(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アリールエーテル結合開裂性の菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜されたダイオキシン分解性糸状菌を用いてダイオキシンを処理するダイオキシン分解方法であって、上記ダイオキシン分解性糸状菌がペリコニア（Periconia）属またはニグロスポラ（Nigrospora）属に属する糸状菌であることを特徴とするダイオキシン分解方法。
【請求項２】
ダイオキシン分解性糸状菌が、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）である請求項１に記載のダイオキシン分解方法。
【請求項３】
β−アリールエーテル結合開裂性の菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜されたダイオキシン分解性糸状菌を含むダイオキシン処理剤であって、上記ダイオキシン分解性糸状菌がペリコニア（Periconia）属またはニグロスポラ（Nigrospora）属に属する糸状菌であることを特徴とするダイオキシン処理剤。
【請求項４】
ダイオキシン分解性糸状菌が、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）である請求項３に記載のダイオキシン処理剤。
【請求項５】
ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）からなるダイオキシン分解性糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糸状菌を用いるダイオキシンの分解方法およびダイオキシン処理剤に関する。さらに詳しく言えば、β−アリールエーテル結合開裂性の菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜される糸状菌を用いるダイオキシンの分解方法、ダイオキシン処理剤および新規なダイオキシン分解性糸状菌に関する。
【０００２】
【従来技術とその課題】
酸素で架橋された２個のベンゼン核の１乃至８個の水素が塩素により置換されたクロロジベンゾジオキシンには７５個の異性体が存在する。これらは毒性が高く、例えば人体に対しては、皮膚の色素沈着、脱毛、多毛、肝機能異常などを引き起こすことが知られ、環境汚染との関わりでダイオキシンと呼ばれている。中でも２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシンは最も毒性が高く、この化合物自体をダイオキシンと呼ぶ場合もあるが、本発明は前記クロロジベンゾジオキシン類を分解の対象とする。
【０００３】
ダイオキシン類は、近年、ごみ焼却施設の焼却灰や集塵灰からも検出されており、焼却によりダイオキシン類を生ずる可能性のある物質の使用を規制する等の対策が採られつつあるが、一旦生成したダイオキシン類についてはこれをいち早く分解して無毒化する必要がある。
ダイオキシンを分解する方法としては、従来、Pseudomonas等の細菌を用いた方法（例えば、中宮邦近ら、第１０回廃棄物学会研究発表会講演論文集、p.880 ,1999）や白色腐朽菌を用いた方法（例えば、近藤隆一郎ら、第１０回廃棄物学会研究発表会講演論文集、p.877 ,1999）等の微生物学的な方法が報告されているが、ダイオキシン分解活性は十分満足できるものではない。
【０００４】
本発明の課題は、ダイオキシンを効率よく分解出来る微生物系をスクリーニングにより見出し、微生物を利用したダイオキシンの分解方法及び分解剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先にリグニンモデル化合物としてＢ環に蛍光物質である４−メチルウンベリフェロンを有する化合物のβ−アリルエーテル結合の開裂による蛍光の強さを指標にして選抜される糸状菌を用いるリグニン分解方法及びリグニン処理剤を提案しているが（特願平１１−５６７２３号）、先の方法で選抜されるリグニン分解性糸状菌の中に、高い確率でダイオキシン分解性の菌が存在することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の糸状菌を用いたダイオキシン分解方法、ダイオキシン処理剤及び新規なダイオキシン分解性糸状菌に関する。
（１）β−アリールエーテル結合開裂性の菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜されたダイオキシン分解性糸状菌を用いてダイオキシンを処理するダイオキシン分解方法であって、上記ダイオキシン分解性糸状菌がペリコニア（Periconia）属またはニグロスポラ（Nigrospora）属に属する糸状菌であることを特徴とするダイオキシン分解方法。
