(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつ遺伝子組換えによりフォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ活性とグルタメートデヒドロゲナーゼ活性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株。
【請求項２】
フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子とグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により、前記フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ活性とグルタメートデヒドロゲナーゼ活性が増幅された請求項１の変異株。
【請求項３】
請求項１または２のＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は発酵法によりＬ−グルタミン酸を製造するために使用される変異株および該変異株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来Ｌ−グルタミン酸は主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されてきた（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００３】
大腸菌（エシェリヒア・コリ）はその増殖速度の大きさ並びに遺伝子解析の進み方から将来的に優れたＬ−グルタミン酸生産菌として利用される可能性を有しているが、従来の報告では大腸菌によるＬ−グルタミン酸の蓄積量は２．３ｇ／ｌと極めて低いレベルにあった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５０巻、１６４〜１６５頁、１９６１年）。ところが最近、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、α−ＫＧＤＨと略す）活性が欠損もしくは低下した変異株が高いグルタミン酸生産能を有することが報告された（仏国特許公開２６８０１７８号）。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エシェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能をさらに向上させ、より安価でかつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、大腸菌の変異株によるＬ−グルタミン酸の製造法について鋭意研究を重ねた結果、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（以下ＰＰＣと略す）活性とグルタメートデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと略す）活性が増幅された変異株が高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（発明１）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株、および、
（発明２）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法
である。
【０００７】
以下、本発明について説明する。
【０００８】
（１）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の取得
【０００９】
本発明の変異株を調製するために使用される出発親株としては、エシェリヒア属に属する微生物で病原性のない菌株が用いられる。具体的な例としては、次のような株が挙げられる。
【００１０】
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）
エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
【００１１】
エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株は以下のようにして調製される。
【００１２】
まず、前記の出発親株に通常の変異処理法、例えばＸ線や紫外線の照射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＧと略す）等の変異剤に接触せしめる等の方法を適用し変異を導入する。
【００１３】
あるいは、遺伝子工学的手法、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いることによっても目的の変異を効率よく導入することができる。
【００１４】
遺伝子組換え法によるα−ＫＧＤＨ活性の欠損株の取得方法は以下の通りである。既に明らかにされているα−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、ｓｕｃＡ遺伝子と略す）の塩基配列（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子を増幅し、増幅したｓｕｃＡ遺伝子内に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失ったｓｕｃＡ遺伝子を作成する。ついで相同組換えを利用して染色体上のｓｕｃＡ遺伝子を薬剤耐性遺伝子の挿入によりその機能を失ったｓｕｃＡ遺伝子に置換する。
【００１５】
親株に変異処理を施した後、目的変異株選抜のためのより具体的な手段は次のようなものである。
【００１６】
α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件下ではグルコースを含む最少培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最小培地にコハク酸またはリジンおよびメチオニンを添加することにより通常の生育が可能となる。あるいは、嫌気的培養条件下で培養するとグルコースを含む最少培地でも生育可能となる（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９年）。これらの現象を指標として目的変異株の選抜が可能である。
【００１７】
以上のようにして得られるα−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては次のものが挙げられる。
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr
【００１８】
α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した性質や、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシトレートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的になった性質を併せ持つことが、Ｌ−グルタミン酸の生産性向上の面から有利である。これらの性質については仏国特許２６８０１７８号に記載されている。また、従来よりＬ−グルタミン酸生産菌の性質として知られている各種栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、または薬剤依存性等の性質を持つことがＬ−グルタミン酸の生産性向上の面から有利であることはいうまでもない。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸の分解能が低下した変異株は、単一炭素源としてグルコースの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地または単一窒素源として硫酸アンモニウムの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する変異株として分離できる。但し、栄養要求性を有する変異株を用いる場合は、生育に必要な栄養素の必要最少限量を当然培地に添加しなければならない。
【００２０】
ａｃｅオペロンの発現が構成的になった変異株は、フォスフォエノールピルベートシンターゼ欠損株を親株とし、乳酸を炭素源とする最少培地で生育し、ピルビン酸または酢酸・ピルビン酸を炭素源とする最少培地では生育できない株として得られる他、好気的培養条件下でα−ＫＧＤＨ欠損もしくは低下株の生育を改善する変異株としても得られる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第９６巻、２１８５〜２１８６頁、１９６８年）。
