(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)既知の亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドの少なくとも２つの亜鉛フィンガーモジュールを有する亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドの亜鉛フィンガーであって、第１のヌクレオチド配列に結合する各モジュールのアミノ酸配列が２つのシステイン残基及び２つのヒスチジン残基を有し、両システインは両ヒスチジンに対してアミノ末端側に位置している、亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドの亜鉛フィンガーにおける第１のヌクレオチド配列に結合するアミノ酸を同定し；
b)亜鉛フィンガーの少なくとも１つにおける、前記a)で同定された少なくとも１つのアミノ酸のランダム化置換を含むポリペプチドをコードする発現ライブラリーを作製し；
c)該ライブラリーを適当な宿主細胞中で発現させ；そして
d)第２のヌクレオチド配列に結合するポリペプチドを産生するクローンを単離することで、ヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を取得する；
ことを含んでなる、ヌクレオチド配列に結合する、単離された亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を得る方法。
【請求項２】
上記のライブラリーがファージ表面発現系において発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ファージ発現系がファージ表面上の発現産物の折りたたみを可能にする還元試薬を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
還元試薬がジチオトレイトールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記のライブラリーが、上記同定されたアミノ酸に対応する配列位置に縮重トリプレットコドンを含むプライマーを用いるＰＣＲによりランダム化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ヌクレオチド配列がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記ヌクレオチド配列がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.  発明の分野
本発明は、一般的に、遺伝子発現の調節の分野に関し、特に、亜鉛フィンガー（zinc finger）-ヌクレオチド結合タンパク質から誘導されたポリペプチドを用いて遺伝子発現をモジュレートする方法に関する。
2.  関連技術の説明
転写調節は主にＤＮＡおよびＲＮＡへのタンパク質の配列特異的結合によって行われている。ＤＮＡの配列特異的認識に関与する既知のタンパク質モチーフのうち、亜鉛フィンガータンパク質はそのモジュール性においてユニークである。今日まで、２〜３７個のモジュールを含む亜鉛フィンガータンパク質が同定されている。２００を越えるタンパク質（その多くは転写因子）が亜鉛フィンガードメインをもつことが明らかになっている。亜鉛フィンガーは主としてＤＮＡ塩基対の特定の配列、すなわちＤＮＡ“梯子”の“横棒”、に結合することによって転写因子をその標的遺伝子に結合させる。
亜鉛フィンガーモジュールは、真核生物のさまざまな転写調節因子中に見いだせる約３０アミノ酸からなるモチーフである。その名が示すように、この核酸結合タンパク質ドメインは亜鉛イオンを取り囲むように折りたたまれている。亜鉛フィンガードメインはツメガエル卵母細胞由来の転写因子ＴＦIIIＡにおいて最初に確認された（Millerら, EMBO, 4:1609-1614, 1985; Brownら, FEBS Lett., 186:271-274, 1985）。このタンパク質は共通配列：
（Tyr, Phe）-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-4-His-X2-6（配列番号１）〔ここでＸは任意のアミノ酸である〕
が不完全に９回繰返し存在している。
ＴＦIIIＡと同様に、ほとんどの亜鉛フィンガータンパク質は、それぞれのフィンガードメイン中に１個の亜鉛原子に四座配位している保存されたシステインおよびヒスチジン残基を含んでいる。このタイプ（２個のシステインおよび２個のヒスチジンを含む）の亜鉛フィンガーペプチドの構造、例えば酵母タンパク質ＡＤＲ１、ヒト雄性関連タンパク質ＺＦＹ、ＨＩＶエンハンサータンパク質およびツメガエルタンパク質Ｘｆｉｎに存在する構造、が高分解能ＮＭＲ法によって解析され（Kochoyanら, Biochemistry, 30:3371-3386, 1991; Omichinskiら, Biochemistry, 29:9324-9334, 1990; Leeら, Science, 245:635-637, 1989）、亜鉛フィンガーとＤＮＡとの相互作用に関する詳細なモデルが提案された（Berg, 1988; Berg, 1990; Churchillら, 1990）。さらに、マウス即時型タンパク質ｚｉｆ２６８（Ｋｒｏｘ−２４とも言う）から誘導された３フィンガーポリペプチド−ＤＮＡ複合体の構造がＸ線結晶構造解析によって解明された（Pavletich and Pabo, Science, 252:809-817, 1991）。各フィンガーは逆平行βターン、フィンガー先端領域および短い両親媒性αヘリックス（ｚｉｆ２６８亜鉛フィンガーの場合には、ＤＮＡの主溝（major groove）の中で結合する）を含んでいる。加えて、保存された疎水性アミノ酸並びにシステインおよびヒスチジン残基による亜鉛配位が個々のフィンガードメインの構造を安定化している。
基本型亜鉛フィンガータンパク質ＴＦIIIＡは５Ｓ ＲＮＡ遺伝子内の４３ｂｐ配列と結合する９個の亜鉛フィンガーの配列を含んでいるが、ｚｉｆ２６８クラスの調節タンパク質（例えば、Ｋｒｏｘ−２０、Ｓｐｌ）はずっと大きなポリペプチド内に３個の亜鉛フィンガーを含んでいるだけである。ｚｉｆ２６８の３個の亜鉛フィンガーはそれぞれ９ｂｐ認識配列内の３ｂｐサブサイトを認識する。ｚｉｆ２６８によって行われるＤＮＡ接触のほとんどはリン酸との接触、およびＤＮＡヘリックスの主溝中の一方の鎖上のグアニン残基との接触である。これに対して、ＤＮＡに結合するＴＦIIIＡの作用機構はもっと複雑である。アミノ末端の３個の亜鉛フィンガーは１３ｂｐ配列を認識して、主溝の中で結合する。ｚｉｆ２６８と同様に、これらのフィンガーも主にＤＮＡの一方の鎖上のグアニンと接触する。ＴＦIIIＡの亜鉛フィンガー４および６は、ｚｉｆ２６８クラスのタンパク質と違って、それぞれが主溝の中でまたは主溝を横切って結合し、フィンガー５および７〜９を主溝と接触させる（Clemensら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:10822-10826, 1992）。
ｚｉｆ２６８の結晶構造は、αヘリックスの表面にある特定のヒスチジン（非亜鉛配位ヒスチジン残基）およびアルギニン残基がＤＮＡ認識に関与していることを示している。詳細には、αヘリックスのすぐ前およびヘリックス位置２、３および６（保存されたヒスチジンのすぐ前）にある荷電アミノ酸がＤＮＡグアニンへの水素結合に関与している。調節タンパク質Ｋｒｏｘ−２０のフィンガー２およびＳｐ１のフィンガー１および３と同様に、ＴＦIIIＡのフィンガー２はこれらのＤＮＡ接触位置にヒスチジン残基とアルギニン残基を含んでいる。さらに、これらの亜鉛フィンガーはそれぞれが配列ＧＧＧを最低限認識する。転写因子Ｓｐ１とＫｒｏｘ−２０の間のフィンガー交換実験により、このクラスのフィンガータンパク質の３ｂｐ亜鉛フィンガー認識暗号が確定された（Nardelliら, Nature, 349:175-178, 1989）。また、突然変異誘発実験によってもＤＮＡ認識を特定するうえでのこれらアミノ酸の重要性が明らかになった。亜鉛フィンガー-ヌクレオチド認識を特定する単純な暗号を確定することが望ましいだろう。このような暗号が解読できたならば、所定のＤＮＡ配列と結合するように亜鉛フィンガーポリペプチドを設計できるかもしれない。また、かかるポリペプチドとその認識配列との複合体が、この配列を含む遺伝子の転写活性をモジュレート（アップまたはダウン）するために利用できるかもしれない。
ＲＮＡに結合する亜鉛フィンガータンパク質も報告されている。Clemensら（Science, 260:530, 1993）は、ＴＦIIIＡのフィンガー４〜７が５Ｓ ｒＲＮＡへのＴＦIIIＡ結合の自由エネルギーの９５％に寄与しており、一方、フィンガー１〜３は５Ｓ遺伝子のプロモーターとの結合に同様に寄与していることを見いだした。２つの既知の５Ｓ ＲＮＡ結合タンパク質、すなわちＴＦIIIＡおよびｐ４３、の比較から、共通の亜鉛リガンド（ＣおよびＨ）、疎水性アミノ酸およびフィンガー６中のトレオニン−トリプトファン−トレオニン・トリプレットモチーフ以外には相同性が少ないことが明らかになった。
亜鉛フィンガーを再設計するために、新たな選択的戦略が開発されねばならず、また、配列特異的ヌクレオチド認識の構造基礎に関する更なる情報が必要とされている。最近のタンパク質工学の成果は配列および／または構造類似性に基づく設計戦略を利用するものである。こうした戦略はモチーフの移し変えにとって十分であるかもしれないが、もともと知られていない新規なヌクレオチド結合モチーフを作りだす能力を制限するものである。実際、類似性に基づく戦略を利用した亜鉛フィンガーの再設計はささやかな成功を収めたにすぎない（Desjarlais and Berg, Proteins, 12:101, 1992）。
その結果、特異的認識部位を有する追加の亜鉛フィンガーを設計するための新たな戦略、並びに遺伝子発現を増強または抑制するための新規な亜鉛フィンガーの必要性が存在している。本発明はこの必要性を満たすものである。
発明の概要
本発明は、細胞性ヌクレオチド配列に結合して該細胞性ヌクレオチド配列の機能をモジュレートする、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモジュールを含んでなる、単離された亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を提供する。この変異体はＤＮＡかＲＮＡのいずれかに結合して、プロモーターからのまたは構造遺伝子内部からの転写を増強または抑制する。細胞性ヌクレオチド配列は細胞中の天然に存在する配列であっても、細胞中のウイルス由来のヌクレオチド配列であってもよい。
別の態様において、本発明は、治療有効量の、細胞性ヌクレオチド配列に結合して該細胞性ヌクレオチド配列の機能をモジュレートする亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体、または治療有効量の、該亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体をコードするヌクレオチド配列を、製剤学上許容される担体とともに含有してなる医薬組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフを、該モチーフと結合する亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体と接触させることを含んでなる、亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフを含む細胞性ヌクレオチド配列を抑制する方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、第１の細胞性ヌクレオチド配列に結合して該ヌクレオチド配列の機能をモジュレートする亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド中のアミノ酸を同定し、同定されたアミノ酸のランダム化置換を含むポリペプチド変異体をコードする発現ライブラリーを作製し、該ライブラリーを適当な宿主細胞中で発現させ、そして第２の細胞性ヌクレオチド配列に結合して該第２のヌクレオチド配列の機能をモジュレートするポリペプチド変異体を産生するクローンを単離する、ことを含んでなる、細胞性ヌクレオチド配列に結合する単離された亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を得る方法を提供する。好ましくは、ポリペプチド変異体をコードする発現ライブラリーはファージディスプレーライブラリーである。
また、本発明は、亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフと結びついた遺伝子発現のモジュレーションと関連づけられる細胞増殖疾患の患者を治療する方法を提供し、この方法は、亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフを、有効量の、該亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフに結合して該遺伝子の活性をモジュレートする亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体と接触させることを含んでなる。
さらに、本発明は、第１の誘導プロモーターに機能的に連結された推定上のモジュレータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２の誘導プロモーターおよび亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフに機能的に連結されたリポーター遺伝子を含む成分を、該成分を相互作用させるのに十分な条件下でインキュベートし、そして該リポーター遺伝子の発現に及ぼす推定上のモジュレータータンパク質の効果を測定する、ことを含んでなる、細胞性ヌクレオチド配列の機能をモジュレートしかつ亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合モチーフに結合するタンパク質の同定方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、TFIIIAの亜鉛フィンガーと５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の内部プロモーターとの相互作用の模型を示す。
図２Ａは、TFIIIAの最初の３つのアミノ酸末端亜鉛フィンガーのアミノ酸配列を示す。
図２Ｂは、zf 1-3に関する最小結合部位の塩基配列を示している。
図３は、23bpの32Ｐ標識二本鎖オリゴヌクレオチドに対するzf 1-3の結合に関するゲル移動度シフトアッセイを示している。
図４は、zf 1-3がＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写をブロックすることを示すin vitro転写のオートラジオグラムを示している。
図５は、zf 1-3のその認識配列への結合が、その近くに位置するＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからの転写をブロックすることを示している。ゲル移動度シフトアッセイでzf 1-3が結合したＤＮＡ分子のパーセントのプロット（ｘ軸）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写の阻害％（ｙ軸）に対してプロットした。
図６は、zf 1-3が、アフリカツメガエルの未受精卵から得られたin vitro転写システムでの真核ＲＮＡポリメラーゼIIIの転写をブロックすることを示すオートラジオグラムである。
図７は、pComb 3.5にクローニングされたzif268の亜鉛フィンガーに関する塩基配列およびその推定アミノ酸配列を示す。
図８は、Zif268タンパク質のアミノ酸配列およびファージ選択のために用いられるヘアピンＤＮＡを示している。（Ａ）は各亜鉛フィンガーの保存された特徴部分を示す。（Ｂ）は9bp共通結合部位を有するヘアピンＤＮＡを示す。
図９は、フィンガー１、２および３の６つのランダム化された残基のリスト表である。
図１０は、IPTG誘導前のZif268変異体A14のSDS-PAGE（レーン２）、IPTG誘導後（レーン３）、封入体の除去後の細胞質フラクション（レーン４）、亜鉛フィンガーペプチドを含有する封入体（レーン５）および変異体Zif268（レーン６）をそれぞれ示している。レーン１は分子量スタンダード（ｋＤ）である。
図１１は、各タンパク質についてｋon（会合速度）、ｋoff（解離速度）、およびＫd（平衡解離定数）を示す表である。
図１２は、野生型Zif268タンパク質（ＷＴ）（□）とその変異体Ｃ７（○）の解離速度（ｋoff）を表面プラスモン共鳴のリアルタイムの変化によって示している。
図１３Ａと図１３Ｂは、Zif268-Junの塩基配列とアミノ酸配列（配列番号３３と３４）を示している。
図１４Ａと図１４Ｂは、Zif268-Fosの塩基配列とアミノ酸配列（配列番号３５と３６）を示している。
図１５は、Ｃ７亜鉛フィンガーの３つのフィンガー構築物の塩基配列とアミノ酸配列（配列番号４１と４２）を示している。
図１６Ａと図１６Ｂは、ＴＧＥＫＰリンカーにより連結させたZif268-Zif268の塩基配列とアミノ酸配列（配列番号４３と４４）を示している。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞のヌクレオチド配列に結合し、且つ細胞のヌクレオチド配列の機能をモジュレートする少なくとも二つの亜鉛フィンガー・モジュールを含む、単離された亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を提供する。このポリペプチド変異体は遺伝子の転写を増強または抑制することができ、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合できる。さらに、本発明は治療に効果的な量の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体、または亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体をコードする治療に効果的な量のヌクレオチド配列を含有する医薬組成物を提供し、ここで前記誘導体は細胞のヌクレオチド配列に結合して、薬学的に許容される担体と共同して細胞のヌクレオチド配列の機能をモジュレートする。本発明は、細胞またはウイルスのヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を得るためのスクリーニング方法も提供する。
亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド「変異体」は、亜鉛フィンガータンパク質の変異形または組換えにより作られた変異形であるポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、あるタンパク質の亜鉛フィンガードメインを第二タンパク質の亜鉛フィンガードメインに結合させて有するハイブリッドでもよい。このドメインは野生型でも、変異を受けたものでもよい。「誘導体」には野生型亜鉛フィンガータンパク質の末端切断型を包含し、これは元々の野生型タンパク質よりも少ない数のフィンガーを有する。誘導体は変異亜鉛フィンガーポリペプチドも包含する。誘導体または変異体を作ることのできる元となる亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドには、TFIIIAとzif268が挙げられる。
ここで用いられる「亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフ」とは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合誘導体ポリペプチドが特異性をもって結合するヌクレオチドセグメントの二次元または三次元的な特徴部分を意味する。この定義に含まれものとして、一般的には５個以下のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列、ならびにＤＮＡ二重らせんの三次元的な特徴（例えば大きいまたは小さい溝、らせんの外見等）が挙げられる。このモチーフは典型的には亜鉛フィンガーポリペプチドが結合することができるのであれば適当な長さのいかなる配列でもよい。例えば、３フィンガーポリペプチドは典型的には約９〜約１４塩基対を有するモチーフと結合する。したがって、本発明はいずれの特異性をも持つ亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドを提供し、亜鉛フィンガー結合モチーフは実験により設計されたか、または亜鉛フィンガータンパク質が結合するいかなる配列でもよい。このモチーフは、調節配列、エキソン、イントロンまたは非コード配列等のどのＤＮＡやＲＮＡ配列にも発見することができる。
本発明の実施にあたって、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合変異体ポリペプチドを得るために亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフが公知である必要はない。亜鉛フィンガータンパク質はこれまで真核生物のみに同定されてきたが、本発明の範囲内で具体的に意図されていることは、亜鉛フィンガーのよく知られている構造特徴を保存しているが、生産方法ならびにアミノ酸配列および三次元構造が天然に見られる亜鉛フィンガータンパク質とは異なる本発明の遺伝子的に修飾された単離構築物の、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフに対する結合によって、該モチーフが非真核生物ＤＮＡまたはＲＮＡ中、特に細菌およびウイルスの自然のままのプロモーター中で同定できるということである。
公知の野生型の亜鉛フィンガータンパク質の特徴的な構造は、２から３７までものモジュラー縦列繰り返しから作られており、各繰り返しが一対の保存されたシステインと一対の保存されたヒスチジンによる四面体配位で亜鉛原子を保持している「フィンガー」を形成している。通常、モジュールがその形を保持するのに役立つ疎水性の核を形成するように相互作用を行なう保存された疎水性アミノ酸も各フィンガーは有している。
本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体は、細胞性ヌクレオチド配列に結合し、且つ細胞性ヌクレオチド配列の機能をモジュールする少なくとも二つの亜鉛フィンガーモジュールを含む。「細胞のヌクレオチド配列」との用語は細胞内に存在するヌクレオチド配列を意味する。この配列は細胞の天然の配列である必要はない。例えば、宿主細胞のＤＮＡ内に組み込まれたレトロウイルスゲノムを「細胞性ヌクレオチド配列」とみなしてもよい。細胞性ヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、イントロンとエキソンの両方を包含する。細胞および／または細胞性ヌクレオチド配列は原核でも真核でもよく、例えば、酵母、ウイルスまたは植物ヌクレオチド配列である。
「モジュレートする」との用語は、機能の抑制、増強または誘導を意味する。例えば、本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体は、プロモーター内のあるモチーフに結合してプロモーター配列を調節することにより、プロモーターの細胞性ヌクレオチド配列に機能可能なように連結させた遺伝子の転写を増強または抑制することができる。もしくは、モジュレーションは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体が構造遺伝子と結合し、そしてＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子読取りをブロックすることによって遺伝子の転写を阻害する遺伝子の転写の阻害も包含してもよい。この構造遺伝子は、例えば通常の細胞遺伝子またはオンコジーンであってもよい。
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子に対して５’に置かれている調節要素を包含する。遺伝子が活性化される場合、転写因子として知られているタンパク質が遺伝子のプロモーター領域と結合する。このアセンブリーは、酵素に第２遺伝子セグメントをＤＮＡからＲＮＡへと転写させる点で「オンスイッチ」と類似している。多くの場合、できたＲＮＡ分子は特定のタンパク質の合成の鋳型として働き、しばしばＲＮＡそれ自体が最終産物である。
このプロモーター領域は通常の細胞プロモーター、または例えばオンコプロモーターでよい。オンコプロモーターは通常はウイルス由来のプロモーターである。例えば、レトロウイルスの長鎖末端繰り返し（ＬＴＲ）は本発明の亜鉛フィンガー結合ポリペプチド変異体の標的ともなりうるプロモーター領域である。ヒトＴ細胞リンパ球性ウイルス（ＨＴＬＶ）１および２、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２等の病原体を包含するLentivirusグループのメンバーからのプロモーターは、本発明の亜鉛フィンガー結合ポリペプチドによる転写調節の標的とし得るウイルスプロモーター領域の例である。
本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体または変異体は、細胞のヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方に結合するポリペプチドを包含する。ＤＮＡに結合する亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド、および具体的には、ＤＮＡに結合する亜鉛フィンガードメインは、二つの亜鉛フィンガー・ドメイン間の「リンカー」領域の検査により容易に同定することができる。リンカーアミノ酸配列ＴＧＥＫ（Ｐ）（配列番号３２）は、ＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガー・ドメインを典型的に示すものである。したがって、特別な亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドが好適にはＤＮＡに結合するのか、またはＲＮＡに結合するのかを、リンカーアミノ酸の検査によって決めることができる。
一つの実施態様において、本発明の方法は、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフを、該モチーフに結合する有効な量の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体と接触させることを特徴とする、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフを有する細胞性ヌクレオチド配列の機能を阻害または抑制する方法を包含する。細胞のヌクレオチド配列がプロモーターである場合、本方法は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含有するプロモーターの転写トランス活性化を阻害することを包含する。「阻害する」との用語は、例えば亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフを含有するプロモーターに機能可能なように連結させた構造遺伝子の転写の活性化レベルの抑制を意味する。さらに、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は構造遺伝子内またはＲＮＡ配列内のモチーフに結合してもよい。
