(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列を有する介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合したことを特徴とする融合選択マーカー遺伝子。
【請求項２】
薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子による、宿主細胞に対する細胞毒性の発現とレポーター機能の発現とを調整したことを特徴とする請求項１記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項３】
介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子のＮ末端を結合するか、又はレポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を結合することを特徴とする請求項１又は２記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項４】
薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であることを特徴とする請求項１から３のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項５】
レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項６】
蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子が、ＥＧＦＰ又はＲＦＰであることを特徴とする請求項５記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項７】
薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であり、レポーター遺伝子がＥＧＦＰであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターに、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータンパク質との融合タンパク質を生成させ、該選択マーカータンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定を行うことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異なる２つの選択マーカーを使用した組換えタンパク質の製造方法、特に異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子産物の機能や局在の解析を行うためには、目的遺伝子を標的細胞に導入し、一過性あるいは安定にある形質を発現させることが必要となる。この際の遺伝子導入法としては、エレクトロポレーションなどの物理的方法や、リン酸カルシウムやリポソームを用いる化学的手段が用いられるが、その導入効率は１００％ではないため、目的遺伝子産物の機能の詳細な検討のためには、目的遺伝子が導入された細胞を選択することが必要となる場合がある。
一般に、目的遺伝子発現細胞の選択を行うためには、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク質などのマーカー遺伝子をｃｏ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎやInternal Ribosome Entry Site(ＩＲＥＳ)を含むベクターを用いて目的遺伝子とともに発現させ、そのマーカー遺伝子発現を指標として用いる。前者は、適当な選択薬剤を使用することにより、目的遺伝子を導入された細胞のみを選択的に回収できる利点を持つ。後者は、目的遺伝子を可視的に同定できる利点があり、導入細胞の選択的採取にはフローサイトメトリー等を用いることができる。両者のうち、特殊な機器を必要としないことなどから、薬剤耐性遺伝子を共発現させる前者の方法が広く行われている。
【０００３】
抗生物質による選択のために、これまで、種々の薬剤耐性遺伝子- 選択薬剤の組み合わせが用いられてきた。しかしながら、どの薬剤を用いても、細胞の中には、耐性遺伝子が導入されていなくても自然に耐性を示すものがあり、選択後の細胞がかならずしも目的遺伝子を発現しているとは限らない、いわゆる擬陽性細胞の問題があった。選択用のベクターで薬剤耐性に加えて新たなマーカーを同時に発現させ、薬剤耐性以外の指標を併せて目的遺伝子導入細胞を同定できれば、目的遺伝子導入細胞の選択作業の著しい効率の改善が期待できると考えられる。この目的のために、ＩＲＥＳを利用して異なる選択遺伝子を発現させることが可能であるが、同一遺伝子上で発現されるのではないことから、擬陽性の問題は解決されない。ＩＲＥＳを利用して異なる遺伝子を発現させた場合、継代を重ねると、特に遺伝子産物が宿主細胞に対して細胞毒性を有する場合にはその発現が消失することがあるとの報告もなされている。従って、異なる２つの選択マーカーを融合タンパク質のかたちで発現させることが望ましいと考えられる。
【０００４】
これまでに、種々の薬剤耐性マーカーが用いられてきたが、比較的よく用いられているものには、ｎｅｏｍｙｃｉｎ,ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子などがある。Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子は歴史的に古くその使用頻度は高い。しかし、必要とされる選択薬剤濃度が高く選択期間も長い傾向がある。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子もｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子と似たような傾向を示す。一方、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子( puromycin N-acetyltaransferase, pac )を用いた場合、選択薬剤濃度が低く選択期間も数日で済む利点がある。
【０００５】
