(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロプロテアーゼ活性を有し、高等脊椎動物のCNSミエリンの非許容性基質特性を中和することができるラットC6原形質膜の組成物。
【請求項２】
患者の神経膠芽腫を検出する方法であって、患者から得た試料中にメタロプロテアーゼが存在することを検出することから成り、該メタロプロテアーゼは高等脊椎動物のCNSミエリンの非許容性基質特性を中和することができ、この中和は、インビトロで神経突起の成長又は繊維芽細胞の拡大を支持する該メタロプロテアーゼの存在下においてCNSミエリンの能力を観察することにより検出される、上記方法。
【請求項３】
適当な薬理学的担体中に、神経突起成長阻害因子の機能に拮抗する抗体又はその抗原結合領域の有効量を含有する、中枢神経系の損傷を有する患者を治療するための薬剤組成物であって、神経突起成長阻害因子が次の特性：
（a）インビトロで神経突起の成長又は繊維芽細胞の拡大を阻害する能力により検出される非許容性基質特性；
（b）高等脊椎動物の中枢神経系ミエリンから分離されうる；及び
（c）ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、約35,000ダルトン及び250,000ダルトンの分子量を有する；
により特徴づけられる蛋白質又はその活性を保持する断片からなる、上記薬剤組成物。
【請求項４】
神経突起成長阻害因子が、ECACCに寄託され、受託番号が88102802であるモノクローナル抗体IN-2により特異的に結合されるものである、請求項３記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記方法が、インビトロで神経突起の成長又は繊維芽細胞の拡大を支持するメタロプロテアーゼの存在下においてCNSミエリンの能力を観察することによりCNSミエリンの非許容性基質特性の中和を検出し、かつ1,10-フェナントロリン、カルボベンゾキシ-チロシン-チロシン、又はカルボベンゾキシ-グリシン-フェニルアラニン-アミドによる前記能力の阻害を検査することを含む、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
１．序
本発明は、神経突起（neurite）の成長を調節する遺伝子及びこのコードされた蛋白、これに対する抗体、及び、かかる蛋白ならびに抗体の治療上又は診断上の使用に向けられる。本発明の蛋白は、中枢神経系ミエリン関連阻害蛋白、及び、悪性腫瘍、殊に、神経膠芽腫（glioblastoma）や脳内に転移し、かつそこで拡大しうる他の腫瘍のような、初期脳腫瘍に関連するメタロプロテアーゼを含む。中枢神経系ミエリン関連阻害蛋白は神経突起の生長、及び、繊維芽細胞の拡大を阻害し、そして、悪性腫瘍の治療において重要な用途をもつことができる。この阻害蛋白に対する抗体は、悪性腫瘍の診断及び中枢神経系の損傷と変性による神経の疾病の治療において用途をもつことができる。本発明の特別の態様において、神経突起成長阻害剤に対する抗体は、脊髄の損傷に続く長い距離にわたるニューロンの再生を促進するのに使用しうる。本発明のメタロプロテアーゼは、神経膠芽腫の侵襲性の成長を許容し、かつ、中枢神経系組織における神経突起の生長を許容する。メタロプロテアーゼは、中枢神経系の損傷及び変性による神経の病気の治療において重要な用途を有する。メタロプロテアーゼの阻害は、悪性腫瘍の治療において、治療上有用でありうる。
２．発明の背景
２．1  中枢神経系の神経突起の成長に影響を与える因子
細胞付着、細胞拡大、細胞能動性及び、特に、神経突起（neurite）の生長は細胞−基質の相互作用に強く依存する。（Sanes, 1983, Ann. Rev. Physiol.45：581-600；Carbonettoら，1987, J. Neurosci.７：610-620）。神経芽細胞の移動又は神経突起の成長に好都合の基質分子の数の増大は、中枢及び末梢神経組織において見い出されている（Cornbooksら，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：3850-3854；Edelman, 1984, Exp. Cell Res. 161：1-16；Liesi, 1985, EMBO J.４：1163-1170；Chiu, A.Y.ら，1986, J.Cell Biol. 103：1383-1398；Fischerら，1986, J.Neurosci.６：605-612；Lindnerら，1986, Brain Res. 377：298-304；Mirskyら，1986, J.Neurocytol. 15：799-815；Stallcupら，1986, J.Neurosci.５：1090-1101；Carbonettoら，1987, J.Neurosci.７：610-620）。これらの因子のいくつかの出現は特別の発展段階と、そして、末梢神経系（ＰＮＳ）においては、さらに、除神経と相関させることができる。（Edelman, 1984, Exp. Cell Res.161：1-16；Liesi,1985, EMBO J. ４：1163-1170；Stallcupら，1985, J.Neurosci. 5：1090-1101；Daniloffら，1986, J.Cell Biol. 103：929-945；Carbonettoら，1987, J.Neurosci.７：610-620）。細胞外の細胞間質蛋白テナスチン（tenascin）は、非許容性の基質特性を有することが示されている。（Chiquet-Ehrismannら，1986, Cell 47：131-139）。
神経突起の成長に有利な可溶性因子の最も特徴的なものの１つは神経成長因子（nerve growth Factor, NGF）である。神経成長因子は、インビボ及びインビトロにおいて、胎児性の感覚及び交感神経系の神経節からの神経繊維の成長、及び、神経突起の成長を促進する。（Thoenenらのレビュー，1982, Repairand Regeneration of the Nervous System, J.G.Nichollas編，Springer-Verlag, NY, p.173-185）。神経成長因子は、又、このような神経突起の成長の方向を導く。神経成長因子には、３つの異なった分子型が認識されている。第１の型は、２個の非共有結合的に結合した、同一のポリペプチド鎖から成るダイマー（分子量〜26,000）である。第２の型は中性pHにおいて安定であり、３個の異なるポリペプチド鎖、α，β及びγを有する（分子量〜140,000）。このβ鎖は生物学的に活性な鎖であり、そして、第１の型の神経成長因子と同一である。第３の型は、主として、マウスのＬ細胞から分離されるが（Youngによる米国特許第4,230,691号明細書を参照。1980年10月28日に発行）、これは、約160,000の分子量を有しており、中性pHにおいて不安定である。神経成長因子は、これまで、マウスの顎下腺、マウスＬ細胞及びモルモット及び雄牛の前立腺から分離されている（Thoenenらの1982年の前掲書）。マウス、モルモット及び雄牛の神経成長因子の生物学的活性の間には、何らの差異も見い出されていない。加えて、マウスから分離された神経成長因子は、ヒトの神経成長因子の受容体に結合することが見い出されている（Johnsonら，1986, Cell 47：545-554）。
高等脊椎動物の分化した中枢神経系（ＣＮＳ）は、損傷の後では、非常に限られた再生的な神経突起の成長のみを可能とする。損傷の後の限られた再生は網膜において（McConnellとBerry, 1982, Brain Res. 241：362-365）及び、化学的損傷の後でアミナージック（aminergic）な非有髄繊維管において（BjorklundとStenevi, 1979, Physiol. Rev. 59：62-95）みられるが、機械的損傷の後ではみられない（Bregman, 1987, Dev. Brain Res.34：265-279）。大人のラットの中枢神経系に移植された胎児の中枢神経系からの神経突起の成長は、幾つかのケースにおいて、灰白質の領域で14ミリに達することが知られているが、白質では１ミリを越えたものは知られていない（Nornesら，1983, Cell Tissue Res. 230：15-35；Bjorklund及びStenevi, 1979, Physiol. Rev. 59：62-95；Commission, 1984, Neuroscience 12：839-853）。一方、拡大した再生的成長は、下等な脊椎動物及びヒトを含むすべての脊椎動物の末梢神経系においてみられる。移植実験の結果は、中枢神経系のニューロンは移植された末梢神経組織にむけて容易に突起を延ばすので、再生の欠乏は中枢神経系ニューロンの固有の特性ではないことを示している（BenfeyとAguayo,1982, Nature（London）296：150-152；Richardsonら，1984, J.Neurocytol. 13：165-182及びSoとAguayo, 1985, Brain Res. 328：349-354）。しかしながら、末梢神経系ニューロンは中枢神経系組織への突起の拡大に失敗したので、この２つの組織の間には、基本的な差異が存在することを示している（Aguayoら，1978, Neurosci. Lett.９：97-104；WeinbergとSpencer, 1979, Brain Res. 162：273-279）。
末梢神経系と中枢神経系の組織の間の１つの主要な差異は、神経突起の成長を促進する細胞外の細胞間質成分ラミニンの異なる分布である（Liesi, 1985, EMBO J,４：2505-2511；Carbonettoら，1987, J.Neurosci.７：610-620）。他の要素も関係するかもしれない。劇的な差異は、坐骨神経細胞外植体と視神経外植体の双方におけるラミニンの免疫反応性の存在にもかかわらず、インビトロにおける両者の外植体の神経突起成長支持特性中に観察される（Schwab及びThoenen, 1985, J.Neurosci.５：2415-2423）。これらの実験は、最適量の神経親和性の（neurotrophic）因子の存在下で実施されたが、差異は試験された基質の凍結時に存在した。
分化した中枢神経系は、発育の間神経突起の成長にとって助けとなる細胞質又は基質成分に欠けているか（Liesi, 1985, EMBO J.４：2505-2511；及びCarbonettoら，1987, J.Neurosci,７：610-620）、又は、神経繊維の再生にとって非許容性の、又は阻害的な成分を含む（Schwab及びThoenen, 1985, J.Neurosci.５：2415-2423）かもしれないことが示唆されてきた。
最近になって、マウス神経芽細胞腫の細胞に対する成長（細胞分化）阻害因子が部分的に精製され、胎児ラットの神経膠芽腫並びにＣ６ラットの神経膠腫細胞の培養媒質から特性化された（Sakazakiら，1983, Brain Res, 262：125-135）。この因子は、5.8の等電点を有し、BioGel P-20のゲル濾過により、約75,000の分子量をもつことが推定された。この因子は神経膠細胞（Ｃ６）又は線維芽細胞（３Ｔ３）の成長速度又は形態を変えるようにはみえなかった。加えて、神経芽細胞腫細胞（Neuro La NS-20Y及びNIE-115）又はクローン化した神経芽細胞（３Ｔ３）に対する有意の神経成長阻害因子活性は検出されなかった。
カロニ（Caroni）とシュワブ（Schwab）は、インビトロにおける神経突起の成長及び線維芽細胞の拡大に対する強力な非許容性基質特性をもつ、35kDと250kDのミエリン膜−結合蛋白の存在を示した（1988, J.Cell Biol. 106：1281-1288）。カロニとシュワブは、阻害性基質蛋白に対して生産されたモノクローナル抗体（IN-1とIN-2と呼ばれる）は、分離されたミエリン膜分画の、培養された高度に分枝した寡突起神経膠細胞、及び大人ラットの視神経外植体の35KD及び250KDの２つの阻害剤の非許容性を中和し、かつ大いに減少させることを示した（1988年３月，Neuron １：85-96）。
２．2  プロテアーゼ及びその阻害剤
過去に、異なった蛋白分解活性が、腫瘍発生細胞系において（Matrisianら，1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：9413-9417；Mignattiら，1986, Cell 47：487-498）、また、初期腫瘍外植体において（MullinsとRohrlich, 1983, Biochem. Biophys,Acta 695：177-214）、また、形質転換された細胞において（Quigley, 1976, J.Cell Biol. 71：472-486；MardaviとHynes,1979, Biochem. Biophys. Acta 583：167-178；Chenら，1984, J.Cell Biol.98：1546-1555；Wilhelmら，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84：6725-6729）、増大されることが示されている。かかる一群のプロテアーゼの１つであるメタロプロテアーゼは、筋原細胞の融合（CouchとStritmatter, 1983, Cell, 32：256-265）、及び、マスト細胞のエキソサイト−シス（MundyとStritmatter, 1985, Cell, 40：645-656）を含む、多くの膜の出来事に関与していることが示されている。
原形質膜−結合のメタロプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ24.11，エンケファリナーゼ）の分離と特徴は、アルメノッホ（Almenoff）とオーロウスキ（Orlowski）により報告されている（1983, Biochemistry 22：590-599）。ラウス肉腫ウイルスにより発現されたメタロプロテアーゼは、フィブロネクチンを分解し、そして粘着サイト及び“インバドポディア（invadopodia）”上に局在するニワトリ胚の線維芽細胞を形質転換することが、チェンとチェン（Chen and Chen）により記載された（1987, Cell 48：193-203）。
プロテアーゼとその阻害剤は、神経芽細胞腫細胞内での神経突起の伸展に（Monardら，1983, Prog. Brain Res.58：359-363）、又、培養された新産のマウス感覚神経節における神経突起の伸展に（Hawkins及びSeed, 1986, Brain Res. 398：63-70）影響を与えることが、研究により指摘されている。培養された神経膠細胞と神経膠腫は43kDの蛋白を放出することが見い出され、神経膠は神経芽細胞腫細胞において神経突起の成長をもたらし、かつ、細胞の移動を阻害する神経突起促進因子（ＧｄＮＰＦ）を誘導する（Monardら，1983，前掲）。Ｇd ＮＰＦは、セリンプロテアーゼ活性に関連する細胞表面の非常に強力な阻害剤であることが示された。通常のマウスの感覚神経節からの神経突起の成長は、セリンプロテアーゼ阻害剤、オボムコイドトリプシン阻害剤、ロイペプチン、大豆トリプシン阻害剤又はトロンビンの添加により促進することができる（HawkinsとSeeds, 1986，前掲）。一方、プロテアーゼがかかる神経突起の成長を阻害することも見い出されている。予備的研究の結果によれば、かかるプロテアーゼはトロンビン又はトリプシン様活性を有することが示される（HawkinsとSeeds,1986，前掲）。
他のプロテアーゼが神経突起の成長における機能的な役割を通じて特徴づけられたということは、未だ知られていない。これらは、ウロキナーゼ様のプラスミノーゲン活性化因子、及び、交感神経ニューロンとラットの知覚ニューロンにより放出されるカルシウム依存性のメタロプロテアーゼを含む（Pittman, 1985, Dev. Biol. 110：911-101）。メタロプロテアーゼは、62kDの分子量を有し、カルシウム活性のために１ミリモルのCa2+を必要とし、カゼイン、アルブミン又はフィブロネクチンよりも容易に、天然及び変成コラーゲンを分解することが見い出された。プラスミノーゲン活性化因子は51kDの分子量を有し、ヒトのウロキナーゼに対して製造されたウサギの抗血清により沈澱させられることが知られている。これは、32kDの活性形に転換できる。
２．3  神経芽細胞腫（Neuroblastoma）
神経芽細胞腫は神経外胚葉から生じ、そして、アナプラスチックな交感神経節細胞を含有する（PinkelとHowarthの1985年のレビュー：Medical Oncology, Calabrese, P.,Rosenburg, S.A.,及びSchein, P.S.,eds.,MacMillan, NY. p.1226-1257）。神経芽細胞腫の一つの興味ある事は、それが、ヒトの腫瘍の中で最大速度の自然の退縮を行うものの１つであり（Everson, 1964, Ann. NY Acad. Sci, 114：721-735）、そして、かかる退縮と良性の神経性節神経腫の成熟の間には相関関係がある（Bolande, 1977, Am, J. Dis. Child, 122：12-14）。神経芽細胞腫細胞は、培養時の形態学的成熟のための能力を保持することが見い出されている。腫瘍は交感神経鎖に沿って、どこでも生じうるものであり、かかる腫瘍の50％は副腎の髄質で生ずる。
神経芽細胞腫は、主に、就学前の年令の小児に生じ、そして、小児において最も一般的な頭蓋の外の固体腫瘍であり、小児ガンの6.5％を占める。その半数は、二才以下の診断において存在する。発覚時、60％の患者において転移が明白であり、通常、骨、骨髄、肝臓、又は皮膚である。みられる症状は初期腫瘍（脊髄のコーラル（coral）の圧迫、腹部の塊り）、転移ガン（骨の痛み）、又は、カテコラミンやガンにより分泌される血管に作用するポリペプチドのような物質の代謝の影響（例えば、高血圧、下痢）に関係するかもしれない。
実験的な証拠は、神経成長因子に対する変化した応答は神経芽細胞腫と関係することを示している（SonnenfeldとIshii, 1982, J. Neurosci,Res.８：375-391）。神経成長因子は、試験した神経芽細胞腫細胞系の半数で神経突起の成長を刺激した；他の半分は非感受性であった。しかしながら、神経成長因子はいかなる神経芽細胞腫の細胞系の成長速度も高められた生存率も減少させなかった。
神経芽細胞腫に対する現在の治療は、外科的及び／又は化学療法を含む。放射線治療は、化学療法に不完全な応答の腫瘍に対して使用される。局部の腫瘍である人においてはその生存率は70〜100％であるが、転移した病気をもつ者においては多剤化学療法を使用しても、生存率は20％にすぎない。一才以下の患者は、それ以上の患者に比べて良好な予後を有する（70％）ように思われる。
２．4. 神経膠芽腫
神経膠芽腫は、通常大脳半球に位置する極度に悪性の神経膠星状細胞の（astrocytic）腫瘍である。神経膠星状細胞はニューロンの支持組織であるように思われ、非常に多数の脳の実質内細胞から成る（Cutler中のレビュー，1987,：Scientific American Medicine V.２，RubensteinとFederman編，Scientific American, Inc., NY, p.1-7）。神経・伝達系の障害と疾病に関する国立研究所（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Strokes）により実施された研究の結果では、米国における初期脳腫瘍の出現率は100,000当たり約８であり、この腫瘍のうちの20％が神経膠芽腫である。これらの腫瘍は、一般には、45〜55才の年令の人に見られる。腫瘍は、又、多葉（multiple lobes）を含み、そして、脳室系内で破裂するか、脳梁を横切って反対側の半球に広がる。頭蓋内圧力の上昇により、腫瘍の増大の症状は、頭痛、悪心及び嘔吐、精神状態の変化及び意識障害をともなう。その高度な浸入性の特性により、神経膠芽腫の予後はよくない。化学療法剤又は放射線治療を使用しうる。しかしながら、患者は一般的に、これらの治療を行っても、２年以上は生存しない。
