモロニー(Moloney)ネズミ白血病ウイルス・ポリメラーゼのようなレトロウイルス逆転写酵素であってもよい。
ある場合には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡエクソヌクレアーゼ活性を欠いている。他の場合には、第二反応媒体中のＤＮＡポリメラーゼはすべてＤＮＡエクソヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を欠いている。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはトリ・ミエロブラストーシス・ウイルス・ポリメラーゼ,ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼβ,あるいはウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
本発明方法は、サイクルのＤＮＡ生成物を結合してクローニング・ベクターとし、ついでこのＤＮＡ生成物をクローニングし、サイクルのＤＮＡ生成物によりコードされた生成物を発現系で発現する工程を含んでいてもよい。
本発明は、核酸配列を増幅するキットを含む。このキットは、(a)細胞性ＲＮＡを合成するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第一ＲＮＡポリメラーゼ、(b)リボヌクレオシド・トリホスフェート、(c)デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェート、(d)第二ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターのプラス配列を含む第一オリゴヌクレオチド・プライマー、(e)第二オリゴヌクレオチド・プライマー,(f)プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである第二ＲＮＡポリメラーゼ、(g)ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ,(h)ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および(I)一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解せずに、ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、を含有する一つまたは二つ以上の容器を含む。
このキットでは、第一ＲＮＡポリメラーゼはEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。キットは、また、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を含有する容器を含んでいてもよい。ある場合には、阻害剤はリファンピシンである。
上述のキットは、また、アルキル化スルホキシドを含有する容器と適切な担体タンパクを含有する容器とを含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
本発明の実施の形態を図示する図面において、
図1は、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを出発材料として用いた核酸増幅方法を説明する一般的な説明図である。
図2は、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼとゲノムＤＮＡを用いることにより生成された転写物の、リボヌクレアーゼＡおよびデオキシリボヌクレアーゼＩに対する感度を示す。
図3Ａは、リファンピシンによるEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼの阻害を示す。
図3Ｂは、ＮＡＳＢＡＴＭの増幅におけるリファンピシの効果を示す。Iはエチジウム・ブロミドを含有するアガロースゲルを示し、IIはノーザン・ブロットハイブリッド形成を示す。
図4は、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼから生成された転写物からの特異的増幅の証拠を示し、ここで4Ａはエチジウム・ブロミドを含有するアガロースゲルの結果を示し、4Ｂはノーザン・ブロットハイブリッド形成を示す。
図5は、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成された転写物から(I)ＧＭ-ＣＳＦおよび(II)Ｇ3ＰＤＨ配列を特異的に増幅する方法を示す。
図6は、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼで生成したＲＮＡ(I)ＰＬ1および(II)ＶＤ1からのChlamydia trachomatisの特異的配列のＮＡＳＢＡTMにおける増幅を示す。
図7は、2-工程対3工程手順および単一の反応容器を用いた、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼで転写したＤＮＡのＮＡＳＢＡTMにおける増幅を示す。
好適な実施の形態の詳細な説明
