(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ａ）及び第２ＤＮＡ断片（ａ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ｂ）及び第２ＤＮＡ断片（ｂ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）との末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とを直線状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）と第１ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片（ａ）と第２ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなることを特徴とするユニバーサルアダプター。
【請求項２】
互いに相補的な第１ＤＮＡ断片及び第２ＤＮＡ断片からなる２本鎖ＤＮＡ断片の両末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片をリング状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなることを特徴とするユニバーサルアダプター。
【請求項３】
請求項１又は２において，上記第１アニール領域の塩基数に対する上記第１−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であり，上記第２アニール領域の塩基数に対する上記第２−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であることを特等とするユニバーサルアダプター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において，上記第１アニール領域及び第２アニール領域の塩基数は，１０〜１００であることを特徴とするユニバーサルアダプター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において，上記第１−３本鎖形成領域及び第２−３本鎖形成領域の塩基数は，１０〜１００であることを特徴とするユニバーサルアダプター。
【請求項６】
互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ａ）及び第２ＤＮＡ断片（ａ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ｂ）及び第２ＤＮＡ断片（ｂ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）との末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とを直線状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）と第１ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片（ａ）と第２ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなるものを準備する工程と，
上記ユニバーサルアダプターにＲｅｃＡ蛋白質を結合させる工程と，
上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して，上記第１ヌクレオチドの第１−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と上記第１−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して，上記第２ヌクレオチドの第２−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）と上記第２−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
ライゲーション反応により，上記第１ヌクレオチドの３' 末端と第１ＤＮＡ断片（ｂ）の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチドの３' 末端と第２ＤＮＡ断片（ａ）の５' 末端との間をリン酸エステル結合により連結する工程とからなることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項７】
請求項６において，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）は，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して，分子数で１〜１０００倍量添加することを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項８】
請求項６又は７において，上記ユニバーサルアダプターは，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して，分子数で０．１〜１０倍量添加することを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項９】
互いに相補的な第１ＤＮＡ断片及び第２ＤＮＡ断片からなる２本鎖ＤＮＡ断片の両末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片をリング状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなるものを準備する工程と，
上記ユニバーサルアダプターにＲｅｃＡ蛋白質を結合させる工程と，
