(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡ及びそのＤＮＡ断片を解析し，該水痘ウイルスサンプルが次の（Ａ１）〜（Ａ８）の８つの要件の全てを満足することを基準として判定することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の同定法。
（Ａ１）水痘ウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素HpaI断片Ｋのサイズが３２３１ｂｐである；
（Ａ２）水痘ウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素EcoRI断片Ｐのサイズが１７４９ｂｐである；
（Ａ３）配列番号３のプライマー(1)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片が制限酵素AccIIIにより２つに分断され、該２断片のサイズがそれぞれ１２０８ｂｐと５５６ｂｐである；
（Ａ４）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片のサイズが４８７ｂｐである；
（Ａ５）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により決定される、水痘ウイルスゲノムＤＮＡと弱毒生水痘ワクチンウイルス岡株ゲノムＤＮＡとの間の両ＤＮＡ断片の電気泳動の移動度が同一である；
（Ａ６）配列番号７のプライマー(PS1)と配列番号８のプライマー(PS2)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片が制限酵素PstIサイトを有さない；
（Ａ７）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対応する、水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡがコードする１６２個のアミノ酸と、配列番号１のアミノ酸配列との間のホモロジーが１００〜９８％である；及び
（Ａ８）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対応する、水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡがコードする５６０個のアミノ酸と、配列番号２のアミノ酸配列との間のホモロジーが１００〜９９％である。
【請求項２】
次の（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれる１組のプライマー。
（ａ）配列番号３のプライマー(1)と配列番号５のプライマー(3)からなる１組。
（ｂ）配列番号３のプライマー(1)と配列番号６のプライマー(4)からなる１組。
（ｃ）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)からなる１組。
（ｄ）配列番号７のプライマー(PS1)と配列番号８のプライマー(PS2)からなる１組。
【請求項３】
弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法であって、請求項１の同定法を実施し、要件（Ａ１）〜（Ａ８）の全てを満足する水痘ウイルスを弱毒生水痘ワクチンの有効成分として用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、弱毒生水痘ワクチンの有効成分である弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の新規で且つ確実な同定法、該同定法により同定された上記岡株とその抗原、及び該同定法を有利且つ効果的に行うための新規なプライマーに関するものである。
従来技術
衆知の通り、現行の弱毒生水痘ワクチンは、弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭５３−４１２０２号；又は米国特許第３，９８５，６１５号）に由来のウイルスをシードとして製造され、世界の諸国で広く実用に供されている［Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984:WHO Technical Report Series、No.725,pp.102-124,1985］。また、かかるワクチンの安全性と有効性とを確保するため、ワクチン製造での継代によるウイルスの遺伝的変異を考慮し、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限、即ち、シード承認時の継代数を０代としてそこから総継代数１０代以内のウイルスをワクチンに用いることを義務づけるシードロットシステムが制定されている。換言すれば、弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証は、各ワクチン製造者によるシードロットシステムの遵守に依存し、シードウイルスやワクチンウイルスのゲノムＤＮＡの直接的な遺伝子解析によるものではない。
