(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
材木植物種において形質の発現に関わる遺伝子又は遺伝子群に由来するＤＮＡ断片を獲得する方法であって、
材木植物種を材料とし、形質発現の差が大きい個体間のゲノムサブトラクションによって多型ＤＮＡ断片を収集し、
ＲＮＡ由来の標識プローブを用いて多型ＤＮＡ断片に対してハイブリダイゼーションを行うことによりＤＮＡ断片を選抜し、
同一個体間においてもゲノムサブトラクションを行って、前記選抜されたＤＮＡ断片と対比することによりヘテロ変異を検出する、
ことを含む前記方法。
【請求項２】
標識プローブが、個体から抽出した全ＲＮＡを鋳型に用いて作製したｃＤＮＡを標識したものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
形質発現の差が大きい個体間のゲノムサブトラクションが兄弟個体群間のゲノムサブトラクションである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
材木植物種がアカシア属に属する植物種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アカシア属に属する植物種がアカシア属のアウリカリフォルミス種である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ゲノムサブトラクションをＲＤＡ法によって行う、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
標識プローブがジゴキシニゲン標識プローブである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ｃＤＮＡが、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によって増幅することにより作製される、請求項２記載の方法。
【請求項９】
多型ＤＮＡ断片をアクリルアミドゲル電気泳動で分画した後でハイブリダイゼーションを行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子工学及び分子遺伝学の分野を用いた植物のＤＮＡ断片の獲得とこれらを活用した植物、特に林木の育種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
育種における典型的な手法は、経験者による発現形質の観察データや分析データを基にした優良個体候補の選抜に始まる。これらの優良個体候補は検定試験を経過したのち、正式な優良個体として保存される(品種の登録)。更には、選抜された優良個体間の交配により親形質の良い形質を併せ持った後代個体の作出を行うことが重要である。多くの生物種において選抜あるいは交雑育種の歴史は様々であるが、例えば、林木等の場合はそれ自身の成長に時間がかかることから特に交雑育種の歴史は浅く、これからの成果が期待される。
育種上有用とされる形質の多くは、多くの生理学的現象が統合された結果として現れる(例えば、林木の場合では材の性質、材の密度など)。１つ１つの現象は個体の特つすべての遺伝子情報(ゲノム)に規定され、必要に応じて発現していると考えられる。しかしながら、実際に鍵となる生理学的現象を正確に把握することや、個々の現象の連携システムを知ることは非常に困難である。実際の育種では、何世代にも及ぶ遺伝家系を作製し、後代検定により有用形質の絞り込みを行うことが一般的である。近年表現形質に加えて、酵素や核酸の分子生物学的解析データを1つの形質のように扱うようになった。これによって、無作為ではあるもののゲノム上のマーカー数が飛躍的に高まった。ある遺伝家系にこのような多くのマーカーを適用し、得られる多型データを統計学的に処理することで、その家系に特有な遺伝子連鎖地図が作製されるようになった。地図上のマーカーが適度に分散しかつ多数存在すれば、理論的にはある表現形質と強く連鎖するマーカーが見出せると考えられ、すなわち、統計遺伝学的なレベルでの形質判定が可能と思われる。しかしながら、いままでのところ、こうした分子マーカーを選抜基準として作用させた選抜の実施を公に報告した例はない。これの要因として、後述する問題点が考えられる。
【０００３】
ゲノムには何らかの遺伝子情報を規定している部分（コード領域）とそれ以外の部分〔非コード領域（機能などは不明、繰り返し、反復などの塩基配列一次構造上の特徴が認められている）〕が存在する。非コード領域はゲノムの大部分を占めており、コード領域はゲノム全体に点在している。一般的に活用されている分子マーカー（特にＤＮＡに由来するもの）は、無作為に獲得されることがほとんどであり、多くの分子マーカーがこのような非コード領域に由来することが否めない。すなわち、現行の分子マーカーは個々の形質発現とは無関係な任意なものである。したがって、ゲノム上の個体間差あるいは種間差によっては、任意の分子マーカーが普遍的に作用できない場合が生じる。すなわち、林木などを含め多くの生物種では、個体毎のヘテロ性が認められるため、育種への応用を考えた場合に、現状のマーカーでは特定個体を母材に用いた場合にのみ有効でしかない可能性が高い。