（２）  ダイオキシン分解性糸状菌が、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）である上記（１）に記載のダイオキシン分解方法。
（３）β−アリールエーテル結合開裂性の菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜されたダイオキシン分解性糸状菌を含むダイオキシン処理剤であって、上記ダイオキシン分解性糸状菌がペリコニア（Periconia）属またはニグロスポラ（Nigrospora）属に属する糸状菌であることを特徴とするダイオキシン処理剤。
（４）ダイオキシン分解性糸状菌が、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）である上記（３）に記載のダイオキシン処理剤。
（５）ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）またはニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）からなるダイオキシン分解性糸状菌。
【０００８】
以下、本発明について詳述する。
（１）ダイオキシン分解性糸状菌
本発明者らは、土壌より採取した多数の糸状菌類について、リグニンモデル化合物としてＢ環に蛍光物質である４−メチルウンベリフェロンを有する化合物のβ−アリルエーテル結合の開裂による蛍光の強さを指標にして糸状菌を選抜し、さらに、選抜した糸状菌について、ダイオキシンモデル化合物である２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解活性を測定した。その結果、これらの糸状菌から非常に高頻度でダイオキシン分解活性を有する菌株が選抜されることが判明した。
【０００９】
本発明者らは、特に強い分解活性を示した５株（ｆ5226株、ｆ5615株、ｆ5625株、ｆ6098株、ｆ6099株）について属種を同定したところ、後述の実施例２で示すようにペリコニア（Periconia）、ペニシリウム（Penicillium）、ニグロスポラ（Nigrospora）及びフザリウム（Fusarium）等に属する糸状菌類であることが判明した。
【００１０】
本発明のダイオキシン分解方法で使用する糸状菌は、β−アリールエーテル結合開裂性の糸状菌の中から、２，７−ジクロロジベンゾジオキシンの分解性の大きさを指標にして選抜される菌株ダイオキシン分解活性を有する糸状菌である。
【００１１】
これらとしては、例えば、不完全菌類（Deuteromycotina）、ペリコニア（Periconia）、ペニシリウム（Penicillium）、ニグロスポラ（Nigrospora）、フザリウム（Fusarium）等に属する菌が挙げられ、具体的には、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）No.ｆ5615株（FERM P-17759）、糸状菌No.ｆ5625株（Strain No.ｆ5625）（FERM P-17748）、ニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERMP-17747）またはフザリウム・エスピー（Fusarium sp.）No.ｆ6099株（FERM P-17746）が挙げられるが、このうち、本発明の菌株はペリコニア（Periconia）属及びニグロスポラ（Nigrospora）属に属する菌株である。
【００１２】
本発明者らは、上記５種類の菌株をそれぞれペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）No.ｆ5615株（FERM P-17759）、糸状菌No.ｆ5625株（Strain No.ｆ5625）（FERM P-17748）、ニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）またはフザリウム・エスピー（Fusarium sp.）No.ｆ6099株（FERM P-17746）と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託している。
【００１３】
（２）培養条件
本発明においては、前記で選抜したダイオキシン分解性糸状菌を好気的または嫌気的条件、好ましくは好気的条件下で培養し増殖することができる。
好気培養は、通常の中温菌の培養に準じ、静置培養でも振盪培養でも良い。培養液のｐＨは２〜８、好ましくは５〜８である。
