(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の塩基配列を決定する方法であって、
ａ）一本鎖核酸の全体の高次構造に関する形態および該高次構造に対応した塩基配列に関するデータベースを構築する工程と、
ｂ）少なくとも塩基配列を決定すべき部分が一本鎖である測定用核酸を調製する工程と、
ｃ）該測定用核酸の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定することにより、測定用核酸の一本鎖部分の高次構造データを得る工程と、
ｄ）この測定用核酸の高次構造データを前記データベースと比較し、同一の高次構造を有する塩基配列を検索する工程とを具備した方法。
【請求項２】
ＤＮＡフラグメント中に含まれる所定の遺伝子の位置を決定する遺伝子マッピング方法であって、
ａ）マッピングすべき目的の遺伝子配列を含む二本鎖のＤＮＡフラグメントから、少なくとも前記目的の遺伝子配列を含む部分よりも広い範囲に亘る領域が一本鎖であるマッピング用フラグメントを調製する工程と、
ｂ）前記目的の遺伝子配列と特異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡプローブを、上記工程で得たマッピング用フラグメントにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記マッピング用フラグメントと前記プローブとの間で形成されたハイブリッド分子の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定することにより、その一本鎖部分およびハイブリッド形成により生じた二本鎖部分の位置を決定する工程と、
ｄ）こうして得られた位置データに基づいて、前記二本鎖ＤＮＡフラグメントにおける前記目的の遺伝子配列の位置を同定する工程とを具備した方法。
【請求項３】
エキソヌクレアーゼ酵素の特性分析方法であって、
ａ）特性を分析すべきエキソヌクレアーゼと、該エキソヌクレアーゼの基質である核酸とを所定時間反応させる工程と、
ｂ）上記の酵素反応を受ける前の基質核酸、および上記酵素反応を受けた後の基質核酸の両者の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定し、その二つのデータを比較することによって、上記酵素反応による基質核酸の変化に関する情報を得る工程と、
ｃ）この得られた情報に基づいて、前記エキソヌクレアーゼの特性を決定する工程とを具備した方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸に関連した分析、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の決定、遺伝子のマッピングおよび制限酵素の特性分析に関する。より具体的には、走査型プローブ顕微鏡を用いてこれら分析を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長いＤＮＡ鎖の配列決定方法としては、化学的方法としてのマクサム・ギルバート法、並びに酵素的方法としてのサンガー法（ジデオキシ・チェインターミネータ法）が従来から広く行われている。また、近年では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた方法も普及してきている。これらの方法は何れも、基本的には次のようにして行われる。即ち、まず配列を決定しようとする長いＤＮＡフラグメント鎖に基づいて、長さの異なる多数の短いＤＮＡ鎖（200 〜300 ヌクレオチド）を生じさせる。次いで、これらのＤＮＡ鎖をゲル電気泳動にかけて長さの違いにより分離した後、各短鎖ＤＮＡの塩基配列を決定する。このような短鎖ＤＮＡであれば、その塩基配列は一度に決定することができる。次に、これら個々の短鎖ＤＮＡの配列に基づき、元の長いＤＮＡフラグメントの一端から順に、各バンドに対応する塩基を同定することによって順次全体の配列を決定する。ＲＮＡの配列決定についても、基本的には同じ戦略が用いられる。
【０００３】
特定の目的遺伝子のマッピング方法としては、従来、次のようなブロッティングを用いた方法が行われている。先ず、元になるゲノムＤＮＡ切片を既知の制限酵素を用いて切断して多くのＤＮＡフラグメントを作製する。これをゲル電気泳動にかけて分画した後、得られた電気泳動パターンをナイロン膜上にサザンブロットする。一方、上記の目的遺伝子と特異的にハイブリダイズできる標識ＤＮＡプローブを作製し、該標識プローブと上記のサザンブロットされたＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーションを行なう。こうして、上記の標識プローブが結合した電気泳動パターン上の特定のバンドを検出することによって、上記の目的遺伝子が何れのＤＮＡフラグメントに含まれているかを知ることができる。各ＤＮＡフラグメントの位置関係は、元のゲノムＤＮＡの制限酵素地図情報から知ることができるから、この情報に基づいて、目的とする遺伝子のゲノムＤＮＡ上の位置を特定する。このようなマッピング法は、例えば K.Gardiner,M.Horisberger et al; EMBO J.,9:25(1990) に記載されている。
【０００４】
