(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を制限酵素を用いて切断し、核酸断片を得る工程と、
前記核酸断片の３'末端に既知塩基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、
前記核酸断片の３'末端から５'末端方向へ１塩基、２塩基もしくは３塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１の選択用塩基配列領域と、前記第１の選択用塩基配列領域の５'末端側に続き、前記オリゴマーと相補的な塩基配列を有する既知塩基配列領域と、前記既知塩基配列領域の５'末端側に続き、任意の塩基配列を有する第２の選択用塩基配列領域とを具備する第１のプライマ―と、前記第２の選択用塩基配列領域と同じ塩基配列を有する第２のプライマーとを用い、前記オリゴマーが付加された前記核酸断片をＰＣＲによって増幅する工程と、
前記ＰＣＲによる増幅産物を検出する工程とを有し、前記第２の選択用塩基配列領域の塩基配列は、第１の選択用塩基配列領域の塩基配列の種類に応じて異なることを特徴とする核酸断片分析方法。
【請求項２】
前記増幅する工程は、前記第１のプライマーを用いる第１の増幅工程と、前記第２のプライマーを用い、前記第１の増幅工程での増幅産物を増幅する第２の増幅工程とを有することを特徴とする請求項１に記載の核酸断片分析方法。
【請求項３】
前記増幅する工程では、蛍光標識された前記第２のプライマーを用い、前記検出する工程では、前記蛍光標識を検出することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の核酸断片分析方法。
【請求項４】
前記増幅する工程では、前記第１の増幅工程におけるアニーリング温度の値が、前記第２の増幅工程におけるアニーリング温度の値以上であることを特徴とする請求項２に記載の核酸断片分析方法。
【請求項５】
既知塩基配列を有する既知塩基配列領域と、
前記既知塩基配列領域の３'末端側と５'末端側とに各々位置する第１の選択用塩基配列領域と第２の選択用塩基配列領域とを具備する第１のプライマーと、
前記第２の選択用塩基配列領域と同じ塩基配列を有し、かつ蛍光標識された第２のプライマーとを有し、前記第２の選択用塩基配列領域の塩基配列は、第１の選択用塩基配列領域の塩基配列の種類に応じて異なることを特徴とする核酸断片分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸増幅法、混合ＤＮＡ断片分析法、発現している遺伝子全てを一度に調べる遺伝子発現パターンの分析、種々のＤＮＡ又はＲＮＡ混合物に含まれる各断片の存在比の分析に関し、特に蛍光標識を用いた核酸断片分析方法および分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子又はＤＮＡの塩基配列比較を行なうには、遺伝子やＤＮＡの塩基配列を決定して比較すればよいが、長いＤＮＡや多数のＤＮＡ断片の混合物からなる試料では塩基配列決定が困難である。そのため、長いＤＮＡを調べる場合には、ＤＮＡを断片化し生成した断片のゲル電気泳動パターンを調べることが行なわれる。
【０００３】
また、遺伝子の機能を調べるには、遺伝子に関連したｍＲＮＡの量的変化と、外部から加えた刺激（温度変化、圧力変化等の物理的刺激、薬剤等による化学的刺激）との相関を調べることが行なわれている。遺伝子機能の分析は人手と時間を要するため、多数の遺伝子について調べることはできなかった。最近、種々計測法、及び装置の発展に伴い、非常に多数の遺伝子発現の様子がモニター可能となってきた。
【０００４】
遺伝子発現の測定法の例として、ゲル電気泳動に基づくスキャニング法と呼ばれる方法がある。スキャニング法には、ＦＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５１、２３１−２３６、１９９４）や末端識別プライマーを用いた方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６、２４、２６１６−２６１７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、１９９６、Ｎｏ．３５、２５７−２５８）が含まれる。
【０００５】
スキャニング法は、何れも複数のＤＮＡ断片に共通に作用する複数のプライマーを用いて試料ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない（多くの場合、蛍光標識プライマーを用いる）、得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンから遺伝子の発現情報を得る方法である。