【００１４】
培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃である。培養を継続する時間は、目的とするダイオキシン含有物質中のダイオキシンを分解するのに十分な時間であればよく、通常は１〜２０日間、好ましくは２週間程度である。
嫌気培養は、上記の好気培養に準じるが、静置培養を行なう。
【００１５】
培地は、通常の微生物、好ましくは糸状菌の培養に用いるものであれば特に制限されない。例えば、ポテト澱粉−デキストロース培地、コーンミール培地、オートミール培地または後述のフォーゲル（Vogel）培地等を用いてもよい。好ましくは、フォーゲル（Vogel）培地である。
培地には、セルロースやリグニン等の木質性成分等を添加することができる。さらに必要に応じて各種の炭素源あるいは窒素源を添加することができる。炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩、亜鉛塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ1塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
【００１６】
（３）ダイオキシン分解方法
本発明のダイオキシン分解方法は、上記のダイオキシン分解活性を有する糸状菌の培養物またはその処理物でダイオキシン類（クロロジベンゾジオキシン類）を処理することにより行なわれる。例えば、上記の培養液にダイオキシン含有物質を添加するか、逆にダイオキシン含有物質に上記の培養液またはその抽出成分を添加して処理する。
【００１７】
反応には、バッチ法、連続法、半連続法等のいずれをも用いることができる。また、本発明のダイオキシン分解性糸状菌を含有するものであれば、他のダイオキシン分解菌と共に用いてもよい。
培養液にダイオキシン含有物質を添加して処理する場合は、上述のダイオキシン分解菌の培養条件に準じて行なうことが出来る。
【００１８】
（４）ダイオキシン処理剤
本発明によるダイオキシン処理剤は、前記したダイオキシン分解性糸状菌を含むものであり、液状であると固形化物であるとを問わない。すなわち、上記のダイオキシン分解活性を有する培養液自体をダイオキシン処理剤として用いることができる。また培養液を乾燥し製造助剤を加えて固形剤としたものを、処理するダイオキシン含有物質自体に、または処理媒体中に添加して使用することもできる。
【００１９】
【実施例】
以下、実験例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例により限定されるものではない。
【００２０】
実験例：β−アリールエーテル結合切断活性を有する糸状菌の単離
（１）菌の採取と培養
日本全国の土壌、腐朽材、植物遺体サンプルより微生物を採取し、木材分解性担子菌培養に多用されているフォーゲル（Vogel）培地（液体）１ｍｌをワッセルマンに入れ、滅菌後、菌を接種して、２週間静置培養した。
なお、Vogel培地は、培地１Ｌ当たりグルコース（純正化学製）１０ｇ、酵母抽出物（Yeast Extract，オリエンタル酵母工業製）2.5ｇのほか、下記組成のストック溶液（Stock solution）２０ｍｌと微量金属（Trace metal）１００μｌ、0.01％ビオチン水溶液（Biotin Solution）１００μｌを含む。
【００２１】
【表１】
0004009678.tif 000002
【００２２】
【表２】
0004009678.tif 000003
【００２３】
（２）β−アリールエーテル結合切断活性を有する糸状菌の選抜
本発明者らが先に特願平１１−５６７２３号に記載しているのと同様の方法により、β−アリールエーテル結合切断活性を有する糸状菌の選出を行なった。
すなわち、リグニンモデル化合物として、Ｂ環に蛍光物質である４−メチルウンベリフェロンを有するウンベリフェロンエーテルおよびウンベリフェロンエーテルを使用し、リグニンモデル化合物中のβ−アリルエーテル結合が開裂して生じる蛍光物質の蛍光の強さに基づいて糸状菌を選抜した。
【００２４】
具体的には、前記培養後の菌体懸濁液に、基質であるリグニンモデル化合物を含むＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド，0.1％）溶液を終濃度が0.01％となるように加え、約２４時間後、エーテル結合の切断により遊離したウンベリフェロンの蛍光強度を３６５ｎｍのＵＶランプを用いて観測した。
その結果、エーテル結合の切断活性を有する糸状菌８４株を分離した。
【００２５】
実施例１：ダイオキシン分解活性の測定