核酸自体の分析ではないが、核酸に関連した分析方法として、エキソヌクレアーゼの特性分析がある。例えば、エキソヌクレアーゼIII のようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ジデオキシ法による配列決定のための鋳型の作製や、ＤＮＡ結合蛋白質の結合部位の解析などに用いられており、核酸を分析するための手段として有用である。従って、これら酵素の活性を検定することは重要な意味を有しており、そのために次のような方法が従来から用いられている。第一の方法は、トリチウムラベルを施したＤＮＡを基質として用い、この基質を上記エキソヌクレアーゼ酵素と反応させるものである。この反応によりＤＮＡ基質から切り出されたヌクレオチドは酸可溶性画分として回収されるから、該画分中に含まれるトリチウムの量を測定することによって酵素活性を調べることができる。第二の方法は、ＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼで消化し、この消化物をゲル電気泳動にかけて分析するものである。エキソヌクレアーゼによる分解の進行に応じて、基質ＤＮＡは分子量および高次構造が変化して移動度が変化する（一般には大きくなる）から、その移動度に基づいて当該エキソヌクレアーゼ酵素の活性を測定するものである。具体的には、例えばφＸ174 ＤＮＡ−ＸｈｏＩフラグメントを塩化マグネシウム、メルカプトエタノール等を含んだ緩衝液中で適当な時間だけ酵素反応を行い、その消化反応生成物を１％アガロースゲルで電気泳動させ、その移動度から分解速度を検定した例が報告されている［S.G.Rogers and B.Weiss; Methodin Enzymology,65:201(1989)、C.C.Richardson,I.R.Lehman et al; Biol.Chem.,239:254(1964) ］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、核酸に関連した従来の分析方法は何れも、電気泳動法およびブロッティング法（サザンブロッティングやノーザンブロッティング等）のように、極めて不便で複雑な実験作業を必要とし、多大な労力および時間を要する問題がある。更に、トリチウム等の放射性アイソトープを用いる場合には、関係法令によって取り扱い者が限定される問題がある。
【０００６】
また、上記従来の方法は何れも、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子そのものの観察に基づく直接的な方法ではなく、分子の集合体としての挙動および特性の観察に基づく間接的な方法である。従って、多量のＤＮＡまたはＲＮＡを必要とし、場合によっては必要な量のＤＮＡおよびＲＮＡを得るためにＰＣＲによる増幅といった複雑な手法を必要とする。また、上記のように間接的な観察に基づくものであるから、当然ながら精度に限界がある。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の個々の核酸分子自体を直接観察して、その形状または構造に基づく分析法を提供することにより、従来技術の問題を一挙に解決することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するために、本発明は、走査型プローブ顕微鏡を用いて個々の核酸分子を直接観察し、その知見に基づいて、ＤＮＡおよびＲＮＡの塩基配列決定、遺伝子のマッピング、およびエキソヌクレアーゼ酵素の特性分析を行う方法を提供する。
【０００９】
即ち、本発明による核酸の塩基配列を決定する方法は、ａ）一本鎖核酸の全体の高次構造に関する形態および該高次構造に対応した塩基配列に関するデータベースを構築する工程と、ｂ）少なくとも塩基配列を決定すべき部分が一本鎖である測定用核酸を調製する工程と、ｃ）該測定用核酸の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定することにより、測定用核酸の一本鎖部分の高次構造データを得る工程と、ｄ）この測定用核酸の高次構造データを前記データベースと比較し、同一の高次構造を有する塩基配列を検索する工程とを具備した方法である。
【００１０】
また、本発明による遺伝子マッピング方法は、ａ）マッピングすべき目的の遺伝子配列を含む二本鎖のＤＮＡフラグメントから、少なくとも前記目的の遺伝子配列を含む部分よりも広い範囲に亘る領域が一本鎖であるマッピング用フラグメントを調製する工程と、ｂ）前記目的の遺伝子配列と特異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡプローブを、上記工程で得たマッピング用フラグメントにハイブリダイズさせる工程と、ｃ）前記マッピング用フラグメントと前記プローブとの間で形成されたハイブリッド分子の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定することにより、その一本鎖部分およびハイブリッド形成により生じた二本鎖部分の位置を決定する工程と、ｄ）こうして得られた位置データに基づいて、前記二本鎖ＤＮＡフラグメントにおける前記目的の遺伝子配列の位置を同定する工程とを具備した方法である。
【００１１】
更に、本発明によるエキソヌクレアーゼ酵素の特性分析方法は、ａ）特性を分析すべきエキソヌクレアーゼと、該エキソヌクレアーゼの基質である核酸とを所定時間反応させる工程と、ｂ）上記の酵素反応を受ける前の基質核酸、および上記酵素反応を受けた後の基質核酸の両者の全体の高次構造に関する形態を走査型プローブ顕微鏡で直接測定し、その二つのデータを比較することによって、上記酵素反応による基質核酸の変化に関する情報を得る工程と、ｃ）この得られた情報に基づいて、前記エキソヌクレアーゼの特性を決定する工程とを具備した方法である。
【００１２】
【発明の実施の態様】
