(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベースライン点を検出し、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第２ベースライン点を検出し、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項２】
試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベースライン点を検出し、前記ｔｂ２におけるクロマトグラム点を第２ベースライン点とし、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項３】
試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１におけるクロマトグラム点を第１ベースライン点とし、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第２ベースライン点を検出し、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項４】
試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘである）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂｘからｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項５】
試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出終了時間（ｔｂ２）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項６】
前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とし、かつ、変数が小さいほど値の小さくなる又は変数が大きいほど値の小さくなる関数であり、第２演算手段は該関数の値が最も小さくなる点又は大きくなる点をベースライン点とすることを特徴とする請求項１〜５いずれかの装置。
【請求項７】
前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの３以上の値を変数とし、かつ、変数が小さいほど値の小さくなる又は変数が大きいほど値の小さくなる関数であり、第２演算手段は該記関数の値が最も小さくなる点又は大きくなる点をベースライン点とすることを特徴とする請求項１〜５いずれかの装置。
【請求項８】
前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差の値を変数とし、かつ、変数が小さいほど値の小さくなる又は変数が大きいほど値の小さくなる関数であり、第２演算手段は該関数の値が最も小さくなる点又は大きくなる点をベースライン点とすることを特徴とする請求項１〜３いずれかの装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等、被分析物を含む試料をカラム等の分離手段に供して取得されるクロマトグラムを解析する解析装置に関するものであり、更に具体的には、例えば液体クロマトグラフィーによる血液や尿中のカテコールアミンやアミノ酸の分析における、クロマトグラムの解析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、種々の被分析物質を液体クロマトグラフィー等に供してクロマトグラムを得、該クロマトグラム中の被分析物のピークを検出し、その高さ、巾、ピーク面積等を解析し、被分析物の定性、定量を行うことが行われている。
【０００３】
クロマトグラムの解析には、被分析物の溶出ピークを検出した後、検出されたピークを予めその存在を予想した成分と関連付ける方法（以下、第１法という）と、予め測定しようとする被分析物毎にピークが出現する時間（標準ピーク出現時間）を予想しておき、この付近でピークを探す方法（以下、第２法という）がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
第１法では、予め予想した成分のピーク以外に、予想していない未知成分のピークを検出することが可能である。即ち、クロマトグラムの解析に当たり、通常はクロマトグラムの傾き等によりピーク開始点とピーク終了点を検出し、この範囲で最大値を取る点をピークとするが、試料中の成分に由来しないノイズピークをもピークとして検出してしまう恐れがある。また、ベースラインがドリフトしている状態（安定していない状態）ではその傾き等を正確に検知することが困難であるため、ピーク開始点及びピーク終了点を正しく検出できないという課題もある。
【０００５】
これに対して前記第２法には、予め予想した被分析物以外のピークを検出することはできないものの、予想した被分析物のピークは正しく検出できるという利点がある。
【０００６】
しかしながら、正確なクロマトグラム解析を行うには、被分析物のピークを正しく検出すること以外にベースラインを正しく設定する必要がある。
