(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位又は電流により所定の時間間隔において試料容器に備えた少なくとも２つの電極１０間で実施する細胞電気穿孔法であって、
(1) 前記時間間隔で消耗し尽くさない電圧もしくは電流源を、調整器として作用する制御可能な電力半導体１４を介して、前記電極１０に接続することと、
(2) 前記時間間隔における電位もしくは電流の態様を、態様の選択可能な曲線を発生させる設定値変換器３６により決定し、且つ、それを電力半導体１４の駆動ステップの前に接続されているコントローラ１６に入力することと、
(3) 前記コントローラ１６が、電極１０に掛けられた実際の電位もしくは電流に対応する値を瞬間値の形で受信することと、
(4) 前記時間間隔が数百ｎｓ〜数分までの時間範囲を有すること。
を特徴とする生体外細胞電気穿孔法。
【請求項２】
穿孔操作繰り返し時における操作毎の前記時間間隔同士の間隔が少なくとも１秒である請求項１記載の生体外細胞電気穿孔法。
【請求項３】
前記時間間隔が１５〜５００μｓである請求項１又は２記載の生体外細胞電気穿孔法。
【請求項４】
細胞電気穿孔法用の回路であって、所定の時間間隔の間、制御可能な半導体を介して電極に接続される電圧乃至電流源を備え、且つ、前記制御可能半導体をトリガーするための装置を備えたものにおいて、電圧乃至電流源が調整エレメントとして作用する制御可能半導体１４を介して電極１０に接続され、制御可能半導体１４のコントローラ１６のための調整信号が電子制御回路により発生され、前記電子制御回路は、電位もしくは電流の態様を予め決定する設定値変換器３６と、電極１０の電位もしくは電流を捕捉する瞬間値変換器３４とを接続して構成したもので、該電子制御回路の出力が電位分離ステージ２２、３０、２６を介してコントローラ１６に結合されるものであることを特徴とする生体外細胞電気穿孔法用回路。
【請求項５】
制御可能な半導体１４がＩＧＢＴである請求項４記載の生体外細胞電気穿孔法用回路。
【請求項６】
設定値変換器３６がコンピュータ４０から成り、コンピュータ４０のステップ状出力信号がデジタル・アナログ変換器３８を介して前記制御回路に入力されるものである請求項４又は５記載の生体外細胞電気穿孔法用回路。
【請求項７】
制御回路のコントローラ１６への接続が、オプトカプラー３０、２２及び変成器２６を介して並列に行なわれ、且つ、オプトカプラー３０、２２並びに変成器２６からの出力信号が総和ステップ２０で総和されるものである請求項４、５又は６記載の生体外細胞電気穿孔法用回路。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特許請求の範囲の請求項１の前文に記載した生体外細胞電気穿孔のための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、例えば動物細胞での遺伝子操作において、検出、発現、標識化、構造分類、富化又は強化、分離、アプトシス（aptosis ）、遺伝子調節、遺伝子療法、変形、細胞間相互作用等の処理を目的として、分子や粒子を細胞に導入することが知られている。このためには、細胞内部や細胞生存能力について極端に妥協することなく、細胞膜に一時的に透過性を持たせることが必要となる。そのため、現在選択し得る方法としては、リポフェクション法（lipofection ）や、電気穿孔（electroporation ）もしくは電気透過法（electropermeation ）等の方法があり、電気穿孔の場合、細胞に電界強度が比較的高く、持続時間の比較的短い電界を掛け、パラメーターを正しく選択することにより、細胞膜に、電気泳動により特定サイズまで拡張可能な１個の微小開口が形成でき、この開口を介して細胞内部に分子や粒子を移入させることが可能となる。この場合の分子としては例えば、Ｘ線撮影や、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、超音波試験、電子顕微鏡による観察などの対象となる、核酸、タンパク質、酵素、調節タンパク質、リガンド、レセプター、抗体、造影剤などが考えられる。また、粒子は、例えば、モノクロゾーム、ウイルス、オルガネラ若しくは細胞、磁性粒子、金、カーボン等である。
【０００３】
ここでいう電気穿孔法は、生体外及び生体内ともに実施可能である。生体外式の場合、細胞を適当な懸濁液に入れ、これを試料容器（キュベット）に入れる。この試料容器には電極板（平板コンデンサ）を備えている。また、生体内式の電気穿孔式の場合は、例えば、針状に形成した電極を身体部分に導入する。なお、本発明は概略、電気穿孔法に基づくものである。
【０００４】
