(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流動性媒体中に浮遊する磁気応答性微小物質を観測する装置であって、
透明壁と流動性媒体を収容するために形成されたチャンバとを有する容器と、上記透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造と、該強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を誘発する磁気手段と備え、磁気応答性物質は上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列されて上記強磁性捕獲構造近傍の壁に沿って固定されるようにした装置。
【請求項２】
容器を介して流体の流れを引き起こす流体入口と流体出口とを容器に設けた請求項１の装置。
【請求項３】
流体入口に接続され、流体入口に複数の試薬を連続的に供給する流体供給手段を備えた請求項２の装置。
【請求項４】
強磁性捕獲構造が、３０ミクロン以下の有効直径を有する複数の強磁性線を備えた請求項２の装置。
【請求項５】
磁気手段が、外部勾配を容器に付与して容器内の物質を捕獲構造の方向に搬送するように形成された請求項４の装置。
【請求項６】
固定された物質を検知し、計数する自動化された光学観測システムを備えた請求項５の装置。
【請求項７】
自動化された観測システムが、上記固定物質を検知する光学検知器と、強磁性線と平行に光学検知器を走査する追跡手段とを備えた請求項６の装置。
【請求項８】
容器を介して流体の流れを引き起こす流体入口と流体出口とを容器に設けた請求項７の装置。
【請求項９】
流体入口に接続され、流体入口に複数の試薬を連続的に供給する流体供給手段を備えた請求項８の装置。
【請求項１０】
流動性媒体中に浮遊する磁気応答性微小物質を観測する装置であって、
透明壁と流動性媒体を収容するために形成されたチャンバとを有する容器と、上記透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造と、該強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を誘発する磁気手段とを備え、磁気応答性物質は上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列されて上記強磁性捕獲構造近傍の壁に沿って固定されるとともに、固定された物質を検知し計数する自動化された光学観測システムを更に備えた装置。
【請求項１１】
自動化された観測システムが、上記固定物質を検知する光学検知器と、捕獲構造に沿って光学検知器を走査する光学追跡手段とを備えた請求項１０の装置。
【請求項１２】
自動化された観測システムが、容器を支持し選択的に振動させる振動自在のサポートを備えた請求項１１の装置。
【請求項１３】
振動自在のサポートが圧電振動子を備えた請求項１２の装置。
【請求項１４】
流動性媒体中に浮遊する磁気応答性微小物質を観測する装置であって、
透明壁と流動性媒体を収容するために形成されたチャンバとを有する容器と、上記透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造と、該強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を誘発し上記強磁性捕獲構造の上記縦部材に垂直に外部勾配を付与する磁気手段とを備え、磁気応答性物質は上記強磁性捕獲構造近傍の壁に向かって搬送されるとともにそれに沿って固定されるようにした装置。
【請求項１５】
磁気手段がテーパ状の極面を有する一対の磁石を備え、容器を収容するギャップをその間に設けた請求項１４の装置。
【請求項１６】
強磁性捕獲構造が、３０ミクロン以下の有効直径を有する複数の強磁性線を備えた請求項１４の装置。
【請求項１７】
強磁性線が壁に付着支持された請求項１６の装置。
【請求項１８】
強磁性線が壁上にリトグラフ法で形成された請求項１７の装置。
【請求項１９】
観測するために流動性媒体中に浮遊する磁気応答性微小物質を固定する方法であって、
透明壁付きチャンバと上記透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造とを有する容器を設け、流動性媒体を上記チャンバ内に導入し、上記チャンバに磁界を印可し上記強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を誘発し、上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列されて上記強磁性捕獲構造近傍の壁に対し保持された磁気応答性物質を観測するステップを備えた方法。
【請求項２０】
強磁性捕獲構造が複数の線形強磁性素子を備え、上記観測ステップが自動化された光学検知システムにより線形強磁性素子に沿って走査するステップを備えた請求項１９の方法。
【請求項２１】
上記観測ステップが磁気応答性物質を計数するステップを備えた請求項１９の方法。
【請求項２２】
上記印加ステップが、強磁性捕獲構造をチャンバの下に位置決めするために容器を方向付けるステップを備え、磁気応答性物質を重力の影響下で捕獲構造に向かって搬送するようにした請求項１９の方法。
【請求項２３】
印加ステップが、外部磁気勾配を容器に印可し磁気応答性物質を捕獲構造に向かって搬送するようにした請求項１９の方法。
【請求項２４】
強磁性捕獲構造が複数の線形強磁性素子を備え、上記観測ステップが自動化された光学検知システムにより線形強磁性素子に沿って走査するステップを備えた請求項２３の方法。
【請求項２５】
観測するために流動性媒体中に浮遊する磁気応答性微小物質を固定する方法であって、
透明壁付きチャンバと上記透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造とを有する容器を設け、流動性媒体を上記チャンバ内に導入し、上記チャンバに外部勾配を有する磁界を印可して上記強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を誘発するとともに磁気応答性物質を上記強磁性捕獲構造に向かって搬送し、上記強磁性捕獲構造近傍で壁に対し保持された線形単分子層に上記磁気応答性物質を収集し、上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列されて上記強磁性捕獲構造近傍の壁に対し保持された磁気応答性物質を観測するステップを備えた方法。
【請求項２６】
流動性サンプル内の少なくとも第１種及び第２種の生物学的物質を区別する方法であって、
第１種及び第２種の生物学的物質に対し結合親和力を有する含鉄流体を流動性サンプルに添加し、チャンバの片側に形成された透明壁を有し該透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造を有する分離容器に流動性サンプルを収容し、上記分離容器を磁場内に位置決めして第１種及び第２種の生物学的物質を上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列して上記強磁性捕獲構造近傍の壁に沿って固定するに十分な内部勾配を上記強磁性捕獲構造の近傍に誘発し、第１種及び第２種の生物学的物質それぞれの異なる光学的特性を観測するステップを備えた方法。
【請求項２７】
第１種及び第２種の生物学的物質にそれぞれのマーカーで印をつけ上記異なる光学的特性を作り出すようにした請求項２６の方法。
【請求項２８】
上記印をつけるステップが、流動性サンプルに第１及び第２の光学的マーカーをつけ第１種および第２種の生物学的物質から異なる光学的応答を生成するステップを備え、上記観測ステップが、上記異なる光学的応答を生成するために容器を光学的放射線で照射するステップを備えた請求項２７の方法。
【請求項２９】
第１及び第２の生物学的物質が細胞型の白血球副集団である請求項２６の方法。
【請求項３０】
白血球副集団が生きた及び死んだ白血球である請求項２９の方法。
【請求項３１】
第１及び第２の生物学的物質がそれぞれ第１及び第２の赤血球副集団である請求項２６の方法。
【請求項３２】
第１及び第２の生物学的物質がそれぞれ細胞型の血小板副集団である請求項２６の方法。
【請求項３３】
上記観測ステップが、第１種及び第２種の生物学的物質のそれぞれの異なる形状を観測するようにした請求項２６の方法。
【請求項３４】
上記生物学的物質が細胞型であり、上記観測ステップが第１種及び第２種の固定された細胞を計数し、固定された細胞の正味表面積に対する固定された物質の比を決定するようにした請求項３３の方法。
【請求項３５】
蛍光薄膜染料を含む稀釈剤で流動性サンプルを稀釈するステップを備え、上記観測ステップが、固定細胞から蛍光量を測定してそれに比例した固定細胞の表面積を決定するようにした請求項３４の方法。
【請求項３６】
容器を介して試薬を連続して流し、異なる光学的応答を作り出すようにした請求項２６の方法。
【請求項３７】
生物学的物質が異なる細胞副集団のそれぞれの細胞であり、容器を介して試薬を連続的に流す前に細胞の薄膜を透過させるステップを備えた請求項３６の方法。
【請求項３８】
試薬の連続的流れが、異なる蛍光性の光学的応答を生成する試薬の連続的流れであり、上記観測ステップが、上記異なる蛍光性応答を生成するために選択された照明で固定細胞を照射するようにした請求項３７の方法。
【請求項３９】
上記生物学的物質が細胞であり、上記観測ステップがその場で固定細胞の混成を行うようにした請求項２６の方法。
【請求項４０】
流動性媒体中に浮遊する生物学的物質の免疫表現型副集団を見分ける方法であって、
生物学的物質に対し結合親和力を有する所定量の磁気応答性粒子を流動性サンプルに添加し、異なる弗化クロムをそれぞれ有する複数のプローブを流動性媒体に付加し、チャンバの片側に形成された透明壁を有し該透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造を有する分離容器に流動性媒体を収容し、上記分離容器を磁場内に位置決めして生物学的物質を上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列して上記強磁性捕獲構造近傍の壁に沿って固定するに十分な内部勾配を上記強磁性捕獲構造の近傍に誘発し、弗化クロムの少なくとも選択された一つを活性化する光学的放射線で上記分離容器を照射し、選択された弗化クロムの光学的応答を観測するステップを備えた方法。
【請求項４１】
流動性サンプル中の赤血球の副集団を区別する方法であって、
流動性サンプル中の赤血球を磁気応答性とし、チャンバの片側に形成された透明壁を有し該透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造を有する分離容器に流動性サンプルを収容し、上記分離容器を磁場内に位置決めして磁気応答性赤血球を磁化するとともに細胞を上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列して上記強磁性捕獲構造近傍の壁に沿って引き付けて固定するに十分な内部勾配を上記強磁性捕獲構造の近傍に誘発し、上記強磁性捕獲構造近傍で固定された赤血球を観測するステップを備えた方法。
【請求項４２】
磁気応答性とするステップが、赤血球を磁化可能な粒子で分類するステップを供えた請求項４１の方法。
【請求項４３】
磁化可能な粒子が、赤血球の少なくとも一つの副集団特徴的決定子と結合するようにした請求項４２の方法。
【請求項４４】
磁化可能な粒子が、ＣＤ７１、グリコホリンＡ及びトランスフェリンからなるグループから選択された少なくとも一つの結合物質である請求項４３の方法。
