(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のポリペプチド。
(a)配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２８〜３４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b)(a)のポリペプチドのアミノ酸配列において１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは転移したアミノ酸配列からなり、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するポリペプチド。
【請求項２】
(a)のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなるものである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
(a)配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２８〜３４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b)(a)のポリペプチドのアミノ酸配列において１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは転移したアミノ酸配列からなり、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するポリペプチド。
【請求項４】
(a)のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列において塩基番号１８１〜１２００の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか一項記載のＤＮＡが導入されており、かつ該ＤＮＡが発現可能な形質転換体。
【請求項８】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項７又は８記載の形質転換体を培地で培養し、前記ＤＮＡがコードするポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素を培養物中に生成蓄積させ、その培養物からポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素を採取することを特徴とする、ポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素の製
造方法。
【請求項１０】
生体から採取した血液中における請求項３〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡの発現量と、胃癌又は膵癌とを関連づけることを特徴とする、胃癌又は膵癌の検出法。
【請求項１１】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡの発現を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする胃癌又は膵癌の診断キット。
【請求項１２】
更に、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１１記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラクトースに対してα1,4結合でN-アセチルグルコサミンを転移する酵素及びそれをコードするＤＮＡ、並びに、それらに基づく胃癌又は膵癌の検出法及び診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、非還元末端にガラクトース残基を有する糖鎖受容体の当該ガラクトース残基に対してN-アセチルグルコサミンを付加する酵素としては、β1,6-N-アセチルグルコサミン転移酵素（IGnT: Genes Dev., 7, 468, 1993）などが知られていたが、上記ガラクトース残基に対してα1,4結合でN-アセチルガラクトサミンを結合する酵素の存在は確認されていなかった。
【０００３】
人工的に多様な糖鎖を合成し、その糖鎖が有する生理活性を解明することは新たな医薬の創製にもつながるが、ガラクトース残基に対してα1,4結合でN-アセチルグルコサミンが結合した構造の糖鎖を酵素的に製造することは不可能であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、受容体糖鎖の非還元末端のガラクトース残基に対してα1,4結合でN-アセチルグルコサミンを結合する活性を有する酵素及びそれをコードするＤＮＡ並びにそれらの利用法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を鑑み、ガラクトース残基に対してα1,4結合でN-アセチルグルコサミンを結合する活性を有する酵素を鋭意探索した結果、驚くべきことにヒトの胃組織において、目的の活性を有する酵素が発現していることを見いだし、さらに、当該組織を形成する細胞より得られた遺伝子の転写産物より、当該目的の酵素をコードするDNAを得ることに成功した。この知見に基づき本発明は完成された。
【０００６】
従って、本発明の第一の要旨は下記の理化学的性質を有するN-アセチルグルコサミン転移酵素（以下、本発明酵素ともいう）である。
活性：
N-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα1,4結合により転移する。
【０００７】
本発明酵素において、N-アセチルグルコサミン供与体がN-アセチルグルコサミン残基を有する糖ヌクレオチドであって、N-アセチルグルコサミン受容体がガラクトース-Y（但し、-はグリコシド結合、YはN-アセチルヘキソサミン、Ｎ−アセチルヘキソサミンを非還元末端に有する糖鎖、又はアグリコンが結合したN-アセチルヘキソサミンを示す）であることが好ましい。
【０００８】
本発明酵素は、さらに下記の理化学的性質を有することが好ましい。
N-アセチルグルコサミン供与体：
UDP-N-アセチルグルコサミン（UDPはウリジン二リン酸を示す）
基質特異性：
N-アセチルグルコサミン供与体から、下記▲１▼〜▲５▼のいずれかの受容体の非還元末端のガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンを転移する。
▲１▼Galβ1,3GalNAcαpNP
▲２▼GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲３▼Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲４▼Galβ1,4GlcβpNP
▲５▼Galβ1,3GlcNAcβpNP
（式中、Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基、pNPはp-ニトロフェノール残基を示す）
活性化及び阻害：
Ｍｎ2+により活性が促進される。
EDTAにより活性が抑制される。
【０００９】
また、本発明の第二の要旨は本発明酵素のポリペプチド（以下、本発明ポリペプチドともいう）である。本発明ポリペプチドは、以下の(a)又は(b)のポリペプチドである。
(a)少なくとも配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号９６〜３４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b)(a)のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは転移したアミノ酸配列からなり、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は(a)のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
【００１０】
本発明ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の一部を含み、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一の抗原性を有するものである。
【００１１】
またさらに、本発明の第三の要旨は上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）である。本発明ＤＮＡは、N-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有するN-アセチルグルコサミン転移酵素を構成するポリペプチドをコードする。
【００１２】
本発明ＤＮＡにおいては、N-アセチルグルコサミン転移酵素が下記の理化学的性質を有することが好ましい。
N-アセチルグルコサミン供与体：
UDP-N-アセチルグルコサミン（UDPはウリジン二リン酸を示す）
基質特異性：
N-アセチルグルコサミン供与体から、下記▲１▼〜▲５▼のいずれかの受容体の非還元末端のガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンを転移する。
▲１▼Galβ1,3GalNAcαpNP
▲２▼GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲３▼Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲４▼Galβ1,4GlcβpNP
▲５▼Galβ1,3GlcNAcβpNP
（式中、Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基、pNPはp-ニトロフェノール残基を示す）
活性化及び阻害：
Ｍｎ2+により活性が促進される。
EDTAにより活性が抑制される。
【００１３】
本発明ＤＮＡは、好ましくは、以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードする。
(a)少なくとも配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号９６〜３４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b)(a)のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは転移したアミノ酸配列からなり、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は(a)のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
