(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’エクソヌクレアーゼ活性を示すがＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の修飾型熱安定酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を示す第２の修飾型熱安定酵素を含有してなる組成物であって、増幅プロセスにおいて、第２の酵素のみを使用するのと比較して、該組成物を使用することにより増幅プロセスの忠実度が向上し、かつ前記第１および第２の修飾型熱安定酵素が、酵素活性を不活性化する修飾試薬により可逆的に修飾されたものであり、室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いて２５℃未満の温度で２０分間、前記第１および第２の修飾型熱安定酵素をインキュベーションしても、それらの酵素の活性の増加が生じず、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで７０℃を超える温度でインキュベーションすると、１０分未満で少なくとも２倍の酵素活性の増加が生じてプライマー伸長産物の形成が可能となる、組成物。
【請求項２】
前記第１および第２の修飾型熱安定酵素が、第１または第２の未修飾型熱安定酵素と修飾試薬との混合物の反応によりそれぞれ生成されるものであり、前記反応が２５℃未満の温度でアルカリ性ｐＨの水性バッファー中で行われ、前記試薬が、以下の一般式：
【化１】
0003969581.tif 000024
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は水素原子または連結されていてもよい有機残基である）
または、以下の一般式：
【化２】
0003969581.tif 000025
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は連結されていてもよい有機残基であり、水素原子はシス配置である）
で表わされる無水ジカルボン酸であり、前記反応により酵素活性の不活性化を生ずる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
無水ジカルボン酸が無水シトラコン酸または無水シスアコニット酸であり、室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いて７０℃未満の温度で１０分間、前記第１および第２の修飾型熱安定酵素をインキュベーションしても、それらの酵素の活性の増加が生じず、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで７０℃を超える温度でインキュベーションすると、１０分未満で少なくとも２倍の酵素活性の増加が生じてプライマー伸長産物の形成が可能となる、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の組成物を含有してなるポリメラーゼ連鎖反応用キット。
【請求項５】
ａ）標的核酸に相補的なプライマー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、および請求項１〜３いずれかに記載の組成物を含有してなる増幅反応混合物と、サンプルとを接触させる工程、ここで、前記誘導体がチオヌクレオチド、７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ、７−デアザ−２’−ｄＡＴＰおよびデオキシイノシン三リン酸からなる群より選択され、
ｂ）前記第１および第２の修飾型熱安定酵素を再活性化してプライマー伸長産物の形成を可能とするのに充分な時間、５０℃を超える温度で、工程ａ）で得られたサンプルと増幅反応混合物との混合物をインキュベートする工程、
を含む、サンプル中に含まれる標的核酸の増幅方法。
【請求項６】
デオキシヌクレオチドまたはその誘導体の１つがｄ−ＵＴＰであり、増幅反応混合物がｄ−ＴＴＰを含まないものである、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸化学の分野に関する。具体的には、核酸配列の増幅方法に関する。本発明によれば、忠実度の高い条件下で核酸の増幅が促進される。本発明を種々の工業、医学および法医学の目的で使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は公知のインビトロ核酸配列増幅方法である（たとえば、特許文献１、特許文献２および特許文献３参照）。反応では変性された標的核酸配列の反対の鎖にハイブリダイズする２つの配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは新しい鎖にデオキシヌクレオチドモノホスフェートを組み込むことによりプライマーの伸長を触媒する。
【０００３】
増幅の特異性はプライマーハイブリダイゼーションの特異性に依存する。典型的なＰＣＲ用いられる高温下では、プライマーは標的配列にのみハイブリダイズする。あまりストリンジェントではない条件下では、プライマーは別の核酸配列に非特異的に結合でき、非特異的伸長生成物の合成を開始する。非特異的ＰＣＲ産物の増幅は標的ＤＮＡの増幅と競合し、標的配列の増幅効率は有意に低下し得る。
【０００４】
過去には非特異的ＰＣＲ産物の形成を低減させるいくつかの方法が開発されている。「ホットスタート」プロトコルと称する方法では、必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するために充分に温度が上昇されるまで、反応混合物から少なくとも１つの決定的な試薬を抜いておく。この様式では反応混合物は欠けていた成分が添加されるまでプライマー伸長反応を支持しない。
【０００５】
ホットスタート法は最初の高温インキュベーション工程の後、反応チューブを開口し、欠けていた試薬を添加することにより手動で実施できる。しかしながら、手動のホットスタート法では夾雑の危険性が増し、労力がかかる。また別に、熱に不安定な物質、例えばワックスを用いて反応成分を分離する（たとえば、特許文献４参照）。高温の反応前インキュベーションにより熱に不安定な物質を溶融し、それにより試薬を混合させる。別の方法ではDNA ポリメラーゼ活性を阻害するための抗体の使用について記載している（たとえば、特許文献５参照）。抗体を、反応混合物を設定する前にポリメラーゼと共にインキュベートし、抗体-DNAポリメラーゼ複合体を形成させる。高温のインキュベーション前工程で抗体を変性させることにより抗体を不活性化する。さらに熱可逆的な様式でDNA ポリメラーゼに結合する短いオリゴヌクレオチドアプタマーのような試薬を添加し、それによりポリメラーゼ活性を阻害することにより伸長産物形成を阻害することもできる（たとえば、非特許文献１参照）。しかしながら、抗体およびアプタマーの製造に費用がかかり、ポリメラーゼ連鎖反応での適用には増幅反応の再設計が必要である。
【０００６】
増幅反応混合物中、高温でインキュベートすることにより再活性化できる熱可逆的に不活性化された熱安定性DNA ポリメラーゼを使用することにより非特異的増幅を低減させることもできる。特異的プライマーハイブリダイゼーションが確実になる温度まで混合物の温度が上昇するまで、ポリメラーゼは不活性であるので、非特異的増幅が低減される（たとえば、特許文献６および特許文献７参照）。
【０００７】
日常的には、5'-3' ポリメラーゼ活性および5'-3' ポリメラーゼ依存性エクソヌクレアーゼ機能を示すテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来の熱安定性DNA ポリメラーゼ（Taq DNA ポリメラーゼ）を用いてPCR を実施する。しかしながら、これは3'-5' エクソヌクレアーゼ活性を有さない（たとえば、非特許文献２参照）。DNA ポリメラーゼの3'-5' エクソヌクレアーゼ活性を「校正活性」と称する。この校正活性によりプライマー鋳型二本鎖の3'末端から誤対合塩基が除去される。これにより増幅中の複製の忠実度が増加するので有利である。Taq ポリメラーゼは3'-5' エクソヌクレアーゼ活性を欠如しているので、これは誤対合プライマー末端を除去しない。しかしながら、これらの誤対合プライマーを伸長させることができ、それにより増幅中に誤った塩基が組み込まれる。いくつかの熱安定性B 型DNA ポリメラーゼは3'-5' エクソヌクレアーゼ活性を呈し、高い忠実度でのDNA 増幅のためのPCR に用いられる。例えば、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）（Pfu DNA ポリメラーゼ；たとえば、特許文献８参照）、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei ）（ロシュ・アプライド・サイエンスより入手可能なPwo DNA ポリメラーゼ）およびサーモコッカス・ゴルゴナリアス（Thermococcus gorgonarius）（Tgo DNA ポリメラーゼ；たとえば、特許文献９参照）に由来するDNA ポリメラーゼが当該分野で公知である。
【０００８】
また、校正活性を有する熱安定性DNA ポリメラーゼを、少なくとも1 つのポリメラーゼがかかる校正活性を呈するDNA ポリメラーゼの混合物としてPCR において使用する（たとえば、特許文献１０参照）。最近、熱安定性3'-5' エクソヌクレアーゼをDNA ポリメラーゼとの混合物としてPCR において使用すると、これは誤対合修正酵素として作用することが示された（たとえば、特許文献１１参照）。
【０００９】
鋳型変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を含む一連の反復サイクルにより、特異的DNA フラグメントが指数関数的に蓄積される。規定のサイクルで合成されたプライマー伸長産物は次のサイクルで鋳型として提供され、従って標的DNA のコピー数は各サイクルでおよそ倍増する。このように、以前のPCR 増幅からの最低量のDNA 夾雑でさえ増幅されて誤った陽性の結果になり得る（繰越夾雑）。従って、かかる夾雑を回避するための方法が開発されている。PCR 増幅ではdUTPをdTTPと置換してウラシル含有DNA （U-DNA ）を生成することができる。増幅前に次のPCR 反応混合物をウラシルDNA グリコシラーゼ（UNG ）と反応させることにより、増幅には適していない夾雑核酸を分解する。polI型熱安定性DNA ポリメラーゼによりdUTPを容易に組み込むことができるが、B 型ポリメラーゼではできない（たとえば、非特許文献３参照）。従って高い忠実度およびUNG 脱夾雑化が必要な場合、B 型DNA ポリメラーゼをPCR 増幅において使用することはできない。
