(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の核酸配列；または
（ｂ）配列番号：２若しくは配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるＩｎｔ６タンパク質をコードする核酸配列；
からなる、精製かつ単離された遺伝子。
【請求項２】
配列番号：１に記載の核酸配列からなる請求項１の精製かつ単離された遺伝子。
【請求項３】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる請求項１の精製かつ単離された遺伝子。
【請求項４】
配列番号：３に記載の核酸配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項５】
上記ｃＤＮＡがＡＴＣＣ受託番号９７０２９および９７０３０を有する、請求項４に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
試料を配列番号：１，配列番号：３，配列番号：５から配列番号：２８，配列番号：３１又は配列番号：３２のヌクレオチド配列からなる少なくとも１個の核酸と接触させることを含む、請求項１の遺伝子を検出するための試料の分析方法。
【請求項７】
上記分析の工程がサザンブロット分析におけるプローブとして上記ヌクレオチド配列を使用することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記配列がｃＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記ｃＤＮＡが配列番号：３に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記分析の工程がノザンブロット分析におけるプローブとして上記ヌクレオチド配列を使用することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
上記プローブが配列番号：３に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記分析の工程がＰＣＲプライマーとして上記ヌクレオチド配列を使用することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
上記プライマーが配列番号：５から配列番号：２８、配列番号：３１および配列番号：３２から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記分析の工程がＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析における上記プライマーを使用することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記分析の工程がＲＴ−ＰＣＲ分析において上記プライマーを使用することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記分析の工程がＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において上記プライマーを使用することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号：５から配列番号：２８、配列番号：３１および配列番号：３２に記載の配列を有している、精製かつ単離されたプライマー。
【請求項１８】
請求項１の遺伝子を検出するための試料分析に有用な診断キットであって、配列番号：５から配列番号：２８および配列番号：３１および配列番号：３２から成る群から選択される核酸配列を有するプライマーを含み、当該プライマーが請求項１の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、上記のキット。
【請求項１９】
上記遺伝子がｃＤＮＡであって、配列番号：３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１７に記載のプライマー。
【請求項２０】
請求項１の遺伝子を検出するための試料分析に有用な診断キットであって、前記キットは配列番号：１，配列番号：３，配列番号：５から配列番号：２８、配列番号：３１および配列番号：３２の核酸配列からなる少なくとも１個の核酸配列を含み、上記核酸配列が請求項１の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる上記のキット。
【請求項２１】
配列番号：４に記載のタンパク質に対してまたはそれから誘導されたペプチド断片に対して指向した抗体を試料と接触させること；およびタンパク質またはそのペプチド断片と形成した抗体複合体の存在を検出し、それにより試料中のタンパク質の存在を検出することを含む、請求項１の遺伝子によってコードされたタンパク質を検出するための試料の分析方法。
【請求項２２】
上記分析の工程が免疫組織化学分析、放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析、酵素免疫分析または化学発光分析を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる組み換えタンパク質。
【請求項２４】
請求項１の遺伝子を含む組み換え発現ベクター。
【請求項２５】
作動要素を含む、請求項２４に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項２６】
上記遺伝子が配列番号：３に記載の核酸配列からなる、請求項２５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項１の核酸によってコードされたＩｎｔ６タンパク質に対する特異的結合親和性を有する抗体。
【請求項２８】
上記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
毒素、放射ヌクレオチドまたは医薬に結合した請求項２７に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２５に記載の組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項３１】
上記細胞が原核細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
上記細胞が真核細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９５年２月９日出願の米国特許出願第０８／３８５，９９８号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、癌の診断及び治療の分野に関する。より特定的には、本発明は、Ｉｎｔ６遺伝子に関し、また、遺伝子療法、ワクチン、診断方法及び免疫療法におけるＩｎｔ６遺伝子の核酸配列及び推定アミノ酸配列に由来の試薬の使用に関する。
発明の背景
マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）は、乳腫瘍のＭＭＴＶ取込み部位に隣接した細胞性遺伝子の発現の調節異常を招く挿入性突然変異誘発物質として作用することが証明されたレトロウイルスである（Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．，１：３０９−３２０）。ＭＭＴＶ感染マウスでは腫瘍発現前の過形成性胞状結節（ＨＡＮ）が高頻度で発達し（Ｄａｎｉｅｌ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，６１：５３−６０；ＤｅＯｍｅ，Ｋ．Ｂ．（１９５９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，７８：７５１−７５７；Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．（１９７３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７：３−５３；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．ら（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４４：３４２６−３４３７）、同系マウスの清浄化された乳脂肪パッド中でこれらの結節を連続外殖（outgrowth）によって継代させると、これらのマウスにおいて確率的に乳腫瘍が発達するという結果がしばしば得られる。更に、乳腫瘍をもつ外殖（outgrowth）を有するマウスの肺に転移病巣が発見されることも珍しくはない。これらの理由から、腫瘍発達の種々の時期に関与すると考えられるＭＭＴＶに誘発された突然変異イベントを同定することは極めて重要である。
ＭＭＴＶゲノムを分子標識として使用して、マウス乳腫瘍の共通のＭＭＴＶ取込み部位（Ｉｎｔ遺伝子座と命名）を表す５つの遺伝子座（Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｆｇｆ−３／Ｉｎｔ−２、Ｉｎｔ−３、Ｗｎｔ−３及びＦｇｆ−４／Ｈｓｔ／ｋ−ＦＧＦ）が同定された（Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｃ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７：５２９−５３６；Ｇａｌｌａｈａｎ，Ｄ．ら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：２１８−２２０；Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．ら（１９８２）Ｃｅｌｌ．，３１：９９−１０９；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，，８６：５６７８−５６８２）。ＭＭＴＶ  ＬＴＲがＷＮＴ−１、Ｆｇｆ−３、Ｉｎｔ−３のいずれかの遺伝子に結合しているトランスジーンを用いたトランスジェニックマウスの研究は、これらの遺伝子の発現の活性化が乳房の腫瘍発生の一因であることを証明した（Ｊｈａｐｐａｎ，Ｃ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，６：３４５−３５５；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９０）Ｅｍｂｏ  Ｊ．，９：９０７−９１３；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ａ．Ｓ．ら（１９８８）Ｃｅｌｌ．，５５：６１９−６２５）。
本発明は、Ｉｎｔ６と命名された新規なＩｎｔ遺伝子の単離を記載しており、また、診断方法、ワクチン、免疫療法及び遺伝子療法における該遺伝子及びその遺伝子産物並びに該遺伝子及びその遺伝子産物に由来の試薬の使用を記載するものである。
発明の概要
本発明はＩｎｔ６遺伝子の単離に関する。本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子のコーディング配列を含むネズミ及びヒトのｃＤＮＡに関する。本発明は更に、Ｉｎｔ６遺伝子及びＩｎｔ６  ｃＤＮＡに由来の核酸配列に関し、また、他の哺乳類のＩｎｔ６遺伝子の相同体単離用プローブまたはＩｎｔ６遺伝子の突然変異検出用プローブとしてこれらの核酸配列を使用することに関する。
組換えＩｎｔ６タンパク質及び該タンパク質に由来のペプチドフラグメントの産生を指令し得る合成核酸配列並びに等価の天然核酸配列を提供することも本発明の目的の１つである。このような天然核酸配列は、Ｉｎｔ６タンパク質の合成を指令し得る遺伝子が同定または単離できるｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーから単離され得る。本出願の目的となる核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは任意のその合成変異体である。
本発明は更に、Ｉｎｔ６タンパク質及び該タンパク質に由来のペプチドに関する。
本発明はまた、Ｉｎｔ６タンパク質または該タンパク質に由来のペプチドに対する抗体に関する。
本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法を提供する。このような突然変異の検出は、被験者の異常増殖組織の存在または被験者の遺伝的癌素因の存在を判断するために有用である。
Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する第一の方法では、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために被験者のＤＮＡを分析することを含む。
Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する第二の方法では、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡ発現の改変を検出するために被験者のＲＮＡを分析することを含む。
Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するまた別の方法では、Ｉｎｔ６タンパク質発現の改変を検出するために被験者のタンパク質を分析することを含む。
本発明はまた、被験者を癌に対して免疫感作するワクチンとして使用するため及び免疫治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。このような医薬組成物の１つは、Ｉｎｔ６タンパク質またはそのペプチドフラグメントの宿主生物合成を指令し得る核酸配列を含む一方、第二の医薬組成物はＩｎｔ６タンパク質または該タンパク質に由来のペプチドを含む。
上記の医薬組成物はまた、癌患者を治療するために免疫治療方法で使用され得る。発明は更に、免疫療法で使用するためのＩｎｔ６タンパク質または該タンパク質に由来のペプチドに対する抗体を含み、これらの抗体が毒素分子、放射性同位体または薬剤に結合している第三の医薬組成物を提供する。
従って本発明は、１種以上の上記医薬組成物を治療有効量で癌患者に投与することを含む癌患者に対する免疫療法の適用に関する。
本発明は更に、
（ａ）特異的Ｔ細胞応答を誘発すべく有効な量のＩｎｔ６タンパク質をコードしている発現ベクターまたはＩｎｔ６タンパク質自体によって患者を免疫し、
（ｂ）免疫した患者からＴ細胞を単離し、
（ｃ）免疫した患者または非免疫患者に治療有効量のＴ細胞を投与する；
ことを含む癌患者の治療方法に関する。
本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＩｎｔ６の対立遺伝子のヌクレオチド配列を決定するための診断用キットを提供する。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーとして有用な精製及び単離された核酸配列を含む。これらのＰＣＲプライマーはまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための被験者のＤＮＡまたはＲＮＡ分析にも有用である。
本発明は更に、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異によってＩｎｔ６タンパク質の発現が改変された細胞に野生型Ｉｎｔ６遺伝子を供給する方法を提供する。この方法は、Ｉｎｔ６タンパク質の発現が改変された細胞に野生型Ｉｎｔ６遺伝子を導入し野生型遺伝子を細胞中で発現させることを含む。
図面の説明
図１Ａ及び１Ｂは、サザンブロット分析の結果を示す。この分析では、１０マイクログラムの細胞性ＤＮＡをＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプローブとハイブリダイズさせた。図１Ａにおいて、分析されたＤＮＡは、図１Ａの上部に示すように、ＣＺＺ−１  ＨＯＧと命名された腫瘍発現前の過形成性外殖細胞系ＣＺＺ−１（レーン１）、及び、乳腫瘍２２（レーン２）、１２６２（レーン３）、１２６３（レーン４）、２０（レーン５）、１９（レーン６）、２３（レーン７）、２１（レーン８）、２４（レーン９）、８（レーン１０）、９（レーン１１）、１２（レーン１２）、１３（レーン１３）及び１４（レーン１４）に由来のＣＺＺ−１から単離した。図１Ｂにおいて、分析されたＤＮＡは、図１Ｂの上部に示すように、腫瘍４９７３（レーン１）に由来のＣＺＺ−１、及び、腫瘍４９７３を保有するマウスの１１個の独立の肺転移（レーン２−１２）から単離した。
