(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
0003899373.tif 000015
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は互いに結合して環を形成してもよく；Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ(Ｒ24)−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を示し（Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい）；Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示すが、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｇ、又はＶ2と結合して環を形成してもよく；Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ10、−ＳＲ11、又は−Ｎ(Ｒ12)(Ｒ13)を示し、Ｒ7とＲ8、Ｒ8とＲ9、及びＲ7とＲ9は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ12とＲ13は互いに結合して環を形成してもよく；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し、ｎが２以上のときにはそれぞれのＲ8又はそれぞれのＲ9は同一でも異なっていてもよく；Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立に−Ｃ(Ｒ5)＝又は窒素原子を示し；ｍは０又は１を示し；Ｒ5は水素原子又は置換基を示し；Ｇは６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を示し、該環はさらに縮合環を有していてもよい）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
下記の一般式（Ｖ）：
【化２】
0003899373.tif 000016
（Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｑ、及びｎは上記と同義であり、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｒ15、又はＲ17と結合して環を形成してもよく；Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を示すが、Ｒ14とＲ15及びＲ16とＲ17は互いに結合して５ないし８員の環を形成してもよい）で表される化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｑが酸素原子又はイオウ原子である請求項２に記載の化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電気的に中性なクロモフォアを有する色素塩基として分類される一群の新規化合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト遺伝子配列の解析がほぼ終了し、今後これらの情報を元に遺伝子の機能解明が急速に進むものと予想されている。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列させたマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の同時解析に非常に有用である。このＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
核酸の検出方法としての色素の研究は比較的古くから行われてきた。電気泳動を利用した核酸の分離の際に核酸の存在位置を知るため、核酸染色を目的とした蛍光性色素として臭化エチジウム等がその例であるが、前述のように核酸を扱う技術革新とともに、核酸検出用の蛍光色素の重要性はますます大きくなっており、極めて多様なものが開発されつつある。この例としてはモレキュラー・プローブス社のHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 8th Edition（Molecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）に詳しく解説されている。
【０００４】
核酸検出用色素に関して必要な機能として、適度な核酸との相互作用を有し、核酸が存在しない場合には蛍光性が小さく、また核酸存在下では強い蛍光性を発揮できるものが必要であり、さらに水溶性が高く、様々な励起波長や検出波長に対応するために励起波長や発光波長のバリエーションの拡充が強く求められている。
【０００５】
また、単に核酸を検出するのみでなく、米国特許５，６５８，７５１号に記載のカチオン性クロモフォアを有する非対称シアニン色素のように、１本鎖核酸が混在した場合でも２本鎖核酸を定量するための色素も開発されている。また、米国特許５，６５６，４４９号には電気的に中性のクロモフォアを有する非対称シアニン色素が記載されており、生細胞においても核酸の蛍光検出に利用できる特徴が示されている。こうした用途においても、より厳密な定量性が得られることや、多様な励起波長や発光波長のバリエーションを与えることや、より高感度に核酸検出が可能になる新規蛍光性色素が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、多様な励起波長や発光波長のバリエーションを与え、幅広い用途に対して対応可能な新規な核酸検出用の高蛍光性色素を提供することである。また、核酸検出技術において、２本鎖核酸を１本鎖核酸から区別して検出する方法において、より高い選択性を発揮する蛍光性色素を提供することも本発明の課題である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は課題を達成するために鋭意検討を行い、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）で示される新規な非対称色素化合物を見出すに至った。これらの色素は中性のクロモフォアを有していることが特徴であり、一般には色素塩基として分類される化合物群の１つである。本発明者が見出した上記色素化合物は中性クロモフォアを有している他に５及び６員の２環が縮環したヘテロ環（アゾ−ル環とピリジン環が縮環している）を有している構造に特徴がある。この縮環系を有する色素は極めて堅牢であり、多様な用途に用いうる特徴を有している。アゾール環とピリジン環が縮環している構造を有するカチオン性のクロモフォアを持つ色素としては、例えば特開２００１−２７０９５７号公報に記載の色素、特開２００１−１６３８９５号公報に記載の色素などが知られているが、中性のクロモフォアを有する本発明の色素構造は知られていなかった。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）：
【化３】
0003899373.tif 000002
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は互いに結合して環を形成してもよく；Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ(Ｒ24)−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を示し（Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい）；Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示すが、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｇ、又はＶ2と結合して環を形成してもよく；Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ10、−ＳＲ11、又は−Ｎ(Ｒ12)(Ｒ13)を示し、Ｒ7とＲ8、Ｒ8とＲ9、及びＲ7とＲ9は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ12とＲ13は互いに結合して環を形成してもよく；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し、ｎが２以上のときにはそれぞれのＲ8又はそれぞれのＲ9は同一でも異なっていてもよく；Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立に−Ｃ(Ｒ5)＝又は窒素原子を示し；ｍは０又は１を示し；Ｒ5は水素原子又は置換基を示し；Ｇは６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を示し、該環はさらに縮合環を有していてもよい）で表される化合物又はその塩を提供するものである。
【０００９】
また、本発明により、下記の一般式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、又は（ＶＩＩＩ）：
【化４】
0003899373.tif 000003
（Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｑ、及びｎは上記と同義であり、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｒ15、又はＲ17と結合して環を形成してもよく；Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を示すが、Ｒ14とＲ15及びＲ16とＲ17は互いに結合して５ないし８員の環を形成してもよい）で表される化合物又はその塩も提供される。上記化合物又はその塩においてＱが酸素原子又はイオウ原子であることが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が置換基を表す場合、好ましい例としては、ハロゲン原子（例えばフロロ基、クロル基、ブロム基、ヨード基）、アルキル基（例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基）、アリール基（例えばフェニル基、トリル基、キシリル基）、ヘテロ環基（例えば、２−ピリジル基、Ｎ−ピロリジニル基、２−ベンゾチアゾリル基）、カルボアミド基（例えばアセチルアミノ基、プロピオニルアミノ基、ブチロイルアミノ基、ベンゾイルアミノ基）、スルホンアミド基（例えばメタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基、トルエンスルホニルアミノ基）、アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基）、アリールオキシ基（例えばフェノキシ基）、アルキルチオ基（例えばメチルチオ基、エチルチオ基、ブチルチオ基）、アリールチオ基（例えばフェニルチオ基、トリルチオ基）、アミノ基（例えばメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、フェニルアミノ基）、アンモニオ基（例えばトリメチルアンモニオ基、ジメチルベンジルアンモニオ基）、カルバモイル基（例えばメチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、ピペリジノカルボニル基、モルホリノカルボニル基、フェニルカルバモイル基）、スルファモイル基（例えばメチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、ピペリジノスルホニル基、モルホリノスルホニル基）、シアノ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホニル基、ホスホニオ基、スルホニオ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ヒドラジノ基、ホルミル基、ボラノ基（例えばジヒドロキシボラノ基）、メルカプト基、シリル基（例えばトリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基）、スルフィニル基（例えばメタンスルフィニル基、フェニルスルフィニル基）、スルホニル基（例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、フェニルスルホニル基、４−クロロフェニルスルホニル基）、アルコキシカルボニル基（例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基（例えばフェノキシカルボニル基）、アシル基（例えばアセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、アルキルベンゾイル基）、ウレイド基（例えばメチルアミノカルボンアミド基、ジエチルアミノカルボンアミド基）、チオウレイド基（例えば、３，３−ジメチルチオウレイド基）、ウレタン基（例えばメトキシカルボンアミド基、ブトキシカルボンアミド基、又はアシルオキシ基（例えばアセトキシ基、プロピオニルオキシ基、クロロアセトキシ基）等が挙げられる。
