(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0003996283.tif 000008
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において有機溶媒中で還元剤と接触処理することを特徴とする化学発光試薬の製造方法。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項１に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項４】
前記有機溶媒がテトラヒドロフラン及び／又はジオキサン類の環状エーテル化合物である請求項１〜２のいずれかの項に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項５】
前記還元剤が水素化リチウムアルミニウムである請求項１〜３のいずれかの項に記載の化学発光試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬として、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、従来から用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素のグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とする化学発光分析法は、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑であることから、ペルオキシダーゼを標識酵素に用いる化学発光分析法用の安価な化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑み、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼを用いることができる新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において有機溶媒中で還元剤と接触させることにより調製した化学発光試薬が、特定アルカリ性ｐＨ条件下において過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下においてペルオキシダーゼの量に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【０００６】
従って、本発明は、下記一般式（１）
【０００８】
【化４】
0003996283.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において有機溶媒中で還元剤と接触処理することを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において還元処理することにより得られる反応生成物を含有するものである。
【００１０】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、
次の一般式（１）：
【００１１】
【化５】
0003996283.tif 000003
で表され、式中、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、各々、互いに同一でも異なるものでもよい。
【００１２】
アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でもまたは異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数が、例えば、１〜２０、特に、１〜１０のものが好ましい。
【００１４】
また、一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具体的には、硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１５】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩などが挙げられる。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適に用いることができるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と複合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反応に伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するものと考えられ、本発明の化学発光試薬の製造反応に反応成分として関与し、反応生成物の水溶性の付与等に寄与しているものと考えられる。
【００１７】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられる蟻酸は、反応を促進し、化学発光試薬の反応収率を著しく高める作用を有し、その使用量はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して０．１〜５０００当量、好ましくは０．５〜１０００当量、特に好ましくは１〜５００当量の割合で用いられる。
【００１８】
本発明の化学発光試薬の製造における還元処理は、還元剤を用いて行なうものであり、還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムボロン、水素化ナトリウムボロン等が挙げられるが、水素化リチウムアルミニウムが特に好ましく用いられる。
【００１９】
還元反応を行なう際に使用される反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類、及びＮ−メチル−２−ピロリドン等が好ましく用いられる。
【００２０】
反応温度は用いられる還元剤及び反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲に設定することができる。また、反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好ましくは３０分〜５時間の範囲で採用することができる。
【００２１】
本発明の化学発光試薬は、塩基性条件下に過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応して発光するが、この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーアゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【００２２】
具体的に述べるならば、本発明の化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェニリン等が非限定的に挙げられる。
【００２３】
本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、化学発光試薬は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲の濃度とし、その使用量としては１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で用いるのが望ましい。また、発光増強剤の使用量としては、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲が望ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが望ましい。なお、過酸化水素のほか、他の無機過酸化物及び有機過酸化物等の水素受容体を使用することもできる。
【００２４】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１］
ルシゲニン１ｍｇ試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下に１、４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１、４−ジオキサン中に微分散させる。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末２００μｇを添加して、６０℃で３時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずづ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定できることが認められた。
【００２７】
【表１】
0003996283.tif 000004
【００２８】
［実施例２］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下に１、４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１、４−ジオキサン中に微分散させる。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末２００μｇを添加して、６０℃で３時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずづ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【００２９】
【表２】
0003996283.tif 000005
【００３０】
［実施例３］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下にＮ−メチル−２−ピロリドン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンをＮ−メチル−２−ピロリドン中に微分散させる。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末２００μｇを添加して、６０℃で３時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【００３１】
【表３】
0003996283.tif 000006
【００３２】
［比較例１］
ルシゲニン１ｍｇを純水２ｍｌに溶解し、これを２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに、各々、西洋ワサビペルオキシダーゼの種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加え、更に、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を正確には測定出来ないことが確認された。
【００３３】
【表４】
0003996283.tif 000007
【００３４】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて短時間で容易に製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下においてペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有することを利用したものであり、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等をウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。