一方で、マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子を、発現を目的とする遺伝子の下流に挿入して置くことも提示されている（特開平１１−２５３１６５号公報）。しかしながら、これらの遺伝子を同時に挿入した場合、マーカー遺伝子とレポーター遺伝子双方の遺伝子の機能を保持して発現することが難しいという問題点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、遺伝子組換えを用いたタンパク質の製造方法において、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク質の製造方法を提供すること、特に異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク質の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合して、これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に結合して、融合タンパク質を含む組換えタンパク質として発現することにより、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させることができ、しかも該薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合することにより、該薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の、宿主細胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現を調整して選択マーカーとしての使用を可能とすることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明における該薬剤耐性遺伝子としては、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）等が、レポーター遺伝子としては、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子である、ＥＧＦＰ又はＲＦＰ等が使用される。
また、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列をコードする塩基配列のような塩基配列が使用される。
【０００８】
すなわち本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列を有する介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合したことを特徴とする融合選択マーカー遺伝子（請求項１）や、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子による、宿主細胞に対する細胞毒性の発現とレポーター機能の発現とを調整したことを特徴とする請求項１記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項２）や、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子のＮ末端を結合するか、又はレポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を結合することを特徴とする請求項１又は２記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項３）や、薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であることを特徴とする請求項１から３のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項４）や、レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項５）や、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子が、ＥＧＦＰ又はＲＦＰであることを特徴とする請求項５記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項６）や、薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であり、レポーター遺伝子がＥＧＦＰであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項７）からなる。
【０００９】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクター（請求項８）や、請求項８記載の発現ベクターに、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータンパク質との融合タンパク質を生成させ、該選択マーカータンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定を行うことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項９）からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合して、これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に結合して、２つの選択マーカーの融合タンパク質を含む組換えタンパク質として発現することにより、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させることができる。しかも該薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を効果的に発現させて、選択マーカーとしての使用を可能とする。すなわち、本発明においては、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を結合して用いる場合に生じる、宿主細胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現の減少の問題を解消して、有効な選択マーカーとしての使用を可能とする。
【００１１】
（異なる２つの選択マーカーからなる融合選択マーカーの構築）
本発明においては、選択マーカーとして、遺伝子の発現の同定の精度を向上させるために、異なる２つの選択マーカーからなる融合選択マーカー遺伝子を採用した。異なる２つの選択マーカーの一方として、薬剤耐性遺伝子を選択した。  薬剤耐性遺伝子の中で、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子(puromycin N-acetyltaransferase：ｐａｃ)は、選択薬剤濃度が低く選択期間も数日で済むという利点があるので、ｐａｃの持つこういった利点に注目し、薬剤耐性遺伝子の材料としてｐａｃを採用し、他のマーカー遺伝子の融合遺伝子の作成の可能性について検討した。
