(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の超可変領域アミノ酸配列：ＣＤＲＨ１（ＧＹＸ1ＦＴＸ2ＹＧＭＮ、ここに、Ｘ1はＴまたはＤであり、Ｘ2は、ＮまたはＨである：配列番号１３０）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ，配列番号２）およびＣＤＲＨ３（ＹＰＸ1ＹＹＧＸ2ＳＨＷＹＦＤＶ、ここに、Ｘ1はＹまたはＨであり、Ｘ2はＳまたはＴである：配列番号１３１）を含む重鎖可変ドメイン、並びに以下の超可変領域アミノ酸配列：ＣＤＲＬ１（ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、配列番号４）、ＣＤＲＬ２（ＦＴＳＳＬＨＳ、配列番号５）およびＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ、配列番号６）を含む軽鎖可変ドメインを有している、約１ｘ１０-8Ｍを超えないＫd値でヒト血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合するヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項２】
約５ｘ１０-9Ｍを超えないＫd値でヒトＶＥＧＦと結合する、請求項１記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項３】
インビトロにおける内皮細胞のＶＥＧＦ−誘導増殖を阻害する、請求項１記載のＥＤ50値が５ｎＭを超えないヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項４】
インビボでのＶＥＧＦ−誘導血管形成を阻害する、請求項１記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項５】
Ａ６７３インビボ腫瘍モデルにおいて、５ｍｇ/kgで少なくとも５０％の腫瘍の増殖を阻害する、請求項４のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項６】
前記ＣＤＲＨ１が、ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項７】
前記ＣＤＲＨ３が、ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項８】
前記ＣＤＲＨ１が、ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１）のアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３が、ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項８記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１０】
配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１〜９のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１１】
配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメインと配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する、請求項１〜８のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１２】
ＣＤＲＨ１が ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号１２８）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１３】
ＣＤＲＨ３が ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１２９）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１４】
配列番号１２７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１５】
配列番号１１８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１６】
さらに配列番号１２６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する、請求項１２〜１５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１７】
さらに配列番号１１７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する、請求項１２〜１５のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１８】
配列番号１１７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインと配列番号１１８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗体ＶＥＧＦ抗体。
【請求項１９】
完全長の抗体である請求項１〜１８のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項２０】
ヒトＩｇＧである請求項１９のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項２１】
抗体フラグメントである請求項１〜１８のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項２２】
Ｆａｂである請求項２１の抗体フラグメント。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントと薬学的に許容し得る担体とを含む組成物。
【請求項２４】
請求項１の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項２４の核酸を含有するベクター。
【請求項２６】
請求項２５のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６の宿主細胞を、核酸が発現されるように培養することを含む、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の製造方法。
【請求項２８】
宿主細胞培養からヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を回収することを更に含む請求項２７の方法。
【請求項２９】
哺乳動物のＶＥＧＦ誘導血管形成の阻害に使用するための、請求項１〜２２のいずれかに記載のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントを含有する医薬組成物であって、該医薬組成物が治療上有効な量で該哺乳動物に投与され、該ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体が約１ｘ１０-8Ｍを超えないＫd値でヒトＶＥＧＦと結合する、医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである請求項２９の医薬組成物。
【請求項３１】
哺乳動物が腫瘍を有する請求項２９の医薬組成物。
【請求項３２】
哺乳動物がレチナール障害を有する請求項２９の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
クロスリファレンス
本出願は、同時係属中の米国特許出願第０８／８３３５０４号（１９９７年、４月７日出願）の一部継続出願であり（この内容は本明細書の一部を構成する）、これに対し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０のもとで優先権を主張するものである。
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的に抗ＶＥＧＦ抗体、特に、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体および変異体抗ＶＥＧＦ抗体に関する。
関連先行技術の説明
種々の障害の病因に血管（脈管）形成が関与することは現在よく確立されている。これには固形癌、増殖性網膜症や加齢性斑紋変性（age-related macular degeneration, AMD）のような眼内血管形成症候群、リューマチ性関節炎、および乾癬が含まれる（Folkmanら、J. Biol. Chem. 267:10931-10934（1992）, Klagsbrunら、Annu. Rev. Physiol. 53:217-239（1991）、およびGarner A., Vascular diseases. In Pathobiology of ocular diseases. A dynamic approach. Garner A. Klintworth GK編、第２版、Marcel Dekker, NY, 1625-1710（1994））。固形癌の場合は、血管新生により腫瘍細胞は正常細胞に比べて増殖が有利となり、増殖的自立性を得ることができる。したがって、腫瘍切片における微小血管密度と乳癌およびいくつかの他の腫瘍における患者の生存性との間に相関性が観察されている（Weidnerら、N Engl J Med 324:1-6（1991）, Horakら、Lancet 340: 1120-1124（1992）,およびMacchiariniら、Lancet 340:145-146（1992））。
血管形成の正の調節因子（positive regulator）の探求により、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、アンギオゲニン、ＩＬ−８などを含む多くの候補が得られてきた（FolkmanらおよびKlagsbrunら）。今までに確認された負の調節因子には、トロンボスポンジン（Goodら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628（1990）、１６キロダルトンの、プロラクチンのＮ末端断片（Clappら、Endocrinology, 133:1292-1299（1993））、アンギオスタチン（O'Reillyら、Cell, 79:315-328（1994））、およびエンドスタチン（O'Reillyら、Cell, 88:277-285（1996））が含まれる。
最近数年間に行われた研究により、正常および異常な血管形成の調節における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の重要な役割が確認された（Ferraraら、Endocr. Rev. 18:4-25（1997））。単一ＶＥＧＦアレルが損失するだけで胎児に致死性をもたらすという事実は、この因子が血管系の発生および分化に代用できない役割を演じることを指摘するものである（Ferraraら）。さらに、ＶＥＧＦは腫瘍および眼内障害と関連した血管形成における重要なメディエーターであることがわかった（Ferraraら）。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡは、試験したヒト腫瘍の大多数に過剰発現する（Berkmanら、J Clin Invest 91:153-159（1993）, Brownら, Human Pathol. 26:86-91（1995）, Brownら, Cancer Res. 53:4727-4735（1993）, Matternら、Brit. J. Cancer. 73:931-934（1996）、およびDvorakら、Am. J. Pathol. 146:1029-1039（1995））。眼液中のＶＥＧＦ濃度も、糖尿病および他の虚血性網膜症の患者における血管の活発な増殖の存在との関連性が高い（Aielloら、N. Engl. J. Med. 331:1480-1487（1994））。さらに、最近の研究は、ＡＭＤ患者の脈絡膜の血管形成膜にＶＥＧＦが局在することを証明した（Lopezら、Invest. Ophtalmo, Vis. Sci. 37:855-868（1996））。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおける種々のヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制し（Kimら、Nature 362:841-844（1993）, Warrenら、J. Clin. Invest. 95:1789-1979（1995）, Borgstroemら、Cancer Res. 56:4032-4039（1996）、およびMelnykら、Cancer Res. 56:921-924（1996））、虚血性網膜障害モデルにおける眼内血管形成も阻害する（Adamisら、Arch. Ophthalmol. 114:66-71（1996））。抗体のヒト化については、Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8:83-93（1995）に概説されている。したがって、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体または他のＶＥＧＦ作用のインヒビターは固形腫瘍および種々の眼内血管形成障害を治療するための有望な候補である。
発明の要約
本出願は、ＶＥＧＦとの強い結合親和性、in vitroにおける内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖の阻害能、およびin vivoにおけるＶＥＧＦ誘導性血管形成の阻害能を含む治療的に望ましい特徴を有するヒト化抗ＶＥＧＦ抗体および抗ＶＥＧＦ抗体変異体について記載している。
本明細書において好ましいヒト化抗ＶＥＧＦ抗体または種々の変異体抗ＶＥＧＦ抗体は、約１ｘ１０-8Ｍを超えない、好ましくは約５ｘ１０-9Ｍを超えないＫd値でヒトＶＥＧＦと結合する。さらに、ヒト化または変異体ＶＥＧＦ抗体は、in vitroで内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害するためのＥＤ５０値が約５ｍＭを超えない値であってよい。本明細書において目的とする特定のヒト化または変異体抗ＶＥＧＦ抗体は、抗体用量５ｍｇ／ｋｇで、Ａ６７３ in vivo腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を少なくとも約５０％阻害するものである。
ある態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、重鎖可変ドメインが以下のアミノ酸配列を有する超可変領域を含む重および軽鎖可変ドメインを有する：ＣＤＲＨ１（ＧＹＸ1ＦＴＸ2ＹＧＭＮ（ここで、Ｘ1はＴまたはＤであり、Ｘ2はＮまたはＨである）：配列番号１３０）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ：配列番号２）、およびＣＤＲＨ３（ＹＰＸ1ＹＹＧＸ2ＳＨＷＹＦＤＶ（ここで、Ｘ1はＹまたはＨであり、Ｘ2はＳまたはＴである）：配列番号１３１）。例えば、重鎖可変ドメインはＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ：配列番号１）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ：配列番号２）、およびＣＤＲＨ３（ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ：配列番号３）のアミノ酸配列を含んでいてよい。好ましくは、３つの重鎖超可変行域は、ヒトフレームワーク領域中に、例えば、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４で示される隣接配列として提供される。
さらに、本発明はアミノ酸配列：
0003957765.tif 000002
（ここで、Ｘ1はＴまたはＤであり、Ｘ2はＮまたはＨであり、Ｘ3はＹまたはＨであり、Ｘ4はＳまたはＴである）を含む抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変ドメインを提供する。ある特定の有用な重鎖ドメイン配列は実施例１のＦ（ａｂ）−１２ヒト化抗体のそれであり、配列番号７の重鎖可変ドメイン配列を含む。そのような好ましい重鎖可変ドメイン配列は、下記の好ましい軽鎖可変ドメイン配列、または他の軽鎖可変ドメイン配列と結合してよい（ただし、該抗体はヒトＶＥＧＦと結合するように製造される）。
