(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導可能なリプレッサー配列および誘導可能なトランスアクチベーター配列の組合せの下流に直接配置されるrep遺伝子からなる組換えDNA分子であって、該誘導可能なリプレッサー配列の少なくとも１つがアデノ随伴ウイルスp5プロモーター由来であり、誘導可能なトランスアクチベーター配列の少なくとも１つがtet(o)である組み換えDNA分子。
【請求項２】
前記請求の範囲第１項に記載の組換えDNA分子を含む細胞。
【請求項３】
不死化されている請求の範囲第２項記載の細胞。
【請求項４】
哺乳類起源である請求の範囲第２項または第３項記載の細胞。
【請求項５】
組換えDNA分子が、発現を誘導することができ、かつ抑制を誘導することができるrep遺伝子を含む請求の範囲第２項〜第４項のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
アデノ随伴ウイルスのRep78／Rep68、Rep52／Rep40の発現および抑制の誘導を可能とする請求の範囲第５項記載の細胞。
【請求項７】
請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載の細胞および／または請求の範囲第１項記載の組換えDNA分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞系。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載のパッケージング細胞系からなり、rAAVベクターの回復、複製、パッケージングおよび組換えに必要な配列情報をin cisで含むアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に隣接する目的の遺伝子を含み、パッケージングされる少なくとも１つの追加の組換え核酸分子をパッケージング細胞が伴う、組換えアデノ随伴ウイルス粒子を産生するための細胞系。
【請求項９】
ウイルス粒子の産生に必要な物質がパッケージング細胞の遺伝物質または追加の組換え核酸に存在するが両者には存在しない請求の範囲第８項記載の細胞系。
【請求項１０】
請求の範囲第８項または第９項記載の細胞系を適切な培養培地で培養することおよび該培養から組換えアデノ随伴ウイルスを採取することからなる組換えアデノ随伴ウイルスの産生法。
【請求項１１】
請求の範囲第10項記載の方法によりえられる組換えアデノ随伴ウイルス。
【請求項１２】
宿主細胞においてrep遺伝子の発現を誘導可能にする方法であって、該遺伝子の発現を本質的に完全にスイッチオフとすることができ、該遺伝子が誘導可能なトランスアクチベーター配列tet(o)とp5プロモーター由来の誘導可能なリプレッサー配列の組合せの制御下にある方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、興味ある産物をコードする組換えDNA分子、ならびに前記分子を用いる方法に関する。とくに、本発明は、宿主細胞内で1またはそれ以上の遺伝子の調節された発現を可能にする組換えDNA分子に関する。とくに、本発明は、宿主細胞内で発現されたとき、いくらか有毒である産物の発現に関する。そのような産物または産物類のよい例は、パルボウイルス（PV）の非構造遺伝子の産物である。これらの産物はその宿主細胞に対して有毒であるので、宿細胞内での前記産物の構成的な発現を行なうことは容易でない。
安定にトランスフェクションされた哺乳類細胞内での高レベルPVタンパク質発現は、組換えDNA技術により前記細胞内に導入されたPVタンパク質遺伝子を宿主細胞に発現させようとするときに達成できない目的であることが非常に多い。たとえば、ヒト細胞内での高レベルPVタンパク質合成は、組換えPVベクターのパッケージング細胞の産生に重要である。そのようなパッケージング細胞では、PVタンパク質がパッケージング細胞によりin transで供給されるときに組換えPVベクターDNAは複製され、PVキャプシドにパッケージングされる。
パルボウイルスのなかのアデノ随伴ウイルス（AAV）は、非病原性のヒトパルボウイルスである（1、2に概説される）。このウイルスは、約4.6kbの一本鎖DNAに対して複製する。プラス鎖およびマイナス鎖の両方はパッケージングされて感染性となる。AAVの効率的な複製は、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスによる細胞の同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、AAVの実質的な複製は観察されない。したがって、AAVは「ディペンドウイルス（dependovirus）」としても分類される。ヘルパーウイルスが存在する場合は、AAVゲノムは宿主細胞ゲノムに組込まれる。
野生型ウイルスは、第19染色体の長腕上の組込み部位（19 q13.3）に対して高選択性（70％）を有する3-5。
組み込まれた後には、ウイルス遺伝子の発現は検出されない。組み込まれたプロウイルスは、形質導入された細胞の分裂時に宿主細胞ゲノムの正常な部分として複製し、最後には両方の娘細胞になる。ウイルス生活環のこの段階は潜伏期として知られている。この潜伏期は非常に安定であるが、形質導入細胞の感染時にヘルパーウイルスにより中断させることができる。ヘルパーウイルスの感染後、AAVは宿主細胞ゲノムから切り出され、その遺伝子を発現し、複製を開始する。この溶解サイクルの初期の間に、REP遺伝子が発現される。約16時間後、キャプシドタンパク質（VP1、VP2、およびVP3）が発現され、そして複製されたウイルスがビリオンにパッケージングされる（AAVゲノムおよびその遺伝子の構造を図1に示す）。ビリオンは細胞の核に集積し、そしてAAVおよびヘルパーウイルスの集積の結果、細胞が溶解すると放出される。
