(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
0003969831.tif 000007
（式中、Ｒはハイドロキシメチル基）
で表されるハイドロキシプロリン誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する臓器・組織障害治療剤。
【請求項３】
肝障害治療剤である請求項２記載の臓器・組織障害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はハイドロキシプロリン誘導体又はその塩及び当該化合物を有効成分として含有する臓器・組織障害治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヒト胎盤及びその水解物には種々の生理活性物質が含まれていることが知られている。例えば、フィラトフ法(Filatov's method)はヒト胎盤水解物を用いた組織治療法で、血管壁の弾力線維及び筋線維を再生招来させるといわれており、喘息、リウマチ、肝炎などの慢性難治性疾患の治療又は老化防止などに用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ヒト胎盤水解物には生理活性物質が含まれていると推察されるが、その本態は不明である。このような問題から、本発明者等は、ヒト胎盤水解物中の生理活性物質を同定するために、ヒト胎盤水解物を分離・精製したところ、細胞増殖作用、細胞保護作用などを有するハイドロキシプロリン誘導体を見出した。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は細胞増殖を促進する作用を有する新規なハイドロキシプロリン誘導体及びそれを含有する臓器・組織障害治療剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、
▲１▼下記一般式（１）、（２）又は（３）
【化２】
0003969831.tif 000002
【０００５】
（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基を示し、当該アルキル基は水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミノカルボニル基、グアニジノ基、複素環式基、メルカプト基、アルキルチオ基又は水酸基を有することのあるフェニル基で置換されていてもよい）
で表されるハイドロキシプロリン誘導体又はその塩；
▲２▼Ｒがハイドロキシメチル基である上記▲１▼記載の化合物；
▲３▼上記▲１▼又は▲２▼記載の化合物を有効成分として含有する臓器・組織障害治療剤；
▲４▼肝障害治療剤である上記▲３▼記載の臓器・組織障害治療剤；
である。
【０００６】
上記の一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物において、Ｒは水素原子又はアルキル基である。当該アルキル基としては炭素数１〜７の低級アルキル基が好ましく、直鎖型、分岐型のいずれでもよい。具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル等が例示される。
【０００７】
かかるアルキル基は置換基として、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミノカルボニル基、グアニジノ基、複素環式基、メルカプト基、アルキルチオ基又は水酸基を有することのあるフェニル基を有していてもよく、複素環式基としては例えばイミダゾリル、インドリルなどが例示され、アルキルチオ基としては例えばメチルチオ、エチルチオなどが例示され、水酸基を有することのあるフェニル基としてはフェニル、４−ハイドロキシフェニルなどが例示される。
【０００８】
一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容され得る無毒性のものであれば特に制限されず、例えば、酸付加塩としては、無機酸との塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等）、有機酸との塩（酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩等）などが挙げられ、塩基付加塩としては、無機塩基との塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等）、有機塩基との塩（例えば、トリエチルアミン塩、アルギニンとの塩等）が挙げられる。
一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物は分子内に不斉炭素及び環構造を有しており、当該不斉炭素及び環構造に基づく光学異性体、幾何異性体、それらの混合物の全てを本発明の化合物は包含するものとする。
【０００９】
一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物は、後述の方法によりヒト胎盤水解物から得ることもできるが、一般的には化学的合成法により調製される。かかる調製法としては種々の方法により合成することができ、例えば、下記式に示される方法により得ることができる。
【００１０】
0003969831.tif 000003
【００１１】
0003969831.tif 000004
（反応工程式−１及び２において、Ｒは前記と同じ、Ｘは水酸基の保護基、Ｙはカルボキシル基の保護基、Ｚはアミノ基の保護基を示す）
【００１２】
