(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウイルスに対する抵抗性を植物に付与する方法であって、該方法は、該植物ウイルスにおいて発現されて該植物ウイルスの移行タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、該植物の細胞に導入する工程を包含する、方法であって、
ここで、該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、配列番号２の１位〜８６位に示される配列を含む、または該配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加された配列を含み、かつ該植物ウイルスの移行タンパク質に結合するか、あるいは、
ここで、該ポリヌクレオチドが、配列番号１の１４位〜２７１位に示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、
方法。
【請求項２】
前記植物ウイルスがＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物ウイルスがトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により作製された植物。
【請求項６】
前記植物が単子葉植物あるいは双子葉植物である、請求項５に記載の植物。
【請求項７】
前記植物がタバコである、請求項６に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（技術分野）
本発明は、植物ウイルスに対する抵抗性を植物に付与する方法に関する。より詳細には、植物ウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質を植物において発現させることにより、植物にウイルス抵抗性を付与する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（背景技術）
植物を侵す糸状菌および細菌は、細胞壁を壊す分解酵素などを分泌しながら植物に侵入する。これに対して植物ＲＮＡウイルスに属するタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）のような植物ウイルスは、細胞壁の分解酵素などの遺伝子をコードしておらず、物理的な傷からの侵入、昆虫または菌類の媒介によって初めて、細胞壁を乗り越えることができる。
【０００３】
いったん侵入したウイルスは、例えば、タバコモザイクウイルスでは、１日で１０６もの子孫をつくりだすような凄まじい増殖力を示す。これだけ増えれば植物が病気になるかという、そうではない。最初に感染を受ける細胞は、全体からするとごく一部であり、大半の細胞はまだ侵略を受けていない。多くの場合、葉の表面細胞が最初に感染を受け、葉肉細胞へと広がり、そこで次の複製を行う。そして周囲の葉肉細胞へと広がるという具合に、植物組織全体に広がっていく。このような植物ウイルスが隣り合った細胞へと広がる過程は、細胞間移行と呼ばれる。維管束鞘細胞、師部柔組織、伴細胞へと移行すると、次に師要素を通じて組織間の移行が開始される。この移行は、長距離移行と呼ばれる（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ第８巻、秀潤社、１４６〜１５５頁、第３章「ウイルス抵抗性のための戦略」第２項、渡辺雄一郎著、「植物ウイルスの細胞間移行」）。
【０００４】
ウイルスの感染に対する宿主植物の抵抗性反応としては、以下が挙げられる：（１）ウイルスの増殖量を抑える、あるいはウイルスが増殖してもほとんど病徴が現れない（トレランス）；（２）ウイルスが初めに侵入した細胞でのみ増殖し得、周辺細胞へのウイルスの移行が妨げられているため、植物体の全身に広がらない（サブリミナル感染）；（３）ウイルスは感染葉で増殖するが、感染葉から上位葉への長距離移行が抑制され、全身感染しない；および（４）ウイルスの感染初期に感染部位の組織が急速に壊死を起こし、局部壊死病斑が形成される。ウイルスが壊死組織内またはその周辺部に局在化し、従って全身感染が免れる（過敏感反応）。このような知見に基いて抵抗性機構をさらに解明するために、感染ウイルスと宿主植物の両方の観点から、生理生化学的分析および遺伝学的解析によって、ウイルス抵抗性の分子的研究がなされてきている（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ第８巻、秀潤社、１６６〜１７６頁、第３章「ウイルス抵抗性のための戦略」第３項、高橋英樹著、「ウイルスに対する宿主抵抗性」）。
【０００５】
植物ウイルスは、個々の細胞におけるゲノム複製、原形質連絡を介する細胞間移行、および師管部を介する長距離移行のような連続的な感染段階を介して増幅する（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８，１６６９−１６８１；Ｂａｋｅｒら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６，７２６−７３３）。これらの段階において、ウイルス移行は、移行タンパク質（ＭＰ）と呼ばれる１つ以上のウイルスコードタンパク質によって促進される（Ｄｅｏｍら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９，２２１−２２４）。この移行タンパク質は、種々の宿主因子と相互作用すると考えられている（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、前出；Ｂａｋｅｒら、前出）。機能的ドメインは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）を含む多数の植物ウイルスのＭＰにおいて特徴付けられている。ＴＭＶにおいて、２つのＲＮＡ結合ドメインは、ＭＰのＣ末端側半分において同定されている（Ｃｉｔｏｖｓｋｙら，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０，６３７−６４７）が、このようなドメインの１つのみが、ＣＭＶ ＭＰ（３ａタンパク質；Ｖａｑｕｅｒｏら，（１９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８，２０９５−２０９９）のＣ末端から３分の１の部位において同定されている。このようなＲＮＡ結合能を利用して、ウイルスは、核タンパク質複合体として細胞間を移行する（ＬａｚａｒｏｗｉｔｚおよびＢｅａｃｈｙ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１，５３５−５４８）。異なるウイルスファミリー由来のＭＰが、管状構造を形成すること（ｖａｎ Ｌｅｎｔら，（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２６１５−２６２３；Ｓｔｏｒｍｓら、（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１４，４８５−４９３；Ｈｕａｎｇら、（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７１，５８−６４）および原形質連絡を通過する物質のサイズ排除限界を増大させること（Ｗｏｌｆら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，３７７−３７９）が示されている。ＭＰは、小胞体、細胞骨格、および原形質連絡を含む種々の小細胞構造と関連して見出されている（Ｔｏｍｅｎｉｕｓら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０，３６３−３７１；Ａｔｋｉｎｓら，（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２０９−２１１；Ｈｅｉｎｌｅｉｎら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，１９８３−１９８５；ＭｃＬｅａｎら，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，２１０１−２１１４；Ｒｅｉｃｈｅｌら，（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４，４５８−４６３）。
【０００６】
ウイルスＭＰと相互作用する宿主因子が、近年関心を持たれている。トマトにおいて、Ｔｍ−２およびＴｍ−２２は、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）に対する抵抗性遺伝子として報告されている（Ｈａｌｌ，（１９８０）．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ２９，１８９−１９７；Ｆｒａｓｅｒ（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８，１７９−２００．２５）。Ｔｍ−２またはＴｍ−２２表現型を克服する変異ウイルス株は、ＭＰにおいてアミノ酸置換を有する。これは、ＭＰと抵抗性遺伝子産物との間の相互作用を示唆する（Ｍｅｓｈｉら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １，５１５−５２２；Ｗｅｂｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，６４３２−６４３８）。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤｎａＪファミリーにおける２つの相同タンパク質が、酵母ツーハイブリッドスクリーンにおいて、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）のＭＰと相互作用することが同定された（Ｓｏｅｌｌｉｃｋら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，２３７３−２３７８）。原形質連絡に局在するペクチンメチルエステラーゼは、ＴＭＶ ＭＰと相互作用することが見出された。このことは、この酵素がＭＰおよび／またはＭＰ／ＲＮＡ複合体を原形質連絡に導くことを示唆する（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６１，２２３−２２８；Ｃｈｅｎら、（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．１９，９１３−９２０）。長距離ウイルス移行に必要なＣＭＶ ２ｂタンパク質（Ｄｉｎｇら、（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，５７６２−５７７２）が、細菌におけるペニシリン耐性に関与する原核タンパク質ＬｙｔＢと非常に類似するタバコタンパク質と相互作用することが報告された（Ｈａｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ９，５４８−５５５）。Ｂｒｉｇｎｅｔｉら（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ １７ ６７３９ ６７４６は、ＣＭＶ ２ｂが、宿主植物において転写後遺伝子サイレンシングのサプレッサーとして機能することを提唱した。より近年では、Ｖｏｉｎｎｅｔら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０３，１５７−１６７は、ジャガイモＸウイルスのＭＰが、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて遺伝子サイレンシングシグナルの蔓延を防ぐことを報告した。
【０００７】
このように、植物ウイルスのＭＰに関する知見は多数存在するが、ウイルスに対する植物感染の防除および植物へのウイルスに対する抵抗性の付与に関連した報告は未だ存在しない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
（発明の開示）
本発明者らは、本発明者らにより同定した、植物ウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質を植物体で発現させることにより、植物ウイルスの移行タンパク質が、ウイルス感染植物宿主のタンパク質と相互作用することを妨げ、それによりこの植物ウイルスの細胞間移行を妨げ、当該植物ウイルスに対する抵抗性を宿主植物に与えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
１つの局面では、本発明は、植物ウイルスに対する抵抗性を植物に付与する方法に関する。この方法は、植物ウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、植物の細胞に導入する工程を包含する。
