(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む脂肪酸低級アルコールエステル混合物を真空蒸留してエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む留分を採取し、該留分を尿素処理することによりエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを濃縮し、次いでその濃縮物を微生物由来のリパーゼおよび界面活性剤と混合して加水分解処理し、続いてその処理物をスチレンジビニルベンゼン重合体を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法。
【請求項２】
脂肪酸低級アルコールエステル混合物の真空蒸留を、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの含有割合が30〜50重量％であり、ドコサヘキサエン酸低級アルコールエステルの含有割合が10重量％以下である留分が得られるまで行う、請求項１に記載のエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法。
【請求項３】
界面活性剤が、エーテル型、エステル型またはアミノ酸誘導体のものである、請求項１または２に記載のエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法。
【請求項４】
微生物由来のリパーゼが、キャンディダ属、リゾプス属、ムコール属またはアルカリゲネス属に属する微生物由来のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
魚油等の天然油脂にはエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという）が含まれている。これらの油脂からエイコサペンタエン酸を直接分離するのは困難であるため、油脂を予め低級アルコールでエステル化して脂肪酸エステル混合物とした後、この混合物からＥＰＡをそれらのエステルとして分離する試みがなされている。このような脂肪酸エステル混合物から、エイコサペンタエン酸のエステルを濃縮する方法として、尿素付加−蒸留法（特開昭57-187397 号公報）、蒸留−尿素付加法（特開昭58-8037 号公報）、蒸留−吸着樹脂法（特開平2-258742号公報）、硝酸銀法（特開平4-103558号公報）などが提案されている。しかし、尿素付加−蒸留法によれば飽和の脂肪酸は除去できるが、オクタデカテトラエン酸（数字記号 18:4 ）、アラキドン酸（数字記号  20:4ω6 ）、エイコサテトラエン酸（数字記号  20:4ω3 ）等のＥＰＡ以外の高度不飽和脂肪酸のエステルが多量に残留するという問題がある。蒸留−尿素付加法によれば、長時間高真空および高温にする必要があるために、高温加熱によって重合物が増加したり、二重結合の異性化が生ずる等の問題がある。また、蒸留−吸着樹脂法によれば、蒸留工程でＥＰＡ含量を60重量％以上にしておかないと吸着樹脂処理工程での操作が煩雑になり、しかも収率が低下する等の問題がある。さらに硝酸銀法においては銀化合物の回収が困難であることなど、工業的見地からの問題が多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＥＰＡ低級アルコールエステルおよびそれ以外の高度不飽和脂肪酸低級アルコールエステルを含む脂肪酸低級アルコールエステル混合物からＥＰＡ低級アルコールエステルを製造する方法であって、蒸留時間の短縮により脂肪酸の変性を抑制し、オクタデカテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸等の高度不飽和脂肪酸低級アルコールエステルを除去して、効率よく選択的に高純度のＥＰＡ低級アルコールエステルを製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵素法を主体として蒸留法、尿素付加法および吸着樹脂法を組み合わせることにより、効率良くＥＰＡ低級アルコールエステルを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明は、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む脂肪酸低級アルコールエステル混合物を真空蒸留してエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを含む留分を採取し、該留分を尿素処理することによりエイコサペンタエン酸低級アルコールエステルを濃縮し、次いでその濃縮物を微生物由来のリパーゼおよび界面活性剤と混合して加水分解処理し、続いてその処理物をスチレンジビニルベンゼン重合体を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、エイコサペンタエン酸低級アルコールエステルの製造方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において原料となる脂肪酸低級アルコールエステル混合物は、ＥＰＡをグリセリドとして含有する油脂を低級アルコールでエステル化したものである。脂肪酸低級アルコールエステル混合物は、油脂に、例えば、水酸化カリウム等の塩基性化合物や硫酸等の酸性化合物の低級アルコール溶液を添加して反応させ、次いで水洗によりグリセリンを除去することにより得られる。油脂としては、ＥＰＡグリセリドの含有割合が高い油脂（例えば、15重量％以上）が好ましい。ＥＰＡグリセリドの含有割合が高い油脂としてはイワシ油、オキアミ油等の魚油が挙げられる。油脂をエステル化する低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
【０００７】
