(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒するに際して合成ＤＮＡがより長く伸長するようにアミノ酸配列を人為的に改変したPfuＤＮＡ合成酵素であって、野生型PfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列における第２位IleをValに、第７１７位LeuをProにそれぞれ置換した、配列番号２のアミノ酸配列からなる改変型PfuＤＮＡ合成酵素。
【請求項２】
さらに、第７１０位ProをArgに、第７１２位SerをArgに、第７１３位LeuをProにそれぞれ置換した、配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１の改変型PfuＤＮＡ合成酵素。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３のＤＮＡを含む組換え体ベクター。
【請求項６】
請求項４のＤＮＡを含む組換え体ベクター。
【請求項７】
大腸菌HMS174(DE3)/pDP5C4（FERM BP-6190）が保有する組換え体プラスミドpDP5C4である請求項５の組換え体ベクター。
【請求項８】
大腸菌HMS174(DE3)/pDP5b17（FERM BP-6189）が保有する組換え体プラスミドpDP5b17である請求項６の組換え体ベクター。
【請求項９】
請求項３または４に記載のＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に生産された目的酵素を単離・精製することを特徴とする改変型PfuＤＮＡ合成酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡ鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等に用いる新規なＤＮＡ合成酵素と、この酵素をコードするＤＮＡ配列、並びにこのＤＮＡ合成酵素の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ polymerase）は１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒する酵素の総称である。ＤＮＡの塩基配列決定や試験管内でのＤＮＡ増幅などには必須の酵素であるが、特にＰＣＲ(Polymerase chain reaction) においては、その一連の反応サイクルを自動化する上で「耐熱性ＤＮＡ合成酵素」は不可欠である。
【０００３】
このような耐熱性ＤＮＡ合成酵素としては、Ｔaq、Ｐfu、ＫOD等が知られており、それぞれの特性に応じて使い分けられている。特に、ＰfuＤＮＡ合成酵素はＤＮＡ鎖合成時における読み違いが極めて少ない（忠実性が高い）酵素として知られている。
しかしながら、このＰfuＤＮＡ合成酵素は、合成量が少なく、また合成鎖に対する伸長活性が不十分であるために、ゲノムＤＮＡ等の高分子ＤＮＡを増幅するには不適当であった。
【０００４】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等により合成、増幅するに際して、ＰfuＤＮＡ合成酵素の特徴である高忠実性を維持しつつ、鋳型ＤＮＡ鎖をより長く効率的に増幅することのできる新規な耐熱性ＤＮＡ合成酵素を提供することを目的としている。
またこの発明は、このＤＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の発現産物として上記ＤＮＡ合成酵素を製造する方法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒するに際して合成ＤＮＡ鎖がより長く伸長するようにＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を人為的に改変したことを特徴とするＤＮＡ合成酵素を提供する。
【０００６】
このＤＮＡ合成酵素は、具体的には、配列番号１または２のアミノ酸配列からなる酵素である。
またこの発明は、配列番号１または２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と、これらのＤＮＡ配列を含む組換え体ベクターを提供する。このようなベクターとしては、大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)/pＤＰ5b17 (FERM BP-6189) が保有する組換え体プラスミドｐＤＰ5b17（配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を保有するベクター）、および大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)/pＤＰ5C4 (FERM BP-6190)が保有する組換え体プラスミドｐＤＰ5C4 （配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を保有するベクター）をも提供する。
【０００７】
さらにまた、この発明は、上記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製することを特徴とするＤＮＡ合成酵素の製造方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明のＤＮＡ合成酵素は、具体的には、ピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＰfuＤＮＡ合成酵素を公知の変異遺伝子作成法 (Strategies, vol 9, p3-4,1996) によって遺伝子工学的に改変した酵素である（以下、この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を「改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素」と記載することがある）。この酵素の作成は以下のとおりに行なった。すなわち、ＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子は塩基配列が公知（Nucleic Acids Research, vol.21, p259-265, 1993) であるため、その両端に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、上記細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によりＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子を調製した。この遺伝子ＤＮＡ断片をベクターにクローニングし、上記文献に記載の方法により変異させた。遺伝子の変異は、ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列の一部がＫODＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列に置き変わるように塩基を置換させた。ＰfuＤＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵素は、アミノ酸配列が約８０％相同であり、ＰＣＲの際に同様の合成停止を生じさせるが（図１）、ＫODＤＮＡ合成酵素の伸長速度はＰfuＤＮＡ合成酵素の約６倍である。そこで、ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸残基をＫODＤＮＡ合成酵素のアミノ酸残基に置換することによって、伸長速度が速く、従って合成ＤＮＡ鎖をより長く伸長させることのできる酵素が得られる可能性があるからである。そして、このようにして変異させた遺伝子を大腸菌で発現させ、その発現産物を回収し、精製することによってこの発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を得た。
