(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０℃の温度条件下で生育可能で、かつリン酸を吸収する能力を有することを特徴とする単離された糸状体ラン藻Fischerella muscicola Gomont Ｇ-４（ＦＥＲＭ Ｐ-１６０７０）。
【請求項２】
請求項１に記載の糸状体ラン藻Fischerella muscicola Gomont Ｇ-４をアルギン酸ナトリウムまたは寒天内に封入して形成された、ことを特徴とする水質浄化剤。
【請求項３】
ガラス繊維フィルターからなる保持材で保持されている請求項２に記載の水質浄化剤。
【請求項４】
請求項２または３に記載の水質浄化剤を環境水中に固定する工程を含む、ことを特徴とする環境水の水質浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リン酸を吸収する能力を有する単離された新規のラン藻（藍藻）とその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
初夏から夏にかけて、湖沼や内湾でのアオコや赤潮の発生が毎年のように報告されている。  特に、現在、陸水（湖や池など）で問題になっているのはアオコによる水質汚染である。  この汚染原因は、この時期に短時間の内に大量に発生するラン藻（水の華）であるとされている。  このアオコの発生により、有毒物質（アナトキシン、ミクロシスチンなど）が形成・放出されると共に、酸欠により魚介類が死滅する現象のみならず、飲料水にカビ臭が付くなどの衛生上の問題をも引き起こすことが知られている。
【０００３】
このようなラン藻の急激な増殖は、温度、水質等のいくつかの条件がラン藻の生育条件と符合した時に発生する。  従って、これらラン藻の必須生育条件の一つを除去することで急激なラン藻の増殖の抑制が可能であると考えられている。
陸水中でのラン藻類の生育に深く関与している因子として、温度、光強度およびリン酸の濃度などがある。  この内、陸水中でのリン酸濃度を低減することで、湖沼や内湾でのアオコや赤潮の発生が抑制できるとされている。  そして、これまでにも、陸水や上水中のリン酸を除去する方法として、生物学的方法や化学的方法が種々提案されている。  前者の代表例として、上水場の活性汚泥中に棲息する微生物によるリン酸の捕食作用を利用する方法があり、また後者の例として、汚水（下水）にアルミニウムを添加してリン酸アルミニウムとしてリン酸を沈殿除去する方法がある。  しかしながら、前者の方法によれば、リン酸を取り込んだ微生物の除去が必要となり、また後者の方法によれば、除去手段として利用したアルミニウム自体が汚染物質であり、また沈殿物（リン酸アルミニウム）の除去も必要となるなど、リン酸を取り込んだ微生物・沈殿物の回収に手間と労力を要する点が課題として残されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した従来技術での問題点に鑑み、リン酸をラン藻によって吸収せしめることで、陸水中のリン酸の除去、ひいてはアオコ発生の解消と陸水の水質浄化を図ることを目的とし、鋭意研究を進めた結果、本発明の完成に至ったものである。
【０００５】
すなわち、本発明の要旨とするところは、優れたリン酸吸収能を有する単離されたラン藻と、水質浄化を目的としたこれらラン藻の利用にある。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、▲１▼ラン藻のスクリーニング、▲２▼ラン藻のリン酸吸収能の評価、▲３▼ラン藻の固定化剤ならびに固定化方法、および▲４▼ラン藻保持剤ならびに保持方法について検討を行った。
【０００７】
