(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質中のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、血管形成作用を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号：２に示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードし、血管形成作用を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項５】
請求項２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項６】
配列番号：２に示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、血管形成作用を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項７】
請求項４に記載のDNAを含むベクター。
【請求項８】
請求項５に記載のDNAを含むベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１３】
請求項10に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
請求項11に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１５】
請求項12に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１８】
請求項３に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１９】
請求項１に記載のタンパク質と被検サンプルとの結合活性を検出する工程を含む、請求項１に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項２に記載のタンパク質と被検サンプルとの結合活性を検出する工程を含む、請求項２に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項３に記載のタンパク質と被検サンプルとの結合活性を検出する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトの血管形成に関わるタンパク質因子に関し、遺伝子工学などの分野に属する。
背景技術
動物の血管の内壁に存在する内皮細胞が新しい血管を作り出す現象、即ち、血管形成(angiogenesis)の過程は、特異的なシグナルの伝達により引き起こされる。このシグナル伝達には、これまで様々な因子が関与していることが報告されている。その中でも最も注目されている物質が、血管内皮細胞成長因子(vascular endothelial growth factor、以下、「VEGF」と称する。)である。VEGFは、血管内皮細胞の増殖や血管の透過性を亢進させる物質として精製、単離されたタンパク質性因子である(Senger,D.R.et al, Science,219-983-985(1993);Ferrara,N and Henzel,W.J. Biochem.Biophys.Res.Commun.,161:851-858(1989))。ヒトVEGF遺伝子には、８つのエキソンが存在し、そのスプライシングの違いにより、121、165、189、及び206のアミノ酸からなる4種類のサブタイプが形成され、この結果、VEGFが異なる分泌パターンを示すことが報告されている(Houck,K.A.et al. Mol. Endocrinol. 5,1806-1814(1991))。また、VEGFには、特異的な受容体であるflt−1が存在し、VEGFのflt−1への結合が、シグナル伝達に重要であることが報告されている(Vries,C.D.et al. Science,255:989-991(1992))。
VEGFの類縁因子としては、これまでにPlGF(Placental growth factor)やPDGF(Platelet-Derived Growth Factor)が単離されており、血管内皮細胞に対し、増殖促進活性を有することが示されている(Maglione, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 9267-9271(1991);Betsholtz, C. et al. Nature 320, 695-699(1986))。さらに最近になって、VEGF-B(Olofsson, B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2576-2581(1996))、及びVEGF-C(Lee, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1988-1992(1996);Joukov, V. et al. EMBO J. 15, 290-298(1996))が単離された。
これら因子は一つのファミリーを形成していると考えられ、上記以外の未知な因子をそのメンバーとして含んでいる可能性も想起される。
VEGFについては、発生段階における血管形成の役割ばかりでなく、糖尿病、リウマチ様関節炎、網膜症、固形腫瘍の増殖の際に認められる病的血管新生にも関与していることが示唆されている。さらに上記血管内皮細胞増殖促進効果に加えてVEGFの持つ血管透過性亢進作用は各種原因に由来する浮腫の形成に関与していることが示唆されている。また、これらのVEGFファミリーは血管のみでなく、血液細胞やリンパ管にも作用し血液細胞の分化増殖やリンパ管の形成にも関与していることが示唆されている。従って、現在、VEGFファミリーは、有用な新薬開発のターゲットとして非常に注目されている。
