(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）より選択されるDNAを発現させることを特徴とする、植物の細胞壁におけるグルカン鎖の合成を促進する方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加したアミノ酸配列を有し、該グルカン鎖の合成を促進するタンパク質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｄ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と90％以上の相同性を有し、該細胞壁の合成を促進するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
グルカン鎖がセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記（ａ）から（ｄ）より選択されるDNAの導入および発現により、野生型の植物体と比較して、細胞壁におけるグルカン鎖の合成が促進されている形質転換植物体。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加したアミノ酸配列を有し、該グルカン鎖の合成を促進するタンパク質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｄ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と90％以上の相同性を有し、該細胞壁の合成を促進するタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
グルカン鎖がセルロースである、請求項３に記載の植物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の細胞壁合成に関与するセルラーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を利用した植物の細胞壁成分の改変に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物において細胞壁成分を改変することは、工業や農業の分野において、様々な重要な意義を有する。例えば、植物の細胞璧成分の改変は、セルロース・ヘミセルロース含量を高めることによるパルプ等繊維原材料植物や、有用な農作物および飼料作物の消化吸収効率の向上などをもたらし、経済性や収益性の点で有意義である。また、細胞壁成分である多糖の構造変化により、新たな産業的価値を有する原材料植物の作出をもたらすことも可能である。
【０００３】
細胞壁およびそれに類する多糖成分の合成は、バクテリア・菌類・植物だけでなく動物でも行われている。細胞壁合成の分子レベルでの研究は、その産業的重要性にもかかわらず、あまり解析は行われていない。植物の細胞壁合成の分子レベルでの研究に関しては、近年、分子遺伝学の手法を用いて解析が行われはじめた。細胞壁合成に関与する遺伝子としては、これまでに例えば、セルロース合成酵素などが報告されている（T. Arioli et al. Molecular analysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis. Science (1998) 279:717-720）。しかし、細胞壁合成に関わる遺伝子としては、いまだ単離されていない多くの遺伝子が存在すると考えられ、細胞壁合成に関しては未知の機構が存在すると考えられている（参考文献：Y. Kawagoe and D. P. Delmer,  Pathway and genes involved in cellulose biosynthesis; Genetic engineering 19 Plenum Press, New York, 1997；K. Nishitani, Construction and Restructuring of the cellulose-xyloglucan framework in the apoplast as mediated by the xyloglucan-related protein family-A hypotheticalscheme. J. Plant Res. 111:159-166, 1998）。
【０００４】
一方、細胞壁を分解する酵素としては、セルラーゼが知られている。セルラーゼは、β-1,4結合した多糖を分解する酵素（Endo β-1,4 glucanase）として、これまでにバクテリア・菌類・粘菌・植物などで報告されている（Beguin, P. Annu. Rev. Microbiol. 44, 219-248. 1990）。アミノ酸配列の疎水性解析から判別される活性部位から、6若しくはそれ以上のクラスにわけられることが示されている。それらのうち、植物のセルラーゼはEファミリーに属する（Beguin, P. Annu. Rev. Microbiol. 44, 219-248. 1990）。バクテリア等のEファミリーセルラーゼは、典型的なセルロース結合ドメインを保持しており、細胞外に分泌され結晶セルロースを分解することができる。バクテリア等は分解産物であるグルコースを栄養源にしている。
【０００５】
