(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
総タンパク質重量に対して、少なくとも１重量％のＤＡＧを含み、かつ、脂質二重層で形成される球状膜小胞の形態であることを特徴とする、組換えＭＧＤＧシンターゼを含む原核細胞または真核動物細胞由来の原形質膜分画。
【請求項２】
ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧモル比が、１０未満であることを特徴とする請求項１に記載の分画。
【請求項３】
ＭＧＤＧシンターゼ／ＤＡＧモル比が、０．１２未満であることを特徴とする請求項２に記載の分画。
【請求項４】
膜小胞が、０．１μｍ〜１０μｍのサイズであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の分画。
【請求項５】
ＭＧＤＧシンターゼが、脂質二重層の内面に位置することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の分画。
【請求項６】
小胞が、非反転型、反転型または混合型の小胞の形態であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の分画。
【請求項７】
分画が、同一の脂質二重層中にＭＧＤＧシンターゼとＤＡＧとを含む混合型の小胞の形態であることを特徴とする請求項６に記載の分画。
【請求項８】
−第１工程で、原核細胞または真核動物細胞を、植物ＭＧＤＧシンターゼをエンコードする遺伝子を含む構築物を使って形質転換する、
−第２工程で、上記細胞を、上記細胞によるＭＧＤＧシンターゼの合成を誘導するために、タンパク質合成を促進する培地で培養する、
−第３工程で、上記工程で培養した細胞を、ホスホリパーゼＣを含む反応培地で培養する、および
−第４工程で、こうしてＤＡＧで富化された細胞を、組換えＭＧＤＧシンターゼと、該膜分画の総タンパク質重量に対して少なくとも１重量％のＤＡＧとを含み、球状小胞の形態である膜分画を得るために分画化する
からなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つで定義されている膜分画の製造方法。
【請求項９】
原核細胞が、細菌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バチルス・セレウスのホスホリパーゼＣを使用することを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ホスホリパーゼＣを、反応培地１ｍｌあたり１Ｕ〜２０Ｕの濃度で使用することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
膜の分画化を、機械的なショック、熱ショック、浸透ショック、電気ショックまたは物理的なショックによって行うことを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
ＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子を、選抜および／またはスクリーニングするための請求項１〜７のいずれか１つで定義されている膜分画の使用。
【請求項１４】
寄生体に対する有効成分または除草剤として使用することができる、ＭＧＤＧシンターゼ活性を抑制する分子を選抜および／またはスクリーニングするための請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
−ｐＨ４〜１１を有する水性相中で、試験基質と、十分な量の請求項１〜７のいずれか１つで定義されている膜分画および放射性同位元素で標識されたＵＤＰ−ガラクトースとを培養することからなる工程、
−膜分画の洗浄からなる工程、
−膜分画の分離からなる工程、そして
−ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定からなる工程
からなることを特徴とするＭＧＤＧシンターゼ活性に影響を与える分子を選抜および／またはスクリーニングするための方法。
【請求項１６】
水性培養相が、バッファーを含み、ｐＨ６〜８を有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＵＤＰ−ガラクトース量が、反応培地１μｌあたり０．１〜１０ｎｍｏｌであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
膜分画の分離からなる工程を、遠心分離またはろ過にて行うことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＧＤＧシンターゼ活性の測定を、膜分画に取り込まれた放射性同位元素で標識されたガラクトース量を測定することで行うことを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
ウエルの底がフィルターからなり、該ウエルが請求項１〜７のいずれか１つで定義されている膜分画を含むことを特徴とする多数のウエルからなるマイクロタイタープレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換えモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)シンターゼを含み、1,2-sn-ジアシルグリセロール(DAG)で富化された細胞の膜分画、該製造方法、MGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子のスクリーニングのためのそれらの使用、およびこれらの膜分画を使ったMGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子のスクリーニング方法に関するものである。
MGDGは、今日までに解析されている全てのプラストの中にあることが知られている：それは、最も多量な色素体膜の脂質であり、50％以上のグリセロリピドを示す。MGDGは、プラスト生物発生(biogenesis)および細胞生存には欠くことができないものであり、他の膜系、特に動物細胞では存在しない(Douce,Sciences,1974,183,852-853)；その生合成は、次の反応によってMGDGシンターゼとも称されるウリジン5'-ジホスフェートガラクトース(UDP-gal)1,2-ジアシルグリセロール3-β-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.46)によって、エンベロープ中で触媒される：
