(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９残基からなるアミノ酸配列、該７４９残基からなるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列、配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１８４〜９５０の７６７残基からなるアミノ酸配列、または該７６７残基からなるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列を含み、かつ下記理化学的性質を有するα−アガラーゼ：
（１）作用：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する；
（２）基質特異性：アガロース、アガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用し、アガロテトラオースに作用しない；
（３）至適温度：５５℃以下の温度で酵素活性を示す；
（４）熱安定性：４８℃、３０秒の処理後に２０％以上の活性を保持する。
【請求項２】
微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）由来の請求項１記載のα−アガラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２記載のα−アガラーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）由来の請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９残基からなるアミノ酸配列、または該７４９残基からなるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列を含むα−アガラーゼをコードする請求項３または４記載の遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１８４〜９５０の７６７残基からなるアミノ酸配列、もしくは該７６７残基からなるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列を含むα−アガラーゼをコードする請求項３または４記載の遺伝子。
【請求項７】
配列表の配列番号１２に示される塩基配列のうちの塩基番号５２９〜２７７５の２２４７塩基からなる塩基配列、または該２２４７塩基からなる塩基配列に１個若しくは数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む請求項３または４記載の遺伝子。
【請求項８】
配列表の配列番号１３に示される塩基配列のうちの塩基番号５５０〜２８５０の２３０１塩基からなる塩基配列、または該２３０１塩基からなる塩基配列に１個若しくは数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む請求項３または４記載の遺伝子。
【請求項９】
請求項４、７または８記載の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ下記理化学的性質を有するα−アガラーゼをコードする遺伝子。
（１）作用：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する。
（２）基質特異性：アガロース、アガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用し、アガロテトラオースに作用しない。
（３）至適温度：５５℃以下の温度で酵素活性を示す。
（４）熱安定性：４８℃、３０秒の処理後に２０％以上の活性を保持する。
【請求項１０】
請求項３〜９のいずれか１項記載の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換えＤＮＡ分子を有する形質転換体。
【請求項１２】
微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）を培養し、培養物から該α−アガラーゼを採取することを特徴とする請求項１または２記載のα−アガラーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の形質転換体を培養し、該培養物からα−アガラーゼを採取することを特徴とする請求項１または２記載のα−アガラーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１または２記載のα−アガラーゼによりアガロースを分解し、該分解物よりアガロオリゴ糖を採取することを特徴とするアガロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、α−アガラーゼおよびその製造方法、さらに詳しくは、アガロースからの種々の生理活性を有する低重合度のアガロオリゴ糖の製造に有用なα−アガラーゼとその製造方法、ならびに該酵素の用途に関する。また、本発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。さらに詳しくは、アガロースからの種々の生理活性を有する低重合度のアガロオリゴ糖の製造に有用なα−アガラーゼのアミノ酸配列と、それをコードする塩基配列に関する。さらに、本発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。さらにまた、本発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドによるアガロオリゴ糖の製造方法に関する。
背景技術
寒天の主要構成成分であるアガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返してなる多糖である。寒天由来のオリゴ糖を製造するためには、このアガロースを分解し、低分子化しなければならないため、従来よりアガロースを化学的に分解する方法および酵素的に分解する方法が知られている。化学的に分解する方法では、酸を用いてアガロースを加水分解することができ、この場合、主としてα−１，３結合が切断される。また、アガロースを分解する酵素としては、アガロース中のβ−１，４結合を切断するβ−アガラーゼ、ならびにα−１，３結合を切断するα−アガラーゼの２種が知られている。
アガロース中のβ−１，４結合を切断して得られるオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、その還元末端はＤ−ガラクトースであり、その重合度は偶数である。一方、α−１，３結合を切断して得られるオリゴ糖はアガロオリゴ糖と呼ばれ、その重合度は偶数であり、その還元末端は３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースである。還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリゴ糖については、近年、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、α−グリコシダーゼ阻害作用等の生理活性を有することが明らかにされ（ＷＯ９９／２４４４７号明細書、特願平１１−１１６４６号明細書）、その生理作用により、該アガロオリゴ糖を有効成分として含有する医薬品や機能性飲食品の提供が可能となっている。
アガロースを化学的に分解する方法では、生産されるオリゴ糖の大きさを制御することが難しく、特に重合度の低い低分子オリゴ糖を選択的に作ることは極めて難しい（徳永隆久ら、バイオサイエンスとインダストリー、第４９巻、第７３４頁（１９９１）等）。また、β−アガラーゼはβ−１，４結合のみを切断するため、該酵素を用いた場合には、上記の生理活性を有しないネオアガロオリゴ糖しか得ることができない。
α−１，３結合を切断する活性を有するα−アガラーゼを使用することにより、生理活性を有するアガロオリゴ等を製造することが期待される。公知のα−アガラーゼとしては、海洋性のグラム陰性細菌ＧＪ１Ｂ株［カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６６巻、第２０７〜２１２頁（１９７８）、なお、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２１４巻、第５９９〜６０７頁（１９９３）には、該菌株はアルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株として記載されている］やビブリオ属細菌（特開平７−３２２８７８号公報、ＪＴ０１０７−Ｌ４株）の生産する酵素がある。しかしながら、アルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ糖を分解することができないため、生理活性が顕著なアガロビオースを生産することは不可能である。さらに、ビブリオ属細菌由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ糖にのみ活性を示す酵素であり、アガロースに対してはまったく作用しないために、アガロースを原料とするアガロオリゴ糖の製造に使用することはできない。
このように、従来の技術では、還元末端が３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであり、様々な生理活性を有するアガロビオース、アガロテトラオース等の低分子アガロオリゴ糖の製造に関して問題を有していた。
発明の目的
本発明の目的は、当該低分子アガロオリゴ糖の効率よい製造に使用することのできるα−アガラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、ならびに当該低分子アガロオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、上記の事情に鑑み、アガロースのα−１，３結合を切断し、かつ顕著な生理活性を有するアガロオリゴ糖を生成する酵素を得ることを目的として鋭意研究、探索を行った結果、この目的に適した性質の酵素を生産する２株の微生物を見出すことに成功し、これらの微生物の生産する酵素を単離し、理化学的、酵素学的性質を解明した。さらに、本発明者らは、該酵素の遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は新規のα−アガラーゼに関し、下記理化学的性質を有することを特徴とする：
（１）作用：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する；
（２）基質特異性：アガロース、アガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用し、アガロテトラオースに作用しない；
（３）至適温度：５５℃以下の温度で酵素活性を示す；
（４）熱安定性：４８℃、３０秒の処理後に２０％以上の活性を保持する。
上記α−アガラーゼとしては、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９残基からなるアミノ酸配列、または該７４９残基からなるアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも一つが導入されているアミノ酸配列を含む酵素、あるいは配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１８４〜９５０の７６７残基からなるアミノ酸配列、または該７６７残基からなるアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも一つが導入されているアミノ酸配列を含む酵素等が例示される。
本発明の第２の発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関し、第１の発明のα−アガラーゼをコードすることを特徴とする。該遺伝子としては、配列表の配列番号１２に示される塩基配列のうちの塩基番号５２９〜２７７５の２４７３塩基からなる塩基配列、または該２４７３塩基からなる塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも一つが導入されている塩基配列を含む遺伝子、あるいは配列表の配列番号１３に示される塩基配列のうちの塩基番号５５０〜２８５０の２３０１塩基からなる塩基配列、または該２３０１塩基からなる塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも一つが導入されている塩基配列を含む遺伝子等が例示される。
本発明の第３の発明は、第２の発明の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ第１の発明のα−アガラーゼをコードする遺伝子に関する。
本発明の第４の発明は、第２の発明または第３の発明の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明の第５の発明は、第４の発明の組換えＤＮＡ分子を有する形質転換体に関する。
本発明の第６の発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、該α−アガラーゼ産生能を有する微生物、例えば、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）が属する微生物属の微生物を培養し、該培養物から第１の発明のα−アガラーゼを採取することを特徴とする。微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαはいずれも、ブダペスト条約のもと、１９９９年１月２６日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１として寄託されている。
