(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
海生菌シゾキトリウム ｓｐ．Ｎ１−２７（ＦＥＲＭ−Ｐ１６７５７）を13C標識炭素源あるいは14C標識炭素源を添加した培地で培養し、該培養物から13C標識ドコサペンタエン酸および13C標識ドコサヘキサエン酸、あるいは14C標識ドコサペンタエン酸および14C標識ドコサヘキサエン酸を採取することを特徴とする標識高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項２】
標識ドコサペンタエン酸および標識ドコサヘキサエン酸を産生する海生菌シゾキトリウムｓｐ．Ｎ１−２７（ＦＥＲＭ−Ｐ１６７５７）およびその変異株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物による標識高度不飽和脂肪酸の製造方法に関するものであり、更に詳しくは、ドコサペンタエン酸（以下ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡ）の生産能の高い微生物を用いた標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡの製造方法、並びに該微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、同位体は原子番号が同じであることから、化学的、あるいは生化学的な性質が同じであることに基づいて、トレーサー実験に用いられるが、質量数の違いによる同位体効果が観察されることがある。最も有名な例は、水素の同位体である二重水素からなる水は植物の生育を阻害することである。微生物の培養に用いる炭素源を炭素の同位体で置換した場合、それらの比は水素の同位体の質量数の比よりも小さいので、同位体効果も小さいと考えられるが、この仮定は証明されていない。また、同位体が脂肪酸に取り込まれる効率は、微生物の代謝過程に依存するので、用いる炭素源によって異なる。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸類、特にＤＰＡやＤＨＡを生産することが出来る微生物として、例えば、特表平5-503425号公報(WO91/11918)には藻類である渦鞭毛虫のクリプテコディニウム(Crypthecodinium)属に属する微生物が開示されているが、この微生物は基質を選ぶことが明細書中に記載されている。また、13C標識ＤＨＡの製造法への言及もあるが実施例の記載はなく13C標識ＤＨＡの生成は確認されていない。
【０００４】
ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング[例えば、Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.81,No.1,76-78(1996)]には、ラビリンチュラ(Labyrinthuliae)類のスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属に属するスラウストキトリウム・アウレム(Thraustochytrium aureum)ATCC-34304によるＤＨＡ生産の詳細な報告がある。また、ジャーナル・オブ・アメリカン・オイル・ケミスト・ソサエティ［例えば、Journal of American Oil Chemists' Society Vol. 73, No. 11, (1421-1426)］にはラビリンチュラ類のシゾキトリウム（Schizochytrium）属に属する新種、SR21によるＤＰＡ及びＤＨＡ生産の詳細な報告がある。しかし、いずれも標識ＤＰＡ及びＤＨＡの製造には言及されていない。
【０００５】
微生物を用いて13Cでユニフォーマルに標識された高度不飽和脂肪酸の製造方法としては、イコサペンタエン酸やアラキドン酸(特開平5-246939号、特開平6-340577号、特開平7-2424号公報)について知られている。また、ＤＰＡやＤＨＡについては、鞭毛藻類からの14Cでユニフォーマル標識物が報告されているだけで（Biochimica et Biophysica ACTA Vol.137,420-426(1967);Biochimica et Biophysica ACTA Vol.187,201-207(1969)）、その標識率や生産量に関する知見はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ユニフォーマルに標識された13C標識ＤＰＡおよび13C標識ＤＨＡあるいは14C標識ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡの効率的な製造方法およびこれを用いる新規微生物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上述の課題を解決するために鋭意研究した結果、海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N1-27が、ＤＰＡおよびＤＨＡを選択的にかつ効率よく生産することを見出した。また、この微生物の培養液中に安価な13Cあるいは14C標識炭素源を添加することによって、同位体効果による生産性の低下などの影響もなく、ユニフォーマルに標識された13C標識ＤＰＡおよび13C標識ＤＨＡあるいは14C標識ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡが生成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N1-27を13Cあるいは14C標識炭素源を添加した培地で培養し、該培養物から13Cあるいは14C標識ＤＰＡおよびＤＨＡを採取することを特徴とする該化合物の製造方法、並びに該微生物を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
（１）13C標識ＤＰＡおよび13C標識ＤＨＡあるいは14C標識ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡの製造方法
