(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
別々に調製されたアルカリ域に至適ｐＨを持つヒダントイナーゼ（以下、Ｈａｓｅと略する）および中性付近に至適ｐＨを持つＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸アミドヒドロラーゼ（以下、ＤＣａｓｅと略する）の両酵素を固定化担体上へ同時に固定化した複合固定化酵素を、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０で用いることを特徴とするＤＬ−５−置換ヒダントインから１段反応で対応するＤ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２】
使用するＨａｓｅがバチルス属（Bacillus）の細菌由来の酵素である請求項１記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
使用するＨａｓｅがバチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＮＫ１０８（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５６）由来の酵素である請求項２記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項４】
使用するＤＣａｓｅがアグロバクテリウム・スピーシーズ（Agrobacterium sp.）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ５０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８２）、イー・コリ（Ｅ．coli）ＪＭ１０９ ｐＡＤ１０８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８４）またはイー・コリＪＭ１０９ pＰＤ３０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８３）由来である請求項１〜３いずれか１項記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
使用するＤＣａｓｅがアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）由来のものをアミノ酸置換によって安定性を向上させた、
イー・コリ（Ｅ．coli）ＪＭ１０９ ｐＡＤ４０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１２）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１３）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４０６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１４）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１５）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３５）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２１、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２２、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２３、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３４）、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２６、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４２７、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４５１、
イー・コリ ＪＭ１０９ ｐＡＤ４５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３６）、または、
イー・コリ ＨＢ１０１ ｐＮＴ４５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６８）である形質転換微生物由来である請求項１〜３のいずれか１項記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
別々に調製されたＨａｓｅとＤＣａｓｅが、両者を同時に生産して複合酵素を得た後、該複合酵素を別々としたものである、請求項１〜５いずれか１項記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
複合酵素を、ＨａｓｅおよびＤＣａｓｅの遺伝子を同一ベクターにつないだプラスミドを挿入した宿主を培養することにより生産する請求項６記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