本発明の第７の発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、第５の発明の形質転換体を培養し、該培養物から第１の発明のα−アガラーゼを採取することを特徴とする。
さらに、本発明の第８の発明はアガロオリゴ糖の製造方法に関し、第１の発明のα−アガラーゼによりアガロースを分解し、該分解物よりアガロオリゴ糖を採取することを特徴とする。
発明の詳細な説明
本明細書において、オリゴ糖とは、２個以上１０個以下の単糖から構成され糖類をいい、アガロオリゴ糖とはＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返し、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。また、多糖類とは単糖およびオリゴ糖以外の糖をいう。
本発明のα−アガラーゼは、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する酵素であり、アガロースのような多糖、ならびにアガロヘキサオースのようなオリゴ糖のいずれにも作用することができるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）の生産するα−アガラーゼを挙げることができる。
微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαの生産するアガラーゼ１−７、および微生物ＴＫＲ４−３ＡＧαの生産するアガラーゼ４−３は、多糖、オリゴ糖中に存在する３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する酵素である。該酵素はアガロース、アガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖、およびネオアガロヘキサオース以上のネオアガロオリゴ糖に作用する。
上記の２種の酵素の活性測定方法および両酵素の理化学的、酵素化学的性質を以下に示す。
（１）酵素活性測定方法
本発明のα−アガラーゼの活性測定は、アガロースを基質として酵素反応を行った後、生じたアガロテトラオースの量を定量することにより行う。本明細書において、精製酵素標品および精製中の酵素の活性測定に用いられた酵素活性測定方法は詳しくは以下のとおりである。
０．２％のアガロース（宝酒造社製、Ｃｏｄｅ：５００３）溶液［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を調製し、この１８０μｌを基質として、酵素溶液２０μｌと混合し、４２℃で３０〜１２０分間、好ましくは６０分間反応させた後、６０℃で１分間加熱することによって反応を停止させる。この反応溶液３０μｌを、内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ  α−２５００（東ソー社製、Ｃｏｄｅ：１８３３９）なるカラムに供し、７０％アセトニトリル溶液を溶離液とし、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた時の約２６分の保持時間を示すピークとして酵素反応によって生じたアガロテトラオースを定量し、１０分間当たり１マイクロモルのアガロテトラオースを生じる酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
（２）至適ｐＨ
アガロースを基質とし、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、リンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．５）、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、７．５、８．８）を用いて調製した反応液に酵素を作用させた結果より、アガラーゼ１−７は中性から弱酸性、アガラーゼ４−３は弱アルカリ性から弱酸性でアガロース分解活性を示すことが明らかとなった。
（３）至適温度
本発明の酵素は５５℃以下の温度で酵素活性を示し、また、３０〜４８℃の範囲で高活性を示し、さらに、３７〜４２℃付近で最大活性を示す。
（４）熱安定性
４８℃、５０℃、６０℃で３０秒間処理した酵素標品の残存活性を測定した結果、アガラーゼ１−７は４８℃処理で２５％、アガラーゼ４−３は５０℃処理で２２％の活性を示した。
（５）分子量
１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、アガラーゼ１−７の分子量は約９５，０００と推定された。
また、アガラーゼ４−３については、グリセロール密度勾配を用いた平衡密度勾配遠心分離法と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとによって分子量の測定を行った。この結果、アガラーゼ４−３の分子量は、約８５，０００と推定された。
（８）エドマン分解法によるアミノ酸配列
エドマン分解法により決定されたアガラーゼ１−７のＮ末端アミノ酸配列はＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ、また、アガラーゼ４−３の配列はＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａであった。配列表の配列番号１および２に、それぞれアガラーゼ１−７およびアガラーゼ４−３のＮ末端アミノ酸配列を示す。
なお、下記に示すようにアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３をコードする遺伝子は共に単離されており、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列も決定されている。アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号１４、１５にそれぞれ示す。配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９アミノ酸からなるポリペプチド、並びに配列番号１５のアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１８４〜９５０の７６７アミノ酸からなるポリペプチドは、それぞれ本発明のα−アガラーゼ活性を示す。
本発明のα−アガラーゼは、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）を培養し、該培養物から精製することができる。ＴＫＲ１−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαは、寒天資化性の細菌として海水中から分離されたものであって、下記の菌学的性質を有するものである。
菌学的性質：
（１）形態
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）１００ｍｌを調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ：０１２３−１７−３）を０．３ｇ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製：Ｃｏｄｅ，０１２７−１７−９）を０．０２ｇ加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、寒天（ナカライテスク社製、Ｃｏｄｅ：０１０−２８）を０．１ｇ加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、上記微生物を接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。該培養液に生育した細胞は、ＴＫＲ１−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαのどちらのものも桿菌であり、また、運動性を有していた。
（２）生育状態
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）１００ｍｌを調製し、これにペプトンを０．３ｇ、酵母エキスを０．０２ｇ加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。これに寒天（ナカライテスク社製、Ｃｏｄｅ：０１０−２８）１．５ｇを加え、オートクレーブした後に平板培地とした。この培地に上記の微生物を接種したところ、
（イ）２３〜３０℃で良好に生育する、
（ロ）菌体の生育に従って、寒天ゲルは液化される、
ことが示された。
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）１００ｍｌを調製し、これにペプトンを０．３ｇ、酵母エキスを０．０２ｇ加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムで種々のｐＨに調整した。これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、寒天０．１ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、上記微生物を接種したところ、
（ハ）ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５において旺盛に生育する、
ことが示された。
ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαは、ブダペスト条約のもと、１９９９年１月２６日（原寄託日）より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１として寄託されている。
上記微生物について、菌株によって特異的な塩基配列を持つことが知られている、１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を解析することにより、その分類学上の位置に関する情報を得ることができる。すなわち、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαの菌株から染色体ＤＮＡを抽出し、上記の遺伝子、またはその一部の領域を増幅可能なプライマーを使用したＰＣＲを実施する。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、該配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースを利用したホモロジー検索を行うことにより、上記の領域において類似した塩基配列を有する微生物、すなわち分類学的に近縁に位置する微生物を知ることができる。
ブレッティン・オブ・ジャパニーズ・ソサエティ・オブ・ミクロビアル・エコロジー（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第３１〜４２頁（１９９５）に記載の方法により、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来のＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲには上記文献に記載のプライマー２７ｆおよび１４９２ｒを使用した（配列表の配列番号１６および１７に、それぞれプライマー２７ｆおよび１４９２ｒの塩基配列を示す）。得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、上記の領域に関して、本発明のα−アガラーゼを生産する微生物との間に９５％程度のホモロジーをもつものとして以下のものが見い出された。
ＴＫＲ１−７ＡＧα：Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｌｉｋｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＴＫＲ４−３ＡＧα：Ｍａｒｉｎｅ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ  ＩＣ０７９
上記微生物の培養に用いる培地には、当該微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、寒天、アガロース等を炭素源として含むものを用いることができる。寒天、アガロースは、市販のものを用いることができる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源は寒天、アガロース以外の炭素源としても使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いることができる。
特に好適には、人工海水であるジャマリンＳなる培地に、ペプトン、酵母エキス、寒天またはアガロースを加えた培地を用いることができる。寒天またはアガロースの濃度は０．１〜２．０％が好ましい。寒天またはアガロースの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能であるが、酵素生産を目的とする場合は濃度０．１〜０．３％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは濃度１．２〜２．０％の固体培養が好ましい。なお、低融点アガロースを液体培養に用いる場合には、０．１〜１．０％の濃度で使用することができる。
