(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から成る群から選択される配列から成り、かつ、トロンビンもしくはプロトロンビンまたはトロンビン及びプロトロンビンの両者に結合するペプチド。
【請求項２】
配列番号１、１９、２０および２１から成る群から選択される配列から成る請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項４】
プロトロンビンおよびトロンビンから成る群から選択されるタンパク質の精製方法であって、タンパク質が基質に結合するために十分な条件下でタンパク質を含む水溶液を基質と接触させることを含んで成り、基質が支持体に結合した請求項１記載のペプチドを含んで成る方法。
【請求項５】
ペプチドが配列番号１、１９、２０および２１から成る群から選択される配列から成る請求項５記載の方法。
【請求項６】
（Ｐ／Ｖ）ＦＰＹ（Ｇ／Ａ／Ｖ）Ｗの配列から成り、かつ、トロンビンもしくはプロトロンビンまたはトロンビン及びプロトロンビンの両者に結合するペプチド。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項８】
プロトロンビンおよびトロンビンから成る群から選択されるタンパク質の精製方法であって、タンパク質が基質に結合するために十分な条件下でタンパク質を含む水溶液を基質と接触させることを含んで成り、基質が支持体に結合した請求項６記載のペプチドを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、一般的にタンパク質−リガンド相互作用の同定、そして具体的にはプロトロンビンおよびその活性化状態であるトロンビンに結合し、かつこれらのタンパク質のアフィニティー精製法に使用できるペプチドリガンドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
α-トロンビンは、血漿セリンプロテアーゼチモーゲンであるプロトロンビンの活性化状態であり、タンパク質中のArg−Gly結合に高い特異性を有する。α-トロンビンは、その内皮細胞レセプター、血漿凝固調節プロテインＣ、凝固V、VIIIおよびXIII因子、ならびに血液凝固の主要タンパク質であるフィブリノーゲンを含む多くの生理学的基質を有する。α-トロンビンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの開裂は、フィブリンの血液凝固への重合を生じる。トロンビンは、典型的にはフィブリングルーまたは封止材と呼ばれる止血用の調製物において商業的に使用されている。
【０００３】
ヒトの血漿からのトロンビンの精製は、コーン画分IIIを出発材料として使用して、Fentonら(1971)ならびにMillerおよびCopeland(1965)の研究から引用されるようにFentonら(1977)に記載された。この方法はアルカリ塩沈殿および陽イオン交換クロマトグラフィーを含むが、高純度のα-トロンビンを生成した。
【０００４】
またトロンビンは、プロトロンビン濃縮物（プロトロンビン複合体濃縮物:prothrombin complex concentrate:PTCとも言う）から調製することもでき、これは典型的には全血漿を陰イオン交換樹脂へ吸着させ、そして溶出させることにより調製される(Coanら、1981に要約されている）。この画分を、プロトロンビン（II因子）、VII、IXおよびX因子、プロテインＣならびにプロテインＳを含む数種のビタミン−Ｋ依存性プロテアーゼのチモーゲン形に濃縮する。続く処理は典型的には、陽イオン交換クロマトグラフィーが必要である（WalzおよびSeegers、1974;Downingら、1975)。
【０００５】
アフィニティー法は、プロトロンビン濃縮物から、または陽イオン交換クロマトグラフィーにより調製された下流の中間体から、血漿α-トロンビンを高純度濃縮するために導入された。トロンビンはアフィニティー相互作用のために利用された構造的特徴、すなわち触媒部位、陰イオン-結合部位(フィブリノーゲン-結合エキソサイトIとしても知られている)、およびヘパリン−結合部位（エキソサイトII）を有する。有用なリガンドは、例えばクロロベンジルアミン（Thompson、1976：ThompsonおよびDavie、1971)およびp-アミノベンザミジン(Lorneら、1989：Khamlichiら、1990)のような合成インヒビター、および触媒部位に結合するL-アルギニルメチルエステル(Yuら、1986)のような基質類似体を含む。ヘパリンおよび陽イオンクロマトグラフィー樹脂は、ヘパリン−結合部位（エキソサイトII）に結合する(Miller-Andersonら、1980：NgaiおよびChang、1991)。
【０００６】
ペプチドリガンドクロマトグラフィー
トロンビンに相互作用し、そして／またはトロンビンにより開裂されると知られているタンパク質の部位に由来する多数のペプチド配列があるが、本発明者はプロトロンビンまたはトロンビンのアフィニティー精製に関して、そのようなペプチドを利用する参考文献が無いことを知っている。Petersら(1993)は、セリンプロテアーゼサーミターゼの精製のために、セリンプロテアーゼインヒビターと認識されているペプチジルメチルケトンを使用することにより、修飾ペプチドリガンドの有用性を実証した。
【０００７】
ヒルジン、浸出抗凝固タンパク質は、トロンビンの陰イオン結合部位で相互作用する結合配列（約55−65残基)を有する(Krstenanskyら、1987)。
