(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物に由来する実質的に純粋なＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）キナーゼであって、次の特徴を有するＭＡＰＫキナーゼ。
（a）ＴＮＦ−αによる刺激及び／又はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化される
（b）ＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化する
（c）ｐ３８は活性化しない
（d）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなる
【請求項２】
請求項１に記載のＭＡＰＫキナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のＭＡＰＫキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチドであって、次の特徴を有するポリペプチド。
（a）キナーゼ活性を欠損した
（b）ＴＮＦ−αによって誘導されるＭＡＰＫキナーゼによるＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化を抑制する
（c）配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０のアミノ酸配列においてキナーゼドメイン以外のその他の部分において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなる
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のＭＡＰＫキナーゼであって、ＭＡＰＫキナーゼの活性化に必要な、キナーゼドメインＶＩＩとＶＩＩＩの境界領域にある２つのセリン残基及び／又はスレオニン残基がリン酸化されていることを特徴とする活性型ＭＡＰＫキナーゼ。
【請求項１２】
ＭＡＰＫキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法において、請求項１に記載のＭＡＰＫキナーゼを、ＳＡＰＫ／ＪＮＫと共に、サンプル材料と接触せしめ、そしてＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化の阻害を指標として、ＭＡＰＫキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のＭＡＰＫキナーゼ、あるいは請求項１１に記載の活性型ＭＡＰＫキナーゼと特異的に結合しうる抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脊椎動物に由来する新規なＭＡＰＫキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡに関する。更に詳細には、ＴＮＦ−αによる刺激及び／又はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化されてＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化するが、ｐ３８は活性化しないＭＡＰＫキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡに関する。本発明のＭＡＰＫキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを用いると、ＭＡＰＫキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が関与する疾患の治療又は予防に有用な化合物のスクリーニングや、そのような疾患の診断剤を作成することができる。又、本発明は、上記ＤＮＡを複製可能なベクターに組込んでなる組換え体ＤＮＡ；上記複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞；上記ＭＡＰＫキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ；並びに上記ＭＡＰＫキナーゼと結合しうる抗体に関する。
従来技術
ＭＡＰ（mitogen-activated protein）キナーゼ（ＭＡＰＫ）は、当初インスリン〔Sturgill,T.W. et al., Biochim. Biophys.Acta 1092:350-357（1991）〕や種々の細胞増殖因子、又は発癌プロモーター〔Nishida,E. et al., Int.Rev.Cytol.138:211-238（1992）〕等の刺激によって活性化されるセリン／スレオニンキナーゼ（Ser/Thr kinase；即ち、蛋白質のセリン残基もしくはスレオニン残基をリン酸化することができる酵素）として１９８０年代後半に見出された。そして、およそ１０年の研究の結果、ＭＡＰキナーゼは外界刺激に応答して、真核細胞の運命決定並びに機能制御を仲介する細胞内シグナル伝達の主要な構成要素であることが判明した〔Nishida,E et al., Trends Biochem.Sci.,18:128-131（1993）；Marshall, C.J., Curr.Opin.Genet.Dev.,4:82-89（1994）；Cobb,M.H. et al., J.Biol.Chem.,270:14843-14846（1995）〕。特に、１９９０年代の細胞生物学の大きな成果として、チロシンキナーゼ活性を有する細胞増殖因子受容体から、ＳＨ２（Src homology 2）とＳＨ３（Src homology 3）からなるアダプター分子を経て、癌遺伝子産物であるＧＴＰ結合蛋白質のＲａｓ、更にセリン／スレオニンキナーゼをコードする癌遺伝子産物Ｒａｆ−１を介してＭＡＰキナーゼへ至るシグナル伝達経路が解明され、この経路が高等真核生物の増殖、分化及び発生を規定する中枢経路であることが明らかとなった。
シグナル伝達分子は、シグナル伝達経路の上流のシグナルを受けて活性型（on）になり、下流にシグナルを伝達した後に不活性型（off）へと戻るが、ＭＡＰキナーゼのon/offの調節機構には興味深い特徴がある。ＭＡＰキナーゼの活性化には、キナーゼサブドメインVIIとVIIIの境界領域にあるＴＥＹ（３文字略記ではThr-Glu-Tyr）の配列中のＴとＹがリン酸化されることが必須である。この両アミノ酸残基のリン酸化（即ち活性化）を触媒する酵素として見出されたのが、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）又はMAPK/ERKキナーゼ（ＭＥＫ）と呼ばれる酵素である。ＭＡＰＫキナーゼはセリン／スレオニンと共にチロシンをリン酸化することもできるdual-specificity kinaseである。
更に、ＭＡＰＫキナーゼの活性化には、キナーゼドメインVIIとVIIIの境界領域にある２つのセリン及び／又はスレオニン残基（即ち、２つのセリン残基、２つのスレオニン残基又はセリンとスレオニン残基）のリン酸化が必要で、このリン酸化を担うセリン／スレオニンキナーゼをＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）と総称する。前記のRaf-1はＭＡＰＫＫキナーゼの一種であり、Ras→Raf-1（即ち、MAPKKK）→MAPKK→MAPKという連鎖は、シグナル伝達の主要経路の一つである。MAPKKK→MAPKK→MAPKという３分子からなるキナーゼの連鎖をＭＡＰキナーゼシグナルカスケードと呼ぶ。
上記したRaf-1/MAPKKK→MAPKK→MAPKのシグナル伝達系は、ＭＡＰキナーゼシグナルカスケードで最初に同定されたことから、屡々、古典的ＭＡＰキナーゼシグナル経路とも呼ばれる。その後、この古典的ＭＡＰキナーゼに類似したキナーゼが多数存在することが明らかになった。一つはStress-Activated Protein Kinase（ＳＡＰＫ）と呼ばれるキナーゼで、細胞に蛋白合成阻害剤などの化学的ストレス、又は熱ショックや浸透圧変化などの物理的ストレスが加わった時に活性化されるキナーゼとして同定された〔Kyriakis,J.M., Nature,369:156-160（1994）〕。ＳＡＰＫは、転写因子JunのＮ末端をリン酸化して転写活性を上昇させるキナーゼとして同時期に独立に同定されたc-Jun N-terminal Kinase（JNK）〔Derijard,B., Cell,76:1025-1037（1994）〕と同一である（以下、屡々、この酵素を“SAPK/JNK”と呼ぶ）。SAPK/JNKは古典的ＭＡＰキナーゼとの相同性を有し、ＭＡＰキナーゼが活性化される際に必要なＴＥＹ配列がＴＰＹ（Thr-Pro-Tyr）となっている。この配列のThrとTyrが単一の上流ＭＡＰＫキナーゼによるリン酸化を受けて活性化されるというメカニズムは古典的ＭＡＰキナーゼと同じであるが、SAPK/JNKを活性化するＭＡＰＫキナーゼは、主にSAPK/ERK kinase-1（ＳＥＫ１）又はmitogen-activated protein kinase kinase 4（ＭＫＫ４）である（以下、屡々、この酵素を“SEK1/MKK4”と呼ぶ）〔Lin,A., et al., Science,268:286-290（1995）, Sanchez,I., Nature,372:794-798（1994）；Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem.,270:12969-12972（1995）〕。従って、古典的なＭＡＰキナーゼに対しては古典的なＭＡＰＫキナーゼがシグナル伝達経路の上流因子として働き、別の新しいＭＡＰキナーゼは別のＭＡＰＫキナーゼによって特異的にリン酸化（活性化）される。又、SAPK/JNKに至る経路の上流のＭＡＰＫＫキナーゼとしてＭＥＫＫというキナーゼが知られているが、他にもＭＡＰＫＫキナーゼとして働くキナーゼが存在すると予想される。
