(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質と特異的に結合する物質により、不溶性担体の表面に、被検液を含む反応液中の測定対象物質を捕捉する反応を行う測定方法において、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を満たすことを特徴とする測定対象物質の測定方法。
（Ａ）担体表面の一部分が被検液を含む反応液のプールに浸漬されている。
（Ｂ）担体表面の他の部分は、反応液で濡れて、反応液の薄い層が形成されている。
（Ｃ）上記（Ａ）および（Ｂ）の担体表面の一部分と他の部分が、反応中絶えず入れ替わっている。
【請求項２】
不溶性担体がポリスチレンボール、ポリスチレンテストチューブまたはポリスチレンカップであることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
測定対象物質とそれに特異的に結合する物質との結合反応が免疫反応（抗原抗体反応）であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
測定対象物質がＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）抗原または抗ＨＩＶ抗体であり、それに特異的に結合する物質がそれぞれ特異的抗ＨＩＶ抗体またはＨＩＶ抗原であることを特徴とする請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
測定対象物質と特異的に結合する物質により、不溶性担体の表面に測定対象物質を捕捉し、当該測定対象物質に標識として酵素を導入し、得られた「不溶性担体−測定対象物質−酵素」複合体を基質を含む酵素反応溶液中で反応させる測定方法（酵素免疫測定法）において、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を満たすことを特徴とする測定対象物質の測定方法。
（Ａ）担体表面の一部分が酵素反応溶液のプールに浸漬されている。
（Ｂ）担体表面の他の部分は、酵素反応溶液で濡れて、当該溶液の薄い層が形成されている。
（Ｃ）上記（Ａ）および（Ｂ）の担体表面の一部分と他の部分が、反応中絶えず入れ替わっている。
【請求項６】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
請求項１または請求項５の測定方法を用いた測定キットおよびその試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象物質と特異的に結合する物質で不溶性の担体に被検液中の測定物質を捕捉してその量（濃度）を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定物質の量を測定するのに、測定対象物質と特異的に結合する別の物質が被覆された不溶性の担体（以下固相ともいう）に測定対象物質を捕捉し測定する方法は、高感度で特異性が高く、従前より様々な物質の測定に応用されている。最も普遍的に用いられている測定系は、固相の表面に抗原物質あるいは抗体が被覆されており、被検液中の特異的抗体あるいは抗原物質と固相上で反応させて測定する免疫学的測定法であり、例えば、アディソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）らによる成長ホルモンの測定〔ホルモン・メタボリック・リサーチ（Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．）、第３巻、第５９頁（１９７１）〕や石川と加藤によるラット肝オルニチンδ−アミノトランスフェラーゼの測定〔スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第８巻（補冊７）、第４３頁（１９７８）〕など古くから数多くの報告がなされている。
【０００３】
また、固相に核酸（ポリヌクレオチド）物質が被覆されており、被検液中の相補的な配列をもつ核酸物質と固相上で特異的にハイブリッドを形成させて測定する方法もよく用いられる手法である。例えば、ヴァータネン（Ｖｉｒｔａｎｅｎ）らによる尿中のサイトメガロウィルスの測定〔ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第２０巻、第１０８３頁（１９８４）〕やランキ（Ｒａｎｋｉ）らによる鼻咽腔中のアデノウィルスの測定〔ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、第３８１頁（１９８３）〕などが報告されている。さらに、受容体で被覆された固相に被検液中のリガンドを結合させて測定する方法〔ガルゴスキー（Ｇａｒｇｏｓｋｙ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ．）、第１２７巻、第３８３頁（１９９０）〕やレクチン分子が被覆された固相に糖鎖物質を結合させて測定する方法〔テューマー・バイオロジー（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．）、第１２巻、第３５頁（１９９１）〕などが報告されている。
【０００４】
これらの測定方法においては、一般的に測定対象物質と特異的に反応する物質が被覆された固相と被検液を含む反応液が接触する部分の表面積が大きいほど単位時間あたりに固相に捕捉される測定物質量が増加し、その分反応時間が短縮され有利である。そのため、一定量の検体に対して接触する固相表面積を増やすための数々の試みがなされてきた。例えば、固相容器の中に羽状の突起物を設けて表面積を増加させる方法〔仏国特許第２６９７９１３号〕、固相容器に薄い隙間を残して密着する棒状物を差し込み反応液が接触する固相表面積を増加させる方法〔特開昭５８−００５６５７〕、あるいは微粒子化した固相を用いて総表面積を増加させる方法〔米国特許第４０１８８８６号〕などが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前述の羽状固相法や棒状物質挿入法は特殊な固相を用いたときのみ実施可能な技術であり汎用性に乏しい。また、微粒子固相は扱いが難しいので用手法には不向きで、自動装置などの限られた場合でのみ使用されている。このように、既存の材料を用い、従来法と変わらない操作性を有した状態において、一定量の反応液に対して直接接触しうる固相の表面積を増やすという試みには自ずから限界があった。また、一定量の被検液に対しての固相の接触表面積を増やすための方策として、被検液を適当な溶媒で希釈し総反応液量を増やして測定する方法も行われるが、この場合測定対象物質の濃度が薄まり、反応効率が低下するので十分な反応時間短縮効果は得られなかった。
【０００６】
これまで上記のような発想しか得られなかった最大の要因は、従来の固相測定法では測定の精度を保持するため固相表面に対して反応液が常に均質に接触していなければならないという固定観念がはたらいていたためである。すなわち、固相の一部分でも反応液と接触していない状態が生じれば、その部分で本来起こるべき反応が起こらず、測定間の反応が不均一になること、または液と接触しなければその部分が乾燥して被覆された反応物質が失活し、結合性の低下あるいは結合物質の離脱が生じることなどの要因で十分な測定精度が得られないことなどの考えが当業者の間においてなかば通念化されていたためである。「固相は充分量の液相に完全に浸して用いる。」という常識は、酵素標識でラベルされた測定対象物質を固相にトラップし、この物質を酵素反応で検出する、酵素免疫測定法（Enzyme Immuno Assay: EIA）の酵素反応系においても、全く同様である。すなわち、「酵素標識−測定対象物質−担体」は酵素基質を含む反応溶液に完全に浸漬された状態で用いられてきた。
【０００７】
本発明の目的は、特殊な固相や自動化装置のみならず、汎用の固相を使用し、用手法でも実施できる、簡便かつ迅速な測定法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、イムノアッセイや核酸のハイブリダイゼーションのように、測定対象物質を特異的に結合する物質で固相にトラップする測定方法において、固相担体の一部分のみ反応液のプールに浸漬させ、その浸漬部分を絶えず入れ替えれば、あたかも固相の全表面が均質に反応液と接触しているがごとく反応が進行し、さらには反応時間が短縮できることを見出し、本発明に到った。更に、酵素免疫測定法における、担体上の標識を検出するための酵素反応においても、本発明の原理の適用に成功した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するものである。
