(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）によって産生され、新規蛋白質ヒトＬＥＣＴ２（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と特異的に反応することを特徴とする抗体。
【請求項２】
融合細胞クローンＡ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）によって産生され、新規蛋白質ヒトＬＥＣＴ２（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と特異的に反応することを特徴とする抗体。
【請求項３】
融合細胞クローン５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）によって産生され、新規蛋白質ヒトＬＥＣＴ２（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と特異的に反応することを特徴とする抗体。
【請求項４】
融合細胞クローンＨ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）によって産生され、新規蛋白質ヒトＬＥＣＴ２（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と特異的に反応することを特徴とする抗体。
【請求項５】
請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の抗体を産生することを特徴とする融合細胞。
【請求項６】
融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）、Ａ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）、５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）、及びＨ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）の群から選ばれた一つである請求の範囲第５項記載の融合細胞。
【請求項７】
下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を含み、下記第１の抗体は請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載された抗体であり、下記第２の抗体は請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載された抗体であって前記第１の抗体とは異なるものであることを特徴とするヒトＬＥＣＴ２の測定法。
ａ）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第１の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としてのヒトＬＥＣＴ２を反応せしめた後、
ｂ）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第２の抗体を標識物質により標識化した標識抗体を反応させ、
ｃ）この反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作成する工程、及び
ｄ）前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
ｅ）前記標識抗体を反応させ、
ｆ）この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるヒトＬＥＣＴ２を測定する工程。
【請求項８】
ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第１の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、
ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第２の抗体を標識物質により標識化した標識抗体とを備え、
前記第１の抗体は請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載された抗体であり、前記第２の抗体は請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載された抗体であって前記第１の抗体とは異なるものであることを特徴とするヒトＬＥＣＴ２の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な蛋白質ヒトＬＥＣＴ２と反応する抗体、その抗体を産生する融合細胞、ヒトＬＥＣＴ２の測定法及び測定用キットに関する。
背景技術
最近、好中球の癌細胞破壊反応への関与が知られるようになり、癌組織において好中球の浸潤像が観察されることから、好中球が癌細胞の分泌する走化性因子に応答したものと考えられている。
ＬＥＣＴ２（Leukocyte-derived chemotaxin 2）は、このような癌細胞から分泌される走化性因子を探索する中から見いだされたものであり、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ−３の培養上清から得られた走化性因子と考えられるものである。
ヒトＬＥＣＴ２は、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ−３の培養上清中に存在するウシ血清中のＬＥＣＴ２をコードするＤＮＡを用いてヒトのｃＤＮＡライブラリーの中から９０％以上のホモロジーを有する蛋白質として新たに見出されたものである。下記表１は、ヒトＬＥＣＴ２とウシＬＥＣＴ２のアミノ酸配列を比較できるように示したものである。
【表１】
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このヒトＬＥＣＴ２もウシＬＥＣＴ２同様の走化性因子であると考えられ、病態の把握や癌の治療への応用が期待されることから、このヒトＬＥＣＴ２の測定法を確立することが望まれた。
