(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするペクチン酸リアーゼ遺伝子。
【請求項２】
ペクチン酸リアーゼ遺伝子が、配列番号３若しくは配列番号４に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるものである請求項１記載のペクチン酸リアーゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
宿主が、微生物である請求項４記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）は、１９６２年、バチルス  ポリミキサ（Bacillus polymyxa）とエルビニア  カルトボーラ（Erwinia cartovora）の培養液に初めて見い出されたもので、反応にカルシウムイオンを必要としている（Starr & Moran, Science, 135, 920-921, 1962）。それ以降、数多くの細菌、真菌類がペクチン酸リアーゼを生産することが知られるようになった（Sakai, et al. Adv. Appl. Microbiol. 39, 213-294, 1993）。さらに、遺伝子組換えの技術が発展するに伴い、例えば、Erwinia chrysanthemi EC16 （Tamaki, et al., J. Bacteriol., 170, 3468-3478, 1988）、Xanthomonas campestrispv. malvaccarum B414 （Liao et al., MPMI, 9, 14-21, 1996）、Fusarium solani f. sp. pisi（Guo et al., J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995、Arch. Biochem. Biophys., 332, 305-312, 1996、Gonzalez-candels & kolattukudy, J. Bacteriol., 174, 6343-6349, 1992）、Aspergillus nidulans（Ho et al., Curr. Genet., 27, 142-149, 1995）等からペクチン酸リアーゼ遺伝子がクローニングされ塩基配列が決定され推定アミノ酸配列が解析されている。
【０００３】
遺伝子学的、生化学的に充分研究されているBacillus属細菌のペクチン酸リアーゼについては、比較的報告例が少ない。Starr とMoran がBacillus polymyxaの培養液にペクチン酸リアーゼを発見して以来、Bacillus pumilus（Dave & Vaughn, J. Bacteriol., 198, 166-174, 1971）、Bacillus subtilis（Chesson & Codner, J. Appl. Bacteriol., 44, 347-364, 1978）、好熱性Bacillus属細菌の一種が生産する最適pHが８．５〜９．３の酵素（分子量は不明）（Karbassi & Luh, J. Food Sci., 44, 1156-1161, 1979）等が発見されている。最近、Sakamotoら（Biosci. Biotech. Biochem., 58, 353-358, 1994）は、プロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼをBacillus subtilis IFO3134から精製している（protopectinase-N）。Bacillus属のペクチン酸リアーゼ遺伝子が決定されているものはBacillus subtilis SO 113 （Nasser et al., FEBS 335 319-326, 1993）、Alkali-tolerant Bacillus sp. YA-14（Kim et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 947-949, 1994）のみであり、しかも、ＳＯ  １１３株とＹＡ−１４株の塩基配列は、９９％の相同性を示し、且つアミノ酸配列は完全に一致しているものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これら従来のペクチン酸リアーゼは、一部製品として入手可能であるが、高価であり、種々の糖質分解酵素も混在している等の問題があり、産業界で広く利用されてはいない。
【０００５】
従って本発明は、洗浄剤、繊維処理等、広く産業界において有用なペクチン酸リアーゼを単一で且つ大量生産を可能にするために、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、及びこれを含有する形質転換体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、ペクチン酸リアーゼを産生する微生物を自然界から探索し、遺伝子工学技術を利用してその遺伝子、その特性及びその大量生産技術を確立すべく種々検討してきたところ、土壌から分離したバチルス属細菌が産生する新規なペクチン酸リアーゼについて、その遺伝子のクローニング、遺伝子組換えによる生産技術の確立に成功し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするペクチン酸リアーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、上記のペクチン酸リアーゼ遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、配列番号１若しくは配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする配列を有する。ペクチン酸リアーゼ活性を失なわない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特に制限されない。また、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列におけるＮ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加していてもよい。
【０００９】