［１］不溶性担体の表面に、測定対象物質と特異的に結合する物質により、被検液を含む反応液中の測定対象物質を捕捉する反応を行う測定方法において、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を満たすことを特徴とする測定対象物質の測定方法。
（Ａ）固相担体の一部分が被検液を含む反応液のプールに浸漬されている。
（Ｂ）固相担体の他の部分は、常に反応液で濡れて、反応液の薄い層が形成されている。
（Ｃ）上記（Ａ）および（Ｂ）の固相担体の部分は絶えず入れ替わっている。
［２］上記担体がポリスチレンボール、ポリスチレンテストチューブまたはポリスチレンカップであることを特徴とする［１]の測定方法。
［３］測定対象物質とそれに特異的に結合する物質との結合反応が免疫反応（抗原抗体反応）であることを特徴とする［１］の測定方法。
［４］測定対象物質がＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）抗原または抗ＨＩＶ抗体、それに特異的に結合する物質が特異的抗ＨＩＶ抗体またはＨＩＶ抗原であることを特徴とする［３］の測定方法。
［５］不溶性担体の表面に、測定対象物質と特異的に結合する物質で測定対象物質を捕捉し、当該測定対象物質に標識として酵素を導入し、得られた「不溶性担体−測定対象物質−酵素」複合体を酵素反応溶液中で反応させる測定方法（酵素免疫測定法）において、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を満たすことを特徴とする測定対象物質の測定方法。
（Ａ）担体表面の一部分が酵素反応溶液のプールに浸漬されている。
（Ｂ）担体表面の他の部分は、酵素反応溶液で濡れて、反応溶液の薄い層が形成されている。
（Ｃ）上記（Ａ）および（Ｂ）の担体表面の一部分と他の部分が、反応中、絶えず入れ替わっている。
［６］酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである［５］記載の測定方法。
［７］ ［１］または［５］の測定方法を用いた測定キットおよびその試薬。
【００１０】
以下、本発明における用語の意味あるいは定義について説明する。
「測定対象物質」とは、本発明の測定法で定量しうる生理活性物質を意味し、これまで、タンパク質のイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションなど、固相測定法において測定され得た物質であれば特に限定されない。例えば、抗原、抗体、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、糖質、脂質およびリガンドなどである。抗原物質としては、例えば、ＨＩＶのコア抗原やＨＢＶの表面抗原のようなウイルス抗原、インスリンや成長ホルモン（ＧＨ）のような蛋白性ホルモン類、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）やフィブリン分解物のような血漿蛋白類、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような腫瘍マーカー類あるいはチロキシンやバソプレッシンのようなハプテン類等が挙げられる。また、抗体としては、抗ＨＩＶ抗体や抗ＨＢＶ抗体のような抗ウィルス抗体、抗核抗体や抗サイログロブリンのような自己抗体、抗インターフェロン抗体や抗成長ホルモン抗体のような抗蛋白製剤抗体あるいはアレルゲン特異ＩｇＥ等が挙げられる。一方、核酸としては、フェニルケトン尿症や家族性アミロイドポリニューロパチーのような遺伝子疾患のＤＮＡ、ＨＩＶや結核菌のような病原体のＲＮＡまたはＤＮＡ、神経芽細胞腫のＮ−ｍｙｃやバーキットリンパ腫のＣ−ｍｙｃのような癌遺伝子のＤＮＡ等が挙げられる。さらに、糖質としては糖化ヘモグロビンＡ１Ｃやヒアルロン酸等が、脂質としてはリポ蛋白（ａ）等が挙げられる。その他リガンドとしては、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３等が挙げられる。
【００１１】
「測定対象物質と特異的に結合する物質」とは、測定対象物質に選択的に高い親和性を示す物質を意味する。例えば、測定対象物質が抗原物質の場合は特異的抗体等が、抗体の場合は抗原または抗抗体等が、核酸の場合は相補的なヌクレオチド配列をもつＤＮＡあるいはＲＮＡ等が、糖質の場合はレクチン等が、あるいはリガンドの場合はレセプター等が挙げられる。
【００１２】
「不溶性の担体」とは、反応液中の測定対象物質をトラップするための固相を意味し、イムノアッセイなど本発明の技術分野において周知の概念である。通常使用される材質としては、ポリスチレン、ポリアクリル、ポリカーボネート、ポリメタクリエート、テフロン、セルロース膜、紙、ガラス、アガロース、フェライト、ラテックス（天然ゴム）等が挙げられる。形状も特に限定されず、例えば、ビーズ、プレート、スティック、ゲル、シート、カプセル等が挙げられる。
【００１３】
測定対象物質と特異的に結合する物質で、固相担体の表面を被覆する技術も、当該分野で公知の技術を用いれば良い。すなわち、測定対象物質と特異的に結合する物質は物理的吸着で被覆されてもよいし、アミノ基やカルボキシル基等を介して共有結合的に被覆されていてもよい。さらに、アビジン−ビオチン系など、一種以上の適当な介在物質を介して間接的に被覆する方法は反応性を高めるための好適な被覆法の一つである。また、被検液中の非特異物質の固相への吸着を防ぐために通常行われる操作についても、従来用いられたいかなる方法でもかまわない。そのために使用される物質の例としては、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルク等が挙げられる。
【００１４】
「被検液」としては、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、髄液、リンパ液等の生体液あるいは細胞培養液、抽出液、懸濁液など測定対象物質を含む各種緩衝液等が挙げられる。当該分野で周知の概念であり、現在までに測定された検体であれば特に限定されない。
【００１５】
「固相担体の一部分が被検液を含む反応液のプールに浸漬されている。」の意味するものは、反応中に、固相担体表面のうち、反応液のプールに浸漬された部分と浸漬されていない部分がそれぞれ存在している状態を示している。この場合、「反応液のプール」とは、まとまった液量の反応溶液が保持された、反応系の一部を意味する。「反応液のプール」は、テストチューブなど凹型の反応容器に適当量の反応液を保持する事で、作ることができる。種々の形態の固相担体は、この反応液プールの中に、一部分が浸漬された状態で用いられる。その代表的な一形態、ビーズ型固相を適当なサイズのテストチューブに保持された反応液プールに一部分浸漬させる場合を図１のＡに示す。この「反応液に浸っている一部分の、固相表面全体に対する比率」は、測定対象および測定条件により変わり得るため、特に限定されないが、当業者であれば適宜最適条件を設定しうる。一般に、当該比率を小さくすればするほど、反応液に対する固相の表面積は大きくすることができるが、実用に際して、均一な反応液の薄層を固相表面に作ることが困難になる。逆に、当該比率が大き過ぎれば、本発明の特徴である反応液容量に対する固相表面積の増加が小さくなり、効果（反応時間短縮、感度増加など）が少なくなる。通常、この実用性と効果のバランスから、比率５〜５０％が好ましい態様として推奨される。特に、ビーズ型の固相担体をもちい、テストチューブに保持された反応液プールを用いる場合、ビーズ表面の１０〜３０％が反応液プールに浸漬されているような態様が好ましい。
【００１６】