【請求項４５】
観測ステップが、異なる形状をそれぞれ有する赤血球の副集団を計数するようにした請求項４１の方法。
【請求項４６】
蛍光薄膜染料を含む稀釈剤で流動性サンプルを稀釈するステップを備え、上記観測ステップが、固定細胞から蛍光量を測定してそれに比例した固定細胞の表面積を決定するようにした請求項４５の方法。
【請求項４７】
第１の流動性媒体中の細胞の定量的解析を行う方法であって、
比較的大きい磁気モーメントを有する既知量の第１磁気応答性粒子を備えた第１マーカーを第１流動性媒体に付加し、細胞に対し結合親和力を有する所定量の第２磁気応答性粒子を第１流動性媒体に付加し、第１流動性媒体を透明壁上にリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造を有する磁気分離器内に配置して磁気応答性物質を上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列して第１流動性媒体の他の成分から分離し、分離した磁気応答性物質を第２流動性媒体中に浮遊させ、第２流動性媒体中の第１マーカーと細胞の量を計数して第１流動性媒体中の細胞の濃度を決定するステップを備えた方法。
【請求項４８】
結合細胞に略等しい磁気モーメントを有する既知量の第３磁気応答性粒子を備えた第２マーカーを第１流動性媒体に付加するステップを有し、上記計数ステップが、磁気分離効率の測定のため、第２流動性媒体中の第２マーカーの量を計数するステップを備えた請求項４７の方法。
【請求項４９】
第２磁気応答性粒子に結合剤を有する所定量の非磁気応答性粒子を供給することにより第２マーカーを作製するステップを備えた請求項４８の方法。
【請求項５０】
上記計数ステップが、第２流体媒体をフロー血球計算器に供給するステップを備えた請求項４７の方法。
【請求項５１】
上記計数ステップが、透明壁と壁に沿って支持された強磁性捕獲構造を有する分離容器のチャンバに第２流動性媒体を収容し、分離容器を磁場内に位置決めして強磁性捕獲構造の近傍に内部磁気勾配を発生させ、強磁性捕獲構造近傍の透明壁に対し固定された細胞を計数するステップを供えた請求項４７の方法。
【請求項５２】
赤血球を含む流動性サンプルの血液パラメータを測定する方法であって、
血液を含む第１流動性サンプルを生成し、既知量の第１磁性粒子を含む稀釈剤で第１流動性サンプルを稀釈して第２流動性サンプルを生成し、第１及び第２流動性サンプルの一つの赤血球を磁気応答性とし、透明壁と壁に沿ってリトグラフ法で縦部材を有するメッシュ格子として形成された強磁性捕獲構造を有する分離容器のチャンバに第２流動性サンプルを収容し、上記分離容器を磁場内に位置決めして赤血球を磁化するとともに上記強磁性捕獲構造近傍に内部磁気勾配を発生させ、上記メッシュ格子の縦部材に沿って配列して上記強磁性捕獲構造近傍の上記透明壁に対し固定された赤血球と第１磁性粒子を計数するようにした方法。
【請求項５３】
磁気応答性とするステップが、赤血球に対し結合親和力を有する第２磁性粒子を第１及び第２流動性サンプルの一つに添加することにより赤血球の磁化を向上させるステップを有する請求項５２の方法。
【請求項５４】
磁気応答性とした赤血球に対応する磁性を有する既知量の第３磁性粒子を第１及び第２流動性サンプルの一つに添加するステップを有し、上記計数ステップが、捕獲構造近傍で固定された第３磁性粒子を計数するようにした請求項５３の方法。
【請求項５５】
上記計数に基づいて、ヘモグロビン含有量、ヘマトクリット、平均血球容量、平均ヘモグロビン濃度、赤血球数のパラメータの少なくとも一つを決定するステップを有する請求項５２の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、流体状の媒体内から生体的な物質を分離し固定化し、また定量化するための装置及び方法に関する。より詳しく言えば、本発明は、磁気的に感応する材料を捕捉機構に向かって移動させるために外部から加えられる力と連係して、容器内に形成された高い内部勾配の磁気式の捕捉機構を採用することにより、生体的な物質の観察を行うことに関する。本発明は、また、自動化された細胞計数技術と連係して定量分析や試料作成を行う際にも役に立つものである。
発明の背景
磁性材料や磁気双極子は、最高磁界強度を増加させる方向に勾配を持った磁界内では移動するものである。流体分離に採用される磁気勾配は、大きくは二つのカテゴリに分かれている。内部式の磁気勾配は、分離容器の内部に配置された感受性のある材料の磁化性を誘導することにより形成される。外部式の勾配は、外部に位置した磁気回路によって形成される。
単純な長方形状の棒状磁石の場合には、磁気回路を形成するフィールドライン（field line）は、通常、北から南に動き、また、鉄のやすり粉で容易に可視化される。基礎物理学におけるこの慣れ親しんだ実験から、磁極の最も近くにフィールドラインのより大きな強度があることが思い起こされるであろう。磁極では、棒材の平面と側面とで形成されたエッジ部が、更に一層大きな密度あるいは勾配を示している。従って、棒状磁石の近くに置かれた鋼球は、まず最初に磁極の真近に引き付けられ、次に、磁界強度が最も高い領域、典型的には最も近いエッジ部に移動する。磁気回路については、フィールドラインの密度の増加あるいは減少を招来するものであればどんな形態であれ、勾配を生じさせるであろう。対向する北極と対向する南極とを有するＮ−Ｓ−Ｎ−Ｓの4極配列のような対向磁石のデザインは、放射状の磁気勾配を生じさせる。
例えばカオリン（kaolin）産業においてスラリーから弱い磁性材料を除去するのに、あるいは、溶液から極小の磁性材料を取り除くのに、内部式の高い勾配の磁気式分離器が５０年近くにもわたって採用されてきた。内部式の高勾配の磁気式セパレータでは、分離容器は均質な磁性容器内に配置されている。磁界を曲げるために、そして、磁場内に”内部”勾配を生じさせるために、鉄磁性構造体が容器内に配置されている。典型的には、例えばコルム（Kolm）に対して付与された米国特許第3,676,337号におけるように、磁性グレード（grade）のステンレス鋼製の人造繊維が柱状体内に詰め込まれ、その後、この柱状体が鋼製繊維上に勾配を誘導する均一な磁界内に配置される。２００キロガウス／センチメートル（kGauss/cm）もの高い勾配が容易に達成される。ワイヤ周辺における磁界の勾配の大きさは、ワイヤの直径に対して反比例関係にある。高勾配領域の空間的な範囲は、ワイヤの直径に対して比例関係にある。以下に詳述するように、磁性材料の収集は、ワイヤの側面に沿って、適用された磁場に対して接する側面ではなく適用された磁力線に対して垂直に生じる。かかるシステムを用いる際には、分離されるべき材料は、結果としての磁気”フィルタ”を通過することになる。その後、収集された材料は洗われ、容器は適用された磁場の外側部位に移動させられ、その結果、磁気が除去され、収集体（コレクタ：collector）が再使用できるようになる。
下記の表Ｉは、磁気勾配の大きさを、直径が異なる円形のワイヤに対して鉄磁性ワイヤの中心からの距離Ｒの関数として示している。勾配はマックスウェルの式によって決定され、この式はワイヤの廻りの磁界強度及び磁場の勾配に対する式Ｉ及びIIを創り出している。ワイヤが単位体積当たりＭの内部磁化率を有するとき、上記式はこれらの量の大きさを与える。もしも、ワイヤが、”ソフトな”鉄磁性材料でできている場合には、磁化率は、外部的に適用される磁場の大きさＢextに依存する。如何なる大きさのＭに対しても、一定で均一な磁化率をもった硬い（ハードな）鉄磁性材料に対してでも、距離とワイヤの直径に対する依存性は、示されている通りである。表１に挙げられた勾配の値は、典型的なワイヤの磁化率を、希土類磁気合金の磁化率に近い値である、４πＭ＝１０キロガウス（kG）であると仮定したものである。表１は、細いワイヤに対しては、勾配の大きさがワイヤからの距離に伴なって大きく低下するけれども、ワイヤの表面での磁場勾配が太いワイヤに対するよりも大きいことを示している。
0003996644.tif 000002
Ｂint＝［Ｂext（μ−１）Ｄ2］／［４（μ＋１）Ｒ2］＝２πＭＤ2／４Ｒ2        (I)
グラッドＢint＝［Ｂext（μ−１）Ｄ2］／［４（μ＋１）Ｒ3］＝２πＭＤ2／４Ｒ3(II)
ここで、Ｄ＝環状ワイヤの直径
Ｒ＝ワイヤの中心からの距離
Ｍ＝ワイヤの磁化率
μ＝ワイヤの透磁率
Ｂext＝ワイヤに垂直な外部磁界の大きさ
Ｂint＝結果としての内部磁界の寄与の大きさ
グラッドＢint＝結果としての内部勾配の大きさ
細胞やその他の壊れ易い小片を分離するための方法および装置が、グラーム（Graham）その他によって米国特許第4,664,796号に記載されている。その装置は、シリンダ内に長方形状のチャンバを収納している。チャンバの対向する一対の側面は非磁性材料で作られる一方、その他の側面は磁性材料で作られている。フローチャンバ（flow chamber）には、鋼製繊維の磁気的に感応するインタースティシャル（interstitial）分離マトリックス（matrix）が詰め込まれている。分離されるべき材料は、均一な磁界内に配置されたチャンバを通過する。分離中、チャンバは該チャンバの磁性側面が適用されるフィールドラインと平行になるように配列され、従って、チャンバ内のインタースティシャルマトリックスの廻りに高い勾配を生じさせる。チャンバがこの位置にあるときには、磁気的に標識が付された細胞はマトリックスに引き付けられてそこに保持される一方、非磁性成分は逃げ去る。その後、磁性側面が磁石と向き合うようにチャンバが回転させられ、そのことが、磁場を短絡（”shunt”or”short-circuit”）させ、フローチャンバ内の勾配を横たえ、重要な小片が流体の流れの剪断力によって除去され得るようにする。
他のタイプの内部磁気式の分離装置が知られている。共有にかかる米国特許第５，２００，０８４号は、溶液から磁気的にラベルが付された細胞を収集するのに、薄い鉄磁性ワイヤを用いることを教示している。ミルテニイ（Miltenyi）に対して付与された米国特許第５，４１１，８６３号は、細胞を分離するのに表面被覆された鋼製繊維あるいは他の磁気的に感受性のある材料を用いることを教示している。リバーティ（Liberti）及びワング（Wang）による米国特許出願０８／４２４，２７１号は、固定，観察および細胞への逐次的な反応の実行に役立つ内部式のＨＧＭＳ装置を教示している。
磁気的に感応する小片を収集するために、外部勾配式の磁気式分離装置もまた公知である。外部式の装置がそう呼ばれるのは、かかる装置では、高い勾配の磁場が、内部の磁気構造体ではなく、分離容器に対して外部に配置された適切な形態の磁石によって創り出されるからである。例えば、標準的な棒状磁石は、磁力線が非直線的な道筋を流れ、各々の道筋に沿って北から南へと”扇形に広がる（fan out）”すなわち膨れ上がるので、勾配を生じさせる。約０．１から１．５キロガウス／センチメートル（ｋＧａｕｓｓ／ｃｍ）という典型的な勾配は、高品質な実験室的な磁石によって創り出される。これらの比較的低い勾配は、磁界のフィールドラインの密度を圧縮もしくは膨張させるように磁気回路を形作ることによって高めることができる。例えば、第１の磁石に対向して配置された第２の磁石は、二つの磁石の間に反発作用を生じせしめる。二つの磁石が互いにより近づくとき、フィールドラインの数は同じででも、それらは圧縮されるようになる。従って、勾配が高められる結果となる。４極を形成するためにこの２極構造に対して対向する磁場の磁石を付け加えることは、高勾配領域の範囲を更に増加させる。例えば対向する磁場の隣り合う磁石のような他の形態が、同等の強さの棒状磁石によって生じる勾配よりも高い勾配を創り出すために採用され得る。外部式の磁場装置において勾配を高める今一つの方法は、磁極の面あるいは磁極片の形状を変化させることである。例えば、尖った面を有する磁石は、平坦な磁極面を有する磁石に比べて相対的に高い勾配を生じさせる。