図２Ａ−２Ｃは、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、以下の手順でハイブリダイズさせた１０マイクログラムの細胞性ＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。図２Ａ及び２Ｂのブロットのレーン１及び２は、宿主のフランキング配列に対応するプローブＤとハイブリダイズした。図２Ａ及び２Ｂのレーン２のブロットを引き続いてＭＭＴＶ  ｇａｇ配列（ＭＭＴＶ  ＧＲ−４０に由来の２．０ｋｂのＰｓｔ−ＸｈｏＩフラグメント；Ｇａｌｌａｈａｎ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１，６６−７４：（１９８７））とハイブリダイズさせ、その結果を図２Ａ及び２Ｂのレーン３に示す。図２Ｃのレーン１及び２はプローブＣとハイブリダイズさせた。レーン２を引き続いてＭＭＴＶ  ｅｎｖ配列（ＭＭＴＶ（Ｃ３Ｈ）に由来の１．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメント；Ｇａｌｌａｈａｎ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：６６−７４；（１９８７））とハイブリダイズさせ、その結果を図２Ｃのレーン３に示す。分析したＤＮＡは、腫瘍２２に由来のＣＺＺ−１  ＨＯＧ（図２Ａ、レーン２及び３）、独立の乳腫瘍１１３９（図２Ｂ、レーン２及び３）、独立の乳腫瘍３１３４（図２Ｃ、レーン２及び３）、及び、正常肝臓（図２Ａ−２Ｃのレーン１）から単離した。図２Ａ−２Ｃの矢印の存在は、ＭＭＴＶに誘発されて転位した制限フラグメントの部位を示す。Ｉｎｔ６遺伝子中のプローブＣ及びＤの位置は図３に示されている。
図３は、ネズミのＩｎｔ６遺伝子座の概略図である。図中、Ｉｎｔ６遺伝子座（１−４で指定）にわたる４つのオーバーラップするラムダクローンの位置が、Ｉｎｔ６遺伝子座中のＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＸｂａＩ（Ｘ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）、ＢｇｌII（ＢＧＬ）、ＨｉｎｄIII（Ｈ）及びＢａｍＨＩ（Ｂ）部位の部分的制限地図に対する相対位置で示されている。Ｉｎｔ６エキソンの位置及びプローブＡ−Ｄとして使用される制限フラグメントの位置は夫々、制限地図の下方に夫々実線枠及び斜線枠で示されている。制限地図の目盛りは、図の下部では１目盛り１．０ｋｂの増加を示し、腫瘍１１３９及び３１４４のＩｎｔ６遺伝子の内部またはＣＺＺ−１  ＨＯＧのＩｎｔ６遺伝子の内部に取込まれたＭＭＴＶプロウイルスゲノムの位置及び転写方向は制限地図の上方の矢印の向きによって示されている。
図４は、Ｉｎｔ６陰性腫瘍（腫瘍１７８）及びＩｎｔ６陽性腫瘍（２２及び１１３９）から単離された全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＮＡをホルムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルで分離し、プローブＡとハイブリダイズさせた。
図５は、ネズミの１．４ｋｂのＩｎｔ６  ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を示す。イントロンの切れ目は次のエキソンの起点の上方の小矢印（▲）で示し、遺伝子産物の推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下方に示す。サイフリックＡＭＰ／サイクリックＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ（○）、タンパク質キナーゼＣ（△）、チロシンキナーゼ（−）、カゼインキナーゼII（▽）のリン酸化可能部位及びグリコシレーション部位（□）を推定アミノ酸配列中に示す。
アミノ酸残基の略号：Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒ．
図６は、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ，ショウジョウバエ、ツメガエル、ニワトリ、マウス及びヒトから単離した細胞性ＤＮＡ（各々１０μｇ）をストリンジェンシーの高い条件下でＩｎｔ６  ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた“Ｚｏｏ”ブロットの結果を示す。
図７は、正常成人組織（上部パネル）及び発達中の胚（下部パネル）から単離した全ＲＮＡ（各々１０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＮＡをホルムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルに流し、次いでナイロン膜に移し、β−アクチンプローブ（２．３ｋｂのｍＲＮＡ）及びネズミのＩｎｔ６  ｃＤＮＡプローブ（１．４ｋｂのｍＲＮＡ）に順次ハイブリダイズさせた。
図８は、ＭＭＴＶ  ＬＴＲの反転配列中の潜在的転写終了シグナルの位置及びヌクレオチド配列（下線部分）を示す概略図である。図示の配列はＬＴＲの３′端から数えて４６４から４９７までの塩基に対応する。斜線枠はＩｎｔ６エキソンに対応し、白抜き枠はＩｎｔ６に取込まれたＭＭＴＶプロウイルスゲノムのＬＴＲに対応する。ＭＭＴＶ  ＬＴＲのＵ５、Ｒ及びＵ３領域、並びに、ＭＭＴＶゲノム及びＩｎｔ６遺伝子の転写方向が示されている。
図９Ａ及び９Ｂは、腫瘍１１３９（図９Ａ）及び２２（図９Ｂ）で検出されたキメラＩｎｔ６−ＭＭＴＶ  ＬＴＲ  ＲＮＡ種のＭＭＴＶ配列とＩｎｔ６配列との結合部のヌクレオチド配列を示す。図９Ａで、図示のヌクレオチド配列はエキソンの５′端を起点とし、小文字で示すヌクレオチド配列はイントロン５の配列に対応する。ＲＮＡ種１のアミノ酸配列に等しいＲＮＡ種２のアミノ酸配列を付点で示し、スプライシングによって除去されたＲＮＡ種２のヌクレオチド配列をダッシュで示す。下線を引いたヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は取込まれたＭＭＴＶゲノムに由来の配列である。
図９Ｂ中、腫瘍２２で検出されたキメラＲＮＡ種に関して図示したヌクレオチド配列は、エキソン９の５′端を起点とし、イントロン９の一部分を通ってＭＭＴＶゲノムの潜在的ポリＡ付加シグナルまで伸びている。イントロンのヌクレオチド配列を小文字で示し、ＭＭＴＶ配列を下線で示し、スプライシングによって除去されたイントロンのヌクレオチド配列をダッシュで示す。付点はＲＮＡ種２及び３によってコードされたアミノ酸残基に対応し、これらの残基はＲＮＡ種１によってコードされたアミノ酸残基に等しい。図９Ａ及び９Ｂに示すアミノ酸の略号は図５の凡例で示した略号と同じである。
図１０は、ヒトＩｎｔ６遺伝子のゲノム地図を示す。マウスゲノムの場合と同様に、ヒトＩｎｔ６遺伝子は１３のエキソン（黒塗り枠）から成り、各エキソンのヌクレオチドの両端も図示されている。７番目のイントロンのＣＡ反復配列の位置も図示されている。
図１１は、ヒトＩｎｔ６遺伝子のイントロン７のＣＡ反復配列にフランキングする核酸配列（下線なし）に相補的なプライマーのヌクレオチド配列（下線付き）を示す。ＣＡ反復配列からプライマーまでの間隔は夫々４０及び１３８塩基対であり、図示のＣＡ反復配列の数（１８）は野生型Ｉｎｔ６遺伝子中に見出される数である。上部の核酸配列は５′から３′の方向で示されており、下部の核酸配列は読取りが左から右に向かって行われる３′から５′の方向で示されている。
図１２は、ヒトＤＮＡ（レーン４）、ヒト染色体６（レーン１）またはヒト染色体８（レーン２）だけを含むチャイニーズハムスター−ヒト体細胞ハイブリットＤＮＡ、ヒト染色体３，７，８，１５及び１７を含むマウス−ヒト体細胞ハイブリットＤＮＡ（レーン３）を、ＨｉｎｄIIIで消化し、ヒトＩｎｔ６  ｃＤＮＡとハイブリダイズさせたサザンブロットの結果を示す。
図１３は、Ｉｎｔ６遺伝子のイントロン７のＣＡ反復配列にフランキングする標識プライマーを用いたヒト原発性乳腫瘍（Ｔ）及び適合性正常組織（Ｌ、Ｌはリンパ球を意味する）に由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を示す。各ブロットの上方の数字は、腫瘍サンプル及び適合性正常組織サンプルを提供した被験者を示す。各ブロットに近接の矢印は、適合性正常ＤＮＡに比べて対立遺伝子のシグナルが完全に消失しているかまたは有意に低下していることを示す。
図１４は、１３のヒトＩｎｔ６エキソンのうちの１２のエキソンの両端に隣接するヌクレオチド配列を示す。各エキソンの両端に隣接する核酸配列（下線なし）に相補的なプライマーの核酸配列（下線付き）を各エキソンの左右に示す。各エキソンの左右の上方に示す核酸配列は５′から３′の方向であり、各エキソンの左右の下方に示す配列は３′から５′の方向である。各エキソンの両端に隣接する配列がイントロン−エキソン結合点から始まるとき、この配列の長さは結合点を起点とする各エキソンの左右の塩基対の数で与えられる。
図１５は、原発性乳腫瘍（Ｔ）及び適合性正常組織（Ｎ）から単離された全ＲＮＡ（各々２０μｇ）のノーザンブロットの結果を示す。ＲＮＡサンプルをホルムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルに流し、次いでナイロン膜に移し、β−アクチンプローブ及びヒトＩｎｔ６  ｃＤＮＡプローブと順次ハイブリダイズさせた。
図１６は、ヒト非小細胞肺癌（５４Ｔ及び５５Ｔ）及び適合性正常組織（５５Ｎ）から単離した全ＲＮＡ（各々２０μｇ）のノーザンブロットの結果を示す。５４Ｔに対する適合性正常組織についてもＩｎｔ６  ｍＲＮＡ発現を観察したが、５４Ｎのノーザンブロットは図示していない。図１５の場合と同様にしてノーザンブロット分析を行った。
発明の説明
本発明は、腫瘍発生中の宿主細胞ゲノムへのＭＭＴＶ取込みに関連する突然変異性イベントが、Ｉｎｔ６と命名されたこれまでは知られなかった遺伝子中で生じることを開示している。この遺伝子はマウスの染色体１５に局在する。より特定的には本発明は、Ｉｎｔ６遺伝子及びその対応するｃＤＮＡに関する。Ｉｎｔ６を保有するマウス染色体１５の領域は、オーバーラップする４つのラムダクローン（図３に符号１−４で示す）中に提示され、完全Ｉｎｔ６遺伝子を含んでいる。Ｉｎｔ６遺伝子は野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す。
本発明はまた、ネズミのＩｎｔ６遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを目的とする。このｃＤＮＡ配列を配列１として以下に示す。
0003911017.tif 000002
ヌクレオチドに使用した略号は当業界で標準的に使用されている略号に準拠した。
ネズミのＩｎｔ６  ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を配列番号２として以下に示す。この配列は、配列番号１のヌクレオチド１７３を起点とし、１１８８ヌクレオチドの長さを有している。
0003911017.tif 000003
0003911017.tif 000004
本発明はまた、ヒトのＩｎｔ６  ｃＤＮＡと相同のヌクレオチド配列を開示している。ヒトのＩｎｔ６  ｃＤＮＡ配列はマウスの配列に８９％の相同性を有している。オーバーラップする２つの組換えクローン（ＨＩＮＴ６ＡとＨＩＮＴ６Ｂ）は夫々、ヒトのＩｎｔ６  ｃＤＮＡ配列の５′側の半鎖及び３′側の半鎖を表している。これらの２つのクローンはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２に１９９５年１月２４日付けで寄託され、ＡＴＣＣ受託番号９７０２９及び９７０３０で受託された。ヒトのＩｎｔ６  ｃＤＮＡ配列を配列番号３として以下に示す。
0003911017.tif 000005
ヒトのＩｎｔ６  ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を配列番号４として以下に示す。この配列は、配列番号３のヌクレオチド１６８を起点とし、１１８８ヌクレオチドの長さを有している。
0003911017.tif 000006
0003911017.tif 000007
ヒト及びマウスのＩｎｔ６タンパク質のアミノ酸配列は等しい。
配列番号１及び３で示すｃＤＮＡ配列中には、配列番号２及び４で夫々示すタンパク質の類似体の産生を指令し得るＤＮＡ配列を与える変異が存在してもよい。上記に示したＤＮＡ配列は本発明の好適例の１つを表すものであることに留意されたい。遺伝コードが縮重性なので、本発明のＩｎｔ６タンパク質またはそれらの類似体の産生を指令し得るＤＮＡ配列を与える多数の代替可能なヌクレオチドが存在することは理解されよう。このことは、上記に示した配列に機能的に等価のＤＮＡ配列、または、上記に示したアミノ酸配列通りに産生されるＩｎｔ６タンパク質の類似体の産生を指令する配列に機能的に等価のＤＮＡ配列が本発明の範囲内に包含されることを意味する。
類似体という用語は、本文中に特定的に示した配列に実質的に等しいアミノ酸残基配列を有しており１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が機能的に等しい残基によって保存的に置換されている任意のタンパク質またはポリペプチドを意味する。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１つの非極性（即ち、疎水性）残基による他の残基の置換、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、もしくは、グリシンとセリンとの間の置換のような１つの極性（即ち、親水性）残基による他の残基の置換、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのような１つの塩基性残基による他の残基の置換、または、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１つの酸性残基による他の残基の置換がある。
保存的置換という表現はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基を使用することを意味する。
化学的誘導体という用語は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたはそれ以上の残基を有するＩｎｔ６タンパク質またはポリペプチドを意味する。このような誘導体化された分子の例としては、遊離アミノ基が誘導体化されて、例えばアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子があるが、これらに限定されない。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチルエステル及びエチルエステルまたは他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、２０個の標準アミノ酸の天然産生アミノ酸誘導体を１つまたはそれ以上の数で含むタンパク質またはペプチドも化学的誘導体に包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに置換し得る。５−ヒドロキシリシンはヒスチジンに置換し得る。ホモセリンはセリンに置換し得る。オルニチンはリシンに置換し得る。
本発明によって提供される核酸配列は、プローブとして多くの目的に使用し得る。例えば、これらの核酸配列は、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用でき、また、点突然変異を検出するためにＲＮアーゼ保護方法でプローブとして使用できる。ＰＣＲ増幅産物を検出するためにもプローブを使用できる。また、他の技術を用いてＩｎｔ６遺伝子またはｍＲＮＡとのミスマッチを検出するためにプローブを使用してもよい。ミスマッチは、酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ）、化学薬品（例えば、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムとピペリジン）を用いて検出してもよく、または、完全に適合したハイブリッドと比較したときの不適正ハイブリッドの電気泳動移動度の変化を利用して検出してもよい。これらの技術は当業界で公知である。プローブはＩｎｔ６遺伝子のコーディング配列に相補的であるが、イントロンに対するプローブも設計できる。野生型Ｉｎｔ６遺伝子の改変を検出するキットを構成するために完全セットの核酸プローブを使用し得る。キットは完全Ｉｎｔ６遺伝子にハイブリダイゼーションできるようになっている。プローブは互いにオーバーラップしてもよくまたは隣合って連続していてもよい。
