(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物検体中でのＭＲＳＡの検出方法において、
（１）前記生物検体から核酸試料を調製する工程と、
（２）前記核酸試料と、
（Ａ）検出すべきＭＲＳＡの染色体上のintＭ  ＤＮＡ中への外来性挿入遺伝子の領域であり、該intＭ  ＤＮＡをその５’側の上流領域と３’側の下流領域とに分割し、該intＭ  ＤＮＡ上流領域と上流側連結部位（junction）で、該intＭ  ＤＮＡ下流領域と下流側連結部位（junction）で連結し、該検出すべきＭＲＳＡに特異的であるmec領域ＤＮＡ（additional DNA；mec)中にある連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
（Ｂ）前記検出すべきＭＲＳＡの染色体上のintＭ  ＤＮＡ中にあり、かつ前記mec領域ＤＮＡ中の塩基配列とは異なる連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
を反応させる工程と、
（３）前記工程（２）の工程による反応生成物から前記生物検体中にＭＲＳＡを同定する工程と
を有し、
前記intＭ  ＤＮＡの５’側の上流領域が、以下の（１）〜（９）の塩基配列：
塩基配列（１）（pLEC12(pLEC1a):図４に示された配列の上流部分）：
【化１】
0003957338.tif 000007
塩基配列（２）（pSJ8-2a：図９〜図１０に示された配列）：
【化２】
0003957338.tif 000008
塩基配列（３）（LO2C4：図１２に示された配列）：
【化３】
0003957338.tif 000009
塩基配列（４）（LG12H2：図１６に示された配列）：
【化４】
0003957338.tif 000010
塩基配列（５）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGCA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
塩基配列（６）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGTGG 3'
塩基配列（７）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGAGG 3'
塩基配列（８）（図５に示された以下のSTP43の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGTAGT AACTACGCAC 
TATCATTCAG CAAAATGACA TTTCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
及び
塩基配列（９）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGCAGT AACTATGCAC 
TATCATTTAG CAAAATGACA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTATAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
から選択された１つの塩基配列からなり、
前記intＭ  ＤＮＡの３’側の下流領域が、以下の（１０）〜（１８）の塩基配列：
塩基配列（１０）（pLEC12(pLEC1a)：図４に示された配列の下流部分）：
【化５】
0003957338.tif 000011
塩基配列（１１）（N315J3rc：図１１に示された配列）：
【化６】
0003957338.tif 000012
塩基配列（１２）（NCTC10442J3rc：図１８に示された配列）：
【化７】
0003957338.tif 000013
塩基配列（１３）（pSJ10-3J3rc：図１９に示された配列）：
【化８】
0003957338.tif 000014
塩基配列（１４）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAGG 3'
塩基配列（１５）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAG 3'
塩基配列（１６）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' AGAGGCGTAT CATAAGTAAA ACTAAAAAAT TCTGTATGAG GAGATAATAA TTTGGAGGGT 
GTTAAATGGT GGACAT 3'
塩基配列（１７）（図５に示された以下のSTP43の配列）;
5' AGAGGGTATC ATAGTAATGA GGTTCATGAT TTTTGACATA GTTAGCCTCC GCAGTCTTTC 
AGTAATATAT CGAATNT 3'
及び
塩基配列（１８）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' AGAGGCGTAT CATAAGTGAT GCTTGTTAGA ATGATTTTTA ACAATATGAA ATAGCTGTGG 
AAGCTCAAAC ATTTGTT 3'
から選択された１つの塩基配列からなる
ことを特徴とするＭＲＳＡの検出方法。
【請求項２】
生物検体中でのＭＲＳＡの検出方法において、
（１）前記生物検体から核酸試料を調製する工程と、
（２）前記核酸試料と、
（Ａ）検出すべきＭＲＳＡの染色体上のintＭ  ＤＮＡ中への外来性挿入遺伝子の領域であり、該intＭ  ＤＮＡをその５’側の上流領域と３’側の下流領域とに分割し、該intＭ  ＤＮＡ上流領域と上流側連結部位で、該intＭ  ＤＮＡ下流領域と下流側連結部位で連結し、該検出すべきＭＲＳＡに特異的であるmec領域ＤＮＡ（additional DNA；mec)中にある連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
（Ｂ）前記検出すべきＭＲＳＡの染色体上の、前記intＭ  ＤＮＡ上流領域及び該intＭ  ＤＮＡ上流領域の５’末端よりも上流の領域中から選択され、かつ前記mec領域ＤＮＡ中の塩基配列とは異なる連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
を反応させる工程と、
（３）前記工程（２）の工程による反応生成物から前記生物検体中にＭＲＳＡを同定する工程と
を有し、
前記intＭ  ＤＮＡの５’側の上流領域が、以下の（１）〜（９）の塩基配列：
塩基配列（１）（pLEC12(pLEC1a):図４に示された配列の上流部分）：
【化９】
0003957338.tif 000015
塩基配列（２）（pSJ8-2a：図９〜図１０に示された配列）：
【化１０】
0003957338.tif 000016
塩基配列（３）（LO2C4：図１２に示された配列）：
【化１１】
0003957338.tif 000017
塩基配列（４）（LG12H2：図１６に示された配列）：
【化１２】
0003957338.tif 000018
塩基配列（５）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGCA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
塩基配列（６）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGTGG 3'
塩基配列（７）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGAGG 3'
塩基配列（８）（図５に示された以下のSTP43の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGTAGT AACTACGCAC 
TATCATTCAG CAAAATGACA TTTCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
及び
塩基配列（９）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGCAGT AACTATGCAC 
TATCATTTAG CAAAATGACA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTATAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
から選択された１つの塩基配列からなる
ことを特徴とするＭＲＳＡの検出方法。
【請求項３】
生物検体中でのＭＲＳＡの検出方法において、
（１）前記生物検体から核酸試料を調製する工程と、
（２）前記核酸試料と、
（Ａ）検出すべきＭＲＳＡの染色体上のintＭ  ＤＮＡ中への外来性挿入遺伝子の領域であり、該intＭ  ＤＮＡをその５’側の上流領域と３’側の下流領域とに分割し、該intＭ  ＤＮＡ上流領域と上流側連結部位で、該intＭ  ＤＮＡ下流領域と下流側連結部位で連結し、該検出すべきＭＲＳＡに特異的であるmec領域ＤＮＡ（additional DNA；mec)中にある連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
（Ｂ）前記検出すべきＭＲＳＡの染色体上の、前記intＭ  ＤＮＡ下流領域及び該intＭ  ＤＮＡ下流領域の３’末端よりも下流の領域中から選択され、かつ前記mec領域ＤＮＡ中の塩基配列とは異なる連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
を反応させる工程と、
（３）前記工程（２）の工程による反応生成物から前記生物検体中にＭＲＳＡを同定する工程と
を有し、
前記intＭ  ＤＮＡの３’側の下流領域が、以下の（１０）〜（１８）の塩基配列：
塩基配列（１０）（pLEC12(pLEC1a):図４に示された配列の下流部分）：
【化１３】
0003957338.tif 000019
塩基配列（１１）（N315J3rc：図１１に示された配列）：
【化１４】
0003957338.tif 000020
塩基配列（１２）（NCTC10442J3rc：図１８に示された配列）：
【化１５】
0003957338.tif 000021
