(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞培養発現系における組換え因子ＶＩＩＩの生産方法であって、
Ａ．（１）４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリン、（２）８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロール、または（３）７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸の一つから選ばれるリン脂質混合物を含んでなるリポソームを前記培養発現系に添加する工程、および
Ｂ．前記哺乳類細胞を培養して組換え因子ＶＩＩＩを発現する工程、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
組換え因子ＶＩＩＩが、配列番号１の配列を有するポリペプチドに連結されている９０ｋＤフラグメントおよび８０ｋＤフラグメントを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
リン脂質混合物が、４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンである請求項１記載の方法。
【請求項４】
リン脂質混合物が、８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールである請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
リン脂質混合物が、７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸である請求項１記載の方法。
【請求項６】
リポソームを含む細胞培養培地であって、前記リポソームが（１）４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリン、（２）８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロール、または（３）７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸の一つから選ばれるリン脂質混合物を含んでなる、上記培地。
【請求項７】
リン脂質混合物が、４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンである、請求項６記載の培地。
【請求項８】
リン脂質混合物が、８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールである、請求項６記載の培地。
【請求項９】
リン脂質混合物が、７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸である、請求項６記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本開示は、一般的には哺乳類細胞発現系における組換え因子ＶＩＩＩの産生に関する。具体的には本開示は、組換え因子ＶＩＩＩの収率を増加させるための、哺乳類細胞培養培地に対して特定された比率で脂質類を含むリポソーム様物質の添加に関する。
【０００２】
【従来の技術】
因子ＶＩＩＩは正常な止血もしくは血液の凝固に必要とされる血漿蛋白質である。機能的な因子ＶＩＩＩは血友病Ａの個体においては欠損しており、Ｘ−染色体中に存在するこの蛋白質をコードする遺伝子の突然変異がその理由となっている。出血現象を制御するためには血友病患者を因子ＶＩＩＩで処理する必要があり、この因子ＶＩＩＩは歴史的にヒト血液の血漿から単離されている。
【０００３】
ヒトの因子ＶＩＩＩ遺伝子は１８６，０００の塩基対を含み、かつ全Ｘ−染色体の０．１％を構成しており、そのためこの遺伝子は中でも既知の最大遺伝子となっている（１）。２６のエキソンに由来するこの因子の転写産物は約９０００塩基対の長さのメッセンジャーＲＮＡであり、これが２３５１のアミノ酸からなる巨大蛋白質をコードしている。因子ＶＩＩＩの構造研究により、この因子は有意な数の炭化水素残基を含む糖蛋白質であることが示されている。因子ＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡがクローン化されており（２、３）、そしてハムスター幼仔の腎細胞（ＢＨＫ−２１）（３）およびチャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）ハムスターの卵巣細胞（４）中で安定に発現されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これらの高産生性細胞クローンの入手が可能になったことから、組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の大量産生が容易となった。ｒＦＶＩＩＩの商業的産生上の２つの重要な挑戦項目は、（ｉ）高密度培養物を支持しかつｒＦＶＩＩＩを安定化させるであろう無血清培地の開発、および（ｉｉ）高純度のｒＦＶＩＩＩを生じるであろう効率のよい精製法である。
【０００５】
