(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド合成機を使用し、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート］／ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）系で固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法により合成を行うことを特徴とする、末端にβ−アラニン残基を有するピロール−イミダゾールポリアミドの合成法。
【請求項２】
Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したβ−アラニン又はＦｍｏｃでアミノ基を保護したγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用いる請求項１に記載の合成法。
【請求項３】
Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類がＦｍｏｃでアミノ基を保護した４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸であり、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類がＦｍｏｃでアミノ基を保護した４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸である請求項２に記載の合成法。
【請求項４】
自動合成法により合成を行った後、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン及び水を用いて固相担体からの切り出しを行う請求項１、２及び３の何れかに記載の合成法。
【請求項５】
次の式、
【化１】
0004012145.tif 000020
次の式、
【化２】
0004012145.tif 000021
又は、次の式、
【化３】
0004012145.tif 000022
のいずれかで表される末端にβ−アラニン残基又は末端にγ−アミノ酪酸残基を有するピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項６】
Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したβ−アラニン又はＦｍｏｃでアミノ基を保護したγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート］／ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）系で固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法により合成した請求項５に記載のピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項７】
Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類がＦｍｏｃでアミノ基を保護した４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸であり、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類がＦｍｏｃでアミノ基を保護した４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸である請求項６に記載のピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項８】
請求項５に記載のピロール−イミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基にＤＮＡアルキル化剤を導入してなるピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項９】
ＤＮＡアルキル化剤がＤＵ−８６（２−メチル−３−メトキシカルボニル−Ａ環ピロール−ＤＵＭＡ）の活性中心であるＡ環部（Ｄｕ８６）である請求項８に記載のピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項１０】
ＤＮＡアルキル化剤を導入した請求項８又は９に記載のピロール−イミダゾールポリアミドを用いることを特徴とする、配列特異的ＤＮＡアルキル化方法。
【請求項１１】
ＤＮＡアルキル化剤がＤｕ−８６（２−メチル−３−メトキシカルボニル−Ａ環ピロール−ＤＵＭＡ）の活性中心であるＡ環部（Ｄｕ８６）である請求項１０に記載の配列特異的ＤＮＡアルキル化方法。
【請求項１２】
末端にβ−アラニン残基又は末端にγ−アミノ酪酸残基を有する請求項５〜７のいずれかに記載のピロール−イミダゾールポリアミドの、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）−ピロール−イミダゾールポリアミドコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、近年の活発な研究により、配列特異的にＤＮＡと結合させることが出来ることが明らかとなり、遺伝子発現の制御等に有用な化合物として注目されているピロール−イミダゾールポリアミドの新規な合成法に関する。
背景技術
近年の活発なゲノム解析研究により、約３０億のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の連なりから構成されているヒトゲノムの解明はほぼ終了した。今や時代は遺伝情報の元となる遺伝子の発見と解明、更には個人の体質の差を左右する遺伝子の一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）の解明へと移ってきている．この研究の中で様々な遺伝子や遺伝情報が明らかとなっており、それらの遺伝情報を特異的に制御する化合物を合成することは、新時代の創薬技術として有用な手法であると考えられる。
本発明者らは、ＤＮＡのＡＴ塩基対に富む部位に選択的に結合することが知られている抗生物質ディスタマイシンに着目し研究を続けてきているが、その一環として、ディスタマイシンの構成単位であるピロールアミドとその誘導体であるイミダゾールアミドとを組み合わせたシステマティックなディスタマイシン誘導体の合成を行い、得られた化合物の生化学的な検討を行っている。そして、その結果として、本発明者らは、これらの化合物はＤＮＡのある特定部位に対して選択的に結合できる化合物であり、その選択性はピロールアミド（Ｐｙ）とイミダゾールアミド（Ｉｍ）の順序により決定できることを明らかにした。
更に本発明者らは、合成したピロール−イミダゾールポリアミドを用いて既存の癌細胞に対する細胞毒性試験を行うシステマティックなスクリーニング法を見出した。この手法は、ヒトゲノム計画の中で明らかにされるであろう、ある特定の癌細胞に特有のＤＮＡ配列を標的とする化合物群の一斉簡易スクリーニング法である。構成単位であるピロール−イミダゾールアミドが８アミド存在する場合、その組み合わせは２５６種類に及ぶ．それらの化合物を同時にスクリーニングすることで、システマティックに細胞毒性を有する化合物を選択できる。無数の組み合わせのＤＮＡ選択的化合物ピロール−イミダゾールポリアミドから、その標的遺伝子に合わせて唯一の有用物質を導き出すことが出来得るようになる画期的なシステムであり、この発明に対して本発明者らは既に特許出願を行なっている（特開２００１−１３６９７４号公報）。
ピロール−イミダゾールポリアミドの合成は、これまで液相法により行っていたが、この方法は他種類の合成に不向きであった。
一方、ピロール−イミダゾールポリアミドの固相合成法は米国カリフォルニア工科大学のダーバン教授によりｔ−ＢＯＣ法が開発されているが（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，６１４１−６１４６）、反応条件が厳しいため長鎖ピロール−イミダゾールポリアミドの合成は困難であり、また、応用性にも乏しい。更に市販の蛋白（ペプチド）合成機を利用した合成法ではないため蛋白質（ペプチド）の導入も容易ではない。また、末端にカルボキシル基を有するポリアミドの合成が難しく、末端をカルボン酸残基として固相から切り出す効率も悪いため、得られた長鎖ピロール−イミダゾールポリアミドを直接修飾して新たな反応性を持たせることも困難である。