上記の反応工程式−１において、一般式（６）で表される化合物は、水酸基及びカルボキシル基をそれぞれ慣用の保護基で保護したハイドロキシプロリン（４）と慣用の保護基でアミノ基を保護したα−アミノ酸化合物（５）とを縮合することにより得ることができる。かかる縮合は、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、活性エステル化法などの慣用のアミド化法に準じて行うことができる。また、保護基を有する化合物（４）及び（５）も常法に準じて調製することができる。なお、上記のα−アミノ酸化合物としては、例えば、セリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、バリン、オルニチン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどが例示される。
【００１３】
かくして得られた一般式（６）で表される化合物は、常法に準じて保護基の脱離反応に付すことにより一般式（１）で表される本発明の化合物が得られる。
また、一般式（６）で表される化合物を、まずカルボキシル基の保護基及びアミノ基の保護基の脱離反応に付し、次いで上記のアミド化法に準じて環化し、さらに水酸基の保護基の脱離反応に付すことにより一般式（３）で表される本発明の化合物が得られる。
【００１４】
一般式（２）及び（３）で表される化合物は、反応工程式−２の方法により、一般式（７）で表される化合物と一般式（８）で表される化合物から一般式（９）で表される化合物を得、この化合物を反抗工程式−１と同様にして処理することにより得ることができる。この反応工程式のアミド化反応、環化反応などは反応工程式−１と同様にして行うことができる。
なお、反応工程式−１及び２において、使用するアミド化反応、環化反応の方法によっては、水酸基を保護することなく反応を行うこともできる。
【００１５】
本発明の一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物は後記の実施例に示されるように細胞増殖活性及び細胞保護作用を有し、障害を受けた臓器や組織の修復、再生に有用であり、特に肝臓（肝細胞）に対して顕著な効果を奏する。具体的に本発明の化合物が奏し、期待される効果を例示すると、例えば、
▲１▼肝からの逸脱酵素（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、ＡＬＰ、ＬＡＰ、ＬＤＨ等）の抑制、
▲２▼ビリルビンの肝取り込み促進、
▲３▼肝の保護（肝実質細胞の変性・壊死の防止及び抑制）、
▲４▼肝線維化の防止、肝線維組織増殖抑制、増殖した肝線維組織・間質結合織の吸収促進、
▲５▼抗脂肝作用（肝への脂肪沈着の減少、肝細胞の脂質変性の改善）、
▲６▼組織呼吸賦活作用（肝のコハク酸脱水素酵素の活性の賦活、組織呼吸の促進、肝細胞の新陳代謝の活性化）、
▲７▼肝細胞膜の安定化作用、
などが挙げられる。
【００１６】
本発明の臓器・組織障害治療剤は、上述の作用・効果に基づくもので、一般式（１）、（２）及び（３）で表される化合物又はそれらの塩を有効成分として含有するものである。特に、肝障害に基づく疾患に好適に利用される。より具体的には、肝炎から肝硬変（甲型及び乙型肝硬変）への進行の抑制、肝硬変から肝癌への進行の抑制、肝線維形成の抑制、脂肪肝の抑制などが例示される。
【００１７】
本発明の治療剤は、一般式（１）、（２）若しくは（３）で表される化合物又はそれらの塩を、適宜の薬理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製薬上必要な成分と混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、注射剤、軟膏などの態様の医薬製剤に調製され、当該製剤は経口的又は非経口的に投与される。上記製剤中に、一般式（１）、（２）若しくは（３）で表される化合物又はそれらの塩はその有効量が配合される。投与量は投与ルート、症状、患者の体重あるいは年令などによって適宜調整される。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の化合物は細胞増殖活性、細胞保護作用などを有し、障害を受けた臓器や組織の修復、再生などに有用である。本発明の臓器・組織障害治療剤は、上記の特性を有する本発明の化合物を有効成分とするもので、各種臓器・組織の障害、特に肝障害の治療に有用である。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
なお、以下の実験に使用した材料、装置は以下のとおりである。
▲１▼ヒト胎盤水解物
ヒト胎盤水解物は、ラエンネック（商品名、日本生物製剤社製）を使用した。なお、ラエンネックはヒト胎盤をアセトンで脱脂し、塩酸で加水分解して調製した製剤である。
▲２▼高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件
ＨＰＬＣによる分析条件は以下のとおりである。
カラム：COSMOSIL 5C18-AR (4.6 I.D. x 150 mm)
検出波長：２１０，２６０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：室温（２６℃）
三次元クロマト：Waters 991J フォトダイオードアレイ検出器
【００２０】
▲３▼分析機器
1Ｈ，13Ｃ−ＮＭＲ：JEOL Lamdba 500
旋光度：JASCO DIP-140
ＦＡＢ−ＭＳ：JEOL HX-110, マトリックス(グリセロール)
ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ：JEOL HX-110, マトリックス(トリエチレングリコール）
ペプチドシーケンサー：Model 470-A(アプライド バイオシステム社製)
アミノ酸分析器：８３５型