【０００７】
従来のピーク解析では、検出された被分析物のピーク出現時間（ｔｘ）を基準として、その前後一定の時間点でのクロマトグラム値を第１及び第２のベースライン点とし、これらを結ぶ直線をベースラインとしている。一定の時間点としては、例えば被分析物を含む標準試料のクロマトグラムにおいて、被分析物のピーク値が１／２となった時のピーク巾（ピーク半値巾）を一定倍した時間点が使用されている。
【０００８】
このため、例えばベースラインを指定するベースライン点に被分析物質以外の成分ピークやゴーストピーク（例えば液体クロマトグラフィーにおける、試料を導入する際の切り替え弁の動作に由来するピーク）が重なってしまうと、その点でのクロマトグラム値が本来のベースライン値からずれてしまい、例えばピーク高さを求める解析を行う際には、解析の結果、本来の高さとは異なるピーク高さが得られてしまうことになる。被分析物質以外の成分ピークやゴーストピークは、その成分の種類や分析条件、更には室温等の分析環境によって大きさや出現時間が変動するため、これらを避けて正しいベースラインを指定すべく、ベースライン点を予め設定するにしても、分析環境等が変化するたびに設定を変更しなければならないという課題がある。
【０００９】
そこで本発明の目的は、予め測定しようとする被分析物毎にピークが出現する時間（標準ピーク出現時間）を予想する等してピークを検出した後に適用されるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物質以外の成分ピークやゴーストピークがあっても正しいベースラインを設定することが可能な解析装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために成された本願請求項１の発明（以下、第１発明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を用いて第１のベースライン点を検出し、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第２のベースライン点を検出し、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１１】
また本願請求項２の発明（以下、第２発明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベースライン点を検出し、前記ｔｂ２におけるクロマトグラム点を第２ベースライン点とし、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１２】
また本願請求項３の発明（以下、第３発明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１におけるクロマトグラム点を第１ベースライン点とし、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第２ベースライン点を検出し、これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１３】
また本願請求項４の発明（以下、第４発明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘである）を検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂｘからｔｘの間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１４】
そして本願請求項５の発明（以下、第５発明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出終了時間（ｔｂ２）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、ここでｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そして、ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の解析装置は、試料中の被分析物を分離・展開した後に検出を行う、いわゆるクロマトグラフィーにおけるクロマトグラム解析に使用することができる。クロマトグラフィーは、分離・展開の原理によって種々の液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーが存在するが、解析対象となるクロマトグラムはいかなるクロマトグラフィーにより得られたものであっても良い。例えば電気泳動結果を適当な染色試薬で染色後、光学測定装置でスキャンニングする等した場合でも、その解析に本発明を使用することができる。
【００１６】
クロマトグラムは、本発明の装置による解析に先立ち、例えば単純移動平均、多項式フィッティング、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスムージング処理を行ったり、単純スパイク除去処理、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるノイズ除去処理を行っておくことが好ましい。これらの処理を行うことにより、ノイズを除去しておけば、クロマトグラムにおける被分析物ピークの最高値や最低値がノイズの影響を受けにくくなり、より信頼性の高い解析結果を得ることができる。
