(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(ａ）または（ｂ）のいずれかからなるアポトーシス誘導タンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変された、上記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかからなるアポトーシス誘導タンパク質：
（ａ）配列番号３または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号３または４に示されるアミノ酸配列において、それぞれ１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変された、上記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」のストリンジェントな条件でハイブリダイスし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号８または９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号８または９に示される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、それぞれ、「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」のストリンジェントな条件でハイブリダイスし、かつアポトーシス誘導性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養し、得られた培養物からアポトーシス誘導タンパク質を回収する工程を有する、請求項１または２に記載のアポトーシス誘導タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載するアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシスを誘導する新規タンパク質及びこれをコードする遺伝子に関する。また本発明は、上記アポトーシス誘導新規タンパク質の製造方法、該製造に用いられる発現ベクター及び形質転換体、並びにタンパク質に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来技術】
アポトーシスあるいはプログラム化された細胞死は、胚発生を含む多くの生物学的プロセスに必須である(VauxおよびKorsmeyer、Cell death in development. Cell 96, 245-254, 1999)。しかしながら、胚発生の間にアポトーシスを制御する正確なメカニズムは解明されていない。もし胚発生時期におけるアポトーシス制御メカニズムが解明できれば、胚細胞を用いた再生医療への応用が期待できる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来の課題であった胚発生時期におけるアポトーシス制御メカニズムを解明するのに有効に用いることのできる、アポトーシス誘導タンパク質及びそれをコードする遺伝子を提供することである。具体的には、本発明の目的は胚性段階でアポトーシスを誘導する新規タンパク質及びそれをコードする遺伝子を提供することである。さらに本発明は、上記アポトーシス誘導タンパク質の製造方法及びそのために使用される材料（発現ベクター、形質転換体）、並びに該タンパク質の生体内での発現状況を調べるために有用な抗体を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
従来よりＦ９細胞及びＰ19細胞等の胚性癌腫(ＥＣ)細胞系は、哺乳類の初期発生段階の遺伝子発現の制御に関する研究のためのモデル細胞として広く使用されている。Ｐ19ＥＣ細胞は、多能性特性を有しており、レチノイン酸の添加及び／又は凝集塊の形成によって、容易に幾つかの細胞型に分化するが（Martin,G.R., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78, 7634-7638 (1981）)、Ｆ９ＥＣ細胞は、ジブチリル・サイクリックＡＭＰの存在または非存在下でレチノイン酸の使用で旁内胚葉様細胞または原始的な内胚葉様細胞に分化することが知られている(Strickland et al., Cell 21, 347-355 (1980); Hogan et al., Cancer Surveys 2, 115-140 (1983))。
【０００５】
そこで、本発明者らは、細胞分化の方向性の異なるＦ９ＥＣ細胞またはＰ19ＥＣ細胞のいずれかに特異的に発現される因子の解明が、哺乳類の初期発生段階での制御メカニズムを解明する糸口になるであろうと考えて、日夜鋭意研究を重ねていたところ、サブトラクションアッセイによってＦ９ＥＣ細胞に特異的に発現する新規タンパク質を見出した。そして、かかるタンパク質について種々検討を重ねたところ、該タンパク質が特異的に核膜周辺に分布する知見を得、このことから当該タンパク質の過剰発現によって核輸送が阻害されてアポトーシスが促進される可能性を見出した。さらに該タンパク質の発現レベルは発生の胚性段階時期に漸進的に増加すること、並びに筋肉系細胞への分化誘導時にその発現レベルが上昇することから、該タンパク質が初期胚性段階における細胞死カスケードに関与する可能性が示唆された。本発明は、かかる種々の知見に基づいて開発されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は下記項１〜３に記載する新規アポトーシス誘導タンパク質である：
項１．  下記(ａ）または（ｂ）のいずれかからなるアポトーシス誘導タンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
項２．  項１記載のタンパク質のアミノ酸配列を有し、且つアポトーシス誘導活性を有するアポトーシス誘導タンパク質。
項３．  下記（ａ）または（ｂ）のいずれかである項２に記載のアポトーシス誘導タンパク質：
（ａ）配列番号３または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号３または４に示されるアミノ酸配列において、それぞれ１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【０００７】
また本発明は下記項４〜７に記載する新規アポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子である：
項４．  項１乃至３のいずれかに記載のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子。
項５．  下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイスし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコートするＤＮＡ。
項６．  項５記載の遺伝子の塩基配列を有し、且つアポトーシス誘導活性を有するアポトーシス誘導タンパク質をコードするものである遺伝子。
項７．  下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのＤＮＡからなるものである項６記載の遺伝子：
（ａ）配列番号８または９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号８または９に示される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイスし、かつアポトーシス誘導性を有するタンパク質をコートするＤＮＡ。
【０００８】
さらに本発明は、下記に掲げる上記アポトーシス誘導タンパク質の製造並びにその製造に使用されるもの、さらに該タンパク質に対する抗体に関する：
項８．  項４乃至７のいずれかに記載の遺伝子を含む発現ベクター。
項９．  項８記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
項１０．項９に記載の宿主細胞を培養し、得られた培養物からアポトーシス誘導タンパク質を回収する工程を有する、項１乃至３のいずれかに記載のアポトーシス誘導タンパク質の製造方法。
項１１．項１乃至３のいずれかに記載するアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１０】
また本明細書において「タンパク質」という用語には、特定の配列で示されるタンパク質だけでなく、これらの生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、及び変異体が包含される。なお、上記変異体には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質とアミノ酸配列において少なくとも90％、好ましくは95％の割合で相同なものを挙げることができる。
【００１１】
さらに本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡが包含される。また特に言及しない限りその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）及び該正鎖の配列と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（逆鎖）、ならびにこれらの断片のいずれもが含まれる。また、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域。コード領域、エキソン、イントロンを含むことができる。
【００１２】
またさらに本明細書において「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１３】
以下、本発明のアポトーシス誘導タンパク質、それをコードする遺伝子、該遺伝子を利用した上記タンパク質の製造方法、該タンパク質に対する抗体に関して、詳細に説明する。
【００１４】
（１）アポトーシス誘導タンパク質
(1-1) ヌクリング
本発明は、アポトーシス誘導タンパク質の一つとして配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。
【００１５】
当該タンパク質は９０１個のアミノ酸からなる分子量約100kDのタンパク質であり、図１Ａに示すように、Ｎ末端から数えて186-228aa領域にロイシンジッパーモチーフ（ＬＺ、図１Ｂの下線部領域）、713-721aa領域にチロシン受容体リン酸化部位（ＴＹＲ、図１Ｂのグレイボックス領域）、及び803-865aa領域にt-SNARE超らせんドメイン（ＳＮＡＲＥ、図１Ｂのボックス領域）を有することを特徴とする。
【００１６】
当該タンパク質は幾つかのユニークな特徴を有する新規タンパク質である。
【００１７】
第１に、当該タンパク質は、核膜周辺への局在特性を備えており、核周囲に凝集しクラスターを形成することによって分子の核膜輸送を阻害する作用を有する（図２Ａ参照）。かかる局在特性に起因して、本発明者らは当該タンパク質を「ヌクリング(Nucling)」と命名した。以下、本明細書において配列番号４に示すアポトーシス誘導タンパク質をヌクリングと総称する。
【００１８】
従来より核膜中のタンパク質の多くは核ポア複合体（NPC）に見つかっている。該ＮＰＣは、120MDaの分子構造物として核のエンベロープ中に埋め込まれた状態で、核と細胞質間の二方向の分子輸送にユニークな役割を担っている（Simos and Hurt, FEBS Lett. 369, 107-112, (1995)）。ＮＰＣの中には核結合に関連する幾つかの特徴的なモチーフ（例えば膜貫通配列、heptadリピート、ロイシンジッパー、亜鉛フィンガー、ＲＮＡ結合配列、保存Ran／TC4結合部位、及び「アルマジロ」リピート等）を含んでいるものが知られている。本発明のヌクリングは、モチーフとしてロイシンジッパーとt-SNARE超らせんドメインを有しており、しかも核と細胞質との間の分子輸送を制御すると考えられることから、ＮＰＣの１種として位置づけられるかもしれない。ヌクリングが有するロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインは、その両方が核膜周辺のタンパク質のクラスター形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。しかしながら、t-SNARE超らせんドメイン単独では核周囲局在性を得ることができない。ロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインは一般に他分子との相互作用に関連するモチーフとして知られているので、ヌクリングの核周囲局在性は、ロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインの分離した領域間での直接または間接的な相互作用によって生じると思われる。
【００１９】