本発明は、特異的核酸配列の増幅方法において、細胞性ＲＮＡを合成するクラスの真核性または原核性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用することに関する。一つの実施の形態においては、そのようなポリメラーゼは、米国特許第5,409,818号公報(Malek et al.)に記載されている増幅方法に使用される。他の実施の形態においては、ポリメラーゼは、米国特許第5,130,238号公報(Make et al.)に記載されている増幅方法において使用される。そのような実施の形態においては、本発明は、増幅サイクルに入る新規な方法に関する。また別の実施の形態においては、このポリメラーゼは、米国特許第4,683,195号公報(Mullis)、米国特許第4,683,202号公報(Mullis)およびGen Probe米国特許第5,399,491号公報(Kacian et al.)に記載されている増幅方法に使用される。
一例をあげれば、特異的核酸シーケンスを含有していることが疑われるか、あるいは知られている、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ(ＤＮＡ第一テンプレート)を含有する第一反応媒体に、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオシド・トリホスフェートが添加される。Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼは非特異的に、特異的プロモーター配列とは独立に、ＤＮＡテンプレートを転写して(Chamberlin,1976;Ovchinnikov et al.,1977)ＲＮＡ第一テンプレートを提供する。Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼのホロ酵素またはコア酵素のいずれをも使用することができるけれども、コア酵素が好ましい。その理由は、シグマ因子が存在しないため、プロモーターから独立した転写が増加するからである。
ＤＮＡ第一テンプレートの転写に続いて,各ＤＮＡ第一テンプレートに対して少なくとも一つのＲＮＡのコピー(ＲＮＡ第一テンプレート)が存在する。ＲＮＡ第一テンプレートを得た後,発明の開示欄において説明したように第二の組の試薬が提供される。
これらの試薬を提供した後、第一プライマーはＲＮＡ第一テンプレートと結合してハイブリッドを形成し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ第一テンプレートを用いて、第一プライマーを延長することによって、ＤＮＡ第二テンプレートを合成し、その結果ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド中間体が生じる。リボヌクレアーゼはＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解する。第二プライマーはＤＮＡ第二テンプレートと結合してハイブリッドを形成し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは第二プライマーおよび第一オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、第二ＲＮＡポリメラーゼによって認識される機能性プロモーターを合成する。第二ＲＮＡポリメラーゼは機能性プロモーターを認識し、かつＤＮＡ第二テンプレートを転写し、それによりＲＮＡ第二テンプレートのコピーを提供する。ついで、ＲＮＡ第二テンプレートは米国特許第5,130,238号公報および米国特許第5,4013,818号公報(Malek et al.)に記載されているサイクルに入り、この方法により特異的核酸配列の複数のコピーが得られるようにする。
従って、この改良により、ＤＮＡ鎖の分離と、第一プライマーによりプライムされたＤＮＡ第一テンプレートの延長とを行う必要がなくなる。ＤＮＡ第一テンプレートは、特異的核酸の増幅の前に、別のプライミング反応ではなく、単一の転写反応において用いられる。
材料および方法
材料
オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）ＤＮＡ合成装置を使用して合成した。カラム、ホスフルアミダイト（phosphoramidites）、およびオリゴヌクレオチド合成に使用する試薬はアプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems,Inc.）から購入した。オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ついでＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーにより精製した。ラジオアイソトープα--32Ｐ-ＣＴＰ(〜3000Ci/mmol)およびγ-32Ｐ-ＡＴＰ(〜3000Ci/mmol)はアマシャム（Amersham）
社製である。リボヌクレアーゼＡおよびリファンピシンはシグマ社（Sigma）から購入した。デオキシリボヌクレアーゼＩはプロメガ社（Promega）から入手した。
ＤＮＡの単離と配列決定
ＫＧ-1とSalmonella typhimurium細胞からSambrook et al.,1989の方法に従ってゲノムＤＮＡを精製した。全核酸をChlamydia infected HeLa細胞からBoom et al.,1990の方法に従って単離した。
アガロースゲル電気泳動とノーザンブロットハイブリッド形成