複合酵素を、ＨａｓｅおよびＤＣａｓｅの遺伝子を複製様式の違う別々のベクターにつなぎ、これらを同一の宿主に導入し、培養することにより生産する請求項６記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項９】
複合酵素をＨａｓｅ生産菌とＤＣａｓｅ生産菌とを混合培養して生産する請求項６記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
複合固定化酵素が、ＨａｓｅとＤＣａｓｅの力価の比が０．５〜１．５：１となるよう固定化担体上へ同時に固定化して得られるものである、請求項１〜９いずれか１項記載のＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
各々異なる、もしくは同じ菌株に由来するＨａｓｅとＤＣａｓｅ、抗酸化剤、マンガンイオンと、前記ＨａｓｅとＤＣａｓｅの両酵素を同時に担持した支持体よりなり、ｐＨ６．５〜８．０内の反応ｐＨにおける当該担持されたＨａｓｅとＤＣａｓｅの両者の酵素活性の割合が０．５〜１．５：１である複合固定化酵素調製物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、複合固定化酵素調製物およびそれを使用するＤ−α−アミノ酸の製造方法に関する。本発明の複合固定化酵素調製物は、特に、抗生物質アモキシシリンの製造に用いるＤ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンなどの抗生物質の中間原料となるＤ−α−アミノ酸の製造に役立つ。
発明の背景
医薬中間体などとして重要な化合物である光学活性Ｄ−アミノ酸類は、５−置換ヒダントイン類を酵素ヒダントイナーゼ（以下、Ｈaseと略する）の作用で対応するＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸に不斉的に加水分解する反応（特公昭６２−３０７８５号）と、生成したＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸を酵素Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸アミドヒドロラーゼ（以下、デカルバミラーゼ：ＤＣaseと略する）の作用で、対応するＤ−α−アミノ酸に変換する反応（ＰＣＴ／ＪＰ９１／０１６９６）を組合せることによって効率よく生産できることが既に知られている。
また、これらの酵素は、イオン交換樹脂等の担体に固定化した、いわゆる固定化酵素として用いると、それぞれの反応がさらに効率よく行えることが、特開昭６３−１８５３８２号やＷＯ ９２／００７３９等に開示されている。
しかし、これらの反応では、両酵素の至適pＨ、安定pＨが大きく異なっているため、２段階の反応で行う必要があり、固定化酵素の調製も別々に行う必要があり、反応操作も煩雑であった。
発明の目的
本発明は、ヒダントイナーゼおよびデカルバミラーゼの２つの酵素が共存する状態で（以下、複合酵素という）、同一の固定化樹脂担体に同時固定化し、この固定化酵素樹脂を使用して、効率よくＤ−α−アミノ酸を製造する技術に関するものである。
５−置換ヒダントインをＤ−α−アミノ酸へ変換する２つの酵素反応のうち、ヒダントイナーゼ反応は、一般に、至適pＨがpＨ８〜９で、pＨが増すにつれて基質の溶解度が増し、ならびにヒダントイン環のラセミ化反応がアルカリ性において促進されることなどによって、反応中のpＨが７〜１０の範囲で、好ましくは、アルカリ域で行うことが望ましい。一方、デカルバミラーゼ反応は、至適pＨが、一般に、pＨ６.５〜９.０であるが、pＨが増すにつれて、生成物のアンモニアによる反応の阻害が急激に増大するため、反応中のpＨは中性付近で行うことが好ましい。
これら２つの酵素反応を１つの反応槽で同時に行う、いわゆる１段反応で行えれば、２つの酵素を別々に反応させる、いわゆる２段反応と比較して操作が簡略になるとともに、全体の反応時間が短縮できること、また、可逆反応のヒダントイナーゼ反応と、不可逆反応のデカルバミラーゼ反応とを組み合わせることによってヒダントインの転換収率を向上させることができるとともに、その後のＤ−アミノ酸の精製も簡略化できるなど、大きなコストダウンが可能になると考えられる。しかし、それぞれの酵素を別々の固定化担体に固定化し、これを混合して使用した場合、両酵素反応の至適pＨが大きく違うため、反応性が劣り、また、固定化した酵素の安定性の点でも問題があった。
そこで、本発明者らは、両酵素を同一の固定化担体に同時に固定化した複合固定化酵素調製物を作製せんとして鋭意研究を重ねた。これら両酵素を同時固定化した場合には、微小な樹脂内の空間で２つの酵素反応が連続して起こるため、デカルバミラーゼの基質、Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸が固定Ｈaseより拡散して固定化ＤＣaseまで移行する必要がなくなることや、微小空間内のpＨ変動が小さくできることから、それぞれの酵素の反応性が増し、アンモニアによる生成物阻害も緩和されるとともに、繰返し反応の際の酵素の安定性も向上すると考えられた。
発明の概略
本発明は、陰イオン交換樹脂よりなる固定化担体に、アルカリ域に至適pＨを持つヒダントイナーゼ（以下、Ｈaseと略する）および中性付近に至適pＨを持つＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸アミドヒドロラーゼ（以下、ＤＣaseと略する）を共存する状態で（以下、複合酵素という）同時に固定化した複合固定化酵素を、中性付近のpＨで用いることを特徴とするＤＬ−５−置換ヒダントインから１段反応で対応するＤ−アミノ酸を効率よく製造する方法を提供するものである。