ヌクリングの第２の特徴は、ヌクリングの遺伝子発現が発生段階でまた組織特異的に制御されていることである。またヌクリングの一過性発現レベルはかなり厳格に下方制御されている。実施例において示すように、ヌクリングの発現はＦ９ＥＣ細胞に特異的であり、また転写物の発現レベルは胚の成長段階中直線的に増加した（図６Ａ、Ｂ）。このことから、ヌクリングが胚の発生に関連している可能性が推測される。加えて、ヌクリング転写物は、成熟マウスの種々組織（心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣(睾丸)）で検出されるのに対し、脳では検出されなかった。この結果は、該遺伝子がＦ９細胞で発現しＰ１９細胞では発現しないという事実と非常によく一致した。Ｆ９細胞は外胚葉細胞に分化することはできないが、ヌクリングが発現されないＰ１９細胞は神経、グリア、及び他の外胚葉細胞に分化できることが報告されている。またヌクリングの発現レベルは、コントロール遺伝子と比べて明らかに非常に低い（図３中のＧ３ＰＤＨ、図６Ａ中のβアクチン）。このことから内在性の発現レベルが厳格に制御されている可能性が考えられる。これらの知見は、ヌクリングが胚性幹細胞などのような多能性細胞からの外胚葉分化のネガティブなレギュレーターであることを示唆するものである（図２Ｂ）。
【００２０】
ヌクリングの第３の特徴はそれがアポトーシスを誘導することである。実施例８に示すように、ヌクリングはトランスフェクションした哺乳細胞にアポトーシス死を誘導する。特にヌクリングのＮ領域とロイシンジッパーモチーフを含む領域（1-260aa）からなる欠失変異体Ｎ／ＬＺ、並びにこれらの領域に加えてさらにＣ領域を含む（1-802aa）欠失変異体ΔＳＮ（図７参照）は、強いアポトーシス活性を示した（実施例８等）。このことから、当該ヌクリング変異体であるヌクリング-Ｎ／ＬＺ（配列番号１）及びヌクリング-ΔＳＮ（配列番号３）は、そのアポトーシス誘導性の観点から特に有用なタンパク質として位置づけることができる。
【００２１】
ヌクリングの第４の特徴はその翻訳後のプロセッシングである。図４にその模式図を示すが、ヌクリングは翻訳直後に少なくとも２つの部分に開裂する。この特徴から、ヌクリングはサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(Cdks)またはCdkインヒビター(CKIs)のように細胞周期を調節するファミリーに属するタンパク質である可能性がある。実施例で示すようにヌクリングは、まず一過性発現レベルが哺乳動物細胞中で下方制御され、さらに翻訳後直ちに開裂される。この翻訳後の開裂はタンパク分解によるものと考えられる。Cdksタンパク質のレベルも転写と翻訳後の両方で制御され、後者は主としてユビキチン仲介タンパク分解によって行われることが知られている(Deshaies, Curr Opin  Cell Biol 7, 781-789, 1995；Glotzerら、Nature 349, 132-138, 1991；Paganoら、Science 269, 682-685, 1995；Schwobら、Cell 79, 233-244, 1994)。
【００２２】
先述するように、ヌクリングはアポトーシスを促進し得る。このことから、ヌクリングの発現制御または開裂は、カスパーゼまたはプロテアソームのようなプロテアーゼによるタンパク質分解性プロセッシングを介して達成されると考えられる。後述する実施例１０は、カスパーゼインヒビターであるzVAD-fmkが、ヌクリングに対する分解速度を明らかに抑制することを示す。その一方で、幾つかのプロテアソームインヒビターによってヌクリングの発現レベルが強力に上方制御されることが明らかとなった（実施例１１）。これは、幾つかのプロテアソームがヌクリングの負の制御物質であり、そのアポトーシス活性をコントロールすることを示唆するものである(図４)。また、ヌクリングが、カスパーゼ-9、カスパーゼ-8およびカスパーゼ-3またはカスパーゼ-6等のカスパーゼを誘導することが明らかになった（実施例１０）。これは、ヌクリングが、若しくはヌクリングの分解物がカスパーゼカスケードシステムを促進することを示唆するものである（図４）。
【００２３】
アポトーシス自身は、システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼに依存し、カスパーゼは、Asp-xボックス結合で細胞性ポリペプチドの別のサブセットを開裂することによって、アポトーシス表現型を表す。カスパーゼに関するコア支持体認識モチーフは、テトラペプチド、N-末端から切断可能な結合まで(P4-P1)からなり、P1中のAspは、開裂のための絶対的要件であり、P4残基は、主要な特異的決定基である (Alnemri et al., Cell 87, 171 (1996)；Nicholson et al., Science 22, 299-306 (1997)；Thornberry et al., J Biol Chem 272, 17907-11 (1997))。カスパーゼは、通常は、健康な細胞中の睡眠状態のプロ酵素として存在するが、多様なアポトーシス刺激に応答して活性なプロテアーゼにタンパク質分解性に転換される。
【００２４】
このことから、本発明のヌクリングの作用メカニズムとして、ヌクリングがプロテアーゼによってプロセッシングされてできた小分子がカスパーゼシステムを活性化し、生じたカスパーゼ促進活性によってアポトーシス細胞死が誘導されるものと考えられる(図４)。
【００２５】
(1-2) ヌクリングの活性同等物、変異体及びその断片
本発明のアポトーシス誘導タンパク質には、前述する配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するヌクリングの他に、当該ヌクリングの活性同等物が含まれる。なお、当該ヌクリングの活性同等物（アポトーシス誘導タンパク質）は、その起源やそのアミノ酸残基数（分子量）等によって制限されるものではなく、前述するヌクリングと同様のメカニズムに基づくアポトーシス誘導活性（活性の程度は問わない）を有するものであればよい。例えば、上記ヌクリングはマウスから単離したものであるが、これに限定されることなく、ヒト、ラット、ウサギ等の各種の哺乳動物に由来するタンパク質であることができる。
【００２６】
当該活性同等物（アポトーシス誘導タンパク質）の一態様として、具体的には上記ヌクリングのアミノ酸配列（配列番号４）において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つアポトーシス誘導性を有するタンパク質を例示することができる。
【００２７】
ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ヌクリング）と同様にアポトーシス誘導活性を有する同効物（アポトーシス誘導活性の程度は問わない）であれば特に制限されない。
【００２８】
なお、アポトーシス誘導活性の評価は、特に制限されず、当業界で一般的に使用される評価方法を利用して行うことができる。例えば生化学的測定法としてＤＮＡの断片化、即ち、クロマチンＤＮＡのヌクレオソーム単位での切断を観察する方法（Gavrieli,Y et al., J.Cell Biol., 119, 493-501 (1992)）、アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化をフローサイトメトリーで測定する方法（Sherwood SW et al., Methods Cell Biol 46, 77-97 (1995))、顕微鏡観察により、その形態的特徴からアポトーシスを検出する直接的方法（Kerr. J.F., Methods in Cell Biology 46, 1-27 (1995))等を例示することができる。
【００２９】
ここでアミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全てのヌクリング相同物を包含するものである。なお。タンパク質におけるアミノ酸の変異数やその変異部位は、その生物学的機能が保持される限り特に制限されるものでなく、当業界における現在の技術常識によれば、DNA Starsoftware等のコンピュータプログラムを用いることによって容易に見出すことができる。タンパク質の構造保持の観点からいえば、置換するアミノ酸残基の物理的または化学的性質（例えば極性（疎水性、親水性、両親媒性）、電荷、可溶性、疎水性など）が、変異前のアミノ酸残基の性質と似た性質を有するアミノ酸残基を用いることが好ましい。
【００３０】
好ましいヌクリング活性同等物（アポトーシス誘導タンパク質）としては、前述するヌクリングのＮ領域とロイシンジッパー領域をよく保存してなるものを例示することができる。より具体的には、アポトーシス誘導タンパク質として配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。当該タンパク質は、アミノ酸配列において上記配列番号４に示すアミノ酸配列と約71.8％もの高い相同性を有している。該タンパク質はヒトの脳由来ｃＤＮＡライブラリーから得られるものであり、上記配列番号４のアミノ酸配列で示されるヌクリング（マウス）のヒト相当物と考えられる。
【００３１】
また、上記ヌクリングの活性同等物（アポトーシス誘導タンパク質）の他の態様として、アポトーシス誘導活性部位を有するヌクリングの部分断片を挙げることができる。かかるヌクリング活性同等物としては、前述するヌクリングのＮ領域とロイシンジッパー領域（ヌクリングの1〜228aa）からなるヌクリングの部分断片、またはかかる領域のアミノ酸配列をよく保存して有するタンパク質を好適に例示することができる。また、かかる部分断片を一部に含むタンパク質であってもよい。この場合、ヌクリングのＮ領域とロイシンジッパー領域を有するものであれば、他の領域のアミノ酸配列は特に制限するものではないが、配列番号４に示されるヌクリングまたは配列番号５で示されるヌクリングのヒト相同物のアミノ酸配列に従って、さらにＣ末端方向に伸長したアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましい。
【００３２】
好ましいヌクリング活性同等物（アポトーシス誘導タンパク質）としては、ヌクリングのＮ領域及びロイシンジッパー領域を有するヌクリングの欠失変異体N/LZ（ヌクリング-N/LZ：配列番号１）、ヌクリングのＮ領域、ロイシンジッパー領域及びＣ領域を含むヌクリングの欠失変異体ΔSN（ヌクリング-ΔSN：配列番号３）、並びに上記ヌクリング-N/LZのヒト相同物（配列番号２）及び上記ヌクリング-ΔSNのヒト相同物を例示することができる。なお、かかるヒト相同物は、前述するヌクリングのヒト相当物（配列番号５）の上記ヌクリング-N/LZやヌクリング-ΔSNに対応する部分断片である。
【００３３】
また本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、タンパク質の他の構造的特徴は特に限定されず、例えば糖鎖等により修飾されていても良い。
【００３４】
本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、本発明で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のアポトーシス誘導タンパク質の合成は、そのいずれによることもできる。また、配列番号４で示すタンパク質（ヌクリング）の同効物または配列相同物を調製するには、例えば、哺乳動物の遺伝子ライブラリーから配列番号９で示すＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション法により得られた遺伝子より、通常の組換え技術等に基づいて容易に得ることができる。
【００３５】
（２）アポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子
また、本発明は前述する本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００３６】
例えば、上記アポトーシス誘導タンパク質のうちヌクリングをコードする遺伝子としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号９に示される塩基配列からなる遺伝子を例示することができる。また、上記ヌクリングの活性同等物である▲１▼ヌクリングのヒト相同物、▲２▼ヌクリング-N/LZ、▲３▼ヌクリング-N/LZのヒト相同物、及び▲４▼ヌクリング-ΔSNををコードする遺伝子としては、それぞれ▲１▼配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号１０に示される塩基配列からなる遺伝子、▲２▼配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号６に示される塩基配列からなる遺伝子、▲３▼配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号７に示される塩基配列からなる遺伝子、及び▲４▼配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号８に示される塩基配列からなる遺伝子を例示することができる。
【００３７】