アガロースゲルはSambrook et al.,1989の方法に従って調製し、使用した。これらのゲルは、0.2mg/mlエチジウム・ブロミドを含む1Ｘトリス−アセテートＥＤＴＡ(ＴＡＥ)中に、3％低融点アガロース(NuSieveTM:ＦＭＣ)および1％アガロースを含有しているか、あるいは2％アガロースのみを含有している。増幅反応物のアリコート(5ml)を分析した。
電気泳動後、増幅された材料を電気ブロット法(Sambrook et al.,1989)によりナイロン膜に移した。核酸をこのナイロン膜に固定し、特異的プローブに、Sooknanan et al.,1993に記載されている条件を用いて、ハイブリッド形成した。プローブ5'-末端を32p(Sambrook et al.,1989)で標識した。ハイブリッド形成し、そして非特異的に結合したプローブを洗浄により除去した後、コダック社(Kodak)ＸＡＲ-5フィルムを使用してオートラジオグラフィーを行った。転写反応物のアリコート(5ml)をSambrook et al.,1989の方法に従ってＴＣＡで沈殿させた。放射活性は液体シンチレーションカウンターで測定した。
実施例1  Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼを用いた天然のゲノムＤＮＡのin vitro転写
標準的なEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写反応液は、66.67mMのトリス(pH8.5)、83.3mMのKCl,20mMのMgCl2、各3.3mMのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、各1.6mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、5μgウシ血清アルブミン、16.6mM ＤＴＴ、7.5単位の胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビター,500ng以下の二本鎖ＤＮＡおよび1単位のEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼコア酵素を最終濃度15μlにしたものを含んでなる。反応液を40℃で30分間インキュベートした。
Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡテンプレートの転写を実証するために、転写反応液のアリコートを2μgのリボヌクレアーゼＡ(ＲＮＡ特異的nuclease)か、あるいは2単位のデオキシリボヌクレアーゼI(ＤＮＡ特異ヌクレアーゼ)のいずれかで37℃で30分間消化し、ついでエチジウム・ブロミド染色アガロースゲル上で分析した。図2,レーンＡ2およびＢ2、はヒト・ミエロイド細胞系統ＫＧ-1およびSalmonella typhimuriumからそれぞれ単離された100ngの天然ＤＮＡから得られた転写生成物を示す。これらの転写生成物はリボヌクレアーゼＡに感受性であった(図2,レーンＡ3およびＢ3)が、デオキシリボヌクレアーゼＩには感受性ではなかった(図2,レーンＡ4およびＢ4)ことから、合成物はＲＮＡであることが確認された。デオキシリボヌクレアーゼＩは、予想通り、挿入されたＤＮＡテンプレートを消化した(図2,レーンＡ4およびＢ4)。さらに、合成されたＲＮＡの大部分は、天然のエチジウム・ブロミド染色アガロースゲル上の1KbＤＮＡ分子量マーカーの上に広がるスミアにより示されるように、不均一であるように見える。
図2では、下記のレーンは下記の材料を有する:
Ａ    250ngのＫＧ-1ゲノムＤＮＡ
Ｂ    250ngのSalmonella typhimuriumゲノムＤＮＡ
Ｍ    二本鎖ＤＮＡ分子量マーカー
１    模擬転写反応液(酵素なし)
２    未反応転写反応液
３    リボヌクレアーゼＡ処理転写反応液
４    デオキシリボヌクレアーゼＩ転写反応液
実施例2  ＮＡＳＢＡTMを阻害しないEscherichia coli ＲＮＡ Polymeraseの特異的阻害
Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼは転写後不活性化してＮＡＳＢＡTMの阻害を防止しなければならない。1.7pmoles a-32Ｐ-ＣＴＰ,100ngの天然ゲノムＤＮＡおよび0,1,10または100μg/mlのリファンピシンを含有するEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ反応液を実施例1に記載のように調製した。
合成されたＲＮＡの量を転写された材料のＴＣＡ沈殿させることにより測定した。10μg/mlおよび100μg/mlのリファンピシンは1単位のEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼを阻害するのに十分であり、ＲＮＡ合成は2％未満であったが、これに対して、1mg/mlのリファンピシンではＲＮＡ合成は10％であり、リファンピシンが存在しないとＲＮＡ合成は100％であった(図3Ａ)。
一方、リファンピシンは10μg/mlまたは100μg/mlの濃度では、いずれもリファンピシン無添加に比べてＮＡＳＢＡTM反応を阻害するように見えた(図3Ｂ)。転写反応液を65℃で少なくとも2分間インキュベートすることによりEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することも可能である(データは示さない).
