(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族基１個当たり平均０．５〜２．０個のスルホン酸基を有する、芳香族スルホン酸とアルデヒドとの縮合ポリマー又はその塩を生理学的に許容される担体中に含んでなる、個体におけるＨＩＶ感染を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
経膣的又は経直腸的に投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
生理学的に許容される担体が避妊薬の処方である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
生理学的に許容される担体が避妊用ゲル、クリーム又はフォームである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
非経口的に投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
縮合ポリマーがナフタレンスルホン酸とホルムアルデヒドとの縮合ポリマーである、請求項１〜５いずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
縮合ポリマーが５０ｋＤａ未満のピーク分子量を有する、請求項１〜６いずれか記載の医薬組成物。
【請求項８】
縮合ポリマーが０．７ｋＤａから５０ｋＤａのピーク分子量を有する請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
縮合ポリマーが１．３ｋＤａから３０ｋＤａのピーク分子量を有する請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
縮合ポリマーが４ｋＤａから１２ｋＤのピーク分子量を有する請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
縮合ポリマーが、芳香族基１個当たり平均１個のスルホン酸基を有するものである、請求項１〜１０いずれか記載の医薬組成物。
【請求項１２】
縮合ポリマーが少なくとも７の治療比（therapeutic ratio）を有するものである、請求項１〜１１いずれか記載の医薬組成物。
【請求項１３】
縮合ポリマーが少なくとも２０の治療比（therapeutic ratio）を有するものである、請求項１２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ＣＤ４＋細胞と呼ばれるＴリンパ球サブセット上に発見された表面糖タンパク質受容体であるＣＤ４は、クラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）認識に関与しており、クラスＩＩのＭＨＣの生理学的受容体であると思われる。ヒトＣＤ４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の受容体でもあり、宿主細胞へのウイルスの侵入と膜融合（いずれもウイルスの細胞間移動とその細胞変性作用に寄与している）に不可欠である。ＨＩＶは免疫系を攻撃しＣＤ４＋細胞を破壊する結果、細菌やウイルス病原体の攻撃に対して生体を無防備にしてしまうことでエイズを引き起こすことが知られている。ＣＤ４は、ＨＩＶがＣＤ４に結合することによりＣＤ４＋細胞に侵入する主な経路となっていることが示されている。
生命を脅かすＨＩＶ感染の作用を遅延または正常化させる手段を提供することを目指して、ＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用や、その相互作用の抑制または阻害を研究するのに多大な努力が払われてきた。今日までに、ＨＩＶによる細胞への感染およびその影響を抑制するジドブジン（ＡＺＴとも呼ばれる）やジデオキシイノシン（ｄｄＩ）などの抗ウイルス薬がいくつか開発されている。ＣＤ４保持リンパ球は循環Ｔリンパ球集団全体の約６０〜８０％を占めるが、このリンパ球にＨＩＶが感染すると免疫系が完全に破壊される可能性があるという事実に鑑みると、このリンパ球のＨＩＶ感染予防手段が開発されると大いに有用であろう。また、ウイルスの治療抵抗性の発現も回避されるものと期待される。硫酸デキストランという化合物はＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用を抑制することが判明したが、この化合物は許容できないレベルの抗凝血活性も示した。かなりのレベルの抗凝血活性を回避しつつ、エイズ関連症候群（ＡＲＣ）、エイズ関連痴呆、無症状性ＨＩＶ感染などのＣＤ４関連疾患の治療に使用することができる薬剤が開発されると、さらに有用性が高いであろう。
これまでも多くのホルムアルデヒドと芳香族スルホン酸との縮合ポリマーが記載されている。米国特許第４，６０４，４０４号には、抗ウイルス剤などのポリマーを単純ヘルペスウイルスに対して使用することが開示されているが、この特許文献は上記化合物をＨＩＶ感染や関連の疾患および病態の治療に使用することについて言及も示唆もしていない。
発明の概要
本発明は、芳香族スルホン酸とアルデヒドの縮合ポリマーおよびその画分、とくにナフタレンスルホン酸とホルムアルデヒドのポリマー（ＰＲＯ  １０４１やＰＩＣ  ０２４．４、および以下に定義するそれらの画分など）は、ＣＤ４／ｇｐ１２０結合測定で示されるようにＨＩＶ  ｇｐ１２０のＣＤ４への結合を阻害しうるという発見に関する。本発明の化合物は、細胞毒性や抗原誘導性Ｔリンパ球増殖に対する阻害性がなく、ＣＤ２／ＬＦＡ−３（リンパ球機能関連抗原（ＣＤ５８）結合測定において阻害性を示さないという特異性を示すことが明らかにされている。これらの発見に基づき、芳香族スルホン酸とアルデヒドの縮合ポリマーおよびそれらの画分を、後天性免疫不全症候群（エイズ）ならびにエイズ関連症候群（ＡＲＣ）、エイズ関連痴呆、および無症状性ＨＩＶ感染の治療に治療薬として使用することができる。本発明の化合物は、血液調製物に含まれるＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を予防するためにイン・ビトロで血液調製物を処理する目的にも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＩＣ  ０２４．４（白抜き四角で示す）およびＰＲＯ  １０４１（黒塗り丸で示す）による固定化可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）へのｇｐ１２０結合の阻害を示すグラフである。
図２は、ＰＩＣ  ０２４．４（白抜き四角で示す）およびＡＺＴ（黒塗り菱形で示す）のＨＩＶ（ＪＲ−ＣＳＦ株）に対するイン・ビトロ抗ＨＩＶ活性を示すグラフである。
図３は、ＰＩＣ  ０２４．４（７日目は白抜き四角、１４日目は黒塗り四角で示す）およびＡＺＴ（７日目は白抜き丸、１４日目は黒塗り丸で示す）が７日目および１４日目に示したイン・ビトロ抗ＨＩＶ（ＡＤＡ株）活性を示すグラフである。
図４は、それぞれ５．６ｋＤａ（白抜き四角）、１０ｋＤａ（黒塗り四角）、１６ｋＤａ（白抜き丸）、および３１ｋＤａ（黒塗り丸）のピーク分子量を有するＰＲＯ  １１３５の画分のサイズと活性の関係をｇｐ１２０のｓＣＤ４への結合阻害（エライザ（Elisa））を指標として表したグラフである。
