(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤を水性溶媒中に含むことを特徴とするイムノアッセイ用試薬。
【請求項２】
以下の２液より構成されるイムノアッセイ用試薬：
（ａ）測定対象物に対する抗体あるいは抗原を感作した不溶性担体粒子を含む試薬、および、（ｂ）親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤を含む水性溶媒。
【請求項３】
界面活性剤の親水部の二糖鎖がマルトースあるいはシュクロースである請求項１または２記載のイムノアッセイ用試薬。
【請求項４】
親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とするイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生体試料中の生理活性物質を測定するためのイムノアッセイ用試薬に関するものであり、特定の試料に含まれている特定の物質の量を定性あるいは定量するものである。この試薬は医学薬学をはじめ、生体成分を分析する様々な分野で利用可能である。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中の特定の物質を測定しようという試みは以前から盛んに行われている。生体試料中の特定物質を検出する方法としては、生体由来の特異的相互作用を利用する方法が知られており、その中でも抗原と抗体の親和性を利用した検出方法は現在臨床検査の分野を始めとして様々な分野で広く用いられている。
【０００３】
抗原抗体反応を利用した特定物質の検出法はイムノアッセイと呼ばれ、様々な測定原理によって抗原抗体反応の検出が可能になっている。その中の１つであり比較的古典的な方法に凝集反応がある。この方法では、抗原や抗体に比べると圧倒的に大きな不溶性の物質（粒子）に、抗原あるいは抗体を固定化して、測定対象物である生体試料と混合することによってそこで抗原抗体反応を生じさせる。この抗原抗体反応は不溶性物質の表面で起こり、抗体が複数個の抗原と結合しうる性質を有していることから、不溶性担体粒子の凝集が生じるという反応を測定原理としたものである。
【０００４】
不溶性担体粒子としては、現在までに赤血球を始め、炭素粉末、ゼラチン粒子など様々な素材が使われてきた。その中でもポリスチレンなどを材料としたラテックス粒子は、その粒径が均一である、表面状態が物質の固定に好都合である、等の利点から幅広く利用されるようになってきた。
【０００５】
現在までにポリスチレンラテックスを利用した体外診断用医薬品としてはＣＲＰ測定試薬、便中ヘモグロビン測定試薬などがあり、測定装置としては、凝集の度合いを吸光度や散乱光でとらえる自動分析装置、凝集の程度をフロー中での前方散乱光強度でとらえる自動分析装置などが市販されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
近年、イムノアッセイの感度は飛躍的に向上しており、発光検出法を主体とする様々な高感度イムノアッセイが検討されている。ラテックス凝集法においても様々な高感度化が図られ、それなりの実績を上げてきている。しかしながらラテックスなどの凝集法は抗原抗体反応時に検体成分が存在するホモジニアスなイムノアッセイであり、高感度化は非特異反応の増大と表裏一体の関係になっている。実際、現在までに報告されている様々な増感剤（それらの多くは水溶性の高分子であり、例えばポリエチレングリコールやデキストラン等が挙げられる）は確かに抗原抗体反応の感度を上げる効果はあるものの、それと同時に非特異的な反応をも増大させるという欠点を有していた。
【０００７】
本発明は、非特異的な反応をできるだけ増大させずに、特異反応のみを増大させることのできるイムノアッセイ用の水性溶媒を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
我々は上記の問題を鑑み、本発明は、親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤を水性溶媒に含むことを特徴とするイムノアッセイ用試薬を提供する。また、本発明は、（ａ）測定対象物に対する抗体あるいは抗原を感作した不溶性担体粒子を含む試薬、および、（ｂ）親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤を含む水性溶媒、により構成されるイムノアッセイ用試薬を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とするイムノアッセイを提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
親水部に二糖鎖を有する非イオン性界面活性剤の例としては、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド；
【００１１】
【化１】
0003916189.tif 000002
【００１２】
ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド；
【００１３】
【化２】