【００１１】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が示すこれら置換基の中でさらに好ましいのは、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、又はスルファモイル基である。これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい（本明細書において「〜」で定義される数値範囲は上限及び下限を含む範囲である）。Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3が互いに結合して環を形成する場合には５〜８員環が好ましい。形成される環は非芳香族又は芳香族のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよい。
【００１２】
Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（Ｒ24）−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を表す。Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい。Ｒ24及びＲ25が示すアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては３〜５０が好ましく、３〜３５がより好ましく、３〜２５がさらに好ましい。Ｑとしては酸素原子又はイオウ原子が好ましく、イオウ原子が最も好ましい。Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては４〜５０が好ましく、４〜３５がより好ましく、４〜２５がさらに好ましい。Ｒ6は可能な場合にはＲ1、Ｒ3、Ｇ、又はＶ2と結合して環を形成してもよい。
【００１３】
Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ10、−ＳＲ11、又は−Ｎ(Ｒ12)(Ｒ13)を示す。Ｒ7とＲ8、Ｒ8とＲ9及びＲ7とＲ9は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9としては水素原子、アルキル基、又はアリール基が好ましく、水素原子又はアルキル基がより好ましい。Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9が水素原子以外の場合はこれらの基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜３５が好ましく、１〜２５がより好ましく、１〜２０がさらに好ましい。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ12とＲ13は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13が示すこれらの基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては３〜５０が好ましく、３〜３５がより好ましく、３〜２５がさらに好ましい。
【００１４】
ｎは０、１、２又は３の整数を表す。ｎが２以上のときには、繰り返し単位におけるそれぞれのＲ8又はそれぞれのＲ9は同一又は異なっていてもよい。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立に−ＣＲ5＝又は窒素原子を表し、ｍは０又は１を表す。Ｇは５又は６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を表すが、該ヘテロ環はさらに縮合環を有していてもよい。縮合すべき環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ5は水素原子又は置換基を表すが、置換基の例としてはＲ1、Ｒ2、及びＲ3の例として挙げたものが好ましく、この置換基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜７０が好ましく、１〜５０がより好ましく、１〜３５がさらに好ましい。
【００１５】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表される化合物は核酸の有無、特に多重鎖核酸の有無によって大きな蛍光強度の差を有していることが望ましく、この観点から上記の一般式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、又は（ＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩がより好ましい。
【００１６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｑ、及びｎは一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のものと同義である。Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、アシル基、メルカプト基を表し、より好ましくは水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、アシル基であり、最も好ましいのは、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、シアノ基、スルホニル基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基である。これらのより具体的な例としてはＲ1、Ｒ2、及びＲ3の例として説明したものが挙げられる。これらの置換基はさらに置換されていてもよい。Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17のそれぞれの総原子数は１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。
【００１７】
Ｒ14とＲ15、及びＲ16とＲ17は互いに結合して５〜８員の環を形成してもよい。形成される環は非芳香族又は芳香族のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよいが、芳香族６員環であることが最も好ましい。本発明においては、Ｒ14とＲ15、又はＲ16とＲ17のいずれかがベンゾ縮合環を形成して、キノリン骨格を形成するものが最も好ましい。
【００１８】
本発明の化合物においては、核酸との相互作用を強めるためにいずれかの置換基中に１個以上のカチオン性基を有することが好ましい。「カチオン性基」の用語は、カチオンの他にプロトン化によってカチオンになりうるものを含む概念として用いる。カチオン性基の例としては、スルホニウム基、ホスホニウム基、アミノ基、又はアンモニウム基を挙げることができ、アミノ基又はアンモニウム基が最も好ましい。結合位置として好ましいのは、一般式（Ｖ）ないし（ＶＩＩＩ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、又はＲ6である。
【００１９】
本発明の化合物の具体例を以下に挙げるが、本発明の範囲はこれらの具体例に限定されることはない。
【００２０】
【化５】
0003899373.tif 000004
【００２１】
【化６】
0003899373.tif 000005
【００２２】
【化７】
0003899373.tif 000006
【００２３】
【化８】
0003899373.tif 000007
【００２４】
【化９】
0003899373.tif 000008
【００２５】
【化１０】
0003899373.tif 000009
【００２６】
【化１１】
0003899373.tif 000010
【００２７】
上記一般式（Ｉ）ないし（ＶＩＩＩ）で表される本発明の化合物は塩を形成する場合がある。塩の種類は特に限定されず、置換基の種類などに応じて、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。また、上記化合物又は塩は水和物又は溶媒和物を形成する場合がある。本発明の範囲にはこれらのいずれの物質も包含される。さらに、本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１又は２以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの異性体が存在する場合があり、オレフィン性の二重結合を含む化合物については幾何異性体が存在する場合もある。本発明の範囲には、任意の異性体、異性体の任意の混合物、ラセミ体などがいずれも包含される。また、本発明の化合物は互変異性体として存在する場合もあるが、任意の互変異性体又はそれらの混合物も本発明の範囲に包含される。
【００２８】
上記化合物は一般にシアニン色素の中の色素塩基として分類されるが、当業界においては一般的な合成法が既知であり、当業者が容易に合成することができる。例えば、米国特許第５，６５６，４４９号、同第５，６５８、７５１号に記載されている方法が好ましく適用可能である。例えば、一般式（Ｉ）ないし（ＶＩＩＩ）で表される化合物においてｎが０であるか１以上であるかによって下記に説明する合成法を採用することにより目的物を容易に製造することが可能である。
【００２９】
＜ｎ＝０の場合＞
メソッド１の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｌは離脱可能な基を表し、ハロゲン原子、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基などが好ましく用いられるが、一般的にはアルキルチオ基が用いられる。色素化の反応は米国特許第５，６５６，４４９号に具体的な例が示されているように、ｐ−トルエンスルホン酸などの酸を触媒として用い、ジメチルホルムアミドなどの非プロトン性極性溶媒中、無水酢酸を作用させて合成することができる。
【００３０】
メソッド２の目的物は一般式（Ｖ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応はジクロロメタンやジメチルホルムアミドなどの非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンなどの塩基を用いて行うことができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００３１】
【化１２】
0003899373.tif 000011
Ｑ＝イオウ原子の場合には、色素の原料となる２−アルキルチオチアゾロピリジン類を合成するために、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するチアゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることができる。チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するためには、２−アミノピリジン類を原料とする以下に挙げた二つの合成ルートを適宜選択することが可能である。
【００３２】
第一の方法として、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類を１−メチル−２−ピロリドン中、エチルキサントゲン酸カリウムと加熱条件下（１６０〜１７０℃）にて反応させることでチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。またヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、ピリジン−２−オン類を原料として用い、これを位置選択的に臭素化した後、オキシ塩化リン、アンモニア水を続けて反応させることにより２−アミノ−３−ブロモピリジン類を合成することも可能である。
【００３３】