「有効な量」との用語は、前もって活性化されたプロモーターの不活性化をもたらす量か、または亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフを有するプロモーターの失活を起こす量、または構造遺伝子の転写若しくはＲＮＡの翻訳をブロックする量を包含する。必要とされる亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、存在しているタンパク質／プロモーター複合体中の天然のままの亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質を置き換えるのに必要な量、またはプロモーター自体との複合物を形成する天然のままの亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質と競合するために必要な量である。同様に、構造遺伝子またはＲＮＡをブロックするために必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合して該ポリメラーゼの遺伝子読取りをブロックする量、または翻訳を阻害する量である。好ましくは、本方法は細胞内で実施される。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に失活化することにより、転写または翻訳が抑制される。亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含有する細胞性ヌクレオチド配列に対して結合または「接触する」有効な量の阻害タンパク質の輸送は、ここに記載されている機構の１つ、例えばレトロウイルスベクター若しくはリポソーム、または本分野でよく知られている他の方法により行なうことができる。
亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、末端の切断または拡張により野生型の亜鉛フィンガータンパク質から、または部位特異的変異誘発によるか、またはそれらの方法の組合せにより野生型由来のポリペプチドの変異体として導かれるか、または作られる。
「末端切断型」との用語は、天然のままの亜鉛フィンガー結合タンパク質中に見られる完全な数の亜鉛フィンガーよりも少ない数の亜鉛フィンガーを含有するか、または所望とされない配列を欠失させた亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を意味している。例えば、通常は９個の亜鉛フィンガーを含有する亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質TFIIIAの末端切断型は、１〜３個の亜鉛フィンガーのみを有するポリペプチドであってよい。拡張とは、付加的な亜鉛フィンガーモジュールが付加された亜鉛フィンガーポリペプチドを意味する。例えば、TFIIIAは３つの亜鉛フィンガードメインを加えることによって１２個のフィンガーまで伸ばしてもよい。さらに、末端切断型亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドは、１つ以上の野生型ポリペプチドからなる亜鉛フィンガーモジュールを有する結果として、「ハイブリッド」亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドとしてもよい。
「突然変異した」との用語は、タンパク質をコードするＤＮＡのランダムまたは部位特異的突然変異誘発を行なうための公知の方法のいずれかを用いることにより得られた亜鉛フィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、TFIIIAにおいて、突然変異を行なって、共通配列の１つ以上の繰り返しの中の非保存残基を置き換えことができる。末端切断型亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質も突然変異させることができる。
亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフを有する細胞性配列の機能を阻害するために、本発明にしたがって末端を切断し、拡張し、および／または突然変異させることのできる公知の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質の例にはTFIIIAとzif268がある。他の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質は当業者に公知であろう。
本発明は、治療上有効な量の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体、または亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体をコードする治療上有効な量のヌクレオチド配列を含み、ここで前記誘導体は細胞性ヌクレオチド配列に結合して、製剤学上許容される担体と共同して細胞性ヌクレオチド配列の機能をモジュレートする。ここに記載される１種類以上の異なる亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合誘導体を含有する医薬組成物は、本発明の治療方法に有用である。
ここに用いられる「製剤学上許容される」、「生理学的に耐えられる」との用語、並びにそれらが組成物、担体、希釈剤および試薬を意味するそれらの文法的に形を変えた用語は、相互交換できるように用いられており、それらの材料は組成物の投与を禁じる程度までの所望とされない生理学的効果、例えば吐き気、めまい、胃の不調等を生じさせることなくヒトに投与することのできる材料を示している。
有効成分を溶解または分散させた医薬組成物の調製は本分野ではよく理解されている。典型的には、そのような組成物は水性、非水性の液体溶液または懸濁液のいずれかとして無菌注射可能薬物として調製されるが、しかし、使用前に液体の形とする、溶液に適する固体形または懸濁液を調製してもよい。この調製物は乳状にすることもできる。
有効成分は、製剤学上許容され且つ該有効成分と相溶性のある賦形剤と、ここで記載の治療方法で使用するために適する量で混合してもよい。適当な賦形剤とは、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびそれらの混合物である。さらに、所望であれば、組成物は湿潤剤または乳化剤等の小量の補助剤ならびに該有効成分の有効性を高めるｐＨ緩衝剤等を含有することができる。
本発明の治療医薬組成物は、ここでの成分の製剤学上許容される塩を含有することができる。製剤学上許容される塩としては、例えば、塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成された酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基を用いて形成されたもの）が挙げられる。遊離のカルボキシル基を用いて形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から得ることもできる。
生理学的に耐え得る担体は本分野でよく知られている。液体担体の典型的なものは、有効成分と水以外に他の物質を含まないか、または緩衝液（生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム等）、生理学的食塩水（リン酸緩衝溶液等）またはその両方を含有している無菌水溶液である。さらに、水性担体は１種類以上の緩衝塩、ならびに塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有することができる。
液体組成物は、水を加えたか、または水を排除した液相を含有してもよい。そうした付加的な液相の典型的なものは、グリセリン、植物油、例えば綿実油、有機エステル、有機エステル、例えばオレイン酸エチル、および水と油のエマルジョンである。
本発明は、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を包含する。天然のままのポリペプチド、末端切断型ポリペプチド、および拡張ポリペプチド等の本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列は、幾つかの方法により得ることができる。例えば、該ＤＮＡを本分野でよく知られているハイブリダイゼーション方法を用いて単離することができる。これら方法には、（１）共有するヌクレオチド配列を検出するためのゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、（２）共有する構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成があるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡ配列は本分野で公知の方法により得ることができる（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., 1989を参照されたい）。
本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードする特定のＤＮＡ配列の開発は、（１）染色体ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、（２）興味の対象であるポリペプチドに必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的製造、および（３）真核ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡのin vitro合成により得ることができる。後者の場合、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補物が最終的に形成され、これは通常はｃＤＮＡと呼ばれる。組換え方法で使用される特定のＤＮＡ配列を開発するためのこれらの３つの方法の中で、遺伝子ＤＮＡの単離が最もポピュラーではない。これはイントロンの存在のために、微生物による哺乳類のポリペプチドの発現を得ることが望まれる場合には特に当てはまる。
亜鉛フィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチドを得るために、ＤＮＡ配列の合成は、所望とされるポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が知られている場合によく選択される方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が知られていない場合、ＤＮＡ配列の直接の合成は不可能で、選択される方法はｃＤＮＡ配列の形成である。興味の対象であるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法の中には、高いレベルの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から得られた、プラスミドを有するｃＤＮＡライブラリーの形成がある。
ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いられる場合、まれな発現産物でさえクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合では、標的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列の複製である標識化一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の生産は、変性させて一本鎖の形としたｃＤＮＡのクローン化されたコピーに対して行なわれるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法で実施してもよい（Jay, et al., Nucleic Acid Research, 11:2325, 1983）。
ハイブリダイゼーション法は、標識化され混合した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより組換え体クローンをスクリーニングするために有用であり、ここで各プローブは、変性二本鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含有するハイブリダイゼーション試料中において、潜在的に特定のＤＮＡ配列の完全な相補物である。そのようなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖または変性二本鎖ＤＮＡのいずれかに対して実施される。興味の対象であるポリペプチドに関してｍＲＮＡ配列の量が非常に少ない場合、ハイブリダイゼーションはソースに由来するｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。非特異的な結合を避けるための厳密なハイブリダイゼーション条件を用いて、例えば、標的ＤＮＡをその完全な相補物である単一プローブと混合物中でハイブリダイズさせることにより、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーにより目で確認することができる（Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 1981; Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, 1982）。
適当なプローブが利用できる場合は、核酸ハイブリダイゼーションに頼るスクリーニング法によって、いかなる微生物からのいかなる遺伝子配列も単離することができる。問題のタンパク質をコードする配列の一部分に対応するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成ができる。このためには、アミノ酸配列中の短いオリゴペプチド程度の配列が知られていなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列はその遺伝暗号から推定できるが、暗号の縮重を考慮に入れなければならない。配列が縮重している場合に、混合付加反応を実施することができる。これには変性二本鎖ＤＮＡの不均一な混合物をともなう。そのようなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性した二本鎖ＤＮＡのいずれかに対して実施される。
本発明のＤＮＡ配列は亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質の実質的にすべてまたはその一部をコードしているために、ＤＮＡからの末端切断型ポリペプチド断片をこのＤＮＡ配列または対応するＤＮＡ配列から調製、サブクローニングし、および発現することは現在ではルーチン的なことである。あるいは、本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドを定めている、ここに記載のＤＮＡ断片を利用することにより、全亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、公知の技術と組み合わせて決定することができる。そのような技術は文献の援用としてここで挙げる米国第4,394,443号と米国第4,446,235号に記載されている。
ラムダｇｔ１１等のｃＤＮＡ発現ライブラリーから、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質、または少なくとも一つのエピトープを有する亜鉛フィンガー由来のポリペプチドを、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質に特異的な抗体を用いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体は、ポリクロナールまたはモノクローナルで得られたいずれでもよく、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するために用いることができる。あるいは、得られたポリペプチドのＤＮＡ標的物への結合を、標的部位へ取り込まれた放射標識したＤＮＡおよび非結合標的部位と比較した場合の電気泳動度の遅延試験により検定することができる。
末端切断型および／または突然変異した亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドの同定に用いられる好適なベクターは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、（１）原核分泌シグナルドメイン、（２）非相同ポリペプチドおよび（３）繊維状ファージ膜アンカードメインを有する融合ポリペプチドをコードし且つ発現できるヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子である。このベクターには、融合ポリペプチドを発現するためのＤＮＡ発現調節配列、好ましくは原核調節配列を包含する。
繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと会合することのできるcpIIIまたはcpVIIIコートタンパク質のドメインであることにより、ファージ表面に融合タンパク質を取り込ませる。
分泌シグナルは、タンパク質の標的をグラム陰性細菌の周縁膜とさせるタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはpelB分泌シグナルである。Erwinia carotovaからの二つのpelB遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの予想されるアミノ酸残基配列は、Leiらにより記載されている（Nature, 331:543-546, 1988）
pelBタンパク質のリーダー配列は、融合タンパク質のために分泌シグナルとして既に用いられている（Better, et al, Science, 240:1041-1043, 1988; Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:5728-5732, 1989;およびMullinax, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8095-8099, 1990）。本発明で有用な大腸菌からの他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列は、Oliver（In Neidhard, F.C.（ed.）Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69（1987））に見ることができる。
ベクターのために好ましい膜アンカーは繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄおよび同等の繊維状ファージから得ることができる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子IIIと遺伝子VIIIによりコードされたコートタンパク質中に見られる。繊維状ファージコートタンパク質の膜アンカードメインは、コートタンパク質のカルボキシ末端領域の一部分であり、脂質二層膜を貫いている疎水性アミノ酸残基部分と、膜の細胞質表面に通常見られ且つ膜から伸びている荷電アミノ酸残基部分とを含む。ファージｆ１において、遺伝子VIIIコートタンパク質の膜を貫いている領域はTrp-26からLys-40までの残基を含有し、細胞質領域は41位から52位までのカルボキシ末端の11残基を含有する（Ohkawa, et al., J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1981）。よって、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基の配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子VIIIコートタンパク質（cpVIIIまたはCP8とも称される）に由来するものである。遺伝子VIIIコートタンパク質は、コートタンパク質の典型的には約2500〜3000コピーを有するファージ粒子の大部分の成熟繊維状ファージ上に存在している。
さらに、もう一つの好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基の配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子IIIコートタンパク質（cpIIIとも称される）から得られる。遺伝子IIIコートタンパク質は、コートタンパク質の典型的には約４〜６コピーを有する、成熟繊維状ファージ上のファージ粒子の一末端に存在している。繊維状ファージ粒子の構造、それらのコートタンパク質および粒子アセンブリーの詳細な説明に関しては、Rachedら（Microbiol. Rev.,50:401-427 1986; およびModel, et al., in "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar, ed. Plenum Publishing Co., pp. 375-456, 1988）を参照されたい。
ＤＮＡ発現調節配列は、構造遺伝子産物を発現するための一組のＤＮＡ発現シグナルを含み、よく知られているように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できるようにシストロンに機能可能なように連結させた５’要素と３’要素の両者を有している。５’調節配列は、転写を開始させるためのプロモーター、および上流の翻訳可能なＤＮＡ配列の５’末端に機能可能なように連結させたリボソーム結合部位を定めている。
大腸菌での高レベルの遺伝子発現を達成するためには、大量のｍＲＮＡを生じさせるための強力なプロモーターのみならず、ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを確実とするリボソーム結合部位をも利用することが必要である。大腸菌において、リボソーム結合部位は開始コドン（ＡＵＧ）およびこの開始コドンから３〜１１ヌクレオチドだけ上流に置かれた３〜９ヌクレオチド長の配列を有している（Shine, et al., Nature,254:34, 1975）。Shine-Dalgarno（SD）配列と呼ばれるAGGAGGU配列は大腸菌１６ＳｒＲＮＡの３’末端に相補的である。ｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡの３’末端の配列に対するリボソームの結合は以下のいくつかのファクターにより影響を受け得る。
（i）ＳＤ配列と１６ＳｒＲＮＡの３’末端との間の相補性の程度。
（ii）ＳＤ配列とＡＵＧとの間隔および恐らくその間にあるＲＮＡ（Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760, 1979a; Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5596, 1979b; Guarente, et al., Science, 209: 1428, 1980; およびGuarente, et al., Cell, 20:543, 1980）。この間隔を系統的に変えているプラスミド中の遺伝子発現レベルの測定により最適化を行なう。異なるｍＲＮＡの比較は、−２０位から＋１３位（ＡＵＧのＡが０位を示す）までに統計学的に好ましい配列が存在していることを示している（Gold, et al., Annu. Rev. Microbiol.,35:365, 1981）。リーダー配列は翻訳に劇的な影響を与えることが示されている（上記のRoberts, et al., 1979a, b）。
（iii）ＡＵＧに続く、リボソーム結合に影響を与えるヌクレオチド配列（Taniguchi, et al., J. Mol. Biol., 118:533, 1978）。
３’調節配列は、不均一な融合ポリペプチドと同じフレーム内で且つ該ポリペプチドに機能可能なように連結させた少なくとも一つの終止コドンを定めている。
好ましい実施態様において、利用されるベクターは原核生物の複製開始点またはレプリコン、すなわち自己複製を指示する能力と、組換えＤＮＡ分子により形質転換された微生物宿主細胞等の原核宿主細胞中に該組換えＤＮＡ分子を染色体外遺伝子として保持することを指示する能力とを有するＤＮＡ配列を包含する。そのような複製開始点は本分野ではよく知られている。好ましい複製開始点とは宿主微生物中で効果的なものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸菌でのベクターの利用のために好ましい複製開始点は、プラスミドpBR322およびその他の多様な慣用のプラスミド中に見られるColE1である。また、pACYCとその誘導体上に見られるp15A複製開始点も望ましい。ColE1レプリコンとp15Aレプリコンは分子生物学で広く利用されており、多様なプラスミド上に利用可能であり、少なくともSambrookら（Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）により記載されている。
ColE1レプリコンとp15Aレプリコンは、それぞれが大腸菌でプラスミドの複製を指示する能力を有しながらも、その他のレプリコンは同じ大腸菌細胞中の第二プラスミドに存在しているため、本発明での利用に特に好ましい。言い換えると、ColE1とp15Aは、二つのプラスミドを同じ宿主に維持させることのできる非干渉性のレプリコンである（例えば、上記のSambrookらの1.3〜1.4ページを参照されたい）。
さらに、原核生物のレプリコンを包含する実施態様は、それで形質転換された宿主微生物に薬剤耐性等の選択的利点を付与する発現を持つ遺伝子をも包含する。典型的な微生物薬剤耐性遺伝子は、アンピリシン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターは、典型的には翻訳可能なＤＮＡ配列を挿入するための便利な制限部位も有している。典型的なベクターにはBioRad Laboratories（カリフォルニア州Richmond）から入手できるプラスミドpUC8、pUC9、pBR322およびpBR329並びにPharmacia（ニュージャージー州Piscataway）から入手できるpPLとpKK223、それにpBS（カリフォルニア州La Jolla所在のStratagene）がある。
ベクターは、上流と下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を、方向性のある連結に適合させたヌクレオチド配列を経てインサートＤＮＡに機能可能なように連結させた第一カセットを含む。上流の翻訳可能な配列はここに記載されている分泌シグナルをコードする。下流の翻訳可能な配列はここに記載されている繊維状ファージ膜アンカーをコードする。このカセットは、好ましくは、翻訳可能なＤＮＡ挿入物（インサートＤＮＡ）が、方向性のある連結に適合させたヌクレオチドの配列を経てカセット中に方向性をもって挿入される場合に作られる亜鉛フィンガー由来のポリペプチドを発現するためのＤＮＡ発現調節配列を含む。繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと結合することのできるcpIIIまたはcpVIIIコートタンパク質のドメインであることによって、融合ポリペプチドをファージ粒子表面に取り込む。
亜鉛フィンガー由来のポリペプチド発現ベクターは、第二レセプターポリペプチドを発現するための第二カセットも含有する。第二カセットは、分泌シグナルをコードする第二の翻訳可能なＤＮＡ配列の３’末端を、方向性のある連結に適合させたヌクレオチドの配列を経て、カセットのリーディングフレーム中で典型的には少なくとも一つの終止コドンを定めるベクターの下流ＤＮＡ配列に、ここで記載されているように機能可能に連結させてなるものである。第二の翻訳可能なＤＮＡ配列の５’末端には、５’要素を形成するＤＮＡ発現調節配列を機能可能なように連結させている。第二のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）の挿入の際に、分泌シグナルのレセプターと該インサートＤＮＡによりコードされたポリペプチドとを含む第二融合ポリペプチドを発現することができる。本発明の目的のために、第二カセット配列は欠失させた。
