(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物によるリガンド／受容体相互作用または酵素触媒反応の阻害の程度を決定すること、又は標的分子への該化合物の結合の程度を決定することを目的とする複数の該化合物の迅速スクリーニングのための高効率検定法であって、
（ａ）試験対象である該化合物を
（１）リガンド及び受容体、
（２）酵素及び該酵素の基質、又は
（３）標的分子、
と接触させる工程であって、そこでは一つ以上の該試験化合物による阻害又は結合が、該リガンド及び受容体（それらの一方が標識されている）の相互作用により、
該酵素と該酵素の基質（それらの一方が標識されている）の相互作用により、又は
標識された試験化合物と該標的分子の相互作用により、
懸濁可能な細胞又は固体支持体に結合した光学的に検出可能な標識の量の変化を惹起するものであり、
（ｂ）個々の細胞又は固体支持体に結合した該光学的に検出可能なシグナルの量を共焦点顕微鏡の使用により測定し、該量を該細胞又は固体支持体に結合していない該検定法におけるバックグラウンドシグナルの量と比較し、そして該結合シグナルと該バックグラウンドシグナルの間の差から阻害又は結合の該程度を決定することにより、阻害又は結合の該程度を決定する工程、を含んで成る方法。
【請求項２】
酵素阻害剤に対する検定を含むものである請求項１に記載の検定法。
【請求項３】
受容体結合の阻害剤に対する検定を含むものである請求項１に記載の検定法。
【請求項４】
該受容体が該リガンドに結合する受容体ドメインからなるものである請求項３に記載の検定法。
【請求項５】
該光学的に検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光性標識、及び可視光の変化を生じさせる酵素からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の検定法。
【請求項６】
該リガンドが蛍光標識されているものである請求項１に記載の検定法。
【請求項７】
該化合物が蛍光標識されているものである請求項１に記載の検定法。
【請求項８】
溶液中の酵素及び化合物が、懸濁可能な固体支持体に付着している蛍光的に標識されている基質とインキュベートされる検定を含むものである請求項２に記載の検定法。
【請求項９】
酵素及び蛍光的に標識された基質が、該酵素／基質反応の反応生産物に特異的に結合する部分で被覆されている懸濁可能な固体支持体とインキュベートされ、そして該反応生産物が蛍光的に標識されるものである請求項２に記載の検定法。
【請求項１０】
該受容体が標識を付されそして該リガンドが該懸濁可能な固体支持体に結合するものである請求項１に記載の検定法。
【請求項１１】
該共焦点顕微鏡検査が共焦点レーザー走査顕微鏡検査である請求項１に記載の検定法。
【請求項１２】
該共焦点顕微鏡検査がニプコウディスク（Nipkow disc）を用いるものである請求項１に記載の検定法。
【請求項１３】
該化合物が酵素及び基質と接触し、そして該酵素への結合、該基質への結合、酵素と基質の複合体への結合、及び酵素と生産物の複合体への結合より成る群から選択される１機構により阻害するものである請求項１記載の検定法。
【請求項１４】
懸濁可能な細胞又は固体支持体上に含まれる標的分子への蛍光標識されたリガンドの結合の阻害を目的として複数の化合物を迅速スクリーニングするための高効率検定法であって、
（ａ）該化合物の存在下に該蛍光標識されたリガンドを該懸濁可能な細胞又は懸濁可能な固体支持体上に含まれる該標的分子と接触させる工程、
（ｂ）個々の細胞又は固体支持体に結合する蛍光標識されたリガンドの量を共焦点顕微鏡検査により測定することにより該結合の阻害の程度を決定する工程、
（ｃ）該量を、該細胞又は固体支持体と結合していない該検定中の蛍光と比較する工程、及び
（ｄ）該相違を該阻害の程度と相関させる工程、を含んで成る方法。
【請求項１５】
該標的分子が受容体又は受容体ドメインである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該受容体又は受容体ドメインが懸濁された細胞の表面に含まれるものである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該標的分子が懸濁可能な固体支持体に付着しているものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
該懸濁可能な固体支持体が５０μｍより小さな直径をもつものである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該懸濁可能な固体支持体が１０μｍより小さくそして１μｍより大きな直径をもつものである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
リガンドと細胞表面受容体又は受容体ドメインの間の結合の阻害を目的として化合物ライブラリーをスクリーニングするための均一検定法であって、
（ａ）該細胞表面受容体又はドメインを発現する細胞の液体懸濁液を複数の容器に加える工程、
（ｂ）該阻害のためにスクリーニングされる化合物のライブラリーを該複数の容器に添加する工程、
（ｃ）該受容体に対する蛍光標識リガンドを該容器に添加する工程、
（ｄ）該細胞、該化合物、及び該蛍光標識リガンドをインキュベートする工程、
（ｅ）共焦点顕微鏡検査により該容器中の該細胞と結合している蛍光の量を個々に測定する工程、及び
（ｆ）一つ以上の化合物による該受容体への該リガンドの結合の阻害の程度を決定する工程、を含んで成る方法。
【請求項２１】
該インキュベーションの後でそして該測定の前に、７５％より多くの該細胞が該容器の容積の２５％より少ない場所に沈着するように、該細胞を該容器中に沈着させるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該インキュベーションの後でそして該測定の前に、９０％より多くの該細胞が該容器の容積の１０％より少ない場所に沈着するように、該細胞を該容器中に沈着させるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該化合物が６００ｎｍより長波長で蛍光を発する官能基部分で蛍光標識されているものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該容器が一つ以上のミクロタイタープレート中のウエルを含むものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
該容器が１μｌ以下の検定溶液を含むものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
リガンドと懸濁可能な固体支持体に付着した標的分子の間の結合の阻害を目的とする化合物ライブラリーのスクリーニングのための均一検定法であって、
（ａ）該懸濁可能な固体支持体に付着した該標的分子の液体懸濁液を複数の容器に添加する工程、
（ｂ）該阻害についてスクリーニングすべき複数の化合物を該複数の容器に添加する工程、
（ｃ）蛍光的に標識されたリガンドを該容器に添加する工程、
（ｄ）固体支持体に付着した該標的分子、該化合物、及び該蛍光的に標識されたリガンドをインキュベートする工程、
（ｅ）共焦点顕微鏡検査により該固体支持体と結合している蛍光の量を個々に測定する工程、及び
（ｆ）該リガンドの該標的分子への結合の、該化合物の一つ以上による阻害の程度を決定する工程、を含んで成る方法。
【請求項２７】