ジョーンズ（Jones）に対して付与された米国特許第３，３２６，３７４号およびオウブレイ（Aubrey）に対して付与された米国特許第３，６０８，７１８号は、典型的な外部勾配式の分離器について述べている。水系に酸化物や石灰質が堆積することを防止するための双極状に形作られた分離器が、ムーディ（Moody）に対して付与された米国特許第３，２２８，８７８号およびヘルツォグ（Herzog）に対して付与された米国特許第４，９４６，５９０号に記載されている。ヴォランスキ（Wolanski）その他に対して付与された米国特許第４，８６９，８１１号およびソマー（Sommer）その他に対して付与された米国特許第４，０６８，１４５号に記載されているように、鉄および非鉄のスクラップの分離用のドラム若しくはロータ式の分離器に、反対極性の隣り合う磁石が用いられてきた。
外部勾配式の装置は、細胞の分離および抗体分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の分野においても用いられてきた。ギアエバー（Giaever）に対して付与された米国特許第３，９７０，５１８号および第４，０１８，８８６号は、駆動コイルを用いて細胞を分離するのに小さい磁気粒子を用いることを記載している。ノルウェイのオスロ（Oslo,Norway）にあるダイナル社（Dynal Corp.）は、種々のタイプの細胞分離についてキャリヤビーズ（carrier beads）を分離するために、単一の外部磁界を採用した分離器を製作している。共有にかかる米国特許第５，４６６，５７４号および第５，５４１，０７２号は、溶液に対して細胞を分離し、分離容器の壁部上に細胞あるいは他の生物学的な成分の単層を形成するために、外部磁場を用いることを開示している。収集された材料の遊離および回収には、通常、勾配磁場およびある程度のレベルの物理的な撹拌からの収集容器の取り出しを必要とする。かかる収集装置において用いられる磁性小片に話題を変えれば、種々のヘルスケアおよび生物学的処理の用途において、ここ２０年来、超常磁性体材料が磁気式分離技術のバックボーンとなってきた。大きさが２５ナノメートル（ｎｍ）から１００ミクロンメートル（μｍ）の範囲に及ぶこのような材料は、磁界内に置かれるとただ磁気的なだけであるという特性を有している。一旦、磁場が取り去られると、それらは磁気的でなくなり、消散して浮遊し得る。超常磁性体的な挙動の基礎原理は、かかる材料が磁区（磁気ドメイン：magnetic domain）のサイズよりも小さいと評価される２０−２５ナノメートル（ｎｍ）よりも小さい磁気コア（core）を包含していることである。磁区は永久磁石の双極が存在するための最小の大きさである。磁気的に感応し得る小片は、一つ若しくはそれ以上のそのようなコアの廻りに形成され得る。他の遷移元素の酸化物およびその混合物も使用し得るのであるが、特別上等の磁性材料は磁性鉄である。
上述のタイプの磁性小片が、種々の用途、特に、例えば抗体の分析（immunoassay），細胞分離および分子生物学などのヘルスケアの分野において用いられてきた。２ミクロンメートル（μｍ）から５ミクロンメートル（μｍ）に及ぶ小片が、ダイナル（Dynal）社から入手可能である。これら小片は、その中に磁性結晶体が配置された球面状の重合材料でなっている。これら小片は、その磁性鉄の成分およびサイズの故に、比較的低い外部的な勾配（０．５から２ｋＧａｕｓｓ／ｃｍ）で容易に分離される。今一つの良く似た種類の材料は、ローヌポウレンク（Rhone Poulenc）によって製造される小片であり、それは典型的には０．７５ミクロンメートル（μｍ）の範囲で作り出される。そのサイズの故に、それらは同等の勾配においてダイナル（Dynal）社のビーズ（beads）よりもよりゆっくりと分離する。今一つの種類の材料が、アドバンスドマグネテック（Advanced Magnetics)から入手可能である。これら小片は、基本的には、サイズが約１ミクロンメートル（μｍ）で、アミノポリマーシラン（amino polymersilane）で被覆され、生体的受容体（バイオレセプタ：bioreceptor）と結合し得る磁性鉄の結晶の集まりである。これらの強く磁化された材料は、０．５ｋＧａｕｓｓ／ｃｍぐらいの低い勾配で容易に分離される。アドバンスドマグネテック（Advanced Magnetics）及びローヌポウレンク（Rhone Poulenc）の材料は共に、そのサイズのおかげで、溶液中で同時に何時間も遊離状態を維持する。
上述のものとは異なったカテゴリに位置させる特性を有する生体的な分離に適用される種類の磁性材料がある。これらはナノサイズ（nanosize）のコロイド（colloids）である（モルディ（Molday）に対して付与された米国特許第４，４５２，７７３号；オーウェン（Owen）その他に対して付与された第４，７９５，６９８号；ユデルソン（Yudelson）に対して付与された第４，９６５，００７号；リバーティ（Liberti）及びピコリー（Piccoli）に対して付与された第５，５１２，３３２号；リバーティ（Liberti）その他に対して付与された第５，５９７，５３１号およびリバーティ（Liberti）その他の米国特許出願０８／４８２，４４８号参照）。それらは典型的には、水性で相溶性（コンパティブル：compatible）にする重合材料で被覆された一つ若しくは多重の塊状の磁性鉄の結晶でなっている。個々の結晶は、８から１５ナノメートル（ｎｍ）のサイズの範囲にある。これら材料の被覆材は、それらを永久的にコロイド状の浮遊状態に保つに十分な溶解水との相互作用を有している。典型的には、１５０ナノメートル（ｎｍ）以下の十分に被覆された材料は、６カ月程もの長い間でも沈殿した証拠を見せないであろう。これらの材料は、実質的には鉄性流体（フェロウフルーイド：ferrofluids）の特性を全て有している。
小さい粒子サイズと溶解水との強い相互作用のために、フェロウフルーイドを分離するにはかなりの磁気勾配が必要とされる。１００−２００ｋＧａｕｓｓ／ｃｍの勾配を発生させる上述の鋼製繊維の柱状体（コラム：column）装置を用いるのが、文献上では通例である。しかしながら、かかる材料が磁場において（首飾り上ののビーズのように）”鎖（チェーン：chains）”を形成し、従って、５或いは１０ｋＧａｕｓｓ／ｃｍ程度の低い勾配の磁場での分離を許容することが、それに続いて観察された。この観察が、比較的低い勾配を生じさせる大きなゲージワイヤ（gauge wire）を用いた分離装置の開発を導いた。大きなゲージワイヤは、収集中にフェロウフルーイドに均一な層を生じさせるのに使用され得る。システム中のフェロウフルーイドの量を制御することによって単相が形成され得る。共有にかかる米国特許第５，１８６，８２７号および第５，４６６，５７４号に記載されているように、磁気的に標識が付された細胞はこのようにして単相を形成するようにされ得る。
体液の細胞組成の分析は、種々の疾患の診断に用いられる。スライド上に塗られ若しくは置かれ、ロマノフスキー（Romanowsky）又は細胞化学の手段により染色される細胞の顕微鏡検査法は、細胞分析に関して、伝統的な方法であり続けてきた。１９５０年代の後半におけるインピーダンスに基づく細胞カウンタは、細胞の計測及び細胞の鑑別の精度において、大きな前進を導いた。それ以来、蛍光活性化フローサイトメトリ（Fluorescence  actvated  Flowcytometry），定量軟膜分析法，体積測定毛細管サイトメトリ及びレーザ走査サイトメトリのような他の様々な技術が、細胞の計測及び細胞の鑑別に導入されてきた。蛍光に基づくフローサイトメトリは、異種細胞の混合物における異なる細胞のタイプを識別する能力を向上させてきた。１００〜１００００細胞／秒に達する速度で測定オリフィスを通過する、個々の細胞についての複数のパラメータの同時査定は、有効な技術である。しかしながら、血液の希釈を要する高い細胞濃度の分析に不向きなこと，数の少ないすなわち稀な細胞の検出が不可能なこと，注目する細胞の再検査が不可能なことなど、技術の限界がある。これらの限界を克服するために、臨床の標本は、典型的には、フローサイトメトリに先立って、赤血球の溶解，濃度分離，免疫を特定する選択（immunospecific  selection）又は細胞密度の低減などの種々の強化技術にさらされる。
多くのバイオ分析技術は、体液，培養液又は環境からの標本等の流体媒体中の細胞若しくは微生物などの目標物の同定及び分離を必要とする。また、目標となる実体を分析する、同定する、あるいは、特徴付けるには、分離時に、その目標となる実体を、無傷及び／又は生かしたままにすることがしばしば望ましい。例えば、血中の特定のサブセットの白血球における絶対及び相対数を測定するには、血液の標本、例えばこのサブセットに特有な蛍光性で標識を付された抗体が、プローブで引き出され、培養される。その後、その標本は、随意に固定液を含む溶解緩衝剤で希釈され、希釈した標本が、フローサイトメトリにより分析される。こうした分析のための処理は、多くの異なる抗原に対して適用され得る。しかしながら、この処理の欠点は、比較的稀な事象の分析のために、多くの標本が必要とされる場合に明らかになる。その状況では、これらの標本を分析するために、フローサイトメータに必要とされる時間が極めて長くなり、経済上の懸念から分析が行えなくなる。
フローサイトメータを用いて、問題の幾つかを克服することを試みた１つのシステムが、所謂「サイトディスク（Cytodisk）」と呼ばれるものである。これは、１９８５年にディグルース（DeGrooth），ギアケン（Geerken）及びグリーブ（Greve）によって論述された（サイトメトリ，６：２２６−２３３（１９８５））。著者は、グラモフォン（gramophone）のレコード盤の溝に細胞を整列させる方法を説明している。乾燥した細胞を備えたレコード盤が、レコードプレーヤ上に載置され、針の直ぐ後ろにある光ファイバを備えたレコードプレーヤのアームが用意される。針は、光ファイバをレコード盤の溝と整列させたまま保つ。報告された試験に用いられた単細胞の藻類の細胞（直径３ミクロン）は、溝の底に残る。この間、光学システムによって分析を待ちうける。サイトディスクの長所は、細胞が、光学的なクロストーク（cross-talk）なしで、複数のパラメータの測定を受け、各細胞が、その測定に対して指標付けされ、更に、細胞が、分析分解能の異なるレベルで繰返し測定可能であることを含むものであった。しかしながら、上記システムは、グラモフォンのレコード盤上で、細胞が乾燥することを必要とし、不均一なプロセスが、多くの細胞にダメージを与えることになる。たとえ細胞が分析のために実質的に乾燥させられても、それらは死んだ細胞であるだろう。従来の発明では、複数のパラメータの測定，指標付け及び繰返し可能な測定を、培養あるいは生体組織への再注入を含む他の再利用のためにリリース可能な無傷の細胞の分析が可能であるという新しい特徴と組み合せることが求められている。
発明の概要
この発明は、自動化された手段による分析が可能となるように、全血を含む流体媒体から収集チャンバにおける規定範囲へ、細胞のような生体的な実体を含む対象物を分離させることを可能とする顕微鏡検査の対象物の固定方法に関する。また、この発明は、マイクロリットル量の標本が低い頻度で生じる物質を含む目標の実体を検出すべく利用され得るように、磁気的に標識を付された目標となる実体の定量収集に有用なものである。
