(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有し、下記一般式（ＶＩ）：
【化１】
0003899372.tif 000028
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は互いに結合して環を形成してもよく；Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ(Ｒ24)−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を示し（Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい）；Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示すが、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｒ15、又はＲ17と結合して環を形成してもよく；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し；Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を示すが、Ｒ14とＲ15及びＲ16とＲ17は互いに結合して５ないし８員の環を形成してもよい）
で表される化合物である方法。
【請求項２】
多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質；
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有し、上記一般式（ＶＩ）で表される化合物である方法。
【請求項３】
多重鎖核酸の光学的測定方法であって、
(1)下記一般式（Ｉ）における化合物（Ｂ）を多重鎖核酸と接触させる工程、及び
(2)化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成した化合物（Ｃ）の蛍光を測定する工程
【化２】
0003899372.tif 000029
（式中、双方向の矢印は化学平衡を示し；
化合物（Ａ）は実質的に無蛍光性の化合物を示し；
化合物（Ｂ）は、少なくとも１つの条件下では、実質的に無蛍光性であり、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有さない化合物を示し；
化合物（Ｃ）は、上記の条件下において、化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成し、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有し、かつ上記相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物を示し；
Ｘは−Ｃ（Ｒ）＝Ｙに結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；ＹはＸ−Ｃ（Ｒ）＝と結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；Ｒは水素原子又は置換基を示し、Ｘ及び／又はＹと結合して環を形成してもよく；Ｙ’は化合物（Ａ）におけるＣ＝Ｙの二重結合がプロトン化されるように電子の移動を起こした結果として標記される残基を示し；Ｚは酸ＨＺの共役塩基を示し、Ｘ、Ｙ（若しくはＹ’）、又はＲに結合していてもよい）
を含み、該化合物（Ａ）が上記一般式（ＶＩ）で表される化合物である方法。
【請求項４】
溶液状態の多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
固相担体上に固定された多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な多重鎖核酸の光学的測定法に関する。さらに詳しくは、遺伝子解析分野において有用な蛍光測定法を用いたハイブリッド多重鎖核酸の光学的測定技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、非常に盛んに研究が行われている分野として、核酸の検出方法としての色素の応用がある。電気泳動を利用した核酸の分離の際に、核酸の存在位置を知る目的で利用される臭化エチジウムを初めとして、広範囲な用途に極めて多様な色素が開発されている。例としては、モレキュラー・プローブス社のHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 8th Edition（Molecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）に詳しく解説されている。また、遺伝的な情報を知る目的、あるいは病理組織の遺伝子発現情報を得るなどの目的で、生体内から抽出した核酸を適当な処理を行い蛍光色素で標識し、これをプローブ核酸とハイブリダイゼーションすることによって対象となる核酸の存在の有無あるいは量を検出する方法が開発されている。
【０００３】
この方法を応用し、一度に多数の遺伝子や遺伝子発現に関する情報を得る手段として、例えばＤＮＡチップやＤＮＡアレイと呼ばれる検出技術（以下、総称して「ＤＮＡアレイ」と呼ぶ）が開発され、大きな注目を集めている。この技術では、固相担体平面上に部分的あるいは全体の配列が既知であり、それぞれ異なった配列を有する多数の核酸を整列して点状に固定し、平面上の位置と核酸の配列を対応づける（「アドレッシング」とも呼ばれる）。この平面上に配列未知の核酸（この核酸は１種でもよいし、２種以上でもよい）を一様に展開し、ハイブリダイゼーション条件にさらす。配列未知の核酸に対して、相補的な配列を有する核酸が固相担体平面上に存在すれば、両者はハイブリッドを形成し、洗浄後も固相平面上に残存することになる。
【０００４】
この時に、ハイブリッドを何らかの方法によって検出することができれば、固相平面上に残存したハイブリッドの位置と対照させることにより未知の核酸の中に検出対象となる配列が存在するか否かの判定、あるいは定量又は配列の特定などが可能になる。生物の遺伝子は２０個以上の塩基配列が相同である確率は極めて低く、従って、前述の固相平面上に固定する核酸の配列として２０塩基以上の適当な配列を選択すると、固定された配列既知の核酸と検出対象遺伝子との間に１対１の関係を持たせることが可能となる。現在、知られているＤＮＡアレイと呼ばれるもののほとんどが以上の原理の上に成り立っており、この原理により１回の処理で多数（固相平面上に固定されている遺伝子に対応した配列を有する核酸の種数）の遺伝子（あるいは発現遺伝子）の有無や量的な情報を得ることを可能になっている。このように、ＤＮＡアレイ技術はアドレッシング技術及び核酸同志の相同性を相関づけるハイブリダイゼーション技術によって支えられている。
【０００５】
上述の技術をもとにして、ゲノム遺伝子を適当な長さに切断してＤＮＡアレイで解析することにより、生体個々の遺伝子情報をえることができる。また、ＰＣＲ等の手法を利用して特定の範囲の配列を対象として増幅を行い、一塩基多型などの生体個々のゲノム情報を知ることができるほか、個体内の組織毎の遺伝子発現状態や、発生段階、発育段階の各時間スケール毎の遺伝子発現状態を知ることも可能である。この方法は一般に遺伝子発現解析と呼ばれており、ゲノムＤＮＡより転写されるｍＲＮＡの種類や量的な情報を知るため、あるいは比較を行う目的で利用されている。
【０００６】
ＤＮＡアレイを用いた解析の対象となるのは主としてゲノムＤＮＡやｍＲＮＡである。前述したようにＤＮＡアレイの手法は相補的な核酸により形成されたハイブリッド多重鎖核酸を検出することが必要であるが、生体内より採取された核酸は微量である上に、検出に適した化学種とは言い難い。このため、現在、検出に最も広く用いられているのは核酸標識法と呼ばれる方法である。この方法については多くの成書や文献に具体的な方法が記載されており、類似した方法も多いが、その標識原理は、検出対象となる核酸の複製を作成する際に、標識されたヌクレオチド三リン酸を複製の原料として用いることによって生成する核酸ポリマー（オリゴマー）に取り込ませて標識することにある。標識の種類としてはＲＩ（放射性同位元素）、蛍光色素などの直接的な標識法や、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの間接的な標識法が知られている。ＲＩ標識の場合には放射線の検出、蛍光色素標識の場合には蛍光検出、ビオチンやジゴキシゲニンの場合には蛍光や化学発光などで検出できるように適宜処理を施したのちに検出を行い、それぞれ高感度で検出できるように検出システムが設計される。
【０００７】
しかし、これら標識法に基づくハイブリッドの検出に関しては、主に２つの問題点が指摘されている。１つは標識の際に用いられる核酸を複製する手法、すなわちＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）やＲＴ（逆転写）反応において、オリジナルの核酸混合物の量的な相対関係が複製物に正確には反映されない可能性があることである。もう１つは、ＲＩ標識法を除いて、複製された遺伝子核酸は標識用化合物が結合するために、正確には複製ということができない別の化学種となってしまうことである。この点についての具体的な問題点としては、ハイブリダイゼーションの効率低下（量的低下）、及びプローブ核酸と試料核酸の認識性低下に基づく誤認識（情報の質的低下）があるとされており、標識法の根本的な問題になる可能性がある。
【０００８】
上述のように標識法は本質的な問題を有している。このため、これら問題点の解決可能な方法として、標識を行わずに、すなわち非標識でハイブリッド２本鎖核酸を検出する方法が提案されている。特開平５−１９９８９８号公報には、電極上にハイブリッドを形成させ、電気化学的に活性な化学種で修飾したインターカレーターを用いてハイブリッドの形成を検出する方法が記載されている。この方法によれば、ＤＮＡアレイ法においてハイブリダイゼーションによって形成されたハイブリッド２本鎖を標識することなしに検出することができることから、この方法は標識法が持つ問題を解決可能な方法であると考えられる。もっとも、この方法は検出のための装置の小型化が可能であるなどいくつかの利点はあるものの、電気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に固定化する必要があり、同時多数の検出を行うためには多数の電極を平面上に作成し、かつそれぞれにプローブ核酸を固定化する必要があり、検出方法として越えるべき障害が多い。また、シグナル／バックグラウンド比においてもハイブリッドと非ハイブリッド（プローブ１本鎖）の識別性が必ずしも十分とは言えず、定量的な検出を行うことは困難である。
【０００９】
他の方法として、多重鎖核酸との相互作用によって蛍光強度が増大する蛍光色素を用いる方法も考えられる。プローブ核酸（１本鎖）との相互作用では蛍光強度が小さく、ハイブリダイゼーションにより形成された多重鎖との相互作用により蛍光強度が著しく増大する色素が存在すれば、標識することなくハイブリッド２本鎖が検出可能になると考えられる。モレキュラー・プローブス社より商品名 PicoGreenとして市販されている色素は２本鎖核酸が定量できるとされているが、１本鎖核酸が存在した場合にも少なからぬ蛍光を発するため高いシグナル／バックグラウンド比は期待できない。
【００１０】
微量成分検出法では、一般的にプローブは検出対象物に対して過剰に使用されるため、非標識でハイブリッド２本鎖核酸を検出するためには、過剰に存在するプローブ１本鎖核酸とハイブリダイゼーションによって形成された２本鎖核酸を厳密に識別可能な方法が必要となるが、これまでそのようなものは知られていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は多重鎖核酸との相互作用によって、１本鎖と区別して高いシグナルを発する化合物を提供することであり、さらにこのような化合物を用いて多重鎖核酸を測定する方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意研究を行った結果、１本鎖核酸と多重鎖核酸を厳密に区別するためには、単に１本鎖核酸と多重鎖核酸に対する親和性を制御して、多重鎖核酸にのみ結合し、かつ検出可能なシグナルを発するように設計することは極めて難しい課題であると考えるに至った。そして、既知の方法とはまったく別の発想に基づいて、本発明者らは以下の方法を考え出した。すなわち、たとえ１本鎖核酸と多重鎖核酸のそれぞれに対する結合の差は大きくなくても、１本鎖核酸のみが存在している状態（多重鎖核酸が存在しない場合）では実質的に無色であり、多重鎖核酸が存在する場合に有色へと変化し、かつ蛍光を発する化合物を用いれば、１本鎖核酸の場合には光吸収が起こらないため蛍光は観測されず、一方、多重鎖核酸が存在する場合には光吸収が起こり、蛍光が観測可能となる。本発明者らは上記の方法を検証し、この方法が多重鎖核酸の測定方法として極めて優れた方法であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質；
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である方法も提供される。
【００１５】
上記発明の好ましい態様によれば、多重鎖核酸と相互作用可能な上記化合物が下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）で表される化合物からなる群：
【化４】
0003899372.tif 000002
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は互いに結合して環を形成してもよく；Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ(Ｒ24)−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を示し（Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい）；Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示すが、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｇ、又はＶ2と結合して環を形成してもよく；Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ10、−ＳＲ11、又は−Ｎ(Ｒ12)(Ｒ13)を示すが、Ｒ7とＲ8、Ｒ8とＲ9、及びＲ7とＲ9は互いに結合して環を形成してもよく（Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を表すが、Ｒ12とＲ13は互いに結合して環を形成してもよい）；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し、ｎが２以上の場合にはそれぞれのＲ8又はそれぞれのＲ9は同一でも異なっていてもよく；Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立に−Ｃ(Ｒ5)＝又は窒素原子を示し；ｍは０又は１を示し；Ｇは５又は６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を示すが、形成された上記５又は６員環含窒素ヘテロ環はさらに縮合環を有していてもよく；Ｒ5は水素原子又は置換基を示す）
から選ばれる上記方法が提供される。
【００１６】
また、別の好ましい態様によれば、多重鎖核酸と相互作用可能な上記化合物が下記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）で表される化合物からなる群：
【化５】
0003899372.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｑ、及びｎは上記と同義であり、Ｒ6はＲ1、Ｒ3、Ｒ15、又はＲ17と結合して環を形成してもよく；Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を示すが、Ｒ14とＲ15及びＲ16とＲ17は互いに結合して５ないし８員の環を形成してもよい）
から選ばれる上記の方法も提供される。