▲４▼細胞増殖活性の測定法
試料の細胞増殖活性は、常法に準じて、ＢＨＫ(baby hamster kidney)−２１細胞に対する増殖活性を測定することにより行った(Planta Med. 62, 115-118, 1996など参照)。
より詳細には、ＢＨＫ−２１細胞（１×１０4個）を５％ウシ胎児血清と２ｍＭグルタミンを含むイーグル最小限培地(Eagle's minimum essential medium)に、試料（μｇ／ｍｌ培地）とともに３７℃、ｐＨ７．２、５％ＣＯ2／空気で３日間培養し、それをトリプシンと0.02％ＥＤＴＡで処理して細胞を取り出して、その細胞の一定量を０．４％トリパンブルーで染色後、生細胞数をカウントし、対照(medium control)の細胞数を１００％としてそれぞれの活性について比較検討した。
【００２１】
実施例１
ヒト胎盤水解物からの本発明の化合物の単離・精製
ラエンネックの水溶液をＨＰＬＣにより３種の溶離液を用いて３つの画分（Ｆｒ．１〜３）に分離した。その結果を図１Ａに示す。
得られたＦｒ．１〜３について、ＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を測定した。その結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示されるように、Ｆｒ．１に増殖活性が認められた。
【００２２】
上記でＦｒ．１に活性が認められたので、当該画分を再度ＨＰＬＣに付し、水を溶離液に用いて溶出順に１０の画分（Ｆｒ．１〜１０）に分離した。その結果を図２Ａに示す。
得られたＦｒ．１〜１０について、ＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を測定した。その結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示されるように、Ｆｒ．１〜３に低濃度(Dose:6.25, 12.5, 25μg)で増殖活性が認められた。
【００２３】
上記でＦｒ．１〜３に活性が認められたので、当該画分を更にＨＰＬＣに付し、１０-3Ｍ酢酸を溶離液に用いて３つの画分（Ｆｒ１−３−１〜１−３−３）に分離した。その結果を図３Ａに示す。
得られた３つの画分について、ＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を測定した。その結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示されるように、Ｆｒ．１−３−３に低濃度(Dose:6.25, 12.5, 25μg)で増殖活性が認められた。
【００２４】
以上の結果に基づき、ＨＰＬＣでモニタリングしながら、細胞増殖活性の認められた保持時間３．１〜３．３分の画分をラエンネック（凍結乾燥：６２．７ｇ）からCosmosil 75C18-PREP（カラム：4.6 I.D. x 150 mm，水で溶出）を用いて分取し（９．４ｇ）、次いでSephadex LH-20カラムクロマト（カラム：3 I.D. x 85 mm，水で溶出）で分離し、化合物１（６．２ｍｇ）と化合物２（７．６ｍｇ）が得られた。
上記の化合物２について、ＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を測定した。その結果を図４に示す。図４に示されるように、化合物２には細胞増殖活性が認められた。なお、上記の化合物１は機器分析の結果、ウラシルであることが判明した。
【００２５】
そこで、化合物２について分析したところ、以下の結果が得られた。
(1)ニンヒドリン反応陽性；
(2)アミノ酸分析からハイドロキシプロリンとセリン(1:1)からなるペプチド；
(3)ペプチドシーケンサーによるアミノ酸配位の検討から、Ｎ末端はブロックされていること；
(4)酸加水分解物のChiral ＨＰＬＣ分析により、Ｌ−セリン及びトランス−ハイドロキシプロリンを同定；
(5)これらの結果から、化合物２は下記の一般式（３−１）で示される３’−ハイドロキシメチル−４−ハイドロキシピロリド［１，２−ｆ］２’，５’−ピペラジンジオン(3'-Hydroxymethyl-4-hydroxypyrrolido[1,2-f]2',5'-piperazinedione)であると推定された。
【００２６】
0003969831.tif 000005
【００２７】
更に、化合物２の機器分析の測定結果は以下のとおりであり、これらの結果は何れも上記の構造式を支持するものであった。
▲６▼ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０１［Ｍ＋１］+
0003969831.tif 000006
▲８▼1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ 1.86 (1H, dd, J=12.5, 6.5), 2.05 (1H, dd, J=12.5, 5.0), 3.20 (1H, dd, J=12.5), 3.56 (1H, dd, J=12.5, 4.0), 3.68 (1H, dd, J=10.0, 5.2), 3.70 (1H, dd, J=10.5, 5.2), 4.07 (1H, t, J=4.0), 4.29 (1H, t, J=5.2), 4.36 (1H, dd, J=5.0, 6.0)
▲９▼13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ 56.8 (C-2), 37.2 (C-3), 66.7 (C-4), 53.7 (C-5), 56.7 (C-3'), 59.8 (-CH2OH)
【００２８】