一方、水痘ワクチンの効果の追跡や市販後調査（ＰＭＳ：Post-Marketing Surveillance）、また、疫学の観点から、自然感染による水痘患者から分離した水痘ウイルス新鮮野外株と上記岡株に由来のワクチン株との間のウイルス学的相違の解析が必要となり、種々試みられている。ＶＺＶゲノム遺伝子とその構造が報告（Journal of General Virology,67,1759-1816,1986）されて以来、例えば、ＶＺＶ株間のＤＮＡ塩基配列の違い（Journal of Virology,59,660-668,1986）、制限酵素ＰstＩサイトの有無（Japanese Journal of Experimental Medicine,59,233-237,1989）、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を用いるＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）に基づく判定（Journal of Virology,66,1016-1020,1992）、上記ＰstＩサイトの有無とＰＣＲ産物のＲＦＬＰとの組合わせ（Journal of Clinical Microbiology,33,658-660,1995）等による試行が報告されている。しかし、これ等はいずれも信頼性に欠け確定的ではない。
換言すれば、現行の水痘ワクチンの品質管理、品質保証、効果追跡、ＰＭＳ、並びに水痘の疫学のいずれの観点からも、弱毒生水痘ワクチンの有効成分である前記弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の同定ないし確定は、極めて重要である。しかし、上述の通り、未だその方法は確立されておらず、解決すべき急務の課題として残されていた。
発明の概要
このような状況下にあって、本発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株を確実に且つ比較的迅速に同定する新規な方法を開発すべく鋭意研究を行なった。即ち、本発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株及び弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株と、上記岡株及びその上記由来株以外の種々の水痘ウイルス株、例えば公知株及び新鮮野外株、のウイルス株との間のゲノムＤＮＡの差異を調べるための広汎なな遺伝子解析を行なった。その結果、或る水痘ウイルス株が後記する特定の８つの要件のすべてを満足するか否かを評価決定することによって、満足するものが弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株である目的株であり、該８つの要件の１つでも満足しないものは上記目的株ではないことを、確実に且つ比較的迅速に同定できることを知見した。本発明はこの知見に基いて完成されたものである。
しかして、本発明の１つの目的は、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株を確実に且つ比較的迅速に同定する新規な方法を提供することである。
本発明の他の１つの目的は、上記の同定方法により同定された弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルス株として許容されるその由来株と実質的に同一のウイルス株を提供することである。
本発明の更に他の１つの目的は、上記の同定方法により同定された弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルス株として許容されるその由来株と実質的に同一のウイルス株を有効成分として免疫を奏する量含有する弱毒生水痘ワクチンを提供することである。
本発明の更に他の１つの目的は、本発明によりはじめて得られた。弱毒水痘ウイルス岡株のゲノムＤＮＡの或る特定の領域のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列のうちの少なくとも１部を含有する弱毒水痘ウイルス抗原を提供することである。
本発明の更に他の１つの目的は、上記同定法を有利且つ効果的に行うための新規なプライマーを提供することである。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表及び図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
本発明に用いられる用語の定義と説明
（１）ＶＺＶ：水痘及び帯状疱疹の原因となるウイルスであり、屡々単に水痘ウイルスと呼ばれる水痘・帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus)の略語である。本発明の同定方法は、水痘患者及び帯状疱疹患者のいずれから単離されるウイルス株に対しても用いることが可能である。
（２）水痘ワクチン：ＶＺＶ感染又は該感染による発症の予防に有効なワクチン。
（３）弱毒岡株：弱毒水痘ウイルス岡株を意味する（日本国特公昭５３−４１２０２号及び米国特許第３，９８５，６１５号参照）。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣ（American Type Culture Collection;12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852 USA）に寄託されている。
