(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化することを特徴とするマンノースの製造方法。
【請求項２】
炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムのいずれかのアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化する請求項１のマンノースの製造方法。
【請求項３】
請求項１のマンノースの製造方法において、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化した後、反応液を亜硫酸型または重亜硫酸型のいずれかの陰イオン交換樹脂と接触させることにより、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物を除去し、精製するマンノースの製造方法。
【請求項４】
請求項２のマンノースの製造方法において、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムの存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化した後、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムを気化させることにより反応液から除去し、精製するマンノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明はＤ−マンノース(以下、マンノースと記載する)とＤ−フラクトース(以下、 フラクトースと記載する)を相互変換する酵素、マンノースイソメラーゼを用い、フラクトースからマンノースを高い収率で製造する方法に関するものである。さらに、詳しくは、この出願の発明は、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いて、フラクトースからマンノースを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マンノースはマンニトールの原料や、動物細胞培養の原料として広く用いられている。また、マンノースには腸内サルモネラ菌の増殖を抑制する効果があると報告されており、ニワトリなどの家禽類の飲料水や飼料に添加することが検討されている（R.H.Brown, Feedstuff, June 12,10 (1989)）。さらに、マンノースは様々な食品の風味を改善することでも知られており、食品素材としての利用も考えられている。
【０００３】
従来、マンノースの製造方法としては、木材やコンニャクなどの植物に含まれるグルコマンナンを酸分解する方法や、モリブデン酸塩を触媒としてグルコースを高温加熱処理する方法が知られていた。しかし、いずれの方法も、原料資源が不足していたり、高価な試薬や高温を要するために、コストが高いという問題があったのである。そのため、マンノースはこれまで非常に高価であった上、十分な量が提供されていなかったのである。
【０００４】
発明者は、フラクトースを原料として、マンノースイソメラーゼを用い、マンノースを製造する技術や、マンノースイソメラーゼとグルコースイソメラーゼとを用いてグルコースから直接マンノースを製造する技術を確立することを目的として、鋭意研究を進めてきた。
【０００５】
マンノースイソメラーゼは、1956年、PalleroniとDoudoroffらによりシュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）中に初めて見い出された（Journal Biological Chemistry, Vol.218, 535 (1956)）。その後、本願発明者は、キサントモナス・ルブリリネアンス（Xanthomonas rubrilineans）と同定した細菌（日本農芸化学会誌、第37卷、524 (1963)、Agricaltural Biological Chemistry, Vol.28,601(1964)）や、ストレプトマイセス（Streptomyces）属菌（工業技術院発酵研究所報告、第28卷、89 (1966)）が同酵素を生産することを見出し、報告した。
【０００６】
さらに、発明者は、この酵素（マンノースイソメラーゼ）の工業的利用を目的として、熱安定性に優れたマンノースイソメラーゼ生産菌の探索を行い、これまでにシュードモナス属細菌やアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌の生産する耐熱性マンノースイソメラーゼを確認し、報告した（特開平４−２１８３７０、特願平１１−１２３４８７０他）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のマンノースイソメラーゼによるフラクトースからマンノースへの異性化においては、収率（異性化率）は約２５％と少なく、反応後の反応液からマンノースを分離精製することが困難であった。したがって、精製にコストを要するという問題があったのである。
【０００８】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決し、フラクトースからマンノースへの異性化率を高め、高い収率で、マンノースを製造する方法を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化することを特徴とするマンノースの製造方法を提供する。