【００１４】
好ましくは、上記(a)のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１５】
本発明ＤＮＡは、また、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の一部を含み、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチドをコードする。
【００１６】
本発明ＤＮＡとしては、配列番号１の塩基配列において塩基番号１８１〜１２００の塩基配列を有するものが挙げられる。
【００１７】
本発明はさらに、本発明ＤＮＡまたはそのＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド、本発明ＤＮＡを含む組換えベクター、本発明ＤＮＡが導入されており、そのＤＮＡが発現可能な形質転換多体（例えば、本発明ＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体）、及び、この形質転換体を培地で培養し、前記ＤＮＡがコードするポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素を培養物中に生成蓄積させ、その培養物からポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素を採取することを特徴とする、ポリペプチド又はそれを含むN-アセチルグルコサミン転移酵素の製造方法も提供する。
【００１８】
また、本発明は、本発明ＤＮＡの発現に基づく胃癌又は膵癌の検出法（以下、本発明検出法ともいう）を提供する。好ましい態様の検出法は、生体から採取した体液中における本発明ＤＮＡの発現量、好ましくは転写産物量と、胃癌又は膵癌とを関連づけることを特徴とする。体液は好ましくは血液である。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明ＤＮＡの発現を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする胃癌又は膵癌の診断キット（以下、本発明診断キットともいう）を提供する。この診断キットは、更に、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含むことが好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【００２１】
＜１＞本発明酵素、本発明ポリペプチド及び本発明DNA
本発明酵素（以下、「α4GnT」とも略記する）は、受容体糖鎖の非還元末端のガラクトース残基に対してα1,4結合でN-アセチルグルコサミンを転移する。本発明酵素は、上記活性を有するものである限り、その由来は限定されるものではないが、哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明酵素には、以下のような理化学的性質を有するα4GnTが包含される。
活性：
N-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)をα1,4結合により転移する（以下、この酵素活性を「本酵素活性」ともいう）。N-アセチルグルコサミン供与体は、N-アセチルグルコサミン残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましく、具体的にはX-N-GlcNAc（但し、XはADP、CDP、UDP、又はGDPを示す）が挙げられ、最も好ましいものはUDP-GlcNAcである。N-アセチルグルコサミン受容体はガラクトース-Y（但し、-はグリコシド結合、YはN-アセチルヘキソサミン、N-アセチルヘキソサミンを非還元末端に有する糖鎖、又はアグリコンが結合したN-アセチルヘキソサミンを示す）であることが好ましい。Ｎ−アセチルヘキソサミンとしては、特にN-アセチルガラクトサミン又はN-アセチルグルコサミンが好ましい。また、アグリコンとはN-アセチルヘキソサミンにグリコシド結合した非糖質部分であり、例えば脂肪族化合物、芳香族化合物、アルカロイド、脂質等が挙げられ、特に限定はされないが、より具体的にはp-ニトロフェノール等が挙げられる。
【００２３】
本発明酵素は、好ましくは、さらに下記の理化学的性質を有する。
N-アセチルグルコサミン供与体：
UDP-N-アセチルグルコサミン（UDPはウリジン二リン酸を示す）
基質特異性：N-アセチルグルコサミン供与体から、下記▲１▼〜▲５▼のいずれかの受容体のガラクトース残基にGlcNAcを転移する。
▲１▼Galβ1,3GalNAcαpNP
▲２▼GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲３▼Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP
▲４▼Galβ1,4GlcβpNP
▲５▼Galβ1,3GlcNAcβpNP
活性化及び阻害：
Ｍｎ2+により活性が促進される。
EDTAにより活性が抑制される。
【００２４】
ここで、活性が促進されるとは、pH 7.0、37℃の条件で5 mMのMn2+により非添加時と比して活性が１．２倍以上、好ましくは１．３倍以上になることを意味する。また、活性が抑制されるとは上記条件で10 mMのEDTAにより非添加時と比して活性が３分の２以下、好ましくは２分の１以下になることを意味する。
【００２５】
本発明ポリペプチドは、以下の(a)又は(b)のポリペプチドである。
(a)少なくとも配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号９６〜３４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b)(a)のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは転移したアミノ酸配列からなり、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にN-アセチルグルコサミンをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は(a)のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
【００２６】
ここで、「酵素を構成する」とは、ポリペプチドがそれ自体で目的の酵素活性を有するか、又は糖鎖の付加等のように他の物質と複合化することによって、目的とする酵素活性を有する場合に用いる。
【００２７】
好ましくは、上記(a)のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２８】
本発明ポリペプチドは、また、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の一部を含み、かつN-アセチルグルコサミン供与体から、N-アセチルグルコサミン受容体が有する糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にGlcNAcをα１,４結合により転移する活性を有する酵素を構成するか、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一の抗原性を有するものである。配列番号２のアミノ酸配列の一部としては、例えばアミノ酸番号２８〜３４０、６１〜３４０、８７〜３４０又は９６〜３４０が挙げられる。
【００２９】
本発明ＤＮＡには、本発明ポリペプチドをコードしているものが包含され、これらのポリペプチドをコードしているのであればその塩基配列は特に限定されない。
【００３０】
配列番号２のアミノ酸配列又はその部分配列を有するポリペプチドは、本酵素活性を有する酵素を構成するポリペプチドであり、本酵素活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は転位を有するポリペプチドをコードする、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有するＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細書における「アミノ酸の数個」とは当該酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば３４０アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、５０程度以下の数を示す。
【００３１】
本酵素活性の測定法は公知の方法（J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999）において、宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質をα4GnTのものに変更し、反応液中のEDTAを5 mMのMnCl2に変更することによって容易に行うことが可能であり、例えば本明細書中において具体的に示した方法により当業者であれば容易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。ＤＮＡの塩基配列の変異（置換、欠失、挿入又は転位）は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００３２】
同一活性を有する酵素タンパク質のアミノ酸配列には、種間や個体間において活性に影響を与えないアミノ酸配列の相違があり得ること（同等の活性の変異体が存在し得ること）が当然に予想される。従って上記の活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位は、種間あるいは個体間変異程度の範囲内であることが好ましい。
【００３３】
また、ポリペプチドの抗原性の異同は公知の免疫学的方法で決定することができる。
【００３４】
