(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列から成る重鎖可変部および配列番号４に示されるアミノ酸配列から成る軽鎖可変部を含んで成るヒト免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に特異的なヒト化抗体。
【請求項２】
ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１１７７をもつ細胞株により生産される、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に特異的なヒト化抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヒト化抗体由来の抗原結合領域、および標的エピトープに特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を含んで成る、二官能性抗体またはヘテロ抗体。
【請求項４】
請求項３記載の二官能性抗体またはヘテロ抗体であって、該標的エピトープがガン細胞のエピトープである、上記の抗体。
【発明の詳細な説明】
背景
３つの構造的および機能的に異なる種類（すなわちＦcγＲＩ、ＦcγＲIIおよびＦcγＲIII）があるヒトＦcγ受容体（ＦcγＲ）（Fanger,M.W.,ら(1989)Immunology Today 10:92-99を参照にされたい）は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）オプソニン化標的の食作用または抗体−依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する、特性がよく知られた細胞表面糖タンパク質である。例えばイムノトキシンを特定の標的細胞型に標的とさせるか、あるいは特定の標的細胞型の放射線画像化のような様々な目的でＦcγＲに対する抗体が作成された。
ネズミモノクローナル抗体は抗体が大量に精製でき、そして肝炎またはヒト免疫不全ウイルスのようなヒト病原体による混入が無いので、ヒトの治療用に望ましい場合がある。ネズミモノクローナル抗体はヒトの治療に使用されたこともあるが、“外来”のネズミタンパク質に対する免疫反応の発生から結果がいつも望ましいものとは限らなかった。この免疫反応はヒト抗−マウス抗体またはＨＡＭＡ反応と名付けられ（Schroff,R.,ら（1985）、Cancer Res.,45,879-885）そしてその症状はヒトの血清疾患を引き起こし、個体の循環から急速なネズミ抗体のクリアランスをもたらす。ヒトでの免疫反応はネズミ免疫グロブリンの可変および定常領域の両方に対するものであることが示された。
組換えＤＮＡ法により、１つの種からの特異的な免疫グロブリン領域を別の種からの免疫グロブリン領域に置き換えることにより抗体を変化させる技法が提供された。Neubergerら（特許協力条約出願番号PCT/GB85/00392）は、１つの種由来のＩｇ分子の相補的な重および軽鎖可変領域ドメインを、別の種由来の相補的な重および軽鎖Ｉｇ定常ドメインと結合できる方法を記載している。この方法ではネズミ定常領域ドメインを置換するために使用してヒトの治療に使用するための“キメラ”抗体を作成することができる。Neubergerらに記載されるように生成されたキメラ抗体は、抗体が媒介するエフェクター効果（例えば補体固定：complement fixation）を効率的に刺激するためのヒトＦｃ領域を有するという利点があるが、ネズミ（“外来”）可変領域に対するヒトの免疫反応を顕現する可能性をもつ。
Winter（英国特許出願公開第GB2188538A）は、相補性決定部位（ＣＤＲ）を別の種由来のものと置き換えることにより抗体を変化させる方法を記載している。この方法は所望の結合特性（例えばヒト病原体に対して）をもつモノクローナル抗体のネズミ可変領域ドメインからのＣＤＲを、ヒト重および軽鎖Ｉｇ可変領域ドメイン中に置き換えるために使用できる。これらの変化したＩｇ可変領域は次にヒトＩｇ定常領域と連結させて組成が完全にヒトの（置換したネズミＣＤＲは除く）抗体を作成することができる。このWinterに記載された“再形成された”または“ヒト化した”抗体は、ネズミの組成がかなり低いのでヒトにおいてキメラ抗体と比較してかなり減少した免疫反応を現す。さらに変化した抗体の循環における半減期は、天然のヒト抗体の半減期に近づくはずである。しかしWinterにより言及されたように、ＣＤＲをウイルスまたは細菌タンパク質のような抗原に特異的な別の抗体由来の相補的ＣＤＲと交換するだけでは所望の結合能を保持する変性抗体を必ずしも生成できるとは限らない。実際、抗体の可変領域の枠組み構造内のアミノ酸の中にはＣＤＲを作成するアミノ酸残基と相互反応するので、抗原結合性を保存するためにヒトＩｇ可変領域中へのアミノ酸置換が必要になることもある。
発明の要約
本発明はＦｃ受容体（ＦｃＲ）に特異的なヒト化された抗体に関する。このヒト化された抗体は非−ヒト抗体由来（例えばネズミ）の相補性決定部位（ＣＤＲ）の部分を少なくとも有し、そして残る部分はヒト起源である。ヒトの治療においてはネズミ抗体よりはむしろヒト化抗体の使用が、ネズミモノクローナル抗体の使用に関連する問題を解消する場合もある。なぜならば置換したＣＤＲのみがヒト宿主の免疫系にとって外来となるからである。
本発明はさらにＦｃＲに特異的なヒト化された抗体を、ヘテロ抗体類、二官能性抗体類またはイムノトキシンの成分として使用することに関する。ＦｃＲに特異的なヒト化された抗体を同様に、そして同じ目的で対応するネズミの対応物として使用できる。例えば本発明のヒト化した抗−Ｆｃ受容体抗体をガン、アレルギーならびに感染および自己免疫疾患を治療するために使用できる。抗体の診断的な応用にはそれらのＦｃＲＩレベルのアッセイおよびＦｃＲレベルに影響する物質に関するアッセイでの使用がある。