【００２１】
以上の変異株の具体例としては次のものが挙げられる。
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭＢＰ−３８５３）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８株は、α−ＫＧＤＨ活性が低下し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下し、ａｃｅオペロンの発現が構成的になった性質を併せ持つ変異株であり、エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４株は、α−ＫＧＤＨ活性が低下し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異株である（仏国特許２６８０１７８号参照）。
【００２２】
かくして得られるα−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、ＴＣＡサイクルのα−ケトグルタル酸を経てＬ−グルタミン酸に至る生合成経路の流れが改善されておりＬ−グルタミン酸の生産能が向上している。またα−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し、かつ生成したＬ−グルタミン酸の分解活性が著しく低い変異株や、これら性質に加えてさらにａｃｅオペロンが構成的に発現するために生育が改善した変異株では、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上している。
【００２３】
（２）エシェリヒア属に属し、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅された変異株の取得
【００２４】
後述の実施例では、エシェリヒア属に属し、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅された変異株の取得を、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を出発親株として行った。しかし、エシェリヒア属に属する野生型の菌株を出発親株として行い、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅された変異株の取得を行った後にα−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下するよう育種してもかまわない。
【００２５】
従って、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅された変異株を調製するために使用される出発親株としては、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株、あるいはエシェリヒア属に属する微生物で病原性のない野生型菌株が用いられる。具体的な例としては、次のような株が挙げられる。
【００２６】
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭＢＰ−３８５３）
（以上、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株）
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）
エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
（以上、エシェリヒア属に属する微生物で病原性のない野生型菌株）
【００２７】
ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するにはＰＰＣおよびＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＰＰＣおよびＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをｐｐｃ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＰＰＣ活性およびＧＤＨ活性が増幅される。
【００２８】
クローニングされるｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子は一種類のプラスミド上にクローン化されて宿主となる上記出発親株に導入されるか、もしくは共存可能な二種類のプラスミド上に別々にクローン化されて出発親株に導入される。
【００２９】
ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するにはｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されるようにｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＰＰＣ活性およびＧＤＨ活性が増幅される。
【００３０】
ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを強力なものに置換することによっても達成される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによってＰＰＣ活性およびＧＤＨ活性が増幅される。
【００３１】
ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＰＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補する遺伝子を単離することによって取得できる。またエシェリヒア・コリのこれら遺伝子は既に塩基配列が明かにされていることから（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年、Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００３２】
（３）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の生産
【００３３】
エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を用いてＬ−グルタミン酸を生産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００３４】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００３５】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００３６】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００３７】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
【００３８】
培養方法は、発酵温度２０ないし４５℃、ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００３９】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
【００４０】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する
【００４１】
実施例１
（１）エシェリヒア・コリのｓｕｃＡ遺伝子、ジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｓｕｃＡ遺伝子および、ジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝子（以下、ｓｕｃＢ遺伝子と略す）の塩基配列は既に明かにされている。明らかにされているｓｕｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３７４頁、１９８４年に開示されているが、同配列を配列表の配列番号７にも記載した。３２７番目から３１２８番目に至る塩基配列がｓｕｃＡ遺伝子のＯ．Ｒ．Ｆ．に相当し、３１４３番目から４３５７番目に至る塩基配列がｓｕｃＢ遺伝子のＯ．Ｒ．Ｆ．に相当する。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１から４に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子をそれぞれ増幅した。