発明の詳細な説明
本発明で用いるヒダントイナーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業生産のためには微生物が適している。かかる微生物としては、例えば、特公昭６２−３０７５８号に開示されたものが挙げられ、細菌に属するものとして、アクロモバクター属（Ａchromobacter）、アエロバクター属（Ａerobacter）、アエロモナス属（Ａeromonas）、アグロバクテリウム属（Ａgrobacterium）、アルカリゲネス属（Ａlcaligenes）、アルスロバクター属（Ａrthrobacter）、バチルス属（Ｂacillus）、ブレビバクテリウム属（Ｂrevibacterium）、コリネバクテリウム属（Ｃorynebacterium）、エンテロバクター属（Ｅnterobacter）、エルウイニア属（Ｅrwinia）、エシエリヒア属（Ｅscherichia）、クレブシーラ属（Ｋlebsiella）、ミクロバクテリウム属（Ｍicrobacterium）、ミクロコッカス属（Ｍicrococcus）、プロタミノバクター属（Ｐrotaminobacter）、プロテウス属（Ｐroteus）、シュードモナス属（Ｐseudomonas）、サルチナ属（Ｓartina）、セラチア属（Ｓerratia）、キサントモナス属（Ｘanthomonas）など、放線菌に属するものとしてはアクチノミセス属（Ａctinomyces）、ミコバクテリウム属（Ｍycobacterium）、ノカルデイア属（Ｎocardia）、ストレプトミセス属（Ｓtreptomyces）、アクチノプラネス属（Ａctinoplanes）など、かびに属するものとしてはアスペルギルス属（Ａspergillus）、パエシロミセス属（Ｐaecilomyces）、ペニシリウム属（Ｐenicillium）など、酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Ｃandida）、ピヒア属（Ｐichia）、ロードトルラ属（Ｒhodotorula）、トルロプシス属（Ｔorulopsis）などがある。
また、上記の微生物の中で、ヒダントイナーゼ活性が比較的高く実用性の優れた菌株を具体的に例示すれば、アエロバクター・クロアカエ（Ａerobacter cloacae）ＩＡＭ １２２１、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａgrobacterium rhizogenes）ＩＦＯ １３２５９、ブレビバクテリウム・インサータム（Ｂrevibacterium incertum）ＩＦＯ １２１４５、コリネバクテリウム・セペドニカム（Ｃorynebacterium sepedonicum）ＩＦＯ ３３０６、ミクロバクテリウム・フラバム（Ｍicrobacterium flavum）ＡＴＣＣ １０３４０、ミクロコッカス・ロゼウス（Ｍicrococcus roseus）ＩＦＯ ３７６４、シュードモナス・ストリアタ（Ｐseudomonas striata）ＩＦＯ １２９９６、ミコバクテリウム・スメグマテイス（Ｍycobacterium smegmatis）ＡＴＣＣ ６０７、ノカルディア・コラリナ（Ｎocardia corallina）ＩＦＯ ３３３８、ストレプトミセス・フラベオラス（Ｓtreptomyces flaveolus）ＩＦＯ ３２４１、バチルス・スピーシーズ（Ｂacillus sp.）ＫＮＫ １０８（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５６）、バチルス・スピーシーズ（Ｂacillus sp.）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）などがある。
また、遺伝子組換えによってヒダントイナーゼ産生能を付与された微生物、例えば、イー・コリ（Ｅ．coli）ＨＢ１０１pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４）など、あるいは増強された人工微生物の生産する酵素や、同等の活性を有する、特開昭５３−１３６５８３号等に開示されたジヒドロピリミジナーゼも使用可能である。
また、本発明で用いるデカルバミラーゼとしては、その由来については動物、植物、微生物など特に制限はないが、工業生産のためには微生物が適している。かかる微生物としては、例えば、特公昭５７−１８７９３号、特公昭６３−２０５２０号および特公平１−４８７５８号に開示されたアグロバクテリウム属、シュードモナス属、アースロバクター層、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、モラキセラ属、パラコッカス属、アエロバクター属、アエロモナス属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、フラボバクテリウム属、セラチア属などの天然の微生物や、ＷＯ ９１／０１６９６に記載されるごとき遺伝子組換えによって脱カルバミル酵素産生能を付与された、あるいは増強された人工微生物が挙げられる。