(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩とグリオキシル酸またはその塩を遷移金属イオンおよび塩基の存在下に反応させた後、加水分解することを特徴とする該メチオニン残基の除去方法。
【請求項２】
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子工学的に製造されたペプチドがＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基が付加した成長ホルモン、ニューロトロフィン−３、ベータセルリン、副甲状腺ホルモンまたはインターロイキン−２である請求項２記載の方法。
【請求項４】
塩基が、アルキルアミン類、芳香族アミン類または尿素である請求項１記載の方法。
【請求項５】
遷移金属イオンが銅イオンである請求項１記載の方法。
【請求項６】
塩基がピリジンである請求項４記載の方法。
【請求項７】
塩基を用いて加水分解することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
塩基がアミン類である請求項７記載の方法。
【請求項９】
塩基がジアミン類またはチオもしくはセレノセミカルバジド類である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ジアミン類がｏ−フェニレンジアミンである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加したヒト成長ホルモン、ニューロトロフィン−３、ヒトベータセルリン、副甲状腺ホルモンおよびヒトインターロイキン−２から選ばれたペプチドまたはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とする該ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項１２】
式  CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖を示す。］で表される化合物またはその塩。
【請求項１３】
請求項１２記載の化合物を加水分解することを特徴とするペプチドまたはその塩の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ末端にメチオニンを有するペプチド（蛋白質を含む）またはその塩からメチオニンを除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質が細胞内で生合成される際には、そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメチオニンから始まっていることが知られている。しかしながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによって取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例である。
遺伝子組換え技術の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、例えば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、本手法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存している例が見い出されている。例えば、大腸菌で発現させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加率はほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４０８（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにおいては５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２では、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニンではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端にさらにメチオニンの付加した分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認められている。
一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する方法としては、Dixon が、１９６４年に、ＤＬ−アラニルグリシンにグリオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応させるとアミノ基移転反応が起こり、ピルボイルグリシンが生成すること［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９２，６６１（１９６４）］、さらに、化合物にチオセミカルバジドを反応させるとアミド結合の解裂が起こり、グリシンを生成することを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.J），９０，２Ｃ（１９６４）］。次いで、この反応をチトクロームＣ−５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ−５５１）に応用し、Ｎ末端グルタミン酸が除去されることを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９４，４６３（１９６５）］。しかしながら、これらは合成ペプチドまたは成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸の除去に限定されており、遺伝子組換え蛋白質のＮ末端に付加したメチオニンの除去に、本反応を有効に利用している例は見い出せない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
同じ蛋白質であっても、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありうるものと考えられる。従って、産業利用上の観点から、この開始コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確立することは意義あることと考えられる。
この課題を解決するため、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチオニンを取り除く方法が提案［サイエンス（Science），１９８，１０５６（１９７７）］されているが、この場合は所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しないことが前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法によっては、決して満足する結果は得られない。
Ｎ末端にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的かつ効率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去することを可能とする化学的な方法は全く知られていないが、このことは、最終生産物となるペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マイルドな条件下でＮ末端メチオニンを除去しうる化学的な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられる。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に製造される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを目的とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオニンを除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性が低下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行させる必要があり、化学的な反応条件としては制限が多いので、良好な反応条件を見い出せないのが現状であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子工学的に製造される蛋白質におけるＮ末端のメチオニンのみを切断することによる、天然型のアミノ酸配列を有する蛋白質の製造法を提供すべく鋭意研究したところ、メチオニンの付加した蛋白質においてメチオニンをα−ジケトン体に変換した後、有機ジアミン類を作用させて、メチオニンの付加した蛋白質から、Ｎ末端メチオニンを除去する方法を見い出すべく鋭意努力した結果、下記式（Ｉ）で表わされるメチオニンの付加したペプチドまたは蛋白質に、α−ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、アミン類であるピリジンを反応させて、アミノ基移転反応を行い、メチオニンをα−ジケトン体に変換した後、さらにジアミン類であるｏ−フェニレンジアミンと反応させて加水分解反応を行うことにより、メチオニンの付加したペプチドまたは蛋白質から、Ｎ末端メチオニンを除去し、その活性を低下させることなく、Ｎ末端にメチオニンの付加していないペプチドまたは蛋白質を得る方法を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。
【化１】
0003913316.tif 000002
［式（I）中、Ｘはアミノ酸残基または２以上の任意のアミノ酸数を有するペプチド鎖であればいずれでもよいが、実用的な面からは、遺伝子工学的に製造された蛋白質のＸに対応する部分のペプチド鎖が挙げられる。なお、本願明細書において、蛋白質あるいはペプチドと称する場合、複数のアミノ酸からなるペプチドまたは蛋白質は、非グリコシル化またはグリコシル化ペプチドまたは蛋白質のいずれであってもよい。］
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類を反応させた後、加水分解することを特徴とする該メチオニン残基の除去方法；
（２）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである前記（１）記載の方法；
（３）遺伝子工学的に製造されたペプチドがＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基が付加した成長ホルモン、ニューロトロフィン−３、ベータセルリン、副甲状腺ホルモンまたはインターロイキン−２である前記（２）記載の方法；
（４）遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴とする前記（１）記載の方法；
（５）塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴とする前記（１）記載の方法；
（６）遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴とする前記（１）記載の方法；
（７）α−ジケトン類がグリオキシル酸またはその塩である前記（１）記載の方法；
（８）遷移金属イオンが銅イオンである前記（４）記載の方法；
（９）塩基がピリジンである前記（５）記載の方法；
（１０）塩基を用いて加水分解することを特徴とする前記（１）記載の方法；
（１１）塩基がアミン類である前記（１０）記載の方法；
（１２）塩基がジアミン類またはチオもしくはセレノセミカルバジド類である前記（１０）記載の方法；
（１３）ジアミン類がｏ−フェニレンジアミンである前記（１２）記載の方法；
（１４）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加したヒト成長ホルモンまたはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とするヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法；
（１５）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加したニューロトロフィン−３またはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とするニューロトロフィン−３またはその塩の製造法；
（１６）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加したヒトベータセルリンまたはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とするヒトベータセルリンまたはその塩の製造法；
（１７）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加したヒトインターロイキン−２またはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とするヒトインターロイキン−２またはその塩の製造法；
（１８）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加した副甲状腺ホルモンまたはその塩とグリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンと反応させることを特徴とする副甲状腺ホルモンまたはその塩の製造法；
（１９）式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。］で表される化合物またはその塩；および
（２０）前記（１９）記載の化合物を加水分解することを特徴とするアミノ酸、ペプチドまたはその塩の製造法；などに関する。
【０００６】
本明細書において、酸化されていてもよいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキシドおよびスルホン体が挙げられる。
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質としては、式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。］で表されるペプチドまたは蛋白質が挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩としては、本発明の反応を阻害しないものであれば何れでもよいが、中でも薬学的に許容可能な塩が好ましく、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などがあげられる。
【０００７】
上記式中、ｍとしては０が好ましい。また、Ｘとしてはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖が好ましい。
本発明の除去方法に用いるペプチドとしては、アミノ酸数が５０未満のいわゆるペプチドあるいはアミノ酸数が５０以上のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。
このように、本願明細書において、「ペプチド」で示される用語は、アミノ酸数が５０未満の分子のみならず、アミノ酸数が５０以上の分子をも含むものであるが、なかでも、アミノ酸数が５０以上の分子（いわゆる蛋白質）が好ましく用いられる。
