(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列で表される、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のインベルターゼ前駆体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基番号第２８１０番〜第４５５５番の塩基配列で表される、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）のインベルターゼ前駆体をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターで形質転換された分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）または大腸菌（Escherichia coli）からなる形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のショ糖分解酵素であるインベルターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、およびこれを用いた形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）は、真核生物でありながら遺伝学、分子生物学の応用がきわめて容易な単細胞生物として広く研究されている。その生育には炭素源としてブドウ糖（グルコース）や果糖（フルクトース）等の単糖が用いられている。生育する際に培地中にこれら単糖が存在しない場合、ショ糖（スクロース）をブドウ糖と果糖に分解する酵素であるインベルターゼの発現が誘導され、生育に必要な炭素源を獲得することが知られている。
【０００３】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においても同様に、固有のインベルターゼの誘導生産現象（脱抑制）が知られている。その発現における遺伝子レベルでの制御、生合成経路、糖鎖部分の構造解析等に関する研究はすでに詳細に行われている。すなわち、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのインベルターゼ遺伝子は染色体上に６個重複しており、ＳＵＣ１〜ＳＵＣ５およびＳＵＣ７という遺伝子によってコードされている。このうちの１つでも活性なＳＵＣ遺伝子を持てばスクロースとラフィノースの資化性を示すことが知られている（Hohmann, S. and Zimmermann, F.K. Curr.Genet. 11, 217（1986））。ＳＵＣ遺伝子からは、転写開始点が離れた２種のｍＲＮＡが転写される。短い方のｍＲＮＡは構成的な転写であり、細胞内インベルターゼを発現している。長い方のｍＲＮＡは分泌型インベルターゼをコードしており、その発現はカタボライト抑制を受け、その脱抑制比は２００倍以上である（Carlson, M. et al. Mol.Cell.Biol. 3. 439（1983））。長い方のｍＲＮＡに対するプロモーター領域の解析がなされた結果、−６５０ｂｐから−４１８ｂｐの間にある特別な繰り返し配列に制御因子が結合していると考えられている（Salokin,L. and Carlson, M. Mol.Cell. Biol. 6, 2314（1986））。
【０００４】
これに対し分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは、インベルターゼタンパク質の精製については報告されているが（Moreno, S. et al. Arch. Microbiol.
142, 370（1985））、その遺伝子に関する研究はなされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベは、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは系統進化的に非常に異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、RNAスプライシング機構、糖タンパク質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で、動物細胞と類似しているという利点がある。分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて、インベルターゼは細胞表層に存在しており、分子量２０５ＫＤａの高分子量糖タンパク質である。その６７％が糖鎖であり、等モルのマンノース残基とガラクトース残基から成り立っている。精製酵素のタンパク分子量やアミノ酸組成および抗体を用いた実験から、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ由来のインベルターゼは出芽酵母サッカロミセス・ポンベのインベルターゼとタンパク質化学的にも非常に類似していることが知られている（Moreno, S. et al. Biochem. J. 267, 697（1990））。またグルコース濃度の低下によりインベルターゼの合成抑制が解除されることも知られている（Mitchison, J. and Crenor, J. Cell Sci, 5. 373（1969））。
【０００６】
しかし分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子を発現させた場合、宿主に依存してガラクトース残基が含まれるが、カタボライト抑制を受けずに構成的な発現がなされることが知られている（Zarate, V and Belda, F. J.Applied Bacteriology. 80, 45,（1996））。このことから、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベと出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとでは、インベルターゼのカタボライト抑制のメカニズムが異なっている可能性がある。