図3Ｂで、Iはエチジウム・ブロミドを含有するアガロースゲルを示し、IIはノーザン・ブロットハイブリッド形成を示す。
図3Ｂで、下記のレーンは下記の材料を有する：
Ａ    -    リファンピシンなし
Ｂ    -    10μg/mlのリファンピシン
Ｃ    -    100μg/mlのリファンピシン
Ｍ    -    二本鎖ＤＮＡ分子量マーカー
１    -    テンプレート無添加
2,3    -   10ngのＰ1-プライムされたゲノムＤＮＡをテンプレートとした
実施例3  二本鎖ＤＮＡテンプレートからのEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたＲＮＡからの特異的増幅の証拠
各10ngの天然ヒドゲノムＤＮＡを含有する6種類の転写反応液を実施例１に記載のように反応させた。標準化のために、これらの反応液をプールし、6つの等しい量に再分割した。アリコートのうち2つを各2μgのリボヌクレアーゼＡで消化し、他の2つを各2単位のデオキシリボヌクレアーゼＩで実施例１に記載のように消化した。最後の2つのアリコートを他のものと同様にインキュベートしたが、この場合はヌクレアーゼを添加しなかった。
インキュベーション後、サンプルからタンパクを除去し、そして核酸を5μlの無菌Ｈ2Ｏ中でエタノール沈殿させて回収した。各5μlのサンプルを、ついで、ＧＭ-ＣＳＦ特異プライマーを含有する標準ＮＡＳＢＡTM反応液に添加し、40℃で90分間増幅した。並行して、各10ngの未反応の天然ＨＧＤを含有する複製ＮＡＳＢＡTM反応液を反応させた。
増幅反応液の5μlのアリコートに含まれている生成物を、エチジウム・ブロミド染色アガロースゲル上で分析したのち、ノーザンブロット・ハイブリッド形成を行った。反応液はすべてエチジウム・ブロミド染色に基づいて増殖された材料を含んでいた(図4a,レーン1-10)ので、増幅は阻害されなかったことがわかる。しかしながら、増幅されたＧＭ-ＣＳＦ配列に特異的なプローブでハイブリッド形成すると、未消化の転写材料(図4b,レーン5,6)およびデオキシリボヌクレアーゼIで消化された材料(図4b,レーン9,10)を含有する反応液からだけに陽性信号がみられた。天然ＤＮＡまたはリボヌクレアーゼＡで消化された材料のいずれかを含有する反応液は陰性であった(図4b,レーン2,3および7,8)。これらの結果から、ＧＭ-ＣＳＦに特異的な増幅は、天然ＤＮＡのEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼによる転写の後に生成されるＲＮＡに由来することがわかった。
図4bでは,下記のレーンは下記の材料を有する:
１    テンプレート無添加
2,3   10ngの天然ＤＮＡをテンプレートとして
４    テンプレート無添加
5,6   未処理転写反応液をテンプレートとして
7,8   リボヌクレアーゼＡ処理転写反応液をテンプレートとして
9,10  デオキシリボヌクレアーゼI処理転写反応液をテンプレートとして
実施例4  ヒト・ゲノムＤＮＡ(ＨＧＤ)のEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写後に生成されたＲＮＡからの特異的シーケンスのＮＡＳＢＡＴＭ中での増幅
1ng,１０ngまたは100ngのＨＧＤを含有するEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写反応液を実施例１に記載するように反射させた。転写後、適切なプライマー混合物を直接転写反応液に添加して、25μl中の最終濃度を0.2μＭの第一プライマー(Ｐ1),0.2μＭの第二プライマー(Ｐ2)および15％(v/v)のＤＭＳＯとした。反応混合物を65℃で2分間加熱し、ついで40℃に移した。40℃で2分間経過した後、8単位のＡＭＶ逆転写酵素,0.2単位のリボヌクレアーゼＨ,40単位のＴ7ＲＮＡポリメラーゼおよび100μg/mlのＢＳＡを含有する酵素混合物を各反応液に添加し、Ｈ2Ｏで最終反応液体積を25mlに調整した。反応液を40℃でさらに90分間インキュベートした。
並行して、1ng,10ngおよび100ngのＨＧＤを変性し、Ｐ1-プライムした。Ｐ1-プライムＤＮＡを熱変性により分離し、標準25μl ＮＡＳＢＡTM反応液(40mM Tris、pH8.5、50mM KCl、0 12mM MgCl2、各2mM ofのＡＴＰ,ＣＴＰ,ＧＴＰおよびＵＴＰ,各1mMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,10mM ＤＴＴ,8単位のＡＭＶ逆転写酵素、0.2単位のリボヌクレアーゼＨ、40単位のＴ7ＲＮＡポリメラーゼおよび100μg/mlのＢＳＡ)に添加し、そして40℃で90分間インキュベートした。1ng,10ngまたは100ngの未反応の天然ＨＧＤをテンプレートとして含有する第三の組のＮＡＳＢＡTM反応液を反応させた。