好ましいペプチドとしては、アミノ酸数が２ないし１０００であるペプチド、さらに好ましくはアミノ酸数が１５ないし５００であるペプチドが挙げられ、その具体例としては、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インシュリン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、４または６、中枢神経成長因子、グリア成長因子、肺由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αまたはβ、血管内皮細胞成長因子、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベータ、ウロキナーゼ、プロテインＣ、トロンボモジュリン、骨形成因子、カルシトニン、インスリン様成長因子、インターフェロン−α、βまたはγ、インターロイキン−１（α、β）〜１２、顆粒コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ・コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、ＰＡＣＡＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、巨核球成長因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、モチリン、イムノトキシン、腫瘍壊死因子、ヒルジン、コルチコトロピン、アンジオテンシン、アンジオテンシン２およびそのペプチド性拮抗薬、アンジオテンシン３、ブラジキニン類、ブラジキニン増強因子、α、βまたはγエンドルフィン、エンケファリン、好球中走化性因子、ガストリン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、キョウトルフィン、カリジン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン、ニューロテンシン、トリプシンインヒビター、オキシトシン、プロインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ユビキチン、ウロガストロン、バソプレッシン類、キニン類、タフトシン、ソマトメジン、コルチコトロピン放出因子、インスリン様成長因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＰＴＨrＰ、ＶＩＰ、ＤＨＩ、インスリノトロピン、ＧＲＰ、ＣＣＫ−ＰＺ、Galanin（ガラニン）、アカトラムペプチド（Antrum Peptide）、ＰＰＹ、Pancreatic Polypeptide、ＰＳＰ、パンクレアスタチン、hＣＧ、hＣＳ、リラキシン、血清胸腺因子、サイモポイエチン、サイモシン、ファクターXIII、ファクターVIII、プロウロキナーゼ、ＳＯＤ、ファクターVIIａ、アンチトロンビンなどの蛋白質およびそれらのムテイン（天然型の蛋白質に１つ以上のアミノ酸が置換、欠損または付加し、天然の蛋白質と同等またはそれ以上の生物学的または免疫学的活性を示すもの）など、あるいは化学合成などにより製造される公知または新規のペプチドなどが挙げられるが、なかでも、遺伝子工学的に製造された蛋白質、とりわけ、遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニンが付加した成長ホルモン、ニューロトロフィン−３、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン、インターロイキン−２などが好ましく用いられる。
上記した天然型の蛋白質は、何れの動物種由来のものであってもよいが、実用的には、ヒト由来の蛋白質が好ましく用いられる。
【０００８】
本明細書において、α−ジケトン類は、上記したペプチドまたはその塩のアミノ基移転反応を進行させうるものであれば何れでもよく、例えば式Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい低級アルキルもしくはフェニル基（好ましくは水素またはメチル、さらに好ましくは水素）を示し、Ｒ2は水酸基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合物またはその塩などが挙げられる。上記式中、Ｒ1で示される低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキル基などが挙げられ、Ｒ2で示される低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ基などが挙げられる。また、Ｒ2で示される低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、前記したＲ1で示される低級アルキル基を１ないし２個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩としては、上記したペプチドまたは蛋白質の塩と同様なものが挙げられる。α−ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オキソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用いられる。
【０００９】
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、ペプチドまたはその塩１モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約５分ないし２時間（好ましくは約１５分ないし１時間）反応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ないし７、とりわけ、約５ないし６に調整して、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩が変性しない条件下で反応を進行させるのがよい。
該アミノ基転移反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu+，Cu2+）、コバルトイオン（Co2+，Co3+）、ニッケルイオン（Ni2+，Ni3+）、鉄イオン（Fe2+，Fe3+）、亜鉛イオン（Zn2+）、アルミニウムイオン（Al3+）、マンガンイオン（Mn2+など）、ガリウムイオン（Ga3+）、インジウムイオン（In3+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、カルシウムイオン（Ca2+）などを用いることができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわけ、銅イオン（Cu2+）が好ましく用いられる。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
【００１０】
また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.１ないし２モル（好ましくは０.５ないし１.０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類、尿素などの有機塩基などを用いることができるが、なかでも、芳香族アミン類、とりわけ、ピリジンが好ましく用いられる。
【００１１】
さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。
該アミノ基転移反応により得られ、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩は、新規な化合物であり、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。
アミノ基転移反応で得られたジケトン体は、通常、塩基による加水分解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基が除去されたアミノ酸、ペプチドまたはその塩に変換することができる。
【００１２】
加水分解反応に用いる塩基としては、例えば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類、ｏ−フェニレンジアミン、トリレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸、２,３−ジアミノフェノール、４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、ｏ−フェニレンジアミン類）、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類などを用いることができるが、なかでも、アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバジド類が好ましく用いられ、特に、ｏ−フェニレンジアミンが好ましく用いられる。
【００１３】
塩基の量は、通常、ジケトン体１モルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約５００ないし２０００モルである。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１ないし５０時間（好ましくは約１０ないし２５時間）で進行させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好ましく、緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし６の中性付近に調整して、得られるアミノ酸、ペプチドまたはその塩が変性しない条件下で反応を進行させるのがよい。
このようにして得られるアミノ酸、ペプチドまたはその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、好ましい例として、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア  バイオテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー(株)）を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が挙げられる。
【００１４】
本発明により製造されるポリペプチドはそのＮ末端にメチオニンを有さず、また天然の生理活性ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、天然のポリペプチドと同様の活性を有し低毒性で安全に医薬品や診断用薬剤として使用できる。
本発明により、メチオニンの付加したペプチドからＮ末端メチオニンを特異的に除去することができる。
本発明の明細書および〔図面〕においてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
【００１５】
ＳＤＳ  ：  ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇly    ：  グリシン
Ａla    ：  アラニン
Ｖal    ：  バリン
Ｌeu    ：  ロイシン
Ｉle    ：  イソロイシン
Ｓer    ：  セリン
Ｔhr    ：  スレオニン
Ｃys    ：  システイン
Ｍet    ：  メチオニン
Ｇlu    ：  グルタミン酸
Ｇln    ：  グルタミン
Ａsp    ：  アスパラギン酸
Ａsn    ：  アスパラギン
Ｌys    ：  リジン
Ａrg    ：  アルギニン
Ｈis    ：  ヒスチジン
Ｐhe    ：  フェニルアラニン
Ｔyr    ：  チロシン
Ｔrp    ：  トリプトファン
Ｐro    ：  プロリン
Ａsx    ：  Ａsp ＋ Ａsn
Ｇlx    ：  Ｇlu ＋ Ｇln
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【実施例】
参考例１
Ｍet−rhＧＨの製造：
特開昭６２−１７１６９９の参考例４に記載の方法に準じて、Ｍet−rhＧＨを製造した。
（i） 生産菌
ＡＴＣＣより分譲されたヒト成長ホルモン遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ Ｋ１２ χ１７７６／pＨＧＨ １０７（ＡＴＣＣ  ３１５３８）を使用した。
（ii）培  養
形質転換体エシェリヒア・コリ  Ｋ１２ χ１７７６／pＨＧＨ １０７（ＡＴＣＣ  ３１５３８，ＩＦＯ  １４５０５）を２L 容マイヤーのバクト・トリプトン１％，バクト・イースト０.５％，食塩０.５％，テトラサイクリン・塩酸１０mg／L，アンピシリン・ナトリウム１０mg／L，チミン２０mg／L およびジアミノピメリン酸１００mg／L を含む液体培地（pＨ ７.０）１L に接種して３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液を、リン酸１水素ナトリウム１.６８％，リン酸２水素カリウム０.３０％，塩化アンモニウム０.１０％，食塩０.０５％，消泡剤２００mg／L，グルコース１.００％，カザミノ酸１.００％，硫酸マグネシウム２４６mg／L，テトラサイクリン・塩酸１０mg／L，アンピシリン・ナトリウム１０mg／L，チミン２０mg／L およびジアミノピメリン酸１００mg／L を含む液体培地（pＨ ６.８）２０L の入った５０L 容ジャーファーメンターに移し、３７℃で１０時間通気撹拌培養した。この培養液を遠心分離し、菌体を集めた。
【００１７】
参考例２
参考例１で得た湿菌体２kgを取り出し、この菌体に８Ｍ塩酸グアニジンを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ ８.０）６L を加え、菌体の固まりがなくなるまで十分撹拌し菌体を溶解した後、遠心分離（１０,０００rpm、６０分）を行い約６L の菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を約７０L の１０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ ７.０）に対して２回透析し、透析終了後得られた透析内液約９L に、最終濃度が２０％飽和硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて溶解した後、遠心分離（４,２００rpm、６０分）を行い約１０L の遠心上澄液を得た。この上澄液を２回に分けてフェニル−トヨパール６５０Ｃカラム（５cmφ×５０cm）に通液し、吸着、洗浄した後、▲１▼４０％飽和硫酸アンモニウムを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ ７.０）と▲２▼１０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.０）とによる濃度勾配溶出法により溶出し、Ｍet−rhＧＨ画分を集め、５０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）に対して透析した。得られた透析内液を遠心分離（４,２００rpm、４５分）し、約３.７L の遠心上澄液を得た。この上澄液を４回に分けてＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（４cmφ×５０cm）に通液し、吸着、洗浄した後、▲１▼１０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）と▲２▼１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）とによる濃度勾配溶出法によりＭet−rhＧＨを溶出し、集めたＭet−rhＧＨ画分を５０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）に対して透析した。得られた約１.２L の透析内液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（５５mmφ×２０cm、東ソー）及び▲１▼１０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）と▲２▼１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）とによる濃度勾配溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより吸着、溶出し、約６００mlのＭet−rhＧＨ画分を得た。この溶液をアミコンダイアフロー（ＹＭ−１０膜、７６mmφ、アミコン社）で濃縮した後、この濃縮液約２９４mlを、１００mＭ炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ ８.２）で平衡化したトヨパールＨＷ−５０Ｆカラム（８cmφ×５０cm）を用いてゲルろ過を行い、Ｍet−rhＧＨ画分を得た。ついでマイレクスＧＶフィルター（０.２２μm、ミリポア社）でろ過し、８６９mgのＭet−rhＧＨを得た。
