(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオ−イノシトールに、細菌であるアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868として寄託）を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させることを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに該細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させ、これにより、培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、そして、培養液からシロ−イノソースを回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、その培養液から得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールに作用させて前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成させ、そして生成したシロ−イノソースを回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミオ−イノシトールに、細菌であるアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868として寄託）を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させることによってシロ−イノソースを生成させ、得られた反応液から生成したシロ−イノソースを単離することなしに、シロ−イノソースを含有する該反応液に還元剤を添加して作用させてシロ−イノソースからシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させることを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法中に還元剤の作用でシロ−イノソースを還元してシロ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成させ、生成されたシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを含む反応液に、再度、アセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）を作用させることにより、反応液中に存在するシロ−イノシトールには何ら影響を与えずに、シロ−イノシトールと同時に生成したミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換し、得られた反応液に次に還元剤を添加してシロ−イノソースからシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを再び生成させることにより、反応液中のシロ−イノシトールの含有量を高める、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法中にシロ−イノソースを還元した際に生成するミオ−イノシトールを、アセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）で再びシロ−イノソースへ変換する工程を数回繰り返し実行し、得られた反応液に次に還元剤を添加して、シロ−イノソースからシロ−イノシトールを生成させることにより、反応液中のシロ−イノシトールの濃度を段階的に高める、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載のアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに当該細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換することにより培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、得られた反応液からシロ−イノソースを単離することなしに、シロ−イノソースを含有する該反応液に次に還元剤を直接に添加して、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして得られた反応液からシロ−イノシトールを回収する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法中に、シロ−イノソースから還元剤でシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させた反応液に、再度、アセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）を作用させることにより反復回分で培養を実施して、反応液中に生成したミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換し、この反応液に還元剤を直接に添加して該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させることにより、反応液中のシロ−イノシトールの含有量を高め、こうして得られた反応液中からシロ−イノシトールを回収する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、その培養液から得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールと反応させて前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成せしめ、得られた反応液から生成したシロ−イノソースを単離することなしに、シロ−イノソースを含有する該反応液に還元剤を直接に添加し、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして生成したシロ−イノシトールを回収する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに選択的に変換できる特性を有して独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−18868の受託番号で寄託されたアセトバクター・エスピーAB10253株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自然界から新たに本発明者らが分離したアセトバクター属細菌AB10253株を新規な微生物として利用し、安価なミオ−イノシトール（myo−Inositol）から、医薬品その他の原料として利用価値の高いシロ−イノソース（scyllo−Inosose）を製造する方法に関する。また、本発明はミオ−イノシトールから得たシロ−イノソースを化学的に還元して、アルツハイマー病の治療薬（The Journal of Biological Chemistry、第275巻No.24、第18495〜18502頁、2000年）や、生理活性物質の合成原料（米国特許第5,412,080号明細書）、液晶化合物の合成原料（ドイツ連邦共和国公開特許第3,642,999号公報）としての用途が期待されているシロ−イノシトール（scyllo−Inositol）を効率よく製造する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミオ−イノシトールは次の平面式（A）
0003981597.tif 000002
または次の立体構造式（A'）
0003981597.tif 000003
で表される天然に産する既知の物質である。
【０００３】
また、シロ−イノソースは次の平面式（B）
0003981597.tif 000004
または次の立体構造式（B'）
0003981597.tif 000005
で表される既知の化合物である。さらに、シロ−イノシトールは次の平面式（C）
0003981597.tif 000006
または次の立体構造式（C'）
0003981597.tif 000007
で表される既知の化合物である。
【０００４】
シロ−イノシトールはミオ−イノシトールの立体異性体の一つで、動物・植物中に広く見出される物質である。また、シロ−イノソースはミオ−イノシトールの2位のアキシャルな水酸基が酸化された構造を有する化合物でこれも天然物として普遍的に存在する。