本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号１〜３４０、２８〜３４０、６１〜３４０、８７〜３４０又は９６〜３４０のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいがこれに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有するＤＮＡ」とは、例えばα4GnTのポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズしα4GnTのＤＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる又はコードされるポリペプチドがα4GnT活性を有するあるいはα4GnTと同様の抗原性を有するＤＮＡを示す。本発明は、このような本発明ＤＮＡまたはそのＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を提供する。上記ハイブリダイズは、一般にスクリーニング等においてＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせる際に用いられている方法によって行えばよく、例えば、ＤＮＡのスクリーニングなどに使用される条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で目的ＤＮＡをプレハイブリダイズし、32Ｐラベルした本発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、さらに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより洗浄することが挙げられる。一般的なハイブリダイズは上述のような条件下で行われることが多いが、当業者であれば同様のハイブリダイズを目的として各溶液の組成や詳細な条件を変更することにより同様のハイブリダイズを行うことが可能であるため、同様な効果を得ることが可能な条件であれば上述の条件に特に限定はされない。
【００３５】
本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基番号１８１〜１２００、２６２〜１２００、３６１〜１２００、４３９〜１２００又は４６６〜１２００の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
配列番号１に示す塩基配列においては、α4GnTのｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端部に４つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれている。5'末端よりに存在する２つのＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足しており、また他の２つのＡＴＧコドンも＋４の位置にＡ、Ｃがあって共通配列に部分的に適合しており、いずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性がある。
【００３７】
ところで、β１，４−ガラクトース転移酵素は、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J. Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β１，４−ガラクトース転移酵素は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。さらに、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様に、α4GnTについても、複数のＡＴＧコドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドンであっても、上記のα4GnTのポリペプチドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目、又は第４番目のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含されるものである。従って、α4GnTのポリペプチドは配列番号２記載のアミノ酸配列において少なくともアミノ酸番号９６〜３４０に相当する領域を有するものである。
【００３８】
配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、３４０アミノ酸残基からなり、分子量３９，４９７Ｄａ、Ｎ−結合型糖鎖の付く部位である可能性がある４カ所の部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、Ｎ末端から４〜２５番目のアミノ酸残基にわたる長さ２２残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有することが予想される。
【００３９】
尚、遺伝暗号の縮重によって、同一アミノ酸配列をコードし、配列番号１の塩基配列とは異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００４０】
また、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ポリペプチドをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。また、本発明ＤＮＡは、翻訳前に除かれるイントロンの配列を含んでいてもよい。
【００４１】
特に配列番号１の塩基配列の部分配列又はそれに相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、組織において発現している本発明酵素を測定する際に、ＰＣＲ法やin situ hybridization法によって本発明ＤＮＡの転写産物量を測定するためのプライマーやプローブとして利用可能である。前述のプライマーやプローブとしての使用に適する塩基配列は、配列番号１の塩基配列を基に適宜選択することが可能であるが、市販のコンピュータプログラム（例えばOligo version 4.0プログラム：ナショナルバイオサイエンス社製等）を使用することで効率的に設計することも可能である。
【００４２】
また更に、本発明ＤＮＡは、α4GnTのポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を有していてもよく、またα4GnTのポリペプチドの一部分をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００４３】
ところで、一般に哺乳動物の同一酵素のポリペプチドは、アミノ酸配列に高い相同性を有することが知られており、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドも、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約６５％以上と想定される。従って、本発明で具体的に開示しているＤＮＡがコードするポリペプチドと高い相同性を有するポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包含される。上述のようにα4GnTのポリペプチドは膜貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から当該膜貫通領域を含む領域を欠失したα4GnTのポリペプチドの部分もまた本発明に包含される。このようなポリペプチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２６〜３４０などが挙げられる。
【００４４】
＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法
以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発明ＤＮＡは、実施例に示すようにヒト胃組織のｃＤＮＡライブラリーから本酵素活性を指標に調製することができる。また、本発明によりα4GnTのポリペプチドのアミノ酸配列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体DNAあるいはmRNAから本発明DNAを増幅することによって取得することも可能である。特に以下の各工程からなる発現クローニング法によりヒトのα4GnTをコードするDNAを製造することも可能である。
（１）ヒトのcDNAライブラリーを宿主細胞に導入する。
（２）細胞表面にα結合で非還元末端にGlcNAcが結合したO-グリカンを発現した宿主細胞を検出し、回収する。
（３）α4GnT cDNAのシブセレクションによる取得
【００４５】
スクリーニングによって、通常には上記α4GnTの完全長cDNAを選択する。
以下に、本発明DNAを製造する方法の一例を具体的に説明する。
【００４６】
（１）ヒトのcDNAライブラリーの宿主細胞への導入
ヒトのcDNAライブラリーが由来する組織は、α4GnTが発現している細胞が存在する組織が好ましく、具体的には胃及び膵臓が好ましい。前記組織のcDNAライブラリーは例えばクロンテック社などから商業的に入手することも可能であり、また生検などにより生体から取り出された組織から調製することも可能である。例えば、生検によって取り出された組織から常法に従ってグアニジンチオシアネート／CsCl法（Kingston, R.E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Supple. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）等の公知の方法により全RNAを調製する。このようにして得られる全RNAから、オリゴdT（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラフィーなどによってポリ(A)+RNAを精製することができる。
【００４７】
上記(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写PCRにより、組織由来のcDNAを増幅することができる。逆転写PCRは、常法に従って行えばよいが、具体的に示すならば以下の通りである。1μgのポリ(A)+RNA、それぞれ100 pmolのオリゴdTとランダムオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ500μMの4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素（ギブコBRL社製等）、1 mMジチオスレイトール(DTT)、120単位のRNase（リボヌクレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製等）を含む緩衝液（終量20μl）を50℃で60分間インキュベートし、cDNA一次鎖を合成する。次の上記の逆転写反応混合液5μl、各100 pmolのランダムオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ250μMの4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、1.25単位のTaqポリメラーゼを含む反応液（終量50μl）に対し、95℃1分、46〜62℃1分及び72℃2分を35サイクル程度繰り返して行う方法などが例示として挙げられる。