また、本発明の遺伝子には、上記各塩基配列と相補的な塩基配列に対してそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子も含まれる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とは、上記相補配列と完全な相補関係にある塩基配列に限らないことを意味するものであり、配列番号６〜１０のいずれかに示される塩基配列のうち、少なくとも１つのコドンの置換、少なくとも１つのコドンの挿入、または少なくとも１つのコドンの欠損があっても、これによってコードされるタンパク質がアポトーシス誘導活性を備えてるものであればよい。
【００３８】
ストリンジェントな条件としては常法に従って複合体を形成する核酸の融解温度（Tm）に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイス状態を維持できる洗浄条件として厳格には「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件を挙げることができる。具体的には、このような塩基配列を有する遺伝子として、上記各塩基配列（配列番号６〜１０）と相補的な塩基配列と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子を例示することができる。
【００３９】
このような遺伝子は、公知の方法、例えばｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製して単離したり、ゲノムＤＮＡから単離することもできる他、本発明によって提供された情報に基づいて化学的に合成することもできる。
【００４０】
（３）アポトーシス誘導タンパク質の製造方法
本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、当該タンパク質をコードする前記遺伝子を該遺伝子を発現し得る適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞を該発現ベクターで形質転換又は形質導入し、得られた宿主細胞を増殖させて、細胞内又は細胞外に分泌させることにより得ることができる。このようなタンパク質の製造方法は、当業界で周知慣用技術であり、例えばScience, 224,1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm.,130,692(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,5990 (1983)、大野らの「タンパク実験プロトコール１機能解析編、細胞工学別冊、実験プロトコールシリーズ、1997年、秀潤社」を参考にして実施することができる。
【００４１】
この際、使用できる発現ベクターとしては、プラスミド、ウィルス等の他に本発明の遺伝子を組み込むことが可能であり、発現しようとする宿主細胞で該遺伝子を安定に存在させることができるＤＮＡ断片等を挙げることができる。発現ベクターは、転写プロモーター、転写を制御するエンハンサー、オペレーター配列、適切なリボソーム結合配列、転写および翻訳を制御する配列、ベクターＤＮＡの複製を行うための配列等が必要である。また、細胞外へ分泌させる場合には分泌シグナル配列が必要となる。本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、並びにその発現等に必要な各種の制御要素を含む発現ベクターの作製は、当業者に周知の方法で行うことができ、例えばこれらの方法にはin vitroまたはin vivo組換えＤＮＡ技術や合成技術が含まれる（Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harber Press, Planview NY (1989) ; Ausubel F.M. et al., Current Protocol in Molecular Biology, John Wilky & Sons, New Yorkなど）。
【００４２】
また、これらの発現ベクターを組み込む宿主細胞も特に制限されず、大腸菌などの原核細胞、酵母等の真核細胞、昆虫細胞、動物細胞のいずれをも使用できるが、好ましくは細菌である大腸菌、酵母、またアフリカミドリザルの線維芽細胞由来のＣＯＳ７細胞、ヒト由来のＨｅＬａ細胞等を用いることができる。なお、これらは市販品を用いることができる。
【００４３】
本発明の遺伝子を含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法、得られた形質転換体を培養する方法はいずれも常法に従って行うことができる。斯くして得られる組換えタンパク質は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) 等参照〕により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示することができる。特に好ましい上記方法としては本発明のアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーを例示することができる。また、アポトーシス誘導タンパク質の精製指標またはその確認には、各工程の分画または単離タンパク質のアポトーシス活性を測定する方法、アポトーシス誘導タンパク質に対する抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
【００４４】
（４）抗体
本発明は、上記アポトーシス誘導タンパク質に対する抗体も提供する。当該抗体は、前述するようにアポトーシス誘導タンパク質の製造において精製やその確認のためのツールとして有用であるだけでなく、生体内でのアポトーシス誘導タンパク質の発現状況や分布の調査、またその結果に基づく該アポトーシス誘導タンパク質の作用メカニズムの解明に有効に使用できる。さらには、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現に起因する疾病の診断、または本発明のアポトーシス誘導タンパク質を用いて治療された患者の疾患の予後のモニターアッセイに用いることもできる。
【００４５】
当該抗体は、当業界で周知の方法を用いて作製することができる。本発明の抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、Fabフラグメント及びFab発現ライブラリーにより精製されるフラグメントが含まれる。
【００４６】
このような例えばポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの種々の宿主に、本発明のアポトーシス誘導タンパク質またはその免疫学的特性を保持する任意部分を注入して、免疫化し、得られた血清から調製することができる。この場合、宿主の種類に応じて種々のアジュバンドを用いて各宿主の免疫学的応答を高めることもでき、かかるアジュバンドとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットアジュバントヘモシニアンアジュバント、並びにジニトロフェノールアジュバント、並びにＢＣＧ（カルメット-ゲラン桿菌）やコリネバクテリウムパルバム等のヒトアジュバントが含まれる。
【００４７】
また、モノクローナル抗体は、各種のハイビリドーマ技術に従って調製することができる（Koehler et al., Nature 256, 495-497 (1975); Kosbor et al., Immunol Today 4, 72 (1983); Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, 77-96 (1985)など）。また、キメラ抗体（Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604-608 (1984); Takeda et al.,Nature 314, 452-454 (1985）など)また１本鎖抗体(米国特許第4946778号など)も常法に従って調製することができる。
【００４８】
なお、これらの抗体は、上記の使用目的に応じて、放射性または非放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質またはリポーター分子などで標識して用いることができ、本発明の抗体にはかかる標識抗体も含まれる。
【００４９】
（５）アポトーシス誘導タンパク質またはそれをコードする遺伝子の用途
本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、そのアポトーシス誘導乃至促進能に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待することができる。該適用疾患としては、より具体的には、例えば、癌，ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連疾患）、ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病：Adult T-cell leukemia）、毛様細胞性白血病、脊髄症（HAM/TSP）、呼吸器障害（HAB/HABA）、関節症（HAAP）、ブドウ膜炎（HAU）、等のHTLV-I関連疾患、自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）等の膠原病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenic Purapura : ITP）、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、橋本病、インスリン依存性（Ｉ）型糖尿病等が例示できる。また、血小板減少を伴う各種の疾患、例えば、骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少性、汎発性血管内凝固症等にも適用できる。さらに、本発明の誘導剤は、Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型等の各種の肝炎、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、心筋炎、ＡＲＤＳ（成人呼吸急迫症候群）、感染症、肝硬変、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群（Chronic Faligiu Syndrome）、筋シストロフィー（Myolonic dyslrophy）等の各種疾患にも適用できる。
【００５０】
例えば、本発明のタンパク質を癌細胞に適用した場合、アポトーシスを誘導若しくはこれが促進され、かくして制癌作用を発揮することができる。また、血小板減少症治療剤として用いる場合、芽球の増殖が抑制され、かくして成熟細胞の増殖を起こさせることができる。さらに、本発明のタンパク質は、アポトーシスを誘導乃至促進することにより、薬剤性ウイルス性肝炎患者における肝炎の治療乃至肝細胞の繊維化防止を行うことができ、したがって肝硬変予防剤として利用することができる。
【００５１】
本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、公知の非毒性で薬学的に許容できる担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位処方で、経口的（散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、乳化剤、懸濁剤）または非経口的（例えば、静脈内、筋肉内あるいは点滴）に投与される。例えば悪性腫瘍の治療のために必要なアポトーシス誘導タンパク質の投与量は、用法、患者の年令、性別、症状の程度、等を考慮して適宜決定されるが、通常、成人１日当たり、約0.1〜500mg程度であり、１日１回または数回に分けて投与する。
【００５２】
さらに本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、アポトーシス誘導用試薬としても有用である。この試薬によれば、腫瘍細胞等の細胞にアポトーシスを誘導させることができ、アポトーシスを起こした細胞の細胞形態、細胞遺伝子及び細胞内シグナル伝達機構の解明を研究する試薬キットとして使用できる。
【００５３】
また、本発明のアポトーシス誘導タンパク質のうちでも特にヌクリングは、それが発現するＦ９ＥＣ細胞は内胚葉系細胞へのみ分化誘導されるポテンシャルを有することから、該細胞が外胚葉系へと分化するシグナル経路を負に制御する因子として機能しているものと期待される。内胚葉は、消化管の主要部分、その付属腺である肝臓・膵臓などや胸腺・甲状腺などの咽頭派生体、呼吸器官などに分化することが知られている。ゆえに、本発明が提供するヌクリングは、全ての胚葉に分化する能力を有するがゆえに万能細胞と呼ばれる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた再生医療の臨床医学応用に際して、内胚葉系臓器の再生を特異的に誘導して、移植医療に供する際の重要な分子としての利用が期待される。
【００５４】