増幅後、各反応液の5μlのアリコートを、エチジウム・ブロミド染色アガロースゲル上で分析し、ついでノーザンブロット・ハイブリッド形成を行った。ＧＭ-ＣＳＦおよびＧ3ＰＤＨ配列に特異的なプライマーについての結果を図5IおよびIIにそれぞれ示す。Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼでＤＮＡを転写した後に生成されるＲＮＡから特異的ＤＮＡシーケンスを増幅する能力は従来のＰ1-プライム法(図5IおよびII,レーンＣ2-7およびＢ2-7)に比べると同じであった。未反応ＤＮＡの場合は、いずれのプライマーの組についても特異的増幅が得られなかった(図5IおよびII,レーンＡ2-7)。
図5では、下記のレーンは下記の材料を有する:
Ａ    -    未反応天然ＤＮＡ
Ｂ    -    Ｉ-プライムＤＮＡ
Ｃ    -    ＤＮＡからのEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ
１    -    テンプレートなし
2,3   -    100pgのＤＮＡ
4,5   -    １ngのＤＮＡ
6,7   -    10ngのＤＮＡ
実施例5  Chlamydia trachomatis ＤＮＡのEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写後に生成されたＲＮＡからの特異的配列のＮＡＳＢＡTM中での増幅;バクテリア・モデル
Chlamydia trachomatis感染HeLa細胞から単離された異なる量の全核酸を含有するEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写反応液を実施例１に記載のように反応させた。クリプティックプラスミド(cryptic plasmid)(ＰＬ1)およびＭＯＭＰ遺伝子(ＶＤ1)に特異的なプライマーをＮＡＳＢＡTM中で試験した。転写後、適切なブライマー混合物を直接転写反応液に添加し、最終濃度を25μlの体積において0.2μＭのＰ1,0.2μＭのＰ2および15％(v/v)のＤＭＳＯにした。これらの反応液を65℃で2分間加熱し、ついで40℃に移した。40℃で2分間経過後、8単位のＡＭＶ逆転写酵素,0.2単位のリボヌクレアーゼＨ,40単位のＴ7ＲＮＡポリメラーゼおよび100μg/mlのＢＳＡを含有するＮＡＳＢＡTM酵素混合物を各反応液に添加した。Ｈ2Ｏで最終反応体積を25mlに調整し、反応液を40℃でさらに90分間インキュベートした。並行してＮＡＳＢＡTM反応液をＰ1-プライム材料および混ぜ物のない純粋材料を同様の濃度で反応させた。
増幅後、各反応液の5μlのアリコートをノーザンブロットハイブリッド形成で分析した。ＰＬ1およびＶＤ1プライマーからの特異的増幅が10pgおよび1pgの未反応総核酸(純粋)からそれぞれ観察された(図6I、レーンＡ6-7および図6II,レーンＡ6-7)が、これはおそらくサンプルにすでに含有されているＲＮＡによるものである。しかしながら、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼで転写した後は、ＰＬ1およびＶＤ1プライマーの双方に対する特異的増幅が100fgの全核酸から得られた(図6I,レーンＣ2-3および図6II,レーンＣ4-5)が、これはＤＮＡに対するＰ1-プライム手順を用いたときの増幅と同様であった(図6I,レーンＢ2-3および図6II,レーンB4-5)。
図６では、下記のレーンは下記の材料を有する：
Ａ    -    未反応全ＤＮＡ
Ｂ    -    ＰＩ-プラムＤＮＡ
Ｃ    -    ＤＮＡからのEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ
１    -    テンプレートなし
2,3   -    10fgの全核酸
4,5   -    100fgの全核酸
6,7   -    1pgの全核酸
8,9   -    10pgの全核酸
実施例6  2-工程対3-工程手順および単一反応容器を用い、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼで転写したＤＮＡのＮＡＳＢＡTM中での直接増幅
実施例3は、2つの別個の反応容器を用い、ＮＡＳＢＡTM中でＤＮＡから、Escherichia coli ＲＮＡポリメラーゼで生成した転写物を増幅する3-工程手順を説明する。一方、実施例4は、単一反応容器を使用して同じ作業をする3-工程手順を説明する。
本実施例では、単一反応容器を使用した3-工程手順を単一反応容器を使用した2-工程手順によって置き換えた。すなわち、プライマー混合物を一次転写反応液に添加する代わりに、ＤＭＳＯ(最終20.83％(v/v))を一次転写反応液に添加し、そしてプライマー１および2を酵素溶液と組み合わせて、後に添加した。本実施例では、一次転写反応液はすべて10ngのＨＧＤを含有し、ＧＭ-ＣＳＦ特異的プライマーを用いて増幅を行った。
