(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端側の５０２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列であり、
下記式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体又はその塩を、下記式（II）で示されるプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体へ変換する能力を有し、
アミコラトプシス  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｇ６５０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８２）菌株、又は、アミコラトプシス  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｇ６５０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８３）菌株である微生物。
【化１】
0003957053.tif 000007
【化２】
0003957053.tif 000008
【請求項２】
請求項１記載の微生物を、下記式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体又はその塩に作用させて、下記式（II）で示されるプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体へ変換させる、プラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体の製造方法。
【化３】
0003957053.tif 000009
【化４】
0003957053.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗高脂血症剤として有用なプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体を得るのに有用な微生物、及びその微生物を用いたプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗高脂血症剤として有用なプラバスタチンの製造方法、特に生物学的変換方法によるものとしては、イヌ及びウサギ肝臓ホモジネートを用いて、メバスタチンから変換する方法が、特公昭６１−１３６９９号公報に開示されている。微生物を用いてメバスタチンから変換する方法として、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、カニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属、シンセファロスポラム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属を用いる製法が、特公昭６２−５４４７６号公報及び特公昭６３−２１６７２号公報に開示されている。また、特公昭６３−２８５９５号公報及び特公平０３−５４１０３号公報には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾープス（Ｒｈｉｓｏｐｕｓ）、チゴリンクス（Ｚｙｇｏｒｙｎｃｈｕｓ）、シルシネラ（Ｃｉｒｅｉｎｅｌｌａ）、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）、フィコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ピタノポラス（Ｐｙｔｈａｎｏｐｏｒｕｓ）及びリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）の各属に属する微生物を用いる方法が開示されている。さらに、特公平０３−７１１１６号公報には、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属を使用した製造法が開示されている。また、特公平０４−８２１３５号公報及び特公平０７−２４５７９号公報には、新規微生物ストレプトミセス  カルボフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）が、３”,６’−ジヒドロキシ−メバスタチン誘導体生産菌として開示されているが、「放線菌図鑑」(日本放線菌学会編、１９９７年、朝倉書店、ｐ１２９）や、「今話題のくすり−開発の背景と薬効」（（社）日本農芸化学会編、１９９４年、学会出版センター、Ｐ７６−８１）等に、同菌がプラバスタチン生産菌であることが記載されている。特開２００１−２８６２９３号公報には、ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属を用いるプラバスタチンの製造方法が開示されている。
しかし、従来の製法は、変換率が低く、生産効率が悪いため、満足いくものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、メバスタチンからプラバスタチンを効率よく高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物、及びそれを用いたプラバスタチンの製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記目的を達成するため鋭意検討の結果、メバスタチンの６β位水素原子を水酸基に変換し、プラバスタチンを高い生産性で生成する能力を有する新種の微生物を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端側の５０２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列であり、下記式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体又はその塩を、下記式（II）で示されるプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体へ変換する能力を有し、アミコラトプシス  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｇ６５０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８２）菌株、又は、アミコラトプシス  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｇ６５０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８３）菌株である微生物を提供するものである。
