(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の複合体を形成する方法であって、
最終濃度約２質量％で非変性界面活性剤を用いて３７℃で１時間インフルエンザＡウイルスから全ＨＡタンパク質を抽出する工程を含む方法によって、インフルエンザＡウイルスからトランスメンブレンおよびエンドドメインを含む全ＨＡタンパク質を単離し、
前記全ＨＡタンパク質を処理してタンパク質のエンドドメイン内に遊離のスルフヒドリル基を形成し、さらに、
前記遊離のスルフヒドリル基を介して、前記ＨＡタンパク質に結合することによって該ＨＡタンパク質に対する免疫応答を高めることができるキャリヤー分子に、スルフヒドリル基含有ＨＡタンパク質を架橋結合させる、工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記非変性界面活性剤抽出において、オクチル−β−グルコシドまたはコリン酸ナトリウムを用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
単離された全ＨＡタンパク質を処理して遊離のスルフヒドリル基を形成する際に、ヒドロキシルアミンを用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
前記キャリヤー分子が、架橋剤分子を介して前記全ＨＡタンパク質に結合する遊離のスルフヒドリル基を有する全ＨＡタンパク質を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤分子がビスマレイミド化合物であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
前記キャリヤー分子が、異種二機能性架橋剤分子を介して前記全ＨＡタンパク質に結合するキャリヤータンパク質または炭水化物を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
前記キャリヤータンパク質または炭水化物が、ジフテリア毒素、破傷風毒素またはインフルエンザＮＰタンパク質を含むことを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
前記異種二機能性架橋剤がマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
前記複合体がワクチンとして製剤化されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）がキャリヤー分子に接合した複合体、ならびにそのような複合体を免疫原性組成物、とりわけヒトに投与するワクチンとして使用することに関する。
発明の背景
生体に投与された全ウイルスワクチンは、ウイルス性抗原に対する抗体を形成することにより免疫応答を起こす。インフルエンザウイルスの場合には、このウイルスに対するウイルス中和抗体の標的はインフルエンザＨＡタンパク質である。ある市販の全ウイルスワクチンは分断ウイルスワクチンであり、これは不活化ウイルスを界面活性剤で処理して得られるものであり、コノートラボラトリーズ（Connaught Laboratories, Inc.）からフルゾン（FLUZONE）という商標名で販売されている。
ワクチンに関する傾向としては、全ウイルスを材料とするものから離れて、一般的により小さく、十分に確認されている、より精製された材料からなるものへと移行している。インフルエンザＨＡ抗原は単離されているが、特定のサブユニットは免疫原性が弱く、多くの個体に対して十分に高い免疫応答を誘起することができない。
本発明の出願者によって出願され、ＥＰ87−310377として公開されているものの中には、ＨＡをジフテリア毒素へ共有結合させたものについて既に記載されている。その中の記載においては、ブロメリン開裂により全ウイルスからＨＡを除去し、異種二機能性の架橋剤であるマレイミド−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル型ものも、好ましくはＭＣＳ（マレイミド−カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、得られたＨＡサブユニットをジフテリア毒素に共有結合した。このＨＡ−Ｄ複合体を調製するにあたっては、まずＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミディル−Ｓ−アセチルチオ酢酸）で処理することによってＨＡサブユニットにスルフヒドリル基を導入し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルがジフテリア毒素（ＤＴ）のアミノ基と反応し、次に、マレイミド部位がＨＡ抗原に導入された遊離のスルフヒドリル基と反応してＨＡ分子とＤＴ分子とが結合し、ＨＡ−Ｄ複合体が形成される。
