(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する組換え抗体分子であって、
ａ）Kabatの番号付けシステムに従った、残基31位〜35位、50位〜65位、および95位〜102位がラットモノクローナル抗体39D10由来のドナー残基である相補性決定領域(CDR)付加H鎖；及び
ｂ）Kabatの番号付けシステムに従った、残基24位〜34位、50位〜56位、および89位〜97位がラットモノクローナル抗体39D10由来のドナー残基である相補性決定領域(CDR)付加L鎖を含み、
該相補性決定領域(CDR)付加H鎖が、ヒトアクセプター抗体H鎖のフレームワーク残基を優先的に含有する可変ドメインを有し、かつ、該相補性決定領域(CDR)付加L鎖が、ヒトアクセプター抗体L鎖のフレームワーク残基を優先的に含有する可変ドメインを有し、
該相補性決定領域(CDR)付加H鎖において、Kabatの番号付けシステムに従った、フレームワーク残基の少なくとも24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位、および78位が、ラットモノクローナル抗体39D10由来の付加的なドナー残基であり、
該相補性決定領域(CDR)付加L鎖において、Kabatの番号付けシステムに従った、フレームワーク残基の少なくとも68位および71位が、ラットモノクローナル抗体39D10由来の付加的なドナー残基であることを特徴とする組換え抗体分子。
【請求項２】
該相補性決定領域(CDR)付加H鎖のフレームワーク残基23位及び77位に、ラットモノクローナル抗体39D10由来の付加的なドナー残基をさらに含む請求項１記載の組換え抗体分子。
【請求項３】
該相補性決定領域(CDR)付加L鎖のフレームワーク残基22位に、ラットモノクローナル抗体39D10由来の付加的なドナー残基をさらに含む請求項１又は２記載の組換え抗体分子。
【請求項４】
該相補性決定領域(CDR)付加H鎖のヒトアクセプター残基がヒトIII群H鎖残基であり、該相補性決定領域(CDR)付加L鎖のアクセプター残基がヒトI群L鎖残基である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え抗体分子。
【請求項５】
図６（SEQ ID 28）のH鎖可変領域と図５（SEQ ID 26）のL鎖可変領域を含む請求項４記載の組換え抗体分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え抗体分子の相補性決定領域(CDR)付加H鎖可変ドメイン及び／又は相補性決定領域(CDR)付加L鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え抗体分子を含むアレルギー性疾患の処置用又は診断用医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え抗体分子を含む喘息の処置用又は診断用医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え抗体分子を含む好酸球増加症の処置用又は診断用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換え抗体分子(RAM)に関し、特に、ヒトインターロイキン−５(hIL-5)に対して特異性を有するヒト化抗体分子(HAM)、上記組換え抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインをコードする核酸、組換えDNA技術を用いて上記抗体を産生する方法、および組換え抗体の治療的使用に関する。
本明細書中では、用語「組換え抗体分子」(RAM)は、組換えDNA技術の使用を伴う方法により産生される抗体を記載するために用いられる。用語「ヒト化抗体分子」(HAM)は、ヒト免疫グロブリンに由来する分子を記載するために用いられる。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおいて適切なフレームワーク領域に付加された1つ以上の相補性決定領域(CDR)のいずれかを含有し得る。略語「MAb」は、モノクローナル抗体を示すために用いられる。
用語「組換え抗体分子」は、完全な免疫グロブリン分子のみでなく抗原結合免疫グロブリンフラグメント（例えば、Fv、Fab、およびF(ab')2フラグメント）ならびにそれらの任意の誘導体（例えば、単鎖Fvフラグメント）も包含する。
天然の免疫グロブリンが、アッセイ、診断、および制限された範囲内の治療に用いられている。治療における免疫グロブリンの使用は、治療剤としての使用可能性のある大部分の抗体が齧歯動物脾臓細胞と齧歯動物ミエローマ細胞との融合物により産生されるMAbであるために妨げられている。従って、これらのMAbは、本質的に齧歯動物タンパク質である。ヒトにおけるこれらのMAbの治療剤としての使用は、HAMA（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる、望ましくない免疫応答を誘起し得る。ヒトにおける齧歯動物MAbの治療剤としての使用は、ヒト被験体がMAbに対して免疫学的応答を高め、これによりその有効性を完全に取り除くか、または少なくとも減少させるかのいずれかであるという事実により本質的に制限される。
このような非ヒトMAbの抗原特性を減少させるための多くの技術が開発されている。これらの技術は一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作するために組換えDNA技術の使用を伴う。これらの方法は一般に、「ヒト化」技術と呼ばれる。
MAbをヒト化する初期の方法は、キメラ抗体の産生を伴う。ここで、１つの抗体の完全な可変ドメインを含有する抗原結合部位は、別の抗体に由来する定常領域に融合される。このようなキメラ化手順を実行する方法は、EP 0120694(Celltech Limited)およびEP 0125023(Genentech Inc.およびCity of Hope)に記載されている。しかし、ヒト化キメラ抗体は、かなりの部分の非ヒトアミノ酸配列を依然として含有し、そして特に長期にわたって投与される場合に、依然として何らかのHAMA応答を惹起し得る[Begentら，Br.J.Cancer,62,487(1990)]。