【００１０】
１つの実施形態では、上記タンパク質が、配列番号２の１位〜８６位に示される配列を含むタンパク質、または該配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加された配列を含み、かつ該植物ウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質である。
【００１１】
別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の１４位〜２７１位に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００１２】
１つの実施形態では、上記植物ウイルスは、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、好ましくは、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）である。
【００１３】
１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来する。
本発明の別の局面では、本発明の方法により作製された植物もまた提供される。
【００１４】
１つの実施形態では、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物である。１つの実施形態では、上記植物は、タバコである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明によれば、植物ウイルスに対する抵抗性を植物に付与する方法が提供される。「植物ウイルスに対する抵抗性を植物に付与する」とは、植物にウイルスが感染しても、ウイルスによる病害を生じさせない、またはそのような病害を最小限にとどめることをいう。本発明の方法は、植物ウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、植物の細胞に導入する工程を包含する。
【００１６】
本発明の方法に用いられるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、感染される植物ウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）に結合する。この相互作用により、感染ウイルスの移行タンパク質が、ウイルス移行に関与し得る、宿主植物中に存在する因子との相互作用が妨げられ、従って原形質連絡を介する細胞間のウイルスの移行を阻害し得る。上記タンパク質が植物で発現されると、植物ウイルスの細胞間移行、および従って組織間の移行（長距離移行）が阻害され得、結果、ウイルスによる病害が生じないか、またはそのような病害は最小限にとどめられる。従って、本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドは、植物ウイルスの移行タンパク質に結合し得るタンパク質を植物において発現して、植物ウイルスに対する抵抗性をこの植物に付与し得る。
【００１７】
本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドは、植物ウイルスのＲＮＡゲノムにコードされる移行タンパク質（ＭＰ）に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、植物のｃＤＮＡライブラリーから選抜され得る。以下、本明細書中では、この移行タンパク質に結合するタンパク質を、移行タンパク質相互作用タンパク質（ＭＩＰ）と称する。移行タンパク質相互作用タンパク質（ＭＩＰ）は、既知のタンパク質と結合する未知のタンパク質を検索できるウェストウェスタン法を用いることによって同定され得る。例えば、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）のＲＮＡゲノムにコードされる移行タンパク質（ＭＰ）に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、およびＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのような植物のｃＤＮＡライブラリーから選抜され得る。このようなＭＩＰとしては、例えば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍライブラリー由来のＭＩＰ２０４、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓライブラリー由来のＭＩＰ１０２、ＭＩＰ１０５、およびＭＩＰ１０６が挙げられるが、これらに制限されない。これらのＭＩＰの中では、ＭＩＰ１０２がトマトモザイクウイルス移行タンパク質と最も強い結合を示し得る。ＭＩＰ１０２のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列のそれぞれは、配列番号２および配列番号１に示される。
【００１８】
例示の移行タンパク質相互作用タンパク質ＭＩＰ１０２は、その全長およびＮ末端側に存在する部分が移行タンパク質に結合する。従って、１つの実施形態では、本発明の方法に使用されるポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から８６位のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。別の実施形態では、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６５位のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドはまた、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質がウイルス移行タンパク質に結合する機能を有する限り、上述の配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００１９】
１つの実施形態では、本発明におけるポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１の１４位〜２７１位に示されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、本発明におけるポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１の１４位〜５０８位に示されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
開示されたヌクレオチド配列およびそれによりコードされたタンパク質のフラグメントおよび改変体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」によって、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、従って、それによってコードされるタンパク質もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメントは、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１つ以上を保持するタンパク質フラグメントをコードし得る。本発明の方法においては、ウイルス移行タンパク質に結合する限り、開示されたヌクレオチド配列およびそれによりコードされたタンパク質のフラグメントもまた、使用され得る。
【００２１】
本発明におけるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型または人為操作から生じ得る。
【００２２】
本発明におけるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿入を包含する）で変化され得る。このような操作のための方法は、一般に、当該分野で公知である。例えば、本発明のストレス耐性を制御し得る植物遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中で引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００２３】
従って、「１もしくは数個が欠失、置換および／もしくは付加された」とは、遺伝的多型または人為操作（上述したような周知の方法を含む）によって置換、欠失および／もしくは付加され得る程度の数個のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加され得ることを意味する。
【００２４】
本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質がウイルス移行タンパク質に結合し得る、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから８６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質がウイルス移行タンパク質に結合し得る、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから１６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質がウイルス移行タンパク質に結合し得るタンパク質であって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから８６位のＧｌｙまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４位のＡから２７１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列）と、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドはまた、このポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質がウイルス移行タンパク質に結合し得る、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから１６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４位のＡから５０８位のＣまでに示されるヌクレオチド配列）と、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００２５】
本発明におけるポリヌクレオチドはまた、上述した領域のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の外側、すなわち、５’末端側または３’末端側に、さらなるヌクレオチド配列（例えば、非翻訳領域）を含み得る。好ましくは、本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドは、配列番号１の１位〜９１３位に示された全長配列からなる。ここで、本願発明のポリヌクレオチドは、配列番号１における縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできるＤＮＡを意味する。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを、縮重異性体と呼ぶこととする。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００２８】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性％を算定するためにＤＮＡ配列のアラインメントは、ＢＬＡＳＴのデフォルトのパラメーターを使用して行われ得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって、同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００３１】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して、記載されるアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、アミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００３２】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことである。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列を共有する。ペプチドの同一性比較のためにＧＥＮＥＴＹＸプログラムが使用され得る。このとき、デフォルトのパラメーターが使用され得る。