【００１７】
さらに、本発明により、多重鎖核酸の光学的測定方法であって、
(1)下記一般式（Ｉ）における化合物（Ｂ）を多重鎖核酸と接触させる工程、及び
(2)化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成した化合物（Ｃ）の蛍光を測定する工程
【化６】
0003899372.tif 000004
（式中、双方向の矢印は化学平衡を示し；
化合物（Ａ）は実質的に無蛍光性の化合物を示し；
化合物（Ｂ）は、少なくとも１つの条件下では、実質的に無蛍光性であり、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有さない化合物を示し；
化合物（Ｃ）は、上記の条件下において、化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成し、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有し、かつ上記相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物を示し；
Ｘは−Ｃ（Ｒ）＝Ｙに結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；ＹはＸ−Ｃ（Ｒ）＝と結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；Ｒは水素原子又は置換基を示し、Ｘ及び／又はＹと結合して環を形成してもよく；Ｙ’は化合物（Ａ）におけるＣ＝Ｙの二重結合がプロトン化されるように電子の移動を起こした結果として標記される残基を示し；Ｚは酸ＨＺの共役塩基を示し、Ｘ、Ｙ（若しくはＹ’）、又はＲに結合していてもよい）
を含む方法が提供される。
【００１８】
この発明の好ましい態様によれば、化合物（Ａ）が上記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）で表される化合物からなる群から選ばれる上記方法；化合物（Ａ）が上記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれる上記方法が提供される。
【００１９】
これらの発明の好ましい態様によれば、溶液状態の多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む上記の方法、及び固相担体上に固定された多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む上記の方法が提供される。
【００２０】
さらに別の観点からは、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定するための試薬であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である試薬が提供される。
【００２１】
また、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定するための試薬であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を含み、該化合物が下記の性質；
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である試薬が提供される。
これらの試薬に含まれる化合物の好ましい例として、上記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）からなる群から選ばれる化合物、又は上記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物であることを特徴としている。
【００２３】
本明細書において、「無色」とは４００〜１０００ｎｍ（本明細書において「〜」で表される数値範囲は特に言及しない場合には上限及び下限を含む範囲である）における最大分子吸光係数が０〜８０００未満、好ましくは０〜５０００未満であり、最も好ましくは０〜３０００未満である。また、有色とは４００〜１０００ｎｍにおける最大分子吸光係数が２００００以上、好ましくは３００００以上であり、最も好ましくは４００００以上である。無色状態から有色状態への分子吸光係数の変化率としては５倍以上、好ましくは７倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。
【００２４】
本明細書において、「相互作用可能」とは、上記化合物と多重鎖核酸とが親和性を有しており、可逆的な結合によりエネルギーの受け渡しなど何らかの物理化学的な相互作用を行うことができることを意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはらなず、最も広義に解釈する必要がある。「少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができる」とは、通常は溶液状態におけるｐＨや塩濃度などの条件が適宜選択された状態において、化合物が上記に定義された性質を有することを意味しており、その条件下以外における性質はいかなるものであってもよい。当業者は溶液のｐＨや塩濃度を通常の方法で適宜選択することにより、化合物が所望の性質を有するか否かを容易に判定することが可能である。
【００２５】
本明細書において、多重鎖核酸とは核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態をとることが知られており、本明細書における多重鎖核酸にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書における多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核酸」と呼ぶ。
【００２６】
本発明の方法に用いる上記の特徴を有する化合物としては、例えば、溶液状態でプロトン化されることによって実質的に無色化する性質を有する色素化合物を用いることができる。例えば、シアニン色素の中には水溶液中でプロトン化を受けて無色化するものがあり、例えば、ベンズイミダカルボシアニン色素類にはこのような性質を有するものが多く存在する。この現象はシアニン色素のメチン鎖炭素上にプロトン化が起こった結果として色素共役系が切断され、無色化したものと考えられる。この場合、シアニン色素は系のプロトン濃度に依存して本来の色素の状態とプロトン化され無色化した状態の平衡にあるものと考えられる。
【００２７】
本発明の方法に好適に用いられる化合物は多重鎖核酸と相互作用可能な色素化合物であって、以下の特徴を有する化合物である。
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する。
【００２８】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の好ましい態様の原理は、プロトン化により無色化した色素化合物が多重鎖核酸と相互作用し、多重鎖核酸から受け取った相互作用エネルギーによって本来の色素の状態（色素共役系の回復）へと平衡が移動して有色化すること、及び多重鎖核酸が存在しない場合には実質的に無色の状態が保持されることに基づいている。反応系内に１本鎖核酸が存在しても色素と一本鎖核酸との相互作用エネルギーは小さいために実質的に無色の状態が保持されるが、一方、色素と多重鎖核酸との相互作用は十分に大きく、無色化された色素は多重鎖核酸との相互作用により有色の色素へと変化する。その結果、色素に光吸収が起こり蛍光性を発現させることが可能になる。
【００２９】
本発明の好ましい態様として、下記の工程：
(1)下記一般式（Ｉ）における化合物（Ｂ）を多重鎖核酸と接触させる工程、及び
(2)化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成した化合物（Ｃ）の蛍光を測定する工程
を含む方法を例示することができる。
【化７】
0003899372.tif 000005
式中、双方向の矢印は化学平衡を示し；
化合物（Ａ）は実質的に無蛍光性の化合物を示し；
化合物（Ｂ）は、少なくとも１つの条件下では、実質的に無蛍光性であり、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有さない化合物を示し；
化合物（Ｃ）は、上記の条件下において、化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成し、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有し、かつ上記相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物を示し；
Ｘは−Ｃ（Ｒ）＝Ｙに結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；ＹはＸ−Ｃ（Ｒ）＝と結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；Ｒは水素原子又は置換基を示し、Ｘ及び／又はＹと結合して環を形成してもよく；Ｙ’は化合物（Ａ）におけるＣ＝Ｙの二重結合がプロトン化されるように電子の移動を起こした結果として標記される残基を示し；Ｚは酸ＨＺの共役塩基を示し、Ｘ、Ｙ（若しくはＹ’）、又はＲに結合していてもよい。
【００３０】
以下にＸ及びＹにより形成される好ましい基本骨格をそれぞれ（ＤＸ）、（ＤＹ）として列挙するが、本発明の方法に用いられる化合物の範囲はこれらの例に限定されない。（ＤＸ）及び（ＤＹ）で示した構造において、Ａはアルキル基、芳香族基、又は非共有電子対を表し、２つ以上のＡが存在する場合にはそれぞれが同一又は異なっていてもよい（式中、Ａがアルキル基又は芳香族基を表す場合には対イオンやイオン符号は省略して示した）。Ａ’及びＡ”はそれぞれアルキル基又は芳香族基を表す。ｋは０、１又は２の整数を表す。また、水素原子は置換基で置換されていてもよく、可能な場合には縮環構造を形成してもよい。
【００３１】
【化８】
0003899372.tif 000006
【００３２】
【化９】
0003899372.tif 000007
【００３３】
【化１０】
0003899372.tif 000008
【００３４】
【化１１】
0003899372.tif 000009
【００３５】
多重鎖核酸と相互作用可能な色素化合物であって、(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物は、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（Ｖ）で表される化合物の中から選択されることがより好ましい。
【化１２】
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式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が置換基を表す場合、好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基であり、これらの置換基はさらに置換されていてもよい。これらの置換基の総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ1とＲ2及びＲ2とＲ3が互いに結合して形成される環は５〜８員環が好ましく、非芳香族又は芳香族の環のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよい。
【００３６】
Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（Ｒ24）−、又は−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−を表す。Ｒ24及びＲ25はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ24とＲ25は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい。Ｒ24及びＲ25が示すアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては３〜５０が好ましく、３〜３５がより好ましく、３〜２５がさらに好ましい。Ｑとしては酸素原子又はイオウ原子が好ましく、イオウ原子が最も好ましい。Ｒ6はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては４〜５０が好ましく、４〜３５がより好ましく、４〜２５がさらに好ましい。Ｒ6は可能な場合にはＲ1、Ｒ3、Ｇ、又はＶ2と結合して環を形成してもよい。
【００３７】
Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ10、−ＳＲ11、又は−Ｎ(Ｒ12)(Ｒ13)を示す。Ｒ7とＲ8、Ｒ8とＲ9及びＲ7とＲ9は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9としては水素原子、アルキル基、又はアリール基が好ましく、水素原子又はアルキル基がより好ましい。Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9が水素原子以外の場合はこれらの基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜３５が好ましく、１〜２５がより好ましく、１〜２０がさらに好ましい。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ12とＲ13は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13が示すこれらの基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては４〜５０が好ましく、４〜３５がより好ましく、４〜２５がさらに好ましい。
【００３８】
ｎは０、１、２又は３の整数を表す。ｎが２以上のときには、繰り返し単位におけるそれぞれのＲ8又はそれぞれのＲ9は同一又は異なっていてもよい。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立に−ＣＲ5＝又は窒素原子を表し、ｍは０又は１を表す。Ｇは５又は６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を表すが、該ヘテロ環はさらに縮合環を有していてもよい。形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ5は水素原子又は置換基を表すが、Ｒ5が置換基の場合には置換基の例としてはＲ1、Ｒ2、及びＲ3の例として挙げたものが好ましく、この置換基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。
【００３９】
上記の化合物には、核酸との相互作用を強めるためにいずれかの置換基中に１個以上のカチオン性基を有することが好ましい。「カチオン性基」の用語は、カチオンの他にプロトン化によってカチオンになりうるものを含む概念として用いる。カチオン性基の例としては、スルホニウム基、ホスホニウム基、アミノ基、又はアンモニウム基を挙げることができ、アミノ基又はアンモニウム基が最も好ましい。結合位置として好ましいのは、一般式（ＶＩ）ないし（ＩＸ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、又はＲ6である。
【００４０】
多重鎖核酸との接触によって蛍光性を発現する化合物の好ましい例として、下記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）で表される化合物を挙げることができる。
【００４１】
【化１３】
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【００４２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｑ、及びｎは一般式（ＩＩ）〜（Ｖ）のものと同義である。Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を表す。これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ14とＲ15及びＲ16とＲ17は互いに結合して５〜８員の環を形成してもよい。形成される環は非芳香族又は芳香族のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよいが、芳香族環であることがより好ましい。
