(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バトロキソビンを有効成分として含有することを特徴とするアポトーシスが関与する疾患の予防及び／又は治療薬であって、アポトーシスが関与する疾患が、虚血性疾患（再灌流障害を除く）、神経変性疾患、末梢神経障害、再生不良性貧血、肝障害又はＨＩＶ感染症である、アポトーシスが関与する疾患の予防及び／又は治療薬。
【請求項２】
アポトーシスが関与する疾患が、神経変性疾患、末梢神経障害、再生不良性貧血、肝障害及びＨＩＶ感染症からなる群より選ばれる疾患である、請求項１記載の予防及び/又は治療薬。
【請求項３】
アポトーシスが関与する疾患が、神経変性疾患であり、該神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎及び小脳変性からなる群より選ばれる疾患である、請求項２記載の予防及び/又は治療薬。
【請求項４】
アポトーシスが関与する疾患が、虚血性疾患であり、該虚血性疾患が、心筋梗塞、狭心症、うっ血性心不全及び不整脈からなる群より選ばれる心疾患である、請求項１記載の予防及び/又は治療薬。
【請求項５】
アポトーシスが関与する疾患が、虚血性疾患であり、該虚血性疾患が、脳卒中、くも膜下出血、脳梗塞及び脳血栓からなる群より選ばれる脳血管性疾患である、請求項１記載の予防及び/又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バトロキソビン(batroxobin)を有効成分として含有することを特徴とする、アポトーシスが関与する疾患の予防及び／又は治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、Kerr、Wyllie、Currieらによって提唱された細胞死の過程又は様式の一つである（Brit.J.Cancer,26,239 (1972) 参照) 。発生学においては、胚発生の一定時期に一定の場所に決まって生じる細胞死が知られており、発生のプログラムにしたがって生ずる細胞死という意味で“プログラム細胞死”ともいわれている。従って、必要な細胞が障害を受けて死ぬ過程である、「ネクローシス（壊死）」とは形態学的に区別される。アポトーシスの形態学的特徴として、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及び核凝縮、核の分節化等を挙げることができ、更に、細胞表面の微絨毛の消失及び細胞表面の平滑化（細胞表面の水泡形成：membrane blebbing ）等も観察される。また、エンドヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡが断片化する現象も観察され、細胞自体がアポトーシス小体とよばれる細胞断片を形成し、この形成されたアポトーシス小体が、迅速に周囲の細胞やマクロファージ等により貪食分解され、アポトーシスが起こるとされている。
【０００３】
生体は細胞増殖と細胞死とのバランスにより恒常性（homeostasis ）を維持していることが知られている。従来より、細胞増殖の制御については、よく研究されているが、細胞死の制御についてはほとんど知られていない。アポトーシスは、生理活性物質（神経成長因子（ＮＧＦ）やコロニー刺激因子（ＣＳＦ）等）の欠如、アポトーシス誘導因子（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やリンフォトキシン等の因子及びｃ−ｍｙｃ、ｐ-53 遺伝子産物等）によって誘導され(Cell,69,119 (1992);Nature,362,849 (1993) 参照）、一方、アポトーシス抑制因子（ｂｃｌ-2など）によってアポトーシスは阻害される(Nature,359,552 (1992);Nature,359,554 (1992)参照) 等、多くのことが知られている。
【０００４】
最近、このようなアポトーシスが多種多様な疾患において重要な係わりを有することが明かにされてきており、細胞のアポトーシスを誘導あるいは抑制することにより、これらの疾患の診断、予防及び治療を図る試みが種々行われ、注目されるに及んでいる（Science,267,1456 (1995) 参照）。
また、現在、虚血後の神経細胞死では海馬遅発性神経細胞死がアポトーシスとの関連から注目されている。すなわち、スナネズミやラットの両側頸動脈を短時間（〜10分間）閉塞後再開通すると、２日（48時間）以降に両側海馬ＣＡ１領域の細胞死が観察され、４日（96時間）以上経過すると細胞は縮小し樹状突起に空包がみられ、以後１週間後には消滅してしまう。
【０００５】
脳は、全身の組織の中で最も酸素消費量が高い組織であり、しかも多量のエネルギーを消費する場でもある。従って、虚血に対して脆弱であり神経細胞死による脳機能障害が起こりやすい。神経細胞死は発生過程で顕著に認められるが、生まれた後も絶えず死滅している。ヒトの大脳皮質においては１日に約１０万個の神経細胞が死んでいるといわれている。神経細胞は再生することができないので、何らかの障害で過度に死ぬと機能障害が生じる。特に問題視されるのは、虚血、薬物、ストレス又はウィルス等によって引き起こされる神経細胞死であり、その機構を解明することは、脳虚血障害の治療やＡＩＤＳによる神経障害など、多くの神経疾患の治療薬の開発や治療法の確立に、また、神経細胞の長期生存能力を理解する手掛かりを得る上で重要性を増している。
また、アルツハイマー病やパーキンソン病などを含めた神経変性疾患についてもアポトーシスとの関連が最近注目され、発症機序の解明、及び予防方法や治療薬の開発がますます重要な課題となってきている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はアポトーシスを抑制することにより、アポトーシスが関与する疾患に対して有効な予防及び／又は治療薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