また、固相担体そのものをテストチューブ型のような凹型にした場合は、反応液プールもその固相上に保持でき、図２に示すように、特異的に結合する物質で被覆された固相表面（テストチューブの内面）の一部分が反応液に浸っているという状態で用いられる。図２は、凹型固相を斜めにして回転させ、反応液プールと反応液薄層を作る例である。また、底面が円錐型になっている円筒型カップも凹型担体として好ましい態様である（図３）。カップ静止時、反応液プールは円錐型の底部に形成されるが、カップを回転させることによって、遠心力で、カップ側面に移動する。その後、回転を停止すれば、再び反応液プールは底部に移動する。即ち、カップの回転を断続的に行うことによって、固相表面に接する反応液プールと反応液の薄層は、絶えず入れ替わることになる。カップの回転は、カップの底に回転モーターの軸を接続するなどして容易に達成しうるので、この反応形態は、本発明を自動化装置に適用する場合の好ましい実施形態の１つである。
【００１７】
上記のように、本発明においては、反応液プールに浸漬される固相表面が絶えず入れ替わることが最大の特徴である（図１〜３、Ｂ〜Ｃ）。すなわち、固相表面のそれぞれの箇所は、「一定時間内に一度は」反応液のプールに浸漬されるように、また、その他の時間は、プール外で外気に露出されるが、反応液で濡れている状態になるように操作、調整される。すなわち、反応中、固相表面は反応液プール内と外とを絶えず循環し（循環）、反応は、反応液プール内と固相表面の薄い液層（薄層液相）の両方で行われるのである。
【００１８】
ここで強調されるべき点は、ただ単に反応液プールと固相の接触部位を循環させて、反応に関わる固相の延べ表面積を広げているだけではないということである。測定対象物質に特異的に反応する物質や非特異吸着を防ぐための物質が表面に被覆されることにより、一般的な担体表面は、溶液に対する親和力が高くなっている。従って、反応液のプールと直接接触していない状態に曝されても、一定時間は表面に薄い反応液の層が保持され（図１、Ｃ）、反応液プールと直接接触している部分と同じようにして反応が進行する。そして、薄液層中に存在する測定対象物質の固相への結合が飽和に達したり、固相表面が乾燥したりして反応が止まるまでの時間内に、反応液のプールに接触させるようにすれば、あたかも固相の全表面が反応液のプールに均質に浸っているかのごとくに反応が進行し、反応速度が飛躍的に向上するのである。従って、ここでいう「一定時間」とは、薄膜層中に存在する測定対象物質の固相との反応が飽和に達したり、固相表面が乾燥したりして反応が止まるまでの時間をいう。通常は５分間以内、好ましくは１分以内である。
【００１９】
常に固相が循環するような環境を達成するための手段は、特に限定されるものではないが、下記のような方法が例示される。
（１）固相の回転、移動、変形等。固相を回転、移動等させる方法としては反応容器を振とう、攪拌、転倒等させる物理的方法や、固相内部に鉄などを仕込ませ外から磁力で操作する方法、あるいは電気モーターの回転力を利用する方法などが挙げられる。最も手軽に出来る方法は、ビーズ型など回転しやすい形状の固相を、適当なサイズの丸底のチューブにいれて、チューブごとインキュベータで振とうさせる方法である。また、テストチューブ型固相を斜めにして回転させる方法も簡便である。テストカップ型固相を垂直にして断続的に回転／停止させる方法も用いうる。（２）反応液を回転、移動、浸透等させてもよい。反応液を回転、移動等させる方法としては上記物理的方法の他にポンプ等で液を循環させる方法、溶液自身の毛管現象を利用する方法などが挙げられる。
【００２０】
上述の薄層液相循環システムは、また、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識アッセイの酵素反応に応用しうる。即ち、被検液中の測定対象物質と特異的に結合する物質で被覆された不溶性担体の表面に測定対象物質を捕捉し、当該測定対象物質に標識として酵素を導入し、得られた「固相担体−測定対象物質−酵素」を酵素の基質溶液に加えて、酵素反応の反応生成物を定量する際、（Ａ）「固相担体−測定対象物質−酵素」の一部が、酵素基質を含む溶液のプールに浸漬されており、（Ｂ）担体表面の他の部分は、基質溶液で濡れて、基質溶液の薄い層が形成されており、（Ｃ）上記（Ａ）および（Ｂ）の担体表面の一部分と他の部分が、反応中、絶えず入れ替わっている、状態で反応を行うことにより、優れた反応効率を得ることが出来る。反応液中の測定対象物質と固相上の特異的結合物質との結合が促進されるのと同様に、基質溶液中の酵素基質と固相上の酵素との結合も促進されるからである。一般に、ラベル酵素用の基質は、その酵素のＫｍ値以下の濃度で用いられるため、通常の系でも基質濃度を上げれば反応速度も上がる。が、従来の基質溶液を充分量用いる系で基質濃度を上げれば、基質の総量、即ち基質由来の発色や蛍光が増えて測定の妨げになる。本発明の系では、基質の総量を低く押さえたまま、高い基質濃度で反応を行うことができるのが特徴である。勿論、先述のように、固相担体上の酵素はまんべんなく基質溶液に接触するように操作されるため、反応の均質性、定量性が損なわれることはない。「固相担体−測定対象物質−酵素」複合体の形成方法は、通常の酵素免疫測定法で用いられるいかなる方法でもかまわない。すなわち、あらかじめ酵素標識された、測定対象物質と特異的に結合する物質を用いて（サンドイッチ法）形成させても良いし、あらかじめ酵素標識された、測定対象物質と競合反応する物質を用いて（競合法）形成させてもよい。前者の場合は、１ステップ法でも２ステップ法でもかまわなし、測定対象物質と酵素標識された物質を先に液相で反応させた後に固相担体に捕捉してもよい。
【００２１】
本発明の酵素反応系を実施するにあたって、酵素標識の種類や基質の種類、濃度には特に制限は無いが、一般的には酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼやペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が用いられる。酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合の反応方法の例としては、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として、生成物４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定する方法等が挙げられる〔今川ら、アンナルス・クリニカル・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２１巻、第３１０頁（１９８４）〕。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法は、下記の手順にて実施できる。以下、本発明の一態様：測定対象物質が抗原である２ステップサンドイッチイムノアッセイの場合を例にとって具体的に説明する。
（１）特異的抗体による固相担体の被覆。ポリスチレンボールなどのイムノアッセイ用固相を抗体溶液で処理し、物理的に抗体を表面に吸着させて、固相担体を調製する。
（２）反応液プールの調製。適当なサイズのテストチューブに、免疫反応用の緩衝液および測定対象物質を含む被検液を加え、反応液プールを作る。このとき、反応液プールの液量や液深は、予備的試験により設定された適当なものを用いる。一般的には、固相表面を十分に濡らしうる範囲でなるべく少ない量を選択すると効果的である。直径６ｍｍのボールを内径１３ｍｍのテストチューブに入れた場合、液量は１０〜３０μＬ有れば十分である。
（３）反応。固相担体を反応液プールに加え、振とうしながら、インキュベートする。反応終了後、固相を反応液から分離して、洗浄する。
（４）標識化。測定対象の抗原に特異的に結合する抗体を予め標識したものを、洗浄された固相に加え、（２）で固相表面にトラップされた抗原を標識化する。標識には、β−ガラクトシダーゼなどの酵素標識、放射性ヨウ素などのＲＩ標識、蛍光物質など、公知の標識物質を適宜用いうる。
（５）測定。（４）で標識化された抗原を公知の方法で定量する。あるいは、上記（２）の免疫反応と同様に、本発明の循環薄層液相法を用いて酵素反応を行う。
【００２３】
以上、代表的な態様の手順を記載したが、もとより、本発明は、これまで固相を用いて実施されてきた全ての測定において使用可能である。免疫複合体転移法においては、第一固相へ測定対象物質をトラップする反応、第一固相から第二固相への免疫複合体を転移させる反応、いずれに於いても用いることができる。すなわち、測定系はホモジニアス系でもヘテロジニアス系でもよく、サンドイッチ法でも競合法でもよい。また、検出方法も比色、蛍光、発光、放射線等いっさいの制限はない。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例にて説明する。