該インキュベーションの後でそして該測定の前に、該細胞の７５％より多くが該容器の容積の２５％より少ない場所に沈着するように該固体支持体を該容器に沈着させるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該インキュベーションの後でそして該測定の前に、該細胞の９０％より多くが該容器の容積の１０％より少ない場所に沈着するように該固体支持体を該容器に沈着させるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該化合物が６００ｎｍより長波長で蛍光を発する官能基部分で蛍光的に標識されているものである請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
該容器が一つ以上のミクロタイタープレート中のウエルを含むものである請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
該容器が１μｌ以下の検定溶液を含むものである請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
リガンドと懸濁し得ない固体支持体に付着した標的部分との間の結合の阻害を目的として化合物のライブラリーをスクリーニングするための均一検定法であって、
（ａ）該阻害についてスクリーニングすべき複数の化合物を該懸濁し得ない固体支持体を含む容器に添加する工程、
（ｂ）蛍光的に標識したリガンドを該容器に添加する工程、
（ｃ）該懸濁し得ない固体支持体に付着した該標的部分、該化合物、及び該蛍光標識したリガンドをインキュベートする工程、
（ｄ）共焦点顕微鏡検査により該固体支持体と結合している蛍光の量を測定する工程、及び
（ｅ）該標的部分への該リガンドの結合の、該化合物の一つ以上による阻害の程度を決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項３３】
該容器がミクロタイタープレート中のウエルを含み、そして該懸濁し得ない固体支持体が該プレート中のウエルの底を含むものである請求項３２に記載の検定法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、標的分子との相互作用を目的とする化学化合物の高処理量スクリーーニングに関する。
発明の背景
薬の発見プログラム用の先導化合物を見出すために、多数の化合物が、酵素阻害剤又は受容体アゴニスト／アンタゴニストとしてのそれらの活性についてスクリーニングされることがしばしばある。化合物の大きなライブラリーがこのようなスクリーニングには必要とされる。この分野での発展の結果として、現在、スクリーニング用に何百又は何千もの小分子を含む組合せライブラリー（combinatorial libraries）を同時に生産することが可能である。しかしながら、このようなライブラリーが利用可能になったので、大きなスケールの迅速スクリーニング法に対する必要性が生じてきた。
例えば、該ライブラリーは、各化合物がピコモル量で存在するミクロビーズ上に含有されていてもよい。化合物の量が非常に少ないので、非常に小さい容量で、例えば、１μｌのオーダーで、高処理量スクリーニング法を行なうのが有利である。このような検定法は、１９９７年２月１８日に出願された米国特許出願第６０／０３７，６３６号に記載された１５３６穴プレートで行なうことができる。しかしながら、このような小容量での微量検定は、従来の方法を用いて正確にかつ反復して行なうことが困難である。
高処理量スクリーニングに使用される受容体結合検定は、通常三つの工程を含んでいる。第１に、標識したリガンドを、リガンド／受容体結合の阻害について試験される化合物の存在下で標的受容体とインキュベートする。第２に、受容体及びリガンド（及び化合物）を、固定された受容体の濾過及び／又は洗浄を用いて分離する。最後に、受容体に結合した標識リガンドの量を定量する。この従来のスクリーニング法は、「分離−様式」検定法、すなわち、濾過膜を用いるか、又は結合成分もしくは遊離の成分の、ある表面（例えば、ミクロタイタープレートの表面）への選択的接着を用いるかのいずれかで、結合したリガンドを遊離のリガンドから物理的に分離する検定法である。
しかしながら、分離は時間がかかるので、高処理量スクリーニングを遅らせる。用いる流体の操作工程が十分に正確でないときは、分離は、その検定法で発生するシグナルに変化を引き起こすことも可能であり、平衡結合条件を攪乱することもできる。さらに、分離は、自動化することが困難であり、放射性物質を含む場合は潜在的に有害である。これらの問題は、少量の試験化合物を用いて微量の容量で行なわれる検定法においては特に深刻である。
したがって、均一検定法、すなわち、分離の必要性を排除する検定法において結合したリガンドと遊離のリガンドを区別することは、高処理量スクリーニングに有利である。大スケールの組合せライブラリーのスクリーニングに特に役立つためには、かかる検定法は、用いられる試験化合物の小容量及び少量を容易に可能にするものであるべきである。
発光物質（scintillant）を含浸させたビーズ（これらはシンチレーション・プロキシミティー・アッセイ・ビーズ（ＳＰＡTM、アマシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ州）として市販されている）を用いる均一検定法が米国特許第４，５６８，６４９号に記載されている。このビーズは、試料中の放射性標識された標的と結合することができるリガンドでも被覆されている。このリガンドが放射性標識された標的に結合すると、ビーズ上の発光物質は、放射性標識により活性化される。発光物質により発生した光エネルギーのレベルは、試料中の結合した標識化標的の量を示す。しかしながら、この方法は、放射性試薬の操作を必要とし、多少感度に制限がある。
標識されたリガンドと標識された標的が相互作用する場合にシグナルが発生するもう一つの均一検定法が知られている。一方の標識は、より長寿命の蛍光励起状態を持つエネルギー供与性Ｅｕ−クリプテートであり、他方は、短い蛍光励起状態を有するエネルギー受容性タンパク質であるアロフィコシアニンである。エネルギーの転移は、７ｎｍより少なくしか離れていない場合にこれらの標識間で起こる。検定の間、Ｅｕ−クリプテートはパルスレーザーで励起され、その蛍光放射はアロフィコシアニンを連続的に再励起する、そしてその蛍光は時間設定型蛍光測定器で測定される。しかしながら、この方法は、リガンドと標的の両方の標識を必要とし、いくつかの他の市販の検定法ほど感度が良くない。また、アロフィコシアニンは非常に大きな多量体タンパク質であり、予想できない仕方でこの検定法に影響を及ぼしうる。
蛍光イメージングプレートリーダーを用いて、膜電位及び細胞内カルシウムを測定する、細胞に基づく動力学的検定法における光学的スクリーニングが行なわれている。この検定法は、検定用のウエルの底に向けたＣＣＤカメラにより測定する視野の深さを限定する光学的方法を用いる。ここでは、生存している接着細胞層内の蛍光が測定される。細胞層の視野の深さを限定することにより、細胞外色素由来のバックグラウンド蛍光が低減される。データは、経時的測定、例えば、細胞の脱分極にわたって得られる（シュレーダー（Schroeder）ら、（1996）Journal of Biomolecular Screening 1: 75-80）。しかしながら、この方法は、迅速な細胞事象を引き起こすために複雑に調整された液体の操作を必要とする検定の間中維持を必要とする生きた細胞を使用する。このような操作は、少量のライブラリー化合物の高処理量スクリーニングで使用される微小容量で行なうためには、不可能でないとしても、非常に困難である。また、大きな試料、すなわち、細胞層全体が測定されるので、この検定法は、個々の懸濁細胞に結合した蛍光とバックグラウンドの蛍光とを区別しない。
したがって、本発明の目的は、分離工程を必要としない、すなわち、均一な高処理量スクリーニングのための検定法を提供することにある。
本発明の別の目的は、放射性廃棄物の発生を回避し、リガンドと標的分子の両方の標識化を避けることにある。
本発明の別の目的は、微小容量での小型化に容易に適応可能なそして高感度な検定法を提供することにある。
本発明の別の目的は、ピコモル量の化合物を表面に有するビーズの組合せライブラリーで見られるような少量の化合物の活性を検出するための高処理量スクリーニング法を提供することにある。
