(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、配列番号１（プライマーＡ）及び配列番号２（プライマーＢ）で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項２】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、配列番号１（プライマーＡ）及び配列番号３（プライマーＣ）で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項３】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、配列番号４（プライマーＤ）及び配列番号５（プライマーＥ）で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項４】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、配列番号４（プライマーＤ）及び配列番号２（プライマーＢ）で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項５】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、配列番号３（プライマーＣ）及び配列番号６（プライマーＦ）で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を制限酵素処理した後にアガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項６】
制限酵素としてＲｓａＩを使用すること、を特徴とする請求項５に記載の醸造用酵母の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の判別に関するものであり、更に詳細には、醸造用酵母の判別、分類、同定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
醸造用酵母としては、ブドウ酒酵母、清酒酵母、焼酎酵母等いくつかの種類の酵母が使用されており、また更にこれらの各酵母の内、例えばブドウ酒酵母としては協会ブドウ酒酵母１号、３号、４号等が使用され、また清酒酵母も協会７号、９号、１０号酵母等が使用され、焼酎酵母も鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ．泡盛酵母等が使用されている。
【０００３】
しかしながら、これらの醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に分類されるものであって、同一種に属し醸造に使用されるため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間に且つ正確にそれぞれ区別することはきわめて困難である。したがって、現時点においては、酵母を小仕込試験するなどとして、その醸造特性から判別したり、薬剤や培養条件を変えることで酵母を判別したりする方法で酵母の判別を行わざる得ないのが実情である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの判別方法は、酵母を実際に培養したり、実際に仕込みを行ってその醸造特性を確認したりする必要があるため、判別に相当の時間を要することは不可避であり、当業界においてその改善が求められている。
【０００５】
このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、例えばブドウ酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間だけでなく、その判別が非常デリケートで難しい、例えば協会ブドウ酒酵母１号、３号、４号といった同一用途の酵母間においても、それを短期間で正確且つ簡易に判別できるシステムの開発というきわめて解決困難な技術的課題をあえて新規に設定した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から検討を行い、遺伝子を利用する方法に着目した。そして、本発明者らは、既に報告されている（Miguel. B. L. Alison, S. Paul, A. H, and Peter L. Applied and Enviromental Microbiology (1996) P4514-4520) LA-1 primer（GCGACGGTGTACTAAC）を用いて焼酎酵母のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ法により増幅したところ、５００ｂｐ付近に増幅されたＤＮＡのバンドに特徴を認めた。更にこのＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列情報を決定したところ、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子の一部であることをはじめて見出した。この新知見に着目して、本発明者らは更に研究を続けた結果、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子が醸造用酵母で異なることを発見した。
【０００７】
このように、本発明は、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子が醸造用酵母で異なることを発見し、これら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成されたものであって、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子に基づいた醸造用醸母の判別、確認、検出システムにも関与するものである。ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子自体は既知であるが（文献名Lye，G．，Bowman，S．and Churcher，C．unpublished．ただし、インターネットにて公表）、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子に着目した酵母の判別は行われておらず、また、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子が醸造用酵母間で異なることも報告されていない。ましてや、異なった種類の醸造用酵母はもとより、同一種類の酵母さえもきめ細かく判別することができることなど全く報告されておらず、本発明が最先である。
【０００８】
すなわち、本発明は、サッカロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に属する醸造酵母のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子の一部又は全部を増幅させ、その増幅される断片の長さ、数の違いにより、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【０００９】