上記SAPK/JNKの他に、その分子量から単にｐ３８と呼ばれるＭＡＰキナーゼと類縁のキナーゼが知られており、リンパ球細胞を刺激した時に、早期にチロシンリン酸化される蛋白質として同定・クローニングされている〔Han,J., et al., Science,265:808-811（1994）〕。同時期に、リンパ球における炎症性のサイトカインの産生を抑制する薬剤cytokine-suppressive antiinflammatory drug（CSAID）に結合する蛋白質〔CSAID binding protein（CSBP）〕〔Lee,J.C., et al., Nature,372:739-746（1994）〕が同定されたが、この蛋白質も現在では、ｐ３８と同一であることが確認されている。更に、ストレス刺激で活性化するキナーゼとして独立に単離されたＭＰＫ２もｐ３８と同じ分子である〔Rouse,J., et al., Cell,78:1027-1037（1994）〕（以下、屡々、この酵素を単に“ｐ３８”と呼ぶ）。ｐ３８においては、前述のＴＸＹ配列（ただし、Ｘは、任意のアミノ酸を示す）の真ん中がＧであり、やはりこのThrとTyrが単一の上流ＭＡＰＫキナーゼによってリン酸化された結果、活性化される。ｐ３８を特異的に活性化するＭＡＰＫキナーゼとしては、ＭＫＫ３とＭＫＫ６が知られている〔Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem.,271:26981-26988（1996）；Cuenda,A., et al., EMBO J.,15:4156-4164（1996）〕。古典的ＭＡＰキナーゼ、SAPK/JNK及びｐ３８は互いに配列の相同性を有することからスーパーファミリーを形成しており、３者にそれぞれ特異的なＭＡＰＫキナーゼも互いに相同性を有し、ＭＥＫ，ＳＥＫ１／ＭＫＫ４，ＭＫＫ３，ＭＫＫ６などが属するスーパーファミリーを形成している〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316（1996）；Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473（1994）〕。一方、それぞれのＭＡＰＫキナーゼをリン酸化によって活性化する更に上流のＭＡＰＫＫキナーゼどうしの相同性は比較的低く、Ｒａｆ，ＴＡＫ１，ＭＥＫＫ，ＭＬＫ３，Ａｓｋ１，ＭｏｓなどのＭＡＰＫＫキナーゼ活性を持つキナーゼ同士では、キナーゼドメイン内でも３０％程度の相同性しかない。このことは、非常にバラエティーに富んだ刺激に応じて必要なＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を特異的に起動するというシステムの合目的性とよく一致している。
SAPK/JNKとｐ３８は、古典的ＭＡＰキナーゼを活性化する増殖因子の刺激ではほとんど活性化されないが、いずれも浸透圧ショックや熱ショックなどのストレスや、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α又はカケクチン）、ＩＬ−１などのサイトカインによって活性化される〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316（1996）；Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473（1994）〕。又、細胞死を誘導するＵＶ照射や血清・増殖因子除去などによっても活性化される〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316（1996）；Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473（1994）〕。古典的なＭＡＰキナーゼが、チロシンキナーゼ型の受容体から発せられるシグナルによって活性化されるのに対し、SAPK/JNKやｐ３８の系は、その開始シグナルが非常に多様なのが特徴である。
上記したＴＮＦ−αは、炎症、組織障害、免疫応答、及び病変部への細胞侵入に多様な影響を及ぼすことから、自己免疫疾患や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）における関与が示唆されており〔J.Exp.Med., 166:1280（1987）〕、特にリウマチ様関節炎をはじめとする炎症性関節疾患の発症に関与すると考えられている〔Lancet, 11:244-247（1989）, Ann.Rheumatic Dis. 51:480-486（1990）〕。抗ＴＮＦ−α抗体は、投与を関節炎発症前に開始するか後に開始するかに関わらず、ＤＢＡ／１マウスのコラーゲン関節炎に伴う炎症を軽減し、関節破壊の程度を顕著に低下させる〔Williams,R.O. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9784-9788（1992）〕。臨床的にも、キメラ抗ＴＮＦ−α抗体が、慢性関節リウマチやクローン病の治療に有効であることが確認されている〔Derkx,B. et al., Lancet, 342:173-174（1993）；Elliott,M.J. et al., Lancet, 344:1105-1110（1994）；Elliott M.J. et al., Lancet, 344:1125-1127（1994）〕。
ＴＮＦ−αのシグナル伝達機構の解析も進んでいる。ＴＮＦ−αには２種類のリセプター、分子量５５ｋＤのＴＮＦ−Ｒ１と分子量７５ｋＤのＴＮＦ−Ｒ２があるが、最近、ＴＮＦレセプターに会合している分子群が酵母のtwo-hybrid systemを用いて直接クローニングされている。ＴＮＦ−Ｒ１に会合している分子群としては、ＴＲＡＤＤ（TNF-R1 associated death domain protein）〔Hsu,H. et al., Cell, 81:495-504（1995）〕、ＴＲＡＰ１、ＴＲＡＰ２〔Song,H.Y. et al., J.Biol.Chem., 270:3574-3581（1995）〕、ＲＩＰ〔Stanger,B.Z. et al., Cell, 81:513-523（1995）〕など、ＴＮＦ−Ｒ２に会合する分子としては、ＴＲＡＦ１やＴＲＡＦ２がクローニングされている〔Rothe,M. et al., Cell, 78:681-692（1994）〕。このようにＴＮＦリセプターと会合する分子が同定される一方、近年、ＴＮＦ−αでＮＦ−κＢ、セラミドキナーゼ、ＭＡＰキナーゼも活性化されることが明らかになった。細胞透過性のセラミド誘導体であるＣ８−Ｃｅｒ（Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン）やＣ２−Ｃｅｒ（Ｎ−アセチルスフィンゴシン）がＴＮＦ−αに類似した作用を発揮することが報告されており〔Kolesnick,R. et al., Cell, 77:325-328（1994）〕、ＭＡＰキナーゼやセラミドキナーゼを活性化するとされている。このように、ＴＮＦ−αのシグナル伝達機構に関する理解は急速に進んでいるが、ＴＲＡＤＤをはじめとするレセプター会合蛋白質とキナーゼとの活性化機構の関係や、ＴＮＦ−αで活性化されるＭＡＰキナーゼカスケードなど、未解決の問題も数多く残されている。
上記したSEK1/MKK4は、SAPK/JNKをリン酸化することが現在知られている唯一のＭＡＰＫキナーゼである。しかし、ＴＮＦ−αによる刺激でSAPK/JNKはリン酸化されるが、SEK1/MKK4は活性化されない。このことから、本発明者らは、ＴＮＦ−αで活性化され、SAPK/JNKを基質として活性化する未同定のＭＡＰＫキナーゼが存在すると推測した。即ち、本発明の課題は、ＴＮＦ−αで活性化され、SAPK/JNKをリン酸化する新規なＭＡＰＫキナーゼ遺伝子とその蛋白質を見出し、これを医薬・医療の分野で利用する方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、Xenopus Oocytes（アフリカツメガエル卵母細胞）のｃＤＮＡライブラリーから、ショウジョウバエのＭＡＰＫキナーゼであるＨｅｐに類似する新規なＭＡＰＫキナーゼの断片をクローニングすることに成功した。そしてこの新規ＭＡＰＫキナーゼ断片をプローブとしてMouse Brain（マウス脳）のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、構造上ＭＡＰＫキナーゼファミリーに属する新規なマウスのＭＡＰＫキナーゼ（以下、屡々、ＭＫＫ７という）をクローニングすることに成功した。更に発明者らは、この新規マウスＭＡＰＫキナーゼの塩基配列をもとに、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）データベース上でヒト型ＭＫＫ７と推定されるクローンを発見し、その配列をもとに、ヒト心臓ｍＲＮＡからヒト型ＭＫＫ７の全長塩基配列をクローニングすることに成功した。そして、更に上記マウスＭＫＫ７が公知のＳＥＫ１やＭＫＫ６とは異なり、ｐ３８やＳＡＰＫ３を活性化することなく、ＳＡＰＫを特異的に活性化するＭＡＰＫキナーゼであり、生体内でＴＮＦ−αからSAPK/JNKへのシグナル伝達に深く関与していることを確認した。又、ＭＫＫ７がＦａｓ抗原から誘導されるアポトーシスシグナルにも関与している可能性を見出し、本発明を完成させるに至った。
従って、本発明の主たる１つの目的は、以下のＭＡＰＫキナーゼを提供することにある。脊椎動物に由来する実質的に純粋なＭＡＰＫキナーゼであって、次の特徴を有するＭＡＰＫキナーゼ。
