(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子であって、キャリヤタンパク質とカップリングされた、下記構造によって表される１，３−ジケトンハプテンを有する免疫源で動物を免疫することにより生成することができ、かつε−アミノ基を有するリシンをもち、１，３−ジケトンハプテンと前記触媒抗体のリシンのε−アミノ基間の複合体の形成によって１，３−ジケトンハプテンによる阻害を受け、前記複合体が安定な共有結合ビニローグアミド、複合エナミン及びシッフ塩基からなる群より選ばれることを特徴とする、前記抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子。
【化１】
0003996642.tif 000009
【請求項２】
クラム・フェルキン方向及びアンチクラム・フェルキン方向のアルドール付加反応のジアステレオ面の選択性を制御する、請求項１記載の抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子。
【請求項３】
前記脂肪族ケトンドナーが下記構造によって表される群より選ばれる、請求項１記載の抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子。
【化２】
0003996642.tif 000010
【請求項４】
前記アルデヒドアクセプターが下記構造によって表される群より選ばれる、請求項１記載の抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子。
【化３】
0003996642.tif 000011
【請求項５】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００５を有するハイブリドーマ３８Ｃ２によって分泌される、請求項１記載の分子。
【請求項６】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００４を有するハイブリドーマ３３Ｆ１２によって分泌される、請求項１記載の分子。
【請求項７】
培養液中で培養した場合、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒し、かつε−アミノ基を有するリシンをもち、１，３−ジケトンハプテンと前記触媒抗体のリシンのε−アミノ基間の複合体の形成によって１，３−ジケトンハプテンによる阻害を受け、前記複合体が安定な共有結合ビニローグアミド、複合エナミン及びシッフ塩基からなる群より選ばれることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の抗体分子又はその抗体結合部位部分を含む分子を産生する細胞。
【請求項８】
該培養液中に前記モノクローナル抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を更に分泌する、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
ハイブリドーマ細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００５を有するハイブリドーマ３８Ｃ２である、請求項９記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００４を有するハイブリドーマ３３Ｆ１２である、請求項９記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】
脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する方法であって、
工程Ａ：請求項１記載のモノクローナル抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子の触媒的に有効な量と、前記脂肪族ケトンドナーと前記アルデヒドアクセプターとを水性培養液中で混合して反応混合液を形成する工程；及び
工程Ｂ：前記工程Ａの前記反応混合液を、前記抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子が前記脂肪族ケトンドナーと前記アルデヒドアクセプター間の前記アルドール付加反応を触媒するのに十分な時間維持する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記抗体分子又はその抗体結合部位部分を含む分子がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００５を有するハイブリドーマ３８Ｃ２によって分泌される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体分子又はその抗体結合部位部分を含む分子がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２００４を有するハイブリドーマ３３Ｆ１２によって分泌される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
アルドール付加反応を行う方法であって、
工程Ａ：脂肪族ケトンドナー、アルデヒドアクセプター、及び該脂肪族ケトンドナーと反応するε−アミノ基を有するリシンを含む請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体又はそのパラトープ含有部分の触媒的に有効な量を混合することにより反応混合液を形成してエナミン中間体を形成する工程；及び
工程Ｂ：前記反応混合液を生物学的反応条件下で前記工程Ａのエナミン中間体が該アルデヒドアクセプターと反応するのに十分な時間維持してアルドール付加生成物を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項１６】
培養液中で培養した場合、脂肪族ドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生する細胞の調製方法であって、
工程Ａ：キャリヤタンパク質とカップリングされた、下記構造によって表される１，３−ジケトンハプテンを含む免疫原を動物に免疫する工程；
工程Ｂ：前記動物が前記ハプテンリガンドと免疫反応する抗体を分泌するのに十分な時間前記動物を維持する工程；
工程Ｃ：前記工程（Ｂ）の前記維持し免疫した動物の抗体産生細胞からの抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子をコード化する遺伝子をホスト細胞に移入して少なくとも２種の供給源から遺伝子を含むハイブリッド細胞を形成し、形成したハイブリッド細胞が、（ｉ）培養した場合に前記移入した遺伝子から抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生しかつ（ｉｉ）ほぼ無制限に培養される工程；
工程Ｄ：該ハイブリッド細胞を適切な培養液中で該ハイブリッド細胞が抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生するのに十分な時間培養する工程；
工程Ｅ：該培養したハイブリッド細胞から抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を回収する工程；
工程Ｆ：該アルドール付加反応を触媒する得られた抗体分子又は抗体結合部位部
分を含む分子をスクリーニングする工程；及び
工程Ｇ：該脂肪族ドナーと該アルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生する前記同定ハイブリッド細胞のクローンを増殖する工程
を含む、前記方法。
【化４】
0003996642.tif 000012