【０００２】
【化１】
0004024147.tif 000002
【０００３】
MGDGシンターゼは、無秩序な方法で基質を結合し(Marechalら.,J.Biol.Chem,1994,269,5788-5798)、酸化感受性システインを有し、触媒にとって重要な二元機能酵素である(Marechalら.,J.Biol.Chem,1995,270,5714-5722)。
それ故、MGDGシンターゼは、プラスト生物発生に不可欠な酵素でもあり、それ故、潜在的に除草性の分子を選抜したりスクリーニングしたりするために特別上等な標的である。加えて、マラリア(熱帯熱原虫(P.falciparum)を含むマラリア原虫類(Plasmodium)の4種)、トキソプラズマ症(トキソプラズマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii))および獣医学の分野の悩みの原因、例えば、コクシジウム症(アメーバ(Eimeria))の原因となる寄生体は、寄生体の生存に必須であると実証されている退化クロロプラスト(アピコプラスト(apicoplast))を含む (G.McFaddenおよびDavid Roos,"Apicomplexan plastids as drug targets",1999,7,No.8,328-333)。
【０００４】
これらアピコプラストを含む寄生体は、アピコンプレクサン寄生体と称される。
それ故、MGDGシンターゼ活性に対して抑制作用を有する分子は、潜在的に高い除草能力および抗-アピコンプレクサン寄生能力を有し、有利には、前記アピコンプレクサン寄生体に対する有効な新規薬品として、また除草剤として使用することができる。
除草剤として、またはアピコンプレクサン寄生体に対する有効成分として使用することができるMGDGシンターゼ活性を抑制する生成物を選抜またはスクリーニングするためのMGDGシンターゼの使用は、特に特許出願FR-A-2 790 915で既に提唱されている。
【０００５】
その出願によれば、その様な産物の選抜および/またはスクリーニングは、試験基質と生物膜に埋め込まれたMGDGシンターゼとを培養し、培養後、特異的な酵素活性を測定することからなる方法に従って行われる。
その前出願で使用した生物膜は、特に、植物から単離した色素体膜または組換えMGDGシンターゼを過剰発現する大腸菌のその他の膜分画である。
【０００６】
MGDGシンターゼによって行われるガラクトシル化活性の測定は、現時点では大変複雑であり、特に次の理由から、容易には縮小化できない：
(1)2つの基質の添加：酵素の2つの基質(DAGおよびUDP-gal)を、培地に同時に添加されなければならない。特にこれら2つの基質は、非常に異なる物理化学特性：一方は高親水性(UDP-gal)、他方は高疎水性(DAG)を有しているという事実のため、系の同質性が問題である。それゆえ、これら2つの基質の導入の制御は、縮小化するのが困難である。
(2)界面活性剤の添加：DAGは疎水性が高いため、水-混和性ではない。それゆえ、酵素がこの外的基質に接近するためには、界面活性剤、例えば生物膜を砕き、ミセルの形態で全ての疎水性分子を再配置させる3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルフォネート(CHAPS)を、培地に導入しなければならない。ミセルは、あまりにも細かいため、ろ過または遠心分離によって反応培地から分離できない(ストークス半径3.8 nm；Marechalら,1994、前述)。
(3)相分離：反応産物(MGDG)を含む液相を抽出するため、有機溶媒(クロロホルムおよびメタノール)の混合物を、Blighらが記載した方法(Can.J.Biochem.Physiol.,1959,37,911-917)に従って、反応の最後に添加した。二相が形成し、脂質は、低有機相で回収される。二相の形成および有機相の抽出は、あまりにも複雑な工程であり、縮小化された工程で用いることができない。
【０００７】
現在、MGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子の検索の状況で、潜在的に除草剤またはアピコンプレクサン寄生体に対する有効成分として使用できる多数の分子を試験するための簡単で、比較的安価で、迅速かつ縮小化された方法を有することは不可欠である。
発明者らは、これらの問題を改善するために、本発明の対象を開発した。
特に、発明者らは、同一の脂質小葉中にMGDGシンターゼおよびDAGの両方を含む新規な生物膜分画を開発した。これらの膜は、MGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子(抑制剤または活性剤)の自動化されたハイスループットスクリーニング(HTS)用の酵素方法で使用することができる。
【０００８】
それゆえ、本発明の対象は、前記分画が総タンパク質重量に対して少なくとも1重量％のDAG を含み、球状小胞の形態であることを特徴とし、少なくとも1つの組換えMGDGシンターゼを含む脂質小葉からなる原核細胞または真核動物細胞由来の原形質膜分画である。
事実、発明者らは、反応培地の容量をかなり減少できるMGDGシンターゼ活性に影響を与える分子をスクリーニングおよび/または選抜する方法で上記膜分画中にMGDGシンターゼおよびDAGが同時に存在することにより、これらの膜分画を使用でき、結果として該方法の縮小化を可能にすることができることを実証した。
【０００９】
これら膜分画によって、対照MGDGシンターゼ/DAG混合を促進する界面活性剤の添加が省かれ、酵素反応は、直接膜内で起こる。
発明の好ましい実施態様に従うと、MGDGシンターゼ/DAGモル比は、10未満、さらには、特に0.12未満である。
特に、酵素/基質比は、ミカエリス-メンテン酵素学的モデルを利用できる測定条件を重視すべきである：特に、基質は、初期反応の制限因子となるべきではない。
【００１０】
発明による膜分画は、脂質二重層を形成する球状小胞の形態が好ましい。
これら膜小胞は、通常、0.1μm〜10μmの間のサイズである。