【００４８】
このようにして得られたヒト組織のcDNAは、発現プラスミドベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞いずれも使用することが可能であり、当業者で有れば用いる宿主細胞にあわせてDNAの導入及び発現が可能な発現プラスミドベクターを上述の発現プラスミドベクターとして選択して使用することは容易であるが、特に真核細胞を宿主細胞として使用することが好ましく、その中でも特にほ乳類由来の細胞を宿主細胞として使用することが好ましい。そのような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）細胞（細井ら：Cytotechnology, 1, 151, 1988）、チャイニーズハムスター由来のCHO細胞（ATCC CCL61等）、サル由来のCOS細胞（ATCC CRL1650等）、マウス由来の3LL細胞（Taniguchi,S.（信州大学加齢適応研究センター））等が挙げられる。本発明においては、特に細胞表面にα1,4結合でガラクトースに結合したN-アセチルグルコサミンが発現していない細胞が好ましく、上述のCOS細胞の一系統であるCOS-1細胞などが好ましい。
【００４９】
発現プラスミドベクターとしてはpCEV18（Maruyama,K.（東京医科歯科大学））、pCXN2（Niwa,H., Yamamura,K. and Miyazaki,J.(Gene, 108, 193-200, 1991）、pFLAG-CMV-2（Eastman Kodak製）、pAGE107（Miyajiら、Cytotechnology, 3, 133, 1990）、pAS3-3（特開平2-227075号公報）、pAMoERC3Sc（特開平5-336963号公報）、pcD2（Chen,Cら、Mol. Cell. Biol., 7, 2445-2452, 1987)、pRcCMV（インビトロゲン社製）、pME18S（丸山ら、Med. Immunol., 20, 27, 1990）、及びpcDNAI（クロンテック社製）などが挙げられる。上述の宿主細胞として好ましいCOS-1細胞を使用する場合にヒトcDNAライブラリーの製造に使用するにはpcDNAIが好ましいがこれに限定されるわけではない。
【００５０】
上述のCOS-1などは、本発明酵素がα1,4結合でN-アセチルグルコサミンを付加する受容体を発現していないが、そのような細胞には外的にN-アセチルグルコサミン受容体を発現するためのcDNAを上述のヒト組織のcDNAライブラリーの宿主細胞への導入と同時に導入することで細胞表面に本発明酵素の活性による産物（α結合で非還元末端にGlcNAcが結合したO-グリカン）を発現させることが可能となる。本発明酵素の働きにおいてN-アセチルグルコサミン受容体となる物質として好ましくはヒトのロイコシアリンが挙げられ、ヒトのロイコシアリンを発現させるための遺伝子をCOS-1細胞に導入するためにはpRcCMV-leu（Fukuda,M. in Cell Surface Carbohydrates and Cell Development, 127-159, 1992）等を使用することが好ましい。
【００５１】
（２）細胞表面にα結合で非還元末端にGlcNAcが結合したO-グリカンを発現した宿主細胞の検出、回収
上記（１）でcDNAを導入した細胞は、15時間以上、好ましくは20〜80時間程度通常の培養条件下において培養する。培養後、非還元末端にα結合でGlcNAcが結合したO-グリカンを発現した細胞を回収する。
【００５２】
α結合で非還元末端にGlcNAcが結合したO-グリカンの検出は、通常はその簡略化された手法が確立されていることから抗原抗体反応を用いることが好ましい。抗原抗体反応に用いる抗体としては、GlcNAcが結合したO-グリカン、特にGlcNAcα1,4Gal構造に特異性を有する抗体が好ましい。そのような抗体としては例えばHIK1083、PGM36、及びPGM37等（Biochem. J. 318, 409-416, 1996、Comp. Biochem. Physiol. 121B, 315-321, 1998）が挙げられ、いずれの抗体であっても使用することが可能である。また、上述の抗体はそれぞれ単独で使用することも可能であるが、上述の抗体から選択された２種類あるいは３種類すべての抗体を混合して、上述の目的の構造を検出するために使用することも可能である。
【００５３】
抗体が結合した細胞の検出法は、常法に従って行えばよいが、例えばラベルされた、上述の好ましい抗体に対する二次抗体を使用する方法などが挙げられる。上記二次抗体のラベルは、検出可能なラベルであってそれを指標として細胞を回収する手段が存在する前記ラベル（例えば蛍光標識ラベル（フローサイトメトリーとセルソーターにより細胞を回収可能）、特異的結合対（ビオチンとアビジンなど）の一方など（特異的結合対の他方を固相したカラムなどにより細胞を吸着、回収可能））を使用することが好ましい。特に公知の蛍光標識ラベルを結合した二次抗体を使用すると、フローサイトメトリー及びセルソーターを使用することによって、細胞の検出及び回収を容易に行うことができるため好ましい。
【００５４】
セルソーターでの蛍光の強い細胞の回収は、個数で細胞集団全体の20%以下、好ましくは10%以下、特に好ましくは5%以下の細胞を選別することが好ましいがこれに限定されない。回収した細胞からは、常法に則って発現プラスミドベクターを抽出することができる。
【００５５】
（３）α4GnT cDNAのシブセレクションによる取得
上記の操作によって得られた発現プラスミドベクターを適当な宿主に導入してα4GnTcDNAをシブセレクションにより取得する。シブセレクションは公知の方法によって行うことが可能であるが、E. coliなどの適当な原核細胞株（宿主菌）に上記の発現プラスミドベクターを導入し、この宿主菌を培養してコロニーを形成させ、目的のcDNAが導入されたコロニーを絞り込む方法が簡便なため好ましい。上述の好ましい発現ベクターとして例示したpcDNAIを使用する場合は、宿主菌としてE. coli MC1061/P3を使用することができる。複数のコロニーからα4GnT cDNAを含む発現プラスミドベクターが導入された宿主菌によって構成されるコロニーを選択する方法としては、例えば以下の方法があげられる。
【００５６】
すなわち、生じた宿主菌の複数のコロニー（ホスト）をニトロセルロース膜などに転写してレプリカを作成し、当該レプリカを複数のプールに分けてそれぞれのプールから発現プラスミドベクターを常法に従って調製する。この発現プラスミドベクターを（１）に記載した方法と同様に宿主細胞に導入して培養し、目的のα4GnTを発現した細胞を検出することでα4GnTcDNAを含むプラスミドベクターが含まれるレプリカを特定し、それに基づいてコロニーの特定が可能である。
【００５７】
α4GnTを発現した宿主細胞の検出は、上記（２）と同様に、細胞表面に非還元末端にα結合でGlcNAcが結合したO-グリカンを発現した宿主細胞を検出することにより行うことができるため、宿主細胞としてはほ乳類由来の細胞が好ましく、（１）で記載した宿主細胞が好ましい。上述のHIK1083、PGM36、及びPGM37等の抗体を使用した抗原抗体反応を利用することで上記検出を行うことが簡便となるため好ましい。
【００５８】
上記でα4GnTの発現が検出された宿主細胞から、対応するレプリカを特定し、さらにそのレプリカのホストを特定することができる。α4GnTcDNAは当該ホスト上のコロニーに含まれる宿主菌から常法に従って取得することが可能である。
【００５９】
通常は、レプリカの作成、複数プールへの分割、α4GnTcDNAを含むプラスミドベクターを含むプールの選択、及び対応するホストの選択を繰り返すことで目的のα4GnTcDNAの単一クローンを得ることが可能である。
【００６０】
目的遺伝子α4GnTcDNAを含む発現プラスミドベクターpcDNAI（pcDNAI-α4GnT）を常法に従ってこの単一クローンから抽出し、挿入されたα4GnTのcDNAの塩基配列の決定を行うことができる。上述の様にして得られるα4GnTのcDNAの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列としては例えば配列番号１に記載された塩基配列及び配列番号２に記載されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００６１】
また、膜貫通領域を欠失した、すなわち可溶性タンパク質の形態のα4GnTのポリペプチドをコードするDNAは以下のようにして得ることが可能である。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づき、当該酵素のポリペプチドのN-末端側で適当な短縮化形態となるように選択したプライマーを合成し、クローン化したα4GnTのcDNAを鋳型としてPCR法により増幅する。例えばN-末端の27アミノ酸残基が欠失した短縮化形態のポリペプチド（配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２８〜３４０のアミノ酸配列を有する）をコードするDNAを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の3'及び5'末端部に存在する塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ5'プライマー及び3'プライマーとして用いてPCRを行えばよい。次いで、増幅して得られたPCR産物を必要により精製して目的DNAを得ることが可能である。
【００６２】
＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコードされるα4GnTのポリペプチドの全部又は一部からなるポリペプチド
