(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を含むロドサーマス マリナスのアルカリホスファターゼ。
【請求項２】
SDS-PAGEにより測定されると約45,000-55,000 の見掛け上のサブユニット分子量を有し、そして65℃で1 時間加熱に対して安定な、請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項３】
配列番号：４のアミノ酸配列のうちの21-455番の残基から本質的になる、請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項４】
請求項１−３のいずれか１項記載の熱安定性アルカリホスファターゼをコードする精製された核酸。
【請求項５】
請求項４記載の核酸により形質転換された細胞。
【請求項６】
約45,000-55,000 の見掛け上のサブユニット分子量を有する、大腸菌により組換え生産された、請求項１−３のいずれか１項記載のロドサーマス マリナスのアルカリホスファターゼ。
【請求項７】
請求項１−３のいずれか１項記載の熱安定性アルカリホスファターゼで標識化された核酸、蛋白質、または抗体を提供する工程からなる、サンプル中の核酸または蛋白質を検出する方法。
【請求項８】
請求項１−３のいずれか１項記載のロドサーマス由来の熱安定性アルカリホスファターゼで標識化された核酸、蛋白質または抗体を提供する工程からなる、サンプル中の核酸または蛋白質を検出する方法。
【請求項９】
配列番号：４と比較して10個未満の保守的アミノ酸交換を含む、請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項１０】
配列番号：４と比較して10個未満のアミノ酸付加を含む、請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロドサーマス  マリナスの熱安定性アルカリホスファターゼに関する。
【０００２】
【従来技術】
アルカリホスファターゼは通常、核酸分子の末端からリン酸基を除去するために行われるごく普通の生化学的手法に使用される。たとえば、子牛腸のアルカリホスファターゼは、このようなリン酸基を除くために使用される熱不安定性酵素であり、高熱に曝されることにより不活化される。この熱不安定性は、アルカリホスファターゼを次の操作の前に反応混合物から除去する必要がないので有利である。
【０００３】
アルカリホスファターゼはまた、特異的たんぱく質またはDNA 標識物の検出のための非- 放射性マーカーとしても使用される。これはたんぱく質またはDNA オリゴヌクレオチドと結合してこれらの標識物の検出の助けとなる。酵素熱安定性は50 bp より大きいDNA の標識化に使用するのに望ましく、貯蔵の間に酵素の安定性を向上するための他の用途にも有用である。
【０００４】
様々な好熱性のおよび他の生物由来のアルカリホスファターゼが知られている：イェーおよびトレラ( Yeh and Trela) (1976) “ サーマス  アクアティカス由来の代表的アルカリホスファターゼの精製および特性決定( Purification and Characterization of a Repressible Alkaline Phosphatase from Thermus aquaticus）" J. Biol. Chem. 251 : 3134-3139 ;ハルトッグおよびダニエル( Hartog and Daniel ）(1992) “サーマス種菌株 Rt41A由来のアルカリホスファターゼ(An Alkaline Phosphatase from Thermus sp Strain Rt41A）" Int. J. Biochem. 24 : 1657 - 1660 ; シャッフェルおよびヒューレット( Schaffel and Hulett）(1978)“ バチルス  リチェニホルミス由来のアルカリホスファターゼ( Alkaline Phosphatase from Bacillus licheniformis）" Biochimica et Biophysica Acta 526 : 457-467 ; ヒューレット- カウリングおよびキャンベル(  Hulett-Cowling and Campbell）(1971)  “ バチルス  リチェニホルミス由来のアルカリホスファターゼの精製および性質( Purification and Properties of an Alkaline Phosphatase of Bacillus licheniformis）" Biochem. 10: 1364 - 1371。
【０００５】
【発明の構成および効果】
