(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患もしくはＴ細胞由来ヒト白血病の治療または予防薬として使用する医薬品の製造のためのＥｔｘまたはＣｔｘのＢサブユニットの使用（ただし、該サブユニットは、抗原決定基とは、直接結合していない）。
【請求項２】
自己免疫疾患の治療または予防薬として使用する、請求の範囲第１項に記載の使用。
【請求項３】
該自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、または糖尿病である、請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項４】
ＥｔｘのＢサブユニットの使用である、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
自己または交差反応抗原を補助投与しない、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ＥｔｘまたはＣｔｘのＢサブユニットを含む、自己免疫疾患用もしくはＴ細胞由来ヒト白血病の治療用または予防用医薬組成物（ただし、該サブユニットは、抗原決定基とは、直接結合していない）。
【請求項７】
自己免疫疾患治療用または予防用医薬組成物である、請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項８】
該自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、または糖尿病である、請求の範囲第７項に記載の組成物。
【請求項９】
請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の組成物と、自己または交差反応抗原決定基とを別々に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、哺乳動物、特にヒトの自己免疫疾患の治療に用いられる治療薬に関する。本発明はまた、いわゆる「ワクチンキャリアー」としてのＴ細胞由来のヒト白血病の治療に有用な治療薬、及びヒト移植拒否反応および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の予防に用いられる薬剤に関する。
「ザ  ジャーナル  オブ  イムノロジー」１９９５年第１５４巻第１０３２〜１０４０頁（The Jouranal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040）、チャールズ  オー．  エルスンらによる「コレラ毒素およびそのＢサブユニットによる粘膜Ｔ細胞の形態学的及び機能的変質」（"Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B subunit" by Charles O. Elson et al.）と題された論文において、コレラ毒素（Ｃｔｘ）およびＣｔｘＢサブユニットが、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞を阻害することが開示されている。
また、「ザ  ジャーナル  オブ  イムノロジー」１９９５年第１５４巻第３６１１〜３６１７頁（The Jouranal of Immunology, 1995, 154; 3611-3617）、ビー．ヤンケレビッチらによる「新規な免疫抑制薬を用いた治療による急性移植片対宿主疾患の予防」（"Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" by B. Yankelevich et al.）と題された論文が参考文献として挙げられる。同文献は、ＣｔｘＢが、骨髄移植において急性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の予防薬となることを示している。
ＷＯ  ９５／１０３０１には、特定の寛容原に結合した粘膜結合分子を含有する免疫寛容誘導薬が開示されている。
本明細書においては、「Ｃｔｘ」はコレラ毒素を表わし、「ＣｔｘＢ」はコレラ毒素のＢサブユニットを表す。これらは、時々他の文献において、それぞれ「ＣＴ」または「Ｃｔ」、および「ＣＴＢ」または「ＣｔＢ」と表されているものと同一である。本明細書では、「Ｅｔｘ」は大腸菌の非耐熱性腸管毒を意味し、「ＥｔｘＢ」はＥｔｘのＢサブユニットを意味する。これらは、時々他の文献において、それぞれ「ＬＴ」または「Ｌｔ」、「ＬＴＢ」または「ＬｔＢ」と表されているものと同一である。
本発明のあらゆる見地の根拠は、ＥｔｘＢ（大腸菌の非耐熱性腸管毒の純粋なＢサブユニット）が哺乳動物細胞表面で発見されたＧＭ−１ガングリオシド受容体に結合すること、およびこの結合は、ＣＤ８+Ｔ細胞の特異的消耗、および連動するＢ細胞活性化を含む、リンパ球個体数への特異な影響を誘発することの発見にある。ＧＭ−１結合活性のない突然変異ＥｔｘＢタンパク質が用いられた場合、こうした影響は見られない。
自己免疫疾患
自己免疫は、身体が自己抗原に対して免疫反応を引き起こすメカニズムを表すのに用いられる用語である。
本発明の第１の態様によれば、自己免疫疾患の治療または予防薬として使用するための、
（ｉ）ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、または
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、
が提供される。
本発明による薬剤は、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるアポプトシスの誘発、ＣＤ４+細胞の増強活性化及びＢ細胞の多クローン性活性化をもたらすリンパ球個体数を調節することが分かっている。こうした現象は、サイトカインに連動したＴｈ２の誘発に対する免疫反応をシフトするようである。自己または交差反応抗原に対する前記反応は、ある種の自己免疫疾患に対する間接防護であると理解される。
本発明の前記第１の態様の第１の実施形態では、薬剤は進行中の自己免疫疾患の治療法に使用される。この実施態様においては、薬剤は患者に、自己または交差反応抗原の補助投与とともにまたは補助投与なしに、投与される。本発明の第一の態様の前記実施形態による薬剤の投与により、自己抗原に対する免疫反応の性質が調節されて疾病による炎症活性化が除去され、自己免疫疾患から防護される。
本発明の第一の態様の第２の実施形態においては、薬剤は自己免疫疾患に対する被検哺乳動物のワクチン接種法に使用され、その際、前記疾病に関連する自己又は交差反応抗原決定基（または異なる自己又は交差抗原決定基の組合せ）が補助投与される。かかる方法によって、自己抗原または交差抗原に対する被検者の免疫反応が切り変えられて病原の活性化が取り除かれ、ゆえに、将来的な自己抗原に対する自己免疫反応から防護される。
本発明の当該第１の態様においては、治療薬および自己または交差反応決定基が被験者に補助投与される、またはされてもよい。これによって、治療薬および抗原決定基の各々の投与部位および投与時間は、必要とされる免疫系調節によって決定されることを意味する。それゆえ、治療薬および抗原決定基が同時に同じ部位に投与されてもよいが、治療薬が抗原決定基と異なる時間に異なる部位に投与されると有利な場合もあるかも知れない。
治療薬および抗原決定基は単一回用量で満足な場合もあるが、本発明の当該態様の範囲内での複数回用量も考慮される。
本発明の第１の態様の当該第２の実施形態においては、異なる成分を別々に投与することが可能なので、治療薬および抗原決定基を結合しないで別々に投与することが好ましいが、治療薬と抗原決定基を、例えば共有結合で結合して、単一の活性薬剤を形成してもよい。
本発明の当該態様により治療される特定の自己免疫疾患は、関節リウマチ多発性硬化症、糖尿病のごとき細胞媒介性免疫が病理に関連する自己免疫疾患である。
加えて、本発明の当該第１の態様のもとでは、自己免疫疾患の予防薬として使用する医薬品の製造のために、Ｃｔｘ、ＥｔｘまたはＣｔｘもしくはＥｔｘのＢサブユニットの使用が提供される。
また、
（ｉ）ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、または
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、
および医薬的に許容される担体またはそれらのための希釈剤からなるヒト自己免疫疾患の治療のための医薬組成物が提供される。
本発明の当該態様の医薬組成物は、例えば鼻内噴霧のごとき粘膜経路によって投与するよう形成するか、または非経口的に、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路によって投与するため、組成物を注射可能な形態に形成してもよい。
医薬組成物は、適当な自己または交差反応抗原とともに形成されてもよい。あるいは、それぞれ治療薬および抗原決定基のための別々の組成物を含むキットとして提供されてもよい。
本発明の当該態様で使用してもよい特定の治療薬としては、ＥｔｘＢおよびＣｔｘＢまたはＧＭ−１結合活性を保持したそれらの突然変異体がある。
この種の困難な治療ではある程度の毒性は認容され得るが、本発明の第１の態様において使用される薬剤は、実質的に非毒性であることが好ましい。
本発明の当該第１の態様は、哺乳動物の自己免疫疾患の治療に用いるための、ＧＭ−１結合活性を有するすべての薬剤の使用を包含するばかりでなく、細胞内情報伝達を媒介するＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、すなわち擬態ＧＭ−１結合薬の使用をも包含するものである。
それゆえ、本発明の当該第１の態様は、ヒト自己免疫疾患の治療において、治療薬としてＥｔｘＢタンパク質の使用を制限するものではない。しかし、そのような治療のためのＥｔｘＢタンパク質（５つの同一サブユニットの５量体である）の使用は、本発明の好ましい実施形態を表している。本発明の当該好ましい態様もまた、野生型ＥｔｘＢに加えて、ＧＭ−１結合活性を有するＥｔｘＢの突然変異体ばかりでなく、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）およびＧＭ−１結合活性を有するそれらの突然変異体のごとき他の同等のタンパク質をも包含するものである。
本発明の第１の態様による自己免疫疾患の治療のための他の治療薬としては、ＧＭ−１に結合するヒト化モノクロナール抗体がある。そのような薬剤の同定法および製法は当業界において周知である。
Ｔ−リンパ球白血病
本発明の第２の態様によれば、ＣＤ８  Ｔ細胞由来のヒト白血病のごときＴ細胞由来のヒト白血病の治療に用いるための、
（ｉ）ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、または
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、
が提供される。
この種の困難な治療ではある程度の毒性は認容され得るが、本発明の第２の態様において使用される薬剤は、実質的に非毒性であることが好ましい。
加えて、本発明の当該第２の態様においては、ＣＤ８  Ｔ細胞由来のヒト白血病のごときＴ細胞由来のヒト白血病の治療用医薬品の製造のための、ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニットの使用が提供される。
また、
（ｉ）ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、または
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、
および医薬的に許容される担体またはそれらのための希釈剤を含有するＴ細胞由来のヒト白血病の治療のための医薬組成物が提供される。
本発明の当該態様の医薬組成物は、例えば鼻内噴霧のごとき粘膜経路によって投与するよう形成するか、または非経口的に、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路によって投与するため、組成物を注射可能な形態に形成してもよい。
本発明の当該第２の態様は、Ｔ細胞由来のヒト白血病の治療に用いるための、ＧＭ−１結合活性を有するすべての薬剤の使用を包含するばかりでなく、細胞内情報伝達を媒介するＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、すなわち擬態ＧＭ−１結合薬の使用をも包含するものである。
それゆえ、本発明の当該第２の態様は、ヒトＴ細胞白血病の治療において、治療薬としてＥｔｘＢタンパク質の使用を制限するものではない。しかし、そのような治療のためのＥｔｘＢタンパク質の使用は、本発明の好ましい実施形態を表している。本発明の当該好ましい態様もまた、野生型ＥｔｘＢに加えて、ＧＭ−１結合活性を有するＥｔｘＢの突然変異体ばかりでなく、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）およびＧＭ−１結合活性を有するそれらの突然変異体のごとき他の同等のタンパク質をも包含するものである。