【００１０】
【特許文献１】
米国特許第4,683,202 号明細書
【特許文献２】
米国特許第4,684,195 号明細書
【特許文献３】
米国特許第4,965,188 号明細書
【特許文献４】
米国特許第5,411,876 号明細書
【特許文献５】
米国特許第5,338,671 号明細書
【特許文献６】
米国特許第5,773,258 号明細書
【特許文献７】
米国特許第5,677,152 号明細書
【特許文献８】
国際公開第92/09689号パンフレット
【特許文献９】
国際公開第981590号パンフレット
【特許文献１０】
米国特許第5436149 号明細書
【特許文献１１】
国際公開第01/23583号パンフレット
【非特許文献１】
リン（Lin ）とジャヤセナ （Jayasena）、J.Mol.Biol.271:100-111(1997)
【非特許文献２】
ローヤー（Lawyer）ら、J.Biol.Chem.264:6427-6437(1989)
【非特許文献３】
スラップハウグ （Slupphaug ）ら、Anal.Biochem.211:164-169(1993)
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本明細書に記載する本発明では、高い複製忠実度を有するホットスタートPCR を実施できる熱安定酵素の混合物を開発した。本発明は、特許請求の範囲で規定するプライマーを使用する増幅反応を用いる核酸増幅のための方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬により高い複製忠実度を有する、非特異的増幅が低減された核酸増幅が可能になる。さらに本発明によりUNG 脱夾雑化法の適用が可能になる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
〔１〕  ３’エクソヌクレアーゼ活性を示すが本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の修飾型熱安定酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を示す第２の修飾型熱安定酵素を含有してなる組成物であって、増幅プロセスにおいて、第２の酵素のみを使用するのと比較して、該組成物を使用することにより増幅プロセスの忠実度が向上し、かつ前記第１および第２の修飾型熱安定酵素が、酵素活性を不活性化する修飾試薬により可逆的に修飾されたものであり、室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いて２５℃未満の温度で２０分間、前記第１および第２の修飾型熱安定酵素をインキュベーションしても、それらの酵素の活性の有意な増加が生じず、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで５０℃を超える温度でインキュベーションすると、２０分未満で少なくとも２倍の酵素活性の増加が生じてプライマー伸長産物の形成が可能となる、組成物、
〔２〕  前記第１および第２の修飾型熱安定酵素が、第１または第２の未修飾型熱安定酵素と修飾試薬との混合物の反応によりそれぞれ生成されるものであり、前記反応が２５℃未満の温度でアルカリ性ｐＨの水性バッファー中で行われ、前記試薬が、以下の一般式：
【化３】
0003969581.tif 000002
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は水素原子または連結されていてもよい有機残基である）
または、以下の一般式：
【化４】
0003969581.tif 000003
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は連結されていてもよい有機残基であり、水素原子はシス配置である）
で表わされる無水ジカルボン酸であり、前記反応により酵素活性の不活性化を生ずる、前記〔１〕記載の組成物、
〔３〕  無水ジカルボン酸が無水シトラコン酸または無水シスアコニット酸であり、室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いて７０℃未満の温度で１０分間、前記第１および第２の修飾型熱安定酵素をインキュベーションしても、それらの酵素の活性の有意な増加が生じず、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで７０℃を超える温度でインキュベーションすると、１０分未満で少なくとも２倍の酵素活性の増加が生じてプライマー伸長産物の形成が可能となる、前記〔２〕記載の組成物、 
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の組成物を含有してなるポリメラーゼ連鎖反応用キット、
〔５〕  ａ）標的核酸に相補的なプライマー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、および前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の組成物を含有してなる増幅反応混合物と、サンプルとを接触させる工程、
ｂ）前記第１および第２の修飾型熱安定酵素を再活性化してプライマー伸長産物の形成を可能とするのに充分な時間、５０℃を超える温度で、工程ａ）で得られたサンプルと増幅反応混合物との混合物をインキュベートする工程、
を含む、サンプル中に含まれる標的核酸の増幅方法、ならびに
〔６〕  デオキシヌクレオチドまたはその誘導体の１つがｄ−ＵＴＰであり、増幅反応混合物がｄ−ＴＴＰを含まないものである、前記〔５〕記載の方法、 
に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の主題は、3'エクソヌクレアーゼ活性を示すが本質的にDNA ポリメラーゼ活性を示さない第1 の修飾型熱安定酵素、およびDNA ポリメラーゼ活性を示す第2 の修飾型熱安定酵素を含んでなる組成物であり、増幅プロセスの忠実度は、増幅プロセスにおいて第2 の酵素のみを使用するのに比較して、増幅プロセスにおいて該組成物を使用することにより向上し、かつ該第1 および第2 の修飾型熱安定酵素は酵素活性を不活性化する修飾試薬により可逆的に修飾されており、室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いて25℃未満の温度で20分間、該第1 および第2 の修飾型熱安定酵素をインキュベートすることにより、該第1 および第2 の修飾型熱安定酵素の活性が有意に増加することはなく、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで50℃を超える温度でインキュベートすることにより、20分未満で酵素活性が少なくとも2 倍に増加してプライマー伸長産物の形成が可能となる。
【００１４】
本発明によれば、第1 の酵素が3'エクソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNA ポリメラーゼ活性を示さず、第2 の酵素がDNA ポリメラーゼ活性を示すが、本質的に3'エクソヌクレアーゼ活性を示さないのが好ましい。以下に記載する実施例では、該第2 の熱安定酵素としてテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来のDNA ポリメラーゼ（Taq DNA ポリメラーゼ）および該第1 の熱安定酵素としてアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来のエクソヌクレアーゼIII （Afu Exo III ）に関する本発明の概要を示す。現状の技術から周知のように、適当な酵素を別の供給源、例えば好熱真正細菌または古細菌から取得できる。実例としては：テルムス（Thermus ）属、サーモトガ（Thermotoga）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、ピロディクチウム（Pyrodictium ）属、ピロコッカス（Pyrococcus）属およびサーモシフォン（Thermosiphon）属の種がある。PCR 増幅において有用な熱安定性DNA ポリメラーゼが取得されている代表的な種にはテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）、テルムス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima ）、ピロディクチウム・オカルタム（Pyrodictium occultum）、ピロディクチウム・アビッシー（Pyrodictium abyssi）およびサーモシフォン・アフリカナス（Thermosiphon africanus）などがある。熱安定性DNA ポリメラーゼは米国特許第4,889,818 号、米国特許第5,352,600 号、米国特許第5,079,352 号、PCT/US90/07639、PCT/US91/05753、PCT/US91/0703 、PCT/US91/07076、同時係属中の米国特許出願第08/062,368号、国際公開第92/09689号パンフレットおよび米国特許第5,210,036 号に記載されており、これらは参照により本明細書の一部とする。熱安定性DNA ポリメラーゼはパーキン・エルマー・ノーウォーク、コネティカットより市販により入手できる。本発明の方法は例示された酵素の使用には限定されない。
【００１５】