出願人は、好熱種ロドサーマス  マリナス(Rhodothermus marinus)から新規アルカリホスファターゼを単離および精製した。この酵素は高pH適合性( 〜10.8)を有し、そして65℃で24時間インキュベーション後でさえもその活性の60% を維持する熱安定性である。この酵素はまた、6M尿素中65℃で一晩インキュベーションすることを含む他の変性条件にも耐性がある。この酵素のより高いpHの適合性は非常に有利である。この高pH適合性およびしたがって高pHでの安定性は、たとえば酵素をストレプタビジンとともに使用する場合に、非- 放射性検出システムにおける酵素の使用を強化する。さらに、高pH適合性により、この酵素がアルカリ性pHで発光形へ迅速に転化するジオキセタン基質とともに使用するのに適するようになる。
【０００６】
アルカリホスファターゼの熱安定性はまた、酵素を核酸プローブへ直接架橋した後で、厳しい条件下で、すなわち高い温度下で重大な酵素活性の損失がなくこのような標識化プローブをハイブリッド化し次いで洗浄することができるようになる点でも有利である。
【０００７】
したがって、第一の見地において本発明は、pHが10.5以上、たとえば10.8以上の最適pHを有し、また少なくとも65℃の温度にも耐性がある( すなわち、この温度でその活性の少なくとも10% を維持する）ロドサーマス  マリナスに存在する熱安定性アルカリホスファターゼの酵素活性部分を特徴とするものである。
【０００８】
ホスファターゼとは、たとえばDNA 分子または他の分子たとえばp-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)からリン酸基を除去する活性を有するたんぱく質またはそのフラグメントを単に意味する。“ アルカリホスファターゼ" は、pH7 以上で活性であるもの、そして本発明では以下に列挙した条件を用いて10.0以上の最適pHを有するものである。当業者であれば、最適pHが緩衝液の条件および基質濃度に依存することはわかるであろう。
【０００９】
“ 熱安定性" とは、酵素が65℃で1 時間以上、好ましくは5 または10時間加熱後にその活性が少なくとも10% を維持するものを意味する。
【００１０】
出願人は本発明のアルカリホスファターゼの一実施例を提供するが、約10.8の最適pHを有するアルカリホスファターゼが天然に存在しそして単離することができるという事実を知った当業者であれば、容易に細胞抽出物をスクリーニングしてこのような活性の存在を確認することができ、そしてここに記載した標準的方法でこのような酵素部分を単離しそして精製することができる。
【００１１】
本発明はまた図９（配列番号４）に示すロドサーマス マリナスのアルカリホスファターゼの酵素活性部分と比較して10個未満の保守的アミノ酸交換または10個未満のアミノ酸付加を含む。
【００１２】
本発明において、酵素は精製形で提供されるのが好ましく、すなわちこれが天然に生じる環境から単離される。一般にはこのような環境は細菌細胞内にあり、そしてたんぱく質は細胞における存在と比べて少なくとも10- 倍または100-倍豊富な細胞の細胞壁および／またはその細胞膜から単離される。より好ましくは、これが実質的に均質の調製物であるように、すなわちこれが調製物におけるたんぱく質性物質の主な種であるように、1000-10,000-倍またはそれ以上豊富である。さらに好ましくは、たんぱく質はただ一つの種であり、すなわちサンプルにおけるたんぱく質性物質の少なくとも95% を表す。このようなたんぱく質は、これが天然に産生する細菌細胞から調製されるか、またはこれが天然に産生しない細菌または他の細胞、たとえば大腸菌において高いたんぱく質発現レベルを起こさせるための標準的組換えDNA 方法を用いて調製されうる。このような組換えたんぱく質の粗製抽出物は精製たんぱく質の定義の範囲内である。
【００１３】
標準的技術を用いて、以下に示す酵素は、たんぱく質またはそのフラグメントをミクロ配列化し、望ましい生物たとえばロドサーマス  マリナスの核酸から生じるクローンのライブラリーのためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを調製し、そしてこのようなプローブでそのライブラリーをスクリーニングしてたんぱく質をコードするDNA のフラグメントを単離することにより、直ちにクローン化されうる。これに代わり、たんぱく質に対する抗体を作り、どのクローンがこの抗体により識別される抗原決定基を発現するかを確認するために発現ライブラリーをスクリーニングしてもよい。他の標準技術は、請求の範囲に記載のたんぱく質をコードするような遺伝子を単離するために当業者に公知のものである。このような遺伝子は組換えアルカリホスファターゼをコードする。
【００１４】
したがって、第二の見地において、本発明は前記性質を有する組換えアルカリホスファターゼ、およびこのような組換えDNA を含む核酸をコードする細胞を特徴とするものである。このようなホスファターゼをコードする同等遺伝子は標準的技術を用いてクローン化される。