【図面の簡単な説明】
第１図はネズミ０２２ＶＨ（配列番号３）のアミノ酸配列を、ヒト化ＮＥＷＭを基本としたＶＨ（０２２ＮＭＶＨ）（配列番号１）およびヒト化ＫＯＬを基本としたＶＨ（０２２ＫＬＶＨ）（配列番号２）のアミノ酸配列と比較したものである。ＣＤＲを枠で囲む。ヒト部分に保存されたネズミ残基は逆転黒塗り三角で示す。
第２図はネズミ０２２ＶＫ（配列番号２８）のアミノ酸配列を、ヒト化ＲＥＩを基本としたＶＫ（０２２ＨｕＶＫ）（配列番号４）と比較したものである。ＣＤＲを枠で囲む。ヒト部分に保存されたネズミ残基は反転黒塗り三角で示す。
第３図はヒト化またはキメラ０２２重鎖遺伝子の発現に使用したベクターを図解する。
第４図はヒト化またはキメラ０２２カッパ鎖遺伝子の発現に使用したベクターを図解する。
第５図は実施例に記載した酵素結合免疫アッセイでの試験抗体の結合性を図解する。
詳細な説明
本発明はＦｃ受容体に特異的なヒト化された抗体に関する。このヒト化された抗体は非−ヒト抗体由来の相補性決定部位（ＣＤＲ）の部分を少なくとも有するヒト抗体から作成される。この部分はヒトＦｃ受容体のためにヒト化された抗体の特異性を提供するように選択される。ヒト化された抗体は非−ヒト抗体由来のＣＤＲを有し、そして抗体の残る部分はヒトである。
この抗体は完全長の重および軽鎖を有する完全な抗体、またはその任意の断片（例えばＦａｂまたは（Ｆａｂ’）2断片）であってもよい。抗体はさらに軽鎖または重鎖の二量体、あるいはLanderら（米国特許第4,946,778号明細書、１９９０年８月７日発効、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載されたＦｖまたは単一鎖構造物のようなそれらの任意の最小断片であってもよい。
本発明のヒト抗体は非−ヒトＣＤＲを保持することができる任意のヒト抗体であることができる。好ましいヒト抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）に関しては既知のタンパク質ＮＥＷＭおよびＫＯＬ由来のものであり、そしてＩｇカッパ鎖、可変領域（ＶＫ）に関してはＲＥＩ由来のものである。これらのタンパク質は以下の実施例で詳細に記載する。
“相補性決定部位”（ＣＤＲ）は技術的に認識された用語であり、そしてＣＤＲを記載した配列中に配置するために使用する技術も従来の方法である。
ヒト抗体中に挿入された非−ヒトＣＤＲの部分は、ヒト化された抗体がＦｃ受容体に結合できるために十分であるように選択される。十分な部分はＣＤＲの部分をヒト抗体に挿入し、そして作成されたヒト抗体の結合能力を以下の実施例に記載する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することにより選択することができる。
特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲはすくなくとも１つの非−ヒトＣＤＲの部分と置き換えることができ、あるいはいくつかのＣＤＲだけを非−ヒトＣＤＲで置き換えることができる。ヒト化抗体をＦｃ受容体に結合させるために必要な数のＣＤＲの置き換えが必要なだけである。例示された非−ヒトＣＤＲはネズミ抗体由来であり、特にＣＤＲはモノクローナル抗体（ｍａｂ）．ｍａｂ２２由来である。このｍａｂ２２抗体はＦｃ受容体に特異的であり、そしてさらに米国特許出願第07/151,450号明細書（１９８８年２月２日出願）およびFangerら（米国特許第4,954,617号明細書、１９８８年９月４日発効）に記載されている。前述の係続中の出願および発効された特許は引用により本明細書に編入される。
このＣＤＲはヒトＦｃ受容体に特異的な非−ヒト抗体に由来する。このＣＤＲはFangerらにより特許出願および発効された特許（今後Fangerらという）で述べられたような既知のＦｃ受容体抗体由来であることもできる。ヒト免疫グロブリンＧにより遮断されない部位でＦｃ受容体と結合する抗体由来であることもできる。抗体はヒト免疫グロブリンＧの高親和性Ｆｃ受容体に特異的であってもよい。非−ヒトＣＤＲを誘導できる抗体の例は、ｍａｂ３２、ｍａｂ２２、ｍａｂ４４、ｍａｂ６２、ｍａｂ１９７および抗−ＦｃＲＩ抗体６２である。ヒト化ｍａｂ２２抗体生産細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクションに１９９２年１１月４日にＨＡ０２２ＣＬ１の名称で寄託され、そして受託番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
本発明はさらにヒト化された抗−Ｆｃ受容体抗体由来の少なくとも１つのヒト化された抗原結合領域、および標的エピトープに特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を有する二官能性抗体類またはヘテロ抗体類に関する。ヒト化された抗原結合領域は上記のようにヒト化された抗−Ｆｃ受容体抗体由来であってよい。Ｆｃ受容体に特異的な抗体部分を有する二官能性抗体またはヘテロ抗体はFangerらに詳細に記載されている。
本発明のヒト化抗体はFangerらにより記載された対応する非−ヒト化対応物のように、例えばイムノトキシン類またはヘテロ抗体類の成分として同様に使用できる。ヒト化抗体はさらに、それらの非−ヒト化対応物と同様な利用性を共有する。Fangerらの出願および特許のすべての考察事項および教示は引用により本発明に編入される。
本発明のヒト化抗体は少なくともヒト抗体のＣＤＲ部分を、非−ヒト抗体由来のＣＤＲと置き換えることができる任意の方法により作成できる。Winterは本発明のヒト化抗体を調製するために使用できる可能性のある方法を記載しており（英国特許出願公開第GB2188638A号、１９８７年３月２６日出願）、その内容は引用により本明細書に編入される。このヒトＣＤＲは非−ヒトＣＤＲに、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を使用して以下の実施例に記載するように置き換えることができる。