３．発明の概要
本発明は、神経突起の成長を調節する遺伝子及びそのコードされた蛋白、ならびに、この蛋白の診断上及び治療上の使用に関する。かかる蛋白は、ここでは、神経突起成長調節因子と呼ばれる。本発明の神経突起成長調節因子は、その一の態様において、神経突起の成長を阻害する中枢神経系のミエリン関連の蛋白を含み、ここでは、これは神経突起成長阻害因子と呼ばれる。本発明の他の態様は、悪性腫瘍、特に、脳に転移する腫瘍に関係するメタロプロテアーゼである神経突起成長調節因子に向けられる。このメタロプロテアーゼは阻害的な中枢神経系の環境を圧倒して、脳及び脊髄の大部分の領域に浸入可能にさせる。
中枢神経のミエリン関連蛋白は、神経細胞及び神経芽細胞腫細胞における神経突起の成長を阻害し、又、繊維芽細胞とメラノーマ細胞の拡大を阻害する。この阻害蛋白は、これに限定されないが、35,000ダルトンと250,000ダルトンの分子量の蛋白、その類似体、誘導体及び断片を含む。中枢神経系のミエリン関連阻害蛋白は、これに限定されないが、メラノーマ及び神経組織腫瘍（例えば、神経芽細胞腫）を含む悪性腫瘍にかかった患者の治療に使用することができる。ミエリン関連阻害蛋白の非存在は、脳に転移する腫瘍（例えば、神経膠芽腫）のような悪性腫瘍の存在を診断することができる。本発明は、又、限定されるものではないが、例えば、IN-1又はIN-2抗体のような抗体を含む中枢神経系のミエリン関連阻害蛋白の拮抗体にも関する。かかる抗体は、損傷、変成（degeneration）、又は炎症の後の再生的修復のための神経突起成長阻害因子を中和するのに、使用できる。更に、特定の態様において、モノクローナル抗体IN-1は、脊髄の損傷に続く長い距離にわたる神経繊維の再成を促進させるのに使用しうる。
本発明は、更に、神経突起成長調節因子受容体及びそのフラグメント、並びに、この神経突起成長調節因子受容体及びフラグメントをコードする核酸配列、及び、その治療ならびに診断上の使用に関する。神経突起成長調節因子受容体に作動体（アゴニスト）又は拮抗体として作用する基質も想起され、これも本発明の範囲内にある。
本発明のメタロプロテアーゼは、悪性腫瘍、特に、脳に転移しうるものに関連して見出された。特別の態様において、メタロプロテアーゼは神経膠芽腫細胞の膜に関連する。メタロプロテアーゼ、及び、その類似体、誘導体及び断片は、中枢神経系の損傷、疾病、変成等から生じる神経の損傷の治療において価値を有するものである。本発明の他の態様において、メタロプロテアーゼは、神経の損傷を治療するため、神経突起の成長阻害因子に対する抗体と組みあわせて、使用しうる。
本発明は、又、本発明のメタロプロテアーゼの阻害剤及び／又は、抗体にも向けられる。かかる阻害剤及び／又は抗体は、限定されるものではないが、神経膠芽腫を含む、脳に転移しうる腫瘍のような、悪性の腫瘍の診断及び／又は治療において使用できる。代わりに、中枢神経系のミエリン関連阻害的蛋白、又はその類似体、誘導体及び断片と組みあわせたメタロプロテアーゼ阻害剤は、限定されるものではないが、神経膠芽腫、神経芽細胞腫及びメラノーマを含む悪性の腫瘍の治療及び／又は診断において、使用しうる。
３．1. 定義
ここで使用される時、次の語は以下に示す意味をもつべきである。
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
cbz-tyr-tyr：カルボベンゾキシ−チロシン−チロシン
cbz-gly-phe-NH2：カルボベンゾキシ−グリシン−フェニルアラニン−アミド
cbz-ala-phe-NH2：カルボベンゾキシ−アラニン−フェニルアラニン−アミド
cbz-phe-phe-NH2：カルボベンゾキシ−フェニルアラニン−フェニルアラニン−アミド
cbz-gly-phe-phe-NH2：カルボベンゾキシ−グリシン−フェニルアラニン−フェニルアラニン−アミド
ＣＮＳ：中枢神経系
ＣＳＴ：錐体前路
ＤＭＥＭ：ドルベコ（Dulbecco）の修正最小必須培地
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラアセテート
ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアセテート
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＧｄＮＰＦ：神経膠由来の神経突起促進因子
ＧＦＡＰ：神経膠原繊維酸蛋白（glial fibrillary acid protein）
ＨＢＯ：高度に分枝した寡突起神経膠細胞
ヘペス（Hepes）：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
IN-1：ゲル精製した250キロダルトンのＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に対するモノクローナル抗体
IN-2：ゲル精製した35キロダルトンのＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に対するモノクローナル抗体
Ｊ１：分子量が160〜180キロダルトンの細胞付着分子
KD：キロダルトン
Mab：モノクローナル抗体
ＭＷ：分子量
Ｎ−ＣＡＭ：神経細胞付着分子（neural cell adhesion molecule）
ＮＧＦ：神経成長因子
神経突起成長調節因子（neurite growth regulatory factors）：ＣＮＳミエリン関連35kD及び250kD阻害蛋白、及び神経膠芽腫細胞膜内メタロプロテアーゼ
ＰＢＳ：燐酸緩衝食塩水
ＰＬＹＳ：ポリ−Ｄ−リジン
ＰＮＳ：末梢神経系
ＰＯＲＮ：ポリオルニチン
ＳＣＧ：上頸神経節
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
４．発明の具体的な説明
本発明は神経突起の成長を調節する遺伝子及びこれをコードする蛋白、及び、かかる蛋白の診断及び治療上の使用に向けられる。本発明の蛋白（本明細書では神経突起成長調節因子と呼ばれる。）は、神経突起成長阻害因子と呼ばれる、高度に非許容性の基質特性を有する中枢神経系のミエリンと関連する蛋白を含む。神経突起成長調節因子は、又、悪性腫瘍、特に、脳に転移する悪性の腫瘍に関連して見出されるメタロプロテアーゼを含む。
本発明のＣＮＳミエリン関連蛋白は、神経細胞又は神経芽細胞腫細胞内で神経突起の成長を阻害する。蛋白は、又、繊維芽細胞の拡大及び移動を阻害する。この阻害的な蛋白は活性な交差種（cross-species）であり、そして、これに限定されないが、メラノーマ及び神経組織の腫瘍（例えば、神経芽細胞腫）を含む悪性の腫瘍をもつ患者の治療において使用できる。本発明の特別の例において、35キロダルトン及び250キロダルトンのＣＮＳミエリン関連蛋白が記載される。
本発明は、又、ＣＮＳミエリン関連蛋白に対する抗体、及び、この治療ならびに診断のための使用に向けられる。この抗体は、例えば、中枢神経系等の外傷（例えば、脊髄傷害）、病気、変成的な傷害から生ずる神経の損傷を治療するのに使用しうる。特に、ＣＮＳミエリン関連蛋白に対する抗体は、神経繊維の再生を促進するために使用できる。本発明の特別の態様において、モノクローナル抗体IN-1は、脊髄損傷の後の長い距離にわたる神経繊維の再生を促進するのに使用できる。
さらに、本発明は、神経突起成長調節因子受容体、ならびにそのペプチド断片、及び、神経突起成長調節因子受容体ならびにその断片をコードする核酸の配列、及び、その治療、診断上の使用に関する。神経突起成長調節因子受容体に対する抗体も想起され、これも本発明の範囲内である。
本発明は、又、悪性腫瘍、特に、脳に転移するものに関連するメタロプロテアーゼに向けられる。特別の態様において、メタロプロテアーゼは神経膠芽腫細胞に関係する。本発明のメタロプロテアーゼは悪性腫瘍細胞のＣＮＳ浸透活性に関連し、ＣＮＳミエリン関連蛋白の阻害的基質特性を中和することができる。メタロプロテアーゼは中枢神経系等の外傷（例えば、脊髄損傷）、病気、変成的障害から生ずる神経のそれらの損傷の治療に価値がある。さらに、メタロプロテアーゼは、神経の損傷を治療するために、ミエリン関連阻害蛋白に対する抗体と組みあわせて使用することもできる。
本発明は、又、メタロプロテアーゼの阻害剤に向けられる。かかる阻害剤は悪性腫瘍細胞が拡大し浸透するのを防ぎ、そして、悪性腫瘍（例えば、神経膠芽腫）の治療に使用されうる。特別の態様において、35,000ダルトン及び／又は250,000ダルトンの分子量の蛋白やヒトのそれと均等の作用をもつもの等のＣＮＳミエリン関連阻害蛋白と組み合わせられたメタロプロテアーゼ阻害剤は、これに限定されるものではないが、神経膠芽腫、神経芽細胞腫及びメラノーマを含む悪性腫瘍の診断及び治療に使用される。
本発明の方法は、単に記載を目的として、次の工程に分けることができる：（1）神経突起成長調節因子の分離及び精製；（2）神経突起成長調節因子の特性の記述；（3）神経突起成長調節因子をコードする遺伝子又は遺伝子断片の分子クローニング；（4）神経突起成長調節因子に対する抗体の製造；及び（5）神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体及びペプチドの産出。さらに、この方法は、神経突起成長調節因子とその抗体の診断及び治療上の使用を含む。
４．1. 神経突起成長調節因子の分離及び精製
本発明は、ＣＮＳミエリン関連の神経突起成長阻害蛋白、ＣＮＳミエリン関連の神経突起成長阻害蛋白の受容体、及び、神経膠芽腫細胞の膜に関連するメタロプロテアーゼに関する。本発明のＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は最初にミエリンを分離し、次に、これを精製することにより分離しうる。同様にして、メタロプロテアーゼは、哺乳動物の神経膠芽腫細胞からの分離により得られる。用いられる分離方法は、後の項でより完全に記載される。この代わりに、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白、又は、メタロプロテアーゼは、組換え発現システムから得られる（後の4.3を参照。）。ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に対する受容体の分離及び精製のための方法は、後の4.1.2項で記載される。
４．1.1. ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白の分離及び精製
ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は、これに限定されないが、鳥又は哺乳動物を含む高等脊椎動物のＣＮＳミエリンから分離できる。ミエリンは、これに限定されないが、脊髄又は脳幹を含む中枢神経系組織又は視神経から得ることができる。組織は文献に記載された方法を使用してホモジナイズされる（Colmanら，1982, J. Cell Biol. 95：598-608）。ミエリン分画は、引き続き、記載された方法を使用して分離できる（Colmanら，1982，上掲）。
本発明の一態様において、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は界面活性剤中に可溶化される（例えば、Nonidet P-40，登録商標、ソジウム  デオキシコレート）。この溶解された蛋白は引き続いて、種々の公知の方法で精製することができるが、この方法は、これに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ及びサイズクロマトグラフィー）、遠心分離、電気泳動法、分別溶解（differential solubility）、又は、他のいかなる通常の蛋白精製のための手法（例えば、CaroniとSchwab, 1988, J. Cell Biol. 106：1281を参照）を含む。
代わりに、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は、免疫学的手法を使用して分離かつ精製することもできる。例えば、本発明の一態様において、蛋白は最初に界面活性剤（例えば、Nonidet P-40，登録商標，ソジウム  デオキシコレート）を使用して溶解される。次に、蛋白は35キロダルトン及び／又は250キロダルトンの蛋白に対する抗体による免疫沈澱により分離される。代わりに、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白はイムノアフィニティクロマトグラフィーを使用して分離され、この際、蛋白は可溶化形で抗体カラムに適用される。
４．1.2. ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に対する受容体の分離及び精製
ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に対する受容体は、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白により、その付着、拡大、成長及び／又は運動が阻害される細胞から分離されうる。かかる細胞は、これに限定されないが、繊維芽細胞および神経細胞を包含する。好ましい態様において繊維芽細胞が受容体の分離及び精製のための供給源として使用される。
一の実施の態様において、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は繊維芽細胞の細胞抽出物にアフィニティクロマトグラフィーを実施することにより分離でき、この際、ミエリン関連阻害蛋白又はそのペプチド断片は固体担体に固定される。
４．1.3. 悪性腫瘍に関連するメタロプロテアーゼの分離及び精製
本発明のメタロプロテアーゼは、悪性腫瘍細胞、殊に、脳へ転移し得る腫瘍から分離しうる。好ましい態様において、メタロプロテアーゼは哺乳類の神経膠芽腫細胞から分離しうる。好ましい方法において、メタロプロテアーゼはかかる細胞の原形質膜分画から分離される。細胞は、この分野において既知の方法を使用して、腫瘍を解離させ、ホモジナイズすることにより、又は、腫瘍細胞系から得ることができる。原形質膜は、この分野で既知の方法、例えば、勾配遠心（gradient centrifugation）を使用して得られる（Quigley, 1976, J. Cell Biol. 71：472-486）。メタロプロテアーゼは、この分野ですでに記載している方法を使用して、穏やかなイオン性の、又は非イオン性の界面活性剤（例えば、デオキシコレート、Nonidet P-40（登録商標），Triton（登録商標），Bvij（登録商標））で可溶化することにより、膜から分離できる（Cooperのレビュー，1977, Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, NY, p.355-406）。
メタロプロテアーゼの精製は、限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、電気泳動法、分別溶解、又は蛋白の精製のための他のすべての常法を含む、既知の方法により実施できる。
４．2. 蛋白の特性
本発明の神経突起成長調節因子は、その物理的、免疫学的、又は機能的な特性に基づくアッセイにより、分析しうる。培養細胞中の神経突起成長調節因子の半減期（half life）は、例えば、蛋白合成の阻害剤であるシクロヘキシミドを使用して研究しうる（Vasquez, 1974, FEBS LETT. 40：563-584）。他の実験において、神経突起成長調節因子の生理学的受容体は、例えば、神経突起成長調節因子が固定されたアフィニティークロマトグラフィー、交差結合によるラベルされた神経突起成長調節因子への結合及び免疫沈澱（immunoprecipitation）等を使用することにより神経突起成長調節因子との複合体形成（complex formation）を検出するアッセイにより同定できる。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び二次元電気泳動法等の電気泳動法は、蛋白の構造をスタディするのに使用できる。使用しうる他の方法は、これに限定されるものではないが、ペプチドマップ法、等電点電気泳動及びクロマトグラフ手法を含む。
第一次ミエリン関連阻害剤又はメタロプロテアーゼのアミノ酸配列は、利用可能ならばＤＮＡ配列から演繹により導びかれ、又は、他の場合には、蛋白の直接配列決定、例えば、自動アミノ酸配列決定装置により導くことができる。蛋白の配列は、さらに、親水性分析（hydrophilicity analysia）により特性化される（HoppとWoods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78：3824-3828）。親水性プロフィル（profile）は、蛋白の疎水性及び親水性領域（及び、かかる領域をコードする遺伝子配列が利用可能な場合には、その相応する領域）を同定するために、使用できる。
二次構造分析（Chou及びFasman,1974, Biochemistry 13：222）は、特異的な二次構造を想定するＣＮＳミエリン関連阻害剤又は神経膠芽腫メタロプロテアーゼ配列の領域を同定するために、使用できる。構造分析の他の方法も用いられる。これらは、限定されるものではないが、Ｘ線結晶学（Engstom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11：7-13）及びコンピュータモデリングを含む（Fletterick, R.及びZoller,M.（eds.）,1986,Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Commumications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。
４．3. 神経突起成長調節因子をコードする遺伝子又は遺伝子断片の分子クローニング
4.3.1.神経突起成長調節因子をコードする遺伝子の分離及びクローニング
限定されるものではないが、カロニ（Caroni）とシュワブ（Schwab）に記載された（1988, Neuron１：85-96）35kD及び／又は250kDのミエリン関連蛋白を含むＣＮＳミエリン関連阻害蛋白又は、神経膠芽腫に関連するメタロプロテアーゼをコードする遺伝子を、ここではこれらを神経突起成長調節因子遺伝子と呼ぶが、これらを分子クローニングするための核酸源として、潜在的にいかなる哺乳動物細胞も使用しうる。
ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー（library）”から、この分野で既知の標準的方法により、化学合成により、cＤＮＡクローニングにより、又は、所望の哺乳動物細胞から精製されたゲノムＤＮＡ又はその断片のクローニングにより得ることができる（例えば、（Maniatisら，1982, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Glover, D.M.（ed.）1985, DNA Clonig：A Practical Approach, MRL Press, Lrd.,Oxford, U.K., Vol. I, II.を参照）。ゲノムＤＮＡから得られたクローンは、コード領域（coding regions）に加えて、調節及びイントロンＤＮＡ領域を含むかもしれない。cＤＮＡから得られるクローンは、エキソン配列のみを含むであろう。供給源が何であれ、所定の神経突起成長調節因子遺伝子は、遺伝子の増殖のために適当なベクター中に分子的にクローンされるべきである。
