(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小動物の体液中の、モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が認識する抗原を測定することを特徴とする小動物の腫瘍抗原の検出法。
【請求項２】
モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が認識する抗原を抗原抗体反応を用いて測定する、請求項１記載の検出法。
【請求項３】
モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を用いる請求項２記載の検出法。
【請求項４】
体液が全血、血漿又は血清である請求項１、２又は３記載の検出法。
【請求項５】
小動物が、犬又は猫である請求項１ないし４のいずれかに記載の検出法。
【請求項６】
抗原が、末端にシアル酸が存在する糖鎖を有する抗原である請求項１ないし５のいずれかに記載の検出法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の検出法による小動物の腫瘍の診断法。
【請求項８】
腫瘍が乳癌である請求項７に記載の診断法。
【請求項９】
モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が認識する抗原を測定するための抗体を含むことを特徴とする小動物の腫瘍抗原の検出又は小動物の腫瘍の診断用試薬。
【請求項１０】
請求項９記載の診断用試薬を含む小動物の腫瘍の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、小動物の腫瘍抗原を検出または小動物の腫瘍を診断する方法に関する。さらに詳しくは、小動物の体液中の、モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が認識する抗原（以下単に小動物腫瘍ＮＳ抗原という）の濃度を測定することにより、小動物の腫瘍抗原を検出する方法及び腫瘍であるか否かを診断する方法（術後の再発を検出又は確認する方法を含む）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍マーカーを用いた診断法は、ヒトでは良く研究・利用されており、体外診断用医薬品も販売されている。ヒトでは、以下に例示する様々な抗原をマーカーとして用いている。
Ｉ．癌胎児性蛋白；ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＢＦＰ（塩基性フェトプロテイン）等
II．癌関連抗原
１）糖鎖抗原  ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９等
２）その他の癌関連抗原  ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）
ＩＡＰ（免疫抑制酸性蛋白）、ＣＡ１５−３等
III．酵素       ；エステラーゼ１  等
IV．ホルモン    ；ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）等
Ｖ．癌遺伝子産物；ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物  等
VI．その他      ；急性相反応物質  等
【０００３】
しかし上述の腫瘍マーカーはいずれもヒトの腫瘍のマーカーであり、一般的に、ヒトと小動物とはパラレルに結果が反映しないと言われている。そして現在のところ、腫瘍マーカーを利用して、小動物の腫瘍抗原の検出又は腫瘍の診断が行われた実績は無い。
【０００４】
小動物の腫瘍は、乳腺腫瘍、皮膚腫瘍、リンパ・造血器系腫瘍等が多く、獣医師は、もっぱら問診・視診、触診を行っている。腫瘍が疑われる場合には、腫瘤表面のスタンプまたは針バイオプシーによる細胞診を行いその後、Ｘ線や超音波検査により腫瘤の構造や周囲組織への影響と肺や肝臓などへの遠隔転移の有無を確認している。悪性腫瘍であれば（１）外科治療（２）化学療法（３）免疫療法等の治療方針を決め、オーナーと相談して治療の方向を決めている。小動物の腫瘍診断薬が現在ない状態なので前述の方法が一般的状況であった。また、根治を目的とした外科的手術を行った後の早期再発確認も診断マーカーがないため、再発後再度前述の方法を繰り返えさざるを得なかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
