(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化されているエリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、液体薬剤組成物。
【請求項２】
水性溶液である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
等張性溶液である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
アニオンが、多価の荷電無機強酸のアニオンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
アニオンが、硫酸、クエン酸又はリン酸イオンよりなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
アニオンが、硫酸アニオンである、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
１０〜２００mmol/lの硫酸塩を含むことを特徴とする、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
pHが、５．８〜６．７である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
pHが、６．０〜６．５である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
pHが、約６．２である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
緩衝液が、リン酸緩衝液又はアルギニン／Ｈ2ＳＯ4／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液よりなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
緩衝液が、１０〜５０mmol/lのリン酸緩衝液である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が、１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤が、薬剤学的に許容しうる塩、希釈剤、溶媒及び保存料よりなる群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
薬剤学的に許容しうる賦形剤が、張度剤、ポリオール類、酸化防止剤及び非イオン性界面活性剤よりなる群から選択される、請求項１３又は１４記載の組成物。
【請求項１６】
薬剤学的に許容しうる賦形剤が、ポリオールである、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ポリオールが、マンニトールである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
酸化防止剤を含むことを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
酸化防止剤が、メチオニンである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
１mmol/l以下のＣａＣｌ2を含むことを特徴とする、請求項１３〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８である、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー１８８である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
組成物が、１％（w/v）以下の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項２２又は２３記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、０．１％（w/v）以下の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２６】
エリトロポエチンタンパク質が、ヒトエリトロポエチンである、請求項１〜２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２７】
エリトロポエチンタンパク質が、内因性遺伝子活性化により発現される、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
エリトロポエチンタンパク質が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２６又は２７記載の組成物。
【請求項２９】
タンパク質が、１〜６個のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３０】
エリトロポエチンタンパク質が、下記：
【表１】
0003967594.tif 000028
よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３１】
ヒトエリトロポエチンの配列が、少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により修飾される、請求項２６〜３０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３２】
転位が、ヒトエリトロポエチンのＮ結合グリコシル化部位のいずれかの欠失と、ヒトエリトロポエチンの配列の８８位でのＮ結合グリコシル化部位の付加とを特徴とする、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
糖タンパク質が、下記：
【表２】
0003967594.tif 000029
よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する、請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体は、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する）よりなる群から選択されるエリトロポエチン糖タンパク質を含むことを特徴とし；該糖タンパク質は、式：−ＣＯ−（ＣＨ2）x−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲの「ｎ」個のポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており、各式：−ＣＯ−（ＣＨ2）x−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲの−ＣＯは、該アミノ基の１個とのアミド結合を形成する（ここで、Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２又は３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり、そしてｎ及びｍは、複合体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し引いた分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトンであるように選択される）、請求項１〜３３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
式（Ｉ）：
【化１】
0003967594.tif 000030
〔式中、ｍ、ｎ、ｘ及びＲは、上記と同義であり、そしてＰは、ポリ（エチレングリコール）基とアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を含まない糖タンパク質の残基である〕で示されるエリトロポエチンタンパク質を有する、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
式（Ｉ）において、ｘが、２であり、ｍが、６５０〜７５０であり、ｎが、１であり、そしてＲが、メチルである、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体は、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒトエリトロポエチンの１次構造を有する）よりなる群から選択されるエリトロポエチン糖タンパク質を含むことを特徴とし；該糖タンパク質は、１〜３個の低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）基は、リンカーである式：−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ここで、リンカーの−ＣＯは、該アミノ基の１個とのアミド結合を形成し、Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であり、ｋは、１〜１０であり、Ｙは、下記式：
【化２】
0003967594.tif 000031
で示される）を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）残基の平均分子量が、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり、そして複合体の分子量が、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである、請求項１〜３３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３８】
下記式：
【化３】
0003967594.tif 000032
〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエリトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
下記式：
【化４】
0003967594.tif 000033
〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエリトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項３７記載の組成物。
【請求項４０】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜３９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４１】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜２００mmol/lの硫酸塩、及び１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６．０〜６．５）を含むことを特徴とする、請求項１〜４０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４２】
２０mM以下のメチオニン、１〜５％のポリオール（w/v）、０．１％以下のポロキサマー１８８（w/v）及び場合により１mM以下のＣａＣｌ2を含むことを特徴とする、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、４０mmol/lの硫酸塩、１０mmol/lのリン酸塩、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（w/v）（pH６．２）を含むことを特徴とする、請求項４１又は４２記載の組成物。
【請求項４４】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜１００mmol/lのＮａＣｌ、１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６．０〜７．０）、場合により１〜５％のポリオールを含むことを特徴とする、請求項１〜４０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４５】
２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のポロキサマー１８８及び場合により７．５μmol/lのＣａＣｌ2を含むことを特徴とする、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１００mmol/lのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８、及び１０mmol/lのリン酸塩（pH７．０）を含むことを特徴とする、請求項４４又は４５記載の組成物。
【請求項４７】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜５０mmol/lのアルギニン（pH６〜pH６．５）、１０〜１００mmol/lの硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜４０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４８】
２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のポロキサマー１８８、場合により１mmol/l以下のＣａＣｌ2及び場合により１〜５％のポリオールを含むことを特徴とする、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、４０mmol/lのアルギニン（pH６．２）、３０mmol/lの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８及び場合により１mmol/lのＣａＣｌ2を含むことを特徴とする、請求項４７又は４８記載の組成物。
【請求項５０】
２５〜２５００μg/mlのエリトロポエチンと、
ａ）１０mMのリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．０）又は
ｂ）１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム（pH６．２）又は
ｃ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（pH６．２）又は
ｄ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（pH６．２）又は
ｅ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（pH６．２）又は
ｆ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（pH６．２）
とを含むことを特徴とする、請求項１〜４０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５１】
エリトロポエチンの量が、５０、１００、４００、８００又は２５００μg/mlである、請求項１〜５０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５２】
１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（pH６．２）を含むことを特徴とする、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（pH６．２）を含むことを特徴とする、請求項５１記載の組成物。