また、スペインのマスカレナス教授や米国カリフォルニア大学ブルース教授によりポリピロールのＦｍｏｃ合成法も報告されているが（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，４０，３６２１−３６２４；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１，１２３，２４６９−２４７７）、イミダゾールアミドを導入できていないためＤＮＡの配列を正確に識別することができない。
発明の開示
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、より長いピロール−イミダゾールポリアミドを簡便に合成することが出来、蛋白質（ペプチド）の導入も容易なピロール−イミダゾールポリアミドの製造法であって、固相担体から切り出すことが可能なカルボン酸残基を末端に有し、種々の官能基を直接導入することが可能で、ＤＮＡの配列を正確に識別することができるピロール−イミダゾールポリアミドを効率よく製造することが出来る該ポリアミドの製造法を提供することを目的とする。
本発明は、ペプチド合成機を使用し、固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法により合成することを特徴とする、ピロール−イミダゾールポリアミドの合成法の発明である。
また、本発明は、末端にカルボキシル基を有するピロール−イミダゾールポリアミドの発明である。
更に、本発明は、上記ピロール−イミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基にＤＮＡアルキル化剤を導入してなるピロール−イミダゾールポリアミドの発明である。
更にまた、本発明は、ＤＮＡアルキル化剤を導入した上記ピロール−イミダゾールポリアミドを用いることを特徴とする、配列特異的ＤＮＡアルキル化方法の発明である。
また、本発明は、末端にカルボキシル基を有するＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）−ピロール−イミダゾールポリアミドコンジュゲートの発明である。
即ち、本発明者らは、より長いピロール−イミダゾールポリアミドを簡便に合成する手法として固相Ｆｍｏｃ法（Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル）による自動合成法を開発した。無数の組み合わせのピロール−イミダゾールポリアミドを固相Ｆｍｏｃ法によるコンビナトリアル自動合成手法と、上で述べた本発明者らが開発したスクリーニング法を組み合わせることにより、生理活性をもつピロール−イミダゾールポリアミドを素早く選択することが出来る。また、本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロール−イミダゾールポリアミドに導入することが可能である。例えば、ＤＮＡに対してアルキル化能をもつデュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、またそれらの誘導体を導入することが可能である。また、この手法は市販の蛋白（ペプチド）合成機を利用した自動合成であるため、天然に存在する蛋白質とピロール−イミダゾールポリアミドとのコンジュゲート、更には非天然蛋白質とのコンジュゲートの合成をも自動合成法で可能とする合成手法なのである。更にまた、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和なため、蛋白質以外の有機化合物の中でも酸性条件で不安定な官能基を持つ化合物の導入も可能であり、その応用は幅広い。例えば、ピロール−イミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡとのコンジュゲート、それらの誘導体とのコンジュゲートを自動合成することも可能である。
先に述べた如く、従来の方法は、例えば液相法は他種類の合成に不向きであり、また、ｔ−ＢＯＣ法は、反応条件がＦｍｏｃ法に比べて厳しいため長鎖ピロール−イミダゾールポリアミドの合成は困難であり、また、応用性にも乏しい、更には市販の蛋白合成機を利用した合成ではないため蛋白質の導入も容易ではない、また、末端をカルボン酸残基として固相から切り出すのが難しいため、得られた長鎖ピロール−イミダゾールポリアミドを直接修飾して新たな反応性を持たせることも困難である等の問題点を有しており、更に、ポリピロールのＦｍｏｃ合成法も、イミダゾールアミドを導入できていないためＤＮＡの配列を正確に識別することができない等、何れも問題点を有しているが、本発明者らが開発した手法はこれらの問題点を全て解決した画期的な手法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の合成法によれば、末端にカルボキシル基を有するピロール−イミダゾールポリアミドを簡便に且つ効率的に合成することが出来る。
末端にカルボキシル基を有するピロール−イミダゾールポリアミドの具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基を有するピロール−イミダゾールポリアミドや末端にγ−アミノ酪酸残基を有するピロール−イミダゾールポリアミド等が挙げられる。
末端にβ−アラニン残基を有するピロール−イミダゾールポリアミド或いは末端にγ−アミノ酪酸残基を有するピロール−イミダゾールポリアミドは、例えば、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類と、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したβ−アラニン又はＦｍｏｃでアミノ基を保護したγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法により合成することが出来る。
アミノピロールカルボン酸類の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられ、アミノイミダゾールカルボン酸類の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類及びＦｍｏｃでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類の合成法をＮ−メチルピロール又はＮ−メチルイミダゾールを出発原料として用いた場合を例にして反応スキームで示すと以下の如くなる。なお、参考までに、Ｆｍｏｃでアミノ基を保護したγ−アミノ酪酸の合成法の反応スキームも以下に併せて示す。
0004012145.tif 000002
なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。
本発明におけるペプチド合成機での固相合成法は、通常、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート］／ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）系で行われる。
ペプチド合成機としては、例えば、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ法を採用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ等が用いられる。
本発明に係るピロール−イミダゾールポリアミドの固相合成法を反応スキームで示すと以下の如くなる。
0004012145.tif 000003
ｉ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液、ｉｉ）モノマーユニット、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ  ｉｉｉ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液、ｉｖ）モノマーユニット、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ  ｖ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液、ｖｉ）５％無水酢酸、５％ピリジン／ＤＭＦ液  ｖｉｉ）取り出し、減圧乾燥、ｖｉｉｉ）９５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸），２．５％ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン），２．５％水。
なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。
本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロール−イミダゾールポリアミドに導入することが可能であるが、例えばＤＮＡアルキル化剤を導入する場合を例にして記すと以下の如くなる。
即ち、固相担体から切り出したカルボン酸末端に対して、例えば、ＤＮＡアルキル化剤のＤＵ−８６（２−メチル−３−メトキシカルボニル−Ａ環ピロール−ＤＵＭＡ）の活性中心であるＡ環部（Ｄｕ８６）を導入する場合、先ず、カルボン酸末端を有するピロール−イミダゾールポリアミドを例えばＤＭＦ等の溶媒に溶解し、この溶液に室温下、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を加え、同温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下留去し、残査をジエチルエーテル等で適宜洗浄し、イミダゾールエステル体を得る。
Ｄｕ８６をＤＭＦ等の溶媒に溶解し、この溶液に冷却下（例えば−１５℃）、水素化ナトリウムを加え、３０分程度撹拌した後、この溶液に、上で得られたイミダゾールエステルのＤＭＦ溶液を滴下し、同温度で一晩撹拌する。これにリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８６）等を加えてｐＨを調整した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びＨＰＬＣ等による精製を行ない、カップリング体（ＤＮＡアルキル化剤を導入したピロール−イミダゾールポリアミド）を得る。
かくして得られた、ＤＮＡアルキル化剤を導入したピロール−イミダゾールポリアミドを用いることにより、配列特異的ＤＮＡアルキル化が可能となる。
なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。
ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）は古くから抗体の蛍光標識試薬として知られている。今回本発明者らが開発したＦｍｏｃ法によるピロール−イミダゾールポリアミド合成の発展として、ＦＩＴＣをピロール−イミダゾールポリアミドに導入してコンジュゲートを合成することも可能である。得られてくるコンジュゲートは、特定のＤＮＡ配列を認識出来る蛍光標識試薬として用いることが出来、がんを含めた遺伝病に関係するＤＮＡ配列を容易に識別出来る。これは、ピロール−イミダゾールポリアミドを用いた治療を行なう前段階に利用出来るだけでなく、診断薬としての利用も可能である。
合成は先に示したピロール−イミダゾールポリアミドの固相合成法と同じ手法、即ち、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ法を採用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ等を用いて固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法により合成することが出来る。
なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。
実施例
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  モノマーユニットの合成（上記［化１］の反応スキーム参照）
固相合成に用いるモノマーユニット１１、１２及び１４は次に示した方法により合成した。また、β−アラニンのＦｍｏｃ保護体は市販されているものを用いた。
なお、反応及び精製に用いた試薬、溶媒は市販のものを用いた。１Ｈ−ＮＭＲは日本電子ＪＮＭ−Ａ５００を使用した。
試薬の略号は以下のように用いた。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ），トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）。
（１）１−メチル−２−トリクロロアセチルピロール（３）の合成
トリクロロアセチルクロリド（２００．０ｇ，１．１０ｍｏｌ）の塩化メチレン（６００ｍｌ）溶液中に１（９０．３ｇ，１．１０ｍｏｌ）の塩化メチレン（２００ｍｌ）溶液を３時間かけて滴下した。この際に、窒素ガスを溶液中に噴霧し、反応の際に発生する塩化水素を除去した。一晩撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１０，ｖ／ｖ）溶出部よりトリクロロアセチル体３（１８９．７ｇ，７６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９５（３Ｈ，ｓ），６．２０（１Ｈ，ｓ），６．９５（１Ｈ，ｓ），７．４８（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３８．５，９６．３，１０８．９，１２１．８，１２４．０，１３３．６，１７２．９；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１６５７，１４０４，１３６３，１３３４，１１０２，１０６９，８４５，８０８，７４５，６９０ｃｍ−１。
（２）１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルピロール（５）の合成  ３（４５．２ｇ，０．２００ｍｏｌ）の無水酢酸（２００ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、同温下発煙硝酸（１８．５ｍｌ，０．３６０ｍｏｌ）を滴下した。室温で２時間撹拌した後、イソプロパノールを加え、析出した固体をろ取し、ニトロ体５（２７．２ｇ）を得た。更にろ液を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１０，ｖ／ｖ）溶出部より更に５（１０．７ｇ）を得た。（総収率７０％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：４．０６（３Ｈ，ｓ），７．７２（１Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３９．７，９４．８，１１７．５，１２１．４，１３０．２，１３５．３，１７３．６；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１６９８，１４０６，１３２５，１２２６，１１８５，１１１２，９９８，８５７，８１０，７５２，７１６，６８３ｃｍ−１。
（３）１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルイミダゾール（６）の合成
トリクロロアセチルクロリド（３６．３ｇ，０．２０ｍｏｌ）の塩化メチレン（１２０ｍｌ）溶液中に２（１６．４ｇ，０．２０ｍｏｌ）の塩化メチレン（８０ｍｌ）溶液を２時間かけて滴下した。４時間撹拌した後、氷冷下トリエチルアミン（２０．２ｇ，０．２０ｍｏｌ）を滴下した。溶媒を減圧下留去した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１，ｖ／ｖ）溶出部よりトリクロロアセチル体４（２３．２ｇ，５１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：４．０３（３Ｈ，ｓ），７．１４（１Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３７．１，９４．８，１２８．５，１３０．５，１３６．１，１７２．３；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１６５７，１５１８，１４６６，１４０８，１３５２，１３１３，１２７８，８１０，７７９ｃｍ−１。
