(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ゲルにVIII因子含有水溶液を負荷する組換え血液凝固VIII因子の精製方法であって、前記水溶液を前記ゲルに負荷する前に、水溶液中及び／またはゲルを平衡させるために使用するバッファ溶液中に少なくとも１種類の界面活性剤を存在させることを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１種類の界面活性剤が水溶液及びバッファ溶液の双方に存在していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤がブロックコポリマー類またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類から成る群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
水溶液中の界面活性剤の濃度が０．０１から０．０９％（ｗ／ｗ）の範囲であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
水溶液がアルカリ金属塩化物及び酢酸アンモニウムから成る群から選択された少なくとも１種類の塩を含有することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
水溶液が単糖類、二糖類及び糖アルコールから成る群から選択された少なくとも１種類の化合物を含有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ゲルに負荷される水溶液が、VIII因子をゲルから溶出させるために使用される溶液のイオン強度以上のイオン強度を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ゲルに吸着されたVIII因子を１Ｍ以下のイオン強度を有する溶液によって溶出させることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ゲルに吸着されたVIII因子を０．０１から０．０９％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を含有する溶液によって溶出させることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ゲルに負荷される水溶液及びVIII因子を溶出させるために使用される溶液が６．１から６．８の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
精製のために使用される全ｐＨ範囲内でゲルが無電荷であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ゲルが、疎水性リガンドが結合したアガロースのマトリックスから成ることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リガンドが、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、フェニル及びオリゴエチレングリコールから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リガンドが、グリシジル−エーテルカップリングによってアガロースマトリックスに結合したブチルリガンドであることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組換え血液凝固VIII因子が血液凝固活性を維持した全長VIII因子の欠失誘導体であることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
VIII因子の欠失誘導体が組換えVIIIＳＱ因子（ｒ−VIIIＳＱ）の欠失誘導体であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー段階に先行してアニオン交換クロマトグラフィー段階を行うことを特徴とする請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を２回以上行うことを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
血友病の症状を示す患者に投与するための医薬の製造における請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法で精製された組換えVIII因子を含む水溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ゲルにVIII因子含有水溶液を充填することによって組換え血液凝固VIII因子を精製する方法に関する。本発明方法では、水溶液をゲルに充填する前に、水溶液中及び／またはゲルを平衡させるために使用するバッファ溶液中に少なくとも１種類の界面活性剤を存在させる。VIII因子含有溶液をＨＩＣゲルに充填するときに界面活性剤が存在していると、完全形（ｉｎｔａｃｔ）の活性VIII因子分子を構造異常をもつ分子から効率的に分離することが可能である。本発明によれば更に、ＤＮＡ及び／またはＣＨＯ細胞夾雑物の含有量をかなり減少させ、VIII因子産物の活性をこれまでになかった程度まで保持することが可能である。本発明は更に、本発明方法によって精製された組換えVIII因子を含有する水溶液、及び、血友病の症状を有する患者に投与する医薬を製造するためのかかる水溶液の使用に関する。本発明はまた、本発明方法によって精製した組換えVIII因子を治療有効量で投与する血友病の治療方法に関する。
発明の背景