実施例１
本実施例では、本発明の特徴を直接的に示すために、一定量の溶液中に存在する擬似被検物質を固相に捕捉する反応を本発明法により行った。各物質の精製・調製の詳細、および実験手順の詳細は以下の通りである。
〔緩衝液〕
本実験では、以下の緩衝液を主に使用した。
緩衝液Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
緩衝液Ｂ：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
緩衝液Ｃ：０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ、インターゲン社、ニューヨーク）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌアジ化ナトリウム
緩衝液Ｄ：緩衝液Ｃにおいてウシ血清アルブミン濃度が０．１ｇ／Ｌのもの
【００２５】
〔アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化固相の調製〕ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン抗体（ＩｇＧ）溶液を２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンカラムに吸着後、ｐＨ２．５で溶出する公知の方法〔橋田ら、アナリティカル・レターズ（Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．）、第１６巻、第３１頁（１９８３）〕でアフィニティー精製した抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧを既報〔石川ら、スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（前出）〕〕の方法に従い、ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ、イムノケミカル社、岡山）及びポリスチレンテストチューブ（１２×７５ｍｍ、マキシソープ４４４２０２、ヌンク社、ロスキルデ、デンマーク）に不溶化した。用いた溶液のＩｇＧ濃度は５０μｇ／ｍＬであり、ポリスチレンテストチューブ１本あたりに用いた溶液量は６００μＬであった。
【００２６】
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製〕
５ｍｍｏｌ／ＬのεＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン（東京化成工業、東京）を含む緩衝液Ａ、４５０μＬと３０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート（同仁化学研究所、熊本）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０μＬを混合し３０℃で３０分間反応させた。この６−マレイミドヘキサノイル・εＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン溶液７．５μＬ（２２．５ｎｍｏｌ）と２．７ｍｇ（５ｎｍｏｌ）の大腸菌由来β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社、マンハイム、ドイツ）を含む緩衝液Ｂ、３００μＬを３０℃で３０分間反応させた。その後反応液に０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１９３μＬを加えてセファデックスＧ−５０（ファイン、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、ウプサラ、スウェーデン）カラム（１．１×５．３ｃｍ）を用いて既報〔Ｈ．Ｓ．ペネフスキーら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第５６巻、第５２７頁（１９７９）〕のゲル濾過クロマトグラフィー法により２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを精製した。ゲル濾過に用いた緩衝液は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を用いた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当りに導入された２，４−ジニトロフェニル基の平均の数は３．９個であった。
【００２７】
〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定〕
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質とする公知の方法〔今川ら、アンナルス・クリニカル・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２１巻、第３１０頁（１９８４）〕で反応させ、生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を分光蛍光光度計（ＲＦ−５１０、島津製作所、京都）で測定した。蛍光値は、１×１０−８ｍｏｌ／Ｌの４−メチルウンベリフェロンを含む０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．３の示す蛍光強度を１００として補正を行った。
【００２８】
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールへの結合〕
１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ、１５μＬ（濃度７．７ａｍｏｌ／μＬ）を１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブの底に入れ、これにアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を加え、室温で１．２５分間および２．５分間振とう反応させた。振とうの条件は、１５×１５×２０（高さ）ｍｍの枠の中にスチロールテストチューブを立て、２．５ｃｍの振幅を毎分１４０往復させて振とうした。次いでポリスチレンボールを緩衝液Ｄ、２ｍＬにより４回洗浄した後、ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性を室温５分間反応で測定した。それぞれの反応時間において、最初の緩衝液中に含まれていた１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのうちポリスチレンボールに結合した割合（％）を表１および図４に示す。
【００２９】
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのアフィニティ精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンテストチューブへの結合〕
抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンテストチューブ（１２×７５ｍｍ）に１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ、１５μＬ（濃度７．７ａｍｏｌ／μＬ）を添加し、添加した反応溶液がＩｇＧ不溶化面に一様にかわるがわる接触するように、チューブを毎分約３０回の速さで回転させながら、室温で１．２５分間および２．５分間反応させた。次いで、チューブ内を緩衝液Ｄ、０．７ｍＬで２回、０．９ｍＬで２回洗浄した後、ポリスチレンテストチューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性を室温で５分間反応させて測定した。それぞれの反応時間において、最初の緩衝液中に含まれていた１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのうちポリスチレンテストチューブに結合した割合（％）を表１および図４に示す。
【００３０】
比較例１
