(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチキャピラリー電気泳動装置に装着される複数のキャピラリーカラムに試料が電気泳動する媒体となるゲルを充填するためのゲル充填装置であって、
それらのキャピラリーカラムは、その試料注入側の端部がカセットホルダの保持部材を貫通して２次元的に配列され、その保持部材との間に気密を保って固定されてキャピラリーカセットを構成しており、
このゲル充填装置は、上面に開口が設けられ、その開口には前記キャピラリーカラムの試料注入側の端部を内側に入れて前記カセットホルダによりその開口を密閉する密閉手段が設けられ、さらに排気口及び大気への開放口が設けられたチヤンバと、
ゲル溶液を収容し、前記キャピラリーカラムの試料注入側とは反対側の端部が浸されるゲル容器と、
前記チヤンバの排気口に設けられた排気手段と、
前記開放口に設けられた開閉弁と、を備えたことを特徴とするゲル充填装置。
【請求項２】
マルチキャピラリー電気泳動装置に装着される複数のキャピラリーカラムに試料が電気泳動する媒体となるゲルを充填するためのゲル充填装置であって、
それらのキャピラリーカラムは、その試料注入側の端部がカセットホルダの保持部材を貫通して２次元的に配列され、その保持部材との間に気密を保って固定されてキャピラリーカセットを構成しており、
このゲル充填装置は、上面に開口が設けられ、その開口には前記キャピラリーカラムの試料注入側の端部を内側に入れて前記カセットホルダによりその開口を密閉する密閉手段が設けられ、内部には前記開口が前記カセットホルダにより密閉された状態で前記キャピラリーカラムの試料注入側の端部が浸される位置にゲル溶液を収容し、さらに加圧口及び大気への開放口が設けられたチヤンバと、
前記チヤンバの加圧口に設けられた加圧手段と、
前記開放口に設けられた開閉弁と、を備えたことを特徴とするゲル充填装置。
【請求項３】
前記開放口と前記開閉弁との間には流量を調節する流量調節弁が設けられている請求項１又は２に記載のゲル充填装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はマルチキャピラリー電気泳動装置において使用される複数本のキャピラリーカラムに試料が電気泳動する媒体となるゲルを充填するためのゲル充填装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動装置は核酸、タンパク質、ぺプチド、糖などを分離分析するために使用されており、特に、ＤＮＡの塩基配列の解析には重要な役割を果たしている。
人ゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能力をもった電気泳動装置が必要となる。その１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配列したマルチキャピラリー電気泳動装置が提案されている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少なく高感度検出ができるのである。
【０００３】
複数本のキャピラリーカラムは、試料注入側では二次元的に配列され、検出側では平面上に一列に配列された状態で電気泳動装置に装着される。その複数本のキャピラリーカラムは、操作性の観点から、カセットホルダによって配列が固定されたキャピラリーカセットとすることが検討されている。
キャピラリー電気泳動装置の初期のものは１本のキャピラリーカラムを用いるものである。その場合にはキャピラリーカラムへのゲルの充填方法として、キャピラリーカラムの一端を容器内のゲル溶液に浸し、その容器を密閉してその容器内を加圧することによりゲルをキャピラリーカラムに押し込んで充填している。他の方法として、キャピラリーカラムの一端をゲル溶液に浸し、キャピラリーカラムの他端を減圧してゲルをキャピラリーカラムに吸引することにより充填することも行なわれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