これらの微生物の代表的な例としては、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａgrobacterium sp.）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐseudomonas sp.）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐseudomonas species）ＫＮＫ５０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８２）、イー・コリ（Ｅscherichia coli）ＪＭ１０９ pＡＤ１０８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８４、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９１０９５）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＰＤ３０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８３、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９１０９６）などが挙げられる。
また、デカルバミラーゼの耐熱性に関与するアミノ酸を他のアミノ酸に置換して、安定化させたデカルバミラーゼを使用する場合は、ＷＯ ９４／０３６１３に開示された以下の形質転換株が使用できる。例えば、イー・コリ（Ｅ.coli）ＪＭ１０９ pＡＤ４０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１２、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９３０３８）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１３、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９３０３８）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４０６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１４）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９１５、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９３０４０）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２８、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３５）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４３１、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４３４、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４３５、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４３９、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４４１、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４４５、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４４７、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４４８、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５０、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２１、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２２、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２３、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３４、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９３０４１）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２５、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２６、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４２７、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５１、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５２、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５３、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４６１、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５４、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０３６）、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４５６、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４６８、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４６９、イー・コリ ＪＭ１０９ pＡＤ４７０またはイー・コリ ＨＢ１０１ pＮＴ４５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６８、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ９３０４２）などの形質転換微生物が挙げられる。この様な安定な酵素を用いると、本複合固定化酵素調製物の繰り返し使用に、さらに良い結果が得られる。
本発明で用いる酵素の生産は、両酵素を共に生産できる微生物を用いて同時に生産可能であり、また、それぞれの酵素を単独で生産する微生物を用いて別々にまたは同時に生産することもできる。両酵素の生産能を有する菌としては、天然界より分離した菌株、例えば、特公昭６３−２０５２０号に開示されたアグロバクテリウム属の菌株などを用いる方法があり、また、これらの菌から両酵素の遺伝子を分離して、宿主に導入した組換え微生物、例えば、ＷＯ ９４／００５７７に開示された菌などが使用できる。また、両酵素遺伝子を同一または別々の微生物から分離し、いずれの遺伝子も発現できる形で同一ベクターに挿入したり、複製様式の異なる別々のベクター、例えば、pＵＣ１９とpＡＣＹＣ１８４などに挿入して、大腸菌等の導入可能な宿主に形質転換して、１種類の組換え微生物に両酵素を生産させ、使用することもできる。これらの場合、種々の能力を持つプロモーターの種類やコピー数の異なるプラスミドを選択することによって、目的により両酵素の生成比率を変えることが可能であるが、本発明において、通常は、ほぼ等量の酵素蛋白を生成する様に設定することが望ましい。それぞれの酵素を単独に生産する微生物を用いる場合も、天然界より分離した菌株や、遺伝子組換え技術を用いて作成した組換え微生物が使用可能であるが、その生産の際には、それぞれの酵素生産菌を別々に培養する場合と、これらを種々の比率、好ましくは、ほぼ同量の酵素蛋白を生産する比率で混合培養することができる場合がある。
培養は、好気的な培養、例えば、フラスコ等を用いた振盪培養や攪拌式培養槽などによる通気攪拌培養によって行うことができる。その際に用いる培地としては、通常、一般的に用いられている天然栄養源、例えば、肉エキスやポリペプトンを含む栄養培地等が使用可能であるが、ヒダントイナーゼを単独または同時に生産する場合は、マンガンイオンを、例えば、塩化マンガンとして１〜１００mg／リットル好ましくは２０mg／リットル程度添加して培養するとよい結果を得ることができる。
本発明において、使用する酵素は精製酵素、部分精製酵素または粗酵素として、固定化酵素調製物中に存在していてよく、それぞれの酵素活性を発揮できる状態にあれば、存在型態や共存物を問わない。
また、本複合固定化酵素調製物の調製および使用に際しては、酸化防止剤を添加することにより繰返し使用にさらに良い結果が得られるが、その様な酸化防止剤としては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、Ｌ−システイン塩酸塩、システアミン塩酸塩、ジチオエリスリトール、ジチオスレイトールとジチオエリスリトールの混合物、還元型グルタチオンなどが使用できる。
用いる固定化支持体は、使用する酵素の固定化時の態様によって異なるが、無細胞抽出液のような粗酵素液や硫安分画等を行った部分精製酵素液を固定化に供する場合は、イオン交換基や共有結合基をもったポリマー支持体が使用できる。
イオン交換基を持ったポリマー支持体としては、陰イオン交換樹脂、例えば、第１、２、３、４級アミンを交換基とするデュオライト（登録商標）ＡやアンバーライトＩＲＡ（登録商標）のシリーズ、あるいはジエタノール型の官能基を持つポリスチレン樹脂、例えば、ダイアイオンＥＸなどが使用できる。
共有結合基を持つものとしては、アルデヒドを結合基として持つ置換ポリメタクリル酸ポリマー、ポリエチレンイミン／グルタルアルデヒド複合体で被覆された高密度アルミナなどが使用できる。