（４）弱毒水痘ワクチンウイルス：製造承認された水痘シードウイルス（ＷＨＯ Technical Report Series No.725,pp.107〜108,1985参照）の継代数を０代とした時の総継代数が１０代以内であり、水痘ワクチンの有効成分として用いることが可能な弱毒水痘ウイルスを意味する。
（５）ＶＺＶ遺伝子番号（Gene14及びGene38）と該遺伝子のＤＮＡの塩基番号：Davison & Scottの報告（Journal of General Virology,67,1759-1816,1986）に基づく。
（６）制限酵素断片のサイズ（bp）：cohesive endを生じる制限酵素で切断されるＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片のサイズは、制限酵素の切断部位に基づき算出する。例えば、制限酵素Ｅの切断部位が第１０番塩基及び第６０番塩基の２カ所である場合、得られるＤＮＡの制限酵素Ｅ断片は６０−１０＝５０より５０ｂｐと表記する。
（７）ＨＫ断片：図１のＨpaＩ−Ｋ（Journal of Infectious Diseases,149,956-963,1984；制限酵素ＨpaＩによるＶＺＶゲノムＤＮＡのＫ断片）の略語である。
（８）ＥＰ断片：図１のＥcoＲＩ−Ｐ（Journal of Virology,59,660-668,1986；制限酵素ＥcoＲＩによるＶＺＶゲノムＤＮＡのＰ断片）の略語である。
（９）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism解析法の略語であり、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をＳＳＣＰ（Proceedings of National Academy of Sciences,USA.,86,2766-2770,1989）で解析する方法である。
（１０）Ｒ２−４８７領域：ＶＺＶのGene14の繰り返し配列Ｒ２を含む領域であり、表１に記載のＰＣＲプライマー(２)及び(３)を用いたＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片である。弱毒水痘ウイルス岡株のＲ２−４８７領域のサイズは４８７ｂｐである。
（１１）Ｒ２−１７６４領域：ＶＺＶのGene14の繰り返し配列Ｒ２を含む領域であり、表１に記載のＰＣＲプライマー(１)及び(３)を用いたＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片である。弱毒水痘ウイルス岡株のＲ２−１７６４領域のサイズは１７６４ｂｐである。
（１２）プライマー：本発明で用いるＰＣＲのプライマーの名称と各ＤＮＡ塩基配列［左（５’）から右（３’）方向へ記載］を次の表１に示す。
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前記したように、本発明は、弱毒岡株ウイルスまたは弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株と、該岡株及びその上記由来株以外のＶＺＶ株、例えば、公知株、新鮮野外株等のウイルスとの間のゲノムＤＮＡの差異を調べるための遺伝子解析の結果に基づき完成されたものであり、その遺伝子解析の概要は次の（ａ）〜（ｅ）に記載の通りである（図１参照）：
（ａ）ＶＺＶゲノムＤＮＡのＨＫ断片及びＥＰ断片の各サイズ（bp）を測定する；
（ｂ）ＶＺＶGene14のＲ２−１７６４領域をＰＣＲで増幅し、得られるＶＺＶゲノムＤＮＡ断片が制限酵素ＡccIII［A Practical Guide to Molecular Cloning,Second Edition(1988)］で２つに分断されることを確認すると共に、該２断片のサイズを測定する；
（ｃ）ＶＺＶGene14のＲ２−４８７領域をＰＣＲで増幅し、得られるＶＺＶゲノムＤＮＡ断片のサイズを測定すると共に、該領域をＰＣＲ−ＳＳＣＰにより解析する。更に、該領域ＤＮＡの塩基配列を決定する；
（ｄ）ＶＺＶGene38の一部領域をＰＣＲで増幅し、得られるＶＺＶゲノムＤＮＡ断片が、制限酵素ＰstＩで２つに分断されない、又はＰstＩで２つに分断される、即ち、ＰstＩサイトの有無を、制限酵素ＰstＩ処理前後のＤＮＡサイズを測定することにより確認する；及び
（ｅ）ＶＺＶGene14のORF（open reading frame）全領域をＰＣＲで増幅し、その塩基配列を決定する。
本発明は、上述（ａ）〜（ｅ）の結果に基きなされたものである。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、弱毒岡株ゲノムＤＮＡのＲ２−４８７領域の塩基配列と、該配列をUniversal Codeで判読したアミノ酸配列（162アミノ酸残基）であり；
配列番号２は、弱毒岡株ゲノムＤＮＡのGene14のORF全領域の塩基配列（1683bp）と、該配列をUniversal Codeで判読したアミノ酸配列（560アミノ酸残基）であり；
配列番号３〜８は、弱毒水痘ウイルス岡株の同定に用いられるＶＺＶゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片を得るために用いられるＰＣＲプライマーである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＶＺＶゲノムＤＮＡ（約125kb）におけるGene14の位置、及び弱毒岡株ゲノムＤＮＡの各制限酵素断片の位置とサイズ、並びに本発明で用いるプライマーの塩基配列であり；