【請求項１７】
前記工程Ｃで形成された細胞がハイブリドーマ細胞である、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野：
本発明は、アルドラーゼ活性をもつ触媒抗体に関する。更に詳細には、本発明は、アルドラーゼ活性をもつ触媒抗体であって、かかる触媒抗体に対して自殺基質活性をもつβ−ジケトンハプテンを有する免疫複合体によって作成される前記触媒抗体に関する。
背景
アルドール付加反応は、２反応分子を結合すること及び新しい炭素−炭素結合を有する生成物を生じることを含む可逆反応である。反応成分は各々カルボニル基、即ち、アルデヒドか又はケトンを含む。反応中、反応成分の一方はカルボニル基に最も近い炭素原子からプロトンを失い、よって求核基になる。次に、第１反応成分の求核基炭素が第２反応成分のカルボニル基を攻撃する。この縮合反応の逆も起こり、炭素−炭素結合の開裂及び１分子の２成分への解離を含む。アルドール付加反応は、解糖系において重要であり、アルドラーゼ酵素によって触媒される。アルドール付加反応は、また、炭素−炭素結合の形成と解離についての有機化学の基礎である。有機化学においては、該反応は塩基によって触媒される。
２種類の機械論的アルドラーゼ酵素、即ち、クラスＩ及びクラスIIアルドラーゼの進展があった。（W.J. Rutter, Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol.（1964）:vol. 23, p 1248.）クラスＩアルドラーゼは、活性部位のLysのε−アミノ基を用いて基質の１種とシッフ塩基を生成し、アルドールドナーとして基質を活性化する。
クラスＩアルドラーゼの機構を図１に示す。反応は、二分子反応であり、共有結合触媒によって多数の中間体を介して進行する。電子シンクとして作用するイミニウムイオン又はシッフ塩基が生じ、Ｃαからのプロトンの引き抜きと続いてのエナミンの生成のための活性化エネルギー（Ｅa）を低下させる。エナミンは、炭素求核剤又はアルドールドナーとして作用し、アルデヒド親電子剤、アルドールアクセプターと反応して新しいＣ−Ｃ結合を形成する。次に、シッフ塩基が加水分解され、生成物が遊離する。機構の実質は、新生炭素求核剤であるエナミンの生成である。
クラスIIアルドラーゼは、基質のカルボニル酸素に配位することによるエノレート形成を促進する金属酵素である。金属を含むアルドール反応の遷移状態のモデルも開示された。（H.E. Zimmermanら, J. Am. Chem. Soc.（1957）: vol. 79, p 1920.）しかしながら、クラスIIアルドラーゼの機構は、依然として確認されている。
多くの酵素がアルドール縮合を触媒する。これらの酵素の機構は、十分に確認されている。（C.Y. Laiら, Science（1974）: vol. 183, p1204; A.J. Morrisら, Biochemistry（1994）vol. 33, p 12291.）しかしながら、アルドラーゼ酵素は、比較的限られた範囲の基質を受容する。（C.-H. Wongら, Enzymes in Synthetic Organic Cemistry（Permagon, Oxford, 1994）; M.D. Bednarski, Comprehensive Organic Synthesis, B.M. Trost, Ed.（Pergamon, Oxford, 1991）, vol 2, pp. 455-473; C.F. Barbas IIIら, J. Am. Chem. Soc.（1990）: vol 112, p 2013; H.J.M. Gijsenら, J. Am. Chem. Soc.（1995）: vol. 117, p 2947; C.-H. Wongら, J. Am. Chem. Soc.（1995）: vol. 117, p.3333; L. Chenら, J. Am. Chem. Soc（1992）: vol. 114, p 741.）天然アルドラーゼ酵素はアルドールアクセプターに対しては広範囲の特異性を示すが、アルドールドナーは通常天然基質に制限される。所望の基質特異性が所望のアルドール付加反応を触媒する程度まで生じる場合には、有機合成の当該技術は非常に有益である。
新しい炭素−炭素結合を形成する有機化学において、非酵素塩基触媒アルドール付加反応が広く用いられている。また、アルドールの立体化学を制御するために様々な有効試薬が開発された。しかしながら、これらの試薬は、化学量論的であり、予め生成したエノレート及び広範な保護基化学を必要とする。（C.H. Heathcock, Aldrichim. Acta（1990）: vol. 23, p 99; C.H. Heathcock, Science（1981）: vol. 214, p 395; D.A. Evans, Science（1988）: vol. 240, p420; S. Masamuneら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.（1985）: vol. 24, p 1; D.A. Evansら, Top. Stereochem.（1982）: vol. 13, p 1; C.H. Heathcocketら, Comprehensive Organic Synthesis, B.M. Trost, Ed.（Pergamon, Oxford, 1991）, vol. 2, pp. 133-319（1991）; I. Paterson, Pure & Appl. Chem.（1992）, vol. 64, 1821.）最近、向山交差カップリングアルドールを含む予め生成したエノレートを用いる触媒アルドール反応が開発された。（S. Kobayashiら, Tetrahedron（1993）: vol. 49, p 1761; K. Furutaら, J. Am. Chem. Soc.（1991）: vol. 113, p 1041; T. Bach, Angew. Chem. Int. Ed, Engl.（1994）: vol. 33, p 417及びその中の参考文献; E. M. Carreiraら, J. Am. Chem. Soc.（1995）: vol. 117, p 3649.）
いくつかの反応についての複雑な中間体の問題は、通常不活性な抗原よりむしろ相対的に反応性の化合物を用いて動物に免疫するか又は抗体誘導方法が結合部位において実際の化学反応を含むようなライブラリーから抗体を選択することにより解決される。（C.F. Barbas IIIら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1991）: vol. 88, p 7978（1991）; K.D. Jandaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1994）: vol. 191, p 2532.）次に、抗体を誘導するために用いられる抗原と化学反応性を共有する基質と抗体が相互作用する場合にはその同じ反応が触媒機構の一部となる。
有機化学の主な目標の１つは、反応機構の理解を用いて新しい触媒を設計することである。これは、高エネルギーや複雑な構造を有する中間体に取組まなければならないのでたいてい容易なことではない。抗体触媒は、化学反応の律速遷移状態と相互作用し、よってエネルギーを低下させかつ反応速度を上げるように実験者によってプログラムされる点でこの問題に１つの潜在的な解決を与える。（R.A. Lernerら, Science（1991）: vol. 252, p 659.）しかしながら、ここでさえ触媒をプログラムする実験者の能力は詳細な反応機構よりはむしろ遷移状態の全体的な態様に制限される。従って、反応座標に沿って生じる高エネルギー充足率、立体電子構造、及び幾何構造を扱うことがきるが、多数の複雑な反応中間体の組織化は依然として困難である。