【請求項５４】
凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末である、請求項１〜５３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５５】
エリトロポエチンタンパク質を、多価の陰性荷電アニオン及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする溶液と混合することを特徴とする、請求項１〜５３のいずれか１項記載の組成物の製造方法。
【請求項５６】
慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳに関連した疾患の治療及び予防、及び／又は化学療法を受ける癌患者の処置に有用な医薬の製造のための、請求項１〜５３のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項５７】
慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳ及び化学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び予防のための請求項１〜５３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５８】
請求項１〜５３のいずれか１項記載の組成物を含むことを特徴とする、局所及び全身性の持続放出のためのインプラント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、液体薬剤組成物に関する。この組成物は、赤血球新生に関連する疾患の予防及び治療に特に有用である。
【０００２】
赤血球新生は、細胞破壊を補うために存在する、赤血球の産生である。赤血球新生は、十分な赤血球を適正な組織の酸素供与のために利用可能にする、制御された生理学的機序である。天然ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）は、腎臓において産生され、そして赤血球産生を刺激する液性の血漿因子である（Carnot, PとDeflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432；Erslev, AJ (1953) Blood 8: 349；Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372；Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W及びPlzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4）。天然ＥＰＯは、骨髄における拘束された赤血球系始原細胞の分裂及び分化を刺激し、赤血球系前駆細胞上の受容体に結合することによりその生物学的活性を発揮する（Krantz, BS (1991) Blood 77: 419）。
【０００３】
エリトロポエチンは、組換えＤＮＡ法を用いて生合成により製造されており（Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, Jら (1986) Immunobiol. 72: 213-224）チャイニーズハムスターの卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）に挿入され、かつ発現されるクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ｈＥＰＯの主な完全にプロセッシングを受けた形態の１次構造は、配列番号１に示されている。Ｃｙｓ7−Ｃｙｓ161及びＣｙｓ29−Ｃｙｓ33の間に２個のジスルフィド架橋が存在する。糖残基を含まないＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は、１８，２３６Daである。未変性ＥＰＯ分子において、分子量の約４０％は、タンパク質上のグリコシル化部位でタンパク質をグリコシル化する、炭水化物基により占められている（Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A及びFukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059）。
【０００４】
ヒトエリトロポエチンは、赤血球形成において必須であるため、このホルモンは、低いか又は不完全な赤血球産生を特徴とする血液障害の処置において有用である。臨床的には、ＥＰＯは、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血の処置（Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MRら (1987) NEJM 316: 73-78；Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JKら (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992；Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262；Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, Dら (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114）並びにＡＩＤＳ及び化学療法を受ける癌患者（Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RIの MB, Garnick編 Erythropoietin in Clinical Applications - An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.301-324）に使用されている。
【０００５】
既知の薬剤組成物は、以下の不都合の少なくとも１つを有する：
−これらは、凍結乾燥品である。複雑な製造手順のほかに、凍結乾燥品は、ヒトに注射する前に復元しなければならないという不都合を有する。このため、医療従事者による追加的な取扱いを必要とし、そしてこのことは、不便であり、かつ製剤の誤った取扱いのリスクを負う；
−これらは、ヒト血清アルブミンを添加物として含む。ヒト血清アルブミンは、ヒト体液から誘導される製品であるため、アルブミン調剤には混入によるウイルス感染のリスクが存在する。また、アレルギー反応も可能性がある；
−現在市販されている全てのエリトロポエチン組成物は、高温、即ち、通常２〜８℃の間である冷蔵庫温度より高い温度では不安定である。したがって、これらを、冷蔵庫（２〜８℃）内に貯蔵しなければならず、室温（およそ２０℃）では貯蔵できない。このため、低温での貯蔵及び輸送により発生する費用がかかることになり、また、薬物の取扱いにも不便を引き起こす。ここでいう不安定とは、高温、例えば２５℃での長期（即ち、数ヶ月、又は６ヶ月以上）の貯蔵が、タンパク質の分解をもたらすことを意味する。ここでいう分解とは、高温（８℃超）で優先的に起こることが知られている、タンパク質分子の物理変化（例えば、凝集又は変性）及び化学変化（例えば、一般に化学結合の酸化又は修飾）を表現する。タンパク質をその転移温度（融点とも呼ばれる）近く又はそれを超えてインキュベートすると、タンパク質のアンフォールディングが起こる、即ち、ポリペプチドの本来の構造及び生物学的活性が失われる。転移温度は、タンパク質の温度安定性に強く相関しており、そしてタンパク質の環境（例えば、pH、塩、イオン強度、緩衝剤など）に依存している。例えば、変性は、エリトロポエチン分子の凝集、即ち、ダイマー（共有又は非共有結合）、高次凝集体そして更には微粒子の形成をもたらす。これによって、薬物の効力が低下し、そしてヒトへの注射後に有害な副作用を誘導することがある。
【０００６】
よって本発明の基調をなす問題は、上述の不都合を最小化又は抑制することができる組成物を提供することである。
【０００７】
この問題は、本発明により、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０のpHの緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、薬剤組成物を提供することによって解決される。
【０００８】
驚くべきことに、エリトロポエチンをこの組成物に処方すると、冷蔵庫温度（２〜８℃）を超える温度、特に室温（即ち、２５℃未満）そして更に高温、例えば、４０℃でも、その安定性が改善されることが見い出された。このことは、長期にわたり冷却することなく、活性の有意量を失うことなく、そして有意に分解することなく、組成物を貯蔵できることを意味する。
【０００９】
他に記載がなければ、以下の定義は、本明細書の発明を記述するために使用される種々の用語の意味と範囲を、例示及び定義するために述べられる。
【００１０】
「多価の荷電無機アニオン」という用語は、１分子当たり２個以上の負電荷を有する無機アニオン、例えば、硫酸イオンＳＯ42-、又はリン酸アニオン、即ち、リン酸水素イオンＨＰＯ42-を意味する。多価の荷電無機アニオンは、対応する塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩及びこれらの混合物の形態で、及び／又は緩衝剤、例えば、リン酸緩衝剤の形態で添加してよい。
【００１１】
「等浸透性又は等張性」という用語は、その成分に影響を及ぼすことなく、体液と混合できる溶液を意味する。塩化ナトリウム０．９％のような、血液と等張性である溶液は、血清と同じ浸透圧を有しており、そしてこれらは、赤血球の膜に影響を及ぼさない。一般に、血液と等張性である溶液は、約２９０mosm/kg  Ｈ2Ｏである。
【００１２】
「無機強酸」という用語は、１Ｎ溶液中で２０〜１００％の解離を示す無機酸、例えば、Ｈ2ＳＯ4を意味する。
【００１３】
本明細書において使用されるとき「薬剤学的に許容しうる」という用語は、その緩衝剤又は塩が、毒性の観点から許容しうることを意味する。
【００１４】
「希釈剤」という用語は、薬理学的活性を欠いているが、製剤学的に必要であるか又は望ましい、医薬品中の成分を意味する。例えば、希釈剤は、注射すべき薬物の溶解のための液体、例えば、水であってよい。
【００１５】
「溶媒」という用語は、別の物質を溶液中に保持する、即ち、それを溶解する液体、例えば、水を意味する。
【００１６】
「保存料」という用語は、細菌増殖を防止するために、薬剤組成物に加えられる物質、例えば、塩化ベンザルコニウム又はベンジルアルコールを意味する。
【００１７】
「ポリオール」という用語は、多価アルコール及び炭水化物を含む、複数のヒドロキシル基のある任意の物質を意味する。多価アルコールは、ソルビトール、マンニトール及びグリセロールのような化合物を含む。炭水化物は、例えば、ショ糖又はトレハロースのような、ケト又はアルデヒド基を有してもよい環状分子である。
【００１８】
「エリトロポエチン」又は「エリトロポエチンタンパク質」という用語は、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を持ち、かつヒトエリトロポエチン及び以下に定義される類似体よりなる群から選択されるタンパク質を意味する。
【００１９】
「ＰＥＧ化エリトロポエチン（Ｐｅｇ−ＥＰＯ又はＰＥＧ−ＥＰＯ）」という用語は、後述されるような１〜３個のポリエチレン誘導体と共有結合しているエリトロポエチンタンパク質を意味する。
【００２０】
「装置」という用語は、特定の目的のための考案品を意味する。本発明において、この目的は、液体薬剤組成物の投与を実現、支持又は促進することである。
【００２１】
更に詳細には、本発明は、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、液体薬剤組成物に関する。
【００２２】
好ましい実施態様において、本組成物は、液体の溶液、例えば水性溶液である。本発明の好ましい実施態様において、上記薬剤組成物は、等張性溶液である。
【００２３】
このアニオンは、好ましくは、Ｈ2ＳＯ4、Ｈ3ＰＯ4又はクエン酸のような、無機強酸のアニオンから選択される。したがって、好ましいアニオンは、硫酸、リン酸及びクエン酸イオン、好ましくは硫酸又はリン酸イオン、そして最も好ましくは硫酸イオンからなる群から選択される。多価の荷電無機アニオンの濃度は、１０〜２００mmol/lの間、例えば、硫酸アニオンでは１０〜２００mmol/lの間で変化させることができる。
【００２４】
本発明においてpHを約５．５〜約７．０の範囲、好ましくは５．８〜６．７の範囲、更に好ましくは６．０〜６．５の範囲、そして最も好ましくは約pH６．２に維持するために使用すべき緩衝液は、有機又は無機酸の従来の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、アルギニン／Ｈ2ＳＯ4／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液、又は他の任意の薬剤学的に許容しうる緩衝系）であってよい。好ましい実施態様において、本組成物は、リン酸又はアルギニン／Ｈ2ＳＯ4／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液、更に好ましくは１０〜５０mmol/lのリン酸緩衝液を含むことを特徴とする。当然ながら、これらの緩衝系の組合せもまた、本発明の一部である。pH値は、それぞれ、対応する塩基、例えば、リン酸緩衝系中のＮａＯＨ、及び対応する酸、例えば、アルギニン緩衝系中の硫酸で調整することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴としてよい。これらの薬剤学的に許容しうる賦形剤は、薬剤学的に許容しうる塩、希釈剤及び／又は溶媒及び／又は保存料など、例えば、張度剤（等張化剤）、ポリオール類、酸化防止剤又は非イオン性界面活性剤から選択することができる。これらの物質の例は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、サッカロース、トレハロース、アセチルシステイン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）である。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様において、薬剤組成物は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択されるポリオール（好ましくは、マンニトール）を含んでよい。ポリオールの濃度は、１〜１０％（w/v）の間で変化させることができる。
【００２７】
酸化防止剤の例は、システイン、メチオニン、アセチルシステイン又はアスコルビン酸、好ましくはメチオニンである。酸化防止剤は、通常０．０１〜０．５％（w/v）の間の濃度、即ち、例えばメチオニンの場合には１〜２０mMの濃度で加えられる。
【００２８】
また、上述の組成物は、場合により、約０．０１〜約０．９％（w/w）の等張化剤を含むことを特徴としてよい。これらの化合物は、当該分野において知られている；これらの剤の例は、塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムである。本発明の好ましい実施態様において、本組成物は、等張性溶液である。上記組成物はまた、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０又はポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）、好ましくはポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）のような、非イオン性界面活性剤を、例えば、１％（w/v）以下、更に好ましくは０．１％（w/v）以下、例えば、０．００１〜０．０１％（w/v）含んでもよい。