【００４３】
以下、本発明の方法に好適に用いられる化合物の具体例を挙げるが、本発明の方法はこれらの化合物を用いる場合に限定されることはない。
【００４４】
【化１４】
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【００４５】
【化１５】
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【００４６】
【化１６】
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【００４７】
【化１７】
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【００４８】
【化１８】
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【００４９】
【化１９】
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【００５０】
【化２０】
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【００５１】
上記化合物は一般にシアニン色素の中の色素塩基として分類されるが、当業界においては一般的な合成法が既知であり、当業者が容易に合成することができる。例えば、米国特許第５，６５６，４４９号、同第５，６５８、７５１号に記載されている方法が好ましく適用可能である。例えば、一般式（ＶＩ）ないし（ＩＸ）で表される化合物においてｎが０であるか１以上であるかによって下記に説明する合成法を採用することにより目的物を容易に製造することが可能である。
【００５２】
＜ｎ＝０の場合＞
メソッド１の目的物は一般式（ＶＩＩ）に相当するものであり、一般式（ＩＸ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応はジクロロメタンやジメチルホルムアミドなどの非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンなどの塩基を用いて行うことができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００５３】
メソッド２の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｌは離脱可能な基を表し、ハロゲン原子、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基などが好ましく用いられるが、一般的にはアルキルチオ基が用いられる。色素化の反応は米国特許第５，６５６，４４９号に具体的な例が示されているように、ｐ−トルエンスルホン酸などの酸を触媒として用い、ジメチルホルムアミドなどの非プロトン性極性溶媒中、無水酢酸を作用させて合成することができる。
【００５４】
【化２１】
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Ｑ＝イオウ原子の場合には、色素の原料となる２−アルキルチオチアゾロピリジン類を合成するために、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するチアゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることができる。チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するためには、２−アミノピリジン類を原料とする以下に挙げた二つの合成ルートを適宜選択することが可能である。
【００５５】
第一の方法として、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類を１−メチル−２−ピロリドン中、エチルキサントゲン酸カリウムと加熱条件下（１６０〜１７０℃）にて反応させることでチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。またヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、ピリジン−２−オン類を原料として用い、これを位置選択的に臭素化した後、オキシ塩化リン、アンモニア水を続けて反応させることにより２−アミノ−３−ブロモピリジン類を合成することも可能である。
【００５６】
第二の方法では、ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、１９６７年、１２６頁に記載されているように、まず２−アミノピリジン類に対し、臭素の存在下、チオシアン酸カリウムを反応させることにより２−アミノチアゾロピリジン類を合成する。得られた２−アミノチアゾロピリジン類を常法に従い亜硝酸ナトリウムを作用させてジアゾニウム塩とした後、塩化銅（Ｉ）と反応させることで対応する２−クロロチアゾロピリジンを合成する。さらに２−クロロチアゾロピリジンに対しチオ尿素を反応させ、加水分解することにより目的とするチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。
【００５７】
チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するための以上の方法は、いずれもアミノピリジン類又はピリジン−２−オン類を原料として用いることができるが、それらに限定されることはなく、アミノキノリン類（具体例としてはケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１９５９年、８６９頁に記載）やアミノイソキノリン類（具体例としてはカナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can. J. Chem.）、１９６６年、２４６５頁に記載）、その他のヘテロ原子を含む縮環系化合物（具体例としてはジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９５年、２５４６頁に記載）へも適用可能である。以上の合成工程の出発原料である２−アミノピリジン類のＲ1、Ｒ2、Ｒ3には種々の置換基を導入することが可能であり、これにより本発明の方法に使用可能な化合物の製造中間体であるチアゾロピリジン−２−チオンへと誘導することができる。
【００５８】
アミノピリジン類の類縁体については、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類は市販の試薬も数多くあるが、アミノピリジン類をハロゲン化することで容易に合成することができる。アミノピリジン類の臭素化はシンセシス（Synthesis）、２００１年、２１７５頁に詳しく述べられており、２−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体、３−アミノ体からは２−ブロモ及び２，６−ジブロモ体、４−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体をそれぞれ反応条件を変えることにより選択的に合成可能である。２−アミノピリジンの塩素化では文献（Zh. Russ. Fiz.-Khim. O-va、１９２８年、６８５頁）に記載のように、塩素を作用させることにより３−クロロ体及び３,５−ジクロロ体が得られる。２−アミノピリジンのヨウ素化では、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、１９９３年、７４９３頁に記載されているようにヨウ素及び過ヨウ素酸を作用させることにより、５−ヨード体が得られる。
【００５９】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のいずれかがハロゲンの場合、置換反応によってさらに誘導体へと変換することができる。Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3が塩素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９８２年、２０２５頁に記載のように、ナトリウムメトキシドと反応させることによりメトキシ基へと変換できる。また、Recl. Trav. Chim. Pays-Bas、１９５６年、１１８７頁に記載のように、ナトリウムエトキシドと反応させることによりエトキシ基へと変換できる。Org. Prep. Proced. Int.、１９９７年、１１７頁に記載のように、３規定水酸化ナトリウム水溶液と反応させることにより水酸基へと変換できる。
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3が臭素原子の場合、Bull. Chim. Soc. Fr.、１９９５年、２９０頁に記載のように、ｔ−ブトキシカリウム及びヨウ化カリウムの存在下、２−メルカプトピリジンと反応させることにより２−ピリジルチオ基へと変換できる。Chem.Zentralbl.、１９３６年、１２１９頁に記載のように、硫酸銅の存在下、メチルアミンと反応させることによりメチルアミノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリー（J. Organomet. Chem.）、１９９５年、２５９頁に記載のように、パラジウム触媒の存在下、ビニンルベンゼンと反応させることにより２−アミノ−５−スチリルピリジンへと変換することができる。
【００６０】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がヨウ素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、メタンチオールと反応させることによりメチルチオ基へと変換できる。また、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、プロパンチオールと反応させることによりプロピルチオ基へと変換できる。ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９４４年、１４７９頁に記載のように、シアン化銅と反応させることによりシアノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９７年、３１０９頁に記載のように、ナトリウム及び銅の存在下、メタノールと反応させることによりメトキシ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８１年、１５１８頁に記載のように、ナトリウムエチキシド及び銅の存在下、１−プロパノールと反応させることにより１−プロポキシ基へと変換することができる。
【００６１】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がハロゲンの場合は、遷移金属触媒を用いるカップリング反応を利用することによりさらに広い範囲の置換基へと変換することができる。例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９８７年、２７１１頁にあるように、パラジウム触媒を用いる２−アミノ−５−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができる。また、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、２０００年、６７５頁に記載のようにパラジウム触媒を用いる２−アミノ−６−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができ、またジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９９５年、１２４１６頁にあるように２−アミノ−６−ブロモピリジンとアセチレン類とをパラジウム触媒及び銅試薬の存在下で反応させることにより、対応するアセチレン誘導体を得ることができる。
【００６２】
２−アミノピリジン類への他の官能基導入法としては、２−アミノピリジンを混酸によってニトロ化すると、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９５５年、３１５４頁に記載のようにニトロ基が導入された２−アミノ−５−ニトロピリジンが得られる。２−アミノピリジンを発煙硫酸又は硫酸/三酸化硫黄で処理すると、(Bull. Soc. Chim. Fr.)、１９３９年、７３６頁に記載のようにスルホ基が導入された６−アミノ−ピリジン−３−スルホン酸が得られる。２−アミノピリジンに塩化ベンジルを作用させると、ポリッシュ・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Pol. J. Chem.）、１９８４年、９５９頁に記載のように２−アミノ−５−ベンジルピリジンが得られる。
【００６３】
Ｒ1、Ｒ2、又はＲ3がカルボキシル基である場合には、ヘテロ環基へと変換することも可能であり、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９６年、３３７５頁にあるように６−アミノ−ニコチン酸と２−アミノ−ベンゼンチオールとを反応させることにより２−（２−アミノピリジン−５−イル）ベンゾチアゾールが得られる。他のヘテロ環が結合した２−アミノピリジン誘導体としては、３,４'−ビピリジン−６−アミン（Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈ, Ｒ2＝４−ピリジル）は米国特許第４，２７６，２９３号に合成法が記載されている。２−エチル [３,４−ビピリジン]−６−アミン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝４−ピリジル、Ｒ3＝エチル）は米国特許第４，３１３、９５１号に合成法が記載されている。
【００６４】
ピリジン−２−オン類への置換基導入法も種々知られている。ピリジン−２−オン類は置換基が導入された後にピリジン−２−オン類を２−アミノピリジン類へと容易に変換可能なことから本発明の方法に使用可能な化合物を合成する上で重要である。ピリジン−２−オンとベンゾフェノン類を反応させるとカルボニル基に対する付加反応が進行し、テトラヘドロン（Tetrahedron）、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1が３級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンにアリールアルデヒド類を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ1が２級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンに二酸化炭素を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がカルボキシル基となる。ピリジン−２−オンにフェニルイソシアナートを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がアニリド基となる。ピリジン−２−オンにフェニルアセチルクロリドを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ1がフェニルアセチル基となる。ピリジン−２−オンにヨウ化メチルを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ1がメチル基となる。ピリジン−２−オンにペルオキソ二硫酸カリウムを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９９０年、２８９１頁に記載のようにＲ2が水酸基となる。ピリジン−２−オンに臭化ベンジルを反応させると、ケミストリー・レターズ（Chem. Lett.）、１９９６年、３３３頁に記載のようにＲ2がベンジル基となる。