第二の方法では、ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、１９６７年、１２６頁に記載されているように、まず２−アミノピリジン類に対し、臭素の存在下、チオシアン酸カリウムを反応させることにより２−アミノチアゾロピリジン類を合成する。得られた２−アミノチアゾロピリジン類を常法に従い亜硝酸ナトリウムを作用させてジアゾニウム塩とした後、塩化銅（Ｉ）と反応させることで対応する２−クロロチアゾロピリジンを合成する。さらに２−クロロチアゾロピリジンに対しチオ尿素を反応させ、加水分解することにより目的とするチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。
【００３４】
チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するための以上の方法は、いずれもアミノピリジン類又はピリジン−２−オン類を原料として用いることができるが、それらに限定されることはなく、アミノキノリン類（具体例としてはケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１９５９年、８６９頁に記載）やアミノイソキノリン類（具体例としてはカナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can. J. Chem.）、１９６６年、２４６５頁に記載）、その他のヘテロ原子を含む縮環系化合物（具体例としてはジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９５年、２５４６頁に記載）へも適用可能である。以上の合成工程の出発原料である２−アミノピリジン類のＲ1、Ｒ2、Ｒ3には種々の置換基を導入することが可能であり、これにより本発明の化合物の製造中間体であるチアゾロピリジン−２−チオンへと誘導することができる。
【００３５】
アミノピリジン類の類縁体については、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類は市販の試薬も数多くあるが、アミノピリジン類をハロゲン化することで容易に合成することができる。アミノピリジン類の臭素化はシンセシス（Synthesis）、２００１年、２１７５頁に詳しく述べられており、２−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体、３−アミノ体からは２−ブロモ及び２，６−ジブロモ体、４−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体をそれぞれ反応条件を変えることにより選択的に合成可能である。２−アミノピリジンの塩素化では文献（Zh. Russ. Fiz.-Khim. O-va、１９２８年、６８５頁）に記載のように、塩素を作用させることにより３−クロロ体及び３,５−ジクロロ体が得られる。２−アミノピリジンのヨウ素化では、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、１９９３年、７４９３頁に記載されているようにヨウ素及び過ヨウ素酸を作用させることにより、５−ヨード体が得られる。
【００３６】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のいずれかがハロゲンの場合、置換反応によってさらに誘導体へと変換することができる。Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3が塩素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９８２年、２０２５頁に記載のように、ナトリウムメトキシドと反応させることによりメトキシ基へと変換できる。また、Recl. Trav. Chim. Pays-Bas、１９５６年、１１８７頁に記載のように、ナトリウムエトキシドと反応させることによりエトキシ基へと変換できる。Org. Prep. Proced. Int.、１９９７年、１１７頁に記載のように、３規定水酸化ナトリウム水溶液と反応させることにより水酸基へと変換できる。
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3が臭素原子の場合、Bull. Chim. Soc. Fr.、１９９５年、２９０頁に記載のように、ｔ−ブトキシカリウム及びヨウ化カリウムの存在下、２−メルカプトピリジンと反応させることにより２−ピリジルチオ基へと変換できる。Chem.Zentralbl.、１９３６年、１２１９頁に記載のように、硫酸銅の存在下、メチルアミンと反応させることによりメチルアミノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリー（J. Organomet. Chem.）、１９９５年、２５９頁に記載のように、パラジウム触媒の存在下、ビニンルベンゼンと反応させることにより２−アミノ−５−スチリルピリジンへと変換することができる。
【００３７】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がヨウ素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、メタンチオールと反応させることによりメチルチオ基へと変換できる。また、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、プロパンチオールと反応させることによりプロピルチオ基へと変換できる。ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９４４年、１４７９頁に記載のように、シアン化銅と反応させることによりシアノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９７年、３１０９頁に記載のように、ナトリウム及び銅の存在下、メタノールと反応させることによりメトキシ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８１年、１５１８頁に記載のように、ナトリウムエチキシド及び銅の存在下、１−プロパノールと反応させることにより１−プロポキシ基へと変換することができる。
【００３８】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がハロゲンの場合は、遷移金属触媒を用いるカップリング反応を利用することによりさらに広い範囲の置換基へと変換することができる。例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９８７年、２７１１頁にあるように、パラジウム触媒を用いる２−アミノ−５−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができる。また、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、２０００年、６７５頁に記載のようにパラジウム触媒を用いる２−アミノ−６−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができ、またジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９９５年、１２４１６頁にあるように２−アミノ−６−ブロモピリジンとアセチレン類とをパラジウム触媒及び銅試薬の存在下で反応させることにより、対応するアセチレン誘導体を得ることができる。
【００３９】
２−アミノピリジン類への他の官能基導入法としては、２−アミノピリジンを混酸によってニトロ化すると、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９５５年、３１５４頁に記載のようにニトロ基が導入された２−アミノ−５−ニトロピリジンが得られる。２−アミノピリジンを発煙硫酸又は硫酸/三酸化硫黄で処理すると、(Bull. Soc. Chim. Fr.)、１９３９年、７３６頁に記載のようにスルホ基が導入された６−アミノ−ピリジン−３−スルホン酸が得られる。２−アミノピリジンに塩化ベンジルを作用させると、ポリッシュ・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Pol. J. Chem.）、１９８４年、９５９頁に記載のように２−アミノ−５−ベンジルピリジンが得られる。
【００４０】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がカルボキシル基である場合には、ヘテロ環基へと変換することも可能であり、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９６年、３３７５頁にあるように６−アミノ−ニコチン酸と２−アミノ−ベンゼンチオールとを反応させることにより２−（２−アミノピリジン−５−イル）ベンゾチアゾールが得られる。他のヘテロ環が結合した２−アミノピリジン誘導体としては、３,４'−ビピリジン−６−アミン（Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈ, Ｒ2＝４−ピリジル）は米国特許第４，２７６，２９３号に合成法が記載されている。２−エチル [３,４−ビピリジン]−６−アミン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝４−ピリジル、Ｒ3＝エチル）は米国特許第４，３１３、９５１号に合成法が記載されている。
【００４１】
ピリジン−２−オン類への置換基導入法も種々知られている。ピリジン−２−オン類は置換基が導入された後にピリジン−２−オン類を２−アミノピリジン類へと容易に変換可能なことから本発明の化合物を合成する上で重要である。ピリジン−２−オンとベンゾフェノン類を反応させるとカルボニル基に対する付加反応が進行し、テトラヘドロン（Tetrahedron）、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1が３級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンにアリールアルデヒド類を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ1が２級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンに二酸化炭素を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がカルボキシル基となる。ピリジン−２−オンにフェニルイソシアナートを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がアニリド基となる。ピリジン−２−オンにフェニルアセチルクロリドを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ1がフェニルアセチル基となる。ピリジン−２−オンにヨウ化メチルを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がメチル基となる。ピリジン−２−オンにペルオキソ二硫酸カリウムを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９９０年、２８９１頁に記載のようにＲ2が水酸基となる。ピリジン−２−オンに臭化ベンジルを反応させると、ケミストリー・レターズ（Chem. Lett.）、１９９６年、３３３頁に記載のようにＲ2がベンジル基となる。
【００４２】
上記にはピリジン環に対してチアゾール環を閉環する手法を説明したが、チアゾール環を先に構築してから後にピリジン環を形成させる合成ルートも可能であり、以下に示すようにさらに多様な誘導体が合成できる。シアノイミドジチオカルボン酸２カリウムは多くの２−アルキルチオ−４−アミノチアゾール類を与える共通中間体であり、これを増炭させることによりチアゾロピリジン類へと誘導することができる。例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９８４年、１３６１頁に記載されている下記合成ルートにより７−ヒドロキシ−２−メチルチオチアゾロ[４,５−ｂ]ピリジン−６−カルボン酸エステルが得られる。さらに同種の反応を利用することによって、文献（J. Prakt. Chem.、１９７９年、２６０頁）に記載のように７−ヒドロキシチアゾロ[４,５−ｂ]ピリドン類が合成できる。
【００４３】
また、同様にチアゾール環から構築する手法として、アミノアセトニトリルを原料に用い、２−メチルチオチアゾロ[５,４−ｂ]ピリジン類を得ることができる。具体的にはジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）に記載の合成ルートが挙げられる。その他にも、縮環系化合物としてチアゾロナフチリジン骨格を以下のように合成できる。中間体である１，６−ナフチリジノン類の合成はジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９９０年、２０８５頁に記載されており、それらからチアゾロナフチリジン類への誘導はヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に詳しく記載されている。