【００２９】
上記組成物はまた、追加の塩、例えば、１mmol/l以下のＣａＣｌ2を含んでもよい。
【００３０】
本発明は、薬剤学的活性成分としてエリトロポエチンを含むことを特徴とする薬剤組成物の製造に特に有用である。「エリトロポエチン」又は「エリトロポエチンタンパク質」又は「ＥＰＯ」という用語は、以下のとおりである：詳細には、この用語は、糖タンパク質、例えば、（配列番号１）若しくは（配列番号２）に記述されるアミノ酸配列、又は実質的にこれらと相同なアミノ酸配列を有しており、そしてその生物学的性質が、赤血球産生の刺激、並びに骨髄における拘束された赤血球系始原細胞の分裂及び分化の刺激に関連する、例えば、ヒトエリトロポエチンを意味する。本明細書において使用されるとき、これらの用語は、例えば、部位特異的突然変異により故意に、又は突然変異を通じて偶然に修飾されたタンパク質を含む。これらの用語はまた、グリコシル化のための１〜６個の付加部位を有する類似体、糖タンパク質のカルボキシル末端に少なくとも１個の追加アミノ酸を有する類似体（ここで、追加アミノ酸は、少なくとも１個のグリコシル化部位を含む）、及び少なくとも１個のグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。これらの用語は、天然及び組換えの両方により産生されたヒトエリトロポエチンを含む。
【００３１】
以下に詳細に述べられるように、ＥＰＯの製造及び精製は、当該分野において周知である。エリトロポエチンとは、組織、タンパク質合成、天然又は組換え細胞での細胞培養のような、任意の従来の供給源から得られるような、天然又は組換えタンパク質、好ましくはヒトタンパク質を意味する。突然変異タンパク質又は別の方法で修飾されたタンパク質のような、エリトロポエチンの活性を有する任意のタンパク質が包含される。組換えＥＰＯは、ＣＨＯ−、ＢＨＫ−又はＨｅＬａ細胞株における発現を介して、組換えＤＮＡ法により、又は内因性遺伝子活性化により製造することができる。内因性遺伝子活性化によるものを含む、タンパク質の発現は、当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,733,761号、5,641,670号、及び5,733,746号、並びに国際公開第93/09222号、第94/12650号、第95/31560号、第90/11354号、第91/06667号及び第91/09955号に開示されているが、これらのそれぞれの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。エリトロポエチン糖タンパク質生成物の製造のための好ましいＥＰＯ種は、ヒトＥＰＯ種である。更に好ましくは、ＥＰＯ種は、配列番号１又は配列番号２に記述されているアミノ酸配列、更に好ましくはアミノ酸配列：配列番号１を有する、ヒトＥＰＯである。
【００３２】
更に、エリトロポエチンは、グリコシル化のための１〜６個の付加部位を有する、糖タンパク質類似体であってよい。１個以上のオリゴ糖基でのタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド基本骨格に沿う特定の位置で起こり、タンパク質安定性、分泌、細胞内局在、及び生物学的活性のような、タンパク質の物性に大きく影響を及ぼす。グリコシル化は、通常２つのタイプがある。Ｏ結合オリゴ糖は、セリン又はトレオニン残基に結合し、そしてＮ結合オリゴ糖は、アスパラギン残基に結合する。Ｎ結合及びＯ結合両方のオリゴ糖上に見い出される１つのタイプのオリゴ糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）であり、これは、９個以上の炭素原子を含むアミノ糖のファミリーである。シアル酸は、通常Ｎ結合及びＯ結合両方のオリゴ糖の末端残基であり、そしてこれは負電荷を持つため、糖タンパク質に酸性の性質を与える。１６５個のアミノ酸を有するヒトエリトロポエチンは、３個のＮ結合オリゴ糖鎖及び１個のＯ結合オリゴ糖鎖を含み、そしてこれらは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を構成する。Ｎ結合グリコシル化は、２４、３８、及び８３位に位置するアスパラギン残基で起こり、そしてＯ結合グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基で起こる。オリゴ糖鎖は、末端シアル酸残基で修飾される。エリトロポエチンのシアル化は、肝結合タンパク質による結合、及びこれに続くクリアランスを妨げるため、グリコシル化エリトロポエチンから全てのシアル酸残基を酵素的に除去すると、インビボ活性の消失が起こるが、インビトロ活性は消失しない。
【００３３】
本薬剤組成物の「エリトロポエチン」という用語は、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列に１つ以上の変更を加えて、シアル酸結合のための部位の数を増加させた、ヒトエリトロポエチンの類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用可能な部位を増加させるか又は変える、アミノ酸残基の付加、欠失、又は置換のある、部位特異的突然変異により生成することができる。シアル酸のレベルがヒトエリトロポエチンに見い出されるそれよりも大きな糖タンパク質類似体は、生物学的活性に必要な２次又は３次コンフォメーションを混乱させない、グリコシル化部位を付加することにより生成される。本発明の糖タンパク質はまた、通常Ｎ結合又はＯ結合部位に近接した１個以上のアミノ酸の置換を伴う、グリコシル化部位で炭水化物結合のレベルが増加した類似体をも含む。本発明の糖タンパク質はまた、エリトロポエチンのカルボキシル末端から伸長する１個以上のアミノ酸を有しており、少なくとも１個の追加の炭水化物部位を提供する類似体をも含む。本組成物のエリトロポエチンタンパク質はまた、少なくとも１個のグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体をも含む。このようなグリコシル化部位の転位は、ヒトエリトロポエチンにおける１個以上のグリコシル化部位の欠失と１個以上の非天然グリコシル化部位の付加を伴う。エリトロポエチン上に炭水化物鎖の数が増加し、そのためエリトロポエチン分子当たりのシアル酸の数が増加すると、溶解度の増大、タンパク質分解に対する抵抗性の増大、免疫原性の低下、血清半減期の増大、及び生物学的活性の増大のような、有利な性質が与えられる。追加のグリコシル化部位を持つエリトロポエチン類似体は、更に詳細には１９９５年３月１日に公開されたElliotのヨーロッパ特許出願第640,619号に開示されている。
【００３４】
好ましい実施態様において、本発明の薬剤組成物は、下記から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を含むことを特徴とするエリトロポエチン（これらに限定されない）のような、グリコシル化のための少なくとも１個の追加部位を含むアミノ酸配列を持つエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする：
【００３５】
【表３】
0003967594.tif 000002
【００３６】
アミノ酸配列の修飾のための本明細書において使用される表記法は、上付の数により表示される対応する未修飾タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号２のｈＥＰＯ）の位置が、各上付の数の直前にあるアミノ酸に変更されていることを意味する。
【００３７】
エリトロポエチンタンパク質はまた、糖タンパク質のカルボキシル末端に少なくとも１個の追加のアミノ酸を有する類似体であってもよい（ここで、追加のアミノ酸は、少なくとも１個のグリコシル化部位を含む）。追加のアミノ酸は、ヒト絨毛性ゴナドドロピンのカルボキシル末端から誘導されるペプチド断片を含んでいてもよい。好ましくは、この糖タンパク質は、（ａ）カルボキシル末端から伸長する、アミノ酸配列：Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln（配列番号３）を有する、ヒトエリトロポエチン；（ｂ）更にSer87 Asn88 Thr90 ＥＰＯを含むことを特徴とする（ａ）における類似体；及び（ｃ）更にAsn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 ＥＰＯを含むことを特徴とする（ａ）における類似体よりなる群から選択される類似体である。
【００３８】
エリトロポエチンタンパク質はまた、少なくとも１個のグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体であってもよい。転位は、ヒトエリトロポエチンにおけるＮ結合炭水化物部位のいずれかの欠失、及びヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列の８８位のＮ結合炭水化物部位の付加を含むことを特徴としてよい。好ましくは、この糖タンパク質は、Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 ＥＰＯ；Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 ＥＰＯ；及びGln83 Ser87 Asn88 Thr90 ＥＰＯよりなる群から選択される類似体である。
【００３９】
更に詳細には、上述の本薬剤組成物のエリトロポエチンタンパク質はまた、そのＰＥＧ化誘導体を含んでもよい。エリトロポエチンのＰＥＧ化誘導体及びその製造法は、当該分野において知られており、例えば、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO 93/25212、WO 94/20069、WO 95/11924、米国特許第5,56号、EP-A-584,876、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、米国特許第5,359,030号及び5,681,811号、米国特許第4,179,337号、日本特許、WO 98/32466、米国特許第5,324,650号に記載されている。ＰＥＧ化エリトロポエチン種の好ましい実施態様は、後述のような誘導体に当てはまる。
【００４０】
したがって、本発明はまた、エリトロポエチン複合体に関するものであり、該複合体は、少なくとも１個の遊離アミノ酸を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有する、上述のようなエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とし、そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する）よりなる群から選択され；該エリトロポエチンは、式：−ＣＯ−（ＣＨ2）x−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲで示される「ｎ」個のポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル）は、該アミノ基の１個とアミド結合を形成する（ここで、Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２又は３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり、そしてｎ及びｍは、複合体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し引いた分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトンであるように選択される）。本発明は更に、ｎが１である複合体の百分率が、組成物の全ての複合体の少なくとも９０パーセント、好ましくは少なくとも９２パーセント、更に好ましくは９６パーセントである、本明細書に記載される複合体を含む薬剤組成物を提供する。
【００４１】
更に具体的には、上記複合体は、式（Ｉ）：
【００４２】
【化５】
0003967594.tif 000003
【００４３】
〔式中、Ｐは、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有する、本明細書に記載されるエリトロポエチンタンパク質の残基（即ち、式（Ｉ）に示されるカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を含まない）であり；そしてＲは、低級アルキルであり；ｘは、２又は３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり；そしてｎ及びｍは、複合体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し引いた分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトンであるように選択される〕により表される。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチル、エチル及びイソプロピルを含む。本発明では、Ｒは、任意の低級アルキルである。Ｒがメチルである複合体が好ましい。
【００４５】
「ｍ」という記号は、ポリ（エチレンオキシド）基中のエチレンオキシド残基（ＯＣＨ2ＣＨ2）の数を表す。エチレンオキシドの単一のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）サブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。即ち、複合体の分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、「ｍ」という数に依存する。本発明の複合体において、「ｍ」は、約４５０〜約９００（約２０kDa〜約４０kDaの分子量に対応する）、好ましくは約６５０〜約７５０（約３０kDaの分子量に対応する）である。ｍという数は、得られる本発明の複合体が、未修飾ＥＰＯに匹敵する生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応する未修飾ＥＰＯの活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分であろう。「約」ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数の合理的範囲に入ることを意味する。「ｍ」という数は、エリトロポエチン糖タンパク質に共有結合している各ポリ（エチレングリコール）基の分子量が、約２０kDa〜約４０kDaであり、そして好ましくは約３０kDaであるように選択される。
【００４６】
本発明の複合体において、「ｎ」という数は、エリトロポエチンタンパク質の遊離アミノ基（リシンアミノ酸のε−アミノ基及び／又はアミノ末端アミノ基を含む）にアミド結合を介して共有結合しているポリ（エチレングリコール）基の数である。本発明の複合体は、ＥＰＯの１分子当たり、１個、２個、又は３個のＰＥＧ基を有してよい。「ｎ」は、１〜３の範囲の整数であり、好ましくは「ｎ」は、１又は２であり、そして更に好ましくは「ｎ」は１である。上述の複合体の好ましい複合体は、ｘが２であり、ｍが６５０〜７５０であり、ｎが１であり、そしてＲがメチルである、化合物を含むことを特徴とする。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物は、式（II）：