一般式（１）又は（２）で表される化合物において、Ｒがハイドロキシメチルの化合物を別途合成し、これらの化合物のＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を測定したところ、何れの化合物にも細胞増殖活性が認められた。
【００２９】
試験例１
ＡＮＩＴ処理ラット血清中肝逸脱酵素の測定
α-ナフチルイソチオシアネート(α-naphthylisothiocyanate、ＡＮＩＴ)５０ｍｇ／ｋｇ(溶媒：オリーブ油)をラット腹腔内に投与する前０．５時間及び投与後８、２４、３６、４６時間に、本発明のハイドロキシプロリン誘導体１．３６又は６．２５ｍｇ／ｋｇ(溶媒：生理食塩水)を陰茎静脈(０．２５ｍｌ、ｉｖ)より、６．２５又は２５ｍｇ／ｋｇを経口(２．０ｍｌ、ｐｏ)より投与した。ＡＮＩＴ処理後４７時間に腹大動脈より血液を採集し、遠心(３５００ｒｐｍ、１５分)した後、採集された血清中の肝逸脱酵素ＧＰＴ(glutamic-pyruvic transaminase)、ＡＬＰ(alkalinephosphatase)、ＬＡＰ(lactate dehydrogenase)及びγ−ＧＴＰ(γ-glutamyltranferase)濃度並びにビリルビン(bilirubin、ＢＩＬ)濃度を各測定キット(和光純薬社製)を用いて測定した。なお、本発明のハイドロキシプロリン誘導体として、一般式（３）においてＲがハイドロキシメチルの化合物(Hyp Serという、以下同様）と一般式（２）においてＲがハイドロキシメチルの化合物(Hyp Ser OHという、以下同様)を用いた。
測定結果を図５(ＧＰＴ）、図６(ＡＬＰ)、図７(ＬＡＰ)、図８(γ−ＧＴＰ)及び図９(ＢＩＬ)に示す。図中の測定値は一群３匹の平均値±標準誤差である。有意差検定はstudent t-testにより行い、ＡＮＩＴに対して＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。
図に示されるように、本発明のハイドロキシプロリン誘導体を投与することにより、血中肝逸脱酵素量が低減し、本発明のハイドロキシプロリン誘導体は肝保護作用を有することが判明した。
【００３０】
試験例２
四塩化炭素(ＣＣｌ4)処理した初代培養ラット肝細胞培地における肝逸脱酵素の測定
中村らの方法(「初代培養肝細胞実験法」、学会出版センター発行、1987、pp. 29)に準じ、in situ collagenase灌流法により、肝細胞を分離した。得られた遊離肝細胞(生存率８８−９３％)を培地(ＷＥ培地、５％牛血清を含む)で２．５×１０5細胞／ｍｌに希釈し、コーニング社製２４穴培養プレートに０．５ｍｌを加え、３７℃で２４時間培養を行った。その後無血清培地に交換し、５ｍＭの四塩化炭素(最後濃度)を加え、各濃度のハイドロキシプロリン誘導体(Hyp Ser及びHyp Ser OH)を添加し、さらに２４時間培養した。その後、培地を収集し、培地中におけるＧＯＴ(glutamic-oxaloacetic transaminase)及びＬＤＨ(lactic dehydrogenase)濃度を酵素測定キット(和光純薬社製)を用い測定した。なお、比較例として、肝細胞に対して増殖・保護作用をすることが知られている肝実質細胞増殖因子、ＨＧＦ）を用い、同様な試験を行った。
試験結果を図１０（ＧＯＴ）及び図１１（ＬＤＨ）に示す。図中の測定値は３サンプルの平均値±標準誤差である。有意差検定はstudent t-testにより行い、コントロールに対して＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。
図１０及び１１に示されるように、本発明のハイドロキシプロリン誘導体を添加することにより、肝逸脱酵素量が低減し、本発明のハイドロキシプロリン誘導体は肝細胞保護作用を有することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト胎盤水解物（ラエンネック）をＨＰＬＣで分画した結果（Ａ）及び各画分の細胞増殖活性（Ｂ）を示す図である。
【図２】Ｆｒ．１をＨＰＬＣで分画した結果（Ａ）及び各画分の細胞増殖活性（Ｂ）を示す図である。
【図３】Ｆｒ．１−３をＨＰＬＣで分画した結果（Ａ）及び各画分の細胞増殖活性（Ｂ）を示す図である。
【図４】本発明の化合物のＢＨＫ−２１細胞に対する細胞増殖活性を示す図である。
【図５】本発明の化合物を投与したＡＮＩＴ処理ラットの血清中肝逸脱酵素(ＧＰＴ）の測定結果を示す図である。
【図６】本発明の化合物を投与したＡＮＩＴ処理ラットの血清中肝逸脱酵素(ＡＬＰ)の測定結果を示す図である。
【図７】本発明の化合物を投与したＡＮＩＴ処理ラットの血清中肝逸脱酵素(ＬＡＰ)の測定結果を示す図である。
【図８】本発明の化合物を投与したＡＮＩＴ処理ラットの血清中肝逸脱酵素(γ−ＧＴＰ)の測定結果を示す図である。
【図９】本発明の化合物を投与したＡＮＩＴ処理ラットの血清中ビリルビン(ＢＩＬ)の測定結果を示す図である。
【図１０】四塩化炭素処理した初代培養ラット肝細胞培地に本発明の化合物又はＨＧＦを添加したときの肝逸脱酵素(ＧＯＴ)の測定結果を示す図である。
【図１１】四塩化炭素処理した初代培養ラット肝細胞培地に本発明の化合物又はＨＧＦを添加したときの肝逸脱酵素(ＬＤＨ)の測定結果を示す図である。
【図１】
0003969831.tif 000008
【図２】
0003969831.tif 000009
【図３】
0003969831.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0003969831.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
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