ウシのリポ蛋白質もしくはヒトの低密度リポ蛋白質の無血清培地への添加により、組換えＢＨＫ−２１細胞およびヒト胎児腎臓（２９３Ｓ）細胞が発現するｒＦＶＩＩＩの産生性が有意に改善されたことがこれまでに論証されている（５）。フォン  ビルブラント（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子の同時発現およびリン脂質類の無血清培地への添加がｒＦＶＩＩＩ発現性ＣＨＯ細胞により産生されるｒＦＶＩＩＩの安定性を亢進させるのに有効であることが示されている（６）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、少なくとも２種（好ましくは、少なくとも３種）の脂質を含むある種のリポソーム様物質を、ｒＦＶＩＩＩの無血清産生の際に培養補足物として用いることが可能であることを発見した。従来の技術（６）とは対照的に、本発明者は、単一の脂質（例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、もしくはホスファチジルセリン（ＰＣ）のようなもの）からなる所定のリポソーム様物質はＢＨＫ−２１細胞および２９３Ｓ細胞でのｒＦＶＩＩＩ発現には全く影響を及ぼさないという所見を得た。しかしながら異なる脂質［例えば、コレステロール、脂肪酸（例、リノール酸およびパルミチン酸）ＰＣ、ＰＥ、およびＰＳ］の所定の比率での組み合わせ物を含むリポソーム様物質はＢＨＫ−２１細胞および２９３Ｓ細胞でのｒＦＶＩＩＩ発現に有意な増強効果を及ぼすことが見いだされた。ｒＦＶＩＩＩの長期産生のための無血清産生培地はこれらの新規の所見から開発された。
【０００７】
本発明者は、約４倍を上回る倍率で組換え因子ＶＩＩＩを産生する哺乳類細胞発現系の生産性の実質的な増加のための方法および培地を発見した。この方法の必須の段階は、発現系の細胞増殖培地へのリポソーム様物質の添加からなる。本明細書に用いられる際には「リポソーム様物質」は、固定されたモル比での少なくとも２種の脂質から構成される一つもしくは複数の二分子層を含んでなる小胞を意味する。モル比はおおよそのものであると理解されるべきである。
【０００８】
本発明は以下の実施例に具体的に説明され、それらの実施例によっては高レベルのｒＦＶＩＩＩを発現する組換え細胞の脂質補足物を供給するためにリポソーム様物質を用いるｒＦＶＩＩＩの産生（好ましくは連続的産生）のための典型的な方法および細胞培養培地が記載される。
【０００９】
リポソーム様物質の調製  全合成性リン脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．社（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ）から取得した。リン脂質は０．１μのリポソーム様物質として供給した。凍結乾燥化リン脂質を５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で再構成し、そして取っ手型装置であるＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．社、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の助けを借りて０．１μのポリカーボネート膜を通して押し出した。サイズ揃えを施したリポソーム様物質をその後に０．２μのフィルターで濾過し、そして無菌的に培地に添加した。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）を、単一構成成分もしくは混合物のいずれかとして調査した。他の脂質（例えば、コレステロールおよび遊離脂肪酸）もそのリポソーム様物質内に取り込ませた。
【００１０】
【実施例】
実施例Ｉ
２９３Ｓ細胞におけるｒＦＶＩＩＩの発現における様々な脂質混合物の効果
ＧＳ−１０（高レベルの因子ＶＩＩＩを発現する組換え２９３Ｓ細胞）細胞を、インシュリン（１０μｇ／ｍｌ）およびトランスフェリン（２５μｇ／ｍｌ）を補足してある無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、から得られる１：１での比率のダルベッコーの（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）最少必須培地およびＦ１２）を用いて震盪フラスコ内で無血清培養物として維持した。長期的評価は、３×１０6細胞／ｍｌの初期撒種密度を用いて震盪フラスコ内で実施した。完全な培地交換は２４時間の間隔で実施し、この際に細胞を遠心、洗浄、および３×１０6細胞／ｍｌで再撒種した。典型的な震盪器内培養物は２５〜５０ｍｌの細胞を含む。因子ＶＩＩＩの活性を発色性アッセイであるＣｏａｔｅｓｔ  ＶＩＩＩ（Ｋａｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｏｈｉｏ）により製造業者の指示書に従って測定した。
【００１１】
リン脂質の初回スクリーニングを２４時間目のプレート培養物を用いて実施した。様々なリン脂質の至適比率を決定した後、この結果を１０〜１４日の期間にわたり震盪フラスコ内で確認した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
表１に示されるように、ＰＣおよびＰＥが単独であると因子ＶＩＩＩ発現には全く影響を示さない一方で、ＰＳが単独であると阻害性を示すことが見いだされた。ＰＣ、ＰＳ、およびＰＥを様々な比率で組み合わせることにより因子ＶＩＩＩ発現における有意な増加が観察された。最高の産生性は、ＰＣ：ＰＥ：ＰＳ（４：１：１）、ＰＣ：ＰＳ：コレステロール（８：１：１）、およびＰＣ：ＰＳ：パルミチン酸：リノール酸（７：３：０．５：０．５）を補足した細胞において観察された。リン脂質の至適濃度は３０μｇ／ｍｌであることが見いだされた。様々なリン脂質のアシル側鎖の至適鎖長はＣ１８であると決定された。全ての至適化研究を、引き続きジオレオイルリン脂質類に関して実施した。
【００１４】
実施例ＩＩ
連続培養における因子ＶＩＩＩの発現
本発明者は、ＰＣ：ＰＥ：ＰＳ（４：１：１）、ＰＣ：ＰＳ：パルミチン酸：リノール酸（７：３：０．５：０．５）、およびＰＣ：ＰＳ：コレステロール（８：１：１）を用い、長期震盪フラスコ培養による因子ＶＩＩＩの産生性における各種リポソーム様物質の効果を測定した。培養条件は実施例Ｉに記載されるように実施した。