AAVゲノムは、repおよびcapの2つの遺伝子からなる（図1）。3つのプロモーター（P5、P19およびP40）が、4つのRepタンパク質（Rep78、Rep68、Rep52およびRep40）ならびに3つのキャプシドタンパク質（VP1、VP2およびVP3）をコードするmRNAの合成を作動させる。RepおよびVPタンパク質の両方は、重複するリーディングフレームでコードされている。したがって、Repタンパク質もVPタンパク質も、共通するカルボキシ末端を有するが、それらのＮ末端は異なる。AAVゲノムは、両端で、逆方向末端反復（ITR）と呼ばれる145bpの配列が隣接する。ITRは、AAVゲノムの複製、パッケージング、および組込みのためにin cisで必要とされるすべての情報を含む。増殖性感染の間、P5プロモーターがまず活性化され、Rep78およびRep68の産生を作動させる。これらのタンパク質は、AAV複製およびウイルス遺伝子のtrans調節のために必須である。大きなRepタンパク質はP19プロモーターおよびP40プロモーターを活性化する。しかし、潜伏感染において、Rep78およびRep68は、P5プロモーターの発現をダウンレギュレート（downregulate）し、AAVの潜伏を維持するように助ける（概説については、1を参照のこと）。より小さいRepタンパク質（Rep52およびRep40）は、P19プロモーターからの転写産物によりコードされており、感染性ウイルスの形成に重要である6。P40プロモーターは活性化される最後のプロモーターであり、ヘルパーアデノウイルスの後期遺伝子の発現ののちに発現する。選択的スプライシングを介して、構造タンパク質（VP1、VP2およびVP3）をコードする異なるmRNAが産生される。VP2およびVP3は同一のメッセンジャーから翻訳されるが、VP2は上流のACGで開始する。成熟AAVビリオンは、5％VP1、5％VP2および90％VP3からなる7。
最初の組換えAAVベクターは、rep遺伝子またはcap遺伝子に由来する配列を目的の配列に置換することにより作製された8-10。ベクターゲノムは、当該ベクターを含有するプラスミドを、欠失AAV遺伝子を含有するプラスミド、またはλファージDNAの挿入によりパッケージングされるには大きすぎる組換えAAVゲノムのいずれかとともにアデノウイルス感染細胞に同時トランスフェクションすることによりパッケージングされた8-10。このようにして作製された組換えウイルスは、（組換え体の力価と比較して、10〜50％の範囲である）野生型AAVが常に混在した。これは、おそらくは、実質的な重複領域を含有する2つの同時トランスフェクションされたプラスミド間での組換えによるか、またはλDNA配列の欠失によるものであった。混在する野生型AAVにより、アデノウイルス感染細胞の新しい集団の感染時に、rAAVのさらなる増幅がもたらされた。このことは、より高いrAAV力価をもたらすばかりでなく、混在する野生型AAVの増幅もまた引き起こした8-10。
野生型AAVの産生を避けるために、ベクタープラスミドとの重複を含まないパッケージングプラスミドを構築した11。このパッケージングプラスミドにより、検出可能な量の野生型AAVを含まず、そして同時に、細胞あたり0.1〜1個のrAAV粒子の産生を可能にするrAAVウイルスストックを作製することが可能である11。このパッケージングシステム、またはそれから誘導される類似システムは、現在のところ多くの研究室により標準的に使用されている。これは、現在、とくに好まれている方法であるが、最適とはいいがたく、rAAVベクターの「工業的」産生のために規模を大きくすることは容易ではない。標準化または規模拡大化を行なうには、プラスミドトランスフェクションは本質的に非効率的で困難である。これは、同時トランスフェクションについてもあてはまる。さらに、野生型ウイルスは細胞あたり１０3〜１０4個の粒子まで複製するが、現在の方法11、12を用いる典型的なrAAV産生におけるrAAVの収量（細胞あたり0.1〜1個の粒子）は非常に低い。このように収量が低いことにより、rAAVの精製を行なうことが困難となる。この産生問題は、遺伝子治療の目的のためのAAVベクター技法のさらなる開発を現実の技術的な障害に提案している。rAAVの産生のために効率的ではあるが簡便である方法が大いに必要とされていることは明らかである。最も都合のよいパッケージングシステムは、組換えにより産生される精製AAVタンパク質によるrAAVのin vitroパッケージングであろう。実用的な代用は、パッケージング細胞系がrAAV産生のために必要とされるAAVおよびヘルパーウイルスタンパク質をin transで供給する、rAAVのパッケージング細胞系の作製である。特定の組換えAAV産生細胞系は、組換えAAVを含有するプラスミドをパッケージング細胞に安定にトランスフェクションすることにより作製することができる。本発明は、in vitroパッケージング法およびパッケージング細胞系法の両方に有用である。
パッケージング細胞系は、現在、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが遺伝子治療のような治療目的に産生される最も効率的な方法である13、14。工業的規模でのin vitroパッケージングのためのウイルスタンパク質産生は、現在、λファージに対して用いられている。レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターの現在入手可能なパッケージング細胞系は、in transで必要とされるウイルスタンパク質を構成的に産生する15-21。rAAVの効率的なパッケージングまたはAAVタンパク質産生に有用な哺乳類細胞は入手できない。組換えAAVパッケージング細胞系は、in transで必要とされるAAVタンパク質産生が、rAAVベクターの産生期の期間中のみ細胞内に存在すること、を必要とする。構成的な発現は、2つの理由のために所望されない：1）産生前のベクターDNAの回復（rescue）および複製は、細胞系の増殖および安定性を損なう；および2）とくに、Repタンパク質は、組換えAAVベクターの非存在下でさえ、細胞に対して有毒である。後者は、主として、充分に説明されるが、これまで特徴付けされていない、大きなRepタンパク質の抗増殖効果による22、23。Rep78およびRep68は、一過性アッセイで細胞およびウイルスのプロモーターの両方を抑制する24、25。安定的なトランスフェクションでは、大きなRepタンパク質は細胞増殖を阻害する22、23。その機構は、充分に理解されていない。mRNAの転写および翻訳の観測された阻害は、細胞の重要な遺伝子を抑制し得る26-28。一方、大きなRepタンパク質がDNA複製を直接的に阻害し得る24、29、30A。細胞でのRepタンパク質発現の多面発現性効果を考慮すると、両方の効果は、大きなRepタンパク質の抗増殖効果での役割を果たし得る。