高等植物のセルラーゼは、生長・発生・分化などに伴い、細胞自身の細胞壁の改変に関係しているといわれている（D. J. Cosgrove,. How do plant cells extend? Plant Physiol. 102, 1-6, 1993）。そのため、セルラーゼは細胞外に分泌される必要があり、これまでに報告された植物のセルラーゼには、全て分泌のためのシグナルペプチドが存在する（Z. Shani, M. Dekel, G. Tsabary and O. Shoseyov. Plant Mol. Biol. 34. 837-842, 1997.  M. L. Tucker, R. Sexton, E. del Campillo and L. N. Lewis. Plant Physiol. 88:1257-1262. 1988）。
【０００６】
植物の生長や分化時には、細胞壁の構造や性質などの変化が生じている。例えば、新たな細胞壁の合成や、既にある細胞壁多糖の修飾・再構築などが生じ、それにより細胞の大きさ、形、機能などが変化していく。これまでに植物のセルラーゼは、バックボーンとしてβ-1,4グルカン鎖をもつヘミセルロースもしくはセルロースを標的として機能すると示唆されている（Y.-S. Wong, G. B. Fincher and G. A. Maclachlan. J. Biol. Chem. 252, 1402-1407. 1977.  T. Hayashi, Y.-S. Wong and G. A. Maclachlan. Plant Physiol. 75, 605-610, 1984）。しかしながら、結晶セルロースを分解するために必要なセルロース結合ドメインを保持していないなどの矛盾点が存在するため、植物中ではセルラーゼが実際に何を標的に機能しているかは明確にされておらず、バクテリア等のセルラーゼと比べ、高等植物での知見は非常に乏しい。
【０００７】
ところで本発明者らは、化学突然変異剤EMSによって処理したシロイヌナズナの集団の中に、#66という検索番号が付与された、細胞や器官の形状が異常な突然変異体を見出した（平成8年8月25日  第7回シロイヌナズナワークショップ、平成9年3月27日  日本植物生理学会1997年度年会、平成9年11月13日  第8回シロイヌナズナワークショップ、平成10年5月3日  日本植物生理学会1998年度年会）。この突然変異はacw1（altered cell wall 1）と名付けられ、この突然変異の原因となっている遺伝子がACW1遺伝子と命名された。しかしながら、ACW1遺伝子についてはいまだ単離されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の細胞壁合成に関与する酵素をコードする遺伝子を利用して、植物の細胞壁成分を改変することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物の細胞壁合成の異常をもたらすACW1変異の原因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定し、単離することに成功した。本発明者らは、単離したACW1遺伝子の塩基配列を決定し、これと構造的に関連した遺伝子のデーターベース検索を行い、ACW1遺伝子と同一遺伝子をデーターベース上に見出した。この遺伝子は、細胞壁分解酵素としてこれまで知られてきた植物の分泌型セルラーゼのホモログとして特徴づけされていた。
【００１０】
しかしながら、本発明者らがacw1変異体の細胞壁成分につき種々の解析を行った結果、驚くべきことに、ACW1遺伝子がコードするタンパク質（以下、「ACW1タンパク質」と称する）が、細胞壁の分解というよりもむしろ合成に関わる機能を持つことを見出した。細胞壁の合成に関与するセルラーゼに関する報告は、これまでになされていない。本発明者らは、このようなACW1タンパク質の性質から、ACW1遺伝子を利用することにより、植物の細胞壁成分を改変することが可能であることを見出した。
【００１１】
本発明は、植物の細胞壁合成に関与するセルラーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を利用した植物の細胞壁成分の改変に関し、より具体的には、
（１）  植物の細胞壁成分を改変するために用いる、下記（ａ）から（ｄ）より選択されるDNA、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。
（２）  植物の細胞壁成分がグルカン鎖である、（１）に記載のDNA、
（３）  （１）における（ａ）から（ｄ）より選択されるDNAを使用することを特徴とする、植物の細胞壁成分を改変する方法、
（４）  植物の細胞壁成分がグルカン鎖である、（３）に記載の方法、
（５）  （１）における（ａ）から（ｄ）より選択されるDNAの導入および発現により、野生型の植物体と比較して、細胞壁成分が改変されている形質転換植物体、
（６）  植物の細胞壁成分がグルカン鎖である、（５）に記載の植物体、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物の細胞壁成分を改変するための、植物の細胞壁の合成に関与するセルラーゼ様タンパク質をコードするDNAの利用に関する。本発明における植物の細胞壁成分の改変は、具体的には、植物の細胞壁の合成に関与するセルラーゼ様タンパク質をコードするDNAを保持する形質転換植物体を作出することにより行う。細胞壁成分の改変に用いるDNAとしては、「ACW1」遺伝子が好ましい。
本発明者らにより単離された「ACW1」遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：２に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：３に示す。