なお、当初、ウシＬＥＣＴ２をＬＥＣＴ２ａ、ヒトＬＥＣＴをＬＥＣＴ２ｂと称していたが、従前の名称は相応しくないことから名称を変更した。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、ヒトＬＥＣＴ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キットを提供することを目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するため、本発明の第１である抗体は、ヒトＬＥＣＴ２（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と特異的に反応することを特徴とする。かかる抗体としては、例えば、融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）によって産生される抗体、融合細胞クローンＡ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）によって産生される抗体、融合細胞クローン５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）によって産生される抗体、融合細胞クローンＨ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）、あるいは、融合細胞クローン８９Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２２９）によって産生される抗体がある。
本発明の第２である融合細胞は、ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する抗体を産生することを特徴とする。かかる融合細胞としては、例えば、融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）、Ａ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）、５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）、Ｈ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）、８９Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２２９）がある。
本発明の第３であるヒトＬＥＣＴ２の測定法は、下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を含むことを特徴とする。即ち、
ａ）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第１の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としてのヒトＬＥＣＴ２を反応せしめた後、
ｂ）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第２の抗体を標識物質により標識化した標識抗体を反応させ、
ｃ）この反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作成する工程、
及び
ｄ）前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
ｅ）前記標識抗体を反応させ、
ｆ）この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるヒトＬＥＣＴ２を測定する工程。
本発明の第４であるヒトＬＥＣＴ２の測定用キットは、ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第１の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第２の抗体を標識物質により標識化した標識抗体とを備えたことを特徴とする。
本発明の第３、第４において、第１の抗体は、融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）によって産生される抗体、融合細胞クローンＡ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）によって産生される抗体、融合細胞クローン５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）によって産生される抗体、融合細胞クローンＨ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）によって産生される抗体、あるいは、融合細胞クローン８９Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２２９）によって産生される抗体であり、前記第２の抗体は前記５つの抗体のいずれかであって第１の抗体とは異なるものであることが好ましい。また、標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれたものを用いることができる。
本発明のヒトＬＥＣＴ２の測定法及び測定用キットによれば、検体中に含まれる走化性因子ヒトＬＥＣＴ２を測定することができるため、その測定結果を利用して肝臓等の病態の把握や治療への応用が可能となるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
図１はＥＬＩＳＡ法によるヒトＬＥＣＴ２の検出結果を表すグラフであり、図２はウェスターンブロットによる各クローンのモノクローナル抗体の反応特異性を表す説明図であり、図３はヒトＬＥＣＴ２の濃度と吸光度との関係を表すグラフであり、図４は急性肝炎患者検体の急性期と寛解期におけるヒトＬＥＣＴ２の測定値を表すグラフであり、図５は健常者の組織の染色像を表す写真であり、（Ａ）は１００倍拡大写真、（Ｂ）は２００倍拡大写真であり、図６は肝硬変患者の組織の染色像を表す写真であり、（Ａ）は１００倍拡大写真、（Ｂ）は２００倍拡大写真である。
発明を実施するための最良の形態
［ヒトＬＥＣＴ２に特異的に反応する抗体、及び、その抗体を産生する融合細胞］
ヒトＬＥＣＴ２に特異的に反応する抗体の作製について以下に説明する。
Ａ．抗原
抗原としてはヒトＬＥＣＴ２（配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をクローニングし、免疫原として使用した。
Ｂ．上記抗原による免疫
免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合のための脾臓細胞を取り出す。
Ｃ．細胞融合