塩基配列（１３）（pSJ10-3J3rc：図１９に示された配列）：
【化１６】
0003957338.tif 000022
塩基配列（１４）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAGG 3'
塩基配列（１５）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAG 3'
塩基配列（１６）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' AGAGGCGTAT CATAAGTAAA ACTAAAAAAT TCTGTATGAG GAGATAATAA TTTGGAGGGT 
GTTAAATGGT GGACAT 3'
塩基配列（１７）（図５に示された以下のSTP43の配列）;
5' AGAGGGTATC ATAGTAATGA GGTTCATGAT TTTTGACATA GTTAGCCTCC GCAGTCTTTC 
AGTAATATAT CGAATNT 3'
及び
塩基配列（１８）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' AGAGGCGTAT CATAAGTGAT GCTTGTTAGA ATGATTTTTA ACAATATGAA ATAGCTGTGG 
AAGCTCAAAC ATTTGTT 3'
から選択された１つの塩基配列からなる
ことを特徴とするＭＲＳＡの検出方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）がpolymerase chainreaction (PCR)法用のプライマーであり、前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）として、前記上流側連結部位を含んだＤＮＡ断片をPCR法により増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）によりPCR増幅したＤＮＡ断片を検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）がpolymerase chainreaction (PCR)法用のプライマーであり、前記下流側連結部位を含んだＤＮＡ断片をPCR法により増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）によりPCR増幅したＤＮＡ断片を検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項３に記載の検出方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）が、5'-TCGGGCATAAATGTCAGGAAAAT-3'(J7)からなり、前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）が5'-ATGAAAGACTGCGGAGGCTAACT-3'(Nmec6)または5'-ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3'(Gmec1045)からなる請求項４に記載の検出方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）がligase chain reaction (LCR)法用のＤＮＡ断片であり、前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）として、前記上流側連結部位を挟んだＤＮＡ断片をLCR法により該連結部位を含むＤＮＡが増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）によりLCR増幅したＤＮＡ断片を検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項２に記載の検出方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）がligase chain reaction (LCR)法用のＤＮＡ断片であり、前記オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）として、前記下流側連結部位を挟んだＤＮＡ断片をLCR法により該連結部位を含むＤＮＡが増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）によりLCR増幅したＤＮＡ断片を検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項２に記載の検出方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）として、5'-ATGCTCTTTGTTTTGCAGCA-3'（Nmec5)からなるものと、5'-ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3'（Gmec1045）からなるものを用い、前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）が5'-GTTCAAGCCCAGAAGCGATGT-3'(J6)からなる請求項２に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記mec領域DNAの塩基配列が、下記３種：
（イ）pSJ8-2a（図9、10の塩基配列）：
【化１７】
0003957338.tif 000023
（ロ）LO2C4 （図12の塩基配列）：
【化１８】
0003957338.tif 000024
（ハ）LG12H2（図16の塩基配列）：
【化１９】
0003957338.tif 000025
の塩基配列及びこれらのreverse complementaryの塩基配列から選択される請求項１、２、４または７に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）が、以下のオリゴヌクレオチド：
Nmec2：5'-GATAGACTAATTATCTTCATC-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec3：5'-CAGACTGTGGACAAACTGATT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec4：5'-TGAGATCATCTACATCTTTA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec4-2：5'-GGATCAAAAGCTACTAAATC-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec5：5'-ATGCTCTTTGTTTTGCAGCA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec6：5'-ATGAAAGACTGCGGAGGCTAACT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Gmec1045：5'-ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
から検出法に応じて選択された少なくとも１種である請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）が、以下のオリゴヌクレオチド：
J3：5'-AAGAATTGAACCAACGCATGA-3' またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
IntM1：5'-AAACGACATGAAAATCACCAT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
J7：5'-TCGGGCATAAATGTCAGGAAAAT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
J6：5'-GTTCAAGCCCAGAAGCGATGT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nif：5'-TTATTAGGTAAACCAGCAGTAAGTGAACAACCA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
から検出法に応じて選択された少なくとも１種である請求項１０または１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記mec領域DNAの塩基配列が、下記３種：
（イ）N315IS-J3（図17の塩基配列）：
【化２０】
0003957338.tif 000026
（ロ）NCTC10442J3rc（図18の塩基配列）：
【化２１】
0003957338.tif 000027
（ハ）pSJ10-3J3rc（図19の塩基配列）：
【化２２】
0003957338.tif 000028
の塩基配列及びそのreverse complementaryの塩基配列から選択される請求項１、３、５、８または９に記載の検出方法。
【請求項１４】
以下の各ヌクレオチド：
Nmec2：5'-GATAGACTAATTATCTTCATC-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec3：5'-CAGACTGTGGACAAACTGATT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec4：5'-TGAGATCATCTACATCTTTA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec4-2：5'-GGATCAAAAGCTACTAAATC-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec5：5'-ATGCTCTTTGTTTTGCAGCA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nmec6：5'-ATGAAAGACTGCGGAGGCTAACT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Gmec1045：5'-ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