MGDGシンターゼは、これら小胞内で、通常、脂質二重層の内面に位置している。
これら小胞は、非反転型（noninverted）、反転型または混合型の小胞の形態であってもよい。
事実、膜の崩壊は、反転型または非反転型の小胞の形成を可能にする：しかし両者の場合、MGDGシンターゼは、表面上、殆どDAGの反対側にある。反転型と非反転型の小胞との間での融合は、同一の脂質小葉中でMGDGシンターゼとDAGとを有する小胞の新たなファミリーを生成することができる。
【００１１】
このタイプの混合型小胞は、増大された触媒活性(利用しやすい基質(accessible subtrate))を提示することができ、この結果、本発明によれば好ましい。
発明の対象は、上記膜分画を製造する方法でもあり、：
−第1工程で、原核細胞または真核動物細胞を、植物MGDGシンターゼをエンコードする遺伝子を含む構築物を使って形質転換する、
−第2工程で、上記細胞を、上記細胞によるMGDGシンターゼの合成を誘導するために、タンパク質合成を促進する培地で培養する、
−第3工程で、上記工程で培養した細胞を、少なくとも1つのホスホリパーゼCを含む反応培地で培養する、および
−第4工程で、こうしてDAGで富化された細胞を、少なくとも1つの組換えMGDGシンターゼと、該膜分画の総タンパク質重量に対して少なくとも1重量％のDAGとを含み、球状小胞の形態である膜分画を得るために分画化する
からなることを特徴とする。
【００１２】
この方法に従って使用できる原核細胞の中で、本発明による特に好ましいいものは、例えば大腸菌のような細菌が挙げられる。
この方法に従って使用できる真核細胞の中で、酵母、例えばサッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の細胞、昆虫、例えばキイロショウジョウバエ由来の細胞、および、従来、遺伝子を発現させるのに使用されている哺乳類細胞、例えばCOS細胞およびCHO細胞が挙げられる。
第1工程で、細胞の形質転換は、細菌細胞で行われるのが好ましく、より好ましくは大腸菌細胞である。
【００１３】
形質転換は、特許出願FR-A-2 790 915に記載の方法に従って、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)MGDGシンターゼAをエンコードする配列を含むプラスミドpET-Y3aを使い、ヒートショックにて行うことができる(Miegeら.,Eur.J.Biochem.,1999,265,990-1001)。
MGDGシンターゼの発現を促進するために、第2工程で使用される培地は、富化培地であり、培養する細胞のタイプの機能によって選択される。細菌細胞について特殊な場合、特に大腸菌の場合、ルリアット・ブロース(LB)培地を使用できる。
【００１４】
本発明による製造方法の第3工程でのPLCの使用は、原形質細胞膜におけるDAGでの富化に不可欠である。
特に、これら細胞膜は、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン(リン脂質の80％)が富んでいる。これらリン脂質は、極頭(polar head)には特異的ではないPLCによって加水分解される。
PLCは、次の反応によって、ホスファチジルエタノールアミンをDAGに変換するのを触媒する：
【００１５】
【化２】
0004024147.tif 000003
【００１６】
それゆえ、PLCは、そのリン脂質の加水分解によって、DAGで細胞膜を富化させることができる。
発明に従って使用されるPLCの特性は、DAGで富化されるように意図した膜のリン脂質に対して活性であるならば、重要ではない。
発明の特に好ましい実施態様によれば、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)のホスホリパーゼCが使用される。
PLCは、好ましくは、反応培地1mlあたり1U〜20U/mlの間の濃度、さらに好ましくは5〜12U/mlの間の濃度で使用される。
【００１７】
もちろん、第3工程で使用される反応培地は、通常、PLCの正確な機能化に適合されるべきｐHの緩衝液培地である。このｐHは、通常、6〜8の間である。
第4工程で、膜小胞の形態で自発的に癒着する膜分画を発生させるため、膜を分画化する。膜の分画は、例えばフレンチプレスを使った機械的なショック、熱ショック(凍結/解凍)、あるいは、浸透、電気または他の物理的なショック、例えば超音波で行うことができる。
その結果、得られた膜分画は、任意に、例えばパーコールのクッションで精製することができる。
【００１８】
発明による膜分画の製造が終われば、それらをMGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜またはスクリーニングするのに使用する前に任意に凍結することができる。
それゆえ、発明の対象は、MGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および/またはスクリーニングするための上記膜分画の使用でもある。
特に、発明の対象は、寄生体に対する有効成分として、または除草剤として使用することができ、MGDGシンターゼ活性を抑制する分子を選抜またはスクリーニングするための上記膜分画の使用である。
【００１９】
発明の対象は、MGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および/またはスクリーニングする方法でもあり、：
−pH 4〜11を有する水性相中で、試験基質と、十分な量の先に定義した膜分画および放射性同位元素で標識されたUDP-ガラクトースとを培養することからなる工程、
−膜分画の洗浄からなる工程、
−膜分画の分離からなる工程、そして
−MGDGシンターゼ活性の測定からなる工程
からなることを特徴とする。
【００２０】
この方法に従って、酵素反応は膜分画内で直接起こり、そのサイズは、遠心分離またはろ過による反応培地からの分離物と適合している。この方法を使えば、事実、MGDGは、放射性同位元素で標識され、組み込まれたガラクトースの放射能の簡便な測定を行うことができる膜分画で捕捉されるので、反応産物を抽出するために有機溶媒を使う必要はもはやない。
発明の好ましい実施態様によれば、水性培養相は、緩衝液を含み、ｐH 6〜8である。
【００２１】