図５は、それぞれ５．６ｋＤａ（白抜き四角）、１０ｋＤａ（黒塗り四角）、１６ｋＤａ（白抜き丸）、および３１ｋＤａ（黒塗り丸）のピーク分子量を有するＰＲＯ  １１３５の画分のサイズと活性の関係をｇｐ１２０のＣＤ４／ｇｐ１２０における結合の阻害を指標として表したグラフである（結合測定法：細胞法）。
図６は、ＰＲＯ  １１３５の３１ｋＤａ（白抜き四角）、１０ｋＤａ（黒塗り四角）、および５．６ｋＤａ（黒塗り菱形）画分の抗凝血活性示すグラフである。
図７は、ホルムアルデヒド−２−ナフタレンスルホン酸縮合オリゴマーのＰＲＯ  １１９１（オクタマー、白抜き四角）およびＰＲＯ  １０７２（テトラマー、白抜き菱形）について、細胞測定法で測定したｇｐ１２０のＣＤ４への結合の阻害を示すグラフである。ＰＲＯ  １１９１とＰＲＯ  １０７２はそれぞれ５２と７８のＩＣ50値を示した。
図８は、ホルムアルデヒド−２−ナフタレンスルホン酸縮合オリゴマーのＰＲＯ  １１９１（オクタマー、白抜き四角）、ＰＲＯ  １０７２（テトラマー、白抜き菱形）、およびＰＲＯ  １０７３（ヘキサマー、白抜き丸）について、エライザ測定法で測定したＣＤ４−ｇｐ１２０結合の阻害を示すグラフである。
発明の詳細な説明
芳香族スルホン酸とアルデヒドの縮合ポリマーの製造方法は当該分野においてよく知られている。本明細書で使用する場合、「芳香族スルホン酸」という用語は、１個以上のスルホン酸部分で置換された芳香族カルボン酸環および複素環を含むものとする。芳香族カルボン酸環としては、たとえばフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、ビフェニル、フェニルアルキルフェニル、フェニルアルケニルフェニル、フェノキシフェニル、フェニルチオフェニル、およびフェノキシアルコキシフェニルなどが挙げられる。芳香族複素環としては、たとえばピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、チオフェニル、フラニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピロリル、およびチアゾリルなどが挙げられる。本発明の化合物の製造に使用できるアルデヒドとしては、たとえばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、およびベンズアルデヒドなどが挙げられる。アルデヒドはホルムアルデヒドであることが好ましい。本明細書で使用する場合、「ポリマー」という用語は、２つ以上のモノマーすなわち反復単位を連結することによって形成されるすべての化合物を含むものとする。米国特許第４，６０４，４０４号には、本発明に有用な適当なポリマーおよびそれらの製造方法が例示されているが、この文献の記載内容は引例により本明細書に含まれるものとする。
あるいは、上記化合物の１種であるホルムアルデヒドとナフタレンスルホン酸の縮合ポリマーは、当該化合物を分散剤として添加したいくつかの化合物の混合物から成る市販染料のダイレクトイエロー２９などの染料組成物から単離することもできる。生理学的に許容される適当なビヒクルと組み合わせて処方する前に、沈殿、結晶化、抽出、および／またはクロマトグラフィーなどの既知の精製法を用いてＰＩＣ  ０２４．４を単離することで調製物を精製することができる。後者の１例を実施例で詳細に説明している。
本発明で使用する縮合ポリマーは、さらに分画して分子量範囲が狭いか単分散性分子量の縮合ポリマーを得ることもできる。
一般に、ポリマーの分子量が増大するとその化合物の治療効果も増大するが、化合物の抗凝血活性も分子量に伴い増大する。したがって、抗凝血作用を極力抑えながら最適な抗ウイルス活性が得られるように分子量を選択するのが有利である。
好ましい治療効果比が得られる化合物を選択することができる。本明細書で使用する「治療効果比」という用語は、下記の抗凝血活性測定法を用いて求めた正常部分トロンボプラスチン時間上限値の平均２倍の抗凝血時間を得るのに要する用量（μｇ／ｍｌ）を下記の細胞測定法で求めたＣＤ４−ｇｐ１２０結合の５０％阻害に要する用量（μｇ／ｍｌ）で割った値と定義する。治療比は少なくとも約７が好ましく、少なくとも約２０が最も好ましい。
ピーク分子量（Ｍｐ）は約５０ｋＤａ未満および／または約０．７ｋＤａを越えるのが好ましい。ピーク分子量が約１．３ないし約３０ｋＤａのポリマーがさらに好ましく、約４ないし約１２ｋＤａが最も好ましい。芳香族基１個あたりのスルホン酸の数の平均は約０．５ないし約２．０が好ましく、約１．０が最も好ましい。
上記分子量範囲が狭いか単分散性分子量のポリマーは、溶媒沈殿法、ゲル浸透クロマトグラフィー、塩析法、および二重濾過法（difiltration）など当該分野において既知の分画方法（たとえばポリマーフラクショネーション（Polymer Fractionation）、Cantow and Manfred，Jr．編、Acad．Press発行、1967年参照）によって製造することができる。あるいは、上記ポリマーは、ナフタレンスルホン酸とホルムアルデヒドを段階的または制御的に縮合させることで製造することもできる。
一次結合測定法で、ＰＩＣ  ０２４．４はＣＤ４／ｇｐ１２０結合を阻害した。この化合物は、イン・ビトロ測定で、ＨＩＶ株であるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、ＪＲ−ＣＳＦ、およびＡＤＡに対して抗ウイルス活性を示した。さらに、この化合物は、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用およびＴ細胞増殖を抑制する活性や調べた様々な細胞系に対する毒性を示さなかったことから、その作用は特異的であり、そして細胞毒性を示さないことがわかった。以下、このデータについてさらに詳細に説明するが、上記タイプの縮合ポリマーはＨＩＶウイルスに対して抗ウイルス剤として作用するものと結論付けられる。
本明細書に示した結果から判断すると、ＰＲＯ  １０４１やＰＩＣ  ０２４．４などのホルムアルデヒドと芳香族スルホン酸の縮合ポリマーを含む製剤は、ＨＩＶ感染のＣＤ４媒介段階すべてをブロックしうるといえる。したがって、これらの製剤はＨＩＶに感染した個体をイン・ビボで（たとえば被感染者に投与するなどの手段による）治療する目的に使用することができる。該化合物は、ＨＩＶウイルスの非合胞体誘導性（ＮＳＩ）および合胞体誘導性（ＳＩ）表現型によるＣＤ４媒介感染を抑える作用を示す。また、未感染者（誤って注射針を刺してしまった場合や、母親から新生児への感染など）やＨＩＶ抗体陽性であるが無症状の者に対して予防的に使用することもできる。該製剤はＣＤ４リンパ球へのＨＩＶの結合を阻害したり、合胞体の形成により媒介されるＨＩＶ感染を含む、感染細胞から未感染細胞へのウイルス伝播を阻害する目的に使用することができる。該化合物はＣＤ４へのＨＩＶの結合を阻害し、この阻害は免疫系特異的干渉現象であるため、ウイルスの抵抗性の発現はないと思われる。
本発明の縮合ポリマーは薬学的に許容される塩として投与してもよい。適当な塩の例としては、カルシウム塩、ナトリウム塩、およびアンモニウム塩などのアルカリ土類塩、アルカリ金属塩、アンモニウム塩が挙げられる。