ラン藻は、様々な場所で生育する。  その中でも、温泉地に生育するラン藻は生育速度が速いため、短時間で必要な細胞数を集めることができる。  例えば、Synechococcus vulcanusに属するラン藻の細胞は約４時間（最適条件では３時間）で１回分裂するのに対し、温泉地以外の場所に生育するラン藻では１回の細胞分裂に約８時間以上の時間を要している。  また、ラン藻は、通常、室温で保管することから他の微生物が混入する可能性も低く、もし混入があっても高温（40〜55℃程度）での培養・増殖を行うことで混入微生物を死滅できるなどの有利な点がある。  このような事情から、本発明者らは、和歌山県や北海道の温泉地13ヶ所を回ってラン藻の採取を行い、一般的なラン藻用培地で良好に生育し、かつ純粋な状態で単離できた３株を選択した。
【０００８】
単離したこれら３株を、単細胞ラン藻 Synechococcus vulcanus Y-34 (以下、『Y-34』と称する）、糸状体ラン藻 Fischerella letestui Fremy H-2(以下、『H-２』と称する）、および糸状体ラン藻 Fischerella muscicola Gomont G-4 ( 以下、『G-４』と称する）とそれぞれ命名し、平成９年２月７日に、本願出願人によって、茨城県つくば市東町１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、それぞれ受託番号 FERM P-16071 、 FERM P-16069 および FERM P-16070 が付与されており、本願発明は、この寄託微生物自体はもちろん、この微生物の能力を実質的に引き継いだその変異体および子孫まで意図するものである。
【０００９】
次に、単離株と通常のラン藻のリン酸吸収能を分析化学的に定量し、本発明のラン藻のリン酸除去能力を検討した。
【００１０】
さらに、本発明のラン藻の施工現場での施工性を考慮して、ラン藻の固定化剤による固定化を検討した。  ラン藻の細胞は、単細胞ラン藻では２〜５μｍ、また細胞が繋がった糸状体ラン藻でも５〜10μｍという大きさであり、このような大きさの細胞を直接的に取り扱うのは非常に困難であり、また使用している細胞が環境中に放出されると、この放出されたラン藻によって環境汚染（二次汚染）を引き起こすことが懸念される。  よって、ラン藻細胞の取扱いを容易ならしめ、かつ細胞の環境への放出を防止すべく、固定化材についても検討を加えることにした。  本発明のラン藻に適用可能な固定化材としては、取扱性と環境に対する影響を考慮すれば、天然素材の固定化材、特に、アルギン酸ナトリウムや寒天などが好ましい。
【００１１】
また、陸水の水質浄化の目的で、ラン藻細胞を取り込んだ固定化剤を湖沼などに設置する際の実用性を考慮して、固定化材に封入されたラン藻を設置箇所で保持するための保持材についても検討を行った。  つまり、固定化材に封入されたラン藻に環境水を通すことでリン酸の除去を行うと共に、固定化材から漏出したラン藻の環境水中への放出を防ごうとするものである。  本発明に適用可能な保持材としては、取扱性、環境に対する影響、耐久性、水透過性などを考慮すれば、ガラス繊維フィルターやサラシ綿などが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下に、本願発明を具体的に説明するが、本願発明が以下の実施例の開示に基づいて限定的に解釈されるべきでない。
【００１３】
実施例１：ラン藻の単離と特徴
和歌山県と北海道の温泉地13ヶ所から採取したラン藻試料を、以下の手順に従って、単離した。
【００１４】
〔試料の単離〕
温泉地から採取したラン藻試料をBG11液体培地（組成を下記表１を示した）に接種し、水槽に50℃の水を張り、水槽に培養瓶を浸し、培養瓶に空気を通気しながら、光（100W白熱球）を当てて培養を１週間継続した。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
１週間の培養の後、培養物を超音波処理する。  この超音波処理によって、糸状体ラン藻を構成する細胞は互いに分離され、単一の細胞となる。
【００１７】
次に、ラン藻細胞を滅菌済のBG11培地で洗浄し、オートクレーブした無菌の寒天培地にこのラン藻細胞を接種した。
【００１８】
雑菌より離間した位置に生えたラン藻細胞を選択・採取し、これを他の寒天培地に植え継ぎ、所望のラン藻細胞の増殖を行った。
【００１９】