【０００７】
本発明は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子の塩基配列を明らかにし、さらにカタボライト抑制に関与している遺伝子領域を明らかにしようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明では、従来その遺伝子レベルでの実体が不明であった分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子の塩基配列を決定し、糖鎖付加部分を決定した。また遺伝子破壊法によりインベルターゼ遺伝子が１種ですべての活性を担っていることを明らかにした。本発明の遺伝子およびポリペプチドは、タンパク質の細胞内輸送経路解析や糖鎖修飾機構の解明などのためのマーカーとしての重要な物質であり、応用面においても重要性が高い。
【０００９】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列で表される、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ前駆体をコードする遺伝子を含むＤＮＡに関する。
【００１０】
さらに本発明は、この遺伝子を含む組換えベクター、およびそれにより形質転換された分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベまたは大腸菌に関する。
【００１１】
本発明者らは、具体的には以下に示す方法で分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼの前駆体遺伝子を見出し、その構造を決定した。
【００１２】
（１）分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子に良く保存されたアミノ酸配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。
【００１３】
（２）得られたＰＣＲ産物をプローブとして分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのゲノムライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法によりポジティブクローンを選別する。
【００１４】
（３）ポジティブクローンを制限酵素で消化して電気泳動パターンを確認する。
【００１５】
（４）確認されたポジティブクローンからサザンハイブリダイゼーション法を用いて特定長のフラグメントを選別し、全塩基配列を決定する。
【００１６】
（５）遺伝子破壊法を用いてインベルターゼ活性の有無を調べる。
【００１７】
【実施例】
以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。
【００１８】
［実施例１］
ＰＣＲ法によるインベルターゼ遺伝子の単離
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子間で良く保存されたＩＮＶ−１１、ＩＮＶ−１２、ＩＮＶ−１３、ＩＮＶ−１５、ＩＮＶ−２０、ＩＮＶ−ＨＤ１、ＩＮＶ−ＨＤ２の各配列をプライマーに用いてＰＣＲ反応を行った（図１）。なお図1中、ＩＮＶ−１５、ＩＮＶ−２０はＳｐｅＩサイトに変異させるためのプライマーを示す。その結果、４００ｂｐ、３００ｂｐの近傍にＰＣＲ反応により増幅されたバンドが得られた。
【００１９】
それぞれのＰＣＲ産物をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ（宝酒造（株）製）を用いて回収した。ｐＭＯＳＢｌｕｅＴベクターキットを用いて得られたＰＣＲ産物をベクターに組み込み、塩基配列の決定を行った。
【００２０】
その結果、４００ｂｐのＰＣＲ産物をアミノ酸に変換した部分アミノ酸配列は出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子と高い相同性を示した（図２）。図２は、上記ＰＣＲフラグメントと、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子のアミノ酸配列との比較を示す。同図中、２つの塩基間の星印は同一アミノ酸を示す。本遺伝子（４００ｂｐのＰＣＲフラグメント）にコードされているインベルターゼホモログ遺伝子をｉｎｖ１+と命名した。
【００２１】
［実施例２］
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのゲノムＤＮＡライブラリーからの全インベルターゼ遺伝子の取得
実施例１で得られた４００ｂｐのＰＣＲフラグメントをプローブとして、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのゲノムＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法により全インベルターゼ遺伝子を含むポジティブクローンの取得を試みた。その結果、約８０００のプラークのうち１５個のポジティブクローンが取得された。
【００２２】
このポジティブクローンの２次スクリーニングを行うため、再びハイブリダイゼーションを行った。その結果、感光したプラークが４個得られ、このＤＮＡをプレートから単離した。プラークハイブリダイゼーションの結果、単離されたポジティブクローンのファージＤＮＡを少量抽出し、種々の制限酵素で処理して切断パターンを比較したところすべて同一であった。よって、取得されたポジティブクローンは１種類であることがわかった。
【００２３】
［実施例３］
サザンハイブリダイゼーションによるインベルターゼ遺伝子の検索
実施例２で得られたポジティブクローンから1つを選び、ファージＤＮＡの大量抽出を行った。
【００２４】
得られたファージＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩを用いて消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。結果を図３（ａ）、（ｂ）に示す。図３（ａ）はアガロースゲル電気泳動の結果を示し、図３（ｂ）はサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。図３（ａ）、（ｂ）中、符号１は分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化）、符号２はポジティブクローンをＡＣＣＩで消化、符号３はポジティブクローンをＢａｍＨＩで消化、符号４はポジティブクローンをＣｌａＩで消化、符号５はポジティブクローンをＥｃｏＲＩＩで消化、符号６はポジティブクローンをＨｉｎｄＩＩＩで消化、符号７はポジティブクローンをＰｓｔＩで消化、符号８はポジティブクローンをＳａｌＩで消化した場合を示す。図３（ａ）、（ｂ）から明らかなように、ポジティブクローンから制限酵素処理により生じたＤＮＡフラグメントのいずれかにハイブリッドの形成が確認された。
【００２５】
［実施例４］
ｉｎｖ１+遺伝子の取得と確認
インベルターゼ遺伝子の全長を取得するためにハイブリッドを形成し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理（実施例２の図３（ａ）、（ｂ）中、符号６）した約３．０ｋｂフラグメントを抽出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）（東洋紡（株）製）に組み込んだ。この組換えプラスミドをテンプレートとして、図１に示す他生物種起源のインベルターゼ遺伝子に良く保存されたプライマーを用いてＰＣＲ反応により約４００ｂｐのバンドの増幅を確認し、ＰＣＲフラグメントのシークエンスを行って目的のインベルターゼ遺伝子が含まれていることを確認した。
【００２６】
［実施例５］
ｉｎｖ１+遺伝子の塩基配列の決定
種々の制限酵素でｉｎｖ１+遺伝子を消化し、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの制限酵素部位が確認された。そして、これらの制限酵素を用いてサブクローニングを行い、加えて、ディレーションを併用して塩基配列の決定を行った。
【００２７】
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩ消化のＤＮＡフラグメントにはｉｎｖ１+遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）をすべて含むことがわかった。しかし、ｉｎｖ１+遺伝子の発現に関与すると思われる上流領域は約２００ｂｐしか含まないことが明らかとなった。そのため、ハイブリッドを形成したＢａｍＨＩ消化（実施例２の図３（ａ）、（ｂ）中、符号３）３．５ｋｂフラグメントからＨｉｎｄＩＩＩ消化により２．６ｋｂのｉｎｖ１+遺伝子の上流領域を含むフラグメントを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（-）に組み込み、サブクローニングとディレーションにより塩基配列を決定した。ｉｎｖ１+遺伝子の制限酵素地図および塩基配列を決定した部位を図４に示す。ｉｎｖ１+の塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１および図５に示す。なお、図５では最上流側の塩基配列は省略されている。
【００２８】
なお、図４において、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベｉｎｖ１+の制限酵素地図は、配列解析のために使われた制限酵素切断サイトを示し、他のサイトは示していない。他の塩基配列はデリーションのあるプラスミドの配列解析によって決定された。図４中、矢印は塩基配列の方向と範囲を示す。符号Ｂは制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を、符号Ｓｃは制限酵素ＳａｃＩ切断部位を、符号ＨはＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、符号ＳｌはＳａｌＩ切断部位を、それぞれ示す。
【００２９】
図５において、推定ＴＡＴＡボックスは２重線を付した（塩基番号第２６５７番〜第２６６０番）。Ｎ−グリコシリレーションの可能性のある配列は箱印（□）で囲んだ。７塩基繰り返し配列［（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＡＴ］は点線下線で示した（塩基番号第１８８８番〜第１８９４番、第２１８９番〜第２１９５番、第２４９２番〜第２４９８番の３箇所）。翻訳終止コドンは４箇所存在する（塩基番号第１５５３番〜第４５５５番、第４５７２番〜第４５７４番、第４６１９番〜第４６２１番、第４６２９番〜第４６３１番）。
【００３０】
この結果、ｉｎｖ１+遺伝子にはアスパラギン結合型糖鎖付加部位が１６箇所存在していることがわかった。
【００３１】
図６に、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのｉｎｖ１+のアミノ酸配列とｉｎｖ０+のアミノ酸配列、シュワニノミセス・オキシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）のインベルターゼのアミノ酸配列、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２のアミノ酸配列の各Ｎ末端部を示す。各配列の左端にアミノ酸番号を示した。またｉｎｖ１+と同一アミノ酸を箱印（□）で囲んで示した。同図から明らかなように、ｉｎｖ１+遺伝子は他生物種起源インベルターゼであるシュワニノミセス・オキシデンタリス  インベルターゼや出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ  ＳＵＣ２との高い相同性を示した。また、他生物種起源のインベルターゼとｉｎｖ１+遺伝子はそれぞれＮ末端側で高いホモロジーを示すことがわかった。
【００３２】
［実施例６］
ｉｎｖ１+遺伝子の破壊