ここで用いられている「ベクター」との用語は核酸分子を意味し、ベクターが機能可能なように連結している別の核酸を、異なる遺伝子環境間に運ぶことができる。好ましいベクターは、ベクターをＤＮＡセグメントに機能可能なように連結させた場合に、該ＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自己複製と発現を可能とベクターである。したがって、ベクターは前に記載のレプリコンおよび選択マーカーを有している。
ＤＮＡ配列またはセグメントに関してここに用いられている「機能可能なように連結させた」との語句は、該配列またはセグメントが、好ましくは慣用のホスホジエステル結合によって、ＤＮＡ鎖中に一本鎖の形であるか二本鎖の形であるかにかかわらず共有結合させられたことを意味している。本発明の転写ユニットまたはカセットに機能可能なように連結させたベクターの選択は、本分野ではよく知られているように、所望とされる機能的性質（例えばベクター複製とタンパク質発現）および形質転換を受ける宿主細胞に直接に依存し、これらが組換えＤＮＡ分子を構築する際の技術に内在する制限となる。
方向性のある連結に適合させたヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーは、ＤＮＡ発現ベクターの一領域であり、この領域は（１）上流と下流の翻訳可能なＤＮＡ配列の複製と輸送のために機能可能なように連結し、そして（２）ベクター中にＤＮＡ配列を方向性をもって連結するための部位または手段を提供する。典型的には、方向性のあるポリリンカーは、２種類以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（すなわち制限部位）を定めるヌクレオチド配列である。制限切断の際に、二つの部位が、翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結させることのできる粘着末端を生む。好ましくは、この二つの制限部位が制限切断の際に非相補性の粘着末端であることによって、翻訳可能なＤＮＡ配列を、カセット中へ方向性をもって挿入することができる。一つの実施態様において、方向性のある連結手段は、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列、またはその両方に存在するヌクレオチドにより提供される。もう一つの実施態様において、方向性のある連結に適合させたヌクレオチドの配列は、方向性のある複数のクローニング手段を定めるヌクレオチドの配列を含む。方向性のある結合に適合させたヌクレオチドの配列が数多くの制限部位を定めている場合、それは多クローニング部位と呼ばれている。
好ましい実施態様において、ＤＮＡ発現ベクターは、便利な操作のために、本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするＤＮＡをカプセル化する繊維状ファージ粒子の形で設計される。この実施態様において、ＤＮＡ発現ベクターが、繊維状ファージの複製開始部位を定めるヌクレオチド配列をさらに有することで、ベクターは、適当な遺伝子の相補性の表現の際に一本鎖の複製の形の繊維状ファージとして複製することができ、繊維状ファージ粒子中へのパッケージングができる。この特徴は、ＤＮＡ発現ベクターにファージ粒子中へパッケージングできる能力を提供するものであり、その後、本分野でよく知られているスクリーニング技術を用いて、該粒子およびそれに含まれるベクターをファージ粒子群からなる他の粒子から分離させることができる。
繊維状ファージの複製開始点は、よく知られているように、複製開始部位、複製停止部位、および複製により作られた複製形のパッケージング部位を定めるファージゲノム領域である（例えば、Rasched, et al., Microbial. Rev., 50:401-427, 1986; およびHoriuchi, J. Mol. Biol.,188:215-223, 1986を参照されたい）。
本発明に用いられる好ましい繊維状ファージの複製開始点はＭ１３、ｆ１またはｆｄファージの複製開始点である（Short, et al.（Nucl. Acids Res., 16:7583-7600, 1988））。好ましいＤＮＡ発現ベクターは発現ベクターの修飾pCOMB3、具体的にはpCOMB3.5である。
亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の生産は、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする染色体ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであるオリゴヌクレオチドを用いて行なうことができる。これらの特有のオリゴヌクレオチドプライマーは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと近接するフランキング領域の同定に基づいて作ることができる。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするフランキング・ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることのできる配列、およびそれと相補的な配列を含み、増幅生成物に点突然変異を導入するために用いることができる。
本発明のプライマーは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のかなりの数の核酸上で重合の特定の開始を提供する十分な長さと適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。具体的には、ここで用いられる「プライマー」という用語は、２種類以上、好ましくは３種類以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる配列を意味し、該配列はプライマー伸長生成物の合成を開始することが可能で、且つ亜鉛フィンガー結合タンパク質の核酸鎖に実質的に相補的であるが、選択された残基部位で増幅生成物に変異を導入することもできる配列である。合成の助けとなる実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸、並びに重合および伸長用の試剤（ＤＮＡポリメラーゼ等）並びに適当な緩衝液、温度およびｐＨがある。プライマーは増幅の最大効率には一本鎖が好ましいが、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物を作るために用いられる前に、最初に処理して二つの核酸鎖に分ける。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ヌクレオチドの重合と伸長のための誘発性試剤の存在下で伸長生成物を開始させるのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液およびヌクレオチド組成物等の多くのファクターに依存するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５〜２２またはそれ以上のヌクレオチドを有するが、それよりも少ないヌクレオチドを有してもよい。あるいは、本分野でよく知られているように、ヌクレオシド三リン酸の混合を偏らせて変異の形成に影響を与えることで、推定亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡライブラリーを得て、このライブラリーを、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフ（例えばプロモーター中のモチーフでその結合が転写活性化を阻害するもの）への結合に関する機能性アッセイでのスクリーニングにかけることができる。
本発明のプライマーは、増幅される亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードするポリペプチドの各鎖のセグメントに「実質的に」相補的であるように設計されている。これは、プライマーが、重合用試薬およびヌクレオチド延長を行なわせる条件下でそれらの各鎖とハイブリダイズするように十分に相補的でなければならないことを意味する。言い換えると、プライマーは、ハイブリダイズしようとするフランキング配列と十分に相補的でなければならず、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの増幅を可能とするものでなければならない。これらプライマーは、フランキング配列の核酸鎖と正確な相補性を有していることが好ましい。
亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実際に行なった反応ステップ数に対して指数関数的な量で作る酵素連鎖反応である増幅プロセスに、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。典型的には、一つのプライマーは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの負（−）鎖に相補的であり、もう一つのものは陽（＋）鎖に相補的である。変性核酸にプライマーをアニーリングした後、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片（クレノウ）等の酵素とヌクレオチドとを用いる伸長を行なって、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質のポリヌクレオチド配列を有する新しく合成された（＋）鎖と（−）鎖が得られる。これらの新しく合成された配列も鋳型であるので、変性の繰り返しサイクル、プライマーのアニーリング、および伸長の結果、プライマーにより定められた配列（すなわち、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質のポリヌクレオチド配列）の指数関数的な生産が得られる。この連鎖反応の生成物は、使用された特定のプライマーの末端に相応する末端を有する分離核酸二重型である。当業者は、標的核酸のコピー数を上げるために利用することもできる他の増幅方法についても知っているであろう。これら方法には、例えば、連結活性化転写（ＬＡＴ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換活性化（ＳＤＡ）があるが、ＰＣＲが好ましい方法である。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、適当な方法、例えば慣用のホスホトリエステル法およびホスホジエステル法またはそれらの自動化された態様を用いて調製してもよい。一つのそうした自動化された態様において、ジエチルホスホロアミダイトを出発材料として用い、Beaucageら（Tetrahedron Letters,22:1859-1862, 1981）による記載のように合成してもよい。修飾された固体支持体を用いてオリゴヌクレオチドを合成する一つの方法が米国特許第4,458,066号に記載されている。本発明にしたがって用いることのできる増幅の一つの方法は、米国特許第4,683,202号および同第4,683,195号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
ペプチド配列の変異を得るための繊維状ファージライブラリーを利用する方法は、ここで文献の援用として挙げるLadnerらの米国特許第5,223,409号に開示されている。
本発明の一つの実施態様において、ランダム化されたヌクレオチド置換を、公知の亜鉛フィンガータンパク質の１個以上のフィンガーをコードするＤＮＡに対して行なうことで、転写調節要素等の遺伝子を有するＤＮＡ上の部位への結合の際に遺伝子発現を修飾する誘導ポリペプチドを得ることができる。亜鉛フィンガーを構成するアミノ酸への修飾に加えて、亜鉛フィンガー由来のポリペプチドは、それが得られた元の野生型タンパク質中に含まれる全部のフィンガーの数よりも多いまたは少ない数でフィンガーを含有していてもよい。
部位特異的突然変異誘発のどの方法も変異を行なうために用いることができるが、修飾しようとする亜鉛フィンガータンパク質のセグメントをランダム化するために用いられる方法は、式ＮＮＳまたはＮＮＫ（およびその相補ＮＮＭ）（ここで、ＳはＧまたはＣのいずれかであり、ＫはＧまたはＴのいずれかであり、ＭはＣまたはＡのいずれかであり（ＮＮＫの相補物の場合）、およびＮはＡ、Ｃ、ＧまだはＴであることができる）で示される複数のトリプレットコドンを有する縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールを利用するのが好ましい。縮重トリプレットコドンに加えて、縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、野生型亜鉛フィンガータンパク質をコードするＤＮＡと少なくとも一端でハイブリダイズするように設計された少なくとも一つのセグメントも有し、そしてこれらプライマーは、オーバーラップ伸長ＰＣＲとして本分野で知られているＰＣＲ増幅の連続的な繰り返しに用られ、プライマープール中のプライマーの非縮重領域で囲まれた特定された縮重領域を作る。
ｃＤＮＡの特定領域をランダム化するように用いられるオーバーラップＰＣＲの方法は本分野ではよく知られており、以下の実施例３でさらに具体的に説明する。オーバーラップＰＣＲ反応の縮重生成物を集めて、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によるゲル精製を行なった後、表面表示ファージ発現ベクターに連結してライブラリーを作り、その後これを公知または推定の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合モチーフに対するスクリーニングを行なう。
縮重プライマーを、本分野でオーバーラップ伸長ＰＣＲとして知られているＰＣＲ増幅の連続的な繰り返しに用いて、推定亜鉛フィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列のライブラリーを作る。通常、得られるポリペプチドはフィンガー領域に対応する縮重領域を有しており、該領域は、フィンガーの三次元構造を維持するのに必要なフィンガーの保存領域に対応する非縮重領域により囲まれたＤＮＡ（通常はフィンガーの先またはαらせん領域中に存在する）に結合する。
精製または未精製の形のいかなる核酸試料も、それが本発明の亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質の特定の核酸配列を含有するか、または含有すると思われる場合に、上記方法の出発核酸として用いることができる。よって、本プロセスは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を用いることができ、ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。ＲＮＡが鋳型として用いられる場合、酵素、および／またはＤＮＡに対する鋳型を逆転写するための最適な条件が利用されるであろう。さらに、各々の鎖を有するＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドを利用してもよい。核酸の混合物も用いてもよく、または、同じか異なるプライマーを用いて前の増幅反応で作られた核酸を利用してもよい。増幅しようとする特定の核酸、すなわち亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質配列は、それよりも大きい分子の一部でもよいし、または最初に分離した分子として存在させて、その特定の配列で全核酸を構成してもよい。増幅しようとする配列は最初に純粋な形で存在させることは必要でなく、例えば全ヒトＤＮＡ中またはどの生物のＤＮＡ中にも含まれているような複合混合物中のわずかな一部でもよい。例えば、ＤＮＡ源として、原核生物、真核生物、ウイルスおよび植物が挙げられる。
試料の標的核酸配列が二本の核酸鎖を有している場合、それを鋳型として用いることができるようにするには核酸の鎖を分けることが必要である。核酸鎖の分離は別個のステップとして行なってもよいし、またはプライマー伸長生成物の合成と同時に行なってもよい。この鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的な方法などの多様な適当な変性条件を用いて達成することができ、ここで「変性」という言葉はすべてのそのような手段を包含する。核酸の鎖を分離する一つの物理学的な方法は、核酸が変性するまで加熱を行なうことである。典型的な熱変性は、約１分間から１０分間までの時間にわたって約８０℃から１０５℃までの範囲の温度をともなうであろう。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られているクラスの酵素から誘導してもよく、ヘリカーゼ活性を有し、且つリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られているRecA酵素により誘導してもよい。ヘリカーゼによる核酸の鎖分離に適する反応条件はKuhn Hoffmann-Berlingにより記載されており（CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978）、またRecAを用いる技術はC. Raddingによる概説がある（Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982）。
増幅しようとする配列を有する核酸が一本鎖である場合、その相補物は１または２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを添加することにより合成される。一本鎖のプライマーが利用される場合、プライマー伸長生成物は、プライマー、重合用試薬、および以下に記載の４種類のヌクレオシド三リン酸の存在下で合成される。生成物は前記一本鎖核酸に部分的に相補的であり、且つ一本鎖核酸とハイブリダイズして、長さが等しくない鎖の二重型を形成し、次にこれを分けて一本鎖とすることで二本の単一の分離された相補的な鎖を作る。別法では、２種類のプライマーを一本鎖核酸に添加して、反応を上記のように実施してもよい。
核酸の相補鎖が分かれている場合、その核酸が元は二本鎖であったか一本鎖であったかにかかわらず、その分かれた鎖はそのまますぐにさらに別の核酸鎖を合成するための鋳型として用いることができる。この合成は、鋳型に対してプライマーのハイブリダイゼーションを起こさせる条件下で行なわれる。通常、合成は緩衝水溶液中で、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは約８で起こる。好ましくは、モル過剰量（染色体核酸の場合、プライマー：鋳型は通常約１０8：１）の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを、分けられている鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。しかし、相補鎖の量は、本発明の方法が診断応用に用いられている場合では分かっていないこともあるので、相補鎖の量に対するプライマーの量は確実に決定することはできないことを理解されたい。しかし、実用的には、増幅しようとする配列が複合長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる場合は、添加されるプライマーの量は、通常は相補鎖（鋳型）の量を超えるモル過剰量とする。モル大過剰量が方法の効率を向上させるために望ましい。
デオキシリボヌクレオチド三リン酸のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰをプライマーとは別にまたは一緒に十分な量で合成混合物に添加し、得られた溶液を、約９０〜１００℃に約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱後、溶液をプライマーハイブリダイゼーションに好ましい温度まで冷却する。この冷却混合物にプライマー伸長反応を行なうのに適当な試薬（ここでは「重合用試薬」と呼ぶ）を添加して、本分野で知られている条件下で反応を行なう。重合用試薬が熱に安定である場合、他の試薬とともに添加してもよい。室温から重合用試薬が働かなくなるまでの温度でこの合成（または増幅）反応を行なうことができる。最も簡単には室温で反応させる。
重合用試薬は、プライマー伸長生成物の合成を達成するように働くいずれの化合物またはシステム（酵素を含む）であってもよい。この目的のための適当な酵素は、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ変異体、逆転写酵素、および他の酵素、例えば熱安定酵素（すなわち、変性を起こすように十分に高く上げた温度に供した後にプライマー伸長を行なう酵素）が挙げられる。適当な酵素は、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質の核酸の各鎖に相補的なプライマー伸長生成物の生成に適する形でヌクレオチドの組合せを助けるであろう。通常、この合成は各プライマーの３’末端で開始され、合成が終わるまで鋳型の鎖に沿って５’方向で進んで、長さが異なる分子を作る。しかし、上記と同じ方法を用いて、５’方向で合成を開始して、反対の方向に進む重合用試薬も存在するであろう。
新しく合成された亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドの核酸鎖とその相補的な核酸鎖は、ハイブリダイズさせる上記条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドがその後の方法のステップに用いられる。この次のステップでは、新しく合成された二本鎖分子は上記の方法のいずれかを用いる変性条件に供して一本鎖の分子を得る。
上記プロセスは一本鎖の分子上で繰り返される。重合用試薬、ヌクレオチド、およびプライマーを所望であればさらに加えて、反応を上記条件下で進める。再び、前記反応を各オリゴヌクレオチドプライマーの一末端で開始させ、鋳型の一本鎖に沿って進めることで核酸がさらに作られるであろう。このステップ後、伸長生成物の半分が２種類のプライマーが結合した特定の核酸配列からなる。
変性と伸長の生成物合成のステップは必要に応じて繰り返して、検出に必要な程度まで亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質の核酸鎖を増幅することができる。この特定の作られる核酸配列の量は指数関数的に蓄積する。
本発明の方法により増幅される配列は、さらに、評価、検出、クローニング、配列決定等を、溶液の形か、または固体支持体に結合させた後に、特定のＤＮＡ配列の検出に通常利用される方法、例えば、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Sakai, et al. Bio/Technology,31008-1012, 1985）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Conner, et al., Proc. Natl. Acad Sci, USA, 80:278, 1983）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（Landegren, et al., Science, 241:1077, 1988）により行なうことができる。ＤＮＡ分析の分子的技法には概説がなされている（Landegren, et al., Science, 242:229-237, 1988）。好ましくは、本発明の新規な亜鉛フィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチドは上記技術を用いて単離することができ、ここでプライマーは、独自の亜鉛フィンガーが作られるようにヌクレオチドの置換等の修飾ができる（さらに詳細には実施例を参照されたい）。
本発明において、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を組換え発現ベクターに挿入してもよい。「組換え発現ベクター」との用語は、亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合タンパク質の遺伝子配列の挿入または導入により処理された本分野で知られるプラスミド、ウイルスまたは他の媒体を意味する。そのような発現ベクターは、宿主中で挿入遺伝子配列の効果的な転写を助けるプロモーター配列を有している。発現ベクターは、典型的には複製開始点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型の選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。本発明での使用に適するベクターは、細菌における発現のためにＴ７に基づく発現ベクター（Rosenberg, et al., Gene 56:125, 1987）、哺乳細胞における発現のためのpMSXND発現ベクター（Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988）および昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来のベクターがあるが、これらに限定されない。ＤＮＡセグメントは、調節要素、例えばプロモーター（例えばＴ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）を機能可能なように連結させたベクター中に存在することができる。
本発明の新規な亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞中へのＤＮＡの人工的移入によりin vitroで発現することができる。「宿主細胞」は、ベクターを増殖させ、そのＤＮＡを発現させることのできる細胞である。この用語は対象の宿主細胞の子孫も包含する。複製中に変異が起こることもあるので、すべての子孫は親細胞とは同一ではない可能性のあることを理解されたい。しかし、そのような子孫は「宿主」という用語が用いられる場合に包含される。安定な移入の方法とは、言い換えると外来ＤＮＡが継続して宿主中に保持される場合であり、そうした方法は本分野で知られている。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は当業者によく知られている慣用の技術により実施してもよい。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、ＤＮＡ取込が可能なコンピテント細胞は、指数増殖期の後に集めて、本分野でよく知られている方法のＣａＣｌ2方法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ2かＲｂＣｌを用いることができる。形質転換は、宿主細胞の原形質体の形成後か、またはエレクトロポレーションにより実施することもできる。
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿当のＤＮＡの人工的移入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の慣用の機械的方法、リポソーム中に取り込ませたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターを用いてもよい。