融合遺伝子を用いることの主な利点をまとめると、以下の３点が挙げられる。１）レポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上にあるため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポーターと選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断される可能性が低くなる。
２）ＥＧＦＰなどの特別な前処理を行うことなくｉｎ  ｓｉｔｕで発現の確認可能なレポーター遺伝子を融合タンパク質の相手として選んだ場合、遺伝子導入細胞を生きた状態で識別することが可能となる。たとえばフローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングなどを利用することにより、遺伝子導入細胞を効率良く選択することができる。
３）２）のようにＥＧＦＰを融合遺伝子とした場合には、融合遺伝子の蛍光シグナルが同時に耐性遺伝子の発現を意味するため、薬剤による細胞の選択後、擬陽性細胞（選択薬剤に耐性であるが遺伝子導入されていない細胞）の識別を容易に行うことができる。
【００１２】
本発明者は、ｐａｃとＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）（Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 707-711, 1996）,ＲＦＰ（red fluorescent protein）（Nat. Biotechnol. 17, 969-973, 1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 462-467, 2001）との融合遺伝子の可能性について検討した。本発明者は、ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端に融合させ、ＣＭＶ プロモーター下にＣＯＳ７細胞に発現させた。ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端どちらに融合させた場合にも、遺伝子導入されたＣＯＳ７細胞はｐｕｒｏｍｙｃｉｎに耐性を示し、同時に細胞の胞体全体にＥＧＦＰ,ＲＦＰの発現が蛍光顕微鏡下に確認された。ＧＦＰやＲＦＰは共に蛍光タンパク質ではあるが、その構造は全く異なる異種のタンパク質である。この両者で目的とする形質が保持されたことは、今回選択した遺伝子以外を用いてもｐａｃと他の様々な他のマーカー遺伝子の融合遺伝子の作製の可能性があることを強く示している。しかしながら、ｐａｃとＥＧＦＰ,ＲＦＰ融合タンパク質が細胞毒性を示すという問題があった。
【００１３】
今回Ｐａｃに融合させたＥＧＦＰはコドン使用頻度を最適化することにより真核細胞での発現を増強したものであり、その高発現によって細胞毒性を呈することがあることが記載されている。そこで、本発明者は、まず融合タンパク質の発現量を調節することによって細胞毒性を減弱させることを試みた。ＥＧＦＰ, ｐａｃ融合遺伝子の発現プロモーターをＣＭＶからＣＭＶプロモモーターに比してプロモーター活性の低いｔｋプロモーターに変えると、発現量が低下することにより細胞の生存期間の延長を認めた。しかしながら、発現量低下によって視認性とｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対する抵抗性が低下した。また、培養を継続するとＣＭＶプロモーターで発現させた場合と同様に、融合タンパク質の不適切な蓄積による細胞毒性が認められた。
【００１４】
そこで次に介在アミノ酸配列について検討を行った。その結果、ＥＧＦＰとｐａｃとを結ぶ介在アミノ酸配列の差異により細胞毒性に変化が見られることが判明した。その介在アミノ酸配列の差異による毒性変化の詳細な機構は不明であるが、介在アミノ酸配列によって生成融合タンパク質の細胞内分布、蛍光強度等に影響がみられ、それらの要因の相互作用によって細胞毒性が規定される可能性があることが明らかになった。実際に、ある介在配列が存在する場合、融合タンパク質が細胞内の不適切な位置に蓄積し、極めて強い細胞毒性が認められた。これらの現象は、ＣＯＳ７細胞ばかりでなく、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａａ細胞でも認められた。
そして、検討を重ねた結果、適当な介在アミノ酸配列に変えることにより、ＣＭＶプロモーター下でも細胞毒性が少ないＥＧＦＰ−ｐａｃ融合遺伝子Ｇｐａｃの作製に成功した。この融合遺伝子から発現されるタンパク質はＥＧＦＰによる十分な視認性を有し、かつｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を可能とするものであった。
【００１５】
さらに本発明者は、今回作製したＧｐａｃ発現ベクターを用いてＣＯＳ７細胞においてＧｐａｃの安定形質発現細胞を確立することに成功した。この細胞は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析で融合タンパク質の発現が確認され、高濃度のｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で増殖することが確認された。ついで、ＧｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅに組み込み、これをＶＳＰ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇの手法によりＴ細胞株であるＨ９ならびにＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
Ｂ  ｃｅｌｌ(Ｂ−ＬＣＬ)に導入し、ＨＩＶ−１タンパク質を安定に発現する細胞の作製に成功した。
【００１６】
（異なる２つの融合選択マーカーの実施の態様）
本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合し、融合選択マーカー遺伝子として使用することからなる。本発明で用いる薬剤耐性遺伝子としては、ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ等既知の薬剤耐性遺伝子を用いることができるが、選択薬剤濃度が低く選択期間も数日で済むという利点を有するｐｕｒｏｍｙｃｉｎが有利に利用できる。また、本発明で用いるレポーター遺伝子としては、既知のレポーター遺伝子を用いることができるが、ＥＧＦＰ,ＲＦＰ等の蛍光タンパク質を発現する遺伝子が特に有利に利用できる。本発明においては、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合するが、該介在アミノ酸配列としては、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子のマーカー機能の発現をみて、好ましいアミノ酸配列のものを、適宜選択することができる。好ましい配列として、ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列を挙げることができる。薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子との結合は、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子のＮ末端を結合しても良いし、又はレポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を結合しても良い。