【０００５】
ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースへ変換する酵素（ミオ−イノシトールデヒドロゲナーゼ）は自然界に広く存在する酵素であり、動物、藻類、酵母、細菌等、多くの生物種からのものについて報告がある。上記酵素を有する代表的な微生物種としては、グルコノバクター属細菌（Helvetica Chimica Acta、第24巻、第1045〜1058頁、1941年及びJournal of Organic Chemistry、第26巻、第912〜918頁、1961年等）、バチルス属細菌（特開平4−126075号公報）、シュードモナス属細等（Monatshefle fur Chemie、第100巻、第1327〜1337頁、1969年及びJournal of Bacteriology、第131巻、第872〜875頁、1977年）がある。なお、グルコノバクター属細菌を記載する前記のHelvetica Chimica Acta、第24巻、第1045〜1058頁（1941年）及びJournal of Organic Chemistry、第26巻、第912〜918頁（1961年）等の論文中にはAcetobacter oxydansあるいはAcetobacter suboxydansと記載されているが、これらの菌株はその後Gluconobacter属として再分類され、Bargcy’s Manual of Deteminative Bacteriology第8版（1974年）から以降はGluconobacter属に移されている。
【０００６】
また、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールへ変換できる微生物としてはアグロバクテリウム属細菌が知られている（特開平9−140388号公報）。
【０００７】
一方、化学合成的手法でシロ−イノソースまたはシロ−イノシトールを製造する方法としては、(1)ヘキサヒドロキシベンゼンをラネイニッケルで還元し、シロ−イノシトールを得る方法（Journal of the American Chemical Society, 70巻、293頁、1948年）；(2)グルコフラノース誘導体から5段階の反応でシロ−イノソースを得た後、還元して、シロ−イノシトールを得る方法（Journal of the American Chemical Society、第90巻、第3289〜3290頁、1968年）；(3)シス−トリオキサ−トリス−ホモベンゼンを原料に4段階以上の反応でシロ−イノシトールを得る方法（Angwandte Chemie、第85巻、第1110〜1111頁、1973年）；(4)ミオ−イノシトールを白金触媒で酸化してシロ−イノソースを得、続いてエステル化した後、還元と加水分解を行って、シロ−イノシトールを得る方法（ドイツ連邦共和国公開特許第3,405,663号公報）等がある。
【０００８】
以上のように、ミオ−イノシトールを微生物により酸化してシロ−イノソースを生成する方法、及び、シロ−イノソースを適当な還元剤で還元してシロ−イノシトールを生成する方法は公知の技術である。
【０００９】
しかしながら、これら既知のシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの製造方法は、いずれも工業的規模で実施する方法としては、使用される微生物の変換活性が弱く、また操作の煩雑さ、環境汚染あるいは経済性の面で問題があるので、これらの従来法は全て必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率よくシロ−イノソースを製造する方法、及びシロ−イノシトールを製造する方法が要望されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高純度のシロ−イノソースを効率よく製造できる新しい方法及びシロ−イノシトールを効率よく製造できる新しい方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、本発明者らが自然界より新たに分離した、シュードモナス属細菌と同定されてAB10064の菌株番号を付与された新菌株の細菌を、ミオ−イノシトールに作用させると、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを選択的に高収率で生成させ得る選択的な酸化の活性をもつことを見出した。また、同様な活性が別個に分離されたアセトバクター属細菌と同定されてAB10253の菌株番号を付与された菌株にも見出された。
【００１２】
本発明者らの研究によれば、ミオ−イノシトールと通常の炭素源及び窒素源とを含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトールと窒素源とを含有する液体培地で上記のアセトバクター・エスピーAB10253株の細菌を好気的に培養して、これにより得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ且つシロ−イノソースを高い含有量で蓄積させるようにしてシロ−イノソースの新しい製造法を本発明で実施できる。また、本発明のシロ−イノソースの新しい製造方法では、培養液中にまたは水性媒質中に高い含有量で蓄積したシロ−イノソースは、これに何ら化学的処理を施さずに、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を使用するイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは晶析操作にかけることにより、あるいはこれらの処理の組合せにかけることにより、高純度なシロ−イノソースとして、効率よく回収するようにして実施できる。
【００１３】
さらに、本発明者らが別途の研究を行った結果、上記の培養液中に蓄積されたシロ−イノソースは、培養液から菌体を除去した後、得られた培養上清液に直接、適当な量の水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を添加して、培養上清液中で上記シロ−イノソースに該還元剤を反応させた場合には、シロ−イノソースはシロ−イノシトールに効率よく還元されること、およびミオ−イノシトールが副生されることが知見された。すなわち、培養上清液中のシロ−イノソースは、該上清液から単離されなくとも、上記還元剤との反応により培養上清液内でシロ−イノシトールに効率よく還元され得ることが見出された。また、このとき、シロ−イノシトールの生成と同時にミオ−イノシトールも副成することが見出された。こうして得られた還元反応液に対して、還元反応前に培養液から除去した前記AB10253株の細菌を再度添加し、酵母エキス等の適当な栄養源と共に反復回分培養を実施すると、還元反応液中のシロ−イノシトールには全く影響を与えずに、副成したミオ−イノシトールのみをシロ−イノソースへ変換する酸化反応が進行することが判明した。更に、この酸化の反応液（培養液）から除菌し、さらにその培養上清液に再度、還元剤を添加し、シロ−イノソースを還元すると、ここで得られた還元反応液中のシロ−イノシトールの含量が増大し、従って、このように行われた方法は効率的なシロ−イノシトールの製造方法として非常に有効な手段であることを知見した。この微生物的酸化反応と化学的還元反応は、繰り返し実施することで更に反応液または培養液（または培養上清液）中のシロ−イノシトールの含有量を増大させることが可能であることも知見した。
【００１４】
従って、第1の本発明においては、ミオ−イノシトールに、細菌であるアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868として寄託）を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させることを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法が提供される。
【００１５】
適当な精製方法、例えばイオン交換樹脂処理、あるいは晶析等あるいはこれらの組合せにかけることにより、上記の方法で得られた反応液または培養上清液から効率よくシロ−イノソースを回収することができる。
【００１６】
第1の本発明の方法は、具体的には以下に示す（A）及び（B）の2つの実施方法で行うことができる。
【００１７】
