(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤学的に許容される賦形剤と治療に有効な量のFasリガンドまたはFasリガンドをコードするポリヌクレオチドとを含む、移植拒絶反応の治療に有用な薬学的組成物。
【請求項２】
Fasリガンドが、図２に示されるアミノ酸103〜281の間のアミノ酸配列を有する可溶性のヒトポリペプチドである、および/または、図２に示されるヌクレオチド374〜909の間のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
注入による投与が可能である、請求項１または２記載の薬学的組成物。
【請求項４】
受容哺乳動物におけるT-リンパ球仲介型移植拒絶反応を抑制する医薬品の製造のための、Fasリガンド、Fasリガンドをコードするポリヌクレオチド、またはFasリガンドを発現する細胞の使用方法。
【請求項５】
哺乳動物におけるT-リンパ球仲介型疾患の再発を抑制または予防する医薬品の製造のための、Fasリガンド、Fasリガンドをコードするポリヌクレオチド、またはFasリガンドを発現する細胞の使用方法。
【請求項６】
哺乳動物におけるT-リンパ球仲介型疾患を治療する医薬品の製造のための、Fasリガンド、Fasリガンドをコードするポリヌクレオチド、またはFasリガンドを発現する細胞の使用方法。
【請求項７】
移植されるべき細胞、組織、または臓器にFasリガンドまたはFasリガンドをコードするポリヌクレオチドをインビトロで投与することによる、移植に使用するための、免疫学的特権を有する細胞、組織、または臓器を作出する方法。
【請求項８】
T-リンパ球仲介型の炎症部位に投与される医薬品の製造のための、Fasリガンド、Fasリガンドをコードするポリヌクレオチド、またはFasリガンドを発現する細胞の使用方法。
【請求項９】
遺伝子治療で用いられるウイルスベクターおよび遺伝子に対する免疫保護を提供する医薬品の製造のための、外来遺伝子をコードするウイルスベクターに挿入するFasリガンドをコードするポリヌクレオチドの使用方法。
【請求項１０】
a.インビトロでドナー組織におけるFasリガンドの発現を決定すること；および
b.移植に使用するためのFasリガンドを発現するドナー組織を選択することにより実施される、
移植に使用するためにインビトロでドナー組織を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、自己免疫条件における自己組織に対する免疫応答および／または移植された組織に対する免疫応答を含むリンパ球仲介型免疫応答の抑制に関する。
発明の背景
I型、即ち若年型糖尿病は、アメリカ合衆国における主要な健康問題である。糖尿病およびその合併症は、致命的な心臓疾患の危険度を二倍にし、また失明や脳卒中の危険度を四倍にまで増加させる。真性糖尿病は、血糖値の正常な調節を妨害し、高血糖やケトアシドーシスを引き起こすインシュリンの欠乏によって特徴付られる。腎臓移植に至る腎臓疾患の第1原因は糖尿病である。
ペプチドホルモンであるインシュリンは、グルコース利用、タンパク質合成、中性脂肪の形成と貯蔵、そしてある種の細胞の生長を助長する。インシュリンは膵臓のランゲルハンス島にあるβ細胞によって産生される。若年型糖尿病（症例の10〜20％）は、β細胞の徹底的な破壊を引き起こす自己免疫応答によって引き起こされる。成年型糖尿病には多くの原因があるが、ほとんどの場合、β島細胞がインシュリン分泌能を欠陥している。
インシュリン注入治療は通常ブタまたはウシのインシュリンを用いて行われ、高血糖やケトアシドーシスが起こるのを妨げることはできるが、完全に正常な血糖値にすることはできない。注入治療はかなりうまく行われてはいるが、糖尿病の病的状態の原因をもたらす早期の血管悪化を予防することはできない。糖尿病が関連する血管の悪化は、微小血管の変性およびアテローム性動脈硬化症の進行の両方を含んでおり、最終的に腎不全、網膜の変性、狭心症、心筋梗塞、末梢神経障害、および動脈硬化症を引き起こす。
ヒトインシュリンの大量生産が、ヒトインシュリン遺伝子のクローニングにより可能となり、卓越した処理法としてウシおよびブタのインシュリンに取って代わり始めた。ヒトインシュリンを使用すると、他の型のインシュリンで起こるいくつかの問題、即ち、非ヒトインシュリンの構造がわずかに異なることから生じる抗体仲介型インシュリン耐性やアレルギー反応などの問題を減少させることができる。これらの利点があるにもかかわらず、ヒトインシュリンを用いた治療法では血管の悪化を予防することはできない。
インシュリン輸送ポンプとしては、インシュリンの用量を、活性、日常の食事、時刻、および他の予め決まっている要因に基づいてさまざまに変えて投与できるものが開発されている。このような装置は、血糖値の調節を改善することはできるが、やはり血管の悪化を予防することはできない。
外因性のインシュリンを利用して血糖値を維持することは、糖尿病に関連した合併症の減少において重要な価値を有することが証明されているが、最も有効な形態は、内因性のインシュリン源を患者に提供することであると考えられる。しかしながら一部のまたは全ての膵臓を外科的に移植することは困難である。というのは、膵臓は虚弱で悪化しやすい器官であり、死亡したドナーのみが実際上の起源となるためである。さらに、膵臓の小さな一部分だけ、即ちランゲルハンス島のβ細胞だけがインシュリンを産生し、膵臓の残りの部分は移植拒絶反応に対する強力な標的となる。ランゲルハンス島は、膵臓の残りの部分から単離されても栄養状態の信号に応答して適切な量のインシュリンを分泌し続けるため、ランゲルハンス島のみを移植することが望ましい目標である。
ランゲルハンス細胞の移植は、β細胞を破壊する薬物で前処理することにより作成した糖尿病動物で成功している。これらの動物での移植の成功は、血糖値が正常に回復すること、そしてさらに血管が悪化するのを減少させることより明らかにされている。これらの動物モデルでは、糖尿病の受容体に同系の（充分に組織適合性（tissue compatible）がある、また組織適合性（histocompatible）ともいう）のドナーから採取したランゲルハンス島を用いることが可能である。ヒトでは充分に組織適合性のあるドナーは稀であり（200,000人に1人）、実際上の見地からすると、非適合性のヒト（同種異系移植片）または非ヒト（異種移植片）から採取したランゲルハンス島を用いる必要があるであろう。
組織の移植に関連した主要な問題点は、免疫仲介型の移植拒絶反応であって、この拒絶反応では受容体のT-リンパ球がドナーの組織適合性抗原を外来物として認識する。したがって、たとえヒトインシュリンおよび異種インシュリンを糖尿病を部分的に調節するのに用いることができるとしても、糖尿病の真の治療法として同種異系移植片および／または異種移植片を使用することは、移植による拒絶反応をいかに抑制できるかにかかっている。多くの組織および臓器を移植するための現在の方法では、免疫抑制剤を一生の間投与することが必要となる。これらの薬物は重大な副作用を有しており、感染感受性、腎不全、高血圧症、および腫瘍発生を増大させる可能性がある。
同種異系組織および異種組織の差の認識に基づく移植拒絶反応に加えて、ホストおよびドナーが遺伝子的に同一の場合でさえ移植された島細胞が糖尿病のホストで破壊されることがあることが、最初にげっ歯動物で、後にヒトで観察された。「Naji et al.（1981）Science 213: 1390」は、自然に発生した糖尿病動物は皮膚および骨髄の同種異系移植片を維持するが、皮膚および骨髄の同種異系移植片と同じ遺伝的構造を有する島同種異系移植片は破壊されることを示している。天然の島β細胞を破壊する疾患の経過が再発し、移植された島細胞が破壊されると考えられる。この現象は、疾患の再発と言われ、同種異系移植片の反応に関与するドナーとホストの間の組織適合性の違いとは関係なく標的組織が破壊される過程である。この疾患は、従来の移植応答といくつかの点で異なっている。おそらく最も重大な違いは、ほとんどの同種異系移植片（例えば、腎臓、肝臓など）の急性拒絶反応を抑制するために有効に用いられる免疫抑制剤の用量が、糖尿病での疾患の再発の抑制にはとうてい有効ではないことである。この効果の低さは異種移植片についても当てはまる。免疫抑制剤の用量を増すと、毒性が生じて来る。したがって移植による拒絶反応および疾患の再発の両方を抑制し、移植された細胞を保護する手法が開発される必要があることは明白である。
第2の問題点は、移植に適した島組織が不足していることである。非霊長類種から得られるドナーインシュリンの起源は高血糖の抑制において臨床的に有効であるが、その一方で異種のドナー組織は激しい拒絶反応を受ける。更に島組織の起源としての非ヒトドナーの入手の容易性は、今のところ現実的には価値がない。
哺乳動物におけるいくつかの免疫学的な特権的部位においては、移植された同種異系移植片が長期にわたり生存することができる（Naji & Baker（1976）J. Surg. Res. 20: 261-267参照）。腹部精巣に移植された島の同種異系移植片および異種移植片は、極めて良好に生存することが報告されている（Selawry & Fojaco（1985）Diabetes 34: 1019-1024、Bellgrau & Selawry（1990）Transplantation 50: 654-657、Selawry et al.（1987）Diabetes 36: 1061-1067参照）。「Selawry et al.（1991）Transplantation 52: 846-850」には、精巣のセルトリー細胞（Sertoli cell）によって放出される一個または複数個の未知の因子が、拒絶反応から精巣内部の島同種異系移植片および島異種移植片を保護しているらしいということが示されている。この未知の因子は、インビトロでIL-2の産生を阻害することが報告されている（Selawry et al.（1991）上記、参照）。