【００１３】
本発明の植物の細胞壁成分の改変においては、「ACW1」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、「ACW1」遺伝子以外のDNAを用いることも可能である。このようなDNAとしては、例えば、「ACW1」タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加したアミノ酸配列を有し、「ACW1」タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。本発明において「機能的に同等」とは、タンパク質が植物の細胞壁合成、より具体的にはグルカン鎖の合成において機能することを指す。タンパク質が植物の細胞壁合成において機能するか否かは、例えば、変異株において「ACW1」遺伝子を発現させることによる機能相補試験により、また「ACW1」遺伝子の発現制御や「ACW1」タンパク質の機能阻害による植物の細胞壁合成の変化、例えば、細胞壁成分の変化（非結晶グルカンの蓄積）、器官や細胞形態の変化として検出することが可能である。「ACW1」タンパク質のアミノ酸配列の人工的な改変は、例えば、変異や置換であれば「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。アミノ酸の改変数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。また、アミノ酸の変異はこのような人工的なもののみならず、自然界においても生じることがある。
【００１４】
本発明者らは、acw1変異において、ACW1遺伝子の1355位の塩基グアニンのアデニンへの置換（それにより429位のアミノ酸グリシンからセリンへと置換される）が、温度感受性変異タンパク質（低温条件下では植物に野生型の表現系を付与するが、高温条件下では異常な表現系を付与する）を生じることを見出している（実施例１）。本発明においては、このように特定の温度下において「ACW1」と同等の機能を示すタンパク質も用いることが可能である。このようなタンパク質は温度調節により、機能を制御することができる点で有用である。
【００１５】
また、本発明においては、「ACW1」タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする限り、「ACW1」遺伝子の塩基配列と相同性を示す塩基配列を有する他の植物種由来のDNAを用いることも可能である。このようなDNAは、例えば、「ACW1」遺伝子の塩基配列の全部若しくは一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術（Southern 1975 J. Mol. Biol. 98:503、Maniatis et al. Molecular Cloning  Cold Spring harbor Laboratry Press）により、また「ACW1」遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR技術（島本功、佐々木卓治  監修、「植物のPCR実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社  1995年４月10日発行）を利用して単離することができる。「機能的に同等」とは、上記と同様に、タンパク質が植物の細胞壁合成、より具体的にはグルカン鎖の合成において機能することを指す。ハイブリダイズ技術やPCR技術により得られるDNAは、「ACW1」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする場合には、通常、「ACW1」遺伝子と高い相同性を有する。高い相同性とは、それぞれのDNAがコードするアミノ酸のレベルにおいて45％以上の相同性、好ましくは60％以上の相同性、さらに好ましくは75％以上の相同性、さらに好ましくは90％以上の相同性、さらに好ましくは95％以上の相同性を指す。このような遺伝子を単離するためのシロイヌナズナ以外の植物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコ、綿、アカシア、マツ、スギ、ユーカリ、ポプラなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００１６】
これらDNAを植物細胞内で発現させるためには、(i)植物細胞で転写可能なプロモーター配列の下流に連結されたDNA分子と、(ii)必要に応じて該遺伝子の下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発現カセットを植物細胞に導入する。
【００１７】
発現カセットは、挿入されているDNAを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23:567）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：387）やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol. Gen Genet. 240:1）、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1406）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００１８】