【００３３】
本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、ポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明の方法で用いられる全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２４３アミノ酸）をコードする。ＰＣＲプライマーについてハイブリダイゼーションプローブとして用いるための、植物ウイルスに対する抵抗性を付与するヌクレオチド配列のフラグメントは、一般に、植物ウイルスに対する抵抗性を付与するポリヌクレオチドにより発現されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００３４】
例示の移行タンパク質相互作用タンパク質ＭＩＰ１０２はＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓに由来するが、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ以外の他の植物に由来する、移行タンパク質相互作用タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた含み得る。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、開示された全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、本明細書中に記載の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。本明細書中に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって包含される。
【００３５】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、３２Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書で開示されたヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築のためのプローブの調製のための方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００３６】
例えば、本明細書中に開示された植物ウイルスに対する抵抗性を付与する植物遺伝子のヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する植物ウイルスに対する抵抗性を付与する植物遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、植物ウイルスに対する抵抗性を付与する植物遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する植物ウイルスに対する抵抗性を付与する植物遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために、または生物中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００３７】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００３８】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、４．４×ＳＳＣ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）、１×デンハート溶液、０．２％ＳＤＳおよび変性サケ精子ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中での、４２℃でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で室温での洗浄、最後の０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中での４２℃での洗浄が挙げられる。
【００３９】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００４０】
得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。
【００４１】
本発明におけるポリヌクレオチドは、代表的には、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００４２】
上述のようにして遺伝子工学的手法または化学合成手法のような手順に従って生成されたポリヌクレオチドが、所望の活性、すなわちウイルス抵抗性を付与することを、以下のようにして確認し得る。当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを生成し、これを適切な細胞で発現させたタンパク質が、目的とする植物ウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）に結合することを、下記の実施例１に記載の手順と実質的に同様の手順を用いて決定し得る。次いで、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、下記の実施例４に記載の手順と実質的に同等の手順を使用して、ウイルスと同時に植物細胞中に導入されたときウイルスの細胞間移行の抑制を示すことを、例えば、緑色蛍光遺伝子のようなレポーター遺伝子を指標にして確認し得る。
【００４３】
本発明の方法に用いられるポリヌクレオチドは、植物ウイルスに対する抵抗性をその植物に付与するが、この植物ウイルスは必ずしも特異的ではない。あるウイルスの移行タンパク質に結合する移行タンパク質相互作用タンパク質は、別のウイルスの移行タンパク質にも結合し得る。例えば、トマトモザイクウイルス移行タンパク質に結合する代表的なタンパク質のＭＩＰ１０２およびＡｔＫＥＬＰ（ＭＩＰ１０２全長とアミノ酸配列が約７５％同一であるタンパク質）はまた、アブラナ科モザイクウイルス（ｃｒｕｃｉｆｉｅｒ ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）およびキュウリモザイクウイルスに結合し得る。
【００４４】
本実施例では、例示のため、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）に対するウイルス抵抗性を示しているが、本発明の方法によって、植物は、他の植物ウイルスに対する抵抗性もまた付与され得る。抵抗性が付与され得る植物ウイルスとしては、例えば、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔｉｖｉｒｕｓ、Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ属のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用されるポリヌクレオチドは、抵抗性が付与されるべき植物ウイルスの移行タンパク質を同定し、実施例１に記載したようなウェストウェスタンスクリーニング法によって、この同定された移行タンパク質に結合するタンパク質を選択することによって入手され得る。
【００４５】
本発明におけるポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
【００４６】
「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遣伝子、およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００４７】
「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用いることができる。
【００４８】
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より詳細な環境または発生制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、病原菌の感染や侵入、植物の傷害、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，９５）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００４９】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【００５１】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【００５２】
ポリペプチド発現が所望される場合、一般に、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含めることが望ましい。このポリアデニル化領域は、天然遺伝子、種々の他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加されるべき３’末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子もしくはオクトピンシンターゼ遺伝子、または別の植物遺伝子に由来し得る。あるいは、より好ましくはないが、任意の他の真核生物遺伝子に由来し得る。
【００５３】
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、ｐＡＲＴ系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【００５４】
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物の細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。植物細胞には、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が含まれる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
【００５５】
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。パーティクルガン法は、例えば、Ｋｌｅｉｎら（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３；Ｃｈｒｉｓｔｏｎ，Ｐ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９２）２，２７５−２８１に記載されている。形質転換プロトコルおよび植物内へヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、形質転換について標的化される植物または植物細胞の型（すなわち、単子葉または双子葉）に依存して変化し得る。植物細胞内へのヌクレオチド配列の導入および引き続くその植物ゲノム内への挿入の適切な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｃｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、米国特許第５，５６３，０５５号）、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２）、および銃式（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓｒａ，米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら、米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；およびＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）が挙げられる。また、以下も参照のこと：Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）��ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇら、米国特許第５，３２２，７８３号および同第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｇａｍｂｏｒｇ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔら（１９８５）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｃｈａｐｍａｎｎら編（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７−２０９頁（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５ならびにＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＦｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（トウモロコシ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介する））（これら全ては、本明細書中で参考として援用される）。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００５６】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された細胞は、従来の方法に従って、植物に成長させ得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照のこと。
