(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染の危険性がある従属栄養の宿主細胞に、膜輸送により細胞内へ取込まれる糖とラジカル中心を持つ原子団の化合物を取込ませ、この化合物に起因するラジカル信号の有無を指標としてウイルス感染の有無を判定することを特徴とするウイルス感染判定方法。
【請求項２】
従属栄養の宿主細胞が単細胞生物または多細胞生物から単離した細胞である請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、糖スピンプローブ剤による宿主内ラジカル信号検出によりウイルスの宿主への感染を判定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルス感染は人の健康、畜獣の飼育、農作物・海産物の育生などに有害な感染症を引き起こす。インフルエンザウイルス、エイズウイルスはヒトやその他の動物に感染し、感冒やエイズを引き起こし（高橋甫ら(1989)、「微生物学」、倍風館；根路銘国昭(2000)、「驚異のウイルス」、羊土社）、モザイクウイルスは、ダイズ、キュウリ、タバコ、ムギ、トマト等に害を与え（与良清ら(1983)、「植物ウイルス事典」、朝倉書店）、細菌ウイルス（バクテリオファージ）は、乳酸発酵バクテリアに感染し、チーズ等の乳製品生産に被害を及ぼす（内海誓一郎(1958)、「細菌ウイルス」、共立出版）。
【０００３】
ウイルスの解析は19世紀末のBeijerink MWによるタバコモザイクウイルスの研究、Loeffler Fと Frosch Pによるウシ口蹄疫の研究によりはじまった。これらは細菌とは異なり、細胞濾過器（滅菌フィルターと同等の物）を通過し、宿主を離れて自己増殖できない（人工無細胞培地での培養ができない）病原体として認知された（内海誓一郎(1958)、「細菌ウイルス」、共立出版）。ウイルス核酸の種類はウイルス種により異なっており、RNAまたはDNAをもつが、自己増殖能のある生物のようにDNAとRNAの両方を同時にもつことはない。この点においてウイルスは独特の非生物生命体である。その増殖機構は、ウイルスの宿主細胞への吸着、ウイルス核酸の宿主細胞内への侵入、宿主細胞の機構を借りたウイルス核酸の複製、キャプシド（エンベロープ）タンパク質の合成、核酸とキャプシドの組み立て、宿主細胞の溶菌、そして、ウイルスの細胞外放出である（高橋甫ら(1989)、「微生物学」、培風館）。細胞外に放出されたウイルスは、組織中の隣接細胞に感染し、その後、循環器を巡り個体内全体の細胞に感染する。感染個体は、体液・分泌液等を飛散、放出したり、蚊やアブラムシなどの節足動物キャリアーを媒介して他生物にウイルスを伝達する。ウイルスの核酸はウイルス種ごとに異なっており、1本鎖RNA、2本鎖RNA、1本鎖DNA、あるいは、2本鎖DNAのいずれかを持つ。それぞれの核酸は通常エンべロープにより包まれているが、この構造をもたないウイルス種もある（以下、これらのエンべロープウイルス・裸ウイルスをまとめてウイルスと記載する）。
【０００４】
感染症病原となるウイルスは、感染後にそのウイルスに特有な病徴を宿主にもたらす。発病した宿主に対しては、ウイルス病徴の診断とウイルス培養により感染ウイルス種を推定する。その結果を参考にして抗体を用いた免疫学的手法、PCR法やRT-PCR法などの分子生物学的手法などによりウイルス種を確認する。そして、その後感染個体の治療と、他個体への二次感染防止などの対処をおこなう。
【０００５】
ウイルスは宿主体内で遺伝子の点突然変異を急速におこないアミノ酸配列を置換する。エイズウイルスは宿主体内で急速にエンベロープタンパク質遺伝子に点突然変異をおこし、アミノ酸が置換し抗原性が変わってしまう（根路銘国昭(2000)、「驚異のウイルス」、羊土社）。インフルエンザウイルスでは点突然変異によるアミノ酸置換の結果として毒性が強化された株が生じたが、この強毒ウイルス株の核酸配列フィンガープリントと抗原性が変異前の弱毒ウイルス株と変わらなかった。そのために、宿主病状の診断結果が免疫学的・分子生物学的解析の解析データと矛盾し、変異ウイルス株の正確な感染判定が行えなかった（根路銘国昭(2000)、「驚異のウイルス」、羊土社）。また、ウイルス遺伝子ではウイルスの株間、あるいは、宿主とウイルス間で遺伝子の組み換え（遺伝子の転位）がしばしばおこなわれ、毒性の強化・感染宿主の拡幅が生じることがある。例えば、ベロ毒素による食中毒をもたらす病原性大腸菌0157は、細菌ウイルスにより赤痢菌からの毒素遺伝子が転位された結果生じたものである（根路銘国昭(2000)、「驚異のウイルス」、羊土社）。以上のとおり、ウイルス遺伝子の短時間での急激な変化は、従来の免疫学的・分子生物学的なウイルス感染検出の方法の限界を示している。