「Selawry & Cameron（1993）Cell Transplantation 2: 123-129」には、腎臓の被膜下の部位にインビボで免疫学的な特権的部位を樹立するためにセルトリー細胞を用いる研究がなされている。糖尿病のPVGラットに、セルトリー細胞（セルトリー細胞が濃縮された分画、すなわちSEF）を用いてまたは用いることなく、またシクロスポリン（CsA）を用いてまたは用いることなく、ラットの島細胞移植片を移植した。その結果より、島細胞のみを受容した受容ラット、島細胞およびCsAのみを受容した受容ラット、または島細胞およびSEFのみを受容した受容ラットの70％〜100％が高血糖を示したままであることが明らかになった。これに対して、島細胞、SEF、およびCsAの組み合わせを受容したラットでは、100日以上もの長い期間にわたり正常血糖値の維持が達成された。
発明の概要
本発明は、拒絶反応から精巣内の島同種異系移植片および島異種移植片を保護する精巣セルトリー細胞によって産生される因子が、Fasリガンドであるという、発明者らの発見に一部基づく。
本発明は、薬剤学的に許容される賦形剤と治療に有効な量のFasリガンドとを含む、移植拒絶反応の治療に有用な薬学的組成物を特徴とする。本発明の方法において有用なFasリガンドには、完全型のヒトおよびマウスのFasリガンド、ならびに可溶型のヒトおよびマウスのFasリガンドが含まれる。ヒトの可溶性ポリペプチドは、図2に示すようにアミノ酸103〜281の間のアミノ酸配列を有している。本発明は、ヌクレオチド374〜909（図2参照）の間のヌクレオチド配列を有する、ヒトの可溶性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。また、図1に示されているようにアミノ酸101〜280の間のアミノ酸配列を有する可溶性のマウスのポリペプチドも含む。本発明は、ヌクレオチド426〜966（図1参照）の間のヌクレオチド配列を有する、マウスの可溶性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。本発明の可溶性Fasリガンドポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も、本発明に含まれる。
本発明は、受容哺乳動物に有効量のFasリガンドを投与することによって、移植された組織を有する該受容哺乳動物によるリンパ球仲介型の拒絶反応を抑制する方法を特徴とする。このドナーの哺乳動物は、受容哺乳動物と同じ種であってもよいし、または異なる種であってもよい。
またもう一つの面において、本発明は、有効量のFasリガンドをそれを必要としている患者に投与することによって、例えば糖尿病の再発などのリンパ球仲介型疾患の再発を抑制かつ予防する方法を特徴とする。
またもう一つの面において、本発明は、患者に有効量のFasリガンドを投与することによって、若年型糖尿病のようなリンパ球仲介型の原発性の疾患を治療する方法を特徴とする。
更に本発明は、受容哺乳動物にFasリガンドを発現する細胞を導入することによって、移植された組織を有する該受容哺乳動物によるリンパ球仲介型の拒絶反応を抑制する方法を特徴とする。
また本発明は、Fasリガンドを発現する細胞をそれを必要としている患者に導入することによって、例えば糖尿病の再発などのリンパ球仲介型疾患の再発を抑制かつ予防する方法を特徴とする。
本発明はまた、Fasリガンドを発現する細胞をそれを必要としている哺乳動物に導入することによって、若年型糖尿病のようなリンパ球仲介型の原発性の疾患を治療する方法を特徴とする。
本発明はまた、胚細胞および体細胞にFasリガンドポリペプチドをコードするDNA配列を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を特徴とする。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、全ての臓器および組織の細胞中に生物学的に活性なFasリガンドを発現させる能力があり、したがって、Fasリガンドを発現し拒絶反応の起こり易さを小さくすることができるドナーの器官または細胞の起源として有用である。
本発明のFasリガンド投与の一態様においては、精製された天然または組換えのFasリガンドポリペプチドが、受容哺乳動物の移植片の部位に提供される。他の態様においては、移植された組織自体がFasリガンドの起源として機能する。この態様においては、移植された組織が、胚細胞および体細胞にFasリガンドをコードする遺伝子を含む非ヒト動物から得られる。Fasリガンド遺伝子を含むトランスジェニック組織は、受容ホスト動物に移植された際に、生物学的に活性なFasリガンドを発現する能力を維持している。本発明は、Fasリガンド発現組織だけの移植を含み、それによって人工の免疫学的な特権的部位が作られる。Fasリガンド発現組織だけの移植には、例えばトランスジェニック島細胞を糖尿病患者へ移植したり、または繊維芽細胞のようなFasリガンド発現同種組織を未操作ドナー組織と共に移植することが含まれ、例えばFasリガンド発現組織と共にそれを必要としている患者の移植部位に非トランスジェニック島細胞を移植することが含まれる。この場合、移植されたFasリガンド発現組織は、移植された島細胞の拒絶反応を抑制するように機能する。
もう一つの面において、本発明は、受容患者による拒絶反応に対する保護バリアが形成されるように、例えば免疫学的な特権的部位が作られるように、Fasリガンドポリペプチドを移植された細胞、組織、もしくは器官を被覆するかまたは還流する方法を提供する。
さらにもう一つの面において、本発明はFasリガンド、またはFasリガンドを発現する同種の細胞を炎症部位に投与することによって、自己免疫炎症を治療または抑制する方法を提供する。
またさらにもう一つの面において、本発明は、Fasリガンドおよび目的の外来タンパク質で同時形質転換された同種の細胞を投与することによって、外来のタンパク質、または移植された細胞、組織、もしくは器官のいずれかに対する耐性を導入するための方法を提供する。関連のある面において、Fasリガンドを発現するドナー起源から得られる同種の細胞を投与することによって、移植の前に、移植される細胞、組織、または臓器に対する耐性を受容患者に与えるための方法が提供される。また、遺伝子治療によりFasリガンドをコードする遺伝子を供給することによって、疾患を治療または抑制するための方法も提供される。
本発明はまた、Fasリガンドをコードするポリヌクレオチドを外来遺伝子をコードするウイルスベクターに挿入することによって、遺伝子治療で用いられるウイルスベクターおよび外来遺伝子に対する免疫保護作用を提供する方法を含む。
本発明のその他の特徴および利点は、以下に記述する好ましい態様から、また請求の範囲から明らかとなろう。
図画
図1は、マウスのFasリガンドについてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である（Takahashi et al.（1994）Cell 76: 969-976参照）。完全なタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸1〜280（ヌクレオチド配列126〜966）に位置する。可溶性のFasリガンドの配列は、アミノ酸101〜280（ヌクレオチド配列426〜966）に位置する。線は、完全なポリペプチドおよび可溶性のポリペプチドを合成するために用いられるプライマーの配列を表示している。
図2は、ヒトのFasリガンドについてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である（Takahashi et al.（1994）Intl. Immunol. 6: 1567-1574参照）。完全なタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸1〜281（ヌクレオチド配列67〜907）に位置する。可溶性のFasリガンドの配列は、アミノ酸103〜280（ヌクレオチド配列374〜909）に位置する。線は、完全なポリペプチドおよび可溶性のポリペプチドを合成するために用いられるプライマーの配列を表示している。
詳細な説明
本発明の原理を説明するために、以下の実施例および請求の範囲とともに、本発明の有用な態様に対する参照を詳細に提供する。本発明は、記載された特定の実施例に限定されず、当然のことではあるが例えば種々に変形することができる。また本明細書において用いられる用語は、特定の態様のみを記述することを目的としているのであって、本発明の請求の範囲を制限するものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ制限されることを理解すべきである。
他の方法で定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術に通常従事している人によって共通に理解されているのと同じ意味を有している。本明細書で記述されている方法および材料と同じ、または同等のいかなる方法および材料も、本発明を実施したり試験したりするのに用いることができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記述されている。本明細書で言及している刊行物は全て、関連している特定の情報を記載し開示するために、参照として本明細書に組み入れられる。
