(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子のポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において第５１７位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）および／または第６０８位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）にそれぞれ塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１の第５１７位置換塩基ｔおよび／または第６０８位置換塩基ｔを含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、該塩基置換部位を検出することができるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、または請求項１のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号１の第５１７位置換塩基ｔおよび／または第６０８位置換塩基ｔを含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなり、該塩基置換部位を検出することができるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項４】
請求項１のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第１７３位のＡｒｇ（アルギニン）がＣｙｓ（システイン）および／または第２０３位のＰｒｏ（プロリン）がＬｅｕ（ロイシン）にそれぞれアミノ酸置換されているポリペプチド。
【請求項５】
請求項４のポリペプチドの一部であって、配列番号２の第１７３位置換アミノ酸Ｃｙｓおよび／または第２０３位置換アミノ酸Ｌｅｕを含む５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項６】
請求項２のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブ。
【請求項７】
請求項２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子診断の技術分野に属し、特に、ヒドロキシ酪酸尿症の病因遺伝子となるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする異常遺伝子とそれを利用する４−ヒドロキシ酪酸尿症の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
４−ヒドロキシ酪酸尿症（以下、４−ＨＢＡ尿症と略記することがある）は、ＧＡＢＡ（γ−aminobutyric acid：ガンマ−アミノ酪酸）代謝経路の異常症であり、その臨床症状は軽微な神経症状から進行性の神経変性症状まで様々である。原因はＧＡＢＡの代謝産物であるコハク酸セミアルデヒド（succinic semialdehyde）がコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（succinic semialdehyde dehydrogenase : SSADH）の異常に因りコハク酸に代謝されず、４−ヒドロキシ酪酸（４−ＨＢＡ）が過剰に産生され神経障害を来すためとされているが、その詳細は不明である。４−ＨＢＡ尿症の報告は欧米では多く、いくつかのＳＳＡＤＨ遺伝子異常がすでに知られている。これに比べ、日本での報告は極めて少ない。特に、ＳＳＡＤＨ遺伝子のゲノム構造と４−ＨＢＡ尿症との関係は明らかにされていなかった。４−ＨＢＡ尿症は比較的まれな疾患であるが、早期診断と治療により症状の進行防止を期待できるため、遺伝子レベルでの早期診断法の開発が望まれている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このたび、４−ＨＢＡ尿症の病因となる新たなＳＳＡＤＨ遺伝子の変異を見出した。すなわち、後にも詳述するように、４−ＨＢＡ尿症と確定診断された患者とその両親の遺伝子を用い、ＳＳＡＤＨ遺伝子を検索した結果、ＳＳＡＤＨ遺伝子のｃＤＮＡにおいて第５１７位がシトシンではなくチミンに、また、第６０８位がシトシンではなくチミンに変異していることを突き止め、これが両親由来であること、比較した健常者２００人の遺伝子ではこれらの変異はなく、これらの変異が４−ＨＢＡの病因であることを確認した。
【０００４】
本発明は、このような知見を基礎に導かれたものであり、この出願は、前述の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１５）の発明を提供する。
（１）  コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子のポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において第５１７位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）および／または第６０８位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）にそれぞれ塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列。
（２）  前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１の第５１７位置換塩基ｔおよび／または第６０８位置換塩基ｔを含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
（３）  前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
（４）  前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、または前記発明（３）のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号１の第５１７位置換塩基ｔおよび／または第６０８位置換塩基ｔを含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（５）  前記発明（１）または（３）のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第１７３位のＡｒｇ（アルギニン）がＣｙｓ（システイン）および／または第２０３位のＰｒｏ（プロリン）がＬｅｕ（ロイシン）にそれぞれアミノ酸置換されているポリペプチド。
（６）  前記発明（５）のポリペプチドの一部であって、配列番号２の第１７３位置換アミノ酸Ｃｙｓおよび／または第２０３位置換アミノ酸Ｌｅｕを含む５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
（７）  前記発明（６）のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
（８）  ４−ヒドロキシ酪酸尿症の診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に前記発明（３）のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（９）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する前記発明（８）の方法。
（１０）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する前記発明（８）の方法。