アルドラーゼに効率を与える反応機構を用いるが基質の範囲及び抗体と有効な立体化学特異性を利用する反応機構を用いる抗体誘導方法が求められている。化学と生物学において最も基本的なＣ−Ｃ結合形成反応であるとも言えるアルドール縮合によって炭素−炭素結合を形成する問題に対して化学と酵素の簡便な方法の最良の特徴を融合する戦略が求められている。
要約
本発明は、アルドール反応を触媒する抗体の作成に関する。触媒抗体は、安定なビニローグアミド、即ち、共有結合抗体／ハプテン複合体の生成による抗体の結合ポケットのリシン（Lys）残基を共有結合でトラップする反応性化合物を免疫することにより作成される。クラスＩアルドラーゼ天然酵素によって用いられる触媒機構をミミックするこれらの触媒抗体の触媒機構が開示される。
共有結合抗体／ハプテン複合体を形成するために用いられる同様の反応機構がアルドール反応を触媒するために用いられる。触媒作用中、抗体はLysのε−アミノ基を用いてケトン基質とエナミンを生成し、次に、新生炭素求核剤としてこのエナミンを用いて新しい炭素−炭素結合を形成する。本明細書に開示される触媒抗体は、幅広い基質特異性及びクラム・フェルキン方向とアンチクラム・フェルキン方向双方の反応のジアステレオ面の選択性を制御する能力を特徴とする。
更に詳細には、本発明の態様は、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子に関する。これらの抗体は、ε−アミノ基を有するリシンをもっていることを特徴とする。更に、1,３−ジケトンハプテンと触媒抗体のリシンのε−アミノ基間の複合体の形成によって1,３−ジケトンハプテンによる阻害を受けることを特徴とする。複合体の実質は、安定な共有結合ビニローグアミド、複合エナミン又はシッフ塩基とすることができる。好適実施態様においては、抗体分子はクラム・フェルキン方向とアンチクラム・フェルキン方向双方のアルドール付加反応のジアステレオ面の選択性を制御する。好ましい脂肪族ケトンドナーとしては、下記構造によって表される化合物が含まれる。
0003996642.tif 000002
好ましいアルデヒドアクセプターとしては、下記構造によって表される化合物が含まれる。
0003996642.tif 000003
本発明の他の態様においては、ATCC受託番号HB12005を有するハイブリドーマ38C2又はATCC受託番号HB12004を有するハイブリドーマ33F12によって分泌される請求項１記載の分子に関する。
本発明の別の態様は、培養液中で培養する場合にアルドール付加反応を触媒する上記で示したモノクローナル抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生する細胞に関する。好適実施態様においては、細胞は培養液中にモノクローナル抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を分泌するタイプである。ハイブリドーマ細胞、即ち、ATCC受託番号HB12005を有するハイブリドーマ38C2のハイブリドーマ細胞及びATCC受託番号HB12004を有するハイブリドーマ33F12のハイブリドーマ細胞が好適実施態様である。
本発明の態様は、更に、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する方法に関する。該方法は、請求項１記載の抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子の触媒的に有効な量と、脂肪族ケトンドナーと前記アルデヒドアクセプターとを水性培養液中で混合して反応混合液をつくることにより開始する。反応混合液をつくった後、抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子が脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒するのに十分な時間維持される。上記合成法の好適方法においては、抗体分子又はその抗体結合部位部分を含む分子はATCC受託番号HB12005を有するハイブリドーマ38C2又はATCC受託番号HB12004を有するハイブリドーマ33F12によって分泌される。
本発明の代替的方法は、脂肪族ケトンドナー、アルデヒドアクセプター、及びモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体のパラトープ含有部分の触媒的に有効な量をｐＨ約６〜１０の水性培養液中で混合して反応混合液を形成することによりアルドール付加反応を行う方法に関する。モノクローナル抗体又はそのパラトープ含有部分は、脂肪族ケトンドナーと反応してエナミン中間体を形成するε−アミノ基を有するリシンを含むタイプを有する。反応混合液を形成した後、エナミン中間体がアルデヒドアクセプターと反応してアルドール付加生成物を生成するのに十分な時間生物学的な反応条件下で維持される。
本発明の他の態様は、培養液中で培養する場合に脂肪族ドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生する細胞の調製方法に関する。該方法は、1,３−ジケトンハプテンを含む免疫原を動物に免疫することにより開始する。次に、動物を、ハプテンリガンドと免疫反応する抗体を分泌するのに十分な時間維持する。次に、抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子をコード化する遺伝子を、動物を維持し免疫した抗体産生細胞からホスト細胞へ移入してハイブリッド細胞を形成する。ハイブリッドホスト細胞は、少なくとも２種の供給源からの遺伝子を含有する。形成したハイブリッドハイブリッド細胞は、２つの特性をもっている。即ち、（ｉ）培養した場合に、移入された遺伝子から抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生し、（ii）ほぼ無制限に培養される。次に、抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生するのに十分な時間ハイブリッド細胞を適切な培養液中で培養する。次に、培養したハイブリッド細胞から抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を回収する。次に、得られた抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子についてアルドール付加反応に対する触媒活性をスクリーニングする。最後に、脂肪族ドナーとアルデヒドアクセプター間のアルドール付加反応を触媒する抗体分子又は抗体結合部位部分を含む分子を産生する同定したハイブリッド細胞のクローンを増殖する。好ましいハイブリッド細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
【図面の簡単な説明】
図１は、アルドール付加反応を触媒するクラスＩアルドラーゼの一般機構を示すスキームである（Laiら, Science 183, 1204（1974）; Morrisら, Biochemistry 33, 12291（1994）; Rutterら, Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol. 23, 1248（1964））（Enz,酵素; B,塩基）。
図２は、1,３−ジケトンハプテン５を用いて抗体（Ab）結合ポケットのLys残基の実質的なε−アミノ基をトラップする機構を示すスキームである。安定な共有結合ビニローグアミド（下方右側の図）の生成は、λ=316で検出される（εは吸光係数=15000）。R=ρ（HOOC（CH2）3CONH）C6H4-.