大きなRepタンパク質を構成的に発現する安定細胞系を作製することは不可能である（本発明者ら自身の未発表結果）。メタロチオニンプロモーター22またはステロイドで誘導可能なマウス乳腫瘍ウイルス（MMTV）の長い末端反復配列（LTR）プロモーター23のような誘導可能なプロモーターによるP5プロモーターの置換後、大多数のクローンから、Rep78を誘導的に発現するクローンを、それぞれ、1つおよび2つ単離することができた。Rep52は、3つのクローンのうち2つで構成的に発現した。一方、スプライシングされたmRNAから翻訳されるRep68およびRep40は、検出されなかった22、23。クローンはRep78およびRep52を機能的に産生し得たが、そのレベルは組換えAAVの複製およびパッケージングにはあまりにも低かった22、23。さらに、Rep78を発現するクローンの割合は非常に低かった。したがって、高レベルのrep発現に対して充分な選択を行なった。
最近、Clarkら30bは、アデノウイルスの感染時に特定のrAAVベクターを産生し得る最適な細胞系の作製を報告した。
これは、rAAVゲノム、選択マーカー遺伝子、およびAAVパッケージングゲノムを有する共有結合で閉環した単一のプラスミド構築物をトランスフェクションすることにより達成された。一方、パッケージング構築物および選択マーカー遺伝子のみの安定なトランスフェクションにより、rAAV構築物のトランスフェクション後に、rAAVを複製し得るが、rAAVをパッケージングし得ない細胞系が生じた。したがって、この方法を用いて、異なるrAAVベクターの産生のための一般的なパッケージング細胞系を作製することはできない。
上記の問題を解決する試みにおいて、本発明者らは、今や、発現が本質的に完全にスイッチオフされ得る方法により宿主細胞内での組換えDNA分子の調節された発現を提供することに成功した。本発明者らは、組換えアデノウイルス随伴ウイルスベクターシステムにおけるこの予想外の方法を見出した。その一方で、この現象が、一般的に哺乳類細胞または真核生物細胞さえにも適用することができない場合でも、かなり広い分野で少なくとも他のパルボウイルスベクターシステムに対して適用されることは当業者には明らかである。
したがって、本発明は、誘導可能なリプレッサーおよび誘導可能なトランスアクチベーターの組合せの制御下にある遺伝子を含有する組換えDNA分子を提供する。本発明者らは、発現される遺伝子をこの制御様式下に置くことにより、少なくとも誘導可能なリプレッサー機能および別の誘導可能なアクチベーター機能が、目的の遺伝子の上流に存在する（およびその遺伝子に機能的に連結する）こと、抑制の誘導およびアクチベーターの非誘導により発現が本質的に完全に抑制され得ることを見出した。アクチベーターがモジュレーターである場合、ある状況では抑制され、そして別の状況では活性化される点で、モジュレーターは抑制状況で存在するはずである。リプレッサーもまた、モジュレーターである場合には、もちろん、同じことがいえる。抑制機能が、「スイッチ・オフされた」状態での非機能的なアクチベーター、ならびに「スイッチ・オンされた」状態での非機能的なリプレッサーおよび機能的なアクチベーター機能と同時に存在することは重要である。したがって、これは、これらの2つの任意の組合せ（リプレッサー−アクチベーター、モジュレーター−モジュレーター、モジュレーター−リプレッサー、またはモジュレーター−アクチベーターのいずれか）により達成される得る。発現が、「オフ」状態で本質的に完全に遮断されるだけでなく、「オン」状態での発現レベルもまた、予想外に高い。
本発明は、遺伝子（その産物は、この産物を発現する細胞にとって有毒である）の発現にとくに有用である。もちろん、多くの公知のリプレッサーおよび／またはアクチベーターが存在する。それらのいくつかはプロモーターであってもよく、そして他のものは、プロモーターの上流のDNA分子の一部である。これらのすべては、本発明にしたがって使用され得る。「誘導可能な」という用語は、すべてのそのようなプロモーター、アクチベーター、またはリプレッサーを包含することを意味する。それらは、転写の向上または転写の減少のいずれかにより、シグナルの存在または非存在（たとえば、化学物質の存在または温度の変化）に対して応答する。選択しなければならないことは、両方の機能性（リプレッサーおよびアクチベーター）が一緒になって、本質的に完全に「スイッチ・オフ」状態および増強された「スイッチ・オン」状態をもたらすことである。多数の好ましい組合せを、本明細書中、以下に示す。1つのそのような組合せは、テトラサイクリンレセプターの結合部位である少なくとも1つのトランスアクチベーター配列を含む：好ましくは、結合部位は、本明細書中、下記のtn10に由来する。
別のそのような好ましい態様は、以下の組換えDNA分子を含有する：少なくとも1つの誘導可能なリプレッサー配列は、YY1リプレッサーの結合部位である；または、少なくとも1つの誘導可能なリプレッサーは、主要後期転写因子（major late transcription factor、mTLF）の結合部位である；または、少なくとも1つの誘導可能なリプレッサーは、以下にすべてが記載されるアデノ随伴ウイルスp5プロモーターに由来する。
本発明の分子は、好ましくは、パルボウイルス遺伝子産物を発現するために使用される。したがって、好ましい態様は、遺伝子がパルボウイルスタンパク質の少なくとも特定の部分をコードする組換えDNA分子および／または遺伝子がパルボウイルスの非構造遺伝子（好ましくは、アデノ随伴ウイルスのrep遺伝子）である組換えDNA分子を含む。
本発明の組換えDNA分子を使用することにより、細胞を、それにより安定にトランスフェクションすることができる。そのような細胞（とくに、不死化され、そして哺乳動物起源のそのような細胞）はまた、本発明の一部である。
本発明の目標の1つは、遺伝子治療のためのより良い手段および方法を提供することである。遺伝子治療用の手段の作成において使用される、そのための最も適切な細胞は哺乳類細胞である。それらはまた、本発明によれば、好ましい、ウイルスの天然の宿主である。本発明の細胞（これは、組換えウイルスのタンパク質、粒子、またはビリオンの産生設備として使用され得るか、またはパッケージング細胞系である）は、組換えDNA分子内に含まれる遺伝子の誘導された発現および誘導可能な抑制を可能にすることが必要である。
細胞が、組換えアデノウイルス随伴ウイルス粒子のパッケージングまたは産生のために使用される場合、それらは、好ましくは、少なくとも、アデノ随伴ウイルスのRep78／Rep68またはその誘導体の誘導可能な発現および抑制を可能にするはずである。