別のアプローチはEP-A-0239400(Winter)に記載されており、組換えDNA技術を用いるヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域へのマウスMAbの相補性決定領域(CDR)の付加を伴う。それぞれのＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインには、３つのCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)が存在する。このようなCDR付加ヒト化抗体は、それらの含有する非ヒトアミノ酸配列の割合がより少ないという点からみて、ヒト化キメラ抗体よりもHAMA応答をより誘起しないようである。Riechmannら[Nature,332 323-324(1988)]において、CDR単独の転移は、Kabat[Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国厚生省、NIH、USA(1987)]により明らかにされたように、CDR付加産物に満足な抗原結合活性を提供するのに十分でなかった。Riechmannらは、CDRの外側、特にCDR1に隣接するループの中の多くの残基を変えることが必要であることを見出した。しかし、得られた最善のCDR付加抗体の結合親和性は、依然として元のMAbの結合親和性よりも顕著に低かった。
WO 91/09967において、Adairらは、CDR付加抗体のＨ鎖およびＬ鎖を記載し、そしてドナー残基のヒエラルキー(hierarchy)を決定した。
WO 93/16184において、Chouらは、ヒトインターロイキン-5に対するヒト化モノクローナル抗体の設計、クローニング、および発現を記載した。動物抗体のヒト化のためのヒトフレームワークとして用いられるヒト抗体配列を選択するための方法が示唆され、この方法は、同一性百分率、配列のアンビギュイティー(ambiguity)、および同様のPIN領域スペーシングについて、ヒト可変ドメイン配列と、ヒト化される動物MAbの可変ドメイン配列とを比較する工程を包含する。PIN領域スペーシングは、ドメイン内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基間の残基数として定義される。これらの特徴の最善の組み合わせを有するヒト抗体が選択される。ヒト化のために選択されるべき動物MAbの可変ドメイン残基がどれであるかを決定する方法もまた、示唆される。この方法は、動物モノクローナル抗体の潜在的な最小の残基（CDR構造ループならびにCDR構造ループを支持および／または方向付けするために必要な残基を含有する残基）および最大の残基（KabatのCDR、CDR構造ループ、CDR構造ループを支持および／または方向付けするために必要な残基、およびCDR構造ループの約10Åの中にあり、かつ約５Å2またはそれより大きい水溶媒接近可能表面を有する残基を含有する残基）を決定する工程を包含する。さらに、コンピューターによるモデル化が、全ての可能な組換え抗体で行われる。この抗体は、最小の残基および最大の残基が挿入されているヒト抗体フレームワーク配列を含有する。最小の残基および最大の残基が、動物モノクローナル抗体の構造に最も近いコンピューターモデル構造を有する組換え抗体を作出する組み合わせに基づいて、選択される。得られたヒト化抗IL-5抗体は、hIL-5分子に対するその親和性をかなりの量で失ったようである。
hIL-5分子に対する改善された親和性を有するヒト化抗体分子を提供することが本発明の目的である。
従って、本発明は、ヒトIL-5に親和性を有し、かつヒトIL-5に対する親和性を有するドナー抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインに由来する抗原結合領域を含有するRAMを提供し、RAMは、ドナー抗体の結合親和性と類似の結合親和性を有する。
本発明のRAMは、任意の適切なドナー抗IL-5抗体に由来する抗原結合領域を含有し得る。代表的には、ドナー抗IL-5抗体は、齧歯動物MAbである。好ましくは、ドナー抗体は、MAb 39D10である。
MAb 39D10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインを、以下で図１および図２を参照して特に記載する。
本発明の好ましい１つの局面によれば、本発明のRAMは、混成Ｈ鎖および相補的なＬ鎖を含有する、ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子である。上記混成Ｈ鎖は、主にアクセプター抗体Ｈ鎖のフレームワーク残基およびドナー抗体Ｈ鎖の抗原結合残基を含有する可変ドメインを有する。上記ドナー抗体は、ヒトIL-5に対して親和性を有する。ここで、上記混成Ｈ鎖は、少なくとも31位〜35位、50位〜65位、および95位〜102位（Kabatの番号付けシステムに従う）[Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest、第Ｉ巻、第５版、1991、米国厚生省、国立衛生研究所]にドナー残基を含有する。
好ましくは、混成Ｈ鎖フレームワークは、23位、24位、27位〜30位、37位、49位、73位、および76位〜78位に、または24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位、および78位にドナー残基をさらに含有する。
本発明の第２の好ましい局面によれば、混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖を含有する、ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子が提供される。上記混成Ｌ鎖は、主にアクセプター抗体Ｌ鎖のフレームワーク残基およびドナー抗体Ｌ鎖の抗原結合残基を含有する可変ドメインを有する。上記ドナー抗体は、ヒトIL-5に対して親和性を有する。ここで、上記混成Ｌ鎖は、少なくとも24位〜34位、50位〜56位、および89位〜97位（Kabatの番号付けシステムに従う）にドナー残基を含有する。
好ましくは、混成Ｌ鎖フレームワークは、22位、68位、および71位に、または68位および71位にドナー残基をさらに含有する。
本発明の第３の好ましい局面によれば、本発明の第１の局面に記載の混成Ｈ鎖および本発明の第２の局面に記載の混成Ｌ鎖を含有する、ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子が提供される。
好ましくは、本発明のそれぞれのRAMは、ヒトIL-5に対して10-9Ｍを超える大きさの親和定数を有する。
本発明が、一般に抗IL-5 RAMの産生に広範に適用できるということが認識される。従って、ドナー抗体は、任意の動物に由来する任意の抗IL-5抗体であり得る。アクセプター抗体は、同じ種の動物に由来し得、そして同じ抗体クラスまたはサブクラスであり得る。しかし、より通常には、ドナー抗体およびアクセプター抗体は、異なる種の動物に由来する。代表的には、ドナー抗IL-5抗体は、非ヒト抗体（例えば、齧歯動物MAb）であり、アクセプター抗体は、ヒト抗体である。
