(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蔗糖と脂肪酸から蔗糖脂肪酸エステルを合成する酵素を産生するイデオネラ属細菌No.１３（Ideonella sp. No.１３（ＦＥＲＭ Ｐ-１６２０６))。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蔗糖脂肪酸エステル(SE)の合成に関与する酵素を産生する、単離された新規の微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
蔗糖脂肪酸エステルは、界面活性剤の一種であり、人体・生態系に対する高い安全性が確認されているため、今日まで、商業ベースで工業的に大量生産され、食用品の乳化・分散剤などの用途を含め、幅広く使用されている。
【０００３】
この蔗糖脂肪酸エステルの従来の製造法は、化学法が主流であるが、一方で、酵素法による合成方法を待望する声が根強いのも事実である。
【０００４】
この背景として、酵素法によると、化学法に比べて、以下のような利点が期待できることが挙げられる。  すなわち；
▲１▼  酵素反応は常温、常圧、中性ｐＨの条件下で反応が進行するため、耐酸、耐アルカリ、耐圧設計の設備が不要となり、また、反応温度が化学法より低いため、温度調節に要する設備負担が軽減され、その管理も容易になる。
【０００５】
▲２▼  酵素はタンパク質であるため、無毒かつ生分解性であり、環境や生態系に対する影響が小さいSEの製造法の実現が図れる。
【０００６】
▲３▼  酵素反応は反応特異性が高く、常温、中性ｐＨにて反応が進行するため、副反応が起こりにくく、よって、純度の高い生成物が得られやすい。  さらに、反応中に原料の変質が起こりにくく、また、未反応原料が次回の反応に供することができるので、原料の有効利用も可能となる。
【０００７】
▲４▼  酵素反応によれば、位置特異的反応が可能であり、これを利用することで、蔗糖の特定位置の水酸基のみをエステル化して、目的とする改変体（生成物）が高い純度で得ることができる。
【０００８】
近年、エステル合成に適した固定化リパーゼ剤（リポザイム、ノボザイム等）の入手が容易になったこともあって、酵素法によるエステル合成への関心が高まり、とりわけ糖類はエステル化可能な水酸基を多数有することから、その位置的選択（部位特異的）エステル化は、多くの科学者が研究テーマとしている。
【０００９】
例えば、Klibanov等［Klibanov et al., "Protease-catalyzed Regioselective esterification of sugars and related compunds in anhydrous dimethylformamide", J. Am. Chem. Soc., 110, pp. 584-589 (1988)]は、原料に高反応性の脂肪酸トリクロロエチルエステルを用い、プロテアーゼを触媒とすることで、蔗糖の1'位を選択的にエステル化している。［Patil et al., "Enzymatic synthesis of a sucrose-containing linear polyester in nearly anhydrous organic media", Biotechnol. Bioeng., 37, pp. 639-646 (1991);  Chan et al., "A regioselective, chemoenzymatic synthesis of sucrose-1'-methacrylate", Biocatalysis, 8, pp.163-169 (1993);およびSoedjak et al., "Enzymatic transesterification of sugars in anhydrous pyridine, Biocatalysis, 11, pp.241-248 (1994)の文献も参照されたい］。
【００１０】
また、Fregapane等［Fregapane et al., "Enzymatic solvent-free synthesis of sugar fatty acid ester", Enzyme Microb. Technol., 13, pp. 796-800 (1991)]は、アセトンを付加した糖（イソプロピリデン誘導体）を原料に用いることで、糖の脂肪酸メチルへの溶解性を向上させ、さらに、市販の固定化リパーゼ剤を触媒として用いることで、主に単糖類をエステル化している。  ［Fregapane et al., "Facile chemo-enzymatic synthesis of monosaccharide fatty acid esters", Biocatalysis, 11, pp.9-18 (1994); およびSarney et al., "Chemo-enzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters", J. Am. Oil Chem. Soc., 71, pp.711-714 (1994)の文献も参照されたい］。
【００１１】