【００１５】
第三の見地において、本発明はたんぱく質または核酸の標識化において、および様々な分子バイオロジー技術において前記酵素を使用するための方法を特徴とするものである。すなわち、本発明の酵素は標準ラベル化反応および診断分析に使用されうる。これらはまた、リン酸基の除去が望ましい分子バイオロジー技術においても使用される。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施態様の以下の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１７】
実施例：ロドサーマス  マリナス由来のアルカリホスファターゼ
以下はロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼの単離および特性決定の例である。これは本発明を限定するものではない。
【００１８】
培養条件：
ロドサーマス  マリナス、菌株、ATCC 43812は、アルフレッドソンら( Alfredsson et al. ） (1988) “Rhodothermus marinus, gen. nov., sp. nov., a Thermophilic, Halophilic Bacterium from Submarine Hot Springs in Iceland" J. Gen. Microbiology 134, 299-306 に記載のように65℃にて好気性条件下で増殖した。連続流れ遠心分離により細胞を採取し、-80 ℃で貯蔵した。
【００１９】
活性分析：
アルカリホスファターゼ活性を、p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)をp-ニトロフェノールへ転化し続いて405 nmで分光分析によりモニターした。1 単位は、1 分間にp-ニトロフェノールの1 μモルを放出するのに必要な酵素の量として定義される。すべての検定は、特記しないかぎり、100 mM CAPS (3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸) pH 10 、15% グリセロール、1mM MgCl2 および6mM pNPPにおいて37℃で行われた。
【００２０】
精製：
凍結した細胞( 33 g) を、25mM  トリス-HCl pH 7.4 、50mM NaCl 、1mM MgCl2 および0.1%トリトンX-100(最終容量100ml)に懸濁させ、そして超音波により溶菌した。溶菌物を遠心分離して細胞破壊物を除き透明にし、最終NaCl濃度350mMへ補給し、そして25mMトリス-HCl pH7.4および350mM NaClで平衡化したDE 52 陰イオン交換樹脂( ワットマン(Whatman);細胞1g当たり樹脂4g) においてクロマトグラフィーを行った。アルカリホスファターゼ活性の大部分は、塩濃度を100mMまで低めるために25mMトリス-HCl pH7.4において希釈された流れにおいて現れた。希釈した流れを、25mMトリス-HCl pH7.4および100mM NaClで平衡化したヘパリン- セファロース( Heparin Sepharose ）CL-6B 樹脂( ファルマシア( Pharmacia)）へ施した。アルカリホスファターゼ活性は樹脂と結合しなかった。流れを次いで、25mMトリス-HCl pH7.4および100mM NaClで平衡化したQ-セファロースFFカラム( ファルマシア）へ施した。カラムを25mMトリス-HCl pH7.4において100-350mM NaClまでの直線状勾配で展開した。アルカリホスファターゼは〜250mM NaClで溶出した。適当なフラクションをプールして、1mM MgCl2 へ補給し、そして25mMトリス-HCl pH7.4および10mM NaCl ( 緩衝液A)で平衡化したヒドロキシルアパタイト( バイオ- ラド(BIO-RAD) ）において溶解した。酵素活性が100%緩衝液Aから100%緩衝液B (50mM Naホスフェート、pH7.0)までの直線状勾配で溶出した。アルカリホスファターゼ活性を含むフラクションをプールし、セントリプレプ(Centriprep）-30 濃縮器( アミコン( Amicon) ）において50mMトリス-HCl pH 9.3および25mM NaCl ( 緩衝液A)で平衡化し、そして緩衝液 Aで平衡化したQ-セファロース FF カラムへ施した。酵素活性は、緩衝液A における25 -600mM NaClまでの直線状勾配で溶出した。プールしたフラクションを、前記した25mMトリス-HCl pH7.4および25mM NaCl へ交換し、同じ緩衝液においてDEAE- セファセル( Sephacel）カラム( ファルマシア）へ施した。アルカリホスファターゼは25mMトリス-HClにおいて25 - 300mM NaCl からの直線状勾配で溶出した。適当なDEAE- セファセルフラクションを集め、セントリプレプ-30 装置において25mMトリス-HCl、25mM NaCl および50mM MgCl2へ交換し、100 ℃で10分間加熱した。不溶性の熱変成たんぱく質を遠心分離により除去した。