任意の適切なアクセプター可変フレームワーク配列は、抗原結合領域が由来するドナー抗体のクラスまたはタイプを考慮して用いられ得る。好ましくは、用いられるアクセプターフレームワークのタイプは、ドナー抗体のクラスまたはタイプと同一または類似のクラスまたはタイプである。便宜的には、選択されるフレームワークは、ドナー抗体に最も相同性を有する。好ましくは、ヒトIII群γ生殖系列フレームワークが混成Ｈ鎖に用いられ、そしてヒトＩ群κ生殖系列フレームワークが混成Ｌ鎖に用いられる。
本発明のRAMの定常領域ドメインは、計画される抗体機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのIgA、IgE、IgG、またはIgMドメインであり得る。特に、ヒト化抗体分子が治療的使用を意図される場合、および抗体エフェクター機能が必要とされる場合、IgGヒト定常領域ドメイン、とりわけ、IgG1およびIgG3イソタイプのヒト定常領域ドメインが用いられ得る。あるいは、ヒト化抗体分子が治療目的を意図される場合、および抗体エフェクター機能が、（例えば、特異的に結合してヒトIL-5の生物学的活性を中和するために）必要とされない場合、IgG2およびIgG4イソタイプが用いられ得る。改変されたヒト定常領域ドメインはまた、１つ以上のアミノ酸残基が、特定のエフェクター機能を変化させるために改変または欠失されている場合に、用いられ得る。好ましくは、RAMの定常領域ドメインは、ヒトIgG4である。
本出願中で上記または他のいずれかに記載の残基の名称は、Kabatの番号付け[Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第Ｉ巻，第５版，1991，米国厚生省、国立衛生研究所]に従って番号付けされている。従って、残基の名称は、アミノ酸残基の一次番号付けと必ずしも直接対応するわけではない。実際の一次アミノ酸配列は、Kabatの番号付けよりも少ない、または付加的なアミノ酸を含有し得、これは、基本的な可変ドメイン構造の短縮または基本的な可変ドメイン構造への挿入に対応する。
また、本発明の抗IL-5抗体分子は、それらをエフェクターまたはレポーター分子に結合させたものであり得る。あるいは、組換えDNA技術の手順は、免疫グロブリン分子を産生するために用いられ得、ここで、完全な免疫グロブリンのFcフラグメントまたはCH3ドメインは、機能的非免疫グロブリンタンパク質（例えば、酵素、サイトカイン、成長因子、または毒素分子）により置換されているか、またはペプチド結合によりそれらに結合している。
従って、抗体分子の残りの部分は、免疫グロブリンに由来する配列のみを含有する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするDNA配列を、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするDNA配列と融合した遺伝子が、構築され得る。
本発明のさらなる局面は、混成Ｈ鎖および混成Ｌ鎖をコードするDNA配列を包含する。このDNA配列を含有するクローニングベクターおよび発現ベクター、このDNA配列で形質転換した宿主細胞、および形質転換した宿主細胞中でこのDNA配列を発現する工程を包含する抗体分子を産生する方法もまた、本発明のさらなる局面である。
ベクターを構築し得る一般的方法、トランスフェクション法、および培養法は、当該分野で周知であり、そして本発明の部分を構成するものではない。
抗IL-5ドナーアミノ酸配列をコードするDNA配列は、当該分野で周知の方法により得られ得る（例えば、国際特許出願第WO 93/16184号を参照のこと）。例えば、抗IL-5コード配列は、適切なハイブリドーマ細胞株（例えば、39D10細胞株）からゲノミッククローニングまたはcDNAクローニングにより得られ得る。ポジティブクローンは、必要なＨ鎖およびＬ鎖のための適切なプローブを用いてスクリーニングされ得る。また、PCRクローニングも用いられ得る。
アクセプターアミノ酸配列をコードするDNAは、任意の適切な方法により得られ得る。例えば、好ましいヒトアクセプターフレームワーク（例えば、ヒトのＩ群Ｌ鎖およびヒトのIII群Ｈ鎖）をコードするDNA配列は、当業者に広範に利用される。
分子生物学の標準的な技術は、所望のDNA配列を調製するために用いられ得る。この配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術も、適切に用いられ得る。例えば、Jonesら[Nature,321,522(1986)]に記載のようなオリゴヌクレオチド特異的合成(oligonucleotide directed synthesis)が、用いられ得る。また、既存の可変領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発が、例えば、Verhoeyenら[Science,239,1534-1536(1988)]に記載のように用いられ得る。また、T4 DNAポリメラーゼを用いてのギャップのあるオリゴヌクレオチドの酵素的充填が、例えば、Queenら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,10029-10033(1989)およびWO 90/07861]に記載のように用いられ得る。
任意の適切な宿主細胞およびベクター系が、RAMをコードするDNA配列の発現に用いられ得る。好ましくは、真核（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系が用いられる。特に、適切な哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞、ならびにミエローマまたはハイブリドーマ細胞株を包含する。
従って、本発明のさらなる局面によれば、以下の工程を包含する、抗IL-5 RAMを産生するための方法が提供される：
(a)第１の発現ベクターにおいて、本発明の第１の好ましい局面により定義されるような混成Ｈ鎖をコードするDNA配列を有する第１のオペロンを産生する工程；
(b)随意に、第１または第２の発現ベクターにおいて、本発明の第２の好ましい局面により定義されるような混成Ｌ鎖であり得る相補的なＬ鎖をコードするDNA配列を有する第２のオペロンを産生する工程；
(c)該ベクターまたはいずれかのベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；および
(d)トランスフェクトした細胞株を培養してRAMを産生する工程。
