(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠く欠陥ポックスウイルスであって、該必須領域は前記親ポックスウイルスの生存および感染に必要とされる親ポックスウイルスゲノム内の領域であり、該欠陥ポックスウイルスはポックスウイルスプロモーターの転写調節下の外来ポリヌクレオチドを含み、前記欠陥ポックスウイルスは補完性宿主細胞内でのみ生存又は感染することができ、該補完性宿主細胞は、必須領域が宿主細胞によって発現されるように又は細胞内の必須領域が宿主細胞の感染時に誘導されるように前記宿主細胞内で活性なプロモーターの下に挿入された同じ又は類似のポックスウイルス必須領域を宿主細胞内に有することを特徴とする、前記欠陥ポックスウイルス。
【請求項２】
前記外来ポリヌクレオチドが前記必須領域に挿入されている請求項１に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項３】
前記外来ポリヌクレオチドの挿入に先立って、前記必須領域を前記欠陥ポックスウイルスから欠失させている請求項２に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項４】
マーカーが前記必須領域を置換している請求項３に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項５】
前記外来ポリヌクレオチドが前記マーカーに挿入されている請求項４に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項６】
前記親ポックスウイルスがワクシニアである請求項１乃至５のいずれか一項に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項７】
前記必須領域がＩ７Ｌ、Ｆ１８Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ６Ｒ、Ａ８Ｌ、Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ、Ｈ４Ｌ、Ａ１０Ｌ及びＡ３Ｌの中から選択した読取り枠である請求項１乃至６のいずれか一項に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項８】
前記必須領域が、１４キロダルトンエンベロープタンパク質又は２５キロダルトン構造タンパク質をコードする読取り枠である請求項１乃至６のいずれか一項に記載の欠陥ポックスウイルス。
【請求項９】
タンパク質を製造する方法であって、親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠く欠陥ポックスウイルスを供給するステップを含み、該必須領域は前記親ポックスウイルスの生存および感染に必要とされる親ポックスウイルスゲノム内の領域であり、前記欠陥ポックスウイルスがポックスウイルスプロモーターの転写調節下にある外来ポリヌクレオチドを含み、前記欠陥ポックスウイルスは補完性宿主細胞内でのみ生存又は感染することができ、該補完性宿主細胞は、必須領域が宿主細胞によって発現されるように又は細胞内の必須領域が宿主細胞の感染時に誘導されるように前記宿主細胞内で活性なプロモーターの下に挿入された同じ又は類似のポックスウイルス必須領域を宿主細胞内に有することを特徴とする、前記方法。
【請求項１０】
前記供給ステップを、前記外来ポリヌクレオチドを前記親ポックスウイルスの前記必須領域に挿入することによって実施する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記供給ステップを、前記親ポックスウイルスの前記必須領域を前記外来ポリヌクレオチドで置換することによって実施する請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記供給ステップを、前記親ポックスウイルスの前記必須領域をマーカーで置換することによって実施する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
外来ポリヌクレオチドを前記マーカー内に挿入する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
外来ポリヌクレオチドで前記マーカーを置換する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーがｇｐｔ遺伝子である請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
組換えポックスウイルスは、例えば動物、植物、原生動物、菌類、細菌及びウイルスといったような種々の由来源に由来する外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用されてきた。組換えポックスウイルスはまた、キメラ遺伝子及び合成由来源からの遺伝子の発現にも使用できる。典型的には、キメラ遺伝子及び合成遺伝子は、天然の配列に由来する又はその配列に基づくＤＮＡ配列である。例えば、レトロウイルス由来のものを含むＲＮＡ転写体から形成されたｃＤＮＡ配列は、組換えポックスウイルスベクターを用いて発現することができる。
現在使用されているポックスウイルスベクターは、ウイルスの生存能力にとって必須ではないゲノム領域に挿入された外来ＤＮＡを含む。外来遺伝子を発現するこれらのポックスウイルスは通常、相同的組換えによって細胞培養でウイルスを増殖させるために必須ではないゲノム領域に外来配列を挿入することにより構築する。Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−３１（１９８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７４１５−１９（１９８２）参照。好ましくは、直接的分子クローニングによって組換えポックスウイルスを構築し得る。欧州特許第０  ５６１  ０３４号；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９９７７−８１（１９９２）；Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１９０：５２２−２６（１９９２）参照。非必須領域に外来ＤＮＡを挿入したウイルスは宿主生物内で自律的に増殖し得るため、それぞれの宿主に対して感染性を保持する。
非必須領域産物の不在は、組換えポックスウイルスの生存能力を不当に損なうことはない。しばしば原型ポックスウイルスとみなされるワクシニアの場合は、挿入用の主要非必須領域の一つがチミジンキナーゼ遺伝子である。外来遺伝子をワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子に挿入すると、ウイルス中にその遺伝子産物は存在しない。それにもかかわらず、組換えワクシニアは生存能力を維持する。別のポックスウイルスを別の非必須領域で類似の操作にかけることもできる。例えば、組換え鳥類ポックス（ａｖｉｐｏｘ）、例えば鶏痘は、外来ＤＮＡを非必須領域に挿入した場合に得られた。
組換えワクシニアは、大量発現系で、また他の様々な用途で、生ワクチンとして使用できる。Ｍｉｎｅｒ及びＨｒｕｂｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  ８：２０−２５（１９９０）参照。しかしながら、タンパク質を大量発現させるためのこれら組換えウイルスの使用にはかなりの危険が伴う。なぜなら、ウイルスは感染能力を保持するからである。従って、組換えワクシニアを取り扱う場合には、コストのかかる安全対策と面倒な処理とが必要とされる。例えば、総ての媒体、液体及び汚染された実験器具の熱的不活性化、並びにウイルスを扱う総ての人員の特別な訓練が必要となる。これらの繁雑な措置の必要を最小限度に押さえるために、幾つかの方法が考えられてきた。例えば、高度に弱毒化したワクシニア株が開発された。これらの高度に弱毒化した株は感染力が制限されている。従って、これらの高度に弱毒化した株でのタンパク質生産が試みられた。残念ながら、高度に弱毒化したウイルス株は増殖が遅く且つ制限されているため、大量タンパク質生産には余り適さないことが多い。
高度に弱毒化したポックスウイルスの他に、別のウイルスの弱化株（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）が知られている。例えば、弱化レトロウイルスは、弱化ウイルスを補助することができるヘルパー細胞系中で増殖できる。Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０），３３−３９；“Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−５９（１９８３）参照。しかしながら、レトロウイルスは宿主細胞のゲノム中に組込むことによって増殖する低分子ＲＮＡ含有ウイルスであるため、発現ベクター又はワクチンとして使用するのに適していない。
補助細胞中で増殖した弱化アデノウイルスは、Ｅｌｉｏｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４２５−３１（１９９０）に記載のようにワクチンとして使用されてきた。アデノウイルスは、ワクシニアウイルスと異なり、感染細胞の核内で複製され、狭い宿主範囲を有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。また、ヘルパー細胞中での弱化ヘルペスウイルスの増殖も報告されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０３５９５号、ＷＯ９４／２１８０７号及びＷＯ９２／０５２６３号参照。ヘルペスウイルスも感染細胞の核内で複製される。そのままのヘルペスＤＮＡ、例えばアデノウイルスＤＮＡは感染性である。従って、これらのウイルスのプロモーターは宿主細胞内で正常に機能する。
ポックスウイルスと対照的に、ヘルペス及びアデノウイルスは核ウイルスである。しかしながら、核ウイルスから誘導した欠陥ウイルスは、相同的組換えを介して宿主細胞から欠陥領域を救出する能力を有する。このような組換え事象は望ましいものではなく、危険である。なぜなら、欠陥ウイルスは潜在的に野生型状態に戻ることができ、その結果感染力及び毒力が増加すると共に、挿入した外来遺伝子が消失するからである。
より安全な組換え体発現系及びワクチンの必要に鑑み、基本的に異なる組換えポックスウイルスの開発が要求されている。本明細書に記載の方法は、外来遺伝子をポックスウイルスの必須領域に挿入することからなる。ポックスウイルスの必須領域の産物の欠損は、別の由来源、例えば組換え宿主細胞、ヘルパーウイルス又はトランスジェニック動物の同じ又は類似の産物によって補完される。
従って本発明は、目的の一つとして、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのような外来ポリヌクレオチドを発現することができる組換えポックスウイルスを提供する。
本発明の別の目的は、ポックスウイルスゲノムの必須領域によって付与される機能を欠失しているために欠陥性である組換えポックスウイルスを提供することにある。
本発明の別の目的は、ポックスウイルスゲノムの必須領域に挿入された外来ポリヌクレオチドを有する欠陥ポックスウイルスを提供することにある。
本発明の更に別の目的は、必須領域の全部又は一部が欠失している欠陥ポックスウイルスを提供することにある。
本発明の別の目的は、ワクチンとして使用できる欠陥ポックスウイルスを提供することにある。
本発明の更に別の目的は、欠陥ポックスウイルスの欠失機能を補完することができる宿主細胞、ヘルパーウイルス又はトランスジェニック動物を提供することにある。
本発明のこれらの目的及び他の目的を達成するために、本発明の一態様では、親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している欠陥ポックスウイルスであって、プロモーターの転写調節下にある外来ポリヌクレオチドを含む欠陥ポックスウイルスを提供する。即ち、該欠陥ポックスウイルスは親ポックスウイルスから誘導したものであるが、親ポックスウイルスに通常存在する機能を欠失している。
プロモーターは、欠陥ポックスウイルス又は感染宿主の酵素で作動可能なものでなければならない。このようなプロモーターとしては、ポックスウイルスプロモーター、及びポックスウイルスプロモーターに基づく合成プロモーターが挙げられる。外来ポリヌクレオチドは必須領域に挿入し得、又は必須領域の一部もしくは全部を置換し得る。
また、外来ポリヌクレオチドをウイルス内に挿入する前に、マーカーで必須領域を置換することもできる。その後で外来ポリヌクレオチドをマーカーに挿入するか、又は外来ポリヌクレオチドでマーカーを置換すればよい。好ましくは、親ポックスウイルスはワクシニアであり、欠失すべき必須機能は、読取り枠Ｉ７Ｌ、Ｆ１８Ｒ、Ｆ１３Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ６Ｒ、Ａ８Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ、Ａ１０Ｌ及びＡ３Ｌでコードされるか、又は１４キロダルトンのエンベロープタンパク質もしくは２５キロダルトンの構造タンパク質をコードする読取り枠でコードされる。
本発明は別の態様で、欠陥ポックスウイルスの欠失機能を補完する能力を有する細胞系、トランスジェニック動物及びヘルパーウイルスを提供する。前記補完能力は、組換えウイルスの欠失機能を補完する産生物をコードする遺伝子を発現可能なように組込むことによって付与される。
本発明は更に別の態様で、タンパク質の製造方法を提供する。この方法は、親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している欠陥ポックスウイルスを供給するステップを含み、前記欠陥ポックスウイルスが、産生すべきタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドがプロモーターの転写調節下にある。プロモーターは、欠陥ポックスウイルス又は感染宿主で作動可能なものでなければならず、このようなプロモーターとしてはポックスウイルスプロモーターが挙げられる。ポリヌクレオチドは親ポックスウイルスの必須領域に挿入し得る。別の実施態様では、マーカー、例えばｇｐｔ遺伝子によって必須領域の一部もしくは全部を置換し、次いでポリヌクレオチドをマーカーに挿入するか又はポリヌクレオチドでマーカーの一部もしくは全部を置換し得る。その結果マーカーの機能が喪失すれば、そのポリヌクレオチドが欠陥ポックスウイルス内に配置されたことになる。