本発明は上記重鎖可変ドメイン配列、または他の重鎖可変ドメイン配列と結合してよい好ましい軽鎖可変ドメイン配列も提供する（ただし、該抗体はヒトＶＥＧＦとの結合能を保持するように製造される）。例えば、該軽鎖可変ドメインは以下のアミノ酸配列を有する超可変領域を含んでいてよい：ＣＤＲＬ１（ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ：配列番号４）、ＣＤＲＬ２（ＦＴＳＳＬＨＳ：配列番号５）、およびＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ：配列番号６）。好ましくは、３つの軽鎖超可変領域は、ヒトフレームワーク領域、例えば、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４で示される隣接配列として提供される。
ある態様において、本発明は、下記のアミノ酸配列を含むヒト化抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変ドメインを提供する：
0003957765.tif 000003
（ここで、Ｘ1はＭまたはＬである）。ある特定の有用な軽鎖可変ドメイン配列は、実施例１のＦ（ａｂ）−１２ヒト化抗体のそれであり、配列番号８の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
本発明は親抗ＶＥＧＦ抗体の変異体も提供し（該親抗体は好ましくはヒト化またはヒト抗ＶＥＧＦ抗体である）（ここで、変異体はヒトＶＥＧＦと結合する）、親抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインの超可変領域にアミノ酸置換を含む。該変異体は、好ましくは抗ＶＥＧＦ抗体の１またはそれ以上の超可変領域中に１またはそれ以上の置換を有する。好ましくは該置換は親抗体の重鎖可変ドメイン中にある。例えば、該アミノ酸置換は、重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ３中にあってよい。好ましくは、これら両超可変領域に置換が存在する。そのような「親和性が成熟した（matured）」変異体は、本明細書において、それが生じた親抗ＶＥＧＦ抗体より強くヒトＶＥＧＦと結合することがわかっている（すなわち、該変異体は親抗ＶＥＧＦ抗体より有意に低いＫd値を有する）。好ましくは、該変異体は、in vitroにおける内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害するＥＤ５０値が、抗ＶＥＧＦ抗体より少なくとも約１０倍低く、好ましくは少なくとも約２０倍低く、最も好ましくは約５０倍低い。ある特に好ましい変異体は、アミノ酸配列：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号１２８）を含むＣＤＲＨ１、およびアミノ酸配列：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１２９）を含むＣＤＲＨ３を有する、実施例３のＹ０３１７変異体である。これら超可変領域およびＣＤＲＨ２は一般的にヒトフレームワーク領域中に提供され、例えば、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを生じる。そのような重鎖可変ドメイン配列は所望により、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、好ましくは、配列番号１１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と結合する。
該抗体の種々の形が本明細書から予期される。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は完全長の抗体（例えば、完全ヒトＦｃ領域を有する）、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2）であってよい。さらに、該抗体は、検出可能な標識で標識するか、固相上に固定化するか、そして／またはヘテロローガスな化合物（細胞毒性物質のような）と結合させてよい。
該抗体の診断的および治療的使用が予期される。ある診断的応用において、本発明は、ＶＥＧＦタンパク質を含むと思われる試料を抗ＶＥＧＦ抗体に曝露し、該抗体の該試料への結合を測定することを含むＶＥＧＦタンパク質の存在を測定する方法を提供する。この使用のために、本発明はＶＥＧＦタンパク質を検出するための抗体と該抗体を使用するための指示書を含むキットを提供する。
さらに本発明は、該抗体をコードする単離された核酸、所望により、該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列と操作可能に結合した該核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該核酸が発現するように宿主細胞を培養し、所望により該宿主細胞培養から（例えば、宿主細胞培養培地から）該抗体を回収することを含む該抗体の製造方法を提供する。本発明は抗ＶＥＧＦ抗体と医薬的に許容される担体または希釈剤を含む組成物も提供する。治療に用いる組成物は無菌であり、凍結乾燥してもよい。さらに、本発明は、腫瘍または網膜障害に罹患した哺乳動物の治療方法であって、該哺乳動物に対し治療的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａおよび１Ｂは、ｍｕＭａｂＶＥＧＦ Ａ．４．６．１の可変重ドメイン（配列番号９）および軽ドメイン（配列番号１０）、ヒト化Ｆ（ａｂ）（Ｆ（ａｂ）−１２）の可変重ドメイン（配列番号７）および軽ドメイン（配列番号８）、およびヒトコンセンサスフレームワーク（重サブグループIIIのｈｕｍIII（配列番号１１、軽κサブグループ１のｈｕｍκ１（配列番号１２）を示す。図１Ａは可変重ドメイン配列を一列に並べ、図１Ｂは可変軽鎖ドメイン配列を一列に並べている。アスタリスクはヒト化Ｆ（ａｂ）−１２とネズミＭａｂ、またはＦ（ａｂ）−１２とヒトフレームワークの相違を示す。相補性決定領域ＣＤＲ）には下線を付している。
図２は、ヒト化Ｆ（ａｂ）−１２ＶＬおよびＶＨドメインのモデルの帯状ダイアグラムを示す。ＶＬドメインは茶色で示し、ＣＤＲは黄褐色で示す。残基Ｌ４６の側鎖は黄色で示す。ＶＨドメインは紫色で、ＣＤＲは桃色で示す。ヒトからネズミに変化したＶＨ残基の側鎖は黄色で示す。
図３は、実施例１から得られるヒト化抗ＶＥＧＦ Ｆ（ａｂ）−１２によるＶＥＧＦ誘導性有糸分裂誘発の阻害を示す。ウシ副腎皮質由来毛細内皮細胞を、実施例１に記載のごとく６ウェルプレートに６ｘ１０3個／ウェルの密度で摂取した。ｍｕＭＡｂ ＶＥＧＦ Ａ．４．６．１またはｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ（ＩｇＧ１；Ｆ（ａｂ）−１２）のいずれかを、示した濃度に加える。２〜３時間後、ｒｈＶＥＧＦ１６５を最終濃度３ｎｇ／ｍＬに加える。５または６日後、細胞をトリプシン処理し、算定する。示した値はデュプリケートで測定した平均である。平均からの変動は１０％以下である。
図４は、実施例１から得られるヒト化抗ＶＥＧＦ  Ｆ（ａｂ）−１２によるin vivoにおける腫瘍増殖の阻害を示す。Ａ６７３横紋筋肉腫細胞をマウス１匹につき２ｘ１０6個の密度でＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに注射した。腫瘍細胞を摂取して２４時間後から、動物の腹腔内に、１週間に２回、コントロールＭＡｂ、ｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１、またはｒｈｕＶＥＧＦ ＭＡｂ（ＩｇＧ１；Ｆ（ａｂ）−１２）の注射を開始した。コントロールＭａｂの用量は５ｍｇ／ｋｇであり、抗ＶＥＧＦ ＭＡｂは示したごとく０．５または５ｍｇ／ｋｇ投与した（ｎ＝１０）。腫瘍細胞を注射して４週後に、動物を安楽死させ、腫瘍を取り出し、計量した。＊ＡＮＯＶＡによるコントロール群と比較したときの有意差（Ｐ＜０．０５）。
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、実施例２から得られるネズミ抗体Ａ４．６．１（ＶＬは配列番号１０、ＶＨは配列番号９）、ヒト化Ａ４．６．１変異体ｈｕ２．０（ＶＬは配列番号１３、ＶＨは配列番号１４）、およびｈｕ２．１０（ＶＬは配列番号１５、ＶＨは配列番号１６）の軽および重可変ドメインのアミノ酸配列を示す。配列番号付けは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に従い、ミスマッチはアスタリスク（ネズミＡ４．６．１対ｈｕ２．０）またはビュレット（ｈｕ２．０対ｈｕ２．１０）で示す。変異体ｈｕ２．０は、ヒト軽鎖κサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１２）および重鎖サブグループIIIコンセンサスフレームワーク（配列番号１１）上に組み込んだネズミ抗体由来のＣＤＲ配列（太字）のみを含む。ｈｕ２．１０は、本明細書に記載のファージソーティング試験から得られたコンセンサスヒト化クローンであった。
図６は、実施例２における無作為化の標的となるフレームワーク残基を示す。
図７は、ファージ上のＦａｂ−ｐIII融合物の表面を表現するファージミッド構築物を示す。ファージミッドはＭ１３遺伝子IIIコートタンパク質の部分と融合した抗体Ａ４．６．１のＦａｂ断片のヒト化バージョンをコードする。融合タンパク質は重鎖のカルボキシ末端で１グルタミン残基、次いで遺伝子IIIタンパク質のＣ末端領域（残基２４９−４０６）と連結したＦａｂ（ｓｕｐＥ Ｅ．ｃｏｌｉのアンバーコドンのサプレッションから）からなる。Ｆ+ Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換、次いでＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージによる重感染は、これらの少ない割合が融合タンパク質の１コピーを表現するファージミッド粒子を生じる。
図８Ａ−Ｅは、実施例３のファージ−表現抗体ベクターｐｈＭＢ４−１９−１．６のヌクレオチド配列（配列番号９９）、およびそれによりコードされるアミノ酸配列（配列番号１００〜１０２）を示す。
図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、実施例１のＦ（ａｂ）−１２と比較した、実施例３の親和性が成熟した抗ＶＥＧ変異体の軽および重可変ドメインのアミノ酸配列の配置を示す（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号８および７）。ＣＤＲには下線を付しており、Ｌ、軽鎖、またはＨ、重鎖および番号１−３で示す。残基には、Kabat番号付け法とは反対にＶＬおよびＶＨドメインに連続番号をつける。鋳型分子、ＭＢ１．６（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１０３および１０４）は変異体：Ｈ２３０５．６（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１０５および１０６）、Ｙ０１０１（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１０７および１０８）、およびＹ０１９２（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１０９および１１０）と共に示される。Ｆ（ａｂ）−１２との相違は影付ボックスで示す。
図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、実施例１のＦ（ａｂ）−１２と比較した、実施例３から得られる親和性が成熟した抗ＶＥＧＦ変異体の軽および重可変ドメインのアミノ酸配列の配置を示す（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号８および７）。ＣＤＲには下線を付しており、Ｌ、軽鎖、またはＨ、重鎖および番号１−３で示す。変異体は、Ｙ０２４３−１（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１１１および１１２）、Ｙ０２３８−３（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１１３および１１４）、Ｙ０３１３−１（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１１５および１１６）、およびＹ０３１７（軽および重可変ドメイン、それぞれ配列番号１１７および１１８）で示される。Ｆ（ａｂ）−１２との相違は影付ボックスで示す。
図１１は、実施例１から得られる完全長Ｆ（ａｂ）−１２、および変異体Ｙ０２３８−３、Ｙ０１９２、およびＹ０３１３−１に対する実施例３のＨｕＶＥＣ活性アッセイの結果を示す。
図１２は、実施例１からの完全長Ｆ（ａｂ）−１２（ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ）、実施例１からのＦ（ａｂ）−１２のＦａｂ断片（ｒｈｕＦａｂ ＶＥＧＦ）、および実施例３からの親和性が成熟したＹ０３１７のＦａｂ断片（ｒｈｕＦａｂ ＶＥＧＦ（親和性成熟））によるＶＥＧＦ誘導性有糸分裂誘発の阻害を示す。
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で用いている用語「ヒトＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、および関連１２１−、１８９−、および２０６−アミノ酸血管内皮細胞成長因子（Leungら、Science 246:1306(1989)、およびHouckら、Mol. Endocrin.5:1806(1991)に記載）、およびこれら成長因子の天然のアレル形およびプロセス形を表す。
本発明は、１またはそれ以上のＶＥＧＦの生物活性、例えば、有糸分裂誘発または血管形成活性を阻害することができる抗ＶＥＧＦアンタゴニスト抗体を提供する。ＶＥＧＦのアンタゴニストは、ＶＥＧＦの細胞レセプターへの結合に干渉するか、ＶＥＧＦにより活性化された細胞を無能力にするかもしくは殺すか、またはＶＥＧＦが細胞レセプターに結合した後の血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。ＶＥＧＦアンタゴニストによる介入のそのようなすべての点は本発明の目的と等価であると考えられよう。
本明細書で用いている用語「ＶＥＧＦレセプター」または「ＶＥＧＦｒ」は、通常血管内皮細胞にみいだされる細胞表面レセプターであるＶＥＧＦの細胞レセプター、およびｈＶＥＧＦとの結合能を保持しているその変異体を表す。ＶＥＧＦレセプターの１例は、チロシンキナーゼファミリーの貫膜レセプターであるｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｆｌｔ）である。DeVriesら、Science 255:989(1992), Shibuyaら、Oncogene 5:519(1990)。ｆｌｔレセプターは、チロシンキナーゼ活性を有する細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与するが、細胞内ドメインはシグナル変換に関与する。ＶＥＧＦレセプターの別の例は、ｆｌｋ−１レセプター（ＫＤＲとも呼ぶ）である。Matthewsら、Proc.Nat.Acad.Sci.88:9026(1991), Termanら、Oncogene 6:1677(1991),Termanら、Biochem.Biophys.Res.Commun.187:1579(1992)。ＶＥＧＦのｆｌｔレセプターへの結合は、見かけの分子量が２０５０００および３０００００ダルトンの少なくとも２つの高分子量コンプレックスの形成をもたらす。３０００００ダルトンのコンプレックスはＶＥＧＦの１分子と結合したレセプター２分子を含む二量体であると考えられる。
本明細書で用いている用語「エピトープＡ４．６．１」は、特記しない限り、Kimら、Growth Factors 7:53(1992)およびKimら、Nature 362:841(1993)に開示のＡ４．６．１抗体と結合するヒトＶＥＧＦの領域を表す。
「治療（処置）」は、治療的処置および予防的もしくは抑制的方法の両方を表す。治療を要するもの（対象）には、すでに障害を有するものおよび障害を予防すべきものが含まれる。
治療を目的とする「哺乳動物」は、ヒト、およびイヌ、ウマ、ネコ、乳牛などのような家畜(domestic and farm animals)、および動物園の、競技用、もしくはペット動物を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を表す。
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異抗原との結合特異性を有するが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで、またミエローマにより高レベルで産生される。