培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、培養温度は２３〜３０℃、好ましくは２５℃、培地のｐＨはｐＨ７．０〜８．５、好ましくは７．２〜８．２、培養時間は１２〜４８時間、好ましくは２４〜３６時間である。
以上のようにして培養中に産生された本発明のα−アガラーゼは、菌体外に分泌されるので、培養終了後、菌体を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去して培養液上清を得る。
得られた培養液上清を、真空濃縮法または限外濾過法を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状酵素として粗酵素標品を調製することができる。また、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のα−アガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
このようにして得られた培養液または種々の精製度の本発明のα−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはアガロースを基質として反応させることにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース等のアガロオリゴ糖を製造することができる。
アガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返してなる多糖である。β−アガラーゼは、このアガロースのβ−１，４結合を加水分解する酵素である。該酵素によって生成する、還元末端にＤ−ガラクトースを有するオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、アガロオリゴ糖に見られるような生理活性を示さない。アガロースのα−１，３結合を切断するα−アガラーゼを用いた場合には、還元末端が３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであるアガロオリゴ糖を製造することが可能である。α−アガラーゼは、これまでにアルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株由来、ビブリオ属細菌（ＪＴ０１０７−Ｌ４株）由来の２種の酵素が知られている。ところが、アルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株の生産するα−アガラーゼはアガロヘキサオース以下のオリゴ糖に作用することができず、一方、ビブリオ属細菌由来のα−アガラーゼはアガロースを分解することができない。すなわち、従来公知のα−アガラーゼでは、アガロースを原料としたアガロビオース、アガロテトラオースの効率の良い生産は不可能であった。
本発明のα−アガラーゼは、上記理化学的性質から明らかなように、アガロース、ならびにアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用する酵素であるため、アガロースに作用してアガロオリゴ糖を生成し、さらにこうして生じたアガロヘキサオース中の一ヶ所のα−１，３結合を切断することも可能である。すなわち、本発明のα−アガラーゼをアガロースに作用させることによって、従来の方法では殆ど生成されなかった２糖と４糖であるアガロビオースとアガロテトラオースを大量に得ることが可能となる。
従来公知のα−アガラーゼと本発明のα−アガラーゼの基質特異性を表１に示す。表中、＋はその基質を分解できることを、また、−は分解できないことをそれぞれ示す。
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なお、本発明のα−アガラーゼは、アガロヘキサオースに作用してアガロビオースとアガロテトラオースとを生成する。
本発明のα−アガラーゼを使用して生産されたアガロオリゴ糖はアガロビオース、アガロテトラオースを含有するものであり、その使用目的に支障のない限りにおいてアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖を含んでいてもよい。本発明のα−アガラーゼを使用してアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースを生産するための原料としては、寒天、アガロース、または寒天およびアガロース由来のオリゴ糖を使用すればよい。α−アガラーゼを作用させる条件は、該酵素が活性を示すものであれば特に限定はないが、例えば、アガラーゼ１−７の場合は中性〜弱酸性、アガラーゼ４−３は弱アルカリ性〜弱酸性で、いずれも３７〜４２℃で作用させることが好ましい。また、反応液の組成も当該酵素の作用に適したものであれば特に限定はない。
本発明のα−アガラーゼによって生産されるオリゴ糖は、上記のように６糖以下の重合度の低いオリゴ糖を中心とするが、反応条件等により重合度の異なるオリゴ糖を自由に製造することも可能である。このようにして得られたオリゴ糖を分離精製することにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースを単独で得ることも可能である。
本発明のα−アガラーゼ遺伝子とは、上記α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、すなわち、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明のα−アガラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９０）由来のアガラーゼ１−７をコードする塩基配列を含む遺伝子、または微生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９１）由来のアガラーゼ４−３をコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３をコードする遺伝子としては、例えば配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号１５のアミノ酸番号１８４〜９５０の７６７アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のα−アガラーゼ遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が導入されたアミノ酸を有し、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包合する。
また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号１２の塩基番号５２９〜２７７５の２２４７３塩基からなる塩基配列を有する遺伝子、配列番号１３の塩基番号５５０〜２８５０の２２４７塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含され、さらに上記した塩基配列において１個以上の塩基の置換、欠失、付加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包含される。
さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）に記載の方法により実施することができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。
本発明のα−アガラーゼ遺伝子のクローニングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来る。
α−アガラーゼを生産する微生物よりゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡは適当な公知の方法に従って調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処理、ＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、エタノール沈殿等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。このようにして得られたゲノムＤＮＡを適当な公知の方法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで、該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。組み換えＤＮＡ分子の作製、形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上記したモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてα−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を含むゲノムライブラリーが得られる。
つぎに、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングし、α−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を選択する。スクリーニングの方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
（１）α−アガラーゼ活性の発現を指標にしたスクリーニング
ゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。α−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体は、α−アガラーゼ活性を持つポリペプチドを発現し、そのα−アガラーゼ活性により寒天ゲルを溶解するので、寒天プレートの寒天ゲルを溶解するコロニーまたはプラークを選択する。
（２）抗体を用いたスクリーニング
α−アガラーゼの粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れかを抗原として常法に従って抗α−アガラーゼ抗体を調製する。
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルターに移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と上記の抗α−アガラーゼ抗体を反応させ、該抗体と反応するクローンを同定する。
抗体と反応するクローンの同定は、公知の方法に従って、例えば、抗α−アガラーゼ抗体を反応させたフィルターを、パーオキシダーゼ結合二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベートし、発色を検出することによって行なうことが出来る。
なお、上記（１）、（２）の方法に用いるゲノムライブラリーの作製に、ベクターに組み込まれたＤＮＡ上の遺伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合には、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択することが出来る。
（３）ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定する。このフィルター上のＤＮＡと標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするクローンを同定する。
本スクリーニングに用いられるプローブとしては、上記したα−アガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、その他のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれらのアミノ酸配列の情報から作製したプライマーによって増幅したＰＣＲ断片等が挙げられる。これらのプローブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソトープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識等が挙げられる。
スクリーニングに用いるゲノムライブラリーとしては、以下の方法で作製したα−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーを使用しても良い。
α−アガラーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロンまたはニトロセルロースのフィルターにブロッティングする。このフィルター上のＤＮＡと上記の標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。
こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてα−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーが得られる。
該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効率の良いスクリーニングを行なうことが出来る。