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（-）の制限酵素ＣｌａＩサイトに分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ由来のｕｒａ４+を組み込んだプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して平滑末端化の後、セルフライゲーションを行い、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを破壊した。このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｃＩＩで二重消化してｕｒａ４+フラグメントを取得した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（-）を制限酵素ＳｐｅＩで消化して平滑末端化し、さらに、制限酵素ＸｂａＩで消化したベクターに、上述のｕｒａ４+フラグメントを組み込み、ＢａｍＨＩサイトをｕｒａ４+の両側に配置したプラスミドを作製した。
【００３３】
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（-）のＢａｍＨＩサイトも上述のように制限酵素処理、平滑末端化、セルフライゲーションにより破壊し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にインベルターゼ遺伝子を含む３．０ｋｂのフラグメントを挿入した。このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して、挿入フラグメント中の１．４ｋｂのフラグメント（ｉｎｖ１+ＯＲＦのＣ末端側領域を含む）を除き、両側にＢａｍＨＩサイトを持つｕｒａ４+遺伝子を組み込んだ。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ消化して両端にｉｎｖ１+遺伝子の近傍の領域を含むＤＮＡフラグメントを取得した。このＤＮＡフラグメントを分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベの野生株（ＷＴ）に形質転換してウラシル無添加の培地に生育してきたコロニーを得た。オーバーレイアッセイによりインベルターゼ活性について検討したが、活性の消失した株は２８株中７株存在していた。得られたｕｒａ４+コロニーの中でインベルターゼ活性の消失した株は２５％であった。
【００３４】
染色体上のｉｎｖ１+遺伝子の破壊の確認をサザンハイブリダイゼーションにより行った。ｉｎｖ１+遺伝子からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化フラグメント（約２ｋｂ）をプローブとしてインベルターゼ活性の消失した株からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩで消化してサザンハイブリダイゼーション法により確認を行った。
【００３５】
結果を図７（ａ）、（ｂ）に示す。図７（ａ）はｉｎｖ１+遺伝子の制限酵素地図を示し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印で表した。ＯＲＦを含んだｉｎｖ１+の１．４Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ  ｕｒａ４+遺伝子に置き換えられていることにより、破壊株ができた。ハイブリダイゼーションに使用されたプローブは２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントである。ゲノムＤＮＡは単離消化され、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩで消化された。
【００３６】
図７（ｂ）に示すようにインベルターゼ活性の消失した株の染色体ＤＮＡはｕｒａ４+遺伝子に置換されていることをＳａｌＩ消化により３ｋｂのハイブリッドが形成されたことから確認した。
【００３７】
以上の結果から、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて発現しているインベルターゼ遺伝子はｉｎｖ１+遺伝子ただ１つであることが証明された。
【００３８】
［実施例７］
ｉｎｖ１+遺伝子によるインベルターゼ活性の回復
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ発現用ベクターｐＡＬ−ＫＳ、ｐＡＵ−ＳＫ（大阪市立大学理学部下田親博士より供与）にインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１+を含むＨｉｎｄＩＩＩ  ３．０ｋｂフラグメントを組み込んで、インベルターゼ欠損株に形質転換してインベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイにより調べた。さらに、インベルターゼ遺伝子の上流領域を含むＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ２．６ｋｂフラグメントをインベルターゼ遺伝子のＯＲＦを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ  ２．０ｋｂのフラグメントと連結させたＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ４．６ｋｂフラグメントをベクターｐＡＬ−ＫＳ、ｐＡＵ−ＳＫに組み込み、このプラスミドもインベルターゼ欠損株に形質転換してインベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイにより調べた。
【００３９】
その結果、いずれのプラスミドを形質転換した株においてもそのほとんどが青く染色しており、インベルターゼを発現していることが確認された。加えて、上流領域を付加した場合、染色度が強くインベルターゼが高発現していることが示唆された（図８（ａ）、（ｂ））。図８（ａ）はゲルオーバーレイアッセイ写真、図８（ｂ）は図８（ａ）の染色部分を説明する模式図を示す。
【００４０】
