(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に含まれるDNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、DNA断片の末端をラジオアイソトープまたは蛍光色素で標識したものを、電気泳動によるシーケンス処理によりサンプル中に含まれるDNA鎖の塩基配列によるシーケンス波形として得られる塩基配列データをサンプルデータとして取得する段階と、
前記サンプル中に含まれるDNA鎖と同等配列位置における標準的な塩基配列を有する基準DNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、DNA断片の末端をラジオアイソトープまたは蛍光色素で標識したものを、電気泳動によるシーケンス処理により基準DNA鎖の塩基配列によるシーケンス波形として得られる塩基配列データを基準データとして取得する段階と、
前記サンプルデータと基準データの同一ピーク位置を対応させ、対応させたピーク位置に基づいて（サンプルデータ）−（基準データ／２）によるシーケンス波形の差分データを生成する段階と、
前記差分データと基準データのシーケンス波形に対して塩基配列を特定するベースコール処理を行い、前記ベースコール処理により特定された差分データの塩基配列と基準データの塩基配列とに基づいて、各塩基配列を整列させるアライメント処理を行い、差分データと基準データの各塩基配列が適切に対応しているか否かを判定することによりSNPs情報を検出する段階と、
を含むDNA塩基配列におけるSNPs検出方法。
【請求項２】
前記SNPs情報は、SNPsの有無情報、SNPsの位置情報、SNPsの類型情報を含む、請求項１に記載のDNA塩基配列におけるSNPs検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNA塩基配列における１塩基遺伝子多型（SNPs：Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法に関し、特に、DNA鎖の一方に対応する塩基が存在しないIns/Delを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNA塩基配列を増幅する技術のひとつとして、耐熱性酵素を使用するポリメラーゼ連鎖反応法（PCR：Polymerase Chain Reaction）が知られている。このPCR法は、DNAポリメラーゼがDNAの合成に際してプライマーを必要とし、このプライマーから5'から3'の方向にDNAを合成していくということを利用して、DNA鎖の単一鎖への変性、プライマーの結合、耐熱性DNAポリメラーゼによる相補鎖の合成というサイクルを繰り返すことにより、目的とする遺伝子領域だけを増幅させる方法である。この方法を用いて、特定のDNA鎖を迅速にかつ解析可能な量まで増幅することが可能となる。
【０００３】
このようなPCR法等により増幅されたDNA断片の5'末端のみを放射性同位元素（ラジオアイソトープ）で標識して電気泳動を行い、オートラジオグラフィーでシーケンスすることにより塩基配列を検出することが可能となる。また、放射性同位元素に代えて蛍光色素を用いてDNA断片の末端を標識し、これを電気泳動してシーケンスすることで塩基配列を検出する方法がある。
【０００４】
このようなシーケンス処理により、遺伝子を構成するアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の４つの塩基がどのように配列されているかを特定することができる。
ヒトの全ゲノム（約3000MB）中の99.9％は塩基配列が等しいが、0.1％（約3MB）の確率で存在している一塩基遺伝子多型（SNPs：Single Nucleotide Polymorphism）がゲノム中に散在することに起因する塩基対の多様性により個人間に差が存在する。
【０００５】
SNPsは、図１（Ａ）に示す正常なDNA塩基配列に対して、（Ｂ）DNA鎖の一方の塩基配列中の一つが置換されている場合と、（Ｃ）DNA鎖の一方に欠落または挿入が生じているようなIns/Delの場合が考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前述したようなPCR法等を用いてサンプル中のDNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、シーケンス処理して塩基配列を特定する場合、一方の単一鎖から得られるシーケンス波形と、他方の単一鎖から得られる相補鎖から得られるシーケンス波形とが合成された波形が得られることとなる。
【０００７】
したがって、図１（Ａ）のようにSNPsが存在しない正常なDNAの場合、図２（Ａ）に示すように、一方の単一鎖から得られるシーケンス波形と他方の単一鎖の相補鎖から得られるシーケンス波形とがほぼ同一波形となり、これを合成した波形は図２（Ｂ）に示すように、各塩基が同一位置で増幅されたシーケンス波形となる。