上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞としては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望ましいが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲である。約１０8個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤としては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法により細胞融合を行ってもよい。
Ｄ．目的とする抗体を産生する融合細胞の選択
別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。これに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で生存できる。
かくして、融合細胞が検出された後、前記のヒトＬＥＣＴ２に対する抗体について酵素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)によりスクリーニングを行い、ヒトＬＥＣＴ２と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融合細胞だけを選択する。このような融合細胞として、例えば融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８）、融合細胞クローンＡ１Ｇ１Ｃ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９）、融合細胞クローン５Ｃ５（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０）、融合細胞クローンＨ１２Ｄ１０Ｄ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１）、融合細胞クローン８９Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２２９）が挙げられる。
Ｆ．目的とする抗体の取得
目的とする抗体を産生する融合細胞を適当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗体は２つの異なった方法で産生することができる。その第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地で培養することにより、その培養上清からその融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
［ヒトＬＥＣＴ２の測定法］
Ａ．固相化抗体
ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を作成するには、この抗体と不溶性支持体を接触させることにより不溶性支持体の表面に抗体を吸着させて行うほか、共有結合等の化学的な方法によっても結合させることができる。
不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどを例示することができる。また、不溶性担体の形状としては、トレイ状、球状、棒状、線維状、盤状、容器状、セル、試験管など種々の形状であることができる。
Ｂ．標識抗体
ヒトＬＥＣＴ２に特異的に反応する抗体は、完全抗体であってもよく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2等のフラグメントであってもよい。
標識物質としては、通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に限定されるものではないが、酵素、アビジン、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが好ましい。酵素としてはペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプロテイン、フィコエリスリン等、発光物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としては125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等を用いることができる。また、標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標識アビジンを用いることにより高い感度を得ることができるので、より好ましい。この場合の標識酵素としては抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることができるが、ペルオキシダーゼは特に好ましい。
酵素を標識物質として用いた場合にはその活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質としてＨ2Ｏ2を用い、発色剤として２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオロセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いることができる。
Ｃ．検量線の作成
固相化抗体に標準物質としてのヒトＬＥＣＴ２を反応せしめ、次いで固相化抗体と特異的に反応したヒトＬＥＣＴ２に標識抗体を反応させ、その後、この標識抗体の標識量を測定する。これにより、ヒトＬＥＣＴ２の量に対する標識量の関係、即ち検量線が得られる。
この免疫学的測定方法において用いられる反応用媒体としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨ６．０〜８．０の範囲のものが示される。
Ｄ．検体に含まれるヒトＬＥＣＴ２の測定
固相化抗体に検体を反応せしめ、次いで標識抗体を反応させる。このときに検体中に含まれるヒトＬＥＣＴ２の濃度に応じて標識抗体が反応する。その後、この標識抗体の標識量を測定する。この測定値を検量線に照らすことにより、検体中のヒトＬＥＣＴ２の濃度が測定される。尚、反応用媒体については、上記Ｃ．で述べた通りである。
［ヒトＬＥＣＴ２の測定用キット］
測定用キットは、少なくとも、
（１）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第１の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体、
（２）ヒトＬＥＣＴ２と特異的に反応する第２の抗体を標識物質により標識化した標識抗体
を含み、その他に、反応用媒体を含んでいてもよいし、あるいは、標準物質（ヒトＬＥＣＴ２）を含んでいてもよい。尚、標識抗体の標識物質が酵素の場合には、通常、酵素の活性を測定するための基質及び反応停止液を含む。また、不溶性支持体、標識物質については上述したのでその説明は省略する。この測定用キットによれば、上述の測定法を実施することができる。