先に、本発明者らは、バトロキソビンが、虚血再灌流時において心疾患、脳疾患の予防及び／又は治療に有効であることを見出し、特許出願をした（特願平７- １６１６６５号）。該出願は、バトロキソビンが、細胞が傷害を受けて死ぬ過程である「ネクローシス」を抑制することを見出し、なされたものである。前述したように、「アポトーシス」と「ネクローシス」とは形態学的に全く異なるものであり、上記出願においては、バトロキソビンとアポトーシス抑制との関係については全く言及されていない。
本発明者らは、バトロキソビンの薬理作用について更に詳細に研究したところ、バトロキソビンがアポトーシス抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明に係わるバトロキソビンは「Bothrops atrox moojeni蛇毒由来のトロンビン様酵素」であり、市販の製剤としては、例えば、東菱薬品工業（株）により製造されているバトロキソビン製剤等があげられる。
【０００９】
本発明の、アポトーシス関連疾患の予防及び／又は治療薬は、アポトーシスを抑制することにより、かかるアポトーシス関連疾患の予防及び／又は治療薬として使用される。上記アポトーシス関連疾患としては、例えば、虚血性疾患（再灌流障害を除く）、神経変性疾患、末梢神経障害、再生不良性貧血、肝障害又はＨＩＶ感染症等が挙げられる。上記虚血性疾患としては、例えば、心筋梗塞、狭心症、うっ血性心不全及び不整脈等の心疾患、脳卒中、くも膜下出血、脳梗塞及び脳血栓等の脳血管性疾患等が挙げられる。また、上記神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎及び小脳変性等が挙げられる。
【００１０】
バトロキソビン（Bothrops atrox moojeni蛇毒由来のトロンビン様酵素）製剤 1ml中の成分及び分量は、次の通りである。
0003866800.tif 000002
【００１１】
本発明によるバトロキソビンの投与量は症状により異なるが、一般に成人１日１回当たり、１〜２０バトロキソビン単位（Batroxobin Unit 、略してＢＵ）であり、なお、症状により増減できる。これを適宜希釈し、点滴静脈内投与、静脈内投与、動脈内投与あるいは局所投与することが好ましい。ここで言うバトロキソビン単位とは、バトロキソビンの酵素活性量を示す単位であり、３７℃の温度で、標準ヒトクエン酸加血漿 0.3mlに、バトロキソビン溶液 0.1mlを加えるとき、血漿を19.0± 0.2秒で凝固する活性量を２ＢＵとする。
バトロキソビンの急性毒性試験はマウス、ラット、ウサギ及びイヌに静脈内投与して行った。ＬＤ50（ＢＵ／ｋｇ）は次の通りであった。
0003866800.tif 000003
【００１２】
以下に実施例を示して、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
バトロキソビンによるラット脳虚血再灌流障害モデルでのアポトーシス抑制効果
実験方法
体重 250〜300gのWistar系雄ラット51匹を用い、無処置群 6匹、偽手術群 9匹、虚血対照群 18 匹及びバトロキソビン投与群 18 匹に分けた。Smith らの方法（Acta.Neurol.Scand,69,385 (1984) 参照）に従い、両側の総頸動脈を閉塞して、瀉血により平均動脈圧を 50mmHg に維持した。総頸動脈を10分間閉塞した後、虚血対照群には生理食塩水 2 ml を投与して、再灌流を行い、以後 24 、48、96時間後に断頭し、致死させた。バトロキソビン投与群には、バトロキソビンを生理食塩水で希釈した溶液２mlを、1.6 BU／kgとなるように静脈内投与した。偽手術群は総頸動脈の閉塞や瀉血を施さず、他の操作は虚血群と同様に行った。無処置群は何も処置せず、直接断頭し、致死させた。
細胞アポトーシスの観察は“In situ 細胞死検出キットAP”(Boehringer Mannheim社製) を用い行った。すなわち、凍結組織切片を 4％のパラフォルムアルデヒド（Sigma 社製）で固定し、ＰＢＳで3 回洗浄し、ＴＵＮＥＬ(TdT using nick end labeling) 反応混合液でＤＮＡ鎖分解物を標識した。その後 37 ℃、45分間放置した後、ＰＢＳで洗浄し、コンバーター-AP を加え、37℃、60分間処理した。定法どおり脱水、透明化、封入し、光学顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞の染色質は核膜周辺に新月型に凝縮され、紫青色のアポトーシス小体が観察され、400 倍光学顕微鏡でこれらの 1mm長あたりのアポトーシス陽性細胞数を測定する。Student's t-検定により統計分析し、( 平均値±標準偏差) で表示した。
【００１４】
結果
無処置群及び偽手術群ではアポトーシス小体が見られなかった。虚血対照群では再灌流24時間後の海馬ＣＡ１領域にはアポトーシス陽性細胞がみられた。その細胞の染色質は、核内で典型的な新月型に凝縮され、かつアポトーシス小体の存在が認められた。再灌流後の時間経過に伴い、アポトーシス陽性細胞の数も増え、96時間経過後には最大となった。バトロキソビン投与群では、再灌流24時間後にはアポトーシス小体は見られなかった。48時間経過後及び96時間後においては、アポトーシス小体の存在が認められたが、虚血対照群よりアポトーシス陽性細胞の数は顕著に減少していた（表１）。以上の如く、バトロキソビンは、アポトーシスに対して顕著な抑制作用を示した。
【００１５】
【表１】
0003866800.tif 000004
【００１６】
【発明の効果】
本発明のバトロキソビンを含有するアポトーシス関連疾患の予防及び／又は治療薬はアポトーシス抑制作用を有し、アポトーシスが関与する疾患に対する予防及び／又は治療薬として有効である。