組換えパルボウイルス産生、好ましくはrAAVの産生施設として使用される細胞系は、本発明のパッケージング細胞を包含するべきである。このパッケージング細胞は、パルボウイルス（好ましくは、さらなる核酸が少なくとも目的の遺伝子を含有すべきrAAV）にパッケージングされ、rAAVベクターの回復、複製、パッケージング、および組込みに必要とされる配列情報をin cisで有するパルボウイルスの逆方向末端反復が隣接する少なくとも1つのさらなる組換え核酸分子が備わっている。
細胞系は、ウイルス粒子の産生に必要な物質が、パッケージング細胞の遺伝物質内に存在するか、または両方ではなく、さらなる組換え核酸上に存在することが好ましい。本発明はまた、本発明の細胞系を適切な培養培地で培養すること、およびその培養から組換えパルボウイルスを収穫することを包含する組換えパルボウイルスを産生する方法を提供し、そしてそのような方法により得られる組換えパルボウイルスを包含する。
本発明はさらに、AAVタンパク質の産生および精製、ならびにrAAVパッケージング細胞系の産生に有用なRep78およびRep68を調節された様式で発現する細胞系を提供する。本発明はさらに、調節されたプロモーターエレメントと組み合わせたか、または安定にトランスフェクションされた哺乳類細胞でのRep78およびRep68の調節された発現を単独で促進するAAV P5プロモーター内の配列の同定を開示する。本発明はさらに、rAAVパッケージング細胞の作製に有用な哺乳類細胞でAAVコード領域を発現するそのような細胞系の作製方法を開示する。
本発明の1つの態様において、高レベルのRep78およびRep68を調節された様式で発現する細胞系が提供される。
さらなる態様において、rAAVパッケージング細胞系の作製に有用な哺乳類細胞での調節されたAAVタンパク質合成を行なう方法が提供される。
本発明のさらなる態様は、産生された野生型AAVの量を減少させることによりrAAV調製物の質を高める方法、およびAAV転写単位を分離し、そしてそれらを異なる構築物に置くことにより細胞あたりのrAAVの全収量を向上させる方法を包含する。
用語「組換えAAVパッケージング細胞」は、改変された野生型AAVゲノムもしくは組換えAAVゲノムの複製および／またはパッケージングに必要で、in transで必要とされるAAVタンパク質を提供する細胞系を意味することが理解される。in transで必要とされるタンパク質は、構成的な様式または調節された様式のいずれかで提供される。
本明細書中で使用されるように、用語「機能的なレベルのパルボウイルスタンパク質発現」は、組換えまたは野生型のパルボウイルスゲノムの複製および／またはパッケージングに充分なレベルの発現をいう。
用語「調節された発現」は、細胞環境を操作すること、またはアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのようなウイルスで細胞を感染させることのいずれかにより変化させることができる発現レベルを意味することを意図することが理解される。
以前にいくらか記載したように、用語「調節されたプロモーター」は、たとえば細胞が増殖する培地に化合物の添加または除去により、細胞環境を変化させることにより改変させることができるレベルで、連結した遺伝子を発現させることができるDNA配列、好ましくはプロモーターを意味することがさらに理解される。
活性化と組み合わせた抑制システムは、同様にin vivo環境で使用され得る。それにより、遺伝子のスイッチングのオンおよびオフが誘導剤の投与により達成される。
【図面の簡単な説明】
図1は、wtAAVの構造およびゲノム構造を示す。
図2は、tet(o)+p5-repおよびtet(o)ΔP5-repの構築を示す。
図3は、一過性トランスフェクションされたHtTA細胞でのtet(o)+p5-repおよびtet(o)ΔP5-repからのRep78およびRep68の調節された発現を示す。
図4は、組換えAAV IG-CFT産生のためのパッケージング構築物としてのtet(o)+p5-repおよびtet(o)ΔP5-repの使用を示す。パッケージングプラスミドpAAV/Adは、ポジティブコントロールとしてアッセイに充分であった。そして、アデノウイルス感染HtTA細胞は、ネガティブコントロールとしてアッセイに充分であった。
図5は、安定にトランスフェクションされたHtTA細胞でのtet(o)+p5-repおよびtet(o)ΔP5-repからのRep78およびRep68の調節された発現を示す。
図6は、CAT発現の効率的なサイレンシング（silencing）が、調節可能なトランスアクチベーターおよびリプレッサーにより支配された転写単位からの非誘導状態で観測される2つの実験を示す。図6Aは、CAT活性アッセイのオートラジオグラムを示す：レーン1〜4およびレーン9〜12は、ptet(o)OPCAT；pCMVLacI、pBluescript SK＋、pCMVLacZのDNAでトランスフェクションされた細胞でのCAT活性を示す。レーン5〜8およびレーン13〜16は、トランスフェクションされていないコントロール培養由来の細胞のCAT活性を示す。図6Bは、測定されたクロラムフェニコール転換を示す。図6Cは、レーン2およびレーン10でのそれぞれのCAT活性に対する、レーン1〜4およびレーン9〜12でのCAT活性の誘導を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、１つの観点において、調節された様式で高レベルのRep78およびRep68を発現する安定な細胞系の効率的な産生を可能にする配列の発見に基づく。上記のように、調節された様式でRep78タンパク質を発現する安定なクローンを獲得できることが示されている。しかし、そのようなクローンが有する調節されたRep78の発現頻度、およびより重要なことに、そのレベルは非常に低い。
これは、rAAVのパッケージング細胞系の適用および開発を著しく制限する。本発明は、組換えAAVの産生に効率的なパッケージング細胞系の作製を初めて記載する。