上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して，上記第１ヌクレオチドの第１−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片と上記第１−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して，上記第２ヌクレオチドの第２−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片と上記第２−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
ライゲーション反応により，上記第１ヌクレオチドの３' 末端と第１ＤＮＡ断片の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチドの３' 末端と第２ＤＮＡ断片の５' 末端との間をリン酸エステル結合により連結する工程とからなることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１０】
請求項９において，上記ユニバーサルアダプターは，上記２本鎖ＤＮＡ断片に対して，分子数で０．１〜１０倍量添加することを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項において，上記ライゲーション反応を行う工程の後に，上記ＲｅｃＡ蛋白質を除去する工程を行うことを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか１項において，上記ライゲーション反応は，４５〜８０℃で行うことを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１３】
請求項１２において，上記ライゲーション反応は，耐熱性ライゲースを用いて行うことを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項において，上記第１アニール領域の塩基数に対する上記第１−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であり，上記第２アニール領域の塩基数に対する上記第２−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか１項において，上記第１アニール及び第２アニール領域の塩基数は，１０〜１００であることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【請求項１６】
請求項６〜１５のいずれか１項において，上記第１−３本鎖形成領域及び第２−３本鎖形成領域の塩基数は，１０〜１００であることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は，２本鎖ＤＮＡ断片を連結するためのユニバーサルアダプター，及びこれを用いた核酸ＤＮＡの連結方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来，核酸ＤＮＡの連結方法としては，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）をアダプターを用いて連結するアダプター法がある。
この方法は，まず，図９（Ｃ１），（Ｃ２）に示すごとく，ライゲーション反応により，連結させたい一方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）９２の末端に，突出末端形成用のアダプター９１を連結して，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）９２の末端を突出末端とする。次いで，図９（Ｃ３）に示すごとく，未反応のアダプター９１をゲルろ過により除去する。次いで，図９（Ｃ４）に示すごとく，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）９２の突出末端をリン酸化する。次いで，図９（Ｃ５）に示すごとく，連結させたい他方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）９３で，アダプターの突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を有するものを準備し，ライゲーション反応により，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）９２，９３を連結する。
【０００３】
【解決しようとする課題】
しかしながら，上記従来の核酸ＤＮＡの連結方法においては，以下の問題がある。
まず，実験操作が，４段階以上にもなり，操作も煩雑で熟練を要する。また，作業時間も約４時間以上必要である。そのため，従来の連結方法を用いてＤＮＡクローニングをする場合には，クローニング操作が遅くなる。
第２に，反応容器を何度も交換する必要があり，ＤＮＡの損失が大きい。
第３に，ＰＣＲ産物である２本鎖ＤＮＡ断片を連結する場合には，その中に目的以外の２本鎖ＤＮＡ断片が多く含まれている。そのため，副産物の多い２本鎖ＤＮＡ断片の中で目的の２本鎖ＤＮＡ断片だけを連結させる必要がある。しかし，上記従来の連結方法では，副産物ＤＮＡ断片を同時に連結してしまうため，精度が悪く，また後の実験操作を更に遅らせるという問題がある。
【０００４】
本発明はかかる従来の問題点に鑑み，連結反応の操作が容易で，ＤＮＡの損失が少なく，また目的のＤＮＡ同志を精度良く連結することができるユニバーサルアダプター及びこれを用いた核酸ＤＮＡの連結方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題の解決手段】