発明の開示
本発明は、VEGFファミリーに属する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を単離することを課題とする。
本発明者等は、最近クローニングされたVEGFファミリーの一つ、VEGF-Cとホモロジーを持った遺伝子の検索をGenBankデータベース中のEST(Expressed sequence tag)及びSTS(Sequence tagged sites)に対して行った。その結果、VEGF-CのC末端部分にホモロジーを有すると推定されるESTを見いだした。次いで、この配列を基にプライマーを設計し、5'RACE法、及び3'RACE法で該当するcDNAを増幅し、単離した。単離したcDNAの塩基配列を決定し、これを基に推定アミノ酸配列を決定したところ、該アミノ酸配列は、全体に渡って、VEGF-Cのアミノ酸配列と有意な相同性を有することが判明した。その相同性から、本発明者等は、単離したヒトクローンがVEGFファミリーに属する4番目のメンバー(以下、「VEGF-D」と称する)であると考えた。また、本発明者等は、単離したヒトVEGF-D遺伝子がコードするタンパク質を大腸菌内で発現させ、これを精製し単離することに成功した。さらに本発明者等は、単離したヒトVEGF-D遺伝子を基にマウスおよびラットのVEGF-D遺伝子を単離することにも成功した。
即ち、本発明は、VEGFファミリーに属する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子に関し、より具体的には、
（１）  配列番号：１に記載のタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）  配列番号：２に記載のDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質、
（３）  （１）に記載のタンパク質をコードするDNA、
（４）  配列番号：２に記載のDNAとハイブリダイズするDNA、
（５）  （３）または（４）に記載のDNAを含むベクター、
（６）  （５）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（７）  （６）に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、（１）または（２）に記載のタンパク質の生産方法、
（８）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（９）  （１）または（２）に記載のタンパク質と被検サンプルとの結合活性を検出する工程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法、
（１０）  （９）に記載の方法により単離される、（１）または（２）に記載のタンパク質に結合する化合物、
に関する。
本発明のタンパク質（VEGF-D）は、VEGF-Cに対し有意な相同性を有しており、VEGFファミリーの第4番目の因子であると考えられる。VEGFは、発生段階における血管形成を主要な機能とし、その他、糖尿病、リウマチ様関節炎、網膜症、固形腫瘍の増殖の際に認められる病的血管新生等にも関与していることが考えられており、本発明のタンパク質も同様の機能を担っていると考えられる。
当業者であれば、公知の方法により、配列番号：1に記載のVEGF-Dのアミノ酸の1若しくは数個のアミノ酸を付加、欠失、置換して、本発明のVEGF-Dに改変を加え、機能的に同等なタンパク質を調製することがおできる。また、タンパク質の改変はこのような人工的な改変以外に、天然においても生じうる。このような改変タンパク質もまた本発明の目的である。アミノ酸の付加、欠失、置換のための公知の方法としては、例えば、OE-PCR（overlap extension polymerase chain reaction）法(Gene 1989 77(1)p51)などの方法が挙げられる。
また、本発明のVEGF-Dをコードする配列番号:2に記載のDNAは、他の生物においてVEGF-Dと同様の機能を有するタンパク質をコードするDNAの単離に用いられる。例えば、当業者であれば、配列番号:2に記載のDNA配列もしくはその一部をプローブとして、他の生物由来のDNAに対しハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明のヒトVEGF-Dのホモログを他の生物から単離することは、通常行いうることである。従って、配列番号:2に記載のDNAとハイブリダイズするDNAもまた本発明の目的である。他の生物としては、例えば、マウス、ラット、うさぎなどが挙げられる。
VEGF-Dと機能的に同等なタンパク質をコードするDNAは、配列番号：2に記載のDNAと通常高い相同性を有する。ここで高い相同性とは、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の配列の同一性を指す。
高い相同性を有するDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の一例を示せば、以下の如くである。即ち、ExpressHyb Solutionで68℃で30分間プレハイブリダイゼーションをおこなう。ラジオアイソトープラベルしたプローブを95℃〜100℃で2〜5分間変成し、氷上で急冷する。新しいExpressHyb Solutionにプローブを加える。プローブを含む溶液に入れ替え、68℃〜55℃の温度グラジエント条件で2時間ハイブリダイゼーションを行う。室温の2xSSC、0.05% SDS溶液で10分間ずつ、4回洗浄する。45℃の0.1xSSC、0.1% SDS溶液で3分間洗浄する。オートラジオグラフィーを取る。