図２Ａ及び図２Ｂは、弱毒岡株、Davison & Scottの報告（Journal of General Virology,67,1759-1816,1986）及びKinchingtonらの報告（Journal of Virology,59,660-668,1986）の３者間のＶＺＶゲノムＤＮＡGene14の全ＯＲＦの塩基配列の比較（図２Ａ）、並びに各塩基配列をUniversal Codeで判読したアミノ酸配列の比較（図２Ｂ）である。
発明の詳細な説明
本発明によれば、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の新規で且つ確実な同定方法が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡ及びそのＤＮＡ断片を解析し、該水痘ウイルスサンプルが次の（Ａ１）〜（Ａ８）の８つの要件の全てを満足することを基準として判定することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の同定法。
（Ａ１）水痘ウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素ＨpaＩ断片Ｋのサイズが３２３１ｂｐである；
（Ａ２）水痘ウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素ＥcoＲＩ断片Ｐのサイズが１７４９ｂｐである；
（Ａ３）配列番号３のプライマー(1)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片が制限酵素ＡccIIIにより２つに分断され、該２断片のサイズがそれぞれ１２０８ｂｐと５５６ｂｐである；
（Ａ４）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片のサイズが４８７ｂｐである；
（Ａ５）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)とを用いるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により決定される、水痘ウイルスゲノムＤＮＡと弱毒生水痘ワクチンウイルス岡株ゲノムＤＮＡとの間の両ＤＮＡ断片の電気泳動の移動度が同一である；
（Ａ６）配列番号７のプライマー(PS1)と配列番号８のプライマー(PS2)とを用いるＰＣＲ法で増幅される水痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片が制限酵素ＰstＩサイトを有さない；
（Ａ７）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対応する、水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡがコードする１６２個のアミノ酸と、配列番号１のアミノ酸配列との間のホモロジーが１００−９８％である；及び
（Ａ８）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対応する、水痘ウイルスサンプルのウイルスゲノムＤＮＡがコードする５６０個のアミノ酸と、配列番号２のアミノ酸配列との間のホモロジーが１００−９９％である。
２．前項１に記載の同定法により同定された弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルス株として許容されるその由来株と実質的に同一のウイルス株。
３．前項１に記載の同定法により同定された弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒生水痘ワクチンウイルス株として許容されるその由来株と実質的に同一のウイルス株を有効成分として免疫を奏する量含有する弱毒生水痘ワクチン。
４．配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも３個の連続したアミノ酸配列を有する弱毒水痘ウイルス抗原。
５．次の（a）〜（ｄ）よりなる群から選ばれる１組のプライマー。
（ａ）配列番号３のプライマー(1)と配列番号５のプライマー(3)からなる１組。
（ｂ）配列番号３のプライマー(1)と配列番号６のプライマー(4)からなる１組。
（ｃ）配列番号４のプライマー(2)と配列番号５のプライマー(3)からなる１組。
（ｄ）配列番号７のプライマー(PS1)と配列番号８のプライマー(PS2)からなる１組。
以下、本発明について具体的に説明する。
尚、本発明において、ＤＮＡ塩基配列中のＡはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
また、本発明において、アミノ酸配列中のＡｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリンである。
（１）ＨＫ断片及びＥＰ断片の調製とサイズの測定：
弱毒岡株ウイルス、また、自然感染した水痘患者の水疱液等を接種し培養した感染細胞からＶＺＶゲノムＤＮＡを抽出精製する。抽出した各ＤＮＡを制限酵素ＨpaＩ又はＥcoＲＩで消化し調製したＤＮＡ断片のサイズをそれぞれ、アガロースゲル電気泳動で測定する。尚、ＶＺＶの培養には、例えば、WI-38細胞やMRC-5細胞等を用いることができる。また、新鮮野外株ウイルスゲノムＤＮＡを増幅・調製するための被検体としては、自然感染による発症後３日以内の水痘患者から採取した水疱液の使用が望ましい。