【００６５】
上記にはピリジン環に対してチアゾール環を閉環する手法を説明したが、チアゾール環を先に構築してから後にピリジン環を形成させる合成ルートも可能であり、以下に示すようにさらに多様な誘導体が合成できる。シアノイミドジチオカルボン酸２カリウムは多くの２−アルキルチオ−４−アミノチアゾール類を与える共通中間体であり、これを増炭させることによりチアゾロピリジン類へと誘導することができる。例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９８４年、１３６１頁に記載されている下記合成ルートにより７−ヒドロキシ−２−メチルチオチアゾロ[４,５−ｂ]ピリジン−６−カルボン酸エステルが得られる。さらに同種の反応を利用することによって、文献（J. Prakt. Chem.、１９７９年、２６０頁）に記載のように７−ヒドロキシチアゾロ[４,５−ｂ]ピリドン類が合成できる。
【００６６】
また、同様にチアゾール環から構築する手法として、アミノアセトニトリルを原料に用い、２−メチルチオチアゾロ[５,４−ｂ]ピリジン類を得ることができる。具体的にはジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）に記載の合成ルートが挙げられる。その他にも、縮環系化合物としてチアゾロナフチリジン骨格を以下のように合成できる。中間体である１，６−ナフチリジノン類の合成はジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９９０年、２０８５頁に記載されており、それらからチアゾロナフチリジン類への誘導はヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に詳しく記載されている。
【００６７】
Ｑが酸素原子の場合、基本的には３位に水酸基を有する２−アミノピリジンを二硫化炭素やチオホスゲン、あるいはキサントゲン酸カリウムを作用させてオキサゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様にアルキル化試薬により２位に結合するイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。２−アルキルチオ−オキサゾロピリジン類は、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するオキサゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることにより容易に得られる。  オキサゾロピリジン−２−チオン類を合成するためには、まず３−ヒドロキシピリジン類を混酸によってニトロ化し、続いて得られたニトロ体を還元して２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類を合成する。これらの工程については、例えばファーマシューィカル・ブレティン（Pharm. Bull.）に記載のものが知られている。さらに２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類をケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８１年、４４１頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、エタノール中、エチルキサントゲン酸カリウムを作用させることにより、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。あるいは、ファーマシューティカル・ブレティン（Pharm.Bull.）、１９５７年、４６２５頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、水酸化カリウムの含水メタノール溶液中、二硫化炭素を作用させることによっても、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。
【００６８】
３−ヒドロキシピリジン類のニトロ化には以下の合成例が知られている。３−ヒドロキシ−４−メチルピリジンのニトロ化については、例えばヘテロサイクルズ(Hetereoctcles.)、１９９４年、５２９頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−５−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−６−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。また４−ヒドロシキイソキノリンも同様にニトロ化することができ、例えばケミカル・ファーマシューティカル・ブレティン（Chem. Pharm. Bull.）、１９５９年、５０１頁に記載のものが知られている。
【００６９】
３−ヒドロキシピリジン類にアミノ基を導入する方法としては、上述のニトロ基の還元以外にも以下に挙げる手法が知られている。３−ヒドロキシ−２−ヨードピリジン類に硫酸銅の存在下でアンモニアを作用させる方法としては、（Rocz. Chem.）、１９３６年、５０２頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン類にナトリウムアミドを作用させる方法としては、文献（Zh. Prikl. Khim.、１９４９年、１１０３頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸アミドに次亜臭素酸ナトリウムを作用させる方法として文献（Biochem. J.、１９５０年、５０６頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−２−フェニルアゾピリジン類にハイドロサルファイトナトリウムを作用させる方法としては、文献（Prace. Minist. Prizem. Chem.、１９５２年、１４頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−２−クロロピリジン類にヒドラジン水和物を作用させる方法としては、ジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９４年、２４８頁に記載のものが知られている。
【００７０】
Ｑが−Ｎ（Ｒ24）−の場合には、基本的には３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を二硫化炭素やチオホスゲンを用いてイミダゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様に２位のイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を得るには、上記Ｑ＝イオウ原子の場合の置換基導入法が参考にできる。Ｑが−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−の場合には、まずピロリノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−オン骨格を合成したのちに、３位にＲ24及びＲ25に相当する基を導入してジ置換体とし、さらにローソン試薬などを用いて２位のラクタム酸素原子をイオウ原子に変換することにより、合成することができる。
【００７１】
ｎ≧１の場合の合成方法に関して、メソッド３及びメソッド４の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。メソッド３及び４はいずれの方法も好ましく用いることができ、合成中間体や生成色素の収率や精製のしやすさやに応じて適宜選択することができる。ｎ＝０の場合と異なるのは、原料として用いられるアゾロピリジン類の２位がメチル基になっている点である。２−メチル体の合成法については後述する。
【００７２】
【化２２】
0003899372.tif 000020
【００７３】
ｎ≧１の場合のメチン炭素鎖伸長は、ｎ＝１のときはＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンを、ｎ≧２の場合にはメチン炭素鎖数に応じてビニル基を追加したビニローグ体を用い、無水酢酸などの酸無水物を作用させて行うことができる。反応温度は室温〜１８０℃程度を選択することができ、溶媒としては無水酢酸等の酸無水物を溶媒にすることができるが、種々の非プロトン性溶媒も好ましく用いることができる。これらの反応は当業界においては極めて一般的な方法である。
【００７４】
色素化の反応はプロトン性、非プロトン性の溶媒を用いることができ、単に加熱することによっても色素化が進行する場合もある。好ましくは非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンやピリジン類などの塩基を用いて行うことができ、反応温度は室温から１２０℃程度が好ましい。この反応も当業界において極めて一般的な反応であり、上記以外にも種々の反応条件を用いることができる。
【００７５】
式中Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００７６】
メソッド５及びメソッド６の目的物は一般式（ＶＩＩ）に相当するものであり、一般式（ＩＸ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。ここに示した反応は基本的にはメソッド３とメソッド４と同じである。
【００７７】
【化２３】
0003899372.tif 000021
２−メチルアゾロピリジン類の合成については、Ｑが酸素原子又は−Ｎ(Ｒ２４)−の場合には、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムを用いてアゾロピリジン−２−チオンへと変換する反応の際に、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムの変わりに無水酢酸を用いて加熱する方法、オルト酢酸トリエチルなどのオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱することによって合成することができる。この場合、反応温度は１００〜１７０℃が好ましく、通常、反応試剤を溶媒として用いて行うことが好ましい。
【００７８】
Ｑがイオウ原子の場合にはｎ＝０のときの合成法で述べた中間体、２−アミノ−３−ハロピリジン類をオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱して２−アセチルアミノ−３−ハロピリジン類へと変換し、さらに５硫化リンやＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬などを用いて２−チオアセチルアミノ−３−ハロピリジン類としたのち、水素化ナトリウムやｔ−ブトキシカリウムなどの強塩基を作用させて２−メチルチアゾロピリジン類を得ることができる。強塩基を作用させる場合の溶媒はジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒などを用いることができる。Ｑが−Ｃ(Ｒ24)(Ｒ25)−の場合には、特開２００１−２７０８６４号やケミカル・レビュー（Chem. Rev.）６３巻、３７３頁（１９６３年）に記載のフィッシャーのインドール合成反応として知られる反応を利用して合成することができる。
【００７９】
含窒素６員環がピリジン環である化合物については非常に多くの合成法が知られているので、当業者は種々の文献を参照しつつ合成が可能である。また、極めて多くの化合物が市販されており容易に入手可能である。含窒素６員環がキノリン環である場合、合成原料となる４−メチルキノリン（レピジン）類と２−メチルキノリン（キナルジン）類について以下に合成法を示す。レピジン類については市販されている２−クロロレピジンと適当な求核剤とを反応させることにより、レピジンの２位に適当な置換基を導入することができる。２−クロロレピジンに１級アミン、２級アミン、環状アミン、アルコール、チオール、チオ尿素、及びフッ化物などを反応させた例が知られている。
【００８０】
１級アミンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、２３２２頁に記載のものがある。２級アミンとの反応では、例えば薬学雑誌（Yakugaku Zasshi）、１９４９年、１３７頁に記載のものがある。環状アミンとの反応では、例えばシンセティック・コミュニケーション（Synth. Commun.）、２０００年、４４７９頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９４９年、７７１頁に記載のものが知られている。アルコールとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８６年、１０２頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５１年、１５２９頁に記載のものが知られている。チオールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４８年、４９１頁に記載のものがある。チオ尿素との反応では、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１９２９年、２７３２頁に記載のものが知られている。フッ化物との反応では、例えばフッ化カリウムとの反応が（J. Chem. Res. Synop.）、１９９８年、５８６頁に記載されており、またテトラブチルアンモニウムフルオリドとの反応が（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載されている。また、パラジウム触媒を用いた２−クロロレピジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することも可能であり、例えばテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。
【００８１】
アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの２位に置換基を導入することも可能である。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８７年、７頁に記載のものが知られている。４−メチル−２−フェニルキノリンの合成としては、例えば（J. Prakt. Chem.）、１９２５年、７３頁に記載のものが知られている。
【００８２】
３位に適当な置換基を有するレピジン類の合成については、３位が塩素もしくは臭素の場合は、ともに３−メチルインドールを原料に用いて合成することができる。塩素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２５２頁に記載のものが知られている。臭素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２６１３頁に記載のものが知られている。上記で得られたハロゲン体はさらに他の置換基への変換が可能である。例えばパラジウム触媒及び塩基の存在下、フェニルホウ酸とカップリングさせることによりアリール化体が合成できる。具体例としてはテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。また、アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの３位に置換基を導入することも可能である。具体例を以下に示す。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、２７８２頁に記載のものが知られている。
【００８３】
