(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に含まれる標的生物物質を単離するための方法であって、捕捉相が与えられ、前記標的生物物質が少なくとも一の捕捉相と接触させられ、捕捉相に結合した該標的生物物質が検出される方法において、前記方法は、該捕捉相が、少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これが少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなることを特徴とする方法。
【請求項２】
捕捉相が、標識を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉相が、検出相であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検出相かさらに与えられ、これが、少なくとも一の反応性官能基を有する有機分子、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質、及び標識を含み、前記タンパク物質が有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これが少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検出相中の有機分子及びタンパク物質が、捕捉相中の有機分子及びタンパク物質と、それぞれ同一及び／または相違することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有機分子が、粒子状または直線状であることを特徴とする請求項１及び／または４に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーが、ホモポリマー、例えばポリリジンまたはポリチロシン；及びコポリマー、例えばマレイン酸無水物コポリマー、Ｎ-ビニルピロリドンコポリマー、天然または合成の多糖類、ポリヌクレオチド及びアミノ酸コポリマー、例えば酵素より選択されるポリマーであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリマーが、マレイン酸無水物／メチルビニルエーテルコポリマー、Ｎ-ビニルピロリドン／Ｎ-アクリルオキシスクシンイミドコポリマー及びポリ-６-アミノグルコースより選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
捕捉相及び／または検出相の有機分子が、ハプテンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
有機分子が、担体分子に結合することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有機分子がビオチンであり、担体分子がアビジンであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
検出相中の有機分子が、標識であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
タグが、捕捉相及び／または検出相のタンパク物質のＮ-またはＣ-末端に配されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
捕捉相及び／または検出相の有機分子の反応性官能基が、エステル、酸、ハロカルボニル、スルフヒドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロアルキル及びアルデヒド官能基より選択されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク物質が抗原を含み、生物物質が前記抗原によって特異的に認識される抗体であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク物質が、抗体を含み、生物物質が前記抗体によって特異的に認識される抗原であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的生物物質のための捕捉相であって、少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これが少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなることを特徴とする捕捉相。
【請求項１８】