【０００６】
一方、ウイルスが感染した後に宿主からラジカルが発生することは広く知られており、そのメカニズムはインフルエンザウイルスとマウスを用いた系において研究がすすめられてきた。この系では、感染宿主内でキサンチンオキシダーゼ（XO）、NO合成酵素（NOS）が合成され、O2-、NOラジカルを発生させる（Maeda H とAkaike T（1998）、 Biochemistry (Mosc) 63:854-865）。同様なラジカル発生はサイトメガロウイルス（Ikdedaら(1992)、 Arch Virol 127:11-24）、ヘルペスウイルス（藤井重元ら(1996)、第69回日本生化学会要旨集:1013）、狂犬病ウイルス、borna disease virus（Koprowski Hら（1993） Proc Natl Acad Sci USA 90:3024-3027）、coxsakie virus （Mikami Sら(1996)、 Biochem Biophys Res Commun 220:983-989）、tickborne encephalitis virus（Kreil TRら(1995)、 Virology 212: 174-178）の感染においても報告されている。しかし、これらの測定では公知のスピンプローブ剤を用いてウイルス感染ラジカルの検出を行っているが、そのスピンプローブ剤が細胞内に入っているかどうかについては不明であり、単に細胞外（血液や体液中）のラジカルを見ている可能性もある。また、この従来のスピンプローブ剤を用いる方法では、スピンプローブ剤の正味の細胞取り込み量が重要な問題となる単細胞生物や多細胞生物から単離した細胞についての研究は困難である。
【０００７】
それ以外のラジカルを用いた技術で細菌細胞のウイルス感染を研究した例は幾つかある［例えば、Datema KPら（1987、Biochemistry 26:7571-7574）、Datema KPら（1988、Biochim Biophys Acta 944:507-515）、Wolfs JAら（1989、Biochemistry 28:9995-10001）、Sanders JCら（1992、Eur Biophys J 21:305-311）、Stopar Dら（1997、Biochemistry 36:8261-8268）、de Jongh HHJら（1990、Biochim Biophys Acta. 1024:82-88）、 Peelen SJCJら（1992、Biochemistry 31:2670-2677）など］。しかし、これらの報告では、観測しているラジカルがファージ等の脂質またはタンパク質に化学反応により付加させたラジカルである点と、大腸菌ウイルス（バクテリオファージ）外皮と宿主外皮との相互作用を観測している点で、この出願の発明の趣旨と異なっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、従来のウイルス感染判定方法は、特定ウイルス種に特異的な抗体・核酸配列などの要素をもとにおこなわれてきた。これらの従来の検出方法では、関連するあらゆるウイルス種・株の１つ１つに特異的な抗体・塩基配列をあまねく揃える必要があり、ウイルス遺伝子の点突然変異、遺伝子転位によって生じる新型ウイルスの検出には必ずしも適用できない。また、従来の感染判定方法では感染性病徴診断、検査生物での培養などをおこなう必要があり、この作業には多大の時間と熟練が要求される。以上述べたように、ウイルス種・株に特定されないパラメーターに注目し、その検出手段を高度化したウイルス感染検出方法の開発はなされていなかった。
【０００９】
また、ウイルス感染した宿主がラジカル信号を発することが知られているが、従来技術はスピンプローブ剤を細胞に取り込ませ、それに起因するラジカル信号を検出しているが、このスピンプローブ剤は細胞への取り込み量が少ないため、高精度のウイルス感染判定が困難であるという欠点を有していた。
【００１０】