このような状況を打開するために、有用形質の判定が可能で、かつヘテロ性にとらわれない普遍的な利用が可能な育種マーカーの獲得が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物において、育種目標となる形質の発現に関わる遺伝子あるいは遺伝子群に由来するＤＮＡ断片を単離することを目的とする。また、本発明は、該ＤＮＡ断片を解析することによって得られるプロモーター配列の利用、更には該ＤＮＡ断片を育種における選抜指標として活用する育種方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、（１）植物を材料とし、ゲノム比較によって得られる多型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を得ることを特徴とする植物におけるＤＮＡ断片の獲得方法、（２）（１）記載の方法により得られるすべてのＤＮＡ断片、（３）（２）記載のＤＮＡ断片をコードする遺伝子、（４）（３）記載の遺伝子の少なくとも一部を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡ、（５）（４）記載のＤＮＡを含む発現ベクター、（６）（５）記載の発現ベクターを保持する細胞に由来するか、これを含む形質転換植物、（７）（２）記載のＤＮＡ断片を指標とすることを特徴とする植物の育種方法からなる。
【０００６】
本発明者らは、育種目標となる形質の発現に関わる遺伝子あるいは遺伝子群の存在を見出す方法を検討した。多くの植物種においては、人為的な選抜が行われた作物品種と異なり、個体間の遺伝子型にばらつきが見られるため（高いヘテロ性）、形質発現に顕著な差が認められることが多い。すなわち、形質発現の差が大きい個体間のゲノム比較を行うことにより、ゲノム上の差異を拾い上げることが可能であると構想した。
ゲノム比較についての具体的な手段としては、近年複数の方法が開示されており、リシチン（Lisitsyn）らにより示されたゲノム比較法であるレプリゼンテーション  ディファレンス  アナリシス（representation difference analysis）を用いた。この方法により、ゲノム間差異に由来すると考えられるＤＮＡ断片が多く検出される。これらのＤＮＡ断片は、両ゲノム間で認められる多型部位を直接反映した結果として得られるが、多くのＤＮＡ断片は特定の遺伝子をコードしていない非コード領域に由来すると考えられる。これらを１つ１つ解析することは困難であることから排除する方法を構想した。そうすることによって、コード領域に由来するＤＮＡ断片のみを獲得することができる。
本発明者らは解析の対象となる個体から全RNAを抽出し、これを鋳型に用いて相補的なＤＮＡ（cＤＮＡ）を作製し、この際に化学標識物質を作用させてcＤＮＡの化学標識を行った。先に述べたゲノム間差異に由来するＤＮＡ断片をアクリルアミドゲル電気泳動にて分画した後、ナイロンメンブランに転写、固定後、常法に従ってハイブリダイゼーションを行い、ポジティブなＤＮＡ断片をいくつか検出した。また、これらの断片をプローブに用いて常法に従いゲノムに対してハイブリダイゼーションを行い、ゲノム間差異を反映した多型が検出されることにより、本発明を完成した。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
以下に、本発明の実施の形態として、本発明におけるゲノム比較法、及び本発明のＤＮＡ断片の利用法を詳細に説明する。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等の遺伝子組換えに必要な一般的な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や実験書〔例えば、１９８２年、コールド  スプリング  ハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Maniatis）ほか著、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（ Molecular Cloning,A Laboratory Manual）参照〕に記載されている方法に従った。
【０００８】
＜１＞ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得
本発明におけるゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得方法、並びに該方法により得られるＤＮＡ断片は、第１に、植物組織、例えばアカシアの植物組織由来のゲノムＤＮＡをゲノム比較法によってＤＮＡ断片として収集・選抜することを特徴とする。
ゲノム比較法については、イン  ゲル  コムペティティブ  リアソシエーション（in gel competitive reassociation）(IGCR)法〔ヨコタ  H、（Yokota H.）ほか、１９９０〕、リストリクション  ランドマーク  ゲノム  スキャニング（restriction landmark genome scanning）(RLGS)法〔ハタダ  Ｉ、（Hatada I.）ほか１９９１〕、既述のレプリゼンテーション  ディファレンス  アナリシス(RDA)法（リシチン  Ｎ．、１９９３）が挙示される。RDA法については、宝酒造社から解析用キットが販売されている。上記のどの方法を用いても、任意の植物ゲノムを材料として多型検出が可能である。