発明の概要
本発明は、多数の化合物の迅速スクリーニングのための高処理量検定法に関する。この検定法は、リガンド／受容体相互作用又は酵素触媒反応の、化合物による阻害の程度、又はライブラリー化合物の標的分子への結合の程度を決定する。ライブラリー化合物による阻害（又は結合）は、懸濁可能な細胞又は懸濁可能な固体支持体のいずれかに結合する光学的に検出可能な標識の量の変化を惹起する。阻害（又は結合）の程度は、個々の細胞又は固体支持体に結合している標識の量を顕微鏡検査により、測定することにより、決定される。これらの量を、個々の細胞又は固体支持体に結合しない標識の量（すなわち、バックグラウンドシグナル）と比較する。阻害又は結合の程度は、このデータを用いて決定される。測定は共焦点顕微鏡を用いて行なうことが好ましい。結合した標識の量は、個々の細胞又は固体支持体の走査により区別されるので、この検定法は均一である、すなわち、未結合標識を除去するための分離工程を必要としない。この方法は、小容量かつ少量の試験化合物を用いる検定法では例外的な感度及び高処理量を得ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜１Ｄは、蛍光標識したリガンドに結合する表面受容体を有する細胞懸濁物を用いる本発明の態様の図式的描写である。活性なライブラリー化合物は、細胞に結合している蛍光を阻害し、個々の細胞で測定されるシグナルの減少を惹き起こす。
図２は、活性なライブラリー化合物が存在しない場合に、検定培地中で蛍光標識リガンドに結合する標的分子により表面が被覆されているビーズを用いる本発明の態様の図式的描写である。
図３は、Ｃｙ５−ＮＫＡのＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ細胞への結合について計算された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。
図４は、Ｃｙ５−ＮＫＡのＳＲ４８．９６８による置換について対照のパーセントとして計算された、細胞と結合した蛍光を示すグラフである。
図５は、蛍光標識ＩＬ−８の未標識ＩＬ−８による置換に対して得られたＦ値のグラフである。
発明の詳細な説明
本明細書に列挙されたすべての特許出願、公報その他の参考文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は、活性な薬物候補を決定するために、組合せライブラリーに見出されるもの等の化合物の高処理量スクリーニングを可能にする。この方法は、このようなライブラリーのスクリーニングに要する時間を、非不均一法が要する時間よりも実質的に減少させる。また、それは、洗浄した反応物の廃棄の必要性をも排除し、微容量検定容器での実行に高度に適応可能である。さらに、この方法は、より高いシグナル対ノイズ比の点でそして一つの標識のみの使用を必要とする点で、従来の均一検定法を改良する。それは、ミクロビーズライブラリーに由来する非常に少量の化合物のスクリーニングを成功させる高感度検定法を提供することにより、それらのミクロビーズを用いるさらなる検定法及びより速くより効果的なスクリーニングを可能にする。
本発明の方法は、顕微鏡使用による検定法において結合したシグナルと遊離のシグナルの量の測定を含んでいる。これは、例えば、狭い焦点深度を用いる従来の顕微鏡を使用して、試料中の異なる深さを順次観察することにより行なうことができる。しかしながら、本発明の好ましい方法によれば、個々の細胞のサイズの粒子に対して結合しているシグナルの量を個々に決定するために、共焦点顕微鏡検査が用いられる。
共焦点顕微鏡検査は、照射した対象物又は試料の検出を薄い対物平面に制限する。対象物又は試料の「スライス」の観察が得られる。これは、例えば、対物レンズと検出器との間に位置する像の平面中にピンホール等の空間フィルターを置くことにより達成される。対物平面に近い狭い領域から発せられた光のみが、空間フィルターを通過して収束する。他の水平面からの光は、フィルターによりブロックされる。例えば、「スライス」を得るためには視野の点を順に走査することにより、対物平面の像が得られる。
本発明に使用するには、レーザー走査を用いる共焦点顕微鏡が特に好ましい。適当なレーザー走査顕微鏡は、バイオメトリックイメージング社（マウンテンビュー、カルフォルニア州）により「ＩＭＡＧＮ／２０００」として市販されている。また、レーザー走査顕微鏡は、米国特許第５，５５６，７６４号及び第５，５４７，８４９号にも記載されている。これらの顕微鏡は、蛍光抗体により標識された細胞数を決定するために、毛細管内で血液を分析するのに慣用されている。
非レーザー走査顕微鏡はよく知られており、本発明を実施するためにも使用することができる。例えば、所望ならばＮｉｐｋｏｗディスクの回転を用いる共焦点顕微鏡又は類似の配置を使用することができる。このような顕微鏡は、例えば、ディクソン（Dixon）（1996）Nature, 383:760、ジャスカイティス（Juskaitis）ら（1996）Nature, 383:804、ペトラン（Petran）ら（1968）J. Opt. Soc. Am. 58, 661、及びシャウ（Xiao）ら（1988）Appl Phys. Lett. 53:716に記載されている。
また、有用な共焦点顕微鏡は、例えば、米国特許第５，０３２，７２０号、第５，１２０，９５３号、第５，２６０，５７８号、第５，３０４，８１０号、第５，２８３，６８４号、第５，３５１，１５２号及び第５，１６２，９４６号にも記載されている。
本発明の方法によれば、共焦点顕微鏡検査により得られたデータを分析して、個々の懸濁細胞又は固体支持体に結合するシグナルとバックグラウンドシグナルとの差を決定し、阻害又は結合の尺度を得る。例えば、ＣＤ４＋細胞の計数用に慣用されている共焦点顕微鏡検査は、この決定又は化合物の高処理量スクリーニングに関係しない。
蛍光標識及び化学発光標識を含むいかなる所望の光学検出標識をも本発明で使用することができる。標識が化学発光の場合、短寿命のシグナルを発生することが好ましい。適当な基質の存在下で可視色の変化を生じさせる酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼも用いることができる。蛍光標識が好ましく、本発明の好ましい態様という観点から以下に記載する。しかしながら、望ましいときは、他の光学的に検出可能な標識をこれらの態様において置き換えてもよい。
一つの態様において、本検定法は、懸濁可能な細胞又は固体支持体のいずれかの表面に含まれる標的分子への蛍光標識リガンドの結合を阻害する化合物をスクリーニングする。結合阻害の程度は、共焦点顕微鏡検査により、該化合物の存在下で個々の細胞又は支持体に結合した標識リガンドの量を測定することにより決定される。
この態様では、懸濁した細胞の膜に結合した受容体は、受容体結合の阻害に関してスクリーニングするライブラリー化合物の存在下で、蛍光標識リガンドと接触させることができる。（本明細書に用いられる「受容体」という用語は、受容体全体ばかりでなく受容体ドメインをも包含するものとする。）一例として、ＩＬ−８のその細胞表面受容体への結合阻害に関してスクリーニングするライブラリー化合物を、蛍光標識したＩＬ−８の存在下で受容体を産生する細胞の懸濁物と接触させる。共焦点顕微鏡検査により調べた場合、標識したＩＬ−８に結合した細胞は、相対的に一定の「遊離」標識のバックグラウンド上で増加した蛍光の領域として出現する。細胞に結合した蛍光の量は、活性化合物がリガンドの受容体への結合を阻害する検定ではより少ない。