【００５７】
本発明におけるポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【００５８】
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。また、次いで、これらの植物を増殖させ得、そして同じ形質転換株または異なる株のいずれかで受粉させ得、そして所望の表現型特性を有する生じたハイブリッドを同定し得る。２以上の世代を成長させて、その表現型特性が安定に維持および遺伝されることを確認し得、種子を回収して、所望の表現型特性または他の特性が達成されていることを確認し得る。
【００５９】
本発明の方法により作製され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物の伝播体（花粉など）、および植物細胞、ならびにそれらの子孫への言及を含む。植物細胞は、本明細書中で使用される場合、限定されることなく、種子懸濁培養物、胚、メリステム領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物の両方を包含する。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含まれる。本発明の方法が適用される最も好ましい植物は、タバコである。
【００６０】
本発明に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００６２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００６３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００６４】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００６５】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
【００６６】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００６７】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
【００６８】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
【００６９】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００７０】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００７１】
本発明の方法によって付与されるウイルス抵抗性は、形質転換植物当代に加え、その後代植物にも遺伝し得る。形質転換当代植物および次世代植物、その伝播体（例えば、花粉）、およびその伝播体から生成された種子においても、本発明の方法によって付与されるウイルス抵抗性は発揮し得る。本発明の方法において用いられるポリヌクレオチドの後代への遺伝は、例えば、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドの配列をプローブとしたサザン分析またはＰＣＲ法によって確認され得る。
【００７２】
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組換え法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養、形質転換および植物再生について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野で知られる、およびこの書類を通じて提供される、種々の一般的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される）において記載されている。
【００７３】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００７４】
【実施例】
（実施例１：移行タンパク質に結合するタンパク質（ＭＩＰ）のファーウェスタン（「ウェストウェスタン」）スクリーニング）
ＴｏＭＶ ＭＰに結合する植物タンパク質を同定するために、λＧＥＸ５においてＮ．ｔａｂａｃｕｍおよびＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ発現ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡライブラリーの構築は以下のように行った。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ ＮＮの葉、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（Ｓ９／Ｓ９）の柱頭、Ａ ｔｈａｌｉａｎａ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａの花芽を、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるＲＮＡ単離、続いてＴｉｍｅ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるｃＤＮＡ合成に供した。λファージベクターλＧＥＸ５（Ｆｕｋｕｎａｇａら、（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１９２１−１９３３；これは、ＧＳＴリーディングフレームの下流にＩＰＴＧ誘導性プロモーターおよびｃＤＮＡ−クローニング部位を有する）を、発現ｃＤＮＡライブラリーの構築のために使用した。リン酸化オリゴヌクレオチドアダプター（５’−ＡＧＧＴＧＣＴＧＧ−３’，５’−ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡ−３’）をアニールし、ｃＤＮＡに連結させ、ＳｆｉＩ切断ベクターと適合する末端を作製した。ｃＤＮＡを、このベクターアームと連結し、そしてインビトロパッケージングに供した。ファージライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＢ４中で増幅させた。
【００７５】
メンブレン上に固定化した各ＧＳＴ融合ｃＤＮＡと、プロービングのために［γ３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化したＧＳＴ融合ＴｏＭＶ ＭＰ（ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰ）との間でのタンパク質間結合に基づいて、ＭＰ相互作用タンパク質（ＭＩＰ）のファーウェスタンスクリーニングを実施した。
【００７６】
［γ３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化したＧＳＴ融合ＴｏＭＶ ＭＰ（ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰ）を以下のように作製した。
【００７７】
まずＴｏＭＶ ＭＰ発現プラスミドを以下のように作製した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ＴｏＭＶ ＭＰ（ＧＳＴ−ＭＰ）の発現のためのプラスミドｐＧＥＸ−３０Ｋは、以前に記載された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２０９５−２１０２）。ＧＳＴとＭＰとの間にプロテインキナーゼＡのコンセンサスリン酸化配列を付加するために、５アミノ酸ＲＲＡＳＶをコードする合成オリゴヌクレオチド３０Ｋ−ＰＫＡ１（５’−ＡＡＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣ−３’）および３０Ｋ−ＰＫＡ２（５’−ＡＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＣＧ−３’）をアニールし、そしてｐＧＥＸ−３０ＫのＥｃｏＲＩ部に適切な方向で挿入し、ｐＧＥＸ−ＰＫＡ−３０Ｋを生成した。このプラスミドを、組換えタンパク質ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰの産生のために使用した。ｐＧＥＸ−ＰＫＡ−３０Ｋの１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ挿入片を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２ベクターのＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に配置し、ｐＧＥＸ−６Ｐ２−ＰＫＡ−３０Ｋを構築した。このプラスミドを、ＧＳＴ−Ｐ−ＰＫＡ−ＭＰの産生のために使用した。これは、ＧＳＴを除去し、そして組換えタンパク質ＰＫＡ−ＭＰを調製するために、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって切断することができる。
【００７８】
ｐＧＥＸ−３０ＫｄＡプラスミドおよびｐＧＥＸ−３０ＫｄＳＸプラスミドの構築は、以前に記載された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、前出）。ｐＧＥＸ−３０ＫｄＡによってコードされた組換えタンパク質ＧＳＴ−ＭＰｄＡは、このベクターに由来する２７の人工残基（ＱＶＡＬＦＧＥＭＣＡＥＰＬＦＶＹＦＳＫＹＩＱＩＣＩＲＳ）が置換されたＣ末端９アミノ酸の欠失を有した。ｐＧＥＸ−３０ＫｄＳＸによりコードされた別の組換えタンパク質ＧＳＴ−ＭＰｄＳＸは、ベクター由来の７残基（ＬＥＲＰＨＲＤ）が置換されたＣ末端の３１アミノ酸の欠失を有した。
【００７９】
組換えタンパク質の産生および精製は以下のように行った。組換えＧＳＴ融合タンパク質を、上述のようにして、適当なプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で産生させ、そして以前に記載されるように（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、前出）、グルタチオンセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用することにより精製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した抗ＧＳＴ抗体（ヤギ）を、ウェスタンブロッティング分析によって融合タンパク質を同定するために使用した。精製タンパク質を、ＮＥＴＮ−Ｄバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ）中に保存した。
【００８０】
３２Ｐ標識タンパク質プローブを以下のように調製した。約１μｇの組換えＧＳＴ融合タンパク質と結合体化させたグルタチオンセファロースビーズを、３．７ＭＢｑの［λ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１６８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）および１０単位のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含む２００μｌのキナーゼバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．５）中に懸濁した。この反応を、ローテーターで３０℃で３０分間続け、そして１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で４回ビーズを洗浄することにより終結させた。リン酸化されたタンパク質を、１０ｍＭグルタチオンを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーを用いてビーズから溶出した。示しているところで、リン酸化ＧＳＴ融合タンパク質を、結合実験のためのプローブとして使用する前に、ＧＳＴドメインを除去するために、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅで消化した。プローブの比放射能は、約１×１０７ｃｐｍ／μｇタンパク質であった。