本比較例では、実施例１と同じく一定量の溶液中に存在する擬似被検物質を固相に捕捉する反応を従来のように固相全体に反応液が接触する状態で行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は実施例１に記載した通りである。
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールへの結合〕
実施例１と同様、１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ、１５０μＬ（濃度０．７７ａｍｏｌ／μＬ）を１０×７５ｍｍのガラステストチューブに入れ、これにアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を加え、室温で１．２５分間および２．５分間振とう反応させた（１５０μＬは、直径６．３５ｍｍのポリスチレンボール全体を反応液に浸しておくために必要な最小体積である）。振とうの条件は、１４×１４ｍｍ枠の試験管立てにガラステストチューブを入れて、２．５ｃｍの振幅を毎分１７０往復させて振とうした。次いでポリスチレンボールを緩衝液Ｄ，２ｍＬにより４回洗浄した後、ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性を室温５分間反応で測定した。それぞれの反応時間において、最初の緩衝液中に含まれていた１１５．５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのうちポリスチレンボールに結合した割合（％）を実施例１の結果と合わせて表１および図４に示す。また、１０倍量である１１５５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ、１５０μＬ（従って、濃度は実施例１と同じ７．７ａｍｏｌ／μＬ）を用いて全く同様の操作を行った。このときの反応時間と、最初の緩衝液中に含まれていた１１５５ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのうちポリスチレンボールに結合した割合（％）の関係を同じく実施例１の結果と合わせて表１および図４に示す。
【００３１】
【表１】
0003871806.tif 000002
【００３２】
実施例２
本実施例では、実施例１と同様に、本発明法により擬似被検物質を固相に捕捉する反応を、遠心カップ型固相を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は実施例１に記載した通りである。
〔アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンカップの調製〕
１０μｇ／ｍＬのアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５ｍＬをポリスチレンカップ（図３、Ｄ）に加え、４℃で一夜静置した。抗体溶液を除去した後、ポリスチレンカップに緩衝液Ｃを１０ｍＬ加えて、使用まで４℃で静置し保存した。
【００３３】
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンカップへの結合〕
アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンカップを使用前に緩衝液Ｃにより洗浄した後、以下の２通りの方法により実験を行った。
（手動法）ポリスチレンカップに２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１．１５５ｐｍｏｌを含む緩衝液Ｃ１５０μＬを加えて、手動により、反応液プールを抗体不溶化表面上で順次移動させながら、室温で１分間、２分間および４分間反応させた後、反応液中の残存β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ポリスチレンカップに添加された２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼのうち、抗体不溶化表面に捕捉された分子の割合（％）を求めた。
（回転装置法）あらかじめ、回転装置の回転軸方向にカップの中心軸をそろえて固定した抗体不溶化ポリスチレンカップに、手動法と同様、１．１５５ｐｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ１５０μＬを添加した後、回転装置によりカップを回転させて、その遠心力により反応液プールが抗体が不溶化されたカップ側面に移動したら回転を止めて反応液プールを下降させる操作を繰り返し、手動法と同様、１分間、２分間および４分間の反応後に、抗体不溶化表面に捕捉された２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ分子の割合（％）を求めた。
それぞれの結果を表２および図５に示した。
【００３４】
【表２】
0003871806.tif 000003
【００３５】
実施例３
本実施例では、抗ｐ２４抗体が不溶化された直径６．３５ｍｍのポリスチレンボール固相を用いた被検液中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定を本発明法を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔遺伝子組み替えＨＩＶ−１，ｐ２４（ｒｐ２４）の調製〕
遺伝子組み替えＨＩＶ−１，ｐ２４（ｒｐ２４）は、ＨＩＶ−１単離株由来のＤＮＡからポリメラーゼ鎖反応法（ＰＣＲ法）で増幅させたｐ２４ＤＮＡ断片をプラスミドに導入し、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、その後各種蛋白精製法を用いて精製した後に、ベーリンガー・マンハイム社（マンハイム、ドイツ）のキットを用い、同社の操作手順に従って、ビオチニルＸａ因子によるｒｐ２４とＭＢＰの切断およびストレプトアビジンカラムによるビオチニルＸａ因子の除去を行って調製した。精製したｒｐ２４の純度は電気泳動法にて確認した。
【００３６】
〔２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’の調製〕
精製ｒｐ２４を既報〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第３３巻、第２９８頁（１９９５）〕の方法にてウサギに免疫して抗血清を得、さらに公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第１０巻、第３０２頁（１９９６）〕で２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’を調製した。
【００３７】
〔２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’不溶化ポリスチレンボールの調製〕
２００ｆｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’を含む緩衝液Ｃ１５μＬを１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブの底に入れ、実施例１で作製したアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を添加し、実施例１と同様の方法で１０分間振とうした後にポリスチレンボールを洗浄して調製した。
【００３８】
〔マウスモノクローナル抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製〕
マウス抗ｐ２４モノクローナル抗体は、イノジェネティクス社（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、ベルギー）から購入し、既報〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（１９９６）、（前出）〕の方法により調製した。
【００３９】
〔被検液中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定〕