発現カセットが導入される植物細胞としては特に制限はない。細胞壁成分を改変することを望む植物体の細胞を用いることができる。例えば、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコ、綿、アカシア、マツ、スギ、ユーカリ、ポプラなどの細胞が挙げられる。発現カセットが導入される植物細胞としては、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al. 1993 Transgenic Res. 2:218、Hiei et al. 1994 Plant J. 6:271）、エレクトロポレーション法（Tada et al. 1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri et al. 1991 Theor. Appl. Genet 81:437）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1987 J. Part. Sci. tech. 5:27）など当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。
【００１９】
形質転換された植物細胞は、再生させることにより植物体を作出することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、ジャガイモであればVisserら（Theor. Appl. Genet 78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられる。これにより作出された植物体またはその繁殖媒体（例えば、種子、塊茎、切穂など）から得えた植物体は、野生型の植物体と比較して、本発明のタンパク質の発現が変化し、これにより細胞壁成分が改変される。「細胞壁成分の改変」としては、細胞壁成分の量的変化、質的変化および細胞形態の変化を含む。細胞壁成分としては、好ましくはグルカン鎖である。グルカン鎖の改変は、グルカンの重合度（重合している糖の数）の調整（グルカンの重合度には、例えば、針葉樹型、広葉樹型、双子葉型、単子葉型がある）、結晶化度（グルカンが束ねられて形成される繊維の太さであり、繊維強度の決定要素である）の調整を含む。
【００２０】
植物における細胞壁成分の改変は、多くの利点を有する。細胞壁成分の増加は、例えば、植物の成長量の増加、パルプ等繊維原の増加をもたらすことができ、細胞壁成分の質的変化は、新素材の開発や飼料作物の消化吸収効率の増加をもたらすことができる。また細胞形態の変化は新たな美的価値を有する鑑賞用植物の作出などへ応用することも考えられる。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、DNAの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)」）に基本的に従った。また、シロイヌナズナの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、ゲノムDNAの調製は実験書（例えば「モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）」）に基本的に従った。
【００２２】
[実施例１]  ACW1遺伝子の単離
まず、ACW1遺伝子の染色体上の位置を決定するために、分子マーカーを用いてマッピングを行った。acw1（altered cell wall 1）変異体はシロイヌナズナのコロンビアエコタイプにおいて見出されているため、この変異体に、別のエコタイプであるランズバーグ・エレクタ種を交配し、次世代の種子を採種し、それを生育させ、自殖させてF2世代の種子を得た。このF2世代の種子を発芽させ、育成した植物（830個体）からゲノムDNAを抽出した。これらのゲノムDNAを、マーカーとして自ら作製した「2I5,2.2」、「miP5-9,1.1」をそれぞれを用いて、同ゲノムDNAに対して、PCR法により組換価を算出した。具体的には、「2I5,2.2」を増幅することができる2種類のPCRプライマー「配列番号：４／5-TCAAATAGATATATGTAATATGTTTCGC-3」、「配列番号：５／5-CAATAAATAATTATACAAAACTTTCAAG-3」を合成し、これらを用いて、F2世代のゲノムDNAをPCR法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は112bpにコロンビア種は110bpにバンドを示すため、これに基づいて計算したところ、ACW1遺伝子と同マーカーとの間には1染色体で組み換えが認められた。次に「miP5-9,1.1」を増幅することができる2種類のPCRプライマー「配列番号：６／5-TACTTAATAAAGTAGGATAATGTCG-3」、「配列番号：７／5-GAACATGAATTCATGTGTTACACTG-3」を合成し、これらを用いて、F2世代のゲノムDNAをPCR法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は87bpにコロンビア種は91bpにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ACW1遺伝子と同マーカーとの間には1染色体で組み換えが認められた。
【００２３】