更に、本発明のゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得方法並びにＤＮＡ断片は、最終的に、上記で得られるＤＮＡ多型断片に対し、ゲノム比較の材料として用いた個体よりＲＮＡを抽出し、ファルマシア・アマシャム社製の逆転写酵素を用いてcＤＮＡを合成する際に、例えばロッシュ・ダイアグノスティクス社製の標識物質であるジゴキシニゲン-dＵＴＰ（ＤＩＧ）を混合して作製されたＤＩＧ標識cＤＮＡをプローブに用いて、常法によりハイブリダイゼーションを行い、ポジティブなバンドを選択することを特徴とする。
上記の工程によって得られたＤＮＡ断片は、ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片である。上記方法により、比較対象となる植物間においてゲノム上の差異に由来し、かつ何らかの遺伝子発現を伴う領域、すなわち、比較対象とした個体間の形質差異の要因となっている遺伝子の一部を取得することができる。
【０００９】
本発明により、対象となる形質発現を司る遺伝子の存在、あるいは発現の有無を判定するための指標（ＤＮＡマーカー）を単離する方法が確立され、これらの指標は具体的には育種における選抜マーカーとして活用することが可能である。
本発明により得られたＤＮＡ断片の具体的な提示は後述の実施例の項で詳細に説明する。
【００１０】
＜２＞本発明のＤＮＡ断片に由来するプロモーター領域の単離、及び解析
本発明によって得られるＤＮＡ断片は、対象となる形質発現を司る重要な遺伝子の一部に由来することから、得られたＤＮＡ断片を解析することによって、容易にプロモーター領域を獲得することが可能である。
【００１１】
＜３＞本発明のＤＮＡ断片に由来するプロモーター領域を導入した形質転換植物の作製
上記で示したプロモーター領域の少なくとも一部を含む領域の下流に、植物細胞で発現させることを所望する任意の遺伝子のコード領域部分を順方向に転写されるように結合し、形質転換ベクターに組込んで組換えＤＮＡを作製する。この際、形質転換に利用可能なベクターは植物の形質転換法に応じて異なる。例えば、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）等により植物細胞を形質転換する際には、例えばブルースクリプト（Bluescript）（ストラータジーン社製）等の大腸菌で利用可能なプラスミドベクターが形質転換ベクターとして使用できる。また、リーフディスク法、インフィルトレーション法等のアグロバクテリウム感染法によって植物体や植物細胞を形質転換する際には、例えばＴｉプラスミド由来のpＢＩ121（クローンテック社製）等のバイナリーベクターが利用可能である。
植物細胞の形質転換は、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム感染法によって植物細胞あるいは植物体に組換えＤＮＡを導入することによって可能である。なお、植物細胞に導入した組換えＤＮＡは植物のゲノムＤＮＡに組込まれることが望ましい。
形質転換植物体、あるいは形質転換植物細胞は、形質転換に用いる組換えＤＮＡ中にカナマイシンやハイグロマイシン等に対する薬剤耐性遺伝子を組込んでおくことによって、これらの薬剤を含む寒天固定培地上あるいは液体培地中で栽培あるいは培養することにより安定的に維持することが可能である。
本発明のＤＮＡ断片に由来するプロモーター領域は、シロイヌナズナやタバコのような双子葉植物、イネやトウモロコシのような単子葉植物、ポプラ、ユーカリ、アカシア等の木本性植物の植物体及び植物細胞に導入可能である。
本発明におけるプロモーター活性を有するＤＮＡの制御下にある遺伝子としては、あらゆる外来遺伝子が考えられる。特にレポーター遺伝子を結合した組換えＤＮＡを導入した植物体では、育種の対象となる形質を向上させるための薬剤のスクリーニングに用いるなどの利用方法があり、これらの産業の発展にも貢献することが可能である。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００１３】
実施例１  ゲノム比較並びにＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片の獲得
「材料と方法」
ゲノム比較法として、ＲＤＡ法を用いた。材料にはアカシア属のアウリカリフォルミス種の兄弟個体群より、成長差の著しい２個体を用いた。これらは同時期に播種し、同一の環境下で栽培を行い２年を経過した段階では樹高で約５０センチの差が認められた。根本径についても約２センチの差が認められた。各々の葉から常法により調製したゲノムＤＮＡを用いてリシチンらの方法に従い、ゲノムサブトラクションを行った。
【００１４】