本発明の好適な実施の形態では、その内部で強磁性のラインが透明な壁部に沿って接着力により支持される収集容器が設けられている。上記ラインは、０．１μｍ〜３０μｍの有効直径を有しており、磁気的に標識を付された生体的な物質を規則正しいアレイに固定し整列させることになる。本発明の特に好適な実施の形態では、人間の血液細胞が、自動化された分析のために整列させられる。
本発明の方法は、粒子を収集するために、２つの力を利用する。１つの実施の形態では、目標となる物質が、重力により内側に急勾配を備えた範囲に導かれる。他の実施の形態では、一重に加えられた磁場が２つの目的にかなう。加えられた磁場は、まず、磁気的に反応する粒子を収集容器の範囲に移動させる外部式の磁気勾配を有する。同時に、加えられた磁場は、強磁性の収集構造における磁化を導き、それによって、分析のために収集容器の規定範囲へ移動させるように、磁気的に反応する粒子に作用する第２の内部勾配が付加されることになる。上記容器は、外部勾配が目標の物質に作用する重力の影響に反して、あるいは共働して作用するように、方向付けられることが可能である。
本発明の方法は、分子（例えばプロテイン）及び高分子（例えば核酸−ＲＮＡやＤＮＡ）とともに、真核性のもの（例えば白血球，赤血球，小板，上皮細胞，間葉細胞、若しくは菌類）及び原核性のもの（例えばバクテリア，原虫類又はミコプラズマ（mycoplasma））の両細胞、及び、ウィルス、並びに、エンドソーム（endsome），リゾリーマルパッケージ（lysosomal  package）又は核などの細胞構成物を含む生体的なソースからなる種々様々な物質を包含する生体的な実体の分離に有用である。注目する生体的な実体は、組織ホモジェネート（homogenates），非集合組織又は細胞培養媒体とともに、全血，血清，血漿，骨髄，喀痰，尿，脳脊髄液，羊水、若しくは洗浄液のような生体的な液体を含む種々のソースからなる標本又は被験物に少なくとも存在し得る。それらは、また、汚泥，スラリー（slurry），水（例えば地下水又は流水），食品、若しくは、他のソースのような臨床のソースを有していない物質に存在するかもしれない。本発明の方法は、糞、尿又は他のソースからの種々のバクテリアや寄生虫の分離に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の１つの実施の形態による分離容器の分解図である。
図２は、図１の分離容器内に配設された強磁性のグリッドを拡大して示す斜視図である。
図３は、図１の分離容器内に収集された細胞を観察するための装置の側面図である。
図４Ａ及び４Ｂは、他の照明方法のもとで、図３の装置に収集された細胞の写真である。
図５Ａは、本発明による強磁性の捕捉構造体を有する他の実施の形態の分離容器の斜視図である。
図５Ｂは、図５Ａの５Ａ−５Ａ線に沿った分離容器の断面説明図である。
図６は、比較的均等な水平方向の外部磁場に配置された図５Ａの分離容器を概略的に示す説明図である。
図７は、上記分離容器の全体にわたって置かれた磁気的に反応する各粒子に対する磁場の影響を示すコンピュータ作成ダイアグラムである。
図８は、外部勾配を有する磁場に配置された分離容器を概略的に示す説明図である。
図９は、図８の分離容器における磁気的に反応する多数の粒子の、専ら外部勾配による軌道成分を示すコンピュータ作成ダイアグラムである。
図１０は、外部勾配，内部勾配および重力を考慮に入れた、図８の分離容器における磁気的に反応する粒子がたどる軌道を示すコンピュータ作成ダイアグラムである。
図１１は、図５Ａに示されるタイプの分離容器内に収集された目標の実体の自動化された分析用の装置を概略的に示す説明図である。
図１２は、連続した反応を成すべく使用される分離容器及びその内部に捕捉された分析の目標となる物質を概略的に示す説明図である。
発明の詳細な説明
Ｉ．全体に通じる定義
特に指示がなければ、本明細書の全体にわたって使用される用語は、以下の用に定義される。
ここで用いられる用語「プローブ（probe）」は、検出可能な標識を有する、若しくは、それを含むように適した抗体又は他の特定の結合物質を指す。検出可能な標識は、特有の又は認知可能な光散乱性、若しくは、他の光特性を有する複合物とともに、蛍光性の，化学ルミネッセンスの、また、放射性の複合物を有する。検出可能な標識は、また、特性決定因子に結合する場合にのみ検出可能である複合物を有する。
ここで用いられる用語「強磁性の捕捉構造体」は、磁気的に反応する粒子を引き寄せるように存在する磁場において磁化する強磁性の材料の構造を指す。上記捕捉構造体は、分離容器の壁部の上に又は側に支持される、ワイヤ，薄いストリップ，平板印刷で形成されたストリップ若しくは電気メッキされた強磁性材料の様式で設けることが可能である。上記強磁性材料は、鉄，ニッケル，コバルト，その同様のものの合金，磁性の少ないアース素子の合金、若しくは、他の常磁性の材料を含み得る。ここで用いられる用語「内部勾配」は、上記磁場内に置かれた上記捕捉構造体により導かれる磁気勾配を指す。用語「外部勾配」は、専ら分離容器の外側に位置した磁石又はポール部品の構成により加えられる磁気勾配を指す。本発明に有用な磁場を形成するためには、電磁石を用いてもよい。
用語「決定因子」は、ここで、生体的な実体の一部がその中に含まれ、また、選択的な結合の発生に必要とされる特定の結合物質に対する選択的な結合に反応することをあらわすように、広い意味で用いられる。「特性決定因子」という表現は、ここで、細胞に関係して、例えば、特定の細胞のタイプを同定し、それを他のタイプと鑑別するのに有用なエピトープ（epitope）（又はエピトープのグループ）を表すために用いられる。細胞が関係した決定因子は、例えば、寄生の又はウィルス性のソースの一方の細胞表面抗原、組織適合性抗原、若しくは、膜受容体を含む膜結合タンパク質又は糖タンパク質などの細胞膜の構成物を有する。
ここで用いられる「特定の結合物質」という表現は、注目しない生体的な実体に存在する決定因子を実質的に除外して、注目する生体的な実体における特性決定因子を選択的に認知し、それと相互作用するいかなる物質をも指している。抗体，抗ハプチン（antihaptens），レクチン，ペプチド，ペプチド核酸，共役体（conjugate），核酸，タンパク質Ａ，タンパク質Ｇ，コンカナバリンＡ，大豆アグルチニン（soybean  agglutinin），ホルモン及び成長因子は、親和結合分離に用いられ得る特定の結合物質に含まれる。ここで用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン，単クローン性の又は多クローン性の抗体，免疫活性の免疫グロブリンの断片，単鎖抗体、並びに、ペプチド、オリゴ核酸塩、又は、伝統的な方法によってもたらされた抗体に類似する特異性で決定因子を特定するそのいかなる組合せをも含んでいる。
ここで用いられる用語「磁気的に反応する粒子」は、随意にポリマーで被覆された、好ましくは、ＢＳＡのような生体的なソースのポリマーで被覆された、金属又は有機金属の構成物の磁性粒子を指す。粒子は、抗体又は他の特定の結合物質と連鎖され、それらを注目する生体的な実体と結合させる。適切な磁性材料は、ダイナル（Dynal），ローン・ポーレンク（Rhone  Poulenc)，ミルテニ・バイオテック（Miltenyi  Biotec)，カーディナル・アソシエイト（Cardinal  Associates），バングス・ラブズ（Bangs  Labs），フェロフルイディックス（Ferrofluidics）、並びに、イミュニカン・コープ（Immunicon  Corp）により製造される。用語「磁気的に反応する粒子」には、また、蛍光性の標識又は他の検出可能な標識に随意に結合される、生体的な実体−磁性粒子の複合体が含まれている。
この発明を実行する上で好適な磁性粒子は、典型的なコロイドとして振舞う粒子である。このような粒子は、標準以下のミクロン、一般的には約２００ナノメートル未満という粒子のサイズ、及び、長時間の間に重力による溶液からの分離に対する安定性によってその特性を表される。かかる小さな粒子は、それらが光の波長範囲よりも著しく小さいため、光学顕微鏡による目標となる実体の観察を助成する。適切な材料は、磁性コアに対して、物理的に吸収され、若しくは共有結合させられる、また、安定化コロイド特性を与える分子によって取り囲まれる超常磁性材料の結晶状コアからなる。コロイド性粒子のサイズは、それらが完全な磁性領域を有しないように十分に小さく、それらのブラウンエネルギーは、それらの磁気モーメントを越える。その結果、上記コロイド性の磁性粒子の北極，南極の配列及び結果として伴う相互の引力／斥力は、それらの溶液安定性の一因となって、適度に強い磁場においてさえ起こりそうにない。従って、コロイド性の粒子は、強い電磁石を用いてさえ、溶液から用意に分離することはできないものの、その代わりとして、個々の粒子の分離を達成するために粒子が浮遊させられる試験媒体内でもたらされる磁気勾配を必要とする。前述した特性を有する磁性粒子は、米国特許第４７９５６９８号，５５１２３３２号及び５５９７５３１号に記載されるように用意可能である。
II  重力補助された内部勾配による不動化
図１を参照すると、本発明の第１の実施形態による分離容器１０の分解組み立て図が示してある。容器１０は、垂直な壁１６により分離された１対の相対向する平行な壁部材１２と１４を含み、チャンバーを規定している。長手方向に延伸した部材を含む強磁性体の捕獲構造が、そのチャンバーの内面上でそれに沿って支持されている。例えばニッケルメッシュ１８が、壁１４の内面に配置され、接着剤により保持されている。
メッシュ１８の一部は、図２に示されている。メッシュは、電気メッキ法により形成され、交互に織られた又は重ね合わせた交差部が毛細管引力によって非目標物質を捕獲することはない。適当なメッシュは、電子顕微鏡で使用されるニッケル格子を含み、ペンシルバニア州ワリントンのポリサイエンス社（Polyscience Inc.）（例えば、カタログ＃  ８４２４Ｎ）により販売されている。メッシュは、多数の縦部材１８ａが交差部材１８ｂと接合されて、機械的支持のための格子を形成する。縦部材１８ａ間の間隔は、捕集されるべき粒子の径の少なくとも２倍とする。容器１０が、縦部材１８ａに横方向に作用する磁場中に配置されたとき、磁気的に標識化された目標材料が、各縦部材の両側に沿って捕獲されるだろう。メッシュ１８を支持する壁１４の内面に沿って目標粒子の単層の直線的配列を形成するために、縦部材１８ａの高さは、目標物の平均直径よりも大きくされるべきでない。容器１０内に捕獲できる目標物の数は、目標粒子によって分割された縦部材１８ａの全高さの２倍に等しい。強磁性体捕獲構造、従って、チャンバーは、試験流体中に存在すると見られる目標物のほぼ全ての捕獲を可能にするように寸法が決められる。
実施例１
全血液中の白血球の分別
５ｍｍに３ｍｍの寸法の壁１４の領域に沿って、１５０ｍｍの長さで延びている縦部材１８ａを有する容器１０が作られた。縦部材１８ａは、高さ５μｍで、幅２０μｍ、隙間６３μｍで分離されていた。支持部材１８ｂは、４８μｍの幅であった。チャンバーの高さは０．１３ｍｍで、チャンバーの容積は２μｌであった。そこで、捕集する白血球については、平均直径１０μｍであるので、粒子捕獲能力は３０，０００個であった。この捕獲能力は、チャンバー容積中にある白血球をほぼ全部捕集するのに十分であった。
試験流体は、１μｌの血液中に、１３０ｎｍのＣＤ４５で標識化された磁性流体０．４μｇとアクリジンオレンジ３ｎｇと、臭化エチジウム１０ｎｇとを添加して調製した。試験流体は、１０分間培養され、容器１０内に入れられた。次いで、容器は、図３に示すように、１対の磁石２０ａ、２０ｂの間に置いて、メッシュ１８が容器の底部に位置付けされ、標識化された細胞は、重力の作用でメッシュ側に設定され、これにより、メッシュの縦部材に沿って内部生起の高勾配領域に配列された。捕獲された材料の観察を改善するため、図３に示した装置を反転させて、非目標物をメッシュから離れて定着させるようにした。