【００１８】
実施例１
参考例２で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒト成長ホルモン（Ｍet−rhＧＨ）５０mgを凍結乾燥した後、５０mＭリン酸緩衝液（pＨ ８.０）４０mlに溶解した後、０.１Ｍ硫酸銅５ml、グリオキシル酸２.３ｇ、ピリジン５mlの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２Ｍ酢酸−２Ｍ酢酸ナトリウム溶液で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ml／分の流速で展開し、Ｍet−rhＧＨのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に、ｏ−フェニレンジアミンを２０mＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２０時間反応した。反応終了後、反応液を２０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を６ml／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないヒト成長ホルモン（rhＧＨ）画分をプールした。プールしたrhＧＨ画分を２０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ ８.０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１.５mmID×１５０mmL）に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝２０mＭトリス塩酸緩衝液＋１Ｍ ＮaＣl、pＨ８.０）の段階勾配で３０分間、８.５ml／分の流速で溶出を行い、rhＧＨ画分をプールした。さらに、５％エタノールで平衡化したトヨパールＨＷ−５０（２０mmID×６００mmL）（トーソー(株)）にrhＧＨ画分を通液した後、平衡化に用いた溶液を６ml／分の流速で展開し、rhＧＨ画分をプールした後、凍結乾燥を行い、rhＧＨの凍結乾燥粉末を得た。
【００１９】
実施例２
（rhＧＨの特徴決定）
ａ) ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１で得られたrhＧＨを Sample buffer［Laemmli, ネイチャー（Nature），２２７，６８０（１９７０）］に懸濁し、１００mＭ  ＤＴＴにより１００℃で１分間加熱した後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品(株)）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染色したところ、単一バンドの蛋白質が認められ、精製品はほぼ単一であった。結果を〔図１〕に示す。〔図１〕において、Lane １〜３はrhＧＨ（３μg）、blank および分子量マーカーを示す。
ｂ) Ｎ末端アミノ酸配列分析
実施例１で得られたrhＧＨのＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ  モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたrhＧＨのＮ末端アミノ酸配列は cＤＮＡの塩基配列から推定したrhＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した。結果を〔表１〕に示す。
【表１】
0003913316.tif 000003
【００２０】
ｃ) アミノ酸組成分析
実施例１で得られたrhＧＨを約２０μg 用い、そのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。その結果、rhＧＨの cＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した。結果を〔表２〕に示す。
【表２】
0003913316.tif 000004
ｄ) Ｃ末端アミノ酸分析
実施例１で得られたrhＧＨを１５n mol用いて、そのＣ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。rhＧＨの cＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した。結果を〔表３〕に示す。
【表３】
0003913316.tif 000005
【００２１】
実施例３
（rhＧＨの活性測定）
Ｎb ２細胞を用いる「ジャーナル  オブ  クリニカル  エンドクリノロジー  アンド  メタボリズム（Journal of Clinical Endocrinology ＆ Metabolism），５１，１０５８（１９８０）」に記載の方法で測定したところ、実施例１で得られたrhＧＨの精製品は、標準品とほぼ同等の活性を有していた。
【００２２】
参考例３
Ｍet−ＮＴ−３の製造：
特願平８−７４７７５号明細書の参考例１〜３および実施例１〜２に記載の方法に準じてＭet−ＮＴ−３を製造した。
（１）ＮＴ−３  ＤＮＡのクローニング
E. coli Ｙ１０９０にヒトグリオーマ由来のλgt  １１ cＤＮＡライブラリー（Clontech Laboratories, Inc.）を感染させたのち、約６×１０5個のファージをＮＺＣＹ培地（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Clod Spring Harbor Laboratory, １９８２に記載）にまき、３７℃で５時間培養した。次にナイロン膜をプレート上にのせ、１分間放置後、プレートからはずした。このナイロン膜を０.５Ｍ  ＮaＯＨ−１.５Ｍ  ＮaＣl、ついで１.５Ｍ  ＮaＣl−０.５Ｍ  Tris−ＨＣl  pＨ８.０に浸し、さらに２×ＳＳＣ〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual 前掲参照〕に浸し、風乾後、８０℃で２時間放置した。
ヒトβＮＧＦ〔ネイチャー（Nature），３０３，８２１（１９８３）〕をコードするＤＮＡ（約０.３８kb）を化学合成し、ニックトランスレーションによって〔α−32Ｐ〕dＣＴＰでラベル化することによってプローブを作製した。
上記で得られたナイロン膜とプローブを用いて Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Clod Spring Harbor Laboratory, １９８２に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションを行った。即ち、プローブを含むハイブリダイゼーション溶液にナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間保温した。該ナイロン膜を室温において２×ＳＳＣ−０.１％ＳＤＳで洗浄したのち、６０℃において１×ＳＳＣ−０.１％ＳＤＳで洗浄した。次にオートラジオグラフィーによって陽性クローンを得た。このようにして得られたクローンλβＧＮ１３２１からＥcoＲＩで cＤＮＡを切り出し、プラスミド pＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）のＥcoＲＩ部位に挿入し、プラスミド pＵＮＫ５を得た。
【００２３】
（２）大腸菌用のＮＴ−３発現ベクターの構築
参考例３（１）で得られたプラスミド pＵＮＫ５に挿入されているＮＴ−３ cＤＮＡには、ＮＴ−３のＮ末端の１１番目のチロシン残基をコードする領域付近にＳcaＩ部位が、ＮＴ−３の終止コドンの５０塩基下流付近にＮsiＩ部位が存在する。そこで pＵＮＫ５より０.３kb  ＳcaＩ−ＮsiＩ断片を単離し、これにアダプターＮＧＦＴＥ−１（３５mer）、ＮＧＦＴＥ−２（３３mer）、ＮＧＦＴＥ−３（７mer）、ＮＧＦＴＥ−４（１５mer）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち制限酵素ＮdeＩとＢamＨＩで処理し、０.３kb ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片を得た。
該アダプターを次に示す。
ＮＧＦＴＥ−１：５’TATGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT 3’ ３５mer（配列番号：１）
ＮＧＦＴＥ−２：５’ACTCCCCTCGGTGACTCTTATGCTCCGCGTACA 3'    ３３mer（配列番号：２）
ＮＧＦＴＥ−３：５’TGCCAGG 3'                                ７mer
ＮＧＦＴＥ−４：５’GATCCCTGGCATGCA 3'                      １５mer（配列番号：３）
一方、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクター pＥＴ−３Ｃ〔Rosenberg et al., ジーン（Gene），５６，１２５（１９８７）〕をＮdeＩとＢamＨＩで切断し、４.４kb  ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片を単離した。
上記で得られた４.４kb  ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片と０.３kb  ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Escherichia coli  ＤＨ１に導入し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体〔Escherichia coli  ＤＨ１／pＥＮＧＦＴ１０３〕から単離したプラスミドを pＥＮＧＦＴ１０３と命名した。
【００２４】
（３）大腸菌用のＭet−ＮＴ−３の生産
参考例３（２）で得られたＮＴ−３発現ベクター pＥＮＧＦＴ１０３及びT7リゾチーム発現ベクター pＬysＳを用いて、Escherichia coli  ＭＭ２９４（ＤＥ３）〔Molecular Endocrinology, ４，８６９（１９９０）〕の形質転換を行い、形質転換体 E. coli  ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＥＮＧＦＴ１０３（ＩＦＯ  １５９３２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４８３）を得た。
形質転換体 E. coli  ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＥＮＧＦＴ１０３を５０μg／mlのアンピシリンと１５μg／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地〔１％ペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム〕１リットルを含む２リットル容フラスコで３０℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を２０リットルの主醗酵培地〔１.６８％リン酸一水素ナトリウム、０.３％リン酸二水素カリウム、０.１％塩化アンモニウム、０.０５％塩化ナトリウム、０.０５％硫酸マグネシウム、０.０２％消泡剤、０.０００２５％硫酸第一鉄、０.０００５％塩酸チアミン、１.５％ブドウ糖、１.５％カザミノ酸〕を仕込んだ５０リットル容醗酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、１００mg／L 分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
【００２５】
（４）大腸菌用のＭet−ＮＴ−３の生産（大量生産）
上記形質転換体 E. coli  ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＥＮＧＦＴ１０３を５０μg／mlのアンピシリンと１５μg／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地〔１％ペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム〕１リットルを含む２リットル容フラスコで３０℃、１６.５時間振とう培養した。得られた培養液を２０リットルのＬＢ培地〔０.０２％消泡剤、５０μg／mlのアンピシリン及び１５μg／mlのクロラムフェニコールを含む〕を仕込んだ５０リットル容醗酵槽へ移植して、３０℃、７時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主醗酵培地〔１.６８％リン酸一水素ナトリウム、０.３％リン酸二水素カリウム、０.１％塩化アンモニウム、０.０５％塩化ナトリウム、０.０５％硫酸マグネシウム、０.０２％消泡剤、０.０００２５％硫酸第一鉄、０.０００５％塩酸チアミン、１.５％ブドウ糖、１.５％カザミノ酸〕を仕込んだ５００リットル容醗酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、１００mg／L 分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、５.５時間後に培養を遠心分離して、約６kgの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
【００２６】
（５）Ｍet−ＮＴ−３の活性化
参考例３（３）で得た湿菌体のうち４０ｇを取り出し、この菌体に１０mＭ ＥＤＴＡ（pＨ７.０）２４０mlを加えて懸濁した後、氷冷下でソニファイアー４５０（ブランソン社）を使って超音波により細胞を破砕し、遠心分離（１００００rpm、１時間）を行った。得られたペレットを同様の操作を２回行って洗浄した。次いで、５０mＭトリス塩酸／４Ｍ尿素／５mＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（pＨ８.０）を１６０ml加えてホモジナイズした後遠心分離を行い、得られたペレットに２０mＭクエン酸／８Ｍ尿素（pＨ３.０）を１２０mＭ加えて溶解後、遠心分離を行い、上澄液と沈降物を分離し、沈降物に対して再度同様の操作を行い得られた上澄液と先に得られた上澄液を混合し、２４０mlのペレット溶解液を得た。
この溶解液に１００mＭ酢酸溶液を７６０ml加えて希釈し、同じく１００mＭ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１.３cmφ×５０）に通液し、尿素を除去した変性Ｍet−ＮＴ−３溶液１６４０mlを得た。この溶液を４℃で２日間静置した後、５０mＭリン酸緩衝液／１２.５％ショ糖（pＨ６.８）を加えて８.５L とし、５Ｍ水酸化ナトリウム又は濃リン酸を用いてpＨ６.０に調整し、再び４℃で２日間静置し活性化を行った。静置後２００mＭ硫酸銅を最終濃度が１０μＭになるように加え、撹拌後、さらに活性化を継続するため、再度４℃に２日間静置した。
【００２７】
（６）Ｍet−ＮＴ−３の精製
参考例３（５）で活性化を終了した溶液を、１００mＭリン酸緩衝液／０.１％３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）（pＨ６.０）で平衡化したＳＰ−セファロース Fast Flowカラム（２.５cmφ×１２cm、ファルマシア  バイオテク社）に通液し、吸着後２００mlの１００mＭリン酸緩衝液／０.１％ＣＨＡＰＳ／２００mＭ塩化ナトリウム（pＨ６.０）でカラムを洗浄し、次いで１００mＭリン酸緩衝液／０.１％ＣＨＡＰＳ／４００mＭ塩化ナトリウム（pＨ６.０）で溶出し、Ｍet−ＮＴ−３を含む溶出液を得た。この溶出液を Resource  １５ＲＰＣカラム（２cmφ×３０cm、ファルマシア  バイオテク社）に吸着した後、▲１▼１６％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡと▲２▼３６％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡによる濃度勾配溶出法で溶出し、その溶出液を凍結乾燥し、約２８mgのＭet−ＮＴ−３の白色粉末を得た。