以上のようにして、ACW1遺伝子を含む染色体上の領域が、「2I5,2.2」、「miP5-9,1.1」の2つの分子マーカーによって挟まれていることが確認された。そこで、分子マーカー「2I5,2.2」、「miP5-9,1.1」をそれぞれを含むゲノムDNA断片を単離して、遺伝子単離を進めることにした。具体的には、60-90kbpのシロイヌナズナコロンビア種のゲノムDNAで構成されるゲノムDNAライブラリー（約10000クローン）を「2I5,2.2」、「miP5-9,1.1」をプローブとしてスクリーニングし、「2I5,2.2」プローブで3つのクローン（TAC6M17, 12J22, 13F4と命名した）を、「miP5-9,1.1」プローブで2つのクローン（TAC15E4, 9P8と命名した）を得た。「TAC15E4」の「left」側（「2I5,2.2」側）のDNA断片（約600b）（この断片を「15E4-L」と称する）を、TAIL-PCR法（植物のPCR実験プロトコール（秀潤社））を用いて単離した。この際、TAIL-PCR法にはプライマーとしてL1、L2、L3、AD2を用いた。単離したDNA断片の塩基配列をもとに「15E4-L」を増幅することができる２種類のPCRプライマー「配列番号：８／5-GCTTATAAATGGGTATAAACCTATCAGC-3」、「配列番号：９／5-TGCTTAATTCTCCGGTAACATTACCGGC-3」を合成し、これらを用いて、ランズバーグ種とコロンビア種のゲノムDNAをPCR法を用いて増幅させ、塩基配列を解読したところ、ランズバーグ種ではプライマー（配列番号:8）より96位の塩基配列がGに、コロンビア種ではTであることが認められ、このDNA断片は分子マーカーとして利用できることが判明した。そこで、ACW1遺伝子とこの新しいマーカーとの距離を、前述のF2植物で算出したところ、1660染色体間で、組み替えは見られなかった。
【００２４】
TACゲノムDNAライブラリーは、挿入されたDNA断片を直接、アグロバクテリウムを介して植物に遺伝子導入できるベクター（TACベクター）で作製されているので、TAC6M17, 12J22を胚軸カルストランスフォーメーション法を用いて、acw1変異体に遺伝子導入した。胚軸カルストランスフォーメーションは「KazuhitoAkama, Hideaki Shiraishi, Shozo Ohta, Kenzo Nakamura, Kiyotaka Okada and Yoshiro Shimura; Efficient transformation of Arabidopsis thaliana: comparison of theefficiencies with various organs, plant ecotypes and Agrobacterium strains」「Plant Cell Reports (1992)12:7-11」の方法に従い、また、アグロバクテリアとしてはMP90株を用いた。その結果2個体で野生型に表現型が回復した。つまり、この「TAC6M17」、「12J22」クローンに含まれるゲノムDNA断片の重複する領域に、ACW遺伝子が含まれることになる。
【００２５】
そこで、この領域のDNA断片の塩基配列を解読した。「2I5,1.1」マーカーと上記のDNA領域との間には、4つの遺伝子が存在することが予想された。そこで、この4つの仮想遺伝子の野生型の塩基配列を、acw1変異体に関して比較したところ、セルラーゼホモログとして登録されているcDNA（登録番号U37702）に相当する遺伝子領域において、突然変異が生じていることが判明した。この4個の遺伝子のなかでは、セルラーゼホモログのみが、acw1変異体において塩基配列の変異が認められることから、同遺伝子がACW1遺伝子であることが判明した。
【００２６】
ACW1遺伝子の全長cDNAを、λZAPIIcDNAライブラリー(STRATAGENE社)より単離したところ、5個のイントロンが含まれていた。遺伝子からコードされるアミノ酸配列を解析したところ、セルラーゼに相同性が見られた。一般的に植物のセルラーゼは、菌類のセルラーゼが持つセルロース結合ドメインを持たない、膜外に分泌されるためのシグナル配列を持つなどの特徴があるが、インビボで何を標的にしているかは明らかにされていない。ACW1遺伝子の産物もセルラーゼとして働いていると考えられる。しかしながら、▲１▼分子量が大きい（ACW1は69kD、他のほとんどは約54kD程度）、▲２▼シグナル配列を持っていない、▲３▼N末端側にチャージアミノ酸領域が存在する、▲４▼膜貫通ドメインを持つ、などの特徴から他のセルラーゼとは異なる新規のファミリーに属すると考えられる。
【００２７】
[実施例２]  acw1変異体の組織化学的解析
1/2Ｂ5培地に無菌播種して7日目の根および下胚軸を切り取り、それら試料を３％グルタールアルデヒド液中で4℃で固定した。試料をリン酸バッファー(pH7.0)で洗浄した（2〜4℃）。なお、バッファーは10〜20分間隔で4〜6回入れ替えた。次いで、1% OsO4・3% KMnO4液で1〜2時間固定し、その後上記リン酸バッファーで洗浄した。試料をアルコールシリーズ（30, 50, 70, 90, 99.5, 99.5, 99.5%エタノール）に各10〜20分間浸し脱水を行った。試料をプロピレンオキシドに20分間隔で4回浸し、次いでエポキシ樹脂（Quetol 812）に3〜6時間浸し浸透させた。試料を包埋用の型に入れ、エポキシ樹脂（Quetol 812）、硬化剤（DDSA）、加速剤（DMP-30）を加えた包埋用樹脂を注いだ。35℃の恒温器内に1日、次いで45℃の恒温器内に1日、次いで60℃の恒温器内に1日静置した。十分な硬化を確認後、45℃の恒温器内に数日〜１週間静置した。型から試料を取り出し、電顕用ミクロトームで0.1μmの超薄切片サンプルを作製した。この超薄切片サンプルを、ウラニルアセテート・クエン酸鉛染色、もしくはPATAgで染色した後、透過型電子顕微鏡で観察した（前者はヘミセルロースやペクチンなどの非結晶の多糖を、後者は非結晶の糖を染色する作用を有する）。
