(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ａ）
0003871713.tif 000028
（式中、Ｚは標識細胞に親和性を有する化合物由来の残基を表し、X0は-COAlk1-、-SAlk1-、-COOAlk1-、-CONHAlk1-、-COAlk1CO-、
0003871713.tif 000029
を表し、W0は、-CO-、-Alk1CO-または-Alk1Ｓ-を表し、W1は、単結合、-S-、-OAlk1CO-、-NHAlk1CO-、-NHAlk1NH-、
0003871713.tif 000030
を表し、Ｙ1は毒素残基を表し、R1およびR2は同一または異なってアミノ酸残基を表し、Alkはアルキレンを表し、ｎは１〜１０００の整数を表し、ｍは１〜１００の整数を表す（式中、Alk1およびAlk2は同一または異なって、直鎖または分岐状の炭素数1〜8のアルキレンを表す））
で表される毒素複合体。
【請求項２】
一般式（I）
0003871713.tif 000031
（式中、Ｚは標識細胞に親和性を有する化合物由来の残基を表し、X1は-CO-、-S-または
0003871713.tif 000032
を表し、Wは、単結合または
0003871713.tif 000033
を表し、Ｙ1は毒素残基を表し、R1およびR2は同一または異なってアミノ酸残基を表し、ｎは１〜１０００の整数を表し、ｍは１〜１００の整数を表す）
で表される毒素複合体。
【請求項３】
Ｚが該基内にCO、N、SまたはOを有する残基であり、Y1が該基内にN、SまたはOを有する残基である請求の範囲１または２記載の毒素複合体。ただし、X1がSのときZは該基内のCOを介してX1と結合し、X1がS以外の基のときZは該基内のN、SまたはOを介してX1と結合する。また、Y1は該基内のN、SまたはOを介してWまたはR2と結合する。
【請求項４】
Zが蛋白質またはペプチド由来の残基である請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の毒素複合体。
【請求項５】
蛋白質が抗体または抗体フラグメントである請求の範囲４記載の毒素複合体。
【請求項６】
R1がアラニン残基、ロイシン残基またはグリシン残基を表し、R2がプロリン残基、バリン残基またはロイシン残基である請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載の毒素複合体。
【請求項７】
Y1がアドリアマイシン、ダウノルビシン、デュオカルマイシン誘導体、マイトマイシンA、マイトマイシンC、リシンA、ジフテリアトキシンまたはシュードモナスエクソトキシン由来の残基である請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の毒素複合体。
【請求項８】
一般式（Ｂ）
X1−(OAlk)nO−W0−R1−R2−W2    （Ｂ）
（式中、X1はHOOCAlk1-、HSAlk1-、HOOCOAlk1-、HOOCNHAlk1-、HOOCAlk1CO-、
0003871713.tif 000034
を表し、W0は、-CO-、-Alk1CO-または-Alk1S-を表し、W2は、-OH、-SH、-OAlk1COOH、-NHAlk1COOH、-NH-Alk1NH2、
0003871713.tif 000035
を表し、R1およびR2は同一または異なってアミノ酸残基を表し、Alkはアルキレンを表し、ｎは１〜１０００の整数を表し、ｍは１〜１００の整数を表す（式中、Alk1およびAlk2は同一または異なって、直鎖または分岐状の炭素数1〜8のアルキレンを表す））で表される化合物。
【請求項９】
一般式（Ba）
X1−(OAlk)nOCH2CO−R1−R2−W2    （Ba）
（式中、X1はHOOCCH2-、HSCH2-または
0003871713.tif 000036
を表し、W2は、-OHまたは
0003871713.tif 000037
を表し、R1およびR2は同一または異なってアミノ酸残基を表し、Alkはアルキレンを表し、ｎは１〜１０００の整数を表す）で表される化合物。
【請求項１０】
アルキレンがエチレンである、請求の範囲９記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、毒素残基と標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基、例えば癌特異的な抗体あるいは抗体フラグメント由来の残基とをスペーサーを介して結合させた毒素複合体に関する。本発明により得られる毒素複合体は、標的細胞に対して選択的かつ効率的に細胞増殖抑制作用を有し、抗腫瘍剤の有効成分として有用である。
背景技術
アントラサイクリン系制癌剤化合物としては、ダウノマイシン（米国特許第３，５９０，０２８号）、アドリアマイシン（米国特許第３，５９０，０２８号）などが知られており、これらは臨床的にも広く使用されている制癌剤である。しかしながら、例えばアドリアマイシンは、心臓毒性、骨髄抑制などの副作用を発現し［Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 4, 5-10(1980)など］、これらの副作用の軽減が一つの大きな課題である。この課題の解決のための研究は従来から広範に行われており、近年、特に毒性の軽減、血中濃度の維持、癌細胞親和性を求めたドラッグデリバリーシステムの研究も行われている。例えば、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体による修飾（特開昭６０−６７４９０）、デキストラン修飾［Cancer Treatment Reports, 66, 107(1982)］などが知られている。
また、癌細胞特異性をもたせた抗体コンジュゲート（毒素複合体）も検討されており、例えば、下記の例[Bioconjugate Chem., 1, 13(1990)]があげられる。
0003871713.tif 000002
この他にも、抗体コンジュゲートに関して報告がなされている［特開昭６０−６７４３３号；特開昭６３−３５５７５号；特開昭６３−１５０２８２号；特開昭６３−２４６３３６号；Biochem. J., 173, 723(1978);Cancer Res., 50, 6600(1990);Sience, 261, 212(1993);Bioconjugate Chem., 4, 275(1993);Bioconjugate Chem., 4, 251(1993);Bioconjugate Chem., 5, 88(1994);Bioconjugate Chem., 5, 31(1994);Bioconjugate Chem., 5, 246(1994)]。
また、低分子ポリエチレングリコールをスペーサーとして用いた例［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9287(1991);特表平５−５０８８５６号；Bioconjugate Chem., 4, 455(1993)］あるいは抗体自身のポリエチレングリコール修飾(WO 93/08838;WO 86/04145など）が知られている。また、スペーサーにペプチドを含むものが知られている［米国特許第４，６７１，９５８号；特表平５−５０２８８６号；Bioconjugate Chem., 4, 10(1993)など］。
発明の開示
本発明者らは、腫瘍細胞に対し選択的に殺傷効果を発揮する優れた毒素複合体の探索に鋭意検討を重ねた。その結果、ポリエチレングリコールとジペプチドとから構成される新規スペーサーを介して毒素分子と癌細胞に特異的に親和性を有する分子とを化学的に結合することにより、特定細胞内でスペーサーが特異的に切断される複合体が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基と毒素残基とをポリアルキルグリコールおよびジペプチドを含有するスペーサーを介して結合させた毒素複合体に関する。
具体的には、例えば一般式（Ａ）
0003871713.tif 000003
（式中、Ｚは標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基を表し、Ｙ1は毒素残基を表し、Ｒ1およびＲ2は同一または異なってアミノ酸残基を表し、Ａｌｋはアルキレンを表し、ｎは１〜１０００の整数を表し、ｍは１〜１００の整数を表す）で表される毒素複合体があげられる。Ｘ0、Ｗ0およびＷ1は特に限定されないが、例えばＸ0は−ＣＯＡｌｋ1−、−ＳＡｌｋ1−、−ＣＯＯＡｌｋ1−、−ＣＯＮＨＡｌｋ1−、−ＣＯＡｌｋ1ＣＯ、
0003871713.tif 000004
等を表し、Ｗ0はＣＯ、−Ａｌｋ1ＣＯ−、−Ａｌｋ1Ｓ−等を表し、Ｗ1は単結合、Ｓ、−ＯＡｌｋ1ＣＯ−、−ＮＨＡｌｋ1ＣＯ−、−ＮＨＡｌｋ1ＮＨ−、
0003871713.tif 000005
等を表し、式中、Ａｌｋ1およびＡｌｋ2は同一または異なってメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレンなどの直鎖または分枝状の炭素数１〜８のアルキレンを表す。
中でも、一般式（Ｉ）
0003871713.tif 000006
（式中、Ｘ1はＣＯ、Ｓまたは
0003871713.tif 000007
を表し、Ｗは単結合または
0003871713.tif 000008
を表し、Ｚ、Ｙ1、Ｒ1、Ｒ2、ｎおよびｍは前記と同意義を表す）で表される毒素複合体［以下、一般式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）という。他の式番号の化合物についても同類である］が好ましい。
上記の各基の定義において、アルキレンおよびポリアルキレングリコールのアルキレン部分としては、直鎖または分枝状の炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレンなどがあげられる。標的細胞に親和性を有する化合物としては、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＳＨ、ＯＨなどのＸ1に結合可能な構造を有する化合物、例えば標的細胞に親和性を有する上皮細胞増殖因子（EGF）、トランスフェリンなどのレセプターリガンド、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列に代表される接着分子、抗体、抗体フラグメントなどの蛋白質、ペプチドなど、好ましくは抗体、抗体フラグメントなどがあげられる。抗体は、公知の方法で作製される多クローン抗体、単クローン抗体の双方を含み、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどのクラスのもの、およびサブクラスのもの、例えばＩｇＧではＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4などを包含する。好ましくは、癌細胞に高発現がみられるガングリオシドＧＤ3に対する抗体であるＫＭ−６４１抗体（特開平５−１７６７９１号）、シアリルルイスａに対する抗体であるＫＭ−２３１（ＡＭＣ−４６２）抗体（特開昭６３−０２１５６２号）、共通人急性リンパ性白血病細胞抗原（ＣＡＬＬＡ）に対する抗体であるＮＬ−１抗体［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4386-4390(1982)］などがあげられる。抗体フラグメントとしては、上記抗体をペプシンなどの蛋白質分解酵素で処理することにより得られるＦ（ab')2、さらにＦ（ab')2をメルカプタンで還元することにより得られるＦab’、抗体をパパイン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミンなどの蛋白質分解酵素で分解することにより得られるＦabなどがあげられる。Ｆ（ab')2、Ｆab'、Ｆabおよびその製法については公知である（山村雄一ら、免疫化学、４６１頁、朝倉書店、昭和４８年）。毒素としては、ＮＨ、ＳＨ、ＯＨなどの末端アミノ酸Ｒ2のカルボキシル基と縮合可能な構造あるいはマレインイミドの二重結合部に付加可能な構造を有する毒素、例えばアドリアマイシン（米国特許第３，５９０，０２８号）、ダウノルビシン（米国特許第３，６１６，２４２号）などのアントラサイクリン系化合物、ＤＣ−８８Ａ誘導体（特開平２−２８８８７９）、参考例記載の化合物などのデュオカルマイシン誘導体、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、あるいはリシンＡ、ジフテリアトキシン、シュードモナスエクソトキシンなどの蛋白性の毒素などがあげられる。アミノ酸残基としては、アラニン残基、ロイシン残基、グリシン残基、プロリン残基、バリン残基があげられる。
なお、以下の記載において使用される略号は、特に断わらない限りそれぞれ以下の意味を有する。
アミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（IUPAC-IUB Commition on Biochemical Nomenclature）の勧告[Biochemistry, 11, 1726(1972)]に従った。
Ａｌａ：L-アラニン
Ｖａｌ：L-バリン
Ｐｒｏ：L-プロリン
Ｇｌｙ：グリシン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
Ｂｚｌ：ベンジル
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｐｉｃ：ピコリル
ＨＯＮＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＯＮＳｕ：スクシンイミドオキシ
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア
ＡＤＭ：アドリアマイシン
ＤＮＲ：ダウノルビシン
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート
ＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＤＭＡＰ：４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン
ＰＥＧ：ＣＯＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＯ
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＮＭＲ：核磁気共鳴
次に、化合物（Ｉ）および一般式（II）
X2−CH2(OCH2CH2)nOCH2CO−R1−R2−Y2          （II）
（式中、Ｘ2はカルボキシ、メルカプトまたは
0003871713.tif 000009
を表し、Ｙ2はヒドロキシまたは
0003871713.tif 000010
を表し、Ｒ1、Ｒ2およびｎは前記と同意義を表す）で表されるポリエチレングリコール誘導体の製造法について説明する。
製造法１：化合物（Ｉ）においてＺが該基内にＮ、ＳまたはＯを有する基かつＸ1がＣＯかつＷが単結合である化合物（Ｉａ）の製造法
化合物（Ｉａ）は、次の反応工程に従い製造することができる。
0003871713.tif 000011
（式中、Ａ1およびＡ2は同一または異なってカルボン酸の保護基を表し、Ａ3およびＡ4は同一または異なってカルボン酸を活性化する基を表し、Ｈａｌはハロゲンを表し、Ｚ1はＺの定義のうち該基内にＮ、ＳまたはＯを有する基を表し、Ｙ1、Ｒ1、Ｒ2およびｎは前記と同意義を表す）
カルボン酸の保護基としては、一般的なペプチド合成に用いられるカルボン酸の保護基（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）、例えばｔＢｕ、Ｂｚｌ、Ｐｉｃなどがあげられ、カルボン酸を活性化する基としては、ＯＮＳｕなどがあげられる。ハロゲンは、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
（工程１）
化合物（Ｖ）は、ポリエチレングリコールジカルボン酸（III）と０．１〜１当量、好ましくは０．５当量の化合物（IV）とを、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、ＤＭＦなどの溶媒中、−５０〜３０℃で１〜２４時間反応させることにより得ることができる。この際、生成物に含まれるジエステルおよび未反応のジカルボン酸は、分配、吸着樹脂、逆相シリカゲル、アルミナ、珪藻土、イオン交換樹脂、好ましくはシリカゲルカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーにより除去することができる。
（工程２）
化合物（VII）は、化合物（Ｖ）と一般的な液相ペプチド合成法（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）により得られる化合物（VI）とを、１〜２当量の塩基の存在下、１〜１０当量、好ましくは１〜２当量の縮合剤を用いて、溶媒中縮合させることにより得ることができる。塩基としては、トリエチルアミン、ＮＭＭなどがあげられ、縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＣなどの通常のアミノ酸の縮合試薬があげられ、溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦなどがあげられる。反応は、０〜３０℃で１〜２４時間攪拌することにより行われる。
なお、化合物（VI）のカルボン酸の保護基として用いられるＡ2は、化合物（Ｖ）のＡ1とは別に選択的に除去できる基が好ましい。
化合物（VII）は、化合物（Ｖ）と１〜１０当量、好ましくは１〜２当量のＨＯＮＳｕ、ＨＯＢｔなどとを、当量の塩基の存在下、１〜５当量、好ましくは１〜２当量の縮合剤を用いて、溶媒中縮合させることにより活性エステルを得、次いでこれと化合物（ＶＩ）とを０〜３０℃で１〜２４時間反応させることにより得ることもできる。塩基、縮合剤および溶媒としては、上記と同じものがあげられる。
（工程３）
化合物（VIII）は、化合物（VII）より、一般的なペプチド合成に用いられる保護基の除去方法（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）に従ってＡ2を選択的に脱保護することにより得ることができる。
（工程４）
化合物（Ｘ）は、化合物（VIII）と当量の毒素とを、１〜２当量の塩基の存在下、１〜１０当量、好ましくは１〜２当量の縮合剤を用いて、溶媒中縮合させることにより得ることができる。塩基としては、トリエチルアミン、ＮＭＭなどがあげられ、縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＣなどの通常のアミノ酸の縮合試薬があげられ、溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦなどがあげられる。反応は、−３０〜３０℃で１〜２４時間攪拌することにより行われる。
化合物（Ｘ）は、化合物（VIII）と１〜１０当量、好ましくは１〜２当量のＨＯＮＳｕ、ＨＯＢｔなどとを、当量の塩基の存在下、１〜５当量、好ましくは１〜２当量の縮合剤を用いて、溶媒中縮合させることにより活性エステル（IX）を得、次いでこれと毒素とを−３０〜３０℃で１〜２４時間反応させることにより得ることもできる。塩基、縮合剤および溶媒としては、上記と同じものがあげられる。
（工程５）
化合物（XI）は、化合物（Ｘ）より、一般的なペプチド合成に用いられる保護基の除去方法（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）に従ってＡ1を脱保護することにより得ることができる。なお、工程３および工程５において脱保護される保護基の組み合わせとして例えばＡ1にＢｚｌ、Ａ2にｔＢｕを用いた場合、Ａ1はパラジウム炭素触媒下での水素添加など、Ａ2はトリフルオロ酢酸処理などの通常のアミノ酸保護基の選択的除去方法に従い脱保護され、Ａ1およびＡ2を各工程で選択的に除去することができる。Ａ1およびＡ2の組み合わせを逆にして脱保護の順序もそれにあわせて逆にすることも可能である。
また、化合物（XI）は、工程４における化合物（IX）より工程５の方法に準じてＡ1を脱保護した後、工程２の方法に準じて毒素と反応させることにより得ることもできる。
（工程６）
化合物（Ｉａ）は、化合物（XI）と標的細胞に親和性を有し、分子内にＮＨ、ＳＨまたはＯＨを有する化合物とから、工程２の方法に準じて得ることができる。標的細胞に親和性を有する化合物は、蛋白質、ペプチドなどのように有機溶媒中で変性失活するおそれのある化合物が多く、上記反応は好ましくは緩和な水溶液中で行われる。この場合、反応は、ｐＨ６〜８の燐酸あるいはほう酸などの緩衝液中に標的細胞に親和性を有する化合物を溶解し、これに１〜５００当量、好ましくは１〜５０当量の化合物（XI）およびＥＤＣなどの縮合剤を加え、０〜３０℃で１〜４８時間攪拌することにより行われるか、あるいは、工程２の方法に準じて活性エステル（XII）を得、これを、０〜１０％、好ましくは０〜５％のＤＭＳＯあるいはＤＭＦの存在下、ｐＨ６〜８の緩衝液中に標的細胞に親和性を有する化合物を溶解した溶液に１〜５００当量、好ましくは１〜５０当量の割合で混合し、０〜３０℃で１〜４８時間攪拌することにより行われる。