多様な宿主／発現ベクターシステムを、亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合をコードする配列を発現するために利用してもよい。これらシステムには、亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列を有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物；  亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合をコードする配列を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；  組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；  タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させたか、または亜鉛フィンガー由来のＤＮＡ結合をコードする配列を有する組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞システム；  亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合をコードする配列を有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；  または亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合をコードする配列を有する組換えウイルス発現ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞システム、または安定な発現のために作られた形質転換細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。グリコシル化が重要であるような場合、翻訳および翻訳後修飾を提供する発現システム（例えば哺乳類、昆虫、酵母または植物発現システム）を用いてもよい。
利用される宿主／ベクターシステムに基づいて、構成プロモーターおよび誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の多数の適当な転写要素と翻訳要素を発現ベクター中に用いてもよい（例えば、Bitter, et al., Methods in Enzymology,153:516-544, 1987を参照）。例えば、微生物のシステムでのクローニングの場合、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等の誘導プロモーターを用いてもよい。哺乳細胞システムでのクローニングの場合、哺乳細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類のウイルス（例えばレトロウイルスの長い末端リピート；  アデノウイルスの後期プロモーター；  ワクチニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を用いてもよい。組換えＤＮＡまたは合成技術により作られたプロモーターは、挿入された亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の転写を提供するために用いてもよい。
微生物システムにおいて、発現される亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドの意図される利用に基づいて、多くの発現ベクターから選択することが有利であろう。例えば、大量に生産しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルでの発現を指令するベクターが望ましいであろう。タンパク質を回収するために役立つ切断部位を有するように作られたものが望ましい。そのようなベクターには大腸菌発現ベクターpUR278（Ruther, et al., EMBO J.,2:1791, 1983）（ここでは、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質をコードする配列を、lac Zをコードする領域を有するフレーム中の該ベクターに連結することによって、亜鉛フィンガー／lac Zのハイブリッドを作ることができる）；  pINベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989）等があるが、これらに限定されない。
酵母では、構成プロモーターおよび誘導プロモーターを有する多くのベクターを用いてもよい。概説については、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Inters cience, Ch. 13; Grant, et al., 1987,「酵母の発現と分泌ベクター」（"Expression and Secretion Vectors for Yeast"）, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; およびBitter, 1987,「酵母の不均一遺伝子発現」（"Heterologous Gene Expression in Yeast"）, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684;および「酵母サッカロミセスの分子生物学」（"The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces"）, 1982, Eds. Strathem et al., Cold Spring Harbor Press, Vol. IとIIを参照されたい。ＡＤＨまたはＬＥＵ２等の構成酵母プロモーター、またはＧＡＬ等の誘導プロモーターを用いてもよい（「酵母のクローニング」（"Cloning in Yeast"）, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.）。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ断片の組み込みを促進するベクターを用いてもよい。
植物発現ベクターを用いる場合、亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれを用いて開始してもよい。例えば、CaMVの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターと１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Brisson, et al., Nature,310:511-514, 1984）、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Takamatsu, et al., EMBO J., 6:307-311, 1987）等のウイルスプロモーター」を用いてもよい；  または、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーター（Coruzzi, et al., EMBO J.3:1671-1680, 1984; Broglie, et al., Science 224:838-843, 1984）；  または熱ショックプロモーター、例えばダイズhsp17.5-E若しくはhsp17.3-B（Gurley, et al., Mol. Cell. Biol., 6:559-565, 1986）を使用してもよい。これらの構築物はＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を用いて植物細胞に導入することができる。そうした技術の概説については、例えば、Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp.（421-463, 1988;  およびGrierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988を参照されたい。
本発明のタンパク質を発現するために用いることのできる別の発現システムは昆虫システムである。一つのそのようなシステムにおいて、Autographa californica核ポリヘドロシスウイルス（AcNPV）は外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。該ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列は、該ウイルスの非必須領域中（Spodoptera frugiperdaの例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下においてもよい。亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子は失活して、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされているタンパク質含有コートを欠如したウイルス）が生産される。次に、これらの組換えウイルスを細胞に感染させて、挿入された遺伝子を発現させる（例えば、Smith, et al., J. Biol. 46:584, 1983;  Smithの米国特許第4,215,051号を参照されたい）。
真核生物システム、および好ましくは哺乳類の発現システムによって、発現哺乳類タンパク質の適当な翻訳後修飾を起こさせる。したがって、真核細胞、例えば一次転写物の適当な処理、グリコシル化、リン酸化および有利には遺伝子産物の分泌に関する細胞機構を有する哺乳類細胞は、亜鉛フィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドの発現のために好ましい宿主細胞である。そのような宿主細胞系はＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、−２９３およびＷ１３８があるがこれらに限定されない。
発現を指令するために組換えウイルスまたはウイルス要素を利用する哺乳動物細胞系を作ってもよい。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、亜鉛フィンガー由来のポリペプチドのコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターと３分節系リーダー配列に連結してもよい。次に、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムにin vitroまたはin vivo組換えにより挿入することができる。ウイルスゲノムの非主要領域（例えばＥ１またはＥ３領域）への挿入の結果、感染宿主で亜鉛フィンガーポリペプチドを発現することのできる生存可能な組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659, 1984を参照されたい）。あるいは、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーターを用いてもよい（例えば、Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79:7415-7419, 1982; Macket t, et al., J. Virol.49:857-864, 1984; Panicali, et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 79:4927-4931, 1982を参照されたい）。特に興味のあるものは、染色体外の要素として複製能のあるウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである（Sarver, et al., Mol. Cell. Biol.1:486, 1981）。このＤＮＡをマウス細胞中に導入した直後、このプラスミドは１細胞あたり約１００〜２００コピーまで複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は宿主の染色体中へのプラスミドの組み込みを必要としないので、高レベルの発現が得られる。これらのベクターは、プラスミドにｎｅｏ遺伝子等の選択マーカーを持たせることにより安定な発現のために用いることができる。あるいは、レトロウイルスのゲノムを修飾して、宿主細胞中で亜鉛フィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質遺伝子の導入とその発現を指令することのできるベクターとして用いることができる（Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353, 1984）。メタロメチオニンＩＬＡプロモーター及び熱ショックプロモーター等の、しかしこれに限定されない誘導プロモーターを用いて高いレベルの発現を達成してもよい。
組換え体タンパク質の長期間の高収率の生産のためには安定な発現が好ましい。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりは、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるcDNA及び選択可能マーカーにより宿主細胞を形質転換することができる。組換え体プラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込み、成長して順番にクローン化して細胞株に拡張することができるフォーカスを形成することを可能とする。例えば、外来DNAを導入した後に、遺伝子操作された細胞を１〜２日間強化培地中で増殖させ、その後選択培地に切り換える。多数の選択系を使用することができ、以下のものを含むが限定されるものではないが、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で使用できる単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Wigler, et al., Cell 11:223, 1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, et al., Cell, 22:817, 1980）遺伝子が含まれる。また、抗代謝物耐性を与える遺伝子を選択の基礎とすることができ、例えばメトトレキセートに対する耐性を与えるdhfrのための遺伝子（Wigler, et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980; O'Hare, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527,1981）、マイコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981）、アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo（Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981）及びヒグロマイシン対する耐性を与えるhygro（Santerre, et al., Gene, 30:147, 1984）が挙げられる。最近、別の選択可能な遺伝子が報告されている。即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするhisD（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:804, 1988）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を与えるODC（オルニチンデカルボキシラーゼ、McConlogue L., Current Communications in Molecular Biology中, Cold Spring Harbor Labolatry ed., 1987）である。
本発明により提供される、微生物により発現されたタンパク質あるいはそのフラグメントの単離及び精製は慣用手段によって行うことができ、それには分取クロマトグラフィー及びモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を使用する免疫学的分離が含まれる。本発明中で提供される抗体は、本発明の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質に対して免疫反応性を有する。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体を実質的に含む抗体、並びに別々のモノクローナル抗体標品が得られる。モノクローナル抗体は、当分野で周知の方法により前記タンパク質の抗原含有フラグメントから得られる（Kohler, et al., Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., 1989）。
本発明はまた、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む細胞ヌクレオチド配列に関連する細胞増殖性疾患の治療のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドポリヌクレオチドを増殖性疾患に罹患している動物の細胞中に導入することによりその治療効果を得るはずのものである。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えばキメラウィルスのような組換発現ベクターあるいはコロイド状分散系を使用することによりデリバリーすることができる。
「細胞増殖性疾患」の用語は、周辺組織から形態学的に異なるように見えることが多い悪性並びに非悪性の細胞集団を意味する。細胞増殖性疾患は、遺伝子の発現レベルの増加または減少を生じる転写性疾患であり得る。疾患の原因は細胞の起源あるいはウィルスの起源であり得る。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを使用した遺伝子治療は、例えばヒト、並びに植物におけるウィルス誘発性の細胞増殖性疾患の治療に使用することができる。治療は、植物細胞を例えばウィルスに対して耐性にするための予防的なもの、あるいはウィルス生産物の生成を阻止することによる細胞中で確立された感染を軽減するための治療的なものとすることができる。
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、種々の器官系、例えば肺、乳房、リンパ球、胃腸及び泌尿器系の悪性腫瘍、並びに殆どの結腸癌、直腸細胞腫瘍、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌のような悪性腫瘍を含む腺癌の治療に有用である。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、乾癬、尋常性天庖瘡、ベーチェット症候群及び脂質性組織球増殖症を含む、非悪性細胞増殖性疾患の治療にも有用である。本質的に、プロモーター、構造遺伝子あるいはRNAを含む亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフの活性化に病因学的に関連するあらゆる疾患は、誘導体あるいは変異体亜鉛フィンガー誘導ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより治療され得る可能性があると考えられるはずである。
本明細書において教示される遺伝子治療のために利用できる種々のウィルスベクターとしては、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニア、あるいは好ましくはレトロウィルスのようなRNAウィルスが含まれる。レトロウィルスベクターは好ましくは、マウスあるいは鳥類のレトロウィルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウィルスベクターの例としては、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウィルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウィルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウィルス（MuMTV）、及びラウス肉腫ウィルス（RSV）が挙げられる。その他の多くのレトロウィルスベクターは複数の遺伝子を取り込むことができる。これらのベクターはいずれも、選択可能なマーカーの遺伝子を転移あるいは導入し、形質導入された細胞を同定し生成できるようにすることができる。例えば、対象の亜鉛フィンガー誘導DNA結合ポリペプチド配列を、特異的な標的細胞上のレセプターについてのリガンドをコードするもう１つの別の遺伝子とともにウィルスベクターに挿入することにより、ベクターを標的特異的なものとすることができる。レトロウィルスベクターは、例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するとにより標的特異的なものとすることができる。好ましいターゲッティングでは、抗体を使用してレトロウィルスベクターを標的とする。レトロウィルスゲノム中に挿入し、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質ポリヌクレオチドを含むレトロウィルスベクターの標的特異的なデリバリーを可能とすることができる特定のポリヌクレオチド配列は、当業者であれば理解でき、あるいは過度の実験をすることなしに容易に確認できるであろう。
組換えレトロウィルスは欠陥を有しているので、感染性のベクター粒子を形成するためにはアシストを必要とする。このアシストは例えば、LTR中の調節配列の制御下にレトロウィルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することにより与えることができる。これらのプラスミドは、包膜化のためのRNA転写物を認識するパッケージングメカニズムを可能とするヌクレオチド配列を失っている。パッケージシグシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株は、限定するものではないが、例えばΨ２、PA317及びPA12である。これらの細胞株はゲノムがパッケージされていないので空のビリオンを生成する。レトロウィルスベクターを、パッケージングナルは本来のものであるが構造遺伝子が対象となる別の遺伝子により置き換えられたこのような細胞に導入すると、そのベクターをパッケージすることができ、ベクタービリオンを生成することができる。この方法により生成されたベクタービリオンをその後組織細胞株、例えばNIH3T3細胞に感染させ、大量のキメラレトロウィルスのビリオンを製造することができる。
亜鉛フィンガー誘導DNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのための別の標的デリバリー系は、コロイド状分散系である。コロイド状分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームのような脂質をベースとする系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームはin vitro及びin vivoにおけるデリバリービヒクルとして有用な人工的な膜ベシクルである。0.2〜4.0μmのサイズの範囲にある大きな単一ラメラベシクル（LUV）は、大きな巨大分子を含む水性バッファーのかなりのパーセンテージをカプセル化することができることが示されている。RNA、DNA及び本来のビリオンを水性の内部にカプセル化し、生物学的に活性な形態で細胞にデリバリーすることができる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981）。哺乳動物細胞に加え、植物、酵母及び細菌細胞にポリヌクレオチドをデリバリーするためにリポソームが使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移送ビヒクルであるためには以下の特徴が存在していなければならない。（１）対象の遺伝子を高い効率でカプセル化するが、その生物学的活性を減少させないこと、（２）非標的細胞と比較して、標的細胞に優先的に実質的な結合をすること、（３）ベシクルの水性内容物を標的細胞の細胞質に高い効率でデリバリーすること、及び（４）遺伝子情報が正確に効率よく発現されることである（Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988）。
リポソームの組成は通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質と、通常はステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。その他のリン脂質あるいは脂質も使用できる。リポソームの物理的特性はpH、イオン強度、及び二価のカチオンの存在に依存する。
リポソームの製造に有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セロブロシド、及びガングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールで脂質部分が14〜18、特に16〜18の炭素原子を含み、飽和しているものである。リン脂質の例は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンである。
リポソームの標的指向は、解剖学的要因に基づくもの、及び物理的要因に基づくものに分けられる。解剖学的な分類は、選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性等に基づく。物理的標的指向は、それが受動的なものまたは活性なものであるかにより区別される。受動的標的指向は、リポソームがシヌソイド毛細管を含む器官における細網内皮系組織（RES）の細胞に広がろうとする自然の傾向を利用する。一方、活性標的指向は、リポソームを例えばモノクローナル抗体、糖、グリコリピド、あるいはタンパク質のような特異的なリガンドに結合するか、リポソームの組成あるいはサイズを変更してリポソームを変化させ、天然に生じている局在化部位以外の器官及び細胞の型の標的化を得る。
標的デリバリー系の表面は種々の方法で修飾することができる。リポソーム標的デリバリー系の場合は、脂質基をリポソームの脂質二重層に導入し、標的指向リガンドがリポソームの二重層と安定に会合しているように維持する。脂質鎖を標的指向リガンドに結合するために種々の結合基を使用することができる。
一般には、標的デリバリー系の表面に結合する化合物はリガンドまたはレセプターであり、これらは標的デリバリー系が所望の細胞を発見し、「目標にする」ことを可能とする。リガンドは、別の対象化合物、例えばレセプターに結合する任意の化合物とすることができる。
一般には、特異的なエフェクター分子に結合する表面膜タンパク質はレセプターと呼ばれる。本発明においては、抗体が好ましいレセプターである。特異的な細胞表面リガンドをリポソームの標的とするのに抗体を使用することができる。例えば、腫瘍関連抗原（TAA）と呼ばれる、腫瘍細胞上に特異的に発現される特定の抗原を、悪性腫瘍を抗体−亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質含有リポソームの直接の標的とする目的で開発することができる。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質遺伝子産物はその作用における細胞型を区別しないので、標的デリバリー系により、非特異的なリポソームのランダムな注射に対して有意な改善が得られる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をリポソーム二重層に共有結合させるためには多くの方法を使用できる。抗体により標的指向させられるリポソームは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいは標的細胞の抗原エピトープに効率的に結合できるものであればFab、F（ab'）2のようなそれらのフラグメントを含むことができる。リポソームは、ホルモンあるいはその他の血清因子に対するレセプターを発現している細胞を標的とすることもできる。