標的生物物質のための検出相であって、少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質、及び標識を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これが少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなることを特徴とする検出相。
【請求項１９】
有機分子が、粒子状または直線状であることを特徴とする請求項１７に記載の捕捉相。
【請求項２０】
有機分子が、粒子状または直線状であることを特徴とする請求項１８に記載の検出相。
【請求項２１】
ポリマーが、ホモポリマー、例えばポリリジンまたはポリチロシン；及びコポリマー、例えばマレイン酸無水物コポリマー、Ｎ-ビニルピロリドンコポリマー、天然または合成の多糖類及びポリヌクレオチド及びアミノ酸コポリマー、例えば酵素より選択されるポリマーであることを特徴とする請求項１９に記載の捕捉相。
【請求項２２】
ポリマーが、ホモポリマー、例えばポリリジンまたはポリチロシン；及びコポリマー、例えばマレイン酸無水物コポリマー、Ｎ-ビニルピロリドンコポリマー、天然または合成の多糖類及びポリヌクレオチド及びアミノ酸コポリマー、例えば酵素より選択されるポリマーであることを特徴とする請求項２０に記載の検出相。
【請求項２３】
ポリマーが、マレイン酸無水物／メチルビニルエーテルコポリマー、Ｎ-ビニルピロリドン／Ｎ-アクリルオキシスクシンイミドコポリマー、ポリ-６-アミノグルコース、ホースラディッシュペルオキシド（ＨＲＰ）及びアルカリ性ホスファターゼより選択されることを特徴とする請求項２１に記載の捕捉相。
【請求項２４】
ポリマーが、マレイン酸無水物／メチルビニルエーテルコポリマー、Ｎ-ビニルピロリドン／Ｎ-アクリルオキシスクシンイミドコポリマー、ポリ-６-アミノグルコース、ホースラディッシュペルオキシド（ＨＲＰ）及びアルカリ性ホスファターゼより選択されることを特徴とする請求項２２に記載の検出相。
【請求項２５】
有機分子が、ハプテン、例えばビオチンであることを特徴とする請求項２３に記載の捕捉相。
【請求項２６】
タグが、タンパク物質のＮ-またはＣ-末端に配されることを特徴とする請求項１７に記載の捕捉相。
【請求項２７】
タグが、タンパク物質のＮ-またはＣ-末端に配されることを特徴とする請求項１８に記載の検出相。
【請求項２８】
有機分子の反応性官能基が、エステル、酸、ハロカルボニル、スルフヒドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロアルキル及びアルデヒド官能基より選択されることを特徴とする請求項１７に記載の捕捉相。
【請求項２９】
有機分子の反応性官能基が、エステル、酸、ハロカルボニル、スルフヒドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロアルキル及びアルデヒド官能基より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の検出相。
【請求項３０】
有機分子が、標識であることを特徴とする請求項１８に記載の検出相。
【請求項３１】
標識が、酵素、タンパク質、ペプチド、抗体、ハプテン、例えばビオチンまたはイミノビオチン、蛍光化合物、例えばローダミン、放射性化合物、化学発光化合物、電子密度成分、磁性成分及び類似物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８または３０に記載の検出相。
【請求項３２】
請求項１７、１９、２１、２３、２５、２６、及び２８のいずれか一項に記載の捕捉相及び／または請求項１８、２０、２２、２４、２７、２９、３０、及び３１のいずれか一項に記載の検出相を含む、標的生物物質を単離するための試薬。
【請求項３３】
捕捉相が、直接または間接的に受動吸収または共有結合より固体サポートに結合することを特徴とする請求項３２に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、少なくとも一の反応性官能基を有する有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、標的生物物質を認識または結合可能な、少なくとも一のタンパク物質を含む捕捉相を使用し、前記タンパク物質が、有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有する、サンプル中に含まれる標的生物物質を単離する方法に関する。
Ｔ細胞の増殖または成長及びキラーリンパ球の製造を促進するために、反応性官能基によって固体サポート上にタンパク質を固定化する方法は、欧州特許出願０，３１９，０１２号により既知である。この目的のため、タンパク質は、そのＣ末端に、前記反応性官能基に結合する共有結合部位を有し、これは２から４のリジン残基が分布したアミノ酸配列からなる。