以下に、本発明の好適な実施例を図面に基づいて説明する。尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の形態を採り得ることはいうまでもない。
［実施例１］免疫原（ヒトＬＥＣＴ２）の作製
［１−１］ヒトＬＥＣＴ２のクローニングおよびクローニングされたヒトＬＥＣＴ２のヌクレオチド配列の決定
ヒトＬＥＣＴ２  ｃＤＮＡのクローニングは次のようにして行った。５０μg/mlのＰＨＡ−Ｐ（DIFCO社製）でＴ細胞白血病細胞ＳＫＷ−３を処理しｐｏｌｙＡ+ＲＮＡを調製した。５μgのｐｏｌｙＡ+ＲＮＡを用い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーにしてファーストストランドｃＤＮＡ（１ｓｔ  ｃＤＮＡ）を合成した。
次に、ウシＬＥＣＴ２（配列番号９にそのアミノ酸配列を示す）の部分アミノ酸配列を基にＰＣＲのプライマーを合成した。即ち、アミノ酸配列ＷＡＩＩＣＡより６種類のオリゴヌクレオチドを演繹して５’のプライマーとし、アミノ酸配列ＨＩＥＮＣＤより４種類のオリゴヌクレオチドを演繹して３’のプライマーとした。ＰＣＲ法により、１ｓｔ  ｃＤＮＡを鋳型とし上記プライマーの組み合わせである２４種類の反応にてＤＮＡ断片の増幅を行った。アミノ酸配列ＤＶＬＣＳＤＧＳＴＶＹＡＰＦを基にＤＮＡプローブ（GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT、配列番号４参照）を使い、増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、サザンブロットにより解析した。その結果、約３７０bpのＤＮＡ断片が検出され、それをｐＵＣ１９にクローニングした。
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、クローニングされたｃＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングしたところ、１３０万個のクローン中１２クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクローンはすべて、制限酵素の解析により２種類に分けられることがわかり、それぞれのグループの一番長いｃＤＮＡ断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、２種類のｃＤＮＡは同一の遺伝子由来で３’側に存在する２種類のｐｏｌｙＡシグナルにより生じることが推定された。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よりウシＬＥＣＴ２の決定されたアミノ酸配列に約９０％のホモロジーを有することが判明し、このコードされると考えられるタンパク質をヒトＬＥＣＴ２と命名した。このヒトＬＥＣＴ２のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号１及び２に示す。
［１−２］ヒトＬＥＣＴ２遺伝子を含む組換えプラスミドの構築
クローニングされたヒトＬＥＣＴ２  ｃＤＮＡをもとに、５’側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG（配列番号５参照）、３’側のプライマーとしてCGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG（配列番号６参照）をそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてヒトＬＥＣＴ２のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIでの処理後、この断片をｐＭＡＬTM−Ｃ（Biolab Inc.）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ヒトＬＥＣＴ２と命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下マルトース結合タンパク質（maltose-binding-protein）とヒトＬＥＣＴ２の融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＴＥＶプロテアーゼ（Tabacco Etch Virus由来）の切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
また、クローニングされたヒトＬＥＣＴ２  ｃＤＮＡをもとに、５’側のプライマーとしてGCGGGATCCCCGGGCCATGGGCTAATAT（配列番号７参照）、３’側のプライマーとしてCGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG（配列番号８参照）をそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてヒトＬＥＣＴ２のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＢａｍＨＩで処理後、この断片をｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia Inc.）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＧＥＸ−Ｘａ−ヒトＬＥＣＴ２と命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトＬＥＣＴ２の融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＸａプロテアーゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
［１−３］ヒトＬＥＣＴ２遺伝子を含む組換えプラスミドによる大腸菌の形質転換
上記のようにして得られた組換えプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ヒトＬＥＣＴ２を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法により期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニングし、期待されるＤＮＡ断片を持つ大腸菌クローンＭａｌ−ヒトＬＥＣＴ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６６９、なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３０２が付された）を得た。