ヒトに対する有効性試験で得られた結果では、ＨＡ−Ｄ複合体ワクチンはＨＡサブユニットワクチン単独よりも高い免疫応答を示したが、全インフルエンザウイルスワクチンと比較すると、ＨＡ−Ｄ複合体はヒトに対して十分な免疫応答を示さなかった。
発明の概要
このたび、発明者らは、これまでに記載されている複合体（conjugates）よりも免疫原としての効果が高いＨＡ複合体、およびその他のウイルスのサブユニットタンパク質の複合体を調製する新規な方法を開発した。本発明においては、これまでに記載されていた方法と異なる方法で全ウイルスからＨＡサブユニットを分離し、このことにより、より良い結果が得られる。
本発明は、ＨＡタンパク質の免疫的に重要な部位を無傷（インタクト）のまま残すような方法を開示するものである。これまでに行われていた方法−これはブロメリン開裂と呼ばれ、複合体形成過程においてアミノ基の誘導体化を伴うものである−においてはそのような部位の変性を行うため、全インフルエンザワクチンと比較すると有効性が大きく劣るといった結果を招いた。
すなわち、本発明のひとつの目的は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の複合体を形成する方法を提供することにある。該方法の第一の工程は、界面活性剤抽出により、インフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を分離することである。従来の方法においては、ブロメリンによりＨＡタンパク質を該ウイルスから切り出していた。本発明で使用している界面活性剤による抽出法の効果としては、分離されたＨＡタンパク質内にトランスメンブレンとエンドドメインとが含まれていることであり、ブロメリン開裂の場合には、これらの部分はウイルス材料の方に残っていた。ウイルスからＨＡタンパク質を抽出する以外に、ＨＡタンパク質を組換えによって作成し、次の工程に供することもできる。
次に、分離したＨＡタンパク質をヒドロキシルアミンまたはその他の適切な化学物質で処理し、エンドドメイン内のチオエステル基を転換することにより、エンドドメイン内に反応性に富むスルフヒドリル基を生成する。従来の方法においては、硫化により、ブロメリン開裂したサブユニットにスルフヒドリル基を導入していた。２つの異なる抽出方法により得られたＨＡサブユニット内のこの違いが、特性が異なっていることの原因だと考えられる。
得られた遊離のスルフヒドリル基を有するＨＡタンパク質を、ＨＡタンパク質に対して有効な免疫応答を示すことができるキャリヤー分子に架橋する。そのような架橋が、ビスマレイミド架橋剤を用いて該ＨＡタンパク質自身に対して行われるか、またはマレイミド変性ジフテリア毒素、破傷風毒素、もしくはインフルエンザＮＰタンパク質に対して行うことにより、複合体を形成することができる。得られたＨＡ複合体をインフルエンザに対するワクチンとして製剤化することができる。
発明の詳細な説明
上述のように、本発明は、複合体化により、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する有効な免疫応答を得ることに関する。本発明の方法において重要な点は、インフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を抽出、もしくは組換えにより形成し、複合化する際に、免疫学的に重要な部位をすべてＨＡタンパク質にインタクトのまま残していることである。本発明は、Ａ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザを含むインフルエンザのさまざまな株からのＨＡタンパク質の分離に応用することが可能である。
ＨＡタンパク質に関して、本発明で得られた成功は、全ウイルスから単離され、または組換え過程によって形成されたその他の免疫原性の弱いタンパク質であって、エンドドメインに遊離のスルフヒドリル基が生じているようなタンパク質に対してもこの手法が応用可能であることを示唆している。本発明の手法を用いることができるその他の免疫原性の弱いタンパク質としては、ラクロッスウイルスのＧ１およびＧ２タンパク質（明細書の最後に掲載されている参考文献リスト内の参考文献１）、マウス肝炎ウイルスのＥ２タンパク質（参考文献２）、１型単純ヘルペスウイルスのｇＥタンパク質（参考文献３）、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質およびＨＮタンパク質（参考文献４）、ラウス家禽肉腫ウイルスのｇｐ35タンパク質（参考文献５）、腹腔小胞ウイルスのタンパク質Ｇ（参考文献６）、牛痘ウイルスのＰ37タンパク質（参考文献７）、シンドビスウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質（参考文献８）、Ｈ−ラスタンパク質（参考文献９）、インフルエンザＭ２タンパク質（参考文献11）およびヒトトランスフェリンレセプター（参考文献10）が挙げられる。