図３は、1,３−ジケトンハプテン構造が化学トラップとエントロピートラップの要素を含むことを示すスキームである。ハプテン５で誘導された結合ポケットは、アクセプター上のアルドールドナーの攻撃に適度なヒースコック角の達成を妨げない。適当な攻撃形は、エナミン面とアルデヒド面双方の単純な回転によって得られる。
図４は、ハプテン５の合成を示す図である。工程は次の通りである。（a）LDA[2当量(eq)], THF, 40℃, １時間;（b）4-ニトロベンジルブロミド，ヘキサメチルホスホルアミド，-78〜-40℃, 収率48%;▲Ｃ▼（I）Pd/C, H2, エタノール;（ii）グルタル無水物, CH2CH2, 収率74%.
図５は、ビニローグアミド中間体（下方右側の構造；図２）の生成のための抗体スクリーニングを示すグラフである。ハプテン５, ５eqを、ＰＢＳバッファー（pH=7.5）中各抗体の20mM溶液にマイクロタイタープレート方式で加えた。アルドラーゼ触媒活性をもつ抗体は３１６nmでビニローグアミドの典型的な吸収最大値を示した（上方ラインに示した例）が、不活性な抗体はいずれも示さなかった（下方ラインに示した例）。２０個の中から２個の抗体がビニローグアミド中間体（下方右側の構造;図２）を生成し、引き続き触媒することが求められた。この効率の良い方法は、多数の抗体の迅速なスクリーニングを与える。
図６（Ａ）は、ビニローグアミド中間体（下方右側の構造；図２）の吸光係数の定量を示すグラフである。所定の濃度（１００mM）のハプテン５を表示した濃度の抗体33F12に加えた。抗体エナミン複合体は、２mM程度の抗体濃度で容易に検出される。図６（Ｂ）は、抗体38C2の活性部位がアセチルアセトンで滴定されたことを示すグラフである。抗体濃度（20mM）は一定とした。アセチルアセトン（０〜4.５eq）を加え、316nmの吸収を測定した。２つのラインの交点は、抗体38C2に対するアセチルアセトンの1.９の比率に対応し、抗体の両方の結合部位がエナミン付加物（下方右側の構造；図２）を形成することが示される。
図７は、順相HPLCキラル支持体カラムによる（6+7）とアセトンとの30%変換後の抗体触媒反応の生成物分布を示す図である。
図８は、1.５％触媒の存在下に３６時間にわたってモニターされるアルデヒド（6+7）とアセトンのアルドール付加反応を示す図である。触媒は、複数のターンオーバー（〜２ターンオーバー／時間）を示し、ほとんど生成物阻害を示さなかった。レトロアルドール反応を最少にする過剰量のアセトン（5% v/v）の存在下に９０％変換が得られた。完全な物質収支（上方ライン）は、脱離又は重合のような副反応がその時間で起こらなかったことを示している。従って、抗体触媒アルドール反応は、Ｃ−Ｃ結合形成の例外的な緩和な方法である。
図９は、抗体38C2の基質特異性を示す表である。各反応の速度論パラメーターkcatとＫmをアルデヒド（12又は6+7）について計算した。アルドールドナー（アセトン、2-ブタノン、3-ペンタノン、2-ペンタノン及びアセトアルデヒド）を各実験において5% v/vの濃度で固定した。生成物15/16と18/19を各々94:4と73:27の比で生成した。
図10は、ヘック反応（Jeffreyら, J. Chem. Comm. 1984, 1287）を用いるp-ヨードアニリンからアルデヒド（6+7）と12の合成を示すスキームである。アルドール付加の生成混合物は、化合物（6+7）と12からNaOH、水及びアセトンを用いて得られた。
図11は、ハプテン５、アルデヒド12及びアセトンから誘導された抗体38C2と33F12を用いて化合物13/14, pH:7.02を得るアルドール反応の速度論を示す図である。Ｋcat=4.0 10-3[min-1]; ＫM=5.8[μM].
図12は、ハプテン５、アルデヒド12及びアセトンから誘導された抗体38C2と33F12を用いて化合物13/14を得るアルドール速度論とレトロアルドール速度論を示す図である。前方向矢印: アルドール反応, pH=7.44: Ｋcat=6.7 10-3[min-1]; ＫM=17[μM]; 逆方向矢印: レトロアルドール反応, pH=7.22: Ｋcat=4.4 10-3[min-1]; ＫM＝54[μM].
図13は、ハプテン５から誘導された抗体38C2と33F12及び生成物13/14を用いてアルデヒド12とアセトンを生成するレトログレードアルドール反応速度論を示すスキームである。手順は次の通りである。0.2mM EDTA、100mMトリス、4.5mg酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、0.43mg NADH及び4mMb-ヒドロキシケトン４を含む溶液、100ml, pH=7.22をマイクロタイタープレートの４個のウェルに導入した。抗体38C2と33F12（100ml, 34.6mM, トリスバッファー, pH=7.22）を２個の異なるウェルに加え、残りのウェルに100mlバッファーを加え、ブランクとした。340nmの紫外線吸光度を24時間15分毎に測定した。触媒反応からブランクの吸光度を引き、ε=6220 M-1 cm-1を用いて速度を求めた。レトログレードアルドール反応, pH=7.22: Ｋcat=3.7 10-3[min-1]; ＫM=46[μM].
