(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有することを特徴とする、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖の製造方法であって、ガゴメ昆布より熱水抽出または酢酸カルシウム溶液抽出により得られたフコース硫酸含有多糖混合物を、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする、フコース硫酸含有多糖の製造方法。
（１）構成糖：ウロン酸を含有しない。
（２）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化されない。
【請求項２】
下記理化学的性質を有することを特徴とする、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖の製造方法であって、ガゴメ昆布より酢酸カルシウム溶液抽出により得られたフコース硫酸含有多糖混合物より、１．５〜２Ｍの塩化ナトリウムの存在下、塩化セチルピリジニウムで目的の多糖を沈殿させ、さらに前記沈殿より目的の多糖を回収する工程を包含することを特徴とする、フコース硫酸含有多糖の製造方法。
（１）構成糖：ウロン酸を含有しない。
（２）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化されない。
【請求項３】
共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする請求項１または２記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品として利用可能なアポトーシス誘発剤、制がん剤及び発がん予防剤に関する。また、本発明はアポトーシス機構解明、アポトーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトーシス誘発方法を提供する。更に本発明により純化されたフコース硫酸含有多糖及びその分解物が提供され、フコース硫酸含有多糖分解物の製造や、構造究明に有用なフコース硫酸含有多糖分解酵素が提供される。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis 、アポプトーシスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）と言う様式が注目されている。
【０００３】
このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死であると考えられている。すなわち何らかの外部的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプログラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したプログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。
【０００４】
このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要若しくは病原細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アポトーシスを誘発する作用を有する安全性の高い化合物を開発し、該化合物を含有するアポトーシス誘発剤、制がん剤、発がん予防剤、及び該化合物を有効成分として使用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。また本発明の化合物の分解物の製造に有用な該化合物分解酵素を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はアポトーシス誘発剤に関し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有することを特徴とする。
【０００７】
本発明の第２の発明はアポトーシス誘発方法に関し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有効成分として使用することを特徴とする。
【０００８】
本発明の第３の発明は制がん剤に関し、本発明の第５又は第６の発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の第４の発明は発がん予防剤に関し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の第５の発明は下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に関する。
（１）構成糖：ウロン酸を含有する。
（２）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２） の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なく とも下記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物より選択される一種以上 の化合物が生成する。
【化１】
0003916394.tif 000002
【化２】
0003916394.tif 000003
【化３】
0003916394.tif 000004
【００１１】
本発明の第６の発明は下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に関する。
（１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（２）フラボバクテリウム(Flavobacterium）ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。
【００１２】
本発明の第７の発明は本発明の第５の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含することを特徴とする。
【００１３】
本発明の第８の発明は本発明の第５の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１４】
本発明の第９の発明は本発明の第５の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第５の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする。
【００１５】
本発明の第１０の発明は本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解酵素をもつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１６】
本発明の第１１の発明は本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で目的の多糖を沈殿させる工程を包含することを特徴とする。
【００１７】
本発明の第１２の発明は本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１８】
本発明の第１３の発明は本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする。
【００１９】
本発明の第１４の発明はフコース硫酸含有多糖混合物の製造方法に関し、海藻から本発明の第７、８、１０、１１又は１２の発明に使用するフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオンとカルシウムイオンを共存させることを特徴とする。
【００２０】
本発明の第１５の発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素に関する。
（ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化させる。
（ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium)  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用しない。
（ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium)  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合 物より選択される一種以上の化合物が生成する。
【化４】
0003916394.tif 000005
【化５】
0003916394.tif 000006
【化６】
0003916394.tif 000007
（ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近にある。
（iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付近である。
【００２１】
本発明の第１６の発明はカルシウム源と本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を含有する酵素組成物に関する。
【００２２】
本発明の第１７の発明は本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の製造方法に関し、本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテロモナス属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする。
【００２３】
本発明の第１８の発明はフコース硫酸含有多糖の低分子化物に関し、本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を本発明の第６の発明のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるものであることを特徴とする。
【００２４】
本発明者らは様々な純化されたフコース硫酸含有多糖やその分解物を得ることに成功し、次いでそれらの生物活性を検討し、それらの物質ががん細胞に対してアポトーシスを誘発させること及び強い制がん作用を示すことを見出した。またフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物が強い発がん抑制作用を示すことを見い出した。更に本発明の分解物の調製に有用なフコース硫酸含有多糖分解酵素の単離に成功し、本発明を完成させた。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に関して具体的に説明する。
本発明に使用されるフコース硫酸含有多糖は特に限定されるものではなく例えばヒバマタ由来の物、ガゴメ昆布由来の物、マ昆布由来の物、ワカメ由来の物その他すべての褐藻植物由来の物を使用することができる。また、ナマコも体壁にフコース硫酸含有多糖を持っていることが知られているが、本発明にはナマコ由来のフコース硫酸含有多糖も使用することができる。また本発明にはフコース硫酸含有多糖の分解物も使用することができる。フコース硫酸含有多糖の分解方法としては酸処理等の化学的に分解する方法、超音波処理など物理的に分解する方法、あるいは酵素的に分解する方法等が挙げられる。
【００２６】
本発明者らは、上記のような様々なフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物をがん細胞の培養液に添加したところ添加後１日から数日で癌細胞がアポトーシスを起こすことを見出した。また、正常細胞に対しては毒性を示さないことも確認した。
【００２７】
本発明において、フコース硫酸含有多糖とは、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されている〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式会社、昭和３０年１２月１５日発刊、多糖類化学、第３１９頁、第３２１頁〕。なお褐藻植物由来のフコース硫酸含有多糖はフコイダン、フコイジン、フカンと通称され、いくつかの分子種があることが知られているがこれらは総称的にフコイダンと呼ばれることが多い。例えば、市販シグマ社製のフコイダンを１３種もの分子種に分けたという報告があり〔カーボハイドレート  リサーチ（Carbohydrate Research)、第２５５巻、第２１３〜２２４頁（１９９４）〕、その中にはフコースを主成分とする一群と、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを多く含む一群の分子種がある。その生物活性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗凝血等様々なものが報告されているが、フコース硫酸含有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種にあるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精製して調べる必要があった。フコース硫酸含有多糖には、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを含むもの等がある。以下、本明細書においてはウロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多糖−Ｆとし、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフコース硫酸含有多糖−Ｕとし、両者の混合物をフコース硫酸含有多糖混合物と記載する。
【００２８】
これまでに知られているフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する方法は分子量分画や陰イオン交換樹脂による分離であり、その分離は不充分なため薬品や機能性食品として大量調製が困難なものであった。
【００２９】
また、フコース硫酸含有多糖から着色性物質を完全に除去することは困難なことが知られており、市販のフコイダン等にも着色性物質が含まれている。通常この着色性物質はポリフェノールが重合したものであり極めて反応性が強く様々な酵素反応を阻害したり細胞の生育を阻害したり、また、例えば接した樹脂や樹脂性の容器等に不可逆的に吸着することがある。そのためフコース硫酸含有多糖の生物活性を正確に調べるため、また、容器や樹脂等の汚染を防ぐためにはフコース硫酸含有多糖から反応性の強い着色性物質を除去する必要があった。
【００３０】
また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する際に可溶性の酢酸バリウムや塩化バリウムや塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため、後の精製が有利であることが知られているが、可溶性のバリウム塩は廃液の処理などが容易ではなく、また塩化カルシウムは海藻と混合するとｐＨが変動するため非分解性のフコース硫酸含有多糖を得るにはｐＨ調整が必要である。このｐＨ調整の際に海藻粉末が粘性を帯びて凝集することがあるため、その後の抽出効率が低下したり固液分離とりわけろ過が困難となることがある。
【００３１】
すなわち、現在フコース硫酸含有多糖の産業上の有用性が期待されているにも関わらず、分子種的に分別が充分なフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコース硫酸含有多糖−Ｕの市販品もなく、またその効率的な製造方法に関する報告もない。更には市販のフコース硫酸含有多糖には上記のように反応性の強い着色性物質が含まれている。
【００３２】
フコース硫酸含有多糖には様々な活性があるが、前述のごとくその分別調製が困難であるためいまだに実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコース硫酸含有多糖−Ｕは得られていなかった。
【００３３】
しかしながら本発明により、実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｕ、その簡便な抽出方法及びフコース硫酸含有多糖−Ｕの製造方法が提供された。また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖−Ｕが提供された。
【００３４】
更に本発明により、実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、その簡便な抽出方法及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの製造方法が提供された。
【００３５】
また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖−Ｆが提供された。
【００３６】
本発明に使用するフコース硫酸含有多糖としては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。フコース硫酸含有多糖抽出液の調製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はない。
【００３７】
また、本発明に使用する、フコース硫酸含有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるものであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法を使用することができる。
【００３８】
また、本発明に使用するフコース硫酸含有多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許容される塩を包含する。
【００３９】
フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、昭和５２年発刊の原色日本海藻図鑑、第２２〜５２頁に記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evanescens) 、ガゴメ昆布（Kjellmaniella crassifolia)、マ昆布（Laminaria japonica) 、ワカメ（Undaria pinnatifida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。
【００４０】
フコース硫酸含有多糖を含有するナマコとしては、例えば、特開平４−９１０２７号公報記載のナマコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus)、ニセクロナマコ（Holothuria leucospilota)等を使用することができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。
【００４１】
フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂で処理することによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれらの分解物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の塩に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それらの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用いられ、例えばカリウム、ナトリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、ピリジニウム等の有機塩基との塩、及びアンモニウム塩等が挙げられる。
【００４２】
フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フコース硫酸含有多糖含有粉体を調製することができる。
【００４３】
フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖抽出液を調製することができる。
【００４４】
フコ−ス硫酸含有多糖含有物からの抽出温度、時間としては０〜２００℃、１〜３６０分の範囲から目的に応じ選択すれば良いが、通常１０〜１５０℃、５〜２４０分、好適には５０〜１３０℃、１０〜１８０分の範囲より選択して行うのが良い。
【００４５】
フコース硫酸含有多糖含有率を高めるための抽出物精製手段としては、塩化カルシウム、酢酸バリウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応じこれらを組合せて、精製を行うことができる。
【００４６】
フコース硫酸含有多糖の分解方法としては、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸含有多糖分解方法として公知の方法を使用することができ、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。
【００４７】
通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種類は特に限定されるものではなく、例えばヒバマタ由来のもの、ガゴメ昆布由来のもの、マ昆布由来のもの、ワカメ由来のもの、その他すべての褐藻類由来のものを使用することができる。
【００４８】
フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐藻類の水系溶媒による抽出液を得る。
【００４９】
また、抽出に供する海藻は生海藻でも良いが、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にしたり、６０〜１００％のアルコールやアセトン等で洗浄したり、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に減少するため有利である。
【００５０】
また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可溶性の酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため後の精製が有利であるが上述した理由により抽出の際には、１ｍＭ〜１Ｍ程度の酢酸カルシウム溶液で５０〜１３０℃で抽出するのが好ましい。
【００５１】
海藻が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、最初から０．２Ｍ以上の酢酸カルシウムを用いると抽出効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したものに、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿を除去すれば良い。
【００５２】
しかしながらフコース硫酸含有多糖をアルギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネシウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クエン酸、リン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液のｐＨや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分子化が進行し易い。加熱温度、時間、ｐＨ等を調整することにより、任意の分解物を調製することができ、例えばゲルろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の平均分子量、分子量分布等を調整することができる。
【００５３】