請求項１の発明は，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ａ）及び第２ＤＮＡ断片（ａ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ｂ）及び第２ＤＮＡ断片（ｂ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）との末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とを直線状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）と第１ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片（ａ）と第２ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなることを特徴とするユニバーサルアダプターである。
【０００６】
本発明は，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とをユニバーサルアダプターを介在させて直線状に連結する方法である。
本発明において最も注目すべきことは，ユニバーサルアダプターが，互いに相補的なアニール領域を有する第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドとからなること，また，ユニバーサルアダプターは，上記アニール領域の上流側，即ちアニール領域を挟んで反対側（トランス）の位置に，第１−３本鎖形成領域と第２−３本鎖形成領域とが突出する構造を有することである。
【０００７】
そのため，突出した一方の第１−３本鎖形成領域には，連結させたい２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）の内の一方の第１ＤＮＡ断片（ａ）の末端が相補的に重なりあい，２本鎖ＤＮＡ断片の末端と第１−３本鎖形成領域とからなる３本鎖ＤＮＡ複合体が形成される。
【０００８】
また，突出した他方の第２−３本鎖形成領域には，連結させたい２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の内の他方の第２ＤＮＡ断片（ｂ）の末端が相補的に重なりあい，２本鎖ＤＮＡ断片の末端と第２−３本鎖形成領域とからなる３本鎖ＤＮＡ複合体が形成される。
そのため，この状態で，ライゲーション反応を行うことにより，連結させたい２本鎖ＤＮＡ断片の末端を，ユニバーサルアダプターを挟んで連結することができる。
【０００９】
本発明のユニバーサルアダプターによれば，第１，第２ヌクレオチドの３本鎖形成領域を，連結させたい２本鎖ＤＮＡ断片の末端にそれぞれ重なり合わせる操作と，この状態でライゲーションさせる操作とを行うことにより，２本鎖ＤＮＡ断片を連結でき，非常に少ない工程で短時間に連結操作を行うことができる。また，これらの操作は，１つの反応容器内で行うことができ，操作が簡便であり，２本鎖ＤＮＡ断片の損失も少ない。
なお，連結すべき２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）の末端は，平滑末端でもよいし，また付着末端でもよい。
【００１０】
次に，請求項２の発明は，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片及び第２ＤＮＡ断片からなる２本鎖ＤＮＡ断片の両末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片をリング状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなることを特徴とするユニバーサルアダプターである。
【００１１】
本発明は，２本鎖ＤＮＡ断片の両末端をユニバーサルアダプターを介在させてリング状に連結する方法である。
【００１２】
本発明のユニバーサルアダプターは，互いに相補的なアニール領域を有する第１，第２ヌクレオチドからなり，これらは，アニール領域の上流側の位置，即ち，アニール領域を挟んでトランスの位置に，それぞれ３本鎖形成領域を有する。そのため，上記請求項１の発明と同様に，３本鎖形成領域に対して２本鎖ＤＮＡ断片を重ね合わせる工程と，ライゲーション反応を行う工程によって２本鎖ＤＮＡ断片を連結できる。それ故，少ない工程数でＤＮＡを連結でき，簡単な操作で，ＤＮＡの損失も少なく，精度良く高い効率で２本鎖ＤＮＡ断片を連結することができる。
なお，連結すべき２本鎖ＤＮＡ断片の両末端は，平滑末端でもよいし，また付着末端でもよい。
【００１３】
次に，請求項３の発明のように，上記第１アニール領域の塩基数に対する上記第１−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であり，上記第２アニール領域の塩基数に対する上記第２−３本鎖形成領域の塩基数の比率は，０．１〜１０であることが好ましい。
【００１４】
これにより，安定な３本鎖ＤＮＡ複合体を形成できる。そのため，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が高くなる。
一方，第１アニール領域の塩基数に対する上記第１−３本鎖形成領域の塩基数の比率が０．１未満の場合，又は第２アニール領域の塩基数に対する上記第２−３本鎖形成領域の塩基数の比率が０．１未満の場合には，３本鎖ＤＮＡ複合体が不安定になり，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が低下するおそれがある。また，第１アニール領域の塩基数に対する上記第１−３本鎖形成領域の塩基数の比率が１０を超える場合，又は第２アニール領域の塩基数に対する上記第２−３本鎖形成領域の塩基数の比率が１０を超える場合には，３本鎖ＤＮＡ複合体が不安定になり，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が低下するおそれがある。