無水酢酸（２００ｍｌ）溶液を氷冷し、同温下発煙硝酸（１８．５ｍｌ，０．３６０ｍｏｌ）を滴下した。更に同温下で濃硫酸（０．５ｍｌ）を加え、同温で４（３４．０ｇ，０．１５０ｍｏｌ）を少量づつ２時間かけて加えた後、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残査をクロロホルムで洗浄して６（１６．０ｇ）を得た。同様の操作を二度繰り返して更に６（８．６ｇ）を得た。（総収率６０％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：４．１０（３Ｈ，ｓ），７．９０（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３８．２，９３．５，１２６．０，１３３．６，１４５．８，１７２．８；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１７０９，１５４１，１５１４，１４９１，１４６４，１３４４，１３１７，１１３５，１０２３，１０００，８１６，７４３，６３８ｃｍ−１。
（４）メチル  ４−ニトロ−１−メチルピロール−２−カルボン酸エステル（７）の合成
５（３２．４ｇ，０．１２ｍｏｌ）のメタノール（１４０ｍｌ）溶液中にＤＭＡＰ（０．５０ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）を加えた、４０分撹拌した。その後沈殿をろ別し、メタノールで洗浄し７（１８．９ｇ）を得た。ろ液は溶媒を減圧下留去した後、同様の操作を繰り返し、更に７（２．３ｇ）を得た。（総収率９７％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１７１１，１５４１，１５１０，１４２５，１３１５，１２５７，１１９５，１１１８，１０８９，７５２ｃｍ−１。
（５）メチル  ４−ニトロ−１−メチルイミダゾール−２−カルボン酸エステル（８）の合成
６（７０．０ｇ，２５６ｍｍｏｌ）のメタノール（５００ｍｌ）溶液中にをにＤＭＡＰ（０．５００ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）を加えた後、２時間撹拌した。その後沈殿をろ別し、ジエチルエーテルで洗浄し８を得た。ろ液は減圧下留去した後、同様の操作を２回繰り返し、８（４６．０ｇ，９７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３．９６（３Ｈ，ｓ），４．１０（３Ｈ，ｓ），７．８２（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：３７．０，５２．８，１２４．２，１３４．６，１４５．８，１５８．４；ＩＲ（ＫＢｒ）ν：１７２９，１６４３，１４９７，１４６０，１３７７，１３５０，１３１３，１２６５，１１４７，１１２９，９９８，８４５，８１４，６５６ｃｍ−１。
（６）１−メチル−４−アミノピロール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（９）の合成
７（１５．３ｇ，８３．０ｍｍｏｌ）をメタノールとジクロロメタン（１５０ｍｌ，１：２，ｖ／ｖ）混合溶媒に溶解し、１０％パラジウム炭素（３ｇ）を加え懸濁させ、水素雰囲気下で２日間撹拌した。その後、セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に１０％塩酸を加えた。生じた沈殿をろ別し、９（４．７１ｇ）を得た。更にろ液を減圧下留去した後、酢酸エチル−メタノールで再結晶を行い９（６．８６ｇ）を得た。（総収量  １１．６ｇ，７３％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７４（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），６．８０（１Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｓ），１０．０７（３Ｈ，ｂｒ）；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ７Ｈ１０Ｎ２Ｏ２（Ｍ−ＨＣｌ＋Ｈ）１５４．１，ｆｏｕｎｄ  １５４．１。
（７）１−メチル−４−アミノイミダゾール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（１０）の合成
８（２０．０ｇ，１０８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３００ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（５ｇ）を加え懸濁させ、水素雰囲気下で１日間撹拌した。その後セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に１０％塩酸を加え酸性にした。沈殿物をろ取し、１０（１９．８ｇ，９６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），７．３７（１Ｈ，ｓ），９．９６（３Ｈ，ｂｒ．ｓ）；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６Ｈ９Ｎ３Ｏ２（Ｍ−ＨＣｌ＋Ｈ）１５６．１，ｆｏｕｎｄ  １５６．１。
（８）４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−ピロールカルボン酸（１１）の合成
９（１０．９ｇ，５７．２ｍｍｏｌ）を蒸留水（８０ｍｌ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（９．２ｇ）を加えた。一晩撹拌した後、１Ｎ塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（１００ｍｌ，１：１，ｖ／ｖ）に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸ナトリウム（５．３ｇ）を溶解させた後、９−フルオレニルメチルクロロホーメート（１７．８ｇ，６８．６ｍｍｏｌ）加えた。一晩撹拌した後、沈殿をろ別し、１１（１２．３ｇ，３４．１ｍｍｏｌ）を得た。更にろ液を１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液とジエチルエーテルの混合溶液（１：１，ｖ／ｖ）に加えた。沈殿はろ別し、更に１１（３．４ｇ）を得た。水層は１０％塩酸で酸性にした後、酢酸エチルで抽出した。その有機層を減圧下留去し、ヘキサン−ジオキサンで再結晶し、１１（１．６ｇ）を得た。（総収量  １７．３ｇ，８４％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７７（３Ｈ，ｓ），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），６．６０（１Ｈ，ｓ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），９．４０（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３６．１，４６．７，６５．４，１０７．６，１１８．８，１１９．９，１２０．１，１２２．４，１２５．０，１２７．１，１２７．６，１４０．８，１４３．８，１５３．３，１６１．８。
（９）４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸（１２）の合成