すなわち本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量及び糖組成はフコース硫酸含有多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸含有多糖の抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解され、アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量、分子量分布はその１例にすぎず、フコース硫酸含有多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で１００℃、１時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ３００の分子ふるい膜を使用すれば、分子量分布１０００から１万程度のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆが調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子量分布の本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを調製できる。
【００５４】
前記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中性糖等を除くためには、例えば０．２〜０．６Ｍの濃度の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくなるまで塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を加え、沈殿を集めれば良い。
【００５５】
必要に応じてこの沈殿を０．２〜０．６Ｍの濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、この沈殿を溶解後陰イオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理したり限外ろ過等を行ってもよい。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。
【００５６】
本発明者らは０．６〜３Ｍの１種類又は２種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆと本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことを見出した。
【００５７】
例えば本発明の方法を用いて、フコース硫酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離することができる。
【００５８】
まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６〜２Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。
【００５９】
通常本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆと本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する場合１．５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる（後記する図１の説明参照）。  例えば上記塩類の塩濃度を１．５Ｍに調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫酸含有多糖−Ｆが沈殿を形成するので、沈殿を除去すると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの溶液が得られる。必要に応じてこの溶液を濃縮後、４倍量のエタノールなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖−Ｕを沈殿させ、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。
【００６０】
次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆのみを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニウム等で凝集させる際に、０．２〜０．６Ｍの塩濃度ではなく、例えば２Ｍの塩濃度にすれば沈殿は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆのみを含む。
【００６１】
本発明者らは、フコース硫酸含有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなることも見出した。すなわち、本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオン源となる薬品を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１ｍＭ以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジエントによりフコース硫酸含有多糖を溶出させる。本方法を用いる場合、添加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ以上ならばよいが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕをカラムに吸着させる目的の時は０．５Ｍ未満が望ましい。また本方法に用いる２価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。
【００６２】
また、褐藻類から通常の方法でフコース硫酸含有多糖混合物を製造すると上述のように反応性の強い着色性物質が混入し、それらが接する樹脂や樹脂性容器を汚染したり、酵素反応や細胞生育を阻害したりする。この着色性物質は多糖性の物質あるいは陰イオン交換基を有する物質に結合あるいは吸着させれば容易に除去できることを見出した。すなわち、フコース硫酸含有多糖を含む溶液に例えば、セルロファイン、ＧＣＬ−２０００（生化学工業社製）や、セファクリルＳ−５００、セファデッスクＧ−２００、セファロースＣＬ−２Ｂ（共にファルマシア社製）等の多糖性の樹脂あるいは、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、ＱＡＥ−セファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ−セファセル（共にファルマシア社製）、ＴＳＫ−ゲルＤＥＡＥ−トヨパール６５０、ＴＳＫ−ゲルＤＥＡＥトヨパール５５０（トーソー社製）、アンバーライト系の陰イオン交換樹脂（オルガノ社販売）キトパール系の陰イオン交換樹脂（富士紡績社製）等の陰イオン交換基を有する物質を添加かくはん後除去したり、あるいはこれらを充てんしたカラムにフコース硫酸含有多糖を含む溶液を通過させればこの反応性の強い着色性物質は容易に除去できる。但し、陰イオン交換樹脂の場合フコース硫酸含有多糖も結合し得るので、着色性物質を吸着させる時に塩濃度を２Ｍ程度にしておくことが好ましい。
【００６３】
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは例えば実施例６に記載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質を示すが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはこの例に限定されるものではない。
【００６４】
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、及び実施例８で得た本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリウム濃度における、過剰量の塩化セチルピリジニウム存在下における沈殿形成性を図１に示す。
【００６５】
図１の縦軸は沈殿形成率（％）を示し、横軸は塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。図中、実線及び白丸は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナトリウム濃度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三角は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリウム濃度（Ｍ）での沈殿形成率を示す。
【００６６】
沈殿形成率の測定は、溶液温度３７℃にて、以下のように行った。
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれ２％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、これらを様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液を各１２５μｌずつ調製した。次に、塩化セチルピリジニウムを２．５％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した１．２５％の塩化セチルピリジニウム溶液を調製した。
【００６７】
水に溶解している２％の本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．２５％の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿させるには容量で３．２倍必要であった。そこで、各濃度の塩化ナトリウムに溶解した２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各１２５μｌに対して各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解した塩化セチルピリジニウム溶液を４００μｌ添加後、充分かくはんし、３０分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Analytical Chemistry) 、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を算出した。
【００６８】
得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により求めたところ、約１９万を中心とした分子量分布を示した（図２参照）。なお、図２において、縦軸はフェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション  ナンバーを示す。
【００６９】
なお、ゲルろ過の条件を下記に示す。
カラムサイズ：３．０８×１６２．５ｃｍ
溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
流速：１．５ｍｌ／分
サンプル濃度：０．２５％
サンプル液量：２０ｍｌ
分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社製）
【００７０】
次に、得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの成分を分析した。
まず、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従いフコース量を定量した。
【００７１】
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ（GlycoTAG) 及びグライコタッグ  リージェント  キット（GlycoTAG Reagent Kit) （共に宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ：宝酒造社製）
溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
【００７２】
次に、アナリティカル  バイオケミストリー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
【００７３】
次に、バイオケミカル  ジャーナル（Biochemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
【００７４】
以上の結果、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸であった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基はモル比で約１０：７：４：５：２０であった。
【００７５】
次に、フコース硫酸含有多糖−Ｕのカルシウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計  ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社製）により測定したところ図３に示すスペクトルが得られた。なお、図３において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ−１）を示す。
【００７６】
次に、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕのカルシウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）により測定したところ図４に示すスペクトルが得られた。
【００７７】
図４中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、  １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ５．２７（マンノースの１位のＨ）、５．０７（フコースの１位のＨ）、４．４９（フコースの３位のＨ）、４．３７（グルクロン酸の１位のＨ）、４．０４（フコースの４位のＨ）、３．８２（フコースの２位のＨ）、３．５４（グルクロン酸の３位のＨ）、３．２８（グルクロン酸の２位のＨ）、１．０９（フコースの５位のＣＨ３  のＨ）
【００７８】
この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−５３．６度であった。
【００７９】
本発明者らは、以下に述べるごとく得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの構造を決定した。
【００８０】
フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｕの分解及び分解物の精製
精製したフコース硫酸含有多糖−Ｕに下記のエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。
【００８１】
すなわち、１％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応の進行と共に２３０ｎｍの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｕが分解されていることが判明した。この反応液をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に分離精製した。
【００８２】
なお、上記のエンド型フコイダン分解酵素は以下の方法により調製される。
【００８３】
該エンド型フコイダン分解酵素の生産に用いる菌株としては、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例としては例えば、フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．  ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が挙げられる。
【００８４】
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
１．フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２株
ａ．形態的性質
（１）本菌は短かん菌である。
幅      ０．８〜１．０μｍ
長さ    １．０〜１．２μｍ
（２）胞子の有無      なし
（３）グラム染色性    陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育の温度範囲
３７℃以下で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。
（２）酸素に対する態度      好気性
（３）カタラーゼ        陽性
（４）オキシダーゼ      陽性
（５）ウレアーゼ        弱陽性
（６）酸の生成
Ｄ−グルコース      陽性
ラクトース          陽性
マルトース          陽性
Ｄ−マンニトール    陽性
スクロース          陰性
トレハロース        陰性
（７）加水分解
デンプン      陰性
ゼラチン      陽性
カゼイン      陰性
エスクリン    陽性
（８）硝酸塩の還元          陰性
（９）インドールの生成      陰性
（１０）硫化水素の生成      陰性
（１１）ミルクの凝固        陰性
（１２）ナトリウムの要求性        陽性
（１３）塩類要求性
０％食塩培地での生育        陰性
１％食塩培地での生育        陰性
海水培地での生育            陽性
（１４）キノン系      メナキノン６
（１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量      ３２％
（１６）ＯＦ−テスト    Ｏ
（１７）集落の色調      黄色系
（１８）運動性      なし
（１９）滑走性      なし
【００８５】
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  システィマティック  バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) 、第１巻（１９８４）、及びバージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネイティブ  バクテリオロジー (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)、第９巻（１９９４）に記載のフラボバクテリウム  アクアタイル（Flavobacterium aquatile)、及びフラボバクテリウム  メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum) の類縁細菌と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できない点、３７℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２と命名した。
【００８６】
なお、上記菌株は Flavobacterium ｓｐ．  ＳＡ−００８２と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５４０２（国際寄託への移管請求日：  平成８年２月１５日）として寄託されている。
【００８７】
本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、エンド型フコイダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【００８８】
本エンド型フコイダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で本エンド型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本エンド型フコイダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
【００８９】
本エンド型フコイダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
【００９０】
上記のフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【００９１】
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化された本エンド型フコイダン分解酵素を得ることができる。
【００９２】
また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
【００９３】
エンド型フコイダン分解酵素の精製例を示す。
【００９４】
フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）をグルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２４時間培養して種培養液とした。グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％、及び消泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
【００９５】
この菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本エンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地１ｍｌ中に５ｍＵの活性が検出された。
【００９６】
本抽出液に、終濃度が９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で充分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル  Ｓ−３００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセファクリル  Ｓ−３００の保持時間から求めたところ約４６万であった。次にこの活性画分を２５０ｍＭの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析した。この酵素液を、あらかじめ２５０ｍＭの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したモノ（Mono）Ｑ  ＨＲ５／５のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で充分洗浄後、２５０ｍＭから４５０ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。以上の精製工程を表１に示す。
【００９７】
【表１】
0003916394.tif 000008
【００９８】
本酵素の活性測定は下記の様に行う。
【００９９】
２．５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液５０μｌと、１０μｌの本酵素と、６０μｌの６６７ｍＭ塩化ナトリウムを含む８３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液１０５μｌと水２ｍｌを混合かくはんし、その２３０ｎｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定する。対照として、本酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定する（ＡＢ１及びＡＢ２）。
【０１００】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸光係数を５．５として計算し行う。なお、酵素の活性は下記式により求める。
（ＡＴ−ＡＢ１−ＡＢ２）×２．１０５×１２０／５．５×１０５×０．０１×１８０＝Ｕ／ｍｌ
２．１０５：吸光度を測定するサンプルの液量（ｍｌ）
１２０：酵素反応液の液量（μｌ）
５．５：不飽和ウロン酸の２３０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数（／ｍＭ）