【００１５】
請求項４の発明のように，上記第１アニール領域及び第２アニール領域の塩基数は，１０〜１００であることが好ましい。これにより，第１，第２ヌクレオチドが安定して２本鎖を形成することができる。一方，上記第１アニール領域又は第２アニール領域の塩基数が，１０未満の場合には第１，第２ヌクレオチドがアニール領域で相補的に配列し難くなる。また，上記第１アニール領域及び第２アニール領域の塩基数は，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率の点から，１００以下であることが好ましい。
【００１６】
請求項５の発明のように，上記第１−３本鎖形成領域及び第２−３本鎖形成領域の塩基数は，１０〜１００であることが好ましい。これにより，安定した３本鎖ＤＮＡ複合体が形成され，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が高くなる。一方，第１−３本鎖形成領域又は第２−３本鎖形成領域の塩基数が１０未満の場合には，３本鎖ＤＮＡ複合体が不安定になり，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が低下するおそれがある。また，上記第１−３本鎖形成領域及び第２−３本鎖形成領域の塩基数は，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率向上の点から，１００以下であることが好ましい。
【００１７】
次に，上記ユニバーサルアダプターを用いて２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）を直線状に連結する方法について説明する。即ち，その連結方法は，請求項６の発明のように，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ａ）及び第２ＤＮＡ断片（ａ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ｂ）及び第２ＤＮＡ断片（ｂ）からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）との末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とを直線状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）と第１ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片（ａ）と第２ＤＮＡ断片（ｂ）との末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなるものを準備する工程と，
上記ユニバーサルアダプターにＲｅｃＡ蛋白質を結合させる工程と，
上記第１ＤＮＡ断片（ａ）の３' 末端塩基配列に対して，上記第１ヌクレオチドの第１−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と上記第１−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
上記第２ＤＮＡ断片（ｂ）の３' 末端塩基配列に対して，上記第２ヌクレオチドの第２−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）と上記第２−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
ライゲーション反応により，上記第１ヌクレオチドの３' 末端と第１ＤＮＡ断片（ｂ）の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチドの３' 末端と第２ＤＮＡ断片（ａ）の５' 末端との間をリン酸エステル結合により連結する工程とからなることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法である。
【００１８】
本発明は，ユニバーサルアダプターとＲｅｃＡ蛋白質とを用いて，２本鎖ＤＮＡ断片を直線状に連結する方法である。ＲｅｃＡ蛋白質は，元来生体内に存在して，ＤＮＡに突然変異が生じた場合にその変異部位を正常な塩基配列に組み換える蛋白質である。
【００１９】
本発明の連結方法においては，上記ＲｅｃＡ蛋白質を用いて，ユニバーサルアダプターの３本鎖形成領域と２本鎖ＤＮＡ断片とを重なり合わせている。そのため，３本鎖ＤＮＡ複合体が非常に効率良く行われ，形成された３本鎖ＤＮＡ複合体も，非常に安定である。また，連結工程数も，従来に比べて少ない。また，１つの反応容器内で操作できるため，操作が簡便でＤＮＡの損失も少ない。そのため，本発明によれば，高い効率で精度良く２本鎖ＤＮＡ断片を連結することができる。
【００２０】
請求項７の発明のように，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）は，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して，分子数で１〜１０００倍量添加することが好ましい。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）を効率よく連結することができる。一方，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）が，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して分子数で１倍未満の場合又は１０００倍を超える場合には，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）の連結効率が低下するおそれがある。