J3：5'-AAGAATTGAACCAACGCATGA-3' またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
IntM1：5'-AAACGACATGAAAATCACCAT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
J7：5'-TCGGGCATAAATGTCAGGAAAAT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
J6：5'-GTTCAAGCCCAGAAGCGATGT-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
Nif：5'-TTATTAGGTAAACCAGCAGTAAGTGAACAACCA-3'またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
からなる群から検出方法として用いるＰＣＲ法、ＬＣＲ法またはハイブリダイゼーション法に応じて選択された少なくとも２種のオリゴヌクレオチドからなるＭＲＳＡ診断薬。
【請求項１５】
ＭＳＳＡとＭＲＳＡとを含む生物検体中にＭＲＳＡを同定するためのＭＲＳＡの検出方法において、
（１）前記生物検体から核酸試料を調製する工程と、
（２）前記核酸試料と、ＭＲＳＡと区別すべきＭＳＳＡの染色体上のintＭ  ＤＮＡ中の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの１種以上と、を反応させる工程と、
（３）前記工程（２）での反応による生成物がないことにより前記生物検体中にＭＲＳＡを同定する工程と、
を有し、
前記intＭ  ＤＮＡ中の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種が、前記intＭ  ＤＮＡ中へのmec領域ＤＮＡの挿入がある場合に前記反応生成物を生成しないものであり、
前記intＭ  ＤＮＡの前記mec領域ＤＮＡの挿入部位よりも５’側の上流領域が、以下の（１）〜（９）の塩基配列：
塩基配列（１）（pLEC12(pLEC1a):図４に示された配列の上流部分）：
【化２３】
0003957338.tif 000029
塩基配列（２）（pSJ8-2a：図９〜図１０に示された配列）：
【化２４】
0003957338.tif 000030
塩基配列（３）（LO2C4：図１２に示された配列）：
【化２５】
0003957338.tif 000031
塩基配列（４）（LG12H2：図１６に示された配列）：
【化２６】
0003957338.tif 000032
塩基配列（５）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGCA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
塩基配列（６）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGTGG 3'
塩基配列（７）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCCTGCAC AAGGACGTCT TACAACGCAG TAACTACGCA 
CTATCATTCA GCAAAATGAC ATTCCCACAT CAAATGATGC GGGTTGTGTT AATTGAACAA 
GTGTACAGAG CATTTAAGAT TATGCGAGG 3'
塩基配列（８）（図５に示された以下のSTP43の配列）:
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGTAGT AACTACGCAC 
TATCATTCAG CAAAATGACA TTTCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTACAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
及び
塩基配列（９）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' TTCGTCATTG GCGGATCAAA CGGCTGCACA AGGACGTCTT ACAACGCAGT AACTATGCAC 
TATCATTTAG CAAAATGACA TTCCCACATC AAATGATGCG GGTTGTGTTA ATTGAACAAG 
TGTATAGAGC ATTTAAGATT ATGCGTGG 3'
から選択された１つの塩基配列からなり、
前記intＭ  ＤＮＡの前記mec領域ＤＮＡの挿入部位よりも３’側の下流領域が、以下の（１０）〜（１８）の塩基配列：
塩基配列（１０）（pLEC12(pLEC1a)：図４に示された配列の下流部分）：
【化２７】
0003957338.tif 000033
塩基配列（１１）（N315J3rc：図１１に示された配列）：
【化２８】
0003957338.tif 000034
塩基配列（１２）（NCTC10442J3rc：図１８に示された配列）：
【化２９】
0003957338.tif 000035
塩基配列（１３）（pSJ10-3J3rc：図１９に示された配列）：
【化３０】
0003957338.tif 000036
塩基配列（１４）（図５に示された以下のATCC25923の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAGG 3'
塩基配列（１５）（図５に示された以下のSTP23の配列）:
5' AGAGGCGTAT CACAAATAAA ACTAAAAATG GAGTAACTAT TAATATAGTA TAAATTCAAT 
ATGGTGATAA AAACAG 3'
塩基配列（１６）（図５に示された以下のNCTC8325の配列）:
5' AGAGGCGTAT CATAAGTAAA ACTAAAAAAT TCTGTATGAG GAGATAATAA TTTGGAGGGT 
GTTAAATGGT GGACAT 3'
塩基配列（１７）（図５に示された以下のSTP43の配列）;
5' AGAGGGTATC ATAGTAATGA GGTTCATGAT TTTTGACATA GTTAGCCTCC GCAGTCTTTC 
AGTAATATAT CGAATNT 3'
及び
塩基配列（１８）（図５に示された以下のSTP53の配列）：
5' AGAGGCGTAT CATAAGTGAT GCTTGTTAGA ATGATTTTTA ACAATATGAA ATAGCTGTGG 
AAGCTCAAAC ATTTGTT 3'
から選択された１つの塩基配列からなる
ことを有することを特徴とするＭＲＳＡの検出方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドがpolymerase chainreaction (PCR)法用のプライマーであり、前記オリゴヌクレオチドとして、前記intＭ  ＤＮＡ中のmec領域ＤＮＡの挿入が生じる部位を含むＤＮＡ断片をPCR法により増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチドによるPCR増幅がないことを検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドがligase chain reaction (LCR)法用のプライマーであり、前記オリゴヌクレオチドとして、前記intＭ  ＤＮＡ中のmec領域ＤＮＡの挿入が生じる部位を含むＤＮＡ断片をPCR法により増幅可能となるように選択し、これらのオリゴヌクレオチドによるPCR増幅がないことを検出することにより、検体中にＭＲＳＡを同定する請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドを、前記intＭ  ＤＮＡ中のmec領域ＤＮＡの挿入が生じる部位を含んで一本鎖あるいは二本鎖のＤＮＡ断片をプローブとして作製し、前記核酸試料とのハイブリダイゼーションがないことを検出することによりＭＲＳＡを同定する請求項１５に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐性菌の遺伝子診断を行う、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を特異的に高感度に検出する診断薬に関する。すなわち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, 以下ＭＲＳＡ）を特異的に迅速に検出同定できる診断方法及び診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＲＳＡは、世界各国の病院における院内感染の主要な病原菌であり、有効な抗菌薬が限られているために、大きな医療問題となっている。臨床において、その正確、迅速な同定は、感染患者の診断と治療に重大な課題となっている。
【０００３】
ＭＲＳＡは、メチシリンをはじめとする、現在までに開発されたすべてのβ−ラクタム系抗菌薬に低親和性の細胞壁合成酵素ＰＢＰ（penicillin-binding protein）であるＰＢＰ２’（またはＰＢＰ２ａ）を産生する黄色ブドウ球菌である。このＰＢＰ２’の産生により、ＭＲＳＡは、従来のすべてのβーラクタム系薬に耐性を示す。１９６１年に、その最初の臨床分離株が、英国で報告されて以来、全世界に蔓延し、現在では、世界各国の病院で、院内感染菌として、現代医療の大きな問題となっている。
【０００４】