これら試料の内、和歌山県の川湯温泉で採取したY-34、北海道の平田内温泉で採取した H-2、および北海道の宮内温泉で採取した G-4の３株が、上記方法を経て純粋な状態で単離できた。  各株の性質は以下の通りであった。
【００２０】
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0003913308.tif 000004
実施例２：ラン藻のリン酸除去効果
実施例１で単離した３つのラン藻に関して、そのリン酸除去性能を以下の手順に従って定量と評価を行った。
【００２１】
(1) 検量線の作成
リン酸の定量は、ＪＩＳ規格K-0120に記載のモリブデン青［塩化すず(II)］吸光度法に基づいて行った。
【００２２】
〔モリブデン酸アンモニウム溶液の調製〕
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物15ｇを、水 150mlに溶かした。  この溶液中に、硫酸溶液（水600ml に硫酸182ml を静かに攪拌しながら加えて放冷したもの) を攪拌しながら加え、アミド硫酸アンモニウム10ｇを溶かし、全量が１ｌになるように水を加えた。
【００２３】
〔塩化すず(II)溶液の調製〕
塩化すず(II)二水和物１ｇを塩酸５mlに溶かし、水を加えて50mlにする。  そして、小粒のすずを数個加えた。
【００２４】
〔吸光度測定〕
試料８mlにモリブデン酸アンモニウム溶液１mlを加えて振り混ぜ、さらに、塩化すず溶液50μl 、水0.95mlを加えて振り混ぜた。  15分間放置した後、700nm 付近のピークの吸光度を測定した。
【００２５】
〔検量線の作成〕
リン酸濃度0.02〜６ppm の範囲で、リン酸イオン溶液を８点用意し、上述の方法に従って吸光度を測定した。  得られた吸光度値を下記表２に示し、その結果を図１にグラフとして示した。  なお、0.5ppm以上のリン酸濃度については、１cmセルを、また、0.5ppm以下のリン酸濃度については、発色が小さいので、５cmの長吸収セルを用いて吸光度を測定した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
(2)  Y-34 によるリン酸吸収能の測定
リン酸濃度が６ppm の培地を用意し、そこにラン藻Y-34の0.01ｇを培養した。このリン酸濃度は、富栄養状態のリン酸濃度（0.07〜0.3ppm) よりもはるかに高いリン酸濃度である。  培養開始後、約10時間おきに培地の上清を採取し、実施例２(1) に記載の方法に従って吸光度測定を行い、図１に記載の検量線に基づいてリン酸の定量を行った。  残存リン酸濃度を下記表３に示し、その結果を図２にグラフとして示した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
表３および図２に記載の結果から、６ppm のリン酸濃度の培地では、培養を開始して73時間後には０ppm までリン酸濃度が減少した。  つまり、６ppm という高いリン酸濃度の培地でも培養開始から３日以内に貧栄養状態に至ったものであり、さらに高濃度のリン酸についても、Y-34によるリン酸除去が期待できる。
【００３０】
(3) H-2 と G-4によるリン酸吸収能の測定
リン酸濃度が5.5ppmの培地を用意し、 H-2と G-4の各0.01ｇを、個別に培養した。  このリン酸濃度は、富栄養状態のリン酸濃度（0.07〜0.3ppm) よりもはるかに高いリン酸濃度である。  培養開始後、約10時間おきに培地の上清を採取し、実施例２(1) に記載の方法に従って吸光度測定を行い、図１に記載の検量線に基づいてリン酸の定量を行った。  残存リン酸濃度を下記表４に示し、その結果を図３にグラフとして示した。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
この実験結果によれば、 G-4の場合で培養開始後約 3.5日後に、一方、 H-2の場合で約６日後には0.006ppmのリン酸濃度となり、いずれの培地でもほとんどすべてのリン酸が吸収されていた。
【００３３】