（ａ）ＴＮＦ−αによる刺激及び／又はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化される。
（ｂ）ＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化する。
（ｃ）ｐ３８は活性化しない。
本発明の他の１つの目的は、上記ＭＡＰＫキナーゼをコードするＤＮＡを提供することにある。
本発明の更に他の１つの目的は、上記ＭＡＰＫキナーゼのドミナントネガティブ型であって、ＴＮＦ−αによって誘導されるSAPK/JNKの活性化を抑制するポリペプチドを提供することである。
本発明の更に他の１つの目的は、上記ＭＡＰＫキナーゼによるSAPK/JNKの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
配列表の簡単な説明
以下に述べる各配列番号の塩基配列において、左側端部及び右側端部はそれぞれ５’末端及び３’末端であり、アミノ酸配列においては、左側端部及び右側端部はそれぞれＮ末端及びＣ末端である。
配列番号１は、ヒト心臓由来のＭＫＫ７のｃＤＮＡ塩基配列と、該配列がコードする全長アミノ酸配列であり；
配列番号２は、ヒト心臓由来のＭＫＫ７の全長アミノ酸配列であり；
配列番号３は、マウス脳由来のＭＫＫ７のｃＤＮＡ塩基配列と、該配列がコードする全長アミノ酸配列であり；
配列番号４は、マウス脳由来のＭＫＫ７の全長アミノ酸配列であり；
配列番号５は、マウス脳由来のＭＫＫ７のオルタナティブスプライシング（alternative splicing）産物のｃＤＮＡ塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり；
配列番号６は、マウス脳由来のＭＫＫ７のオルタナティブスプライシング産物のアミノ酸配列であり；
配列番号７は、Xenopus由来のＭＫＫ７の断片のｃＤＮＡ塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり；
配列番号８は、Xenopus由来のＭＫＫ７断片のアミノ酸配列であり；
配列番号９は、配列番号３の塩基配列を基に合成したドミナントネガティブ型ＭＫＫ７の塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり；
配列番号１０は、合成したドミナントネガティブ型ＭＫＫ７のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
添付の図面において、
図１は、マウスＭＫＫ７、ショウジョウバエ（Drosophila）のＨｅｐ、及びマウスＳＥＫ１のアミノ酸配列を比較した図であり、図中−は、空欄、影は影内のアミノ酸配列が同一であることを表し；
図２は、実施例３で行ったマウスの各臓器におけるＭＫＫ７のNorthern blotであり；
図３は、実施例５において確認したマウスＭＡＰＫキナーゼ（ＭＫＫ７，ＭＫＫ６，ＳＥＫ１）のＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ，ＳＡＰＫ，ｐ３８，ＳＡＰＫ３）に対する基質特異性を示すＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図であり、図中＋は、測定系にそのキナーゼを添加したことを示し、−は添加しなかったことを示し；
図４は、実施例６で行ったＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、マウスＭＫＫ７がＴＮＦ−αで活性化されるが、マウスSEKl/MKK4は活性化されないことを示す図であり；
図５は、実施例７で行ったマウスＭＫＫ７のドミナントネガティブ型であるＭＫＫ７ＫＬを発現させると、SAPK/JNKの活性化が抑制されることを示す電気泳動の結果であり；
図６は、実施例８で行ったマウスSAPK/JNKとＭＫＫ７はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化されることを示す電気泳動の結果であり；
図７は、実施例９で行った活性化型ＭＫＫ７がＪＮＫ１をリン酸化することを示すドットハイブリダイゼーションの結果であり、活性型ＭＫＫ７の濃度に依存して、ＪＮＫ１のリン酸化を意味するドットの濃さが増大することを示す。
発明の詳細な説明
本発明の一つの態様によれば、脊椎動物に由来する実質的に純粋なＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）キナーゼであって、次の特徴を有するＭＡＰＫキナーゼが提供される。
（ａ）ＴＮＦ−αによる刺激及び／又はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化される。
（ｂ）ＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化する。
（ｃ）ｐ３８は活性化しない。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．脊椎動物に由来する実質的に純粋なＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）キナーゼであって、次の特徴を有するＭＡＰＫキナーゼ。
（ａ）ＴＮＦ−αによる刺激及び／又はＦａｓ抗原に対する刺激で活性化される。
（ｂ）ＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化する。
（ｃ）ｐ３８は活性化しない。
２．該ＭＡＰＫキナーゼが、配列番号２、４及び６からなる群より選ばれるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする前項１に記載のＭＡＰＫキナーゼ。
３．前項１又は２に記載のＭＡＰＫキナーゼをコードするＤＮＡ。
４．該ＤＮＡが、配列番号１、３及び５からなる群より選ばれる塩基配列、あるいは該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする前項３に記載のＤＮＡ。
５．前項３又は４に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ
６．前項５に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞。
７．前項１又は２に記載のＭＡＰＫキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチドであって、該ポリペプチドはキナーゼ活性のみを欠損した該ＭＡＰＫキナーゼであり、ＴＮＦ−αによって誘導されるＭＡＰＫキナーゼによるSAPK/JNKの活性化を抑制するポリペプチド。
８．該ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする前項７に記載のポリペプチド。
９．前項７又は８に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
１０．該ＤＮＡが、配列番号９の塩基配列、あるいは該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする前項９に記載のＤＮＡ。
１１．前項９又は１０に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ。
１２．前項１１に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞。
１３．前項１又は２に記載のＭＡＰＫキナーゼであって、活性化に必要なセリン残基及び／又はスレオニン残基がリン酸化されていることを特徴とする活性型ＭＡＰＫキナーゼ。
１４．ＭＡＰＫキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法にして、前項１又は２に記載のＭＡＰＫキナーゼ及び／又は前項１３に記載の活性型ＭＡＰＫキナーゼを、SAPK/JNKと共に、サンプル材料と接触せしめ、そしてSAPK/JNKの活性化の阻害を指標として、ＭＡＰＫキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
１５．前項１又は２に記載のＭＡＰＫキナーゼ、あるいは前項１３に記載の活性型ＭＡＰＫキナーゼと特異的に結合しうる抗体。
以下、本発明について具体的に説明する。
尚、本発明において、ＤＮＡ塩基配列中のＡはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
また、本発明においては、３文字表示で、アミノ酸配列中のＡｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリンである。
更に、本発明においては、１文字表示で、アミノ酸配列中のＡはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンである。
本発明において「ポリペプチド」とは、一般的に当業者にペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質等として理解されているものを含む。従って、天然の蛋白質や、化学合成又は組換え技術によって得られたポリペプチドやペプチドも含まれており、ポリペプチドは糖鎖の結合やリン酸化などの翻訳後修飾を受けていても、受けていなくても良い。
本発明でいう「ＭＡＰＫキナーゼ」とは、ＭＡＰキナーゼカスケード系において、ＭＡＰキナーゼをリン酸化して活性化する蛋白質リン酸化酵素群である。公知のＭＡＰＫキナーゼとしては、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６等が挙げられる。例えば、ＭＫＫ４は、ＭＡＰキナーゼの一つであるｐ３８の１８０番目のThrと１８２番目のTyrをリン酸化して活性化し、更に、別のＭＡＰキナーゼであるＳＡＰＫ／ＪＮＫの１８３番目のThrと１８５番目のTyrをリン酸化して活性化する。本発明の新規ＭＡＰＫキナーゼであるＭＫＫ７もＭＡＰキナーゼをリン酸化することによって活性化する酵素であり、具体的には、上記ＭＫＫ４とは異なり、ＳＡＰＫ／ＪＮＫを特異的に活性化するが、ｐ３８は活性化しない酵素である。