一例に、緩衝液は、特に、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸またはKCl/K2HPO4混合物であってもよい。
培地で使用されるUDP-ガラクトース量は、もちろん、反応の制限因子を構成しないように、十分であるべきである。この量は、好ましくは反応培地1μlあたり0.1〜10nmolである。
培養工程は、周囲温度で少なくとも10秒間、より好ましくは1〜45分行われるのが好ましい。
【００２２】
培養工程の最後で、反応を、培地を冷却させるか(通常、約4℃の温度)、または遠心分離で停止させるのが好ましい。
反応が終了したら、膜分画に組み込まれていない過剰な放射性同位元素で標識されたUDP-ガラクトースを除去するために、膜分画の洗浄からなる工程を行う。1回以上の連続した洗浄を、通常水を使って行ってもよい。
そして、膜分画を遠心分離またはろ過にて分離する。後者の技術は、マイクロプレートでの方法の縮小化に特に適している。
【００２３】
MGDGシンターゼの活性の測定は、膜分画に組み込まれた放射性同位元素で標識されたガラクトースの量を測定することで行う。この測定は、従来、放射線計測器を使って行われている。
本発明によるMGDGシンターゼ活性に影響を及ぼす分子を選抜および/またはスクリーニングする方法は、少ない反応量を使い、先行技術で以前に示されている方法の場合のような界面活性剤または有機溶媒を使用していないため、容易に縮小化することができる。
【００２４】
それゆえ、発明の対象は、ウエルの底がフィルターからなり、該ウエルが上記の膜分画を含むことを特徴とする多数のウエルからなるマイクロタイタープレートでもある。
これらのマイクロプレートは、使用する前に冷凍庫で保存することができる。それらは、分離可能な底を任意に備えていてもよい。
【００２５】
本発明によるマイクロプレートは、ウエルの底でフィルターによって保持された膜分画に組み込まれ、放射性同位元素で標識されたガラクトースの放射能を直接測定することで、MGDGシンターゼ活性を測定することができる。
それゆえ、それらを、MGDGシンターゼ活性へ影響を与えるそれらの活性について、分子の巨大な化学ライブラリーを試験するのに使用してもよい。
【００２６】
最後に、発明の対象は、抗寄生体薬品または除草剤を製造するための、本発明によるスクリーニングおよび選抜する方法に従って選抜されるMGDGシンターゼ活性を抑制する少なくとも1つの分子の使用である。
上記取り決めとは別に、発明は、本発明による膜分画製造の実施例、MGDGシンターゼ活性の測定の比較例、アピコンプレクサン寄生体中のMGDGの存在の実証例、および添付図に言及する次の記載から明らかになるであろうその他の取り決めからもなる。：
−図1は、DAGで富化された膜分画に1時間当たり組み込まれるガラクトースのnmol数を、タンパク質のμg数の関数として表している、
−図2Aは、１時間およびタンパク質(DAGで富化された膜分画)1mgあたりに組み込まれるガラクトースのnmol数を、DAGのμmol数の関数として表している、
−図2Bは、１時間およびタンパク質1mgあたりに組み込まれるガラクトースのμmolの逆数をDAGのμmolの逆関数として示すラインウェーバーおよびバークタイプの逆座標プロットを表している、
−図3は、トキソプラズマ・ゴンディイの膜脂質によって組み込まれ、標識されたガラクトースの量を表している。
【００２７】
しかし、これらの実施例は、発明の対象を例示する目的でのみ挙げたものであり、限定するものではないことをないことを明確に理解すべきである。
【００２８】
実施例1：MGDGシンターゼおよびDAGを含む膜分画の製造
1)大腸菌での組換えMGDGシンターゼの製造
A-細菌の形質転換
細菌を、特許出願FR-A-2 790 915に記載の方法に従って形質転換する。
全ての培養物を、滅菌条件下で製造する。コンピテント細菌(大腸菌の菌株BL21またはBLR)を、プラスミドpET-Y3aを用いて、ヒートショックにて形質転換する。これにより、MGDGシンターゼの想定される配列が22アルギニン残基を含み、そのうち17が大腸菌中では実際に使われることがほとんどないAGGまたはAGAコドンによってエンコードされているという事実から、問題を克服することができる。
【００２９】
プラスミドpET-Y-3aは、特許出願FR-A-2 790 915に記載されており、希なコドンAGA/AGGと関連するアルギニントランスファーRNAをエンコードするarg U遺伝子(またはDNA Y)を、プラスミドpET-3a(Novagen)に挿入して構築される。プラスミドpET-Y3aは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)MGDGシンターゼAをエンコードする配列(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド：IPTGで誘導可能なプロモーターの制御下で)、カルベニシリン耐性遺伝子およびアルギニントランスファーRNAをエンコードする配列を含む。このARG4 tRNAは、MGDGシンターゼのようなタンパク質合成を可能にし、それらの配列は、細菌で希なArgコドンを多く含む。
【００３０】
B-大腸菌での組換えMGDGシンターゼAの製造
組換え細菌から単離されたコロニーを、抗生物質(最終濃度20μg/mlのカルベニシリン)の存在下の8mlのルリアット・ブロース(LB)培地に移す。前培養物を規則的な攪拌をしながら37℃で培養し、0.5の値が得られるまで600nmでの光学濃度(OD)を測定して細菌生育の進展を追跡する。
前培養物を500mlのLB培地(カルベニシリン最終濃度20μg/ml)に移し、規則的な攪拌をしながら37℃で培養する。そして、600nmで0.5が測定されるODでは、細菌群は、著しいタンパク質合成の時期である指数増殖期にある。
【００３１】
IPTGの添加(最終濃度0.4mM)は、組換えMGDGシンターゼの合成を誘導することができる。
そして、培養物を、その活性形態でタンパク質の生産を促進させるため、振とうしながら28℃で3時間培養する。
誘導された細菌の懸濁液を、250mlの2つの分画に分け、5000rpmで15分間遠心分離に付す(Sorvall(登録商標)RCSC遠心機、GS-3ローター)。
回収したペレットを、10mlの培地(LB、カルベニシリン最終濃度20μg/ml)で再懸濁し、5000rpmで15分間遠心分離する(Sorvall(登録商標)RCSC、SLA 600 TCローター)。