【０００８】
ここで、図１（Ｂ）のようにSNPsが存在する場合には、図１（Ｂ）の下段に示す単一鎖から生成される相補鎖より生成されるシーケンス波形は図３（Ａ）の上段のようになり、図１（Ｂ）の上段に示す単一鎖から生成されるシーケンス波形は図３（Ａ）の下段のようになる。これらを合成すると、図３（Ｂ）のようなシーケンス波形が得られる。一方の単一鎖から得られるシーケンス波形と他方の単一鎖の相補鎖から得られるシーケンス波形は、SNPsの存在位置において異なる塩基配列となるため、振幅が半分の波形が互いに重なって現れることとなる。このようにして、塩基の置換に基づくSNPsの存在の有無情報、その配列位置情報などを得ることが可能となる。
【０００９】
図１（Ｃ）で示すようなIns/Delが存在する場合、図１（Ｃ）の下段に示す単一鎖から生成される相補鎖より生成されるシーケンス波形は図４（Ａ）の上段のようになり、図１（Ｃ）の上段に示す単一鎖から相補的に生成されるシーケンス波形は図４（Ａ）の下段のようになる。これらを合成すると、図４（Ｂ）のようなシーケンス波形が得られる。このように、DNA塩基配列中にIns/Delが存在する位置から２つのシーケンス波形がずれてしまうので、以降のSNPsの存在の有無情報や位置情報を得ることができなくなるという問題を内包している。
【００１０】
本発明では、DNA塩基配列中のSNPsの存在の有無情報、その位置情報の検出を可能とし、特に、Ins/Delが存在するか否か、存在する場合にはその位置情報を検出することを目的とする。
【００１１】
本発明に係るDNA塩基配列におけるSNPs検出方法は、サンプル中に含まれるDNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、DNA断片の末端をラジオアイソトープまたは蛍光色素で標識したものを、電気泳動によるシーケンス処理によりサンプル中に含まれるDNA鎖の塩基配列によるシーケンス波形として得られる塩基配列データをサンプルデータとして取得する段階と、サンプル中に含まれるDNA鎖と同等配列位置における標準的な塩基配列を有する基準DNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、DNA断片の末端をラジオアイソトープまたは蛍光色素で標識したものを、電気泳動によるシーケンス処理により基準DNA鎖の塩基配列によるシーケンス波形として得られる塩基配列データを基準データとして取得する段階と、サンプルデータと基準データの同一ピーク位置を対応させ、対応させたピーク位置に基づいて（サンプルデータ）−（基準データ／２）によるシーケンス波形の差分データを生成する段階と、差分データと基準データのシーケンス波形に対して塩基配列を特定するベースコール処理を行い、ベースコール処理により特定された差分データの塩基配列と基準データの塩基配列とに基づいて、各塩基配列を整列させるアライメント処理を行い、差分データと基準データの各塩基配列が適切に対応しているか否かを判定することによりSNPs情報を検出する段階とを含む。
【００１２】
また、差分データは、（サンプルデータ）−（基準データ／２）として生成することができる。
さらに、差分データと基準データに対してそれぞれ塩基配列を特定し、特定された差分データの塩基配列と基準データの塩基配列とに基づいてサンプルデータ中に含まれるDNA鎖の塩基配列を決定するように構成できる。
【００１３】
また、SNPs情報は、SNPsの有無情報、SNPsの位置情報、SNPsの類型情報を含むように構成できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の１実施形態が採用されるDNA塩基配列におけるSNPs検出方法を、図１のフローチャートに基づいて説明する。
ステップＳ１では、サンプル中に含まれるDNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、シーケンス処理により得られる塩基配列データをサンプルデータとして取得する。ここでは、サンプル中に含まれるDNA鎖の相補鎖を生成する工程を繰り返して増幅を行うものであり、たとえば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて増幅することが可能である。相補的に増幅されたDNA断片の末端をラジオアイソトープや蛍光色素で標識し、これを電気泳動してシーケンスすることで、サンプル中に含まれるDNA鎖の塩基配列によるシーケンス波形を得ることができる。
【００１５】
ステップＳ２では、サンプル中に含まれるDNA鎖と同一配列位置における標準的な塩基配列を有する基準DNA鎖を相補鎖の生成により増幅し、シーケンス処理により得られる塩基配列データを基準データとして取得する。ここでは、前述のサンプルデータ取得と同様にして、PCR法などを用いて基準DNA鎖を増幅し、電気泳動などにより基準DNAのシーケンス波形を基準データとして取得する。
【００１６】