本発明の遺伝子は、前記本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードするものであるので、これらの工業的生産に有効に利用できる。またかかる遺伝子はこれを含むベクターを用いて、悪性腫瘍の形成および／または転移を抑制する遺伝子治療剤として用いることができる。かかる遺伝子治療剤は、HVJリポソーム法、本発明の遺伝子を注射等によってそのまま投与する方法、リンサンカルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法、あるいはリポフェクションによって投与する方法、適当なベクター、例えば、アデノウイスルベクター、アデノ関連ベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いて、ヒトを含む哺乳類に投与することができる。本発明の遺伝子治療剤は、局所的、または一時的アポトーシスの誘導の必要性から、ヌクリング等のアポトーシス誘導タンパク質が一過性に発現するような状況で投与することが望ましい。そのためには、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を注射等によって、そのまま投与する方法、HVJリポソーム法、アデノウイスルベクターを用いる方法、ワクシニアウイルスベクターを用いる方法等が挙げられる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。なお、下記の実施例において使用した実験材料及びその実験手法は、下記の通りである。
＜実験材料及び実験手法＞
１．細胞株及び培養条件
ヒトHeLa細胞、サルCos７細胞及びマウスF9EC細胞は、10％ウシ胎児血清（GIBCO BRL、ROCKVILLE）、100U/mlペニシリン及び100μg/ml硫酸ストレプトマイシンを補足したダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM：Dulbecco's modified Eagles's medium、GIBCO BRL）中で培養した。なお、マウスF9EC細胞は２〜３日毎に1mlあたり２×104細胞の割合で継代してlog-phage成長の状態に維持した（Sakai et al., J.Biochem., 118, 621-628 (1995))。また、マウスP19EC細胞はRudnicki and McBurneyら（A Practical Approach. E. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), 1987, pp.19-47)に記載する方法に従って調製した。
【００５６】
２．ＲＮＡ分析
成熟マウス多能組織と胚性組織ポリ(Ａ)+ＲＮＡブロットをクローンテック社から取得し、ＲＮＡ分析を製造者の指示に従って実施した。Ｆ９ＥＣ細胞とＰ１９ＥＣ細胞のポリ(Ａ)+ＲＮＡはMicro-Fast Track ｍＲＮＡ Isolationシステムキット(Invitrogen)を用いて抽出した。ＥＣ細胞ＲＮＡブロット分析のために、３マイクログラムのポリ(A)+ＲＮＡを、レーンごとに使用した。ＲＮＡサンプルを、1.5％(w/v)ホルムアルデヒド含有アガロースゲル(Maniatisら、1982)中で、電気泳動により分画し、20xSSC中Hybond Nナイロンフィルター(Amersham)に移し、ランダムプライムした32P-標識DNAプローブ(Feinberg et al., Anal. Biochem.137, 266-267 (1984))と、最終濃度106cpm/mlで終夜ハイブリダイズさせた。フィルターを、高いストリンジェンシー(65℃、0.2xSSC、0.1%(w/v)SDS)で１時間洗浄し、Kodak Scientific Imaging Film(Bio Max MS)に70℃で、それぞれ72時間(ヌクリング)、24時間(βアクチン)または1時間(G3PDH)の間、曝した。
【００５７】
３．インビトロ転写翻訳
全長のヌクリングタンパク質は、T3 RNAポリメラーゼとともに、ウサギ網状赤血球分解物中でTnT Kit(Promega)を用いて、pBluescript II KSにサブクローニングしたヌクリングcDNAプラスミドをインビトロで転写-翻訳することによって調製した。またビオチン化したヌクリングタンパク質は、Transcend Non-Radioactive Detection System(Promega)を用いて、インビトロで転写-翻訳することによって調製した。ネガティブコントロール分解物は、T3 RNAポリメラーゼの代わりにT7 RNAポリメラーゼを使用する以外は同様の操作を行って調製した。
【００５８】
４．免疫蛍光分析
Cos7細胞またはHeLa細胞を18x18mmのガラス製カバースリップ上で増殖させた後、Effecten(QIAGEN)を用いて所望のｃＤＮＡをトランスフェクトし、その後、PBS中の氷冷4％パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、メタノールで２分間透過処理を行った。トランスフェクトされたタンパク質の検出のために、細胞をPBS(-)で２回洗浄し、続いて、2％ヤギ血清を含むPBS(-)と共に１時間インキュベートし、そして染色した。抗Flag M5モノクローナル抗体(Kodak)は、1:200の割合で使用し、FITCまたはTexasレッド第２抗体複合体(Cappel)は、1:100の割合で使用した。なお、Vectashieldマウンティング培地は、Vector Labsから購入したものを使用した。検出は、Zeiss Axiophot上で蛍光光学顕微鏡検査を行なうことによって行い、共焦点レーザースキャニング顕微鏡およびソフトウェア(Leica TCS NT)を用いて３次元の顕微鏡画像処理を行った。トランスフェクション効率は、ヌクリングまたはその変異体を発現する細胞数を共焦点画像中でカウントし、これらの数を細胞のトータル数で割ることによって求めた。
【００５９】
５．細胞死アッセイ
ヨウ化プロピジウム染色アッセイは標準的プロトコール(Oncor)を用いて、またTUNELアッセイはIn Situ Cell Detection Kit, Fluorescein(Roche)を用いてそれぞれ行なった。細胞死のパーセントは、トリパンブルー染色アッセイにより測定した。培養培地中のpFlag-ヌクリングまたはその変異体でトランスフェクトされた分離したCos7細胞を、遠心分離(800g×5分間)により濃縮して、100μlの氷冷PBSに再懸濁し、その後、0.4％トリパンブルー溶液(Sigma)と共に10分間インキュベーションし、血球計で100以上の細胞を数えた。
【００６０】
６．ウェスタンブロット分析
(1)  細胞抽出物の調製
トランスフェクション２日後に直径10cmプレート上で２日間培養した細胞を5ml冷却PBSで２回洗浄し、遠心分離(1000rpmで5分間)してペレットを回収した。該ペレットを、プロテアーゼインヒビターカクテル(0.1mM PMSF、2μg/mlのロイペプチンおよびアプロチニン)を補足した２mlの冷却TNEバッファー(1% NP-40, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl[pH7.8], 1mM EDTA)中に再懸濁し、26Gニードル中に通して細胞を破壊し、そして氷上で30分間インキュベートした。遠心分離(14,000rpmで20分間4℃)により、細胞質成分を含む上清と核および細胞骨格組織を含むペレットを取り出し、SDS-PAGEに関する1xサンプルローディングバッファーで変性させた。なお、各画分のタンパク質濃度は、BSAを標準品として用いてPierce Protein Assay (Pierce)により推定した。
【００６１】
（２）ウエスタンブロット分析
１レーンの総タンパク質量が10μｇとなるように、適当％のTris-グリシンゲル上にロードし、電気泳動した後、ニトロセルロース膜上に移し、所望の抗体と共にインキュベートすることによってウエスタンブロット分析を行った。なお、抗体として、ヌクリングのFlag-エピトープ(M5)(Kodak)、EGFP(CLONTECH)、カスパーゼ-9(PharMigen)およびヌクリングの中間領域に反応性を有する抗体をそれぞれ使用した。検出は、ECL検出(Amersham-Pharmacia)またはAP検出(Roche)を用いて、その標準的手順に従って行なった。
【００６２】
また、下記において示す「Flag」とは８アミノ酸からなるマーカーペプチド（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）、「EGFP」とは緑色の蛍光性タンパク質（Enhanced Green Fluorecent Protein）を意味するものであり、いずれも公知の標識ラベルである。
【００６３】
＜実施例＞
実施例１  Ｆ９ＥＣ細胞に特異的なｃＤＮＡのクローニング
マウスＦ９ＥＣ細胞とマウスＰ19ＥＣ細胞との間でｃＤＮＡサブトラクションを行い、Ｆ９ＥＣ細胞に特異的なｃＤＮＡをクローニングした。
（１）ライブラリーの構築及びサブトラクトラクションプローブの調製
Ｆ９ＥＣ細胞またはＰ19ＥＣ細胞から、各ポリ(A)+ＲＮＡを、Micro-Fast Track mRNA Isolation system kit（Invitrogen）を用いて精製した。これらのＲＮＡから、ＰＣＲ-SelectTMｃＤＮＡ Subtraction Kit(CLONTECH, PALO ALTO,CA)を利用してサブトラクトｃＤＮＡプールを作成した。該サブトラクトｃＤＮＡプールをAdvantage cＤＮＡ ＰＣＲ Kit(CLONTECH, PALO ALTO,CA)を用いたＰＣＲで増幅し、次いで該ｃＤＮＡプールをpT7 Blueベクター（Novagen）にＴ／Ａクローニングして単方向性のｃＤＮＡライブラリー（F9EC細胞またはP19EC細胞）を構築した。
【００６４】
またＦ９ＥＣ細胞またはＰ１９ＥＣ細胞から調製したＲＮＡについて、上記サブトラクションキットを使用してサブトラクティブハイブリダイゼーションを行って、Ｆ９ＥＣ細胞に特異的なｃＤＮＡを取り出し、これを32P-標識ヌクリングcDNAプローブとして調製した。
【００６５】
（２）ライブラリースクリーニング及び配列分析
スクリーニングに用いるマウス由来のライブラリー（F9EC細胞またはP19EC細胞）を、40mg/lアンピシリンと40mg/l  X-galを含むφ10cm ＬＢプレート上に100-500の密度になるようにまいた。白いコロニーを釣り上げ、サブトラクションキット中のプライマーを使用してＰＣＲによって、所望のｃＤＮＡが挿入されているかを確認した。所望のｃＤＮＡを含むコロニーをＰＣＲ-Select Differential Screening Kit(CLONTECH, PALO ALTO,CA)を使用して再度スクリーニングした。かかるスクリーニングによってＦ９ＥＣ細胞に特異的なクローンを１３個拾い上げた。そのうち１つのクローンは、ノーザンブロッティングによってＦ９ＥＣ細胞に強い特異性を示し、約４.５kbに単一バンドを示した（図３）。
【００６６】
次いで、MarathonTM cDNA Amplification Kit（CLONTECH, PALO ALTO,CA)を使用してＦ９ＥＣ細胞に特異的な遺伝子の全長ｃＤＮＡを取得し、その配列を決定した。具体的には、配列決定は、ネスト欠失を有するオーバーラッピングクローン（double-stranded Nested Deletion Kit;Pharmacia）を使用して両方のストランドについて行った。配列の分析はジェネチックスコンピューターグループソフトウエアパッケージを使用して行った（Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12, 387-395, 1984)。決定した塩基配列を配列番号９に示す。次いで、この塩基配列をBLASTプログラムのGenBankデータベース（Altshul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410,（1990)）で検索して、これが新規の遺伝子であることを確認した。該遺伝子の塩基配列情報を、GenBankヌクレオチド配列データベースに受託番号AB030647として登録した。
【００６７】
（３）Ｆ９ＥＣ細胞特異的タンパク質の構造及びそのアミノ酸配列
上記（２）で得られたＦ９ＥＣ細胞特異的ｃＤＮＡの全長塩基配列（配列番号９）から、この塩基配列は９０１アミノ酸の潜在的なオープンリーディングフレームをコードするものであることがわかった（図１Ａ，Ｂ、配列番号４）。なお、そのタンパク質は、アミノ末端から順次、(186-228aa)領域に典型的なロイシンジッパーモチーフ（図１Ａ：ＬＺ、図１Ｂ：下線部）、(713-721aa)領域に推定的チロシン受容体リン酸化部位（図１Ａ：ＴＹＲ、図１Ｂ：グレイボックス）、及びカルボキシ末端領域（(803-865aa)領域）にｔ−ＳＮＡＲＥ超らせんドメイン（図１Ａ：ＳＮＡＲＥ、図１Ｂ：ボックス）を有していた。理論上のｐＩと分子量はそれぞれ７.５７及び103532.39であった（ExPASy Molecular Biology Server, the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)）。
【００６８】