あるいは、この方法は、混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖をコードする配列の使用を包含し得る。
Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を含有するRAMの産生のために、細胞株が２つのベクターでトランスフェクトされ得る。第１のベクターは、混成または相補的なＨ鎖をコードするオペロンを含有し得、そして第２のベクターは、混成または相補的なＬ鎖をコードするオペロンを含有し得る。好ましくは、ベクターは、各ポリペプチド鎖が等しく発現されることを可能な限り確実にするために、コード配列および選択マーカーに関する範囲を除いて同一である。好ましい別の方法においては、単一のベクターが用いられ得、このベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方をコードする配列を含有する。
Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のコード配列におけるDNAは、cDNAまたはゲノムDNA、あるいはその両方を含有し得る。
本発明はまた、RAMを含有する治療用組成物および診断用組成物、ならびに治療および診断におけるこのような組成物の使用を包含する。
従って、さらなる局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアと組み合わせて、本発明の上記の局面によるRAMを含有する治療用組成物および診断用組成物を提供する。
これらの組成物は、例えば、抗体全体、単鎖Fvフラグメント、または抗体フラグメント（例えば、FabまたはFvフラグメント）として、本発明のRAMを用いて調製され得る。このような組成物は、IL-5ブロック効果またはIL-5拮抗効果を有し、そしてIL-5活性を抑制するために用いられ得る。
本発明による組成物は、任意の適切な経路により投与するために従来の実施に従って処方され得、そして一般に、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、または筋肉内経路により投与するためには液体形態で[例えば、無菌の生理的に受容可能な緩衝液中のRAMの溶液]；鼻経路または頬内経路により投与するためにはスプレーの形態で；または移植のために適切な形態であり得る。
本発明はまた、治療方法または診断方法を提供する。これらの方法は、ヒトまたは動物被験体に、本発明の上記の局面によるRAMの有効量、好ましくは0.1〜10mg/kg体重を投与する工程を包含する。正確な投薬量および総用量は、RAMの意図される使用ならびに処置される患者の年齢および状態に従って変化する。RAMは、単回用量として、またはある期間にわたって連続的に投与され得る。投薬は、適切に反復され得る。
本発明の上記の局面によるRAMが、抗IL-5抗体（例えば、39D10）が用いられているかまたは将来用いられ得る、任意の治療的使用に用いられ得る。
IL-5は好酸球の一次アクティベーターであり、そして抗体によるこのサイトカインの機能のブロッキングは、特定のアレルギー性疾患に関連する好酸球増加を防ぐかまたは軽減することが示されている。従って、本発明のRAMは、この目的で用いられ得、特に、喘息の処置において有用であり得る。ここで、喘息肺における好酸球の蓄積および活性化を防ぎ、その結果、気管支の炎症および気道が狭くなるのを軽減することが期待され得る。喘息の処置に使用するために、本発明のRAMは、有利には、例えば、鼻経路により投与するためにスプレーとして処方された単鎖Fvフラグメントであり得る。
本発明に従って抗IL-5抗体分子を得るための好ましいプロトコルを以下に示す。このプロトコルは、本明細書中の既に記載および定義したような本発明の概要に対し、権利を侵すことなく与えられる。
ヒトIL-5に対して惹起された39D10ラットモノクローナル抗体が、ドナー抗体として用いられる。39D10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインは、以前にクローン化されており(WO 93/16184)、そしてこれらのドメインのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図１および図２に示す。適切なアクセプターＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインが、決定されなければならず、それによりアミノ酸配列が知られる。次いで、RAMがアクセプター配列の基礎から始めて設計される。
１．CDR
第１の工程では、ドナー残基がCDRにおいてアクセプター残基に対して置換される。この目的のために、CDRは、好ましくは以下のように定義される：
0003973682.tif 000002
次いで、ドナー残基がフレームワークにおいてアクセプター残基に対して置換される位置が、まず第１にＨ鎖に関して、続いてＬ鎖に関してという順で選択される。
２．Ｈ鎖
2.1  ドナー残基は、Ｈ鎖の24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位、および78位の全てか、または23位、24位、27位〜30位、37位、49位、73位、および76位〜78位の全てのいずれかで用いられる。
３．Ｌ鎖
3.1  ドナー残基は、22位、68位、および71位の全てか、または68位および71位の全てかのいずれかで用いられる。
本発明は、ドナー抗体の結合親和性と実質的に等しい結合親和性を有する組換え抗IL-5抗体分子に関する。本発明は、ここで、添付の図面を参照して、単に例示のために記載される。ここにおいて：
図１  39D10Ｈ鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す；
図２  39D10Ｌ鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す；
図３  39D10Ｈ鎖可変ドメインフレームワーク領域とヒトIII群Ｈ鎖のコンセンサス配列のＨ鎖可変ドメインフレームワーク領域との整列を示す；
図４  39D10Ｌ鎖可変ドメインフレームワーク領域とヒトＩ群Ｌ鎖のコンセンサス配列のＬ鎖可変ドメインフレームワーク領域との整列を示す；
図５  CDR付加した抗IL-5Ｌ鎖であるCTIL-5-gL6のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す；
図６  CDR付加した抗IL-5Ｈ鎖であるCTIL-5-10gHのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す；