【００２１】
特性決定：
前記精製方法に続いて、SDS-PAGEによる調製物の分析により、酵素サブユニットがほぼ55,000ダルトンの見掛け上の分子量で移動する二つの密接した間隔のポリペプチドに相当することが明らかになった( 図1)。使用するゲルはバイオ- ラッド社からミニ- プロテイン( Mini-Protein）IIレディ- ゲル(  Ready Gel）,カタログ番号161 - 0902として入手されるもので、製造業者の手引き書にしたがって使用された。酵素活性を示す二つのたんぱく質バンドの存在は、同じたんぱく質のイソ酵素、酵素の翻訳後修飾形、部分的たんぱく質分解または場合により精製方法よる人為的産物を表す。後者が本当であるなら、当業者は、二つのポリペプチドを得るかまたは得られないかもしれない他の手段で酵素を精製してもよいことが分かる。
【００２２】
最終生成物は、比活性の研究により確認されるように粗製細胞溶解物の350 倍以上の精製を表す。酵素調製物はさらに、最適酵素活性の温度およびpHを測定することにより特性決定された。最適酵素活性の温度を測定するために、貯蔵アルカリホスファターゼ( 0.32 mg/ml) を、25mMトリス-HCl pH 7.4 、25mM NaCl および1mM MgCl2 において250 倍に希釈し、指示された温度で標準条件( 前記参照）下に活性を検定した。結果を図2 に示す。最適酵素活性のpHを測定するために、貯蔵アルカリホスファターゼを、25mMトリス-HCl pH 7.4 、25mM NaCl および1mM MgCl2 において200 倍に希釈した。酵素検定は、いずれかの0.1M CAPS 、1mM MgCl2 および6mM pNPP、またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、1mM MgCl2 および6mM pNPPの各々0.1Mにおいて37℃で指示されたpH値で行われた( 前記）。結果を図4 に示す。65℃での酵素安定性を測定するために、貯蔵アルカリホスファターゼを、25mMトリス-HCl pH 7.4 、25mM NaCl 、1mM MgCl2 および 15%グリセロールにおいて20倍に希釈し、65℃で指示された時間インキュベーションした。サンプルをさらに10倍に希釈した後、標準条件下で活性検定を行った。結果を図3 に示す。
【００２３】
またアルカリホスファターゼをドットブロットDNA の非- 同位体検出に使用した( 図5)。標的DNA ( λ- Hind III) を、TE + 0.2M NaOHにおいて変性し、様々な量(0.01 ng、0.05 ng 、0.1 ng、0.5 ng、1 ng、5 ng、10ng）でナイロン膜(バイオダイン( Biodyne ） A; パル( Pall) ）にスポットし、80℃で1 時間焼成することにより定着した。400mMNaCl 、4%カゼインおよび50mM MgCl2を補給したECL ゴールドハイブリッド化緩衝液( アマーシャム( Amersham) ）において65℃で1.5-2 時間予備ハイブリッド化した。プローブは、ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼをλ- Hind III DNAへ架橋することにより調製された。熱変性プローブ(10mM Naホスフェート pH5.5中、10ng/ μl ) 、アルカリホスファターゼ(10mM Naホスフェート pH5.5中、60ng/ μl ) およびグルタルアルデヒド(1.5%)の等量( 一般的には各々10μl ）を混合し、37℃で45分間インキュベーションした。酵素/ プローブ複合物を予備ハイブリッド化反応物へ直接添加(10ngプローブ/ ハイブリッド化緩衝液 ml)) し、65℃で一晩ハイブリッド化した。ハイブリッド化に続いて膜を以下のもので洗浄した：2X SSC、25mMトリス-HCl pH7.4 、10mM MgCl2、0.1% SDS (室温で3 x 5 分）；0.2X SSC, 25mMトリスpH 7.4、10mM MgCl2( 37℃で3 x 5 分); 0.1M CAPS pH10 、15% グリセロール、2mM MgCl2(室温で30分間) 。洗浄してから、膜を、膜1cm2当たり〜20μl CDP-スター(Star）基質( トロピックス( Tropix) ）とともに食品密閉バッグ(seal-a-meal bag) に入れ、1 分間オートラジオグラフィーフィルムへ暴露した。
【００２４】
ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼのクローニング
標準的方法を用いて、ゲノムDNA をロドサーマス  マリナスから単離した。クロモゾームDNA に部分的Sau 3AI 消化を受けさせ、低融点アガロースにおいてゲル電気泳動により溶解した。4-9 kbの範囲のフラグメントをゲルから単離し、すでにBamHI で消化されそして脱ホスホリル化されたp ブルースクリプト(pBluescript) SK+ ( ストラタジーン( Stratagene) ）へ結合した。結合後、DNA を超官能性大腸菌株 XL2- ブルーMRF ´( ストラタジーン）へ形質転換し、そして100μg /ml アンピシリン、50μg /ml BCIP( 5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート、クロモゲンインジケーター) および5mM IPTG( イソプロピル- β-D-チオガラクトピラノシド) を含む LB 寒天培地に塗布した。プレートを37℃にて一晩インキュベーションした。単一の青いコロニー(pBRM1) がほぼ6000個の形質転換体として観察された。
【００２５】
クローン pBRM1
クローン pBRM1の制限分析により、細胞溶解物におけるアルカリホスファターゼ活性をコードするほぼ6kb の挿入部が示された。空のp ブルースクリプトベクターで行われた平行研究では酵素活性はほとんど見られなかった。アルカリホスファターゼ活性は、100 ℃で10分間の加熱後に酵素活性の75% 以上を維持しているので、熱安定性であることがわかった。SDS-PAGEに続いて正常化された細胞溶解物において行われたゲル比色分析では、酵素活性が見掛けの分子量〜46,000ダルトンで移動するポリペプチドへ局部化することが示された。pBRM1 を大腸菌 CC118 [ara D139  Δ( ara,leu) 7697   Δlac X74 phoA  Δ20 galE galK thi rpsE rpoB arg Eam recA1] へ形質転換し、そして BCIP インジケータープレートにおいて増殖した。この大腸菌株は、アルカリホスファターゼ(pho A) 遺伝子における欠失を含む。青いコロニーの発生は、クローン化酵素が天然大腸菌アルカリホスファターゼ(BAP) と区別されることを示す。
【００２６】
クローン pBRM1/ Kpn I
マッピング、欠失および発現の研究により、pBRM1 における6 kb挿入部のほぼ1/2 が酵素活性に影響を与えることなく失われることが示された。〜3kb の挿入部を含むより小さいクローンを、pBRM1/ Kpn Iとして消化した( 配列番号 1。図7 参照）。DNA 配列決定を促進するために、pBRM1/ KpnI をSacII で消化して0.45、1.9 および0.5 kbフラグメントを得、個々に pブルースクリプトへサブクローンした。
【００２７】
クローン pCRM1.8
DNA 配列データのBLAST 分析( ギッシュ(Gish)ら、(1993) Nat. Genet. 3:266-72)により、〜1kb の挿入部がアルカリホスファターゼをコードせず、したがって欠失されたことが示された。pBRM1/ KpnI をHind III/Kpn Iで消化して、1.8kb フラグメントを放出し、これを次いでpUC19 へサブクローンした。得られたクローンを pCRM1.8として消化した( 配列番号 2。図8 参照）。
【００２８】
クローン化アルカリホスファターゼの発現および精製
組換えプラスミド pBRM1.8を含む大腸菌株 JM109の一晩培養物を、LB + 100μg / mlアンピシリンにおいて1:40に希釈し、そしてA600が1.30に達するまで37℃で振盪しながら増殖した。培養を、2.5mM IPTGの添加により始め、次いでさらに18時間インキュベーションした。細胞を4 ℃で20分間 6000Xg で遠心分離することによりペレット化し、-80 ℃で貯蔵した。凍結細胞(12g) を溶かし、溶菌緩衝液(25mM トリスHCl pH 7.4、50mM NaCl 、1mM MgCl2 、1mM EDTA、0.05% トリトン X-100および1mg/mlリソチーム）60 ml に再懸濁した。再懸濁物を時々4 ℃にて45分間攪拌し、超音波処理して粘度を下げ、4 ℃にて30分間70,000Xgで遠心分離することにより透明化した。上澄みを最終濃度50 mM MgClへ補給し、80℃で20分間加熱すると熱不安定なたんぱく質が沈殿し、これを次いで前記のように遠心分離により除去した。上澄みを、緩衝液 A(25mM トリスHCl pH 7.4、20mM NaCl、1mM MgCl2)で1:1 に希釈して塩濃度を低下させ、そしてDE 52 陰イオン交換樹脂( ワットマン）においてクロマトグラフィーにかけた。カラムを、緩衝液A における20-500mM NaCl の6 カラム容量直線状勾配で展開した。アルカリホスファターゼ活性が〜180mM NaClで溶出した。