この出願は以上の事情に鑑みてなされたものであって、ウイルス種によって限定されることなく、宿主へのウイルス感染の有無を簡便かつ正確に検出する方法を提供することを課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明者らは、前記の課題を解決するため、鋭意努力した結果、スピンプローブ剤に膜輸送される糖を結合させることにより細胞のスピンプローブ剤取り込み量が大幅に増大することを見い出した（実施例１、２参照）。この出願の発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
【００１２】
すなわち、この出願は、前記の課題を解決するための発明として、ウイルス感染の危険性がある従属栄養の宿主細胞に糖スピンプローブ剤を導入し、この糖スピンプローブ剤に起因するラジカル信号の有無を指標としてウイルス感染の有無を判定することを特徴とするウイルス感染の判定方法を提供する。
【００１３】
この方法においては、宿主細胞が従属栄養の単細胞生物または多細胞生物から単離した細胞であること、また糖スピンプローブ剤が、膜輸送により細胞内へ取込まれる糖とラジカル中心を持つ原子団の化合物であることを望ましい態様としている。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明は、宿主細胞にあらかじめ糖スピンプローブ剤を取り込ませ、ウイルスに感染した時に宿主細胞に発生する刺激をラジカル信号としてESR装置等で検出することにより、細胞のウイルス感染を判定する方法である。
【００１５】
宿主細胞は、従属栄養の単細胞生物または多細胞生物から単離した細胞である。従属栄養の単細胞生物としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトコックス菌（Streptococcus）、アクチノミセス菌（Actinomyces）、淡水産ないし海産の動物プランクトン等を対象とすることができる。また、従属栄養の多細胞生物としては、ハエ、カイコ、Spodoptera、Trichoplusiaを含む昆虫から、ゼブラフィッシュ、メダカ、サケを含む魚類、カエル、イモリを含む両生類、ニワトリ、シチメンチョウを含む鳥類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシ、およびヒトを含めた哺乳動物までを対象とすることができる。
【００１６】
ここに記載する糖スピンプローブ剤とは、細胞分子認識学的思考に基づくものであり、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、マルトース等に代表される細胞膜トランスポーターやレセプターの搬入対象となる単糖、二糖、またはオリゴ糖と、4-hydroxy-2,2,6,6,-tetramethyl-1-piperidinyloxy (TEMPOL)を代表とするラジカル中心を有する原子団を結合させた化合物であり、この化合物の分子全体はトランスポーターまたはレセプターの認知対象物質となることが期待されるものである。例えば、特開平07-304786に開示されているような、六単糖のグルコースと六員環構造をとる TEMPOLとがα1,4またはβ1,4結合した形をとる4-(D-glucosyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (G-TEMPO) 等を例示することができる。
【００１７】
宿主細胞へ糖スピンプローブ剤を取り込ませる手段は、宿主が単細胞生物の場合はその細胞を、宿主が多細胞生物の場合は個々の細胞によって構成される組織または器官等の細胞塊を、糖スピンプローブ剤を加えた培地でインキュベートすることによっておこなう。さらに必要に応じて細胞または細胞塊を飢餓状態においてから糖スピンプローブ剤と培養することにより細胞へ効率良く取り込ませてもよい。インキュベート用の培地としては、LB培地、NZY培地、High Five培地、Grace's昆虫培地、DES発現培地、MEM培地、RPMI1640培地、ESM培地、人工海水、海水などの細菌・培養細胞用培地（液体培地ないし固形培地）等を用いることができる。
ラジカルの測定は、宿主細胞または宿主より取った細胞塊をサンプリングしたもので行う。測定する方法は公知の測定方法によって行う。すなわち、サンプルを適当な試料管に挿入し、X-band、L-band、W-band等のESR装置等により経時的におこなう。