本発明は更に別の態様で、欠陥ポックスウイルスを含むワクチンを提供する。これらの欠陥ポックスウイルスは、病原体に対する抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のワクチンに適したポックスウイルスは、本発明の他の欠陥ポックスウイルスと同じ又は類似の方法で構築できる。
本発明の前述の態様及び他の態様は、本明細書における開示によって当業者に明らかにされよう。
第１図はプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌの構築を簡単に示している。
第２図は、プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。
第３図は、プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。
第４図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ８Ｌ−３’／２の構築を簡単に示している。
第５図は、プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。
第６図は、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。
第７図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ及びｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’の構築を簡単に示している。
第８図は、プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。
第９図は、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。
第１０図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｊ１Ｒの構築を簡単に示している。
第１１図は、プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。
第１２図は、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ＺＧの構築を簡単に示している。
第１３図は、プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。
第１４図は、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。
第１５図は、プラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌの構築を簡単に示している。
本発明は、その一態様で、タンパク質を製造するための欠陥ポックスウイルスの使用に関する。本発明の「欠陥ポックスウイルス」は、欠陥ポックスウイルスの基である親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失しているポックスウイルスである。従って欠陥ポックスウイルスは、別の由来源による欠失機能の補完なしには生存又は感染することはできない。「必須領域（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、親ポックスウイルスの生存力又は感染力に必要なポックスウイルスゲノムの領域である。「補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、別の由来源、例えば宿主細胞、トランスジェニック動物又はヘルパーウイルスによる欠失機能の回復を意味する。従って欠陥ポックスウイルスは、親ポックスウイルスを非生存性又は非感染性にした形態であり、補完体の存在下で生存可能又は感染性になることができる。
親ポックスウイルスは天然のポックスウイルス、又は天然ポックスウイルスに由来するポックスウイルスであり得る。好ましくは、親ポックスウイルスは、ワクシニアのウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ＝ＷＲ）株又はその関連株のような速増殖性野生型ウイルスである。
欠陥ウイルスは、天然ポックスウイルス又は天然ポックスウイルス由来のポックスウイルス等の親ポックスウイルスに基づく（から誘導される）。親ポックスウイルスとして使用するための天然ポックスウイルス由来ポックスウイルスは、領域特異的及び部位特異的突然変異誘発を介する遺伝子工学、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え、突然変異誘発物質の存在下もしくは不在下で宿主細胞を介するウイルスの継代のような方法、並びにこれらの方法の任意の組合わせによって得ることができる。欠陥ポックスウイルスは、必須領域の欠陥の導入が可能な任意の種類のポックスウイルスをベースとし得る。
欠陥ポックスウイルスはタンパク質発現系として使用できる。本発明の欠陥ポックスウイルスによって産生されたタンパク質は、外来ポリヌクレオチド、例えば遺伝子、又はＲＮＡ転写体のｃＤＮＡ型（ｃＤＮＡ  ｖｅｒｓｉｏｎ）、でコードされる。「外来ポリヌクレオチド」という用語は、欠陥ポリヌクレオチドの由来源である親ポックスウイルス内には通常存在しないポリヌクレオチド、又は欠陥ポックスウイルスの由来源である親ポックスウイルスにおけるものとは異なる位置もしくは形態で存在するポリヌクレオチドを意味する。外来ポリヌクレオチドは種々の由来源、例えば動物、植物、原生植物、菌類、細菌及びウイルスに由来し得る。
本発明の欠陥ポックスウイルスは、欠陥ポックスウイルス内での外来ポリヌクレオチドの転写を調節するために、欠陥ポックスウイルス又は欠陥ポックスウイルスに感染した宿主で作動可能なプロモーターを含み得る。「プロモーター」とは、転写を開始及び／又は指令できるヌクレオチド配列である。本発明では、欠陥ポックスウイルスで、又は感染宿主内で作動可能な任意のプロモーターを使用し得る。「作動可能（ｏｐｅｒａｂｉｌｉｔｙ）」という用語は、転写酵素によるプロモーターの認識可能性又は読取り可能性を意味する。典型的には、プロモーターはポックスウイルスプロモーター、又はポックスウイルス由来プロモーターをベースとする合成プロモーターである。
欠陥ウイルスは、ポックスウイルスの必須領域に挿入された外来ポリヌクレオチドを少なくとも一つ有し得る。プロモーターは、ポリヌクレオチドをプロモーターの転写調節下におくために、プロモーターとポリヌクレオチドとが一緒に挿入されるように、外来ポリヌクレオチドに結合し得る。あるいは、外来ポリヌクレオチドの転写を調節するプロモーターを、外来ポリヌクレオチドの転写を調節できるような位置で欠陥ポックスウイルス内に予め存在させておいてもよい。
必須領域は、補完源のゲノムと欠陥ウイルスとの間で相同的組換えが生起し得ないように、欠陥ウイルスのゲノムから完全に欠失させ得る。このような欠失を有する欠陥ウイルスは、補完源、例えばトランスで必須領域の機能を付与するヘルパー細胞系の存在下でしか増殖できない。欠陥ウイルスの純粋ストックはヘルパー細胞系では増殖できるが、正常細胞及び生物内での増殖は不可能である。この種のウイルスの宿主範囲は、欠陥ウイルスの欠陥を補完するために特別に工学的に操作されたヘルパー細胞系に限定され得る。欠陥ポックスウイルスでは、マーカー遺伝子を用いて必須領域を置換することができる。次いで、相同的組換えにより、外来ポリヌクレオチドをマーカー内に挿入するか、又は外来ポリヌクレオチドでマーカーの全部又は一部を置換し得る。この方法は、目的の挿入体を含むポックスウイルスの選択系を提供する。
この種のマーカーの一つはｇｐｔ遺伝子である。該遺伝子は、Ａ９細胞（マウスＬＭ（ＴＫ−）細胞の誘導体）又はＳＴＯ細胞（６−チオグアニンに対して耐性であり、逆ｇｐｔ選択を可能にする）のような補完細胞系で逆ｇｐｔ選択のために使用し得る。この系は、所望の欠陥ウイルスの純粋ストックを得るための迅速且つ効率的な方法を提供する。純粋ストックを得るのに通常必要とされる多数回のプラーク精製は、野生型ウイルスの能動殺害によって回避される（ｇｐｔ選択のような優性選択操作（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）では達成できない）。
本発明は、極めて大量のタンパク質発現に有用である。本発明の欠陥ポックスウイルスはワクチン接種にも使用できる。例えば、適当な必須遺伝子が不活性化しても、欠陥ウイルスは細胞内に侵入して不稔的生活環を開始する能力を保持する。このような遺伝子は生活環の後半に必要とされる遺伝子であり、従ってウイルスは依然として自己のＤＮＡを複製することができ、場合によっては未熟粒子を形成し、外来ポリヌクレオチドを含むゲノム情報を発現することができる。この点で、これらの欠陥ウイルスは“不活生ワクチン（ｄｅａｄ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）」の効果を有し得る。Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ６：４６６−６８（１９８８）。ワクチンとして使用される欠陥ポックスウイルスは、抗原をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。抗原は、生物よって外来であると認識される分子である。これらの抗原は、抗原に暴露された生物から免疫応答を誘発できる。抗原には、細菌、ウイルス、菌類及び原生動物に由来するタンパク質が含まれる。ワクチンとして使用する欠陥ウイルスを構築するための好ましい親ワクシニア株は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３２５）のようなワクチン株である。
本発明の欠陥ポックスウイルスは、欠陥ウイルスの欠失した必須機能を補完することができる宿主細胞内で増殖できる。典型的には、これらの宿主細胞は、欠失機能を補完するように特別に工学的に操作された細胞系に由来する。典型的には、宿主細胞は、必須領域が宿主によって発現されるように、又は細胞内の必須領域が宿主細胞の感染時に誘導され得るように、宿主細胞内に挿入された同じ又は類似のポックスウイルス必須領域を有する。
補完並びにその後のウイルス及びタンパク質産生のために選択する細胞系は、取り扱いが容易であり、ウイルスプラークを形成させ、産生物の機能に必要な総てのステップを実施することができるようなものでなければならない。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ８１）及びマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞はこれらの要件を満たし、宿主として適当である。ｔｋ遺伝子欠失ウイルスの負の選択は、ＴＫ陰性ベロ細胞上で実施し得る。ＴＫ陰性ベロ細胞は、ブロモ−デオキシウリジンの存在下で細胞系のサブクローニングを繰り返すことにより得られる。ベロ細胞は高細胞密度に増殖でき、組換えタンパク質の産生にうまく使用されている（Ｂａｒｒｅｔｔら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．５：１５９−７１（１９８９））。
Ａ９細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．４）、即ちマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞系誘導体も６−チオグアニンに対して耐性であり、逆ｇｐｔ選択を可能にする。これは、欠陥ウイルスを分離するために直接選択圧を適用する上で有用な特徴である。Ｉｓａａｃｓら，Ｖｉｒｏｌ．７８：６２６−３０（１９９０）。
補完遺伝子の組込みを容易にするために、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような優性選択マーカーを使用する。一つのプラスミドに外来遺伝子を結合するか、あるいは同時形質転換操作を適用し得る（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １６：７７７−７８５（１９７９））。単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような別の選択マーカーをマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞と一緒に使用してもよい。
補完のためにポックスウイルス必須領域を制御するプロモーター（補完物質（ｃｏｍｐｅｌｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ））は、それぞれの細胞系で活性でなければならない。好ましいプロモーターはＳＶ４０に由来する。ＳＶ４０はマウスＬ細胞及びベロ細胞中で活性を示す強い構成プロモーターを有する。永久（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）細胞系中での発現に通常使用される別のプロモーターとしては、Ｇｕｎｎｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４８３１−３５（１９８７）に記載のアクチンプロモーター、及びＢｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−３０（１９８５）に記載のヒトサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは本発明でも使用し得る。
ワクシニア感染細胞に特に適し得る転写系は、ヒト７０ｋＤ熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）由来プロモーターを非翻訳上流領域と共に含む。Ｈｕｎｔ及びＭｏｒｉｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６４５５−５９（１９８５）参照。他の多くの遺伝子の発現と異なり、Ｈｓｐ７０合成は、ワクシニア感染細胞内のワクシニアウイルス宿主タンパク質遮断によって悪影響を受けない。Ｊｉｎｄａｌ及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３５７−６２（１９９２）参照。