【００２８】
実施例４
参考例３（６）で得られたＭet−ＮＴ−３  ５０mgを４.６mlの蒸留水で溶かした溶液に、グリオキシル酸９２.５mg、ピリジン２００μl、１００mＭ硫酸銅溶液２００μl を混合した溶液を加え、静かに撹拌した後、室温で１５分間静置し反応させた。反応終了後、この反応液を２Ｍ酢酸緩衝液（pＨ４.９）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２.５cmφ×５９cm）に通液し、Ｍet−ＮＴ−３のジケトン体３６mlを集めた。この溶液にｏ−フェニレンジアミン７８mgを加えて、３７℃で１５時間反応させた後、この反応終了液を、２Ｍ酢酸緩衝液（pＨ４.９）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２.５cmφ×５９cm）に通液し、得られたＮＴ−３画分７５mlを、ＯＤＰ−５０カラムを用いた▲１▼０.１％ＴＦＡと▲２▼０.１％ＴＦＡ／８０％アセトニトリルによる濃度勾配溶出法により、ＨＰＬＣで精製した後、得られたＮＴ−３画分を凍結乾燥し、ＮＴ−３の凍結乾燥粉末を得た。
【００２９】
実施例５
（ＮＴ−３の特徴決定）
ａ) ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例４で得られたＮＴ−３を Sample buffer［Laemmli, ネイチャー（Nature），２２７，６８０（１９７０）］に懸濁し、１００mＭ  ＤＴＴにより１００℃で１分間加熱した後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品(株)）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった〔図２〕。〔図２〕において、Lane １〜２は分子量マーカーおよびＮＴ−３を示す。
【００３０】
ｂ) Ｎ末端アミノ酸配列分析
実施例４で得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列分析を、気相プロテインシークェンサー４７７Ａ（モデル４７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。その結果、得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列は cＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した。結果を〔表４〕に示す。
【表４】
0003913316.tif 000006
【００３１】
ｃ) アミノ酸組成分析
実施例４で得られたＮＴ−３を約２０μg 用いて、そのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（システム６３００Ｅ、ベックマン社）により決定した。その結果、ＮＴ−３の cＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成とよく一致した。結果を〔表５〕に示す。
【表５】
0003913316.tif 000007
【００３２】
ｄ) Ｃ末端アミノ酸分析
実施例４で得られたＮＴ−３を１５n mol用いて、そのＣ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（システム６３００Ｅ、ベックマン社）により決定した。その結果、ＮＴ−３の cＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した。結果を〔表６〕に示す。
【表６】
0003913316.tif 000008
【００３３】
参考例４：Ｍet−ヒトＢＴＣの製造
特開平６−８７８９４の実施例４〜６、８および１３に記載の方法に準じて、Ｍet−ヒトＢＴＣを製造した。
（１）大腸菌のヒトＢＴＣ cＤＮＡ発現プラスミドの構築
成熟ヒトＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコードする０.６Ｋb のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片を、特開平６−８７８９４の実施例５に記載のプラスミド pＴＢ１５１５から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（配列番号４：５’ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ  ３’；配列番号５：５’ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ  ３’）を有する合成アダプターを上記０.６Ｋb 断片のＥcoＲＩ部位に連結した後、生成した０.６Ｋb ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片を、Ｔ７プロモータ（ジーン、５６、１２５（１９８７））を含有するプラスミド pＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミド pＴＢ1505を構築した。
ヒトＢＴＣの８０のアミノ酸残基（特開平６−８７８９４の〔図１０−１〕〜〔図１０−２〕の１（Ａsp）から８０（Ｔyr）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプラスミド pＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリゴヌクレオチド（配列番号６：５’ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ  ３’；配列番号７：５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ  ３’）を用いてＰＣＲを行った。生成物をＮdeＩ及びＢamＨＩで消化し、２.０％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０.２５Ｋb ＤＮＡ断片を単離した。この０.２５Ｋb ＮdeＩ−ＢamＨＩ断片を、pＥＴ−３ｃのＴ７プロモータの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼで連結挿入しプラスミド pＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４の〔図１３〕参照）。
【００３４】
（２）大腸菌中でのヒトＢＴＣの発現
E. coli ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、このプラスミド pＬysＳを E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳを得た。この菌体に参考例４（１）で得られたプラスミド pＴＢ１５１６を導入し、これにより、E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＴＢ１５１６を得た。
この形質転換細胞 E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８３６で１９９２年４月２１日付で通産省工業技術院微生物工業研究所に寄託され、またこのものは１９９２年４月１６日付で受託番号ＩＦＯ  １５２８２としてＩＦＯに寄託されている。
【００３５】
（３）組換え型大腸菌より産生されたＢＴＣの精製
参考例４（２）で得られた E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＴＢ１５１６を一晩培養した後、培養菌液を、２０倍希釈になるようにＬＢ培地に植菌した。３７℃で２時間培養後、ＩＰＴＧを最終濃度０.１mＭになるように添加し、さらに３時間培養した。遠心により菌体を集め使用時まで−２０℃に保存した。
５リットル培養相当の菌体ストックを解凍し、氷冷した５０mＭ Tris・ＨＣl（pＨ７.４），１０mＭ  ＥＤＴＡ−０.２Ｍ  ＮaＣl，１０％ sucrose, １mＭＡＰＭＳＦを含むバッファー３００mlに懸濁した。これに卵白リゾチーム４０mgを溶解し、４℃で２時間インキュベートした後、超音波処理を行い、２０,０００×ｇで１時間遠心して上清を取得した。この上清を２００mlのＱ−セファロースベットに通過させた後、ＴＣＡを最終濃度４％になるように加え、４０℃で１０分間静置した。２０,０００×ｇで２０分遠心して集めた沈殿を、１００mlの２０mＭ Tris（pＨ７.４），１mＭ  ＥＤＴＡ−０.１５Ｍ  ＮaＣl，１mＭ  ＡＰＭＳＦを含むバッファーに懸濁し、乳鉢中でホモゲナイズしながら、５Ｍ  ＮaＯＨを加え、pＨ６に調整した。このホモゲネートを１００,０００×ｇで１時間遠心して、得られた上清をＳ−Sepharose カラム（径１.６×１０cm，pharmacia）にかけた。カラムを０.１Ｍ potassium phosphate（pＨ６.０），１mＭ  ＥＤＴＡ，０.５mＭ  ＰＭＳＦを含むバッファーで洗浄した後、０Ｍから１ＭのＮaＣl 濃度勾配を４００ml，２００分にわたってかけ、溶出液を５ml毎に集めた。高い生物活性の認められた分画番号２０から２７を E. coli ＢＴＣ画分として、プールした。
E. coli ＢＴＣ画分にＴＦＡを最終濃度０.１％になるように添加し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径１.０×２５cm；Asahipak ＯＤＰ−５０，Asahi chemical）にかけた。カラムを０.１％ＴＦＡで洗浄後、０％から６３％のアセトニトリル濃度勾配を、３４０ml，１７０分間にわたってかけ、ＢＴＣ画分を集めた。この方法により６３０μg の E. coli ＢＴＣが得られた。
E. coli ＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列を２０アミノ酸残基まで決定した。ＢＴＣは翻訳開始メチオニンから始まる予想通りのＮ末端を有した分子であることがわかった。
【００３６】
実施例６
参考例４（３）で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトベータセルリン（Ｍet−ＢＴＣ）２０mgを、５０mＭリン酸緩衝液（pＨ８.０）１６mlに溶解した後に、０.１Ｍ硫酸銅２ml、グリオキシル酸０.９２ｇ、ピリジン２mlの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、２Ｍ酢酸−２Ｍ酢酸ナトリウム溶液で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に反応液を通液し、平衡化に用いた溶液を６ml／分の流速で展開し、Ｍet−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０mＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２０時間反応した。反応終了後、２０mＭトリス緩衝液（pＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に反応液を通液し、平衡化に用いた緩衝液を６ml／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないヒトベータセルリン（ＢＴＣ）画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をpＨ６.０に調整後、１００mＭリン酸緩衝液（pＨ６.０）で平衡化したＳＰ−セファロース（１０mmID×２００mmL）に吸着した後に、０−１００％Ｂ（Ｂ＝１００mＭリン酸緩衝液＋１Ｍ  ＮaＣl、pＨ６.０）の段階勾配で６０分間、２.０ml／分の流速で溶出を行い、ＢＴＣ画分をプールした。さらに、０.１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０（１０mmID×２５０mmL、昭和電工(株)）に吸着した後、２０−６０％Ｂ（Ｂ＝アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml／分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣの凍結乾燥粉末を得た。
【００３７】
実施例７：（ＢＴＣの特徴決定）
ａ) ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例６で得られたＢＴＣの１μg を Sample buffer［Laemmli, ネイチャー（Nature），２２７，６８０（１９７０）］に懸濁し、１００ｍＭ  ＤＴＴにより１００℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品(株)）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった。結果を〔図３〕に示す。〔図３〕において、Lane １〜２は分子量マーカーおよびＢＴＣを示す。
【００３８】
ｂ) Ｎ末端アミノ酸配列分析
実施例６で得られたＢＴＣを１n mol 用いて、そのＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ  モデル４７７Ａ）により決定した。その結果、ＢＴＣの cＤＮＡの塩基配列から推定したＮ末端アミノ酸配列と一致した。結果を〔表７〕に示す。
【表７】
0003913316.tif 000009
【００３９】
ｃ) アミノ酸組成分析
実施例６で得られたＢＴＣを約２０μg 用いて、そのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。その結果、ＢＴＣの cＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した。結果を〔表８〕に示す。
【表８】
0003913316.tif 000010
【００４０】
ｄ) Ｃ末端アミノ酸分析
実施例６で得られたＢＴＣを１５n mol用いて、そのＣ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。その結果、得られたＢＴＣの cＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した。結果を〔表９〕に示す。
【表９】
0003913316.tif 000011
【００４１】
ｅ) ＢＴＣの生物活性
モレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）に記載の方法により、ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３  Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３、（１９７３）を用いた活性測定を行い、実施例６で得られたＢＴＣの精製品が標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００４２】
参考例５
メチオニルヒトインターロイキン−２（Ｍet−ＩＬ−２）の製造
特開昭６２−１７１６９９の参考例２に記載の方法に準じてＭet−ＩＬ−２を製造した。
（i）発現用プラスミドの構築