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１共有ジスルフィド結合により重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖は一定の間隔で鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は１末端に可変ドメイン（ＶH）、次いで多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は１末端に可変ドメイン（ＶL）と他の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと一列に並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一列に並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽および重鎖可変ドメイン間にインターフェースを形成すると考えられている。
用語「可変(の)」は、可変ドメインのある部分の配列が抗体間で広範囲に異なる事実を表し、各特定抗体のその特定抗原に対する結合および特性において用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメイン両方の超可変領域と呼ばれる３部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβ−シート配置をとり、３つの超可変領域によって結合し、β−シート構造を繋ぎ、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含む。各鎖中の超可変領域はＦＲによって密接に隣接して結合し、その他の鎖の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に関与する（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版、Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),647-669頁参照）。定常ドメインは抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与といった種々のエフェクター機能を有する。
本明細書において用語「超可変領域」は、抗原との結合をもたらす抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest.第５版、Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)）、および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）；ChothiaおよびLesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン消化により「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが１個の抗原結合部位を持った２つの同じ抗原結合断片と、容易に結晶することから名付けられた、残る「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理すると、２つの抗原結合部位を持ち、まだ抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）2断片が生じる。
「Ｆｖ」は完全な抗原認識と抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１重鎖および１軽鎖可変ドメインが強く非共有結合した二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域はＶH−ＶL二量体表面の抗原結合部位を限定するように相互作用する。６つの超可変領域がまとまって抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、１つの可変ドメイン（すなわち、抗原特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でも、完全な結合部位より親和性は低いものの抗原を認識し、結合する能力を持っている。
Ｆａｂ断片も軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が加わっていることがＦａｂ断片とは異なる。本明細書において、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保持するＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして本来生じる。抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
あらゆる脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる明らかに異なる２タイプの１つに分類することができる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができよう。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体)、および所望の生物活性を有する抗体断片を含む。
「抗体断片」は、完全長抗体の部分、一般的にその抗原結合もしくは可変ドメインを含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ断片、ディアボディ（diabody）、線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異性抗体を含む。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」は、実質的にホモローガスな抗体、すなわち、ポピュレーションを構成する個々の抗体が少量存在するかも知れない天然に生じ得る突然変異を除いて同一なポピュレーションから得られる抗体を表す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原部位に対して誘導される。さらに、典型的には、異なる決定基(エピトープ)に対して誘導された異なる抗体を含む通常の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一決定基に対して誘導される。用語「モノクローナル」は、実質的にホモローガスな抗体のポピュレーションから得られる抗体の特性を表し、該抗体を何らかの特定の方法により製造する必要があるものと解釈してはならない。例えば、本発明にしたがって用いるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature 256:495(1975)が最初に記載したハイブリドーマ法により製造するか、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4816567号参照）により製造することができよう。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら、Nature 352:624-628(1991)およびMarksら、J.Mol.Biol.222:581-597(1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできよう。
本明細書においてモノクローナル抗体は、特に、重および／または軽鎖の部分が特定の種由来の抗体の対応する配列と同じかもしくはホモローガスであるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属するが、残りの鎖が別の種由来の抗体の対応する配列と同じかもしくはホモローガスであるかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する「キメラ」抗体、および所望の生物活性を有する、そのような抗体の断片(米国特許第4816567号、およびMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)を含む。
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限に含むキメラ抗体である。主としてヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類といったヒト以外の種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体やドナー抗体中にみられない残基を含んでいてよい。これらの修飾は抗体の能力をさらに洗練させるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてもしくは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応しており、ＦＲのすべてもしくは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のそれである、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含むであろう。所望により、ヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの部分も含むであろう。さらなる詳細は、Jonesら、Nature 321:522-525(1986),Reichmannら、Nature 332:323-329(1988)、およびPresta, Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)参照。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、一本のポリペプチド鎖中に存在する、抗体のＶHおよびＶLドメインを含む。一般的に、ＦｖポリペプチドはさらにＶHおよびＶLドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これによりｓＦｖは抗原と結合するための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag,New York, 269-315(1994)参照。
用語「ディアボディ」は、同じポリペプチド鎖（ＨＶ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を表す。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングさせるには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを別の鎖と相補的なドメインと強制的にペアリングさせ、２つの抗原結合部位を生じさせる。ディアボディについては、例えば、EP404097、WO93/11161、およびHollingerら、Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)により完全に記載されている。
本明細書において用語「線状抗体」は、Zapataら、Protein Eng.8(10): 1057-1062(1995)に記載の抗体を表す。簡単には、該抗体は抗原結合領域のペアを形成するタンデムＦｄ部分（ＶH−ＣH１−ＶH−ＣH１）のペアを含む。
本明細書において「変異体」抗ＶＥＧＦ抗体は、親抗体配列中の１またはそれ以上の残基の付加、欠失、および／または置換により、「親」抗ＶＥＧＦ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を表す。好ましい態様において、該変異体は親抗体の１またはそれ以上の超可変領域に１またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、該変異体は親抗体の１またはそれ以上の超可変領域に少なくとも１個、例えば、約１〜約１０、好ましくは約２〜約５個の置換を含んでいてよい。通常、該変異体は親抗体重または軽鎖可変ドメイン配列（例えば、配列番号７または８中の）と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。本明細書において、この配列の同一性または相同性は、必要であれば配列同一性パーセントが最大となるように配列を一列に並べ、ギャップを挿入した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントで定義する。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失、もしくは挿入はいずれも配列の同一性または相同性に影響しないと解釈すべきである。該変異体はヒトＶＥＧＦとの結合能を保持し、好ましくは親抗体より優れた特性を有する。例えば、該変異体は、より強い結合親和性を有し、内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖の阻害能が増大し、そして／またはin vivoにおけるＶＥＧＦ誘導性血管形成の阻害能が増大していてよい。そのような特徴を分析するには、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体の構成は本明細書に開示した生物活性アッセイにおけるその活性に影響することがわかっているので、変異体のＦａｂ形を親抗体のＦａｂ形と比較するか、または変異体の完全長形と親抗体の完全長形を比較すべきである。本明細書において特に目的とする変異体抗体は、親抗体と比べて少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、最も好ましくは少なくとも約５０倍生物活性が増大している変異抗体である。
本明細書において「親」抗体は、該変異体を製造するのに用いるアミノ酸配列によってコードされる。好ましくは、該親抗体はヒトフレームワーク領域と、もしあれば、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体はヒト化またはヒト抗体であってよい。
「単離された」抗体は、天然環境の成分から同定され、分離および／または回収されたものである。天然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用と干渉する物質であり、これには酵素、ホルモン、および多のタンパク質または非タンパク質性溶質が含まれよう。好ましい態様において、該抗体は、（１）Lowry法で測定して抗体の９５重量％以上まで、好ましくは、９９重量％以上まで、（２）スピニングカップシーケネターを用いてＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用い、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで精製されるであろう。単離された抗体は、該抗体の天然環境の少なくとも１要素は存在しないであろうから、組換え細胞中のその場の抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗血合いは少なくとも１つの精製工程により製造されよう。
本明細書において用語「タグ付エピトープ」は「エピトープタグ」と融合した抗ＶＥＧＦ抗体を表す。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体を作ることができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、ＶＥＧＦ抗体の活性と干渉しないように十分短い。該エピトープタグは、好ましくは、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないほど十分にユニークである。一般的に、適切なタグポリペプチドは少なくとも６アミノ酸残基、通常約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約９〜３０残基）を有する。例にはｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Fieldら、Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988)）、ｃ−ｍｙｃタグ、およびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Evanら、Mol.Cell.Biol.5(12):3610-3616(1985)、およびHerpes Simplexウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ、およびその抗体（Paborskyら、Protein Engineering 3(6):547-553(1990)が含まれる。ある態様において、エピトープタグは「サルベージレセプター結合エピトープ」である。本明細書において、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のin vivoにおける血清半減期の増大をもたらすＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、またはＩｇＧ4）のＦｃ領域のエピトープを表す。