なお、英国特許公報ＧＢ２２２７３８０号や、ドイツ特許公報ＤＥ３７１８９４１号からは、試料容器の電極に対し、所定の持続時間と波高を持った方形衝撃波の形態で電圧を加えることが知られている。この場合、電流は１００アンペアより高く、電圧は約３０００ボルトであり、電圧源として試料容器の電極に対しパワースイッチにより切替えられるコンデンサが用いられている。また、パワースイッチとして、並列に設けられた多数のサイリスタが用いられている。サイリスタの切替え時間がモニターされ、所定時間に達すると、サイリスタが遮断される。
【０００５】
また、米国特許５２７３５２５号若しくは５４３９４４０号に開示された生体内式電気穿孔法においては、フランクが指数関数的に減衰するパルスや、方形パルス、単極性もしくは双極性の振動パルスなどの各種の形状のパルスを電極に掛けることにより、電極間に０．２〜２０ｋｖ／ｃｍの電界強度を発生させる。また、１００個までの、パルスを、１０〜１００ｍｓのパルス長で、次々に発生させることができる。なお、これら米国特許には更に、電気穿孔法のパラメーターを選択することが述べられており、その選択に基づいて各種条件が整い、細胞をどの程度自然状態に保つかが決まる。また、パラメーターの選択に応じて、パルスの電界強度並びにパルス持続時間も、変更する必要があり、これにより所望のパラメーターが達成されるとともに、細胞を損なうことを避けることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、使用する液や、細胞のタイプ並びに性質に関する実際の条件の下での電界強度が、電圧入力や電極の形状寸法、配置に基づいて意図された電界強度とは異なってしまう（即ち、これら２つの場合における電界強度は、既知の通り、試料容器における各種媒介物の比誘電率に依存し、また、その特性の大半が正確には再生的誘発が不可能な媒介物の導電能に依存する）。このことから、一連の電圧もしくは電流を試料容器の電極に入力するだけでは、ジェネレーターを適宜の方法で制御するという点からみて、不十分であることが確認されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の問題に鑑み、本発明の目的は、効果的に作用するとともに細胞の生存率を継続的な形で改善し得る細胞の電気穿孔（透過）のための方法を提供する点にある。
【０００８】
前記目的は、特許請求の範囲の請求項１の態様により達成される。
本発明方法によれば、一連の電位もしくは電流が試料容器の電極を介して設定される。また、一連の時間間隔もしくは持続時間は実験に基づいて決定される。本発明の１実施例においてこの時間間隔は１５〜５００μｓであり、他の方法に比べて短い。また本発明によれば、一連の電圧もしくは電流がモニターされ、瞬間値変換器を介してコントローラに供給されて、コントローラが電力半導体制御信号を発する。前記電力半導体を介して、電圧源が電極に接続されている。以上の構成から、本発明方法によれば、電力半導体がスイッチとしてではなく、指示された時間間隔において電極に掛けられる電圧を調整するためのサーボコンポーネント乃至制御部材として用いられる。
【０００９】
また、適宜の実験の結果から、有効な電気穿孔処理法における一連の電圧の特定の形状が多数の穿孔細胞について高い生存率を確保した場合、本発明の方法は、その電圧形状に相応する電界強度を容易に形成し得る立場にある。
【００１０】
また、生体外細胞電気穿孔法のための回路としては、制御可能な半導体のコントローラのための調整信号を発生させる電子制御回路を用いる。本発明の１実施例によれば、この半導体はパワーエレクトロニクス特にパワーコンバーター技術において知られている絶縁ゲート双極トランジスタ（ＩＧＢＴ）である。瞬間値変換器が電極の電流もしくは電圧を捕捉して、これに対応する瞬間値を前記コントローラに送る。そして、曲線を描写する設定値変換器からは、所定の時間間隔における電圧もしくは電流の形状が入力される。
【００１１】
電圧乃至電流源は、従来技術の公知のコンデンサにより形成してよいが、本発明においては、コンデンサの静電容量を、時間間隔に対しコンデンサが消滅しきることのないタイプの源として使用しうるように、適当に大きい容量とすることが必須である。また、電極に掛けられるパルスの形状は設定値変換器により単独で決定される。この設定値変換器は、本発明の別の実施例によれば、デジタル・アナログ変換器を介して電子制御回路に連続的な出力信号を送るコンピュータにより形成できる。コンピュータ出力信号が段階的に出力されることにより、このステップ信号のアナログ信号への変換は、曲線を描くこととなる。従って、パルスを、例えば、基本的に公知の、指数関数的に減衰する形状で構成してもよい。なお、前記出力信号のステップ信号の長さは、所望の曲線形状に対する近似値が最も効率よく達成し得るよう決定される。
【００１２】