近年、ぺットフードの改良および治療薬の進歩にともない、飛躍的に小動物の寿命が延びた。このため高齢化が進み、小動物の特異感染疾病（原虫、線虫、条虫等の消化管寄生虫、ノミ、ダニ等による外部寄生虫による感染症）の問題からヒトでいう高齢病と同じ疾患（肥満、糖尿病、腫瘍、心疾患、白内障、歯科疾患、循環器系疾患、慢性腎疾患等）が問題になってきている。特に腫瘍の発生率は、犬では９歳を越すと飛躍的に多くなる。小動物における腫瘍の早期発見は、小動物自身から、自覚症状をオーナーに訴えることができないため、オーナーの観察力、また動物病院の獣医師の的確なオーナーへの問診・視診、触診に頼らざるを得ないのが現状である。そのため小動物における腫瘍の早期発見のための簡便な腫瘍の検出または測定法の開発が待たれている。
【０００６】
前記したように、ヒトでは様々な腫瘍抗原を測定して、腫瘍の診断が行われているにも拘わらず、従来小動物の腫瘍抗原を測定して、小動物の腫瘍の検出又は診断をした実績が報告されていないのは小動物における腫瘍測定に適する腫瘍抗原が見いだされていなっかったためと思われる。また、ヒトの腫瘍抗原の測定に使用されるモノクローナル抗体が小動物の腫瘍抗原の測定に使用されていないのは、一般に、該モノローナル抗体はヒトの抗原を用いて、作成されており、ヒトの抗原に特異的なもので有るから、種の違う他の生物の体液に、該モノクローナル抗体が認識する抗原が生存するとは考えられなかったものと思われる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、小動物の腫瘍を容易に診断できる腫瘍マーカーを見いだすべく種々検討した。ヒトの腫瘍診断に使用されている他のマーカーでは小動物の腫瘍の診断は困難であったが、小動物腫瘍ＮＳ抗原を測る方法は、特異的に小動物の癌、特に犬の乳癌の診断に利用できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、下記（１）ないし（１０）に関するものである。
（１）小動物の体液中の、小動物腫瘍ＮＳ抗原を測定することを特徴とする小動物の腫瘍抗原の検出法。
（２）小動物腫瘍ＮＳ抗原を抗原抗体反応を用いて測定する、（１）記載の検出法。
（３）モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を用いる（２）記載の検出法。
（４）体液が全血、血漿又は血清である（１）、（２）又は（３）記載の検出法。
（５）小動物が、犬又は猫である（１）ないし（４）のいずれかに記載の検出法。
（６）上記（１）ないし（５）における小動物腫瘍ＮＳ抗原が、末端にシアル酸が存在する糖鎖を有する抗原である（１）ないし（５）のいずれかに記載の検出法
（７）上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の検出法による小動物の腫瘍の診断法。
（８）腫瘍が乳癌である（７）に記載の診断法。
（９）小動物腫瘍ＮＳ抗原を測定するための抗体を含むことを特徴とする小動物の腫瘍抗原の検出又は小動物の腫瘍の診断用試薬。
（１０）上記（９）記載の診断用試薬を含む小動物の腫瘍の診断用キット。
【０００９】
小動物の体液としては、測定に使用できるものであればいずれでもよく、全血、血漿、血清、髄液、尿、唾液等が利用できる。また、糞便も生理食塩水等に懸濁した後、遠心分離やろ過等を行うことによって得られる糞便抽出液も本発明で言う体液に含まれる。好ましい体液としては血液であり、さらに好ましくは、血清あるいは血漿である。
【００１０】
小動物とは、家畜といわれる、牛、豚、鶏以外のすべての愛玩動物を指し、犬猫は、最もその代表といえる。
小動物腫瘍ＮＳ抗原を測定する方法は、該抗原を測定できる方法で有れば特に限定されないが、通常は抗原抗体反応を利用して測定するのが好ましい。
【００１１】
本発明で検出又は診断のための標的となる抗原を見いだすために使用されたモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９は、特公平１−５２４００公報等に記載されたＩｇＭクラスの抗体であり、下記の性質を有するモノクローナル抗体である。
（１）ヒトでは分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原と反応し、認識する抗原決定基は末端にシアル酸が存在する糖鎖である。
（２）ヒト胃癌、ヒト大腸癌、ヒト膵癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌、ヒト胆管癌、ヒト子宮癌、ヒト食道癌と反応する。
（３）正常のヒト顎下腺、ヒト近位尿細管上皮、ヒト気管支腺、ヒト扁平上皮角化層、ヒト膵ラ氏島、ヒト肝細胞膜、ヒト十二脂腸腺と反応する。
（４）ヒト腸上皮化生胃粘膜と反応する。
（５）正常なヒト前立腺、ヒト胆管上皮、ヒト上皮とは反応しない。