また、本発明は、前記微生物を、下記式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体又はその塩（以下、これらを総称してメバスタチン類ということがある）に作用させて、下記式（II）で示されるプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体（以下、これらを総称してプラバスタチン類ということがある）へ変換させる、プラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体の製造方法を提供するものである。
【０００６】
【化７】
0003957053.tif 000002
【０００７】
【化８】
0003957053.tif 000003
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５'末端側の５０２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列である。本発明の微生物は、メバスタチン類をプラバスタチン類へ変換する能力を有する。
【０００９】
前記塩基配列を有する微生物は、土壌より得ることができる。特に、メバスタチン類からプラバスタチン類への変換能力の高い菌株として、アミコラトプシスエスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）Ｇ６５０６菌株及びＧ６５０８菌株が例示できる。これらの微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ、微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）として、「Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｇ６５０６」受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８２」と「Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｇ６５０８」受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６８３」として寄託されている。
【００１０】
前記Ｇ６５０６菌株は、愛媛県の土壌より分離された菌株である。この菌株の分離方法としては、土壌懸濁液を下記組成の選択培地に塗布し、好気的に培養する方法を用いた。［選択培地の組成：グリセリン  １％、ビタミンフリーカゼイン  ０．０３％、ＫＮＯ3  ０．２％、ＮａＣｌ  ０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．００５％、ＣａＣＯ3  ０．００２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．００１％、寒天  １．８％、（ｐＨ７．１）］
【００１１】
また、前記Ｇ６５０８菌株は、東京都の土壌より分離された菌株である。この菌株の分離は、前記組成の選択培地を用いて、前記Ｇ６５０６菌株と同様に行なった。
【００１２】
本発明の前記両菌株の菌学的性状は、次のとおりである。
１．形態
両菌株とも栄養細胞は糸状で分断する。気菌糸及び基底菌糸を形成し、胞子嚢あるいは運動性胞子を形成しない。
【００１３】
２．生理性状試験
（１）クエン酸の分解：陰性
（２）４５℃での増殖：陰性
（３）イノシトールからの酸生成：陰性
【００１４】
３．化学分類学的性質
両菌株ともグラム陽性菌であり、細胞壁成分であるジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｉｍｅｒｉｃａｃｉｄ）の異性体型はｍｅｓｏ型で、細胞壁の化学型はIII型であった。全菌体の特徴的な糖組成として、アラビノース及びガラクトースが検出され、Ａ型であった。菌体成分としてミコール酸は検出されなかった。リン脂質はＰＩＩ型で、メナキノン組成はＭＫ−９であった。
【００１５】
４．１６Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の遺伝子解析
前記のＧ６５０６菌株及びＧ６５０８菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の約５００ｂｐの塩基配列を決定した。この塩基配列は、具体的には、前記両菌株よりＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡに対応する１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基を慣用のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって増幅し、シークエンサーにより決定した。
前記両菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端側の５０２塩基の配列は、全く同一であった。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に示す。さらに、得られた塩基配列に基づいてデータベース（MicroSeqTM Bacterial 500Library v.0.0023及びGenBank/EMBL/DDBJ 国際ＤＮＡデータベース）検索を行い、前記両菌株と類縁菌との相同性を調べた。その結果を表１に示す。また、前記両菌株と近縁株の基準株（Type Strain）との近隣接合法による系統樹を図１に示す。
【００１６】
【表１】