１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブの底に３００ａｍｏｌのＨＩＶ−１，ｐ２４抗原を含む緩衝液Ｃを１５μＬ入れ、これに２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ｐ２４Ｆａｂ’不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）を加えて、実施例１と同じ方法により１．２５分間、２．５分間および５分間振とうして反応させた後ポリスチレンボールを洗浄した。次いで、４０ｆｍｏｌのマウスモノクローナル抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ１５μＬを入れた１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブに洗浄したポリスチレンボールを移し、同様に５分間振とう、洗浄を行った後、ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を３０分間反応で測定した。最初の反応の反応時間とポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値の関係を表３および図６に示す。
【００４０】
比較例２
本比較例では、実施例３と同じく一定量のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原を含む溶液と抗ｐ２４抗体不溶化ポリスチレンボールの反応を従来のようにポリスチレンボール全体に反応液が接触する状態で行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔被検液中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定〕
３００ａｍｏｌのｐ２４抗原を含む緩衝液Ｃ１５０μＬを１０×７５ｍｍのガラステストチューブに入れ、これに２，４−ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を加えて、比較例１と同じ方法により２．５分間および５分間振とうした後、実施例１と同様の方法によりポリスチレンボールを洗浄した。次いで、実施例３と同じ方法により洗浄したポリスチレンボールをモノクローナルマウス抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼと反応させた後、ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。最初の反応の反応時間とポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値の関係を実施例３の結果とあわせて表３及び図６に示す。
【００４１】
【表３】
0003871806.tif 000004
【００４２】
実施例４
本実施例では、ｐ１７抗原が不溶化された直径６．３５ｍｍのポリスチレンボール固相に被検液中の抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体を捕捉し、酵素標識ｐ１７で検出する測定を本発明法を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔マルトース結合蛋白融合遺伝子組換えＨＩＶ−１，ｐ１７抗原及び遺伝子組換えＨＩＶ−１，ｐ１７抗原の調製〕
マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）融合遺伝子組換えｐ１７（ｒｐ１７）は、実施例３に記載のｒｐ２４の調製法と同様に大腸菌で発現させ精製して調製した。さらに実施例３に記載のｒｐ２４の調製法と同様にＭＢＰ−ｒｐ１７を特異酵素で切断してｒｐ１７を調製した。精製したｒｐ１７−ＭＢＰおよびｒｐ１７それぞれが単一であることは電気泳動法にて確認した。
【００４３】
〔２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７の調製〕
Ｎ−サクシニミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートを用いてチオール基を導入したｐ１７−ＭＢＰとＮ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを用いてマレイミド基を導入したεＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンを反応させる公知の方法〔石川榮治著、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、第３１１頁（１９９３）〕により調製した。２８０ｎｍと３６０ｎｍの吸光度から求めるアイゼンらの方法〔Ｅｉｓｅｎら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第７３巻、第２９６頁（１９５４）〕で計算されたＭＢＰ−ｒｐ１７、１分子あたりに導入された２，４−ジニトロフェニル基の平均の数は、３．９個であった。
【００４４】
〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒｐ１７の調製〕
メルカプトアセチル−ｒｐ１７とマレイミド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させる公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第７巻、第３５３頁（１９９３年）〕により調製した。
【００４５】
〔２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７不溶化ポリスチレンボールの調製〕
１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブの底に８００ｆｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７を含む緩衝液Ｃを１５μＬ添加し、そこへ実施例１で作製したアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を加え、実施例１と同様の方法により５分間振とうした後、ポリスチレンボールを洗浄して調製した。
【００４６】
〔被検液中の抗ｐ１７抗体の測定〕
ＨＩＶ−１感染者血清を非感染者血清により、２×１０４倍、２×１０５倍および２×１０６倍に希釈し、その１０μＬと緩衝液Ｃ５μＬを、１４×５４ｍｍのスチロールテストチューブの底に入れて、これに２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）を加え、実施例１と同様の方法により、５分間振とうした。これに４０ｆｍｏｌのｒｐ１７−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ１０μＬを追加して、さらに１０分間同様に振とうした。次いで、実施例１と同じ方法によりポリスチレンボールを洗浄した後、ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を１０分間反応で測定した。各希釈血清を用いた時のポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値を表４に示す。
【００４７】
比較例３
本比較例では、実施例４と同様にＨＩＶ−１感染者血清を非感染者血清で希釈した血清検体中の抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体を従来の技術であるウェスタン・ブロッティング法で検出した。
〔抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体のウェスタン・ブロッティング法による検出〕
実施例４と同じＨＩＶ−１感染者血清を非感染者血清で希釈した検体（１×１０３倍および３×１０２倍希釈を含む）について、オルソＨＩＶウェスタン・ブロットキット（オルソ・ダイアグノスティック・システムス社（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ、ニュージャージー州、米国）を使って、既報〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（１９９３）（前出）〕の方法により、抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体の検出を行った。各希釈血清における検出結果を実施例４の結果と合わせて表４に示す。