補完に適した別の宿主としては、補完性ポックスウイルス遺伝子を保有するウシパピローマウイルス（例えばＡＴＣＣ  ３７１１０）ベクターを含むプラスミドでトランスフェクションされたマウスＣ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）又はその誘導体が挙げられる。この系における相同的組換えの危険を最小限度に抑えるために、補完性ポックスウイルス遺伝子は欠陥ウイルスのそれとは異なる属に由来するものが好ましい。このようなヘルパーウイルス法を用いると、補完性ポックスウイルス遺伝子は宿主細胞が欠陥ポックスウイルスに感染した時にだけ活性化される。
欠陥ポックスウイルスの増殖に使用し得る別の宿主としては、ワクシニア必須遺伝子を導入したトランスジェニック動物（以後「補完性トランスジェニック動物」と称する）が挙げられる。この種の動物は、補完性トランスジェニック動物内でポックスウイルス必須遺伝子を発現するために選択したプロモーターに応じて、総ての体細胞又は好ましい組織内で補完機能を付与し得る。動物、好ましくはマウスは、ポックスウイルス感染の研究及び関連研究のための安全なモデルを構成する。所定の器官における導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の選択的発現は、組織特異的遺伝子発現の研究及び／又は特定器官の選択的機能もしくは機能障害の研究を可能にできる。
トランスジェニック動物を作る方法は当業者に公知である。例えば、トランスジェニック動物は、マイクロインジェクション、胚性幹細胞の形質転換又はレトロウイルスベクターの使用によって形成できる。適当な方法はＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬＳ
0003911010.tif 000002
に詳述されている。
補完物質として適当な必須遺伝子産物は、一般的には、ポックスウイルス生活環の後期に必要とされる遺伝子産物を包含する。この種の遺伝子産物の具体例としては、形態形成又は他の複製後事象に関与する遺伝子産物、並びに酵素及び調節タンパク質が挙げられる。
適当な補完物質である必須遺伝子産物の一つは、読取り枠（ｏｒｆ）Ｉ７Ｌによってコードされる４７−ｋＤａタンパク質（Ｉ７タンパク質）であり、これはウイルスゲノム構成に関与すると考えられている。Ｋａｎｅ及びＳｃｈｕｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２６８９−９８（１９９３）。Ｉ７タンパク質はウイルス核で被包されている。ｔｓ１６として知られている温度感受性（ｔｓ）突然変異が存在する。Ｃｏｎｄｉｔら，Ｖｉｒｏｌ．１２８：４２９−４３（１９８３）。従って、Ｉ７遺伝子は必須遺伝子の従来の要件、即ち条件致死変異株（温度感受性）の存在という要件を満たす。
本発明で適当な補完物質である必須遺伝子産物のなかには、Ｄ１３Ｌ  ｏｒｆによってコードされる６５ｋＤａタンパク質がある。このタンパク質は感染の後期に発現される。発現が阻止されても複製は影響を受けないが、ウイルス形態形成は初期段階で阻止される。Ｚｈａｎｇ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１８７：６４３−５３（１９９２）。補完物質として適当な別の必須遺伝子産物は、Ｌａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２１７４−８０（１９９０）に記載のワクシニア１４ｋＤａエンベロープタンパク質、Ｗｅｉｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：５３４−４０（１９８５）に記載のワクシニア２５ｋＤａ主要構造タンパク質、並びにＰ４ａ及びＰ４ｂのような他の構造タンパク質である。
補完物質として使用できる別の必須遺伝子産物は、ＷＲ野生型ウイルスのＦ１８Ｒ  ｏｒｆ（ワクシニアのコペンハーゲン株のＦ１７Ｒとして知られている）によってコードされる、Ｗｉｔｔｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：３７１−７８（１９８４）に記載の１１ｋＤａリンタンパク質である。Ｇｏｅｂｅｌら，Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７−６６（１９９０）参照。Ｆ１８Ｒ  ｏｒｆによってコードされる１１ｋＤａリンタンパク質は、正しいビリオン組み立てに必要な必須遺伝子である。Ｚｈａｎｇ及びＭｏｓｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６１０１−１０（１９９１）参照。Ｆ１８Ｒ及びＦ１７Ｒ  ｏｒｆ内の条件致死ワクシニア変異株は、特定の条件下で異常な内部構造を有する未熟粒子を形成する。しかしながらＦ１８Ｒはｏｒｆ  Ａと重なり合い、従って通常は第一に選択すべき必須領域ではない。Ｇｏｅｂｅｌら、前出文献。
酵素及び調節タンパク質も補完物質として使用できる。なぜなら、これらのタンパク質は触媒量で存在させるだけでよく、このような量は補完細胞系によって容易に供給できるからである。ワクシニアウイルス初期転写因子（ＶＥＴＦ）のサブユニットはこの点で適当な物質である。ＶＥＴＦは「初期」ワクシニア遺伝子の転写開始にとって必須である。ＶＥＴＦを欠くワクシニアＲＮＡポリメラーゼはｉｎ  ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡ鋳型を転写することができない。Ｂｒｏｙｌｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０７５４−６０（１９８８）参照。この因子は、ワクシニアＷＲゲノムのＤ６Ｒ及びＡ８Ｌ遺伝子ｏｒｆによってそれぞれコードされる７７ｋＤａポリペプチド及び８２ｋＤａポリペプチドを有するヘテロダイマーである。Ｇｅｒｓｈｏｎ及びＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４４０１−０５（１９９０）参照。ＶＥＴＦタンパク質は感染の後期に発現され、発生期のウイルス粒子中にパッケージされる。従って、ＶＥＴＦ発現細胞から分離されたＤ６Ｒ又はＡ８Ｌ遺伝子を欠失する欠陥ウイルスは、それ以上のタンパク質合成制限なしに、非補完性細胞系上で完全な生活環を更に実施することができる。タンパク質合成は、このような欠陥ウイルスを「不活生ワクチン」として使用するための必須要件である。
「不活生ワクチン」は、哺乳動物宿主の免疫に使用されてきた、外来遺伝子を発現する鳥類ポックスウイルスを含む。哺乳動物宿主ではウイルスは増殖せず、不稔的生活環を実施する。それにもかかわらず、この種のワクチンは特定Ｔ細胞の免疫応答を刺激する。Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、前出文献参照。ＶＥＴＦを欠く欠陥ウイルスは、不稔的生活環を実施することしかできないウイルスと比べて、野生型宿主内で更に生活環を実施することができ、従って抗原をより多く産生できるため、望ましい。
補完に適した別のウイルス因子はＲＮＡポリメラーゼ関連タンパク質ＲＡＰ９４又は初期転写特異性因子である。ＲＡＰ９４はｏｒｆ  Ｈ４Ｌによってコードされ（Ａｈｎ及びＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：ＵＳＡ  ８９：３５３６−４０（１９９２））、解離可能なウイルスＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットである。該サブユニットは、初期段階遺伝子の転写を開始させるために、ＲＮＡポリメラーゼ複合体にプロモーター特異性を付与する。該サブユニットは補完物質としてＶＥＴＦサブユニットと同じ要件を満たす。ＲＡＰ９４は感染後期に合成され、発生期ウイルス中にパッケージングされて、次の感染ラウンドで初期転写を仲介する。従って、Ｈ４Ｌ遺伝子を欠く表現型的に完全なウイルス粒子は、それ以上のタンパク質合成制限を伴わずに、非補完性宿主内で更にもう１ラウンドの感染を実施することができる。条件致死変異株の存在（Ｃｏｎｄｉｔ及びＭｏｔｙｔｚｃａ，Ｖｉｒｏｌ．１１３：２２４−４１（１９８１））は、Ｈ４Ｌが必須遺伝子であることを示すものである。該タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体の別の成分と比べて、モル未満（ｓｕｂｍｏｌａｒ）在することが判明している。Ａｈｎ及びＭｏｓｓ、前出文献。従って、補完性細胞系内のＲＡＰ９４の低発現レベルは、欠陥ウイルスの増殖に影響しない。
欠陥ウイルスを補完するために使用し得る別の遺伝子はＪ１Ｒ遺伝子である。これは、細胞培養でのウイルス増殖にとって必須の遺伝子である。その遺伝子産物はまだ同定されてないが、このｏｒｆはワクシニアウイルスゲノム上でチミジンキナーゼ遺伝子に隣接して位置するため、かなり注目すべきものである。ｏｒｆ  Ｊ１Ｒと隣接チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の少なくとも一部とを含む配列が欠失すると、補完性細胞系に依存すると共に、ＬＫ（ＴＫ−）細胞又はｔｋ−陰性ベロ細胞のようなｔｋ−陰性細胞上で負の選択によって選択できるウイルスが得られる。欠陥ウイルスの純粋ストックはこのようなさらなる選択操作によって迅速に得られる。
Ｊ３Ｒ遺伝子は、Ｊ１Ｒ  ｏｒｆと同じ意味で注目に値する。ｔｋ−陰性細胞上での負の選択は、Ｊ３Ｒ  ｏｒｆ及び隣接Ｊ２Ｒ  ｏｒｆ（チミジンキナーゼ）が同時に欠失しているために実施できる。Ｊ３Ｒ遺伝子は、ｍＲＮＡの５’キャップ構造の形成に必要とされ且つ長いポリ（Ａ）テールの形成を刺激するポリ（Ａ）ポリメラーゼサブユニット（ＶＰ３９）をコードする。Ｇｅｒｓｈｏｎら，Ｃｅｌｌ  ６６：１２６９−７８（１９９１）；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２８９７−０１（１９９１）。
本発明の欠陥ポックスウイルスは、非必須領域に挿入体を有する組換えウイルスに使用されるものと同じ多くの方法で製造できる。例えば、相同なフランキング領域（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を介するｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを使用し得る。Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−３１（１９８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら，上記文引献７９：７４１５−１９（１９８２）参照。欠陥ポックスウイルスを製造するための別の方法は、直接的分子クローニング及び異種パッケージング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）である。欧州特許第０  ５６１  ０３４号；Ｓｃｅｉｆｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７−８１（１９９２）；Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１９０：５２２−２６（１９９２）参照。
本発明では、必須遺伝子内又は必須遺伝子の以前の位置（マーカーによる置換を含む欠失に起因して消滅した位置）に非反復（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位を有する欠陥ポックスウイルスをクローニングビヒクルとして使用し得る。あるいは、所望であれば選択マーカーを含むウイルスの必須遺伝子を非反復制限部位でフランキングして、必須遺伝子及びマーカー（存在すれば）の同時切除を可能にすることもできる。同時切除後は、ウイルスベクターへの外来ポリヌクレオチドの連結を容易にする強制クローニング（ｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ）で、１個以上の外来ポリヌクレオチドの挿入を行うのが好ましい。
必須領域内に又は必須領域に隣接して非反復部位を有する親ウイルスのベクターアーム（ｖｅｃｔｏｒ  ａｒｍ）は、外来ポリヌクレオチドに連結して、ヘルパーウイルスとしての鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）と共に補完性細胞系中にパッケージングし得る。ＦＰＶは哺乳動物細胞内で生活環を完了することができず、増殖できないため、このウイルスは次のプラークアッセイで重大な汚染物質とはならない。しかしながら、挿入体のない再連結欠陥ウイルスはプラークを形成し得る。但しこの問題は、ベクターアームを注意深く形成し、挿入体をウイルス内に強制クローニングすることによって解決される。以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明をより明らかにするためのものである。
実施例１：  Ｉ７Ｌタンパク質（ｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧ）を欠く欠陥ワクシニアウイルス及びベロ細胞をベースとする補完性細胞系（Ｖ−Ｉ７Ｌ）の構築
補完性細胞系Ｖ−Ｉ１７Ｌの構築
ヘルパー細胞系の構築の最初のステップは、一般的なＰＣＲ仲介法による大腸菌発現プラスミド及び真核生物発現プラスミド内への１７Ｌ  ｏｒｆのクローニングであった。大腸菌における１７Ｌ  ｏｒｆの発現は、抗Ｉ７Ｌタンパク質抗体を得るためにウサギを免疫感作するためのタンパク質の迅速産生を可能にする。前記抗体は、後で永久細胞系中のＩ７Ｌタンパク質を同定するために使用し得る。