マルチキャピラリー電気泳動においては、複数本のキャピラリーカラムを扱うため、試料注入側では試料注入の際にキャピラリーカラム端面を揃える必要があり、検出側では検出を行なう際のキャピラリー皮膜除去部を揃えて扱う必要があることから、試料注入側、検出側ともに所定の配置関係になるようにカセットホルダによって配列が固定されたキャピラリーカセットとすることが望ましい。
そして、キャピラリーカセットとした状態でキャピラリーカラムの１本ずつにゲルを充填することは非常に手間がかかり、また、現実的には不可能である。そこで、キャピラリーカセットを単位としてそれに含まれる全てのキャピラリーカラムにゲル充填を簡便に行なえるようにすることが望まれている。
そこで、本発明はそのようなキャピラリーカセットに含まれる全てのキャピラリーカラムへゲルを簡便に充填できるようにする装置を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、マルチキャピラリー電気泳動装置に装着される複数のキャピラリーカラムの試料注入側の端部がカセットホルダの保持部材を貫通して２次元的に配列されその保持部材との間に気密を保って固定されたキャピラリーカセットのキャピラリーカラムにゲルを充填するための装置である。
キャピラリーカラムへのゲル充填は吸引又は加圧のいずれによっても行なうことができる。ゲル充填の際、それぞれのキャピラリーカラムを１本ずつシールして吸引又は加圧を行なうのではなく、キャピラリーカラムを気密を保って固定しているカセットホルダにより、そのキャピラリーカセットの全てのキャピラリーカラムをシールし、同時にゲル充填を行なうようにする。
【０００６】
吸引によりゲル充填を行なう方式では、本発明は上面に開口が設けられ、その開口にはキャピラリーカラムの試料注入側の端部を内側に入れてカセットホルダによりその開口を密閉する密閉手段が設けられ、さらに排気口及び大気への開放口が設けられたチヤンバと、ゲル溶液を収容し、キャピラリーカラムの試料注入側とは反対側の端部が浸されるゲル容器と、チヤンバの排気口に設けられた排気手段と、開放口に設けられた開閉弁とを備えている。
吸引によりゲル充填を行なう場合、キャピラリーカセットの全てのキャピラリーカラムの検出側（試料注入側とは反対側）の先端をゲル容器に入ったゲルに浸し、チャンバの開口をキャピラリーカセットのカセットホルダで密閉し、排気手段によりチャンバ内を減圧してキャピラリーカラムにゲル溶液を吸入する。
【０００７】
また、加圧によりゲル充填を行なう方式では、本発明は上面に開口が設けられ、その開口にはキャピラリーカラムの試料注入側の端部を内側に入れてカセットホルダによりその開口を密閉する密閉手段が設けられ、内部にはその開口がカセットホルダにより密閉された状態でキャピラリーカラムの試料注入側の端部が浸される位置にゲル溶液を収容し、さらに加圧口及び大気への開放口が設けられたチヤンバと、チヤンバの加圧口に設けられた加圧手段と、開放口に設けられた開閉弁とを備えている。
加圧によってゲル充填を行なう場合、チヤンバ内にゲル溶液を入れ、そのゲル溶液に試料注入側のキャピラリーカラムの先端を浸してカセットホルダによりチャンバの開口を密閉し、加圧手段によりチャンバ内を加圧してキャピラリーカラムにゲルを圧入する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
チャンバの開放口と開閉弁との間には流量を調節する流量調節弁が設けられていることが好ましい。キャピラリーカラムへのゲル充填後、チャンバ内の圧力は大気に開放されるが、この時、チャンバ内が復圧するスピードをその流量調節弁により調整することができる。また、チャンバ内の減圧又は加圧の度合いが大きいときはキャピラリーカラムに充填されたゲルに空気が混入することがあるが、その場合にはその流量調節弁により減圧又は加圧の度合いを調整することができる。