なお、ラジカル測定の前に、必要に応じて、宿主細胞外の糖スピンプローブ剤の洗浄等を公知の方法によりおこなう。たとえば、細胞懸濁液中の細胞を糖スピンプローブ剤を含まない液で洗浄、遠心、上清除去を行うことなどによって行う。あるいは、アスコルビン酸、グルタチオン、システインなどの公知のスカベンジャーないし、Na2MnEDTAなどの公知のクエンチンチャ（quencher）等を培地に添加することなどによって細胞の外側の糖スピンプローブ剤由来シグナルを除去ないし減衰させることをおこなってもよい。特に、細胞塊の場合は、トリプシン処理等によりばらした細胞を単細胞と同様に洗浄ないしシグナル除去・減衰操作処理をしてもよい。あるいは、生体内の内在的還元力（たとえば生体内抗酸化物質や呼吸などの電子伝達系による還元力）による細胞外糖プローブ剤シグナルの減衰を利用してもよいし、あるいは前述のクエンチャー、還元剤を利用してもよい。
【００１８】
以下、実施例を示して、この出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
一般のスピンプローブ剤と糖スピンプローブ剤の細胞への取り込み量の差を調べる目的で以下の実験をおこなった。大腸菌（Escherichia coli）を37℃で一晩LB培地（10g/lバクトトリプトン、5g/lイーストエクストラクト、10g/l塩化ナトリウム）中で震盪培養した。10mmol/l MgSO4を予め加えたLB培地を試験管１、２、３、４に分注した。試験管１、３に1 mmol/lの 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy（TEMPOL）を、試験管２、４に1 mmol/lの4-(D-glucosyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy（G-TEMPO）を加え、さらに各試験官に50μlの大腸菌前培養液を接種し、37℃で約8時間震盪培養した。各試験管から1.5mlの大腸菌懸濁液を回収し、遠心し、上清除去し、沈澱を蒸留水で洗浄し、さらにこの操作を２回くり返した。上清除去後、試験管１、２、３、４由来の各沈澱8μlをガラスキャピラリーに挿入し、X-band ESRスペクトルを常法により測定した。その後、試験管１、２に31%H2O2を、試験管３、４に1 mmol/l K3Fe(CN) 6をそれぞれ1滴滴下し、再びX-band ESR装置によりラジカル信号を測定した。その結果、試験管２におけるH2O2添加によるESRシグナル強度の増加量は試験管１のそれに比べ20倍以上であり、試験管４におけるK3Fe(CN) 6添加によるESRシグナル強度の増加量は試験管３のそれにくらべ４０倍以上であった（図１）。
実施例２
さらに、大腸菌増殖のさまざまな時期におけるスピンプローブ剤と糖スピンプローブ剤の細胞への取込み量の差を詳細に調べた。大腸菌の成長曲線を調べた後に、各時期から２時間の間大腸菌を1mmol/l TEMPOLまたは1mmol/l G-TEMPOでパルスラベルし、実施例１のように、1mmol/lフェリシアン化カリウム溶液を大腸菌沈澱に１滴滴下し、ESR測定を行った。その結果、G-TEMPOを添加したときには、定常期初期（菌接種後８時間目）から７時間後の時期までは糖スピンプローブ剤の取り込み量が増加し、その後は、十分な取り込み量を維持した。一方、TEMPOLで同様にパルスラベルを試みたが、細胞への取込み量はごく少ないか、検出限界値以下であった（図２）。
実施例３
実施例１のようにG-TEMPOと共に震盪培養した大腸菌に予め滅菌フィルター（孔サイズ0.2マイクロメーター）で濾過した20μlのλファージ液（1 x 109 pfu/ml）を添加したものと、しなかったものをさらに30分間震盪培養し、前述のとおり両者から1.5mlを回収し、遠心し、上清除去し、沈澱を蒸留水で洗浄し、さらにこの操作を２回くり返し、ESRスペクトルを同様に測定した。その結果、ファージ液を加えた場合のみESR信号が検出された（図３）。
実施例４