【０００９】
実際には、この発明の発明者等は、上記の方法により数多くの改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を作成し、それぞれについてＤＮＡ合成実験をおこない、伸長したＤＮＡ鎖を電気泳動的に解析することによって、従来酵素に比べて合成量を高め、合成鎖の伸長を促進させることのできるＤＮＡ合成酵素を得、この発明を完成させた。
【００１０】
この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素（改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素）は、具体的には、配列番号１または２のアミノ酸配列を有する酵素である（以下、これらを改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I およびIIと記載することがある）。これらのアミノ酸配列は、従来公知のＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列のうち、表１に示すアミノ酸残基がそれぞれ置換された新規な配列である。そして、これらの新規酵素を用いてＰＣＲ等のＤＮＡ合成を行なった場合には、下記の実施例に示すように、大量かつ高分子の合成産物を得ることが可能となる。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
これらの改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡ配列としては、上記の酵素作成過程で得られたＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の変異遺伝子を例示することができる。これらの変異遺伝子は、例えば配列番号１または２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列については、それぞれ組換え体プラスミドｐＤＰ5b17およびｐＤＰ5C4 にクローニングされており、これらの組換え体プラスミドは大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)に導入され、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている (各々、寄託番号FERM BP-6189およびFERM BP-6190) 。
【００１３】
また、この発明のＤＮＡ配列は、例えば配列番号１または２の各アミノ酸残基に対応する塩基コドンをつなぎ合わせたＤＮＡ配列として適宜にデザインすることもできる。
この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素は、大腸菌などの微生物で発現させて得ることができる。例えば、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、上記ＤＮＡ配列を挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ＤＮＡ配列にコードされている酵素を微生物内で大量生産することができる。
【００１４】
以下、実施例を示し、この発明のＤＮＡ合成酵素についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
実施例１：ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子のクローニング
ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の塩基配列（Nucleic Acids Research, vol.21, p259-265, 1993) に従ってＰＣＲプライマーを合成し、ピロコッカスフリオサス (P. furiosus)のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって目的遺伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターにクローニングした。クローニング方法の詳細は以下のとおりである。
【００１６】
P.furiosus DSM3638を上記文献に記載された方法で培養した。先ず、文献記載の培地を調製し、高温加圧滅菌ののち、蜜素ガスを吹き込み、植菌して95℃で15時間静置培養した。200mlの培養掖から遠心分離により約0.5mgの菌体を得た。集菌体を緩衝液Ａ（10mMトリス−ＨＣＬ，pH8.0, 1mMＥＤＴＡ, 100mM ＮaCl ）に懸濁し、10% ＳＤＳを１ml加え、撹拌の後、プロテイナーゼＫを0.5mg 加えて55℃で60分反応させた。反応液を順次フェノ一ル抽出、フェノ一ル／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出し、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化し、回収した。得られたＤＮＡを１mlのＴＥバッファー（10mMトリス−ＨＣｌ，pH8.0，１mMＥＤＴＡ）に溶解し、0.5mgのＲＮase Ａを加えて37℃で60分反応させたのち、再度フェノール抽出、フェノ一ル／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出し、エタノ一ル沈殿でＤＮＡを回収してＴＥバッファ−に溶解させ、約0.3mgのＤＮＡを得た。
【００１７】
次いで、目的のＤＮＡ合成酵素遺伝子をＰＣＲ増幅するために、既知の配列データをもとに配列番号３および４に示す２種のプライマ−ＤＮＡを合成した。すなわち、フォアードプライマー配列中には目的遺伝子の開始コドンＡＴＧおよび制限酵素ＮcoＩ配列(5'-CCATGG-3')を導入し、リバースプライマーは終止コドンの下流の適当な位置に結合するように設計した。ＰＣＲは、P.furiosusＤＮＡ２μgとプライマー各10pmolを用い、ＬＡＴaq（宝酒造）と添付のバッファー条件で、50μlの反応系で行った。サイクル条件は、酵素を加える前に93℃／３分を行い、94℃／0.5 分、55℃／0.5 分、72℃／1.0 分を３０サイクルした。増幅したＤＮＡ断片を精製し、ＮcoＩで処理した後、同じくＮcoＩで切断後に平滑末端化し、さらにＮcoＩ処理した発現ベクターｐＥＴ15−ｂのＴ７プロモーター下流に組み込んだ。この発現ベクターをｐＤＰＷＴ100とし、挿入遣伝子の塩基配列を確認した。
実施例２：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I 遺伝子の作成
