(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
YPS1遺伝子及びYPS3遺伝子の欠失変異を酵母宿主に付し；
ヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする遺伝子を含む発現ベクターで酵母宿主を形質転換し；かつ
形質転換酵母宿主を適当な培地で培養する
工程からなる、酵母宿主からの組換えヒト副甲状腺ホルモン(hPTH)の生産方法。
【請求項２】
欠失変異が、酵母選択マーカーを用いて、YPS1遺伝子及びYPS3遺伝子を欠失させて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母宿主が、YPS1遺伝子、YPS2遺伝子及びYPS3遺伝子の全てを欠失している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで、YPS1遺伝子及びYPS3遺伝子を欠失している酵母変異体を形質転換して作製される、酵母株。
【請求項５】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH(受託番号KCTC 0815BP)であり、発現ベクターがpG10-hPTH1である請求項４に記載の酵母株。
【請求項６】
ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで、YPS1遺伝子、YPS2遺伝子及びYPS3遺伝子を欠失している酵母変異体を形質転換して作製される、酵母株。
【請求項７】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエSLH18/pG10-hPTH (KCTC 0816BP)であり、発現ベクターがpG10-hPTH1である請求項６に記載の酵母株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
1.  発明の分野
本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone)(以降、「hPTH」とする)の製造に関する。より詳細には、この発明は、アスパラギン酸プロテアーゼのYPS1、YPS2及びYPS3のヤップシン(yapsin)ファミリーの少なくとも１つにおいて遺伝学的に崩壊(disrupt)し、hPTH遺伝子を有する発現ベクターで形質転換される、サッカロミセス・セレビシエ(Sacharomyces cerevisiae)変異株のホルモン産生における使用に関する。
【０００２】
2.  従来技術の説明
hPTHは、副甲状腺によって生産される、84アミノ酸残基からなるペプチドである。hPTHは、カルシウムの代謝及び骨形成を促進する生理学的機能を有するので、腎臓と骨でカルシウムの恒常性を維持する。米国と欧州では、エストロゲン又はカルシトニンが骨粗鬆症の治療として広く使用されているが、骨吸収を妨げることが認められている。したがって、世界中の第一流の製薬会社が、hPTHの骨形成促進能力を利用することによって骨粗鬆症の治療剤を開発するため、徹底的かつ広範囲にわたってhPTHを研究している。特に、現代社会は高齢化社会になりつつあるので、骨粗鬆症の予防と治療に多くの重大な関心が払われている。上記の理由から、活発な研究は、今では、従来の骨粗鬆症の治療に代わる治療となることが期待されるhPTHを大量生産するためのバイオテクノロジーの手法を開発することに向けられている。
【０００３】
例えば、原核細菌は比較的高い発現効率を示すので、宿主細胞として大腸菌を用いることによる組換えhPTHの大量生産方法の開発が、種々試みられている。しかし、大腸菌から生産される組換えタンパク質を再生し、精製することは、非常に難しい。これに対し、単細胞真核細胞である酵母は、遺伝子転写及び翻訳系ならびにそのタンパク質-分泌系において高等種に極めて近いので、適切に折りたたまれ、その結果、活性なタンパク質を発現し、分泌する利点を有する。したがって、酵母は、細胞外タンパク質をほとんど分泌せず、外因性タンパク質を回収し、精製しやすい点で、対象タンパク質の生産用宿主として有用である。さらに、酵母サッカロミセス・セレビシエは、身体に病原性でなく、内毒素を生産しない(一般に安全とされている)GRAS微生物である。医療用の組換えhPTHの生産体として極めて有用であるとの期待から、サッカロミセス・セレビシエは、hPTH発現系の開発で研究されている。組換えhPTHの生産用発現宿主としてのその種々の利点にもかかわらず、サッカロミセス・セレビシエは、そのような宿主として工業的には利用されていない。というのは、細胞外に分泌された組換えhPTHは、酵母自体の内因性タンパク質分解酵素によって分解され、完全なhPTH分子はごく少量しか回収できないからである(Gabrielsenら、Gene 90,255(1990))。
【０００４】
最近の10年において、組換えhPTHのタンパク質分解の問題を解決するために、広範囲な研究が行われている。例えば、hPTHが、酵母ゴルジ体に存在するプロテアーゼであるKEX2の認識部位と同一のArg-25とLys-26との間で切断されるという知見に基づいて、リシンの代わりにアミノ酸配列の26位にグルタミンを有するhPTHの置換変異体が、hPTHを切断するとの推定上のプロテアーゼであるKEX2によるタンパク質分解を妨害する目的で作製された(Reppeら、J. Biol. Chem. 266, 14198(1991))。遺伝子組換え技術を用いては、hPTH-関連タンパク質を酵母ユビキチン遺伝子の3'-末端に直接連結して、切断不可能なhPTH-関連タンパク質が生産された(Rianら、Eur. J. Biochem., 213, 641(1993))。しかし、タンパク質変異体を医療に用いる場合には、一般的に新規な薬剤と認識されるため、その医療用途の認可を得るために厳重な試験が必要となる。遺伝子融合技術を用いる際には、予定される消化によって融合部位を除く必要がある。なぜなら、対象のタンパク質は融合部位があるために、比較的低い収率で生産される可能性があるためである。