１０（８．２４ｇ，４１．９ｍｍｏｌ）を蒸留水（６０ｍｌ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（４．２ｇ）を加えた。一晩撹拌した後、１Ｎ塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（２００ｍｌ，１：１，ｖ／ｖ）に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸水素ナトリウム（１４．１ｇ）を溶解させた後、９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（１６．９ｇ，５０．１ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、沈殿をろ別し、１２（１０．８ｇ，２９．７ｍｍｏｌ）を得た。更にろ液を１０％塩酸で酸性にした後、生じた沈殿をろ別し、その沈殿を酢酸エチルで洗浄して１２（１．２ｇ，３．３０ｍｍｏｌ）を得た。（総収量  １２．０ｇ，７９％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．８７（３Ｈ，ｓ），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｓ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），９．５０（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３５．４，４６．５，６６．１，１１３．４，１２０．１，１２５．４，１２７．１，１２７．７，１３２．０４，１３７．４，１４０．７，１４３．７，１５３．３，１５９．９；ＭＳスペクトルはメチルエステルに変換して測定した。ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ１９Ｎ３Ｏ４（Ｍ）ａｓ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ３７７．１３７６，ｆｏｕｎｄ  ３７７．１３８０。
（１０）４−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酪酸（１４）の合成
１３（５．０ｇ，４８．５ｍｍｏｌ）を、水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（２００ｍｌ，１：１，ｖ／ｖ）に溶解させた後、９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（１６．４ｇ，４８．６ｍｍｏｌ）を加えた。更に炭酸ナトリウム（１０ｇ，９４．４ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。生じた沈殿をろ別し、１４（１０．３ｇ）を得た。更にろ液を１Ｎ塩酸で酸性にした後、生じた沈殿をろ別し、１４（４．４ｇ）を得た。（総収量  １４．７ｇ，９４％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．９８，（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０，６．０Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．６７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１１．０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）；ＭＳスペクトルはメチルエステルに変換して測定した。ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ１９ＮＯ４  ａｓ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ３３９．１４７１，ｆｏｕｎｄ  ３３９．１４７５。
実施例２  ピロール−イミダゾールポリアミドの固相合成（上記［化２］の反応スキーム参照）
実施例１で得られた化合物１１，１２，１４並びに市販品のβ−アラニンＦｍｏｃ保護体を用いて、各種ピロール−イミダゾールポリアミドの合成を行った。合成プロトコールを表１に示す。
0004012145.tif 000004
固相合成はＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ法を採用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒを用いて行った。固相担体はＦｍｏｃ−β−アラニンがプレロードされた市販のＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎを用いた。また、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ及びモノマーユニットは、固相担体の活性末端に対して４当量用いた。合成前に固相担体をＤＭＦに３０分膨潤させた後、Ｐｉｏｎｅｅｒの合成カラムに詰めた。合成はまず、担体にプレロードされているβ−アラニンのＦｍｏｃ基を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で５分間処理することにより脱保護した。その後、担体を４メタノールで５０秒間洗浄し、導入したいモノマーユニット、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡをカラムに通し、６０分間サイクルさせた後、メタノールで再度４０秒間洗浄した。この脱保護、伸長というサイクルを一サイクルとして、モノマーユニットを目的とするポリアミドの配列通りに順に縮合させた。その後、脱保護を同様に行った後、５％無水酢酸、５％ピリジンのＤＭＦ溶液でアセチル化を行った。反応終了後、固相担体をカラムから取り出し、減圧乾燥を行った後、５０ｍｌのナスフラスコ中に移し、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水を５ｍｌ加えて３０分間撹拌し、担体から切り出しを行った。精製は０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより行った。
得られたピロール−イミダゾールポリアミドの構造式と収率及び各種スペクトルデータ等を以下に示す。
なお、以下の記載において、Ｉｍは１−メチル−４−アミノイミダゾール−２−カルボン酸残基を、Ｐｙは１−メチル−４−アミノピロール−２−カルボン酸残基を、Ａｃはアセチル基を、γ−ｂｕｔｙｌはγ−アミノ酪酸残基を、β−ａｌａ−ＣＯＯＨはβ−アラニンをそれぞれ表す。
0004012145.tif 000005
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１９％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２．１５（３Ｈ，ｓ），２．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．９０（３Ｈ，ｓ），４．０４（３Ｈ，ｓ），６．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．３５（１Ｈ，ｓ），４つのプロトン（３  ＮＨｓ  ａｎｄ  １  ＣＯＯＨ）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ２１Ｏ５Ｎ６（Ｍ＋Ｈ）３７７．２，ｆｏｕｎｄ  ３７７．２。
0004012145.tif 000006
Ａｃ−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１８％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２．０７（３Ｈ，ｓ），２．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．８７（３Ｈ，ｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．９０（３Ｈ，ｓ），６．７６（１Ｈ，ｓ），６．８２（１Ｈ，ｓ），６．９１（１Ｈ，ｓ），７．１１（３Ｈ，ｓ），７．１８（２Ｈ，ｓ），５つのプロトン（４  ＮＨｓ  ａｎｄ  １  ＣＯＯＨ）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２３Ｈ２８Ｏ５Ｎ７（Ｍ＋Ｈ）４９８．２，ｆｏｕｎｄ  ４９８．３。
0004012145.tif 000007
Ｉｍ−Ｉｍ−β−ａｌａ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率３１％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），４．０１（３Ｈ，ｓ），４．１１（３Ｈ，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｓ），７．５４（１Ｈ，ｓ），７．６２（１Ｈ，ｓ），６つのプロトン（５  ＮＨｓ  ａｎｄ  １  ＣＯＯＨ）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ３４Ｏ７Ｎ１１（Ｍ＋Ｈ）６３６．３，ｆｏｕｎｄ  ６３６．３。
