(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウチの水及び／又はアルコール抽出物であり、かつ分子量３０００以上の成分の含有量が２０重量％以下であることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、食品、健康食品、特定保健用食品などに使用することができるトウチを有効成分として含有してなるα−グルコシダーゼ阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼ阻害剤は、小腸の微絨毛に局在するα−グルコシダーゼを阻害し、食後の血糖値の急上昇及びそれに続くインスリン値の上昇を抑制することが、Diabate Medicine, 10, 688(1993)に報告され、人間及び人間以外の動物においても炭水化物（特に、澱粉由来のオリゴ糖、シュクロース等）の代謝を抑制するために、例えば血糖上昇抑制作用を示し、過血糖症状及び過血糖に由来する肥満症、糖尿病などの種々の疾患の改善に有用である。また、α−グルコシダーゼ阻害剤を添加して製造した食品は、代謝異常の患者食に適しており、さらに代謝異常予防食として健康な人にも適している。
【０００３】
食品に由来するα−グルコシダーゼ阻害剤として、例えば、特開平９−６５８３６号公報には、動物性蛋白質又は植物性蛋白質の酵素加水分解物が開示され、特開平５−１７３６４号公報には茶ポリフェノールが開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特開平９−６５８３６号公報に記載のα−グルコシダ一ゼ阻害剤は、活性を示すためには食品として大量に摂取しなくてはならず、また、特開平５−１７３６４号公報開示技術では、ポリフェノールの精製が煩雑であり、かつ通常摂取する茶ではやはり多量に摂取する必要があった。
本出願人は、先に特願平１０−２３９３２６号で、中華料理の食材としても用いられているトウチ（豆鼓）が、強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有するということを報告した。これは、従来公知のα−グルコシダーゼ阻害剤よりも阻害活性の点で効果が大きく、原料も入手しやすく、摂取も容易であったが、更なるα−グルコシダーゼ阻害活性の向上が課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を鋭意研究していたところ、トウチの水及び／又はアルコール抽出物であり、かつ分子量３０００以上の成分を２０重量％以下としたものが強い阻害活性を発現することを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるトウチは通常蒸した大豆をこうじで発酵させたものであり、日本の大徳寺納豆、浜納豆、寺納豆、塩から納豆、一休寺納豆等の納豆も本発明のトウチに含まれる。
また、一般的に発酵させる際には塩漬けするが、塩漬けを省略して同様に製造したもの、発酵終了時に脱塩したものも本発明に用いることができる。
【０００７】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は上記の如きトウチから水及び／又はアルコールで抽出されるものであり、かかる抽出に用いるアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられるがメタノール、エタノールが好ましい。抽出方法としては、撹拌抽出、浸漬抽出、超臨界抽出などの抽出方法が挙げられるが、通常は撹拌抽出あるいは浸漬抽出が用いられる。水とアルコールを併用する時は、水／アルコールの混合比（重量比）としては、１／１０〜１０／１が好ましく、更には、１／５〜５／１である。
【０００８】
水で抽出する場合は、トウチをそのまま、あるいは粉砕し、これに１〜２０倍量の水を加え、４０〜６０℃で１２〜２０時間撹拌抽出したり、１００〜１４０℃で１〜３時間撹拌抽出する。
アルコール抽出あるいは水及びアルコール抽出する場合は、トウチをそのまま、あるいは粉砕し、これに１〜１５倍重量のアルコール、あるいは水及びアルコールを加え４０〜６０℃で３〜１０時間撹拌抽出したり、室温で１０時間〜７日浸漬抽出して、更にアルコールを留去しておく。
上記抽出方法により得られた水及び／又はアルコール抽出物中には、通常後述する分子量３０００以上の成分が３０〜９０重量％含有される。
【０００９】
本発明では上記の如く抽出されたトウチの水及び／又はアルコール抽出物中に含まれる分子量３０００以上の成分の含有量を２０重量％以下とすることを最大の特徴とし、具体的には該抽出物から分子量３０００以上の成分を取除いて、その成分の含有量を２０重量％以下、好ましくは０．１〜１０重量％にすることにより、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤が得られるのであって、該含有量が２０重量％を越えると、グルコシダーゼ阻害活性の向上が見られず不適当である。
【００１０】
なお、本発明での分子量は試料をゲル濾過クロマトグラフィーにより測定する。具体的には分子量既知のアミノ酸、ペプチド、蛋白質〔Ａｌａ（分子量８９）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（分子量３３０）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（分子量５６３）、ニューロテンシン（分子量１６３７）、リボヌクレアーゼ（分子量１３７００）〕を標準物質として、以下の条件で抽出物を溶出させて、溶出時間を測定し、対数グラフの縦軸に分子量、横軸に溶出時間をプロットした検量線に基づいて分子量を求める。なお本発明では、分子量３０００以上の成分の重量％は得られた溶出チャートの分子量３０００の位置でピークを分割し、３０００以上の成分に相当するピーク面積の面積％で求めることとする。