ヒトＩＬ−２遺伝子を有するプラスミド pＩＬＯＴ １３５−８［特開昭６０−１１５５２８の実施例１（vii）参照］を制限酵素ＨgiＡＩで切断した。得られた１２９４bpＤＮＡ断片をＴ４ポリメラーゼで平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥcoＲＩリンカーdＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡ（配列番号：８）を結合させた。得られたＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、翻訳開始コドンＡＴＧおよびヒトＩＬ−２遺伝子を有するＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を、あらかじめＥcoＲＩ−ＰstＩ部位を消化した ptrp ７８１［ヌクレイック・アシズ・リサーチ，第１１巻，３０７７頁（１９８３）］にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。かくして得られた発現用プラスミド pＴＦ１は trp プロモーターの下流に翻訳開示コドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する（特開昭６２−１７１６９９の〔第４図〕参照）。
プラスミド pＴＦ１を制限酵素ＳtuＩで切断し、ＢamＨＩリンカーと結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩおよびＥcoＲＩで処理し、ついでＥcoＲＩ−ＢamＨＩ部位にλＰＬプロモーターを有するプラスミド pＴＢ２８１に挿入した。かくして得た発現用プラスミドを pＴＢ２８５と命名した（特開昭６２−１７１６９９〔第５図〕参照）。
【００４３】
（ii）形質転換体の製造
上記で得たプラスミド pＴＢ２８５でエシェリヒア  コリＮ４８３０をコーエンらの方法［プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），第６９巻，２１１０頁（１９７２）］に従い形質転換し、上記プラスミドを含有する形質転換体エシェリヒア  コリＮ４８３０／pＴＢ２８５を得た。
（iii）形質転換体の培養
形質転換体 E. coli Ｎ４８３０／pＴＢ２８５（ＩＦＯ  １４４３７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−８５２）を２５０ml容フラスコ内のバクト・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ，アメリカ）１％，バクト・イーストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ，アメリカ）０.５％，食塩０.５％およびアンピシリン５０μg／mlを含む液体培地（pＨ７.０）５０mlに接種して３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液をカザミノ酸０.５％，グルコース０.５％およびアンピシリン５０μg／mlを含むＭ９培地２.５L の入った５L 容ジャーファーメンターに移し３５℃で６時間、ついで４２℃でさらに３時間通気撹拌培養して培養液２.５L を得た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で凍結して保存した。
【００４４】
（iv）抽出
凍結菌体２０ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０.１Ｍ Tris−ＨＣlを含む抽出液（pＨ７.０）１００mlに均一に懸濁し、４℃で１時間撹拌した後、２８,０００×ｇで２０分間遠心分離し上清を得た。
（v）メチオニルインターロイキン−２蛋白質の部分精製
得られた上清を０.０１Ｍ Tris−ＨＣl 緩衝液（pＨ８.５）に対して透析後、１９,０００×ｇで１０分間遠心分離して得た上清を、０.０１Ｍ Tris−ＨＣl 緩衝液（pＨ８.５）で平衡化したＤＥ５２（ＤＥＡＥ−セルロース，ワットマン社製，イギリス）カラム（５０ml容）に通して蛋白を吸着後、ＮaＣl 濃度直線勾配（０〜０.１５Ｍ  ＮaＣl，１L）を作成して、Ｍet−ＩＬ−２を溶出させ、活性画分を得た。
【００４５】
（vi）メチオニルインターロイキン−２蛋白質の精製
上記で得られた活性画分をＹＭ−５メンブラン（アミコン社製，アメリカ）を用いて、５mlに濃縮し、０.１Ｍ Tris−ＨＣl（pＨ８.０）−１Ｍ  ＮaＣl 緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア製，スウエーデン）カラム（５００ml容）を用いて、ゲルろ過を行った。活性画分４０mlをＹＭ−５メンブランで３mlに濃縮した。得られた濃縮液を、ウルトラポアＲＰＳＣ（アルテックス社製，アメリカ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ（４.６×７５mm）；カラム温度，３０℃：溶出溶媒Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム，０分（６８％＋３２％Ｂ）−２５分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）；溶出速度，０.８ml／min；検出波長，２３０nm。
本条件下で保持時間約３９分のＭet−ＩＬ−２画分を集めた。
【００４６】
（vii）ＳＰ−５ＰＷカラムによるＭet−ＩＬ−２の精製
Ｍet−ＩＬ−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０，蛋白質濃度１.０３mg／ml）０.５mlを、０.０２５Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.４）で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＳＰ−５ＰＷカラム（０.７５×７.５cm；東ソー社製）にのせ、０.０２５Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.４）を用いて蛋白質を溶出した。カラム温度は３５℃に、緩衝液の流速は０.５ml／min に設定した。クロマトグラフシステムはバリアン社製５５００型液体クロマトグラフを用いた。
本条件下で保持時間約７０分のＭet−ＩＬ−２画分を集めた。
【００４７】
実施例８
参考例５で得られたメチオニルヒトインターロイキン−２（Ｍet−ＩＬ−２）２０mgを、２０mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０）２７mlに溶解した後、グリオキシル酸１.５５ｇ、２５mＭ硫酸銅３.３７５ml、ピリジン３.３７５mlの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、２０mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に３００ml／h の流速で反応液を通液し、Ｍet−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０mＭ濃度になるように添加し、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、２０mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５mmID×６００mmL）に３００ml／h の流速で反応液を通液し、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を２５mＭリン酸緩衝液（pＨ７.０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷに吸着した後、３０−８０％Ｂ（Ｂ：２５mＭリン酸緩衝液、pＨ８.０）pＨ勾配で２５分間、１.０ml／min の流速で溶出を行い、ＩＬ−２画分をプールした。さらに、▲１▼０.１％ＴＦＡと▲２▼０.１％ＴＦＡ＋８０％アセトニトリル（８０％：２０％）で平衡化したＯＤＰ−５０カラム（４.６mmID×１５０mmL）に吸着した後、２０−１００％Ｂ濃度勾配で１５分間、０.８ml／min の流速で溶出を行い、精製ＩＬ−２を得た。得られたＩＬ−２画分を凍結乾燥し、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【００４８】
実施例９（ＩＬ−２の特徴決定）
ａ) ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例８で得られたＩＬ−２の３μg を Sample buffer［Laemmli, ネイチャー（Nature），２２７，６８０（１９７０）］に懸濁した後、１００mＭ  ＤＴＴにより１００℃で５分間の還元処理を行い、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色したところ、標品と同じ移動度を示し、単一バンドであった。結果を〔図４〕に示す。〔図４〕おいて、Lane １〜２はＩＬ−２および分子量マーカーを示す。
【００４９】
ｂ) Ｎ末端アミノ酸配列分析
実施例８で得られたＩＬ−２を１n mol 用いて、そのＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム  モデル４７７Ａ）により決定した。その結果、ＩＬ−２の cＤＮＡの塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した。結果を〔表１０〕に示す。
【表１０】
0003913316.tif 000012
【００５０】
ｃ) アミノ酸組成分析
実施例８で得られたＩＬ−２を約２０μg 用いて、そのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。その結果、ＩＬ−２の cＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した。結果を〔表１１〕に示す。
【表１１】
0003913316.tif 000013
【００５１】
ｄ) Ｃ末端アミノ酸分析
実施例８で得られたＩＬ−２を１５n mol用いて、そのＣ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）により決定した。その結果、ＩＬ−２の cＤＮＡの塩基配列から予想されるＣ末端アミノ酸と一致した。結果を〔表１２〕に示す。
【表１２】
0003913316.tif 000014
【００５２】
ｅ) 生物活性
生物活性の測定は、インターロイキン−２依存性細胞を用いる日沼らの方法［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），１０９，３６３（１９８２）］に従って行い、実施例８で得られたＩＬ−２の精製品が標品と同等の活性を有することを確認した。
【００５３】
参考例６  （Ｔ７プロモーターを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築）
ｈＧＨの構造遺伝子はプラスミドｐＨＧＨ１０７（特公平６−１２９９６に記載、寄託番号ＡＴＣＣ３１５３８およびＡＴＣＣ４００１１）からＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで切断し約０．７５ｋｂの断片を単離した。一方、ｐＥＴ−３Ｃ〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ジーン（Ｇｅｎｅ）、５６巻、１２５頁（１９８７年）〕をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、Ｔ７プロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を有する約４．６ｋｂの断片を単離した。
両断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ、宝酒造株式会社製）で平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。出現したコロニーの中から１２個を拾い、これらからプラスミドを調製し制限酵素ＰｓｔＩによる切断パターンを調べたところ、６個のコロニーからのプラスミドにおいてｈＧＨ遺伝子が正しい方向で挿入されていることがわかった。この中の１株から得られたプラスミドをｐＴＧＡ２０１と命名した。
【００５４】
参考例７  （大腸菌でのＭｅｔ−ｈＧＨの発現）
大腸菌ＪＭ１０９を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、参考例６で得られたｈＧＨ発現ベクターｐＴＧＡ２０１をこの大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／ｐＴＧＡ２０１を得た。
この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤；三洋化成工業製）および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０２４６％硫酸マグネシウム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、４時間後に培養液を遠心分離して、約４．５ｋｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／ｐＴＧＡ２０１は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３２として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ  １６００１として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【００５５】
参考例８  （Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例７で得られた菌体２ｋｇに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）６リットルを加えて菌体を溶解後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）１８リットルを加えてｐＨ８．０に調整した後、４℃で５日間活性化を行った。
【００５６】
参考例９  （Ｍｅｔ−ｈＧＨの精製）
参考例８で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０分間）し、濃縮液の上清５リットルを得た。ついでこの液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、０〜２５％Ｂ（Ｂ＝２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）の濃度勾配で１００分間、３００ｍｌ／分の流速で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として１０リットルの溶出液を得た。さらに、この溶出液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩した。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、３２０ｍｌ／分の流速で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分６リットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）溶液３００ｍｌ加えてｐＨ７．２に調整し、ついでペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、９，９７９ミリグラムのＭｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００５７】