１０５：希釈に用いる反応液の液量（μｌ）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
１８０：反応時間（分）
【０１０１】
タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。
【０１０２】
なお基質のガゴメ昆布由来のフコイダンは次の様に調製した。
【０１０３】
乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、１０倍量の８５％メタノール中で７０℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を１０倍量のメタノール中で７０℃、２時間処理し、ろ過する。残渣に２０倍量の水を加え、１００℃、３時間処理しろ過により抽出液を得る。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離する。その沈殿を、エタノールで充分洗浄し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できたら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去する。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダンを得る。
【０１０４】
酵素反応生成物の構造解析
上記のエンド型フコイダン分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕ中に存在するＤ−マンノースとＤ−グルクロン酸の間のα１→４結合を脱離的に分解する酵素であり、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用させると下記式（Ｉ）、（II）、及び（III）の構造を有するオリゴ糖が生成した。
【化７】
0003916394.tif 000009
【化８】
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【化９】
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【０１０５】
以下、詳細に説明する。
【０１０６】
上記のＤＥＡＥ−セファロースＦＦで分離精製した３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）をそれぞれ一部だけグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端を、ピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、各ＰＡ化糖（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）を得た。（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）をＨＰＬＣにより分析した。
【０１０７】
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
【０１０８】
（ア）分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ分析
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＳＨＯＤＥＸ  ＳＢ−８０３(４．６×２５０ｍｍ)（昭和電工社製）
溶離液：０．２Ｍ塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシド＝９：１
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
【０１０９】
（イ）逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：Ｌ−カラム（４．６×２５０ｍｍ）〔（財）化学薬品検査協会〕
溶離液：５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．５）
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【０１１０】
図５、６、及び７には各々ピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）のＨＰＬＣの各溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。
【０１１１】
下記に式（Ｉ）、式（II）、及び式（III）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の物性を示す。
【０１１２】
図８に（ａ）の、図９に（ｂ）の、図１０に（ｃ）のマスのスペクトルを示し、図１１に（ａ）の、図１２に（ｂ）の、図１３に（ｃ）のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、横軸はｍ／ｚ値を示す。
【０１１３】
更に図１４は（ａ）の、図１５は（ｂ）の、図１６は（ｃ）の  １Ｈ−ＮＨＲスペクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【０１１４】
なお、  １Ｈ−ＮＨＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
【０１１５】
（ａ）の物性
分子量  ５６４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６３〔Ｍ−Ｈ＋  〕−  
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ４  〕−  、１５７〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ２  Ｏ−Ｈ＋  〕−  、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋  〕−  、２２５〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２  Ｏ−Ｈ＋  〕−  、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋  〕−  、３１９〔不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ２  Ｏ−Ｈ＋  〕−  、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋  〕−  、４８３〔Ｍ−ＳＯ３  −Ｈ＋  〕−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１−Ｈ）、５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，５．８Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．８６（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．０，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２  のＨ２  ）、３．６５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，６．１Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３  のＨ３  ）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸塩  １分子（Ｌ−フコースの３位）
なお、  １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（IV）の通りである。
【化１０】
0003916394.tif 000012
【０１１６】
（ｂ）の物性
分子量  ７２４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ７２３〔Ｍ−Ｈ＋  〕−  、３６１〔Ｍ−２Ｈ＋  〕２−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ４  〕−  、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋  〕−  、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋  〕−  、３２１〔Ｍ−ＳＯ３  −２Ｈ＋  
〕２−、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−２ＳＯ３−Ｈ＋  〕−  、４１７（Ｍ−Ｌ−フコース−２ＳＯ３  −Ｈ＋  〕−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１″−Ｈ）、５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，′−Ｈ）、５．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１．８，１１．０Ｈｚ，５−ＣＨのＨ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，１１．０Ｈｚ、５−ＣＨのＨ）、３．９９（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）３．５４（１Ｈ，ｂｒ−ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３  のＨ３  ）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸塩  ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マンノースの６位）
なお、  １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。
【化１１】
0003916394.tif 000013
【０１１７】
（ｃ）の物性
分子量  １１２８
ＭＳ  ｍ／ｚ  １１２７〔Ｍ−Ｈ＋  〕−  
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ４  〕−  、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋  〕−  、２２５〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２  Ｏ−Ｈ＋  〕−  、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋  〕−  、３７１〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｌ−フコース−ＳＯ３  −２Ｈ＋  〕２−、４０５〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ＋  〕−  、７２１〔Ｍ−Ｄ−マンノース−Ｌ−フコース−ＳＯ３  −Ｈ２  Ｏ−Ｈ＋  〕−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ５．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｓ，（１）−Ｈ）、５．１６（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，（３）′−Ｈ）、４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（２）−Ｈ）、４．１４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．０４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｍ，（４）′−Ｈ），３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２  のＨ２  ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２  のＨ２  ）、３．６７（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５１（１Ｈ，ｔ
，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３″−Ｈ）、３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３  のＨ３  ）、１．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３  のＨ３  ）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸塩  ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、  １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（VI）の通りである。
【化１２】
0003916394.tif 000014
【０１１８】
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに上記エンド型フコイダン分解酵素を作用させると反応の進行と共に脱離反応が起こって２３０ｎｍの吸光度が増加するが、脱離反応の生成物となる不飽和ヘキスロン酸基が主要反応生成物のすべてにあることから得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子内にヘキスロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖の多くはフコースであるためフコース硫酸含有多糖−Ｕは一般の多糖より酸に分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らはガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している糖鎖中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレート  リサーチ、第１２５巻、第２８３〜２９０頁（１９８４）の方法を参考にして、まずフコース硫酸含有多糖混合物を０．３Ｍのシュウ酸に溶解し１００℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が３０００以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後４Ｎの塩酸で酸加水分解し、ｐＨ８に調整後、ＰＡ化し、ＨＰＬＣによりウロン酸の分析を行った。なおＨＰＬＣの条件は下記によった。
【０１１９】
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＮ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（宝酒造社製）
溶離液：２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【０１２０】
なお、ＰＡ化ヘキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィカ（Acta Chemica Scandinavica)、第１５巻、第１３９７〜１３９８頁（１９６１）記載の方法に従い、和光純薬社製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものをＰＡ化することにより得た。
【０１２１】
この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合物の糖鎖中に含まれるヘキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。
【０１２２】
更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
【０１２３】
また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖混合物をあらかじめ上記のエンド型フコイダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、上記のエンド型フコイダン分解酵素が脱離反応により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造はＤ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。
【０１２４】
更に、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマーをＮＭＲ分析した。
【０１２５】
ポリマーのＮＭＲの測定結果を以下に示す。但し、  １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を１．１３ｐｐｍに、１３Ｃ−ＮＭＲではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を９．３２ｐｐｍとして表した。
【０１２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ５．２５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．００（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、３．７１（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、３．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、３．５７（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、３．５３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、２′−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
δ１７５．３（５′−ＣＯＯＨのＣ）、１０２．５（１′−Ｃ）、９９．６（１−Ｃ）、７８．５（２−Ｃ）、７７．９（４′−Ｃ）、７７．０（３′−Ｃ）、７６．７（５′−Ｃ）、７３．９（５−Ｃ）、７３．７（２′−Ｃ）、７０．６（３−Ｃ）、６７．４（４−Ｃ）、６１．０（５−ＣＨ２  ＯＨのＣ）
なお、ピークの帰属の番号は下記式（VII）の通りである：
【化１３】
0003916394.tif 000015
【０１２７】
Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はそのビシナル結合定数が７．６Ｈｚであることからβ−Ｄ−グルクロン酸であると決定した。
【０１２８】
また、マンノースの１位の立体配置はその化学シフト値から５．２５ｐｐｍであることからα−Ｄ−マンノースであると決定した。
【０１２９】
構成糖の結合様式は  １Ｈ検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。
【０１３０】
１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
【０１３１】
ＨＭＢＣスペクトルにより１−Ｈと４′−Ｃの間及び４′−Ｈと１−Ｃの間、１′−Ｈと２−Ｃの間及び２−Ｈと１′−Ｃの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合でＤ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。
【０１３２】
上記の結果を考え併せると、（ａ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｂ）は硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、２個の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｃ）は還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合し、更にそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つことが判明した。
【０１３３】
以上、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕは、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持ち、少なくとも１つ以上のＤ−マンノースにＬ−フコースが結合している構造を有する。
【０１３４】
また、下記一般式（VIII）で表される部分構造を有する（但し、式中の少なくとも１つのアルコール性水酸基は硫酸エステル化しており、またｎは１以上の整数を表す）。
【化１４】
0003916394.tif 000016
【０１３５】
本発明により、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｕが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは構成糖としてウロン酸を含有し、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも上記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物より選択される１ 種以上の化合物が生成する。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｕを調製することができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコース硫酸含有多糖を提供することができる。
【０１３６】
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはフコース硫酸含有多糖−Ｆの有する強い抗凝血活性を有さず、抗凝血活性を実質上示さないフコース硫酸含有多糖が提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは純化されたフコース硫酸含有多糖として制がん剤、抗転移剤、発がん予防剤等に使用でき、また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用である。更にこのフコース硫酸含有多糖−Ｕより、上記式（Ｉ）、（II）、（III）等の構造を有するオリゴ糖が製造でき、これらの新規化合物の製造にも有用である。
【０１３７】
次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ及びその製造方法について記載する。本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際にはフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよく、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多糖−Ｕを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素はフコース硫酸含有多糖−Ｕを選択的に分解できる酵素であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例えば、フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．  ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が生産する上記のエンド型フコイダン分解酵素が挙げられる。
