(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体を添加することよりなる、免疫学的検出に用いられるアクリジニウムアシルスルホンアミドで標識されたトレーサーの水溶液中における安定性を改善する方法。
【請求項２】
アクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体が、ＤＳＭＡＣＣ  ２１８３として寄託されたハイブリドーマによって産生されたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫学的検出に用いられるアクリジニウムアシルスルホンアミドで標識されたトレーサーおよびアクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体を含む免疫学的検出のためのキット。
【請求項４】
免疫学的検出が競合免疫学的検出であり、被検物質誘導体、アクリジニウムアシルスルホンアミドで標識された抗体、ならびにアクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体から構成される請求項３に記載のキット。
【請求項５】
免疫学的検出がサンドイッチアッセイであり、被検物質に対する２種の抗体、すなわち被検物質の異なるエピトープに結合し、抗体の一方がアクリジニウムアシルスルホンアミドで標識された抗体である２種の抗体、ならびにアクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体から構成される請求項３に記載のキット。
【請求項６】
アクリジニウムアシルスルホンアミドに対する抗体が、ＤＳＭＡＣＣ  ２１８３として寄託されたハイブリドーマによって産生されたものである請求項３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、加水分解感受性の分子または分子部分を安定化する方法に関する。本発明はとくに、水溶液中において、加水分解感受性標識および標識含有トレーサーを安定化する方法に関する。
免疫学的検出方法は、インビトロ診断において極めて重要になっている。この理由は、それらが高度に特異的で、また極めて高感度であることによる。さらにこれらの方法は、操作が簡単なことが特徴的である。検出方法は検出すべき被検物質とその結合パートナーの１種または複数種の間の免疫学的相互反応に基づいている。
サンドイッチアッセイの場合、被検物質は２つの異なる抗体によって、サンドイッチ様式で結合される。２種の抗体の一方は標識を有し、それにより、その濃度、すなわちサンドイッチ複合体の濃度を測定することができる。サンドイッチ法は小さな被検物質には適用できない。立体的な理由により２つの異なる抗体が同時に被検物質に結合できないからである。このような場合には一般的に、競合アッセイが用いられる。これらのアッセイにおいては、被検物質と被検物質の合成誘導体が抗体上の結合部位で競合する。一般に、被検物質誘導体（古典的な競合法）または抗体のいずれかが標識される。
慣用の標識は、たとえば、放射性同位元素または発光性（蛍光、リン光、化学ルミネッセンス、生物ルミネッセンス等）物質もしくは吸光可能な物質である。標識試薬（抗体、被検物質誘導体）は以下、トレーサーと呼ぶ。
トレーサーは、そのまま使用できる水溶液中に保存されることが多い。標識は多くの場合、加水分解に抵抗性のない物質であるから、水溶液中での保存では、一般に意に反した安定性の限界が生じる。これはとくに、保存期間が長くなるに従って測定されるシグナル高が低下することによって明らかである。この結果、完全なキットの貯蔵寿命は短くなることが多い。
本発明はしたがって、分子、分子部分およびとくに免疫学的検出方法において標識として用いられる物質の加水分解に対する感受性を低下させる方法を見出すという技術的問題に基づくものであった。
この技術的問題は、請求の範囲において定義される実施態様の提供によって解決される。驚くべきことに、安定化すべき分子、分子部分、または標識に対する抵抗の添加は、上記物質の加水分解に対する感受性を著しく低下させることが見出されたのである。加水分解−保護効果は、恐らく親水性粒子（Ｈ2Ｏ、ＯＨ-、Ｈ3Ｏ+）の攻撃が立体的理由および／または疎水性環境の創成によって遮蔽されるという事実によるものと考えられる。この種の加水分解−保護効果は、加水分解に感受性の分子、分子部分または標識に対する抗体の存在が本発明による方法の実施を可能にするものである限り、原理的にこれらのすべての加水分解感受性物質に及ぶものである。