本発明でいう「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、自然界において見出される対立遺伝子変異や自然突然変異、更には、人為的な突然変異や遺伝子組換え技術を用いて得られる変異体のアミノ酸配列を意味する。又、ＭＫＫ７のオルタナティブスプライシング（alternative splicing）産物が本発明者らによってｃＤＮＡレベル及びWestern Blottingで確認されているため、オルタナティブスプライシング産物も本発明のＭＫＫ７に含まれる。マウスＭＫＫ７のオルタナティブスプライシング産物は、Ｎ末端付近及びＣ末端のアミノ酸配列が一部欠失しているが、本発明の新規ＭＡＰＫキナーゼの特徴を有するものである（その配列を配列番号５及び６に記載した）。
本発明に包含されるアミノ酸配列は、全て本発明の新規ＭＡＰＫキナーゼの活性を有するポリペプチドであり、たとえ１つのアミノ酸残基の改変であっても、その活性を損失させるような変化を含むアミノ酸配列は本発明には含まれない。従って、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」は、配列番号２、４又は６に記載した本発明のＭＡＰＫキナーゼのアミノ酸配列に存在するキナーゼドメインI〜XIからなる領域（セリン／スレオニンキナーゼに共通する、活性に携わる領域）を保存するアミノ酸配列であり、特にその中でも活性に非常に重要であると考えられる１５個のアミノ酸残基［Hanks, S.K. and Quinn, A.M., Method in Enzymology, vol. 200, pp. 38-62（1991）］を有するアミノ酸配列である。具体的には、本発明のマウスＭＫＫ７のキナーゼ領域は、配列番号４のアミノ酸配列の１３６番〜３９６番からなる配列であり、その中で非常に重要であると考えられる１５個のアミノ酸残基は、１４３番のGly、１４５番のGly、１５０番のVal、１６５番のLys、１７５番のGlu、２５９番のAsp、２６１番のLys、２６４番のAsn、２７７番のAsp、２７９番のGly、３０２番のPro、３０３番のGlu、３２０番のAsp、３２５番のGly、及び３８４番のArgである。尚、本発明のヒトＭＫＫ７（配列番号２）にも、上記のマウスＭＫＫ７のキナーゼ領域に対応する領域及び重要であると考えられる１５個のアミノ酸が存在する。
本発明でいう「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件、例えば温度や塩濃度を適当に変化させることにより、非特異的なハイブリダイゼーションを減少させた条件下で同定される、高度に相補的な塩基配列を意味する。具体的には、１．０×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃のような、ハイブリダイズするポリヌクレオチド間の特異性を保証する条件でハイブリダイズする塩基配列であり、本発明のＭＡＰＫキナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列である。
本発明でいう「ドミナントネガティブ型」のポリペプチドとは、キナーゼ活性だけを欠いたＭＫＫ７であり、上記のＭＫＫ７のキナーゼドメインを一部を改変したポリペプチドである。ドミナントネガティブ型のポリペプチドは、キナーゼネガティブとも呼ばれ、ＭＫＫ７と共存すると、ＭＫＫ７のキナーゼ活性を阻害することができる。本発明のドミナントネガティブ型のポリペプチドの一例であるＭＫＫ７ＫＬは、ＭＫＫ７によるSAPK/JNKの活性化を阻害するポリペプチドであり、配列番号４のマウスＭＫＫ７のキナーゼドメインに存在する１６５番目のLys（Ｋ）をLeu（Ｌ）に置換したアミノ酸配列である（ＭＫＫ７ＫＬの配列を配列番号９及び１０に記載した）。本発明に包含されるＭＡＰＫキナーゼのドミナントネガティブ型は上記のＭＫＫ７ＫＬに限定されるものではなく、配列番号１〜６に記載のヒト及びマウスの塩基及びアミノ酸配列を基に、キナーゼ活性のみを欠いたポリペプチドを作成することは容易である。又、配列番号１０のＭＫＫ７ＫＬのアミノ酸配列に限定されるものでもなく、そのドミナントネガティブ型としての機能を損失させない範囲でアミノ酸配列を改変することもできる。具体的には、配列番号１０のＭＫＫ７ＫＬのアミノ酸配列に存在するキナーゼ領域を保存するアミノ酸配列であれば、その他の部分に１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が存在するＭＫＫ７ＫＬの変異体であってもよい。
次に、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的諸特徴について説明する。
新規ＭＡＰＫキナーゼをクローニングする目的で公知のヒトＭＫＫ３をプローブとし、Xenopus Oocytes（アフリカツメガエル卵母細胞）のｃＤＮＡライブラリーをクロスハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。その結果、ショウジョウバエのＭＡＰＫキナーゼであるＨｅｐに類似する、配列番号７及び８に記載した新規Xenopus ＭＡＰＫキナーゼの断片をクローニングすることに成功した。Ｈｅｐはショウジョウバエの胚発生において重要な役割を担う酵素であると考えられており〔Glise,B. et al., Cell,83:451-461（1995）〕、従来、Ｈｅｐに対応する哺乳類のＭＡＰＫキナーゼは見つかっておらず、Ｈｅｐと、ヒトのＭＡＰＫキナーゼであるＭＫＫ３及びＭＫＫ４とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ４８％及び５６％である。
ショウジョウバエ以外の生物にもＨｅｐに相同なＭＡＰＫ、キナーゼが見出されたことから、哺乳類にも同様のＭＡＰＫキナーゼが存在する可能性が示唆された。哺乳類におけるＨｅｐ相同キナーゼをクローニングする目的で、上記のXenopus由来の新規ＭＡＰＫキナーゼ断片をプローブとしてMouse Brain（マウス脳）のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、構造上ＭＡＰＫキナーゼファミリーに属する、配列番号３及び４に記載した新規なマウスＭＡＰＫキナーゼをクローニングすることに成功した。
このマウスＭＡＰＫキナーゼは、これまでに知られているどの哺乳類のＭＡＰＫキナーゼとも異なり、最も相同性の高いキナーゼがショウジョウバエのＨｅｐである。キナーゼドメインにおける、このマウスＭＡＰＫキナーゼとショウジョウバエのＨｅｐとのアミノ酸配列の相同性は６９％であるが、このマウスキナーゼとマウスSEK1/MKK4との相同性はわずか５３％であるため、今回クローニングに成功したＭＡＰＫキナーゼはよりＨｅｐに近い分子であることが判明した（図１を参照）。従って、このＭＡＰＫキナーゼは哺乳類におけるＨｅｐのホモログであると考えられる。
この新規ＭＡＰＫキナーゼをＭＫＫ７と命名した。マウスＭＫＫ７をコードするプラスミドベクターをE. coliに導入し、E. coli: DH5-pBluemMKK7（受託番号FERM BP-6397）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）］に平成９年６月２６日（原寄託日）に国際寄託した。
本発明者らは、更にこのマウスＭＫＫ７の塩基配列をもとにＥＳＴデータベースを検索したところ、ヒト型ＭＫＫ７と推定されるクローン２種（共に無作為に抽出したヒトｍＲＮＡから作ったｃＤＮＡ）を発見した。データベースから得られた配列をもとに、ヒト心臓ｍＲＮＡより５’ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA end）法、３’ＲＡＣＥ法及びＰＣＲ法を用いて、配列番号１及び２に記載のヒトのＭＫＫ７の全長をクローニングした。マウスＭＫＫ７とヒトＭＫＫ７とのアミノ酸配列の相同性は９１％であった。
ヒトＭＫＫ７をE. Coliに導入し、E. Coli:DH5-pTrCHisBhMKK7（寄託番号：FERM BP-6398）として通商産業省工業技術院生命工学技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）に平成９年８月８日（原寄託日）に国際寄託した。
次に、マウスＭＫＫ７の生体内における発現をノザンブロット法により調べたところ、ほぼすべての臓器でｍＲＮＡは発現しており、特に心臓や骨格筋で強く発現していることが確認された（図２を参照）。
ＭＫＫ７はその一次構造からＭＡＰＫキナーゼファミリーに属することはほぼ確実であったため、次に各種ＭＡＰキナーゼを基質として用い、ＭＡＰＫキナーゼによるＭＡＰキナーゼの活性化を測定した。ＭＡＰＫキナーゼとしてはＭＫＫ７、ＭＫＫ６、ＳＥＫ１を、ＭＡＰキナーゼとしてはＭＡＰＫ、ＳＡＰＫ、ｐ３８、ＳＡＰＫ３をそれぞれ異なる組み合わせで細胞内に共導入し、その後、各ＭＡＰキナーゼの活性を、遺伝子導入細胞によるＭＡＰキナーゼに対応する基質のリン酸化を測定することにより決定した。すると、マウスＭＫＫ７は、ＳＥＫ１やＭＫＫ６とは異なり、ｐ３８やＳＡＰＫ３を活性化することなく、ＳＡＰＫのみを特異的に活性化した（図３を参照）。更に、ＭＫＫ７がむしろｐ３８の活性を抑制する可能性が実験結果によって示唆された。又、ＭＫＫ７の至適ｐＨはｐＨ７〜８の間であり、７０℃以上で失活することが判明した。