（４）ＰＣＲを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング
上記（１）〜（３）の方法は、何れも形質転換体をスクリーニングして目的に遺伝子をクローニングする方法であるが、ＰＣＲ法を用いることによって、形質転換体を利用することなくｉｎ  ｖｉｔｒｏでクローニングを行なうことが出来る。
α−アガラーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な公知の方法、例えば超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られたＤＮＡ断片に通常用いられている方法によってリンカーを連結する。
α−アガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチドと、リンカーにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記ゲノムライブラリーを鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。得られた増幅産物を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込む。
以上（１）〜（３）のようにして得られたα−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体中、および（４）のようにして得られたα−アガラーゼ遺伝子を有する組み換えＤＮＡ分子中のα−アガラーゼ遺伝子の塩基配列は公知の方法に従って決定することが出来る。該クローンがα−アガラーゼのポリペプチド全長をコードしていない場合は、解読された塩基配列をもとに新たなプローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、新たなクローンを得る操作を繰り返すことにより、α−アガラーゼのオープンリーディングフレーム全体が解読される。その情報をもとに、例えば、α−アガラーゼをコードするオープンリーディングフレーム全体を含むクローンを作製することが出来る。
以上のようにして得られたα−アガラーゼをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに連結することにより、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝子工学的に大量に製造することが出来る。
以下に、アガラーゼ１−７の遺伝子を取得する方法についてその概略を説明する。
ＴＫＲ１−７ＡＧを培養し得られた菌体をリゾチームで溶菌させた後、タンパク質除去、エタノール沈殿等の操作を施し、ゲノムＤＮＡを得る。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクター（アンピシリン耐性）に挿入してプラスミドライブラリーを作製する。このプラスミドライブラリーで大腸菌を形質転換して、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を含む含むＬＢ寒天培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上で生育させ、３７℃で５日間培養する。培養後、周辺の寒天が分解されているコロニーを単離し、これをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して培養し、菌体から調製された粗抽出液のα−アガラーゼ活性を確認する。α−アガラーゼ活性が確認された形質転換体より常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、そこに挿入されているインサートＤＮＡの長さを確認したところ約８ｋｂであった。この組換えプラスミドはｐＡＡ１と命名され、また該プラスミドで形質転換された大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＡ１と命名表示され、ブダペスト条約のもと、１９９９年５月２６日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９２として寄託されている。
上記のプラスミドｐＡＡ１の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、α−アガラーゼをコードする領域として９２５個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）を有することが明らかとなった。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１２に、該読み取り枠がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１４に示す。すなわち、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列は本発明のアガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列と先に決定されたアガラーゼ１−７のＮ末端アミノ酸配列Ｐ１を比較することにより、アガラーゼ１−７は配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちの２８〜９２５のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は配列表の配列番号１２の塩基配列のうちの８２〜２７７８（終止コドンを含む）にコードされることが示される。また、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちの１〜２７のアミノ酸配列はシグナル配列と考えられる。さらに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうちの１７７〜９２５の７４９残基からなるアミノ酸配列のポリペプチドも、本発明のα−アガラーゼ活性を有している。
以下に、α−アガラーゼ４−３の遺伝子を取得する方法について、その概略を説明する。配列表の配列番号２で示されるアガラーゼ４−３のＮ末端アミノ酸配列Ｐ２をもとにミックスプライマー３、およびミックスプライマー４を作製した。配列表の配列番号６にミックスプライマー３の配列を、配列番号７にミックスプライマー４の配列を示す。
上記のα−アガラーゼ１−７の場合と同様に調製したＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍＨＩリンカーを連結した。得られたＤＮＡを鋳型とし、ミックスプライマー３、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ１を用いたＰＣＲを実施した。
つぎに、このようにして得られた一次ＰＣＲ産物を鋳型に用い、ミックスプライマー４とＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ２を用いたＰＣＲを実施したところ、約２ｋｂの増幅産物が確認され、該ＤＮＡフラグメントを４−３Ｎと命名した。
この増幅フラグメントの末端領域の塩基配列を解析し、アガラーゼのＮ末端側をコードする領域に相当する塩基配列より、配列表の配列番号８および９にそれぞれ塩基配列を示すプライマー５および６を作製した。同様にアガラーゼのＣ末端側に相当する塩基配列より、配列表の配列番号１０および１１にそれぞれの塩基配列を示すプライマー７および８を作製した。
ミックスプライマー３および４にかえて、それぞれプライマー５および６を使用し、上記の４−３Ｎの場合と同様にＰＣＲを実施し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片４−３ＵＮを取得した。同様にプライマー７および８を使用したＰＣＲを実施し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片４−３Ｃを取得した。得られたフラグメント４−３ＵＮ、４−３Ｃの塩基配列を解析し、この結果を先に解析された４−３Ｎの塩基配列と総合した結果、９５１個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が見出された。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１３に、該読み取り枠の塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１５に示す。なお、４−３ＵＮ中にはアミノ酸配列Ｐ２部分の塩基配列が存在し、その上流に１８３個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流にＳＤ様配列が見出された。
すなわち、配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列は本発明のアガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列を先に決定されたアガラーゼ４−３のＮ末端アミノ酸配列を比較することにより、アガラーゼ４−３は配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列のうちの１８４〜９５１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は配列表の配列番号１３の塩基配列のうちの５５０〜２８５６（終止コドンを含む）にコードされることが示される。
以上のようにして得られたアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３のアミノ酸配列および該酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、公知のアガロース分解酵素で本発明のアガラーゼと異なる切断様式を持つβ−アガラーゼのアミノ酸配列および該酵素をコードする遺伝子の塩基配列とのホモロジーはなく、全く新規の配列であると考えられる。
本発明のα−アガラーゼをコードする遺伝子、例えば、上記のアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３をコードする遺伝子を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡ分子を作製することが出来る。また、当該組換えＤＮＡ分子を適当な宿主に導入して形質転換体を作製することが出来る。当該形質転換体を培養することにより、培養物中に本発明のα−アガラーゼが産生される。すなわち、該形質転換体を使用して、本発明のα−アガラーゼ、例えば、アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３を大量に製造することが可能となる。
また、公知の方法でα−アガラーゼをコードする遺伝子に変異を導入することにより、変異を導入したα−アガラーゼを製造することも出来る。変異の導入方法としては特に限定はなく、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７５（１９９５））、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０（１９８７））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７（１９８７））等を用いることが出来る。
また、発現させようとするα−アガラーゼのＮ末端側にシグナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現させれば、目的のα−アガラーゼを形質転換体外に分泌させることが出来る。このようなシグナル配列に特に限定はなく、例えば配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１〜２７で表されるα−アガラーゼ１−７のシグナル配列が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号１２の塩基番号１〜８１にコードされている。
上記の組換えＤＮＡ分子の作製に使用されるベクターは、特に限定するものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することが出来、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。α−アガラーゼの生産を目的として組換えＤＮＡ分子を作製する場合には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を含むベクターが好適である。そのようなプラスミドベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ｐＫＦ１９ｋ、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ、ｐＥＴ１６ｂ等が挙げられる。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用することが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベクターで作製された組換えＤＮＡ分子が使用される。
以下に、アガラーゼ１−７を遺伝子工学的に製造する方法についてその概略を説明する。