本発明の方法は何れも、走査型プローブ顕微鏡（scanning probe microscopy ；ＳＰＭ）を用いることにより、分子の集合体としての全体的な性質ではなく、個々の核酸分子自体を観察することに基づいている。ここで、走査型プローブ顕微鏡とは、原子レベルでの観察が可能な走査型顕微鏡の総称であり、走査型トンネル顕微鏡（scanning tunneling microscopy ；ＳＴＭ）、原子間力顕微鏡（atomic force microscopy ；ＡＦＭ）が含まれる。ＡＦＭは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、アメリカ合衆国カリホルニア州サンタバーバラに所在するデジタルインスツルメント社の登録商標）等に大別されるが、この分野の研究は著しく進展している最中であり、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡等の新しい顕微鏡が開発されつつある。本発明における走査型プローブ顕微鏡とは、その趣旨に鑑み、現在知られているものに限らず、原子レベルの分解能を有する顕微鏡であれば将来開発されるものをも含むものである。
【００１３】
次に、本発明の方法について順次説明する。
本発明による核酸の塩基配列決定方法は、次の事実に基づいている。即ち、二本鎖ＤＮＡの形態は直鎖状であるが、一本鎖ＤＮＡは分子内での対合(pairing) 等により、ループまたはヘアピン等の形状を複雑に組み合わせた三次元の高次構造を形成し、この高次構造はＤＮＡの塩基配列によって様々に異なることである。この現象は、ＲＮＡについては古くから知られていた。しかし、一本鎖ＤＮＡについては、このような配列特異性をもった高次構造（Single Strand Conformation Polymorphism ：ＳＳＣＰ）の研究は比較的新しいものである［Orita.M et al; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,86:2766-2770(1989) ］。
【００１４】
このＳＳＣＰを塩基配列の決定に利用とする試みとして、高次構造をもった一本鎖ＤＮＡを電気泳動させた際の移動度の変化を用いる方法（Single Strand Conformation Polymorphism electrophoresis ：ＳＳＣＰＥ）が提案されている［Orita, M. et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 86: 2766-2770 (1989) ：Orita, M. et al.,Genomics, 5:874-879 (1989) ］。しかし、この方法は個々のＤＮＡ分子そのものの観察に基づくものではなく、ＤＮＡ分子の集合体としての性質である移動度を測定することに基づくものである。その結果、ＰＣＲ等によるＤＮＡ鎖の増幅を必要とし、更にＰＣＲやゲル電気泳動を用いることに起因して、扱い得るＤＮＡの長さが数Ｋｂに制限されるという問題がある。更に、この方法では検出に放射性アイソトープ（ＲＩ）を用いなければならない等、既述した従来の方法と同様の問題がある。個々の一本鎖ＤＮＡ分子の高次構造に関するデータに基づいて塩基配列を決定することは、本発明によって初めて提案されるものである。
【００１５】
以下、本発明による塩基配列決定方法の各工程に付いて説明する。
工程ａ）は、走査型プローブ顕微鏡で測定した一本鎖ＤＮＡの高次構造から、該高次構造に対応した特定の塩基配列を決定するための前提となるものである。即ち、特定の高次構造データが如何なる塩基配列に対応するかを特定できるデータベースを構築することによって初めて、測定された高次構造を有する一本鎖ＤＮＡの塩基配列を特定することが可能になる。
【００１６】
一本鎖核酸の高次構造が如何なる塩基配列に対応するかに関するデータベースを構築するには、例えば、塩基配列が公知の一本鎖核酸について、その高次構造を走査型プローブ顕微鏡を用いて測定し、既知の塩基配列に対応させた高次構造のデータをできる限り多く蓄積すればよい。また、場合によっては、所定の塩基配列からコンピュータ処理によって予測された高次構造データを用いることも可能である。
【００１７】
なお、この方法における核酸とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの何れでもよく、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの何れであってもよい。また、ここで構築するデータベースには、高次構造の三次元データだけでなく、ＳＴＭを用いて得られる電気的データをも含めることができ、磁気的データおよび光学的データを含めることも可能である。
【００１８】
工程ｂ）は、走査型プローブ顕微鏡を用いた測定の直接の対象、即ち、高次構造をもった一本鎖核酸を形成するための工程である。このような測定用核酸を調製する方法としては、例えば、サンプルの二本鎖ＤＮＡをエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて消化し、その塩基配列を決定しようとする部分を一本鎖とすればよい。また、二本鎖ＤＮＡをアニールして一本鎖にしたものを、測定用核酸として用いることもできる。より好ましくは、アニールにより形成された一本鎖核酸に対して、これに含まれる公知のＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズできるプローブを反応させ、配列が公知の部分を二本鎖とし、それ以外の部分が一本鎖であるような測定用核酸を用いることができる。一方、大部分のＲＮＡは本来的に一本鎖であるから、何ら処理することなく、そのまま測定用核酸として用いることができる。しかし、上記と同様のハイブリッド形成により、配列が既知の部分を二本鎖としたものを測定用核酸として用いてもよい。
【００１９】