ＭＲＳＡは、本来黄色ブドウ球菌がもっている４種のＰＢＰに加えて、ＰＢＰ２’を産生するが、このＰＢＰをコードする遺伝子mecAは１９８６年に松橋らによりクローン化され、その全塩基配列が決定された。mecA遺伝子は、ＭＲＳＡの染色体上に存在するが、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ；methicillin-susceptible Staphylococcus aureus）には存在しない。従って、mecA遺伝子は、黄色ブドウ球菌の染色体上に外来性に獲得された遺伝子であると考えられている。このmecA遺伝子を一般にＰＣＲ（polymerase chain reaction)法,  hybridization法で黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡ上に検出すれば、ＭＲＳＡと同定することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本邦では、ED-PCR（enzyme detection PCR)法によるmecA同定キットが開発され、厚生省の認可と保険薬価を得て、臨床診断に頻用されている（Ubukata, K., et al. J. Clin. Microbiol. 30,1728-1733, 1992.）。しかし、この方法によるＭＲＳＡの同定には、少なくとも、以下の２つの問題点がある。
【０００６】
１）患者検体から、あらかじめ菌を培養し、黄色ブドウ球菌の菌種同定の操作を行った後にしか用いることができないので、迅速性に難があり、種々の問題が発生する。
【０００７】
即ち、mecA遺伝子は、病原性の低いヒトの常在菌であるStaphylococcus (S.) epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. capitis, S. warneri, S. sciuri, S. caprae などの、ブドウ球菌属の他菌種にも広く分布しており（Eiko Suzuki et al. Antimicrb. Agents Chemother. 37, 1219-1226, 1993.）、患者検体では、多くの場合、これらmecA保有ブドウ球菌菌種が同時に検出されるため、検体から直接mecA遺伝子を検出してもＭＲＳＡの存在を証明することにはならない。このために、mecA遺伝子検出法は、患者検体から、菌の培養を行い、黄色ブドウ球菌であることを、従来の菌種同定法で確定した後に用いなければならないという制約があった。それ故、感染菌同定までの間は、empiric therapyに頼らざるを得なかった。また、結果的にバンコマイシンの不要の投与も行わざるを得なかった。
【０００８】
２）ＰＣＲの内部コントロールの欠如。即ち、現今のＰＣＲ操作においては、thermal cyclerの作動条件により、偽陽性、偽陰性がでることがあり、陽性、陰性を判定する場合、毎回の操作における、陰性、陽性の内部コントロールがあることが望ましいが、現行の診断方法では、それがほとんど行われていない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、迅速・簡便で信頼しうるＭＲＳＡの特異的同定方法を確立することを目的として、ＭＲＳＡの遺伝子をより詳細に解析してきた。そして、メチシリン耐性の遺伝子座に数十キロベース（Ｋｂ）以上の外来性のadditional DNAが存在するという報告に着目した（Beck, W.D. et al. J. Bacteriol. 165,373-378, 1986. Skinner, S. et al. Mol. Microbiol. 2, 289-298, 1988.）。
【００１０】
そして、本発明者らはＭＲＳＡの染色体上にＭＲＳＡ特異的な遺伝子配列が存在しないか、鋭意研究を続け、目的とする特異的なＤＮＡ断片を発見・同定するに及び、本発明を完成した。以下本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明者は、上記ＤＮＡ断片、即ちmec region DNA(mec 領域ＤＮＡ, 以下mec（Keiichi Hiramatsu:Microbiol. Immunol. 39(8), 531-543, 1995.））を染色体walkingにより、日本のＭＲＳＡ臨床分離株N315（２型コアグラーゼ産生株;type2j MRSA）, 英国のＭＲＳＡ臨床分離株NCTC10442（３型コアグラーゼ産生株; type3e MRSA）、及びドイツのＭＲＳＡ臨床分離株85/3907（４型コアグラーゼ産生株; type 4e MRSA）から、それぞれクローン化し、その塩基配列を決定した。これら３株は、リボタイピング(ribotyping)法、コアグラーゼ法、mecI遺伝子の塩基配列の決定による変異の位置と性質による分類で、世界各国で分離された流行分離株の代表として、選出した株である。その結果、図1,2,3に示すように、１）mecは、N315では52Kb、NCTC10442では33Kb、85/3907では54Kb以上の巨大なＤＮＡ領域であり、いずれもＭＳＳＡの染色体ＤＮＡとは交叉hybridizationをしないＤＮＡからなっていることが判明した（図1,2,3）。
２）mecの両端には20-30ベース（base pair; bp）の逆位配列(inverted repeat;以下IR）があり、本明細書では、この 両端のIRを含めてmecと定義する（図1,2,3）。
３）これらmec領域ＤＮＡは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ上の特定のorf（open reading frame)（以後intMと呼ぶ）の中に挿入していることが判明した（図4）。
４）これら、３株の塩基配列を比較することによりmec領域ＤＮＡの上流側は、お互いに大きく異なること、また、その下流側では、N315とNCTC10442は同一の塩基配列を保有しており、85/3907は他２株とは異なる配列であることが判明した。
５）intMのmec挿入部位より５’側の部分及びその上流（図4の上側）の染色体ＤＮＡの塩基配列は、いずれの株でもよく保存されていたが、intMのmec挿入部位より３’側及びその下流（図4の下側）の染色体ＤＮＡの塩基配列は、N315とNCTC10442では良く保存されていたが、85/3907では異なっていた（図16）。
【００１２】
以上の事実から、intM遺伝子は、mec領域ＤＮＡの挿入部位としての役割があることが推定されたため、由来の異なるＭＳＳＡ５株の、intMを含むＤＮＡ断片をクローン化し、その塩基配列を決定した（図5）。その結果、
６）intM遺伝子は、いずれも、mec挿入部位より５’側では同一の塩基配列を保っていたが、その３’側の塩基配列は異なっていた。
７）intMの外部の塩基配列については、intMの５’側上流の塩基配列は、いずれも保存されていたが、その３’側下流の塩基配列は、菌株ごとに異なり多様性が観察された。
【００１３】
ついで、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌菌種におけるmecの挿入部位を確かめる目的で、mecA遺伝子を保有するS. haemolyticus  臨床分離株JA178 、495 およびS. epidermidis臨床分離株G3からmec下流端部のプローブを用いて、mecの下流junctionを含んだＤＮＡ断片をクローニングした。その塩基配列を決定すると、
８）いずれのmec下流端部の塩基配列もN315のmecの塩基配列と相同であったが、juncitonの外側（下流）の塩基配列は、N315のintMと大きく異なっていた(図6）。
【００１４】
そこで、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌菌種の染色体ＤＮＡ上にintMと相同性の高い遺伝子がないことを確認するために、ブドウ球菌各菌種の標準株 ATCC25923, NCTC8325(S. aureus),ATCC14990 (S. epidermidis),ATCC29970(S. haemolyticus),DSM20672(S. arlettae),CCM3573(S. caprae),ATCC29062(S. sciuri),ATCC33753(S. auricularis),ATCC27840(S. capitis),DSM20501(S. carnosus),ATCC29750 (S. caseolyticus),NCTC10530(S. chromogenes),ATCC29974(S. cohnii),DSM20771(S. delphini),DSM20674(S. equorum),JCM7469(S. felis),CCM3572(S. gallinarum),ATCC27844(S. hominis),ATCC29663(S. intermedius),DMS20676(S. kloosii),ATCC29070(S. lentus),ATCC43809(S. lugdunensis),ATCC15305(S. saprophyticus),ATCC43808(S. schleiferi subsp. schleiferi),JCM7470(S. shcleiferi subsp. coagulans ),ATCC27848(S. simulans),ATCC27836(S. warneri),ATCC29971 (S. xylosus)を用いて、N315のintMをプローブとしてdot-blot hybridization をおこなった。その結果、
９）intMのプローブは、黄色ブドウ球菌以外の菌種の標準株とは、hybridization は陰性であった。
【００１５】
以上の結果から、以下の結論が得られた。
１）ＭＲＳＡのmecには、少なくとも、３種類があり、お互いに大部分の領域で異なっていたが、そのうちの２種（N315mecとNCTC10442mec）はmec の下流端部は相同の配列であった（図12）。
２）mecのjunction部に相当して、比較的保存された20-30塩基の配列IRが存在する。
３）ＭＲＳＡの染色体への挿入部位は、調べたすべてのＭＲＳＡ株で同一であり、intMの中にある（図17,18,19）。
４）intM の塩基配列は、少なくとも、mec下流junctionより右側（下流部分）ではほとんど同一である（図6）。
５）intMの５’より上流部分の塩基配列は、３種のＭＲＳＡで、同一であった（図13,15,17,18,19）。
６）コアグラーゼ２と４型の株間では、intMのmec挿入部位より３’側（左側）の塩基配列は異なっていた（図6）。
【００１６】