この抗体は上記公報に記載されているように、細胞融合法で、概略下記のようにして製造される。
即ち、モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９の認識する抗原例えば、ヒト胃低分化型腺癌の癌細胞もしくはホモジネート等を用いて、マウス又はラット等を免疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン化し、上記モノクローナル抗体を産生する融合細胞を選択し、これを培養して、抗体を回収すれば良い。免疫法、融合法、融合細胞の選択等は通常の方法で行うことが出来る。
このモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９は日本化薬株式会社により、販売されている。
モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が認識する抗原はシアル酸基を有する糖鎖を抗原決定基（エピトープ）として有するものであることが知られている（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），７６，４３−５２；Ｊａｎｕａｒｙ，１９８５）。従って小動物腫瘍ＮＳ抗原が、シアル酸基を有する糖鎖を抗原決定基（エピトープ）として有する抗原であることは明らかである。以上の知見からすれば本発明において使用される該抗原の検出用又は診断用に使用できる抗体はモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９のみに限定されないことは明らかである。同一の抗原決定基と反応する抗体であれば抗体の種類は問わない。さらにモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良い。抗体を作成する動物種も限定されない。マウス、ラット、家兎、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、鶏等の動物由来の抗体も使用できる。
【００１２】
抗原抗体反応を用いる測定は、「役に立つ免疫実験法」（西岡ら、講談社サイエンティフィック、１９８４）、「酵素免疫測定法」（石川ら、医学書院、１９８７）等に記載されるように種々の方法が知られているが、本発明において測定法は特に限定されない。例えば、抗体を担持した血球や合成ラテックス等による凝集反応や比濁反応、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、着色粒子や金属あるいは非金属の有色コロイド等を結合した標識抗体を用いる測定法、表面プラズモン共鳴を用いる測定法等が使用できる。これらはいずれも小動物腫瘍ＮＳ抗原に対する抗体を含む試薬を検出用又は診断用試薬として使用することができるもので、該抗体は物理吸着により坦体に坦持されていても、また坦体又は標識物質などと化学的に結合されていてもよい。本発明において該抗体を含む小動物の腫瘍抗原の検出又は腫瘍の診断用試薬と言った場合、該抗体を、上記のように坦体に物理吸着もしくは化学結合したものも、また場合により、坦体に坦持せずにフリーの型で含むものもいずれの形で含むものもすべてを含む意味で使用する。
【００１３】
凝集反応や比濁反応に用いる非生体粒子としては、カオリン、ベントナイト、活性炭粒子、ポリスチレンラテックス、ポリアクロレインラテックス等があり、磁性鉄の表面をポリマーで覆った様な複合粒子であっても良い。また、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、水酸基、トレシル基等の官能基を有するものを使用することもある。好ましい粒子の直径は、０．０５〜２０μｍである。抗体は、粒子懸濁液に添加することで物理吸着により粒子上に担持される。また、抗体はアミノ基やチオール基を有しており、架橋試薬や縮合剤を使用することにより共有結合で粒子上に担持できる。例えば、グルタルアルデヒドや水溶性カルボジイミドを用いて抗体を粒子上のアミノ基やカルボキシル基に結合することができる。さらに、抗体は酵素処理や化学処理して抗体断片にし使用しても良い。例えばＦａｂ’にしてヒンジ部分のチオール基を用いて粒子上に共有結合させることもできる。抗体を担持した粒子は必要に応じ、動物血清、アルブミン、スキムミルク、カゼイン等を含んだ緩衝液でブロック処理を行い、適当な緩衝液に懸濁して測定試薬とする。
【００１４】
凝集反応にはガラス板法やマイクロタイター法があり、検体と上記測定試薬を混合し、その凝集像により判定を行う。比濁法では、検体と上記測定試薬を混合し、比濁計でその濁度の変化量を測定し、標準抗原から得られた濁度の変化量と比較することにより、抗体中の抗原濃度を求めることができる。
【００１５】