この態様を図１に図式的に描く。図１Ａ及び１Ｃは、受容体が蛍光標識したリガンド（「Ｆ」で付箋した黒塗り四角）に結合するので、付着した受容体（「Ｙ」）を有する細胞を示す。図１Ｃにおいて、蛍光標識したリガンドは、ライブラリー化合物（白抜きの三角）により置換される。図１Ｂ及び１Ｄは、それぞれ、活性ライブラリー化合物を有する及び有しない試料の切片から集めた蛍光を図式的に示す。バックグラウンド蛍光と比較した「スポット」の存在は、結合したリガンドを示す。一方、バックグラウンド蛍光それ自体は、遊離のリガンドから生じる。共焦点顕微鏡検査により、個々の細胞の大きさの結合した蛍光の「スポット」の測定が可能になる。遊離の蛍光性リガンドの量も同時に決定することができる。図１Ｂにおいて、細胞は、バックグラウンドよりも有意に多くの蛍光を発しているので、より強いスポットとして現れる。図１Ｄでは、活性なライブラリー化合物による置換の効果を例示する。同じ細胞が、リガンド置換の結果として減光になるか又はバックグラウンドと区別できなくなった。したがって、「結合した」シグナルの消失は、高処理量スクリーニング検定法における活性分子を示す。受容体結合検定法は、通常、過剰のリガンドを用いて行なわれるので、バックグラウンド蛍光の量は、正常では変化しない。
本発明の検定法では、この検定法での個々の細胞（又は固体支持体）と結合する蛍光の量を合計する。この合計量は、リガンドと標的との間の結合量の尺度を提供する。この量を遊離の蛍光の量と比較して、ライブラリー化合物の活性の指標値に達する（この量は、この検定法の設定され方に依存して、活性薬物候補に関して増加又は減少することがありうる）。結合（又は結合の阻害）を示す特定の値に達するための特定の方法論を、以下に記載する。バックグラウンド蛍光が各検定法において個々に測定されうるかぎり、バックグラウンド蛍光が比較的一定であることは必要でないかもしれない。
本発明の方法は、バックグラウンドノイズに対するシグナルのレベルを増加させる点で特に有利である。測定される粒子又は細胞を含む「スライス」の外側の溶液に含まれる標識からのシグナルを除くことにより、バックグラウンドノイズは有意に低下する。シグナル対バックグラウンドノイズの比は、125Ｉで標識したリガンドを用いる市販の従来の不均一（すなわち、分離に基づく）検定法の場合、本発明の方法よりも約１５倍も低いことがわかった。
本発明の方法は、沈着させておいた試料についての蛍光を測定する点で特に有効である。共焦点顕微鏡検査は、容器内の液体の「スライス」又は「切片」の正確な測定を可能にする。したがって、測定は、例えば、細胞又は固体粒子に結合した蛍光が濃縮されている試料の底部１０％で行なうことができる。これは、慣用の光学検出を用いる従来技術の検定法では不可能である。なぜなら、このような検定法では沈着した細胞又は固体粒子の上方の容積からのシグナルを除去しないからである。このシグナルの除去は本発明の方法により達成される非常に高いシグナル対ノイズ比の説明の一部となる。
懸濁細胞（又は懸濁した固体支持体）を、約７５％を越える該細胞又は支持体が測定容器の容積の約２５％より少なく、すなわち、細胞又は支持体の層が底の上で形成されるように約１０分間又はそれ以上沈着させておくことが好ましい。９０％を越える細胞又は支持体を、該容器の容積の約１０％より少なく沈着させることが最も好ましい。一つの好ましい態様では、細胞又は支持体の層の厚さは、共焦点対物平面の厚さとほぼ同じである。沈着に要する時間は、カラムの高さの関数であり、例えば、１５３６穴プレート内の試料よりも９６穴プレート内の試料の方がより高い。
本発明の検定法においては、いかなる所望のリガンドと受容体との組合せを用いても、活性な阻害剤について試験することができる。リガンドとそれらの細胞に基づく受容体の例としては、ニューロキニンとＮＫ２Ｒ細胞、及びＩＬ−８とＩＬ−８Ｂ／ＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの受容体及びリガンドは、以下の実施例でさらに議論する。
リガンドと受容体の他の例には、インスリン／インスリン受容体、ブラジキニン／ブラジキニン受容体、エリスロポエチン／ＥＰＯ受容体及びレプチン／Ｏｂ受容体が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの検定法を行なうための細胞株が利用可能である。例えば、ＩＭ−９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５９）は、ヒトインスリン受容体を構成的に発現する。ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ７９３１）は、ブラジキニンＢ２受容体を構成的に発現し、インターロイキン−１βで刺激されてブラジキニンＢ１受容体を産生することができる。ＥＰＯ受容体を発現する細胞は、キタムラ（Kitamura）ら、J. Cellular Physiology 140: 323-334（1989）に記載されている。レプチン受容体（すなわち、ＯＢ受容体）を発現する細胞は、タータグリア（Tartaglia）ら、Cell 83: 1263-1271（1995）に記載されている。
本発明の別の態様では、標的分子を、例えばビオチン／アビジン会合を介して、懸濁可能な固体支持体に結合させ、溶液中のライブラリー化合物及び蛍光標識リガンドを該支持体と接触させる。活性化合物は、該標的から蛍光性リガンドを置換することにより支持体と結合した蛍光の減少を惹起させ、そして試験化合物の存在及び／又は能力が定量化される。支持体の蛍光の明るさは、試験化合物の能力に比例して減少する。この方法を図２に図式的に描く。
「懸濁可能な固体支持体」とは、液体に懸濁され得るいかなる固体支持体をも含むことを意図する。この支持体は、検定用ウエルの底に沈着した際に残りの溶液に光学的に接近することを妨げないように、十分小さくなければならない。他方、該支持体は、検定成分が混合された後のさらに長い期間懸濁したままでないように、十分大きくなければならない。好ましい支持体は、直径約５０μｍ未満であり、最も好ましくは直径１０μｍ未満である。支持体の直径は、共焦点対物平面の厚さよりも有意に小さくなくてもよいが、それ未満であることが好ましい。支持体は、懸濁物が検定容器の底に支持体を濃縮させるための遠心分離を必要としないように、直径１μｍより大きいことが好ましい。
好ましい懸濁可能な支持体は、ポリスチレン製の６．２μｍビーズであり、スフェロテック社（リバティービレ、イリノイ州）から市販されている。このビーズは、アビジンで被覆されており、通常ビーズ当たり１０6個の結合部位を含んでいる。しかしながら、セルロースビーズ、孔調整ガラスビーズ、シリカゲル及び他の型のポリスチレンビーズ（ジビニルベンゼンで架橋されていてもよく、ポリエチレングリコールでグラフト重合されていてもよく、又はアミノ、ヒドロキシ、カルボキシル又はハロ基で機能性高分子にされてもよい）を含むいかなる適当な懸濁可能固体支持体をも用いることができる。さらなる支持体としては、グラフトコポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、ジメチルアクリルアミドビーズ（Ｎ，Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されていてもよい）、疎水性ポリマーで被覆したガラス粒子等（すなわち、剛体表面又は半剛体表面を有する）を含む。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ2▲Ｒ▼ビーズ（ラップポリメア、チュービンゲン、ドイツ）のような、ジビニルベンゼンで架橋したポリエチレングリコールでグラフト重合したポリスチレン型ビーズを用いることができる。
固体支持体は、ヒドロラーゼ（プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼを含む）、リガーゼ（ＤＮＡ又はＲＮＡ系の）及びトランスペプチダーゼならびに抗体等の結合タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質及びこれらのタンパク質のドメインを含むいかなる所望の標的で被覆することもできるが、これらに限定されるものではない。
