(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３種以上の被分析物を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、得られたクロマトグラムを記憶するための第１記憶手段、クロマトグラム中のピークを検出し、各被分析物のピークとして同定するための第１演算手段、同定された被分析物ピークを評価するための各被分析物毎の基準ピーク出現時間を記憶するための第２記憶手段、記憶された基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値を求める第２演算手段、そして、相関の程度を表示する表示手段とを具備するクロマトグラムの解析用装置。
【請求項２】
第２記憶手段が、クロマトグラムにおいて被分析物のピークが出現すると予想される標準ピーク出現時間を基準ピーク出現時間として記憶するものである請求項１の装置。
【請求項３】
前記標準ピーク出現時間が、各被分析物を含む標準試料をクロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムから計測されたピーク出現時間であることを特徴とする請求項２の装置。
【請求項４】
第２演算手段が、相関係数の値又は相関係数の値を二乗した値を基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値として求めるものであることを特徴とする請求項１の装置。
【請求項５】
第２演算手段が、基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間の間の直線回帰式で表される直線と基準ピーク出現時間及び被分析物のピーク出現時間で示される点の間の距離を被分析物のピーク出現時間の誤差とし、誤差の絶対値の最大値、該誤差の絶対値の平均値、該誤差の標準偏差又は該誤差の分散値を基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値として求めるものであることを特徴とする請求項１の装置。
【請求項６】
第２演算手段が基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値を求めた後、該値を所定の相関基準値と比較するものであり、表示手段が該比較結果を表示するものである、請求項１の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術の分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等、被分析物を含む試料をカラム等の分離手段に供して取得されるクロマトグラムを解析する解析装置に関するものであり、更に具体的には、例えば液体クロマトグラフィーによる血液や尿中のカテコールアミンやアミノ酸の分析における、クロマトグラムの解析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、種々の被分析物質を液体クロマトグラフィー等に供してクロマトグラムを得、該クロマトグラム中の被分析物のピークを検出し、その高さ、巾、ピーク面積等を解析し、被分析物の定性、定量を行うことが知られている。
【０００３】
クロマトグラムの解析では、被分析物の溶出ピークを検出した後、検出されたピークを予めその存在を予想した成分と関連付けることが必要である。このための方法として、クロマトグラム中のピークを全て検出した後で、被分析物毎に、検出したピークの中から１つのピークを選んで関係付けて同定する方法（以下、第１法という）と、予め測定しようとする被分析物毎にピークが出現する時間  （標準ピーク出現時間）を予想しておき、この付近でピークを探す方法（以下、第２法という）がある。
【０００４】
第１法では、測定で対象とする被分析物のピーク以外に、予想していない未知成分のピークを検出することが可能である。即ち、クロマトグラムの解析に当たり、通常はクロマトグラムの傾き等によりピーク開始点とピーク終了点を検出し、この範囲で最大値を取る点をピークとすることにより、未知成分のピークも検出可能であるが、微小ピークの検出を可能とするようにピーク検出感度を上げれば、試料中の成分に由来しないノイズピークをもピークとして検出してしまう恐れがある。
【０００５】
これに対して前記第２法では、測定で対象とする被分析物以外のピークを検出することはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、第２法においても、例えばヒト血液や血清等の生体試料等を試料として得られたクロマトグラムを解析する場合には、試料に含まれる被分析物以外の夾雑物に由来するピーク（妨害ピーク）により、ピーク検出が困難になることがある。例えば血清等はそれ自体がさまざまな成分を含むうえ、薬物投与を受けている者の血清試料では、該薬物やその代謝物までも含まれるため、クロマトグラム中には多数の妨害ピークが出現することになる。そして、被分析物ピークと妨害ピークが近接して出現する場合が生じる。