本発明の製剤は、経膣的または経直腸的（たとえば避妊薬や座剤）、経口的（たとえばカプセル剤、錠剤、液剤）、非経口的（たとえば筋肉内注射剤、静脈内注射剤、皮下注射剤）、局所塗布的、経鼻的に、または徐放性マイクロ担体を用いて、生理的に許容されるビヒクルと任意に選ばれるアジュバントと保存料とを含有する投与処方として投与することができる。生理的に許容される適当なビヒクルとしては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液などが挙げられる。具体的には、たとえば米国薬局方塩化ナトリウム注射液（０．９％）、米国薬局方リンゲル注射液、米国薬局方乳酸添加リンゲル注射液、米国薬局方乳酸ナトリウム注射液、米国薬局方デキストロース注射液（５％または１０％）、米国薬局方注射用静菌水、および米国薬局方注射用滅菌水などが使用できる。本発明の化合物は、避妊用ゲル剤、クリーム剤、またはフォーム剤などの避妊処方として投与するのが有利である。有効成分の具体的用量は、その製剤の生物学的活性、患者の年齢、体重、性別、全身健康状態、およびエイズの臨床経過段階など複数の因子によって決まる。
ＨＩＶウイルスの複製を抑制するその他の抗ウイルス剤を本発明の方法に従い、本発明の製剤と組み合わせて投与することができる。抗ウイルス剤を併用投与すると、ウイルスのライフサイクルの様々な段階を効果的に抑制することができるので、ウイルス感染能およびそれに関連する症状を減少または除去するという本発明の製剤の治療効果を最大限に発揮させることができる。たとえば、ジドブジン（ＡＺＴ）やジデオキシイノシン（ｄｄＩ）などのＨＩＶ逆転写酵素阻害剤やＨＩＶプロテアーゼやネビラピンなどの非ヌクレオシド系阻害剤を本発明の縮合ポリマーと別処方として併用投与してもよいし、本発明の縮合ポリマーやその他の単数または複数の抗ウイルス剤とを含有する単一の投与処方として併用投与してもよい。
また、本発明の化合物はイン・ビトロで血液調製物に添加することもできる。この態様においては、本発明の化合物はウイルスの結合とＣＤ４＋細胞への侵入を効果的にブロックし、Ｔ細胞への感染を予防する。本発明の化合物は、血液調製物に対して単独で添加してもよいし、たとえば食塩滅菌水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液などの適当なビヒクルと組み合わせて添加してもよい。必要な有効量は、血液製剤の種類や選んだビヒクルの種類など複数の因子によって決まる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
ＰＩＣ  ０２４．４の単離と特性分析
１０．０ｇのダイレクトイエロー２９（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company）、ロット番号００３３１８７；シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）、ロット番号１７Ｆ３４８４）を２００ｍｌの水に溶かし、この水溶液をトリフルオロ酢酸（トリフルオロ酢酸最終濃度０．１％）で酸性化し、４℃で１時間攪拌した。沈殿を濾去し、濾液をプレパックＲＣＭ（PrePak RCM）カートリッジカラムアセンブリー（ウオータース・クロマトグラフィー（Waters Chromatography），Division of Millipore，Milford，MA）を取付けたウオータース６００Ｅシステムを用いる分取用高速液体クロマトグラフィーに付した。移動相は、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル／水溶液（６０：４０）（溶媒Ｂ）から成るものであった。溶媒Ａ７０％対溶媒Ｂ３０％の当初溶媒混合比、流速２５ｍｌ／分で４０ｘ３００ｍｍデルタパック（DeltaPakTM）Ｃ18カラム（粒径１５μｍ、平均孔隙径３００オングストローム）を用い、原液（５ｍｌ）をカラムにかけた。溶媒Ｂの濃度を１．２％／分の割合で７０％まで上昇させた後、１５％／分の割合で１００％まで上昇させた。２８０ｎｍでモニターしながら、１０．０〜２１．８分にかけて溶出する物質を集め、濃縮して、ＰＩＣ  ０２４．４を得た。
ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ、ＵＶ、および蛍光測定法など様々な手法を用いてＰＩＣ  ０２４．４の特性分析を行なった。
ＰＩＣ  ０２４．４の1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（２５０ＭＨｚ、Bruker社、ＤＭＳＯ−ｄ6）は下記のピークを示した：δ６．５−８．６（ｂｒ  ｍ）、４．８−５．０（ｂｒ  ｓ）、４．２−５．０  ｐｐｍ（ｂｒ  ｓ）。
ＰＩＣ  ０２４．４のＩＲ（ＦＴ、Perkin Elmer社、ＫＢｒ）では、３４４８、１６３０、１４００、１１８６、１１２２、１０３０、および６８０ｃｍ-1に主ピークが見られた。
縮合物の合成：重合
２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（１．１５ｇ、５ｍｍｏｌ）、３７％ホルムアルデヒド水溶液（０．６５ｍｌ、約６ｍｍｏｌ）、およびスルホン酸（０．７ｇ濃硫酸を０．５ｍｌの水に溶かしたもの）の混合物を９８〜１００℃で４３時間加熱した。次いで、反応混合物を水（３０ｍｌ）で希釈し、炭酸カルシウムでｐＨ７まで中和し、濾過し、濾液を蒸発乾固させて、１．２２ｇの縮合物ＰＲＯ  １０４１を得た。
この生成物の1Ｈ  ＮＭＲとＩＲは上記したＰＩＣ  ０２４．４のデータと似ていることがわかった。
表１に例示したように反応パラメータを変更して上記実験を繰り返した。
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縮合物の合成：段階別
５−ブロモ−２−ナフタレンスルホン酸
攪拌下、５−アミノ−２−ナフタレンスルホン酸（１１．１５ｇ、５０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液に溶かした。得られた暗赤色溶液に水（約１００ｇ）を加えて、０℃まで冷やした。氷が完全に解ける前に、２０ｍｌの４０％ＨＢｒ水溶液を滴下し、生じた懸濁液を−５〜０℃に保った後、３０分かけて１０ｍｌのＮａＮＯ2（３．６５ｇ）水溶液を加えた。混合物を−５〜０℃で３０分間連続攪拌した。反応終了時に３５０ｍｇの尿素を加えて、未反応のＮａＮＯ2を分解した。生じた暗色ジアゾニウム懸濁液を０℃以下に保ち、４０ｍｌの４０％ＨＢｒにＣｕＢｒ（７．１５ｇ）を溶かしたものを１時間かけて７０℃で激しく攪拌しながら滴下した（ＣｕＢｒ溶液は１０００ｍｌフラスコに入れた）。生じた暗色混合物を８０℃で４０分間攪拌した後、室温まで冷やし、２００ｍｌの水を加えた。沈殿をブフナーロートで集め、約５０ｍｌの水で洗った。これを真空乾燥させたところ、１３．９ｇの粗製物が得られた。この粗製化合物を５００ｍｌの水中で２時間還流させ、室温まで冷やし、濾過した。濾液を蒸発乾固させ、得られた固体を真空乾燥させて、８．２３ｇ（収率５７％）の純粋品が得られた。
生成物の純度は逆相ＨＰＬＣと1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ）で確認した。
８，８’−メチレン−ビス−５−ブロモ−２−ナフタレンスルホン酸（ナトリウム塩）