【０００６】
スキャニング法では、遺伝子に対応した特異なプローブがなくても発現の様子を検査できるため、塩基配列未知の遺伝子の発現情報が得られる利点がある。例えば、末端識別プライマーを用いる方法では、２本鎖ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片末端の切断部に既知塩基配列を持つオリゴマーを導入する。ｃＤＮＡの３’末端には通常ポリＡ鎖が存在しているが、ポリＡ鎖と導入されたオリゴマーとで挟まれる塩基配列は各々のｃＤＮＡに特異的であると考えられる。
【０００７】
従って、此の部分のＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡを代表する又は識別する部分として計測する。生体内では数千から数万種の遺伝子が発現しているため、ｃＤＮＡを代表する部分のＤＮＡ断片は非常に多く、一つの電気泳動レーンでは区別して計測できない。
【０００８】
このため、全ての上記の代表断片を複数のグループに分け、一つのグループ内のＤＮＡ断片数を、充分分離計測できる程度に減らしてからゲル電気泳動を行なう。これには、ＰＣＲプライマーの３’末端に２塩基からなる選択用塩基配列を付加したプライマーを用いる。断片の末端２塩基が選択用塩基配列に相補な断片だけが増幅される。２塩基の選択用塩基を持つプライマーセット２組から各々１つのプライマーを選択し、任意の２つのプライマーの組み合わせからなるグループを構成する。
【０００９】
各グループのプライマーを用いてＰＣＲを行ない、増幅産物を電気泳動で分析する。各グループの電気泳動パターンに現れるＤＮＡ断片を合わせると、全ての発現している遺伝子に関する情報が得られる。その結果、発現している各ｃＤＮＡの種類と量を知ることができる。計測する場合にはオリゴｄＴプライマーと導入されたオリゴマーに相補的なプライマーのうち少なくとも一方のプライマーを蛍光標識し、蛍光標識されたプライマーを用いてＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、ＤＮＡの断片数を装置の検出感度以上に増幅した後、蛍光式ＤＮＡシーケンサー等の装置を用いて計測する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
電気泳動に基づく従来技術に於ける遺伝子発現モニター方法について説明したが、実用面では種々の問題がある。電気泳動に基づく方法では、ＰＣＲ増幅に用いたプライマーから増幅されるべき断片以外の断片が増幅するという問題がある。これはプライマーの３’末端に付加した２塩基の選択用塩基配列の選択性が完全ではないことが原因で生じる。即ち、プライマーの選択用塩基配列とＤＮＡ断片の末端の２塩基が相補的でない場合にも、僅かながら相補鎖合成反応が進行するためである。このため、本来ＤＮＡ断片が観測されるべき位置以外にも増幅断片が検出され、擬陽性シグナルとなる。擬陽性シグナルの存在は、遺伝子発現モニターの際に、発現していない遺伝子が発現しているという誤った解釈を生む原因となる。
【００１１】
本発明の目的は、擬陽性シグナルを減少させ遺伝子同定精度を向上させた、電気泳動に基づく遺伝子発現モニター方法を可能とする混合ＤＮＡ断片分析法を提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明では、ＰＣＲ増幅に用いる選択プライマーを工夫し、選択プライマーの３’末端の第１の選択用塩基配列（１塩基から３塩基の範囲の塩基からなる）が相補的でない時には、相補鎖合成反応が進行しないようにする。具体的には、選択プライマーの５’末端側に１０〜２０塩基程度の第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）を持つ第１プライマーと、第１プライマーの第２の選択用塩基配列だけで構成された第２プライマーを、同時又は順次用いてＰＣＲを行なう。第１プライマーの第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）は、第１の選択用塩基配列に１対１対応した塩基配列にしておく。
【００１３】
即ち、第１の選択用塩基配列が異なると第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）も異ならせておく。第２プライマーの塩基配列は第１プライマーの第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）と相同であるため、第１プライマーの第１の選択用塩基配列の種類と同種類の第２プライマーを用意する。例えば、第１プライマーの選択用塩基が１塩基で、第１の選択用塩基配列が４種類であれば、第２プライマーも４種類用意する。第１プライマーの選択用塩基が２塩基で、選択用塩基配列が１６種類であれば、第２プライマーも１６種類用意する。ＰＣＲには、第１プライマーのうちの１種とその第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）と相同な塩基配列を持つ第２プライマーを一連のセットとして用いる。