上清を除去し、細菌ペレットを-80℃で保存する。
【００３２】
2)ホスホリパーゼCを使った処理によるDAGでの細菌膜の富化
前工程でMGDGシンターゼを誘導した5mlの細菌のペレットを、5mlの10mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、pH7.8、1mMジチオスレイトール(DTT)および10％(w/v)グリセロールに再懸濁する。
20μlのバチルス・セレウスのホスホリパーゼC(PLC)(ホスファチジルクロリン  クロリンホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.4.3)を、最終濃度8U/mlに達するように添加する。反応を、攪拌しながら環境温度で3時間行い、EDTA(最終濃度0.4M)を添加することで停止させる。
【００３３】
3)細菌膜の精製
PLCで処理されることで膜がDAGで富化され、前の工程で上記のようにして得られた誘導された細菌の溶液を、50mlの5mM MOPS、pH7.8、0.5mM DTT、5％(w/v)グリセロールに入れる。
細菌を、フレンチプレスを使って高圧(800psi)で破壊する：そして水性溶液中の膜を、それ自体で自発的に小胞および反転型小胞に組織化する。
得られた6mlの溶解物を、35％のパーコールのクッション(10mM MOPS、pH 7.8、1mM DTT、10％グリセロール中)に置き、そして4℃の温度にて、5000rpmで10分間遠心分離する(Sorvall(登録商標)RC SC、HB-6ローター)。
【００３４】
MGDGシンターゼと、総タンパク質重量に対して少なくとも1重量％のDAGとを含む脂質二重層からなる小胞を得る。
そして、4つの分画を形成する：上清(チューブの上部)、上清/パーコール界面、35％パーコールのクッションおよびペレット。
全ての膜分画を回収し、10mM MOPS、pH 7.8、1mM DTT、10％(w/v)グリセロールの5倍量の希釈液で洗浄し、4℃の温度にて、5000rpmで15分間遠心分離する(Sorvall(登録商標)RCSC、HB-6ローター)。
【００３５】
上清を除去し、そして、もろいペレットを、4℃の温度にて13000rpmで10分間再び遠心分離(エッペンドルフ遠心機 5804)するため、注意深く1mlの洗浄媒体に入れる。
ペレットを、500μlの10mM MOPS、pH 7.8、1mM DTT、10％(w/v)グリセロールに再懸濁させ、-20℃で保存する。
【００３６】
実施例2：先行技術と本発明とによるMGDG合成活性の比較測定
1-BlighおよびDyer(1959)の方法によるMGDG合成活性の従来の測定
この方法は、BilighおよびDyer"A Rapid Method Of Total Lipid Extraction and Purification",Can.J.Biochem.Physiol.,1959,37,911-917.による論文に記載された。
ガラクトシル化活性の測定は、放射性(14C)UDP-galを起源とするガラクトースを、反応培地の脂質分画に組み込むことを基にしている。
反応を環境温度で行う。100μgのDAG疎水性基質(1mg/ml)と200μgのホスファチジルグリセロール(PG)のクロロホルム溶液(10mg/ml)とをチューブに導入し、アルゴン下で乾燥させ、そして11μlの界面活性剤媒体(85mM CHAPS、0.7 M MOPS、14mM DTT)、75μlのKCl(1M)および75μlのKH2PO4(1M)で再懸濁する。
界面活性剤、この場合CHAPSの存在は、界面活性剤、DAG、PGおよびサンプル起源のMGDGシンターゼを含む混合ミセルを形成することを可能にする。
150μlのサンプル添加後、反応培地の最終組成(最終容量300μl中、50mM MOPS、1mM DTT、250mM KCl、250mM KH2PO4、6mM CHAPS)は、表面希釈モデル(Marechalら,1995前述)の基準を満たす。
この実施例は、界面活性剤としてCHAPSを使用するが、他の界面活性剤、例えばコール酸塩、デオキシコール酸塩、トリトン-X 100(登録商標)、NONIDET(登録商標)、オクチルグルコシドまたはラウリルジメチルアミン酸化物(LDAO)を使用することもできる。
【００３７】
反応を、10μlのUDP-[14C]-ガラクトース(New England Nuclear 25 Bq/μmol、10mM)を導入することで開始する。反応を、1.5mlの1/2(v/v)クロロホルム/メタノール混合物を添加することで停止させる。
0.5mlのクロロホルムと0.6mlの水との添加は、1000rpmで10分間遠心分離(エッペンドルフA-4-44遠心分離器,5804ローター)した後、明瞭な二重相(チューブの上部中の高放射性水性相と底部中の有機相)を得ることができる。
水性相は酵素で使用されない残留UDP-galの放射能を含むが、有機相は、反応の疎水性生成物：MGDGの放射能を含んでいる。
UDP-[14C]-galを有さない同一容量の水性相を使って水性相を2回洗浄した後、生産されたMGDGを含む有機相を計数バイアルに移す。
回収された分画をアルゴン下で乾燥させ、10mlのシンチレーション液に入れ、サンプルの放射能を見積もる。
ガラクトシル化活性は、タンパク質のmgおよび時間あたりに脂質分画に取り込まれるガラクトースのμmol数で定義される。
【００３８】
II-発明に従った遠心分離後の膜の精製による測定
この測定は、酵素(MGDGシンターゼ)と、その疎水性基質(DAG)との両方を隔絶する膜の小胞からなるサンプルについてのみ行うことができる。そして、この場合に限り、酵素および基質を接触させるために、もはや界面活性剤を添加する必要はない。
使用される反応培地は、有機溶媒での脂質の抽出後、従来の方法で得られたものとは異なる。
実施例1、工程3で得られるようなMGDGシンターゼおよびDAGを含む膜分画サンプルを、250mM KClおよび250mM KH2PO4を含む最終容量300μlに懸濁させる。
反応を、UDP-放射性同位元素で標識された[14C]galを添加することで開始させる。
反応を、10分間氷に移すことで停止させる。
【００３９】