【０００７】
被分析物ピークと妨害ピークの大きさが同程度である場合は、両ピークが重複したとするとピーク出現時間の差に応じて重複ピークのピーク巾が広がるため、ピーク巾の広がりを解析することにより妨害ピークの重複を知ることができる。しかし、被分析物ピークが妨害ピークに比較して小さい場合、重複ピークでは妨害ピークが支配的になり、被分析物ピークのピーク巾と妨害ピークのピーク巾の差が小さい時にはピークの巾の広がりを解析しても妨害ピークの重複を知ることは困難である。
【０００８】
従って、妨害ピークが被分析物ピークの近くに出現すると、妨害ピークを被分析物のピークと誤認して同定する可能性が生じる。理論上は被分析物ピークの出現時間と妨害ピークの出現時間が異なれば、被分析物ピークを検出するための時間巾を狭くすることによりピーク同定の誤認を回避することが可能であるが、カラムの劣化、移動相の変化、測定温度等の環境の変化により被分析物ピークの出現時間が変動する可能性があり、実際上はある程度以上は該時間巾を狭くすることは困難で、妨害ピークを被分析物のピークと誤認する恐れを排除できない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、ピーク検出により被分析物ピークを同定した後、該同定結果が正しいか否かを判定するためのクロマトグラムの解析用装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために成された本発明の装置は、３種以上の被分析物を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、得られたクロマトグラムを記憶するための第１記憶手段、クロマトグラム中のピークを検出し、各被分析物のピークとして同定するための第１演算手段、同定された被分析物ピークを解析するための各被分析物毎の基準ピーク出現時間を記憶するための第２記憶手段、記憶された基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値を求める第２演算手段、そして、相関の程度を表示する表示手段とを具備するクロマトグラムの解析用装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の解析装置は、試料中の３種以上の被分析物を分離・展開した後に検出を行う、いわゆるクロマトグラフィーにおけるクロマトグラム解析に使用することができる。クロマトグラフィーは、分離・展開の原理によって種々の液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーが存在するが、解析対象となるクロマトグラムはいかなるクロマトグラフィーにより得られたものであっても良い。例えば電気泳動結果を適当な染色試薬で染色後、光学測定装置でスキャンニングする等した場合でも、その解析に本発明を使用することができる。
【００１２】
本発明が、試料が３種以上の被分析物を含む場合にのみ適用されるのは、ピークの出現時間の相関を評価するために少なくとも３つのピークが必要であることによる。
【００１３】
クロマトグラムは、本発明の装置による解析に先立ち、例えば単純移動平均、多項式フィッティング、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスムージング処理を行ったり、単純スパイク除去処理、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるノイズ除去処理を行っておくことが好ましい。これらの処理を行うことにより、ノイズを除去しておけば、クロマトグラムにおける被分析物ピークの最高値や最低値が正確になり、ピーク検出精度が向上するため、高い解析結果を得ることができる。
【００１４】
単純移動平均はＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｘｉ）／ｍで表され（Ｓｕｍは連続するデータＸｉを加算する関数であり、ｍは加算するデータの数である）、多項式フィッティングはＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｋｉ×Ｘｉ）／Ｓｕｍ（Ｋｉ）で表され（Ｓｕｍ及びＸｉは前記同様であり、Ｋｉは例えばＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法により、データを２次式又は３次式にフィッティングするように決定される係数である）、フーリエ変換はデータをフーリエ変換して周波数軸で高周波成分をカットするウィンドウ関数をかけ、逆フーリエ変換で時間軸に戻すことをいい、ウェーブレット変換は例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６９巻、１号、１９９７年、第７８〜９０頁に記載された処理であり、単純スパイク除去処理としてはメディアン法（Ｙ＝Ｍｅｄｉａｎ（Ｘｉ）で表される、連続する３ないし５のデータの中心を取る方法）等が例示できる。