【００１４】
先ず、第１プライマーを用いて、２０サイクル以下の第１段階目のＰＣＲを行なう。第１段階目のＰＣＲで得られた増幅産物の一部の塩基配列（第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）に相補な塩基配列部分）を鋳型として、第１段階目のＰＣＲで使用した第１プライマーに対応する第２プライマーを用いて、２０〜３０サイクルの第２段階目のＰＣＲを行なう。第１段階目のＰＣＲで第１プライマーによって相補鎖合成された第１プライマーの第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）に相補な塩基配列に、第２プライマーがハイブリダイズしてＤＮＡ断片が増幅される。
【００１５】
しかし、第１段階目のＰＣＲで第１プライマーによって相補鎖合成されなかった場合には、第２プライマーはハイブリダイズできずにＤＮＡ断片は増幅されない。即ち、第１プライマーによる相補鎖合成反応が進行した場合のみ、ＤＮＡ断片が増幅される。２０サイクル以下の第１段階目のＰＣＲでは選択が正しく進行するようにＰＣＲ条件を設定できるため、第１プライマーによる相補鎖合成反応の選択性を向上できる。第１段階目のＰＣＲでは、第１プライマーの第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）に対しては相補鎖は合成されない。
【００１６】
その後、第２プライマーを用いて第２段階目のＰＣＲを行なうと、第１段階目のＰＣＲで正しく選択されたＤＮＡ断片だけが増幅されるため、塩基の誤認識による増幅産物の生成を抑えることができ、擬陽性シグナルの発生を減少できる。
【００１７】
また、２段階からなるＰＣＲを行なうのではなく、少量の第１プライマーと過剰量の第２プライマーとを同時に使用してＰＣＲを行ってもよい。この場合も第１プライマーが消費される迄の最初の数サイクルのＰＣＲ条件を厳しくして、第１プライマーの塩基誤認識を防ぎ、選択性を向上させて、擬陽性シグナルの発生を減少できる。
【００１８】
本発明の、制限酵素（クラスＩＩ）で切断された核酸断片の混合物の分析法は、核酸断片の３’末端に既知塩基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、オリゴマーの塩基配列に相補な塩基配列に続く制限酵素の認識配列の一部又は全てに相補な塩基配列と、制限酵素の認識配列の一部又は全てに相補な塩基配列の３’末端に１塩基から３塩基の範囲の塩基からなる第１の選択用塩基配列と、オリゴマーの塩基配列に相補な塩基配列の５’末端に選択用塩基配列に対応して異なる第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）とを有する第１のプライマーの２種類と、第２の選択用塩基配列と同じ塩基配列を有する第２のプライマーの２種類とを用いて、核酸断片を鋳型としＰＣＲ増幅を行なう工程とを有することに特徴を有し、ＰＣＲ増幅を行なう工程は、第１のプライマーを用いる第１の増幅工程と、第２のプライマーを用いて、第１の増幅工程で増幅された核酸断片を増幅する第２の増幅工程とを有すること、第２のプライマーは蛍光標識されており、第２の増幅工程で増幅された核酸断片を電気泳動すること、第１のプライマーの第１の選択用塩基配列の５’末端側の塩基配列の一部を塩基をヌクレオチドアナログ、又は該一部の塩基と異なる塩基で置換したこと、上記オリゴマーの３’末端の塩基が、ＤＮＡポリメラーゼにより伸張しないように修飾されていること、第１の増幅工程の繰り返し数が２０回以下であり、第１の増幅工程におけるアニーリング温度が、第２の増幅工程におけるアニーリング温度以上の温度であることに特徴がある。上記の分析法に於いて、上記の第１のプライマーの２種類に代えて第１のプライマーからなる群、上記の第２のプライマーの２種類に代えて第２のプライマーからなる群、をそれぞれ使用する構成としても良い。
【００１９】