0003916189.tif 000003
【００１４】
シュクロースモノカプレート（ｎ＝８）、シュクロースモノラウレート（ｎ＝１０）；
【化３】
0003916189.tif 000004
【００１５】
等が挙げられる。ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシドは、親水部がマルトースであり、シュクロースモノカプレート及びシュクロースモノラウレートは、親水部がシュクロースである。濃度については、測定項目によって至適濃度は異なるが、一応の目安としては、反応液全体として０．０１〜２．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５〜１．０ｗ／ｖ％で使用できる。
【００１６】
本発明で用いられる水性溶媒としては、従来既知のあらゆる凝集試験用水性溶媒が使用でき、例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液など）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、正常ヒト及び動物血清溶液、合成高分子溶液等、およびこれらの組み合わせからなる溶液が例示される。当該水性溶媒のｐＨは、約６．０〜８．５が好ましく、ｐＨの調整は緩衝液で行われることが好ましい。水性溶媒の塩濃度は、測定に支障がない限りとくに制限されないが、生理的等張な溶液であることが好ましい。
【００１７】
ここで凝集反応に用いる不溶性担体は、従来既知のものであれば何でも使用可能である。固定化した赤血球を始め、炭素粉末、ゼラチン粒子など従来の試薬に応用可能であるが、自動測定を可能に使用するためには、粒径の均一なラテックス粒子を使用するのが好ましい。
【００１８】
不溶性担体表面に結合する抗体あるいは抗原としては種々のものが使用可能である。
【００１９】
各動物種の抗体は、ラテックス表面に簡単に物理吸着させることが可能であることは周知の事実である。抗原あるいは抗体の固定化方法としては、物理吸着以外に、担体表面の官能基を利用する共有結合法も利用可能である。
【００２０】
凝集試験を行うにあたっては、本発明の非イオン性界面活性剤を含むラテックス懸濁液と試料とを混合して行うことができるが、あらかじめ本発明の非イオン性界面活性剤を含む反応緩衝液を試料に添加し混合してから、ラテックス懸濁液と反応させるのが好ましい。
【００２１】
測定方法は凝集法であるが、その検出方法には様々なものがある。最も古典的な方法は目視で凝集を確認する方法であるが感度も低く個人差が大きい。凝集の程度を吸光度の変化や散乱光の変化でとらえる方法も広く用いられており、自動測定装置も数多く開発されている。近年は、凝集した粒子をフロー中に流し、そこにレーザー光線を当てることによって、粒子から得られる前方散乱光強度を測定する装置が開発されている。粒子の凝集の程度により得られる散乱光強度には変化が生じ、個々の粒子の散乱光強度から凝集した粒子と凝集していない粒子とを区別でき、全体の凝集率を高感度に検出できる。この方法を用いれば試料中の微量の抗体を検出することができる。たとえば、東亜医用電子（株）のＰＡＭＩＡシリーズでは、約１０万個の粒子を計測後、その凝集率を凝集した粒子の数（Ｐ）とトータルとして計数した粒子数（Ｔ）の比（Ｐ／Ｔ）（％）で表わす。あらかじめ既知の濃度のキャリブレータを測定しておき、凝集率と濃度について検量線を作成しておけば、試料の凝集率からその試料中に含まれる測定対象物の量を定量することができる。
【００２２】
【実施例】
本発明を以下の実施例で説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００２３】
実施例１：ランリームＡＦＰに対する増感作用
東亜医用電子（株）製のイムノアッセイ試薬、「ランリームＡＦＰ」（東亜医用電子（株）の商標）を用いてｎ−ドデシル−β−マルトシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、シュクロースモノカプレートおよびシュクロースモノラウレートの増感作用を調べた。なお、東亜医用電子（株）の「ランリーム」試薬は、ラテックス試薬、反応緩衝液、キャリブレータ及び検体希釈液から構成される試薬キットである。本実施例及び以下の実施例では、反応緩衝液に上述の非イオン性界面活性剤を添加し、測定を行なった。測定には同社製の免疫凝集測定装置（商品名：ＰＡＭＩＡ−２０）を用いた。
【００２４】
この装置は、測定試料１０μｌ、ラテックス試薬１０μｌ、反応緩衝液８０μｌを反応槽中で混合し、４５℃で加温する。試薬混合後、約２０秒と１５分後の試料を抜き取り、その凝集率を測定し、それぞれＴ１、Ｔ２とする。凝集率は、Ｐ／Ｔ（％）の形で算出され、Ｔ２をあらかじめ求めておいた検量線に当てはめて濃度を算出する。
【００２５】
Ｔ１は、オーバーレンジ判定をするのに必要な測定である。検体中の目的物質の量が多いと、見かけ上凝集率が低下するという現象が起こる。このため、高濃度領域では目的物質の量を正確に測定することが困難になる。しかしながら、反応初期においては、そのような過剰領域においても凝集率の低下が見られないことを利用し、２回の測定を行っている。なお、この測定は本発明を実施する上では特に必要ではない。