ｍＲＮＡとのミスマッチを検出するためにリボプローブを使用する場合、リボプローブはヒト野生型Ｉｎｔ６遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。従ってリボプローブは、センス鎖の反対の極性を有するのでＩｎｔ６タンパク質をコードしないアンチセンスプローブである。一般にはリボプローブを、当業界で公知の任意の手段を用いて放射性物質、比色物質または蛍光物質によって標識し得る。ＤＮＡとのミスマッチを検出するためにリボプローブを使用する場合、リボプローブがセンスまたはアンチセンスのいずれの極性を有していてもよい。ＤＮＡプローブも同様にしてミスマッチを検出するために使用し得る。
核酸プローブはまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異対立遺伝子に相補的であってもよい。これらの対立遺伝子特異的プローブは、ミスマッチではなくハイブリダイゼーションに基づいて他の被験者中の同様の突然変異を検出するために有用である。Ｉｎｔ６プローブはまた上述のように、欠失及び挿入のような染色体の顕著な変化を検出するためにゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションで使用できる。プローブはまた、腫瘍組織及び正常組織からＩｎｔ６遺伝子のｃＤＮＡクローンを選択するために使用できる。更に、発現の改変が野生型Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の結果であるか否かを判断すべく、プローブを組織中のＩｎｔ６  ｍＲＮＡを検出するために使用できる。Ｉｎｔ６遺伝子及びＩｎｔ６  ｃＤＮＡの配列が配列番号１及び３に示す配列である限り、特定のプローブの設計は平均的な当業者の技術の範囲内である。
本発明はまた被験者のＩｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する方法に関する。
本発明において、被験者は哺乳動物を意味し、突然変異は、野生型Ｉｎｔ６遺伝子の反転、転位、挿入、欠失または点突然変異を意味する。
腫瘍組織中に見出される多くの突然変異はＩｎｔ６タンパク質の発現の改変に導く突然変異であると考えられている。しかしながら、非機能性遺伝子産物に導く突然変異もまた癌の原因となり得る。更に、点突然変異は、調節領域（例えばプロモーター）で発生するか、または、適正なＲＮＡプロセッシングを混乱させ、その結果としてＩｎｔ６  ｍＲＮＡの発現の低下の原因またはＩｎｔ６タンパク質の発現の消失の原因となると理解されている。
マウスの腫瘍発現前の乳房病巣で観察されるＩｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの取込みは、Ｉｎｔ６の突然変異が癌の初期イベントに関与することを示唆する。従ってＩｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は診断及び予後に関する情報を提供し得る。例えば臨床医は、腫瘍中のＩｎｔ６遺伝子の突然変異の検出に基づいて治療計画を選択し得る。本発明の方法はＩｎｔ６の突然変異が発生するいかなる腫瘍にも適用できる。肺及び乳房の腫瘍ではＩｎｔ６遺伝子の発現の消失が観察された。従ってこれらの腫瘍では、Ｉｎｔ６が腫瘍発生に何らかの役割を果たしている。更に、Ｉｎｔ６は、脳、心臓、腎臓、肝臓、卵巣、脾臓及び精巣などの試験したすべての組織中で発現されるので、Ｉｎｔ６遺伝子の発現に不利な影響を及ぼす突然変異はこれらの組織中の異常増殖の一因ともなり得る。最後に、肺腫瘍及び乳腫瘍は上皮組織に由来するので、本発明方法は、非小細胞肺癌のような上皮細胞由来の癌の検出にも有用であろう。
更に、本発明で開示された検出方法が胎児の出生前スクリーニングまたは家族の病歴に基づいて癌の危険が予測される被験者の前兆スクリーニングにも使用できることが当業者に理解されよう。
本発明の１つの実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は、野生型Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために被験者のＤＮＡを分析することを含む。ＤＮＡ分析のためには、生物標本を被験者から採取する。本方法で使用するために採取される生物標本の例としては、組織生検及び血液があるが、これらに限定されない。組織調製物中の腫瘍細胞を富化する手段は当業界で公知である。例えば、パラフィン切片もしくはクリオスタット切片から組織を単離してもよい。また、フローサイトメトリーによって正常細胞から癌細胞を分離してもよい。正常細胞から腫瘍を分離するこれらの技術及びその他の技術は当業界で周知である。または、平均的な当業者に公知の方法を用いて腫瘍生検から一次細胞培養物を樹立してもよい。
Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために、生物標本から単離したＤＮＡを種々の方法で分析し得る。例えば、適当な制限酵素による消化後のサザンブロッティング（制限酵素断片長多型、ＲＥＬＰ）（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８０）６９：２０１−２０５）、変性勾配電気泳動法（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５−４９８）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８４）３：１３３２１−１３２６）、プローブＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の二重鎖のＲＮアーゼ消化（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２：７５７５−７５７９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７−４９１；米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（欧州特許出願第０，３２０，３０８号及び第０，４３９，１８２号）、並びに、ＰＣＲ−一本鎖コンフォーメーション分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９８９）５：８７４−８７９；Ｄｅａｎ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：８６３−８７１）などの方法がある。
１つの好ましい実施態様では、腫瘍または血液のＤＮＡ中のＩｎｔ６遺伝子の顕著な転位を観察するためにサザンブロット分析を使用できる。サザン分析によって分析すべきＤＮＡを、１つまたはそれ以上の制限酵素によって消化する。制限消化後、得られたＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって分離し、標識した核酸プローブとのハイブリダイゼーションによってフラグメントを検出する（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９８：５０３−５１７）。
サザン分析においてプローブとして使用される核酸配列は、一本鎖または二重鎖の形態で標識できる。核酸配列の標識は当業者に公知の技術によって行うことができる。このような標識技術では、ラジオラベル及び酵素を使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。更に、化学的部分をピリミジン環及びプリン環に結合させる方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．（１９６８）Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０：５５１８−５５２３）、化学発光によって検出する方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０）、ビオチニル化した核酸プローブを使用する方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．ら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１２６−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら（１９８２）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：２４１−２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３−１２８）及び市販製品を用いる蛍光検出方法のような非放射性のシグナル増幅技術も知られている。プローブの大きさは約２００ヌクレオチドから約数キロ塩基の範囲に及ぶ。好ましいプローブの大きさは約５００〜約２０００ヌクレオチドである。プローブはＩｎｔ６遺伝子のイントロンに由来してもよくまたはエキソンに由来してもよい。サザン分析でプローブとして使用される核酸配列の各々はネズミまたはヒトのＩｎｔ６遺伝子の対応する部分、即ちこれらの遺伝子が夫々配列番号１または３で示すｃＤＮＡ配列を有している部分に実質的に相同である。好ましい実施態様において、プローブは、配列番号３に示すＩｎｔ６  ｃＤＮＡ配列を有するヒトＩｎｔ６遺伝子に由来する。「実質的に相同な」という表現は、プローブとして使用される核酸配列とヒトまたはネズミのＩｎｔ６遺伝子の対応する配列との間の相同性のレベルを意味する。相同性のレベルは、好ましくは７０％以上、極めて好ましくは８０％以上であり、特に好ましい核酸配列はマウスまたはヒトのＩｎｔ６遺伝子の配列と９０％以上の相同性を有している。
分離したＤＮＡフラグメントと標識した核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、オートラジオグラフィーによって制限消化パターンを可視化し、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異に関連した制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の有無を検査する。
別の好ましい実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析してもよい。この方法では、ＰＣＲで使用するために選択されたプライマー対の各々を、Ｉｎｔ６遺伝子中の配列とハイブリダイズして増幅され、変性した増幅産物中の突然変異が非変性型ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出され得るように設計する。好ましい実施態様では、プライマー対がヒトＩｎｔ６遺伝子に由来する。より好ましい実施態様では、プライマー対がヒトＩｎｔ６遺伝子の所与のエキソンの５′端及び３′端に隣接するイントロン性配列に由来する。ヒトＩｎｔ６遺伝子のエキソンの特異的増幅を可能にするプライマー対の例を以下に示すが、これらに限定されない：
0003911017.tif 000008
0003911017.tif 000009
配列番号５及び６はエキソン１の両端に隣接し、配列番号７及び８はエキソン２の両端に隣接し、配列番号９及び１０はエキソン３の両端に隣接し、配列番号１１及び１２はエキソン４の両端に隣接し、配列番号１３及び１４はエキソン５の両端に隣接し、配列番号１５及び１６はエキソン６の両端に隣接し、配列番号１７及び１８はエキソン８の両端に隣接し、配列番号１９及び２０はエキソン９の両端に隣接し、配列番号２１及び２２はエキソン１０の両端に隣接し、配列番号２３及び２４はエキソン１１の両端に隣接し、配列番号２５及び２６はエキソン１２の両端に隣接し、配列番号２７及び２８はエキソン１３の両端に隣接する。Ｉｎｔ６遺伝子配列に対して十分に特異的なハイブリダイゼーションを得るための増幅反応の最適化は当業者の知識の範囲内であり、好ましくはアニーリング温度の調整によって行う。
本発明のプライマーは公知のオリゴヌクレオチド合成方法のいずれかを用いて合成できる（例えば、Ａｇａｒｗａｌら（１９７２）Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１：４５１のホスホジエステル法、Ｈｓｉｕｎｇら（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：１３７１のホスホトリエステル法、または、Ｂｅｕａｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２の全自動ジエチルホスホルアミダイド法）。または、これらのプライマーは天然産生ＤＮＡまたはクローン化したＤＮＡの単離フラグメントであってもよい。更に、オリゴヌクレオチドを、種々の製造業者から販売されている全自動装置によって合成できること、または、業者に注文生産することができることが当業者には明らかであろう。１つの実施態様においては、プライマー延長産物を検出及び／または同定するために適当な検出可能ラベル（例えば、ビオチン、アビジンまたは放射性標識ｄＮＴＰ）を含むようにプライマーを誘導体化してもよく、または増幅産物の単離を容易にする物質（例えばビオチンまたはアビジン）によってプライマーを誘導体化してもよい。
別の実施態様においては、Ｉｎｔ６疾病遺伝子の突然変異形態にハイブリダイズするようにプライマー対を選択し得る。選択されたプライマー対は、突然変異した遺伝子配列に十分に特異的にハイブリダイズし、従って、野生型Ｉｎｔ６遺伝子配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションが、突然変異遺伝子配列の増幅産物の同定を妨害することはない。Ｉｎｔ６遺伝子配列中の突然変異にハイブリダイズするプライマー対は、生物サンプルのＤＮＡ中に存在する特異的突然変異遺伝子配列を増幅するために使用できる。
ＰＣＲの増幅産物は直接または間接に検出できる。増幅産物の直接検出はプライマー対の標識を介して行う。本発明のプライマーを標識するための好適なラベルは当業者に公知であり、例えば、放射性ラベル、ビオチン、アビジン、酵素及び蛍光分子がある。増幅反応を実施する前に所望のラベルをプライマーに組込むとよい。好ましい標識手順では、放射性標識したＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。または、増幅反応中のプライマー延長産物に１つまたはそれ以上の標識ｄＮＴＰの形態で所望のラベルを組込んでもよい。本発明においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための標識された増幅ＰＣＲ産物の分析を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）によってＰＣＲ産物を分離するかまたはＰＣＲ産物を直接配列決定することによって行う。
更に、別の実施態様においては、Ｉｎｔ６疾病遺伝子中の突然変異を検出するための非標識増幅産物の分析を、サザンブロットまたはドットブロット中の放射性標識またはビオチン標識した核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって行う。この実施態様に有用な核酸プローブは、サザン分析に関して前述した核酸プローブである。更に別の実施態様においては、配列番号１及び３に示したｃＤＮＡ配列を用いて腫瘍組織中に存在する対立遺伝子を分子クローニングし、当業界で周知の技術を用いてこの対立遺伝子を配列決定することによって点突然変異を検出し得る。
第２の実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は、Ｉｎｔ６特異的ｍＲＮＡ発現の改変を検出するために被験者のＲＮＡを分析することを含む。