免疫系は、骨髄由来の細胞および血漿タンパク質の集団からなり、それらは共同して生物体の完全性に対する脅威と格闘する。免疫系は、実際には、疾患、例えば自己免疫疾患および移植拒絶反応を引き起こすこともある。免疫系で中心となる細胞はTリンパ球である。T細胞は抗原を特異的に認識するレセプターを有する。それらの抗原レセプターが抗原と結合すると、免疫応答のエフェクターアーム（effector arm）を活性化するリンホカインを産生しかつ分泌するようにヘルパーT細胞が活性化される。リンホカインはマクロファージおよび細胞障害性T細胞を活性化し、そして抗原に対する抗体を分泌するようにB細胞を刺激する。この炎症反応が始まると結果的に好中球も活性化される。まずT細胞が抗原と出会うと、それらの表面にFas分子が発現する。Fas（CD95）は45kDの細胞表面糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子レセプターのスーパーファミリーの構成要素である（Nagata and Golstein（1995）Science 267: 1499、Smith et al.（1994）Cell 76: 959参照）。Fasは肝臓、心臓、および卵巣などの多くの組織で発現する（Watanabe-Fukunaga et al.（1992）J. Immunol. 148: 1274、Leithauser et al.（1993）Lab. Invest. 69: 415参照）が、その主要な生物学的役割は免疫応答の調節であると考えれらている（Nagata and Golstein（1995）上記、参照）。機能性Fasを発現する能力を欠如するLprマウスは、末梢のリンパ系器官で異常なT細胞およびB細胞を多量に蓄積し、そして自己免疫疾患を発症する。
Fasに対する抗体は、リンパ性白血病由来の種々の細胞系でアポトーシスを誘導する（Traugh et al.（1989）Science 245: 301、Tonehara et al.（1989）J. Exp. Med. 169: 1747、Debatin et al.（1990）Lancet 335: 497参照）。非活性化状態のリンパ球は、低レベルのFasを発現し、抗Fas抗体によって殺されることはない（Miyawaki et al.（1992）J. Immunol. 149: 3753、Daniel & Krammer（1994）J. Immunol. 152: 5624、Alderson et al.（1995）J. Exp. Med. 181: 71参照）。しかしながら抗原を刺激した後24時間以内に、T細胞およびB細胞はFasの発現を促進制御し、更に2〜3日たった時点でFasが架橋されると、Fas発現T細胞が死滅する（Miyawaki et al.（1992）J. Immunol. 149: 3753、Owen-Schaub et al.（1992）Cell Immunol. 140: 197参照）。Fasの架橋、および活性化されたリンパ球の死滅は、インビボで、Fasリガンド、即ち腫瘍壊死因子に関連する40kDのII型膜糖タンパク質によって仲介される（Nagata and Golstein（1995）上記、Rouvier et al.（1993）J. Exp. Med. 177: 195参照）。
ヒトおよびマウスのFasリガンド遺伝子が単離されており、配列が決定されている（Takahashi et al.（1994a）Intl. Immunol. 6: 1567-1574、Takahashi et al.（1994b）Cell 76: 969-976参照）。精製されたFasリガンドは、Fasを発現する細胞に対する細胞溶解活性を示す。実験は、Fasリガンドの発現が、免疫応答の間Fasの促進制御と協調して起こることを示している。
本発明は、完全なFasリガンドポリペプチドおよび可溶性のFasリガンドポリペプチドの使用を含む。完全なFasリガンドは、本明細書に開示されているような免疫抑制活性を有する膜結合型ポリペプチドである。可溶性のFasリガンドポリペプチドは、Fasリガンドポリペプチドの細胞外カルボキシ末端部分を含み、天然のタンパク質の免疫抑制活性を保有している。可溶性のFasリガンドは、生物活性が最適になるように、Fasリガンドの二量体または三量体を含む、一個またはそれ以上の分子と複合体を形成してもよい。このような複合体は、化学的修飾および共有結合架橋法などの当技術分野において既知の種々の方法によって形成することができる。Fasリガンドは、本発明によれば、移植された組織のリンパ球仲介型の拒絶反応を抑制するために用いられる。またこのFasリガンドは、リンパ球仲介型の疾患の再発を予防し、リンパ球仲介型の原発性の疾患を治療するためにも用いられる。本発明の方法は、移植された組織のリンパ球仲介型の拒絶反応、疾患の再発、および／または原発性の疾患を抑制するために有効な量のFasリガンドを提供することを含む。
リンパ球仲介型の免疫応答の間、ヘルパーT細胞がまず活性型となり、そして免疫系のエフェクター細胞を活性化する作用のある因子（例えば、リンホカイン）を分泌する。これらの細胞には、ヘルパーT細胞自体が含まれるが、細胞傷害性Tリンパ球、Bリンパ球、単球／マクロファージ、および好中球も含まれる。免疫のエフェクターアームを遂行するために、T-リンパ球仲介型免疫応答の過程でこれらの白血球がすべて活性化される（例えば、細菌の撲滅、毒物の中和、ウイル感染細胞またはウイルス移植細胞の撲滅など）。それらが活性化されると、それぞれの細胞群は、その表面に高レベルの機能性Fasを発現する。したがってこれらの細胞はすべて、本発明のFasリガンドの仲介による免疫抑制法の標的として機能する。
同種移植片による拒絶反応において、免疫系のほとんどは環境中にある抗原によってのみ刺激を受けるため、受容動物の免疫系はあらかじめ応答するように刺激されていることはない。同種の他の系から得られる組織は、例えばウイルスおよび細菌が存在しているのと同じ方法で、存在していることはない。同種移植片拒絶反応の場合では、免疫抑制方法は、免疫系がエフェクター段階に到達しないように設計されている。しかしながら、異種移植片拒絶反応に対する免疫の特徴は、同種移植片拒絶反応よりも疾患の再発に似ている可能性がある。疾患が再発する場合、免疫系は既に活性化されており、このことは天然の島細胞の破壊によって証明されている。したがって疾患が再発すると、免疫系は既にエフェクター段階に至っている。Fasリガンドは、同種移植片に対しても異種移植片に対しても免疫応答を抑制することができる。これはリンパ球が活性化されてFasを発現するエフェクター細胞に分化したためであって、それによってFasリガンドに感受性となる。
T-リンパ球が免疫応答または疾患の影響を仲介する際に必要とされている場合、その免疫応答または疾患はリンパ球仲介型であると考えられる。移植用の組織（「ドナー」組織）の細胞が、その表面に、外来の組織適合性抗原を備えているならば、これらの抗原は受容体において細胞毒性T-リンパ球の活性化を誘発し、数段回の一連の活性化段階を経た後でドナー細胞の撲滅に至る。このカスケード系は、ホストのT-リンパ球上にある抗原特異性なT-細胞レセプターと、ドナー細胞上にある主要組織適合性抗原との間で複合体が形成されることによって開始する。複合体の形成に続いてT-リンパ球仲介型の活性化が起こり、結果的にドナー細胞の死に至る。この工程が進行すると結局、種間での移植でさえも拒絶反応が引き起こされることになる。本発明によれば、この問題は、ドナー細胞の破壊が開始する段階より前にT-リンパ球応答を抑制することによって解決される。
本発明は、特に移植拒絶反応および疾患の再発を抑えることを目指しているが、他の型のリンパ球仲介型の医学的状態を抑制するためにも有用である。疾患によって活性化されたリンパ球、および外来移植片の導入によって活性化されたリンパ球は、Fasを発現しており、したがってFasリガンドを用いた治療法に対して感受性である。一般的に、免疫抑制剤としてのFasリガンドは、刺激された、または活性化された免疫系に対して最も活性が高い。刺激された、または活性化された免疫系は、T-リンパ球またはB-リンパ球のいずれかが活性化されている疾患の状態に関係している。活性化されたT-リンパ球は、ホストに対する移植片の反応における疾患（例えば、骨髄移植など）、ならびにほとんどの形態の自己免疫疾患、即ち多発性硬化症、慢性関節リウマチ、狼瘡、および重症性筋無力症など（これらに限られるわけではない）の自己免疫疾患に関連しているらしい。FasはB-リンパ球腫瘍およびT-リンパ球腫瘍によって発現するため、Fasを発現する白血病も、Fasリガンドを用いる治療に感受性である可能性がある。
Fasリガンドは、慢性の移植拒絶反応を治療するために用いることもできる。ほとんどの移植が、慢性的な移植片の破壊過程を受けることが当業者に認識されている。慢性的な移植拒絶反応の機構は従来の同種移植による免疫とは異なっており、従来の免疫抑制はその治療法では効果がない。慢性の移植拒絶反応はFasリガンドを用いて治療することができるため、結果的に長期間うまく移植することができ、ドナー組織を新しい受容体のために利用できるようにする。
またFasリガンドは、急性の移植拒絶反応を治療するためにも用いることができる。しばしば移植の受容体であるホストでは、重篤な移植拒絶反応が、即ちエフェクター段階に至るのを阻止することができるが活性化されたエフェクター細胞に対しては効果のない免疫治療（通常はシクロスポリンによる治療）では解決できないような、重篤な移植拒絶反応が進行する危機の期間が発生することがある。急性の移植拒絶反応に対する従来の治療方法は、T-リンパ球レセプター複合体に対する抗体の利用である。これによって結果的に、受容体であるホストにおいて重篤な免疫抑制が引き起こされる。Fasリガンドを用いた治療法は、活性化された細胞に対して、すなわち移植組織を攻撃する細胞に対してより特異的な治療法を提供するものであって、免疫系に存在する全てのT-リンパ球に対するものではない。