本明細書において、用語「細胞毒性物質」は、細胞の機能を阻害するか、抑制し、そして／または細胞を破壊する物質を表す。該用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、およびＲｅ186）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物もしくは植物起源の酵素活性を有する毒素のような毒素、またはその断片を含むことを意図している。
「化学療法剤」は癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテレ（Taxotere、ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4675187号参照）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタードが含まれる。
本明細書において用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比べて腫瘍細胞に対する毒性が低い医薬的に活性な物質の前駆体または誘導体を表し、酵素的に活性化または変換されてより活性な親形になることができる。例えば、Wilman,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical Society Transactions, 14,375-382頁、第６１５回会議、Belfast(1986)、およびStellaら、「Prodrugs;A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」,Directed Drug Delivery,Borchardtら編、247-267頁,Humama Press(1985)参照。本発明のプロドラッグには、限定されるモノではないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、所望により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または所望により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、およびより活性な無毒性薬剤に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。本発明に用いるプロドラッグ形に誘導体化することができる細胞毒性薬剤の例には、限定されるものではないが、上記化学療法剤が含まれる。
本明細書において用語「標識」は抗体と直接または間接的に結合する検出可能な化合物または組成物を表す。標識は、それ自身が検出可能であるか（例えば、放射性同位元素標識、または蛍光標識）、または酵素標識の場合には検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒することができよう。
「固相」は、本発明の抗体を吸着することができる非水性マトリックスを意味する。本明細書に含まれる固相の例には、部分的または完全にガラス（例えば孔制御ガラス）、ポリサッカライド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコンで形成されたものがある。ある態様では文脈に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを、他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。この用語には、米国特許第4275149号に記載のような分離した粒子の不連続な固相も含まれる。
「リポソーム」は、種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または薬剤（本明細書に開示の抗ＶＥＧＦ抗体、および所望により化学療法剤のような）を哺乳動物に供給するのに有用な界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、通常、生物膜の脂質配置と同様に二重層を形成するよう配列する。「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然の供給源と通常結合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は天然にみいだされる形または配列（setting）以外のものである。したがって、単離された核酸分子は天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば天然の細胞とは異なる染色体位置にある、抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物中で操作可能に連結されたコード配列を発現するのに必要なＤＮＡ配列を表す。例えば、原核生物に適した制御配列にはプロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれているとき「操作可能に連結している」という。例えば、プレ配列のＤＮＡまたは分泌リーダーは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡと操作可能に連結しているか、プロモーターまたはエンハンサーは、それらが配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と操作可能に連結しているか、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促すように位置している場合にコード配列と操作可能に連結している。一般的に、「操作可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し、読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していてはならない。連結は好都合な制限部位で結合することにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを通常の方法に従って用いる。
本明細書において、用語「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は置き換え可能に用いられ、すべてのそのような名称には子孫が含まれる。このように、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、一次対象細胞とトランスファー数に関わらずそれらから誘導された培養を含む。すべての子孫は、意図的または偶然の突然変異によりＤＮＡ含量が正確に同じではないことがあることも理解される。最初の形質転換細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異子孫も含まれる。異なる意味を意図する場合は文脈から明らかであろう。
II．本発明の実施方法
下記の実施例において、（ａ）ＶＥＧＦ抗原に対する強い結合親和性、（ｂ）in vitroにおける内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害する能力、および（ｃ）in vivoにおけるＶＥＧＦ誘導性血管形成の阻害能を含む治療的観点から望ましい特性を有するヒト化および変異体抗ＶＥＧＦ抗体の製造方法を説明する。
抗体の親和性は、下記実施例に記載のごとく測定することができよう。好ましいヒト化または変異体抗体は、約１ｘ１０-7Ｍを超えない、好ましくは約１ｘ１０-8Ｍを超えない、最も好ましくは約５ｘ１０-9Ｍを超えないＫｄ値でヒトＶＥＧＦと結合する抗体である。
ヒトＶＥＧＦに対する強い結合親和性を有する抗体のほかに、治療的観点から他の有益な特性を有するヒト化または変異体抗体を選ぶことも好ましい。例えば、該抗体はＶＥＧＦに応じた内皮細胞増殖を阻害するものであってよい。ある態様において、該抗体は、ＶＥＧＦのほぼ最大有効濃度（３ｎｇ／ｍＬ）に応じたウシ毛細血管内皮細胞増殖を阻害することができよう。好ましくは、該抗体の「内皮細胞増殖アッセイ」において内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害するための有効用量５０（ＥＤ５０）値は、約５ｎＭを超えず、好ましくは約１ｎＭを超えず、最も好ましくは約０．５ｎＭを超えず、すなわち、これらの濃度で該抗体はin vitroにおけるＶＥＧＦ誘導性内皮細胞増殖を５０％阻害することができる。好ましい「内皮細胞増殖アッセイ」には、下記実施例１に実質的に記載のごとく、１０％子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、および抗生物質を添加した低グルコースDulbecco改良Eagle培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）（増殖培地）の存在下でウシ副腎皮質由来毛細血管内皮細胞を培養することを含む。この内皮細胞を、増殖培地を入れた６ウェルプレートに６ｘ１０3個の密度で接種する。次に、親抗ＶＥＧＦ抗体（コントロール）、ヒト化または変異体抗ＶＥＧＦ抗体を１〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で加える。２〜３時間後、精製ＶＥＧＦを最終濃度３ｎｇ／ｍＬに加える。特異性のコントロールとして、各抗体を単独かまたは２ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦの存在下で、濃度５０００ｎｇ／ｍＬで内皮細胞に加えてよい。５または６日後、細胞をトリプシンに曝露して分離し、Coulterカウンター（Coulter Electronics,Hialeah,FL）でカウントする。データは４パラメーター適合プログラム（KaleidaGraph）により分析することができよう。
好ましいヒト化または変異体抗ＶＥＧＦ抗体は、in vitro腫瘍抑制活性を有するものでもよい。例えば、該抗体は、ヌードマウスにおいてヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞または乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖を抑制することができよう。in vivo腫瘍実験において、ヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞（ACTT;CRL1598）または乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（ACTTから入手可能）を、下記実施例１に記載のごとく１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、および抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養する。雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６〜１０週令）の背部に腫瘍細胞２ｘ１０6個（容量２００μＬ）を皮下注射する。次に、動物をヒト化または変異体抗体、およびこのアッセイにおいて活性のないコントロール抗体で処理する。ヒト化または変異体抗ＶＥＧＦ ＭＡｂは０．５および／または５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。腫瘍細胞を接種して２４時間後から各ＭＡｂ（容量１００μＬ）の１週間に２回の腹腔内投与を開始する。腫瘍のサイズを１週間間隔で測定する。腫瘍細胞を接種して４週間後に動物を安楽死させ、腫瘍を取り出し、重さを量る。統計分析はＡＮＯＶＡにより行うことができよう。好ましくは、この「in vivo腫瘍アッセイ」において該抗体は用量５ｍｇ／ｋｇで、ヒトＡ６７３腫瘍細胞の増殖を約５０〜１００％、好ましくは約７０〜１００％、最も好ましくは約８０〜１００％阻害する。
好ましい態様において、ヒト化または変異体抗体は、ヒト患者に治療的有効量の抗体を投与しても免疫原性反応を誘導しない。免疫原性反応を誘導する場合は、好ましくは該反応は、該抗体がまだそれで治療される患者に治療的恩恵を与えるほどのものであろう。
ヒト化または変異体抗体は、ヒトにおけるＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害する、例えば、ヒト腫瘍増殖を阻害し、そして／または網膜障害において眼内血管形成を阻害することができるものも好ましい。
好ましい抗体は、本明細書で定義した「エピトープＡ４．６．１」を結合する。目的とする抗体と結合するヒトＶＥＧＦのエピトープと結合する抗体（例えば、Ａ４．６．１抗体のヒトＶＥＧＦへの結合をブロックするもの）をスクリーニングするには、Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,HarlowおよびDavid Lane編（1988）に記載されているような常套的交差ブロッキングアッセイを実施することができる。あるいはまた、例えば、Champeら、J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)に記載のエピトープマッピングを実施し、抗体が目的とするエピトープと結合するかどうかを測定する。
本明細書において、好ましい態様の抗体は、式：ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４（ここで、「ＦＲ１−４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＨ１−３」は抗ＶＥＧＦ抗体可変重ドメインの３つの超可変領域を表す）によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１−４は、下記実施例に記載のごとく「コンセンサス配列」（すなわち、ヒト免疫グロブリンの重または軽鎖のクラス、サブクラス、またはサブグループの最も共通したアミノ酸）から誘導されるか、または個々のヒト抗体フレームワーク領域もしくは異なるフレームワーク領域配列の結合物から誘導することができよう。多くのヒト抗体フレームワーク領域配列は、例えばKabatら（上記）に記載されている。ある好ましい態様において、可変重ＦＲは、Kabatら（上記）に記載のごとくヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により提供される。好ましくは、ヒト免疫グロブリンサブグループはヒト重鎖サブグループIII（例えば配列番号１１にあるような）である。好ましくは、ヒト可変重ＦＲ配列はその中に置換を有し、例えば、ヒトＦＲ残基は対応する非ヒト残基で置換されているが（「対応する非ヒト残基」は、ヒトおよび非ヒト配列を一列に並べる時に目的とするヒト残基と同じKabat位置番号を有する非ヒト残基を意味する）、非ヒト残基による置換は必要でない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換ＦＲ残基はファージ表示により選ぶことができよう（下記実施例２参照）。置換されていてよい可変重ＦＲ残基に例には、ＦＲ残基番号：３７Ｈ、４９Ｈ、６７Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７５Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈ、９４Ｈ（ここではKabat残基番号付け法を用いた）のいずれか１つまたはそれ以上を含む。好ましくは、これら残基の少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、または少なくとも４つが置換されている。ＦＲ置換の特に好ましい組合せは、４９Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈ、および９４Ｈである。
重鎖超可変領域に関して、これらは以下のアミノ酸配列を有することが好ましい：
ＣＤＲＨ１
ＧＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＹＧＸ5Ｎ（配列番号１１９）（ここで、Ｘ1はＤ、Ｔ、またはＥであるが好ましくはＤまたはＴであり、Ｘ2はＦ、Ｗ、またはＹであるが好ましくはＦであり、Ｘ3はＴ、Ｑ、Ｇ、またはＳであるが好ましくはＴであり、Ｘ4はＨまたはＮであり、Ｘ5はＭまたはＩであるが好ましくはＭである）。
ＣＤＲＨ２
ＷＩＮＴＸ1ＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１２０）（ここで、Ｘ1はＹまたはＷであるが好ましくはＹである）。
ＣＤＲＨ３