本発明の核酸増幅法は、核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定断片を、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の少なくとも１塩基を除いて特定塩基配列に相補な塩基配列を有し、特定塩基配列の５’末端側に特定塩基配列に対応して各々異なる選択用塩基配列（アンカー塩基配列）を有する第１のプライマーと、選択用塩基配列と同じ塩基配列を有する第２のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いて選択的にＰＣＲ増幅することに特徴があり、ＰＣＲ増幅を行なう工程は、第１のプライマーを用いる第１の増幅工程と、第２のプライマーを用いて、第１の増幅工程で増幅された核酸断片を増幅する第２の増幅工程とを有すること、上記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤＮＡを制限酵素（クラスＩＩ）により断片化して得た断片であること、第２のプライマーは、蛍光標識されていることに特徴がある。
【００２０】
更に、本発明の核酸増幅法は、核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定断片を、特定塩基配列と相補な塩基配列の、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の塩基Ａ又は塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換した、特定塩基配列と実質的に相補な塩基配列を有し、特定塩基配列の５’末端側に特定塩基配列に対応して各々異なる選択用塩基配列（アンカー塩基配列）を有する第１のプライマーと、選択用塩基配列と同じ塩基配列を有する第２のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いて選択的にＰＣＲ増幅することに特徴がある。
【００２１】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施例による発現遺伝子モニターの概念をフローチャートで示す図である。試料ｃＤＮＡとして、ヒト全血から抽出したＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ヒト全血にクエン酸ナトリウムを作用させて赤血球を破壊した後、白血球より小さなポアサイズを持つフィルターを用いて、白血球とその他の成分を分離し、チオシアン酸グアニジンを作用させて白血球を破壊してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡに変換し試料ｃＤＮＡとした。
【００２２】
図１に示すように、２本鎖の試料ｃＤＮＡ１（種々ｃＤＮＡ混合物）を制限酵素（クラスＩＩ）により切断して、２本鎖ｃＤＮＡ断片２を得る。ｃＤＮＡ断片２の切断部の３’末端に、ライゲーション反応により塩基配列が既知である既知塩基配列オリゴマー１０を導入し、３’末端に既知塩基配列オリゴマー１０の導入された２本鎖ｃＤＮＡ断片３を得る。
【００２３】
次に、３’末端に既知塩基配列オリゴマー１０を導入したｃＤＮＡ断片３を鋳型として、第１プライマー１４を用いて第１段階目のＰＣＲを行なう。第１プライマー１４は、５’末端側に位置する第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１と、既知塩基配列オリゴマー１０と相補な塩基配列の共通塩基配列１２と、２塩基からなる第１の選択用塩基配列１３からなる。第１の選択用塩基配列１３は全ての塩基の組み合わせの塩基配列から構成されており、第１プライマー１４は、４2＝１６種類からなるプライマーのセット（第１プライマーセット）となる。第１段階目のＰＣＲは、１６種の第１プライマーのセットの中から２種類のプライマーを選んで行なう。
【００２４】
ｃＤＮＡ断片３の＋鎖４に対して、第１プライマーセットから選ばれたプライマーがハイブリダイズして相補鎖伸長が起こる。ｃＤＮＡ断片３の−鎖５に対しても、同様に第１プライマーセットから選ばれたプライマーがハイブリダイズして相補鎖伸長が起こる。ＰＣＲの結果、ｃＤＮＡ断片２の５’末端側に第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１と、既知塩基配列オリゴマー１０と相補な塩基配列１２を持ち、且つ、３’末端側に既知塩基配列オリゴマー１０と、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１に相補な塩基配列１７を持つＰＣＲ増幅産物６が生成する。
【００２５】
第１段階目のＰＣＲ増幅産物の一部の塩基配列を鋳型（第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）に相補な塩基配列部分１７）として、第２段階目のＰＣＲを行なう。第２段階目のＰＣＲには蛍光体１６で標識された第２プライマー１５を用いる。第２プライマー１５は、第１段階目のＰＣＲで用いた第１プライマー１４の第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）と相同な塩基配列であるため、第２プライマー１５も、第１プライマー１４と同様に１６種類からなるセット（第２プライマーセット）となる。