これらの知見をもとにmec とintM及びその５’側の塩基配列を利用することにより、以下の諸方法により、ＭＲＳＡの同定を行うことができる。以下には、mecの下流juncitonを囲んでプライマー、プローブを用いる方法の概念を述べるが、mecの上流juncitonを囲んで同様の効果をえることができる。ただし、後者の方法では、N315、NCTC10442,85/3907のmec上流junctionを含んだ塩基配列に基づき、少なくとも3種のプライマーあるいはプローブのセットを設計すること必要となる。この場合のプライマーあるいはプローブの選定には、pSJ8-2a(図９、１０の塩基配列）、LO2C4(図12の塩基配列）、LG12H2 (図16の塩基配列）及び図５の塩基配列のなかからmec上流junctionを囲んで、数多くのプライマーの設計と組み合わせが可能である。
【００１７】
mec下流junctionを囲んだプライマーあるいはプローブの設定によるＭＲＳＡの同定法
（１）mec領域ＤＮＡ内と、intM及びその５’側にプライマーを設計し、ＰＣＲ法を用いる。図7に示すように、mecとintMのjunctionを含んだＤＮＡ断片が増幅されることにより、ＭＲＳＡと判定される（図7A）。ＭＳＳＡの場合は、mec領域ＤＮＡ側のプライマーが反応できないために陰性となり（図7B）、黄色ブドウ球菌以外のmec領域ＤＮＡ保有株についても、intＭ及びその５’側のプライマーと反応できないために陰性となる（図7C）。
（２）ＬＣＲ（ligase chain reaction）による場合は、mecとintMのjunctionを囲んでＤＮＡ断片を２つ作成し、反応をおこなうことにより、ＭＲＳＡを同定できる。
（３）mecとintMのjunctionを含んで一本鎖あるいは二本鎖のＤＮＡプローブを合成し、hybridizationを用いてＭＲＳＡを同定できる。
４）以上の方法に用いるMSSA側のプライマーあるいはプローブは、intMをおよびその周りの染色体領域の塩基配列pLEC12(図4の塩基配列）及び図５の塩基配列のintM及びその5'側の塩基配列から数多く選定することができる。
（５）mec側のプライマーあるいはプローブは、以下の塩基配列、即ちN315IS-J3（図17の塩基配列）、NCTC10442J3rc（図18の塩基配列）、pSJ10-3J3rc （図19の塩基配列)のmecに相当する塩基配列から数多く選定することができる。
【００１８】
この方法によれば、患者検体に黄色ブドウ球菌以外のmec保有ブドウ球菌が混在していても、検体から菌の培養を経ることなく、直接ＭＲＳＡの存在を確定することができるので、迅速診断法として有用であり、臨床診断上の価値が高い。
【００１９】
さらに、ＭＲＳＡの同定法の陰性コントロールとして、図8に示すように、intMのmec挿入箇所の３’側あるいは、挿入箇所を含んでプライマーあるいはＤＮＡプローブを設計し、ＰＣＲをおこなうことにより、ＭＲＳＡであれば、陰性の結果が得られ、ＭＳＳＡであれば陽性の結果が得られるため, 内部陰性コントロールとして、実施条件の評価を行うことができる。また、この方法でＰＣＲが陰性になることを利用して、ＭＲＳＡの同定を行うことも可能である。ただし、これらの試験では、ＭＳＳＡの混入した患者検体については、陽性になるため、ＭＲＳＡと判定された菌を単離、培養したのちに、上記（１）、（２）、（３）の各法に加えて行うとよい。この方法は、LCR, hybridization法にも適用できる。これらの目的に使用するプライマーあるいはプローブと、その組み合わせは、以下の塩基配列のmec挿入部位を含む、あるいは囲んだMSSA染色体ＤＮＡに相当する塩基配列から数多く選定することができる。即ち、pLEC12(pLEC1a)（図４の塩基配列）、pSJ8-2a (図9、10の塩基配列）、LO2C4 (図12の塩基配列）、LG12H2（図16の塩基配列）である。
【００２０】
上記の（１）〜（５）の方法を、本邦を含む世界18カ国の流行ＭＲＳＡ分離株28株につき、実施すると、すべて陽性となったが、コントロールとして用いたＭＳＳＡ株、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌菌種の標準株、mecを保有する黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌臨床分離株では陰性の結果となり、本診断法がきわめて有効で、かつ有用なものであることが実証された（表1）。
【００２１】
【表１】
0003957338.tif 000002
*標準株３株ＡＴＣＣ２５９２３、ＮＣＴＣ８３２５、ＡＴＣＣ１２６００を含む日本の臨床分離株。
**１８カ国の流行分離株：Ｅｎｇｌａｎｄ，ＮＣＴＣ１０４４２，６１／６２１９，６１／３８４６，６１／４１７６，８６／４３７２，８６／５６０，８６／９６１，８６／２６５２，８６／９３０２；Ｙｕｇｏｓｌａｖｉａ，８５／１３４０；Ｈｕｎｇａｒｙ，８５／１７６２；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ，８５／２０８２；Ｎｏｒｗａｙ，８５／２１１１；Ｈｏｌｌａｎｄ，８５／３５６６；Ｓａｕｄｉ  Ａｒａｂｉａ，８５／５４９５；Ｊａｐａｎ，ＭＲ１０８，Ｎ３１５；Ｓａｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ，８４／９５８０；Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｗｅｓｔ），８５／１８３６；Ｆｒａｎｃｅ，８５／１９４０；Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，８５／２１４７；Ａｕｓｔｒｉａ，８５／３６１９；Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｅａｓｔ），８５／３９０７；Ｃａｎａｄａ，８５／４２３１，８５／４６７０；Ｉｓｒａｅｌ，８５／４５４７；Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５／２２３２，８５／２２３５．
***黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌標準株ＡＴＣＣ１４９９０（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ），ＡＴＣＣ２９９７０（Ｓ．ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃｕｓ），ＤＳＭ２０６７２（Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ），ＣＣＭ３５７３（Ｓ．ｃａｐｒａｅ），ＡＴＣＣ２９０６２（Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ），ＡＴＣＣ３３７５３（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ），ＡＴＣＣ２７８４０（Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ），ＤＳＭ２０５０１（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ），ＡＴＣＣ２９７５０（Ｓ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ），ＮＣＴＣ１０５３０（Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ），ＡＴＣＣ２９９７４（Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ），ＤＳＭ２０７７１（Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ），ＤＳＭ２０６７４（Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ），ＪＣＭ７４６９（Ｓ．ｆｅｌｉｓ），ＣＣＭ３５７２（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ），ＡＴＣＣ２７８４４（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ），ＡＴＣＣ２９６３（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ），ＤＭＳ２０６７６（Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ），ＡＴＣＣ２９０７０（Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ），ＡＴＣＣ４３８０９（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ），ＡＴＣＣ１５３０５（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ），ＡＴＣＣ４３８０８（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ），ＪＣＭ７４７０（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ），ＡＴＣＣ２７８４８（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ），ＡＴＣＣ２７８３６（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉｉ），ＡＴＣＣ２９９７１（Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ）
****黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌でメチシリン耐性の臨床分離株：Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，６株；Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、５株；Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ、３株；Ｓ．ｃａｐｒａｅ、２株；Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、２株；Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、１株；Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、１株
以下、本発明につき、mec及びmec挿入junctionを含んだＤＮＡ断片をＭＲＳＡ株からクローン化する実施例、またＭＳＳＡ株からmecの挿入部位を含んだＤＮＡ断片をクローン化する実施例などを記述し、より詳細に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１