５−ブロモ−２−ナフタレンスルホン酸（１７．２２ｇ）、ＴＦＡ（２００ｍｌ）、アンバーリスト−１５樹脂（１７ｇ、アルドリッチ）、パラホルムアルデヒド（４．５ｇ）、およびＨ2Ｏ（５０ｍｌ）の混合物を密閉した肉厚試験管中、１３０℃で１４時間加熱した。反応混合物を室温まで冷やした後、ブフナーロートで濾過し、集めた固体を約１０ｍｌのＴＦＡで洗い、２５０ｍｌのメタノール／水（４／１）に溶かし、濾過した。濾液を蒸発乾固させ、得られた固体を８０ｍｌの水に懸濁し、１０ＭのＮａＯＨでｐＨ約８まで中和した。固体を濾過し、６０ｍｌのアセトンで洗い、１晩真空乾燥させた。１５．０３ｇ（収率８０％）の純粋品が得られた。
８，８’−メチレン−ビス−２−ナフタレンスルホン酸
８，８’−メチレン−ビス−５−ブロモ−２−ナフタレンスルホン酸（ナトリウム塩、６．３０ｇ）とＮａＯＨ（０．３２ｇ）を３００ｍｌのＭｅＯＨに懸濁した液にアルゴン雰囲気下にＰｄ−Ｃ（１０％、５．０ｇ）を徐々に加えた。懸濁液を５０ｐｓｉのＨ2下に１８時間振とうした。次いで、混合物を濾過し、濾液を約２０ｇのＩＲ−１２０樹脂充填カラムに通した。溶媒をロータリーエバポレーター（rotavap）上で除去し、残留物を２００ｍｌの水に溶かした後、再び濾過した。濾液を５ＭのＮａＯＨでｐＨ約７まで中和し、約５０ｍｌ容量まで濃縮した後、攪拌しながら３００ｍｌのアセトンを徐々に加えた。生じた白色沈殿をブフナーロートで集め、２０ｍｌのアセトンで洗い、真空乾燥させたところ、３．５１ｇの乾燥品（ナトリウム塩）が得られた。
テトラマーとヘキサマーのオリゴマー化
ダイマーのナトリウム塩５．１１ｇを水中でＩＲ−１２０樹脂カラムに通すことによって遊離酸に変換した。ロータリーエバポレーター上で水を除去し、残留物を再び１０ｍｌの水に溶かし、肉厚フラスコに入れたＴＦＡ５０ｍｌに移した後、パラホルムアルデヒド（０．１９５ｇ）を加え、フラスコを封鎖した。溶液を６０〜６５℃で１５時間攪拌した。溶媒を除去し、残留物をメタノールに溶かし、シリコンゲル上に被覆し、フラッシュシリコンゲルカラム（EMサイエンシーズ、カラム用シリカゲル６０Ｆ−２５４、２３０〜４００メッシュ）に付し、当初混合比ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１６：１：１から最終混合比５：１：１への溶出を行なった。
テトラマー画分から得られた固体を、５ｍｌの水に溶かした５ＭのＮａＯＨでｐＨ約７まで中和し、５ｍｌのＭｅＯＨと１２５ｍｌのアセトンを加え、０．９４ｇの沈殿を得た。この沈殿塩をＩＲ−１２０樹脂に通すことによって遊離酸に変換し、０．７３ｇの乾燥テトラマーを得た。
テトラマーの取得に使用したものと同じ方法でヘキサマー画分から０．２１ｇのヘキサマーを得た。
最初の画分から３．５ｇの原料物質（ダイマー）が回収された。
オクタマー
テトラマー（１３０ｍｇ）、アンバーリスト−１５樹脂（１５０ｍｇ）、水（０．４ｍｌ）、およびパラホルムアルデヒドのＴＦＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌの混合物を８５℃で１５時間、テフロンキャップをかぶせたサンプルバイアル中で攪拌した。反応混合物を室温まで冷やし、５ｍｌの水で希釈し、濾過した。濾液を蒸発乾固させ、メタノールに溶かし、シリカゲル上に被覆した後、フラッシュカラムに通し、ＴＨＦ：イソプロパノール：Ｈ2Ｏ＝６：１：１でテトラマーを溶出させ、ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ（８５／１５）でオクタマーを溶出させた。後者画分から５０ｍｇの粗製オクタマーが得られた。
この粗製オクタマーをＩＲ−１２０樹脂に通し、逆相分取用ＨＰＬＣで精製し、１５ｍｇのオクタマー（分析用ＨＰＬＣによる測定純度９６．６％）を得た。
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＰＩＣ  ０２４．０とＰＲＯ  １０４１を、ゾルバクス（Zorbax）ＲＸ−Ｃ１８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ；粒径５μｍ、孔隙径９０オングストローム）を取付けたウオータース６２５ポンプ／４９０検出器／サテライトＷＩＳＰシステムを用いる分析用ＨＰＬＣに付した（MAC-MODアナリティカル、Chadds Ford，PA）。移動相は、０．１％のトリフルオロ酢酸の水溶液（溶媒Ａ）と、０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル／水溶液（６０：４０）（溶媒Ｂ）から成るものであった。当初混合比を溶媒Ａ９０％対溶媒Ｂ１０％として、流速１ｍｌ／分でサンプルを注入した。溶媒Ｂの濃度を２．５％／分の割合で１００％まで上昇させ、溶出を２３３ｎｍでモニターした。ＰＩＣ  ０２４．４とＰＲＯ  １０４１は類似のクロマトグラフィープロフィルを示した。
ＵＶ吸収スペクトル
ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に濃度約２μｇ／ｍｌで溶かしたＰＲＯ  １０４１およびＰＩＣ  ０２４．４の両者のサンプルにつき、１ｎｍのスペクトル解像度で２００ｎｍ〜３５０ｎｍの波長範囲について２０℃でＵＶスペクトルを記録した。スペクトル測定装置としてはパーキンエルマーラムダ６（Lambda ６）を使用し、経路長１ｃｍのキュベットを使用した。
ＰＲＯ  １０４１とＰＩＣ  ０２４．４の両者のスペクトルは２２８ｎｍに極大が見られた。両方の化合物のスペクトルには、３３０ｎｍにショルダーを有する２９６ｎｍの小さなバンドも見られた。
蛍光スペクトル測定
約２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶かしたＰＲＯ  １０４１およびＰＩＣ  ０２４．４の両者のサンプルにつき、２ｎｍのスペクトル解像度で３２０ｎｍ〜５００ｎｍの波長範囲について、２０℃で蛍光放射スペクトルを記録した。蛍光スペクトル測定装置はSLM-アミンコＳＰＦ５００Ｃを使用し励起波長は４ｎｍのバンドパスで３００ｎｍとした。経路長０．５ｃｍのキュベットを使用し容量は５００μｌとした。
ＰＲＯ  １０４１とＰＩＣ  ０２４．４はよく似た放射スペクトルを示し、約３５５ｎｍに極大吸収が見られた。
サイズ分画クロマトグラフィー
ウオータースＭ６２５ポンプとＭ９９６ダイオードアレイ検出器とミレニウム・ソフトウエアシステムと６μｍ２５０オングストロームのウオータース・ウルトラハイドロゲルカラム（７．８ｘ３００ｍｍ；移動相流速１ｍｌ／分）２本または１７μｍのトーソーハースＧ３０００ＰＷカラム（２１．５ｘ６００ｍｍ）１本とＴＳＫ−ゲル・ガードＰＷＨカラム（２１．５ｘ７５ｍｍ；流速３ｍｌ／分）を組み合わせて用いて、一定量の合成ポリマー溶液をサイズ別に分画した。移動相は、氷酢酸（ベーカーアナライズドＨＰＬＣ試薬）と水酸化アンモニウム（２５％、マリンクロット）から作成した０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．２）および３５％アセトニトリル（B&Jブランド）から成るものであった。使用に先立ち、移動相を０．４５μｍのナイロン膜で濾過し、等級５のヘリウムを吹き込んだ。最大２００μｌのミリキュー水（MilliQ Water）に２．２〜１０ｍｇの割合で溶かした合成サンプルの溶液をウルトラハイドロゲルに注入した。または、最大２ｍｌのミリキュー水移動相に４０〜３００ｍｇの割合で溶かしたもの（５０：５０、ｖ／ｖ）を、超音波処理（Branson 2200）、攪拌、および濾過（０．４５μｍアクロディスク、ゲルマンサイエンシーズ）した後、トーソーハース・カラムに注入した。集めた画分を溶出時間に応じてプールした。吸光度測定による重ね合わせ可能クロマトグラフィープロフィルを二連の実験によって証明し、Savant社製スピードバック（speed-vacs）を用いて溶媒を高温で除去した（ＳＣ２００とVapornet VN100またはPlusSC210A）。残留物を再び水に溶かし、乾燥させて、捕捉溶媒を除去した。乾燥物を秤量し、水に溶かし、２９０ｎｍにおける吸光度測定値を標準品と比較して原液濃度に対して正規化した。