血友病は何世紀も前から知られていた遺伝性疾患であるが、種々の形態、即ち血友病Ａ及び血友病Ｂが判別できるようになってから４０年しか経っていない。発病頻度が多いのは血友病Ａのほうである。血友病は出生男児１００００あたり１〜２人の割合で男性だけに発生する。生物学的に活性の血液凝固VIII因子（抗血友病因子）は通常は血漿中に存在するタンパク質であるが、血友病の原因は、この因子の極度のレベル低下または欠損にある。血友病Ａの臨床症状は、強い出血傾向であり、VIII因子濃縮物による治療が導入される前は、罹患患者の平均寿命は２０歳に達していなかった。ほぼ３０年前からは血漿から得られたVIII因子濃縮物が使用できるようになっている。これは血友病患者の治療状況をかなり改善し、普通の生活を送ることも可能になっている。
最近まで、治療用VIII因子濃縮物は血漿の分画化によって調製されていた。しかしながら、例えばＷ．Ｗｏｏｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，ｐ．３３０−３７（１９８４）及び欧州特許ＥＰ−Ａ−０１６０４５７に報告されているように、数年前からは組換えＤＮＡ技術を用いた細胞培養でVIII因子を産生させる方法が使用できるようになっている。
ヒト血漿に由来のVIII因子濃縮物は、ＡｎｄｅｒｓｓｏｎらによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐ．２９７９−８３（１９８６年５月）に記載されているように、フラグメントに分割された複数の完全に活性のVIII因子形態を含有している。最も小さい活性形態は分子量１７０ｋＤａを有しており、（１つまたは複数の）金属イオンによって互いに結合された９０ｋＤａと８０ｋＤａとの２つの鎖から構成されている。これに関しては欧州特許ＥＰ−Ａ−０１９７９０１を参照するとよい。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎは、治療用VIII因子濃縮物中の１７０ｋＤａの血漿VIII因子形態に対応する組換えVIII因子産物を開発した。切断された組換えVIII因子の分子はｒ−VIIIＳＱと命名され、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた無血清培地中の細胞培養によって産生される。
組換えVIII因子産物一般の構造及び生化学は、ＫａｕｆｍａｎによってＴｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９（１９９１）及びＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，ｐ．１５５−６５（１９９１）に記載されている。ｒ−VIIIＳＱの構造及び生化学は国際特許ＷＯ−Ａ−９１０９１２２に記載されている。
高性能疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質の精製に適した分離技術である。ＨＩＣ段階を実施するための一般的特徴及び適当な条件は、Ｋ−Ｏ  ＥｒｉｋｓｓｏｎによってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２０７−２２６（１９８９）に記載されている。この技術においては、漸減するイオン強度をもつ溶液を使用し、界面活性剤を導入し、溶媒の極性を反転させ、及び／または、単に温度を低下させることによって比較的弱い疎水性固定相からタンパク質を溶出させる。このような比較的穏やかな条件は、活性を実質的に保持しながらタンパク質を回収するために有利である。
ＨＩＣにおいて吸着及び脱着に影響を与える要因はＴ．Ａｒａｋａｗａ及びＬ．Ｏｗｅｒｓ  ＮａｒｈｉによってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３，ｐ．１５１−１７２（１９９１）に十分に説明されている。種々のタンパク質とＨＩＣゲル（樹脂）との相互作用に対する界面活性剤の影響は、Ｊ．Ｊ．Ｂｕｃｋｌｅｙ及びＤ．Ｂ．ＷｅｔｌａｕｆｅｒによってＪ．Ｃｈｒｏｍ．，５１８，ｐ．９９−１１０（１９９０）に記載されている。しかしながらこの文献の主な目的は、勾配溶出プロフィルに対する界面活性剤の影響を評価することであった。
疎水性または半疎水性のリガンドに接触する種々のゲル（樹脂）が文献に記載されており、例えば、アミノアルキル基またはジアミノアルキル基で誘導体化したアガロースがある。従来技術には、このようなゲルを利用することによってVIII因子を精製したいくつかの実例がある。例えば、ＣＮＢｒカップリング技術を使用し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎより販売）をブチルアミンで誘導体化することによってブチルアガロースゲルが調製された。得られたゲルをVIII因子の精製に利用した。これらは、Ｔｈ．ＶｕｋｏｖｉｃｈらによってＦｏｌｉａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｌｅｉｐｚｉｇ，１０７（１），ｐ．１４８−１５１（１９７９）に、及び、Ｔｈ．ＶｕｋｏｖｉｃｈらによってＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ（Ｐｒｏｃ．Ｓｅｒｏｎｏ  Ｓｙｍｐ．），Ｇ．Ｇ．Ｎｅｒｉ  Ｓｅｒｎｅｒｉ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｍ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ｅｄｓ．，１５，ｐ．４０７−４１０（１９７９）に報告されている。タンパク質混合物を極めて低いイオン強度でこのゲルに吸着された。脱着は塩化ナトリウムの濃度を増加させることによって得られた。これは、利用された力が主として静電気であること、即ち、関与するメカニズムが通常はイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）と呼ばれているメカニズムであることをはっきりと示す。更に、例えば、Ｂ．Ｌ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＩ．ＤｒｅｖｉｎはＪ．Ｃｈｒｏｍ．，３２１，ｐ．３３５−３４２（１９８５）において、ＣＮＢｒカップリング技術がリガンドとマトリックスとの間のイソ−ウレア基を生成し、これは酸性及び中性のｐＨで正電荷を有していると報告している。これはゲルの全体特性に著しい影響を与える。
Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒは、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．，４７（２），ｐ．１２４（１９８２）に記載されているように、アミノアルキル基またはジアミノアルキル基で誘導体化した一連のアガロースゲルによるVIII因子精製を比較した。アミノアルキル基で誘導体化したアガロースゲル（アルカンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））にVIII因子を可逆的に結合させることは難しいことが判明した。従って、塩誘導溶出は、ＣＮＢｒカップリング技術を用いて短いアミノアルキル基で誘導体化したゲルからのみ可能であり、しかもある程度の結果にしか到達しないことが判明した。エチレングリコール溶出はアルキル鎖の長さにかかわりなく失敗した。対照的に、０．１％以上の濃度の界面活性剤を添加することによって、この種のカラムからVIII因子の脱着が得られることが知見された（欧州特許ＥＰ−Ａ−０２０９４０１）。しかしながら、示された実施例では、ＨＩＣカラムの容量及び溶出因子の濃度は低い値であった。
欧州特許ＥＰ−Ａ−０２８６３２３は、ポリペプチド、特にVIII因子を精製するための２段階手順に関する。第一段階は固定化抗体を使用し、第二段階は親和性の領域に基づく。親和性の領域はイオン交換ゲルでもよくまたはＨＩＣゲルでもよい。界面活性剤は本来はウイルス不活性化に対して有効な物質として考えられている。界面活性剤がイオンの力に媒介される分子間会合を抑制することも従来技術に示されているが、親和性の領域における脱着段階中に界面活性剤を使用したという報告はない。
米国特許ＵＳ−Ａ−４，７４３，６８０もまた、カラムクロマトグラフィーによるVIII因子（抗血友病因子またはＡＨＦ）の精製中のバッファ組成物に関する。界面活性剤はアミノヘキシル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような混合機能アフィニティクロマトグラフィーゲルからの溶出を促進すると記載されている。米国特許ＵＳ−Ａ−４，７４３，６８０は、疎水性樹脂に対する吸着段階の界面活性剤の使用については記載していない。
ＨＩＣをVIII因子精製に使用するのが難しい理由は、適当な保持窓（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）及び溶出条件を確立する際に様々の問題が生じるからである。「適当な保持窓」なる用語は、VIII因子分子は疎水性相互作用によってＨＩＣゲルの表面に保持されるが、主として核酸及びタンパク質から成る他の不純物は低度にしかまたは好ましくは全く保持されないことを意味する。更に、「VIII因子の適当な保持窓」なる用語は、VIII因子分子をあまり厳重でない条件で溶出させることができ、従って分子の変性が生じないことを意味する。このような窓は、マトクリックスとこれに付着した疎水性リガンドとから成る適当なゲルの選択によって得られる。リガンドの種類及び密度は、VIII因子分子とＨＩＣゲルの表面との間の相互作用、従って保持窓に顕著な影響を与える。保持窓に影響を与えるその他のパラメーターとしては例えばイオン強度、温度、ｐＨ及びカラムの長さがある。
治療用タンパク質製剤中では極めて低レベルの量の負電荷核酸は許容されるので、正電荷のような非特異的吸着因子の使用を避けることは方法の選択性に対して特に重要である。また、組換えＤＮＡ技術によって産生される治療用タンパク質の精製においては、ＤＮＡの含有量を米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって規定された極めて低いレベルに減少させるのがかなり問題であることはよく知られている。最近の実例は、Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．のＰ．Ｎｇ及びＧ．ＭｉｔｒａによってＵ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，Ａ  ６５８，ｐ．４５９（１９９４）に開示されており、この実例では、ＤＮＡの濃度は減少しているが、32Ｐ  Ｒ３  ＤＮＡハイブリダイゼーション法によって測定すると、治療用タンパク質の基準量（ｄｏｓａｇｅ）あたり約１ｎｇの濃度までしか減少しなかった。
非電荷ゲルを穏やかな溶出条件と共に用いる純粋な疎水性相互作用クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー及びイムノアフィニティクロマトグラフィーで既に使用された分離基準に比べて追加の分離基準を使用するので、組換えVIII因子の精製方法にもう１つの要素を加える。従って、組換えVIII因子の総合的な精製を最適化するためにより多くの処理技術を使用し得ることになる。更に、過度に強い吸着はタンパク質のコンホメーションを変化させることもあり得るので、穏やかな条件による脱着を可能にする過度な強さの吸着が得られる条件を見出すことが重要であろう。
発明の詳細な説明
本発明の１つの目的は、高度に濃縮された極めて純粋な組換えVIII因子溶液を産生するための効率的な精製方法を提供することである。
本発明の別の目的は、活性が本質的に保持された効率的な方法を提供することである。
本発明の別の目的は、高純度産物を提供しながらも段階中の滞留時間を短縮することである。
本発明の更に別の目的は、完全形のVIII因子を構造異常を有する分子から分別することが可能な処理段階を提供することである。