【００１１】
（分画条件）
カラム    ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ６０（Ｗａｔｅｒｓ社製）５×２５０ｍｍ
移動相    ：０．１容量％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）含有５０容量％アセトニトリル水溶液
流速      ：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出      ：ＲＩ
サンプル量：１ｍｇ
【００１２】
（標準物質の分子量と溶出時間の関係）
0003911366.tif 000002
上記条件では分子量３０００の物質は２５分に溶出されるので、本発明では２５分以前に溶出する物質を分子量３０００以上の成分とする。
【００１３】
分子量３０００以上の成分を取除く方法としては、▲１▼ゲル濾過クロマトグラフィーにより、分子量３０００以上の画分を取除く方法、▲２▼膜処理により、分子量３０００以上の画分を除く方法、▲３▼該抽出物をメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼンなどの極性有機溶媒を用いた溶媒分画法で高分子画分を取除く方法等を単独あるいは適宜組合わせて実施する。
かかる▲１▼〜▲３▼の方法について簡単に説明する。
▲１▼の方法は前記分子量の分析法として述べた方法を工業的なスケールで実施する。
▲２▼の方法は、抽出物を分画分子量が３０００程度の膜（ＵＦ膜）、例えばミリポア社製ＵＦ膜「ＰＬＢＣ（分画分子量３０００）」、旭化成製ＵＦ膜「ＳＥＰ１０１３（分画分子量３０００）」等を通過させて実施する。
▲３▼の方法は、水／及びアルコール抽出液を析出物が出ない程度に濃縮して、そこに５〜１０倍程度のアルコールを添加することにより、高分子物質を沈殿させる方法である。
【００１４】
かくして得られた本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、血糖上昇抑制作用を有しているので水、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールなどの液状担体や、でんぷん、セルロース、ポリアミド粉末などの固形担体などの無毒性担体で希釈して、アンプル剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤などの医薬品、健康食品として代謝異常の患者食又は予防薬、糖尿病の予防薬、あるいは抗肥満食、ダイエット食として用いることができる。さらに、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有する上記製剤を、食前、食中、食後、食間などに服用することにより、喫食による血糖濃度の増加を抑制することができる。
【００１５】
本発明の阻害剤はトウチの水及び／又はアルコール抽出物の２〜１０００倍の阻害活性を持つので、摂取量としては、乾燥粉末として、０．００００１〜５ｇ／日が好ましく、特に０．００５〜０．１ｇ／日が好ましい。
【００１６】
本発明のα−グルコシターゼ阻害剤は、食品に添加することも可能で、例えば、以下のような食品に添加可能である。
（１）農水産加工品
はるさめ、こしあん、こんにゃく、パン、麺類（即席めん、パスタ、生めん、乾めん）、餅、シリアル食品、大豆加工品（豆腐、豆乳、納豆、凍豆腐）、水産加工品〔練り製品、（かに風味）蒲鉾、（魚肉）ハム、（魚  肉）ソーセージ、（魚肉）ウィンナー、ふりかけ、お茶づけのり〕、卵含有食品（スープ、丼等）、缶詰（シーチキン、オイルサーディン、焼鳥）、レトルト食品（カレー、シチュー、スパゲティー）
（２）乳製品
牛乳、加工乳、乳酸菌飲料、バター、チーズ、練乳、粉乳
（３）調味料
味噌、醤油、うま味（風味）調味料、（粉末）天然調味料、ソース、ドレッシング、焼き肉のたれ、みりん、カレー、シチュー、香辛料、スパイス、ヨーグルト
（４）健康食品（栄養補助食品）
▲１▼サポニン含有食品（オタネニンジン根含有食品、エゾウコギ含有食品）
▲２▼糖含有食品〔オリゴ糖（フラクトオリゴ糖含有食品、イソマルトオリゴ糖含有食品、ガラクトオリゴ糖含有食品）、多糖類（シイタケ含有食品、ムコ多糖、蛋白含有食品、コンドロイチン硫酸含有食品、マンネンタケ（霊芝）含有食品、キチン、キトサン含有食品
▲３▼ミネラル含有食品（カルシウム含有食品、アルファルファ含有食品、プルーンエキス食品、β−カロチン含有食品
▲４▼油脂含有食品
ビタミンＥ含有油脂〔麦（小麦、鳩麦）胚芽油、大豆胚芽油、米胚芽  油〕エイコサペンタエン酸含有食品、大豆レシチン含有食品、γ−リノレン酸含有食品（月見草油、ボラージ油）、ドコサヘキサエン酸含有食品
▲５▼蛋白質含有食品
大豆蛋白含有食品、カゼイン、ホエー蛋白、鯉加工食品
▲６▼タウリン
牡加工食品、シジミ加工食品、緑イ貝加工食品
（５）その他
スッポン加工食品、アミノ酸代謝異常用食品、流動食（病食）
また、下記のような、糖を多量に含有する食品にも添加可能であるが、本発明の効果が明確に発現しない場合もあり、下記のような食品に添加する場合は、糖含有量をできるだけ低くしてから添加するのが好ましい。
（６）菓子
ケーキ、ムース、（粉末）デザート、アイスクリーム、飴、チョコレート、グミ、キャンディー、クッキー、ウエハース、ゼリー
（７）飲料