海生菌シゾキトリウム sp. N1-27を培養してＤＰＡおよびＤＨＡを製造しようとする場合、基礎栄養培地としてはこの微生物が増殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培地は窒素源として例えば酵母エキス、ポリペプトンなどの１種類又は複数種類を含有する。また、この培地には標識炭素源としてグルコースの様な各種の13Cあるいは14C標識糖類を加える。糖類のほかに13Cあるいは14Cで標識された酢酸ナトリウム、アミノ酸類、二酸化炭素等も標識炭素源として用いられる。この培地には天然海水や人工海水を加えることが好ましい。より具体的には、例えば13Cあるいは14C標識グルコース3.0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解した培地、あるいは13Cあるいは14C標識酢酸ナトリウム3.0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解した培地を用いる。
【００１０】
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが、目的とする標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡを多量に得るためには、液体培地を用い、静置培養もしくは振盪培養、通気・撹拌培養などにより好気的条件下で培養を行なうことが好ましい。培養温度は菌が生育し、標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡが生産される温度範囲であればいずれの温度でもよく、好ましくは１５〜３５℃であり、より好ましくは１８〜３０℃である。pHは６〜９の範囲である。培養時間は採取し得る量の標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡ含有脂質が生産される時間を選べばよく好ましくは１〜７日間である。
【００１１】
次に得られた培養物から標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡが採取される。採取法としては通常の脂質精製法を用いることができる。例えば、培養液から遠心分離、濾過などの常用の手段によって菌体を集める。次にこの菌体を所望により水、食塩水、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝液などにより洗浄した後、これらの液中に再懸濁する。この懸濁液を脂質の抽出のために常用されている溶剤、例えばクロロホルム／メタノール混合物により抽出し、相分離してクロロホルム相を得る。次にこのクロロホルム相を蒸発除去することにより標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡ含有脂質を含む材料が得られる。常法によりこれをけん化することによって遊離の標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡ、又はその塩を得ることができ、エステル化によって標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡエステルが得られる。これら標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡの精製は、硝酸銀処理シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)や硝酸銀処理シリカゲルクロマトグラフィーによって行うことができる。
【００１２】
菌体中のあらゆる脂肪酸誘導体の脂肪酸組成は、培養された菌体を凍結乾燥後、常法により塩酸メタノールあるいはナトリウムメチラート等でメチルエステル化またはエチルエステル化し、GC-MSで分析することができる。また、湿菌体あるいは乾操菌体から適当な有機溶剤などを用いて脂質を抽出し、シリカゲルTLCにて脂質を分画した後、各々脂質についてもその構成脂肪酸組成を同様にして分析できる。
なお、本発明においてエステル体とはメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル等のアルキルエステル、モノ、ジ及びトリグリセリド、リン脂質などを意味する。
【００１３】
（２）微生物
本発明の海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N1-27は次のようにして分離した。
まず、表１に示す組成の培地を調製した。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
滅菌海水と滅菌松花粉を入れた試験管に、茨城県那珂湊港より採取した表層海水を加え、常温で３〜５日間置いた後、水表面に浮遊している松花粉を拾ってこの組成の寒天平板培地に播種し、25℃で２〜４日間培養した。出現したコロニーを、表1の培地組成から寒天とクロラムフェニコールを除いた液体培地に植菌して、25℃で静置培養した。n−3およびn−6高度不飽和脂肪酸生産能は得られた培養液を前記の方法により検定した。このようにして、ＤＰＡおよびＤＨＡを顕著に生産する海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N1-27（海生菌 N1-27）を得た。
この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 ＦＥＲＭ−Ｐ１６７５７として寄託された。
この菌株は、炭素源の利用能について次の表２に示す特徴を有する。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
【表３】
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表中、炭素利用能が高い順に、「+++」、「++」、「+」、「t」で示し、「-」は増殖が検出できなかったことを示す。
【００１８】
海生菌シゾキトリウム sp.N1-27は、ＤＨＡ生産能が報告されている前出のシゾキトリウムsp.SR21及びスラウストキトリウム・アウレムATCC34304と炭素源の利用能において明らかに異なる。さらに、シゾキトリウム sp.N1-27の炭素源利用能のスペクトルは、n-3高度不飽和脂肪酸の製造において報告されたシゾキトリウム属とスラウストキトリウム属の微生物（特表平８−５０９３５５号）とも異なる。
【００１９】
また、菌学的特徴の指標の一つである塩分要求性については、シゾキトリウム sp. N1-27は海水濃度の1.5倍に極大値を示した。一方、スラウストキトリウム・アウレムATCC34304の塩分要求性は海水濃度の0.5倍に極大値を示すことが報告されている［Journal of Fermentation and Bioengineering Vol. 81, No. 1, (76-78)］。
【００２０】
