(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
比表面積が１グラム当たり０．１平方メートル以上であり、水不溶性担体に窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下である第４級アンモニウム基を結合してなることを特徴とする分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項２】
水不溶性担体がポリスルホン系重合体である請求項１記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項３】
水不溶性重合体がポリ（芳香族ビニル化合物）である請求項１記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項４】
窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下である第４級アンモニウム基を結合した水不溶性重合体を膜、繊維、粒状物またはこれらの組み立て品に成型した請求項１〜３のいずれかに記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項５】
窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下である第４級アンモニウム基を結合した水不溶性重合体を、膜、繊維、粒状物のいずれかの表面に被覆せしめた請求項１〜３のいずれかに記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項６】
血液中において分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに対する吸着能が吸着材１グラムあたり３４０ミリグラム以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材を充填した体外循環カラム。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の分子量が２５０００程度のトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータに他の蛋白質が結合したトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータの吸着材を充填した癌治療用体外循環カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中に過剰に存在すれば免疫の大幅な低下を招き、癌の形成が促進される免疫抑制性蛋白質である分子量が２５０００程度のＴＧＦβに他の蛋白質が結合したＴＧＦβを除去するための吸着材および体外循環カラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学の発達した今日でも、依然として日本人の主な死亡原因の一つが癌である。その原因は患者には手術で取りきれない癌細胞が存在するためであり、その除去のため抗癌剤治療や放射線治療が行われてきた。しかし、これらは正常細胞をも傷害するため患者の生命を維持しつつ癌細胞を完全に除去することができない。一方、最近、患者の免疫力を高めて、患者自身の白血球で癌を排除しようとする細胞療法が盛んに試みられる様になった。最も有望なものとして、患者の樹状細胞を体外で癌抗原刺激した後、患者に戻し、癌特異的キラー細胞（ＣＴＬ）を誘導して治療しようとする樹状細胞輸注療法がある。しかし、健康な動物の血液からはＣＴＬを誘導できても癌末期の担癌動物からは誘導できないことが多い。また、動物実験では好成績を得ても臨床では目に見えた効果が出ないことが殆どである。この理由として患者の血中には免疫を抑制する物質が存在するためと考えられる。その免疫抑制物質の代表的なものがトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータ（ＴＧＦβ）や免疫抑制酸性蛋白である。この物質がＣＴＬの誘導や機能発現を阻害していると考えられる。ＴＧＦβは、健康な人の血液中にも存在する蛋白質で免疫作用を調整する重要な物質であるが、癌の進行に伴って異常に増え、癌細胞の増殖を助けていると考えられる。ＴＧＦβは単独では分子量２５０００程度の蛋白質であるが、血中では他の蛋白質と結合して１０万前後の分子量で存在するため、従来の吸着材では吸着除去が困難な物質である。従って、癌患者の血液中から異常に増えたＴＧＦβを効率よく除去できる吸着材は知られていない。また、免疫抑制酸性蛋白は分子量５万程度の蛋白質で、癌の悪性度のマーカーとして臨床で利用されているが、免疫を抑制すると言われている。活性炭カラムでの除去も試みられたが、吸着能力が不十分だったためか治療効果が明確でなかった。また、活性炭は粉が出やすいので、直接、血液と接触する用途には向かない。これら免疫抑制物質の除去には、理論上、血漿交換も有効であるが、感染の危険が避けがたい本質的な欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑み、一般的に普及可能であり、体液中から、直接、血液中において分子量が２５０００程度のＴＧＦβに他の蛋白質が結合したＴＧＦβを高い効率で選択的に吸着し、かつ、安全に体外循環できる、血液中において分子量が２５０００程度のＴＧＦβに他の蛋白質が結合したＴＧＦβの吸着材を提供し、ひいては癌の治療に役立てることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、比表面積が１グラム当たり０．１平方メートル以上であり、不溶性担体に親水性アミン残基を結合してなる、血液中において分子量が２５０００程度のＴＧＦβに他の蛋白質が結合したＴＧＦβを吸着することを特徴とする免疫抑制性蛋白質の吸着材である。