【００１７】
本発明の融合選択マーカー遺伝子は、発現ベクターに挿入して利用される。すなわち、本発明の融合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターに、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータンパク質とを融合した組換えタンパク質を生成させ、該選択マーカータンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定を行う。本発明の融合選択マーカー遺伝子を用いることにより、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させると共に、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を効果的に発現させて、優れた選択マーカーとしての使用を可能とする。
【００１８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［方法と材料］
（ベクター）
この実施例で、用いたベクターは、以下の様にして作製した。
（１）ｐＧｐａｃ（図２）
pPUR(CLONTECH)をｔｅｍｐｌａｔｅにして、以下に示す５′、３′末端それぞれに、ClaI site,XhoI siteを付加したｐｒｉｍｅｒを用いて、ＰＣＲ法をもちいてＰａｃ遺伝子を増幅し、pCR-BluntII TOPO vector (Invitrogen) にｃｌｏｎｉｎｇし(pTOPO-pac)、sequenceを確認した。
forward primer :CATCGATGACCGAGTACAAGCCCA（配列番号１：Ｐ１）
reverse primer : CTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGG（配列番号２：Ｐ２）
ここから、Ｐａｃ遺伝子を含む形で、ClaI site からBamHI siteまでを切り出し、pEGFP-C3 (CLONTECH )のAccI siteからBamHI siteに組み込んだ。こうしてできたplasmidがpG-MCS-pacでＥＧＦＰとＰａｃを結ぶ介在配列を図１に示す。pG-MCS-pacのBglII siteからPstI site間をａｄａｐｔｅｒで置き換え介在配列を変化させたものがpGpacでその配列は、図１に示す通りである。参考にもとのベクターpEGFP-C3についても示した。図２にpGpac plasmidの構造を示す。図に示すように、５′末端には、NheI,AgeI,Eco47III site 、３′末端にはXhoI,EcoRI,SpeI,BamHIをユニークな制限酵素部位として付加し、この融合遺伝子を切り出すことができるように設計した。
【００１９】
（２）ｐＦＬＡＧ−ｐａｃ
Ｐａｃの局在と分子量を確認するために、pTOPO-pac のClaI site からXhoI siteまでのＰａｃを含む領域を制限酵素を用いて切り出し、pFLAG CMV-2 ( Sigma ) のClaI siteからSalI siteに組み込んだベクターを作製し( pFLAG- pac )、ＰａｃのN末端にFLAG epitopeを付加した形でＰａｃ遺伝子が発現されるようにした。ＦＬＡＧとｐａｃの間の介在アミノ酸配列を図３に示した。
【００２０】
（３）ｐＨＸＢ２  Ｇｐａｃ（図４−（１））
ＨＩＶ−１にＧｐａｃ発現遺伝子を組み込んだｐＣＴＬＧｐａｃは以下のように作製した。ＨＩＶ−１の感染製分子クローンであるpSP65HXB2Ecogptをもとに作製した。Vesicular stomatitis virus のenvelope protein (VSV-G)を用いてpseudotypingを行うために、以下の様にしてenv geneを欠損させた。まず、ＨＩＶ−１の感染製分子クローンであるNL4-3のenv geneのAflIII siteからMfeI siteまでの約１．５ｋｂｐｓを切り出し、XbaI linkerを組み込んだ。この欠損したenvを含むSalI siteからBamHI siteまでの領域を、HXB2のSalI siteからBamHI siteに組み込んだ。
Gpac geneは、pGpacからＰＣＲを用いて、５′endに ClaI site、３′endにXhoI siteを付けて増幅し、HXB2の nef 領域のClaIとXhoIに組み込んだ。VSV-G発現ベクターは、CLONTECH社から販売されているpVSV-Gを購入して用いた（図４−（２））。
【００２１】
（Ｐａｃの分子量と局在の確認）
５×１０5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレにまき、１２時間後、それぞれ０．５μｇのpFLAG-pacをFuGENE6(Roche)を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２時間後、細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μｌのRIPA lysis bufferで溶解し、遠心したのち上清を回収しSDS PAGEを行った。その後、anti-FLAGM2 monoclonal antibody (Sigma)を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
同じｖｅｃｔｏｒをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされたＣＯＳ７細胞を４％ paraformaldehydeで固定し、０．５％Triton X-100で処理した。Ｐａｃの局在を調べるため、一次抗体にanti-FLAGM2 monoclonal antibody、二次抗体にFITC conjugated anti-mouse IgG antibodyを用いた間接蛍光抗体法を行った。同時に、ＰＥで核染色をおこなった。
【００２２】