(4) 単細胞ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 と
糸状体ラン藻 Phormidium sp. によるリン酸吸収能の測定
東京大学教養学部の池内昌彦博士より委譲された、パスツゥール藻類保存施設(Pasteour Culture Collection) 由来の単細胞ラン藻 Synechocystis sp. PCC6803〔室温（25℃）培養株〕と、兵庫県赤穂郡上郡町に所在の姫路工業大学理学部の敷地内で採取した糸状体ラン藻 Phormidium sp. 株〔30℃培養株〕を、実施例１に記載の単離方法に従って、室温下で単離した。  そして、これら二つの単離株について、それぞれのリン酸吸収能力について検定を行った。
【００３４】
リン酸濃度が６ppm の培地を用意し、そこにラン藻 PCC 6803 と Phormidium sp. の各0.01ｇを培養した。  この６ppm のリン酸濃度は、富栄養状態のリン酸濃度（0.07〜0.3ppm) よりもはるかに高いリン酸濃度である。  培養開始後、約10時間おきに培地の上清を採取し、実施例２(1) に記載の方法に従って吸光度測定を行い、図１に記載の検量線に基づいてリン酸の定量を行った。  残存リン酸濃度を下記表５に示し、その結果を図４にグラフとして示した。
【００３５】
【表５】
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【００３６】
表５および図４に記載の結果から、６ppm のリン酸濃度の培地では、培養を開始して 141時間後(PCC 6803)、および 185時間後(Phormidium sp.)に1000分の１以下のリン酸濃度にまで減少した。  つまり、６ppm というリン酸濃度を貧栄養状態に至らしめるまでに、単細胞ラン藻PCC 6803で６日、糸状体ラン藻Phormidium sp.で 7.5日もの日数を要していた。
【００３７】
(5) まとめ
実施例２(2) 〜(4) の結果から、本発明者らが単離したY-34、 H-2および G-4は、いずれも、コントロール株である単細胞 Synechocystis sp.PCC 6803および糸状体 Phormidium sp. よりも強力なリン酸吸収能を有していることが実証された。
【００３８】
すなわち、これら単離株は富栄養状態のリン酸濃度の約20倍に相当する６ppm 前後のリン酸濃度条件下でも、６日以内（Y-34と G-4では 3.5日以内）にほとんどのリン酸を吸収除去し、通常のラン藻（コントロール株）よりも迅速にリン酸の除去ができ、その有用性が確認されたのである。
【００３９】
特に、これら本発明の単離ラン藻は、培養の至適条件下では約４時間で１回細胞分裂を起こし、他に類を見ない速さで分裂するものであり、この生理活性の高さが優れたリン酸吸収能の一因であると考えられる。  このように、本発明者らが単離した３種のラン藻は、優れたリン酸吸収能を有し、陸水の水質浄化に少なからず寄与するものと考えられる。
【００４０】
実施例３：ラン藻の固定化
実施例２でリン酸吸収能が確認された３つの単離ラン藻に関して、その固定化方法ならびに固定化材について検討を行った。  すなわち、本実施例では、(1) アルギン酸ナトリウム、(2) κ−カラギーナン、(3) 寒天および(4) ポリアクリルアミドを用いてラン藻の固定化を試み、各単離ラン藻に好適な固定化材を検討した。
【００４１】
(1) アルギン酸ナトリウム
アルギン酸ナトリウムは、紅藻などが合成する天然高分子化合物であり、粘稠剤（食品添加物）として利用されている物質である。
【００４２】
(i)  Y-34 の固定
まず、アルギン酸ナトリウム４ｇに 200mlの水を加えた。  そして、これを80℃の湯浴中にて攪拌しながら、アルギン酸ナトリウムを溶解したものを、固定化用のアルギン酸ナトリウム溶液とした。
【００４３】
次に、Y-34の培養液を遠心分離 (5000×ｇ、10分) して得たラン藻0.02ｇを、前述のアルギン酸ナトリウム溶液 400μl に加えたものを、５％塩化カルシウム溶液に滴下してラン藻の固定化（一段階固定）を行い、１時間放置した。
