(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体選択的２級アルコール脱水素酵素として、
（ａ）作用：
酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成し、また、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する、
（ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とし、１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高く、２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする、
（ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万である、
上記（ａ）から（ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、さらに補酵素を再生させるアルコールを添加し、４−ハロアセト酢酸エステルの不斉還元により（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造にする際に、３０℃以下の低温下で行うことを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法において、得られた（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの光学純度は９９％ｅｅ以上であることを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の立体選択的２級アルコール脱水素酵素が、キャンディダ属由来の２級アルコール脱水素酵素であることを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項４】
立体選択的２級アルコール脱水素酵素として、
（Ａ）作用：
酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成し、また、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する、
（Ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とし、１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高く、１−フェニルエタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする、
（Ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約５１，０００、ゲル濾過で測定した場合、約１０７，０００である、
上記（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、さらに補酵素を再生させるアルコールを添加し、４−ハロアセト酢酸エステルの不斉還元により（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造にする際に、３０℃以下の低温下で行うことを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法において、得られた（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの光学純度は９９％ｅｅ以上であることを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の立体選択的２級アルコール脱水素酵素が、ゲオトリカム属由来の２級アルコール脱水素酵素であることを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法において、上記（ａ）から（ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、４−ハロアセト酢酸エステルの不斉還元により（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造にする際に、２０℃以下の低温下で行うことを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項８】
請求項４に記載の（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法において、上記（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、４−ハロアセト酢酸エステルの不斉還元により（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造にする際に、２０℃以下の低温下で行うことを特徴とする（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医農薬合成の中間体として重要なハロゲン置換を有する光学活性アルコール、特に、カルニチンなどの合成中間体として有用な光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどのハロゲン置換を有する光学活性アルコールを製造する方法として、パン酵母など微生物の不斉還元反応を利用した方法（特開昭６１−１４６１９１号公報、特開平６−３８７７６号公報他に開示）、不斉合成による方法（特開平１−２１１５５１号公報に開示）、３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（特開平１−２７７４９４号公報に開示）、グリセロール脱水素酵素（Tetrahedron Lett. 29, 2453-2454 (1988)に開示）、サーモアナエロビウム・ブロッキー（Thermoanaerobium brockii, ）や馬肝臓（J.  Am. Chem. Soc. 107, 4028-4031 (1985)に開示）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus MT-4, Biotechnol. Lett. 13, 31-34 (1991)に開示）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp. PED, J. Org. Chem. 57, 1526-1532 (1992) に開示）由来のアルコール脱水素酵素を用いた不斉還元による方法、パン酵母由来の還元酵素（Bull. Chem. Soc. Jpn. 67, 524-528 (1994)）やスポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor ）由来のアルデヒド還元酵素（特許公報２５６６９６０）などの還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下、「ＮＡＤＰＨ」と略す）依存性の還元酵素を利用した方法などが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法は、生成する光学活性アルコールの光学純度が低く、蓄積濃度も低いなどの問題があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、２級アルコール脱水素酵素が持つ４−ハロアセト酢酸エステルなどハロゲン置換を有するケトンの不斉還元反応と、不斉還元反応に付随して還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤＨ」と略す）から生成する酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ+ 」と略す）を２級アルコール脱水素酵素自身を保持するアルコール酸化に伴うＮＡＤ+ からＮＡＤＨへの再生反応を利用し、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどハロゲン置換を有する光学活性アルコール合成の反応条件を検討した結果、反応を低温下で行うことにより、基質４−ハロアセト酢酸エステルなどハロゲン置換を有するケトン、並びに光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどハロゲン置換を有する光学活性アルコールの酵素に対する毒性、変性作用を軽減させ、また基質の分解を抑制することにより、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどハロゲン置換を有する光学活性アルコールの蓄積量が顕著に増加することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
なお、本明細書でいう２級アルコール脱水素酵素とは、ＮＡＤ+ もしくはＮＡＤＰ+ に依存したアルコールの酸化、及びＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨに依存したケトンの還元反応を触媒するアルコール脱水素酵素であって、ｎ−プロパノールよりもイソプロパノールに好ましく作用する２級アルコール脱水素酵素を指す。
【０００６】
すなわち、本発明は、立体選択的２級アルコール脱水素酵素として、
（ａ）作用：
酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成し、また、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する、
（ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とし、１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高く、２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする、
（ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万である、
上記（ａ）から（ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、または、立体選択的２級アルコール脱水素酵素として、
（Ａ）作用：
酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成し、また、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する、
（Ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とし、１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高く、１−フェニルエタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする、
（Ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約５１，０００、ゲル濾過で測定した場合、約１０７，０００である、
上記（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質を有する酵素を用い、さらに補酵素を再生させるアルコールを添加し、アルコールを還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド再生用基質（以下、「ＮＡＤＨ再生用基質」と略す）とし、４−ハロアセト酢酸エステルなどハロゲン置換を有するケトンの不斉還元により光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどのハロゲン置換を有する光学活性アルコールを製造する際に、３０℃以下の低温下、好ましくは２５℃以下の低温下、より好ましくは２０℃以下の低温下で行うことを特徴とする光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどのハロゲン置換を有する光学活性アルコールの製造を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
更に、本発明について詳説する。
【０００８】
本発明で用いられる立体選択的２級アルコール脱水素酵素は、４−ハロアセト酢酸エステルなどのハロゲン置換を有するケトンを不斉還元する能力を有し、３０℃以下、好ましくは２５℃以下の低温下での反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどのハロゲン置換を有する光学活性アルコールの蓄積量が増加する立体選択的２級アルコール脱水素酵素であれば、酵素の起源を問わず利用可能であるが、以下の性質を有する２級アルコール脱水素酵素（特開平７−２３１７８９号公報に開示）が特に有用である。
【０００９】
（ａ）作用：
ＮＡＤ+ （酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）を補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【００１０】
（ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００１１】
（ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万である。
【００１２】
ここで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の略であり、またＳＤＳとは、ドデシル硫酸ナトリウムのことである。
【００１３】
このような性質を有する２級アルコール脱水素酵素としてキャンディダ属、特にキャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の２級アルコール脱水素酵素があげられる。
【００１４】
また、以下の性質を有する２級アルコール脱水素酵素（特願平８−２７９０９２号に開示）も特に有用である。
【００１５】
（ａ）作用：
ＮＡＤ+ （酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトンまたはアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）を補酵素としてケトンまたはアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【００１６】
（ｂ）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。１−フェニルエタノールのＳ体を優先的に酸化し、アルデヒドまたは芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００１７】
（ｃ）分子量：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約５１，０００、ゲル濾過で測定した場合、約１０７，０００である。
【００１８】
このような性質を有する２級アルコール脱水素酵素として、ゲオトリカム属、特にゲオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum ）由来の２級アルコール脱水素酵素があげられる。
【００１９】
これらの２級アルコール脱水素酵素は、それらの酵素を元来保有する微生物、その抽出物、部分精製酵素、精製酵素など様々な形態で利用可能である。
【００２０】
また、２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、乳酸菌、パン酵母、ピキア属、ハンゼヌラ属などの酵母、アスペルギルス属などのカビなどにより発現させた酵素を用いることも可能である。例えば、キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素（以下、「ＣｐＡＤＨ２」と略す）遺伝子を大腸菌にクローニングし、ｔａｃプロモータ下流にＣｐＡＤＨ２の後続遺伝子を連結した発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１を含む大腸菌（特開平７−２３１７８５号公報に開示）を培養して得られた組換え大腸菌は特に好ましく利用することができる。
【００２１】
ハロゲン置換を有するケトンのハロゲン原子としては、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、４−ハロアセト酢酸エステルのエステルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、オクチル、ベンジルなどの直鎖、分岐鎖、芳香族置換を含むアルコールのエステルが含まれる。
【００２２】
ＮＡＤＨ再生用の基質として利用されるアルコールとしては、特異性、安定性、平衡などを考慮して最も適したアルコールを利用することが好ましいが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、１−フェニルエタノールなどが利用可能である。
【００２３】
反応を行う温度は、利用する２級アルコール脱水素酵素の特性を考慮して決定されるが、３０℃以下、２５℃以下が好ましく、２０℃以下がより好ましい。
【００２４】
また、反応は、水に溶解しにくい有機溶媒と水系との２相系、固定化酵素、膜型リアクターなどを用いてもよい。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１：
２級アルコール脱水素酵素を含む大腸菌の調製
キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素（ＣｐＡＤＨ２）の発現ベクターであるｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中、３０℃で培養後、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭ添加し、更に、５時間培養を継続して２級アルコール脱水素酵素を含む菌体を得た。
【００２７】
実施例２：
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル合成に及ぼす反応温度の影響
培養液２５ｇより調製した２級アルコール脱水素酵素を含む大腸菌、３％  ４−クロロアセト酢酸エチル、３．３％  イソプロパノール、２００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含む２５ｇの反応液を調製し、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃で１７時間反応を行い、反応液の４−クロロアセト酢酸エチル、生成物の４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル濃度、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度をそれぞれ測定した。
【００２８】
４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルのそれぞれの濃度の定量は、以下の条件でガスクロマトグラフィーを用いて行った。サーモン３０００クロモソルブＷ（信和化工株式会社製）、２ｍ、カラム温度：１５０℃、検出温度：２５０℃の条件で、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）により行った。
【００２９】
光学純度の測定は、反応液から４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラム、ダイセル化学工業（株）製「キラルパックＡＳ」、移動相：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／エタノール／シクロヘキサノール（９２／２．５／１．２／０．２５）、ＵＶ：２２０ｎｍ検出、流速：１ｍＬ／分）により測定した。測定結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】
0004012299.tif 000002
なお、ゲオトリカム属由来の２級アルコール脱水素酵素を用いた場合も、上記同様に、低温下で、生成物の蓄積物濃度をあげることができた。
【００３１】
【発明の効果】
立体選択的２級アルコール脱水素酵素を利用した光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどのハロゲン置換を有する光学活性アルコールの合成方法を低温下で行うことにより、生成物の蓄積濃度をあげる方法を提供することができる。