【００８１】
ｃＤＮＡライブラリーのファーウェスタンスクリーニングを以下のようにして行った。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＢをファージライブラリーでの感染のために使用した。細菌を４２℃で３時間インキュベートし、１００〜２００／ｃｍ２の密度のプラークを得た。細菌プレートの上に、１０ｍＭ ＩＰＴＧで湿らせたニトロセルロースフィルターを重ね、そして３７℃で３．５時間さらにインキュベートした。フィルターを洗浄し、そしてブロッキング溶液Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬）中で４℃で１時間インキュベートし、その後４℃で１６時間３２Ｐ−標識ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰ（２×１０５ｃｐｍ／ｍｌ）とインキュベートした。次いで、このフィルターを、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加したＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．７６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で４回、各々５分間、洗浄し、そしてＢＡＳ１５００ｓｙｓｔｅｍ（富士写真フィルム）でオートラジオグラフィーにかけた。
【００８２】
いくつかの陽性クローンが単離された。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍライブラリーからはＭＩＰ２０４が、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓライブラリーからはＭＩＰ１０２、ＭＩＰ１０５、ＭＩＰ１０６が単離された。これらの陽性クローンのうち、ＭＩＰ１０２が、最も高い結合活性を示し、そしてこの結果、これをさらなる分析のために選択した。
【００８３】
ＭＩＰ１０２クローンから単離したファージＤＮＡを用いてＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２を産生する発現プラスミドｐＧＥＸ−Ｂｃ２を再構築し、これをタンパク質結合アッセイに使用した（図１）。
【００８４】
タンパク質間相互作用を、３２Ｐ標識タンパク質プローブと、メンブレン上に固定化した標的タンパク質との間の結合アッセイによって試験した。標的タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０％ ２−プロパノール，ｐＨ８．０）およびバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ β−メルカプトエタノール，ｐＨ８．０）で各々室温で１時間洗浄した後、メンブレンを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含むバッファーＢ中で室温で１時間インキュベートし、タンパク質を変性させた。再生のために、メンブレンを、５分間リンスし、そして０．０４％Ｔｗｅｅｎ４０を含有するバッファーＢ中に４℃で一晩インキュベートした。非変性系のために、タンパク質を、スロットブロッターを用いて、直接、ニトロセルロースメンブレン上に固定化した。メンブレンを、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで４℃で３０分間処理し、そしてＤＮａｓｅ Ｉ（１８μｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅ Ａ（６０μｇ／ｍｌ）を添加したＢｌｏｃｋ Ａｃｅ中で３２Ｐ標識タンパク質プローブと４℃で４時間インキュベートした。フィルターメンブレンを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳで各々５分間４回洗浄し、そしてオートラジオグラフィー分析に供した。これらの結果を図１に示す。
【００８５】
クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色ゲルにおいて、ＩＰＴＧで誘導されたとき４８ｋＤａタンパク質が観察された（図１Ａ，レーン２）。抗ＧＳＴ抗体を使用するウェスタンブロット分析は、このタンパク質がＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２であることを示した（データ示さず）。３２Ｐ標識ＴｏＭＶ−ＭＰプローブを使用することにより、特異的バンドが、誘導されたタンパク質に対応する位置で検出された（図１Ｂ、レーン２）が、このようなシグナルは、未誘導レーンでは観察されなかった（図１Ｂ、レーン１）。
【００８６】
続いて、ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２およびＧＳＴを、グルタチオンセファロースビーズを用いることにより精製し（図１Ｃ）、そして同じプローブを用いてタンパク質結合アッセイのためにそれらを使用した（図１Ｄ）。精製ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２は、陽性結合シグナルを与えたが（図１Ｄ、レーン１）、精製ＧＳＴは、与えなかった（図１Ｄ、レーン２）。この結果は、ＭＩＰ１０２クローンが、ＭＰとの特異的相互作用によって単離されたのであり、ＧＳＴ−ＧＳＴ相互作用によってプロービングされたわけではなかったことを示した。
【００８７】
（実施例２：ＭＩＰ１０２のｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡ分析）
ＭＩＰ１０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を以下のようにして決定した。
【００８８】
ファージＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ λキットを用いることにより、各クローンのプレート溶解物から調製した。ｃＤＮＡのさらなる分析のために、ファージＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、ｃＤＮＡ挿入片を有するｐＧＥＸ−ＰＵＣ−３Ｔベクターに対応するＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを自己連結し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、それからプラスミドクローンを回収した。ファージクローンＭＩＰ１０２から回収したプラスミドｐＧＥＸ−Ｂｃ２を、ＧＳＴ融合タンパク質ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２を産生するために使用した。
【００８９】
ヌクレオチド配列を、以下のプライマーを使用することにより決定した：ｐＧＥＸ１プライマー（５’−ＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧ−３’）、ｐＧＥＸ５プライマー（５’−ＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣ−３’）、Ｂｃ２Ｆ０３（５’−ＧＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧ−３’）、およびＢｃ２Ｒ０２（５’−ＧＣＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴ−３’）。
【００９０】
ＭＩＰ１０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（８９８ｂｐ（ポリＡを除く））を図２に示す。ＢＬＡＳＴを用いる相同性検索は、この推定タンパク質が、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの転写コアクチベーターＫＥＬＰ（ＡｔＫＥＬＰ；Ｃｏｒｍａｃｋら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４，６８５−６９２）と類似していた（７５％同一）ことを示した（図３）。ペプチド同士の同一性パーセントの評価のために、ＧＥＮＥＴＹＸプログラムを使用した。また、ＭＩＰ１０２は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＫＩＷＩ（Ｃｏｒｍａｃｋら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４，６８５−６９２）とは、３６％同一であった（図３）。関連タンパク質もまた、いくつかの他の分類学的に異なる生物（例えば、ヒト（ＰＣ４／ｐ１５，３６％同一）（ＧｅおよびＲｏｅｄｅｒ，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８，５１３−５２３；Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、前出）およびＳ．ｐｏｍｂｅ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子番号Ｚ９７１８５中のＣＡＢ１０００３．１というＰｒｏｔｅｉｎ ＩＤのタンパク質；１９％同一）において見出された。ＡｔＫＥＬＰとのＮ末端相同性に基いて（図３）、最初のＡＴＧコドンをＭＩＰ１０２の開始コドンとした。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、算定分子量１９，２２７ＤａおよびｐＩが４．８の１６５アミノ酸ポリペプチドをコードした。ＰＣ４／ｐ１５の一本鎖ＤＮＡ結合活性において示された高度に保存された領域が同定された（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、前出）（図３）。ＭＩＰ１０２の中央の領域は、グルタミンおよびグルタミン酸に富んでいた（アミノ酸位置６６位〜８１位）。ホモポリマーグルタミンストレッチが、転写因子効力を増大することが報告されている（Ｇｅｒｂｅｒら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，８０８−８１１；Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６，１９５−２０４）。
【００９１】
ＭＩＰ１０２の遺伝子構成を分析するために、ＰＣＲによってゲノミックＤＮＡフラグメントを増幅し、そしてそのヌクレオチド配列を決定した。ゲノミックＤＮＡを、フェノール／ＳＤＳ法（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，（１９９７）Ｐｈｅｎｏｌ／ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｌｏｌｏｇｙ”（Ｖ Ｂ Ｃｈａｎｄａ Ｅｄｓ）Ｖｏｌ １，ｐｐ．４．３．１−４．３．３．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によってＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの葉から単離した。ゲノミックサザンハイブリダイゼーションは、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるとおりに行った。ＤＮＡサンプル（１０μｇ）を適当な制限酵素で消化し、１．０％アガロースゲルによって分画し、そして正に荷電したナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。ブロットを、５０％ホルムアミド、４．４×ＳＳＣ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）、１×デンハート溶液、０．２％ＳＤＳおよび変性サケ精子ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中で３２Ｐ−標識プローブと、４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。メンブレンを、０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で室温で数回洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で４２℃で３０分間洗浄した。