（１１）  ４−ヒドロキシ酪酸尿症の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明（５）のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（１２）  被験者から単離した生体試料中に、前記発明（７）の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する前記発明（１１）の方法。
（１３）  前記発明（２）のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブ。
（１４）  前記発明（２）のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
（１５）  前記発明（７）の抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体。
【０００５】
以下、これらの各発明の実施形態について詳しく説明する。なお、本明細書においては、１０１個以上のヌクレオチドの連続配列をポリヌクレオチド、２〜１００個の連続ヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドと定義する。また、３１個以上のアミノ酸連続配列をポリペプチド、２〜３０個の連続アミノ酸配列をオリゴペプチドと定義する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明（１）は、ＳＳＡＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の変異ＤＮＡ配列であり、配列番号１のＤＮＡ配列において第５１７位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）および／または第６０８位のｃ（シトシン）がｔ（チミン）にそれぞれ塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列である。
なお、配列番号１で示されるＳＳＡＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列は、GenBankにAccessin No. Y 11192として登録されている。既述したように、本発明に係る異常遺伝子は、この正常（野生型）ＳＳＡＤＨ遺伝子のｃＤＮＡの５１７位および／または第６０８位が点変異したミスセンス変異（missense mutation）に因るものである。
【０００７】
発明（１）のポリヌクレオチドは、例えば、後記の発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、４−ＨＢＡ尿症患者の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができ得る。また後記の発明（４）のプライマーセットを用い、４−ＨＢＡ尿症患者のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲによって単離することもできる。あるいは、野生型（正常）ＳＳＡＤＨ遺伝子のｃＤＮＡに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。
【０００８】
この出願の発明（２）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、各々の置換塩基を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列である。
発明（２）のオリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成して作製することができる。また、発明（１）のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
発明（２）のポリヌクレオチドは、後記の発明（８）の４−ＨＢＡ尿症の診断方法等に使用することができる。
【０００９】
この出願の発明（３）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）である。ここで、ストリンジェント（stringent）な条件とは、それらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。よく知られているように、ストリンジェント条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシー（stringency）は高くなり、ハイブリダイズしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい例として、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。１つの好ましい例として、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。ストリンジェントな条件については、例えば、J. Sambrookらによる「Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、特に１１．４５節“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”」に詳述されており、それらの記載を参照することによって容易に適切な条件を使用することができる。
発明（３）のポリヌクレオチドは、例えば、発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、上述したようなストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、４−ＨＢＡ尿症患者の染色体ＤＮＡから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
これらの発明（３）のポリヌクレオチドは、後記の発明（８）の４−ＨＢＡ尿症の診断方法において検出対象等となるものである。
【００１０】
この出願の発明（４）は、前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）、または前記発明（３）のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１の置換塩基を含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の置換塩基の５’側または３’側の任意の連続ＤＮＡ配列またはその相補配列とすることができる。
これらのプライマーセットは、それぞれの置換塩基を含む配列番号１に基づいて公知のＤＮＡ合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。
発明（４）のプライマーセットは、後記の発明（８）の４−ＨＢＡ尿症の診断方法等に使用することができる。
【００１１】
この出願の発明（５）は、発明（１）または（３）のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第１７３位のＡｒｇ（アルギニン）がＣｙｓ（システイン）および／または第２０３位のＰｒｏ（プロリン）がＬｅｕ（ロイシン）にそれぞれアミノ酸置換されているポリペプチドである。
すなわち、既述したように、発明（１）のポリヌクレオチドにおける塩基置換は、ミスセンス変異であり、１または２個の塩基置換によって正常（野生型）ポリペプチドのアミノ酸が上記のように変異している。
これらのポリペプチドは、４−ＨＢＡ尿症患者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの置換アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは発明（１）のポリヌクレオチド（変異ｃＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。これらの発明（５）ポリペプチドは、例えば、後記の発明（１１）の４−ＨＢＡ尿症の診断方法の検査対象とすることができる。