工程ｃ）は、測定用核酸の個々の分子自体を走査型プローブ顕微鏡で観察し、その一本鎖の高次構造を測定する工程である。この場合、測定用核酸が一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有する場合には、一本鎖部分の高次構造に関する情報だけでなく、その二本鎖部分の位置および長さに関する情報も得られる。例えば、二本鎖部分の配列が既知であるような場合には、この二本鎖部分に関する情報も、塩基配列を決定するために有用である。なお、この測定の際に、高次構造の三次元データのみならず、電気的データ、磁気的データ、光学的データ等を測定してもよい。
【００２０】
工程ｄ）は、先に構築したデータベースから、測定用核酸から得られた高次構造データに類似するかまたは一致するデータを検索し、これに対応する核酸配列を決定する工程である。この場合、三次元高次構造のデータのみならず、電気的データ、磁気的データ、光学的データ等をも含めた検索を行えば、より精度の高い塩基配列決定を行うことができる。
【００２１】
上記のように、本発明の塩基配列決定方法は、例えば電気泳動における移動度のようなＤＮＡ分子の集合体としての性質の測定ではなく、個々のＤＮＡ分子の直接観察に基づいている。従って、扱うことができるＤＮＡの長さには実質的に制限はない。また、電気泳動やブロッティングのような煩雑な操作を行う必要がなく、複雑な塩基配列を迅速に決定することができる。更に、この方法では、検出に放射性アイソトープ（ＲＩ）を用いる必要もない。加えて、本発明の方法によれば、分子全体の塩基配列決定だけでなく、その部分的な一致をデータベースから検索することにより、遺伝子ファミリー、ホモロジードメイン等を予測することも可能である。
【００２２】
次に、本発明による遺伝子マッピング方法について説明する。
この方法では、目的の遺伝子配列を含むＤＮＡフラグメントを一本鎖とし、続いて当該遺伝子配列部分を二本鎖とした後、このＤＮＡ分子を走査型プローブ顕微鏡で測定する。そして、高次構造を有する一本鎖部分および直鎖状の二本鎖部分の位置および長さに基づいて、前記ＤＮＡフラグメントにおける当該遺伝子の位置を決定する。以下、各工程を追って説明する。
【００２３】
工程ａ）では、目的の遺伝子配列を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントから、マッピング用フラグメントを作製する工程である。マッピング用フラグメントは、目的の遺伝子配列を含むより広い部分が一本鎖であればよい。従って、全体が一本鎖であってもよく、また目的の遺伝子配列以外の領域に二本鎖部分を含むものであってもよい。このようなマッピング用フラグメントは、塩基配列決定方法に関連して述べた同じ方法で作製することができる。こうして調製されたマッピング用フラグメントにおいて、一本鎖部分は高次構造を有しており、もし二本鎖部分が含まれていれば、その部分は直鎖状になっている。なお、マッピング用フラグメントを作製するための元の二本鎖ＤＮＡとしては、例えばゲノムＤＮＡを、非常に希に切断する制限酵素（rare-cutter 酵素）を用いて切断したＤＮＡ切片を用いることができる。
【００２４】
工程ｂ）は、上記工程で得たマッピング用フラグメントの一本鎖の領域に含まれる、目的の遺伝子配列部分を二本鎖にする工程である。この工程で用いるＤＮＡプローブは、当該遺伝子ＤＮＡの単離されたアンチセンス鎖またはその一部であってもよく、当該遺伝子の既知の配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で合成したものを用いてもよい。場合によっては、このプローブに適切なマーカーを結合してもよい。このようなプローブをハイブリダイズすることにより、マッピング用フラグメントの中の高次構造をもった一本鎖領域のうちで、目的の遺伝子配列部分のみが二本鎖となり、直鎖状に変化する。その際、上記ＤＮＡプローブに加えて、第二のプローブをハイブリダイズさせてもよい。この第二のプローブとしては、例えば、マッピング用フラグメントにおける位置が既に知られている、特定の配列に対して特異的にハイブリダイズするものを用いることができる。この場合の第二のプローブは、目的の遺伝子位置を決定する際の参照として用いることができる。また、斯かる第二のプローブは二つ以上を用いてもよい。
【００２５】
工程ｃ）は、上記のようにしてＤＮＡプローブとハイブリダイズしたマッピング用フラグメント分子を走査型プローブ顕微鏡で測定し、観察する工程である。この測定によって、二本鎖の直鎖状部分と一本鎖の高次構造部分の位置および長さを同定することができる。その際、先の工程で用いたプローブにマーカーを結合しておけば、ハイブリッド形成部分以外に別の二本鎖部分が存在する場合でも、ハイブリッド形成による二本鎖部分を容易に決定することができる。また、先の工程で二つ以上のプローブを用いた場合にも、何れのプローブによるハイブリッドであるかを容易に識別することが可能になる。
【００２６】
工程ｄ）は、工程ｃ）で得た情報に基づいて、元の二本鎖ＤＮＡフラグメントにおける目的の遺伝子配列の位置を決定する工程である。即ち、工程ｃ）で得た情報から、ハイブリッド形成により直鎖状の二本鎖になった遺伝子配列部分部分の長さおよび他の二本鎖部分の長さがわかり、一本鎖の高次構造部分の大きさから一本鎖部分の長さが分かる。従って、これらの情報から、元の二本鎖ＤＮＡフラグメントにおける目的遺伝子の位置をマッピングすることができる。なお、上記で述べたような、既知の位置にハイブリダイズする第二のＤＮＡプローブを用いれば、これにより形成された二本鎖部分を位置参照として、目的の遺伝子をより正確にマッピングすることができる。
【００２７】