0003957053.tif 000004
【００１７】
決定された塩基配列（配列番号１）、相同性検索結果（表１)、近縁株の基準株との近隣接合法による系統樹（図１）より、前記のＧ６５０６菌株及びＧ６５０８菌株はアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）との近縁性が高いが、最も相同性の高いアミコラトプシス  ルビダス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｂｉｄｕｓ）との相同性が９８．０４％であり、系統樹からクラスターを形成する近縁種が見つからなかった。
【００１８】
次に、ｒＲＮＡの遺伝子解析に加えて、形態分析、生理性状試験、化学分類学的性質等の菌学的性質を加味して、前記両菌株の帰属種をバージェイの細菌分類書（Bergey's manual of determinative bacteriology, ninth edition，１９９４）に従って検討した結果、前記両菌株(Ｇ６５０６菌株及びＧ６５０８菌株）は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する新菌種アミコラトプシス  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）であると判断した。
【００１９】
なお、従来プラバスタチン生産菌として知られる特公平０３−７１１１６号公報に記載のノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属は、細胞壁の化学型がIV型であることが知られている（特公平０３−７１１１６号公報及びThe Journal of Antibiotics, 36(9), 1176-1183(1983)を参照）。また、特公平０４−８２１３５号公報及び特公平０７−２４５７９号公報に記載の新規微生物ストレプトミセス  カルボフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）は、細胞壁の化学型がI型であることが知られている。しかし、本発明のアミコラトプシス属に属する前記両菌株の細胞壁の化学型はIII型であり、これらの菌株とは明らかに異なる。
【００２０】
本発明の微生物は、式（Ｉ）で示されるメバスタチン類の６β位水素原子を水酸基に変換し、式（II）で示されるプラバスタチン類を生成させるのに有用である。メバスタチン類は、メバスタチン、そのラクトン開環体又はその塩であればよく、プラバスタチン類としてプラバスタチン、その塩又はそのラクトン閉環体が生成される。
【００２１】
本発明のプラバスタチン類の製造方法の好ましい実施形態について、以下に説明する。
本発明のプラバスタチン類の製造方法においては、本発明の微生物が用いられる。該微生物をメバスタチン類に作用させ、出発物質（基質）であるメバスタチン類がインキュベーション処理されればよい。作用させる微生物としては、その菌株、培養菌体、培養菌体調製物（培養菌体をホモジナイズした菌体等）及び培養菌体処理物（固定化菌体等）のいずれも用いることができ、さらに、該微生物を作用させる際、該微生物由来の酵素（粗酵素、固定化酵素等）が存在していてもよい。
【００２２】
前記微生物を基質に作用させて基質をインキュベーション処理する方法としては、▲１▼前記菌株を培養する際に、その培養液中に基質を添加する方法、▲２▼前記培養菌体、前記培養菌体調製物又は前記培養菌体処理物の懸濁液中に基質を添加し、酸素を含む気体、例えば空気を通気しながらインキュベーションする方法等が挙げられる。
【００２３】
前記▲１▼の方法において、培養液への基質の添加は、培養開始時又は培養開始後一定期間経過した時のいずれの時期に行ってもよい。前記菌株の培養及び基質が添加された状態で行われる前記菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、通常、液体培養による振とう培養、通気攪拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００２４】
該培養に用いられる培地としては、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地等いずれも利用可能である。該培地には、炭素源として、グルコース、マルトース、キシロース、フルクトース、シュークロース等を単独又は組合せて用いることができる。これらの炭素源は、培養途中で随時添加してもよく、例えばグルコースを３〜７ｇ／ｌの濃度範囲となるようにフィードすると、メバスタチン類からプラバスタチン類への変換速度を相対的に増大させることができる。また、窒素源として、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、麦芽エキス、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独又は組合せて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００２５】
前記菌株の培養条件は、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６〜９．５、２５〜３５℃で２〜８日間程度培養するとよい。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。培地への菌株の接種量は、フラスコ培養の場合は１白金耳、スケールアップの場合は種培養液を本培養液の１〜５％（ｖ／ｖ）添加することが好ましいが、実質的に培養可能であればこの限りではない。
【００２６】
基質となるメバスタチン類は、粉末のままか、あるいは水溶性有機溶媒、例えばエタノール等に溶解して培養液に添加することができ、その添加量は、培養液１ｌ当り０．５〜４．０ｇが好ましい。添加量を４．０ｇ／ｌより多くすると、変換速度が著しく遅くなり好ましくない。基質添加後は、好ましくは２５〜３５℃で１〜７日間、特に約２〜５日間、振とうあるいは通気攪拌等の操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより、基質であるメバスタチン類を目的のプラバスタチン類に変換することができる。
【００２７】