また、Klibanov等［Klibanov et al., "Lipase-catalyzed acylation of sugars solubilized in hydrophobic solvents by complexation", Biotechnol. Bioeng., 42, pp. 788-791 (1993)]は、糖のフェニルホウ酸エステルを原料に用いることで、糖類の溶剤への溶解性を向上せしめ、さらに、リポプロテインリパーゼを触媒とすることで、蔗糖アクリレートを合成している。  ［Schlotterbeck et al., "Lipase-catalyzed monoacylation of fructose", Biotechnol. Letters, 15, pp.61-64 (1993)およびOguntimein et al., "Lipase catalyzed synthesis of sugar ester in organic solvents", Biotechnol. Letters, 15, pp.175-180 (1993)等の文献も参照されたい］。
【００１２】
さらに、特殊な誘導体を用いずに、単糖類と脂肪酸を直接反応させた例として、市販の固定化酵素剤（リポザイム、ノボザイム等）を触媒として、果糖またはグルコースをエステル化した報告もされている。  ［Khaled et al., "Fructose oleate synthesis in a fixed catalyst bed reactor", Biotechnol. Letters, 13, pp.167-172 (1991); Coulon et al., "Comparison of direct esterification of fructose by Candida antartica lipase", Biotechnol. Letters, 17, pp.183-186 (1995);およびLjunger et al., "Lipase catalyzed acylation of glucose", Biotechnol. Letters, 11, pp.1167-1172 (1994)等の文献も参照されたい］。
【００１３】
このように、糖と脂肪酸を原料として単糖エステルを酵素法で合成することは可能であったのに対して、蔗糖エステルは、特殊な誘導体を原料とすることで初めて酵素法によって合成できていたのが実情であった。  このような特殊な誘導体の利用は、蔗糖エステルを工業生産する上には不利であり、従って、このことが酵素法による工業生産が未だ達成されていない理由の一つでもあった。
【００１４】
また、合成用に使用されている酵素はいずれも市販のリパーゼ剤またはプロテアーゼ剤であり、これらの蔗糖脂肪酸エステルに対する活性は満足のゆくものではなかった。  実際、市販のリパーゼ剤13種の内、蔗糖脂肪酸エステルに対して分解活性が認められたのは、リパーゼMY(名糖産業）とリパーゼOF(名糖産業）の２種類のみであり、これらの分解活性にしても実用レベルにはほど遠いものであった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した従来技術での問題点に鑑み、蔗糖脂肪酸エステル(SE)に対する活性が高い酵素とそれを産生する微生物を自然界から検索し、これらを利用した酵素法による工業規模での蔗糖脂肪酸エステル(SE)の合成を図ることを目的として、鋭意研究を進めた結果、本発明の完成に至ったものである。
【００１６】
すなわち、本発明の要旨とするところは、蔗糖と脂肪酸から蔗糖脂肪酸エステルを合成する酵素を産生する、単離されたイデオネラ(Ideonella)属に属する新規の微生物とその利用にある。
【００１７】
【発明の実施の形態】
まず、本発明者らは、エステル化反応が平衡反応であることから、SEに対して高い分解活性を示す酵素が、反応条件の変化によって（反応条件次第で）高い合成活性を示すとの認識の下、脂肪酸エステル分解活性が大きい微生物（以下、単に「SE分解菌」と称する）を探索した。  微生物試料は、蔗糖脂肪酸エステルの製造工場や大学などの研究機関周辺の土壌試料（84株）とした。  そして、比較的高い活性を呈した８株を選抜し、この中から最高の分解活性を示した１株を選択した。
【００１８】
この株を、イデオネラ属細菌No.13 (Ideonella sp. No.13 (以下、『No.13株』と称する))と命名し、平成９年４月24日に、本願出願人は、茨城県つくば市東町１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にこれを寄託し、そこで、受託番号 FERM P-16206 が付与されており、本願発明は、この寄託微生物自体はもちろん、この微生物の能力を実質的に引き継いだその変異体および子孫まで意図するものである。
【００１９】
そして、このNo.13株を培養して粗酵素を調製したところ、No.13株は、グルコースを１％添加したＬ培地で、菌体の増殖に伴ってエステラーゼを産生した［産生量：2.6単位／ml］。  また、このエステラーゼを用いた反応系での蔗糖脂肪酸エステル類の合成を確認した。
【００２０】
【実施例】
以下に、本願発明を具体的に説明するが、本願発明が実施例の開示に基づいて限定的に解釈されるべきでない。
【００２１】
実施例１：SE分解菌の単離
まず、本出願人の蔗糖脂肪酸エステル製造工場（滋賀県神崎郡五箇荘町下日吉427）構内の土壌ならびに同所に併設されている排水処理場の廃液、活性汚泥、および大阪大学工学部（大阪府吹田市山田丘２−１）構内ならびに近辺の土壌から、計84個の分離用試料を任意に採取した。
【００２２】