アクリジンオレンジは、凝集した細胞に吸収されると、青い光（４６０〜５００ｎｍ）で励起されて緑色光を放射する。同様の光照射の下で、白血球の細胞質内顆粒は、赤色を発光する。臭化エチジウムは、傷のついた膜を持つ細胞（即ち死んだ細胞）にだけ吸収されて、青色光照射下で、深い赤色の光を発する。
チャンバー内での物質の青色照射による光学的な応答は、暗視野顕微鏡により観察された。その結果として図４の写真画像は、青色照射（捕獲された細胞からの放射された発光の観察を可能にする）と周辺の白色光の照射（強磁性体メッシュの観察を可能にする）の組み合わせで得られた。捕獲された発光性の細胞は、他の血液成分と容易に識別できる。
細胞の型の識別は、選ばれた放射スペクトルと捕獲されて細胞の光分散特性のの検出によって容易に達成できる。種々の特異性と異なる光の励起及び放射を有するプローブが、捕獲され配列された細胞間の分別するのに使用できることは、当業者にとって明らかであろう。また、１以上の励起光波長が、目標物間の識別に、あるいは、目標物と捕獲構造との識別の利用できる。例えば、図４Ｂは、青色の単色光下での捕獲された同じ細胞を示している。捕獲構造物はもはや見えず、捕獲された白血球が容易に視認できる。そこで、標準的な顕微鏡が細胞観察に使用できる。
この例は、２つの型の細胞の識別を例証している。この場合、白血球は、他の細胞型と分離され、配列された白血球の中で、生きている細胞は、色素を使用して死んだ細胞と区別される。どのような２つの（あるいは、それ以上の）細胞の型も、種々のプローブを使用して、識別できる。例えば、胎児の凝集した赤血球を母体の赤血球から、循環器系の腫瘍細胞（Ｅｐcam+ＣＤ４５-）を正常に凝集した赤血球から、血漿板（ＣＤ４１+，ＰＡＣ−１-）を活性化した血漿板（ＣＤ４１+，ＰＡＣ−１+）から、さらに、種々の白血球の部分集合を区別できる。ヒト血液に見られる重要な白血球の部分集合は、ＣＤ４+又はＣＤ８+細胞（Ｔ−リンパ球細胞）、ＣＤ５６+細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９+細胞（Ｂ−リンパ球）、ＣＤ１４+細胞（単核白血球）、ＣＤ８３+細胞（樹状突起細胞）、ＣＤ３３+、ＣＤ６６ａ+又はＣＤ６４+細胞（顆粒状白血球）、ＣＤ６６ａ+ＣＤ６６ｂ+細胞（活性化顆粒状白血球）、ＣＤ３４+細胞（前駆細胞）及びＣＤ９０ｗ+細胞（造血幹細胞）を含む。
実施例２
血液中の免疫表現型分別
血液サンプルが、蛍光性核酸色素と、細胞表面エピトープ、例えば、Ｔ−ヘルパーリンパ球細胞及び単核細胞上で発現されるＣＤ４や前駆細胞上に存在するＣＤ３４に対する抗体で標識を付した磁性流体と、で培養される。培養は、分離容器の中又は外で起こる。容器は、磁場中に導かれ、生物的活性な磁性流体により認識された細胞表面抗原を表す細胞が、強磁性体線の両側に配列する。全ての凝集した細胞は、蛍光により標識を付されているが、強磁性体線に近接するものだけが、目標細胞であり、ここに述べるように、強磁性体線に沿って細胞を走査するように配列された光学的検出装置により同定される。
目標細胞の頻度が小さいと、正常なドナー（１〜１０ＣＤ３４+細胞／１μｌ）中のＣＤ３４によって識別されるような末梢血液中の前駆細胞についての場合のように、磁性体線と一致して存在する非目標物が、計数の精度に影響するという見込みが大きくなる。その非目標物が磁性体線と一致して存在しこれが、目標細胞として誤って数えられる可能性は、強磁性体線の全長を短くすることにより低減される。これは、チャンバー中の磁性体線の数を減らすことにより達成できる。
これに代わる方法は、蛍光性の核酸染色を使わないで、蛍光標識化したモノクロナル抗体又は他の生物活性的な磁性流体と同じ細胞型に対して向けられたプローブを使用することができる。好ましくは、このプローブは、生物活性的な磁性流体として異なるエピトープに対して向けられている。この方法は、目標細胞だけが蛍光により標識化され上記のように同定される。後者の手法の欠点は、高い感度の検出装置が必要なことである。他の標識化の方法は、フローサイトメトリーで使用される方法を含み、多色及び／又は多次元分析と呼ばれる。この場合、生物活性な磁性流体が、磁性体線に沿って目的の粒子を配列するのに使用され、異なる螢光色素で標識化したモノクロナル抗体又は他の抗原のプローブが、免疫磁気学的に不動化された粒子の範囲内で、異なる特性ないし分布を同定するのに使用される。
III．外部磁場支援内部勾配不動化
本発明の第２の実施形態の分離方法は、内部で発生させ外部で適用する磁気勾配を、磁気感応性の目標物質を捕集し不動化するために使用する。分離容器には、一様な磁場が印加される。外部磁場勾配が、磁気感応性粒子を強磁性捕獲手段の方に移動させる。印加された磁場は、また、容器中に保持された強磁性捕獲構造物を磁化する。磁気感応性粒子が強磁性捕獲構造物の方に移動すると、それらは内側に生じた勾配の付加的な影響を受けて、その捕獲構造物に引き寄せられる。その構造物か適当な形状を有していれば、磁気感応性粒子は、その捕獲構造物に沿って配列され不動化され、分離容器の規定される透明な壁を通して、分析される。目標物質が適切に標識化されていると、蛍光又は光分散がその壁を通して測定され、試験サンプル中の目標物質の量が測定される。
本発明の好ましい実施形態において、印加された磁場は、重力の力に抗して磁気感応性粒子の移動を強制し、標識化されていない粒子から標識化された粒子を分離する付加的な手段を提供し、それにより、粒子の不特定の捕集を低減する。
上記のように磁気感応性コロイド粒で標識化した目標物質は、図５Ａと図５Ｂに示したように、捕集容器１０に集められる。容器１０は、凹所を有するチューブ状の輸送部材１２と、上部側の壁部材１４とからなっている。壁部材１４は、輸送部材１２内に嵌るような形状であり、壁部材１４の内面と輸送部材１２の内面を境界とするチャンバーを規定している。壁部材１４は、ガラス、石英、透明プラスチックのような非磁性の透明材料から形成されている。輸送部材も、非磁性材料から形成され、好ましくは透明である。
壁部材１４は、輸送部材１２に形成された凹所を覆い、チャンバーの１１の長手方向の両端部でオリフィス１６ａ、１６ｂを備えている。輸送部材１２の露出した凹所１６ａ、１６ｂには、分析のために試験流体の一滴を受け入れる受容部を備えている。その流体はチャンバー１１に流れ込む。チャンバーが十分に狭いと、チャンバー１１への流体の流入は毛細管作用により助けられる。基準点マーク（不図示）が、チャンバー１１内に含まれる流体の容積の測定の手段を提供するのに、形成されるか押引されていてもよい。
強磁性捕獲構造は、壁部材１４の内面に接着されて支持されているか、又は成形されている。図５Ａ及び図５Ｂに示す実施形態において、強磁性捕獲構造は、壁部材１４の内面上に形成されリトグラフ法により規定された強磁性の線２０を含んでいる。チャンバー１１の壁は、ＢＳＡ、シリコーンのような材料や負に荷電する表面コーティング材で付随的に被覆されて、化学的又は生物的に不活性な内面にされている。壁表面への静電荷の蓄積を除去することは、目標粒子や浮遊磁性材料のチャンバーの壁への不特定な結合を制限するのに重要である。
容器１０が磁場中に配置されたとき、強磁性体の線が磁化される。強磁性体線２０によって形成された磁気勾配は、同じ断面積を有する円形のワイヤについて計算した勾配になぞらえることかできる。強磁性体線の幅は、磁性体線に沿った粒子の単層形成には影響しないであろうが、しかし、その幅は、磁気勾配の強さに影響を与える。磁性体線２０の間の隙間は、目標粒子の直径の少なくとも２倍であるのが好ましい。任意に、単一の強磁性体線も捕集のために使用できる。
磁性体線の厚みは、捕集されるべき磁気感応性の目標物の大きさのオーダに合うように選ばれ、それにより、目標物はその線の反対側７に沿って単層で配列される。それゆえ、線２０は、捕集されるべき粒子の厚みのオーダでよい。線２０は、捕集される物質の直径より薄いのが好ましい。仮に捕集されるべき物質が直径１０μｍのオーダのヒトリンパ球で、強磁性体線２０が５μｍあるとすると、その細胞は、厚み１０μｍの単層で並べられる。磁性体線としては、捕獲すべき粒子の直径より十分に薄いことが好ましい。例えば、０．２５μｍのオーダの磁性体線は、直径１０μｍの物質を捕集するのに使用できる。
このような薄い磁性体線は、コンピュータチップの製造に現在使用されている方法によって製造可能である。そのような方法では、最初は、壁部材の表面が、真空蒸発ないしスパッタリングなどの蒸着法により強磁性体で被覆される。そのような方法は、容器の結果としての内面に接着された単一金属層を提供する。磁性材料と壁部材を形成するのに使用された材料との組み合わせは、磁性材料の壁部材への十分な接着を提供するように選ばれる。一層の感光性ポリマー或いはフォトレジストが壁部材の被覆表面に適用され、強磁性捕獲構造の所望のパターン（あるいは、使用されたフォトレジストに対応して、そのネガティブパターン）に対応した紫外光パターンに暴露される。フォトレジストは現像され、金属コーティングが好ましくない部分を湿式化学エッチングや反応性イオンエッチングなどのエッチングによって除去する。これに代えて、磁性体線をリフトオフ法で形成することもでき、これは、フォトレジストのパターンが壁部材に塗着され、強磁性コーティング材の蒸着後に除去される。
こうしたリトグラフ法を用いて強磁性金属皮膜の特定のパターンを形成するに当り、単一の壁部材にこの手法を適用しても良いし、大面積基板にこの手法を適用し、後から複数の壁部材に分割しても良い。こうしたリトグラフ手法は、電着法や電鋳法に比較して実質的に安価な方法であるといえる。電着法や電鋳法は、より厚いラインの形成に使用される。薄いラインは、本来的に、厚いラインに比較して滑らかになる傾向もある。ラインが整っていることは上記製造手法の副産物であると言える。滑らかなラインは重要である。なぜなら、これにより誘起される磁場が、ライン同様に整然となるからである。巾の狭いラインを用いるため、磁場の強度は比較的「凹凸のある」ラインに大きく影響され、このことは収集した磁性物質の凝集の原因となる。したがって、より滑らかな強磁性捕獲構造を用いて、より整然とした磁場をつくることは、磁性物質をより均等に配置させる結果となる。これにより、収集した物質の自動検査が容易となる。
容器１０を用いて磁力に反応する対象物質を分離することについて、種々の磁場構造との関係において、以下に述べる。対象物質とは例えば、磁性粒子によりラベルされた人間のリンパ球である。磁性粒子によりリンパ球をラベルすることについては米国特許第４，７９５，６９８号、第５，５１２，３３２号、第５，５９７，５３１号、及び米国特許出願第０８／４８２，４４８号に開示されている。
図６は、実質的に均一な磁場内に配置された容器１０について示しており、磁場は磁力線３０によって示されている。磁場は、相反する磁極を有する２つの磁石２１の間の空間に形成されている。適切な磁化を行うため、強磁性捕獲構造の縦軸は磁力線３０に垂直に配置されている。
図７はコンピュータにより作成した図であり、容器を均一な磁場内に配置した後に多数の磁気応答性粒子４１が移動する軌跡を示す。磁化された強磁性ライン２０は５μｍの厚みを有しており、その端部が図示されている。チャンバー内の大多数の粒子は、チャンバー内の磁力勾配の影響を受けることなく、重力の影響によって最終的にチャンバーの底に落下する。
図７を作成するのに使用したコンピュータプログラムにおいては、チャンバー内の全ての磁性粒子が磁力に反応すると仮定した。実際の分離過程においては、大多数の細胞は磁力に反応せず、重力の影響を受けてチャンバーの底に落下することとなる。比較的少数の対象細胞が、強磁性ラインに沿って線状の単粒子層を形成する。