さらに、非常に高い相同性を有するDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の一例を示せば、以下の如くである。即ち、ExpressHyb Solutionで68℃で30分間プレハイブリダイゼーションをおこなう。ラジオアイソトープラベルしたプローブを95℃〜100℃で2〜5分間変成し、氷上で急冷する。新しいExpressHyb Solutionにプローブを加える。プローブを含む溶液に入れ替え、68℃で1時間ハイブリダイゼーションを行う。室温の2×SSC、0.05% SDS溶液で10分間ずつ、4回洗浄する。50℃の0.1×SSC、0.1% SDS溶液で40分間、途中1回溶液を取り替えながら洗浄する。オートラジオグラフィーを取る。
但し、ハイブリダイゼーションの条件は、用いるプローブの長さ（オリゴマーか、数百ベース以上のプローブか）やラベルの方法（ラジオアイソトープラベルしたプローブか非ラジオアイソトープラベルのプローブ）、また、クローニングしようとする目的の遺伝子の種類によっても変動しうる。当業者であれば、好適なハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することが可能である。本発明においては、特に、VEGF-CをコードするDNAとハイブリダイズしない条件であることが好ましい。
本発明のDNAは、また、本発明のVEGF-Dを組み換えタンパク質として生産するために用いられる。即ち、VEGF-DをコードするDNA（例えば、配列番号：2に記載のDNA）を適当な発現ベクターに組み込み、このベクターを宿主に導入し、該形質転換体を培養し組み換えタンパク質を発現させることにより、組み換えタンパク質を大量に生産することができる。
組み換えタンパク質の生産に用いられるベクターとしては、特に制限はないが、pGEMEX-1(Promega社製)、pEF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990 18(18)17p5322)などのベクターが好適に用いられる。また、ベクターの導入される宿主としては、大腸菌、CHO細胞、COS細胞などが好適に用いられる。
形質転換体に発現させたVEGF-Dタンパク質は、例えば、ホモジェナイザー、超音波細胞破砕などによる可溶化処理、各種緩衝液による抽出処理、酸またはアルカリによる可溶化もしくは沈殿処理、更には有機溶媒による抽出もしくは沈殿処理、硫安などによる塩析、透析、メンブレンフィルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動もしくはゲル電気泳動、抗体や受容体等を固定化したアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を行うことが可能である。
組み換えタンパク質が得られれば、公知の方法により抗体を調製できる。公知の方法としては、精製後の該タンパク質をウサギや羊等を免疫してポリクロナール抗体を作製する方法や、マウスやラットに免疫してその抗体産生細胞からモノクロナール抗体を作製する方法等が挙げられる。得られた抗体を用いてVEGFの定量が可能となる。また得られた抗体は、直接用いることも可能であるが、免疫原性を低下させるため、ヒト型化した後に用いると有効である。ここで、抗体をヒト型化する方法としては、モノクロナール抗体生産細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するCDR graft法や、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを免疫して、通常のモノクロナール抗体と同様に直接ヒト抗体を作製する方法などが挙げられる。得られたVEGF-Dタンパク質又はその抗体は、皮下注射などの方法により、体内に投与することが可能である。
また、当業者であれば公知の技術を用いて本発明のタンパク質に結合する化合物をスクリーニングすることも可能である。
例えば、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現してることが予想される細胞（例えば、哺乳動物の肺、小腸、心臓の細胞）よりファージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、本発明のタンパク質をビオチンラベル、あるいはGSTタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィルターと反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを、ストレプトアビジン、あるいは抗GST抗体により検出する「ウエストウエスタンブロッテイング法」（Skolnik EY, Margolis B, Mohammadi M, Lowenstein E, Fischer R, Drepps A, Ullrich A, and Schlessinger J(1991)Cloning of PI3 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases. Cell 65, 83-90）により調製することが可能である。また、本発明のタンパク質をSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて酵母細菌の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来cDNAを単離しって大腸菌に導入して発現させる（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「twoハイブリッドシステム」（「MATCHMARKER Two-Hybrid System」,「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay kit」,「MATCHMAKER One-Hybrid System」(いずれもclontech社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(stratagene社製)、文献「Dalton S, and Treisman R(1992)Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612」）に従い調製することも可能である。