本発明の最も好ましい態様では、第1 の酵素が3'エクソヌクレアーゼ活性を示すエクソヌクレアーゼであり、第2 の酵素が本質的に3'エクソヌクレアーゼ活性を示さないPolIポリメラーゼである。第1 の酵素としてエクソヌクレアーゼを使用することによりdUTPをdTTPと置換して、増幅反応（たとえば、ＰＣＲ）としての核酸合成反応においてウラシル含有DNA （U-DNA ）を生成することが可能になる。増幅の前に次のPCR 反応混合物をウラシルDNA グリコシラーゼ（UNG ）と反応させ、増幅には適していない夾雑核酸を分解する。従って、本発明の組成物では第1 の酵素が3'エクソヌクレアーゼ活性を示すエクソヌクレアーゼであり、第2 の酵素が本質的に3'エクソヌクレアーゼ活性を示さないPolI型ポリメラーゼであるので、「繰越防止（carry over prevention ）」の可能性のために最も好ましい。
【００１６】
酵素の活性は酵素と修飾試薬間の反応により可逆的にブロック（block ）され、これにより全てまたはほとんど全ての酵素の活性が喪失する。修飾試薬は修飾が高温で可逆的であるように選択される。1 つの態様では、修飾試薬は該熱安定酵素の1 つを修飾できる抗体でよい。抗体を使用する代わりに、任意に、該熱安定酵素の1 つに可逆的な化学的修飾を施す別の修飾試薬により酵素を修飾することもできる。本発明で記載するように、熱安定酵素の可逆的な不活性化をリジン残基の化学的修飾により実施することができる。このリジンの化学的修飾を酸無水物により実施できる（欧州特許第0962526 号）。しかしながら、別のアミノ酸残基の化学的修飾により適当な特性を有する修飾された酵素を得てもよい。可逆的な様式でアミノ基と反応する多くの化合物が文献に記載されている。例えばトリフルオロアセチル化（GoldbergerおよびAnfinsen、Biochemistry 1:410(1962)参照）、アミジン化（amidination ）（HunterおよびLudwig、J. Amer. Chem. Soc. 84:3491(1962) 参照）、マレイル化（maleylation ）（Butlerら、Biochem. J. 103:78 (1967) 参照）、アセトアセチル化（Marzottoら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 26:517(1967) ；およびMarzottoら、Biochim. Biophys. Acta 154:450 (1968) 参照）、テトラフルオロサクシニル化（Brannitzerら、Hoppe-Seylers's Z. Physiol. Chem. 349:265 (1968)参照）、およびシトラコニル化（citraconylation ）（Dixon およびPerham、Biochem. J. 109:312-314(1968) ；ならびにHabeebおよびAtassi、Biochemistry 9 (25):4939-4944 (1970)参照）によりアミノ基が可逆的に修飾されている。
【００１７】
リジン残基のイプシロンアミノ基の化学的修飾に好ましい試薬は無水ジカルボン酸である。従って、本発明によれば、該第1 および該第2 の修飾型熱安定酵素が第1 または第2 の未修飾型熱安定酵素各々と修飾試薬との混合物の反応により製造される組成物が好ましく、ここで該反応は約２５℃未満の温度でアルカリ性ｐH の水性バッファー中で実施され、ここで該試薬は一般式：
【化５】
0003969581.tif 000004
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は水素原子または連結されていてもよい有機残基である）、または
一般式：
【化６】
0003969581.tif 000005
（式中、Ｒ1 およびＲ2 は連結されていてもよい有機残基であり、水素原子はシス配置である）
の無水ジカルボン酸であり、ここで該反応により酵素活性が不活性化される。
【００１８】
有機残基は炭素−炭素結合により、または炭素−ヘテロ原子結合、例えば炭素−酸素、炭素−窒素、または炭素−硫黄結合を介して環に直接結合できる。有機残基は互いに連結されて例えば無水3,4,5,6 −テトラヒドロフタル酸のような環状構造を形成することもできる。
【００１９】
好ましい修飾試薬の例としては、無水マレイン酸；無水マレイン酸置換体、例えば無水シトラコン酸、無水シスアコニット酸、および無水2,3 −ジメチルマレイン酸；無水エクソ−シス−3,6 −エンドクソ−．Δ．4 −テトラヒドロフタル酸；および無水3,4,5,6 −テトラヒドロフタル酸などがある。当該試薬は市販により例えばアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、シグマ・ケミカル・カンパニー（セントルイス、ミズーリー州）、またはスペクトラム・ケミカルMfg.コーポレーション（ガルデナ、カルフォルニア州）から入手可能である。無水マレイン酸置換体試薬である無水シトラコン酸および無水シスアコニット酸を用いた熱安定性DNA ポリメラーゼの修飾については実施例に記載されている。
【００２０】
前記の試薬を用いてアシル化したアミノ基の相対的安定性は以下の順で低下する：無水マレイン酸；エクソ−シス−3,6 −エンドクソ−．Δ．4 −テトラヒドロフタル酸；無水シスシトラコン酸；無水3,4,5,6 −テトラヒドロフタル酸；無水シスアコニット酸；および無水2,3 −ジメチルマレイン酸（Palacianら、前出参照）。
【００２１】
本発明の方法は例示した修飾試薬またはリジン残基の化学的修飾によるタンパク質の修飾に限定するものではない。全てまたはほとんど全ての酵素活性を可逆的に喪失させる、タンパク質と反応する、文献に記載された、いずれの化合物も可逆的に不活性化された酵素の調製に適している。ここで、修飾は増幅反応バッファー中高温でのインキュベーションにより可逆的である。可逆的にタンパク質を修飾する新規化合物を利用できるようになったので、これらは本発明の方法に使用するのに非常に適している。従って、本発明の修飾型熱安定酵素の調製のための化合物には以下の特性を満足する化合物などがある：
（１）プライマー伸長を触媒する熱安定酵素との反応により酵素が有意に不活性化される；
（２）得られた修飾型酵素を水性バッファー中pH約8 〜9 で約室温（25℃）かまたはそれ以下の温度でインキュベートすることにより約20分未満に酵素活性が有意には増加しない；および
（３）得られた修飾型酵素を室温でpH約8 〜9 に処方した増幅反応バッファー中、約50℃を超える高温でインキュベートすることにより約20分未満に酵素活性が少なくとも2 倍に増加する。
【００２２】
本発明に従ってとりわけ好ましいのは、無水シトラコン酸または無水シスアコニット酸、最も好ましくは無水シスアコニット酸の修飾試薬としての使用である。
【００２３】
室温でのｐＨがアルカリ性である水性バッファーを用いた70℃未満の温度で10分間のインキュベーションにより第1 および第2 の修飾型熱安定酵素の活性が有意に増加せず、水性バッファー中、アルカリ性ｐＨで70℃を超える温度でのインキュベーションでは10分未満で酵素活性が少なくとも2 倍に増加し、これによりプライマー伸長産物の形成が可能になる、化学的修飾で可逆的に修飾された該第1 および第2 の修飾型熱安定酵素を含んでなる組成物が最も好ましい。かかる好ましい組成物を得るには、修飾試薬として、好ましくは無水シトラコン酸または無水シスアコニット酸、より好ましくは無水シスアコニット酸を使用する。
【００２４】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は検出対象のプライマー、プローブおよびオリゴマーフラグメントを意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D- リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含む）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のN グリコシドであるポリヌクレオチドのいずれか別の型に対する総称である。「核酸」および「オリゴヌクレオチド」の用語間で長さの区別を意図するものではなく、これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。これらの用語には二本鎖および一本鎖DNA 、並びに二本鎖および一本鎖RNA が含まれる。いずれかの適当な方法でオリゴヌクレオチドを調製することができる。合成方法の概説に関してはGoodchild 、Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187(1990) にて提供され、これは参照により本明細書の一部とする。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」なる用語は相補的な塩基対形成による、2 つの一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは十分に相補的である核酸鎖間、または誤対合の小領域を含む「実質的に相補的である」核酸鎖間で生じ得る。十分に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件を  「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称する。実質的に相補的な配列の安定した二本鎖はあまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で達成できる。核酸技術の分野の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度および誤対合塩基対の発生率などの多くの変動因子を考慮して、当業界により提供されるガイダンスに従って二本鎖の安定性を経験的に決定できる（Sambrookら、(1989)前出参照）。
【００２６】
一般に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を規定のイオン強度およびpHで、特異的配列に関して融解温度（Tm）より約5 ℃低くなるように選択する。Tmは（規定のイオン強度およびpHで）50％の塩基対が解離した温度である。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩和することにより、配列誤対合を許容できるようになり；許容できる誤対合の程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調整により調節できる。
【００２７】