【００１０】
また、第２には、この出願の発明は、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムのいずれかのアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化するマンノースの製造方法を提供する。
【００１１】
さらに、この出願の発明は、第３には、前記のマンノースの製造方法において、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物の存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化した後、反応液を亜硫酸型または重亜硫酸型のいずれかの陰イオン交換樹脂と接触させることにより、還元性のイオウ酸素酸化合物またはアンモニウム化合物を除去し、精製するマンノースの製造方法を提供する。
【００１２】
そして、第４には、この出願の発明は、上記のマンノースの製造方法において、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムの存在下で、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースをマンノースに異性化した後、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムを気化させることにより反応液から除去し、精製するマンノースの製造方法をも提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態を示し、この出願の発明について、さらに詳しく説明する。
【００１４】
この出願の発明は、発明者の鋭意研究により、マンノースイソメラーゼを用いてフラクトースからマンノースを生成する反応を、還元性のイオウ酸素酸化合物の存在下またはアンモニウム化合物の存在下で行うことで、フラクトースからマンノースへの異性化率が顕著に高められることを見出したことによりなされたものである。
【００１５】
具体的には、還元性のイオウ酸素酸化合物として、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、またはメタ重亜硫酸（ピロ亜硫酸ともいう）ナトリウムの存在下、ｐＨ５．５〜７．０で反応を行うことにより、フラクトースからマンノースへの異性化率を６０〜９０％まで高められることが確認された。
【００１６】
アンモニウム化合物として、例えば、炭酸アンモニウムや、硫酸ヒドロキシアンモニウムの存在下で反応を行うことにより、マンノースへの異性化率を約３０〜８５％まで高められ、高い収率でマンノースが生産できることが確認された。さらに、これらいずれかの化合物で処理されたイオン交換樹脂の存在下で反応を行っても、マンノースへの異性化率は顕著に高められ、収率よくマンノースが生産できることが確認された。しかし、硫酸ナトリウムなどの還元性のないイオウの酸素酸を存在させてもマンノースの収率は増大しなかった。
【００１７】
この出願の発明は、以上の知見に基づいてなされたものである。
【００１８】
この出願の発明のマンノースの製造方法において使用されるマンノースイソメラーゼは、前述のキサントモナス属（Xanthomonas）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等の菌から、例えば、日本農芸化学会誌、第37巻、524-528 (1963)、Agricultural Biological Chemistry, Vol.28, No.9, 601-604 (1964)、Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.76, No.3, 237-239 (1993)、工業技術院発酵研究所報告、第28巻、89頁（1965)、特開平４−２１８３７０などに記載された方法に従い、ポリペプトンなどの有機窒素源やグルコースなどの有機炭素源を含む液体培地において、３０℃で１〜３日間培養することにより得られる。マンノースイソメラーゼは、培養後の菌を遠心分離した菌体として、または菌体から超音波処理法または自己消化法により抽出し、遊離酵素として得られる。さらには、マンノースイソメラーゼは、菌体または遊離酵素を公知の方法により固定化した酵素としても使用できる。
【００１９】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、マンノースの収率は、選択する還元性のイオウ酸素酸化合物やアンモニア化合物の種類に大きく影響される。
【００２０】
還元性のイオウ酸素酸化合物としては、亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）、亜硫酸カリウム（K2SO3）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Na2S2O5）（ピロ亜硫酸ナトリウムまたは二亜硫酸ナトリウムともいう）、メタ重亜硫酸カリウム（K2S2O5）（ピロ亜硫酸カリウムまたは二亜硫酸カリウムともいう）、重亜硫酸ナトリウム（NaHSO3）、重亜硫酸カリウム（KHSO3）、次亜硫酸ナトリウム（Na2S2O4）、次亜硫酸カリウム（K2S2O4）などの水溶性の塩が例示されるが、中でも亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムが高い反応率でマンノースを与え、好ましい。異性化率の面では、とくに、メタ重亜硫酸ナトリウムが好ましい。