本発明のヒト化抗体は以下の簡単な説明に記載されるように作成できる。詳細な作成方法は実施例で説明する。同じ結果を得るために当業者は周知の従来技術を以下に記載された技術と置き換えることができることを理解すべきである。本発明のヒト化抗体は以下の工程で作成できる：
（ａ）常法により、非−ヒト免疫グロブリン由来の抗体重鎖（その中にＣＤＲ、および抗体結合特異性を保持するために必要な可変ドメイン枠組み構造領域の最小部分が含まれている）ならびにヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列を持つオペロンを含有する発現ベクターを構築し、これによって本発明のベクターを作成し、
（ｂ）常法により、非−ヒト免疫グロブリン由来の相補的抗体軽鎖（その中にＣＤＲ、および供与抗体結合特異性を保持するために必要な可変ドメイン枠組み構造領域の最小部分が含まれている）ならびにヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列を持つオペロンを含有する発現ベクターを構築し、これによって本発明のベクターを作成し、
（ｃ）発現ベクターを宿主細胞に常法によりトランスフェクトして本発明のトランスフェクトした宿主細胞を作成し、そして
（ｄ）トランスフェクトした細胞を常法により培養して本発明の変性抗体を生成する。
宿主細胞は本発明の２つのベクター（第一ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを有し、そして第二ベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを有する）でコートランスフェクト（cotransfcted）することができる。この２つのベクターは異なる選択マーカーを有するか、あるいは抗体重および軽鎖コーディング配列とは別に、重および軽鎖ポリペプチドの均等な発現をできる限り確実にするために、好ましくは同一である。場合によっては軽および重鎖ポリペプチドの両方をコードする配列を含む単一のベクターを使用できる。軽および重鎖のコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡあるいは両方を含んで成る。
本発明の変性抗体を発現するために使用する宿主細胞は、大腸菌のような細菌細胞または真核細胞のいずれかであってよい。特にミエローマ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のようなこの目的のためによく知られている哺乳類細胞を使用できる。
本発明のベクターを構築できる一般的方法、本発明の宿主細胞を生産するために必要なトランスフェクション法、およびそのような宿主細胞から本発明の抗体を生成するために必要な培養法は、すべて常法である。同様に、本発明のヒト化抗体をいったん生成すれば当該技術分野の標準的な方法（クロス−フロー濾過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）で精製できる。
本発明のヒト化抗体は同じ抗体の非−ヒト化変性体と同じか、または同様な方法で行うことができることを理解するべきである。また本発明のヒト化抗体は、同じ療法のために有用となるペプチドまたは非−ペプチド化合物（模造体）のいずれかを設計および合成するための抗体として使用できる（Saragobiら、Science 253:792-795(1991)、この内容は引用により本明細書に編入される）。
以下の実施例は本発明をさらに説明するために提供されたものであり、制限すべきためのものではない。
実施例
以下の実施例において、すべての必要名制限および修飾酵素、プラスミドならびに他の試薬および材料は特に指示しない限り市販されているものから入手した。
以下の実施例では特に指示しない限りすべての一般的組換えＤＮＡ法はニューヨーク、コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）により出版された“モレキュラークローニング、ア  ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）”(1982)、T.Maniatisら編集（この内容は引用により本明細書に編入される）、に記載されたように行った。
以下の実施例で次の略号を使用した：
ｄＣＴＰ    デオキシシチジン  三リン酸
ｄＡＴＰ    デオキシアデノシン  三リン酸
ｄＧＴＰ    デオキシグアノシン  三リン酸
ｄＴＴＰ    デオキシチミジン  三リン酸
ＤＴＴ      ジチオスレイトール
Ｃ          シトシン
Ａ          アデニン
Ｇ          グアニン
Ｔ          チミン
ＰＢＳ      リン酸緩衝塩溶液
ＰＢＳＴ    ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝塩溶液（ｐＨ７．５）
実施例１−Ｆｃ受容体に特異的なヒト化抗体の生成