加圧によってゲル充填を行なう方式の場合、チャンバ内にゲル溶液を直接入れてもよいが、チャンバ内に着脱可能な容器を設け、その容器にゲル溶液を収容するようにすれば、チャンバの保守の面で好ましい。
【０００９】
【実施例】
マルチキャピラリー電気泳動装置の一例の概略斜視図を図１に示す。
キャピラリーカセット２は複数本のキャピラリーカラム１０２が配列され、カセットホルダ４、６により固定されてキャピラリーアレイを構成したものであり、そのキャピラリーアレイの一端２ａが試料注入側となってカセットホルダ４により二次元的に配列されて固定されており、試料注入後に泳動用のリザーバ６２のバッファ液と接触する。そのキャピラリーアレイの終端２ｂはキャピラリーカラム１０２が一列に配列されており、先端でリザーバ５６のバッファ液と接触する。キャピラリーアレイの終端側にはキャピラリーカラム１０２が一列に配列されてカセットホルダ６により支持されている被検出部２ｃが設けられている。キャピラリーカラム１０２は破損から守るために皮膜により被覆されている。泳動してきた試料を検出するのに蛍光検出法が用いられる場合、その被覆が蛍光を発するものであるときは、被検出部２ｃではその皮膜を除去しておく。キャピラリーカラム１０２として、無蛍光材質の被膜により被覆されているものを使用すれば、被検出部２ｃでもキャピラリーカラムの１０２の被膜は除去する必要がない。キャピラリーカセット２には多数のキャピラリーカラム、例えば３８４本のキャピラリーカラムが配列されている。
各キャピラリーカラム１０２には異なる試料がそれぞれ注入され、同時に電気泳動がなされる。
【００１０】
試料又は試料を標識した蛍光物質を励起するための励起光源８として、例えばアルゴンガスレーザ装置が設けられている。１０は励起・受光光学系であり、被検出部２ｃのキャピラリーカラム１０２に励起光のビームを照射し、試料からの蛍光を検出するものであり、走査機構（図示略）により、被検出部２ｃでのキャピラリーカセットの配列面に平行で泳動方向に直交する走査方向に走査される。励起光源８からの励起光ビームが励起・受光光学系１０の走査によってもずれないようにするために、ここでは一例として励起光源８からのレーザビームがカップラーにより結合された光ファイバ９を経て励起・受光光学系１０に導かれている。
【００１１】
下側のリザーバ６２には泳動用バッファ液が入れられ、キャピラリーアレイの下端２ａがそのバッファ液に浸され、そのバッファ液を通してキャピラリーカセット２の下端２ａのキャピラリー端に泳動用電圧が印加される。上側のリザーバ５６のバッファ液には上側電極５４が浸されて接触し、下側のリザーバ６２のバッファ液には下側電極５８が浸されて接触し、両電極５４，５８には高圧電源６０から泳動電圧が印加される。その電源電圧は例えば３０ｋＶで、電流容量は１０〜３０ｍＡである。
泳動される試料はタンパク質試料や、蛍光物質で標識されたＤＮＡフラグメント試料などである。
【００１２】
図２、図３及び図４に本発明によるゲル充填装置に装着されるキャピラリーカセットの一例の概略構成図を示す。図２は正面図、図３は左側面図、図４は上面図である。図１と同一の役割をする部分には同一符号を付す。
試料注入側のカセットホルダ４は、皮膜を有し、外径３００μｍ、内径１００μｍの石英ガラスキャピラリーカラム１０２を２次元的に配列するための樹脂製のホルダ板４ａ、４ｂの間に、キャピラリーカラム１０２を挟持して固定する厚さ５ｍｍのシリコーンゴム製のゴム板１４が挾み込まれ、固定ネジ４ｃにより一体化されたものである。ホルダ板４ａ，４ｂには、試料導入に使用する３８４穴マイクロプレートの各穴の位置に対応して、３８４個のキャピラリーカラム１０２を通す穴が４.５ｍｍピッチの１６×２４の２次元に設けられている。それらのホルダ板４ａ，４ｂの穴はキャピラリーカラム１０２の外径よりも大きく設定されている。キャピラリーカラム１０２は両ホルダ板４ａ、４ｂ及びその間に挾まれたゴム板１４を貫通し、ゴム板１４の穴内にゴムの弾性により挟持されることによりカセットホルダ４との間に気密を保って固定されている。ホルダ板４ａの一端にはキャリア取付け具２０が設けられている。