この方法でＲＮＡを分析するためには、被験者から得られた血液サンプルまたは腫瘍生検サンプルからＲＮＡを単離できる。このような腫瘍の例は乳房及び肺の腫瘍であるが、これらに限定されない。
分析すべきＲＮＡを血液サンプルまたは生検サンプルから全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）+ＲＮＡとして単離できる。全細胞ＲＮＡは当業者に公知の方法によって単離できる。このような方法には、差別的沈降によるＲＮＡの抽出（Ｂｉｒｎｂｉｏｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１４８７−１４９７）、有機溶媒によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９）、及び、強い変性剤によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９）がある。ポリ（Ａ）+ＲＮＡはオリゴ−ｄ（Ｔ）カラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーによって全細胞ＲＮＡから選択できる（Ａｖｉｖ，Ｈ．ら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８−１４１２）。ＲＮＡの好ましい単離方法は、酸−フェノールによる全細胞ＲＮＡの抽出である（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，１９８７）。
Ｉｎｔ６特異的ｍＲＮＡ発現のパターンまたはレベルの改変を検出するためにＲＮＡを分析する方法としては、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５０−５３５４）、ドット及びスロットハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．ら（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７：１５４１−１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；９：１７４−１７９）、ＲＮアーゼ保護（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２），“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及び、ＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰがある。好適な方法はノーザンブロッティングである。
Ｉｎｔ６特異的ｍＲＮＡ発現を検出するプローブとして使用される核酸配列は配列番号１または３に実質的に相同である。「実質的に相同」という表現は、核酸配列と配列番号１または３のｃＤＮＡ配列との間の相同性のレベルを意味する。相同性のレベルは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であり、特に好ましい核酸配列は配列番号１または３に示すｃＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有している。
第二の好ましい実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子中の突然変異を検出するためにＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析する。逆転写酵素を用いて腫瘍の全ＲＮＡまたはポリＡ+富化ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを調製する。この方法においては、得られる一本鎖ｃＤＮＡのＰＣＲに使用すべく選択されたプライマー対の各々は、増幅され、次いで変性した増幅産物中の突然変異が非変性型ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出されるべく適正な間隔（少なくとも約１００〜３００ヌクレオチド）を隔てて遺伝子中に存在するＩｎｔ６  ｃＤＮＡ中の配列とハイブリダイズするように設計される。オーバーラップするＩｎｔ６遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし得るプライマー対は、Ｉｎｔ６遺伝子配列に由来し得る。プライマー対は、上記に示した配列番号１及び３中のｃＤＮＡ配列に由来し得る。好ましい実施態様において、プライマーは配列番号３に示すヒトＩｎｔ６  ｃＤＮＡ配列に由来する。対を成すプライマーの各々は、二重鎖標的配列の一方の鎖の３′端の配列に相補的な約１５〜２０塩基の長さの一本鎖オリゴヌクレオチドである。各対が２つのこのようなプライマーを含み、一方のプライマーが相補的３′端であり、他方のプライマーが標的配列の他の３′端に相補的である。標的配列は一般的には約１００〜約３００塩基対の長さである。Ｉｎｔ６  ｃＤＮＡに対して十分に特異的なハイブリダイゼーションを得るための増幅反応の最適化は当業界でよく知られており、好ましくはアニーリング温度の調整によって行う。または、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出すべく変性ＲＴ−ＰＣＴ産物を分析するために、ＲＴ−ＰＣＴ産物を直接配列決定してもよい。
更に別の好ましい分析方法はＲＮアーゼ保護方法であり、この方法は、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：ｐ．７５７５（１９８５）及びＭｅｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：ｐ．１２４２（１９８５）に詳細に記載されている。本発明の実施にあたっては、方法がヒト野生型遺伝子のコーディング配列に相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブと腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡとを一緒にアニーリング（ハイブリダイズ）し、次いで二重鎖ＲＮＡ構造中のミスマッチを検出できる酵素ＲＮアーゼＡによって消化する。ＲＮアーゼＡによりミスマッチが検出された場合、それはミスマッチの部位を開裂させる。リボプローブはＲＮＡまたは遺伝子の全長を含む必要はなく、ＲＮＡまたは遺伝子のいずれか一方の一部分を含んでいればよい。リボプローブがＩｎｔ６  ＲＮＡまたはＩｎｔ６遺伝子の一部分だけを含む場合に、全ｍＲＮＡ配列をミスマッチのためにスクリーニングするためには、これらのプローブを複数で使用するのが望ましい。
本発明はまた、配列番号１及び３に示すｃＤＮＡに由来の組換えタンパク質を包含する。組換えＩｎｔ６タンパク質は当業者に公知の組換えＤＮＡ方法によって産生できる。Ｉｎｔ６タンパク質のアミノ酸配列がマウス（配列番号２）及びヒト（配列番号４）で等しいので、配列番号４に示すアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質をコードし得る適当な核酸配列は、配列番号３または配列番号１に示された配列である。好ましい実施態様では、このような適当な核酸配列を、宿主生物に導入され宿主生物中で複製され得るベクターにクローニングできる。
本発明で使用するように設計されたベクターは、上記の核酸配列が任意の好適なまたは必要な作動要素と共に挿入され次いで宿主生物に導入され宿主生物中で複製され得るような任意のベクターである。好ましいベクターは、十分に解明された制限部位を有しており且つ核酸配列の転写に好適なまたは必要な作動要素を含んでいるベクターである。
本文中で使用された「作動要素」という用語は、少なくとも１つのプロモーターと、少なくとも１つのオペレーターと、少なくとも１つのリーダー配列と、少なくとも１つの終止コドンと、ベクター核酸の適正な転写及びその後の翻訳に必要なまたは好適な他の任意のＤＮＡ配列とを意味する。このようなベクターは特に、宿主生物によって認識される少なくとも１つの複製起点を、少なくとも１つの選択可能マーカーと核酸配列の転写を開始させ得る少なくとも１つのプロモーター配列と共に含むように設計されている。
本発明のクローニングベクターの構築においては、さらに、核酸配列及びそれに付帯する作動要素との多数コピーを各ベクターに挿入し得ることに注目するべきである。このような実施態様においては、宿主生物が産生するベクターあたりの所望Ｉｎｔ６タンパク質の量が増加している。ベクターに挿入し得るＤＮＡ配列の多数コピーの数は、適当な宿主微生物に導入され複製及び転写されるベクターの能力のみによって限定され、この能力は得られるベクターの大きさに依存する。
別の実施態様では、Ｉｎｔ６タンパク質のコーディング配列を含む制限消化フラグメントを、原核細胞または真核細胞中で機能する適当な発現ベクターに挿入し得る。「適当な」という用語は、ベクターがＩｎｔ６タンパク質をコードする完全核酸配列を保有し発現し得ることを意味する。細菌のような原核細胞中で機能する発現ベクターの例は、Ｔ７プロモーターに基づくベクター及びｔｒｐＥ及びｌａｃＺ融合物を産生するベクターであるが、これらに限定されない。好適な発現ベクターは、真核細胞中で機能するベクターである。このようなベクターの例は、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスまたは哺乳類のＣ型レトロウイルスのベクターであるが、これらに限定されない。
次に、選択された組換え発現ベクターを、組換えタンパク質を発現させる目的の適当な真核細胞系にトランスフェクトし得る。このような真核細胞系の例としては、ヒトＭＣＦ１０ＡまたはマウスＨＣ１１乳房上皮細胞のような細胞系があるが、これらに限定されない。バキュロウイルスベクターと共に使用するための好ましい真核細胞系の一例は、ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｙｅｒｄａ由来のＳＦ２１卵巣細胞である。
発現された組換えタンパク質を、クーマシーブルー染色、及び、抗Ｉｎｔ６抗体含有血清を用いるウエスタンブロッティングのような当業界で公知の方法によって検出し得る。
別の実施態様においては、発現された組換えタンパク質を粗溶解物として得ることができ、または当業界で公知の標準タンパク質精製手順によって精製することもできる。このような精製手順としては、分画（differential）沈殿、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティー及びイムノアフィニティークロマトグラフィー、などがある。イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、Ｉｎｔ６タンパク質に特異的な抗体を結合させた樹脂を含むカラムに通すことによって組換えタンパク質を精製し得る。
更に別の実施態様においては、本発明は、配列番号２及び４に示すＩｎｔ６アミノ酸配列に由来のペプチドに関する。本発明のペプチドまたはその類似体が、種々の製造業者によって販売されている全自動装置によって合成できること、業者に注文生産させることができること、または、適当な発現ベクターから上述のように発現させることができることは当業者に容易に理解されよう。「類似体」という用語は本発明のペプチドを説明するために本文中で既に説明したが、更に、分枝状または非直鎖状のペプチドも類似体に包含される。好ましいペプチドは約２０〜約２４アミノ酸の長さの免疫原性ペプチドである。本発明の実施例８で後述するように、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の結果として、発現されたＩｎｔ６タンパク質は先端が切断されている。点突然変異したｒａｓタンパク質が適正にプロセッシングされることによって特異的Ｔ細胞媒介細胞障害性の標的となり得ることは従来の研究（Ｔｓａｎｇ，Ｋ．Ｙ．ら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：１８３−１９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．Ｓ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１１８−１２１；Ｊｕｎｇ，Ｓ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：２７３−２７６（１９９１）；Ｐｅａｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：２０５９−２０６５；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９３）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８５：１２９４−１３０２；Ｇｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ，Ｔ．，IIIら（１９９２）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：２６６−２７４及びＧｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ，Ｔ．，IIIら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：１３３１−１３３７）で指摘されており、これらの研究に基づいて、突然変異したＩｎｔ６タンパク質は、ＭＨＣ装置を介して腫瘍細胞表面に提示されることによって特異的Ｔ細胞応答を誘発すると考えられる。
従って本発明は、ワクチン及び免疫治療方法で使用するためのＩｎｔ６タンパクまたは該タンパク質に由来のペプチドを含む医薬組成物を提供する。哺乳類の癌を防御するワクチンとして使用される場合、医薬組成物は、組換え発現ベクターまたは発現タンパク質を含有する培養上清をトランスフェクトした細胞から得られた細胞溶解物を免疫原として含有し得る。または、免疫原が、部分的もしくは実質的に精製された組換えタンパク質または合成ペプチドであってもよい。
獣医薬及びヒト医薬の双方に使用される上記の組成物又は製剤は、上記のような免疫原を、１種またはそれ以上の適格な医薬用担体及び任意の他の治療用成分と共に含有する。（１種または複数の）担体は、製剤の他の成分と相溶性であり、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。製剤は単位量の剤形で提供されるのが好都合であり、製剤業界で周知の任意の方法によって調製できる。
すべての方法が、有効成分と１種またはそれ以上の補助成分を構成する担体とを会合させる段階を含む。一般には、有効成分を液体担体または微細分割した固体担体またはその双方と均一かつ均質に会合させ、次いで、必要に応じて製品を所望の製剤形態に形成することによって製剤を調製する。
静脈内筋肉内、皮下、または腹腔内投与に好適な調剤は便宜的には、受容者の血液と好ましくは等張である溶液を含む活性成分の滅菌水性溶液を含む。そのような調剤は、固体活性成分を塩化ナトリウム（例えば０．１〜２．０Ｍ）、グリシンなどのような生理学的に適合可能な物質を含み、水性溶液を製造するための生理学的条件と適合可能な緩衝化したｐＨを有する水に溶解し、そして上記溶液を滅菌することによって便宜的に調製することができる。これらは、単位または多数回投薬容器、例えば、シールしたアンプルまたはバイアル中に存在することができる。
本発明の調剤は安定剤を取り込むことができる。例示的な安定剤はポリエチレングリコール、タンパク質、多糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらはそれらのみでも混合物としてでも使用することができる。これらの安定剤は、好ましくは、免疫原の１重量部当たり０．１１〜１０，０００重量部の量で取り込まれる。２以上の安定剤を使用することを意図する場合、それらの総量は好ましくは上記で特定した範囲内である。これらの安定剤は好適な濃度およびｐＨにおいて水性溶液中で使用される。そのような水性溶液の特定の浸透圧は一般的には０．１〜３．０浸透圧モルの範囲内であり、好ましくは０．８〜１．２の範囲内である。水性溶液のｐＨは５．０〜９．０の範囲内、好ましくは６〜８の範囲内に調整される。本発明の免疫原を配合する際に、抗吸着剤を使用してもよい。