詳細な説明:
抗体の活性部位の必要なLys残基を双方でトラップするハプテン、実質的なエナミン中間体を生成する抗体を誘導するハプテン、及び二分子反応に固有のエントロピー障壁を克服する２つの基質の適切な結合部位を誘導するハプテンが設計される。シンプルな1,３−ジケトンハプテン５は、図２に示されるように、ケミカルトラップとエントロピートラップ双方の要素を与える。水中では、図示されたハプテンのケト形はエノール形より３：１の比で優先する。（M. Moriyasuら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. II（1986）: p 515.）ハプテンが抗体と相互作用する場合に予想されるアルドール付加の反応座標と反応機構は、いくつかの共通中間体を共有する。両者の場合において、脱水してカチオンイミニウムを得、これがエナミンに互変異性化する４面体のカルビノールアミン中間体が生じる。ハプテン反応機構に従って誘導された抗体がアルドール反応の反応座標に沿って類似の遷移状態とカチオン中間体を安定化することが予想された。1,３−ジケトンハプテンと抗体との反応の推進力は、ハプテンとリシンのε−アミノ基間の安定な共有結合ビニローグアミド又は複合エナミンの形成である。エノンのウッドワード法則を用いる計算からビニローグアミドがその同定を可能にする適切な紫外線スペクトル領域に吸収最大値をもつことが示された。λmax=318nm（E. Pretschら, Tables of Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds,（Springer-Verlag, Berlin, ed. 2, 1989）, p. U20.）このタイプの化合物の安定性とスペクトル特性は、ウェステイマーと共同研究者らによるアセトアセテートデカルボキシラーゼの研究で以前に言及された。（W. Tagakiら, Biochemistry（1968）: vol. 7, p 905.）我々は、ジケトンケミカルトラップにおいて第２基質（アルドールアクセプター）の取込みによるエントロピー優位を予想した。エントロピー効果は、天然酵素の速度加速に対して108〜1011だけ生じ得ることができることが示されている。（M.I. Pageら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1971）: vol. 68, p 1678.）
開示された反応の好ましい例は、アセトンの3-フェニルプロピオンアルデヒド誘導体へのアルドール付加である。第２基質は、ハプテンの3-フェニルプロピオノニル部分によって示される。ジケトンハプテンにおける２つの基質の束縛により、アルデヒドについてのエナミンの攻撃のヒースコック角がＣ−Ｃ結合形成の律速遷移状態において最も外の９０°までねじられる基質複合体が存在する。（E.P. Lodgeら, J. Am. Chem. Soc.（1987）: vol. 109, 3353.）これは、図３に示されるようにエナミン面とアルデヒド面双方の回転が適度なヒースコック角を与えなければならないことから予想されず触媒反応において主な障害でないことも証明された。
本明細書に開示される本発明の中心概念は、共有結合反応機構を用いる触媒が反応性化合物を免疫することにより誘導されることである。本明細書に示される本原理の例は、シッフ塩基又はエナミン機構が含まれるがこれに限定されない。本方法は、達成されるべき化学が非共有結合相互作用の協奏によってでも容易に達成されるものの範囲を超える場合には特に有効である。
実施例：
化合物３の合成（図4）
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化合物３：CaH2上で蒸留したジイソプロピルアミン（1.43ml, 2.1eq）を乾燥THF（80ml）に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、ヘキサン中1.6Mブチルリチウム（6.4ml, 2.1eq）を徐々に加えた。LDA（リチウムジイソプロピルアミド）の無色溶液を０℃で30分間維持し、ヘキサメチルホスホルアミド（0.8ml, 0.9eq）を加えた。乾燥THF（20ml）に溶解した新たに蒸留した2,4-ペンタンジオン（0.5ml, 1.0eq; Aldrich）を徐々に加えた。混合液を40℃まで１時間加熱した。ジアニオンの黄色溶液を-78℃に冷却し、乾燥THF（20ml）に溶解した4-ニトロベンジルブロミド（20ml）を徐々に加えた。温度を-40℃まで徐々に（〜20分）上げた（TLC対照: AcOEt/石油エーテル1:3）。反応液をCH2Cl2とNH4Cl飽和溶液（100ml）の氷冷混合液に注入した。層分離した後、水相をCH2Cl2で再抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を蒸発した。残留物をカラムクロマトグラフィー（SiO2, 230-400メッシュ, AcOEt/石油エーテル1:3）で精製して3（544mg, 48%）を黄色固形物として得、これをAcOEt/石油エーテル1:3から再結晶した。1H NMR（CDCl3, 300MHZ）: エノール形d 8.12-8.19（m, 2H）,7.33-7.41（m, 2H）, 5.47（s, 1H）, 3.05（t, J=7.5, 2H）, 2.65（t, J=7.5, 2H）, 2.08（s, 3H）; 13C NMR（CDCl3, 125MHZ）: エノール形d 192.7, 190.3, 148.5, 129.2, 123.7, 100.1, 39.2, 30.9, 24.5; 部分ケト形d 146.5, 57.7, 44.2, 28.9; IR（ニート）nmax3078, 2928, 2853, 1706, 1600, 1516, 1343, 1108, 854cm-1; MS m/z（相対強度）236（M+H+, 100）; C12H13NO4（235.239）.