たとえば、マウスメタロチオニンプロモーターまたはマウス乳腫瘍ウイルス長末端反復プロモーターのような古典的な誘導可能な真核生物プロモーターは、重金属、熱ショック、またはホルモンに応答する31-38。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）長い末端反復配列プロモーターは、HIVトランスアクチベータータンパク質TATまたはアデノウイルスE1Aタンパク質により誘導され得る。TATによるHIVプロモーター誘導に基づく誘導可能な発現システムが、特許出願EP 0455 424に記載されており、そしてHIVプロモーターにより駆動されるAAV repタンパク質の発現が、特許出願WO 95/13365で示唆された。しかし、すべてのこれらの誘導可能なプロモーターが、原理的には、（有毒な）遺伝子を誘導的に発現させるために申し分なく適することはない。なぜなら、これらのプロモーターは、非誘導状態で完全にサイレントではないからであり32、および／またはその誘導性成分は、標的細胞での多面作用効果を誘導するからである39。調節されたプロモーターを新しく作製することにより、細菌の転写単位由来の部分を真核生物細胞での使用に適合させた40-47。これらの人工的な転写単位は、E. coli由来のlacリプレッサー−オペレーター−インデューサー系またはTN10特異的テトラサイクリン耐性オペロンから適合される。3つの異なるシステムを記載する：ｉ）プロモーター上に、うまく配置されたリプレッサー−オペレーター複合体による転写開始の阻止40-42、46；またはii）リプレッサー−オペレーター複合体による伸長中のRNAポリメラーゼIIの阻止43、46；またはiii）人工的なトランスアクチベーター（tA）により認識され得るオペレーター配列により補充される最小のTATAボックスの活性化（この場合、tAは、lacリプレッサーもしくはテトラサイクリンリプレッサー由来のオペレーター結合成分ならびにVP16、単純ヘルペスウイルスがコードする転写アクチベーターに由来の転写活性化ドメインからなる44、45、47）。tAのオペレーター配列への結合は、特定の化合物、すなわちlacリプレッサーオペレーター結合ドメインに基づくtAに関するIPTG、およびテトラサイクリン−リプレッサーオペレーター結合ドメインに基づくtAに関するテトラサイクリンまたはテトラサイクリン関連化合物、を用いて効果的に阻害することができる。
詳細には、最小のプロモーターがtetリプレッサー由来のオペレーター配列と組み合わせられる後者のシステムは、外来遺伝子の調節された発現に適する。真核生物細胞において、機能的なトランス活性化タンパク質は、tetオペレーター配列に結合しないので、これらのプロモーターは、テトラサイクリンまたは関連化合物（たとえば、ドキシサイクリン）の低濃度の存在下では、実際には不活性である47、48。適切な発現パターンは同様に、lacリプレッサーのオペレーター結合性成分を含有するtAを用いるシステムで得ることができる。しかし、lacリプレッサー／オペレーターに基づくシステムを哺乳類細胞で利用することは限られている。なぜなら、インジューサー化合物β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）は、その迅速な取込みおよび細胞内安定性にもかかわらず、かなりゆっくり作用し、そして効率的に作用しないからである。したがって、そのようなシステムは、中程度の発現誘導をもたらすのみである（47）。テトラサイクリンリプレッサーVP16融合遺伝子（tA）を構成的に発現する安定な細胞系が存在する。したがって、本発明の1つの実施態様では、AAV rep遺伝子が、tetオペロンから下流に配置され、そしてこの構築物がtA発現細胞に導入される。テトラサイクリンまたは関連化合物は、細胞増殖の間培地中に存在する。AAV rep発現は、培養物から前記化合物を除去することにより誘導することができる。
テトラサイクリンおよび多くのテトラサイクリン誘導体が、遺伝子発現を止めるために必要とされる低濃度で、真核生物細胞に対して有毒でないとしても、それらの絶え間ない存在は、種々の実験的および工業的な使用において最善ではない；たとえば、トランスジェニック動物の繁殖、遺伝子治療、または大容量のバイオリアクターにおいてである。この場合、遺伝子発現の完全な活性化のために、テトラサイクリンまたは誘導体は、充分に洗い除く必要がある。これらの目的のために、誘導性エフェクター物質が阻害性化合物以上に好まれ、そして改変tAが開発された（Gossen et a1., Science 268（1995）：1766-1769）。Tetリプレッサーにおけるいくつかの変異は、（テトラサイクリンの存在下で結合し、そしてその非存在下で結合しない）リプレッサータンパク質の結合特性を明らかにした。この新しいタンパク質は、リバースTetリプレッサー（rTetR）として示される。rTetRがVP16に融合されたリバーステトラサイクリン制御アクチベーター（rtTA）が開発された。rtTAを発現する細胞系が作製され、そしてこれを用いて、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体による誘導時に、tetオペロン制御の転写単位を発現することができる（Gossen et al., Science 268（1995）：1766-1769）。したがって、本発明の別の実施態様では、tetオペロンから下流にクローン化されたAAV rep遺伝子がrtTA発現細胞に導入される。そして、AAV rep発現は、テトラサイクリンまたは関連化合物を培地に添加することにより誘導することができる。
本発明を、以下の材料および方法を用いる以下の限定されない実施例により例示する。以下に引用される各参考文献の全開示は、発明に包含されるものである。
実施例１
フランキングITR欠失AAVゲノムの調節プロモーターへのライゲーション
本発明者らは、構成的にtAを発現するHeLa細胞系HtTA47を用いてtet(o)-rep遺伝子構築物からの調節されたrep発現について調べた。これまでのところ、tet(o)のすぐ下流XbaI部位に完全なrepおよびcapコードドメインを含むpAAV/Ad11（R. J. Samulski博士より贈与）由来4.3kbXbaIフラグメントをクローン化した（図２）。この構築物、tet(o)+P5-repと称する、ではtet(o)が-68bp p5プロモーター（TATAボックスのはじめの塩基から測定して）の上流に位置する。tet(o)に対してp5プロモーターを完全に置換するためには、適切な制限酵素部位がないために本発明者らはPCR反応を行なわなければならなかった。上流のプライマーは5′-ATTAATCTAGACTAGTCGCGCAGCCGCCATGCCGGGG-3′であり、下流のプライマーは5′-TGTGGAAGTAGCTCTCTCCC-3′であった。PCR反応は製造業者のすすめる緩衝液および反応条件を用いてpfuTM（ストラタジーン（Stratagene）社製）