実施方法（A）では、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地に、前記AB10253株の細菌を接種して好気的に培養し、得られた培養液中で該細菌をミオ−イノシトールに作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させ、これにより培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、そして培養液から菌体を除き、得られた培養上清液で例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、培養上清液からシロ−イノソースを回収する。
【００１８】
実施方法（B）は、上記AB10253株の細菌をミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、その培養液から菌体を除き、ここで得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールに作用させて前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成せしめ、そして、生成したシロ−イノソースを例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せにより回収する。
【００１９】
以下においては、第1の本発明の方法の実施方法（A）及び（B）をより詳しく説明する。
【００２０】
実施方法（A）では、ミオ−イノシトールならびに炭素源及び窒素源を含む液体栄養培地に、前記AB10253株の細菌を接種して好気的に培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ、蓄積させる。
【００２１】
用いる液体培地の組成は、目的を達成し得る限り何ら特別の制限はなく、シロ−イノソースへの変換原料であるミオ−イノシトールを含有しかつ更に炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地、天然培地のいずれも使用できる。液体培地はミオ−イノシトールを0.1％〜40％、より好ましくは10％〜30％含有し、炭素源として、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0％〜20％、より好ましくは0％〜5％含有し、窒素源として、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％含有することが望ましい。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培地または培養液の水素イオン濃度をpH4〜10、好ましくはpH5〜9に調整して微生物を培養すると、ミオ−イノシトールを効率よくシロ−イノソースに変換することができる。
【００２２】
培養条件は、用いる培地の種類によっても異なる。培養温度は12〜35℃、好ましくは20〜27℃である。また、培養は液体培地を振盪したり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行うのがよい。培養時間は、培養液中のミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、シロ−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行えばよく、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
【００２３】
培養後に、培養液（物）から菌体を除き、その培養上清液から目的物を採取する方法としては、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、シロ−イノソース以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH−型はシロ−イノソースを化学変化させるので、使用することはできない。かくして、シロ−イノソースを含有する上澄液が得られる。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。
【００２４】
より具体的には、シロ−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）C−20（H＋型）の充填カラムを通過させて通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ、洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併する。こうして合併された水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）A368S（遊離塩基型）を充填したカラムを通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ、洗浄して洗浄液を集め、ここで得られた通過液及び洗浄液を合併して、シロ−イノソースを含みかつそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を取得するのが好ましい。この水溶液を濃縮して得られたシロ−イノソースの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なシロ−イノソースの結晶を晶出させることができる。
【００２５】
実施方法（B）では、アセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）を培養して得られた菌体を、あるいはその菌体の破砕物をミオ−イノシトールと緩衝液または液体培地中で反応させ、シロ−イノソースを生成させる。
【００２６】
菌体としては、実施方法（A）により得られた培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、前記微生物を別途、適当な培養条件で培養して得たものを用いてもよい。集菌すなわち、菌体の分離は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
【００２７】
得られた菌体または菌体破砕物をミオ−イノシトールと反応させる反応媒質としては、液体培地または緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施方法（A）で用いたものと同様のものを用いてもよく、あるいは、別途、上記微生物を培養した液体培地をそのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good’s）のCHES緩衝液等を10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いればよい。溶液中のミオ−イノシトールの濃度は0.1〜40％程度とするのが好ましい。
【００２８】
反応条件は、用いる菌株や培地、緩衝液の種類によって異なる。反応温度は5〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は1〜50時間、好ましくは12〜36時間であり、液体培地または緩衝液のpHは2〜10、好ましくは3〜9である。反応終了後の反応液からの目的物質を単離する方法は実施方法（A）と同様に行えばよい。
【００２９】
第2の本発明においては、ミオ−イノシトールにアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868）の細菌を作用させて、ミオ−イノシトールから培養液または水性媒質中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、その生成されたシロ−イノソースを含む反応液または該水性媒質から、生成したシロ−イノソースを単離することなしに、該シロ−イノソースを含有する該反応液または水性媒質に還元剤を添加して作用させ、シロ−イノソースを還元してシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させることを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【００３０】
第2の本発明方法は、具体的には以下に示す（C）、（D）の2つの実施方法で行うことができる。
【００３１】