【００４２】
ｓｕｃＡ遺伝子の増幅に用いた合成プライマーは配列表配列番号１および２に示す塩基配列であり、配列表配列番号１はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の４５番目から６５番目の塩基に至る配列に相当する。また、配列表配列番号７として記載する塩基配列の４５番目から６５番目の塩基に至る配列に相当する。
【００４３】
配列表配列番号２はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３６４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の３１７３番目から３１９３番目までの配列に相当する。また、配列表配列番号７として記載する塩基配列の３１７３番目から３１９３番目の塩基に至る配列に相当する。
【００４４】
またｓｕｃＢ遺伝子の増幅に用いた合成プライマーは配列表配列番号３および４に示す塩基配列であり、、配列表配列番号３はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の２１７９番目から２１９８番目までの塩基配列に相当する。また、配列表配列番号７として記載する塩基配列の２１７９番目から２１９８番目の塩基に至る配列に相当する。
【００４５】
配列表配列番号４はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１４１巻、３６４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の４５６６番目から４５９１番目の塩基配列に相当する。また、配列表配列番号７として記載する塩基配列の４５６６番目から４５９１番目の塩基に至る配列に相当する。  尚、ｓｕｃＡ遺伝子とｓｕｃＢ遺伝子はオペロンを成す。
【００４６】
エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡの回収は、常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、９７ー９８頁、培風館、１９９２年）。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件を用いた。
【００４８】
次いで生成したＰＣＲ産物の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑にし、ベクターであるｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ｐＢＲ３２２にｓｕｃＡ遺伝子をクローニングしたプラスミドをｐＢＲ−ｓｕｃＡ、同様にｓｕｃＢ遺伝子をクローニングしたものをｐＢＲ−ｓｕｃＢと名づけた。以上の様にして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に導入し、プラスミドを調製後、制限酵素地図を作成し、報告されているｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ遺伝子の制限酵素地図と比較し、クローニングされた遺伝子がｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ遺伝子であることを確認した。
【００４９】
図１に示すようにｐＢＲ−ｓｕｃＢをＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｓｕｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。ｐＢＲ−ｓｕｃＡをＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、大断片を調製した。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結しｐＢＲ−ｓｕｃＡＢを作成した。
【００５０】
（２）エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子の破壊
図２にエシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子の破壊の概略を示す。
【００５１】
ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢをＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。一方、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシアから購入）をＰｓｔＩで消化し、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＢＲ−ｓｕｃＡ：：Ｋｍrを作成した。次に本プラスミドからカナマイシン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、この直鎖状ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大）から入手したエシェリヒア・コリＪＣ７６２３株（ｔｈｒ−１、ａｒａー１４、ｌｅｕＢ６、△（ｇｐｔーｐｒｏＡ）６２、ｌａｃＹ１、ｔｓｘ−３３、ｓｕｐＥ４４、ｇａｌＫ２、λー、ｒａｃー、ｓｂｃＢ１５、ｈｉｓＧ４、ｒｆｂＤ１、ｒｅｃＢ２１、ｒｅｃＣ２２、ｒｐｓＬ３１、ｋｄｇＫ５１、ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−１、ａｒｇＥ３、ｔｈｉ−１）を形質転換し、染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の挿入されたｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に組換えられた株を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ培地（バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、酵母エキス  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）上で選択した。エシェリヒア・コリＪＣ７６２３株はｒｅｃＢー、ｒｅｃＣー、ｓｂｃＢーの形質を有しているために直鎖状のＤＮＡを用いて形質転換を行っても頻度良く組換えをおこす。
【００５２】
カナマイシン耐性株が１２株得られたので１２株それぞれから染色体ＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩで消化し、ｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行い、１２株全てが染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた株であることを確認した。ｐＢＲ−ｓｕｃＡのｓｕｃＡ遺伝子を含む２．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行うと野生株ではｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の中にＫｐｎＩ部位が存在するために５．２Ｋｂと６．２Ｋｂの２本のバンドが現れるが、カナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた株ではカンマイシン耐性遺伝子の挿入の際にＫｐｎＩ部位が破壊されているため１１．４Ｋｂの１本のバンドしか現れない。この様にして得られたカナマイシン耐性のエシェリヒア・コリＪＣ７６２３（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）株にＰ１ファージを感染させ、溶菌液を調製後、エシェリヒア・コリＷ３１１０株にｓｕｃＡ：：Ｋｍrを形質導入した。Ｐ１ファージによる形質導入は常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、７５−７６頁、培風館、１９９２年）。カナマイシン耐性株として分離した株の内代表株をＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrと名付けた。
【００５３】
Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株並びにエシェリヒア・コリＷ３１１０株のα−ＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１３巻、５５頁、１９６９年）により測定した。その結果を表１に示す。  エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株にはα−ＫＧＤＨ活性は検出されなかった。すなわち、エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株はα−ＫＧＤＨを欠損している株である。
【００５４】
【表１】
0003880636.tif 000002
【００５５】
（３）エシェリヒア・コリＷ３１１０株のｇｄｈＡ遺伝子のクローニング
ｓｕｃＡおよびｓｕｃＢ遺伝子のクローニングと同様にＰＣＲ法によりｇｄｈＡ遺伝子をクローニングした。Ｆｅｒｎａｎｄｏ等により報告されているｇｄｈＡ遺伝子の塩基配列をもとにしてＰＣＲ用プライマーを合成した。ｇｄｈＡ遺伝子の塩基配列はＧｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年に開示されているが、配列表の配列番号８としても記載した。ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を配列表配列番号５及び６に示す。
【００５６】
配列表配列番号５はＧｅｎｅ、第２７巻、１９５頁、１９８４年に記載されているｇｄｈＡ遺伝子の塩基配列図上の−１９１番目から−１７１番目の配列に相当し、配列表配列番号８の３番目から２３番目の配列に相当する。
【００５７】
配列表配列番号６はＧｅｎｅ、第２７巻、１９５頁、１９８４年に記載されているｇｄｈＡ遺伝子の塩基配列図上の１６８７番目から１７０７番目の塩基までの配列に相当し、配列表配列番号８の１８８０番目から１９００番目の塩基までの配列に相当する。
【００５８】
調製したエシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして合成したプライマーを用いてＰＣＲ法によりｇｄｈＡ遺伝子を増幅し、得られたＰＣＲ産物を精製後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、ＥｃｏＲＶで消化したｐＢＲ３２２に連結しプラスミドｐＢＲＧＤＨを作成した。
【００５９】
（４）ｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成
図３にｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの構築方法を示した。ｐＢＲ３２２のＳａｌＩサイトにエシェリヒア・コリＫ−１２株に由来するｐｐｃ遺伝子の全領域を含む４．４ＫｂのＳａｌＩ断片が挿入されたプラスミドｐＳ２（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９巻、９０９〜９１６頁、１９８４年）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。一方ＰＣＲ法で合成したｇｄｈＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした。次いで両者をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。得られたプラスミドで、エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大）より入手したＧＤＨ欠損株エシェリヒア・コリＰＡ３４０（ｔｈｒ−１、ｆｈｕＡ２、ｌｅｕＢ６、ｌａｃＹ１、ｓｕｐＥ４４、ｇａｌ−６、λー、ｇｄｈ−１、ｈｉｓＧ１、ｒｆｂＤ１、ｇａｌＰ６３、Δ（ｇｌｔＢ−Ｆ）、ｒｐｓＬ１９、ｍａｌＴ１（λR）、ｘｙｌ−７、ｍｔｌ−２、ａｒｇＨ１、ｔｈｉ−１）を形質転換し、アンピシリン耐性でかつグルタミン酸要求性を消失した株を分離した。この株よりプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、本プラスミド上にｐｐｃ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子が存在することを確認し、本プラスミドをｐＧＫと名付けた。
【００６０】
（５）α−ＫＧＤＨ欠損株エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：ＫｍrへのｐＳ２、ｐＢＲＧＤＨ、ｐＧＫの導入と培養評価
αＫＧＤＨ欠損株エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：ＫｍrをｐＳ２、ｐＢＲＧＤＨ、ｐＧＫでそれぞれ形質転換し、得られた形質転換株をそれぞれ表２の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とうフラスコに接種して、３７℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養したところ、表３に示す結果が得られた。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
【表３】
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【００６３】
ｐＳ２を導入しＰＰＣ活性を増幅した形質転換株では宿主であるＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrに比較して若干生育が低下したが、Ｌ−グルタミン酸の蓄積量は宿主と変わらなかった。また、ｐＢＲＧＤＨを導入しＧＤＨ活性を増幅した株では生育が極めて悪く、驚くことにＬ−グルタミン酸の蓄積量はＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株に比較して低下した。
【００６４】
ところが一方、ｐＧＫを導入しＰＰＣとＧＤＨ活性を同時に増幅した形質転換株では生育は宿主と変わらず、Ｌ−グルタミン酸蓄積量には顕著な増加が認められた。ｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＧＫが導入されたエシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株をＡＪ１２９４９と名付けた。エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０３９が付与されている。
【００６５】
尚、宿主であるＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株は寄託したＡＪ１２９４９株より宿主細胞を損なうことなく宿主細胞中のプラスミドを除去することにより得られる。プラスミドは宿主より自然に失われることもあるし、除去操作によって除くこともできる（Ｂａｃｔ．  Ｒｅｖ．、第３６巻、３６１〜４０５頁、１９７２年）。他の除去操作の例は以下の通りである。ＡＪ１２９４９株をＬブロス（バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、酵母エキス  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に接種し、４０℃で一晩培養後、培養液を適当に希釈し、アンピシリンを含有しないＬ培地に塗布し、３７℃で一晩培養後出現したコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ培地に移植し、アンピシリン感受性のコロニーを分離する。  かくして得られる株がＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrである。
【００６６】
【発明の効果】
本発明の方法により、エシェリヒア属に属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることができ、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造することができる。
【００６７】
【配列表】
【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢの構築図を示す。
【図２】エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子を破壊する過程を示す。
【図３】ｐＧＫの構築図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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