従って、本発明は広い観点からみると、細胞性材料からの抽出あるいは組換え手法によって、細胞性材料に関連するタンパク質の複合体を形成する方法であって、末端部位に少なくともひとつのチオエステル基を有するタンパク質を細胞性材料から分離し、分離したタンパク質を処理することにより、少なくともひとつのチオエステル基から少なくともひとつの遊離のスルフヒドリル基を形成し、さらに、少なくともひとつの遊離のスルフヒドリル基の結合を介して、スルフヒドリル基を有するタンパク質をキャリヤー分子に架橋することを含む方法を提供するものである。
本発明の手法は、以後、ＨＡタンパク質に関して記載しているが、同様の手法は、他のタンパク質についてそれらの複合体を形成する場合にも用いることができることに留意されたい。
複合体形成の第一段階は、変性を起こさない条件下でインフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を単離することである。そのような方法には、オクチル−β−グルコシド、コリン酸ナトリウム、またはその他の非変性界面活性剤を用いた界面活性剤抽出が含まれる。別の方法としては、適切な発現系を用いて発現を行うことにより、組換えによってＨＡタンパク質を形成することもできる。
界面活性剤を用いて全ＨＡタンパク質を抽出、または組換え手法によりＨＡタンパク質の形成を行った後、ＨＡタンパク質をヒドロキシルアミン、チオール還元剤で処理することにより、または酸加水分解もしくはアルカリ加水分解により、タンパク質のエンドドメイン内に遊離のスルフヒドリル基を形成するか、あるいはエンドドメイン内のチオエステル結合を解離することにより遊離のスルフヒドリル基を形成する。
次に、遊離のスルフヒドリル基を有するＨＡタンパク質を、遊離のスルフヒドリル基による化学結合を介して他の分子に結合する。そのような結合は、次式で表されるような適切なビスマレイミド化合物を利用することにより、ＨＡタンパク質自身への結合を経由しているものと考えられる：
0004024849.tif 000002
ここで、Ｒはヘキサンなどの炭化水素ラジカルである。
別の方法としては、ＨＡタンパク質の結合は、ジフテリア毒素、破傷風毒素、もしくはインフルエンザ（ＮＰ）タンパク質などのマレイミド変性キャリヤータンパク質に対して、またはアルギニン酸、デキストラン、もしくはポリエチレングリコールなどの炭水化物に対して行うことができる。そのようなマレイミド変性キャリヤー分子は、上述の従来技術に記載されているように、キャリヤー分子をマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル型の異種二機能性の架橋剤に反応させることにより形成することができる。
そのような化合物は次のような構造式で表される：
0004024849.tif 000003
ここでＲは任意の適切な酸残基であり、また、必要に応じて置換されたフェニレン基、炭素数１〜12、好ましくは炭素数５〜12のシクロアルケン基またはアルキレン基を含むことがある。そのような二機能性エステルの例としては、マレイミド−カプロイック−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）、マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、マレイミド−ベンゾイル−スルフォスクシンイミドエステル（スルフォ−ＭＢＳ）、スクシンイミディル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミディル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＰ）、スルフォスクシンイミディル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルフォ−ＳＭＣＣ）およびスルフォスクシンイミディル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルフォ−ＳＭＰＰ）がある。
Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル部位はキャリヤータンパク質のアミン基と反応してマレイミド部位をフリーにし、抗原のスルフヒドリル基と反応して架橋材料を形成する。