このようにしてＰＲＯ  １１３５を画分したところ、ピーク分子量（Ｍｐ）それぞれ３１ｋＤａ（平均分子量ＭＷ＝３８ｋＤａ）、１６ｋＤａ（ＭＷ＝２２ｋＤａ）、１０ｋＤａ（ＭＷ＝１５ｋＤａ）、および５．６ｋＤａ（ＭＷ＝１０ｋＤａ）を有するポリマー画分が得られた。
光散乱法
サンプルを、ＰＤ２０００レーザー光散乱強度検出器（プリシジョン・ディテクターInc.，Amherst，MA）を内蔵したウオータース６２５ポンプ改良４１０ＲＩ検出器を用いる分析用ＨＰＬＣに付した。このシステムに、ウオータース・ウルトラハイドロゲル２５０水性ＧＰＣカラム（内径７．８ｍｍｘ３００ｍｍ；孔隙径２５０オングストローム、排除限界８ｘ１０4、ＰＥＯ）を取付けた。移動相は、アイソクラティックモード（isocratic mode）で６５％０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）／３５％アセトニトリルから成るもので、１ｍｌ／分の流速で使用した。溶出は、ＲＩおよび低角度（１５°）および高角度（９０°）光散乱でモニターし、このデータから絶対分子量範囲を求めた。
ＣＤ４への結合の証明
ＰＲＯ  １０４１、ＰＩＣ  ０２４．４及び分画産物の蛍光放射スペクトルを上記のように３１５ｎｍの励起波長を用いて記録した。次いで、野生型２ドメインの組換えＣＤ４（ＰＢＳ中の１３０μＭストック溶液を２０μｌ）を最終濃度５μＭになるように添加して測定を繰り返した。内部フィルター効果も蛍光シグナルも除去された３１５ｎｍの励起波長は付加的なタンパク質により与えられた。さらに、使用した試薬の低濃度により衝突による蛍光消光は顕著に除去された。従って、ＰＲＯ  １０４１及びＰＩＣ  ０２４．４の蛍光シグナルが両者とも６０〜７０％の消光を示したことは、受容体への結合の証拠である。
この実験において記載した研究に基づき、ＰＩＣ  ０２４．４をＰＲＯ  １０４１と同一の特性を有するナフタレンスクホン酸・ホルムアルデヒド縮合物、すなわち色素へのポリマー分散用付加物であると同定した。
ＣＤ４／ｇｐ１２０結合測定：細胞への
ＣＥＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤから入手可能なヒト細胞白血病細胞株、３×１０6細胞／ｍｌ）を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨバイオサイエンシース、レネクサ、ＫＳ）及び０．１％アジドナトリウムと共にＰＲＭＩ１６４０（ホイタッカー−バイオプロダクツ、ウオーカースビル、ＭＤ）中に懸濁した。この懸濁液１００μｌを各チューブに注入した。試験対象の化合物は、通常、最終濃度４ｍｇ／ｍｌになるように水に溶解した。ＰＩＣ  ０２４．４、ＰＲＯ  １０４１又は分画されたＰＲＯ  １１３５のさまざまな希釈液（１：４０、１：１００、１：２００）を上のチューブに添加し、２５℃で２時間インキュベートした。次に、ｇｐ１２０（アメリカン・バイオテクノロジース，Ｉｎｃ．，ケムブリッジ、ＭＡ）を、ＰＲＭＩ１６４０緩衝液に希釈して最終濃度１０ｎＭになるように添加した。ついで、この溶液を３７℃で一夜（約１６時間）インキュベートした。
細胞を、１０％ＦＢＳ及び０．１％のアジドナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で徹底的に洗浄した。結合ｇｐ１２０を明確にするために、次にｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体（ＮＥＮ−デュポン、ＮＥＡ−９２８４）を１μｇ／ｍｌ（チューブ当たり１００μｌ）の濃度でこの細胞と氷上で３０分間インキュベートした。この細胞を上記のように徹底的に洗浄し、フルオレセイン（チューブ当たり５０μｌ）で標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス、インディアナポリス、ＩＮ）で氷上３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎTM（ベクトン・ディキンソン）を用いて蛍光について分析した。
ＣＤ４／ｇｐ１２０結合測定：ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ（デュポン  ＮＥＮ、ボストン、ＭＡ）には、９６穴ミクロタイタープレートに固定されたチャイニーズハムスター卵巣細胞から精製された４−ドメイン可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）を用いた。ｇｐ１２０（２０ｎｇ／ｍｌで１ｎｇ）の５０μｌと適当な濃度の活性化合物５０μｌとを二連でミクロタイタープレートに添加し、４℃で一夜インキュベートした。このプレートを洗浄緩衝液（２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳ）で６回洗浄し、そして抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体１００μｌを添加した。プレートを４℃で２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で６回洗浄し、そしてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質溶液を用いて２５℃で３０分間発色させた。可溶性のバキュロウイルス由来ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ株）の濃度を増加させて用量−応答曲線を作成したところ、ｇｐ１２０の３０８−３２２残基に特異的なＨＲＰコンジュゲート化抗ｇｐ１２０モノクロナール抗体により検出したとき、１／２最大結合が２０ｎｇ／ｍｌの濃度であることを示した。従って、ポリマーのさまざまな濃度を固定量のｇｐ１２０（２０ｎｇ／ｍｌで１ｎｇ）の存在下にインキュベートしてＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用の阻害を評価した。
試験したポリマーのＩＣ50は表２に要約してある。