【００９２】
ＭＩＰ１０２のｃＤＮＡに対応するゲノミックＤＮＡフラグメントを、以下の２つのプライマーセットを用いてＰＣＲによって増幅した：Ｂｃ２Ｆ０４（５’−ＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧ−３’）およびＢｃ２Ｒ０２（上述）；Ｂｃ２Ｆ０５（５’−ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＧＡＣＧＡＡＣ−３’）およびＢｃ２Ｒ０７（５’−ＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＡＴ−３’）。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてヌクレオチド配列を、上述のインターナルプライマーＢｃ２Ｆ０２およびＢｃ２Ｒ０２に加えて、以下のベクタープライマーを用いて、３つの独立したクローンについて決定した：Ｆｏｒｗａｒｄ−ＡＢＩ（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’）およびＲｅｖｅｒｓｅ−１（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’）。
【００９３】
ゲノミックＤＮＡのヌクレオチド配列とｃＤＮＡのヌクレオチド配列との比較は、ＭＩＰ１０２遺伝子が２つのイントロン（図２）（７３ｂｐ（イントロン１）および２７８ｂｐ（イントロン２））を含むことを示した。これらのイントロンの位置は、ＡｔＫＥＬＰ（Ｃｏｒｍａｃｋら、前出）のイントロンの位置と同じであった。Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓにおけるＭＩＰ１０２ホモログをコードする遺伝子の数を推定するために、ＭＩＰ１０２ ｃＤＮＡの４４０ｂｐフラグメントを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションを行った（図４）。ＤＮＡプローブは、各レーンにおいて１つのバンドとハイブリダイズした。このことは、ＭＩＰ１０２がＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓにおいて１コピーの遺伝子によってコードされることを示す。
【００９４】
（実施例３：ＭＩＰ１０２の欠失変異体を用いる結合アッセイ）
Ｎ末端またはＣ末端欠失を有するＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２を生成し、そしてＭＰ結合を担うＭＩＰ１０２ドメインを決定するために、実施例１に記載のようなタンパク質結合アッセイにおいて使用した。
【００９５】
プラスミドｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２は、ファージクローンＭＩＰ１０２（上述）に由来した。ｐＧＥＸ−Ｂｃ２のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（８４２ｂｐ）を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入し、ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２を作製した。
【００９６】
ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２ｄＮを構築するために、ＭＩＰ１０２のＣ末端半分のＤＮＡフラグメントをｐＧＥＸ−Ｂｃ２から、ＰＣＲによって、Ｂｃ２Ｆ０２プライマー（５’−ＡＡＹＡＡＲＧＡＲＴＴＹＧＡＹＧＡＹＧＡ−３’）およびｐＧＥＸ５プライマー（上述）を用いて増幅し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてＮｏｔＩで消化した。得られた６７９ｂｐフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２のＳｍａＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入した。
【００９７】
ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２ｄＣの構築のために、ＭＩＰ１０２のＮ末端側半分のＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＸ−Ｂｃ２から、ＰＣＲによって、ｐＧＥＸ１プライマー（上述）およびＢｃ２Ｒ０５プライマー（５’−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＴ−３’）を用いて増幅し、そしてＢａｍＨＩ＋ＸｈｏＩで消化した。得られた３３１ｂｐフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入した。
【００９８】
ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２を、ＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２（ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２）の発現のために使用した。ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２ｄＮを、Ｎ末端の８６アミノ酸残基が欠失したＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２（ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＮ）のために使用し、ｐＧＥＸ−Ｐ−Ｂｃ２ｄＣを、Ｃ末端の７９アミノ酸残基が欠失したＧＳＴ融合ＭＩＰ１０２（ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＣ）のために使用した。ＰＣＲフラグメント由来のコード配列は、エラーがないことを確認した。
【００９９】
図５Ａにおいて示されるように、３２Ｐ標識ＰＫＡ−ＭＰは、ＭＩＰ１０２のＮ末端側半分（アミノ酸１〜８６）を含むＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＣ（レーン３）ならびに全長ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２（アミノ酸１〜１６５）（レーン１）に結合した。ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＣのレーンにおいて観察された二重バンド（図５Ｂ，レーン３）は、Ｃ末端近傍のタンパク質分解に起因し得る。さらなる欠失を伴う低い方のバンドはなお結合能を示した。対照的に、ＧＳＴ（レーン４）およびＭＩＰ１０２のＣ末端側半分（アミノ酸位置８７位〜１６５位）を含有するＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＮ（レーン２）においては、ＭＰ結合活性は見られなかった。この結果は、ＭＩＰ１０２のＮ末端側半分がＭＰ結合ドメインを含むことを示唆する。
【０１００】
（実施例４：ＭＩＰ１０２のＮ末端領域の細胞間移行阻害）
ＴｏＭＶの移行を視覚的に観察できるようにウイルスゲノムの外被タンパク質（ＣＰ）遺伝子を欠失させ、その代わりに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入したプラスミドｐｉＬ．Ｇ３を用いた。このプラスミドを京都大学の飯 哲夫先生より戴いた（ＴａｍａｉおよびＭｅｓｈｉ、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（２００１）１４，１２６−１３４）。実施例３で得たＣ末欠失型ＭＩＰ１０２（ＭＩＰ１０２ｄＣ）を発現させるプラスミドｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡもまた作製した。これらの作製方法を以下に示す。
【０１０１】
ＭＩＰ１０２ｄＣを発現させるために植物発現用バイナリーベクターｐＡＲＴ７を使用した（Ａｎｄｒｅｗ Ｐ．Ｇｌｅａｖｅ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２０，１２０３−１２０７より入手）。ＭＩＰ１０２のＮ末端側半分のＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＸ−Ｂｃ２から、ＰＣＲによって、ｐＧＥＸ１プライマー（前出）およびＢｃ２Ｒ０６ＨＡプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＴＣ−３’；このＢｃ２Ｒ０６ＨＡプライマーは、ＨＡタグ配列を含む）を用いて増幅し、そしてＳｍａＩ＋ＸｂａＩで消化した。得られた約３５０ｂｐフラグメントはＣ末端にヘマグルチニンエピトープ（ＨＡ）断片配列をコードするタグが挿入されている。この断片を、ｐＡＲＴ７のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流にあるＳｍａＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡを生成した。また、コントロールのプラスミドとして、ＧＵＳを発現するプラスミドｐＡＲＴ７−ＧＵＳもまた作製した。
【０１０２】
プラスミドｐｉＬ．Ｇ３のみ、あるいはｐｉＬ．Ｇ３およびｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡの両方をプラスミドを、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の本葉の葉片とパーティクルガン法に供し、これらプラスミドをタバコ細胞に導入した。このパーティクルガン法による細胞への遺伝子の導入は、ＢｉｏＲａｄ遺伝子導入装置ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステムを用いて、製造者の説明書に従って行った。緑色蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した。ウイルスゲノムが隣接細胞に移行すると、移行された細胞で緑色蛍光タンパク質が生産されて、この細胞は緑色に光る（図６の「複数細胞」）。対して、ウイルスが細胞間を移行しない場合、蛍光は１細胞のみで生じる（図６の「１細胞」）。従って、蛍光の差異によって、ウイルス移行の様子を知ることができる。
【０１０３】
次に、ＣＰ遺伝子の代わりにＧＦＰが挿入されているプラスミドｐｉＬ．Ｇ３と、ＧＵＳ（ｐＡＲＴ−ＧＵＳ）またはＭＩＰ１０２のＭＰ結合領域（ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ）を発現するプラスミドを、量比を変えて、タバコの本葉の葉片をパーティクルガン法に供し、これらプラスミドをタバコ細胞に導入した。この結果を表１に示す。
【０１０４】
【表１】
0003914993.tif 000002
【０１０５】
表１に示される結果より、ウイルスゲノム移行を示す緑色蛍光の拡大は、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡを導入することにより阻害されることが判明した。従って、ＭＩＰ１０２のＮ末端側のタンパク質が細胞内に発現するとウイルスのＭＰの機能が抑制され、ウイルス移行が阻害されると考えられた。
【０１０６】
また、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡとｐｉＬ．Ｇ３との混合モル比を変えて細胞間移行の割合を観察した。この結果を図７に示す。図７の縦軸に細胞間移行の割合を蛍光スポットの比（複数細胞／総数）を示し、横軸にプラスミド混合モル比（ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ／ｐｉＬ．Ｇ３）とを示す。ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡが相対的に増加すると複数細胞への緑色蛍光の拡大が減少し、移行の阻害が認められた。
【０１０７】
（実施例５：ＥＲ局在型ＧＦＰ発現プラスミドを用いた場合のＭＩＰ１０２発現プラスミド共導入の効果）