このようにして形成された複合体分子を精製し、ワクチン材料としての免疫原性組成物に用い、宿主に投与した際にＨＡタンパク質に対する免疫応答を誘起するが、その強さはＨＡ単独よりも強く、いくつかの例においては市販の分断インフルエンザワクチンによる応答を越えている。
そのような複合体分子を含む免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョンなどの注射可能な形態に調製することができる。複合体分子は、それらと適合性のある生体許容性のキャリヤーと混合することができる。これらのキャリヤーとしては、水、生理食塩水、デキストラン、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。組成物にはさらに、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ調整剤などの補助剤を含んでいてもよい。ワクチンは皮下もしくは筋肉内注射によって投与することができ、または粘膜表面において免疫応答を誘起するような方法で投与することができる。
該免疫原性組成物は、製剤として適合できるような方法で、治療上有効、防御的、または免疫原性を有するような量で投与する。投与する複合体の量は、免疫を与える対象に依存しており、この中には、該対象の免疫系が抗体を合成する能力、さらに、必要に応じて細胞性免疫を産生する能力も考慮される。投与する複合体の正確な量は、医療従事者の判断にゆだねられている。しかしながら、好ましい投与量の範囲は同業者によって容易に決定でき、それはμｇからｍｇのオーダーである。好ましい初回投与および追加投与の方式における投与量もさまざまであるが、初回投与後数回に分けて投与を行うこともできる。ワクチンの投与量は、投与経路にも依存しており、また、対象の大きさもよっても異なる。
本明細書に開示している新規な複合体からなる免疫原性組成物は、抗原特異的な抗体を産生するのに有用であり、この抗体は、イムノアッセイにおいて該抗原を特異的に同定するのに役立つ。そのようなイムノアッセイとしては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよびその他の当業者に知られている非酵素性抗体結合アッセイなどが含まれる。
実施例
実施例１
本実施例は、インフルエンザウイルスサブユニットの調製について記述する。
インフルエンザウイルス（Ａ／台湾型およびＡ／北京型）を遠心分離により沈澱させ、上清を除去し、この沈澱を少量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。10重量％の界面活性剤、オクチル−β−グルコシドを含有するＰＢＳを加え、界面活性剤の最終濃度を２重量％とした。材料を穏やかに混合し、37℃で１時間インキュベートした。ウイルスのコアおよび組織片は遠心分離により除去した。遠心分離により得られた上清には、界面活性剤抽出によってウイルスから分離されたＨＡサブユニットが含まれていた。
実施例２
本実施例は、ＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体の調製について記述する。
実施例１の記載に従って調製した界面活性剤抽出ＨＡに、次に、５ＭのヒドロキシルアミンとｐＨ7.2の２ｍＭのＥＤＴＡとを４：１の割合で混合し、ＨＡ分子内に末端スルフヒドリル基を生成した。３倍モル量以上のビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ、ジメチルスルフォキシドに溶解して５mg／mlとしたもの）をＨＡ単体に加えた。反応は、室温で30分インキュベートして行った。次に、ＢＭＨ変性ＨＡを過量のヒドロキシルアミン処理ＨＡと混合した。Ａ／台湾型のＨＡを用いて材料を調製し、このときのＢＭＨ変性ＨＡに対する非変性ＨＡの比は１：２、１：４、１：８、および１：16とした。Ａ／北京型のＨＡを用いて材料を調製した場合の比は、１：２、１：４および１：８とした。これらの反応は、室温で数時間インキュベートして行った。最終生成物は、分子量300,000を基準として分離する膜を用いた限外ろ過により精製した。
実施例３
本実施例は、ＨＡ−キャリヤー抗原複合体の調製について記述する。