これら試料をL+SE液体培地（組成を下記表１を示した）およびL/10+SE培地（組成を下記表２を示した）の双方の培地に接種した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【表２】
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【００２５】
なお、蔗糖モノステアレートを主成分とするＤＫエステルＳＳ（商品名；第一工業製薬株式会社製）を50g/lの水溶液とし、これを別途に高圧蒸気滅菌または濾過滅菌したものを、「蔗糖脂肪酸エステル(SE)」として各培地に添加した。
そして、固体培地とする場合には、15g/lの寒天をさらに加えた。
【００２６】
各試料を滅菌水に懸濁した後、寒天培地に塗布し、30℃または37℃で、菌体の十分な増殖が目視で確認できるまで培養を継続した。  培地中の蔗糖脂肪酸エステル(SE)は、培養当初は培地に溶解して透明であるが、分解が進行すると、高級脂肪酸を遊離して白濁する。  菌体の周囲に形成される白いハロー（白濁円）の有無に基づいて、蔗糖脂肪酸エステル(SE)を分解しているSE分解菌を選抜した。
具体的には、以下に記載のSE寒天法または滴定法によった。
【００２７】
［SE寒天法］
SE寒天法は、0.2％の蔗糖脂肪酸エステル(SE)、pH７の50mMリン酸緩衝液を含む1.5％の寒天に、直径４mmの円形の穴を開け、異なる濃度の酵素液20μlをそこに注入し、37℃で一夜静置した後、白濁円の直径(mm)を測定した（図１参照）。
【００２８】
［滴定法］
滴定法は、まず、（５mlの５％蔗糖脂肪酸エステル(SE)水溶液、４mlのMcIlvanine緩衝液(pH 8)、１mlの様々な濃度の酵素液からなる）反応液を、37℃または60℃で30分間反応させる。  次いで、アセトン／エタノール＝50%/50%の混液を10ml、そして、0.05規定水酸化ナトリウムを10ml加えて反応を停止し、さらにアセトン／エタノール＝50%/50%の混液を10mlを加えた後、フェノールフタレインを指示薬として0.05規定の塩酸で遊離脂肪酸を逆滴定した。  そして、この条件下で、１分間に１μmolの脂肪酸を遊離するために必要な酵素量を１単位と定義した。
【００２９】
なお、SE寒天法で測定した白濁円の直径(mm)と、滴定法で測定した酵素活性（単位/ml）との間には、図２に示したように、片対数グラフにて直線関係が得られる。 この関係式を利用することで、両者のデータの互換が図れる。
【００３０】
ここまでの分離手順で、計44株が、コロニー周辺にハローを形成した。
【００３１】
また、L+SE寒天培地よりも、L/10+SE寒天培地の方でハローを形成した菌が圧倒的に多かった。  これは、分離源となった工場廃水（汚泥）や土壌が、栄養分の希薄な環境であるため、栄養価が希薄なL/10+SE寒天培地でよく生育したものと思われる。
【００３２】
そして、高い分解活性を示した菌の多くは、蔗糖脂肪酸エステル製造工場の排水および廃水処理場から分離された菌であった。  これは、常に蔗糖脂肪酸エステル(SE)に曝され続け、比較的温度が安定している分離源の環境が、SE分解菌の生育に適合したものと考えられる。
【００３３】
なお、分解活性は高くないものの、土壌試料からもSE分解菌は分離されており、このことは、SE分解菌が自然界に比較的広範に分布していることを示唆するものである。
【００３４】
次に、分離株を、L/10+SE液体培地に接種し、充分に増殖するまで、１〜３日間、30℃または37℃で、振とう培養し、培養液の遠心上清の酵素活性をSE寒天法で測定した。  その結果、84株の内、８株がSE寒天上で８mm以上の直径の白濁円を形成した。  これらの菌株は、顕微鏡観察により、その菌体の大きさから、いずれも細菌であると認められた。  ８株の内、最も活性の高かった分離株、SE分解菌 No.13株を選択し、そのハロー形成の状態を図３に示した。
【００３５】
なお、リパーゼの産生能を備えたArthrobacter属細菌（４株）についてもSE寒天法を適用したが、いずれの株によっても、直径８mmを超える白濁円の形成には至らなかった。
【００３６】
実施例２：SE分解菌 No.13株の同定
実施例１にて単離されたNo.13株の菌学的位置づけを決定すべく、No.13株の形態的性質、培地における生育状態、生理学的性質およびNo.13株が保有する遺伝子について分析（解析）を行った。
【００３７】
［No.13株の形態的、培養的性質］
図４および５は、（SEを含む／含まない）寒天培地上で生育したNo.13株の写真であり、コロニーの色は白色乃至クリーム色であった。  Leptothrix属（鞘皮）細菌はマンガンを含む寒天培地にて、マンガンを酸化して酸化マンガンを生成し、コロニーが黒色になるものが多いが、マンガンを含む寒天培地にNo.13株を接種してもコロニーは黒色は呈さず、また、鞘皮細菌によく見られる歪つな形状のコロニーも形成されなかった。  液体培養した菌体を集菌したところ、薄いピンク色乃至普通のピンク色を呈していた。  これに対して、蔗糖脂肪酸エステル(SE)を含む培地では、コロニー周辺に、SEの分解に起因する白いハローが形成されていた。
【００３８】
図６は、No.13株の光学顕微鏡写真（倍率：1000倍）であり、この細菌は、幅0.5μm×長さ1.5μm〜2.0μmの桿菌で、運動性が認められた。  培養条件によっては、菌体の長さが５μmに至ることがあり、２〜５個の菌が、鎖状に連なることもある。  しかしながら、鞘皮細菌に見られる鞘状物は認められなかった。