ゲノムＤＮＡからの神経突起成長調節因子遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片が製造され、そのうちのいくつかは、所望の神経突起成長調節因子遺伝子をコードするであろう。ＤＮＡは種々の制限酵素を使用して、特定の箇所で開裂されうる。代わりに、ＤＮＡを断片化するためにマンガンの存在下でＤＮアーゼを使用してもよく、又、ＤＮＡは例えば音波処理にする場合のように、物理的にせん断することができる。線状のＤＮＡ断片は、次に、限定されるものではないが、アガロースやポリアクリルアミドゲル電気泳動法やカラムクロマトグラフィーを含む通常の方法により、サイズに従がって分離されうる。
ＤＮＡ断片が一度製造されると、神経突起成長調節因子遺伝子を含む特異的なＤＮＡ断片の同定は多くの方法においてなしうる。例えば、もし一定量の神経突起成長調節因子遺伝子又はその特異ＲＮＡ又はその断片が入手でき、かつ精製され、ラベルがなしうるならば、製造されたＤＮＡ断片はラベルされたプローブに対する核酸ハイブリッド形成によりスクリーンされうる（BentonとDavis, 1977, Science196：180；GrunsteinとHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72：3961-3965）。例えば、好ましい態様において、神経突起成長調節因子アミノ酸配列の一部がＤＮＡ配列を演繹するのに使用でき、次に、そのＤＮＡ配列はハイブリッド形成プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドとして合成することができる。代わりに、もし精製された神経突起成長調節因子プローブが利用できない場合には、神経突起成長調節因子に富んだ核酸分画が初期選択方法のプローブとして使用しうる。
もし、それらが利用できない場合には、又、制限酵素での消化、及び、断片サイズの既知の制限酵素地図により予期されるものとの比較を行うことにより、相応の神経突起成長調節因子をコードする断片を同定することも可能である。更に、遺伝子の特性に基づく選択、又はその発現生成物の物理的、化学的又は免疫学的な特性は、上述のように、初期選択の後に使用できる。
神経突起成長調節因子遺伝子は、又、核酸ハイブリッド形成を使用するmＲＮＡ選択、それに続くインビトロでのアフリカツメガエルの卵母細胞における翻訳により、同定することができる。翻訳による方法の実例において、卵母細胞は全部の又はサイズ分画されたＣＮＳ mＲＮＡポピュレーションとともに注入され、そして、膜に関係する翻訳生成物は機能アッセイ（３Ｔ３細胞拡大）においてスクリーンされる。表現された阻害因子の非存在につながる、ＲＮＡの相補的ＤＮＡ（cＤＮＡ）のプールによる予備吸着は、所望のcＤＮＡの存在を示している。プールサイズの減少は、最終的には一重鎖cＤＮＡクローンの分離につながる。他の方法において、ＤＮＡ断片はハイブリッド形成による相補的mＲＮＡsを分離するのに使用できる。このＤＮＡ断片は入手しうる精製された神経突起成長調節因子ＤＮＡ、又は、神経突起成長調節因子配列に富んだＤＮＡを表わすことができる。分離されたmＲＮＡsのインビトロにおける翻訳生産物の免疫沈澱分析又は機能アッセイは、mＲＮＡ及び、それゆえ、神経突起成長調節因子配列を含むcＤＮＡ断片を同定する。このような機能アッセイの実例は非許容性に対するアッセイを含み、ここでは、ポリリジンで被覆された組織培養皿上の３Ｔ３細胞の拡大に対する、種々の翻訳生産物の効果が観察される（CaroniとSchwab, 1988, J. Cell Biol. 106：1281を参照のこと）。加えて、特異mＲＮＡsは、神経突起成長調節因子蛋白に対して特異的に向けられた抗体を固定するために細胞から分離されたポリソームの吸着により選択されうる。放射性ラベルのされた神経突起成長調節因子cＤＮＡは、鋳型として選択されたmＲＮＡ（吸着されたポリソームからのもの）を使用して、合成できる。放射性ラベルのされたmＲＮＡ又はcＤＮＡは、次に、他のゲノムＤＮＡ断片の中から神経突起成長調節因子ＤＮＡ断片を同定するためのプローブとして使用される。
神経突起成長調節因子ゲノムＤＮＡを同定する他のものは、これに限定されるものではないが、既知の配列から化学的に遺伝子の配列自体を合成すること、又は、cＤＮＡを神経突起成長調節因子遺伝子をコードするmＲＮＡにすることを含む。他の方法も可能であり、これも本発明の範囲内にある。
同定され、そして分離された遺伝子又はcＤＮＡは、次に、相応のクローニングベクター中に挿入できる。当業者に知られている多くのベクターホストシステムが使用しうる。可能なベクターは、これに限定されないが、コスミド、プラスミド、又は修正されたウイルスを含むが、このベクターシステムは使用される宿主細胞に相容のものでなければならない。このようなベクターは、限定されるものではないが、１ambda誘導体のようなバクテリオファージ、又はpBR322又はpUCプラスミド誘導体のようなプラスミドを含む。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポーレーション（electroporation）等を介して、宿主細胞中に導入できる。
他の態様において、神経突起成長調節因子遺伝子は、“ショットガン”アプローチにより適当なクローニングベクター中に挿入した後で、同定及び分離できる。例えば、低い神経突起成長調節因子のプロデューサーに特異的なcＤＮＡのサイズ分画又は引き去り（subtraction）による、所定の神経突起成長調節因子遺伝子のための豊富化は、クローニングベクターへの挿入の前にすることもできる。他の態様において、ＤＮＡは発現ベクターシステム中に挿入することもでき、神経突起成長調節因子遺伝子を含む組換え発現ベクターは、次に、神経突起成長因子蛋白に対する機能アッセイにより検出される。
遺伝子配列の多くのコピーを製造するために、神経突起成長調節因子遺伝子は、相応の宿主細胞を形質転換し、トランスフェクトし、又は、感染するのに使用できるクローニングベクター中に挿入される。このことは、相補的な付着末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡ断片をリゲートする（ligating）ことにより、達成される。しかしながら、もしＤＮＡを断片化するために使用される相補的な制限箇所がクローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾してもよい。代わりに、いかなる所望の箇所も、ＤＮＡ末端へヌクレオチド配列（リンカー）を結合することにより製造しうる；これらの結合されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特別に化学合成されたオリゴヌクレオチド配列から成るものでよい。代替法において、開裂されたベクター及び神経突起成長調節因子遺伝子はホモポリマー性のテーリングにより修飾されてもよい。
クローン化された神経突起成長調節因子の同定は、ＤＮＡ自体の特性に基づく多くの方法、又は、代わりに、コードされた蛋白の物理的な、免疫的、又は機能的な特性に基づく多くの方法により成しうることができる。例えば、ＤＮＡそれ自体は、プラーク又はラベルされたコロニー核酸ハイブリッド形成により検出してもよい（Benton, WとDavis, R.,1977, Science 196：180；Grunstein, M.及びHogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72：3961）代わりに、神経突起成長調節因子遺伝子の存在は、発現された生成物の特性に基づくアッセイにより検定してもよい。たとえば、適当なmＲＮＡsをハイブリッド−選択するcＤＮＡクローン又はＤＮＡクローンは、インビトロで神経突起の成長を阻止する蛋白を製造するものを選ぶことができる。もし、神経突起成長調節因子に対する抗体が利用できるときは、神経突起成長調節因子蛋白はＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）型方法において、神経突起成長調節因子合成クローンと推定されるものへラベルされた抗体を結合させることにより、同定してもよい。
特別の態様において、分離された神経突起成長調節因子遺伝子、cＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ配列を取込んだ組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの製造を可能とする。このように、形質転換体を成長させ、この形質転換体から組換えＤＮＡ分子を分離し、そして所望ならば、分離した組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子を多量に得ることが可能になる。
もし最終の目的が遺伝子をワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなウイルス発現ベクターに挿入することであるならば、神経突起成長調節因子遺伝子を取り込んだ組換えＤＮＡ分子は、ウイルスにより感染された細胞内で、遺伝子組換えが可能なウイルス配列が遺伝子に隣接するようにモディファイされ、その結果、遺伝子はウイルスゲノム中に挿入できる。
神経突起成長調節因子ＤＮＡ含有クローンが同定され、成長され、そして収穫されると、そのＤＮＡ挿入断片は後述の4.3.4に記載のようにして特性化される。神経突起成長調節因子遺伝子の遺伝子構造が既知であるならば、本発明において最適に使用するために構造を操作することも可能である。例えば、蛋白の増加された発現を提供するために、天然のプロモーターに加えて、又は、それに代えて、プロモーターＤＮＡが神経突起成長調節因子コード配列の５′に結合できる。多くの操作が可能であり、これも本発明の範囲内にある。
4.3.2.クローン化神経突起成長調節因子遺伝子
神経突起成長調節因子蛋白、又は、その一部をコードするヌクレオチド配列は、適切な表現ベクター、例えば、挿入された蛋白をコードする配列の転写及び翻訳のために必要な要素を有するベクターに挿入できる。必要な転写及び翻訳シグナルは、天然の神経突起成長調節因子遺伝子及び／又はそのフランキング領域により与えることができる。蛋白をコードする配列を表現するために、種々のホスト−ベクターシステムが利用しうる。これらは、限定されるものではないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）により感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）により感染された昆虫の細胞系；イーストベクターを含有するイーストのような微生物、又は、コスミドＤＮＡを含む。これらベクターの発現要素は、その強さ及び特異性において異なる。使用されるホスト−ベクターシステムに依存して、多くの適切な転写及び翻訳要素のいずれか１つを使用しうる。
適当な転写／翻訳のコントロールシグナル及び蛋白をコードする配列から成るキメラ遺伝子を含有する表現ベクターを構成するために、ＤＮＡ断片をベクターに挿入するために過去に記載された方法のいずれのものも使用しうる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ、及び、合成手法、及び、インビボでの組換え（遺伝子組換え）を含んでよい。
神経突起成長調節因子遺伝子の挿入断片を含有する発現ベクターは、３つの一般的なアプローチにより同定できる：（a）ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリッド形成、（b）“マーカー”遺伝子機能の存在、非存在及び（c）挿入断片配列の発現。第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来性の遺伝子の存在は、挿入された神経突起成長調節因子遺伝子に相同である配列を有するプローブを使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成により検出できる。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／ホストシステムは、ベクターに外来性の遺伝子を挿入することにより生じた或る種の“マーカー遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスでのオクルーションボディ（Occlusion body）形成等）の存在又は非存在に基づき、同定され、選択できる。例えば、もし所定の神経突起成長調節因子遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、この神経突起成長因子挿入断片を有する組換え体はマーカー遺伝子機能の非存在により同定できる。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換えにより発現された外来性の遺伝子生成物をアッセイすることにより同定できる。このようなアッセイは、所定の神経突起成長調節因子遺伝子生成物の物理的、免疫的又は機能的特性に基づいてできる。
一度、特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、そして分離されると、それを増殖させるために、当業者に知られたいくつかの方法が使用しうる。一度、適切なホストシステムと成長条件が確立されると、組換え発現ベクターが増殖され、多量に製造できる。前述のように、使用しうる発現ベクターは、限定されるものではないが、次のベクター、又は、その誘導体を含む：ワクシニアウイルスやアデノウイルスのようなヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；イーストベクター；バクテリオファージベクター（例えば、lambda）、及びプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレイト（modulate）し、又は、所望の特別の型で遺伝子生産物を修飾し、処理するものが選ばれる。或る種のプロモーターからの発現は或る種の誘発物質の存在下で高めることができる。こうして、遺伝子工学的な神経突起成長調節因子蛋白の発現をコントロールできる。さらに、異なる宿主細胞は、蛋白の翻訳処理及び翻訳後処理及び修飾（例えば、グルコシル化、開裂）のための特性及び特異メカニズムを有する。発現した外来性蛋白の所望の修飾及び処理を確保するために、適当な細胞系又はホストシステムが選ばれる。例えば、バクテリアシステムにおける発現は非グリコシル化コアタンパク質生成物を製造するのに使用できる。イーストにおける発現は、グリコシル化された目的物を製造するだろう。哺乳動物細胞（例えば、コス細胞）における発現は、異種の神経突起成長調節因子蛋白の“天然の（native）”グリコシル化を確保するのに使用できる。さらに、異なったベクター／ホスト発現システムは、蛋白加水分解による開裂といった処理反応に、異なった程度で影響を与えることができる。
4.3.3.発現された遺伝子生成物の同定及び精製
一度、所定の神経突起成長調節因子遺伝子を発現する組換え体が同定されると、遺伝子生産物は上述の4.1における記載のとおりにして精製し、かつ上述の4.2の記載のとおりにて分析できる。
所定の神経突起成長調節蛋白のアミノ酸配列は、クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列から推論でき、これにより、当業者は既知の通常の化学的方法により、蛋白又はその断片を合成しうる（例えば、Hunkapillerら、1984, Nature 310：105-111を参照。）。
この発明の特別の態様において、限定されるものではないが、この神経突起成長調節因子蛋白は、組換えＤＮＡ法により製造されたものであれ、又は、化学的合成法で製造されたものであれ、蛋白における残基が機能的に均等なアミノ酸で置換され、そのことにより、何らの変化も生じないような、変更された配列を有するものも含む。例えば、配列内の１又は複数のアミノ酸残基は、機能的に均等に作用し、無症状の変化（silent alteration）を生ずる、類似の極性をもつ他のアミノ酸で置換できる。配列内のアミノ酸の置換体は、そのアミノ酸が属するクラスの他のものから選択しうる。例えば、非極性（疎水性の）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含む。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性の）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性の）アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸である。翻訳時に、又は、その後に、異なるように修飾された、例えば、グルコシル化、蛋白加水分解開裂等がされた神経突起成長調節因子蛋白も、本発明の範囲内にある。
4.3.4.神経突起成長調節因子遺伝子の特性
所定の神経突起成長因子遺伝子の構造は、当業者に既知の種々の方法により分析できる。
所定の神経突起成長調節因子遺伝子に相応するクローン化されたＤＮＡ、即ちcＤＮＡは、限定されるものではないが、サザンハイブリッド形成（Southern, 1975, J. Mol. Biol.98：503-517）、ノーザンハイブリッド形成（Alwineら，1977,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74：5350-5354；Wahlら，1987, Meth. Enzymol. 152：572-581）、制限エンドヌクレアーゼマッピング（Maniatisら，1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）及びＤＮＡ配列分析を含む方法により分析できる。
ＤＮＡ配列の分析は、これに限定されるものではないが、マキサム（Maxam）とギルバート（Gilbert）の方法（1980, Meth. Enzymol. 65：499-560）、サンガー（Sanger）のジデオキシ法（Sangerら，1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74：5463-5467）、又は、自動ＤＮＡ配列決定装置の使用（例えば、Applied Biosystems,Foster City,CA）を含む当業者に既知のいかなる方法によっても実施できる。
４．4. 神経突起成長調製因子に対する抗体の製造
神経突起成長調節因子又は関連する蛋白を認識する抗体を製造できる。かかる抗体はポリクローナル又はモノクローナルとすることができる。