上記のように、本発明のマッピング方法によれば、元の二本鎖ＤＮＡを制限酵素で切断し、ゲル電気泳動にかけ、その電気泳動パターンをナイロン膜にサザンブロッティングするといった複雑で面倒な操作を必要としない。従って、迅速に遺伝子のマッピングを行うことができる。また、ゲル電気泳動を必要としないため、元の二本鎖ＤＮＡの長さに実質的な制限がないのも大きな利点である。更に、複数の遺伝子配列の夫々に対して特異的にハイブリダイズできる複数のＤＮＡプローブを用い、個々のＤＮＡプローブに相互に識別可能なマーカー手段を付しておけば、一度に数種類のマッピングを行うことができる利点が得られる。このマーカー手段には、夫々のＤＮＡプローブの長さを変えることも含まれる。
【００２８】
最後に、本発明によるエキソヌクレアーゼ酵素の特性分析方法について説明する。この方法は、エキソヌクレアーゼ酵素とその基質核酸とを所定時間反応させたのち、消化されて小さくなった基質核酸を観察し、酵素反応による基質の変化からエキソヌクレアーゼ酵素の特性を解析するものである。この点では、消化物を電気泳動させる従来の方法と同じであるが、本発明では消化された個々の基質分子を直接観察する点で従来の方法とは異なる。
【００２９】
工程ａ）は、エキソヌクレアーゼと基質核酸とを反応させて、核酸を末端から順次削り取る工程である。エキソヌクレアーゼとは、ポリヌクレオチド鎖の一端から、３′，５′−ホスホジエステル結合を順次分解する酵素の総称であり、個々のエキソヌクレアーゼの特性は多種多様である。例えば、大別すると(1) ３′→５′の方向へ分解するもの、(2) ５′→３′方向に分解するもの、(3) どちらの方向へでも分解するものの３種類に分類されるが、より詳細には、二本鎖ＤＮＡに特異的に作用するもの、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解するもの、一本鎖のＤＮＡに選択的に作用するもの等、その特性は多岐に亘っている。何れにしても、この酵素反応は使用したエキソヌクレアーゼ酵素の特性に従って進行するから、残存した基質核酸には該酵素の特性が刻印されることになる。
【００３０】
典型的な例として、二本鎖ＤＮＡに対してこれを分解するエキソヌクレアーゼを反応させると、二本鎖ＤＮＡの末端は一本鎖となり、反応の進行に伴って二本鎖部分の長さが短くなる。二本鎖部分は直鎖状のまま残るが、一本鎖になった部分は高次構造に変化する。また、末端が一本鎖で中央部が二本鎖のＤＮＡに対して、一本鎖ＤＮＡに選択的に作用するエキソヌクレアーゼを作用させれば、その一本鎖部分が反応時間と共に短くなり、高次構造を成している部分は小さくなる。更に、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに対して、これを分解するエキソヌクレアーゼを反応させた場合には、一本鎖の長さが短くなるに伴ってその高次構造の大きさが小さくなり、同時に高次構造の形態自体が変化する。
【００３１】
工程ｂ）は、上記の酵素反応を行う前の核酸基質と、上記の反応を受けた後の核酸基質の両者を走査型プローブ顕微鏡で測定し、その二つのデータを比較することによって、酵素反応により生じた変化、即ち、上記で述べたような核酸基質の変化に関する情報を得る工程である。この場合、顕微鏡の視野に含まれる核酸基質分子については、個々の分子の夫々を直接観察できるから、単に分子の集合体としての性質の変化ではなく、個々の分子の変化を直接観察できる。例えば、全ての分子が同じ変化をしているか、或いは幾つかの分子は他の分子とは違った変化をしているかについての情報をも得ることができる。
【００３２】
工程ｃ）は、上記の測定結果に基づいて、酵素反応に使用したエキソヌクレアーゼの特性を決定する工程である。ここで決定できる特性には、そのエキソヌクレアーゼが、既述したタイプの何れに属するかが含まれることは言うまでもない。
また、全ての核酸分子が同じ変化をしているか否か、或いはどの程度の分子が異なった変化をしているかの情報に基づいて、使用したエキソヌクレアーゼの純度を知ることができる。加えて、時間当たりの変化の大きさから、反応速度または使用したエキソヌクレアーゼの活性を知ることができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例１
この実施例の目的は、本発明の方法によって核酸の塩基配列決定が可能であることを示す予備的実験を行うことである。
【００３４】
＜実験手順＞
（ｉ）先ず、プラスミドｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して直鎖状にした。
【００３５】
プラスミドｐＵＣ１１８は、緩衝液中の懸濁液として、例えば宝酒造株式会社から入手可能である。また、ｐＵＣ１１８で形質転換された大腸菌（例えば宝酒造株式会社から入手可能なＪＭ１０９大腸菌細胞をｐＵＣ１１８で形質転換しておき、この大腸菌から当該プラスミドを取り出し、イオンクロマトグラフィー（例えばQIAGEN GmbH 社製の QIAGEN Plasmid Kit ）を用いて精製したｐＵＣ１１８を用いてもよい。ｐＵＣ１１８は環状ＤＮＡであり、そのマルチクローニング部位には、一つのＥｃｏＲＩ制限酵素部位が含まれている。そこで、上記プラスミドｐＵＣ１１８を、５単位／μｇＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限酵素（東洋紡績株式会社から商業的に入手可能）を用いて３７℃で消化し、前記ＥｃｏＲＩ部位で切断することにより、３．２ｋｂｐの直鎖状ＤＮＡを得た。
【００３６】
なお、上記のようにして得られた直鎖状ｐＵＣ１１８の塩基配列は公知であり、後述の配列表に配列番号１として示した通りである。