【００４４】
Ｑが酸素原子の場合、基本的には３位に水酸基を有する２−アミノピリジンを二硫化炭素やチオホスゲン、あるいはキサントゲン酸カリウムを作用させてオキサゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様にアルキル化試薬により２位に結合するイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。２−アルキルチオ−オキサゾロピリジン類は、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するオキサゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることにより容易に得られる。  オキサゾロピリジン−２−チオン類を合成するためには、まず３−ヒドロキシピリジン類を混酸によってニトロ化し、続いて得られたニトロ体を還元して２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類を合成する。これらの工程については、例えばファーマシューィカル・ブレティン（Pharm. Bull.）に記載のものが知られている。さらに２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類をケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８１年、４４１頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、エタノール中、エチルキサントゲン酸カリウムを作用させることにより、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。あるいは、ファーマシューティカル・ブレティン（Pharm.Bull.）、１９５７年、４６２５頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、水酸化カリウムの含水メタノール溶液中、二硫化炭素を作用させることによっても、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。
【００４５】
３−ヒドロキシピリジン類のニトロ化には以下の合成例が知られている。３−ヒドロキシ−４−メチルピリジンのニトロ化については、例えばヘテロサイクルズ(Hetereoctcles.)、１９９４年、５２９頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−５−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−６−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。また４−ヒドロシキイソキノリンも同様にニトロ化することができ、例えばケミカル・ファーマシューティカル・ブレティン（Chem. Pharm. Bull.）、１９５９年、５０１頁に記載のものが知られている。
【００４６】
３−ヒドロキシピリジン類にアミノ基を導入する方法としては、上述のニトロ基の還元以外にも以下に挙げる手法が知られている。３−ヒドロキシ−２−ヨードピリジン類に硫酸銅の存在下でアンモニアを作用させる方法としては、（Rocz. Chem.）、１９３６年、５０２頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン類にナトリウムアミドを作用させる方法としては、文献（Zh. Prikl. Khim.、１９４９年、１１０３頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸アミドに次亜臭素酸ナトリウムを作用させる方法として文献（Biochem. J.、１９５０年、５０６頁）に記載のものが知られている。
３−ヒドロキシ−２−フェニルアゾピリジン類にハイドロサルファイトナトリウムを作用させる方法としては、文献（Prace. Minist. Prizem. Chem.、１９５２年、１４頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−２−クロロピリジン類にヒドラジン水和物を作用させる方法としては、ジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９４年、２４８頁に記載のものが知られている。
【００４７】
Ｑが−Ｎ（Ｒ24）−の場合には、基本的には３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を二硫化炭素やチオホスゲンを用いてイミダゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様に２位のイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を得るには、上記Ｑ＝イオウ原子の場合の置換基導入法が参考にできる。Ｑが−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−の場合には、まずピロリノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−オン骨格を合成したのちに、３位にＲ24及びＲ25に相当する基を導入してジ置換体とし、さらにローソン試薬などを用いて２位のラクタム酸素原子をイオウ原子に変換することにより、合成することができる。
【００４８】
ｎ≧１の場合の合成方法に関して、メソッド３及びメソッド４の目的物は一般式（Ｖ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。メソッド３及び４はいずれの方法も好ましく用いることができ、合成中間体や生成色素の収率や精製のしやすさやに応じて適宜選択することができる。ｎ＝０の場合と異なるのは、原料として用いられるアゾロピリジン類の２位がメチル基になっている点である。２−メチル体の合成法については後述する。
【００４９】
【化１３】
0003899373.tif 000012
【００５０】
ｎ≧１の場合のメチン炭素鎖伸長は、ｎ＝１のときはＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンを、ｎ≧２の場合にはメチン炭素鎖数に応じてビニル基を追加したビニローグ体を用い、無水酢酸などの酸無水物を作用させて行うことができる。反応温度は室温〜１８０℃程度を選択することができ、溶媒としては無水酢酸等の酸無水物を溶媒にすることができるが、種々の非プロトン性溶媒も好ましく用いることができる。これらの反応は当業界においては極めて一般的な方法である。
【００５１】
色素化の反応はプロトン性、非プロトン性の溶媒を用いることができ、単に加熱することによっても色素化が進行する場合もある。好ましくは非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンやピリジン類などの塩基を用いて行うことができ、反応温度は室温から１２０℃程度が好ましい。この反応も当業界において極めて一般的な反応であり、上記以外にも種々の反応条件を用いることができる。
【００５２】
式中Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００５３】
メソッド５及びメソッド６の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。ここに示した反応は基本的にはメソッド３とメソッド４と同じである。
【００５４】
【化１４】
0003899373.tif 000013
２−メチルアゾロピリジン類の合成については、Ｑが酸素原子又は−Ｎ(Ｒ24)−の場合には、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムを用いてアゾロピリジン−２−チオンへと変換する反応の際に、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムの変わりに無水酢酸を用いて加熱する方法、オルト酢酸トリエチルなどのオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱することによって合成することができる。この場合、反応温度は１００〜１７０℃が好ましく、通常、反応試剤を溶媒として用いて行うことが好ましい。
【００５５】
Ｑがイオウ原子の場合にはｎ＝０のときの合成法で述べた中間体、２−アミノ−３−ハロピリジン類をオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱して２−アセチルアミノ−３−ハロピリジン類へと変換し、さらに５硫化リンやＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬などを用いて２−チオアセチルアミノ−３−ハロピリジン類としたのち、水素化ナトリウムやｔ−ブトキシカリウムなどの強塩基を作用させて２−メチルチアゾロピリジン類を得ることができる。強塩基を作用させる場合の溶媒はジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒などを用いることができる。Ｑが−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−の場合には、特開２００１−２７０８６４号やケミカル・レビュー（Chem. Rev.）６３巻、３７３頁（１９６３年）に記載のフィッシャーのインドール合成反応として知られる反応を利用して合成することができる。
【００５６】
含窒素６員環がピリジン環である化合物については非常に多くの合成法が知られているので、当業者は種々の文献を参照しつつ合成が可能である。また、極めて多くの化合物が市販されており容易に入手可能である。含窒素６員環がキノリン環である場合、合成原料となる４−メチルキノリン（レピジン）類と２−メチルキノリン（キナルジン）類について以下に合成法を示す。レピジン類については市販されている２−クロロレピジンと適当な求核剤とを反応させることにより、レピジンの２位に適当な置換基を導入することができる。２−クロロレピジンに１級アミン、２級アミン、環状アミン、アルコール、チオール、チオ尿素、及びフッ化物などを反応させた例が知られている。
【００５７】
１級アミンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、２３２２頁に記載のものがある。２級アミンとの反応では、例えば薬学雑誌（Yakugaku Zasshi）、１９４９年、１３７頁に記載のものがある。環状アミンとの反応では、例えばシンセティック・コミュニケーション（Synth. Commun.）、２０００年、４４７９頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９４９年、７７１頁に記載のものが知られている。アルコールとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８６年、１０２頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５１年、１５２９頁に記載のものが知られている。チオールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４８年、４９１頁に記載のものがある。チオ尿素との反応では、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１９２９年、２７３２頁に記載のものが知られている。フッ化物との反応では、例えばフッ化カリウムとの反応が（J. Chem. Res. Synop.）、１９９８年、５８６頁に記載されており、またテトラブチルアンモニウムフルオリドとの反応が（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載されている。また、パラジウム触媒を用いた２−クロロレピジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することも可能であり、例えばテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。
【００５８】
アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの２位に置換基を導入することも可能である。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８７年、７頁に記載のものが知られている。４−メチル−２−フェニルキノリンの合成としては、例えば（J. Prakt. Chem.）、１９２５年、７３頁に記載のものが知られている。
【００５９】
３位に適当な置換基を有するレピジン類の合成については、３位が塩素もしくは臭素の場合は、ともに３−メチルインドールを原料に用いて合成することができる。塩素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２５２頁に記載のものが知られている。臭素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２６１３頁に記載のものが知られている。上記で得られたハロゲン体はさらに他の置換基への変換が可能である。例えばパラジウム触媒及び塩基の存在下、フェニルホウ酸とカップリングさせることによりアリール化体が合成できる。具体例としてはテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。また、アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの３位に置換基を導入することも可能である。具体例を以下に示す。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、２７８２頁に記載のものが知られている。
【００６０】
６位に適当な置換基を有するレピジン類は、パラ置換アニリン類と３−ブテン−２−オン類もしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。４−フルオロアニリンとの反応では、例えば文献（Mutat. Res.、２０００年、１７３頁）に記載のものが知られている。４−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。４−ブロモアニリンとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。４−メトキシアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４５年、８６頁に記載のものが知られている。４−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９２０年、２３９７頁に記載のものが知られている。４−ジメチルアミノアニリンとの反応では、例えば文献（Bull. Chim. Soc. Fr.、１９２０年、４３４頁）に記載のものが知られている。４−ニトロアニリンとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。４−ベンゾチアゾ−２−イル−アニリンとの反応では、例えば文献（Sog. Prog. Chem.、１９７７年、６２頁）に記載のものが知られている。４−ベンゾヂフェニルホスホノイルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８２年、３１５頁に記載のものが知られている。４−アセチルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。４−ジエチルスルファミドアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。
【００６１】
以上の反応で得られるキノリン類をさらに変換することも可能である。６−ブロモ−４−メチルキノリンはパラジウム触媒及び塩基の存在下でホスホン酸ジエステルとのカップリング反応を行うことでホスホン酸誘導体が得られる。具体的には文献（Zh. Obshch. Khim.、１９８６年、２５０３頁）に記載のものが知られている。６−アミノ−４−メチルキノリンを合成するためには、４−ニトロアニリンを原料に用いて合成した４−メチル−６−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。
【００６２】
４−メチル−キノリン−６−カルボン酸を合成するためには、４−メチルアニリンを原料に用いて合成した４,６−ジメチルアニリンを酸化すればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２２６５頁に記載のものが知られている。６−（２−ベンゾオオキサゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノフェノールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。同様に６−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノベンゼンチオールを反応させ、４−メチル−６−（２−オキサゾロ[４,５−ｂ]ピリジル）−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノ−３−ヒドロキシピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｂ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２,３−ジアミノ−ピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に３,４−ジアミノ−ピリジンを反応させればよく、これらもすべてジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。４−メチル−キノリン−６−スルホン酸を合成するためには、４−メチルキノリンを硫酸と反応させればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２６８０頁に記載のものが知られている。
【００６３】
７位に適当な置換基を有するレピジン類は、メタ置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。３−フルオロアニリンとの反応では、例えば（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載のものが知られている。３−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１８５１頁に記載のものが知られている。３−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。３−アミノフェノールとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。
【００６４】
８位に適当な置換基を有するレピジン類は、オルト置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。２−メトキシアニリンとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られている。o−トルイジンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。２−アミノフェノールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、３９８６頁に記載のものが知られている。２−ニトロアニリンとの反応では、例えば日本化学雑誌、１９５８年、４０８頁に記載のものが知られている。またレピジンを混酸で処理することによっても４−メチル−８−ニトロキノリンが得られ、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４７年、３８０頁に記載のものが知られている。２−エチルアニリンとの反応では、例えばテロラヘドロン・アシンメトリー（Tetrahedron Asymmetry）、１９９５年、４１９頁に記載のものが知られている。２−アミノ安息香酸エチルとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られており４−メチルキノリン−８−カルボン酸が得られる。４−メチルキノリン−８−カルボン酸は、８位のカルボキシル基をさらに変換することが可能であり、８−（２−ベンゾオキサゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノフェノールを反応させ、また８−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノベンゼンチオールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７９年、１５７９頁に記載のものが知られている。４−メチル−８−アミノキノリンを合成するためには、４−メチル−８−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１５２４頁に記載のものが知られている。以上の説明はレピジンのモノ置換体の合成について記載したが、より多置換のものを望む場合は、これらの反応を組み合わせることで目的物を合成することができる。
【００６５】
一般式（Ｉ）ないし（ＶＩＩＩ）で表される本発明の化合物は核酸測定用の蛍光性色素として有用である。また、核酸測定技術において２本鎖核酸を１本鎖核酸から区別して測定する方法において、より高い選択性を発揮する蛍光性色素として用いることもできる。本明細書において「測定」という用語は、検出及び定量などを含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。もっとも、本発明の化合物の用途はこれらに限定されることはなく、多様な用途に利用可能であることは言うまでもない。
【００６６】
本発明の化合物を用いて溶液中の核酸を測定する場合に、検出対象は多重鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの２本鎖などであってもよい。本発明の化合物の好ましい濃度は測定対象の核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０-10モル／Ｌないし１×１０-3モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０-9モル／Ｌないし１×１０-4モル／Ｌであり、５×１０-8モル／Ｌないし１×１０-5モル／Ｌが最も好ましい。本発明の化合物と核酸とを接触させる場合には、試料核酸の溶液と本発明の化合物の溶液とを混合する方法が最も好ましく用いられるが、試料核酸の溶液に本発明の化合物を固体として添加してもよいし、他の媒体に本発明の化合物を吸着させて試料核酸溶液に混合してもよい。
【００６７】
本発明の化合物を核酸と接触させた後に光学的な測定を行う際には、測定用セル中で光学的検出を行いながら両者を接触させてもよいし、多重鎖核酸と本発明の化合物とを接触させた後に測定用セル中で光学的測定を行ってもよい。好ましくは核酸と本発明の化合物とを接触させた後、０．０１秒〜１０００秒の間に測定を行うことが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に測定を行うことが好ましい。
【００６８】
測定を行う際の溶液のｐＨは２．０〜１０．０が好ましく、３．０〜９．０がより好ましく、４．０〜８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために緩衝液を用いることも好ましい。緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。
【００６９】
測定を行う際の溶液としては水溶液が好ましく用いられるが、さらにメタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン又はジエチレングリコールなどのアルコール類やジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド又はスルホランなどの水混和性溶媒も混合して用いることができる。
【００７０】
光学的な測定としては蛍光測定法が感度の点で好ましく、一般的には蛍光光度計で測定することができる。この際、通常の溶液に励起光を通過させ、直角方向から蛍光を測定する方法を用いることも好ましが、反射光を測定するような方法を用いてもよい。また、試料溶液を固相担体上に展開又はスポットしたのちに、乾燥してあるいは乾燥せずに蛍光レーザースキャナーやＣＣＤ（電荷結合素子）などで測定する方法を採用してもよい。また、測定は１試料ごとに行ってもよく、あるいは９６穴や３８４穴マイクロプレートなどを用いて多数の試料を同時に測定してもよい。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［合成例１］色素（Ｄ−１）の合成