この従来技術の共有結合部位が伴う問題は、診断に応用した際、これとの結合が可能な標的生物物質の単離の結果は、こうした結合部位を有しないタンパク物質において得られるものと同様であるという事実にある。
本発明に依れば、前記タンパク物質を効率よく配向させる共有結合部位を有するタンパク物質を含み、ひいては、前記生物物質の高感度で高品質の検出を与える少なくとも一の捕捉相を使用することによって、標的生物物質を単離するための方法が与えられる。
したがって、サンプル中に含まれる標的生物物質を単離するための本発明の方法は、下記の段階を含む：
・捕捉相が与えられ、これは少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これは少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残査を含む少なくとも一のタグからなり、
・前記標的生物物質を少なくとも一の捕捉相に接触させておき、また、
・捕捉相に結合した標的生物物質を検出する。
本発明に依れば、“生物物質を単離する”との表現は、この物質の結合、分離、単離、検出及び／または計量、標的生物物質を含むフラクションの濃縮を意味し、質的及び／または量的、特定的または非特定的な結合方法によるものである。
該方法の一形態によれば、捕捉相は標識を更に含有可能であり、この場合は特に、これが検出相からなることが可能である。
該方法の別の形態によれば、検出相もまた与えられ、これは少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質、及び標識を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これは少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなる。
この場合は、捕捉相及び検出相中の有機分子はそれぞれ同一でも相違してもよく、捕捉相及び検出相中のタンパク物質はそれぞれ同一でも相違してもよい。
本発明により理解されるように、サンプルは生物物質を含有可能なあらゆるサンプル、特に生物液体から得られるもの、食物起源のサンプル、または細胞培養等のサンプルを含む。
サンプルは、別のサンプルの全てまたは一部からなる：特にアリコートまたは希釈液からなるものが可能である。
本発明のタンパク物質は、タンパク質、特に組換タンパク質、特に抗原、抗体及びペプチド、例えば合成ペプチドを含む。本発明の方法はまた、例えば核酸のペプチド類似体（ＰＮＡ）等の物質を用いて行ってもよい。
“有機分子”との用語は、可変サイズの分子を意味し；従ってこれはハプテン等の小分子及びポリマーなどのマクロ分子のいずれも意味する。
ハプテンの例としては、ホルモン、ビタミン、例えばビオチン、または医薬製品を挙げることができる。この場合は、本発明の方法には、標的生物物質の検出の段階前に、有機分子を担体分子に結合させる段階が含まれる。好ましくは、ハプテンはビオチンであり、担体分子はアビジンである。
本発明により使用されるポリマーは、粒状形態または直線形態のポリマーである。これは、特に、ポリリジン及びポリチロシンから選択されるホモポリマー、または、特に、マレイン酸無水物、Ｎ-ビニルピロリドンコポリマー、天然または合成の多糖類、ポリヌクレオチド及びアミノ酸コポリマー、例えば酵素などより選択されるコポリマーであってよい。マレイン酸無水物／メチルビニルエーテルコポリマー、Ｎ-ビニルピロリドン／Ｎ-アクリルオキシスクシンイミドコポリマー、ポリ-６-アミノグルコース、及び酵素、例えばホースラデッシュペルオキシド（ＨＲＰ）またはアルカリ性ホスファターゼまたは少なくとも一の反応性官能基を有するその誘導体が望ましい。
“有機分子の反応性官能基”との表現は、特にエステル、ハロカルボニル、スルフヒドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロアルキル及びアルデヒド官能基より選択される反応性官能基；または、例えばカルボジイミドまたはホモ-またはヘテロ二官能性化合物等の活性化剤により活性化可能な官能基のいずれかを意味する。例としては、活性化可能な官能基は、特に酸、アミン及びヒドロキシル官能基より選択される。
上記に定義される共有結合部位は、タンパク物質中に天然に存在しうる。あるいはまた、これを予め、樹脂上でのＩＭＡＣ（固定化金属イオン−アフィニティ・クロマトグラフィー）法によるタンパク質の精製に使用される技術等の当業者にはよく知られた方法によってタグの形態でタンパク物質中に“導入”することもできる（１，２）。例としては、こうした部位は、遺伝工学によりタンパク物質、特にタンパク質に導入可能であり、組換タンパク質が得られる。