【００１２】
この出願の発明（６）は、前記の発明（５）のポリペプチドの一部であって、置換アミノ酸を含む５〜３０の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらのオリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは発明（５）のポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、後記の発明（７）の抗体作製のための抗原として使用することができる。
【００１３】
発明（７）の抗体は、前記の発明（６）のオリゴポリペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。これらの抗体は公知の抗体作製法により作製することができる。また、この抗体は、発明（５）のポリペプチドを特異的に認識することができ、後記の発明（１１）の４−ＨＢＡ尿症の診断方法等に使用することができる。
【００１４】
この出願の発明（８）は、被験者が４−ＨＢＡ尿症を発症する可能性があるか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、発明（３）のポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者を４−ＨＢＡ尿症に関してハイリスクと判定する。ポリヌクレオチドの検出は公知の様々な方法によって行うことができるが、発明（９）または（１０）の方法が好ましい。
【００１５】
発明（９）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは発明（２）のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が４−ＨＢＡ尿症に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡとポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、例えば、発明（１３）のＤＮＡプローブや、発明（１４）のＤＮＡチップを用いて、例えば、ＡＳＯ（allele specific oligomer）法によるハイブリダイゼーションを行うことにより、簡便かつ高精度で行うことができる。
【００１６】
また発明（１０）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記の発明（４）のプライマーセットを用いて、公知の方法に従いＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者が４−ＨＢＡ尿症に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲ産物の分析も公知の方法に従って実施することができる。
【００１７】
この出願の発明（１１）も、被験者が４−ＨＢＡ尿症を発症する可能性があるか否かを診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、発明（５）のポリペプチドが存在する場合に、その被験者を４−ＨＢＡ尿症に関してハイリスクと判定する。ポリペプチドの存在は様々な公知方法によって行うことができるが、発明（１２）の方法が好ましい。発明（１２）の方法は、発明（７）抗体を用いる方法であって、特に発明（１５）の標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、アイソトープ、蛍光色素等の公知の各種のものを使用することができる。
【００１８】
以下に、本発明の基礎となった遺伝子変異を確認した研究内容について説明する。研究は、重症臨床症状を呈する日本人４−ＨＢＡ尿症の兄弟例においてＳＳＡＤＨ遺伝子の異常を同定して、ＳＳＡＤＨ遺伝子のゲノム構造を明らかにする目的で行った。
方法
患者、その両親および健常対照者Ｂリンパ球より樹立したリンパ芽球と、末梢血より調製したＤＮＡを材料とした。リンパ芽球細胞のＳＳＡＤＨ酵素活性を対照細胞のそれと比較した。患者および両親のＳＳＡＤＨ遺伝子の全エクソンと隣接イントロンをGenBankの情報に基づき、ＰＣＲで増幅し、直接シークエンスを行った。変異と思われる塩基置換は変性ＨＰＬＣ（denaturing high performance liquid chromatography）を用いて健常対照者１００名のアレルで頻度を行った。変異解析はインフォームドコンセントを得て行われ、倫理委員会で承認された。
【００１９】
症例
症例１は症例２の兄で診断時２才1ヶ月の男児で、妊娠分娩歴に異常がなく、非血縁の両親の間に生まれた。１生月より全身強直性けいれんが出現し、以後部分運動発作が頻発し種々の治療に抵抗した。著明な精神運動発達遅滞を伴い、３才時の現在寝たきりの状態である。頭部ＭＲＩで重度な脳萎縮を呈する。症例２は診断時２生月の男児。１生月より眼球のミオクロニーが出現し、２生月から全身性強直性けいれんが認められるようになった。１才1ヶ月の現在、未頚座で寝たきりの状態である。ウレアーゼ処理・ＧＣ／ＭＳ分析法により患者の尿中で４−ＨＢＡが著増しており、４−ＨＢＡ尿症と化学診断した。両者ともビバガトリンによる治療を開始している。
【００２０】
成績
患者兄弟のリンパ芽球のＳＳＡＤＨ酵素活性は正常に比べ明らかに低下しており、化学診断を支持した。父のＳＳＡＤＨ酵素活性は軽度の低下が見られたものの、母のそれは比較的高い活性が認められた。兄弟のＳＳＡＤＨ遺伝子のエクソン３に、５１７位におけるシトシンがチミンに、６０８位におけるシトシンがチミンにそれぞれ変異している二つの変異を見出した。前者は１７３番目のアミノ酸Ａｒｇ（アルギニン）のコドンの１番目に位置しＣｙｓ（システイン）へのアミノ酸変異を、また、後者は２０３番目のアミノ酸Ｐｒｏ（プロリン）のコドンの２番目に位置しＬｅｕ（ロイシン）へのアミノ酸変異をもたらすミスセンス変異であった。家族および患者のゲノム解析を行ったところ、父親は５１７位のｃ→ｔ塩基変異（１７３位のＡｒｇ→Ｃｙｓアミノ酸変異）を、母親は６０８位のｃ→ｔ塩基変異（２０３位のＰｒｏ→Ｌｅｕアミノ酸変異）をヘテロ接合体として有しており、患児は両者の変異の複合へテロ接合体であると判断した。この二つの変異は健常対照者２００アレルに見出されなかった。
【００２１】
結論
兄弟はＳＳＡＤＨ遺伝子に父親由来の５１７位のｃ→ｔ塩基変異（１７３位のＡｒｇ→Ｃｙｓアミノ酸変異）と、母親由来の６０８位のｃ→ｔ塩基変異（２０３位のＰｒｏ→Ｌｅｕアミノ酸変異）を複合へテロ接合体として有していた。変異が生ずる１７３位Ａｒｇと２０３位Ｐｒｏはともに、原核細胞のアルデヒド脱水素酵素から進化を越えて高度に保存されている領域に位置していた。さらに、両変異は健常対照者の２００アレルに見出されなかったことから、これらの変異を４−ＨＢＡ尿症をもたらす新規のＳＳＡＤＨ病因遺伝子異常と判断した。同時に他の２つのミスセンス変異を見出したが、そのアミノ酸の保存性、健常対照者のアレルの頻度より正常多形と判断した。病因遺伝子異常と判断される変異をヘテロ接合体として有する母親のインビトロでのＳＳＡＤＨ酵素活性が高いことより、両変異が相乗作用を有して重症な４−ＨＢＡ尿症の発症にいたる可能性が示された。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、４−ＨＢＡ尿症の病因遺伝子となる新規なＳＳＡＤＨ変異遺伝子と、それを利用する４−ＨＢＡ尿症の診断方法を提供するものであり、遺伝子レベルでの４−ＨＢＡ尿症の早期診断と治療の発展に資することができる。
【００２３】
【配列表】
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