【０００５】
hPTHタンパク質の変異体又は融合体に頼ることなくhPTHの分解を妨げる研究の結果として、本発明者らは、培養培地にL-アルギニンを高濃度で単に添加することにより、hPTHの切断を有意な程度まで防止できる方法を開発した(Chung及びPark、Biotechnol. Bioeng. 57, 245 (1998))。培養培地中のL-アルギニンの存在によってhPTHの切断が有意な程度まで防止されるという事実は、hPTH切断が細胞内プロテアーゼKex2pによるよりむしろ細胞外プロテアーゼによって主に行われていることを示している。この知見から、本発明者らは、1個又は1対の塩基性アミノ酸のC-末端部又は中央部を切断でき、酵母の細胞質膜に結合する、KEX2のようなYap3p(酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3)が、酵母培養培地へ分泌されるhPTHの切断に特に責任を果たしていると推論した。この推論に基づいて、本発明者らは、YAP3遺伝子-崩壊酵母株(yap3Δ)を作製し、酵母変異体の使用によりhPTH生産系を構築した。フラスコでの培養によって、hPTH生産系は、80％と同じくらい高い効率でhPTHの切断を防止し、その結果、高収率で完全なhPTH分子を生産することが分かった(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 187(1998); 韓国特許登録第0246932号(12月8日1999年))。野生型株よりもかなり高いhPTH生産性を示すにもかかわらず、yap3Δ変異体は、高濃度培養の後期段階で有意な程度までhPTHを切断できることが認められた(Song及びChung、 Process Biochem 35, 503(2000)。これは、hPTHがYap3pによっては切断されず、後期の培養段階で他のプロテアーゼによって切断されることを示している。サッカロミセス・セレビシエは、構造及び機能の上でYap3pに極めて類似しているアスパラギン酸プロテアーゼMkc7pを有することが報告されている(Komano及びFuller, Proc Natl Acad Sci, USA, 92, 10752(1995))。本発明者らは、培養段階終期のhPTH切断に対する酵素の影響の観察で用いるため、双方の遺伝子が崩壊している(yap3Δ/mkc7Δ)酵母変異体を作製した。しかし、変異体yap3Δとyap3Δ/mkc7Δとで有意な相違は認められなかった(Choiら、J. Microbiol BiotEChnoL 9,679(1999))。これらの結果は、Mkc7pプロテアーゼが、Yap3pと高いホモロジーを有し(53％のホモロジー)、Kex2pの不在下でプロ-α-接合因子の処理に関与していることをとおして、hPTHの切断に大きく責任を果たしているわけではないことを立証した。
【０００６】
最近開示されたサッカロミセス・セレビシエについてのゲノム情報の分析を通じて、YAP3(最近はYPS1に改名された)と同類の遺伝子について検索が行われ、PEP4及び BAR1に加えて、未知のアスパラギン酸プロテアーゼをコードする3個の新規な遺伝子が存在するとの知見が得られた(Olsenら、Biochem. J. 339, 407(1999))。YPS1及びYPS2のようなヤップシンファミリーのアスパラギン酸プロテアーゼの新たなメンバーをエンコードすると推測されることから、3個の新規な遺伝子は、それぞれYPS3、YPS6及びYPS7と命名された。YPS3はYPS1及びYPS2の双方と50%のホモロジーを有することが分かったが、YPS6とBAR1、ならびにYPS7とPEP4では、それぞれ35%及び25%のホモロジーが見られた。YPS3とYPS1とのホモロジーから、本発明者らは、yps1Δ(先のyap3Δ)株の終期培養段階に起こるhPTH切断はヤップシン 3によって行われている可能性があると推定した。
【０００７】
発明の要約
前記の背景に留意して、本発明は、hPTHを高収率で生産できるタンパク質発現系を提供することを目的とする。
本発明の別の目的は、高収率のhPTHの生産法を提供することである。
hPTHの翻訳後修飾の知識によって、本発明に至る修飾及び適用が可能である。
徹底的な研究の結果として、またhPTHの生物学的生産の研究をとおして、本発明者らは、ヤップシン遺伝子の崩壊により、サッカロミセス・セレビシエでの組換えhPTHの内因性分解が驚くべきことに低下することを見出した。
本発明の観点によれば、YPS1及びYPS3遺伝子の双方、又はYPS1、YPS2及びYPS3遺伝子の全てが崩壊したサッカロミセス・セレビシエの変異株が提供される。
本発明の別の観点によれば、生産体としてサッカロミセス・セレビシエ変異株を用いることによるhPTHの生産方法が提供される。
【０００８】
図面の簡単な説明
本発明の上記及び他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面に関連する以下の詳細な記載からより明らかに理解されるであろう。