図７  プラスミドpMR14の地図を示す；
図８  プラスミドpMR15.1の地図を示す；
図９  キメラ39D10抗体およびCTIL-5-10gH＼-gL6抗体の親和定数および会合速度および解離速度を示す；
図10  抗体のパネルによるTF1アッセイにおけるIL-5の中和のグラフを示す；
図11  ラット39D10、キメラ39D10抗体、およびCTIL-5-10gH/gL6抗体についての競合アッセイの結果を示す；そして
図12  サル好酸球増加症に対するCTIL-5-10gH/gL6の効果を示す。
実施例
１．材料および方法
39D10は、ヒトIL-5に対して誘起されるラットモノクローナル抗体である。39D10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインの遺伝子は、以前にクローン化されており(WO 93/16184)、そしてこれらのドメインのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図１および図２に示す。39D10Ｈ鎖の可変ドメインのクローニングに用いられた戦略のために、フレームワーク領域の最初の５個のアミノ酸が未知である。しかし、抗体YTH34.5HL、Riechmannら[Nature,332,323-327(1988)]由来のフレームワーク１のリーダー配列および最初の５個のアミノ酸を含有するＨ鎖が入手可能であった。
２．分子生物学的手順
用いた分子生物学的手順は、Maniatisら[Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版，第１巻〜第３巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]に記載されるようであった。
３．組換えＨ鎖および組換えＬ鎖遺伝子の構築
Ｈ鎖
Ｈ鎖Vh領域を、オリゴヌクレオチドR3601およびR2155を用いてPCRにより生成した。これらの配列は、以下のようである：
0003973682.tif 000003
反応混合液(100μl)は、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、1.5mM Mgcl、50mM KCl、0.01％ w/vゼラチン、0.25mMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、0.1μg 39D10 Ｈ鎖DNA、6pmolのR3601およびR2155、ならびに0.25単位のTaqポリメラーゼを含有した。反応混合液を94℃にて５分間加熱し、次いで94℃１分間、55℃１分間、および72℃１分間をサイクルさせた。30サイクル後、反応液を等容量のフェノール／クロロホルム（１：１v/v）で抽出し、次いでクロロホルムで抽出した後、25容量のエタノールを添加することにより沈澱させた。PCR産物を適切な緩衝液に溶解し、HindIIIおよびApaIで消化し、アガロースゲルで精製し、そしてベクターpMR14（図７）（このベクターもまた、HindIIIおよびApaIで消化した）に連結した。E.coli LM1035に形質転換した後、コロニーを一晩増殖させ、そしてプラスミドDNAをVhの挿入について分析した。プラスミドpARH1217中のVh領域のヌクレオチド配列を図１に示す。
Ｌ鎖
V1 Ｌ鎖遺伝子を、WO 93/16184に記載のように、オリゴヌクレオチドR3585およびR3597でのPCRにより元のV1からクローン化して生成した。これらの配列は、以下のようである：
0003973682.tif 000004
PCRを、上記のように行った。PCR産物を酵素BstBIおよびSplIで消化し、そして精製後、予め同じ酵素で消化したpMR15.1（図８）に連結した。
E.coli LM1035の形質転換後、V1挿入物を有するプラスミド(pARH1215)を含有したコロニーを同定した。V1挿入物のヌクレオチド配列を図２に示す。
39D10のCDR付加
Ｌ鎖
39D10のCDRループのための最も適切なヒトアクセプターフレームワークを決定するために、39D10のフレームワーク１〜３のアミノ酸配列を、公知のヒトκＬ鎖のアミノ酸配列と比較した。39D10は、ヒトＩ群Ｌ鎖に最も相同であることが見出された。これに基づいて、CDR付加のためにヒトＩ群生殖系列のフレームワークを用いることを決定した。これらの配列の間の相同性を図３に示す。39D10のフレームワーク４領域と公知のヒトＩ群Ｌ鎖との間のコンセンサス配列との間の相同性もまた示す。39D10における、ヒトのコンセンサス配列とは異なる残基に下線を付す。これらの残基が抗原結合に対してなし得る寄与を分析し、そして２つの遺伝子をCDR付加Ｌ鎖について構築した。これらは、CTIL-5-gL5およびCTIL-5-gL6であり、ここでは、CDR残基と同様に、残基22、68、および71、または残基68および71のいずれかもまた、それぞれ、39D10に由来した。CTIL-5-gL6のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図５に示す。
Ｈ鎖
39D10のＨ鎖のCDR付加を、Ｌ鎖について記載のように行った。39D10のフレームワーク領域は、ヒトIII群抗体のフレームワーク領域に最も相同であることが見出された。その結果、ヒトIII群生殖系列遺伝子のフレームワークのコンセンサス配列を、39D10Ｈ鎖のCDRを受け入れるために用いた。先述のように、ヒトIII群のフレームワーク４領域に対するコンセンサス配列もまた、選択した。これらの配列の比較を図４に示し、39D10においてヒトのコンセンサス配列とは異なる残基に下線を付す。
抗原結合に影響し得る39D10におけるフレームワーク残基の分析を行い、そしてこれに基づいて２つの遺伝子（CTIL-5-9gHおよびCTIL-5-10gH）を、構築した。ここで、残基23位、24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位〜78位、あるいは残基24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位および78位はいずれも、それぞれ、39D10に由来した。CTIL-5-10gHのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図６に示す。
抗IL-5抗体の発現および生物学的活性
キメラ（ラット／ヒト）39D10およびCDR付加39D10を、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に同時トランスフェクション後のＨ鎖およびＬ鎖対の一時的な発現により生物学的に評価するために、リン酸カルシウム沈澱を用いて産生した。