【００３９】
［No.13株の生理学的性質］
No.13株の生理学的性質を決定すべく、api 20E キット(bio Merieux)およびapi 20NE キット(bio Merieux)を用い、各キットに添付のプロトコールに従った。
【００４０】
炭素源利用能力の判定
炭素源利用能力を判定するために、No.13株が良好に生育したPTYP基本培地（表３に組成を示した）に、濾過滅菌した炭素源を１g/lまたは２g/l添加した培地を用いた。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
なお、炭素源にカルボン酸を用いる場合、水酸化ナトリウムでpHを７に調整した上でカルボン酸を添加した。  グルコース１g/lを含むPTYP基本培地に、１白金耳のNo.13株を接種し、これを37℃で、一夜振とう培養して前培養液を得た。
この前培養液を、所定の炭素源を含む前出のPTYP基本培地に0.6体積％接種し、好気的に、37℃で、２日間振とう培養した。  菌体の生育を、培養液に関して、600nmの吸光度で測定した。
【００４３】
各種炭素源を添加したPTYP培地で好気培養した時の吸光度を、炭素源を添加しなかった培地で培養した場合の吸光度と比較し、炭素源の資化性（利用能力）を判定した。  その結果を、表４に示した。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
api 20 kitによる判定結果と、後述する16S-rRNA遺伝子塩基配列の相同性比較において、高い相同性を示した細菌の炭素源利用能力に関する比較を、表５に示した。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
表５の結果から、Rubribivax gelatinosusとは、クエン酸とグリセリン、メタノール、エタノール、マンノースの利用性において相違が認められる。
【００４８】
Leptothrix cholodniiは、種々の有機酸や糖類を資化しているのに対し、No.13株は利用できない有機酸や糖類が散見される。
【００４９】
Ideonella属細菌は、１属１種(イデオネラ デクロラタンス(Ideonella dechloratans))が報告されている[Malmqvist et al., "Ideonella dechloratans gen.nov., sp.nov., a New Bacterium Capable of Growing Anaerobically with Chlorate as an Electron Acceptor", System. Appl. Microbiol. 17, 58-64 (1994)］のみで、炭素源資化性に関するデータも少ないが、報告されている範囲内ではNo.13株の炭素源資化性データと一致している。
【００５０】
また、活性汚泥からよく分離されるBrachymonas denitrificansは、No.13株とはグルコース、フルクトース、グリセリンの利用性が異なるのに加え、Brachymonas denitrificansは運動性が無い点でNo.13株の性状とは一致しない。
【００５１】
嫌気条件下での生育の判定
グルコース１g/lを含むPTYP基本培地に、表６に記載の電子受容体を10mMまたは20mM添加して培地を調製した。  電子受容体を含まない培地で、好気的に、37℃で、一夜振とう培養した前培養液を、電子受容体を含む培地に、0.6体積％接種し、嫌気ボックス中（窒素ガス、水素ガス、炭酸ガスの90：５：５の体積比率の混合ガス雰囲気）、蛍光灯照射下、30℃で７日間静置培養した。  菌体の生育を、培養液に関して、600nmの吸光度で測定した。  その結果を、以下の表６に示した。
【００５２】
【表６】
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【００５３】
電子受容体としてKNO3を添加した場合にのみ、無添加条件のものと比較して吸光度の有意な増加が観察された。  好気的に培養した場合と比べれば、増殖効果は極めて悪いが、No.13株には微弱ながら硝酸呼吸能力のあることが確認された。  後述する通り、No.13株が、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力を有していることも、この結果を支持している。
【００５４】
16S-rRNA遺伝子塩基配列の比較においてNo.13株との間で高い相同性が認められたIdeonella属細菌は、硝酸塩と塩素酸塩を電子受容体として、嫌気条件下で生育できることが知られているのに対し、No.13株は硝酸塩の利用しか認められなかった。  No.13株の硝酸呼吸能力が微弱であることは、絶対好気性であるLeptothrix属細菌の挙動と似ている。
【００５５】
［No.13株が保有する遺伝子の解析］
No.13株の細菌学的位置づけを遺伝子工学的側面から特徴付けるために、No.13株の16S-rRNA遺伝子のクローニング、次いで、その塩基配列の決定（解析）を行った。
【００５６】
No.13株が保有する遺伝子のクローニング
まず、鋳型ＤＮＡには、Sarkosyl法[Morikawa et al., "Isolation of a new surfactin producer Bacillus pumilus A-1, and cloning and nucleotide sequence of regulator gene, psf-1", J. Ferment. Bioeng., 74, 255-261 (1992)]で調製したNo.13株染色体DNAを充てた。