固体支持体上を被覆する標的（又はリガンド）は、いかなる所望の手段によってそこに結合させてもよい。例えば、それは、ビオチン化され次いでストレプトアビジン被覆支持体に非共有結合させてもよい。また、支持体を被覆させた抗体（標的に特異的なもの）に標的（又はリガンド）を結合させることも可能である。また、共有結合も当該技術分野において知られている。
支持体は、組換え技術により生産された受容体又は受容体結合ドメインで被覆してもよい。これは、細胞表面に正常では発現しない受容体又はドメインにとって特に有利である。例えば、ステロイド受容体等の核受容体を組換え技術により有利に発現させて、本発明のミクロビーズ検定法に用いる。かかる受容体の一例は、ヒト組換えエストロジェン受容体（アレクシス  バイオケミカルズ、サンジエゴ、カルフォルニア州）である。しかしながら、細胞表面受容体の場合は、受容体が結合しているビーズとは対照的に、受容体を発現する懸濁細胞を用いることが好ましい。
例えば、懸濁可能な固体支持体をリガンドで被覆し、リガンド／受容体結合の阻害のスクリーニング対象である化合物の存在下に、溶液中で標識受容体を用いて本発明の検定法を行なうことも可能である。
本発明によれば、溶液中の蛍光標識したライブラリー化合物を懸濁した細胞又は固体支持体と共にインキュベートーし、リガンドの非存在下で該化合物と細胞又は支持体との間の結合を測定することも可能である。換言すれば、この検定法は、化合物により置換されるリガンドを追加する必要がなく、細胞又は支持体上の標的分子と化合物との間の結合の直接的な尺度を提供する。
別の態様では、酵素触媒反応の阻害に関して化合物のライブラリーを検定し、個々の懸濁可能な固体支持体に結合した蛍光の量を測定して阻害の程度を決定する。例えば、かかる検定法の一例では、阻害性化合物の存在下でミクロビーズに結合した蛍光の量は、非阻害性化合物が存在する場合よりも大きい。個々のビーズに結合した蛍光の量は、共焦点顕微鏡検査により決定される。この型の検定法を用いて、固体支持体に結合した蛍光標識基質を切断するカテプシンＤ等のプロテアーゼの阻害を決定することができる。カテプシンＤの場合は、基質は、一端がミクロビーズに他端が蛍光標識Ｃｙ−５に連結したｌｙｓ−ｐｒｏ−ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｌｅｕ等のペプチドであることができ、いずれかの連結がガンマアミノ酪酸等のスペーサーを用いて完成され得る。
また、この型の検定法を用いて、蛍光標識オリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ切断の阻害を決定することも可能である。エンドヌクレアーゼを、ライブラリー化合物及び蛍光標識オリゴヌクレオチド基質で被覆した懸濁可能な固体支持体と共に溶液中に入れる。基質の切断の際に、蛍光標識した生成物が支持体から放出される。ビーズに結合したまま存在する蛍光の量は、活性な阻害剤が存在するところで増加する。
酵素阻害に関する別の検定法においては、酵素と蛍光標識基質の両方を、試験化合物及びリガンドで被覆したミクロビーズと共に溶液中でインキュベートする。リガンド（抗体等）は、酵素触媒反応の反応生成物に特異的に結合する。該反応生成物は蛍光標識を保持したままである。例えば、チロシンキナーゼの阻害剤は、キナーゼと蛍光標識ペプチド基質が溶液中に存在する検定法で決定することができる。このペプチド基質は、その配列の中央にチロシンアミノ酸を含み、反応生成物はホスホチロシンを含む。この検定溶液はホスホチロシン含有反応生成物に対する抗体で被覆した懸濁可能なミクロビーズを含む。ライブラリー化合物による阻害が成功すれば、対照と比較したときのビーズに結合した蛍光は減少する結果となる。
酵素触媒反応の阻害が決定される本発明の検定法において、阻害性化合物は、いかなる機構によっても阻害することができる。例えば、それらは、酵素への結合、基質への結合、酵素と基質の複合体への結合又は酵素と生成物の複合体への結合により阻害することができる。
好ましくは、本発明の検定法は、１９９７年２月１８日に出願された米国特許出願第６０／０３７，６３６号に記載された１５３６穴プレート等の微容量容器を有するミクロタイタープレートを用いて行なわれる。共焦点走査顕微鏡は、ミクロタイタープレートの各ウエルの底を順次走査する。
また、この方法は、従来の９６穴ミクロタイタープレート中もしくは他のいかなる容器中又は液体試料を保持することができ、かつ、共焦点顕微鏡により走査されうるいかなる表面上でも行なうことができる。例としては、１２穴、２４穴、３８４穴、８６４穴プレート及び顕微鏡用スライドが挙げられる。
受容体産生細胞が用いられる本発明の態様においては、所望の細胞密度は、好ましくは、１５３６穴プレートでは１μｌ当たり約１００〜１０００細胞の間であり、慣用の９６穴プレートでは１μｌ当たり約３０〜３００細胞の間であろう。通常、統計学的に適切な結果を得るためには、試料当たり少なくとも１００〜１０００細胞からのシグナルを測定することが必要であると信じられている。最適の密度は、指針としてこれらの濃度並びに用いる特定の細胞のサイズを用いて、そしてリガンド／受容体相互作用の既知の阻害剤を用いる検定法で提供されるシグナルを測定することにより決定することができる。走査する領域を限定し、走査時間を減らすことにより、測定される細胞の数が十分である限り処理量を増加させることができる。
懸濁可能な支持体を約６μｍの好ましいサイズで用いるならば、支持体の好ましい密度は、一般的に、細胞の場合と同様に好ましい範囲内にあるであろう。該密度は、支持体のサイズ及び各支持体に固定される標的の量に依存して変動する。
本発明によって検出されるシグナルは、蛍光標識により発生させることが好ましい。この標識は、受容体又は他の標的分子に結合するリガンドに付着させることができる。また、本発明のある種の態様においては標識受容体（又は他の標的分子）を用いることも可能である。また、望ましいときは、標識化抗体が、例えば、未標識リガンド、受容体又は標的分子を探す「第２の標識化」アプローチを用いることができる。
また、ライブラリー化合物それ自体が蛍光標識された本発明の検定法を行なうことも可能である。例えば、第一アミンである化合物のライブラリーは、アミン特異的蛍光標識（例えば、一官能性Ｃｙ５−ＮＨＳエステル）で標識することができる。次いで、該化合物を細胞又は懸濁された支持体上の標的分子への直接結合について試験することができる。結合した蛍光の量は、結合の程度と相関する。
本発明での使用に適する蛍光標識はよく知られており、Ｃｙ−５、Ｃｙ−５．５、Ｃｙ７（アマシャム社）等のシアニン色素、フルオレッセイン、ローダミン及びテキサスレッドが挙げられる。細胞を用いる本発明の態様では、細胞起源の蛍光とガラス及びプラスチック容器起源の蛍光との干渉を避けるために、蛍光標識が比較的高波長、すなわち、約４５０ｎｍよりも高い波長で蛍光を発することが好ましい。この標識は、６００ｎｍより上でそして約８００ｎｍより低い蛍光を発することが最も好ましい。約４００ｎｍで励起する標識は、近ＵＶ光により惹起される光脱色（photobleaching）を避けることができる。
また、非蛍光標識も、前記した本発明の態様において使用することができる。化学発光発生標識ルシフェラーゼを用いる一つの態様では、懸濁可能な固体支持体を受容体で被覆する。この被覆された支持体を、ルシフェラーゼ結合リガンド、ルシフェラーゼの基質及び試験対象の化合物と共にインキュベートする。受容体／リガンド結合の阻害の非存在下では、ルシフェラーゼは懸濁可能な固体支持体と会合し、ルシフェラーゼの酵素作用から生じる化学発光シグナルが支持体周辺に集中する。阻害性化合物の存在下では、支持体と結合するシグナルが減少する。