上記目的が本発明によって達成される。本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ゲルにVIII因子含有水溶液を充填することによって組換え血液凝固VIII因子を夾雑物から精製する方法であって、水溶液をゲルに充填する前に、水溶液中及び／またはゲルを平衡させるために使用するバッファ溶液中に少なくとも１種類の界面活性剤を存在させることを特徴とする方法に関する。
本発明の発明者らは意外にも、組換えVIII因子含有溶液をＨＩＣ段階に充填するときに界面活性剤を存在させ且つイオン強度を慎重に調整するならば、疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が有利であることを知見した。このようにすると、表面にVIII因子分子を吸着するために十分な力が存在し、この力は、同じ分子の脱着が難しくなったりまたは不可能になったりするほど強力ではない。従って本発明の発明者らは、これまでに開示されたことがないようなＨＩＰ段階で精製される組換えVIII因子の保持窓を提供することに成功した。
本発明の使用により、ＤＮＡの含有量をかなり減少させることが可能である。ＤＮＡの含有量は典型的にはＨＩＣ段階の１００分の１以下に減少する。クロマトグラフィー段階の順次処理が終点に近づくと、この含有量は典型的には米国のＦＤＡによって現在設定されているレベルであるVIII：Ｃ因子１０００ＩＵあたり約１０ｐｇを下回る値まで減少する。我々の知識の範囲では、このような低レベルがこれまでに開示されたことはない。更に、夾雑物であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の含有量もかなり減少し得る。
以下の記載から明らかなように、ＨＩＰ段階は精製処理系の種々の位置で使用できる。試験したすべての位置で、構造異常を有するVIII因子分子を効率的に処分するためにVIII因子分子を分別することが可能であった。
本発明において、VIII因子は組換え体であり、全長VIII因子であるかまたは好ましくは血液凝固活性を有する全長VIII因子の欠失誘導体である。より好ましくは、欠失誘導体は組換えVIIIＳＱ（ｒ−VIIIＳＱ）因子である。本文中の欠失誘導体なる用語は、Ｂ−ドメインの全部または一部が欠損しているが血液凝固活性は保持しているVIII因子を意味する。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、市販の種々のマトリックスに結合した疎水性の無電荷リガンド、好適には脂肪族または芳香族のリガンドを含むゲルで行う必要がある。無電荷リガンドを与える慣用のカップリング技術によってリガンドをマトリックスに結合させ得る。このような技術の最も常用の好適例はグリシジルエーテルカップリング手順である。この技術においては、ヒドロキシル基含有ポリマーを、一端に所望のアルキル基またはアリール基を含むグリシジルエーテルと反応させる。別の技術では、アガロースマトリックスを先ず水中でグリシドオキシプロピルトリメトキシシランによって活性化する。次いで、アルコール中でリガンドを固定化しこれをゲルにカップリングする。更に別の適当な技術では、アガロースマトリックスを先ず１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなビス−エポキシドで活性化する。得られたエポキシ活性ゲルを多様なリガンド、例えば適当なアミノアルキルメルカプタンまたはアルキルメルカプタンにカップリングし得る。使用可能なその他の技術としては、例えば１，１′−カルボニル−ジイミダゾール活性化及びジビニルスルホン活性化がある。これらの技術によって得られるゲルは全ｐＨ範囲で無電荷である。即ち、ゲルが完全に無電荷であり、VIII因子分子と疎水性相互作用だけを行う。これらの技術に関しては、Ｊａｎｓｓｏｎら，Ｐａｃｋｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．７６２−７６６、及び、Ｋ−Ｏ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２１４−２１７（１９８９）を参照するとよい。
本発明において、脂肪族リガンドは、好適にはプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルから成るアルキル類のグループから選択され、好ましくはブチルである。また、オリゴエチレングリコール類、−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨ〔但し、ｎ＜１０〕からリガンドを適宜選択してもよい。オリゴエチレングリコールリガンドとの併用に好適なＨＩＣゲルの一例は、ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡによって販売されているＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＨｉｃＰａｋ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅｒ  Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍである。アルキルリガンドは直鎖状（ノルマルアルキル）でも分枝状（イソ−またはネオアルキル）でもよい。芳香族基は好ましくはフェニルである。マトリックスは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎによって販売されている種々のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスのようなアガロースマトリックス、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎによって販売されているＴＳＫ−ＧＥＬ：ｓのような有機ポリマーマトリックス、または、Ｐｅｒ  Ｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡによって販売されている極めて多孔性の有機ポリマーマトリックス、のような種々の強い疎水性のマトリックスから選択できる。