タグは、タンパク物質の元来の構造に“導入”すなわち、添加されるアミノ酸配列として定義可能であり、前記の元来の構造において所望の場所に導入され、特に共有結合に関して適切な方法で有機分子に接触（expose）させることができる。
本発明に依れば、懸かるタンパク物質の共有結合部位は、６以上のリジンまたはリジンを主成分とする残基、または任意に他のアミノ酸を含むタグからなるものであってよく、あるいは前記タグの数種類からなるものでもよい。
“リジンを主成分とする”との用語は、リジンが化学的に変性されていることを意味するが、これらの変性では共有結合部位の特異性が維持されることは必須であり、これを向上させさえすることが条件である。挙げることのできる例は、Ｌ-リジンのＤ-リジンによる交換、及びその逆；リジン側鎖の変性、例えばアミン官能基のアセチル化またはカルボキシル官能基のエステル化；ペプチド結合、例えば、カルバ（carba）、レトロ、インバーソ（inverso）、レトロ−インバーソ、還元及びメチレンオキシ結合の変性である。
上述のタグは、タンパク物質の一次構造中、あらゆる場所に見られる。好ましくは、これはタンパク物質のＮ-またはＣ-末端に位置する。
本発明に依れば、特に以下に示す性質によってサンプル中に含有される標的生物物質を単離するための多様な方法が定義される：
・標的生物物質が抗体である場合、タンパク物質は前記抗原を特異的に認識する抗原を含む；
・標的生物物質が抗原である場合、タンパク物質は前記抗原を特異的に認識する抗体を含む。
本発明の他の主題の概要を以下に述べる。
このように、本発明は、少なくとも一の反応性官能基を有する有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、標的生物物質を認識または結合可能な、少なくとも一のタンパク物質を含む標的生物物質の捕捉のための相に関し、前記タンパク物質が、有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これは少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなり；好ましくは、有機分子がポリマーまたはハプテンである。
望ましいポリマーは、粒子状または直線状であり、特に、例えばポリリジンまたはポリチロシンより選択されるホモポリマー；及び、マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ-ビニルピロリドンコポリマー、天然または合成の多糖類、ポリヌクレオチド及びアミノ酸コポリマー、例えば酵素等のコポリマーより選択される。さらに望ましくは、ポリマーはマレイン酸無水物／メチルビニルエーテルコポリマー、Ｎ-ビニルピロリドン／Ｎ-アクリルオキシスクシンイミドコポリマー、ポリ-６-アミノグルコース、及び酵素、例えばホースラデッシュペルオキシド（ＨＲＰ）及びアルカリ性ホスファターゼより選択される。
有機分子がハプテンである場合、捕捉相はまた、適切な担体分子を含有可能である。好ましくはハプテンはビオチンであって、必要な場合は担体分子はアビジンである。
望ましくは、上記に定義したタグは、タンパク物質のＮ-またはＣ-末端に配される。
有機分子の反応性官能基は、特にエステル、酸、ハロカルボニル、スルフヒドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロアルキル及びアルデヒド官能基より選択される。
本発明はまた、上記の捕捉相と同様の特徴を有し、さらに標識を含む、標的生物物質の検出のための相にも関する。
上記の通り、有機分子としてはポリマーまたはハプテンが可能である。第二の可能性に依れば、ハプテンからなる有機分子は、標識をも意味する。
検出相のための標識は、好ましくは酵素、タンパク質、ペプチド、抗体、ハプテン、例えばビオチンまたはイミノビオチン、蛍光化合物、例えばローダミン、放射性化合物、化学発光化合物、電子密度成分、磁性成分等からなる群より選択される。
本発明の別の主題は、標的生物物質を単離するための試薬であり、これは本発明の捕捉相及び／または本発明の検出相を含む。
望ましくは、捕捉相が、直接的または間接的に、受動吸収または共有結合により固体サポートに結合する。
固体サポートは、あらゆる適切な形態、例えばプレート、コーン、任意に放射性及びまたは蛍光及び／または磁性及び／または導電性であるビーズ、バー、ガラス管、ウェル、シート、チップなどであってよい。これは、ポリスチレン、スチレン／ブタジエンコポリマー、ポリスチレンと混合したスチレン／ブタジエンコポリマー、ポリプロピレン、ポリカーボナート、ポリスチレン／アクリロニトリルコポリマー、スチレン／メチルメチルメタクリラートコポリマーの中から、合成及び天然の繊維の中から、及び、多糖類及びセルロースの誘導体、ガラス、シリコン及びその誘導体の中から選択される。