また、当該全長ｃＤＮＡから調製したインビトロ転写翻訳産物は約100kDaを有しており、これが全長タンパク質（ヌクリング）に相当すると思われた（図５Ａ参照）。同様にインビトロ転写翻訳によって約120kDaの翻訳産物の生成が認められたが（図５Ａ参照）、このバンドはヌクリング過剰発現細胞分解物のウエスタンブロット分析では観察されなかったので（図５Ｂ参照）、上記全長タンパク質（ヌクリング）の共有結合修飾物に由来するものと考えられた。
【００６９】
実施例３  発現パターンからみるヌクリングの多様性
ヌクリングの組織分布を調べるために、上記ヌクリング全長ｃＤＮＡを32Ｐ−マウスヌクリングcDNAをプローブとして、成熟マウスの組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣(睾丸)）及び胚性組織（Ｅ7、Ｅ11、Ｅ15、Ｅ17）に対してノーザンブロッティングを行った。また、それに引き続いて、同組織を32Ｐ-標識マウスβ-actin cDNAプローブを用いてノーザンブロッティングを行った。結果を図６Ａに示す。この結果からわかるように、成熟マウスの組織に関しては、約４.５ｋｂサイズの単一の転写物が主として心臓、肝臓、腎臓及び精巣（睾丸）に、また僅かに肺及び骨格筋に発現していた。一方、当該転写物は脳と脾臓には全く発現していなかった。また胚性組織に関して、ヌクリングｍＲＮＡの発現レベルは、マウスの後期発生期間に直線的に増加すること（図６Ａ、Ｂ）、及び筋肉系細胞への分化誘導時に上昇することが明らかとなった。
【００７０】
なお、図６Ｂは、胚性組織に関して得られたノーザンブロットのバンド（図６Ａ）の密度をImage Quant Version 5.0ソフトウェア(Molecular Dynamics)を用いて定量し、得られたヌクリングmRNAの量を同様にして得られる各レーンのβアクチンmRNA量で割った値をプロットしたものである。
【００７１】
実施例４  ヌクリングの細胞内における局在性
（１）ヌクリングの細胞内での局在性を調べるために、該タンパク質のＮ末端を単一のFlagエピトープで標識し（図７のWild-type参照）、サルCos７細胞またはヒトHeLa細胞中で発現させて免疫蛍光分析を行った。
【００７２】
結果を図８（Ａ〜Ｃ、Ｋ）に示す（サルCos７細胞（図８Ａ〜Ｃ）、ヒトHeLa細胞（図８Ｋ））。図８Ａ〜Ｃ及び図８Ｋは、Flag標識したヌクリング（Flag-ヌクリング）でトランスフェクトしたサルCos7細胞及びヒトHeLa細胞を、抗Flag M5モノクローナル抗体(Kodak)（緑）を用いて間接免疫蛍光法で分析した結果を示す。なお、比較のため、当該サルCos7細胞及びヒトHeLa細胞に対してエチジウムブロミド染色（ＤＮＡ染色）した結果を赤色で示す。その結果、Flag-ヌクリングが核膜周辺にクラスター状になって局在していることが判明した（図８Ａ−Ｂ，Ｋ）。また、これらヌクリング発現細胞の２〜５％では核膜周辺のみならず細胞質中にも広範囲にヌクリングの発現が認められた（図８Ｃ）。本発明のタンパク質を「ヌクリング」と命名したのは、このようなユニークな発現プロフィール（核周囲に存在して、核に絡みつく分子）に基づくものである。
【００７３】
（２）また、Flag-ヌクリング及びその変異体（Flag-ヌクリング-C/SN）を過剰発現するようにCos7細胞をトランスフェクションし、この細胞抽出物（上清(sup)：細胞質、ペレット(pellet)：核・細胞骨格）について、抗Flag M5モノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析した結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ（左；wild type）からわかるように、Flag-ヌクリングの免疫反応バンド（105kD）は、核・細胞骨格画分(pellet)にだけ見られ、細胞質画分(sup)には見られなかった。このタンパク質の局在性は上記（１）に示すヌクリングの発現パターンと一致していた。
【００７４】
実施例５  ヌクリングのモチーフとクラスター形成との関係
一般に、ロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインの両方は、サブユニットのオリゴマー化を仲介することが知られている（Cohen and Parry, Science 263, 488-489, 1994； Weimbs et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 94, 3046-3051, 1997）。そこで、我々はヌクリング中のこれらのモチーフがヌクリングのクラスター形成にどのように関係しているかを調べるために、ヌクリングの幾つかの欠失変異体を用いて、これらのHeLa細胞またはCos７細胞中での発現パターンを実施例４と同様にして免疫蛍光分析によって調べた。
【００７５】
図７に各種ヌクリングの欠失変異体を示す。変異体１はヌクリングのＮ領域(1-186aa)（Ｎ）を含み；変異体２はヌクリングのＮ領域とロイシンジッパーモチーフ(1-228aa)（Ｎ／ＬＺ）を含み；変異体３はヌクリングのＣ領域とt-SNARE超らせんドメイン(228-901aa)（Ｃ／ＳＮ）を含み；変異体４はヌクリングのＣ領域(228-803aa)（Ｃ）を含み；変異体５はヌクリングのＮ領域とロイシンジッパーモチーフとＣ領域(1-803aa)（t-SNARE超らせんドメインの欠失体：ΔＳＮ）を含み；変異体６はヌクリングのＮ領域とＣ領域（ロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインの欠失体：ΔＬＺ／ＳＮ）を含み；変異体７はヌクリングのＮ領域とＣ領域とt-SNARE超らせんドメイン（ロイシンジッパー領域の欠失体：ΔＬＺ）を含んでいる。なお、これらの変異体はすべてＮ末端をFlag-ペプチド（変異体３〜５）またはEGFP(Enhansed GFP)（変異体１〜２、５〜７）で標識した（図中、Tag-と示す）。
【００７６】
各欠失変異体の細胞中での発現局在性を図７（右端）、並びに図８（Ｄ〜Ｊ）に示す。その結果、Ｎ領域とロイシンジッパーモチーフを有する変異体２（ヌクリング-N/LZ）は、主に核の周囲にクラスター状に凝集し（図８Ｆ）、さらにこれからロイシンジッパー領域を欠いた変異体１（ヌクリング-N）はクラスターを形成できなかった（図８Ｇ）。また、ヌクリング全長配列からロイシンジッパーモチーフだけを欠いた（t-SNARE超らせんドメインを有する）変異体７（ヌクリング-ΔLZ）もクラスター形成能を有していた（図８Ｉ）。しかしながら、ロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインの両方を欠く変異体６(ヌクリング-ΔLZ/SN)は、この能力を消失していた（図８Ｊ）。さらに、t-SNARE超らせんドメインを有するものの、Ｎ領域を欠いた変異体３（ヌクリング-C/SN）もクラスター形成能力を消失していた（図８Ｈ）。この結果から、Ｎ領域＋ロイシンジッパーモチーフまたはＮ領域＋ｔ-SNARE超らせんドメインがクラスター形成に何らかの形で作用していると思われた。
【００７７】
以上、図８に示すように、Ｎ領域とロイシンジッパーモチーフを欠失した（Ｃ領域とt-SNARE超らせんドメインを有する）変異体３(ヌクリング-C/SN)（図８Ｈ）、Ｎ領域だけを有する変異体１（ヌクリング-N）（図８Ｇ）、及びＣ領域だけを有する変異体４（ヌクリング-C）（データなし）は、核周囲に分布しないで細胞質全体に広く分布していた。そこで、これらの欠失変異体について実施例４（２）と同様にして調製した細胞抽出物（上清(細胞質)、ペレット（核・細胞骨格））についてウエスタンブロット分析を行ったところ、変異体３（ヌクリング-C/SN）（図５Ｂ：mutant C/SN）、変異体１（ヌクリング-N）及び変異体４（ヌクリング-C）（データなし）については、ヌクリング（wild-type）とは異なって、核・細胞骨格画分と細胞質画分との間に局在性は見られず、上記の発現パターンとよく一致していた。
【００７８】
実施例６  ヌクリング−トランスフェクト哺乳動物細胞における発現効率の低下
コントロールベクター（pFlag-BAPベクター（Kodak社製）、pEGFP-C1ベクター(クローンテック社製)）とEffectene lipofection kit（キアゲン社製）を用いてCos7細胞に50-80％の効率でトランスフェクションを行ったところ、ヌクリングを用いたトランスフェクションの効率は0-10％にまで減少した。このことから、ヌクリングの発現が負方向に制御されている可能性が示唆された。かかるヌクリングの発現レベルの制御に関わる構造上の特徴を解明するために、図７に示す各種の欠失変異体を用いてトランスフェクション効率（Cos7細胞、HeLa細胞）を調べた。結果を図７に「トランスフェクション効率」として併せて示す。なお図には、各タンパク質をコードする遺伝子を発現した細胞の割合「約0-10％」、「約10-40％」及び「約40-80％」に応じて、それぞれ「low」、「medium」及び「high」と示す。
【００７９】
その結果、Ｎ領域とロイシンジッパーモチーフを有する変異体２(ヌクリング−N/LZ)の発現効率は明らかに減少するのに対し（Cos7細胞で10-40％、HeLa細胞で10-30％）、Ｎ領域だけを有する変異体１（ヌクリング−Ｎ）の発現効率はコントロールベクターと同様に高かった（Cos7細胞で40-80％、HeLa細胞で40-60％）。この結果は、ロイシンジッパーモチーフが、細胞数の減少（発現効率の低下）にいくらか関与していることを示す。しかしながら、ロイシンジッパーモチーフを欠く変異体７（ヌクリング−ΔLZ）は、野生株と殆ど同じ低い発現効率を示した（0-12%）ので、ロイシンジッパーモチーフそれ自身は、細胞数の減少（発現効率の低下）に直接関わらないようである。またロイシンジッパーモチーフとt-SNARE超らせんドメインの両方を欠く変異体６（ヌクリング-ΔLZ/SN）の発現効率は、ロイシンジッパーモチーフだけを欠く変異体７と比べて僅かに増加した（Cos7細胞で10-30%）。このことから、t-SNARE超らせんドメインは、ヌクリング発現レベルの制御に何らかの役割を担っていると思われた。
【００８０】
実施例７  ヌクリングの核輸送阻害性
ヌクリングは核膜周辺でクラスター状に蓄積することから、その核輸送に対する影響を調べた。具体的には、核マーカー蛋白の発現ベクター（pEGFP-Nucベクター：リポーターベクター）を、細胞質マーカー蛋白の発現ベクター（Flag-BAPベクター：ターゲットベクター No.１）または Flag-ヌクリング若しくはFlag-ヌクリング変異体（変異体３：ヌクリング-C/SN、変異体４：ヌクリング-C）の発現ベクター（ターゲットベクター No.２）のいずれかと同時にトランスフェクトし、得られた細胞について免疫蛍光分析を行った。モル比１：１０の割合でターゲットベクターとリポーターベクターとを同時トランスフェクトした。ターゲットベクターとして、Flag-BAPベクターを使用した結果を図９(Ａ〜Ｃ)に、Flag-ヌクリング発現ベクターを使用した結果を図９(Ｄ〜Ｆ、Ｍ)に、Flag-ヌクリング-C/SN発現ベクターを使用した結果を図９(Ｇ〜Ｉ)に、及びFlag-ヌクリング-C発現ベクターを使用した結果を図９(Ｊ〜Ｌ)に、それぞれ示す。
【００８１】
その結果、Flag-BAP（bacterial alkaline phosphatase）を発現する細胞（図９Ｂ中、赤で示す）の殆どが（99.1%）、EGFP-Nuc（図９Ａ中、緑で示す）を同時発現しているのに対して（図９Ｃ）、Flag-ヌクリング発現細胞（図９Ｅ中、赤で示す）はいずれもEGFP-Nuc（図９Ｄ）を同時には発現していなかった（図９Ｆ）。
【００８２】
また、ヌクリングの変異体の発現に関しては、Ｎ領域とロイシンジッパーモチーフを欠く変異体３（Flag-ヌクリング-C/SN）発現する細胞の約４４.７％（図９Ｈ,Ｉ中、赤で示す）が、EGFP-Nuc（図９Ｇ,Ｉ中、緑で示す）を同時に発現した。殆ど同じ結果がＣ領域のみ有する変異体４（Flag−ヌクリング-C）についても得られ、変異体４を発現する細胞の約６６.８％がEGFP-Nucを同様に発現した（図９Ｊ−Ｍ）。また、Flagモノクローナル抗体に代えてヌクリングポリクローナル抗体を用いた場合も、同様の結果が得られた(データは示さず)。また、細胞質内でEGFP-Nucを発現するか又は分泌する幾つかの細胞が観察された（図９Ｍ）。
【００８３】
これらの結果、すなわち、1）共焦点レーザー顕微鏡像で、ヌクリングが核周囲を覆い隠すようにまとわり付いた発現を示していたこと、2）ヌクリング強制発現細胞で、核に発現するはずのEGFP-Nucを発現している細胞が極端に少なかったこと、及び3）EGFP-Nucが核ではなく、細胞質に留まって発現している像が確認されたことなどから、ヌクリングは核輸送を阻害する機能を有している可能性が示された。また、ヌクリングは細胞質タンパク質を同時に発現していないこともわかった。このことからもヌクリングは核輸送または蛋白発現を阻害し得る可能性が示唆された。
【００８４】
実施例８  ヌクリングのアポトーシス誘導活性
上記の実施例において得られたヌクリングの発現制御及び核輸送阻害性に関する結果、並びにヌクリングを発現する細胞の核崩壊性の結果（図８Ｌ〜Ｍ）は、ヌクリングにアポトーシス誘導作用があることを示唆するものである。この推論の正否を調べるために、下記の実験を行った。