清涼飲料（炭酸飲料、果実飲料、スポーツドリンク、栄養飲料）、嗜好飲料（コーヒー、ココア、麦汁）
【００１７】
上記（１）〜（７）における添加量としては、上記食品に対して、乾燥粉末として、０．００００１〜２０重量％が好ましく、特に０．００１〜１０重量％が好ましい。
更に本発明の効果を阻害しない範囲で、甘味剤、保存剤、分散剤、着色剤、酸化防止剤等も併用することができる。更に、その他の公知のα−グルコシダーゼ阻害剤であるバリエナミンやアミノシクリトールなどのα−グルコシダ一ゼ阻害剤と併用してもよい。
【００１８】
【実施例】
以下本発明について具体的に説明する。尚、以下の記述で「％」とあるのは重量％である。
実施例１
乾燥したトウチ１ｋｇを１０ｌの５０％メタノール水溶液に室温で１日浸漬抽出し、得られた浸漬液をロータリーエバポレーターで濃縮し、これを水に溶解した後、ろ過した。得られたろ液を減圧濃縮し、抽出液（Ｅ−１）を得た。
該抽出液をロータリーエバポレーターで乾固したところ１９３ｇの固形物を得た。該固形物の３０ｇを下記の条件で膜処理して、膜濃縮画分（Ｅ−３）を取除いて、膜通過画分（Ｅ−２）を得て濃縮乾固して５．８ｇの乾固物を得た。膜通過画分（Ｅ−２）は本発明の方法で分子量を測定したところ、分子量３０００以上の成分の含有量は１５％であった。
（膜処理条件）
装置    ：レモリーノ（ミリポア社製）
膜      ：ＰＬＢＣ（分画分子量３０００、ミリポア社製）
加圧条件：窒素ガスにより５ｋｇに加圧
それぞれの画分（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）のα−グルコシダーゼ阻害活性を以下のように測定した。
【００１９】
（１）ラット小腸からの二（三）糖加水分解酵素（α−グルコシダーゼ）の調製冷凍保存しておいたラット小腸（空腸）を解凍し、粘膜をピンセットで押出すように採取した。該粘膜に５倍重量の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、冷却しながらホモゲナイズした。その後遠心分離（４℃、２１０００×ｇ、６０分）し、得られた沈殿物に５倍重量になるように１％トリトンＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、可溶化処理（４℃、６０分）を行った。これを超遠心分離（４℃、１１００００×ｇ、９０分）し、この上清を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析（４℃、２４時間）し、酵素液とした。
【００２０】
（２）酵素（α−グルコシダーゼ）活性の測定
酵素活性は市販のキットを用い、基質としてはシュクロースを用いた。
標準反応液組成は、６０ｍＭ基質溶液（シュクロースを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．３に溶解してたもの）０．７ｍｌ、被験物質溶液（それぞれの分画成分の水、有機溶剤を完全に除去した後、５０％ジメチルスルホキシド水溶液に溶解）０．２ｍｌ、上記酵素液０．１ｍｌ（計１．０ｍｌ）とした。これを３７℃、１５分間反応させ、２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌを用いて反応を停止させ試験液とした。
次に９６穴マイクロプレートに１穴あたり発色試薬〔グルコースＢテストワコー（和光純薬製）〕２００μｌに試験液５０μｌ（酢酸エチル等は留去したもの）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製、ＭＯＤＥＬ５５０）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。基質溶液の代りに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を加えた時の吸光度をブランク値とし、この値を差し引いた値をＡ490sとした。被験液の代りに５０重量％ジメチルスルホキシド水溶液を加えた時の吸光度をコントロール値（Ａ490c）とし、下式によりα−グルコシダーゼ阻害活性を求めた。測定は２回行い、平均値を測定値とした。
【００２１】
α−グルコシダーゼ阻害活性（％）＝[(Ａ490c−Ａ490s)/Ａ490c]×１００それぞれの画分（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）のα−グルコシダーゼ阻害活性を表１に示した。
【００２２】
【表１】
0003911366.tif 000003
＊それぞれの分画成分を濃縮乾固して重量を求め、原料の重量に対する値とした。
尚Ｅ−１中の分子量３０００以上の成分の含有量は８０％であった。
【００２３】
実施例２
実施例１で得られた（Ｅ−１）の濃縮乾固物３０ｇを１００ｍｌの水に溶解後、エタノールを９５容量％となるように添加して室温で一晩放置して、析出した画分（Ｅ−４）を濾過して取除き、溶解液からエタノールを減圧留去して、画分（Ｅ−５）４．２ｇを得た。該画分（Ｅ−５）は本発明の方法で分子量を測定したところ、分子量３０００以上の成分の含有量は５％であった。
実施例１と同様にα−グルコシダーゼ阻害活性を測定し、表２に示した。
【００２４】
【表２】
0003911366.tif 000004
＊それぞれの分画成分を濃縮乾固して重量を求め、原料の重量に対する値とした。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、トウチの水及び／又はアルコール抽出物の分子量３０００以上の成分の含有量を２０重量％以下としたもので、摂取し易く、強い阻害活性を示す。