「治療」および「治療する」などの用語は、本明細書において、一般的に望ましい薬理的効果および／または生理的効果を得ることという意味で用いられている。この効果は、疾患、不調、またはそれらの兆候を完全にまたは部分的に抑制するという意味で予防的なものであったり、また疾患および／またはその疾患が原因となる副作用を部分的にまたは完全に治すという意味で治療的なものであったりする。「疾患」という用語は、受容患者による移植された細胞、組織、または器官の免疫仲介型の拒絶、ならびにFas発現細胞により仲介される免疫応答から引き起こされる糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、嚢胞性繊維症などを含むものとして広く定義される。
更に特定すると「治療」という用語は、移植された細胞、組織、または器官の急性または慢性の拒絶反応、T-リンパ球仲介型疾患の再発、T-細胞仲介型の原発性の疾患、およびT-細胞仲介型の自己免疫疾患、を患う患者に対する、治療のための検出可能な有利な効果を提供することを意味する。
更に特定すると「治療」とは、（1）移植された細胞、組織、または器官のTリンパ球による免疫仲介型拒絶反応、（2）例えば糖尿病の再発などの免疫仲介型疾患の再発、および（3）例えば若年型糖尿病、慢性関節リウマチ、嚢胞性繊維症、または多発性硬化症などの免疫仲介型の原発性の疾患、の予防、軽減、および／または阻害を意味する。本発明の方法は特に、免疫応答に関与するFas発現性免疫エフェクター細胞を標的とし、アレルギー反応などの有害な自己免疫反応を治療するために用いることもできる。
「Fasリガンド」または「Fasリガンドポリペプチド」という用語は、免疫抑制効果を有し、かつFasリガンドポリペプチドに対して特異的な抗体と反応するFasリガンドポリペプチドまたはその断片の全アミノ酸配列を意味する。Fasリガンドには、膜結合型（完全な）Fasリガンドポリペプチド、および可溶性のFasリガンドポリペプチドが含まれ、そして本発明の方法には、リンパ球仲介型の疾患および障害の治療に完全なFasリガンドおよび可溶性のFasリガンドを用いる方法が含まれる。本明細書で用いられるように「可溶性Fasリガンド」という用語は、天然のFasリガンドの免疫抑制活性を有し、Fasリガンドに特異的な抗体と反応することのできるFasリガンドポリペプチドの細胞外カルボキシ末端部分を含むFasリガンド断片を意味する。下記に記載したように、完全なFasリガンドまたは可溶性のFasリガンドは、哺乳動物の体内に免疫学的な特権的部位を作る能力があり、それによって受容患者による拒絶反応から移植された組織を保護できるという特徴を有する。可溶性のFasリガンドは、インビボでの生物活性を最適化するために、Fasリガンドの二量体または三量体を含む、一個またはそれ以上の分子と複合体を形成していてもよい。このような複合体は、架橋などの分子間のイオン性相互作用、水素結合、または共有結合によって形成することができる。Fasリガンド複合体はFasリガンド分子同士で形成されていてもよいし、または一個またはそれ以上のFasリガンド分子と、ペプチド、タンパク質、脂質、および／または炭水化物を含む他の分子との間で形成されていてもよい。本発明の方法には、Fas発現エフェクター細胞によって仲介される免疫応答を抑制する効果のある、哺乳動物起源由来の完全なFasリガンドまたは可溶性のFasリガンドの使用が含まれる。
「有効量」または「治療に有効な量」などの用語は、治療すべき疾患をうまく抑制したりまたは阻害したりするのに充分な量を意味する。本発明の方法にしたがって投与されるべきFasリガンドの有効量の正確な値は、特定の受容体、および治療を受ける症状の重度を含む多くの要因に依存する。例えばFasリガンドの有効量とは、T-リンパ球仲介型の移植拒絶反応および疾患の再発を阻害するのに有効な量である。
免疫抑制剤、即ち疾患の再発における免疫応答の攻撃、および異種のドナー組織に対する激しい免疫応答の攻撃に抵抗する薬剤の安全かつ有効な新規な形態が当技術分野において要望されている。本発明は、移植の必要があるヒト患者へ移植するために非ヒト組織を利用することができる方法を提供することにより、上記の要望を満たそうとするものである。本発明の方法は、異種の組織の拒絶反応を抑制する。従って本発明は、組織および器官の同種間の移植だけでなく、異種間移植をも可能にするものであり、ヒト患者に移植するために非ヒト哺乳動物においてドナーの器官および組織を「飼育する」ことの可能性を開発する。異種間移植の場合、本発明は、ドナー細胞の表面に存在する不要な抗原をマスクするか、修飾するか、または減少させるためのその他の方法と共に実施することもできる。それは例えば米国特許第5,283,058号に記載されている方法であり、これは参照として本明細書に組み入れられる。
「内因性のFasリガンド源」とは、Fasリガンドがホストの受容体である哺乳動物自体の中で合成され、かつ分泌される方法で提供されることを意味している。対照的に、外因性のFasリガンド源は、ホストの受容哺乳動物に埋め込まれたポンプによって精製されたFasリガンドを連続的に注入することにより提供することができる。
ドナー組織  ドナー組織は、受容哺乳動物と同じ種または異なる種から得ることができる。「ドナー組織」とういう用語は、これらに限定されるわけではないが、島細胞、腎臓、心臓、肝臓、肺、脳、および筋肉組織を含む、ドナーの哺乳動物から得られる細胞および器官を含む。
ドナー組織は哺乳動物、好ましくはブタから得ることができる。ブタは、器官および細胞のドナー動物として利用すると、多くの利点をもたらす。例えば心臓および腎臓のような多くのブタの器官は、ヒトの器官と大きさが似ていることである。
精製されたFasリガンド  投与されるFasリガンドは天然の起源から得ることができ、マウス、ラット、ブタなどを含むいかなる動物または細胞起源から精製してもよい。培養されたPC60-d10S細胞からFasリガンドを精製するための簡単な方法は、「Suda & Nagata（1994）J. Exp. Med. 179: 873」に記載されている。
また本発明において、DNA組換え法によって製造された精製されたFasリガンドを用いることできる。高純度のFasリガンドを大量に製造するのに必要な組換え方法は、完全なマウスおよびヒトのFasリガンドポリペプチド、ならびに可溶性のマウスおよびヒトのFasリガンドポリペプチドを生産する方法について下記に記述されている。
Fasリガンドの投与  精製されたFasリガンドを移植された受容体に投与することによって、受容哺乳動物で起こる移植された組織のT-リンパ球仲介型拒絶反応を抑制したり、または置き換えられた内因性組織を破壊する疾患の再発を抑制したりすることができる。精製されたFasリガンドは、当業者に既知の多くの方法によって投与することができる。本発明の一態様では、Fasリガンドを含む治療用組成物または薬学的組成物が、リンパ球仲介型の移植拒絶反応または疾患の再発を抑制するのに充分な有効量で哺乳動物に投与される。本発明の治療用組成物または薬学的組成物は、注射、または埋め込み式ポンプからの連続注入などのさまざまな手法で投与することができる。その他にも適当な投与形態が考えられる。例えば、薬物または薬剤を輸送する手段として有用な半透性の膜装置が知られている。神経伝達因子を分泌する細胞のカプセル化、およびパーキンソン病患者の脳へのそのような装置の埋め込みについては、次の文献に記載されている。米国特許第4,892,538号、米国特許第5,011,472号、米国特許第5,106,627号参照。精製されたFasリガンドの製剤は、一種またはそれ以上の薬剤および薬剤学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。「賦形剤」または「薬剤学的に許容される賦形剤」という用語は、薬剤学的組成物の他の成分と共存可能で、かつ受容体に有害ではないという意味で許容される担体を意味している。
本発明の一態様において、Fasリガンドは、生物学的に活性な型のFasリガンドを発現し分泌することができる形質転換された細胞を患者に移植することにより、治療のために投与される。
実施例1には、糖尿病のPVGラットの腎臓被膜下の部位へのラットの島細胞の移植が記載されている。生理食塩水（対照用）、または精製されたFasリガンド（実験用）を分配するポンプが、移植部位近くに埋め込まれる。
精製されたFasリガンドの移植部位への投与に代わる方法として、移植組織を、Fasリガンド遺伝子配列を含むようここ遺伝子を変更させられたトランスジェニック動物において生育させることができる。このようなトランスジェニック動物は、標準的なトランスジェニック技術によって作ることができる（実施例2）。実施例3には、移植された組織自体が内因性のFasリガンド源となっているトランスジェニックラットから得た島細胞の移植が記載されている。
本発明は、内因性細胞の破壊、例えば糖尿病におけるインシュリン産生膵臓β島細胞の破壊などから引き起こされる多くのヒトの疾患状態を治療するために用いることができる。本発明の重要な特徴は、ヒト患者のための組織および器官のドナーとしての、非ヒト哺乳動物の利用を可能にするというである。上記の方法には、外因性の島細胞を移植することによって糖尿病のヒト患者を治療するための本発明の利用が記載されている。外因性の島細胞は、例えばFasリガンドポリペプチドを発現する正常ブタまたはトランスジェニックブタから得ることができる。実施例4には、糖尿病のヒト患者にトランスジェニックブタの島細胞を移植することが記載されている。
