(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む有機溶剤含有溶液に、好熱性古細菌から調製したもの、または、好熱性古細菌由来のＤＮＡから発現されたものであるペプチジルプロリル−シス，トランス−イソメラーゼを含有させることにより、前記溶液中のタンパク質の有機溶剤による不活性化を抑制することを特徴とするタンパク質の安定化方法。
【請求項２】
好熱性古細菌がメタノコッカス・サーモリソトロフィカス(Methanococcus thermolithotrophicus)であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機溶剤含有溶液中に含まれるタンパク質の安定化方法に関する。更に詳しくは、有機溶剤含有溶液中に含まれるタンパク質が、上記有機溶剤と接触することによって不活性化することを防止し、活性を維持させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は複数のアミノ酸がペプチド結合により連なったポリペプチドである。タンパク質がその特性を発現するためには、分子内または分子間の相互作用により形成される特有の高次構造（立体構造）が重要である。タンパク質分子は立体構造において、通常、チロシンやトリプトファンといった疎水性アミノ酸残基を分子内部に取り込み、疎水性領域を形成する。逆に、タンパク質分子の表面は親水性の高いアミノ酸が占めており、水分子となじみやすくなることが多い。
【０００３】
ところで、タンパク質を含む溶液に有機溶剤のような非極性溶媒が存在すると、タンパク質の分子内部の疎水性領域が分子表面に露出し、結果としてタンパク質の凝集及び不活性化が起こる。このことから一般にタンパク質は水溶液中に存在させ、活性を発現させる必要があった。
【０００４】
このような問題に対して、有機溶剤中で生育する微生物が発見されて以来、耐有機溶剤性を有するタンパク質に関する研究が盛んになっている。耐有機溶剤性を有する有用タンパク質を得るためには、所望の生理活性を有し、且つ、耐有機溶剤性を有する微生物をスクリーニングし、目的のタンパク質を精製するか、またはそのタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌などに組み込み、発現させる手法がとられていた。しかしながら、このような耐有機溶剤性を有する微生物の種類は少なく、目的とする微生物をスクリーニングすることは多大な労力を要する。
【０００５】
近年、タンパク質の立体構造形成及び構造変化に関与する因子として分子シャペロンに関心が高まっている。分子シャペロンは熱ショックタンパク質の一群であり、細胞が温度変化など様々な環境ストレスにさらされた際に生産される。これらは原核生物、真核生物を問わず広く存在しており、特に大腸菌から生産される分子シャペロンとしてＧｒｏＥ（以下、シャペロニンともいう）が良く知られている。シャペロニンはタンパク質の種類を選ばず、非特異的にタンパク質の立体構造形成及び凝集抑制に関与することが明らかにされている。ＧｒｏＥを形成するＧｒｏＥＬは、７個のサブユニットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なった、合計１４サブユニットからなる特徴的な構造を有している。
【０００６】
このシャペロニンをタンパク質の安定化に応用する試みがいくつかなされている。例えば、特開平７−６７６４１号公報には、酵素含有溶液にシャペロニンタンパク質及びＡＴＰなどのヌクレオチドを含有せしめ、溶液中の酵素を安定化する方法が開示されている。また他の分子シャペロンを利用したタンパク質の安定化の例として、特開平５−２７９３８２号公報には、Ｈｓｐ９０タンパク質ファミリーの一つもしくはいくつかのメンバーを、タンパク質を含有する水溶液に添加することを特徴とする水溶液中におけるタンパク質の安定化方法が開示されている。
【０００７】
これらはいずれもシャペロニンが有するタンパク質の立体構造形成作用を利用したものであり、変性したタンパク質を認識し、タンパク質のポリペプチド鎖を本来の立体構造に巻き戻す（折り畳む）作用により、目的を達成するものである。
【０００８】
しかしながら、シャペロニンは一般的に熱などの環境ストレスに対して、タンパク質を安定化する方法は報告されているが、タンパク質の有機溶剤に対する不活性化を抑制するといった報告はない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題に鑑み、有機溶剤に対して不安定なタンパク質について、簡便に耐有機溶剤性を付与する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載のタンパク質の安定化方法は、タンパク質を含む有機溶剤含有溶液に、好熱性古細菌から調製したもの、または、好熱性古細菌由来のＤＮＡから発現されたものであるペプチジルプロリル−シス，トランス−イソメラーゼを含有させることにより、前記溶液中のタンパク質の有機溶剤による不活性化を抑制することを特徴とする。
【００１１】
請求項２記載のタンパク質の安定化方法は、請求項１記載のタンパク質の安定化方法において、好熱性古細菌がメタノコッカス・サーモリソトロフィカス(Methanococcus thermolithotrophicus)であることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、タンパク質折り畳み因子、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質（以下、分子シャペロンという）が有するポリペプチド鎖の折り畳み作用及びタンパク質の凝集抑制作用；ペプチジルプロリル−シス，トランス−イソメラーゼ（以下、ＰＰＩアーゼという）が有するペプチジルプロリン−シス，トランス異性化作用、ポリペプチド鎖の折り畳み作用及びタンパク質の凝集抑制作用を利用し、有機溶剤含有溶液中に含まれるタンパク質の有機溶剤による不活性化を抑制することを特徴とする。
【００１６】