これまではin vitroの実験結果などから、ＭＡＰキナーゼシグナルカスケードにおけるSAPK/JNKの上流のＭＡＰＫキナーゼはSEK1/MKK4であると考えられていたが、SAPK/JNKがＴＮＦ−αによって強く活性化を受けるのに対し、SEK1/MKK4の活性化はＴＮＦ−αによる刺激に依存しない（図４を参照）。従って、実際に生体内でSAPK/JNKの上流のＭＡＰＫキナーゼとして働いているキナーゼは、SEK1/MKK4以外にも存在する可能性が考えられていた。そして、上記の結果から、本発明のＭＡＰＫキナーゼであるＭＫＫ７が、SAPK/JNKの上流のＭＡＰＫキナーゼであって、ＴＮＦ−αによって誘導されるMAPKKK→MKK7→SAPK/JNKというシグナルカスケードを形成していることが明らかとなった。
更にＭＫＫ７が真のSAPK/JNKを活性化する上流のＭＡＰＫキナーゼであることを実証するために、まずマウスＭＫＫ７の活性化がＴＮＦ−αによって誘導されることを確認した（図４を参照）。次に、ドミナントネガティブ型のマウスＭＫＫ７を作成して細胞内で発現させたところ、このドミナントネガティブ型ＭＫＫ７を発現する細胞においては、ＴＮＦ−αによる刺激に依存するSAPK/JNKの活性化は抑制された（図５を参照）。以上の結果から、ＭＫＫ７が生体内でＴＮＦ−αからSAPK/JNKへのシグナル伝達に深く関与しているキナーゼであることを実証した。
又、SAPK/JNKやｐ３８がアポトーシスへ関与しているという近年のデータ［Xia,Z. et al., Science,270:1326-1331（1995）; Verheij,M. et al., Nature,380:75-79（1996）; Santana,P. et al., Cell,86:189-199（1996）］や、アポトーシスを誘導するＡＳＫ１というＭＡＰＫＫキナーゼ［Ichijo,H.et al., Science,275:90-94（1997）］についての報告などから、ＭＡＰキナーゼカスケードがアポトーシスに関与すると考えられており、この考えに基づき、本発明者らはＭＫＫ７のアポトーシスへの関与をＦａｓ抗原を刺激することによって検討した。Ｆａｓ抗原は、ＡＰＯ−１、ＣＤ９５とも呼ばれる細胞にアポトーシスを誘導するリセプターで、TNF/NGFレセプターファミリーに属するＩ型膜蛋白質である［Suda,T. et al., Cell,75:1169-1178（1993）］。抗Ｆａｓ抗体（CH-11）を用いて細胞のＦａｓ抗原を刺激し、その際のSAPK/JNK及びＭＫＫ７の活性を測定した。その結果、SAPK/JNKとＭＫＫ７は共にＦａｓ抗原からのシグナルによって活性化されることが明らかとなった（図６を参照）。上記の結果は、ＭＫＫ７がSAPK/JNKと共に、Ｆａｓ抗原によって伝達されるアポトーシスシグナルの伝達に関与している可能性を示唆している。
本発明では、ＴＮＦ−αによる刺激又はＦａｓ抗原が刺激されることによって活性化され、SAPK/JNKを活性化するがｐ３８は活性化しない、新規ＭＡＰＫキナーゼＭＫＫ７をコードするｃＤＮＡがクローニングされた。本発明でクローニングされたＤＮＡの塩基配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサーのような転写調節配列や、終止配列、並びにＭＫＫ７の発現を制御する他の調節配列を含む、宿主細胞内で発現可能な発現ベクターに連結させることができる。本発明で用いられる発現ベクターは、宿主細胞に導入することが可能であり、宿主細胞内で複製し、ベクターに挿入されたＤＮＡを発現することが可能なベクターであれば特に限定されない。発現ベクターは、原核生物性もしくは真核生物性のいずれでもよく、典型的なベクターとしてはウィルスもしくはプラスミドが用いられる。
本発明のいずれかの塩基配列を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物又は細胞は、形質転換、即ち、塩基配列を細胞内へ導入する方法を用いて作成することができる。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等が挙げられるが、これらには限定されるものではない。又、上記したように、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＭＫＫ７の発現を調節することもできる。例えば、適切な制御因子をＭＫＫ７配列と連結させた後で、宿主細胞をこの組換えＭＫＫ７配列で形質転換することにより、所望の発現を達成することができる。宿主細胞内での塩基配列のコピー数、それらの塩基配列が転写される効率、翻訳される効率及び翻訳後修飾等の効率は、宿主となる微生物又は細胞や、組換えＤＮＡの構成を操作することによって、制御することが可能である。
本発明のＭＫＫ７のポリペプチド及びＤＮＡは、ＭＡＰキナーゼカスケードにおいて、ＭＫＫ７の機能を調節する化合物の同定に有用である。上記した「ＭＫＫ７の機能の調節」には、ＭＫＫ７の活性化とその活性の阻害が含まれるが、特にＭＫＫ７の活性を阻害する化合物には様々な用途がある。このような化合物は、ＭＫＫ７によるＭＡＰキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が、少なくとも部分的には発症に関与するような疾患の治療又は予防に有効である。本発明において、ＭＫＫ７のドミナントネガティブ型が、ＴＮＦ−αによるSAPK/JNKの活性化を抑制することから、ＭＫＫ７が実際にＴＮＦ−αによって誘導される細胞内シグナル伝達の一部を担っていることを証明した。ＴＮＦ−αが自己免疫疾患や炎症反応の誘因もしくは進展に関与していることを考慮すると、ＭＫＫ７も上記の疾患において重要な役割を担うものと予想される。
上記したように、本発明では、Ｆａｓ抗原が刺激されることによってもＭＫＫ７が活性化されて、SAPK/JNKを活性化することを明らかにした。このことは、ＭＫＫ７がＦａｓ抗原に対する刺激やＴＮＦ−αによって誘導されるアポトーシスシグナルの伝達に関わっている可能性を示唆している。アポトーシスの抑制が治療につながる疾患としては、ＧＶＨＤ、Toxic epidermal necrolysis（ＴＥＮ）などの皮膚疾患、増殖性腎炎（IgA腎症、紫斑病性腎炎、ループス腎炎）、劇症肝炎などが挙げられる。逆に、アポトーシスの誘導が治療につながる疾患としては、腫瘍が挙げられる。ＭＫＫ７は、ストレスによっても活性化されることが明らかとなっており、ストレスによって起こる病態である虚血性心疾患、熱や放射線（ＵＶ、Ｘ線、γ線、β線など）による火傷などの治療への応用も考えられる。
本発明のＭＫＫ７に特異的に作用する化合物、特にＭＫＫ７の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法としては、例えば実施例５の実験系を使用することができる。具体的には、図３に示す+MKK7+SAPK+c-Junの系において、c-Junのリン酸化のみが抑制され、他の系には影響しない化合物をスクリーニングすれば、ＭＫＫ７に特異的な阻害剤を選択することができる。別のスクリーニング方法としては、細胞表面レセプター、例えばＴＮＦレセプターやＦａｓ抗原から開始するシグナルを調節することが可能な化合物を同定する方法も考えられる。この方法においては、（１）レセプターとＭＫＫ７を発現する細胞を化合物と接触させ、（２）次に細胞をレセプターのリガンドと接触させ、（３）SAPK/JNKの活性を測定することにより、化合物がＭＫＫ７の活性に与える影響を評価することができる。しかしながら、本発明のスクリーニング方法は上記の方法に限定されるものではない。上記の方法においては、ＭＫＫ７は細胞内で自然にリン酸化を受けることによって活性化されているが、別の方法として、実施例９に示した実験系を用いてＭＫＫ７を積極的にリン酸化し、活性化することによってスクリーニングを実行することもできる。活性化されているＭＫＫ７においでは、ＭＡＰＫキナーゼの活性化に必要なセリン残基及び／又はスレオニ残基がリン酸化されている。又、リン酸化を受けないＭＫＫ７が極めて弱いながらも活性を持つ可能性も考えられるので、大量の非リン酸化型ＭＫＫ７を用いてその阻害剤をスクリーニングすることも可能である。
スクリーニングに使用できる化合物は、高分子であっても経口投与可能な低分子化合物であってもよい。このようにしてスクリーニングされたＭＫＫ７特異的阻害剤は、例えばＴＮＦ−αの作用の一部をブロックするが、それ以外には影響しない、特異的な抗炎症剤又は慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療薬としての用途が考えられる。
又、本発明のＭＫＫ７の塩基配列をもとに、それと相補的なＭＫＫ７に特異的アンチセンスを設計することは容易である。ここでいうアンチセンスとは、ＭＫＫ７をコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡなど）であり、ＭＫＫ７の転写及び翻訳を阻害するものをいう。具体的には、アンチセンスとして用いることができるポリヌクレオチドは、ＭＫＫ７をコードする塩基配列の連続した１２塩基以上の配列に対して１００％の相同性を有するポリヌクレオチド配列である。更に、本発明の形質転換体を用いて、そのアンチセンスの効果を確認することもできる。更に、ＭＫＫ７遺伝子は、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療を目的とした遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療とは、疾病の治療を目的として、遺伝子又は遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与することを意味する。