【００４８】
【表４】
0003871806.tif 000005
【００４９】
実施例５
本実施例では、２種類の固相を用いて測定のバックグランドを減らし、超高感度に被検物質を測定する技術〔石川榮治著、「超高感度酵素免疫測定法」（前出）〕による抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体の測定を本発明法を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。〔アフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ不溶化ポリスチレンチューブの調製〕
ポリスチレンチューブ（１２×７５ｍｍ、マキシソープ４４４２０２、ヌンク社、デンマーク）にアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ、１０μｇ／ｍＬ及び１ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を４００μＬ加えて、４℃で一夜静置した。次いで、チューブを緩衝液Ｃで洗浄し、同緩衝液５００μＬを加えて、使用まで４℃で保存した。
【００５０】
〔被検液中の抗ｐ１７抗体の測定〕
ＨＩＶ−１感染者血清を実施例４と同様の方法で希釈した検体１０μＬとそれぞれ１００ｆｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７とｒｐ１７−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及び５μｇの不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ムテイン、ベーリンガー・マンハイム社、ドイツ）を含む緩衝液Ｃ（ただし塩化ナトリウム濃度は０．６２ｍｏｌ／Ｌ）１２μＬとを混合し、１４×５４ｍｍスチロールチューブ中で１０分間静置した。これに前記のアフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個を加えて、実施例１と同様の方法により５分間振とうして反応させた。ポリスチレンボールを緩衝液Ｄ２ｍＬで４回洗浄した後、１ｍｍｏｌ／ＬのεＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンを含む緩衝液Ｃ、３０μＬを底に添加したアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ不溶化ポリスチレンチューブにポリスチレンボールを移し、振とうして１０分間反応させた。振とうのためには、ポリスチレンチューブを１５×３０×２０（深さ）ｍｍの枠に入れて、２５ｍｍの幅を毎分１５０往復させた。ポリスチレンチューブを実施例１の方法により洗浄した後、チューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を１時間測定した。ただし、用いた基質溶液は実施例１の半分量、７５μＬとし、抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧを不溶化したチューブ内面が常に基質溶液と接触するようチューブを回転させた。各希釈血清を測定した時のポリスチレンチューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値を表５に示す。
【００５１】
実施例６
本実施例では、実施例４と同様の超高感度酵素免疫測定法による抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体の測定を本発明法を用い、実施例５とは異なる測定原理で行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔被検液中の抗ｐ１７抗体の測定〕
実施例５で用いたのと同じＨＩＶ−１感染者血清を非感染者血清で希釈した検体１０μＬと５μｇの不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ムテイン）を含む緩衝液Ｃ（ただし、塩化ナトリウムの濃度は０．７３ｍｏｌ／Ｌ）、６μＬを加えた１４×５４ｍｍスチロールチューブの底に、実施例３と同様の方法で調製した２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７不溶化ポリスチレンボール（６．３５ｍｍ）１個を添加し、実施例１と同様の方法で５分間振とうし反応させた。次いでこのチューブに、２００ｆｍｏｌのｒｐ１７−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ（ただし、塩化ナトリウム濃度は０．４ｍｏｌ／Ｌ）１０μＬを加えて、再び同様の方法で５分間振とうし反応させた。ポリスチレンボールを実施例１と同様の方法で洗浄した後、このポリスチレンボールを実施例４と同様の方法により、εＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンとともにアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ不溶化ポリスチレンチューブ（１２×７５ｍｍ）に入れて５分間振とうした。ポリスチレンチューブを洗浄した後ポリスチレンチューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を６０分間測定した。各希釈血清を測定した時のポリスチレンチューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値を表５に示す。
【００５２】
実施例７
本実施例では、実施例６と同じ測定を総測定時間の短縮を目的として一部反応時間を変えて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔被検液中の抗ｐ１７抗体の測定〕
実施例６の測定において、ｒｐ１７−β−Ｄ−ガラクトシダーゼとの反応時間を５分から１０分に、ポリスチレンチューブ内の反応を５分から１０分に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定時間を６０分から３０分に変えて行った。各希釈血清を測定した時のポリスチレンチューブに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値を表５に示す。
【００５３】
比較例４
本比較例では、超高感度酵素免疫測定法による抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体の測定を従来の技術を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径３．２ｍｍ）およびアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（直径３．２ｍｍ）の調製〕
実施例１の方法に従い、アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧおよびアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ、５０μｇ／ｍＬを含む緩衝液Ａ中にポリスチレンボール（直径３．２ｍｍ、イムノケミカル社、岡山）を４℃で２４時間浸すことにより物理的に吸着させて調製した。なお、両ポリスチレンボールを区別するため、アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧの不溶化には着色ポリスチレンボールを、アフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧの不溶化には白色ポリスチレンボールを用いた。
【００５４】
〔被検液中の抗ｐ１７抗体の測定〕