（２）ＰＣＲプライマーの調製：
ＶＺＶゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲで増幅しようとする目的領域の一方の鎖及び相補鎖（例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖）の塩基配列に相当する連続した約15-30塩基からなるポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成装置により合成して１組とし、ＰＣＲプライマーとして該１組を同時に使用する。尚、プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列の採用には、従来技術の項で前述した既報を参考にできる。しかしながら、本発明のプライマーを用いることが好ましい。本発明のプライマーを用いることにより、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるその由来株の同定を行う際に解析するゲノムＤＮＡ断片を、容易且つ高い効率で得ることができる。
（３）Ｒ２領域の調製、サイズ（bp）の測定及び塩基配列の解析：
前記の水痘患者水疱液から直接、ＶＺＶゲノムＤＮＡを抽出した後、抽出したＤＮＡのＲ２−４８７領域及びＲ２−１７６４領域をＰＣＲで増幅し、調製した各ＤＮＡ断片のサイズをアガロースゲル電気泳動で測定する。塩基配列の解析は、常法、例えば、Dideoxy法、Cycle Sequence Kit（日本国、宝酒造社製）等により行うことができる。
ＶＺＶGene14ＯＲＦ全領域についても上記と同様にして調製し、その塩基配列の解析を行うことができる。弱毒水痘ウイルス岡株のGene14のＯＲＦ全領域の塩基配列を配列番号2に記載した。この配列は本願発明者らによって初めて開示されたものである。
尚、Ｒ２は、上記Gene14の一部分を占める繰返し配列であって、また、ＨＫ及びＥＰ両断片の一部分でもある（図１参照）。増幅したＲ２−１７６４領域については、制限酵素ＡccIIIを用いるＲＦＬＰも採用できる。
（４）ＰstＩサイト領域の調製とＰstＩサイトの有無の判定：
前記の水痘患者水疱液から直接、水痘ウイルスゲノムＤＮＡを抽出の後、各ＤＮＡのＰstＩサイト領域（647 bp）をそれぞれ、ＰＣＲで増幅し、調製した各被検体をＰstＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動にかけ、647 bpのＰstＩサイト領域が、290bpと357bpの２つに分断される否かを判定する。かかる分断はＰstＩサイトの存在を意味する。弱毒岡株のゲノムＤＮＡは、ＰstＩサイトを有しないので、分断されない。
（５）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ：
ＶＺＶゲノムＤＮＡのＲ２−４８７領域を、５’末端を32Ｐで標識したプライマーを用いるＰＣＲで増幅の後、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、その泳動パターンを比較することにより行う。
（６）弱毒岡株を用いるワクチン：
本発明により同定される弱毒岡株ウイルスは、水痘ワクチンの有効成分として適格であり、水痘ワクチンとして提供できる。
（７）診断剤に用いる抗原としての弱毒水痘ウイルス岡株のgpV：
図２からも明らかなように、本発明により同定される弱毒水痘岡株ウイルスは、弱毒水痘ウイルス岡株に特有のアミノ酸配列(配列番号２に記載)を有する。従って、弱毒水痘ウイルス岡株ゲノムのGene14がコードするgpV（glycoprotein V）は、例えば、診断用の抗原として有利に用いることができる。例えば、本発明の抗原を用いた皮内反応により、弱毒生水痘ワクチン接種の必要性の有無を診断することができる。本発明の弱毒水痘ウイルス抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも３個の連続したアミノ酸配列、好ましくは５個の連続したアミノ酸配列、更に好ましくは７個の連続したアミノ酸配列を有することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例をあげ、本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これ等の実施例にのみ限定されるものではない。
実施例１
弱毒岡株を比較対照として用い、ＶＺＶ野外株である河口株及び自然感染による水痘患者９例の各水疱液から分離した新鮮野外株９検体、合計１０検体について、次の試験を行った。
試験（１）ＨＫ断片サイズの測定：