ジケトンハプテンの合成（図4）
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化合物５: ジケトン３（100mg, 0.43ミリモル）をEtOH（10ml）に溶解した。10% Pd/C（45mg, 0.1eq）を加え、混合液を強くかきまぜて45分間水素添加した（TLC: CH2Cl2/Et2O 1:3）。スラリーをセライトでろ過し、CH2Cl2（〜50ml）で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒を蒸発して粗アミン４を得、これをCH2Cl2（15ml）に再溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、グルタル無水物（53mg, 1.1eq）を加えた。混合液を室温で1.５時間攪拌した（TLC: CH2Cl2/Et2O 1:3）。この溶液を0.2N NaOHで抽出した。水相を2 N HClでpH=1.0まで酸性にし、AcOEt（15ml）で３回抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を蒸発して5（100mg, 74%）を白色固形物として得た。1H NMR（CDCl3, 500 MHZ）:エノール形d 8.08（s, 1H）, 7.39-7.42（m, 2H）, 7.06-7.10（m, 2H）, 5.47（s, 1H）, 2.86（t, J=8.1, 2H）, 2.54（t, J=8.1, 2H）, 2.39-2.44（m, 4H）, 2.03（s, 3H）, 1.98-2.04（m, 2H）; ケト形d 8.13（s, 1H）, 7.39-7.42（m, 2H）, 7.06-7.10（m, 2H）, 3.56（s, 2H）, 2.78-2.85（m, 4H）, 2.39-2.44（m, 4H）, 2.19（s, 3H）, 1.94-1.98（m, 2H）; 13C NMR（CDCl3, 125 MHZ）:エノール形d 193.3, 191.3, 178.0, 171.3, 136.7, 135.9, 128.7, 120.3, 100.1, 36.9, 36.0, 33.0, 30.8, 24.8, 20.6; 部分ケト形d 57.8, 45.1, 32.9, 28.7, 19.6; IR（KBr）nmax 3325, 3113, 3044, 2935, 1696, 1658, 1602, 1531, 1413, 1311, 918, 830, 683cm-1;MS m/z（相対強度）320（M+H+, 92）; C17H21NO5（319.357）. 注: ジケトン５の約83%がCHCl3中でケト形である。
ハプテンのキャリヤタンパク質へのカップリング
ハプテン５を、一般に用いられる担体タンパク質キーホールリンペットヘモシアニンにHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 79に指定された条件に従ってカップリングした。
ハイブリドーマ細胞系からの抗体の生産
129 GIX+マウス（Scripps Research Institute）を免疫した後、５に対するハイブリドーマ産生抗体20個をG. Kohlerら, Nature 256, 495（1975）に記載される標準法で得た。次に、各細胞系からの抗体を硫酸アンモニウム沈降、アニオン交換、及びV.E. Gouverneurら, Science 262, 204（1993）に記載されるプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。20個の抗体を単離した。
抗体のスクリーニング（図5）
20mM抗体を100mMのジケトンハプテン５とインキュベートすることにより、全20個の抗体について図２に示される提案した安定なビニローグアミドの生成能をマイクロタイタープレート分析においてスクリーニングした（図5）。２つの抗体38C2と33F12が、図２に示される提案したビニローグアミドに特有の316nmにおいて強い吸収最大値を示し、318nmのタンパク質の存在しないときの吸収最大計算値に近似した（図5）。５をリシンと同じ条件下でインキュベートすることにより吸光度の上昇は生じなかった。
吸光係数の定量（図6A）
抗体の吸光度を引いた後の抗体−エナミン複合体の吸光係数は15000cm-1 M-1であり（図6A）、アセトピルベートと酵素アセトアセテートデカルボキシラーゼとの反応の測定値, 19000cm-1 M-1に近似した。（W. Tagakiら, Biochemistry（1968）: vol. 7, p 905.）
アセチルアセトンを用いた滴定による抗体／エナミン複合体の化学量論の定量（図6B）
抗体が合成反応においてアセトンによりエナミンを生成することが予想されることから、ビニローグアミド発色団の測定はハプテンのアルドールアクセプター（ベンジル）部分に依存しないものでなければならない。我々は、最少のジケトンが発色団を生じると予想されるアセチルアセトンを試験した。両方の抗体がこの化合物と反応し、予想した吸光度スペクトルを生じた。抗体／エナミン複合体の化学量論を求めるために、Tagakiら, Biochemistry 7, 905, 1968の条件に従って抗体のアセチルアセトンによる滴定を行った。エナミンを生じる反応が不可逆的であることを前提とすると、滴定の化学量論は抗体活性部位の濃度に対応しなければならない。滴定は抗体に対するアセチルアセトンの比率1.9を示し、抗体の２つの同じ抗原結合部位の各々がビニローグアミド付加物を形成することを意味する（図6B）。ビニローグアミドの生成の触媒作用は、抗体とハプテンの混合の際に実質的に完結しかつこの反応の速度の定量がストップトフローキネティークス実験を必要とするのに十分迅速であった。
抗体の存在下アルデヒドにアルドールドナーを付加してβ−ヒドロキシケトンを生成する（図9）
抗体38C2と33F12についてアルドールドナー（アセトン、2-ブタノン、3-ペンタノン及び2-ペンタノン）のアルデヒド６、７及び12への付加の触媒能を分析した（図９）。典型的な手順は次の通りである。0.2mM EDTA、100mMトリス及び約5% v/v（ドナー容量／溶媒容量）のアルドールドナー濃度を有する100μlのpH7.5バッファー溶液をマイクロタイタープレートのｎ個に導入した。抗体38C2と33F12（100μl, 34μM, トリスバッファー, pH=7.5）を別個のウェルに加えた。残りのウェルには100mlのバッファーのみ加え、ブランクとした。340nmの紫外線吸光度を24時間15分毎に測定した。ブランクの吸光度を触媒反応から引き、ε=6220 M-1cm-1を用いて速度を求めた。抗体38C2と33F12は、同じkcat=4.53 10-3 min-1であった。これはHPLC測定と十分に相関する。β−ヒドロキシケトンの消費と生成を次のように逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）でモニターした。RP-C18カラム（MICROSORB-MV, 0.45cm/22cm）を75/25; H2O（0.1%トリフルオロ酢酸）/H2O:アセトニトリル1:1, 1.5ml／分の均一なプログラムで用い、254nmでモニターした。アルデヒド12とアルドール生成物（13,14）の保持時間は、各々6.35分及び8.78分である。速度論実験についてはケトン濃度を5% v/vに固定し、アルドール付加反応の実験では12又は6+7の濃度を30〜200μMに変動させた。アニオン交換カラムを用いた追加の精製工程後にも抗体を分析し、同じ結果であった。