別の態様においては、本発明により、細胞ヌクレオチド配列に結合する単離された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体を得る方法が提供され、この方法は最初に第１の細胞ヌクレオチド配列に結合し、そのヌクレオチド配列の機能をモジュレートする亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド中のアミノ酸を同定することを含む。２番目に、最初の段階で同定されたアミノ酸のランダム化された置換を含むポリペプチド変異体をコードする発現ライブラリーを作製する。３番目に、当業者に明らかなようにライブラリーを適当な宿主細胞中で発現させ、最後に、第２の細胞ヌクレオチド配列に結合し、その第２のヌクレオチド配列の機能をモジュレートするポリペプチド変異体を生成するクローンを単離する。本発明は上記の方法により生成された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体も包含するものである。
好ましくは、本明細書の実施例に記載したように、ファージ表面発現系をライブラリーとして使用する。ファージライブラリーをジチオトレイトールのような還元剤で処理すると、ファージ表面の発現産物が適当に折り畳まれる。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体をコードし、ランダム化されたポリヌクレオチド配列からライブラリーを形成するが、これは好ましくは、方法の最初の段階で決定されたアミノ酸に対応する配列位置の縮重三塩基コドンを含むプライマーを使用したPCRにより行う。縮重三塩基コドンは式NNSまたはNNKを有しており、SはGまたはCであり、KはGまたはTであり、Nは独立してA、C、GまたはTから選択される。
細胞ヌクレオチド配列の機能のモジュレーションは、特にヌクレオチド配列がプロモーターである場合は、細胞ヌクレオチド配列に機能的に連結された遺伝子の転写を促進するか抑制することを伴うものである。このモジュレーションは、構造遺伝子、あるいはウィルスDNA配列内またはウィルスRNA配列内のヌクレオチド配列の転写の抑制をも含む。またモジュレーションはmRNAの翻訳の阻害も含む。
さらに本発明は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを細胞内にex vivo導入し、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を細胞内でモジュレートすることによる、細胞増殖性疾患の治療方法も開示する。細胞増殖性疾患は、典型的には減少したレベルまたは増加したレベルでの遺伝子の転写に関連する上記のような疾患を含む。本発明の方法は、プロモーター、構造遺伝子、あるいはRNAレベルのいずれかでそのような遺伝子の発現をモジュレートする方法を提供する。該方法は、疾患を有する患者から組織試料を取り出し、その組織試料から造血細胞またはその他の細胞を単離し、単離した細胞を亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質をコードするDNAを含む組換え発現ベクター、および任意に標的特異性遺伝子と接触させることを含む。任意に、細胞を患者に再導入する前に、例えばインターロイキン-2のような増殖因子により細胞を処理し、細胞増殖を刺激してもよい。再導入されたとき、細胞はそれらが最初に単離された細胞集団を特異的に標的とする。このように、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドのトランス抑制活性（trans-repressing activity）を使用して患者における望ましくない細胞増殖を阻害あるいは抑制することができる。ある場合においては、細胞内におけるヌクレオチド配列のモジュレーションとは、細胞ヌクレオチド配列に機能的に連結された遺伝子の転写の抑制あるいは促進をいうものである。好ましくは患者はヒトである。
組換えレトロウィルスベクターについての別の使用は、そのウィルスを含む細胞の皮膚移植物により宿主中にポリヌクレオチド配列を導入することを含む。転写を推進するのに強力なハウスキーピング遺伝子プロモーターを使用すれば、繊維芽細胞を起源とする細胞を使用した移植物中での外来遺伝子の長期間の発現が得られる。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子プロモーターを使用することができる。繊維芽細胞のような細胞に、例えば切断及び／または突然変異亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパクのような対象の遺伝子を、腫瘍関連抗原（TAA）のような特異的標的指向を可能とする遺伝子、及び強力なプロモーターとともに含むレトロウィルス構築物を含むビリオンを感染させることができる。感染した細胞をコラーゲンマトリックス中に埋め込み、これを受容患者中の真皮の結合織中に移植できる。レトロウィルスが増殖し、マトリックスから放出されるに従って、標的細胞集団に特異的に感染する。このように、移植により、細胞増殖性疾患を示す細胞中で生産されたトランス抑制亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの量が増加される。
本発明の新規な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質は、プロモーター、構造遺伝子、あるいはRNAレベルのいずれかで転写活性化あるいは翻訳をモジュレートするが、植物種にも使用できる。トランスジェニック植物を作製し、例えば植物を特定の細菌あるいはウィルス病原体に耐性を有するものとすることができる。核酸を植物中に移し、発現させる方法は当分野で周知である（例えば、Hiatt, et al., 米国特許第5,202,422号を参照。これは引用により本明細書の一部とする。）。
さらに別の態様においては、本発明により、対象となる亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフに結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドから誘導されたモジュレーティングポリペプチドを同定する方法が提供され、この方法は、第１の誘導可能なプロモーターに機能的に連結された推定モジュレーティングタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び第２の誘導可能なプロモーター及び亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む成分を、成分が相互作用するのに十分な条件下でインキュベートし、推定モジュレーティングタンパク質のレポーター遺伝子の発現に対する効果を測定することを含む。
「モジュレートする」の用語は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターからの発現を、それが過剰に活性化されたときに阻害または抑制し、あるいはそのようなプロモーターからの発現を、その活性化が過少なときに増加させあるいは促進することを意図するものである。例えばアラビノースプロモーターのような第１の誘導可能なプロモーターを推定モジュレーティングポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。例えばラクトースプロモーターのような第２の誘導可能なプロモーターを亜鉛フィンガー誘導DNA結合モチーフに、その後例えばβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子に機能的に連結する。成分のインキュベートはin vitroあるいはin vivoのいずれで行ってもよい。in vivoのインキュベートには、大腸菌のような原核生物系あるいはCOS細胞のような真核生物系を各々使用することができる。アッセイを進行させる条件には、それぞれ第１及び第２の誘導可能なプロモーターを活性化するアラビノースやラクトース等の基質の存在下にインキュベーションを行い、推定トランスモジュレーティングタンパク質ヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を発現させることが含まれる。推定モジュレーティングタンパク質が第２の誘導可能なプロモーターに機能的に連結された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフに結合するかどうか、及びその活性に影響するかどうかをレポーター遺伝子の発現により測定する。例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼの場合、青または白色のプラークの存在が、推定モジュレーティングタンパク質がプロモーターからの遺伝子発現を増強あるいは阻害しているかどうかをそれぞれ示す。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）アッセイのような、プロモーターからの機能を評価するために通常使用されるその他のアッセイが当業者に理解されるであろう。原核生物系及び真核生物系の両方を使用することができる。
本発明は、新規な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体あるいは変異体、及び該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同定するのに有用である。前記方法は、野性型亜鉛フィンガータンパク質のフィンガーの修飾を内包し、それらはそのタンパク質により本来認識される配列以外のDNAまたはRNAであるヌクレオチド配列を認識する。例えば、公知の亜鉛フィンガータンパク質を修飾し、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）のプロモーター領域（LTR）を認識し、これに結合し、不活性化する新規な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを製造することが望ましい。タンパク質の同定の後、その部位から通常活性化される転写を抑制するタンパク質の切断型が生成される。HIVにおいては、プロモーター内の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフに対する標的部位はCTG-TTG-TGTである。例えばzif268の３つのフィンガーは実施例に記載するように突然変異される。フィンガーは同じタンパク質において独立して（１つずつ）突然変異されるか、独立してもしくは「段階的」（"piecewise"）に３つの異なるzif268分子で突然変異され、突然変異された後に再結合される。これらの２つの方法のいずれかが好ましいが、別の方法でも３つのフィンガーを同時に突然変異させることができる。突然変異の後、ファージディスプレイライブラリーを構築し、対象の結合部位を含む適当なオリゴヌクレオチドによりスクリーニングする。フィンガーが同じタンパク質上で独立して突然変異されている場合は、連続的なライブラリーを構築し、各ライブラリーの構築の後にパンニング（panning）を行う。例えば、zif268においては、フィンガー３ライブラリーを構築し、フィンガー３特異的オリゴによりパンニングする。このスクリーニングからの陽性クローンを回収し、フィンガー２ライブラリーを作製するのに使用する（フィンガー３ライブラリーDNAを鋳型として使用して）。フィンガー３２特異的オリゴを使用してパンニングを行う。DNAを陽性クローンから回収し、フィンガー１ライブラリー構築のための鋳型として使用する。最後に３つの新しいフィンガーを有するタンパク質についての選択をフィンガー３２１特異的オリゴで行う。この方法により、HIVプロモーターからの転写を認識し、これに結合し、抑制する新規な亜鉛フィンガー誘導DNA結合タンパク質が同定される。その後の新規なタンパク質の種々のフィンガーの切断、突然変異、あるいは拡張によりHIVプロモーターからの転写を抑制するタンパク質が得られる。
実施例７〜13において、上記した本発明によるZif268の修飾について説明する。従って別の態様においては、本発明により、HIV配列に結合しそのHIV配列、例えばHIVプロモーター配列の機能をモジュレートする少なくとも２つの亜鉛フィンガーモジュールを含む新規な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体が提供される。
新規な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質を同定することにより、これらのタンパク質が結合するプロモーターからの遺伝子発現をモジュレートすることができる。例えば、細胞増殖性疾患が亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの過剰活性化に関連している場合は、アンチセンスポリヌクレオチド配列や結合抗体のような抑制試薬を、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質誘導体の添加の代わりに細胞に導入することができる。あるいは、細胞増殖性疾患が前記プロモーターの過少な活性化に関連している場合は、センスポリヌクレオチド配列（DNAコード鎖）または亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを細胞に導入することができる。
一次アミノ酸配列の僅かな修飾により、本明細書に記載した亜鉛フィンガー誘導結合タンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質が得られる。そのような修飾は部位指向突然変異のような意図されたものでもよく、あるいは自然発生的なものでもよい。これらの修飾により生成された全てのタンパク質は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質活性が存在する限り本発明に包含されるものである。
別の態様においては、本発明の亜鉛フィンガータンパク質は延長された標的配列を認識し、それに結合するように操作することができる。例えば、約２〜20の亜鉛フィンガーZif（2）〜Zif（20）、好ましくは約２〜12の亜鉛フィンガーを含む亜鉛フィンガータンパク質を、タンパク質のbZIPファミリーの典型的なメンバーであるJun/Fosタンパク質のロイシンジッパードメインに融合することができる（O'Shea, et al., Science, 254:539, 1991）。あるいは、ヘテロダイマーを形成することができ、ダイマー化ドメインを有するその他のタンパク質に亜鉛フィンガータンパク質を融合することができる。そのようなタンパク質は当業者に理解されるであろう。
Jun/Fosロイシンジッパーを説明のために記載するが、これはヘテロダイマーを優先的に形成し、12〜72塩基対の認識を可能とする。以下、Jun/Fosはこれらのタンパク質のロイシンジッパードメインをいうものである。亜鉛フィンガータンパク質を、タンパク質を結合するのに当分野で通常に使用されている方法によりJunに、そして独立にFosに融合する。精製の後、Zif-Jun及びZif-Fos構築物（それぞれ配列番号33、34及び35、36）である、タンパク質を混合し、自発的にZif-Jun/Zif-Fosヘテロダイマーを形成させる。あるいはこれらのタンパク質をコードする遺伝子の同時発現によりin vivoでZif-Jun/Zif-Fosヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーをN-末端核局在化シグナルに融合することにより、核に対する発現の標的指向が得られる（Calderon et al., Cell, 41:499, 1982）。活性化ドメインをロイシンジッパー融合構築物の１つあるいはそれぞれに導入し、転写のアクティベーターを生成することもできる（Sadowski, et al., Gene, 118:137, 1992）。これらのダイマー構築物により転写の特異的な活性化あるいは抑制が可能となる。これらのヘテロダイマーZif構築物は、パリンドローム配列（Jun及びFos上の両方のフィンガーが同じDNA/RNA配列を認識する場合）、あるいは延長された非対称配列（Jun及びFos上のフィンガーが異なるDNA/RNA配列を認識する場合）を認識することを可能とするので有利である。例えば、パリンドローム配列
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は、Zif268-Fos/Zif268 Junダイマーにより認識される（xは任意の数）。サブサイト間の距離は、JunあるいはFosジッパードメインとZifとの融合の部位及びZif及びジッパードメインの間のリンカーの長さにより決定される。サブサイト間隔は、当業者に知られた結合部位選択法により決定される（Thiesen, et al., Nucleic Acids Research, 18:3203, 1990）。延長された非対称配列の認識の例は、Zif（C7）6-Jun/Zif-268-Fosダイマーにより示される。このタンパク質は、Junに結合したC7型の６フィンガー（実施例11）及びFosに結合したZif268の３フィンガーからなり、延長された配列、
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を認識する。
金属キレート錯体を有するDNAあるいはRNAの酸化または加水分解による開裂は当業者に知られた方法で行うことができる。別の態様においては、好ましくは、キレート化基のZifタンパク質への結合を、タンパク質の開始メチオニン（Met）及び最初のチロシン（Tyr）の間にシステイン（Cys）残基を導入することにより容易にする。このCysはその後当業者に公知のキレート化剤、例えばEDTA誘導体でこれまでに記載されたようにアルキル化する（Sigman, Biochemistry, 29:9097, 1990）。あるいは、配列Gly-Gly-Hisをアミノ最末端残基として形成することができ、これはこれらの残基からなるアミノ末端がCu+2をキレート化できることが記載されているからである（Mack, et al,. J. Am. Chem. Soc., 110:7572, 1988）。好ましい金属イオンとしては、Cu+2、Ce+3（Takasaki and Chin., J. Am. Chem. Soc., 116:1121, 1994）、Zn+2、Cd+2、Pb+2、Fe+2（Schnaith, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:569, 1994）、Fe+3、Ni+2、Ni+3、La+3、Eu+3（Hall, et al., Chemistry and Biology, 1:185, 1994）、Gd+3、Tb+3、Lu+3、Mn+2、Mg+2が挙げられる。キレート化金属による開裂は通常、O2、過酸化水素H2O2のような酸化剤及びチオール及びアスコルビン酸塩のような還元剤の存在下に行われる。開裂の部位及び鎖（+または-部位）は経験的に決定され（Mack, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:7572, 1988）、第１のフィンガーに先立つMet及びTyrの間のCysの位置に依存する。タンパク質Met（AA）Tyr-（Zif）1-12においては、キレートはMet-（AA）x1Cys-キレート-（AA）x2-Tyr-（Zif）1-12となり、AAは任意のアミノ酸であり、xはアミノ酸の数である。Zif-Jun/Zif-Fos型のダイマーzif構築物が、標的オリゴヌクレオチド内の２つの部位あるいは単一の長い標的部位の開裂のために好ましい。二本鎖開裂が望まれる場合には、Jun及びFosの両方を含むタンパク質をキレート化剤でラベルし、開裂を当業者に知られた方法により行う。この場合、制限酵素により生成されたものに類似したずれのある二本鎖切断物が得られる。
フィンガー１特異性あるいはアフィニティが修飾されたZif268タンパク質の変異体の突然変異と選択の後、当分野で知られた方法によりＴＧＥＫＰリンカー配列を使用して、フィンガーの複数のコピーを有するタンパク質を構築することができる。例えば、C7フィンガーは式
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に従って構築することができる。ここで最後のリンカーの配列は、それが末端にあり２つのフィンガーを１つに結合するのに関与しないので変化する。このタンパク質は、オリゴヌクレオチドヘアピンCCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC GAG G（配列番号40）中の設計された標的配列GCG-GCG-GCG（配列番号32）に9nMのアフィニティで結合し、一方GCG-TGG-GCG配列をコードするオリゴヌクレオチドについては300nMのアフィニティである（表面プラスモン共鳴分析により測定）。使用されるフィンガーは同一のものでなくてもよく、混合され、所望の標的配列を認識するタンパク質を製造するのに適合されていてもよい。これらはロイシンジッパー（例えばFos/Jun）、あるいはその他のヘテロダイマーとともに使用して、延長配列認識を示すタンパク質を製造することもできる。
フィンガー１のポリマーを製造することに加え、完全な３フィンガーZif268及びその中の修飾されたものをコンセンサスリンカーTGEKPを使用して融合して延長認識部位を有するタンパク質を製造することもできる。例えば、タンパク質Zif268-Zif268を製造することができ、ここではTGEKPリンカーを使用して天然タンパク質がそれ自体に融合されている。このタンパク質はこれで配列GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCGに結合する。従って、Zif268の３つのフィンガーあるいは当分野で知られたその他の亜鉛フィンガータンパク質での修飾物を一体に融合して延長された配列を認識するタンパク質を形成することができる。これらの新規な亜鉛タンパク質は所望によりロイシンジッパーと組み合わせて使用することもできる。
本発明を十分に記載したが、本発明の概念及び範囲を逸脱することなく種々の変更及び改変を行うことができることは当業者に明らかであろう。
実施例
９つのTFIIIA亜鉛フィンガー（Clemens, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 89:10822, 1992）の３つを含む組換えポリペプチドを、TFIIIAのcDNAからのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅及び大腸菌中での発現により生成した。zfl-3と称する組換えタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーで精製し、DNaseIフットプリンティング及び合成オリゴヌクレオチドに対する結合の組み合わせにより5S遺伝子内のその結合部位を決定した（Liao, et al., J. Mol. Biol., 223:857, 1992）。実施例においては、このポリペプチドの、活性RNAポリメラーゼプロモーターの近くにあるその認識配列に対する結合が、in vitroでそのプロモーターの活性を阻害することを示す実験を行う。そのような試験系を提供するために、zfl-3についての13bp認識配列を含む26bpオリゴヌクレオチドを、プラスミドpUC19のT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列の近くのポリリンカー領域中にクローン化した。我々の組換えzfl-3の調製物のDNA結合活性は、結合部位を含むオリゴヌクレオチドによるゲル移動度シフト分析により測定した。さらに、DNA結合力価評価（titration）で使用したのと同量のzfl-3ポリペプチドの存在下及び非存在下に、in vitro転写をT7 RNAポリメラーゼにより行った。zfl-3により結合された各DNA分子において、そのDNA分子は転写について不活性化された。従ってこれらの実験においては、近傍の標的配列に結合することによりプロモーターの活性を十分にブロックする亜鉛フィンガーポリペプチドが製造された。
実施例１
亜鉛フィンガータンパク質による配列特異性遺伝子標的指向化
Ａ．zif268の結晶構造から、α−ヘリックスの表面上、フィンガーチップ、及びヘリックス位置２、３及び６（保存ヒスチジンの直前）の特異的ヒスチジン（非亜鉛配位His残基）及びアルギニン残基がDNAグアニンに対する水素結合に関与していることは明らかである。亜鉛フィンガー錯体の構造体の数が増加し続けると、異なるアミノ酸及び異なる位置が塩基特異的認識に参加しやすくなる。図２（パネルＡ）は、TFIIIAの３つのアミノ末端フィンガーの配列を示すものであり、これらの位置の基本アミノ酸に下線を付した。調節タンパク質zif268（Krox-20）のフィンガー２及びSp1のフィンガー１及び３と同様に、TFIIIAのフィンガー２はこれらのDNA接触位置においてヒスチジン及びアルギニン残基を含み、さらにこれらの亜鉛フィンガーのそれぞれは5S遺伝子プロモーター内で配列GGGを殆ど認識しない（図２、パネルＢ）。
これらの３つのTFIIIA亜鉛フィンガーを含む組換えポリペプチドを、TFIIIAのcDNAからのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅と大腸菌中での発現により生成した（Clemens, et al., 上出）。このポリペプチドの、活性RNAポリメラーゼプロモーターの近傍にあるその認識配列に対する結合がin vitroでそのプロモーターの活性を阻害するかどうかを調べる実験をデザインした。そのような試験系を得るため、以下のような実験を行った。zfl-3に対する13bpの認識配列を含む23bpオリゴヌクレオチド（Liao, et al., 1992,上出）を、T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列の近くで、プラスミドpBluescript SK+（Stratagene, La Jolla, CA）のポリリンカー領域にクローン化した。親プラスミドを制限酵素EcoRVで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼによる脱リン酸化の後、リン酸化23bpオリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼによるライゲーションにより挿入した。ライゲーション生成物をDH5α大腸菌細胞の形質転換に使用した。23bpインサートを有するクローンをミニプレップDNAの制限消化により同定した。クローニングの成功はDNA配列分析によっても確かめられた。