セルトリー細胞におけるFasリガンドmRNAの産生は、実施例6に記載されているようにして樹立する。Fasリガンド特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして選別された、精製されたラットセルトリー細胞由来のmRNAは、セルトリー細胞が精巣組織におけるFasリガンドの唯一の起源ではないにしても、主要な起源であることを示している。機能性Fasリガンド分子が存在しないと、セルトリー細胞が免疫抑制機能を発揮することができなくなるか否かを試験するために、精巣組織をBALB/cマウスに移植した（実施例7参照）。B6およびB6-gldドナーは両方とも、受容体であるBALB/cと遺伝子的に適合しない。B6-gld種は、Fasリガンド遺伝子中に、発現タンパク質がアポトーシスを誘導するように作用することを抑制する一つの点突然変異を有している。移植されたB6組織が、受容体であるBALB／c動物内で健全に維持されているのに対して、移植されたB6-gld組織は7日以内に完全に破壊されてしまった。これらの実験を、B6およびB6-gld動物から単離されたセルトリー細胞をBALB/c受容体に移植することにより繰り返した（実施例8参照）。その結果は、移植された組織を用いて得られる結果と同様であった（実施例7参照）。表1には、B6、B6-gld、およびB6-lprマウスから得られた完全な精巣組織および単離されたセルトリー細胞を、BALB/c受容体に同種移植した場合に観察された結果がまとめられている。実施例10には、B6マウスから得られた完全な精巣組織または単離されたセルトリー細胞を移植されたBALB/c受容マウスに、移植後14日後にB6脾臓細胞を抗原として投与した、またはしなかった実験が記載されている。この結果は、Fasリガンドを有する細胞および組織は、ホストが他の非Fasリガンドを有する同種組織を破壊した場合でも、同種移植片拒絶反応に抵抗することを示している（表2参照）。
膜結合型の（完全な）マウスおよびヒトのFasリガンド、ならびに可溶性のマウスおよびヒトのFasリガンドが、実施例11に記載されているように単離され、クローニングされた。可溶性マウスFasリガンドをコードするDNA配列が図1に示されており、それは426〜966ヌクレオチド位の配列によってコードされ、アミノ酸101〜280である（Takahashi et al.（1994）Cell 76: 969-976参照）。可溶性ヒトFasリガンドポリペプチドをコードするDNA配列が図2に示されており、それは374〜909ヌクレオチド位の配列によってコードされ、アミノ酸103〜281である（Takahashi et al.（1994）Intl. Immunol. 6: 1567-1574参照）。
精製された完全なポリペプチドおよび可溶性のポリペプチドを、それぞれのポリペプチドに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生するために用いた（実施例12参照）。本発明の抗体は、完全な分子、およびエピトープ決定基を結合する能力があるその断片、例えばFab、F（ab'）2、およびFvを含む。治療のためのFasリガンドの使用および遺伝子治療については、実施例13および14に記載されている。
本発明の全ての方法および組成物において、可溶性Fasリガンドまたはその抗原性断片が用いられる。
次の実施例は本発明を限定するものではなく、例示するためのものである。それらは用いることができる典型的なものであり、当業者に知られている他の手法が代わりに用いられてもよい。
実施例1 移植された組織のT-リンパ球仲介型拒絶反応のFasリガンドの投与による抑制
島の調製  ラットから単離された新鮮な島細胞は既知の方法によって調製する。例えば、「London et al.（1990）Transplantation 49: 1109-1113」を参照のこと。適当な環境の下で、島細胞は、移植を行う前に予備処理を行うことによりドナー抗原を封じ込める（「マスクする」）か、または移植片の免疫原性を修飾することができる。それは当業者にとって既知の方法、例えば米国特許第5,283,058号に記載された方法によって行われる。
精製されたFasリガンド  精製されたFasリガンドは、哺乳動物の起源から入手することもできるし、または組換え体のタンパク質としてインビトロで産生してもよい。本発明の一態様において、精製されたFasリガンドは天然の起源から得られる。培養細胞からFasリガンドを大量に精製するための簡単な方法については、これまでに報告されている（Suda & Nagata（1994）上記、参照）。簡単に述べると、Fasリガンドを発現する細胞は、培養され、そして回収される。可溶化された膜画分は、アフィニティー精製により精製され、Fasリガンドは「Suda & Nagata（1994）上記」によって記述されているようにして溶出される。
Fasリガンドのバイオアッセイ  精製されたFasリガンドの生物活性は、「Suda & Nagata（1994）上記」によって記述されている細胞毒性アッセイによりインビトロで評価される。
ラットの移植および精製されたFasリガンドの投与  下記のように、糖尿病のPVGラットに、島細胞が移植され、生理食塩水（対照用）または精製されたFasリガンド（実験用）を分配するポンプが埋め込まれる。糖尿病のPVGラットを、メトキシフルランUSPで麻酔し、左の側腹を切開し、腎臓を露出させる。島細胞（10島／体重1g）が、「Selawry & Cameron（1993）上記」によって記述されているように、腎臓の被膜の下に注入される。経験的に決定された期間にわたって生理食塩水または精製されたFasリガンドのいずれかを分配するようにプログラムされたポンプが、腎臓被膜下に埋め込まれる。シクロスポリン（CsA）を7日間にわたり1日あたり25mg／kgずつ皮下に注入してもよい。
受容ラットを、血漿グルコースレベルについて評価する。尿量および尿中のグルコース含有量は、文献記載のようにして求め、決定することができる（Selawry & Cameron（1993）上記）。Fasリガンドを受け入れた受容ラットは、長期間にわたって正常血糖値を示すようになる。
実施例2 FasリガンドをコードするDNAを含むトランスジェニック哺乳動物の作出
Fasリガンド遺伝子を含む胚細胞および体細胞を有するトランスジェニックラットは、当技術分野において既知の方法によって作出される。例えば、トランスジェニック哺乳動物の形成について開示している米国特許第4,736,866号を参照のこと。なおこれは参照として本明細書に組み入れられる。一般的に、FasリガンドをコードするDNA配列は、動物に導入されたり、または胎児の段階（好ましくは一個の細胞、即ち受精した卵母細胞の段階、そして一般的にはおよそ8細胞期よりも後でない段階）にある動物の原種に導入される。外来遺伝子を動物の胎児に導入し、その外来遺伝子を安定に発現させるための方法には、いくつかの当業者に知られた方法がある。一つの方法は、胎児が自然に発生したときに遺伝子でその胎児を形質転換し、それから外来遺伝子が結果的に発現するような遺伝子座において染色体に組み込まれている、形質転換された動物を選択するというものである。他の方法には、胎児に導入される前に外来遺伝子またはその対照配列を修飾することが含まれる。例えば、Fasリガンド遺伝子は、増強された、誘導可能な、または組織特異的なプロモーターで修飾されていてもよい。
トランスジェニックラットの組織はFasリガンドの存在について、直接RNAを分析することによって、またはFasリガンドについてその組織をアッセイすることによって、または分泌されたFasリガンドについて調整培地をアッセイすることによって分析される。例えば、トランスジェニックラットから得られる細胞を35S-メチオニンの存在下で培養してから、その上清についてFasリガンドに対する抗体を用いて免疫沈降を行う。沈澱したタンパク質は還元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されて、オートラジオグラフィーによって可視化される。調整培地についても、「Suda & Nagata（1994）上記」の方法によって細胞毒活性をインビトロで試験することができる。
実施例3 Fasリガンドを発現するトランスジェニック島細胞の移植
島細胞を、実施例2のトランスジェニックラットから得、それを実施例1に記載された方法によって糖尿病のPVGラットに移植する。上述のようにして評価すると、受容ラットは長期間にわたり正常血糖を保つことができる。
実施例4 ヒト糖尿病患者へのトランスジェニックブタの島細胞の移植
全ての胚細胞および体細胞がヒトのFasリガンドをコードする組換えDNA配列を含む、トランスジェニックブタが得られる。ヒトのFasリガンドDNA配列は当業者に既知の方法によってブタに導入した。島細胞は、実施例2に記載された方法によってトランスジェニックブタから得られ、当技術分野において既知の方法によって糖尿病のヒト患者に移植される。ヒト患者について、適切に評価すると、長期間にわたり正常血糖が保たれている。
実施例5 その他の態様
本発明の方法は、内因性の組織を破壊してしまう疾患が再発するのを抑制するためにも用いることができる。例えば、島のβ細胞抗原に対するT-リンパ球により仲介される疾患の再発は、移植された島細胞を破壊してしまう。したがってFasリガンドを移植部位に供給することにより糖尿病の再発を抑制し、そして島β細胞抗原に対する免疫応答を抑制することによって受容哺乳動物が正常血糖値を示すようになる。
実施例6 単離されたセルトリー細胞によるFasリガンドmRNAの産生