【００２１】
また、この出願の発明のマンノースの製造方法においては、上記の還元性のイオウ酸素酸化合物のイオンを結合したイオン交換樹脂を用いてもよい。このような還元性のイオウ酸素陰イオンを結合させるためのイオン交換樹脂は、とくに限定されないが、アンバーライト（Amberlite）IRA-400（ローム＆ハース社製）、ダウエックス（Dowex）１-X8（ダウ・ケミカル社製）などの強塩基性陰イオン交換樹脂やこれと陽イオン交換樹脂との混合樹脂（例えば、アンバーライトMB-1）などが例示される。混合樹脂は反応液のｐＨを望ましい領域に維持するのに効果的であり、好ましい。このように、陰イオン交換樹脂を用いる場合においても、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、およびメタ重亜硫酸ナトリウムで処理した場合が最も高い収率でマンノースが得られ、好ましい。
【００２２】
これらの陰イオン交換樹脂の処理方法はとくに限定されないが、例えば、陰イオン交換樹脂を水酸化ナトリウムでＯＨ型とした後、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、あるいはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元性のイオウ酸素酸化合物で処理し、水洗する方法があげられる。また、陰イオン交換樹脂の大きさ等は、とくに限定されないが、メッシュが小さいほど樹脂あたりの基質量を多くすることができ、効率よくにマンノースを製造することが可能となる。
【００２３】
このようにして得られた還元性のイオウ酸素酸化合物結合陰イオン交換樹脂をフラクトースとマンノースイソメラーゼを含む反応液と接触させる方法としては、種々のものが考慮される。例えば、還元性のイオウ酸素酸化合物結合陰イオン交換樹脂をカラムに充填し、反応液を通過させてもよいし、反応液中に還元性のイオウ酸素酸化合物結合陰イオン交換樹脂を浸漬させてもよい。
【００２４】
さらに、この出願の発明のマンノースの製造方法では、還元性のイオウ酸素酸化合物の代わりに、アンモニウム化合物を用いてもよい。このようなアンモニウム化合物としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸二アンモニウム（(NH4)2HPO4）、燐酸二水素アンモニウム（NH4H2PO4）、炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3)、炭酸アンモニウム（(NH4)2CO3）、ヒドロキシルアンモニウム（ヒドロキシアミンともいう、(NH2OH)）、塩化ヒドロキシアンモニウム、硫酸ヒドロキシアンモニウムなどの化合物が例示される。さらに、これらの化合物のいずれかによって処理された陽イオン交換樹脂を用いてもよい。
【００２５】
アンモニウム化合物イオンを結合させるイオン交換樹脂としては、特に限定されないが、例えば、アンバーライト（Amberlite）IR-120、アンバーライトIRC-50（以上、ローム＆ハース社製）、ダウエックス（Dowex）50-X8（ダウ・ケミカル社製）などの陽イオン交換樹脂や陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂との混合樹脂などが適用される。
【００２６】
これらの陽イオン交換樹脂の処理方法はとくに限定されないが、陽イオン交換樹脂を水酸化ナトリウムでＮａ型または塩酸でＨ型とした後、前記のアンモニウム塩またはヒドロキシアンモニウム塩で処理し、水洗する方法が例示される。また、陽イオン交換樹脂の大きさ等は、とくに限定されないが、メッシュが小さいほど樹脂あたりの基質量を多くすることができ、効率的にマンノースを製造することが可能となるため好ましい。
【００２７】
このようにして得られたアンモニウム化合物結合陽イオン交換樹脂を、フラクトースとマンノースイソメラーゼを含む反応液に接触させる方法としては、種々の方法が考えられる。例えば、アンモニウム化合物結合陽イオン交換樹脂をカラムに充填し、反応液を通過させてもよいし、反応液中にアンモニウム化合物結合陽イオン交換樹脂を浸漬させてもよい。
【００２８】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、還元性のイオウ酸素酸化物やアンモニウム化合物以外にも、ヒドラジンまたはこれにより処理された陽イオン交換樹脂を使用してもマンノースの収率を高めることができる。しかし、前記の還元性のイオウの酸素酸化合物やアンモニウム化合物は、食品添加物として使用されており、安全性において優れているためより好ましい。
【００２９】
これらの化合物の添加量は、その種類、反応時の原料基質の濃度、あるいは目的とするマンノースへの異性化率により異なる。すなわち、原料基質に対する化合物の添加量が多くなるにつれて、マンノースへの異性化率が増加するのである。例えば、原料基質濃度１０％以上では、当該化合物を基質モル濃度の約１〜２倍モル濃度添加することにより、反応液中のマンノース含量を、これまでの約２５％程度から４０〜９０％まで増加することができる。
【００３０】