本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるα4GnTのポリペプチドの全部又は一部からなるポリペプチドも提供する。本明細書において、上記のポリペプチドの「一部」とは、当該ポリペプチドの「一部」を有する酵素がα4GnT活性を有する、あるいはα4GnTのペプチド配列の全配列と同一の抗原性を有するなどのα4GnTのポリペプチド全部と共通の何らかの活性ないし機能を有する部分を意味する。本ポリペプチドは単独であっても良いし、又はポリペプチドと融合していても良い。また、膜貫通領域を欠失していても良い。膜貫通領域のみを欠失したポリペプチドとしては例えば配列番号２のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２８〜３４０のものが挙げられる。
【００６３】
また、本ポリペプチドを免疫原として本発明ポリペプチド又は本発明酵素に対する抗体を常法により製造することも可能である。
【００６４】
具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部を有し、本発明酵素に特徴的なアミノ酸配列を有する上記ポリペプチドを免疫原として、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは由来が異なる動物に投与することによって免疫し、常法に従ってポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を調製することができる。免疫原を免疫感作する動物は、上記免疫原によって感作されて本発明の抗体を産生できる動物であれば限定はされないが、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、アヒル等が挙げられ、特にウサギ、ラット、マウス、ヤギが好適である。
【００６５】
動物への免疫原の投与に際し、好ましくは常法により上記免疫原とアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバントなど）との混合物（懸濁液）を調製し、これを上記動物の皮下、皮内、静脈内又は腹腔内に投与する。
【００６６】
初回投与後、１〜５週間に一度、１〜５回程度同様に追加免疫を行うと、上記免疫原に対する抗体が免疫感作された動物の体内に産生される。このように産生された抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として常法により採取される。
【００６７】
＜４＞本発明ＤＮＡを利用した本発明ポリペプチド又は本発明酵素の製造方法
上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチド又はそれを含むα4GnTを培養物中に生成蓄積させ、その培養物からポリペプチド又はそれを含むα4GnTを採取することによって、ポリペプチド又はそれを含むα4GnTを製造することができる。
【００６８】
本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換えベクターを構築し、この組換えベクターを用いて、細胞を形質転換することによって得ることができる。なお、本発明は、本発明ＤＮＡを保持する組換えベクターが導入されており、かつ該ＤＮＡが発現可能で、本発明酵素の製造に使用できる形質転換体（例えば、上記組換えベクターを含む形質転換体）も提供するものである。
【００６９】
細胞としては大腸菌などの原核細胞や、ほ乳類細胞などの真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明DNAの発現によって生じるα4GnTのポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にα4GnTのポリペプチドのみを得ることが可能であり、またほ乳類細胞などの真核細胞を用いた際は、本発明DNAの発現によって生じるα4GnTのポリペプチドに糖鎖の付加がなされ、本発明酵素(α4GnT)が製造される。
【００７０】
本製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、COS-1細胞、3LL-HK46細胞などのほ乳類由来の培養細胞とpcDNAI、pME18S、pCEV18等のほ乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましいが、特に限定はされず、ほ乳類由来でない培養細胞と、その細胞で発現し得る発現ベクターとの組み合わせを利用しても製造することができる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞にあわせて適宜選択される。
【００７１】
本発明DNAによってポリペプチドの全長のみを発現させてもよいが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また本発明DNAの一部を用いて部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００７２】
上記融合ポリペプチドを発現する組換えプラスミドの構築方法の具体例としては以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のDNAを、挿入したDNAと同一読み出し領域にプロテインAなどのタンパク質を含むように構築した発現プラスミドベクター（例えばpGIR201protA: J. Biol. Chem. 269, 1394-1401, 1994、pcDNAI-A: J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999など）に通常の方法に従って組み込み、複数のタンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有する発現プラスミドベクターを構築し、宿主細胞に導入することができる。また、この発現プラスミドベクターから、融合タンパク質をコードする断片を制限酵素により切り出して、上記と同様の操作により他の発現プラスミドベクターに連結させて宿主細胞に導入することも可能である。
【００７３】
培養物からの本発明ポリペプチド又は本発明酵素の採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。具体的には例えば、本発明酵素の基質などを結合したセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。融合ポリペプチドとして発現させた場合は、上記アフィニティーカラムの他、α4GnTと融合したポリペプチドに対し親和性の高い物質（例えば抗体など）を結合したアフィニティークロマトグラフィー等に宿主細胞の培養物を付することによって精製することができる。さらに、融合ポリペプチド中のα4GnTと他のタンパク質のポリペプチドとの間に、例えば特定のタンパク質分解酵素が認識して切断するアミノ酸配列を有するリンカーを予め組み込んでおくことにより、融合ポリペプチドを精製した後にリンカー部位で融合ポリペプチドを切断することにより、α4GnTを得ることが可能である。上記タンパク質分解酵素とそれが認識する特定の配列の組み合わせとしては、例えばプロインスリンの合成時に働くシグナルペプチダーゼとインスリンのシグナルペプチドの組み合わせが挙げられる。なお、上記の培養物には、培地及び当該培地中の細胞が包含される。
【００７４】
α4GnTの活性の測定方法としては、J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999に記載された基質特異性試験の方法において、EDTAの代わりに5 mMのMnCl2を含む反応液を用いることにより実施することが可能である。
【００７５】
＜５＞本発明検出法
胃および膵臓の組織は癌化に伴いコンカナバリンAパラドックス染色で検出されるIII型粘液が増加することが知られている（J. Histochem. Cytochem., 46, 793-801, 1998、Hum. Pathol., 23, 925-933、Hum. Pathol., 26, 725-734, 1995）ため、組織又は血液などの体液中に存在する細胞における本発明ＤＮＡの転写産物の発現を、例えば、リアルタイムRT-PCR法、PCR法などによって定量することにより、癌の診断に利用することができる。
【００７６】
すなわち、生体から採取した体液におけるα4GnTのＤＮＡの発現量と、胃癌又は膵癌とを関連づけることで、胃癌又は膵癌の検出を容易に行うことが可能である。本明細書において、発現量と、胃癌又は膵癌とを関連づけるとは、発現量を、胃癌又は膵癌の有無、進行度、転移の有無、治癒の程度などの胃癌又は膵癌に関する定性的又は定量的な指標とすることを意味する。ここで発現量とは、転写産物量、酵素タンパク質としての発現量、及び酵素活性の量のいずれをも含む概念であるが、転写産物量であることが好ましい。
【００７７】
体液、その中でも特に血液及びリンパ液中、特に好ましくは血液中に存在する微量の胃癌又は膵癌由来の細胞におけるα4GnTのＤＮＡの発現量を検出することで胃癌又は膵癌の検出を行うことができる。特に健常人の血液中にはα4GnTのＤＮＡを発現した細胞が存在しないため、血液中のα4GnTのＤＮＡの発現、好ましくは転写産物の検出が最も胃癌又は膵癌の検出に有用である。
【００７８】
α4GnTの活性の測定方法は例えばJ. Biol. Chem. 274, 3215-3221に記載された方法に準じて行うことができ、特にEDTAなどのキレート剤を反応混合液に添加せずに、Mn2+を添加することが好ましい。また、受容体としては特にGalβ1,3GalNAcαpNP、GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP、Galβ1,4GlcβpNP、Galβ1,3GlcNAcβpNP等が挙げられ、好ましい。
【００７９】