製造法２：化合物（Ｉ）においてＺが該基内にＮ、ＳまたはＯを有する基かつＸ1がＣＯかつＷが
0003871713.tif 000012
である化合物（Ｉｂ）の製造法
化合物（Ｉｂ）は、次の反応工程に従い製造することができる。
0003871713.tif 000013
（式中、Ａ1、Ｙ1、Ｚ1、Ｒ1、Ｒ2およびｎは前記と同意義を表す）
（工程７）
化合物（XIII）は、化合物（VIII）とアミノエチルマレイミドとから、工程２の方法に準じて得ることができる。
（工程８）
化合物（XIV）は、化合物（XIII）と毒素とを反応させることにより得ることができる。反応は、ｐＨ６〜８の燐酸あるいはほう酸などの緩衝液中に毒素を溶解し、これに１〜５０当量の化合物（XIII）を加え、０〜３０℃で１〜４８時間攪拌することにより行われる。
（工程９）
化合物（Ｉｂ）は、化合物（XIV）から、工程５および工程６の方法に準じて得ることができる。
製造法３：化合物（Ｉ）においてＺが該基内にＣＯを有する基かつＸ1がＳかつＷが単結合である化合物（Ｉｃ）の製造法
化合物（Ｉｃ）は、次の反応工程に従い製造することができる。
0003871713.tif 000014
（式中、Ａ4はチオールの保護基を表し、Ｚ2はＺの定義のうち該基内にＣＯを有する基を表し、Ａ1、Ｙ1、Ｒ1、Ｒ2およびｎは前記と同意義を表す）
チオールの保護基としては、ベンジル、ピコリル、ニトロベンジルなどがあげられる。
原料化合物（XV）は、Poly(Ethylene Glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,(J. M. Harris, Ed., Plenum, NY.1992)記載のポリエチレングリコール誘導体の合成手法に従い得ることができる。
（工程１０）
化合物（XVI）は、一般的なペプチド合成に用いられる保護基の導入方法（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）に従って化合物（XV）のチオール基を保護することにより得ることができる。
（工程１１）
化合物（XVII）は、化合物（XVI）から、工程３の方法に準じて得ることができる。
（工程１２）
化合物（XVIII）は、化合物（XVII）から、工程２および工程３の方法に準じて得ることができる。
（工程１３）
化合物（XIX）は、化合物（XVIII）から、工程４の方法に準じて得ることができる。
（工程１４）
化合物（XX）は、化合物（XIX）を、一般的なペプチド合成に用いられる保護基の除去方法（”ペプチド合成の基礎と実験”、泉屋信夫ら、丸善）に従って脱保護することにより得ることができる。
（工程１５）
化合物（Ｉｃ）は、化合物（XX）と標的細胞に親和性を有し、分子内にCOOHを有する化合物とを、J. Applied Biochem., 6, 56-63(1984)記載のチオール基の活性化法などの方法を用い結合させることにより得ることができる。
製造法４：化合物（Ｉ）においてＺが該基内にＮ、ＳまたはＯを有する基かつＸ1が
0003871713.tif 000015
かつＷが単結合である化合物（Ｉｄ）および化合物（II）においてＸ2が
0003871713.tif 000016
かつＹ2がヒドロキシである化合物（IIｄ）の製造法
化合物（Ｉｄ）および化合物（IIｄ）は、次の反応工程に従い製造することができる。
0003871713.tif 000017
（式中、Ａ1、Ｙ1、Ｚ1、Ｒ1、Ｒ2およびｎは前記と同意義を表す）
原料化合物（XXI）はPoly(Ethylene Glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applicatioins,(J. M. Harris, Ed., Plenum, NY.1992)記載のポリエチレングリコール誘導体の合成手法に従い得ることができる。
（工程１６）
化合物（XXII）は、化合物（XXI）から、工程３の方法に準じて得ることができる。
（工程１７）
化合物（IIｄ）は、化合物（XXII）から、工程２および工程３の方法に準じて得ることができる。
（工程１８）
化合物（XXIII）は、化合物（IIｄ）から、工程４の方法に準じて得ることができる。
（工程１９）
化合物（Ｉｄ）は、化合物（XXIII）と標的細胞に親和性を有し、分子内にＮＨ、ＳＨまたはＯＨを有する化合物とから、工程８の方法に準じて得ることができる。
製造法５：化合物（II）においてＸ2がカルボキシかつＹ2がヒドロキシである化合物（IIａ）の製造法
（工程２０）
化合物（IIａ）は、化合物（VIII）から、工程３の方法に準じて得ることができる。
製造法６：化合物（II）においてＸ2がカルボキシかつＹ2が
0003871713.tif 000018
である化合物（IIｂ）の製造法
（工程２１）
化合物（IIｂ）は、化合物（XIII）から、工程３の方法に準じて得ることができる。
製造法７：化合物（II）においてＸ2がメルカプトかつＹ2がヒドロキシである化合物（IIｃ）の製造法
（工程２２）
化合物（IIｃ）は、化合物（XVIII）から、工程１４の方法に準じて得ることができる。
以上に記載した方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望の基を有する化合物（Ｉ）あるいは化合物（II）を得ることができる。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種カラムクロマトグラフィーあるいは通常の半透膜を用いた透析により単離精製することができる。また、中間体においては、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
上記製造法によって得られる毒素複合体（Ｉ）の具体例を第１表に示す。
0003871713.tif 000019
次に、毒素複合体の薬理活性について試験例で説明する。
試験例１
毒素複合体を用い、細胞増殖抑制効果の検討を行った。標的細胞株としては、ＣＡＬＬＡ抗原を発現していない子宮頚癌ＨｅＬａＳ３（ＣＡＬＬＡ-）およびＣＡＬＬＡ抗原を発現しているバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ（ＣＡＬＬＡ+）を用いた。９６穴平底プレートに標的細胞株５０μｌ（１×１０3個／穴）をそれぞれまき、３７度で２時間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。培養後、種々の濃度に希釈した毒素複合体あるいはモノクローナル抗体を５０μｌ添加し、さらに３７度で６８時間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。3Ｈ−チミジン２０μｌ（４６３ＫＢｑ／ｍｌ）を各穴に添加して４時間後、ハーベストし、細胞内に取り込まれた3Ｈ−チミジンの放射活性をマトリックス９６（パッカードジャパン社製）で測定した。細胞増殖抑制活性は以下の式により算出した。
0003871713.tif 000020
その結果、化合物（Ｉａ−３）あるいは化合物（Ｉａ−１）を添加した場合、高濃度では若干ＨｅＬａＳ３にも細胞増殖抑制効果が認められたが、Ｄａｕｄｉに対してはごく低濃度より強い細胞増殖抑制効果が認められた。また、化合物（Ｉａ−９）あるいは化合物（Ｉａ−７）を添加した場合には、ＨｅＬａＳ３細胞にはほとんど効果が認められず、Ｄａｕｄｉに対してより特異性の高い増殖抑制効果が認められた。一方、モノクローナル抗体（ＮＬ−１）のみを添加した場合は、ほとんど増殖に影響を及ぼさなかった（第１図）。
試験例２
試験例１と同様にして、化合物（Ｉａ−６）を用い細胞増殖抑制効果の検討を行なった。標的細胞株としては、ｓＬｅa抗原を発現していない子宮頚癌ＨｅＬａＳ３（ｓＬｅa-）およびｓＬｅa抗原を発現している大腸癌ＳＷ1116（ｓＬｅa+）を用いた。その結果、化合物（Ｉａ−６）を添加した場合、ＳＷ１１１６に対しては細胞増殖抑制効果が認められたが、ＨｅＬａＳ３に対しては効果が認められなかった。一方、モノクローナル抗体（ＫＭ−２３１）のみを添加した場合は、いずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制効果が認められず、複合体の抗原特異的細胞増殖抑制効果が確認された（第２表）。
0003871713.tif 000021
以上より、種々の複合体の抗原特異的細胞増殖抑制効果、スペーサーの有用性が確認された。
試験例３
化合物（Ｉａ−１０）を用い、細胞増殖抑制効果の検討を行った。標的細胞株としては、ｓＬｅa抗原を発現していない子宮頚癌ＨｅＬａＳ３（ｓＬｅa-）およびｓＬｅa抗原を発現している大腸癌ＳＷ１１１６（ｓＬｅa+）を用いた。９６穴平底プレートに標的細胞株５０μｌ（１×103個／穴）をそれぞれまき、３７度で２時間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。培養後、種々の濃度に希釈した薬物−モノクローナル抗体複合体あるいはモノクローナル抗体を５０μｌ添加し、さらに３７度で２時間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。培養後、プレートを遠心し、培養上清を除去した。すぐに培地１００μｌを加え、さらに６４時間培養を行なった。3Ｈ−チミジン２０μｌ（４６３ＫＢｑ／ｍｌ）を各穴に添加して４時間後、ハーベストし、細胞内に取り込まれた3Ｈ−チミジンの放射活性をマトリックス９６（パッカード  ジャパン社製）で測定した。細胞増殖抑制活性は以下の式により算出した。
0003871713.tif 000022
その結果、化合物（Ｉａ−１０）を添加した場合、ＳＷ１１１６に対しては細胞増殖抑制効果が認められたが、ＨｅＬａＳ３に対しては効果が認められなかった。一方、モノクローナル抗体（ＫＭ−２３１）のみを添加した場合は、ごくわずかにＳＷ１１１６に対して細胞増殖抑制効果が認められただけであり、この系においても複合体の抗原特異的細胞増殖抑制効果、スペーサーの有用性が確認された（第３表）。
0003871713.tif 000023
試験例４
１０％牛胎児血清を含むＰＲＭＩ−１６４０培地で２×１０8個／ｍｌに調製したヒトミエローマ細胞ＳＫ−Ｌｙ−１８をマトリゲル［Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、ＵＳＡ）］と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、その０．１ｍｌ（１×１０7個／マウス）をＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）の皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に、１群５匹で、薬物−モノクローナル抗体複合体（ＡＤＭ，７．５ｍｇ／ｋｇ相当量）またはＡＤＭ（７．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。対照群には、生理食塩水を同様にして投与した。経日的に腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積は、楕円体の近似値として以下の式により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝（ａ×ｂ2）／２
ａ：長径（ｍｍ）  ｂ：短径（ｍｍ）
移植腫瘍に対する治療効果は、測定評価日の腫瘍体積（Ｖ）と薬物投与日の腫瘍体積（Ｖ0）の比Ｖ／Ｖ0で評価した。
その結果、対照群においては著しい腫瘍の増殖が認められたが、化合物（Ｉａ−１）および化合物（Ｉａ−３）投与群では著しい腫瘍の増殖抑制効果が認められた。一方、同量のＡＤＭ単独投与群では、対照群に比較し増殖抑制効果が認められず、薬物−モノクローナル抗体複合体の有用性が示された（第２図）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、毒素複合体またはモノクローナル抗体による細胞増殖抑制効果を示すものである。
（ａ）  化合物（Ｉａ−３）を用いた場合の結果
（ｂ）  化合物（Ｉａ−１）を用いた場合の結果
（ｃ）  化合物（Ｉａ−９）を用いた場合の結果
（ｄ）  化合物（Ｉａ−７）を用いた場合の結果
（ｅ）  ＮＬ−１を用いた場合の結果
○    Ｄａｕｄｉを用いた場合の結果
●    ＨｅＬａＳ３を用いた場合の結果
第２図は、毒素複合体または薬物による移植腫瘍に対する治療効果を示すものである。
●    対照群
□    化合物（Ｉａ−１）を用いた場合の結果
△    化合物（Ｉａ−３）を用いた場合の結果
○    ＡＤＭを用いた場合の結果
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例および参考例によって本発明の態様を説明する。
実施例１  毒素複合体（Ｉａ−１）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭ）m
参考例６で得られる化合物（XI−１）２７５μｇ(0.21μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(1.1μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１３．０ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(1.1μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（２２．０ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１．５時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，７０μｌに溶解し、燐酸緩衝液１４００μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．３ｍｇ／ｍｌ）４８０μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、ゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分を精製した［カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅｌ２（ファルマシア社製）、展開液：燐酸緩衝液、流速：０．５ｍｌ／分、２８０ｎｍの吸光度で検出］。目的とする溶出画分を少量限外濾過膜（ミリポア社製、分画分子量５０００）で濃縮し、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭ）mを７７１μｇ（蛋白濃度０．６７ｍｇ／ｍｌ）得た（収率４９％）。
本複合体において、２８０ｎｍ（蛋白質の吸収＝２８０ｎｍにおける全吸収−２８０ｎｍにおけるアドリアマイシンの吸収）および４９５ｎｍ（アドリアマイシンの吸収、ε＝１．２１×１０4Ｍ-1ｃｍ-1、ε280＝ε495）における吸光度から算出したアドリアマイシンの結合数は抗体１分子当り２．２個であり、抗体の結合力価が未結合の抗体の結合力価とほぼ等しいことは以下に記載の蛍光抗体法により確認した。
＜蛍光抗体法による抗体の結合力価測定＞
Ｄａｕｄｉ細胞１×１０6個に上記複合体（１０μｇ／ｍｌ）を加え、氷冷下３０分間反応させた。細胞を燐酸緩衝液で３回遠心洗浄し、未反応の複合体を除去した後、ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）標識抗マウスＩｇＧ抗体（和光純薬（株）社製、３０倍希釈）２０ｍｌを加え、氷冷下３０分間反応させた。再び燐酸緩衝液で３回遠心洗浄した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ、コールター社製）を用いて測定を行った。コントロールには、細胞にＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体のみを反応させたものを用いた。
実施例２  毒素複合体（Ｉａ−２）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）m
参考例７で得られる化合物（XI−２）２８９μｇ(0.22μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(1.1μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１３．０ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(1.1μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（２３．１ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１．５時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，９５μｌに溶解し、燐酸緩衝液１９００μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．３ｍｇ／ｍｌ）５１０μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣによる抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）mを１０６０μｇ（蛋白濃度０．８８ｍｇ／ｍｌ）得た（収率６３％）。
本複合体において、実施例１と同様にして２８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおける吸光度から算出したアドリアマイシンの結合数は抗体１分子当り１．８個であり、また、本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例３  毒素複合体（Ｉａ−３）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）m
参考例８で得られる化合物（XI−３）２５９μｇ(0.20μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(1.0μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１１．７ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(1.0μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（２１．０ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１．５時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，７６μｌに溶解し、燐酸緩衝液１４６０μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．３ｍｇ／ｍｌ）４６０μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣによる抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）mを９１２μｇ（蛋白濃度０．７６ｍｇ／ｍｌ）得た（収率６０％）。
本複合体において、実施例１と同様にして２８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおける吸光度から算出したアドリアマイシンの結合数は抗体１分子当り１．５個であり、また、本複合体が未結合に抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例４  毒素複合体（Ｉａ−４）：ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲ）m
参考例９で得られる化合物（XI−４）９６μｇ(0.08μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(0.38μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（４．３ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(0.37μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（７．７ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，２７μｌに溶解し、燐酸緩衝液１１４μｌを加えた後、ＫＭ−２３１抗体水溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）５６３μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲ）mを５１０μｇ（蛋白濃度０．８５ｍｇ／ｍｌ）得た（収率９１％）。