上記の２個体より、全ＲＮＡを抽出した。抽出方法は日尾野らの方法（特開平８−８０１９１号）に従った。当該抽出方法の発明は、木本性植物組織をバナジルリボヌクレオシド化合物及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを含有する緩衝液中で処理することを特徴とする木本性植物からの核酸抽出方法に関する。
得られたＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド〔配列表の配列番号１（5'-GGGAGGCCCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）〕を基にファルマシア社製のcＤＮＡ合成キットを用いて一本鎖cＤＮＡを作製した。得られた一本鎖cＤＮＡの5'末端側に宝酒造社製のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びデオキシグアニンを用いて十数個のグアニン鎖を連結した。
次いで２種のオリゴヌクレオチド〔配列表の配列番号１、及び配列表の配列番号２（5'-AAGGAATTCCCCCCCCCCCCCC-3'）〕をプライマーに用いたＰＣＲ法によってcＤＮＡ断片の増幅を行った。この際の増幅反応溶液中に、ロッシュ・ダイアグノスティクス社製の標識物質であるジゴキシニゲン-dＵＴＰ（ＤＩＧ）を混合することにより、増幅ＤＮＡを化学標識し、cＤＮＡ由来の発現プローブとした。
リシチンらの方法により得られたサブトラクション後のＤＮＡ断片を、アクリルアミドゲル電気泳動法により分画後、日本エイドー社製の核酸転写装置を用いて、ロッシュ・ダイアグノスティクス社製のナイロン膜に転写し、サブトラクションフィルターとした。上記の発現プローブを用いて、これらのフィルターのハイブリダイゼーションを常法に従い行った。
ポジティブなＤＮＡ断片をインビトロゲン社製のTAクローニングキットを用いてサブクローニングし、ダイデオキシ法により塩基配列を決定した。
【００１５】
「結果」
サブトラクションが十分に作用した場合、材料に同一のゲノムを用いたときは、理論的にはＤＮＡ断片が残存しないことになる。しかしながら、実際の条件下では多くのＤＮＡ断片が認められることが判明した。これはゲノム上における細かな差異に因るものと考えられ、ヘテロ性を有する生物を材料に用いた場合にはこれらをいかにして排除するかが必要である。これに対応する手段として、本発明者らは同一個体間におけるサブトラクションを行うことによって、内在性のヘテロ変異の検出を試みた。すなわちこれを対照実験として用いることにより、目的とする個体間のサブトラクション結果に対比させることで本来の個体間におけるゲノム比較を正確に判断できるように工夫した。これは発現プローブを用いたハイブリダイゼーションにおいても反映できるためヘテロ性の高い材料を用いる場合の必須条件と言える。
【００１６】
実験対象とした２個体について、相互にサブトラクションを行い最終的に６つのＤＮＡ断片を獲得した（図１参照）。
なお、図１は、アカシアにおけるゲノムサブトラクション（上段）及び発現プローブによるハイブリダイゼーション（下段）の結果を示す図である。
図１は個体番号２（成長の良いアカシア個体）をサブトラクションされる側（testerと示した）とし、個体番号４（成長のよくないアカシア個体）をサブトラクションする側（driverと示した）に用いた場合の結果である。サブトラクションは原法に従い３回連続して行っており、制限酵素は３種類（BamHI, EcoRI, HindIII）を用いた。  tester及びdriver双方とも個体番号２となっているものは、比較のための対照実験として行った同一個体間によるサブトラクションを示す。図１中の丸印は、サブトラクションにより選抜されてきたＤＮＡ断片の中で、更に発現プローブと相補的であると判断されるものを示す。
【００１７】
得られたＤＮＡ断片を実験に用いた２種のアカシアのゲノムに対してサザン分析を行い、多型が認められることを確認した。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、植物よりゲノム比較によって得られる多型ＤＮＡ断片を収集した後、これをＲＮＡ由来の標識プローブを用いて選抜されたＤＮＡ断片を得るための方法が確立された。これによって、個体に特異的な形質発現の有無を判定でき、かつゲノム上のヘテロ性にとらわれない普遍的な育種マーカーの獲得が可能となった。更には、本方法により得られるＤＮＡ断片がコードする遺伝子、あるいはプロモーター領域を利用することによって人為的な発現調節も可能である。
【００１９】
【配列表】
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【００２０】
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【００２１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アカシアにおけるゲノムサブトラクション（上段）及び発現プローブによるハイブリダイゼーション（下段）の結果を示す図である。
【図１】
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