本発明で用いられる分子シャペロンは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の一群が例示される。例えば、ＨＳＰ７０ファミリーとして、大腸菌のＤｎａＫ；酵母のＳｓａ１−４ｐ、Ｓｓｃ１ｐ、Ｋａｒ２ｐ、ＢｉＰ及びＧｒｐ７８；ほ乳類のｈｓｃ７０などがある。またＨＳＰ６０ファミリーとして大腸菌のＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳ；カビ類のＨＳＰ６０；植物のｒｕｂｉｓｃｏ；ほ乳類のＨＳＰ５８及びＨＳＰ１０などがある。その他、大腸菌のＳｅｃＢ、ほ乳類のＨＳＰ９０などが挙げられる。また、大腸菌の分子シャペロンとして研究されているＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及びＧｒｏＥの一群は近年注目されており、これらも用いられ得る。分子シャペロンを用いる場合、反応系にＡＴＰや、ＣＤＰ、ＵＴＰなどの高エネルギー核酸関連化合物を加えることが望ましい。
【００１７】
一方、本発明で用いられるＰＰＩアーゼとしては、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）（免疫抑制剤であるサイクロスポリンＡへの結合タンパク質）タイプ及びＦＫＢＰ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結合タンパク質）タイプのうち、いずれのＰＰＩアーゼも用いることができる。
【００１８】
上記ＰＰＩアーゼは、真核生物、真正細菌もしくは古細菌から調製したもの、または、上記いずれの生物種のＤＮＡ塩基配列から発現されたものでも用いることができる。上記古細菌の中でも、特に好熱性古細菌から調製したもの、または、好熱性古細菌由来のＤＮＡから発現されたものが好ましい。
【００１９】
上記真核生物由来のＰＰＩアーゼとしては特に限定されず、例えば、ブタ由来の１９ＫＰＰＩアーゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ産物、トマトやトウモロコシ等の高等植物由来のシクロフィリン、アカパンカビ由来のシクロフィリン、Ｎｃ−ＦＫＢＰ、酵母由来のシクロフィリン、ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が挙げられる。また、例えば、シグマ社から市販されているシクロフィリンタイプのＰＰＩアーゼ（子牛胸腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰＩアーゼ（ヒト由来）等が手軽に入手できる。
【００２０】
上記真正細菌由来のＰＰＩアーゼとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のＰＰＩアーゼ−α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる（タンパク質核酸酵素Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．１１（１９９１））。
【００２１】
上記好熱性古細菌は、温泉地帯や海底の熱水床といった高温な極限環境で生育する古細菌の総称であり、通常、５５℃以上の温度環境で生育する菌である。
【００２２】
上記好熱性古細菌としては特に限定されず、例えば、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、サルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、スルフロコッカス（Ｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、デサルフォロバス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｂｕｓ）属、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモディスカス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ）属、ピロディクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、スタフィロサーマス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アーカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ピロバクラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属等が挙げられる。好ましくは、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）である。
【００２３】
本発明で用いられるＰＰＩアーゼは、上記真核生物、上記真正細菌または上記古細菌から直接精製して得ることができるが、これらの生物のＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡ塩基配列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物に組み込んで調製することが、大量に生産できるので好ましい。具体的な手法としては、「新生物化学実験の手引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロトコール等の常法を応用することで充分である。
【００２４】
上記好熱性古細菌から得られるＰＰＩアーゼは、熱安定性に優れており、例えば、メタノコッカス・サーモリソトロフィカスから得られたＰＰＩアーゼは、９０℃及び１００℃といった高温条件下で放置しても失活しにくい（図１参照）。また、このＰＰＩアーゼは有機溶剤に対しても比較的安定であり、活性を維持することができる。これまで市販されているＰＰＩアーゼは、６５℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で用いることはできなかった。しかしながら、上記メタノコッカス・サーモリソトロフィカスから得られたＰＰＩアーゼは、３７〜６５℃といった中温だけでなく、８０〜９０℃といった高温条件下でも使用可能であるため、ＰＰＩアーゼ自身の失活を防ぐことができる。
【００２５】
従って、このメタノコッカス・サーモリソトロフィカス菌由来のＤＮＡから発現されたＰＰＩアーゼを本発明に使用することにより、通常タンパク質が変性してしまうような高温条件下においても、タンパク質の立体構造を維持し、有機溶剤に対して安定化することができる。また、この菌由来のＰＰＩアーゼは、他のＰＰＩアーゼが有するペプチジルプロリン−シス，トランス異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作用以外に、分子シャペロン様のタンパク質の不可逆的凝集抑制作用も併せ持つため、酵素をはじめとするタンパク質を安定化する効果が大きい。