【００１５】
本発明の装置は、ピーク検出により被分析物ピークを同定した後、該同定結果が正しいか否かを評価するための装置である。しかしながら、本発明の装置に更に被分析物のピーク面積やピーク高さ等を解析するためのベースラインを設定する手段や、設定されたベースラインを用いてピーク高さ、ピーク面積等を検出するための手段を追加することに制限はない。
【００１６】
第１記憶手段は、解析するクロマトグラムを記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成でき、例えば液体クロマトグラフィーにおける検出装置からの検出信号を経時的に記憶できれば良い。第１記憶手段は後述する第２記憶手段と一体に構成することもできる。なお、該経時的記憶は連続的なものであっても良いし、例えば１秒毎等の、間欠的なものであっても良い。間欠的にクロマトグラムを記憶する場合には、ピーク巾に比較して十分に短い時間間隔で値を記憶することが好ましい。ここで、時間は、例えば分離カラム等の分離手段に試料を供した時間を０（ゼロ）として計算しても良いし、例えばクロマトグラフィーに試料を供してから所定時間経過後にクロマトグラムの経時的記憶を開始する場合には該開始時間を０（ゼロ）として計算しても良い。電気泳動の結果をスキャンする場合には、移動距離を時間に置き換えて考えれば良い。
【００１７】
第１演算手段は、第１記憶手段に記憶された、３種以上の被分析物を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析し、その中のピークを検出するための手段であり、例えばコンピュータ等で構成することができるが、後述する第２演算手段と兼用としても良い。第１演算手段としては、従来のピーク検出手段等を用いることができるが、具体的な構成として以下の例を例示することができる。まず、適当な記憶手段に被分析物のピークを検出するためのピーク検出開始時間（ｔｐ１）やピーク検出終了時間（ｔｐ２）等を記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することが可能であり、例えばキーボード等の入力装置を用いてこれらを入力し、記憶させれば良い。この記憶のため、第１演算手段に別途記憶手段を併設するか、又は、本発明の記憶手段を兼用としても良い。
【００１８】
ｔｐ１とｔｐ２は、クロマトグラムにおいて解析しようとする被分析物のピークを検出するためのものであり、被分析物の種類毎に設定される。これらの値はｔｐ１＜ｔｐ２の関係を満たすが、例えば、被分析物のみを含む標準試料をクロマトグラフィーに供してクロマトグラムを得、このクロマトグラムから被分析物の基準ピーク出現時間（ｔｓ）を求め、ｔｐ１＜ｔｓ＜ｔｐ２と設定することが例示できる。ｔｐ１及びｔｐ２は、より好ましくは、使用するクロマトグラフィーの分離の様式、移動相等の速度、分析を行う室温等の分析環境等が変化した場合にも被分析物ピークを検出し得るように、ｔｓがこれら環境が変化した場合に変動する時間巾を勘案し、適宜設定する。
【００１９】
ｔｐ１及びｔｐ２については、被分析物以外の成分が含まれていることが予想される場合にはｔｐ２−ｔｐ１が小さくなるように設定し、被分析物以外の成分の存在が予想されない場合にはｔｐ２−ｔｐ１が大きくなるように設定することが好ましいが、一般的にｔｐ２−ｔｐ１は被分析物を含む標準試料のクロマトグラムの高さがピーク高さの１／２となる時のピーク巾（ピーク半値巾）の１倍程度〜２倍程度となるように設定することが例示できる。ただし、必ずしもｔｓ−ｔｐ１＝ｔｐ２−ｔｓとする必要はない。そしてｔｐ1 〜ｔｐ２までの範囲内で、最高値を有するクロマトグラム点を被分析物のピークとする等すれば良い。
【００２０】
第２記憶手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することができ、前記第１記憶手段と一体に構成することもできる。第２記憶手段には、各被分析物の基準ピーク出現時間を記憶させるため、外部入力装置等を接続する。
【００２１】