また、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡとｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＥＲ局在型ＧＦＰ発現プラスミド）との混合モル比を変えて細胞間移行の割合を観察した。ｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＥＲ局在型ＧＦＰ発現プラスミド）は、京都大学の飯 哲夫先生より入手した（玉井 淳、飯 哲夫、平成１２年度・日本植物病理学会大会講演要旨予稿集、岡山大学）。
【０１０８】
この結果を図８に示す。図８の縦軸に細胞間移行の割合を蛍光スポットの比（複数細胞／総数）を示し、横軸にプラスミド混合モル比（ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ／ｐｉＬ．ｅｒＧ３）とを示す。ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡが相対的に増加すると複数細胞への緑色蛍光の拡大が減少し、移行の阻害が認められた。この図８と図７とを比較したところ、ｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＥＲ局在型ＧＦＰ発現プラスミド）を用いた場合、ＥＲ非局在型ＧＦＰ発現プラスミド（ｐｉＬ．Ｇ３）を用いた場合よりも阻害の程度が大きいことが判明した。
【０１０９】
（実施例６：ＭＩＰ遺伝子導入による形質転換植物作製用プラスミドの構築およびこのプラスミドによる形質転換植物の作製）
形質転換植物を作製するために、ＭＩＰ１０２クローンから単離したファージＤＮＡを用いて、ＭＩＰ１０２のＮ末端の結合領域を産生する発現プラスミドｐＡＲＴ２７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ．ａを構築した。ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ（前出）由来の２．４５ｋｂのＮｏｔＩ断片を、ｐＡＲＴ２７（Ａｎｄｒｅｗ Ｐ．Ｇｌｅａｖｅ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２０，１２０３−１２０７より入手）のＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＡＲＴ２７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ．ａを生成した。このベクター構築図を図９に示す。
【０１１０】
ｐＡＲＴ２７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ．ａを、アグロバクテリウム法により、タバコ葉片に導入した。アグロバクテリウム法は、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））に従った。まず、上記発現ベクターで、エレクトロポレーションによって、アグロバクテリウムを形質転換した。次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法（ラボマニュアル、植物遺伝子の機能解析 岩淵雅樹、志村令郎編、１９９２年、丸善、３１〜５６頁）により植物組織に導入した。２週間ごとに上記葉片を継代し、上記のポリヌクレオチドと同時にタバコ細胞に導入されたｐＡＲＴ２７由来のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン抵抗性の有無で形質転換したタバコ細胞を選抜した。選抜された形質転換タバコ細胞は、常法により、植物体に再分化させた。
【０１１１】
ＭＩＰ１０２が導入された形質転換タバコの葉を液体窒素中で粉砕し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで１００℃で４分間抽出した。この抽出物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ポリアクリルアミドゲル濃度１０〜２０％）に供した後、抗ＫＥＬＰ抗体（ｐＧＥＸ−Ｐ−ＫＥＬＰ（作製については実施例９に下述）由来精製ＫＥＬＰをウサギに免疫して作製した）および抗ＨＡ抗体（ＭＢＬより入手）をプローブに用いて、常法によりウェスタンブロッティング解析を行った。
【０１１２】
図１０に結果を示す。（Ａ）クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色ゲル、（Ｂ）ＨＡタグ抗体を用いた結果、（Ｃ）ＫＥＬＰ抗体を用いた結果。各結果におけるレーンは、左端のレーンが分子量マーカーであり、残りは左から順に形質転換タバコの株１０１、１０２、１０５、および１１８を示し、右端は、非形質転換タバコ（コントロール）を示す。これらの結果において、形質転換タバコの株のうち１０１、１０３、１１８において、ＭＩＰ１０２と考えられる１４ｋＤａの特異的なバンドが検出された。１０５および非形質転換タバコ（コントロール）では検出されなかった。
【０１１３】
（実施例７：ＴｏＭＶ−ΔＣＰ／ＧＦＰ転写産物感染によるウイルス細胞間移行の検定）
ＭＩＰ１０２が導入された形質転換タバコにおいてウイルス移行を観察するために、ＭＩＰ１０２が導入された形質転換タバコ１０１、１０３、１０５、および１１８ならびにこれらの再生個体である１０１ｒ、１０３ｒ、１０５ｒ、および１１８ｒ、ならびに非形質転換植物（ＳＲ１）の葉に、ＴｏＭＶ−ΔＣＰ／ＧＦＰ転写産物（ＲＮＡ）を葉に塗布した。なお、再生個体は、葉片より常法に従って作製した。転写産物の塗布は、ｐＴＬ．Ｇ３（京都大学の飯 哲夫先生より戴いた；このプラスミドは、ｐｉＬ．Ｇ３のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの代わりに、Ｔ７プロモーターがウイルス遺伝子の上流に転写されている）をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで処理して転写ＲＮＡ産物を得、このＲＮＡ転写産物１μｇをタバコの幅３〜５ｃｍぐらいの葉に接種した。２日後、感染させた葉を切り取り、蛍光顕微鏡下でＧＦＰの蛍光を観察した。この結果を表２に示す。
【０１１４】
【表２】
0003914993.tif 000003
【０１１５】
表２に示されるように、実施例６においてＭＩＰ１０２が高発現されていることが明らかとなった形質転換個体１０１、１０３、および１１８ならびにこれらの再生個体１０１ｒ、１０３ｒ、および１１８ｒでは緑色蛍光の拡大が抑制され、高発現していない個体１０５、その再生個体１０５ｒ、および非形質転換植物（コントロール）では緑色蛍光の拡大が観察された。このことから、ＭＩＰ１０２を発現した植物では、ウイルス移行の阻害がもたらされることが判明した。
【０１１６】
（実施例８：ＴｏＭＶ粒子感染によるウイルス感染の検定）
ＭＩＰ１０２が導入された形質転換タバコにおいて、ＴｏＭＶ感染に対する抵抗性を獲得したか否かを調べるために、ウイルス粒子感染を行い、感染葉および上位葉におけるウイルス外被タンパク質（ＣＰ）の蓄積を調べた。ＭＩＰ１０２が導入された形質転換タバコ１０１、１０３、１０５、および１１８の再生個体である１０１ｒ、１０３ｒ、１０５ｒ、および１１８ｒ、ならびに非形質転換植物（コントロール）の葉に、ＴｏＭＶウイルス粒子０．０６μｇを感染させた。１０日後、感染させた葉（感染葉）およびその上位に存在する葉（上位葉）を切り取り、液体窒素中で粉砕し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで１００℃で４分間抽出した。この抽出物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ポリアクリルアミドゲル濃度１０〜２０％）に供した後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０１１７】
この結果を、図１１に示す。各レーンは、両端のレーンが分子量マーカーであり、残りは左から順に形質転換タバコの株１０１ｒ、１０２ｒ、１０５ｒ、および１１８ｒ（これらは、形質転換タバコ株１０１、１０２、１０５、および１１８の再生個体である）、非形質転換タバコ（ＳＲ１）を示す。各株において、左側が上位葉（Ｕ）であり右側が感染葉（Ｉ）を示す。矢印で示したバンドが外被タンパク質に相当し、このバンドは、非形質転換体ＳＲ１の感染葉および上位葉、ならびに実施例６においてＭＩＰ１０２の高発現を示さなかった形質転換体１０５ｒにおいて顕著に観察された。ＭＩＰ１０２が高発現してウイルス移行の阻害が認められた個体である形質転換株１０１ｒ、１０３ｒ、および１１８ｒにおいては、外被タンパク質の蓄積が減少しており、ウイルス抵抗性となることが期待された。
【０１１８】
（実施例９：ＡｔＫＥＬＰを用いる結合アッセイ）
ＴｏＭＶ ＭＰが、ＭＩＰ１０２と相同性の高い（７５％）ＡｔＫＥＬＰにもまた結合するか否かを調べるために、ＡｔＫＥＬＰのｃＤＮＡをＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ＧＳＴ融合ＡｔＫＥＬＰ（ＧＳＴ−ＡｔＫＥＬＰ）をコードするプラスミドを構築し、そして精製融合タンパク質を、プローブとしてＴｏＭＶ ＭＰを用いるタンパク質結合アッセイのために使用した。タンパク質結合アッセイは、実施例３と同様にして行った。
【０１１９】
ＡｔＫＥＬＰ発現プラスミドは以下のように構築した。ＡｔＫＥＬＰ（Ｃｏｒｍａｃｋら、前出）のコード配列を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの５’−ストレッチｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ＰＣＲによって、ＫＥＬＰ−Ｆ０１プライマー（５’−ＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡ−３’）およびＫＥＬＰ−Ｒ０１プライマー（５’−ＴＴＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＧＡＴＴＣＣＡＴＴＴ−３’）を用いて増幅した。増幅された０．５２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化、そしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入し、ｐＧＥＸ−Ｐ−ＫＥＬＰを作製した。ＫＥＬＰのコード配列を、塩基変更のないことを確認した。プロテインキナーゼＡのリン酸化配列を付加するために、合成オリゴヌクレオチドＫＤ−ＰＫＡ１（５’−ＧＡＴＣＡＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧ−３’）およびＫＤ−ＰＫＡ２（５’−ＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’）をアニールし、そしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＧＥＸ−６Ｐ１−３ｘＰＫＡを構築した。これは、３セットのオリゴヌクレオチドを、ＧＳＴ ＯＲＦの下流に適切な方向で挿入した。ｐＧＥＸ−Ｐ−３ｘＰＫＡ−ＫＥＬＰの構築のために、ｐＧＥＸ−Ｐ−ＫＥＬＰの０．５２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＧＥＸ−６Ｐ１−３ｘＰＫＡのＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間でクローニングした。ｐＧＥＸ−Ｐ−ＫＥＬＰおよびｐＧＥＸ−Ｐ−３ｘＰＫＡ−ＫＥＬＰを、それぞれ、ＧＳＴ−ＡｔＫＥＬＰおよびＧＳＴ−ＰＫＡ−ＡｔＫＥＬＰの発現のために使用した。
【０１２０】
図１２に示されるように、ＧＳＴ−ＡｔＫＥＬＰ（レーン１）および陽性コントロールのＧＳＴ−ＭＩＰ１０２（レーン２）の両方がＭＰ結合活性を示したが、陰性コントロールのＧＳＴは、この活性を示さなかった。
【０１２１】
（実施例１０：ＣＴＭＶ−ＷおよびＣＭＶのＭＰを用いる結合アッセイ）
他の植物ウイルスのＭＰに対するＭＩＰ１０２およびＡｔＫＥＬＰの結合能力もまた調べた。ここで、ＣＴＭＶ−ＷおよびＣＭＶのＭＰを使用した。タンパク質結合アッセイは、実施例３と同様にして行った。
【０１２２】