ヒト化抗体の調製に使用した供与ＣＤＲの起源はネズミモノクローナル抗体，ｍａｂ２２であり、これはＦｃ受容体に特異的である。ｍａｂ２２ハイブリドーマ細胞系（０２２ＷＣＬ−１）を樹立した。細胞質ＲＮＡをｍａｂ２２細胞系からFavoloroら（Method in Enzymology 65,718-749(1980)、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載された方法を使用して調製した。ｃＤＮＡをＩｇＧＩおよびカッパ定常領域プライマーを使用して合成した。プライマーＣＧ１ＦＯＲを重鎖可変（ＶＨ）領域用に、そしてプライマーＣＫ２ＦＯＲをＩｇカッパ鎖領域（ＶＫ）用に使用した。ｃＤＮＡ合成反応混合物は全容量５０μｌ中に１μｇのＲＮＡ、０．５μＭのＣＧ１ＦＯＲまたはＣＫ２ＦＯＲ、２５０μＭのそれぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのジチオスレイトール、３ｍＭのＭｇＣｌ2および２０μＲＮＡガード（guard）（英国ミルトンケイネスのファルマシア（Pharmacia）から販売されている）から成るものであった。試料を７２℃で２時間加熱し、そしてゆっくりと３７℃に冷却した。ネズミモロネイ白血病ウイルス逆転写酵素（１００μｌ英国パイスレイのライフテクノロジー社：Life Technologiesから販売されている）を試料に加え、そして転写酵素を含有する試料を４２℃で６０分間インキュベーションした。
ＶＨおよびＶＫｃＤＮＡを次にSaikiら（Science 239,487-491(1988)、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載されたようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。上記工程に使用したプライマー次のとおりである。
0003888643.tif 000002
クローニングに利用するためのプライマーに包含される制限部位に下線を引いた。
ネズミＩｇＤＮＡのＰＣＲ増幅は、Orlandiら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3833-3838(1989)、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載された方法を使用して行った。ＤＮＡ／プライマー混合物は、ＶＨのＰＣＲ増幅用にＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド（１０μｌ）および２５ｐｍｏｌの各ＣＧ１ＦＯＲおよびＳＨ１ＢＡＣＫまたはＳＨ２ＢＡＣＫから構成した。ＤＮＡ／プライマー混合物はＶＫのＰＣＲ増幅用にＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド（１０μｌ）および２５ｐｍｏｌの各ＣＫ２ＦＯＲおよびＶＫ１ＢＡＣＫ、ＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ６ＢＡＣＫ、ＶＫ７ＢＡＣＫから構成した。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各２５０μＭ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、６０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１（重量／容量）％ゼラチン、０．０１（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１（容量／容量）％ＮＰ４０および２．５μアンプリタック（Amplitaq、英国ビアコンスフィールドをシータスから販売されている）を最終容量５０μｌの試料中に加えた。試料を９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の２５−３０回のＰＣＲ循環に供し、循環の最後は７２℃で５分間であった。
増幅したＶＨおよびＶＫ  ＤＮＡを、クローニングおよびシークエンシングのために低融点アガロースゲルで泳動し、そしてElutip−カラムクロマトグラフィー（英国アンダーマン、ウェルトンのシュライヒャーアンドシュウール：Schleicher and Schueellから販売されている）により精製した。精製したＶＨ  ＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、そしてＭ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９（英国ケイネス、ミルトンのファルマシアから販売されている）中にクローン化した。精製したＶＫ  ＤＮＡをＰｖｕIIまたはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、そしてＭ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９中にクローン化した。一般的なクローニング法はSambrookらの方法（モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ(1989)、この内容は引用により本明細書に編入される）を参照されたい。生成したクローンの集団をＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（英国ケイネス、ミルトンのファルマシアから販売されている）を使用してジデオキシ法によりSangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463-5467,(1979)、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載されたようにシークエンシングした。
０２２ＶＨおよびＶＲドメインの配列から、ＣＤＲ配列をKabatら（“免疫的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）”ヘルスアンドヒューマンサービス米国部門（US Department of Health and Human）、米国政府出版部、この内容は引用により本明細書に編入される）のデータベースを参考にして決定し、そして他のＶＨおよびＶＫ配列との整合性をコンピューターを使用して決定した。