第２記憶手段は、同定された被分析物ピークを評価するための各被分析物毎の基準ピーク出現時間を記憶する。基準ピーク出現時間としては、被分析物ピークが出現すると予想される時間を記憶すれば良い。該時間としては、前記したｔｓ、即ち被分析物のみを含む標準試料をクロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムから算出された、該被分析物のピーク出現時間を用いることが特に好ましい。  第２演算手段は、基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間との相関を示す値を求める手段であり、コンピュータ等を例示することができる。  相関を示す値としては、例えば相関係数の値、相関係数の値を二乗した値を例示することができる。例えばＸｉとＹｉの相関係数（ｒ）を二乗した値は、ｒ2＝（ｎ×ΣＸｉＹｉ−ΣＸｉ×ΣＹｉ）2／（ｎ×ΣＸｉ2−（ΣＸｉ）2）（ｎ×ΣＹｉ2−（ΣＹｉ）2）で表される。基準ピーク出現時間をＸｉ、同定された被分析物のピーク出現時間をＹｉとして前記式を適用すると、被分析物ピーク出現時間の間隔が基準ピーク出現時間の間隔と同一で、単にピークの出現時間が平行に移動した（早まったか、遅くなった）だけの場合や、クロマトグラムにおける時間軸が伸縮しただけの場合（即ち、被分析物のうち任意の２つの被分析物のピーク出現時間の間隔と、対応するこれらの基準ピークの出現時間の間隔の比が一定となっている場合）には相関が保持され、ｒ＝１となる。従って、例えばｒ＝１の場合には、仮にピーク出現時間にズレがあったとしても、ピーク出現時間が分析環境の変化によって生じたものであると考えることができ、第１演算手段におけるピーク同定結果を正しいと判定すること等ができる。この判定の基準については、本発明を適用しようとするクロマトグラフィーの種類（分離・展開手段の種類）や被分析物の種類、更には分析環境のうち変化し得る要因とその影響の様子等を総合的に勘案したり、実際の被分析物を含む標準試料と妨害ピークを出現させる夾雑物やゴーストピークの様子等を勘案して決定することができるが、通常はｒ＞０．９９９又はｒ2＞０．９９８とならない場合には第１演算手段における同定結果を誤りと判定することが例示できる。
【００２２】
また相関を示す値としては、例えば基準ピーク出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間の間の直線回帰式で表される直線と基準ピーク出現時間及び被分析物のピーク出現時間で示される点の間の距離を被分析物のピーク出現時間の誤差とし、誤差の絶対値の最大値、該誤差の絶対値の平均値、該誤差の標準偏差又は該誤差の分散値を用いることもできる。直線と点の距離は、縦方向（ｙ軸に平行）に測っても、横方向（ｘ軸に平行）に測っても、点から該直線に垂線をおろした方向に測っても良い。例えば直線回帰式をｙ＝Ａ＋Ｂｘ、基準ピーク出現時間をＸｉ、同定された被分析物のピーク出現時間をＹｉとすると、係数Ａ及びＢはＸｉ及びＹｉを用いて、Ｂ＝（ｎ×ΣＸｉＹｉ−ΣＸｉ×ΣＹｉ）／（ｎ×ΣＸｉ2−（ΣＸｉ）2）、Ａ＝（ΣＹｉ−Ｂ×ΣＸｉ）／ｎと表すことができる。
【００２３】
回帰直線と点（Ｘｉ、Ｙｉ）の距離を縦方向に測った場合、被分析物のピーク出現時間の誤差はＹｉ−（Ａ×Ｘｉ＋Ｂ）で表される。被分析物ピーク出現時間の間隔が基準ピーク出現時間の間隔と同一で、単にピークの出現時間が平行に移動した（早まったか、遅くなった）だけの場合や、クロマトグラムにおける時間軸が伸縮しただけの場合（即ち、被分析物のうち任意の２つの被分析物のピーク出現時間の間隔と、対応するこれらの基準ピークの出現時間の間隔の比が一定となっている場合）には相関が保持され、基準ピークの出現時間と同定された被分析物ピークの出現時間で示される点は回帰直線の上に並ぶため、ピーク出現時間の検出誤差を考慮しても、誤差の絶対値の最大値＜０．０２分程度となる。従って、例えば誤差の絶対値の最大値＞０．１分の場合には、第１演算手段におけるピーク同定結果が正しくないと判定すること等ができる。この判定の基準については、本発明を適用しようとするクロマトグラフィーの種類（分離・展開手段の種類）や被分析物の種類、更には分析環境のうち変化し得る要因とその影響の様子等を総合的に勘案したり、実際の被分析物を含む標準試料と妨害ピークを出現させる夾雑物やゴーストピークの様子等を勘案して決定することができるが、通常は誤差の絶対値の最大値＜０．１分とならない場合には第１演算手段における同定結果を誤りと判定することが例示できる。
【００２４】
ここで、例えば液体クロマトグラフィーにおいて溶出液の構成成分の濃度を連続的又はステップ式に切り替えて被分析物を溶出させるような場合、単に上記のような相関を示す値を用いて本発明を実施することは困難である。これは、被分析物の出現時間の変動が平行な移動や時間軸の伸縮にとどまらないという理由による。従って、かかる場合には得られたクロマトグラムを溶出液の構成成分の濃度の変化に応じて適当な時間で分割して本発明を実施することができる。また例えば、被分析物がイオン交換作用だけではなく、疎水吸着作用で液体クロマトグラフカラムと相互作用するような場合には、複数の被分析物を温度や溶出液の濃度、ｐＨ変化等に対して同じ挙動を示す群に分け、各群に含まれる被分析物に対して本発明を実施することができる。
【００２５】