【００１７】
単純移動平均はＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｘｉ）／ｍで表され（Ｓｕｍは連続するデータＸｉを加算する関数であり、ｍは加算するデータの数である）、多項式フィッティングはＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｋｉ×Ｘｉ）／Ｓｕｍ（Ｋｉ）で表され（Ｓｕｍ及びＸｉは前記同様であり、Ｋｉは例えばＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法により、データを２次式又は３次式にフィッティングするように決定される係数である）、フーリエ変換はデータをフーリエ変換して周波数軸で高周波成分をカットするウィンドウ関数をかけ、逆フーリエ変換で時間軸に戻すことをいい、ウェーブレット変換は例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６９巻、１号、１９９７年、第７８〜９０頁に記載された処理であり、単純スパイク除去処理としてはメディアン法（Ｙ＝Ｍｅｄｉａｎ（Ｘｉ）で表される、連続する３ないし５のデータの中心を取る方法）等が例示できる。
【００１８】
なお本発明において第２演算手段で第１のベースライン点及び第２のベースライン点を検出するに当たり、単純移動平均処理等を行ってスムージングをした後にこれら点を計算することは、これら点を計算するに当たり、任意時点のクロマトグラムの値としてその前後の値を平均した値を用いてこれら点を計算することと同価となる。
【００１９】
本発明の解析装置は、クロマトグラムについて初期的な解析が行われ、クロマトグラム中のピークを被分析物のピークと同定した後にベースライン設定等を行うための装置である。しかしながら、本発明の装置に被分析物のピークを検出するための手段を追加することに制限はない。
【００２０】
被分析物のピークを検出するための第１演算手段としては、従来のピーク検出手段等を用いることができるが、以下のような構成をも一例として例示することができる。まず、適当な記憶手段に被分析物のピークを検出するためのピーク検出開始時間（ｔｐ１）やピーク検出終了時間（ｔｐ２）等を記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することが可能であり、例えばキーボード等の入力装置を用いてこれらを入力し、記憶させれば良い。この記憶のため、第１演算手段に別途記憶手段を併設するか、又は、本発明の第１又は第２記憶手段を兼用に配置しても良い。第１演算手段は例えばコンピュータ等で構成することができるが、後述する第２演算手段と兼用としても良い。
【００２１】
ｔｐ１とｔｐ２は、クロマトグラムにおいて解析しようとする被分析物のピークを検出するためのものであり、被分析物の種類毎に設定される。これらの値はｔｐ１＜ｔｐ２の関係を満たすが、例えば、被分析物のみを含む標準試料をクロマトグラフィーに供してクロマトグラムを得、このクロマトグラムから被分析物の標準出現時間（ｔｓ）を求め、ｔｐ１＜ｔｓ＜ｔｐ２と設定することが例示できる。より具体的にｔｐ１及びｔｐ２は、使用するクロマトグラフィーの分離の様式、移動相等の速度、分析を行う室温等の分析環境等におけるｔｓと、該環境が変動した場合にｔｓが変動する時間巾を勘案し、適宜設定すれば良い。即ち、ｔｐ１＜ｔｘ＜ｔｐ２とするのである。なお関係を満たすようにｔｐ１及びｔｐ２を設定するために、ｔｓとｔｘの差を求め、ｔｓに基づいて設定したｔｐ１及びｔｐ２の設定をこの差に基づいて変更する等しても良い。
【００２２】
ｔｐ１及びｔｐ２については、被分析物以外の成分が含まれていることが予想される場合にはｔｐ２−ｔｐ１が小さくなるように設定し、被分析物以外の成分の存在が予想されない場合にはｔｐ２−ｔｐ１が大きくなるように設定することが好ましいが、一般的にｔｐ２−ｔｐ１は被分析物を含む標準試料のクロマトグラムにおけるピークの高さが１／２となる時のピーク巾（ピーク半値巾）の１倍程度〜２倍程度となるように設定することが例示できる。ただし、必ずしもｔｓ−ｔｐ１＝ｔｐ２−ｔｓとする必要はない。そしてｔｐ１〜ｔｐ２までの範囲内で、最高値を有するクロマトグラム点を被分析物のピークとする等すれば良い。本発明の第１記憶手段は、第１〜第５発明の態様に応じて、前記のようにして検出された被分析物のピークについて、その分析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）及びベースライン検出終了時間（ｔｂ２）等を記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することが可能である。
【００２３】