【００４８】
【化６】
0003967594.tif 000004
【００４９】
〔式中、Ｒ及びｍは、上記と同義である〕で示される化合物をエリトロポエチン糖タンパク質と縮合することにより、既知の重合性物質から製造することができる。ｘが３である、式（II）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低級アルコキシ、酪酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ）である。ｘが２である、式（II）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低級アルコキシ、プロピオン酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）である。活性化エステルをアミンと反応させてアミドを形成する、任意の従来法を利用することができる。上述の反応において、例示されるスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす脱離基である。タンパク質との複合体を生成するための式（II）の化合物のようなスクシンイミジルエステルの使用は、１９９７年９月３０日発行の米国特許第5,672,662号（Harrisら）に開示されている。
【００５０】
ヒトＥＰＯは、９個の遊離アミノ基：アミノ末端アミノ基に加えて８個のリシン残基のε−アミノ基を含む。ＰＥＧ化試薬を式（II）のＳＢＡ化合物と化合させると、pH７．５、１：３のタンパク質：ＰＥＧ比、及び２０〜２５℃の反応温度で、モノ−、ジ−、及び痕跡量のトリ−ＰＥＧ化種の混合物が生成したことが判った。ＰＥＧ化試薬が式（II）のＳＰＡ化合物であるとき、タンパク質：ＰＥＧ比が１：２であることを除いて同様の条件で、主としてモノ−ＰＥＧ化種が生成した。ＰＥＧ化ＥＰＯは、混合物として、又はカチオン交換クロマトグラフィーで分離した異なるＰＥＧ化種として投与することができる。反応条件（例えば、試薬の比、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間など）を操作することにより、異なるＰＥＧ化種の相対量を変化させることができる。
【００５１】
上述の薬剤組成物はまた、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒトエリトロポエチンの１次構造を有する）よりなる群から選択される、上記と同義のエリトロポエチンタンパク質を含んでもよく；該糖タンパク質は、１〜３個の低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基と共有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）基は、リンカーである式：−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−〔ここでリンカーのＣ（Ｏ）は該アミノ基の１個とアミド結合を形成し、Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であり、ｋは、１〜１０であり、Ｙは、下記式：
【００５２】
【化７】
0003967594.tif 000005
【００５３】
で示される〕を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）残基の平均分子量は、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり、そして複合体の分子量は、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである。
【００５４】
このエリトロポエチン種はまた、式（III）：
【００５５】
【化８】
0003967594.tif 000006
【００５６】
〔式中、Ｒは、任意の低級アルキルであってよく、そしてメチル、エチル、イソプロピルなどのような、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。好ましいアルキルは、メチルである。Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であってよく、ここで、ｋは、１〜約１０である。好ましくは、ｋは、１〜約４であり、更に好ましくは、ｋは、１又は２である。最も好ましくは、Ｘは、−（ＣＨ2）である〕により表されてもよい。
【００５７】
式（III）において、Ｙは、下記式：
【００５８】
【化９】
0003967594.tif 000007
【００５９】
で示され、好ましくは下記式：
【００６０】
【化１０】
0003967594.tif 000008
【００６１】
で示され、更に好ましくは下記式：
【００６２】
【化１１】
0003967594.tif 000009
【００６３】
で示される。
【００６４】
式（III）において、ｍという数は、得られる式（III）の複合体が、未修飾ＥＰＯに匹敵する生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応する未修飾ＥＰＯの活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分であろう。ｍは、ＰＥＧ単位中のエチレンオキシド残基の数を表す。−（ＯＣＨ2ＣＨ2）−の単一のＰＥＧサブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。即ち、複合体の分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、ｍという数に依存する。「約」ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数の合理的範囲に入ることを意味する。ｍは、約４５０〜約９００（２０〜４０kDaの分子量に対応する）の範囲の整数であり、好ましくはｍは、約５５０〜約８００（約２４〜３５kDa）であり、そして最も好ましくはｍは、約６５０〜約７００（約２９〜約３１kDa）である。
【００６５】
式（III）において、ｎという数は、ＰＥＧ単位にアミド結合を介して共有結合しているエリトロポエチンタンパク質中のリシンアミノ酸のε−アミノ基の数である。本発明の複合体は、ＥＰＯの１分子当たり、１個、２個、又は３個のＰＥＧ単位を有していてよい。ｎは、１〜３の範囲の整数であり、好ましくはｎは、１又は２であり、そして更に好ましくはｎは、１である。
【００６６】
式（III）の好ましいエリトロポエチンタンパク質は、下記式：
【００６７】
【化１２】
0003967594.tif 000010
【００６８】
により表される。
【００６９】
最も好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：
【００７０】
【化１３】
0003967594.tif 000011
【００７１】
〔上記式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエリトロポエチン糖タンパク質の残基である〕により表される。
【００７２】
他の好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：
【００７３】
【化１４】
0003967594.tif 000012
【００７４】
により表される。
【００７５】
更に好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：
【００７６】
【化１５】
0003967594.tif 000013
【００７７】
により表される。
【００７８】
これらのエリトロポエチンタンパク質は、以下により製造することができる：
（ａ）式：Ｐ−〔ＮＨ2〕nにより表されるエリトロポエチンタンパク質のリシンアミノ酸のε−アミノ基を、式：Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑにより表される二官能性試薬と共有結合で反応させて、下記式：
【００７９】
【化１６】
0003967594.tif 000014
【００８０】
〔式中、Ｐは、アミド結合を形成するアミノ基を除くエリトロポエチンタンパク質であり；ｎは、１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、反応性基、例えば、カルボン酸−ＮＨＳエステルであり；Ｘは、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）k−（ここで、ｋは、１〜約１０である）であり；そしてＱは、アルカノイル（例えば、アセチル）のような保護基である〕により表されるアミド結合を持つ中間体を形成すること。
【００８１】
（ｂ）工程（ａ）からのアミド結合を持つ中間体を、式：Ｗ−〔ＯＣＨ2ＣＨ2〕m−ＯＲにより表される活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と共有結合で反応させて、下記式：
【００８２】
【化１７】
0003967594.tif 000015
【００８３】
〔式中、Ｗは、スルフヒドリル反応性型のＹであり；ｍは、約４５０〜約９００の範囲の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；そしてＹは、上記と同義である〕により表されるエリトロポエチン糖タンパク質生成物を形成すること。
【００８４】
本実施態様において、二官能性試薬は、好ましくはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート又はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタートであり、Ｚは、好ましくはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドであり、そして活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体：Ｗ−〔ＯＣＨ2ＣＨ2〕m−ＯＲは、好ましくはヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン、及びメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドよりなる群から選択される。
【００８５】
更に詳細には、式（III）のエリトロポエチンタンパク質は、ＥＰＯへのチオール基の共有結合（「活性化」）及び得られた活性化ＥＰＯとポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体とのカップリングにより製造することができる。本発明のＰＥＧ化ＥＰＯの製造のための第１工程は、ＥＰＯのＮＨ2基を介してのチオール基の共有結合形成を特徴とする。このＥＰＯの活性化は、保護チオール基と、活性エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）、無水物、スルホン酸のエステル、それぞれカルボン酸及びスルホン酸のハロゲン化物のような追加の反応性基とを持つ二官能性試薬により実施される。チオール基は、当該分野において既知の基（例えば、アセチル基）により保護される。これらの二官能性試薬は、アミド結合を形成することにより、リシンアミノ酸のε−アミノ基と反応することができる。反応の第１工程は、以下に記述される：
【００８６】
【化１８】
0003967594.tif 000016
【００８７】
ＥＰＯ、ｎ及びＸは、上記と同義であり、そしてＺは、当該分野において既知の反応性基、例えば、下記式：
【００８８】
【化１９】
0003967594.tif 000017
【００８９】
で示されるＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）置換基である。
【００９０】
好ましい実施態様において、リシンε−アミノ基の活性化は、スクシンイミジル残基を有する二官能性試薬との反応により実施される。二官能性試薬は、異なるスペーサー種、例えば、−（ＣＨ2）k−又は−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）k−残基（ここで、ｋは、１〜約１０、好ましくは１〜約４、そして更に好ましくは１又は２、そして最も好ましくは１である）を持っていてよい。
【００９１】
【化２０】
0003967594.tif 000018
【００９２】
これらの試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）又はアセチルチオアルキル−カルボン酸−ＮＨＳ−エステル
【化２１】
0003967594.tif 000019
【００９３】
〔ここで、ｋは、上記と同義である〕である。
【００９４】
二官能性試薬の製造法は、当該分野において知られている。２−（アセチルチオ）−（エトキシ）k−酢酸−ＮＨＳ−エステルの前駆体は、DE-3924705に記載されており、一方アセチルチオ化合物への誘導は、March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376に記載されている。ＳＡＴＡは、市販されている（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州、米国及びピアース（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）。
【００９５】
ＥＰＯ分子に付加すべきチオール基の数は、反応パラメーター、即ち、タンパク質（ＥＰＯ）濃度及びタンパク質／二官能性試薬比を調整することにより、選択することができる。好ましくは、ＥＰＯは、ＥＰＯ１分子当たり１〜５個のチオール基、更に好ましくはＥＰＯ分子当たり１．５〜３個のチオール基を共有結合させることにより活性化される。これらの範囲は、ＥＰＯタンパク質集団全体にわたるチオール基の統計的分布に関する。
【００９６】
この反応は、例えば、水性緩衝液（pH６．５〜８．０）中で、例えば、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ（pH７．３）中で行われる。二官能性試薬は、ＤＭＳＯ中に加えられる。反応の終了後、好ましくは３０分後、反応は、リシンの添加により停止される。過剰の二官能性試薬は、当該分野において既知の方法により、例えば、透析又はカラム濾過により分離される。ＥＰＯに付加したチオール基の平均数は、例えば、Grasetti, D.R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967)に記載されている光度測定法により求めることができる。
【００９７】
上記反応に続いて、活性化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体の共有結合のカップリングが行われる。適切なＰＥＧ誘導体は、約２０〜約４０kDa、更に好ましくは約２４〜約３５kDa、そして最も好ましくは約３０kDaの平均分子量を持つ活性化ＰＥＧ分子である。
【００９８】
活性化ＰＥＧ誘導体は、当該分野において知られており、例えば、Morpurgo, M.ら, J. Bioconj. Chem. (1996) 7, page 363以下にＰＥＧ−ビニルスルホンに関して報告されている。直鎖及び分岐鎖ＰＥＧ種は、式（Ｉ）の化合物の製造に適している。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ及びメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである：