この出願の発明のマンノースの製造方法においては、以上のとおりの化合物を添加するタイミングは、反応開始時であっても、反応開始後、マンノースがある程度（１０〜２５％）生成した時点であってもよい。この出願の発明のマンノースの製造方法では、添加される化合物によるマンノースイソメラーゼ反応の阻害はあまり大きくないため、化合物を反応の最初から添加しても高い収率でマンノースを得ることができるのである。
【００３１】
さらに、反応のｐＨは、とくに限定されないが、還元性のイオウの酸素酸化合物を使用する場合には、ｐＨがマンノースの収率に著しく影響する。マンノースイソメラーゼの最適ｐＨは、ｐＨ８付近であるが、種々の還元性のイオウの酸素酸化合物を使用する場合には、最適ｐＨは、生成する複塩の安定性と関連していると考えられ、添加する化合物によって異なるため、基質濃度や目標とするマンノースの収率に応じて適宜設定できる。好ましくは、ｐＨ５〜８付近とする。
【００３２】
一方、アンモニウム化合物を使用する反応においては、ｐＨによる顕著な影響は認められておらず、その値はとくに限定されないが、好ましくはｐＨ５．５〜９とする。
【００３３】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、反応温度もマンノースの収率に影響する。したがって、高い収率を与える４０〜６０℃で反応が行うことが好ましい。もちろん、これ以外の温度範囲で行なってもよい。
【００３４】
さらに、この出願の発明のマンノースの製造方法においては、還元性イオウ酸素酸雰囲気では酸素の存在によってマンノースの収率が低下する場合があるため、できるだけ不活性雰囲気下で反応を行うことが好ましい。例えば窒素ガスやヘリウムガス雰囲気下で反応を行うこともできる。
【００３５】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、添加した還元性のイオウ酸素酸化合物やアンモニウム化合物などの化合物を除去し、精製することにより、より純度を高めることができる。
【００３６】
これまでに、マンノースが重亜硫酸ナトリウム（NaHSO3）と複合体を形成する性質を利用したマンノースの分離精製法が報告されている（特公昭６３−２１６７８）。これは、重亜硫酸ナトリウムが示す強い酸性（ｐＨ３．５以下）条件下で、安定な結晶性複合体が形成される性質を利用したもので、遠心分離により結晶を分離し、過酸化水素により重亜硫酸を硫酸に酸化することにより、遊離マンノースを与える。
【００３７】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、従来のような強酸条件を用いることなく、高い収率でマンノースを得ることが可能となる。具体的には、ｐＨ６付近で認められる還元性のイオウ酸素酸化合物とマンノースとの弱い親和性を利用し、マンノースイソメラーゼの存在下で、フラクトースをマンノースに変換しながら、マンノースの収率を高めることができるのである。
【００３８】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、生成されたマンノースと添加した還元性のイオウ酸素酸化合物やアンモニウム化合物等の塩を分離精製する方法としては、例えば、塩化カルシウムを添加して塩をカルシウム塩として沈殿させ、不溶性の塩として除去する方法、陽イオン交換樹脂や陰イオン交換樹脂、またはイオン交換膜を用いた電気透析法によって除去する方法、カルシウムなどの金属イオンを結合した陽イオン交換樹脂や、亜硫酸（SO3-）型または重亜硫酸（HSO3-）型の陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによる方法などが例示される。また、一般に、イオウ酸素酸化合物の塩（亜硫酸塩）はアルコールに溶け難いことから、イオウ酸素酸化合物の塩を含む反応液にアルコールを添加して塩を分離除去することもできる。以上例示された種々の精製方法の中でも、とくに亜硫酸型、または重亜硫酸型の陰イオン交換樹脂を用いる方法が分離効率が高く、好ましい。
【００３９】
亜硫酸型、または重亜硫酸型の陰イオン交換樹脂と反応液を接触させる方法としては、反応液に添加した化合物と同じ化合物で処理した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに反応液を通してもよいし、該イオン交換樹脂を反応液に浸漬させてもよい。さらには、該イオン交換樹脂と固定化マンノースイソメラーゼをカラムに充填し、ｐＨを調整し、連続的にフラクトースまたはフラクトース含有液を流してもよく、このような方法を用いることにより、フラクトースからのマンノースへの転換を高めることも可能となる。
【００４０】
さらに、この出願の発明のマンノースの製造方法では、反応において、アンモニウム化合物として揮発性の高い炭酸アンモニウムや重炭酸アンモニウムが使用される場合には、反応液を加熱することにより、反応液からアンモニウム化合物のみを除去、回収することができる。しかし、フラクトースなどの糖は、加熱により分解、着色しやすいため、処理は減圧下で行うことが好ましい。減圧することにより、４０℃のような比較的低温下においても、短時間で、完全にアンモニウム化合物を気化させ、除去することが可能となる。このとき、アンモニウム化合物の除去効率は減圧の程度によっても異なるが、必ずしも高度の減圧は必要でなく、３０mmHg程度の減圧でも十分目的を達成することができる。
【００４１】