【０００８】
トロンビンおよびＸａ因子への結合に関して、本発明で見いだされたペプチドＱＬＷＧＳＨ（配列番号１）は、トロンビンの既知の機能に関するタンパク質に明らかな配列相同性を持たない。例えば、データベース中のタンパク質に対する相同性配列では、ＱＬＷＧＳＨに対して同一のものは無いが、ハロバクテリウムハロビウム（Halobacterium halobium)由来のスーパーオキシドジスムターゼ、大腸菌(E.Coli)由来のウラシル-DNAグリコシラーゼ(EC3.2.2.-)およびソラナム チューベロサム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)由来の4-アルファ-グルカノトランスフェラーゼ(EC2.4.1.25)と、６つ連続残基の中に５つの同一性が明らかになった。
【０００９】
付加されたアミノ−末端ヒスチジンを含むＱＬＷＧＳＨの変異体（ＨＱＬＷＧＳＨ、配列番号２１）は、トロンビンの既知の機能に関与するタンパク質と明らかな配列相同性を持たない。データベースの調査では、ＨＱＬＷＧＳＨとの同一のものは導かれなかったが、レイシュマニア ドノバニ(Leishmania donovani)由来の多剤耐性Ｐ-グリコプロテインは、７つの中に５つの同一連続残基を有することが判明した。この調査ではまた、すでに述べたＱＬＷＧＳＨの配列も明らかになった。ＱＬＷＧＳＨ変異体と同一の配列に関するデータベースの調査では、ＲＱＬＷＧＳＨ（配列番号２０）が同じものを持たないことが明らかになった。７つの連続同一アミノ酸の中の５つを持つ２つの配列が見いだされた：それはヒトアデノウイルス由来の初期Ｅ２Ａ ＤＮＡ 結合タンパク質およびマウスポリオーマウイルス由来の小Ｔ抗原である。
【００１０】
ペプチドＹＦＰＧＰＹＬ(配列番号１９）に関する配列相同性の調査では、トロンビンの既知の機能に関与するタンパク質と配列類似性が無いことが明らかとなった。７つの非連続的な同一残基の中の５つを持つ３つのタンパク質が、データベース調査により見いだされた：ムス ムスカラス(Mus musculus)由来のパラオキソナーゼ、ソルガム ビカラー（Sorghum bicolor)由来の澱粉シンターゼ(EC2.4.1.11)およびコリストネウラ フミフェローナ(Choristoneura fumiferona)由来の遺伝子p74タンパク質である。
【００１１】
【発明の構成】
今回、出願人はプロトロンビンおよびトロンビンに結合する能力を特徴とするペプチドの一群を見いだした。この群には以下のペプチドアフィニティーリガンドを含む：ＱＬＷＧＳＨ、ＲＱＬＷＧＳＨ、ＨＱＬＷＧＳＨおよびＹＦＰＧＰＹＬ（それぞれ配列番号１、２０、２１、１９）。好適なリガンドはＱＬＷＧＳＨ（配列番号１）およびＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１９）である。また出願人は、プロトロンビンおよびトロンビンの精製法も記載し、この方法はタンパク質含有溶液を、定めた配列のペプチドアフィニティーリガンドを結合している基質上に通し、そして次にプロトロンビンまたはトロンビンを溶出することを含んで成る。
【００１２】
【発明の態様】
材料  トロンビンに対するモノクローナルマウス抗体は、アメリカン ダイアグノスティカ（American Diagnostica：グリーンウィッチ、コネチカット州）から購入した。第二抗体結合体であるヤギ抗−マウスIgG-アルカリホスファターゼおよび色素基質NBT/BCIPおよびFast Red TRは、ピアス化学社（Pierce Chemical Co.:ロックフォード、イリノイ州）から購入した。ヒトのトロンビンはエンザイム リサーチ ラボズ(Enzyme Research Labs：サウスベンド、イリノイ州）から購入した。Fmocアミノ酸は、ノボビオケム（Novobiochem：ラジョラ、カリフォルニア州）から購入した。他の全ての化学品は試薬級以上であった。
【００１３】
一般的方法  PELICAＮ法を使用する組み合わせペプチドライブラリーのスクリーニング(Buettnerら、1996)は、2.1mm×15cmのカラム内でミクロボア(microbore)ＨＰＬＣ(ミクローム バイオリソースイズ：Microme Bioresources、オバーン、カリフォルニア州)で行った。ペプチドおよび６-merの組み合わせライブラリーは、Buettnerら(1996)により記載されたように、標準的なFmoc化学を使用して、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン(Totda:アルドリッチ;Aldritch、セントルイス、モンタナ州)で修飾したToyopearl AF Chelate 650M(トーソーハース:TosoHaas、モンゴメリービル、ペンシルバニア州）で合成した。ペプチドはギルソン（Gilson)AMS 422を使用することにより、ロボットで合成した。上記の方法で達成されたペプチドの密度は、典型的には0.2−0.5ミリモル／ｇ樹脂の範囲であった。
【００１４】