【００２１】
請求項８の発明のように，上記ユニバーサルアダプターは，上記２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して，分子数で０．１〜１０倍量添加することが好ましい。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）を効率よく連結することができる。一方，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）が，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）に対して分子数で０．１倍未満の場合又は１０倍を超える場合には，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）の連結効率が低下するおそれがある。
【００２２】
次に，上記ユニバーサルアダプターを用いて２本鎖ＤＮＡ断片をリング状に連結する方法について説明する。即ち，その連結方法は，請求項９の発明のように，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片及び第２ＤＮＡ断片からなる２本鎖ＤＮＡ断片の両末端の間に介在して，上記２本鎖ＤＮＡ断片をリング状に連結するためのユニバーサルアダプターであって，
上記ユニバーサルアダプターは，上記第１ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第１ヌクレオチドと，上記第２ＤＮＡ断片の両末端を連結するための第２ヌクレオチドとからなり，
上記第１ヌクレオチドは，上記第２ヌクレオチドに対してアニールし得る第１アニール領域と，該第１アニール領域の上流側に設けた，上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第１−３本鎖形成領域とからなり，
上記第２ヌクレオチドは，上記第１ヌクレオチドに対してアニールし得る第２アニール領域と，該第２アニール領域の上流側に設けた，上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる第２−３本鎖形成領域とからなるものを準備する工程と，
上記ユニバーサルアダプターにＲｅｃＡ蛋白質を結合させる工程と，
上記第１ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して，上記第１ヌクレオチドの第１−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片と上記第１−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
上記第２ＤＮＡ断片の３' 末端塩基配列に対して，上記第２ヌクレオチドの第２−３本鎖形成領域を重ね合わせることにより，上記２本鎖ＤＮＡ断片と上記第２−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部を形成する工程と，
ライゲーション反応により，上記第１ヌクレオチドの３' 末端と第１ＤＮＡ断片の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチドの３' 末端と第２ＤＮＡ断片の５' 末端との間をリン酸エステル結合により連結する工程とからなることを特徴とする核酸ＤＮＡの連結方法である。
【００２３】
本発明においても，上記請求項６と同様に，ユニバーサルアダプターとＲｅｃＡ蛋白質とを用いて２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）の連結を行っているため，工程数を少なくでき，簡便な操作でＤＮＡの損失も少なく，精度良く高い効率で２本鎖ＤＮＡ断片を連結することができる。
【００２４】
請求項１０の発明のように，上記ユニバーサルアダプターは，上記２本鎖ＤＮＡ断片に対して，分子数で０．１〜１０倍量添加することが好ましい。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片の両末端を効率よく連結することができる。一方，ユニバーサルアダプターが，２本鎖ＤＮＡ断片に対して分子数で０．１倍未満の場合又は１０倍を超える場合には，２本鎖ＤＮＡ断片の連結効率が低下するおそれがある。
【００２５】
請求項１１の発明のように，上記ライゲーション反応を行う工程の後に，上記ＲｅｃＡ蛋白質を除去する工程を行うことが好ましい。これにより，連結されたＤＮＡの精製，分析，増幅，ＤＮＡ加工を行うことができる。
【００２６】
請求項１２の発明のように，上記ライゲーション反応は，４５〜８０℃で行うことが好ましい。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片の末端の間にユニバーサルアダプターを介在させた状態で両者を連結することができる。一方，４５℃未満の場合には，２本鎖ＤＮＡ断片の末端同志が直接連結するおそれがあり，設計通りの塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片の連結体を得ることができない場合がある。また，８０℃を超える場合には，ライゲーション反応が進行しにくくなるおそれがある。
【００２７】
ライゲーション反応を４５〜８０℃で行う場合には，請求項１３の発明のように，上記ライゲーション反応は，耐熱性ライゲースを用いて行うことが好ましい。これにより，酵素活性が高くなり，ライゲーション反応が迅速に行われる。耐熱性ライゲースとしては，特に限定されないが，例えば，アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ），Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ，Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ等を用いることができる。