マトリックスは好ましくはアガロースマトリックスである。本発明に好適なアガロースマトリックスとしては、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）以外にも、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ａ／Ｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋによって販売されているＭｉｎｉｌｅａｋ（登録商標）及びＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍによって販売されているＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ａがある。好ましくは、高速流（ＦＦ）を可能にし、高い産生能力を与えるようにマトリックスを架橋させる。より好ましくは、本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィーをＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦゲルにおいて行う。４個の炭素原子を含む短いアルキル基は、ＨＩＣ表面とVIII因子分子との間に好適な強い相互作用を生じさせ、穏やかな脱着条件下の確実な分離を可能にする。
本発明の界面活性剤は好適には非イオン性界面活性剤、または、より正確には正味電荷０の界面活性剤である。好ましくは、界面活性剤は、ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪エステル及びアルキルエトキシレートから成るグループから選択される。ブロックコポリマーの好適例はポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールとの組合わせ、例えば、ＢＡＳＦ，Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）である。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪エステルの好適例は、ポリオキシ−エチレン−（２０）−ソルビタンモノラウレート、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、及び、ポリオキシ−エチレン−（２０）−ソルビタンモノオレエート、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０である。双方とも、ＩＣＩ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎから販売されている。アルキルエトキシレートの好適例はＵｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ，ＵＳＡによって販売されているＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００である。
ＨＩＣ表面からVIII因子分子を脱着させるときにも界面活性剤が存在するのが好ましい。その場合、界面活性剤非存在下の溶出に比較して効率が向上し得る。脱着中に存在する界面活性剤は吸着中に使用した界面活性剤と同じでもよくまたは異なっていてもよい。
ＨＩＣに充填されるVIII因子水溶液中の界面活性剤の濃度は、０．００４−１．０％（ｗ／ｗ）の範囲、好適には０．００７−０．５％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくは０．０１−０．０９％（ｗ／ｗ）の範囲でなければならない。
充填前にゲルを平衡させるためにバッファ溶液を使用する場合、このバッファ中の界面活性剤の濃度は、ＨＩＣに充填されるVIII因子水溶液中の濃度と同じでよい。しかしながら、界面活性剤の濃度がかなり低いバッファ、例えば上記に示したVIII因子水溶液の濃度の１／１０の濃度のバッファを使用することも可能である。この場合、ゲルの界面活性剤を好適な濃度にするために例えば１０倍量のバッファを用いてゲルを平衡させる。好ましくは、同じまたは異なる界面活性剤を含有するVIII因子水溶液を充填する前にゲルを界面活性剤で平衡させる。
VIII因子をＨＩＣから溶出させるときの界面活性剤の濃度は、０．５％（ｗ／ｗ）以下、好適には０．００４−０．２％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０１−０．０９％（ｗ／ｗ）でなければならない。
ＨＩＣ段階で充填される溶液のイオン強度及び溶出用溶液のイオン強度は、得られる精製のタイプ及び精製効率にとって重要である。従って、先ずVIII因子とＤＮＡとの効率的な分離を可能にするためには、ＨＩＣゲルに充填される溶液のイオン強度を、ＨＩＣゲルからVIII因子を溶出させるために使用される溶液のイオン強度以上の値にしなければならない。そうでない場合には、この段階は普通のイオン交換段階であろう。更に、VIII因子分子の可逆性吸着を得るためには、ＨＩＣ段階に充填される溶液のイオン強度は、０．３−４Ｍ、好適には０．６−２Ｍ、好ましくは１−１．５Ｍの範囲でなければならない。ＨＩＣ段階からVIII因子を溶出させるために使用される溶液のイオン強度は、溶出開始のときに１Ｍ以下、好適には０．８Ｍ以下、好ましくは０．２−０．６Ｍでなければならない。溶出段階全体にわたってイオン強度を一定に維持してもよく、または、直線状もしくは段階的もしくは双方の組合わせの形態で減少させてもよい。
イオン強度の減少以外にも、溶媒の極性を反転させる、界面活性剤を添加する、及び／または、温度を低下させる、などによってVIII因子分子を溶出させる、即ち、疎水性相互作用を低下させることが可能である。例えばエチレングリコールまたは（イソ）プロパノールを添加することによって溶媒の極性を反転させ得る。