実施例４と同様に希釈したＨＩＶ−１感染者血清中の抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体を、既報〔石川節子ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第１２巻、第１７９頁（１９９８）〕の方法により測定した。ただし、２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−ｒｐ１７の代わりに２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７を用いた。実施例４と同じ希釈血清１０μＬを１００ｆｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７、１００ｆｍｏｌのｒｐ１７−β−Ｄ−ガラクトシダーゼおよび５０μｇの不活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ムテイン、前出）を含む緩衝液Ｃ（０．４ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む）１４０μＬと１０×７５ｍｍのガラステストチューブ中で室温で３０分間反応させた（全容積１５０μＬ）。反応後、アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ不溶化着色ポリスチレンボール（直径３．２ｍｍ）２個を加えて、比較例１と同じ方法により１時間振とうし、さらに着色ポリスチレンボールを洗浄した。洗浄した着色ポリスチレンボール２個を、１ｍｍｏｌ／ＬεＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンを含む緩衝液Ｃ、１５０μＬおよびアフィニティー精製抗ヒトＩｇＧγ鎖ＩｇＧ不溶化白色ポリスチレンボール（直径３．２ｍｍ）２個とともに１０×７５ｍｍのガラステストチューブに入れて、比較例１と同様の方法により室温で１時間振とうした。その後実施例１と同様の方法により白色ポリスチレンボールを洗浄し、白色ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を室温で１時間測定した。各希釈血清を用いた時の白色ポリスチレンボールに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値を実施例５〜７の結果と合わせて表５に示す。
【００５５】
【表５】
0003871806.tif 000006
【００５６】
実施例８
本実施例では、酵素免疫測定法における担体上の標識を検出するための酵素反応においても、本発明の薄層循環液相法が有用であることを示すために、不溶性担体の表面に結合した酵素の活性測定反応を本発明の方法を用いて行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合ポリスチレンボールの調製〕
実施例１の方法で調製した、アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル基ＩｇＧ結合ポリスチレンボール（直径６．３５ｍｍ）１個と２００ａｍｏｌの２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液Ｃ１５０μＬを１４×５４ｍｍスチロールテストチューブに添加し、振とうしながら１０分間室温でインキュベーションして調製した。
【００５７】
〔ポリスチレンボール結合β−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性測定〕
２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合ポリスチレンボールを緩衝液Ｃで洗浄後、０．１ｍｍｏｌ／Ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む緩衝液Ｄ２０μＬと１４×５４ｍｍスチロールテストチューブ中で、実施例１と同様の方法で振とうしながら１０分間室温で反応させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．３、２．５ｍＬを加えて反応を停止した後、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで蛍光強度を測定した。蛍光強度は、０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．３に溶解した１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ４−メチルウンベリフェロン溶液の蛍光強度を１００として補正した。また、２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの結合していないポリスチレンボールを用いて同様の実験を行った。２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの有無におけるそれぞれの蛍光強度および両者の比率を表６に示す。
【００５８】
比較例５
本比較例では、実施例８と同じく不溶性担体の表面に結合した酵素の活性測定反応を、従来のように担体全体に基質溶液が接触する状態で行った。各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。
〔ポリスチレンボール結合β−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性測定〕
実施例８の測定において、０．１ｍｍｏｌ／Ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む緩衝液Ｄの量を１５０μＬに変えて測定を行った。２，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの有無におけるそれぞれの蛍光強度および両者の比率を実施例８の結果と合わせて表６に示す。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
【発明の効果】
本発明法を用いると、検体中の被検物質を固相に捕捉する反応において、従来法に比べて飛躍的に反応効率が高まる結果、短い反応時間で高い捕捉率を達成し得る。この効果は、通常の抗原および抗体のサンドイッチ測定において顕著であるのみならず、、本発明者が開発した「免疫複合体転移法」にも有効である。従来の同方法に比べて１０分の１の免疫反応時間、あるいは３分の１以下の総測定時間で、従来と同等もしくはそれ以上の感度を達成できる。また、酵素免疫測定法において、本発明法を用いて酵素測定を行うと、従来法に比べて少量の基質溶液で反応が進むため、試薬自身に由来する反応のノイズが数分の１になり、測定の感度（信号／ノイズ）が数倍向上する。
【００６１】
以上のように、本発明法を用いれば、測定対象物質と特異的に結合する物質が被覆された不溶性の担体に被検液中の測定物質を捕捉して測定する系において、従来の材料を用いて、一定量の被検液に対して測定対象物質を高濃度に保ったままでより大きな表面積の固相と反応させることができるので、反応速度が飛躍的に高まり、それゆえ測定にかかる時間を大幅に短縮することが可能である。また、測定対象物質の濃度が高いため、もともと被検液中に存在した測定対象物質のうち固相へ捕捉される量が増え検出感度が高まる。さらに、反応が平衡に達するまでの時間が短いのでより再現性のよい測定ができること、反応に必要な溶液量が少量ですむので試薬量が節約でき、また試薬自身のもつノイズが減って測定の信号（Ｓ）／ノイズ（Ｎ）値が高くなることなどの利点もあわせ持つ。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態の一例を模式的に示す断面図である。
【図２】本発明の実施形態の一例を模式的に示す断面図である。
【図３】本発明の実施形態の一例を模式的に示す断面図である。
【図４】一定量の溶液中に含まれる被検物質と固相上の物質との反応において、ビーズ型およびチューブ型の固相を用いて、本発明法を用いた場合と従来の技術を用いた場合の反応時間と反応速度（率）の関係を示す図である。
【図５】一定量の溶液中に含まれる被検物質と固相上の物質との反応において、カップ型の固相を用いて本発明法を行った場合の反応時間と反応速度（率）の関係を示す図である。
【図６】被検液中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原を抗ｐ２４抗体が被覆された固相に捕捉して測定する系において、本発明技術と従来技術それぞれの反応時間と蛍光強度の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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