本複合体において、実施例１と同様にして２８０ｎｍおよび４９５ｎｍ（ε＝１．１５×１０4Ｍ-1ｃｍ-1）における吸光度から算出したダウノルビシンの結合数は抗体１分子当り３．１個であり、また、本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例５  毒素複合体（Ｉａ−５）：ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ）m
参考例１０で得られる化合物（XI−５）３４８μｇ(0.27μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(1.4μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１５．７ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(1.4μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（２８．２ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，１００μｌに溶解し、燐酸緩衝液４１０μｌを加えた後、ＫＭ−２３１抗体水溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）２．０５ｍｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ）mを２．０ｍｇ（蛋白濃度１．３６ｍｇ／ｍｌ）得た（収率１００％）。
本複合体において、実施例４と同様にして２８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおける吸光度から算出したダウノルビシンの結合数は抗体１分子当り１．９個であり、また、本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。この際、評価細胞にはＳＷ１１１６を用いた。
実施例６  毒素複合体（Ｉａ−６）：ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ）m
参考例１１で得られる化合物（XI−６）１５４μｇ(0.12μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(0.61μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（７．０ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(0.61μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１２．６ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，４０μｌに溶解し、燐酸緩衝液１８５μｌを加えた後、ＫＭ−２３１抗体水溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）８２５μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ）mを６６０μｇ（蛋白濃度１．１ｍｇ／ｍｌ）得た（収率８０％）。
本複合体において、実施例４と同様にして２８０ｎｍおよび４９５ｎｍにおける吸光度から算出したダウノルビシンの結合数は抗体１分子当り１．５個であり、また、本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例５に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例７  毒素複合体（Ｉａ−７）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０））m
参考例１２で得られる化合物（XI−７）１００μｇ(0.08μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(0.41μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（４．７ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(0.41μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（８．４ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１．５時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，３０μｌに溶解し、燐酸緩衝液５２７μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．０ｍｇ／ｍｌ）２０３μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０））mを６４８μｇ（蛋白濃度１．１ｍｇ／ｍｌ）得た（収率１００％）。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
抗体１分子当りの化合物（２０）の結合数は、参考例２７に記載の方法に従って酸素処理（サーモリシン）し、遊離したＨ−Ｖａｌ−化合物（２０）をHPLCで定量することにより算出した。これにより、本複合体において、抗体１分子当り０．３８個の化合物（２０）が結合していることを確認した。
実施例８  毒素複合体（Ｉａ−８）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０））m
参考例１３で得られる化合物（XI−８）２１１μｇ(0.17μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(0.85μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（９．８ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(0.85μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１７．５ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，６０μｌに溶解し、燐酸緩衝液１１１５μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．０ｍｇ／ｍｌ）４２５μｌを加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０））mを１．２ｍｇ（蛋白濃度１．７６ｍｇ／ｍｌ）得た（収率９７％）。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
抗体１分子当りの化合物（２０）の結合数は、参考例２７に記載の方法に従って酵素処理（プロリエンドペプチダーゼ）し、遊離した化合物（２０）をHPLCで定量することにより算出した。これにより、本複合体において、抗体１分子当り０．４５個の化合物（２０）が結合していることを確認した。
実施例９  毒素複合体（Ｉａ−９）：ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０））m
参考例１４で得られる化合物（XI−９）１３５μｇ(0.11μmol)を塩化メチレン５００μｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ(0.55μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（６．３ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣ(0.55μmol)の塩化メチレン溶液１０μｌ（１１．３ｍｇ／ｍｌ）を順に加えた。氷冷下１時間、次いで室温で１時間攪拌した後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，４０μｌに溶解し、燐酸緩衝液７３５μｌを加えた後、ＮＬ−１抗体水溶液（３．０ｍｇ／ｍｌ）２７５μｌを加え、４℃で一昼夜静かに撹拌した。０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０））mを７７４μｇ（蛋白濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）得た（収率９４％）。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例１に記載の蛍光抗体法により確認した。
抗体１分子当りの化合物（２０）の結合数は、参考例２７に記載の方法に従って酵素処理（プロリエンドペプチダーゼ）し、遊離した化合物（２０）をHPLCで定量することにより算出した。これにより、本複合体において、抗体１分子当り０．４９個の化合物（２０）が結合していることを確認した。
実施例１０  毒素複合体（Ｉａ−１０）：ＮＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２））m
参考例１６で得られる化合物（Ｘ−１）０．４５ｍｇ(0.33μmol)をメタノール０．４ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下１０％パラジウム炭素触媒１ｍｇを加え、水素気流中、−１５℃で５時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を０℃以下で減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２）０．１４ｍｇ(0.11μmol)を得た。この化合物０．１４ｍｇを氷冷下ＨＯＮＳｕの塩化メチレン溶液２５０μｌ（０．０７６ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、ＤＣＣの塩化メチレン溶液２５０μｌ（０．１４ｍｇ／ｍｌ）を加え、氷冷下２．５時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、０℃以下に冷却したまま溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，３６μｌに溶解し、氷冷した燐酸緩衝液２０４μｌを加えた後、氷冷下ＫＭ−２３１抗体水溶液（０．９９ｍｇ／ｍｌ）０．５６ｍｌを加え、４℃で静かに一昼夜撹拌した。０．２２μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＫＭ−２３１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２））mを２５０μｇ（蛋白濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）得た（収率５．１％）。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例４に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例１１  毒素複合体（Ｉａ−１１）：ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２））m
参考例１６で得られる化合物（Ｘ−１）２．５ｍｇ(1.8μmol)をメタノール０．３ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下１０％パラジウム炭素触媒１ｍｇを加え、水素気流中、−１８℃で４時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を０℃以下で減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２）０．０５ｍｇ(0.04μmol)を得た。この化合物０．０５ｍｇを氷冷下ＨＯＮＳｕの塩化メチレン溶液２５０μｌ（０．０２８ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、ＤＣＣの塩化メチレン溶液２５０μｌ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を加え、氷冷下４．５時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、０℃以下に冷却したまま溶媒を減圧下除去した。残渣をＤＭＳＯ，１５μｌに溶解し、冷却した燐酸緩衝液８０μｌを加えた後、氷冷下ＫＭ−６４１抗体水溶液（１．４７ｍｇ／ｍｌ）２０５μｌを加え、４℃で静かに一昼夜攪拌した。０．２２μｍのフィルターで不溶物を除去し、次いで実施例１と同様にしてゲル濾過ＨＰＬＣで抗体の画分の精製、濃縮を行い、ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２））mを２００μｇ（蛋白濃度７０μg/ml）得た（収率６６％）。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例４に記載の蛍光抗体法により確認した。
参考例１  化合物（VIII−１）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨ
（ａ）化合物（Ｖ−１）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−ＯＨ
ポリエチレングリコールジカルボン酸［ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、平均分子量６００（フルカ  ファイン  ケミカルズ社製）］１０ｇ(16.7mmol)をＤＭＦ，１００ｍｌに溶解し、無水炭酸カリウム２．７５ｇを加え、室温で攪拌した。この溶液に臭化ベンジル２ｍｌ(8.4mmol）をＤＭＦ，１００ｍｌに溶解した溶液を３０分間かけて滴下し、さらに一昼夜攪拌した。水１００ｍｌを加え、１ＮＨＣｌでｐＨ１〜２に調整した。酢酸エチル１００ｍｌで６回抽出を行い、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１を各々２００ｍｌ使用し、１０ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去した。残渣を少量のクロロホルムに溶解し、濾過後、濾液から溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−ＯＨを０．９ｇ(1.3mmol）得た（収率７．８％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝３：１、Ｒｆ値０．５
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）
（ｂ）化合物（VI−１）：Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕ
Ｈ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕ塩酸塩１．６ｇ(7.6mmol）をＴＨＦ，１６０ｍｌに溶解し、ＮＭＭ，１．０ｍｌ(9.2mmol）を加え、室温で攪拌した。この溶液にＺ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ，２．５ｇ(7.6mmol）を加え、さらに室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルム、燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を順次５０ｍｌずつ加えた後、クロロホルム層を抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下除去し、オイル状の残渣を得、これをシリカゲル２００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１を各々２００ｍｌ順に使用し、１０ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．９］で確認しながら目的分画の溶媒を減圧下除去し、オイル状の目的物Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕを３．０ｇ得た。この化合物３．０ｇにＴＨＦ，６０ｍｌおよびメタノール６０ｍｌを加えて溶解し、１０％パラジウム炭素触媒３２０ｍｇを加え、水素雰囲気下、室温で７時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、目的物Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕを１．７ｇ(7.1mmol）得た（収率９３％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．４
質量分析（ＳＩＭＳ）：２４５（Ｍ＋Ｈ）
（ｃ）化合物（VIII−１）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨ
上記（ａ）で得られたＢｚｌＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，４００ｍｇ(0.58mmol)を塩化メチレン６．０ｍｌに溶解し、氷冷下ＤＣＣ，１１９ｍｇ(0.58mmol)を加え、20分間攪拌した。この溶液に上記（ｂ）で得られたＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕ，１１８ｍｇ(0.48mmol)の塩化メチレン溶液６．０ｍｌを加え、さらに氷冷下２時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５．０ｍｌを加え、氷冷下１時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５０ｍｌで精製した（展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１を各々１００ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．７］で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕを０．１９ｇ得た。この化合物０．１９ｇを塩化メチレン４．６ｍｌに溶解し、ＴＦＡ，４．６ｍｌを加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２０ｍｌで精製した（展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、１０：１、５：１を各々５０ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨを０．１４ｇ(0.16mmol)得た（収率２８％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．２
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、ＣＨ3（Ａｌａ））、０．８９（６Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））
参考例２  化合物（VIII−２）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ
（ａ）化合物（VI−２）：Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ
Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ，６５７ｍｇ(3.8mmol）をＴＨＦ，６５．７ｍｌに溶解し、Ｚ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ，１．２３ｇ(3.8mmol）を加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルム、燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を順次５０ｍｌずつ加えた後、クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下除去し、オイル状の残渣を得、これをシリカゲル２００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１を各々１００ｍｌ順に使用した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．８］で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、オイル状の目的物Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを１．４７ｇ得た。この化合物１．４７ｇにＴＨＦ，３０ｍｌおよびメタノール３０ｍｌを加えて溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２５０ｍｇを加え、水素雰囲気下、室温で８時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した後、残渣をシリカゲル２００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、１０：１、５：１を各々１００ｍｌ使用し、１０ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを０．６７ｇ(2.8mmol)得た（収率７４％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．２