「プライマー」なる用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち適当なバッファー中および適当な温度で４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合化のための試薬（すなわちDNA ポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、DNA 合成の開始点として作用できる、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドアナログ、例えば「ペプチド核酸」はプライマーとして作用することができ、本明細書で用いる「プライマー」なる用語の意味に包含される。プライマーは好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは意図されるプライマーの用途に依存するが、典型的には6 から50ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子には一般には鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度が要求される。プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分相補的でなければならない。
【００２８】
本明細書で用いる「プライマー伸長」なる用語は、開始点としてプライマーを用いる個々のヌクレオシド三リン酸の重合化の結果生じるDNA の合成、およびプライマーを伸長させるためのプライマーへのさらなるオリゴヌクレオチドの結合の双方を意味する。本明細書で用いる「プライマー伸長」なる用語は、次いで将来増幅サイクルで標的として役に立つことができるより長い産物を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのライゲーションを包含することを意図する。本明細書で用いる「プライマー」なる用語は隣接点でハイブリダイズする第2 のオリゴヌクレオチドのライゲーションにより伸長するライゲーション媒介増幅方法で用いられるオリゴヌクレオチドを包含することを意図する。
【００２９】
プライマーの検出または固定を可能にするが、DNA 合成の開始点として作用するというプライマーの基本的な特性を変化させない別の特徴をプライマーに組み込むことができる。例えば、プライマーは標的核酸にハイブリダイズしないが増幅産物のクローニングを容易にする別の核酸配列を5'末端で含有できる。ハイブリダイズするために鋳型に十分相補的であるプライマーの領域を本明細書ではハイブリダイジング領域と称する。
【００３０】
「標的領域」および「標的核酸」なる用語は増幅される核酸の領域または配列を意味する。プライマーハイブリダイゼーション部位をプライマーハイブリダイゼーションのための標的領域と称することができる。
【００３１】
本明細書で用いるように、オリゴヌクレオチドと標的配列間に存在する誤対合の数がサンプル中に存在し得るオリゴヌクレオチドと非標的配列間に存在する誤対合の数よりも少ない場合、オリゴヌクレオチドプライマーは標的配列に関して「特異的」である。存在する誤対合の数がオリゴヌクレオチドと標的配列間に存在する誤対合の数ほどである場合のみ、安定した二本鎖を形成するハイブリダイゼーション条件を選択できる。かかる条件下、オリゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定した二本鎖を形成できる。従って、適当にストリンジェントな増幅条件下で標的特異的プライマーを使用することにより、標的プライマー結合部位を含有するこれらの標的配列の特異的増幅が可能になる。配列特異的増幅条件を用いることにより正確に相補的なプライマー結合部位を含有するこれらの標的配列の特異的増幅が可能になる。
【００３２】
「非特異的増幅」なる用語は、標的配列以外の配列にハイブリダイズし、プライマー伸長の基質として役立つプライマーから得られる標的配列以外の核酸配列の増幅を意味する。プライマーの非標的配列へのハイブリダイゼーションを  「非特異的ハイブリダイゼーション」と称し、低温で、低ストリジェント反応前条件で生じ得る。
【００３３】
「熱安定酵素」なる用語は相対的に熱に安定な酵素を意味する。熱安定酵素は非可逆的失活を被ることなく、修飾基を除去するために用いられる、典型的には50℃を超える高温インキュベーションに耐えることができ、本発明の方法において使用できる修飾型熱安定酵素には、熱安定性DNA ポリメラーゼおよび熱安定性エクソヌクレアーゼなどがある。
【００３４】
「熱安定性DNA ポリメラーゼ」なる用語は相対的に熱に安定で、ヌクレオシド三リン酸の重合化を触媒して、標的配列の核酸鎖の1 つに相補的であるプライマー伸長産物を形成する酵素を意味する。酵素はプライマーの3'末端で合成を開始し、合成が終止するまで、鋳型の5'末端の方向に進行する。精製された熱安定性DNA ポリメラーゼに関しては米国特許第4,889,818 号、米国特許第5,352,600 号、米国特許第5,079,352 号、PCT/US90/07639、PCT/US91/05753、PCT/US91/0703 、PCT/US91/07076、同時係属中の米国特許出願第08/062,368号、国際公開公報第92/09689号および米国特許第5,210,036 号に記載されており、これらは参照により本明細書の一部とする。
【００３５】
「熱安定性3'-5'-エクソヌクレアーゼ」なる用語は相対的に熱に安定であり、DNA ポリメラーゼとの混合物としてPCR において使用する場合、誤対合修正酵素として作用する酵素を意味する。熱安定性3'-5'-エクソヌクレアーゼは増幅中に新生核酸鎖の3'末端から誤対合核酸を除去する。かかる熱安定性3'-5'-エクソヌクレアーゼについては例えば国際公開公報第01/23583号に記載されている。
【００３６】
本明細書で用いる生物に「由来する」酵素とは生物から精製されるか、または生物から精製された酵素の組換え版である酵素を意味し、分子生物学の技術を用いてアミノ酸配列が修飾されている酵素を含む。
【００３７】
本発明の組成物における第1 の酵素の第2 の酵素に対する比率は1:10から1:75の範囲であるのが好ましい。
別の供給源に由来する酵素および化学的修飾の別の方法に関しては、異なる比率の酵素を適用できる。
【００３８】
該酵素の化学的修飾をバッファー中アルカリ性条件で約25℃未満の温度で実施できる。使用できるバッファー成分にはpH約7.5 から9.5 のトリスHCl などがある。KCl のような別の成分（好ましくは約100mM から1M）、または界面活性剤、好ましくはトゥイーン20（約0.1 ％から2 ％）などが含まれ得る。しかしながら別の成分はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
第1 および第2 の酵素の化学的修飾を、0.1mg/mlから10mg/ml 、好ましくは 0.5mg/ml から5mg/mlの濃度で該酵素を修飾試薬と共にインキュベートすることにより実施できる。修飾試薬を1:10から1:200 、好ましくは1:10から1:100 のモル比（タンパク質：修飾試薬）で用いることができる。しかしながら、異なる濃度および条件を異なるタンパク質および修飾試薬に適用することができる。
【００４０】
化学的修飾の後、タンパク質溶液を保存バッファーに対して透析できる。保存バッファーは、pHは好ましくは約7.5 から10、より好ましくは8.5 から9.5 、および好ましくは10mMから500mM 、より好ましくは約20mMから50mMの濃度でトリスHCl を含有できる。さらに、保存バッファーは塩、好ましくはKCl を10mMから500mM の濃度で、界面活性剤のような別の添加物、好ましくはトゥイーン20、SH- 保護試薬、グリセロールおよびEDTAを含有することができる。
【００４１】
前記酵素の混和物（Blends）は酵素溶液を混合することにより得ることができる。さらなる希釈工程を用いて適当な酵素混和物を得ることもできる。本発明の好ましい態様では、混和物はポリメラーゼおよびエクソヌクレアーゼを10:1から75:1の容量比の範囲で含有する。DNA ポリメラーゼを適当な容量活性で、好ましくは５単位（units ）/ μl から２０単位/ μl で用い、これを適当な濃度（好ましくは1mg/mlから10mg/ml ）を有するエクソヌクレアーゼ溶液と混合する。しかしながら、異なる濃度および比率を用いて本発明に有用な酵素混和物を得ることができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、第1 および第2 の修飾型熱安定酵素は連鎖伸長反応において基質としてd-UTP を受容する。本発明によれば、第1 の修飾型熱安定酵素がアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来の3'-5' エクソヌクレアーゼを修飾試薬で修飾してなるものであり、第2 の修飾型熱安定酵素がテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来のDNA ポリメラーゼを修飾試薬で修飾してなるものであるのが好ましい。
【００４３】
本発明の態様は本発明の組成物を含んでなる「反応混合物」である。「反応混合物」なる用語は規定の反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を意味する。「増幅反応混合物」は増幅反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を意味し、典型的には適当なバッファー中にオリゴヌクレオチドプライマーおよびDNA ポリメラーゼを含有する。「PCR 反応混合物」は典型的には適当なバッファー中にオリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性DNA ポリメラーゼ、dNTPおよび2 価の金属カチオンを含有する。反応混合物は、反応を可能にするのに必要な全ての試薬を含有する場合、完全と称し、必要な試薬のサブセットのみを含有する場合、不完全と称する。利便性、保存安定性の理由で、および適用に依存する成分の独立した濃度調整を可能にするために、反応成分を各々全成分のサブセットを含有する別個の溶液として通常保存すること、並びにさらに反応成分を反応前に組み合わせて完全な反応混合物を作製することを当業者であれば理解するであろう。
【００４４】