６位に適当な置換基を有するレピジン類は、パラ置換アニリン類と３−ブテン−２−オン類もしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。４−フルオロアニリンとの反応では、例えば文献（Mutat. Res.、２０００年、１７３頁）に記載のものが知られている。４−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。４−ブロモアニリンとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。４−メトキシアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４５年、８６頁に記載のものが知られている。４−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９２０年、２３９７頁に記載のものが知られている。４−ジメチルアミノアニリンとの反応では、例えば文献（Bull. Chim. Soc. Fr.、１９２０年、４３４頁）に記載のものが知られている。４−ニトロアニリンとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。４−ベンゾチアゾ−２−イル−アニリンとの反応では、例えば文献（Sog. Prog. Chem.、１９７７年、６２頁）に記載のものが知られている。４−ベンゾヂフェニルホスホノイルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８２年、３１５頁に記載のものが知られている。４−アセチルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。４−ジエチルスルファミドアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。
【００８４】
以上の反応で得られるキノリン類をさらに変換することも可能である。６−ブロモ−４−メチルキノリンはパラジウム触媒及び塩基の存在下でホスホン酸ジエステルとのカップリング反応を行うことでホスホン酸誘導体が得られる。具体的には文献（Zh. Obshch. Khim.、１９８６年、２５０３頁）に記載のものが知られている。６−アミノ−４−メチルキノリンを合成するためには、４−ニトロアニリンを原料に用いて合成した４−メチル−６−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。
【００８５】
４−メチル−キノリン−６−カルボン酸を合成するためには、４−メチルアニリンを原料に用いて合成した４,６−ジメチルアニリンを酸化すればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２２６５頁に記載のものが知られている。６−（２−ベンゾオオキサゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノフェノールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。同様に６−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノベンゼンチオールを反応させ、４−メチル−６−（２−オキサゾロ[４,５−ｂ]ピリジル）−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノ−３−ヒドロキシピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｂ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２,３−ジアミノ−ピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に３,４−ジアミノ−ピリジンを反応させればよく、これらもすべてジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。４−メチル−キノリン−６−スルホン酸を合成するためには、４−メチルキノリンを硫酸と反応させればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２６８０頁に記載のものが知られている。
【００８６】
７位に適当な置換基を有するレピジン類は、メタ置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。３−フルオロアニリンとの反応では、例えば（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載のものが知られている。３−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１８５１頁に記載のものが知られている。３−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。３−アミノフェノールとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。
【００８７】
８位に適当な置換基を有するレピジン類は、オルト置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。２−メトキシアニリンとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られている。o−トルイジンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。２−アミノフェノールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、３９８６頁に記載のものが知られている。２−ニトロアニリンとの反応では、例えば日本化学雑誌、１９５８年、４０８頁に記載のものが知られている。またレピジンを混酸で処理することによっても４−メチル−８−ニトロキノリンが得られ、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４７年、３８０頁に記載のものが知られている。２−エチルアニリンとの反応では、例えばテロラヘドロン・アシンメトリー（Tetrahedron Asymmetry）、１９９５年、４１９頁に記載のものが知られている。２−アミノ安息香酸エチルとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られており４−メチルキノリン−８−カルボン酸が得られる。４−メチルキノリン−８−カルボン酸は、８位のカルボキシル基をさらに変換することが可能であり、８−（２−ベンゾオキサゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノフェノールを反応させ、また８−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノベンゼンチオールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７９年、１５７９頁に記載のものが知られている。４−メチル−８−アミノキノリンを合成するためには、４−メチル−８−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１５２４頁に記載のものが知られている。以上の説明はレピジンのモノ置換体の合成について記載したが、より多置換のものを望む場合は、これらの反応を組み合わせることで目的物を合成することができる。
【００８８】
本発明の方法の代表的な実施形態としては以下の（１）及び（２）の２つが挙げられる。
（１）溶液中の多重鎖核酸の測定を行う。
（２）ＤＮＡアレイ形態において、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定を行う。
本明細書において「測定」という用語は、検出及び定量などを含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。上記のうち、溶液中の多重鎖核酸核酸の検出及び定量を行う態様は、単に試料溶液中の多重鎖核酸の測定を行う用途の他に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）で代表される核酸増幅法を用いた試料核酸中の標的核酸配列測定方法としても極めて有効であり、本発明の光学的測定方法を好ましく適用できる。
【００８９】
溶液中の多重鎖核酸を測定する場合に、上記の化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０-10モル／Ｌないし１×１０-3モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０-9モル／Ｌないし１×１０-4モル／Ｌであり、５×１０-8モル／Ｌないし１×１０-5モル／Ｌが最も好ましい。多重鎖核酸と上記化合物を接触させためには、一般的には、試料核酸の溶液と本発明の化合物の溶液を混合すればよいが、試料核酸の溶液に上記化合物を固体として添加してもよいし、他の媒体に本発明の化合物を吸着させて試料核酸溶液に混合してもよい。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的な測定を行う際に、検出用セルを光学的測定を行いながら多重鎖核酸と接触させてもよいし、多重鎖核酸と接触させた後に光学的な検出を行ってもよい。好ましくは多重鎖核酸と上記化合物を接触させた後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を行うことが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を行うことが好ましい。
【００９０】
測定を行う際の溶液のｐＨは２．０ないし１０．０が好ましく、３．０ないし９．０がより好ましく、４．０ないし８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましい。緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。プロトン化により無色化する化合物を測定に用いる場合には、プロトン化が生じるｐＨ以下に調整することが好ましい。測定を行う際の溶液は水溶液が好ましく用いられるが、さらにメタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン又はジエチレングリコールなどのアルコール類やジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド又はスルホランなどの水混和性溶媒も混合して用いることができる。
【００９１】
光学的測定は蛍光検出法が感度の点で好ましい。通常は蛍光光度計で測定することができ、溶液に励起光を通過させて直角方向から蛍光を測定する方法を用いることが好ましいが、反射光を測定するような方法を用いてもよい。また、試料溶液を固相担体上に展開又はスポットしたのちに、乾燥して、あるいは乾燥せずに蛍光レーザースキャナーやＣＣＤ（電荷結合素子）などで測定する方法を採用してもよい。また、測定は１試料ごとに行ってもよいし、９６穴や３８４穴マイクロプレートなどを用いて多数の試料を同時に測定してもよい。
【００９２】
上記（２）のＤＮＡアレイ形態においては、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定に本発明の方法を好ましく適用することができる。この場合、プローブ核酸は溶液中に存在していてもよいが、固相担体に固定されている方が好ましい。固相担体としては、その表面に凹凸を有する平面性の低いものであってもよい。固相担体の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース類、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを拳げることができる。また、形状としては平板状、球状、ファイバー状、又は棒状等を例示することができるが、特に限定されることはない。固相担体の大きさも特に限定されず、ｎｍオーダーのものからｃｍオーダーのものであってもよい。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２〜５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。平板プレート状の場合、固相担体の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００９３】
固相担体上へのプローブ核酸の固定化法は、核酸断片の種類及び基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いることができる。結合をより強固にするために紫外線を照射する方法も用いることができる。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性の高分子等を含ませることも可能であり、このような処理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処理を行うことによって、疎水性、あるいは親水性に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進することができる。基板としては、表面処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを用いることが好ましい。
【００９４】
合成ヌクレオチドを固定する場合には、基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した基板に共有結合させる方法を用いることができる。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。特開２００１−２２８１５２号に記載の方法も好ましく用いることができる。基板としては、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラスやシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。基板上に固定される核酸断片は、後述する検出対象の試料核酸断片であってもよい。以下、基板に固定される核酸断片を塩基配列が既知の核酸断片とし、核酸分析素子に接触させる核酸断片を試料核酸断片として説明する。
【００９５】
ＤＮＡ断片の種類は目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２〜１００量体であることが好ましく、２０〜８０量体であることが特に好ましい。
【００９６】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド及び低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１03〜１０5の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度及び２５〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００９７】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００９８】
ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１０2〜１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１ｎＬ〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００９９】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、本発明の原理に基づく非標識核酸の光学的検出法である。
【０１００】
本発明の方法を行うにあたっては、他の核酸標織方法と併用して行うことができる。他の標識法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、本発明の方法はいずれの方法とも併用することができる。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【０１０１】