本発明の菌は好気性で、長さの異なる二本の鞭毛を有する遊走子を経る増殖をし、また寒天培地上では酵母様のコロニーを作る。このような特徴から、本菌株は海洋環境に広く分布する菌類として扱われてきたラビリンチュラ類に属する。ラビリンチュラ類の主要な属としては、シゾキトリウム属の他にスラウストキトリウム属などが提案されている。液体培地中においてシゾキトリウム属の生長細胞は二分裂増殖を繰り返し、細胞塊を形成するのに対して、スラウストキトリウム属ではこのような増殖と細胞塊を形成しないことからこれらの属は区別される［Mycological Research Vol. 102, No. 4, (439-448)］。従って、本菌は上述のような細胞の分裂様式により、シゾキトリウム（Schizochytrium）属に分類される。さらに、炭素源利用能が既知の種と一致しないことから、シゾキトリウム属の新種と同定された。
【００２１】
以上、自然界から分離した菌株について詳細に記述したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を得ることもできる。本発明の菌株は常法に従って保存することができ、例えば寒天スラント培地上で、または凍結乾燥法により、又はグリセロール法により保存することができる。寒天スラント培地として、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用することができる。又、凍結乾燥保存、グリセロール保存も常法に従って行なうことができる。
【００２２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
参考例１
[13C]グルコース(13C;25%) 3%、コーンスティープリカ 0.05%、酵母エキス 0.05%、酢酸ナトリウム 0.25%、硫酸アンモニウム 0.1%、人工海水 50%からなる培地20mlにスラウストキトリウム・アウレムATCC-34304を植菌して25℃で振盪培養した。培養64時間で菌体密度は最高値に達した。このときの乾燥菌体重量は140mgであった。乾燥菌体中の構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエステルとしてGC-MS分析を行った。その結果、DHAメチルエステルの親イオンとしてm/z=342, 344, 346, 348, 350, 352, 354のイオンが検出された。非標識グルコースの培地で培養した菌体から得たDHAメチルエステルのm/zが342であるので、標識率は0〜55%であり、最も生成量の多い13C標識DHAの標識率は27%であった。また、ドコサペンタエン酸(DPA)の親イオンとしてm/z=344, 346, 348, 350, 352, 354のイオンが検出された。非標識グルコースの培地で培養した菌体から得たDHAメチルエステルのm/zが344であるので、標識率は0〜45%であり、最も生成量の多い13C標識DHAの標識率は27%であった。同じ試料のGLC分析から、これらの13C標識DHAと13C標識DPAは各々26mgと6.8mg生成したことがわかった。
【００２４】
参考例２ 非標識n−3およびn−6高度不飽和脂肪酸の調製
酢酸ナトリウム3.0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解した培地200mlを加熱滅菌した後、海生菌シゾキトリウム sp．N1-27を接種し、25℃で120時間好気的に培養した。培養後、遠心分離器で菌体を採取し、湿重量2.1gの菌体を得た。この菌体を凍結乾燥後、塩酸メタノールを加えて加熱し脂肪酸メチルエステルを得た。メチルエステルをガスクロマトグラフィで分析した結果を表３に示した。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
実施例１；13Cユニフォーマル標識n-3およびn-6高度不飽和脂肪酸の調製
[13C]グルコース(13C;25 atom%)3.0%、酵母エキス0.05%、コーンステイープリカー0.05%、酢酸ナトリウム0.25%、硫酸アンモニウム0.1%を50%濃度の人工海水に溶解し、PHを6.0に調製した培地20mlを加熱およびろ過によって滅菌した後、海生菌シゾキトリウム sp.N1-27を接種し、25℃で145時間好気的に培養した。培養後、遠心分離器で菌体を採取し、湿重量168mgの菌体を得た。この菌体を凍結乾操後、塩酸メタノールを加えて加熱し脂肪酸メチルエステルを得た。n-3高度不飽和脂肪酸としてドコサへキサエン酸を68mg、n-6高度不飽和脂肪酸としてドコサペンタエン酸を28mg得た。これらの脂肪酸メチルエステルを質量分析計で測定し、親イオンの値から標識率を求めたところ、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸とも平均18%、最高55％であった。
【００２７】
実施例2;13Cユニフォーマル標識n-3およびn-6高度不飽和脂肪酸の調製
[13C]酢酸ナトリウム(13C;99 atom%)3.0%、酵母エキス0.5%を50%濃度の人工海水に溶解し、PHを6.0に調製した培地33mlを加熱滅菌した後、海生菌シゾキトリウム sp.Nl-27を接種し、25℃で118時間好気的に培養した。培養後、遠心分離器で菌体を採取し、湿重量222mgの菌体を得た。この菌体を凍結乾燥後、塩酸メタノールを加えて加熱し脂肪酸メチルエステルを得た。n-3高度不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸を24mg、n-6高度不飽和脂肪酸としてドコサペンタエン酸を8mg得た。これらの脂肪酸メチルエステルを質量分析計で測定し、親イオンの値から標識率を求めたところ、ドコサへキサエン酸、ドコサペンタエン酸とも100%であった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、13Cあるいは14Cでユニフォーマル標識されたドコサペンタエン酸およびドコサへキサエン酸を効率よく発酵生産することができる。とくに安定同位体である13Cでユニフォーマル標識されたドコサペンタエン酸およびドコサへキサエン酸は、安全であるため直接人体への投与も可能である。これによって、これまで実験が不可能であったヒトのインビボ(in vivo)におけるドコサペンタエン酸/ドコサへキサエン酸の代謝を検討することができ、個体差を考慮した高度不飽和脂肪酸などの使用が可能になる。
また、標識化合物を用いることによって、これまで不明であったドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の生理作用機作などを明かにすることができ、これら有用な高度不飽和脂肪酸の持つ薬理作用をより有効に利用できる。