所定の神経突起成長調節因子の抗原決定基に対するポリクローナル抗体の製造のために、当業者に既知の種々の方法が使用しうる。抗体を製造するために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット等のホスト動物は、神経突起成長調節因子蛋白、又は合成蛋白、又はその断片を注射することにより免疫されうる。免疫反応を増大させるために、ホストの種に依存して、種々のアジュバントが使用でき、これは、限定されるものではないが、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム等の鉱質ゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化物、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）及びコリネバクテリウムパルブームを含む。
神経突起成長調節因子の抗原決定基に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞系により抗体分子を製造するために提供される、すべての手法を使用することにより、製造されうる。これらは、限定されるものではないが、コーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）により最初に記載されたハイブリドーマ（1975, Nature 256：495-497）、及び、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozborら，1983, Immunology Today ４：72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら，1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p.77-96）を含む。特別の態様において、35kDと250kDのＣＮＳミエリン関連阻害蛋白を認識するマウスモノクローナル抗体を得るために、8.1で後記する方法を使用してもよい。
治療に使用されるモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体、又は、キメラなヒト−マウス（又は他の種）のモノクローナル抗体であってもよい。ヒトモノクローナル抗体は、当業者に既知の多数の方法のいずれによって製造されてもよい。（例えば、Tengら，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：7308-7312；Kozborら，1983, Immunology Today ４：72-79；Olssonら，1982, Meth. Enzymol. 92：3-16）。キメラな抗体分子は、マウスの抗原−結合領域をヒトの不変部領域に入れて製造してもよい（Morrisonら，1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81：6851, Takedaら，1985, Nature 314：452）。
神経突起成長調節因子の抗原決定基に対する抗体の分子クローンは、既知の方法で製造できる。組換えＤＮＡの方法論（例えば、Maniatisら，1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）は、モノクローナル抗体分子、又はその抗原結合領域をコードする核酸配列を構成するために使用しうる。
抗体分子は、例えば、免疫吸着、又はイムノアフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ法、又は、その組みあわせ等の既知の方法により精製してもよい。
イディオタイプの分子を含む抗体断片は、既知の方法により製造できる。例えば、限定されるものではないが、かかる断片は、抗体分子をペプシンで消化することにより製造できるＦ（ab'）2断片；このＦ（ab'）2断片のジスルフィド架橋を還元して製造できるＦab'；及び、抗体分子をパパインと還元剤で処理して製造できる２個のＦab又はＦab断片を含む。
４．5. 神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体、及びペプチド
所定の神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体及びペプチドの製造及び使用も想定され、これも本発明の範囲にあるが、これは、神経突起成長調節因子に拮抗的な分子も含む（例えば、これに限られないが、アンチイディオタイプ抗体）。所望の阻害活性をもつ、かかる誘導体、類似体、又はペプチドは、例えば、神経芽細胞腫の治療において使用できる（前記4.6参照）。神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体又はペプチドは、非許容性基質効果のためのアッセイにより、所望の活性を試験できる。例えば、ポリリジンで被覆された組織培養皿上の３Ｔ３細胞の拡大に対する種々の翻訳生成物の作用が観察される、非許容性に対するアッセイのような方法である（CaroniとSchwab, 1988, J. Cell Biol. 106：1281を参照。）。
本発明の神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体及びペプチドは、当業者に既知の種々の方法で製造できる。これらを製造する操作は、遺伝子又は蛋白レベルにある。例えば、クローン化された神経突起成長調節因子遺伝子は、当業者に既知の多くの手法のいずれかで修飾できる（Maniatisら，1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。所定の神経突起成長調節因子配列は制限エンドヌクレアーゼにより相応の箇所で開裂することができ、所望ならば酵素的修飾を行い、分離され、そしてインビトロで結合される。神経突起成長調節因子に関連する誘導体、類似体又はペプチドをコードする遺伝子の製造の際には、この修飾された遺伝子が神経突起成長調節因子と同じ翻訳読み枠内に残り、所望の神経突起成長調節因子がコードされている遺伝子領域において、翻訳終了シグナルにより中断されないようにすることに注意が払われるべきである。
加えて、所定の神経突起成長因子は、翻訳、開始及び／又は停止の配列を創造し及び／又は破壊するため、コード領域で変化を生じさせ、及び／又は新しい制限エンドヌクレアーゼ箇所を形成し、又は、すでに存在しているものを破壊するため、インビトロでの修飾をさらに助長するために、インビトロあるいはインビボで突然変異されうる。限定されるものではないが、インビトロでの部位特異的突然変異誘発、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（ファルマシア）の使用等を含む、当業者に既知の変異誘発法を使用できる（Hutchinsonら，1978, J. Biol Chem 253：6551）。
４．6. 神経突起成長調節因子の用途
4.6.1.診断用途
4.6.1.1.ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白
ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白、その類似体、誘導体および断片、ならびに抗阻害蛋白抗体は、診断に用途を有する。これらの分子は、神経突起の成長、伸長、侵入力および再生に影響する種々の状態、疾病、障害等を検出、予知、診断またはモニターするための分析、例えばイムノアッセイに使用することができる。本発明の一実施態様において、これらの分子は、悪性度の診断に使用することも可能である。あるいは、ＣＮＳミエリン関連蛋白、その類似体、誘導体および断片を、究極的に神経の損傷を持たらす疾病および状態の治療のモニターに使用することもできる。そのような疾病および状態の例としては、ＣＮＳの外傷（例えば、脊髄損傷）、梗塞、感染、悪性腫瘍、毒物への暴露、栄養欠陥、疑似新生物症候群、退行性神経症（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺症。但し、これらに限定されない）を挙げることができる。さらに他の実施態様において、ＣＮＳ繊維の再生の指標として、神経突起の増加の検出にこれら分子を使用することもできる。
例えば、ＣＮＳミエリンを含有する患者のサンプル中でのＣＮＳミエリン関連阻害蛋白の不存在は、悪性腫瘍（膠細胞芽腫、神経芽細胞腫およびメラノーマを含む。但し、これらに限定されない）が存在すること、または患者の体内に神経の成長、伸長または再生を伴う状態が存在することを示す、診断上のマーカーになり得る。一つの態様において、阻害蛋白の不存在は、イムノアッセイにより、抗阻害蛋白抗体（例えば、IN-1、IN-2）への結合が起こらないことを観察することによって、検出される。
使用可能なイムノアッセイ法としては、これに限定されるものではないが例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）、サンドイッチ免疫分析、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、凝集分析、補体結合分析、イムノラジオメトリック分析、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、免疫電気泳動分析、組織片上での免疫組織化学などの技術を利用する拮抗、または非拮抗分析システムを挙げることができる。
他の態様において、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白に結合する配位子をイメージング技術により使用することができる。例えば、阻害蛋白に結合可能であり、かつ適切に標識した場合には血液脳関門を透過し得る小さなペプチド（例えば、阻害蛋白レセプターの断片）を、患者の健康な組織を冒さない条件下に、例えばＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）診断またはシンチグラフィー検出によるイメージング技術により用いることができる。
神経突起阻害因子の遺伝子、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ＲＮＡ、これらに関連した核酸配列およびそれらの断片（相補配列を含む）を、ハイブリダイゼーション分析に用いることもできる。神経成長阻害因子の核酸配列、または少なくとも15のヌクレオチドを含むその断片、をハイブリダイゼーションのプローブとして用いることもできる。ハイブリダイゼーションアッセイを、上記のような、神経突起阻害因子の発現の変化に関連する状態、障害、病状などを検出、予知、診断またはモニターするのに用いることもできる。例えば、患者から採取した生検組織片のミエリン中の総ＲＮＡを分析することにより、神経突起成長阻害因子mＲＮＡの存在量を定量することが可能であり、これにより、神経突起成長阻害因子mＲＮＡの量を、当該患者の体内での神経突起成長活動の阻害レベルの指標として用いることができる。
4.6.1.2.ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター
ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター、その類似体、誘導体および断片、ならびに抗レセプター抗体は、診断に用途を有する。本発明によるこれらの分子は、神経突起の成長、伸長、侵入および再生に影響する種々の状態、疾病、障害などを検出、予知、診断またはモニターするための分析、例えばイムノアッセイまたは結合アッセイに使用することができる。例えば、これらのレセプターの低レベルの発現は、神経突起の侵入または再生の増大を伴う種々の障害、例えば、神経の損傷、梗塞、退行性神経病、悪性腫瘍などの障害が存在する場合に検出される。ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白リセプター、その類似体、誘導体および断片は、究極的に神経の損傷に至る疾病および異常〔例えば、ＣＮＳ外傷（例えば、脊髄損傷）、脳卒中、退行性神経病。但し、これらに限定されない〕、ならびに悪性腫瘍のモニター療法にも使用することができる。
使用可能な分析法は、前記4.6.1.1に記載したものと同じである（但し、それらに限定されない）。
神経突起成長阻害因子レセプター遺伝子、これに対応する核酸配列（相補配列を含む）、ならびにそれらの誘導体および断片は、神経突起阻害因子レセプターの発現の変化を伴う障害、疾病または状態を検出、予測、診断、またはモニターするためのハイブリダイゼーションアッセイにも使用可能である。
4.6.1.3.メタロプロテアーゼおよびその阻害剤
本発明によるメタロプロテアーゼ、その類似体、誘導体および断片、ならびにその阻害剤および抗メタロプロテアーゼ抗体は、診断目的に用いることができる。本発明によるこれらの分子は、神経突起の成長、伸長、侵入または再生に影響する種々の状態、疾病および障害を検出、予知、診断またはモニターするため、イムノアッセイまたは阻害分析に用いることができる。一つの態様において、本発明によるこれらの分子は、メタロプロテアーゼの濃度レベルの増加を検知することにより、悪性腫瘍、特に脳に転移し得る悪性腫瘍（例えば、神経膠芽腫）の診断に用いることができる。あるいは、メタロプロテアーゼの濃度レベルの変化を検出することにより、それらを神経膠芽腫などの悪性腫瘍の治療のモニターに用いることができる。この最後の態様において、メタロプロテアーゼの消失またはその濃度レベルの低下は、治療効果の指標となる。
使用可能な分析法は、前記4.6.1.1に記載したものと同じである（但し、それらに限定されない）。
メタロプロテアーゼ遺伝子、これに対応する核酸配列（相補配列を含む）、ならびにそれらの誘導体および診断は、上記のようなメタロプロテアーゼの発現の変化を伴う障害、疾病または状態を検出、予測、診断またはモニターするためのハイブリダイゼーションアッセイにも使用可能である。例えば、患者から採取したサンプル（例えば、神経膠細胞）中の総ＲＮＡを定量することにより、メタロプロテアーゼmＲＮＡの存在量を定量することが可能であり、これにより、メタロプロテアーゼmＲＮＡの存否または存在量を患者の体内の悪性腫瘍の指標として用いることができる。特に、脳に転移する悪性腫瘍（例えば、神経膠芽腫）の検出が可能である。
4.6.2.治療用途
4.6.2.1.ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白
本発明によるＣＮＳミエリン関連阻害蛋白は、例えばメラノーマ、神経組織の腫瘍（例えば、神経芽細胞腫）などの悪性腫瘍を持つ患者の治療に有用である。一つの態様において、神経突起伸長阻害剤である35kD蛋白および／または250kD蛋白、その類似体、誘導体、それらの断片、あるいは体内機能上これらと等価のものを用いて、神経芽細胞腫を持つ患者の治療が行われる。他の態様においては、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白およびメタロプロテアーゼの両者が患者に投与される。
さらに別の態様においては、体内で産生される阻害蛋白の機能を阻害する、ＣＮＳミエリン阻害蛋白誘導体、類似体または断片を、神経突起の伸長、成長あるいは再生が望まれるケース（例えば、神経に損傷を有する患者の場合）における療法に用いることができる。このような阻害蛋白拮抗物質を用いて、外傷（脊髄損傷、脊髄障害、その他のＣＮＳ経路障害を含む。但し、これらに限定されない）、手術による神経障害、梗塞による二次障害、感染、毒物への暴露、悪性腫瘍、疑似新生物症候群などで苦しむ患者、あるいはその他種々のタイプの中枢神経系（ＣＮＳ）退行性障害）「（Scientific American Medicines」第２巻、11-1-11-13ページ、Scientific American Inc. 社（ニューヨーク）、1987年発行中のCutlerの論文参照）で苦しむ患者を治療することができる。そのような障害の例として、これに限定されないがアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症および進行性核上性麻痺症を挙げることができる（但し、これらに限定されない）。上記のような拮抗物質は、ＣＮＳの経路、ファイバーシステムおよび束の再生を促進するために用いることができる。患者の体内での35kD蛋白および／または250kD蛋白の機能を阻害するため、例えば35kD蛋白および250kD蛋白などのＣＮＳミエリン関連阻害蛋白のエピトープと結合し得る抗体（またはその結合部、あるいはそのような抗体を分泌する細胞）を投与することも可能である。本発明のある態様において、脊髄損傷後、神経繊維の長距離再生を促進するため、35kDおよび／または250kDミエリン結合阻害蛋白に対する抗体（具体例としては、例えば、モノクローナル抗体IN-1）が使用される。
種々のデリバリー法が知られており、それらを、ＣＮＳミエリン阻害蛋白、その関連分子またはそれらの抗体のデリバリーに利用することができる。例えば、リポソームまたは半透膜によるカプセル化、バクテリアによる発現などが利用可能である。治療を必要とする体内の所望部位を標的とし、該部位にミエリン阻害蛋白関連分子を運ぶため、配位子（例えば、抗体）との結合を利用することができる。体内への導入法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下または鼻腔を経由するルート、および脳室または腫瘍除去部位への注入がある（但し、これらに限定されない）。同様に、抗ＣＮＳミエリン阻害蛋白抗体の恒久源とするため、適当な生物学的膜を用いてカプセル化した、ＣＮＳミエリン阻害蛋白拮抗体を分泌する細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞）を患者中に植え付けてもよい。
さらに、ＣＮＳミエリン阻害蛋白の合成を阻害する手段を講じ、その機能を減じることもできる。例えば、ＣＮＳミエリン阻害蛋白合成細胞に有害な物質、例えば、寡突起神経膠細胞（欠突起膠細胞）を使用して阻害蛋白の濃度を低下させ、ニューロンの再生を促進することができる。
4.6.2.2.ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター
ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター、その断片またはそれらの抗体は、ＣＮＳの外傷（例えば、脊髄損傷）、硬塞またはＣＮＳの再生障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺症）に起因する神経損傷を有する患者の治療に有用である。例えば、一つの態様において、ＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター、阻害蛋白結合部位を含むその断片、またはそれらの類似体を患者に投与することによって、阻害蛋白とその自然のレセプターとの結合を拮抗により阻害し、それによって患者の体内での神経の成長または再生を促進することができる。他の態様において、阻害蛋白レセプター（またはその結合部位）の抗体、またはレセプターと結合する抗体を分泌する細胞を患者に投与してレセプターが機能するのを阻害し、それによって患者の体内での神経の成長または再生を促進することができる。そのような療法が望ましい患者の例には、神経損傷、脳卒中あるいは上記の如きＣＮＳの再生障害を有する患者が含まれる（但し、これらに限定されない）。
種々のデリバリー法が知られており、それらをＣＮＳミエリン関連阻害蛋白レセプター、その関連物質またはそれらの抗体のデリバリーに利用することができる。例えば、リポソームによるカプセル化、バクテリアによる発現などが利用可能である。治療を必要とする体内の所望の部位を標的とし、該部位にミエリン関連蛋白レセプター関連分子を誘導するため、配位子（例えば抗体）との結合を利用することができる。体内への導入法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下または鼻腔を経由するルート、および脳室または腫瘍除去部位への注入がある（但し、これらに限定されない）。