質量分析（ＳＩＭＳ）：２４３（Ｍ＋Ｈ）
（ｂ）化合物（VIII−２）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ
参考例１（ａ）で得られたＢｚｌＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，４００ｍｇ(0.58mmol)を塩化メチレン６．０ｍｌに溶解し、氷冷下ＤＣＣ，１１９ｍｇ(0.58mmol)を加え、２０分間攪拌した。この溶液に上記（ａ）で得られたＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ，１１６ｍｇ(0.48mmol)の塩化メチレン溶液６．０ｍｌを加え、さらに氷冷下２時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５．０ｍｌを加え、氷冷下１時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む残渣０．２１ｇを得た。これを塩化メチレン５．１ｍｌに溶解し、ＴＦＡ，５．１ｍｌを加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、１０：１、５：１、３：１を各々５０ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨを１６４ｍｇ(0.19mmol)得た（収率３３％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝５：１、Ｒｆ値０．２
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．４０（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．８０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ａｌａ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，OCH2CH2）、３．５９（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、２．３６（１Ｈ，ｂｒ，CH(Pro)）、２．０２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、１．２９（３Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））
参考例３  化合物（VIII−３）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ
（ａ）化合物(VI−３）：Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ
Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ，１．０ｇ(5.8mmol）をＴＨＦ，１００ｍｌに溶解し、Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＮＳｕ，１．８ｇ(5.8mmol）を加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルム、燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を順次５０ｍｌずつ加えた後、クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下除去し、オイル状の残渣を得、これをシリカゲル２００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１を各々１５０ｍｌ使用し、１０ｍｌずつ分画した）。シリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．９］で目的物画分を確認しながら目的画分の溶液を減圧下除去し、オイル状の目的物Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを１．９３ｇ得た。この化合物１．９３ｇにＴＨＦ，２０ｍｌおよびメタノール４０ｍｌを加えて溶媒し、１０％パラジウム炭素触媒４４０ｍｇを加え、水素雰囲気下、室温で１５時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、目的物Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを１．１３ｇ(4.9mmol）得た（収率８６％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．２
質量分析（ＳＩＭＳ）：２１１（Ｍ＋Ｈ）
（ｂ）化合物（VIII−３）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ
参考例１（ａ）で得られたＢｚｌＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，４００ｍｇ(0.58mmol)を塩化メチレン６．０ｍｌに溶解し、氷冷下ＤＣＣ，１１９ｍｇを加え、２０分間攪拌した。この溶液に上記（ａ）で得られたＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ，１１０ｍｇ(0.48mmol)の塩化メチレン溶液６．０ｍｌを加え、さらに氷冷下２時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５．０ｍｌを加え、氷冷下１時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１を各々１００ｍｌ使用し、１０ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．７］で確認しながら目的画分の溶媒を減圧除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを０．２１ｇ得た。この化合物０．２１ｇを塩化メチレン５．１ｍｌに溶解し、ＴＦＡ，５．１ｍｌを加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、３：１を各々５０ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨを１６４ｍｇ(0.2mmol）得た（収率３３％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．２
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．４０（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．８２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５９（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、２．２１（１Ｈ，ｓ，CH(Pro)）、２．０２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））
参考例４  化合物（VIII−４）：ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ
（ａ）化合物（Ｖ−２）：ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−ＯＨ
ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，１０ｇ(16.7mmol)をＤＭＦ，５０ｍｌに溶解し、塩化ピコリル塩酸塩１．３７ｇ(8.4mmol）、次いでトリエチルアミン３．４ｍｌ(25.1mmol）を加え、９０〜１００℃で２時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、ポリエチレングリコールジカルボン酸（未反応物）、モノピコリルエステルおよびジピコリルエステルの混合物を得た。この反応混合物１．９７ｇをクロロホルム１００ｍｌに溶解し、水１００ｍｌを加え、１Ｎ水酸化ナトリウムで水層のｐＨを９．５に調整した。水層を抽出し、１ＮＨＣｌでｐＨ６．５に調整した後、クロロホルム１００ｍｌで６〜７回抽出した。この際、水層のｐＨが徐々に上昇するので１ＮＨＣｌでｐＨを６．５に保った。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下除去し、目的物ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−ＯＨを１．０ｇ(1.5mmol）得た（収率８．９％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝３：１、Ｒｆ値０．５
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：５．２１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−３，Ｈ−５（Ｐｉｃ））、８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２，Ｈ−６（Ｐｉｃ））
（ｂ）化合物（VIII−４）：ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ
上記（ａ）で得られたＰｉｃＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，５００ｍｇ(0.73mmol)を塩化メチレン８ｍｌに溶解し、氷冷下ＤＣＣ，１５１ｍｇ(0.73mmol)を加え、２０分間攪拌した。参考例３（ａ）で得られたＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ，１３９ｍｇ(0.61mmol)の塩化メチレン溶液８ｍｌを加え、氷冷下３時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５ｍｌを加え、氷冷下１時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、２０：１、１０：１を各々50ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．５］で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを３７４ｍｇ得た。この化合物３７４ｍｇを塩化メチレン９．０ｍｌに溶解し、ＴＦＡ，９．０ｍｌを加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲルカラム２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、１０：１、５：１を各々50ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨを１３１ｍｇ(0.16mmol)得た（収率２６％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝５：１、Ｒｆ値０．１
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：５．２１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．４０（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．８２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５９（２Ｈ，ｂｒ，CH2(Pro)）、２．２１（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０２（２Ｈ，ｂｒ，CH2(Pro)）、７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−３，Ｈ−５（Ｐｉｃ））、８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２，Ｈ−６（Ｐｉｃ））
参考例５  化合物（VIII−５）：ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨ
参考例４（ａ）で得られたＰｉｃＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，４５９ｍｇ(0.67mmol)を塩化メチレン７ｍｌに溶解し、氷冷下ＤＣＣ，１３８ｍｇ(0.80mmol)を加え、20分間攪拌した。参考例１（ｂ）で得られたＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕ，１３４ｍｇ(0.55mmol)の塩化メチレン溶液７ｍｌを加え、氷冷下３時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５ｍｌを加え、氷冷下１時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、２０：１を各々５０ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．４］で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕを３２８ｍｇ得た。この化合物３２８ｍｇを塩化メチレン８．０ｍｌに溶解し、ＴＦＡ，８．０ｍｌを加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、１０：１、５：１を各々５０ｍｌ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、目的物ＰｉｃＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨを１３１ｍｇ(0.15mmol)得た（収率２７％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝５：１、Ｒｆ値０．１
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：５．２１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−３，Ｈ−５（Ｐｉｃ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，CH(Val)）、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２，Ｈ−６（Ｐｉｃ））、０．８９（６Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））
参考例６  化合物（XI−１）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭ
参考例１で得られた化合物（VIII−１）１１．４ｍｇ(13.3μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．４ｍｇ(29.5μmol)およびＤＣＣ，６．２ｍｇ(30.1μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、アドリアマイシン塩酸塩０．２５ｍｇ(0.46μmol)をトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液３８３μｌ（８．５μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝１０：１、７：１、５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６、１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭを１７９μｇ(0.20μmol)得た（アドリアマイシンからの収率４４％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ部分  ４．１９（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．４８（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２２（１Ｈ，ｂｒｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２５（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，CH3(Ala)）、０．８９（６Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ3（Ｖａｌ））、アドリアマイシン部分  7.99（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．７３（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−３）、５．４３（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−１’）、５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１４ｂ）、５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．１４（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．３４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５’）、４．１０（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ3）、３．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、３．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ａ）、２．５０（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、２．０６（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ｂ）、１．８９（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ａ）、１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３２，２７４，４９５，５３４，５７５ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５８０，３４００，３０００，２９２４，２８７０，１７８６，１７１７，１６６０，１６０５，１５２０，１４５０，１２９５，１１０５ｃｍ-1
参考例７  化合物（XI−２）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ
参考例２で得られた化合物（VIII−２）９．５ｍｇ（11.1μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．４ｍｇ(29.5μmol)およびDCC，６．２ｍｇ(30.1μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、アドリアマイシン塩酸塩０．２５ｍｇ(0.46μmol)をトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液３８３μｌ（８．５μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝１０：１、７：１、５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを１８２μｇ(0.21μmol)得た（アドリアマイシンからの収率４６％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ部分  ４．５２（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．７５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，CH(Ala)）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５５（2H，br，CH2(Pro)）、２．３４（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０４（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、１．１５（３Ｈ，ｂｒ，ＣＨ3（Ａｌａ））、アドリアマイシン部分  ８．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．８０（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−３）、５．５４（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−１’）、５．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−１４ｂ）、５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−14a）、５．１９（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５’）、４．１３（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ3）、３．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、３．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ａ）、２．５９（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、２．１４（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ＝２’ｂ）、１．８２（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２’ａ）、１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３３，２５２，２９０，４７０，４９５，５３４，５７８ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５８０，３４００，３００５，２９３０，２８７０，１７８０，１７１８，１６５８，１５８０，１４５０，１２８２，１１１０ｃｍ-1
参考例８  化合物（XI−３）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ
参考例３で得られた化合物（VIII−３）１０．８ｍｇ(12.5μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．４ｍｇ(29.5μmol)およびＤＣＣ，６．２ｍｇ(30.1μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、アドリアマイシン塩酸塩０．１７５ｍｇ(0.3μmol)をトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液２５０μｌ（８．５μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭを２４０μｇ(0.19μmol)得た（アドリアマイシンからの収率６２％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ部分  ４．２２（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１７（４Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2）、４．０８（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５２（２Ｈ，ｂｒ，CH2(Pro)）、２．２２（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、１．９５（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、アドリアマイシン部分  ８．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．７７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−１４ｂ）、５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．１９（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．３１（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５’）、４．１０（３Ｈ，ｓ，４−OCH3）、３．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ａ）、２．４８（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、２．０４（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ｂ）、１．８３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２’ａ）、１．１４（３Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３３，２５０，２９０，４７０，４９５，５３０，５７６ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５９０，３４００，３０００，２９４０，２８６０，１７２０，１６５０，１４５０，１１１５ｃｍ-1
参考例９  化合物（XI−４）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲ
参考例１で得られた化合物（VIII−１）１１．４ｍｇ(13.3μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．６ｍｇ(31.3μmol)およびＤＣＣ，６．４ｍｇ(31.0μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、ダウノルビシン塩酸塩０．９０ｍｇ(1.7μmol)をトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液５００μｌ（０．４８μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間、次いで室温で１時間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝１０：１、７：１、５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各10ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＤＮＲを３８μｇ(0.03μmol)得た（ダウノルビシンからの収率１．８％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ部分  ４．１９（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．４９（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２０（１Ｈ，ｂｒｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２９（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２９（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，CH3(Ala)）、０．９５（６Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ3（Ｖａｌ））、ダウノルビシン部分  7.82（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．７２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．２７（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．３１（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５’）、４．１９（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ3）、３．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、３．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ａ）、２．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４）、２．３４（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、１．９１（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ｂ）、１．８３（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ａ）、１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３２，２７４，４９５，５３４，５７５ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５８０，３４００，３０００，２９２４，２８７０，１７８６，１７１７，１６６０，１６０５，１５２０，１４５０，１２９５，１１０５ｃｍ-1
参考例１０  化合物(XI−５）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ
参考例２で得られた化合物（VIII−２）９．７ｍｇ(11.3μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．１ｍｇ(26.9μmol)およびDCC，５．５ｍｇ(26.7μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、ダウノルビシン塩酸塩０．９ｍｇをトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液５００μｌ（０．４８μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液の中の１６５μｌ(0.5μmol)を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間、次いで室温で１時間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝１０：１、７：１、５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧｊ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを１５０μｇ(0.1μmol)得た（ダウノルビシンからの収率２０％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ部分  ４．５２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．７５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，CH(Ala)）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．４２（2H，br，CH2(Pro)）、２．３７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０８（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、１．２９（３Ｈ，ｂｒ，ＣＨ3（Ａｌａ））、ダウノルビシン部分  ８．０３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．７２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．５２（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．３６（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−１’）、５．２９（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．３４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５’）、４．０９（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ3）、３．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、３．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−10a）、２．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４）、２．４２（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、２．０６（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ｂ）、１．８７（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ａ）、１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３２，２５１，２９０，４６９，４９５，５３２，５８０ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３６９０，３５８０，３４００，３０１５，２９３６，２８７８，１７８２，１７１４，１６５０，１６００，１５２５，１４５７，１４３２，１３５０，１２８５，１２４０，１１０８cm-1
参考例１１  化合物（XI−６）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲ
参考例３で得られた化合物（VIII−３）１１．０ｍｇ(12.8μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．５ｍｇ(30.4μmol)およびＤＣＣ，６．３ｍｇ(30.5μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に、ダウノルビシン塩酸塩０．９ｍｇをトリエチルアミンの乾燥ＤＭＦ溶液５００μｌ（０．４８μｇ／ｍｌ）に溶解した溶液中の１５６μｌ(0.5μmol)を氷冷下加えた。反応液を氷冷下３０分間、次いで室温で１時間静置した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝１０：１、７：１、５：１、３：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）として副生成物ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを溶出除去した後、クロロホルム：メタノール：水＝13：６：１，２０ｍｌで目的のＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＮＲを１８０μｇ(0.1μmol)得た（ダウノルビシンからの収率２６％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ部分  ４．５１（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１７（４Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2Ｏ）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５６（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．５０（２Ｈ，ｍ，CH2(Pro)）、２．２１（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０２（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、ダウノルビシン部分  ８．０４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−２）、７．７９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１’）、５．２７（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７）、４．５２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ＝５’）、４．１２（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ3）、３．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ｂ）、２．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，Ｈ−１０ａ）、２．９０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４）、２．３５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ｂ）、２．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｈ−８ａ）、２．０２（１Ｈ，ｂｒｍ，Ｈ−２’ｂ）、１．１８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，５’−ＣＨ3）
紫外可視吸収スペクトル（メタノール中、λmax）：２３５，２５２，２８９，４７０，４９５，５３４，５７８ｎｍ
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５８０，３０００，２９３０，２８８０，１７９０，１７１９，１６５８，１６１０，１４５０，１４０４，１３５０，１２９０，１１１０ｃｍ-1
参考例１２  化合物（XI−７）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０）