【００５７】
そして、上流側プライマーに、5'-AAGAGTTTGATCATGGC-3'(配列番号：１）を、そして、下流側プライマーに、5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(配列番号：２）のプライマーを用い、Vent DNA ポリメラーゼ（東洋紡社製）でPCR増幅した。
【００５８】
PCR反応の条件は、添付のカタログの記載に従った。  PCR増幅断片をプラスミドベクターpUC18のSmaI部位にクローニングした。
【００５９】
宿主菌に E. coli JM109[recA1, endA1, gryA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, △(lac-proAB), F'(traD36, proAB+, lac1y, lacZ △ M15)]を用いた。  QIAGEN KIT(フナコシ）で組み換えプラスミドの大量調製を行った。  大腸菌の形質転換は、Lederberg とCohen[Lederberg et al., "Transformation of Salmonella typhimurium by plasmid deoxyribonucleic acid", J. Bacteriol., 119, 1072-1074 (1992)]の方法によった。 また、必要に応じて、適当な制限酵素部位を利用してサブクローニングを行った。  さらに、培地は、Ｌ培地（組成を表７に示した）を用いた。
【００６０】
【表７】
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【００６１】
なお、抗生物質を添加する場合、50μg/mlアンピシリンを用いた。
【００６２】
No.13株が保有する遺伝子の解析
No.13株のクローンが保有する遺伝子の塩基配列を、自動解析装置(Auto Read Sequencing Kit)(Pharmacia社製）とALFexpress(Pharmacia社製）装置を用いて、ジデオキシ法によって解析した。  なお、解析ソフトウェアには、DNASIS(Hitachi)を使用した。  その解析結果を、配列番号：３として示した。
【００６３】
微生物分類の重要な指標の一つである、16S-rRNA遺伝子の塩基配列（配列番号：３）を基に、他の微生物が保有する16S-rRNA遺伝子との相同性について検索を行い、その結果を、以下の表８に示した。
【００６４】
【表８】
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【００６５】
配列番号：３から明らかなように、この配列には、Proteobacteriaに特徴的な塩基配列が含まれている。  Proteobacteriaは、紅色細菌とその類縁細菌の系統分類名であり、さらに、α、β、γ、δのサブクラスに細分される。  表８に記した微生物の大半は、Proteobacteriaβサブクラスに分類される菌であり、No.13株も、Proteobacteriaβサブクラスに属すると考えられる。
【００６６】
16S-rRNAの塩基配列を基に作成したSphaerotilus-Leptothrixグループの系統図[Ghiorse et al., "Phylogeny of Sphaerotilus-Leptothrix group inferred from morphological comparisons, genomic fingerprinting, and 16S ribosomal DNA sequence analysis", Int. J. Syst. Bacteriol., 46, pp.173-182 (1996)]によれば、No.13株と相同性の高いLeptothrix discophora、Sphaerotilus natans、Rubribivax gelatinosusはクラスターとなっており、ProteobacteriaβサブクラスのRubribivax サブディビィジョンに位置している。
【００６７】
そして、前出のGhiorseらの文献によれば、Ideonella dechloratansは、ProteobacteriaβサブクラスのComamonasグループに分類されている。  99.2％という最も高い一致率を示したIdeonella 属は、活性汚泥から分離された細菌で、塩素酸塩を電子受容体として嫌気条件下で生育することを特徴とした菌である。 また、Rubribivax 属、Rhodocyclus属細菌は光合成細菌であり、嫌気・光条件下で生育できることを特徴としている。Leptothrix属、Sphaerotilus属細菌は鞘皮細菌と呼ばれ、菌体の周囲に長い筒状の鞘を形成することを特徴としている。
【００６８】
これに対して、No.13株は、嫌気条件下でほとんど生育せず、また、表５に記載の炭素源資化性でもクエン酸とグリセリンの利用性が異なるなど、No.13株が Rubribivax 属細菌とは考えにくい。  なお、Ideonella 属細菌については、これまでに報告された内容から検討してみると、シトクロムＣオキシダーゼが陽性であること、プロテアーゼとエステラーゼを生産すること、およびグルコースを発酵／酸化しない点においてNo.13株との間で一致が認められる。