本発明の方法は熱活性化熱安定酵素を用いる増幅反応の実施を含み、ここで活性な第2 の酵素または酵素組成物は各々プライマー伸長に必要である。酵素を活性化する高温インキュベーションの前には増幅反応混合物はプライマー伸長を支持（support ）せず、非伸長産物、そうでなければ非特異的なものが形成される。酵素を再活性化する高温インキュベーションに続いて、増幅反応を、反応特異性を確実にする高温で維持する。従って、増幅特異性を確実にする条件下でのみプライマー伸長産物が形成される。
【００４５】
本発明の方法では、熱活性化された第2 の酵素は活性化状態でプライマー伸長反応を触媒する。典型的な増幅反応（例えばPCR ）で使用するために、熱活性化された熱安定な第2 の酵素は、その活性化状態でDNA ポリメラーゼ活性を有する。
【００４６】
本発明の別の態様は本発明の組成物を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応用キットである。
【００４７】
本発明はまた本方法を実行するのに有用な成分を含んでなるキット、多容器ユニットにも関する。有用なキットは可逆的に不活性化されている熱安定酵素および増幅反応を実行する１つまたはそれ以上の試薬、例えばオリゴヌクレオチドプライマー、基質ヌクレオシド三リン酸、コファクター、および適当なバッファーを含有する。
【００４８】
サーモサイクルの数を鋳型DNA の量およびその純度に依存して、約18から約50サイクルにできる。
【００４９】
本発明の方法は種々のバッファー、並びに種々のデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド濃度に対して比較的に影響されない。
【００５０】
使用できるバッファー成分にはpH約7.5 から9.5 、および約50から500 ｍM 、好ましくは約100 から250 ｍM の濃度のトリスHCl 、約2 から6mM の濃度のMgCl2 、反応容量の約1 から5 ％の濃度のDMSO、約0.3 ｍM （任意に約0.05ｍM ）の濃度のベタイン、1 ％メルカプトエタノール、約0.28％のトゥイーン20および/ または約0.02％ノニデット40などがある。しかしながらバッファー成分はこれらに限定するものではない。
【００５１】
修飾アミノ基の脱アシル化は温度上昇および付随するpHの低下の双方の結果生じる。典型的には室温でpH7.5 から9.0 に処方されたトリスHCl バッファー中で増幅反応を実施する。室温ではアルカリ性反応バッファー条件がアミノ基のアシル化形態に都合がよい。反応バッファーのpHを室温でpH7.5 から9.0 に調整するが、トリスHCl 反応バッファーのpHは温度上昇と共に低下する。従って反応バッファーのpHは、増幅が実施される、とりわけ活性化インキュベーションが実施される高温で低下する。反応バッファーのpHの低下はアミノ基の脱アシル化に都合がよい。
【００５２】
高温の反応条件の結果生じるpHの変化は使用するバッファーに依存する。生理学的反応において用いられる多様なpHのバッファーの温度依存性がGoodら、 Biochemistry 5(2):467-477(1966)に報告されている。トリスバッファーでは、pKa 、すなわち緩衝範囲の中間点でのpHの変化は、以下のように温度と相関する：．Δ．pKa/°C=-0.031。例えば25℃で処方されたトリスHCl バッファーは活性化インキュベーションのために95℃まで上昇させた場合、pKa は2.17に低下する。
【００５３】
増幅反応は典型的にはトリスHCl バッファーで実施されるが、増幅反応を温度に伴うpH変化がより小さいまたはより大きいバッファーで実施することができる。使用するバッファーに依存して、多かれ少なかれ安定な修飾型酵素が望ましいであろう。例えばあまり安定でない修飾型酵素を生じる修飾試薬を用いることにより、バッファーpHのより小さい変化で十分な酵素活性の回復が可能になる。前記したような種々の試薬で修飾した酵素の相対的安定性を経験的に比較することにより、特定のバッファーでの使用に適した、修飾型酵素の選択が導かれる。
【００５４】
本発明のとりわけ好ましい態様では、DNA の融点を低下させる薬剤、例えばグリセリン、トレハロースおよびその他の当業者に公知のベタインまたはDMSOのごとき薬剤を反応混合物に添加する。
【００５５】
デオキシヌクレオチドはdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPから選択できるが、これらに限定するものではない。しかしながら、本発明によれば、デオキシヌクレオチドの誘導体を使用することも可能である。デオキシヌクレオチド誘導体は熱安定性DNA ポリメラーゼにより、温度サイクル反応において合成される合成中のDNA 分子に組み込むことができるこれらのデオキシヌクレオチドまたは修飾型デオキシヌクレオチドとして定義される。デオキシヌクレオチド誘導体の例としてはチオヌクレオチド、7-デアザ-2'- dGTP 、7-デアザ-2'- dATP 、ならびにdATP、dGTP、dTTPまたはdCTPの代替デオキシヌクレオチドとしても使用できるデオキシイノシン三リン酸などがある。しかしながら、デオキシヌクレオチド誘導体はこれらの実例に限定されるものではない。本発明の好ましい態様では、ｄUTP をdTTPの代替として用いて増幅反応、例えばPCR のような核酸合成反応においてウラシル含有DNA （U-DNA ）を製造する。
【００５６】
前記したデオキシヌクレオチドおよびその誘導体を約100 μM から約4mM の濃度で用いるのが好ましい。
【００５７】
本発明の別の態様は、工程：
ａ）標的核酸に相補的なプライマー、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体、ならびに第1 の修飾型熱安定酵素および第2 の修飾型熱安定酵素を含む本発明の組成物を含有してなる増幅反応混合物と、サンプルとを接触させる工程；
ｂ）第1 および第2 の修飾型熱安定酵素を再活性化してプライマー伸長産物を形成させるのに充分な時間、約50℃を超える温度で、工程ａ）で得られたサンプルと増幅反応混合物との混合物をインキュベートする工程；
を含む、サンプル中に含まれる標的核酸の増幅方法である。
【００５８】
本発明の好ましい態様では、該第1 の修飾型熱安定酵素はアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来の3'-5' エクソヌクレアーゼを修飾試薬で修飾してなるものであり、該第2 の修飾型熱安定酵素はテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来のPol I 型DNA ポリメラーゼを修飾試薬で修飾してなるものである。
【００５９】
本発明の方法の好ましい態様では、デオキシヌクレオチドまたはその誘導体の1 つはdUTPであり、dTTPは増幅反応混合物に含まれない。
【００６０】
本発明の組成物を標的核酸の増幅に用いることができる。好ましい態様では、可逆的に不活性化された熱安定性DNA ポリメラーゼおよび3'エクソヌクレアーゼ活性を示す可逆的に不活性化された熱安定酵素を用いてPCR 増幅を実施する。PCR 増幅において用いられるアニーリング温度は典型的には約55から75℃であり、反応前インキュベーションはアニーリング温度と等しいかまたはそれより高い温度で、好ましくは約90℃を超える温度で実施する。増幅反応混合物を好ましくは約90から100 ℃で、約12分間までインキュベートし、温度サイクルの前に修飾型酵素を再活性化させる。
【００６１】
典型的なPCR 増幅における第1 の工程は二本鎖標的核酸の熱変性からなる。サンプル核酸の変性に必要な正確な条件はサンプル核酸の長さおよび組成に依存する。典型的には90から100 ℃で約10秒から約4 分間までのインキュベーションがサンプル核酸を十分に変性するのに有効である。最初の変性工程を反応前インキュベーションとして提供し、DNA ポリメラーゼを再活性化させることができる。しかしながら、最初の変性工程の長さおよび温度、並びに酵素の不活性化に使用した修飾試薬に依存して、酵素活性の回復が不完全になり得る。酵素活性の回復が最大であるのが望ましい場合、反応前インキュベーションを延長させるか、または、他方、増幅サイクルの数を増加させることができる。
【００６２】
本発明の好ましい態様では、修飾型酵素および最初の変性条件を、回復可能な酵素活性の分画のみが最初のインキュベーション工程で回復されるように選択する。各々が高温変性工程を含む次のPCR のサイクルにより酵素活性がさらに回復される。従って、酵素活性の活性化は増幅の最初のサイクルを越えて遅延する。DNA ポリメラーゼ活性のこの「タイムリリース性（time release）」が観察され、非特異的増幅をさらに低下させる。過剰のDNA ポリメラーゼが非特異的増幅に寄与することが知られている。本方法では、標的配列の数が少ない場合、存在するDNA ポリメラーゼ活性の量は増幅の最初の段階では少なく、これは形成される非特異的伸長産物の量を低減させる。標的配列の数が多い場合、最大DNA ポリメラーゼ活性は増幅の後の段階で存在し、これにより高い増幅収量が可能になる。必要な場合、増幅サイクル数を増加させて最初のサイクルに存在するDNA ポリメラーゼ活性のより低い量を補うことができる。
【００６３】
本発明の方法の利点は反応混合物の最初の調製の後、反応混合物の操作が必要でないことである。従って、方法は自動増幅系において、およびインサイチュー増幅法で使用するのに理想的であり、この方法では最初の変性工程の後の試薬の添加またはワックスバリヤの使用は不便で、実際的ではない。
【００６４】
本発明の方法はとりわけ非特異的増幅の低減およびPCR における「繰越」夾雑の防止に適している。しかしながら、本発明はいずれかの特定の増幅系に限定されるものではない。本発明の可逆的不活性化酵素を、熱安定酵素を使用し、増幅特異性を達成するために反応温度に依存する任意のプライマーを使用する増幅系において使用することができる。本発明の方法を、熱安定酵素を使用する等温増幅系に適用することができる。酵素活性を回復するために高温での一時的なインキュベーションのみが必要とされる。酵素活性を回復するために反応混合物を高温インキュベーションに供した後、適当な反応温度で反応を実施する。
【００６５】