この出願の発明のマンノースの製造方法では、以上とおりの方法によって分離された亜硫酸塩、アンモニウム塩、および残存した原料のフラクトースは再利用することができる。また、反応液は、そのままマンニトール製造の原料として使用することができる。
【００４２】
さらに、この出願の発明のマンノースの製造方法では、原料基質としては、フラクトースのみならず、フラクトースとマンノースの混合糖液（フラクトース７５〜１００％、マンノース０〜２５％）や異性化糖や転化糖などのフラクトース含有液も使用できる。
【００４３】
また、この出願の発明のマンノースの製造方法では、酵素としてマンノースイソメラーゼだけでなく、グルコースイソメラーゼを組み合わせて反応を行うことも可能である。つまり、原料基質として、グルコースや、異性化糖、転化糖のようなグルコース含有液を使用し、直接マンノースを得ることもできるのである。以下、実施例を示し、この出願の発明をより詳しく説明する。なお、この出願の発明は以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００４４】
【実施例】
以下の実施例において、酵素活性は、次の方法により測定した。
＜酵素活性の測定方法＞  ０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した０．２Ｍのマンノース液０．５ｍｌに、適当量の酵素を加え、水で全量を１．０ｍｌとし、５０℃で反応した。０．５Ｍ過塩素酸溶液を加えて反応を止め、生成したフラクトースをシステインーカルバゾール法で定量した。この条件で、1分間に１μＭのフラクトースを生成する酵素量を１単位とした。
＜実施例１＞
ポリペプトン２％、グルコース１％、酵母エキス ０．２％、K2HPO4 ０．３％、 MgSO4・7H2O ０．０３％からなる培地（ｐＨ６）２００ｍｌを１Ｌの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間加圧殺菌後、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens) IFO12664(ATCC-4718)を接種し、３０℃で３日間振盪培養した。
【００４５】
培養後、菌体を遠心分離により回収し、水洗後、蒸溜水に懸濁した。その一部について２０ＫＣ超音波細胞破砕機で細胞を破砕し、抽出されたマンノースイソメラーゼ活性を測定したところ、懸濁液１ｍｌ当たり０．７単位の該酵素が含まれていた。
【００４６】
以下、この菌体懸濁液を用いて実験を行った。
試験例１
調製したマンノースイソメラーゼを用い、亜硫酸ナトリウム存在下の反応における、マンノースの収率と反応ｐＨの関係について調べた。
【００４７】
４０％フラクトース溶液０．４５ｍｌ（１６０ｍｇ、０．９Ｍ）に亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）１００ｍｇ（０．８Ｍ）と上記のマンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を加え、蒸留水で全量約１ｍｌとし、５０℃で２０時間反応を行った。反応液中のマンノース含量は高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表１と図１に示す。
【００４８】
【表１】
0003916858.tif 000002
【００４９】
表１と図１から明らかなように、マンノースの収率は反応時のｐＨに著しく影響を受け、マンノースの収率が最大となる最適ｐＨは６付近であることが確認された。
【００５０】
なお、亜硫酸ナトリウムを存在させなかった反応（ｐＨ７．０、５０℃）のマンノース収率は２５．４％であった。
試験例２
試験例１と同様に、亜硫酸ナトリウムを存在させ、マンノースイソメラーゼによるフラクトースからのマンノースの異性化反応を行ない、マンノースの収率と反応温度の関係について調べた。
【００５１】
試験例１で使用した４０％基質溶液０．４０ｍｌ（１６０ｍｇ、０．９Ｍ）に亜硫酸ナトリウム（Na2SO3)１００ｍｇ（０．８Ｍ量)とマンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を加え、蒸留水で全量約１ｍｌ（ｐＨ約６．０）とし、各温度で２０時間反応を行った。
【００５２】
生成したマンノースを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表２と図２に示す。
【００５３】
【表２】
0003916858.tif 000003
【００５４】
実施例において使用したマンノースイソメラーゼの活性については、最適温度が約６０℃であったものの、表２および図２から、マンノースの収率は反応温度にも影響を受け、この反応においては、４５〜５５℃の温度が最適であることが示された。
試験例３
前記試験例１および２と同条件で、亜硫酸ナトリウムを存在させたマンノースの生成反応を行ない、原料基質（フラクトース）濃度の影響を試験した。
【００５５】
フラクトースと亜硫酸ナトリウムを、表３に示した各濃度になるように加え、これにマンノースイソメラーゼ０．２ｍｌ（０．１４単位）を加えた後、ｐＨを約６．０に調整し、蒸留水で全量約１ｍｌとして５０℃で２０時間異性化反応を行った。
【００５６】
反応液中のマンノース量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
0003916858.tif 000004
【００５８】