【００９９】
【化２２】
0003967594.tif 000020
【０１００】
これらのヨード活性化物質の使用は、当該分野において既知であり、そして例えば、Hermanson, G.T.のBioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p.147-148に記載されている。
【０１０１】
最も好ましくは、ＰＥＧ種は、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ  ３００００；シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.））のような（アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミド）を用いて、マレイミドにより活性化される。アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドの構造は、下記式：
【０１０２】
【化２３】
0003967594.tif 000021
【０１０３】
〔ここで、Ｒ及びｍは、上記と同義である〕で示されるとおりであり、好ましくは下記式：
【０１０４】
【化２４】
0003967594.tif 000022
【０１０５】
で示される。
【０１０６】
アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドとのカップリング反応は、水性緩衝液、例えば、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）中でのチオール保護基のインサイチューの開裂後に起こる。保護基の開裂は、例えば、２５℃、pH６．２で約９０分間、ＤＭＳＯ中でヒドロキシルアミンにより実施することができる。ＰＥＧ修飾には、活性化ＥＰＯ／アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比は、約１：３〜約１：６、そして好ましくは１：４であるべきである。反応は、システインの添加、及び残りのチオール（−ＳＨ）基とＮ−メチルマレイミド又はジスルフィド結合を形成することができる他の適切な化合物との反応により停止することができる。任意の残りの活性チオール基と、Ｎ−メチルマレイミドのような保護基又は他の適切な保護基との反応のため、本発明の複合体中のＥＰＯ糖タンパク質は、このような保護基を含んでいてもよい。一般に、本明細書に記述される手順では、ＰＥＧ−マレイミドと複合体形成しない糖タンパク質上の活性化チオール基の数に依存して、異なる数の保護基により保護された種々の数のチオールを有する分子の混合物が生成する。
【０１０７】
Ｎ−メチルマレイミドは、ＰＥＧ化タンパク質上の残りのチオール基をブロックするのに使用されるとき、同じタイプの共有結合を形成するが、ジスルフィド化合物は、分子間スルフィド／ジスルフィド交換反応において、ブロッキング試薬のジスルフィド架橋カップリングをもたらす。この型のブロッキング反応に好ましいブロッキング試薬は、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、システイン及びシスタミンである。システインでは、ＰＥＧ化タンパク質に追加の正味の電荷は導入されないが、ブロッキング試薬のＧＳＳＧ又はシスタミンの使用により追加の負又は正電荷が生じる。
【０１０８】
モノ−、ジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の分離を含む、式（III）の化合物の更なる精製は、当該分野において既知の方法、例えば、カラムクロマトグラフィーにより行われる。
【０１０９】
ＰＥＧ化エリトロポエチン誘導体を含む組成物は、好ましくは、少なくとも９０％のモノ−ＰＥＧ複合体、即ち、ｎが１である複合体を含み、実施例５に示されるように製造することができる。通常、ジ−ＰＥＧ複合体よりも高い活性を有する傾向があるため、エリトロポエチン糖タンパク質のモノ−ＰＥＧ複合体が望ましい。モノ−ＰＥＧ複合体の百分率、更にはモノ−及びジ−ＰＥＧ種の比は、溶出ピークの周りのより広い画分をプールしてモノ−ＰＥＧの百分率を低下させるか、又は狭い画分をプールして組成物中のモノ−ＰＥＧの百分率を増大させることにより、制御することができる。約９０パーセントのモノ−ＰＥＧ複合体は、収量と活性が良好に均衡している。時として、例えば、少なくとも９２パーセント又は少なくとも９６％の複合体がモノ−ＰＥＧ種（ｎは１に等しい）である組成物が望まれることがある。本発明の実施態様において、ｎが１である複合体の百分率は、９０％〜９６％である。
【０１１０】
本発明の組成物は、上述のように１ml当たり１０〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴としてよい。好ましくは、本組成物は、１ml当たり１０〜１０００μg、例えば、１０、５０、１００、４００、８００又は２５００μgを含むことを特徴とする。
【０１１１】
更に、本発明の組成物は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜２００mmol/lの硫酸塩、１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６．０〜６．５）を含むことを特徴としてよい。この組成物はまた、２０mM以下のメチオニン、１〜５％のポリオール（w/v）、０．１％以下のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）及び場合により１mM以下のＣａＣｌ2を含むことを特徴としてよい。この組成物の一例は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、４０mmol/lの硫酸塩、１０mmol/lのリン酸塩、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）（pH６．２）を含むことを特徴とする。
【０１１２】
本発明の更に別の実施態様において、本組成物は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜１００mmol/lのＮａＣｌ、１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６．０〜７．０）、場合により１〜５％（w/v）のポリオールを含むことを特徴としてよい。更に、この組成物は、２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）及び場合により７．５μmol/lのＣａＣｌ2を含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１００mmol/lのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）、及び１０mmol/lのリン酸塩（pH７．０）を含むことを特徴としてよい。
【０１１３】
本発明はまた、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜５０mmol/lのアルギニン（pH６〜pH６．５）、１０〜１００mmol/lの硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、上記組成物に関する。更に、この組成物は、２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）、場合により１mmol/l以下のＣａＣｌ2及び場合により１〜５％（w/v）のポリオールを含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、４０mmol/lのアルギニン（pH６．２）、３０mmol/lの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）及び場合により１mmol/lのＣａＣｌ2を含むことを特徴としてよい。
【０１１４】
本発明の好ましい実施態様は、１０〜１００００μg/mlのエリトロポエチン、好ましくは２５〜２５００μg/mlのエリトロポエチンと、
ａ）１０mMのリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．０）又は
ｂ）１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム（pH６．２）又は
ｃ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）（pH６．２）又は
ｄ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）（pH６．２）又は
ｅ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）（pH６．２）又は
ｆ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）（pH６．２）
とを含むことを特徴とする組成物に関する。
【０１１５】
最も好ましい実施態様において、本組成物は、５０、１００、４００、８００又は２５００μg/mlの量のエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする。最も好ましい組成物は、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）（pH６．２）、又は４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）（w/v）（pH６．２）のいずれかを含むことを特徴とする。
【０１１６】
本発明の組成物は、スプレー乾燥粉末の形状であってよい。
【０１１７】
更に本発明は、上述のような組成物の凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末である組成物に関する。本組成物は、溶媒、例えば水の添加により復元して液体溶液を生成するか、又は例えば吸入装置若しくは経皮投与装置により直接適用することができる。
【０１１８】
本発明はまた、エリトロポエチンタンパク質を、多価の陰性荷電アニオン及び場合により上記と同義の１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする溶液と混合することを特徴とする、上述の組成物の製造方法を含むことを特徴とする。
【０１１９】
更に、本発明は、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳに関連した疾患の治療及び予防、及び／又は化学療法を受ける癌患者の治療に有用な医薬の製造のための、上記と同義の組成物の使用に関する。これは、患者に上記と同義の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳ及び化学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び予防のための方法を含む。
【０１２０】
本発明の更に別の実施態様は、上記と同義の組成物を含むことを特徴とする、局所及び全身性の持続放出のための装置に関する。これは、例えば、ポリマー基剤のマイクロ−又はナノ粒子のような、上述の組成物を含むことを特徴とする、エリトロポエチンの制御放出を提供する任意の種類のインプラントであってよい。上述の組成物はまた、充填済みシリンジとして、又は例えば、無針注射装置若しくは吸入装置のような、他の任意の投与装置に入れて提供することができる。
【０１２１】
本発明の組成物は、注射用又は静脈内投与用の単位用量として与えることができる。他方では、本発明の組成物は、液体又は固体のいずれかの形状で貯蔵することができ、後で静脈内又は注射投与のために単位用量剤形に分割することができる。したがって、本発明の液体組成物は、投与のための単回用量剤形としての使用のために０．３mlという少量で与えることができる。他方では、特許請求される組成物の容量は、分配される前に一括投与剤形で貯蔵されるときに、６０リットルという多量であってもよい。その安定性の強化という観点から、本発明の組成物は、後で医師、患者及び病院に分配するのに適した包装手段に配置されるように、大きな容器で貯蔵することができる。
【０１２２】
本発明の注射用溶液を、一般に０．３ml〜２０mlの本組成物を単回の単位用量として投与できるシリンジのような従来の注射手段により投与することができる。他方では、本発明の組成物は、本組成物を凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末のいずれかとして含むアンプルを利用して、次にこれを注射の前に従来法で復元して、注射により投与することができる。他方では、本発明の組成物の安定性のため、組成物は、約０．３ml〜約１０mlの本組成物を含むバイアルのような、単位用量剤形に分配してもよい。更に、本発明の組成物は、点滴バッグを利用して静脈内投与することができる。このようなバッグは、溶液が患者に投与される時間に依存して、約２０ml〜約５００mlの溶液を含む。本発明では、本発明の液体溶液を貯蔵容器に貯蔵することができ、そこから更に、医師、病院及び患者への分配のための少量の投与剤形のパッケージに分割することができる。本発明の組成物の安定性のため、これらの組成物は、投与前に長期にわたってこのような貯蔵容器に貯蔵することができる。
【０１２３】
上述の組成物のための成分として、又は上述のエリトロポエチン誘導体の製造の出発点としてのエリトロポエチンの製造法は、例えば、米国特許第5,547,933号及び5,621,080号、EP-B 0,148,605、Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712、EP-B 0,205,564、EP-B 0,209,539及びEP-B 0,411,678更にはLai, P.H.ら, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、及びSasaki, H.ら, J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076に詳細に記載されている。治療用途のエリトロポエチンは、組換え法により産生してもよい（EP-B 0,148,605、EP-B 0,209,539及びEgrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J.ら, (1986) Immunobiol. 72: 213-224）。
【０１２４】
無血清培地でのエリトロポエチンの発現及び製造のための方法は、例えば、１９９６年１１月１４日公開のBurgのWO 96/35718、及び１９９２年６月１２日公開のKochのヨーロッパ特許公開第513,738号に記載されている。上述の刊行物に加えて、ＥＰＯ遺伝子を含む組換えＣＨＯ細胞の無血清発酵を実施できることは公知である。このような方法は、例えば、EP-A 0,513,738、EP-A 0,267,678に、そして一般的な形でKawamoto, T.ら, Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453、EP-A 0,248,656、Kowar, J.とFranek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292、Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51、EP-A 0,481,791、EP-A 0,307,247、EP-A 0,343,635、WO 88/00967に報告されている。