ダイオキシンモデル化合物として２，７−ジクロロジベンゾジオキシン（以下、２，７−ＤＣＤＤとする。）を使用して前記８４株の糸状菌についてダイオキシン分解活性の測定を行なった。
すなわち、各糸状菌を培養後、ろ液4.95ｍｌをそれぞれ太口試験管に入れ、これに２，７−ＤＣＤＤを最終濃度が４０μＭとなるように添加して、３５℃、３時間振盪処理を行なった。内部標準物質としてアントラセンを加えた後、ｎ−ヘキサン１０ｍｌで２回、５ｍｌで１回抽出した。得られた抽出物を遠心エバポレーターで減圧濃縮した後、ＧＣ−ＭＳにより２，７−ＤＣＤＤの定量を行なった。対照として、培養ろ液を振盪処理前に１２１℃、１分間オートクレーブにて熱処理したものを用いた。
その結果は図１に示す通り、５％以上の分解活性を示すものが４３株（５１％）、１０％以上の分解活性を示すもの２５株（３０％）、２０％以上の分解活性を示すもの１３株（１５％）であった。
【００２６】
実施例２：ダイオキシン分解活性を有する糸状菌の形態および同定
上記実施例１で特に強い分解活性を示した５株（ｆ5226株、ｆ5615株、ｆ5625株、ｆ6098株、ｆ6099株）について、その性状を調べ以下の結果を得た。
(1)ｆ5226株：本菌株のＰＤＡ培地（７日培養）上での菌叢は、ビロード状でほぼ均一、ピンク色をして軽い成長輪環（zonation）を起こしている。裏面は周辺部が淡白色で、中心部は褐色である。分生胞子は黒褐色で、球形または亜球形（φ１０μｍ）、特異的に外膜が認められることがある。従って、本菌株はペリコニア（Periconia）に属する糸状菌であると同定された。
【００２７】
(2)ｆ5615株：本菌株のＰＤＡ培地（７日培養）上での菌叢は、ビロード状で均一、灰緑色をしてやや盛り上がっている。裏面は周縁部は白色で、中心部は黒色である。従って、本菌株はペニシリウム（Penicillium）に属する糸状菌であると同定された。
【００２８】
(3)ｆ5625株：本菌株のＰＤＡ培地（７日培養）上での菌叢は、ビロード状で均一、やや盛り上がって白色のコロニーを形成している。中心部は灰緑色である。実体顕微鏡下では中心部は菌叢の一部が樹枝状を呈する。裏面は淡褐色である。
【００２９】
(4)ｆ6098株：本菌株のＰＤＡ培地（７日培養）上での菌叢は、均一で淡褐色を帯びた白色、気中菌糸が密生する。裏面は均一で淡褐色である。分生子柄は球状細胞をし、特異的で暗緑色の球形または亜球形をしたアレウロ型分生胞子（φ１４〜２０μｍ）を単生する。従って、本菌株はニグロスポラ（Nigrospora）に属する糸状菌であると同定された。
【００３０】
(5)ｆ6099株：本菌株のＰＤＡ培地（７日培養）上での菌叢は、ビロード状でほぼ均一、白色、部分的に紫色を呈する。裏面は周辺が白色、中心部が紫色である。小型分生子柄はほとんど未発達で菌糸上に胞子塊を形成する。小型分生胞子は無色で長楕円形（７〜１０×2.2〜3.0μｍ）である。従って、本菌株はフザリウム（Fusarium）に属する糸状菌であると同定された。
【００３１】
これらの５種類の菌株のうち、ぺリコニア（Periconia）属及びニグロスポラ（Nigrospora）属に属する菌株が本発明の菌株であり、残り３種は参考菌株である。
これらの菌株は、ペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）No.ｆ5615株（FERM P-17759）、糸状菌No.ｆ5625株（Strain No.ｆ5625）（FERM P-17748）、・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）およびフザリウム・エスピー（Fusarium sp.）No.ｆ6099株（FERM P-17746）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００３２】
【発明の効果】
本発明は、ダイオキシン分解性糸状菌の培養物またはその処理物を用いてダイオキシンを分解するダイオキシンの分解方法、ダイオキシン処理剤および新規ダイオキシン分解性糸状菌を提供したものである。特に本発明者らが見出したペリコニア・エスピー（Periconia sp.）No.ｆ5226株（FERM P-17749）、及びニグロスポラ・エスピー（Nigrospora sp.）No.ｆ6098株（FERM P-17747）はダイオキシン分解活性が高いため、本菌株を用いることにより、ダイオキシンを効果的に分解することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  糸状菌による２，７−ジクロロジベンゾジオキシン（２，７−ＤＣＤＤ）の分解活性（減少率％）を評価した結果を示す。
【図１】
0004009678.tif 000004