4.6.2.3.メタロプロテアーゼおよびその阻害剤
本発明によるメタロプロテアーゼは、種々のタイプの神経損傷または中枢神経系（ＣＮＳ）の再生障害（例えば4.6.2.2に記載のもの）の治療に有用である。一つの態様において、外傷、脳卒中または神経再生障害で苦しむ患者を、神経突起の伸長またはＣＮＳ繊維の再生を促進するメタロプロテアーゼ、その活性類似体、または誘導体、あるいはそれらの断片を用いて治療することができる。
他の態様において、メタロプロテアーゼと拮抗し、またはその機能を阻害するメタロプロテアーゼ誘導体、類似体またはそれらの断片、もしくはメタロプロテアーゼ活性の化学的阻害剤を、ＣＮＳにおける侵入的移動および拡大の阻害が望まれる場合の療法に用いることができる。そのような阻害剤の例には、1,10−フェナントロリン，ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ，cbz-tyr-tyr，cbz-gly-phe-NH2，cbz-phe-phe-NH2およびcbz-gly-phe-phe-NH2が含まれる（但し、これらに限定されない）。これらのうち、1,10−フェナントロリン，ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡは市販されている（例えば、Sigma Chemical社より）。また、cbz-tyr-tyr，cbz-gly-phe-NH2，cbz-phe-phe-NH2およびcbz-gly-phe-phe-NH2も市販されている（例えば、Vega Biotechnologies社より）。あるいは、これらを化学的に合成することもできる。具体例としては、そのような阻害剤を用いて、種々のタイプの悪性腫瘍（特に、脳に転移するもの）を有する患者を治療することができる。一つの好ましい例では、そのような阻害剤により、神経膠芽腫の患者の治療が行われる。他の具体例では、患者の体内におけるメタロプロテアーゼの機能を阻害するため、メタロプロテアーゼのエピトープに対する抗体が投与される。本発明のさらに、他の具体例においては、メタロプロテアーゼ阻害剤およびＣＮＳミエリン結合阻害蛋白の両者が、悪性腫瘍（例えば、神経膠細胞芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ。但し、これらに限定されない）の治療のため、患者に投与される。
種々のデリバリー法が知られており、それらをメタロプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼ関連分子のデリバリーに利用することができる。例えば、リポソームまたは半透膜によるカプセル化、バクテリアによる発現などが利用可能である。治療を必要とする体内の所望の部位を標的とし、該部位に所望の分子を運ぶため、配偶子（例えば抗体）との結合を利用することができる。体内への導入法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、口腔または鼻腔を経由するルート、および脳室または腫瘍除去部位への注入がある（但し、これらに限定されない）。
５．寡突起神経膠細胞（Oligodendrocytes）およびＣＮＳミエリンが試験管内における神経突起の成長および繊維芽細胞の拡大を許容しない基質であることについて
ニューロンと中枢神経系（ＣＮＳ）神経膠細胞との相互作用について調べるため、解離した交感神経または知覚神経結節腫細胞、または胎児の網膜細胞を、若いラットの解離した視神経神経膠細胞の培養物に塗布した。星状膠細胞はニューロンの接触および神経突起の発達を促進したのに対し、寡突起神経膠細胞（欠突起膠細胞）は、ニューロン基質としての性質を大いに異にしていた。未成熟の寡突起神経膠細胞（O4+，A2B5+，Galc-）に対しては、しばしばニューロンおよび神経突起が接触した。これと対照的に、分化した寡突起神経膠細胞（O4+，A2B5-，Galc+）は、ニューロンの接触および神経突起の成長を許容しない基質であることを示した。神経芽細胞腫細胞または３Ｔ３繊維芽細胞を視神経神経膠細胞培養物に塗布したときにも、同様の差異が観察された。すなわち、分化した寡突起神経膠細胞は細胞の接触、ニューロンの成長、繊維芽細胞の拡大を許容しなかった。この非許容性寡突起神経膠細胞は、放射状の、高度に枝分れした突起網を特徴とし、しばしばミエリン基本蛋白（ＭＢＰ）を含有しており、それ故、ミエリン様膜の生産に積極的に関与する細胞に該当する。
成長したラットの脊髄から分離したミエリンを、ポリリジンを塗布した培養皿に吸養させ、末梢ニューロン、神経芽細胞腫細胞または３ＴＣ細胞に対する基質としてのテストを行った。この場合においても、細胞の接触、神経突起の発達および繊維芽細胞の拡大を強く阻害した。この効果には、ミエリンの物理的、化学的性質は無関係である。なぜなら、ラットの坐骨神経のミエリンは、ニューロンの接触、神経突起の成長、ならびに３Ｔ３細胞の拡大を促すからである。これらの結果は、分化した寡突起神経膠細胞が非許容基質としての性質を発現することを示しており、このことは、ＣＮＳの発育または再生にとって重要である。
５．1. 材料および方法
5.1.1.神経膠細胞の培養
生後７〜12日のウイスターラットまたは若いウイスターラット（体重180〜220g）から視神経を切取し、プレーティング培地［エアー緩衝、ラット血清５％含有Ｌ15富化培地。MainsおよびPatterson, J. Cell Biol., 59, p.329-345（1973）］中に集めた。髄膜および血管を顕微鏡下に慎重に除去し、神経を小片に切断した。10日後、神経の解離処理を２回、各25分行った。該処理は、0.25％のトリプシン（Sigma社）および0.02％のコラゲナーゼ（Worthington社）を含むＣＭＦ−ＰＢＳ（Ca++，Mg++不含有リン酸緩衝液）中、37℃で行った［Raff他，Brain Res., 174, p.283-318（1979）］。成長した視神経を、トリプシン0.1％、コラゲナーゼ0.1％含有液中、温度37℃で１時間、ついで0.5％トリプシン含有液中で10分間かけて解離した。パスツールピペットを用いて洗浄、解離後、細胞を、４つの内孔を有する35mmの組織培養皿の各孔中に、20,000〜30,000細胞／孔の割合で入れた（孔の表面積：95mm2）。７〜10日経過後の神経に関し、解離収量は１神経当り約10,000細胞であった。
多数の実験において、培養基質としてポリオルニチン（ＰＯＲＮ）（シグマ社。ホウ酸緩衝液中0.5mg／ml。一夜培養）またはポリリジン（ＰＬＹＳ）（シグマ社。水中50ng／ml）を用い、いくつかの実験においては、乾燥コラーゲン膜（子牛皮コラーゲン。殺菌液を用いて一夜培養）、ラミニンコートＰＯＲＮ、精製マウスＥＨＳ腫瘍ラミニン（５ng／ml。予めＰＯＲＮを塗布した皿の上で３時間培養）または単純な組織培養用プラスチックを用いた。培地としては、ラット血清（５％）、ペニシリン（100U/ml）およびストレプトマイシン（100ng／ml）を含有する富化Ｌ15培地［MainsおよびPatterson, J. Cell Biol., 59, p.329-345（1973）］を用いた。一部の実験においては、ラット血清の代りに10％牛胎血清（ＦＣＳ）を用いた。
Ｅ13またはＥ17チキンの胎児の視神経を短時間のトリプシン／コラーゲン処理により解離し、ＰＯＲＮを塗布した培養皿上で、ＦＣＳ５％含有Ｌ15培地を用い、２〜７日間培養した。
5.1.2.神経膠細胞、神経細胞の共培養
３種の異なる種類の神経細胞、すなわち、新生ラットの上部頸神経節の交感ニューロン、新生ラットの背根神経節の感覚ニューロン、またはＥ17−Ｅ18ラットの胚の網膜細胞、を神経膠細胞と共培養した。上部頸神経節および背根神経節は切除し、個体細胞に解離した［MainsおよびPatterson, J. Cell Biol.,５, p.2415-2423（1985）；SchwabおよびThoenen, J. Neurosei.,５, p.2415-2423（1985）］。網膜は、胎児から切除し、血管を除き、トリプシン0.03％およびＤＮアーゼ0.03％中で10分間37℃で培養し、血清含有培地中にて遠心分離により洗浄し、すりつぶしにより解離した。
ニューロンを、同一培地中にて２〜10日培養した神経膠細胞培養物中に加えた。但し、感覚ニューロンおよび交感ニューロンの培地にはＮＧＦ（2.5Ｓ  ＮＧＦ、50または100ng／ml）を、網膜細胞の培地には脳由来の向神経因子を添加した［J.E.ジョンソン他、J. Neurosci., ６, p.3031-3038（1986）］。末梢神経と共に添加されたシュワン細胞の成長を阻害するため、一部の実験においては、共培養の２日目および５日目に、24時間のシトシンアラビノシドのパルス（Ara C, 10-5M）を与えた。共培養物の抗体染色処理を、網膜細胞の場合には、共培養の１〜５日後、末梢神経節細胞の場合には２日〜３週間後に行った。
ＤＭＥＭ／10％ＦＣＳ中で培養した、マウスの神経芽細胞腫細胞（ラインＮＢ-2Ａ）を、ＤＭＥＭ／ＦＣＳの添加により停止したＣＭＦ−Hank液中の0.1％トリプシンにより短時間処理することにより、培養フラスコから分離した。洗浄後、分離した細胞を、ジブチリル−サイクリックＡＭＰまたは神経膠細胞由来の神経突起促進因子（ＧｄＮＰＦ）［Guenther他，EMBO J.,４, p.1963-1966（1986）］を２mM含有するＤＭＥＭ／ＦＣＳ中の神経膠細胞培養物に加えた（40,000〜20,000細胞／孔）。
生後７日のラットまたは新生ラットの網膜細胞を、牛胎児血清10％含有ＤＭＥＭ培地、またはインシュリン（20ng／ml）およびトランスフェリン（50ng／ml）添加ＭＥＭ培地中で２〜３日培養した培養物中に上記神経芽細胞と同様に処理したマウスのＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、20,000〜40,000細胞／孔の濃度で加えた。培養物を培養器に２〜４時間入れ、ついで、リン酸緩衝液中の４％温ホルマリンにより固定し、O1およびO2抗体により二重に染色した。
5.1.3.免疫螢光法
寡突起神経膠細胞、星状膠細胞、ニューロンまたは繊維芽細胞に対するマーカーとして次の抗体を使用した。寡突起神経膠細胞：マウスのモノクローナル抗体（mAB）O4［SommerおよびSchachner,Dev.Biol.,83, p.311-327（1981）］、マウスmAB O1（同上）、ガラクトセレブロシドに対して特異的（Galc,SinghおよびPfeiffer, J.Neurochem.,45,p.1371-1381（1985）］およびラビットのミエリン基本蛋白に対するヤギ抗血清［Omlin他，J.Cell Biol.,95, 242-248（1982）］。プレカーサー細胞：マウスのmABおよびA2B5（英国Crawley DownのSera-Lab）。星状膠細胞：グリアのフィブリラリ酸蛋白（ＧＦＡＰ）に対するラビットの抗血清（DahlおよびBignami, Brain Res.,116, p.150-157（1976）］。ニューロン：ギニアピッグまたはラビットの神経フィラメントに対するマウスmAB［WillardおよびSimon, J.Cell Biol.,89, p.198-205（1981）］。繊維芽細胞：Thy-1.1（Sera-Lab）に対するマウスmAB Ox７、および人のフィブロネクチンに対するヤギ抗血清（ＬＥＴＳ蛋白。Cappel, NC）。
これらの特異抗体は、対応する抗マウス−、抗ラビッド−または抗ヤギ−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、または同ローダミンチオイソシアナート（ＲＩＴＣ）に結合した２次抗体（Cappel, NC）により可視化した（Cappel, NC）。染色に先立ち、培養物を２回、スクロース５％およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）0.1％を含有するＰＢＳで洗浄した。抗体O1、O2およびA2B5は表面抗原に対するものであるから、ＰＢＳ／スクロース／ＢＳＡ中希釈率１：20、室温にて30分間生きた培養物上でそれら抗体をインキュベートした。Thy-１に対する抗体は１：10、抗フィブロネクチンは１：20にそれぞれ希釈した。ついで培養物を２回洗浄し、４％ホルマリン溶液（ＰＢＳ）を用い10分間で固定し、再度洗浄し、標識した２次抗体（希釈度１：30〜１：100）を用いて１時間インキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ：グリセロール（１：１）にマウントした。ミエリン基本蛋白（ＭＢＰ）の可視化は培養物を４％ホルマリン中で短時間固定し、ついでエタノール／酢酸混合物で処理し、最後に抗ＭＢＰ抗血清（希釈度１：500）と共に室温で一時間培養することにより行った。エタノール／酢酸混合物による固定は、ニューロフィラメントの可視化にも用いた。A2O5またはO1抗体と、O4抗体との二重標識実験に際しては、生きている培養物をまず抗体A2B5またはO1と共に培養し、ついで抗マウスＦＩＴＣを用いて培養し、最後に抗体O4抗原と共に培養した（但し、一部の実験ではこの順序を逆にした）。ＧＦＡＰの染色は、予め95％エタノール／５％酢酸混合物中で30分間４℃で固定し、ＰＢＳ中に再水和した培養物に対して行った。O4とＧＦＡＰとの二重標識実験においては、まずO4抗体を用いて生きている培養物に対して染色を行った後、４％ホルマリン中で10分間固定し、ついでエタノール／酢酸処理およびＧＦＡＰ染色を行った。ＭＢＰの可視化のためには、培養物を４％ホルマリン中にて短時間固定し、ついでエタノール／酢酸で処理し、最後に抗ＭＢＰ抗血清（１：500）を用いて室温で１時間培養した。エタノール／酢酸による固定は、ニューロフィラメントの可視化にも用いた。
二重標識した培養物の評価は、螢光顕微鏡下で１つの抗原（通常O4）の存否を系統的にスクリーニングすることにより行い、他の抗原（例えば、A2B5、O1またはＧＦＡＰ）についてすべての標識細胞を調べた。
5.1.4.神経細胞、神経芽細胞腫細胞または３Ｔ３細胞との共培養物の評価
抗体で標識した培養物を螢光顕微鏡中で系統的にスクリーニングし、全てのO4標識細胞を写真撮影した。同一視野を位相差照明下に撮影した。ニューロン、神経突起、神経節シュワン細胞または３Ｔ３細胞により覆われた、または接触している、寡突起神経膠細胞の表面積を推定し、寡突起神経膠細胞を３つのカテゴリー、すなわち細胞の領域の、▲１▼20％未満、▲２▼20％〜80％、▲３▼80％超がニューロン、神経突起または３Ｔ３細胞により覆われたもの、にグループ分けした。単一の細い突起しか有さない細胞、特に未成熟細胞は、高度に枝分れした寡突起神経膠細胞の密な突起のネットワークとの類似性があるので、評価の対象から除外した。網膜細胞を用いる実験においては、寡突起神経膠細胞の全面積および網膜細胞で覆われた寡突起神経膠細胞の領域を、ヒューレットパッカード社製デジタル計測器を用いて計測した。寡突起神経膠細胞の亜類型は、螢光顕微鏡写真により同定した。同定には、細胞形態および抗原特性（O4／O1）を基準として用いた。A2B5染色は、未成熟細胞に対するマーカーとしては用い得なかった。これは、該抗原は、ニューロンとの共培養後、細胞の形態の変化を伴うことなく急速に失われることによる。識別のための形態上の基準としては、細胞体の形状およびサイズ、一次突起の数、突起の分枝パターン、および突起のネットワーク中の網目構造および膜シートの出現、を用いた。これらの基準を用いることにより、高度に分枝した寡突起神経膠細胞と未成熟な寡突起神経膠細胞を再現性よく識別することができた。高度に分枝した細胞の多く（但し、全てではない）がO1抗原に陽性であり、未成熟細胞は常に陰性であった。
第５図に示すようにして、高度に分枝した寡突起神経膠細胞の神経芽細胞腫突起の生長方向の定量化を行った。高度に分枝した寡突起神経膠細胞を系統的にサンプリングし、寡突起神経膠細胞の突起網の端と、その隣りのＮＢ-2Ａ細胞との距離が、細胞の直径の２倍より小さい場合に、これら隣り合う２個の神経芽細胞腫細胞は「隣接」しているとして分類した。これより離れている細胞は「遠隔」であるとして分類した（第４図および第５図）。区割の中心が１つの神経芽細胞腫細胞の中心と重なり、１本の区割線が最も近い神経芽細胞腫細胞に向うようにして、放射状に８区割（４クラス）を設定し、各区割内の神経芽細胞腫突起の数を数えた（第５図）。
5.1.5.ミエリンの調製
体重200ｇのラットから脊髄を切取し
、付着している背根および前根を注意深く除去し、ホモジナイズした（ポリトンを使用し、半速にて30秒間攪拌）。坐骨神経を切取し、細断し、ホモジナイズした。スクロースの濃度勾配を利用し、低速上澄み液浮遊法により、ミエリン膜を含むフラクションを単離した［Colman他，J. Cell Biol.,95, p.598-608（1982）］。一部の実験において、混入物を除去するため、粗膜フラクションを洗浄し、低張ショックを施した。10,000Ｇ、５分間の遠心処理により、低張媒体中に沈降させた。50mM以下のイオン種しか含有しないスクロース溶液中の膜フラクションを、ＰＬＹＳを塗布した組織培養皿の壁に数時間かけて吸着させた（組織培養皿１cm2当りの蛋白＝約0.1mg）。ＣＭＦ−ハンク溶液で３回洗浄することにより、結合しなかった膜を除去した。このコートした培養皿を直ちに基質テストに使用した。交感ニューロンおよび感覚ニューロンを用いる実験においては、中枢ミエリンまたは末梢ミエリンの小滴を、35mmの培養皿上に規定どおりのパターンで付着させた。
上記の操作により、交感ニューロンまたは感覚ニューロンを、12時間後ないし４日間後に調べた。神経芽細胞腫細胞は５〜24時間後、３Ｔ３細胞は１〜４時間後にそれぞれ調べた。定性のため、神経芽細胞腫細胞を、「丸い細胞」、「糸状仮足または短い突起を有する細胞」、および「細胞の直径より長い突起を有する細胞」の３種のカテゴリーに分類した。３Ｔ３細胞は、「丸い細胞」、「糸状仮足または短い突起を有する細胞」、または「大きい平板状の細胞」のいずれかに分類した。各実験とも、３個の培養物をランダムに選び、１培養物につき３〜４枚の顕微鏡写真をランダムに撮影した。
５．2. 結果
5.2.1.離解した若いラットまたは成長ラットの視神経の培養物
生後10日のラットの視神経から切取した細胞の約30％は、ＧＦＡＰ陽性の星状膠細胞であった。該細胞の約50％は、分化した寡突起神経膠細胞（GalC陽性）および未成熟寡突起神経膠細胞（A2B5陽性）のマーカーである、O4抗原に陽性であった。O4とＧＦＡＰ、またはO4とThy-１との間の標識化には、重複は全く見られず、O4抗体の、寡突起神経膠細胞に対するマーカーとしての特異性を確認することができた［SommerおよびSchachner, Dev. Biol., 83, p.311-327（1981）］。若いラットの視神経中の細胞の約20％、大きい平板状形態を有するThy-１陽性繊維芽細胞であった。
5.2.2.寡突起神経膠細胞の亜種
生後７〜10日のラットの培養物中において、O4陰性の細胞の約50％は、A2B5標識細胞であった。そのような細胞はO1陰性であり（第１表参照）、「多角形の細胞体と不規則な突起を有する細胞」、「表面突起を有する平板状細胞」、「双極状細胞」、「糸状仮足を有する細胞」を含む、種々の異なる形態を有していた。このようなマーカーのプロフィール（A2B5+，O4+，O1-）ならびにSchnitzerおよびSchachnerの結果との一致に基づき、我々は、これらの細胞はプレカーサーであり、未成熟の寡突起神経膠細胞であると解釈し、「未成熟寡突起神経膠細胞」と呼ぶことにする。この細胞グループは、異なる形態が示唆するように、恐らく不均一である。糸状仮足を有する細胞が恐らく最も進化したものである（第１表）。