対象粒子の定量的な情報を得るためには、再現性良く、対象粒子をこの装置によって高い割合で収集することが望ましい。比較的少ないもの、例えば、循環する腫瘍細胞、母体中の胎児の細胞、造血幹細胞については、事実上全ての粒子を収集する必要がある。比較的薄い強磁性構造を用いてこれらの粒子を配列させるためには、チャンバー内のこれらの細胞を「掃き上げる（sweep up）」方法を用いて、これらの粒子を装置内部の限られた空間にある高勾配の領域に移動させることが必要である。これらの粒子を「掃き上げる」方法の１つは、浅いチャンバーを使用することである。図７に示されるように、５μｍ厚の強磁性ラインの場合、チャンバーの厚さを１００μｍ以下とすれば良い。しかし、そのためにはチャンバーの体積を小さくしなければならず、少ない種を観察する機会を制限することとなる。また、チャンバーを長くして体積を増加させることもできるが、そのためには、長い強磁性捕獲構造が必要となり、強磁性捕獲構造に沿って収集した対象物質をサーチするのに必要な時間が長くなってしまう。その代りにチャンバーの上下を反転して、実施形態１に関連して既述したように、重力の助けにより全ての粒子を線上に固定しても良い。しかし、対象外の種が支配的な異種の個体群を含む流体においては、磁気的にラベルされた物質が、滞留している非対象の物質の間を通過して強磁性捕獲構造に到達するのは困難であるため、選択性が低下し、また検査領域が詰まってしまうであろう。もう１つの方法は、磁石による磁場の強度を上げることである。しかし式IIにおいて示したように、磁力勾配の領域を２倍に広げるためには、外部の磁場強度を８倍にする必要がある。
本発明の方法の１つは、不均一な磁場を使用することにより、強磁性捕獲構造を磁化すると共に、捕獲構造に対して垂直な外部磁力勾配を作り、初期に内部の磁力勾配の及ばない範囲にある磁気反応粒子を「掃き上げる」ものである。適用する外部の磁場は、対象の細胞を強磁性捕獲構造に向かって移動させるのに十分な大きさの外部磁力勾配を提供できるものであることが好ましい。その後、対象の細胞は、内部の磁力勾配により強磁性捕獲構造に隣接した壁に固定される。こうした磁場の特徴として、この磁場が強磁性捕獲構造に平行な平面内においては均一であり、またこの磁場が強磁性捕獲構造の水平方向の縦軸に対して垂直方向に向いていることが挙げられる。さらに、この磁場は、外部の垂直方向の磁力勾配成分を有しており、この磁力勾配は強磁性捕獲構造に向かって強くなっている。この外部磁力勾配は、磁気的にラベルされた物質を捕獲構造に向けて移動させるのに十分な強度を有する。こうした２つの役割を兼ねた磁場は、種々の磁石配置によって作り出し得る。図８に、外部磁石の好ましい配置を示す。
図８は、間にギャップを有する１組の反対の磁極２３及び２４に対して、好ましい位置に配置した分離容器１０を示す。磁極２３及び２４の下面はギャップに向かって勾配を有しており、そのためチャンバーに与えられる磁場は均一ではなく、実質的に垂直な磁力勾配を有している。垂直な磁力勾配は、チャンバー内の磁気反応粒子を、上側の壁にある強磁性捕獲構造に向かって、重力に逆らって効果的に移動させる。
図９は、こうしたチャンバー内の粒子が、強磁性捕獲構造がない時に、通過する軌跡を示している。図よりわかるように、外部から付される磁力勾配の影響は粒子を実質的にチャンバーの上側の壁に向かって垂直に移動させるのに十分な大きさを有する。
図１０は、強磁性捕獲構造の存在により生じる効果を含めて、チャンバー内の粒子が通過する軌跡を示している。強磁性捕獲構造はリトグラフ法により形成された厚さ５μｍ、巾２０μｍのラインである。図よりわかる通り、外部より付された磁力勾配は、最初にチャンバーの下方領域に位置していた粒子を、磁化された強磁性ラインによって形成された大きな磁力勾配の領域へと移動させる。望ましい強い内部磁力勾配を誘起し、かつ望ましい強い外部垂直勾配を与えるのに必要な、磁石２３及び２４についての正確な設計パラメーターが図８に示されている（また、自動観測システムと関連して図１１に示されている）。このパラメーターは、応用に際しての特定の状況、例えば採用した磁性粒子の磁化や、対象とする存在の量や大きさ、流体媒の粘度や温度にも依存する。当業者であれば、こうしたことを考慮して適当な設計パラメーターを選択することが可能である。例えばここに述べる実験条件においては、内部磁化１２００ガウスである１組の希土類磁石（クルーシブル磁石社（Crucible Magnets）、Elizabethtown，Kentucky）を用いた。これらは正確に２０°のテーパー角を有しており、収集した存在の観察を可能にするギャップを形成するように５．０ｍｍの距離をおいて分離されている。分離容器の上面は、ギャップに対して２．０〜３．０ｍｍ下方に位置している。図１０は、２００μｍの高さのチャンバーを示すが、高さ１ｍｍのチャンバーが作られ、実際に磁気的にラベルされた細胞の収集と定量に使用されている。
もちろん、多くの対象物質を収集するように努力することにより、磁力線の容量よりも多く収集することが可能であるが、対象粒子の単粒子層よりも多く収集することは不可能である。こうした場合、試験試料を希釈するか、又はより大きな線状の磁力線容量を有するより大きなチャンバーを使用することが必要となる。
このようにして、磁気的にラベルされた対象物質を分析することが可能となる。対象となる物質が単粒子層として配列している事により、自動手段により分析を行うことが可能となる。自動手段とは、例えば機械的に自動化された細胞計数技術である。対象となる物質に透明な壁部材を通して光照射を行い、対象物質の光学的性質を検知することが可能である。光学的な性質を検知することには、対象物質を直接観察すること、吸収、散乱、蛍光を観察することが含まれる。さらに、対象物質の分析に際して、基板や他の化合物を付加して分析を補助しても構わない。他の化合物には、対象物質の決定的な特徴を認識可能なプローブ、及び細胞核、細胞質、または細胞膜の染料が含まれる。これらのプローブは、もともとの蛍光体でも、蛍光性の標識（tag）であっても、決定的な特徴部にのみ結合する蛍光体であっても良い。対象物質の部分を認識する特定結合物質を用いることにより、対象物質、即ち白血球の区別が可能になる。
上述の説明は白血球の収集を例として行ったが、本発明の装置を用いれば他の細胞を固定することも可能である。例えば、血小板をＣＤ４１又はＣＤ６１を使用することにより選択可能である。サブセット（subset）への区別手段には、活性化状態の分析（ＣＤ６２ｐまたはＰＡＣ−１によって認識される）、または顆粒（granules）の存在の分析（ＣＤ６３またはＬＤＳ−７５１によって認識される）が含まれる。赤血細胞の固定は、本明細書の他の部分において議論する。
本発明の装置及び方法の特筆すべき利点は、線状の単粒子層を提供し、高速かつ高効率に一連の反応を行う機会を提供することである。したがって、本発明の装置及び方法は、細胞表面の特性を決定するための細胞の分析、例えばＴ細胞、Ｂ細胞プロジェニター（progenitor）細胞及びそれらのサブセットマーカー（subset  markers）の分析に使用するだけでなく、原理的に細胞間構成物質（intercellular  components）または遺伝子の分析に使用し得る。これらの分析を行うには、対象の細胞をまず捕獲、配列する。このステップの後、一連の連続したフローバイ反応（flow-by  reaction）を行う。これは、細胞膜を浸透して、対象物質を標識し、標識された物質の信号強度を増幅する。この能力が、従来の血球計算技術に対する、顕著な利点となる。
以下の実施例は、さらに本発明の別の態様を示すものである。
実施例３
直接被覆した含鉄流体（ferrofluid）を米国特許出願第０８／４８２，４４８号に基づいて準備した。含鉄流体の粒子はＣＤ４５抗体によって被覆され、白血球に結合する。含鉄流体は１００μｇ／ｍｌにおいてｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液に保存される。
対象の細胞は、濃度５ｘ１０6ｃｅｌｌ／ｍｌのＣＥＭ細胞である。１００μｌの細胞を、収集チャンバーに充填する前に、１０−３０μｌの含鉄流体と共に室温１０分間の培養を行った。
０．１ｍｍｘ５ｍｍｘ２０ｍｍの大きさのチャンバーを備えた分離容器を準備した。強磁性捕獲構造は、リトグラフ手法で形成されたニッケルのラインであり、厚さ約５μｍ、巾約２５μｍである。ラインは１００μｍ間隔で配置された。
培養の後、約１０μｌの磁気的にラベルされたＣＥＭ細胞を収集チャンバーに充填した。チャンバー内部を磁場をかけない状態において初期観察したところ、殆ど全ての細胞がチャンバーの底に沈んでいた。チャンバー内をかき回して細胞を再度懸濁させた。それから、収集チャンバーを２つの方形磁石（図２に示したような磁石）により形成される磁場内に配置した。容器を、磁石に直接挟まれた均一磁場領域の外側にある不均一磁場領域内に設置した（即ち、図６に示す位置３３に設置した）。これにより垂直方向の外部磁力勾配がチャンバーに与えられ、磁気反応粒子が強磁性捕獲手段に向かって移動させられる。
収集チャンバーを磁場内に配置した後、チャンバーを顕微鏡のステージに設置し、チャンバーの透明な壁を通して細胞を観察した。殆ど全ての対象細胞が強磁性捕獲ラインに単層の状態で配列しているのが観察された。チャンバーを磁場に設置して約１０秒後には、大部分の細胞は配列していた。1分間後には、全ての識別可能な移動は終了していた。
他の実験においては、充填したチャンバーは、図６に示したチャンバー１０のように、実質的に均一な磁場内に設置された。磁化された金属線は約５０％の磁気的にラベルされたＣＥＭ細胞を収集していたが、多数の細胞が収集チャンバーの底に沈んでいた。
実施例４
実施例３の実験を人体の血液全組成について行った。１００μｌの血液を、実施例１に述べた含鉄流体によってラベルされたＣＤ４５の１０−３０μｌと共に培養した。室温で１０分間培養した後、収集チャンバーを１０μｌの試料によって充填し、上述の磁石配置に設置した。非対象の赤血細胞を強磁性捕獲手段から離してチャンバーの底に沈め、対象である白血球細胞をを観察可能にするために必要な時間は１分間程度の短い時間であった。顕微鏡観察を行うと、対象の細胞は強磁性捕獲ラインに配列しているのが観察された。蛍光体によってラベルされた有核細胞（nucleated cell）を用いた他の実験においては、収集した対象細胞（即ち白血球）を明確に識別するために、落ち着かせる時間は必要なかった。
この例は血液全組成中における白血球の配列を示したものであるが、必要な特定型の白血球に対するプローブを添加することにより、白血球をさらに区別あるいは識別することも可能である。実施例１において述べたように、当業者によればこの実施例に説明した方法を、非常に多くの種類の細胞の分離あるいは識別に利用可能である。
実施例５
本発明は、競争的な免疫測定を行うのにも有効である。図１Ａ及び図１Ｂに関連して説明したものに類似の装置を用いることにより、たんぱく質、ホルモン、あるいは他の血液組成を血液全組成中において測定可能である。分析対象の血液組成に直接あるいは間接的に結合する磁性粒子を、分析対象の血液組成に直接あるいは間接的に結合する蛍光体あるいは化学ルミネッセンス物質あるいは他の検知可能なプローブと共に、血液サンプル中に導入することができる。血液、磁気反応粒子、及び検知可能なプローブを含む溶液を装置に導入し、装置を不均一な磁場に設置する。重力と外部から付加した磁力勾配が、逆に作用せずに、互いに補い合うように装置を配置する。磁気的にラベルされたたんぱく質、ホルモン、または他の血液組成が磁気捕獲構造に引き寄せられる。過剰な検知可能なプローブは溶液中に残留する。また血液中の細胞組成は重力の影響によって磁気捕獲構造に向かって引き寄せられる。束縛されていない検知可能なプローブを蛍光発光あるいは化学ルミネッセンス発光または他の手段により、収集装置の透明な壁部材を通して観察可能である。束縛されていない検知可能なプローブの発する信号、例えば発光は、初期には赤血細胞等の細胞によって妨害される。しかし、こうした細胞は、最後には強磁性捕獲構造の上に層を形成して沈殿するため、蛍光発光あるいは光散乱によるプローブ信号を、妨害されずに検知可能である。