本発明の複合固定化酵素調製物は以下の様にして製造される。Ｈase、ＤＣase各々の酵素カ価を適切に調整した複合粗酵素液を支持体と接触させて、各々の酵素を吸着させ、架橋剤で処理して安定化させる。複合粗酵素液の調製には、まず、菌体を培養することによって、それぞれの酵素を生産させる。その際に、両酵素を共に生産できる菌を用いた場合には、菌体を採取して、超音波破砕、機械的破砕（ホモジナイザーなど）、酵素処理などによって無細胞抽出液を調製できる。別々の菌によって作成する場合は、それぞれの菌を別々に培養し、菌体を採取し、無細胞抽出液を調製してから混合する方法、培養液または採取した菌体を混合したり、両酵素それぞれの生産菌を混合培養した後、菌体を同時に破砕して２酵素の混合された無細胞抽出液を作成する方法等で調製できる。両酵素を別々の菌で生産する場合、その生産性は菌の種類や培養方法の違いによって大きく異なるが、一般に、ヒダントイナーゼは、通常の菌で０.１〜１０単位／ml（ここで、酵素１単位は、４０℃、pＨ８.７で基質の５−（p−ヒドロキシフェニル）ヒダントインを１分間でＤ−Ｎ−カルバミル−p−ヒドロキシフェニルグリシンに転換するのに必要な酵素量である）、組換え人工微生物では５〜１５０単位／ml程度生産され、デカルバミラーゼでは、通常の菌で０.０１〜２単位／ml（ここで、酵素１単位は、４０℃、pＨ７.０で基質のＤ−Ｎ−カルバミル−p−ヒドロキシフェニルグリシンを１分間でＤ−p−ヒドロキシフェニルグリシンに転換するのに必要な酵素量である）、組換え人工微生物では０.１〜２０単位／ml程度である。複合粗酵素液中のＨaseとＤＣ
aseの酵素力価の割合は、５−置換ヒダントインからＤ−α−アミノ酸を製造する反応が最も効果的に進行するように調節する。後にも記載するように、この反応はＤＣaseの至適pＨに近い中性付近で行われるため、Ｈaseの活性が最大に発揮される条件ではないなどの要因から、両酵素活性を調節して、反応pＨ下で同程度の酵素活性を示すようにすることが望ましい。例えば、pＨ７.５で反応させる場合、ほぼ同程度の蛋白量、活性比にしてヒダントイナーゼが５倍単位程度多く存在する酵素液を用いて固定化反応を行うことによって、目的とする複合固定化酵素調製物を作製することができる。固定化後にこのような活性を保つためには、複合粗酵素液中の酵素力価の割合が、Ｈase：ＤＣaseの比率が１〜１０：１の範囲であることが望ましい。したがって、菌体の破砕後、吸着させる前に、複合粗酵素液の酵素力価をこのように調節する。
また、適切な酵素量を吸着させるためには、複合粗酵素液中のデカルバミラーゼの酵素量の濃度を１０〜３００単位／mlにしておくのが好ましい。吸着される酵素の力価は添加した酵素の２０〜９０％程度であり、両酵素とも大差ない。
支持体は、交換基を食塩水などで活性化した後、緩衝液等の中で平衡化させたものを使用する。上記複合粗酵素液と支持体の割合は粗酵素液の総蛋白量を支持体の最大吸着量と同じ位にするのが好ましい。必要に応じて１〜１０mＭの酸化防止剤および／または０.５〜２０mＭのマンガンイオンを存在せしめ、４〜３０℃、好ましくは１５℃で攪拌し、酵素の吸着量が所期の量に達した後（通常８〜４８時間、できれば窒素等の不活性ガスの雰囲気下で行う）、濾集し、洗浄後、架橋剤で処理して不溶化し、安定化させる。架橋剤としては、例えば１％以下（好ましくは０.１〜０.２％）のグルタールアルデヒド等の公知のものが使用できる。架橋された複合固定化酵素調製物は、蒸留水や緩衝液（先に記載した酸化防止剤０.１〜２０mＭ、通常、１〜５mＭを含むのが好ましい）で洗浄し、低温（約４℃）にて、密閉容器中に湿潤状態で保存する。こうして得られた複合固定化酵素調製物の酵素活性は、一般に、デカルバミラーゼについては、５〜８０単位／ｇ支持体、ヒダントイナーゼについては、吸着時の条件によって、その１〜１０倍程度の支持体あたりの活性がある。
つぎに、本複合固定化酵素調製物を使用した５−置換ヒダントボンからＤ−α−アミノ酸を製造する工程について説明する。
反応は、反応基質である５−置換ヒダントインに複合固定化酵素調製物を、必要により抗酸化剤および／またはマンガンイオンの存在下に作用させる。通常、反応は０.１〜２０mＭの酸化防止剤およびマンガンイオンの存在下で行うことが好ましく、反応式：
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（式中、Ｒはフェニル基、水酸基で置換されたフェニル基、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基またはチエニル基を示す）に従って進行する。
反応基質である５−置換ヒダントインの濃度は、０.１〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜５ｗ／ｖ％で使用される。複合固定化酵素調製物の使用量は、対基質当たり、デカルバミラーゼ活性で、１０〜２０単位／ｇ基質程度で用いるのが好ましい。反応温度は、酵素によって異なるが、一般には、３０℃〜６０℃、特に耐熱性の酵素ではさらに高い温度で使用することもできる。
反応pＨは６.５〜８.０の間から適宜選ばれる。このpＨ域では、ＤＣaseは、ほぼ至適pＨ近くであるが、Ｈaseは至適pＨからかなりはずれているため、活性が数分の１に低下している。また、ＤＬ−５−置換ヒダントインのラセミ化速度も遅くなっている。しかし、Ｄ−α−アミノ酸の生成は、結局、最後の工程の酵素であるＤＣaseによって支配されるので、これを基準として酵素量や反応条件（すなわち、ＤＣaseの至適条件）を設定し、これに均合ったＨase活性を組み合わせるのが好ましい。反応条件で異なるが、一般には、同程度の活性を発現できるように、吸着される酵素の比率を調整する。同程度の活性とは、反応pＨ、例えば、ｐＨ７.５で測定したヒダントイナーゼ活性（単位（pＨ７.５）で表される）と、先に記載したデカルバミラーゼ活性が、ほぼ０.５〜１.５：１の割合である状態をいう。こうして選ばれたpＨ域、通常pＨ７.５で制御しつつ反応をおこなう。