PCR （米国特許第4,683,195 号；第4,683,202 号；および第4,965,188 号）に加えて別の増幅方法には、非限定例としては以下のものなどがある：リガーゼ連鎖反応(LCR、WuおよびWallace 、Genomics 4:560-569(1989)並びにBarany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193(1991))、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(Barany 、PCR Methods and Applic. 1:5-16(1991)) 、Gap-LCR （国際公開第 90/01069 号パンフレット) 、修復連鎖反応( 欧州特許公開番号第439,182 A2号), 3SR (Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177(1989) ；Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878(1990) ；国際公開第 92/0880A 号パンフレット) 並びにNASBA ( 米国特許第5,130,238 号) 。前記の参考文献は全て参照により本明細書の一部とする。本発明をいずれか特定の増幅系に限定するものではない。別の系が開発されたとき、それらの系は本発明の実行により有利になるであろう。増幅系の最近の調査はAbramsonおよびMyers 、Current Opinion in Biotechnology 4:41-47(1993)で公開されており、これは参照により本明細書の一部とする。
【００６６】
各々の増幅反応に適したサンプル調製法は当分野で報告されている（例えばSambrookら、前出および前記で引用した増幅方法について記載する参考文献を参照）。単純で迅速な、標的配列のPCR 増幅のためのサンプル調製法がHiguchi 、PCR Technology (Erlich編、ストックトン・プレス、ニューヨーク、1989) および PCR Protocols、第18-20 章(Innisら編、アカデミック・プレス、1990) に記載されており、双方共に参照により本明細書の一部とする。当業者は適当なプロトコルを選択し、経験的に最適化できるであろう。
【００６７】
増幅産物の検出方法は文献に詳細に記載されている。標準的な方法にはゲル電気泳動、またはオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによる分析などがある。プローブと増幅された核酸間で形成されたハイブリッドの検出を、ドットブロットアッセイ様式および逆ドットブロットアッセイ様式などの種々の様式で実施することができる。（Saiki ら、Nature 324:163-166(1986)；Saiki ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230(1989)；国際公開第89/11548号パンフレット；米国特許第5,008,182 号および第5,176,775 号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis ら編、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア州)337-347参照）；各々を参照により本明細書の一部とする。マイクロウェルプレートを用いる逆ドットブロット法は同時係属中の米国特許出願第141,355 号；米国特許第5,232,829 号；Loeffelholz ら、J. Clin. Microbiol. 30(11):2847-2851(1992)；Mulderら、J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300(1994) ；およびJackson ら、AIDS 5:1463-1467(1991)に記載されており、各々参照により本明細書の一部とする。
【００６８】
5'- ヌクレアーゼアッセイと称するもう1 つの適当なアッセイ方法が米国特許第5,210,015 号；およびHolland ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280(1991) に記載されている；双方共に参照により本明細書の一部とする。5'- ヌクレアーゼアッセイの場合、DNA ポリメラーゼ、例えばTaq DNA ポリメラーゼの5'から3'エクソヌクレアーゼ活性によるプライマー伸長と同時に標識プローブが分解される。プローブ分解産物の検出により、プローブと標的DNA 間のハイブリダイゼーションが生じ、増幅反応が生じたことが示される。1994年9 月1 日出願の同時係属中の米国特許出願第08/299,682号および1994年11月23日出願の第08/347,657号（双方共に参照により本明細書の一部とする）は増幅と同時に生じるプローブの分解を検出するための改善された方法について記載している。
【００６９】
反応混合物中の二本鎖DNA の全量の増加をモニター観察することによる核酸の増幅を検出するための別法がHiguchi ら、Bio/Technology 10:413-417(1992) ；Higuchi ら、Bio/Technology 11:1026-1030(1993) ；および欧州特許公開番号第487,218 号および第512,334 号に記載されており、各々は参照により本明細書の一部とする。二本鎖標的DNA の検出はエチジウムブロマイド（EtBr）およびその他のDNA 結合標識が二本鎖DNA に結合したときに呈する蛍光の増加に依る。標的配列の合成の結果生じる二本鎖DNA の増加により蛍光が検出可能な増加に至ることである。この方法における問題は非標的配列の合成、すなわち非特異的増幅により、標的配列の合成の結果生じる蛍光の増加の測定値と干渉する蛍光の増加に至る。従って、本発明の方法によれば非特異的増幅が低減され、それにより非標的配列の増幅の結果生じる蛍光の増加を最低にするので、当該方法はとりわけ有用である。
【００７０】
以下に提示する本発明の実施例は説明目的でのみ提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本願の特許請求の範囲に記載する本発明の多くの態様は前記の本文および以下の実施例を読めば当業者には明らかであろう。
【００７１】
【実施例】
実施例1
エクソヌクレアーゼIII （Exo III ）の化学的修飾
この実施例は無水シスアコニット酸を用いたExo III の化学的修飾について記載する。Exo   III 活性の完全な不活性化を得るのに必要な不活性化反応における酵素に対する修飾試薬のモル比を示す、修飾型Exo III の活性の測定を実施例1 および実施例3 に記載する。
【００７２】
組換えExo III を例えば国際公開第 0123583号パンフレットに記載されるようにして大腸菌（E.coli）LE392 （ロシュ株BMTU  7369）から精製できる。Exo III を50mMトリス、300mM KCl 、1mM EDTA、0.2 ％トゥイーン20からなる、 25 ℃、pH8.0 の溶液中、1.3mg/mlの濃度で用いた。
【００７３】
無水シスアコニット酸は市販により入手可能である（シグマA-3413、ドイツ）。1 組みの修飾反応では無水シスアコニット酸を以下の濃度：26.9mg/ml 、40.3mg/ml 、53.8mg/ml 、80.7mg/ml 、107.6mg/ml；でメタノール（メルク）に溶解した。
【００７４】
一連の各溶液に関しては、溶解した無水シスアコニット酸  72μl をExo III 溶液7.2ml に加え、無水シスアコニット酸に対するExo III のモル比でおよそ1:40, 1:60, 1:80, 1:120 および1:160 を含有する溶液が得られた。溶液を4 ℃で一晩インキュベートしてExo III を不活性化した。化学的修飾の後、酵素を保存バッファー（20mMトリス、250mM KCl 、0.1mM EDTA、1mM DTT 、0.2 ％トゥイーン20、50％グリセロール、25℃でpH 9.0）に対して透析した。透析後、最終濃度は4.9 mg/ml であった。化学的に修飾した酵素にはファストスタートExo III （FS Exo III）という名称を使用した。
【００７５】
FS Exo III活性アッセイ（アガロースゲル）：
１）アッセイ
このアッセイでは直鎖状DNA フラグメントのエクソヌクレアーゼ活性による分解をモニター観察した。この実施例では熱インキュベーションによりFS Exo IIIを再活性化させる前および後の双方でのFS Exo IIIに関する活性アッセイについて記載する。修飾型のFS Exo IIIのサンプル（1:40, 1:60, 1:80, 1:120 および 1:160）およびExo III （修飾していない；4.5 mg/ml ）を50mMトリス、10mM KCl、5mM (NH4)2SO4 、2mM MgCl2 からなるバッファーで各々1:10および1:45に希釈した。バッファーのpHは室温で8.3 であった（ファストスタートTaq DNA ポリメラーゼ PCRバッファー；ロシュ・アプライド・サイエンス (RAS)、Cat. No. 2158264）。希釈したFS Exo IIIおよびExo III のサンプルを80℃で3 時間インキュベートした。さらに対照としてサンプルを氷上で保存した。
【００７６】
２）基質の調製（5'伸長を有するDNA ）：
SuRE/ 切断バッファー B (10ｘ濃度; RAS, Cat. No. 1417967):       80μl
pBR 322 DNA (277ng/ μl; RAS, Cat. No. 481238 ):                576 μl
Bam HI (40U/μl; RAS, Cat. No. 798975):                         16μl
水:                                                             128 μl
【００７７】
混合物を37℃で20分間インキュベートし、切断したDNA を高純度PCR 精製キット（RAS, Cat. No. 1732668 ）で精製した。切断したDNA （pBR 322 x Bam HI）の最終濃度は141.5ng/μl であった。
【００７８】
３）反応混合物（15x ）：