本発明の当該態様によるこれらの疾患の治療のための他の治療薬としては、ＧＭ−１に結合するヒト化モノクロナール抗体がある。そのような薬剤の同定法および製法は当業界において周知である。
移植片拒絶およびＧＶＨＤ
本発明の第３の態様によると、移植片拒絶またはＧＶＨＤの予防／治療を目的とする治療薬として使用される、
（ｉ）  ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤；または、
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤が提供される。
さらに、本発明のこの第３の態様においては、移植片拒絶またはＧＶＨＤの予防のための薬剤の製造のための、ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘもしくはＥｔｘのＢサブユニットの使用が提供される。
本発明のこの態様の好ましい実施態様においては、前記治療薬は、同種あるいは異種の実質臓器移植片拒絶の予防に用いられ得る。これらはまた、例えば、骨髄移植手技の間のような、急性移植片体宿主疾患の防止においても用いられ得る。
本発明のこの態様における、患者が移植前に処置される実施態様においては、前記治療薬は、同種抗原または異種抗原と同時投与される。移植後に患者が処置される実施態様においては、前記治療薬は、抗原の同時投与をすることなく用いられる。
本発明のこの態様における、前記治療薬およびアロまたはキセノ抗原決定基が患者に同時投与される実施態様においては、前記治療薬および抗原決定基のそれぞれの投与の部位および時間は、免疫系の必要な調節が達成されるようにするつもりである。これゆえ、前記治療薬および抗原決定基が、時期および部位を同じにして投与され得る一方で、前記治療薬を抗原決定基と異なる時間及び異なる部位に投与することにおいて、有利な点もあり得る。さらにまた、前記治療薬および抗原決定基を、単一の活性な薬剤を形成するために、共有結合させることも可能である。しかしながら、前記治療薬と抗原決定基がこのように結合していない状態での別々の投与が、異なる分量割合での別々の投与が可能となるゆえに好ましい。
前記治療薬および抗原決定基の単回投与が好ましいものであるが、複数回投与も本発明の範疇に含まれると考えられる。
前記治療薬がＧＶＨＤの予防において用いられる、本発明のこの態様において、前記治療薬は、通常、例えば、骨髄細胞のような、移植される細胞に直接適用されるであろう。
毒性のある度合いは、この種の過酷な治療において許容されているものではあるものの、前記治療薬は、好ましくは実質的に非毒性である。
また、
（ｉ）ＧＭ−１結合活性を有する薬剤；または、
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤；
およびこれらのための薬理学的に許容される担体または希釈剤からなる移植片拒絶の治療に用いられる医薬組成物もまた提供される。
本発明のこの態様の医薬組成物は、例えば鼻内噴霧のごとき粘膜経路によって投与するよう形成するか、または非経口的に、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路によって投与するため、組成物を注射可能な形態に形成してもよい。
前記医薬組成物は、適当なアロまたはキセノ抗原決定基と共に処方され得る。或いは又、前記治療薬および抗原決定基のそれぞれのための別々の組成物からなるキットが提供され得る。
本発明のこの第３の態様は、移植片拒絶またはＧＶＨＤの予防／治療に用いるための、ＧＭ−１結合活性を有するすべての薬剤の使用を包含するばかりでなく、細胞内情報伝達を媒介するＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、すなわち擬態ＧＭ−１結合薬の使用をも包含するものである。
これゆえ、本発明のこの第３の態様は、移植片拒絶の治療における治療薬としてのＥｔｘＢタンパク質の使用に限定されるものではない。しかしながら、ＥｔｘＢタンパク質（これは５つの同一のサブユニットの５量体である。）のこのような治療のための使用は、本発明の好ましい実施態様である。野生型ＥｔｘＢ以外に、本発明のこの好ましい態様は、ＧＭ−１結合能を有するＥｔｘＢ変異体、並びに、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）およびＧＭ−１結合能を有するその変異体、のようなその他の同等なタンパク質に対しても拡大される。
本発明に基づく移植片拒絶の治療のための他の治療薬としては、ＧＭ−１に結合するヒト化モノクロナール抗体がある。そのような薬剤の同定法および製法は当業界において周知である。
ワクチン接種
ＣｔｘＢおよびＥｔｘＢはいわゆる「ワクチンキャリアー」としてすでに提唱されている。この効果の根源はその一部において、ＥＸｔＢがＧＭ−１レセプターに結合することによってリンパ球個体数を調節することができる能力を有する（上述したように）ことである、ということが今回発見された。
それゆえ、本発明の第４の態様によると、被検哺乳動物へのワクチン接種に使用される、
（ｉ）ＣｔｘもしくはＥｔｘ、またはＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤；または、
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤；
が提供される。
この薬剤は、非関連外来抗原決定基と共に供給された際に免疫応答を調節できるものである。非経口的にこの薬剤が供給される場合、このような免疫修飾は、特定の望まれる方向において「指向された（directed）」免疫応答によるものである。この薬剤が非関連抗原と共に粘膜的に供給された場合、いわゆる「粘膜アジュバント」として、この薬剤は前記非関連抗原に対する粘膜免疫応答を容易なものとすることができる。前記抗原および薬剤は、別々の分量割合として同時に供給されることができ、あるいはまた、例えば、共有結合によって、１つに結合され得る。
前記薬剤は、好ましくは非毒性である。くわえて、この薬剤が胃腸粘膜を通じて粘膜的に供給される場合、胃腸管を通じて透過する間安定に留まるようにすべきであり、例えば、タンパク質分解に対して耐性がある、酸ｐＨで安定である、胆汁の洗浄性効果に対して耐性があるものとすべきである。
さらにまた、
（ｉ）ＧＭ−１結合活性を有する薬剤；または、
（ｉｉ）ＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤；
および医薬的に許容される担体またはそれらのための希釈剤からなる被検哺乳動物へのワクチン接種に使用される医薬組成物もまた提供される。
本発明のこの態様の医薬組成物は、例えば鼻内噴霧のごとき粘膜経路によって投与するよう形成するか、または非経口的に、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路によって投与するため、組成物を注射可能な形態に形成してもよい。
前記医薬組成物は、適当なアロまたはキセノ抗原決定基と共に処方され得る。或いは又、前記治療剤および抗原決定基のそれぞれのための別々の組成物からなるキットが提供され得る。
本発明のこの第４の態様は、免疫修飾剤としての、ＧＭ−１結合活性を有するすべての薬剤の使用を包含するばかりでなく、細胞内情報伝達を媒介するＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤、すなわち擬態ＧＭ−１結合薬の使用をも包含するものである。
これゆえ、本発明のこの第４の態様は、免疫修飾剤としてのＥｔｘＢタンパク質の使用を制限するものではない。しかし、そのような治療のためのＥｔｘＢタンパク質（５つの同一サブユニットの５量体である）の使用は、本発明の好ましい実施形態を表している。本発明の当該好ましい態様もまた、野生型ＥｔｘＢに加えて、ＧＭ−１結合活性を有するＥｔｘＢの突然変異体ばかりでなく、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）およびＧＭ−１結合活性を有するそれらの突然変異体のごとき他の同等のタンパク質をも包含するものである。
本発明に基づく免疫修飾剤のための他の治療薬としては、ＧＭ−１に結合するヒト化モノクロナール抗体がある。そのような薬剤の同定法および製法は当業界において周知である。
本発明の治療剤がタンパク質、例えば、ＥｔｘＢサブユニットまたはＣｔｘＢサブユニット、である場合、本発明の全ての態様において用いるために、これらは、次のような方法、すなわち、前記タンパク質の遺伝子、または前記タンパク質が形成される特定のペプチド鎖（または鎖群）をコードする遺伝子が、適当なベクター中へと挿入され、そしてこれが適当な宿主へと形質移入されるという方法によって生産されることができる。例えば、ＥｘｔＢアセンブルからのポリペプチド鎖をコードする遺伝子は、例えば、プラスミドｐＭＭＢ６Ｂへと挿入され、そして次いで、例えば、ビブリオ種６０（Vibrio sp. ６０）のような宿主細胞へと形質移入するために用いられる。そして該タンパク質は、続いて公知の方法において純化され単離される。活性な変異ＥｔｘＢタンパク質を発現する変異遺伝子は、次に、野生型遺伝子から公知の方法によって生産されうる。
上述したように、特別に設計されたヒト化モノクローナル抗体のような、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤は、当分野において公知の方法によって、上記したところにほぼ沿って、設計されそして製造されることができる。
本発明の全ての態様において、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤はまた、ＧＭ−１レセプターを架橋できるものであり得る。ＥｔｘＢは、このような薬剤の１つであり、その５量体形態によってＧＭ−１レセプターに架橋し得る。
次に、本発明を、添付の図面および以下の実施例を参照することによって、具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥｔｘＢおよびＥｔｘＢのある変異形態（ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ））の物理化学的特性の分析を示すものである；
図２は、ＥｔｘＢによるレセプター結合がインビボにおける（in vivo）その潜在免疫原性に必須なものであることを図示するものである；
図３は、マウスにＥｔｘＢを注射した後のリンパ球増殖の動態を図示するものである；
図４は、ＥｔｘＢがＢ細胞の増大された活性を引き起こすことを図示するものである；
図５は、ＥｔｘＢがＣＤ４+Ｔ細胞の増大された活性およびＣＤ８+細胞の逓減を引き起こすことを図示するものである；
図６はＥｔｘＢによるＯＶＡ−応答性ＣＤ８+Ｔ細胞の選択的逓減を示すものである；
図７はＥｔｘＢによって結合されるレセプターが、アポプトシス（apoptosis）が進行する細胞のリンパ球核形態学特性における変化を誘導することを示すものである；
図８は細胞サイクル分析によって測定された、ＣＤ８+Ｔ細胞のＥｔｘＢレセプターが媒介するアポプトシスを示すものである；
図９ａおよび図９ｂは、ＥｔｘＢによって結合されるＧＭ−１が、ある動物モデルにおける、コラーゲン誘発関節炎の進行を阻止することを示すために、企画された実験の結果を示すものである；
図１０は、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）ではないＥｔｘＢが、正常ヒト末梢血単核細胞の個体数におけるアポプトシスを誘発することを示すために、企画された実験の結果を示すものである；および、
図１１は、ＧＭ−１の架橋が、マウスＣＴＬＬ細胞の個体数におけるアポプトシスを引き起こすことを示す実験の結果を示すものである。
図面の詳細な説明
図１
ＥｔｘＢおよびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の物理化学的特性の分析
（Ａ）ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：それぞれのタンパク質５μｇが、予め加熱するあるいは加熱なしにβ−メルカプトエタノールの存在下還元条件のもと分析された。レーン１、野生型ＥｔｘＢ、非加熱。レーン２、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）、非加熱。レーン３、野生型ＥｔｘＢ、９５℃で加熱。レーン４、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）、９５℃で加熱。分子量標準（バイオラッド（BioRad））がパネルの左側に示されている。