配列番号１中、アミノ酸番号９４〜２２８の間で、他の酵素との相同性を検討すると、図６に示すように、Aspergillus nidulansに由来するペクチン酸リアーゼＰｅｌＡ（Meng-Chen Ho, et al., Curr. Gcnet., 27. 142-149, 1995）が最も相同性が高いが、４３．９％の相同性があるにすぎない。従って、配列番号１のアミノ酸番号９４から２２８の間で適切にアライメントした時、これら以上の相同性がある酵素は、本発明の遺伝子がコードする酵素に含まれる。すなわち、アミノ酸配列の相同性は配列番号１におけるアミノ酸番号９４〜２２８に対して４５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００１０】
また、配列番号１中、アミノ酸番号１〜３０２の間で、他の酵素との相同性を検討すると、Glomerella cingulata（GenBank 登録No. GCU32942）に由来するペクチン酸リアーゼが最も相同性が高いが、配列番号１４〜２８７間において３９．９％の相同性があるにすぎない。従って、配列番号１のアミノ酸番号１４から２８７の間で適切にアライメントした時、これら以上の相同性がある酵素は、本発明の遺伝子がコードする酵素に含まれる。すなわち、アミノ酸配列の相同性は配列番号１におけるアミノ酸番号１４〜２８７に対して４０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００１１】
本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子は、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列又はその前記変異体をコードするものであればよいが、配列番号３若しくは配列番号４で示される塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
【００１２】
本発明の遺伝子がコードするペクチン酸リアーゼは、土壌から分離したバチルス属に属する微生物（例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８８）やバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８５）やそれらの変異株を培養し、得られた培養物から採取することによって製造できる。
【００１３】
本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８８）やバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８５）等からクローニングすることができる。該クローニング手段としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法で目的とする遺伝子をクローニングする方法等が挙げられる。
【００１４】
前記ペクチン酸リアーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターにペクチン酸リアーゼ遺伝子を組み込めばよい。かかるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。
【００１５】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、常法、例えばプロトプラスト法、コンピテントセル法等により行われる。宿主としては、特に制限されないが、微生物が好ましく、バチルス属、ストレプトマイセス属等のグラム陽性菌；大腸菌（Escherichia coli）等のグラム陰性菌；サッカロマイセス属酵母、アスペルギルス属カビ等の真菌等が挙げられる。
【００１６】
得られた形質転換体を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養し、得られた培養液中から一般の酵素の採取及び精製方法に準じた方法により、ペクチン酸リアーゼを得ることができる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１：バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｐ７株の培養
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）とした。
【００１９】
実施例２：バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｐ７株由来ペクチン酸リアーゼの精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株の培養液を遠心分離（10,000×ｇ、15分、４℃）し、その上澄液（900ml）に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（10,000×ｇ、15分、４℃）を行い沈殿物を回収した。これを少量の基本緩衝液〔１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）〕に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（105ml）をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（２．５×１６cm）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた。次に、この非吸着画分をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＣＭ−Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（２．５×２２cm）へ添着した。約３００mlの基本緩衝液にて洗浄溶出を行った後、０から０．１Ｍの塩化カリウムを含む基本緩衝液（４００mlずつ）を用いた濃度勾配溶出法により、吸着タンパク質を溶出させた。ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びＫＳＭ−Ｐ７株由来ペクチン酸リアーゼは７０〜８０mM付近の塩化カリウム濃度で単一ピークとして溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにＴａｂｅｒ法によるＰＡＧＥにおいても均一なタンパク質として検出された。これらの画分を集め限外濾過（ＹＭ３メンブレン、アミコン社製）にて濃縮し、２０％グリセロール液として−２０℃に凍結保存した。上記の操作により得られたＫＳＭ−Ｐ１０３株由来精製ペクチン酸リアーゼ酵素の場合、活性収率は約４２％、精製倍率は約５００倍であった。一方、ＫＳＭ−Ｐ７株由来精製ペクチン酸リアーゼ酵素の場合、活性収率は約２５％、精製倍率は約１８０倍であった。