さらなる薬学的方法を使用して、作用の持続を調節することができる。調節された放出調製物をポリマーの使用を通じて達成し、本タンパク質またはその誘導体を複合化または吸収することができる。調節された運搬は、放出を調節することを目的として、好適な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）と、巨大分子の濃度と、配合の方法とを選択することによって達成することができる。調節された放出調製物による作用の持続を調節するためのもう一つ別の可能な方法は、タンパク質、タンパク質アナログまたはそれらの機能的誘導体を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材料の粒子中に配合することである。あるいは、これらの試薬をポリマー粒子に配合する代わりに、これらの材料を、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製したマイクロカプセル中に、例えば各々ヒドロキシ−メチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド薬剤運搬システム中に、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル中に、あるいはマクロエマルジョン中に、入れることも可能である。
経口調製物を所望する場合、組成物を、ラクトース、スクロース、澱粉、タルクステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたは中でもアラビアゴムなどの典型的な担体と組み合わせることができる。
本発明のタンパク質は、キットの形態、単独、または上記のような医薬組成物の形態で供給できる。
ワクチン化は慣用的方法により実施できる。例えば、免疫原は、食塩水または水などの好適な希釈剤、あるいは完全または不完全アジュバンド中において使用できる。さらに、免疫原は、タンパク質を免疫原性にするために担体に結合してもよいし、しなくてもよい。そのような担体分子の例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下などの抗体産生に適した任意の経路によって投与することができる。免疫原は、有意な力価の抗−Ｉｎｔ６抗体が生産されるまで、一回または周期的間隔で投与することができる。抗体は以下に記載する免疫分析を使用して血清中に検出することができる。
さらに別の態様において、本発明は、Ｉｎｔ６タンパク質またはＩｎｔ６タンパク質配列から誘導されたペプチドの宿主生物合成を指令できる核酸配列を含む医薬組成物を提供する。そのような核酸配列は、当業者に既知の方法によって好適な発現ベクター中に挿入することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで高効率遺伝子移入を生み出すために好適な発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターの作動要素は、本明細書中に以前に開示されており当業者に既知である。そのような発現ベクターは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口的に投与することができる。
免疫原が、Ｉｎｔ６タンパク質、それから誘導されたペプチド、あるいはＩｎｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドの宿主生物合成を指令できる核酸配列であるにせよ、免疫原は予防または治療目的の何れかのために投与することができる。予防的に付与される場合、免疫原は癌または癌に起因する任意の症状に先立って付与される。免疫原の予防的投与は、癌のいかなる次の発症を防止または衰退させるのに役立つ。治療的に付与される場合、免疫原は癌または癌に付随する任意の症状の発症時または発症直後に付与される。
免疫原が部分的または実質的に精製された組み換えＩｎｔ６タンパク質またはＩｎｔ６ペプチドである場合、Ｉｎｔ６に対する抗体応答を引き出すのに有効な投与量は約１０μｇから約１５００μｇの範囲である。
Ｉｎｔ６に対する抗体応答を引き出すのに有効な核酸配列をコードするＩｎｔ６タンパク質の投与量は、約１０から約１０００μｇの範囲である。
Ｉｎｔ６タンパク質（単数または複数）の宿主生物合成を指令できる核酸配列を含む発現ベクターは、キットの形態、単独、または上記したような医薬組成物の形態で供給することができる。
本発明はさらに、薬学的に許容できる担体中に、Ｉｎｔ６タンパク質あるいはＩｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指令できる発現ベクターを含む癌に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンに関する。
ワクチンとしての並びに免疫治療における使用に加えて、上記組成物はＩｎｔ６タンパク質に対する抗体を調製するために使用することができる。抗体を調製するためには、宿主動物は、Ｉｎｔ６タンパク質あるいはそれから誘導されたペプチドあるいはＩｎｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドを発現することができる上記発現ベクターを使用して、免疫される。宿主の血清または血漿を適当な時間間隔後に回収し、ウイルス粒子と反応性を有する抗体を含む組成物が得られる。ガンマグロブリン画分またはＩｇＧ抗体を、例えば、飽和硫酸アンモニウムまたはＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、または当業者に公知の他の技術を使用することによって得ることができる。抗体は、薬剤のような他の抗ウイルス剤に付随することがある多くの有害副作用を実質的には含まない。
抗体組成物は、潜在的な有害免疫系応答を最小化することによって、宿主系とより適合可能にすることができる。これは、外来種抗体のＦｃ部分の全部または一部を除去することによって、または宿主動物と同一種の抗体を使用することによって、例えば、ヒト／ヒトハイブリドーマからの抗体の使用によって、達成することができる。ヒト化抗体（即ち、ヒトにおいては非免疫原性）は、例えば、抗体の免疫原性部分を、対応するが非免疫原性である部分で置き換えることによって作製することができる（即ち、キメラ抗体）。そのようなキメラ抗体は、１つの種からの抗体の反応性または抗原結合部位および異なる種からの抗体（非免疫原性）のＦｃ部位を含むことができる。キメラ抗体の例としては、非ヒト哺乳動物−ヒトキメラ、げっ歯動物−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒトキメラが挙げられるが、これらに限定されない（Robinson et al., 国際特許出願１８４，１８７；Taniguchi M., 欧州特許出願１７１，４９６；Morrison et al., 欧州特許出願１７３，４９４；Neuberger et al., ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：3439；Nishimura et al., 1987 Canc. Res. 47：999；Wood et al., 1985 Nature 314：446；Shaw et al., 1988 J. Natl. Cancer Inst．80：15553，これらは全て引用により本明細書中に取り込まれる）。
「ヒト化」キメラ抗体の一般的考察は、Morrison S., 1985 Science 229：1202およびOi et al., 1986 BioTechniques 4；214により提供される。
好適な「ヒト化」抗体はあるいはまたＣＤＲまたはＣＥＡ置換によって作製することができる（Jones et al., 1986 Nature 321：552；Verhoeyan et al., 1988 Science 239：1534；Biedleret a1. 1988 J. Immunol. 141：4053，これらは全て引用により本明細書中に取り込まれる）。
抗体または抗原結合断片はまた遺伝子工学によって作製することができる。E. coli中における重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方の発現のための技術は、ＰＣＴ特許出願；公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４およびHuse et al., 1989 Science 246：1275-1281の対象である。
あるいはまた、抗Ｉｎｔ６抗体を免疫原として抗イディオタイプ抗体を投与することによって誘導することができる。便宜的には、上記で説明したように調製された精製した抗Ｉｎｔ６抗体調製物を使用して、宿主動物中に抗イディオタイプ抗体を誘導する。本組成物は好適な希釈剤中で宿主動物に投与される。投与後に、通常は反復投与後に、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Ｆｃ領域に対する免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同一種により産生された抗体を使用することができ、または投与された抗体のＦＣ領域を除去することができる。宿主動物中に抗イディオタイプ抗体を誘導した後、血清または血漿を取り出し、抗体組成物が得られる。本組成物は抗−Ｉｎｔ６抗体に関して上記説明したように、あるいは親和性マトリックスに結合した抗−Ｉｎｔ６抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。産生した抗イディオタイプ抗体は真正なＩｎｔ６抗原と立体配置が同様であり、Ｉｎｔタンパク質を使用するよりはむしろ、ワクチンを調製するために使用することができる。
動物中に抗−Ｉｎｔ６抗体を誘導するための手段として使用する場合、抗体の注入方法はワクチン接種目的の場合と同一であり、即ち、アジュバンドと一緒にまたはそれなしに、生理学的に好適な希釈剤中において有効濃度において、筋肉内、腹腔内、皮下などに注入される。１以上の追加免疫注入が望ましい場合もある。
Ｉｎｔ６タンパク質に対する抗体および抗イディオタイプ抗体の両方のｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために、並びに診断用途のためには、モノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。モノクローナル抗−Ｉｎｔ６抗体または抗イディオタイプ抗体は当業者に既知の方法によって作製することができる（Goding, J. W. 1983. Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, pp. 56-97）。ヒト−ヒトハイブリドーマを作製するために、ヒトリンパ球提供者が選択される。Ｉｎｔ６抗原を有することが知られる提供者は好適なリンパ球提供者として役立つ場合がある。リンパ球は抹消血液試料から単離することができ、提供者が脾除去に付される場合は脾臓細胞を使用できる。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を使用してヒトリンパ球を不死化することができ、またはヒト融合パートナーを使用してヒト−ヒトハイブリドーマを作製することができる。ペプチドによる１次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作またヒトモノクローナル抗体の生成においても使用することができる。
不死化された細胞により分泌される抗体をスクリーニングして、所望の特異性を有する抗体を分泌するクローンを決定する。モノクローナル抗体については、抗体はＩｎｔ６タンパク質またはペプチドに結合しなければならない。モノクローナル抗イディオタイプ抗体のためには、抗体は抗−Ｉｎｔ６抗体に結合しなければならない。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞が選択される。
上記の抗体およびその抗原結合断片は、キット形態、単独またはｉｎ  ｖｉｖｏ用途用の医薬組成物において提供することができる。免疫治療において医薬組成物として使用する場合、本書中に記載した抗体またはキメラ抗体はまた、慣用的方法により毒素分子、ラジオアイソトープ、および薬剤に結合することができる（Vitetta et al.（1991）in「Biologic Therapy of Cancer」De Vita VT, Hellman S., Rosenberg, S.A. （編集）J. B. Lippincott Co. フィラデルフィア；Larson, S.M. et al. （1991）in「Biological Therapy of Cancer」De Vita V.T., Hellman S., Rosenberg, S.A. （編集）J.B. Lippincott Co., フィラデルフィア）。抗体を結合させることができる毒素の例としては、リシンおよびシュードモナスエンドトキシンであるが、これらに限定されない。薬剤または化学治療剤の例としては、アドリアマイシンが挙げられるが、これに限定されない。ラジオアイソトープの例としては、131Ｉが挙げられるが、これに限定されない。上記試薬に共有結合により結合した抗体は、癌の化学治療において使用することができる。抗体はまた、下記に説明するような免疫分析において治療用途そして診断用途のために、Ｉｎｔ６タンパク質を精製するための免疫親和剤としても使用することができる。
従って、本発明は、Ｉｎｔ６タンパク質発現における変化について被験体のタンパク質を分析することを含む、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための第３の方法に関する。
この方法によるタンパク質の分析のためには、タンパク質は腫瘍ビオプシー試料などのような生物学的試料から得られる。タンパク質は、粗製ライセートとして得ることができ、またはそれは当業者に既知の方法によってさらに精製することができる（Sambrook, J. et al. （1989）in「Molecular Cloning, A laboratory Manual」, Cold Spring Harbor press, Plainview, NY）。
粗製タンパク質ライセートは、抗−Ｉｎｔ６抗体を使用する免疫分析によってＩｎｔ６タンパク質について分析することができる。
本発明の免疫分析は、放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析、酵素免疫分析、化学発光分析、免疫組織化学分析などが挙げられる。ＥＬＩＳＡについて当業者に既知の標準的技術は、Methods in Immunodiagnosis，第２版、RoseおよびBigazzi, eds., John WileyおよびSons, 1980およびCampbell et al., Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc, 1964に記載されており、これらは共に引用により本明細書中に取り込まれる。このような分析は、技術文献に記載されているように直接、間接、競合、または非競合免疫分析でもよい（Oellerich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin.Biochem. 22：895-904）。
形成したＩｎｔ６タンパク質抗Ｉｎｔ６抗体複合体の検出は、複合体と標識抗ラビット抗体などの２次抗体との反応により達成することができる。標識は、好適な蛍光または発色試薬の存在中で複合体をインキュベートすることによって検出される酵素であればよい。他の検出可能な標識、例えば、放射標識または金コロイドなども使用できる。標識されたＩｎｔ６タンパク質−抗Ｉｎｔ６抗体複合体は次いで、オートラジオグラフィーによって視覚化される。
本発明はまた、Ｉｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指令できる核酸配列を含む発現ベクター、または抗−Ｉｎｔ６抗体を、治療的に有効量において含む医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法を包含する。治療的に付与される場合、ラジオアイソトープ、毒素分子または薬剤に結合したＩｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タンパク質をコードする発現ベクター、または抗Ｉｎｔ６抗体は、感染の発症時（またはその直後）、または癌に起因する感染または疾患の任意の症状の発症時に付与される。Ｉｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タンパク質をコードする発現ベクター、または抗Ｉｎｔ６抗体の治療的投与は感染または疾患を減衰させるのに役立つ。