（Ｇｐａｃ発現ＣＯＳ７細胞株の樹立）
５×１０6のＣＯＳ７細胞に、１０μｇのpGpacをエレクトロポレーションによって遺伝子導入した。４８時間培養後、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液中でさらに培養を継続した。選択開始から４８時間後に一度限界希釈法によるｃｌｏｎｉｎｇを行ったのち、さらに１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液中でさらに培養を継続した。
【００２３】
（ＨＩＶ−タンパク質、Ｇｐａｃ発現Ｈ９細胞株の樹立）
ＣＯＳ７細胞に、HXB2GpacとpVSV-G (CLONTECH)をFugene6 (Roche)を用いてｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。４８時間後、pseudotype vurusを含む上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通した後、１ｍｌの上清を１×１０6個のＨ９およびＢ−ＬＣＬに加えることにより感染させた。６時時間後、一度ｍｅｄｉｕｍで洗ったのち、さらに４８時間培養を行った。その後、培養液中に０．５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加え、２日ごとにｍｅｄｉｕｍを交換した。
選択開始４日後、細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、FACS (FACS Calibur, BECTON DICKINSON)による解析を行った。
【００２４】
（Ｇｐａｃ、ＨＩＶ−１タンパク質の発現の確認）
５×１０5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレにまき、１２時間後、０．５μｇのpEGFP-C3をFuGENE6(Roche)を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２時間後、細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μｌのRIPA lysis bufferで溶解し、遠心したのち上清を回収した。
また、今回樹立した１×１０6のＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞ならびにＨＩＶ−１タンパク質とＧｐａｃを安定発現している１×１０7のＨ９、Ｂ−ＬＣＬから、同様の方法で細胞溶解液を調製した。
これらの細胞溶解液を用いてSDS PAGEを行い、Ｇｐａｃはanti-EGFP monoclonal antibody (CLONTECH)、ＨＩＶ−１タンパク質についてはＨＩＶ−１感染者血清 を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
【００２５】
［結果］
（介在配列が融合タンパクの機能に与える影響）
ｐＥＧＦＰＣ３のＥＧＦＰのＣ末端にあるmultiple cloning  siteにあるClaIならびにBamHI siteにＰａｃ遺伝子を組み込み、pG-MCS-pacを作製した。その結果、図２に示すように、ＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質にYSDLELKLRILQSという介在配列が存在することとなった。これをＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察すると、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞の核周囲に蛍光物質の著明な蓄積を認めた(図５−（１）)。 ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞で４８時間以上生き残ったものは稀であった。元のベクターであるＥＧＦＰＣ３をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした場合、この現象は認められなかった（図５−２（２））。また、pFLAGpacをＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし間接蛍光抗体法で局在を調べたが、細胞全体に分布していることが確認された。
【００２６】
原因について検討した結果、本発明者は、ＥＧＦＰのＣ末端に存在している時には問題にならなかったが、Ｐａｃを融合させた結果、介在配列がそれ自身もしくは全体の構造の変化をもたらすことなどにより、細胞毒性を増強している可能性があると考えた。そこで、介在配列からELKLRILを除いた融合タンパク質を発現するベクター (pGpac ; 図２)を作製した。これを、pG-MCS-pacと同様の方法で表現型を調べたところ、強発現している細胞でも蛍光物質の不適当な蓄積が無く(図５−（３）)、細胞毒性も大幅に減弱した。また、優れた視認性を有すると共に、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対して選択に十分な耐性を示した。以下に、ｐＧｐａｃを用いて、その有用性の検討を進めた。
【００２７】
（Ｇｐａｃ発現ＣＯＳ７細胞株の樹立）
図６に、ｐＧｐａｃをエレクトロポレーションによって遺伝子導入後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して２ヶ月を経過したＣＯＳ７細胞の写真を示す。（Ａ）は可視光下、（Ｂ）はＵＶ照射下で観察した場合を示す。ほとんどすべての細胞でＥＧＦＰの十分な発現が認められた。この細胞は、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎの存在下でも非形質転換細胞とほぼ同様の増殖を示し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ抵抗性を獲得していることが明らかになった。
今回、遺伝子導入後ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して４８時間で、生存する細胞のほとんどはＥＧＦＰ発現細胞となり、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎにより、迅速な遺伝子導入細胞の選択が可能であることが明らかになった。今回は限界希釈法にｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を組み合わせて、迅速にｃｌｏｎｉｎｇを行うことができたが、セルソーターなどを組み合わせることにより、発現細胞の選択がより簡便になると考えられた。
【００２８】
（Ｇｐａｃの発現）