適当なフラクションをプールし、25mMトリスHCl pH 7.4および50mM NaCl ( 緩衝液B)で平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム( バイオ- ゲル HTP; バイオラド）へ施した。カラムを緩衝液B の2 カラム容量で洗浄して残留MgCl2 を除去し、次いで緩衝液A から150mM Naホスフェート  pH7.0 へ8 カラム容量直線状勾配で展開した。アルカリホスファターゼはホスフェート濃度〜40mMで溶出した。プールしたフラクションを緩衝液B で1:1に希釈し、Q-セファロースFF  陰イオン交換カラム( ファルマシア）へ施した。カラムを緩衝液B で洗浄し、残留ホスフェートを除去し、そして緩衝液A において20-500mM NaCl の10- カラム容量直線状勾配で展開した。酵素活性は〜250mMNaClで溶出することがわかった。最終生成物は、SDS-PAGEにより測定されると90%以上の純度であり〜3000ユニット/ mgの比活性であることがわかった。クローン化たんぱく質は、ロドサーマス  マリナスから単離された天然たんぱく質のものより低い見掛け分子量を有する。両方のたんぱく質のアミノ酸末端のたんぱく質配列決定により、ロドサーマス  マリナスから単離された成熟アルカリホスファターゼの大部分がセリン残基22で開始し( 配列番号 4、図9 参照) 、一方大腸菌から単離されたたんぱく質はグルタミン残基21で開始することが明らかであった。したがって、両方のたんぱく質の間の明らかなな分子量における差はクローン化たんぱく質のアミノ酸末端において先端を切ったこと(truncation)によるものではない。アルカリホスファターゼが大腸菌および他の細菌においてペリプラズミ酵素であるので、これらの残基のアミノ酸上流は、シグナルペプチドとして機能すると思われる。
【００２９】
クローン化ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼで標識化されたDNAプローブ
クローン化アルカリホスファターゼを、ヒトゲノムDNA の同位体検出に使用した( 図6)。N-ras 遺伝子は、サザンブロット分析により全ヒトゲノムDNA の0.1μg サンプルにおいて簡単に検出される。ブロットは、1.0%アガロースゲルによりゲノムDNA のHind III消化物を分画し、続いて10 X SSC緩衝液を用いてハイボンド(Hybond)N 膜( アマーシャム）へ毛管移植することにより作られた。400mMNaCl、4%カゼインおよび20mM MgCl2を補給した変性ECL ゴールドハイブリッド化緩衝液( アマーシャムから、6M尿素の代わりに2M尿素、0.4% SDSの代わりに 0.2% SDS ）において、膜を1.5 - 2 時間予備ハイブリッド化した。プローブは、クローン化ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼをN-ras DNA へ架橋することにより作られた。熱変性プローブ( 水中、10ng/ml)、使用直前に希釈されたクローン化アルカリホスファターゼ(10 mM MES緩衝液 pH 5.0 中、40ng/ml ）およびホルムアルデヒド( 水中、2%）の等量( 一般的には各々10μl ）を混合し、37℃で30分間インキュベーションした。プローブを予備ハイブリッド化反応物( ハイブリッド化緩衝液 5ng/ml)へ直接添加し、50℃で一晩ハイブリッド化した。ハイブリッド化に続いて、膜を以下のようにして洗浄した：1 回リンスし、次いで55℃まで予備加熱した以下の緩衝液で2 x 10分洗浄した( 洗浄は室温にて振盪器の台上で行った）；100mM Naホスフェート  pH7.0 、150 mM NaCl 、2M尿素、0.4% SDS、10mM MgCl2。続いて1 回リンスし、次いで55℃まで予備加熱した以下の緩衝液で2 x 5 分洗浄した( 室温で洗浄）；100mM Naホスフェート  pH7.0 、150 mM NaCl 、10mM MgCl2。最後のリンスを室温にて50mMトリス pH 10、100 mM NaCl 、2mM MgCl2 で行った。膜を、膜 1cm2 当たり20μl のCDP-スター基質( トロピックス( Tropix))を入れた密閉プラスチックバッグに入れ、オートラジオグラフィーフィルムへ2 時間曝した。
【００３０】
使用
本発明のアルカリホスファターゼは、たんぱく質および核酸の検出のための多数の非- 同位体方法において幾つかの潜在的用途がある。たとえば、この酵素の高い最適pHによりアルカリpHでは発光形へ迅速に転化するジオキセタン基質に好適なものとなる。核酸ハイブリッド化におけるように、陽性に帯電した膜においてアルカリホスファターゼと結合したストレプタビジンを用いる場合、バックグラウンドを低下させるために、9.5 以上のpHが好ましい。さらに、このアルカリホスファターゼの高い熱安定性により核酸プローブへの直接の架橋に有用になる。ハイブリッド化およびその後に続く洗浄を、厳しい条件下( すなわち高い温度またはたとえば6M尿素のような変性因子の存在下）に、酵素活性を損なうことなく行うことができる。