図1は、ポップ-アウト(pop-out)のURA3選択マーカーの使用による、YPS3遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である；
図2は、サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させ、URA3選択マーカーを回収する工程を示す図である；
【０００９】
図3は、24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエ2805(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ 2805/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SY28Y3/pG10-hPTH1(レーン4及び5)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SY28Y4/pG10-hPTH1(レーン6及び7)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断した(truncated)hPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している；
【００１０】
図4は、24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエL3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SLH15/pG10-hPTH1(レーン4及び5)、サッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH1(レーン6及び7)、サッカロミセス・セレビシエ SLH17/pG10-hPTH1(レーン8及び9)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン10及び11)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している；及び
【００１１】
図5は、ガラクトースを連続的に供給して72時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ L3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS3-二重崩壊体(a)：サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエSLH11/pG10-hPTH1(レーン8〜13)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊体(b)：サッカロミセス・セレビシエ SLH16/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン8〜13)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ヤップシンファミリーのYPS1、YPS2及びYPS3プロテアーゼの少なくとも1つを生産できない酵母宿主から、組換えhPTHを生産する方法に関する。
エキソプロテアーゼ活性はhPTHのC-又はN-末端からの残基の切断を示すので、プロテアーゼのヤップシン1(以降「YPS1」とする)、ヤップシン2(以降「YPS2」とする)又はヤップシン3(以降「YPS3」とする)は、酵母宿主で完全なhPTH分子を生産しにくくする。したがって、本発明は、3個のプロテアーゼYPS1、YPS2及びYPS3の少なくとも1つを発現できない酵母変異体を宿主細胞として用いることによる高収率での完全なhPTH分子の生産法からなる。
【００１３】
YPS1とYPS2は、主としてhPTH生産用の形質転換体の初期培養段階で酵素活性を発揮するが、YPS3は、主に後期培養段階でhPTHを切断するものと考えられている。YPS1遺伝子が損傷しているyps1Δ株の場合、hPTHは、YPS1を欠いているために初期培養段階に高収率で得ることができるが、YPS3の必然的なタンパク質分解活性のために後期培養段階では低い収率で得られる。
したがって、酵母宿主の培養をとおしてhPTHの生産率を改善するには、好ましくはYPS1とYPS3の双方(yps1Δ/yps3Δ)、より好ましくはYPS1、YPS2及びYPS3の全て(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)を欠く変異体が宿主として用いられる。
【００１４】
プロテアーゼの欠失は、酵素選択マーカーの使用によって、YPS1、YPS2及びYPS3からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を崩壊させて行うことができる。
酵母の選択マーカーは特に限定されないが、ポップアウトできるものが好ましい。本発明の好ましい具体例では、URA3選択マーカーはカセットの形態で提供される。酵母選択マーカーを含むポップ-アウトカセットは、酵母ゲノムに含まれる標的遺伝子、つまりyps1、yps2及びyps3をホモロジー組換え法によって崩壊できるように、その両端にYPS1、YPS2及びYPS3のN-ならびにC-末端部位をコードする遺伝子フラグメントを有する。ゲノムにカセットを有する酵母を選択できれば、いずれの選択マーカーも用いることができる。ここで、yps3遺伝子がURA3選択マーカーによって崩壊しているyps3Δ変異体は、yps3::URA3と示される。