実施方法（C）は、前記AB10253株の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに当該細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換することにより培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、ついで、得られた培養液から菌体を除去するがシロ−イノソースを単離することなしに、シロ−イノソースを含有する反応液（培養上清液）に還元剤を直接に添加して、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして、還元後の培養上清液（反応液）からシロ−イノシトールを回収する方法である。すなわち、実施方法（C）は、第1の本発明の実施方法（A）により培養液中に生成させ、蓄積させたシロ−イノソースを、培養上清液から単離せずに、例えば水素化ホウ素アルカリ金属等の適当な還元剤で還元し、生成したシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの混合溶液から例えば活性炭処理、イオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、シロ−イノシトールを回収する方法である。
【００３２】
実施方法（D）は、前記AB10253株の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、得られた培養液から菌体を除去し、ここで得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールと反応させ、前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成せしめ、ここで得た反応液中に生成したシロ−イノソースを単離すること無しに、シロ−イノソースを含有する該反応液に還元剤を直接に添加し、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして生成したシロ−イノシトールを回収する方法である。すなわち、実施方法（D）は、前記AB10253株の細菌を使用して、第1の本発明の実施方法（B）により得られたシロ−イノソースを、単離せずに、例えば水素化ホウ素アルカリ金属等の適当な還元剤で還元し、シロ−イノソースから生成したシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの混合溶液から例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、シロ−イノシトールを回収する方法である。
【００３３】
以下においては、第2の本発明方法の実施方法（C）及び（D）をより詳しく説明する。
【００３４】
実施方法（C）では、前記第1の本発明の実施方法（A）の方法で培養液中にシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させた後、培養液から菌体を除去するがシロ−イノソースを単離せず、培養上清液に適当な還元剤を添加し、還元反応を行う。こうして得られた還元反応液中から生成されたシロ−イノシトールを取得する。すなわち、培養液から菌体を除去後、得られた培養上清液に直接に還元剤を添加して還元反応を行う。これによって、培養上清液内でシロ−イノソースからシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールが生成される。使用される還元剤は、水系中でシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元できる還元剤であり、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムであるのが望ましい。ここで得られた還元反応液からシロ−イノシトールを回収し、採取するには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち還元反応液を、活性炭やイオン交換樹脂で処理することにより、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を得る。この水溶液からシロ−イノシトールだけを取得するには、主に水に対する溶解度の差を利用することが有効である。すなわち、前記の水溶液を濃縮し、水に対する溶解度の低いシロ−イノシトールを固体として析出せしめこれを取得すればよい。
【００３５】
実施方法（C）の改良方法として、以下に記す方法はシロ−イノシトールを効率良く取得するのにきわめて有効である。すなわち、シロ−イノソースを適当な還元剤で還元した溶液中ではシロ−イノシトールの他にミオ−イノシトールも生成されるが、この溶液に対して、遠心分離等で除いておいた前記AB10253株の菌体を再び添加し、反復回で培養を行うことになり、シロ−イノシトールには何の変化を与えずに、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ再度変換させ、培養液中にシロ−イノシトールとシロ−イノソースを蓄積させる。この際、ミオ−イノシトールの適量を追加添加したり、また炭素源や窒素源を培養開始前に添加しても良い。こうして得られた培養液から菌体を除いた後、培養上清液に再び還元剤を添加することによりシロ−イノソースを還元して、還元反応液中にシロ−イノシトールを多量に生成させ蓄積させることが可能であることが、本発明者らによって初めて明らかになった。この様にして得られた反応溶液からシロ−イノシトールを単離し、精製するには、前記した通常の手法を用いて実施することができる。本発明の方法は、前記AB10253株の細菌が基質としてミオ−イノシトールを認識するがシロ−イノシトールは認識しないという前記AB10253株の細菌の有するミオ−イノシトール酸化酵素の基質特異性を利用したもので、繰り返し実施することで生成シロ−イノシトールの蓄積量を更に高めることが出来る。
【００３６】
実施方法（D）では、液体栄養培地に、前記AB10253株の細菌を接種して好気的に培養することにより、該菌体を取得し、こうして得られた該菌体を、緩衝液あるいは液体培地等の水性媒質中に溶解させたミオ−イノシトールに作用させて、シロ−イノソースを生成蓄積させ、シロ−イノソースを単離せず、適当な還元剤を添加し、還元反応を行い、こうして得られた還元反応液から、生成されたシロ−イノシトールを取得する。
【００３７】
この実施方法（D）で使用される菌体または菌体破砕物は、実施方法（B）と同様の手段で得ることができる。また、液体反応の方法も実施方法（B）と同様の手法で実施できる。シロ−イノソース含有反応液から遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体を除去した後、得られた菌体を除去された反応液（培養上清液）に還元剤として水素化物を添加して、シロ−イノソースの還元反応を行い、これによりシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを生成させる。この還元反応は、実施方法（C）で説明したと同じ要領で行い得る。更に、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトール含有の還元反応液からシロ−イノシトールを取得する方法は、先に実施方法（C）で説明した手法と同様に実施できる。
【００３８】
前述したようにミオ−イノシトールからシロ−イノソース生産する菌は多種存在するが、例えば本発明者らが神奈川県厚木市の土壌より分離したアセトバクター・エスピーAB10253株は本発明に最も有効に使用される菌株の例である。本菌株の菌学的性質を以下に示した。
【００３９】
なお、本菌株の同定の当たっては、「新細菌培地学講座」（第2版、近代出版）、「医学細菌同定の手引き」（第2版、近代出版）、「細菌学実習提要」（丸善）に準じて実験を行い、実験結果を「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」Vol.1（1984）を参考にして同定した。
前記したAB10064株の細菌の主性状は、グラム陰性の桿菌で、大きさは0.4〜0.7×0.6〜4.0μmである。本菌株は生育適温12℃〜34℃の中温菌でpH4.0では生育しない。硝酸塩の還元性はなく、カタラーゼ及びオキシダーゼ陽性であり、グルコースを好気的に分解し、酸を生成する。ユビキノンの分子種はQ9で、DNAのGC含量は62％であった。
【００４０】