（ii）次に、上記で得た５μｇの直鎖状ＤＮＡと、１５０単位のエキソヌクレアーゼIII （東洋紡績株式会社から商業的に入手可能）とを、２３℃において反応させた。この反応は、50mM Tris-HCl(pH 7.6) ，1mM MgCl2 ，1mM 2-メルカプトエタノールの溶液（２５μリットル）中で行った。また、反応時間は、０分、５分、１０分および１５分とした。
【００３７】
図１は、この反応によって生じる直鎖状ｐＵＣ１１８の変化を模式的に示す説明図である。同図において、（Ａ）は反応前の二本鎖ＤＮＡを示している。この二本鎖ＤＮＡにエキソヌクレアーゼIII を作用させると、同図（Ｂ）に示すように、各ＤＮＡ鎖の３′側からヌクレオチドが削り取られる結果、両端部分に一本鎖ＤＮＡが形成される。なお、一方の一本鎖部分はセンス鎖であり、他方の一本鎖部分はアンチセンス鎖である。こうして形成された夫々の一本鎖部分、は内部で対合を形成することにより、同図（Ｃ）に示すように高次構造を形成することになる。
【００３８】
なお、図示のような反応が生じたことについては、次のようにして確認した。即ち、２３℃で１５分間、上記の反応生成物をＳ１ヌクレアーゼと反応させる。これによって一本鎖部分のみが消化されるから、元の二本鎖よりも短い二本鎖のみのＤＮＡが得られる。次いで、これをアガロース電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色を行って可視化する。こうして検出されたバンドの移動度から、元の二本鎖ＤＮＡよりも小さい二本鎖ＤＮＡが検出されれば、上記のエキソヌクレアーゼ反応が生じていていたことを確認することができる。
【００３９】
（iii ）上記のエキソヌクレアーゼIII との反応で得られた各ＤＮＡ鎖について、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた測定を行った。測定に際しては、まず、上記の工程（ii）で部分消化されたＤＮＡを、10mM MgCl 2 、10mM HEPES溶液中に約0.01μｇ／ｍｌの濃度で希釈した。このＤＮＡ希釈溶液１０μリットルを雲母劈開面（雲母板の大きさは１cm×１cm程度、形状は不問）に滴下し、３０分間静置することにより、ＤＮＡ分子を雲母劈開面に吸着させた。これを１ｍｌ程度の純水で洗浄し、ＡｒまたはＮ２等の不活性ガス雰囲気下で乾燥した後に、ＡＦＭ測定を行った。使用したＡＦＭ顕微鏡は、アメリカ合衆国カリホルニア州サンタバーバラに所在のデジタルインスツルメント社から市販されているナノスコープIII ａである。
【００４０】
なお、上記のＤＮＡ希釈溶液を形成する際には、HEPES 以外の緩衝液を用いてもよく、Ｍｇの代わりに他の２価の陽イオンを用いてもよい。また、ＤＮＡを雲母劈開面に吸着させるために静置する時間は、ＤＮＡ希釈溶液の濃度に応じて決まる。ＤＮＡの雲母劈開面への吸着法については、例えば Helen G. Hansma, et al. Nucleic Acids Reserch 1996,Vol.24,No.4 を参照されたい。
【００４１】
＜実験結果＞
上記の（ii）での測定結果は次の通りであった。
図２は、エキソヌクレアーゼIII と１０分間反応させたＤＮＡ試料についての測定結果示す写真である。また、図３は、反応時間を１５分としたＤＮＡ試料についての同様の写真である。これらの写真は、二本鎖の直鎖状部分の両端に、一本鎖になった高次構造部分が存在していることを示している。更に、両端部に存在する高次構造は、夫々の塩基配列に起因して異なることを示している。また、図２と図３とを比較すると、反応の進行によって中央の二本鎖部分が短くなり、両端の高次構造部分が大きくなっていること、並びに両端の高次構造自体が変化していることが分かる。なお、反応時間を５分としたＤＮＡ試料のＡＦＭ写真は省略するが、この場合は中央部の直鎖状部分が図２よりも長く、両端の高次構造部部分は図２よりも小さかった。
【００４２】
図４は、反応時間を５分としたＤＮＡ試料（ＡＦＭ写真を省略したもの）について、ＡＦＭでの測定結果を市販のコンピュータソフトウエアで解析した結果を示している。この図から、一本鎖になったＤＮＡ分子の両端部では既に高次構造が形成されており、且つ夫々の高次構造はその塩基配列の相違に起因して異なっていることが分かる。なお、図中の数字はＤＮＡ試料のヌクレオチド番号を示している。
【００４３】
図５は、図２の写真に示したＡＦＭでの測定結果（反応時間１０分）を、上記と同様のコンピュータソフトウエアで解析した結果を示している。この解析結果は、二本鎖部分の両端に存在する高次構造の相違を、図２の写真よりも更に明確に示している。なお、図中には、各高次構造および直鎖状部分の大きさ（塩基対数）、並びにヌクレオチド番号が付されている。
【００４４】
図６は、図３の写真に示したＡＦＭでの測定結果を、上記と同じコンピュータソフトウエアで解析して得た図である。図中の数字は、両端部の高次構造および中央の直鎖状部分の大きさ（塩基対数）、並びに塩基番号を示している。
【００４５】
なお、参考までに上記の酵素反応を２０分継続させたものでは、全てが一本鎖になっており、それ以上反応させても変化はなかった。
＜考察＞
上記の結果から分かるように、夫々の一本鎖ＤＮＡの高次構造は、その塩基配列に対応して明確に異なっている。従って、既知の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡの高次構造をデータベースとして蓄積しておけば、塩基配列が未知のＤＮＡサンプルについてその高次構造をＡＦＭで測定し、この測定データに類似するかまたは一致する高次構造を上記のデータベースから検索することにより、ＤＮＡサンプルの塩基配列を決定することが可能である。