ＨＩＣ段階に充填される溶液及びVIII因子を溶出させるために使用される溶液のイオン強度は好適には、アルカリ金属塩化物、例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムまたは酢酸アンモニウムまたはその任意の組合わせの存在によって得られる。好ましくは酢酸アンモニウムを使用する。
吸着の効果は、ＨＩＣ段階に充填される溶液に、単糖類、二糖類及び糖アルコールから成るグループから選択される少なくとも１種類の化合物、好ましくはソルビトールを存在させることによって増進し得る。この化合物の使用は、最初の濃縮用カチオン交換クロマトグラフィー段階の後にＨＩＣ段階を行うときに特に適当である。溶液中の単糖類もしくは二糖類または糖アルコールの濃度は、少なくとも５％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも１０％（ｗ／ｗ）でなければならない。
VIII因子をゲル表面に吸着させるためにＨＩＣに充填される溶液は、約５−約８、好適には５．８−７．３、好ましくは６．１−６．８の範囲のｐＨを有し得る。精製されたVIII因子をゲル表面から脱着させるとき、溶出用溶液のｐＨは５．８−７．３、好適には６．１−６．８の範囲でなければならない。
ＨＩＣ段階におけるVIII因子の吸着及び脱着は、室温、即ち１８−２５℃の温度で行うのが好適である。この場合には、複雑で高価な温度調節装置が不要である。しかしながら、室温で吸着させ温度を例えば約４℃まで下げることによって脱着させることも可能である。
本発明のＨＩＣ段階は、組換えVIII因子精製処理系の種々の他の段階と組合わせること及び精製処理系の複数の位置に組込むことが可能である。従って、例えばカチオン交換クロマトグラフィー段階から成る最初の濃縮段階後にＨＩＣ段階を実施してもよい。イムノアフィニティクロマトグラフィー（ＩＡＣ）段階後にＨＩＣ段階を実施してもよい。しかしながら好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィー段階後にＨＩＣ段階を実施する。このような方法では、アニオン交換段階で得られた溶出物の高いイオン強度を以後のＨＩＣ段階で利用できる。
本発明においては、精製処理系に合計で２回、３回またはより多い回数のＨＩＣ段階が含まれるようにＨＩＣ段階を繰り返してもよい。複数のＨＩＣ段階の使用によって不純物の含有量が更に減少し、同時にVIII因子の濃度が増加する。これらの利点及びその他の利点は勿論、装置の経費増加を勘案し、採算が合うように調整する。ＨＩＣ段階を２回以上使用する場合、各ＨＩＣ段階の間に中間処理段階を任意に存在させてもよい。
実施例に基づいて本発明をより詳細に以下に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
実験
組換えVIII因子の調製
組換えVIIIＳＱ（ｒ−VIIIＳＱ）因子の産生を国際特許ＷＯ−Ａ−９１０９１２２の実施例１３に記載の手順にほぼ従って実施した。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞系（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）に、ｒ−VIIIＳＱ遺伝子含有発現ベクターとジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子含有発現ベクターとを電気穿孔によって導入した。選択培地で選択後、段階的に増量するメトトレキセート中で増殖させることによって生存コロニーを増幅した。得られたコロニーの上清をVIII因子活性に基づいて個々にスクリーニングした。産生クローンを選択し、次いで、規定培地中で無血清懸濁増殖させ、最後に大規模細胞培養処理に発展させた。複数の時期に上清を採取し、以下に記載の手順で更に精製した。
実施例１
（ウシ胎仔血清を含有する）ならし培地を清澄化し、次いで正接流濾過によって濃縮した。凍結し解凍した後、溶液を２０ミリモル／リットルのイミダゾールで緩衝した。塩化ナトリウムを濃度１．０モル／リットルまで添加し、塩化カルシウムを５ミリモル／リットルまで添加した。
溶液をイムノアフィニティクロマトグラフィーゲルに充填した。ゲルのリガンドは、VIII因子のＨ鎖に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ、８Ａ４と命名）であった。洗浄後、５０ミリモル／リットルのＣａＣｌ2と５０％のエチレングリコールとを含有するバッファによってVIII因子を溶出させた。
ｍＡｂ溶出物を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから販売されているアニオン交換カラムＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦに充填した。洗浄後、５０ミリモル／リットルのヒスチジン、０．６モル／リットルのＮａＣｌ、１ミリモル／リットルのＣａＣｌ2及び０．２ｇ／リットルのＴｗｅｅｎ８０（登録商標），ｐＨ６．８を含有するバッファによってVIII因子を溶出させた。
Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦゲルを用いるバッチ式吸着実験を本発明に従って実施した。疎水性相互作用クロマトグラフィーゲルを水洗し、次いで各０．１ｇのドライゲルを８個のエッペンドルフ管に導入した。５０ミリモル／リットルのヒスチジンと１ミリモル／リットルのＣａＣｌ2とを含有し且つ以下の表に示すような種々のｐＨを有し且つ種々の濃度の塩（ＮａＣｌ）及び界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））を含有する１．２ｍｌのバッファ中で室温でゲルを平衡させた。１６３０ＩＵ／ｍｌのVIII：Ｃ活性を有するVIII因子含有Ｑ−溶出物を各管に４０マイクロリットルずつ加えた後、管を１０ｒｐｍで完全に回転させた。指定された時間に管を２０００ｒｐｍで１分間遠心し、サンプル（１５０ｍｌ）を上清から採取し、分析するまで凍結保存した。２５ミリモル／リットルのヒスチジンと０．５ミリモル／リットルのＣａＣｌ2と０．４モル／リットルのＮａＣｌとを含有する０．５ｍｌの溶液の添加によって溶出を実施した。ｐＨは６．８であり、溶出用溶液中に界面活性剤は存在していなかった。次に管を３０分間回転させ、次いで上記のように遠心した。水を用いて同じ手順で第二の溶出を実施した。発色基質法、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）VIII因子キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してVIII因子のプロ凝固活性を測定した。方法の相対標準偏差（ＲＳＤ）は７％である。溶出物中のVIII因子活性及び回収率は以下の表から明らかである。
0003871710.tif 000002
表から明らかなように、VIII因子の充填前にＨＩＣゲルに界面活性剤を存在させると、界面活性剤非存在下の試験に比較してVIII因子の活性及び回収率が飛躍的に増加する。
実施例２
実施例１に使用したならし培地を、実施例１で使用したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦカラムからVIII因子を溶出させるまでは実施例１と同様に処理した。次いで、実施例１のＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦゲルを用いたバッチ式吸着実験を本発明に従って実施した。ゲルを水洗し、次いで各０．１ｇのドライゲルを９個のエッペンドルフ管に導入した。５０ミリモル／リットルのヒスチジンと１ミリモル／リットルのＣａＣｌ2とを含有し、ｐＨ６．８を有し且つ以下の表に示す種々の濃度の塩（ＮａＣｌ）及び界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））を含む１．２ｍｌのバッファを用いて別の組の９個の管を調製した。１６３０ＩＵ／ｍｌのVIII：Ｃ活性を有するVIII因子含有Ｑ−溶出物を各管に４０マイクロリットルずつ加えた。サンプル採取後、１．０ｍｌの各溶液をＢｕｔｙｌゲル管に導入し、次いで１０ｒｐｍで完全に回転させた。指定された時間に管を２０００ｒｐｍで１分間遠心し、サンプル（４０マイクロリットル）を上清から採取し、分析するまで凍結保存した。５０ミリモル／リットルのヒスチジンと１ミリモル／リットルのＣａＣｌ2とを含有する１．０ｍｌの溶液の添加によって溶出を実施した。ｐＨは６．８であり、溶出用溶液中に界面活性剤は存在していなかった。次に管を２０分間回転させ、次いで上記のように遠心した。溶出物中のVIII因子活性及び回収率は以下の表から明らかである。
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表から明らかなように、VIII因子の充填前にＨＩＣゲルに界面活性剤を存在させると、界面活性剤非存在下の試験に比較してVIII因子の活性及び回収率が飛躍的に増加する。
実施例３
組換えVIII因子を実験の項に記載の方法で産生した。この場合、産生培地はウシ胎仔血清の代わりにヒト血清アルブミンを含んでいた。
ならし培地を濾過によって清澄化し、ｐＨを調整し、次いで濾液をＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦカラム（カラム容量３リットル）に充填した。洗浄後、５ｍＭのＣａＣｌ2と０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００とを含有する塩バッファによってVIII因子を溶出させた。このカチオン交換クロマトグラフィー段階は２−８℃で実施した。Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ段階の溶出物（Ｓ−溶出物）を以後の精製まで凍結した。Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦカラム（カラム容量７７ｍｌ）を室温で１Ｍのソルビトールと１．２ＭのＮａＣｌと０．１ＭのＮＨ4Ａｃと５ｍＭのＣａＣｌ2と０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．８とを含有するバッファによって平衡させた。Ｓ−溶出物を解凍し、平衡バッファの組成に合わせて調整した。次に、室温でＨＩＣカラムに充填し、次いでカラムの４倍容の平衡バッファで洗浄した。０．４ＭのＮａＣｌ、０．０２ＭのＮＨ4Ａｃ、５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．８を含有するバッファによって溶出を実施した。
ＨＩＣ溶出物をイムノアフィニティクロマトグラフィーによって更に精製すると、１１ｐｇ／ｋＩＵのＤＮＡ含有量が得られた。最後に、アニオン交換クロマトグラフィー段階で処理した後、ＤＮＡ含有量は２．２ｐｇ／ｋＩＵを下回っていた。この低い含有量はＨＩＣ段階なしでは達成されなかった。VIII因子活性及びＤＮＡ対VIII因子の比は以下の表から明らかである。
0003871710.tif 000004
表から明らかなように、本発明のＨＩＣ段階の使用によってＤＮＡ含有量をかなり減少させることが可能である。
実施例４