いずれも原料基質（フラクトース）と亜硫酸ナトリウムが等モル濃度存在する反応であるが、反応液中のマンノース含量は、基質濃度が高くなるにしたがい増加する傾向にあった。すなわち、高基質濃度下で反応を行う方が、亜硫酸ナトリウム当たりのマンノース収率を高めることができることが示された。
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法で、亜硫酸ナトリウムの代わりに、メタ重亜硫酸ナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウムまたは二亜硫酸ナトリウムともいう：Na2S2O5）を使用して、ｐＨ５．６から８．２で異性化反応を行った。
【００５９】
実施例１で使用した基質溶液０．４５ｍｌ（１８０ｍｇ）に、メタ重亜硫酸ナトリウム２７０ｍｇ、マンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を添加し、５０℃で４５時間反応を行った。
【００６０】
得られた結果を表４と図１に示す。
【００６１】
【表４】
0003916858.tif 000005
【００６２】
表４と図１から明らかなように、メタ重亜硫酸塩存在下での反応においても、亜硫酸ナトリウムと同様に、最適ｐＨは６付近に認められた。
＜実施例３＞
原料基質（フラクトース）に対する亜硫酸ナトリウム量を変化させ、実施例１および２と同様の方法で反応を行った。
【００６３】
実施例１で使用した４０％フラクトース溶液０．４５ｍｌ（１８０ｍｇ）に、亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）を表に示した各量添加し、マンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を加えて全量約１ｍｌとして、ｐＨ約６．０、５０℃で２０時間反応を行った。
【００６４】
反応液中のマンノース量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した結果を、表５および図３に示した。
【００６５】
【表５】
0003916858.tif 000006
【００６６】
表５、および図３より、原料基質に対する亜硫酸ナトリウム量が多くなるに従い、マンノース量が増加することが示された。基質に対し亜硫酸ナトリウムを１．５倍量（モル濃度）添加したときには、フラクトースの約５５％がマンノースに異性化され、２．０倍量添加したときには、フラクトースの約５９％がマンノースに異性化された。
＜実施例４＞
実施例３と同様の反応を、亜硫酸ナトリウムの代わりに、メタ重亜硫酸ナトリウムを用いて行った。
【００６７】
実施例１で使用した４０％フラクトース溶液０．４５ｍｌ（１８０ｍｇ）にメタ重亜硫酸ナトリウム（Na2S2O5）を表に示した量添加し、実施例１で調製したマンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を加え、ｐＨ約６．０に調整して、５０℃で２０時間反応を行った。
【００６８】
反応液中のマンノース含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した結果を表６と図３に示した。
【００６９】
【表６】
0003916858.tif 000007
【００７０】
原料基質に対するメタ重亜硫酸ナトリウム添加量が多くなるに従い、反応液中のマンノース含量は次第に増加し、1モル量の基質に対し、メタ重亜硫酸ナトリウムを、それぞれ１．５倍、１．７５倍、および２．０倍モル量添加したとき、反応液中のマンノース含量は、それぞれ、約７５％、約８０％、約８３％となった。
【００７１】
以上の結果より、メタ重亜硫酸ナトリウムは亜硫酸ナトリウムよりも高い異性化率でフラクトースをマンノースに異性化できることが示された。
＜実施例５＞
実施例１で使用した４０％フラクトース溶液 ０．２ｍｌ（８０ｍｇ）、０．４ｍｌ（１６０ｍｇ）、あるいは０．８ｍｌ（３２０ｍｇ）に、マンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）と蒸留水を加え、全量約１ｍｌとした後、それぞれに、亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）で処理した亜硫酸型ダウエックス（Dowex）1-X8を各１ｇ（湿量）添加し、ｐＨ約６．０、４０℃で２０時間反応を行った。
【００７２】
反応後、反応液中のマンノース量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、結果を表７に示した。
【００７３】
【表７】
0003916858.tif 000008
【００７４】
亜硫酸型陰イオン交換樹脂存在下での反応においても、マンノースの増加が認められた。
＜実施例６＞
強酸性陽イオン交換樹脂と強塩基性陰イオン交換樹脂の等量混合物であるアンバーライトMB-1イオン交換樹脂（ローム＆ハース社製造、オルガノ株式会社販売）をメタ重亜硫酸ナトリウムで処理し、カラムに充填（径２．０ｃｍ×長さ２．５ｃｍ）し、これに、実施例１で使用した４０％フラクトース溶液２．５ｍｌとマンノースイソメラーゼ０．５ｍｌ（０．３５単位）を加え、ｐＨを６．０〜６．２に調整しながら、５０℃で反応を行なった。
【００７５】
５時間反応後、反応液中のマンノース含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した結果、フラクトースの３８．５％がマンノースに異性化されていた。
