(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体内に鉄含量として１％以上を含有させる鉄含有酵母の製造方法であって、該酵母がキャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母であり、培地中に鉄濃度として７００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍ、マグネシウム濃度として２０ｐｐｍ以上を添加することを特徴とする鉄含有酵母の製造方法。
【請求項２】
培養温度が２１〜２４℃である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
培地中の燐酸濃度が０．０３％〜０．５％である請求項１または２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、鉄化合物存在下で特にＣａｎｄｉｄａ属の食用酵母を培養することにより、該酵母の菌体内に鉄含量として１％以上を含有する、健康食品用途向けの酵母の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の健康ブームの中で、栄養素としてのビタミンと共にミネラル、微量元素への関心が高まりつつある。このような中で鉄分は、日本人の場合カルシウムと並び不足していると言われているミネラルの１つである。特に成長期の子供や妊婦は要求量が増大するため、鉄欠乏性貧血症にかかりやすいと言われている。そこで飲み易く吸収され易い形の鉄分が要求されている。
【０００３】
鉄分はすでに加工食品等への添加が積極的に行われ、通常、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、コハク酸第一鉄等が使用されている。しかしながらこれらの化合物は、元々鉄臭さを有する物であり、その為添加量を制限せざるを得ないし、体内への吸収の点でも問題があった。そこで、最近注目されているのが酵母に鉄分を吸収させて、有機鉄の形にして鉄臭さを低減させたり、人間の体内への吸収性を高めた形で供給する試みである。
【０００４】
鉄含有酵母の製造方法としては、鉄化合物を含む培地で食用微生物を培養し、鉄を多量に含有する微生物菌体の製造法（特公昭６１−９８３５号公報）、鉄化合物の存在下に、糖類含有栄養培地中で酵母を培養する有機第一鉄含有補血剤組成物の製造法（特開昭５８−１０１６８６号公報）、炭素源及び窒素源を含有する培地に鉄化合物を添加して微生物を培養することにより、おおむね１％弱の鉄を含有していること、及び培地中のマグネシウムの濃度が１０ｍｇ／ｌ以下であることが必要な微生物菌体の製造方法（特開昭６２−１３４０８３号公報）が知られている。さらに、酵母を培養して得た菌体を有機化合物及び二価の水溶性鉄化合物を含有する水溶液に分散し、鉄分を蓄積せしめる二価鉄含有酵母菌体の製造法（特開平５−１７６７５８号公報）が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように従来の鉄含有菌体を得る方法は、予め鉄化合物を培地中へ添加した培地で微生物を培養、増殖せしめることにより鉄含有菌体を得るか、または予め鉄化合物を添加しない培地で微生物を培養、増殖させ、その後菌体を集菌し鉄化合物を添加して、菌体中に取り込ませて鉄含有菌体を得るものである。前者の方法は一般に鉄による増殖阻害があるため高濃度の鉄の添加ができない。さらに、添加した鉄化合物は培養中に、通気撹拌により比較的短時間の内に酸化が起こり、特に通常の必須の培地成分として添加される燐酸イオンのと間で、燐酸鉄等の不溶性の化合物となり、微生物の鉄分の取り込みを阻害するだけでなく、培養終了後の遠心分離等による菌体分離において、不溶物と菌体との沈降速度に大きな差がないため、菌体との分離が困難である。この不溶物の存在は鉄臭さや色さらに吸収性の面での障害になる。
一方、後者の方法は、鉄自体の微生物に対する増殖阻害効果を回避するための手段と考えられるが、燐酸と鉄の化合物は、両者の濃度及び接触時間に依存して増大するため、予め鉄を添加していない培地で培養した微生物菌体を集菌して、後から鉄化合物と接触させて鉄を取り込ませる方法においても、鉄の取り込みを容易にするためには、高濃度の燐酸及び鉄化合物を使用するため燐酸鉄等の生成とその除去が問題になった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる課題を解決するため鋭意研究の結果、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母を、高濃度の鉄化合物及びマグネシウム化合物存在下培養したところ、鉄の含有量が高く増殖阻害も起こらないことを見いだし、本発明を完成するにいたった。すなわち本発明は、鉄を１％以上、好ましくは２％以上含有した酵母の製造方法を提供するものである。