組換えzfl-3の調製物のDNA結合活性は、zfl-3についての結合部位を含むコーンから誘導された56bpの放射性標識EcoRI/XhoI制限フラグメント及び放射活性標識23bpオリゴヌクレオチドでのゲル移動度分析によっても測定した。ゲルシフトアッセイはこれまでに記載されたように行った（Liao, et al.,上出; Fried, et al., Nucl. Acids., Res., 9:6505, 1981）。後者の分析の結果を図３に示す。結合反応物（20μl）は、１μgの同じ23bp配列を有する非標識プラスミドDNAをも含んでいた。レーン２〜12においては、示したzfl-3の量が反応物中にも含まれていた。室温で30分間のインキュベートの後、試料を88mMトリス-ホウ酸塩バッファー、pH8.3中の６%非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。各反応物において、痕跡量の放射性標識オリゴヌクレオチドを一定量（１μg）のzfl-3結合部位を有するプラスミドDNAとともに使用した。レーン２〜12の反応物は、増加する量のzfl-3ポリペプチドを含んでいた。ゲルのオートラジオグラムを示す。結果は、zfl-3の放射性標識DNAに対する結合が電気泳動による移動の遅延を起こしたことを示している。zfl-3により結合された放射性標識DNA分子のパーセンテージは、結合非標識プラスミドDNA分子のパーセンテージも反映している。
同量のzfl-3結合部位を有するプラスミドDNAでのDNA結合力価評価で使用したのと同量のzfl-3ポリペプチドの存在下及び非存在下に、in vitro転写実験をT7 RNAポリメラーゼにより行った。各反応物は、25μlの容量中に、１μgのベクターのEcoRV部位に挿入されたzfl-3の23bp結合部位を含むPvuII消化pBluescript SK+DNA、40単位のRNasin、0.6mMのATP+UTP+CTP、20μMのGTP及び10μCiのα-32P-GTP及び10単位のT7 RNAポリメラーゼ（Stratagne）を含んでいた。反応バッファーはStratageneより得た。37℃で１時間のインキュベートの後、転写産物をフェノール抽出により精製し、エタノール沈殿により濃縮し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。T7転写を放射活性ヌクレオチドの移動転写物中への取り込みによりモニターした。図４は、得られた転写産物の変性ポリアクリルアミドゲル分析のオートラジオグラムを示す。この実験においては、プラスミドDNAは制限酵素PvuIIにより開裂し、移動転写物の予想長は245塩基であった。反応物へのzfl-3ポリペプチドの添加により、T7 RNAポリメラーゼによる転写が抑制された。
図５は、DNAゲル移動度アッセイにおけるzfl-3により結合されたDNA分子のパーセンテージ（x-軸）と同じ量のzfl-3によるT7 RNAポリメラーゼ転写の阻害のパーセンテージ（y-軸）をプロットしたグラフである。各データ点は２つのアッセイにおいて使用したzfl-3の同じ量に対応することに注意されたい。２つのデータのセットの１対１の対応は明確である。T7転写は放射活性ヌクレオチドの移動転写物中への取り込みによりモニターした。ゲル電気泳動、オートラジオグラフィー、及びデンシトメトリーにより転写物を定量した。ゲル移動度アッセイは同様の方法で定量した。zfl-3により結合された各DNA分子において、そのDNA分子は転写について不活性化される。従ってこれらの実験においては、亜鉛フィンガーポリペプチドは、近傍の標的配列に結合することによりプロモーターの活性を完全にブロックした。
Ｂ．上記の実験は原核生物RNAポリメラーゼにより行ったので、以下の実験は亜鉛フィンガーポリペプチドzfl-3が真核生物RNAポリメラーゼの活性もブロックすることができるかどうかを調べるために行った。これを試験するために、未受精ツメガエル（xenopus）卵から転写物抽出物を調製し（Hartl, et al., J. Cell Biol., 120:613, 1993）、ツメガエル5S RNA遺伝子鋳型を使用した。これらの抽出物は、RNAポリメラーゼIIIによる5S RNA及びtRNAの転写において非常に活性が高い。試験鋳型として、TFIIIA及びzfl-3についての結合部位を天然に含む5S RNA遺伝子を使用した。それぞれの反応物は、25μlの反応物中に、10μlの卵ホモジネートの高速上清、9ngのTFIIIA、0.6mMのヌクレオシドトリリン酸（ATP, UTP, CTP）、及び10μCiのα-32P-GTP及び20μMのGTPを含んでいた。全ての反応物は、180ngのツメガエル体細胞型5S RNA遺伝子の単一のコピーを有するプラスミドDNAを含み、レーン２及び３の反応物は300ngのツメガエルtRNAmet遺伝子含有プラスミドも含んでいた。ツメガエル卵抽出物及びTFIIIAの添加の前に、0.2及び0.4μgのzfl-3をレーン２及び３の反応物にそれぞれ加えた。レーン２の実験において使用したzfl-3の量は、１つの結合反応物における5S遺伝子含有DNAの全てに結合するのに十分なものであった。15分後、インキュベートによりzfl-3をその認識配列に結合させ、その他の反応成分を加えた。２時間のインキュベートの後、転写産物をフェノール抽出により精製し、エタノール沈殿により濃縮し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。オートラジオグラムを図６に示す。図６には亜鉛フィンガータンパク質を加えなかった対照反応の結果も示す（レーン１）。対照として、レーン２及び３はtRNA遺伝子鋳型も含み、これはTFIIIA及びzfl-3についての結合部位を欠くものである。5S RNA転写はzfl-3により抑制されたが、tRNA転写は影響を受けなかった。これらの結果は、zfl-3が真核生物RNAポリメラーゼIII転写複合体のアセンブリをブロックすることを示し、この効果はTFIIIAから誘導された組換え亜鉛フィンガータンパク質の結合部位を有するDNA分子に特異的であることを示している。
2D、3D及び4D NMR法を用いて、TFIIIAの最初の３つの亜鉛フィンガーを含むタンパク質について、３次元溶液構造を分析した。この目的のため、そのタンパク質を大腸菌から発現させて精製し、13C及び15Nにより均一にラベルした。NMR構造により個々の亜鉛フィンガーは限界フィンガー構造に折り畳まれており、αヘリックスに対して小さいβシートが充填されていることが示される。フィンガーは溶液中で完全に独立していないが、それらの間には微かな相互作用があることが示される。同様の方法を使用することにより、zfl-3と、5S RNA遺伝子上のその特異的結合部位に対応する13bpオリゴヌクレオチドとの間の複合体の3D構造を調べ、TFIIIA亜鉛フィンガーによる配列特異的ヌクレオチド認識の分子的基礎についての本質的な情報を得るのに使用する。そしてこの情報を、前もって選択された標的遺伝子の制御のための新規な亜鉛フィンガー誘導ヌクレオチド結合タンパク質を設計するのに使用する。同様のNMR法を使用して、設計された亜鉛フィンガータンパク質とその標識遺伝子との間に形成される複合体の詳細な構造を分析し、標的遺伝子選択性を改良し、結合アフィニティを向上させるための、構造をベースとするアプローチの一部とすることができる。
実施例２
新規亜鉛フィンガー-ヌクレオチド結合タンパク質の単離
亜鉛フィンガー変異体の大きいライブラリーを迅速に選別するために、抗体ライブラリーに対して最初に開発されたファージ表面表示システム（Barbasら、METHODS, 2:119, 1991）を使用した。このために、pComb3を亜鉛フィンガーの選択用に修飾した。抗体Ｌ鎖プロモーターおよびクローニング配列を除去して新規ベクターpComb3.5を作った。zif268の３個のフィンガータンパク質をＰＣＲによって修飾し、pComb3.5に挿入した。亜鉛フィンガーは、ファージが配列に依存してＤＮＡに結合することを示す固相アッセイによって測定すると、ファージ上に機能的に示される。ライブラリーの構築を容易にするために、部位特異的突然変異誘発を行なってフィンガー１と２との間にNsiI部位を挿入した。さらに、zif268は、その結合が便利にモニターできるデカペプチド標識に融合すると機能的である。最初のライブラリーは、オーバラップＰＣＲ（Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457, 1992）によって構築して、フィンガー３の変異体を作った。ここでは、識別に関与するαヘリックスのアミノ末端側の６残基を、縮重を与えるＮＮＫドーピング法によって変えた。この第三のフィンガーは、最初はGCGの3bpサブサイトに結合した。AAAサブサイトへの結合の選択は、選択した配列に共通パターンが現れることを示した。
zif268含有プラスミドpZif89（Pavletichら、Science 252:809, 1991）を、亜鉛フィンガー修飾のためのzif268 ＤＮＡ源として使用した。簡単に述べると、pZif89を、下記プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した後、プラスミドpComb3.5に入れてクローン化した。
0004012243.tif 000005
ＰＣＲ反応は、各々1μgのオリゴヌクレオチドプライマーZFおよびZR、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、1.5mMのＭｇＣｌａ、Taqポリメラーゼ（５単位）、10ngの鋳型pZif89および10μlの10 x ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Corp.）を含む100μlの反応液中で行なった。Perkin-Elmer Cetus 9600 Gene Amp ＰＣＲシステム熱サイクラーでＰＣＲ増幅を30回行なった。増幅サイクルは、94℃で１分の変性、54℃で１分のアニーリング、および72℃で２分の伸長で構成した。得られたＰＣＲ増幅産物は、下記に記載するようにゲル精製し、XhoI/SpeIで消化して、pComb3.5に連結した。pComb3.5はpComb3の変異体であり（Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:7978, 1991）、lacZプロモーターを含むＬ鎖が除去されている。簡単に述べると、pComb3をNheIで消化し、クレノウ処理し、XbaIで消化し、再連結してpComb3.5を形成した。pComb3.5の代わりに使用することができる他の同様のベクター、例えばSurfZapTM（Stratagene, La Jolla, CA）は当業者には公知である。
次いで、zif268を含むファージミドpComb3.5を本明細書で述べるようにＰＣＲ増幅に使用し、ヌクレオチドの代わりをzif268の亜鉛フィンガーに導入して新規亜鉛フィンガーを作った。これは、特定の認識配列に結合し、一定のプロモーター配列に結合した後の転写を増強したり抑制したりする。特定配列の認識特異性および遺伝子発現能の調節を有する新規亜鉛フィンガーの調製法は、下記工程を含む。
１．オーバーラップＰＣＲの使用により、まず、第一の亜鉛フィンガー（例えば、zif268の亜鉛フィンガー３）をランダム化した。
２．ランダム化亜鉛フィンガーを含むオーバーラップＰＣＲから得た増幅産物をpComb3.5に戻して連結し、ランダム化ライブラリーを形成した。
３．ライブラリーから得られるバクテリオファージコートタンパク質III−固定亜鉛フィンガーの発現の後、ファージを発現する表面タンパク質を特定の亜鉛フィンガー認識配列に対してパンニング（panning）し、いくつかの特定のランダム化亜鉛フィンガーを選択した。
４．配列に特異的な亜鉛フィンガーを選択した後、対応するファージミドの配列決定を行い、それからアミノ酸残基配列を誘導した。
実施例３
ランダム化亜鉛フィンガーの調製
上述したpComb3.5でのzif268の亜鉛フィンガーのランダム化のために、本明細書に記載したように各フィンガーに対して二つの別個のＰＣＲ増幅を行い、次いで、第三のオーバーラップＰＣＲ増幅を行なうと、先の二つの増幅産物がアニーリングされ、次いで、第三の増幅を行なった。鋳型pComb3.5のzif268の亜鉛フィンガーのヌクレオチド配列を図７に示し、配列番号４に列挙する。亜鉛フィンガー３でランダム化されたヌクレオチドの位置は、ヌクレオチド217で始まってヌクレオチド237で終わり、セリンは含まない。その特定された位置にある鋳型zif268配列は、フィンガー３の全部で８個のアミノ酸残基をコードした。pComb3.5におけるフィンガー３の修飾することができたアミノ酸残基配列は、Arg-Ser-Asp-Glu-Arg-Lys-Arg-His（配列番号５）である。下線部のアミノ酸は、ランダム化されたアミノ酸残基を表す。
下記のヌクレオチドの式を有する縮重オリゴヌクレオチドプライマーBZF3およびZF36K、ならびに非縮重プライマーR3BおよびFTX3（Operon Technologies, Alameda, CAによって合成）を含むオリゴヌクレオチドのプールを使用して、pComb3.5におけるzif268の亜鉛フィンガー３のランダム化を行なった。ランダム化ヌクレオチドを導入するための６個のトリプレットコドンは、繰り返し配列NNM（NNKの相補型）（MはGまたはCであり、NはA、C、GまたはTである。）を含むものであった。
最初のＰＣＲ増幅の結果、pComb3.5ファージミドベクタークローンにおいて亜鉛フィンガー３断片の5'領域が増幅された。この領域を増幅するために、下記のプライマー対を使用した。ヌクレオチド配列5'-GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G-3'（配列番号６）を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーFTX3は、zif268の最初の二つのヌクレオチドを含むその5'領域（ベクター配列を含む）に対応するフィンガー３の非コード鎖に対してハイブリッド形成した。ヌクレオチド配列5'-GGC AAA CTT CCT CCC ACA AAT-3'（配列番号７）を有する3'オリゴヌクレオチドプライマーBZF3は、ヌクレオチド216で始まり、ヌクレオチド196で終わるフィンガー３のコード鎖に対してハイブリッド形成した。
ＰＣＲ反応は、１μgの各オリゴヌクレオチドプライマーFTX3およびBZF3、200mMのdNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、1.5mMのＭｇＣｌ2、Taqポリメラーゼ（５単位）（Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT）、10ngの鋳型pComb3.5 zif268および10μlの10 x ＰＣＲ緩衝液（市販、Perkin-Elmer Corp.）を含む100μlの反応液中で行なった。Perkin-Elmer Cetus 9600 GeneAmp ＰＣＲシステム熱サイクラーでＰＣＲ増幅を30回行なった。増幅サイクルは、94℃で30秒の変性、50℃で30秒のアニーリング、および72℃で１分の伸長で構成した。十分な量の増幅産物を得るために、同じＰＣＲ反応を30回行なった。
得られたＰＣＲ増幅産物を次いで、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrookら編、Cold Spring Harbor, NY（1989）に記載された標準的な電気溶出法を使用して、1.5％アガロースゲル上でゲル精製した。簡単に述べると、消化したＰＣＲ増幅亜鉛フィンガードメインをゲル電気泳動した後、予め定めた大きさのＤＮＡ断片を含むゲルの領域を切り取り、透析膜中に電気溶出してエタノール沈殿し、10mMのトリス−HCl（ｐＨ7.5）および１mMのＥＤＴＡを含む緩衝液に再懸濁して、最終濃度を50ng/mlとした。
最初の反応から精製して得られたＰＣＲ増幅産物を次いで、第二のＰＣＲ反応産物（両方とも以下に記載する）とともにオーバーラップエクステンション（overlap extention）ＰＣＲ反応で使用し、二つの産物をランダム化亜鉛フィンガーを含む再構築zif268に再結合した。
第二のＰＣＲ反応の結果、上記産物およびフィンガー３の伸長3'とオーバーラップするzif268フィンガー３の3'端が増幅された。この領域を増幅してフィンガー３のコードされた８個のアミノ酸残基配列をランダム化するために、下記のプライマー対を使用した。5'をコードするオリゴヌクレオチドプライマープールをZF36Kと命名し、そのヌクレオチド配列を式：5'-ATT TGT GGG AGG AAG TTT GCC NNK AGT NNK NNK NNK NNK NNK CAT ACC AAA ATC CAT TTA-3'（配列番号８）（ヌクレオチド196〜255）によって表した。3'非コードプライマーR3Bは、配列5'-TTG ATA TTC ACA AAC GAA TGG-3'（配列番号９）を有する遺伝子III（gIII）の3'端のコード鎖に対してハイブリッド形成した。プライマープールの二つの特定端の間の領域は、15-mer NNK縮重によって表される。第二のＰＣＲ反応を、記載したように各オリゴヌクレオチドプライマーを1μg含む上記した100μlの反応液中で、pComb3.5の鋳型の第二のアリコート上で行なった。得られたＰＣＲ産物は、長さが８個のアミノ酸残基のランダム化zif268フィンガー３領域の種々の集団をコードした。その産物は次いで、上述したようにゲル精製した。
二つのＰＣＲ増幅のアニーリング反応に対しては、第一および第二のＰＣＲ反応からのゲル精製した物質各1μgを次いで混合し、上述した35回のＰＣＲに対してプライマーを存在させないで融合した。得られた融合産物は次いで、最終ＰＣＲ反応のプライマー対として各1μgのFTX3およびR3Bオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、オーバーラップエクステンションにより完全なzif268断片を形成した。オーバーラップＰＣＲ増幅は、他の上記ＰＣＲ増幅に対して記載したように行なった。
十分な量の増幅産物を得るために、30回の同じオーバーラップＰＣＲ反応を行なった。得られた断片は、5'から3'方向に伸長し、６個のアミノ酸残基をコードするフィンガー３をランダム化した。30回の反応の各々において長さ約450bpのランダム化されたzif268増幅産物をまずプールし、次いで上述したようにゲル精製し、XhoIおよびSpeIで切断した後、pComb3.5表面表示ファージミド発現ベクターに入れ、続く亜鉛フィンガー認識配列オリゴヌクレオチドに対するスクリーニングのためのライブラリーを形成して、特定の亜鉛フィンガーを選択した。発現ベクターライブラリーの作製における連結法および続くzif268ランダム化pComb3.5クローンの発現は、下記実施例４に記載したように行なった。
同様に、ヌクレオチドの置換を別の亜鉛フィンガー上で行なってもよい。例えば、zif268において、フィンガー１および２を、別の結合部位が確認できるように、修飾することもできる。亜鉛フィンガー２の修飾の場合、プライマーFTX3（上述）およびZFNsi-B: 5'-CAT GCA TAT TCG ACA CTG GAA-3'（配列番号10）（ヌクレオチド100〜120）を最初のＰＣＲ反応に使用し、R3B（上述）およびZF2r6F（5'-CAG TGT CGA ATA TGC ATG CGT AAC TTC（NNK）6 ACC ACC CAC ATC CGC ACC CAC-3'）（配列番号11）（ヌクレオチド103〜168）を第二の反応に使用する。フィンガー１の修飾の場合、RTX3（上述）およびZFI6rb（5'-CTG GCC TGT GTG GAT GCG GAT ATG（MNN）5 CGA MNN AGA AAA GCG GCG ATC GCA GGA-3'）（配列番号12）（ヌクレオチド28〜93）を最初の反応に使用し、ZFIF（5'-CAT ATC CGC ATC CAC ACA GGC CAG-3'）（配列番号13）（ヌクレオチド70〜93）およびR3B（上述）を第二の反応に使用する。オーバーラップ反応は、フィンガー３に対して上述したように、FIX3およびR3Bを使用する。好ましくは、各フィンガーを、一つの反応で３個全てとは対照的に、１個のタンパク質分子上で個々に、継続的に修飾する。zif268のフィンガー１のヌクレオチドの修飾は、下線部のアミノ酸ＲＳＤＥＬＴＲＨ（配列番号14）を含み、これはヌクレオチド49〜72によってコードされる。zif268のフィンガー２のヌクレオチドの修飾は、ＳＲＳＤＨＬ（配列番号15）を含み、これはヌクレオチド130〜147によってコードされる（図７参照）。
実施例４
ランダム化された亜鉛フィンガーを有するファージミド表示配列の調製
zif268配列を含むファージミドpComb3.5は、上述したように、ファージ表示固定タンパク質の発現に備えるファージミド発現ベクターである。元のpComb3発現ベクターは、コンビナトリアルFabライブラリーのクローニングに対して、発現した抗体タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質３上で固定できるように設計した。フレームワーク１で始まり、フレームワーク４を通って伸びる領域から成る完全なＰＣＲ増幅Ｈ鎖（Fd）配列のクローン化のために、XhoIおよびSpeI部位を作った。繊維状ファージの遺伝子IIIは、この406残基の小さいファージコートタンパク質cpIII（cp3）をコードし、それは、細菌膜上でのファージ構成過程における排出の前に発現され、大腸菌のペリプラズム中に向かう内部膜上に蓄積する。
この系では、最初のシストロンが、融合タンパク質zif268-cpIIIに機能的に連結したペリプラズム分泌シグナル（pelBリーダー）をコードする。pelBリーダーが存在すると、ランダム化された亜鉛フィンガーを有する融合タンパク質の細菌細胞質からペリプラズム空間への分泌が促進される。
この方法により、zif268-cpIIIはpelBリーダー配列によってペリプラズム空間に運ばれ、その後、分解した。ランダム化された亜鉛フィンガーは、cpIII膜固定ドメインによって膜に固定された。pComb3.5と命名されたファージミドベクターは、亜鉛フィンガータンパク質の表面表示を可能にした。XhoI/SpeI部位の存在により、ランダム化されたzif268 ＰＣＲ産物のXhoI/SpeI消化物がpComb3.5ベクターに挿入できた。すなわち、実施例３で調製したzif268突然変異誘発ヌクレオチド配列の連結の結果、ＰＣＲ増幅されたフィンガー３から成る完全zif268断片のインフレーム（同じ読み枠）での連結が得られた。pComb3.5発現ベクターのクローニング部位は、Huseら、Science, 246: 1275-1281（1989）およびPerssonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:2432-2436（1991）に記載されているように、先に報告されたマウスおよびヒトＰＣＲプライマーに適合した。発現タンパク質をペリプラズム空間に向けるためのリーダー配列であるpelBのヌクレオチド配列は、Huseら（前出）によって報告された通りであった。
ベクターはまた、Shineら、Nature, 254:34,（1975）によって記載されているように、リボソーム結合部位も含んでいた。ColE1およびF1起源およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むファージミドベクターpBluescriptの配列は、以前、Shortら、Nuc. Acids Res., 16:7583-7600（1988）によって記載され、完全な配列に対しては遺伝子バンク受理番号52330を持っている。空のベクターのXhoIおよびSpeI部位の間に位置する別の制限部位SalI、AccI、HincII、ClaI、HindIII、EcoRV、PstIおよびSmaIは、Shortら（前出）によって記載されているように、pBluescriptの51bp中央部断片（stuffer fragment）から誘導した。整然とした二次構造に欠けるフレキシブルな５アミノ酸残基つなぎ配列（tether sequence）をコードするヌクレオチド配列をFabおよびcp3ヌクレオチドドメインの間に並置して、発現融合タンパク質における相互作用を最小にした。
すなわち、その結果得られたコンビナトリアルベクターpComb3.5は、融合タンパク質zif268/cp3を発現するためのカセットを有するＤＮＡ分子で構成された。ベクターはまた、次に挙げる5'から3'の方向に機能的に連結した要素、すなわち、LacZプロモーター／オペレーター配列から成るカセット；NotI制限部位；リボソーム結合部位；pelBリーダー；スペーサー領域；5'XhoIおよび3'SpeI制限部位を境界とするクローニング領域；つなぎ配列；ならびにバクテリオファージcp3をコードする配列およびそれに続く停止コドンに対するヌクレオチド残基配列も含んでいた。最初の二つのカセット（Ｈ鎖およびＬ鎖に対する）間に位置するNheI制限部位；第二のlacZプロモーター／オペレーター配列およびそれに続く発現コントロールリボソーム結合部位；pelBリーダー；スペーサー領域；5' SacIおよび3' XbaI制限部位を境界とするクローニング領域およびそれに続く発現コントロール停止配列；ならびに第二のNotI制限部位は、pComb3から削除してpComb3.5を形成した。当業者であれば、本発明の方法で使用することができるSurfZapTMベクター（Stratagene, La Jolla, CA）などの類似ベクターについては公知である。
上記発現ベクターでは、zif268/cp3融合タンパク質はlacプロモーター／オペレーター配列のコントロール下にあり、膜上での機能的構成に対するpelBリーダー配列によりペリプラズム空間に向けられる。ベクターにファージF1遺伝子間領域を含めると、ヘルパーファージにより一本鎖ファージミドのパッケージングが可能になった。ヘルパーファージ重感染の使用は、cp3の二つの形態の発現を可能にした。その結果、通常のファージの形態形成は、ビリオンへの混入に対するFd/cp3融合とヘルパーファージの天然のcp3との間の競合によって混乱した。その結果得られるパッケージングされたファージミドは、感染に必要な天然のcp3、および選択に対して表示されるコードされた融合タンパク質を持っていた。Ｃ−末端ドメインとの融合が、ファージミドの接近によりもたらされた。なぜならば、感染性Ｎ−末端ドメインとの融合は宿主細胞を感染耐性にするからである。
上記のpComb3および3.5発現ベクターは、ランダム化された亜鉛フィンガータンパク質の産生に対して本発明で使用する表示ファージミド発現ベクターの基礎的構成を形成する。
実施例５
ファージミドライブラリーの構築
ランダム化された亜鉛フィンガーを表す発現タンパク質を得るために、ファージミドライブラリーを構築した。そのライブラリーは、亜鉛フィンガーが実施例３に記載したようにランダム化された組換え分子の表面発現に備えた。
実施例３で得たＰＣＲ産物を発現するためのファージミドライブラリーを調製するために、ＰＣＲ産物をまずXhoIおよびSpeIで消化し、同様に消化した元の（すなわち、ランダム化されていない）pComb3.5ファージミド発現ベクターと別々に連結した。XhoIおよびSpeI部位は、上述したようにpComb3.5ベクターに存在した。ライゲーションの結果、zif268がベクターに機能的に連結し、5'はcp3遺伝子側に位置した。増幅産物が、最初はＨ鎖可変ドメイン配列を有していた鋳型pComb3.5発現ベクターに挿入されたので、Ｈ鎖ドメインクローニング部位のみが置き代わり、pComb3.5発現ベクターの残りの部分は不変のままであった。組換えクローンから発現させると、発現タンパク質はランダム化された亜鉛フィンガーを含んでいた。
本発明のランダム化された亜鉛フィンガーの各々を発現するためのファージミドライブラリーは、以下の方法で調製した。ＰＣＲ産物挿入物を含む環状ベクターを作るために、640ngの消化したＰＣＲ産物を２μgの線状pComb3.5ファージミドベクターと混合し、10単位のＢＲＬリガーゼ（Graithersburg, MD）／ＢＲＬリガーゼ緩衝液を使用して150μlの反応体積中、室温で一夜、連結を行った。５個の別々の連結反応を行なって、ランダム化された亜鉛フィンガーを有するファージライブラリーの大きさを増大させた。連結反応の後、２μlの20mg/mlグリコーゲン、15μlの３M酢酸ナトリウム（pH5.2）および300μlのエタノールの混合物により、環状ＤＮＡを−20℃で２時間、沈殿させた。次いで、ＤＮＡを４℃で15分間、マイクロ遠心分離にかけることによりペレット化した。ＤＮＡペレットを冷70%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。ペレットを10μlの水に再懸濁し、300μlの大腸菌XL1-Blue細胞に電気穿孔法により形質転換し、ファージライブラリーを形成した。