ネズミ０２２ＣＤＲをヒトの枠組み構造中に移すことは、Nakamyeら（Nucleic Acid Res 14,9679-9687(1989)、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載されたオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法により行った。使用したプライマーは次のとおりである。
0003888643.tif 000003
ＮＭＨＣＤＲ１のプライマーはＮＥＷＭ残基Ｓｅｒ２７Ｔｈｒ２８からＰｈｅ２７Ｉｌｅ２８への変化を含むように伸長させた。ＮＭＨＣＤＲ２のプライマーはＮＥＷＭ残基Ｖａｌ７１からＡｒｇ７１への変化を含むように伸長させた。
ＶＨの突然変異誘発法に使用したＤＮＡ鋳型は、Saulら（J.Biol.Chem.53,585-597(1978)）に記載された結晶学的に溶解したタンパク質ＮＥＷまたはSchmidtら（Z.Physical Chem.364,713-747(1983)）に記載されたＫＯＬからのヒト枠組み構造領域を含んで成るものであった。ＶＫの突然変異誘発法に使用したＤＮＡ鋳型は、Eppら（Eur.J.Biochem.45,513-524(1974)）に記載された結晶学的に溶解したタンパク質ＲＥＩからのヒト枠組み構造領域を含んで成るものであった。上記２つの文献の内容は引用により本明細書に編入される。
不適切なＣＤＲのヒト枠組み構造を含んで成るＭ１３を基本とした鋳型Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１（ＮＥＷＭＶＨ用）、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ２（ＫＯＬＶＨ用）およびＭ１３ＶＫＰＣＲ２（ＲＥＩＶＫ用）は、Riechmannら（Nature 332,323-327(1988)、この内容は引用により本明細書に編入される）により記載されたように調製した。オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法は以下の方法を使用して行った。５倍モル過剰の各リン酸化突然変異誘発オリゴヌクレオチドをユニバーサルＭ１３シークエンシングプライマーの前進方向に付加した（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）（配列番号２４）。すべてのプライマーを２０μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭのＭｇＣｌ2中で７０−８５℃に２分間加熱することによりアニールし、ゆっくり室温に冷却した。１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、４０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．５μＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（米国バイオケミカルズ：Biochemicalsから販売されている）および０．５μＴ４  ＤＮＡリガーゼ（英国パイスリーのライフテクノロジーから販売されている）をアニールしたＤＮＡに、３０μｌの反応容量で加え、そして２２−３７℃に１−２時間インキュベーションした。新たに伸長した、そして連結し鎖を、Ｍ１３リバースシークエンシングプライマー（５’ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）（配列番号２５）を使用して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが支配する反応で親の鎖にわたって選択的に増幅した。リバースシークエンシングプライマーは親の鎖とは相補的ではない。５０μｌの反応混合物は、１μｌの伸長／連結生成物、２５ｐｍｏｌのＭ１３リバースシークエンシングプライマー、２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１μＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（英国ビショップのストートホード、ニューイングランドバイオラボズ：New England Biolabsから販売されている）または２．５μAmpliTaq（米国、ベアコンスフィールドのシータスから販売されている）を適当な酵素供給元が推薦する緩衝液中に含め、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７５または７２℃で９０秒、そして最後の循環が７２℃で５分間の３０回の熱循環に供した。この試料の４μｌのアリコートを次に、５０μｌの反応混合物中に２５ｐｍｏｌの各プライマー、２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．５μAmpliTaq（シータス）を適当な酵素供給元が推薦する緩衝液中に含め、Ｍ１３ユニバーサルおよびリバースシークエンシングプライマーの両方を使用したＰＣＲにより増幅させた。増幅したＤＮＡをＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＭ１３ｍｐ１９中にクローン化し、そしてシークエンシングした。
Ｍ１３ＶＨＰＣＲ２  ＫＯＬ  ＶＨ残基Ｌｅｕ７１からＡｒｇ７１の突然変異誘発法は、Hoら（Gene,77,51-55(1989)、この内容は引用により本明細書に編入される）の重複／伸長ＰＣＲ法（overlap/extension PCR method）によるものであった。使用した重複するオリゴヌクレオチドは５’−ＴＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡ（配列番号２６）および５’−ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＧＴＡＡＡ（配列番号２７）。