次に上記原料を真空蒸留して、ＥＰＡ低級アルコールエステル留分を採取する。真空蒸留により、原料に含まれる酵素反応の効率を低下させる低級脂肪酸低級アルコールエステルが除かれる。真空蒸留における圧力は、２Torr以下、好ましくは 0.5Torr以下である。また、真空蒸留は、 140〜190 ℃の範囲で行うのが好ましい。真空蒸留は、ＥＰＡ低級アルコールエステルの含有割合が好ましくは30〜50重量％、より好ましくは40〜50重量％であり、ドコサヘキサエン酸低級アルコールエステルの含有割合が好ましくは10重量％以下、より好ましくは５重量％以下の留分が得られるまで行う。
【０００８】
真空蒸留後、採取されたＥＰＡ低級アルコールエステルを含む留分を尿素で処理する。尿素処理は、飽和脂肪酸低級アルコールエステルの分離除去のために行うものである。尿素処理は、常法（J. Radell, J. W. Connolly, L. D. Yuhas, J. Org. Chem., 26, 2022(1961))により行うことができる。例えば、尿素を低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール）に50〜60℃で溶解させ、その溶液に上記留分を加えて混合する。この場合、尿素は上記留分１重量部当たり１〜２重量部の範囲で用いるのが好ましい。また、低級アルコールは上記留分１重量部当たり２〜５重量部とするのが好ましい。混合後、尿素処理液を冷却して尿素付加物の結晶を析出させる。冷却温度は低いほうが都合がよく、通常、25℃以下、好ましくは５〜20℃である。析出した尿素付加物を濾別し、濾液を濃縮する。この濾液にヘキサン等の非極性溶媒を加えて抽出を行う。非極性溶媒相を水で洗浄後、該溶媒を留去する。このようにして、ＥＰＡ低級アルコールエステルを含む高度不飽和脂肪酸エステルの濃縮物が得られる。得られた濃縮物中の高度不飽和脂肪酸エステルの含有割合は、通常70重量％以上である。尚、本発明において、高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという）とは、１分子当たり20個以上の炭素原子を有し、３個以上の二重結合を有する脂肪酸をいう。また、該濃縮物中には、通常、ＥＰＡエステルが60重量％以上、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという）エステルが15重量％以下、オクタデカテトラエン酸エステルが５重量％以下、アラキドン酸エステルが５重量％以下、エイコサテトラエン酸エステルが５重量％以下含まれる。
【０００９】
続いて、上記濃縮物をリパーゼおよび界面活性剤と混合して加水分解を行う。この加水分解は、次の工程のスチレン−ジビニルベンゼン重合体を用いたクロマトグラフィーでは除去し難いオクタデカテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸およびＤＨＡの含有割合を低減するためのものである。
【００１０】
前記濃縮物のリパーゼおよび界面活性剤による加水分解処理は、水中で濃縮物、リパーゼおよび界面活性剤を混合することにより行う。これらの混合の順序は特に制限はないが、界面活性剤は予め濃縮物に溶解しておくのが好ましい。加水分解反応は、静置でも進行するが、攪拌下で反応させるとより効率的である。水の添加量は、濃縮物１重量部当たり 0.5〜10重量部が好ましく、２〜５重量部がより好ましい。また、反応は、好ましくはpH 4.0〜9.0 で行う。pH調節には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いると効果的である。反応温度は35〜45℃が好ましい。また、リパーゼによる加水分解性を高めるため、塩化カルシウム、水酸化カルシウム等のカルシウム塩の添加が効果的である。カルシウム塩の添加量は、濃縮物１重量部当たり、0.02〜0.1 重量部が好ましい。
【００１１】
リパーゼとしては、市販のもの（例えば、商品名リパーゼＱＬ、名糖産業社製）を用いることができ、例えば、キャンディダ属、リゾプス属、ムコール属、またはアルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼが挙げられる。本発明においては、特に、アルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼが効率よく使用できる点で好ましい。リパーゼの添加量は、脂肪酸エステルの加水分解活性の単位Ｕ（ユニット）で示した場合、濃縮物１ｇ当たり１〜7500Ｕが好ましく、 200〜2000Ｕがより好ましい。
【００１２】
界面活性剤は、反応の促進及び選択性向上のために添加される。界面活性剤としては、エーテル型、エステル型、アミノ酸型誘導体等の界面活性剤が挙げられる。エーテル型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等が挙げられる。エステル型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等が挙げられる。アミノ酸誘導体型の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレングリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル等が挙げられる。これらの中で好ましいものは、ＥＰＡ低級アルコールエステル以外の脂肪酸低級アルコールエステルへの酵素の選択性がさらに期待できるという点で、ポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。界面活性剤の添加量は、濃縮物１重量部当たり0.01〜0.2 重量部が好ましく、0.03〜0.1 重量部がより好ましい。
【００１３】
加水分解反応終了後、常法にしたがって脱酸を行うことによりＰＵＦＡ低級アルコールエステル含有割合の高い処理物が得られる。該処理物中のＰＵＦＡエステル含有割合は、通常、90重量％以上である。また、この処理物中には、通常、ＥＰＡエステルが70重量％以上、ＤＨＡエステルが15重量％以下、オクタデカテトラエン酸エステルが１重量％以下、エイコサテトラエン酸エステルが３重量％以下、アラキドン酸エステルが３重量％以下含まれる。