【００２６】
１６種からなる第２プライマー１５のセットの中から、第１段階目のＰＣＲで用いた第１プライマー１４の第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１と同じ塩基配列を持つ第２プライマー１５を選んでＰＣＲを行なう。第１段階目のＰＣＲ増幅産物６の＋鎖７に対して、第２プライマーセットから選ばれたプライマーが第１段階目のＰＣＲで生成した第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１に相補な塩基配列１７にハイブリダイズして相補鎖伸長が起こる。第１段階目のＰＣＲ増幅産物６の−鎖８に対しても、同様に第２プライマーセットから選ばれたプライマーが第１段階目のＰＣＲで生成した第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１に相補な塩基配列１７にハイブリダイズして相補鎖伸長が起こる。ＰＣＲの結果、ｃＤＮＡ断片２の５’末端側に第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１と、既知塩基配列オリゴマー１０と相補な塩基配列１２を持ち、且つ、３’末端側に既知塩基配列オリゴマー１０と、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１に相補な塩基配列１７を持つＰＣＲ増幅産物９が生成する。ＰＣＲ増幅産物９は、電気泳動分離された後に分析される。第２プライマー１５は蛍光体１６で標識されているので、ＰＣＲ増幅産物９も蛍光標識される。従って、ＰＣＲ増幅産物９の分析は、蛍光検出型の電気泳動装置等を用いて行なう。測定の結果得られるシグナルは、試料ｃＤＮＡを制限酵素切断して得たｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅産物に基づく。このため、増幅ＤＮＡ断片の断片長とその蛍光強度を測定して、種々ｍＲＮＡの種類と量を知ることができる。
【００２７】
図２は、相補鎖合成により、３’、５’の両末端に第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）を持つＤＮＡ断片が生じる過程を説明する図である。プライマー２０は、５’末端側に第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１を持ち、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１に続いてＤＮＡ断片３１（３’末端がビオチン化されたオリゴマー３０が導入された２本鎖ＤＮＡ断片）の３’末端に導入された既知の塩基配列を持つオリゴマー３０に相補な塩基配列（共通塩基配列２２）を持ち、３’末端側に２塩基からなる第１の選択用塩基配列２３を持っている。ＤＮＡ断片３１は、＋鎖３２と−鎖３３からなる２本鎖である。ビオチン標識２５が、ＤＮＡ断片３１の３’末端に導入されたオリゴマー３０の３’末端の塩基に結合されている。このため、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１に対してオリゴマー３０の相補鎖合成反応は進行しない。プライマー２０と３’末端にオリゴマー３０が導入されたＤＮＡ断片３１の＋鎖３２が２本鎖を形成した際に、第１の選択用塩基配列２３がミスマッチなくハイブリダイズした場合のみ、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー２０の相補鎖合成反応が進行する。同様に、プライマー２０と３’末端にオリゴマー３０が導入されたＤＮＡ断片３１の−鎖３３が２本鎖を形成した際に、第１の選択用塩基配列２３がミスマッチなくハイブリダイズした場合のみ、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー２０の相補鎖合成反応が進行する。その結果、＋鎖３２に対して相補鎖合成反応産物３４が形成され、−鎖３３に対して相補鎖合成反応産物３５が形成される。ＰＣＲ中に、相補鎖合成反応産物３４と相補鎖合成反応産物３５との２本鎖が形成され、プライマー２０の共通塩基配列２２（オリゴマー３０に相補な塩基配列を持つ）に対して、相補鎖合成反応が進行して共通塩基配列２２に相補な塩基配列４０が形成され、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１に対して、相補鎖合成反応が進行して第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１に相補な塩基配列４１が形成される。