第１〜第３発明において第１記憶手段が記憶するベースライン検出開始時間  （ｔｂ１）とベースライン検出終了時間（ｔｂ２）は、ベースラインを設定するベースライン点を検出するためのものである。ｔｂ１とｔｂ２は、ｔｂ１＜ｔｂ２との関係を満たすが、被分析物のピーク出現時間（ｔｘ）との関係ではｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２の関係をも満たすように設定する。一般的にｔｂ２−ｔｂ１は被分析物のピーク高さが１／２となるときのピーク巾（ピーク半値巾）の２倍〜６倍程度とすることが例示できる。またここで、必ずしもｔｘ−ｔｂ１＝ｔｂ２−ｔｘとする必要はない。なお、本発明の解析装置において、ベースラインを設定するまではピーク高さやピーク巾を得ることはできないがピーク巾の概略値を求めれば十分であるため、ピーク巾の初期値として例えば被分析物のみを含む標準試料を予め分析し、得られたクロマトグラムについて大まかに設定したベースラインに基づきピーク巾を求め、この値を第１記憶手段に入力して第２演算手段に伝えるようにすれば良い。そして本発明の解析装置における第２演算手段でベースラインを設定した後は、該ベースラインに基づき決定されたピーク巾を第１記憶手段にフィードバックしても良い。ｔｂ１及びｔｂ２は、各被分析物のピークに対して異なる値を設定するが、ｔｂ１からｔｂ２の巾、即ちｔｂ２−ｔｂ１は、全て同一であっても、ピーク毎に異なっていても良い。またｔｂ１及びｔｂ２は、ｔｓの値に基づいて予め設定しておいても良い。更に、ｔｓ−ｔｂ１とｔｂ２−ｔｓは等しくても異なっていても良い。
【００２４】
一方、例えばｔｓと実際の被分析物の出現時間ｔｘに差が生じた場合には、該差によりｔｂ１、ｔｂ２を補正するように構成しても良い。また、標準試料では既知量の被分析物が含まれるのに対し、試料には未知量の被分析物が含まれるため、標準試料として予想される量の被分析物を含むものを使用してピーク半値巾を求めることが好ましい。
【００２５】
本発明者の知見によれば、ベースライン点の設定において夾雑物のピークやゴーストピークによる妨害がないと予想される場合、ｔｂ１とｔｂ２としては、共にｔｘから被分析物のピーク高さが１／２となるときのピーク巾分離れた時点を設定できるが、２倍分又は３倍分離れた時点を設定することもできる。またベースライン点の設定において夾雑物のピークやゴーストピークによる妨害があると予想される場合、ｔｂ１とｔｂ２としては、共にｔｘから被分析物のピーク高さが１／２となるときのピーク巾の３倍分離れた時点を設定することが好ましい。第２記憶手段は、解析するクロマトグラムを記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成でき、例えば液体クロマトグラフィーにおける検出装置からの検出信号を経時的に記憶できれば良い。第２記憶手段は前記第１記憶手段と一体に構成することもできる。なお、該経時的記憶は連続的なものであっても良いし、例えば１秒毎等の、間欠的なものであっても良い。間欠的にクロマトグラムを記憶する場合には、可能な限り短い時間間隔で値を記憶することが好ましい。なお、時間は、例えば分離カラム等の分離手段に試料を供した時間を０（ゼロ）として計算しても良いし、例えばクロマトグラフィーに試料を供してから所定時間経過後にクロマトグラムの経時的記憶を開始する場合には、該開始時間を０（ゼロ）として計算しても良い。電気泳動の結果をスキャンする場合には、移動距離を時間に置き換えて考えれば良い。
【００２６】
第２演算手段では、以上のように設定したｔｂ１とｔｘの間、及び、ｔｘとｔｂ２の間で、クロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いてそれぞれ第１ベースライン点、第２ベースライン点を設定し、これらを結ぶ直線をベースラインとして設定する。該手段としては、コンピュータ等を例示することができる。
【００２７】
前記関数は、詳しくは、クロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とし、それらの値又はそれらの値の絶対値の和を表す関数や、それぞれの値の和と積を組み合わせる関数が例示できる。クロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの３以上の値を変数とする関数ではゴーストピーク等を避けた位置にベースライン点を決定するために好ましく、これら全てを変数とする関数は特に好ましい。
【００２８】
特に好ましいクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差の全てを変数とする関数として、より具体的に以下のような関数が例示できる。
【００２９】
例えば、関数＝（クロマトグラム点の高さ）＋ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）＋ｂ×（クロマトグラムの曲率の絶対値）＋ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／  （ｔｂ１−ｔｘ））の４乗）で表される関数。また例えば、関数＝（クロマトグラム点の高さ）×（１＋ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値））×（１＋ｂ×（クロマトグラムの曲率の絶対値））×（１＋ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ））の４乗）で表される関数。