これらの菌学的性質を総合して、前記10064株の菌株はシュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株であると判断した。「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」 Vol 1（1984）第141頁〜第199頁によると、シュードモナス属細菌は30種以上の種（species）が知られており、遺伝子的に幅のある分類群を形成している。
【００４１】
AB10064株の菌学的性状を上記の既知の種と比較検討した結果、AB10064株はシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に最も近縁の種であると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質は炭素源の資化性等の結果が、シュードモナス・プチダの性状と完全には一致しなかったので、本AB10064株を公知のものと区別するため、シュードモナス・エスピーAB10064株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−18330として寄託した（寄託日は平成13年5月17日）。
アセトバクター・エスピーAB10253株の菌学的性質を次に記載する。
（a）形態的特徴
（1）細胞形態：球桿菌で大きさは0.5〜0.8×0.6〜16μｍ。多形性は無い
（2）運動性：−（懸滴法）
（3）普通寒天培地上での生育：生育は極微。色調は黄土色〜黄色
（b）生理生化学的性状
（1）グラム染色：                −（一部variable）
（2）OFテスト：                   O（Oxidative）
（3）好気条件での生育：          ＋
（4）嫌気条件での生育：          −
（5）生育温度：
10℃                       −
12℃                       ±
15℃                       ＋
35℃                       ＋
38℃                       ＋
42℃                       ±
（6）食塩耐性：
0%                         ＋
1%                         ＋
2%                         −
（7）グルコース耐性：
10%                        ＋
20%                        ＋
30%                        ＋
（8）エタノール耐性試験：
1%                         ＋
2%                         ＋
5%                         ＋
10%                         ＋
（9）生育pH：
pH3.0                      −
pH4.0                      ＋
pH5.0                      ＋
pH7.0                      ＋
pH8.0                      ±
（10）色素の産生：
GYC培地    菌体周囲が黄土色〜茶色に着色
（11）チトクロームオキシダーゼ：  −
（12）カタラーゼ：                ＋
（13）硝酸塩還元性：              −
（14）硫化水素産生：              −
（15）ゼラチンの液化：            −
（16）インドールの産生：          −
（17）マロン酸の利用性：          −
（18）ONPG分解性：                −
（19）エスクリンの分解性：        ＋
（20）クエン酸の利用性：          −
（21）アルギニンヒロラーゼ活性：  −
（22）尿素の分解性：              −
（23）デオキシリボヌクレアーゼ活性：＋
（24）各種糖から酸の生成；
D−グルコース               ＋
D−キシロース               ＋
D−マンノース               ＋
L−アラビノース             ＋
D−フルクトース             −
ガラクトース                ＋
L−ラムノース               −
マンニトール                −
シュークロース              −
アドニトール                −
エリスリトール              −
アラビトール                −
ミオ−イノシトール          ＋
ソルビトール                −
トレハロース                −
D−セロビオース             −
エタノール                  ＋
グリセロール                ＋
ラクトース                  −
リボース                    ＋
ラフィノース                −
プロピレングリコール        −
β−ヒドロキシーブチレート  −
α−メチルーグルコース      −
（25）炭素源の資化性
D−グルコース               ＋
ガラクト−ス                −
L−アラビノース             −
D−キシロース               −
グリセロール                ＋
ミオ−イノシトール          ＋
シュ−クロース              −
L−ヒスチジン               −
レバリン                    −
L−アルギニン               −
L−セリン                   −
（26）ユビキノンの分子種：       ユビキノン9（Q9）
（27）DNAのGC含量：              58%
【００４２】
以上のとおり、アセトバクター・エスピーAB10253株の主性状は、グラム陰性の球桿菌で、大きさは0.5〜0.8×0.6〜1.6μｍ。生育適温は30℃〜34℃の中温菌で至適生育pHはpH5。硝酸塩の還元性は無く、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、30%グルコース培地で好気的に生育する。ユビキノンの分子種はQ9で、DNAのGC含量は58%であった。
【００４３】
これらの菌学的性質を総合して、本AB10253株はアセトバクター（Acetobacter）属に属する菌株であると判断した。Bergey's Manual of Systematic Bacteriology VOL.1（1984）268頁〜274頁によると、アセトバクター属はアセトバクター・アセティ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・リケファシエンス（Acetobacter liquefaciens）、アセトバクター・パステウリアヌス（Acetocacter pasteurianus）、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）の４つの種（species）から構成されている。AB10253株の菌学的性状を上記の既知の種と比較検討した結果、AB10253株はアセトバクター・アセティ（Acetobacter aceti）に最も近縁の種であると考えられた。しかし、高濃度のグルコース及びエタノールに対して耐性である点、生育温度において38℃でも生育する点、可溶性色素を産生する点など本菌株の有するいくつかの菌学的性質において、アセトバクター・アセティの性状とは一致しなかったので、本AB10253株を公知のものと区別するため、アセトバクター・エスピーAB10253株と命名し、産業枝術総合研究所特許生物寄託センターにFERM  P−18868として寄託した（寄託日は平成14年5月27日）。
【００４４】