を有するpAAV/Adで行なった。最終構築物、tet(o)Δp5-repは、SfiIおよびXbaIで299bp PCR産物を消化し、pAAV/Ad由来の3.95kb SfiI-XbaIフラグメントを用いる3つのパートのライゲーションにおいてえられた248bpフラグメントを、tet(o)構築物のすぐ下流のXbaI部位へライゲーションすることにより産生させた。構築物の増幅された部分を配列決定して調べ、期待していたとおりであることを確認した。
実施例２
これらのプラスミドに由来するrepおよびcapの発現
組換えAAVパッケージング構築物の発現能力を調べるために、ウイルスのプロモーター類の活性について決定することが必要であった。この目的のために、（1μg/ml）ドキシサイクリンの存在下もしくは非存在下ならびにアデノウイルスts149（感染多重度20）の非存在下もしくは存在下でtet(o)Δp5-repおよびtet(o)+p5-repを、HtTA細胞にトランスフェクトした。2日後タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットに付した。フィルターをRep78、Rep68特異的モノクローナル抗体7B7（R. J. Samulski博士より贈与）とともにインキュベートした（図3）。tet(o)Δp5-repおよびtet(o)+p5-rep構築物の両者はドキシサイクリンで調節される様式でHtTA細胞にRep78とRep68を発現する。tet(o)Δp5-repプロモーターおよびtet(o)+p5-repプロモーターの両者はアデノウイルス感染の際に、アップレギュート（upregulate）された。誘導されない状態でのRep78とRep68の発現（すなわち、ドキシサイクリンを用いるがアデノウイルスは用いない）は、同一条件下でtet(o)Δp5-rep構築物からRep78とRep68を発現させるばあいと比べると、tet(o)+p5-repで著しく減少する。これらの結果より、ｉ）人工のtetオペロンを用いるとRep78／Rep68の調節された発現がえられる、ii）アデノウイルス感染は両構築物においてrep遺伝子からの発現をアップレギレュートする。これはおそらく、tet(o)および最小TATAボックスへの直接的な効果によるか、またはAAVゲノムのアデノウイルス応答性エレメント（エンハンサー）によるためである。ほかに可能性のあるメカニズムとしては、アデノウイルス感染細胞においてRep78／Rep68の特定のmRNAの翻訳を促進するようにアデノウイルスが誘導される、ということがあげられる、iii）tet(o)+p5-rep構築物において、p5プロモーターの後期主要転写因子（MTLF）部位および2つのYY1部位が、誘導されない状態で観察された、tet(o)+P5-repからのRep78およびRep68発現のダウンレギュレーション（downregulation）の少なくとも一部分、ならびにアデノウイルス感染HtTA細胞におけるtet(o)+p5-repからのRep78およびRep68発現のアップレギュレーション（upregulation）の少なくとも一部分を媒介するようである、ということが証明される。
rep遺伝子発現が機能的かどうかを決定するために、構築物類を用いて組換えAAVを産生させた。この目的のためにこの構築物類を、組換えAAVベクター49を担持するプラスミドpIG-CFTとともにアデノウイルスts149（感染多重度20）感染HtTA細胞に同時トランスフェクトさせた。49に記載されているように39℃および10％ＣＯ2で3日間インキュベートしたのち、細胞と培養上清を集め、3回凍結融解サイクルに付した。遠心分離（1200rpm、rt）により細胞の残骸（debri）を除去し、残ったアデノウイルスts149を熱失活させた（1時間、56℃）。
49に記載されているように、組換えAAVストックの連続希釈によるレプリケーション・センター・アッセイ（replication center assay（RCA））を用いて、アデノウイルスts149およびwtAAVで感染された293細胞20について組換えAAVの力価を測定した。このアッセイには、組換えAAV-DNAがwtAAVとアデノウイルス感染293細胞中にきわめて多量に複製される、という利点がある。1日後、形質転換された細胞の核中のベクターDNA蓄積は個々の感染細胞を検出してベクターに特異的なプローブでハイブリダイズできるほど充分に多くなっている。この目的のために、1日後、PBS-EDTA（5mM）中に細胞を集め、単一の細胞懸濁液をハイボンドN+（hybond N+）ナイロンメンブレンへ移した。フィルターを処理したのちにneo-プローブ（1002bp SmaIフラグメント）の個々のスポットとのハイブリダイゼーションにより、組換えAAVベクターで導入された細胞を検出する。RCAを用いたところ、希釈して調整されたtet(o)Δp5-repパッケージング構築物は6×104感染粒子（IP）/mlの力価に相当する約20スポットを産生し、一方tet(o)+p5-repパッケージング構築物は1.0×105IP/mlの力価に相当する約34スポットを産生した（図4）。したがって、AAVタンパク質コードドメインは両構築物において機能的である。
実施例３
高レベルに調節されるRep78およびRep68を発現する安定な細胞系
アデノ随伴ウイルスp5プロモーターが13S ElAタンパク質によるトランス活性化を媒介する開始部位に対して-60と+1に中心をおくモチーフを含むことは前に示した。モチーフに結合する細胞因子、YY1を同定し、そのcDNAをクローン化した。YY1は異種基本のプロモーターの上流に結合すると転写を抑制する414アミノ酸のジンクフィンガータンパク質であり、ElAタンパク質はYY150による転写の抑制および活性化を和らげる（relieve）。