【００２８】
この電子顕微鏡による組織化学的な解析の結果、acw1変異体の根切片におけるウラニルアセテート・クエン酸鉛染色では非結晶グルカンの蓄積が認められた（図１B,C）が、野生型では認められなかった（図１A）。下胚軸切片においても同様の結果が得られた（図２）。また、根切片におけるPATAg染色においても、同様にacw1変異体にのみ非結晶グルカンの蓄積が認められた（図３）。これらの非結晶性のグルカンは、本来より長いグルカン鎖へと転移され結晶化する。非結晶のグルカンが蓄積していることから、ACW1セルラーゼ遺伝子は、グルカン転移活性を持った新規セルラーゼであると考えられた。従来、分解活性の機能のみが予想されてきた高等植物のセルラーゼであるが、ACW1遺伝子産物は細胞壁の分解よりもむしろ合成に関わる機能を持つことが証明された。このようなセルラーゼは、ACW1遺伝子をおいて他に報告例はない。
【００２９】
[実施例３]  acw1細胞壁成分の分析
21℃で2週間生育させた後、31℃で2週間生育させたacw1変異体の、地上部の細胞壁成分を調べた。細胞壁成分分析のための細胞壁粗精製サンプルの調製は、Zablackisらの方法（Zablackis et al, Plant Physiol,107,1129-1138(1995)）に従った。まず、液体窒素中で凍らせた植物を乳鉢ですりつぶし、リン酸バッファー(pH7.0)を加え、これを遠心チューブにピペットで移した。ポリトロンで破砕（130rpm, 45秒, 3回）した後、遠心（9,500rpm, 10分, 4℃）した。上清を捨てリン酸バッファーを加え、上記の破砕・遠心を再度行った。これをもう一度（計3回）繰り返した。沈殿を洗浄するため、蒸留水を加え遠心（9,500rpm, 10分, 4℃）した。これを計４回行った。70％エタノールを加え、よく懸濁し一晩（4℃）置いた。遠心して回収後、クロロフォルム/メタノール（1:1）液を加えスターラーで撹拌した（30分）。遠心（9,500rpm, 15分, 4℃）後上清を捨て、もう一度クロロフォルム/メタノール（1:1）抽出を行った。これらのクロロフォルム/メタノール（1:1）抽出液は、濃縮エバポレーターで濃縮乾固した（これを実施例５の薄層クロマトグラフィー等に用いた）。遠心回収後の沈殿にフェノール/酢酸/水（2:1:1）を加え、スターラーで室温で1時間撹拌し、遠心（9,500rpm, 15min. 4℃）した。これをもう一度繰り返した後、100％エタノールを加え、洗浄し、遠心した。さらに蒸留水で2回洗浄した後、アミラーゼ処理（0.1M リン酸バッファー+α-アミラーゼ 2mg/ml(Sigma社) Aspergillus oryzae由来+トルエン５滴）を、48時間、緩やかに振とうしながら行った。遠心後、上清を捨て、蒸留水で５回洗浄した。最終的に回収した沈殿を細胞壁粗精製サンプルとした。これを-80℃で保存し、必要な量を解凍して分析に用いた。
【００３０】
このサンプルを用いて糖定量を行った。まず、調製した細胞壁サンプルを、適当量とり凍結乾燥させた。ガラス管に5mg測り取り、2Mのトリフルオロ酢酸（TFA）を2.5ml（0.5ml TFA/1mg 細胞壁）加え、オイルバス中で121℃で1時間インキュベートし、非結晶糖を加水分解した。室温まで自然冷却した後、遠心（5,00rpm, 10分, 卓上遠心機）して上清と残磋（沈殿）に分けた。残磋に蒸留水を加え、遠心して上清を取り、先に採取した上清に加えた。上清は、乾固した後に、蒸留水1mlに溶かし、糖定量を行った。残磋に72％H2SO4を加え、室温で2時間静置した。途中で緩やかに撹拌し溶かした。蒸留水で35倍に希釈し沸騰水中で2時間ボイルし、完全に加水分解した。ボイル後、氷中に置き冷却し、メスシリンダーでメスアップし、糖定量を行った。糖定量は、全糖量をフェノール硫酸法で、ウロン酸量をm-ヒドロキシビフェニル法で行った。
【００３１】
その結果を図４に示す。TFA可溶性画分では、acw1変異体のグルコースの量（1790.0±86.4nmol/mg 細胞壁）は、wt（野生型）（1907.6±158.4nmol/mg 細胞壁）とほぼ同じであった。しかし、TFA不溶画分では、acw1変異体のグルコースの量（436.7±20.0nmol/mg 細胞壁）は、wt（1342.5±31.5nmol/mg 細胞壁）より少なかった。TFAに不溶なものは、結晶セルロースである。したがって、TFA不溶画分のグルコースは、セルロース由来である。この結果から、acw1変異体ではセルロースが減少していることが示された。acw1変異体のラムノースとウロン酸の量（それぞれ145.7±7.0, 659.6±31.7nmol/mg 細胞壁）は、wt（90.3±7.5, 441.6±9.7nmol/mg 細胞壁l）より多かった。ラムノースとウロン酸が多いことから、ペクチン(Rhamnogalacturonan)が増加していることが示唆された。電顕観察で見られた染色性の変化は、ペクチンの増加が原因であると思われる。TFAで分解される非結晶多糖は、ペクチンの増加が示唆された他は特に変化はなかった。
【００３２】
[実施例４]  セルロース繊維の観察