【００１３】
検出側のカセットホルダ６は、密着して平面上に並べられたキャピラリーカラム１０２を下側からはホルダ板６ａにより、上側からは厚さ２ｍｍのシリコーンゴム製のゴム板１６により挾むことによって固定している。ゴム板１６によりキャピラリーカラム１０２をホルダ板６ａに押しつけて固定するために、キャピラリーカラム１０２の配列の両側部でゴム板１６をホルダ板６ａに固定するホルダ板６ｂが設けられている。
【００１４】
カセットホルダ６において３８４本のキャピラリーカラム１０２を一列に並べると、密着させて並べても幅が約１２ｃｍとなるため、ゴム板１６は両端部を固定すると中央部で外側に向かって湾曲し、そのためカセットホルダ６の中央付近でゴム板１６がキャピラリーカラム１０２を保持する力が弱くなる。そこで、ゴム板１６がホルダ板６ｂによりホルダ板６ａに固定されている両端部間でゴム板１６がホルダ板６ａから離れる方向に浮き上がらないように、ホルダ板６ｂの内側（ゴム板１６との対向側）にはキャピラリーカラム１０２の配列方向に延びる２本の溝１７ａが設けられ、その溝１７ａにはゴム板１６をホルダ板６ａの方向に押すクランプバー１８ｂが数個所、例えば両側にそれぞれ３か所ずつの合計６ヵ所の位置に嵌め込まれ、各クランプバー１８ｂにはホルダ板６ｂに螺合してホルダ板６ｂの外側に突出したクランプねじ１８ａが設けられている。そのクランプねじ１８ａを調節することにより、ゴム板１６を介してキャピラリーカラム１０２を押しつける締め付け力を調節できるようになっている。
【００１５】
キャピラリーカラム１０２の全長は約５００ｍｍであり、インジェクション端から約４００ｍｍの位置に被検出部２ｃが設けられている。被検出部２ｃに検出用ウィンドウを形成するために、ホルダ板６ａ、６ｂ及びゴム板１６にはキャピラリーカラム１０２の配列方向に沿った長穴１７ｂがそれぞれ開けられ、長穴１７ｂの重なった部分が被検出部２ｃとなっている。電気泳動の際の信号検出は、その長穴１７ｂを通して行なわれる。
また、本発明によるゲル充填装置には、後述のように、カセットホルダ４を案内するガイド棒３０ａと、カセットホルダ４を固定する固定手段１１が設けられており、カセットホルダ４にはそのガイド棒３０ａが通るガイド穴３０ａと、その固定手段１１と係合するように４隅の厚さが外方向に向かって薄くなるように傾斜した固定部４ｄが設けられている。
【００１６】
本発明によるキャピラリーゲル充填装置の一実施例の概略構成図を図５、図６及び図７に示す。図５は密閉手段部及び固定手段部を一部切り欠いて示す正面図、図６はポンプ手段収納ボックスの上部及びその内部に設置されるタイマーユニットを一部を切り欠いて示す平面図、図７はポンプ手段収納ボックスを一部切り欠いて示す図６のＡ−Ａ線位置での断面図である。
基板１上に、図２、図３及び図４に示す試料注入側カセットホルダ４が固定されて密閉空間を作るチャンバ３と、そのチャンバ３内を加圧又は減圧するポンプ手段を内部に備えるポンプ手段収納ボックス５と、検出側カセットホルダ固定手段７と、検出側ゲル容器固定手段２９と、が備えられている。
【００１７】
チャンバ３は、上部及び底部を閉じるための厚さ１０ｍｍ、１７０ｍｍ角のアクリル板３ａ、３ｃ、及び側部を閉じるための外形１６５ｍｍ、内径１４５ｍｍのアクリルパイプ３ｂから構成されている。アクリルパイプ３ｂの両断面とアクリル板３ａ、３ｃとの間はシリコーンゴムパッキンを挾んでシールされている。アクリル板３ａには８０ｍｍ×１１５ｍｍの角穴の開口１３が設けられており、ここに試料注入側カセットホルダ４が装着される。この角穴開口１３の周りには溝が掘られ、その溝には環状で断面が円形のシリコーンスポンジ１３ａが篏め込まれている。シリコーンスポンジ１３はアクリル板３ａの表面より約半分が出ており、アクリル板３ａと試料注入側カセットホルダ４との間をシールする。アクリル板３ａ上には試料注入側カセットホルダ４をアクリル板３ａに固定するための４個のクランプ１１が備えられており、試料注入側カセットホルダ４の４隅の固定部４ｄと係合し、このクランプ１１を締めつけることにより、カセットホルダ４がスポンジ１３に押しつけられてチャンバ３の空間を密閉する。