III．固定した目標物質の自動光学分析
図６について前述したように、一対の対向する矩形断面磁石の下方における房状に広がる磁界は、強磁性収集構造体の内部磁化作用を惹起しながら、所望の垂直方向への外勾配を醸し出すことができる。光学観察システムが例えば５ミリ以下とかの有限焦点距離を有している場合で収集物質を顕微鏡観察するには、収集容器の頂壁と磁界を醸し出している磁気エレメントの頂部との垂直方向距離を減少するのが望ましい。一般に、この目標は、隙間を間に挟んで区画され、図８に示す如く当該隙間に向かってテーパーした表面を有する互いに対向した極面を有する磁気装置において達成できる。
磁気装置の頂部と容器の頂部との間の距離を望ましくは小さくすることで、種々の自動観察手段を利用できるようになる。また、目標物質は透明チャンバの内表面に秩序よく並んだパターンに収集されることから、自動観察システムとしては、収集した目標物質が発生するか、または、吸収する光のスペクトル分析を含む自動計数測定のために収集目標物質を「追跡」するために、容器と観察システムの集光エレメントとを相対移動自在に構築することもよいことである。
そのような自動化分析システム１００を図１１に示す。分析システム１００は、オーディオ情報記憶の分野でよく知られているコンパクトディスクの読取りに使われているのと類似の、光追跡用とビーム分析用の構成部品からなる。簡単に説明すれば、一対のレーザーダイオード１１０、１１２が電源装置１１４に接続されていて、それぞれ平行光ビームを発するようになっている。一方の光ビームは、強磁性収集構造体のラインの検出追跡のために分析システムで利用する。他方の光ビームは検出したラインの近傍での収集された目標物質の有無を検出するのに利用する。分析システム１００の光学エレメントの間での相対移動は、機械的トラッキング装置１１６によりなされる。分析システム１００の数々の機能のコーディネートは、マイクロプロセッサー１１８がそれを行う。
レーザー１１２は追跡ビームを発するもので、この追跡ビームは二色性ミラー１２０、１２２を介して伝達された後、対物レンズ１２４により、分離容器１０の上部内表面上に合焦される。この追跡ビームは分離容器の内表面から反射した後、二色性ミラー１２２、１２０を経て光検出器１２６に入射する。光検出器１２６は、反射光に応答して電気信号を出力するが、この電気信号はマイクロプロセッサー１１８に入力される。機械的トラッキング装置１１６はこのマイクロプロセッサー１１８により動作させられて、強磁性収集構造体のラインの予想方向に対物レンズを移動させる。このマイクロプロセッサー１１８は、光検出器１２６の電気出力信号におけるズレを検出することで、機械的トラッキング装置１１６にフィードバック信号を供給し、これにより強磁性収集構造体のラインと直交する方向における対物レンズ１２４の位置を調節するようにプログラミングされている。
強磁性収集構造体のラインを追跡すべく対物レンズを移動させるにつれて、レーザー１１０を励起して、収集した目標物質の有無を検出する光ビームを発生させる。このレーザー１１０からの光ビームは二色性ミラー１２８、１２２を経て、収集容器の上部内表面に合焦させられることで、追跡ビームの焦点近傍にスポット光を形成する。目標物質から反射した光は二色性ミラー１２２、１２８を介して光検出器１３０に入射する。光検出器１３０は目標物質からの反射光に相当する電気信号を発生するが、この電気信号はマイクロプロセッサー１１８へと出力される。マイクロプロセッサー１１８は、出力端子１３２に計数信号の如くの分析溶出力信号を出力するために、光検出器１３０からの電気信号の変動をモニターするようにプログラミングされている。尚、そのような出力信号は、これを更に処理することで、収集した目標物質の量と位置についての情報が得られるようにしてもよいものである。
別の実施の形態では、図示の分析システム１００において利用した二つのレーザーの代わりに、一つのレーザーを利用してチャンバを照射することもできるようにしている。所望によっては、レーザーの使用を全面的にやめて、チャンバをその側方または下方から照射する光源を含めて、発光ダイオードないしその他の光源でチャンバを照射するようにしてもよい。また別の実施の形態としては、光学フィルターや回折格子の如くのスペクトル分析用部品のみならず、種々のスペクトル特性を有する照射用部品も自動分析システムに用いて、分析システムの対物レンズが強磁性収集構造体を追跡すべく移動されるにつれて収集した物質から発生する光のスペクトル分析を行うようにすることもできる。
場合によっては、チャンバを振動させる手段を用いて、磁性粒子がチャンバの壁部に摩擦作用でとりつくのを防いでもよい。チャンバを振動させれば、振動の影響による磁気分離効率が高まるのが判明している。このように振動をやり易くするには、チャンバを所望周波数で振動させるべく電源装置に接続した圧電結晶１２３に分離容器を載置させればよい。
IV．体液成分の定量測定
Ａ．希種群（Rare Species）豊富化とサンプル調製
目標個体数の出現頻度が減少するに伴って、目標個体群の検出、計数、検査を信頼性よく行うのがますます困難になっている。識別子、即ち、プローブないしプローブ群の特異性について要求が高まっているばかりではなくて、大量の体液を処理する必要性に加わって、特定の目標を豊富化する方法の必要性も生じている。表IIは、正常ヒトの末梢血の有核細胞における種々の細胞個体群の出現頻度を示すことで、前述の必要性を示している。
0003996644.tif 000003
CD34+細胞ないしその部分細胞の如くの出現頻度の低い細胞を分析する場合では、或いは、循環系内の疾患誘発性腫瘍細胞の場合では、目標個体群を信頼性よく検出、計数、検査するのに必要な血液量はほぼ１μlよりも大量必要である。大量の血液を実地で分析するということは、ほぼ長時間にわたる処理時間が伴う。例えば１ml血液サンプルのフローサイトメトリック分析では、サンプル内の赤血球が分解するのが通常であり、その結果サンプルが１０倍も希釈されてしまう。従って、サンプル流量が通常の１μl/秒とすると、分解したサンプルを１０ml分析するのに２．７８時間もかかる。従って、目標個体群を豊富化してその濃度を増大させるのが望まれているのは明らかである。分離容器内に十分大量の目標成分を含ませて検出ができるように、分析すべきサンプル内の所望目標の濃度を増大させるには種々の豊富化方法を採用することができる。この方法で成功したかどうかは、実際に実行した後での非目標成分の排除量（carryover）、目標成分の収集量、目標成分の濃縮能、目標成分の分析能を調べることで判断できる。目標成分が濃縮され、非目標成分を減少させた体液からのサンプルを分離容器に導入すれば、目標成分の個体数の計数と検査ができるようになる。
ある一つのサンプル調製方法では、米国特許第5,186,827号に開示されている如くの外勾配分離器を利用している。例えば、１０mlの血液を含有する容器に、上皮腫から取り出した細胞を識別する生物活性のある含鉄液体（ferrofluid）を添加する。それを適当にインキュベーションした後に、容器の壁部に磁気吸着されていない血液成分を取り出す一方で、所望の目標物質だけが分離器の壁部に付着したままにしておく。このように分離された細胞を、分離容器を磁界から離したときにより少量に再懸濁化する。
再懸濁化したサンプルに、蛍光標識したプローブを添加する。インキュベーションの後、サンプルを再び外勾配磁気分離器に入れる。この分離器で分離した後に、上澄を取り除け、分離した細胞を本発明の分離容器のチャンバと釣り合った量に再懸濁化する。１０mlの血液に細胞が１０8個含まれていたとすると、０．０１％だけ排除すれば細胞数は１０4個となり、本発明の装置の細胞捕獲能の範囲内に納まる。１０7個の細胞内での目標細胞出現頻度が１だとし、また、細胞捕獲効率が７０%だとすると、７個の目標細胞を捕獲することができ、この数で識別とその後の特性測定には十分である。含鉄液体によりターゲットされた抗原を表現する細胞は、含鉄液体に非特異的に結合したその他の細胞と共に、強磁性ラインに並んで現れる。その他の理由で捕獲された細胞、例えば捕捉細胞などはそのラインには現れず、従って、出現頻度の低い細胞種の更なる精製が必要になる。
目標細胞の識別とその後の特性測定は蛍光の散乱とスペクトルでの相違により得られる。また、蛍光性の、生物活性のある含鉄液体を利用するればもっとよくすることができ、そうすれば、細胞が発する蛍光の量で目標細胞を非特異的に結合した細胞と弁別することができる、即ち、目標細胞の細胞表面における抗原の密度が、非目標細胞に対する非特異的に結合した含有液体の密度から大きく異なっている場合が多い。フローサイトメトリック測定法とは異なって、本発明により単離化したここの目標成分は再検査でき、その点、光学検出システムを、目的とする目標粒子の位置を同定し、かつ、記録するように構築することができる。目標細胞の位置が検出されて記録されると、共焦点顕微鏡（cofocal microscope）の如くの高性能光学検出システムで固定化容器を検査することができるようになる。
Ｂ．定量分析
ある細胞型を定量分析するには、対象細胞型を磁気的に捕獲するに先立って元の血液サンプルを何回も希釈するのに困難が伴う。何回も希釈した後に、元の血液量に対する捕獲成分の濃度を判定するには、正確な希釈比や磁気捕獲効率についての知識が必要である。これらの定量性については元の血液サンプルに濃度マーカを添加することで判定できる。
希釈度を判断するための第１マーカは、ほぼ全効率で捕獲すべき磁気応答性物質を十分付加した個々に識別可能な粒子の既知濃度がそれである。目標細胞の磁気捕獲効率の判断のための第２マーカは、目標細胞とほぼ同一量の磁気応答性物質を付加した個々に識別可能な粒子の既知濃度がそれである。この第２マーカとしては、含鉄液体でラベル付けした目標物質の磁気モーメントとほぼ等量の磁気モーメントを有し、また、類似の流体搬送挙動を有するように十分な磁性物質で形成した磁気応答性ビードであってもよい。別の方法としては、この第２マーカは、結合箇所の数が目標細胞とほぼ同一数で、結合力もほぼ同一の結合物質でコートした磁気的不活性な集合体（bodies）であってもよい。目標物質に対して同一収集挙動を有する第２マーカを得るのにその他の方法を用いることもできる。このような方法については下記の実施例において説明する。
実施例６
磁性付加マーカを用いた濃度較正サンプル調製
血液１０mlに、上皮腫細胞特異型含有流体を含む試薬５mlと、ビード一個につき約５００個の含鉄液体の粒子が付着している、径が１０μlの緑色蛍光ビード10,000個と、ビード一個につき約5,000個の含鉄液体の粒子が付着している、径が１０μlの赤色蛍光ビード10,000個、添加する。１５分にわたりインキュベーションした後、サンプルを米国特許第5,186,827号に開示されている如くの磁気分離器に１５分間、放置する。容器の壁部に付着しないサンプルの部分は捨て、その後容器を磁界から離して壁部に収集された細胞を、等浸透圧バッファーの如くの溶液、もしくは、細胞膜を浸透する（permeabilize）ことのできる溶液２mlに再懸濁化する。再懸濁した細胞を５分間にわたり磁界に置いた後、容器の壁部に付着しなかったサンプルを捨てる。壁部に収集された細胞についてのみ、例えばCD45 PerCP識別白血球、抗EPCAM PE及び／又は抗シトケラチンPE識別上皮腫細胞の如くの蛍光識別した抗体を含有する溶液０．２mlに再懸濁する。所望によっては、サンプルをもう一度分離して、過剰抗体を捨て、収集した細胞を、蛍光性複合モノクロナル抗体が発する蛍光とはスペクトル上で区別できる蛍光特性を有する核酸色素を含む溶液に再懸濁させてもよい。