本発明の別の態様では、懸濁不可能な固体支持体の処理表面への結合の程度を決定する目的でこの検定法が行われる。支持体は、ミクロタイタープレートの底等の容器又は器それ自体でありうる。あるいは、この懸濁不可能な支持体は、例えば、ディスクであってもよい。この支持体がミクロタイタープレートのウエルの底である態様では、該プレートを標的分子で被覆し、次いで、標識したリガンドに曝す。プレートの底の層を含む共焦点切片を、光学的に検出可能なシグナルについて測定する。ミクロタイタープレートの底を含まない他の共焦点切片で、遊離のシグナルを測定する。次いで、支持体に結合したシグナルを計算することができる。この方法は、走査を迅速に行なうことができる点で有利である。個々の細胞／ビーズを同定する必要はなく、高処理量が得られる結果となる。薄い共焦点対物平面を使用することは、被覆プレートの上部から発生するシグナルを排除するため及び高いシグナル対ノイズ比を維持するために好ましい。この方法の一つの態様では、共焦点対物平面は１０μｍ未満である。
本発明の高処理法で測定される化合物は、ポリマービーズ上の組合せライブラリーに由来するものであることが好ましい。いくつかの検定法用に各ビーズ上に十分な化合物を合成することにより、化合物の取扱いが低減又は除去される。かかるビーズは、例えば、ビーズ当たり１００ピコモルオーダーの化合物を含むことが可能であり、そして試験は約１μＭの濃度で行なわれることが多い。約１００回までの試験に１つのビーズを用いることができるので、かかるビーズを用いるときは、１μｌの試験容量が有利である。
ライブラリー化合物をビーズから溶出し、この検定法の準備にミクロタイタープレート中で蒸発乾燥させることが好ましい。ビーズ上の化合物は、光切断又は別の型の切断により放出され得る。光切断可能なリンカーの切断が好ましい。このようなリンカー及びそれらの切断方法は、バラニー（Barany）ら、（1985）J. Am. Chem. Soc. 107: 4936に記載されている。他のリンカー及び関連する切断試薬の例は、ＷＯ９４／０８０５１号に記載されている。
ビーズ上に調製した組合せライブラリーを使用して、ＷＯ９４／０８０５１号ならびに米国特許出願第０８／４３６，１２０号及び第０８／２３９，３０２号（ＷＯ９５／３０６４２号に相当する）に記載されたコード化システムを用いて、活性化合物の同一性を決定することが好ましい。このシステムでは、化合物の同一性をコード化する化学タグを固体支持体に適用する。所定の支持体上の化合物の同一性は、該支持体から化学タグを脱着させて、ガスクロマトグラフィー等により該タグを同定し、タグの同一性を化合物の同一性と関連付けることにより決定することができる。一旦活性化合物が同定されると、対応するビーズ（該化合物を含んでいたもの）を調べ、そしてこの方法によりタグを放出させて解読することにより化合物の同一性を決定することができる。
試験のためにいくつかの大きなライブラリーが利用可能な場合には、各検定容器中に一つを超える試験化合物を入れることにより各ライブラリーを「探索」することが有利でありうる。活性化合物を有する検定容器は、この容器中に存在する複数の化合物のそれぞれを個別に評価することによりさらに研究することができる。この方式で「高密度」でスクリーニングすることは、各ライブラリー中の活性化合物の数と能力を統計学的に評価することを可能にする。最も活性な化合物を含むライブラリーは、より徹底的に試験することができる。この検定法でスクリーニングした活性化合物の割合が高いときは、活性化合物の第２の検定法をより低い濃度で行なって、最も活性な化合物を選択しさらに評価されるべき化合物を選択してもよい。
本発明を以下の実施例により説明するが、これは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：受容体結合用の化合物のスクリーニング
本発明を、共焦点顕微鏡検査装置及び元々蛍光サイトメトリー用に意図されたソフトウエアを用いて示した。得られたデータをさらに分析して、リガンドと細胞表面受容体の間の結合量の指標となる数値を提供した。
１）リガンドの合成
（ａ）Ｃｙ−５標識ニューロキニン−Ａ（ＮＫＡ）。
ニューロキニン−Ａ（ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ）は、ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ（ＰＰ−０５−０８２６Ａ）から購入し、一官能性Ｃｙ５色素は、アマシャム（ＦｌｕｏｒｏｌｉｎｋTMコンジュゲーションキットとして、カタログ番号Ａ２５００１）から購入した。ＮＫＡ（１ｍｇ）を０．８８ｍＬの重炭酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．３）に溶解し、Ｃｙ５色素（約１ｍｇ）を０．１３ｍＬの重炭酸緩衝液に溶解した。二つの溶液を混合し、室温で１．５時間インキュベートした後、５℃に移してさらに１７時間インキュベートした。このコンジュゲートは、ＨＰＬＣ（Ｈ2Ｏ、０．１％ＴＦＡ中２０−４０％ＣＨ3ＣＮ勾配、Ｖｙｄａｃ▲Ｒ▼分析用Ｃ１８カラム上、Ｒf８．９分＠１．５ｍＬ／分）により精製して、１５７ｎｍｏｌ（理論収量の１８％）を得た。リガンドの同一性は、受容体に対する競合及び質量分析法により確認した。
（ｂ）Ｃｙ−５標識ＩＬ−８
ヒトインターロイキン−８のＳｅｒ→Ｃｙｓ突然変異体（ｈＩＬ−８（Ｓ７２Ｃ）は、ＰＣＲ技術を用いてヒトｃＤＮＡからクローニングし、配列を決定して突然変異とその配列を確認した。一官能性Ｃｙ５−ヨードアセトアミドは、アマシャムから入手した。５００ｎＭのＣｙ５−ヨードアセトアミドを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、４００ｍＭのＮａＣｌ中２００ｎｍｏｌ（２００μｌの１ｍＭストック）のｈＩＬ−８（Ｓ７２Ｃ）に加えた。試験管を攪拌し、周囲の温度で暗所に置いた。ＨＰＬＣ分析により、４８時間後に反応が完了したことが示された。生成物を、未反応のＣｙ５−ヨードアセトアミド及び酸化されたｈＩＬ−８（Ｓ７２Ｃ）からＨＰＬＣにより精製した（２ｘ１００μｌ注入）。試料を、４００μＭの推定濃度で５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で再構成した。次いで、この試料の一部の蛍光スペクトルから、より正確な濃度を決定した。さらなる特性決定により、ｈＩＬ−８（Ｓ７２Ｃ）−Ｃｙ５は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で野生型ＩＬ−８と同様の移動度を有し、慣用の［125Ｉ］ＩＬ−８リガンド置換検定法で２ｎＭのＫｉを示すことが示された。
２）細胞株
（ａ）ニューロキニン−２受容体を発現する細胞（ＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ）を得た。ＮＫ２Ｒを発現する細胞はよく知られており、当業者により容易に得られる。例えば、ＮＫ２Ｒを発現する細胞は以下の参考文献に記載されている。すなわち、アーキンストール（Arkinstall, S.）、エドガートン（M. Edgerton）ら（1995），「分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）におけるニューロキニンＮＫ２受容体及びＧタンパク質成分の共発現。」FEBS Lett 375(3): 183-7、ブラッドシャウ（Bradshaw, C. G.）、セスコウスキー（K. Ceszkowski）ら（1994）「ニューロキニンＮＫ２受容体に対する選択的蛍光性リガンドの合成と特性決定。」J Med Chem 37（13）: 1991-5、グリスハンマー（Grisshammer, R.）、リトル（J. Little）ら（1994）「大腸菌におけるラットＮＫ２（ニューロキニン−Ａ）受容体の発現。」Receptors Channels 2（4）: 295-302、ランドストローム（Lundstrom, K.）、ミルズ（A. Mills）ら（1995）「セムリキ森林ウイルス発現系を用いるＧタンパク質結合受容体の高レベル発現。」J Recept Signal Transduc Res 15（1-4）: 617-30、及びターカッティー（Turcatti, G.）、ネメス（K. Nemeth）ら（1996）「特異的部位での蛍光アミノ酸の生合成による取り込みを介するタキキニン・ニューロキニン−２受容体の構造と機能の探索。」J Biol Chem 271（33）: 19991-8である。