【００２６】
これら分子シャペロン及びＰＰＩアーゼといったタンパク質折り畳み因子を、タンパク質を含む溶液中に共存させることにより、該タンパク質の立体構造が安定化されるため、溶液中に非極性有機溶剤などの有機溶剤が存在しても立体構造変化に起因するタンパク質の凝集を防止でき、タンパク質の活性を維持することができる。
【００２７】
溶液中に含まれるタンパク質は溶解状態である以外、不溶性担体に固定されたタンパク質に対しても安定化することが可能である。タンパク質の固定化方法としては担体結合法、架橋法、包括法によって固定化する方法など、いずれの方法で固定化されたタンパク質に対しても有効である。
【００２８】
上記不溶性担体としては、汎用されるアクリルアミドゲル、アルギン酸カルシウム、κ−カラギーナン、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリマー、セルロース誘導体などが挙げられるが、これらに限らず、不溶性担体にイオン結合、吸着作用、共有結合などいずれで固定化されたタンパク質に対しても安定化が可能である。その他、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの高分子材料、ガラス、金コロイド、カーボン粉末、フェライト、マグネタイトといった無機材料、その他赤血球といった不溶性担体に固定されたタンパク質に対しても有効である。
【００２９】
さらに、抗原・抗体を用いた免疫反応において使用される標識酵素などについても安定化が可能である。
【００３０】
一般に、変性・凝集したタンパク質を塩酸グアニジンや尿素などで可溶化し、リフォールディング（再生）する場合、ポリペプチド鎖中の構成アミノ酸であるプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合は自由に回転できず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。その結果、いったん変性・凝集したポリペプチド鎖はプロリンのシス−トランス異性化反応などが律速となり、自発的な再生が阻害される。
【００３１】
本発明で用られるＰＰＩアーゼは、上記プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合の回転を促進するため、高次構造の再生を促進し、タンパク質の不可逆的な不活性化を抑制することができる。さらに、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス菌由来のＤＮＡから発現されたＰＰＩアーゼは、分子シャペロン様のタンパク質折り畳み作用及びタンパク質凝集抑制作用を有するためより効果的である。
【００３２】
本発明においては分子シャペロンやプロテイン−ジスルフィド−イソメラーゼ（ＰＤＩ）などを添加するとさらに効果的である。ＰＤＩはタンパク質の折り畳み反応においてジスルフィド結合の形成を促進する酵素である。
【００３３】
本発明において、タンパク質を含む有機溶剤含有溶液に、タンパク質折り畳み因子を添加する際のタンパク質折り畳み因子の使用量は、該溶液中のタンパク質折り畳み因子の含有量が、該溶液中の目的タンパク質のモル濃度の０．１〜１０００倍モル濃度となるように使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明を用いることにより、非極性溶剤のような有機溶剤に対して不安定なタンパク質についても、タンパク質折り畳み因子を添加するだけで安定化することが可能となる。
【００３５】
本発明で用いられる有機溶剤は、水に溶解するもの、及び、水に溶解しない有機溶剤のいずれであってもかまわないが、タンパク質折り畳み因子を著しく阻害しない程度の極性であることが好ましい。本発明で用いられる有機溶剤含有溶液の一例としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、アセトニトリル等の水溶性溶媒と水との混合溶液；ヘキサン、シクロヘキサン、シクロオクタン、ベンゼン、酢酸エチル、トルエン、キシレンなどの非極性溶媒と、水とが混合された二相系の溶液が例示される。
【００３６】
本発明を応用することにより、酵素などのタンパク質の有機溶剤に対する失活を防止することが可能となる。例えば有機溶剤を含む反応相で、加水分解酵素や合成酵素による触媒反応を行うことにより、新規化合物の合成や合成反応を効率的に行うことが可能となる。もちろん加水分解酵素や合成酵素だけでなく、その他の有用タンパク質を耐有機溶剤化して利用することも可能となる。
【００３７】
【実施例】
以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
参考例１  ＰＰＩアーゼの調製
（発現プラスミドの構築及び大腸菌へのトランスフォーメーション）
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）のＰＰＩアーゼをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５６２２として寄託されているプラスミドｐＵＦＫＣ１を鋳型とし、配列番号１のフォワードプライマー及び配列番号２のリバースプライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅させた。上記配列番号１に示した配列の５′末端から３〜８番目の塩基配列は、ＮｃｏＩの認識部位である。また、上記配列番号２に示した配列の５′末端から３〜８番目の塩基配列は、ＢａｍＨＩの認識部位である。
【００３９】
上記プライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅、回収された断片を、ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩで消化後、同様の制限酵素処理が施された発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラティジェン社製）にライゲーションした。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティジェン社製）にトランスフォーメーションし、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１リットル（ｐＨ７．０））にて培養後、コロニーをピックアップし、グリセロールストックとした。