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ロゼット阻害測定：ＣＤ２／ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（ホイタッカー−バイオプロダクツ、ウオーカースビル、ＭＤ）を２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ、４０μｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間前処理し、ハンクの均衡塩溶液（ＨＢＳＳ  メディアテック）プラス２．５％ＦＣＳ中で洗浄し、そして１．５×１０9細胞／ｍｌになるように再懸濁した。ジャーカット細胞（Jurkat cells）をＨＢＳＳプラス２．５％ＦＣＳ中で洗浄し、同様に１．２５×１０7細胞／ｍｌになるように再懸濁した。ジャーカット細胞の２０μｌを種々の濃度でＰＩＣ  ０２４．４の２０μｌと４℃で３０分間インキュベートした。ＳＲＢＣ（１０μｌ中１．５×１０7）をジャーカット細胞に添加しそしてこれらの細胞を室温で５分間一緒にインキュベートし、３００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、氷上で１時間インキュベートした。細胞を穏やかに再懸濁し、ＨＢＳＳプラス２．５％ＦＣＳで希釈しそして血球計で観察した。
Ｔ細胞増殖測定
１．細胞
単核細胞（ＭＮＣ）を、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、風疹（rubella）、及び／又は破傷風菌毒素に応答性のあることが知られている供与者の末梢血から分離した。全血をＨＢＳＳで１：４に希釈し、フィコール−パーク（ファルマシアＬＫＢ  バイオテクノロジーＩｎｃ．、ピスカタウエーＮＪ）上に層状に載せ、そして１６００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ＭＮＣをＨＢＳＳで３回洗浄した後、５％ヒトＡＢ血清（フローラブス、マクリーン、ＶＡ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム及びＨＥＰＥＳを補足したＲＰＭＩ１６４０を含む培地中で培養した。増殖測定のために、細胞を９６穴丸底ミクロタイタープレート中、５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中で３７℃において培養液した。ジャーカット細胞は上記の補足物を加えたＲＰＭＩ１６４０プラス１０％ＦＣＳ中で維持した。
２．増殖測定
Ｔ細胞をウイルス抗原で刺激するために、ウエル当たり１０5ＭＮＣを阻害剤の存在下又は不存在下にＨＳＶ−１又は風疹感染細胞由来の濃縮培養液液の希釈液と共に培養液した。対照の上清（ＳＮ）として感染していない細胞（ミクロビクス  バイオシステムスＩｎｃ．トロント、オンタリオ）由来の培養液を使用した。ＳＮはガンマ照射により不活性化されたウイルスを含んでいた。ＨＳＶ−１培養は３日目に3Ｈ−チミジン（ＴｄＲ）でパルスし、４日目に収穫した。風疹培養は５日目にパルスし６日目に収穫した。破傷風菌毒素に対して免疫化された供与者からのＭＮＣは破傷風菌毒素の希釈液（０．４−４ＬＦ／ｍｌ、マサチューセッツ・デパートメント・オブ・パブリック・ヘルス、ボストン、ＭＡ）と共にウエル当たり１０5で５日間培養した。
細胞をウエル当たり１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲ（ＩＣＮ、アービン、ＣＡ）で一夜パルスし、ＰＨＤハーベスター（ケムブリッジテクノロジーＩｎｃ．、ウオータータウン、ＭＡ）を用いてグラスファイバーフィルター上で収穫した。チミジンの取込みは、ファルマシア・ベータ・カウンター（ファルマシア  ＬＫＢ  ヌクレアーＩｎｃ．，ガイサースベルク、ＭＤ）を用いて液体シンチレーション計測により測定した。
マイトマイシン処理ＭＮＣすなわち刺激細胞を幾つかの実験で使用した。細胞を１０7／ｍｌでＨＢＳＳに懸濁しそしてマイトマイシンＣ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）の５０μｇ／ｍｌで３７℃においし３０分間処理した。
アロ（allo-）抗原へのＴ細胞の応答を測定するために、ＭＨＣの異なる供与者２名からＰＢＬを得た。１セットの細胞をマイトマイシンＣで処理し、これを刺激細胞として用いた。他のセットは応答細胞集団として用いた。細胞（ウエル当たり２×１０5）をミクロカルチュアウエルに入れ、４−５日後にトリチル化チミジンで上記のようにパルスし、収穫しそして放射能を測定した。
ＣＤ８保持細胞を測定するため、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたＢ細胞に特異的なＴ細胞株を使用した。この株は健常人からＥＢＶ形質転換Ｂ細胞による刺激それに続くインターロイキン２（ＩＬ−２）中での拡張／休止を反復することにより作られたものである。このＴ細胞の８０％以上が免疫蛍光により判断するとＣＤ８を持っている。本研究のために、ＥＢＶ株をマイトマイシンで処理して増殖を阻止した。Ｔ細胞（１×１０5）をミクロカルチュアウエルに添加し、上記のように増殖を測定した。
毒性試験
この化合物が一般的な抗増殖効果（毒性の指標となる）をもつかどうかを決定するため、さまざまな細胞株ジャーカット（Ｔ白血病）、Ｋ５６２（赤白血病）、Ｕ９３７（組織球）、ＣＥＭ（Ｔリンパ芽球）及びＲＳ−ＥＢＶ（ＥＢＶ形質転換細胞株）を用いて該化合物を試験した。細胞（５×１０5／ｍｌ）をＰＩＣ  ０２４．４の種々の希釈液と共にミクロカルチュアウエル中でインキュベートした。通常、細胞は自然に増殖しそしてこれは3Ｈチミジンの取込みを測ることにより測定することができる。２４時間後に細胞をウエル当たり１μＣｉのチミジンに接触させ、その１６時間後にプレートを収穫し、フィルター上の放射能を計測した。比較するため、培地のみを入れた標準ウエルを設け、これらのウエルとチミジン取込みの阻害を測定するための基礎として用いた。ＰＩＣ  ０２４．４は、ＣＥＭ細胞の増殖を１００μｇ／ｍｌで１４％だけ阻害し、ＲＳ−ＥＢＶ細胞の増殖を１００μｇ／ｍｌで２７％だけ阻害した。
上記の測定におけるＰＩＣ  ０２４．４のスクリーニングの結果は下記の表３に示す。図１はＰＩＣ  ０２４．４及びＰＲＯ  １０４１を用いたＣＤ４／ｇｐ１２０のＥＬＩＳＡ測定の結果を示す。ＰＩＣ  ０２４．４及びＰＲＯ  １０４１は用量依存的にｇｐ１２０のＣＤ４への結合を阻害し、そのＩＣ50は約０．２μｇ／ｍｌである。ロゼット阻害測定の結果では、１００μｇ／ｍｌまでの投与量ではＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用に対するＰＩＣ  ０２４．４の効果は認められなかった。Ｔ細胞増殖測定でも、これらの投与量で同様な効果の欠如を示す。インビトロ毒性試験により示されるように、ＰＩＣ  ０２４．４はＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用の阻害に活性な濃度では毒性を示さない。
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ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢを用いる抗ウイルス活性及び細胞毒性測定