下記の実験の欄に示すとおり、出願人は上記に定義したタグ、特に、６つのリジン残基の配列からなるタグに対して逆方向に配列したモノクロナール抗体を得た。
このように、生物物質の単離のための方法において、こうしたタグの使用を強することが可能であり、この方法によれば：
捕捉相が与えられ、前記標的生物物質を少なくとも一の捕捉相に接触させ、捕捉相に結合した標的生物物質を検出するが、この方法に依れば、捕捉相は少なくとも一の反応性官能基を有する有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、標的生物物質を認識または結合可能な、少なくとも一のタンパク物質を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これは少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなる。
こうした方法はまた、検出相の使用も含み、これは上述した捕捉相の特徴を有し、さらに標識を含む。この標識は、前記抗体からなることが望ましい。
本発明の様々な主題の特徴及び利点を、実施例１から６及び図１から７を参照して以下に示す。
図１は、タンパク質ＲＨ２４Ｋ（色の薄い棒グラフ）及びタンパク質ＲＨ２４（色の濃い棒グラフ）とコポリマーとの共有結合によるカップリングの収量の、異なるカップリング条件；Ａｃｅｔ＝アセトン；Ｐｈｏｓ＝ホスファート；Ｂｏｒ＝ボラート；Ｃａｒｂ＝カルボナートに反映するグラフを表す。
図２は、時間（日）の関数としてのポリマー（ＭＡＶＥ）／タンパク質（ＲＨ２４Ｋ）複合化合物（曲線■）の安定性と遊離のＲＨ２４Ｋタンパク質（曲線●）のものと比較したグラフを表す。
図３は、“サンドウィッチ”検出技術をまとめたスキームを表す。
図４は、モノクロナール抗体に関して、ポリマー／ＲＨ２４複合化合物（曲線●）と、ポリマーＲＨ２４Ｋ複合化合物（曲線■）の免疫反応性を反映させたグラフを表す。
図５は、血漿に関して、ポリマー／ＲＨ２４複合化合物（曲線●）と、ポリマーＲＨ２４Ｋ複合化合物（曲線■）の免疫反応性を反映させたグラフを表す。
図６は、抗体ＩＧ２Ｄ４を用いたサンドウィッチ及び間接ＥＬＩＳＡ試験の結果を、抗体滴定量の関数としてＯＤを表したグラフを用いて表す。
図７は、抗体ＩＧ２Ｄ４を用いた間接ＥＬＩＳＡ試験の結果を、抗体滴定量の関数としてＯＤを表したグラフを用いて表す。
（実施例１：ＲＫ２４Ｋの発現及び精製）
ｐＭＨ２４（Cheynet et al., 1993）を、ｐ２４遺伝子の３’末端での合成アダプターの挿入により変性させ、Ｃ末端に“ポリリジンテイル”と呼称される共有結合のための特定部位を有し、６つの隣接するリジン残基からなるＲＨ２４に相当するＲＨ２４Ｋを発現させた。
アダプターは、それぞれ下記の配列：
配列ＩＤ番号１：
0003880633.tif 000002
配列ＩＤ番号２：
0003880633.tif 000003
を有する二つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、１０mMのトリス、５０mMのＮａＣｌ、１mMのＤＴＥ、１０mMのＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５の緩衝液中で、７０℃で５分間加熱し、次いでまず３０分間かけて３７℃に、次いで３０分間かけて室温までゆっくりと冷却することによって予め調製した。その後、このアダプターを、ＲＨ２４遺伝子の３’末端でＳｍａＩ及びＸｂａＩの間にクローン化した。得られたプラスミドｐＭＨ２４Ｋ３’を、E. coli XLI細菌株（recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,1ac[F’proAB,lacIPZΔM15,Tn10(tetr)]中で増幅させた後、Taq Dye Deoxy Terminator Matrix Standard method(Applied Biochem)によって配列させた。得られた配列及びＣ末端で得られたタンパク質上の対応する配列は下記の通りであった。
0003880633.tif 000004