実施例１０（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１６５０ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、３５ｍＭ硫酸銅、６Ｍピリジン溶液４１３ｍｌを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１２５ｃｍ、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を、よく撹拌しながら直接４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン、３Ｍ尿素溶液４リットル中に加えた。溶出終了後、この反応溶液８リットルを４℃に３日間静置した。静置後、ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で４リットルに濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１４０ｃｍ、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分４．７リットルを集めた。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、３２０ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１０リットルを得た。このｈＧＨ画分に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）溶液を５００ｍｌ加えてｐＨ７．２に調整後、ミニタンII（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮し、この濃縮液５００ｍｌを蒸留水で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１３．ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシア社）に２リットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分１６５１ｍｌを得た。更に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過し、ｈＧＨ溶液１４８７ｍｌ（３３０９ｍｇのｈＧＨ）を得た。
【００５８】
実施例１１  （ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１０で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサンプルバッファー［Laemmli, Nature, 227, 680（1970）］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、約２２ｋｄに単一バンドが認められたことから、精製ｈＧＨはほぼ単一であることが確認された（図５）。図５において、レーン１〜２は分子量マーカーおよびｈＧＨを示す。
【００５９】
（ｂ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表１３）。
【表１３】
0003913316.tif 000015
【００６０】
（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１４）。
【表１４】
0003913316.tif 000016
【００６１】
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表１５）。
【表１５】
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【００６２】
実施例１２  （ｈＧＨの活性測定）
実施例１０で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞〔ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）〕に対する増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショナル社、Temecula，California，USA）と同等であった。
【００６３】
実施例１３  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化ニッケル、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６４】
実施例１４  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化コバルト、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６５】
実施例１５  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸亜鉛、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６６】
実施例１６  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ酢酸銅、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６７】
実施例１７  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭトリレン−３，４−ジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６８】
実施例１８  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭ４−クロロ−ｏフェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００６９】
実施例１９  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液を加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００７０】
実施例２０  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液１ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、６Ｍ尿素（ｐＨ７．０）溶液１ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に４０ｍＭになるようにシステアミンを加えよく撹拌した後３７℃で１５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００７１】
実施例２１  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、３Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液２ｍｌに４Ｍ酢酸ナトリウム、０．８Ｍ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、１０ｍＭ硫酸銅、２．５Ｍ尿素溶液２ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、３Ｍ尿素、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後４℃で３日間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００７２】
実施例２２  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例９と同じ方法で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液を限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、４３ｍｍ、アミコン社）を使って２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、３Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換するとともにＭｅｔ−ｈＧＨの濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。この溶液２ｍｌに１Ｍイミダゾール、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、２．５Ｍ尿素溶液２ｍｌを加えよく撹拌した後室温で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×３０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−ｈＧＨのジケトン体画分を集め、この溶出液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、３Ｍ尿素、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液を加えよく撹拌した後４℃で３日間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤ×４０ｃｍＬ、ファルマシア社）に通液し、ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００７３】
実施例２３  （Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
参考例４で得られたＮ末端にＭｅｔの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液（ｐＨ５．０）を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度となるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にＭｅｔの付加していないＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ６．０に調整後、１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（７．５ｍｍＩＤ×７５ｍｍＬ）、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）の段階勾配で３０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＢＴＣ画分をプールした、さらに、ＢＴＣ画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ）、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ｍｌ／分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約７６０μｇを得た。
【００７４】
実施例２４  （ＢＴＣの特徴決定）
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例２３で得られたＢＴＣを１００ｍＭ  ＤＴＴを添加したＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、約１６Ｋｄに単一バンドの蛋白が認められた。このことから、精製ＢＴＣはほぼ単一であり、ＤＴＴによる還元条件下でも強固な二量体を形成していることが判った（図６）。図６において、レーン１〜２は分子量マーカーおよびＢＴＣを示す。
【００７５】
（ｂ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定されたアミノ酸組成と一致した（表１６）。
【表１６】
0003913316.tif 000018
【００７６】
（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムモデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１７）。
【表１７】
0003913316.tif 000019
【００７７】
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１８）。
【表１８】
0003913316.tif 000020
【００７８】
実施例２５  （ＢＴＣの生物活性）
モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、５８８頁（１９８８年）に記載の方法により、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３  Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３頁（１９７３年））を用いた活性測定を行い、実施例２３で得られた精製ＢＴＣが標準品（特開平６−８７８９４の実施例１３に記載の精製ＢＴＣＩ）と同等の細胞増殖促進活性を有することを確認した。
【００７９】
実施例２６
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、トリレン−３，４−ジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８０】
実施例２７
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、２，３−ジアミノフェノールを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８１】
実施例２８
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８２】
実施例２９
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８３】
実施例３０
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にシステアミン４０ｍＭ濃度になるように添加し、ｐＨ８．５に調製した後、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８４】
実施例３１
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸ニッケル、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８５】
実施例３２
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化コバルト、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８６】
実施例３３
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸亜鉛、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８７】
実施例３４
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ酢酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８８】
実施例３５
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、０．８Ｍ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、１０ｍＭ硫酸銅、３Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００８９】
実施例３６
参考例４で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、１Ｍイミダゾール、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、３Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例２３と同様の方法で精製を行い、ＢＴＣを得た。
【００９０】