例えば、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号２８、若しくは１７７以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、α−アガラーゼ１−７の遺伝子をコードする上記したプラスミドｐＡＡ１を鋳型としたＰＣＲによって増幅し、これを適当なプラスミドベクター、例えばｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ（宝酒造社製）、又はｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）等に挿入したプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等を適当な液体培地中で培養し、必要に応じてＩＰＴＧ等による誘導を行い、各プラスミド上の挿入ＤＮＡ断片にコードされているポリペプチドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位培養液あたりのα−アガラーゼ活性は、通常、ＴＫＲ１−７ＡＧαの培養液より高い値を示す。
また、アガラーゼ４−３は、例えば配列表の配列番号１５のアミノ酸番号１８４以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、微生物ＴＫＲ４−３α由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって増幅した後、上記のアガラーゼ１−７と同様の方法によってα−アガラーゼを発現する形質転換体を遺伝子工学的に作製することが出来る。得られた形質転換体は、α−アガラーゼ活性を発現し、かつその単位培養液あたりの活性は、通常、ＴＫＲ４−３ＡＧαの培養液より高い。
以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本発明のα−アガラーゼは、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のα−アガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
このようにして得られた種々の精製度の本発明の遺伝子組換えα−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはアガロースを基質として反応させることにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース等のアガロオリゴ糖を製造することができる。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
ＴＫＲ１−７ＡＧα由来のα−アガラーゼの製造
本発明のα−アガラーゼの精製を行うにあたって、その酵素活性は、アガロースＬ０３（宝酒造社製、Ｃｏｄｅ：５００３）を基質として酵素反応を行った後、生じたアガロテトラオースの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量することにより測定した。以下にその操作の詳細を示す。
０．２％のアガロースＬ０３溶液［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を調製し、その１８０μｌを酵素溶液２０μｌと混合し、４２℃で３０〜１２０分間、好ましくは６０分間反応させた後、６０℃で１分間加熱することによって反応を停止させる。この反応溶液３０μｌを内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ  α−２５００（東ソー社製、Ｃｏｄｅ：１８３３９）なるカラムに供し、７０％アセトニトリル溶液を溶離液とし、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた時の約２６分の保持時間を示すピークとして酵素反応によって生じたアガロテトラオースを定量する。本発明のα−アガラーゼ１単位（１Ｕ）は、１０分間当たりに１マイクロモルのアガロテトラオースを生じる酵素量と定義する。
１００ｍｌの人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ：０１２３−１７−３）を０．３％、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ：０１２７−１７−９）を０．０２％となるようにそれぞれ加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、寒天（ナカライテスク社製、Ｃｏｄｅ：０１０−２８）０．１ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαを接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。得られた培養液を前培養液とした。
本培養は、以下の手順で行った。５リットル容のジャーファーメンター容器に上記の培地３リットルを調製し、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った。この培地に上記の前培養液３０ｍｌを接種し、２５℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した後、培養液について８，０００×ｇ、２０分間の遠心分離を行い、菌体を除いた約３リットルの上清を回収した。
これより以降の操作は４℃以下で行った。
上記の上清を透析膜（三光純薬社製、Ｃｏｄｅ：ＵＣ−３６−３２−１００）に入れ、約５００ｇのポリエチレングリコール中に二晩浸漬させて内液が約１００ｍｌとなるまで濃縮した後、緩衝液Ａ［２０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］に対して透析を行い脱塩を行った。この透析液を、予め緩衝液Ａで平衡化した強陰イオン交換樹脂であるＳｕｐｅｒＱ（東ソー社製、Ｃｏｄｅ：１７２２７）３０ｍｌを充填したカラム（φ２ｃｍ×９．５ｃｍ）に負荷し、吸着したα−アガラーゼを１０ｍＭから１５０ｍＭへの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量６００ｍｌ）で溶出させ、塩化カルシウム濃度が５０ｍＭから１００ｍＭの間に溶出してくる約６０ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を回収した。
この画分を緩衝液Ｂ［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］に対して透析して脱塩を行い、２０ｍｌのＳｕｐｅｒＱを充填したカラム（φ２ｃｍ×６．３ｃｍ）に負荷した。この場合は塩化ナトリウムの１０ｍＭから１．０Ｍへの直線濃度勾配法（総溶出量２００ｍｌ）により吸着した酵素を溶出させ、０．５Ｍ前後で溶出するα−アガラーゼ画分４０ｍｌを得た。この画分を緩衝液Ｂで透析し、１０ｍｌのＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製、Ｃｏｄｅ：００７４７３）を充填したカラム（φ０．８ｃｍ×５．７ｃｍ）に供した。１０ｍＭから１５０ｍＭの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量１００ｍｌ）により、約２０ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を回収した。
ついで、この画分を遠心限外濾過膜セントリプレップ−１０（アミコン社製、Ｃｏｄｅ：４３０４）を用いて約１ｍｌに濃縮した。これを緩衝液Ｂで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（ファルマシア社製、Ｃｏｄｅ：１７−００６０−０１）を充填したカラム（φ０．８ｃｍ×６０ｃｍ）を用いたゲル濾過に供し、約１５ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を得た。この画分を５ｍｌのＱＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製、Ｃｏｄｅ：１４０２６）なるカラム（φ０．８ｃｍ×１０ｃｍ）に供し、１０ｍＭから１５０ｍＭへの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量１００ｍｌ）による溶出を行い約４ｍｌのα−アガラーゼ画分を得た。
こうして得られたα−アガラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、目的の酵素はほぼ単一に精製され、その分子量は約９５，０００であった。また、こうして得られた精製α−アガラーゼ標品の全活性は４５Ｕであった。以降、この画分をアガラーゼ１−７として実験に使用した。
実施例２
ＴＫＲ４−３ＡＧα由来のα−アガラーゼの製造
微生物ＴＫＲ４−３ＡＧαの培養は、実施例１に記載の微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαと同じ方法により実施し、約３リットルの培養液上清を得た。
この培養液上清を透析膜（三光純薬社製、Ｃｏｄｅ：ＵＣ−３６−３２−１００）に入れ、約５００ｇのポリエチレングリコール中に二晩浸漬させて内液が約３００ｍｌとなるまで濃縮した後、緩衝液Ｃ［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム］に対して透析を行った。この透析液の約３分の２を、予め緩衝液Ｃで平衡化した３０ｍｌのＳｕｐｅｒＱを充填したカラム（φ２ｃｍ×９．５ｃｍ）に負荷し、吸着したα−アガラーゼを１０ｍＭから８０ｍＭへの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量４００ｍｌ）で溶出させ、塩化カルシウム濃度が４０ｍＭから５０ｍＭの間に溶出してくる約４０ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を回収した。
この画分をセントリプレップ−１０にて濃縮した後、緩衝液Ｂで希釈を行って脱塩し、１０ｍｌのＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを充填したカラム（φ１．５ｃｍ×５．７ｃｍ）に負荷した。吸着したα−アガラーゼは塩化カルシウムの１０ｍＭから１００ｍＭへの直線濃度勾配法（総溶出量１００ｍｌ）により溶出させ、塩化カルシウム濃度４５ｍＭ前後で溶出するα−アガラーゼ活性画分９ｍｌを得た。この画分をセントリプレップ−３０（アミコン社製、Ｃｏｄｅ：４３０６）で濃縮後、緩衝液Ｂで５倍希釈し、次いで緩衝液Ｂで平衡化した２ｍｌのＱＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを充填したカラム（φ０．８ｃｍ×４ｃｍ）に供した。１０ｍＭから１２０ｍＭの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量４０ｍｌ）でカラムに吸着したα−アガラーゼの画分を回収した。
こうして得られたα−アガラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、α−アガラーゼはほぼ単一に精製されていた。得られた全活性は、１．５３Ｕであった。以降、この画分をアガラーゼ４−３として実験に使用した。
実施例３
酵素の諸性質の検討
（１）基質特異性および作用
アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースの４種類のアガロオリゴ糖（それぞれ２．５ｍＭ）、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースの３種類のネオアガロオリゴ糖（それぞれ２．５ｍＭ）ならびにアガロースＬ０３（１％）のそれぞれを含む１０μｌの反応用緩衝液［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を調製し、これにアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３溶液１０μｌずつをそれぞれ加えて４２℃、３０分間の反応を行った。この反応生成物をクロロホルム：メタノール：酢酸＝３：３：１の組成から成る展開溶媒を用いた薄層クロマトグラフィーに供し、展開後、オルシノール硫酸法により反応生成物の確認を行った。
その結果、アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３ともにアガロヘキサオース、アガロオクタオース、ネオアガロヘキサオースおよびアガロースを切断することが明らかとなった。
アガロヘキサオースにアガラーゼ１−７を作用させた場合の薄層クロマトグラフィーの結果を図１に、また、アガラーゼ４−３を作用させた場合の薄層クロマトグラフィーの結果を図２に示す。図１および２において、１はアガロビオース、２はアガロテトラオース、３はアガロヘキサオース、４は本発明のアガラーゼを作用させたアガロヘキサオース、５はアガロビオースとアガロテトラオースの混合物が展開されたレーンをそれぞれ示す。これらの図より明らかなように、本発明のα−アガラーゼはアガロヘキサオースを分解し、アガロビオースとアガロテトラオースを生成する。
（２）α−アガラーゼの反応産物の同定