（Ｂ）ゲル瀘過クロマトグラフィーによるＥｔｘＢおよびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の見かけ分子量の測定：標準曲線（丸印）が、上から下への順で、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、ニワトリ卵アルブミン（４５ｋＤａ）、ウシ赤血球カルボン酸無水物（２９ｋＤａ）およびウマ心臓チトクロームＣ（１２．４ｋＤａ）を用いて、作成された；ＥｔｘＢおよびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は、それぞれ、見かけ分子量３６ｋＤａおよび３８ｋＤａで溶離した；Ｖｅ−タンパク質の溶出容積、Ｖｏ−ゲル瀘過カラムの空隙容量。
（Ｃ）ガングリオシドＧＭ−１に対するＥｔｘＢおよびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の拮抗結合に関するＥＬＩＳＡ：プレートがＧＭ−１で被覆され、ブロックされそして１μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）でインキュベートされ、１μｇ／ｍｌから連続的に希釈（３倍）された。
図２
ＥｔｘＢによって結合されるレセプターが、インビボにおける（in vivo）その潜在免疫原性に必須なものであること
ＢＡＬＢ／ｃマウス（各グループごと４匹）に、ＰＢＳにおけるＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を皮下注射したまたは、重炭酸塩バッファーにおける該タンパク質を経口投与した。血清が、２回の皮下注射の１０日後（Ａ）、または３回の経口投与の１週間後（Ｂ）に分析され、そして、腸分泌液が、３回の経口投与の１週間後（Ｃ）に分析された。比較対照マウスからの試料においては何の反応も検出されなかった（図示せず）。結果は、血清中における平均ＩｇＧ抗体力価として示され、また腸分泌液中におけるＩｇＡは以下に述べる「特異活性」として示される。
図３
リンパ球増殖の動態
マウスは、完全フロイントアジュバント中のＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）３０μｇを腹腔内注射された。ＭＬＮが１０日後に摘出され、そして細胞が、抗原の不在下（白四角）、８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢ存在下（黒三角）、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）存在下（白三角）、または９５℃で加熱することによってもたらされた、ＥｔｘＢの分解された単量体形態の存在下（黒丸）およびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の分解された単量体形態の存在下（白丸）、においてインキュベートされた。それぞれのサンプリング日数において最後の６時間、細胞を［3Ｈ］チミジンの１μＣｉでパルス（pulse）した。データは３連ウェルの平均ｃｐｍおよびＳＥＭで表すものである。
図４
ＥｔｘＢがＢ細胞の増大された活性を引き起こすこと
マウスがＣＦＡ中のＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で免疫された。細胞がＭＬＮの１０日目に単離され、そしてＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の８０μｇ／ｍｌの存在下、またはそれぞれのタンパク質４０μｇ／ｍｌづつの混合物の存在下にインキュベートされた。細胞はビオチン化抗ＣＤ２５（７Ｄ４）およびフィコエリトリン（ＰＥ）抗Ｂ２２０  （Ｒａ３−６Ｄ２）で標識づけされた。ストレプタビジンＦＩＴＣ（Streptavidin FITC）が第２抗体コンジュゲートとして使用された。抗体に関する比較対照群も含まれた（図示せず）。２重フロー血球計算的分析（dual flow cytometric analysis）が、増殖してから４日目に行われた。
図５
ＥｔｘＢがＣＤ４+Ｔ細胞の増大された活性およびＣＤ８+細胞の逓減を引き起こすこと
免疫化手順、細胞の単離およびインビトロの（in vitro）感染は、図４の説明において述べたと同様である。ＣＤ２５を検出するために、ビオチン化抗ＣＤ２５（７Ｄ４）およびストレプタビジンＦＩＴＣ（Streptavidin FITC）が用いられた。ＣＤ４およびＣＤ８を検出するために、ＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ４（ＲＮＲＭ４−５）およびＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ８α（５３−６．７）が用いられた。抗体に関する適当な比較対照群も含まれた（図示せず）。
図６
ＥｔｘＢによるＯＶＡ−応答性ＣＤ８+Ｔ細胞の選択的逓減
ＯＶＡで初回抗原刺激されたマウスから摘出されたＭＬＮからの細胞の培養物が、抗原の不在下、またはＯＶＡ＋ＥｔｘＢ存在下、ＯＶＡ＋ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）存在下、もしくはＯＶＡのみの存在下に、１００μｇのＯＶＡおよび４０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の量あるいは１００μｇのＯＶＡのみという量で、５日間かけて株化された。細胞は、次のマウス抗体で標識付けされた：ＦＩＴＣ抗ＣＤ４またはＦＩＴＣ抗ＣＤ８α、およびストレプタビジン−フィコエリトリンを伴うビオチン抗ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）。非染色細胞および第２抗体のみで染色された細胞も比較対照として含まれた。細胞はＦＡＣＳ（ベクトン  ディッキンソン（Becton Dickinson））によって分析された。他の処理と比較して、ＥｔｘＢを含有する培養物における全細胞の割合中でのＣＤ２５+の高い増加は、この標識を発現するＢ細胞のより高い割合での存在に起因するものである（図示せず）。蛍光強度のスケールは、対数（log）である。
図７
ＥｔｘＢによって結合されるレセプターが、アポプトシス（apoptosis）が進行する細胞のリンパ球核形態学特性における変化を誘導すること
＞９０％  ＣＤ３+Ｔ細胞を有しそしてマクロファージを除去したＭＬＮＣが、８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたは８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかで１８時間インキュベートされ、そしてアシジリンオレンジで染色された。細胞は周知のまたは共焦点の蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ４Ｄ）で調べられた。それぞれの処置に関する代表的な顕微鏡区（×５４０）が示される［ＥｔｘＢ  左手パネル；ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）  右手パネル］。抗原不在下でインキュベートされた細胞はＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で処理されたものと同様の結果を示した（図示せず）。
図８
細胞サイクル分析によって測定された、ＣＤ８+Ｔ細胞のＥｔｘＢレセプターが媒介するアポプトシス
細胞サイクルのサブ−Ｇ0／Ｇ1におけるＣＤ４+およびＣＤ８+ＳＰＬＴＣの細胞数はヨウ化プロピジウム（propidium iodide）での染色の後に、ＤＮＡ量のフロー血球計算的分析によって算定された。ＳＰＬＴＣは、上述したようなネガティブな選択によって脾臓から単離された。該細胞は、（ａ）抗原なし、（ｂ）８０μｇ／ｍｌ  ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）または（ｃ）８０μｇ／ｍｌ  ＥｔｘＢで、１８時間処理され、そしてその後ＦＩＴＣ−ラット抗ＣＤ４またはＦＩＴＣ−ラット抗ＣＤ８αで染色された。細胞は続いてヨウ化プロピジウムで染色された。ヨウ化プロピジウムで共染色（co-stain）された細胞数が、ＦＩＴＣ−ラット抗ＣＤ４またはＦＩＴＣ−ラット抗ＣＤ８αで染色された細胞においてゲーテイングすることによって算定された。この実験は細胞において実行され、その結果はまた図７および表３においても報告される。
実施例
実施例１
本実施例は、リンパ球集団に特異な効果（differential effect）を誘導するＧＭ−１結合のための必要条件を説明する。
材料および方法
ＥｔｘＢのレセプター結合変異型の生成
３３番目のＧｌｙのＡｓｐへの置換を、ＥｔｘのＡ−及びＢ−サブユニットに関する遺伝子を含む、ファージミドベクター（phagemid vector）ピーブルースクリプト  アイアイケーエス＋（pBluescript IIKS+）の誘導体である、プラスミドｐＴＲＨ２９（ユ  ジェー（Yu, J.）、ウェッブ  エッチ（Webb, H.）及びハースト  ティーアール（Hirst, T.R.）（１９９２年）、モレク  ミクロバイオル（Molec. Microbiol.）、６、頁１９４９〜１９５８）を用いてヒトのＥｘｔＢのレセプター結合部位中に導入した。突然変異誘発を、鋳型として１本鎖のｐＴＲＨ２９を及び突然変異誘発プライマーとして合成オリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ−３’）（ミクロアナリティカル  ファシリティー（Microanalytical Facility）、アイエーピージーアール（IAPGR）、ケンブリッジ  リサーチ  ステーション（Cambridge Research Station）、英国から）を用いたインビトロの特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発キット（oligonucleotide-directed mutagenesis kit）（アマシャム  インターナショナル（Amersham International））により行った。正確なＧｌｙからＡｓｐへの置換を、シークエナーゼＩＩ（ユナイテッド  ステーツ  バイオケミカル  コーポレイション（United States Biochemical Corp.））を用いたジデオキシ配列決定によって確認し、得られたプラスミドをｐＴＲＨ５６と称した。ｐＴＲＨ５６の変異型ｅｔｘＢ遺伝子を、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限酵素を用いて切り取り、ｐＭＭＢ６８（サンドクビスト  エム（Sandkvist, M.），ハースト  ティーアール（Hirst, T.R.）及びバダサリアン  エム（Bagdasarian, M.）（１９８７年）、ジェー  バクテリオル（J. Bacteriol.）、１６９、頁４５７０〜４５７６）中に挿入し、広範な宿主範囲発現ベクター、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を発現するｐＴＲＨ６４を得た。
抗原
野生型のＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を、アミン（Amin）及びハースト（Hirst）（アミン  ティー（Amin, T.）及びハースト  ティーアール（Hirst, T.R.）（１９９４年）、プロット  エックスプレス  アンド  ピュリフ（Prot. Express. and Purif.）、５、頁１９８〜２０４）によって報告された方法を修飾したものを用いて、それぞれ、ビブリオ種６０（ｐＭＭＢ６８）（Vibrio sp.60（pMMB368））及びビブリオ種６０（ｐＴＲＨ６４）（Vibrio sp.60（pTRH64））の培養上清から精製した。簡単に言うと、タンパク質を、ダイフィルトレーション及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮した。このタンパク質溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ１０カラム（PD10 column）（ファルマシア（Pharmacia）、英国）で脱塩し、−３０℃で貯蔵した。
ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の純度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。個々の単量体の分子量をレーザーデソープション質量分析（laser desorption mass specrtometry）（プロテイン  サイエンス  ファシリティー（Protein Science Facility）、ユニヴァーシティー  オブ  ケント（University of Kent）によって確認した。
ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の見かけの分子量を、スマートシステム（SMART system）（ファルマシア（Pharmacia））を用いたゲル瀘過クロマトグラフィーによって測定した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．５）におけるスーパーデックス  ７５  ピーシー  ３．２／３０カラム（Superdex 75 PC 3.2/30 column）から溶出させた。
リンパ球増殖アッセイ（下記参照）に用いる、Ｂサブユニット五量体の不可逆的な変性を、タンパク質を９５℃で５分間加熱することによって、達成した。
動物、サンプルの収集および免疫化プロトコル
７〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２d；ＥｔｘＢに対する高応答動物）を、チャールズ  リバー  ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）から購入し、ユニヴァーシティー  オブ  ケント（University of Kent）の動物舎で維持した。ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）に対する抗体の応答性を、ＰＢＳにおける３０μｇのタンパク質を皮下注射しさらに１０日後に追加免疫した後、測定した。他のマウス群には、重炭酸ナトリウム溶液において同様のタンパク質投与量（５０μｇ／ｍｌ）を、３回、１週間間隔で、経口投与した。コントロールマウスには、ＰＢＳを投与した。最後に皮下注射してから１０日目にまたは最後に経口給餌してから１週間後に血液を集めた。生きたマウスからの腸からの分泌物を、最後に給餌してから１週間後に、前記（エルソン  シーオー（Elson, C.O.）、イールディング  ダブリュー（Ealding, W.）及びレフコビッツ  ジェー（Lefkowitz, J.）（１９８４年）、ジェー  イムノル  メタ（J. Immunol. Meth.）、６７、頁１０１〜１０８）と同様にしてプロテアーゼ阻害剤溶液中で単離した。次に、サンプルを超音波処理し、遠心（１３，２２６×ｇ、１０分、４℃）によって清澄化した。
増殖アッセイを目的として、マウスに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）における３０μｇのＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を腹腔内注射し、腸間膜リンパ節を１０日後に単離した。コントロールの非免疫マウスもまた含ませ、そのリンパ節を同様にして単離した。
酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）
ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のＧＭ−１への結合を、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡ（アミン  ティー（Amin, T.）及びハースト  ティーアール（Hirst, T.R.）（１９９４年）、プロット  エックスプレス  アンド  ピュリフ（Prot. Express. and Purif.）、５、頁１９８〜２０４）によって試験した。
血清及び腸からの分泌物について、サンプルをＰＢＳにおける５μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で被覆したマイクロタイタープレート（microtiter plate）（イムロン  アイ（Immulon I）、ダイナテック（Dynatech）、アメリカ）に添加したＥＬＩＳＡによって、抗ＢサブユニットＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の存在を調べた。腸からの分泌物上清における抗ＢサブユニットＩｇＡ抗体は、各プレートの２列のウェルをＰＢＳにおける１μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＡ（α鎖に特異的；ザイメド  ラブ（Zymed Lab）、アメリカ）で被覆しさらに１μｇ／ｍｌのマウスのミエローマＩｇＡ（エムオーピーシー  ３１５（MOPC 315）、シグマ（Sigma）、アメリカ）を添加することによって作成した標準曲線から外挿法によって推定した。全ＩｇＡを測定するために、ウェルをウサギ抗マウスＩｇＡで被覆した後、腸からの分泌物上清を添加した。すべてのサンプルを連続して希釈した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメントに特異的；ジャックソン  ラブ（Jackson Lab）、アメリカ）またはヤギ抗マウスＩｇＡ（α鎖に特異的；シグマ（Sigma））−ペルオキシダーゼ複合体（conjugate）を希釈し、すべてのウェルに添加した。抗ＢサブユニットＩｇＧ力価、Ａ450nm≧０．２、を測定した。腸からの分泌物における各ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）に対するＩｇＡ抗Ｂサブユニットの応答を、「ＩｇＡ特異活性」［平均ＩｇＡ抗Ｂサブユニット（μｇ／ｍｌ）／全ＩｇＡ（μｇ／ｍｌ）］として算出した。
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γのサイトカインレベルを測定するためのＥＬＩＳＡ法を、前記（ハーパー  エッチエム（Harper, H.M.）、ピーエッチディ  学位請求論題目（PhD thesis）、ユニヴァーシティー  オブ  ブリストル（University of Bristol）（１９９５年））したのと同様にして用いた。簡単に言うと、マイクロタイタープレートをマウスのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γに対するラットの抗体で被覆した。プレートを２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで遮断した。培養液の上清をウェルに添加し、希釈していった（dilute down）。各サイトカイン用の各プレートの１列に、標準的な量の組換サイトカインを含ませた。次に、プレートを０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗サイトカインモノクローナル抗体と共にインキュベートした後、アビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ）基質を加え、Ａ450nmを読み取った。
リンパ球増殖アッセイ
マウスを頸部脱臼によって殺し、腸間膜リンパ節を無菌的に切り出し、ハンクス液（ＨＢＳＳ）（フロー  ラボラトリーズ（Flow Laboratories）、イルバイン、レンフリューシャイアー（Irvine, Renfrewshire）、英国）中にステンレス鋼メッシュを通してミンスした（mince）。細胞をＨＢＳＳ中で遠心（５００×ｇ、１０分、４℃）によって洗浄し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（フロー（Flow））、１００ＩＵ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（フロー（Flow））及び２−メルカプトエタノールを予め添加した改変イーグル培地（フロー（Flow））（完全培地）中に再懸濁した。非免疫マウス由来の新鮮な自己の正常なマウスの血清を０．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えた。培養物は、２４穴のプレートの２ｍｌ容中にあるいは２５ｃｍ3のフラスコ（ヌンク  エー／シー（Nunc A/S）、ロスカイド（Roskide）、デンマーク）の８ｍｌ容中に２×１０6生存細胞／ｍｌを含み、これを図の説明文に示されるような抗原の存在下でまたは不存在下で確立した。培養物を６日間５％ＣＯ2及び９５％空気の湿潤化雰囲気下で３７℃でインキュベートした。所定の時間で、０．１ｍｌのサンプルを培養物から除去し、９６穴のＵ−底プレート（ヌンク（Nunc））に移し、６時間、１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジン（アマシャム（Amersham）、英国）でパルスした（pulse）後、集め（マック  ＩＩＩ  ハーベスティング  ９６  トムテック（Mach III harvesting 96 Tomtec）、オレンジ，コン（Orange, Conn.）、アメリカ）、標準的な液体シンチレーション１４５０マイクロβプラス（liquid scintillation 1450 Micro β plus）、エルケービー−ウォラック（LKB-Wallac）、ターク（Turku）、フィンランドによってカウントした。同様にして、０．５ｍｌの上清をサイトカイン分析用に培養物からサンプリングした。細胞をペレット化して、上清を分析するまで−６８℃で貯蔵した。
培養細胞の表現型分析
培養してから４日目に集めた培養細胞を洗浄し、生存細胞を、ＨＢＳＳ／１８％メトリザミド（ナイガード  アンド  シーオー（Nyegaad and Co.）、オスロ（Oslo）、ノルウェー）グラジエントの界面で回収した後、２０℃で５００×ｇで１５分間遠心した。細胞を２回洗浄し、０．２％アジ化ナトリウム（シグマ（Sigma））及び１０％正常なラットの血清を含むＨＢＳＳ中に再懸濁した。以下のラットの抗体（ファルミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ（San Diego）、アメリカ）を使用した：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４（ＲＮＲＭ４−５）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８（５３−６．７）、ビオチン標識抗ＣＤ２５（７Ｄ４）及びフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｄ２）。加えて、ビオチン標識抗体では、ストレプトアビジン−ＰＥ（Streptavidin-PE）またはストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Streptavidin-FITC）（セロテック（Serotech）、英国）を使用した。すべての抗体をアジ化物を含むＨＢＳＳで希釈し、所定の濃度で使用した。２００μｌの２×１０6細胞及び２００μｌの各抗体を混合し、３０分間氷上でインキュベートした。ストレプトアビジン−ＰＥまたはＦＩＴＣ  ２次抗体を必要とする際には、細胞をさらに３０分間これらの抗体と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ及びＰＥ抗体用の適当なコントロールもまた含ませた。細胞をＨＢＳＳで洗浄した後、２フローサイトメトリー（ベクトン  ディッキンソン（Becton Dickinson））によって分析した。
結果
ＥｔｘＢのレセプター結合変異型の形成および特性化