ＹＰＸ1ＹＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＨＷＹＦＤＶ（配列番号１２１）（ここで、Ｘ1はＨまたはＹであり、Ｘ2はＹ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、またはＷであるが好ましくはＹであり、Ｘ3はＧ、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｔ、Ｋ、またはＳであるが好ましくはＧであり、Ｘ4はＳ、Ｔ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｅ、またはＧであるが好ましくはＳまたはＴであり、Ｘ5はＳまたはＧであるが好ましくはＳである）。
所望により、重鎖可変ドメインは本明細書においてＦＲ３中の（すなわち、の一部を構成する）「ＣＤＲ７」で示される（図９Ｂおよび１０Ｂ参照）（ここで、ＣＤＲ７は以下のアミノ酸配列を有してよい：
ＣＤＲ７
Ｘ1ＳＸ2ＤＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＴＸ7（配列番号１２２）（ここで、Ｘ1はＦ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、またはＡであるが好ましくはＦであり、Ｘ2はＡ、Ｌ、Ｖ、またはＩであるが好ましくはＬであり、Ｘ3はＴ、Ｖ、またはＫであるが好ましくはＴであり、Ｘ4はＳまたはＷであるが好ましくはＳであり、Ｘ5はＳまたはＫであるが好ましくはＫであり、Ｘ6はＮまたはＳであるが好ましくはＳであり、Ｘ7はＶ、Ａ、Ｌ、またはＩであるが好ましくはＡである））。
本明細書において好ましい態様の抗体は、式：ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４（ここで、「ＦＲ１−４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＬ１−３」は抗ＶＥＧＦ抗体可変重ドメインの３つの超可変領域を表す）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１−４は、下記の実施例に記載のごとく「コンセンサス配列」（すなわち、ヒト免疫グロブリンの重または軽鎖のクラス、サブクラス、またはサブグループの最も共通したアミノ酸）から誘導するか、または個々のヒト抗体フレームワーク領域もしくは異なるフレームワーク領域配列の組合せから誘導することができよう。ある好ましい態様において、可変軽ＦＲはKabat（上記）に記載のごとくヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により提供される。好ましくは、ヒト免疫グロブリンサブグループはヒトκ軽鎖サブグループＩ（例えば、配列番号１２中）。
好ましくは、ヒト可変軽ＦＲ配列はその中に置換を有するが（例えば、ここで、ヒトＦＲ残基は対応するマウス残基で置換されている）、非ヒト残基による置換は必要でない。置換されていてよい可変ＦＲ残基の例には、ＦＲ残基番号：４Ｌ、４６Ｌ、および７１Ｌ（ここではKabat残基番号付け法を用いた）のいずれか１つまたはそれ以上を含む。好ましくは、４６Ｌのみが置換されている。別の態様において、４Ｌおよび４６Ｌがともに置換されている。
ＣＤＲに関して、これらは以下のアミノ酸配列を有することが好ましい：
ＣＤＲＬ１
Ｘ1ＡＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＳＮＹＬＮ（配列番号１２３）（ここで、Ｘ1はＲまたはＳであるが好ましくはＳであり、Ｘ2はＳまたはＮであるが好ましくはＳであり、Ｘ3はＱまたはＥであるが好ましくはＱであり、Ｘ4はＱまたはＤであるが好ましくはＤであり、Ｘ5はＩまたはＬであるが好ましくはＩである)。
ＣＤＲＬ２
ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１２４）。
ＣＤＲＬ３
ＱＱＹＳＸ1Ｘ2ＰＷＴ（配列番号１２５）（ここで、Ｘ1はＴ、Ａ、またはＮであるが好ましくはＴであり、Ｘ2はＶまたはＴであるが好ましくはＶである）。
好ましいヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、実施例１のＦ（ａｂ）−１２の重および／または軽可変ドメイン配列を有する抗体、および実施例３の変異体Ｙ０３１７、Ｙ０３１３−１、およびＹ０２３８−３を含む親和性成熟形のような該抗体の変異体であり、Ｙ０３１７が好ましい変異体である。本明細書において目的とするヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を製造する方法については以下に詳述する。
Ａ．抗体の製造
非ヒトＶＥＧＦ抗体のヒト化方法、および抗ＶＥＧＦ抗体の変異体の製造方法は下記実施例に記載している。抗ＶＥＧＦ抗体をヒト化するには、非ヒト抗体出発物質を調製する。変異体を作製する親抗体を調製する。そのような非ヒト抗体出発物質および親抗体の作製方法の例は以下の項に記載する。
（ｉ）抗原の製造
抗体の製造に用いるＶＥＧＦ抗原は、例えば完全ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ断片（例えば、「エピトープＡ４．６．１」を含むＶＥＧＦ断片）であってよい。抗体を製造するのに有用な他のＶＥＧＦは当業者に明らかであろう。抗体を製造するのに用いるＶＥＧＦ抗原は、好ましくは、例えばLeungら、Science 246: 1306(1989)、およびHouckら、Mol.Endocrin.5:1806(1991)に記載のヒトＶＥＧＦである。
（ii）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物で生じさせるのが好ましい。二機能性または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタールアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ2、またはＲ1 Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）を用い、関連抗原を、免疫する種に対して免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターと結合させるのに有用かも知れない。
例えば、タンパク質またはコンジュゲート１００μｇまたは５μｇ（それぞれウサギまたはマウスに対し）をフロインドの完全アジュバント３容量と混合し、該溶液を複数部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体で免疫する。１ヶ月後に、フロインドの完全アジュバント中の、最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを複数箇所に皮下注射することにより動物にブースターをかける。７〜１４日後に動物から採血し、血清中の抗体価を測定する。抗体価がプラトーに達するまで動物にブースターをかける。好ましくは、別の架橋試薬を用いておよび／または異なるタンパク質と結合させた同じ抗原とのコンジュゲートを用いて動物にブースターをかけるのが好ましい。コンジュゲートは組換え細胞培養中でタンパク質融合物として作製することもできる。アラムのような凝集剤も免疫応答の増強に使用するのに適している。
（iii）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495(1975)に最初に記載のハイブリドーマ法を用いて製造するか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第4816567号）により製造することができよう。
ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターもしくはマカークザルのような他の適切な宿主動物を既述のごとく免疫し、免疫に用いたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか、もしくは産生することができるリンパ球を誘導する。次に、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103(Academic Press,1986)。
このように作製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合の親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含む、適切な培養液に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合は、典型的には、該ハイブリドーマ用の培養液には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を抑制する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USAから入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍、およびAmerican  Type Culture Collection,Rockville,Maryland USAから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導される細胞のようなネズミミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系によるヒトモノクローナル抗体の製造も記載されている（Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984), Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養液について、該抗原に対するモノクローナル抗体の産生をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなin vitro結合アッセイにより測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonら、Anal.Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析により測定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定し、次いで、該クローンを限界希釈法によりサブクローンし、標準的方法により増殖させることができよう（Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103(Academic Press,1986)。この目的に適した培養液は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞はin vivoにおいて動物の腹水腫瘍として増殖することができよう。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィのような通常の免疫グロブリン精製法により培養液、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体は、コードするＤＮＡは通常の手順を用いて容易に単離し、配列決定することができる（例えば、モノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。ハイブリドーマ細胞はＤＮＡのような好ましい供給源として供給される。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、次いでこれをこれをE.coli細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞といった宿主細胞にトランスフェクションし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させる。抗体の組換えによる製造については以下でより詳細に説明する。
（iv）ヒト化およびアミノ酸配列変異体
以下の実施例１−２は、抗ＶＥＧＦ抗体のヒト化方法を記載する。ある態様において、これらのヒト化抗体のアミノ酸配列変異体を作成するのが望ましくあり得、特に、これらは、ヒト化抗体の結合親和性または他の生物学的性質を改善する。実施例３は、親抗体に比べて親和性が高められた抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列変異体を作成する方法を記載する。
抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗ＶＥＧＦ抗体のＤＮＡに導入することにより、またはペプチド合成により製造する。そのような変異体には、例えば、本明細書中での実施例の抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらの残基への挿入、および／またはそれらの残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特性を有するならば、欠失、挿入、および置換のいずれかの組み合わせを最終構築物で達成させる。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるような、ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体の翻訳後プロセスも変え得る。
変異誘発に好ましい位置である抗ＶＥＧＦ抗体のある残基または領域の同定に有用な方法は、CunninghamおよびWells, Science, ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）により記載されているように、「アラニン走査型変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基または基を同定して（例えば、arg、asp、his、lys、およびgluといったような荷電残基）、中性または陰性に荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、アミノ酸とＶＥＧＦ抗原との相互作用に影響を与える。次いで、さらなる変異体または他の変異体を置換部位に導入することにより、またはそれらを置換部位に代えて導入することにより、置換に対する機能的感受性を実証するそれらのアミノ酸の位置を正確にする。従って、アミノ酸配列の変異を導入する部位は予め決定しておくが、その変異の種類を本来は予め決定しておく必要はない。例えば、ある一定部位での変異の成果を分析するためには、ala走査またはランダム変異誘発を標的コドンまたは領域で行って、発現した抗ＶＥＧＦ抗体の変異体を所望の活性に関してスクリーニングする。アラニン走査型変異誘発を実施例３に記載する。
アミノ酸配列挿入には、１つの残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドの範囲にわたるアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、さらにはまた、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基をもつ抗ＶＥＧＦ抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗ＶＥＧＦ抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの抗ＶＥＧＦ抗体のＮまたはＣ末端への融合が含まれる（以下を参照）。
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＶＥＧＦ抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されていて、違う残基がその場所に挿入されている。置換変異誘発に最も重要な部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲ変更もまた意図する。同型置換を「好ましい置換」という表題で表１に示す。そのような置換が生物学的活性に変化を及ぼすなら、表１において「例示的な置換」と称する、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載する、より多くの実質的変化を導入して、生成物をスクリーニングするのがよい。
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抗体の生物学的性質における実質的改変は、（ａ）例えば、イス形もしくはらせん形配座のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するそれらの効果において著しく異なる置換を選択することにより成し遂げられる。天然に存在する残基を共通の側鎖の性質に基づいてグループに分ける。