また、ＹＰ−スクロース培地（アンチマイシン１０μｇ／ｍｌ）における生育度を調べた結果、インベルターゼ欠損株（ｉｎｖ１Δ）はほとんど生育を示さなかったが、野生株（ＷＴ）と形質転換株（ｉｎｖ１Δ／ｐＡＵ：：ｉｎｖ１+）は、インベルターゼ活性が存在するためにスクロースをグルコースとフルクトースに分解することを３０℃、５日間の培養で確認した（図９（ａ）、（ｂ））。図９（ａ）はコロニーの形態を示す写真、図９（ｂ）は図９（ａ）を説明する模式図を示す。
【００４１】
以上の結果よりｉｎｖ１+遺伝子がインベルターゼを発現して細胞表層にインベルターゼを生産していることが証明された。
【００４２】
［実施例８］
ｉｎｖ１+遺伝子のグルコース抑制に関する解析
分裂酵母シゾサッカロミセズ・ポンベにおいて、インベルターゼ遺伝子のグルコース抑制に必要なグルコース量ははっきりとわかっていなかった。そのため、野生株ＴＰ４−１Ｄ（ｈ-、ｌｅｕ１、ｕｒａ４、ａｄｅ６−Ｍ２１６、ｈｉｓ２；Imperial Cancer Research Foundationの登田隆博士より供与）およびインベルターゼ欠損株にｉｎｖ１+遺伝子を含むプラスミド（ｐＡＵ−ＳＫ：：ｉｎｖ１+  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ）を形質転換した株をそれぞれ各種グルコース濃度（２％、４％、８％、１６％）に調製したＭＭ液体培地５ｍｌに接種した後、対数増殖期中期になるまで３０℃、振盪培養した。菌体を集菌し、インベルターゼの酵素活性を測定した。結果を図１０に示す。
【００４３】
また、１８時間培養後の培地中のグルコース量の変化もフェノール硫酸法によって調べた（図１１）。同図から１８時間培養後のＭＭ培地中のグルコースの減少がわかる。
【００４４】
以上の結果から、インベルターゼ活性は８％の濃度がグルコースの減少度も少なく、グルコース抑制にも十分であることがわかった。
【００４５】
インベルターゼの誘導生産を行うために最も効果のあるグルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれぞれグルコース０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％の濃度で含有するＭＭ培地に対数増殖期中期になるまで生育させた野生株と形質転換株（インベルターゼ欠損株）を移して２７℃、３時間で振盪培養してインベルターゼ活性を測定した（図１２）。インベルターゼ合成の脱抑制におけるグルコースの効果対数増殖期まで２％グルコースが含まれた培地で生育した抑制菌体を、グルコース濃度を変化させた最小培地にて培養することによって脱抑制させた。各点における菌体のインベルターゼ活性を１８０分に３０℃で測定した。インベルターゼの１unitは３０℃、ｐＨ４．０のもとに１分間にショ糖を１ｎｍｏｌのグルコースに変化させる酵素の量を示す。
【００４６】
その結果、野生株では誘導に最適なグルコース濃度は０．１％であり、形質転換株では０．０５％であることがわかった。また野生株では、抑制解除時のインベルターゼ活性は４０倍の値を示した。このような結果から分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいてカタボライト抑制が存在していることが明示された。図１３は、インベルターゼ合成の時間変化を示す。分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ ＷＴ  ＴＰ４−１Ｄ菌体を２％グルコースを含んだ最少培地で中間対数増殖期まで生育させた後、３０℃、０．１％グルコースを含んだ最小培地で脱抑制させた。横軸に示す時間でのインベルターゼ活性を測定した。
【００４７】
【発明の効果】
従来その実体が不明であった分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼの分子的実体を明らかにするとともに、特定の栄養源の有無によりこのインベルターゼ遺伝子の発現が制御される制御遺伝子領域の取得に成功した。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｉｎｖ１+（ＰＣＲフラグメント）取得に用いたＰＣＲプライマーを示す図である。
【図２】ｉｎｖ１+と出芽酵母のＳＵＣ２のアミノ配列（部分）の比較を示す図である。
【図３】図３（ａ）はアガロース電気泳動写真である。図３（ｂ）はｉｎｖ１+をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す観察図（電気泳動写真）である。
【図４】ｉｎｖ１+の制限酵素地図を示す図である。
【図５】ｉｎｖ１+の塩基配列とそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。
【図６】ｉｎｖ０+とｉｎｖ１+のアミノ酸配列比較を示す図である。
【図７】図７（ａ）はｉｎｖ１+遺伝子の制限酵素地図を示す。図７（ｂ）はｉｎｖ１+遺伝子破壊を示す電気泳動図である。
【図８】図８（ａ）はゲルオーバーレイアッセイによるインベルターゼ活性を示すコロニーの図面代用写真（生物の形態）である。図８（ｂ）は図８（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図９】図９（ａ）はコロニーの形態を示す図面代用写真（生物の形態）である。図９（ｂ）は図９（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図１０】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図１１】１８時間培養後のＭＭ培地中のグルコースの減少を示すグラフである。
【図１２】インベルターゼ活性とＭＭ培地中のグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図１３】インベルターゼ合成の時間変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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