実施例３７
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＮＴ−３画分をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ６．０に調整後、１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）の段階勾配で５５分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０−６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ｍｌ／分の流速で溶出した。ＮＴ−３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＮＴ−３約６００μｇ得た。
【００９１】
実施例３８（ＮＴ−３の特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例３７で得られたＮＴ−３を１００ｍＭ  ＤＴＴを含む Sample buffer［Laemmli, Nature, 227, 680(1970)］に懸濁し１００℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー  ブリリアント  ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図７）。図７において、レーン１〜２は分子量マーカーおよびＮＴ−３を示す。
【００９２】
Ｎ末端アミノ酸配列分析
実施例３７で得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ  モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した。（表１９）
【表１９】
0003913316.tif 000021
【００９３】
ｂ）アミノ酸組成分析
実施例３７で得られたＮＴ−３のアミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表２０）
【表２０】
0003913316.tif 000022
【００９４】
Ｃ末端アミノ酸分析
実施例３７で得られたＮＴ−３のＣ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン  システム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＮＴ−３のＣ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表２１）。
【表２１】
0003913316.tif 000023
【００９５】
実施例３９（ＮＴ−３の生物活性の測定）
実施例３７で得られたＮＴ−３について、ＤＲＧを用いた生物活性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等の活性を有することを確認した。
【００９６】
実施例４０
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、トリレン−３，４−ジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【００９７】
実施例４１
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、２，３−ジアミノフェノールを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【００９８】
実施例４２
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【００９９】
実施例４３
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１００】
実施例４４
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０.２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にシステアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加し、ｐＨ８．５に調製した後、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０１】
実施例４５
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸ニッケル、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０２】
実施例４６
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化コバルト、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０３】
実施例４７
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸亜鉛、６Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０４】
実施例４８
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ４０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ酢酸銅０．５ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０５】
実施例４９
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、４Ｍ酢酸ソーダ、０．８Ｍ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、１０ｍＭ硫酸銅、３Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０６】
実施例５０
参考例３で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＮＴ−３  ２０ｍｇを３Ｍ尿素溶液２ｍｌに溶解した後、１Ｍイミダゾール、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、３Ｍ尿素の溶液２ｍｌを添加し、２５℃で１時間反応した。
反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了後、実施例３７と同様の方法で精製を行い、ＮＴ−３を得た。
【０１０７】
変性Ｍｅｔ−ＮＴ−３の活性化および活性化されたＭｅｔ−ＮＴ−３の精製は例えば以下の方法により行うこともできる。すなわち、参考例３（５）で得られたペレット溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ）した後、上澄液を１．８Ｍ尿素、０．２Ｍ  Ａｒｇ、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ、１．０ｍＭ  ＧＳＨ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で約２０倍に希釈し、４℃、４週間で変性Ｍｅｔ−ＮＴ−３のリフォールディングを行うことができる。また、リフォールディング終了後の再生液をｐＨ６．０に調整し、１００ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ６．０)で平衡化したＳＰ−セファロースカラム（２２ｍｍＩＤ×１２０ｍｍＬ）に吸着した後、４００ｍＭ  ＮａＣｌ／１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出し、Ｍｅｔ−ＮＴ−３を含むフラクションをプールし、続いて０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０（２１．５ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ）（昭和電工（株））に吸着し、０〜８０％Ｂ（Ｂ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で６０分間、５ｍｌ／分の流速で溶出して得られるＮＴ−３のフラクションを凍結乾燥して、Ｍｅｔ−ＮＴ−３の粉末を得ることができる。さらに、上述のアルギニンの代わりに、シトルリン、アラニン、バリン、リジン、アスパラギン酸などを用いてリフォールディングを行うこともできる。
【０１０８】
実施例５１
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ塩化ニッケル３．３７５ｍｌ、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、６Ｍ尿素の溶液、３．３７５ｍｌを加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１０９】
実施例５２
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ塩化コバルト３．３７５ｍｌ、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、６Ｍ尿素の溶液、３．３７５ｍｌを加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１０】
実施例５３
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸亜鉛３．３７５ｍｌ、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、６Ｍ尿素の溶液、３．３７５ｍｌを加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１１】
実施例５４
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ酢酸銅３．３７５ｍｌ、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、６Ｍ尿素の溶液、３．３７５ｍｌを加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１２】
実施例５５
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸銅３．３７５ｍｌ、ピリジン３．３７５ｍｌの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分をｐＨ８．５に調製した後、システアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１３】
実施例５６
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸銅３．３７５ｍｌ、ピリジン３．３７５ｍｌの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にトリレン−３，４−ジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１４】
実施例５７
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸銅３．３７５ｍｌ、ピリジン３．３７５ｍｌの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１５】
実施例５８
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸銅３．３７５ｍｌ、ピリジン３．３７５ｍｌの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１６】
実施例５９
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸１．５５ｇ，０．１Ｍ硫酸銅３．３７５ｍｌ、ピリジン３．３７５ｍｌの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に２，３−ジアミノフェノールを４０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１７】
実施例６０
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸亜鉛、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）、６Ｍ尿素の溶液を等量加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１８】
実施例６１
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ酢酸銅、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）、６Ｍ尿素の溶液を等量加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１１９】
実施例６２
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化ニッケル、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）、６Ｍ尿素の溶液を等量加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１２０】
実施例６３
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化コバルト、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）、６Ｍ尿素の溶液を等量加え、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１２１】
実施例６４
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、３Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２Ｌに対して透析した。この透析内液に１Ｍイミダゾール、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、２．５Ｍ尿素溶液を等量混ぜ、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１２２】
実施例６５
参考例５で得られたＮ末端にメチオニンの付加したヒトインターロイキン２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）２０ｍｇを２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）２７ｍｌに溶解した後、３Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２Ｌに対して透析した。この透析内液に４Ｍ酢酸ナトリウム、０．４Ｍグリオキシル酸、１０ｍＭ硫酸銅、０．８Ｍ酢酸、２．５Ｍ尿素溶液を等量混ぜ、室温で１時間反応した。反応終了後、反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に３００ｍｌ／ｈの流速で通液し、Ｍｅｔ−ＩＬ−２のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分にｏ−フェニレンジアミンを２０ｍＭ濃度になるよう添加して、脱気、窒素ガスシールを行った後、３７℃で２１時間反応した。反応終了後、実施例８の方法に従い、ＩＬ−２の凍結乾燥粉末を得た。
【０１２３】
参考例１０