試料核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムの場合には、赤血球を除く任意の組織、サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。本発明の方法ではｍＲＮＡを直接検出することも可能であるが、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡを用いることもできる。この場合、ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡの量は液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、適切なプライマー存在下で標的領域のＰＣＲを行って得ることもできる。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションは、試料核酸断片を溶解あるいは分散させた水性液を上記で作製したＤＮＡチップ上に展開することによって行うことが好ましい。展開の量は特に限定されないが、通常は１〜１００μＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、例えば、室温〜７０℃の温度範囲で１〜２０時間の範囲で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ハイブリダイゼーションと同時に上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸と接触させて相互作用させる方法を採用する場合には、上記と同じような方法で洗浄を行ってもよいが、特に洗浄を行わずにそのまま光学的測定を行うことも可能であり、そのような態様は好まし方法である。
【０１０３】
ＤＮＡアレイを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【０１０４】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に対して接触させる時の溶媒は特に限定されないが、通常は水又は各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリンなどが好ましい。また、水又は緩衝液とこれらの有機溶媒とを混合して用いることも好ましい。本発明の多重鎖核酸の測定において、上記化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０-10モル／Ｌ〜１×１０-3モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０-9モル／Ｌ〜１×１０-4モル／Ｌであり、５×１０-8モル／Ｌ〜５×１０-5モル／Ｌが最も好ましい。
【０１０５】
ＤＮＡアレイを用いて上記化合物を多重鎖核酸と接触させる場合には、上記化合物の溶液をアレイ上に展開する方法が最も好ましく用いられるが、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡアレイを上記化合物の溶液に浸漬する方法も好ましく用いることができる。また、上記化合物をハイブリダイゼーション時に存在させる方法も採ることができる。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的測定を行う際に、好ましくは多重鎖核酸と接触後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を開始することが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を開始することが好ましい。
【０１０６】
光学的測定を行うときの上記化合物の溶液のｐＨは２．０〜１０．０が好ましく、３．０〜９．０がより好ましく、４．０〜８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましく、緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。
【０１０７】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に接触させた後は、過剰の化合物を除去するために洗浄を行ってもよい。この場合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で行うことができる。また、前述したように、本発明の方法では洗浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を省略することも好ましい。
【０１０８】
なお、光学的検出は溶液系で多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光度計を用いることもできるが、多数同時検出が可能な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行うことが好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイゼーション後の基板を乾燥させるか、あるいは水性溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよく、あるいは該基板を乾燥させないように基板をカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）法や蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよい。
【０１０９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［合成例１］色素（Ｄ−１）の合成
（１−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、 ６０巻、５７２１頁（１９９５年）に記載の方法を参考に合成を行った。１０ｇの２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン、２０ｇのキサントゲン酸カリウム、２００ｍＬのエタノールを混合し、１５時間還流した。こののち、溶媒を減圧留去し、残さを８０ｍＬの水に溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量１１ｇ
【０１１０】
（１−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
３．９ｇの原料（２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジン）をＤＭＦに溶解し、３．０ｇのｔ−ブトキシカリウムを添加した。ついで、２ｍＬのヨウ化メチルを加え、室温で３０分撹拌した。原料がほぼ消失したので、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して目的物を油状物として得た。この油状物を放置すると結晶化した。
（１−３）臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
１ｇの２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンに３ｇの３−ブロモプロピオン酸アミドを加え、１１０℃で１時間加熱後、冷却し、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。この操作を３回繰り返したのち、残さはそのまま次の反応に用いた。
【０１１１】
（１−４）１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナートの合成
１０ｇの４−メチルキノリン（レピジン）、１９．５ｇのパラトルエンスルホン酸メチルを混合し、１５０℃で１時間反応した。酢酸エチルを加えて撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄した。目的物は吸湿性であった。
（１−５）色素（Ｄ−１）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（１−４）で合成した１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナート４０ｍｇをジメチルホルムアミド４ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物はそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、黄色の成分を集めて目的物を得た。クロマトグラフィーによる精製を繰り返して目的物２ｍｇを得た。
【０１１２】
［合成例２］色素（Ｄ−２）の合成
（２−１）二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
５ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と１０ｇの４−メチルキノリンを混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１３】
（２−２）色素（Ｄ−２）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物に酢酸エチルを添加し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去したのち、残さをメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製を行い、短いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝２／１）で１回精製い、目的物４ｍｇを得た。
【０１１４】
［合成例３］色素（Ｄ−３）の合成
（３−１）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５００ｍｇに１，３−ジフェニルホルムアミジン２ｇを加え、無水酢酸１０ｍＬを添加して１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を３回繰り返し、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１５】
（３−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
（３−２−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７−アザ−２，３，３−トリメチルインドレニン）の合成
２００ｇの２−ヒドラジノピリジンと３００ｍＬのトルエンを混合し、２５０ｇの３−メチル−２−ブタノンをこれに加え、３０分間加熱還流を行った後、溶媒を完全に濃縮し、油状物を得た。この油状物に塩化亜鉛１０ｇを添加し、２１５℃に加熱して５時間反応を行った。冷却後、水４００ｍＬを添加し、クロロホルム３００ｍＬで４回抽出を行い、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残さを減圧蒸留（１１２−１３５℃／０．２ｍｍＨｇ）し、留出成分をヘキサン１．５リットルを用いて再結晶を行い、目的物を得た。収量７０．０ｇ、収率２３．８％
【０１１６】
（３−２−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（３−２−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル３ｇと混合し、９０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１７】
（３−３）色素（Ｄ−３）の合成
合成例（３−１）で合成した二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇと合成例（３−２）で合成した塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、無水酢酸０．５ｍＬを加えたのち、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し室温で２時間反応した。酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去した後、残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で精製し、青色の色素（Ｄ−３）の前駆体粗生成物を得た。この前駆体粗生成物に３％の臭化水素酸を加え、２時間８０℃で反応したのち、反応液を減圧留去した。残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝３／１）で１回精製い目的物を３ｍｇを得た。
【０１１８】
［合成例４］色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン（アルドリッチ社製）１５ｇにオルト酢酸エチル８０ｍＬ、触媒量のパラトルエンスルホン酸一水和物を添加した後に、４時間１２０℃で反応した。冷却後、トリエチルアミン２ｍＬを加えたのち、溶媒を減圧留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製した。目的物は結晶として得られた。
（４−２）色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）で合成した２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンを用いて合成例３に示した方法に従って色素（Ｄ−４）を得た。
【０１１９】
［合成例５］色素（Ｄ−５）の合成
（５−１）６−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−５−ブロモ−３−ヒドロキシピリジン４ｇ、キサントゲン酸カリウム８ｇ、エタノール５０ｍＬを混合し、１０時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、水４０ｍＬを加えて残さを溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗を行い、乾燥した。収量４．０ｇ、収率８１．８％
（５−２）６−ブロモ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−１）で合成した５−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン２ｇを１５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて溶解した。ついで、１ｍＬのヨウ化メチルを加え室温で１時間反応した。反応終了後、水を加え、析出した結晶を減圧ろ過した。水洗、乾燥を行い、目的物を得た。収量２ｇ、収率９４．３％
【０１２０】
（５−３）臭化１−（３−エトキシカルボニルプロピル）−４−メチルキノリニウムの合成
１９．５ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルと１４．３ｇのレピジンを混合し、１３０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を繰り返し、目的物を油状物として得た。このものはさらに精製を行うことなく次の反応に使用した。
（５−４）色素（Ｄ−５）の合成
合成例（５−２）及び（５−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−５）を合成した。
【０１２１】
［合成例６］色素（Ｄ−６）の合成
（６−１）６−メチル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法に従って合成した。１０ｇの２−アミノ−３−ブロモ−５−メチルピリジン、Ｎ−メチルピロリドン１２０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム１６．７ｇを混合し、１７０℃で３．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量８．７ｇ、収率８９．２％
【０１２２】
（６−２）６−メチル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成２ｇの原料チオールを１０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを添加した。次に、ヨウ化メチル１．５ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。水洗を行い、乾燥して目的物を得た。収量１．７ｇ、収率７８．９％