【００４０】
（組み換え大腸菌からのＰＰＩアーゼ調製）
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１リットル（ｐＨ７．０））２００ｍｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ３）株（組み換え大腸菌）一白耳を接種し、３７℃で１６時間予備培養した。この培養液を上記ＬＢ培地６リットルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行った。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、−３０℃にて凍結保存した。
【００４１】
次に、回収した組み換え大腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を採取し、３０分間、８０℃の水浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集させ、遠心分離にて除去した。更に、上清に硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を８０％飽和となるように添加し塩析を行った。３０分後に遠心分離にて採取した沈殿部を１．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。この溶液を、Ａ液：１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍφ×７．５ｃｍ）（東ソー社製）に供し、５分後からＢ液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）の６０分間直線グラジエントにてＰＰＩアーゼを溶出した。ＰＰＩアーゼは硫酸アンモニウム０．５Ｍ濃度付近で溶出される画分に現れた。本画分を透析により脱塩し、凍結乾燥後以下の実施例及び比較例に使用した。
【００４２】
（β−ガラクトシダーゼに対する有機溶剤変性抑制作用）
（実施例１）
エタノール／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）＝７／３の混液５００μｌに５７．５μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液１０μｌを添加し、混合後、有用タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼ（７．７μＭ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）１０μｌを添加し、室温にて１５分間インキュベートした（β−ガラクトシダーゼの有機溶剤変性）。
【００４３】
０．７９ｍｇ／ｍｌ濃度の２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（２−ＮＰＧ）／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに上記試料１０μｌを添加し、３７℃、５分間にて残存するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性測定は、同酵素によって２−ＮＰＧから遊離するニトロフェノールの波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。結果を表１に示した。
【００４４】
実施例１においてエタノール／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）＝７／３の混液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いたこと以外は同様の操作を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。活性は０．７４４６であった。これをβ−ガラクトシダーゼ活性の残存率が１００％とし、コントロールとした。
【００４５】
（実施例２）
５７．５μＭ濃度のＰＰＩアーゼの代わりに２８．８μＭ濃度のＰＰＩアーゼを用いたこと以外は実施例１と同様に操作した。結果を表１に示した。
【００４６】
（実施例３）
４ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ塩化カリウム及び２ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）とエタノールの混液（３／７）の混液５００μｌに１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＧｒｏＥ水溶液（Ｓｉｇｍａ社）１０μｌを加え、混合後、有用タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼ（７．７μＭ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）１０μｌを添加し、室温にて１５分間インキュベートした（β−ガラクトシダーゼの有機溶剤変性）。
【００４７】
０．７９ｍｇ／ｍｌ濃度の２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（２−ＮＰＧ）／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに上記試料１０μｌを添加し、３７℃、５分間にて残存するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性測定は、実施例１と同様に、同酵素によって２−ＮＰＧから遊離するニトロフェノールの波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。結果を表１に示した。
【００４８】
（比較例１）
５７．５μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を添加したこと以外は実施例１と同様に操作した。結果を表１に示した。