また、より簡便に操作を行うことができる上述の胃癌又は膵癌の検出法としてはα4GnTのＤＮＡの転写産物を検出する方法が挙げられる。なお、α4GnTのＤＮＡの転写産物量は一般に極微量であるので、これを逆転写してcDNA（又はその一部）を調製し、これをPCRによって大量に増幅して、増幅されたPCR産物を検出することにより、α4GnTのＤＮＡの転写産物を間接的に検出することが好ましい。この方法としては、例えば配列番号７及び８、並びに／又は、配列番号９及び１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、常法に従って体液中の細胞から調製した全RNAを逆転写して調製したcDNAとを用いてPCR法を行い、増幅されたPCR産物を電気泳動などの方法により分離して公知の方法に従って可視化することでα4GnTのＤＮＡの転写産物を、その逆転写物であるcDNA（又はその一部）を介して間接的に検出する方法が例示される。上記プライマーは本発明DNAが有する塩基配列（配列番号１）のうちの通常には150bp以上、好ましくは200bp以上、より好ましくは250bp以上をPCR法によって増幅するためのプライマーであり、かつ好ましくはジェノミックＤＮＡを増幅しない限りにおいて特に限定されず、上記に例示した塩基配列を有するプライマー以外でも、本発明DNAの塩基配列が開示されているため当業者であれば適宜設計することが可能であり、また市販のプライマー設計用のソフトウェア等を使用することで容易に設計することが可能である。例えば配列番号７及び８の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いてPCR法によりα4GnTのＤＮＡの転写産物の逆転写物であるcDNAの一部を増幅した場合には、生じるPCR産物は290bpのポリヌクレオチドであり、配列番号９及び１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いてPCR法によりα4GnTのＤＮＡの転写産物の逆転写物であるcDNAの一部を増幅した場合には270bpのPCR産物が得られる。
【００８０】
更に上述の可視化した電気泳動像を市販の画像解析ソフトウェアを用いて解析することで、α4GnTのＤＮＡの転写産物を、その逆転写物であるcDNA又はその一部（増幅したもの）を定量することにより間接的に定量することも可能であり、特に血中に侵入した胃癌又は膵癌細胞の量を定量して上記胃癌又は膵癌の進行度、転移の有無、治癒の程度などの指標とすることも可能である。
【００８１】
例えば、実施例７に記載の方法に従って、末梢血中に存在する胃癌又は膵癌由来の細胞中に存在するmRNAから、α4GnTのDNAの転写産物であるmRNAを逆転写PCR法によってcDNA又はその一部として増幅して胃癌及び膵癌を検出する場合は、例えば５mlの末梢血から回収した全RNAを逆転写してcDNAを調製し、これを鋳型として、配列番号７及び８のヌクレオチドプライマーとAmpliTaq Goldポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin-Elmer)製）を用いてPCR反応を行う。すなわち、最初に95℃で10分間加熱してポリメラーゼを活性化した後、変性反応を94℃で30秒、アニーリングを60℃で30秒、伸長反応は72℃で30秒としてこのサイクルを50サイクル行い、さらに５分間の伸長反応を行う。この操作によって生じたPCR産物を鋳型としてさらに配列番号９及び１０のヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行う。このときの増幅も１回目のPCRと同じ条件である。この操作によってα4GnTのＤＮＡの転写産物の逆転写物（cDNA）又はその一部を増幅することができる。この場合は、健常人では約270bpの増幅産物（PCR産物）は検出されないのに対し、胃癌又は膵癌の患者では検出可能となる。例えばアガロースゲル電気泳動をした後にエチジウムブロマイドで染色した後に紫外線を照射することで、肉眼により確認することができる顕著なバンドが観察される。
【００８２】
また、α4GnTのＤＮＡの転写産物を検出する方法の別の態様としては、放射性同位体等の検出可能な標識物質により標識を行ったα4GnTのＤＮＡと、体液中のα4GnTのＤＮＡの転写産物又はそれを増幅して調製した複製物とのハイブリダイゼーションを行い、上記標識物質を検出する方法が挙げられる。標識物質として放射性同位体を用いた場合は、検出はオートラジオグラフィー等によって容易に行うことができる。標識を行ったα4GnTのＤＮＡとして具体的には32Pラベルされた本発明ＤＮＡ又はその断片を用いることが可能である。ハイブリダイゼーションはノザンハイブリダイゼーションなどで通常に用いられる条件で行うことができ、検出も常法に従って容易に行うことが可能である。
【００８３】
＜６＞本発明診断キット
更に本発明はα4GnTをコードするＤＮＡの発現を検出するために使用するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする胃癌又は膵癌の診断キットも提供する。
【００８４】
上記の通り、α4GnTの体液中での発現は、胃癌又は膵癌であることを特異的に示すため、当該ＤＮＡの発現を検出するためのキットを構成すれば、これを用いて胃癌及び膵癌のいずれかであることが検出できる。本発明診断キットは、α4GnTのＤＮＡの発現を簡便な手法により検出するために、α4GnTのＤＮＡの転写産物を検出可能なオリゴヌクレオチドを含む限りにおいて特に限定されない。
【００８５】
上記オリゴヌクレオチドとしては、ハイブリダイゼーション法による検出に用いるための、標識物質により標識した本発明ＤＮＡ又はその一部分、または逆転写PCR法による検出に用いるための、例えば配列番号７及び８の組み合わせ、並びに、配列番号９及び１０の組み合わせのプライマー対が例示される。本発明ＤＮＡの一部分とは、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの一部分を指称し、その大きさは通常には150bp以上、好ましくは200bp以上であり、250bp以上であることが最も好ましい。また、上述のオリゴヌクレオチドが上述のプライマーである場合は、α4GnTのＤＮＡの転写産物から、その一部分、好ましくは150bp以上、より好ましくは200bp以上、最も好ましくは250bp以上の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドからなるプライマーで、かつ好ましくはジェノミックＤＮＡを増幅しないものであれば上述のプライマーに限定されない。
【００８６】
本発明診断キットは、上述のオリゴヌクレオチドとして上述したプライマーを包含する場合は、当該プライマーの他に、更に胃癌又は膵癌の疑いのある組織から抽出した全ＲＮＡ又は体液より抽出した全ＲＮＡから、α4GnTのＤＮＡ又はその塩基配列のうちの通常には150bp以上、好ましくは200bp以上、より好ましくは250bp以上からなる一部分を増幅するための試薬を包含しても良い。そのような試薬としては、ＲＮＡからＤＮＡを逆転写反応により合成する逆転写酵素、及び前記逆転写反応によって生じたＤＮＡを鋳型として相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成するためのＤＮＡポリメラーゼが例示される。さらにこの場合、本発明診断キットは上述の試薬の他に、例えばマイクロチューブ、ＲＮａｓｅ阻害剤、緩衝液、精製水、アガロースゲル、エチジウムブロマイド等を適宜含んでも良い。
【００８７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に詳述するが、本発明はこれに限定はされない。
【００８８】
１．本発明酵素を発現する細胞のスクリーニング
真核細胞の発現ベクターであるpcDNAIに組み込んだヒトの胃組織のcDNAライブラリー（クロンテック社製）30μgを、ヒトのロイコシアリンを発現するpRcCMV-leu  30μgと共に1.2×107個のCOS-1細胞に導入した。このCOS-1細胞を60時間培養した後、細胞の表面に、糖鎖の非還元末端にα結合で結合したGlcNAc残基を発現したCOS-1細胞を、ベクトンディッキンソン社製のセルソーター(FACStar)及びα結合したGlcNAcと特異的に反応する抗体混合液（HIK1083、PGM36、及びPGM37(Biochem. J. 318, 409-416, 1996、Comp. Biochem. Physiol. 121B, 315-321, 1998)からなる）を使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)により濃縮し、258個のCOS-1細胞を回収した。
【００８９】
その後、常法に従ってプラスミドDNAを回収し、Cell-Porator（ライフテクノロジー社製）を用いて宿主菌であるE. coli MC1061/P3に導入した。導入した宿主菌のうち、目的のcDNAを含む宿主菌をアンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性による選択で、325個のコロニーが生じた。
【００９０】
３２５個のコロニーをニトロセルロース膜に転写してレプリカを作成し、このレプリカを１０等分してプールし、それぞれのプールからプラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドDNAを再度、pRcCMV-leuと共にCOS-1細胞に導入し、上述の抗体混合液を使用した免疫蛍光染色を行い、その後、顕微鏡によりCOS-1細胞を観察した。その結果、強い蛍光を発するCOS-1細胞の存在が確認され、対応するレプリカを介して目的のcDNAを保持したコロニーが存在するホストを特定した。
【００９１】
さらに、この特定されたホストから新たなレプリカを上記と同様に作成して、上記と同様に目的のcDNAを保持するホストを絞り込んだ。レプリカの作成〜ホストの絞り込みを３回繰り返して行った時点で、ホストに存在するコロニーが１つとなった。このコロニーを形成した宿主菌が保持していたプラスミドをpcDNAI-α4GnTと名付けた。
【００９２】
２．塩基配列の決定
１．で絞り込まれた宿主菌のコロニーから常法に従ってプラスミドDNAを回収して、常法によりアプライドバイオシステムス社製の373A DNAシークエンサーを使用したダイジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション(dye dideoxy nucleotide chain-termination)法によって3'→5'、5'→3'双方の向きに塩基配列の解析を行った。その結果、この宿主菌に組み込まれているプラスミドDNAには1292bpの塩基対からなる配列番号１記載の塩基配列を有するα4GnTのcDNAが挿入されていたことが明らかとなった。この塩基配列のオープンリーディングフレームから340アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２）が予測された。
【００９３】