（６−３）色素（Ｄ−６）の合成
合成例（６−２）及び合成例（５−２）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−６）を合成した。
【０１２３】
［合成例７］色素（Ｄ−１５）の合成
（７−１）４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステルの合成
２５０ｍＬのジメチルアミン５０％水溶液と２００ｍＬのエタノールを混合し、１０℃以下に保ちながら１２０ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルを滴下した。滴下終了後、室温で２時間反応したのち、５０℃に昇温して２時間反応した。溶媒を半分程度に濃縮し、氷水で冷却しながら水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル４００ｍＬを加えて抽出を行った。この有機相を４Ｍの塩酸１５０ｍＬで４回抽出を行い、有機相を廃棄した。塩酸抽出液を氷水で冷却し、水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル２００ｍＬで３回抽出した。有機相を炭酸カリウムで乾燥し、濃縮を行い、目的物を得た。収量４５ｇ
【０１２４】
（７−２）臭化（６−ブロモヘキシル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，６−ジブロモヘキサン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。吸湿性結晶。収量２１ｇ
【０１２５】
（７−３）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムの合成
８ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと１２ｇのレピジンを混合し、１２５℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物、収量６ｇ
（７−４）色素（Ｄ−１５）の合成
合成例（７−３）及び合成例（１−４）で合成した原料を用い、合成例１で示した合成法に従って色素（Ｄ−１５）を合成した。
【０１２６】
［合成例８］色素（Ｄ−１６）の合成
（８−１）５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。３３．２ｇ（0.225モル）の３−フルオロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で０．１８モルのメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、得られた異性体混合物（５−フルオロ−４−メチルキノリンと７−フルオロ−４−メチルキノリン）を蒸留した。５−フルオロ−４−メチルキノリンの比が高い初留成分を酢酸エチルに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物のアセトン溶液を加え、氷水冷却すると、５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の結晶が得られた。収量１．７ｇ
また、７−フルオロ−４−メチルキノリンについてもパラトルエンスルホン酸塩の結晶として単離した。
【０１２７】
（８−２）臭化（４−ブロモブチル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，４−ジブロモブタン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。収量３０ｇ
（８−３）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−５−フルオロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと０．１ｇの５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩を混合し０．２ｍＬのトリエチルアミンを加えて、１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（８−４）色素（Ｄ−１６）の合成
合成例（８−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１６）を得た。
【０１２８】
［合成例９］色素（Ｄ−１７）の合成
（９−１）５−クロロ−４−メチルキノリンの合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。４０．０ｇ（0.225モル）の３−クロロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で１２．６ｇ（０．１８モル）のメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相は５−クロロ−４−メチルキノリンと７−クロロ−４−メチルキノリンであったので、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製し、それぞれを分離した。
【０１２９】
（９−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル−５−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例８−２）と０．１ｇの５−クロロ−４−メチルキノリンを混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（９−３）色素（Ｄ−１７）の合成
合成例（９−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１７）を得た。
【０１３０】
［合成例１０］色素（Ｄ−１８）の合成
（１０−１）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オンの合成
１５０ｍＬの濃硫酸にＮ，Ｎ−ジフェニルアセトアセタミド６０ｇを５〜１０℃で少量ずつ添加した。ほぼ完溶したのち、室温とし一晩放置した。反応が完結したので、氷水に注ぎ、酢酸エチル２００ｍＬを加え撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取、乾燥し、目的物を得た。
（１０−２）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオンの合成
１０ｇの４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オン（０．０４２５モル）、９ｇのローソン試薬をトルエン中で混合し、加熱還流した。原料消失後、反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。クロロホルムで溶出させ、ヘキサン／酢酸エチルより再結晶した。
【０１３１】
（１０−３）二臭化２−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチルチオ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムの合成
合成例（１０−２）で合成した４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオン０．５ｇと合成例（８−２）で合成した臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム１ｇを混合し、１３０℃にて１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解性成分を除去したのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。
（１０−４）色素（Ｄ−１８）の合成
合成例（６−２）及び合成例（１０−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−１８）を合成した。
【０１３２】
［合成例１１］色素（Ｄ−１９）の合成
（１１−１）色素（Ｄ−１９）の合成
合成例（７−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１に示した方法によって色素（Ｄ−１９）を合成した。
［合成例１２］色素（Ｄ−２３）の合成
（１２−１）３−クロロ−４−メチルキノリンの合成
シンセシス（Synthesis）798頁 (１９７６年)を参考にして合成した。すなわち、３−メチルインドール１．３１ｇ（１０ミリモル）と塩化ベンジルトリメチルアンモニウム５０ｍｇ、及びクロロホルム（エタノールフリー）／ベンゼンの１／１混合液３．２ｍＬを４０℃にて激しく撹拌し、水酸化ナトリウム３ｇ／水６ｍＬの溶液を１５分かけて滴下した。８時間反応を行ったのち、反応混合物を酢酸エチルと水で希釈し、２Ｎ塩酸で抽出した。この酸性溶液を濃厚な水酸化ナトリウムで弱塩基性とし、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、粗目的物を得た。さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
【０１３３】
（１２−２）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−３−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例７−２）と０．１ｇの３−クロロ−４−メチルキノリン（合成例１２−１）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（１２−３）色素（Ｄ−２３）の合成
合成例（１２−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法に従って色素（Ｄ−２３）を合成した。
【０１３４】
［合成例１３］色素（Ｄ−２５）の合成
（１３−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
（１３−１−１）２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸の合成
５０ｇの６−クロロニコチン酸を３００ｍＬのｎ−ブタノールと混合し、８０ｇのヒドラジン１水和物を添加して、１０時間加熱還流を行った。冷却後、５００ｍＬの希塩酸に注ぎ、析出した結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い目的物を得た。収量４４．２ｇ、収率９０．９％
【０１３５】
（１３−１−２）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸の合成
３０ｇの２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸と３０ｇの３−メチル−２−ブタノンを混合し、１２０ｍＬのエチレングリコールを添加し、１００℃で１時間反応を行った。減圧下で過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去し、ついで加熱を行い５時間還流を行った。冷却後、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、ＴＬＣ上で発色液（ｐ−アニスアルデヒド／エタノール／硫酸＝５／９０／５（容量パーセント））によって発色するフラクションを集めた。このフラクションは目的物と目的物のエチレングリコールエステルとの混合物であったため、混合物のまま１Ｎ水酸化ナトリウムで加水分解し、中和後、結晶として目的物を得た。また、約４０％は原料ヒドラジンと３−メチル−２−ブタノンから生成するヒドラゾンとして回収された。収量１．８ｇ、収率４．５％
【０１３６】
（１３−１−３）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
１ｇの２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸、１．５ｇのパラトルエンスルホン酸一水和物、１００ｍＬのエタノールを混合し、加熱を行い、溶媒を少しずつ留去し、エタノールを適宜追加しながら、８時間反応した。冷却後、溶媒を７０％程度留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出を行い、炭酸ナトリウム水溶液で有機相を洗浄後、濃縮した。短いカラムでシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、目的物を得た。収量０．８ｇ、収率７０．３％
（１３−２）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシルキノリニウムの合成
合成例（７−３）で合成した二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムを用いて、合成例（３−１）に示した合成法と同様にして目的物を得た。
【０１３７】
（１３−３）塩化５−エトキシカルボニル−７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（１３−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル０．１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル０．８ｇと混合し、１１０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１３−４）色素（Ｄ−２５）の合成
合成例（１３−２）及び合成例（１３−３）で合成した化合物を原料として、合成例（３−３）に示した方法と同様にして色素（Ｄ−２５）を得た。
【０１３８】
［合成例１４］色素（Ｄ−２７）の合成
（１４−１）６−ブロモ−２−メチルチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２５．２ｇの２−アミノ−３，５−ジブロモピリジンを５００ｍＬのアセトニトリルに懸濁し、５０ｍＬの無水酢酸を加えて３時間加熱還流した。冷却後、水を加えて析出した結晶を濾取した。結晶を乾燥後、ジオキサン３００ｍＬに懸濁し、６ｇの水素化ナトリウムを加えて４時間加熱還流した。冷却後、エタノール２０ｍＬを加えた後、溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
（１４−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと２ｇの４−メチルキノリン（レピジン）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いた。セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製し、結晶として得た。
【０１３９】
（１４−３）二臭化４−（４−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）−１，３−ブタジエン−１−イル）−１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
合成例（１４−２）で合成した二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウム０．５ｇに２ｇのマロンアルデヒドジアニリド塩酸塩を加え、無水酢酸５ｍＬを混合して１１０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１４−３）色素（Ｄ−２７）の合成
合成例（１４−１）及び（１４−３）に示した化合物を原料として、合成例３と同様の方法で合成した。
【０１４０】
［合成例１５］色素（Ｄ−３５）の合成