拡大（Expand）高忠実度 PCRバッファー
(10 ｘ濃度.; RAS,  Cat. No.1732641)                              150μl
基質 (pBR 322 x Bam HI; 141.5ng/μl)                            105 μl
水                                                              1095μl
【００７９】
反応混合物90μl に酵素希釈物（前記を参照）10μl を添加した。65℃で3 時間インキュベートした後、10μl 尿素で反応を停止させた。反応物のアリコート（20μl ）を0.5 ％アガロースゲル上で分析した（図１）。
【００８０】
実験条件下で、化学的に修飾したエクソヌクレアーゼは残存性の活性を示さなかった。80℃で3 時間インキュベートした後、エクソヌクレアーゼを再活性化させて、活性を観察する。残存性の活性の程度は用いた修飾試薬のモル比に依存する。直鎖状DNA 基質の分解の程度は、修飾の比率が低いほど再活性化の後観察される活性が高くなることを示している。
【００８１】
実施例2
Taq DNA ポリメラーゼの化学的修飾：
この実施例は無水シスアコニット酸を用いるTaq DNA ポリメラーゼの化学的修飾について記載する。大腸菌（E.coli）から精製した組換えTaq DNA ポリメラーゼ（Taq ）を50 mM トリス、300 mM KCl、1 mM EDTA 、0.2 ％トゥイーン20からなる、25℃、pH 8.0の溶液中1.22 mg/mlの濃度で使用した。
【００８２】
修飾反応には、無水シスアコニット酸をメタノール中最終濃度22.0 mg/mlで溶解した。無水シスアコニット酸溶液1061μl をTaq DNA ポリメラーゼ溶液106.1ml に添加した。溶液を4 ℃で一晩インキュベートしてTaq を不活性化した。化学的修飾の後、酵素を保存バッファー（20 mM トリス、100 mM KCl、0.1 mM EDTA 、1 mM DTT、0.2 ％トゥイーン20、50％グリセロール、25℃でpH 9.0）に対して透析した。透析後、サンプルも保存バッファーで1:29に希釈した。化学的に修飾した酵素にはファストスタートTaq DNA ポリメラーゼ（FS Taq）という名称を使用した。
【００８３】
実施例4 に記載するようにFS Taqの活性を測定した。酵素を80℃で3 時間インキュベートしてポリメラーゼ活性を活性化した。酵素を保存バッファー中希釈（1:300 から1:700 ）し、以下に記載するように活性を決定した。80℃で3 時間インキュベートしなかった酵素サンプルは活性を示さなかった（＜1 ％）。
【００８４】
実施例３
FS Exo IIIの再活性化
１）試験原理
エクソヌクレアーゼ活性を試験するために、酵素サンプルを3H標識DNA 1 μg と共に65℃で1 時間インキュベートし、3H標識ヌクレオチドの放出を測定した。
【００８５】
２）方法
再活性化
FS Exo III（1:40修飾；c ＝4.9mg/ml）をファストスタートTaq DNA ポリメラーゼPCR バッファー（RAS, Cat. No. 2158264 ）で1:10に希釈した。100 μl のアリコートを異なる温度（65°C 、70°C 、75°C 、80°C 、85°C 、90°C および95°C ）で10分間インキュベートした。
【００８６】
反応混合物（10x ）：
拡大高忠実度 PCRバッファー
(10 ｘ濃度、RAS, Cat. No.1732641)                               100 μl
3H-DNA (約 0.25 μg/μl)                                        200 μl
水                                                              340 μl
【００８７】
反応混合物のアリコート（64μl ）に予めインキュベートしたエクソヌクレアーゼ（36μl 、FS Exo III 18 μg に相当）のサンプルを添加した。65℃で1 時間インキュベートした後、サンプルを氷上で冷却した。ヘリング（hering）精子DNA （1mg/ml）100 μl および10％TCA 溶液300 μl を添加することにより、DNA を沈殿させた。氷上で20分間保存した後、サンプルを遠心分離した。上澄のアリコート（400 μl ）を除去し、シンチレーション液2ml 中βカウンターで計測した（フォーミュラー989 、パッカード・バイオサイエンスB.V.）。算出したΔcpm 値を用いてFS Exo IIIの再活性化率を定量した。
【００８８】
実験条件下、70℃を超える温度でインキュベートしたときのFS Exo IIIの再活性化を観察する。70℃までの温度では活性化は観察されない（図２参照）。
【００８９】
実施例4
FS Taqの再活性化
１）試験原理
FS Taqの活性をアッセイするこの試験では、ポリメラーゼ活性用により未標識ヌクレオチドおよび標識α32P-dCTPを合成DNA に組み込む。鋳型／プライマーハイブリッドを基質として用いる。鋳型／プライマーハイブリッドはM13 シークエンシングプライマー（5'- GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' ）にハイブリダイズしたM13mp9ss DNAから成る。合成生成物をTCA で沈殿させ、組み込まれたα32P-dCTPをシンチレーションカウンターを用いて定量する。
【００９０】
２）方法
予備インキュベーション
FS Taq (5 U/μl 、 RAS, Cat. No. 2158264) をファストスタート Taq-DNAポリメラーゼ PCRバッファー（ RAS, Cat. No. 2158264) で1:10に希釈した。50μl アリコートを異なる温度(65 °C 、70°C 、75°C 、80°C 、85°C 、90°C 、95°C)で１０分間インキュベートした。予めインキュベートした後、サンプルを保存バッファー（20mMトリス、100mM KCl 、0.1mM EDTA、1mM DTT 、0.2 ％トゥイーン20, 50％グリセロール、25℃で pH 9.0 ）で1:30に希釈した。
【００９１】
試験混合物
以下の試薬を含有する50μl で反応を実施した：
67mMトリス、25℃で pH 8.3 、5mM MgCl2 、10mMメルカプトエタノール、0.2 ％ポリドカノール、0.2mg/mlゼラチン、200 μM dATP、100 μM dCTP、200 μM dGTP、200 μM dTTP、DNA/プライマー混合物(1μg DNA; 0.3μg プライマー) およびα32P-dCTP (1 μCi) 。
酵素希釈物3 μl を試験混合物に添加してよく混合し、65℃で60分間インキュベートする。インキュベーションの後、サンプルを氷上に置き、DNA を10％ TCA溶液で沈殿させた。サンプルをGFC フィルター（ワットマン）を通して濾過し、フィルターを5 ％ TCAで3 回洗浄し、乾燥してシンチレーション液2ml 中βカウンターで計測した。算出したΔcpm 値を用いてFS Taqの再活性化率を定量した。
【００９２】
実験条件下、80℃を超えるインキュベーション温度でFS Taqの再活性化が観察される。80℃までの温度では活性化は観察されない（図３参照）。
【００９３】
実施例5
酵素混和物の製造
１）Taq/Exo III 混合物
増幅反応にTaq/Exo III を10:1の比率で使用した。Taq DNA ポリメラーゼ（5 U/μl 、RAS, Cat. No. 1146173 ）のアリコート（90μl ）をExo III （1mg/ml）のアリコート（10μl ）と混合し、-20 ℃で保存した。
【００９４】
２）FS Taq/ FS Exo III混合物
増幅反応にFS Taq/ FS Exo IIIを10:1および75:1の比率で使用した。10:1の比率に関してはファストスタートDNA ポリメラーゼ（5 U/μl 、RAS, Cat. No. 2032929 ）のアリコート（90μl ）をExo III （1:40修飾、4.9 mg/ml ）のアリコート（10μl ）と混合した。75:1の比率に関してはファストスタートTaq DNA ポリメラーゼ 74 μl をFS Exo III 1μl と混合した。酵素混和物を-20 ℃で保存した。
【００９５】
実施例6
PCR 増幅
１）この実施例はPCR 増幅（ＣＦ−３１）におけるTaq DNA ポリメラーゼ、Taq/Exo III 混合物(10:1)およびFS Taq/FS Exo III 混合物(75:1)の使用について記載する(CF-31) 。
【００９６】
２）背景情報: CFTR遺伝子はヒト第７染色体の長腕に位置する。CF-31 プライマー混合物( 直線アレイ CF-31キット、RAS, Cat. No. 3017443)は、この遺伝子の14個の異なる領域を同時に増幅するために28個の異なるプライマーを含有する。
【００９７】
以下の反応条件下、反応容量100 μl でPCR を実施した。
【００９８】
0003969581.tif 000006
【００９９】
0003969581.tif 000007
【０１００】
増幅産物を4 ％アガロースゲルで分析した（図４）。
【０１０１】
実施例７
PCR における誤対合プライマー修正
１）PCR 中のFS Taq / FS Exo III 混合物の修復効率を3'末端誤対合プライマーで試験した。PCR 増幅にはプライマーを使用した。ここで、フォワードプライマーは、3'末端に鋳型DNA と塩基対形成できない1 個のヌクレオチドを有する。誤対合プライマー末端の切除および修復プライマーの増幅により、続いて制限エンドヌクレアーゼBsi EI（ニューイングランド・バイオラブ）で切断できる生成物が作製されるが、誤対合プライマーから生じる生成物は切断に抵抗する。
【０１０２】
用いたプライマー配列：
0003969581.tif 000008
【０１０３】
２）以下の反応条件下、反応容量50μl でPCR を実施した。
0003969581.tif 000009
【０１０４】
0003969581.tif 000010
【０１０５】
0003969581.tif 000011
【０１０６】
0003969581.tif 000012
【０１０７】