【００４６】
実施例２
この実施例の目的は、本発明の方法による遺伝子マッピングの一例を示すことである。
【００４７】
＜実験手順＞
（ｉ）先ず、以下の方法により、セルソータを用いて目的の染色体を分離する。即ち、コルセミド等を用いて、増殖中の細胞の細部周期をＭ期で停止させる。このＭ期の細胞の膜を穏和な界面活性剤等で破壊し、該細胞の染色体を臭化エチジウムまたはヨウ化プロピウム等の蛍光色素で染色し、セルソータにより分画する。次いで、アガロースブロック法等により目的の染色体ＤＮＡを分離する。
【００４８】
なお、アガロースブロック法を用いる場合には、染色体ＤＮＡを１％の低融点アガロース中に入れて固めた後、0.5M EDTA, 0.1M Tris-HCl(pH7.5), 0.1% 2-メルカプトエタノール溶液を添加し、３７℃で一晩インキュベートする。これを別の容器に移し、0.5M EDTA, 0.1M Tris-HCl(pH7.5),1% N- ラウオイルサルコシン酸ナトリウム、２mg／mlプロテイナーゼＫを加え、５０℃で１日間インキュベートすればよい。
【００４９】
（ii）次に、分離した目的の染色体（この実施例ではヒトＸ染色体上のBruton agammaglobulinemia (Btk) ）のＤＮＡを、ＮｏｔＩのようなレアカッタ酵素(rare-cutter enzyme)を用いて切断し、次いでＰｖｕＩおよびＡｖａＩ制限酵素（東洋紡績株式会社製）で消化し、更にＰｖｕＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化したリンカーＤＮＡをライゲーションする。これをパルスフィールドゲル電気泳動等で分画し、目的のＤＮＡフラグメントを得る。
【００５０】
なお、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）ではＤＮＡフラグメントの長さを測定できるから、本発明の方法では上記のゲル電気泳動による分画操作は必ずしも必要としない。その代わりに、フェノール等でＤＮＡ以外の夾雑物を取り除くだけでよい。
【００５１】
こうして、図７（Ａ）に示すように、約９ｋｂ（8679ｂ）の二本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。
（iii ）上記の方法で得た１０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、エキソヌクレアーゼIII で片側を削り込むことにより（２３℃で５０分）、図７（Ｂ）に示すように、ヌクレオチド１〜１５０部分以外の部分を一本鎖にした。
【００５２】
その代わりに、熱変性、アルカリ処理（0.1 ＮのＮａＯＨ等）、ファージベクターを用いた方法等で一本鎖ＤＮＡとした後、ヌクレオチド番号１〜１５０に対応するＤＮＡプローブをハイブリダイズさせて、図７（Ｂ）の状態を得てもよい。
【００５３】
（iv）次に、図７（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、マッピングしようとする目的の遺伝子（この実施例ではＢｔｋエキソン１４を含む配列）の配列に基づいて作成した２００ｂ程度のＤＮＡプローブを、次のようにして上記の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせた。
【００５４】
即ち、上記のＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション溶液（80％ホルムアミド, 0.4M NaCl, 0.05M PIPES(pH6.4), 1mM EDTA ）中において８０〜９０℃で３〜５分加温した後、３０〜７０℃で約３時間ハイブリダイズさせた。
【００５５】
（ｖ）次に、２．５倍量のエタノールを加えてＤＮＡをエタノール沈殿させた。この沈殿したＤＮＡを回収し、Tris-HCl, EDTA溶液に溶かし、ＳＰＭ観察用の試料を調製した。このサンプルを用い、実施例１の工程（iii ）で説明した方法により、ＡＭＦ観察を行った。
【００５６】
＜実験結果＞
上記（ｖ）でのＡＦＭ分析において、ヌクレオチド番号１〜１５０（ＰｖｕＩ部位を１とする）に対応する二本鎖部分と、目的の遺伝子に対応する２００ｂｐのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションにより二本鎖となった部分は直線として観察された。一方、その他の一本鎖部分は高次構造を形成してた。高次構造の大きさから、図７（Ａ）に示した約９ｋｂの二本鎖ＤＮＡフラグメントに含まれる目的のＢｔｋエキソン１４を含む配列の位置は、ヌクレオチド番号58001 〜6000と決定された。
【００５７】
一方、従来のマッピング法を用いて決定された上記遺伝子のヌクレオチド番号は5825〜6024であり、略同様の結果が得られた。
なお、位置が既に知られている１００ｂｐ程度の参照プローブを用い、これを上記のＤＮＡプローブと共に用いれば、目的の遺伝子の位置に関するより正確かつ詳細な情報を得ることができる。
【００５８】
実施例３
この実施例の目的は、ＡＦＭ観察によって得られる直鎖状部分の長さが、この直鎖状部分を構成する二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド数（ｂｐ）と正確に対応していること、即ち、ＡＦＭ観察によって二本鎖ＤＮＡの塩基対数を測定できることを示すことにある。
【００５９】
この目的を達成するために、塩基対数が既知の二本鎖ＤＮＡ（夫々１５５ｂｐ、２８８ｂｐ、７７８ｂｐ、１８７４ｂｐ、５３８６ｂｐ）を調製し、夫々のＤＮＡについて、そのＡＦＭ上の長さ（ｎｍ）を測定した。
【００６０】