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明に使用する酵母は、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母である。本発明のいう高ＲＮＡ含有酵母とは、例えば特公昭５６−４６８２４号公報等に開示されているごとく、ＲＮＡを菌体重量当たり１２重量％以上生成蓄積させる能力をもつ酵母をいう。
【０００８】
本発明は、培地中に鉄濃度として７００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍ、マグネシウム濃度として２０ｐｐｍ以上を添加することにより実施される。
本発明に使用する鉄化合物については、適当な水溶性があれば、有機、無機いずれの物質であっても良い。この様な給源の具体例としてクエン酸第一鉄、フマル酸第一鉄、乳酸第一鉄等をあげることができる。この他通常の微生物培養において培地成分として使用される硫酸第一鉄、塩化第一鉄等も当然使用できる。以上のように種々の鉄化合物が使用可能であるが、工業規模の生産を考えると安価でしかも食添用の規格がある、硫酸第一鉄が最も好ましい。これらの添加量としては鉄濃度として、７００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍである必要がある。７００ｐｐｍより低濃度であれば鉄の蓄積量が１％未満となり、一方２０００ｐｐｍを越えると増殖阻害が現れはじめ、添加した鉄の蓄積効率が低下する。
本発明に用いられるマグネシウムとしては、硫酸マグネスイウム、塩化マグネシウム等を例示することができる。マグネシウムの濃度は２０ｐｐｍ以上必要で、それ以下であるとＲＮＡ合成に必要なマグネシウムが不足するため、対糖菌体収率の低下、さらには鉄の蓄積にも悪影響を及ぼす。
【０００９】
本発明においては、燐酸濃度を制限した培地成分下で培養温度を２１〜２４℃の比較的低温下で培養することにより、菌体内に高含有量の鉄分を蓄積し、不溶性の無機鉄化合物を培地中に残存させることなく、また菌体中にもほとんど低分子の鉄化合物を含まない鉄高含有酵母を製造することができる。
使用される燐酸としては、燐酸カリウム、燐酸アンモニウム等が挙げられ、燐酸濃度としては０．０３％〜０．５％程度が好ましい。
【００１０】
菌株の培地組成として、炭素源としては通常微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム  硝酸塩等が使用される。燐酸、カリウム源も燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、塩化カリウム等が用いられる。その他微量金属としては、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩が有効である。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。
【００１１】
本発明に使用される菌体は、培養温度２０〜３３℃の範囲で生育可能であるが、鉄の蓄積には２１℃〜２４℃の比較的低温が好ましい。この理由としては、一般にＲＮＡ含量は、増殖速度に比例して増加し、同じ増殖速度においては、培養温度が低いほどＲＮＡ含量が高いといわれていることと関係があると本発明者らは推察している。培養ｐＨは３．５〜７．５、好ましくは４．０〜６．０であり、培養時間は炭素源の濃度により異なるが、通常２０〜３０時間である。高ＲＮＡ含有酵母を使用すると、燐酸の取り込み能力が高いため、燐酸鉄等の沈殿物を可溶化して鉄分をも吸収するため、高濃度の鉄化合物を添加した培地で培養を行っても、増殖阻害がほとんど見られない。また、例えば特開昭６２−１３４０８３号公報に記載されているように、鉄高含有微生物を取得するためには培地中のマグネシウム濃度を低くする必要があることが公知であるが、本発明によると、マグネシウム濃度を公知例より高くすることにより、１％以上、好ましくは２％以上の鉄を含有した酵母が容易に製造できる。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例を上げて説明する。
尚、菌体濃度の測定は、培養液の一定量を取り、遠心分離機で菌体を２回水洗後、その一部を取って１０５℃、一夜乾燥させた後の重量から求めた。この菌体に取り込まれた鉄含量の測定は、菌体を湿式分解法で灰化した後、原子吸光法で行った。以下の実施例及び参考例における菌体濃度及び菌体内に取り込まれた鉄の濃度の測定はすべて同様の方法で行った。
【００１３】
実施例１  酵母の培養と鉄の蓄積
ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し１２１℃で１５分間殺菌した後、キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とう培養し種菌とした。これを３０ｌ容発酵槽に全量植菌した。培地としてはグルコース６．５％、燐酸一アンモニウム０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マンガン２ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐｍを用い、バッチ培養を行った。培養条件は、槽内液量１５ｌ、培養温度３０℃、通気量１５ｌ／分、撹拌４００ｒｐｍ、ｐＨ４．０（アンモニア添加による自動コントロール）にて行った。鉄は、硫酸第一鉄を５０００ｐｐｍ（鉄として１０００ｐｐｍ）を培地中に最初に添加した。