このアミノ酸配列からは、分子量が39,497Daで、Ｎ−結合型糖鎖が結合する可能性がある４カ所の部位（配列番号２においてアミノ酸番号９９、１３８、２５１及び２８２）を有するタンパク質が予測された。また、このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、Ｎ末端から４〜２５番目のアミノ酸残基に渡る長さ２２残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、その部分のＮ末端側が短く、その部分が塩基性アミノ酸残基により挟まれていることから、α4GnTは、膜貫通領域を有するタイプIIの膜貫通タンパク質であることが予想された。
【００９４】
３．α4GnTのCOS-1細胞における発現
１．で得られた宿主菌のコロニーからプラスミドベクターpcDNAI-α4GnTを常法に従って調製した。このプラスミドベクター又はpcDNAI（対照）を、pRcCMV-leuと共にCOS-1細胞に導入した。同様に、COS-1細胞にpcDNAI-α4GnTを単独で導入した。導入６０時間後、各細胞を固定し、α結合したGlcNAcと特異的に反応する抗体HIK1083又は抗ロイコシアリン抗体1G10（PharMingen）と反応させ、次いで、フルオレセインイソチオシアネートを結合させた抗マウスＩｇＭ（HIK1083に対して）又は抗マウスＩｇＧ（1G10に対して）と反応させた。
【００９５】
pRcCMV-leu及びpcDNAIを導入したCOS-1細胞は、1G10により免疫染色されたがHIK1083により染色はされなかった。pRcCMV-leu及びpcDNAI-α4GnTを導入したCOS-1細胞は、1G10及びHIK1083のいずれによっても免疫染色された。また、pcDNAI-α4GnTのみを導入したCOS-1細胞は、1G10により染色されず、HIK1083では、弱い染色性が見られた。このことはHIK1083がクラスターO-グリカンに付加されたα1,4-GlcNAcに、より強く結合することを示唆している。PGM36及びPGM37のそれぞれによって免疫染色をした場合も、HIK1083で免疫染色した場合と同様の染色性が見られた。
【００９６】
これらの結果から、pcDNAI-α4GnTにコードされるタンパク質が、ロイコシアリン上にあるムチン型糖鎖の非還元末端にGlcNAcをα結合により付加する活性に関与していることが示された。
【００９７】
４．α4GnTの部分配列を有する可溶性形態のα4GnTをコードするDNAの調製
塩基配列から予測されたα4GnTのアミノ酸配列から、α4GnTはタイプIIの膜タンパク質であることが予測されたため、膜貫通領域を欠失した可溶性形態のα4GnT（以下「α4GnT(S)」とも記載する）を調製した。すなわち、配列番号２記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２７に相当するＮ末端領域のアミノ酸を欠失した、配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２８〜３４０のアミノ酸配列を有するα4GnT(S)を得るために、配列番号３記載の塩基配列を有するプライマーを上流域プライマー（BamHIサイトを内部に有する）、配列番号４記載の塩基配列を有するプライマーを下流域プライマー（XhoIサイトを内部に有する）として用いて、pcDNAI-α4GnTを鋳型としてPCR法を行った。得られたPCR産物を制限酵素BamHI及びXhoIにより消化処理し、配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２６２〜１２１５の塩基配列を有するDNAを調製した。プロテインＡをコードするDNAを組み込んだpcDNAIプラスミドベクター（pcDNAI-A）（J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999）のBamHI-XhoIサイトに上述の塩基番号２６２〜１２１５の塩基配列を有するDNAを組み込みpcDNAI-A-α4GnT(S)を得た。このプラスミドベクターはα4GnT(S)とプロテインAとを同一読み出し領域にコードしているため、α4GnT(S)とプロテインAとの融合タンパク質（α4GnT(S)-A）を発現する。
【００９８】
５．α4GnT(S)の精製及び基質特異性試験
常法に従って、COS-1細胞にpcDNAI-A-α4GnT(S)を導入し、その培養上清からα4GnT(S)-Aを、J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999に記載の方法と同様にIgG-Sepharoseカラム（アマシャムファルマシア社製）を使用して単離した。
【００９９】
基質特異性試験はJ. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999に記載された基質特異性試験の方法に準じて行ったが、10 mMのEDTAにより本発明酵素の活性は約２／３に抑制された。更にEDTAを添加せずに5 mMのMn2+を加えることで本発明酵素の活性は約１．３倍に促進されたため、前記方法において、反応液を、EDTAの代わりに5 mMのMnCl2を含む反応液に代えた方法で、表１に記載された受容体合成基質をN-アセチルグルコサミンの受容体として使用してα4GnT活性の測定を行った。表１の受容体合成基質No. 9に対する活性を100%として他の基質に対する相対活性で表した結果を図２に示す。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
図２に示されるように、α4GnT(S)はコア２の分岐オリゴ糖であるGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP（表１、No. 9）に対して、GlcNAcを転移する活性が最も強いことが明らかとなった。また、α4GnT(S)はコア１の受容体合成基質であるGalβ1,3GalNAcαpNP（表１、No. 6）よりも、よりGlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP（表１、No. 8）に対してGlcNAcを転移する活性が強いことを示す結果が得られた。
【０１０２】
α4GnT(S)はGalβ1,4GlcβpNPと比較してGalβ1,3GalNAcαpNP（表１、No. 6）に対してよりGlcNAcを転移するが、さらにGlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP（表１、No. 8）及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNP（表１、No. 9）に対してGlcNAcを転移する活性が強い。また、Galβ1,3GlcNAcβpNP（表１、No. 3）及びGalβ1,4GlcβpNP（表１、No. 4）にGlcNAcを転移する弱い活性を有した。このことから主にはα4GnT(S)はO-グリカン中のβ1,4結合及びβ1,3結合で結合したガラクトース残基を認識してGlcNAcを転移すると推測された。またα4GnT(S)は、糖供与体としてUDP-GalNAcを使用した場合は、上記のいずれの受容体合成基質に対しても糖（GalNAc）を転移しなかった。
【０１０３】
α4GnT(S)のGlcNAc転移活性によって生じた生成物の構造を特定するために、上述の条件において反応液を300μlにスケールアップし、一晩反応させて得られた反応生成物を、Sep-Pak C18カートリッジカラムを使用して、J. Biol. Chem. 273, 34843-34849, 1998に記載された方法に従って精製した。反応生成物の純度が99%以上であることをHPLCにより確認した後、常法に従ってNMRにより構造を分析した。NMRスペクトルの解析は500 MHz Varian Unity-Plusスペクトロメーターを用いた。ケミカルシフトの帰属には受容体およびα-D-GalNAc-pNP、Galβ1,3GalNAc-pNP及びGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAc-pNPのスペクトルの全てを用いた。スペクトルは繰り返し重水置換を行った後に重水を溶媒として測定した。1H NMRのスペクトルは、二次元二量子フィルター相関スペクトル（2D-DQF-COSY）と、二次元全相関スペクトル（2D-TOCSY：50 ms）を組み合わせて帰属した。精度を上げるためにスペクトル解析は5℃、22℃、及び30℃で行った。13Cの帰属とグリコシド結合は、異核多重量子コヒーレンススペクトル（HMQC）及び二次元回転機構NOEスペクトル（2D-ROESY：150ms及び300ms）を補助的に使用して決定した。
【０１０４】
300ナノモルのGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαpNPを受容体としてα4GnT(S)の活性によりGlcNAcを転移させた反応生成物を使用してNMRによる構造解析を行った。1H NMRのスペクトルから、表２に示すように、６個のアノマーの原子について二重線の特異的シグナルが得られた。非アノマープロトンのシグナルは、2D-DQF-COSY及び2D-TOCSYスペクトルのH-4の位置に観察されたクロスピークに基づいて帰属された。13C NMRのスペクトルは、反転モードを使用した二次元水素検出異核1H-13C相関によって解析した。HMQCスペクトルにより、β-D-Gal残基の４位の炭素原子は置換が起こっていることが示された。2D-ROESYスペクトルでは、α-D-GlcNAc H-1／β-D-Gal H-4のδ3.96ppm付近のクロスピークが観察され、それがα1,4結合により結合していることが示された。スペクトル中の他のクロスピークも、GalにGlcNAcがα1,4結合で結合した構造に合致した。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
６．各組織でのα4GnT発現
６-1  ノザンブロット分析