(膜に取り込まれない)余分なUDP-[14C]galの洗浄を、4℃の温度にて、13000rpmで、10分間サンプルを遠心分離し、そして500μlの滅菌水中にペレットを入れて行う。
この洗浄工程を3回繰り返す。得られたペレットを、真空下で1時間遠心分離にて乾燥させる(エッペンドルフ濃縮器5301スピード-バック)。そして、乾燥サンプルを、計数バイアルに移すため、1/2(v/v)クロロホルム/メタノール混合物に入れ、アルゴン下で乾燥させ、10mlのシンチレーション液で可溶化する。
サンプルの放射能を、Kontron(登録商標)(Betamatic)計測器を使って見積もる。
ガラクトシル化活性は、タンパク質のmgおよび時間あたりに取り込まれるガラクトースのμmol数で定義される。
【００４０】
III-変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動
解析されるサンプルを、負荷媒体(0.15MトリスHCl、pH 6.8、10％ グリセロール、0.02％ SDS、0.01％ ブロモフェノールブルー、0.025％ DTT)に懸濁させ、そして4分間沸騰させる。
アクリルアミド溶液を、0.192Mグリシンおよび0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む25mMトリス緩衝液(分離ゲルpH8.3、スタッキングゲルpH6.5)中で製造する。
スタッキングゲル(5％アクリルアミド)上および分離ゲル(12％アクリルアミド)上での電気泳動を、環境温度にて、100Vの定電圧下で、0.192Mグリシン(pH8.3)および0.1％(w/v)SDSを含む25mMトリス緩衝液で行う(U.K.Laemmli,Nature,1970,227,680-683)。
ブロモフェノールブルーがゲルを離れた時点で移動を止める。
そして、クマシーブルー(0.5％(w/v)クマシーブリリアントブルー8250、25％メタノール、10％(v/v)酢酸)でタンパク質を染色する。
ゲルを、25％イソプロパノール、10％(v/v)酢酸の連続浴で脱色する。
【００４１】
ＩＶ-タンパク質のアッセイ
原理：タンパク質を、Lowry法(Lowryら.,J.Biol.Chem.,1951,193,265-275)にて、2つの同時に着色された反応を測定することでアッセイする。
“ビューレット”反応と類似した第一反応は、タンパク質のペプチド結合(-CO-NH-)とアルカリ媒体中のCu2+イオンとの錯体の形成をもたらし、第二反応は、チロシンのフェノールによるフォリン-シオカルト試薬の還元をもたらす。この方法は、2〜200mg/mlの濃度範囲を有する溶液をアッセイすることを可能にする。
実験手法：アッセイされるサンプルの容量を、滅菌水を使って200μlに調節し、そして、1mlのアッセイ試薬を即席で製造する(50容量の2％ CO3Na2、0.1N NaOHと1容量のCuSO4、0.5％ SH2O、1％酒石酸ナトリウム)。
20℃で10分間の反応後、100μlのフォリン-シオカルト試薬を添加し、反応を20℃で30分間インキュベートする。
アッセイされるサンプル中のタンパク質の量を、ウシ血清アルブミン(BSA)を使って設定した基準範囲を使って750nmでの吸光度を比較することで測定する。
【００４２】
Ｖ-結果
A- UDP-Galの存在下でのガラクトシル化活性の測定を可能にするため、組換え細菌はDAGで人工的に富化されているに違いない
導入工程(実施例1、工程1、図1)の間に行われる細菌サンプルの総タンパク質の解析は、IPTGを使った導入が、タンパク質の約30％を占めるMGDGシンターゼAの蓄積をもたらすことを示す。
DAGの存在下および不在下でMGDGシンターゼAを発現する誘導される細菌の粗の抽出物中で測定されるガラクトシル化活性の比較を行った。
ガラクトシル化活性を、BlighおよびDyer(上記参照)の方法に従って、PGの不在下で、28℃で誘導される、および50μgのDAGの存在下に置かれることでも可能である20μlの細菌培養物について脂質を抽出することで測定した。
得られた結果を以下の表１に表す：
【００４３】
【表１】
0004024147.tif 000004
【００４４】
これらの結果は、かなりのガラクトシル化活性が、270μMのDAGで培養したこの抽出物中で観察され、一方、DAGの外的導入なしで培養された細菌膜にはガラクトースの組み込みが実質的にないことを示す。
結果として、細菌膜は、組換え酵素の活性の独立した測定を行うに十分な量の内生DAGを有していない。
【００４５】
B- PLCを使った細菌膜の処理は、ガラクトシル化活性を測定するのに利用できるDAGを生成する
MGDGシンターゼのガラクトシル化活性を、PLCによる内生DAGの合成後、または外的DAGの添加後に測定した。この活性を、3μlのPLC(2000U/ml)、50μgのDAG(1mg/mlおよび任意に1または10μlのCaCl2の存在下で)の存在下または不在下にて、28℃で誘導した20μlの同一の細菌培養物で測定した。
結果を以下の表2に表す：
【００４６】
【表２】
0004024147.tif 000005
【００４７】
これらの結果は、PLCを使った細菌膜の処理が、270μMの外的DAGを添加した後に得られたものよりも大きいガラクトシル化活性を計測できることを示す。
それゆえ、PLCは、リン脂質の加水分解によって、DAGを使って細菌膜を負荷することを可能にする。DAGを添加した際に得られたガラクトースの取り込みが乏しいのは、添加されたDAGの割合が大変少ないのは、PLCの不在下で細菌膜へ浸透でき、MGDGシンターゼに対する基質として作用できるという事実で説明される。
PLCの活性剤であるカルシウムが、測定されるガラクトースの取り込みに影響を与えておらず、細菌懸濁液のCa2+濃度がPLCの最適活性を測定するのに十分であることを示唆していることに留意するのも重要である。
【００４８】
C-放射性ガラクトースのDAGで富化された膜への取り込み
前記実施例1、工程B-3)で記載したように、放射性ガラクトースの溶解された膜小胞への取り込みを測定し、溶解されていないがMGDGシンターゼAの発現が誘導された細菌による放射性ガラクトースの取り込みと比較した。ガラクトシル化活性を、150μgのPG(10mg/ml)および100μgの外的DAG(1mg/ml)の存在下ならびに不在下で、150μlのサンプル(前記)について測定する。
得られた結果を以下の表3に挙げる。