N315株からのmec領域ＤＮＡ（mec)およびmecとMSSA染色体ＤＮＡの挿入組み替え連結部位(junction)を含んだＤＮＡ断片（上流、下流の２断片）のクローン化及びMSSA標準株NCTC8325からのmec挿入部位(int）を含んだ染色体ＤＮＡ断片のクローン化。
１）１９９０年代の日本のＭＲＳＡは、コアグラーゼ２型、ＴＳＳＴ−１産生型のものが、日本全国で７０％以上を占めている（Tae Tanaka et  al. J. Infect. Chemother. 1(1),40-49, 1995.）。この流行型ＭＲＳＡと、コアグラーゼ型、リボタイプ（平松啓一  日本臨床50, 333-338, 1992）が同一のＭＲＳＡ臨床分離株N315（Keiichi Hiramatsu et al. FEBS Lett. 298, 133-136, 1991）をL-brothにて一夜培養したのち、10mMtris 1mMEDTA(pH8.0)に浮遊させたのち、アクロモペプチダーゼ処理により溶菌後、proteinaseK処理を行い、その後、フェノール抽出、クロロフォルム抽出により染色体ＤＮＡを抽出した。抽出した染色体ＤＮＡを用いて、plasmid library及びλphage（λdash II）libraryを作製した。
【００２３】
即ち、染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3A1にて切断し、9Kbから20Kbの大きさのものをagarose gel電気泳動で精製して使用した。plasmid libraryの場合には、このSau3A1断片0.3μｇと、制限酵素BamH1にて切断したplasmid vector pACYC184  1.1μｇとをligationした後、大腸菌MC1061を形質転換し、colony hybridizationにより、目的とするクローンを得た。phage libraryの場合には、このSau3A1断片0.3μｇとBamH1にて切断したλdash II 1μgとをligationした後、in vitro packagingを行い、大腸菌XL1-blue MRA(P2)に感染させた後、plaque hybridizationを行い,  目的とするクローンを得た。hybridization に用いたプローブは、mecAを最初のプローブとして用い、得られたDNAクローンの末端部の塩基配列を決定することにより、次回のプローブをoliginucleotideの合成、あるいは、サブクローニングで得て、さらに隣接するＤＮＡ領域を含むクローンを順次クローニングした（染色体walking法）（図1）。
２）このようにして、mecA 遺伝子を含むクローンpSJ1からはじめて、pSJ2, pSJ4, pSJ5, pSJ7, pSJ8を得た。これらの、クローンをそれぞれサブクローニングし、probe1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11を得た。これらのプローブを用いて、ＭＲＳＡ２９株及びＭＳＳＡ９株より抽出した染色体ＤＮＡを用いてdot-blot hybridization法により、それぞれのプローブの反応性を検討した。染色体ＤＮＡ、200ngを９５℃５分熱処理したのち、ナイロン膜上にスポットし、ジゴキシゲニンにて標識したプローブと反応後、抗ジゴキシゲニン抗体標識アルカリフォスファターゼと反応させ、発光基質AMPPDを加えて検出を行った。その結果probe１ー９は全くＭＳＳＡ株とは反応せず、probe 10ではじめてＭＳＳＡ株と反応した。このことから、probe 10がmecの上流junction を含んだＤＮＡ断片であることが、示された。
３）dedeoxy termination法により、autosequencer(Applied biosystem 373A)を使用し、probe 10の塩基配列を決定した。sequence反応はDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit 及びDye primer Cycle Sequencing Kitを用いて行った。４）次に、mecの挿入部位を含んだ染色体ＤＮＡ領域を特定する目的で、mecの上流端のＭＳＳＡと反応する領域のＤＮＡプローブprobe 11（図1）を用いて、ＭＳＳＡの染色体ＤＮＡ断片のクローニングを行った。NCTC8325から抽出した染色体DNAを制限酵素Sau3A1にて切断し、agarose gel 電気泳動で調製した9kbから20kbのＤＮＡ断片0.3μgとBamH1にて切断したλdash II  １μgとをligationした後、パッケイジングを行い、phage libraryを作製した。その後、plaque hybridization法により、陽性を示す、plaqueから、recombinant phage を回収した。５）上記recombinant phage からサブクローニングしたＤＮＡクローンLD8325が、probe 10とhybridizationすることがdot-blot hybridization法で確認された。そこで、制限酵素地図を作製したのち、さらに、mecの挿入部位を含んだEcoR1-PstI断片（pLE1a）のサブクローニングを行い、その塩基配列を決定した。６）LD8325のサブクローンpLE1aの塩基配列（pLEC12 reverse complementary)とprobe 10 の塩基配列（pSJ8-2a)を比較すると、mec挿入部位より左側の塩基配列は、互いに高い相同性を示した（図9、10）。
７）次に、LD8325のmec挿入部位より右側に設定したprimer J4とNifを用いてPCRで増幅したＤＮＡ断片をプローブ（probe N1）として、N315のgenomic libraryをplaque hybridizationでスクリーニングして、N315mecの下流junctionを含むＤＮＡクローンLN4を得た。
８）mec挿入部位を含むLN4のサブクローンpLN2の塩基配列（J3 reverse complementary)を決定すると、このサブクローンのmec挿入部位より外側の塩基配列はLD8325(pLEC12 reverse complementary)のintM及びその上流部（5'側）（図4）とほぼ同一の塩基配列を有していることが判明した（図11）。このようにして、N315のmecは、ＭＳＳＡ染色体上のある特定の位置に挿入していることが示された。
【００２４】
実施例２
日本以外のＭＲＳＡ流行分離株として、英国において世界で最初に報告されたＭＲＳＡ臨床分離株NCTC10442 (Jevons, M.P. Br. Med. J. 1, 124-125, 1961. )を用いて、mec及びその挿入部位を含んだ染色体ＤＮＡをクローン化した。即ち、
１）上記N315の場合と同様の方法を用いて、mec及び上流部junctionを含んだクローンLO2,LO5, LO7をクローン化し(図2）、その塩基配列を決定した。
２）mec 上流junctionを含んだサブクローンLO2C4の塩基配列をN315のpSJ8-2aの塩基配列と比較したところ、mecの上流端の塩基配列は、かなり異なっていたが、junctionの外側のＭＳＳＡ染色体に相当する部分は、pSJ8-2a と相同であった(図12）。
３）そこで、probeN1を用いて、NCTC10442のphage library をplaque hybridizationを用いてスクリーニングし、mec下流のjunctionを含むクローンLO21を得、その塩基配列を決定した。
４）図13に示すように、mec junction より下流のＭＳＳＡ染色体に相当する領域では、NCTC10442とN315では共通の配列が見られたが、mec内の下流断端部の塩基配列はIRの配列以外では、相同性が見られなかった。
５）しかし、NCTC10442mec  juncitonから上流側に約200塩基遡った領域に、N315mec の下流断端部と相同の塩基配列が発見された（図14）。
６）以上から、日本及び英国、１９８２年と１９６１年という、地理的、時間的に大きく隔たたり、しかもコアグラーゼ型などの疫学的マーカーも異なるふたつのＭＲＳＡ株のmecが同一の挿入部位に挿入されていること、さらに、mec内の構造は異なるものの、両者に共通の塩基配列を見出し得ることが判明した。
７）しかし、一方で、mec領域ＤＮＡの構造は、多様であることから、有効なプライマーの設計は、世界で蔓延している流行型のＭＲＳＡ株のそれぞれについて、mecの構造及び塩基配列を決定した後にしか、実現できないことが明らかとなった。
【００２５】
実施例３
そこで、日本以外の流行ＭＲＳＡ分離株に関しても、そのmecの構造解析を行った。世界各国に最も広く蔓延している流行ＭＲＳＡ株は、コアグラーゼ４型のＭＲＳＡである（Keiichi Hiramatsu:Microbiol. Immunol. 39(8), 531-543, 1995.）。このＭＲＳＡを代表するドイツの分離株85/3907を用いてmec及びそのjunctionを含んだ染色体ＤＮＡ断片をクローン化した（図3）。
１）probe11及びprobe N1を用いて、85/3907の染色体ＤＮＡのplasmid libraryをcolony hybridizationによりスクリーニングし、反応する２種のクローンpSJ9、pSJ10を得た。
２）これらクローンの塩基配列を決定したところ、クローンpSJ10は、intMと同一の塩基配列を含み、N315, NCTC10442のmecの挿入部位に一致して、これらＭＲＳＡ株のmecの下流末端部の塩基配列に相同の塩基配列が見出された。しかし、85/3907のmec下流断端部の塩基配列は、N315, NCTC10442のそれと異なっていた（図15）。
３）もう一つのクローンpSJ9（図3）の塩基配列は、mecとのjunction部位を含んでいなかった。