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我々による培養条件下で２日培養した後において、O4陽性細胞の約50％はA2B5陰性かつO1陽性であった。これらの細胞の多くは、典型的な高度に分枝した放射状突起網を示した。この特徴的形態の故に、我々はこれらの細胞を「高度に分枝した寡突起神経膠細胞」と呼ぶ（第１表）。生後10日のラットの視神経からの高度分枝寡突起神経膠細胞の多くは、２日培養後ミエリン基本蛋白（ＭＢＰ）に対する抗血清により染色可能であった。それ故、我々は、これらの細胞はミエリン形成性寡突起神経膠細胞であると解釈する。その特徴である突起網、ところどころに平膜部を含む、不安定な部分的に崩壊したミエリン膜の結果であるかも知れない。成熟神経からの細胞の総収量は極めて低かった。分化したO1陽性の高度分枝寡突起神経膠細胞、および未成熟のA2B5陽性寡突起神経膠細胞は、いずれも成熟組織の培養物中にも存在していた。
5.2.3.高度分枝寡突起神経膠細胞に対する種々のタイプの細胞の反応
5.2.3.1.交感ニューロンまたは感覚ニューンとの共培養
新生ラットの上部子宮頸管神経節または背根神経節からの解離細胞を、２〜10日培養した神経膠細胞に加えた。一部の実験において、神経節シュワン細胞および繊維芽細胞をAra Cのパルスにより排除した。繊維を急速に成長させ、数日以内に密な神経突起網を形成させるため、培地にＮＧＦ（50〜100ng／ml）を添加した。ＮＧＦ単独では、寡突起神経膠細胞の出現およびその形態には全く影響がなかった。実験（２日〜２週間共培養）の終了時に抗体染色を行い、神経膠細胞のタイプを判定した。
密な神経突起網を有する培養物中において、最も目立ったことは、神経突起の存在しない「窓（windows）」が出現し、その中心部に放射状の高度に分枝した突起を有する細胞が観察されたことであった（第１図）。抗体染色により、これら細胞は、高度分枝寡突起神経膠細胞であることが確認された。寡突起神経膠細胞と交感神経節細胞との相互作用の定量分析の結果を第２図ａおよび第２図ｂに示した。これらの培養物中においては、寡突起神経膠細胞に隣接する星状膠細胞は、全般的に神経膠細胞の密度が低いことから、まれであった。それ故、星状膠細胞との選択的結合により、この結果を説明することはできない。高度分枝寡突起神経膠細胞は、用いた培養基質の種類にかかわらず、その領域からニューロンを排除した。同様の「窓」は、単純プラスチック、コラーゲン、ＰＯＲＮまたはラミニンを塗布した培養皿の上でも形成された。交感ニューロンと感覚ニューロンとの間に何らの差異も見られなかった。すなわち、両者共、高度分枝寡突起神経膠細胞の領域から排除された。同様に、シュワン細胞は、寡突起神経膠細胞の突起網に侵入、あるいは突起網上で成長することはなかった（第１ｂ図）。これと対照的に、不規則な形およびO1抗原の欠除により特徴付けられる、未成熟寡突起神経膠細胞は、神経突起が、自己の突起および細胞体上に成長するのを許容しなかった（第１ｂ、１ｅおよび１ｆ図）。未成熟寡突起神経膠細胞とニューロンとの共培養において、A2B5は、ニューロンの添加後、急速に失なわれることから、マーカーとして使用することはできなかった。成長円錐体と寡突起神経膠細胞との会会の直接観測は、糸状仮足との接触が確立された後、成長円錐体の運動が阻まれることを示した。未成熟細胞との接触および交差の際には、正常な成長円錐体の活動が見られた。これらの観測結果もまた、「窓」が神経突起網中に二次的に形成される可能性を排除するものである。星状膠細胞は、同じ培養物中において、しばしば単一の神経突起、または神経突起束により乗り越えられた（第３ａおよび３ｂ図）。このことは、平板状および星形、いずれの形態の細胞にも妥当する。
5.2.3.2ラット胎児の網膜細胞との共培養
視神経非ニューロン細胞を５日間培養した培養物の上に、単層の網膜細胞で覆ったところ、典型的な視神経の配列が観測された。寡突起神経膠細胞のプレカーサー細胞には、しばしば網膜細胞が接触したが、高度分枝寡突起神経膠細胞には、ほとんどの場合接触しなかった。（第１ｇ，１ｈ、３ｃおよび３ｄ図）。ここでも再び、星状膠細胞は、ＰＯＲＮに対する基質として好ましいものであった。
5.2.3.3高度分枝寡突起神経膠細胞に対する他のタイプの細胞の反応
神経芽細胞腫細胞（ラインＮＢ-2Ａ）を、解離した視神経培養物中に高い細胞密度で接種し、２mMのジブチル−サイクリック−ＡＭＰまたはＧｄＮＰＦにより繊維の生産を刺激した。７時間、24時間または48時間後、培養物を固定し、寡突起神経膠細胞を抗体O4またはO1により同定した。この場合にも、神経芽細胞腫細胞は高度分枝寡突起神経膠細胞の領域を明瞭に避けていた（第４ａおよび４ｂ図）。寡突起神経膠細胞の近辺に位置する神経芽細胞腫細胞の突起は、寡突起神経膠細胞から離れた方向を向いていた（第４ａ，４ｂ図、第５図および第ＩＡ表）。
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３Ｔ３細胞はもとより、一次培養繊維芽細胞および視神経調製物中の星状膠細胞も、高度分枝寡突起神経膠細胞に対する強い回避行動を示した。視神経グリア培養物中に高い細胞密度で接種された３Ｔ３細胞は、ＰＯＲＮ基質に、30分ないし３時間で付着し、平坦になった。この単層の形成に際しても、高度分枝寡突起神経膠細胞の領域に対応して、特徴的な「窓」が現われた（第４ｃおよび４ｄ図）。接触場所において、３Ｔ３細胞は三日月状の細胞質の膨らみを生じた。この領域にはラメリポジウムは存在しなかった。重要なことは、高度分枝寡突起神経膠細胞上に直接着地した繊維芽細胞は全く拡大しなかったことである。ニューロンに関し、３Ｔ３細胞は、未成熟寡突起神経膠細胞を回避しなかった（視認による）（第６図）。
5.2.4.種特異性の欠除
寡突起神経膠細胞の形態も基質特性も種特異的ではなかった。Ｅ13およびＥ17でよこの視神経からの、解離した非ニューロン細胞は、O4陽性／A2B5陰性／O1陽性の高度分枝寡突起神経膠細胞を含有していた。ニワトリのひなの非ニューロン細胞の上に接種した３Ｔ３細胞は、その寡突起神経膠細胞のまわりに特徴的な「窓」を形成した。
5.2.5.基質としてのミエリン
ミエリンは螺旋状に巻かれた寡突起神経膠細胞膜から形成されていることから、ニューロンおよび繊維芽細胞に対する基質としてのミエリンの特性についてもテストした。スクロース勾配フローテーション法により、成長ラットの脊髄または坐骨神経から、粗ミエリン・フラクションを調製した。ミエリンをＰＬＹＳをコートした組織培養皿に吸着させ、上部頸神経節細胞、背根神経節細胞、神経芽細胞腫細胞、および３Ｔ３細胞に対するその基質特性をテストした。これら４種の細胞は全て、ＣＮＳミエリンにあまり付着せず、それらの突起の成長が著しく困難であることを示した。すなわち、ＣＮＳミエリン上の交感ニューロンおよび感覚ニューロンは丸いままであるか、ＮＧＦ（50ng／mlまたは100ng／ml）の存在にかかわらず、短い、発育不全の繊維を形成した（第７図Ａおよび第17図ｃ）。対照的に、同じ培養皿中の坐骨神経ミエリンの島は、長い繊維を形成した（第７図ｂおよび第17図ｄ）。ＰＬＹＳ上に「窓」として現れた小さいＣＮＳミエリンの島は、排除された神経突起により輪郭付けられていたのに対し、ＰＮＳミエリンとＰＬＹＳとの境界は、成長する神経突起によっては明らかに検知されなかった。
ジブチリル−サイクリックＡＭＰの存在下における神経芽細胞腫細胞（ラインＮＢ-2Ａ）の突起の成長は、ＣＮＳミエリンにより有意な減少を示した（第８図Ａ）。
３Ｔ３繊維芽細胞の拡大は、ＣＮＳミエリンにより強く阻害された（第８図Ｂ）。３Ｔ３細胞は、細胞基質間相互作用が最小であり、丸いままにとどまるか、紡垂形又は多角形の形態となった。対照的に、ポリリジン上では20〜30分以内に大きい平坦な膜が形成され、末梢神経系からのミエリン上においても、上記よりやや長い時間内に、大きい平坦な膜を形成した（第８図Ｂ）。
ほとんどの非許容膜のペレット状化を行うのに、低張条件下10,000Ｇ、５分間の沈降（前記6.1.5参照）条件で十分であったことから、非許容は、少なくともその多くの部分を、ミエリン膜と関連付けることができる。この条件下では、0.85Ｍスクロース液より密度（比重）が低い液に浮遊する表面膜成分は、沈降するものとは考えられない。
最小量の白質（表面皮質層）を含むＣＮＳ組織からの細胞膜調製物が繊維芽細胞の拡大に対する許容基質であることから、上記のＣＮＳミエリン非許容は星状膠細胞膜によるものではない。
これらの実験は、生きている高度分枝寡突起神経膠細胞と同様に、ＣＮＳからのミエリンが、一次培養ニューロン、神経芽細胞腫細胞および３Ｔ３繊維芽細胞に対する、強い非許容基質であることを示している。末梢神経系からのミエリンは、そのような非許容基質効果を示さない。
５．3 ディスカッション
本研究において、我々は、ミエリン形成性寡突起神経膠細胞および単離されたＣＮＳミエリンが、交感ニューロン、感覚ニューロンおよび神経芽細胞腫細胞の神経突起の成長、ならびに網膜細胞の付着および繊維芽細胞の拡大に対し、非許容基質効果を及ぼすことを観察した。
解離したラットの視神経の短期培養物中には、数種の細胞が存在していた。すなわち、寡突起神経膠細胞（欠突起膠細胞）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ陽性）、繊維芽細胞（Thy-１、フィブロネクチン陽性）および若干種のプレカーサー細胞である。寡突起神経膠細胞類（O4陽性）［SommerおよびSc-hachner, Dev. Biol., 83, p.311-327（1981）］における１つの主要な一群（サブクラス）の細胞は、ミエリンの特徴であるO1抗原（GalC）およびＭＢＰ［Mirsky他，J. Cell Biol., 84, p.483-494（1980）］の不存在および抗体A2B5に対する結合位置の存在により特徴付けられる。A2B5は、寡突起神経膠細胞のプレカーサー、タイプII星状膠細胞プレカーサー、タイプII星状膠細胞およびニューロンに対するマーカーであることが示された［SchnitzerおよびSchachner, Cell TissueRes., 224, p.625-636（1982）；E.R. Abney他，Dev. Biol., 100, p.166-171（1981）；およびRaff他，Nature, 303, p.390-396（1983）］。それ故、我々は、これらの細胞は、未成熟の寡突起神経膠細胞であって、恐らく、Dubois-Dalcyが報告しているもの［Soc. Neurosci. Abstr., 12, 767（1986）］、ならびにSommerおよびNobleが報告しているもの［Soc. Neurosci. Abstr., 12, 1585（1986）］を含むものと考えた。これらの細胞は、O4の存在により、Ｏ２Ａプレカーサー［M.C. Raff他，Nature, 303, 390-396（1983）］であると同定される。これら未成熟細胞は、双極状ないし多角形の不規則かつ可変の細胞形態を示し、しばしば糸状仮足を伴う不規則な突起を示した。この種の細胞は、恐らく不均等であり、またその細胞分裂も認められた。第２の主要な寡突起神経膠細胞のサブクラスは、放射状の高度に分枝した交差突起網を有するA2B5陰性、O1陽性の細胞である。生後10日のラットの視神経の２日培養物中の高度分枝寡突起神経膠細胞の多くは、我々の培養条件下において、ＭＢＰに陽性であった。それ故、我々は、この高頻度で出現する細胞種は、神経突起の不存在下に培養基質に平坦に付着するミエリン膜の合成に活発に関与する寡突起神経膠細胞であると解釈した。膜は不安定であり、崩壊して特徴的な交差突起網を形成する。このタイプの細胞は、従来「有毛眼球細胞（hairy eyeball cell）」と呼ばれており［SommerおよびSchachner, Dev. Biol.,83, p.311-327（1981）］、長期培養によりコンパクトなミエリンの螺旋を形成することが観察されている［Rome他，J. Neurosci. Res.,15, p.49-65（1986）；およびYim他，J. Biol. Chem., 261, 11808-11815（1986）］。
生後７〜10日のラットまたは成長したラットの視神経の培養物、生後１日のラットの視神経の培養物、新生ラットの脊髄の培養物、成長ラットの脳梁の培養物、Ｅ13またはＥ17チキンの胚の脊髄および視神経の培養物中には、いずれも未成熟寡突起神経膠細胞およびミエリン形成性寡突起神経膠細胞の両者が見られた。若い段階での解離物中では明らかに未成熟細胞が優性であったが、成育日数の増加した場合に解離時に生じる大きい細胞塊が、その数の定量的分析を不可能とした。しかしながら、未成熟寡突起神経膠細胞は、成長ラットの白質組織からも、常に得られた。これはFrench-ConstantおよびRaffによる観察と一致する［Nature, 319, p.499-502（1986）］。
確立されたグリア培養物中へニューロンを添加した際には、種々のタイプの非ニューロン細胞が、ニューロンへの付着および繊維の成長に関し、基質特性上顕著な差異を示した。星状膠細胞、特に平板状の反応性原形質星状膠細胞は付着性であり、ニューロンへの付着および成長を好んだ。これは、従来の観察結果と一致する［Foucaud他，Cell Res., 137, p.285-294（1982）；Hatten他，J. Cell Biol., 98, p.193-204（1984）；Noble他，J. Neurosci., ４, p.1982-1903（1984）；およびFallon, J. Cell Biol., 100, p.198-207（1985）]。未成熟寡突起神経膠細胞には、神経突起および神経細胞体も頻繁に接触した。この挙動は、生理的に高い関連性を有する。成育中、寡突起神経膠細胞のプレカーサーは、既形成の神経突起束中に移動し、突起を伸ばしていくつかの数の神経突起と接触する。ついで突起は、神経突起を螺線状に包み、ミエリンと呼ばれる構造を形成する（Wood and Bunge,1984,W.T.Norton, ed.,１-46）。
我々は、星状膠細胞および寡突起神経膠細胞のプレカーサーとは対照的に、ミエリン形成性寡突起神経膠細胞が、ニューロンの付着および繊維の成長、ならびに繊維芽細胞の付着および拡大に対し、強い非許容基質特性を示すことを見出した。この効果は、他のケースにおいては神経突起の成長に対する優れた基質であるラミニン塗布培養皿上においても、強力かつ顕著であった［Manthorpe他，J. Cell Biol., 97, p.1882-1980（1983）；およびRogers他，Dev. Biol., 98, p.212-220（1983）］。この効果は、交感ニューロン又は感覚ニューロンの培養物中へのＮＧＦの大量添加、あるいは神経芽細胞腫細胞の培養物中へのＧｄＮＰＦまたはジブチリル−サイクリック−ＡＭＰの大量添加によっても打ち消されなかった。ラットのＣＮＳミエリンは類似ないし同一の非許容基質特性を有していたが、末梢神経のミエリンはそのような特性を示さなかった。神経細胞および神経芽細胞腫は、寡突起神経膠細胞またはＣＮＳミエリン塊の直近周辺部に自由に移動し、かつ良く成長することから、上記効果は厳密に接触依存性である。マウスの３Ｔ３細胞もまた、チキンの寡突起神経膠細胞により阻害された。このことは、該効果が種特異的ではないことを示している。
ラットの視神経において、神経突起（axon）数は、胚の20日目にピーク値に達し、その後急激に減少する［Crespo他，Dev. Brain Res., 19, p.129-134（1985）］。寡突起神経膠細胞のプレカーサーはＥ17以降に現われ［Raff他，Cell, 42, p.61-69（1985）］、生成前後にGalCを発現する［Miller他，Dev. Biol., 111, p.35-41（1985）］。電子顕微鏡で検知し得る最初のミエリンは、出生６日後に現われる［HildebrandおよびWaxman, J. Comp. Neurol., 224, p.25-37（1984）］。この神経突起の成長とミエリンの形成との間の明快な時間的分離は、チキンの視神経においても観察され［Rager他，Cell Biol., 63, p.1-92（1980）］、あまり研究されていないものの、多数のＣＮＳの白色索についても見られる［MatthewsおよびDuncan, J. Comp. Neurol., 142, p.1-12（1971）；およびLooneyおよびElberger, J. Comp. Neurol., 248, p.336-347（1986）］。それ故、通常の発達過程において、成長中の神経突起は、ミエリンまたはミエリン形成性寡突起神経膠細胞と、束（fascicle）中において遭遇することは決してなく、むしろ、プレカーサーまたは未成熟寡突起神経膠細胞と相互に作用する。この試験管内でのミエリン形成において観察された［Wood他，Brain Res., 196, p.247-252（1980）, WoodおよびWilliams, Dev. Brain Res., 12, p.225-241（1984）］極めて遅い時間過程は、未分化の寡突起神経膠細胞がまず神経突起と相互作用し、分化し、ついでミエリンを形成することと整合する。
発達段階とは異なり、ＣＮＳ再生中には、神経突起の成長した錐状体または芽は未成熟の寡突起神経膠細胞およびミエリンと遭遇する。ＣＮＳ組織の基質特性、特に、高等脊髄動物の分化したＣＮＳ中のラミニンのような、神経突起促進基質の存在は、ＣＮＳ再生における重要な側面である［Liesi, EMBO J., ４, p.2505-2511（1985）；およびCarbonetto他，J. Neurosci.,７, p.610-620（1987）］。しかしながら、末梢神経およびＰＮＳ／ＣＮＳ移植とは異なり、ミエリンおよび寡突起神経膠細胞は、脱神経ＣＮＳ索中に長期間残存することから［FulcrandおよびPrivat, J. Comp. Neur., 176, p.189-224（1977）；およびBignami他，J. Neuropath, Exp. Neurol.,40,p.537-550］、白質領域中での繊維再生の欠除は、非許容基質因子と関係付けることができる。
正常な条件下において、後から成長する神経突起を一定の領域から排除すること、ＣＮＳ突起パターンの発達中における許容および非許容基質物質間の拮抗、ならびに分化したＣＮＳ中の出芽の空間的制限は、いずれもこの寡突起神経膠細胞関連非許容基質特性の可能な機能である。
６．試験管内における神経膠芽腫の中枢神経系（ＣＮＳ）組織への侵入に対するメタロプロテアーゼの関与
以下に詳述する実施例において、我々は、膜関連メタロプロテアーゼについて記述する。このメタロプロテアーゼは、ラットの神経膠芽腫が、試験管内においてＣＮＳ組織に侵入する上で重要な役割を演じるものである。
我々は、神経膠芽腫による試験管内ＣＮＳ組織の悪性腫瘍の侵入が原形質膜に結合した金属依存減成活動を必要とすることを発見した。Ｃ６細胞は、視神経の外植体に侵入し、小脳凍結部の白色ないし灰白質質上、またはＣＮＳミエリン上に付着し、拡大する。金属イオンのキレート化剤である1,10−フェナントロリンおよびジペプチドの１種である。cbz-tyr-tyr（但し、これらは、他の３種のプロテアーゼの阻害剤ではない）は、ＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を最大67％阻止した。３Ｔ３細胞に対するＣＮＳミエリン阻害基質特性を中和する金属依存活性の１つは、あるＣ６原形質膜のフラクションと結びつけることができる。このメタロプロテアーゼの阻害剤は、またＣＮＳ基質外植片の侵入および小脳凍結部のＣＮＳ白質上への拡大をも阻害する。