また、本発明のタンパク質に結合する物質、例えば、受容体などが発現していることが予想される細胞（例えば、血管内皮細胞、骨髄細胞もしくはリンパ管細胞など）から構築した発現cDNAライブラリーをCOSなどの細胞に導入し、本発明のタンパク質そのもの、または放射性物質もしくは蛍光物質で標識したものを用いて、本発明のタンパク質が結合することを検出し、結合タンパク質をクローニングする方法（Yamasaki K,Taga T,Hirata Y,Yawata H,Kawanishi Y,Seed B,Taniguchi T,Hirano T,Kishimoto T(1988)Cloning and expression of human interleukin-6(BSF-2/IFN beta2)receptor.Science,241:8258-828、Fukunaga R,Ishizaka-Ikeda E,Seto Y,Nagata S(1990)Expression cloning of a receptor for murine granulocyte colony-stimulating factor.Cell,61,341-350）により調製することも可能である。さらに、本発明のタンパク質を固定したアフィニティーカラムに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより調製することも可能である。なお、得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴDNAを合成し、該DNAをプローブとしてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のタンパク質と結合するタンパク質をコードするDNAを得ることも可能である。
また、固定した本発明のタンパク質に、化合物、または天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング（Wrighton NC;Farrell FX;Chang R;Kashyap AK;Barbone FP;Mulcahy LS;Johnson DL;Barrett RW;Jolliffe LK;Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science（UNITED STATES）Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature（ENGLAND）Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed combinatorial chemistry. Nature（ENGLAND）Nov 7 1996, 384 p17-9）により本発明のタンパク質に結合する化合物をスクリーニングすることも可能である。
本発明のVEGF-Dの利用法としては、さらに、VEGF-D遺伝子をVEGF-D遺伝子欠損症患者の体内に導入したり、また体内で発現させるなどして遺伝子治療を用いることが考えられる。一方、該遺伝子のアンチセンスを用いて、該遺伝子の自体の発現を阻害し、病的血管新生を抑制することも考えられる。
VEGF-D遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスを体内に導入する方法としては、種々の方法が考えられるが、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデニルのウイルス法などが、好適に用いられる。
また、これら遺伝子を体内で発現させるためには、該遺伝子を適当なベクターに組み込み、上記のレトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などによって、体内に導入する方法が考えられる。用いられるベクターには、特に制限はないが、pAdexlcwやpZIPneoなどのベクターが好適である。
また、VEGF-D遺伝子の塩基配列異常を検出するPCRなどによりVEGF-D遺伝子の異常による疾患の診断への応用が考えられる。
さらなる本発明の利用法としては、VEGF-Dタンパク質の血管形成作用を利用して、VEGF-Dタンパク質やそのアゴニストを創傷治療、副血行路形成促進、あるいは造血幹細胞の造血支持に応用することや、VEGF-Dタンパク質の抗体やアンタゴニストを病的血管新生、リンパ管形成異常や造血異常などの治療済、あるいは各種原因に由来する浮腫の治療済として利用することも考えられる。またVEGF-Dの抗体を用いた定量法により、VEGF-D産生異常による疾患の診断に応用することも考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、VEGF-D遺伝子、各EST配列、及びクローニングに用いたプライマーの関係を示す図である。
図２は、EST（H24828）とVEGF-Cとのアミノ酸配列の比較を示す図である。
図３は、VEGF-D遺伝子と、これまでに報告されたVEGFファミリーを構成する遺伝子とのアミノ酸配列の比較を示す図である。
図４aは、VEGF-Dの疎水性プロットを示す図である。図4bは、VEGF-Dのシグナルペプチド切断点の予想を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  TFASTA法によるホモロジー検索