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の疎水性：cys、ser、thr；
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：gly、pro；および
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非同型置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを必然的に伴う。
ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体の適切な配座を維持するのに関与しないシステイン残基をいずれもまた、一般的には、セリンで置換して、その分子の酸化安定性を改善して、異常な架橋を防ぐこともできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、その抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたはそれ以上の超可変領域の残基を含む。一般的には、さらなる開発のために選択される、その結果得られた変異体は、それらを作成する親抗体に比べて改善された生物学的性質を有するであろう。そのような置換変異体を作成するための便利な方法は、ファージ表示を使用する親和性成熟である（本明細書中の実施例３を参照）。簡単に言えば、幾つかの超可変領域の部位（例えば、６−７の部位）を変異させて、各々の部位で全ての可能なアミノ置換を生じさせる。このようにして作成した抗体の変異体を、各々の粒子内に詰め込まれたＭ１３の遺伝子III産物への融合のような、繊維状ファージ粒子に由来する一価方法で表示する。次いで、そのファージで表示した変異体を、本明細書中に開示するそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングする。改変に関して候補となる超可変領域の部位を同定するために、抗原結合に著しく寄与する同定された超可変領域の残基に対して、アラニン走査型変異誘発（実施例３を参照）を行うことができる。あるいはまた、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＶＥＧＦとの間の接触点を同定するのが有利となり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書中で詳細に述べる技術による置換に関しての候補である。そのような変異体を作成したら、パネルの変異体を本明細書中に記載するスクリーニングにかけて、１つまたはそれ以上の関連したアッセイにおいて優れた性質をもつ抗体をさらなる開発のために選択するのがよい。
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、その抗体の元のグリコシル化パターンを変える。変えるという語は、抗体中に見出される１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体中には存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の結合をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除き、いずれかのアミノ酸である。）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素結合に対する認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンへの、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用することができる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、便利には、１つまたはそれ以上の上記の（Ｎ結合型グリコシル化部位に対する）トリペプチド配列を含むよう、アミノ酸配列を変えることにより成し遂げられる。その変更はまた、元の抗体の配列への（Ｏ結合型グリコシル化部位に対する）１つもしくはそれ以上のセリンもしくはトレオニン残基の付加、またはそれらでの置換によっても成され得る。
抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当業界で知られている様々な方法により製造する。これらの方法には、限定されるものではないが、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または抗ＶＥＧＦ抗体の初期に作成した変異体または非変異体種のオリゴヌクレオチドが媒介する（もしくは部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット式変異誘発による製造が含まれる。
（ｖ）ヒト抗体
ヒト化の他の方法として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、現在、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の不存在下に全レパトアのヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが可能である。例えば、キメラおよび生殖系変異マウスにおける抗体の重鎖接続領域（ＪH）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を引き起こすことが記載されている。そのような生殖系変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原攻撃に対してヒト抗体の産生を引き起こすであろう。例えば、Jakobovitsら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９０:２５５１（１９９３）；Jakobovitsら, Nature, ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Bruggermannら, Year in Immuno., ７：３３（１９９３）；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号を参照。ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーから誘導することもできる（Hoogenboomら, J. Mol. Biol,, ２２７：３８１（１９９１）；Marksら, J. Mol. Biol., ２２２：５８１−５９７（１９９１）；並びに米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）。上に論じたように、ヒト抗体はまた、インビトロにおける活性化Ｂ細胞により作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照）。
（vi）抗体フラグメント
ある態様において、ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体は、抗体フラグメントである。様々な技術が抗体フラグメントの産生に関して開発されている。伝統的には、これらのフラグメントを完全な抗体のタンパク質分解消化によって誘導した（例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods ２４：１０７−１１７（１９９２）およびBrennanら, Science ２２９：８１（１９８５）を参照）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントをE. coliから直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成することができる（Carterら, Bio／Technology １０：１６３−１６７（１９９２））。別の態様において、ロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して、Ｆ（ａｂ’）2を形成し、Ｆ（ａｂ’）2分子の集合を促進する。別の方法により、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）2フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかであろう。
（vii）多重特異性抗体
幾つかの態様において、少なくとも２つの違うエピトープに対して結合特異性を有する、多重特異性（例えば、二重特異性）ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体を作成するのが望ましくあり得る。例示的な二重特異性抗体は、ＶＥＧＦタンパク質の２つの違うエピトープに結合し得る。あるいはまた、ＶＥＧＦ発現細胞に対する細胞防御機構に焦点を合わせるよう、抗ＶＥＧＦアームを、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような白血球上のトリガーリング（triggering）分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲII（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲIIIに（ＣＤ１６）といったような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合するアームと組み合わせてもよい。二重特異性抗体をまた使用して、ＶＥＧＦを発現する細胞に細胞傷害性物質を局在化することもできる。これらの抗体は、ＶＥＧＦ結合アーム、および細胞傷害性物質（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として製造することができる。
二重特異性抗体を製造するための別の方法により、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大にすることができる。好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも部分を含んでなる。この方法では、一次抗体分子の界面に由来する１つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、その大きな側鎖と同一または同様の大きさの代償的な「空洞」が二次抗体分子の界面上に作り出される。このことは、ホモダイマーのような他の所望されていない最終生成物に対するヘテロダイマーの収率を増大させる機構を与える。１９９６年９月６日に発行されたＷＯ９６／２７０１１を参照。
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートでの抗体のうちの１つをアビジンに結合して、他方をビオチンに結合することができる。いずれかの便利な架橋方法を使用して、ヘテロコンジュゲート抗体を製造することができる。適当な架橋剤は当業界で周知であって、多くの架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して、二重特異性抗体を製造することができる。Brennanら, Science ２２９：８１（１９８５）は、完全な抗体をタンパク質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを作成するという方法を記載している。これらのフラグメントをジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元し、隣接のジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を防ぐ。次いで、作成したＦａｂ’ブラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、そのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つをメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再び転換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための物質として使用することができる。またさらなる態様において、E. coliから直接回収したＦａｂ’−ＳＨフラグメントをインビトロにおいて化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med. １７５：２１７−２２５（１９９２）。
組換え細胞培養から直接、二重特異性抗体フラグメントを製造して単離するための様々な技術もまた記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して、二重特異性抗体を産生している。Kostelnyら, J. Immunol. １４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの違う抗体のＦａｂ’部分に結合させた。その抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元して、モノマーを形成した後、再び酸化して、抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生にも利用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載されている「ジアボディ（diabody）」技術は、二重特異性抗体フラグメントを製造するための他の機構を与えている。そのフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にすることができないリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶL）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶH）を含んでなる。従って、１つのフラグメントのＶHおよびＶLドメインを別のフラグメントの相補的ＶLおよびＶHドメインと対にするようにし、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを製造するための別の方法もまた報告されている。Gruberら, J. Immunol. １５２：５３６８（１９９４）を参照。あるいはまた、二重特異性抗体は、Zapataら, Protein Eng. ８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されているように製造した「線状抗体」であってもよい。
２価以上の抗体を意図する。例えば、三重特異性抗体を製造することができる。Tuttら, J. Immunol. １４７：６０（１９９１）を参照。
（viii）他の改変
ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体の他の改変を意図する。例えば、癌を処置する際の抗体の有効性を高めるよう、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変するのが、例えば、望ましくあり得る。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによって、この領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能とし得る。このようにして作成したホモダイマー抗体は、改善されたインターナリゼーション能力および／または増大された補体が媒介する細胞壊死および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caronら, J. Exp. Med. １７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびShopes, B., J. Immunol. １４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。Wolffら, Cancer Research ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているヘテロ二官能性架橋物質を使用して、高められた抗腫瘍活性をもつホモダイマー抗体をまた製造することもできる。あるいはまた、２つのＦｃ領域を有する抗体を操作することができ、それによって、高められた補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design ３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）といったような細胞傷害性物質にコンジュゲートした本明細書中に記載する抗体を含んでなるイムノコンジュゲートに関する。