２．０ｍｌの１．０％のアガロースＬ０３溶液［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］にアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３をそれぞれ添加して４２℃、６０分間の反応を行った。反応終了後、溶離液として７０％アセトニトリルを用いたゲル濾過カラム（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  α−２５００）に反応液の一部を供し、０．８ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーを実施した。約２６分の保持時間で溶出される画分を分取し、該画分をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固したのち、その重量を測定したところ約４ｍｇであった。
ついで、上記の画分をＪＮＭ−ＥＸ２７０  ＦＴ  ＮＭＲシステム（日本電子社製）を用いた核磁気共鳴法によって分析したところ、両酵素によりアガロースから生成される、上記画分に含有される物質はアガロテトラオースであることが確認された。すなわち、アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３はともにアガロース分子中のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解し、アガロテトラオースを含有するアガロオリゴ糖を生成することが明らかとなった。
（３）反応ｐＨ
１％アガロースＬ０３、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含み、それぞれ終濃度１０ｍＭの緩衝液でｐＨを４．５（酢酸緩衝液）、５．５（リンゴ酸緩衝液）、６．０、６．５（酢酸緩衝液）、７．０、７．５、８．８（トリス緩衝液）に調整した１０μｌの反応液を調製し、これに酵素溶液１０μｌを加えて４２℃にて１時間反応させた。この反応液を薄層クロマトグラフィーに供し、クロロホルム：メタノール：酢酸＝３：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）で展開し、オルシノール硫酸法により反応生成物の確認を行った。これによりアガラーゼ１−７は中性から弱酸性、アガラーゼ４−３は弱アルカリ性から弱酸性でアガロース分解活性を示すことが明らかとなった。
（４）至適温度
アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３の酵素活性測定を種々の温度において実施した。酵素の失活が抑制され、速やかに反応が進む温度はアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３ともに３７〜４２℃であった。
（５）熱安定性
アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３精製酵素溶液を４８℃、５０℃、６０℃で３０秒間加熱した後、０．２％のアガロースＬ０３溶液［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を添加し、４２℃で１時間反応させた。沸騰水中で１分間加熱することにより反応を停止させたのち、実施例１に記載の活性測定方法に準じて反応生成物を定量した。この結果、上記の加熱処理を行わない場合の活性を１００％とした場合、アガラーゼ１−７は４８℃処理で２５％、アガラーゼ４−３は５０℃処理で２２％の活性を示した。
（６）分子量
アガラーゼ１−７の分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で測定した。ＳＤＳを含む１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用し、分子量マーカー（バイオラッド社製、分子量  ２００，０００のミオシン、１１６，２５０のβ−ガラクトシダーゼ、９７，４００のフォスフォリラーゼｂ、６６，２００のウシ血清アルブミン、４５，０００のオブアルブミン、３１，０００のカルボニックアンヒドラーゼ、２１，５００のトリプシンインヒビター、１４，４００のリゾチーム）とともにアガラーゼ１−７の電気泳動を行った。ゲル上での移動度から分子量を求めたところ、アガラーゼ１−７の分子量は約９５，０００ダルトンであった。
また、アガラーゼ４−３については平衡密度勾配遠心分離法によって分子量を求めた。密度勾配は１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．０、１０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液中でグリセリン濃度を１５％〜３５％に変化させて作製した。２本の５ｍｌ容の遠心管のそれぞれに、最下層が３５％、最上層が１５％グリセリンになるように４．８ｍｌの直線密度勾配液を作製した。さらに、その一方の上層には、分子量マーカーローレンジ（Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ、バイオ・ラッド社製）１５μｌを前述の緩衝液で１５％のグリセリンを含む１００μｌの溶液としたものを重層し、もう１本にはアガラーゼ４−３酵素標品１００μｌを重層した。これらの遠心管を、スイングローターを用い、４５，０００ｒｐｍ、４℃、２１時間遠心分離した。遠心後、両遠心管の上層から順に２５０μｌずつ緩衝液を抜き取り、フラクション１〜２０とした。分子量マーカー遠心管の各フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、酵素標品遠心管の各フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性測定に供した。α−アガラーゼ酵素活性のピークはフラクションＮｏ．８〜１０に検出され、それは分子量マーカーのフラクションでのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果からは分子量約６５，０００〜８５，０００に相当した。この結果と、酵素標品フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とから、アガラーゼ４−３の分子量は約８５，０００と推定された。
（７）エドマン分解法によるアミノ酸配列分析
実施例１、２で得られたα−アガラーゼ１−７、４−３のアミノ酸配列をエドマン分解法にて決定した。それぞれ１０ピコモル相当の酵素タンパクを含むアガラーゼ１−７と４−３の精製酵素標品溶液を１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロブロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブロッティングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテインシークエンサー（Ｇ１０００Ａ、ヒューレット・パッカード社製）を用いて分析した。この結果、アガラーゼ１−７についてはアミノ酸配列Ｐ１：Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ（配列番号１）、アガラーゼ４−３についてはアミノ酸配列Ｐ２：Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ（配列番号２）が明らかにされた。
実施例４
アガロオリゴ糖の製造
２ｍｌの反応用緩衝液［１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］に１．０％（ｗ／ｖ）になるようにアガロースＬ０３を加え、さらに２Ｕのアガラーゼ１−７精製標品を加えて４２℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、Ｃｏｄｅ：ＳＬＧＶＬ０４０Ｓ）で濾過した。この反応液を実施例１に記載の、本発明の酵素の活性測定において使用されたものと同条件の高速液体クロマトグラフィーにより分析し、生成したアガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液中にアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースが検出され、上記の酵素反応により、これらの低分子アガロオリゴ糖が生成していることが確認された。
実施例５
ＴＫＲ１−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮＡの調製
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、ペプトン（ＤＩＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ：０１２３−１７−３）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ：０１２７−１７−９）を０．０２％（ｗ／ｖ）となるよう加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整し、これに寒天（ナカライテスク社製、Ｃｏｄｅ：０１０−２８）を０．１％（ｗ／ｖ）になるように加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った。２ｍｌの培地にα−アガラーゼ生産菌株であるＴＫＲ１−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαのグリセロールストックより１０μｌを植菌し、２５℃で一晩培養した。それより１ｍｌを１００ｍｌの同培地へ植菌し、同じく２５℃で一晩培養し、８，０００×ｇ、１０分間遠心することより菌体を回収した。その菌体を１０ｍｌの緩衝液Ａ［１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に懸濁し、０．２５ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃、１時間インキュベートした。つぎに、２．５ｍｌの５％ＳＤＳ含有緩衝液Ａを加えた後、６０℃で２０分間振とうしながらインキュベートし、１．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。その後３７℃で一晩インキュベートし、その溶液に対してほぼ等量のフェノールを加えて室温で約１０分間穏やかに振とうした。２，０００×ｇ、１０分間遠心し、その上清を冷エタノールに移し、染色体ＤＮＡをガラス棒で巻き取った。この操作を２回繰り返した後、５０μｌのＲＮａｓｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液から染色体ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、５ｍｌの緩衝液Ｂ［１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）］に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、それぞれ約１．５ｍｇ（ＴＫＲ１−７ＡＧα）、約３．１ｍｇ（ＴＫＲ１−７ＡＧα）の染色体ＤＮＡを得た。その純度をＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで検定したところ、両方共に約１．８であり、以下のクローニングに使用することにした。
実施例６
α−アガラーゼ１−７遺伝子のクローニング
制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化したＴＫＲ１−７ＡＧαの染色体ＤＮＡ  １０μｇについて１．０％低融点アガロースゲルを用いた電気泳動を行ない、エチジウムブロミドによる染色後、紫外線照射下で４〜１０ｋｂに相当する部分を切り出した。ゲルから常法に従って熱融解によりＤＮＡを抽出精製し、回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＢａｍＨＩサイトにＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて挿入した。このプラスミドライブラリーで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、その形質転換体を寒天を１．５％（ｗ／ｖ）濃度含むＬＢ寒天培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上で生育させた。３７℃で一晩培養したところ１プレート当たり約１，０００株の形質転換体が生育し、このプレート２０枚をさらに２５℃で４日間インキュベートした。その結果コロニー周辺の寒天が分解されているものが２株存在し、この株を２ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養し、得られた菌体から調製された粗抽出液にα−アガラーゼ活性が認められた。この株より常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断してインサートＤＮＡの長さを確認したところ両方ともに約７．２ｋｂであった。このハイブリッドプラスミドはその制限酵素切断パターンから同じ物と考えられ、ｐＡＡ１と命名した。プラスミドｐＡＡ１で形質転換された大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＡ１と命名表示され、ブダペスト条約のもと１９９９年５月２６日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９２のもとで寄託されている。