（１−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、 ６０巻、５７２１頁（１９９５年）に記載の方法を参考に合成を行った。１０ｇの２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン、２０ｇのキサントゲン酸カリウム、２００ｍＬのエタノールを混合し、１５時間還流した。こののち、溶媒を減圧留去し、残さを８０ｍＬの水に溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量１１ｇ
（１−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
３．９ｇの原料（２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジン）をＤＭＦに溶解し、３．０ｇのｔ−ブトキシカリウムを添加した。ついで、２ｍＬのヨウ化メチルを加え、室温で３０分撹拌した。原料がほぼ消失したので、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して目的物を油状物として得た。この油状物を放置すると結晶化した。
【００７２】
（１−３）臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
１ｇの２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンに３ｇの３−ブロモプロピオン酸アミドを加え、１１０℃で１時間加熱後、冷却し、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。この操作を３回繰り返したのち、残さはそのまま次の反応に用いた。
（１−４）１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナートの合成
１０ｇの４−メチルキノリン（レピジン）、１９．５ｇのパラトルエンスルホン酸メチルを混合し、１５０℃で１時間反応した。酢酸エチルを加えて撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄した。目的物は吸湿性。
【００７３】
（１−５）色素（Ｄ−１）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（１−４）で合成した１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナート４０ｍｇをジメチルホルムアミド４ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物はそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、黄色の成分を集めて目的物を得た。クロマトグラフィーによる精製を繰り返して目的物２ｍｇを得た。
【００７４】
［合成例２］色素（Ｄ−２）の合成
（２−１）二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
５ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と１０ｇの４−メチルキノリンを混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【００７５】
（２−２）色素（Ｄ−２）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物に酢酸エチルを添加し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去したのち、残さをメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製を行い、短いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝２／１）で１回精製い、目的物４ｍｇを得た。
【００７６】
［合成例３］色素（Ｄ−３）の合成
（３−１）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５００ｍｇに１，３−ジフェニルホルムアミジン２ｇを加え、無水酢酸１０ｍＬを添加して１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を３回繰り返し、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【００７７】
（３−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
（３−２−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７−アザ−２，３，３−トリメチルインドレニン）の合成
２００ｇの２−ヒドラジノピリジンと３００ｍＬのトルエンを混合し、２５０ｇの３−メチル−２−ブタノンをこれに加え、３０分間加熱還流を行った後、溶媒を完全に濃縮し、油状物を得た。この油状物に塩化亜鉛１０ｇを添加し、２１５℃に加熱して５時間反応を行った。冷却後、水４００ｍＬを添加し、クロロホルム３００ｍＬで４回抽出を行い、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残さを減圧蒸留（１１２〜１３５℃／０．２ｍｍＨｇ）し、留出成分をヘキサン１．５リットルを用いて再結晶を行い、目的物を得た。収量７０．０ｇ、収率２３．８％
（３−２−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（３−２−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル３ｇと混合し、９０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【００７８】
（３−３）色素（Ｄ−３）の合成
合成例（３−１）で合成した二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇと合成例（３−２）で合成した塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、無水酢酸０．５ｍＬを加えたのち、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し室温で２時間反応した。酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去した後、残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で精製し、青色の色素（Ｄ−３）の前駆体粗生成物を得た。この前駆体粗生成物に３％の臭化水素酸を加え、２時間８０℃で反応したのち、反応液を減圧留去した。残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝３／１）で１回精製い目的物を３ｍｇを得た。
【００７９】
［合成例４］色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン（アルドリッチ社製）１５ｇにオルト酢酸エチル８０ｍＬ、触媒量のパラトルエンスルホン酸一水和物を添加した後に、４時間１２０℃で反応した。冷却後、トリエチルアミン２ｍＬを加えたのち、溶媒を減圧留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製した。目的物は結晶として得られた。
（４−２）色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）で合成した２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンを用いて合成例３に示した方法に従って色素（Ｄ−４）を得た。
【００８０】
［合成例５］色素（Ｄ−５）の合成
（５−１）６−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−５−ブロモ−３−ヒドロキシピリジン４ｇ、キサントゲン酸カリウム８ｇ、エタノール５０ｍＬを混合し、１０時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、水４０ｍＬを加えて残さを溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗を行い、乾燥した。収量４．０ｇ、収率８１．８％
（５−２）６−ブロモ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−１）で合成した５−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン２ｇを１５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて溶解した。ついで、１ｍＬのヨウ化メチルを加え室温で１時間反応した。反応終了後、水を加え、析出した結晶を減圧ろ過した。水洗、乾燥を行い、目的物を得た。収量２ｇ、収率９４．３％
【００８１】
（５−３）臭化１−（３−エトキシカルボニルプロピル）−４−メチルキノリニウムの合成
１９．５ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルと１４．３ｇのレピジンを混合し、１３０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を繰り返し、目的物を油状物として得た。このものはさらに精製を行うことなく次の反応に使用した。
（５−４）色素（Ｄ−５）の合成
合成例（５−２）及び（５−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−５）を合成した。
【００８２】
［合成例６］色素（Ｄ−６）の合成
（６−１）６−メチル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法に従って合成した。１０ｇの２−アミノ−３−ブロモ−５−メチルピリジン、Ｎ−メチルピロリドン１２０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム１６．７ｇを混合し、１７０℃で３．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量８．７ｇ、収率８９．２％
【００８３】
（６−２）６−メチル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成２ｇの原料チオールを１０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを添加した。次に、ヨウ化メチル１．５ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。水洗を行い、乾燥して目的物を得た。収量１．７ｇ、収率７８．９％
（６−３）色素（Ｄ−６）の合成
合成例（６−２）及び合成例（５−２）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−６）を合成した。
【００８４】
［合成例７］色素（Ｄ−１５）の合成
（７−１）４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステルの合成
２５０ｍＬのジメチルアミン５０％水溶液と２００ｍＬのエタノールを混合し、１０℃以下に保ちながら１２０ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルを滴下した。滴下終了後、室温で２時間反応したのち、５０℃に昇温して２時間反応した。溶媒を半分程度に濃縮し、氷水で冷却しながら水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル４００ｍＬを加えて抽出を行った。この有機相を４Ｍの塩酸１５０ｍＬで４回抽出を行い、有機相を廃棄した。塩酸抽出液を氷水で冷却し、水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル２００ｍＬで３回抽出した。有機相を炭酸カリウムで乾燥し、濃縮を行い、目的物を得た。収量４５ｇ
【００８５】
（７−２）臭化（６−ブロモヘキシル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，６−ジブロモヘキサン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。吸湿性結晶。収量２１ｇ