0004012145.tif 000008
Ａｃ−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１８％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：２．０６（３Ｈ，ｓ），２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．８６（６Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ），３．８８（３Ｈ，ｓ），３．８９（３Ｈ，ｓ），６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１４−７．１６（４Ｈ，ｍ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），９つのプロトン（８  ＮＨｓ  ａｎｄ  １  ＣＯＯＨ）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ５１Ｏ１０Ｎ１４（Ｍ＋Ｈ）９３５．４，ｆｏｕｎｄ  ９３５．４。
0004012145.tif 000009
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１８％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．０１（３Ｈ，ｓ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．２１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１２．５Ｈｚ），３．７９（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），７．１６−７．１７（３Ｈ，ｍ），７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５），７．４１（１Ｈ，ｓ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５），８．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５），９．８１（１Ｈ，ｓ），９．８７（１Ｈ，ｓ），９．８８（２Ｈ，ｓ），９．９３（１Ｈ，ｓ），１０．２１（１Ｈ，ｓ），３つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ，ａｎｄ  ＣＯＯＨ）は検出されなかった。（重なったため）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３８Ｈ４８Ｏ１３Ｎ９（Ｍ＋Ｈ）８２８．３，ｆｏｕｎｄ  ８２  ８．３。
0004012145.tif 000010
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１０％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．０１（３Ｈ，ｓ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．２１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．５，７．５Ｈｚ），３．７９（３Ｈ，ｓ），３．８０（６Ｈ，ｓ），３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．１６−７．１７（２Ｈ，ｍ），７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），８．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），９．８１（１Ｈ，ｓ），９．８７（２Ｈ，ｓ），９．８８（２Ｈ，ｓ），９．９３（１Ｈ，ｓ），１０．２１（１Ｈ，ｓ），４つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ）はＤＭＳＯ溶媒のピークの一つがオーバーラップするため確認できない。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ５３Ｏ１０Ｎ１５（Ｍ＋Ｈ）９５０．４，ｆｏｕｎｄ  ９５０．３。
実施例３  ピロール−イミダゾールポリアミドのカルボン酸末端へのＤＮＡアルキル化剤の導入
ＤＮＡアルキル化剤であるＤＵ−８６の構造式及びＤＵ−８６の活性中心であるＡ環部（Ｄｕ８６）の構造式を以下に示す。
0004012145.tif 000011
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固相担体から切り出したカルボン酸末端に対して、ＤＮＡアルキル化剤であるＤＵ−８６の活性中心であるＡ環部（Ｄｕ８６）１５を導入した。操作手順は以下の通りである。
実施例２で得られた、カルボン酸末端を有するピロール−イミダゾールポリアミド（０．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液に室温下、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２４．３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え、同温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残査をジエチルエーテルで２回洗浄し、イミダゾールエステル体（３０−７０％）を得た。
１５（６．２ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を−１５℃に冷却し、６０％水素化ナトリウム（２．０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を加え、同温下３０分撹拌した。その溶液に、上で得られたイミダゾールエステル（０．０２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を滴下し、同温度で一晩撹拌した。リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８６）を加えた後、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、更に、ＨＰＬＣによる精製を行ない、カップリング体（２０−５０％）を得た。
得られたイミダゾールエステル体及びカップリング体の構造式と得量、収率及び各種スペクトルデータ等を以下に示す。
なお、以下の記載において、Ｉｍ’はイミダゾリル基を表し、β−ａｌａ−ＣＯはβ−アラニン残基を表し、Ａｃ，Ｉｍ，Ｐｙ及びγ−ｂｕｔｙｌは前記と同じ。
0004012145.tif 000013
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｉｍ’：５．６ｍｇ（４５％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．０１（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．０６（１Ｈ，ｓ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．４０（１Ｈ，ｓ），７．７２（１Ｈ，ｓ），８．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｓ），９．９２（１Ｈ，ｓ），１０．２３（１Ｈ，ｓ），４つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ）はＤＭＳＯ溶媒のピークがオーバーラップするため確認できない。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ２３Ｏ４Ｎ８（Ｍ＋Ｈ）４２７．２，ｆｏｕｎｄ  ４２７．２。