本発明のＭＫＫ７蛋白質やＤＮＡは、診断目的にも使用できる。本発明のＭＫＫ７で形質転換された細胞を使ってＭＫＫ７を大量に生産し、その蛋白質を用いて、ＭＫＫ７に特異的なモノクローナル抗体を得ることは容易である。免疫抗原としては、ヒト又はマウスＭＫＫ７の全長を用いても、ＭＫＫ７のアミノ酸配列の連続した少くとも５アミノ酸残基からなる断片を用いても良い。抗体には、完全な抗体の他に、抗原結合部位を含んだ断片であるFab, F（ab'）2, Fv, scFvなども含まれる。このような抗体を用いれば、細胞や組織中のＭＫＫ７蛋白質の検出を目的としたＥＬＩＳＡやＲＩＡ、又はウェスタンブロット系を構築することが可能である。このような検出系は診断目的に使用できる。又、ＭＫＫ７のｍＲＮＡに特異的なプローブを用いて細胞や組織のＭＫＫ７の発現を検出することもできるので（実施例３及び図２を参照）、この様なプローブも診断的アッセイに利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
マウスＭＫＫ７のクローニング
まず、本発明の新規マウスＭＫＫ７遺伝子のクローニングについて具体的に説明する。ヒトＭＫＫ３遺伝子の翻訳領域全体をプローブとして用い、アフリカツメガエル卵母細胞のライブラリー（Xenopus laevis, oocytes 5'-STRETCH cDNA library；米国、CLONTECH社製）に対して、プラークハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ存在下、４２℃の条件で洗浄したところ、合計１２万個のプラークから１０個の陽性クローンが得られた。得られた陽性クローンの塩基配列を解析したところ、ショウジョウバエのＨｅｐと相同性の高い新規なキナーゼをコードしているクローンが３個単離された。このXenopusのキナーゼ遺伝子断片の塩基配列を配列番号７に示した。
次に、この新規なXenopus laevisのキナーゼ遺伝子断片をプローブとしてマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Mouse brain cDNA library Uni-ZapTM XR vector；米国、STRATAGENE CLONING SYSTEMS社製）に対してプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃の条件で洗浄したところ、２０万個のプラークから１１個の陽性クローンが得られた。こうして得られたクローンの塩基配列を決定したところ、配列番号３に示す、新規キナーゼ蛋白質をコードする塩基配列が得られた。この配列によってコードされる蛋白質をＭＫＫ７と名付けた。又、配列番号５に記載したＮ末端付近及びＣ末端に欠失のあるクローンも同時に得られた。このクローンは、配列番号３のクローンとは異なった位置でスプライシングされているクローン（即ち、オルタナティブスプライシング産物）と推定された。
陽性クローンのUni-ZapTM XR vectorからマウスＭＫＫ７遺伝子を切り出し、Bluescript Vectorに挿入した組換えプラスミドをE. Coliに導入して得た形質転換体を、E. Coli:DH5-pBluemMKK7として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）］に平成９年６月２６日（原寄託日）に寄託した（受託番号：FERM BP-6397）。
実施例２
ヒトＭＫＫ７のクローニング
実施例１で得られたマウスＭＫＫ７の塩基配列を用いて、ＥＳＴ データベース（ヒト及びマウスの様々な組織から無作為に抽出したｍＲＮＡから作ったｃＤＮＡの配列を公表しているデータベース）をホモロジー検索したところ、マウスＭＫＫ７の配列と相同性の高いヒト由来の２クローンが発見された（Homo sapiens cDNA clone 665682及びclone 363521）。クローン665682はマウスＭＫＫ７のＮ末側に極めて高い相同性を持った断片（配列番号１の９６１〜１１９０ｂｐに相当）であり、又クローン363521はマウスＭＫＫ７のＣ末側に極めて高い相同性を持った断片（配列番号１の３６０〜８２０ｂｐに相当）であった。この２クローンを基に、ヒトＭＫＫ７の塩基配列を決定した。具体的には、データベースから見出された塩基配列の情報をもとに、ヒト心臓のｐｏｌｙＡ  ＲＮＡ（米国、CLONTECH社製）を材料として、米国、GIBCO BRL社製の５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ，３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍをそれぞれ用いて、添付のプロトコールに従ってＭＫＫ７の塩基配列を決定した。５’ＲＡＣＥ法によるｃＤＮＡ合成のプライマーとしては、合成オリゴヌクレオチド5'-TTTGGTCTCTTCCTGTGATC-3'を用いた。又実際に５’末端のクローニングを行う際には、キットに添付されたAUAPプライマーと共に、合成オリゴヌクレオチド5'-TGCTTAACGGCAATGACGTG-3'を用いてＰＣＲを１５サイクル行い、得られたＰＣＲ産物１μｌを用いて、更にAUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-TTGATTTCTGCCTGGTAGCG-3'を用いたＰＣＲを２５サイクル行い、最終的にヒトＭＫＫ７の５’末端を持つクローンをクローニングするに至った。３’ＲＡＣＥ法は、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した後に添付のAUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-CAGTCCTTCGTCAAAGACTG-3'とを用いたＰＣＲを３４サイクル行い、更にそのＰＣＲ産物１μｌを用いて、AUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-CAGTCCTTCGTCAAAGACTG-3'を用いたＰＣＲを２５サイクル行い、最終的にヒトＭＫＫ７の３’末端を持つクローンをクローニングするに至った。又、両末端の間の配列に関しては、５’側のプライマーとして合成オリゴヌクレオチド5'-CGCTACCAGGCAGAAATCAA-3'を、又３’側のプライマーとして合成オリゴヌクレオチド5'-TTTGGTCTCTTCCTGTGATC-3'を用い、５’ＲＡＣＥ法に用いたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを３４サイクル行い、ヒトＭＫＫ７全長クローンを得た。得られたクローンの塩基配列を決定し、ヒトＭＫＫ７の全長塩基配列として配列番号１に記載した。
上記のヒトＭＫＫ７の全長塩基配列を大腸菌の発現ベクターpTrCHisB（オランダ国、Invitrogen Corporation社製）に組込み、この組換えプラスミドをE. Coli（DH5）に導入して得られた形質転換体を、E. Coli:DH5-pTrCHisBhMKK7として通商産業省工業技術院生命工学技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）］に平成９年８月８日（原寄託日）に寄託した（寄託番号：FERM BP-6398）。
実施例３
ノーザンハイブリダイゼーション
本発明の新規なＭＡＰＫキナーゼのｍＲＮＡの発現を調べるために、マウスＭＫＫ７の翻訳領域をプローブとして、マウスの心臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣について、Mouse Multiple Tissue Northern Blot（米国、CLONTECH社製）に対してノザンハイブリダイゼーションを行った。プローブの放射標識は、deoxynucleotidyl transferase（日本国、東洋紡社製）と［α-32P］CTP（英国、Amersham International社製）を用いて行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件としては２×ＳＳＣ、０．０４％ＳＤＳ、室温で２０分間の洗浄を２回行い、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で２０分間の洗浄を２回行った。洗浄後、オートラジオグラフィーによって放射活性を測定した。結果を図２に示した。
図２からも明らかなように、ＭＡＰＫキナーゼのｍＲＮＡは、いずれの臓器でも発現していることが判明し、特に、心臓や骨格筋で強く発現していることが判明した。
実施例４
ドミナントネガティブ型ＭＫＫ７の作成
マウスＭＫＫ７の１６５番目のリジン（Ｋ）をロイシン（Ｌ）に置換することにより、ドミナントネガティブ型ＭＫＫ７を作成した。具体的には、合成オリゴヌクレオチド5'-CAGGGCACATCATTGCTGTTCTGCAGATGCGGCGCTCTGGGAAC-3'と共に、米国、CLONTECH社製のTransformer Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、添付のプロトコールに従ってドミナントネガティブ型ＭＫＫ７を作成し、「ＭＫＫ７ＫＬ」と命名した。作成したドミナントネガティブ型ＭＫＫ７の配列を配列番号９及び１０に記載した。
実施例５
（１）各種発現ベクター及び組換え蛋白質の作成
哺乳動物細胞発現ベクターpSRα456のBglII及びEcoRIサイトに合成オリゴヌクレオチド5'-GATCGCCGCCACCATGTACCCATACGACGTCCCAGATTACGCTCCCGGGAGATCTG-3'と合成オリゴヌクレオチド5'-AATTCAGATCTCCCGGGAGCGTAATCTGGGACGTCGTATGGGTACATGGTGGCGGC-3'をそれぞれ挿入することにより、ベクターpSRα-HA1を作成した。実施例４で作成したドミナントネガティブ型ＭＫＫ７遺伝子のコード領域も、ベクターpSRα456の上記サイトに挿入することによって、ベクターpSRα-MKK7KLを作成した。又マウスＳＡＰＫα遺伝子のコード領域も、ベクターpSRα-HA1のBglIIサイトに挿入し、ベクターpSRα-HA-SAPKαを作成した。