【００１５】
この発明によれば、hPTH遺伝子は、発現ベクターによって酵母に保持される。したがって、この発明は、hPTH遺伝子が挿入されている組換え発現ベクターに関する。この発明で有用な発現ベクターは、酵母で遺伝子を発現させる手段であり、かつ発現を制御する手段を有する。ベクターの選択と組換えベクターの構築は当業者に自明であり、またその詳細を以下の実施例に記載する。
別の観点で、この発明は、組換え発現ベクターを用いてyps1Δ/yps3Δ又はyps1Δ/yps2Δ/yps3Δ酵母変異体から調製される形質転換体に関する。
【００１６】
この発明の好ましい具体例で、組換えベクターpG10-hPTH1を、サッカロミセス・セレビシエ変異体(yps1Δ/yps3Δ及びyps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)に形質転換し、形質転換体SLH16/pG10-hPTH及びSLH18/pG10-hPTHを作製した。これらは、2000年7月6日にそれぞれKCTC 0815BP及びKCTC 0816BPの受託番号で韓国生命工学研究所(KRIBB)の韓国の培養コレクション(Korean Collection for Type Culture)に寄託された。
この発明は、例示であって、この発明を限定しない以下の実施例に照らしてより良く理解される。
【００１７】
実験株及びプラスミド
サッカロミセス・セレビシエでのhPTHの発現には、GAL10プロモーター ::ppL::hPTH::GAL7タミネーターからなるhPTH発現カセットを含むプラスミドpG10-hPTH1を用いた(Chung及びPark、Biotechnol. Bioeng. 57、245(1998))。ポップ-アウトのURA3選択マーカー(URA3::tc5)カセットは、pTcUR3由来の1.8kb BamHIフラグメントから調製した(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 575-582 (2000))。サッカロミセス・セレビシエ2805とサッカロミセス・セレビシエL3262aを、YPS3-欠失変異体調製用親細胞として用いた(Kangら、J. Microbiol. Biotechnol., 8, 42-48(1998))。また、本発明で用いた細胞は、YPS1遺伝子が欠失している、酵母株SLH11(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 187(1998))、 SLH12とSLH14(Choiら、J. Biosci. Bioengin., 89, 77(2000))(先のYAP3)、YPS2遺伝子(先のMKC7)又はその双方であった。酵母株の遺伝学的特徴を、以下の表１に要約する。
【００１８】
【表１】
0003957630.tif 000002
【００１９】
培地組成及び培養条件
酵母株を、YPS3遺伝子を崩壊するURA3カセット又は発現ベクターpG10-hPTH1で形質転換する際、ウラシルを欠く合成培地SC-URAのみを用いた。得られたyps3::URA3変異体からURA選択マーカーを回収するために、5-FOA(5-フルオロテート(fluorotate))培地を用いた(Adamsら、Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997)。GAL10 プロモーター制御下のhPTH発現の誘導で用いるため、YPDG(酵母抽出物1%、バクトペプトン2%、グルコース1%、ガラクトース 1%)培地で48時間のあいだ培養した。
【００２０】
実施例１：YPS3遺伝子-崩壊酵母変異体の確立
YPS3遺伝子の崩壊で用いるためのURA3カセットを含む組換えベクターの構築を、図１に例示する。
YPS3遺伝子の崩壊をもたらすホモロジー組換えに必要なYPS3遺伝子のN-及びC-末端フラグメントを、GenBankに登録されたサッカロミセス・セレビシエのYPS3塩基配列に基づいて合成した2対のプライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により作製した。あとの遺伝子操作を簡便にするため、N-末端フラグメント増幅用のプライマーセット(5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' (SEQ ID NO:1)及び5'-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3 (SEQ ID NO:2))を、各5'-末端部位にEcoRI及びBamHIの認識部位(下線部)を有するように設計したが、BamHI及びXbaIの認識部位を、C-末端フラグメントの増幅用のプライマーセット(5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' (SEQ ID NO:1)及び5'-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3 (SEQ ID NO:2))の5'-末端部位に導入した(下線部)。