【０１３８】
本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利に進むように基質濃度や温度、ｐＨ等を設定すればよいが、基質濃度は通常０．１から１０％程度、温度は２０から４０℃付近、ｐＨは６から９付近が望ましい。
【０１３９】
また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地に添加し、フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物はフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよいが、具体的には上記記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）又はフコイダノバクター  マリナス（Fucoidanobacter marinus) ＳＩ−００９８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３）が挙げられる。
【０１４０】
培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、該分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【０１４１】
また、培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、フコース硫酸含有多糖−Ｕの分解活性が最大になるように設定するのはもちろんのことであるが、一般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９で、５〜７２時間の通気かくはん培養を行えばよい。培養終了後、低分子化したフコース硫酸含有多糖−Ｕや培地中のフコース硫酸含有多糖−Ｆ以外の成分は限外ろ過などで除去すればよい。
【０１４２】
なお、上記のフコイダノバクター  マリナスＳＩ−００９８株は、青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
１．フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８
ａ．形態的性質
（１）本菌は双球菌（短かん菌）である。
幅        ０．５〜０．７μｍ
長さ      ０．５〜０．７μｍ
（２）胞子の有無      なし
（３）グラム染色性    陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育の温度範囲
３７℃で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。
（２）酸素に対する態度    好気性
（３）カタラーゼ          陽性
（４）オキシダーゼ        陰性
（５）ウレアーゼ          陰性
（６）加水分解
デンプン              陽性
ゼラチン              陰性
カゼイン              陰性
エスクリン            陽性
（７）硝酸塩の還元                陰性
（８）インドールの生成            陰性
（９) 硫化水素の生成              陽性
（10) ミルクの凝固                陰性
（11）ナトリウムの要求性          陽性
（12）塩類要求性
０％食塩培地での生育          陰性
１％食塩培地での生育          陰性
海水培地での生育              陽性
（13）キノン系        メナキノン７
（14）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量      ６１％
（15）細胞壁のジアミノピメリン酸      陰性
（16）グリコリル試験              陰性
（17）ヒドロキシ脂肪酸の存在      陽性
（18）ＯＦ−テスト        Ｏ
（19）集落の色調          特徴的な集落色素を生成せず
（20）運動性              あり
（21）滑走性              なし
（22）鞭毛                極単毛
【０１４３】
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネイティブ  バクテリオロジー、第９巻（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、ＧＣ含量が６１％の点でグループ４に属する菌と大いに異なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。
【０１４４】
グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム属及びシトファーガ（Cytophaga)属は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細菌のＧＣ含量は、土壌細菌であるシトファーガ  アーベンシコラ（Cytophaga arvensicola)が４３〜４６％、海洋細菌であるシトファーガ  ジフルエンス（Cytophaga diffluens)、シトファーガ  ファーメンタンス（Cytophaga fermentans) 、シトファーガ  マリーナ（Cytophaga marina) 、及びシトファーガ  ウリギノーサ（Cytophags uliginosa)が４２％であり、本菌株の性質とは全く異なる。更に、本菌株と既同定株の１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株ベルコミクロビウム  スピノサム（Verrucomicrobium spinosum)においてもその相同性は、７６．６％であった。１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性が９０％以下の場合、両細菌の属が異なることは一般に広く知られていることから、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８と命名した。
【０１４５】
なお上記菌株は Fucoidanobacter marinus  ＳＩ−００９８と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１４８７３として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５４０３（国際寄託への移管請求日：  平成８年２月１５日）として寄託されている。
【０１４６】
本発明者らは前述のように０．６〜３Ｍの１種類又は２種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことも見出した。
【０１４７】
例えば本発明の方法を用いて、フコース硫酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを分離することができる。
【０１４８】
まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６〜３Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こうして塩濃度を調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、沈殿を集めると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆが得られる。
【０１４９】
しかし上記塩濃度を２Ｍ超にすると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆが塩化セチルピリジニウムにより沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する目的では通常１．５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる（図１の説明参照）。
【０１５０】
次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを得る。こうして得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。
【０１５１】
本発明者らは、前述の様にフコース硫酸含有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなることも見出している。すなわち、本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオン源となる薬品を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１ｍＭ以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェントによりフコース硫酸含有多糖−Ｆを溶出させる。本方法を用いる場合、添加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。
【０１５２】
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは例えば実施例８に記載のように得ることができる。以下、このフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆはこの例に限定されるものでは無い。
【０１５３】
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により求めたところ、約１９万を中心とした分子量分布を示した（図１７参照）。なお、図１７において、縦軸はフェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション  ナンバーを示す。
【０１５４】
また、ゲルろ過の条件を下記に示す。
カラムサイズ：  ３．０８×１６２．５ｃｍ
溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
流速：１．５ｍｌ／分
サンプル濃度：０．２５％
サンプル液量：２０ｍｌ
分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社製）
【０１５５】
次に、得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの成分を分析した。
まず、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従いフコース量を定量した。
【０１５６】
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
【０１５７】
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
【０１５８】
次に、アナリティカル  バイオケミストリー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
【０１５９】
次に、バイオケミカル  ジャーナル（Biochemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
【０１６０】
以上の結果、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル比は約１０：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
【０１６１】
１％のフコイダン−Ｆ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの前出のフラボバクテリウムｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応による分解物の生成は認められず、その低分子化も認められなかった。
【０１６２】
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆのカルシウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計  ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社製）により測定したところ図１８に示すスペクトルが得られた。なお、図１８において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ−１）を示す。
【０１６３】
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆのナトリウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）により測定したところ、図１９に示すスペクトルが得られた。
【０１６４】
図１９中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、  １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ）
５．３０（フコースの１位のＨ）、１．１９（フコースの５位のＣＨ３のＨ）
【０１６５】
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−１３５度であった。
【０１６６】
本発明により、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは構成糖としてウロン酸を実質的に含有せず、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｆを調製することができ、糖組成、還元末端等の理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース硫酸含有多糖−Ｆを提供することができる。
【０１６７】
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは、実質上抗凝血活性を有さないフコース硫酸含有多糖−Ｕと分離しているため、強い抗凝血活性を有しており、該フコース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又はその分解物は純化されたフコース硫酸含有多糖として抗凝血剤に使用でき、また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用である。
【０１６８】
本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物をがん細胞の培養液に１μｇ／ｍｌ以上の濃度で添加すれば、添加後１日から数日で癌細胞はアポトーシスを起こす。すなわち、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物は強いアポトーシス誘発作用を有する。なお、これらの物質は正常細胞にはアポトーシスを誘発せず、毒性も示さない。特に、食用褐藻植物、ナマコ由来のフコース硫酸含有多糖、その分解物は安全性が高い。
【０１６９】
本発明のアポトーシス誘発剤を製剤化するには、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せればよい。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体を添加することにより液状となし得る乾燥品とすることができる。
【０１７０】
本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤、あるいは注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【０１７１】
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。これらの具体例としては、以下に示す物が挙げられる。
（結合剤）デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。
（崩壊剤）デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。
（界面活性剤）ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０。
（潤沢剤）タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール。
（流動性促進剤）軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム。
【０１７２】
また、経口用の液剤としては、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることができ、これらの各種剤型には矯味、矯臭剤、着色剤を配合してもよい。
【０１７３】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
【０１７４】
本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
【０１７５】
本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
【０１７６】
制がん作用を有する、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
【０１７７】
制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【０１７８】
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
【０１７９】
制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
【０１８０】
制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【０１８１】
発がん抑制作用を有する、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば発がん予防剤を製造することができる。発がん予防剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
【０１８２】
発がん予防剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【０１８３】
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
【０１８４】
発がん予防剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
【０１８５】
発がん予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【０１８６】
本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物は天然由来物質であり、マウスに経口投与を行っても毒性は認められない。
【０１８７】
本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又は昂進あるいはがん疾患、ウイルス性疾患等の治療剤として用いることが期待される。発がん予防剤として健康保持に使用することができる。また本発明のアポトーシス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウイルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等に有用である。特に、食用褐藻植物、食用ナマコから、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物を調製すれば、これらは食品として長い歴史を有するものであり、これらから調製したフコース硫酸含有多糖、その分解物は、経口投与の場合において、極めて安全性の高いものである。
【０１８８】
次にフコース硫酸含有多糖は極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるより、抗原性、均一性、抗凝血活性などの改善のため、フコース硫酸含有多糖をある程度分解することが必要とされているが、本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｆのみを選択的に分解する酵素、該酵素を作用させて得られるフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物が提供された。
【０１８９】
本発明に使用される菌株としては、アルテロモナス（Alteromonas）属細菌に 属し、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよい。また、該エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖に作用させれば、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を得ることができる。
【０１９０】
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
ａ．形態的性質
（１）本菌はかん菌である。
幅    約１μｍ
長さ  約２μｍ
（２）胞子の有無    なし
（３）グラム染色性  陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育の温度範囲
好適な生育温度は１５−３０℃である。４℃あるいは４０℃では生育できない。
（２）酸素に対する態度    好気性
（３）カタラーゼ      陽性
（４）オキシダーゼ    陽性
（５）リパーゼ        陽性
（６）資化性
グルコース        陽性
マンノース        陰性
スクロース        陽性
ラクトース        陰性
セロビオース      陽性
メリビオース      陰性
マンニトール      陽性
グリセリン        陽性
メタノール        陰性
ＤＬ−リンゴ酸    陰性
コハク酸          陰性
フマル酸          陰性
クエン酸          陰性
サリシン          陰性
（７）加水分解
デンプン    陰性
ゼラチン    陰性
（８）硝酸塩の還元                  陰性
（９）脱窒反応                      陰性
（１０）アルギン酸の分解            陽性
（１１）β−ヒドロキシ酪酸の利用    陰性
（１２）ポリヒドロキシ酪酸の蓄積    陰性
（１３）ナトリウムの要求性          陽性
（１４）塩類要求性
０％食塩培地での生育      陰性
１％食塩培地での生育      陰性
海水培地での生育          陽性
（１５）キノン系            ユビキノン８
（１６）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量    ３６％
（１７）ＯＦ−テスト  Ｏ
（１８）集落の色調    特徴的色素を生成せず
（１９）発光性        陰性
（２０）運動性        陽性
（２１）鞭毛          極単毛
【０１９１】
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  システィマティック  バクテリオロジー、第１巻、第３４３〜３５２頁（１９８４）、及びバージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネイティブ  バクテリオロジー、第９巻、第７５頁、第１３２〜１３３頁（１９９４）に記載されているアルテロモナス属細菌と同定した。しかしながら、本細菌の生理的性状は文献に記載されているいずれの菌種とも一致せずＧＣ含量も低い値であった。そこで、本菌株をアルテロモナス  ｓｐ．