タンパク質を、E. coli XLI細菌株（上記参照）中、Ｔａｃプロモーターの制御の下で発現させた。発現ベクターを含有するE. coli XLIのプレカルチャーを、ＬＢ−ａｍｐ−ｔｅｔ培地（１／４０から１／２５）を接種に用いるため、ルリア培地（ＬＢ）中、アンピシリン（ａｍｐ；５０μg/ml）及びテトラサイクリン（ｔｅｔ；１２μg/ml）の存在下、３７℃で一晩かけて予め調製した。この培地を、６００nmにおいて０．６のＯＤが得られるまで培養した。その後、培地に、３７℃にてイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を２時間半で１mMの割合で攪拌しつつ添加することにより、タンパク質の発現を誘発した。４℃で１０分間、５０００回転／分での遠心分離（ＪＡ２１ローター、Beckman）を行った後、細菌を、５０mMのトリス−ＨＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１００mMのＮａＣｌ、１０mMのＭｇＣ１２、ｐＨ８の緩衝液（バイオマス３ml/g）中で、プロテアーゼ抑制剤（２μg/mlのアプロチニン及び２μg/mlのロイペプチン）の存在下で取り出し、０℃での超音波処理により溶菌した。可溶性フラクションを、４℃で１５分間、１０，０００回転／分での遠心分離（ＪＡ２１ローター、Beckman）して取り出した後、金属キレートアフィニティカラムにおき、ＲＨ２４Ｋを精製した（Chelating Sepharose Fast Flow No. 17057501）。提供者の推奨にしたがってゲルをＺｎ2+でプレロードした後、６７mMのＮａＣｌを含有するｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液で、次いで２００mMの酢酸アンモニウム、０．５MのＮａＣｌを含有するｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡させた。ＲＨ２４Ｋを、２００mMの酢酸アンモニウム、０．５MのＮａＣｌ、ｐＨ４を用いて溶離した。収集したフラクションを、５０mM、ｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液で透析した。
精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動により、またゲル濾過／ＨＰＬＣ中を通すことにより特定した。その純度は、９０％より高く、このためＲＨ２４の純度と同等であった。マススペクトルで分析したところ、その分子量は２８，０２７であり、理論値２７，９９２と一致した。該タンパク質は、ウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法において、ポリクローナルまたはモノクローナルのアンチｐ２４抗体と認識された。
（実施例２：ＲＨ２４ＫとＲＨ２４とのカップリングによるＭＡＶＥコポリマー）
濃度１g/lのポリマー溶液５μlを、適切な緩衝液中、１g/lのタンパク質溶液に添加した。
反応培地を３７℃にて３時間攪拌した。
反応の進行をWaters排除カラムにおいて、溶離液として０．１M、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液を用いたＨＰＬＣによってモニターした。
図１に示したカップリングの収量は、変性タンパク質が、好ましくはポリマーと、また、より広いスペクトルに渡る実験条件でカップリングすることを示している。
（実施例３：カップリング収量におけるポリマーの性質の効果）
ポリマーの組成物のコモノマー形成部分の性質の効果を上記と同様の条件下で評価した。
結果を以下の表に示す。
ポリマー                                        カップリング収量（％）
ＭＡＶＥ                                                ６５
ポリ（メチルビニルエーテル／マレイン酸無水物）
ＰＥＭＡ                                                ８６
ポリ（エチレン／マレイン酸無水物）
ＳＭＡ                                                  ４９
ポリ（スチレン／マレイン酸無水物）
ＮＶＰＭＡ                                              ３６
ポリ（Ｎ-ビニルピロリドン／マレイン酸無水物）
カップリング収量が、コモノマーの性質に依って３６から８６％の範囲で相違するため、コモノマーの効果はかなり明白である。
（実施例４：タンパク質単独に対するタンパク質／ポリマー複合化合物の相対安定性）
複合化合物を、３７℃にてカップリング培地中貯蔵し、排除クロマトグラフィーで分析し、カップリング培地中の残留タンパク質の量を評価した。結果を図２に示したグラフにまとめた。
このように、ポリマーとのカップリングにより、タンパク質はより優れた貯蔵安定性を有する。
（実施例５：ＲＨ２４Ｋの直接（directed）ビオチニル化）
調製した複合化合物は、図３に示したスキームにより、ｐ２４抗原サンドウィッチテストにおいて検出に使用されるビオチニル化ｐ２４ｓ（ＲＨ２４またはＲＨ２４Ｋ）である。
ビオチンカップリングは、ＲＨ２４Ｋ及びＲＨ２４で行われ、チェックした後抗原サンドウィッチテストで分析し、ＲＨ２４Ｋに好適なカップリング条件を決定した。