制限酵素での切断：
続いてPCR 産物を制限エンドヌクレアーゼBsi EIで切断した。PCR 産物１μg あたり制限酵素5 単位を加えた。60℃で60分間のインキュベーションの後、反応を停止させ、アリコートをアガロースゲル８で分析した（図５参照）。
【０１０８】
実施例8
UNG 夾雑物除去
1 ）ウラシルDNA グリコシラーゼ（UNG 、 RAS, Cat. No. 1269062）をdUTPと共に用いて前のDNA 合成反応からのPCR 「繰越」夾雑を排除できる。PCR 産物を分解できるようにするために、PCR 反応混合物中dTTPをdUTPで置換しなければならない。
【０１０９】
2 ）以下の反応条件下、反応容量50μl でPCR を実施した。
【０１１０】
反応混合物：
0003969581.tif 000013
【０１１１】
0003969581.tif 000014
【０１１２】
UNG 処理:
ウラシルDNA グリコシラーゼ（UNG ）で処理する前に、市販の精製キット（高純度 PCR産物精製キット、 RAS, Cat. No. 1732668）を用いてPCR 産物を精製した。UNG (RAS, Cat. No. 1269062)4単位を用いて反応容量50μl （1x Taq DNAポリメラーゼ PCRバッファー）中の精製されたPCR 産物1 μg を消化した。37℃で1 時間インキュベートした後、0.6M NaOH 10μl を加えた。３７℃で５分間さらにインキュベーションした後、０．６Ｍ  ＨＣｌ  １０μｌを加え、アリコートをアガロースゲルに適用した（図６参照）。
【０１１３】
実施例９
PCR 増幅（Epo 1.8 kb）：
FS Taq/FS Exo III 混合物の感度を示すために、ヒトEpo 遺伝子からの1.8 kbのフラグメントを種々の濃度のヒトゲノムDNA を用いて増幅した。
【０１１４】
用いたプライマー配列：
0003969581.tif 000015
【０１１５】
用いたヒトゲノムDNA 希釈物：
100ng/μl 、50ng/ μl 、10ng/ μl 、5ng/μl 、1ng/μl および0ng/μl
【０１１６】
以下の反応条件下、反応容量50μl でPCR を実施した。
【０１１７】
0003969581.tif 000016
【０１１８】
0003969581.tif 000017
【０１１９】
増幅産物を1 ％アガロースゲルで分析した。FS Taq/FS Exo III 混合物で得られた結果を図７に示す。Taq/Exo III 混合物で得られた結果を図８に示す。
【０１２０】
実施例10
PCR 増幅（tPA4.8kb）：
FS Taq/FS Exo III 混合物の感度を示すために、ヒトtPA 遺伝子からの4.8 kbのフラグメントを種々の濃度のヒトゲノムDNA を用いて増幅した。
【０１２１】
用いたプライマー配列：
0003969581.tif 000018
【０１２２】
用いたヒトゲノムDNA 希釈物：
100ng/μl 、50ng/ μl 、10ng/ μl 、5ng/μl 、1ng/μl および0ng/μl
【０１２３】
以下の反応条件下、反応容量50μl でPCR を実施した。
【０１２４】
0003969581.tif 000019
【０１２５】
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【０１２６】
増幅産物を0.5 ％アガロースゲルで分析した。FS Taq/FS Exo III 混合物で得られた結果を図９に示す。ファストスタートTaq-DNA ポリメラーゼで得られた結果を図１０に示す。
【０１２７】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１２８】
配列番号：２は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１２９】
配列番号：３は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３０】
配列番号：４は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３１】
配列番号：５は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３２】
配列番号：６は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３３】
配列番号：７は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３４】
配列番号：８は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０１３５】
【発明の効果】
本発明により、プライマーを使用する増幅反応を用いる核酸増幅のための方法および試薬（組成物）が提供される。これらの方法および試薬により高い複製忠実度を有する、非特異的増幅が低減された核酸増幅が可能になる。さらに本発明によりUNG 脱夾雑化法の適用が可能になる。
【０１３６】
【配列表】
0003969581.tif 000021
0003969581.tif 000022
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、FS Exo III活性アッセイの結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM:分子量マーカー II
（ロシュ・ダイアグノスティックス GmbH, Cat. No. 236250)
レーン A: 氷上で保存したサンプル
レーン B: 80℃で3 時間インキュベートしたサンプル
レーン C: 反応混合物 (対照)
【図２】図２は、FS Exo IIIの再活性化の温度依存性の結果を示す図である。
【図３】図３は、FS Taqの再活性化の温度依存性の結果を示す図である。
【図４】図４は、PCR (CF-31) の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM VIII: 分子量マーカーVIII
(ロシュ・ダイアグノスティックスGmbH, Cat. No. 1336045)
レーン 1: Taq DNA ポリメラーゼを用いる増幅
レーン 2: Taq/Exo III 混合物を用いる増幅
レーン 3: FS Taq/FS Exo III 混合物を用いる増幅
レーン A: 増幅反応
レーン B: 陰性対照 (ヒトゲノムDNA を含まない増幅)
【図５】図５は、誤対合修復の結果を示す図である。以下に図を説明する:
レーン 1: Taq DNA ポリメラーゼを用いる増幅
レーン 2: 拡大高忠実度 PCR系を用いる増幅
レーン 3: Taq/Exo III 混合物を用いる増幅
レーン 4: FS Taq / FS Exo III 混合物を用いる増幅
レーンA : 増幅反応
レーンB : BsiEI と処理した増幅反応
【図６】図６は、UNG 夾雑物除去の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM VIII: 分子量マーカー VIII
（ロシュ・ダイアグノスティックス GmbH)
レーン 1: UNG 処理をしていないPCR 産物
レーン 2: UNG 処理したPCR 産物
【図７】図７は、Epo 、 FS Taq/FS Exo IIIの PCR増幅の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM VI: 分子量マーカー VI
（ロシュ・ダイアグノスティックスGmbH)
レーン 1: 100ng ヒトゲノムDNA
レーン 2: 50ngヒトゲノムDNA
レーン 3: 10ngヒトゲノムDNA
レーン 4: 5ng ヒトゲノムDNA
レーン 5: 1ng ヒトゲノムDNA
レーン 6: 0ng ヒトゲノムDNA
【図８】図８は、Epo 、 Taq/Exo IIIの PCR増幅の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM VI:分子量マーカー VI
（ロシュ・ダイアグノスティックス GmbH)
レーン 1: 100ng ヒトゲノムDNA
レーン 2: 50ngヒトゲノムDNA
レーン 3: 10ngヒトゲノムDNA
レーン 4: 5ng ヒトゲノムDNA
レーン 5: 1ng ヒトゲノムDNA
レーン 6: 0ng ヒトゲノムDNA
【図９】図９は、tPA 、FS Taq/FS Exo III のPCR 増幅の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM II: 分子量マーカー II
（ロシュ・ダイアグノスティックスGmbH)
レーン 1: 100ng ヒトゲノムDNA
レーン 2: 50ngヒトゲノムDNA
レーン 3: 10ngヒトゲノムDNA
レーン 4: 5ng ヒトゲノムDNA
レーン 5: 1ng ヒトゲノムDNA
レーン 6: 0ng ヒトゲノムDNA
【図１０】図１０は、  tPA 、 Taq/Exo IIIの PCR増幅の結果を示す図である。以下に図を説明する:
MWM II: 分子量マーカー II
（ロシュ・ダイアグノスティックスGmbH)
レーン 1: 100ng ヒトゲノムDNA
レーン 2: 50ngヒトゲノムDNA
レーン 3: 10ngヒトゲノムDNA
レーン 4: 5ng ヒトゲノムDNA
レーン 5: 1ng ヒトゲノムDNA
レーン 6: 0ng ヒトゲノムDNA
【図１】
0003969581.tif 000026
【図２】
0003969581.tif 000027
【図３】
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【図４】
0003969581.tif 000029
【図５】
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【図６】
0003969581.tif 000031
【図７】
0003969581.tif 000032
【図８】
0003969581.tif 000033
【図９】
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【図１０】
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