PCRを、「GeneAmp PCR 2400」のようなPerkin Elmer製のサーマルサイクラーで、変性に95℃/30秒、アニーリングに55℃/30秒、かつ伸長に72℃/30秒からなる25サーマルサイクルを用いて行い、それぞれYPS3遺伝子領域のN-末端及びC-末端領域をエンコードする800bp及び700bp DNAフラグメントをサッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAから作製した。PCR産物、つまりYPS3 N-末端及びC-末端フラグメントを、制限酵素EcoRI/BamHI及びBamHI/XbaIそれぞれを用いて二重に消化し、あらかじめEcoRI/XbaIで処理したpBluescript II KS(+)ベクター(Stratagen)に2つの制限酵素消化物を連結した。得られた組換えベクターpB-YPS3NCの2つの末端フラグメント間に位置するBamHI認識部位に、URA3ポップアウト選択マーカーを導入し、YPS3遺伝子の崩壊に使用するためのpB-yps3::URA3:tc5ベクターを構築した。
【００２１】
次に、図2に例示するように、URA3カセットを用い、URA3選択マーカーをそれから回収することにより、サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させた。
詳細には、EcoRI/XbaIを用いるベクターpB-yps3::URA3:tc5の制限酵素処理によって得られるDNAフラグメントをサッカロミセス・セレビシエ 株2805、L3262a、SLH11 (yps1△)、SLH12 (yps2△)、及びSLH14 (yps1△/yps2△)にトランスフェクトした後、Ura+形質転換体の一次選択をSC-URA選択培地で行った。PCRを行い、Ura+形質転換体がYPS3遺伝子を崩壊させているかどうかを同定し、その後、こうして選択したyps3::URA3:tc5形質転換体を5-FOAプレートに広げ、ホモロジー組換えによるURA3遺伝子のポップアウトから生じるyps3::tcクローンを選択した。
【００２２】
最終的に得られたyps3△変異体のYPS3遺伝子の崩壊をPCRによって再同定し、他のヤップシンプロテアーゼ遺伝子を任意に欠くyps3-崩壊体、S28Y4、 SLH15、 SLH16、SLH17及びSLH18を得た。これらの変異体株を以下の表２に要約する。
【００２３】
【表２】
0003957630.tif 000003
【００２４】
実施例２： hPTH 発現性の組換え酵母株の確立及びhPTH発現の分析
サッカロミセス・セレビシエ野生型株2805及びL3262ならびにサッカロミセス・セレビシエ変異体S28Y4、SLH15 (yps3△)、SLH16 (yps1△/yps3△)、SLH17(yps2△/yps3△)及びSLH18(yps1△/yps2△/yps3△)を、発現ベクターpG10-hPTH1で形質転換し、次いでUra+形質転換体を選択した。hPTHを発現できる、これらの組換え酵母株を、hPTH発現分析に付した。
【００２５】
酵母変異体を、最少選択培地(アミノ酸-欠損酵母窒素基質0.67%、グルコース2%、カサミノ酸(casamino acid) 0.5%)で24時間30℃で前培養した。各培養物をYPDG培地(酵母抽出物1％、バクトペプトン2％、グルコース1％、ガラクトース1％)に2％量で接種し、次いで48時間30℃で培養した。この培養中、試料を24時間と48時間で回収した。各試料500μlを5分5,000rpmで遠心分離し、バイオマスから上清を分離した。DOC(デオキシコール酸)とTCA(トリクロロ酢酸)それぞれを上清の1/10量で加え、次いで30分0℃に置き、中に含まれるタンパク質を沈澱させた。10分12,000 rpmで遠心分離して得たペレットを、アセトンで洗浄し、沈澱タンパク質中に残存するTCA溶液を除き、溶解緩衝液25μl中に溶解し、5分100℃で加熱して、細胞外タンパク質画分を得た。細胞外タンパク質画分10μlを15％ポリアクリルアミド分離ゲル(pH8.8、10cm幅、8cm長、0.7mm厚)に充填し、1.5時間125Vかつ25mAで電気泳動に付した。ゲルで動いたタンパク質をクマシーブルーで視覚化した。24時間の試料についての電気泳動の結果を図3aに、48時間の試料についての結果を図3bに示す。
【００２６】
これらの電気泳動写真に見られるように、サッカロミセス・セレビシエ株から分泌される組換えhPTHをSDS-PAGEで分離したところ、3つのバンド：完全な分子についてのi(1-84)；N-末端切断型分子についてのd1(27-84)；及びC-末端切断型分子についてのd2(1〜80)として現れた。バンドi及びバンドd1に位置するタンパク質を、PVDF(ポリビニリデンジフルオライド)膜に移した。Milligen/Biosearch M6000タンパク質シーケンサーでのタンパク質のN-末端アミノ酸シークエンスにより、バンドi及びd1のタンパク質のN-末端領域でアミノ酸配列Ser-Val-Ser-Glu-Ile  (SEQ ID NO:3)及びLys-Leu-Gln-Asp-Val (SEQ ID NO:4)がそれぞれ同定され、バンドiのタンパク質は完全なhPTH分子であるが、d1バンドのタンパク質は、hPTHのN-末端領域の26アミノ酸残基を欠く切断型(27〜84)であることが示された。バンドd2については、完全な分子より14kDa大きい電気泳動のバンドが示されたが、HPLC、MALDI質量分析及びC-末端アミノ酸シークエンスによって分析されるように、そのタンパク質が、C-末端(1〜79、80)の4〜5アミノ酸残基を欠く切断型hPTHであることが分かった。特徴的な電気泳動のパターンは、C-末端の除去によるタンパク質の配座変化に帰することが報告されている(Vad ら、Protein Expr. Purif. 13: 396-402 (1998))。