そのようなイムノコンジュゲートの作成に有用な化学療法剤を上に記載している。使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（Pseudomonas aeruginosaに由来する）エンドトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡII、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロテン（crotin）、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンズ（tricothecenes）が含まれる。様々な放射性核種を放射性コンジュゲートした抗ＶＥＧＦ抗体の産生に利用することができる。例には、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅが含まれる。
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（iminothiolane）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチル・アジピミデート（dimethyl adipimidate）ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）といったような、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して、抗体および細胞傷害性物質のコンジュゲートを製造する。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitettaら, Science ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように製造することができる。炭素−１４で標識化した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションに関する例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
別の態様において、抗体を腫瘍の前標的化における利用のための「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートさせ、ここで、その抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、続いて、キレート化剤を使用して、結合していないコンジュゲートを循環から除去した後、細胞傷害性物質（例えば、放射性核種）にコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与するのがよい。
本明細書中に開示する抗ＶＥＧＦ抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化することもできる。Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８２：３６８８（１９８５）；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７７：４０３０（１９８０）；並びに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているような、当業界で知られている方法により、その抗体を含むリポソームを製造する。高められた循環時間をもつリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物での逆相蒸発方法により作成することができる。リポソームを、定められた細孔径のフィルターを通して押出し、所望の直径をもつリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Martinら, J. Biol. Chem. ２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応によってリポソームにコンジュゲートすることができる。場合により、化学療法剤（例えば、Doxorubicin）をリポソーム内に含む。Gabizonら, J. National Cancer Inst. ８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照。
本発明の抗体はまた、その抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照）を活性抗癌剤に転換するプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することもできる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照。
ＡＤＥＰＴに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分には、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に転換するような方法で、それに作用することができるいずれかの酵素が含まれる。
本発明の方法において有用である酵素には、限定されるものではないが、ホスフェートを含むプロドラッグを遊離の薬物へと転換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルフェートを含むプロドラッグを遊離の薬物へと転換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒の５−フルオロシトシンを抗癌剤である５−フルオロウラシルへと転換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含むプロドラッグを遊離の薬物へと転換するのに有用な、セラチア（serratia）プロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）といったようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを転換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬物へと転換するのに有用な、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミダーゼといったような炭水化物を切断する酵素；β−ラクタムで誘導体化した薬物を遊離の薬物へと転換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；並びに各々、それらのアミン窒素のところをフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化した薬物を遊離の薬物へと転換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼといったようなペニシリンアミダーゼが含まれる。あるいはまた、当業界ではまた「触媒抗体」としても知られている酵素活性をもつ抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離の活性薬物に転換することができる（例えば、Massey, Nature ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照）。抗体−触媒抗体コンジュゲートは、腫瘍細胞集団への触媒抗体の送達に関して本明細書中に記載するように製造することができる。
上に論じたヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような、当業界でよく知られている技術により、本発明の酵素を抗ＶＥＧＦ抗体に共有結合させることができる。あるいはまた、当業界でよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した、本発明の抗原の少なくとも抗原結合領域を含んでなる融合タンパク質を構築することができる（例えば、Neubergerら, Nature ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照）。
本発明のある態様において、完全な抗体よりはむしろ、抗体フラグメントを使用して、例えば、腫瘍浸透を増大させるのが望ましくあり得る。この場合には、抗体フラグメントを改変して、その血清半減期を増大させるのが望ましくあり得る。このことは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの取込みにより（例えば、抗体フラグメント中の適当な領域の変異により、またはペプチドタグにエピトープを取込んだ後、例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって、抗体フラグメントに端または真中のところで融合させることにより）達成することができる。１９９６年１０月１７日に発行されたＷＯ９６／３２４７８を参照。
そのサルベージ受容体結合エピトープは、一般的には、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する、いずれかの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を抗体フラグメントの類似（analogous）領域に転移させるという領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する、３つまたはそれ以上の残基を転移させる。またより好ましくは、そのエピトープを（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取って、その抗体のＣＨ１、ＣＨ３、またはＶH領域、または１つ以上のそのような領域に転移させる。あるいはまた、そのエピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取って、その抗体フラグメントのＣL領域もしくはＶL領域、または両方に転移させる。
ある最も好ましい態様において、そのサルベージ受容体結合エピトープは、特に、その抗体フラグメントがＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である場合、配列：ＰＫＮＳ  ＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号１７）を含んでなり、場合により、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号１８）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１９）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２０）、またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号２１）よりなる群から選択される配列をさらに含んでなる。別の最も好ましい態様において、そのサルベージ受容体結合エピトープは、配列：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１９）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２０）、またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号２１）、および配列：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号１７）を含むポリペプチドである。
ヒト化または変異抗ＶＥＧＦ抗体の共有結合による改変もまた、本発明の範囲内に含まれる。それらは、化学合成により、または適用できるならば、抗体の酵素もしくは化学切断により成され得る。他のタイプの抗体の改変は、抗体の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することできる有機誘導体化剤と反応させることにより分子に導入される。ポリペプチドの例示的な共有結合による改変は、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている（この米国特許に記載されている内容は、本発明の一部を具体的に構成する）。抗体の好ましいタイプの共有結合による改変は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に示されている方法で、抗体を様々な非タンパク質性（nonproteinaceous）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに結合することを含んでなる。
Ｂ．ベクター、宿主細胞および組換方法
本発明はまた、ひと化または変異抗−ＶＥＧＦ抗体をコードする分離された核酸、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞、および抗体産生のための組換技術を提供する。
抗体の組換体産生のために、これをコードする核酸を分離し、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入する。別の態様において、この抗体は相同組換によって産生することができる。例えば、それは米国特許第５，２０４，２４４号に記載されており、ここに引用してこの明細書の記載とする。モノクローナル抗体をコードする抗体は容易に分離され、常套的手段を用いて配列決定することができる（例えば、この抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。多くのベクターを利用することができる。一般的に、ベクター成分は下記のもの１つまたはそれ以上を含むが、これに限定されるものではない：シグナル配列、複製開始点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、および転写終結点配列、例えば、１９９６年７月９日発行の米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、ここに引用してこの明細書の記載とする。
ここに記載のベクターのＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は原核生物、酵母、上記の高等真核細胞である。この目的のために適した原核細胞はグラム陰性またはグラム陽性微生物などの真生細菌、例えば、EscherichiaなどのEnterobacteriaceae、例えば、E. coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えば、Salmonella typhimurium、Serratia、例えばSerratia marcescansおよびShigella、およびBacilli、例えばB. subtilisおよびB. licheniformis（例えば、１９８９年４月１２日刊行のＤＤ２６６，７１０に開示されたB. licheniformis 41P）、Pseudomonas、例えば、P. aeruginosalおよびStreptomycesなどである。好ましいE. coliクローニング宿主はE. coli２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、E. coli B, E. coli Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびE. coli Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）などの他の株も適している。これらの例は説明のためのものであり限定ではない。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核細菌は抗−ＶＥＧＦ抗体コードベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。
Saccharomyces cerevisiaeまたは他の普通のパン酵母は下等真核宿主微生物のうち最も普通に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種および株はここでは通常用いられ、有用である。例えば、Schizosaccharomyces pombe；K. lactis、K. fragilis（ＡＴＣＣ １２，４２４）、K. bulgaricus（ＡＴＣＣ １６，０４５）、K. wickeramii（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、K. waltii（ＡＴＣＣ ５６，５００）、K. drosophilarum（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、K. theromotoleransおよびk. marxiamisなどのKluyveromyces宿主；Pichia pastoris（EP 183,070）；Candid；Trichoderma reesia（ＥＰ ２４４，２３４）；Neurospora crassa；Schwanniomyces occidentalisなどのSchwanniomyces；および、例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladiumなどの糸状菌およびA.nidulansおよびA.nigerなどのAspergillus宿主である。