本発明はまた、癌を有する被験者を治療する別の方法であって、
（ａ）特異的Ｔ細胞応答を引き出すのに有効な量のＩｎｔ６タンパク質またはＩｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指令できる発現ベクターにより被験者を免疫し；
（ｂ）上記Ｔ細胞を上記免疫された被験者から単離し；そして
（ｃ）上記Ｔ細胞を上記免疫された被験者または非免疫被験者に治療的な有効な量において投与する、
ことを含む方法を包含する。
Ｉｎｔ６タンパク質に対して反応性であるＴ細胞集団を、Ｉｎｔ６タンパク質で免疫した提供者の抹消血液試料または脾臓細胞から単離することができる。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用してヒトリンパ球を不死化することができ、ヒト融合パートナーを使用して、ヒト−ヒトハイブリドーマを作製することができる。Ｉｎｔ６タンパク質による１次ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作もまた、Ｉｎｔ６タンパク質に対して反応性であるＴ細胞の生成において使用することができる。
Ｔ細胞は約７日〜約９０日まで培養し（Yanelli, J.R. J. Immunol. Methods 139：1-16（1991））、次いでスクリーニングして、Ｔ細胞応答性を分析する既知の方法を使用して免疫原性キメラタンパク質中に含まれる他のペプチドに対する所望の反応性を有するクローンを決定する；かくして、所望の応答性を産生するＴ細胞が選択される。
上記のＴ細胞は、Ｔ細胞を哺乳動物に静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与することによって、癌に罹患した個人の治療としてｉｎ ｖｉｖｏ使用のために使用することができる。好ましい投与経路は、静脈内または腹腔内である。
本発明はまた、野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターをＩｎｔ６遺伝子の突然変異を有する被験者に投与する、遺伝子治療方法に関する。野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列は、配列番号１および配列番号３に示されているものである。そのような核酸配列は当業者に既知の方法によって好適な発現ベクター中に挿入することができる。高効率遺伝子移入をｉｎ ｖｉｖｏで生み出すのに好適な発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。
野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口的に投与することができる。好ましい投与経路は静脈内である。
本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための診断キットを提供する。この診断キットは、Ｉｎｔ６疾患遺伝子の突然変異についてＤＮＡまたはＲＮＡを分析する際におけるＰＣＲプライマーとして有用な精製かつ単離された核酸配列を含む。
本明細書中に引用された如何なる文献または特許は引用により取り込まれる。以下の実施例は本発明の多様な側面を例示するために提示されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
実施例
実施例１
ＭＭＴＶゲノムの新規の挿入部位の同定
高率のガンの表現型による選択的な同型交配によって偏向していない、乳癌ＤＮＡにおける新規Ｉｎｔ遺伝子座を同定するため、チェコスロバキアで捕獲されたM. musculus（CZECH II）（Gallahan, D. and Callahan, R．（1987）J. Virol., 61：66-74）の単一家系のつがい由来の野生のマウス株を利用した。高発現率の同型交配マウス株とは異なり、CZECH IIマウスは内因性のＭＭＴＶゲノムを欠いているが、乳を通して先天的に受け継がれるＭＭＴＶの感染性の株を保持する（Callahan, R. et al．（1982）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 79：4113-4117）。CZECH IIマウスにおいては、腫瘍形成に先立って、安定で、クローン優性で、時には肺に転移するフォーカス乳癌を形成する過増殖外殖ライン（ＨＯＧ）が発達していた。ＨＯＧまたはＨＯＧ由来の腫瘍、またはＨＯＧ由来の腫瘍をもつマウスの肺転移における、ゲノムＤＮＡへのＭＭＴＶプロウイルスゲノムの挿入を検出するために、ＣＺＺ１と呼称するＣＺＥＣＨ  ＩＩ  ＨＯＧライン、またはＣＺＺ−１由来の悪性腫瘍または肺転移から細胞ＤＮＡを単離して、以下のようにサザンブロットにより解析した。１０μｇの細胞ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に吸着させ、Gallahan, D. and Callahan, R．（J. Virol．（１９８７）６１：６６−７４）に記載されているように、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプローブでハイブリダイゼーションを行った。簡略には、ハイブリダイゼーションの前に、フィルターを３７℃で４から２４時間、３×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．４］、および１ｍＭのＥＤＴＡからなる）、５×デンハルト溶液（０．０２％ファイコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、および０．０２％牛血清アルブミン）、２．５％デキストラン硫酸、および５０％ホルムアミドを含むプレハイブリダイゼーション溶液中に浸した。４０％ホルムアミドを含む以外はプレハイブリダイゼーション溶液と同様の溶液に、変性させたプローブを加えた。この混合液をプレハイブリダイゼーションしたフィルターを含むプラスチックバッグに加え、３７℃で２４時間保温した。フィルターを、６５℃で０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌと０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムからなる）と０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを３回取り替え（２０から３０分の洗浄ごとに取り替えた）、ストリンジェント条件下で洗浄した。フィルターは、コダックＸＡＲ−５  Ｃ線フィルムに一晩から数日間露光した。これらのサザンブロットの結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａに示す結果は、３個のＭＭＴＶプロウイルスゲノム（６個のＥｃｏＲＩ制限酵素断片）を有する、一つのＣＺＺ−１  ＨＯＧラインのＤＮＡが細胞ＤＮＡへ挿入されていることと、これらのプロウイルスゲノムがまた、ＨＯＧ内で独立に発生した原発腫瘍中にも存在することを示す。この結果はさらに、これらの６個のＭＭＴＶ関連断片がもともとの外殖物中やそれぞれの継代移植世代中にも再現性良く認められるため、ＣＺＺ−１が腫瘍形成に先立つ細胞中でクローン優性集団であることを示す。実際、ＣＺＺ−１  ＨＯＧのクローン優性な性質は、４．８および２．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制限酵素断片に相当する一つの完全なプロウイルスゲノムを欠いた、腫瘍１２６２（図１Ａレーン３）により明らかにされている。図１Ａで解析された１３の腫瘍ＤＮＡのうち５つ、および腫瘍４９７３をもつマウスの肺の１１の独立な転移部位のうち５つ（図１Ｂ）が付加的な挿入ＭＭＴＶゲノムを有するという観察は、付加的挿入が付加的な細胞遺伝子を活性化（または不活性化）することによって腫瘍の進行に寄与していることを示唆する。しかし、既知の共通の挿入部位（Ｗｎｔ−１、Ｆｇｆ−３、Ｉｎｔ３、Ｗｎｔ−３およびＦｇｆ−４）はいずれもＣＺＺ−１  ＨＯＧ中でＭＭＴＶにより組換えられていないので、それぞれのＣＺＺ−１  ＨＯＧのＥｃｏＲＩ宿主−ＭＭＴＶ結合制限酵素断片の組換え体クローンを得て、宿主配列のサブクローンをＭＭＴＶ誘導ＤＮＡ組換えの証拠として、独立のＭＭＴＶ誘導乳癌ＤＮＡのサザンブロットをスクリーニングするためのプローブとして用いた。
この手法を利用して、ＣＺＺ−１  ＨＯＧの一つのＭＭＴＶプロウイルスの近傍の宿主配列（すなわち、図１Ａに示す３．０ｋｂ断片）からなるプローブを、ＣＺＺ−１  ＨＯＧ由来の腫瘍２２（図２Ａ、レーン２および３）、および独立の乳癌１１３９（図２Ｂ，レーン２および３）および３１４４（図２Ｃ、レーン２および３）のＩｎｔ６共通挿入部位を同定するのに用いた。簡略には、腫瘍ＤＮＡおよび正常な肝臓ＤＮＡ（各パネルのレーン１）由来の細胞ＤＮＡ（１０μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜上にブロットした。図２Ａおよび２Ｂのブロットのレーン１および２は、宿主近傍配列に相当するプローブＤでハイブリダイゼーションした。その後、図２Ａおよび２Ｂのレーン２を、ＭＭＴＶ  ｇａｇ配列（Gallahan and Callahan（１９８７）J. Virol.６１：６６−７４）を用いてハイブリダイゼーションし、その結果を図２Ａおよび２Ｂのレーン３に示す。図２Ｃのレーン１および２はプローブＣでハイブリダイゼーションした。その後、レーン２はＭＭＴＶｅｎｖ配列（GallahanおよびCallahan（１９８７）J. Viro1.６１：６６−７４）を用いてハイブリダイゼーションし、その結果を図２Ｃのレーン３に示す。最初のプローブでのそれぞれのブロットのハイブリダイゼーションはこの実施例の前述の記載（GallahanおよびCallahan（１９８７）J. Virol.６１：６６−７４）に従い実施した。その後ブロットを第二のプローブでハイブリダイゼーションする場合、ブロットをGallahanおよびCa11ahan（（１９８７）J. Virol.６１：６６−７４）に従い、以下のように再びプローブを加えた。簡略には、フィルターを１００ｍｌの０．４ＮのＮａＯＨ中に浸し、室温で２０分間保温することによってジェネトランフィルターからプローブＤＮＡを除去した。この溶液を捨て、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）−０．１×ＳＳＣ−０．５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液に取り替えてフィルターを中和した。フィルターを室温で１５分間保温した後、中和溶液を取り替えて保温をさらに１５分間続けた。その後、この実施例で以前に記載したようにフィルターをプレハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼーションした。この方法で処理したジェネトランフィルターはＤＮＡが顕著に失われるまで、少なくとも５回は再使用し得る。
結果は、ＭＭＴＶ誘導再構成（図２Ａから２Ｃにおいて矢印で示す）が二つの独立のＭＭＴＶ誘導乳癌ＤＮＡ（図２Ｂおよび２Ｃのレーン２と３）で検出されたことを表す。興味深いことに、ＭＭＴＶ誘導型再構成が検出されたそれぞれの場合、再構成した制限酵素断片はＭＭＴＶｇａｇ又はｅｎｖ配列を含む断片と一緒に泳動されていた。これらの結果は、各腫瘍におけるウイルスゲノムの転写の向きが同じ方向であることを表す。すなわち、挿入されたＭＭＴＶゲノムに近接した宿主配列は、Ｉｎｔ６と名付けられた、ＭＭＴＶの新しい共通の挿入部位を示す。
実施例２
ネズミＩｎｔ６遺伝子の単離
Ｉｎｔ６遺伝子座の組換えゲノムクローンを得るため、宿主近傍配列を含む３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図１Ａに示す）のサブクローン（すなわち、プローブＤ、図３）を、マウス株１２９／ｓｖ由来のゲノムＤＮＡのラムダファージライブラリー（Stratagene, LaJolla, CA）をプローブ探査するのに用いた。このゲノムＤＮＡは、ヌクレオチド配列解析によって決定されたように野生型Ｉｎｔ６ＤＮＡを含む。Ｉｎｔ６遺伝子座の４７ｋｂを覆うような重なりあうラムダクローンがさらに３つ、プローブＡ−Ｃ（図３）を用いて得られた。これらの４つの重複するラムダクローンは、図３に示すようにネズミＩｎｔ６遺伝子を覆う。遺伝子はマウスの１５番染色体上のｍｙｃガン原遺伝子の動原体部位に位置する。Ｉｎｔ６遺伝子座のゲノムクローンのさらなるヌクレオチド配列解析から、この遺伝子は図３に示すようにゲノムＤＮＡの３４ｋｂにおよぶ１３のエキソンをもつことが示された。
実施例３
CZECH II乳ガンにおけるＩｎｔ６遺伝子の発現
ＣＺＥＣＨ  ＩＩ乳ガンにおけるＩｎｔ６遺伝子の発現を研究するため、Ｉｎｔ６陰性腫瘍（腫瘍１７８）および、Ｉｎｔ６上にウィルスの挿入されたＩｎｔ６陽性腫瘍（２２および１１３９）から調製された総ＲＮＡ（２０μｇ）をホルムアルデヒド存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで泳動した。ＲＮＡをナイロン膜に吸着させ、Gallahan, D.およびCallahan, R.（１９８７）J. Virol., ６１：６６−７４に記載されたようにプローブＡとハイブリダイゼーションを行った（図３）。ノーザンブロット解析の結果を図４に示す。簡略には、３つの腫瘍の各々において、プローブＡでのハイブリダイゼーションによって１．４ｋｂの型のＲＮＡが検出され、腫瘍１１３９にはさらにプローブＡの配列に関係する０．９ｋｂの型のＲＮＡが含まれた。ウィルスによるＩｎｔ６の再構成を伴わない腫瘍１７８（図４）、およびＭＭＴＶによって誘導されるいくつかの他の乳ガンでは、プローブＡによって検出される１．４ｋｂの型のＲＮＡを発現したという観察結果から、腫瘍２２および１１３９におけるＩｎｔ６遺伝子の発現レベルはこの遺伝子座へのウィルスの挿入による重要な結果ではないことが示唆される。
実施例４
野生型ネズミＩｎｔ６のｃＤＮＡの単離
野生型１．４ｋｂのＩｎｔ６ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを単離するため、ＭＭＴＶによるＩｎｔ６の再構成を伴わない、ＭＭＴＶによって誘導された乳ガンのネズミｃＤＮＡライブラリーを、標準的な方法（Sambrook et al（１９８９）”Molecular Cloning,A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）を用いて調製し、プローブＡを用いてプローブ探査した（プローブＡは図３に示したＸｂａＩ断片である）。ネズミＩｎｔ６  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、これを図５に示す。１．４ｋｂの型のＩｎｔ６ＲＮＡの翻訳から、４３．５キロダルトンのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが発見された。図５に示すように、このタンパク質には２つのＮ−グリコシル化され得る部位（Chem., ２６０：１２４９２−１２４９９）、チロシンキナーゼ（Hunter, T.およびCooper, J.A．（１９８５）Ann.Rev.Biochem, ５４：８９７−９３０）、およびカゼインキナーゼＩＩ（Pinna, L.A.（１９９０）Biochem Biophys Acta, １０５４：２６７−２８４）が含まれる。
実施例５
種間に渡るＩｎｔ６ｃＤＮＡの保存