ＰＩＣ  ０２４．４を４ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌水に溶解した。培地中で希釈液を調製し、化合物をハーフｌｏｇ10希釈で１００μｇ／ｍｌから０．００３μｇ／ｍｌの濃度範囲で試験した。
測定はＣＥＭ−Ｔ４ヒトＴリンパ球細胞株を用い９６穴組織培養プレート中で行った。使用した培地は、２５ｍＭのＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−ｎ1−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ、シグマケミカルＣｏ．）及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地であり、これに１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍｌのペニシリンＧ及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を補充した。ＣＥＭ−Ｔ４細胞を２μｇ／ｍｌの濃度のポリブレン（polybrene）で処理し、そして１３０μｌ容の細胞（１×１０4細胞）を各ウエルに分配した。薬物のそれぞれに対する１個の測定プレートに、５０μｌ容の各薬物の希釈液（４倍濃縮液として調製）を細胞のウエル５個に添加し、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。これは、薬物１．１×濃度による細胞の前処理となる。各薬物に対する第二の測定プレートは分配された細胞だけを含むが、これも平行してインキュベートした。
すべての測定プレートについて、ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩＩB株の凍結培養物をｍｌ当たり２．５×１０4ＴＣＩＤ50の濃度になるように培地中に希釈し、２０μｌ容（ウイルスの５００ＴＣＩＤ50を含む）を各薬物濃度の３個のウエルに添加した。これは、ＨＩＶ感染試料に対し０．０５の感染多重度となる。通常の培地２０μｌ容を各薬物濃度の２個のウエルに添加し、薬物の細胞毒性の評価をした。
ウイルスと３７℃で２時間インキュベーションした後、５０μｌ容の各薬物希釈液（４×濃度として調製）を細胞の感染ウエル３個に、及び各薬物の第二測定プレートの細胞の非感染ウエルにそれぞれ添加した。
測定プレートはそれぞれ、未処理の試料、非感染の試料、細胞の対照試料の５個のウエル、そして未処理の試料、感染した試料、ウイルス対照試料の５個のウエルを含んでいた。２’，３’−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）を、薬物添加の両方のプロトコールを用いて平行して測定した。
組織培養プレートを加湿下、５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃でインキュベートして、毒性及び／又は細胞変性の効果について顕微鏡下に観察した。感染後８日目に各ウエルの細胞を懸濁し、細胞懸濁液のそれぞれ５０μｌの試料を新たな９６穴プレートに移して以後の測定に用いた。１００μｌ容の新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地及び３０μｌ容の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の５ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ細胞懸濁液のそれぞれに添加し、そして細胞を５％ＣＯ2中３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーションの間に、ＭＴＴは生細胞により代謝的に還元されて、着色したフォルマザン産物を生ずる。２０％ドデシル硫酸ナトリウムの０．０２Ｎ塩酸水溶液５０μｌを各試料に添加し、この試料を一夜インキュベートした。各試料について、モレキュラー・デバイシスＶmaxミクロプレートリーダーを用い５９０ｎｍの吸光度を測定した。この測定により、残存細胞によるＭＴＴ−フォルマザンの生成を測定することにより、ウイルスによる細胞障害効果（ＣＰＥ）の薬物に誘導される抑制並びに薬物の細胞毒性を検出できる。ＣＰＥ−阻害又は毒性に対する用量依存性の効果をみると、５０％効果用量に対する値は、チョウ及びチョウ（Chou and Chou）の用量−効果分析ソフトウエア（エルスビール−ビオソフト）を用いて計算した。
この結果を表４に要約する。
ＪＲ−ＣＳＦ株を用いるインビトロ抗−ＨＩＶ測定及び細胞毒性測定
この手法の目的は、組換え可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）による治療に対し抵抗性があることが既に認められているウイルス単離物（ＪＲ−ＣＳＦ）に対するヒトのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）芽細胞の遊離ＨＩＶウイルス感染に対する化合物の毒性及び効果をインビトロでみることである。測定を行う前日にヒトＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽細胞を液体窒素から融解し、イスコーブ修正ドゥルベッコ培地（ＩＭＤＭ）プラス７％ＦＣＳ及び５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２中で、１０6／ｍｌの密度まで一夜培養した。
ＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽細胞をペレット状とし、これを７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地中にｍｌ当たり４×１０6個で再懸濁した。この細胞懸濁液２５μｌを丸底９６穴ミクロタイタープレートの各ウエルに入れ（ウエル当たり１０5）、３７℃インキュベーター中に置いた。試験対象となる化合物２５μｌを５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２（２×最終濃度）を含む７％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ又は組織培養用培地のみ（ネガティブコントロールとして）中に適当な希釈度で溶解して上の細胞に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。２００μｌの培地を添加し、そして９６穴プレートを１０００ｒｐｍでの２分間遠心分離と２５０μｌの吸引により試験化合物を洗浄した。細胞を７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む培地５０μｌ中に再懸濁した。ＨＩＶ（ＪＲ−ＣＳＦ、コヤナギら、サイエンス、２３６：８１９−８２１（１９８７））を、２４穴プレート中の７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２とポリブレン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＩＭＤＭ中、５０ＴＣＩＤ50（２５μｌに）まで希釈した。ウイルスの２５μｌを細胞のウエルそれぞれに添加した。ＨＩＶ感染３７℃で２時間行わせ、ついで培地２００μｌを添加した。１０００ｒｐｍで２分間９６穴プレートの遠心分離及び２５０μｌの吸引、そして７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２及び試験化合物の適当量（１×）を含む新鮮な培地２００μｌの添加によりウイルスを洗浄した。４日目に、培地を除去し、７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２プラス試験化合物（１×）を含む新鮮な培地で置換した。７日目に、プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各ウエルから慎重に上清を除去した。この細胞を溶解し１：３５希釈でｐ２４抗原について試験した。