各精製酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（４７６Ａ型、アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端配列を１８番目のアミノ酸まで決定した結果、ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びＫＳＭ−Ｐ７株由来の酵素ともＡＮＦＮＱＱＧＦＳＴＬＮＧＧＴＴＧＧであった。
【００２０】
実施例３：ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
（１）バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株染色体ＤＮＡの調製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株を液体培地で振盪培養した培養液を遠心し、菌体を回収した。得られた菌体からＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）で染色体ＤＮＡを調製した。
【００２１】
（２）プライマーの調製
実施例２で得られた精製酵素のアミノ末端配列及びペクチン酸リアーゼ保存領域アミノ酸配列から、プライマー１及びプライマー２を合成した（図１）。
（３）クローニング
このプライマー１と２を用い、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の染色体ＤＮＡ（０．５μｇ）を鋳型として、ＰＣＲを行った。得られた増幅断片をＰＣＲ断片精製キット（ベーリンガー・マンハイム社製）で精製した後、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に導入してクローン化した。得られたクローン４個の塩基配列を決定したところ、目的とするペクチン酸リアーゼ遺伝子配列の一部が検出され、アミノ酸配列も推定できた（図２参照）。
次に、上述のＰＣＲ増幅断片の上流と下流の領域を増幅するためにインバースＰＣＲを行った。図２中に認められる塩基配列、プライマー３とプライマー４を用いた。バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の染色体（１μｇ）を、あらかじめＨｉｎｄIII で消化し、フェノール／クロロホルム抽出して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて分子内結合（環状化ＤＮＡ結合）させて鋳型とした。ＰＣＲは、Long Template System  ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて行った。その結果約４．５kbp の増幅断片が検出された。ダイレクトシークエンスによってこのＤＮＡ断片及びプライマー１〜２間の配列決定を行ったところ、Ｎ−末端アミノ酸配列から終止コドン（ＴＡＡ）の前のアミノ酸までの３０２アミノ酸からなるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列及び塩基配列（配列番号１及び３）を決定した。バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の生産するペクチン酸リアーゼ（分泌型成熟酵素）の分子量は、この配列から３３，２１２Ｄａ（約３３kDa）と推定される。また、同様な方法でバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株の生産するペクチン酸リアーゼのＮ−末端アミノ酸配列から終止コドン（ＴＡＡ）の前のアミノ酸までの３０２アミノ酸からなるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列及び塩基配列（配列番号２及び４）を決定した。バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７株の生産するペクチン酸リアーゼ（分泌型成熟酵素）の分子量は、この配列から３３，３５５Ｄａ（約３３kDa）と推定される。
【００２２】
実施例４：組換えプラスミドの造成と枯草菌によるペクチン酸リアーゼの生産
まず、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の産生するペクチン酸リアーゼのＮ−末端アミノ酸Ａｌａと、用いた宿主のベクター由来のシグナル配列が連結するように上流側のプライマー（プライマー５、図３参照）をデザインした。下流側のプライマー（プライマー６、図３参照）は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子の終止コドン（ＴＡＡ）から７３bp下流に位置する２６bpからなる配列をデザインした。使用したベクターｐＨＳＰ６４（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 872-877, 1992）のシグナル配列コード部分の３′側に存在するＳａｌＩ部位とその１１bp下流に存在するＳｍａＩ部位間に、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入することとした。
【００２３】
すなわち、プライマー５と６を用い、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約１kb ｐＤＮＡ断片が増幅された。これをＸｈｏＩで消化しておき、ＳａｌＩとＳｍａＩで切断されたｐＨＳＰ６４とリガーゼで連結した（図４を参照）。
この組換えプラスミドをｐＨＳＰ−１０３ＰＡＬと命名した。
【００２４】
次にｐＨＳＰ−１０３ＰＡＬで枯草菌ＩＳＷ１２１４を形質転換し、液体培地中で３０℃で３日間培養したところ菌体外に著量のペクチン酸リアーゼを生産した。また、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ７由来のペクチン酸リアーゼ構造遺伝子を利用して上記と同様な方法によって菌体外に著量のペクチン酸リアーゼを生産した。