レセプター認識を欠失した変異型Ｂサブユニットを得るために、ＧｌｙのＡｓｐへの置換を、ＥｔｘＢの特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発（oligonucleotide-directed mutagenesis）によって大腸菌の熱不安定のエンテロトキシンのＢサブユニット中に導入した。ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と称する、この変異型タンパク質、および野生型のＥｔｘＢを均質になるまで精製した（材料および方法を参照）。精製したＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の分子量をレーザーデソープション質量分析（laser desorption mass specrtometry）によって測定した。分子量は、単量体ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のそれぞれの理論上の分子量である１１７０２及び１１７６０Ｄａの２０Ｄａ以内であった。予め加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、野生型のＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は双方とも、離散性の（discrete）安定オリゴマーとして移動し、見かけの分子量は４２ｋＤａ及び５６ｋＤａであった（図１Ａ、それぞれ、レーン１及びレーン２）。ＥｔｘＢの観察された電気泳動の移動度及びＳＤＳ−安定性はＢサブユニット五量体の特徴的な性質である（サンドクビスト  エム（Sandkvist, M.），ハースト  ティーアール（Hirst, T.R.）及びバダサリアン  エム（Bagdasarian, M.）（１９８７年）、ジェー  バクテリオル（J. Bacteriol.）、１６９、頁４５７０〜４５７６参照）。五量体のＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）が双方とも高分解能ゲル瀘過クロマトグラフィーによって分析する際に同様の保持時間を示すため、オリゴマーのＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の電気泳動の移動度がより遅いことは構成Ｂサブユニット単量体の数の相違によるものではない。したがって、野生型のＥｔｘＢに対するＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）オリゴマーの電気泳動の移動度の不一致は、ＳＤＳ結合の抑制及びそれに続くより遅い移動を引き起こす負に荷電したＡｓｐ残基の導入によるものであると考えられる。
ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）をまた、低ｐＨ緩衝液における安定性、１．０ｍｇ／ｍｌのトリプシンまたはプロテイナーゼＫに対する耐性、および抗Ｂサブユニットモノクローナル及びポリクローナル抗体のパネルへの相対的な反応性について比較した。これらの各試験において、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は野生型のＥｔｘＢと同様の性質を示した。したがって、ＥｔｘＢの３３番目のＧｌｙをＡｓｐに置換してもオリゴマーの立体配置、ＳＤＳ、ｐＨ若しくはプロテアーゼの安定性、または抗体反応性は野生型のＥｔｘＢと比較しても変わらないと結論付けられる。
ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のレセプターＧＭ−１への結合活性を、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡを用いて評価した（図１Ｃ）。これから、野生型のタンパク質と比較した場合、変異型のＧＭ−１への結合活性はかなり有意に抑制される（Ａ450nmの読み取りにおいて＞９９％の減少）ことが示された。さらに、野生型のＥｔｘＢに対して、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は、免疫蛍光法によって試験される際にＣＨＯ細胞に結合しなかった。これにより、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）はインビトロ及びインシツ（in situ）で、ＧＭ−１ガングリオシドへの結合活性が欠損することが結論付けられた。
インビボにおけるＥｔｘＢの潜在免疫原性はレセプター結合に依存する
ＥｔｘＢの免疫原性におけるレセプター結合の重要性を、ＰＢＳにおけるＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の経口デリバリーまたは皮下注射後のマウスにおいて評価した。ＥｔｘＢを経口デリバリーすることにより、血清中の高いＩｇＧ抗体力価および腸からの分泌物中の高いＩｇＡ抗体活性が検出された（図２）。これに対して、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を同様に経口で免疫しても、検出可能な抗体活性は生じなかった。ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は、応答は野生型のＥｔｘＢに対する抗体の応答性に比べるとかなり低い（それぞれ、１０５０及び１７１０００であり、平均抗体力価が＞１６０倍減少する）ものの、皮下注射後の血清の抗体の応答性は誘導していた。これより、ＥｔｘＢによるレセプターの結合はインビボにおける潜在免疫原性（potent immunogenicity）に必須であると結論される。
レセプター結合はＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下でのリンパ球の増殖の範囲に影響を及ぼさない
インビトロにおけるリンパ球の増殖に関するＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の効果を試験した。リンパ球を、ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかで免疫したマウスの膝窩及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から単離し、これらのいずれかのタンパク質で、あるいはＥｔｘＢ若しくはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の熱で変性させた調製物でインビトロで刺激した。膝窩リンパ節またはＭＬＮ由来のリンパ球の増殖の応答性は同等であった。それぞれの場合において、各タンパク質調製物の増殖は、Ｂサブユニットの濃度が増加するに従って向上した。ＭＬＮを用いた実験からの代表的なデータを表１に示す。野生型及び変異型五量体に対する応答性の度合いは、熱で変性させた野生型及び変異型単量体の存在下での度合いと同等であった。図３は、８０μｇ／１ｍｇの各タンパク質調製物の存在下で得られた増殖応答性の動態を示すものである。反応性は、抗原の存在に依存し、各タンパク質の存在下で同様のパターンに従った。反応性は、培養してから３日目に明瞭になり、４日目に［3Ｈ］チミジンの取り込みがピークに達し、その後にウェイニング（waining）した。図３に明らかなピークの応答の時期の若干の違いは繰り返して行った実験では観察されなかったことから、ＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）に対する応答の既往特性は同等であることが示される。これより、天然のタンパク質の存在下での刺激のレベルはレセプターの結合または導入された変異によって影響を受けないと考えられると結論付けられる。
トキシンレセプターの結合はＢ細胞及びＴ細胞サブセットの免疫修飾を引き起こす
ＥｔｘＢによるレセプター結合がインビトロでのリンパ系細胞集団に何らかの影響を及ぼすかどうかを試験するために、リンパ球を、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で腹腔内に初回抗原刺激を受けたマウスのＭＬＮから単離した後、ＥｔｘＢ若しくはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）またはこれらの混合物で刺激した。加えて、ＥｔｘＢを注射されたマウス由来のＭＬＮ由来のリンパ球を用いて平行実験を行った結果、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で初回抗原刺激を受けたマウスで得られたものと実質的に同一の知見が得られた。
（ｉ）ＥｔｘＢはＢ細胞の活性化を向上させる
Ｂ細胞へのＥｔｘＢの効果を、活性化マーカーＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）さらにはＢ細胞マーカーＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現によって試験した。図４に示されるように、ＥｔｘＢで刺激された培養物におけるＢ細胞の数は全細胞の６２．９％であり、これらのうち高い割合（２８．４％）が細胞活性化マーカーＣＤ２５を発現した。これに対して、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で刺激した後のＢ細胞の割合は、野生型のものの半分未満（２２．２６％）であり、より少ない割合（５．６％）が活性化された。ＥｔｘＢによって奏される効果が優性であるかどうかを確立するために、細胞を等モル濃度のＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下でインキュベートした。フローサイトメトリーデータは、野生型のＥｔｘＢ単独の存在下で刺激した後に得られたデータと同様であった（Ｂ細胞が６０．６％で、これらのうち、２６％が活性化された）。これから、ＥｔｘＢのレセプター結合特性はインビトロにおけるＢ細胞の活性化の促進を仲介すると結論される。
（ｉｉ）ＥｔｘＢはＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を向上させかつＣＤ８+Ｔ細胞を完全に逓減させる
Ｔ細胞に関するＢサブユニットレセプター結合の影響を調べるために、リンパ球を、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体さらにはＣＤ２５に対する抗体で標識した（図５）。さらに、別途、一部の細胞をＣＤ３マーカーに対する抗体で標識した（示さず）。ＥｔｘＢの存在下で刺激した際にＣＤ４マーカーを発現するＴ細胞の割合は３６．７％であり、これらのうち、高い割合（３２．７％）が活性化された。これに対して、検出可能なＣＤ８+Ｔ細胞はＥｔｘＢを含む培養物中に存在しなかった。
比較として、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を双方ともにＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で刺激した培養物中に存在させた。このような培養物は、大きな割合のＣＤ４+Ｔ細胞（６６．６％）を含んだが、これらのうち１２％のみが活性化された。ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で検出されたＣＤ８+Ｔ細胞の割合は全細胞数の１１．７％であったが、これらのうちほとんどの細胞は、ＣＤ２５マーカーの不存在によって示され、活性化されなかった。加えて、等モル濃度のＥｔｘＢ及びＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）から構成される混合物の存在下では、応答細胞のパターンは野生型のＥｔｘＢ単独の存在下でのパターンと同様であった；ＣＤ４+Ｔ細胞が４１．６８％（これらのうち、２８．６％がＣＤ２５＋であった）であり、検出可能なＣＤ８+Ｔ細胞は存在しなかった（図５）。上記すべての分析において、ＣＤ３で染まる細胞の割合はＣＤ４及びＣＤ８マーカーを発現するものの合計にほとんど等しかった。これらのデータから、Ｂ及びＣＤ４+Ｔ細胞の活性化の向上及びＣＤ８+Ｔ細胞の選択的な逓減（depletion）はトキシンレセプター居在係数（occupancy）が仲介することが示される。
サイトカインの産生
リンパ球集団へのＥｔｘＢの効果がサイトカインの産生の変化に依存するかどうかを評価するために、細胞培養物をＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と共にインキュベートし、分析用に上清を２、３、４、５及び６日目に除去した。最大濃度のサイトカインが検出された、５日目に集めたサンプルの結果を表２に示す。相対的なサイトカインレベルは異なるが、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２がＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で刺激された培養物の上清において検出された。野生型のＥｔｘＢと共にインキュベートされた細胞の培地は、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で刺激された培養物の上清と比べて、３倍高い濃度のＩＬ−２及び１．５倍低いレベルのＩＦＮ−γを含んでいた。他の抗原に応答する他の増殖Ｔ細胞培養物が高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を産生するという知見があるにもかかわらず、これらのサイトカインのうちＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で刺激された培養物中で検出されたものはなかった。ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と比較した際の、ＥｔｘＢによる刺激後のＩＬ−２レベルの増加及びＩＦＮ−γレベルの減少は、Ｂ及びＣＤ４+Ｔ細胞の活性化状態を最も反映すると考えられる。にもかかわらず、これらの結果は、ＣＤ８+Ｔ細胞集団への野生型のＥｔｘＢの顕著な効果は、レセプター居住係数の結果としての、サイトカインプロフィールの主要なシフトによって仲介されないと考えられることを示す。