【０００５】
また本発明は、上記の吸着材を充填した体外循環カラムである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
続いて、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】
本発明で用いる水不溶性担体としては、水に不溶で、親水性アミンを固定化できるものであれば良く、特に制限はない。
水不溶性担体の具体例としてはポリスチレンで代表されるポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）や−｛（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｃ（ＣＨ3）2−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−ＳＯ2 −（ｐ−Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−｝n−（以下ユーデルポリスルホンと略記する）などで代表されるポリスルホン系重合体、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイドなどで、かつ、親水性アミンを固定化できるものがあげられる。親水性アミンを固定化するための反応性官能基としては、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基、ハロゲン化アルキル基などの活性ハロゲン基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基、酸無水物基などをあげることができるが、とりわけ、活性ハロゲン基、中でも、ハロアセチル基は、製造が容易な上に、反応性が適度に高く、親水性アミンの固定化反応が温和な条件で遂行できると共に、この際生じる共有結合が化学的に安定なので好ましい。さらに具体的な例としては、クロルアセトアミドメチルポリスチレン、クロルアセトアミドメチル化したユーデル・ポリスルホン、クロルアセトアミドメチル化したポリエーテルイミドなどがあげられる。さらに、これらのポリマーは有機溶媒に対し可溶であると、成型しやすい利点がある。
【０００８】
本発明で言う親水性アミン残基とは、単独では水に溶解もしくは水を溶解するアミンがポリマーに化学的に結合した状態のものを意味する。さらに、親水性アミン残基の親水性アミンとしては、炭素数で言うと、窒素原子１個当たり炭素数１８以下であるものがこれに相当する。
【０００９】
さらに、親水性アミンの中でも、窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下、とりわけ、４以上１４以下のアルキル基を持つ第３級アミンから得られる第４アンモニウム基を結合したものが優れている。そのような第３級アミンの具体例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルヘキシルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルオクチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−エチル−ヘキシルアミンなどがあげられる。さらに、親水性アミンを構成するアルキル基が親水性基である水酸基やエーテル基を含むもの、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−ヒドロキシヘキシルアミンやＮ，Ｎ−ジメチル−４−メトキシブチルアミン等も親水性アミンとして好ましく用いうる。
【００１０】
本発明における親水性アミン残基の結合の密度は、水不溶性重合体の化学構造および用途により異なるが、少なすぎるとその機能が発現しない傾向にあり、一方、多すぎると、固定化後の重合体の物理的強度が悪くなり、吸着材としての機能も下がる傾向にあるので、該密度は水不溶性重合体の繰り返し単位あたり０．０１〜２．０モル、より好ましくは０．１〜１．０モルが良い。
【００１１】
本発明の吸着材の表面積は吸着材１グラム当たり０．１平方メートル以上であることが重要であり、より好ましくは、１平方メートル以上である。ただし無限に大きくはできないので、実際上、限界があり、１００平方メートル以下が好ましい。この表面積は窒素ガス吸着法（ＢＥＴ法）で求めることができる。
【００１２】
本発明の吸着材は、親水性アミン残基を結合した水不溶性重合体を膜、繊維、粒状物またはこれらの組み立て品に成型するか、あるいは親水性アミン残基を結合した水不溶性重合体を、膜、繊維、粒状物のいずれかの基材に被覆せしめるか、あるいは水不溶性重合体の膜、繊維等の成型品に親水性アミンを結合させるか等により得ることができる。
【００１３】