４）そこで、85/3907のphage libraryを用いて、plaque hybridization により、クローンpSJ9と反応するＤＮＡ断片をクローン化し、さらにそのＤＮＡ断片の端の塩基配列をプローブとして、クローンLG12を得、以下同様の操作を繰り返して、染色体walkingを行った（図3）。
５）これらのクローンは、いずれもMSSA株NCTC10442の染色体ＤＮＡとは、dot-blot hybridization により、反応しなかった。
６）そこで、コアグラーゼ４型のＭＳＳＡ標準株であるATCC25923の染色体ＤＮＡを抽出して、上記クローンとのdot-blot hybridizationを行ったところ、hybridization が陽性となった。しかし、上記クローンのうち、クローンLG12の右側の部分をプローブとすると、hybridizationが陰性となった。
７）LG12の塩基配列LG12H2を決定すると、N315, NCTC10442のmec上流端のIR塩基配列及びintMの3'末端部に相当するjunctionに隣接した約20塩基に相同の配列が見出された以外には、mecの内外でほとんど相同性がみられなかった（図16）。８）以上から、mec が異なったMSSAの染色体上に挿入して誕生した明らかに異なる起源のＭＲＳＡ株があり、少なくともmec上流junctionの外側（左側）のMSSA染色体領域は、起源の異なるＭＲＳＡ株同士では大きく異なることが判明した。９）しかし、mec下流junctionの外側（右側）ではintMの塩基配列を含め、調べた限りすべてのＭＲＳＡ株で保存されていた。
１０）したがって、mec junctionを囲んでＰＣＲ，ＬＣＲ、hybridization用のプライマー、プローブを設計する際、ＰＣＲの場合は、mec側の塩基配列としてはN315, NCTC10442用のものと、85/3907用のものとを別々に設計する必要があることがわかった。ＬＣＲ、hybridizationによる場合は、N315用, NCTC10442用, 85/3907用の３種のプライマー、プローブを用意しなければならない。
１１）このように、mec-MSSA染色体juncitonを囲んだPCR,LCR, hybridizationによるＭＲＳＡの同定は、単に、mecがいくつかのＭＲＳＡにおいて同一の染色体挿入部位を持っているというだけの初期の知見（Keiichi Hiramatsu:Microbiol. Immunol. 39(8), 531-543, 1995.）からは、実現不可能であることが明かになった。
【００２６】
実施例４
ＭＲＳＡのmecの相同性の検証
１）N315, NCTC10442, 85/3907のそれぞれのmec領域をカバーするＤＮＡクローンをプローブとして、世界18カ国26株の流行ＭＲＳＡ株の染色体ＤＮＡとの反応性をdot-blot hybridization 法で検索した。100 ng/μlの染色体DNA溶液と T10E1(10mM Tris, 1mM EDTA [pH8.0])を等量混合したのち,９５℃５分間加熱したのち、冷却し20XSSCを等量加えナイロン膜に４μlスポットする。0.5N NaOH, 1.5MNaClにて変性後、1.5M Tris (pH7.3),  1.5MNaCl, 1mMEDTAにて中和した後、ジゴキシゲニンにて標識したプローブを用いてhybridizationを行い、抗ジゴキシゲニン抗体標識アルカリフォスファターゼを用いて検出を行った。
２）表2,3,4に示すように、上記３種のmecは、お互いのプローブでほとんど検出されないことが判明した。
３）N315, NCTC10442, 85/3907の各mecプローブを用いることにより、26株は、上記３種のいずれかのタイプに分類されることが示唆された（表2,3,4）。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
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【００２９】
【表４】
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実施例５
N315, NCTC10442のmecの塩基配列に基づき、type2j,3eのmecを検出するためのプローブを常法により合成した。プライマーを選定するための塩基配列は、N315のmecの右側（下流）のIS431（図１） から 下流junctionにいたるmec領域の塩基配列N315IS-J3（図17）及びNCTC10442J3rc(図18）をもとにして設計した。以下は、任意に選んだプライマーで、同等のプライマーは、上記塩基配列に基づいて、数多く設計することができる。プライマーの塩基配列と、その位置をN315IS-J3（図17）の塩基番号で示す。
Nmec2    5'-GATAGACTAATTATCTTCATC-3'    229-249
Nmec3    5'-CAGACTGTGGACAAACTGATT-3'    507-527
Nmec4    5'-TGAGATCATCTACATCTTTA-3'     676-695
Nmec4-2  5'-GGATCAAAAGCTACTAAATC-3'     903-922
Nmec5    5'-ATGCTCTTTGTTTTGCAGCA-3'     1504-1523
Nmec6    5'-ATGAAAGACTGCGGAGGCTAACT-3'  2051-2073
実施例６
85/3907のmecの塩基配列pSJ10-3J3rc（図19）に基づき、type4eのmecを検出するためのプローブを合成した。
Gmec1045        5'-ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3'     10-33
実施例７
intM及びその上流の塩基配列pLEC12(pLEC1a)(図4）に基づきＭＳＳＡの染色体ＤＮＡを検出するためのプローブを合成した。
J3      5'-AAGAATTGAACCAACGCATGA-3'            1664-1684
IntM1   5'-AAACGACATGAAAATCACCAT-3'            1389-1409
J7      5'-TCGGGCATAAATGTCAGGAAAAT-3'          1267-1289
J6      5'-GTTCAAGCCCAGAAGCGATGT-3'             949-969
Nif     5'-TTATTAGGTAAACCAGCAGTAAGTGAACAACCA-3' 639-671
実験例１
プライマーの設定の予備実験１
N315, NCTC10442のmecの塩基配列に基づき作製したtype2j,3eのmecを検出するためのプライマー６種、85/3907のmecの塩基配列に基づき作製したtype4eのmecを検出するためのプライマー２種とintM及びその上流の塩基配列に基づきＭＳＳＡの染色体ＤＮＡを検出するために作製したプライマー６種を組み合わせてプライマー設定のための予備実験を行なった。PCR法は20μｌから50μｌの反応液（10 mM Tris-HCl pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001%(w/v) gelatin, 200 μM of dNTPs, 1.0μM primer, template DNA, 0.01 u/μl Taq DNA polymerase)中にて行った。反応条件は94℃３０秒、55℃１分、７２℃２分を３０サイクル繰り返す系を使用した。
【００３０】
結果１
表５に示すように、試験に供した世界各国の流行ＭＲＳＡ株のすべてが、N315,NCTC10442のmecの塩基配列に基づき作製したGmec1045と反応するタイプと、85/3907のmec の塩基配列に基づき作製したNmec6と反応するタイプのどちらかに分類された。したがって、上記２種のmec の塩基配列に基づき作製したプライマーを用いることにより、世界各国のＭＲＳＡをすべて検出同定することが可能であることが示された。
【００３１】
【表５】
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結果２
図２０に示すように、Nmecシリーズのプライマーとの組み合わせでは、J7（図２０A）、J6（図２０Ｃ）, Nif （図２０B）ともに反応が見られたが、特にJ6J7を用いた場合のシグナルが強かった。また、Gmec1045とＭＳＳＡ側のプライマーの組み合わせの実験（図２０D）では、いずれも強いシグナルが得られた。
【００３２】
実験例２
プライマーの設定の予備実験２
次に、２種のmecのプライマーと１種のMSSA側プライマーを混合した場合の検討を行った。PCRの条件は実験例１と同様である。
結果
図２１に示すように、Gmec1045と、J7(図２１A),Nif（図２１B）, J6（図２１C）のそれぞれの組み合わせに、Nmecシリーズのプライマーを組み合わせたところ、Gmec1045とJ6を使用した場合、Nmec4,3,2のプライマーを加えたときのシグナルがやや減弱した（図２１Ｃ  lane4,5,6）以外には、良好なシグナルが得られた。しかし、同じ組み合わせでNmec6,5,4-2を使用した場合（図２１Ｃlane1,2,3 ）には、むしろ他の組み合わせよりもシグナルが強かった。
【００３３】
実験例３
実験例２の結果を踏まえて、J6, Gmec1045, Nmec5のプライマーを組み合わせて、ＰＣＲ法で、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、mec を有する、及びmecを有しない黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌株の臨床分離株を用いて、その有効性を検証する。プライマーはmec側はGmec1045とNmec5、ＭＳＳＡ側はJ6を用いた。PCR法は20μｌから50μｌの反応液（10 mM Tris-HCl pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001%(w/v) gelatin, 200 μM of dNTPs, 1.0μM primer, template DNA, 0.01 u/μl Taq DNA polymerase)中にて行った。反応条件は94℃３０秒、55℃１分、７２℃２分を３０サイクル繰り返す系を使用した。