次に、糖スピンプローブ剤を取り込ませた宿主へのウイルス感染時のESRシグナルを経時的に測定するための実験をおこなった。大腸菌をLB培地で一晩37℃で震盪培養した。最終濃度10mmol/l MgSO4および1 mmol/lのG-TEMPOを添加したLB培地3mlを各試験官に入れ、50μlの大腸菌前培養液を接種し、37℃で約７時間震盪培養した。予め滅菌フィルターで濾過した20μlのλファージ液（1 x 109 pfu/ml）を各試験管に混合し震盪培養した。その後、0分後、15分後、30分後、45分後、60分後に1.5mlの大腸菌・λファージ混合液を回収し、それぞれ前述のとおり遠心し、上清除去し、沈澱を蒸留水で洗浄し、さらにこの操作を２回くり返し、上清除去後の宿主大腸菌沈澱をガラスキャピラリーに挿入し、同様にX-band ESR装置によりラジカル信号を測定した。その結果、ラジカル信号はλファージを添加後0分後のサンプルでは、検出できなかったが、15分後のサンプルに0.55μmol/l相当のラジカルが検出された。30分後、45分後のサンプルの検出シグナルには、それぞれ15分後のそれの約3分の1、約6分の1の強度のシグナルが検出された（図４）。λファージ混合15分後に検出されたラジカルの強度は、λファージを混合せずに15分間培養したコントロールのシグナル強度に比べ、装置誤差を考慮に入れても、有意義に大きい値であった。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、糖スピンプローブ剤をもちいた従属栄養の宿主細胞へのウイルス感染判定方法が提供される。
この発明のウイルス感染判定方法は、ウイルス種に特異的なタンパク質・核酸塩基配列に依存しないパラメーター（感染による宿主細胞内のラジカル応答）に起因するものであり、点突然変異・遺伝子転位等によるウイルスの核酸配列・抗原性の変化により生じる新ウイルス株にも適用することが可能である。また、種・株に左右されない公汎なウイルス群にも応用が可能である。そのため、人、畜獣などの動物、海産の動物、動物プランクトン、細菌などを宿主とした感染症病原ウイルスの感染検出に用いることができる。その感染検出の結果、一次感染個体への早期治療、あるいは二次感染の防止に役立てることにより検疫に応用することができる。より具体的には、インフルエンザウイルスやエイズウイルスなど感染症のヒト・家畜への感染の検出、動物への癌ウイルス、あるいは、癌ウイルスのヘルパーウイルスの感染の検出、発酵乳製品生産に用いている発酵細菌への細菌ウイルスの感染の検出、抗生物質産生菌へのウイルス感染の検出などに役立てることができる。また、サイトメガロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスベクターの遺伝子導入の確認方法としても用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy （TEMPOL）または4-(D-glucosyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy（G-TEMPO）を含む培地でインキュベート後、細胞外のTEMPOLまたはG-TEMPOを遠心除去した大腸菌と、その後さらに過酸化水素水またはフェリシアン化カリウム溶液を添加した大腸菌のＸband ESRスペクトルの記録例である。過酸化水素水またはフェリシアン化カリウム溶液添加によるピーク強度の増加量が大腸菌に吸収されたTEMPOLまたはG-TEMPOの量を示している（但しK3Fe(CN)6添加の方が感度が良い）。測定条件：マイクロ波パワー 5mW、磁場変調(100kHz) 0.2mT、ゲイン1x100、時定数 0.1s、磁場掃引速度 10mT/8min、マイクロ波周波数 9.43GHz。
【図２】大腸菌の増殖曲線（600nmにおける濁度の変化）の記録例、およびTEMPOLまたはG-TEMPOを添加する時期と吸収されるTEMPOLまたはG-TEMPO量との関係の記録例である。各測定で大腸菌は、TEMPOLまたはG-TEMPO添加の２時間後に遠心洗浄し、ESR測定を行った。測定条件：図１に同じ。
【図３】  G-TEMPOとインキュベートした後遠心洗浄した大腸菌と、この後さらにλファージを添加した大腸菌のX-band ESRスペクトルの記録例である。下のスペクトルではλファージ感染によるラジカル信号が３本のESRピークとして観測されている。測定条件：図１に同じ。
【図４】λファージ添加後の時間と感染により発生したラジカル信号強度との関係の記録例である。λファージは、ある時間にG-TEMPOとインキュベート中の大腸菌に添加し、グラフで示された時間経過後、遠心洗浄しESR測定を行った。各点の縦線は各測定でのノイズレベルを示す。測定条件：図１に同じ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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