弱毒岡株及び河口株各ウイルス、並びに自然水痘患者の水疱液９検体をそれぞれＭＲＣ−５細胞に接種し培養した各感染細胞（１０6 cells）を低速遠心（４００×ｇ、４℃、５分）にて集め凍結融解し、これを後述のlysis buffer５．０mlに懸濁し、DNaseＩ及びRNase Aを各５０μgずつ加え、３７℃で３０分間反応させた後、１０分間氷冷する。これにtrichloro-trifluoroethane２．５mlを加え６分間、激しく撹拌の後、低速遠心（４００×ｇ、４℃、１５分）し、その上清を採取する。更に、その上清を不連続密度勾配［glycerol濃度が５％（Ｖ／Ｖ）及び４０％（Ｖ／Ｖ）のlysis buffer各７．５mlからなる２層］の上に重層し、超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、７０分）する。その沈渣を０．５ｍｌのＳＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ［１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)；０．０５Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）；及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（２Ｎａ）］に再浮遊させた後、５００μｇのproteinase Kを添加混合して６５℃、３時間にて消化する。各ＶＺＶゲノムＤＮＡは、該消化液から水飽和フェノール抽出を3回繰り返した後、エタノール沈殿（−７０℃）により精製した。
Lysis bufferの組成
50mM Tris-HCl buffer(pH７．４)［Tris:Tris(hydroxymethyl)aminomethane］中の各溶質の濃度は次の通り：
3mM塩化カルシウム；
5mM酢酸マグネシウム；
125mM塩化カリウム；
1mM EDTA(2Na)(disodium ethylenediaminetetraacetate)；
1mM DTT（dithiothreitol）；
0.5％(W/V)SDC(sodium deoxycholate)；及び
0.5％(W/V)Nonidet P-40［米国、Sigma Chemical Company社製］。
次に各ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨpaＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（ＨＫ断片）のサイズをそれぞれ、０．５％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動で測定した。その結果、弱毒岡株のＨＫ断片のサイズは3231bpであり、１０検体中３例がこれと同サイズであった。
試験（２）ＥＰ断片サイズの測定：
制限酵素ＥcoＲＩを用いる以外は、上記試験（１）と同様にして各ウイルスのＤＮＡ断片（ＥＰ断片）の調製及び電気泳動によるサイズの測定を行った。その結果、弱毒岡株のＥＰ断片のサイズは1749bpであり、１０検体中３例がこれと同サイズであった。
試験（３）Ｒ２−４８７領域サイズの測定及び塩基配列の解析：弱毒岡株及び河口株各ウイルスのＤＮＡ断片は、該各ウイルスの感染細胞の培養液より調製した。新鮮野外株９検体のゲノムＤＮＡは水痘患者水疱液から直接調製した。具体的には、ＶＺＶゲノムＤＮＡを、最終濃度5.5M guanidine thiocyanate溶液で可溶化させ、フェノール、及びクロロホルム／イソアミルアルコール抽出の後、イソプロピルアルコール沈殿により精製した。得られた各ゲノムＤＮＡの断片を各々、表１に記載のプライマー（２）と（３）とを組合わせて用いたＰＣＲ法で増幅・調製の後、各該領域のサイズを4％（W/V）アガロースゲル電気泳動で測定した。その結果、岡ワクチン株のＲ２−４８７領域のサイズは487bpであり、１０検体中５例がこれと同サイズであった。
また、該領域の塩基配列の解析をCycle Sequence Kit（日本国、宝酒造社製；説明書Code No.Ｒ014）を用いて行った。更に、塩基配列ホモロジー、及び該配列をUnivesal Codeで判読したアミノ酸配列のホモロジーを、GENETYX遺伝子解析用ソフト(ver.9.0)［日本国、Software Development Co.,Ltd.社製］により解析した。その結果を配列番号１に示す。
弱毒岡株と１０検体の各株との間のＲ２−４８７領域の塩基配列の比較では、いずれも４か所以上、塩基が相違し、しかも、これ等の塩基の相違はアミノ酸（162コドン；162＝487/3）の変異を伴っていた。即ち、弱毒岡株と10検体の各株との間のアミノ酸配列ホモロジーは98％［487bp/3＝162コドン；(162-4)/162×100＝97.5＜98］未満であった。
試験（４）Ｒ２−１７６４領域サイズの測定：
上記試験（３）と同様にして各ウイルスのＤＮＡ断片を調製し、表１に記載のプライマー（１）と（３）とを組合わせて用いたＰＣＲ法でＲ２−１７６４領域を増幅・調製した。調製した各Ｒ２−１７６４領域を制限酵素ＡccIIIで消化の後、各領域のサイズを4％(W/V)アガロースゲル電気泳動で測定した。その結果、弱毒岡株のＲ２−１７６４領域はＡccIIIにより1208bpと556bpの２つの断片に分断され、これと同様の分断は１０検体中５例において確認された。
試験（５）ＰstＩサイトの有無の判定：
弱毒岡株及び河口株各ウイルスのＤＮＡ断片は、該各ウイルスの感染細胞の培養液より調製した。新鮮野外株９検体のゲノムＤＮＡは水痘患者水疱液から直接調製した。具体的には、ＶＺＶゲノムＤＮＡを上記試験（３）と同様にして抽出の後、各ＤＮＡのＰstＩサイト領域（647bp）をそれぞれ、表１に記載のプライマー(PS1)と(PS2)とを組合わせて用いたＰＣＲで増幅し、増幅した各被検体のＤＮＡ断片を制限酵素ＰstＩで消化した後、4％(W/V)アガロースゲル電気泳動にかけ、該領域の有無を判定した。その結果、弱毒岡株と河口株の該領域（647bp）は、ＰstＩにより２断片に分断されず、ＰstＩサイトを有さないことが確認された。一方、残り９検体はいずれも、290bpと357bpの２つの断片に分断され、ＰstＩサイトの存在が確認された。