第２演算手段には、前記のようにして算出される相関を示す値について、相関基準値を設定しておくこともできる。相関基準値としては、相関を示す値について許容し得る範囲をしきい値として設定しておくことが例示ができる。即ち、前記のようにして算出された相関を示す値とこの相関基準値を比較し、その結果を後述の表示手段に出力するように構成するのである。しきい値としては、前記した０．９９９や０．１を用いることが例示できる。
【００２６】
なお、既知の濃度の被分析物のみを含む標準試料の評価と被分析物以外の成分が含まれる可能性のある未知試料の評価においては、基準ピーク出現時間及び／又は相関基準値を変えても良い。例えば、標準試料の評価に用いる基準ピーク出現時間は予め別の装置で標準試料を測定して得られたピーク出現時間を用い、相関基準値を甘く設定することができる。また、未知試料の評価に用いる基準ピーク出現時間はバッチ毎に測定する標準試料の測定結果から得られたピーク出現時間を用い、相関基準値を厳しく設定することができる。
【００２７】
表示手段は、第２演算手段が算出した相関を示す値等を表示し又は印刷等する手段であるが、第１演算手段による各被分析物のピーク同定結果をも表示・印刷し得る手段であることが好ましい。算出した相関を示す値と相関基準値を比較するように第２演算手段を構成した場合には、比較結果や該結果に基づくクロマトグラムの同定の可否を表示するように構成することもできる。また例えば、第１記憶手段中に記憶されたクロマトグラムを表示・印刷したり、第２記憶手段中に記憶された基準ピーク出現時間をも表示・印刷できるように構成しても良い。
【００２８】
本発明の解析装置においては、これまでに説明した各手段に加え、例えば各被分析物のピークと同定され、かつ、本発明の装置によってピーク同定結果が正しい等と判定された場合に、各ピークについてベースラインを設定し、ピーク高さやピーク面積などを算出するための演算手段を追加装備したり、同定結果が誤っていると判定された場合や被分析物のピークを検出できなかった場合に警告を発生する手段等を追加装備することができる。更に、相関を示す値が同定結果の判定の境界領域にある値の場合には、ピーク高さやピーク面積などを算出する演算手段と警告を発生する手段を追加装備することも例示できる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために図面に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
図１は、本発明を液体クロマトグラフィー用のクロマトグラム解析装置に適用した一例を示すものである。図中、１は分離カラム、２は検出器を示し、送液ポンプや試料導入装置等のその他のクロマトグラフィー装置は省略した。図中、点線で囲った部分が本発明の解析装置であり、一台のコンピュータにより本発明の各手段を構成した。図中、３は第２記憶手段、４は第１記憶手段、５は第１演算手段、６は第２演算手段、８はプリンタを用いた表示手段をそれぞれ示す。第２記憶手段３はキーボード７からの入力を記憶し、第１記憶手段４は検出器２からの出力（クロマトグラム）を記憶し、第１演算手段５は第１記憶手段と連絡され、そして第２演算手段は第１演算手段、第２記憶手段及び表示手段と連絡されている。
【００３１】
図２は、以下の実施例で用いた液体クロマトグラム装置の構成の概略を示すものである。該装置は、溶離液ポンプ９ａ、９ｂ、試薬ポンプ１０ａ、１０ｂ、オートサンプラ１１、２本の前処理カラム１２及び１３と１本の分析カラム１４、リアクタ１５、そして蛍光検出器１６から構成され、さらに溶離液を切り替えるバルブや流路を切り替えるバルブを有するものである。図１に示した本発明の解析装置は検出器１６と連結される。
【００３２】
図３は液体クロマトグラフィーで得られたカテコールアミンの成分であるノルエピネフリン（ＮｏｒＥｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；ＮＥ）、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；Ｅ）及びドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ；ＤＡ）のクロマトグラムについて第１演算手段によりピーク検出を行った結果を示す結果である。分析に供した試料は、カテコールアミン成分であるＮＥ、Ｅ及びＤＡを各１ｐｇ／ｍｌ含む標準試料であり、これを室温（２４．６℃）条件下で測定したものである。ピーク出現時間が約１６分のピークがＮＥ、約１８分のピークがＥ、そして約２５分のピークがＤＡである。液体クロマトグラフィー装置としては、前処理カラムとして２本のカラム（第１の前処理カラム１２は直径４．６ｍｍ×７５ｍｍの逆相（エーテルゲル）カラム、第２の前処理カラム１３は直径３．０ｍｍ×６０ｍｍのイオン交換カラム）、分離カラム１４として逆相（ＯＤＳ）用カラム（直径４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を配置した装置を用いた。この装置では、ポンプ９ａで溶離液（リン酸緩衝液（ｐＨ７））で試料を第１の前処理用カラムに送液し（１．