［１−４］動物細胞によるヒトＬＥＣＴ２の産生
ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位にＨｉｎｄIIIからＥｃｏＲＩの方向でクローニングされたヒトＬＥＣＴ２  ｃＤＮＡの５’側をエキソヌクレアーゼIIIにより−１４の塩基配列まで欠失させ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、ＰｓｔＩリンカーをライゲーションし、ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断し、発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９４のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ヒトＬＥＣＴ２を高発現する株１株（Ｃ１Ｄ８−１）（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６６８、なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３０１が付された）を得た。
（分子量の決定）
リコンビナントヒトＬＥＣＴ２（動物細胞発現）は、35Ｓ−メチオニンによってメタボリックラベルし、ＣＨＯ細胞の培養上清をＳＤＳゲル電気泳動にかけることにより検出した。その結果、分子量が約１４kDaと１６kDaの２本のバンド（１６kDaが主要であり、２つのバンドはプロセッシングの違いにより生じると考えられる）が得られた。
［実施例２］免疫
上記実施例１のように作製した免疫原ヒトＬＥＣＴ２  １００μｌとフロイントの完全アジュバント１００μｌを良く混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を２匹のマウス（雄ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔に１匹当たり抗原として２５μｌずつ投与した。さらに１週間おきに同量の抗原を５回投与し、その３日後に脾臓を取り出し融合実験を行った。
別に、家兎２羽に対しても同様に免疫し、採決して血清を分離した後、常法に従い吸収操作を行い、ＩｇＧ分画を分離してポリクロナール抗体を得た。
［実施例３］細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞の選択と取得
摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞（ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ−１４）とを約１０：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１０6cells/mlの細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）に懸濁し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下同じ）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
融合細胞は、ＣＯ2インキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行い、ＨＡＴ培地中で馴化し、さらに１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で馴化した。
融合培養細胞上清中の抗体は、ヒトＬＥＣＴ２蛋白質を固相化したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウエルに対しては限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、ヒトＬＥＣＴ２に対する反応性を有するクローンを５種類選択し、それぞれをＧ２Ａ５Ｄ７、Ａ１Ｇ１Ｃ６、５Ｃ５、Ｈ１２Ｄ１０Ｄ６、８９Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６３９、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２２９）と命名した。
得られたクローンはそれぞれ１０％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナル抗体は、クローンをマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水中からプロテイン−Ａセファロースカラームを用いてそれぞれを精製した。
［実施例４］モノクローナル抗体の特異性の確認
▲１▼ＥＬＩＳＡ法による特異性の確認
ヒトＬＥＣＴ２のＰＢＳ溶液（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を調製し、この溶液でヒトＬＥＣＴ２を固相化したマイクロタイタープレートに各クローンの抗体溶液を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（カベル社製）を反応させ、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液を基質として波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図１に示す。
吸光度の値は固相化したヒトＬＥＣＴ２の濃度に伴って上昇し、ある濃度からは一定になることから、各クローンともヒトＬＥＣＴ２に特異的に反応することが確認された。
▲２▼ウエスターンブロットによる特異性の確認
ヒトＬＥＣＴ２とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の混合物を抗原としてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（１６．５％モノアクリルアミド／ビスアクリルアミド；３％ビス／モノアクリルアミド＋ビス）を行い、泳動後ウェスターンブロットにより反応の特異性を確認した。各クローンのモノクローナル抗体とも約１６ｋＤに反応性を認め、ＭＢＰとは反応しなかった。この結果を図２に示す。
尚、図２でＣＢＢはクマーシーブリリアントブルーの略で蛋白染色を示す。第１レーンは分子量マーカー、他はヒトＬＥＣＴ２＋ＭＢＰを抗原として泳動し、第１レーン、第２レーンは蛋白染色、他は各モノクローナル抗体によるウェスターンブロットを示す。