cDNAの合成  精製されたラットのセルトリー細胞から得られる全RNAは、「Chomczynski and Sacchi（1987）Anal. Biochem. 162: 156」に記載された方法によって細胞ペレットから単離された。そのRNA（5μg）を、メチル水銀水酸化物（最終濃度は10mM）（Alfa Products, Ward Hill, MA）でまず変性し、続いてTaq（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼ緩衝液（50mMのKCl、10mMのTris-HCl、pH8.3、2.5mMのMgCl2、および0.01％のゼラチン）に、RNAガード（20ユニット）（Pharmacia, Piscataway, NJ）、β-メルカプトエタノール（40mM）、dNTPs（0.5mM）（Pharmacia）、1μgのランダムヘキサマー（Pharmacia）およびAMV（トリ骨髄芽球腫ウイルス）逆転写酵素（20ユニット）（Life Sciences Inc., St. Petersburg, FL）の存在下で、50μlの反応液量中で、42℃で90分間かかってcDNAに変換した。
PCR増幅  合成に続いて、5μlのcDNAを、200mMのdNTPs（Pharmacia）と、1.5mMのMgCl2を含むポリメラーゼ緩衝液と、TaqDNAポリメラーゼ（1ユニット）（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）と、ラットのFasリガンド特異性のオリゴヌクレオチドプライマーである5'-GCCCGTGAATTACCCATGTC-3'（配列番号：1）および5'-TGGTCAGCAACGGTAAGATT-3'（配列番号：2）（それぞれ、順方向および逆方向）とを含む氷上のチューブに移した。これらの試料を軽量のミネラルオイル（Sigma Chemical Corp., St. Lous, MO）で被膜層を形成してから、加熱循環器（MJ Reserch, Inc., Watertown, MA）に移した。DNA／RNA複合体を変性するために94℃で5分間加熱したのち、その試料を94℃で1分間、55℃で1.5分間、72℃で2分間のサイクルを28回行い、更に最後に72℃で10分間かけて増幅した。
検出  50μlの反応出発物より20μlを1.6％のアガロースゲル電気泳動によって分離した。次の試料を泳動した。即ち、32℃（レーン1）または37℃（レーン3）でインキュベートしたセルトリー細胞由来のmRNA、32℃（レーン2）または37℃（レーン4）でインキュベートした第2の動物から採取したセルトリー細胞由来のmRNAである。そのゲルに含まれるDNAを続いて、「Southern（1975）J. Mol. Biol. 98: 503」に記載された方法にしたがってニトロセルロースフィルター（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。そのフィルターをUVで架橋し（Stratagene, San Diego, CA）、次に6×SSC（1×SSC＝0.15Mの塩化ナトリウムと0.015Mのクエン酸ナトリウムの混合溶液）と、1×デンハート（Denharts）溶液（0.02％ずつのフィコール400、ウシ血清アルブミン、およびポリビニルピロリドン）と、20μg／mlのコムギ胚のtRNAと、0.1％のSDSと、32Pで末端を標識したFasリガンド特異的オリゴヌクレオチドである5'-AACATAGAGCTGTGGCACC-3'（配列番号：3）を添加した0.05％のピロ燐酸ナトリウムとを含む溶液中で37℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。0.05％のピロ燐酸ナトリウムを添加した6×SSC中で、47℃で十分洗浄したあと、そのフィルターを乾燥させ、コダックX-Oマット（X-Omat）フィルムに露光した。
増幅されたラットセルトリー細胞のmRNAのオートラジオグラフを得た。レーン1およびレーン3はそれぞれ32℃または37℃でインキュベートした細胞から得られたmRNAであり、またレーン2およびレーン4はそれぞれ32℃と37℃で培養された第2の動物から採取したセルトリー細胞から得られたmRNAである。これらの結果は、セルトリー細胞が、排他的ではないにしても、精巣内でのFasリガンドの起源として優勢を保っていることを示している。
DNAの配列決定  PCR産物は、「Sanger et al.（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5453」に記載された標準的なDNA配列決定方法により、「Suda et al.（1993）Cell 75: 1169」によって公表されている配列と同一であることを決定した。
実施例7 移植された精巣の生存におけるFasリガンドの効果
機能性Fasリガンド分子が存在しないと、セルトリー細胞が免疫抑制機能を発揮できなくなるか否かを試験するために、本発明者らは雄のB6-gldまたは遺伝子的に相互作用しないがFasリガンドが影響するC57BL／6（B6）マウスから採取した精巣の組織をBALB／c受容体に移植した。このB6-gld種およびB6種は、主要組織適合性複合体（MHC）が同一であり、またFasリガンドを除いて、他の（副の）組織適合性抗原についてもすべて本質的に共通である。B6-gldはFasリガンド遺伝子に一つの点突然変異を有する（Takahashi et al.（1994b）上記）。B6-gldおよびB6は、主要組織適合性複合体（MHC）および多くの副遺伝子座の両方について、BALB／c種とは異なっている。
B6-gldまたはB6の精巣移植片は、BALB／c受容体の腎臓被膜の下に移植した。マウスは体重を測定し、アベルチン（Avertin）（12ml/g）を注射してからメトファン（Metophane）で麻酔する。このマウスの左側の胸郭の下の毛を剃ってから体壁を貫通する小さな切開（約8mm）を形成する。腎臓の背側の端部に付いている脂肪組織を、腎臓が露出されるようように吸引する。腎臓を、ハンク塩基性塩溶液（Hank's Basic Salt Solition/HBSS）を用いてその湿度を保つ。まっすぐな切開部を腎臓の背側端部に形成し、腎臓被膜をプローブを用いて腎臓から注意深く開放する。移植すべき組織をその被膜の下に置き、プローブを用いて腎臓の腹側の部分に静かに移動させる。腎臓を体内で置き換えて、切開部を閉じる。
血塊の移植手順  この手順は、細胞群または集合していない島が受容ホストの腎臓被膜の下に移植されるように設計される。血塊内に細胞を埋め込むと、移植者は、移動しない相対的に決定された位置にそれらの細胞を位置づけることができる。
移植すべき細胞をシリコン処理をした15mlの遠心分離チューブに移し、5分間静置する。細胞懸濁液中に含まれる細胞を、シリコン処理をした15mlの遠心分離チューブに移し、300×gで5分間遠心分離する。上清のほとんどを除去し、細胞を残りの200μlの培地に再懸濁する。その細胞を再懸濁し、300μlのマイクロチューブに移してから500〜1000×gで30秒間遠心分離し、氷上に置く。大部分の上清を除去すると、約4〜5mmの流体が残る。外科用メスを用いて液体レベルの真上で上部を切取り、残った液体をキャピラリーチューブを用いて取り除く。血液を受容動物の尻尾の血管から採取して、約5μlの血液を先の細胞ペレットに添加する。血塊は10分間で形成される。残りの血清は吸引する。細胞は血塊のマトリックス内に埋め込まれて、容易に移動することはない。続いてこの細胞の塊を腎臓被膜に移植することができる。
結果  2および7日目に（B6-gld）、または2、7、および28日目に（B6）移植された組織を、移植拒絶反応について肉眼または顕微鏡を用いて分析した。受容体であるBALB／cマウスを、過剰量のペントランを用いて安楽死させた。移植片を含む腎臓を取り除いてから通常の生理食塩緩衝溶液に固定し、通常の組織学的手法によって処理した。その腎臓を、5μlの部分に切り取ってヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した後、パラフィン中に固定した。B6組織を用いて移植されたBALB／cの腎臓から得られた腎組織は、光学顕微鏡によって構造的に正常であることが明らかになった。移植された組織は腎臓被膜に隣接したところに見いだされた。それは、組織適合性に関して遺伝的に同一のBALB／c組織がドナー組織の起源として用いられる場合に見られるものと形態学上違いはないことが明らかになった。B6-gldを移植された腎臓では、2日では移植片にリンパ球がかなり浸入しており、精巣組織の構造が破壊された。腎組織も、移植片の内部だけでなく隣接部にも明らかにリンパ球が浸入しているのが判明した。7日までには精巣組織がほとんど認められなくなるとともに、リンパ球の浸入が減少しており、このことは7日よりも前に破壊過程のピークがあることを示している。これらの所見は免疫抑制におけるFasリガンドの役割を確立するもので、機能性Fasリガンド遺伝子が存在すれば、移植された精巣細胞を移植拒絶反応から防御することができることを示している。
実施例8 セルトリー細胞のFasリガンドの免疫抑制活性の効果
単離されたセルトリー細胞が、精巣組織の移植片で得られた結果と同じ結果を示すか否かを確認するために（実施例6）、セルトリー細胞をB6-gldおよびB6マウスの精巣組織から単離、精製して、BALB／cマウス内の腎臓被膜の下に単一細胞懸濁液として移植した。これは、本質的に「Selawry and Cameron（1993）Cell Transplantation 2: 123」および上記の実施例7に記載されているように行われた。精巣をマウスから摘出し、5mlのHAM'S F12/DMEM培地（Ham's培地）内で小さな断片に切断した。この組織を50mlのチューブに入れ、25mlsのHam's培地を添加し、800×gで2〜5分間遠心分離することによってペレット化した。このペレットを、20mgのトリプシンおよび0.4mgのDNAseを含有する20mlのHam's培地に再懸濁した。得られた混合物を、250mlのフラスコに入れて37℃に保たれたインキュベーター中で30分間温め、続いて800×gで2〜5分間遠心分離してペレット化した。この細胞ペレットは、1Mのグリシン、2mMのEDTA、0.01％の大豆トリプシン阻害因子、および0.4mgのDNAseを含有する溶液20ml中に10分間、室温において再懸濁した。この混合物を上記のように遠心分離し、細胞ペレットを二度洗浄した。細胞を10mgのコラゲナーゼを含む20mlのHam's培地に再懸濁して、37℃のインキュベーターに5分間設置し、ペレット化し、20mgのコラゲナーゼおよび0.1mgのDNAseを含む20mlのHam's培地に再懸濁した。その試料を37℃のインキュベーターに入れた250mlのフラスコに移し、30分間温めた。その細胞を上述したようにペレット化して洗浄した。細胞を20mgのヒアルロニダーゼおよび0.1mgのDNAseを含む10mlのHam's培地に再懸濁し、37℃のインキュベーター中に入れた250mlのフラスコ内に30分間放置した。その細胞をペレット化して洗浄した。この最後のペレットは、腎臓被膜の下に移植するまで氷上に保った。このペレットは、ホストのマウスから採取した血液を用いて塊にしてもよい（上述した血塊移植法を参照のこと）。