【００１５】
リポソーム様物質の濃度は３０μｇ／ｍｌであった。完全な培地交換を２４時間の間隔で実施した。結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
実施例ＩＩＩ
連続培養における因子ＶＩＩＩの発現
短縮された因子ＶＩＩＩ（因子ＶＩＩＩのＢドメインの全部または一部の欠失）の産生に対する各種リポソーム類の効果を、因子ＶＩＩＩの９０ｋＤおよび８０ｋＤのフラグメントに結合する下記配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）を有するＢドメイン欠失因子ＶＩＩＩの高レベル発現組換え２９３Ｓ細胞で試験した。
【００１８】
９０-ｋＤ--ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ--８０ｋＤ
（上記配列中のアミノ酸の略号は、引用文献（７）に示されるとおりであり、この文献は引用することによって本明細書の内容となる。）
上記短縮された因子ＶＩＩＩは、引用文献（８）に記載されており、この文献は引用することによって本明細書の内容となる。
【００１９】
培養は、５％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中で、ウェル当り２×１０5細胞の初期撒種密度により、１２ウェルプレートにより行った。細胞が集密になった後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで実施例Ｉに記載したように無血清産物を添加した。結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
表３から、対照生理食塩水より、少なくとも３倍生産性が高まることがわかる。最高の生産性は、ジオレオイルＰＣ／ＰＥ／ＰＳ（８：１：１）およびジオレオイルＰＣ／ＰＳ／コレステロール（８：１：１）を補足した細胞で観察された。
【００２２】
引用文献
１．Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒら、１９８４  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３２６−３２９
２．Ｗｏｏｄら、１９８４  Ｎａｔｕｒｅ３１２：３３０−３３７
３．Ｔｏｏｌｅら、１９８４  Ｎａｔｕｒｅ３１２：３４２−３４７
４．Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１２３３−１２４２
５．Ｃｈａｎら、１９９１  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７：１２１
６．Ｋａｕｆｍａｎら、１０／１９９３  米国特許第５,２５０,４２１号
７．Ｓｃｈｏｌｚら、５／１９９３  米国特許第５，２１０，０７５号
８．Ａｌｍｓｔｅｄｔら、６／１９９１  国際公開第９１／０９１２２号。
【００２３】
本発明の主な特徴または態様は以下のとおりである。
【００２４】
１．  哺乳類細胞培養発現系において組換え因子ＶＩＩＩの産生レベルを少なくとも４倍増加させるための方法であって、産生性の４倍の増加を確実に行わせるに十分であるモル比および条件下で少なくとも２つの異なる脂質を含むリポソーム様物質をその培養系に添加する段階を含んでなる方法。
【００２５】
２．  リポソーム様物質が少なくとも３つの異なる脂質からなる、前記１に記載の方法。
【００２６】
３．  リポソーム様物質が、約４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンからなる、前記２に記載の方法。
【００２７】
４．  リポソーム様物質が、約８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールからなる、前記２に記載の方法。
【００２８】
５．  リポソーム様物質が、約７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸、リノール酸からなる、前記２に記載の方法。
【００２９】
６．  リポソーム様物質を含む細胞培養培地であって、前記リポソーム様物質が哺乳類細胞培養系における因子ＶＩＩＩ発現の４倍増加を確実に行うに十分なモル比で少なくとも２つの異なる脂質を含む細胞培養培地。
【００３０】
７．  リポソーム様物質が、約４：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンからなる、前記２に記載の細胞培養培地。
【００３１】
８．  リポソーム様物質が、約８：１：１のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールからなる、前記２に記載の細胞培養培地。
【００３２】
９．  リポソーム様物質が、約７：３：０．５：０．５のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸、リノール酸からなる、前記２に記載の細胞培養培地。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、リポソーム様物質の形態で供給した場合、脂質混合物は、組換え細胞における因子ＶＩＩＩの産生を有意に増強することを実証した。これらのリポソーム様物質を培地補足物として用いて、因子ＶＩＩＩの産生、好ましくは因子ＶＩＩＩの連続生産を支持することが可能である。なお、本明細書で使用される場合、因子ＶＩＩＩの語は、因子ＶＩＩＩの活性を有する因子ＶＩＩＩのすべての変異体または短縮された形態のものも包含することを意図している。
【００３４】
【表４】
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