参考例１で得られた化合物（VIII−１）１１．５ｍｇ(13.4μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．６ｍｇ(31.3μmol)およびＤＣＣ，６．４ｍｇ(31.0μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間３０分激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝２０：１、１０：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてベンジルエステル体ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＮＳｕを溶出除去した後、参考例１７で得られる化合物（２０）０．０５ｍｇ(0.10μmol)を乾燥ＤＭＦ，２００μｌに溶解した溶液をカラムにチャージした。さらに乾燥ＤＭＦ，１５０μｌをカラム上に加えた後、室温で３０分間反応させた。クロロホルム：メタノール＝１０：１、５：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール：水＝13：６：１，１０ｍｌで目的物ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０）を溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０）を１１２μｇ(0.09μmol)得た（化合物（２０）からの収率８８％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ部分  ４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、０．８９（６Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））、化合物（２０）部分  １０．５７（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．０Ｈｚ）、６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ，ｍ）、４．２７（２Ｈ，ｍ）、４．１６（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）、３．９０（３Ｈ，ｓ）、３．８２（３Ｈ，ｓ）、３．６７（１Ｈ，ｍ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、２．６３（３Ｈ，ｓ）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ）、１．５２（２Ｈ，ｍ）、１．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３６９０，３５９２，３４００，３０００，２９００，１７１２，１６５０，１６００，１４５０，１３００，１１１０ｃｍ-1
参考例１３  化合物（XI−８）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０）
参考例２で得られた化合物（VIII−２）９．８ｍｇ(11.4μmol)を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．２ｍｇ(27.8μmol)およびＤＣＣ，５．６ｍｇ(27.1μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で３時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝２０：１、１０：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてベンジルエステル体ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＮＳｕを溶出除去した後、参考例１７で得られる化合物（２０）０．０５ｍｇ(0.10μmol)を乾燥ＤＭＦ，２００μｌに溶解した溶液をカラムにチャージした。さらに乾燥ＤＭＦ，１００μｌをカラム上に加えた後、室温で３０分間反応させた。クロロホルム：メタノール＝１０：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，１０ｍｌで目的物ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０）を溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０）を２３３μｇ(0.10μmol)得た（化合物（２０）からの収率１００％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ部分  ４．５２（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．４２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、３．２３（１Ｈ，ｓ，CH(Ala)）、２．３７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０８（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、化合物（２０）部分  １０．２３（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．０Ｈｚ）、６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ，ｍ）、４．２９（２Ｈ，ｍ）、４．２０（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）、３．８９（３Ｈ，ｓ）、３．８２（３Ｈ，ｓ）、３．６７（１Ｈ，ｍ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、２．６３（３Ｈ，ｓ）、２．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ）、１．５２（２Ｈ，ｍ）、１．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３６９０，３５９２，３４００，３０００，２９００，１７１２，１６５０，１６００，１４５０，１３００，１１１０ｃｍ-1
参考例１４  化合物（XI−９）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０）
参考例３で得られた化合物（VIII−３）１１．２ｍｇ(13.0μml）を塩化メチレン０．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．６ｍｇ(31.3μmol)およびＤＣＣ，６．４ｍｇ(31.0μmol)を加え、０℃で２時間攪拌した。不溶物(DCU)を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を窒素気流中メタノール３００μｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２〜３ｍｇを加え、水素気流中、室温で３時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル３．０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００）。クロロホルム：メタノール＝２０：１、１０：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてベンジルエステル体ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＮＳｕを溶出除去した後、参考例１７で得られる化合物（２０）０．０５ｍｇ(0.10μmol)を乾燥ＤＭＦ，２００μｌに溶解した溶液をカラムにチャージした。さらに乾燥ＤＭＦ，１５０μｌをカラム上に加えた後、室温で３０分間反応させた。クロロホルム：メタノール＝１０：１、２：１を展開溶媒（各１０ｍｌ）としてカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１，１０ｍｌで目的物ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０）を溶出した。この画分の溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０）を１３５μｇ(0.10μmol)得た（化合物（２０）からの収率１００％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール：水＝１３：６：１、Ｒｆ値０．６
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ部分  ４．２２（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１７（４Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2）、４．０８（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５２（２Ｈ，ｂｒ，CH2(Pro)）、２．２２（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、１．９５（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、化合物（２０）部分  ９．９７（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、７．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．０Ｈｚ）、６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ，ｍ）、４．２７（２Ｈ，ｍ）、４．１６（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）、３．９０（３Ｈ，ｓ）、３．８２（３Ｈ，ｓ）、３．７０（１Ｈ，ｍ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、２．６３（３Ｈ，ｓ）、２．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ）、１．６２（２Ｈ，ｍ）、１．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３６９０，３５９２，３４００，３０００，２９００，１７１２，１６５０，１６００，１４５０，１３００，１１１０ｃｍ-1
参考例１５  化合物（１２）
化合物（１２）は、次の反応工程に従い合成した。
0003871713.tif 000024
0003871713.tif 000025
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（化合物（１））３．０ｇ(16mmol)をＤＭＦ，３０ｍｌに溶解し、無水炭酸カリウム３．４ｇを加え、さらに臭化ベンジル３．０ｍｌ(25mmol)を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。０．１ＮＨＣｌ，３００ｍｌを加え、酢酸エチル２００ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、シリカゲル３００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はヘキサン：酢酸エチル＝３：１を使用した）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（２）を４．７ｇ(17mmol)得た（収率１００％）。
アジド酢酸メチル１１．８ｇ(103mmol)をアルゴン気流中メタノール７０ｍｌに溶解し、−５０℃で２８％ナトリウムメトキサイド２０．９ｍｌ(103mmol)を１時間１５分かけて滴下し、３０分間攪拌した。化合物（２）４．７ｇのメタノール：トルエン＝１：１混合溶液４０ｍｌを２５分間かけて加え、−５０℃から−１０℃程度まで自然昇温させて一昼夜攪拌した。水およびジエチルエーテルを適量加え、エーテル層を抽出した。エーテル層を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、化合物（３）を２．８ｇ(7.6mmol）得た（収率４５％）。
化合物（３）２．８ｇをキシレン７５０ｍｌに溶解し、１４０〜１５０℃で２時間加熱した。室温に冷却後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル１５０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はヘキサン：酢酸エチル＝４：１を使用した）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（４）を２．４ｇ(7.0mmol）得た（収率９３％）。
化合物（４）２．４ｇをテトラヒドロフラン：メタノール＝１：１の混合溶媒１１６ｍｌに溶解し、二酸化白金４７１ｍｇを加え、水素気流中一昼夜激しく攪拌した。二酸化白金２００ｍｇを追加し、水素気流中さらに７時間攪拌した。セライトで触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル１２０ｍｌカラムで精製した（展開液；ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（５）を１．６ｇ(6.4mmol）得た（収率９１％）。
化合物（５）１００ｍｇ(0.4mmol）をＤＭＦ，５ｍｌに溶解し、無水炭酸カリウム２７５ｍｇ(2mmol）を加え、さらに１，２−ジブロモエタン１７３μｌ(2mmol）を滴下し、窒素気流中室温で１９時間攪拌した。反応液に燐酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１を使用した）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（６）を９４ｍｇ(0.26mmol)得た（収率６５％）。
化合物（６）９４ｍｇ(0.26mmol)をＤＭＦ，９．５ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム８５ｍｇ(1.3mmol）を加え、室温で２５時間攪拌した。反応液に酢酸エチルおよび燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を適量加え、酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、化合物（７）を７９ｍｇ得た（収率９５％）。
化合物（７）７９ｍｇをＴＨＦ，８ｍｌおよび水１０ｍｌの混合溶媒に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２．５ｍｌを加え、室温で３．５時間攪拌した。反応液に１ＮＨＣｌを加えて酸性にした後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、化合物（８）を７５ｍｇ得た（収率９８％）。
化合物（８）７５ｍｇを氷冷下塩化メチレン７ｍｌに溶解し、ＤＣＣ，１０３ｍｇ(0.5mmol）を加え、氷冷下１時間攪拌した。パラニトロフェノール７０ｍｇ(0.5mmol）およびジメチルアミノピリジン６１ｍｇ(0.5mmol）を加え、０℃〜室温で１時間２０分攪拌した。不溶物を濾別し、０．５ＮＨＣｌを加え、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去した。残渣をエタノールから再結晶し、化合物（９）を７２ｍｇ得た（収率６９％）。
アルゴン気流中、５０％水酸化ナトリウム３７ｍｇ(0.9mmol）をＤＭＦ，１．５ｍｌに溶解し、−２０℃で特開平５−１７８８５８号に記載の方法に従って得られる化合物（１０）１８５ｍｇ(0.7mmol）をＤＭＦ，２．９ｍｌに溶解した溶液を加え、３時間攪拌した。化合物（９）３６８ｍｇ(0.9mmol）をＤＭＦ，６ｍｌに溶解した溶液を加え、−２０℃から室温まで自然昇温させて一昼夜攪拌した。反応液に酢酸エチルおよび燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を適量加え、酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチル層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル８０ｍｌで精製した（展開液；クロロホルム：メタノール＝１００：１）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（１１）を２７８ｍｇ(0.5mmol）得た（収率７１％）。
なお、化合物（２）〜化合物（９）および化合物（１１）の構造は、1Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析で確認した。
窒素気流中、化合物（１１）２０ｍｇ(36.6μmol)を酢酸０．２ｍｌおよびテトラヒドロフラン９．８ｍｌの混合溶媒１．１ｍｌに溶解し、１０〜１５℃で１０％パラジウム炭素触媒７．３ｍｇ加え、水素気流中、１０〜１５℃で３時間２０分激しく攪拌した。−２０℃以下に冷却して触媒を濾別した後、冷却状態のまま溶媒を減圧下除去し、化合物（１２）を９ｍｇ(17.3μmol)得た（収率４７％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：１１．５８（１Ｈ，ｂｒｓ，１−ＮＨ）、９．４０（１Ｈ，ｂｒｓ，１’−ＮＨ）、７．１２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−３’）、６．８１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４’）、４．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、４．０８（３Ｈ，ｓ，７’−ＯＣＨ3）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，OCH2）、３．９０（３Ｈ，ｓ，５’−ＯＣＨ3）、３．８２（３Ｈ，ｓ，３−COOCH3）、３．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４ａ）、３．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，CH2）、２．６３（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ3）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ，Ｈ−４）、１．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，Ｈ−４）
質量分析（ＳＩＭＳ）：５２１（Ｍ＋Ｈ）
参考例１６  化合物（Ｘ−１）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２）
参考例１で得られる化合物（VIII−１）１３ｍｇ(15.2μmol)を塩化メチレン２．４ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，２．０ｍｇおよびＤＣＣ，４．３ｍｇを順に加え、２時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をピリジン２ｍｌに溶解し、氷冷下実施例２４で得られた化合物（１２）７．８ｍｇ(15.0μmol)をピリジン１．５ｍｌに溶解した溶液を加えた。氷冷下１時間、次いで室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル５ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：１、８０：１、６０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１を各々５ｍｌ使用し、０．５ｍｌずつ分画した）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２）を２．８ｍｇ(0.2μmol)得た（収率１．４％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．５
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ部分  ７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、０．８９（６Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））、化合物（１２）部分  １１．５８（１Ｈ，ｂｒｓ，１−ＮＨ）、９．４０（１Ｈ，ｂｒｓ，１，−ＮＨ）、７．１２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−３’）、６．８１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４’）、４．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、４．０８（３Ｈ，ｓ，７’−ＯＣＨ3）、３．９０（３Ｈ，ｓ，５’−ＯＣＨ3）、３．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，ＯＣＨ2）、３．８２（３Ｈ，ｓ，３−ＣＯＯＣＨ3）、３．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４ａ）、３．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ2）、２．６３（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ3）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ，Ｈ−４）、１．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，Ｈ−４）