【００６９】
以上述べた方法によって得られたデータを、以下にまとめた。
【００７０】
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No.13株の同定
No.13株の16S-rRNA遺伝子の塩基配列を比較したところ、Ideonella 属細菌、Rubribivax 属（光合成）細菌、 Leptothrix属（鞘皮）細菌の16S-rRNA遺伝子の塩基配列と95％以上の高い一致をみた。
【００７１】
光合成細菌の特徴である嫌気・光条件での生育が極めて悪いこと、クエン酸とグリセリンの利用能力が異なることから、No.13株は、Rubribivax 属細菌ではないと判断した。
【００７２】
Leptothrix属細菌の中には、鞘を形成せず、マンガンを酸化しない変異株も知られているが、No.13株が鞘皮細菌の特徴である鞘を菌体の周囲に形成しないこと、マンガン塩を酸化して黒色の酸化マンガンを培地中に形成しないこと、そして利用できない糖類が比較的多いことから、No.13株がLeptothrix属細菌である可能性も否定された。
【００７３】
そして、Ideonella 属細菌が、塩素酸塩と硝酸塩を電子受容体として嫌気で生育できるのに対し、No.13株は微弱ながら硝酸塩のみを利用して嫌気で生育した。
【００７４】
また、Ideonella 属細菌について報告された範囲内で検討したところ［前出の、Malmqvist 等の文献］、炭素源の資化性と生理学的性質の一致をみている。
さらに、16S-rRNA遺伝子の塩基配列は、99.2%という極めて高い一致率を示しており、No.13株はIdeonella 属に最も近縁にある細菌であると判断し、No.13株をIdeonella sp. No.13と命名した。
【００７５】
実施例３：SE分解菌 No.13株による酵素生産
実施例１で単離したNo.13株に関して、その酵素（蔗糖脂肪酸エステル(SE)の合成酵素）の生成能力を以下の手順に従って評価した。
【００７６】
(1) 培地の調製ならびに検討
L培地（組成を下記表９を示した）、L/10培地（組成を下記表10に示した）、および最少培地（組成を下記表11を示した）の３種類の培地を基本培地とし、炭素源として、蔗糖脂肪酸エステル(SE)またはグルコース(Glu)を添加した培地を調製した。
【００７７】
【表９】
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【００７８】
【表１０】
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【００７９】
【表１１】
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【００８０】
No.13株の培養は500ml容の坂口フラスコで行った。  L/10＋１％グルコース培地で培養した前培養液0.5mlを100mlの各培地に接種し、37℃で２日間振とうした。
【００８１】
そして、No.13株の培地および炭素源が与える影響について検討した。  つまり、前出のL/10培地、Ｌ培地および最少培地に、炭素源として蔗糖脂肪酸エステル(SE)またはグルコース(Glu)を添加し、 図７に示した培地の栄養条件下でNo.13株を培養し、菌体増殖とエステラーゼ活性を調べた。  炭素源を添加したL/10培地、Ｌ培地で菌体は良好に増殖し、高いエステラーゼ活性が認められた。
【００８２】
最少培地での菌体の増殖は芳しくなかった。  誘導剤として用いた蔗糖脂肪酸エステル(SE)は、その使用の有無にかかわらず、No.13株はエステラーゼを生産しているいことが判明した。  これらの結果を受けて、エステラーゼ生産量の多かったＬ＋Glu１％培地を、以後の実験に用いた。
【００８３】
(2) No.13株の培養
まず、前培養を、L/10＋１％グルコース培地で、37℃で、一夜振とう培養して行った。  L培地よりもL/10培地の方が、培養初期の増殖が良好なため、前培養にはL/10培地を用いた。  本培養には、５ｌ容量のミニジャーファーメンター（マルビシ  バイオ  エンジ製）を用い、培地は、L＋１％グルコース培地とし、培地量2.5l、温度37℃、通気量1.25l/分(0.5VVM)、接種量50ml(2%)の条件下で培養を行った。  消泡剤としてアデカノール103を必要時に添加した。
【００８４】
図８に、No.13株をミニジャーファーメンターで培養した時の培養経過図を示した。  それによると、約10時間後の誘導期の後、対数増殖し、その後、吸光度は徐々に減少した。  目視観察によれば、栄養的に貧弱な培地であるL/10＋Glu１％培地を用いた方が、誘導期は短かった。  そして、培養液上清のエステラーゼ活性は、菌体増殖に伴って増加し、増殖が停止した後も、徐々に増加した。
最終的に、2.6単位/mlのエステラーゼを生産した。
【００８５】
一方、培養液のpHは培養の進行に従って上昇し、培養開始時に7.3であったのが、終了時には8.79になった。  培養終了時の培養液はアンモニア様の臭気を呈しており、アミン系化合物が生成され、その結果、pHがかように上昇したものと考えられる。  高いpHによる、菌体増殖および酵素生産の阻害を懸念して、pHコントローラーを用い、塩酸によりpHを7.6に調整して同様の培養実験を行ったが、菌体増殖および酵素生産にはほとんど変化はなかった。