本発明においては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動又は制限酵素処理したのちアガロースゲル電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので、作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子（この場合ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子の一部又は全部）を増幅させるプライマーを用いることで、ＰＣＲ法での増幅で得られるＤＮＡ断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【００１０】
本発明の実施にあたり、プライマーとして、今回本発明者らがはじめて開発するのに成功したプライマーＡ〜Ｆ（それらの塩基配列を配列表の配列番号１〜６（図１）に示す。）を選択、使用し、酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うのであるが、プライマーとしては、上記したプライマーを合成して用いてもよい。ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子は、実験室用酵母 Ｓ２８８Ｃ strain（Invitrogen(株)より購入）より得ることができ、これより切り出してもよい。 プライマーとしては、判別しようとする酵母に応じたものを適宜選択して使用すればよく、酵母によってはＡ〜Ｆ以外のプライマーをＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子から設計し、合成して用いてもよい。ＰＣＲは常法にしたがって行えばよく、その結果、目的とする遺伝子断片を得ることができる。
【００１１】
このようにして増幅して得た遺伝子断片は、これを直接アガロースゲル電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また、所望するのであれば、ＰＣＲにて増殖された遺伝子断片を制限酵素で切断し、これを電気泳動してその泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡便且つ明確に行うことができる。
【００１２】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは逆に、特定の醸造用酵母を判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよく、酵母のバリエーションが出るようにあるいはそれに対応するようにプライマー等についてもバリエーション設計をすればよい。
【００１３】
このようにして本発明によれば、醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくともひとつが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーＡ及びＢを用いて、あるいは、これらのプライマーのＰＣＲ産物を用いて、協会ブドウ酒酵母３号の判別、同定、分類用キットを組むことができる。
【００１４】
本発明において、酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母等）、ワイン酵母（協会ブドウ酒１号酵母、協会ブドウ酒３号酵母、協会ブドウ酒４号酵母等）、焼酎酵母（鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号等）等の実用酵母に使用できる。本発明は、清酒酵母とワイン酵母の判別、ワイン酵母と焼酎酵母の判別といった異なった用途の酵母間の判別が可能であることはもとより、同じワイン酵母であって、協会ブドウ酒１号酵母と同２号酵母、同２号酵母と同３号酵母の判別といった同一用途の酵母間の判別も可能であるという著効も奏するものである。特に後者については、判別自体が困難であって非常にデリケートな要件が必要とされ、従来、簡便にして正確な方法で満足できる方法は報告されていなかったのである。
【００１５】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１６】
【実施例１】
（協会ブドウ酒１号酵母、協会ブドウ酒３号酵母、協会ブドウ酒４号の判別法）
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する協会ブドウ酒１号酵母、協会ブドウ酒３号酵母、協会ブドウ酒４号、実験実酵母Ｘ２１８０Ｂ株より宝酒造（株）の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムＤＮＡを、プライマ−Ａ（配列番号１、図１）とプライマーＢ（配列番号２、図１）、プライマ−Ａ（配列番号１、図１）とプライマーＣ（配列番号３、図１）、プライマ−Ｄ（配列番号４、図１）とプライマーＥ（配列番号５、図１）、の各々の組み合わせでＰＣＲ法にて増幅したのち、アガロースゲル電気泳動を行った。（電気泳動結果を図２に示す）を得た。
【００１７】
図２において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
１：ラムダHindIII Digested Marker
２：協会ブドウ酒酵母１号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
３：協会ブドウ酒酵母３号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
４：協会ブドウ酒酵母４号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
５：Ｘ２１８０Ｂ株ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
６：協会ブドウ酒酵母１号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＣでＰＣＲ法にて増幅
７：協会ブドウ酒酵母３号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＣでＰＣＲ法にて増幅
８：協会ブドウ酒酵母４号ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＣでＰＣＲ法にて増幅
９：Ｘ２１８０Ｂ株ゲノムＤＮＡをプライマーＡ及びＣでＰＣＲ法にて増幅
１０：協会ブドウ酒酵母１号ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＥでＰＣＲ法にて増幅
１１：協会ブドウ酒酵母３号ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＥでＰＣＲ法にて増幅
１２：協会ブドウ酒酵母４号ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＥでＰＣＲ法にて増幅
１３：Ｘ２１８０Ｂ株ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＥでＰＣＲ法にて増幅
【００１８】
ＰＣＲは、上記プライマーを用いて上記ゲノムＤＮＡに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