（７−３）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムの合成
８ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと１２ｇのレピジンを混合し、１２５℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物、収量６ｇ
（７−４）色素（Ｄ−１５）の合成
合成例（７−３）及び合成例（１−４）で合成した原料を用い、合成例１で示した合成法に従って色素（Ｄ−１５）を合成した。
【００８６】
［合成例８］色素（Ｄ−１６）の合成
（８−１）５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。３３．２ｇ（0.225モル）の３−フルオロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で０．１８モルのメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、得られた異性体混合物（５−フルオロ−４−メチルキノリンと７−フルオロ−４−メチルキノリン）を蒸留した。５−フルオロ−４−メチルキノリンの比が高い初留成分を酢酸エチルに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物のアセトン溶液を加え、氷水冷却すると、５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の結晶が得られた。収量１．７ｇ
また、７−フルオロ−４−メチルキノリンについてもパラトルエンスルホン酸塩の結晶として単離した。
【００８７】
（８−２）臭化（４−ブロモブチル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，４−ジブロモブタン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。収量３０ｇ
（８−３）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−５−フルオロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと０．１ｇの５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩を混合し０．２ｍＬのトリエチルアミンを加えて、１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（８−４）色素（Ｄ−１６）の合成
合成例（８−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１６）を得た。
【００８８】
［合成例９］色素（Ｄ−１７）の合成
（９−１）５−クロロ−４−メチルキノリンの合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。  ４０．０ｇ（0.225モル）の３−クロロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で１２．６ｇ（０．１８モル）のメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相は５−クロロ−４−メチルキノリンと７−クロロ−４−メチルキノリンであったので、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製し、それぞれを分離した。
【００８９】
（９−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル−５−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例８−２）と０．１ｇの５−クロロ−４−メチルキノリンを混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（９−３）色素（Ｄ−１７）の合成
合成例（９−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１７）を得た。
【００９０】
［合成例１０］色素（Ｄ−１８）の合成
（１０−１）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オンの合成
１５０ｍＬの濃硫酸にＮ，Ｎ−ジフェニルアセトアセタミド６０ｇを５〜１０℃で少量ずつ添加した。ほぼ完溶したのち、室温とし一晩放置した。反応が完結したので、氷水に注ぎ、酢酸エチル２００ｍＬを加え撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取、乾燥し、目的物を得た。
（１０−２）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオンの合成
１０ｇの４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オン（０．０４２５モル）、９ｇのローソン試薬をトルエン中で混合し、加熱還流した。原料消失後、反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。クロロホルムで溶出させ、ヘキサン／酢酸エチルより再結晶した。
【００９１】
（１０−３）二臭化２−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチルチオ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムの合成
合成例（１０−２）で合成した４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオン０．５ｇと合成例（８−２）で合成した臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム１ｇを混合し、１３０℃にて１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解性成分を除去したのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。
（１０−４）色素（Ｄ−１８）の合成
合成例（６−２）及び合成例（１０−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−６）を合成した。
【００９２】
［合成例１１］色素（Ｄ−１９）の合成
（１１−１）色素（Ｄ−１９）の合成
合成例（７−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１に示した方法によって色素（Ｄ−１９）を合成した。
【００９３】
［合成例１２］色素（Ｄ−２３）の合成
（１２−１）３−クロロ−４−メチルキノリンの合成
シンセシス（Synthesis）798頁 (１９７６年)を参考にして合成した。すなわち、３−メチルインドール１．３１ｇ（１０ミリモル）と塩化ベンジルトリメチルアンモニウム５０ｍｇ、及びクロロホルム（エタノールフリー）／ベンゼンの１／１混合液３．２ｍＬを４０℃にて激しく撹拌し、水酸化ナトリウム３ｇ／水６ｍＬの溶液を１５分かけて滴下した。８時間反応を行ったのち、反応混合物を酢酸エチルと水で希釈し、２Ｎ塩酸で抽出した。この酸性溶液を濃厚な水酸化ナトリウムで弱塩基性とし、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、粗目的物を得た。さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
【００９４】
（１２−２）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−３−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例７−２）と０．１ｇの３−クロロ−４−メチルキノリン（合成例１２−１）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（１２−３）色素（Ｄ−２３）の合成
合成例（１２−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法に従って色素（Ｄ−２３）を合成した。
【００９５】
［合成例１３］色素（Ｄ−２５）の合成
（１３−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
（１３−１−１）２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸の合成
５０ｇの６−クロロニコチン酸を３００ｍＬのｎ−ブタノールと混合し、８０ｇのヒドラジン１水和物を添加して、１０時間加熱還流を行った。冷却後、５００ｍＬの希塩酸に注ぎ、析出した結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い目的物を得た。収量４４．２ｇ、収率９０．９％
（１３−１−２）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸の合成
３０ｇの２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸と３０ｇの３−メチル−２−ブタノンを混合し、１２０ｍＬのエチレングリコールを添加し、１００℃で１時間反応を行った。減圧下で過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去し、ついで加熱を行い５時間還流を行った。冷却後、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、ＴＬＣ上で発色液（ｐ−アニスアルデヒド／エタノール／硫酸＝５／９０／５（容量パーセント））によって発色するフラクションを集めた。このフラクションは目的物と目的物のエチレングリコールエステルとの混合物であったため、混合物のまま１Ｎ水酸化ナトリウムで加水分解し、中和後、結晶として目的物を得た。また、約４０％は原料ヒドラジンと３−メチル−２−ブタノンから生成するヒドラゾンとして回収された。収量１．８ｇ、収率４．５％
【００９６】
（１３−１−３）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
１ｇの２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸、１．５ｇのパラトルエンスルホン酸一水和物、１００ｍＬのエタノールを混合し、加熱を行い、溶媒を少しずつ留去し、エタノールを適宜追加しながら、８時間反応した。冷却後、溶媒を７０％程度留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出を行い、炭酸ナトリウム水溶液で有機相を洗浄後、濃縮した。短いカラムでシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、目的物を得た。収量０．８ｇ、収率７０．３％
（１３−２）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシルキノリニウムの合成
合成例（７−３）で合成した二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムを用いて、合成例（３−１）に示した合成法と同様にして目的物を得た。
【００９７】
（１３−３）塩化５−エトキシカルボニル−７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成合成例（１３−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル０．１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル０．８ｇと混合し、１１０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１３−４）色素（Ｄ−２５）の合成
合成例（１３−２）及び合成例（１３−３）で合成した化合物を原料として、合成例（３−３）に示した方法と同様にして色素（Ｄ−２５）を得た。
【００９８】
［合成例１４］色素（Ｄ−２７）の合成
（１４−１）６−ブロモ−２−メチルチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２５．２ｇの２−アミノ−３，５−ジブロモピリジンを５００ｍＬのアセトニトリルに懸濁し、５０ｍＬの無水酢酸を加えて３時間加熱還流した。冷却後、水を加えて析出した結晶を濾取した。結晶を乾燥後、ジオキサン３００ｍＬに懸濁し、６ｇの水素化ナトリウムを加えて４時間加熱還流した。冷却後、エタノール２０ｍＬを加えた後、溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