ＳＮ−１００９と命名した。
【０１９２】
なお上記菌株はAlteromonas ｓｐ．  ＳＮ−１００９と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成８年２月１３日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１５４３６として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７（国際寄託への移管請求日：  平成８年１１月１５日）として寄託されている。
【０１９３】
本発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【０１９４】
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
【０１９５】
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは６〜９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産量は最高に達する。
【０１９６】
培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
【０１９７】
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
【０１９８】
上記のアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【０１９９】
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化された本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を得ることができる。
【０２００】
また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
【０２０１】
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。
（ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｆに作用して、該フコース硫酸含有多糖−Ｆを低分子化させる。
（ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium)  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用しない。
（ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium)  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（Ｉ）、（II）、（III）より選択される少なくとも一種以上の化合物が生成する。
【化１５】
0003916394.tif 000017
【化１６】
0003916394.tif 000018
【化１７】
0003916394.tif 000019
（ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近である（図２０）。
すなわち図２０は本酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた曲線であり、点線は下記（ｖ）−（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。
（iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付近である（図２１）。
すなわち図２１は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた場合の曲線であり、点線は下記（ｖ）−（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。
（iv）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたところ、約１０万であった。
【０２０２】
（ｖ）酵素活性の測定方法：
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素活性の測定は次のようにして行った。
【０２０３】
まず、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖−Ｆ、及びＰＡ−ＦＦを下記（１）から（３）の工程により調製した。
【０２０４】
（１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製
乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノール中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程をさらに３回繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、ろ過により抽出液を得た。  抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。  その沈殿を、８０％のエタノールで繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇを得た。
【０２０５】
（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇを６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじめ０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。
塩化ナトリウム濃度が０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を、３．３ｇ得た。
【０２０６】
（３）ＰＡ−ＦＦの調製
上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品１２ｍｇを水４８０μｌに溶解し、１２μｌずつ３６本に分注後、凍結乾燥しグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端を、ＰＡ化し、ＰＡ−ＦＦを得た。  得られたＰＡ−ＦＦを、１５ｍｌの１０％のメタノールを含む１０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液に溶解し、セルロファインＧＣＬ−３００のカラム（４０ｘ９００ｍｍ）によりゲルろ過し、高分子画分を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ３５００の透析膜を用いて充分透析して脱塩し、次にエバポレーターにより５ｍｌに濃縮して本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の基質用ＰＡ−ＦＦとした。
また、こうして得られたＰＡ−ＦＦを、市販のピリジル−（２）−アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）と比較することにより定量したところ約４０ｎｍｏｌであった。
【０２０７】
上記（１）及び（２）の工程により得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆを用いて本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。
【０２０８】
すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
【０２０９】
対照として、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
【０２１０】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
｛（12 ×2.5)/(100 ×MF) ｝×｛(MF/M)-1｝×｛0.12/(180 ×0.01) ｝＝U/ml（１２×２．５）／１００：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ）
ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
０．１２：反応液総量（ｍｌ）
【０２１１】
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４（８ｍｍ×３００ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
【０２１２】
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
【０２１３】
上記（１）〜（３）の工程により得られたＰＡ−ＦＦを用いて本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。
【０２１４】
すなわち、８ｐｍｏｌ／μｌのＰＡ−ＦＦ溶液２μｌと、５μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１０μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、２３μｌの水と、５０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ８．２）と、１０μｌの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、８０μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
【０２１５】
対照として、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びＰＡ−ＦＦ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
【０２１６】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖のフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
16×10−６×｛（MF/M)-1 ｝×｛1/(180×0.01) ｝＝Ｕ／ml
１６ｘ１０−６：反応系中に添加したＰＡ−ＦＦ（μｍｏｌ）
ＭＦ：基質ＰＡ−ＦＦの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
【０２１７】
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３（8 mm ×300 mm）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０％のジメチルスルホキシドを含む２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液
検出：蛍光検出器 F-1150（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波 長４００ｎｍで検出。
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
【０２１８】
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）をグライコタッグ及びグライコタッグリージェント  キットを用いて還元性末端を、ＰＡ化し、様々な分子量のＰＡ化プルランを得た。得られた様々な分子量のＰＡ化プルランを上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
【０２１９】
タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
【０２２０】
本発明者らは、以下に述べるように、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の作用機作を決定した。
【０２２１】
（１）エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｆの分解及び分解物の調製
精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆに本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させ、分解物の調製を行った。
【０２２２】
まず、フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産を行った。すなわち、アルテロモナスｓｐ．  ＳＮ−１００９  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン１．０％、酵母エキス０．０２％、前記のガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌの粗酵素を得た。
【０２２３】
こうして得られた粗酵素のうち４０ｍｌと、人工海水４４ｍｌと、前記のフコース硫酸含有多糖−Ｆ５１０ｍｇと水３６ｍｌを混合し、ｐＨを８に調整し、２５℃で４８時間反応後、セルロファインＧＣＬ−３００によりゲルろ過を行い、４画分に分け、分子量の大きな方から順に、Ｆ−Ｆｄ−１（分子量２５０００超）、Ｆ−Ｆｄ−２（分子量２５０００〜１２０００超）、Ｆ−Ｆｄ−３（分子量１２０００〜６５００超）、及びＦ−Ｆｄ−４（分子量６５００以下）とした。これらの４画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ１７０ｍｇ、２７０ｍｇ、３００ｍｇ、及び３４０ｍｇ得た。
【０２２４】
フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物、すなわち低分子化物のセルロファインＧＣＬ−３００によるゲルろ過の結果を図２２に示す。図２２において縦軸は４８０ｎｍの吸光度（フェノール硫酸法による発色量）、横軸はフラクションナンバーを示し、１フラクション１０ｍｌである。カラムボリュームは１０７５ｍｌであり、溶出液は１０％のエタノールを含む０．２Ｍの酢酸アンモニウム溶液である。
【０２２５】
図２２中、白丸印はフコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれゲルろ過した結果を表す。
【０２２６】
上記セルロファインＧＣＬ−３００の結果から、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の反応生成物の分子量分布は約１０００〜３万程度であることが判明した。
【０２２７】
（２）酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析
上記のＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の一部をグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端をＰＡ化し、得られた各ＰＡ化糖（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）を４規定の塩酸、１００℃、３時間処理により加水分解し、ＨＰＬＣにより還元末端糖を調べた。
【０２２８】
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（4.6 mm× 150 mm）（宝酒造社製）
溶離液：７００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ ９）：アセトニトリル＝９：１
検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、 蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
【０２２９】
この結果、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）の還元末端糖は総てフコースであった。
【０２３０】
また、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の中性糖組成を下記の方法により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有多糖−Ｆを硫酸加水分解後グライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて構成糖の還元性末端をＰＡ化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を分析したときと同じＨＰＬＣ条件で分析したところ、フコースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立体配位はそれぞれＬ及びＤであったので生成物に関してもＬ−フコースとＤ−ガラクトースのみを測定した。
【０２３１】
すなわち、構成糖の一つであるＤ−ガラクトースの含量を調べるためにＦ−キット  乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ社製）を用い、説明書に従ってＤ−ガラクトースのみを測定できる反応系を構築し、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。
【０２３２】
更にもう一方の構成糖であるＬ−フコースを定量するために、クリニカル  ケミストリー（Clinical Chemistry)、第３６巻、第４７４〜４７６頁（１９９０）記載の方法に従って、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。
【０２３３】
以上の結果Ｌ−フコースとＤ−ガラクトースの比率はＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４それぞれおよそ１００：４４、１００：２７、１００：５、及び１００：１であった。
【０２３４】
以上の結果をまとめると、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｆに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量約１０００〜３万程度の低分子化物を生成し、その低分子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高いことが判明した。なお、低分子化物の還元性末端はすべてＬ−フコースであった。
【０２３５】
次に、本酵素の基質特異性を調べるためにフコース硫酸含有多糖−Ｕに本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させた。
【０２３６】
すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（１．６ｍＵ／ｍｌ）とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
【０２３７】
対照として、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代わりに、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたものを用意し、同様にＨＰＬＣにより分析した。
【０２３８】
なお、ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４（8 mm× 300 mm）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
【０２３９】
その結果、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕを全く低分子化しなかった。
【０２４０】
既述のように、本発明は、上記した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素と、カルシウム源とを含有する酵素組成物に関する。
【０２４１】
使用可能なカルシウム源としては、固形組成物においては、例えば塩化カルシウム、炭酸カルシウム、酢酸カルシウムのようなカルシウム塩、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、あるいはそれらの水和物などが挙げられる。他方、水、アルコール等の溶媒中に溶解、懸濁、乳化させた液状組成物においては、カルシウム源は、前記したような単体であっても、あるいは溶解などによりイオン化した状態のものであってもよい。
【０２４２】
これらカルシウム源は、当該酵素を賦活又は安定化するので有効である。
【０２４３】
したがって、上記酵素組成物は上記したカルシウム源の作用効果を阻害しない範囲で、用途に応じて常用の添加剤を含有していてもよい。
【０２４４】
本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物に作用させることによって、フコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を調製することができる。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物としては、例えばフコース硫酸含有多糖−Ｆ精製品でもよく、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中のフコース硫酸含有多糖濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して選定すればよい。
【０２４５】
フコース硫酸含有多糖−Ｆ溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低分子化物の分子量を調整することができる。
【０２４６】
次に低分子化物を分子量分画することによって、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｆ低分子化物を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本発明の低分子化物の乾燥品を調製することもできる。
【０２４７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。
【０２４８】
実施例１
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を熱水で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出液１．８リットルを凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖標品１５．４ｇを得た。次に残りの抽出液に０．４Ｍとなるように食塩を加え、更に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は７６ｇであった。
【０２４９】
実施例２
マ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し、８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返し、エタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を熱水で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出液に０．４Ｍとなるように食塩を加え、更に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．３Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は５２ｇであった。