０ｍｌ／分）、第１の前処理用カラムに保持された成分に対して、電磁弁を切り替えることによりポンプ９ａで溶離液（硝酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの混合液）を送液して第２の前処理用カラムに導入し、そして第２の前処理用カラムに保持された成分に対して、ポンプ９ｂで溶離液（硝酸アンモニウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７））を分析カラムに送液して分離し（０．７ｍｌ／分）、分析カラムから溶出する成分に蛍光反応試薬を混合した後にリアクタ１５に導入した。リアクタで蛍光反応試薬であるＤＰＥ（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）と９０℃、３分間反応させて蛍光誘導体化した。蛍光反応試薬はポンプ１０ａとポンプ１０ｂ（各０．２５ｍｌ／分）を用いて送液した。蛍光誘導体化した各被分析物は、蛍光検出器を用いて励起波長３４０〜３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定し、クロマトグラムを得た。
【００３３】
図４は、前記同様の試料を２４．６℃条件下で液体クロマトグラフィーに供した場合の各被分析物のピーク出現時間をプロットした図である。横軸は２４．６℃での各被分析物のピーク出現時間（基準ピーク出現時間）であり、縦軸は２２．２℃及び２５．６℃の各被分析物のピーク出現時間である。ＮＥ、Ｅ及びＤＡに関するプロットは２２．２℃と２５．６℃でそれぞれ直線上に並んでおり、温度条件を変えて取得したクロマトグラムにおける各被分析物のピーク出現時間では良好な相関が保たれていることが分かる。
【００３４】
また、図には記載していないが、２４．６℃での各基準ピーク出現時間に対して２４．６℃での各ピーク出現時間をプロットすると、ｙ＝ｘの直線上に並ぶが、これら３本の直線は１５分付近で一点に交わる。この事実から、クロマトグラムを行う温度が変化すると１５分を基準にして時間軸が伸縮することが示された。  図５は、２２．２℃の温度条件下で、夾雑物であるレボノルデフリン（Ｌｅｖｏｎｏｒｄｅｆｒｉｎ；ＬＥ）を含む試料を前記同様に液体クロマトグラフィーに供した場合のピーク出現時間を図３におけるＥに代えてプロットした図である。ＬＥのピーク出現時間は約１７．７分であり、Ｅのピーク出現時間と近い。このため、従来方法ではクロマトグラム中のピーク検出後にＬＥのピークを検出し、かつ、ＬＥのピークをＥのピークと誤って同定してしまう可能性がある。
【００３５】
図６は、２２．２℃条件下でＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む試料を液体クロマトグラフィーに供した場合のクロマトグラムであり、図７は同一条件下でＮＥ、ＬＥ及びＤＡを含む試料を液体クロマトグラフィーに供した場合のクロマトグラムである。このように実際のクロマトグラムについても、ＬＥのピークはＥのピークに近い位置に出現することから、ピーク検出のやり方によってはＬＥのピークをＥのピークとして同定してしまう可能性を否定できない。
【００３６】
表１は、図６及び図７のクロマトグラムを本発明の解析装置で解析した結果を示すものである。本例では、２４．６℃条件下でＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む標準試料を液体クロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムから求めたこれら被分析物のピーク出現時間を基準ピーク出現時間として第２記憶手段に記憶してある。なお、図７のクロマトグラムの解析においては、ＬＥのピークをＥのピークと誤同定したとして本発明の装置による解析を行った。
【００３７】
【表１】
0003911867.tif 000002
【００３８】
表１から明らかなように、標準試料に含まれるＮＥ、Ｅ及びＤＡの各被分析物ピークの出現時間は液体クロマトグラフィーを実施する温度条件が変化することにより変動するが、各ピーク出現時間は良好な相関を保持しているため、本発明の第２演算手段により算出される「相関を示す値」のうち相関係数等は１．００００となり、誤差の絶対値の最大値等は非常に小さい値となる。これに対してＬＥのピークをＥのピークと誤同定したと仮定して本発明の解析装置により解析した場合には、第２演算手段により算出される「相関を示す値」のうち相関係数等は０．９９９未満となり、誤差の絶対値の最大値等は大きい値となる。この結果、カテコールアミンの分析においてＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク同定結果を判定するにあたっては、相関係数等を「相関を示す値」とする場合には該値として０．９９９未満の値が第２演算手段で算出されたとき、そして誤差の絶対値の最大値等を「相関を示す値」とする場合には該値として０．１分以上の値が第２演算手段で算出された時に、第１演算手段による同定結果が誤りであることを知ることができる。