ディスカッション
これらの考察は、ＥｔｘＢのレセプター結合部位中の単一点突然変異（single point mutation）（Ｇ３３Ｄ）の導入によりＧＭ−１結合活性が有意に失われたことを示すものである。重要なことであるが、変異型ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）は、ゲルクロマトグラフィー、ＳＤＳ、酸及プロテアーゼにおける安定性によって示されるように、立体配置に関しては野生型のＥｔｘＢと同一の物理化学的な特性を示した。特異的な抗体応答性をＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかで免疫した後に測定した際には、劇的な相違が観察された。マウスにＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を皮下注射すると、野生型と比較すると抗体力価が非常に有意に落ちた（約＞１６０倍）が、経口投与後では抗体反応は検出されなかった。これらの相違は抗体による分子の認識に、または抗体の産生に有効なＴ細胞の補助の刺激に係わる優性エピトープの破壊から生じる可能性がある。しかしながら、ＧｌｙからＡｓｐへの置換が特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体のパネルによるＢサブユニットの認識に何等効果を持たなかったことは注目すべき点である。さらに、ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を培養物に添加した際に得られる増殖応答性はどちらのタンパク質をインビボの初回抗原刺激に使用したかにかかわらず同等であった；ことから、Ｔ細胞の反応性はいずれかの分子に特異的ではないことが示される。したがって、ＥｔｘＢによるレセプター結合はインビボでの潜在免疫原性（potent immunogenicity）に必須であることが結論付けられた。
ＥｔｘＢの潜在免疫原性におけるレセプター結合の重要性は、数多くの方法で説明される。第一に、ＧＭ−１へのＥｔｘ及びＣｔｘのＢサブユニットの結合はこれらのタンパク質の吸収効率を向上させ、免疫システムに有用な局所的なタンパク質濃度を上昇させる。粘膜表面に結合できる他のクラスのタンパク質は有効な免疫原であることが発見された（デ  アイズプラ  エッチジー（De Aizpura, H.J.）及びラッセル−ジョーンズ  ジージェー（Russel-Jones, G.J.）（１９８８年）、ジェー  エックスプ  メド（J. Exp. Med.）、１６７、頁４４０〜４５１）。経口投与後のＥｔｘＢ及びその変異型の免疫原性の観察された相違は、腸管腔からのＥｔｘＢの効率的な吸収によるものである。しかしながら、非経口による免疫（抗原を高濃度で局所的にデリバーする）後の劇的な相違は、他の効果を示唆するものである。例えば、ＧＭ−１へのＥｔｘＢの結合は抗原提示細胞活性の効率に影響を与える。このような結合は、特に、後天的な向上した抗原提示活性に関連する、Ｂ７等の、必須の共刺激（co-stimulatory）分子の発現に関して、クラスＩＩ−保有細胞（bearing cell）の活性化を引き起こす（ジェンキンス  エムケー（Jenkins, M.K.）及びジョンソン  ジェージー（Johnson, J.G.）（１９９３年）、キャル  オピン  イムノル（Curr. Opin. Immunol.）、５、頁３６１〜３６７）。または、レセプター結合はリンパ球のサブ集団（sab-population）に直接効果を有する。本研究からの数多くの考察は、これが確かにこの場合に当てはまるという強力な証拠となる。
インビトロの研究から、ＥｔｘＢが初回抗原刺激を受けたりンパ節細胞の増殖を誘導できることが示された。この性質は、同様の既往特性を有する応答性が野生型のＥｔｘＢ、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）またはＧＭ−１に結合できないこれらのタンパク質の熱で変性された単量体形態を用いて得られたので、レセプター結合に依存しなかった。これらの考察は、Ｃｔｘ及びＣｔｘＢまたは精製された組換ＣｔｘＢの一般的な調製物がインビトロのリンパ球の増殖を強力に阻害することは広く報告されてきたので、それ自体興味深いことである。明らかな矛盾（apparent discrepancy）は、従来の実験は精製されたリンパ球で行われ、マイトジェン刺激リンパ球培養物（クローニングにより応答を制限していない）を多く使用しており、異なるメカニズムを伴うという事実から生じたものである。これは、コンカナバリンＡで刺激されたリンパ球の増殖はＥｔｘＢによって阻害されるという我々の考察と一致した。しかしながら、ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかで刺激された初回抗原刺激を受けたリンパ節細胞の培養物における細胞集団の分析によって、Ｂ細胞さらにはＣＤ４やＣＤ８を有するＴ細胞に関する重要な差異が明らかになった。
Ｂ細胞は、ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかの存在下で４日間培養した後、検出された。しかしながら、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と比較すると、ＥｔｘＢによる培養物中に存在するＢ細胞の相対的な割合は約１００％増加した。このような増加は、非常に高い割合のＢ細胞でのＣＤ２５の発現と関連があった。示された実験において、応答するリンパ球はインビボでＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で初回抗原刺激を受けた。ＥｔｘＢで免疫されたマウス由来の細胞での同様の実験でも、同様の結果が明らかになった。したがって、レセプター結合に関連するインビボ効果があるにかかわらず、ＥｔｘＢの存在下での培養物は、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で刺激されたものと比べてより大きな割合のＢ細胞を含んでいた。結果は検出されたサイトカインのプロフィールにおける主要なシフトを示唆しないので、これらのＢ細胞に関する効果はまた、少なくとも部分的には、インビトロでの、Ｔ細胞による調節に依存しないと考えられる。したがって、インビトロでは、ＥｔｘＢによるレセプター結合はＢ細胞への直接的な効果と関連があり、これにより、この集団が比例して拡大し、さらに活性化されると考えられる。また、ＣｔｘＢが抗原刺激を受けたことのないＢ細胞でのＭＨＣクラスＩＩの発現を向上させることが示され、このような性質はＧＭ−１結合変異型ＣｔｘＢ（Ｇ３３Ｅ）では示されなかった（フランシス  エムエル（Francis, M.L.）、リアン  ジェー（Ryan, J.）、ジョブリング  エムジー（Jobling, M.G.）、ホルメス  アールケー（Holmes, R.K.）、モス  ジェー（Moss, J.）及びモンド  ジェージェー（Mond, J.J.）（１９９２年）、ジェー  イムノル（J. Immunol.）、１４８、頁１９９９〜２００５）ことも注目すべき点である。これらの実験における結果は、抗原で初回刺激したＢ細胞におけるＥｔｘＢによる直接的な分裂促進効果の存在を示唆し、さらに、このような効果はレセプター結合によって仲介されることが示される。
培養物中のＢ細胞へのＥｔｘＢの効果に加えて、フローサイトメトリー分析から、このトキソイドは検出可能なＣＤ８+細胞を完全に逓減させたことが示される。繰り返すが、この効果は、このＴ細胞集団はＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を含む培養物中では逓減されなかったので、レセプター結合に依存することが示された。さらに、ＥｔｘＢを含む培養物におけるＣＤ８+細胞の完全な逓減が、野生型のＥｔｘＢで免疫したマウスから、観察された。このような効果が仲介されるメカニズムとしては以下の３メカニズムが考えられる。１）ラットのＭＬＮ細胞上のＧＭ−１へのＣｔｘまたはＣｔｘＢの結合がパッチ及びキャップ形成を誘導することは既知である（クレイグ  エスダブリュー（Craig, S.W.）及びクァトレカサス  ピー（Cuatrecasas P.）、（１９７５年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７２巻、頁３８４４〜３８４８）。このプロセスにおいて、ＥｔｘＢ−ＧＭ−１複合体及びＣＤ８等の他の分子が内在化する可能性がある。このようなプロセスはマーカーとしてＣＤ８を用いたこれらの細胞のフローサイトメトリーによる検出を阻害し、これにより、表面のＴＣＲ複合体が関連した欠失によりこれらの細胞が死亡する。後者は培養物におけるＣＤ８+Ｔ細胞の不存在を説明するものであるが、他では、ＣｔｘＢを使用した際にヒトのジャーカットＴ細胞系（Jarkat T cell line）の表面由来のＴＣＲ複合体は欠失しないことが示された（イムボデン  ジェービー（Imboden, J.B.）、ショバック  ディーエム（Shoback, D.M.）、パティソン  ジー（Pattison, G.）及びストボ  ジェーディー（Stobo, J.D.）（１９８６年）、プロック  ナショル  アカデ  サイ  ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８３巻、頁５６７３〜５６７７）。キャッピングの結果としての効果が存在しないことは、ＣＤ３及びＣＤ４マーカーは影響を及ぼされないという知見によって支持される。２）別のメカニズムとしては、培養物中のサイトカインによって奏される効果に関するものである。本研究によると、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの双方が検出された。しかしながら、これらの結果は、このようなＣＤ８+Ｔ細胞の劇的な効果を説明するサイトカインプロフィールにおける主要なシフトを示唆しない。３）ＣＤ８+Ｔ細胞の不存在は、アポプトシスの積極的な誘導（active induction）によるものである。アポプトシスによるリンパ球の死亡は、上記したキャッピングを伴う、または細胞内の情報伝達に関する効果によってキャッピングの不存在に介在される。活性化によって誘導される計画された死亡はＣａ2+に依存し、ホスファターゼ及びキナーゼを伴う。リンパ球へのＣｔｘＢの結合は、プロテインキナーゼＣ依存性増殖を阻害することが示され、さらに細胞内Ｃａ2+の顕著な増加を誘導したが、これらの事象はＣＡＭＰレベルの増加には関係がなかった。ＥｔｘＢがＣＤ４+Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８+Ｔ細胞を逓減できることは、リンパ球のこれらのサブセットの表面上のＧＭ−１を架橋することから生じる、ＣＤ４／ＣＤ８−ＴＣＲ複合体と関連するシグナルの特異な効果によるものである。これは、ＣｔｘＢについて報告されるような膜上のトキソイドの特異な結合のあるいはＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞における特異な情報伝達メカニ���ムの結果であると考えられる。
検出可能なＣＤ８+Ｔ細胞が完全に存在しないと、ＥｘｔＢは、レセプター結合変異型と比較した場合に、活性化されるＣＤ４+Ｔ細胞の割合を増加させた。Ｃｔｘに対する応答におけるＣＤ４+Ｔ細胞の必須要件はインビボで示された。しかしながら、このＴ細胞のサブセットの活性化が促進される理由は不明である。ＣｔｘＢがＤＮＡ合成および静止状態の非形質転換マウスの３Ｔ３細胞の細胞分裂を促進することが示されたことは注目に値する。ＣＤ４+Ｔ細胞に関する選択的な分裂促進効果もまた、ＥｘｔＢがＧＭ−１において結合する同様の成分である、Ｇａｌβ−１−３−３ＧａｌＮＡｃに結合する植物レクチンの存在下で発見された。ＥｘｔＢがＣＤ４+Ｔ細胞へのＧＭ−１結合が依存する直接的な効果を仲介し、これにより活性化が起こるという可能性を排除することはできない。しかしながら、ＥｘｔＢを含む培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の促進される活性化は上記したようなＢ細胞やＣＤ８+Ｔ細胞集団への変化の結果であるという可能性もある。Ｂ細胞の活性化はＣＤ４+Ｔ細胞に関する抗原提示細胞としての応答性の促進と関連することが知られている。さらに、ＣＤ８+Ｔ細胞は、インビボ及びインビトロでの免疫反応性における調節の役割と広範に関連する。Ｔ細胞増殖培養物からのこれらの除去は、ＣＤ４+Ｔ細胞分裂の長期化及びレベルの向上と関連があった。