【００２８】
上記の２本鎖ＤＮＡ断片の直線状又はリング状に連結する方法においては，請求項１４〜１６に記載のように，上述したユニバーサルアダプターを用いることが好ましい。
なお，ＲｅｃＡ蛋白質は，例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ．等の微生物より抽出することにより得られる，ＲｅｃＡ蛋白質様分子を用いることができる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
実施形態例１
本発明の実施形態例にかかるユニバーサルアダプター，及びこれを用いた核酸ＤＮＡの連結方法について，図１〜図６を用いて説明する。
ユニバーサルアダプター１は，図１に示すごとく，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ａ）２１及び第２ＤＮＡ断片（ａ）２２からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）２と，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片（ｂ）３１及び第２ＤＮＡ断片（ｂ）３２からなる２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３との末端の間に介在して，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）２と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３とを直線状に連結するためのアダプターである。
【００３０】
ユニバーサルアダプター１は，第１ＤＮＡ断片（ａ）２１と第１ＤＮＡ断片（ｂ）３１との末端を連結するための第１ヌクレオチド１１と，第２ＤＮＡ断片（ａ）２２と第２ＤＮＡ断片（ｂ）３２との末端を連結するための第２ヌクレオチド１２とからなる。
【００３１】
第１ヌクレオチド１１は，第２ヌクレオチド１２に対してアニールし得る第１アニール領域１１０と，第１アニール領域１１０の上流側に設けた第１−３本鎖形成領域１１１とからなる。第１−３本鎖形成領域１１１は，第１ＤＮＡ断片（ａ）２１の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる。
【００３２】
第２ヌクレオチド１２は，第１ヌクレオチド１１に対してアニールし得る第２アニール領域１２０と，第２アニール領域１２０の上流側に設けた第２−３本鎖形成領域１２１とからなる。第２−３本鎖形成領域１２１は，第２ＤＮＡ断片（ｂ）３２の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる。
【００３３】
第１，第２ヌクレオチド１１，１２の塩基数は，図２に示すごとく，いずれも７５ｍｅｒである。第１ヌクレオチド１１は，４０ｍｅｒのｐＢＲ３２２ＤＮＡＳｃａ１断片末端配列と，それに続く３５ｍｅｒの配列とからなる。第２ヌクレオチド１２は，４０ｍｅｒのｐＵＣ１９  ＤＮＡ  Ｓｃａ１断片末端配列と，それに続く３５ｍｅｒ配列とからなる。
【００３４】
第１ヌクレオチドの３５ｍｅｒ部位と，第２ヌクレオチドの３５ｍｅｒ部位は，互いに相補的な塩基配列を有し，前者は第１アニール領域１１０であり，後者は第２アニール領域１２０である。
第１ヌクレオチド１１における４０ｍｅｒのｐＢＲ３２２ＤＮＡ  Ｓｃａ１断片末端配列は，第１−３本鎖形成領域１１１である。第２ヌクレオチド１２における４０ｍｅｒのｐＵＣ１９  ＤＮＡ  Ｓｃａ１断片末端配列は，第２−３本鎖形成領域１２１である。
次に，上記ユニバーサルアダプター１を用いて２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）２と２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３とを直線状に連結する方法を説明する。まず，その概要を説明すると，図３に示すごとく，連結すべき２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）２に，ユニバーサルアダプター１をＲｅｃＡ蛋白５存在下で重ね合わせる（図３（Ｓ１〜３））。次いで，連結すべき他方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３を加えて，これにユニバーサルアダプター１に重ね合わせる（図３（Ｓ４））。次いで，アンプリガーゼ６を添加することにより，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）２，３を連結し（図３（Ｓ５）），その後，ＲｅｃＡ蛋白５を除去する（図３（Ｓ６））。以下，この連結方法について詳細に説明する。
【００３５】
まず，図４（Ｓ１）に示すごとく，ＰＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断することにより２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）を調製した。また，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３は，ＰＵＣ１９ＤＮＡを制限するＳｃａＩで切断して調製した。
また，図２に示す塩基配列となるように，第１，第２ヌクレオチド１１，１２からなるユニバーサルアダプター１を合成した。
【００３６】