実施例7に記載された結果と同一の結果が得られた。腎臓被膜の下に移植された組織適合性の受容BALB／cマウスのB6-gldセルトリー細胞は、完全なままであった。これらの結果は、Fasリガンドが、セルトリー細胞の免疫抑制効果を担う有効な免疫抑制因子であることを示している。
表1は、完全な精巣組織および単離されたセルトリー細胞を移植した時に得られる結果をまとめたものである。受容とは、移植片に存在するドナー組織が正常な形態を有していて、移植後8〜20日たっても受容体の白血球が浸入した兆候がないことを示している。拒絶反応とは、移植片に検出できるドナー組織が見あたらず、受容体の白血球が移植部位にかなり浸入している証拠があることを示している。
実施例9 ドナー組織または受容体の移植部位を選択するためのFasリガンド発現の診断的使用
機能性Fasリガンド遺伝子と移植拒絶反応からの保護との間にある相互関係の発見を、診断に応用することができる。種々の非リンパ性組織のFasリガンドを発現する起源としての能力は、Fasリガンドに対するモノクローナル抗体を用いて組織を検査することによって、またはRT-PCRによってFasリガンドmRNAを評価することによってのいずれかの方法で検出され、その起源の能力によって移植後に特定の組織が維持されるかまたは拒絶されるかについての可能性を予測することができる。高いレベルでFasリガンドを発現する組織は、器官の移植を成功させるための好ましい部位を提供する。ドナー組織をFasリガンド発現についてスクリーニングすることも、移植の成功を予言する手助けになるであろう。
実施例10 移植後にドナー組織移植抗原に対して免疫された同種動物におけるFasリガンド発現組織の維持
B6マウスから摘出された完全な精巣組織および単離されたセルトリー細胞を、上述したように同種のBALB／cマウスの腎臓被膜の下に移植した。移植後14日たった時点で、受容体であるマウスに、1×106個のドナー（B6）脾臓細胞を腹膜内に注入した。移植後21日でその動物を安楽死させ、腎臓を組織学的検査に処した。
その結果が表2に示されている。受容とは、移植片に存在するドナー組織が正常な形態を有していて、受容体の白血球が浸入した兆候がなかったことを示している。拒絶反応とは、移植片に検出できるようなドナー組織が見あたらず、移植部位に受容体の白血球のかなりの浸入があったことを示している。この結果は、Fasリガンドを有している精巣組織およびセルトリー細胞は、ホストが非セルトリー起源の他の同種組織を破壊している場合でさえ、同種移植片による拒絶反応に抵抗することを示している。
実施例11 完全なマウスFasリガンドおよびヒトFasリガンド、ならびに可溶性のマウスFasリガンドおよびヒトFasリガンドをコードする遺伝子のクローニングおよび発現
マウスのFasリガンドをコードする遺伝子は、細胞毒性のマウスのT-細胞クローンDAB-6から精製されたRNAから逆転写（RT）し、PCR方法によってクローニングした。DAB-6細胞（Duke（1989）J. Exp. Med. 170: 59-71参照）は、ホルボールミリスチン酸およびイオノマイシンを用いて処理した後でFasリガンドを発現する（Rouver et al.（1993）J. Exp. Med. 177: 195-200参照）。充分な長さのFasリガンド遺伝子を合成するのに用いられたプライマーは、5'プライマー5'-CGGGATCCATGCAGCAGCCCATGAATTAC-3'（配列番号：4）、および3'プライマー5'-CGGAATTCCTTTTAAAGCTTATATAAGCC-3'（配列番号：5）であった。
ヒトFasリガンド遺伝子は、既に記述されているようにして（Takahashi et al.（1994a）上記）コンカナバリンA、ヒトIL-2、ホルボールミリスチン酸、およびイオノマイシンを用いてT-細胞を刺激した後で、健康な成人から入手した末梢血液から精製されたRNAから同様の方法を用いてクローニングした。充分な長さのFasリガンド遺伝子の合成で用いられるプライマーは、5'プライマー5'-CGGGATCCATGCAGCAGCCCTTCAATTA-3'（配列番号：6）、および3'プライマー5'-CGGAATTCCTCTTAGAGCTTATATAAGCC-3'（配列番号：7）であった。
可溶性のヒトFasリガンド遺伝子は、5'プライマー5'-CGGGATCCATGCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGAGCTGGC-3'（配列番号：8）、および3'プライマー5'-CGGAATTCCTCTTAGAGCTTATATAAGCC-3'（配列番号：9）を用いて合成した。可溶性のマウスFasリガンド遺伝子は、5'プライマー5'-CGGGATCCATGCAGCTCTTCCACCTGCAGAAGGAACTGGC-3'（配列番号：10）、および3'プライマー5'-CGGAATTCCTTTTAAAGCTTATATAAGCC-3'（配列番号：5）を用いて合成した。Fasリガンド遺伝子の内部領域は、Fasリガンドポリペプチドの細胞外にあるカルボキシ末端の可溶性部分をコードしている。遺伝子のこの部分を、可溶性リガンドを発現するようにpCDNA3へとサブクローニングする前に、シグナル配列にインフレームで連結させた。異種のシグナル配列は、細胞から分泌する前に、分泌経路に可溶性のFasリガンドを導くために必要とされる。
全RNAはトライゾール（TRIzol）試薬（Life Technologies, Inc.）を用いて単離し、ポリ-A+RNAはポリアトラクトキット（polyAttract kit）および磁気ビーズ法（Promega）を用いて濃縮した。RT反応は、スーパースクリプトII逆転写酵素（BRL）を50℃で利用して、公表されたFasリガンド配列（Takahashi et al.（1994b）上記）から得た特異的な3'オリゴヌクレオチドを用いて開始した。PCR反応はVentポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼの混合物を用いて行うことによって、ポリメラーゼ反応の信頼度を確かなものにした。PCR産物を細菌プラスミドにサブクローニングし、そして産物を内部オリゴヌクレオチドを用いる巣状（nested）PCR反応によって確認した。
クローニングした充分な長さのマウスおよびヒトのFasリガンド遺伝子、それに可溶性のヒトFasリガンド遺伝子を、マウス腫瘍細胞（L1210.3-白血病、およびB16-黒色腫）、サル腎臓細胞（COS-1）、およびマウス繊維芽細胞（BC10MEおよびBALB 3T3）を含む哺乳動物の細胞で発現させるために、pCDNA3（Invitrogen）などのCMVプロモーターの支配下でベクターにサブクローニングした。
実施例12 抗体の産生
完全なマウスおよびヒトのFasリガンド、ならびに可溶性のマウスおよびヒトのFasリガンドに対して、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生するために、細菌性のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として、適当なFasリガンド遺伝子をpGEXベクターにインフレームでサブクローニングした。細菌で発現したGST-Fas融合タンパク質をグルタチオン-結合型セファロースで精製し、還元型グルタチオンを用いて溶出することによって免疫のための精製された融合タンパク質を得ることができた。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は当業者に知られた方法によって作ることができる（例えば、Kohler et al.（1975）Nature 256: 495参照）。
実施例13 治療のためのFasリガンドの使用
移植された細胞、組織、または器官は、移植された組織または器官を保持されているFasリガンドで被覆することによって拒絶反応から保護される。融合タンパク質は、例えばインシュリンまたはインテグリンなどの細胞特異的なレセプターリガンドに融合した可溶性のFasリガンドポリペプチドを含むタンパク質であって、上述したように作られる。一態様において、可溶性Fasリガンドがインシュリンと融合させられ、受容体である検体に移植されるべき島細胞がFasリガンド−インシュリン融合タンパク質を用いて処理される。インシュリンは島細胞のレセプターに結合し、拒絶反応に対するバリアをもたらすFasリガンドで島細胞を被覆する。もう一つの態様では、脈管構造の内皮をFasリガンドで被覆することによって反応性を有するリンパ球が器官の組織に入り込むのを阻止するように、Fasリガンド−インテグリン融合タンパク質で移植される器官を潅流する。