標識抗体（あるいは標識抗原と抗体）を用いる測定方法には非常に多くのバリエーションがあり、いずれであってもよく、例えば標識抗原と検体中の抗原を競合させながら液層中の抗体と反応させる二抗体法、標識抗原と検体中の抗原を競合させながら固相化抗体に反応させる第一抗体固相法、検体中の抗原と抗体を予め反応させた後に未反応の抗体を固相化抗原と反応させて測定する結合阻害法等も使用できる。ここでは固相サンドイッチ法に基づく測定法について説明する。
【００１６】
抗体を固定化する固相には、プラスチックの試験管、プラスチックやガラスのビーズ、プラスチック製のマイクロプレート、磁性粒子、ニトロセルロースやナイロンのメンブレン等を用い、抗体は凝集反応や比濁反応で述べたように物理吸着あるいは共有結合で固相化する。
【００１７】
標識抗体に用いる標識物質としては、125Ｉや131Ｉ等のラジオアイソトープ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素等のような酵素、フルオロセンインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートやＥｕ3+等の蛍光物質、金コロイド、セレンコロイド、着色したポリマー粒子、染料や顔料粒子等の着色粒子等がある。
【００１８】
抗体へのヨウ素の結合には、クロラミンＴ法、ヨードゲン法、ラクトペルオキシダーゼを用いる方法、ボルトン−ハンター試薬を用いる方法等がある。酵素と抗体を結合する方法としては、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸酸化法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等がある。Ｅｕ3+の様に直接標識するのではなく、キレート試薬を抗体に結合させ、それを介して標識する方法もある。
さらにアビジン−ビオチンや抗体等の生物学的親和性を利用して標識する方法もある。着色粒子に関しては、物理吸着や化学結合が用いられる。
【００１９】
酵素標識抗体の場合に検出できるシグナルを得るためには、さらに酵素の基質を必要とする。基質としては発色基質、蛍光基質、発光基質がある。ペルオキシダーゼの発色基質には１，２−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）等、蛍光基質には４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光基質にはルミノール、イソルミノール等が知られる。アルカリフォスファターゼの発色基質には、４−ニトロフェニルリン酸、ＮＡＤＰによる酵素サイクリングを介する４−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット等、蛍光基質には４−メチルウムベリフェリルリン酸等が挙げられ、発光基質としては３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）−１，２−ジオキセタン等が使用出来る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質には２−ニトロフェニル−β−Ｄガラクトシド等、蛍光基質には４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄガラクトシド等が挙げられる。
【００２０】
着色粒子で標識した抗体は、ニトロセルロース膜等に固定化した抗体と組み合わせてイムノクロマト法やフロースルー法で用いることも出来る。
【００２１】
測定操作の代表例として、抗体結合ビーズを用いた２ステップ固相サンドイッチ法に基づく酵素免疫測定について述べるが、これに限定されるものではない。まず検体である小動物の体液例えば血清等を適当な緩衝液で希釈した溶液にモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を坦持したビーズを入れて、ビーズに結合したモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９と小動物腫瘍ＮＳ抗原を反応させる。その後、検体を含む緩衝液を除き、さらにビーズを生理食塩水等で洗って未反応の抗原を除去する。洗浄したビーズを酵素標識したモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を含む溶液に入れ、ビーズ上にトラップされた抗原と反応させる。酵素標識モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を含む溶液を除き、再びビーズを洗って、未反応の酵素標識モノクローナル抗体ＮＣＣ−ＳＴ−４３９を除去する。標識した酵素によって発色する基質を含む溶液にビーズを入れ、発色させる。発色強度は、試料中の抗原量を反映するので、抗原濃度を測定することができる。この測定法は日本化薬（株）の販売しているラナザイムＳＴー４３９を用いることにより、簡単に行うことができる。