トランスフェクションの１日前に、セミコンフルエンスに達したCHO-L761h細胞(Cockettら，Nucl.Acids.Res.,19,319-325,1991)のフラスコをトリプシン処理し、細胞数を計数し、そしてそれぞれ107細胞をT75フラスコに入れた。翌日、培養培地をトランスフェクションの３時間前に変えた。トランスフェクションのために、それぞれ50μgのＨ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターを含有する1.25mlの0.25M CaCl2を1.25mlの２×HBS（１リットルの水中16.36g NaCl、11.9g HEPESおよび0.4g Na2HPO4、pHをNaOHで7.1に調整する）と混合することにより、リン酸カルシウム沈澱を調製し、そして直ちに細胞の培地に添加した。CO2インキュベーター中、37℃にて３時間の後、培地および沈澱を取り除き、そしてリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中の15％グリセロールを15ml添加することにより、１分間、細胞に衝撃を与えた。グリセロールを取り除き、細胞をPBSで１回洗浄し、そして10mM酪酸ナトリウムを含有する25mlの培地中で48〜96時間インキュベートした。抗体をプロテインＡ−Sepharoseに結合させ、そしてそこからの溶出により培養培地から精製した。抗体濃度を、ヒトIg ELISA（以下を参照のこと）を用いて測定した。
ELISA
抗体発現を、Ｈ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子の対をCHO細胞にトランスフェクトし、そして３日間のインキュベーション後、培養培地中に蓄積した抗体の量をELISAにより測定することにより評価した。
ELISAのために、Nunc ELISAプレートを、４℃にて一晩、コート緩衝液（15mM炭酸ナトリウム、35mM炭酸水素ナトリウム(pH6.9)）中、５μg/mlでポリクローナルヤギ抗ヒトFcフラグメント特異的抗体(Jackson Immunoresearch,コード番号109-006-098)のF(ab')2フラグメントを用いてコートした。非コート抗体を、蒸留水で５回洗浄することにより除去した。定量されるサンプルおよび精製スタンダードを、結合緩衝液（0.1M Tris-HCl(pH7.0)、0.1M NaCl、0.2％v/v Tween20、0.2％ w/v Hammerstenカゼイン）中に約１μg/mlに希釈した。サンプルを、マイクロタイターウェルにおいて２倍希釈で滴定して各ウェル0.1mlの最終容量とし、そしてプレートを室温にて１時間、振盪しながらインキュベートした。最初のインキュベーション工程の後、プレートを蒸留水で10回洗浄し、次いで、0.1mlの結合緩衝液中700倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒトκ（クローンGD12）ペルオキシダーゼ結合抗体（The Binding Site、コード番号MP135）とともに、以前のように１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、そして基質溶液（0.1ml）を各ウェルに添加した。基質溶液は、10mlの0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム（pH6.0）中に150μlのN,N,N,N-テトラメチルベンジジン（DMSO中10mg/ml）、150μl過酸化水素（30％溶液）を含有した。プレートを、630nmでの吸光度がトップスタンダードに対して約1.0となるまで、５〜10分間発色させた。630nmでの吸光度を、プレート読み取り機を用いて測定し、そして滴定曲線をスタンダードの滴軸線と比較してサンプルの濃度を決定した。
抗IL-5抗体に対する親和定数の決定
キメラ抗IL-5抗体とCDR付加抗IL-5抗体との親和性を生物特異的相互作用分析(BIA)を用いて決定した。抗体をＨ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子の組み合わせでトランスフェクションすることによりCHO細胞において産生し、そしてプロテインＡ Sepharoseで培養上清から精製した。親和性の測定のために、ポリクローナル抗ヒトFc抗体をPharmacia Biosensorチップ（12150相対応答単位、RU）に結合させ、これを用いて10mM HEPES、0.15M NaCl、3.4mM EDTA(pH7.4)中、５μg/mlでチップを通過した抗IL-5を捕獲した。各ランで捕獲された抗IL-5の量は、約1600RUであった。次いで、組換えヒトIL-5を、上記緩衝液中で種々の濃度（0.6〜５μg/ml)でSensorchipに通過させた。各ラン後に、Sensorchipを100mM HClおよび100mMオルトリン酸で浄化し、結合したIL-5および抗体を除去した。生成したセンサーグラム(sensorgram)をBIAcore machineで入手可能な動力学ソフトウェアを用いて分析した。
２つの抗体（キメラ39D10およびCTIL-5-10gH/-gL6）の親和定数ならびに会合速度および解離速度の値を決定した。結果を図９に示す。キメラ39D10がヒトIL-5に極めて高い親和性を有し、そしてこの値がCTIL-5-10gH/-gL6においても再現されることが示された。
インビトロバイオアッセイにおける抗IL-5抗体の活性
TF1細胞を用いるインビトロでのバイオアッセイにおいて、種々のCDR付加抗体の活性をキメラ39D10の活性と比較した。TF1は、増殖のためにGM-CSFを必要とする赤白血病細胞株である。GM-CSFは、IL-5で置換され得るが、この例では、細胞は生存するのみで増殖しない。しかし、生存のためのIL-5への依存は、TF1細胞が種々の抗IL-5抗体の活性を比較するためのバイオアッセイに用いられ得ることを意味する。
抗IL-5抗体による中和を、一定量のIL-5（２ng/ml）および種々の量の抗体を用いて、96平底プレート中で１ウェルあたり５×104細胞とともに３日間インキュベートして測定した。最後の４時間は、細胞を500μg/mlトリアゾリルブルー(MIT)の存在下で培養する。この色素は、生存細胞中のミトコンドリアの酵素により紫色の不溶型に転換される。不溶性の物質は、100μlの50％ジメチルホルムアミド、20％ SDS(pH4.7)の添加後に一晩インキュベートすることにより溶解され、そして取り込まれた色素量を分光測光法で決定した。抗体の存在下で残存する生物活性のあるIL-5のレベルを、IL-5濃度に関連する色素の取り込みの標準曲線から推定した。