【０２５０】
実施例３
マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出
マ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出液３６リットルを得た。
【０２５１】
実施例４
マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の調製
実施例３で得られたろ液に、５％の塩化セチルピリジニウムを、それ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．３Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は５２ｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。
【０２５２】
実施例５
実施例４記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カルシウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそれぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分に洗浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸含有多糖しか吸着しなかった。
また、いずれのカラムにおいても、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕは実質的に分離された。
【０２５３】
実施例６
ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。
このろ液を排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器により２リットルに濃縮し、次に、終濃度が１．５Ｍとなるように食塩を添加し５％の塩化セチルピリジニウムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過により１リットルに濃縮し、４リットルのエタノールを添加し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に１００ｍｌの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水２リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥したフコース硫酸含有多糖−Ｕの重量は１５ｇであった。また、この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。
またこのフコース硫酸含有多糖−Ｕは、前記エンド型フコイダン分解酵素を作用させると上記式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるオリゴ糖を生じた。
【０２５４】
実施例７
ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。得られたろ液に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈澱を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度を０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は９０ｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。  このフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を７ｇ秤量し、０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解した。次に、４０００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを０．２Ｍの塩化カルシウムで平衡化した。０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムで充分洗浄し、次に、０〜４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が０．０５〜０．８Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖−Ｆと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｕを２．１ｇ得た。
また、上記溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が０．９〜１．５Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖−Ｕと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｆを４．７ｇ得た。
【０２５５】
実施例８
フコース硫酸含有多糖−Ｆの製造
実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１．２ｇ秤量し、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液に終濃度０．２％となるように溶解し、１．２５％の塩化セチルピリジニウムの１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により集め、この沈殿を５００ｍｌの１．５Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水５００ｍｌに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は７１０ｍｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆであった。
【０２５６】
実施例９
フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素的精製方法
実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１０ｇ秤量し、５００ｍｌの人工海水に溶解後、前記フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素を５Ｕ添加し２５℃、５０時間反応させた。反応液を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は６ｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まず、フコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆであることが判明した。
【０２５７】
実施例１０
フコース硫酸含有多糖−Ｆの培養的精製方法
実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２００ｇと酵母エキス４ｇを加え、３０リットルのジャーファーメンターに入れ滅菌後、前記フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を植菌して２５℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離し菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は３６ｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆであることが判明した。
【０２５８】
実施例１１
実施例７記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カルシウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそれぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分洗浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸含有多糖しか吸着しなかった。
また、いずれのカラムにおいても、フコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕは実質的に分離された。
【０２５９】
実施例１２
実施例１記載のフコース硫酸含有多糖混合物を７ｇ秤量し、８００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解した。次に、４リットルのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを０．２Ｍの塩化カルシウムで平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖溶液を全量カラムにかけ、８リットルの０．２Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄後、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内ウロン酸が検出される画分（塩化ナトリウム濃度約０．９Ｍ以下：フコース硫酸含有多糖−Ｕ）、ウロン酸が検出されない画分（塩化ナトリウム濃度約１．２Ｍ付近：フコース硫酸含有多糖−Ｆ）のそれぞれを脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ１．４ｇ及び４．８ｇ得た。
【０２６０】
実施例１３
実施例１で得られるフコース硫酸含有多糖混合物に、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するエンド型フコイダン分解酵素を作用させると下記の構造を有するオリゴ糖を生成する。
【化１８】
0003916394.tif 000020
【化１９】
0003916394.tif 000021
【化２０】
0003916394.tif 000022
【０２６１】
本発明者らは、下記の酵素反応を行い、上記オリゴ糖を得た。
【０２６２】
すなわち、２．５％の実施例１のフコース硫酸含有多糖混合物溶液８０ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム２０ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵素溶液４０ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。
【０２６３】
反応液をセルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分を分離し、再度脱塩後、凍結乾燥した。こうして上記各式（Ｉ）、（II）、（III）のオリゴ糖をそれぞれ２５０ｍｇ、３１０ｍｇ、５２ｍｇ得た。
【０２６４】
実施例１４
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物１０ｇを０．２Ｍのクエン酸５００ｍｌに溶解し、ｐＨを２．９に調整後、１００℃で３時間処理した。この加水分解物に１Ｍの酢酸カルシウム溶液を１５０ｍｌ添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去後セルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過で分子量分画し（分子量５０００以上、５０００〜３０００超、３０００〜２０００超、２０００〜１０００超、１０００〜５００超、５００以下）、分子量の大きい方から順に、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−１、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−２、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−３、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−４、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−５、及びＧＦｄ−Ｏｌｉ−６とした。これらの６画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ２．３ｇ、１．７ｇ、０．８８ｇ、１．８ｇ、１．４ｇ、及び０．７２ｇ得た。
【０２６５】
実施例１５
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２００ｇと酵母エキス４ｇを加え３０リットル容のジャーファーメンターに入れ滅菌後、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を植菌し２５℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は３６ｇであった。
【０２６６】
実施例１６
マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、かくはんしながら４リットルのエタノールを添加し、１時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのフコース硫酸含有多糖を得た。
【０２６７】
実施例１７
ヒバマタ（Fucus vesiculosus ）を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し、８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０リットルの水に懸濁後、１００℃、２時間処理し、ろ過した。ろ液に０．５Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、更に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ塩化ナトリウムに懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に２５０ｇの塩化ナトリウムを加え、３リットルのエタノール中に懸濁し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの塩化ナトリウム３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したＤＥＡＥーセルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び塩化ナトリウムを完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖の重量は９２ｇであった。
【０２６８】
実施例１８
わかめ（Undaria pinnatifida)を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルのエタノールに懸濁し、７５℃、１時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して８０％のエタノールを９リットル添加、かくはんし、８０℃、１時間処理後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して、上記８０％エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返し、エタノール洗浄残渣１９０８ｇを得た。この残渣のうち６８４ｇを９リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウムに懸濁後、９５℃、１時間処理し、２４時間静置後その上清を得た。上清を除去した沈殿に９リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウムを添加かくはんし、１時間静置後上清を得、上記上清と合せた。こうして得られた上清をろ紙でろ過後、排除分子量１０，０００のホロファイバーを備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、３５０ｍｌに濃縮した。濃縮液を遠心分離し、沈殿を除去後、２ｍＭの塩化ナトリウムを添加しながら限外ろ過し、完全に酢酸カルシウムを除去後、凍結乾燥し、凍結乾燥物３．２ｇを得た。凍結乾燥物中のフコース硫酸含有多糖の重量は３．１ｇであった。
【０２６９】
実施例１９
（１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製
乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノール中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程を更に３回繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピリジルクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、８０％のエタノールで繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇを得た。
【０２７０】
（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇを６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじめ０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を３．３ｇ得た。
【０２７１】
（３）エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の調製
アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２５時間培養して種培養液とした。  ペプトン２００ｇ、酵母エキス４ｇ、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）４ｍｌを含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、別に１２０℃、１５分殺菌した２リットルの人工海水に溶解した２０ｇの実施例８の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆ及び上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
培養上清中の本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の活性をフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いて測定したところ、５ｍＵ／ｍｌ・培養液であった。
得られた培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去し、８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、４００ｍｌの粗酵素を得た。
【０２７２】
得られた粗酵素液を、あらかじめ５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、及び６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集めた。
得られた部分精製酵素の活性はフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いて測定したところ、１０２００ｍＵ（１０．２Ｕ）であった。なお、他のフコース硫酸含有多糖分解酵素の混入は認められなかった。
得られた部分精製酵素の一部をあらかじめ１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したセファクリル  Ｓ−２００でゲルろ過を行い、その分子量を求めたところ約１０万であった。
【０２７３】
（４）上記実施例で得た部分精製酵素及びＰＡ−ＦＦをそれぞれ酵素源及び基質として本酵素の活性に及ぼすカルシウム濃度の検討を行った。
酵素反応に用いる緩衝液には５０ｍＭの酢酸、イミダゾール、及びトリス−塩酸を含むｐＨ７の緩衝液を用いた。また、反応液には終濃度４００ｍＭの塩化ナトリウムを溶存させた。
反応液中の塩化カルシウム濃度を０〜１００ｍＭまで変化させ、酵素活性を測定したところ、図２３に示すような結果が得られた。なお、図２３において、縦軸は相対活性（％）、横軸は反応液中カルシウム濃度（ｍＭ) を示す。
この結果、本酵素はカルシウム塩の存在下著しく活性が高められることが判明した。
【０２７４】
（５）本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を下記６種類の緩衝液で透析しながら５℃で２０時間保持した後、残存活性を測定した。
１．２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
２．５ｍＭアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
３．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
４．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
５．５ｍＭアジ化ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
６．５ｍＭアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
以上の結果、１、２、及び３の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素は失活し、４、５、及び６の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素は活性が保持された。
このことから本酵素は５００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下あるいは１０ｍＭのカルシウムイオンの存在下で安定化されることが判明した。
【０２７５】
（６）上記実施例で調製したフコース硫酸含有多糖−Ｆを５ｇ秤量し、４７１ｍｌの５０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）、１２．５ｍｌの４Ｍ塩化ナトリウム、６．２５ｍｌの４Ｍ塩化カルシウム、及び実施例１９−（３）で得られた本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の部分精製品１０ｍｌ（６ｍＵ相当）を混合し、２５℃で１２０時間反応させたところフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物が得られた。
得られた低分子化物のＩＲ及びＮＭＲの分析結果はそれぞれ図２５及び図２６に示すとおりであった。また、セルロファインＧＣＬ−３００でゲルろ過したところ、図２４に示す結果が得られた。すなわち、本物質は分子量１０００〜３００００にわたって分布するものである。
また、本物質の硫酸含量はＳＯ４（分子量９６）として４６％であり、中性糖組成はフコース：ガラクトース＝１００：４であった。
なお、図２４〜図２６における縦軸及び横軸は、それぞれ図２〜図４と同義である。
【０２７６】
実施例２０