【００４４】
固定化したラン藻を取り出し、DyerとGafford の改良培地に入れ、実施例１に記載の培養条件に従って培養を行った。  なお、この場合、水槽に50℃の水を張り、水槽に培養瓶を浸し、培養瓶に５％炭酸ガスを含む空気を通気しながら、光を当てて培養を行った。
【００４５】
そして、一段階固定した小粒のラン藻をアルギン酸ナトリウムと混合し、５％塩化カルシウム溶液に滴下してラン藻の固定化（二段階固定）を行い、１時間後に固定化したラン藻の粒を取り出した。  そして、前出の培養条件に従って培養を行った。
【００４６】
一段階固定によって得られた固定化ラン藻は、比較的容易に調製できた。  しかし、この固定化ラン藻を培養したところ、培養開始の翌日には固定化粒が白化し、ラン藻細胞の大部分が死滅した。  その後さらに培養を続けたところ、生存していたラン藻がアルギン酸ナトリウムのカプセル外で増殖し始め、培養試験管全体が緑色を呈するケースもあった。  これは、調製したアルギン酸ナトリウムカプセルが壊れやすかったことと、カプセル表面にまで漏出したラン藻細胞が増殖したことによるものと考えられる。
【００４７】
そこで、一段階固定したラン藻の再固定化（二段階固定）を行ったが、二段階固定自体が難しい作業であり、一つのカプセルに４〜５個の一段階固定したラン藻が入ってしまった。  この二段階固定カプセルの培養を行ったところ、固定化ラン藻粒が白化するなど、一段階固定ラン藻と同様の結果となった。
【００４８】
この固定化ラン藻粒の白化現象は、カプセル内に二酸化炭素や栄養分の取り込みが不十分な状況下で、強光が照射されたことも一因と考えられ、この点を改善することで実用性が図れるものと考えられる。
【００４９】
(ii) H-2および G-4の固定
H-2または G-4の各培養液を遠心分離 (5000×ｇ、７分) して回収したラン藻0.05ｇを、前記(i) で調製したアルギン酸ナトリウム溶液と混合し、５％塩化カルシウム溶液中に滴下した。  １時間後に、固定化ラン藻を取り出し、培養液をBG11とした以外は、前記(i) に記載の Y-34 と同様の条件・手順にて培養した。糸状体ラン藻の固定化は、 Y-34 と同様、簡単に行うことができた。  増殖速度は Y-34 よりも早く、白化現象も認められなかった。  しかし、培養開始の３日後には、糸状体ラン藻が繋がったままカプセル外に出て、マリ藻のようにカプセルを包むように増殖していた。  また、糸状体の一部が分解して、カプセル外に遊離して増殖するものもあった。  ただし、 Y-34 のように、カプセル外部に漏れた細胞が培養液全体に拡散して増殖することはなかった。
【００５０】
糸状体ラン藻は、ラン藻細胞が繋がって一つの個体を形成しているため、カプセル外に漏れ出てもすぐに遊離せずに、繋がった状態を維持しながら増殖する。しかし、漏出量自体は少量であり、しかも、 Y-34 より増殖速度が速く、また、カプセルの白化現象も認められなかった。  これら結果から、漏出した細胞を捕獲する担体や保持材（フィルター等）を工夫することで、アルギン酸ナトリウムの固定化材としての実用性が期待できる。
【００５１】
(iii) 架橋剤の利用
上記(i) でのアルギン酸ナトリウムによる固定化効果を改善すべく、Y-34とアルギン酸ナトリウムを共有結合させる架橋剤を用いて、ラン藻細胞の固定化を行った。  また、塩化カルシウム溶液でゲル化すると、培地中のリン酸によって、アルギン酸ナトリウム製カプセルが溶解してしまうので、他の多価金属イオンの利用も検討した。
【００５２】
まず、液体培地（DyerとGafford の改良培地）で培養した Y-34 の細胞を遠心分離 (5000×ｇ、10分) で回収した。  これに、上記(i) でのアルギン酸ナトリウム溶液 150μl と、20％水溶性カルボジイミド溶液（架橋剤）を終濃度が１％になるように混合して得られた混液を、0.34Ｍ塩化マグネシウム溶液、0.34Ｍ塩化第二鉄溶液あるいは0.34Ｍ塩化カルシウム溶液中に滴下してラン藻の固定化を行った。  １時間後に固定化ラン藻を回収し、上記(i) に記載の培養条件に従って培養を行った。