【００４９】
【表３】
0004024147.tif 000006
【００５０】
これらの結果によると、DAGまたはPGの添加なしで溶解された細菌で測定されたガラクトシル化活性が、MGDGシンターゼとDAGとの両方を含む小胞が形成され、酵素がその触媒能を維持していたことを指す。
それらは、溶解された分画の活性が、溶解されていない分画のものよりも大きいことも示す。この観察は、MGDGシンターゼAが、細菌膜の脂質二重層の内面に位置することと一致する。特に、PLCのみが脂質二重層の外側に接近するため、内面に位置するMGDGシンターゼの分画は形成されたDAGの一部のみを捕捉することができ、これは膜の小葉外部から小葉内部に横切る移動を受ける。膜の破壊は、反転型および非反転型の小胞の形成を可能にするが、両者の場合には、MGDGシンターゼは、表面上、殆どDAGと反対側にある。反転型と非反転型の小胞との間での融合は、同一膜小葉で、酵素およびDAGを有する小胞の新たなファミリーを生成してもよい。このタイプの小胞は、増大された触媒活性(利用しやすい基質)を発揮してもよい。小胞のこれら3つの集団、反転型、非反転型および混合型の生成が、同程度に起こりうる場合、溶解されたサンプルの活性は、本場合で観察される溶解されていないサンプルに対して1.33の力価で増大される。
【００５１】
D-小型化されえるアッセイの開発
1)PLCの役割の実証
PLCで処理することで、MGDGシンターゼAおよび任意にDAGで富化された膜小胞を含む溶解された細菌の懸濁は、前記のように35％のパーコール勾配(9ml)で分画される。上清および界面(S+SL：6ml)に相当する分画ならびにペレット(P：1ml)に相当する分画も回収する。ガラクトシル化活性およびタンパク質の量を、採取した様々な分画(S+SL=6ml、P=1ml)ならびに沈殿した分画(6mlのD)でも測定する。
得られた結果を、以下の表4に挙げる。
【００５２】
【表４】
0004024147.tif 000007
【００５３】
これらの結果は、PLCでの処理でDAGでの富化を受けた膜は、それらがPLCでの処理を受けていないために、DAGで富化されていない膜よりも多くのUDP-galを変換できることを示す。
変性条件下でのアクリルアミドゲル電気泳動による分画の解析は、上清からペレットに亘るMGDGシンターゼに相当するポリペプチドに対する富化を示す。ペレット中の低ガラクトシル化活性(表4)は、主に封入体(不活性酵素)でのこの分画の富化を示唆する。それゆえ、ミカエリス-メンテン酵素学の妥当性に対する基準関数として、MGDGシンターゼの酵素活性を解析するためにDAGで富化された膜と結合するMGDGシンターゼAを含むS+SL分画を選択した。
【００５４】
2)MGDGシンターゼの酵素活性の解析
結果を図1に挙げ、初期率(時間あたりに取り込まれるガラクトースのnmol)を、タンパク質/チューブのμg数の関数として表す。初期率を、PLCで処理し、および処理されたS+SL分画(25、50、75μgのタンパク質)中に存在する様々な量の膜の、培養15および30分後のガラクトースの取り込みを測定することで決定した。
この図1は、ガラクトースの取り込みが、UDP-galの存在下で培養したサンプル量の1次関数であることを示す。曲線の傾きは、時間およびタンパク質のmgあたりに取り込まれる340nmolのガラクトース活性を想定することができる。
PLCでの処理後に得られたDAGの量は測定されないが、サンプルのタンパク質の量がたとえいくらであったとしても、膜小胞中のこの基質の濃度は一定のままである。この点で、DAGの表面濃度(膜表面のユニットあたりのモル分画またはDAGのモル)およびUDP-galのモル濃度は、一定である。結果として、初期反応率は、タンパク質の量に直接比例し、酵素量を制限する特性を表している。直線の関係は、ミカエリス-メンテン酵素学解析における条件を確認する条件の１つである。
【００５５】
3) 細菌膜中で、PLCでの処理によって生成されるDAG量の評価
PLCで処理されておらず、パーコール勾配で精製された5μgの膜の活性(組み込まれたガラクトースのnmol数/時間/mg)を、導入された種々のDAG量について測定した(図2A)。初期率を、培養15および30分後のガラクトースの取り込みを測定することで決定した。測定を、導入された種々のDAG量について行った(12.5μg：25μg：37.5μg；300μl反応培地あたり)。
測定は、ラインウェーバー-バーク タイプの反転型座標プロットを設定することを可能にする(図2B)。
【００５６】
PLCで処理されていない膜上で行われた測定が、DAG内容物を評価する基準曲線を構成している場合、本質的な活性が340nmol/h/mgである5μgのサンプルは、DAG 0.5μgが添加され、処理されていない同等のサンプルに匹敵すると考えられる。
その結果、そこから、PLCでの処理が、タンパク質のμgあたり約0.1μgのDAGを得ることが可能であることを推定することができる。
【００５７】
4)MGDGシンターゼおよびDAGで富化された膜の溶解前後のガラクトシル化活性の測定
ガラクトースを取り込むために-20℃で1日間凍結された膜の能力を測定し、凍結工程を受けていない膜と比較した。
2つのサンプル間で、有意差は観察されなかった。
結果として、この特性は、膜サンプルを製造することを可能にし、およびMGDGシンターゼ活性に影響を与える分子をスクリーニングするための、活性の喪失なしに冷条件下でサンプルを保存することからなる工程からなってもよい自動化装置で膜サンプルを再現的に扱うことを可能にする。
【００５８】
5)ガラクトシル化活性の単純化された測定は、MGDGシンターゼおよびDAGで富化された膜サンプルを含む
ホスホリパーゼCでの処理によってDAGで富化され、任意に精製されたMGDGシンターゼを含む膜小胞を、それゆえこれら同一な小胞中のMGDGの生産を測定するのに使用することができる。
50μgの膜小胞(50μgのMGDGシンターゼおよび50μgのDAGに匹敵する)を、チューブ(チューブ No.1)に含まれる水性相(250mM KCl、250mM K2HPO4、最終容量300μl、pH 7.8)に懸濁する。
比較として、対照チューブ(チューブ No.2)を作製した：50μgのMGDGシンターゼと50μgのDAGとを、チューブ No.1で使用したのと同一の水性相に懸濁した。