種々の組み合わせのＨ鎖およびＬ鎖の活性を、TF1バイオアッセイを用いて評価した。結果を図10に示す。CDR付加Ｈ鎖およびＬ鎖の全ての組み合わせがキメラ39D10に等力である抗体を産生することが示され得る。これらの結果は、Ｌ鎖の残基22だけでなく、Ｈ鎖の残基23または78も、最適な結合のために39D10特異的である必要がないことを示す。従って、より少ない39D10特異的残基の組み合わせはCTIL-5-10gH/-gL6である。
競合アッセイにおける抗IL-5抗体の活性
組換えヒトIL-5を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中、１μg/mlに希釈し、そして100μlのアリコートをマイクロタイタープレート(Costar Amine Binding plate)に添加し、そして４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、0.5％ Tween20を含有するPBSで３回洗浄し、そして何らかの残存する活性部位を、PBS中の２％ウシ血清アルブミン(BSA)で30分間ブロックした。次いで、プレートを吸引し、そして叩いて乾燥させた。親のラット抗体(39D10)の相対結合活性をキメラ抗体および付加抗体と比較するために、PBS/1％ BSA中で各抗IL-5抗体の系列希釈を調製し、そして50μlを２連のウェルにするために添加して、その直後に50μlの39D10−ビオチン結合物を0.125μg/mlで添加した。アッセイを撹拌しながら室温で２時間インキュベートし、次いでPBSで２回洗浄した。ストレプトアビジンに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（１μg/ml）を全てのウェルに添加し、そしてさらに30分間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、そして100μlのテトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加した。発色を630nm（参照490nm）で読み取り、そしてOD(630-490)を1og(10)抗体濃度に対してプロットした。
ラット39D10、キメラ39D10、およびCTIL-5-10gH/gL6の活性を、上記競合アッセイにて比較した場合、図11に示す結果が得られた。３つの抗体は全て、IL-5への結合に対してビオチン化39D10と同等に十分に競合した。これは、39D10のCDRループがヒトフレームワークに首尾良く移動されたことを示す。
サル好酸球増加症に対する抗IL-5抗体の効果
抗IL-5抗体（CTIL-5-10gH/gL6）を、喘息症状をモデル化したサルの系（Mauser,P.J.ら，Ann.Rev.Respir.Dis.,印刷中，を参照のこと）で試験した。Ascarisでチャレンジする１時間前に応答性のサルに投与した場合、CTIL-5-10gH/gL6は、0.3mg/kg(静脈内投与)の用量で肺洗浄好酸球増加症を75％阻害する。このセットのサルは、ヒスタミンに過剰応答しない。従って、過剰応答に対するCTIL-5-10gH/gL6の効果を決定し得なかった。この単回投量の３ヶ月後、Ascarisのチャレンジに応答する好酸球の蓄積は、依然として75％阻害される。
アレルギーマウスでは、CTIL-5-10gH/gL6は、１mg/kg(腹腔内投与)で肺の好酸球増加症を阻害する。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：
(A)名称：セルテック  リミテッド
(B)番地：バス ロード 216
(C)市：スロー
(D)州：バークシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：エスエル１  ４イーエヌ
(G)電話：0753 534655
(H)テレファックス：0753 536632
(I)テレックス：848473
(ii)発明の名称：インターロイキン−５特異的組換え抗体
(iii)配列数：２８
(iv)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS／MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0，バージョン ＃1.25(EPO)
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：48塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号１：
0003973682.tif 000005
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：41塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号２：
0003973682.tif 000006
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：44塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号３：
0003973682.tif 000007
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号４：
0003973682.tif 000008
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：333塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..333
(xi)配列：配列番号５：
0003973682.tif 000009
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：111アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号６：
0003973682.tif 000010
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：384塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..384
(xi)配列：配列番号７：
0003973682.tif 000011