【００８６】
(3) 粗酵素の調製
まず、No.13株の前々培養を、試験管を用いて、５mlのL/10＋１％グルコース培地で、37℃で、一夜振とう培養して行った。  前培養は、２l容量の坂口フラスコを用い、前々培養液の全量を、１lのL＋１％グルコース培地で、37℃で、１日振とう培養して行った。  本培養には、100ｌ容量のジャーファーメンター（マルビシ  バイオ  エンジ製、タイプMPF)を用い、培地は、L＋１％グルコース培地とし、培地量50l、温度37℃、通気量50l/分(1VVM)、接種量１l(2%)、培養時間48時間の条件下で培養を行った。
【００８７】
100 l容量のジャーファーメンターで培養した培養液を、シャープレス連続遠心機で除菌した。  得られた上清液を、４℃で、限外濾過濃縮器（旭化成、マイクローザUF SPL-1053)で1/10量にまで濃縮した。  濃縮液に、pH7.5の20mMトリス塩酸緩衝液に溶解し、同緩衝液中で透析、脱塩した。  得られた粗酵素液を凍結乾燥して、粗酵素粉末とした。
【００８８】
そして、実施例１に記載のSE寒天法および滴定法で酵素活性を測定したところ、2000単位／ｇの酵素活性であった。
【００８９】
次に、No.13株培養液上清を濃縮、硫安塩析、透析脱塩した粗酵素について、蔗糖脂肪酸エステル分解の温度特性とpH特性を、前出の滴定法によって分析し、その結果を、それぞれ図９と図10に示した。  pH４〜pH８のpH域ではMcIlvaine緩衝液（リン酸水素２ナトリウムとクエン酸を含む）を、また、pH９〜pH10のpH域ではClark-Lubs緩衝液（ホウ酸、塩化カリウムおよび水酸化ナトリウムを含む）を用いた。
【００９０】
図９のグラフから明らかなように、蔗糖脂肪酸エステル(SE)分解の至適温度は60℃であり、70℃と80℃でも活性が認められた。  一方、図10のグラフから明らかなように、至適pHは８で、pH６〜pH８で高い活性を示した。
【００９１】
そして、エステラーゼまたはリパーゼの基質となり得る代表的なエステル化合物の分解活性を調べた。  以下の表12に、蔗糖脂肪酸モノエステルに対する分解活性を100としたときの相対活性を示した。
【００９２】
【表１２】
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【００９３】
４mlのMcIlvaine緩衝液（pH８）、4.75mlの水、0.25ｇの基質（エステル化合物）、１mlの粗酵素液からなる反応液を、60℃で、30分振とうして反応させた後、滴定法による活性測定と同様にして酵素の相対活性を求めた。  蔗糖脂肪酸モノエステル以外に、糖類のエステル誘導体であるTween-80（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）に対しても分解活性が認められた。  この粗酵素は、同じ糖エステルでも、水に溶解しない蔗糖脂肪酸ポリエステルにはほとんど作用しなかった。
【００９４】
また、エステラーゼの基質である（活性測定条件下では水溶性を呈する）酢酸エチルにもほとんど作用しなかった。  さらに、エステラーゼとリパーゼの活性測定基質として広く使用されているPNPA（パラニトロフェニルアセテート）にもほとんど作用しなかった（データ示さず）。  そして、トリグリセライドについても、水溶性のトリアセチン、および、非水溶性のトリブチリンとオリーブ油に対してもほとんど作用しなかったことから、本酵素はいわゆるリパーゼと呼ばれる酵素ではないものと思われる。  よって、水溶性の糖類エステルに特異的に作用する特殊なエステラーゼである可能性が高く、今後、さらに多くの基質について調査すればその傾向はさらに明確になるであると考えられる。
【００９５】
実施例４：SE分解菌 No.13株産生酵素による蔗糖脂肪酸エステルの合成
実施例３(3)で得られた粗酵素を用いて、様々なショ糖脂肪酸エステルの合成反応を行った。
【００９６】
オクタン酸（C8）、ラウリン酸（C12）またはミリスチン酸（C14）のうちいずれかの脂肪酸10 mg、50重量／容量％ショ糖を含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7）100μl、粗酵素液20μl（3単位）及びジメチルスルホキシド20μl（13.3容量％）を含む反応液をエッペンドルフチューブに入れ、45℃にて20時間反応させた。
次いで、反応液に400μlのメタノール、400μlのクロロホルム及び100μlの水を加えて溶媒抽出し、下層のクロロホルム層40μlを、シリカゲルプレート60（メルク社製）に適用して、薄層クロマトグラフィー分析に供した。 この際の展開溶剤として、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝70／20／８／２の混合溶剤を用いた。  また、対照群として、粗酵素液を含有しない反応液で同様の操作を行った。  この結果を図11に示す（図中、微弱なスポットが存在していた箇所に、手書きにてマークしてその存在を示した）。
【００９７】
図11において、酵素存在下に反応を行うと、各炭素数の脂肪酸について鎖長に応じたRf値（C8：0.19及び0.15、C12：0.22及び0.18ならびにC14：0.25及び0.20）を有する矢印で示される各々２種の反応産物が生成されている（図11、レーンｂ、ｄ及びｆ）。  ここで、脂肪酸の炭素数が大きくなるほど生成物のRf値は大きくなっており、また、本酵素が２つのショ糖脂肪酸エステル異性体を分解したことに対応するように反応産物が２種であるとの知見からして、これらエステラーゼ反応によってショ糖脂肪酸モノエステルの置換位置異性体２種が生成されたと考えられる。