無処理の感染細胞を対照として阻害のパーセントを測定した。例えば、対照のウエル中のｐ２４抗原の量がＡであり試験化合物を含むウエル中のｐ２４の量がＢであるとき、この化合物は（Ａ−Ｂ／Ａ）（１００）％阻害をその濃度で達成する。
毒性を明確にするため、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽細胞をペレットとし、ｍｌ当たり２×１０6で７％ＦＣＳと５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含むＩＭＤＭ中に再懸濁し、９６穴丸底ミクロタイタープレート中にウエル当たり１０5（５０μｌ）で注入した。この９６穴プレートに、５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む７％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ（３×最終濃度）又は組織培養用培地のみ（対照）中に適当な希釈度で溶解した試験対照となる化合物２５μｌを添加した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートした後、２００μｌの培地を添加した。この９６穴プレートを１０００ｒｐｍで２分間の遠心分離及び２５０μｌの吸引、そしてＩＬ−２及び適当な量の試験化合物（１×）を含む新鮮培地２００μｌの添加により、試験化合物を洗浄した。４日目に、培地を除去し、試験化合物を含む新鮮な培地で置換した。
７日目に適当数の細胞（１００μｌ）を他のプレートに移植した。試験化合物の毒性をＭＴＴ試験により実質的に上記のように測定した。
ＡＺＴの分析では、０．０００４〜５０μＭの濃度範囲で毒性は示されなかった。ｐ２４のレベルは、感染前２時間に薬物を添加したとき、０．００４〜５０μＭの濃度範囲で、ＪＲ−ＣＳＦを用いる抗ＨＩＶ試験では相当に減少した。抗ＨＩＶ活性はこの化合物について明瞭に示された。得られた結果は、以前の試験から得られた予想値の範囲にあった。
ＰＩＣ  ０２４．４の分析では、試験された最高濃度（１００μｇ／ｍｌ）の場合のみ僅かな細胞毒性が示された。ｐ２４レベルは、感染前２時間に薬物を添加したとき、ＪＲ−ＣＳＦ及び１００、２０及び４μｇ／ｍｌの濃度を用いる抗ＨＩＶ試験では相当に減少した。この化合物の抗ＨＩＶ活性は明瞭に示され、毒性が観察される濃度の２５倍低い濃度で活性が観察された。
この結果を表４に要約しそして図２に例示する。
ＨＩＶ−１（ＡＤＡ）を用いるヒト単球−マクロファージの研究：単球標的のＨＩＶ感染の測定
向流遠心水ひ（countercurrent centrifugal elutriation）によりヒト末梢血白血球を得、そして単球を組織培養フラスコの表面に付着させた。この単球を、１０％熱不活化ヒトＡＢ+血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１，０００ユニット／ｍｌのマクロファージ・コロニー・刺激因子（ｍＣＳＦ、シータス）を補充したＤＭＥＭ中で７日間、付着単層として培養した。ｍＣＳＦはインビトロでＨＩＶ−１発現を顕著に増加する（７〜１０倍）ので、その前培養を行った。前培養の後、削り取りにより収穫した細胞集団は、ライト染色の細胞学的スミア及び顆粒ペルオキシダーゼ及び非特異的エステラーゼに対する組織化学的染色を用い、９８％以上の単球を含むことが分かった。次いで、１×１０6／ｍｌの濃度で単球を２４穴プレートのウエルに添加し、付着単層を形成させた。ＨＩＶ−１で感染させる前に、それぞれのウエルから慎重に培地を吸引した。プレートを３７℃のＰＢＳで慎重に３回洗い、すべての残存血清を除去した。ＨＩＶADA株（Ｄ．チェスター  カルターら、ジャーナル  オブ  イムノロジー、Ｊ４６、２９８−３０６（１９９２））の３０〜５０μｌ／ウエルを７０〜５０μｌのＲＰＭＩ（これは３．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／１０5細胞を表す）に添加し、３７℃で少なくとも２時間インキュベートした。化合物を、ｍＣＳＦ（Ｃ−３４）１，０００ユニット／ｍｌを含む１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩに溶かし、プレートに添加した。対照は、＋細胞＋ウイルス、＋細胞−ウイルス、及び−細胞＋ウイルスである。７日目に上清を次のように取得した、逆転写酵素用の１ｍｌ、ｐ２４測定用の０．５ｍｌそして培地を新鮮な薬物で補充した。最終収穫は１４日目であった。
この結果を表４及び５に要約し、図３に例示する。
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抗凝血測定：活性化部分トロンボプラスチン時間測定
静脈血（９．０ｍｌ）をトップ・バキュテーナー・チューブ中の３．９％クエン酸ナトリウム１ｍｌ（１：１０の比）に加え、直ちに遠心分離した。このステップにより凝血に必要な因子であるカルシウムが除かれた。この標品は溶血も凝血もしなかった。
０．０２Ｍの塩化カルシウム溶液のチューブを、フィブロメータ・ヒーティング・ブロックの後に置き、約３７℃に加熱した。活性型セファロプラスチン（０．１ｍｌ、デード）をよく混ぜて３個の凝血カップにピペットで注入した。このカップを３７℃で約１分間温めた。
上のクエン酸化血漿１ｍｌを試験化合物と約３７℃で約６０分間インキュベートした。インキュベート後の血漿（０．１ｍｌ）をセファロプラスチンの第一のカップに加えた。その２分後に、第二のカップに０．１ｍｌの血漿を添加した。その３分後に、０．１ｍｌの血漿を第三のカップに添加した。各カップに血漿を添加した後、内容物をよく混合し、約３７℃で約３分間インキュベートした。
次いで、血漿−セファロプラスチン混合物のカップをフィブロメータ  プローブの下に置きそして０．０２Ｍ塩化カルシウムの０．１ｍｌを添加した後、凝血を起こすのに必要な時間（部分トロンボプラスチン時間、ＰＴＴ）を測定した。ＰＴＴに対する通常の値は、一般に約３０〜４５秒の間である。
均等物
当該技術分野における熟練せる者は、単なる定型的実験手法を用いて本明細書に具体的に記載された本発明の具体的態様に均等な多くのものを認識し又は確認することができよう。このような均等物も以下の請求の範囲に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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