試験（６）ＰＣＲ−ＳＳＣＰによる解析：
Ｒ２−４８７領域を上記試験（３）と同様にして増幅・調製した。但し、ＰＣＲに用いたプライマー（２）と（３）の各5'末端を32Ｐで標識して用いた。ＰＣＲ産物は、熱変性（９５℃、２分）の後、5％(W/V)ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、各ＤＮＡ断片の移動度を測定した。その結果、弱毒岡株と同じ移動度を示す検体は皆無であり、１０検体の全てが弱毒岡株と異なることが確認された。
試験（７）弱毒岡株ゲノムＤＮＡGene14の塩基配列の解析：
Gene14のＯＲＦ全領域を、プライマー（１）と（４）とを組合わせて用いるＰＣＲで増幅・調製した後、ＤＮＡシークエンサー［米国、LI-cor社製］により塩基配列の解析を行った。その結果を配列番号２に示す。
更に、上記試験（３）と同様にして、上記結果と２つの既報（Davison & Scott,Journal of General Virology,67,1759-1816,1986及びKinchington et al.,Journal of Virology,59,660-668,1986）の配列との間の各ホモロジー解析を行った。その結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。この図２Ａにおいて、弱毒岡株のアミノ酸配列と２つの既報配列の間にアミノ酸の相違が8か所及び9か所それぞれ存在し、アミノ酸配列ホモロジーはいずれも、99％［(560-8)/560×100＝98.6及び(560-9)/560×100＝98.4］未満であることが判明した。また、上記２つの既報のＶＺＶ株には上記試験（５）の制限酵素ＰstＩサイトがいずれも存在することが確認された。
以上の試験（１）〜（７）の結果のまとめを表２に示す。
0003871346.tif 000003
以上の結果に基づき、弱毒岡株の特性を組合わせて用いることにより、弱毒岡株とＶＺＶ他株とを非常に高い正確さで区別することができ、弱毒岡株が同定された。
産業上の利用可能性
本発明は、現行の弱毒生水痘ワクチンの製造における品質管理と品質保証の精度を高めることができる。更に、予防接種効果の追跡調査とＰＭＳ、並びに水痘・帯状疱疹の疫学に係る研究における極めて正確かつ有用な技術を提供し、これ等を強力に促進させる。ひいては、水痘・帯状疱疹の予防対策に正確さと福音をもたらし、人類の保健に多大に寄与する。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：４８７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
起源
生物名：水痘帯状疱疹ウイルス（varicella-zoster virus）
株名：弱毒水痘ウイルス岡株
配列
0003871346.tif 000004
配列番号：２
配列の長さ：１６８３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
起源
生物名：水痘帯状疱疹ウイルス（varicella-zoster virus）
株名：弱毒水痘ウイルス岡株
配列
0003871346.tif 000005
0003871346.tif 000006
0003871346.tif 000007
0003871346.tif 000008
0003871346.tif 000009
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
0003871346.tif 000010
配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
0003871346.tif 000011
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
0003871346.tif 000012
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
0003871346.tif 000013
配列番号：７
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
0003871346.tif 000014
配列番号：８
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ  ＰＣＲ用プライマー
配列
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【図１】
0003871346.tif 000016
【図２Ａ】
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0003871346.tif 000018
0003871346.tif 000019
【図２Ｂ】
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0003871346.tif 000022