調節される様式で高レベルにRep78およびRep68を発現する安定な細胞系がおこりうるかどうかを決定するために、本発明者らは、HtTA細胞においてtet(o)Δp5-repまたはtet(o)+p5-repと各々10：1の比でSV40プロモーターの転写調節下、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むプラスミドpx343とで同時トランスフェクションを行なった。トランスフェクションは2μg/mlテトラサイクリンの存在下または非存在下で行なった。トランスフェクションの2日後、培地を2μg/mlテトラサイクリンを含むかまたは含まない400μg/mlハイグロマイシンBを含む培地と交換した。この選択培地は3から4日毎に新たにした。2週間後、皿のコロニーをトリプシン処理し、テトラサイクリンを含まない培地に播き、アデノウイルスts149（感染多重度＝20）に感染させた。2日後、細胞を集め、総タンパク質をウエスタンプロットに付した。Repタンパク質発現をRep78／Rep68特異的モノクローナル抗体7B7を用いて分析した。未処理の細胞（レーンHtTA）およびpBluescriptでトランスフェクトしたHtTA細胞（pBlue）では、Rep特異的バンドは検出されなかった。ポジティブコントロールレーンでは、wtAAV-2、Rep78およびRep68が容易に検出された。Rep68はSDS-pageで2本のバンドであった（M. E. の非公開結果）。Rep78、Rep68としてマークされたレーンから精製されたRep78およびRep68タンパク質（Nick Muzyczka博士より贈与）をそれぞれのタンパク質のサイズマーカーとして利用した。pAAV／Ad11をトランスフェクトしたばあいまたはtet(o)Δp5-rep構築物をトランスフェクトしたばあいでは、Rep78およびRep68はアデノウイルスで感染したプールには検出されなかった（図5）。
このように、Rep78およびRep68の発現をおこす機能的エレメントとしてp5プロモーター（pAAV/Ad）のみを担持する構築物は、p5プロモーターを有する調節可能なアクチベーターの組み合わせ（tet(o)+p5-rep）よりも調節可能な様式でRep78／Rep68を発現する安定な細胞系を生じさせることにおいて効果がずっと低い。
このことは、たとえ低レベルのRep78およびRep68でも細胞増殖を阻害するという見解と一致する。反対に、tet(o)+p5-ｒｅｐ構築物は調節された様式でRep78およびRep68の顕著な量を発現する（図5）。テトラサイクリンの存在下で作製されたプールは、tet(o)が不活性であるばあい、培地からテトラサイクリンを除去するとRep78およびRep68を発現する。しかしながら、プールがテトラサイクリンの非存在下で作製されたばあいは、tet(o)が活性であるばあい、Rep78およびRep68の発現は検出されない。これらの結果は、Rep78およびRep68の発現をダウンレギュレートするp5プロモーターの配列の存在は、おそらくアデノウイルス後期主要転写因子（MTLF）およびAAV p5プロモーター中の2つのYY1部位50内に同時に付随することを示す。
実施例４
調節可能なトランスアクチベーターおよび調節可能なトランスリプレッサーの両者により調節されるプロモーターのクロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（CAT）発現の基本レベルの低下
構築物。構築物pOPI3CATおよびpCMVLacIをストラタジーン社（ラ  ホーラ（La Jolla）、カリフォルニア州、米国）からえた。pCMVLacIは、CMVプロモーターの転写調節下にある大腸菌（E. Coli）lacリプレッサーを含む。ptet(o)OPCATでは、pOPI3CAT由来の5.7kb SnaBI-Bg1IIフラグメントを0.66kb CMVプロモーター由来のtet−オペロン＋最小のTATAボックスを含むPvuII-BamHIフラグメントに連結することにより、pOPI3CATに由来の構成的ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターをtet−オペロンと交換した。後者のフラグメントは、pBluescript SK+のClaI-BamHI部位にpUHD10-3（Bujard教授より入手）由来のClaI-BamHIフラグメントを含むpBluescript SK+（ストラタジーン、ラ  ホーラ、カリフォルニア州、米国）からえた。構築物pCMVLacZはトランスフェクションを効率的に制御するものとして用いた。これは、CMVプロモーターの転写調節下にあるレポーター遺伝子として大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持する。
レポーター遺伝子（CAT）は、調節可能なトランスアクチベーター（tet-VP16）および調節可能なリプレッサー（LacI）を有するプロモーターの活性を分析するために用いた。tet-VP16系は本願の実施例１に記載されている。大腸菌lacリプレッサー／オペレーター／インデューサー系は哺乳類細胞で機能することが示されている（Dueschle, U. Hibskind, R. A. およびBujard, H.（1990）, Science 248, 480-483）。この系を用いる抑制は転写干渉（transcription interference）の種々の方法によりえられる。本発明者らは、ストラタジーン（ラ  ホーラ、カリフォルニア州、米国）社により市販されている、伸長の際には転写しているRNAポリメラーゼIIがlacリプレッサー／オペレーター複合体によりブロックされる系を用いた。lacリプレッサー／オペレーター複合体は転写単位から遊離されることが可能であり、培養培地にイソプロプルβ−D−チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することにより伸長させることができる。ptet(o)OPCATでは、CATの発現はIPTGおよび／またはテトラサイクリンまたはその類似体、ドキシサイクリンなど、を培地に添加することにより調節可能である。本発明者らの推定では、調節可能なトランスリプレッサーとトランス活性化機能の両者を含むプロモーターはオフの状態（off-state）ではより低い発現を示すであろう、ということであった。tet(o)OPCATプラスミドでは、この状況は、tet-VP16融合タンパク質が結合を妨げられ、かつlacリプレッサーが転写単位に結合するばあい起こる。