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを４つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液〔ポアサイズ０．２０μｍのセルロースアセテート膜（コーニング社製）でろ過したもの（以下フィルター処理はこの条件で行った）〕を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４０時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及び０．５％のナトリウムラウロイルサルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネースＫを１μｌ添加して５０℃、１時間処理した。処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネータを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認された。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有多糖の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。
この結果より、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発されることが明らかとなった。
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を用い、実施例１、１２、及び１５で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２７７】
実施例２１
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌに対し、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で２０時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を「アポトーシス実験プロトコール」（秀潤社、田沼靖一監修、第９３〜９５頁、１９９５年）に従ってギムザ染色した。すなわち得られた細胞をカルノア固定液（酢酸：メタノール＝１：３）を用いてスライドグラス上に固定し、ギムザ色素（メルク社製）を用いて染色し、光学顕微鏡により観察したところアポトーシス特有の核の断片化が観察された。この結果よりＨＬ−６０細胞は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを起こすことが明らかとなった。
実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２７８】
実施例２２
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０５  コ／４．５ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液４．５ｍｌを４つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１５、及び１８で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕及び１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養開始後２４時間及び４０時間後に細胞数をトリパンブルー染色法で計測した。
【０２７９】
この結果を図２７に示す。図２７はＨＬ−６０細胞の培養液に実施例１、１５、及び１８で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０５  コ／５ｍｌ）を示す。図２７中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、□印が無添加（対照）、＋印が実施例１、・印が実施例１５、×印が実施例１８で得られたフコース硫酸含有多糖であることを示す。
【０２８０】
また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれらの結果から、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１５、及び１８で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明した。
実施例１、１５、及び１８で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、フィルター処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８１】
実施例２３
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）９ｍｌにヒト急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５２）を５×１０５ 個／９ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを５つ用意し、それぞれに実施例１、２、１２、及び１６で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で６０時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及び０．５％のナトリウムラウロイルサルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネースＫを１μｌ添加して５０℃、１時間処理した。処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネータを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認された。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有多糖の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。
この結果より実施例１、２、１２、及び１６で得られたフコース硫酸含有多糖はＭＯＬＴ−３細胞に対してアポトーシスを誘発することが判明した。
実施例１、２、１２及び１６で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、２．９ｇのリン酸水素二ナトリム１２水和物、及び０．２ｇのリン酸二水素カリウムを１リットルの水に溶解したもの）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８２】
実施例２４
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５２）をＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解後ろ過滅菌した実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬社製）の溶液をそれぞれ０．２ｍｌずつ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始２日、４日、６日、８日後の生細胞数をトリパンブルー染色法により計測した。
この結果を図２８に示す。すなわち図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図２８中、培地に添加した硫酸化多糖の種類は、○印が無添加（対照）、●印が実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、□印が実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、△印が実施例１７で得られたフコース硫酸含有多糖、■印が実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖であることを示す。デキストラン硫酸は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。
また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれらの結果から、ＭＯＬＴ−３細胞は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明した。
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬社製）の各溶液（０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解後、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの）のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８３】
実施例２５
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０４  個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液９００μｌを９つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、生理食塩水、及び実施例１で得たフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４、及び実施例１３で得られた３種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）フィルター処理液を１００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４０時間培養した。培養した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。
この結果、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加したＨＬ−６０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩水を添加したＨＬ−６０細胞は細胞数が約４倍に増加したが、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加したＨＬ−６０細胞は細胞数が全く増加しないものから１０分の１以下になるものまでが見られ、これらフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖のアポトーシス誘発作用によりＨＬ−６０細胞の増殖が抑えられることが判明した。
更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記のフコース硫酸含有オリゴ糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有オリゴ糖の場合と同じように、細胞の縮小及び細胞断片化がみられた。この結果より、ＨＬ−６０細胞は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−及び実施例１３で得られたフコース硫酸含有オリゴ糖によりアポトーシスを誘発されることが明らかとなった。
実施例１で得たフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び実施例１３で得られた３種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各溶液〔１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８４】
実施例２６
肺癌細胞Ａ−５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）、ＳＶ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５．１）、及び肝癌細胞ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）をそれぞれ１０４ 個／１．８ｍｌとなるよう、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及び実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で６日間培養した。培養した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。
この結果実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加した肺癌細胞Ａ−５４９、ＳＶ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３、及び肝癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩水を添加した各癌細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明した。
実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オートクレーブ処理物のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８５】
実施例２７
結腸癌細胞ＨＣＴ  １１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）、及び胃癌細胞ＡＧＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３９）をそれぞれ１０４ 個／１．８ｍｌとなるよう、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ' ｓ５ａ培地（ギブコ社製）、Ｈａｍ' ｓ  Ｆ１２培地（ギブコ社製）にそれぞれ懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及び実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４８時間培養した。培養した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。
この結果実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した結腸癌細胞ＨＣＴ  １１６及び胃癌細胞ＡＧＳはすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩水を添加した各種癌細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明した。
実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各ＰＢＳ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オートクレーブ処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８６】
実施例２８
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ  １１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の各溶液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパリン（和光純薬社製）及びデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬社製）を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始１日、２日、３日、４日後の生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年））記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０２８７】
得られた結果を図２９に示す。すなわち図２９はＨＣＴ  １１６細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌ、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図２９中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖あるいはオリゴ糖の種類は、○印が無添加（対照）、●印が実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、■印が実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物である。実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物の場合と実質的に同じ曲線を示した。またヘパリン及びデキストラン硫酸は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の場合と実質的に同じ曲線を示した。
【０２８８】
この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ  １１６細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸を添加したＨＣＴ  １１６細胞は細胞数がほとんど増加しないか、あるいは減少した。
【０２８９】
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸を添加したＨＣＴ  １１６細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸のアポトーシス誘発作用によりＨＣＴ  １１６細胞の増殖が抑制されることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の各溶液のフィルター処理液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパリン、及びデキストラン硫酸の各フィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９０】
実施例２９
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ  １１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０２９１】
得られた結果を図３０に示す。すなわち図３０はＨＣＴ  １１６細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図３０中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９２】
この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ  １１６細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ  １１６細胞は細胞数が減少した。
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ  １１６細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＣＴ  １１６細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９３】
実施例３０
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト胃癌細胞ＡＧＳをＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０２９４】
得られた結果を図３１に示す。すなわち図３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図３１中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９５】
この結果ＰＢＳを添加したＡＧＳ細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加したＡＧＳ細胞は細胞数が減少し、２ｍｇ／ｍｌを添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＡＧＳ細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度でＡＧＳ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９６】
実施例３１
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＬ−１５培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８）をＬ−１５培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０２９７】
得られた結果を図３２に示す。すなわち図３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図３２中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９８】
この結果ＰＢＳを添加したＳＷ４８０細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加したＳＷ４８０細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＳＷ４８０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度でＳＷ４８０細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９９】
実施例３２
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１８）を上記培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の各溶液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０３００】
得られた結果を図３３に示す。すなわち図３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図３３中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、○印が無添加（対照）、■印が実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、●印が実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖である。Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。
【０３０１】
この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を添加したＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少した。
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を添加したＷｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖はＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０３０２】
実施例３３
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１８）を上記培地にて５×１０３  コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０３０３】