（１５−１）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（１５−１−１）５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem）、５７巻、４７８４頁（１９９２年）に記載の方法を参考に合成を行った。すなわち、３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンに強塩基存在下でＮ，Ｎ−テトラメチレンチオカルバモイルスルフェナミドの窒素アニオンを作用させて合成を行った。
（１５−１−２）５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成
３ｇの５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジン（合成例１５−１−１）を３０ｍＬの無水酢酸に懸濁し、触媒量の濃硫酸を添加し、７０℃で１時間反応した。反応終了後、反応混合物を氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取、乾燥した。この後、さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。
【０１４１】
（１５−１−３）２−アミノ−５−アセチルアミノ−３−ヒドロキシピリジンの合成
１ｇの５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンを５０ｍＬのメタノールを加え、オートクレーブ中で５％活性炭パラジウムを触媒として５０℃で水素添加反応を行った。１晩放置後、触媒を濾別し、溶媒を減圧留去した。生成物はさらに精製せずに次の反応に使用した。
（１５−１−４）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１５−１−３）の生成物に２ｇのキサントゲン酸カリウム、５０ｍＬのエタノールを加えて１５時間加熱還流した。冷却後、溶媒を留去し、水を加えて固形物を溶解したのち、酢酸を添加すると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
（１５−２）５−アセチルアミノ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−２）の方法に従って合成した。
（１５−３）色素（Ｄ−３５）の合成
合成例（１５−１−４）及び（１５−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法と同様にして色素（Ｄ−３５）を得た。
【０１４２】
［合成例１６］色素（Ｄ−３７）の合成
（１６−１）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
（１６−１−１）５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジンの合成
２，５−ジブロモピリジン１２５ｇ、エタノール３５０ｍＬ、包水ヒドラジン２５０ｍＬを混合し、３０時間加熱還流した。エタノールを減圧下で留去し、水を加えて析出した結晶を濾取した。水洗、乾燥を行い、５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７７ｇを得た。収率７７．６％
（１６−１−２）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７６ｇ、３−メチル−２−ブタノン１００ミリリットルを混合し、１００℃で３０分間反応した。過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去したのち、１，４−ブタンジオール１００ミリリットルを加え２４０℃に加熱し、５時間還流した。
反応液を冷却し、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ｎｍｒで各フラクションを確認した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を留去したのちヘキサン／酢酸エチルから結晶化し、単褐色結晶として目的物を得た。収量８．５グラム、収率８．８％
【０１４３】
（１６−２）５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１６−１−２）で合成した５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．５ｇ、フェニルボロン酸０．３８ｇ及びジメチルホルムアミド７ｍＬを混合し、窒素気流下にてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム０．０７２ｇ及び炭酸カリウム０．９ｇをこれに加えた。反応混合物を撹拌し、１００℃に加熱し、４時間反応した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離液としてクロロホルム／メタノールを用い、目的物はクロロホルム／メタノール＝４／１で溶出した。目的物を含むフラクションを集め濃縮し、目的物を淡黄色固体として得た。収量０．４５ｇ、収率９１％
【０１４４】
（１６−３）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（１６−２）で合成した５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．２ｇと１ｇの塩化２−メトキシエトキシメチルを混合し、１００℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１６−４）二臭化６−メトキシ−４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
３ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と５ｇの６−メトキシ−４−メチルキノリン（東京化成社製）を混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１４５】
（１６−５）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−６−メトキシ−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
（１６−４）で合成したキノリニウムに１．５ｇの１，３−ジフェニルホルムアミジンを加え、５ｍＬの無水酢酸を混合して１２０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を２回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１６−６）色素（Ｄ−３７）の合成
合成例（１６−５）で合成した化合物にジメチルホルムアミド５ｍＬを添加し、１ｍＬの無水酢酸を加えた。さらにこの混合液に合成例（１６−３）で合成した化合物を添加し、室温で均一溶液とした。室温でトリエチルアミンを０．３ｍＬ添加すると色素が生成した。この色素をセファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製したのち（溶出液：メタノール）、この色素のメタノール溶液に触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸塩を加えて、室温で２日間放置した。この溶液を再度セファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製して色素（Ｄ−３７）を得た。
【０１４６】
［合成例１７］色素（Ｄ−３８）の合成
（１７−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
（１７−１−１）４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンの合成
１０ｇの４−ヒドロキシイソキノリンを８０ｇの濃硫酸に溶解し、２℃で撹拌した。これに１０℃以下に保ちながら、発煙硝酸２．７ｍＬをゆっくり滴下した。そのまま放置し、室温で２時間反応したのち、１Ｋｇの氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取した。
（１７−１−２）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成４ｇの４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンに酢酸エチル、水を加え、さらに過剰量のハイドロサルファイトナトリウムを添加して２時間加熱還流した。分液して有機相をとり、水洗後、溶媒を留去した。残さにエタノール、８ｇのキサントゲン酸カリウムを添加し、５時間加熱還流を行った。冷却後、エタノールを留去し、残さを２０ｍＬの水に溶解し、酢酸を少しずつ加えると、結晶が析出した。結晶を濾取し、水洗を行い、乾燥して目的物を得た。
【０１４７】
（１７−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
２ｇの原料チオールをジメチルホルムアミド１５ｍＬに添加し、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて原料を溶解した。ついで、１．５ｍＬのヨウ化メチルを添加し、室温で１時間反応した。水５０ｍＬを添加すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
（１７−３）色素（Ｄ−３８）の合成
合成例（１７−２）及び合成例（１４−２）で合成した化合物を原料として、合成例３に示した方法と同様にして色素（Ｄ−３８）を合成した。
【０１４８】
［実施例１］溶液系での多重鎖核酸の検出
（試料核酸溶液の調製）
２重鎖核酸としてデオキシリボ核酸ナトリウム，繊維状，サケ精巣製（和光純薬工業（株）製）をｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し１００μｇ／ｍＬを作製した。さらにこれを１００℃で３０分加熱したのちに氷水で急冷し１本鎖のデオキシリボ核酸を作製した。
【０１４９】
（検出用化合物溶液の調製）
表１に示した化合物をｐＨ４．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し、５×１０-5モル／Ｌの溶液を作製した。これらの溶液はいずれも実質的に無色かつ無蛍光であった。比較としてモレキュラー・プローブス社の PicoGreen をｐＨ４．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し、可視域での光学濃度０．５の溶液を作製した。
（蛍光強度の測定）
試料核酸溶液を１、検出用化合物溶液を１、希釈用緩衝液を８の容量比で混合した溶液を作製し、蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定し、その結果を表１に示した。蛍光強度はそれぞれの試料について蛍光励起スペクトルを測定し、強度最大となる波長で励起したときの蛍光強度を示した。
【０１５０】
【表１】
0003899372.tif 000022
【０１５１】
表１に示した結果より、本発明の方法では２本鎖核酸が存在する場合には高い蛍光収率（蛍光強度／吸光度）が達成されていることがわかる。さらに１本鎖に比較して２本鎖の存在によって蛍光強度が飛躍的に上昇しており、本発明の方法が２本鎖核酸を検出するために極めて優れていることがわかる。
【０１５２】
［実施例２］固相担体上での多重鎖核酸の検出
（１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成
２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業株式会社製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後に取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作製した。次いで、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１溶液に１０分間浸した後取り出し、水洗を行い、エタノールで洗浄後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライド（Ｂ）を作成した。
【０１５３】
【化２４】
0003899372.tif 000023
（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定
３’未端がアミノ基で修飾されたＤＮＡ断片（Ｕ−１：配列番号１）及び同様に３’末端がアミノ基で修飾された上記ＤＮＡ断片の相補鎖（Ｕ−２）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に分散させた水性液（１×１０-5Ｍ）を調製し、上記工程（１）で得たスライド（Ｂ）にこれらを点着した。直ちに点着後のスライドを６０℃、湿度９０％にして１晩放置した。このスライドを０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｃ）を得た。
【０１５４】
上記ＤＮＡ配列（Ｕ−１）と相補的な配列を有する６０ｍｅｒのＤＮＡ（Ｕ−３）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣ及び１０質量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、上記で得たスライド（Ｃ）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間インキュベートした。次いで、このスライドを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で１０秒間洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し、スライド（Ｄ）とした。また、比較用として５’末端をＣｙ３で標識した（Ｕ−３）と同配列の６０ｍｅｒについても同様にしてサンプルを作製し、スライド（Ｅ）とした。それぞれをスライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した。励起波長は５３２ｎｍで行い、検出は５７０ｎｍに極大を有するバンドパスフィルターを通して行った。
【０１５５】
【表２】
0003899372.tif 000024
【０１５６】
スライド（Ｄ）と同じものを作製し、本発明の方法により化合物２×１０-5モル／ＬのｐＨ５の２０ｍＭクエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液溶液４０μＬをスライド（Ｄ）に展開した。これらの溶液は調製時点で実質的に無色かつ無蛍光であった。表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後に上記と同様にして蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した。結果を表３に示す。この結果から、本発明方法によれば標識することなく多重鎖核酸を検出可能なことが明らかである。
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
固相担体に固定するオリゴ核酸を配列番号２の核酸（８０ｍｅｒ）、配列番号３の核酸（８０ｍｅｒ）、及び配列番号４の核酸（１００ｍｅｒ）に変更して童謡に実験を行ったところ、上記とほぼ同じ結果が得られ、非標識で多重鎖核酸を検出可能なことがわかった。
【０１５９】
［実施例３］ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの検出
実施例２において、スライドガラス表面に固定した６０ｍｅｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外はまったく同様の実験を行ったところ、ハイブリダイゼーションが起こったスポットが検出され、ＲＮＡの検出も標識することなく行うことができることが明らかとなった。
【０１６０】
【配列表】
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