VEGF-CのC末端側に存在する「BR3P(Balbiani ring 3 protein)リピート」に見られるコンセンサス配列を基に「CGPNKELDENTCQCVC（配列番号:3）」という配列を設計し、Genbankデータベース（1996年2月29日現在）中の全EST及びSTS配列をTFASTA法（Pearson and Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85;2444-2448(1988)）で検索した。検索条件は以下のものを用いた（表１）。
0003911028.tif 000002
この結果、このコンセンサス配列をコードすると考えられるEST(Accession No.H24828)を見いだした。この配列は「The WashU-Merck EST Project」によって登録されたESTの一つであり、検索に用いた16アミノ酸中9個が一致していた。この配列を基にさらにNCBIの「UniGene」による検索を行うと、同一遺伝子由来のESTと考えられる配列が、このESTを含め全部で5個［T64149, H24780, H24633, H24828, T64277（1996.3.1現在）］登録されていることが判明した。このうち、T64277とT64149、H24828とH24780はそれぞれ同一クローンの5'配列と3'配列の組合せであり、そのクローンのインサートサイズはどちらも約0.9kbであった（図１）。
H24828の配列をホモロジーの見つかったフレームでタンパク質配列に翻訳すると、C末端の104アミノ酸をコードしていることが予想された。このアミノ酸配列をVEGF-Cの配列と並べてみると104アミノ酸中28個のアミノ酸が一致しており（27％）、しかもシステインやプロリン等タンパク質の構造保持に重要なアミノ酸がよく保存されていた（図２）。なお、保存された配列を白抜きで示した。
［実施例２］  ライブラリーからのcDNAのクローニング
検索により見いだしたEST(H24828)の配列を基に5'RACE用のプライマー及び3'RACE用のプライマー(5'RACE用：5'-AGGGATGGGGAACTTGGAACGCTGAAT-3'(配列番号:4)、3'RACE用：5'-GATCTAATCCAGCACCCCAAAAACTGC-3'(配列番号:5))を設計した（図１）。ヒト肺由来のポリA+RNAから逆転写酵素を用いて、二本鎖cDNAを合成し、さらに、その両末端にアダプターcDNAを結合させたcDNAである「Marathon-Ready cDNA,Lung（Clontech社製）」を鋳型とし、上記プライマー及びアダプタープライマーであるAP-1プライマー(5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号:6))（図１）を用いて、PCRを行った。なお、上記アダプターcDNA内には、アダプタープライマーAP-1及びAP-2がハイブリダイズする領域が存在する。PCRは、94℃で１分の処理後、94℃で30秒、72℃で4分の処理を5サイクル、次いで、94℃で30秒、70℃で4分の処理を5サイクル、さらに、94℃で20秒、68℃で4分の処理を25サイクルの条件で行った。［ただし、Taqポリメラーゼとして、「Advantage KlenTaq Polymerase Mix」の代わりに、「TaKaRa Ex Taq」（宝酒造製）及び  添付のバッファーを用いた。］この結果、5'側と3'側の、それぞれ1.5Kb、0.9Kbの断片が増幅された。これら断片を、「pCR-Direct Cloning System（Clontech社製）」、「pCR-TRAP Cloning System（GenHunter社製）」、及び「PT7Blue-T vector（Novagen社製）」を用いて、それぞれクローニングした。なお、5'RACE断片を「pCR-Direct vector」にクローニングする際には、「5'-CTGGTTCGGCCCAGAACTTGGAACGCTGAATCA-3'(配列番号:7)」、及び「5'-CTCGCTCGCCCACTAATACGACTCACTATAGG-3'(配列番号:8)」をプライマーとして用い、再増幅を行った。
［実施例３］  塩基配列の解析
「ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Beady Reaction Kit with Amplitaq DNA Polymerase FS」及び「377 A DNA Sequencer（ABI社製）」を用いてDNA配列を決定した。なお、プライマーには、ベクター内のプライマー(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(配列番号:9)、5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(配列番号:10))及び、AP-2プライマー(5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'(配列番号:11))、さらに以下の10種類の配列内プライマーを用いた（表２）。
0003911028.tif 000003