本発明は、したがって、水溶液中の加水分解−感受性分子または分子部分を安定化する方法において、その分子または分子部分の水溶液にその分子または分子部分に対する抗体を添加することからなる方法に関する。「安定化」の語は、本発明の関連では、分子、分子部分または標識の加水分解が防止されるかまたは減速されることを意味する。「分子」の語は、化学結合によって互いに保持される同種もしくは異種の２個または３個以上の原子から構成される粒子を意味する。この用語には、本発明の関連では、その分子のイオンまたはラジカルも包含される。「分子部分」の語は、完全な分子からの放出によって生成可能なこの分子の部分を意味する。「加水分解−感受性」の語は、本発明の関連では、化合物、この場合は分子、分子部分、標識またはトレーサーが、望ましくない生成物、すなわち最早シグナルを産生できないかまたはシグナルを産生する限られた能力しかもたない生成物を導くＨ2Ｏおよび／またはＨ3Ｏ+および／またはＯＨ-が関与する化学反応を受ける能力を意味する。
「抗体」の語はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を意味する。本発明の関連では、この語はキメラ抗体、二特異性抗体、抗体フラグメント〔たとえば（Fab′2）、Ｆａｂ、Ｆｖ′、(半)合成および化学的に修飾された抗体または抗体フラグメントも包含する。
本発明の方法によれば、抗体が向けられた加水分解−感受性分子または分子部分の水溶液中における安定性を著しく増大させることが可能になる。
本発明はとくに、免疫学的検出方法において用いられる標識の安定化方法に関する。「標識」の語は、本発明の関連では、標識、マーカーまたは分子形態でのシグナル放射体を意味する。この標識はルミネッセンス、蛍光、リン光、化学ルミネッセンス、生物ルミネッセンスまたはエレクトロルミネッセンスを発生できる基とすることができる。標識はとくに、アクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド、ルミノールまたはその誘導体、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステルまたはシュウ酸アミドである。したがって、本発明の方法は、標識を有し、たとえば検出方法、とくに免疫学的検出方法に使用できるトレーサーの安定性を著しく増大させることを可能にする。
本発明はさらに、加水分解−感受性分子または加水分解−感受性分子部分およびそれに対する安定化抗体から構成されるキットに関する。本発明はとくに、安定化すべき分子部分が標識であるか、または安定化すべき分子がトレーサーであるキットに関する。本発明のキットは、好ましくは免疫学的検出方法において使用される。とくに好ましい実施態様においては、本発明は、被検物質誘導体または抗体のいずれかが標識を有する被検物質誘導体および抗体、ならびに標識に向けられている、抗体からなる競合免疫学的検出方法を実施するためのキットに関する。他のとくに好ましい実施態様においては、本発明は、被検物質に向けられた２種の抗体、すなわち被検物質の異なるエピトープに結合し、抗体の一方は標識を有する２種の抗体、およびその標識に向けられた抗体から構成される、サンドイッチアッセイを実施するためのキットに関する。
被検物質に対する抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、合成または半合成起源のいずれであってもよい。最後に、本発明は、分子、分子部分または標識に対する抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、合成または半合成抗体、抗体フラグメント、化学的に修飾された抗体または化学的に修飾された抗体フラグメントである上記定義によるキットに関する。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例  １
抗−ＰＳＡトレーサーの安定化
工程１：発光原アクリジニウムアシルスルホンアミド標識に対するモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の調製のため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、フロインド完全アジュバント中に乳化した１０μｇのアクリジニウムアシルスルホンアミド−ＢＳＡの皮下または腹腔内注射を行った。これらに続いて、アジュバントを用いないでさらに４〜５回の免疫処置を行った（いずれの場合も４週間の間隔で）。マウスには、融合前の最後の４日間、再免疫処置を静脈内に行った（10μg／日）。
ハイブリドーマの調製のため、免疫処置された動物を頚部脱臼によって屠殺した。脾臓を無菌条件下に採取し、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を得るために、無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で破砕した。細胞を遠心分離によって収集し（５分間；1800rpm）、ＤＭＥＭ中で１回洗浄した。細胞の総数をトリパンブルー排除法を用い血球計測器により計数して測定した。融合パートナーとして用いたマウス骨髄腫細胞（Sp2/0）は無血清ＤＭＥＭ中で２回洗浄し、遠心分離によって収集し（10分間、1000rpm）、脾臓細胞について上述したようにして計数した。