0004012145.tif 000014
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｄｕ８６：０．５６ｍｇ（９％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．２８（１Ｈ，ｓ），２．０１（３Ｈ，ｓ），２．０９（１Ｈ，ｓ），２．４５（３Ｈ，ｓ），３．３８−３．４４（２Ｈ，ｍ），３．７０−３．７５（１Ｈ，ｍ），３．７１（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），４．０８（２Ｈ，ｓ），６．９３（２Ｈ，ｓ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．４０（１Ｈ，ｓ），８．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），９．８９（１Ｈ，ｓ），１０．２２（１Ｈ，ｓ），１２．３５（１Ｈ，ｓ），２つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ）はＤＭＳＯ溶媒のピークの一つがオーバーラップするため確認できない。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３０Ｈ３３Ｏ７Ｎ８（Ｍ＋Ｈ）６１７．２，ｆｏｕｎｄ  ６１７．３。
0004012145.tif 000015
Ｉｍ−Ｉｍ−β−ａｌａ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｉｍ’：６．３ｍｇ（７４％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．５３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），４．００（３Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｓ），６．８５（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｓ），７．０６（１Ｈ，ｓ），７．１５（２Ｈ，ｓ），７．４６（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｓ），８．０９（１Ｈ，ｓ），８．２３（１Ｈ，ｓ），８．４２（１Ｈ，ｓ），８．６１（１Ｈ，ｓ），９．７５（１Ｈ，ｓ），９．８４（１Ｈ，ｓ），９．８９（１Ｈ，ｓ），４つのプロトン（２  ｏｆ  Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２ｓ）はＤＭＳＯ溶媒のピークの一つがオーバーラップするため確認できない。
0004012145.tif 000016
Ｉｍ−Ｉｍ−β−ａｌａ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｄｕ８６：０．１０ｍｇ（３％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．０４−１．０６（１Ｈ，ｍ），２．０８−２．１２（１Ｈ，ｍ），２．５０（３Ｈ，ｓ），２．５８−２．６６（４Ｈ，ｍ），３．５６（２Ｈ，ｍ），３．６７（２Ｈ，ｍ），３．７０−３．７５（１Ｈ，ｍ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ），４．０１（３Ｈ，ｓ），４．０２−４．０５（２Ｈ，ｍ），４．０５（３Ｈ，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｓ），７．１４（２Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｓ），７．４７（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｓ），６つのプロトン（６  ＮＨｓ）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４２Ｈ４６Ｏ９Ｎ１３（Ｍ＋Ｈ）８７６．３，ｆｏｕｎｄ  ８７６．４。
0004012145.tif 000017
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｉｍ’：２２．５ｍｇ（６８％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７２−１．７８（２Ｈ，ｍ），２．０１（３Ｈ，ｓ），２．２３−２．２９（２Ｈ，ｍ），３．５０−３．５６（２Ｈ，ｍ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），６．８２（２Ｈ，ｓ），６．８９（１Ｈ，ｓ），７．０３（１Ｈ，ｓ），７．０６（１Ｈ，ｓ），７．１２（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｓ），７．２６（１Ｈ，ｓ），７．４１（１Ｈ，ｓ），７．６８（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｓ），８．００−８．０４（１Ｈ，ｍ），８．０４−８．１０（１Ｈ，ｍ），８．４２（１Ｈ，ｓ），９．８０（１Ｈ，ｓ），９．８２（１Ｈ，ｓ），９．８７（１Ｈ，ｓ），９．９３（１Ｈ，ｓ），１０．２１（１Ｈ，ｓ），４つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２  ａｎｄ  Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）はＤＭＳＯ溶媒のピークの一つがオーバーラップするため確認できない。
0004012145.tif 000018
Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｄｕ８６：０．７０ｍｇ（ＨＰＬＣ精製後７％）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．０４−１．０６（１Ｈ，ｍ），２．０８−２．１２（１Ｈ，ｍ），２．５８−２．６６（４Ｈ，ｍ），３．５６（２Ｈ，ｍ），３．６７（２Ｈ，ｍ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ），４．０１（３Ｈ，ｓ），４．０２−４．０５（２Ｈ，ｍ），４．０５（３Ｈ，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｓ），７．１４（１Ｈ，ｓ），７．４７（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｓ），６つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２  ａｎｄ  Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）はＣＤ３ＯＤに変えたことにより検出されなかった。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ５２Ｈ５８Ｏ１１Ｎ１５（Ｍ＋Ｈ）１０６８．３，ｆｏｕｎｄ  １０６８．４。
実施例４  ＤＮＡアルキル化剤を導入したピロール−イミダゾールポリアミドによる配列特異的ＤＮＡアルキル化
（１）上で合成したＡｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｄｕ８６を用いてＤＮＡアルキル化実験を行なった。その結果を第１図に示す。
第１図から明らかなように、本化合物は、５’−ＴＡＡＡ−３’を認識して、３’−末端のアデニンをアルキル化していることが分かった。
（２）また同様の実験をＩｍ−Ｉｍ−β−ａｌａ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯ−Ｄｕ８６を用いて行なった。その結果を第２図に示す。この場合、２つのイミダゾール部がＤＮＡ中のグアニンを認識し、配列特異的なＤＮＡアルキル化が起こることが明らかとなった。即ち、本化合物は５’−ＧＧＡＧＡＡＡ−３’を認識して、３’−末端のアデニンをアルキル化していることが明らかとなった。