【００３０】
前記式において、クロマトグラムの傾きは任意の点におけるクロマトグラム値の一次微分の値であり、クロマトグラムの曲率は任意の点におけるクロマトグラム値の二次微分の値である。またａ〜ｃは係数であり、正又はゼロの数となる。ここで変数を２又は３とする場合には、各２又は１の係数がゼロとすれば良い。係数ｃを含む項は、ｔｘ−ｔｂ１とｔｂ２−ｔｘが異なる場合には、ｃ×（（  （ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２―ｔｘ））の４乗）とし、ｔ＞ｔｘでｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２−ｔｘ））の４乗）としても良い。係数ｃを含む項は、ｔｘ−ｔｂ１とｔｂ２−ｔｘが異なる場合には、ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２−ｔｘ））の４乗）としても良い。また、ｔ＜ｔｘでｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ−ｔｘ））の４乗）とし、ｔ＞ｔｘでｃ（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２−ｔｘ））の４乗）としても良い。
【００３１】
前記式における係数の値は、被分析物のピークや予想されるゴーストピークの出現時間、高さ、巾等の値に応じて適宜決定することができる。また、予想される夾雑物のピーク出現時間、高さ、巾等の値や、クロマトグラフィーを実施する温度条件、溶離液組成に応じて被分析物のピークと夾雑物のピークの出現する位置関係が変化すること等を考慮し、適宜決定することができる。これらに加え、ｔｂ１やｔｂ２の設定の仕方、更には被分析物のピークの高さ等に応じて適宜決定することができる。
【００３２】
前記した関数における係数は、例えば本発明の装置を用いて解析するクロマトグラムが被分析物のピークが夾雑物を含むことが予想される通常の試料のクロマトグラムであるか、又は、夾雑物を含まない標準試料のクロマトグラムであるかに応じて変更できる。即ち、標準試料及び試料のクロマトグラムを解析するに当たり、同一の係数を使用することも可能であるが、異なる係数を使用することもできる。特に、標準試料では既知量の被分析物のみを含み夾雑物を含まないのでゴーストピークの存在だけを考慮して係数を決定すれば良く、係数の値を広い範囲で変化させてもベースライン点はほとんど同一となる。一方、通常の試料では、未知量の被分析物を含むため、ピーク高さ等が大きく変わったり、又は夾雑物に由来するピークが出現するため、正しいベースライン点を検出するためにはこれらで使用する関数の係数を適切な値に設定する必要がある。
【００３３】
上記のうち、クロマトグラム点の高さを変数として用れば、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で最低点に近いクロマトグラム点をベースライン点として検出できる。またクロマトグラムの傾きを変数として用いれば、ピークの斜面ではなくクロマトグラムが水平に近い部分をベースライン点として検出できる。またクロマトグラムの曲率を変数として用いれば、負のゴーストピークの頂点をベースライン点として検出しないようにすることができる。そしてｔｘとの差を変数として用いれば、ピークにできるだけ近い点をベースライン点として検出することができる。従ってこれら変数を２以上、好ましくは３以上、そして特に好ましくは全て使用することで、被分析物の定量等を最も正確に行い得るベースラインを設定するためのベースライン点を検出することが可能となる。
【００３４】
即ち、これら変数を組み合わせることにより、基本的には高さが最も低い点をベースライン点として検出するが、該点が傾斜面に存在するときや負のゴーストピークの頂点に位置するときはこれを無視し、むしろ高さは最低ではないが、より平らな部分をベースライン点として検出するようなことが可能となるのである。また更には、被分析物のピークの裾部分が他の被分析物や夾雑物のピークの裾部分と重複していることが予想される場合にｔｘ−ｔｂ１及びｔｂ２−ｔｘが大きくなるように設定しても、実際にはピークの裾部分の重複が存在しなければ被分析物のピーク出現時間ｔｘ付近にベースライン点を設定することが可能となり、ベースラインドリフト等の影響を排除することも可能になる。
【００３５】
このようにしてクロマトグラムにおけるｔｂ１〜ｔｘ、ｔｘ〜ｔｂ２の値を関数に代入し、各範囲内で関数の値が最も小さくなる点を各第１ベースライン点、第２ベースライン点とする。その後、両点を結ぶ直線をベースラインとして設定するのである。ベースラインが設定された後は、例えば被分析物のピーク高さやピーク面積、ピーク半値巾等を算出し、被分析物の定量等を行うことになるが、本発明においては第２演算手段を当該算出手段と兼用に構成することもできる。第２発明又は第３発明においては、ｔｂ１〜ｔｘの間又はｔｘ〜ｔｂ２の間で前記のようにして第１又は第２ベースライン点を検出する一方、もうひとつのベースライン点としては、ｔｂ２又はｔｂ１におけるクロマトグラム点を用いる。第４発明又は第５発明においては、第２演算手段において、それぞれ、上記した第１発明におけるベースライン検出開始時間（ｔｂ１）又はベースライン検出終了時間（ｔｂ２）のみを使用してベースライン点を１点のみ検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインとして設定する。