まずはじめに、スルフォ−ＳＭＣＣを用いてキャリヤー抗原を変性した。キャリヤータンパク質の濃度は、マイクロ−ＢＣＡタンパク質分析を用いて測定した。これは、ｐＨ7.3のリン酸緩衝生理食塩水中の毒素キャリヤータンパク質を15倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で２時間インキュベートして行った。ＮＰタンパク質は、１モルの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中において25倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で２時間インキュベートした。アルギニン酸は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドの存在下、ｐＨ５において、アジピン酸ジヒドラジドを用いて室温下で120分間インキュベートすることにより変性した。アジピン酸による変性に続いて、この材料をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、未反応のヒドラジドを除去した。ヒドラジド変性アルギニン酸は、ｐＨ7.3のリン酸緩衝生理食塩水中、２倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で270分インキュベートした。
未反応のスルフォ−ＳＭＣＣ架橋剤は、急速脱塩カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー（Pharmacia LKB Biotechnology）社製、米国、ニュージャージー州（New Jersey）、ピスカタウェイ（Piscataway））を用いてゲルろ過を行うことにより除去した。変性キャリヤー中のマレイミド含量は、５’５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて測定した。次に、遊離のスルフヒドリル基１個につきマレイミド基１個の割合で、実施例２に記載しているように調製したヒドロキシルアミン処理ＨＡに変性キャリヤーを結合した。架橋反応および複合体形成した材料の精製は実施例２の記載に従って行った。
実施例４
本実施例は、ある複合体（Ａ／台湾型を使用）に対してマウスにおいて得られた免疫応答に関して記述する。
Ａ／台湾型のＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体およびＨＡ−カルボヒドレート複合体について、マウスを用いて免疫原性および有効性を調べた。マウスに０週および３週目に免疫し、５週目に採血または生きているＡ／台湾型ウイルスをチャレンジした。ＨＡ−ＨＡ複合体およびＨＡ−カルボヒドレート複合体をさまざまなワクチン投与量において市販の分断インフルエンザワクチン（フルゾン（Fluzone））およびプラセボと比較した。得られた結果を次の表Ｉに示している：
0004024849.tif 000004
このデータからわかるように、ＢＭＨを用いて作成した自己複合体はマウスの肺においてウイルスの複製を阻止することができ、従来型のワクチンよりも高い抗体価が得られた。
実施例５
本実施例は、その他の複合体（Ａ／台湾型を使用）に対するマウスの免疫応答について記述する。
ＤＴ、ＴＴおよびＮＰとＨＡとの複合体についてもマウスにおける免疫原性および有効性を実施例４と同様のプロトコールに従って調べ、市販の分断インフルエンザワクチン（フルゾン（Fluzone））およびプラセボ（ＰＢＳ）と比較した。得られた結果を次の表ＩＩに示している：
0004024849.tif 000005
このデータからわかるように、毒素複合体はマウスの肺中でウイルスの複製を阻止することができる。複製の阻止という点に関しては、破傷風毒素複合体がわずかに優れている。
実施例６
本実施例は、ある複合体（Ａ／台湾型を使用）に対してモルモットにおいて得られた免疫応答に関して記述する。
モルモットにおける抗体アッセイでは、マウスについて行った実施例４および５に示されている結果とは異なる結果が得られた。本実施例においては、モルモットを０週目に免疫し、２週目および４週目に追加免疫を行った。５週目および７週目に採血し、試験を行った。
自己複合体および破傷風毒素複合体ともに全細胞ワクチンと同程度の結果を示した。ジフテリア毒素複合体は極めて高い抗体価を示した。ＮＰタンパク質との複合体は低い抗体応答しか示さなかったが、試験期間中を通して応答が上昇し続け、試験終了時には極めて高い抗体応答を示した。得られた結果を表ＩＩＩに示す：
0004024849.tif 000006
実施例７
実施例１および２に記載した方法でＡ／北京型のＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体を調製し、実施例４の記載に従って試験を行った。得られた結果はＡ／台湾型でのものと類似しており、次の表ＩＶに示す：
0004024849.tif 000007
開示のまとめ
本開示をまとめると、本発明は、インフルエンザウイルスからＨＡタンパク質を分離し、複合体化して、ＨＡタンパク質に対する有効な免疫応答を得るための新規な方法に関する。本方法の各種の変形も本発明の範ちゅうに含まれる。
0004024849.tif 000008