樹立したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞において、Ｇｐａｃの発現をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。
まずＰａｃの分子量を確認した。図７−（Ａ）に、ＣＯＳ７細胞にFLAG-pacを一過性に発現させ、その細胞溶解液をanti-FLAGM2 monoclonal antibody ( Sigma ) を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果を示す。Ｐａｃはアミノ酸配列に基づくと予想分子量２２ｋＤａのタンパク質であるが、FLAG epitopeが付与されたことにより若干の分子量の増加が認められた。
図７−（Ｂ）に、ＥＧＦＰ一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、今回作製したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞の細胞溶解液を、anti-EGFP monoclonal antibody (CLONTECH) を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果を示す。ＥＧＦＰは２７ｋＤａの分子量をもつが、pEGFP-C3で発現させた場合はＣ末端に付加されたマルチクローニングサイトのために約３１ｋＤａの分子量を示した。今回作成したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞においては、図７−（Ｂ）のＧｐａｃのｌａｎｅに示されるように、ＰａｃとＥＧＦＰ両者の分子量の和に相当する約５２ｋＤａの分子量を持つ融合タンパク質が生成されていることが明らかになった。遺伝子導入されたＣＯＳ７細胞の表現型から、ＥＧＦＰ／Ｐａｃ融合タンパク質であるＧｐａｃが生成されていると考えられた。
【００２９】
（ＨＩＶ−１タンパク質の発現Ｈ９、Ｂ−ＬＣＬの作製）
様々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法や組み換えウイルスベクターを用いても、外来遺伝子導入効率が極めて低いことが報告されているものに、Ｔ細胞株の一つであるＨ９や、ＥＢ virus transformed B cell (Ｂ−ＬＣＬ)がある。
Ｈ９は、ＨＩＶ−１の標的細胞の一つであるＴ細胞由来の細胞株であり、ＨＩＶ−１増殖機構の解析などに有用である。また、Ｂ−ＬＣＬは、抗原提示細胞として、細胞障害性Ｔ細胞の機能解析をはじめとする免疫学の実験に広く用いられている。様々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法や組み換えウイルスベクターを用いることにより、目的タンパク質をコードする外来遺伝子をこれらの細胞に導入し発現させることが可能であることが報告されている。また、例えば、組み換えワクシニアウイルスベクターを用いることにより、一過性に高効率に目的タンパク質を発現させることが可能である。しかしながら、ほぼすべての細胞に目的タンパク質を安定に発現させるためには、遺伝子導入後、なんらかの方法により遺伝子導入細胞を選択する必要がある。
【００３０】
本発明者は、ＧｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅに組み込み、Ｈ９とＢ−ＬＣＬに導入後ｐｕｒｏｍｙｃｉｎで選択を行うことにより、ＨＩＶ−１のタンパク質を安定に発現する細胞の作製を試みた。
図４に示すように、ＨＸＢ２のnef領域にＧｐａｃを組み込んだベクターpHXB2Gpacを作製した。これをpVSV-GとともにＣＯＳ７細胞にｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、ＶＳＶ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ ウイルスを作製した。これをＨ９とＢ−ＬＣＬに感染させ、４８時間後から、０．５ｕｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むで培養を行った。
４日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を行った遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡によって観察すると、肉眼的に十分視認可能なＥＧＦＰの発現を認め、その後、培養を継続しても強い細胞毒性は認められなかった。ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択開始後4日目にＨ９細胞をｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定したのち、ＦＡＣＳによる解析を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞と比較した。図８−（Ａ）（Ｂ）のドットプロットの図を比較すると、（Ｂ）のウイルス感染後にｐｕｒｏｍｙｃｉｎで選択を行ったものでは多くの死んだ細胞の集族があることがわかる。次に生細胞を示すＲ１のｇａｔｅを用いて、細胞の蛍光強度の測定を行った。結果を図８−（Ｃ）のヒストグラムに示す。ヒストグラム上、０．５μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる４日間の選択によって、Ｍ２に示すように、感染Ｈ９細胞の生き残ったものの９３．４％が非感染Ｈ９細胞に比べて明らかに強い蛍光強度示しており、ＥＧＦＰを発現していることがわかった。
【００３１】
さらに、これらのＨ９細胞の細胞溶解液を調製して、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果を図９に示す。（Ａ）は抗ＥＧＦＰモノクローナル抗体、（Ｂ）はＨＩＶ−１感染者の血清でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果である。（Ａ）ではＣＯＳ７細胞にＧｐａｃを発現させた場合と同じ分子量が約５２ｋＤａのＥＧＦＰ−Ｐａｃ融合タンパク質の発現が認められた。ＦＡＣＳによる解析から、これらのＨ９細胞はｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性を有すると同時に蛍光タンパク質を発現することが明らかになっており、分子量からＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質が発現されていることが示された。（Ｂ）では構造タンパク質p24などのＨＩＶ−１タンパク質の発現が確認された。ＧｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅ上で発現させ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を行うことにより極めて短期間にＨＩＶ−１タンパク質を安定に発現するＨ９を得ることができた。