ヒト化された抗体のアミノ酸配列を第１および２図に示すように既知のネズミ抗体のものと比較した。ＶＨおよびＶＫ遺伝子に置き換えられたＣＤＲを発現ベクターｐＳＶｇｐｔおよびｐＳＶｈｙｇ中に第３および４図に示すように、Orlandiら（同上）に記載されたようにクローン化した。ＮＥＷＭＶＨおよびＫＯＬＶＨ遺伝子に置き換えられたＣＤＲは、Ｉｇ重鎖プロモーター、適当なスプライス部位およびシグナルペプチド配列と一緒にＭ１３からＨｉｎｄIIIおよびｂａｍＨＩによる消化で切り出され、そしてｐＳＶｇｐｔ発現ベクター（ネズミＩｇ重鎖エンハンサー、哺乳類細胞中で選択するためのｇｐｔ遺伝子、および大腸菌中での複製および選択のための遺伝子を含有した）にクローン化した。またプラスミドはヒトＩｇＧＩ定常領域をTakahashiら（Cell 29,671-675(1982)）に記載されたように含む。カッパ鎖発現ベクターは、ｇｐｔ遺伝子がヒグロマイシン耐性遺伝子に置き換わり、そしてヒトカッパ定常領域（Hieterら、Cell 22,197-207(1980)）を含む以外は本質的に同じである。上記２つの文献の内容は引用により本明細書に編入される。
約５μｇの各重鎖発現ベクターおよび１０μｇのカッパ鎖発現ベクターがＰｖｕＩにより消化された。ＤＮＡを一緒に混合し、エタノール沈殿し、そして２５μｌの水に溶解した。約５−１０×１０6ＮＳＯ細胞（英国のポートンダウン、動物細胞カルチャーのヨーロピアンコレクションから）を１０％のウシ胎児血清（スコットランド、パリスレーのミオクローンプラス、ギブコ：Myoclone plus）を加えたダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で半集密状態（semi-confluency）に生育させ、遠心により回収し、そして０．５ｍｌのＤＭＥＭ中に消化ＤＮＡと一緒にキュベット中で再懸濁した。氷中で５分後、細胞に１７０Ｖのシングルパルスを与え（Gene-Pulser、カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッド：BioRad）、さらに氷中に２０分間静置した。細胞を次に２０ｍｌのＤＭＥＭ＋補充１０％ＦＣＳ中に入れて、２４−４８時間回復させた。この後、細胞を２４−ウェルプレートに分割し、そして選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、０．８μｇ／ｍｌマイコフェノール酸および２５０μｇのキサンチン）を添加した。３−４日後、培地および死んだ細胞を回収し、新鮮な選択培地と交換した。トランスフェクトしたクローンは１０日後に裸眼で検出できた。
ｇｐｔ＋トランスフェクション体を含有するウェルの培地中のヒト抗体の存在を、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して測定した。マイクロタイタープレート（バージニア州、ダイナテック、キャニティーのイモロン：Immolon）のウェルを１００ｎｇのヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（英国、クラウレイダウンのセララボ：SeaLab）（１００μlの５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．６中）で被覆した。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝塩溶液ｐＨ７．２）で洗浄した後、１００μｌのＰＢＳＴ（５−５０ｕｌ）の培地を各ウェルに３７℃で１時間加えた。ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、そして１００μｌの１：１０００希釈ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−ヒトカッパ定常領域抗体（英国、クラウレイダウンのセララボ）を３７℃で１時間加えた。ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、そして１００μｌのＯＰＤ基質緩衝液（２４ｍＭのクエン酸／４２ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５中の４００μｇ／ｍｌ  Ｑ−フェニレンジアミンおよび０．０００３（容量／容量）％Ｈ2Ｏ2）を加えた。反応を１２．５％のＨ2ＳＯ4（２５μｌ）を２−３分間加えて停止し、そして４９２ｎｍの吸収を測定した。
抗体分泌細胞を広げ、そして抗体をカルチャー培地からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、HarlowおよびLane（抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、この内容は引用により本明細書に編入される）に記載されたように精製した。
抗体の抗原に対する結合はＥＬＩＳＡにより測定した。マイクロタイタープレート（イモロン１、バージニア州のダイナテック、シャニティリー）のウェルを２００ｎｇのヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体（英国、クラウレイダウンのセララボ）（１００μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中）で３７℃にて少なくとも１時間被覆した。ウェルを空にし、ＰＢＳＴで１回洗浄し、そして１％ＢＳＡで室温にて３０分間ブロックした。ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、そしてＦｃＲＩ／ＩｇＭ融合タンパク質を含有するＣｏｓ上清を加え、そして室温にて１時間インキュベーションした。次にウェルを空にし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した試験抗体を加え、そして室温にて１時間インキュベーションした。