［実施例５］ＥＬＩＳＡ法によるサブクラスの確認
上記実施例３で得られた各モノクローナル抗体について、アメリカンコーレックス社製モノクローナルサブクラスイソタイピングキットを用いてクラス・サブクラスを確認した。結果はクローンＡ１Ｇ１Ｃ６及びＧ２Ａ５がＩｇＧ２ｂ、クローンＨ１２Ｄ１０がＩｇＭであった。尚、クローン５Ｃ５、８９Ｆ２については未確認である。
［実施例６］抗体固相化
上記実施例３で得られたモノクローナル抗体クローンＧ２Ａ５を０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で５μｌ／ｍｌの濃度に調製し、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μｌずつ加え、４℃で２０時間静置反応させた。抗体溶液を捨て、１％ＢＳＡ、５％ショ糖を含むＰＢＳを各ウエルに２００μｌずつ加え、室温（２０〜２５℃）で２時間静置してブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、プレートを風乾し、固相化抗体を得た。この固相化抗体は乾燥剤と共に密封して保存した。
［実施例７］標識抗体の作製
上記実施例２で得たポリクローナル抗体の精製ＩｇＧ１ｍｇ当たり０．０５６Ｕのフィシンを添加し、３７℃で８時間反応させた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡＣＡ４４を用いてゲルろ過し、Ｆａｂ’分画を得た。このＦａｂ’分画にマレイミド法によりペルオキシダーゼを標識し、ペルオキシダーゼ標識抗体とした。なお、標識は医学書院刊、石川栄治著、「酵素免疫測定法第３版」に従って行った。
［実施例８］ヒトＬＥＣＴ２の測定
ヒトＬＥＣＴ２蛋白質をＰＢＳで希釈して０．００１〜２０ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、この液２００μｌを上記実施例６で得た抗体固相化プレートの各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた後、各ウエルをＰＢＳ３００μｌで４回洗浄し、余分のＰＢＳを除き、上記実施例７で得たペルオキシダーゼ標識抗体（１００μｌ）を加え、室温で１時間反応させ、再度ＰＢＳで洗浄し、テトラメチルベンジジンと過酸化水素の溶液１００μｌを加えて反応させ、１．５Ｎリン酸１００μｌを加えて反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの測定結果を表２及び図３に示す。
【表２】
0003888695.tif 000003
これにより、ヒトＬＥＣＴ２の量に対する標識量の関係、即ち検量線が得られ、この検量線を用いることにより検体中のヒトＬＥＣＴ２の量に対する標識量の関係、即ち、検量線が得られ、この検量線を用いることにより検体中のヒトＬＥＣＴ２の含有量を知ることができる。
急性肝炎の患者検体について、その急性期と寛解期における測定値の比較を行ったデータを表３及び図４に示す。
【表３】
0003888695.tif 000004
測定系に関する予備的検討の結果、検体中のヒトＬＥＣＴ２は比較的早期にその抗原性を喪失すること、特に血清では速やかに抗原性が消失することが明らかとなったことから、検体として血漿を用い、各血漿は採血後速やかに分離することによって得たあと、測定時までは−２０℃以下で凍結保存した。また、検体の希釈率が５倍以下の場合、測定値に影響を与える可能性があることから、検体は１０倍希釈して測定した。
各検体の急性期及び寛解期の測定値を比較すると、明らかに寛解期において測定値が低下していることから、検体中のヒトＬＥＣＴ２の濃度は患者の病態を反映しているものと判断した。
このように、検体中の走化性因子ヒトＬＥＣＴ２の含有量を測定することができるため、その測定結果を利用して病態の把握や治療への応用が可能となる。
［実施例９］免疫組織染色
健常者の肝臓組織及びＣ型肝硬変患者の肝臓組織を取り、常法に従いホルマリン固定し、パラフィン包埋した。このパラフィン包埋組織からミクロトームを用いて組織切片を作製し、常法に従い脱パラフィンを用い、実施例３で得たモノクローナル抗体クローン８９Ｆ２より精製したＩｇＧ分画のＰＢＳ溶液約１００μｌ（５μｇ／ｍｌ）を切片にのせ、３７℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。これにペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ダコ社製）を３７℃で３０分間反応させ、再度ＰＢＳで洗浄した後、３，３’，５，５’−ジアミノベンジジンと過酸化水素の溶液を反応させ染色した。細胞の核はヘマトキシリンで染色した。
図５は、健常者の組織の染色像を表す写真であり、（Ａ）は１００倍拡大写真、（Ｂ）は２００倍拡大写真である。また、図６は、肝硬変患者の組織の染色像を表す写真であり、（Ａ）は１００倍拡大写真、（Ｂ）は２００倍拡大写真である。
健常者、肝硬変患者の組織切片とも、肝細胞の細胞質にびまん性の染色を認めた。具体的には、健常者、肝硬変患者とも肝実質細胞にジアミノベンジジンの顆粒状の染色（茶色に染まっている）が認められたが、肝硬変患者では陰陽性の細胞の混在が認められ、健常者とは異なる染色パターン（健常者では肝実質細胞がすべて陽性）を示した。結合組織には染色は認められなかった。なおＭ図５及び図６の写真中、青く点状に染まっているのは核である。このことは、ＬＥＣＴ２が細胞周期と何らかの関連を持っていることを示唆している。
産業上の利用可能性
本発明のヒトＬＥＣＴ２に対する抗体によれば、免疫治療や診断、及びこれらに関連した産業分野において有用である。また、本発明の融合細胞によれば、ヒトＬＥＣＴ２に対する抗体を入手するうえで有用である。更に、本発明のヒトＬＥＣＴ２に対する抗体は、ヒトＬＥＴ２の測定法及び測定用キットに用いることができる。この測定法及び測定用キットによれば、検体中に含まれるヒトＬＥＣＴ２（走化性因子と考えられる）を測定することができるため、その測定結果を利用して病態の把握や治療への応用が可能となるという効果が得られる。具体的には、例えば種々の疾患（例えば肝炎や肝硬変など）の患者から取り出した組織等に対し、本発明の抗体を反応させて、ＬＥＣＴ２を発現している細胞が組織のどこに存在しているかを調べることができる。これにより各種疾患の診断や治療へつなげることが可能となる。
寄託機関
Ｃ１Ｄ８−１及びＭａＩ−ヒトＬＥＣＴ２は、以下の国際寄託機関に、それぞれ下記の受託番号と寄託日で寄託されている。
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