ネズミの乳ガンにおいて、ＭＭＴＶの挿入によって発現が影響されまたは変化する全ての遺伝子は進化を通じて高度に保存されている（Dickson,C. and Peters,G．（１９８７）Nature ３２６：８８３；Rijsewizk,K.F. et al（１９８７）Cell, ５０：６４９−６５７：Robbins, J. et al（１９９２）J. Virol, ６６：２５９４−２５９９）ため、異種間のゲノムＤＮＡにおけるＩｎｔ６遺伝子の保存性をサザンブロット解析によって研究した。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，ショウジョウバエ，アフリカツメガエル，ニワトリ、ネズミ、およびヒト由来の細胞ＤＮＡ（各１０μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に吸着させ、３×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１８０ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４），ｌｍＭのＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液（０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０２％ウシ血清アルブミン）、５％デキストラン硫酸、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中でＩｎｔ６ｃＤＮＡと６５℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、膜をストリンジェント条件下で０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）プラス０．５％ＳＤＳで３回（洗液は２０から３０分の洗浄ごとに換えた）６５℃で洗浄した。Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに３日間感光させた。図６に示すように、Ｉｎｔ６に関連する配列が、検査した全ての真核生物種において検出された。また、Ｉｎｔ６関連配列を含む酵母ＤＮＡの制限酵素消化断片がサザンブロット解析によって検出された（データは示さない）。
さらに、ショウジョウバエのＩｎｔ６相同遺伝子のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定し（データは示さない）、ショウジョウバエのＩｎｔ６タンパク質の推定アミノ酸配列はヒト／ネズミの推定アミノ酸配列と６０％同一であった。併せて考えると、これらの結果によって、Ｉｎｔ６遺伝子の幅広い進化的保存性が証明され、Ｉｎｔ６が基本的な生命機能を果たすことが示唆される。
実施例６
標的組織におけるＩｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現の検出
ＭＭＴＶによる遺伝子の再構成を伴わない腫瘍中のＩｎｔ６の１．４ｋｂの型のＲＮＡを検出した（すなわち図４の腫瘍１７８）ため、正常な成体の組織および発生の各段階の胚のＩｎｔ６  ＲＮＡの発現を以下のようにノザンブロット解析によって調査した。各組織から総ＲＮＡ（各１０μｇ）を調製した。ＲＮＡをホルムアルデヒド存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで泳動した。このＲＮＡ試料をナイロン膜に吸着させ、最初にβ−アクチンプローブと、続いてＩｎｔ６  ｃＤＮＡプローブと、GallahanおよびCallahan（J. Virol., ６１：６６−７４（１９８７））に記載された条件でハイブリダイゼーションした。図７に示すように、Ｉｎｔ６  ＲＮＡは乳腺を含む成体の調査した全ての組織で発現しており、胚におけるＩｎｔ６  ＲＮＡの発現は発生の８日目にすでに検出された。
実施例７
標的組織におけるＩｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現の検出
Ｉｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現を検出するために、種々の組織由来の総ＲＮＡを用いてランダムプライミングしたｃＤＮＡを調製する。Ｉｎｔ６ネズミｃＤＮＡの７００ｂｐ断片を、配列番号２９  ＴＧＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＡＣＧＣＴＡおよび配列番号３０  ＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＡＴＡＣＡとして示すプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲの条件は：変性９４℃１分、アニーリング５５℃１分、伸長７２℃２分を３０サイクルである。最後のサイクルの後、２分の伸長反応を追加する。ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで泳動する。エチジウムブロミド染色の後、ゲルの写真撮影によってＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する。
実施例８
ＭＭＴＶによるＩｎｔ６の再構成が乳癌において新種のＩｎｔ６ＲＮＡの発現をもたらす
図３に示したようなネズミのＩｎｔ６遺伝子のマッピングデータの検査によって、全てのウイルスの挿入がＩｎｔ６遺伝子のイントロン中で起こること、および、取り込まれたウイルスゲノムの転写方向はＩｎｔ６遺伝子のそれと反対方向であることが明らかである。Ｉｎｔ６遺伝子座でのＭＭＴＶの果たす役割について少なくとも４つの可能な仮説がある。第一の仮説では、Ｉｎｔ６遺伝子は実際はＭＭＴＶが作用する標的遺伝子ではない。Ｗｎｔ１、Ｆｇｆ−３、およびＦｇｆ−４遺伝子座（Dickson, C., et al．（１９８４）Cell. 37：529-536；Nusse, R., et al．（１９８２）Cell, ３１：９９−１０９；Peters, G.,et al．（１９８９）Proc.Natl.Acad.Sci. USA. ８６：５６７８−５６８２）において、ＭＭＴＶ挿入部位は標的遺伝子の周囲に規則的様式で集まり、標的遺伝子の５’側に挿入されたウイルスゲノムの転写方向は標的遺伝子のそれと反対方向であるが、標的遺伝子の３’側に挿入されたものは同じ転写方向である。さらに、公表された報告に基づくと、ＭＭＴＶ挿入部位は特定の標的遺伝子から１５ｋｂ以内にある。しかしＩｎｔ６遺伝子の３’側１３ｋｂまでの配列に対応するＲＮＡの発現の活性化の証拠が発見されていないため、推定上の標的遺伝子の位置は挿入されたＭＭＴＶゲノムから、ＣＺＺ−１  ＨＯＧの場合は２４ｋｂ以上、腫瘍１１３９の場合は３０ｋｂ以上離れていなければならず（図３参照）、従ってこの可能性は非常に少ない。
Ｉｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの挿入に起因し得る二番目の結果は、挿入されたウイルスゲノムの３’ＬＴＲから開始する、Ｉｎｔ６の新たなキメラＲＮＡ転写物の発現の活性化である。Ｉｎｔ６の場合以外では、類似した状況がＭＭＴＶによって誘導されるＩｎｔ−３の再構成の場合に起き（Robbins,J.,et a1.（１９９２）J. Vorol., ６６：２５９４−２５９９）、ウイルスゲノムの転写方向がＩｎｔ６の転写方向と反対であるため、Ｉｎｔ６アンチセンスＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。このような結果は、対立遺伝子の両者の発現を不活性化するトランス優性な突然変異を表すと考えられる。しかし、種々の方法を用いたが、ＭＭＴＶによって誘導されるＩｎｔ６アンチセンスＲＮＡの発現は検出されなかった。
三番目の可能性によると、Ｉｎｔ６遺伝子はＩｎｔ遺伝子座内のＭＭＴＶの挿入の標的であると仮定される。この場合ウイルスの挿入は一つの対立遺伝子の発現を阻害し、もう一方の対立遺伝子に劣性の自発的な突然変異が存在することが明らかになると考えられる。この可能性を調べるために、腫瘍２２および腫瘍１１３９内の再構成されていないＩｎｔ６の対立遺伝子に対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列が決定され、どちらの場合も突然変異は見つからなかった。
４番目のよりあり得る仮説は、Ｉｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの挿入が、乳上皮細胞の増殖の正常な制御を失わせるような、生物学的に活性化された遺伝子産物（Ｉｎｔ３のような（Robbins,J.,et al.（１９９２）J.Virol., ６６：２５９４−２５９９））または優性ネガティブ遺伝子産物の発現を引き起こし、影響を受けた乳上皮細胞の過形成をもたらすというものである。これによって、乳ガンの発達を引き起こし得る前悪性の上皮細胞集団が発生する。
ＭＭＴＶのＩｎｔ６遺伝子への挿入によって、変化したＲＮＡ種が発生するかどうかを調べるために、腫瘍１１３９および腫瘍２２からのＩｎｔ６  ＲＮＡのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列が決定された。それぞれの場合において再構成された対立遺伝子の転写によって、ＭＭＴＶ  ＬＴＲの逆転したＵ３部位中の隠れた転写終止シグナルで終止したキメラＲＮＡ種の発現が起こった（図８）。興味深いことに類似した隠れた終止シグナルが、ＭＭＴＶによって誘導されるＦｇｆ−３のいくつかの再構成において活性であることが以前に示されている（Clausse, N.,（１９９３）Virology, １９４：１５７−１６５）。
図９Ａおよび９Ｂは、腫瘍１１３９（図９Ａ）および２２（図９Ｂ）中に検出されたＩｎｔ６−ＭＭＴＶ  ＬＴＲ  ＲＮＡ種のヌクレオチド配列を示す。図９Ａにおいては再構成された対立遺伝子由来の二つのＲＮＡ種（図Ａ、９００ｂｐおよび９６５ｂｐ）が検出された。９００ｂｐのＲＮＡ種に対応するＲＮＡ種が図４においてノザンブロット解析によって検出された。一つのＲＮＡ種においては、エキソン５はＭＭＴＶ  ＬＴＲのＵ５部位の末端にスプライシングされ、もう一つの種においてはイントロン５中の隠れたスプライシング受容部位においてスプライシングが起こった。同様に図９、ＣＺＺ−１ではエキソン９がイントロン９中の隠れた三つの異なるスプライシング受容部位のうちの一つにスプライシングされた三つのキメラＲＮＡ種が存在した。キメラ腫瘍ＲＮＡ種の大きさは正常なＩｎｔ６ＲＮＡのそれに類似しているため、図４の腫瘍２２ＲＮＡのノザンブロット解析では検出されなかった。
再構成したＩｎｔ６  ＲＮＡの仮想されるタンパク質への翻訳によって、すべての５つの種からの産物は、Ｉｎｔ６のイントロンおよび／または逆転したＭＭＴＶ  ＬＴＲヌクレオチド配列によってコードされる新規のアミノ酸配列にＩｎｔ６アミノ酸配列が連結された短縮型のキメラであることが明らかになった。９６５ｂｐのＲＮＡ種が腫瘍１１３９中に存在することはＩｎｔ６遺伝子産物の短縮がＭＭＴＶの挿入の重要な結果であることを示唆する。
実施例９
ヒトＩｎｔ６遺伝子の単離
マウスＩｎｔ６ｃＤＮＡをラムダファージ中のヒト肺ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）をプローブ探査するために用い、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからクローン化したヒトＩｎｔ６  ｃＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号３）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡのＰ１ファージライブラリーを、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によってＩｎｔ６関連クローンについてＰＣＲによってスクリーニングした。この方法を用いて５０ｋｂ以上のヒトゲノムＤＮＡを含むひとつのＰ１ファージクローンおよび二つのラムダクローンが得られた。これらのクローンのヌクレオチド配列解析によって、ヒトＩｎｔ６遺伝子が図１０に示されたような構成であることが明らかになった。マウスゲノム中と同様にヒトＩｎｔ６遺伝子は１３のエキソンから構成される。ヒトＩｎｔ６遺伝子はまた、七番目のイントロン中にＣＡ反復配列を含む（図１０）。
実施例１０
イントロン７に含まれるＣＡ反復配列の大きさの多型
ヒトＩｎｔ６遺伝子のイントロン７中のＣＡ反復配列の周辺の核酸配列に相補的で（図１）、配列番号３１  ＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧおよび配列番号３２  ＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＧＣを有するプライマーが、ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＡ反復配列を含むＩｎｔ６遺伝子の部位をＰＣＲ増幅するために用いられた。ＰＣＲの条件は、９４℃１分間の変性、５５℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長を３０サイクル行った。最後のサイクルの後、２分間の伸長時間を加えた。非変性６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離によって、解析された８４の個々のＤＮＡのうち４６が異なる大きさの（情報を含む）対立遺伝子のヘテロ接合体であることを明らかにした。
実施例１１
ヒトＩｎｔ６遺伝子の染色体上の局在
ヒトＩｎｔ６遺伝子の染色体上の局在を決定するために、ヒトＤＮＡおよび個々のヒト染色体を含む齧歯類−ヒト体細胞融合細胞から単離したＤＮＡのサザンブロット解析が行われた。簡略には、齧歯類−ヒト体細胞融合細胞ＤＮＡまたはヒトＤＮＡをＨｉｎｄIIIによって消化し、３ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、２．５％デキストラン硫酸および４０％ホルムアミド中でヒトＩｎｔ６ｃＤＮＡと３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションした。ブロットを６５℃３回の０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの液交換を含む（それぞれの液交換は２０から３０分毎に行われた）ストリンジェント条件下で洗浄した。このサザンブロットの結果を図１２に示す。レーン１およびレーン２はヒト６番染色体（レーン１）または８番染色体（レーン２）を含むチャイニーズハムスター−ヒト体細胞ハイブリッドＤＮＡを含み、レーン３はヒト３、７、８、１５および１７番染色体を含むマウス−ヒト体細胞ハイブリッドからのＤＮＡを含み、レーン４はヒトゲノムＤＮＡを含む。レーン４に見られる２３ｋｂ断片はＩｎｔ６関連偽遺伝子を含み、Ｉｎｔ６遺伝子をコードする配列はレーン４に見られた４．５、３．５および３．０ｋｂ断片により特定される。この結果から、２３ｋｂ断片がレーン１（ヒト６番染色体を含むハイブリッド）だけにしか検出されない一方、４．５ｋｂおよび３．５ｋｂ断片はレーン２（ヒト８番染色体を含むハイブリッド）に検出されたことがわかる。さらに、３．０ｋｂヒト断片（レーン４参照）はまた、レーン１およびレーン２の両方に検出された。しかし、マウスＤＮＡはＩｎｔ６関連３．０ｋｂＨｉｎｄ  ＩＩＩ断片を含まないことが示されているため、レーン３において３．０ｋｂ断片が検出されたことから、３．０ｋｂ断片が、チャイニーズハムスターの配列ではなくヒトＩｎｔ６関連配列を有することが示された。これらの結果は、ヒトＩｎｔ６遺伝子が８番染色体上に位置することを示す。この染色体上の局在は実施例１０に記載されたＣＡ反復配列多型をもちいた連鎖解析によって確認され、さらに精密には８番染色体ｑ２２−ｑ２４にあることが示された。
実施例１２
ヘテロ接合性の欠失を引き起こすヒト胸部腫瘍ＤＮＡのＩｎｔ６遺伝子中の突然変異の検出
以前に示されたＭＭＴＶ誘導型マウス乳癌の結果に基づき、Ｉｎｔ６遺伝子がヒト胸部腫瘍の悪性腫瘍化の間の変異の標的となるかどうかを決定するために、ヒト胸部腫瘍の生体採取試料由来のＤＮＡを解析した。簡略には、原発ヒト胸部腫瘍由来および、Ｉｎｔ６のＣＡ繰返し配列が既知である４０人の対応する正常組織由来のＤＮＡを、実施例１０で使用したＰＣＲ法により腫瘍ＤＮＡ中にヘテロ接合性の欠失（ＬＯＨ）の存在について解析した。これらの腫瘍のうち１１について（２５％）完全な欠失または対応した正常ＤＮＡと比較して、有意な遺伝子座のシグナルの減少が認められた。これら１１中の５つの腫瘍ＤＮＡ（Ｔ）とそれらに対応した正常試料（Ｌ）を図１３に示す。これらの結果はヒト胸部腫瘍の悪性化の進行のあいだＩｎｔ６遺伝子が変異の標的となることを示す。さらに、Ｉｎｔ６遺伝子の発現がすべての解析を行った組織で検出されるため（図７参照）、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異は他の組織に見られるガンの進行のあいだに引き起こされるのだと考えられる。
実施例１３