レトロアルドール反応の分析（図13）
両者の抗体は、ミカエリス・メンテン速度論によるアルドール付加の触媒作用を示した。レトロアルドール反応においてβ−ヒドロキシケトン４からアセトンとアルデヒド３を生成するこれら２抗体の能力を、アルコールデヒドロゲナーゼとβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元形（NADH）によるカップリング酵素分析において340nmのUV吸光度の低下を追跡することによりモニターした。典型的な手順は次の通りである。0.2mM EDTA、100mMトリス、4.5mg酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、0.43mg NADH及び4mM β−ヒドロキシケトン（13,14）を含む溶液、100ml、pH=7.5をマイクロタイタープレートの４ウェルに導入した。抗体38C2と33F12（100ml, 34.6mM, トリスバッファー, pH=7.5）を２つの別個のウェルに加えた。残りのウェルには100mlのバッファーのみ加え、ブランクとした。340nmの紫外線吸光度を24時間15分毎に測定した。ブランクの吸光度を触媒反応から引き、ε=6220M-1cm-1を用いて速度を求めた。抗体38C2と33F12は、同じkcat=4.53 10-3 min-1であった。これはHPLC測定と十分に相関する。アルデヒド12の生成を、アルコールデヒドロゲナーゼによる続いての還元及びNADHの消費によってモニターした。レトロアルドール反応をHPLCによって実験し、同じ結果を得た。抗体38C2についてのミカエリス定数KMと触媒速度定数kcat値は、各々54μMと4.4×10-3min-1であった。残りの18個の抗体は、合成及びレトロ合成アルドール反応を触媒するのに不安定であり、重要な中間体を生成したもののみ活性であることが示された（図13）。
アルドール反応に対する基質阻害
エナミン中間体を含むアルドール反応を阻害するハプテン５とアセチルアセトンの能力を確認した。３当量のハプテン５か又はアセチルアセトンを供給した場合、アルドール付加又はレトロアルドール分析の前に触媒活性が完全に阻害され、1,3-ジケトンとエナミン中間体とのトラッピングがLysε−アミノ基を含む触媒作用を妨げることが示された。トラッピング分析におけるハプテン及び触媒分析におけるアセトンとのエナミン生成が同じLys残基に依存することを確かめるために、アセトンとインキュベートした抗体をNaBH4で処理した。アセトンと抗体中のLysε−アミノ基との反応において生成したイミン中間体をNaBH4で還元すると、必要なアミンの不可逆イソプロピル化が生じた（Changら, Science 183, 1204（1974）; A.J. MorrisらBiochemistry 33, 12291（1994））。処理後、ジケトンによるビニローグアミドの生成能において抗体は完全に失活した。これらの実験から、1,3-ジケトンハプテンで誘導された反応機構と残留物は触媒反応において回復したものと同じであることが証明される。抗体アルドラーゼは、広範囲の至適pH６〜10を示し、クラスＩ天然アルドラーゼで見られるものに近似した。
アルドールドナーの効率
抗体は、アルドールドナー基質としてアセトン、フルオロアセトン、クロロアセトン、2-ブタノン、3-ペンタノン、2-ペンタノン及びジヒドロキシアセトンを受容する。2-ブタノン及び2-ペンタノンとの反応においては、抗体は最も置換されたエナミンの優先的生成によってアルドール付加の位置選択性の制御を示す。これらの基質との触媒作用の相対効率は、ペンタノンに対するアセトン系のkcat/KMで反映するように1/42倍向上する（図9,エントリー1, 3又は5）。抗体は、ドナーとしてアセトアルデヒドを受容せず、アルドール付加がアルドールドナーとしてのケトンによることが証明される。我々が単離した２つの触媒は、ドナーとしてアセトン又は脂肪族ケトン及びアクセプターとして3-フェニルプロピオンアルデヒド誘導体によるアルドール付加に対する点で制限される。
3-フェニルプロピオンアルデヒドアクセプター（6+7）とアルドール反応してβ−ケトン生成物を生じる（9,10）
分枝鎖の3-フェニルプロピオンアルデヒアクセプター（6+7）（図9,エントリー1）とアセトンとの反応は、最も効率が良く、ほとんど生成物阻害を示さなかった（図8）。実際に、１％未満の触媒が比較的短い時間で基質の高変換を得るのに十分である。反応は、消費した各モルのアルデヒドがβ−ヒドロキシケトン生成物（9,10）（図８及び９）に変換されるので所望のアルドール生成物のみ生じる。この反応については、抗体分析に用いられる同じ条件下でpH=7.5の触媒しないバックグラウンド反応速度、kuncat=2.28×10-7 M-1 min-1が求められた（Reymondら, Tetrahedron Lett. 36, 2575（1995））。これにより、抗体仲介触媒の効率を求めることができる。両抗体、38C2と33F12の（kcat/KM）/kuncatは〜109である。触媒の効率は、大部分が高有効モル濃度、kcat/kuncat>l05Mとして反映される抗体触媒反応でのエントロピー利点によるものである。抗体アルドラーゼの触媒効率（kcat/KM）は最も実験された酵素フルクトース−1,６−ビスホスフェートアルドラーゼより〜1/4000倍速くなるだけである（Changら, Science 183, 1204（1974）; Tolanら, Biochemistry 33, 12291（1994））。図９、エントリー１に示された反応の抗体38C2の触媒効率は、酵素２−デオキシロボース−５−ホスフェートアルドラーゼによる触媒で得られたものより64倍大きい。
アルドール生成物の生成物分布