クローニングした5'側の約1.5kbの断片と3'側の約0.9kbの断片の塩基配列を決定したところ、その重なり部分の塩基配列が一致したことから、目的の遺伝子の5'側と3'側のcDNAが確かに得られたことが判明した。該cDNAの全塩基配列を決定したところ、この新規遺伝子は全長約2kbで、354アミノ酸から成るタンパク質をコードしうる遺伝子であった（配列番号：1及び配列番号：2）。Genbankデータベースに登録されていた各EST配列との関係を図1に示す。他のVEGFファミリーとアミノ酸配列を比較すると、ファミリータンパク質間でよく保存されているアミノ酸はこの新規遺伝子中でも保存されており、この遺伝子がVEGFファミリーに属する新規遺伝子であることが明らかとなった（図３）。なお、図3中の「HSVEGF」は、ヒトの「VEGF」を指し、「HSVEGF-D」、「HSVEGF-C」、「HSVEGF-B」は、ヒトVEGFのホモログであるヒト「VEGF-D」、ヒト「VEGF-C」、ヒト「VEGF-B」をそれぞれ指す。さらに、「HSPDGF-A」はヒトの「PDGF-A」、「HSPDGF-B」はヒトの「PDGF-B」、「HSPlGF2」はヒトの「PlGF2」をそれぞれ指す。また、保存された配列を白抜きで示した。VEGF-Dは、中でもFlt4リガンドとしてクローニングされたVEGF-Cと高いホモロジーを示していることから、Flt4と似たレセプターに対するリガンドであると推定された。
疎水性プロット（図４a）、及びvon Heijneの方法(von Heijne G, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690(1986))でシグナルペプチド切断点を予想すると（図４b）、N末端から21アミノ酸はシグナルペプチドとして切断されると考えられるが、VEGF-Cと同様にさらなるプロセッシングを受ける可能性もあると考えられる。
［実施例４］  ノーザンブロット解析
「pCR-Direct vector」中にサブクローニングされた5'側断片より、EcoRVによって切り出される約1kbqの断片を［α-32P］dCTPにより標識し、プローブとして用いた。標識は「Ready-to Go DNA labelling beads(Pharmacia社製)」を用いたランダムプライマ法により行った。「Multiple Tissue Northern(MTN)Blot-Human」、「Human II」、「Human Fetal」、及び「Human Cell line」（Clontech社製）を用い、「ExpressHyb Hybridization Solution（Clontech社製）」中で常法に従ってハイブリダイゼーションを行った。この結果、肺、心臓、小腸で強く発現しているのが認められた。また、骨格筋、卵巣、結腸、及び膵臓でも弱く発現していた。なお、mRNAの見かけの分子量は約2.2kbであり、今回クローニングした遺伝子はほぼ全長に近いものであると考えられた。
［実施例５］  大腸菌によるVEGF-Dタンパク質の発現
2つのプライマー「5'-TCCAGATCTTTTGCGGCAACTTTCTATGACAT-3'(配列番号:22)」、「5'-CAGGTCGACTCAAACAGGCACTAATTCAGGTAC-3'(配列番号:23)」を合成し、ヒトVEGF cDNAのアミノ酸89番目から181番目に相当する領域を増幅した。得られたDNA断片を制限酵素BglIIとSalIで処理し、制限酵素BamHIとSalIで処理したプラスミドpQE42（QIAGEN社製）と「ligation kit II」（宝酒造社製）を用いて結合した。得られたプラスミドを大腸菌SG19003[pREP4]（QIAGEN社製）に導入し、変異を含まず予定どうり完成したプラスミド（pQE42-BS3）を選択した。プラスミドpQE42-BS3を大腸菌BL21（Invitrogen社製）に導入し、100mg/lのビクシリン（注射用アンピシリンナトリウム、明治製菓社製）を含むL Brothで10ml培養し、それを新しいL Broth 200mlに植菌した。37℃で1.5時間培養後、IPTGを3mMとなるように培地を加えてさらに37℃で5時間培養した。集菌した後、「QIAexpress TypeII kit」のプロトコールに従い、Ni-NTAカラムでタンパク質を精製した。
［実施例６］  大腸菌によるDHFR-VEGF-D融合タンパク質の発現
ヒトVEGF cDNAのアミノ酸89番目から181番目に相当する領域を実施例5と同じプライマーで増殖した。得られたDNA断片を制限酵素BglIとSalIで処理し、制限酵素BamHIとSalIで処理したプラスミドpQE40（QIAGEN社製）と「ligation kit II」（宝酒造社製）を用いて結合した。得られたプラスミドを大腸菌SG19003[pREP4]（QIAGEN社製）に導入し、変異を含まず予定どうり完成したプラスミド（pQE40-BS3）を選択した。プラスミドpQE40-BS3を大腸菌BL21（Invitrogen社製）に導入し、100mg/lのビクシリン（注射用アンピシリンナトリウム、明治製菓社製）を含むL Brothで10ml培養し、それを新しいL Broth 200mlに植菌した。37℃で1.5時間培養後、IPTGを3mMとなるように培地を加えてさらに37℃で5時間培養した。集菌した後、「QIAexpress TypeII kit」のプロトコールに従い、Ni-NTAカラムでDHFR-VEGF-D融合タンパク質を精製した。
［実施例７］マウスVEGF-D cDNAのクローニング
「Mouse lung 5'-stretch cDNA library」(Clontech社製)を1.5x105pfu転写した「Hybond-N+」(Amersham社製)フィルター(20cm×22cm)を2枚作製した。約50ngのhuman VEGF-DのPvuII断片を「Ready-To-Go DNA Labelling Beads(-dCTP)」(Pharmacia社製)でα32P-dCTP(Amersham社製)で標識したものをプローブとして「ExpressHyb Hybridization Solution」(Clontech社製)を用い68℃から55℃へのグラジエントハイブリダイゼーションを2時間行った。2xSSC、0.05% SDSを用いて室温で10分間4回フィルターを洗浄した後0.1xSSC、0.1% SDSを用い45℃で3分間洗浄した。「HyperFilm MP」(Amersham社製)と増感紙を用いフィルターを-80度で一晩露光した。ポジティブクローンは同様に二度目のスクリーニングを行い単一クローンに単離した。単離したラムダDNAはプレートライセートから「QIAGEN Lambda MAXI kit」(Qiagen社製)を用いて精製した。インサートDNAをEcoRIで切り出しpUC118 EcoRI/BAP(Takara社製)にサブクローニングした後ABI377シーケンサー(Perkin Elmer社製)により配列を決定した。得られたクローンのうち重複する2個のクローンからマウスVEGF-Dの全長をコードするcDNAを再構成した。マウスVEGF-D cDNAの塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列番号:24に示す。