さらに各ウェルは２μｇのヒトＩｇＧＩ、ラムダ抗体（英国ポーレのシグマ：Sigma）を含んだ。次にウェルを空にし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、そして４０ｎｇのペルオキシダーゼヤギ抗−ヒトカッパ定常領域抗体（英国、クラウレイダウンのセララボ）（１００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）を各ウェルに加えた。１時間室温でインキュベーションした後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、そして１０μｌのＨＰＤ基質緩衝液を加えた。反応は各ウェルに２５μｌの１２．５％Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止する。４９２ｎｍの吸収を測定し、それを第５図に示す。試験抗体は不適切なＣＤＲ（ＡＡ）、完全なヒト化ＫＯＬ／ＲＥＩを基本とした抗体（ＫＬＶＨＲ／ＨｕＶＫ）、ヒト化抗体の混合および対合誘導体（ＫＬＶＨＲ／ＭｕＶＫおよびＭｕＶＨ／ＨｕＶＫ）、ヒト化ＮＥＷＭ／ＲＥＩ基本抗体（ＮＭＶＫ／ＨｕＶＫ）およびキメラ抗体（ＭｕＶＨ／ＭｕＶＫ）を含有する抗体であった。
本発明の主な特徴および態様は次のとおりである。
１．ヒトＦｃ受容体に対するヒト化抗体の特異性を提供するように選択されている、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域の少なくとも１部分を有するヒト抗体を含んで成るＦｃ受容体に特異的なヒト化抗体。
２．上記部分が、形成されたヒト化抗体がヒト免疫グロブリンＧにより遮断されない部位でＦｃ受容体と結合するように、ヒトＦｃ受容体に対する特異性を提供するように選択される前記第１項記載の抗体。
３．上記部分がヒト免疫グロブリンＧの高親和性Ｆｃ受容体のヒト化抗体の特異性を提供するように選択される前記第１項記載の抗体。
４．相補性決定領域の部分がネズミ抗体由来である前記第１項記載の抗体。
５．相補性決定領域の部分が、ｍａｂ３２、ｍａｂ２２、ｍａｂ４４、ｍａｂ６２、ｍａｂ１９７および抗−ＦｃＲＩ抗体６２から成る群から選択されたモノクローナル抗体由来である前記第１項記載の抗体。
６．モノクローナル抗体がｍａｂ２２である前記第５項記載の抗体。
７．ヒト抗体の全相補性決定領域の少なくとも一部が、非ヒト抗体由来である前記第１項記載の抗体。
８．ヒト抗体の全相補性決定領域の全部が、非ヒト抗体由来である前記第７項記載の抗体。
９．非ヒト抗体がｍａｂ２２である前記第７項記載の抗体。
１０．非ヒト抗体がｍａｂ２２である前記第８項記載の抗体。
１１．ヒト抗体が、ＮＥＷ、ＫＯＬ、ＲＥＩおよびそれらの組み合わせから成る群から選択されたタンパク質由来である前記第１項記載の抗体。
１２．ヒト化抗−Ｆｃ受容体抗体由来の少なくとも１つのヒト化抗原結合領域、および
標的エピトープに特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を含んで成る二官能性抗体またはヘテロ抗体。
１３．ヒト化抗原結合領域が、ヒトＦｃ受容体に対するヒト化抗体の結合がヒト免疫グロブリンＧにより遮断されないように選択されたヒト化抗−Ｆｃ受容体抗体由来である前記第１２項記載の抗体。
１４．ヒト化抗−Ｆｃ受容体抗体がヒト免疫グロブリンの高親和性Ｆｃ受容体に特異的である前記第１３項記載の抗体。
１５．ヒト化抗原結合領域が非ヒト抗体由来の相補性決定領域の部分を少なくとも有する前記第１２項記載の抗体。
１６．相補性決定領域の部分がネズミ抗体由来である前記第１５項記載の抗体。
１７．相補性決定領域の部分が、ｍａｂ３２、ｍａｂ２２、ｍａｂ４４、ｍａｂ６２、ｍａｂ１９７および抗−ＦｃＲＩ抗体６２から成る群から選択されたモノクローナル抗体由来である前記第１５項記載の抗体。
１８．モノクローナル抗体がｍａｂ２２である前記第１７項記載の抗体。
１９．ヒト抗体の全相補性決定領域の少なくとも一部が、非ヒト抗体由来である前記第１５項記載の抗体。
２０．ヒト抗体の全相補性決定領域の全部が、非ヒト抗体由来である前記第１９項記載の抗体。
２１．非ヒト抗体がｍａｂ２２である前記第１９項記載の抗体。
２２．非ヒト抗体がｍａｂ２２である前記第２０項記載の抗体。
２３．標的エピトープがガン細胞のエピトープである前記第１２項記載の抗体。
２４．標的エピトープが感染源のエピトープである前記第１２項記載の抗体。
２５．標的エピトープが抗体生産細胞のエピトープである前記第１２項記載の抗体。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名前：メドアレックス、ＩＮＣ．
（Ｂ）通り：チャンバース通り２２
（Ｃ）市：プリンストン
（Ｄ）州：ニュージュジー
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０８５４２
（Ｇ）電話：（６０９）９２１−７１２１
（Ｈ）ファックス：（６０９）９２１−７４５０
（ii）発明の名称：ヒト単核食細胞上の免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に対するヒト化された抗体
（iii）配列の数：２８
（iv）コンピューター読み取り先：
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）実行システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ  テキスト
（ｖ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vi）先願データ：
（Ａ）出願番号：ＧＢ９２  ２３３７７．４
（Ｂ）出願日：１９９２年１１月４日