ステップＳ３では、サンプルデータと基準データのそれぞれについて、ピーク検索処理を実行する。ここでは、サンプルデータおよび基準データのそれぞれについて、シーケンス波形のピーク位置を検出する。４つの塩基に対してそれぞれ異なる蛍光色素による標識がなされている場合には、サンプルデータおよび基準データはそれぞれ配列位置に４つの色のうちいずれかが配置されたシーケンス波形となっている。ただし、サンプル中に含まれるDNA鎖中にIns/Delが含まれる場合には、図６に示すように、1/2振幅の波形が２つ重なった部分が存在することとなる。
【００１７】
ステップＳ４では、サンプルデータと基準データの同一ピーク位置を決定する。たとえば、図６に示すように、サンプルデータおよび基準データ（図では、基準データ*(1/2)）の各ピーク位置を４つの色毎に参照して、それぞれ対応するピーク位置を決定する。
図６では、サンプルデータおよび基準データともに、左から１番目〜３番目のピーク色が赤（実線）、マゼンタ（点線）、黄色（一点鎖線）で一致している。基準データでは、左から４番目以降、シアン（２点鎖線）、赤（実線）、マゼンタ（点線）、黄色（一点鎖線）、シアン（２点鎖線）の順に配列している。また、サンプルデータでは、左から４番目が赤（点線）とシアン（一点鎖線）、５番目がマゼンタ（点線）と赤（実線）、６番目が黄色（一点鎖線）とマゼンタ（点線）、７番目がシアン（２点鎖線）と黄色（一点鎖線）、８番目がシアン（２点鎖線）の順に配列されている。
【００１８】
ここで、サンプルデータ中にピークの重なりがある部分については、前後の配列を考慮して、基準データのピークとの対応を決定していく。たとえば、図６において、サンプルデータのピークを右から基準データのピークに対応させていくと、右から５番目（左から４番目）のピークは、赤とシアンとが重なっており、基準データの右から４番目のピークが赤であり、５番目のピークがシアンであるため、サンプルデータの５番目のピークを基準データの４番目または５番目のいずれのピークにも対応させることができる。しかしながら、サンプルデータの右から４番目までのピークと、基準データの４番目までのピークとの対応を考慮すると、サンプルデータの右から５番目のピークを基準データの右から５番目のピークに対応させることが適当と考えられる。このようにして、サンプルデータと基準データのピークをそれぞれ対応させる。
【００１９】
ステップＳ５では、対応させたピーク位置に基づいて、それぞれのシーケンス波形の差分データを生成する。ここでは、サンプルデータ−基準データ／２により、サンプルデータ中のピークの重なりを削除する。
ステップＳ６では、基準データ／２の波形を削除した後の差分データ（type1）と、基準データ／２（type2）のシーケンス波形により、DNA鎖の塩基配列データとする。
【００２０】
ステップＳ７では、差分データと基準データ／２のそれぞれを構成する４つの色に対してそれぞれATCGの塩基を当てはめるベースコール処理を実行する。
ステップＳ８では、ベースコールによりATCGの各塩基配列が決定された差分データと基準データ／２を対応させ、各塩基配列を整列させるアライメント処理を実行する。
【００２１】
ステップＳ９では、アライメントにより整列された差分データと基準データ／２の各塩基配列から、SNPsの有無情報、SNPsの位置情報、SNPsの類型情報を判定する。ここでは、２つのDNA鎖を構成する塩基配列が適切に対応している場合には、SNPsがなく正常であると判定し、一方のDNA鎖に塩基の置換がある場合にいはSNPsが存在する旨の情報とその位置情報、一方のDNA鎖に塩基の欠落また挿入がある場合にはIns/Delが存在する旨の情報とその位置情報を生成する。
【００２２】
同一ピーク位置の決定を行う必要がないような場合には、図７に示すように、サンプルデータから基準データ／２を差し引いた差分データを生成し、差分データと基準データ／２に対してベースコール処理を実行して、差分データの塩基配列と基準データ／２の塩基配列に基づいてアライメント処理を行うように構成できる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、相補的に増幅されたサンプルデータと基準データとを用いて、SNPsの有無情報、SNPsの位置情報よおびSNPsの類型情報を自動的に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  SNPsの一例を示す説明図。
【図２】従来手法に基づくSNPs検出の説明図。
【図３】従来手法に基づくSNPs検出の説明図。
【図４】従来手法に基づくSNPs検出の説明図。
【図５】本発明の一実施形態が採用されるSNPs検出方法のフローチャート。
【図６】同一ピークの決定方法の説明図。
【図７】  SNPs情報判定の説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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