実施例３に従ってＳ−溶出物を調製した。Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦカラム（カラム容量１．２リットル）を室温で１Ｍのソルビトール、１．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮＨ4Ａｃ、５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．８を含有するバッファ溶液で平衡させた。Ｓ−溶出物を解凍し、平衡バッファの組成に合わせて調整した。次に、室温でＨＩＣカラムに充填し、次いでカラムの４倍容の平衡バッファで洗浄した。０．７５Ｍのソルビトール、０．３２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮＨ4Ａｃ、５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．８を含有するバッファによって溶出を実施した。
0003871710.tif 000005
表から明らかなように、本発明のＨＩＣ段階の使用によって、ＤＮＡ含有量を典型的には１００分の１に減少させることが可能である。更に、ＣＨＯ細胞の含有量も約１０分の１に減少し得る。
実施例５
実施例３に従ってＳ−溶出物を調製した。３．７００ｍｌのＳ−溶出物を解凍し、温度を室温に調節した。トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を夫々最終濃度０．３％（ｖ／ｖ）及び１．０％（ｖ／ｖ）で用いた３０分間のインキュベーションによってウイルス失活を実施した。２６０ｍｌの容量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）イムノアフィニティカラムを、対応する量のウイルス失活薬品を含有するＳ−溶出物バッファで平衡させた。次にVIII因子溶液をｍＡｂカラムに充填し、次いでカラムを洗浄した。５０％のエチレングリコールを含有するバッファによって溶出を実施した。
４９ｍｌのＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦカラムを、５０ｍＭのヒスチジン、１．４ＭのＮＨ4Ａｃ、１０％のエチレングリコール、５０ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．４を含有するバッファで平衡させた。イムノアフィニティカラムから得られた３５ｍｌの溶出物（ｍＡｂ−溶出物）を平衡バッファに準じた最終組成になるようにバッファで５倍に希釈し、次いで直線流速３５ｃｍ／時でＨＩＣカラムに充填し、カラムの５倍容の平衡バッファで洗浄した。最後にカラムを５０ｍＭのヒスチジン、０．５ＭのＮＨ4Ａｃ、５０ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ６．４を含有するバッファで直線流速３５ｃｍ／時で溶出させた。
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表から明らかなように、精製処理系の後期に本発明のＨＩＣ段階を使用すると、ＤＮＡ含有量の極めて少ない最終産物を得ることが可能である。更に、ＣＨＯ細胞の含有量も約１０分の１に減少している。
実施例６
実施例５に従ってｍＡｂ−溶出物を調製した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを高濃度の塩化ナトリウムで予め平衡させ、次いでイムノアフィニティカラムを溶出させたバッファと同じ組成のバッファで平衡させた。ｍＡｂ−溶出物を充填し、カラムを平衡バッファで洗浄し、次いで生理的イオン強度の洗浄用バッファで洗浄した。塩化ナトリウム濃度を０．６Ｍに上げることによってカラムを溶出させた。Ｑ−カラムの洗浄及び溶出に界面活性剤は使用しなかった。５０ｍＭのヒスチジン、１．４ＭのＮＨ4Ａｃ、５０ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０，ｐＨ６．８を含有するバッファでＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦカラムを平衡させた。Ｑ−溶出物にＮＨ4Ａｃを最終濃度１．０Ｍまで添加し、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を０．０２％まで添加した。この溶液を直線流速６０ｃｍ／時でブチル−ゲルカラムに充填した。次にカラムをカラムの５倍容の平衡バッファで洗浄し、５０ｍＭのヒスチジン、０．５ＭのＮＨ4Ａｃ、５０ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０，ｐＨ６．８を含有するバッファで直線流速３５ｃｍ／時で溶出させた。
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表から明らかなように、好適な精製処理系の後期に本発明のＨＩＣ段階を使用すると、極めて高いVIII因子活性を有しており同時にＤＮＡ及びＣＨＯ細胞タンパク質の含有量の極めて少ない溶出物を産生することが可能である。
実施例７
複数のＳ−溶出物のプールを使用して実施例６に記載の手順でＱ−溶出物を調製した。Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＦＦカラムを、５０ｍＭのヒスチジン、１．３ＭのＮＨ4Ａｃ、５０ｍＭのＣａＣｌ2及び０．０２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０，ｐＨ６．８を含有するバッファで平衡させた。Ｑ−溶出物を塩バッファで倍容に希釈し、ＮＨ4Ａｃを最終濃度１．０Ｍ及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を最終濃度０．０２％まで加えた。この溶液を直線流速６０ｃｍ／時でブチル−ゲルカラムに充填した。実施例６に記載の手順で洗浄及び溶出を実施した。
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表から明らかなように、好適な精製処理系の後期に本発明のＨＩＣ段階を使用すると、極めて高いVIII因子比活性を有しており同時にＤＮＡ及びＣＨＯ細胞タンパク質の含有量の極めて少ない溶出物を産生することが可能である。