その後、白血球、上皮腫細胞、緑色及び赤色ビードを本願明細書に開示する方法もしくは伝統的な計数法により計数する。例えば上皮腫細胞１０個、緑色ビード5000個、赤色ビード7000個の計数結果は、上皮腫細胞の密度が細胞１個当たり含鉄液体粒子５００個の場合ではそれらの濃度は、血液１ml当たり上皮腫細胞が（10 x 10,000/5,000）/10 = ２個、上皮腫細胞の密度が細胞１個当たり含鉄液体粒子5,000個の場合ではそれらの濃度は、血液１ml当たり上皮腫細胞が（10 x 10,000/7,000）/10 = １．４個となる。
この実施例では、二種のマーカを利用して上皮腫細胞の濃度を正確に判定しているが、どの細胞の濃度も判定できるのは明らかである。
実施例７
含鉄液体結合用マーカを利用したサンプル調製
ビード一個につきそれぞれ５００個と5,000個の抗原が付着している緑色蛍光ビード10,000個と赤色蛍光ビード10,000個を添加した以外は、実施例６と同じ細胞分析を繰り返した。（但し、大部分の抗原はクローン化されており、抗体が認識しうる組換えタンパク質を得た。）その後に、両方のビードと上皮腫細胞とを識別する含鉄液体を添加する。この実施例では、目標細胞の絶対数の正確な概算値が得られ、その上、目標細胞特異性含鉄液体が働くかどうか判定できる。
前述の実施例６と７では、細胞分析システムの性能を得るばかりではなくて、単位容量当たりの測定した目標細胞の濃度を指示するサンプル調製法を説明している。前述した方法により調製した分析サンプルは、フローサイトメトリー法を用いるか、又は、本明細書に記載の装置を用いることで定量分析できる。本明細書で説明している装置における容量は既知であるのに対して、フローサイトメーターを通過する容量は、ビード、又は、フローサイトメーターが目標事象を測定する容量の実際の測定により判断すべきである。サンプル精密配分法（ピペット）を用いることで、試薬と希釈剤とを判定することができる。他方、本発明の装置を用いた比較方法では、細胞濃度を判定するには（容量判定にビードの計数を必要としないで）、サンプルと試薬を正確に配分するだけで十分である。しかしながら、この最も簡単な構成にあっては、サンプルの精密配分をなくすのが望ましい。そのために、前述したビードを用いた方法を用いて、前掲したように、目標細胞の分析の元となる精密容量を判定するよりは、サンプルの精密な希釈度を判定している。
実施例８
較正マーカ溶液を用いた細胞濃度判定
目標細胞特異性含鉄液体を含む溶液約５０μl、目標細胞の識別を容易化する蛍光核酸色素の如くの試薬、物理特性が目標細胞と弁別しうると共に、目標細胞と同一の量範囲にある量の含鉄液体でラベル付けした、例えば1,000μlとかの既知濃度の１０μlビードを、本発明の分離容器に導入する。例えば毛細管作用により、一滴の血液も容器に入れる。この血液と液体とを攪拌混合してインキュベーションする。その後、容器を磁界に入れて、目標細胞とビードとを強磁性ラインに配列するようにする。ビードを計数し、その計数値から、液体と混合されている血液の実際の容量を判定する。例えばビードの計数値が6,000個で、チャンバ容量が１０μlだとすると、チャンバにおけるマーカ液体の容量は6,000/1,000 = ６μlである。したがって、チャンバ内の血液量は、１０μl−６μl＝４μlである。また、目標細胞の測定数が32,000であれば、目標細胞の濃度は32,000/4 = 8,000細胞個数／μlである。前述の説明から明らかになるように、マーカ液体におけるビードの濃度が既知で、血液とビードの溶液が完全に混合している限り、血液の正確な容量やマーカ液体の正確な容量は知らなくてもよい。
実施例７におけるの同様に、目標細胞における抗原とほぼ等量の抗原を有するビードを添加してもよい。実施例５、６、７に置いて説明した特徴に加わって、この方法では、方法と、目標物質を選択して検出するのに用いた試薬との有効性を判定する方法が得られる。
Ｃ．赤血球パラメータの評価
血液学上で重要なパラメータはヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容量（MCV）、平均ヘモグロビン濃度（MCH）、平均細胞内ヘモグロビン濃度（MCHC）、それに、赤血球数（RBC）である。赤血球を測定するには、白血球測定やその部分測定に比べて血液を大いに希釈する（1,000倍の高濃度レベル）必要がある。希釈度を大きくするにはチャンバに大量の液体容量を用いてもよい。また、配列した赤血球の数を減少させるためにチャンバの高さを減らすこともよいことである。赤血球は、グリコホリンＡ-標識含鉄液体もしくはトランスフェリン標識含鉄液体の如くの赤血球特異性含鉄液体を用いることで識別し、配列することができ、殊にトランスフェリン標識含鉄液体は、未熟な細網赤血球、即ち、RNA含有赤血球を認識できる。そのような含鉄液体に結合した赤血球は、核蛍光がないことからトランスフェリン受容体を有する有核細胞（nucleated cells）とは区別できる。別の方法としては、赤血球にヘモグロビンがあることを利用して、その赤血球に磁気応答性を持たせるようにしてもよい。従来公知の方法でモグロビンに含まれる鉄分を減らすか、それとも磁性を帯びるようにすることができるので、赤血球細胞を、強磁性ライン近傍で生ずる内勾配により固定化することができる。このような方法では、強磁性ラインに赤血球を吸着させるのに含鉄液体を用いる必要はなく、強磁性ラインへと磁気吸着される割合は、細胞におけるヘモグロビンの量に比例する。
赤血球を一旦強磁性ラインに配列すると、個々の細胞の光拡散特性及び吸光特性の測定を行って、従来公知の血液分析器で測定を行う。本発明での利用に適した方法でヘモグロビンの大きさ、容量、含有量などを評価することができる。
個々の赤血球の形状を評価することができることから、臨床的に有意義な情報が得られる。楕円赤血球や標的赤血球、涙滴状赤血球、球状赤血球、鎌状細胞、分裂赤血球、有棘赤血球、いが状赤血球、口唇状赤血球、乾細胞など、これら全ては、血液分析器で赤血球を評価するだけで正確に定めることのできない症状に関連する赤血球細胞の形を表している。所望によっては、CD71ないしトランスフェリンの如くの赤血球部分を認識するプローブを添加することで、赤血球を更に分化させることもできる。従って、プローブの蛍光ないしその他の検出可能な信号を透明壁部材を介して分析することができる。赤血球細胞の形状の評価の出来具合は、細胞膜の表面面積を測定することにより著しく向上させることができ、細胞膜の表面積測定は希釈液に蛍光膜色素を添加することにより達成できる。この場合、細胞１個当たりの全蛍光量の測定は、膜の全量に比例する。細胞膜の表面積と散乱光の分析と蛍光信号の分析とから、赤血球の細胞形状が判定できる。血液サンプルの希釈は、希釈液にビードを添加することで判断でき、赤血球の数と容量とを求めることができ、本発明の方法でヘマトクリット（細胞容量／全血液容量）も求めることができる。
実施例９
全血における免疫状態と機能の測定
免疫機能について求められている重要な事項の一つに、生体における種々の組織でのリンパ球の循環能がある。この循環には、搬送に血液とリンパが用いられており、リンパ球表面にある抗原受容体が、抗原が血流に侵入する箇所をモニターできるようにしている。例えば麻疹、お多福風邪、破傷風、HIV、ライム病の如くの特定の伝染病に関係のある抗原に特異な記憶Ｔ細胞は滅多に出現しない。しかし、抗原が生体に再侵入すると、それらの数は異常ともいえるほど増大する。疾患特異Ｔ細胞に特異なモノクローナル抗体が作られ、含鉄液体で標識化すると抗原（疾患）特異記憶Ｔ細胞が配列されて計数できる。別の方法としては、特異Ｔ細胞もしくはその部分（subset）が配列されることがある。従って、本発明の装置は、免疫学的刺激に対する細胞部分の特異反応を判定するのに利用できる。
遺伝子ないし疾患特異抗原もしくはその他のマーカの続発性フローバイ反応（sequential flow-by reaction）も、配列した細胞のその他の特性の中から機能的状態と能力を判定するのに利用できる。本発明の利点の一つに、個々の細胞の反応を、刺激を与えてから種々の時点で測定できることがあげられる。この種の分析は、個々の細胞の反応測定がその時に限られるフローサイトメトリ法による免疫機能の測定に勝るのは明らかである。
固定した目標物質に対して「フローバイ」ないし続発性反応を行わせる装置を図１２に示す。ポンプや、重力貯蔵器、或いは、注入器２２０、２２２の如くの液体供給手段を、試験サンプルと目標物質との反応に用いるそれぞれの試薬を収容するのに用意する。それぞれの液体を混合弁２２８へ供給するために、送液管２２４．２２６を注入器２２０、２２２と接続する。混合弁２２８は、一種かそれ以上の液体成分を選択して、それを攪拌した後に分離容器２１０の入力ポート２３０に供給するように構成されている。分離容器２１０には出力ポート２３２があって、この出力ポート２３２を介して液体が分離容器２１０から出てくる。分離容器２１０は、前述した如くの磁気装置と手動式又は自動光学観察手段と利用できるように構成されているので、強磁性捕獲構造体２１８により目標物質が分離容器２１０内において固定でき、その後、液体供給手段により供給されて、複ポート式弁２２８により順に、及び／又は、組合わさって選択された液体との続発性反応にかけられる。
本発明の特に好ましい実施の形態では、図１２に示した装置は、細胞の副集団（subpopulation）の特性の中から差分化するために現場にて蛍光ハイブリッド化（fluorescence in situ hybridization）を行うのに利用できる。そのような方法にあっては、所望種の細胞を装置内で固定することができる。この固定に先立って、或いは、その後に適当な試薬で細胞膜を浸透させる。その後、試薬を容器に順次流すことにより固定し、かつ、浸透させた細胞について現場でハイブリッド化する。蛍光ハイブリッド化の場合では、それぞれの試薬としては、それぞれの蛍光プローブを利用する。
本発明は、強磁性ラインが他の内勾配型分離器に比べてサイズが小さいので、続発性反応を行うのに特に適している。ラインは、容器の壁部で機械的支持体を得ていることから、比較的薄くすることができる。従って、細胞ないしその他の物質を、ライン近傍において生ずる比較的大きい内勾配により強く固定することができる。このように強力な力で固定していることから、固定した物質に対するフローバイ反応を行うに伴って発生する流体力に対して大きな抵抗がえられる。従来では、磁気捕獲構造体は、磁性粒子を固定化するのに十分に大きな空間を有する内部勾配（internal gradient with sufficient spatial extent）を得るために著しく大きなものとならざるを得なかった。本発明によれば、磁性物質を、比較的寸法が小さく、分離容器のチャンバの片側に沿って支持させた捕獲構造体の近傍に生ずる強力な内部勾配部域に引きつけるのに、重力及び／又は応用外勾配を利用できることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１２】
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【図１１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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