受託番号及び寄託日
（１）Ｃ１Ｄ８−１
ＦＥＲＭ ＢＰ−５３０１：１９９４年１１月２５日
（２）Ｍａｌ−ヒトＬＥＣＴ２
ＦＥＲＭ ＢＰ−５３０２：１９９４年１１月２５日
融合細胞クローンＧ２Ａ５Ｄ７、Ａ１Ｇ１Ｃ６、５Ｃ５、Ｈ１２Ｄ１０Ｄ６、８９Ｆ２は、以下の国内寄託機関に、それぞれ下記の受託番号と寄託日で寄託されている。
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
受託番号及び寄託日
（１）融合細胞クーロンＧ２Ａ５Ｄ７
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６３８：１９９６年５月２１日
（２）融合細胞クーロンＡ１Ｇ１Ｃ６
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６３９：１９９６年５月２１日
（３）融合細胞クーロン５Ｃ５
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６４０：１９９６年５月２１日
（４）融合細胞クーロンＨ１２Ｄ１０Ｄ６
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６４１：１９９６年５月２１日
（５）融合細胞クーロン８９Ｆ２
ＦＥＲＭ Ｐ−１６２２９：１９９７年５月１９日
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：151
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
存在位置：58
他の情報：Xaa=ValまたはIle
配列
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配列番号：2
配列の長さ：1092
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
起源：ヒト
細胞の種類：肝臓
配列の特徴：
特徴を表す記号：5'UTR
存在位置：1..200
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：3'UTR
存在位置：657..1092
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：CDS
存在位置：201..656
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：mutation
存在位置：replace(372,"a")
replace(748,"g")
replace(961,"c")
replace(967,"c")
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：684..689
1060..1065
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：3
配列の長さ：1092
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
起源：ヒト
細胞の種類：肝臓
配列の特徴：
特徴を表す記号：5'UTR
存在位置：1..200
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：3'UTR
存在位置：657..1092
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：CDS
存在位置：201..656
特徴を決定した方法：P
特徴を表す記号：mutation
存在位置：replace(372,"a")
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replace(967,"c")
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：684..689
1060..1065
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：4
配列の長さ：41
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA（cDNAプローブ）
配列の特徴
存在位置：6
他の情報：N=CまたはG
存在位置：9
他の情報：N=AまたはG
存在位置：15
他の情報：N=TまたはC
存在位置：21
他の情報：N=CまたはG
存在位置：24
他の情報：N=TまたはC
存在位置：27
他の情報：N=TまたはA
存在位置：30
他の情報：N=CまたはG
存在位置：36
他の情報：N=TまたはC
存在位置：39
他の情報：N=TまたはC
配列
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配列番号：5
配列の長さ：47
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA（プライマー）
配列
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配列番号：6
配列の長さ：26
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA（プライマー）
配列
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配列番号：7
配列の長さ：28
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA（プライマー）
配列
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配列番号：8
配列の長さ：26
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA（プライマー）
配列
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配列番号：9
配列の長さ：98
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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【図１】
0003888695.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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