【０１２５】
EP-A 0,267,678では、Ｓ−セファロースでのイオン交換クロマトグラフィー、Ｃ8カラムでの分取逆相ＨＰＬＣ及びゲル濾過クロマトグラフィーが、透析後の無血清培養で産生したＥＰＯの精製のために記載されている。これに関連して、ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、Ｓ−セファロース・ファストフローでのイオン交換クロマトグラフィーに置き換えることができる。また、ブルー・トリスアクリル（Blue Trisacryl）カラムでの色素クロマトグラフィーをイオン交換クロマトグラフィーの前に行うことが提案されている。
【０１２６】
組換えＥＰＯの精製のためのプロセスは、Nobuo, I.ら, J. Biochem. 107 (1990) 352-359に記載されている。しかしこのプロセスでは、ＥＰＯは、精製工程の前に、トゥイーン（登録商標）２０、フッ化フェニルメチルスルホニル、エチルマレイミド、ペプスタチンＡ、硫酸銅及びオキサミド酸で処理される。１９９６年１１月１４日公開のBurgのWO 96/35718を含む刊行物は、無血清発酵プロセスでのエリトロポエチン（ＥＰＯｓｆ）の製造方法を開示している。
【０１２７】
本発明のＥＰＯ又はＥＰＯ複合体の比活性は、当該分野において既知の種々の測定法により測定することができる。本発明の精製ＥＰＯタンパク質の生物学的活性とは、ヒト患者に注射によりＥＰＯタンパク質を投与すると、注射していない、即ち対照群の被験者に比べて、骨髄細胞からの網状赤血球及び赤血球の産生が増大するというものである。本発明により入手及び精製される、ＥＰＯタンパク質、又はその断片の生物学的活性は、Annableら, Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112及びPharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2)による方法によって試験することができる。ＥＰＯタンパク質の活性を測定するための別の生物学的検定法である、正赤血球血マウス検定法は、実施例６に記載されている。
【０１２８】
本発明は、以下の実施例（本明細書に記述されている発明を例示するが、これを限定はしない）を参照することにより更に理解が深まる。
【０１２９】
実施例実施例１：ヒトＥＰＯの発酵及び精製ａ）接種物調製及び発酵 ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（EP 411,678（ジェネティクス研究所（Genetics Institute））に開示されている、ＡＴＣＣ ＣＲＬ８６９５を使用できる）に由来する、１バイアルのワーキング・セル・バンクを液体窒素貯蔵タンクのガス相から取り出した。細胞をガラススピナーフラスコに移して、炭酸水素緩衝培地で加湿ＣＯ2インキュベーター中で培養した。接種物調製及び発酵のために使用した典型的な無血清培地は、１９９２年６月１２日に公開のKochのヨーロッパ特許出願513,738、又は１９９６年１１月１４日に公開のBurgのWO 96/35718に開示されており、例えば、培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２（例えば、ＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）／ヘーズルトン・バイオロジックス（Hazleton Biologics）、デンバー、米国、注文番号５７−７３６）を、そして追加的に炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルコース、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄（II）、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、及び例えば、ポリビニルアルコールのような哺乳動物細胞用の安定化剤、メチルセルロース、ポリデキストラン、ポリ（エチレングリコール）、ポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）、血漿増量剤のポリジェリン（polygelin）（ヘムアクセル（HEMACCEL）（登録商標））又はポリビニルピロリドン（WO 96/35718）を含む。
【０１３０】
培養物は、混入微生物が存在しないことを顕微鏡で照合し、そして細胞密度を求めた。これらの試験は、各分離工程で実施した。
【０１３１】
初期増殖期の後、細胞培養物は、新鮮培地で開始細胞密度まで希釈して、もう１周の増殖周期を経させた。ガラススピナーフラスコ当たり約２ｌの培養物容量が得られるまで、この手順を繰り返した。約１２倍加後、１〜５リットルのこの培養物が得られ、次にこれを１０ｌ接種物発酵槽のための接種物として使用した。
【０１３２】
３〜５日後、１０ｌ発酵槽中の培養物は、１００ｌ接種物発酵槽のための接種物として使用することができた。
【０１３３】
更に３〜５日の培養後、１００ｌ発酵槽中の培養物は、１０００ｌ生産発酵槽のための接種物として使用することができた。
【０１３４】
ｂ）回収及び細胞分離
バッチ再供給プロセスを使用した（即ち、所望の細胞密度に達したとき、約８０％の培養物を回収した）。残りの培養物に新鮮培地を補充して、次の回収まで培養した。１回の生産運転は、最大１０回の二次回収：９回の部分回収及び発酵の最後の１回の全体回収からなる。回収は３〜４日毎に行った。
【０１３５】
測定した回収容量は、冷却容器に移した。細胞は、遠心分離又は濾過により取り出して、廃棄した。遠心分離工程のＥＰＯ含有上清をインライン濾過して、第２の冷却容器に回収した。各回収物は、精製の間、別々に処理した。
【０１３６】
ＥＰＯタンパク質の精製のための典型的なプロセスは、１９９６年１１月１４日に公開のBurgのWO 96/35718に開示されている。精製プロセスを、以下に説明する。
【０１３７】
ａ）ブルーセファロースクロマトグラフィー
ブルーセファロース（ファルマシア（Pharmacia））は、表面にチバクロン青色素（Cibacron blue dye）を共有結合する、セファロースビーズよりなる。ＥＰＯは、多くの非タンパク質性混入物、幾つかのタンパク質性不純物及びＰＶＡよりもブルーセファロースに強く結合するため、この工程でＥＰＯを濃縮することができる。ブルーセファロースカラムの溶出は、pHと同様に塩濃度を上昇させることにより実施される。
【０１３８】
カラムに８０〜１００ｌのブルーセファロースを充填し、ＮａＯＨで再生させて、平衡化緩衝液（塩化ナトリウム／カルシウム及び酢酸ナトリウム）で平衡化した。酸性にして濾過した発酵槽上清を添加した。添加の終了後、カラムは、最初に高濃度塩化ナトリウムを含む、平衡化緩衝液と類似した緩衝液で洗浄し、続いてトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、トリス塩基緩衝液で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。
【０１３９】
ｂ）ブチルトヨパール（Butyl Toyopearl）クロマトグラフィー
ブチルトヨパール６５０Ｃ（トーソーハース（Toso Haas））は、脂肪族ブチル残基を共有結合でカップリングしている、ポリスチレン系マトリックスである。ＥＰＯは、多くの不純物及びＰＶＡよりもこのゲルに強く結合するため、イソプロパノールを含む緩衝液で溶出しなければならない。
【０１４０】
カラムに３０〜４０ｌのブチルトヨパール６５０Ｃを詰めて、ＮａＯＨで再生し、トリス塩基緩衝液で洗浄して、イソプロパノールを含むトリス塩基緩衝液で平衡化した。
【０１４１】
ブルーセファロース溶出液は、カラム平衡化緩衝液中のイソプロパノールの濃度に調整して、カラムに添加した。次にカラムを、イソプロパノール濃度が上昇した平衡化緩衝液で洗浄した。生成物は、溶出緩衝液（イソプロパノール含量が高いトリス塩基緩衝液）で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。
【０１４２】
ｃ）ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）クロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（バイオセプラ（Biosepra））は、機械的性質を改善するため、アガロースマトリックスに組み込まれた、ヒドロキシアパタイトよりなる。ＥＰＯは、ヒドロキシアパタイトに対して低い親和性を持ち、このためタンパク質不純物よりも低いリン酸濃度で溶出され得る。
【０１４３】
カラムに３０〜４０ｌのヒドロキシアパタイトウルトロゲルを充填して、リン酸カリウム／塩化カルシウム緩衝液及びＮａＯＨ、続いてトリス塩基緩衝液で再生した。次にこれを、少量のイソプロパノールと塩化ナトリウムを含むトリス塩基緩衝液で平衡化した。
【０１４４】
ブチルトヨパールクロマトグラフィーのＥＰＯ含有溶出液をカラムに添加した。続いてカラムを平衡化緩衝液、及びイソプロパノールと塩化ナトリウムを含まないトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、低濃度のリン酸カリウムを含むトリス塩基緩衝液で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。
【０１４５】
ｄ）ヴァイダック（Vydac）Ｃ４での逆相ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料のヴァイダックＣ４（ヴァイダック（Vydac））は、シリカゲル粒子からなり、そしてその表面にＣ４−アルキル鎖を持つ。タンパク質性不純物からのＥＰＯの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配により実施した。
【０１４６】
分取ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８〜３．２リットルのヴァイダックＣ４シリカゲルを充填）を用いて実施した。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル溶出液は、トリフルオロ酢酸を加えて酸性にし、ヴァイダックＣ４カラムに添加した。洗浄及び溶出のために、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を使用した。画分を回収して、直ちにリン酸緩衝液で中和した。ＩＰＣ限界内のＥＰＯ画分をプールした。
【０１４７】
ｅ）ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー
ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア（Pharmacia））材料は、セファロースビーズの表面に共有結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基へのＥＰＯの結合には、イオン相互作用が介在する。アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質を洗浄した後、低pHの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより痕跡不純物を除去した。次にカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄して、イオン強度の高い緩衝液でＥＰＯを溶出した。
【０１４８】
カラムにＤＥＡＥセファロースファストフローを充填した。カラム容量は、３〜１０mgＥＰＯ/mlゲルの範囲のＥＰＯ添加量を確保するために調整した。カラムを水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）で洗浄した。ＨＰＬＣ溶出液のプール画分を添加して、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄した。次にカラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄した。次いで、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）でＥＰＯをカラムから溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。
【０１４９】
ＤＥＡＥセファロースカラムの溶出液は、特定の導電率に調整した。得られた薬物は、無菌濾過によりテフロン（登録商標）瓶に入れて、−７０℃で貯蔵した。
【０１５０】
実施例２：ｍＰＥＧ−ＳＢＡによるＥＰＯのＰＥＧ化
実施例１の無血清法により精製したＥＰＯ（ＥＰＯｓｆ）は、分析法により測定すると均質であり、８個のアイソホームよりなる典型的なアイソホームパターンを示した。これは、正赤血球血マウス検定法により測定すると１９０，０００IU/mgの生物学的比活性であった。使用したＰＥＧ化試薬は、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡであったが、これは、Ｒが、メチルであり；ｘが、３であり；そしてｍが、６５０〜７５０（平均約６８０、約３０kDaの平均分子量に対応する）である、式（II）の化合物である。
【０１５１】
ＰＥＧ化反応
ＥＰＯｓｆ  １００ミリグラム（１０．３mg/ml  ＥＰＯｓｆストック９．７１ml、５．４８μmol）に、３０kDaメトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ  ５０６mg（１６．５μmol）（シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）、ハンツヴィル、アラバマ州から入手）を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）１０mlを加え、室温（２０〜２３℃）で２時間混合した。最終タンパク質濃度は、５mg/mlであり、タンパク質：ＰＥＧ試薬比は、１：３であった。２時間後、氷酢酸でpHを４．５に調整することにより反応を停止させて、精製の準備ができるまで−２０℃で貯蔵した。
【０１５２】
精製
１．複合体混合物：ＳＰ−セファロースＦＦ（SP-SEPHAROSE FF）（スルホ−プロピルカチオン交換樹脂）約２８mlをアミコン（AMICON）ガラスカラム（２．２×７．５cm）に詰めて、２０mMの酢酸緩衝液（pH４．５）で１５０ml/時の流量で平衡化した。タンパク質３０mgを含む反応混合物６ミリリットルを平衡化緩衝液で５倍希釈して、カラムに適用した。非吸着物質を緩衝液で洗い流して、吸着ＰＥＧ複合体混合物をカラムから、平衡化緩衝液中の０．１７５ＭのＮａＣｌで溶出した。なおもカラムに残る未修飾ＥＰＯｓｆは７５０mMのＮａＣｌで溶出した。カラムは、開始緩衝液中で再平衡化した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、そのＰＥＧ化の程度を測定した。０．１７５ＭのＮａＣｌ溶出液は、モノ−更にはジ−及び痕跡量のトリ−ＰＥＧ化種を含んでいたが、一方７５０mMのＮａＣｌ溶出液は、未修飾ＥＰＯｓｆを含んでいたことが判った。
【０１５３】