【００１４】
得られた加水分解処理物を、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体である非極性多孔性ポリマーを素材とする吸着樹脂を担体として充填したクロマトグラフィーのカラムに負荷し処理を行う。
吸着樹脂としては、市販のものを使用することができ、例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオンHP-20 、HP-20SS 、MCIGELCHP-20P 、セパビーズ SP-20SS、SP-825、SP-850、およびSP-207、並びにロームアンドハース社製のアンバーライト XAD-4等が挙げられる。
【００１５】
溶離剤としては、水を１〜50容量％含有した親水性極性溶媒またはこの親水性極性溶媒を非極性溶媒で飽和させたものを用いる。親水性極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メチルエチルケトンおよびホルムアミドが好ましいが、沸点が低いこと、価格が安いこと、極性が大きいことなどからメタノールを使用することがより好ましい。非極性溶媒としては、例えば、n-ヘキサン、n-ペンタン、n-ヘプタン、n-オクタン、イソオクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、メチルエーテル、エチルエーテル、トルエンなど挙げられるが、成分分離、沸点が低いことなどからn-ヘキサンおよびn-ペンタンが好ましい。
【００１６】
このカラムクロマトグラフィー処理により、純度の高いＥＰＡ低級アルコールエステルが得られる。このＥＰＡエステルの純度は、通常、90重量％以上である。また、このＥＰＡエステルに不純物として含まれるＤＨＡエステルの含有割合はほぼ０重量％であり、エイコサテトラエン酸エステルの含有割合は３重量％以下であり、アラキドン酸エステルの含有割合は３重量％以下であり、オクタデカテトラエン酸エステルの含有割合は１重量％以下である。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
〔実施例１〕
(1) 原料の調製
イワシ油１kgに１％水酸化カリウム／エタノール溶液１Ｌを加え、窒素気流中40℃で30分間攪拌した。次いで２％硫酸／エタノール溶液を添加して中和した。その後エタノールを留去して、濃縮物を温水で洗浄した。このようにして脂肪酸エチルエステル混合物1.05kgが得られた。この混合物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００１９】
(2) 真空蒸留
上記工程(1) で調製した脂肪酸エチルエステル混合物をディクソンパッキング（東京特殊金網株式会社製）の入った充填塔を装着した蒸留器を用いて、平均蒸留温度 170℃、平均操作圧力 0.4Torrで真空蒸留した。このようにしてＥＰＡエチルエステル含有脂肪酸エチルエステル留分30ｇが得られた。この留分には、ＥＰＡエチルエステル35.5重量％、ＤＨＡエチルエステル 8.0重量％が含まれていた。この留分の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２０】
(3) 尿素処理
上記工程(2) で得られた留分を、メタノール 1.5Ｌに尿素 450ｇを溶解させた溶液（50〜60℃）に滴下し、その後20℃まで冷却した。次いで、析出した尿素付加体を濾別し、濾液を濃縮した。濃縮物にヘキサン１Ｌを加えて抽出を行った後、温水で洗浄した。次いでヘキサン相を濃縮した。このようにしてＰＵＦＡエチルエステル濃縮物 150ｇが得られた。この濃縮物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２１】
(4) リパーゼおよび界面活性剤処理
上記工程(3) で得られた濃縮物にポリオキシエチレンラウリルエーテルを９ｇ添加して溶解した。その溶液を、蒸留水 450mlに塩化カルシウム12ｇおよびアルカリゲネス属に属する微生物由来のリパーゼ（名糖産業社製） 150,000 Uを溶解した水溶液と混合し、40℃で14時間反応させて加水分解を行った。次いで、反応液にヘキサン 500ml及び５％水酸化ナトリウム水溶液 200mlを添加、攪拌し、静置後下層を除去し、上層を水洗して濃縮した。このようにして、ＰＵＦＡエチルエステル処理物 105ｇが得られた。この処理物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２２】
(5) カラムクロマトグラフィーによる精製
上記工程(4) で得られたＰＵＦＡエチルエステル処理物を、吸着樹脂であるスチレンジビニルベンゼン重合体HP-20SS （三菱化学製） 2.5Ｌが充填されたカラムに負荷した。溶離剤としては、メタノールと水の混合溶媒（メタノール：水＝９：１）を用いた。ＥＰＡエチルエステル画分を採取し、溶離剤を除去した。このようにして、ＥＰＡエチルエステル精製物41ｇが得られた。この精製物の各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２３】
〔比較例１〕
工程(4) を行わなかった以外は実施例１と同様の方法でＰＵＦＡエチルエステル精製物23ｇを得た。工程(1) 、(2) 、(3) および(5) における、各ＰＵＦＡエステルの含有割合を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0003892497.tif 000002
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度のＥＰＡ低級アルコールエステルを製造することができ、しかも効率的かつ選択的に製造することができるので生産性が向上する。