（ＰＣＲ条件）
１サイクル
９４℃      ３ｍｉｎ    １ｃｙｃｌｅ
９４℃      １ｍｉｎ      ＼
６０℃      １ｍｉｎ        ＞２５ｃｙｃｌｅ
７２℃      ２ｍｉｎ      ／
７２℃      ３ｍｉｎ    １ｃｙｃｌｅ
【００１９】
以上の図２の結果から、実験室株Ｘ２１８０Ｂ株のゲノムＤＮＡを用いた場合、いずれのプライマーでもＤＮＡ断片が増幅されたが、プライマーＡ及びＢでＰＣＲ法の増幅の結果、協会ブドウ酒酵母３号のみが、プライマーＡ及びＣでＰＣＲ法の増幅の結果、協会ブドウ酒酵母１号のみが、プライマーＤ及びＥではＰＣＲ法の増幅の結果、いずれの酵母からもＤＮＡ断片が増幅されたが、その長さは、全て実験室株Ｘ２１８０Ｂ株のものと異なっていた。これらの結果から、協会ブドウ酒酵母間の判別法として有効であることが確認された。
【００２０】
【実施例２】
（鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号の判別法）
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属し、焼酎酵母として用いられている鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号、実験室酵母Ｘ２１８０Ｂ株より宝酒造（株）の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムＤＮＡを、プライマ−Ｄ（配列番号４、図１）とプライマーＢ（配列番号２、図１）、の各々の組み合わせでＰＣＲ法にて増幅したのち、アガロースゲル電気泳動を行った。（電気泳動結果を図３に示す）を得た。
【００２１】
図３において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
１：ラムダHindIII Digested Marker
２：鹿児島酵母Ｋ２ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
３：協会焼酎酵母ＳＨ−４ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
４：宮崎酵母ＭＫゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
５：泡盛酵母１号ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
６：Ｘ２１８０Ｂ株ゲノムＤＮＡをプライマーＤ及びＢでＰＣＲ法にて増幅
【００２２】
ＰＣＲは、上記プライマーを用いて上記ゲノムＤＮＡに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
（ＰＣＲ条件）
１サイクル
９４℃    ２min    １cycle
９４℃    １min     ＼
６０℃    １min       〉２５cycle
７２℃    １．５min ／
７２℃    ３min    １cycle
【００２３】
以上の図３の結果から、プライマーＤ及びＢではＰＣＲ法の増幅の結果、いずれの酵母からもＤＮＡ断片が増幅されたが、その長さ・パターンは、いずれとも異なっていた。これらの結果から、焼酎酵母間の判別法としても有効であることが確認された。
【００２４】
【実施例３】
（協会焼酎酵母ＳＨ−４、協会ブドウ酒１号酵母の判別法）
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する協会焼酎酵母ＳＨ−４、協会ブドウ酒１号酵母より宝酒造（株）の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムＤＮＡを、プライマ−Ｃ（配列番号３、図１）とプライマーＦ（配列番号６、図１）、の各々の組み合わせでＰＣＲ法にて増幅したのち、制限酵素ＲｓａＩで増幅されたＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。（電気泳動結果を図４に示す）を得た。
【００２５】
図４において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
１：ラムダHindIII Digested Marker
２：協会ブドウ酒酵母１号ゲノムＤＮＡをプライマーＣ及びＦでＰＣＲ法にて増幅
３：協会焼酎酵母ＳＨ−４ゲノムＤＮＡをプライマーＣ及びＦでＰＣＲ法にて増幅
４：２のＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで切断したもの
５：３のＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで切断したもの
【００２６】
ＰＣＲは、上記プライマーを用いて上記ゲノムＤＮＡに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
（ＰＣＲ条件）
１サイクル
９４℃    ３min    １cycle
９４℃    １min     ＼
６０℃    １min       〉２５cycle
７２℃    ３．５min ／
７２℃    ３min    １cycle
【００２７】
以上の図４の結果から、プライマーＣ及びＦではＰＣＲ法の増幅の結果、両酵母からもＤＮＡ断片が増幅されたが、その長さはほぼ同じであった。しかし更に増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＲｓａＩで切断することで、両遺伝子の電気泳動パターンに差が認められた。これらの結果から両酵母間の判別法として、増幅されたＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子の制限酵素処理も有効であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００２９】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えばブドウ酒酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【００３０】
【配列表】
0003914983.tif 000002
0003914983.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーＡ〜Ｆの塩基配列を示す。
【図２】ブドウ酒酵母の判別を示す電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図３】焼酎酵母及び泡盛酵母の判別を示す電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図４】ブドウ酒酵母、焼酎酵母、及びこれらのＲｓａＩ消化物の判別を示す電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図１】
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【図２】
0003914983.tif 000005
【図３】
0003914983.tif 000006
【図４】
0003914983.tif 000007