【００７６】
なお、該イオン交換樹脂は再生せぬまま再利用することができた。
＜実施例７＞
グルコースを原料基質とし、マンノースイソメラーゼとグルコースイソメラーゼの存在下で、マンノースの生産を行った。
【００７７】
グルコース１８０ｍｇ（１Ｍ量）、亜硫酸ナトリウム１８９ｍｇ（１．５Ｍ量）、０．１Ｍ MgSO4０．０５ｍｌ（０．００５Ｍ量）、市販の固定化グルコースイソメラーゼ剤（ナガセ生化学工業株式会社製造）２０ｍｇ、実施例１で調製したマンノースイソメラーゼ０．１ｍｌ（０．０７単位）を加え、蒸留水で全量約１ｍｌとし、ｐＨ６．０〜６．２、５０℃で２０時間反応を行った。
【００７８】
反応液中のマンノース、フラクトース、およびグルコースの含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した結果、それぞれ、２９．５％、２６．７％、４３．８％であった。すなわち、亜硫酸ナトリウム無添加の場合のマンノースの収率１２．０％に比べ、２倍以上（２９．５％）のマンノースを含む糖液が得られた。
＜実施例８＞
実施例４で調製したマンノース約７５％とフラクトース約２５％の割合で含む約１Ｍの糖液１ｍｌを４０℃に保温した亜硫酸（SO3）型ダウエックス１−X8カラム（径１．５ｃｍ×長さ２５ｃｍ）に供給し、水で溶出した（流速約８ｍｌ/時、分画容量、約２ｍｌ）。得られた結果を図４に示した。
【００７９】
図４から明らかなように、塩と糖をほぼ完全に分離することができた。
【００８０】
図５は、前記亜硫酸型ダウエックス１−X8の代わりに重亜硫酸（HSO3） 型ダウエックス１−X8カラム（径１．５ｃｍ×長さ２５ｃｍ）を用いて、塩と糖の分離を行った（流速約８ｍｌ/時、分画容量約２ｍｌ）結果を示した図である。
【００８１】
図５から明らかなように、マンノースをフラクトースと塩からほぼ完全に分離することができた。
【００８２】
亜硫酸（SO3）型の陰イオン交換樹脂カラムを用いた場合よりも、重亜硫酸（HSO3）型の陰イオン交換樹脂を用いた場合の方が、より完全な分離が達成できることが確認された。
【００８３】
また、亜硫酸塩や重亜硫酸塩以外のイオウの酸素酸塩やアンモニウム塩を含む糖液からも同様にそれぞれを分離することができた。
＜実施例９＞
６４％フラクトースと１６％マンノースからなる８０％の糖液（マンノース含量２０％、フラクトース含量８０％）０．２ｍｌ（１６０ｍｇ）に、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、または炭酸アンモニウムを各々５０ｍｇ、および酵素液を０．１５ｍｌ（０．１１単位）加え、蒸留水で全量約１ｍｌとした後、４５℃で２０時間反応を行った。
【００８４】
反応液中のマンノース含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、結果を表８に示した。
【００８５】
【表８】
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【００８６】
表８から明らかなように、アンモニウム化合物無添加の場合のマンノースの収率が２５．５％であるのに対し、いずれのアンモニウム化合物を添加した場合も、マンノースの収率が顕著に増加した。
＜実施例１０＞
実施例９で使用した基質溶液０．２２ｍｌ（１８０ｍｇ、１．０Ｍ量）に、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムを、無添加、０．２５Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍ量と、酵素液（０．１５ｍｌ、０．１１単位）を添加し、蒸溜水で全量約１ｍｌ（ｐＨ約７．０）とし、５０℃で２０時間反応を行った。反応後、生成したマンノースを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、結果を表９に示した。
【００８７】
【表９】
0003916858.tif 000010
【００８８】
表９から明らかなように、試験したいずれのアンモニウム化合物も添加量が増加するにつれて、マンノース収率が増加し、基質濃度の１．５倍量の炭酸アンモニウムを添加した場合のマンノースの収率は約５５％であった。
＜実施例１１＞
本実施例においては、アンモニア化合物として、ヒドロキシアンモニウム塩を使用した場合について記す。
【００８９】
実施例９で使用した基質溶液０．２ｍｌ（１６０ｍｇ）に、塩化ヒドロキシアンモニウムまたは硫酸ヒドロキシアンモニウムを０．５Ｍまたは１．０Ｍ量と、該マンノースイソメラーゼ液０．１５ｍｌ（０．１１単位）加え、蒸留水で全量約１ｍｌとし、４５℃で２０時間反応を行った。
【００９０】
反応液中のマンノース含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した結果を表１０に示した。
【００９１】
【表１０】
0003916858.tif 000011
【００９２】
表１０から明らかなように、ヒドロキシアンモニウム塩添加によりマンノース収率は顕著に増加し、マンノース含量６０〜７５％の糖液が得られた。
＜実施例１２＞
アンモニウム化合物として、塩化アンモニウム、ヒドロキシアンモニウムまたはヒドラジンで処理した陽イオン交換樹脂を用いて反応を行なった。
【００９３】