これらを合わせて考慮すると、本研究で示されるように、インビボでのＥｘｔＢの潜在免疫原性は、ＧＭ−１に結合した後に生育を調節する効果によって発揮されるＢ細胞の活性化の促進能の結果として生じることが示唆できる。ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化およびＥｘｔＢのインビトロでの培養物中のＩＬ−２の産生の向上能は、Ｂ細胞クローンをさらに拡大するために必要なシグナルを形成する。本研究におけるＥｘｔＢによるＣＤ８+Ｔ細胞の逓減はまた、特に、上記細胞のサブセットが免疫反応の抑制に及び経口耐性にかかわりがあるという点で、全身性のまたは経口によるデリバリー後のインビボの別の免疫強化メカニズムを提供するものである。この点に関しては、Ｃｔｘ及びＥｔｘは双方とも、一緒に供給される（cofed）可溶性タンパク質に対する経口耐性を排除することが示され、他の研究では、上記メカニズムを説明するために腸におけるまたはパイエル板のドームにおける上皮内の（intra-epithelial）リンパ球に関するＣｔｘ及びＣｔｘＢの逓減効果が行われた。インビトロにおけるＣＤ８+Ｔ細胞に関するＣｔｘＢの阻害効果は、移植片対宿主反応を阻害することをも示した。
結論としては、インビボでの抗体反応に関する、およびインビトロでのリンパ球集団に関するＥｘｔＢによる強力な免疫修飾効果の存在が示された。さらに、これらの効果はレセプター結合によって仲介されることが示された。我々の知見はまた、Ｅｘｔ及びＣｔｘが強力なアジュバントとしておよび他の抗原に対する強力なタンパク質キャリアーとして作用することができるという理解にも適合するものであり、このような性質はこれらのトキソイドのリンパ系細胞の表面上のガイグリオシドレセプターへの結合能によるものであることが示唆される。
実施例２
この実施例は、ＣＤ８細胞に関する効果が抗原認識に関わりなく、アポプトシスによって仲介されることを示す。
ＥｔｘＢとＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の組換調製物は、実施例１と同様にして調製された。両タンパク質は、ＧＭ−１への結合、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のパネルへの結合、および各種のその他の物理的−化学的な性状への結合で十分に特徴づけられる。オボアルブミン（ＯＶＡ）はシグマ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）は、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ  マウス［ＥｔｘＢに対する高応答動物（Nashar, T.0. and Hirst, T.R. 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombin ant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin（rEtxB）and cholera toxin（rCtxB）. Vaccine 13;803）］から単離した。マウスに、不完全フロイントアジュバント（シグマ（Sigma））に乳化させた２００μｇのＯＶＡ（シグマ（Sigma））を腹腔内注射した。ＭＬＮを注射から１０日後に除き、ＨＢＳＳ（フロー（Flow）、イルバイン（Irvine）、英国）中にステンレス鋼メッシュを通してミンスした（mince）。回収した細胞をＨＢＳＳ中で遠心（５００×ｇ、１０分、４℃）によって洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）の新鮮な自己由来マウス血清を加えた、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（フロー（Flow））、１００ＩＵ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノールを含む改変イーグル培地（フロー（Flow））（完全培地）中に再懸濁した。培養物は、２４穴のプレートの２ｍｌ容中に（ヌンク（Nunc）、ロスカイド（Roskide）、デンマーク）の８ｍｌ容中に２×１０6生存細胞／ｍｌを含み、単独でまたは４０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）とともに、１００μｇ／ｍｌのＯＶＡ（完全培地中で高度に透析された）の存在下において確立された。培養物は、３７℃、５％ＣＯ2及び９５％空気で５日間インキュベートした。所定の時間で、０．１ｍｌのサンプルを培養物から除去し、９６穴のＵ−底プレート（ヌンク（Nunc））に移し、６時間、１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジン（アマシャム（Amersham）、英国）でパルスした（pulse）後、集め（マック  ＩＩＩ  ハーベスティング  ９６  トムテック（Mach III harvesting 96 Tomtec）、オレンジ，コン（Orange, Conn.）、アメリカ）、標準的な液体シンチレーション１４５０マイクロβプラス（liquid scintillation 1450 Micro β plus）、エルケービー−ウォラック（LKB-Wallac）、ターク（Turku）、フィンランドによってカウントした。Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｅｒｅｎｂｏｄｅｇｅｍ−Ａａｌｓｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）用に、細胞を、下記のラット抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）：ＦＩＴＣで標識した抗−ＣＤ４（ＲＮＲＭ４−５）またはＦＩＴＣ−抗−ＣＤ８α（５３−６．７）で、およびビオチンで標識した抗ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）（７Ｄ４）で、次にストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色した。さらに、ビオチンで標識した抗体では，ＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを用いた。回収した細胞のＦＡＣＳ分析は、［3Ｈ］チミジンの取り込みによって測定したところ、増殖のピーク日（４日）で実施した。
アポプトシス分析用に、新鮮なＭＬＮ細胞（ＭＬＮＣ）と脾臓のＴ細胞（ＳＰＬＴＣ）を８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した。フローサイコメトリー分析で測定したところ、＞９０％ＣＤ３+Ｔ細胞を含むＭＬＮＣは、付着細胞を除去するために３７℃、５％ＣＯ2及び９５％空気で１０％のＦＣＳを含有する完全培地中においてペトリ皿（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で２時間インキュベートした。非接着性フラクションをその後ピペットで除去し、ペレット化し、使用前にＨＢＳＳ中で二度洗浄した。ＳＰＬＴＣを、（Ｗｉｇｚｅｌｌ、Ｈ．１９７６．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｌａｓｓ  ｏｒ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｃｏｌｕｍｎｓ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：  （ｓｕｐｐｌ．５）２３．）に記載されるのと同様にして、正常なマウス血清で、その後ウサギ抗マウスγ−グロブリンで被覆したガラスビーズを用いた負の選択によって精製した。Ｔ細胞の選択集団は、フローサイコメトリー分析によると、＞９０％ＣＤ３+であった。
ＣＤ４+とＣＤ８+Ｔ細胞は、次のように分離した：非接着性ＭＬＮＣを、製造業者の指示に従って、ラットフィコエリトリン−抗−マウスＣＤ４（４７０８−０２）またはＦＩＴＣ−抗−マウスＣＤ８α（５３−６．７）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で標識化し、その後、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）2（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で接合したＭＡＣＳコロイダルスーパーパラマグネット微小ビーズでインキュベートした。これらは、フローサイコメトリー分析によって測定されるのであるが、ＣＤ４とＣＤ８+Ｔ細胞の正（＞９９％純粋）および負（＞９０％純粋）の選択された集団の双方を単離するために最小−ＭＡＣＳカラム（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladabach、Germany）に被覆した。
二つの方法は、アポプトシスの定量に用いられる：ｉ）核形態学を調査するためにアクリジンオレンジを用いるＤＮＡを染色、およびｉｉ）ＤＮＡ染色に続くヨウ化プロピジウムおよび抗−ＣＤ４または抗−ＣＤ８抗体のいずれかを用いる細胞サイクル分析。２×１０6／ｍｌのＭＬＮＣ、ＳＰＬＴＣおよび分画されたＭＬＮＣの培養物は、８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかの不存在または存在下に、１０％のＦＣＳを含有する完全な培地で確立し、４〜１８時間調べた。インキュベーション後、細胞をペレット化し、ＨＢＳＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌのアクリジンオレンジ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
胸腺細胞は１０-7Ｍのデキサメタゾンの不存在または存在下に単離、処理され、アポプトシスを受ける細胞の陽性対照として用いられた。リンパ球中の核形態学変化は、従来のまたは共集点蛍光顕微鏡検査法（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ４Ｄ）で調べた。細胞サイクル中のサブ−Ｇ0/Ｇ1段階においてＣＤ４+とＣＤ８+ＳＰＬＴＣの割合は、ヨウ化プロピジウムの染色後、ＤＮＡ含量のフローサイコメトリー分析によって決定した（Ｏ｀Ｃｏｎｎｏｒ、Ｐ．Ｍ．，Ｊａｃｋｍａｎ、Ｊ．，Ｊｏｎｄｌｅ、Ｄ．、Ｂｈａｔｉａ、Ｋ．、Ｍａｇｒａｔｈ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｏｈｎ、Ｋ．Ｗ．１９９３．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐ５３  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．５３：４７７６．）。単独でまたは４０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢもしくはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を用いてインキュベートしたＳＰＬＴＣの１８時間培養物から単離された細胞は、ＦＩＴＣラット抗−ＣＤ４またはＦＩＴＣ−抗−ＣＤ８αで染色された。染色細胞は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む冷ＨＢＳＳ中で１×１０6に調製し、滴下した冷エタノールで固定した。その後、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムと４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（ＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ）を加え、細胞を室温で１時間インキュベートした。ＣＤ４とＣＤ８+Ｔ細胞中のヨウ化プロピジウムで染色したＤＮＡ染色の相対強度は、各ｍＡＢでともに染色された細胞をゲートすることによって決定した。