この推定をためすために、HtTA細胞を以下の構築物、すなわちpCMVLacI、ptet(o)OPCAT、pBluescript SK+、およびpCMVLacZで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションおよびそののちの培養はDMEM＋10％ FCSおよびゲンタマイシン（50μg/ml）中で行なった。トランスフェクションはライフ・テクノロジー（Life Technologies）社（ブレダ（Breda）、オランダ）製のリン酸カルシウムトランスフェクション系を用いて、製造業者の説明書にしたがい行なった。トランスフェクションの1日前にHtTA細胞（皿あたり3〜6 105細胞）を8枚の60mm皿（グライナー（Greiner）社、アルフェン・アーン・デ・リュン（Alphen aan de Rijn）、オランダ）に播いた。翌日、培地を培地で交換し、表示されているようにドキシサイクリン（1μg/ml, シグマ（Sigma）社製）を添加した。3時間後、4皿に3μg pCMVLacI、1μg pCMVLacZ、0.3μg ptet(o)CATおよび2.7μgpBluescript SK+を含むリン酸カルシウム沈殿物を与えた。ほかの4皿はネガティブコントロールとしてトランスフェクトしなかった。トランフェクションの40時間後、IPTG（3mM）を適切な皿に添加し、その約8時間後に細胞をPBSで洗浄し、かつラバーポリスマンでかき集めることにより1mlの新鮮なPBSに採取した。懸濁液をエッペンンドルフ・チューブに移し、細胞を5分間、600rpmでスピンさせた。細胞ペレットを100μl 250mM Tris-HCl（pH7.8）に再懸濁した。細胞を3回の凍結融解サイクルにより溶解し、残骸を遠心分離（14krpm、5分間、rt）により除去した。抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性をSambrookら（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T：Molecular Cloning：A labolatory manual, 1989）に記載のようにして測定した。同一のβ−ガラクトシダーゼ活性を含むように試料を250mM Tris-HCl（pH7.8）に希釈した。希釈物80μlをCAT活性を決定するために用いた。CATアッセイはSambrook J, Fritsch EF, Maniatis T：Molecular Cloning：A labolatory manual, 1989に記載されているように行なった。薄相クロマトグラフィープレートを光刺激可能なストレージ・フォスファー・プレート（storage phosphor plate）に暴露し、PhosphorImager（モレキュラー・ダイナミクス（Molecular Dynamics）社、サニーべール（Sunnyvale）、カナダ）を用いてスキャンし、クロラムフェニコール変換を定量した。
2つの独立した実験を行なった。実験の結果を図6に示す。図6AはCATアッセイのオートラジオグラムを示す。実験1のレーン1から4および実験2のレーン9から12はトランスフェクションしたもののCATアッセイの結果を示し、実験1のレーン5から8および実験2のレーン13から16はトランスフェクションしていないコントロールの培養物のCATアッセイの結果を示す。下のオートラジオグラムは実験中にIPTGまたはドキシサイクリン（Dox.）が存在する（+）か存在しないか（-）を示す。図6Bは、各レーンのクロラムフェニコールのアセチル化型への変換の百分率を示す。図6Cは、同じ実験で最も抑制された状態（-IPTG、+Doc）におけるCAT活性に対する試料中のCAT活性の誘導を示す。ドキシサイクリンの存在下、およびIPTGの非存在下においてプロモーターがその最も抑制された状態にあるときは、きわめて低いレベルではあるが、CAT発現を検出することができる（図6A、レーン2およびレーン10）。ドキシサイクリンの非存在下またはIPTGの存在下においては、2つの調節可能なエレメントのうち一方のみがオフ状態であるばあい、CAT活性は19に比較して（resp.19）2.3倍増大する。このように、転写単位内での調節可能なアクチベターおよびリプレッサー系の組み合わせは、調節可能な要素の一方のみが存在するばあいよりもより効率的に転写のサイレンシング（silencing）を可能にする。
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配列表
(1)一般情報：
(i)出願人：
(A)名称：イントロヘーネ  ベスローテン  フェンノートシャップ
(B)街路：ランゲ  クレイウェッヒ151
(C)都市：リースヴィーク
(D)州：ズイト−オランダ
(E)国：オランダ王国
(F)郵便番号(ZIP)：2288 GJ
(A)氏名：アイナーハント、マルクス  ペーター  ウィルヘルムス
(B)街路：ズス−ブラウンストラート17
(C)都市：アムステルダム
(D)州：ノールド−オランダ
(E)国：オランダ王国
(F)郵便番号(ZIP)：1034 WX
(A)氏名：ファレリオ、ドメニコ
(B)街路：ヘルブランディラーン12
(C)都市：ライデン
(D)州：ズイト−オランダ
(E)国：オランダ王国
(F)郵便番号(ZIP)：2314 EZ
(ii)発明の名称：安定にトランスフェクションされた哺乳類細胞における調節されたタンパク質発現
(iii)配列の数：２
(iv)機械読取り可能形式：
(A)媒体の形式：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ製パーソナルコンピュータ互換機
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン#1.30(EPO)
(V)本願データ：
出願番号：ＰＣＴ／ＮＬ９６／００４７２
(2)配列番号１に関する情報
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：37
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：ほかの核酸
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(xi)配列：配列番号１
0003881382.tif 000005
(2)配列番号２に関する情報
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：20
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：ほかの核酸
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(xi)配列:配列番号２
0003881382.tif 000006
【図１】
0003881382.tif 000007
【図２】
0003881382.tif 000008
【図３】
0003881382.tif 000009
【図４】
0003881382.tif 000010
【図５】
0003881382.tif 000011
【図６】
0003881382.tif 000012