wtとacw1の細胞壁の、セルロース繊維の電子顕微鏡による観察の結果を図５に示す。実施例３において調製した細胞壁サンプルを2M TFAで加水分解した後の残さを電子顕微鏡で観察した。ペクチンやヘミセルロースなどの非結晶多糖は、2M TFA処理で分解されるので、残さのほとんどは結晶セルロースである。wtの繊維幅は約3.0nmであった。acw1のは約2.4nmで、wtよりも細くなっていた。セルロース繊維は、強酸処理をすると、ミクロフィブリルが膨潤したり、束になって非常に太くなって観察されることがある(図５、矢印）。wtで束になっている（17nm）ものが多く観察されたのは、強酸処理のためだと思われる。しかしながら、同様の処理をしたacw1では、束になっているものがあまり観察されなかった。また、太さも12nm程度であった。強酸処理のためミクロフィブリルのnativeな状態を観察しているとはいえないが、処理後のミクロフィブリルの状態には違いが生じていた。これは、wtとacw1の本来のミクロフィブリルの性質の違いを反映していると思われる。
【００３３】
セルロースは、直鎖状のβ-1,4 グルカンが束ねられて結晶化してできたものである。従って、その分子量を調べれば重合度がわかる。そこで、次ぎに、セルロースの重合度を解析するためにその分子量の測定をゲル濾過分析により行った。測定に用いたセルロースサンプルは、Edashigeらの方法（Edashige et al, Holzforshung, 49, 197-202(1995)）で調製した。適当量の細胞壁粗精製サンプルを、0.05M CDTA, 0.05M Na2CO3, 1N KOH, 4N KOH, 4M KOH+3% ホウ酸塩の各液でシーケンシャルに抽出した。残磋（結晶セルロース）を、あらかじめ用意しておいた発煙硝酸+酸化リン(V)液でニトロ化した。吸引濾過して反応物（ニトロセルロース）を集め、氷水にて洗浄した。再び吸引濾過してサンプルを集め、水を少し加え軽くボイルした。さらに吸引濾過後、60℃で乾燥させた。ゲル濾過分析のため、サンプルをテトラヒドロフランに溶かし、シリンジで50μlインジェクトした。カラムは、Shimadzu LC-6Aを使用した。
【００３４】
その結果、ミクロフィブリルの重合度(D.P.: degrees of polymerization)は、wtでは数百から5,000の広い範囲に分布がみられ（図６）、平均は約1,000であった。ところがacw1は分布が非常に狭くほぼ1ピークでみられ、平均は約5,000であった。
【００３５】
以上の事実から、ACW1遺伝子がセルロース合成に必須な遺伝子であり、この遺伝子の変異により、セルロースの量や質（繊維幅、重合度etc.）などが変化することが示された。
【００３６】
[実施例５]  クロロフォルム/メタノール抽出層の解析
クロロフォルム/メタノール画分を、2M TFAで処理した後、薄層クロマトグラフィー(TLC)で解析した(図７)。薄層クロマトグラフィーにおいては、まず、実施例３で調製した乾固させたクロロフォルム/メタノール抽出層に、2M TFAを適当量加え121℃で1時間インキュベートし、これを加水分解した。処理液を乾固させて、蒸留水とクロロフォルムを加えてよく撹拌し、遠心して上清（水層）を取り乾固した。再び蒸留水を適当量加え、一部を薄層クロマトグラフィー用シリカプレートに、シリンジで展着させ溶媒（n-ブタノール/ピリジン/蒸留水=8:5:4）で展開した。展開後、プレートを乾燥させ、硫酸をスプレーしてホットプレートでインキュベートした。糖のスポットが黒く現れたら（現像）、ホットプレートからおろし自然冷却した。
【００３７】
この解析の結果、wtとacw1ともにガラクトースのスポットが観察された（図７レーン３および４）。これは、葉緑体膜を構成しているガラクトース-脂質由来のものと考えられる。acw1ではグルコースのスポットもはっきりと観察された（図７レーン４矢印）。wtでは観察できなかった。
【００３８】
また、抽出物の成分を分析するために、アルディトールアセテート法によるガスクロマトグラフィー分析を行った。実施例３のクロロフォルム/メタノール抽出液の一部を乾固させ、水素化ホウ素ナトリウム（10mg/ml,NH4OH中）液250μlに溶かし、1時間室温でインキュベートした。酢酸を2,3滴加えた後、酢酸/メタノール（1:9）を250μl加えた。ウォーターバス（40℃）で暖めながら乾固させた。これを計4回行った。さらにメタノールを250μl加え、同様に乾固させた。これも計4回行った。乾固したサンプルに、無水酢酸50μlとピリジン50μlを加え、オイルバス中で121℃で20分インキュベートし、アセチル化した。冷却後、トルエン200μlを加え乾固させる処理を2回行った。そして、ジクロロメタン500μlと蒸留水500μlを加えよく撹拌し、遠心して下層（ジクロロメタン層）を取り、乾固させた。適当量のアセトンに溶かし、ガスクロマトグラフィー（Shimadzu GC14A SP233カラム）にかけた。
【００３９】
TFA可溶層は、乾固したサンプルを上記の方法で処理すればよい。TFA残磋（硫酸加水分解）サンプルは、Ba(OH)2で中和した後、濃縮したものを処理に用いた。
【００４０】
ガスクロマトグラフィー分析の結果、抽出物中にある糖はほとんどがガラクトースとグルコースであった。ガラクトースとグルコースモル比を調べた結果、wtはガラクトース 88.9mol(%), グルコース11.1mol(%)、acw1はガラクトース 70.0mol(%), グルコース30.0mol(%)であった。acw1のグルコース量は、wtと比べモル比で約3倍多くなっていた。
【００４１】
クロロフォルム/メタノール画分で増加しているグルコースは、グルカンであることが予想される。そこで、分子量分布をゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)解析で行った。wtとacw1それぞれのクロロフォルム/メタノール画分を、NaOHでケン化した後、解析した。
【００４２】