【００２８】
その後、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１と同じ塩基配列２７を持ち蛍光体２８で標識されたプライマー２６を用いて、第２段階目の相補鎖合成反応を行なう。第２段階目の相補鎖合成反応では、プライマー２６は、塩基配列４１にハイブリダイズし反応が進行する。第１段階目の反応に於いて、ＤＮＡ断片の３’、５’の両末端で相補鎖合成反応が進行しなかった場合には、塩基配列４１が合成されない。このためプライマー２６はＤＮＡ断片にハイブリダイズできず、第２段階目の反応も進行しなくなる。従って、第１段階目の反応が進行したＤＮＡ断片のみで第２段階目の相補鎖合成反応が進行する。第１の選択用塩基配列２３と第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１とが１対１に対応しているため、合成された塩基配列４１と第１の選択用塩基配列２３とが１対１に対応している。従って、第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１と同じ塩基配列からなるプライマー２６を用いて再度ＰＣＲを行なうと、第１の選択用塩基配列２３を持つ断片のみが増幅する。
【００２９】
第１段階目のＰＣＲでは、プライマー２０の共通塩基配列２２は、全てのＤＮＡ断片に共通なオリゴマー３０にハイブリダイズする。このため、サイクル毎に擬陽性反応が起こる可能性が存在する。擬陽性反応は、選択用塩基配列の塩基の誤認識に起因しているため、プライマーとＤＮＡ断片が２本鎖を形成する際の温度を上げる等して選択用塩基の誤認識を減少させれば、擬陽性反応を低減できる。従来の１段階のＰＣＲで反応条件を厳しくすると、増幅効率が減少するため検出が困難であった。
【００３０】
しかし、本実施例のように、プライマーを少なくとも２セット用意して、２段階からなるＰＣＲを行えば、第１段階目の反応で条件を厳しく設定し、第２段階目の反応では、増幅効率が減少しないような条件に戻すことができる。また、第２段階目のＰＣＲで、プライマー２６は第１段階目の反応に於ける増幅産物にのみハイブリダイズする。これは第１段階目の選択用塩基配列に対応するプライマーだけがハイブリダイズできるように、プライマー２６の塩基配列が、選択用塩基配列と１対１対応するように設計しているためである。
【００３１】
第１段階目の反応で用いる選択用塩基配列が異なる場合は、第２段階目の反応に用いるプライマー２６の塩基配列も全く異なるため、第２段階目の反応では、塩基の誤認識による擬陽性反応は起こらない。また、プライマー２６を構成する塩基配列全てが選択に関わるため選択精度は向上する。このようにして、第１段階目での塩基の誤認識を防ぐため反応条件を厳しく設定し、第２段階目に於いて第１段階目で反応が進行したＤＮＡ断片についてのみ増幅させると同時に、選択に関わる塩基数を増加させて擬陽性シグナルを減少できる。
【００３２】
図３に得られる結果の一部を示す。本実施例ではヒト白血球中に発現している遺伝子の解析を行った。図３（ａ）は、従来のプライマーを用いたＰＣＲ産物を泳動した電気泳動像の一部、図３（ｂ）は、本発明によるプライマーを用いたＰＣＲ産物を泳動した電気泳動像の一部である。５２は、図３（ａ）に示す電気泳動像に於けるレーン、５３は、図３（ｂ）に示す電気泳動像に於けるレーンを各々示す。図３（ｃ）は図３（ａ）のトレース、図３（ｄ）は図３（ｂ）のトレースである。レーン５２、５３に於けるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは各々異なるプライマーの組み合わせでＰＣＲを行ない、増幅産物を各々のレーンにローディングして分析したことを示す。図３（ａ）に示す各々のレーン上に検出されるＤＮＡバンド５５、５６、５７、５８は、各レーンのプライマーの組み合わせで増幅されたｃＤＮＡ断片を示している。本発明によるプライマーを用いて行った電気泳動像（図３（ｂ））には、ＤＮＡバンド５５、５６、５７、５８の各々に対応するＤＮＡバンド６０、６１、６２、６３が検出されており、これら６０、６１、６２、６３のＤＮＡバンドは、ヒト白血球中に発現している遺伝子由来のｃＤＮＡ断片が増幅されてＤＮＡバンドとして検出されていることが分かる。
【００３３】
図３（ａ）に示す電気泳動像のレーンＢには、ＤＮＡバンド５９も検出されている。ところが本発明によるプライマーを用いて行った図３（ｂ）に示す電気泳動像には、５９に相当するＤＮＡバンドは検出されていない。この結果から、ＤＮＡバンド５９が擬陽性シグナルであることが分かる。この擬陽性シグナルの強度は、本発明によるプライマーを用いて２段階からなるＰＣＲを行なうことにより減少できる。