各種ＭＡＰＫキナーゼについては、以下の発現プラスミドを作成した。ＧＳＴ−ＳＥＫ１の発現プラスミドは、ベクターpGEX-2T（スウェーデン国、ファルマシア社製）にマウスＳＥＫ１遺伝子を挿入することにより作成した。Ｈｉｓ−ＭＫＫ６、Ｈｉｓ−ＭＫＫ７の発現プラスミドは、それぞれヒトＭＫＫ６、マウスＭＫＫ７遺伝子をベクターpET28（米国、Novagen Inc. 社製）に挿入することにより作成した。
又、各種ＭＡＰキナーゼについては、以下の発現プラスミドを作成した。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫの発現プラスミドは、ベクターpTrcHisC（オランダ国、Invitrogen Corporation社製）にXenopusＭＡＰＫ遺伝子を組み込むことによって作成した。Ｈｉｓ−ＳＡＰＫα、Ｈｉｓ−ｐ３８、Ｈｉｓ−ＳＡＰＫ３はそれぞれマウスＳＡＰＫα、ｐ３８、ＳＡＰＫ３遺伝子をpET28（米国、Novagen Inc. 社製）に組み込むことにより発現プラスミドを作成した。ＧＳＴ−ｃＪｕｎは、pGEX-3X（スウェーデン国、ファルマシア社製）にヒトcJUN遺伝子のアミノ酸１番目から７９番目をコードする領域を挿入することにより、発現プラスミドを作成した。
上記の発現プラスミドを大腸菌に導入した後、ＧＳＴ（glutathione-S-transferase）フュージョン蛋白質の精製にはglutathione-Sepharose 4Bカラム（スウェーデン国、ファルマシア社製）を用い、Ｈｉｓ（Histidine cluster）タグ付きの蛋白質に関してはpET Expression Systems（米国、Novagen Inc. 社製）のプロトコールに従って精製した。
（２）ＭＫＫ７によるＳＡＰＫの特異的活性化
上記（１）で作成したＨｉｓ−ＭＫＫ７、ＧＳＴ−ＳＥＫ１又はＨｉｓ−ＭＫＫ６を０．１μｇ、Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ、Ｈｉｓ−ＳＡＰＫ、Ｈｉｓ−ｐ３８又はＨｉｓ−ＳＡＰＫ３を０．５μｇと、１００μＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＥＧＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）からなる溶液１０μｌを３０℃で３０分間インキュベートしてＭＡＰキナーゼを活性化した。その後ＭＡＰＫとＳＡＰＫ３の場合は基質としてmyelin basic protein（ＭＢＰ）３μｇと１μＣｉの［γ−32P］ATP（英国、Amersham International社製）を含む溶液５μｌ、ＳＡＰＫの場合はＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）３μｇと１μＣｉの［γ-32P］ATPを含む溶液５μｌ、ｐ３８の場合はＡＴＦ−２を３４μｇと１μＣｉの［γ-32P］ATPを含む溶液５μｌをそれぞれ加えて２０℃にて２０分間インキュベートした。尚、基質として用いたＭＢＰは、Brain Acetone Powder（米国、シグマ社製）を精製したものを用い、ＡＴＦ−２はDr.Suzanne J.BakerとDr.Tom Curran（St.Jude Children's Research Hospital）より供与を受けた。インキュベート後のサンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ＭＢＰ，ｃ−Ｊｕｎ，ＡＴＦ−２の放射活性をオートラジオグラフィーによって検出した。図３から明らかなように、マウスＭＫＫ７は、ｐ３８やＳＡＰＫ３を活性化することなく、ＳＡＰＫを特異的に活性化し、その結果としてｃＪｕｎをリン酸化している。又、ｐ３８の活性に関しては、抑制作用をも示唆している。これに対し、マウスＳＥＫ１は、ＳＡＰＫ、ｐ３８、ＳＡＰＫ３のすべてを活性化し、又、ＭＫＫ６は、ＳＡＰＫを活性化することなくｐ３８とＳＡＰＫ３を活性化している。
実施例６
ＴＮＦ−αによるＭＫＫ７の活性化
ＫＢ細胞は１０％の牛血清を含むDulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）で培養し、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−α（米国、BECTON DIKKINSON AND COMPANY社製Collaborative Biomedical Productsブランド）で刺激した。Ｕ９３７細胞は１０％の仔牛血清を含むRPMI1640で培養し、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αで刺激した。刺激開始から５、１５、３０、６０、１２０、１８０分後にそれぞれの細胞抽出液を調製した。細胞抽出液の調製は、細胞を０．７Ｍ ＮａＣｌにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），２ｍＭ ＥＧＴＡ，２５ｍＭ β-glycerophosphate,２ｍＭ ＤＴＴ,１ｍＭ vanadate,１ｍＭ Phenylmethylsulfonyl fluoride及び１％ aprotininからなるバッファー３００μｌを、直径１００ｍｍのシャーレより得られた細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで３分間、その後４００，０００×ｇで２０分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液200μlに3μlの抗ＭＫＫ７抗血清又は抗SEK1/MKK4抗血清を加えて４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後の混合物に３０μｌの５０％スラリーのProtein A Sepharose Beads（スウェーデン国、ファルマシア社製）を加え、４℃で１時間インキュベートした。Beads上の免疫複合体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），５００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液で３回洗浄した後に、１μｇのＨｉｓ−ＳＡＰＫ及び３μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１〜７９アミノ酸残基）とともに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），２０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ［γ-32P］ATP（3μCi）からなる溶液１５μｌ中で３０℃、２０分間インキュベートした。インキュベート後の反応混合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動後、ｃＪｕｎのリン酸化をオートラジオグラフィーで測定し、それをＴＮＦ−αによるＭＫＫ７の活性化の指標とした。結果を図４に示した。
図４から明らかなように、マウスＭＫＫ７は、ＴＮＦ−αで活性化されるが、マウスSEK1/MKK4は活性化されないことが判明した。
尚、抗ＭＫＫ７抗血清と抗SEK1/MKK4抗血清は、それぞれ実施例５の方法で調製したＨｉｓ−ＭＫＫ７又はＨｉｓ−ＸＭＥＫ２（XenopusのSEK1/MKK4ホモログ）を抗原として用い、ウサギを免疫して作製した。免疫には１回当たり１mgの蛋白質を用い、初回免疫から４週間後に２回目の免疫を行い、それ以降は３週間ごとに免疫した。抗血清の力価はＥＬＩＳＡで評価し、１０万倍の希釈で反応する抗血清が最終的に得られた。
実施例７
ドミナントネガティブ型ＭＫＫ７による、ＴＮＦ−αによって誘導されるＳＡＰＫの活性化の阻害
ベクターpSRα又はベクターpSRα-MKK7KL（1.5μg）と、ベクターpSRα-HA-SAPKα（0.5μg）をＫＢ細胞にリポフェクトアミン（米国、GibcoBRL社製）を用いてco-transfectionし、２４時間後にＴＮＦ−α（100ng/ml）、sorbitol（0.5M）、アニソマイシン（anisomycin）（100μg/ml）をそれぞれ用いて細胞を１５分間刺激した。刺激した細胞の細胞抽出液の調製には、細胞を０．７Ｍ ＮａＣｌにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）, ２ｍＭ ＥＧＴＡ, ２５ｍＭ β-glycerophosphate, ２ｍＭ ＤＴＴ, １ｍＭ vanadate, １ｍＭ phenylmethylsulfonyl fluoride, １％ aprotininからなるバッファー３００μｌを、直径１００ｍｍのシャーレより得られた細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで３分間、４００，０００×ｇで２０分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を抗ＨＡ抗体（抗ヘマグルチニン抗体）（12CA5）で免疫沈降し、ＨＡ−ＳＡＰＫのキナーゼ活性を測定した。結果を図５に示した。
図５から明らかなように、ドミナントネガティブ型ＭＫＫ７（ＭＫＫ７ＫＬ）を発現させた細胞では、ＴＮＦ−αによるSAPK/JNKの活性化のみが抑えられた。このことから、ＴＮＦ−αによるSAPK/JNKの活性化はＭＫＫ７を介するが、sorbitolやanisomycinによるSAPK/JNKの活性化は、ＭＫＫ７とは異なるＭＡＰＫキナーゼを介して起こることが示された。
実施例８
ＭＫＫ７のＦＡＳ抗原刺激による活性化