６．1. 材料および方法
6.1.1.細胞の培養
ラットのＣ６細胞、マウスのＮＩＨ ３Ｔ３細胞およびＢ16細胞を、10％の牛胎血清（ＦＣＳ）を添加したダルベコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した（通常、表面の最大70〜80％が覆われるまで培養を行った）。短時間のトリプシン処理（トリプシン0.1％含有、Ca2+／Mg2+非含有ハンク培地中にて90秒間）を行うことによって細胞を収穫し、過剰のＦＣＳの添加により停止し、遠心分離によって捕集した。細胞をＤＭＥＭ／，ＦＣＳ中、又は規定の血清不含培地（ＭＥＭ）中に再分散し、実験に供した。前記6.1.1項に記載の手順に従い、生後６〜７日のルイスラットの視神経より、解離したラットＣＮＳ神経膠細胞を調製し、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＬＹＳ）を塗布した孔（100mm2、培地100μｌ）中に20,000細胞／孔の割合で接種した。培地としては、ラット血清５％、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、富化Ｌ15培地を使用した。これを２日間培養し、得られた培養物中に、Ｃ６、３Ｔ３およびＢ16細胞を、30,000細胞／孔の割合で加え、２時間培養し、リン酸緩衝液中４％ホルマリンにより固定した。抗体O1およびO4（6.1.3項参照）を用いて、二重標識法により阻害性寡突起神経膠細胞を同定した。
6.1.2.侵入分析のための神経外植体の調製
SchwabおよびThoenenの方法により、視神経および坐骨神経の外植体を調製した［J. Neurosci., ５, p.2415-2423（1985）］。生後８週間のオスのラットから神経をすばやく切取し、髄膜を除き、液体窒素を用いて３回凍結・解凍を繰り返し、テフロン製リング（径13mm、厚さ１mm）の下に置き、シリコングリースを用いて、培養皿を封じた。この方法により、外植体によってのみ連結された２室を作成した。ＤＭＥＭ／ＦＣＳ中の内室にＣ６細胞、３Ｔ３細胞またはＢ16細胞を30万個接種し、５〜20日間培養した。培地は２日毎に取り替えた。培養物を１夜４％ホルマリンにより固定した。神経の外植体上にティッシュテック（Tissue-Tek）を載置し、クリオスタット内で10〜15μmの片に切断し、ゼラチンを塗布したカバーガラス上に捕集した。室温にて一夜乾燥後、切片を0.75％のクレシル紫により染色し、評価した。侵入した細胞を、細胞を加えた端部から、0.1mm毎に数えた。15日間にわたる培養のため、外植体は往々にして直径が異なる。それ故、神経の中央部（0.25mm）のみを考慮した。なぜならば、この部分のみが、組織学的に良質な質を示すからである。予め両側からcbz-tyr-tyr又はcbz-ala-pheの３mM溶液２μｌを注入した視経外植体を使用して阻害実験を行った。
6.1.3.基質としてのＣＮＳ凍結切片およびミエリン
成長したラットの小脳凍結切片を調製し、ガラス製カバーガラスの上で乾燥した。冷ＤＭＥＭ／ＦＣＳで予め洗浄した切片を含む孔に、Ｃ６細胞、３Ｔ３細胞またはＢ16細胞を70,000個／孔（溶液100μ）づつ加えた。２日間37℃で培養した後、培養物を固定し、クレシル紫で染色した。各実験には３〜４個の小脳片を使用すると共に、各実験共、最低２回繰り返した。
第5 1.5に記載したように、連続スクロース勾配上で精製した、ラットの脊髄（ＣＮＳ）または坐骨神経（ＰＮＳ）からのミエリンを、ＰＬＹＳを塗布した孔中で乾燥した（蛋白20μg／孔表面積100mm2）。Ca2+／Mg2+非含有ハンク液で３回洗浄することにより、結合しなかったミエリン膜を除去した。このようにしてミエリンをコートした孔を直ちに基質試験分析に用いた。その際、9,000個／孔のＣ６、３Ｔ３またはＢ16細胞を加えた。あるいはこれに替えて、抽出したＣＮＳミエリン蛋白、またはリポソーム中で再構成した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製35kDおよび250kD阻害蛋白［CaroniおよびSchwab, J.Cell Biol., 106, p.1281-1288（1988）参照］を使用した。カメラを装着した位相差顕微鏡を用い、種々の時点で実験を評価した。定量化は表面積積分法によって行った（各孔の任意の３分野を倍率80倍で撮影し、各写真の少なくとも25個の細胞について測定した）。各数値は、少なくとも３個の孔の平均±ＳＥＭを表わす。結果は、投影した細胞表面積のμ2で表示するか、拡大した細胞の投影表面積から完全に球形の細胞の表面積を減じることによって求め、％により表示した（第II表）。
6.1.4.Ｃ６原形質膜およびならし培地の調製
表面カバー率80％まで成長させたＣ６細胞をハンク培地で２回洗浄し、ゴム製ポリスマンを用いて、8.5％のスクロース50mMのNaClおよび10mMのトリス緩衝液からなる溶液（pH7.4）20ml中に収穫した。サイズが減少する一連の針を通すことにより、機械的にホモジナイズした後、3,000Ｇ10分間、8,000Ｇ10分間、ついで100,000Ｇ２時間の遠心分離を行うことにより、低純度の原形質膜フラクションを得た。これを、不連続スクロース勾配（NaCl 50mM，トリス10mM，pH7.4）に付し、より高い純度のフラクションを得た［Quigley, J.Cell Biol.,71, p.472-486（1976）］。スクロース20〜40％の中間層（Ｃ６原形質膜フラクション）およびスクロース40〜60％の中間層（Ｃ６ミトコンドリア・フラクション）を集め、ハンク培地で洗浄し、ＨＥＭ中に再分散した。
表面覆い率80％のＣ６培養物をＭＥＭ中で１日培養することにより、ならし培地を得た。ついで培地を集め、3,000Ｇで10分間遠心分離した。一部の実験においては、セントリコン管（Centricon Tube）を用いて濃縮（10倍）した。
6.1.5.Ｃ６原形質膜によるＣＮＳミエリンの処理
前項に記載した手順により、ＣＮＳミエリンを塗布したＰＬＹＳ孔を調製した。しかしながら、直ちに基質としてテストする代りに、まず、Ｃ６原形質膜（蛋白0.8mg／mlＨＥＭ）50μｌを加え、温度37℃で30分間培養した。ついで、皿をハンク培地で２回洗浄し、直ちに３Ｔ３細胞に対する基質として使用した。一部の実験においては、プロテアーゼ阻止剤（10倍濃縮液）を膜に加えた。
６．2 結果
6.2.1.Ｃ６神経膠芽腫グリア芽細腫は試験管内において視神経およびＣＮＳの白質に侵入し、３Ｔ３繊維芽細胞およびＢ16メラノーマ細胞は侵入しないことについて
凍結した視神経および坐骨神経の外植体をテフロン製リングの下に置き、シリコン・グリースでシールした［SchwabおよびThoenon, J. Neurosci., ５, p.2415-2423（1985）］。Ｃ６細胞または３Ｔ３細胞をリング内に、該神経外植体の一端に接触する状態で、接種した。培地を、２日毎に交換しつつ、５〜10日間培養した後、神経を固定し、クリオトームを用いて切断した。クレシル紫を用いて染色することにより、侵入した細胞を確認した。ＰＮＳ外植体は、Ｃ６細胞、３Ｔ３細胞、両者の拡大侵入をサポートした（第９図ｃおよびｄ）。Ｃ６細胞は外植体中に高濃度で存在した。視神経外植体中には、これと異なる像が出現した（第９図ａおよびｂ）。すなわち、３Ｔ３細胞は神経に侵入せず、例外的に極く少数の細胞が血管沿いに移動したのみであった（第９図ｂ、矢印）。これに対し、Ｃ６細胞は、視神経中に深く侵入し、14日間で最大３mmの距離に達した（移動率：約0.2mm／日）。
代替モデルとして、成長ラットの小脳の凍結片をＣ６、Ｂ15および３Ｔ３細胞の培養基質として用いた。高度転移性Ｂ16メラノーマ細胞が、細胞の付着、拡大および移動に関し、灰白質と白質の基質特性を明らかに識別することが見出された。実際に、Ｂ16細胞は灰白質領域にのみ付着し、同領域においてのみ拡大し、高濃度で接種した場合においても、白質領域には付着も移動もしなかった（第10図ｅ）。同じ図式が３Ｔ３細胞の場合にも見られた。すなわち、３Ｔ３細胞は灰白質上に密な単層を形成したが、白質上には形成しなかった（第10図ｃおよびｄ）。Ｂ16および３Ｔ３細胞とは対照的に、Ｃ６細胞は、しばしば白質上においても灰白質上においても見出された（第10図ａおよびｂ）。いくつかのケースにおいて、我々は、Ｃ６細胞が白質上において、灰白質上におけるより、より密であり、そこにおいて容易に拡大しない塊をしばしば形成するのを見出した。
6.2.2.神経膠芽腫の拡大はＣＮＳミエリンによっては阻害されないことについて
ＰＬＹＳを塗布した孔に吸着されたＣＮＳミエリン上においてＣ６神経膠芽腫が拡大する挙動を、Ｂ16メラノーマおよび３Ｔ３繊維芽細胞のそれと比較した。ＣＮＳミエリン基質に対するＢ16メラノーマの反応は、３Ｔ３繊維芽細胞のそれと極めて類似していた。すなわち、ＣＮＳミエリン上での３Ｔ３およびＢ16細胞の拡大は強く減速されたのに対し、Ｃ６細胞の拡大は当初（90分間）は少し減速したものの、その後は差異は認められなかった（第11図）。ＣＮＳミエリン上およびＰＬＹＳ上での細胞の挙動の相違は、長時間培養（最長１日）を行った場合にも持続した。
Ｃ６細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、リポソーム中で再構成した２種の阻害剤（35kDおよび250kD）、ならびに生きている培養寡突起神経膠細胞と遭遇させた。この場合においても、35kDおよび250kDリポソームは３Ｔ３細胞の拡大を強く阻害したが、Ｃ６細胞の拡大は阻害しなかった。Ｃ６細胞は、これら再構成されたＣＮＳミエリンフラクション上に吸着され、良く拡大し、特徴的な「目玉焼き（fried egg）」形態となった。
6.2.3.特定のメタロプロテアーゼ阻害剤がＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を阻害することについて
ＣＮＳミエリンまたはＰＬＹＳ上でのＣ６細胞の拡大に対するプロテアーゼ阻害剤の効果を測定することにより、Ｃ６細胞の挙動に対するプロテアーゼの関与について調べた。Cys-，Ser-およびAsp-プロテアーゼ阻害剤は、十分な濃度で用いた場合においても、ＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大に関し、識別可能な効果を全く有さなかった（第II表）。
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他方、メタロプロテアーゼ阻害剤である1,10−フェナントロリンはＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を特異的に阻害した。すなわち、1,10−フェナントロリンは、２時間培養後、ＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を最大67％阻害した（第II表）。テストした阻害剤は、いずれもＰＬＹＳ上でのＣ６細胞の拡大に対し、有意な阻害を示さなかった。1,10−フェナントロリンは、その金属イオンキレート化剤としての性質に基づく、一般的メタロプロテアーゼ阻害剤である。しかしながら、この物質による阻害は、蛋白加水分解作用と規定することはできない。なぜならば、他の金属依存酵素もまた阻害されるからである。メタロプロテアーゼ阻害剤はその他にも多数発見されているが、それらは1,10−フェナントロリン程一般的ではない。ホスホラミドン［Komiya他，Biochem Biophys. Res. Comm.,65, p.352-357（1975）］、ベスタチン［Umezawa他，J. Antibiot.,29, p.857-859（1976）］およびメタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）［Cawston他，Biochem. J.,195, p.159-165（1987）］は、Ｃ６細胞の拡大を阻害しなかった（第II表）。
ＴＩＭＰは、また、脳膜と結合したメタロプロテアーゼ減成エンケファリンを阻止しない。エンケファリナーゼに対して強い親和力を有する修飾ペプチドであるカルボキシメチル-phe-leu[M.C.Fournite-Zaluski他，J. Med. Chem., 26, p.60-65（1983）；およびJ. AlmenoffおよびM. Orlowski, Biochemistry, 22, p.590-599（1983）]は、Ｃ６細胞の拡大を阻害しなかった（第II表）。他方、我々は、cbz-gly-phe-NH2およびcbz-tyr-tyrがＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を55％阻害するが、ＰＬＹＳ上、ＰＮＳミエリン上またはガラス上では阻害しないことを見出した。これらのジペプチドは、メタロプロテアーゼ特異性を有する基質ペプチドである［AlmenoffおよびOrlowski，同上；Baxter他，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 80,p.4174-4178（1983）；CouchおよびStrittmatter, Cell, 32, p.257-265（1983）；ChemおよびChen, Cell, 48,p.198-203（1987）；LelkesおよびPollard, J. Biol. Chem., 262, p.15496-14505（1987）］。
非許容基質上においてＣ６細胞の拡大が一般的に促進されている可能性を排除するため、我々は、ＰＬＹＳおよびＣＮＳミエリン（第12図）に加え、他の２種の基質、ＰＮＳミエリンおよびガラス、の上におけるメタロプロテアーゼ依存Ｃ６細胞の拡大についてもテストした。ＰＮＳミエリンは、ミエリン膜フラクションの一般的特性（例えば、高脂質含量）に対する対照として選択した。ガラスを選んだ理由は、良く知られているところの、その基質としての悪い特性による。ＣＮＳミエリン上では、1,10−フェナントロリンを200μM用いることにより、細胞拡大阻害値の最大値の1/2の値が得られた。これに対し、ＰＬＹＳ上、ガラス上およびＰＮＳミエリン上では、1,10−フェナントロリンは、濃度0.5mMまでＣ６細胞の拡大を阻害しなかった（第12図）。阻害成分であるＣＮＳミエリンに対するモノクローナル抗体（IN-1）［CaroniおよびSchwab, Newron, １, p.85-96（1988）参照］を用いてＣＮＳミエリンを吸収することにより、ＣＮＳミエリンリポソーム上における1,10−フェナントロリンに依存する、Ｃ６細胞の拡大の阻害は、ほとんどくつがえされた（第III表）。IN-1はまた、ＣＮＳミエリン蛋白リポソームの３Ｔ３細胞に対する阻害基質特性をほとんど完全に中和した（第III表）。
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これらの結果は、IN-1阻害特性の中和によりＣＮＳミエリン阻害基質を克服する上で、メタロプロテアーゼが重要な役割を果すことを示している。
6.2.4.Ｃ６原形質膜結合作用がＣＮＳミエリンの阻害基質特性を中和することについて
ＣＮＳミエリンを塗布した培養孔をＣ６ならし培地またはＣ６原形質膜と共にインキュベートした後、３ＴＣ細胞の拡大に対する阻害基質特性についてテストした。我々は、Ｃ６原形質膜には、ＣＮＳミエリン阻害活性を強力に低下させる活性成分が含まれていることを見出した（第13図、第IV表）。同じ処理により、ＣＮＳミエリン蛋白リポソーム、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、再構成した35kDおよび250kD阻害成分による阻害効果も低下した。拡大値およびＤＮＡ合成を測定することにより３Ｔ３細胞の付着および拡大に対するＣＮＳミエリン阻害活性の低下を定量した（第IV表）。
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1,10−フェナントロリン、ＥＤＴＡおよびcbz-gly-phe-NH2は、Ｃ６原形質膜の効果を完全に阻害した。トラジロール、ロイペプチンおよびペプスタチンは、該効果を阻害しなかった。Ｃ６ならし培地（原液および10倍濃縮液）は、ＣＮＳミエリンの阻害基質作用を中和し得る減成活性を有さなかった。
6.2.5.メタロプロテアーゼの阻害剤がＣＮＳ白質上でのＣ６細胞の拡大およびＣＮＳ外植体へのＣ６細胞の侵入を阻害することについて
Ｃ６原形質膜のメタロプロテアーゼ活性が、Ｃ６細胞の付着および拡大だけでなく、Ｃ６細胞の転移および侵入にも関係することを調べるため、二種のメタロプロテアーゼ阻害剤（1,10−フェナントロリンおよびcbz-tyr-tyr）の存在下にＣ６細胞を小脳凍結片上に接種するか、視神経外植体に加えた。これと平行して他の３種のプロテアーゼ（ロイペプチン、ペプスタチンまたはトラジロール）または対照用ジペプチド（cbz-ala-phe）を培養物中に添加してテストを行った。
小脳凍結片を培養基質として用いた場合、種々の濃度（50，100，200または300μM）の1,10−フェナントロリンの存在、またはcbz-tyr-tyr（100μM）の存在により、Ｃ６細胞の白質領域上での分布および挙動は顕著な変化を示した（第14図）。Ｃ６細胞は灰白質上にも多数付着し、広範に拡大した（第14図）。
ラットの視神経にcbz-ala-pheまたはcbz-tyr-tyrの３mM溶液４μｌを注射した。細胞は、0.5mMのペプチドを含有する培地を用いて培養した。細胞が存在しない外室中のペプチド濃度は１mMであった。14日後におけるＣ６細胞の外植体中への移動は大いに異なるものであった（第15図）。培地のみを注射した外植体と比較して、cbz-ala-pheを注射した神経はより多くの細胞を含有しており、Ｃ６細胞の侵入には影響がなかった。他方、cbz-tyr-tyrは、調べた神経８サンプル（２実験）全てにおいて、Ｃ６細胞の侵入を阻害した。Ｃ６細胞は、主として神経の外植体の切断面で見つかり、対照用外植体においては、大規模に発生した深部への侵入は、cbz-tyr-tyrにより強力に低下せしめられた。
６．3. ディスカッション
今般得られた結果は、ニューロン、繊維芽細胞およびＢ16メラノーマ細胞とは対照的に、Ｃ６神経膠芽腫は、視神経外植体中への転移、ならびにＣＮＳ白質、単離されたＣＮＳミエリンおよび生きている寡突起神経膠細胞への付着およびそれらの上での拡大が阻害されないことを示している。検討した全ての分析システムにおいて、Ｃ６細胞の挙動が他の数種の細胞の挙動と特徴的に異なるとの事実は、阻害基質上でのＣ６細胞の拡大、およびある環境（視神経）中でのＣ６細胞の移動性の両者に対して共通する、根元的な細胞生物学的メカニズムが存在し、これが繊維芽細胞、シュワン細胞あるいはメラノーマ細胞の転移を許容しないのみならず再生する神経繊維の内部成長を許容しないことを示唆している。このＣ６細胞の挙動は、阻害成分に対する「不感受性」によるものではない。なぜならば、ＣＮＳミエリン上および白質上におけるＣ６細胞の移動性は、特定のプロテアーゼ阻害剤の存在により顕著に阻害され、しかもこの阻害効果は、モノクローナル抗体（IN-1）を用いてミエリン関連阻害蛋白を選択的に中和することにより、くつがえされるからである。
ミエリン関連阻害成分の不活性化は、生きているＣ６細胞はもとより、Ｃ６細胞の原形質膜によっても起った。種々の公知の特異性を有する多数のプロテアーゼ阻害剤を用いて我々が行った実験は、このＣ６細胞関連活性が、金属酵素群に帰属することを示した。ＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大阻害とミエリン関連阻害蛋白の不活性化の阻害との間に見られる強い類似性は、メタロプロテアーゼによる阻害物質の修飾のメカニズムと、Ｃ６細胞のミエリン上または白質上への拡大、および視神経外植体への侵入を可能とするメカニズムとが同一であることを強く示唆する。