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５９５，３４５０，３０１０，２９００，１７５０，１６６５，１６０８，１５１５，１４６０，１３１０，１１１０ｃｍ-1
参考例１７  化合物（２０）
化合物（２０）は、次の反応工程に従い合成した。
0003871713.tif 000026
３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ桂皮酸（化合物（１３））１．５１ｇ(7.78mmol)をメタノール３０ｍｌとベンゼン１０５ｍｌの混合溶媒に溶解し、トリメチルシリルジアゾメタンの１０％ヘキサン溶液１１ｍｌ(9.6mmol）を加え、室温で３時間撹拌した。トリメチルシリルジアゾメタンの１０％ヘキサン溶液をさらに２．０ｍｌ加え、１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ桂皮酸のメチルエステル（化合物（１４））を１．５５ｇ得た（収率９５．６％）。
化合物（１４）１．５５ｇ(7.44mmol)をＤＭＦ，６０ｍｌに溶解し、炭酸カリウム５．１４ｇ(37.2mmol)および１，３−ジブロモプロパン３．７８ｍｌ(37.2mmol）を加え、室温で１４時間撹拌した。水および酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開液：ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、３’−（３−ブロモプロピルオキシ）−４’−メトキシ桂皮酸のメチルエステル（化合物（１５））を１．９０ｇ得た（収率７７．６％）。
化合物（１５）１．９０ｇ(5.77mmol)をＤＭＦ，１２０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム１．８８ｇ(28.9mmol)を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、３’−（３−アジドプロピルオキシ）−４’−メトキシ桂皮酸のメチルエステル（化合物（１６））の粗成物を１．８１ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ）、７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）、７．０８（１Ｈ，ｓ）、６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）、６．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ）、４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、３．８９（３Ｈ，ｓ）、３．７９（３Ｈ，ｓ）、３．５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．１０（２Ｈ，ｍ）
化合物（１６）の粗成物１．８１ｇをＴＨＦ，６０ｍｌおよび水，２ｍｌの混合溶媒に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１１．５ｍｌを加え、室温で１９時間撹拌した。反応液に２ＮＨＣｌを加え、ｐＨ４にあわせた。水および酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、３’−（３−アジドプロピルオキシ）−４’−メトキシ桂皮酸（化合物（１７））の粗成物を１．６４ｇ得た。
化合物（１７）(5.77mmol)を塩化メチレン，１５０ｍｌに溶解し、４−ニトロフェノール１．３６ｇ(9.8mmol)、トリエチルアミン２．７３ｍｌ(19.6mmol)およびヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム２．５１ｇ(9.8mmol）を加え、室温で５時間撹拌した。４−ニトロフェノール７２２ｍ(5.2mmol)、トリエチルアミン１．４５ｍｌ(10.4mmol)およびヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム１．３３ｇ(5.2mmol）をさらに加え、１７時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開液；ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜２：１）で精製し、３’−（３−アジドプロピルオキシ）−４’−メトキシ桂皮酸の４−ニトロフェニルエステル（化合物（１８））を２．１５ｇ得た。これをさらにエタノールから再結晶して、化合物（１８）２．０１ｇを得た（収率８７％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ）、７．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．１６（１Ｈ，ｓ）、６．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ）、４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、３．９２（３Ｈ，ｓ）、３．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、２．１２（２Ｈ，ｍ）６０％水素化ナトリウム１２ｍｇ(0.3mmol）にＤＭＦ，０．６ｍｌを加え、さらに化合物（１０）６０ｍｇ(0.23mmol)のＤＭＦ溶液１．５ｍｌを加え、アルゴン雰囲気下、０℃で２時間攪拌した。反応液を−２０℃に冷却後、化合物（18）１２４ｍｇ(0.31mmol)のＤＭＦ溶液１．５ｍｌを加え、−２０〜０℃で２時間攪拌した。反応混合物に０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去した。残渣をシリカゲル３０ｍｌで精製し（展開液；クロロホルム：メタノール＝５０：１）、化合物（１９）を７７ｍｇ得た（収率６５％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：９．８１（１Ｈ，ｂｒ）、７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．０Ｈｚ）、７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、６．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、６．５６（１Ｈ，ｂｒ）、４．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）、４．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．０６（１Ｈ，ｍ）、３．８４（３Ｈ，ｓ）、３．７６（３Ｈ，ｓ）、３．５０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．４６（１Ｈ，ｍ）、２．５２（３Ｈ，ｓ）、２．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，３．３Ｈｚ）、２．０５（２Ｈ，ｍ）、１．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，３．４Ｈｚ）
赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）：２０９８，１６９７，１６２２，１６０８，１５１６，１３９２，１２６３，１２１７ｃｍ-1
質量分析（ＳＩＭＳ）：５１８（Ｍ＋Ｈ）
化合物（１９）１５ｍｇ(0.029mmol）をＴＨＦ，１．５ｍｌに溶解し、トリフェニルホスフィン２３ｍｇ(0.088mmol）を加え、室温で０．５時間攪拌した。反応液に水１．５ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去した。残渣をシリカゲル３０ｍｌで精製し（展開液；クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝２００：１０：１）、化合物（２０）を４ｍｇ得た（収率２８％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6中）δ（ｐｐｍ）：７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ）、７．５４（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．４９（１Ｈ，ｂｒ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ）、７．０３（１Ｈ，ｂｒ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）、４．３９（１Ｈ，ｍ）、４．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）、３．９６（３Ｈ，ｓ）、３．８７（３Ｈ，ｓ）、３．６１（１Ｈ，ｍ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．６１（３Ｈ，ｓ）、２．２３（１Ｈ，ｍ）、２．１６（２Ｈ，ｍ）、１．４６（１Ｈ，ｍ）
赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）：１６４７，１６１０，１５１２，１４５８，１３９４，１３８５，１２９４，１２１９ｃｍ-1
質量分析（ＳＩＭＳ）：４９２（Ｍ＋Ｈ）
参考例１８  化合物（Ｘ−２）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（１２）
参考例２で得られる化合物（VIII−２）２１ｍｇ(24.5μmol)を塩化メチレン３．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，３．４ｍｇおよびＤＣＣ，６．３ｍｇを順に加え、２時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣をピリジン３．４ｍｌに溶解し、氷冷下参考例１５で得られた化合物（12）９．９ｍｇ(19μmol)をピリジン２．０ｍｌに溶解した溶液を加えた。氷冷下１時間、次いで室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル１０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：１、８０：１、６０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１を各々１０ｍｌ使用し、１．０ｍｌずつ分画した）。目的画分の溶媒を減圧下除去し、ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（１２）を１０．０ｍｇ(7.3μmol)得た（収率３９％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．５
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ部分  ７．３６（５Ｈ，ｍ，Ｃ6Ｈ5）、５．１９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）、４．５０（２Ｈ，ｂｒｍ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．４２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、３．２３（１Ｈ，ｓ，CH(Ala)）、２．３７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０８（２Ｈ，brm，CH2(Pro)）、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、化合物（１２）部分  １１．５８（１Ｈ，ｂｒｓ，１−ＮＨ）、９．４０（１Ｈ，ｂｒｓ，１’−ＮＨ）、７．１２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、Ｈ−３’）、６．８１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４’）、４．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、４．０８（３Ｈ，ｓ，７’−ＯＣＨ3）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，ＯＣＨ2）、３．９０（３Ｈ，ｓ，５’−ＯＣＨ3）、３．８２（３Ｈ，ｓ，３−ＣＯＯＣＨ3）、３．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４ａ）、３．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ2）、２．６３（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ3）、２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，３．４Ｈｚ，Ｈ−４）、１．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ、Ｈ−４）
赤外吸収スペクトル（クロロホルム中）：３５９５，３４５０，３０１０，２９００，１７５０，１６６５，１６０８，１５１５，１４６０，１３１０，１１１０ｃｍ-1
参考例１９  化合物（２５）：
化合物（２５）は、次の反応工程に従い合成した。
0003871713.tif 000027
２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩３．１ｇ(15mmol)を塩化メチレン７５ｍｌに溶解し、−４０〜−５０℃に冷却した後、ベンジルオキシカルボニルクロライド２．６ｍｌ(18mmol)を滴下した。一昼夜にわたり室温まで自然昇温させた後、溶媒を減圧下除去し、酢酸エチル５０ｍｌおよび１ＮＨＣｌ，５０ｍｌを加え、室温で６時間攪拌した。酢酸エチル層を飽和塩化ナトリウム水溶液５０ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、化合物（２１）を２．０ｇ得た（収率５３％）。
化合物（５）４９５ｍｇ(2.0mmol）をＤＭＦ，１０ｍｌに溶解し、無水炭酸カリウム５４５ｍｇおよび化合物（２１）１０２０ｍｇ(4.0mmol）を順に加え、氷冷下一昼夜攪拌した。燐酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ、ｐＨ７．０）１００ｍｌ、次いで酢酸エチル１００ｍｌを加え、酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチル層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下除去し、残渣をシリカゲル１００ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はヘキサン：酢酸エチル＝５：１、４：１、３：１を各々２００ｍｌずつ使用し、１０ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、Ｒｆ値０．２）で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（２２）を７１３ｍｇ(1.7mmol）得た（収率８３％）。
化合物（２２）６６ｍｇ(0.15mmol)にＴＨＦ，１．５ｍｌおよびメタノール１．５ｍｌを加え、さらに１０％パラジウム炭素触媒６．６ｍｇを加え、水素気流中１８時間激しく攪拌した。触媒を６．６ｍｇ追加し、さらに５時間攪拌した。触媒を濾過し、濾液から溶媒を減圧下除去し、化合物（２３）（セグメントＢ）を３６ｍｇ(0.12mmol)得た（収率８２％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０、クロロホルム：メタノール＝５：１、Ｒｆ値０．３
参考例１で得られた化合物（VIII−１）１０９ｍｇ(0.13mmol)を塩化メチレン１．５ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕ，２１ｍｇおよびＤＣＣ，３８ｍｇを順に加え、氷冷下３時間攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去した。残渣に塩化メチレン１ｍｌを加え、さらに化合物（２３）３４ｍｇ(0.12mmol)の塩化メチレン溶液１ｍｌを氷冷下加えた後、室温まで自然昇温させて一昼夜攪拌した。不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、残渣１９２ｍｇを得、これをシリカゲル２０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、５０：１、３０：１、２０：１を各々２０ｍｌずつ使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（キーゼルゲル６０（メルク（株）社製、クロロホルム：メタノール＝１０：１、Ｒｆ値０．４）で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（２４）を８９ｍｇ(0.08mmol)得た（収率６８％）。なお、化合物（２１）〜化合物（２３）の構造は1HNMRおよび質量分析で、化合物（２４）の構造は1ＨＮＭＲで確認した。
化合物（２４）８９ｍｇ(79μmol)にＴＨＦ，２ｍｌおよびメタノール２ｍｌを加えて溶解し、１０％パラジウム炭素触媒１８ｍｇを加え、水素気流中１５時間激しく攪拌した。触媒９ｍｇを加え９時間、さらに触媒９ｍｇを追加し１５時間、水素気流中で攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、シリカゲル１０ｍｌで精製した（ワコーゲルＣ−２００を用い、展開液はクロロホルム：メタノール＝１００：０、５０：１、３０：１を各々使用し、５ｍｌずつ分画した）。目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、化合物（２５）を５２ｍｇ得た（収率６３％）。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル６０（メルク（株）社製）、クロロホルム：メタノール＝５：１、Ｒｆ値０．４
1ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ部分  ４．１３（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２２（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、０．８９（６Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））、セグメントＢ部分  ９．４０（１Ｈ，ｂｒｓ，１−ＮＨ）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−３）、６．８２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４）、４．０８（３Ｈ，ｓ，７−ＯＣＨ3）、３．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，ＯＣＨ2）、３．９０（３Ｈ，ｓ，５−ＯＣＨ3）、３．８５（３Ｈ，ｓ，２−ＣＯＯＣＨ3）、３．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ2）
参考例２０  ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−セグメントＢ）m
参考例１９で得られた化合物（２５）７．８ｍｇ(7.5μmol)を塩化メチレン０．８ｍｌに溶解し、氷冷下ＨＯＮＳｕの塩化メチレン溶液１．０ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＣＣの塩化メチレン溶液０．９ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）を順に加え、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、残渣にＤＭＳＯ，１ｍｌを加えた。これを、ＫＭ−６４１抗体水溶液（１．４７ｍｇ／ｍｌ）８ｍｌに燐酸緩衝液１１．５ｍｌを加えた溶液に氷冷下加え、４℃で一昼夜静かに攪拌した。０．２２μｍのフィルターで不溶物を除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーで抗体の画分を精製した［カラム：セファクリルＳ２００（ファルマシア（株）社製）２００ｍｌ、展開液：燐酸緩衝液、流速：０．５ｍｌ／分、１１．５ｍｌずつ分画］。第８および第９画分を回収し、ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−セグメントＢ）m（０．３４ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液を得た。