［実施例８］ラットVEGF-D cDNAのクローニング
「Rat lung lambda ZAP II vector」(Stratagene社製)を1.5x105pfu転写した「Hybond-N+」(Amersham社製)フィルター(20cm×22cm)を2枚作製した。約1μgのmouse VEGF-D cDNAの1-782bp断片を「Ready-To-Go DNA Labelling Beads(-dCTP)」(Pharmacia社製)でα32P-dCTP(Amersham社製)で標識したものをプローブとして「ExpressHyb Hybridization Solution」(Clontech社製)を用い68℃から55℃へのグラジエントハイブリダイゼーションを2時間行った。2xSSC、0.05% SDSを用い室温で10分間4回フィルターを洗浄した後0.1xSSC、0.1% SDSを用い45℃で5分間洗浄した。「HyperFilm MP」(Amersham社製)と増感紙を用いフィルターを-80度で一晩露光した。ポジティブクローンは同様に二度目のスクリーニングを行い単一クローンに単離した。単離したポジティブクローンはE.coli SOLAR(Stratagene社製)とヘルパーファージExAssist(Stratagene社製)を用いてpBluescriptへ切り出しした後ABI377シーケンサー(Perkin Elmer社製)により塩基配列を決定した。その結果、ラットVEGF-D cDNAと考えられる配列であったが、終始コドンまで含んでいなかった。
そこで、クローニングできなかったC末端部分のcDNAを得るために「Marathon-Ready rat kidney cDNA」(Clontech社製)をテンプレートにし5'プライマー「GCTGCGAGTGTGTCTGTAAA(配列番号:26)」と3'プライマー「GGGTAGTGGGCAACAGTGACAGCAA(配列番号:27)」を用いて94℃15秒、55℃30秒、72℃2分を40回繰り返すPCRをした。得られた断片をpGEM-T vector(promega社製)にサブクローニングした後、ABI377シーケンサー(Perkin Elmer社製)により配列を決定した。その結果、ラットVEGF-DのC末端部分を含むクローンであった。プラークハイブリダイゼーションで得たクローンとPCRで得たクローンの結果からラットVEGF-Dの全長を決定した。決定した塩基配列および推定アミノ酸配列を配列番号:25に示す。
産業上の利用可能性
本発明により、VEGF-Cと有意な相同性を有する新規なタンパク質（VEGF-D）およびその遺伝子が単離された。VEGF-Dは、発生段階における正常な血管新生だけでなく、糖尿病、リウマチ様関節炎、固形腫瘍の増殖の際に認められる病的血管新生、さらに血液細胞の分化増殖やリンパ管の形成、あるいは各種原因に由来する浮腫の形成にも関与していると考えられる。本発明の遺伝子は、VEGF-D遺伝子異常疾患や診断や、VEGF-D遺伝子欠損症に対する遺伝子治療に用いることが可能であり、また本発明の遺伝子を発現させて得られるVEGF-Dタンパク質は、創傷治癒、副血行路形成促進、さらには造血幹細胞の増殖支持などに、また、VEGF-Dタンパク質に対する抗体や阻害剤は炎症に伴う欠陥形成異常、リンパ管形成異常などに対する治療、各種原因に由来する浮腫の治療、造血異常に対する治療や新規な抗ガン剤として病的血管新生の治療剤に応用することが期待される。またVEGF-Dタンパク質およびその抗体はVEGF-D産生異常による疾患の診断への利用も期待される。
配列表
（１）出願人氏名又は名称：  株式会社中外分子医学研究所
（２）発明の名称：  新規なＶＥＧＦ様因子
（３）整理番号：  Ｃ１−８０２ＰＣＴ
（４）出願番号：
（５）出願日：
（６）優先権のもとになった出願をした国名及び出願の番号：
日本国  平成８年特許出願第１８５２１６号
（７）優先日：  １９９６年７月１５日
（８）配列の数：  ２７
配列番号：  1
配列の長さ：  354
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名  ：ヒト(Homo sapiens)
組織の種類  ：肺(lung)
配列
0003911028.tif 000004
0003911028.tif 000005
0003911028.tif 000006
配列番号  ：2
配列の長さ  ：2004
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  二本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：cDNA to mRNA
起源
生物名  ：ヒト(Homo sapiens)
組織の種類  ：肺(lung)
配列の特徴
特徴を表す記号  ：CDS
存在位置  ：403..1464
特徴を決定した方法  ：E
配列
0003911028.tif 000007
0003911028.tif 000008
0003911028.tif 000009
0003911028.tif 000010
配列番号  ：3
配列の長さ  ：16
配列の型  ：アミノ酸