約１０8個の脾臓細胞を2×107個のＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞と混合した。1000rpmで１０分間遠心分離したのち上清を除去し、容器中のペレットに１mlのポリエチレングリコール（PEG 4000, Merck, 50％）を添加した。ついでペレットを穏やかにタッピングして再懸濁し、３７℃で１分間インキュベートした。穏やかにタッピングしながら１０mlの無血清ＤＭＥＭを滴下して加え、混合物を２〜４分間インキュベートした。融合細胞をついで1000rpmにおいて１０分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、２０％ウシ胎児血清（FCS）ならびにＨＡＴ（ヒポキサンチン0.1mM；アミノプテリン0.4μM；チミジン16μM）−含有ＤＭＥＭ中に再懸濁し、２４ウエル付き培養プレート（Nunc）上、各ウエルあたり約５×１０4〜１０6細胞の濃度で平板培養した。２〜３週間後、単一細胞コロニーを各ウエルから採取し、新しい培養プレートのウエル内で培養した。
培養上清を、ＥＩＡ法により抗原特異的抗体についてスクリーニングした。アクリジニウム−ＢＳＡ（３μg/ml）でコートしたマイクロタイタープレートの各ウエルに上清１００μlを負荷し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ−抗−マウス抗体−ＰＯＤ接合体１００μlを加え、室温にさらに１時間放置した。基質とともに３０分間インキュベートしたのち、発色をBehring-ELISA−プロセッサー（BEP）により４９２nmにおいて測定した。適当な抗原特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、単一細胞マニピュレーターを用いてクローン化した。大量のモノクローナル抗体を調製するため、クローンを大量培養により増殖させた。各モノクローナル抗体の以下の精製はプロテインＡクロマトグラフィーによって行った。
工程２：抗−ＰＳＡトレーサーの調製
０．１mgの抗−ＰＳＡ ＭＡｂ〔前立腺特異的抗原（PSA）に対するモノクローナル抗体；たとえばBW 92-284/03, Behringwerke AG〕を０．１モルリン酸緩衝液（pH 8.0）０．７ml中に溶解した。この溶液に３０μlの標識溶液〔アセトニトリル１mlあたり0.1mgのアクリジニウムアシルスルホンアミド（Ｎ−スクシンイミジル反応基を有する）を含有〕を添加し、反応溶液を室温で１５分間インキュベートした。ついで０．３mlのリジン水溶液（10mg／ml）を添加し、インキュベーションを１５分間継続した。トレーサーはゲルクロマトグラフィーによって精製した（Sephadex G 25）。
精製されたトレーサーを最終的に、０．０５Ｍトリス塩酸塩緩衝液（pH 7.4；１リットルあたりウシ血清アルブミン２ｇ、NaCl 8.8ｇおよびナトリウムアジド0.5ｇ含有）中６００ng／mlの濃度で溶解した。
工程３：トレーサー溶液の安定化
トレーサー溶液Ａ：安定化のために、抗−標識抗体（工程１で得られたBW 90-9/016, DSM ACC 2183）を１μg／mlの濃度で、トレーサー溶液（工程２）に添加した。
トレーサー溶液Ｂ：比較溶液には抗−標識抗体を添加しなかった。
結  果
トレーサー溶液ＡおよびＢを３７℃で５週間保存したのちに、トレーサー溶液Ａの場合は初期のシグナル活性は事実上不変であり、トレーサー溶液Ｂの場合は８７％の低下を示した（図１）。
実施例  ２
抗−Ｔ３トレーサーの安定化
工程１：発光原アクリジニウムアシルスルホンアミド標識（EP-A-0 257 541、およびEP-A-O 330 050）に対するモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は例１の工程１に説明した方法によって調製した。
工程２：抗−Ｔ３トレーサーの調製
０．１mgの抗−Ｔ３ Ｍａｂ、甲状腺ホルモンのトリヨードサイロニン（Ｔ３）に対するモノクローナル抗体（ImmunoGen International Ltd. 注文番号 13-3 D8-38, Gateshead, UK）を０．１モルリン酸塩緩衝液（pH 8.0）０．７ml中に溶解した。この溶液に５μlの標識溶液〔アセトニトリル１mlあたり１．０mgのアクリジニウムアシルスルホンアミド（Ｎ−スクシンイミジル反応基を有する）を含有〕をピペットで添加し、反応溶液を室温にて１５分間インキュベートした。ついで、０．３mlのリジン水溶液（10mg／ml）を加え、１５分間インキュベーションを継続した。トレーサーはゲルクロマトグラフィー（Sephadex G 25）によって精製した。
工程３：トレーサー溶液の調製
精製したトレーサー（工程２）を０．０５Ｍトリス塩酸塩緩衝液〔pH7.4；１リットルあたりウシ血清アルブミン２ｇ、NaCl 8.8ｇ、ANS（８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸）0.25ｇおよびナトリウムアジド0.5ｇ含有〕中に９０ng／mlの濃度で溶解した。
工程４：トレーサー溶液の安定化