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨ（ＩＦＯ１５２１３；ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０８）（特開平５−３０４９７６号）を１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（ｐＨ７）１Ｌに接種し、３０℃で回転振とう培養した。この培養液１Ｌを１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％塩化ナトリウムを含む液体培地（ｐＨ７）１９Ｌに接種し、３０℃で８時間、通気撹拌培養した。この培養液をＭ−９培地（１．５％カザミノ酸、１．５％グルコース、０．０００５％ビタミンＢ1）３４３Ｌの入った５００Ｌ容発酵槽へ１７Ｌ移し、３７℃で７時間の通気撹拌培養を行い、約３５０Ｌの培養液を得た。この培養液を遠心分離して、約４ｋｇの湿菌体を取得し、−８０℃に凍結保存した。
上記の大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨは、受託番号ＩＦＯ
１５２１３として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【０１２４】
参考例１１
凍結菌体１０ｇに７Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）４０ｍｌを加え、菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、６０分）を行い、約４０ｍｌの菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を約２Ｌの２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で希釈した後、遠心分離（４，２００ｒｐｍ、２０分）を行い、約２Ｌの遠心上澄液を得た。この上澄液をＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラム（５ｃｍ×３０ｃｍ）に通液し、吸着、洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で溶出した。この溶出液をＯＤＳ−１２０Ｔカラム（２１．５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー）及び▲１▼０．１％トリフルオロ酢酸と▲２▼０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリルとによる濃度勾配溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより吸着、溶出し、約３０ｍｌのＭｅｔ〔Ｃｙｓ35〕ＰＴＨ（１−８４）画分を得た。この液を５Ｌの６Ｍ尿素を含む０．１Ｍ酢酸に対して透析し、透析液を得た。得られた透析液に約４ｍｇのＤＭＡＰ−ＣＮ（１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）を加え、室温で１５分間反応し、Ｍｅｔ−〔Ｃｙｓ(ＣＮ)35〕ＰＴＨ（１−８４）を得た。得られた反応液をＳＰ−トヨパール６５０Ｍ（２．０ｃｍ×３０ｃｍ）に通液し、吸着した後、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で洗浄を行い、試薬を除去した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で溶出した。この溶出液を５Ｌの６Ｍ尿素に対して透析し、約８ｍｌの透析液を得た。得られた透析液を氷冷し、４００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウムを加え、０℃で１０分間反応した。得られた反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化したトヨパールＨＷ−５０Ｆ（２ｃｍ×５０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行い、ＭｅｔＰＴＨ（１−３４）画分をプールした。得られたＭｅｔＰＴＨ（１−３４）画分をＯＤＳ−１２０Ｔカラム（２１．５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー）及び▲１▼０．１％トリフルオロ酢酸と▲２▼０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリルとによる濃度勾配溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより吸着、溶出し、約５０ｍｌのＭｅｔＰＴＨ（１−３４）画分を得た。この溶出液を凍結乾燥し、約５ｍｇのＭｅｔＰＴＨ（１−３４）を得た。
【０１２５】
実施例６６
参考例１１で得られたＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解した後、グリオキシル酸４６．４ｍｇ、硫酸銅２．５ｍｇ、ピリジン９４．８ｍｇの混合液を加え、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清をＯＤＰ−５０カラム（１ｃｍ×２５ｃｍ、昭和電工）及び▲１▼１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）と▲２▼６０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）とによる濃度勾配溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより吸着、溶出し約５．４ｍｌのＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分をプールした。次にこの画分を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品に蒸留水を加え、４ｍｌとした後、８０ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの混合液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、反応液をＯＤＰ−５０カラム（１ｃｍ×２５ｃｍ、昭和電工）及び▲１▼０．１％トリフルオロ酢酸と▲２▼０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリルとによる濃度勾配溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより吸着、溶出を行い、ＰＴＨ（１−３４）画分をプールした。プールしたＰＴＨ（１−３４）画分を２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）で５倍希釈し、２Ｍ尿素を含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７５ｍｍ、東ソー）に吸着した後、０−５０％Ｂ（Ｂ：２０ｍＭＭＥＳ−２Ｍ尿素−０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８）濃度勾配で３０分間、０．８ｍｌ／分の流速で行い、ＰＴＨ（１−３４）画分をプールした。この画分を１Ｌ蒸留水に対して透析し、凍結乾燥を行い、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１２６】
実施例６７（ＰＴＨ（１−３４）の特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例６６で得られたＰＴＨ（１−３４）をサンプルバッファ［NOVEX JAPAN］に懸濁した後、Peptide-PAGE  mini［TEFCO］で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー  ブリリアント  ブルーで染色したところ、単一バンドであった（図８）。図８において、レーン１〜２は分子量マーカーおよびＰＴＨ（１−３４）を示す。
【０１２７】
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム  モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、ＰＴＨ（１−３４）の塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した。（表２２）
【表２２】
0003913316.tif 000024
【０１２８】
ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ  Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、ＰＴＨ（１−３４）のｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表２３）
【表２３】
0003913316.tif 000025
【０１２９】
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、ＰＴＨ（１−３４）の塩基配列から予想されるＣ末端アミノ酸と一致した。（表２４）
【表２４】
0003913316.tif 000026
生物活性の測定は骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いる方法〔Nakagawa ，S ら、BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONDS，200，1735−1741（1994）〕に従って行い、標品と同等の活性を有することを確認した。
【０１３０】
実施例６８
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化ニッケル、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３１】
実施例６９
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ塩化コバルト、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３２】
実施例７０
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸亜鉛、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３３】
実施例７１
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ酢酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３４】
実施例７２
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶解後、終濃度４０ｍＭになるようにシステアミンを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３５】
実施例７３
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭのトリレン−３，４−ジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３６】
実施例７４
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭの４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３７】
実施例７５
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭの３，４−ジアミノ安息香酸を含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３８】
実施例７６
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの４Ｍ尿素に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、４Ｍ尿素溶液１ｍｌと混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭの２，３−ジアミノフェノールを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１３９】
実施例７７
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの３Ｍ尿素−２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、１Ｍイミダゾール、０．５Ｍグリオキシル酸、２０ｍＭ硫酸銅、２．５Ｍ尿素溶液１ｍｌとを混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭ  ｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１４０】
実施例７８
参考例１１で得た、Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）５ｍｇを１ｍｌの３Ｍ尿素−２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、４Ｍ酢酸ナトリウム、０．８Ｍ酢酸、０．４Ｍグリオキシル酸、１０ｍＭ硫酸銅、２．５Ｍ尿素溶液１ｍｌとを混合して、室温で１時間反応した。反応終了後、遠心分離を行い、その上清を実施例６６と同様にＯＤＰ−５０カラム用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔ−ＰＴＨ（１−３４）のジケトン体画分を得た。
【０１４１】
次にこの画分を凍結乾燥し、４ｍｌの蒸留水に溶解後、８０ｍＭ  ｏ−フェニレンジアミンを含む、４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウムの溶液４ｍｌを加え、脱気窒素ガスシールを行った後、３７℃で１７時間反応した。反応終了後、実施例６６と同じ方法により精製し、ＰＴＨ（１−３４）の凍結乾燥粉末を得た。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチド、蛋白質またはその塩から、該メチオニン残基のみを選択特異的かつ効率的に取り除くことができる。また、本発明の方法によれば、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、しかもマイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を化学的に除去することができるので、遺伝子工学的手法により製造されたメチオニンの付加した蛋白質を原料にして、天然型のアミノ酸配列を有する蛋白質を工業的に有利に製造することができる。
【０１４３】
【配列表】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図２】実施例５ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例７ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例９ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例１１ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例２４ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例３８ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例６７ａ) で得られた電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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