次いで，図４（Ｓ２）に示すごとく，ユニバーサルアダプター１（０．０５ｐｍｏｌ）と，ＲｅｃＡ蛋白５（エピセンターテクノロジー社製）０．１５μｇと，最終濃度が０．４８ｍＭとなるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社製）とを，３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）及び２．５ｍＭ酢酸マグネシウムからなる緩衝液に混ぜ，３７℃で１５分間保温した。
【００３７】
次いで，図４（Ｓ３）に示すごとく，酢酸マグネシウムを１２．０ｍＭに上げると共に８０ｎｇの連結すべき一方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）２を加え，更に，３７℃で２０分間保温した。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と第１−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５１が形成された。
【００３８】
次いで，図５（Ｓ４）に示すごとく，連結すべき他方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）３を加え，更に３０分間保温した。これにより，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）と第２−３本鎖形成領域とＲｅｃＡ蛋白質とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５２が形成された。
【００３９】
次いで，図５（Ｓ５）に示すごとく，反応溶液に同量のライゲーション反応混合溶液を混ぜ，５５℃で２時間から１６時間保温した。これにより，第１ヌクレオチド１１の３' 末端と第１ＤＮＡ断片（ｂ）３１の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチド１２の３' 末端と第２ＤＮＡ断片（ａ）２２の５' 末端との間をリン酸エステル結合６０により連結した。
ライゲーション反応の組成は，４０ｍＭ  T ｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１．０m Ｍ  ＮＡＤ，０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ８．３，４０ｕｎｉｔｓ  アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）であった。
【００４０】
次いで，図５（Ｓ６）に示すごとく，それぞれの最終濃度が，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ，０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫになるように加え，３７℃で３０分間保温して，ＲｅｃＡ蛋白質及びアンプリガーゼをＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５１，５２から除去した。ＲｅｃＡ蛋白５をＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５１，５２から除去すると，そこから第１−３本鎖形成領域１１１と，第２−３本鎖形成領域１２１とが遊離した状態となる（図３（Ｓ６））。
【００４１】
また，比較のために，上記のＤＮＡ連結反応に対して，ＲｅｃＡ蛋白質は加えたがアンプリガーゼを加えない場合，ＲｅｃＡ蛋白質を加えないでアンプリガーゼは加えた場合，ＲｅｃＡ蛋白質及びアンプリガーゼの双方とも加えない場合についても同様の操作を行い，それぞれ試料Ｃ１〜Ｃ３を得た。また，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）を，上記ｐＵＣ１９／Ｓｃａ１に変えて，末端の異なるｐＵＣ１９／Ｓｍａ１を用いて同様の反応を行った。これにより得たＤＮＡ溶液を試料Ｃ４とした。
【００４２】
その後，上記の操作により得られた試料Ｅ１，Ｃ１〜Ｃ４について，０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。各試料は，それぞれゲル８のセル８０に入れた。なお，ＤＮＡサイズマーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片）も同時に電気泳動をした。泳動後に，エチジウムブロミド染色を行い，ゲル８の写真を撮影し，ＤＮＡ断片の連結状態を観察した。その結果，図６に示した。
【００４３】
同図より知られるように，試料を泳動させたレーンには，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）の連結物が観察された。
一方，他の試料Ｃ１〜Ｃ３を泳動させたレーンには，連結されていない２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）が観察されたが，両者の連結物は観察されなかった。このことから，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），（Ｂ）を連結するにはＲｅｃＡ蛋白質とアンプリガーゼの両者が必要であることがわかる。また，試料Ｃ４を泳動させたレーンにも連結産物が観察されなかった。このことから，一方の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の末端配列が，第２ヌクレオチドの第２−３本鎖形成領域の塩基配列と相違すると，２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）は，２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と連結しないことがわかる。