本明細書で先に記したように、1960年代まではアセトバクター属細菌とグルコノバクター属細菌は分類学的な境界が曖昧であり、本来はグルコノバクター属である微生物がアセトバクター属と同定され発表されていた。従ってアセトバクター属細菌によるミオ−イノシトール酸化活性は、本発明で開示したアセトバクター・エスピーAB10253株が初めての発見である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、医農薬合成原料として有用な、純度の高いシロ−イノソースと、医薬及び医農薬合成原料として有用なシロ−イノシトールとを工業的生産レベルで安価に製造することができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下に、第1の本発明方法（補正後の請求項1に係る発明）と、第2の本発明方法（補正後の請求項4に係る発明）とを、後記される実施例7で具体的に説明する。他方、下記に示される実施例1〜6は、補正後の請求項1の第1の本発明および補正後の請求項4の第2の本発明の範囲内では使用されないシュードモナスsp. AB10064株の細菌を用いて方法を行う場合を例示するので、本発明（補正後の請求項1〜10に係る）の実施例に属さないけれども、後記の実施例7の実験手順の説明を理解するのに必要である関係から本明細書中に保留することを付記する。
実施例１
実施方法（A）によるシロ−イノソースの製造例
（1）シロ−イノソースの生成
ミオ−イノシトール12.0%、酵母エキス1.0%、（NH4）2S04 0.1%、K2HPO4 0.7%、KH2PO4 0.2%、MgSO4・7H2O 0.01%を含む液体培地３リットルを、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーAB10064株（FERM P−18330）のスラント培養物を1白金耳接種し、27℃で４日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）し、上清を培養上清液（2900 ml）として得た。
【００４７】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはシロ−イノソースが98mg/mlの濃度で生成していることがわかった（収量284ｇ、ミオ−イノシトールからの変換率80%）。この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
【００４８】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Wakosil 5NH2（4.6×250mm）
カラム温度：40℃
検出器：RIDETECTER ERC−7515A（ERMA CR. INC.）
注入量：20μl
溶媒：アセトニトリル−水＝4：1
流量：2 ml/min
溶出時間シロ−イノソース；11.6分
なお、上記のシロ−イノソースの変換率は、次式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液中のシロ−イノソースのモル数÷培地中のミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００４９】
（2）シロ−イノソースの単離
実施例1（1）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H+型）500mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）を通過させ、その後、このカラムに500mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、合併した水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）368S（遊離塩基型）1000mlを充填したカラム（内径7cm、長さ40cm）を通過させ、その後、このカラムに1000mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した水溶液中には上記シロ−イノソースが含まれ、それ以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【００５０】
上記により得たシロ−イノソース水溶液を減圧下で約700mlまで濃縮し、エタノールを3倍量加え5℃で一晩放置したところ、純粋なシロ−イノソースの精製品の無色結晶216gが得られた。この時の精製回収収率は76％で、ミオ−イノシトールからのシロ−イノソースの通算収率は61％であった。
【００５１】
なお、上記シロ−イノソースの精製回収率は次式により求めた；
精製回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースの量÷培養上清液中の精製前のシロ−イノソースの量〕×100
また、上記シロ−イノソースの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースのモル数÷培地中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５２】
実施例２
実施方法（B）によるシロ−イノソースの製造例
（1）菌体の生産
ミオ−イノシトール 0.5％、(NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH7の液体培地2リットルを500ml容のバッフル付き三角フラスコに100mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーAB10064株を接種し、27℃で3日間振盪培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体を、0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）200mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
【００５３】
（2）シロ−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体30gを、溶解されたミオ−イノシトール 4.0gを含有した0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml（ミオ−イノシトール濃度10mg/ml）中に加え、得られた混合物を30℃で、24時間、緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールに作用させて反応させた。反応終了後、得られた反応液から菌体を除き、その反応液濾液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、シロ−イノソースが8mg/mlの濃度（変換率82％）で蓄積していた。反応液濾液からのシロ−イノソースの回収と単離は、実施例1に記載した方法に準じて行い、シロ−イノソース2.5gを結晶として得た（精製回収率78％）。また、上記シロ−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は64％であった。
【００５４】
なお、上記のシロ−イノソースの変換率は、実施例1に準じて求め、精製回収率は次式により求めた：
精製回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースの量÷反応液中の精製前のシロ−イノソースの量〕×100
また、上記シロ−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースのモル数÷緩衝液中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５５】
実施例３
実施方法（C）によるシロ−イノシトールの製造例の1
（1）シロ−イノソースの生成
実施例1の（1）と全く同様の方法でAB10064株を3リットルの培地で培養し、培養液を遠心分離して菌体を除去した。シロ−イノソースを含有した培養上清液2900mlを得た。
この培養上清液を実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析すると、培養上清液中にはシロ−イノソースが286g（ミオ−イノシトールからシロ−イノソースへの変換率は80％）生成していることがわかった。
【００５６】
変換率（％）＝〔培養上清液中のシロ−イノソースのモル数÷培地中のミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５７】
（2）シロ−イノソースの還元とシロ−イノシトールの生成