【００５３】
その結果、塩化マグネシウム溶液を用いた場合にはアルギン酸ナトリウムのゲル化は認められず、また、塩化第二鉄溶液の場合にはゲル化はしたものの沈殿物しか得られなかった。  一方で、塩化カルシウム溶液では首尾良くゲル化（固定化）ができたので、この固定化物の培養を行ったが、固定化材からのラン藻の漏出が認められた。
【００５４】
これらの結果から、架橋剤と金属イオンの選択の幅を広げる（架橋剤と金属イオンの組み合わせの多様化を図る）ことが今後の研究課題とされた。
【００５５】
(2) κ−カラギーナン
Y-34 の固定化剤として、κ−カラギーナンの使用を検討した。
【００５６】
まず、κ−カラギーナン２ｇを80℃の湯浴中で 0.9％塩化ナトリウム溶液45mlに溶解した。  κ−カラギーナンがすべて溶解するのを待って、45℃まで冷却し、細胞懸濁液と混合するまで45℃で維持し、細胞懸濁液との混合液をκ−カラギーナン溶液として用いた。
【００５７】
次に、 Y-34 の培養液を遠心分離 (5000×ｇ、10分) して回収したラン藻 0.5ｇを、培地（DyerとGafford の改良培地）で懸濁した後、終濃度が 3.8％になるようにκ−カラギーナン溶液を添加して混合し、10℃で30分間冷却した。
【００５８】
κ−カラギーナンによるラン藻の固定化は可能であった。  この固定化方法は、共有結合によりラン藻を固定するというよりも、むしろκ−カラギーナン溶液を、温度変化を利用して、ゲル化することで細胞を固定化する方法である。
【００５９】
ところが、ラン藻の培養温度（50℃) では、κ−カラギーナンのゲルが溶解するため、実用性の検討をするに至らなかった。  つまり、κ−カラギーナンは45℃で凝固する性質を有し、また、κ−カラギーナンのゲル→ゾル変化は温度によって可逆的であるため、45℃〜50℃での固定化作業、換言すれば、ラン藻の培養温度（50℃) ではκ−カラギーナンは溶融してしまい、ラン藻の固定化目的でκ−カラギーナンは使用できないことが判明した。
【００６０】
κ−カラギーナンの例から、ラン藻の固定化において、固定化材の融解温度が重要な因子であることが明らかとなった。
【００６１】
(3) 寒天
(i)  Y-34 の固定
まず、寒天 0.6ｇを20mlの水に溶かし、80℃の湯浴中にて攪拌しながら溶解した。  寒天がすべて溶けたら50℃まで冷まし、この温度を維持したものを、固定化用寒天とした。
【００６２】
次に、 Y-34 の培養液を遠心分離 (5000×ｇ、７分）して回収したラン藻 0.7ｇを、14mlのDyerとGafford の改良培地で懸濁し、前述の寒天溶液15.8mlに加え、固化（固定化）するまで放置した。  固定化した緑色の塊を、約５mm角に切り、実施例３(1)(i)での培養条件に従って培養を行った。
【００６３】
ラン藻の固定化は容易に行うことができた。  この固定化ラン藻を培養したところ、寒天の白化現象は認められなかった。  これは、寒天へのラン藻細胞の封入が、非常に温和な条件下で行われたことに起因するものと考えられる。
【００６４】
寒天による固定化も、温度変化を利用してラン藻の固定化を行うものであるが、前出のκ−カラギーナンより固化温度が低いため、固定化のための温度範囲が広く、扱いやすい利点がある。  また、前述したように、固定化剤と固定化法が温和なため、封入された細胞の多くが生存でき、従って、固定化ラン藻の白化を招かずに増殖できるなどの有用性がある。  寒天は、ラン藻に対して条件的に温和な素材であるので、寒天濃度、細胞懸濁液の濃度を変えることで、より有効に利用できるものと思われる。
【００６５】
さらに、ラン藻細胞を50℃という高温で培養することで、寒天ゲルの溶解が懸念されたが、このような問題は生じなかった。  これは、寒天が固化する温度と融解する温度が異なることによるものであり、この点も寒天を用いる場合の利点の一つである。
【００６６】
(ii) H-2および G-4の固定