その結果、両方とも1, 3, 4, 6糖に相当するピークが得られた。wtの各ピークのエリア比は、36.1%, 14.8%, 28.4%, 20.7%であった。acw1の各ピークのエリア比は、26.9%, 15.2%, 30.0%, 27.9%であった。acw1ではwtに比べ、3, 4, 6糖の量が増えていた。6糖の増加が最も多く7.2%であった。ついで4糖で1.6%であった。増加しているグルコースは、4, 6糖のオリゴ糖として存在していることが予想された。
【００４３】
そこで、次ぎに予想されるグルコースのオリゴ糖の結合様式を、メチル化分析法で調べた。細胞壁粗精製サンプルを適当量とり、DMSO  0.5mlを加えた。2時間室温で撹拌し、4M Na-DMSOを加え、さらに2時間撹拌した。反応液をトリフェニルメタンの粉末に少量つけて赤くなるのを確認し、氷中におきヨウ化メチル50μlを加え1時間撹拌した。その後、蒸留水を0.5ml加え窒素ガスを吹き込んだ。反応液をSep・Pak C-18カラムにアプライし、100%アセトニトリル2mlと100%エタノール4mlでエリューションし、精製液を室温で乾固させた。2M TFAを250μl加え121℃で1時間加水分解し、反応液を乾固させ、イソプロパノール300μlを加え再び乾固した。さらに95%エタノール220μlとNaBD4(NH4OH中)200μlを加え、1時間室温で反応させた後、反応液に酢酸を2,3滴落とし、酢酸メタノールを250μl加え乾固させた。この処理をさらに4回繰り返した。メタノール250μlを加え乾固させる処理を3回繰り返した。次に、無水酢酸を50μl加え121℃で3時間反応（アセチル化）させ、室温に冷却後、蒸留水500μlを加え、Na2CO3を気泡がでなくなるまで加え、さらにジクロロメタンを500μl加えよく混合した。低速で遠心しジクロロメタン層をとり乾固させた。適当量のアセトンに溶かし、ガスクロマトグラフィー/質量分析（GC-MS）を行った。ガスクロマトグラフィー/質量分析には、Shimadzu QP-2000AおよびJEOL.JMS-DX303を用いた。
【００４４】
その結果、ガラクトースは、ターミナル結合、2-結合、3-結合、4-結合、および6-結合が検出された。一方グルコースは、ターミナル結合および4-結合のみが検出された。アルカリケン化した抽出物をβ-1,4 グルカナーゼで処理すると、グルコース単糖がでてくる(データ−は示していない)。以上の結果から、acw1変異体では、グルコースがβ-1,4結合したオリゴ糖が、クロロフォルム/メタノール画分にwtより多く（約３倍）蓄積していることが明らかとなった。
【００４５】
これにより、グルコースがβ-1,4結合したオリゴ糖に、さらに脂質等が結合したものが、セルロース合成の基質となることが初めて明らかにされた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、植物の細胞壁成分を改変するためのセルラーゼ様タンパク質をコードするDNAの利用が提供された。植物の細胞壁の改変は、例えば、パルプ等繊維原材料植物の供給効率の増加、細胞壁合成制御による新素材の開発、農作物の有用成分の増加、飼料作物の消化吸収効率の増加、細胞壁合成量増大による植物の成長量の増加、細胞壁成分の改変に伴う細胞形態の変化による新たな美的価値を有する鑑賞用植物の作出などをもたらすことができるため、農業や工業・園芸の分野において有益である。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  acw1変異体の根切片におけるウラニルアセテート・クエン酸鉛染色の結果を示す電子顕微鏡写真である。Aは野生型、Bは21度（許容温度）での変異体、Cは31度（非許容温度）での変異体における結果をそれぞれ示す。
【図２】  acw1変異体の下胚軸におけるウラニルアセテート・クエン酸鉛染色の結果を示す電子顕微鏡写真である。Aは野生型、Bは31度（非許容温度）での変異体における結果をそれぞれ示す。
【図３】  acw1変異体の根切片におけるPATAg染色の結果を示す電子顕微鏡写真である。Aは野生型、Bは31度（非許容温度）での変異体における結果をそれぞれ示す。
【図４】野生株とacw1変異体の細胞壁構成糖成分を分析した結果を示す。ＡはTFA可溶層の構成糖量を、ＢはTFA不溶画分（残さ；セルロース）の構成糖量を示す。  Rha；ラムノース、Fuc；フコース、Ara；アラビノース、Xyl；キシロース、Gal；ガラクトース、Glc；グルコース、Uronic acid；ウロン酸
【図５】野生株とacw1変異体のセルロース繊維を観察した結果を示す電子顕微鏡写真である。上は野生株のセルロース繊維、下はacw1変異体のセルロース繊維を示す。矢印は、強酸処理により太くなった繊維を示す。
【図６】野生型とacw1変異体のセルロースの重合度を解析するために行ったGPCのクロマトグラムの結果を示す。白丸は変異体、白三角は野生株の結果を示す。横軸は、カラムから溶出される時間を示し、縦軸は検出器で検出された値を示す。早い時間のピークほど分子量が大きい。
【図７】野生型とacw1変異体のクロロフォルム/メタノール層を、TFA加水分解し、薄層クロマトフラフィー（TLC）を行った結果を示す。レーン１はグルコースの対照、レーン２はガラクトースの対照、レーン３は野生株、レーン４は変異体、の結果を示す。明瞭なグルコースのスポットが観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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