前項（1）で得たシロ−イノソース含有培養上清液の2900mlに水素化ホウ素ナトリウム 15.3gを徐々に加え、還元反応を実施した。還元終了後、培養上清液（すなわち還元反応液）を、実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、その還元反応液（培養上清液）中には、シロ−イノシトールが105g存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを151g含有していることがわかった（シロ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は89％：計算式は下記に示す）。シロ−イノソースからのシロ−イノシトールの反応収率は36％であった。
なお、高速液体クロマトグラフィーにおける、各化合物の溶出時間は以下の通りである。
溶出時間：ミオ−イノシトール 17.0分、シロ−イノシトール 17.7分
【００５８】
シロ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のシロ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のシロ−イノソースのモル数〕×100
【００５９】
また、上記のシロ−イノソースからのシロ−イノシトールの反応収率は次式により求めた：
反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のシロ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のシロ−イノソースのモル数〕×100
【００６０】
（3）シロ−イノシトールの単離
前項（2）で得た還元反応液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H+型）400mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）に通過させ、その後、このカラムに400mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、合併した水溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A−113（OH−型）800mlを充填したカラム（内径5cm、長さ60cm）を通過させ、その後、このカラムに800mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００６１】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、シロ−イノシトールと副生成物であるミオ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。この水溶液を減圧下で濃縮すると、水溶解度の低いシロ−イノシトールのみが濃縮液中に析出した。500mlまで濃縮し、析出した結晶を濾過操作により取得した。このようにして得られた結晶（79g）の一部を水に溶解して、実施例1に記した方法による液体クロマトグラフィー及び他の分析装置で分析すると、この結晶はミオ−イノシトールを僅かに含有するシロ−イノシトールの結晶であることが判った。続いて、この結晶を全て4リットルの水に溶解し、グラスフィルターで濾過した後、再度400mlまで濃縮した。ここで析出した結晶を取得し、60gの白色結晶を得た。この結晶を液体クロマトグラフィー及びその他の分析装置で分析すると純粋なシロ−イノシトールであることが判明した。
【００６２】
以上の一連の操作での、シロ−イノシトールの精製回収率は57％、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全収率は17％であった。
【００６３】
なお、上記シロ−イノシトールの精製回収率は次式により求めた；
精製回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷還元反応後の上清液中のシロ−イノシトールの量〕×100
また、上記シロ−イノシトールのミオ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷培地中に添加したミオ−イノシトールの量〕×100
【００６４】
実施例４
実施方法（C）によるシロ−イノシトールの製造例の2
（1）シロ−イノソースの生成と還元
実施例3の（1）と全く同様の方法でAB10064株を培養した。培養上清液中に生成したシロ−イノソースを実施例3の（2）と同様の方法で還元し、シロ−イノシトール（105g）とミオ−イノシトール（152g）を含有する混合溶液（2900ml）を得た。この溶液に、遠心分離により分取されたAB10064株の菌体と酵母エキス（6g）を添加した。得られた混合溶液を5L容ジャーファーメンターに装入して、培養温度27℃、攪拌回転数400rpm、通気量1vvmで3日間培養を行った。培養液を分析した結果、前記混合溶液中のミオ−イノシトールはシロ−イノソースに変換されていた。かくしてシロ−イノソース（122g）及びシロ−イノシトール（105g）と菌体を含有する混合溶液を得た。
【００６５】
この混合溶液から菌体を遠心分離により除き、得られた溶液（培養上清液）に水素化ホウ素ナトリウム 6.5gを徐々に加えて還元反応を実施した。その結果、還元反応後の反応溶液（培養上清液）中にはシロ−イノシトールが162g存在し、更に副生物として、ミオ−イノシトールが66g含有されていることがわかった。最終的にミオ−イノシトールからのシロ−イノシトール変換率は45％であった。
【００６６】
（2）シロ−イノシトールの単離
実施例3の（3）と同じ手法で還元反応液からシロ−イノシトールの単離を行った。即ちイオン交換樹脂による脱塩の後、溶液を約900mlに濃縮し、シロ−イノシトールの結晶を析出させ、この結晶を濾過することにより単離した。こうして取得したシロ−イノシトールの粗結晶を再度8リットルの水に溶解し、得られた水溶液からグラスフィルターで水不溶物を除去し、ついで減圧下濃縮した。水溶液を約800mlに濃縮した後、析出したシロ−イノシトールをグラスフィルターで濾過し、白色結晶（123g）として回収した。ミオ−イノシトールからの全回収率は34％であった。
全回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷培地中に添加したミオ−イノシトールの量〕×100
【００６７】
実施例５
実施方法（C）によるシロ−イノシトールの製造例の3
（1）シロ−イノソースの生成と還元
実施例4の（1）と全く同様の方法でAB10064株の培養、培養上清液の還元、還元反応液の再培養及び2度目の培養上清液の再還元を実施した。こうして得られた還元反応後の反応溶液（培養上清液）にはシロ−イノシトールが160g存在し、副生物として、ミオ−イノシトール65gが含有されていた。この混合溶液に再度、遠心分離して分取されておいたAB10064株の菌体と酵母エキス（2.5g）を添加した。得られた混合液を5L容ジャーファーメンターに装入し、培養温度27℃、攪拌回転数400rpm、通気量1vvmで3日間培養を行った。培養液を分析した結果、前記混合液中のミオ−イノシトールはシロ−イノソースに変換されていた。かくして、シロ−イノソース（52g）及びシロ−イノシトール（160g）と菌体を含有する混合溶液を得た。
【００６８】
この混合溶液から菌体を遠心分離により除き、得られた上清溶液に水素化ホウ素ナトリウム2.8gを徐々に加えて還元反応を実施した。還元反応後の反応溶液（培養上清液）にはシロ−イノシトールが180g存在し、副生物として、ミオ−イノシトール26gが含有されていることがわかった。最終的にミオ−イノシトールからのシロ−イノシトール変換率は50％であった。
【００６９】
（2）シロ−イノシトールの単離
実施例4の（2）と同じ手法でシロ−イノシトールの単離を行った。即ちイオン交換樹脂による脱塩の後、溶液を約900mlに濃縮し、シロ−イノシトールの結晶を析出させ、この結晶を濾過することにより単離した。こうして取得したシロ−イノシトールの粗結晶を再度８リットルの水に溶解し、得られた溶液を減圧下で濃縮した。約800mlに濃縮し、その結果析出したシロ−イノシトールをグラスフィルターで濾過し、白色結晶（140g）として得た。ミオ−イノシトールからの全回収率は39％であった。
【００７０】
実施例６
実施方法（D）によるシロ−イノシトールの製造例