（１４−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと２ｇの４−メチルキノリン（レピジン）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いた。セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製し、結晶として得た。
【００９９】
（１４−３）二臭化４−（４−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）−１，３−ブタジエン−１−イル）−１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
合成例（１４−２）で合成した二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウム０．５ｇに２ｇのマロンアルデヒドジアニリド塩酸塩を加え、無水酢酸５ｍＬを混合して１１０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１４−３）色素（Ｄ−２７）の合成
合成例（１４−１）及び（１４−３）に示した化合物を原料として、合成例３と同様の方法で合成した。
【０１００】
［合成例１５］色素（Ｄ−３５）の合成
（１５−１）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（１５−１−１）５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem）、５７巻、４７８４頁（１９９２年）に記載の方法を参考に合成を行った。すなわち、３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンに強塩基存在下でＮ，Ｎ−テトラメチレンチオカルバモイルスルフェナミドの窒素アニオンを作用させて合成を行った。
（１５−１−２）５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成
３ｇの５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジン（合成例１５−１−１）を３０ｍＬの無水酢酸に懸濁し、触媒量の濃硫酸を添加し、７０℃で１時間反応した。反応終了後、反応混合物を氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取、乾燥した。この後、さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。
【０１０１】
（１５−１−３）２−アミノ−５−アセチルアミノ−３−ヒドロキシピリジンの合成
１ｇの５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンを５０ｍＬのメタノールを加え、オートクレーブ中で５％活性炭パラジウムを触媒として５０℃で水素添加反応を行った。１晩放置後、触媒を濾別し、溶媒を減圧留去した。生成物はさらに精製せずに次の反応に使用した。
（１５−１−４）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１５−１−３）の生成物に２ｇのキサントゲン酸カリウム、５０ｍＬのエタノールを加えて１５時間加熱還流した。冷却後、溶媒を留去し、水を加えて固形物を溶解したのち、酢酸を添加すると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
【０１０２】
（１５−２）５−アセチルアミノ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−２）の方法に従って合成した。
（１５−３）色素（Ｄ−３５）の合成
合成例（１５−１−４）及び（１５−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法と同様にして色素（Ｄ−３５）を得た。
【０１０３】
［合成例１６］色素（Ｄ−３７）の合成
（１６−１）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
（１６−１−１）５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジンの合成
２，５−ジブロモピリジン１２５ｇ、エタノール３５０ｍＬ、包水ヒドラジン２５０ｍＬを混合し、３０時間加熱還流した。エタノールを減圧下で留去し、水を加えて析出した結晶を濾取した。水洗、乾燥を行い、５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７７ｇを得た。収率７７．６％
（１６−１−２）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７６ｇ、３−メチル−２−ブタノン１００ミリリットルを混合し、１００℃で３０分間反応した。過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去したのち、１，４−ブタンジオール１００ミリリットルを加え２４０℃に加熱し、５時間還流した。反応液を冷却し、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ｎｍｒで各フラクションを確認した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を留去したのちヘキサン／酢酸エチルから結晶化し、単褐色結晶として目的物を得た。収量８．５グラム、収率８．８％
【０１０４】
（１６−２）５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１６−１−２）で合成した５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．５ｇ、フェニルボロン酸０．３８ｇ及びジメチルホルムアミド７ｍＬを混合し、窒素気流下にてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム０．０７２ｇ及び炭酸カリウム０．９ｇをこれに加えた。反応混合物を撹拌し、１００℃に加熱し、４時間反応した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離液としてクロロホルム／メタノールを用い、目的物はクロロホルム／メタノール＝４／１で溶出した。目的物を含むフラクションを集め濃縮し、目的物を淡黄色固体として得た。収量０．４５ｇ、収率９１％
【０１０５】
（１６−３）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（１６−２）で合成した５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．２ｇと１ｇの塩化２−メトキシエトキシメチルを混合し、１００℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１６−４）二臭化６−メトキシ−４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
３ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と５ｇの６−メトキシ−４−メチルキノリン（東京化成社製）を混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１０６】
（１６−５）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−６−メトキシ−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
（１６−４）で合成したキノリニウムに１．５ｇの１，３−ジフェニルホルムアミジンを加え、５ｍＬの無水酢酸を混合して１２０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を２回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１０７】
（１６−６）色素（Ｄ−３７）の合成
合成例（１６−５）で合成した化合物にジメチルホルムアミド５ｍＬを添加し、１ｍＬの無水酢酸を加えた。さらにこの混合液に合成例（１６−３）で合成した化合物を添加し、室温で均一溶液とした。室温でトリエチルアミンを０．３ｍＬ添加すると色素が生成した。この色素をセファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製したのち（溶出液：メタノール）、この色素のメタノール溶液に触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸塩を加えて、室温で２日間放置した。この溶液を再度セファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製して色素（Ｄ−３７）を得た。
【０１０８】
［合成例１７］色素（Ｄ−３８）の合成
（１７−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
（１７−１−１）４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンの合成
１０ｇの４−ヒドロキシイソキノリンを８０ｇの濃硫酸に溶解し、２℃で撹拌した。これに１０℃以下に保ちながら、発煙硝酸２．７ｍＬをゆっくり滴下した。そのまま放置し、室温で２時間反応したのち、１Ｋｇの氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取した。
（１７−１−２）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成４ｇの４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンに酢酸エチル、水を加え、さらに過剰量のハイドロサルファイトナトリウムを添加して２時間加熱還流した。分液して有機相をとり、水洗後、溶媒を留去した。残さにエタノール、８ｇのキサントゲン酸カリウムを添加し、５時間加熱還流を行った。冷却後、エタノールを留去し、残さを２０ｍＬの水に溶解し、酢酸を少しずつ加えると、結晶が析出した。結晶を濾取し、水洗を行い、乾燥して目的物を得た。
【０１０９】
（１７−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
２ｇの原料チオールをジメチルホルムアミド１５ｍＬに添加し、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて原料を溶解した。ついで、１．５ｍＬのヨウ化メチルを添加し、室温で１時間反応した。水５０ｍＬを添加すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
（１７−３）色素（Ｄ−３８）の合成
合成例（１７−２）及び合成例（１４−２）で合成した化合物を原料として、合成例３に示した方法と同様にして色素（Ｄ−３８）を合成した。
【０１１０】
［試験例１］溶液系での多重鎖核酸の検出
（試料核酸溶液の調製）
２重鎖核酸としてデオキシリボ核酸ナトリウム，繊維状，サケ精巣製（和光純薬工業株式会社製）をｐＨ６．５のリン酸緩衝液に溶解し１００μｇ／ｍＬの水溶液を調製した。さらにこれを１００℃で３０分加熱したのちに氷水で急冷し１本鎖のデオキシリボ核酸水溶液を調製した。
【０１１１】
（検出用化合物溶液の調製）
表１に示した本発明の化合物をｐＨ６．５のリン酸緩衝液に溶解し、３２０ｎｍでの吸光度が１．０になるように溶液を調製した。比較としてモレキュラー・プローブス社の PicoGreen をｐＨ６．５のリン酸緩衝液に溶解し、可視域での光学濃度０．５の溶液を調製した。
（蛍光強度の測定）
２本鎖核酸又は１本鎖核酸溶液を１、検出用化合物溶液を１、希釈用緩衝液を８の容量比で混合した溶液を作製し、蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。蛍光強度はそれぞれの試料について蛍光励起スペクトルを測定し、強度最大となる波長で励起したときの蛍光強度を示した。この結果より本発明の化合物によって励起、蛍光波長の幅を広げることができ、広範囲の光源適性が期待できることがわかる。また、本発明の化合物は高い蛍光強度を有しており、かつ２本鎖核酸への選択性にも優れることがわかる。
【０１１２】
【表１】
0003899373.tif 000014