これらの結果からも、本発明者らが開発したピロール−イミダゾールポリアミドのＦｍｏｃ法による自動合成法を用いることで、ＤＮＡを配列選択的にアルキル化する化合物が容易に得られることが明らかとなった。この技術により、がん細胞種特有のＤＮＡをターゲットとする薬物の開発、即ち、副作用のない抗がん剤の開発の進展が大いに期待される。
（３）次に、同様の実験をＡｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−Ｄｕ８６を用いて行った。この化合物は、ピロール−イミダゾールポリアミド部位が自らヘアピン構造を取り、一分子でＤＮＡの２本鎖の両側を認識できうる。ヘアピン化合物はＤＮＡに結合する際にＰｙ−ＰｙペアがＡＴまたはＴＡをＩｍ−ＰｙペアがＧＣをＰｙ−ＩｍペアがＣＧを選択的に認識して結合するというダーバン則に従うことが知られているが、この化合物はβ−アラニンペア−Ｉｍという新たな分子認識の組み合わせを含んでいるので、新たな分子認識ルールの発見の可能性があり、ＤＮＡアルキル化実験を行なって確認した。その結果を第３図に示す（ＤＮＡ：ｐＵＣ１８ＩＩＩ  ７０ｎＭ、試薬濃度：１０ｎＭ〜５００ｎＭ，５サンプル、反応条件：リン酸ナトリウム緩衝液（１．４６ｍＭ）３７℃，８時間）。
第３図から明らかなように、この化合物の場合はヘアピン構造を取りながら一つの規則に従ってＤＮＡをアルキル化していることが分かった。即ち、γ−ｂｕｔｙｌヘアピンカーブ部位はＡＴに、Ｐｙ−ＰｙペアがＡＴまたはＴＡを認識し、Ｄｕ８６がＡまたはＧをアルキル化した。この際に、新たな分子認識ペアであるβ−アラニンペア−Ｉｍペアは、選択的にＣＧペアを認識し、配列特異的なアルキル化に重大な寄与をしていることが明らかとなった。この発見は今まで報告のない新たな発見である。
この結果、Ａｃ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−γ−ｂｕｔｙｌ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−ａｌａ−Ｄｕ８６は５’−（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ａ／Ｇ）−３’部位を認識し、３’−末端のアデニンを選択的にアルキル化していると分かった。先にも述べたように、末端がβ−アラニンカルボン酸基を持つピロール−イミダゾールポリアミドの合成は本発明者らが今回発見したペプチド合成機を用いる手法により容易に調製できる。この発見により、本発明の合成手法は、新たなＤＮＡ認識性化合物の合成に寄与するところが極めて大なる発明であるということが明らかとなった。
実施例５  ＦＩＴＣ−ピロール−イミダゾールポリアミドコンジュゲートの固相合成
合成は先に示したピロール−イミダゾールポリアミドの固相合成法と同じ手法、即ち、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ法を採用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒを用いて行った。固相担体はＦｍｏｃ−β−アラニンがプレロードされた市販のＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎを用いた。また、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＦＩＴＣ及びモノマーユニットは、固相担体の活性末端に対して４当量用いた。反応終了後、固相担体をカラムから取り出し、減圧乾燥を行った後、５０ｍｌのナスフラスコ中に移し、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％  水を５ｍｌ加えて３０分撹拌し、担体から切り出しを行った。精製は、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより行った。
得られたＦＩＴＣ−ピロール−イミダゾールポリアミドコンジュゲートの構造式と収率及び各種スペクトルデータ等を以下に示す。
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ＦＩＴＣ−Ｐｙ−−Ｐｙ−β−ａｌａ−ＣＯＯＨ：収率１４％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．７９（３Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ），６．５４−６．６２（５Ｈ，ｍ），６．６６（１Ｈ，ｓ），６．６７（１Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｓ），６．９７（１Ｈ，ｓ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｓ），９．８２（１Ｈ，ｓ），９．８５（１Ｈ，ｓ），１０．０９（２Ｈ，ｓ），１２．２０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），４つのプロトン（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ）はＤＭＳＯ溶媒のピークがオーバーラップするため確認できない。；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｅ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３６Ｈ３１Ｏ６Ｎ９Ｓ（Ｍ＋Ｈ）７２３．２，ｆｏｕｎｄ  ７２３．２。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロール−イミダゾールポリアミドに導入することが可能である。例えば、ＤＮＡに対してアルキル化能をもつデュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、またそれらの誘導体を導入することが可能である。即ち、本発明の方法を用いることで、ＤＮＡを配列選択的にアルキル化する化合物が容易に得られることが明らかとなった。この技術により、がん細胞種特有のＤＮＡをターゲットとする薬物の開発、即ち、副作用のない抗がん剤の開発の進展が期待できる。また、本発明の方法によれば、天然に存在する蛋白質とピロール−イミダゾールポリアミドとのコンジュゲート、更には非天然蛋白質とのコンジュゲートの合成をも可能とする。更にまた、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和なため、蛋白質以外の有機化合物の中でも酸性条件で不安定な官能基を持つ化合物の導入も可能であり、その応用は幅広い。例えば、ピロール−イミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡとのコンジュゲート、それらの誘導体とのコンジュゲートを自動合成することも可能である。
また、ＦＩＴＣをピロール−イミダゾールポリアミドに導入してコンジュゲートを合成することも可能であり、得られてくるコンジュゲートは、特定のＤＮＡ配列を認識出来る蛍光標識試薬として用いることが出来、がんを含めた遺伝病に関係するＤＮＡ配列を容易に識別出来る。これは、ピロール−イミダゾールポリアミドを用いた治療を行なう前段階に利用出来るだけでなく、診断薬としての利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例４の（１）のＤＮＡアルキル化実験における、ＤＮＡアルキル化剤のＤＮＡに対する反応性を４５０ｍｅｒのＤＮＡフラグメントを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。
第２図は、実施例４の（２）のＤＮＡアルキル化実験における、ＤＮＡアルキル化剤のＤＮＡに対する反応性を４５０ｍｅｒのＤＮＡフラグメントを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。
第３図は、実施例４の（３）のＤＮＡアルキル化実験における、ＤＮＡアルキル化剤のＤＮＡに対する反応性を４５０ｍｅｒのＤＮＡフラグメントを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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