(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フイブリノゲンまたはトロンビンを自由流動性形態で含む、可溶性でスプレー乾燥したマイクロカプセル。
【請求項２】
トロンビンおよびカルシウムイオンを含む、請求項２記載のマイクロカプセル。
【請求項３】
フイブリノゲンを含む、請求項１記載のマイクロカプセル。
【請求項４】
壁形成性材料としてアルブミンを含む、請求項１から３のいずれか１項記載のマイクロカプセル。
【請求項５】
賦形剤を追加的に含む、請求項１から４のいずれか１項記載のマイクロカプセル。
【請求項６】
炭水化物を含む、請求項５記載のマイクロカプセル。
【請求項７】
５０μｍのサイズまでである、請求項１から６のいずれか記載のマイクロカプセル。
【請求項８】
少なくとも９０質量％が１０から２０μｍのサイズである、請求項７記載のマイクロカプセル。
【請求項９】
フイブリノゲンおよびトロンビンをそれぞれ含む、請求項１から８のいずれか１項記載の可溶性マイクロカプセルの乾燥混合物。
【請求項１０】
創傷治療または外科的修復に同時使用するための併合製剤としての、フイブリノゲンおよびトロンビンをそれぞれ含む、請求項１から８のいずれか１項記載の第１および第２マイクロカプセルを含む生成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はスプレー乾燥により製造される微粒子、およびそれらの治療用使用に関するものである。特に本発明はフイブリンシーラント（sealant）に関する。
発明の背景
フイブリンシーラントはフイブリノゲンおよびトロンビンからなる生物学的接着剤であり、創傷の治癒の援助に広く使用され、外科手術創傷の縫い合わせのない閉鎖の提供に広く使用される。フイブリノゲンは血液中の主たる構造タンパク質であり、血餅形成の原因である。
血餅形成が生起するためには、フイブリノゲンがタンパク分解性開裂を起こしてトロンビンによりフイブリン単量体に転化される必要がある。このトロンビンは因子Ｘａによりその活性形態に転化される一種のセリンプロテアーゼである。フイブリン単量体はフイブリルへと集合し、その結果３次元網状構造の線維を形成する。血餅形成も因子ＸＩＩＩの活性を必要とする。因子ＸＩＩＩはカルシウムの存在下のトロンビンにより、その活性形に転化される一種のセリンプロテアーゼである。活性化された因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａ）は、次いで集合したフイブリン単量体間の非共有結合をアミノ基転換反応により共有結合へと転化する。これにより、フイブリンゲルがプラスミンによるタンパク分解消化に影響され難くなり、同時にこのゲルの全体的強度と剛性が高まる。フイブリンゲルは酵素および食細胞経路で容易に再吸収される。
この凝固過程を生物学的接着剤の形態で再現するために、フイブリンシーラントのフイブリノゲン成分は通常因子ＸＩＩＩを含み、かつトロンビン成分は塩化カルシウム溶液中で調製される。この２成分は遂次的にまたは同時のいずれかで、典型的には注射器もしくはスプレーで修復箇所に施される。フイブリンシーラントは湿潤表面に容易に接着し、一度重合すると、半剛性の止血性、耐液性の接着剤になり、組織もしくは材料を所望の形態（configuration）に維持させることができる。
最近、フイブリノゲンとトロンビンそのままを混合する例えば二重注射器デバイスを用いてフイブリンシーラント製品を溶液として傷口部位に施している。かかる送達システムの主たる欠点はデバイス内部の血餅形成にあり、これにより針およびチユーブが閉塞する。この２重注射システムは充填および操作が煩雑である。さらに、フイブリノゲンとトロンビン溶液との混合が不適当であると、弱い血餅のみしか形成されない。
多くの傷口部位は滲み、これが原因で傷部位に液が多量に蓄積する。フイブリンシーラント成分の溶液をかかる部位に施すと、多くの場合これらは消失する。
ＵＳ−Ａ第4427651号には、促進止血および傷口閉鎖の最適生化学的制御のためのスプレー可能調剤を開示し、この調剤中にはトロンビン１５−６０重量％、乾燥および安定剤（アルブミン、グロブリンおよび／またはフイブリノゲン）５−８０重量％、およびフイブリン溶解阻害剤１−１０重量％の粉末混合物が含まれる。この粉末状混合物は低沸点で、推進剤（propellant）として使用される無水溶剤中に懸濁されている。