【００２７】
実施例３：ヤップシンプロテアーゼ-欠損変異体におけるhPTH発現パターン
hPTH発現に対するYPS1及びYPS3遺伝子の崩壊の影響を調べるため、野生型サッカロミセス・セレビシエ株2805非形質転換体、野生型サッカロミセス・セレビシエ2805/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△変異S28Y3/pG10-hPTH1形質転換体及びyps3△変異S28Y4/pG10-hPTH1形質転換体から分泌されるhPTH分子を、SDS-PAGE電気泳動に付した。電気泳動の結果を図3に示す。
【００２８】
電気泳動写真に見られるように、非形質転換体の野生型株ではhPTH分子は発現されなかった(レーン1)。形質転換体の野生株2805で発現される約50％以上のhPTHが、切断型d1で存在した(レーン3及び4)。yps1△変異体S28Y3の場合には、24時間培養物から得た際に、培地に分泌されるhPTHの切断型は全hPTHの5％未満であった。これに対し、48時間培養物から得られるhPTHの約30〜40％は、d1型で存在することが分かった。YPS3遺伝子のみを崩壊させた株S28Y4は、hPTH発現パターンにおいて野生型株と異ならなかった：24時間以内に分泌されるhPTHの約50％以上が切断型で存在することが分かった。
【００２９】
ひとまとめにして考慮すると、図3に示す結果は、初期培養段階でhPTH切断を引き起こす主たるプロテアーゼはヤップシン1であり、ヤップシン1以外のプロテアーゼは後期培養段階でhPTHの切断の原因であることを立証している。しかし、YPS3遺伝子のみを崩壊させた株の場合には、有意な作用は得られない。というのは、ヤップシン1の活性は、初期培養段階で有意な程度までhPTHを既に切断しているからである。
【００３０】
したがって、YPS3遺伝子を他のヤップシン遺伝子YPS1及びYPS2と組み合わせて崩壊させた際の、hPTH生産の発現パターンについて調べた。この目的のため、野生型サッカロミセス・セレビシエL3262非形質転換体を対照として、L3262/pG10-hPTH1形質転換体、yps3△変異SLH15/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△/yps3△ 変異SLH16/pG10-hPTH1形質転換体、yps2△/yps3△変異SLH17/pG10-hPTH1形質転換体及びyps1△/yps2△/yps3△変異SLH18/pG10-hPTH1形質転換体でhPTHを発現させた。分泌されるタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、24時間培養後に回収した試料についての電気泳動の結果を図4a、48時間培養後に回収した試料についての結果を図4bに示す。
【００３１】
図4に示されるように、非形質転換株でhPTHは検出されなかった(レーン1)。24時間での回収時、形質転換野生株(レーン2及び3)、YPS3-崩壊株(レーン4及び5)ならびにYPS2及びYPS3-二重崩壊株(レーン6及び7)から分泌されるhPTH の50％が、N-末端切断型d1で存在した。48時間後、hPTH切断は、切断型hPTHの割合をさらに増加させることが分かった。他方、興味深いことに、48時間で得たとしても、YPS1及びYPS3-二重崩壊株(レーン6及び7)、ならびにYPS1、YPS2、YPS3-三重崩壊株(レーン10及び11)から分泌されるhPTH分子は、いずれもN-末端切断型d1を有しなかった。さらに、バンドd2の切断型はYPS1及びYPS3-二重崩壊株から分泌される全hPTHの約20％であることが示されたが、バンドiの完全なhPTHは、YPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊株の48時間培養後ですら観察される一方、d2バンドタンパク質は見られなかった。これらの結果は、ひとまとめにすると、野生型酵母株が有するhPTHの分解の問題が、YPS1、YPS2及びYPS3の遺伝子全てが崩壊している株の使用によりほぼ完全に解消することを示した。
【００３２】
実施例４：高濃度培養におけるhPTH発現パターン
上記のように作製したヤップシンプロテアーゼ-欠損変異体から発現されるhPTHがタンパク質分解を受けるか否かを調べるために、実験を行った。これに関して、ガラクトースを、発酵槽での高濃度培養条件を模倣するためにフラスコに連続的に供給した。YPDG培地で24時間前培養後、株をさらに72時間培養したが、2％レベルで培地のガラクトース濃度を維持するため、24時間間隔でガラクトースを培地に供給した。
【００３３】
これらの条件下、野生型サッカロミセス・セレビシエ L3262非形質転換体を対照として、L3262/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△変異SLH11/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△/yps3△変異SLH16/pG10-hPTH1形質転換体、及びyps1△/yps2△/yps3△変異SLH18/pG10-hPTH1形質転換体でhPTHを発現させた。分泌されたタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、L3262/pG10-hPTH1及びSLH11/pG10-hPTH1株についての電気泳動の結果を図5a、SLH16/pG10-hPTH1及びSLH18/pG10-hPTH1についての結果を図5bに示す。