アフィニティークロマトグラフィー形式でペプチドをスクリーニングするためには、ペプチド−ペプチド相互作用および１つのペプチドにトロンビンが結合する立体障害の危険性を減少させるために、低いペプチド密度が望ましい。これらは許容量および特異性の減少を生じ得る。そのような望ましい密度は、アフィニティークロマトグラフィーの通常の技術で実施されているような0.05−0.2ミリモル／ｇ樹脂(10−40mg/ml樹脂)の範囲となるだろう。Totdaリンカー上に合成されたペプチド密度を制御するために、Fmoc-L-アラニン対t-Boc-L-アラニンの変動比率を含む混合物を、Totda-Toyopearlにカップリングした。以下の混合物を作成した:100％ Fmoc-L-アラニン；20％ Fmoc-L-アラニン／80％t-Boc-L-アラニン；10％ Fmoc-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニン；４％ Fmoc-L-アラニン／96％t-Boc-L-アラニン；および１％Fmoc-L-アラニン／99％t-Boc-L-アラニン。全アミノ酸濃度（［Fmoc-L-アラニン］に［t-Boc-L-アラニン］を加える）は、約2.5ミリモル／ｇ樹脂(Totdaの５倍)で一定に保たれた。当該技術分野で実施されている標準的なFmoc条件を使用して、混合物をカップリングした後、Fmoc保護基はアルカリにより離脱されるが、アルカリ耐性t-Bocは離脱されなかった。残っているt-Boc-誘導化L-アラニンは第一アミンを欠き、そしてさらなるペプチド合成に利用できなかった。次にペプチドは、Fmoc-誘導化-アミノ酸を使用して樹脂上に合成され、続いて酸性条件下で脱保護することにより合成した（これは残存t-Bocも外した）。バッチ樹脂に関するペプチド密度は、標準的な手法により乾燥、測定した全アミノ酸分析により決定した。最適なペプチド密度は、10％Fmoc-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニンの混合物を用いて達成され、約0.1−0.2ミリモル／ｇ樹脂の密度を生じた。
【００１５】
Rink樹脂(ノボビオケム)は、可溶性の精製ペプチドが可溶性の結合リガンドとして必要な時の合成に使用した。ペプチドを開裂し、そして脱保護し、次に調製用の逆相ＨＰＬＣにより精製した。あるいはアフィニティークロマトグラフィーに必要なペプチドの中には、N-末端Fmoc基の除去無しで、脱保護そしてRink樹脂から開裂され、逆相ＨＰＬＣにより精製され、そして適当なアフィニティー樹脂にカップリングされたものもある。可溶性ペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣにより評価し、そして分子量はＦＡＢマススペクトロメトリーで確認した。
【００１６】
分析法  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を、８％または12％ポリアクリルアミドゲル（ノベックス:Novex、サンディエゴ、カリフォルニア州）で、Laemmli(1970)の手法に従い行った。ゲルからのタンパク質の転写はTowbinら(1979)の方法により、未使用の膜結合部位をブロックするためにカゼイン(ピアスケミカル社)を使用して行った。結合した抗体は化学発光物質ＣＳＰＤ（トロピックス：Tropix、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用し、そしてＸＡＲフィルム(イーストマンコダック:Eastman Kodak、ロチェスター、ニューヨーク州）に暴露して検出した。
【００１７】
免疫比濁法は、ベーリング（Behring)比濁計、モデルＢＮＡを使用することにより、ベーリングベルケ社（Behringwerke AG)(マールブルグ、独国）から購入したアッセイキットを用いて行った。
【００１８】
トロンビン活性は、合成基質S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-p-ニトロアラニン・2HCl)(ファルマシア:Pharmacia、フランクリン、オハイオ州)を使用して測定した。
【００１９】
トロンビンへの結合ペプチドの発見
米国特許出願番号第08/438,331号明細書(引用により本明細書に編入する)に使用されたものに類似するアッセイを、プロトロンビンおよびα-トロンビンの両方に結合するペプチドを推定するために使用した。簡単に説明すると、組み合わせペプチドライブラリーを、約0.4ミリモル／ｇ樹脂の最終ペプチド密度で、トーソーハース クロマトグラフィー樹脂、Toyopearl AF Chelate 650M(Buettnerにより修飾)上に直接合成した。ライブラリーはFmoc-化学を使用して、20の天然アミノ酸の中の18個を用いて合成した(システインおよびメチオニンは含まなかった)。
【００２０】
ライブラリー(0.5ml)への最初の添加は、平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.8および0.1M NaCl、0.1mM EGTAおよび0.1容量/容量％ Tween-20）、そして次に洗浄緩衝液（1M NaClを含む平衡化緩衝液）であった。これに続いて連続的に樹脂を検出系の個々の成分と接触させた。これらの成分は、すなわちマウスで作成された抗−ヒトトロンビン抗体、次にアルカリホスファターゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体であり、そしてBCIP/NBT発色系(青)を用いて染色した。第二の接触は、平衡化緩衝液中の１μM α-トロンビン(全１ナノモル)で開始し、続いて検出系、そしてFast Redによる染色を上記に概説し、そしてBuettnerら(1996)に詳細にさらに記載されているように行った。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