図８はその結果を示している。図示のように、ＡＦＭで測定された各二本鎖ＤＮＡの長さと、それらの塩基対数との間には直線的な相関関係があることが分かった。この結果は、ＡＦＭ観察で得られた直鎖状部分の長さから、これに対応する二本鎖ＤＮＡの塩基対数を決定できることを示している。
【００６１】
実施例４
この実施例の目的は、本発明によるエキソヌクレアーゼ酵素の特性分析方法を例示することである。
【００６２】
＜実験手順＞
（ｉ）長さ3185ｂｐの二本鎖ＤＮＡを作成した。この５μｇの直鎖状ＤＮＡと、１５０単位のエキソヌクレアーゼIII （東洋紡績株式会社から商業的に入手可能）とを、50mM Tris-HCl(pH 7.6) ，1mM MgCl2 ，1mM 2-メルカプトエタノールの溶液（２５μリットル）中で反応させた。反応条件は、２３℃で１０分とした。なお、上記のエキソヌクレアーゼIII については、低純度品および高純度品の夫々を用いて実験を行った。
【００６３】
（ii）こうして消化したＤＮＡについて、実施例１で説明したのと同じ方法によりＡＦＭ観察を行った。顕微鏡の視野に含まれる略１００個のＤＮＡ分子について、その二本鎖部分の長さを測定し、実施例３に示した方法に依拠して、個々のＤＮＡ分子の二本鎖部分の塩基対数を決定した。
【００６４】
＜実験結果＞
上記の結果を図９に示す。同図において、横軸はエキソヌクレアーゼIII で処理されたＤＮＡ分子の直鎖状部分（二本鎖部分）の塩基対数であり、縦軸はそのような二本鎖部分を有するＤＮＡ分子の頻度（相対目盛）である。
【００６５】
低純度品では曲線Ｘで示す分布が得られ、また高純度品では曲線Ｙで示す分布が得られた。
＜考察＞
同じ長さの二本鎖ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼIII 酵素を用いて同じ条件で消化しても、全てのＤＮＡ分子が同じ程度に消化される訳ではなく、ばらつきが生じる。その結果、消化生成物の各ＤＮＡ分子における二本鎖部分の長さには分布が生じる。この分布は、使用した酵素の特性、純度、および反応条件（反応温度、基質濃度等）によって相違することになる。
【００６６】
上記の例では、低純度の酵素を用いた反応では消化反応のばらつきが大きいため、消化物ＤＮＡの二本鎖部分は、曲線Ｘで示すように広範囲に分布する。これに対して、高純度の酵素を用いた反応では、曲線Ｙに示すように二本鎖部分の長さの分布は狭くなる。
【００６７】
このように、本発明の方法によれば、消化反応を受けた後の個々のＤＮＡ分子を直接観察しているため、上記の分布のように、従来の方法では得られなかった情報を得ることができる。
【００６８】
また、上記のように二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで部分的に消化し、残存した二本鎖部分の長さを測定する場合、従来の電気泳動による方法では、一本鎖になった部分の高次構造が影響する。そのため、電気泳動におけるバンドの位置から正確な二本鎖部分の長さを知ることは困難である。これに対して本発明の方法では、個々のＤＮＡ分子のＡＦＭ像に基づいて、一本鎖部分の高次構造による影響を受けることなく、その二本鎖部分長さを正確に測定できる利点が得られる。
【００６９】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、走査型プローブ顕微鏡を用いて個々の核酸分子の全体の高次構造に関する形態を直接測定することにより、従来行われてきた電気泳動を用いるＤＮＡシーケンシング法の制約をなくし、核酸の長さにかかわらず迅速に塩基配列の決定を行うことができる。また、遺伝子ファミリーやホモロジードメイン等を迅速かつ簡便に予測することができる。
【００７０】
加えてた、一本鎖とに重鎖を区別するだけで容易に遺伝子マッピングを行うことができ、更に個々の基質核酸分子を観察することによって、エキソヌクレアーゼの詳細な特性を知ることができる。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法により核酸の塩基配列決定が可能であることを示すために行った、予備的実験を模式的に示す説明図である。
【図２】図２は、図１（Ｃ）の状態になった一つのＤＮＡ分子のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図３】図３は、図１（Ｃ）の状態になったもう一つのＤＮＡ分子のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図４】図４は、図１（Ｃ）の状態になったＤＮＡ分子のＡＦＭ測定で得られた情報を、コンピュータ解析して得たＤＮＡ分子の構造を示す図である。
【図５】図５は、図２のＡＦＭ顕微鏡写真に表された情報を、コンピュータで解析して得たＤＮＡ分子の構造示す図である。
【図６】図６は、図３のＡＦＭ顕微鏡写真に表された情報を、コンピュータで解析して得たＤＮＡ分子の構造示す図である。
【図７】図７は、本発明の方法による遺伝子マッピングの一例を模式的に示す説明図である。
【図８】図８は、ＡＦＭで測定された二本鎖ＤＮＡの長さと、それらの塩基対数との間に直線的な相関関係があることを示すグラフである。
【図９】図９は、所定の長さの二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼIII で部分的に消化して得たＤＮＡ分子について、その直鎖状部分（二本鎖部分）の塩基対数の分布を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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