トレーサー溶液Ａ：安定化のために、抗−標識抗体（BW 90-9/016, DSM ACC 2183）を１μg／mlの濃度で、トレーサー溶液（工程３）に添加した。
トレーサー溶液Ｂ：比較溶液には抗−標識抗体を添加しなかった。
結  果
図２には、３７℃で４週間保存後の２種類のトレーサーで得られた標準プロットを示す。シグナル高はトレーサー溶液Ａの方がトレーサー溶液Ｂに比べて明らかに高かった。
実施例  ３
Ｔ３トレーサーの安定化
工程１：発光原アクリジニウムスルホンアミド標識（EP-A-0 275 541, およびEP-A-0 330 050）に対するモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は例１の工程１に説明した方法によって調製した。
工程２：Ｔ３トレーサーの調製
４０mgのウサギ−ＩｇＧを、ＰＢＳ緩衝液、pH７．２に溶解し、これに０．２ＭＬｉＢＯ3溶液（20％ジオキサンを含有する水溶液）８mlならびにＧＭＢＳ溶液（ジオキサン中10mg／mlのγ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル溶液）０．２２mlを添加した。室温に１時間放置したのち塩をBiogel P2カラムによって除去した。得られた溶出液（「溶液１」）の容量は約２０mlであった。
６．９mgのトリヨードサイロニン（Ｔ３）を０．６９mlのＤＭＳＯに溶解した。０．１mlのＤＭＳＯ中に溶解した１０μlのＮ−エチルモルホリンおよび２．１mgのＳＡＭＳＡ（Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸）を添加した。３０分後に、ピペットで１Ｍヒドロキシルアミン水溶液０．１mlを加えた。この溶液（「溶液２」）を室温で１５分間インキュベートした。溶液１および溶液２を混合し、３mlのＤＭＳＯを添加した。２時間後に、塩をBiogel P2カラムによって除去し、接合体を凍結乾燥した。
０．１mgのＩｇＧ−Ｔ３接合体を０．１モルリン酸緩衝液（pH 8.0）０．７mlに溶解した。この溶液に１０μlの標識溶液〔アセトニトリル１mlあたり0.1mgのアクリジニウムアシルスルホンアミド（Ｎ−スクシンイミジル反応性基を有する）を含有〕をピペットで添加し、反応溶液を室温にて１５分間インキュベートした。ついで、０．３mlのリジン水溶液（10mg／ml）を加え、１５分間インキュベーションを継続した。トレーサーはゲルクロマトグラフィー（Sephadex G 25）によって精製した。
工程３：トレーサー溶液の調製
精製したトレーサー（工程２）を０．０５Ｍトリス塩酸塩緩衝液（pH7.4；１リットルあたりウシ血清アルブミン２ｇ、NaCl 8.8ｇ、ANS 0.25ｇおよびナトリウムアジド0.5ｇ含有）中に３０ng／mlの濃度で溶解した。
工程４：トレーサー溶液の安定化
トレーサー溶液Ａ：安定化のために、抗−標識抗体（BW 90-9/016, DSM ACC 2183）を１μg／mlの濃度で、トレーサー溶液（工程３）に添加した。
トレーサー溶液Ｂ：比較溶液には抗−標識抗体を添加しなかった。
結  果
図３には、３７℃で４週間保存後の２種類のトレーサーで得られた標準プロットを示す。シグナル高はトレーサー溶液Ａの方がトレーサー溶液Ｂよりも明らかに高かった。
実施例  ４
各種抗−標識抗体の比較
検討した抗−標識抗体の一部は、トレーサーの安定化能の点で（図４ａ）および発光動態に関して極めて多様な挙動を示した。図４ｂは各種抗−標識抗体からの光収率を測定時間の関数として示す。
以下に記載のハイブリドーマはDSM, Braunschweigに寄託された。このハイブリドーマにより産生される抗体の名称はハイブリドーマの名称に相当する。
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図面の説明
図１：抗標−識抗体を添加した場合および添加しない場合の３７℃で保存後における抗−ＰＳＡトレーサーのシグナル安定性。ＲＬＵは相対光単位を意味する。
図２：３７℃で４週間保存されたトレーサーにより実施した、Ｔ３ ＳＰＡＬＴ（固相抗原ルミネッセンス法）アッセイ。ＳＰＡＬＴアッセイは標識された被検物質誘導体（＝被検物質トレーサー）が標識された抗体（抗体トレーサー）上の結合部位で測定すべき被検物質と競合する競合ルミネッセンスイムノアッセイである。
図３：３７℃で４週間保存されたトレーサーにより実施した、Ｔ３ ＬＩＡ（ルミネッセンスイムノアッセイ）。ＬＩＡは標識された被検物質誘導体（＝被検物質トレーサー）が抗体（この場合、固相に結合されている）上の結合部位で測定すべき被検物質と競合する競合ルミネッセンスイムノアッセイである。
図４ａ：各種抗−標識抗体の様々な安定化効果。
図４ｂ：添加されたモノクローナル抗−標識抗体の関数としての抗−ＰＳＡトレーサーからの光収率。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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