【００８５】
（１）ヨウ化プロピジウム(PI)染色アッセイ
pFlag-ヌクリング発現ベクターでトランスフェクトした細胞（HeLa細胞）（Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞）のアポトーシス損傷を調べるために、ヨウ化プロピジウム(PI)染色アッセイを行って、浸透処理しない細胞の核がＰＩで染色されるかどうかを免疫蛍光顕微鏡によって検査した。比較のため、pFlag-BAP発現ベクターでトランスフェクトした細胞（HeLa細胞）（Flag-BAP/トランスフェクト細胞）についても同様に実験を行った。具体的には、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞またはFlag-BAP/トランスフェクト細胞を、浸透化前処理しないでヨウ化プロピジウム(PI)とともにインキュベートすることによってＰＩ染色を行い、それぞれanti-Flag 染色による染色パターンと比較した。なお、ヌクリング発現細胞またはFlag-BAP発現細胞はanti-Flag染色によって緑色に呈色し、アポトーシスによって損傷した細胞はＰＩ染色によって赤色に呈色する。
【００８６】
結果を図１０Ａに示す。その結果、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞は、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞より約１０倍以上も強くＰＩで染色された。さらにFlag-ヌクリング発現細胞（図１０Ａ：ｄ）とＰＩ陽性細胞（図１０Ａ：e,f）の間には強い関連性があるのに対し、Flag-BAP発現細胞（コントロール；図１０Ａ：a）とＰＩ陽性細胞（図１０Ａ：b,c）の間には相関関係がなかった。この結果から、ヌクリングの発現とアポトーシスの誘導との間に関連性があることが示唆された。
【００８７】
（２）ＴＵＮＥＬ染色アッセイ
細胞損傷に関する上記結果をさらに確認するために、さらにIn Situ Cell Death Detection Kit(ロッシュ)を用いたTUNEL染色アッセイによってアポトーシスの検出を行った。Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞について、TUNEL染色による染色パターン（図１０Ｂ：a、拡大図a'）とFlag染色による染色パターン（図１０Ｂ：b、拡大図b'）とを比較した結果を図１０Ｂに示す。その結果、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞の約１０％がTUNEL陽性を示した。一方、比較のため同様に行ったFlag-BAP/トランスフェクト細胞は、いずれもTUNEL陽性結果が示さなかった(データ示さず)。また、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞のTUNEL-陽性細胞の殆どがFlag-ヌクリングを同様に発現し（図１０Ｂ；a-c）、またクロマチン凝縮、フラグメント化、及び核からのＤＮＡの移動といったアポトーシス特性も見られた（図１０Ｂ、a'-c'）。これらの結果はヌクリングが実際にアポトーシスを誘導する分子であることを示すものと考えられる。
【００８８】
（３）一過性強制発現系における細胞死誘導実験
Flag-ヌクリングまたはその欠失変異体（ヌクリング-N/LZ）の発現ベクターをそれぞれ培養皿（培地）中のCos７細胞にEffecteneを用いてトランスフェクトし、ヌクリングまたはその欠失変異体（ヌクリング-N/LZ）を強制発現させた。次いで、24時間、48時間、および72時間後に、培養皿から付着性を消失して剥がれ浮いてくる細胞数を数えた。また、その剥離細胞をトリパンブルー染色し、死細胞の割合を調べた。コントロールのため pEGFP-C1ベクター（クローンテック社）でトランスフェクトしたCos７細胞についても同様の実験を行った。なお、トリパンブルー染色は、培養皿から剥離したCos７細胞を遠心分離（800ｇ×５分間）によって濃縮し、100μｌの氷冷PBSに懸濁し、0.4％トリパンブルー溶液（シグマ社）とともに10分間インキュベーションすることによって行い、血球計を用いてトリパンブルーで染色した細胞（死細胞）の数を計測した。
【００８９】
ヌクリング及びその欠失変異体（ヌクリング-N/LZ）を強制発現させた細胞並びにコントロール細胞について、１培養皿あたり剥離した細胞数（×1000/plate）の経時的変化を図１１Ａに、全細胞に対する死細胞の割合（％）の経時変化を図１１Ｂに示す。この結果からわかるように、ヌクリングの欠失変異体（ヌクリング-N/LZ）を発現する細胞は、発現から24時間後で非常に多くの細胞が培養皿から剥離し、死に至ることが示された。また、ヌクリングを発現する細胞もまたコントロール細胞に比べて有意に剥離細胞並びに死細胞の割合が高かった。
【００９０】
以上の実験（１）〜（３）で示すように、ヌクリング強制発現細胞は、その多くがアポトーシス検出の一般的な染色法であるＰＩ染色法及びTUNEL染色法のいずれに対しても陽性を示し、また実際にヌクリング強制発現細胞については死細胞の割合がコントロールに比べて有意に多かったことから、ヌクリングが強力なアポトーシス誘導活性を有することが示唆された。さらに(３)の細胞死誘導実験において、ヌクリングの変異体であるヌクリング-N/LZを強制発現する細胞は、ヌクリング強制発現細胞にも増して死細胞数が多かったことから、該ヌクリング-N/LZはヌクリング以上に強力なアポトーシス誘導活性を有することが示唆された。
【００９１】
（４）剥離細胞中におけるヌクリング分子の発現量の測定
上記（３）と同様にして、Cos７細胞にFlag-ヌクリング、その欠失変異体（Flag-ヌクリング-ΔSN）及びコントロール・タンパク（Flag-BAP）を一過性強制発現させ、72時間後に剥離してきた細胞を培地上清から回収し、ウエスタンブロット法によって発現生成したタンパク質を検出した。結果を図１７に示す。なお、図１７中、レーンＭは培地上清画分、レーンS/Nは細胞質画分、レーンＰは核・細胞骨格画分についてのウエスタンブロット結果を示す。その結果、コントロール・タンパク（Flag-BAP）は培地上清画分（剥離細胞）中にその存在を確認することができなかったが、Flag-ヌクリング、及びその欠失変異体（Flag-ヌクリング-ΔSN）はいずれも培地上清画分（剥離細胞）中に、細胞質画分（S/N）及び核・細胞骨格画分（P）に比して有意に強いバンドとして検出された（レーンＭ）。このことから、ヌクリングの変異体であるヌクリング-ΔSNは、ヌクリングど同様に、その発現は細胞にダメージを与え、細胞死が誘導されることが示唆された。
【００９２】
実施例９  ヌクリングの翻訳後プロセッシング
実施例８で示すように、ヌクリングｃＤＮＡの哺乳動物培養細胞へのトランスフェクション効率は非常に低い。このため、ヌクリングは翻訳後にプロセッシングを受けることによって形状が変化している可能性が考えられた。
（１）これを確認するために、ヌクリングの中間部分(467-711aa)に対して反応するNUCL.midポリクローナル抗体（抗NUCL.mid抗体）を作成し、当該抗NUCL.mid抗体と抗Flag M5モノクローナル抗体（抗Flag抗体）を用いてFlag-ヌクリング/トランスフェクト細胞（HeLa細胞）について免疫蛍光分析を行った。なお、NUCL.midポリクローナル抗体は、上記アミノ酸配列領域（467-711aa)を有するペプチドを、pGEX2T(Pharmacia)にクローニングして、ＧＳＴ-融合タンパク質（GST-Nucl.mid：図１２参照）を調製し、これをGlutathione-Sepharose 4Bカラム(Pharmacia)で精製し、これでニホンシロウサギを免疫し、該ウサギの血清から常法に従って調製した。
【００９３】
結果を図１３（ａ〜ｃ）に示す。これからわかるように、抗Flag抗体（anti-FLAG）による染色パターンは、抗NUCL.mid抗体（anti-NUCL.mid）による染色パターンと全く異なっており、完全に区別された。anti-Flag染色は主に核周囲で検出されるのに対し(図１３a)、anti-NUCL.mid染色は細胞質中で検出された(図１３b)。また、全てのFlag陽性細胞は抗NUCL.mid抗体で染色されたが、NUCL.mid陽性細胞には抗Flag抗体で染色されないものが少数あった。
【００９４】
この結果は、ヌクリングが、核周囲局在部分または細胞質局在部分といった幾つかの部分に開裂することを示唆する。或いは、コンホメーション変化は、核周囲局在タイプおよび細胞質ゾルタイプの間での、抗体に対する反応性の相違に関与し得る。
【００９５】
（２）また、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞（HeLa細胞）の細胞抽出物（上清（細胞質画分S/N）：レーン1,2、ペレット（核画分P）：レーン3）について、抗Nucl.midポリクローナル抗体(レーン1)または抗Flag M5モノクローナル抗体(レーン2、3)を用いてウエスタンブロット分析した結果を図１３ｄに示す。これからわかるように、抗Flag抗体反応性バンドは、核分解物を含む画分中（Ｐ）でのみ見られたが、抗Nucl.mid.抗体反応性バンドは、細胞質画分中（S/N）で見られた。またFlag抗体反応性バンドのサイズは約105kDであり、抗Nucl.mid.抗体反応性バンドのサイズ（約80Kd）と異なっていた。実施例１に示すように、核画分（Ｐ）で見られる抗Flag抗体反応性バンド（約105Kd）は、全長ヌクリングに相当する。他方、細胞質画分で見られる低分子量のバンド（約80Kd）は、全長ヌクリングが開裂して生じた抗Nucl.mid抗体反応性分子に相当するものと考えられた。また、核膜周辺に発現される全長ヌクリングについては抗Nucl.mid.抗体への反応性が見られなかった（結果示さず）。これは、核膜周辺でヌクリングが、クラスター形成によるコンフォメーション変化によって抗Nucl.mid.抗体に対して反応性を消失したことによると仮定される。
【００９６】
（３）さらに、全長ヌクリングに代えて各種の欠失変異体（図７参照）を用いて免疫蛍光分析及びウエスタンブロット分析を行った。変異体３（ヌクリング-C/SN）及び変異体７（ヌクリング-ΔLZ）の結果をそれぞれ図１４及び図１５に示す。またその他の変異体の細胞局在性をTag-染色、及び抗Nucl.mid.抗体染色によって調べた結果を図１６に示す。
【００９７】
免疫蛍光分析の結果、変異体５（ヌクリング-ΔSN）および変異体７（ヌクリング-ΔLZ）は、全長ヌクリング（Wild-type）と同様に核画分−細胞質画分間の局在性を示したが、変異体３（ヌクリング-C/SN）、変異体４（ヌクリング-C）及び変異体６（ヌクリング-ΔLZ/SN）にはそのような局在性は見られなかった(図１６)。例えば、図１４に示すように、変異体３（ヌクリング-C/SN）のFlagエピトープ（Tag-エピトープ）の発現パターンと抗NUCL.mid抗体に対するエピトープの発現パターンとは殆どオーバーラップしていたが、変異体７（ヌクリング-ΔLZ）のEGFPエピトープ（Tag-エピトープ）の発現パターンは、抗NUCL.mid抗体に対するエピトープの発現パターンと異なっていた（図１５）。このことから、ヌクリングの開裂には、Ｎ末端(1-267aa)、並びにロイシンジッパーモチーフまたはt-SNARE超らせんドメインの両方が必要ではなく、何れかが必要であることがわかる。
【００９８】
実施例１０  第１開裂段階におけるt-SNARE超らせん領域の作用
実施例９で示すように、ヌクリングは、核膜周辺での局在から、分子内開裂によって細胞質に排出される。タンパク質のどの部分が開裂するかを調べるために、図１５に示す欠失変異体を使用し、ウェスタンブロッティングを行った。具体的にはFlag-変異体／トランスフェクト細胞（Cos7細胞）の細胞抽出物（培地上清：Ｍ、細胞抽出物の上清（細胞質画分）：Ｓ／Ｎ、細胞抽出物のペレット（核画分）：Ｐ）について、抗Nucl.mid.抗体及び抗Flag-M5抗体を用いて免疫ブロットを行った。
【００９９】
抗Nucl.mid抗体を用いたウエスタンブロッティングから、ヌクリングまたは各種のヌクリング変異体（ヌクリング-ΔSN、ヌクリング-ΔLZおよびヌクリング-ΔLZ/SN)を発現する細胞の抽出物から複数のバンドが検出され、ヌクリングがフラグメント化されていることが示された。なお、ヌクリング（Flag-Nucling）及びヌクリング変異体（ヌクリング-ΔSN：Flag-ΔSN）についての結果を図１７にコントロール・タンパク質（Flag-BAP）の結果と併せて示す。フラグメント化は、Ｍ（培地上清）のレーンに示すようにかなり異なっていた。細胞質画分(S/N)および核画分(P)との間のフラグメント化のパターンは、全長ヌクリングにおいて、明らかに異なっていた。他方、ヌクリング-ΔSNとヌクリング-ΔLZ/SN(データ示さず)との間で、細胞質画分S/Nと核画分Pのフラグメント化パターンは同じであった。これは、t-SNARE超らせん領域が、ヌクリングの開裂に必須であることを示す。さらに、細胞質画分S/Nおよび核画分Pのフラグメント化バンドの密度は、培地上清の画分Ｍのものと比べて非常に僅かであった。このことから、ヌクリングは開裂後にさらに小さな分子に分解されることが示唆される。ヌクリング-ΔSN中のフラグメント化バンドの密度は、ヌクリングのそれらよりも更に密であった。これは、t-SNARE超らせん領域が、開裂後のタンパク質の分解にも重要であることを意味する。これは、第１開裂段階が更なる分解に必須であるためと思われる。