タンパク質は、１mg/mlの濃度で使用した。ｐ２４／ＭＡＶＥカップリングの際に試験した緩衝液に基づき、別の緩衝液：０．１Mのボラート、ｐＨ９．２、０．１Mのトリス、ｐＨ７．２、０．１Mのホスファート、ｐＨ７．２及び０．１Mのカーボナート、ｐＨ８．５を試験した。以下のビオチン／ｐ２４比率で試験した：５／１、１０／１、２５／１、５０／１、１００／１。カップリングを、３７℃にて１時間インキュベートした。
ｐ２４／ビオチン複合化合物は、図３に示したスキームによって検出に使用される。
ＲＨ２４／ビオチン及びＲＨ２４Ｋ／ビオチン複合化合物は、モノクローナル抗体及びポシティブ血漿を用いた抗原サンドウィッチテストにおいて活性を呈する。例示のため、図４及び５では、ビオチン官能化の異なる程度で、ＲＨ２４及びＲＨ２４Ｋを用いて得られる複合化合物の相対反応をグラフの形態で示している。図４は、モノクローナル抗体を用いて得られる結果に関し、テストはマイクロタイトレーションプレート上で行った。図５は、BioMerieux社製のVidas immunoanalysis automated machineを用いて血漿に得られた結果を示している。
ＲＨ２４Ｋは、用いた試験条件に関わりなくＲＨ２４よりも大きなシグナルを与えた。最適なビオチン／ｐ２４比は、モノクローナル抗体の場合は２５／１であり、血漿の場合は１０／１であることが観察された。
（実施例６：ポリリジン標識のリジン残基に関して、カップリング効果に対する組成物の影響）
ポリリジン標識のリジン残基としてカップリング効果に対する組成物の影響を評価するために使用した生物物質は下記の通り：
・組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ；これは、そのアミノ末端部分に金属イオンを用いたキレート化によって精製に役立つポリリジン標識[ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ]を有し、カルボキシ末端部分にカップリングに供与するポリリジン標識[ＰＧ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ]を有し；このタンパク質は下記のように表される：
ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４−ＰＧ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ
・組換タンパク質ＲＨＫ２４；これは、そのアミノ末端部分にポリリジン標識[ＭＲＧＳＣＨ（Ｋ）2ＨＨ（Ｋ）2ＨＨ（Ｋ）2ＧＳＶＤＥＳＭ]を有し；このタンパク質は下記のように表される：
ＭＲＧＳＣＨ（Ｋ）2ＨＨ（Ｋ）2ＨＨ（Ｋ）2ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４
・組換タンパク質Ｒ２４；これは、カルボキシ末端ポリリジン標識も、アミノ末端ポリヒスチジン標識も持たず；ｐ２４と表される。
使用したポリマーは、ＭＡＶＥ（マレイン酸無水物−コ−メチルビニルエーテル）である。カップリング条件は、三つのタンパク質と同一とした。
二種類のカップリング緩衝液、０．１M、ｐＨ８．２のカーボナート緩衝液及び０．０５M、ｐＨ９．０のトリスＨＣｌ緩衝液を使用した。
二つの異なる反応条件下で実行した組換タンパク質のＭＡＶＥポリマーとのカップリングの収量を示す下記の表に結果を与えた。これには、リジン残基が隣接していることの重要性が示されている。
その理由は、タンパク質ＲＨ２４Ｋ（６つの隣接したリジン残基）を用いて得られるカップリング収量が、タンパク質ＲＨＫ２４（６つのリジン残基、２つずつのブロック三カ所）を用いて得られるカップリング収量よりも格段に多いためである。
実際のところ、タンパク質ＲＨＫ２４（６つのリジン残基、２つずつのブロック三カ所）を用いて得られるカップリング収量は、タンパク質Ｒ２４（標識なし）を用いて得られるものと同様である。
0003880633.tif 000005
（実施例７：アンチ−ポリリジン標識（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ抗体の製造）
組換タンパク質とのフュージョンの状態でこの標識を認識することのできるアンチ標識抗体を得るために使用した生物物質は、下記の通りである：
・組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ；これは、そのアミノ末端部分に金属イオンを用いたキレート化によって精製に役立つポリリジン標識[ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ]を有し、カルボキシ末端部分にカップリングに供与するポリリジン標識[ＰＧ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ]を有し；このタンパク質は下記のように表される：
ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４−ＰＧ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ
・ペプチドＰ４００、その配列はＣ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬであり、ＫＬＨにカップリングしている（Ｐ４００−ＫＬＨ）。
製造する抗体を選択するために使用した生物物質は下記の通りである：
・組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ
・カルボキシ末端ポリリジン標識を有しない組換タンパク質ＲＨ２４、ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４と表される
・組換タンパク質Ｒ２４；これは、カルボキシ末端ポリリジン標識も、アミノ末端ポリヒスチジン標識も持たず；ｐ２４と表される。
・ペプチドＰ４００、その配列はＣ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ。
下記の二つの試験方式は、モノクローナル抗体を選択するために使用した。
・サンドウィッチＥＬＩＳＡ試験、捕捉相中にアンチマウス・ヤギ抗体を含み、検出相中に、ペルオキシダーゼにカップリングしたアンチ２４モノクローナル抗体によって現れた抗原ＲＨ２４ＫまたはＲ２４を含む；
・間接ＥＬＩＳＡ試験、捕捉相に抗原ＲＨ２４ＫまたはＲ２４またはＰ４００を含み、検出相中にペルオキシダーゼにカップリングしたアンチマウスＩｇＶヤギ抗体を含む。
ＢＡＬＢ／ｃ及びＡ／Ｊマウスを、以下のプロトコルに従って免疫化した：３回の腹膜内注射において、第一の注射はタンパク質ＲＨ２４Ｋ、続く二回の注射はＫＬＨにカップリングしたペプチド４００で行った。フュージョンを行い、上述のサンドウィッチ及び間接ＥＬＩＳＡ試験を利用してスクリーニングを行った。
下記の基準に従って８０のハイブリッドを選択した：
・ペプチドＰ４００（Ｃ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ）の認識
・タンパク質ＲＨ２４Ｋ（ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４−ＰＧ（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬ）の認識
・タンパク質ＲＨ２４（ＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４）の非認識
・タンパク質Ｒ２４が非認識。
このように、これらの抗体は、タンパク質にフューズした配列（Ｋ）6ＳＶＤＥＳＬを認識し、同じくＳＶＤＥＳＬユニットを含むＭＲＧＳ（Ｈ）6ＧＳＶＤＥＳＭもタンパク質ｐ２４も認識しない。
これらのハイブリッドの５つをクローン化し、腹水の形態で製造した：これらは抗体ＩＧ２Ｄ４、２Ｇ２Ｂ３、２Ｇ４Ａ１２、５Ｆ１２ＥＳ及び１４Ｅ１Ｇ７、ＩｇＧ１  ｋアイソタイプの全てである。
ＩＧ２Ｄ４抗体についてのサンドウィッチ及び間接ＥＬＩＳＡ試験を、図６及び７に示した。図６にはサンドウィッチＥＬＩＳＡ試験が示され、ＯＤをＩＧ２Ｄ４抗体腹水の滴定量（希釈度）の関数として表し；検出相を構成する組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ及びＲ２４を０．１μg/mlの濃度で使用した。図７には、間接ＥＬＩＳＡ試験が示され、ＯＤをＩＧ２Ｄ４抗体腹水の滴定量（希釈度）の関数として表し；捕捉相を構成する組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ及びＲ２４を０．５μg/mlの濃度で使用し、合成ペプチドＰ４００を０．０５μg/mlの濃度で使用した。
参考文献
（１）Porath J., Carlsson., Olsson., Belfrage J., Nature, 258, 598（1975）
（２）Porath J.,Trends Anal. Chem., 7, 254（1988）
（３）Cheynet, protein Expression and Purification, 4, 367-372（1993）
【図１】
0003880633.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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