【００４９】
（比較例２）
５７．５μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液の代わりに、０．１重量％濃度で牛血清アルブミンを含む、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を添加したこと以外は実施例１と同様に操作した。結果を表１に示した。
【００５０】
【表１】
0003892954.tif 000002
【００５１】
実施例１〜３及び比較例１、２より得られた結果（活性残存率）を図２に示した。有用タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼを７０％エタノールを含む緩衝液に１５分間保存すると、酵素の不活性化が起こり、残存するβ−ガラクトシダーゼも３７．９％に低下した（比較例１）。また、牛血清アルブミンを用いても、β−ガラクトシダーゼ活性の低下を抑制することはできなかった（比較例２）。一方、ＰＰＩアーゼを共存させると実施例１では残存率は９３．９％であり、実施例２では７０．１％であった。いずれの場合もＰＰＩアーゼを添加しない場合と比較して、β−ガラクトシダーゼの失活を抑制することができた。また、ＧｒｏＥを共存させた場合でも残存率は５９．６％であり、タンパク質を安定化する効果が見られた（実施例３）。
【００５２】
（ペルオキシダーゼに対する有機溶剤変性抑制作用）
（実施例４）
エタノール／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）＝９／１の混液４５０μｌに１３０μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液２５μｌを加え、混合後、有用タンパク質であるペルオキシダーゼ（１０μｇ／ｍｌ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）２５μｌを添加し、室温にて６０分間インキュベートした（ペルオキシダーゼの有機溶剤変性）。
【００５３】
１．１ｍｇ／ｍｌ濃度の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン及び０．３４ｍｇ／ｍｌ過酸化水素液の１：４混合液２．５ｍｌをペルオキシダーゼの基質とし、上記で有機溶剤変性処理したペルオキシダーゼ混液２５μｌを添加し、３７℃にて反応を行った。反応開始２分後に４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、ペルオキシダーゼの活性とした。結果を表２に示した。
【００５４】
実施例４においてエタノール／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）＝９／１の混液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いたこと以外は同様の操作を行い、ペルオキシダーゼ活性を測定した。活性は０．３２３７であった。これをペルオキシダーゼ活性の残存率が１００％とし、コントロールとした。
【００５５】
（実施例５）
１３０μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液の代わりに６５μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液を用いたこと以外は実施例４と同様に操作した。結果を表２に示した。
【００５６】
（比較例３）
１３０μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液の代わりに２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いたこと以外は実施例４と同様に操作した。結果を表２に示した。
【００５７】
（比較例４）
１３０μＭ濃度のＰＰＩアーゼ水溶液の代わりに１３０μＭ濃度の牛血清アルブミン（ナカライテスク社）水溶液を用いたこと以外は実施例４と同様に操作した。結果を表２に示した。
【００５８】
【表２】
0003892954.tif 000003
【００５９】
実施例４、５及び比較例３、４より得られた結果（活性残存率）を図３に示した。有用タンパク質であるペルオキシダーゼを９０％エタノールを含む緩衝液に６０分間保存すると、酵素の不活性化が起こり、残存するペルオキシダーゼも５６．８％に低下した（比較例３）。また、牛血清アルブミンを用いても、ペルオキシダーゼ活性は５８．７％であり、活性の低下を抑制することはできなかった（比較例４）。一方、ＰＰＩアーゼを共存させると実施例４では残存率は８９．８％であり、実施例５では８１．１％であった。いずれの場合もＰＰＩアーゼを添加しない場合と比較して、ペルオキシダーゼの失活を抑制することができた。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のタンパク質の安定化方法の構成は上記の通りであり、不活性化しやすいタンパク質とともにタンパク質折り畳み因子を共存させることにより、有機溶剤による変性に対して不活性化し易いタンパク質を安定化することが可能となった。本発明を用いることにより、例えば酵素を利用した脱水縮合反応を効率的に行うことができる。さらに、本来有機溶剤によって不安定な酵素についても有機溶剤を含む相で反応を行うことができるので、加水分解酵素や合成酵素を用いることにより新規化合物の合成反応を効率的に行うことが期待できる。本発明は特定の酵素に限らず、汎用性が高いため、酵素を用いた工業分野、遺伝子工学分野及び酵素免疫測定法などの免疫測定分野など広い分野で有用である。
【００６１】
【配列表】
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【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＰＩアーゼと加熱時間との関係を表す図である。
【図２】β−ガラクトシダーゼの活性残存率を表す図である。
【図３】ペルオキシダーゼの活性残存率を表す図である。
【図１】
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【図２】
0003892954.tif 000007
【図３】
0003892954.tif 000008