H-2または G-4の各培養液を遠心分離 (5000×ｇ、７分) して回収したラン藻２ｇを、BG11培地20mlに懸濁し、前記(i) で調製した寒天溶液20mlと混合し、固まるまで放置した。  これを約５mm角に切り、実施例３(1)(i)での培養条件に従って培養を行った。
【００６７】
ラン藻の固定化は容易に行うことができた。  この固定化ラン藻を培養したところ、寒天中の細胞は白く退色することもなく、鮮やかな緑色が保たれていた。単細胞Y-34と異なり、糸状体ラン藻は細胞が繋がっているので、寒天からはすぐに遊離せず、培養液全体が緑色を呈することはなかった。  また、固定化した糸状体ラン藻は取扱いが容易で、しかも増殖が速いので、固定化したラン藻を適切な保持材で保護することを含めた改良を行うことで、環境水中のリン酸除去用途への実用性は増すものと考えられる。
【００６８】
(4) ポリアクリルアミド
３日間培養した Y-34 の細胞を遠心分離 (5000×ｇ、10分) により回収し、終濃度が12％になるように30％アクリルアミド溶液と混合し、リボフラビン存在下で光を照射して重合化を進めた。
【００６９】
照射を開始して20〜30分後に、ゲル化した固定化ラン藻を約５mm角に切り、実施例３(1)(i)に記載の培養条件に従って培養を行った。
【００７０】
また、アクリルアミドがラン藻に与える化学的影響を少なくするために、１％および３％のグルタルアルデヒドを添加してラン藻細胞内のタンパク質を架橋して安定化した後に、終濃度が12％になるように30％アクリルアミド溶液を加えて固定化したラン藻試料も調製した。
【００７１】
グルタルアルデヒド処理試料ならびに未処理試料共に、きれいに固まったが、ゲルの上層部が青緑色から黄緑色に変色するなどの変化が見られた。  これは、アルリルアミドがゲル化する際に生成するフリーラジカルによって細胞が損傷を受けたものと考えられる。  このことは、このゲルを引き続き培養した結果、青緑色を呈していた健全に見えた部分まで白化が進み、細胞が死滅したこととも符合する。  また、ゲル中央部分の固まりは弱く、若干の粥状を呈しており、この部分も培養を継続することで白化が進み、細胞の死滅が確認された。  同様の傾向は、細胞の死滅に至る時間は若干長かったが、グルタルアルデヒド処理した試料についても認められた。
【００７２】
アクリルアミドのゲル化は、化学反応による重合化であり、その反応過程でフリーラジカルが発生する。  すなわち、このフリーラジカルがラン藻細胞に作用して細胞の死滅に至ったものと思われる。  さらに、光を照射したゲル部分は、固定化（重合化）反応を行っただけで黄緑色に変色してしまい、重合反応を促進すべき光が逆効果的に作用した結果に終わった。  さらに、アクリルアミドの化学作用を考慮してグルタルアルデヒド処理も試みたが、若干の細胞の延命効果を示したに過ぎなかった。
【００７３】
このような試験結果から、フリーラジカルの発生を伴うゲル化（重合化）を介して固定化材を形成するアクリルアミドのような合成物は、本発明のラン藻細胞の固定化の用途には馴染まないと考えられる。
【００７４】
(5) まとめ
アルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、寒天およびポリアクリルアミドのいずれでもラン藻細胞の取り込み（封入）は容易に行えた。  しかしながら、固定化の過程での細胞死と、封入したラン藻細胞のゲルから漏出という課題を考慮した場合、寒天やアルギン酸ナトリウムといった、天然素材や食品添加物のような生体に対して温和な素材が適していると思われる。
【００７５】
本実施例の結果は、ラン藻細胞の水質浄化材としての用途を考える上で、固定化剤単体あるいは固定化剤と保持材との好適な組み合わせを検討する上での重要な指標となるものである。
【００７６】
実施例４：ラン藻保持材
本発明のラン藻を実際にリン酸除去のために陸水に適用する場合、何らかの手段によって固定化したラン藻を保護する必要がある。  また、このような保護策を講じることで、ラン藻を利用した水質浄化剤の運搬・設置が容易になるのみならず、この水質浄化剤に対して水を強制的に通過・循環せしめることでリン酸とラン藻を作用させてリン酸を除去する合理的なシステムも構築できる。  また、固定化材からラン藻が漏出しても、保持材によってラン藻細胞の環境水中への放出・拡散が有効に予防できる。