【００１８】
アクリルパイプ３ｂの側面（円筒面）には２つのジョイントが設けられており、一方のジョイント１５には、チャンバ３内を加圧又は減圧するポンプ１９が接続されている。他方のジョイントには、ニードルバルブ１７を介して加圧又は減圧されたチャンバ３内の圧力を大気圧に開放する電磁弁２１が接続されており、その復圧スピードはニードルバルブ１７により調整される。
【００１９】
ポンプ手段収納ボックス５には、ポンプ１９及び電磁弁２１の他に、ポンプ１９の作動時間を制御するタイマ２３ａ、電磁弁２１の作動時間を制御するタイマ２３ｂが収納されている。
検出側ゲル容器固定手段２９には、検出側からゲル溶液を吸入する際にそのゲル溶液を蓄えておく検出側ゲル容器９ａが備えられている。ゲル溶液には例えば５％Ｔ、５％Ｃのポリアクリルアミド溶液を使用する。
【００２０】
次に、動作について説明する。実施例では図２、図３及び図４に示す３８４本のキャピラリーカラム１０２を備えたキャピラリーカセットを用いた。
３８４本のキャピラリーカラム１０２の試料注入側は、試料注入側カセットホルダ４によって市販のマイクロプレートに合わせて４．５ｍｍピッチの１６×２４の二次元に配列されて気密性よく固定され、その検出側は、検出側カセットホルダ６によって平面状に一列に密着して固定されている。
【００２１】
チャンバ３内部を減圧することによってゲル充填を行なう場合、検出側ゲル容器２９ａにゲル溶液を蓄えておく。キャピラリーカラム１０２の検出側の先端が検出側ゲル容器２９ａに入ったゲル溶液に浸かるように、検出側カセットホルダ６を検出側カセットホルダ固定手段７に固定する。試料注入側カセットホルダ４の４隅の固定部４ｄをアクリル板３ａ上に設けられた４個のクランプ１１によって固定し、クランプ１１を締め付けることによって試料注入側カセットホルダ４をシリコーンスポンジ１３ａに押し当て、アクリル板３ａに密着固定する。ポンプ１９によりチャンバ３内部を減圧してキャピラリーカラム１０２内部を減圧し、検出側の先端からゲル溶液を吸い込む。キャピラリーカラム１０２にゲル溶液が充填され、試料注入側からあふれ出す過剰量のゲル溶液は、図示しない容器をチャンバ３内部に備えて受けることが好ましい。
【００２２】
チャンバ３内部を加圧することによってゲル充填を行なう場合、ゲル溶液を蓄えた図示しない容器をチャンバ３内部に備え、容器２９ａは空にしておく。試料注入側カセットホルダ４の４隅の固定部４ｄをアクリル板３ａ上に設けられた４個のクランプ１１によって固定したとき、そのゲル容器に試料注入側の全てのキャピラリーカラムの先端が浸かるように、カセットホルダ４から突出するキャピラリーカラムの長さ、及びゲル容器を収容した容器の高さを調整しておく。検出側カセットホルダ６は検出側カセットホルダ固定手段７に固定する。この場合も、試料注入側カセットホルダ４は、クランプ１１を締め付けることによってシリコーンスポンジ１３に押し当てられ、アクリル板３ａに密着固定され、試料注入側カセットホルダ４、アクリル板３ａ、３ｂ及びアクリルパイプ３ｂで囲まれるチャンバ３内部の空間が密閉される。ポンプ１９によりチャンバ３内部を加圧し、その圧力によってゲル溶液をキャピラリーカラム内部に押し込む。キャピラリーカラム１０２にゲル溶液が充填され、検出側からあふれ出す過剰量のゲル溶液は、検出側ゲル容器２９ａによって受ける。
【００２３】