ＷＯ−Ａ−第9213495号公報には粒子サイズの調節なしに沈殿法により調製した凍結乾燥フイブリノゲン粉末の開示がある。通常、この粉末は使用に先立ち水和されるが、上記のような欠点がある。閉じるべき管もしは傷口が小さい場合、および血液損失が急速でない場合、この粉末の直接使用が可能なことも提案されている。この場合、反応は内因性トロンビンの存在に依存する。大きな傷の場合は、多量の血流がこの内因性材料を流し出し、血餅が生起しない。
発明の概要
この度、フイブリノゲンまたはトロンビンを含む新規可溶性微粒子（マイクロカプセルも包含）を得る手段としてスプレー乾燥が有用であることが判明した。
フイブリノゲン含有およびトロンビン含有可溶性微粒子（microparticles）は、それぞれは安定な乾燥形態で一緒に配合できる。所望であれば次いで配合物（formulation）を活性化し、創傷治療および外科的修復に有用なフイブリンシーラントを得ることができる。これは良好な流動性、活性部位への増進された有効な送達性、および送達系中ではなくこの部位のみでの溶解が遂行されるという主目的に適合する。
発明の説明
フイブリノゲンまたはトロンビンを含む微粒子はＷＯ−Ａ第9218164号、ＷＯ−Ａ第9609814号およびＷＯ−Ａ第9618388号公報記載の方法により調製できる。これらのスプレー乾燥および付随の粒子操作方法によれば、一定の例えば直径が５０μｍまでのサイズ分布を有する可溶性タンパク質マイクロカプセルの製造ができる。例えばこれらの文献に記載があるように、２０μｍまで例えば１から１０μｍ、または５μｍまでのサイズが９０重量％またはそれを上回る（質量で）微粒子、所望であればサブミクロンサイズの微粒子を再現性良く製造ができる。
本発明微粒子は活性成分のみの溶液をスプレー乾燥して調製してもよい。別法には、フイブリノゲンまたはトロンビン、および他の壁形成性材料を配合してスプレー乾燥して微粒子を得る、共スプレー乾燥が包含され、この場合の活性成分は粒子の壁中に配合される。
フイブリノゲンまたはトロンビンは完全長のもの、またはその任意の活性断片であってもよい。断片は既知である；CollerらのJ. Clin. Invest. 89:546-555（1992）参照。フイブリノゲン原材料は冷凍溶液であってもよく、スプレー乾燥に先立ち再構成を必要とする凍結乾燥粉末でも使用できる。
糖類（例えばスクロース、ラクトースまたはマンニトール）等の賦形剤または他のタンパク質の存在下でのタンパク質のスプレー乾燥は、対象のタンパクを安定化し、同時に低服用量を必要とする場合の有効な希釈を確実にする。この糖は創傷治療に際して有益な効果がある。
他の好ましいタンパク質は天然由来のもの、または組み換え体である。これらはＷＯ−Ａ−第9218164号記載のような”壁形成性材料”として機能し、各種の例示がある。好ましい材料はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）である。例えばフイブリノゲンは単独でスプレー乾燥され、またはＨＳＡ（例えばフイブリノゲン：ＨＳＡ比１：１、１：３、３：１）および糖類（例えばマンニトール）等の各種量の賦形剤の存在下にスプレー乾燥される。
本発明微粒子は、呼吸性は考慮されないので、サイズは臨界的ではないが、例えば平滑性および球状である等の、上記三種刊行物に記載の物理的特性を有することができる。対象の二種タンパク質のいずれかの最高の回収率を保証する既知条件を、例えば直径ｃ．１．５μｍまたはｃ．１０μｍの微粒子の製造に使用できる。
フイブリノゲンのスプレー乾燥により製造した微粒子は驚くほど活性で可溶性であることが判った。したがって、スプレー乾燥フイブリノゲン調剤の使用は、凍結乾燥フイブリノゲンの溶解に１５分またはそれより多くを要し、通常は加熱が必要な場合の病院での設定には特に有益である。これが速度制限段階であり、患者へのフイブリンシーラント調剤の投与を著しく遅延させる原因となりうる。
フイブリンシーラント中のトロンビン成分濃度は比較的低い（例えばフイブリノゲン４０ｍｇ当り１５０μｇトロンビン）。したがってトロンビンはＨＳＡ、スクロース、ラクトースまたはマンニトール等の賦形剤の各種割合と共にスプレー乾燥するのが好ましい。かくすると、ＰＣＴ出願／ＧＢ97/00953号に詳細な記載があるように均一配合が提供される。
カルシウムイオン例えば塩化カルシウムをトロンビン供給原料中に配合することができる。別法として、プロセス後に塩化カルシウムを添加してもよい。
本発明微粒子は必要または所望に応じて滅菌できる。好ましい手法例は滅菌処理、γ−線照射およびエチレンオキシドである。
本発明フイブリンシーラント中のマイクロカプセル成分は水溶性が好ましいが、微粒子は適当な溶液をスプレー乾燥して好ましく得られ、取得できる微粒子は自由流動性で、個々に分離した無水物であることができる。この事は本発明によるフイブリンシーラントの成分が例えば創傷部位の液体と接触し、湿るに至るまでは活性化されないことを意味する。したがって異なる微粒子の別個の適用も想定できるが、活性成分は乾燥混合物として送達することができる。