また、前記▲２▼の方法における培養菌体は、前記菌株を前記の如くして培養した後、培養液から遠心分離又は濾過により分離することによって得られる。また、培養菌体調製物は、該培養菌体を例えばホモジナイズした菌体等であり、また、培養菌体処理物は、該培養菌体を例えばイオン交換樹脂、セラミック、キトサン等に固定化した固定化菌体等である。これらの培養菌体、培養菌体調製物又は培養菌体処理物の懸濁液の調製に使用できる溶液としては、前記した培地、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の緩衝液を単独又は混合したものが挙げられる。該緩衝液のｐＨは、好ましくは６．０〜９．０、さらに好ましくは７．０〜８．５である。
前記懸濁液中の培養菌体の量は、湿容量比で０．１〜５％程度が好ましい。
また、前記懸濁液への基質の添加は、前記▲１▼の方法における培養液への基質の添加と同様にして行えばよく、また１回当りの基質の添加量は、菌体の活性を維持できる範囲が好ましいが、懸濁液１ｌ当り０．１〜５ｇを１回又は数回に分ける、あるいは０．５〜５ｇ／ｄａｙ程度で連続的に添加してもよい。
また、前記▲２▼の方法におけるインキュベーションは、前記▲１▼の方法における菌株の培養と同様にして行えばよい。
【００２８】
こうして生成した目的のプラバスタチン類を反応系から単離するには、種々の既知精製手段を選択、組合せて行うことが好ましい。例えば、疎水性吸着樹脂への吸着・溶出、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の実施例中のパーセント（％）は、特に断りのない限り、Ｗ／Ｖパーセントを示す。
【００３０】
〔実施例１〕
グルコース２．０％、ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．０５％、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％を含む培地１０ｍｌを２４φ試験管に入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラトプシス  エスピーＧ６５０６菌株を接種し（接種量１白金耳）、２７℃で４日間、振とう培養機（３１０ｒｐｍ）上で培養した。これにメバスタチンを最終濃度で５００ｍｇ／ｌとなるように添加し、さらに３日間、同条件で培養した。得られた培養液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清について、下記の条件でＨＰＬＣにより分析したところ、プラバスタチンの濃度は４３０ｍｇ／ｌであり、メバスタチンからプラバスタチンへの変換率は、８６％であった。
【００３１】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標、Ｗａｔｅｒｓ社製）Ｃ１８  ５μｍ（３．９φ×１５０ｍｍ）
移動相：アセトニトリル／ＰＩＣ−Ａ試薬（５ｍＭ）（３６０：６４０）混液
流速：１．０ｍｌ／分
検出：２３７ｎｍ
【００３２】
〔実施例２〜８〕
実施例１と同じ成分を含む培地１０ｍｌを２４φ試験管に入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これに表２に示した菌株を接種し（接種量１白金耳）、２８℃で４日間、振とう培養機（３１０ｒｐｍ）上で培養した。これにメバスタチンを表２に示す濃度となるように添加し、さらに３日間、同条件で培養した。得られた培養液を実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析した結果を表２に示す。プラバスタチン生産量は、メバスタチン添加量２０００ｍｇ／ｌまでは増加したが、４０００ｍｇ／ｌでは逆に減少した。
【００３３】
【表２】
0003957053.tif 000005
【００３４】
〔実施例９〕
グルコース２．０％、ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．０５％、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＬＧ−２９４（旭電化工業（株）製）０．０５％からなる前培養用培地５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラトプシス  エスピーＧ６５０６菌株を接種し（接種量１白金耳）、２７℃で２日間、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養し、前培養液を調製した。次に２．６ｌ容のジャーファーメンテーター（ＭＤ−２５０：株式会社丸菱バイオエンジ製）に前培養用培地と同組成の変換培養用培地１．５ｌを準備し、１２１℃、３０分間加熱滅菌した。これに前培養液１５０ｍｌを接種し、温度２７℃、攪拌数３００ｒｐｍ、通気量１．０ｖｖｍの条件で培養した。２日後、菌体が十分に増殖したことを確認してメバスタチンを濃度２０００ｍｇ／ｌとなるように添加し、培養を継続した。メバスタチンを添加して３日後には、１７７０ｍｇ／ｌのプラバスタチンが生産された。この時の変換率は８８．５％であった。
【００３５】
〔実施例１０〕
実施例９のアミコラトプシス  エスピーＧ６５０６菌株をアミコラトプシス  エスピーＧ６５０８菌株へ変更する以外は実施例９と同様に操作した。メバスタチンを添加して３日後には、１７９０ｍｇ／ｌのプラバスタチンが生産された。この時の変換率は８９．５％であった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、メバスタチンからプラバスタチンを効率よく高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物及びそれを用いたプラバスタチンの製造方法を提供することができる。
【００３７】
【配列表】
0003957053.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する新種の微生物と近縁株との１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性に基づく系統樹を示す図である。
【図１】
0003957053.tif 000011