２．ジ−ＰＥＧ及びモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ：前工程においてカラムから溶出した精製複合体混合物を、緩衝液で４倍希釈して、カラムに再適用して、前述のように洗浄した。ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ及びモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆを、それぞれ０．１ＭのＮａＣｌ及び０．１７５ＭのＮａＣｌで別々にカラムから溶出した。残りの未修飾ＥＰＯｓｆも全て溶出するために、７５０mMのＮａＣｌでも溶出を実施した。
【０１５４】
あるいは、反応混合物を酢酸緩衝液で５倍希釈して、ＳＰ−セファロースカラムに適用した（≒０．５mgタンパク質/mlゲル）。カラムを洗浄して、吸着したモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ、ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ及び未修飾ＥＰＯｓｆを前セクションに記載されたように溶出した。
【０１５５】
結果
ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、数平均分子量３０kDaの直鎖状ＰＥＧ分子を化学的に複合体形成することにより合成した。ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、アミド結合が生じる、ＥＰＯｓｆの第１級アミノ基と３０kDaのＰＥＧ−酪酸のスクシンイミジルエステル誘導体との間の反応から誘導した。
【０１５６】
結果は、表１に要約した。精製した複合体混合物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定すると、モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆよりなり、そして未修飾ＥＰＯｓｆを含まなかった。複合体混合物は、２３．４mg、即ち出発物質の７８％を占めた。モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆのカチオン交換クロマトグラフィーによる分離は、複合体混合物中のモノ−対ジ−ＰＥＧ比が、ほぼ１：１であることを示した。反応の終了後、モノ：ジ：未修飾の個々の成分の比は、４０：３８：２０（％）であった。総収量は、ほぼ定量的であった。
【０１５７】
【表４】
0003967594.tif 000023
【０１５８】
実施例３：ｍＰＥＧ−ＳＰＡによるＥＰＯのＰＥＧ化
実施例２で使用したＥＰＯｓｆの異なるアリコートを、３０kDaのメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）、ハンツヴィル、アラバマ州）と反応させた。反応は、１：２のタンパク質：試薬比で実施して、精製法は、実施例２によった。主としてモノ−ＰＥＧ化種が生成した。
【０１５９】
実施例４：ＥＰＯへのチオール基の共有結合形成
この実施例は、ＥＰＯへのチオール基の共有結合形成のための反応条件の決定を開示する。条件を決定するために、ブロック化チオール基を含む異なる量の試薬（ここではＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ（１０mg/mlまでＤＭＳＯに溶解））をＥＰＯ溶液（ここでは、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ（pH７．３）中の５mg/mlのＥＰＯ  １ml）に加えた。反応物を約３０分間撹拌（２５℃）して、１Ｍリシン溶液を１０mMで加えることにより反応を停止させた。過剰量のＳＡＴＡ及びＳＡＴＰは、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ及び２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）に対する透析によって除去した。ヒドロキシルアミンでの保護アセチル基の除去後、ＥＰＯに共有結合したチオール基の数を、Grasetti, D.R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, page 41-49 (1967)に記載された方法によって、ジチオジピリジンで光度測定法により求めた。
【０１６０】
ＥＰＯ１分子当たり共有結合したチオール基の数を以下に示した。
【０１６１】
【表５】
0003967594.tif 000024
【０１６２】
実施例５：メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドによる活性化ＥＰＯの修飾
Ａ）ＥＰＯの活性化：
実施例１により産生したＥＰＯ  １００mg（正赤血球血マウス検定法により測定すると１９０，０００IU/mg）を実施例４によりＳＡＴＡ（モル比：ＥＰＯ／ＳＡＴＡ＝１／５）で活性化した。共有結合したブロック化チオール基を有する生じたＥＰＯ（「活性化ＥＰＯ」）を、実施例４に記載されるように透析により、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドのような副産物又は未反応ＳＡＴＡから分離した。１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）中の４．５mg/mlの活性化ＥＰＯの溶液を得た。
【０１６３】
Ｂ）活性化ＥＰＯのＰＥＧ化：
上述の「最も好ましい」構造を有するメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド３８０mg（ＭＷ３０，０００；シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）、ハンツヴィル、（アラバマ州、米国））を活性化ＥＰＯ９５mgを含む上記溶液（１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）中に４．５mg/ml）に溶解した。溶液中の活性化ＥＰＯとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドの間の得られたモル比は、１：４であった。１Ｍのヒドロキシルアミン水溶液を３０mM（pH６．２）まで上記溶液に加えることにより、活性化ＥＰＯの共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。溶液の反応混合物中の得られた活性化ＥＰＯは、遊離チオール（−ＳＨ）基を含んでいた。チオール基の脱ブロッキング後直ちに、今や遊離チオール（−ＳＨ）基を含む活性化ＥＰＯとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドの間で９０分間（撹拌、２５℃）カップリング反応を行った。カップリング反応は、０．２Ｍのシステイン水溶液を２mMまで反応混合物に加えることにより停止させた。３０分後、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドと反応しなかった活性化ＥＰＯの過剰な遊離チオール基を、ＤＭＳＯ中の０．５ＭのＮ−メチルマレイミド溶液を５mMの濃度に達するまで加えることによりブロックした。３０分後、今やＰＥＧ化ＥＰＯ種を含む得られた反応混合物を、１０mMのリン酸カリウム（pH７．５）に対して≧１５時間透析した。
【０１６４】
Ｃ）ＰＥＧ化ＥＰＯ種の精製：
反応混合物からのＰＥＧ化ＥＰＯ種の分離のために、以下の精製プロセスを実施した：５０mlのＱ−セファロースｆｆカラムを１０mMのリン酸カリウム（pH７．５）で平衡化した。工程Ｂ）で得られた反応混合物をカラムに添加した（流量：１時間当たり３カラム容量（CV））。未反応メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド試薬を分離するために、カラムを１０mMのリン酸カリウム（pH７．５）５CVで洗浄した。ＰＥＧ化ＥＰＯ種は、緩衝液Ａ（１０mMのリン酸カリウム（pH７．５））５CV及び緩衝液Ｂ（１０mMのリン酸カリウム、５００mMのＮａＣｌ（pH７．５））５CVからなる上昇する塩勾配で、１時間当たり３CVの流量で溶出することにより分離した。ＮａＣｌ勾配に基づいて、ＰＥＧ化ＥＰＯ種（トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）は最初に溶出し、続いて非ＰＥＧ化ＥＰＯ種を溶出した。ＰＥＧ化ＥＰＯ種（トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）を含む溶出液の画分をプールして濾過した（０．２μmフィルターでの無菌濾過）。
【０１６５】
トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の含量及び純度は、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＡゲル（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）で評価したが、同時にタンパク質濃度は、ベール−ランバートの法則（Beer-Lambert law）により２８０nmで測定した。ＳＤＳ−ＰＡＡ電気泳動により求めたＥＰＯ種の見かけ分子量は、約６８kDa（モノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）、約９８kDa（ジ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）、及び約１２８kDa（トリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）であった。
【０１６６】
トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の更なる分離は、クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス（Superdex）、ｐｇ２００；ファルマシア（Pharmacia））により達成することができる。トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化種を含む溶出液のインビボの生物学的活性の測定は、以下に記載される方法により実施した。
【０１６７】
実施例６：正赤血球血マウス検定法により求めたＰＥＧ化ＥＰＯのインビボ活性
正赤血球血マウス生物検定法は、当該分野において既知であり（Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)）、そしてPh. Eur. BRPのエリトロポエチンのモノグラフにある方法である。試料をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した。７〜１５週齢の健常マウスに、非ＰＥＧ化ＥＰＯ、又は実施例２若しくは３からのトリ−、ジ−若しくはモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯを含む、ＥＰＯ画分０．２mlを皮下投与した。６日間にわたって、尾静脈の穿刺により血液を採取して、血液１μlが０．１５μmolのアクリジンオレンジ染色液１ml中に存在するように希釈した。染色時間は、３〜１０分とした。網状赤血球の計数は、赤色蛍光ヒストグラムの分析により、フローサイトメーターで微蛍光測定法で行った。網状赤血球の数は、絶対数によって与えた（分析した血球３０，０００個当たり）。示したデータでは、各群は１日当たりマウス５匹からなり、マウスは１回だけ採血させた。
【０１６８】
別々の実験で、単回用量の未修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ  ２５ng）、実施例２からのＰＥＧ（ＳＢＡ）−ＥＰＯ混合物（複合体１０ng）、実施例２からのモノ−及びジ−ＰＥＧ化ＥＰＯ（複合体１０ng）、実施例３からのＰＥＧ（ＳＰＡ）−ＥＰＯ（複合体１０ng）、及び緩衝液をマウスに投与した。結果は、表２に示した。この結果は、未修飾ＥＰＯ  ２５ngの投与に比較した、マウス１匹当たり同じ用量（１０ng）を用いての網状赤血球の量の有意な上昇及び最大網状赤血球数の変化によって示される、ＰＥＧ化ＥＰＯ種の優れた活性及び半減期の延長を示している。
【０１６９】
【表６】
0003967594.tif 000025
【０１７０】
実施例７：大部分モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯの調製
ＰＥＧ化反応
実施例１により調製した、１００mMのリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）中のＥＰＯｓｆ  １００mg（５．４８μmol）から出発して、１mMのＨＣｌ  ３mlに溶解した３０kDaのＰＥＧ−ＳＢＡ試薬３２９mg（１０．９６μmol）を加えた。十分な１００mMのリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）を加えて、反応混合物の容量を２０mlにした。最終タンパク質濃度は、５mg/mlであり、タンパク質：ＰＥＧ試薬比は、１：２であった。反応混合物を周囲温度（２０〜２２℃）で２時間混合した。２時間後、氷酢酸でpHを４．５に調整することにより反応を停止させ、精製の準備ができるまで−２０℃で凍結貯蔵した。
【０１７１】
精製
前工程からの反応混合物を１０mMの酢酸ナトリウム（pH４．５）で１：５希釈して、４．２×１９cmカラムに詰めたＳＰ−セファロースＦＦ（スルホプロピルカチオン交換樹脂）３００mlに適用した。カラムは、同じ緩衝液で前もって平衡化した。カラム流出液をギルソン（Gilson）ＵＶモニターで２８０nmでモニターして、キップとゾーネンの記録器（Kipp and Zonen recorder）で記録した。カラムを平衡化緩衝液３００ml、即ち１床容量で洗浄して、過剰な試薬、反応副産物及びオリゴマーのＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。続いて１００mMのＮａＣｌ  ２床容量で洗浄して、ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。次にモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを２００mMのＮａＣｌで溶出した。モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯの溶出の間、タンパク質ピークの最初の５０mlを廃棄して、モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを１５０ml画分として回収した。カラムに残る未修飾ＥＰＯｓｆを７５０mMのＮａＣｌで溶出した。全ての溶出緩衝液は、平衡化緩衝液中で製造した。溶出した試料は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、及び高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。検出可能な未修飾ＥＰＯｓｆを含まなかった、１５０ml画分から得られたモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯのプールは、次に≒４．５〜７．５mg/mlに濃縮して、貯蔵緩衝液の１０mMのリン酸カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．５）中にダイアフィルトレーションにより加えた。濃縮／ダイアフィルトレーションは、５０kDaカットオフのミリポア・ペリコンＸＬバイオマックス５０（Millipore Pellicon XL Biomax 50）膜を取り付けたミリポア・ラブスケール（Millipore Labscale）（登録商標）ＴＦＦシステムで周囲温度で実施した。濃縮モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯは、無菌濾過して、−２０℃で凍結貯蔵した。