【００４４】
実施形態例２
本例は，図７，図８に示すごとく，ユニバーサルアダプター１を用いて，互いに相補的な第１ＤＮＡ断片４１及び第２ＤＮＡ断片４２からなる２本鎖ＤＮＡ断片４の両末端をリング状に連結する方法である。
【００４５】
ユニバーサルアダプター１は，図７に示すごとく，第１ＤＮＡ断片４１の両末端を連結するための第１ヌクレオチド１１と，第２ＤＮＡ断片４２の両末端を連結するための第２ヌクレオチド１２とからなる。
第１ヌクレオチド１１は，第２ヌクレオチド１２に対してアニールし得る第１アニール領域１１０と，第１アニール領域１１０の上流側に設けた第１−３本鎖形成領域１１１とからなる。第１−３本鎖形成領域１１１は，第１ＤＮＡ断片４１の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる。
第２ヌクレオチド１２は，第１ヌクレオチド１１に対してアニールし得る第２アニール領域１２０と，第２アニール領域１２０の上流側に設けた第２−３本鎖形成領域１２１とからなる。第２−３本鎖形成領域１２１は，第２ＤＮＡ断片４２の３' 末端塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる。
【００４６】
上記ユニバーサルアダプター１を用いて，２本鎖ＤＮＡ断片４をリング状に連結する方法について説明する。
まず，図８（Ｋ１）に示すごとく，ユニバーサルアダプター１と２本鎖ＤＮＡ断片４とを調製する。ユニバーサルアダプター１は，実施形態例１と同様のものを合成する。２本鎖ＤＮＡ断片４は，ＰＢＲ３２２ＤＮＡ又はＰＵＣ１９ＤＮＡを制限酵素で１ケ所切断したものである。
【００４７】
次いで，図８（Ｋ２）に示すごとく，にＲｅｃＡ蛋白質５を結合させる。
次いで，図８（Ｋ３）に示すごとく，第１ＤＮＡ断片４１の３' 末端塩基配列に対して，第１ヌクレオチド１１の第１−３本鎖形成領域１１１を重ね合わせることにより，２本鎖ＤＮＡ断片４１と第１−３本鎖形成領域１１１とＲｅｃＡ蛋白質５とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５１を形成する。
【００４８】
次いで，図８（Ｋ４）に示すごとく，第２ＤＮＡ断片４２の３' 末端塩基配列に対して，第２ヌクレオチド１２の第２−３本鎖形成領域１２１を重ね合わせることにより，２本鎖ＤＮＡ断片４と第２−３本鎖形成領域１２１とＲｅｃＡ蛋白質５とからなるＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部５２を形成する。
【００４９】
次いで，図８（Ｋ５）に示すごとく，アンプリガーゼを用いたライゲーション反応により，第１ヌクレオチド１１の３' 末端と第１ＤＮＡ断片４１の５' 末端との間，及び第２ヌクレオチド１２の３' 末端と第２ＤＮＡ断片４２の５' 末端との間をリン酸エステル結合６０により連結する。ライゲーション反応に用いる反応溶液の組成は，実施形態例１と同様である。
【００５０】
次いで，図８（Ｋ６）に示すごとく，ＲｅｃＡ蛋白質５を，プロティナーゼ及びＳＤＳを用いて除去する。
以上により，２本鎖ＤＮＡ断片４が，ユニバーサルアダプター１を介在させた状態でリング状に連結される。
なお，本例において，ＤＮＡ連結方法の詳細は，実施形態例１と同様である。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば，連結反応の操作が容易で，ＤＮＡの損失が少なく，また目的のＤＮＡ同志を精度良く連結することができるユニバーサルアダプター及びこれを用いた核酸ＤＮＡの連結方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施形態例１における，ユニバーサルアダプターの説明図。
【図２】実施形態例１における，核酸ＤＮＡの連結方法の概要を示す説明図。
【図３】実施形態例１における，ユニバーサルアダプターの塩基配列を示す説明図。
【図４】実施形態例１における，核酸ＤＮＡの連結方法を示す説明図。
【図５】図４に続く，核酸ＤＮＡの連結方法を示す説明図。
【図６】実施形態例１における，連結操作後の核酸ＤＮＡをゲル電気泳動させたときの状態を示す説明図。
【図７】実施形態例２における，ユニバーサルアダプターの説明図。
【図８】実施形態例２における，核酸ＤＮＡの連結方法の概要を示す説明図。
【図９】従来例における，核酸ＤＮＡの連結方法の概要を示す説明図。
【符号の説明】
１．．．ユニバーサルアダプター，
１１．．．第１ヌクレオチド，
１１０．．．第１アニール領域，
１１１．．．第１−３本鎖形成領域，
１２．．．第２ヌクレオチド，
１２０．．．第２アニール領域，
１２１．．．第２−３本鎖形成領域，
２．．．２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ），
２１．．．第１ＤＮＡ断片（ａ），
２２．．．第２ＤＮＡ断片（ａ），
３．．．２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ），
３１．．．第１ＤＮＡ断片（ｂ），
３２．．．第２ＤＮＡ断片（ｂ），
４．．．２本鎖ＤＮＡ断片，
４１．．．第１ＤＮＡ断片，
４２．．．第２ＤＮＡ断片，
５．．．ＲｅｃＡ蛋白質，
５１，５２．．．ＲｅｃＡ３本鎖ＤＮＡ複合部，
６．．．アンプリガーゼ，
６０．．．リン酸エステル結合，
【図１】
0003978823.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003978823.tif 000008
【図８】
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【図９】
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