上記から明らかなように本発明の小動物腫瘍ＮＳ抗原の検出法もしくは測定法には、小動物腫瘍ＮＳ抗原を測定するための抗体を含む診断用試薬及びその他必要に応じて、緩衝剤、緩衝剤溶解液、酵素標識抗体、酵素標識抗体溶解液、発色剤、基質液、反応停止剤、標準液などから選ばれる一種以上の試薬をセットとした小動物の腫瘍の診断用キットを使用することが出来る。
【００２２】
正常な小動物の場合、その体液中の小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度は低く、腫瘍の発症により上昇する。従って、小動物の体液中の抗原を上記の方法等で求めることにより小動物の腫瘍の診断を行なうことができる。例えば、後記実施例に示したように、正常犬の血清中の小動物腫瘍ＮＳ抗原は４．４Ｕ／ｍＬ以下であり、一方、腫瘍発症犬の血清中の値は、２１．６Ｕ／ｍＬ以上であった。測定した犬の血清中の小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度が、２０Ｕ／ｍＬ以上で有れば、腫瘍が疑われる。
【００２３】
なお、一般にはカットオフ値を設定して判定する。正常とわかっている複数の小動物と腫瘍を発症している複数の小動物のそれぞれについて体液を採取し、それらの体液中の抗原濃度を測定し、両者を最も良く峻別できる値を求めることによりカットオフ値が設定できる。診断対象である小動物の抗原濃度がカットオフ値以上の場合に、腫瘍を疑う。さらに手術によって治癒した小動物については、抗原濃度は下がるので定期的に抗原濃度を測定し、上昇してくれば再発が疑われる。即ち再発のモニタリングにも使用できる。小動物の体液が犬の血清の場合、カットオフ値は５ないし２０Ｕ／ｍｌの間に設定するのが好ましい。
【００２４】
本発明によれば、小動物の腫瘍の診断を的確に且つ簡便に行なうことができ、術後の再発のチェックも可能となる。
【００２５】
【実施例】
実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明がこれら実施例のみによって限定されるものではない。
【００２６】
実施例１（犬の体液の小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度の測定）
正常犬および乳癌発症犬の前腕ぎょう側皮静脈から採血し、凝固後、遠心分離して血清を得た。血清中の抗原濃度は、日本化薬（株）製のＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原測定用試薬キットであるラナザイム  ＳＴ−４３９を小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度の測定に用いて、同キットの操作方法に従って測定した。
なお同キットは、２ステップ固相サンドイッチに基づいた酵素免疫測定法を用いて抗原を測定する試薬である。
測定結果を表１に示す。
【００２７】
0003996253.tif 000002
0003996253.tif 000003
次に上記実験結果の平均値とその範囲を次表に示す。
【００２８】
0003996253.tif 000004
0003996253.tif 000005
0003996253.tif 000006
【００２９】
正常犬９匹と乳癌犬９匹の小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度の測定結果を比較した。正常犬での値は、２．２〜７．４Ｕ／ｍＬの範囲であった。一方（乳癌犬）は、２１．６〜７０．７Ｕ／ｍＬの範囲であり、正常犬と乳癌犬との小動物腫瘍ＮＳ抗原濃度では、明らかな差が見られた。犬の乳癌の診断に有用であることが判る。なおＣＥＡ及びＣＡ１５−３はそれぞれ、市販の測定キットを用いて測定した。また参考のため上記の抗原の市販キットでのヒトでの基準値（カットオフ値）を記載すると次の通りである。
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９ヒト基準値  ：７．０Ｕ／ｍＬ
ＣＥＡヒト基準値                ：２．５ｎｇ／ｍＬ
ＣＡ１５−３ヒト基準値          ：３０．０Ｕ／ｍＬ
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便な方法で小動物の腫瘍抗原の検出又は腫瘍の診断と術後の再発チェックを行なうことができる。