可溶性のFasリガンドはまた、例えば慢性関節リウマチまたは多発性硬化症などの自己免疫疾患を緩和するために、例えば関節腔または中枢神経系などの自己免疫性炎症のある部位に直接注入してもよい。またFasリガンドを発現する繊維芽細胞などの形質転換された自家移植細胞も、局部的な炎症性の自己免疫疾患に対する治療用として自己免疫性炎症の部位に投与してもよい。
本発明の方法は、アレルゲンのような外来のタンパク質、または移植された細胞、組織、または器官のいずれかに耐性を誘導するために用いることもできる。一態様では、繊維芽細胞などの自家移植細胞は、Fasリガンドと、アレルゲンまたは自己抗原のような外来タンパク質とをコードする遺伝子を用いて同時形質転換される。その自家移植細胞が、外来タンパク質に対する耐性を誘導するために投与される。もう一つの態様では、移植受容体にFasリガンドを発現する移植組織と同じ起源から得た同種の細胞を投与することによって、移植された細胞、組織、または器官に対して予め耐性が付与される。例えば、Fasリガンドを発現する形質転換されたドナー由来の繊維芽細胞も、同じドナーからの細胞、組織、または器官を移植する前に受容体に注入する。
実施例14 遺伝子治療
本発明には、完全なFasリガンドまたは可溶性のFasリガンドをコードする遺伝子を用いた遺伝子治療が含まれる。Fasリガンド遺伝子は、遺伝子治療に用いられるウイルスベクターまたは外来のタンパク質を、受容体である検体の免疫系によって破壊されることから保護する作用をもたらすためにも用いることができる。遺伝子治療は、Fasリガンドポリヌクレオチドを適当な細胞に導入することによって局所的な免疫抑制を提供するために用いられる。Fasリガンドポリヌクレオチド配列は、保護が必要な組織だけにおいてFasリガンドを確実に発現させる組織特異性プロモーターに結合していてもよい。Fasリガンドポリヌクレオチドの供給は、例えばキメラウイルスやコロイド分散系などの組換え発現ベクターをを用いて実施することができる。ポリヌクレオチド配列を治療のために輸送する際に特に好ましいのは、指向化リポソームの使用である。
本明細書で開示したように、遺伝子治療に用いることのできるさまざまなウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはレトロウイルスなどのRNAウイルスが含まれる。RNAウイルスが用いられる場合、それはネズミまたはトリに感染するレトロウイルスの誘導体であることが好ましい。一個の外来遺伝子を挿入することのできるレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウスの白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウスのサルコーマウイルス（HaMuSV）、マウスの乳ガンウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。被験者がヒトである場合には、テナガザルの白血病ウイルス（GalLV）などのベクターを用いることが好ましい。多くの他のレトロウイルスベクターには、複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターの全ては、形質導入された細胞を同定し、かつ発生させることができるように、選択可能なマーカーとなる遺伝子を導入し、組み込むことができる。Fasリガンドポリヌクレオチドを、例えば特定の標的細胞にあるレセプターに対するリガンドをコードするもう一つの遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは標的細胞に対して特異的となる。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質、またはタンパク質と結合することにより、標的特異的になる。好ましい指向化は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって行われる。当業者は、Fasリガンドポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターが標的特異的に輸送されるように、特異的なポリヌクレオチド配列をレトロウイルスのゲノムに挿入したり、またはウイルスエンベロープに結合させたりすることができることを知っているであろうし、また過剰な実験を行うことなく容易に確認することができる。
Fasリガンド遺伝子はまた、Fasリガンドポリヌクレオチドおよび治療目的で用いられる遺伝子の両方をウイルスベクターに挿入することによってもう一つの遺伝子と組み合わせることもできる。Fasリガンドの発現は、ウイルスベクターおよび／または外来遺伝子が受容ホストによって破壊されるのを保護する免疫保護作用をもたらす。
組換えレトロウイルスは不完全であるため、感染性のベクター粒子を形成するためには補助剤が必要となる。この補助剤は例えば、LTR内にある調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることによって提供することができる。これらのプラスミドは、キャプシドに包むためのRNA転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージシグナルの欠失を伴うヘルパー細胞系には、例えばΨ2、PA317およびPA12が含まれるがこれらに限られるわけではない。これらの細胞系は、パッケージされるゲノムがないため、空のビリオンを生成する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルは完全であるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置換されているような細胞に導入されると、そのベクターはパッケージングされてベクタービリオンが形成する。
また、NIH3T3または他の組織の培養細胞を、レトロウイルスの構造遺伝子であるgag、pol、およびenvをコードするプラスミドを用いて従来のリン酸カルシウム形質転換法によって直接形質転換することができる。次にこれらの細胞を、Fasリガンド遺伝子を含むベクタープラスミドを用いて形質転換する。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
Fasリガンドポリヌクレオチドを標的としたもう一つの輸送系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油型の乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどを含む脂質を基本とする系が含まれる。本発明の好ましいコロイド分散系は、リポソームである。リポソームはインビトロおよびインビボで輸送担体として有用な人工膜小胞である。大きさが0.2〜4.0μmの範囲にある大単層小胞（LUV）が、大きな巨大分子を含有する水性緩衝剤を実質的な割合でカプセル化できることが、示されている。RNA、DNAおよび完全なビリオンを水性の内容物中にカプセル化して、生物学的に活性な形態で細胞に輸送することができる（Fraley et al.（1981）Trends Biochem. Sci. 6: 77参照）。リポソームが効果的な遺伝子運搬体になるためには、次のような特徴が必要である。即ち、（1）生物活性を減らすことなく高い効率でFasリガンドポリヌクレオチドをカプセル化すること、（2）非標的細胞よりも標的細胞に対して好適にかつ実質的に結合すること、（3）高い効率で標的細胞の細胞質に伝達小胞の水性内容物を輸送すること、および（4）遺伝子情報を迅速にそして効果的に発現すること、である（Manninno et al.（1988）Biotechniques 6: 682参照）。
リポソームの組成物は通常、ステロール、特にコレステロールと通常組み合わされたリン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質との組み合わせとなっている。他のリン脂質、または他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特徴はpH、イオン強度、および二価のカチオンの存在に依存している。
リポソームの指向化は、解剖学的な要因および機構的な要因に基づいて分類することができる。解剖学的な分類は、選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいている。指向化は、機構的には、受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的な指向化は、リポソームの自然な性向を利用することによって、洞様毛細血管を含む器官にある細網内系（RES）の細胞に分配することができる。これに対して能動的な標的指向性は、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などの特異的リガンドにそのリポソームを結合することによる、または局所で自然に発生する部位よりも器官および細胞型にうまく指向させるためにリポソームの組成または大きさを変えることによるリポソームの変形が関与している。
本発明は、本明細書において、最も実用的で好ましい実施態様であると認められるものについて示されている。しかしながら本発明の請求の範囲内でそれらの態様から新たな発展がなされるであろうこと、および当業者がこの明細書を参照した上で明らかな修飾をなすことができるであろうことが理解される。
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【図１】
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【図２】
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