実施例１において、ＣＤ８+Ｔ細胞がＥｔｘＢに応答してリンパ節細胞増殖の培養物から完全に除去されるという観察は、ＥｔｘＢがこのＴ細胞サブセットにポリクローン性効果を及ぼすことを示唆した。かかる効果がＥｔｘＢ応答細胞の活性化に依存するかどうかを調べるために、培養物はＯＶＡ−初回抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）マウスから確立され、ＯＶＡ単独またはＯＶＡとＥｔｘＢもしくは突然変異体ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）で刺激を受けた。増殖の類似ピークレベル（各ケースにおいて培養の４日）は、ＯＶＡ単独、ＯＶＡとＥｔｘＢまたはＯＶＡとＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）（それぞれ、９７３４±３４７、１２、０３１±１３５および９３０５±２９０ｃ．ｐ．ｍ．）の存在下に達成された。しかしながら、４日（図６）後これらの培養物中のＴ細胞サブセットの分布に劇的な相違があった。培養物の全てには、類似の割合で活性化マーカーＣＤ２５を共発現するＣＤ４+Ｔ細胞が含まれていた。しかしながら、ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＯＶＡとＥｔｘＢでインキュベートした培養物中では検出できなかったが、ＯＶＡとＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）またはＯＶＡ単独の培養物に明らかに存在した（ＣＤ２５発現によって評価されたが活性化されなかった）。これは、ＥｔｘＢがＥｔｘＢ以外の抗原に応答するＣＤ８+Ｔ細胞の除去を誘導することを確立する。そのうえ、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）に対する応答がない場合にトキソイドレセプタ相互作用の後に除去の引き金となることを示す。野生型ＥｔｘＢが存在すると、以前にＥｔｘＢ応答培養物（実施例１）に対して見出されたものであるが、多くがＣＤ２５+（図示せず）であるＢ細胞の割合を顕著に増加させることに注目すべきであった。したがって、ＥｔｘＢによるレセプター占有は、抗原特異性にかかわりなくリンパ球に関する重大な免疫調節薬上の効果を及ぼすと結論づけられる。
ＥｔｘＢの存在下で培養されるときに、ＣＤ８+Ｔ細胞がアポプトシスを受ける可能性は調べられた。初回抗原刺激を受けてないマウスからのＭＬＮＣまたは精製ＳＰＬＴＣは、ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）とともにインキュベートされ、アクリジンオレンジを用いる染色後、細胞核形態学の変化は４〜１８時間（表３と図７）にわたって記録された。細胞の形態学上の変化は、核の小裂片の外観に生ずるクロマチン濃縮の存在によって特徴づけられる（図７）。原形質膜の小水泡や細胞消滅体の存在などのその他の細胞の特徴は同様に観察される。形態学上の変化はＥｔｘＢで処理された各細胞の調製のおよそ三分の一で生じ、一方、より少ない発生率はＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）とともに、または外因性抗原（表３）なしに培養した細胞で観察された。ＣＤ８+Ｔ細胞がＭＬＮＣおよびＳＰＬＴＣ製剤の〜３５−４０％とカウントされたので、これらの細胞の除去は観察されたアポプトシスとカウントできたであろう。これがその場合であるかどうかを確立するために、精製ＣＤ８とＣＤ４+Ｔ細胞の母集団は、抗原の存在下で１８時間培養された（表３）。形態学上の変化の類似の割合は、ＥｔｘＢ，ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）または抗原なしで処理されたＣＤ４+Ｔ細胞（＞９０％ＣＤ４−ベアリング細胞）の負に選択された母集団において誘導され、ＥｔｘＢのレセプターへの結合はこのＴ細胞サブセットにおいてアポプトシスの引き金とならないことが示された。これに対して、負に選択されたＣＤ８+Ｔ細胞（＞９０％純粋）の＞７０％は、野生型ＥｔｘＢで培養されたときに形態学上の変化が示された：その一方、抗原なしまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）とともにインキュベートする場合には、それぞれＴ細胞集団の１１〜１９％だけを変化させた。さらに、精製母集団で（それぞれの場合において〜１０％）汚染細胞が少ないことは観察された効果をカウントできなかった、というのは、＞９９％のＣＤ８またはＣＤ４+Ｔ細胞（陽性選択によって単離された）を含むより高度に精製された母集団は同様な方法でＥｔｘＢに応答するからである（抗原なしやＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）処理の双方の場合の７％と比較して、ＥｔｘＢの存在下にアポプトチックは６０％であった）（表３）。アポプトシスは、それぞれ、デキサメタゾンの不存在または存在下において１８時間インキュベーション後、４０％と８９％の胸腺細胞で検出された。
我々の培養物で観察された形態学上の変化がアポプトシスと一致することを示すために、ＥｔｘＢで１８時間処理されたＳＰＬＴＣの培養物中のおよそ二倍体ＤＮＡの外観が評価された。細胞はヨウ化プロピジウムと抗−ＣＤ８または抗−ＣＤ４抗体で共染色した後フローサイコメトリー分析にかけた（図８）。ＥｔｘＢでインキュベートされた培養物からのＣＤ８+Ｔ細胞の約４８％は、ヨウ化プロピジウム染色の二倍体Ｇ0／Ｇ1ピークを下回り、アポプトシスを受けることを示した（Ｏ｀Ｃｏｎｎｏｒ、Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ、ｓｕｐｒａ）。ＥｔｘＢを備える培養物中のＣＤ４を発現する少量の細胞は、ＤＮＡのサブ−Ｇ0／Ｇ1レベルを示した（〜１１％；これはかかる高割合のＣＤ８+Ｔ細胞の死亡から生ずるであろう）。これに対して、抗原なしでまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の存在下で培養されたＣＤ４またはＣＤ８+Ｔ細胞の主要部は、＜５％アポプトシスを示しながら細胞サイクルのＧ0／Ｇ1相であった。我々は、観察された核形態の変化、ＤＮＡのサブＧ0／Ｇ1の存在が、ＥｔｘＢで処理されたＣＤ８+Ｔ細胞の実質的な割合において、コレラ様エンテロトキシドによってトリガーされた選択的なアポプトシスを示すと結論づけた。レセプター結合突然変異体、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）の類似の効果を誘導することに関する不首尾は、ＣＤ８+Ｔ細胞アポプトシスの誘導がＧＭ−１ガングリオシドに結合する能力にリンクされることを示す。
実施例３
８匹のオスのＤＢＡ／１マウスの各グループは、変化していないもの（グループＡ）かまたは側腹部中に皮内注射により０日目に完全フロイントアジュバント中のウシのコラーゲン１００μｇがそれぞれ注射された。コラーゲンが注射されたマウスは、無防備にしておく（グループＢ；陽性対照）かまたは、０日目に不完全フロインドアジュバント中のＥｔｘＢ１００μｇ（グループＣ）、１４日目に不完全フロインドアジュバント中のＥｔｘＢ１００μｇ（グループＤ）、または０日目に不完全フロインドアジュバント中のＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）１００μｇ（グループＥ）；のコラーゲン対抗量として隣接した部位に皮内投与により疾病発生を予防する試みがなされた。グループＡの動物以外の、全ての動物は、２１日目に皮内の不完全フロインドアジュバントにコラーゲンの増加量を受け入れ、疾病の激しさを、後脚の足首の厚さの測定（実験Ａ）または腫張による各後脚の指の数（０＝正常、３＝最大腫張である０〜３階段標準；実験Ｂ）によって４５日目に評価した。
得られた結果を、図９ａおよび９ｂに示す。これらの図は、ＥｔｘＢが、コラーゲン誘発関節炎の発生からマウスを劇的に保護するが、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）はそうでない事を示す。
実施例４ａ
（正常なヒト給血者から得られた）２つの別のヒトバフィーコート試料を、単核細胞源として用いた。細胞を、フィコール-パック（Ficoll-paque）を用いて単離し、抗原の不存在下で、または表示したように８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢかまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と共に、培養する前に広範囲にわたって洗浄した。培養するより前に、該細胞集団は、両試料それぞれに、２４％ＣＤ８+、２７％ＣＤ４+と、２７％ＣＤ８+、２２．９％ＣＤ４+とからなっていた。１８時間培養した後、該消滅する細胞（apoptotic cells）の出現を、（実施例２で詳述したように）アクリジンオレンジで染色した細胞の試料で評価した。得られた結果を、図１０に示す。図１０は、ＥｔｘＢが正常なヒト末梢血単核細胞の集団中にアポプトシスを誘発するが、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）はそうでない事を示す。
実施例４ｂ
マウスのＴ細胞株（T cell line）、ＣＴＬＬ−２を、密集まで培養し、その後、該細胞を、抗原の不存在下で、または表示したように８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢかまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と共に、１×１０6個の細胞／ｍｌで再播種する前に洗浄した。１８時間後、試料を取出し、アポプトシスの徴候を示す細胞の百分率を（実施例２で詳述したように）アクリジンオレンジを用いて評価した。得られた結果を、図１１に示す。図１１は、ＧＭ−１の架橋結合がマウスのＣＴＬＬ細胞に対する割合でアポプトシスを生ずることを示す。
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マウスに、完全なフロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）３０μｇと共に腹腔内に注射した。腸間膜リンパ節を、それから１０日後に単離した。細胞を単離し、ＥｔｘＢ、ＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）または、９５℃で加熱することにより産出された、分解された単一形態のそれらのタンパク質（★）の存在下で４日間培養した。増殖を、４日目の最後の６時間、１μＣｉの（3Ｈ）ｄＴｈｄの添加により終結させた。データは、３連のウェルの平均ｃｐｍ及びＳＥＭで表わす。非免疫マウスから単利された細胞は、＜１５００ｃｐｍ（投与量１６０μｇ／ｍｌ）であった。
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マウスに、ＣＦＡ中のＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）を注射し、腸間膜リンパ節細胞を、それから１０日後に単離した。その後、細胞を、ＥｔｘＢかまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と共に試験管内（in vitro）で培養し、試料の上澄を、細胞増殖の５日目にサイトカイン含量について分析した。
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抗原の不存在下で、または８０μｇ／ｍｌのＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）と共に４または１８時間培養後、分画されたＣＤ４およびＣＤ８+Ｔ細胞中の核の形態学的変化を、アクリジンオレンジでの染色に続いて蛍光顕微鏡により検査した。全ＭＬＮは、付着細胞で除去した。ＳＰＬＴＣは、マウスγ−グロブリンおよび続発性抗体としてウサギの抗マウスで被覆されたガラスビーズカラムに陰性選択によって単離した。分割されたＳＰＬＴＣは、ラットフィコエリトリン抗マウスＣＤ４またはＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８αでの標識化に伴って得られ、その後、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）2で結合されたＭＡＣＳコロイド超常磁性マイクロビーズと共に培養した。これらは、ＣＤ４およびＣＤ８+Ｔ細胞の陽性（＞９９％純粋）および陰性（＞９０％純粋）の両方に選択された分画を得るために、微小ＭＡＣＳカラムを用いて単離した。核の形態学的変化を、図７の説明に記載したように、治療毎に２００個の細胞のランダムな試料中で４〜１８時間検査した。消滅した細胞の最大パーセントは、１８時間後に出現した。表示された括弧内のデータは、もう一つの分離実験の結果を表す。ＭＬＮ及びＳＰＬＴＣに関するデータは、４つの実験の合計を表わしている。aパーセンテージは消滅した細胞である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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