【０１００】
実施例１１  ヌクリングによるカスパーゼ経路の誘導
カスパーゼは、連続的なプロセッシングによって他を活性化するシグナリングプロテアーゼとして知られているが(例えば、カスパーゼ-8および-9)、最近、カスパーゼ-3、-6および-7がアポトーシスのエフェクターとして作用するという報告がされている(Cohen、Biochem J 326, 1-16 (1997))。また、マウスを用いた実験から、カスパーゼ-3が中枢神経系(CNS)や他の組織のアポトーシス状況でPCDに要求されること(Kuidaら、Nature 384, 368-372, 1996；Wooら、Genes and Development 12, 806-819, 1998）、またカスパーゼ-3は、クロマチン凝縮を含む、アポトーシス関連性核変化に必須のプロテアーゼであること(Woo,M., et al., Genes and Development 12, 806-819 (1998))が明らかになっている。
【０１０１】
そこで、ヌクリングがアポトーシス誘導分子であることを確認するために、ヌクリングとカスパーゼとの関連性を調べた。
【０１０２】
（１）まず、カスパーゼプロテアーゼインヒビターであるzVAD-fmk(Enzyme Systems Products)を用いて、ヌクリングの発現レベルに対する影響を調べた。具体的には、Flag-標識ヌクリングをCos7細胞にトランスフェクションした後、該細胞を直ちにDMSOに溶解したzVAD-fmk（50μM）で終夜処理した。次いでこの細胞を直径10cmプレート上で２日間培養し、回収した細胞を用いて細胞抽出物を調製し、これについてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１８に示す。図のレーンにおいて−はzVAD-fmk処理しなかった細胞抽出物（分解物(lysate)、ペレット）、＋はzVAD-fmk処理した細胞抽出物（分解物、ペレット）についての結果を示す。
【０１０３】
ウエスタンブロット分析の結果から、zVAD-fmkがヌクリングの開裂を有意に抑制することがわかった。抗Flag M5抗体で検出されるp105全長バンドの密度は、zVAD-fmk(+)核画分のレーン(図１８、レーン15)において、zVAD-fmk(-)核画分のレーン(図１８、レーン14)よりも、はるかに高かった。抗Nucl.mid.抗体を用いても同じ結果が得られた(図１８、レーン5-8)。さらに、抗Nucl.mid.抗体を用いると、細胞質画分中に検出される単一の弱いバンドしか観察されなかった(図１８、レーン5)。しかし、トランスフェクション後直ちにzVAD-fmkを培養培地に添加することにより、複数の明確なバンドが出現した(図１８、レーン6)。またこれらのより低分子量のバンドの全て(a', b', c')も、インビトロ翻訳産物に関するレーンで観察された(レーン2、a-c)。よって、これらのバンドは、ヌクリングの自律的開裂によって生じた不安定なバンドかもしれない。他方、３つに開裂されたバンドが、zVAD-fmk添加後に核画分中に出現した(図１８、レーン8)。そして、核画分中の数サイズのヌクリングバンドの強度も、zVAD-fmk処理によって増加した。これらのデータは、ヌクリングが、カスパーゼの作用によって開裂するか、またはヌクリングがカスパーゼ経路を活性化することを示唆する。もし後者の理論が正しければ、３つに開裂されたフラグメント(図１８、レーン6および8、a-c)が、カスパーゼカスケード経路の活性化に重要な役割を果たしているかもしれない。これらのことから、ヌクリングの開裂とカスパーゼ経路とは相関関係があることがいえる。
【０１０４】
（２）次いで、カスパーゼ経路が、ヌクリングのアポトーシス誘導活性に重要かどうか調べるために、zVAD-fmk阻害アッセイを行なった。具体的には、pFlag-BAP(負のコントロール)、または実施例８でアポトーシス誘導活性が確認されたヌクリング変異体（ヌクリング-N/LZ）を発現するpFlag-ヌクリング-N/LZを発現ベクターとして使用して、直径10cm培養皿上の半コンフルエントな状態のzVAD-fmk処理(+)又は未処理(-)のCos7細胞をトランスフェクションし、その後18時間以内に細胞数をカウントし、同時にトリパンブルー染色アッセイを行い、死細胞の割合を算出した。その結果、カスパーゼインヒビターzVAD-fmk処理によってFlag-ヌクリング-N/LZの細胞死誘導活性が顕著に減少したが、Flag-BAP発現細胞に対する影響は見られなかった(図１９)。これは、ヌクリングによるアポトーシス誘導の経路が、カスパーゼシグナリング経路中にあることを示唆する。
【０１０５】
（３）次に、幾つかのアッセイ系を用いてカスパーゼ活性を調べた。
(3-1)  pFlag-BAP（Ｃ）、pFlag-ヌクリング（Ｗ）またはpFlag-N/LZ（N/LZ）を発現ベクターとして用いて、HeLa細胞をトランスフェクトした。また正常のHeLa細胞をTNF-αおよびシクロヘキシミドで処理（TNF-α/Chx処理）して、アポトーシスを誘導するコントロールとして調製した。なお、TNF-α/Chx処理は、カスパーゼシグナリングカスケードを活性化することにより、細胞をアポトーシスに導く。培養した細胞（TNF-α/Chx処理細胞 [TNF-α/Chx]、pFlag-BAP発現細胞 [C]、pFlag-ヌクリング発現細胞 [W]、Flag-ヌクリングN/LZ過剰発現細胞 [N/LZ]）の抽出物（Flag-ヌクリング-N/LZについては分離細胞（Ｍ）と付着細胞（S/N）を分けて）について抗カスパーゼ-９抗体を用いて免疫ブロットを行った。結果を図２０Ａに示す。この結果から、ヌクリング-N/LZがカスパーゼ-９を活性化することがわかる。
【０１０６】
(3-2)  また、上記と同様に培養した細胞（Flag-BAP発現細胞(BAP)、Flag-ヌクリング過剰発現細胞(Nucling)、Flag-ヌクリング-N/LZ過剰発現細胞(N/LZ)、TNF-α/Chx処理細胞(TNF-α/Chx)）の抽出物を回収し（N/LZとTNF-α/Chxは分離細胞(M)と付着細胞（S/N）とを別個に、BAPとヌクリングは両者を纏めて）、ApoAlertTM Caspase-8 Colorimetric Assay Kit(Clontech)を用いて、それぞれのカスパーゼ-８活性を調べた。結果を図２０Ｂに示す。この結果からわかるように、Flag-ヌクリング過剰発現細胞またはFlag-ヌクリングN/LZ過剰発現細胞において、カスパーゼ-８活性が、TNF-α/Chx処理細胞の場合と同じように増強することが観察された。この結果から、ヌクリング及びその変異体（ヌクリング-N/LZ）しおのが代表的なアポトーシス誘導系の一つであるカスパーゼ-系を活性化することが示された。
【０１０７】
(3-3)  また他の実験として、カスパーゼインヒビターzDQMD-fmk阻害アッセイを行なった。なお、zDQMDはカスパーゼ-3およびカスパーゼ-6のインヒビターである。具体的には、pEGFP-C1(Clontech)またはpFlag-ヌクリングを発現ベクターとして使用して、10cm培養皿上の半コンフルエントな状態のzDQMD-fmk処理(+)又は未処理(-)のHeLa細胞をトランスフェクションし、その後18時間以内に細胞数をカウントし（図２１Ａ）、同時にトリパンブルー染色アッセイを行って死細胞の割合を算出した（図２１Ｂ）。結果を図２１に示す。この処理によって、明らかにヌクリングの細胞死活性を抑制された。かかるヌクリング過剰発現細胞に関するzDQMD-fmk処理アッセイの結果から、ヌクリングがカスパーゼ-3またはカスパーゼ-6を活性化することにより細胞死を促進し得ることが明らかになった。
【０１０８】
以上の実験結果は、ヌクリング並びにその変異体（ヌクリング-N/LZ）が、カスパーゼカスケード経路のイニシエーターの１つであることを強く示唆するものである。
【０１０９】
実施例１２  プロテアソームによるヌクリングの分解
ヌクリングの発現レベルがプロテアソームによって負に調節されるかどうかについて調べた。具体的には、pFlag-ヌクリングまたはpFlag-BAP発現ベクターでトランスフェクトされたCos7細胞を、トランスフェクションから２４時間後、各種の薬剤(DMSO、プロテアソームインヒビターI(2μM)、ラクタシスチン(10μM)およびMg-132(2μM))で処理し、次いでトランスフェクト細胞当り300μlの1xサンプルローディングバッファー中（6cm皿中）に回収した。これらの細胞抽出物について抗Flagモノクローナル抗体(M5; Sigma)（図２２Ａ）及び抗Nucl.midポリクローナル抗体（図２２Ｂ）を用いてぞれぞれウェスタンブロッティングを行った。さらにこれらの泳動ゲルのCoomassie Brilliant Blue染色（CBB染色）の結果を図２２Ｃに示す。
【０１１０】
この結果から、いずれのプロテアソームインヒビター処理によっても、Flag-ヌクリングの発現レベルが大きく増加した(図２２、Ａ左およびＢ左パネル)。他方、DMSO及びプロテアソームインヒビターはいずれも、Flag-BAPの発現レベルに影響を与えなかった(図２２，Ａ右およびＢ右パネル)。また、CBB染色の結果から、使用した細胞分解物は、DMSO処理細胞とプロテアソーム処理細胞との間で殆ど同じであることが確認された(図２２、Ｃ左およびＣ右パネル)。すなわち、これらの結果から、Flag-ヌクリングを発現するCos7細胞をプロテアソームインヒビターI、ラクタシスチンまたはMg-132で処理することによって、ヌクリングの発現レベルが特異的に増加することが示された。この結果は、ヌクリングの発現レベルが、プロテアソームによって、負に制御されることを示唆するものである。
【０１１１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウスヌクリングの推定タンパク質の構造(Ａ)及びそのアミノ酸配列(Ｂ)を示す図である。(Ａ) 図中、N region(1-186aa)、LZ(186-228aa)、C region(228-803aa)、TYR(713-721aa)、及びSNARE（803-865aa）は、それぞれＮ-領域、ロイシンジッパーモチーフ、Ｃ-領域、推定チロシン受容体リン酸化部位、およびt-SNARE超らせんドメインを示す。（Ｂ）推定アミノ酸配列を一文字表記で示す。下線領域はロイシンジッパーモチーフ、グレーボックス領域は推定チロシン受容体リン酸化部位、四角で囲んだ領域（ボックス領域）はt-SNARE超らせんドメインをそれぞれ示す。
【図２】（Ａ）ヌクリングの核周囲局在性を示すモデル図である。当該タンパク質は核膜周辺にクラスターとして蓄積して核膜輸送をブロックする。（Ｂ）ヌクリングの推定される機能を示す。ヌクリングは外胚葉分化の負の制御物質であり得る。（Ｃ）ヌクリングの構造的特徴を示す。ヌクリングはＮ末端領域に強力なアポトーシス誘導ドメインを有する。
【図３】ヌクリングmRNAのP19EC細胞及びF9EC細胞における発現パターンを32P-ヌクリングcDNAプローブ（Nucling）、32P-G3PDH cDNAプローブ（G3PDH）を用いて調べた結果を示す図である（ノーザンブロッティング）。これからヌクリングがP19EC細胞中ではなく、F9EC細胞中で特異的に発現されることがわかる。
【図４】ヌクリングの翻訳後プロセッシングを示す模式図である。
【図５】（Ａ）インビトロで翻訳されたビオチン化ヌクリングタンパク質についてウエスタンブロッティングした結果を示す。INVT：1μlの翻訳産物を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(12%ゲル)した後に、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)標識した抗ストレプトアビジン抗体(Promega)およびECL検出キット(Amersham-Pharmacia)を用いてウェスタンブロット分析を行った結果を示す。Control：T7 RNAポリメラーゼを用いて調製したインビトロ翻訳物についてのウエスタンブロット分析結果を示す。コントロールとの対比からビオチン化ヌクリングタンパク質について特異的に見られた105KDa付近と120KDa付近にあるバンドはヌクリング特異的な翻訳産物に相当するものと思われた。（Ｂ）ヌクリングまたはその変異体を過剰発現するCos7細胞抽出物(上清(細胞質画分)、ペレット（核及び細胞骨格画分）)について、抗Flag M5モノクローナル抗体をプローブとして行ったウエスタンブロット分析の結果を示す。図の左はFlag-ヌクリング(全長、wild type:野生型)の結果、右はFlag-ヌクリング-C/SN欠失変異体（mutant C/SN、変異体３）の結果である。