得られた結果を図３４に示す。すなわち図３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４  コ／２ｍｌ）を示す。図３４中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０３０４】
この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加したＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。
また、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＷｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。
すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度でＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０３０５】
実施例３４
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０４ コ／９００μｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製６ウェルプレート上の各ウェルに４．５ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、実施例１９−（６）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を凍結乾燥したものを１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、フィルターろ過処理したものを０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として上記緩衝液のみを同量添加し、同様に培養した。培養開始２２時間後と４６時間後の生細胞数を組織培養の技術（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
この結果ＨＬ−６０細胞は上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を凍結乾燥したものによりアポトーシスを誘発され、細胞増殖速度が抑制されることが判明した。
【０３０６】
実施例３５
ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に５×１０４ 個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液を６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた実施例１９−（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞれ１００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４６時間培養した。
培養開始後２２時間及び４６時間に培養液中の生細胞数を測定した。
また、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を、ＡＳＦ１０４培地（味の素社製）に５×１０４ 個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液を６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞれ１００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４０時間培養した。
培養開始後１６時間及び４０時間に培養液中の生細胞数を測定した。
また、上記２種類の培養を行った細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。
この結果、ＡＳＦ１０４培地で培養した細胞においては、フコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を添加した細胞が総て細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈し、生細胞数はほとんど増加がみられなかったかあるいはほぼ完全に死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細胞数は約３倍に増加していた。一方、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した細胞においてはＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を添加した細胞のみが総て細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈し、細胞はほとんど死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細胞数は約３倍に増加し、フコース硫酸含有多糖−Ｆを添加した培地において細胞数は約２．５倍に増加していた。
以上の結果から、フコース硫酸含有多糖−Ｆは無血清培地で癌細胞に対して強いアポトーシス誘発作用を持つが、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４は、無血清培地でも血清培地でも非常に強いアポトーシス誘発作用を持つことが判明した。
【０３０７】
更に確認のため、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に５×１０４ 個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを２本用意し、それぞれに、１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞれ１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で１６時間培養した。  培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。  得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及び０．５％のナトリウムラウロイルサルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロテイネースＫを１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した。  処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネーターを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認された。  さらに確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤを上記のＦ−Ｆｄ−４の代わりに用いて同様に操作したところ、Ｆ−Ｆｄ−４の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。
すなわち、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｆを分解するとがん細胞に対するアポトーシス誘発作用が強くなることが判明した。
【０３０８】
実施例３６
２１才女性及び３２才男性の健常人静脈血を採血し、１リットル当りグルコースを１００ｍｇ、ＣａＣｌ２ ・２Ｈ２ Ｏを０．７４ｍｇ、ＭｇＣｌ２ を１９．９２ｍｇ、ＫＣｌを４０．２６ｍｇ、ＮａＣｌを７３７１ｍｇ、トリス−塩酸を１７５６．５ｍｇを含む液で２倍希釈後、リンパ球分離溶液（大日本製薬販売）をあらかじめ希釈血液の２倍容量を入れた遠心分離管の中に静かに重層し、１８〜２０℃、４００ｇで３０分間遠心分離した。遠心後、リンパ球分離溶液の上層のリンパ球画分を集めた。
こうして得られた健常リンパ球を１．９×１０５ 個ずつ２４ウェルのプレートに添加し、１．８ｍｌの１０％牛胎児血清（５６℃、３０分処理後のもの）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に０．２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌの上記各実施例で得られたフコース硫酸含有多糖、その分解物を１種類ずつ加えた培地を加え３７℃で培養した。コントロールとしてはフコース硫酸含有多糖溶液の代りに生理食塩水を添加した。培養開始後、顕微鏡で各ウェルの細胞の形態変化及び生細胞数を測定した。この結果、各種フコース硫酸含有多糖、その分解物を加えたウェルもコントロールのウェルも細胞形態に差がなく、また生細胞数の差もほとんど無く、１３日目にはどちらの細胞もほとんど死滅した。この結果より、フコース硫酸含有多糖、その分解物は癌細胞に対して強くアポトーシスを誘発させる濃度においても健常細胞に毒性を示さないことが判明した。
【０３０９】
実施例３７
フコース硫酸含有多糖−Ｕの固形がんに対する制がん作用
マウス固形がんＭｅｔｈＡ（４×１０６ｃｅｌｌｓ／マウス）を８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重約２０ｇ）の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ箇所に１０日間実施例６記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を皮下注射した。一方コントロール群には生理的食塩水を同様に皮下注射した。２週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出して、その重量を測定した。結果を表２に示す。すなわち、コントロール群では平均癌重量は１．２５ｇであったのに対し、フコース硫酸含有多糖−Ｕ投与群では０．２８ｇであり、有意（コントロール群に対しｐ＜０．０１）な制がん作用を示した。抑制率は７７．６％であった。
【０３１０】
【表２】
0003916394.tif 000023
【０３１１】
実施例３８
フコース硫酸含有多糖の発がん予防作用
（１）６週令のＳｐｒａｇｕｒｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄）１９匹に、７．４ｍｇ／ｋｇのアゾキシメタン（ナカライテスク社製）を背部皮下投与し、以降１週間に１回、１０週目まで背部皮下投与した。なお投与時は、アゾキシメタンを０．９％の塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、毎回１００μｌとなるように溶液の濃度を調整した。
上記１９匹中５匹に対しては最初のアゾキシメタン投与と同時に連日、実施例１の記載に準じ調製した、ガゴメ昆布熱水抽出液７０ｍｌを３０週目まで飲料水として経口投与した。この熱水抽出液は２ｍｇ／ｍｌのフコース硫酸含有多糖混合物を含有し、１４０ｍｇ／ｋｇのフコース硫酸含有多糖混合物が連日経口投与された。
なお上記１９匹中１４匹に対してはフコース硫酸含有多糖は投与せず、水道水を飲料水として与え、対照群とした。
３０週目までに対照群の外耳巣がん発生が１４匹中１４匹見られたのに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は５匹中１匹であり、顕著な発がん抑制作用が認められた。
なお３０週目までに対照群は３匹死亡したが、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は全匹生存した。また３０週目の対照群の平均体重が７１６ｇであるのに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群の平均体重は８１７ｇであった。一方アゾキシメタン非投与のラット群（５匹）の平均体重は７８８ｇであり、フコース硫酸含有多糖混合物投与群の体重増加はアゾキシメタン非投与のラット群と同等であった。
次に、対照群の４匹を選抜し、３０週目より連日、上記ガゴメ昆布熱水抽出液４０ｍｌ（フコース硫酸含有多糖混合物８０ｍｇ）を飲料水として経口投与した。３６週目において、４匹中２匹の外耳巣がんが顕著に退縮し、フコース硫酸含有多糖の制がん作用が認めらた。
以上フコース硫酸含有多糖の経口投与により、化学発がん剤による発がん予防作用、化学発がん剤による体重増加抑制の防止作用、更にはがん組織の退縮が認められた。
【０３１２】
実施例３９  注射剤
実施例１で製造したフコース硫酸含有多糖混合物を注射用蒸留水に溶解し５％溶液とした。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、フコース硫酸含有多糖として５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加した。
【０３１３】
実施例４０  注射剤
下記処方に従い注射剤を調製した。
0003916394.tif 000024
同様に実施例１２記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを使用し注射剤を調製した。
【０３１４】
実施例４１  錠剤
下記処方に従い錠剤を調製した。
フコース硫酸含有多糖標品（実施例１）        １０ｍｇ
コーンスターチ                              ６５ｍｇ
カルボキシメチルセルロース                  ２０ｍｇ
ポリビニルピロリドン                          ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ２ｍｇ
１錠当り                                  １００ｍｇ
【０３１５】
実施例４２  注射剤
Ｆ−Ｆｄ−１を注射用蒸留水に溶解し５％溶液とした。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、フコース硫酸含有多糖として５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加した。
【０３１６】
実施例４３  注射剤
下記処方に従い注射剤を調製した。
0003916394.tif 000025
【０３１７】
実施例４４  錠剤
下記処方に従い錠剤を調製した。
実施例１９−（６）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の低分子化物の凍結乾燥物                    １０ｍｇ
コーンスターチ                              ６５ｍｇ
カルボキシメチルセルロース                  ２０ｍｇ
ポリビニルピロリドン                          ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ２ｍｇ
１錠当り                                  １００ｍｇ
【０３１８】
【発明の効果】
本発明により不要若しくは病原細胞に対してアポトーシス誘発作用を有し、がん等の異常増殖細胞疾患や、ウイルス性疾患において、病変細胞にアポトーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な薬剤が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の薬剤を経口投与することによりがん細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、天然食品由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有効成分とする本発明の薬剤は非常に消化器系がんに適した制がん剤である。またその発がん予防効果により、化学発がん剤等による発がんも予防できる。本発明の薬剤は、食用の褐藻植物、食用のナマコ等、食用物質を原料として安価に大量に供給可能であり、且つ安全性が高い点においても優れている。また、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有する食品又は飲料を日常的に摂取することにより、健康を維持、増強することができる。また、本発明により簡便なアポトーシス誘発方法が提供され、本発明の方法を使用することにより、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等を行うことができる。
【０３１９】
また本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｆを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去した糖鎖工学、医学等の分野で有用な本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びその分解物が提供され、その効率的な製造方法も提供された。
【０３２０】
更に本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｕを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去した糖鎖工学、医学等の分野で有用な、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ及びその分解物が提供され、その効率的な製造方法も提供された。
【０３２１】
本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｆの構造解析や分解、フコース硫酸含有多糖−Ｆの生物活性の検索に有用なフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物の製造に用いることができるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素、その製造方法、及びがん細胞に対するアポトーシス誘発作用が強いフコース硫酸含有多糖−Ｆの該酵素による低分子化物が提供された。
【０３２２】
また、本発明によりこれまで安定的に製造されなかった本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を、カルシウムイオンの存在下極めて安定的に製造することができるようになった。さらに、本発明により、カルシウムイオンの存在下本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を極めて効率よく働かせることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示したものである。
【図２】図２はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量分布を示したものである。
【図３】図３はフコース硫酸含有多糖−ＵのＩＲスペクトルを示したものである。
【図４】図４はフコース硫酸含有多糖−Ｕの  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図５】図５は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示したものである。
【図６】図６は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示したものである。
【図７】図７は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示したものある。
【図８】図８は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図９】図９は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１０】図１０は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１１】図１１は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１２】図１２は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１３】図１３は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１４】図１４は糖化合物（ａ）の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図１５】図１５は糖化合物（ｂ）の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図１６】図１６は糖化合物（ｃ）の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図１７】図１７はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量分布を示したものである。
【図１８】図１８はフコース硫酸含有多糖−ＦのＩＲスペクトルを示したものである。
【図１９】図１９はフコース硫酸含有多糖−Ｆの  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２０】図２０は本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素のｐＨと相対活性の関係を示すグラフである。
【図２１】図２１は本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示すグラフである。
【図２２】図２２はセルロファインＧＣＬ−３００を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示したものである。
【図２３】図２３は本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の反応液中のカルシウムイオン濃度と相対活性の関係を示すグラフである。
【図２４】図２４は実施例１９−（６）においてセルロファインＧＣＬ−３００を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解したものの分子量分布を示したものである。
【図２５】図２５はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解したもののＩＲスペクトルを示したものである。
【図２６】図２６はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解したものの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２７】図２７はＨＬ−６０細胞の培養液に実施例１、１５、及び１８で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図２８】図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図２９】図２９はＨＣＴ  １１６細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図３０】図３０はＨＣＴ  １１６細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図３１】図３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図３２】図３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図３３】図３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図３４】図３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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