（Ｃ）分類：
（vii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）名前：マンドラゴウラス、アミー  イー．
（Ｂ）登録番号：３６．２０７
（Ｃ）参考／適用番号：ＭＩＸ−０１３ＰＣ
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（６１７）２２７−７４００
（Ｂ）ファックス：（６１７）２２７−５９４１
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１
0003888643.tif 000004
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２
0003888643.tif 000005
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３
0003888643.tif 000006
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４
0003888643.tif 000007
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号５：
0003888643.tif 000008
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号６：
0003888643.tif 000009
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号７：
0003888643.tif 000010
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号８：
0003888643.tif 000011
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号９：
0003888643.tif 000012
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１０：
0003888643.tif 000013
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１１：
0003888643.tif 000014
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１２：
0003888643.tif 000015
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１３：
0003888643.tif 000016
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１４：
0003888643.tif 000017
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１５：
0003888643.tif 000018
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１６：
0003888643.tif 000019
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１７：
0003888643.tif 000020
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１８：
0003888643.tif 000021
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１９：
0003888643.tif 000022
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２０：
0003888643.tif 000023
（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２１：
0003888643.tif 000024
（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２２：
0003888643.tif 000025
（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２３：
0003888643.tif 000026
（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２４：
0003888643.tif 000027
（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２５：
0003888643.tif 000028
（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２６：
0003888643.tif 000029
（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２４：
0003888643.tif 000030
（２）配列番号２８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２８：
0003888643.tif 000031
【図１Ａ】
0003888643.tif 000032
【図１Ｂ】
0003888643.tif 000033
【図２】
0003888643.tif 000034
【図３】
0003888643.tif 000035
【図４】
0003888643.tif 000036
【図５】
0003888643.tif 000037