【００２６】
使用試薬：
（ラテックス試薬の構成）
リン酸緩衝液（３０ｍＭ，ｐＨ７．０）
抗ＡＦＰ抗体感作０．８μｍポリスチレンラテックス      ０．０５ｗ／ｖ％
（反応緩衝液の構成）
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）
ＮａＣｌ（塩類）                      ０．１Ｍ
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）          ２ｗ／ｖ％
【００２７】
反応緩衝液中に各界面活性剤を０〜０．５ｗ／ｖ％の濃度で添加し、検量線を作成した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
0003916189.tif 000005
【００２９】
検量線は界面活性剤の添加により変化した。感度の変化をＣ１−Ｃ０のＰ／Ｔで評価することにした。この数字を比較してみると無添加の０．０３％に対してｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシドの０．４ｗ／ｖ％添加（反応液全体としては、０．３２ｗ／ｖ％）が０．４２％と最も大きな数字を示した。これ以外の界面活性剤においても、添加による増感効果は認められている。
【００３０】
この結果より、ラテックス凝集反応によるＡＦＰ測定において、親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤にはラテックス凝集に対する増感効果が存在していることが明らかとなった。
【００３１】
実施例２：ランリームＦＲＮに対する増感作用
東亜医用電子（株）製のイムノアッセイ試薬、「ランリームＦＲＮ」（東亜医用電子（株）の商標）を用いて４種類の界面活性剤の増感作用を調べた。測定には同社製の免疫凝集測定装置（商品名：ＰＡＭＩＡ−２０）を用いた。
【００３２】
なお、ラテックス試薬として抗ＦＲＮ感作ポリスチレンラテックスを用いた以外は実施例１と同じである。
【００３３】
反応緩衝液中に各種界面活性剤を０〜０．５ｗ／ｖ％の濃度で添加し、検量線を作成した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
0003916189.tif 000006
【００３５】
検量線は界面活性剤の添加により変化した。増感の指標としてＣ１−Ｃ０の値に注目したところ、対照の０．２３％に対してシュクロースモノラウレートの０．４ｗ／ｖ％添加（反応液全体としては０．３２ｗ／ｖ％）では、０．５３％と増大していた。
【００３６】
このことは感度が増大していることを示すものであり、ラテックス凝集反応によるＦＲＮ測定において、親水部に二糖鎖を有する非イオン性界面活性剤に増感効果のあることがわかった。また他の界面活性剤においても程度の差はあれ、感度の上昇が見られた。
【００３７】
実施例３：ランリームＴＰに対する非特異抑制作用
東亜医用電子（株）製のイムノアッセイ試薬、「ランリームＴＰ」（東亜医用電子（株）の商標）を用いて４種類の界面活性剤の非特異反応抑制作用を調べた。測定には同社製の免疫凝集測定装置ＰＡＭＩＡ−２０を用いた。
【００３８】
なお、ラテックス試薬に梅毒トレポネーマ（ＴＰ）菌由来の成分を感作したポリスチレンラテックスを用いた以外は実施例１と同じである。
【００３９】
反応緩衝液中に各種界面活性剤を０．１ｗ／ｖ％の濃度で添加し（反応液全体としては０．０８ｗ／ｖ％）、検量線を作成した。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
0003916189.tif 000007
【００４１】
検量線は界面活性剤の添加により若干変化した。梅毒トレポネーマ（ＴＰ）試験では１０ＳＵ／ｍｌ以上を陽性としているが、現在の試薬で陽性と判断されるが、他の方法では陽性と判断されない低値の陽性検体（非特異検体）について、界面活性剤の添加効果を調べた。増感効果の至適濃度が、界面活性剤を反応緩衝液に０．１ｗ／ｖ％添加したときであったので、この濃度で検討を行なった。
【００４２】
【表４】
0003916189.tif 000008
【００４３】
界面活性剤の添加により１検体を除き測定値が低下し、その多くが陰性化し非特異反応が抑制されることが認められた。４種類の界面活性剤について調べたところ、効果の大小はあるが全ての界面活性剤で同様の効果が見られた。
【００４４】
このことから親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤は増感効果と共に非特異抑制効果を併せ持つ物質であることが明らかとなった。このような物質は現在までのところ見つかっていない。ラテックス凝集には非常に好都合な物質である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、親水部に二糖鎖を有する非イオン性の界面活性剤を抗原抗体反応系に存在させることによって、感度を増大させることができる。また、それだけでなく、非特異反応を増大させずに特異反応のみを増大させることができる。