培養の終了は、グルコースが完全に消費された時点とした。また、キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９はＲＡＮを高濃度に含有する変異株（特公昭５６ー４６８２４号公報）であるが、その親株について同一の条件で培養を行った。その結果、表１に示すように菌体内にキャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９の方が、鉄の蓄積量が多いことがわかった。蓄積した鉄含量は、１．１６％であった。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
実施例２  燐酸濃度の影響
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９の種母培養を実施例１と同様に行い、３０ｌ容発酵槽に実施例１の培地と燐酸アンモニウム以外は同じ培地組成及び同じ条件で培養を行った。燐酸アンモニウムの濃度は、０．２６％、０．２３４％０．２０８％、０．１８２％に変化させた。その結果を表２に示した。この結果から、増殖を阻害しない燐酸一アンモニウム濃度は、０．１８２％（燐酸として０．１５％）で、この濃度未満では、著しく増殖が阻害され、培養が終了しなかった。従って、鉄として１０００ｐｐｍ添加したときに増殖を阻害しない燐酸濃度の範囲で、バッチ培養を行うことにより、１％以上の鉄含量でしかも不溶性の鉄化合物を生成しない培養液を得ることができた。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
実施例３  培養温度の検討
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９の種母培養及び３０ｌ容発酵槽でのバッチ培養を実施例１と同様に行った。培養条件中の培養温度を、３０℃と２４℃に変えて培養を行った。その結果、低温の２４℃で培養を行った方が菌体内に鉄を約２倍程度の高濃度に蓄積できることがわかった。この場合３０℃の培養の時に比べて燐酸アンモニウムの濃度を増殖を律速しない濃度まで上げる必要があった。すなわち、３０℃の培養の時の燐酸アンモニウム濃度を２０％上げることにより、培養終了時点において、不溶物を殆ど生成しない状態で鉄含有菌体を得ることができた。両温度でＲＮＡ含量及び菌体収率に殆ど変化は無かったことから、鉄の取り込みには燐酸が必須であると考えられる。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
実施例４  硫酸第一鉄濃度の添加量と菌体内鉄濃度
培養温度を２４℃にして、硫酸第一鉄の濃度を５０００〜１００００ｐｐｍに変化させて添加した培地を作成し、実施例１と同様の方法で培養を行った。燐酸アンモニウムは培養に支障がない濃度にして行った。その結果、表４に示すように、硫酸第一鉄濃度が１００００ｐｐｍの時には、鉄の菌体内濃度は４．３２％と高濃度になった。培養時間は２７〜３０時間であり、硫酸第一鉄の添加濃度が５０００〜１００００ｐｐｍ（鉄濃度として１０００〜２０００ｐｐｍ）の範囲では、増殖阻害は殆ど見られなかった。硫酸第一鉄５０００ｐｐｍを添加して培養して得られた培養液１５ｌを、遠心分離で集菌後、同量の蒸留水で懸濁し再度遠心分離して、菌体を集めた。蒸留水を加えて約７％の菌体懸濁液として、生菌数低減のため、８０℃で５分間保持後、スプレードライヤーで菌体を乾燥した。乾燥条件は入口温度２３５±５℃、出口温度１００±５℃、通液速度２ｌ／時間で行った。この結果、鉄含量２．１１％の鉄含有菌体３８０ｇを得た。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
参考例１  鉄化合物の性状
酵母菌体内の鉄がどのような形で存在しているかを推定するために、実施例３において２４℃で培養して得られた、鉄含有酵母菌体の乾燥物を蒸留水に１時間室温下に懸濁放置後、菌体部分と上清の鉄の分析を行った。その結果を、表５に示した。鉄分は水で抽出して約１割しか菌体の外に出てこないことがわかった。従って鉄は高分子の蛋白等と結合して存在していることが示唆される。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
【発明の効果】
以上説明してきた通り、本発明によると、鉄分を多量に添加した培地で、鉄による増殖阻害を受け難い菌を培養することにより、鉄分を高含有に蓄積した食用酵母菌体を製造することができる。このような菌としては、ＲＮＡを高濃度に蓄積できる、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である。さらに、必須の培地成分の一つである燐酸の濃度を調整することにより、通常培養中に生じる燐酸鉄等の無機の鉄分の混入をも低減することができる。