クローン化したＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターｐＤＰＷＴ100に対して、期待する変異を含んだオリゴヌクレオチド（配列番号５および６）とプロメガ社の突然変異導入キットを用い、公知の方法 (Strategies, vol 9, p3-4,1996) に従って改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I の遺伝子を、発現ベクターｐＤＰＷＴ100上で作成し、発現ベクターｐＤＰ5b17を構築した。なお、この改変型遺伝子の塩基配列を決定することにより、改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I のアミノ酸配列（配列番号１）を確認した。
実施例３：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素II遺伝子の作成
配列番号７および８のオリゴヌクレオチドを用いたことを除き、実施例２と同一の方法により、改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素IIの遺伝子を作成し、発現ベクターｐＤＰ5C4 を構築した。この改変型遺伝子の塩基配列を決定することにより、改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素IIのアミノ酸配列（配列番号２）を確認した。
実施例４：改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素I の大腸菌での発現と精製
実施例２で作成した改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素I の遺伝子を次のとおりに大腸菌で発現させ、精製した。
【００１８】
改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素I 遺伝子をもつ発現ベクターｐＤＰ5b17を大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ３）株に導入し、終濃度0.1mMのＩＰＴＧを含んだＬＢ培地で14時間培養し、酵素を大腸菌体内に発現誘導した。遠心して菌体を集めた後、150mM Ｔris/ＨＣl(pH7.5)、2mM ＥＤＴＡ、0.24mM ＡＰＭＳＦおよび0.2%のＴween20を含む緩衝液で超音波処理を行いながら、改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素I を抽出した。この粗抽出液を80℃、15分の熱処理を行うことで大腸菌由来のＤＮＡ合成酵素を失活させると共に、改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素I の部分精製を行なった。部分精製画分は50mMＴris/ＨＣl(pH7.5)、１mMＥＤＴＡ、0.2%Ｔween20、7mM 2-mercaptoethanol および10% glycerolの緩衝液に対し透析した。この段階で改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I に特異的なＤＮＡ合成活性を検出した。
実施例５：改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素IIの大腸菌での発現と精製
実施例３で構築した発現ベクターｐＤＰ5C4 を用い、実施例４と同様の方法により改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素IIを抽出し、部分精製した。
実施例６：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I およびIIによるプライマー伸長反応
実施例４および５でそれぞれ部分精製した改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I およびIIを用い、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖のプライマー伸長反応を試験した。
【００１９】
20mMＴris/ＨＣl(pH8.0)、２mM ＭgＣl2、50μg/mlＢＳＡ、0.1%Ｔriton Ｘ-100、１mMの各cold dNTPs(0.1mM for dCTP)、[α-32P] dCTPの10μCiとＭ13(-21)のプライマーをアニールさせた0.63μgのpBLUESCRIPT プラスミドを含む反応液20μlに、上記の部分精製酵素画分１μgを入れ、75℃で１分および３分間反応させた。伸長したＤＮＡ鎖を８M ureaを含んだポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、イメージアナライザ−によりそのパターンを解析した。また対照として、従来の野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いて同様のＤＮＡ合成を行なった。
【００２０】
結果は図２に示したとおりである。従来の野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いた場合には、約1000ベースに大きな合成停止領域が存在し、このことによる不完全なＤＮＡ鎖の存在を示すバンドが観察された。一方、この発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素I およびIIによるＤＮＡ合成では、約1000ベースのバンドも含めて合成量が増大し、しかもより高分子の（すなわち、より伸長した）ＰＣＲ産物の存在を示すバンドも観察された。
【００２１】
以上の結果から、この発明のＤＮＡ合成酵素は、ＰＣＲ法によるＤＮＡ合成において、合成ＤＮＡ鎖のより長い伸長が可能であることが確認された。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、高分子ＤＮＡをＰＣＲ等によって増幅する場合であっても、その全長を効率よく合成、増幅することのできる新規な耐熱性ＤＮＡ合成酵素が提供される。これによって、ＤＮＡ鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等を簡便かつ高精度で行なうことが可能となる。
【００２３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵素のプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。
【図２】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素（野性型）とこの発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素のプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。
【図１】
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【図２】
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