検出系との非特異的相互作用を示すブルービーズは、0.1％未満でカラム全体に均一に見いだされた：10個のビーズが赤く染まった。個々の赤いビーズを手で単離し、そして不溶性の赤色色素を除去するために20分間、メタノール中で超音波処理を行った。固定化したペプチドをエドマン分解によりシークエンシングし、そしてそれを表１に与える。曖昧な信号があるサイクルについては、最高の応答を有するアミノ酸を第一ラインに掲載し、そしてより低い応答のアミノ酸を続くラインに掲載した。
【００２３】
確認の結合アッセイは、0.2ミリモル／ｇ樹脂の最終置換密度で、Totdaに続いてアラニン残基を用いて修飾したToyopearl 650 M Chelate樹脂（A-Totda-Toyopearl)に、直接合成した個々のペプチド配列を使用して、ミクロボアＨＰＬＣに関するカラムクロマトグラフィーの形式で行った。これらの樹脂の接触には、Ａ）平衡化緩衝液（上記のような）、洗浄緩衝液（上記のような）、高塩濃度緩衝液（３M NaClを含有する平衡化緩衝液）、そして溶出緩衝液（2.5％酢酸）のみ；Ｂ）平衡化緩衝液中のヒト血清アルブミン（hSA；0.5mg）、続いて洗浄、高塩濃度、そして溶出緩衝液、Ｃ−Ｅ）平衡化緩衝液中に段階的な精製α-トロンビンの付加量(50、100および200μg）、続いて洗浄、高塩濃度、そして溶出緩衝液を含んだ。終点は、トロンビン接触物中の酸溶出液中の添加量−依存的増加であり、そして定量は280nm吸収の積算によった。すべてのペプチド樹脂からの溶出液の積算を、表２に与える。
【００２４】
PELICANスクリーニングからの陽性レッドビーズに由来する数種の配列が、添加量依存的な様式でトロンビンに結合した(表２)。溶出は大部分、NaClではなく低ｐＨ処理を使用することにより行なわれ、結合の相互作用がヒルジン-誘導化ペプチドよりも明らかに強いことを示唆していた。トロンビンに結合したこれらのペプチドは、ＱＬＷＧＳＨ（ならびにＱの前にさらにＲまたはＨが挿入された変異体）、ＰＦＰＹＧＷ（およびすべての変異体、ＶＦＰＹＧＷ、ＰＦＰＹＡＷ、ＶＦＰＹＡＷ、ＰＦＰＹＶＷおよびＶＦＰＹＶＷ）、ＹＴＰＦＡＶ（しかし第一位でＶまたはＬをＹへ置換する変異体ではない）、ＬＦＡＰＴＬ（しかしＰＦＡＰＴＬではない）、ＳＶＲＰＦＬ、ＦＥＰＡＮＰ、ＧＦＲＫＧＰ（およびＧＦＲＮＧＰ）、ＥＲＰＹＫＧ（しかしＥＲＰＹＨＧではない）およびＹＦＰＧＰＹＬであった。ＰＦＰＹＶＷを含有するペプチド樹脂はトロンビンに結合するが、添加量依存的様式ではなかった（配列番号については表２を参照にされたい）。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
ペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ（配列番号１）を、さらなる実験に使用するために選択した。精製α-トロンビン(50、100および200μg)の結合および溶出プロフィールは、図１に表す。酸溶出液中に、添加量依存的な増加があった（図１Ｃ、ＤおよびＥ）。画分は、発色物質S2238を使用するトロンビン活性のアッセイのために集められた。添加したα-トロンビンエステラーゼ活性の約64−79％が、酸溶出液のpHを中性に調整した後に回収された(表３)。より少ない活性量が非結合画分中（示さず）および３M NaCl溶出液中に溶出した。アルギニンおよびヒスチジンのアミノ末端への点付加で、結合を強化できた（配列番号２０および２１）。
【００２７】
ペプチド樹脂ＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１９）を、図５に示す精製α-トロンビンおよびｈＳＡ（0.5容量／容量％）の混合物に関する結合および溶出プロフィールに基づくさらなる実験のために選択した。酸溶出液中に、添加量依存的な増加があった（図５Ｃ、ＤおよびＥ）。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【実施例】
実施例１
ＱＬＷＧＳＨ樹脂(配列番号１)を使用することによる、活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのα-トロンビンの精製
ヒトのプール血漿を、標準的な製造技法によりＰＴＣ溶出物に処理した。簡単に説明すると、DEAE-Sephadex樹脂を寒冷沈殿の溶出後に加え、そしてゆるく結合したタンパク質を低塩緩衝液を用いて洗い流した。高濃度のNaClは、プロトロンビンおよびビタミンK-依存的凝固プロテアーゼチモーゲン（VII、IX、X因子、プロテインＣおよびプロテインＳ）を含むＰＴＣと呼ばれる画分を溶出した。ＰＴＣ溶出物の試料を25（重量／重量）％のクエン酸ナトリウムの存在下で４日間、室温で活性化した。約1.0mlの活性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlに注入した(図２のＡ)。カラムは、1.0M NaClを含有する平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.8、1.0mM EGTAおよび0.1（容量／容量）％Tween-20)で洗浄し、そして次に3.0M NaClを含有する平衡化緩衝液でさらに洗浄した。酸処理（2.5％酢酸）は、タンパク質をペプチド樹脂から外すために使用した。
【００３０】
ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlは、活性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した（図２のＡ）。少量のタンパク質が、樹脂に結合し、これはNaClまたは酸処理のいずれかにより放出された。SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング（図３のＡおよびＢ）により、活性化ＰＴＣ溶出物はカラムを通過することによりトロンビンが減った（レーン５、非結合画分を参照にされたい）。１M NaClおよび2.5％酢酸の両方が、高度に濃縮されたトロンビンを含んでいた（図３のＡおよびＢ、レーン６および７）。同量のトロンビンが３M NaClで溶出した(示さず)。約42,000の見かけ上の分子量を持つ第二ポリペプチド(SDS-PAGEの移動度により決定するような)は、トロンビンと同時に溶出するが、トロンビンに対する抗体とは反応しなかった。このポリペプチドのＮ−末端配列分析は、識別しうる配列を生じなかった。これはＱＬＷＧＳＨがトロンビンに結合し、そして濃縮することを示唆している。
【００３１】
実施例２
ＱＬＷＧＳＨ樹脂(配列番号１)を使用することによる、プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのプロトロンビンの精製
ヒトのプール血漿を、実施例１に示したように標準的な製造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。約1.0mlのＰＴＣ溶出物をペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlに注入した(図２のＢ)。カラムは、1.0M NaClそして次に3.0M NaClをを含有する平衡化緩衝液で洗浄した。酸処理（2.5％酢酸）はタンパク質をペプチド樹脂から離すために使用した。
【００３２】
ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlは、非活性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した。全タンパク質の大部分（Ａ280による)が、１M NaClにより放出され（図２のＢ）、これはSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング分析により、プロトロンビンを濃縮した（図４のＡおよびＢ）。少量のプロトロンビンが３M NaClにより放出された（図２のＢおよび図４ＡおよびＢ）。酸溶出は少なくとも３つのポリペプチドを遊離し、そのいずれもトロンビンに対する抗体とは反応しなかった。これらの結果は、プロトロンビンがペプチドＱＬＷＧＳＨに結合し、そして１M NaCl含有の溶出緩衝液により、濃縮された純度でペプチドから外されることができることを実証した。
【００３３】
実施例３
ＹＦＰＧＰＹＬ樹脂(配列番号１９)を使用することによる、活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのα-トロンビンの精製
ヒトのプール血漿を、実施例１に示すように標準的な製造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。ＰＴＣ溶出物の試料を50mM CaCl2の存在下で６日間、４℃で活性化した。300μgのα-トロンビンでスパイクした約１mlの活性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearlに注入した(図６)。カラムは、Ａ280がベースラインに戻るまで平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.5、10mM CaCl2、500mM NaCl、0.1（容量／容量）％PEG-400)で洗浄した。次にペプチドに結合したα-トロンビンを放出するために、このペプチドカラムを１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0で洗浄した。酸処理（２％酢酸）は、カラムに未だに結合しているタンパク質を除去するために、クリーニング工程として使用した。
【００３４】
ペプチドカラムＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearlは、α-トロンビン-スパイク-ＰＴＣ溶出物からのタンパク質を結合した。全タンパク質のほとんどが(Ａ280による）カラムを素通りし、そしてより少量が、１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出された(図６)。１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出されたタンパク質は、SDS-PAGEの定量的スキャンニング分析により示されるように、少なくとも72％のトロンビンであった（図７）。他の少ない混入物は分子量がより高く、そしてトロンビンの分解生成物とは思われない。酸処理で少量のトロンビンおよび高分子量タンパク質種を除去した。これらの結果により、活性化セリンプロテアーゼトロンビンはＹＦＰＧＰＹＬに結合し、そしてペプチドから特別な様式で外し、濃縮できることが実証された。
【００３５】
まとめ