減圧する場合も加圧する場合も、全てのキャピラリーカラム１０２にゲル溶液が充填される時間を見計らって、ポンプ１９及び電磁弁２１の作動時間を予めタイマ２３ａ及び２３ｂによって設定しておく。ゲル溶液の充填がＲＵＮボタンにより開始されると、ポンプ１９が作動を始め、チャンバ３内部は減圧又は加圧される。タイマ２３ａに設定した時間だけ減圧又は加圧を続け、所定の時間でポンプ１９は停止する。ポンプ１９が停止してもチャンバ３内部は減圧又は加圧されたままなので、タイマ２３ｂに設定された時間が経過すると電磁弁２１が開き、ニードルバルブ１７を介してチャンバ３内部の圧力は大気に開放される。この時、チャンバ３内部が復圧するスピードはニードルバルブ１７により調整されている。
チャンバ３内部の減圧・加圧は、ジョイント１５に接続されている配管をポンプ１９の排気ポートと吸気ポートのどちらに接続するかによって選択することができる。
【００２４】
チャンバ３内部の減圧又は加圧の度合いが大きいために、キャピラリーカラムに充填されたゲルに空気が混入するのを防ぐために、減圧又は加圧の度合いを制御することが好ましい。この制御は、タイマ２３ａによりポンプ１９が作動しているときにも電磁弁２１を開いておき、ニードルバルブ１７に備えられたしぼりにより行なうことができる。その場合、タイマ２３ａの設定時間が経過すると電磁弁２１は一旦閉まり、タイマ２３ｂに設定された時間経過後、再び開いてチャンバ３内部を大気開放する。
【００２５】
実施例ではポンプ内臓タイプであるが、充填するゲル溶液が流動ゲルなど粘性の高いものであり高圧を発生する必要がある場合には、圧力発生源を外部とし、例えば高圧ボンベや真空ポンプに接続することが好ましい。高圧ボンベを使用する際には、新たな電磁弁を設けてタイマーにより制御し、ボンベ内の圧縮ガスをチャンバ内に導入することが好ましい。
実施例では減圧・排気の切り換えを可能にするためにダイアフラムポンプを使用したが、吸引のみ又は排気のみのポンプを用いてもよい。
【００２６】
【発明の効果】
マルチキャピラリー電気泳動装置に装着されるキャピラリーアレイを構成する複数本のキャピラリーカラムにゲル溶液を充填するとき、それぞれのキャピラリーカラムを直接密着固定するのではなく、複数本のキャピラリーカラムを気密性よく固定した試料注入側カセットホルダを用いて密着手段にシールしてゲルの充填を行なうので、複数本のキャピラリーカラムのゲル充填を同時に行なうことができる。また、簡便な装着と、装着した際の気密性を両立することができる。
複数本のキャピラリーカラムへのゲル溶液の充填を同時に行なうことができるため、マルチキャピラリー電気泳動の複数試料の泳動を同時に行なうことによる処理能力の向上という最大のメリットをその前処理であるゲル作成のプロセスで損なうことがない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明によりゲルを充填されるキャピラリーカセットを装着するマルチキャピラリー電気泳動装置の一例の概略斜視図である。
【図２】  本発明によりゲルを充填されるキャピラリーカセットの一例の正面図である。
【図３】  同キャピラリーカセットの左側面図である。
【図４】  同キャピラリーカセットの上面図である。
【図５】  一実施例のキャピラリーカラムゲル充填装置の概略構成を一部切り欠いて示す正面図である。
【図６】  同実施例を一部切り欠いて示す平面図である。
【図７】  同実施例を一部切り欠いて示す図６のＡ−Ａ線位置での断面図である。
【符号の説明】
１    基板
３    チャンバ
３ａ、３ｃ    アクリル板
３ｂ    アクリルパイプ
１１    クランプ
１３    シリコーンスポンジ
１７    ニードルバルブ
１９    ポンプ
２１    電磁弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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