(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：128アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号８：
0003973682.tif 000012
(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号９：
0003973682.tif 000013
(2)配列番号１０の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１０：
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(2)配列番号１１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１１：
0003973682.tif 000015
(2)配列番号１２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１２：
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(2)配列番号１３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：32アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１３：
0003973682.tif 000017
(2)配列番号１４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：32アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１４：
0003973682.tif 000018
(2)配列番号１５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１５：
0003973682.tif 000019
(2)配列番号１６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１６：
0003973682.tif 000020
(2)配列番号１７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：30アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１７：
0003973682.tif 000021
(2)配列番号１８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：25アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１８：
0003973682.tif 000022
(2)配列番号１９の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：14アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１９：
0003973682.tif 000023
(2)配列番号２０の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：14アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２０：
0003973682.tif 000024
(2)配列番号２１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：32アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２１：
0003973682.tif 000025
(2)配列番号２２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：32アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２２：
0003973682.tif 000026
(2)配列番号２３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２３：
0003973682.tif 000027
(2)配列番号２４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２４：
0003973682.tif 000028
(2)配列番号２５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：399塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..399
(xi)配列：配列番号２５：
0003973682.tif 000029
(2)配列番号２６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：133アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２６：
0003973682.tif 000030
(2)配列番号２７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：420塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..420
(xi)配列：配列番号２７：
0003973682.tif 000031
(2)配列番号２８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：140アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２８：
0003973682.tif 000032
【図１】
0003973682.tif 000033
【図２】
0003973682.tif 000034
【図３】
0003973682.tif 000035
【図４】
0003973682.tif 000036
【図５】
0003973682.tif 000037
【図６】
0003973682.tif 000038
【図７】
0003973682.tif 000039
【図８】
0003973682.tif 000040
【図９】
0003973682.tif 000041
【図１０】
0003973682.tif 000042
【図１１】
0003973682.tif 000043
【図１２】
0003973682.tif 000044