【００３６】
第４発明及び第５発明においても、ｔｂ１又はｔｂ２の設定は同様である。第１〜第３発明は、被分析物の前後に他の被分析物や夾雑物のピークが出現する場合に特に効果的であり、第４発明は、被分析物のピークの後に他の被分析物ピークや夾雑物のピークが複数個連なって存在する場合やベースラインが変動する場合に特に効果的であり、第５発明は被分析物のピーク前に他の被分析物ピークや夾雑物のピークが複数個連なって存在する場合やベースラインが変動するする場合に特に効果的である。従って本発明の解析装置は、解析するクロマトグラムにおける被分析物ピークの前後に出現するピークの有無により、第１〜第５発明を適宜選択して適用することが特に好ましい。この目的を達成するため、例えば、コンピュータと記憶装置で本発明の装置を構成し、第１〜第５発明の全ての機能をカバーするようにしておき、必要に応じていずれかの態様を選択のうえ、クロマトグラム解析を行うことが例示できる。
【００３７】
本発明の解析装置においては、これまでに説明した各手段に加え、例えば解析結果を表示したり印刷する出力手段や、被分析物のピークを検出できなかった場合に警告を発生する手段等を装備することができる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
図１は、本発明を液体クロマトグラフィー用のクロマトグラム解析装置に適用した一例を示すものである。図中、１は分離カラム、２は検出器を示し、送液ポンプや試料導入装置等のその他のクロマトグラフィー装置は省略した。
【００４０】
図中、点線で囲った部分が本発明の解析装置であり、一台のコンピュータにより本発明の各手段を構成した。図中、３は第１記憶手段、４は第２記憶手段、５は第１演算手段、６は第２演算手段をそれぞれ示す。第１記憶手段３はキーボード７からの入力を記憶し、第２記憶手段４は検出器２からの出力（クロマトグラム）を記憶し、第１演算手段５は第１及び第２の記憶手段と連絡され、そして第２演算演算手段は第１演算手段と連絡されている。また第２演算手段６は、クロマトグラム解析結果をプリンタ８に出力する。
【００４１】
図２は、以下の実施例で用いた液体クロマトグラム装置の構成の概略を示すものである。該装置は、溶離液ポンプ９ａ、９ｂ、試薬ポンプ１０ａ、１０ｂ、オートサンプラ１１、２本の前処理カラム１２及び１３と１本の分析カラム１４、リアクタ１５、そして蛍光検出器１６から構成され、さらに溶離液を切り替えるバルブや流路を切り替えるバルブを有するものである。図１に示した本発明の解析用装置は、検出器１６と連結される。
【００４２】
図３〜図７は、液体クロマトグラフィーで得られたカテコールアミンの成分であるノルエピネフリン（ＮｏｒＥｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；ＮＥ）、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；Ｅ）及びドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ；ＤＡ）のクロマトグラムについて第１演算手段によりピーク検出を行った結果を示す結果である。分析に供した試料は、カテコールアミン成分であるＮＥ、Ｅ及びＤＡを各１ｐｇ／ｍｌ含む標準試料であり、これを室温（２４．６℃）条件下で測定したものである。ピーク出現時間が約１６分のピークがＮＥ、約１８．５分のピークがＥ、そして約２５．５分のピークがＤＡである。液体クロマトグラフィー装置としては、前処理カラムとして２本のカラム（第１の前処理カラム１２は直径４．６ｍｍ×７５ｍｍの逆相（エーテルゲル）カラム、第２の前処理カラム１３は直径３．０ｍｍ×６０ｍｍのイオン交換カラム）、分離カラム１４として逆相（ＯＤＳ）用カラム（直径４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を配置した装置を用いた。この装置では、ポンプ９ａで溶離液（リン酸緩衝液（ｐＨ７））で試料を第１の前処理用カラムに送液し（１．０ｍｌ／分）、第１の前処理用カラムに保持された成分に対して、電磁弁を切り替えることによりポンプ９ａで溶離液（硝酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの混合液）を送液して第２の前処理用カラムに導入し、そして第２の前処理用カラムに保持された成分に対して、ポンプ９ｂで溶離液（硝酸アンモニウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７））を分析カラムに送液して分離し（０．７ｍｌ／分）、分析カラムから溶出する成分に蛍光反応試薬を混合した後にリアクタ１５に導入した。リアクタで蛍光反応試薬であるＤＰＥ  （Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）と９０℃、３分間反応させて蛍光誘導体化した。蛍光反応試薬はポンプ１０ａと１０ｂ（各０．２５ｍｌ／分）を用いて送液した。蛍光誘導体化した各被分析物は、蛍光検出器を用いて励起波長３４０〜３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定し、クロマトグラムを得た。