つぎに、配列表の配列番号１で示されるアガラーゼ１−７のアミノ酸配列Ｐ１に基づいて配列表の配列番号３で示されるミックスプライマー１をデザインし、該プライマーと配列表の配列番号４で示されるｐＵＣベクターに特異的にハイブリダイズするプライマー２を用い、ｐＡＡ１を鋳型としたＰＣＲを行なった。
０．５ｍｌＰＣＲ用チューブに５０ｎｇのｐＡＡ１、５μｌのＥｘＴａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌのミックスプライマー１、１μｌのプライマー２、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分（変性）、５０℃で２分（プライマーのアニーリング）、７２℃で３分（合成反応）を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応後の反応液全量を１．０％低融点アガロース電気泳動を行なった後、約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）に連結した。このＤＮＡ断片の塩基配列をＮ末端側よりＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたジデオキシチェーンターミネーター法で決定した。このようにして決定された配列に基づいて配列表の配列番号５で示されるプライマーをデザインし、該プライマーを用いて上流側の塩基配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列Ｐ１に対応する塩基配列の上流に２７個のアミノ酸をコードする塩基配列が存在し、さらにその上流にＳＤ様配列が存在することが見出され、ｐＡＡ１が合計９２５個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）を有することが明らかとなった。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１２に、該読み取り枠がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１４に示す。なお、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαより精製されたα−アガラーゼのＮ末端配列Ｐ１は配列表の配列番号１３に示されたアミノ酸配列の２８〜３７番目のアミノ酸配列に一致していた。
実施例７
α−アガラーゼ４−３遺伝子のクローニング
配列表の配列番号２で示されるアガラーゼ４−３のアミノ酸配列Ｐ２のアミノ酸番号２〜１１の配列に基づくミックスプライマー３、およびアミノ酸番号１２〜２０の配列に基づくミックスプライマー４をデサインし、これらのプライマーを用いてＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）によるアガラーゼ４−３遺伝子のクローニングを試みた。配列表の配列番号６にミックスプライマー３の配列を、配列番号７にミックスプライマー４の配列を示す。
一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。実施例５で調製したＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍＨＩリンカーをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌＰＣＲ用チューブにとり５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌのミックスプライマー３、１μｌのＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ１、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＬＡＴａｑ加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間（変性）、５０℃で２分間（プライマーのアニーリング）、７２℃で３分間（合成反応）を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。
このようにして得られた一次ＰＣＲ産物を用い、次に、二次ＰＣＲを行なった。一次ＰＣＲ後の反応液１μｌをテンプレートとし、ミックスプライマー４とＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ２の組み合わせで一次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色して増幅産物の確認を行なった。その結果、約２ｋｂの増幅産物が確認され、該ＤＮＡフラグメントを４−３Ｎと命名した。
この増幅フラグメントをアガロースゲルより切り出し、常法に従って抽出精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体を用いて４−３の末端領域の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーター法で決定した。
このようにして決定された４−３Ｎの末端領域の配列に基づいてプライマーをデザインし、４−３Ｎの上流および下流のＤＮＡ断片のクローニングをＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて行なった。
４−３Ｎの上流のＤＮＡ断片のクローニングには、配列が明らかになった４−３Ｎの末端領域のＮ末端付近の領域に基づいてデザインされた、配列表の配列番号８および９に示されるプライマー６および７を用いた。クローニングはプライマーのアニーリング温度を５５℃としたことを除いて４−３Ｎのクローニングと同様の操作にて行なった。その結果、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片が得られ、４−３ＵＮと命名した。
４−３Ｎの下流のＤＮＡ断片のクローニングには、配列が明らかになった４−３Ｎの末端領域のＣ末端付近の領域に基づいてデザインされた、配列表の配列番号１０および１１に示されるプライマー８および９を用いた。クローニングはプライマーのアニーリング温度を５５℃としたこと除いて４−３Ｎのクローニングと同様の操作にて行なった。その結果、約２．０ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られ、４−３Ｃと命名した。
得られたフラグメント４−３ＵＮ、４−３Ｃは、共にｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）に連結し、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定した。以上にようにして決定された４−３Ｎ、４−３ＵＮ、４−３ＣのＤＮＡフラグメントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、９５１個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が見出された。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１３に、該読み取り枠の塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１５に示す。なお、４−３ＵＮ中にはアミノ酸配列Ｐ２部分の塩基配列が存在し、その上流に１８３個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流にＳＤ様配列が見出された。なお微生物ＴＫＲ４−３より精製されたα−アガラーゼについて決定されたＮ末端アミノ酸配列Ｐ２は、配列表の配列番号１５に示されたアミノ酸配列の１８４〜２０３番目のアミノ酸配列に一致していた。
以上のようにして得られたアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３のアミノ酸配列および遺伝子の塩基配列は公知のアガロース分解酵素で本発明のアガラーゼと異なる切断様式を持つβ−アガラーゼのアミノ酸配列および遺伝子の塩基配列とのホモロジーはなく、全く新規の配列であると考えられた。
実施例８
α−アガラーゼ１−７を発現するプラスミドの構築
配列表の配列番号１８で表される配列を有するプライマー１０を合成した。このプライマー１０は、塩基番号８〜１３に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を持ち、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜３１のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１４〜２５に持つプライマーである。
プライマー１０とｐＡＡ１中のｐＵＣ１９ベクター側にハイブリダイズするプライマー２（配列番号４）を用い、ｐＡＡ１を鋳型としたＰＣＲを行なった。
０．５ｍｌ  ＰＣＲ用チューブにプライマー１０、プライマー２を１０ｐｍｏｌずつ、鋳型として実施例６で得たｐＡＡ１  １０ｎｇ、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルとする２５サイクルのＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を分離し、抽出精製した。この精製したものとＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングを行い、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＡＡ２０１と命名した。ｐＡＡ２０１はα−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
このｐＡＡ２０１を導入した形質転換体を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植菌し、２５℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、さらに一晩１５℃で培養して目的タンパク質を発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、１５０μｌの細胞破砕溶液｛２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム｝に再懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みの抽出液と沈澱とに分けた。それぞれを試料としてアガロースを基質としたα−アガラーゼ活性を測定したところ、抽出液に活性が確認された。なお、この活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株であるＴＫＲ１−７ＡＧαのもつ活性の約２５倍であった。
実施例９
α−アガラーゼ１−７のｐＴ７ＢｌｕｅＴを用いた発現系
配列表の配列番号１９で表される配列を有するプライマー１１を合成した。このプライマー１１は、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜３３のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０に持つプライマーである。
プライマー１１とプライマー２を用い、ｐＡＡ１を鋳型とするＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル電気泳動で分離し、抽出精製した。精製されたＰＣＲ産物を、クローニングするために設計されたベクターであるｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（宝酒造社製）に連結し、発現ベクターを構築した。なおＰＣＲのの反応条件は実施例８に準じた方法で行った。ＤＮＡシークエンシングを行い、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択した。
このハイブリッドプラスミドをｐＡＡ３０１と命名した。  ｐＡＡ３０１はｐＡＡ２０１と同様α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
ｐＡＡ３０１を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体をＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む）に植菌し、実施例８と同様にＩＰＴＧにより目的タンパク質の発現を誘導し、α−アガラーゼ活性を確認したところ、抽出液に活性が確認された。これは１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ１−７ＡＧαのもつ活性の約１００倍であった。
実施例１０
α−アガラーゼ１−７のｐＥＴ１６ｂを用いた発現系
配列表の配列番号２０で表される配列を有するプライマー１２を合成した。このプライマー１２はα−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号９１９〜９２４に相当する塩基配列の相補鎖の塩基配列を塩基番号１７〜３４にもち、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号９〜１４に持つプライマーである。