【００３１】
異なった生物からのアルカリホスファターゼは、精製の間に同じように反応するかもしれない( またはしないかもしれない）。活性の高いpH最適値は、精製自体には利用することはできないが、しかしスクリーニングについて以下を参照する。高温最適値は、中程度の温度で増殖する宿主たとえば大腸菌へクローニング後に酵素を精製することにおいて有用である。大腸菌からの抽出物を熱処理して高温で変性する全てのたんぱく質を沈殿させることができるであろう。
【００３２】
65 - 75 ℃で安定な酵素が望ましい場合、これらの温度で良好に増殖する新規生物を単離することを試みることによりこのような酵素の発見のチャンスを増すことができる。また、高いpHに耐性のある微生物を選択することもできる。さらに、アルカリホスファターゼが望ましいと分かっていると、化合物 5- ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート( BCIP) の使用によりアルカリホスファターゼ活性について、生物または組換えクローンのライブラリーをスクリーニングすることができる。この化合物からリン酸基を除去すると青色が得られ、活性をスクリーニングするのに非常に都合がよくなる。次いでpH活性曲線を作り、リン酸基除去活性がアルカリホスファターゼであったかどうかを調べるようにしてもよい。
【００３３】
他の実施態様は特許請求の範囲内である。
【００３４】
【配列表】
【００３５】
0003996964.tif 000002
0003996964.tif 000003
【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】精製したロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼのSDS-PAGEゲルの再現である。レーン1 は、分子量マーカーを表す。レーン2 、3 、4 および5 はそれぞれ精製たんぱく質の0.4 、0.8 、1.6 および3.2 μg を表す。
【図２】酵素の温度活性曲線である。温度はx 軸において示される。比活性( μ/ mg) はy 軸において示される。
【図３】  65℃における酵素の安定性のグラフである。65℃( 時間）におけるインキュベーションがx 軸において示される。初期活性パーセントはy 軸において示される。
【図４】酵素のpH活性曲線である。白い四角形は、0.1M CAPS 、1mM MgCl2 および6 mM pNPP において検定された酵素活性を示す。黒塗りのダイヤモンド形は各々0.1Mのエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、1mM MgCl2および6 mM pNPP において検定された酵素活性を示す。x 軸においてpHが示される。比活性( μ/ mg) はy 軸において示される。
【図５】ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼを用いたドットブロットDNAの様々な量(0.01 ng、0.05ng、0.1 ngおよび0.5ng 、 1 ng 、5 ng、10 ng ）の非- 同位体検出を表す。
【図６】クローン化ロドサーマス  マリナスアルカリホスファターゼで標識化したN-ras DNA フラグメントでプローブしたヒトゲノムDNA のサザンブロットを表す。全DNA の四つの量を充填した：1.0 、0.5 、 0.2、 0.1μg 。標識DNA は0.5 、0.25、0.1 、0.05 pg に相当する。
【図７】アルカリホスファターゼの遺伝子および側枝領域を有するロドサーマス  マリナス由来のゲノムDNA の配列である( 配列番号 1) 。
【図８】  pUC19 へクローンされたロドサーマス  マリナス由来のアルカリホスファターゼおよび側枝領域を含むゲノムDNA の1.8kb セグメントを有するプラスミドpCRM1.8 の配列を表す( 配列番号 2) 。
【図９】  Rma アルカリホスファターゼの推定の全長たんぱく質配列( 455 アミノ酸）(配列番号 4) および相当する核酸配列(1368 bp)(配列番号 3) を表す。最初の20個のアミノ酸配列は、大腸菌において単一配列として機能すると推定される。アミノ酸配列の下線の部分は大腸菌から単離されたクローン化酵素のたんぱく質配列化により変化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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