ＣＴＭＶ−Ｗ ＭＰ発現プラスミドは、以下のようにして構築した。ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓのｗａｓａｂｉ株（ＣＴＭＶ−Ｗ）由来のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＷ６２（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３，１８０１−１８１３）をＳａｌＩで消化した。ＭＰのコード配列を含む得られた１．４ｋｂフラグメントを、ｐＡＳ２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＳａｌＩ部位にＧａｌ４遺伝子と同じ方向で挿入した。得られたプラスミドをＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、クレノウフラグメントで処理し、そして自己連結し、ｐＡＳ−Ｗ３０Ｋを作製した。これは、ＭＰのＯＲＦがＧａｌ４のＯＲＦに連続していた。このプラスミドの１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入し、ｐＧＥＸ−Ｗ３０Ｋを作製した。ＣＴＭＶ−Ｗ ＭＰリーディングフレームをＧＳＴのリーディングフレームと調整するために、ｐＧＥＸ−Ｗ３０ＫをさらにＢａｍＨＩで消化し、クレノウフラグメントで処理し、そして自己連結して、ｐＧＥＸ−Ｗ３０ＫｆＢを生成した。これを、ＧＳＴ融合ＣＴＭＶ−Ｗ ＭＰ（ＧＳＴ−ＣＴＭＶＭＰ）の発現のために使用した。
【０１２３】
ＣＭＶ ＭＰ発現プラスミドは、以下のようにして構築した。ＣＭＶの○株（ＣＭＶ−０）由来のＲＮＡ３ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣＭＶ０３（Ｈａｙａｋａｗａら、（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，４９９−５０４）をＡｖａＩで消化し、クレノウフラグメントで処理し、次いでＳａｌＩで消化し、１．２ｋｂのＡｖａＩ（平滑）−ＳａｌＩフラグメントを単離した。３ａＯＲＦ（ＭＰ）を含むこのフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＳｍａＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入し、ｐＧＥＸ−Ｐ−ＣＭＶＯＭＰを構築した。これは、ＧＳＴ融合ＣＭＶ ＭＰ（ＧＳＴ−ＣＭＶＭＰ）をコードする。
【０１２４】
図１３に示されるように、３２Ｐ標識ＰＫＡ ＡｔＫＥＬＰは、ＴｏＭＶ、ＣＴＭＶ−ＷおよびＣＭＶ−ＯのＭＰに結合した。３２Ｐ−標識ＭＩＰ１０２をプローブとして使用した場合、同様の結合能力が観察された（データは示さず）。
【０１２５】
上記の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の特定のオリゴヌクレオドがどのように作成され、および利用されるのかを例示して記載している。本発明の範囲を制限するものではない。
【０１２６】
【産業上の利用可能性】
植物育種に利用可能なウイルス抵抗性を付与し得るポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドを用いて植物にウイルス抵抗性を付与する方法が提供される。当該ポリヌクレオチドが植物に導入された、植物ウイルスに対して抵抗性が付与された植物もまた提供される。
【０１２７】
【配列表】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴｏＭＶ ＭＰのＭＩＰ１０２に対する結合を示す電気泳動写真である。（Ａ）ｐＧＥＸ−Ｂｃ２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉを、ＩＰＴＧなしで（レーン１）またはＩＰＴＧと共に増殖させた。細菌から抽出した総タンパク質を、１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＢＢで染色した。（Ｂ）ＭＰ結合を再生タンパク質ブロットでアッセイした。（Ａ）のように分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンでアッセイし、そして３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰでプローブした。（Ｃ）アフィニティー精製ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２（レーン１）およびＧＳＴ（レーン２）を１０％ゲル中で電気泳動し、そして染色した。（Ｄ）（Ｃ）のよう分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレン上にブロットし、そして（Ｂ）と同様にして３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＰＫＡ−ＭＰでアッセイした。矢印は、ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２およびＧＳＴの位置を示す。分子量（ｋＤａ）マーカーの位置を左側に示す。
【図２】図２は、ＭＩＰ１０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を示す図である。下線のアミノ酸配列は、推定の一本鎖ＤＮＡ結合ドメインを示し、これは、図３における整列のために使用される。サザンブロッティング分析のために使用した独自のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を、二重下線によって示す。矢印１および２は、ゲノムＤＮＡの解析から明らかになったイントロンの位置を示す。
【図３】図３は、ＭＩＰ１０２およびＡｔＫＥＬＰおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース上の類似配列の多配列整列を示す図である。上方の整列は、ＭＩＰ１０２の推定アミノ酸配列とＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＫＥＬＰ（ＡｔＫＥＬＰ）との比較を示す。ＭＩＰ１０２およびＡｔＫＥＬＰの一致したアミノ酸残基を★で示す。下方の整列は、推定一本鎖結合ドメインでの種々のタンパク質の比較を示す。ＭＩＰ１０２、ＡｔＫＥＬＰ、およびＫＩＷＩを、ヒト（ＰＣ４／ｐ１５）（ＧｅおよびＲｏｅｄｅｒ、１９９４；Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８，５２５−５３４）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｔ１３Ｆ２．２タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子番号Ｚ８１１２２）、およびＳ．ｐｏｍｂｅ（ＣＡＢ１０００３．１タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子番号Ｚ９７１８５−２）のような他の生物で同定された相同配列と整列した。
【図４】図４は、ＭＩＰ１０２のゲノミックサザンハイブリダイゼーションを示す電気泳動写真である。Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓゲノミックＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（レーン１）、ＥｃｏＲＩ（レーン２）またはＥｃｏＲＶ（レーン３）で消化し、そして１．０％アガロースゲルを通して分画し、そしてナイロンメンブレン上に転写した。このブロットを、ｐＧＥＸ−Ｂｃ２の３２Ｐ標識した４４０ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図２に示したｃＤＮＡ挿入片のヌクレオチド１〜４２８位を含む）とハイブリダイズさせた。サイズ（ｋｂ）マーカーの位置を左側に示す。
【図５】図５は、ＭＩＰ１０２のＮ末端へのＴｏＭＶ ＭＰの結合を示す電気泳動写真である。（Ａ）アフィニティー精製ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２（レーン１）、ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＮ（レーン２）、ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２ｄＣ（レーン３）およびＧＳＴ（レーン４）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中に分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。タンパク質の再生後、ブロットを、３２Ｐ標識したＰＫＡ−ＭＰでプローブした。（Ｂ）（Ａ）で使用したゲルにおけるタンパク質プロフィールをＣＢＢ染色によって明らかにした。矢印は、組換えタンパク質の位置を示す。破線矢印は、タンパク質分解の発生を示す。分子量（ｋＤａ）マーカーの位置を左側に示す。
【図６】図６は、ウイルスの細胞間移行についてのレポータータンパク質による植物細胞の緑色蛍光を示す写真である。（Ａ）ウイルスゲノムが隣接細胞に移行すると、移行された細胞で緑色蛍光タンパク質が生産されて、この細胞は緑色に光る（「複数細胞」と標記した写真）。（Ｂ）対して、ウイルスが細胞間を移行しない場合、蛍光は１細胞のみで生じる（「１細胞」と標記した写真）。
【図７】図７は、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡとｐｉＬ．Ｇ３との共導入による細胞間移行の影響を示すグラフである。図７の縦軸に細胞間移行の割合を蛍光スポットの比（複数細胞／総数）を示し、横軸にプラスミド混合モル比（ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ／ｐｉＬ．Ｇ３）を示す。
【図８】図８は、ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡとｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＥＲ局在型ＧＦＰ発現プラスミド）との共導入による細胞間移行の影響を示すグラフである。図８の縦軸に細胞間移行の割合を蛍光スポットの比（複数細胞／総数）を示し、横軸にプラスミド混合モル比（ｐＡＲＴ７−Ｂｃ２ｄＣ−ＨＡ／ｐｉＬ．ｅｒＧ３）を示す。
【図９】図９は、ＭＩＰ１０２のＮ末端の結合領域を産生する発現プラスミドｐＡＲＴ２７−Ｂｃ２−ＨＡ．ａの構築図を示す。
【図１０】図１０は、形質転換タバコにおける目的タンパク質の発現を示す電気泳動写真である。右から順に、（Ａ）クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色ゲル、（Ｂ）ＨＡタグ抗体を用いた結果（中央）、および（Ｃ）ＫＥＬＰ抗体を用いた結果である。各結果におけるレーンは、左端のレーンが分子量マーカーであり、残りは左から順に形質転換タバコの株１０１、１０２、１０５、および１１８を示し、右端は、非形質転換タバコ（コントロール）を示す。
【図１１】図１１は、ＴｏＭＶ粒子感染によるウイルス抵抗性の検定の結果を示す電気泳動写真である。各レーンは、両端のレーンが分子量マーカーであり、残りは左から順に形質転換タバコの株１０１ｒ、１０２ｒ、１０５ｒ、および１１８ｒ（これらは、形質転換タバコ株１０１、１０２、１０５、および１１８の再生個体である）、非形質転換タバコ（ＳＲ１）を示す。各株において、左側が上位葉（Ｕ）であり右側が感染葉（Ｉ）を示す。矢印で示したバンドがウイルス外被タンパク質に相当する。
【図１２】図１２は、ＴｏＭＶ ＭＰのＡｔＫＥＬＰとの結合を示す電気泳動写真である。（Ａ）アフィニティー精製ＧＳＴ−ＡｔＫＥＬＰ（レーン１）、ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２（レーン２）、およびＧＳＴ（レーン３）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中に分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。タンパク質の再生後、ブロットを、３２Ｐ標識したＰＫＡ−ＭＰでプローブした。（Ｂ）（Ａ）で使用したゲルにおけるタンパク質プロフィールをＣＢＢ染色によって明らかにした。矢印は、組換えタンパク質の位置を示す。ＧＳＴ−ＭＩＰ１０２の大きさは、ＧＳＴとＭＩＰ１０２との間に１５アミノ酸余分にあることに起因して、ＧＳＴ−ＡｔＫＥＬＰよりも大きかった。分子量（ｋＤａ）マーカーの位置を左側に示す。
【図１３】図１３は、種々のウイルスのＭＰへのＡｔＫＥＬＰの結合を示す電気泳動写真である。等量（１μｇ）のアフィニティー精製ＧＳＴ−ＭＰ（ＴｏＭＶ）、ＧＳＴ−ＣＴＭＶＭＰ（ＣＴＭＶ−Ｗ）、ＧＳＴ−ＣＭＶＭＰ（ＣＭＶ）、ＧＳＴ、およびウシ血清アルブミンを、ニトロセルロースメンブレン上に固定化し、そして３２Ｐ標識したＰＫＡ−ＡｔＫＥＬＰでプローブした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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