メタロプロテアーゼは、多数のグループを形成し、それぞれ阻害剤に対する感受性を異にする。最も一般的な阻害剤は1,10−フェナントロリンであり、これはＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を最大67％阻害した。これに対し、他の多くのプロテアーゼ阻害剤は、検知可能な効果を有さなかった。ミエリン上でのＣ６細胞の拡大の初期段階（90分）においては、トリプシン様セリン−プロテアーゼ阻害剤の効果が認められたが、後期段階（300分）では認められなかった。1,10−フェナントロリンの効果は用量（濃度）依存性であり、200μMでIC50であった。この効果は、基質としてのＣＮＳミエリンに特異的であり、他の基質（ＣＮＳ灰白質、ＰＮＳミエリン、ガラス、ＰＬＹＳ）上では、1,10−ファナントロリンの存在下においてもＣ６細胞の正常かつ急速な拡大が観測された。他の公知のメタロプロテアーゼ阻害剤、例えばベスタチン（アミノペプチダーゼの阻害剤）［Umezawa他，J.Antibiot.,29, p.857-859（1976）］、ホスホラミドン（サーモリシン様メタロプロテアーゼの阻害剤）［Komiyama他，Biochem. Biophys. Res. Commun., 65, p.352-357（1975）］およびＴＩＭＰ（ＥＣＭ減成メタロプロテアーゼの阻害剤）［Cawston他，Cawston, et, al,195,p.159-165（1981）］は、ＣＮＳミエリン上でのＣ６細胞の拡大を阻害しなかった。メタロプロテアーゼは一般に大きい脂肪族または中性芳香族アミノ酸が続くペプチド結合を加水分解することから、我々は、そのような残基を含むジペプチド基質類似体の効果についてもテストした。cbz-gly-phe-NH2（１mM）またはcbz-tyr-tyr（0.3mM）はＣＮＳミエリン上でＣ６細胞の拡大を特異的に阻害した。cbz-gly-phe-NH2が他の1,10−フェナントロリン感受性酵素活性を比較的大きい特異性で阻害することを見出した［ArmenoffおよびOrlowski, Biochemistry 22, p.590-599（1983）；Baxter他，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,80, p.4174-4178（1983）；CouchおよびStrittmatler Cell, 32, p.257-265（1983）；J. M. ChenおよびW.T. Chen, Cell, 48, p.193-203（1987）；およびLelkesおよびPollard, J. Biol. Chem.,262, 15496-14505（1987）］。
Ｃ６ならし培地およびＣ６細胞分画テストが不活性であることは、ミエリンに対する蛋白加水分解作用がＣ６細胞の原形質膜と関連することを示している。原形質膜と結合したメタロプロテアーゼ〔エンドペプチダーゼ24.11（エンケファリナーゼ）〕−このプロテアーゼも1,10−フェナントロリンにより阻害されるが、ＴＩＭＰでは阻害されない−の単離および特性についてAlmenoffおよびOrlowskiが報告している（上記1983年の文献参照）。しかしながら、本明細書中に記載のメタロプロテアーゼはエンケファリナーゼではない。なぜならば、カルボキシメチル-phe-len−このペプチドはエンケファリナーゼに対し高い親和性を示す［Fournite-Zaluski他，J. Med. Chem., 26, p.60-65（1983）］−は、ミエリン上でのＣ６細胞の拡大に何らの影響も及ぼさない。ChenおよびChenは、Rous sarcomaビールスで形質転換したチキンの胎の繊維芽細胞により発現され、付着部位およびインバドポディアに局在化したメタロプロテアーゼについて記載している（上記1987年の文献参照）。この酵素もまた1,10−フェナントロリンおよびcbz-gly-phe-NH2により阻害されるが、ホスホラミドンによっては阻害されない。しかしながら、ChenおよびChenによる酵素と異なり、我々は、Ｃ６細胞上のフィブロネクチン減成活性を検知することはできなかった。
高度に転移性のＢ16マウスメラノーマ細胞についても、Ｃ６細胞を用いて実施した全てのテストを行った。興味深いことには、Ｂ16細胞は、視神経の外植体中には転移しなかったが、３Ｔ３細胞またはニューロンに極めて類似した態様でミエリン関連阻害剤に反応した。この試験管内挙動と符号し、Ｂ16細胞を脳室内に注射すると、Ｂ16細胞は主として髄膜腫または脳室内腫瘍を形成し、軟組織への有意な侵入を起さない。したがって、末梢においてＢ16細胞に転移性を与えるメカニズムは、ＣＮＳ組織中でＣ６細胞に高い転移性を付与するメカニズムとは異なるものである。
Ｃ６関連メタロプロテアーゼの阻害は、ＣＮＳミエリン上におけるＣ６の拡大を阻害するのみならずＣＮＳ白質上でのＣ６細胞の付着、拡大、及び転移を阻止し、又、ジペプチドcbz-tyr-tyrは視神経外植体中へのＣ６細胞の転移を押えた。したがって、このメタロプロテアーゼ活性は生体内でと同様にＣＮＳ組織中でＣ６神経膠芽腫細胞が浸潤性の挙動を示すことに決定的に係るものであろう。
７．ミエリン関連神経突起成長阻害剤に対するモノクローナル抗体による、ラットの損傷した脊髄中における索の長距離再生
モノクローナル抗体IN-1−この抗体は35kDおよび250kDミエリン関連蛋白ならびにＣＮＳ組織外植体〔CaroniおよびScfhwab, Neuron,１, p.85-96（1988）〕の阻害基質効果を中和する−を、若いラットの大脳に適用した。この適用は、抗体産生腫瘍を新皮質に接種することによって行った。２〜４週齢の錐体路（ＣＳＴ）の皮質脊髄成分を横断して完全に切断したところ、損傷箇所のまわりに大量の新芽形成が認められ、IN-1処理したラットの場合には、２週間以内に損傷箇所の端部に細い神経突起および繊維束が８〜11mm伸長した。対照用ラットにおいては、１mm以上の伸長は、まれであった。この結果は、分化したＣＮＳ組織中の主要な運動ＣＮＳ索の再生を誘起することが可能であると示すと共に、ＣＮＳ神経突起成長阻害剤およびその拮抗物質が臨床的に重要であることを示している。
７．1. 材料および方法
7.1.1.ハイブリドーマ細胞の接種を含む、動物の手術前処置
エーテル麻酔下に若いルイスラット（Ｐ２−11）の背部前頭皮質（dorsal frontal cortex）の片側に１μｌまたは２μｌの１Mio.ハイブリドーマ細胞を注射した。対照用ラットに対しては、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対する抗体を産生するハイブリドーマ・ラインの細胞を、同数注射した。全く注射しない対照ラットも使用した。ハイブリドーマ細胞としては、IN-1分泌ハイブリドーマ細胞を使用した。この細胞は、CaroniおよびSchwabの方法〔Neuron, １,p.85-96（1988）〕に従い、ラットの脊髄ミエリンからの、ＰＡＧＥ精製250kD阻害蛋白に対して免疫したＢＡＬＢ／cマウスの脾臓細胞とＰ３Ｕメラノーマ細胞とを融合させることによって得た。抗ＨＲＰ分泌細胞は、IN-1の場合と同じメラノーマライン（Ｐ３Ｕ）を使用し、Semenenko他の方法〔Histochem., 83, p.405-408（1985）〕に従い、P.Streit博士（チューリッヒ）が作成した細胞を使用した。ハイブリドーマを注射した全てのラットには、数日以内に、固形の、輪部がはっきりした、しばしば全新皮質の厚さに及びかつ側脳室に接触する腫瘍が形成された（第16図）。
シクロスポリンＡの注入（体重１g当たり15μg、３日間隔で２回注射）は、２〜３週間内に起こる可能性のある腫瘍の吸収を防止する上で有効であった。抗体が大量生産されていることは、脳の断面を抗マウスIg-ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ結合イムノグロブリン）で染色することにより確認できた（第16図ｂ）。また、血清中にIN-1抗体が存在することによっても確認した（但し、データの記載は省略する）。
7.1.2.脊髄の損傷法
生後２〜４週間目に、胸部レベルＴ5-7において脊髄骨を僅かに分離し、虹彩切除用のはさみを用いて脊髄の背側３分の２を横に切開することにより、脊髄損傷を与えた。該損傷は、背側灰白質への側突起および中心管を含め、ＣＳＴ（皮質脊髄索）の両側部を完全に横に切開することによって行った。ラットが見掛け上正常に行動し得るように腹部および側部の白質は、そのままとした。損傷は正確には生後15〜29日目、すなわち、ＣＳＴ中における神経突起の成長終了後５〜20日目に行った（第５表）。両ＣＳＴの完全な切開を確保すると共に、損傷箇所をマークするため、Ｕ字形のステンレスワイヤを損傷箇所に埋め込んだ。（但し、ワイヤは、固定脊髄の切片標本を作成する前に除去した）。
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7.1.3.損傷後の評価
生存期間14〜28日後（第Ｖ表）、腫瘍の対側の前頭および頂頭皮質にＷＧＡ−ＨＲＰ５％溶液（１μｌ）を注射した。24時間後、グルタルアルデヒド1.25％、ホルムアルデヒド１％の0.1Mリン酸バッファ溶液を、心臓経由でラットの体中に10分間充満させた。切開した脊髄（10〜15mm）を同一の固定液を用いて１時間、後固定し、十分に洗浄し、切断のためクリオスタットにセットした。長さ方向の完全な切片を、ゼラチン塗布スライド上に載置し、基質としてＴＭＢを使用してＨＲＰと反応させた〔Mesulam,J.Histochem & Cytochem.,26, p.106-117（1978）〕。切片を暗い偏光照明の下で観察した。ＣＳＴの両側に完全な損傷を有し、かつ損傷部の後端部に発芽が見られるラットのみを評価した。
７．2. 結果：IN-1分泌腫瘍を有するラット中におけるＣＳＴ繊維の長距離再生
損傷の２週間（すなわち生後１ヶ月または１ヶ月超）後、前頭および頂頭皮質からのＷＧＡ−ＨＲＰの順行性輸送により、ＣＳＴ標識した。横断切片および縦断切片の組織学的検査は、全ての動物（ラット）について、極めて類似した結果を与えた。すなわち、通常、数個の小さい空洞（caverns）が存在し、中心管（central canal）で連結されている。この特徴点は恐らく、脳脊髄により運ばれた抗体の局所アクセスおよび浸透を大いに促進したものと考えられる。組織は局所的に変化していたが、密な神経膠の痕跡（glial scars）は存在しなかった。標識されたＣＳＴ繊維は損傷部に高密度かつコンパクトな束として発疹に接近し、そこから損傷箇所のより中に向い0.1〜１mmの多数の発芽していた。ほとんどのラット（対照ラット、IN-1を注射したものいずれにおいても）、神経繊維の叢および束が損傷部中および損傷部を横切って存在し、しばしば損傷部の空洞を腹側および側面から包囲しているのが見られたが、ワーヤー索中に再生した組織のブリッジを通って成長することはまれであった。損傷部を離れ、尾部方向に伸びる神経繊維が頻繁に観察された。腫瘍を持たない動物（ラット）および抗ＨＲＰ産生腫瘍を有するラット中においては、損傷部の末梢端から長さ方向に測定した再生繊維の長さは多くの場合１mm以下であった（第Ｖ表、第17および18図）。比較的太い繊維束も、突然途切れるように見うけられた。極めて対照的にIN-1分泌腫瘍を有するラットは、一貫して、損傷箇所の端部に標識された、より長い繊維束および繊維を示した（第17，18図）。ほとんどのケースにおいて2.5〜５mmであり、２例のラットにおいて、８mmおよび11mmが測定された（第Ｖ表）。これら長距離再生ＣＳＴ繊維は、非常にしばしば、元のＣＳＴの位置またはその付近で見られたが、いくつかのケースでは灰白質中に、数例では感覚索に対応する背部に認められた。
７．3. ディスカッション
ラットにおいて、ＣＳＴは出生後10日間に脊髄中を下方に成長し、最後の神経突起はＰ９〜Ｐ10期に生成することが知られている〔Joosten他，Dev.Brain Res., 36, p.121-139（1987）；SchreyerおよびJones, Dev. Brain Res.,38, p.103-119（1988）〕。Ｐ４〜Ｐ５期までの損傷は、損傷部位の包囲と、ＣＳＴ繊維の、しばしば位置異状性である長距離成長を引き起す〔SchreyerおよびJoues,Neurosci.,９, p.31-40（1983）；BernsteinおよびStelzner, J. Comp. Neurol.,221, p.382-400（1983）〕。Ｐ７以降においては、ＣＳＴの再生は見られない。損傷部位の類似の反応がハムスターおよび猫においても観察されている〔KalilおよびReh, J. Comp. Neurol.,211,p.265-273（1982）；TolbertおよびDer, J.Comp. Neurol., 206, p.299-311（1987）〕。猫の場合には、繊維は、神経突起の再生よりも、遅れて成長する〔TolbertおよびDer,J. Comp. Neurol., 211, p.265-275（1987）〕。本発明の結果は、２〜３週齢のＣＳＴ神経突起の少なくとも一部分については、その再生を誘起し、脊髄内を長距離にわたって伸長させることが可能であることを示している。最大伸長速度は0.5〜１mm／日である。
分化した哺乳類のＣＮＳ組織は、発芽距離0.2〜１mmを越える神経突起の成長に対する非許容物質である〔Hafner編「Degeneration and Regeneration of the Nervous System」中のCajalの論文，p.1928，ニューヨーク（1959）；David,Science,214, p.931-933（1981）；およびVidal-Sanz他，J.Neurosci.,７, p.2894-2909（1987）〕。この特性は、培養実験および移植研究が示すように、ＣＮＳ灰白質よりもＣＮＳ白質により、はるかに強く発現される〔SchwabおよびThoenen,J.Neurosci.,５,p.2415-2423（1985）；Carbonetto他，J.Neurosci.,７, p.610-620（1987）；SavioおよびSchwab，印刷中（1989）〕。所定齢の胎児のアドレナリン作用性神経またはセレトニン作用性神経の成体中の脊髄または海鳥への移植は、本発明を除けば、今日までのところ、成体中のＣＮＳ組織中の神経突起の伸長が解剖学的レベルにおいて観察された唯一の実験である〔Nornes他，Cell Tissues Res., 230,p.15-35（1983）；Foster他，Exp. Brain Res.,60, p.427-444（1985）；およびBjorklund他，Brain Res., 170, p.409-426（1979）〕。これらの実験において、伸長した神経突起は、そのほとんどが灰白質領域に局在していた。
神経突起の成長に対する潜在的阻害効果を有する二種の寡突起神経膠細胞およびミエリン関連膜蛋白、すなわちＮI-35（35kD）およびＮI-250（250kD）が同定されている〔SchwabおよびCaroni, J. Neurosci., ８, p.2381-2393（1988）；CaroniおよびSchwab, J. Cell. Biol.,106, p.1281-1288（1988）〕。本明細書中においては、モノクローナル抗体IN-1−この抗体は、成長ラットの視神経外植体を含む種々のインビトロ系において上記成分の活性を中和する〔（CaroniおよびSchwab, Neuron, １, p.85-96（1988）〕−が、若いラットの脊髄損傷において、２週間以内に最大５〜11mmの距離にわたって皮質脊髄神経突起の真の再生を惹起することを示した。皮質中の抗体分泌腫瘍による、脳脊髄液を経由しての高レベルの抗体の連続的供給、および損傷部位の局所的条件が、恐らく組織中への抗体の浸透を助けたものと考えられる。対照抗体産生腫瘍を有するラットにおいては、損傷箇所のまわりに多数発芽するにもかかわらず、損傷箇所の末端では神経突起が伸長しないことから、観察された上記効果が特異的であることが確認できる。これらの結果は、ミエリン関連神経突起成長阻害蛋白に対する抗体が神経繊維の長距離再生を誘起する能力を有すること、および通常の状態において観察される、損傷したＣＮＳ繊維束の不再生に対し、ミエリン関連神経突起成長阻害剤が決定的な役割を演じていることを示している。
８．微生物の寄託
下記のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ECACC（欧州動物細胞カルチャーコレクション、応用微生物学研究センター、英国）に寄託され、下記受託番号が与えられている。
0003866759.tif 000012
本発明の範囲は、寄託された上記セルラインおよび例示された具体例に限定されない。これらは、本発明のいくつかの側面を単に説明するためのものであり、機能上同等のものは全て本発明の範囲に含まれる。また、本明細書中に記載したもの以外にも、本発明に種々の変更・修正を加えうることは当業者に明らかであり、それらも本発明のクレームの範囲内に含まれる。
本明細書中に記載した種々の文献は、参照のためその全体が本明細書に編入される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、神経膠細胞上で共培養されたニューロンの位相差顕微鏡写真及び免疫蛍光法である。第２図は、交感神経ニューロンまたは網膜細胞と寡突起神経膠細胞との重複頻度を示すグラフである。第３図は、星状膠細胞上の交感神経突起及び網膜細胞を示す写真である。第４図、神経膠細胞上で共培養されたＮＢ−２Ａ神経芽細胞腫及び線維芽細胞３Ｔ３を示す写真である。第５図は、高度に分岐した寡突起神経膠細胞共培養された神経芽細胞腫の突起の方向を示す図である。第６図は、３Ｔ３細胞と寡突起神経膠細胞との重複頻度を示すグラフである。第７図は、ＣＮＣミエリンを基質とすることによる神経突起の成長阻害を示す写真である。第８図は、神経突起の成長に対するＣＮＳミエリン及びＰＮＳミエリンの影響を示すグラフである。第９図は、Ｃ６または３Ｔ３細胞と共培養されたラット視神経または座骨神経外稙組織切片の位相差顕微鏡写真である。第１０図は、ラット小脳切片上で培養されたＣ６、３Ｔ３またはＢ１６細胞の位相差顕微鏡写真である。第１１図は、Ｃ６、３Ｔ３及びＢ１６細胞の拡大に対するＣＮＳミエリンの影響を示すグラフである。第12図は、Ｃ６細胞の拡大に対する基質及び１、１０フェナントロリン濃度の影響を示すグラフである。第１３図は、種々の基質、阻害条件下での３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡写真である。第１４図は、メタロプロテアーゼ阻害剤存在下で培養されたラット小脳切片上のＣ６細胞の位相差顕微鏡写真である。第１５図は、ＣＮＳ外稙組織へのＣ６細胞の浸透に対するメタロプロテアーゼ阻害剤の影響を示すグラフである。第１６図は、抗体−分泌マウスＩＮ−１ハイブリドーマ細胞の腫瘍を示す写真である。第１７図は、ＩＮ−１処理ラットの脊髄切片を示す図である。第１８図は、ＩＮ−処理ラットの脊髄切片の暗視野顕微鏡写真である。
なお、第１、３、４、７、９、１０、１３、１４、１６、１８図は、生物の形態を示す写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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