形質転換の後、突然変異誘発フィンガー３を発現するファージを単離するために、ファージを以下に述べるように誘導した後、下記配列（配列番号16）を有するヘアピンオリゴヌクレオチド上でパンニングを行なった。
0004012243.tif 000006
太字の配列は新規亜鉛フィンガー３結合部位（以前はGCG）を示し、下線部の配列はフィンガー２部位を表し、二重下線部はフィンガー１結合部位を表す。
形質転換した大腸菌を３mlのＳＯＣ培地（ＳＯＣは、20gのbacto-トリプトン、５gの酵母抽出物および0.5gのＮａＣｌを１1の水中で混合してｐＨを7.5に調整し、使用直前に20mlのグルコースを混合することにより調製してzif268-cpIIIの発現を誘発する。）中で増殖させ、混合して、培養物を37℃で１時間、220rpmで振とうした。このインキュベーションの後、20μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む10mlのＳＢ（ＳＢは、１lにつき、30gのトリプトン、20gの酵母抽出物および10gのMops緩衝液を混合し、ｐＨを７に調整することにより調製した。）を混合し、その混合物をさらに１時間、300rpmで振とうした。この結果得られた混合物を50μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む100mlのＳＢに混合して１時間振とうし、その後、ヘルパーファージVCSM13（1012pfu）を混合して、その混合物を37℃でさらに２時間振とうした。この後、70μg/mlのカナマイシンを混合し、30℃で一夜保持した。温度が低い方が、ファージ表面上でのzif268の発現が良好であった。上清を遠心分離（JA10ローターで、４℃、4000rpm、15分）により透明にした。ファージを、４%（w/v）のポリエチレングリコール8000および３%（w/v）のＮａＣｌを混合することにより沈殿させ、氷上で30分保持した後、遠心分離（JA10ローターで、４℃、9000rpm、20分）にかけた。ファージペレットを２mlの緩衝液（５mMのＤＴＴ、10mMのトリス−ＨＣｌ（pH7.56）、90mMのＫＣｌ、90mMのＺｎＣｌ2、１mMのＭｇＣｌ2）に再懸濁し、マイクロ遠心分離を３分間行なって破片をペレット化し、新しい管に移して、下記に記載する次のスクリーニングのために−20℃で保存した。ＤＴＴを添加して、ポリペプチドをファージ表面上に再び折りたたんだ。
力価によるコロニー形成単位（ｃｆｕ）を測定するために、ファージ（パッケージングしたファージミド）をＳＢで希釈し、１μlを使用して、10μg/mlのテトラサイクリンを含むＳＢ中で増殖した50μlの新しい（ＡOD600＝１）大腸菌XL1-Blue細胞を感染した。ファージおよび細胞を室温で15分保持した後、LB／カルベニシリンプレート上に直接プレーティングした。ランダム化した亜鉛フィンガー３ライブラリーは、全部で５ x 107PFUから構成されていた。
ファージライブラリーの多重パンニング
ファージライブラリーを、上述したように、変化した結合部位を含むヘアピンオリゴに対して、被覆したマイクロタイタープレート上でパンニングし、新規亜鉛フィンガーを選択した。
使用したパンニング法は数回の認識および複製を含み、ParmleyおよびSmith（Parmleyら、Gene, 73:305-318, 1988; Barbasら、1991, 前出）によって最初に記載された方法の改良法であった。５回のパンニングを行なって配列特異的結合クローンの濃縮を行なった。この操作に対しては、マイクロタイタープレート（Costar 3690）の４個のウェルを1μgのオリゴとともに37℃で一夜乾燥することにより被覆するか、オリゴをＥＤＣ／ＮＨＳ活性化によりＢＳＡに共有的に結合してプレートを被覆した（360μgのアセチル化したＢＳＡ（Boehringer Manheim）、577μgのオリゴ、40mMのＮＨＳおよび100mMのＥＤＣを1.8mlの全体積中で混合し、室温で一夜インキュベートした。）。プレートを、１枚につき50μlを使用して被覆し、４℃で一夜インキュベートした。ウェルを水で２回洗浄し、ウェルに３%（w/v）のＢＳＡ／ＰＢＳを完全に満たしてプレートを37℃で１時間維持することによりブロッキングした。ブロッキング溶液を振り落とした後、上記で調製した50μlのファージ懸濁物（典型的には1012pfu）を各ウェルに混合し、プレートを37℃で２時間保持した。
ファージを取り出し、プレートを水で１回洗浄した。次いで、各ウェルを、室温で１時間かけて、ＴＢＳ／Tween（50mMのトリス−ＨＣｌ（pH7.5）、150mMのＮａＣｌ、0.5%のTween 20）で10回洗浄した。ここでの洗浄は、ピペットで液の上下を行なうことによりウェルを洗浄し、洗浄と洗浄の間はウェルにＴＢＳ／Tweenを完全に満たしたままにした。プレートを蒸留水でもう一度洗浄し、各ウェルに50μlの溶離緩衝液（ｌmg/mlのＢＳＡを含む、固体グリシンでpH2.2に調整した0.1MのＨＣｌ）を添加した後、室温で10分保持することにより、付着ファージを溶離した。溶離緩衝液を数回、ピペットで上下動させ、除去して、使用した溶離緩衝液50μlにつき３μlの２Mトリス塩基により中和した。
溶離したファージを使用して、２mlの新しい（ＯＤ600＝１）大腸菌XL1-Blue細胞を、室温で15分間感染した後、20μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む10mlのＳＢを混合した。20、10および1/10μlのアリコートを培養物から取り出し、プレートから溶離したファージ（パッケージングしたファージミド）の数を測定するためのプレーティングを行なった。培養物を37℃で１時間振とうした後、50μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む100mlのＳＢに添加して、１時間振とうした。次いで、ヘルパーファージVCSM13（1012pfu）を添加して、培養物をさらに２時間振とうした。この後、70μg/mlのカナマイシンを添加し、培養物を37℃で一夜インキュベートした。ファージの調製およびパンニングを上記したようにさらに繰り返した。
各パンニングの後、ファージの収率（％）を求めた。なお、収率（％）＝（溶離したファージの数／使用したファージの数）x 100とした。最初のファージ投入量の比は、選択プレート上で力価を測定することにより求め、各パンニングに対して約1011cfuであった。最終のファージ取出量の比は、対数期のXL1-Blue細胞２mlを上述したように感染し、選択プレート上でアリコートをプレーティングすることにより測定した。この方法により、Fabライブラリーから、新規結合配列オリゴに結合することができるクローンを選択した。選択したクローンは、亜鉛フィンガー３ドメインをランダム化した。
ランダム化した亜鉛フィンガー３ライブラリーの逐次パンニングから得られた結果は、新しいフィンガー３部位を認識する５個の結合配列を示した。天然の部位GCGはAAAに変わり、表１に示す配列がAAAに結合することが確認された。
0004012243.tif 000007
実施例６
プロモーターによる亜鉛フィンガー活性化を同定するための共形質転換検定
産生された新規亜鉛フィンガーの機能特性を評価するため、大腸菌をベースとするin vivo系を誘導した。この系においては、適合するレプリコン、colE1およびp15を有する２つのプラスミドを利用する。亜鉛フィンガーの細胞質発現はこのcolE1プラスミド中のアラビナーゼプロモーターによって実現される。p15レプリカを含むプラスミドはβガラクトシダーゼの１断片を発現するプラスミドのリプレッサー結合部位の代わりに亜鉛フィンガー結合部位を含む。第２のプラスミドのこの部位への亜鉛フィンガーの結合によってβガラクトシダーゼの生成が阻止されるので、便利な青／白選択を使用して、機能に関するこのin vivo検定において、新規亜鉛フィンガーを評価することができる。例えば、アラビノースおよびラクトースの存在下で、亜鉛フィンガー遺伝子が発現し、生成タンパク質が亜鉛フィンガー結合部位に結合し、そしてラクトースプロモーターを抑制する。したがって、βガラクトシダーゼは生成されず、白色プラークが存在するはずである。pComb3.5の制限部位について適合するこの系は、新規フィンガーの迅速な特性決定を促進するものと思われる。さらに、この方法は新規転写調節物質に遺伝的選択をさせることまで発展させることができると思われる。
野性型の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質の突然変異を誘発させる、また別の方法として、遺伝子のコレクションの間での遺伝子セグメントの位置交換（shuffling）ができるＰＣＲ手法を使用したセグメント位置交換が含まれる。好ましくは、遺伝子は限定された相同性領域を含み、少なくとも15塩基対の隣接した配列が同一である。ベクターpComb3.5中の亜鉛フィンガー遺伝子のコレクションをＰＣＲ手法の鋳型として使用する。例えば、94℃で１分の変性と50℃で15秒のアニーリングによるＰＣＲを４サイクル実施する。別の実験において、94℃，１分、50℃，30秒；94°，１分、50°，１分；94°，１分、50°，15秒、72°，１秒でＰＣＲを実施する。すべての実験において同一の鋳型（10ng混合物）を使用する。実験は、各条件下で２組の反応を行なうようにして実施する。各組には頭部または尾部のプライマー鎖のみを含ませ、異なる長さのＤＮＡ一本鎖を産生させるようにする。例えば、一本鎖生成物を得るため、各組において、FTX3、ZFIF、およびFZF3プライマーを使用することができる。次にこれらの反応の生成物を集め、さらに5'および3'末端プライマー（例えばFTX3およびR3B）を添加し、混合物をさらに94°、１分、50°,15秒、72°，１分30秒のＰＣＲ35ラウンドに供する。処理後の混合物を次にXhoI/SpeI消化によってクローン化してもよい。最適亜鉛フィンガーコレクションを選択するため、上記のように、任意の遺伝子パッケージ上での亜鉛フィンガーの表示をパンすることによって、新しい位置交換亜鉛フィンガーを選択することができる。この手法は、少なくとも15塩基対の連続する配列の同一部分を含む遺伝子コレクションのいずれにも適用することができる。プライマー結合領域での変異を誘導するため、プライマーもまた、上記のように、ＮＮＫ例を使用して、一定範囲量を加えることができる。反応時間は使用する鋳型の長さおよびプライマーの数によって変わる。
実施例７
Zif268の特異性の改変
試薬、菌株およびベクター
制限エンドヌクレアーゼはNew England BiolabsまたはBoehringer Mannheimより入手した。T4ＤＮＡリガーゼはGIBCO BRLの製品である。TaqポリメラーゼおよびVentポリメラーゼはPromegaより購入した。ヘパリン−セファロースCL-6B培地はPharmaciaからのものである。オリゴヌクレオチドはOperon Technologies（Alameda CA）からのものか、または実験室において、Gene Assembler Plus（Pharmacia LKB）上で調製した。pZif89はDr.PavletichおよびDr.Paboから贈られたものである（Pavletich,Science,252:809-817,1991）。大腸菌BL21（DE3）pLysSおよびプラスミドpET3aはNovagenより入手し、大腸菌XL1-Blue、ファージVCSM13、ファージミドベクターpComb3およびpAraHAは文献記載の通りである（BarbasIIIら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982,1991;BarbasIIIら, Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2:119-124,1991）。
プラスミド構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した、多重制限部位（XhoI/SacIおよびXbaI/SpeI）の付加によりpzif89（Pavletich、上記）の野性型Zif268遺伝子を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、野性型亜鉛フィンガータンパク質をコードする遺伝子を、Sarmonella typhimurium araBプロモーターの制御下においた。次に、この結果生成したプラスミドベクターをイムノスクリーニングのために、選択した亜鉛フィンガー遺伝子のサブクローン化に使用した。このベクターにおいて、亜鉛フィンガータンパク質はヘマグルチンデカペプチド標識（taq）とのＣ末端における融合体として発現し、これは抗デカペプチドモノクローナル抗体を使用して検出される（図８Ａ）（Fieldら、Mol.&Cell.Biol.8:2159-2165,1988）。Zif268タンパク質は各亜鉛フィンガーの固有の特徴を示すように配列されている。αヘリックスおよび逆平行βシートが示される。各フィンガー配列中の下線部の６アミノ酸残基がライブラリー構築中にランダム化された。Zif268タンパク質のＣ末端がデカペプチド標識を含有する断片と融合した。融合した位置を矢印で示す。
抗体の軽鎖断片を除去するため、ファージミドpComb3をNheIおよびXbaIで消化することによって改変し、Klenow断片を入れ、骨格を自己連結させて、プラスミドpComb3.5を生成させた。Zif268ＰＣＲ断片を上記のようにpComb3.5中に挿入した。ライブラリー構築中のバックグラウンド問題を排除するため、SacIおよびXbaIを使用して、野性型Zif268を1.1kbの官能性のない代用物で置き換えた。この代用物を切り取るため、生成したプラスミドをSacIおよびXbaIで消化し、pComb3.5骨格をゲル精製し、ライブラリー構築のためのベクターとして供した。
亜鉛フィンガーライブラリー
前述の実施例３の条件を使用したＰＣＲオーバーラップ拡張（overlap extension）によって、３つの亜鉛フィンガーライブラリーを構築した。簡単に述べると、フィンガー１ライブラリーについては、鋳型としてプラスミドpAra-Zif268を使用し、Zif268断片の増幅のため、プライマー対Ａ（5'-GTC CAT AAG ATT AGC GGA TCC-3'）（配列番号29）およびZf16rb（配列番号12）；（ここでＮはＡ，Ｔ，ＧまたはＣ、そしてＭはＡまたはＣ）、ならびにＢ（5'-GTG AGC GAG GAA GCG GAA GAG-3'）（配列番号30）およびZf1f（配列番号13）を使用した。２つのＰＣＲ断片を等モル比で混合し、この混合物をオーバーラップ拡張のための鋳型として使用した。プライマーＡおよびＢを使用して、さらにこの組換え断片をＰＣＲ増幅し、得られた生成物をSacIおよびXbaIで消化して、ゲル精製した。各連結反応のため、室温で一晩、消化断片280ngをpComb3.5ベクター1.8μgと連結させた。12反応を実施し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、大腸菌XL1-Blue中にエレクトロポーレーションした。フィンガー１ライブラリー構築の際に使用したＰＣＲプライマーZf16rbおよびZF1fを、フィンガー２ライブラリーにおいてはZfnsi-B（配列番号10）およびZF2r6F（配列番号11）（ここでＫはＧまたはＴ）に、そしてフィンガー３ライブラリーについてはBZF3（配列番号７）およびZF36K（配列番号８）に置き換えた他は同様の方法で、フィンガー２および３ライブラリーを構築した。ライブラリー中、フィンガー１および３のαヘリックス位-1,2,3,4,5,6およびフィンガー２の-2,-1,1,2,3,4位に対応する６アミノ酸残基がランダム化された（図８Ａ）。
亜鉛フィンガーのin vitro選択
亜鉛フィンガーの選択のために、共通のまたは改変Zif268結合部位を含有する34ヌクレオチドのヘアピンＤＮＡを使用した（図８）。共通の結合部位はZ268N（5'-CCT GCG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CGC AGG-3'）（配列番号31）で示される。フィンガー１のための改変部位はTGT（5'-CCT GCG TGG TGT CCC TTTT GGG ACA CAA CGC AGG-3'）、フィンガー２ではTTG（5'-CCT GCG TTG GCG CCC TTTT GGG CGC CAA CGC AGG-3'）、そしてフィンガー３ではCTG（5'-CCT CTG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CAG AGG-3'）である。5'末端に一級n-ヘキシルアミノ基を有するオリゴヌクレオチドを合成した。100mM 1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ）および40mM N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する溶液中で30μM ＤＮＡと3μMアセチル化ＢＳＡを室温で５時間または一晩混合することによって、ＤＮＡ−ＢＳＡ複合体（conjugate）を調製した。１ウェル当たりＰＢＳ緩衝液（10mMリン酸カリウム、160mM ＮａＣｌ、ｐＨ7.4）25μl中のＤＮＡ−ＢＳＡ複合体4.9μgをプレコーティングしたマイクロタイターウェルに、１％ＢＳＡを含有する亜鉛緩衝液（10mMＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ7.5，90mMＫＣｌ，1mMＭｇＣｌ2，90μMＺｎＣｌ2，1mMＭｇＣｌ2および5mM ＤＴＴ）50μl中のZif268ファージ、1032コロニー形成単位を適用した。37℃で２時間インキュベート後、ファージを除去し、選択の１ラウンド用に、0.5％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳ緩衝液（50mMＴｒｉｓ−Ｃｌおよび150mM ＮａＣｌｐＨ7.5）でプレートを１回洗浄した。プレートを２ラウンド用に５回、その後のラウンド用に10回洗浄した。結合ファージを溶出用緩衝液（0.1MＨＣｌ、ｐＨ2.2（グリシンで調整）、および１％ＢＳＡ）で抽出し、感染大腸菌XL1-Blue細胞中で使用して、以後の選択用のファージを産生させた。
イムノスクリーニング
XhoIおよびSpeI制限部位を使用して、５または６ラウンドのパニング後に選択した変異亜鉛フィンガー遺伝子をpAraHAベクター中にサブクローン化した。典型的には、同時に20クローンをスクリーニングした。30μg/mlクロラムフェニコールを含有するＳＢ培地（BarbasIIIら、上記）６ml中、37℃で、細胞を後期対数相（OD6000.8-1）まで生育させた。１％アラビノースを添加して、亜鉛フィンガータンパク質の発現を誘導した。誘導３〜12時間後、細胞を収穫した。細胞ペレットを0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する亜鉛緩衝液600μl中に再懸濁させた。細胞を６サイクルの凍結融解で破壊し、上清を12,000gで５分間遠心分離して清澄化した。ＤＮＡ−ＢＳＡ複合体1.1μgをプレコーティングしたマイクロタイターウェルに、細胞上清の50μlアリコートを適用した。37℃で１時間後、プレートを蒸留水で10回洗浄し、このプレートにアルカリホスファターゼ複合体化抗デカペプチド抗体を添加した。37℃で30分後、プレートを10回洗浄し、p-ニトロフェニルホスフェートを添加した。その後、プレートをマイクロプレート自動読み取り機で405nmでモニターした。
亜鉛フィンガータンパク質の過剰発現および精製
ｐＥＴ発現系（Studierら、Methods Enzymol.,185:60-89,1990）を使用することによって、亜鉛フィンガータンパク質を過剰生産させた。ＰＣＲにしたがって、NdeIおよびBamHI消化ベクターpET3a中にZif268遺伝子を導入した。続いて、Zif268遺伝子を680-bpの非官能性代用物断片と入れ替えた。この結果生成した代用物断片を含有するpETプラスミドを使用して、この代用物をSpeIおよびXhoI部位を使用して亜鉛フィンガー遺伝子と入れ替えることによって、別の亜鉛フィンガー遺伝子をクローン化した。この亜鉛フィンガー遺伝子をコードするpETプラスミドを化学的形質転換によってBL21（DE3）pLysS中に導入した。50μg/mlカルベニシリンおよび30μg/mlクロラムフェニコールを含有するＳＢ培地中で、細胞を中期対数相（ＯＤ6000.4-0.6）まで生育させた。培地に0.7mM ＩＰＴＧを添加することによってタンパク質の発現を誘導した。典型的には、誘導３時間後に培養物500mlを収穫した。細胞ペレットを１mMＰＭＳＦ含有亜鉛緩衝液中に再懸濁し、０℃で５分間音波処理することによって細胞を破壊した。6mM ＭｇＣｌ2の添加後、細胞破壊物を氷上で20分間、10μg/mlＤＮase Ｉとインキュベートした。亜鉛フィンガータンパク質を含有する封入体を25,000gで30分間遠心分離することによって回収し、6M尿素および0.5mM ＰＭＳＦを含有する亜鉛緩衝液10mlに再懸濁させ、４℃で３〜12時間緩やかに混合することによって可溶化させた。抽出物を30,000gで30分遠心分離することによって清澄化し、0.2μm低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。総タンパク質抽出物を亜鉛緩衝液で平衡化したHeparin-SepharoseFPLCカラム（1.6×4.5cm）に通した。タンパク質を0-0.7M ＮａＣｌ勾配で溶出させた。亜鉛フィンガータンパク質を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、プールした。標準品としてＢＳＡ（画分Ｖ）を使用したBranford法によって、タンパク質濃度を測定した（Branford,Anal.Biochem.,72:248-254,1976）。精製タンパク質の収率は１リットルの細胞培養物中７〜19mgであった。タンパク質はＳＤＳ−ＰＱＧＥで判定したところ、90％以上均質であった。
速度論的分析
BIAcore装置（Pharmacia）を使用した表面プラスモン共鳴に基づく分析によって、Zif268ペプチドとそのＤＮＡ標的間の相互作用に関する速度定数を測定した（Malmqvist,Curr.Opinion in Immuno.,5:282-286,1993）。センサーチップの表面をＥＤＣＩおよびＮＨＳの混合物で15分間活性化した。その後、10mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）中200μg/mlのアフィニティー精製ストレプトアビジン（Pierce）40μlを5μl／分の速度で注入した。典型的には、ストレプトアビジン5000-6000共鳴単位がチップ上に固定された。過剰のエステル基を1Mエタノールアミン30μlで失活させた。0.3M塩化ナトリウム中のビオチニル化オリゴヌクレオチド（50μg/ml）40μlを注入することにより、オリゴヌクレオチドをチップ上に固定した。通常、オリゴマーの1500-3000共鳴単位が固定された。亜鉛緩衝液中10-200μg/mlの範囲の５種の異なるタンパク質濃度における表面へのタンパク質の結合速度を実験することによって、会合速度（ｋon）を測定した。会合期後、流速を20μl/分に増大させることによって、解離速度（ｋoff）を測定した。ｋoff値は３回測定の平均である。ｋonおよびｋoff値はBiacore（登録商標）速度論的評価用ソフトウェアを使用して計算した。平衡解離定数を速度定数から演繹した。
実施例９
改変亜鉛フィンガーのファージミドディスプレイ
ライブラリー設計および選択
実施例２−６において記載したようにファージミドディスプレイ系pComb3の改変によって、Zif268タンパク質のファージディスプレイが達成された。pzif89からのZif268配列をpComb3.5のXhoIとSpeI部位間に挿入するため、ＰＣＲによって仕立てた。上記実施例４のように、これらの部位に挿入した結果、Zif268が繊維状ファージ被覆タンパク質III,pIII, 遺伝子のカルボキシル末端セグメントと融合する。ファージ表面にディスプレイされたタンパク質の機能特性を検討するため、亜鉛フィンガータンパク質をディスプレイするファージをマイクロタイターウェル上に固定された標的ＤＮＡ配列とともにインキュベートし、つぎに洗浄、溶出、および溶出ファージの力価測定からなる、単一パニング実験を利用した。
対照実験として、Zif268をディスプレイするファージを、共通結合部位またはTFIIIAの最初の３つのフィンガーの結合部位を担持する標的配列と結合させるパニング実験において、試験した。これらの実験によると、Zif268ディスプレイファージはTFIIIA配列またはBSAよりも９倍多く適合する標的ＤＮＡと結合することがわかり、また、ファージのディスプレイ中、フィンガー複合体の配列特異的結合が維持されることが示された。結合緩衝液中にZn+2およびＤＴＴ含まれないとき、ファージの結合に４倍の減少が見られた。２つの報告が、Zif268がファージ表面にディスプレイされ得ることを立証している（Rebarら、Science,263:671-673,1994;Jamiesonら、Biochem.,33:5689-5695,1994）。
同様の実験において、TFIIIAの最初の３つのフィンガーがファージの表面にディスプレイされ、また特異的結合活性を保持していることが示された。アミノ標識された単一オリゴヌクレオチド内にフィンガーの二重らせんＤＮＡ標的を与えるように、安定したヘアピン配列を設計することによって、ＤＮＡの固定が助長された（図８Ｂ）（Antaoら、Nucleic Acids Research,19:5901-5905,1991）。ファージディスプレイ亜鉛フィンガータンパク質のアフィニティ選択のため、野性型Zif268の9-bp共通結合部位（5'-GCGTGGGCG-3'、枠内）を含むヘアピンＤＮＡを使用した。さらにアフィニティ選択のため、野性型Zif268の3-bpサブサイトを、共通HIV-1 ＤＮＡ配列の3-bpサブサイト（ボックス内）に取り替えた。
アミノリンカーによってヘアピン配列がアセチル化ＢＳＡに共有結合され、その後、選択実験のため、ポリスチレン製マイクロタイターウェルに吸着させて固定化した。ビオチニル化ヘアピン配列も、ストレプトアビジンコーティングプレートに固定された後、選択に際し、同様にうまく機能した。
前述のオーバーラップＰＣＲ突然変異誘発戦略を使用して、Zif268の３つのフィンガーのそれぞれのライブラリーが独立して構築された（Barbas IIIら、Proc.Natl.Acad.Svi.USA,89:4457-4461,1992および実施例2-6）。規定通りに構築され得るライブラリーのサイズに制約されて、ランダム化は６位置のみに限定された（BarbasIII,Curr.Opinion in Biotech.,4:526-530,1993）。ＤＮＡの亜鉛フィンガータンパク質認識は、ＤＮＡの主溝におけるタンパク質の逆平行配置が含まれる。すなわち、アミノ末端領域が標的配列と3'接触に関与し、他方カルボキシル末端領域は5'接触に関与する（図８Ｂ）。得られたフィンガー／ＤＮＡサブサイト複合体内で、接触により逆平行が保持され、そこは、Zif268のフィンガー１においては、ヘリックス位置-1および６のArgのグアニジウム基とGCG標的配列のそれぞれの3'および5'グアニンとの水素結合である。Zif268のフィンガー２、GLIのフィンガー４および５、ならびにTTKのフィンガー１および２において、ヘリックス位置３残基の側鎖による３重サブサイト配列の中央塩基との接触が観察された。報告された亜鉛フィンガー／ＤＮＡ複合体の３つの結晶構造の中では、４を除く-1から６までの残基の側鎖間で直接の塩基の接触が観察されている（Pavletich,上記；Pavletich,Science,261: 1701-1707,1993; Fairallら、Nature,366:483-487,1993）。