この目的のために、Ｉ７Ｌ  ｏｒｆをＰＣＲで増幅し、次いでプラスミドｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングする。プライマーｏＩ７−１（５’−ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＡＧ−３’）（配列番号：１）及びｏＩ７−２（５’−ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣＴ−３’）（配列番号：２）を用いてＩ７Ｌ遺伝子を１．３ｋｂフラグメントとして増幅した。このフラグメントをプライマーｐＣＲIIに挿入して、ｐＣＲ−Ｉ７Ｌを形成した。プラスミドｐＣＴ−Ｉ７ＬはＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII遺伝子フラグメントの由来源であり、該フラグメントは後で強制クローニングによってプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｂ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に挿入して、ｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌを形成した（第１図）。プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌは、Ｔ７プロモーターの下流のＩ７Ｌ  ｏｒｆを過発現させた。Ｔ７プロモーターの制御下の発現はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。該ポリメラーゼは、プラスミド担持大腸菌にバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を感染させることによって得られる。
Ｉ７Ｌタンパク質は、Ｍ１３ｍｐ１８／Ｔ７に感染しプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌを有するＪＭ１０９大腸菌細胞内で過発現された。ｌａｃプロモーターの誘導は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）でバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７内のＴ７ポリメラーゼの発現を推進する。この特定実施例で使用する大腸菌発現系はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手したものであり、親プラスミドｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＲＳＥＴ  Ｂ及びｐＲＳＥＴ  Ｃ並びにＭ１３ベースのヘルパーファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を含む。本発明では他の適当な発現系も使用できる。
発現後に細菌溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。Ｉ７Ｌタンパク質を含んでいるバンドを検出し、ゲルから切除し、電気溶離した（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。ウサギを電気溶離物質及び完全フロイントアジュバントで免疫感作した（投与当たり３０ｍｇタンパク質、ｉ．ｍ．）。１ケ月後、不完全フロイントアジュバント中で同じ投与量で動物に追加抗原刺激を与え、抗体の発生をウェスタンブロットで観察する。
ウェスタンブロットは本質的に、Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４３５０−５４（１９７９）に記載のように実施し得る。第一抗体はウサギ抗１７Ｌ抗体（上述）であり、希釈率１：１００で使用する。第二抗体は、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用する。試薬（ＢＣＩＰ及びＮＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．のものである。
プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌ由来のＮｃｏＩ−ＳｍａＩ遺伝子フラグメントは発現プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨの一部である。第２図参照。プラスミドｐＥＤＨ１（第２図）は、内部リボソーム結合部位（ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）及びハイグロマイシン（ｈｐｈ）遺伝子を含むＥＤＨ遺伝子カセットをＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩフラグメントとして含む。このプラスミドｐＥＤＨ１は、更に４つの制限部位（ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ及びＤｒａＩ）を部位ＳｐｅＩとＮｏｔＩとの間でＥＤＨ遺伝子カセットの下流に挿入した、プラスミドｐＢ４／ＥＤＨＰｒｏ（Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ、論文）に由来する。ｐＥＤＨ１のＥＤＨ遺伝子カセットは、ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩフラグメントとして、プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌの非反復制限部位ＳｍａＩ及びＳａｌＩの間に挿入した。この構築によって、プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨが得られた。
プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌは、ｐＣＲ−Ｉ７Ｌの１．３ｋｂ  ＮｃｏＩ−ＳｍａＩフラグメントをプラスミドｐＳＶ−ＢｂｓのＢｂｓＩ−ＳｍａＩ部位間に挿入することによって得られた。プラスミドｐＳＶ−ＢｂｓはプラスミドｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）の誘導体であり、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠失しているが、単一のＢｂｓＩ部位を含んでいる。ＢｂｓＩ部位は、オリゴヌクレオチドｏＢｂｓ−１（５’−ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  Ａ−３’）（配列番号：３）及びｏＢｂｓ−２（５’−ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  Ｃ−３’）（配列番号：４）を含むリンカーによって導入する。リンカーは、プラスミドｐＳＶβのＡｖｒII及びＨｉｎｄIII部位間に挿入した。第２図参照。
ｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨでは、Ｉ７Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、ｄｈｆｒ及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子であり、永久細胞系内の目的の遺伝子の効率的なスクリーニング及び増幅を可能にする。
0003911010.tif 000003
但し、本発明の実施はこのマーカーの使用に限定されない。
前記プラスミドをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトランスフェクションする。ベロ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−６７（１９７３）の方法でプラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ  ＥＤＨを細胞にトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢをベースとする選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ）中でインキュベートした。１０〜１４日後にコロニーが目で観察できるようになった。これらのコロニーを増殖し、２回サブクローニングし、次いで更に特性を調べた。永久ｈｐｈ陽性細胞系をハイグロマイシンＢの存在下で選択した。該細胞系を更にＰＣＲ分析で特性検査し、補完性遺伝子構築物（Ｉ７Ｌ）の存在を調べた。ウェスタンブロットを用いて、目的の遺伝子、Ｉ７Ｌ−タンパク質が発現されているかどうかを調べる。最終的補完性細胞系はＶ−Ｉ７Ｌと称する。
欠陥ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧの構築
Ｉ７Ｌ産物を欠くウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆを第３図に示すように構築した。このプラスミドはｐＣＲIIベクターをベースとし、一方の側に約０．５ｋｂのフランキング領域を含むＩ７Ｌ−ｏｒｆを含んでいる。プライマーｏＩ７−３（５’−ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  Ａ−３’）（配列番号：５）及びｏＩ７−４（５’−ＧＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ−３’）（配列番号：６）を使用して約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を得、これをｐＣＲIIプラスミド内にサブクローニングしてｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆを形成した。
大腸菌遺伝子ｌａｃＺ及びｇｐｔを含む二重遺伝子カセットをＳｍａＩフラグメントとしてプラスミドｐＬＧｂから切除し、Ｉ７Ｌ−ｏｒｆ内に位置する単一のＨｐａＩ部位に挿入した。これは、その結果得られるプラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧのｐＣＲ−Ｉ７Ｌ遺伝子を不活性化する。
プラスミドｐＬＧｂは、プラスミドｐ１Ｔａ及びｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をベースとするｐ２Ｔから得た。まず、ｐＴＺ１９Ｒの大きいＰｖｕIIベクターフラグメントを、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−１Ｔ（１）：５’−ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  Ａ３’（配列番号：７）及びＰ−１Ｔ（２）：５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ（配列番号：８）と連結した。その結果得られたｐ１ＴａをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開裂した。次いで、開裂したｐ１ＴａをアニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−２Ｔ（１）：５’−ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＡ−３’（配列番号：９）及びＰ−２Ｔ（２）：５’−ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＧ−３’（配列番号：１０）に連結した。その結果得られたプラスミドｐ２ＴをＳｍａＩで開裂した。大腸菌遺伝子ｌａｃＺ及びｇｐｔを含む二重遺伝子カセットを、ＨｉｎｄIII、ＳａｌＩ及びクレノーポリメラーゼ処理フラグメントとして挿入した。二重遺伝子カセットは、プラスミドｐＴＮａ及び関連プラスミドをベースとするプラスミドｐＺｇｐｔ−ａから得られる。
ｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧウイルスを構築するために、ＣＶ−１細胞内でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えにより、プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧをＷＲ株ワクシニアウイルス中に挿入した。まず、５×１０6個のＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間増殖させ、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトランスフェクションし、次いで３日間増殖させた。Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、前出文献参照。ウイルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６２：１８４９−５４（１９８８））及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓ．５：３４０３−０９（１９８５））の存在下でプラーク細胞に使用する。
欠陥ウイルスはＶ−Ｉ７Ｌ細胞内だけで増殖し、ｇｐｔ及びｌａｃＺ陽性であり、野生型ウイルスは両方の細胞系で増殖するが、ｇｐｔ及びｌａｃＺ陰性である。精製を１０回行う。次いで、精製した欠陥ウイルスをより大量に増殖させ、サザンブロットで調べる。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞及び野生型細胞上の欠陥ウイルスのプラークアッセイによって、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査で、欠陥ウイルスは非病原性であることが確認される。
実施例２：補完性細胞系Ｖ−Ｉ７Ｌ内でＨＩＶ  ｅｎｖ  ｇｐ１６０遺伝子（ｄ−Ｉ７Ｌ  ＭＮ）を発現する欠陥ワクシニアウイルスの構築
新規の系における外来遺伝子の発現を明らかにするために、ＨＩＶ  ＭＮ株のＨＩＶ  ｇｐ１６０遺伝子を必須領域Ｉ７Ｌに挿入する。そのために、プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２のＳｍａＩフラグメントから遺伝子カセットを得る。プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２は、強い半合成ポックスウイルスプロモーターＳｅｐによって制御されるＨＩＶ−１  ｇｐ１６０ＭＮ配列と、Ｐ７．５ｇｐｔ遺伝子を含む選択カセットとを含んでいる。Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８４９−５４（１９８８）参照。
プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２を構築するために、まずプラスミドｐＳｅｐ（１）を構築した。ｐＳｅｐ（１）を得るために、後期鶏痘ウイルスプロモーターＰ２（欧州特許出願公開第０  ５３８  ４９６  Ａ１号、Ｄｏｒｎｅｒら）を合成初期プロモーター配列と組合わせることによって、半合成ポックスウイルスプロモーターＳｅｐを構築した。要約すれば、ＨｐａＩ／ＮｃｏＩ消化ベクターｐＳ２ｇｐｔ−Ｐ２（欧州特許出願公開第０  ５６１  ０３４  Ａ２号）を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−Ｓｅｐ（３）及びＰ−Ｓｅｐ（４）と連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、Ｐ−Ｓｅｐ（３）：５’−ＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡ  ＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴ  ＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴ  ＡＴＴＧＣＡＣＧＧＴ  ＣＧＣＧＡ−３’（配列番号：１１）及びＰ−Ｓｅｐ（４）：５’−ＣＡＴＧＧＴＡＣＧＴ  ＡＣＣＧＴＧＣＡＡＴ  ＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴ  ＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡ  ＴＴＴＴＴＡＣＧＡＧ−３’（配列番号：１２）であった。得られたプラスミドをｐＳｅｐ（１）と名付けた。ｐＳｅｐ−ＳＴ２を得るために、まずＨＩＶ１−ＭＮｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドｐＭＮｅｎｖ２（欧州特許出願公開第０  ５６１  ０３４  Ａ２号に記載）に由来する２．６５ｋｂのＳｔｕＩ／ＰｖｕIIフラグメントをＳｎａＢＩ直線化プラスミドｐＳｅｐ（１）と連結した。得られたプラスミド、即ちＳｅｐ−プロモーターに対して適切な方向に挿入体を含むプラスミドをｐＳｅｐ−ｇｐ１６０ｍｎと名付けた。ｇｐ１６０−ｏｒｆ内に位置する点突然変異を修復するために、ｐＳｅｐ−ｇｐ１６０ｍｎの１．９ｋｂ  ＮＳｉＩ／ＳａｌＩフラグメントをプラスミドｐＭＮ−ＳＴ２由来の等価フラグメントで置換した。得られたプラスミドをｐＳｅｐ−ＳＴ２と名付けた。プラスミドｐＭＮｅｎｖ１及びｐＭＮ−ＳＴ２はＭａｒｖｉｎ  Ｒｅｉｔｚ（Ｎ．Ｃ．Ｉ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から入手した。
ｐＳｅｐ−ＳＴ２由来のカセットはＨＩＶ  ｇｐ１６０遺伝子及び大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含み、これをｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆの単一のＨｐａＩ部位に挿入するとプラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＭＮが得られる。このプラスミドを、ＷＲ野生型ウイルスを含有するＣＶ−１細胞内でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換え実験で使用してウイルス未精製ストツクを得る。該ストツクは、（１）２回のクロスオーバー事象を経て組換えウイルスとなった欠陥ウイルスと、（２）１回のクロスオーバー事象を経たウイルスと、（３）野生型ヘルパーウイルスとの混合物である。クロスオーバー事象の総合的説明は、Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３１０８−１１（１９９０）に記載されている。
このウイルス混合物を、実施例１に記載のように純度検査した補完性細胞内でプラーク精製する。但し、プラークアッセイはｇｐｔ−選択のみに基づく。得られたウイルスをｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮと名付け、Ｖ−Ｉ７Ｌ細胞内での組換えｇｐ１６０の発現に使用する。ｇｐ１６０を発現するために、ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮをその補完性細胞系と組合わせて使用する。Ｖ−Ｉ７Ｌ細胞に０．１ｐｆｕのｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮを感染させ、３日間増殖させる。前出のＴｏｗｂｉｎらの方法で、抗−ｇｐ４１モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより組換えタンパク質を検出する。マウスで動物実験を行い、ｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮが非病原体であるがそれでも免疫応答を刺激することができることを明らかにする。
実施例３：初期転写因子の大サブユニットを欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧ）及び該ウイルスを増殖させるための補完性細胞系の構築
ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ａ８Ｌ）の構築
ＶＥＴＦ因子は、ワクシニア−ＷＲゲノムのＤ６Ｒ及びＡ８Ｌ  ｏｒｆでそれぞれコードされる７７ｋＤポリペプチド及び８２ｋＤポリペプチドからなるヘテロダイマーである。Ｇｅｒｓｈｏｎ及びＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４４０１−０５（１９９０）。ＶＥＴＦタンパク質は感染後期に発現され、発生期ウイルス粒子中にパッケージングされる。ＶＥＴＦを欠く欠陥ウイルスは、不稔的生活環を実施することしかできないウイルスと比べて、野生型宿主内で更に生活環を実施することができるため望ましいものである。
Ｄ６Ｒサブユニットは可能なＡＴＰ結合部位を含み、初期プロモーターＤＮＡ配列に結合することが判明している。Ｂｒｏｙｌｅｓ及びＬｉ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６７７−８０（１９９３）参照。温度感受性突然変異をＤ６Ｒ遺伝子までマッピングした。補完性細胞系における望ましくないタンパク質−ＤＮＡ相互作用を回避するためにＡ８Ｌ  ｏｒｆを選択した。
ヘルパー細胞系の構築の最初のステップは、ＰＣＲ仲介法によりＡ８Ｌ  ｏｒｆを大腸菌発現プラスミド及び真核生物発現プラスミド内にクローニングする操作であった。大腸菌内でのｏｒｆの発現は、永久細胞系中でタンパク質を同定するために後で使用される抗ＶＥＴＦ大サブユニット抗体を得るためにウサギを免疫感作するためのタンパク質の迅速産生を可能にした。
この目的のために、Ａ８Ｌ−ｏｒｆをＰＣＲで増幅し、プラスミドｐＣＲII内にクローニングした。プライマーｏＡ８−９ｔ（５’−ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  Ａ−３’）（配列番号：１３）及びｏＡ８−２ｔ（５’−ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＴＴＣ−３’）（配列番号：１４）を用いて、Ａ８Ｌ遺伝子を２．１ｋｂフラグメントとして増幅した。このフラグメントをプラスミドｐＣＲII（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に挿入して、ｐＣＲ−Ａ８Ｌｔを形成した。
プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｔは、０．９ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ遺伝子フラグメントの由来源である。ＢａｍＨＩ部位（Ａ８Ｌ遺伝子内に存在）及びＥｃｏＲＩ部位（ｐＣＲIIの多重クローニング部位によって導入）を開裂してフラグメントを得、これを強制クローニングによりプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｂ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に挿入してプラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ８Ｌ−３’／２を形成した。第４図参照。該プラスミドは、Ｎ’末端６−ヒスチジン−ｔａｇと融合した、ＶＥＴＦ大サブユニットのＣ’末端部分をコードする融合遺伝子を含む。切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａ８Ｌタンパク質は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ８Ｌ−３’／２を含む大腸菌（ＪＭ１０９株）細胞内で過発現された。
その後、ＩＰＴＧの存在下で細菌にヘルパーファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を感染させた。これは、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７内のＴ７ポリメラーゼの発現を推進するｌａｃプロモーターを誘導する。ｈｉｓ−ｔａｇを含む組換え切頭型Ａ８Ｌタンパク質を、ニッケル−ＮＴＡカラムでのアフィニティクロマトグラフィーで、製造業者のプロトコル（Ｄｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に従い、細菌溶解物から精製した。完全フロイントアジュバント中に乳濁させた精製物質を用いてウサギを免疫感作した（投与当たり８０ｍｇタンパク質、ｓ．ｃ．及びｉ．ｍ．）。１ケ月後、同じ投与量で動物に追加抗原刺激を与え、抗体の発生をウェスタンブロットで観察した。
ウサギ抗血清の特性を調べるために、細菌溶解物中のＡ８Ｌタンパク質をウェスタンブロットで検出した。ウェスタンブロットは本質的に前出のＴｏｗｂｉｎらの方法で実施した。第一抗体はウサギ抗Ａ８Ｌタンパク質抗体であり、希釈率１：１００で使用した。第二抗体は、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用した。試薬（ＢＣＩＰ及びＮＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．のものである。
発現プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨを得るために、Ａ８Ｌ遺伝子を２．１ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ遺伝子フラグメントとしてプラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｔから分離した。部位ＰｓｔＩ及びＳｔｕＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＡ８−９ｔ及びｏＡ８−２ｔによって導入した。このフラグメントと、ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ遺伝子フラグメントとを、制限部位ＡｐａＩ、ＡｖｒIII、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩを含む多重クローニング部位（ｍｓｃ）によるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の置換により、ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）に由来するＰｓｔＩ−ＣｌａＩ切断発現ベクターｐＳＶＭＣＳ＃５１内に連結した。そのために、ベクターｐＣＭＶβをＮｏｔＩで切断し、再連結して、プラスミドｐＣＭＶを形成した。このプラスミドをＳａｌＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、クレノーポリメラーゼで処理し、再連結して中間プラスミドを得た。このプラスミドをＸｈｏＩで切断し、制限部位ＡｐａＩ、ＡｖｒIII、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩをコードする二本鎖リンカーを挿入してプラスミドｐＳＶＭＣＳ＃５１を形成した。第５図参照。
プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨ内で、Ａ８Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例１に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子である。
前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの方法でプラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトランスフェクションし、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン）中でインキュベートし、更に実施例１に記載のように処理した。永久ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ陽性細胞系を抗生物質ハイグロマイシンＢの存在下で選択した。５回の継代後、Ａ８Ｌ遺伝子の０．５ｋｂセグメントに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによって外来ＤＮＡの組込みを明らかにした。
ウェスタンブロットを用いて、所期の遺伝子、ＶＥＴＦ大サブユニットが発現されているかどうかを調べる。最大レベルのＶＥＴＦ大サブユニットを発現する細胞系を更にＰＣＲ分析にかけて特性を調べ、補完性細胞系として使用し、Ｖ−Ａ８Ｌと名付ける。
欠陥ウイルスｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧの構築
ウイルスｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧを第６図に簡単に示すように構築した。Ａ８Ｌ  ｏｒｆの両側のフランキング領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．７ｋｂ）をＰＣＲで増幅し、プラスミドｐＣＲII内にサブクローニングして、それぞれｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌ及びｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｒを得た。