一対の反応液(セットＡ)で、実施例4に記載の3-工程手順を行ってコントロールとした。第二の対の反応液(セットＢ)で,増幅反応におけるＤＭＳＯの最終濃度を18.75％(v/v)に調節し、そして同じ3-工程手順を用いた。
反応液の第三の対(セットＣ)では、実施例１に記載の一次転写反応液は、さらに15％(v/v)のＤＭＳＯと5pmolesのプライマー１を全体積18μl中に含有している。これらの反応液を40℃で30分間インキュベートし、65℃に2分間加熱し、ついで40℃で2分間おいた。ついで、さらに15％(v/v)のＤＭＳＯおよび5pmolesのプライマー2を含有する標準酵素混合物を各反応管に添加した。増幅を40℃で90分間行った。
反応液の第四の対(set Ｄ)では、実施例１に記載の一次転写反応液は、さらに20.83％(v/v)のＤＭＳＯを全体積18μl中に含有している。これらの反応液を40℃で30分間インキュベートし、65℃で2分間加熱し、ついで40℃に2分間おいた。ついで、さらに各5pmolesのプライマー1および2を含有する標準酵素混合物を各反応管に添加した。増幅を40℃で90分間行った。
各反応液の5μlのアリコートに含まれる生成物をエチジウム・ブロミド染色アガロースゲル上で分析し、ついでノーザンブロットハイブリッド形成を行った。これら異なるセット(Ａ-Ｄ)の反応の結果を図７に示す。コントロールの3-工程手順反応はＤＭＳＯ濃度が15％(v/v)(図7I、レーンＡ2-3)のときには予想通りであったが、18.75％(v/v)(図7I,レーンＢ2-3)のときにはそうならなかった。
2-工程手順(反応液セットＣ2-3)の一方は特異的増幅がほとんどまたは全くない(Figure 7,lanes Ｃ2-3)が、これはおそらく一次転写反応液にプライマー１が存在することによる物である。第二の2-工程手順は、プライマー1およびプライマー2が酵素混合物とともに添加されているが、この場合は一次転写反応液中のＤＭＳＯ濃度が20.83％(v/v)であるにもかかわらずうまくいっている(図7,レーンD2-3)。このように、2-工程手順のEscherichia coli ＲＮＡポリメラーゼ転写プロトコルと単一容器を用いてＮＡＳＢＡTM中で直接ＤＮＡを増幅することが、ＲＮＡ増幅と同様に、可能である。反応液に酵素混合物を添加する前に85℃加熱工程を行わない場合は、リファンピシン(実施例２参照)を酵素混合物と一緒に添加する必要がある。
図7では、下記のレーンは下記の材料を有する:
Ａ    -    15％ＤＭＳＯ中で3工程単一反応容器手順
Ｂ    -    18.75％ＤＭＳＯ中で3工程単一反応容器手順
Ｃ    -    一次転写反応において15％ＤＭＳＯおよびプライマー１を用いた２工程単一反応容器手順
Ｄ    -    一次転写反応において20.83％ＤＭＳＯを用いた2工程単一反応容器手順
１    -    テンプレート添加なし
２    -    10ngのＨＧＤ
本発明の好適な実施の形態を詳細に説明したが、当業者には了解されうように、いかに規定される本発明の範囲を逸脱することなく、本発明に種々の変更を施すことができる。
参考文献
１．  Boom,R.et al 1990.J.Clin.-Micro.28:495
２．  Chamberlin,M.J.,1976.RNA Polymerase Losick,R and Chamberlin,M.,(eds).Cold Spring Harbor Laboratory
３．  Kacian et al United States Patent No.5,399,491
４．  Malek et al.United States Patent No.5,130,238 and 5,409,818
５．  Mullis.United States Patent Nos.4,683,195 and 4,683,202
６．  Ovchinnikov,Y.A.et al.,197'7 FEBS LetL 76:108
７．  Sambrook,J.et al.,1989.Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ad.Cold Spring Harbor,NY:CSH Laboratory Press.
８．  Socknanan,R.et al.,1993.Experimental Hematology 21:1719.
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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