同様の実験をＢ−ＬＣＬにおいても行ったところ、Ｈ９の場合と同様にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性でＥＧＦＰを発現する細胞が得られ、ＨＩＶ−１感染者の血清を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＨＩＶ−１タンパク質を安定に発現している事が確認された(図８−（Ｃ）)。
【００３２】
Ｇｐａｃを用いることにより、ウイルス粒子を得るためにＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎをした際にも、ＥＧＦＰの発現によりその成否や効率が確認でき、また、標的細胞への感染の成否、効率、選択の成否をｉｎ  ｓｉｔｕで確認できる。また、選択薬剤としてｐｕｒｏｍｙｃｉｎを使用することによりｎｅｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにくらべ短時間で選択が終了する。さらに、ＦＡＣＳ解析やＣｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒによるさらに効率的な遺伝子導入細胞の選択を可能にすることも明らかになった。以上の結果により、Ｇｐａｃは極めて有用な選択マーカーであると考えられる。
ここでは、一例として、ＥＧＦＰをＰａｃのＮ末端に融合させた場合を述べたが、同様にして、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、結合して融合選択マーカーを作製することができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の融合選択マーカー遺伝子は、レポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上にあるため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポーターと選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断される可能性が低くなり、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を向上させることができる。
また、本発明においては、薬剤選択遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子を結合する場合に生じる宿主細胞に対する細胞毒性の発現とマーカー機能の低減の問題を解消し、選択マーカーとしての機能を効果的に発現させて、有効な選択マーカーとしての使用を可能とする。更に、本発明においては、融合選択マーカー遺伝子の相手として、レポーター遺伝子を選定したことにより、特別な前処理を行うことなく、遺伝子導入細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで、生きた状態で発現の確認が可能であり、また、融合遺伝子の蛍光シグナルが同時に耐性遺伝子の発現を意味するため、薬剤による細胞の選択後、擬陽性細胞（選択薬剤に耐性であるが遺伝子導入されていない細胞）の識別を容易に行うことができる。
【００３４】
【配列表】
0004024525.tif 000002
0004024525.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例で用いた、ＥＧＦＰとｐａｃを結合する結合配列の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例で用いた、ｐＧｐａｃベクターの構造を示す図である。
【図３】本発明の実施例で用いた、ＦＬＡＧとｐａｃの間の介在アミノ酸配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例で用いた、ｐＨＸＢ２Ｇｐａｃ及びｐＶＳＶ−Ｇの構造を示すずである。
【図５】本発明の実施例において、ＥＧＦＰとＰａｃの遺伝子を介在配列を介して結合し、該遺伝子をＣＯＳ７にトランスフエクションした結果の蓄積の結果の蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、ｐＧｐａｃをエレクトロポレーションによって遺伝子を導入した後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して２ヶ月を経過したＣＯＳ７細胞の写真を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＣＯＳ７細胞にＦＬＡＧ−ｐａｃを一過性に発現させ、その細胞溶液をウエスタンブロティング解析した結果（Ａ）、及びＥＧＦＰを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、Ｇｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞の細胞溶液を、ウエスタンブロティング解析した結果（Ｂ）、を示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を行った遺伝子導入細胞を、ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、ＦＡＣＳによる解析を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞とを比較した結果の、ドットプロットの図（Ａ）、（Ｂ）、及び生細胞を示すＲ１のｇａｔｅを用いて，細胞の蛍光強度の測定を行った結果（Ｃ）を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ＧｐａｃをＨＩＶ  ｇｅｎｏｍｅに組み込み、Ｈ９に導入後、Ｈ９細胞の細胞溶液を調製して、ウエスタンブロティング解析した結果を示す図である。
【図１】
0004024525.tif 000004
【図２】
0004024525.tif 000005
【図３】
0004024525.tif 000006
【図４】
0004024525.tif 000007
【図５】
0004024525.tif 000008
【図６】
0004024525.tif 000009
【図７】
0004024525.tif 000010
【図８】
0004024525.tif 000011
【図９】
0004024525.tif 000012