Ａ８Ｌ  ５’−フランキング領域の増幅のためのＰＣＲプライマーは、ｏＡ８−８（５’−ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＣ−３’）（配列番号：１５）及びｏＡ８−５（５’−ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＡＡＡ  ＴＣ−３’）（配列番号：１６）であった。Ａ８Ｌ  ３’−フランキング領域用のプライマーはｏＡ８−４（５’−ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＧＣ  ＣＧ−３’）（配列番号：１７）及びｏＡ８−６（５’−ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  Ａ−３’）（配列番号：１８）であった。ｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌ由来の０．７ｋｂ  ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩフラグメントとしてのＡ８Ｌ  ５’−フランキング領域を、ｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｒ内でＡ８Ｌ  ３’フランキング領域のすぐ上流の部位ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ間に連結して、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓを得た。
クローニング操作を更に実施するのを容易にするために、希少（ｒａｒｅ）制限部位ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ及びＲｓｒIIを含む合成リンカーを、ｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓ内のＡ８Ｌ−フランキング領域の間に連結した。該リンカーの構築に使用したオリゴヌクレオチドは、ｏＡ８−１１（５’−ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ−３’）（配列番号：１９）及びｏＡ８−１２（５’−ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  Ｔ−３’）（配列番号：２０）である。その後、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓをＭｕｎＩ及びＨｐａＩで直線化した（二つの部位はそれぞれＰＣＲプライマーｏＡ８−５及びｏＡ８−６によって導入）。その結果得られたプラスミドｐｄＡ８Ｌを実施例１に記載のプラスミドｐＬＧｂ由来の３．９ｋｂ  ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧを形成した。この構築物では、相同的組換えを介する補完性細胞系による欠陥ウイルスの救出を防止するために、Ａ８Ｌ  ｏｒｆを完全に欠失させる。
ｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ＺＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入した。プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧはＣＶ−１細胞内でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えに使用した。まず、５×１０6個のＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキュベートし、前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの方法に従って、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトランスフェクションし、３日間増殖させた。
その結果、野生型ウイルス（ヘルパー）と欠陥ウイルスとを含む未精製ストックが得られた。欠陥ウイルスの純粋ストックを得るために、欠陥ウイルスを補完することができるＶ−Ａ８Ｌ細胞内でプラークアッセイを実施した。ウイルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１９８８）、前出文献）及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、前出文献）の存在下でＶ−Ａ８Ｌ細胞上でのプラークアッセイに使用した。プラーク精製は１０回繰り返す。精製した欠陥ポックスウイルスはより大量に増殖させ、サザンブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞上及び野生型細胞上での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査では、欠陥ウイルスが非病原性であることが確認される。
実施例４：初期転写因子の小サブユニットを欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧ）及び補完性細胞系の構築
ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ｄ６Ｒ）の構築
初期転写因子ＶＥＴＦの小サブユニットは大きさ７７ｋＤのポリペプチドである。実施例３に記載のように、ＶＥＴＦは可能なＡＴＰ結合部位を含み、初期プロモーターＤＮＡ配列に結合することが判明している。Ｂｒｏｙｌｅｓ及びＬｉ、前出文献。Ｄ６Ｒ  ｏｒｆを補完用に選択した。なぜなら、温度感受性突然変異がこの遺伝子に対しマッピングされているからである。これは必須遺伝子を決定するための要素である。Ｓｅｔｏら、Ｖｉｒｏｌ．１６０：１１０−１９（１９８７）。
ヘルパー細胞系Ｖ−Ｄ６Ｒの構築の最初のステップは、一般的には、実施例３の細胞系Ｖ−Ａ８Ｌの構築と同じである。まず、Ｄ６Ｒ  ｏｒｆをＰＣＲ仲介法によってプラスミドｐＣＲII（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングした。得られたプラスミドは、真核生物発現ベクター及び大腸菌発現プラスミドを構築するためのＤ６Ｒ遺伝子フラグメントの由来源である。大腸菌内でのｏｒｆの発現は、永久細胞系内のタンパク質を同定するために後で使用される抗ＶＥＴＦ小サブユニット抗体を得るためにウサギを免疫感作するためのタンパク質を迅速に産生させる。
この目的のために、プライマーｏＤ６−１（５’−ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＴＴＴ−３’）（配列番号：２１）及びｏＤ６−２（５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＧＴＴ−３’）（配列番号：２２）を用いてＰＣＲによりＤ６Ｒ−ｏｒｆを１．９ｋｂフラグメントとして増幅し、ｐＣＲII中にクローニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒを形成した。
第７図に示すように、大腸菌発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’は、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ由来の１．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントをベクターｐＲＳＥＴ−Ｂ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内に連結することによって構築した。プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’は、最初の１００個のアミノ酸を欠失しているＶＥＴＦ小サブユニットに融合したＮ’末端６−ヒスチジン−ｔａｇをコードする融合遺伝子を含む。細菌発現、組換えタンパク質のｔａｇ仲介精製、及び抗ＶＥＴＦ小サブユニット抗体の産生を実施例３に記載のように実施した。発現プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨは下記のように構築した：プラスミドをＰｓｔＩ及びＳｍａＩで切断することにより１．９ｋｂ遺伝子フラグメントＤ６Ｒ  ｏｒｆをｐＣＲ−Ｄ６Ｒから分離し、強制クローニングによってベクターｐＳＶＭＣＳ＃５１（Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ、前出文献）内に連結してプラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒを形成した。部位ＰｓｔＩ及びＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＤ６−１（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧ  ＡＡＴＡＣＣＧＧＡＡ  ＴＴＡＴＡＧＡＴＴＴ−３’）（配列番号：２１）及びｏＤ６−２（５’−ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴ  ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡ  ＣＣＡＣＧＴＴ−３’）（配列番号：２２）によって導入した。ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ遺伝子フラグメントをＳｍａＩ−ＣｌａＩ切断ｐＳＶ−Ｄ６Ｒに連結して、発現プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨを形成した。第８図参照。
プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨでは、Ｄ６Ｒ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例１に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を有する融合遺伝子である。補完性細胞系を構築するためのトランスフェクション及びスクリーニング操作は実施例３と同じである。
欠陥ウイルスｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧの構築
ウイルスｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧを第９図に簡単に示すようにクローニングした。Ｄ６Ｒ  ｏｒｆの両側のフランキング領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．６ｋｂ）をＰＣＲ仲介法によって増幅し、プラスミドｐＣＲII内にサブクローニングしてそれぞれｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ及びｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｒを得た。Ｄ６Ｒ  ５’フランキング領域の増幅のためのＰＣＲプライマーは、ｏＤ６−３（５’−ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＴＣＧ−３’）（配列番号：２３）及びｏＤ６−５（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＴＧ  ＡＧＣ−３’）（配列番号：２４）である。Ｄ６Ｒ  ３’フランキング領域用のプライマーはｏＤ６−４（５’−ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣ−３’）（配列番号：２５）及びｏＤ６−６（５’−ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＣ−３’）（配列番号：２６）である。ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ由来の０．６ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｐｅＩフラグメントとしてのＤ６Ｒ  ５’フランキング領域を、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ内でＤ６Ｒ  ５’フランキング領域のすぐ下流の部位ＳａｃＩ及びＸｂａＩの間に連結してプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓを得た。クローニング操作を更に実施するのを容易にするために、希少制限部位ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ及びＲｓｒIIを含む合成リンカーをｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓ内のＤ６Ｒフランキング領域間に連結した。該リンカーの構築に使用したオリゴヌクレオチドはｏＡ８−１１及びｏＡ８−１２である。実施例３参照。そのためにプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓをＳａｌＩで直線化し、クレノーポリメラーゼで処理し、ＭｕｎＩで切断する（前記二つの制限部位はそれぞれＰＣＲプライマーｏＤ６−５及びｏＤ６−６によって導入する）。その結果得られたプラスミドｐｄＤ６Ｒを、実施例１に記載のプラスミドｐＬＧｂ由来の３．９ｋｂ  ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧを形成する。この構築物では、相同的組換えに起因する補完性細胞系による欠陥ウイルスの救出を防止するために、Ｄ６Ｒ  ｏｒｆを完全に欠失させる。
ｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６ＲＦ−ＺＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入する。プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧはＣＶ−１細胞内でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えに使用する。まず、５×１０6個のＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキュベートし、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトランスフェクションし（前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの方法）、３日間増殖させる。その結果、野生型ウイルス（ヘルパー）と欠陥ウイルスとを含む未精製ストックが得られる。欠陥ウイルスの純粋ストックを得るために、欠陥ウイルスを補完することができるＶ−Ｄ６Ｒ−細胞内でプラークアッセイを実施する。ウイルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１９８８）、前出文献）及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，前出文献）の存在下でＶ−Ｄ６Ｒ細胞上でのプラークアッセイに使用する。プラーク精製は１０回繰り返す。精製した欠陥ウイルスをより大量に増殖し、サザンブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞上及び野生型細胞上での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査では、欠陥ウイルスが非病原性であることが確認される。
実施例５：Ｊ１Ｒ遺伝子産物を欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧ）及び補完性細胞系の構築
ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ｊ１Ｒ）の構築
最初のステップは大腸菌におけるＪ１Ｒ  ｏｒｆの発現であった（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＲＳＥＴ−ベクター系を使用）。まず、プライマーｏＪ１Ｒ−１（５’−ＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣ  ＡＣＡＡＣＣＡＧＴＡ  ＴＣＴＣＴＴ−３’）（配列番号：２７）及びｏＪ１Ｒ−２（５’−ＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡ  ＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＴＴＣＡＣＴＴＴＡ−３’）（配列番号：２８）を用いて得たＪ１Ｒ  ＰＣＲ産物をｐＣＲIIベクター内にクローニングすることによりプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒを構築した。次いで、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＲＳＥＴ−Ｂ内に挿入して大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｊ１Ｒを形成した（第１０図）。このプラスミドを使用すると、Ｊ１Ｒタンパク質が大量に得られた。このタンパク質は特に、ウサギ体内では免疫原性ではなかった。このようにして、永久細胞系内でタンパク質を更に同定するための抗体を、合成Ｊ１Ｒペプチドと担体タンパク質ＫＬＨとの結合体に対して得た。Ｊ１Ｒタンパク質のアミノ酸位置１１８〜１３２に対応するアミノ酸配列ＳＬＡＴＴＡＩＤＰＩＲＹＩＤＰを有する合成ペプチドをＫＨＬ（米国Ｐｉｅｒｃｅ社の予備活性化ＫＬＨ）に結合した。完全フロイントアジュバント中の精製結合体を用いてウサギを免疫感作した（投与当たり１００ｍｇのタンパク質、ｓ．ｃ．及びｉ．ｍ．）。１ケ月後、同量の投与量で動物を追加刺激し、抗体の発生をウェスタンブロットで観察した。
タンパク質はウェスタンブロットで検出する。ウェスタンブロットは本質的に前出のＴｏｗｂｉｎらの方法で実施する。第一抗体はウサギ抗Ｊ１Ｒタンパク質抗体であり、希釈率１：１００で使用する。第二抗体はアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用する。試薬（ＢＣＩＰ及びＮＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）のものである。
ベロ細胞内に形質転換するための発現プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨ（第１１図）を得るために、完全Ｊ１Ｒ遺伝子をコードする０．５ｋｂ  ＮｃｏＩ−ＳｍａＩ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒから分離した。部位ＮｃｏＩ及びＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＪ１Ｒ−１及びｏＪ１Ｒ−２（前出）によって導入した。このフラグメントをＢｂｓＩ切断発現ベクターｐＳＶ−Ｂｂｓ内に連結した（実施例１参照）。ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ遺伝子をＳｍａＩ−ＣｌａＩ切断ｐＳＶ−Ｊ１Ｒに挿入して、ｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨを形成した。第１１図参照。プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨではＪ１Ｒ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例１に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子である。
前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの方法でプラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトランスフェクションし、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン）中でインキュベートし、更に実施例１の記載のように処理した。永久ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ陽性細胞系を抗生物質ハイグロマイシンＢの存在下で選択した。５回の継代後に、Ｊ１Ｒ遺伝子の０．５ｋｂセグメントに特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲにより、外来ＤＮＡの組込みを確認した。ウェスタンブロットを用いて、目的の遺伝子、Ｊ１Ｒタンパク質が発現されたかどうかを調べる。最も高いレベルのＪ１Ｒタンパク質を発現する細胞系の特性をサザンブロットで検査し、補完性細胞系として使用し、Ｖ−Ｊ１Ｒと名付ける。
欠陥ウイルスｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧの構築
ウイルスｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ−ＺＧを第１２図に簡単に示すようにクローニングした。Ｊ１Ｒ  ｏｒｆと約０．５ｋｂの両側のフランキング配列とを含む１．５ｋｂ遺伝子フラグメントをＰＣＲによってワクシニアウイルス（ＷＲ株）から増幅し、プラスミドｐＣＲII中にサブクローニングしてｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆを得た。
ＰＣＲプライマーは、ｏＪ１−３（５’−ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ−３’）（配列番号：２９）及びｏＪ１−４（５’−ＣＧＡ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＡＣＣ−３’）（配列番号：３０）であった。完全Ｊ１Ｒ遺伝子と隣接チミジンキナーゼ遺伝子の最初の４０個のヌクレオチドとを欠失させる操作もＰＣＲ仲介法で実施した。欠失すべき配列を除く完全プラスミドｐＣＲ−Ｊ１ＲｆをＰＣＲで増幅して６ｋｂ産生物を得た。ＰＣＲ産物をポリヌクレオチドキナーゼ処理し、次いで再連結することにより、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ｆｌａｎｋｓを形成した。この反応に使用したプライマーｏＪ１−５（５’−ＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡ  ＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡ  ＡＧＡＡＣＡＴＣＧ−３’）（配列番号：３１）及びｏＪ１−６（５’−ＣＡＧＴＴＡＡＣＴＴ  ＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡ  ＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴ−３’）（配列番号：３２）は制限部位ＭｕｎＩ及びＨｐａＩを導入する。プラスミドをこれらの部位で開裂し、リンカー（実施例３に記載のｏＡ８−１１及びｏＡ８−１２）を挿入してｐｄＪ１Ｒを得た。実施例３と同様に、ｌａｃＺ−ｇｐｔ二重マーカーカセットをｐｄＪ１ＲのＳｍａＩ部位に連結して、組換えベクターｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ−ＺＧを形成した。（このプラスミドのみが、欠陥ウイルスへの隣接Ｌ５Ｒ  ｏｒｆの組込みに必要なＪ１Ｒ遺伝子の４０個の塩基対を５’末端に含む。）
ｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ＺＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入した。プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ−ＺＧはＣＶ−１細胞中でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えに使用した。まず、５×１０6個のＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキュベートし、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトランスフェクションし（前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの方法）、３日間増殖させた。
この操作の結果、野生型（ヘルパー）ウイルスと欠陥ウイルスとを含む未精製ストックが得られた。欠陥ウイルスの純粋ストックを得るために、欠陥ウイルスを補助することができるＶ−Ｊ１Ｒ−細胞中でプラークアッセイを実施した。ウイルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１９８８）、前出文献）及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，前出文献）の存在下でＶ−Ｊ１Ｒ細胞上でのプラークアッセイに使用し、これと交互にＢＵｄＲ（Ｍａｃｋｅｔｔら、前出文献）の存在下でｔｋ陰性Ｖ−Ｊ１Ｒ細胞上でのプラークアッセイを行った。プラーク精製は１０回繰り返す。精製した欠陥ウイルスをより大量に増殖させ、サザンブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞上及び野生型細胞上での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査では、欠陥ウイルスが非病原性であることが確認される。
実施例６：Ｈ４Ｌ遺伝子産物を欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧ）及び補完性細胞系の構築
補完用にはＨ４Ｌ  ｏｒｆを選択する。なぜなら、条件致死温度感受性突然変異がこの遺伝子に対しマッピングされているからである。Ｓｅｔｏら，前出文献。
ヘルパー細胞系Ｖ−Ｈ４Ｌの構築ステップは一般的には実施例３の細胞系Ｖ−Ａ８Ｌの構築と同じである。まず、Ｈ４Ｌ  ｏｒｆをＰＣＲ仲介法でプラスミドｐＣＲII（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングした。得られたプラスミドは、第１３図に示すようなベロ細胞発現ベクターｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨを構築するためのＨ４Ｌ遺伝子フラグメントの由来源である。永久細胞系内でＨ４Ｌ遺伝子産物（ＲＡＰ９４）を同定するための抗体を、合成ペプチドのＫＬＨ結合体に対して得る。前記結合体は、Ｈ４Ｌ  ｏｒｆのアミノ酸位置２４２〜２５８に対応する合成ペプチドＫＩＹＫＮＳＦＳＥＤＨＮＮＳＬＤ（Ｋａｎｅ及びＳｃｈｕｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５７５２−６２（１９９２））を活性化ＫＬＨ（ＫＬＨ結合キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に結合することによって製造した。この結合体を、実施例５と類似の抗Ｈ４Ｌ抗体の産生に使用した。
ベロ細胞発現ベクターを構築するために、プライマーｏＨ４−１（５’−ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴ−３’）（配列番号：３３）及びｏＨ４−２（５’−ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＡ  ＣＴＣ−３’）（配列番号：３４）を用いてＰＣＲによりＨ４Ｌ−ｏｒｆを２．４ｋｂフラグメントとして増幅し、ｐＣＲII内にクローニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌを形成した。発現プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨは下記のように構築した：プラスミドをＮｃｏＩ及びＳｍａＩで切断してｐＣＲ−Ｈ４ＬからＨ４Ｌ  ｏｒｆを２．４ｋｂ遺伝子フラグメントとして分離し、強制クローニングによってベクターｐＳＶ−Ｂｂｓ（実施例１参照）に連結してプラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌを得た。部位ＮｃｏＩ及びＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＨ４−１及びｏＨ４−２によって導入した。ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ遺伝子フラグメントをＳｍａＩ−ＳａｌＩ切断ｐＳＶ−Ｈ４Ｌに連結して発現プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨを形成した。第１３図参照。
プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨではＨ４Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例１に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子である。補完性細胞系を構築するためのトランスフェクション及びスクリーニング操作は実施例３に記載のように、但しＨ４Ｌに特異的な試薬を用いて実施した。
欠陥ウイルスｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧの構築
ウイルスｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌｆ−ＺＧを第１４図に簡単に示すようにクローニングした。Ｈ４Ｌ  ｏｒｆの両側のフランキング領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．６ｋｂ）をＰＣＲ仲介法によって増幅し、プラスミドｐＣＲII内にサブクローニングして、それぞれｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌ及びｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｒを形成した。
Ｈ４Ｌ  ５’フランキング領域を増幅するためのＰＣＲプライマーは、ｏＨ４−３（５’−ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡ  ＧＡＴ  ＣＧＣ−３’）（配列番号：３５）及びｏＨ４−５（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＡＧ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＧＧＡ−３’）（配列番号：３６）である。Ｈ４Ｌ  ３’フランキング領域を増幅するためのＰＣＲプライマーは、ｏＨ４−４（５’−ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧ−３’）（配列番号：３７）及びｏＨ４−６（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＣＧＣ  ＡＴ−３’）（配列番号：３８）である。ｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｒ由来の０．５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＳｐｅＩフラグメントとしてのＨ４Ｌ  ３’フランキング領域を、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ内のＨ４Ｌ  ５’フランキング領域のすぐ下流の部位ＳａｌＩ及びＸｂａＩ間に連結して、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌａｎｋｓを形成した。
クローニング操作を更に実施するのを容易にするために、希少制限部位ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ及びＲｓｒIIを含む合成リンカーをｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌａｎｋｓのＨ４Ｌフランキング領域間に連結した。リンカーの構築に使用したオリゴヌクレオチドはｏＡ８−１１及びｏＡ８−１２である。次いでプラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌａｎｋｓをＭｕｎＩ及びＨｐａＩで直線化した（これら二つの部位はそれぞれＰＣＲプライマーｏＨ４−５及びｏＨ４−６によって導入する）。得られたプラスミドｐｄＨ４Ｌを実施例１に記載のプラスミドｐＬＧｂに由来する３．９ｋｂ  ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ−Ｈ４Ｌｆ−ＺＧを形成した。この構築物では、相同的組換えに起因する補完性細胞系による欠陥ウイルスの救出を回避するために、Ｈ４Ｌ  ｏｒｆを完全に欠失させる。
ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え及びプラーク精製によるｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧウイルスの構築は実施例１に記載の方法で実施する。
実施例７：熱ショック誘導性Ｉ７Ｌ機能を有する補完性細胞系の構築
ワクシニア宿主タンパク質遮断（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）の効果は細胞の種類毎に異なる。これは補完の効果に影響を及ぼし、従って欠陥ウイルスの純粋ストックを得るのに必要なプラーク精製量と宿主細胞系で得ることができる力価とを決める。補完をより効果的にするために、補完機能をコードする必須読取り枠を７０ｋｄヒト熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）遺伝子（Ｈｕｎｔ＆Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，前出文献）のプロモーターの下流にクローニングする。Ｈｓｐ７０遺伝子の転写はワクシニア感染によって誘導され、Ｈｓｐ７０をワクシニアビリオン組み立てに使用することが提案された（Ｊｉｎｄａｌ及びＹｏｕｎｇ、前出文献）。
最初のステップはＰＣＲ法によるＨｓｐ７０プロモーターのクローニングである。オリゴヌクレオチドｏＨＳ−１、５’−ＴＡＣＧＴＡＴＧＧＡ  ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ  ＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：３９）及びｏＨＳ−２、５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴ  ＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴ  ＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣ  ＧＧ−３’（配列番号：４０）を、ヒトＨｓｐ７０プロモーター配列を得るための鋳型として、ヒトＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）と一緒に使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲIIベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｈｓｐを形成する。ＳｎａＢＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメントを用いてプラスミドｐＳＶ−Ｂｂｓ（実施例１参照）内のＳＶ４０プロモーターを置換すると、このプラスミド内に存在するＳＶ４０イントロンの除去後にプラスミドｐＨＳが得られる。このベクターは、ｐＳＶ−Ｉ７Ｌ（実施例１）のＮｃｏＩ−ＳｍａＩフラグメントをｐＨＳに連結することによりＩ７Ｌのような読取り枠を挿入してプラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌを形成するために使用する。第１５図参照。
補完性細胞系を構築するために、同時形質転換操作（Ｗｉｇｌｅｒ、前出文献）を実施する。ベロ細胞内へのトランスフェクションの実験で、適当な選択マーカー、例えばプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ上に存在するネオマイシン耐性遺伝子（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））をプラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌと一緒に使用する。細胞をＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂの前述の方法でトランスフェクションし、抗生物質Ｇ４１８を含む選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８）中でインキュベートする。１０〜１４日後、コロニーが観察できるようになる。これらのコロニーを増殖させ、２回サブクローニングし、次いで更に特性を調べる。細胞系の特性をＰＣＲ分析で更に検査し、補完性遺伝子構築物の存在を調べる。特性ウェスタンブロットを用いて、目的の遺伝子、Ｉ７Ｌ−タンパク質が誘導時に発現されることを明らかにする。最終補完性細胞系をＶＨｓｐ−Ｉ７Ｌと名付ける。この細胞系の特性を実施例１の方法で調べる。欠陥ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧ／Ｈｓｐの構築は、ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧについて実施例１で説明したように行う。但し補完には細胞系ＶＨｓｐ−Ｉ７Ｌを使用し、プラーク精製は５回だけ行って欠陥ウイルスを得る。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
0003911010.tif 000005
配列番号：３
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
0003911010.tif 000006
配列番号：４
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
0003911010.tif 000007
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：７
配列の長さ：６３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：８
配列の長さ：６３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：９
配列の長さ：４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：４５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：５０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：４３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：４３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：１９
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２０
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２２
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３０
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３１
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３２
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３４
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３６
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３８
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：３９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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配列番号：４０
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
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【図１】
0003911010.tif 000044
【図２】
0003911010.tif 000045
【図３】
0003911010.tif 000046
【図４】
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【図５】
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【図６】
0003911010.tif 000049
【図７】
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【図８】
0003911010.tif 000051
【図９】
0003911010.tif 000052
【図１０】
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【図１１】
0003911010.tif 000054
【図１２】
0003911010.tif 000055
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0003911010.tif 000058