これらの作業により、Ｈaseにとって不利な条件を克服し、平衡反応をＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸の生成方向に傾け、予想以上に効率よく反応を行えるとともに、基質である５−置換ヒダントインの転換収率を向上させることができる。もし、反応をヒダントイナーゼの反応至適pＨ付近のアルカリ域で行った場合には、Ｄ−Ｎ−カルバミルアミノ酸の生成までは良好であるが、デカルバミラーゼの活性が１／２以下まで低下し、さらに、反応によって生成したアンモニアにより大幅は反応阻害を受けることにより、全体の反応効率が低下し、デカルバミラーゼ自体の安定性も低下することがわかっている。これらの理由により、複合固定化酵素調製物を用いた反応は、デカルバミラーゼの反応至適条件、反応基質濃度付近で、デカルバミラーゼ反応がやや律速傾向となる両酵素の固定化比率の複合固定化酵素調製物を用いれば、効率良く行うことができる。また、Ｈaseの生産性が高いこと、ＤＣaseが不可逆反応を接触するなどの条件があるので、複合固定化酵素調製物の全体の酵素活性を調節しやすいことも有利な点である。
反応は、カラム法や反応器中に懸濁するなどして行うが、後者ではバッチ反応が普通に行われ、通常１バッチ当たり、６〜４８時間程度の反応時間である。本発明の複合固定化酵素調製物を用いると、１段反応で５−置換ヒダントインから対応するＤ−アミノ酸を高い光学純度で効率よく高収率で生産することが可能であった。以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
まず、ヒダントイナーゼの酵素液を作製するため、バチルス・スピーシーズ ＫＮＫ１０８（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５６）を２５０mlの種母培地（１.０％肉エキス、１.０％ポリペプトン、０.５％イーストエキス（pＨ７.０））に植菌し、３３℃で約２５時間培養した。これを２.５リットルの本培養培地（１.０％肉エキス、１.０％ポリペプトン、０.５％イーストエキス、０.１％ウラシル、２０ppm ＭnＣl2（pＨ７.５））に植菌し、３３℃で約１６時間培養した。菌体を遠心分離で集菌し、５０mlの２０mＭ ＭnＳＯ4水溶液に懸濁し、pＨを８.５に調整後、超音波によって菌体を破砕し、遠心分離によって残渣を除き、これをヒダントイナーゼ粗酵素液（１０７単位／ml）とした。
また、デカルバミラーゼの酵素液を作製するため、イー・コリ ＨＢ１０１ pＮＴ４５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６８）を２０mlの２ＹＴ培地（１.６％バクトトリプトン、１.０％バクトイーストエキス、０.５％ＮaＣl）に５０μg／mlのアンピシリンを添加した培地で、３７℃で約１６時間前培養を行い、これを１.４リットルの２ＹＴ培地に１％植菌し、３７℃で約２８時間培養した。菌体を遠心分離で集菌し、５mＭジチオスレイトール溶液１４０mlに懸濁し、pＨを７.０に調整後、超音波で菌体を破砕し、遠心分離で残渣を除き、その上清をデカルバミラーゼ粗酵素液（３６単位／ml）とした。
実施例２
実施例１で得られた粗酵素液を用いて、酵素の固定化を行った。固定化用担体としてデュオライト Ａ−５６８（ローム・アンド・ハース）をまず１Ｍ ＮaＣl、つぎに１イオン交換水で洗浄後、イオン交換水中でpＨを７.５に調整した。この樹脂８.４ｇに、pＨを７.５に調整したヒダントイナーゼおよびデカルバミラーゼの粗酵素液をそれぞれ２０ml、１１.５ml加え、窒素雰囲気下、１５℃で約２０時間攪拌した。この樹脂を０.５mＭ ＭnＳＯ4溶液で２回洗浄後、５倍量のイオン交換水に懸濁して、pＨ７.５に調整後、２.５％グルタールアルデヒド５４４μlを少しずつ添加して３５分間攪拌した。これを５０mＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.５）、５mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＭnＳＯ4で１晩処理し、濾集して複合固定化酵素調製物（樹脂１g当たりヒダントイナーゼ活性８.２単位（pＨ７.５）、デカルバミラーゼ活性９.９単位）とした。
つぎに、対照として用いる２つの酵素を別々に固定化した樹脂を作製した。
ヒダントイナーゼ粗酵素液２０mlまたはデカルバミラーゼ粗酵素液６０mlを上記の固定化用担体それぞれ４.２ｇ、２２.０ｇと混合し、上記と同様の操作を行って、それぞれの酵素が別々に固定化された固定化酵素樹脂（ヒダントイナーゼ固定化酵素２４単位／樹脂１g（２.７単位／樹脂１g（pＨ７.５））、デカルバミラーゼ固定化酵素３７単位／樹脂１g）を作製した。
実施例３
実施例２で得られた複合固定化酵素調製物およびそれぞれの酵素単独の固定化酵素を用いて、５−置換ヒダントインから１段反応で対応するＤ−α−アミノ酸を生成させる反応を行った。
１００mlの０.１Ｍ ＫＰＢ（pＨ７.５）、１mＭ ＭnＳＯ4，５mＭ ＤＴＴに基質として５−（p−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン１ｇを添加し、窒素ガスを十分通気後、４０℃、pＨ７.５に調整した。両方の酵素活性が同じになる様に複合固定化酵素調製物０.９７ｇまたはヒダントイナーゼ固定化酵素３.０ｇおよびデカルバミラーゼ固定化酵素０.２６ｇを添加し、窒素ガスを通気しながら２Ｎ Ｈ2ＳＯ4または６Ｎ ＮａＯＨでpＨ７.５にスタットして反応を行った。経時的にサンプリングし、２９時間日まで反応を行い、各経時での生成したp−ヒドロキシフェニルグリシンの量を高速液体クロマトグラフィー（日本分光、ファインパック ＳＩＬ Ｃ−１８カラム）で分析定量した。