ｂ）ＩＬ−８Ａ及びＩＬ−８Ｂ受容体を発現する細胞（ＩＬ−８Ａ／ＣＨＯ及びＩＬ−８Ｂ／ＣＨＯ）は、以下のようにして得た。
ヒトＩＬ−８Ａ又はＩＬ−８Ｂの配列をコードするｐＣＤＮＡIIIプラスミドでＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）を、カチオン性リポポリアミン（リポフェクタミン、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を介してトランスフェクトすることにより、ＣＨＯ・ＩＬ−８Ａ及びＩＬ−８Ｂ細胞株を調製した。細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％非必須アミノ酸中で、Ｇ４１８選択（１ｍｇ／ｍｌ）下で培養し、最高の受容体レベルを発現するクローン株を、これらの実験に使用するために維持した。ヒトＩＬ−８Ａ受容体ｃＤＮＡは、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ）ｍＲＮＡからクローニングした。（ＩＬ−８Ａをコードするクローンは、アフジャ（Ahuja）ら、（1992）Nature Genetics 2:31に記載されている。）第１鎖ｃＤＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（プロメガＲｉｂｏｃｌｏｎｅTMｃＤＮＡ合成系）を用いて合成し、プライマー、５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣ３’及び５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣ３’を用いて、ＩＬ−８ＡｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ＋ＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ／ウシ腸ホスファターゼ消化ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロゲン）中に連結した。１つの候補のＤＮＡ配列を、プロメガＳｉｌｖｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｅTM法を用いて確認した。ヒトＩＬ−８Ｂ発現クローンを作製するために、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩを用いて、約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンＢＳ−ｐ３（マーフィー（Murphy）とティファニー（Tiffany）、（1991）Science, 253: 1280）からｐｃＤＮＡ３ベクター中に再クローニングした。
３）検定法
（ａ）Ｃｙ５−ＮＫＡのＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ細胞への結合
ほぼコンフルエントなＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ細胞の培養物を、１２ｍｌのＤＰＢＳ（Ｍｇ+2とＣａ+2を含まない）で洗浄し、トリプシン（２ｍＬ／Ｔ−２５フラスコ）を添加することによりトリプシン消化し、３７℃で約５分間インキュベートした後、１０ｍＬの培地で停止させた。次いで、細胞を計数し、細胞の所望の最終濃度（５，０００細胞／２５μＬ）に希釈した。検定法は、以下の成分を用いて設定した。すなわち、種々の濃度（０．７６〜１３６ｎＭ最終）のＣｙ５−ＮＫＡを含む緩衝液（チオルファン及びバシトラシンを含む１×ＢＳＳ＋０．２％ＢＳＡ）１０μＬ、細胞４０μＬである。プレートに蓋をし、アルミニウムホイルで覆って光から保護し、室温で１時間振盪させた。各試料について、２５μＬを取り、ＩＭＡＧＮ２０００TMキャピラリー中に入れて、ＩＭＡＧＮTMソフトウエア（バイオメトリックイメージング社）を用いて読み取った。細胞がウエルの底の上に静止するまで、試料を沈着させた。沈着に要する時間は、通常１０分であった。
（ｂ）ＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ細胞に結合したＣｙ５−ＮＫＡのＳＲ−４８，９６８による置換。
ＳＲ−４８，９６８は、ＮＫＡニューロキニン２受容体の結合の既知の阻害剤である。設定と検定法は、５μＭのＣｙ５−ＮＫＡという固定濃度で、そしてＳＲ−４８，９６８のストック溶液（ストック１ｍＭ、１．６％ＤＭＳＯ、ＢＳＳ中）をＣｙ５−ＮＫＡ含有緩衝液中８８ｎＭから８．８ｐＭまでに希釈し、（ａ）に記載したように行なった。
（ｃ）細胞に結合したＣｙ５−ＩＬ−８の未標識ＩＬ−８による置換。
ほぼコンフルエントなＩＬ−８Ｂ／ＣＨＯ細胞の培養物を、トリプシン（２ｍＬ／Ｔ−２５フラスコ）を添加することによりトリプシン消化し、３７℃で約１分間インキュベートした後、４ｍＬの培地で停止させた。次いで、細胞を計数し、所望の最終濃度（１５，０００細胞／２５μＬ）に希釈した。検定法は、９６穴ミクロリター（microliter）プレート（１００μＬの全容量）中で設定し、以下の成分からなるものであった。すなわち、緩衝液（１×ＢＳＳ）３０μＬ、細胞２５μＬ、バックグラウンド蛍光（Ｔｒｉｓ−Ｃｙ５、６０μＭ）２５μＬ、ｈＩＬ−８（Ｓ７２Ｃ）−Ｃｙ５（２０ｎＭ）１０μＬ、未標識ＩＬ−８（種々の濃度、ＢＳＳで希釈）１０μＬであった。プレートに蓋をし、アルミニウムホイルで覆って光から保護し、室温で１時間振盪させた。各試料に対して、８５μＬを取り、ＩＭＡＧＮ２０００TMキャピラリー中に入れて、ＩＭＡＧＮソフトウエアを用いて読み取った。
４）データ分析
ＩＭＡＧＮ系から得られたデータは、視野で同定された各細胞に関する情報を含むタブで境界を定められたテキストファイルからなるものである。このＩＭＡＧＮ系は、イメージング視野中の各細胞（又は細胞のサイズの対象物）についての、位置、形及び強度データ（Ｃｙ５及びＣｙ５．５の２チャンネルに対する）ばかりでなくベースラインの情報をも提供する。（この型の装置を用いる典型的な分析において、細胞は、ベースラインシグナルよりも有意に大きな強度を有する２以上の連続した画素により同定される。）データの統計学的パラメーター（例えば、標準偏差）も表にまとめられる。このデータを分析して、結合の量の尺度を提供する試料についてのスカラー値を得ることができる。このさらなる分析を行なうために可能な三つの方法を以下に記載する。
（ａ）平均蛍光強度。この値は、すべての細胞に関する「ＭａＭＯ」の平均値として、データ表から導かれるものである。チャンネル０（ゼロ）はＣｙ５蛍光チャンネルであり、そしてＭａＭＯ値は、最小（ベースライン蛍光）値を差し引いたピークのＣｙ５蛍光（細胞に結合した蛍光に相当する）として計算される。「ＭａＭＯ」は、視野中の各細胞に対して表にまとめられる。
この分析は、細胞表面受容体の高い蛍光濃度及び比較的高いレベルの占有を含む検定法に対して特に有用である。それはすべての細胞が検出され得ない場合、例えば、細胞表面受容体の低い蛍光濃度又は低いレベルの占有の場合には、有利でないことがありうる。Ｆ値の分析（以下に説明する）は、これらの環境下でより正確なデータを提供することができる。具体的には、より弱い蛍光を発する細胞（それらのサイズ及び／又は特異的な結合特性により）は、競合するリガンドにより置換された場合、イメージング視野で最初に「消失」するであろう。（この意味での「消失」は、細胞のイメージを含む画素がベースラインイメージよりも強度が有意に高くないことを意味する。）固定した濃度の蛍光性リガンドを競合体でチャレンジする場合に、二つの変化が実験的に観察される。第１に、細胞全体の強度が減少する（すなわち、平均ＭａＭＯ値が減少する）。第２に、より弱い細胞がバックグラウンド中に消滅するので、観察可能な細胞の数が減少する。Ｆ値は、細胞層における全蛍光を測定するので、すべての細胞が計数できない場合により正確な測定を与える。