Ｉｎｔ６遺伝子のエキソンに結合する配列に由来するプライマーの組を用いたＰＣＲ−ＳＳＣＰによるヒトＩｎｔ６遺伝子の突然変異の解析
１３のヒトＩｎｔ６エキソン（図１４）うち１２に結合する核酸配列に相補的なプライマーの組をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−２８に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−２８から選択されたプライマーの組を用いて、エキソン７以外のＩｎｔ６遺伝子の各エキソンを、Ｉｎｔ６遺伝子にヘテロ接合性の欠失を有する１１の原発胸部腫瘍ＤＮＡ（実施例１２参照）、および対応する正常組織試料のＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により１本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）について解析を行った。エキソン７は、ヒトＩｎｔ６のｃＤＮＡのエキソン７に一致する部分を用いたハイブリッドミスマッチ法により解析を行った。Ｉｎｔ６遺伝子にヘテロ接合性の欠失を有する原発胸部腫瘍ＤＮＡの、１本鎖構造多型解析（ＳＳＣＰ）とハイブリッドミスマッチ法の両方の解析においては、残りの遺伝子座に点変異は一つも検出されなかった（データは示さない）。しかし、残りの遺伝子座におけるプロモーターおよびイントロン領域の突然変異に関する解析は行わなかった。Ｉｎｔ６遺伝子のプロモーター、イントロンおよび／またはコード領域の変異が腫瘍試料中に検出された場合には当然、これらの突然変異は腫瘍および対応する正常組織ＤＮＡ中の変異遺伝子座の塩基配列解析により確かめることが可能である。
実施例１４
ヒト胸部および肺腫瘍試料におけるＩｎｔ６のｍＲＮＡの発現の欠失
３６人の悪性ヒト胸部腫瘍と２人の新生物発生前障害（高度形成異常症）、および対応する正常組織から単離した全ＲＮＡを、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡの発現に関して、β−アクチンおよびヒトＩｎｔ６のｃＤＮＡプローブでGallahanおよびCallahan（J. Virol.６１：６６−７４）に記載された条件で行った連続ハイブリダイゼーションを用いたノーザンブロット解析により解析した。これら３８試料中１４（３７％）はＩｎｔ６ｍＲＮＡの発現について、対応する正常組織試料と比較して有意な減少または検出不能を示した。
これら１４の場合のうち、８は浸潤性導管ガン（ＩＤＣ）で、２はコメド癌（広い導管内成分を有するＩＤＣ）、２は小葉ガン、２つは新生物発生前障害であった。図１５にノーザンブロットの結果をしめす。
別の研究において、４７つの非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）および対応する正常組織におけるＩｎｔ６  ｍＲＮＡの発現を、本実施例中で上記のように１０μｇの総ＲＮＡのノーザン解析により測定した。ノーザンブロットの表示を図１６に、４７つのＮＳＣＬＣ試料のノーザン解析の結果は表１にまとめた。
0003911017.tif 000010
興味深いことに、４７ＮＳＣＬＣ中１４がＩｎｔ６ｍＲＮＡの発現の欠失を示し、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡの発現の欠失は特異的組織学的サブタイプと非常に有意な関係（Ｐ＝０．００３）が見られた。（表１、NSCLCのアデノカルシノーマ）
本実施例で示した結果は、Ｉｎｔ６の発現の欠失はヒト胸部ガンの初期の現象であり、肺ガンのような他の腫瘍形成に寄与する要素であるという結論に一致する。
実施例１５
ネズミＩｎｔ６タンパク質の特性
Ｉｎｔ６遺伝子は５０ＫＤａのタンパク質をコードし、３つの翻訳開始点と考えられ得る部位（マウスの配列の２７ｂｐ，１７４ｂｐおよび１８９ｂｐ）を有する。これらの各々のポリペプチドは、ウサギの網赤血球システムにおけるＩｎｔ６ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の産物として検出された。マウスのＩｎｔ６の５７−７１（ペプチド４７）残基および、２６２−２８１（ペプチド２０）残基のアミノ酸に一致する合成ペプチドに対するウサギのポリクローン血清を調製し、Ｉｎｔ６のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物の免疫沈降に用いた。この免疫沈降は対応するペプチドにより競合される。大人のマウス組織（脳、肺、腎臓、筋肉、心臓及び乳腺）のタンパク質抽出液のペプチド２０（ｒＡＢ２０）に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析で、８０ｋＤのポリペプチドの３量体同様に主要な４０ｋＤａポリペプチドが検出された。これらのポリペプチドとの反応はペプチド２０により競合される。興味深いことに、唾液線抽出液のウェスタンブロットで３０ＫＤのＩｎｔ６関連ポリペプチドの発現もまた観察された。４０ＫＤポリペプチドは５０ＫＤａ前駆体の切断産物であり、８０ＫＤの交差反応したポリペプチドは４０ＫＤのペプチドの２量体であると考えられる。
さらに、細胞画分研究および上記のペプチドに対する抗体を用いた免疫蛍光の研究で、Ｉｎｔ６は主に細胞質に局在する事が示された。さらにマウス胚の免疫蛍光研究で、Ｉｎｔ６タンパク質はゴルジ体に局在する事が示された。
最後にタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位の３つの候補を含むＩｎｔ６タンパク質を、QUIA Express Type ４ベクター（Quiagen, Chatsworth CA）をもちいて細菌中で発現し、精製し、ＰＫＣによりリン酸化されることが示された（データは示さない）。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：健康国民サービス省長官により代表されるアメリカ合衆国政府；ガラハン、ロバート；マルセティ、アントニオ；ブッチッタ、フィアンマ；スミス、ギルバートＨ．
（ii）発明の名称：新規腫瘍遺伝子、Ｉｎｔ６のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列、並びに診断分析、ワクチン、免疫治療および遺伝子治療におけるこれらの配列から誘導された試薬の使用
（iii）配列の数：３２
（iv）通信先：
（Ａ）宛て名：モルガン＆フィンネガン、Ｌ．Ｌ．Ｐ．
（Ｂ）通り：３４５  パーク  アベニュー
（Ｃ）都市：ニューヨーク
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：１０１５４
（ｖ）コンピューター読取り形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーデスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト５．１
（vi）本出願のデータ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９６年２月９日
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／３８５，９９８
（Ｂ）出願日：１９９５年２月９日
（Ｃ）分類：
（viii）弁護士／代理人情報
（Ａ）氏名：ウイリアム  Ｓ．フェイラー
（Ｂ）登録番号：２６，７２８
（Ｃ）参照／ドケット番号：２０２６−４１７９ＰＣＴ
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（２１２）７５８−４８００
（Ｂ）テレファックス：（２１２）７５１−６８４９
（Ｃ）テレックス：４２１７９２
（２）  配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１５０４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１
0003911017.tif 000011
（２）  配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３９６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列記載：配列番号２
0003911017.tif 000012
0003911017.tif 000013
（２）  配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１５００塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３
0003911017.tif 000014
0003911017.tif 000015
（２）  配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３９６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列記載：配列番号４
0003911017.tif 000016
0003911017.tif 000017
（２）  配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号５
0003911017.tif 000018
（２）  配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号６
0003911017.tif 000019
（２）  配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号７
0003911017.tif 000020
（２）  配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号８
0003911017.tif 000021
（２）  配列番号９の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号９
0003911017.tif 000022
（２）  配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１０
0003911017.tif 000023
（２）  配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１１
0003911017.tif 000024
（２）  配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１２
0003911017.tif 000025
（２）  配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１３
0003911017.tif 000026
（２）  配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１４
0003911017.tif 000027
（２）  配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１５
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（２）  配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１６
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（２）  配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１７
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（２）  配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１８
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（２）  配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１９
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（２）  配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２０
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（２）  配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２１
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（２）  配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２２
0003911017.tif 000035
（２）  配列番号２３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２３
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（２）  配列番号２４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２４
0003911017.tif 000037
（２）  配列番号２５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２５
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（２）  配列番号２６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２６
0003911017.tif 000039
（２）  配列番号２７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２７
0003911017.tif 000040
（２）  配列番号２８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２８
0003911017.tif 000041
（２）  配列番号２９の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号２９
0003911017.tif 000042
（２）  配列番号３０の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３０
0003911017.tif 000043
（２）  配列番号３１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３１
0003911017.tif 000044
（２）  配列番号３２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３２
0003911017.tif 000045
【図１Ａ】
0003911017.tif 000046
【図１Ｂ】
0003911017.tif 000047
【図２Ａ】
0003911017.tif 000048
【図２Ｂ】
0003911017.tif 000049
【図２Ｃ】
0003911017.tif 000050
【図３】
0003911017.tif 000051
【図４】
0003911017.tif 000052
【図５】
0003911017.tif 000053
【図６】
0003911017.tif 000054
【図７】
0003911017.tif 000055
【図８】
0003911017.tif 000056
【図９Ａ】
0003911017.tif 000057
【図９Ｂ】
0003911017.tif 000058
【図１０】
0003911017.tif 000059
【図１１】
0003911017.tif 000060
【図１２】
0003911017.tif 000061
【図１３】
0003911017.tif 000062
【図１４】
0003911017.tif 000063
【図１５】
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【図１６】
0003911017.tif 000065