親水性アミン残基を結合した水不溶性担体の成型品の製造には、水不溶性重合体の成型品に親水性アミンの溶液を接触させる不均一系反応の方法と水不溶性重合体の溶液と親水性アミンの溶液を混合して反応させた後、成型する均一系反応の方法とがある。不均一系反応の方法の一例としては、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンの繊維または中空糸などの成型品をジメチルヘキシルアミンやポリアルキレンイミン等のイソプロパノール溶液中に浸し、０〜１００℃の温度で反応させることにより、容易に達成される。均一系反応による方法の一例を述べると、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンの溶液中に対応したポリアミンを加えて、０〜１００℃の温度で反応させることにより、達成される。その量には特に制限はないが、可溶性のポリマーを得るためにはハロアセトアミドメチル基に対し１倍モル以上用いるのが望ましい。とりわけ、ポリアミンの場合は、可溶性の重合体を得るためには親水性アミンを大過剰用いるのが好ましい。
【００１４】
また、反応溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの極性の高い溶媒の方が反応が速く進む利点がある。不均一系反応では、親水性アミンが溶ける溶媒であれば良く、特に制限はない。均一系で反応させる場合には、水不溶性担体と親水性アミンの両方が溶解する溶媒、具体的にはテトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどが好ましく用いらる。また、成型品を表面処理する方法も可能で、そのためには水、メタノール、エタノールなどの、ポリスルホンを溶かさずに親水性アミンを溶かす溶媒が好ましく用いられる。
【００１５】
本発明の吸着材ポリマーをポリエステル繊維、ナイロン繊維、ポリフェニレンサルファイド繊維などの成型品の表面にコーティングすると、簡単且つ安価に表面積の大きな高次の成型品が得られる利点がある。コーティングは、本発明の吸着材を塩化メチレンやテトラヒドロフランなどの低沸点溶媒に溶かしたものにナイロンの編み地や織物を浸したのち、溶媒を蒸発することにより容易に達成できる。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶かしたものを水などのポリマーの貧溶媒に入れる湿式コーティング法も利用できる。コーティングされる成型品のポリマーはポリアミド、ポリウレタン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステルなど、本発明吸着材ポリマーとの接着性の良いものであれば何でも良く、その種類には特に制限はないが、ナイロン、ポリエーテルイミドなどのアミド系のポリマーが接着性が特に良いので、好ましく用いられる。
【００１６】
上記の成型や基材への被覆において、成型品や基材の形態に採用する繊維として、中空糸を用いることも好ましい。この場合、濾過の機能を具備した吸着材が作れるので、人工透析器として、あるいは、血漿分離器として使用しながら免疫抑制物質を除去できる利点がある。
【００１７】
本発明の吸着材は血液中の分子量が２５０００程度のＴＧＦβに他の蛋白質が結合したＴＧＦβの除去の目的で、カラムに詰めた状態で、癌等の病気の体外循環治療に用いられる。本カラム作製は、綿状、筒編み状、フェルト状の本発明吸着材を、空隙容積が２００ｍＬ程度以下になるようにして、適度の大きさの円筒形のカラムに詰めることで達成できる。また、本発明吸着材は輸血用血液、血清、血漿からの免疫抑制性蛋白質の除去の目的にも用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１９】
なお、本実施例中の評価方法は、以下に従った。
１．血液中の成分の分析
ＴＧＦβ１濃度はゼンザイム・テクネ社のヒトＴＧＦ−β１免疫分析キットを使用して求めた。また免疫抑制酸性蛋白の濃度は、三光純薬社製のラットＩＡＰプレートを使用して求めた。アルブミン濃度はアルブミン分析キットであるアルブミンＢ−テストワコーで求めた。
【００２０】
（水不溶性担体）
３６島の海島複合繊維であって、島が更に芯鞘複合によりなるものを次の成分を用いて、紡糸速度８００ｍ／分、延伸倍率３倍の製糸条件で得た。
島の芯成分；ポリプロピレン
島の鞘成分；ポリスチレン９０％、ポリプロピレン１０％
海成分；５−ナトリウムスルホイソフタル酸を３％共重合したポリエチレンテレフタレート
複合比率；芯：鞘：海＝４０：４０：２０。
この海成分を熱苛性ソーダ水溶液で溶解し、芯鞘型のポリプロピレン補強ポリスチレン繊維として、直径４μｍの原糸１を得た。
【００２１】
また、吐出量や延伸倍率を適宜変更し、同様にして直径１０μｍの原糸２、直径５０μｍの原糸３を得た。
【００２２】
（中間体）
ニトロベンゼン６００ｍＬと硫酸３９０ｍＬの混合溶液にパラホルムアルデヒド３ｇを２０℃で溶解した後、０℃に冷却し、７５．９ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、５℃以下で溶解した。これに１０ｇの上記で調製した原糸１を浸し、室温で２時間静置した。その後、繊維を取りだし、大過剰の冷メタノール中に入れ、洗浄した。繊維をメタノールで良く洗った後、水洗し、乾燥して、１５．０ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン繊維（中間体１）を得た。中間体１は比較例１としても用いた。また、１０ｇの原糸２および１０ｇの原糸３を同様に処理して、中間体２（収量１４．４ｇ）および中間体３（収量１２．５ｇ）を得た。
【００２３】
（親水性アミンの不均一系反応による固定）
Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン５０ｇとヨウ化カリウム８ｇを３６０ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液に５ｇの中間体１を浸し、８５℃のバス中で３時間加熱した。繊維を１モル／Ｌ濃度の食塩水に浸漬した後、水洗し、真空乾燥して、７．３ｇのジメチルヘキシルアンモニウム化繊維（実施例１）を得た。