（6+7）とアセトンとの抗体触媒反応の生成物分布を確認した。キラル支持体の順相HPLCカラムで30%変換した後に生成物分布を求めた（図7）。抗体は共に、この基質のC-2の立体化学に無関係に（6+7）のリフェースへのジアステレオ選択付加を触媒する。４個のジアステレオマーが均一プログラム7/1; ヘキサン／エタノール, １ml／分, 254nmによるDAICELキラルパックOJカラム上で分離した。４個の異性体の保持時間は、19.74（4R,5R）、23.32（4R,5S）、25.15（4S,5R）及び27.91（4S,5S）であった。相対配置は以前に求められている[RP-C18カラム（MICROSORB-MV, 0.45cm×22cm）を77/23; H2O（0.1%トリフルオロ酢酸）/H2O:アセトニトリル1:1, 1.5ml／分で用い、254nmでモニターした]。アルデヒド（6+7）とβ−ヒドロキシケトン（13,14）の保持時間は、各々19.20分と21.92分である。絶対配置は、触媒が２−デオキシロボース−５−ホスフェートアルドラーゼ（DERA）である実験から演繹した。DERAは、C-4の（S）配置をもつアルドール生成物のみを生じる（C.-H. Wong & G.M. Whitesides, Enzymes, Synthetic Organic Chemistry（Permagon, Oxford, 1994）。DERAによって生じたアルドール生成物は、（4S,5R）-（化合物9）（92%ジアステレオマー過剰,de）と（4S,5R）-（化合物10）（>95%de）の1:4.5混合物からなる。この特定の形質転換の速度論パラメーターはkcat=4.5×10-2 min-1及びKm=3400mMであった。アルドール反応は、（S）-（6）についてはクラム・フェルキン方法により（4S,5S）-9生成物を生じ、（R）-（7）についてはアンチクラム・フェルキン方法により（4S,5R）-10生成物を生じる。抗体は同様の化学収率でこれらの生成物を生じ、アルドール付加においてラセミ体アルデヒドの速度論分割を示さなかった。２つの抗体は、アセトンの求核基抗体−エナミンに相対する抗体の結合ポケットにおいて（6+7）に配向させる触媒の能力を反映する反応のジアステレオ面の選択性の制御能で区別する。この区別を示す結合は、また、抗体における（6+7）のKMの差に反映される（図9）。
化合物20の合成（図10）
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化合物20: 1.0当量の4-ヨードアニリン（Aldrich）を0.10モル塩化メチレンに懸濁し、０℃に冷却した。次に、1.1当量の酢酸無水物と1.1当量のトリエチルアミンを加え、混合液を０℃で２時間攪拌した。tlcでモニターされた反応が完了すると、混合液を塩化アンモニウム、水の連続飽和溶液洗浄液で急冷し、硫酸マグネシウムで乾燥した。化合物を蒸発し、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物20を全収率81%で得た。
化合物（6+7）の合成（図10）
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化合物6+7: Jeffreyら, J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1287（1984）から変更したヘック反応を用いる手順: 1.0当量の化合物20を窒素下25〜30℃で0.10モルのジメチルホルムアミドに懸濁した。次に、1.1当量の重炭酸ナトリウム、1.1当量の２−メチル−２−プロペン−１−オール（Aldrich）及び２モル%PdCl2を加え、混合液を12時間攪拌した。tlcでモニターされるように反応が完了すると、混合液を酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウム、水の連続飽和溶液洗浄で急冷し、硫酸マグネシウムで乾燥した。化合物を蒸発し、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物6+7を全収率81%で得た。
化合物（12）の合成（図10）
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化合物12: Jeffreyら, J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1287（1984）から変更したヘック反応を用いる手順: 1.0当量の化合物20を窒素下25〜30℃で0.10モルのジメチルホルムアミドに懸濁した。次に、1.1当量の重炭酸ナトリウム、1.1当量のアリルアルコール（AIdrich）及び２モル%PdCl2を加え、混合液を12時間攪拌した。tlCでモニターされるように反応が完了すると、混合液を酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウム、水の連続飽和溶液洗浄で急冷し、硫酸マグネシウムで乾燥した。化合物を蒸発し、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物12を全収率81%で得た。
化合物の合成（8-11; 13,14-図10）
典型的には、50〜100mgのアルデヒド、１mlのケトン、４mlのH2O及び10mlのNaOH飽和溶液を１時間振盪した。生成物を分離し、分取用逆相HPLCで精製した。
触媒特異性の確認:
天然酵素はアルドールアクセプターに対して広範囲な特異性を示すが、アルドールドナーは一般的には天然基質に制限される。合成において天然酵素の適用を最も制限する態様は、基質の範囲のかなり不十分な受容である。対照的に、本明細書に開示されるアルドラーゼ抗体のドナー基質の特異性は、天然酵素と比べて非常に向上する。例えば、抗体触媒を実験したケトン（図9）の中でアセトンだけが天然酵素の基質である。対照的に、抗体アルドラーゼは様々なアルドールドナーとアクセプターを用いることができる。抗体は、アルドールドナー基質としてアセトン、フルオロアセトン、クロロアセトン、2-ブタノン、3-ペンタノン、2-ペンタノン及びジヒドロキシアセトンを受容する。2-ブタノン及び2-ペンタノンとの反応においては、抗体は最も置換されたエナミンの優先的生成によりアルドール付加の位置選択性の制御を示す。これらの基質との触媒の相対効率は、ペンタノンに対するアセトン系においてkcat/KMで反映するように1/42倍向上する（図9）。抗体がドナーとしてアセトアルデヒドを受容しないことにより、アルドール付加がアルドールドナーとしてのケトンによることが証明される。大体において、ジケトンハプテンはハプテン５の２つのケト位置のいずれかで反応する抗体を誘導しなければならず、よってどちらかの方向でアルドール付加する触媒を生成する（図9）。我々が単離した２つの触媒は、ドナーとしてアセトン又は脂肪族ケトン及びアクセプターとして3-フェニルプロピオンアルデヒド誘導体によるアルドール付加に対する点で制限される。付加抗体のスクリーニングは、3-フェニルプロパノン誘導体がアルドールドナーとして許容されかつ脂肪族アルデヒドが図９に示されるようにアクセプターとして働く反応の触媒を示さなければならない。
ハイブリドーマの寄託:
ATCC受託番号HB12005を有するハイブリドーマ38C2（JW 38C2）及びATCC受託番号HB12004を有するハイブリドーマ33F12（JW 33F12）の寄託は、ブダペスト条約に従ってなされ、寄託期間は寄託機関での寄託日から30年間又は本出願から達する米国特許の実施しうる存続期間のいずれか長いほうでなければなならない。寄託機関で生育不能になる細胞系は、補充されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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