ＰＥＬＩＣＡＮ技法を使用して、α-トロンビンを用いた組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより、アフィニティークロマトグラフィーに有用な結合ペプチドを見いだした。ペプチドリガンドＱＬＷＧＳＨ（配列番号１）を含むアフィニティー樹脂は、タンパク質の起源に依存してプロトロンビンまたはトロンビンのいずれかに結合し、そして精製できる。ペプチドリガンドＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１９）を含むアフィニティー樹脂は、活性化ＰＴＣ溶出物からのトロンビンを結合し、そして精製した。
【００３６】
さらに、これらタンパク質のＱＬＷＧＳＨ樹脂への結合および保持は、ヒト血漿画分に混入の可能性がある包膜化ウイルスを不活性化するために有用な非-イオン性界面活性剤であるTween-20の存在下で起こった。これはこの樹脂が調製中にプロ（トロンビン）からウイルス不活性化界面活性剤を除くためにも有用であり、あるいはさらに（プロ）トロンビンをアフィニティー樹脂に結合させながら、ウイルスを不活性化するための界面活性剤を用いた（プロ）トロンビンの処理に有用である。
【００３７】
上記の実施例は本発明を説明することを意図し、そして当業者は変更態様を作成するであろうと考えられる。したがって本発明の範囲は上記の請求項によってのみ限定されることを意図する。
【００３８】
参考文献
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【００５４】
【配列表】
出願人：バイエル  コーポレーション
発明の名称：プロトロンビンおよびトロンビンに結合するペプチド
整理番号：９７０５０８２
出願日：平成９年６月２４日
優先権番号：０８／６７２，８０５
優先権日：平成８年６月２８日
配列の数：２１
配列番号１：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ
１                              ５
配列番号２：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号３：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号４：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号５：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号６：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号７：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ
１                              ５
配列番号８：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ
１                              ５
配列番号９：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ
１                              ５
配列番号１０：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ
１                              ５
配列番号１１：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
１                              ５
配列番号１２：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
１                              ５
配列番号１３：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ
１                              ５
配列番号１４：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ
１                              ５
配列番号１５：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ
１                              ５
配列番号１６：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Asn  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ
１                              ５
配列番号１７：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ
１                              ５
配列番号１８：
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
１                              ５
配列番号１９：
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
１                              ５
配列番号２０：
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ
１                              ５
配列番号２１：
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ
１                              ５□
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでのクロマトグラフィー分離の溶出プロフィールを表す（280nmでの吸収)。（配列番号１）Ａ）緩衝液、タンパク質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）50μgトロンビン；Ｄ）100μg トロンビン；Ｅ）200μg トロンビン。タンパク質は約17μl/分で10分間添加し、そして次にカラムを平衡化緩衝液で865μl／分にて、４分間洗浄した。これに続いて1.0M NaClを含む平衡化緩衝液で５分間、3.0M NaClでさらに５分間、そして0.1M でさらに５分間洗浄した。タンパク質は２％酢酸を使用して30分から35分の間に溶出した。
【図２】活性化および非活性化ＰＴＣ溶出物の、ペプチドＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでのクロマトグラフィー分離の溶出プロフィールを表す（280nmでの吸収)。Ａ）活性化ＰＴＣ溶出物；Ｂ）非活性化ＰＴＣ溶出物。操作条件は図１に記載の通り。
【図３】活性化ＰＴＣ溶出物を、ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した画分のSDS-PAGE（８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果をウエスタンブロット分析した結果を示す図に代わる写真である。パネルＡ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：α-トロンビンに対する抗体を使用したウエスタンブロット。レーン１および９、分子量標準；レーン２、プロトロンビン標準；レーン３および８、α-トロンビン標準；レーン４、活性化ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合画分；レーン６、１M NaCl洗浄画分；レーン７、２％酢酸溶出物。
【図４】ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離したＰＴＣ溶出物のSDS-PAGE（８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果をウエスタンブロット分析した結果を示す図に代わる写真である。パネルＡ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：α-トロンビンに対する抗体を使用したウエスタンブロット。レーン１および１０、分子量標準；レーン２、プロトロンビン標準；レーン３および９、α-トロンビン標準；レーン４、ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合画分；レーン６、１M NaCl洗浄画分；レーン７、３M NaCl洗浄画分；レーン８、２％酢酸溶出物。
【図５】ペプチドＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearl（配列番号１９）でクロマトグラフィー分離した溶出プロフィールを表す（280nmでの吸収)。Ａ）緩衝液、タンパク質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）0.5mg hSA＋50μgトロンビン；Ｄ）0.5mg hSA＋100μg トロンビン；Ｅ）0.5mg hSA＋200μg トロンビン。操作条件は図１に記載の通り。
【図６】活性化ＰＴＣ溶出物をペプチドＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した溶出プロフィールを表す（280nmでの吸収)。平衡（10mM HEPES pH6.5、10mM CaCl2、0.1（容量／容量）％ PGE-400、500mM NaCl)は、0.01mlから18.6ml；１mMクエン酸ナトリウム pH7.0は18.6mlから34.1ml；２％酢酸は34.1mlから43.4mlである。
【図７】ＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した活性化ＰＴＣ溶出物のクーマシー−染色SDS-PAGE（12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を示す図に代わる写真である。レーン１、300μgα-トロンビンでスパイクした、６日目のCaCl2-活性化ＰＴＣ溶出物。レーン２および８、分子量標準；レーン３、プロトロンビン標準（ＭＷ〜71,600)；レーン４、非結合画分；レーン５、１mM クエン酸ナトリウム pH7.0画分；レーン６、２％酢酸画分；レーン７、α-トロンビン標準(ＭＷ〜37,000）。
【図１】
0003978258.tif 000005
【図２】
0003978258.tif 000006
【図３】
0003978258.tif 000007
【図４】
0003978258.tif 000008
【図５】
0003978258.tif 000009
【図６】
0003978258.tif 000010
【図７】
0003978258.tif 000011