【００４３】
図３〜図７は、従来の解析方法でベースライン点を設定した図（図３、６）及び本発明の解析装置でベースライン点を設定した図（図４、５、７）である。図中、ＮＥの前の負のピークとＥとＤＡの間の負のピーク（図中矢印を付す）は、装置の切り替えバルブを切り替えた際に発生したゴーストピークである。
【００４４】
図中Ｐは、第１演算手段により検出されたＮＥのピークであり、ｔｂ１及びｔｂ２はＮＥのピークについてベースラインを設定するために第１記憶手段に記憶されたベースライン検出開始時間及びベースライン検出終了時間、そしてＢは検出されたベースライン点をそれぞれ示す。
【００４５】
図３は、ｔｘからピーク半値巾の５倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として、ベースライン点を検出した結果を示す図である。本例では、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で最も低いクロマトグラム点を検出し、これらをそれぞれ第１ベースライン点、第２ベースライン点とした。
【００４６】
この例では、負のゴーストピークの影響を受けて検出された第１ベースライン点がゴーストピークの斜面上に設定されてしまった。この結果、ＮＥのピーク面積やピーク高さ等が僅かではあるが不正確となった。
【００４７】
図４は、本発明の第１発明の解析装置によりベースライン点を検出した例を示す図である。第２記憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示したものと同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の５倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段に記憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検出には、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ）の４乗））という関数を用い、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で該関数が最低値となるクロマトグラム点を第１及び第２ベースライン点として検出した。
【００４８】
なお、前記関数における係数ｃは、検出下限濃度のピーク高さと同じオーダの値になるように決定した。
【００４９】
この例では、検出されたベースライン点はＮＥのピーク近くにあり、図３に示した例のように負のゴーストピークの影響を受けて第１ベースライン点がゴーストピークの斜面上に検出されることはなかった。
【００５０】
図５は、本発明の第１発明の解析装置によりベースライン点を検出した他の例を示す図である。第２記憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示したものと同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の５倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段に記憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検出には、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）という関数を用い、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で該関数が最低値となるクロマトグラム点を第１及び第２ベースライン点として検出した。
【００５１】
なお、前記関数における係数ａは、ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）の値が、クロマトグラムのピーク以外で最大傾きを持つ点で引いた接線の３０秒あたりの変化量にほぼ等しくなるように決定した。
【００５２】
この例でも、検出されたベースライン点はＮＥのピーク近くにあり、図３に示した例のように負のゴーストピークの影響を受けて第１ベースライン点がゴーストピークの斜面上に検出されることはなかった。
【００５３】
図６は、図３に示したクロマトグラムについてｔｘからピーク半値巾の６倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２としてベースライン点を検出した結果を示す図である。本例では、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で最も低いクロマトグラム点を検出し、これらをそれぞれ第１ベースライン点、第２ベースライン点とした。この例では、負のゴーストピークの影響を受けて検出された第１ベースライン点がゴーストピークの頂点に検出されてしまった。この結果、ＮＥのピーク面積やピーク高さ等が僅かではあるが不正確となった。