Jurkat細胞を抗Ｆａｓ抗体［ＣＨ−１１；日本国、（株）医学生物学研究所（ＭＢＬ）社製］２５０ｎｇ／ｍｌで刺激し、刺激開始から１、２、３、４、５及び６時間後に細胞抽出液を調製した。細胞抽出液の調製は、細胞を０．７Ｍ ＮａＣｌにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）, ２ｍＭ ＥＧＴＡ, ２５ｍＭβ-glycerophosphate, ２ｍＭ ＤＴＴ, １ｍＭ vanadate, １ｍＭ phenylmethylsulfonyl fluoride, １％ aprotininからなるバッファー３００μｌを、直径１００ｍｍのシャーレより得られる細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで３分間、４００，０００×ｇで２０分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。
細胞抽出液２００μｌに３μｌの抗ＳＡＰＫ抗血清又は抗ＭＫＫ７抗血清を加えて４℃で１時間インキュベートした。抗ＳＡＰＫ抗血清としては、米国、Santa Cruz Biotechnology, Inc. 社製のＪＮＫ１抗体（ウサギポリクローナル抗体）を使用した。その後に３０μｌの５０％スラリーのProtein A Sepharose Beadsを加え４℃で１時間インキュベートした。Beads上の免疫複合体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）,５００ｍＭ ＮａＣｌ, ２ｍＭ ＤＴＴ, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０からなるバッファーで３回洗浄した。抗ＳＡＰＫ抗血清免疫複合体とＨｉｓ−Ｊｕｎ ３μｇを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）,１０ｍＭ ＭｇＣｌ2, １００ｍＭ［γ-32P］ATP（3μCi）１５ｍｌからなるバッファー中で３０℃,３０分間インキュベートした。
抗ＭＫＫ７抗血清免疫複合体に関しては、同じバッファー中で、ドミナントネガティブ型のＳＡＰＫをＧＳＴとの融合蛋白質として発現させたGST-KN-SAPKを基質に用い、ＳＡＰＫリン酸化活性を指標に測定した。ＫＮ−ＳＡＰＫは、ＳＡＰＫのキナーゼサブドメインIIのリジン残基をメチオニン残基になるように変異を入れたもので、変異体の作製はKunkel法で行った。
結果を図６に示した。SAPK/JNKとＭＫＫ７は共にＦＡＳ抗原に対する刺激によって同じ様なtime courseで活性化されることが判明した。上記の結果から、Ｆａｓ抗原に対する刺激によって誘導されるSAPK/JNKの活性化は、ＭＫＫ７を介すると考えられた。
実施例９
本発明のＭＡＰＫキナーゼＭＫＫ７を用いたＭＫＫ７阻害剤のスクリーニング
ＭＫＫ７の活性阻害剤をスクリーニングするために、完全に活性化されたＭＫＫ７を調製した。具体的には、ＭＫＫ７の上流でその活性化を行うと予想されるＭＥＫＫ１を活性化因子として使用した。市販のＭＥＫＫ１遺伝子（米国、STRATAGENE CLONING SYSTEMS社製）を、p15Aを複製起点（ori）とする大腸菌の発現ベクターに組み込み、更に、ヒトＭＫＫ７の全長ＤＮＡをベクターpGEX-4T1（スウェーデン国、ファルマシア社製）に組み込み、２種類の発現ベクターを同時に大腸菌ＤＨ５αに導入した。この大腸菌から、Glutathione-Sepharose 4Bカラム（スウェーデン国、ファルマシア社製）を用いて活性化されたGST-MKK7を精製した。
ヒトＪＮＫ１をコードする遺伝子をpGEX-4T1に組み込み、ＧＳＴ−ＪＮＫ１として大腸菌で発現させた。ＧＳＴ−ＪＮＫ１をGlutathione-Sepharose 4Bカラム（スウェーデン国、ファルマシア社製）で精製し、後の活性測定の際に基質として用いた。
上記の方法で調製した活性型ＭＫＫ７とその基質であるＪＮＫ１を用いて、以下の条件でＭＫＫ７の活性を測定した。最終濃度が、０．１μＭ ＭＫＫ７、０．２μＭ ＪＮＫ１、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ β-mercaptoethanol、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ ＡＴＰとなるように５０μｌの反応系を調製した。３０℃で２時間の反応後、反応溶液をＰＶＤＦ膜に転写し、抗活性型ＪＮＫ抗体（米国、Promega社製）を用いてドトハイブリダイゼーション法で活性型ＪＮＫを検出した。その結果、図７に示すように、ＭＫＫ７の活性が確認された。
以上のＭＫＫ７活性測定法を用いて、それを阻害する物質の精製ならびに同定を行うことが可能である。具体的には、様々な菌体や培養細胞等の培養上清や化合物バンクから得られた物質を上記のＭＫＫ７活性測定系に加え、ドットハイブリダイゼーションのドットの濃さがそれらを加えない場合に比べて明らかに薄くなった場合に、ＭＫＫ７の活性を阻害する物質が存在することを確認することができる。このような方法を用いてＭＫＫ７の活性阻害剤をスクリーニングすることが可能である。
産業上の利用可能性
本発明の新規なＭＡＰＫキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを用いると、ＭＡＰＫキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が関与する疾患の治療や予防に有用な化合物のスクリーニング、更にそのような疾患の診断剤を作成することが可能である。更に、本発明のＭＡＰＫキナーゼをコードするＤＮＡは、遺伝子治療に用いられる遺伝子ソースとしても有用である。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１３０８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：ヒト
組織の種類：心臓
配列：
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0004024313.tif 000003
0004024313.tif 000004
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配列番号：２
配列の長さ：４３５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト
組織の種類：心臓
配列：
0004024313.tif 000006
0004024313.tif 000007
0004024313.tif 000008
配列番号：３
配列の長さ：１５１８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：マウス
組織の種類：脳
配列：
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0004024313.tif 000010
0004024313.tif 000011
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配列番号：４
配列の長さ：４６８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：マウス
組織の種類：脳
配列：
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0004024313.tif 000014
配列番号：５
配列の長さ：１２６０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：マウス
組織の種類：脳
配列：
0004024313.tif 000015
0004024313.tif 000016
0004024313.tif 000017
配列番号：６
配列の長さ：４１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：マウス
組織の種類：脳
配列：
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0004024313.tif 000019
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配列番号：７
配列の長さ：４７７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：Xenopus laevis
細胞の種類：卵母細胞
配列：
0004024313.tif 000021
配列番号：８
配列の長さ：１５８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：Xenopus laevis
細胞の種類：卵母細胞
配列：
0004024313.tif 000022
配列番号：９
配列の長さ：１５１８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸    突然変異体
配列の特徴
特徴を表す記号：mutation
存在位置：493..495
特徴を決定した方法：Ｅ
配列：
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配列番号：１０
配列の長さ：４６８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号：mutation
存在位置：165
特徴を決定した方法：Ｅ
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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