これらの観察によると、フィンガー１および３ライブラリーにおいて、ヘリックス位置-1,2,3,4,5, および６に対応する残基がランダム化された。これらの実験において、位置１のSerは保存された。なぜならば、一般的に亜鉛フィンガー配列のこの位置でSerはよく保存され、Zif268においては完全に保存されるからである（Jacobs,EMBO J.,11:4507-4517,1992）。フィンガー２ライブラリーにおいて、別の突然変異誘導戦略を試みるため、ヘリックス位置-2,-1,1,2,3および４をランダム化し、-2位置を実験した。なぜなら、Zif268とGLI構造の両方がこの位置で燐酸塩との接触に関わることがわかっており、このドメインのその他の部分にも関連する影響を持つと考えられるからである。標的配列TTGが野性型TGG部位の5'チミジンを保持しているので、残基５および６を固定した。エレクトロポレーションによる連結ＤＮＡの導入によって、フィンガーライブラリー１，２および３それぞれについて、2×109,6×108および7×108の独立した形質転換細胞からなるライブラリーが構築された。各ライブラリーは野性型配列のその他の２つのフィンガーに関連した突然変異フィンガーをディスプレイする結果となった。
実施例10
選択されたフィンガーの配列分析
特定の標的に結合させるための亜鉛フィンガーの改変の可能性を調べ、また遺伝子治療の可能性を調べるため、標的配列としてHIV-1ゲノム内の保存配列を選択した。転写開始出発部位に関連する位置106-121のHIV-1 HXB2クローンの5'リーダー配列は、HIV-1ゲノム内のいくつかの保存領域の１つを表している（Yuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6340-6344,1993;Myersら、1992）。これらの実験のため、図８Ｂに示す９塩基対領域、113-121を標的とした。
天然の共通またはHIV-1標的配列との結合に関する選択に続いて、イムノスクリーニング検定によって、機能性亜鉛フィンガーを迅速に同定した。pAraHA誘導体中の選択タンパク質の発現の結果、変異Zif268タンパク質とペプチド標識配列との融合がモノクローナル抗体によって認識された（図８Ａ）。粗細胞破壊物を使用して、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて結合を測定した。親和性において少なくとも４倍の差異までの感度のこの方法論によって、特異性の定性評価もまた実行し得る。各選択からのいくつかの陽性クローンを配列決定し、これを図９に示す。フィンガー１および３の６ランダム化残基はαヘリックス領域の位置-1,2,3,4,5および６にあり、フィンガー２においては-2,-1,1,2,3および４にある（図９）。この３つのヌクレオチドは各フィンガーのアフィニティ選択に使用される結合部位を表す。詳細に研究したタンパク質をクローンの指定とともに示す。
共通結合部位GCGを有するフィンガー１の選択は位置-1のLysおよび位置６のArgに強い選択を示した。それぞれ位置-1および２にLysおよびCysを含む３つのクローンにおいて、これらの位置間の共変異が観察された。配列決定した12のクローン内３つに見られたこの事実に基づく選択において、クローンＣ７を優先的に純化した。この領域、TGTにおけるHIV-1標的配列に対立する選択は、位置-1における水素結合側鎖を有する残基への選択と位置３におけるGlnへの控えめな選択（modest selection）を有する多様性のある配列を示した。共通TGGサブサイトに対立するフィンガー２の選択は-1位における芳香族残基への選択を、またHIV-1標的TTGに対立する選択はこの位置における塩基性残基への選択を示した。位置３におけるSerへの優先性はチミジンの認識に関連するようである。GLIおよびTTK構造においてチミンとSerの接触が観察されている（Pavletich,上記；Fairallら、上記）。このテーブル内で、共通残基に対するその他の控えめな選択が観察された。選択は大腸菌のsupE株を使用して実施し、その結果、翻訳中アンバーコドンTAGをGlnとして読みとった。図９に示した51配列の内、14クローンが単一アンバーコドンを所有していた。どのクローンも１以下のアンバーコドンしか所有していなかった。supE株のアンバー停止コドンの抑制の選択は他のＤＮＡ結合タンパク質ライブラリーにおいて見られ、おそらくライブラリーの性質を改良すると思われる。なぜならば、この残基はＤＮＡ結合タンパク質における接触残基としてしばしば使用されるからである（Huangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3969-3973,1994）。遊離のシステインを含有するフィンガーに対する選択も見られ、おそらく実験処方を反映しているものと思われる。正しく折りたたまれたフィンガーを担持するファージの数を最大にするため、Zn+2およびＤＴＴを含有する緩衝液中でファージをインキュベートした。おそらく凝集または正しくない折りたたみのためと推測される、遊離のシステインに対立する選択が、他のタンパク質のファージディスプレイライブラリーにおいて、以前に言及されている（Lowmanら、J.Mol.Biol.,234:564-578,1993）。
さらに特性決定するため、Ｔ７プロモーターを使用して、亜鉛フィンガータンパク質の高レベル発現を達成した（図10）（Studierら、上記）。図10において、タンパク質を15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Coomassie brilliant blueで染色した。レーン１：分子量標準（kDa）。レーン２：ＩＰＴＧ誘導前の細胞抽出物。レーン３：ＩＰＴＧ誘導後の細胞抽出物。レーン４：遠心分離による封入体除去後の細胞質画分。レーン５：亜鉛フィンガーペプチドを含有する封入体。レーン６：Heparin-Sepharose FPLCによって精製した突然変異Zif268ペプチド。クローンＣ10,Ｆ8およびＧ3のそれぞれは、この系で発現する前に、GlnをコードするようにCAGに変わったアンバーコドンを所有していた。
実施例11
親和性および特異性の特性決定
特異性または親和性の変化の機構の見通しを得るため、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）におけるリアルタイム変化を使用して、結合動力学を測定した（Malmqvist、上記）。11タンパク質の速度定数および算出した平衡解離定数を図11に示す。研究した各亜鉛フィンガータンパク質をクローンの指定によって示す（配列については図９参照）。各フィンガーの選択のために使用した標的ＤＮＡ部位を太字で示す。野性型タンパク質への共通結合部位もまた太字で示す。２つの一本鎖ＤＮＡをアニーリングすることによって、非ヘアピン二本鎖ＤＮＡ（下線部）を製造した。各タンパク質について、ｋon、会合速度；ｋoff、解離速度；Ｋd、平衡解離定数を示す。
設計されたヘアピン形態の、またはテトラチミジンループを欠いた線状の二本鎖の形態の共通配列へのZif268の結合に関する算出平衡解離定数は実質的に同一であり、このタンパク質によって認識された二本鎖配列（duplex sequence）のコンフォーメーションがヘアピン内のコンフォーメーションと変わりがないことを示唆している。Zif268の共通配列への結合に関する数値6.5nMは、各種長さおよび配列のオリゴヌクレオチド内の共通配列へのこのタンパク質結合に関する、電気泳動易動度シフト検定を使用して報告されている、0.5-6nMの範囲内である（Pavletich,上記；Rebar,上記；Jamiesonら、上記）。
特異性の測定として、天然共通配列および１フィンガーサブサイトが変化した変異配列への結合に関する各タンパク質の親和性を測定した。図11は表面プラスモン共鳴におけるリアルタイム変化による、野性型Zif268タンパク質（ＷＴ）およびその変異型Ｃ７の解離速度（ｋoff）の測定を示す。装置の応答、ｒは［タンパク質−ＤＮＡ］複合体に比例する。［タンパク質］＝０のとき、dr/dt＝ｋoffｒであるから、ｋoff＝ln（rtl/rtn）／（tn-tl）、ここでrtnは時間tnにおける応答である。各タンパク質に関する単一実験の結果を示す。図11に示す値を得るため、３回の実験を実施した。クローンＣ７は野性型配列GCGの結合に関する親和性において13倍向上した。この親和性の向上への主な寄与は複合体の解離速度が５倍遅いことである（図12）。Ｃ７タンパク質の特異性もHIV-1標的配列に関して９倍向上した。この結果は複合体内でのさらに別の、またはより改善された接触があることを示唆している。タンパク質Ｃ９の研究は、向上した特異性について別のメカニズムを示している。この場合、GCG部位に関するＣ９の総親和性はZif268に等しいが、この複合体の解離速度（off-rate）が増大するため、TGT標的部位への結合に関して、特異性はZif268よりも３倍向上する。タンパク質Ｆ８およびＦ15の特性決定により、フィンガー１の３塩基対認識サブサイトが完全にTGTに変化し、この部位に結合するのに新しいフィンガーが選択され得ることが示される。
フィンガー２ドメインが改変され、TTGサブサイトに結合するよう選択されたタンパク質の特性決定によると、このフィンガーの特異性は改変されやすいことが示された。タンパク質Ｇ４およびＧ６は、Zif268がその共通標的に結合するのと同等の親和性を有する新規なサブサイトを担持するオリゴヌクレオチドに結合する。結合するように選択された標的に関するこれらのタンパク質の特異性は、単一の塩基対が異なる天然の結合部位に比較して、このオリゴヌクレオチドに関して約４倍良好な親和性を示している。この差異の程度は、フィンガー１変異体について報告されているものと同程度である（Jamiesonら、上記）。フィンガー３が改変されたタンパク質Ａ14は、天然フィンガー３サブサイトに結合するように選択され、Zif268よりもわずかに２倍低い親和性でこの部位に結合する。タンパク質Ａ14は認識サブサイトにおいて、天然タンパク質から配列が強度に異なることに注意されたい。特性決定した11のタンパク質の内10種における配列特異性は、複合体の安定性の差異によってもたらされるものだった。単一のタンパク質、Ｇ６のみが会合速度（on-rate）における劇的変化のある特異性を示した。会合速度の変化とタンパク質の荷電変化についての実験は相関関係を示さなかった。
実施例１２
二量体亜鉛フィンガーの構築
本発明の亜鉛フィンガータンパク質は広範囲の標的配列を認識し結合するように加工することができる。例えば、約２から12亜鉛フィンガーを含有する亜鉛フィンガータンパク質、Zif(2)-Zif(12)を、タンパク質のbZIP群の原型種であるJun/Fosタンパク質のロイシンジッパードメインに融合させることができる（O'Sheaら、Science,254:539,1991）。別法として、亜鉛フィンガータンパク質を、ヘテロ二量体を形成することができ、二量体化ドメインを含む他のタンパク質に融合させることができる。こうしたタンパク質は当業者に知られているはずである。
Jun/Fosロイシンジッパーは優先的にヘテロ二量体を形成し、これによって12〜72塩基対の認識ができる。以後は、Jun/Fosをこれらのタンパク質のロイシンジッパードメインを示すものとする。タンパク質を連結させるのに当業界で通常使用される方法によって、亜鉛フィンガータンパク質がJunに、また独立してFosに融合される。Zif-JunおよびZif-Fos構築物（それぞれ図13および14）を精製後、これらのタンパク質を混合して、Zif-Jun/Zif-Fosヘテロ二量体を自然に形成させる。別法として、これらのタンパク質をコードする遺伝子を共発現させて、その結果in vivoでZif-Jun/Zif-Fosヘテロ二量体を形成させる。Ｎ−末端核局在化シグナルと融合させることによって、核への発現を標的とすることができる（Calderonら、Cell,41:499,1982）。転写の活性化物質を製造するため、ロイシンジッパー融合構築物の１つまたはそれぞれに活性化ドメインを組み込むこともできる（Sadowskiら、Gene,118:137,1992）。これらの二量体構築物はさらに転写の特異的活性化または抑制化が可能である。これらのヘテロ二量体Zif構築物は、パリンドローム配列（JunおよびFosの両方の上のフィンガーが同一のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を認識する場合）または広範囲の非対称配列（JunおよびFosの上のフィンガーが異なるＤＮＡ／ＲＮＡ配列を認識する場合）を認識することができる点で有利である。例えば、パリンドローム配列
0004012243.tif 000008
はZif268-Fos/Zif268-Jun二量体によって認識される（ｘは任意の数）。サブサイト間のスペーシングは、ZifのJunまたはFosジッパードメインとの融合部位およびZifおよびジッパードメイン間のリンカーの長さによって決定される。サブサイトスペーシングは当業者に一般的な結合部位選択方法によって決定される（Thiesenら、Nucleic Acids Research,18:3203,1990）。広範囲の非対称配列の認識の例はZif(C7)6-Jun/Zif268-Fos二量体によって示される。このタンパク質はJunに連結したＣ７型（実施例11）の６フィンガーおよびFosに連結したZif268の３フィンガーからなっており、以下の広範囲の配列を認識する。
0004012243.tif 000009
実施例１３
Zif268の第１フィンガーの繰り返しを利用したマルチフィンガータンパク質の構築
フィンガー１の特異性および親和性が改変されたZif268タンパク質の突然変異誘発および変異体の選択（実施例７参照）後、当業界で知られた方法によってＴＧＥＫＰリンカー配列を使用し、フィンガーの多重コピーを保有するタンパク質を構築することができる。例えば、以下のスキームにしたがって、Ｃ７フィンガーを構築することができる。
0004012243.tif 000010
ここで最後のリンカーの配列は変更される。なぜなら、これは末端にあって２つのフィンガーを連結するのに関与しないからである。Ｃ７の３つのフィンガー構築物の例を図15に示す。このタンパク質は、GCG-TGG-GCG配列をコードするオリゴヌクレオチドについての300nMの親和性と比較して、オリゴヌクレオチドヘアピンCCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC GAGG中の設計された標的配列GCG-GCG-GCG（配列番号３２）と、９nMの親和性で結合する（表面プラスモン共鳴試験によって決定）。Ｃ７フィンガーの2-12コピーを含むタンパク質が構築され、ＥＬＩＳＡによって決定したところ、予測された標的に特異性を有することが示された（例えば、実施例７参照）。利用するフィンガーは同一である必要はなく、目的とする標的配列を認識するタンパク質を生成するように混合し組合せてよい。これらはロイシンジッパー（例えばFos/Jun）とともに使用して、広範囲の配列認識をするタンパク質を製造してもよい。
フィンガー１のポリマーを製造する他に、広範囲の認識部位を有するタンパク質を製造するため、共通のリンカーＴＧＥＫＰを使用して、Zif268の３フィンガー全部およびそれらの中の改変体を融合してもよい。例えば、図16はＴＧＥＫＰリンカーを使用して、天然タンパク質をそれ自身と融合させたタンパク質、Zif268-Zif268の配列を示す。このタンパク質はＥＬＩＳＡによって示されたところでは、今度は配列GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCGと結合する。したがって、Zif268の３フィンガー内での改変物を互いに融合させて、広範囲の配列を認識するタンパク質を形成させてもよい。これらの新規亜鉛タンパク質もまた、必要ならば、実施例12に記載したように、ロイシンジッパーと組み合わせて使用してもよい。
配列表
(2)配列番号：１の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２５アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．２５
(C)他の情報：／注＝Tyrが存在する場所では、TyrはPheであってもよい
(xi)配列：配列番号：１：
0004012243.tif 000011
(2)配列番号：２の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：３６塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＦ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．３６
(xi)配列：配列番号：２：
0004012243.tif 000012
(2)配列番号：３の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：４５塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＲ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．４５
(xi)配列：配列番号：３：
0004012243.tif 000013
(2)配列番号：４の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２７３塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ｚｉｆ２６８Ｘｈｏ−Ｓｐｅ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２７３
(xi)配列：配列番号：４：
0004012243.tif 000014
(2)配列番号：５の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：９１アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：５：
0004012243.tif 000015
(2)配列番号：６の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２２塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：FTX3
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２２
(i)配列：配列番号：６：
0004012243.tif 000016
(2)配列番号：７の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：BZF3
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２１
(xi)配列：配列番号：７：
0004012243.tif 000017
(2)配列番号：８の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：６０塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＦ３６Ｋ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．６０
(xi)配列：配列番号：８：
0004012243.tif 000018
(2)配列番号：９の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：Ｒ３Ｂ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２１
(xi)配列：配列番号：９：
0004012243.tif 000019
(2)配列番号：１０の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＦＮｓｉ−Ｂ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２１
(xi)配列：配列番号：１０：
0004012243.tif 000020
(2)配列番号：１１の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：６６塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＦ２ｒ６Ｆ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．６６
(xi)配列：配列番号：１１：
0004012243.tif 000021
(2)配列番号：１２の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：６６塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＡＦ１６ｒｂ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．６６
(xi)配列：配列番号：１２：
0004012243.tif 000022
(2)配列番号：１３の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２４塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(vii)直接の起源：
(B)クローン：ＺＦＩＦ
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２４
(xi)配列：配列番号：１３：
0004012243.tif 000023
(2)配列番号：１４の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：１４：
0004012243.tif 000024
(2)配列番号：１５の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．６
(xi)配列：配列番号：１５：
0004012243.tif 000025
(2)配列番号：１６の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：３４塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．３４
(xi)配列：配列番号：１６：
0004012243.tif 000026
(2)配列番号：１７の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：１７：
0004012243.tif 000027
(2)配列番号：１８の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：１８：
0004012243.tif 000028
(2)配列番号：１９の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：１９：
0004012243.tif 000029
(2)配列番号：２０の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：２０：
0004012243.tif 000030
(2)配列番号：２１の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：２１：
0004012243.tif 000031
(2)配列番号：２２の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：２２：
0004012243.tif 000032
(2)配列番号：２３の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：６１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．６１
(xi)配列：配列番号：２３：
0004012243.tif 000033
(2)配列番号：２４の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．２６
(xi)配列：配列番号：２４：
0004012243.tif 000034
(2)配列番号：２５の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．２６
(xi)配列：配列番号：２５：
0004012243.tif 000035
(2)配列番号：２６の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．２６
(xi)配列：配列番号：２６：
0004012243.tif 000036
(2)配列番号：２７の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：１３塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．１３
(xi)配列：配列番号：２７：
0004012243.tif 000037
(2)配列番号：２８の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１．．８
(xi)配列：配列番号：２８：
0004012243.tif 000038
(2)配列番号：２９の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２１
(xi)配列：配列番号：２９：
0004012243.tif 000039
(2)配列番号：３０の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：２１塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．２１
(xi)配列：配列番号：３０：
0004012243.tif 000040
(2)配列番号：３１の情報
(i)配列の特性
(A)配列の長さ：３４塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．３４
(xi)配列：配列番号：３１：
0004012243.tif 000041
本発明は、目下の好適な実施態様について記載されているが、本発明の本質から離れることなく、種々の改良を行うことができることを理解すべきである。したがって、本発明は下記のクレームによってのみ限定される。
【図１】
0004012243.tif 000042
【図２Ａ】
0004012243.tif 000043
【図２Ｂ】
0004012243.tif 000044
【図３】
0004012243.tif 000045
【図４】
0004012243.tif 000046
【図５】
0004012243.tif 000047
【図６】
0004012243.tif 000048
【図７】
0004012243.tif 000049
【図８Ａ】
0004012243.tif 000050
【図８Ｂ】
0004012243.tif 000051
【図９】
0004012243.tif 000052
【図１０】
0004012243.tif 000053
【図１１】
0004012243.tif 000054
【図１２】
0004012243.tif 000055
【図１３Ａ】
0004012243.tif 000056
【図１３Ｂ】
0004012243.tif 000057
【図１４Ａ】
0004012243.tif 000058
【図１４Ｂ】
0004012243.tif 000059
【図１５】
0004012243.tif 000060
【図１６Ａ】
0004012243.tif 000061
【図１６Ｂ】
0004012243.tif 000062