【００５９】
反応を、各々のチューブで、ガラクトースに14Cを使って放射性同位元素で標識された10μlのUDP-galを添加することで開始し、そして30分後、4℃まで冷却することで停止させる。
そして、チューブ No.1の反応培地を13000rpmで10分間遠心分離し、500μlの水を使って数回洗浄し、再び13000rpmで10分間遠心分離する。
チューブ No.2を、前記のように有機溶媒を用いる従来の脂質抽出法を使って処理した。
遠心分離ペレット(チューブ No.1)中で回収された放射能を、放射線計測器を使って測定したところ、4026dpmであった。
【００６０】
チューブ No.2中の脂質の抽出後に測定した放射能を、同一の方法で測定したところ、4136dpmであった。
結果として、各々のチューブについて測定された放射能に有意差はなく、本発明によるMGDGシンターゼ活性を測定する方法を有効とすることができる。
発明に従って製造された膜小胞のサンプルは、ミカエリス法によって酵素学的な活性の測定に対応する条件下で、酵素およびその疎水性補助基質を含む。加えて、このサンプルは、遠心分離、伸張、ろ過によって、ガラクトシル化活性の測定を単純化し、縮小化することができる。
【００６１】
ＶＩ-結論
この実施例は、ミカエリス-メンテン法に関連するガラクトシル化活性を測定するために、組換えMGDGシンターゼを発現する細胞の培養物由来の膜分画およびマイクロプレートで縮小化できる測定法を使用できることを実証した。
組み込まれた放射能を、反応培地の凝集中で簡単に回収することができ、遠心分離によって集めることができることも実証した。その結果、この系で生成されたMGDGは、精密ろ過による測定系が測定に十分な膜の中に蓄積し、活性分子のハイスループットスクリーニング(HTS)には、この酵素アッセイを使用することを可能にする。特に、潜在的に除草能力を有する新規の分子を選択するために、この方法によって“化学ライブラリー”をスクリーンすることができる。さらに、このように生産されるMGDGシンターゼAに特異的な抑制剤は、ガラクトリピド合成の生理学的な研究を行うことができる効果的な薬理学的ツールであろう。
【００６２】
実施例3：アピコンプレクサン寄生体中でのMGDG合成の実証
この実施例の目的は、アピコンプレクサン寄生体、トキソプラズマ・ゴンディイ中のMGDGの存在、および、結果として抗寄生体特性を有する分子を検索するための標的となるMGDGシンターゼが、明らかにアピコンプレクサン中に存在することを実証することである。
2×108細胞のトキソプラズマ・ゴンディイを、タキゾイドの形態で、2％(w/v)のグリセロールおよび50mMのKClを含む0.1mlの10mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、pH 7.8ならびに1mMジチオスレイトール(DTT)の1:10混合物に懸濁し、4μ CiのUDP-[3H]-ガラクトース(7.5nmol)の存在下で、30分間培養する。
【００６３】
グリコリピドをBlighおよびDyer,1959(上記)の方法に従って抽出し、対照脂質(MGDG；ウシ脳モノガラクトシルセレブロシド(MGCB)；ジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)；トリガラクトシルジアシルグリセロール(トリGDG)およびテトラガラクトシルジアシルグリセロール(テトラGDG))の存在下で、60μシリカゲルプレート上で65/25/4(v/v)のクロロホルム/メタノール/水 混合物を使って解明される薄層クロマトグラフィー(TLC)にて解析する。
そして、標識された脂質の放射能を、TLC-解析装置(LB2842自動TLCスキャナー)を使って検出する。
【００６４】
得られた結果を図3に挙げ、トキソプラズマ・ゴンディイ細胞によって取り込まれ、ラベルされたガラクトース量(cpm)を、センチメートルでの移動の関数として図示する。
この図で、MGCBと同程度移動する3つの第一ピークを観察することができ、それに対して最後のピークは、MGDGと同程度移動する。
【００６５】
移動後、脂質を、0.2％のオルシノールおよび75％の硫酸からなる溶液をシリカゲルプレートにスプレーし、そして100℃の温度で15分間加熱することで目視する(結果は示さず)。
MGDGに相当するピークは、0.1N水酸化カリウムの水/メタノール 混合物において、3時間のアルカリ加水分解後に消失する。
脂質の完全な同定を、緑色コーヒー豆由来のα-ガラクトシダーゼとウシ精巣由来のβ-ガラクトシダーゼとを使った極頭の加水分解後、および穏やかな条件下でアルカリ加水分解での脱アシル化(0.1N KOHの水/エタノール混合物で3時間)後に行う。
【００６６】
ピーク4は、β-ガラクトシダーゼを使った加水分解に感受性であり、ガラクトースが、MGDGに関しては、ベータ位で明確に結合されるのを示している。
さらに、アルカリ加水分解後、ピーク4は、消失し、そのことは、トキソプラズマ・ゴンディイの膜に存在する脂質が、明らかに、ジアシルグリセロールの半分を含むことを実証している。
この実験例は、トキソプラズマ・ゴンディイのタキゾイトの膜中のMGDGの存在を実証し、植物MGDGシンターゼの抑制剤を検索する用途が抗アピコンプレクサン寄生体剤の同定であることを確証している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、DAGで富化された膜分画に1時間当たり組み込まれるガラクトースのnmol数を、タンパク質のμg数の関数として表している。
【図２Ａ】  図2Aは、１時間およびタンパク質(DAGで富化された膜分画)1mgあたりに組み込まれるガラクトースのnmol数を、DAGのμmol数の関数として表している。
【図２Ｂ】  図2Bは、１時間およびタンパク質1mgあたりに組み込まれるガラクトースのμmolの逆数をDAGのμmolの逆関数として示すラインウェーバーおよびバークタイプの逆座標プロットを表している。
【図３】  図3は、トキソプラズマ・ゴンディイの膜脂質によって組み込まれ、標識されたガラクトースの量を表している。
【図１】
0004024147.tif 000008
【図２Ａ】
0004024147.tif 000009
【図２Ｂ】
0004024147.tif 000010
【図３】
0004024147.tif 000011