【００３４】
図３（ｅ）に示す７０は、図３（ａ）に示す電気泳動像のレーンＢのエレクトロフェログラムであり、２つのピーク７２と７３は各々、ＤＮＡバンド５９と５６に由来するピークである。図３（ｆ）に示す７１は、図３（ｂ）に示す電気泳動像のレーンＢのエレクトロフェログラムであり、ピーク７４はＤＮＡバンド６１に由来するピークである。エレクトロフェログラム７０と７１を比較すると、従来のプライマーを用いた実験の結果であるエレクトロフェログラム７０には、擬陽性シグナル７２のピーク強度が大で検出されるが、本発明によるプライマーを用いた実験の結果であるエレクトロフェログラム７１には、擬陽性シグナルは殆ど検出されていないことが分かる。以上説明したように、本発明によるプライマーを用いて、ＰＣＲに於ける擬陽性シグナルを大幅に減少できる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡ断片混合物の中から特定の末端塩基配列を有するＤＮＡ断片だけを増幅する際に、ＤＮＡ断片認識能を決定する塩基配列を２塩基からなる選択用塩基配列だけでなく、２０塩基程度の第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）に委ねることが可能になる。その結果、プライマーの選択性を向上ができ、ＰＣＲに於ける擬陽性シグナルを大幅に減少できる。また、電気泳動に基づく遺伝子発現モニター方法での遺伝子同定精度を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の発現遺伝子モニターの手順を示す図。
【図２】本発明の実施例に於いて、相補鎖合成により両末端に第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）を持つＤＮＡ断片が生じる過程を説明する図。
【図３】本発明の実施例のプライマーを用いて２段階のＰＣＲを行って擬陽性シグナルの減少を実現した例を示す図。
【符号の説明】
１…試料ｃＤＮＡ、２…２本鎖ｃＤＮＡ断片、３…３’末端に既知の塩基配列を持つオリゴマーを導入した２本鎖ｃＤＮＡ断片、４…２本鎖ｃＤＮＡ断片３の＋鎖、５…２本鎖ｃＤＮＡ断片３の−鎖、６…ＰＣＲ増幅産物、７…ＰＣＲ増幅産物の＋鎖、８…ＰＣＲ増幅産物の−鎖、９…蛍光標識されたＰＣＲ増幅産物、１０…既知塩基配列オリゴマー、１１…第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）、１２…オリゴマー１０に相補的な塩基配列、１３…２塩基からなる第１の選択用塩基配列、１４…選択プライマー、１５…第２プライマー、１６…蛍光体、１７…第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）１１に相補な塩基配列、２０…選択プライマー、２１…第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）、２２…共通塩基配列、２３…第１の選択用塩基配列、２５…ビオチン、２６…蛍光体で標識されたプライマー、２７…第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１と同じ塩基配列、２８…蛍光体、３０…共通塩基配列２２に相補な塩基配列を持ち、３’末端にビオチン修飾されたオリゴマー、３１…３’末端がビオチン化されたオリゴマー３０が導入された２本鎖ＤＮＡ断片、３２…２本鎖ＤＮＡ断片の＋鎖、３３…２本鎖ＤＮＡ断片の−鎖、３４…相補鎖合成反応により形成されたＤＮＡ鎖、３５…相補鎖合成反応により形成されたＤＮＡ鎖、４０…共通塩基配列２２に相補な塩基配列、４１…第２の選択用塩基配列（アンカー塩基配列）２１に相補な塩基配列、５２…レーン、５３…レーン、５５…ＤＮＡバンド、５６…ＤＮＡバンド、５７…ＤＮＡバンド、５８…ＤＮＡバンド、５９…ＤＮＡバンド、６０…ＤＮＡバンド、６１…ＤＮＡバンド、６２…ＤＮＡバンド、６３…ＤＮＡバンド、７０…従来のプライマーを用いたＰＣＲ産物を泳動した電気泳動像のレーンＢのエレクトロフェログラム、７１…本発明によるプライマーを用いたＰＣＲ産物を泳動した電気泳動像のレーンＢのエレクトロフェログラム、７２…ＤＮＡバンド５９に由来するピーク、７３…ＤＮＡバンド５６に由来するピーク、７４…ＤＮＡバンド６１に由来するピーク。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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