【００５４】
図７は、本発明の第１発明の解析装置によりベースライン点を検出した例を示す図である。第２記憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示したものと同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の６倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段に記憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検出には、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）＋ｂ×（クロマトグラムの曲率の絶対値）＋ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ））の４乗））という関数を用い、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で該関数が最低値となるクロマトグラム点を第１及び第２ベースライン点として検出した。
【００５５】
なお、前記関数における係数ａは、ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）の値がクロマトグラムのピーク以外で最大傾きを持つ点で引いた接線の３０秒あたりの変化量にほぼ等しくなるように、ｂは、ｂ×（クロマトグラムの曲率の絶対値）がゴーストピークの頂点付近を２次曲線で近似した時に頂点から１０秒離れた点での２次曲線の変化量に等しくなるように、係数ｃは、検出下限濃度のピーク高さと同じオーダの値になるように決定した（ただしｃは、図４における係数ｃの１／２とした）。
【００５６】
本例では、ｔｂ１〜ｔｘの間に負のゴーストピークが存在するにもかかわらず、図６に示した例のように負のゴーストピークの影響を受けて第１ベースライン点がゴーストピークの頂点に検出されることはなかった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー、更には電気泳動等の結果得られるクロマトグラムを解析する際に、被分析物のピークの前及び／又は後ろに夾雑物のピークやゴーストピークが出現しても、より的確なベースラインを設定することが可能となる。この結果、夾雑物ピークやゴーストピークによる影響を排除して、より正確に被分析物のピーク高さやピーク面積等を求めることができる。
【００５８】
特に、被分析物のピークの近くに負のゴーストピークが存在し、その位置が温度等の条件によって変化する場合には、従来は、クロマトグラムから実施者が経験的に判断してその影響を排除し得るようにベースラインを設定していたが、本発明により、自動的に負のゴーストピークの影響をも排除できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の解析装置の概略を示すための図である。
【図２】図２は、実施例で使用した液体クロマトグラフィー装置の概要を示す図である
。
【図３】図３は、カテコールアミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについてベースライン点を検出した様子を示す図である。
【図４】図４は、本発明の解析装置を用いてカテコールアミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについてベースライン点を検出した様子を示す図である。
【図５】図５は、本発明の解析装置を用いてカテコールアミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについてベースライン点を検出した他の様子を示す図である。
【図６】図６は、カテコールアミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについてベースライン点を検出した様子を示す図である。
【図７】図７は、本発明の解析装置を用いてカテコールアミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについてベースライン点を検出した他の様子を示す図である。
【符号の説明】
１  分離カラム、２  検出器、３  第１記憶手段、４  第２記憶手段、５  第１演算手段、６  第２演算手段、７  入力手段、８  出力手段、９ａ、９ｂ  溶離液ポンプ、１０ａ、１０ｂ  試薬ポンプ、１１  オートサンプラ、１２、１３前処理カラム、１４  分析カラム、１５  リアクタ、１６  検出器
【図１】
0003911866.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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