実施例８に準じた条件で、プライマー１０（配列番号１８）と、プライマー１２（配列番号１８）を用いて、ｐＡＡ１をテンプレートとしたＰＣＲを行った。その増幅断片をエタノール沈澱により濃縮、脱塩後、ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した。これをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）に連結し、得られたハイブリッドプラスミドをｐＡＡ４０１と命名した。ｐＡＡ４０１はｐＡＡ２０１、ｐＡＡ３０１と同様α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
ｐＡＡ４０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、得られた形質転換体を用いて実施例８と同様にα−アガラーゼの活性を確認したところ（ただし薬剤はカナマイシンの代わりにアンピシリンを用いた）、その抽出液に活性が確認された。この活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ１−７ＡＧαのもつ活性の約１００倍であった。
実施例１１
α−アガラーゼ４−３を発現するプラスミドの構築
配列表の配列番号２１で表される配列を有するプライマー１３、及び配列表の配列番号２２で表される配列を有するプライマー１４を合成した。
プライマー１３は制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１２〜１７に持ち、さらにα−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号１８４〜１８７のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１８〜２９に持つプライマーである。
プライマー１４は制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号８〜１３に持ち、なおかつクローニングの結果得られたα−アガラーゼ４−３遺伝子の読み枠の下流とハイブリダイズする配列を持つプライマーである。
プライマー１３及びプライマー１４を用いて、  ＴＫＲ４−３ＡＧα野生株由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。プライマー１３、１４を１０ｐｍｏｌずつ、鋳型としてＴＫＲ４−３ＡＧα野生株由来の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化したもの１０ｎｇ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を含むＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５０℃で２分間→７２℃で３分間を１サイクルとする２５サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮し、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を分離し、抽出精製した。実施例８と同様にしてｐＫＦ１９ｋとのハイブリッドプラスミドを作製し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、ＰＣＲ産物が正しい方向で挿入されたものを選択し、これをｐＡＨ１０１と命名した。ｐＡＨ１０１はα−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号１８４〜９５１のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
プラスミドｐＡＨ１０１で形質転換された大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＨ１０１と命名表示され、ブダペスト条約のもと２０００年１月２７日より日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００８のもとで寄託されている。
ｐＡＨ１０１を保持する形質転換体について、実施例８と同様にしてα−アガラーゼ活性を確認したところ、その抽出液に活性が存在した。その活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株であるＴＫＲ４−３ＡＧαのもつ活性の約１５倍であった。
実施例１２
α−アガラーゼ４−３のｐＥＴ１６ｂを用いた発現系
配列表の配列番号２３で表される配列を有するプライマー１５を合成した。
プライマー１５は制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に持ち、α−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号９４５〜９５０のアミノ酸配列に相当する塩基配列の相補鎖の塩基配列を塩基番号１８〜３５に持つプライマーである。
実施例８に準じた条件で、プライマー１３とプライマー１５を用いて、実施例１１に記載のＴＫＲ４−３ＡＧα野生株由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。
その増幅断片をエタノール沈澱により濃縮後、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ切断し、アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した。これをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）に連結し、得られたハイブリッドプラスミドをｐＡＨ２０１と命名した。ｐＡＨ２０１はα−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号１８４〜９５０のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
ｐＡＨ２０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、得られた形質転換体を用いて実施例８と同様にα−アガラーゼの活性を確認したところ（ただし薬剤はカナマイシンの代わりにアンピシリンを用いた）、その抽出液に活性が確認された。これは１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ４−３ＡＧαのもつ活性の約７５倍であった。
実施例１３
改変タンパク質の活性
遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を作製し、それぞれについてα−アガラーゼ活性を確認した。
配列表の配列番号２４で表される配列を有するプライマー１６を合成した。
プライマー１６は、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号１７２〜１７４のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号３〜１１に持ち、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号１７７〜１８１のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３２に持ち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもつプライマーである。
プライマー１６とプライマー２（配列番号４）を用いて、ｐＡＡ１をテンプレートとしたＰＣＲを行い、実施例８と同様にしてｐＫＦ１９ｋへ連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングにより連結部分の配列を確認して、得られたハイブリッドプラスミドをｐＡＡ５０１と命名した。ｐＡＡ５０１はα−アガラーゼ１−７のアミノ酸番号１７６番目までが欠失したもの、即ち配列番号１４のアミノ酸番号１７７〜９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
ｐＡＡ５０１で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を実施例８と同様にして培養し、ＩＰＴＧでｐＡＡ５０１がコードするタンパク質の発現を誘導させ、活性を確認したところ、その抽出液にα−アガラーゼの活性が存在した。
実施例１４
サザンハイブリダイゼーション
α−アガラーゼ４−３のクローンであるｐＡＨ１０１の挿入断片をプローブとし、野性株であるＴＫＲ１−７ＡＧαの染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションを行った。以下の操作は、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識・検出キット（ロシュ社製）のプロトコルに従い実施した。この際のプローブは、ｐＡＨ１０１を制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで切断して得られた約２．４ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、抽出精製し、その約１．０μｇ分を上記キットのプロトコルに従い標識したものを用いた。
約２．０μｇ分のＴＫＲ１−７ＡＧαの染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動した後、常法に従って０．４Ｎ水酸化ナトリウムによりニトロセルロースメンブレン（アマシャム社製）にＤＮＡ断片をトランスファーした。その後、６８℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行い、標識したプローブを熱変性させたものを添加して、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。尚、ハイブリダイゼーションは［６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ］の溶液中で行なった。そのメンブレンを室温で２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで５分間（２回）、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで１５分間（２回）洗浄し、余分なプローブを排除した。その後プロトコルに従い検出反応を行った結果、約７．２ｋｂの位置にバンドが確認された。このように、α−アガラーゼ４−３の遺伝子をプローブに用いてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを実施することにより、活性なα−アガラーゼをコードする遺伝子である野性株ＴＫＲ１−７ＡＧαのα−アガラーゼ遺伝子を検出することができた。なお、α−アガラーゼ１−７とα−アガラーゼ４−３のオープンリーディングフレーム全長の配列を比較したところ、アミノ酸配列のホモロジーは５１％、遺伝子の塩基配列のホモロジーは６１％であった。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なα−アガラーゼが提供される。また、該酵素を用いることにより、重合度が低く、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリゴ糖、たとえばアガロビオース、アガロテトラオースをアガロースから直接生産することが可能となる。本発明のα−アガラーゼを使用して製造されたアガロオリゴ糖は、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用等の生理活性を有しており、医薬品、飲食品の分野で有用である。
また、本発明によりα−アガラーゼのアミノ酸および塩基配列が初めて明らかとなり、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供することが可能となった。また該遺伝子を用いるα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。
さらに、該遺伝子を用いる遺伝子工学的製造方法においてはα−アガラーゼの誘導生産のために培地にアガロースを添加する必要がないため培養時の手間を省くことが出来、また酵素精製も容易であると考えられる。
さらにまた、本発明により、初めてα−アガラーゼ遺伝子が提供されたことにより、該遺伝子の情報をもとにして、そこにコードされる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片、α−アガラーゼに特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーが提供される。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：本発明のα−アガラーゼによるアガロヘキサオースの分解を示す図である。
図２：本発明のα−アガラーゼによるアガロヘキサオースの分解を示す図である。
【図１】
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【図２】
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