【図６】（Ａ）マウス成熟組織及び胚性組織中におけるヌクリングの分布を示す図である。図中、Nuclingは32P-標識マウスヌクリングcDNAプローブによるノーザンブロッティング、β-actinは32P-標識したマウスβ-actin cDNAプローブによるノーザンブロッティングの結果を示す。（Ｂ）（Ａ）における胚性組織中のヌクリングmRNAの発現レベルを定量化した結果を示す図である。（Ａ）のノーザンブロットバンドの密度を、Image Quant Version 5.0ソフトウェアを用いて定量し、発生の段階におけるヌクリングmRNAレベルをβアクチンmRNAレベルに対して標準化したものである。
【図７】ヌクリングの野生型（wild-type）及び欠失変異体を示す模式図である。野生型及び変異体は全てＮ末端を、Flagペプチド(野生型、変異体3-5)またはEGFP(野生型、変異体1、2、5-7)で標識した（図中、Tag-で示す）。図の右には、これらのヌクリング及び変異体の発現性（トランスフェクション効率及び細胞中での発現パターン（局在性））を示す。遺伝子発現した細胞の割合（トランスフェクション効率）は、約0-10%、10-40%および40-80%に応じて、それぞれ「low」、「medium」および「high」と記した。なお、これらの結果は少なくとも２つの別個の実験からの結果である。
【図８】  Flag標識されたヌクリング変異体またはEGFP標識された変異体を発現するCos7細胞またはHeLa細胞中のFlag免疫蛍光染色（抗Flag M5モノクローナル抗体）またはEGFP蛍光染色の共焦点画像を示す。
(A)-(C)：Flag-ヌクリングでトランスフェクトされたCos7細胞を、抗Flag M5モノクローナル抗体(緑)を用い、間接的免疫蛍光により分析した。DNAのエチジウムブロミド染色(A-D中の赤)を、比較のために示す。(D)：Cos7細胞中の、t-SNARE超らせんドメインを欠く変異体5(ヌクリング-ΔSN)の一過性発現パターンを示す。その発現パターンは野生型のものと殆ど同じである。(E)：Cos7細胞中の、変異体３(ヌクリング-C/SN)の一過性発現パターンを示す。変異体3は核に結合する能力を有さず、細胞質全体に広く分布する。変異体を発現する細胞の数も、野生型を発現する細胞の数よりかなり高い。(F-K)：HeLa細胞中の変異体の一過性発現パターン。(F)：変異体2(ヌクリング-N/LZ)の発現パターンは、野生型のものと類似するが、クラスターはより小さく、細胞質に漏出する傾向がより高い。(G)：変異体1(ヌクリング-N)は、細胞中に広く分布している。HeLa細胞中での野生型(K)および変異体3(ヌクリング-C/SN;H)の発現パターンは、Cos7細胞(BおよびE)中での対応するパターンと正確に同じである。(K)：変異体7(ヌクリング-ΔLZ)の発現パターンは、野生型のものと殆ど同じである。(J)：変異体6(ヌクリング-ΔLZ/SN)は、細胞質中で発現され、変異体3のようなクラスターを形成する能力または核膜周辺に局在する能力を失う。(L-M)：核をエチジウムブロミドで染色（赤）した結果をNに示す。ヌクリングを発現する細胞（M）中で核の形状崩壊が見られた。このことからヌクリングが、核を形質転換または崩壊することが示唆される。Lは、NとMの併合画像を示す。
【図９】  ヌクリングの核輸送阻害性を示す図である。
(A-C)高レベルのFlag-BAPおよびEGFP-Nuc(緑；A、C)を発現するHeLa細胞中のFlag免疫蛍光染色(赤；B、C)の共焦点画像である。CはAおよびBの併合画像を示す。pFlag-BAPベクターのモル比は、pEGFP-Nucのものよりも10倍小さく、Flag-BAPを発現する細胞の殆ど(赤；B、C)も、EGFP-Nucを発現した(緑；A、C)。
(D-F、M)Flag-ヌクリングおよびEGFP-Nuc(緑；D、F、M)を発現するHeLa細胞中のFlag染色(赤；E、F、M)の共焦点画像である。FはDおよびEの併合画像を示す。pFlag-ヌクリングベクターのモル比は、pEGFP-Nucのものよりも10倍小さかった；しかしながら、Flag-ヌクリングを発現する細胞の殆どどれも(赤；E、F)も、EGFP-Nucを発現しなかった(緑；D、F)。さらに、幾つかの細胞は、核よりもむしろ細胞質中でEGFP-Nucを発現したか、または核中にEGFP-Nucを漏出した(緑；M)。(G-I)高レベルのFlag-ヌクリング-C/SN(変異体3)およびEGFP-Nuc(緑；G、I)を発現するFlag染色のHeLa細胞中の共焦点画像(赤；H、I)。IはGおよびHの併合画像を示す。変異体3に関するベクターのモル比は、pEGFP-Nucのものよりも10倍少なく、変異体3を発現する細胞の44.7%(赤；H、I)が、EGFP-Nuc(緑；G、I)を発現した。
(J-L)高レベルのFlag-ヌクリング-C(変異体4)およびEGFP-Nuc(緑；J、L)を発現するHeLa細胞中のFlag染色の共焦点画像(赤；K、L)。LはJおよびKの併合画像を示す。変異体4に関するベクターのモル比は、pEGFP-Nucのものよりも10倍少なく、変異体4を発現する細胞の66.8%(赤；K、L)が、EGFP-Nuc(緑；J、L)を発現した。
【図１０】  ヌクリング発現によるアポトーシスの誘導
(Ａ）PI染色アッセイ。a-c：高レベルのFlag-BAPを発現するHeLa細胞中のFlag染色(aおよびc中の緑)の共焦点画像。細胞は、いかなる浸透化前処理もせずにPIと共にインキュベーションし、損傷した細胞のみを赤に染色した(b、c)。cはaおよびbの併合画像を示す。Flag発現細胞およびPI染色された細胞との間にいかなる関連も観察されなかった。d-f：Flag-ヌクリングを発現するHeLa細胞中のFlag染色の共焦点画像(dおよびf中の緑)。細胞をいかなる浸透化前処理もなしに、PIと共にインキュベートし、損傷した細胞のみを赤に染色した(eおよびf中の赤)。fはdおよびeの併合画像を示す。強い相関関係が、Flag発現細胞およびPI染色された細胞との間に観察された。
(Ｂ）TUNEL染色アッセイ。Flag-ヌクリングを発現するHeLa細胞中の、TUNEL(a、a'、c、c'中の緑)およびFlag染色(b、b'、c、c'中の赤)の共焦点画像。パネルcおよびc'は、それぞれaとbおよびa'とb'の併合画像を示す。a'、b'およびc'は、それぞれ、a、bおよびcそれぞれにおける平方面積に対応する拡大画像である。TUNEL陽性細胞の殆どが、Flag陽性であった。それらの幾つかは、クロマチン凝縮、フラグメント化または核からのDNA移動(a'、c')のようなアポトーシス特性を示す。
【図１１】トリパンブルー染色アッセイの結果を示す図である。Cos7細胞(95mmプレート当り5×105個の細胞)を、pEGFP-C1ベクター(コントロール)、pFlag-ヌクリング(野生型)またはpFlag-N/LZ(N/LZ)の4μlのDNAでそれぞれ、トリプリケートにトランスフェクトした。培養培地中の分離した細胞の数をトランスフェクション後に３日間毎日測定した。分離細胞中の死細胞比(％)を、(100×トリパンブルーで染色された細胞数)／(細胞のトータル数)として計算した。結果はトリプリケート数値の平均値±SDで示す。
【図１２】  全長のヌクリングの一次構造をその代表的モチーフと共に示す（上段）。また、ヌクリングの中間部分に対するポリクローナル抗体の作成に使用したGST-Nucling融合タンパク質を示す（GST-Nucl.mid）(下段)
【図１３】Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞（HeLa細胞）について免疫蛍光分析の結果を示す。抗Flag M5モノクローナル抗体(緑；a,c)及び抗NUCL.mid抗体(赤；b、c)を用いた免疫蛍光染色の共焦点画像である。cはaおよびbの併合画像を示す。(d)は、Flag-ヌクリング/トランスフェクト細胞の細胞抽出物のウエスタンブロット分析（抗Nucl.midポリクローナル抗体(レーン1)、抗Flag M5モノクローナル抗体(レーン2、3)をプローブとして使用）の結果を示す。S/N：細胞質画分(レーン1、2)、P：核および細胞骨格画分(レーン3)を示す。
【図１４】変異体３（Flag-ヌクリング-C/SN/トランスフェクト細胞（HeLa細胞）について免疫蛍光分析の結果を示す。抗Flag M5モノクローナル抗体(緑；a,c)及び抗NUCL.mid抗体(赤；b、c)を用いた免疫蛍光染色の共焦点画像である。cはaおよびbの併合画像を示す。FLAGおよびNUCL.mid発現の領域は区別できなかった。(d)は該細胞の細胞抽出物のウエスタンブロット分析（抗Nucl.midポリクローナル抗体(左レーン)、抗Flag M5モノクローナル抗体(右レーン)をプローブとして使用）の結果を示す。
【図１５】変異体７（EGFP-ヌクリングΔLZ/トランスフェクト細胞（HeLa細胞）について免疫蛍光分析の結果を示す。抗GFP抗体(緑；a,c)及び抗NUCL.mid抗体(赤；b、c)を用いた免疫蛍光染色の共焦点画像である。cはaおよびbの併合画像を示す。GFPおよびNUCL.mid発現の領域はFlag-野生型と同様区別可能であった。
【図１６】ヌクリングの野生型及び欠失変異体を示す模式図である。野生型及び変異体は全てＮ末端を、Flagペプチド(野生型、変異体2-5)またはEGFP(野生型、変異体1、5-7)で標識した（図中、Tag-で示す）。図の右には、これらのヌクリング及び変異体について、Ｎ末端標識または抗Nucl.mid抗体を用いた免疫蛍光染色パターン（局在性）を示す。なお、これらの結果は少なくとも２つの別個の実験からの結果である。
【図１７】Flag-BAP(コントロール)、Flag-ヌクリングおよび変異体５（Flag-ヌクリングΔSN）を発現するCos7細胞の抽出物のウエスタンブロット分析（抗Nucl.mid抗体(上)および抗Flag-M5抗体(下)）結果である。M：培養培地からの分離した細胞抽出物、S/N：トランスフェクト細胞抽出物からの上清、P：トランスフェクト細胞抽出物からのペレット。
【図１８】  ヌクリングの開裂がzVAD-fmkで阻害されるかどうか調べた結果を示す図である。各細胞抽出物のウエスタンブロット分析結果を示す。尚、各レーンのローディングサンプルを下記に示す：
レーン１：pBSIIKSベクターのビオチン化in vitro翻訳生成物（bN.C.）、レーン２：ビオチン化マウスヌクリング（in vitro翻訳生成物）（bINVT）、レーン３及び10：pBSIIKSベクターの非標識化in vitro翻訳生成物（N.C.）、レーン４及び11：非標識化マウスヌクリング（in vitro翻訳生成物）（INVT）、レーン５及び12：細胞質分画、zVAD-fmk未処理（zVAD-fmk(-),lysate）、レーン６及び13：細胞質分画、zVAD-fmk処理（zVAD-fmk(＋),lysate）、レーン７及び14：核・細胞骨格分画、zVAD-fmk未処理（zVAD-fmk(-),pellet）、レーン８及び15：核・細胞骨格分画、zVAD-fmk処理（zVAD-fmk(＋),pellet）、レーン９及び16：Flag標識バクテリアアルカリホスファターゼ一過性発現誘導Cos7細胞の全細胞抽出物（FLAG-BAP）
なお、免疫ブロット膜は、HRP-ストレプトアビジン（HRP-avidin）(レーン1、2)、抗Nucl.mid抗体(レーン3-9)でアッセイし、さらにレーン３〜９については抗Flag M5抗体(レーン10-16)でアッセイした。
【図１９】  zVAD-fmk阻害アッセイの結果を示す。pFlag-BAP(負のコントロール)またはpFlag-N/LZを発現ベクターとしてトランスフェクションしたCos7細胞をzVAD-fmk処理(+)又は未処理(-)してトリパンブルー染色によって死細胞と生存細胞の細胞数を算出した。
【図２０】（Ａ）ヌクリングのカスパーゼ-9活性化を示す図である。培養した細胞（TNF-α/Chx処理細胞[TNF-α/Chx]、pFlag-BAP発現細胞[C]、pFlag-ヌクリング発現細胞[W]、Flag-N/LZ過剰発現細胞[N/LZ]）の抽出物（N/LZについては分離細胞（Ｍ）と付着細胞（S/N）を分けて）について抗カスパーゼ-９抗体を用いて免疫ブロットを行った結果である。（Ｂ）ヌクリングのカスパーゼ-８活性化を示す図である。培養した細胞（Flag-BAP発現細胞(BAP)、Flag-ヌクリング過剰発現細胞(Nucling）、Flag-N/LZ過剰発現細胞(N/LZ)、TNF-α/Chx処理細胞(TNF-α/Chx)）の抽出物を回収し（N/LZとTNF-α/Chxは分離細胞(detached)と付着細胞(atached)とを別個に、BAPとヌクリングは両者を纏めて）、それぞれ抗カスパーゼ-８抗体を用いて免疫ブロットを行った結果である。
【図２１】ヌクリングのカスパーゼ-3またはカスパーゼ-6活性化を示す図である。HeLa細胞を、pEGFP-C1(EGFP)またはpFlag-ヌクリング(Nucling)でトランスフェクトしてえられた細胞をzVAD-fmk処理(+)又は未処理(-)し、トリパンブルー染色アッセイで死細胞数と生存細胞数を求めた（図Ａ）。全細胞数に対する死細胞数の割合を図Ｂに示す。
【図２２】  実施例１２の結果を示す図である。Ａ：抗Flagモノクローナル抗体(M5; Sigma)を用いたウェスタン分析、Ｂ：抗Nucl.midポリクローナル抗体を用いたウェスタン分析、Ｃ：クマーシー・ブリリアントブルー染色。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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