pcDNAI-α4GnTから切り出してゲル電気泳動で単離したα4GnTのcDNAを、ストラタジーン社製のPrime-It IIラベリングキットを使用して[α32P]dCTPでラベルして放射性プローブを作成した（1×106cpm/ml）。上記プローブを、クロンテック社製のヒト多組織ノザンブロット用（健常成人組織）メンブラン（Multiple Tissues Nothern Blots）及びクロンテック社製のハイブリダイゼーション溶液（ExpressHyb Hybridization Solution）を用い、キットに添付された手順書に従って分析を行った。すなわち、ExpressHyb Hybridization Solutionを68℃に加熱し、Multiple Tissues Nothern Blotsを68℃で30分間、上記ExpressHyb Hybridization Solution中で振盪してプレハイブリダイズを行った。上記プローブを95℃で2分間変性させて急冷し、その後このプローブを含むExpressHyb Hybridization Solution 5 ml中で上記Multiple Tissues Nothern Blotsを68℃で1時間振盪した。この膜を洗浄液中で30分間室温で振盪し、さらに50℃で40分間洗浄液中で振盪した。このように調製した放射能プローブが結合したMultiple Tissues Nothern Blotsを用いてオートラジオグラフィーによりX線フィルムを感光させた。その結果、1.7kbの大きさのα4GnT遺伝子の転写産物が、胃及び膵臓において観察された。さらに2.1kb及び0.7kbの転写産物が胃及び膵臓にかすかに観察された。
【０１０７】
６-2  GlcNAcα1,4Galβ→R構造又はIII型粘液の組織での発現
ヒト組織でのGlcNAcα1,4Galβ→R構造の発現を検出するために、Histochem. Cell Biol. 110, 113-119, 1998及びJ. Histochem. Cytochem. 46, 793-801, 1998に記載された方法に従って、HIK1083抗体を使用した免疫染色法を行った。すなわち、信州大学医学部附属病院の病理切片ファイルから選択された、ホルマリン固定された後にパラフィン包埋されたヒト健常組織試料（胃、膵臓、及び結腸）を0.3%の過酸化水素水を含む無水メタノールに30分間つけた。HIK1083抗体による免疫組織染色は間接染色法（Ann. NY Acad. Sci. 254, 203-211, 1975）を使用した。二次抗体としては西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ダコ社製）を結合したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を使用し、ジアミノベンジジン-過酸化水素水溶液を使用して発色させた。胃粘膜においては副細胞及び幽門腺細胞に、膵臓においては膵管周囲の付属腺及び胃粘膜化生を示した腺管上皮に強い染色像が観察され、これらの部位においてGlcNAcα1,4Galβ→R構造が強く発現していることが示された。結腸においては染色像は観察されなかった。対照として一次抗体を使用しないで染色を行ったが、非特異的な染色は観察されなかった。
【０１０８】
また、上記と同様の組織におけるIII型粘液を検出するために、J. Histochem. Cytochem. 26, 233-250, 1978に記載された方法でコンカナバリンAパラドックス染色を行った。すなわちホルマリン固定した上記組織検体を60分間1%過ヨウ素酸ナトリウム水溶液中で酸化処理し、その後2分間0.2%水素化ホウ素ナトリウム水溶液で還元処理した。洗浄後、検体を0.1%コンカナバリンA（シグマ社製）中で60分間室温で処理し、その後0.001%西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液に30分間浸した。ペルオキシダーゼ活性はジアミノベンジジン-過酸化水素水溶液を使用して発色させて検出した。
【０１０９】
上述のHIK1083抗体による染色像と、コンカナバリンAパラドックス染色による染色像は酷似しており、非還元末端部にα1,4結合したGlcNAc残基はコンカナバリンAパラドックス染色で検出されるIII型粘液に含まれているものと考えられた。
【０１１０】
７．胃癌及び膵癌における本発明酵素ＤＮＡの転写産物の検出
胃癌患者２９人から末梢血５mlを採取した。採取した末梢血に比重液３mlを添加し、室温において2000×gで遠心処理を行い、単核球層だけを回収した。ここから酸性グアニジンチオシアネートフェノールクロロホルム法に従って調製した全RNAを逆転写反応の鋳型として、オリゴdTをプライマーとしてcDNAの一本鎖を合成し、これをPCRの鋳型として使用した。PCRは、8 pmoleのプライマーｓ（配列番号７：5'プライマー）及びａ（配列番号８：3'プライマー）の混合物、それぞれ200μMの4種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、及び0.35 UのAmpliTaq Goldポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin-Elmer)製）を含む混合液10μlで行った。増幅は以下のように行った。はじめに95℃で10分間加熱しポリメラーゼを活性化した。次に変性反応を94℃で30秒、アニーリングを60℃で30秒、伸長反応を72℃で30秒とし、このサイクルを50サイクル行った。その後、さらに５分間伸長反応を行った。この操作によって生じたPCR産物１μlを鋳型として用いて２度目のPCR反応を行った。このとき用いたプライマーは配列番号９（5'プライマー）及び配列番号１０（3'プライマー）のものであり、増幅は１回目のPCRと同じ条件で行った。この操作によって生じたPCR産物を３％のアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色して解析し、増幅されたＤＮＡのバンド（270 bp)を検出した。
【０１１１】
その結果、17名の胃癌患者の血液からは肉眼で確認できる程度のバンドが観察されたのに対し、対照として用いた10名の健常人の末梢血を用いて調製したPCR産物においてはこのバンドは全く観察されなかった。
同様に、5人の膵癌患者の末梢血から調製したPCR産物からも４例で胃癌患者と同じバンドが観察された。しかし、他の臓器（例えば食道、大腸、肺、肝臓）の癌の患者の末梢血からのPCR産物ではこのバンドは観察されなかった。また、胆嚢及び胆管の癌においてもGlcNAcα1,4Galβ残基を発現していることが知られているので、胃癌及び膵癌と同様に本発明検出法により検出が可能であることが予測された。
【０１１２】
これらのことから、体液中におけるα4GnTのＤＮＡの転写産物を、その逆転写物を介して検出することで、胃癌及び膵癌の特異的な検出を行うことが可能であることが明かとなった。
【０１１３】
８．GlcNAcα1,4Galβ→R構造を発現するAGS細胞の確立
ヒト胃ガン由来のAGS細胞（ATCC: CRL-1739）は2種類の異なるコア２β1,6-N-アセチルグルコサミン転写酵素（C2GnT-M: J. Biol. Chem. 274, 3215-3221, 1999、及びC2GnT-L: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9326-9330, 1992）の転写産物を発現しているが、細胞表面には、糖鎖の非還元末端にα1,4結合で結合したGlcNAc残基は発現していないことが知られている。
【０１１４】
１．で得られた細胞群から常法に従って調製したプラスミドDNA（pcDNAI-α4GnT）をpSV2neo（クロンテック社製）と共に10:1のモル数比となるようにLipofectAMINEを使用して常法に従ってAGS細胞に導入した。対象としてα4GnTの塩基配列を保持していないプラスミドベクターpcDNAIを使用した。ネオマイシン（G418）によりプラスミドベクターを導入したAGS細胞を選択した後、細胞表面にGlcNAcα1,4Galβ→R構造を発現している細胞を、HIK1083抗体を用いた蛍光抗体染色によって選択した。選択された細胞をヌンク社製のLab-Tekチャンバースライドを用いて培養した。一層状に広がったAGS細胞を、HIK1083抗体により免疫染色した。この結果、GlcNAcα1,4Galβ→R構造の発現が蛍光色素により観察された。この細胞を6-2同様にコンカナバリンＡパラドックス染色を行った結果、III型粘液が検出された。pcDNAI-α4GnTを導入していない対照のAGS細胞はHIK1083を使用した免疫染色、及びコンカナバリンＡパラドックス染色のいずれにも染色性を示さなかった。
【０１１５】
この結果は、α4GnTで合成されたGlcNAcα1,4Galβ→R構造がコンカナバリンＡパラドックス染色で検出されることを示した。
【０１１６】
９．α4GnTの染色体上の位置決定
本発明ＤＮＡの染色体上の位置決定を、ＰＣＲ法を利用するスタンフォードG3ラジエーションハイブリッドパネル（Nat. Genet., 7., 22-28, 1994）を使用して、J. Biol. Chem., 274, 3215-3221, 1999に記載された方法に従って行った。ラジエーションハイブリダイゼーションＤＮＡクローン（83個のエッペンドルフチューブに入ったクローン）はリサーチジェネティックス社より購入し、α4GnTの上流プライマー及び下流プライマーとしては、配列番号５及び６を使用した。ＰＣＲ法は、95℃で10分間、ＤＮＡを変性し、続いて、94℃30秒、60℃30秒、及び72℃23秒からなるサイクルを30回繰り返し、最後に72℃に3分30秒保って行った。増幅産物は、3.0%アガロースゲル電気泳動を行い、放射能を有するバンドを検出した。83のハイブリッドクローンのうち、No.7、17、41、43、44、47、68、77、78、82のクローンにおいてバンドが検出され、スタンフォードヒトゲノムセンターのＲＨサーバーにおいて解析した結果、α4GnTはヒト第３染色体のD3S1569及びD3S1550の間に位置することが判明した。すなわち、ヒトα4GnTの染色体上の位置は3p14.3であることが判明した。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明により、これまで入手することが不可能であった酵素の遺伝子工学的な大量合成が可能となる。また当該酵素によりGalにα1,4結合でGlcNAcが結合した構造を有する糖鎖を合成することが可能となる。さらに、胃癌又は膵癌の特異的な検出が可能となる。
【０１１８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  配列番号２記載のアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロットである。
【図２】  実施例で得られたN-アセチルグルコサミン転移酵素の基質特異性を示す。
【図１】
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【図２】
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