【００３４】
図5に示すように、24時間での回収時、野生型酵母(レーン2〜7、図5a)から分泌されるhPTHの約50％が、N-末端切断型d1で既に存在していた。他方、yps1△変異体(図5a、レーン8〜13)及びyps1△/yps3△変異体(レーン2〜7、図5b)の培養物の場合、24時間培養ではhPTHは分解しなかったが、ガラクトースを連続的に与えた48時間の高濃度培養ではhPTH分解が有意に観察された。これに対し、yps1△/yps2△/yps3△変異体の培養物(レーン8〜13、図5b)は、72時間での回収時ですら、N-末端切断型d1のhPTHを有さず、完全なhPTH(iバンド)を有意に増加することが分かった。さらに144時間ですら、三重-崩壊変異体の培養物は、hPTHの切断型を有しないことが観察された。これらの結果は、後期の高濃度培養段階で生じるhPTHの分解の問題が、YPS1、YPS2及びYPS3の遺伝子全てが崩壊している変異体を用いて完全に解消できることを明らかにした。
【００３５】
前記のとおり、ヤップシン1(先のYPA3)とヤップシン3遺伝子がともに崩壊している酵母変異体(yps1△/yps3△)、又はヤップシン1、ヤップシン2(先のMKC7)とヤップシン3遺伝子が全て崩壊している変異株(yps1△/yps2△/yps3△)は、種々の疾患の治療に有用な完全hPTHを、ホルモンペプチドを分解できないために、高収率で分泌することができる。
この発明は例示的に記載されており、使用される用語は限定ではなく、説明を意図していることが理解されるべきである。上記の示唆に照らして、本発明の多くの改変及び変更が可能である。したがって、添付の請求の範囲内で、本発明は、詳述される以外の点で実施され得ることが理解されるべきである。
【００３６】
【表Ａ】
0003957630.tif 000004
【００３７】
【表Ｂ】
0003957630.tif 000005
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ポップ-アウト(pop-out)のURA3選択マーカーの使用による、YPS3遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である。
【図２】  サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させ、URA3選択マーカーを回収する工程を示す図である。
【図３】  24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエ2805(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ 2805/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SY28Y3/pG10-hPTH1(レーン4及び5)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SY28Y4/pG10-hPTH1(レーン6及び7)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断した(truncated)hPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【図４】  24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエL3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SLH15/pG10-hPTH1(レーン4及び5)、サッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH1(レーン6及び7)、サッカロミセス・セレビシエ SLH17/pG10-hPTH1(レーン8及び9)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン10及び11)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【図５】  ガラクトースを連続的に供給して72時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ L3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS3-二重崩壊体(a)：サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエSLH11/pG10-hPTH1(レーン8〜13)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊体(b)：サッカロミセス・セレビシエ SLH16/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン8〜13)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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