【０１７２】
約７５％のＥＰＯｓｆがＰＥＧ化した。精製後、全収率は、≒３０％のモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯであり、検出可能な未修飾ＥＰＯｓｆはなく、そしておよそ２５％のジ−ＰＥＧ−ＥＰＯであった。オリゴマー、及び非ＰＥＧ化ＥＰＯｓｆが残りのタンパク質を占めた。１５０ml画分から得られたモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯのプールは、約９０％のモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯと約１０％のジ−ＰＥＧ−ＥＰＯを含んでいた。
【０１７３】
実施例８：種々の処方中のＥＰＯ及びＰＥＧ化ＥＰＯの熱安定性：ＤＳＣ（示差走査熱量測定法）による分析
示差走査熱量測定法により測定される熱変性の転移温度が、タンパク質の熱安定性に関する有効な指標であることは、一般に認められている。０．６〜１．２mg/mlの間の濃度のエリトロポエチン又はＰＥＧ化エリトロポエチン溶液を、安定化剤を含むか又は含まない種々の緩衝液中で、ナノ−ＤＳＣ（Nano-DSC）（カロリメトリック・サイエンシーズ・コーポレーション（Colorimetric Sciences Corporation）、ユタ州、米国）によって２K/分の加熱速度で分析した。転移温度の上昇は、タンパク質の熱安定性の上昇を示す。測定温度値は、絶対値として理解すべきでなく、むしろ別の処方に対する個々の処方の安定性の差を表す。
【０１７４】
処方の最適pHを規定するために、４〜９の範囲において、ＰＥＧ化エリトロポエチンの熱変性のpH依存性を検討した。タンパク質試料は、３０mMのＮａ2ＨＰＯ4、３０mMのクエン酸ナトリウム、３０mMのホウ酸中で分析した。図３は、約pH６〜約pH９の間での最大転移温度のプラトーと、pH５．５より下での鋭い低下を示した。このことは、最大熱安定性のための最適pHは、pH５．５より上であることを示す（図３）。
【０１７５】
イオン強度の作用を調査するために、熱変性のリン酸濃度依存性を求めた。図４は、熱安定性が、処方のイオン強度の上昇に伴い上昇することを示している。
【０１７６】
緩衝剤の影響もＤＳＣにより調査した。図５から、高い熱安定性のために最も適した緩衝剤又は添加剤は、硫酸、クエン酸又はリン酸塩であることが判る。現在利用可能な処方において緩衝剤として使用されているグリシン（上記を参照のこと）は、さほど適していなかった。
【０１７７】
図６は、硫酸塩は、低pH（例えば、pH６．２）でも適切な緩衝剤／添加剤であるが、一方リン酸塩は、pH７．５に比較してpH６．２ではあまり適していないことを示している。このことは、硫酸塩が、低pHであっても熱安定性を高く保持することを示す。この知見によって、pH６．０〜６．５の処方が、エリトロポエチンの熱安定性に激しい消失のないことが見込める。
【０１７８】
実施例９：熱ストレス下のＥＰＯ及びＰＥＧ−ＥＰＯの凝集：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析
エリトロポエチンタンパク質に及ぼす熱ストレスの作用を調査するために、異なる処方中の試料を熱ストレス（８０℃、２０分）に曝露して、還元（試料緩衝液中にＤＴＴを含む）及び非還元（試料緩衝液中にＤＴＴを含まない）条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。この方法によって、共有結合の凝集体形成が検出できる。上に略述されるように、凝集体形成は、タンパク質の主要な分解経路の１つであり、よってタンパク質の製剤においては防止する必要がある。還元剤（例えば、ＤＴＴ）の非存在下で検出でき、かつ還元剤の存在下で検出できない凝集体は、恐らく熱ストレス下での誤ったジスルフィド架橋である酸化反応により形成される。図７は、熱ストレス下での凝集のpH依存性を示す。この実験は、凝集体の形成が、６．５より低いpHで抑制されることを明白に示した。pHが高いほど、凝集体の量が高い。形成される凝集体の多くは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に試料を還元剤で処理することにより減少させることができるが、このことは、熱ストレス下で形成される凝集体の大部分がジスルフィド架橋したダイマー、オリゴマー及びもっと高次の凝集体であることを示唆している。ひとまとめにすると、このことは、処方のpHをpH６．５以下に保持することにより、凝集体の形成を大部分防止できることを示している。
【０１７９】
図７：pHへのＰＥＧ−ＥＰＯ凝集の依存性。（上述のような）熱ストレス後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質は銀で染色した。レーン１：分子量標準。レーン２：pH５。レーン３：pH５、還元。レーン４：pH６。レーン５：pH６、還元。レーン６：pH６．５。レーン７：pH６．５、還元。レーン８：pH７。レーン９：pH７、還元。レーン１０：ＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレスなし。
【０１８０】
凝集体の形成はまた、酸化防止剤の使用により防止することができる。図８は、酸化防止剤として１mg/mlのアセチルシステインを使用すると、熱ストレス下の凝集体の形成が防止されることを示している。したがって、熱ストレス下の凝集体形成を防止するために、低pH、例えばpH６．２で、例えばアセチルシステインのような酸化防止剤を使用することは有用である。
【０１８１】
図８：ＰＥＧ−ＥＰＯ凝集は、pH６．２及び／又はアセチルシステインにより防止することができる。（上述のような）熱ストレス後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質は銀で染色した。レーン１：ＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレスなし。レーン２：pH７．５、ストレス。レーン３：pH６．２、ストレス。レーン４：pH６．２、ストレス、還元。レーン５：pH７．５、１mg/mlアセチルシステイン、ストレス。レーン６：pH７．５、１mg/mlアセチルシステイン、ストレス、還元。
【０１８２】
実施例１０：４、２５、３０及び４０℃での種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯの安定性
種々の処方中のＰＥＧ化ＥＰＯを幾つかの温度でインキュベートした。表示時点で、試料を取り出し、逆相高性能クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により安定性を評価した。表３は、幾つかの温度での種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯの安定性を比較している。これらのデータは、タンパク質回収及び凝集に関して、本明細書に囲い込まれた処方の優越性を明白に示している。
【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
*処方は、下記である：
処方Ａ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mM塩化ナトリウム、pH７．５。
処方Ｂ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール、pH６．２。
処方Ｃ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMのＮａＣｌ、pH７．０。
処方Ｄ：１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム、pH６．２。
処方Ｅ：４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１mMのＣａＣｌ2、pH６．２。
【０１８５】
実施例１１：最適処方はＥＰＯタンパク質におけるメチオニン５４の酸化を抑制する、酸化防止剤としてのメチオニン
種々の処方中のＰＥＧ化ＥＰＯを幾つかの温度でインキュベートした。６ヶ月後、試料を取り出し、以下のように、メチオニン５４の酸化の程度を測定した。簡単に述べると、ＥＰＯ試料をエンドプロテイナーゼのＬｙｓＣで処理した。得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分離した。酸化したペプチドＴ８（酸化したメチオニン５４を含む）対ペプチドＴ８（酸化されていないメチオニン５４を含む）の比を計算した。データは、表４に要約した。
【０１８６】
【表８】
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【０１８７】
*処方は以下に列挙される。
処方Ａ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMの塩化ナトリウム、pH７．０。
処方Ｂ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール、pH６．２。
処方Ｃ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール、１mMのメチオニン、pH６．２。
【０１８８】
これらのデータは、本発明の好ましい処方（１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール、pH６．２）が、メチオニン５４の酸化の程度に関して、他の処方（１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMのＮａＣｌ、pH７．０）よりも優れていることを明白に示した。処方に１又は１０mMのメチオニンを添加すると、メチオニン５４の酸化が明らかに抑制された。したがって、メチオニンは酸化防止剤として作用して、ＥＰＯを安定化する。
【０１８９】
実施例１２：種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル酸含量
ＰＥＧ−ＥＰＯ糖タンパク質の炭水化物構造の完全性を分析するために、種々の温度で６ヶ月間貯蔵後の最適化処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル酸含量を標準法により分析した。これらのデータは、炭水化物構造の完全性が、本明細書に記載される新しい処方でのタンパク質の貯蔵によって否定的な影響を受けないことを示している（図９）。
【０１９０】
実施例１３：長期間高温で貯蔵後のＰＥＧ化ＥＰＯの生物活性
１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中のＰＥＧ−ＥＰＯの貯蔵が、インビボの生物活性に否定的な影響を及ぼさないことを試験するために、標準的マウスＥＰＯ検定法を行った（実施例６を参照のこと）。表示される温度で、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で６ヶ月間貯蔵したＰＥＧ−ＥＰＯ試料は、新鮮標準品に比較して４、２５及び３０℃での貯蔵後にインビボ活性の消失がないことを示した（図１０）。
【０１９１】
実施例１４：高温で６ヶ月間貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯの凝集体含量
１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で高温で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料中の凝集体含量を分析するために、６ヶ月後試料を取り出して、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
【０１９２】
４、２５及び３０℃で凝集体は検出されなかったが、このことにより上述の処方中のＰＥＧ化ＥＰＯの安定性が証明された。図１１は、サイズ排除クロマトグラムのオーバーレイを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＥＰＯの１次構造（１６５個のアミノ酸）（配列番号１）
【図２】  ヒトＥＰＯの１次構造（１６６個のアミノ酸）（配列番号２）
【図３】  熱安定性に及ぼすpHの影響。転移温度がpHに対してプロットされている。
【図４】  熱安定性に及ぼすイオン強度の影響。転移温度がリン酸塩濃度に対してプロットされている。
【図５】  緩衝剤への熱安定性の依存。
【図６】  図６は、硫酸塩は、低pH（例えば、pH６．２）でも適切な緩衝剤／添加剤であるが、一方リン酸塩は、pH７．５に比較してpH６．２ではあまり適切ではないことを示す。このことは、硫酸塩が低pHであっても熱安定性を高く保持することを示している。
【図７】  pHへのＰＥＧ−ＥＰＯ凝集の依存性。（上述のような）熱ストレス後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を銀で染色した。レーン１：分子量標準。レーン２：pH５。レーン３：pH５、還元。レーン４：pH６。レーン５：pH６、還元。レーン６：pH６．５。レーン７：pH６．５、還元。レーン８：pH７。レーン９：pH７、還元。レーン１０：ＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレスなし。
【図８】  図８は、酸化防止剤として１mg/mlのアセチルシステインを使用すると、熱ストレス下での凝集体の形成が防止されることを示す。熱ストレス（８０℃、２０分）下のＰＥＧ−ＥＰＯの凝集：レーン１：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレスなし；レーン２：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス；レーン３：pH６．２のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス；レーン４：pH６．２のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス、還元；レーン５：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、＋１mg/mlのＮ−アセチル−システイン、ストレス；レーン６：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、＋１mg/mlのＮ−アセチル−システイン、ストレス、還元。
【図９】  種々の温度で６ヶ月間貯蔵した、新しい処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル酸（ＮＡＮＡ）含量。
【図１０】  幾つかの温度で６ヶ月間、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のマウス生物活性検定。
【図１１】  ６ヶ月間、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のサイズ排除クロマトグラムのオーバーレイ（下から上へ：緩衝液、出発物質、４℃、２５℃、３０℃及び４０℃）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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