【００７７】
ラン藻保持材として、▲１▼ガラス繊維フィルター（濾紙タイプ）、▲２▼炭素繊維フィルター、▲３▼アセテートマット、▲４▼サラシ綿（バルク）、▲５▼コットンスパンレース（ソフトタイプ；３枚重ね）、▲６▼コットンスパンレース（ハードタイプ）および▲７▼ミラクルクロス（DF-5) を準備した。
【００７８】
(i)  Y-34 の保持
上記保持材のいずれかを敷いた各濾斗に、 Y-34 の細胞懸濁液を注いだ。  Y-34は単細胞で均一に懸濁されているので、濾過前後の懸濁液の濁度を分光光度計により測定して保持能を算出した。  その結果を、以下の表６に示した。
【００７９】
【表６】
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【００８０】
上記表６の結果から明らかな通り、ガラス繊維フィルターの場合、濾液の濁度が99.5％以上低下し、濾液は透明で緑色が全く混入していなかったが、若干の黄色を呈しており、この影響で濁度が０にならなかったものと思われる。  いずれにしても、ガラス繊維フィルターは実際には完全に細胞を保持していたので、ガラス繊維フィルターによる濾過前後の濁度差を 100％として、他の保持材の細胞保持性能の比較を行った。  その結果を、図５のグラフに表した。  図５から明らかなように、ガラス繊維フィルターに次いでサラシ綿の細胞保持力が良かったが、懸濁液のほとんどが綿に吸収されていた。  その他の保持材については、細胞保持力が弱く、実用に耐え得るものではなかった。
【００８１】
(ii)  H-2 および G-4の保持
H-2および G-4は、細胞が均一に分散されないので、 Y-34 のような濁度測定による定量はできなかったが、使用した７種類の保持材すべてについて、ラン藻細胞はほとんど完全に保持された。  しかしながら、ガラス繊維フィルター以外の保持材では、微細な細胞塊が濾液中に漏れ出していた。  また、ガラス繊維フィルターを用いた場合、細胞が完全に保持される上に、適度の速度で水を通すことも認められた。
【００８２】
従って、糸状体ラン藻とガラス繊維フィルターの組み合わせを含む浄化剤が、施工現場での本発明のラン藻によるリン酸除去効果を期待する上で、最も現実的であると思料される。
【００８３】
【発明の効果】
このように、本発明によると、当初の目的であった陸水中に含まれるリン酸を有効に吸収するラン藻の提供のみならず、アオコ発生とそれに関連する汚染・悪臭などの弊害の解消が実現される。
【００８４】
また、本発明のラン藻を、適切な固定化剤と保持剤の選択と組み合わせることで、実用に十分耐え得る生物水質浄化剤の実現に途を開くなど、様々な優れた効果を奏するのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  (a) および(b) は、リン酸濃度と吸光度の関係を示す検量線を表したグラフである。
【図２】  単細胞ラン藻Synechococcus vulcanus Y-34 のリン酸吸収効果を示すグラフである。
【図３】  糸状体ラン藻 Fischerella letestui Fremy H-2 と糸状体ラン藻 Fischerella muscicola Gomont G-4 のリン酸吸収効果を示すグラフである。
【図４】  コントロール株、単細胞ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 と糸状体ラン藻 Phormidium sp. のリン酸吸収効果を示すグラフである。
【図５】  各種保持材によるSynechococcus vulcanus Y-34 の保持能力を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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