（ｂ）Ｆ値。Ｆ値は、ウエル内に入れた細胞の総数（計数した蛍光性細胞の数とは対照的に）をＭＦＩに乗じそして１０００で除することにより決定される。この値は、細胞層の全蛍光を提供し、共焦点顕微鏡による一定の走査では検出不可能な程その蛍光が弱い細胞を含む。Ｆ値は、一定の試料におけるより正確な結合の尺度を与えると一般に信じられている。
（ｃ）対照のパーセント。対照のパーセント分析は、ＭＦＩ分析又はＦ値分析のいずれかから得られた値を用いて行なうことができ、このデータを規格化する結果となる。それは、関連性のある値に対して以下の式に従って計算される。「最大」及び「最小」とは、関連性のある値に対する最大及び最小の蛍光をいう。
％対照＝（（値−最小）／（最大−最小））ｘ１００
Ｃｙ５−ＮＫＡのＮＫ２Ｒ／ＣＨＯ細胞への結合に対して計算されたＭＦＩを、図３に示す。これらの結果は、７，７２０の最大ＭＦＩ及び３．９ｎＭのＫｄ（解離定数）を示す。
ＳＲ４８，９６８によるＣｙ５−ＮＫＡの置換に対する対照のパーセントとして計算された結果を、図４に示す。０．５７５ｎＭのＩＣ50が決定され、０．２９ｎＭの推定Ｋｉが決定された。０．９６３というＲ2値が決定されたが、これは理論値に対する実験データの「優良適合性」を示すものである。
測定されたヒル係数は、０．９９６であった。ヒル係数は、結合における協同性の尺度である。１つの受容体が１つのリガンドに結合する単純な系に対して、Ｈｉｌｌ係数は１である。多価系に対しては、Ｈｉｌｌ係数は、１から変化しうるが、理想的には多価リガンドに関して小さい整数であるか又は多価受容体に関して小さい整数の逆数である。ＮＫＡ／ＮＫ２Ｒ及びＩＬ−８／ＩＬ−８ＢＲ系は、一価受容体及び一価リガンドを含む。
未標識ＩＬ−８による標識ＩＬ−８の置換に対するＦ値として計算された結果を、図５に示す。
挿入グラフは、４パラメーター曲線適合に対する式を提供する、
ｙ＝（（Ｍ１−Ｍ４）／（１＋（ＭＯ／Ｍ３）M2））＋Ｍ４
式中、Ｍ１は最大値であり、Ｍ４は最小値であり、Ｍ３は曲線の中央点（見かけのＫｄ）であり、Ｍ２は中央点における傾きである。
前記結果に対する結合定数は、遊離のリガンド濃度の関数としての結合したリガンドの測定を含むスキャッチャード分析により決定することができる。具体的には、結合リガンド対遊離リガンドの比を、結合したリガンド濃度に対してプロットする。傾きがリガンドの解離定数の負の逆数であり、Ｘ軸との交点が最大結合値（Ｂmax）である直線が得られる。
これらの実験の結果は、本発明の方法がリガンド／標的結合の正確な定量分析を可能にし、組合せライブラリースクリーニングに普通に用いられる様々な標的に対して用いることができることを証明するものである。本方法は、高処理量スクリーニングにおいて迅速な検出及び分析をも可能にする。結果における変動は低く、この結果は従来の分析方法により得られたものと強く相関する。本方法は、顕微鏡レベルの容量で容易に行なわれる。したがって、それは、１５３６穴プレートを用いる場合等のマイクロリットルの試料での高処理量スクリーニングによく適し、被覆したミクロビーズに由来する少量のライブラリー化合物の有効な使用を可能にする。
５）従来用いられてきた検定法との比較。
受容体結合検定法において、検定の感度は、バックグラウンドにより制約される。バックグラウンドに対する最大シグナルの比を計算することにより、異なる検定の感度を比較することが可能である。ＩＬ−８結合を含む前記検定については、本発明の検定法では、２００の非特異的バックグラウンドの上に６３００のシグナル（Ｆ値）を与え、３１．５というシグナル対バックグラウンド比を与えることがわかった。例えば、同様の濃度の標識ＩＬ−８を用いる［125Ｉ］ＩＬ−８結合分析は、３９，０００ｃｐｍの非特異的バックグラウンドの上に８５，０００ｃｐｍのシグナルを生じ、２．１というシグナル対バックグラウンド比を与える。これらの値に基づくと、本発明の検定法を用いる感度の改良は約１５倍である。
実施例２：ＳＨ２ドメイン結合に関する化合物のスクリーニング
高処理量検定法を行なって、ヒトＧｒｂ２のＳＨ２ドメインに対するリガンド結合の阻害剤を決定する。Ｇｒｂ２は、そのＳＨ２ドメインがホスホチロシン含有タンパク質に結合して、特異的な細胞タンパク質の会合を生じさせることによりシグナル伝達を促進するアダプタータンパク質である。Ｇｒｂ２のクローニングは、ローエンスタイン（Lowenstein）ら、Cell 70: 431-442（1992）に記載されている。ＩＲＳ−１は、インスリン受容体（ＩＲ）チロシンキナーゼの基質であり、チロシンがリン酸化された後のＧｒｂ２のＳＨ２ドメインに結合する。（ＩＲＳ−１とＧｒｂ２との相互作用は、スコールニック（Skolnick）ら、EMBO 12: 1929-1936（1993）に記載されている。）
この検定法のためのリガンドは約１μＭ未満の解離定数を持つことが好ましい。本発明の検定法は、ＩＲＳ−１の配列（ｐＹ８９６アミノ酸の近くに位置する）に由来するホスホチロシン含有ペプチドであるＳＨ２ドメインに対する合成リガンドを用いる。このペプチドは、ＫＳＰＧＮｐＹＶＮＩＥ−ＣＯ2ＮＨ2の配列を有する。
ビーズ当たり１ｘ１０6の結合部位を含む、ストレプトアビジンで被覆した６．２μｍのビーズ（スフェロテック）を用いる。このビーズを、発現中にビオチンで特定の部位を標識したＳＨ２ドメイン（Ｓｒｃホモロジー２ドメイン）とインキュベートする（シャッツ（Schatz, P. J.）（1993）Bio/Technology 11, 1138-1143）。
ビーズ、リガンド及びライブラリー化合物を１５３６穴プレート中で混合し、インキュベートし、振盪する。次いで、試料を約１０分間沈着させ、共焦点レーザー走査顕微鏡によりプレートを読み取る。活性な化合物は、結合した蛍光の量を減少させる。実施例１で前記したように結果を分析して、結合定数及び／又は阻害定数を決定する。
実施例３：ＥＧＦ受容体キナーゼドメインの結合に関する化合物のスクリーニング  高処理量検定法を行なって、上皮成長因子（ＥＧＦ）のキナーゼドメインに対するリガンドの結合を阻害するライブラリー化合物を決定する。このキナーゼは、ペプチドＲＲＫＧＳＴＡＥＮＡＥＹＬＲＶＡ（「１１７３」ペプチド）を含む多数のタンパク質及びペプチドをリン酸化する。アミノ酸配列中の下線を付したチロシンがこのキナーゼによりリン酸化される。
ＥＧＦ受容体キナーゼドメインは、アレクシスバイオケミカルズ（サンジエゴ、カルフォルニア州）から入手する。１１７３ペプチドをビオチン化し、次いで、ストレプトアビジンで被覆した６．２μｍのミクロビーズ（スフェロテック）と共にインキュベートして、このペプチドをビーズに固定させる。ホスホチロシンに特異的なモノクローナル抗体は、シグマ（セントルイス、ミズーリー州）又はバイオゲネシス（サンダウン、ニューハンプシャー州）から入手し、製造業者の指示（アマシャム）に従って、Ｃｙ５で標識する。
１５３６穴プレートで検定を行なう。ＥＧＦキナーゼドメインは、中性緩衝液中、１１７３で被覆したミクロビーズ、Ｍｇ・ＡＴＰ、Ｃｙ５標識抗ホスホチロシン抗体及びライブラリー化合物の存在下でインキュベートする。このキナーゼによる１１７３ペプチドのリン酸化の際に、ペプチドは、蛍光標識抗体によって結合させられ、蛍光がビーズと結合するようになる。阻害性ライブラリー化合物は、リン酸化を妨害し、ビーズに結合した蛍光を減少させる結果となる。プレートのウエルを、共焦点レーザー走査顕微鏡により走査し、得られたデータを実施例１に記載したように、さらに分析して阻害及び／又は結合の値を決定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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