【００２５】
参考例１：組換えペクチン酸リアーゼの特性
実施例４で得られた２つのペクチン酸リアーゼの粗酵素液を実施例２に従って完全精製した。
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に０．２mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．１mlの４mM塩化カルシウム溶液、０．２mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）及び１．４mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を添加し反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラクツロニド量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、盲検は酵素液を加えずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とした。
【００２６】
（１）Ｎ末端アミノ酸配列
実施例２と同じ手法でこれらの酵素のＮ−末端アミノ酸配列を決定したところ、両者の酵素ともＡＮＦＮＱＱＧＦＳＴＬＮＧＧＴＴＧＧを含む配列が検出された。
（２）pH−活性曲線
Ｐ１０３及びＰ７組換えペクチン酸リアーゼのpH−活性曲線を調べた。ポリガラクツロン酸を基質とした時、Ｐ１０３組換えペクチン酸リアーゼのpH−活性曲線は、実施例２で得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１０３株由来のペクチン酸リアーゼのpH−活性曲線とほぼ完全に一致し、最適反応pHは、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中でpH１０付近であった（図５）。Ｐ７組換え酵素の場合も同様の結果であった。
【００２７】
（３）分子量
得られた組換えペクチン酸リアーゼの分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％アクリルアミド）により、測定したところ、Ｐ７及びＰ１０３組換えペクチン酸リアーゼの分子量は、３１から３３kDa の範囲にあることが判明した。この値は推定アミノ酸配列から計算した分子量とほぼ一致した。なお、標準タンパクとしてバイオラット社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Molecular Weight Standards, Low Range を用いた。
（４）木綿繊維からのペクチン遊離
基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断した木綿繊維片１０mgを０．４mM  ＣａＣｌ2 を含む０．０５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、実施例４で得られた２つの組換えペクチン酸リアーゼを添加後、３０℃、１時間反応させた。反応終了液を遠心分離し、上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸法（Sakai, Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）で定量した。その結果、０．１Ｕの酵素を用いた場合、いずれの酵素でも１ｇの木綿繊維あたりガラクツロン酸として２．３〜３．６mgのペクチン遊離量が認められた。このことは両組換えペクチン酸リアーゼが木綿繊維表面のプロトペクチンに作用していることを意味しており、さらに上澄液の２３５nmにおける吸光度も上昇していることが判明したので、Ａ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有していると判断される。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子を用いて洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なペクチン酸リアーゼを単一且つ大量に生産することが可能である。
【００２９】
【配列表】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ペクチン酸リアーゼ遺伝子クローニング用プライマー１及び２の塩基配列を示す図である。
【図２】プライマー１とプライマー２の間のＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列及びプライマー３とプライマー４の位置を示す図である。
【図３】本発明ペクチン酸リアーゼ全領域を増幅するためのプライマー５とプライマー６を示す図である。実施例４で示したＰＣＲ増幅用プライマーで、生成する増幅断片（約１kbp）はＸｈｏＩで消化された後、ＳａｌＩとＳｍａＩで消化されたｐＨＳＰ６４に連結される。
【図４】ペクチン酸リアーゼ遺伝子（Ｐ１０３由来ｐａｌ）の分泌ベクター（ｐＨＳＰ６４）への導入と創製されたペクチン酸リアーゼ発現分泌ベクターｐＨＳＰ−１０３ＰＡＬを示す図である。
Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子
Ｔｅｔ：テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子
【図５】Ｐ１０３組換えペクチン酸リアーゼ（実施例４）のpH−活性曲線を示す。５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液で最大活性を示すpH約１０の値を１００％として、相対活性を表示した。
【図６】Ｐ１０３組換えペクチン酸リアーゼと他の酵素のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
アミノ酸番号は、配列番号１の９４から２２８を基準として、他のアミノ酸配列と相同性を合わせた。＊印は共通のアミノ酸残基を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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