実施例２と全く同様の方法で、AB10064株の洗浄菌体によるミオ−イノシトールの酸化でシロ−イノソースの製造を行った。すなわちミオ−イノシトール4.0gを含有する0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml（ミオ−イノシトール濃度10mg/ml）中にAB10064株の洗浄菌体30g加え、得られた混合物を30℃で24時間緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールと反応させて、反応溶液中にシロ−イノソースを8mg/mlの濃度で蓄積させた。反応液を遠心分離して菌体を除き、得られた溶液（上清液）に水素化ホウ素ナトリウム170mgを徐々に加えて還元反応を実施した。その結果、反応液中にはシロ−イノシトールが1250mg存在し、副生物としてミオ−イノシトール1600mgが含有されていた。
【００７１】
実施例３の（3）と同様の手法でシロ−イノシトールの単離を行い、シロ−イノシトールの白色結晶800mgを得た。ミオ−イノシトールからの全回収率は20％であった。
【００７２】
実施例７
実施方法（C）によるシロ−イノシトールの製造例の４
（1）シロ−イノソースの生成
ミオ−イノシトール 16.0％、酵母エキス 16％を含む液体培地３リットルをpH5.0に調整し、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピーAB10253株（FERM P−18868）のスラント培養物を１白金耳接種し、27℃で４日間振盪培養した。培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）して菌体を除き、上清を培養上清液（2900 ml）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
この培養上清液を実施例1と同様の方法で分析した。その結果培養上清液中にはシロ−イノソースが153mg/ml（459ｇ、変換率97%）生成していることがわかった。この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
【００７３】
（2）培養上清液の還元
前項（1）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の2900 mlに水素化ホウ素ナトリウム30.6gを徐々に加え、還元反応を実施した。還元終了後、培養上清（反応液）を、実施例１で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応後の反応液中（培養上清液）には、シロ−イノシトールが177ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを252ｇ含有していることがわかった。
【００７４】
（3）シロ−イノシトール粗結晶の単離と、菌体反応によるシロ−イノソースの生成
前項（2）で得た還元反応後の反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で99ｇ得られた。ろ液は再度反応させるためにミオイノシトールの228ｇを追加し溶解させた後に、5N HClでpH5.0に調整した。これに前項（1）で分離されて保存しておいた培養菌体を懸濁し、約100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注した。
【００７５】
菌体反応は純酸素ガスを三角フラスコ内の混合液に通気し、27℃で20時間、ロータリーシェーカーで反応させた。反応終了後、反応溶液を遠心分離（8,000rpm 20分間）し、上清を菌体反応上清液（3050 ml）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
【００７６】
（4）菌体反応上清液の還元
前項（3）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の3050 mlに水素化ホウ素ナトリウム31.1ｇを徐々に加え、に還元反応を実施した。還元終了後、菌体反応上清液（還元反応液）を、実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応後の反応液中には、シロ−イノシトールが258ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを256ｇ含有していることがわかった。
【００７７】
（5）シロ−イノシトール粗結晶の単離と菌体再反応によるシロ−イノソースの生成
前記（4）で得た還元反応後の反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で199ｇ得られた。ろ液は再度反応させるためにミオ−イノシトールの224ｇを追加し溶解させた後に、5N HClでpH5.0に調整した。これに前項（3）で分離され保存しておいた培養菌体を懸濁し、約100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注した。
菌体反応は純酸素ガスを三角フラスコ内の混合液に通気し、27℃で20時間、ロータリーシェーカーで反応させた。菌体との再反応終了後、生成したシロ−イノソースを含有した培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）して菌体を除去し、上清を菌体再反応後の培養上清液（3170 m1）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
【００７８】
（6）菌体反応後の培養上清液の還元
前項（5）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の3170 mlに水素化ホウ素ナトリウム31.1ｇを徐々に加えた後に還元反応を実施した。還元終了後、ここで得た還元反応液を、実施例１で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応液中（培養上清液）には、シロ−イノシトールが268ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを253g含有していることがわかった。
【００７９】
（7）シロ−イノシトール粗結晶の単離
前項（6）で得た還元反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で197ｇ得られた。この白色沈殿物と、前項（3）と（5）で得られた白色沈殿物を合わせて、シロ−イノシトールを含有する白色沈殿物を合計495ｇ（99＋199＋197）得た。また、ここまでの反応に要したミオ−イノシトールは932ｇ（480＋228＋224）であった。
【００８０】
（8）シロ−イノシトールの精製と単離
これまでに得られた白色沈殿物487ｇを熱水25Lに溶解させた後、室温まで冷却し、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H＋型）400 mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）に通過させ、その後このカラムに400 mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A−113（OH−型）800 mlを充填したカラム（内径5cm、長さ60cm）に通過させ、その後このカラムに800 mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００８１】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、シロ−イノシトールと副生成物であるミオ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。この水溶液を減圧下で濃縮すると、水溶解度の低いシロ−イノシトールのみが濃縮液中に析出した。500 mlまで濃縮し、析出した結晶を濾過操作により取得した。このようにして得られた結晶(421ｇ)の一部を水に溶解して実施例１に記した方法による液体クロマトグラフィー及び他の分析装置で分析すると、ミオ−イノシトールを含有しない純粋なシロ−イノシトールの結晶であった。
以上の一連の操作での、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全収率は45％（421／932×100）であった。