【００９８】
さらに、同様の条件下での反応におけるエステルの生成を確認するために、ショ糖とラウリン酸を反応させて合成される産物について検討した。  反応条件は、上記と同様であり、反応終了後の抽出物を、ショ糖モノラウレートを含む標準試料（DKエステルS-L18A、第一工業製薬社製）と比較すべく、薄層クロマトグラフィー分析した。  展開溶剤として、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝70／20／8／2の混合溶剤を用いた。  この結果を図12に示す。
【００９９】
図12に明示したように、本酵素を用いたショ糖とラウリン酸との反応によって、標品のショ糖モノラウレートと同様のRf値（0.40及び0.33）を有する産物が得られた。  次いで、この反応産物を高速液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）に供した。  LC-MS装置として、高速液体クロマトグラフィー部分には、カラム Cosmosil 5C18-AR（φ4.6 mm×150 mm、ナカライテスク社製）を装備したLC10AT（島津社製）を用いた。  使用溶離液は、10 mMの酢酸アンモニウム水溶液（溶離液Ａ）と10 mM酢酸アンモニウムのメタノール溶液（溶離液Ｂ）を用い、流速 0.7 ml/分にて溶離液Ａ100％から溶離液Ｂ100％までの直線濃度勾配とした。
【０１００】
質量分析部分には、Finigan Mat LCQ装置（Finigan社製）を用いて、イオン化はESI法により、また検出は負イオンにて行った。  得られた液体クロマトグラフィーの結果を図13に示す。
【０１０１】
図13において、主たるピークａ及びｂの保持時間は、市販のショ糖モノラウレートの標品の保持時間と一致していた。  そして、双方のピークのマススペクトルにより、ショ糖モノラウレートの分子量524.6に対して、-H(523.6)、+CH3CO0(583.6)及び+CF3COO(637.6)の質量数にピークが確認された。  また、市販の標品のマススペクトルにおいても同様の質量数のピークが確認された。
【０１０２】
このように、本発明の酵素存在下で、ショ糖とラウリン酸とを反応させると、ショ糖モノラウレートの２種類のエステル置換位置異性体が得られることが明らかになった。
【０１０３】
【発明の効果】
このように、本発明によると、所期の目的であった、蔗糖と脂肪酸から直接に蔗糖脂肪酸エステル(SE)を合成する酵素と、これを産生する新規の微生物が提供される。
【０１０４】
この酵素の発現に関与する遺伝子の解析がなされている現状では、遺伝子に変更を加えて改変を施し、蔗糖脂肪酸エステル(SE)の合成により適した酵素を作り出すことも可能となる。  すでにプロテアーゼにおいては、構造的に改変を加えて分解活性を抑え、水が多量にある反応系においても高い合成力を備えた酵素が作り出されており、また、エステラーゼとプロテアーゼの反応機構は同じであるため、合成力の高いエステラーゼを作り出すことは、当該技術分野での技術水準からすれば、さほど困難でないと予想される。  同時に、合成反応の条件を最適化することで、反応率を着実に改善することも当然に期待できる。
【０１０５】
つまり、遺伝子レベルでの改変、酵素の改変／修飾と反応条件の検討ならびに改善によって、蔗糖脂肪酸エステル(SE)の収率の改善が大いに期待できるのである。
【０１０６】
【配列表】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  SE寒天法にて培地上に形成されたハローの状態を示す写真である。
【図２】  SE寒天法による白濁円の直径(mm)と、滴定法で測定した酵素活性（単位/ml）との間の相関を示すグラフである。
【図３】  SE分解菌 No.13株によるハロー形成の状態を示す写真である。
【図４】  SEを含む寒天培地上で生育したNo.13株によるハロー形成を示す写真である。
【図５】  SEを含まない寒天培地上で生育したNo.13株によるハロー形成を示す写真である。
【図６】   No.13株の光学顕微鏡写真（倍率：1000倍）である。
【図７】  三種の培地でのNo.13株の生育状況を示すグラフである。
【図８】  No.13株をミニジャーファーメンターで培養した時の培養経過図を示すグラフである。
【図９】  粗酵素の温度特性を示すグラフである。
【図１０】  粗酵素のpH特性を示すグラフである。
【図１１】  本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによる種々のショ糖脂肪酸エステルの合成の態様を表す図である。
【図１２】  本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖ラウレートの合成の態様を表す図である。
【図１３】  図１２において得られたショ糖ラウレートの高速液体クロマトグラフィーにおける分離を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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