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：ペプチド
配列
0003911028.tif 000011
配列番号  ：4
配列の長さ  ：27
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000012
配列番号  ：5
配列の長さ  ：27
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000013
配列番号  ：6
配列の長さ  ：27
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000014
配列番号  ：7
配列の長さ  ：33
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000015
配列番号  ：8
配列の長さ  ：32
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000016
配列番号  ：9
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000017
配列番号  ：10
配列の長さ  ：22
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000018
配列番号  ：11
配列の長さ  ：
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000019
配列番号  ：12
配列の長さ  ：17
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000020
配列番号  ：13
配列の長さ  ：17
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000021
配列番号  ：14
配列の長さ  ：17
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000022
配列番号  ：15
配列の長さ  ：18
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000023
配列番号  ：16
配列の長さ  ：18
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000024
配列番号  ：17
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000025
配列番号  ：18
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000026
配列番号  ：19
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000027
配列番号  ：20
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000028
配列番号  ：21
配列の長さ  ：19
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000029
配列番号  ：22
配列の長さ  ：32
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000030
配列番号  ：23
配列の長さ  ：33
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000031
配列番号  ：24
配列の長さ  ：1581
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  二本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：cDNA to mRNA
起源
生物名  ：マウス
組織の種類  ：肺(lung)
配列の特徴
特徴を表す記号  ：CDS
存在位置  ：96..1169
特徴を決定した方法  ：E
配列
0003911028.tif 000032
0003911028.tif 000033
0003911028.tif 000034
0003911028.tif 000035
配列番号  ：25
配列の長さ  ：1491
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  二本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：cDNA to mRNA
起源
生物名  ：ラット
組織の種類  ：肺(lung)
配列の特徴
特徴を表す記号  ：CDS
存在位置  ：270..1247
特徴を決定した方法  ：E
配列
0003911028.tif 000036
0003911028.tif 000037
0003911028.tif 000038
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配列番号  ：26
配列の長さ  ：20
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000040
配列番号  ：27
配列の長さ  ：25
配列の型  ：核酸
鎖の数  ：  一本鎖
トポロジー  ：直鎖状
配列の種類  ：他の核酸  合成DNA
配列
0003911028.tif 000041
【図１】
0003911028.tif 000042
【図２】
0003911028.tif 000043
【図３】
0003911028.tif 000044
【図４】
0003911028.tif 000045