また、制御用電子装置を半導体調整器の駆動装置段階から、ガルバニ電気的に、分離することも公知である。この目的のために、変成器（transformer)やオプトカプラーを用いてもよい。本発明の１実施例によれば制御スイッチをコントローラへカップリングすることにより、オプトカプラーと変成器の並列接続がなされ、この回路においてこれら各エレメントの出力信号が総和ステップで総計される。この構成によれば、前記の２つのカップリングエレメントの助けにより、極端に急勾配で上昇するフランク (flank)を持った所望長さのパルスが伝達されるという制御速度にとって有利な事実が利用できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施の形態を示して発明をより詳細に説明する。
添付した図面には、本発明の生体外細胞電気穿孔法のための回路を示している。図において、符号１０は試料容器に設けた電極であり、所定間隔を持つ平板コンデンサを形成している。電極１０は、結合ポスト１２で生じる端子電圧ＵQ へ、ＩＧＢＴ１４を介して接続される。この場合電源としては、例えば比較的大きな静電容量のコンデンサ（図示せず）を用いて、これを結合ポスト１２にスイッチ（図示せず）を介して繋ぐ。
【００１４】
ＩＧＢＴ１４のためのコントローラ１６は、増幅器１８に入力を総和ステップ２０に接続し、この総和ステップ２０の入力の一方を光感受性トランジスタ２２のエミッタにつなぎ、他方を変成器２６の主コイル２４に繋いで構成される。変成器２６の二次側コイル２８は、前記光感受性トランジスタ２２とによりオプトカプラーを構成する発光ダイオード３０と並列に設ける。発光ダイオード３０と二次側コイル２８は、操作電圧ＵB に集電器があるトランジスタ３２のエミッタに接続する。トランジスタ３２のベースは瞬間値変換器３４の出力側に接続する。瞬間値変換器３４のプラス側入力部は設定値変換器３６につなぎ、この変換器３６にはデジタル・アナログ変換器３８を介してコンピュータ４０が接続されている。前記瞬間値変換器３４のマイナス側入力部は、抵抗４２’を介してＩＧＢＴ１４と電極１０の間の部位に接続される。抵抗４２と抵抗４４は電極１０と並列であって、電圧分割器を構成している。また、電極１０とアースの間には電極１０から流出する電流を獲得するためのシャント４６を接続している。
【００１５】
また、電極１０に、指数関数的に減衰する形状を持ち１５〜１００μｓの時間間隔の電圧を加えることも考えられる。この目的のためには、結合ポスト１２に電圧源（図示せず）を接続するスイッチを閉じなければならない。この操作は、コンピュータ４０により制御できる。同時にコンピュータ４０は、デジタル・アナログ変換器３８によって、アナログ信号に変換される時、所望の曲線に大きく近づくようなステップ状のコースをとる曲線を入力することにより公称関数を発生させる。そしてこの信号は、アナログ設定値変換器３６により瞬間値変換器３４に入力される。これにより、トランジスタ３２と、コントローラ１６への前述のカップリングとにより、電極１０で減衰する電圧に所望の態様形状とサイズを有せしめるよう設定信号に従ってＩＧＢＴ１４をトリガーするコントローラ１６のための調整信号を発生させる。なお、この操作は自動的に、先に述べた操作につながっていくわけではないので、電圧を電圧分割器４２、４４を介して瞬間値変換器３４の入力部に戻し、制御を実行することとなる。
【００１６】
更に、述べるべきことは、増幅ファクターがフィードバックループ４２により設定されるという点である。この場合、ＩＧＢＴ１４を、互いに並列にした多数のＩＧＢＴから構成してよい。また、ステップ４４が電圧オフセットを備える。
【００１７】
また、損傷防止のために、電流をモニターすることが有益であり、例えば、図中４８の部位に電流計を設けて分流させる。これにより、電流が所定値を越えた場合、電圧源が切られる。
【００１８】
また、ここで説明した電圧制御の代わりに、電流制御を行なうことも可能である。そのためには、電流瞬間値を、電圧制御の場合と基本的に同様に構成された電子式制御装置に入力すればよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の生体外細胞電気穿孔法の１回路を示す電気系統図である。
【符号の説明】
１０  電極
１２  結合ポスト
１４  ＩＧＢＴ
１６  コントローラ
１８  増幅器
２０  総和ステップ
２２  光感受性トランジスタ
２４  主コイル
２６  変成器
２８  二次側コイル
３０  発光ダイオード
３２  トランジスタ
３４  瞬間値変換器
３６  設定値変換器
３８  デジタル・アナログ変換器
４０  コンピュータ
４１’抵抗
４２  抵抗
４４  抵抗
【図１】
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