【００２４】
また、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアミン５０ｇとヨウ化カリウム８ｇを３６０ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液に５ｇの中間体１を浸し、８５℃のバス中で３時間加熱した。繊維をイソプロパノールで洗浄後、１モル／Ｌ濃度の食塩水に浸漬した後、水洗し、真空乾燥して、８．３ｇのジメチルオクチルアンモニウム化繊維（実施例２）を得た。
【００２５】
また、Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミン５０ｇとヨウ化カリウム８ｇを３６０ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液に５ｇの中間体１を浸し、８５℃のバス中で３時間加熱した。繊維をイソプロパノールで洗浄後、１モル／Ｌ濃度の食塩水に浸漬した後、水洗し、真空乾燥して、９．３ｇのジメチルラウリルアンモニウム化繊維（実施例３）を得た。また、中間体２および中間体３を同様に処理して、それぞれ実施例４（比表面積１．４ｍ2／ｇ）および比較例４（比表面積０．０４ｍ2／ｇ）を得た。
【００２６】
（非親水性アミンの不均一系反応による固定）
また、非親水性アミンとして、ステアリルアミン５０ｇを３６０ｍＬのエタノールに溶かした溶液に５ｇの中間体１を浸し、８５℃のバス中で３時間加熱した。繊維をイソプロパノールで洗浄後、水洗し、真空乾燥して、７．２ｇのステアリルアミノ化繊維（比較例２）を得た。
【００２７】
（スルホン化繊維）
また、パラホルムアルデヒド５００ｍｇを溶解した硫酸５０ｍＬに、５ｇの原糸１を浸し、９５℃で１時間加熱した後、水洗、１モル／Ｌ濃度の食塩水での洗浄、水洗、乾燥を逐次行って、７．３ｇのスルホン化繊維（比較例３）を得た。
【００２８】
（親水性アミン結合ポリマーの合成とコーティング）
ニトロベンゼン１６ｍＬと硫酸３２ｍＬの混合溶液を０℃に冷却後、４．２ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、溶解し、これを、１０℃のユーデルポリスルホンＰ３５００の３Ｌのニトロベンゼン溶液（３００ｇ／３Ｌ）に、良く撹拌しながら加えた。さらに、室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿をメタノールで良く洗った後、乾燥し、さらに、ジメチルホルムアミド／メタノールから再沈殿して、３０３ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン（置換率：０．０５；重合体Ｃ）を得た。
【００２９】
ポリエチレンイミン（平均分子量１００００：和光純薬）６０ｇを３００ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液と３０ｇの重合体Ｃを含む３００ｍＬのＤＭＦ溶液と混合し、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を大過剰の飽和食塩水に加え、沈殿したポリマーをろ取した。ポリマーを水洗後、乾燥し、さらに、ジメチルホルムアミド／メタノールから再沈殿して、２７ｇのＮ−アルキル化ポリアルキレンイミン固定化ポリスルホン（重合体Ｄ）を調製した。
【００３０】
上記重合体Ｄを５ｇ含む塩化メチレン２５０ｍＬの溶液に、単糸の直径が３．５μｍのポリエチレンテレフタレート繊維の綿２０ｇを浸し、２０時間後に綿を取り出し、液を切って風乾し、２１ｇのコーティング綿（実施例５）を得た。
【００３１】
（非イオン性官能基の吸着材）
酢酸セルロース５ｇを塩化メチレン２５０ｍｌに溶かし、単糸の直径が３．５μｍのポリエチレンテレフタレート繊維の綿２０ｇを浸し、２０時間後に綿を取り出し、液を切って風乾し、２１ｇのコーティング綿（比較例５）を得た。
【００３２】
（吸着能の評価）
８週令のＨＯＳ：Ｄｏｎｒｙｕラット（雄）の背部皮下にＹＳ細胞（東北大学加齢研究所提供）２×１０8個接種して調製した担癌ラット５匹から血液を採取し、血清３０ｍＬを調製した。その血清１ｍＬに吸着材５０ｍｇを入れ、３７℃で４時間振とうした。上清中の各蛋白質濃度を測定して、表１の結果を得た。
【００３３】
【表１】
0004009772.tif 000002
【００３４】
表１の比較例１では比表面積が大きいにも拘わらず、親水性アミノ基のリガンドがないため吸着性がない。比較例２は親水性でないアミノ基のリガンドのため吸着能が無い。比較例３からスルホン酸基のリガンドは吸着性がないことが分かる。また、比較例４は親水性アミノ基のリガンドであるが、実施例３及び実施例４と異なり比表面積が低いため吸着能が殆ど無い。比較例５及び比較例６は比表面積は小さくないが、親水性アミノ基のリガンドがないため吸着能がない。これらの結果から、吸着には親水性アミンの官能基が必要であること、比表面積が０．０４平方メートルでは吸着能が低いことが分かる。また、親水性アミンの中でも、窒素原子１個当たりの炭素数が１４のものより１０および８のものの吸着能が大きいことが分かる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、免疫抑制性物質を効率よく吸着除去することが可能となり、癌の患者の治療に有用である。