乾燥粉末フイブリンシーラント製品は、広い面積域への適用を要する場合に特に価値がある。この例中には、肝臓および脾臓等各種臓器の外傷の手術および修復が包含される。さらに有益な応用分野は、火傷患者、具体的には皮膚皮シートをin vitroで培養し、次いで創傷部位に移す場合の皮膚移植である。後者におけるフイブリンシーラントの使用は、皮膚グラフトに対する生物学的適合性固着を前提にすれば、広範囲火傷患者には特に有効であることがわかった。局所潰瘍の治療にも適する。
本発明の生成物は実質的に乾燥物であることができる。この事は、例えば止血の場合に、作用部位で生成物を乾燥・濃縮する液状フイブリンシーラントに比べて特に有利であり得る吸収材料と共に処方可能であることを意味する。かかる好ましい材料としてカルボキシメチルセルロースが挙げれる。
この配合にはＮＯスキヤベンジャーも含有することができ、さらに一般的には、血餅凝集を促進する材料はいずれもこれらの分解を阻害し、またはフイブリン溶解を阻害する。アルブミン等の材料はＳＨ基を有する。これらは凝集部位からＮＯを取り除き、血餅形成を増強することができる。
ＷＯ−Ａ−第9609814号に詳細な記載があるように、スプレー乾燥微粒子は治療剤の結合に利用できる官能基を保持できる。本発明では、所望に応じて適用部位で微粒子に薬剤が結合できる。かくすると、例えば皮膚がん治療を所望する場合に細胞毒性薬剤が使用できる。
本発明生成物中に含有できる他の薬剤例えばフイブリノゲン含有薬剤には、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩＩＩ、およびフォン・ウイルブラント（von Willebrand's）因子等の凝固因子がある。これは共スプレー乾燥により配合できる。
最近、変性アルブミン微小バブル（microbubbles）が損傷内皮に優先的に付着することが判った。この事は、フイブリノゲン活性化が原因であるのみならず、この微粒子のアルブミン成分が存在すれば、本発明生成物が創傷部位に蓄積するであろうことを示唆している。
次の実施例は本発明の説明である。
実施例
フイブリンシーラントを調製した。これはフイブリノゲンおよびトロンビンそれぞれを含む微粒子の乾燥粉末混合物を含んだ。
フイブリノゲン（ＳＮＢＴＳ）はスクロース６００ｍｇと共に配合した。採集容器を具備したMini Spray Dryerを用いてスプレー乾燥した。条件は次のようである：
入口温度：    １００℃
出口温度  ：  ６５℃
噴霧圧    ：  １．０バール
噴霧タイプ：  Schlick 970/0
原料供給速度：１ｇ／分
最終２０％賦形剤配合が達成された。動力学的試験で検出された活性は１３．８８ｍｇ／１００ｍｇであった。理論活性は１０ｍｇ／１００ｍｇである。このことは、フイブリノゲン生物学的活性の完全保持を示す。
別個に、Ｄ−マンニトール１ｇ（Roquette, ESEX 4）を４０ｍＭ  ＣａＣｌ2の１０ｍｌ中に溶解した。得られる溶液を１バイアルのトロンビン（ＳＮＢＴＳ）の再構成に用いた。スプレー乾燥の採用条件は、出口温度がｃ．６２℃、原料供給速度が０．７５ｇ／分に減少した以外は上記と同じ条件を用いた。
トロンビン血餅試験によると、トロンビン活性は９１．８６単位／１００ｍｇであることが判った。この活性は理論値９３単位／１００ｍｇに都合良く匹敵する。
フイブリノゲンおよびトロンビンを含む個々の微粒子をガラス製バイアル中で混合して５０：５０混合物を形成させた。このバイアルを２０分間、ローラミキサー上に置いた。
上記混合物を各種混合サイズで、肉（meat）粘着試験で評価した。各試験はレバー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）の二つの部分を必要とする。一つのレバー部分は１片の厚紙にステープルで留める。両部分はアルミニウムホイルで包み、３７℃で２０分間保温する。
ゆるんだレバー部分を綿でつなぐ。ヒト血清アルブミン５％溶液を両レバー部分の表面に施し、次いでフイブリノゲンおよびトロンビンの乾燥粉末混合物（フイブリンシーラント）を施す。この二つのレバー部分を一緒に置き、３７℃、１０分間保温する。
次いでレバー部分をクランプから懸垂し、フックを綿に取り付ける。フック上に荷重し、懸垂全重量を用いて乾燥粉末フイブリンシーラント混合物の引っ張り強度をｍｇ／ｍｍ2で計算する。結果を次表に示す。
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