結果
実験結果図２２及び２３をまとめたものが表１である。世界各国のＭＲＳＡは、いずれも陽性のシグナルを示し、ＭＳＳＡはすべて陰性。黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌は、mec の保有、非保有に関わらず、すべて陰性であった。
【００３４】
以上より、mecの下流端部分に２種のプライマーを合成し、intM内あるいは、その５’側にもう一つのプライマーを合成すれば、ＰＣＲを用いて、世界の主要なＭＲＳＡ臨床分離株のmec のほとんどが、検出され、しかも、この方法では、mecを持つ黄色ブドウ球菌以外のヒトの常在ブドウ球菌の混入があっても、偽陽性を生じないことが実証された。
【００３５】
【発明の効果】
本法を用いて臨床検体からの超迅速ＭＲＳＡ同定のための条件設定を行えば、従来の公知の技術の範囲内で、痰、血液、尿、滲出液、などの検体から、直接、３０分−１時間以内に、ＭＲＳＡを検出することが可能である。この方法は、患者検体からベッドサイドでＭＲＳＡ同定をおこなうことにより、有効な化学療法剤の選択とＭＲＳＡ感染症の早期治療が可能となる。また、この方法は、医療従事者などの健康者のＭＲＳＡの保菌検査にも応用できるため、院内感染の勃発を未然に防ぐための検査としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】染色体ワーキングによるＮ３１５のmec領域ＤＮＡのクローニングを説明するための図である。HはHindIII, ＰはPstI, EはEcoR1のそれぞれ制限酵素切断部位を示す。
【図２】染色体ワーキングによるＮＣＴＣ１０４４２のmec領域ＤＮＡのクローニングを説明するための図である。λファージライブラリーより得られたクローンLO2, LO5, LO7, LO21の制限酵素 地図及びmec 領域ＤＮＡの挿入部位を示す。１〜７はmec領域ＤＮＡのプローブを示す。H, HindIII; E, EcoRI; S, SalI; X, XbaI
【図３】ＭＲＳＡ株、85/3907の mec領域ＤＮＡの構造と、その染色体上の挿入部位を示す図である。プラスミドライブラリーより得られたクローンpSJ9, pSJ10, λファージライブラリーより得られたクローンLG12, LG25の制限酵素地図及びmec 領域ＤＮＡの挿入部位を示す。１〜７はmec領域ＤＮＡのプローブを示す。H, HindIII; E, EcoRI; S, SalI; X, XbaI; P, Pst1
【図４】ｍｅｃ挿入部位を含むＬＤ８３２５の制限酵素マッピングとその部分塩基配列を示す図である。縦の矢印は、mec の挿入部位を示す。水平の矢印は、塩基配列の方向を示す（5'から3'にむけて）。塩基配列の下線の部分はintMのopen reading frameを意味する。塩基番号1856と1857の間の矢印はmecの挿入部位を示す。
【図５】  mec挿入部位の前後の染色体ＤＮＡ塩基配列のＭＳＳＡ菌株間での比較を示す図である。各菌株の産生するコアグラーゼ型は、ATCC25923, ４型; STP23, ４型; NCTC8325, ３型;STP43, ７型; STP53, ５型。mec挿入部位（矢印）を含んだNCTC8325pLEC12の塩基番号1708から1932の225塩基を他の菌株の相当する225塩基と比較した。括弧で括った塩基はすべての菌株に共通のものである。
【図６】ＭＲＳＡとメチシリン耐性菌との塩基配列での比較を示す図である。SH 495, SH JA178はS. haemolyticus 臨床分離株。SE G3はS. epidermidis臨床分離株。
【図７】ＭＲＳＡの同定法の概略を示す図である。矢印はＰＣＲのプライマーを示す。Aのように設定したプライマーは、MSSAの染色体ＤＮＡとは、MSSA側プライマーは反応するが、mec側プライマーとは反応しない（B ）。また、mecをもった黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌株の染色体ＤＮＡとは、mec側プライマーは反応するが、MSSA側プライマーは反応しない（C）。
【図８】ＰＣＲ内部コントロールの概念を示す図である。MSSAのintMを含んだ領域を囲むようにプライマーを設計するとMSSAの染色体ＤＮＡとは反応してPCRによりＤＮＡ断片が増幅されるが、MRSAの染色体ＤＮＡの場合は、30Kb以上のmec領域ＤＮＡが挿入することにより、通常のPCRでは増幅ができない。さらに、mec 挿入部位を含めてプライマーを合成した場合は、MRSAの場合には、プライマー自体が反応しなくなる。
【図９】塩基配列ｐＬＥＣ１２ｒｃとｐＳＪ８−２ａの相同性を示す図である。N315のmec上流junctionを含むサブクローンpSJ8-2a（図１参照）（下側の塩基配列）とNCTC8325のintMを含む染色体ＤＮＡクローンpLEC12(pLEC1a)の塩基配列（上側の塩基配列）を比較した。mecの上流junctionより外側の塩基配列はほとんど同一である。pLEC12rcはpLEC12のreverse complementaryの塩基配列である。
【図１０】塩基配列ｐＬＥＣ１２ｒｃとｐＳＪ８−２ａの相同性を示す図であり、図９の続きの部分を示す。
【図１１】塩基配列ｐＬＥＣ１２ｒｃとＮ３１５Ｊ３ｒｃの相同性を示す図である。N315のmec下流junctionを含むサブクローンの塩基配列N315J3（図１参照）（下側の塩基配列）とNCTC8325のintMを含む染色体ＤＮＡクローンpLEC12(pLEC1a)の塩基配列（上側の塩基配列）を比較した。mec領域ＤＮＡの外側のintM の塩基配列はほとんど同一であった。N315J3rcはN315J3の塩基配列のreverse complementaryの塩基配列である。
【図１２】  N315 とNCTC10442のmecの上流junctionを含むクローンの塩基配列を比較した図である（N315, 上側の塩基配列; NCTC10442, 下側の塩基配列）。mecの塩基配列はjunction近傍のIR以外はお互いにきわめて異なっている。一方、junctionの外側の塩基配列は同一であった。
【図１３】  N315とNCTC10442のmecの下流juncitonを含むクローンの塩基配列を比較した（N315, 上側の塩基配列; NCTC10442, 下側の塩基配列）図である。お互いのmec の塩基配列は、IR 以外はきわめて異なっていた。一方、junctionの外側（下流）の塩基配列はきわめて相同性が高かった。NCTC10442J3はNCTC10442J3の塩基配列のreverse complementaryの塩基配列である。
【図１４】  N315IS-J3rcとNCTC10442のJ3rcを比較した図である。上側の塩基配列、N315IS-J3（図1, 図17を参照）；下側の塩基配列, NCTC10442のJ3rc（図13参照）のmec領域に相当する最初の176塩基配列。
【図１５】  N315J3rcとpSJ10-3J3rcを比較する図である。上側の塩基配列、N315J3rc; 下側の塩基配列、pSJ10-3J3rc。pSJ10-3J3rcはpSJ10-3J3の塩基配列のreverse complementaryの塩基配列である。
【図１６】  pSJ8-2aとLG12H2を比較する図である。上側の塩基配列、pSJ8-2a; 下側の塩基配列、LG12H2。
【図１７】Ｎ３１５ＩＳ−Ｊ３の塩基配列を示す図である。細い下線は, NCTC10442のJ3rcのmec領域に相当する最初の176塩基配列 に相当する塩基配列（図１４参照）。太い下線は、mec下流junctionの外側intMに相当する塩基配列。
【図１８】ＮＣＴＣ１０４４２Ｊ３ｒｃの塩基配列を示す図である。下線は、mec下流junctionの外側intMに相当する塩基配列。
【図１９】ｐＳＪ１０−３Ｊ３ｒｃの塩基配列を示す図である。下線は、mec下流junctionの外側intMに相当する塩基配列。
【図２０】実験例１の結果を示す図面代用写真である。プライマーの検討。A：J7とNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2。 B：NifとNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2)。Ｃ：6とNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2  Ｄ：Gmec1045とNif, J6, J7, IntM1, J3の組み合わせ。1, Nif; 2, jun6; 3, J7; 4, IntM1; 5, J3.  A-CはtemplateとしてN315染色体ＤＮＡを、 Dはtemplateとして 85/3907染色体ＤＮＡを使用した。
【図２１】実験例２の結果を示す図面代用写真である。３種混合プライマーの検討。A：J7とGmec1045とNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2。 B：NifとGmec1045とNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2)。Ｃ：J6とGmec1045とNmec2,3,4,4-2, 5,6との組み合わせ。1, Nmec6; 2, Nmec5;3, Nmec4-2;4, Nmec4, 5;Nmec3, 6; Nmec2。templateとしてN315染色体ＤＮＡを使用した。
【図２２】実験例３の結果を示す図面代用写真である。ＭＲＳＡの特異的同定。ＭＲＳＡ２６株、ＭＳＳＡ１１株、ブドウ球菌標準株  ２５株、ＭＲブドウ球菌  ２０株についてJ6とGmec1045とNmec5  の３種のプライマーを用いてＰＣＲ法を実施した。A, MRSA   ；Ｂ, ＭＳＳＡ；  Ｃ, 黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌。 lanes１ー２５, mecを有しないブドウ球菌; ２６−４５、mec を有するブドウ球菌。分子量マーカーとしてlambda pahge をHindIIIで切断したものを用いた。
【図２３】実験例３の結果の続きを示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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