抗体１分子当りのセグメントＢの結合数は、参考例２２に記載の方法に従って酵素処理（サーモリシン）し、遊離したＨ−Ｖａｌ−セグメントＢをＨＰＬＣで定量することにより算出した。これにより、本複合体において、抗体１分子当り１．９個のセグメントＢが結合していることを確認した。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを以下に記載の酵素免疫測定法により確認した。
＜酵素免疫測定法［ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）］による抗体の結合力価の測定＞
カングリオシドＧＤ3（２ｎｍｏｌ）をフォスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ社製）５ｎｇ／コレステロール２．５ｎｇを含有するエタノール２ｍｌに溶解し、２０μｌずつ９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（Ｌｉｎｂｒｏ社）に分注し、乾燥させてコートし、１％牛血清アルブミンを含有する燐酸緩衝液でブロッキングした。これに、上記複合体（１０μｇ／ｍｌ，５０μｌ）を加え、室温で２時間（もしくは４℃で一昼夜）反応させた後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ダコ社）を加え、室温で１〜２時間反応させた。洗浄後、ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ社）溶液を加え、発色後、ＮＪ−２００１（日本インターメッド社）で４１４ｎｍの吸光度を比色測定した。
参考例２１  スペーサー部位の酵素特異的切断
スペーサー−セグメントＢ（モデル側鎖）結合体を用いた実験
本参考例は、スペーサー−抗癌剤結合体のスペーサー部のペプチド結合が細胞内で特異酵素によって切断されること、および血清中でスペーサー部の切断が起こらないことを、参考例１９で得られた化合物（２５）を用いて説明するものである。本参考例では、切断酵素としてサーモリシンを用いたセグメントＢの遊離を以下のように確認した。
燐酸緩衝液で調製した化合物（２５）（０．２ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌに酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ（酵素量９４ｐＵ）を加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析することにより、化合物（２５）から遊離するＨ−Ｖａｌ−セグメントＢ量を確認した（切断効率１００％）。
逆相ＨＰＬＣ分析条件；装置：ＵＶＩＤＥＣ−１００ＩＶ分光検出器、TRIROTAR ＳＲ（日本分光（株）社製）、カラム：ＵＮＩＳＩＬ  ＰＡＣＫ  ５Ｃ１８−１５０Ａ（ジーエルサイエンス社）、溶離液：５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（１０〜７０％のアセトニトリルグラジエント（３５分））、流速：０．７ｍｌ／分、検出波長：３００ｎｍ
溶出時間：３９．０分
質量分析（ＳＩＭＳ）：３９３．２（Ｍ＋Ｈ）
アミノ酸分析：Ｖａｌ１．０（１．０）
一方、本参考例のスペーサー部分が血清中では切断されないことは、以下にようにして確認した。
燐酸緩衝液で調製した化合物（２５）（０．２ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌにヒト血清０．１ｍｌを加え、３７℃で２日間放置した。上清を逆相ＨＰＬＣで上記実験と同様の分析条件（ただし、溶離液は５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５．９））で分析したところ、セグメントＢ由来のピークは確認されなかった。
参考例２２  スペーサー部位の酵素特異的切断
抗体−スペーサー−セグメントＢ（モデル側鎖）結合体を用いた実験
本参考例は、抗体−スペーサー−抗癌剤結合体のペプチド結合が細胞内で特異酵素によって切断されるが血清中では安定に存在することを、参考例２０で得られた抗体−スペーサー−セグメントＢ結合体を用いて説明するものである。本参考例では、細胞内切断酵素としてサーモリシン、血中主要蛋白分解酵素としてプラスミンを用い、以下のようにしてスペーサーの特異的切断を確認した。
ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−セグメントＢ）m（０．３３ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌにサーモリシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌ（酵素量２．４ｐＵ）（または１／２００に希釈したプラスミン２．５μｌ（酵素量２５０μＵ））および燐酸緩衝液５．７μｌを加え、３７℃で一昼夜放置し、逆相ＨＰＬＣで上清を分析した。ＨＰＬＣの分析条件は参考例２１と同様にして行った。
サーモリシンで処理した結合体では、溶出時間４２．０分に参考例２１と同様のＨ−Ｖａｌ−セグメントＢのピークを確認したが、プラスミンで処理した結合体ではピークは確認されなかった。プラスミンは血中の主要な蛋白質分解酵素であることから、これらの結果は、結合体が血中では安定に存在するが細胞内に取り込まれた際に特定酵素によって特異的に抗癌剤部分が切断され抗癌活性を発現することを示すものである。
参考例２３  スペーサー部位の酵素特異的切断
スペーサー−化合物（１２）結合体を用いた実験
（１）化合物（Ｘ−１）［ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（12）］のサーモリシンによる切断
参考例１６で得られた化合物（Ｘ−１）２０μｇ(15nmol)をＤＭＳＯ，１０μｌに溶解し、燐酸緩衝液９０μｌを加え、さらにサーモリシン溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ（酵素量１．９μＵ）を加え、３７℃で５時間放置した。逆相ＨＰＬＣで上清の分析を行い、化合物（Ｘ−１）（溶出時間：３５．１分）からのＨ−Ｖａｌ−化合物（１２）の遊離を確認した（切断効率７８％）。
逆相ＨＰＬＣ分析条件；装置は参考例２１と同様。溶離液：０．２Ｍ燐酸水素二ナトリウム水溶液および０．１Ｍクエン酸水溶液で調製したｐＨ４．８の緩衝液を２５％含有する溶液（１０〜７０％アセトニトリルグラジエント（３５分））、流速：０．７ｍｌ／分、検出波長：３３０ｎｍ
溶出時間：３１．６分
質量分析（ＳＩＭＳ）：６２０（Ｍ＋Ｈ）
アミノ酸分析：Ｖａｌ１．０（１．０）
（２）化合物（Ｘ−２）［ＢｚｌＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（12）］のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
参考例１８で得られた化合物（Ｘ−２）５４μｇ(40nmol)にＤＭＳＯ，２０μｌおよび燐酸緩衝液３７０μｌを加え、さらにプロリンエンドペプチダーゼ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを加え、３７℃で２．５時間放置した。逆相ＨＰＬＣで分析し、化合物（Ｘ−２）からの化合物（１２）の遊離を確認した（切断効率１００％）。
逆相ＨＰＬＣ分析条件；装置は参考例２１と同様。溶離液：５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５．９）（１０〜７０％アセトニトリルグラジエント）、流速：０．７ｍｌ／分、検出波長：３３０ｎｍ
溶出時間：３０．６分（化合物（１２）と一致）
質量分析（ＳＩＭＳ）：５２１（Ｍ＋Ｈ）
参考例２４  スペーサー部位の酵素特異的切断
抗体−スペーサー−化合物（１２）結合体を用いた実験
実施例１１で得られた化合物（Ｉａ−１１）［ＫＭ−６４１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（１２））m］（０．０７ｍｇ／ｍｌ）７４０μｌにサーモリシン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）５．１μｌ（酵素量２６μＵ）を加え、３７℃で８時間放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−１１）からのＨ−Ｖａｌ−化合物（１２）の遊離を確認した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は参考例２３（１）と同様にして行った。
溶出時間：３１．６分
質量分析（ＳＩＭＳ）：６２０（Ｍ＋Ｈ）
参考例２５  スペーサー部位の酵素特異的切断
スペーサー−アドリアマイシン結合体を用いた実験
（１）化合物（XI−３）（ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
参考例８で得られた化合物（XI−３）１４．３μｇ(11nmol)をＤＭＳＯ，２０μｌに溶解し、燐酸緩衝液２１０μｌを加え、さらにプロリンエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ（酵素量２．８Ｕ）を加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（XI−３）（溶出時間：２３．３分）からのＡＤＭの遊離を確認した（切断効率５０％）。
逆相ＨＰＬＣ分析条件；溶離液：５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５．９）（１０〜７０％アセトニトリルグラジエント（３５分））、流速０．７ｍｌ／分、測定波長２３３ｎｍ
溶出時間：２４．０分（ＡＤＭと一致）
質量分析（ＳＩＭＳ）：５４４．２（Ｍ＋Ｈ）（ＡＤＭと一致）
（２）化合物（XI−１）（ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭ）のサーモリシンによる切断
実施例６で得られた化合物（XI−１）０．０９ｍｇ(10.2nmol)をＤＭＳＯ，１０μｌに溶解し、燐酸緩衝液２１０μｌを加え、さらにサーモリシン（１．０ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ（酵素量７５０ｐＵ）を加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（XI−１）（溶出時間：２３．８分）からのＨ−Ｖａｌ−ＡＤＭの遊離を確認した（切断効率１００％）。なお、ＨＰＬＣの分析条件は（１）と同様にして行った。
溶出時間：２５．２分
質量分析（ＳＩＭＳ）：６４３（Ｍ＋Ｈ）
参考例２６  スペーサー部位の酵素特異的切断
抗体−スペーサー−アドリアマイシン結合体を用いた実験
（１）化合物（Ｉａ−３）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）m］のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
実施例３で得られた化合物（Ｉａ−３）（０．１９ｍｇ／ｍｌ）３５μｌにプロリンエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ）７０μｌ（酵素量２．４Ｕ）および燐酸緩衝液９５μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−３）からのＡＤＭの遊離を確認した（切断効率10％）。なお、ＨＰＬＣの分析条件は参考例２５と同様にして行った。
溶出時間：２３．７分（ＡＤＭと一致）
（２）化合物（Ｉａ−１）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＡＤＭ）m］のサーモリシンによる切断
実施例１で得られた化合物（Ｉａ−１）（０．４２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌにサーモリシン（２．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ（酵素量０．９μＵ）および燐酸緩衝液１００μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−１）からのＨ−Ｖａｌ−ＡＤＭの遊離を確認した（切断効率１００％）。なお、ＨＰＬＣの分析条件は参考例２５と同様にして行った。
溶出時間：２８．１分
（３）化合物（Ｉａ−２）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＤＭ）m］のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
実施例２で得られた化合物（Ｉａ−２）（０．２７ｍｇ／ｍｌ）４０μｌにプロリンエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ）１１０μｌ（酵素量３．９Ｕ）および燐酸緩衝液５０μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−２）からのＡＤＭの遊離を確認した（切断効率１０％）。なお、ＨＰＬＣの分析条件は参考例２５と同様にして行った。
溶出時間：２３．９分（ＡＤＭと一致）
参考例２７  スペーサー部位の酵素特異的切断
抗体−スペーサー−化合物（２０）結合体を用いた実験
（１）化合物（Ｉａ−９）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−化合物（２０））m］のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
実施例９で得られた化合物（Ｉａ−９）（１．２ｍｇ／ｍｌ）１７μｌにプロリンエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ（酵素量２．８Ｕ）および燐酸緩衝液５３μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−９）からの化合物（２０）の遊離を確認した。
逆相ＨＰＬＣ分析条件；装置、カラムなどは参考例２１と同様。溶離液；５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）（１０〜７０％アセトニトリルグラジエント（３５分））、流速；０．７ｍｌ／分、測定波長；３３０ｎｍ
溶出時間：２６．０分（化合物（２０）と一致）
（２）化合物（Ｉａ−７）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−化合物（２０））m］のサーモリシンによる切断
実施例７で得られた化合物（Ｉａ−７）（１．１ｍｇ／ｍｌ）１８μｌにサーモリシン（３．０ｍｇ／ｍｌ）６０μｌ（酵素量１．７μＵ）および燐酸緩衝液７２μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−７）からのＨ−Ｖａｌ−化合物（２０）の遊離を確認した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は（１）と同様にして行った。
溶出時間：１７．７分
（３）化合物（Ｉａ−８）［ＮＬ−１−（ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−化合物（２０））m］のプロリンエンドペプチダーゼによる切断
実施例８で得られた化合物（Ｉａ−８）（１．８ｍｇ／ｍｌ）１１μｌにプロリンエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ（酵素量２．８Ｕ）および燐酸緩衝液５９μｌを加え、３７℃で一昼夜放置した。逆相ＨＰＬＣで上清を分析し、化合物（Ｉａ−８）からの化合物（２０）の遊離を確認した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は（１）と同様にして行った。
溶出時間：２５．９分（化合物（２０）と一致）
参考例２８  化合物（IIａ−１）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨ
参考例１で得られた化合物（VIII−１）１００ｍｇ(117μmol)を窒素気流中メタノール５．０ｍｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２０ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨを７６ｍｇ(99μmol)得た（収率８５％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．２３（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ａｌａ））、２．２３（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．２６（１Ｈ，ｓ，ＣＨ（Ｖａｌ））、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））、０．８９（６Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ｖａｌ））
参考例２９  化合物（IIａ−２）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ
参考例２で得られた化合物（VIII−２）１００ｍｇ(117μmol)を窒素気流中メタノール５．０ｍｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２０ｍｇを加え、水素気流中、室温で３時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨを７０ｍｇ(91μmol)得た（収率７８％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：４．４０（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．８０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ（Ａｌａ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，ＯＣＨ2ＣＨ2）、３．５９（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、２．３６（１Ｈ，ｂｒ，ＣＨ（Ｐｒｏ））、２．０２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、１．２９（３Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，ＣＨ3（Ａｌａ））
参考例３０  化合物（IIａ−３）：ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ
参考例３で得られた化合物（VIII−３）１００ｍｇ(116μmol)を窒素気流中メタノール５．０ｍｌに溶解し、１０％パラジウム炭素触媒２０ｍｇを加え、水素気流中、室温で２時間激しく攪拌した。触媒を濾別し、濾液から溶媒を減圧下除去し、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨを７６ｍｇ(98μmol)得た（収率８５％）。
1ＨＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中）δ（ｐｐｍ）：４．４０（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、４．１２（４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ2）、３．８２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2（Ｇｌｙ））、３．６４（４ｎＨ，ｂｒｓ，OCH2CH2）、３．５９（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））、２．２１（１Ｈ，ｓ，CH(Pro)）、２．０２（２Ｈ，ｂｒ，ＣＨ2（Ｐｒｏ））
産業上の利用可能性
本発明によれば、毒素と標的細胞に親和性を有する基、例えば癌特異的な抗体あるいは抗体フラグメントとをスペーサーを介して結合させた、抗腫瘍剤の有効成分として有用な毒素複合体、および該複合体を用いる生体外診断法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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