結果を図１に示す。
図１から明らかなごとく、同一樹脂に２つの酵素を同時固定した方が効率よく反応が行えることがわかった。
実施例４
複合固定化酵素調製物の繰り返し反応を行った際の酵素活性の安定性を調べた。１００mlの１mＭ ＭnＳＯ4、５mＭ ＤＴＴに５−（p−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン２ｇを添加し、pＨを７.５に調製したものに実施例２で得られた複合固定化酵素調製物８.９ｇを添加し、４０℃で窒素ガス通気下、pＨ７.５にスタットして、２３時間反応させた。反応液を吸引濾過した後、同様に反応液を加え、反応を行う操作を５回繰り返し、それぞれの反応終了時の両酵素活性を測定した。
第１回目の反応に対する相対活性を図２に示す。
５回の反応で活性の低下はほとんどみられなかった。
実施例５
ヒダントイナーゼの酵素液を作製するため、バチルス・スピーシーズ ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）のヒダントイナーゼ遺伝子を持つイー・コリＨＢ１０１pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）を２０mlの２ＹＴ培地で、３７℃にて１６時間前培養した。これを１.２リットルの２ＹＴ培地に、５０μg／mlのアンピシリン、４００ppmのＭnＣl2・４Ｈ2Ｏを添加した培地で３７℃にて２６時間培養した。菌体を遠心分離して集菌し、８０mlの１mＭ ＭnＳＯ4水溶液に懸濁し、pＨをアンモニア水で８.５に調整後、超音波によって菌体を破砕し、遠心分離によって残渣を除いた。この上清をpＨ８.５に調整後、６０℃、２０分間の熱処理を行い、変性蛋白を遠心分離して除き、これをヒダントイナーゼ粗酵素液（１,１００単位／ml）とした。
この粗酵素液と、実施例１と同様の方法で調製したデカルバミラーゼ粗酵素液（２４０単位／ml）を用い、実施例２に示す方法で複合固定化酵素調製物を作成した。デカルバミラーゼ粗酵素液を３０mlと、ヒダントイナーゼ粗酵素液を１３mlを２９ｇの樹脂に実施例２に示す方法で固定化した（樹脂１g当たりデカルバミラーゼ４５単位、ヒダントイナーゼ１１９単位、４４単位（pＨ７.５））。
対照として用いる２つの酵素を別々に固定化した樹脂として、デカルバミラーゼ固定化酵素（４３単位／樹脂１g）は実施例２と同様にして作製したものを用い、ヒダントイナーゼ固定化酵素としては、６０mlの粗酵素液に固定化用樹脂２１.８ｇを混合して実施例２で示す方法で固定化して作製した（１７７単位／樹脂１g、５１単位／g（pＨ７．５））。
実施例６
実施例５で得られた固定化酵素のうち、複合固定化酵素５ｇおよび、別々に固定化した酵素として、ヒダントイナーゼ固定化酵素５.６ｇと、デカルバミラーゼ固定化酵素５.２ｇとを混合したもの（複合固定化酵素と比較して、デカルバミラーゼ活性（pＨ７.５）が同じで、ヒダントイナーゼ活性（pＨ８.７）が２倍の活性を有する）を用いて、実施例３の方法で３％濃度の基質による反応を行った。
その結果を図３に示す。
図３から明らかなごとく、複合固定化酵素の反応は、ヒダントイナーゼ活性が１／２にもかかわらず、ほぼ同程度の反応性を示しており、複合固定化酵素の方が効率よく反応が行え、また、高価な固定化用樹脂も大幅に削減できることがわかった。
実施例７
実施例５で得られた複合固定化酵素各５ｇを用いて反応時のpＨの影響を調べた。pＨ７.０、７.２５および７.５の３水準で、実施例３に示した方法で３％濃度の基質による反応を行った。９９％の基質が転換するのに要する反応時間を調べたところ、それぞれ５.５時間、５.４時間、６.７５時間であり、pＨ７.０および７.２５の方が、反応に有利であることがわかった。
以上記載したごとく、本発明によれば、５−置換ヒダントインから対応するＤ−α−アミノ酸を製造するプロセスにおいて、ヒダントイナーゼおよびデカルバミラーゼを同一樹脂に同時固定化した複合固定化酵素調製物を用いることにより、２段反応よりは、はるかに簡便な操作で、また別々の樹脂にこれらの酵素を固定化した２種類の固定化酵素を混合したものよりは、反応効率よく１段反応を行うことが可能になった。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例３における、複合固定化酵素調製物およびヒダントイナーゼおよびデカルバミラーゼをそれぞれ別の樹脂に固定化した固定化酵素を混合したものを用いて、５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインから対応するＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの生成を経時的に示すグラフである。
図２は、実施例４における、複合固定化酵素調製物の繰返し反応時の酵素の安定性を示すグラフである。
図３は、実施例６における、複合固定化酵素調製物と別々の固定化酵素調製物の混合物（ヒダントイナーゼ活性２倍）との酵素活性を対比した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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