【００３９】
以上、本例ではカテコールアミン分析におけるＮＥ、Ｅ及びＤＡを被分析物とし、ＬＥを妨害ピークを発生する夾雑物として本発明における相関を示す値と誤同定を判定するための値を具体的に説明したが、被分析物の具体的な種別や予想される夾雑物の種別と実際のクロマトグラムから、前記のようなしきい値的な数値を勘案することが可能である。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の装置により、内的・外的要因によりピーク出現時間が変化することがあっても、クロマトグラム中の測定されるべき被分析物に由来するピーク近傍に夾雑物に由来する妨害ピークやゴーストピークが出現する可能性がある場合に、従来のピーク検出方法によって検出されたピークが被分析物に由来するピークか否かを判定することが可能となる。即ち、従来の方法によって被分析物ピークであると同定されたピークについて解析を行い、その同定結果が正しいか否かを判定することが可能となるのである。
【００４１】
この結果、夾雑物の妨害ピークやゴーストピークを被分析物のピークといったん同定してしまった場合にも、これら誤った同定に基づいて妨害ピーク等を被分析物のピークとしたままピークの解析を行ってしまうという可能性を排除できるようになる。このことは、多くのクロマトグラフィーが微量の被分析物の定量等に用いられていることや、時にはクロマトグラフィーが臨床的意義を有する微量の被分析物（例えば血液中に存在する蛋白質等）の定量に用いられ、その結果が患者の治療等に反映される臨床診断の分野においては重要な意義を有する。
【００４２】
本発明は、温度や溶媒組成を一定にして分析する場合に好ましく適用することができる。温度や溶媒組成を連続的に、又は、段階的に変化させながら分析する場合には、クロマトグラムを時間を基準にして複数のクロマトグラムに分割し、分割したクロマトグラムに対して本発明を適用することができる。また、被分析物がイオン交換作用だけでなく、疎水吸着作用で液体クロマトグラムカラムと相互作用するような場合には、複数の被分析物を同じ挙動を示す群に分け、各々の群に含まれる被分析物に対して本発明を適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の解析装置を説明するための模式図である。
【図２】図２は、実施例で用いたカテコールアミン分析用の液体クロマトグラフィー装置の概要を示す図である。
【図３】図３は、カテコールアミンの成分であるＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む標準試料を液体クロマトグラフィー装置に供して得たクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、ＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む試料を各種温度条件下で液体クロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムについてピーク検出を行い、検出された各ピークのピーク出現時間をプロットした図である。
【図５】図５は、夾雑物であるＬＥを含む試料を前記同様に液体クロマトグラフィーに供した場合のピーク出現時間を図３におけるＥに代えてプロットした図である。
【図６】図６は、２２．２℃条件下でＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む試料を液体クロマトグラフィーに供した場合のクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７は、図５のクロマトグラムを得たのと同一条件下でＮＥ、ＬＥ及びＤＡを含む試料を液体クロマトグラフィーに供した場合のクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
１  分離カラム、２  検出器、３  第１記憶手段、４  第２記憶手段、５  第１演算手段、６  第２演算手段、７  入力手段、８  表示手段、９ａ、９ｂ  溶離液ポンプ、１０ａ、１０ｂ  試薬ポンプ、１１  オ−トサンプラ、１２、１３前処理カラム、１４  分析カラム、１５  リアクタ、１６  検出器
【図１】
0003911867.tif 000003
【図２】
0003911867.tif 000004
【図３】
0003911867.tif 000005
【図４】
0003911867.tif 000006
【図５】
0003911867.tif 000007
【図６】
0003911867.tif 000008
【図７】
0003911867.tif 000009