アンバーライトIR-120(ロームアンドハース社製造、約３０メッシュ)を１Ｎ塩酸でＨ型とし、塩化アンモニウム、ヒドロキシアンモニウムまたはヒドラジンで処理した後、蒸留水で洗浄した樹脂、それぞれ１ｇ（湿量）を試験管に採り、実施例９で使用した原料基質溶液０．２ｍｌ（１６０ｍｇ）とマンノースイソメラーゼ液０．１５ｍｌ（０．１１単位）加え、全量約１ｍｌとし、４５℃で２０時間反応を行った。結果を表１１に示した。
【００９４】
【表１１】
0003916858.tif 000012
【００９５】
表１１から明らかなように、アンモニウム型、ヒドロキシアンモニウム型、ヒドラジン型陽イオン交換樹脂のいずれにおいても、反応液との接触により、マンノース収率の顕著な増加が見られた。
＜実施例１３＞
実施例１２で使用したヒドロキシアンモニウム処理アンバーライトIR-120各１ｇ（湿量）、原料基質溶液０．１ｍｌ（８０ｍｇ）、０．２ｍｌ（１６０ｍｇ）、０．３ｍｌ（２４０ｍｇ）、０．４ｍｌ（３２０ｍｇ）または０．５ｍｌ（４００ｍｇ）、および酵素液０．１５ｍｌ（０．１１単位）を加えて、全量約１ｍｌとし、４５℃で２０時間反応を行った。
【００９６】
得られた結果を表１２に示した。
【００９７】
【表１２】
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【００９８】
表１２から、樹脂当たりの基質量を適量（樹脂湿量１ｇ当たり基質約８０ｍｇ）とすることにより、マンノース含量約５９％の糖液が得られることが確認された。
＜実施例１４＞
アンバーライトIRC-50（約３０メッシュ、ローム＆ハース社製造）を１Ｎ塩酸でＨ型とし、塩化アンモニウムまたはヒドロキシアンモニウム塩酸塩でそれぞれ処理した後、蒸留水で洗浄したもの各１ｇ（湿量）を試験管に採り、実施例１で使用した原料基質溶液０．２ｍｌ（１６０ｍｇ）と該酵素液０．１ｍｌ（０．１１単位）を加えて、全量約１ｍｌとし、４５℃で２０時間反応を行った。
【００９９】
結果を表１３に示した。
【０１００】
【表１３】
0003916858.tif 000014
【０１０１】
表１３から、アンモニウム型またはヒドロキシアンモニウム型弱酸性陽イオン交換樹脂を使用した場合もマンノースの収率を顕著に増加できることが確認された。
＜実施例１５＞
マンノース６．８％、フラクトース２．２％と炭酸アンモニウム１０．０％を含む反応液２ｍｌを試験管（径１４ｍｍ×長さ１００ｍｍ）に採り、５０、５５、６０、６５、７０、８０または１００℃の各温度で加熱した。経時的に、一定量を採り、密度計により残存している炭酸アンモニウム量を求めた。得られた結果を表１４と図６に示す。
【０１０２】
【表１４】
0003916858.tif 000015
【０１０３】
表１４と図６から、６０℃以上の温度で加熱することにより、炭酸アンモニウムを気化させ、生成物（マンノース）溶液から分離、除去できることが確認された。
＜実施例１６＞
実施例１５で使用したマンノース６．８％、フラクトース２．２％と炭酸アンモニウム１０．０％からなる反応液５ｍｌを１００ｍｌ容の濃縮フラスコに入れ、４０、５０、６０、７０、および８０℃の各温度のもと、３０mmHgの減圧下で濃縮処理した。
【０１０４】
水分が蒸発したところで、同容量の蒸留水を加え、濃縮を繰り返した。各処理時（３〜５分）に、採取した試料について、密度計により残存している炭酸アンモニウム量を求めた。
【０１０５】
得られた結果を表１５に示した。
【０１０６】
【表１５】
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【０１０７】
表１５から、この方法により、炭酸アンモニウムを、比較的低温で、短時間に、かつ効果的に気化させ、反応液から完全に分離除去できることが明らかになった。
【０１０８】
【発明の効果】
以上、詳しく説明したとおり、この出願の発明のマンノースの製造方法によって、従来のマンノースイソメラーゼを用いた反応においては、約２５％という低い収率でのみ製造可能であったマンノースの収率を、９０％以上まで高めることができる。
【０１０９】
したがって、この出願の発明のマンノースの製造方法を用いることにより、フラクトースからマンノースやマンニトールを大量に、安価に、製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の実施例１（試験例１）において、反応ｐＨとマンノース収率の関係を示した図である。
【図２】この出願の発明の実施例１（試験例２）において、反応温度とマンノース収率の関係を示した図である。
【図３】この出願の発明の実施例３および実施例４において、基質濃度に対する亜硫酸塩の添加量（モル濃度比）とマンノースの収率の関係を示した図である。
【図４】この出願の発明の実施例において、亜硫酸型陰イオン交換樹脂カラムを用いたマンノースとフラクトースをそれぞれ含む糖液からの亜硫酸塩と各糖の分離を示した図である。
【図５】重亜硫酸型陰イオン交換樹脂カラムによる、マンノースとフラクトースをそれぞれ含む糖液からの亜硫酸塩と各糖の分離を示す図である。
【図６】この出願の発明の実施例１５において、炭酸アンモニウムを含む反応液からの炭酸アンモニウムの気化除去における処理温度の影響を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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