グコシル化抗−ＶＥＧＦ抗体の発現に適した宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株および変異体およびSpodoptera frugiperda（イモムシ）、Aedes aegypti（カ）、Aedes albopitus（カ）、Drosophila melanogaster（ミバエ）およびBombyx moriなどの宿主からの対応許容昆虫宿主細胞が確認されている。転写のための種々のウイルス株が一般に用いられており、例えば、Autographa californica NPVのＬ−１変異体およびBombyx mori NPVのＢｍ−５株であり、また、そのようなウイルスは本発明のここに記載のウイルスとして用いられ、特に、Spodoptera frugiperda細胞の軽質移入のために用いられる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物は宿主として用いることができる。
しかしながら、最も興味深いのは脊椎動物細胞であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は常套的方法になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系；ひと胎児性腎臓系（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59（1977）、２９３または懸濁培養物中生長のためにサブクローニングされた２９３細胞；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（CHO,Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980））；マウスセルトリ細胞（TM4, Mathgr, Biol. Reprod. 23:243-251（1980））；サル腎臓細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ひと頚部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；牡牛ネズミ肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ひと肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ひと肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら、Annals N.Y.Acad. Sci.383:44-68（1982））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびひと肝臓癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は抗−ＶＥＧＦ抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーター誘導、形質転換体選択、所望の配列をコードする遺伝子増幅に適するように修正された通常の栄養培地中で培養される。
本発明の抗−ＶＥＧＦ抗体産生のために用いられる宿主細胞は種々の培地中で培養される。Ham'sＦ１０（Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ），（Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）およびダルベコ修正イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma）などの市販の培地は宿主細胞の培養に適している。さらに、Ham et al., Meth. Enz.58:44（1979）、Barnes et al., Anal.Biochem. 102:255（1980）、米国特許第４，７６７，７０４号；４，６５７，８６６号；４，９２７，７６２号；４，５６０，６５５号；または５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Re．第３０，９８５号記載の培地は宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地のいくつかには、必要ならば、ホルモンおよび／または他の成長因子（インシュリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝液類（ＨＥＰＥＳなど）ヌクレオチド類（アデノシンおよびチミジンなど）抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬剤など）、微量成分（通常μモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が補充される。他の必要な補充物が当業者に知られている適当な濃度で含まれる。温度、ｐＨなどの培養条件は発現のために用いられた宿主細胞で既に用いられた条件であり、当業者に明らかである。
組換技術を用いるとき、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔中に産生されるか、または直接培地中に放出される。抗体が細胞内に産生されるならば、第１段階として、宿主細胞または融解フラグメントのいずれかの粒子状の細片が、例えば、遠心分離または限外濾過にて除去される。Carter et al., Bio/Technology 10:163-167（1992）はE.coliの細胞膜周辺腔に分泌された抗体の分離方法を開示している。要約すれば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下約３０分以上浸漬する。細胞片は遠心分離で除去できる。抗体が培地中に分泌される場合は、発現系からの上清は一般に、最初市販の蛋白濃縮フィルター、例えば、アミコンまたはミルポアペリコン限外濾過ユニットによって濃縮される。ＰＭＳＦなどの蛋白質分解酵素阻害剤を蛋白質分解阻害のために前の段階のどこかで添加してもよく、また、外来性の混入物の成長を阻害するために抗生物質を添加してもよい。
細胞から産生された抗体組成物は例えば、ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティ・クロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティ・クロマトグラフィーが精製技術として好ましい。アフイニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在するイムノグロブリンＦｃの種類および同位元素によって変化する。プロテインＡはひとγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:I-13（1983））。プロテインＧはすべてのマウス同位元素およびひとγ３に好ましい（Guss et al., EMBO J. 5:15671575（1986））。アフィ二ティ・リガンドが結合するマトリックスは多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスも使用することができる。調整された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスでは、アガロースがなし得るより、早い流速および短い処理時間が可能である。抗体がＣH３ドメインを含む場合は、Bakerbond ABXTM樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に好適である。イオン交換カラムでの分留、エタノール沈殿、逆層ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（アスバラギン酸カラム）上のヘパリンセファローズTMクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿などの蛋白質精製のための他の技術もまた、回収する抗体に応じて利用することができる。
何らかの予備的精製段階（複数あり）の後、当該抗体および混入物を、好ましくは低塩濃度（例えば、０−０．２５Ｍ塩から）で、ｐＨ約２．５−４．５の溶出緩衝液を用いて、低ｐＨ疎水的相互作用クロマトグラフィーにかける。
Ｃ．医薬製剤
抗体の治療製剤は、任意の生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤とともに所望の精製度を有する抗体を混合して貯蔵のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に製造される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980））。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、レシピエントにとって採用される投与量および濃度で無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコールなど；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾールなど）；低モル量（約１０残基以下）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンなどの蛋白質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−蛋白質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮTM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTMまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含む。
本発明の製剤は、治療される具体的な指示の必要性に応じて、１種以上の活性化合物を含むことができ、それらは好ましくは互いに悪影響を与えない補足的な活性を有するものである（下記Ｆ項参照）。そのような化合物は意図する目的に効果的な量で適切に組合されて含まれる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術および界面重合などによって、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタアクリレート）マイクロカプセル中に封入され、コロイド薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−パーティクルズおよびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中封入することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980）に記載されている。
インビボ投与に用いられる製剤は滅菌する必要がある。これは滅菌濾過膜による濾過によって行うことができる。
徐放性製剤も製造することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性材料を含み、この材料は成形粒子、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性材料の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、Lupron DepotTM（米国特許第５５３４６１５号に記載の乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリウプロリドアセテートから構成される注射可能なマイクロスフィア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシラク酸などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを挙げることができる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間にわたって分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルはより短い時間で蛋白質を放出する。カプセル化された抗体は長時間体内にとどまるが、３７℃で水分にさらされると、変性したり凝集したりすることがあり、生物学的活性を損失する。関連するメカニズムに従って安定化のための合理的な方法を案出することができる。例えば、凝集のメカニズムが、チオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることがわかれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の調節、適当な添加剤の使用、特異的なポリマー材料組成物の開発によって、安定化を図ることができる。
Ｄ．抗体の非治療的用途
本発明の抗体は、アフィニティ精製試剤として用いることができる。この方法では、抗体は当業者に公知の方法を用いてセファデックス樹脂またはろ紙などの固体相に固定化される。固定化された抗体を、精製すべきＶＥＧＦ蛋白質（またはそのフラグメント）を含む試料と接触させ、ついで、固定化抗体に結合しているＶＥＧＦ蛋白質以外の試料中のすべての物質を実質的に除去する適当な溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、抗体からＶＥＧＦ蛋白質を分離させる別の適当な溶媒、例えば、グリシン緩衝液、ｐＨ５．０、で支持体を洗浄する。
抗−ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦ蛋白質の診断試験にも有用であり、例えば、具体的な細胞、組織、または血清中のＶＥＧＦ蛋白質の発現を検出することができる。このような診断方法は癌診断に有用である。
診断に適用するために、具体的には抗体を検出可能な分子成分で標識する。一般に下記の群に分類できる多くの標識を用いる:
（a）放射性同位元素：35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉなど、抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs.（1991）に記載の技術を用いて放射性同位元素で標識することができ、放射活性はシンチレーション計数器を用いて測定することができる。
（b）蛍光標識:希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよぴその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドなど。蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology,supraに記載の技術を用いて抗体に結合させることができる。蛍光度は蛍光光度計を用いて定量することができる。
（c）種々の酵素−基質標識を用いることができ、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのいくつかの概説を記載している。酵素は一般に、色素生産性基質の化学変化を触媒し、これは種々の技術を用いて測定することができる。例えば、酵素は基質の色素変化を触媒し、これは、分光光度的に測定することができる。別法として、酵素は基質の蛍光または化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量する技術は上記の通りである。化学発光基質は化学反応によって電気的に励起させられ、ついで（例えば、化学発光測定計を用いて）測定可能な光を放出するか、または蛍光受容体にエネルギーを与える。酵素標識の例としてはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペロキシダーゼ、マイクロペロキシダーゼなどが含まれる。酵素を抗体に結合させる技術はO'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym.（ed J. Langone & H. Van Vunakis）, Academic press, New York, 73:147-166（1981）に記載されている。
酵素−基質の組合せの例は、例えば、
（ｉ）基質としてヒドロゲンペルオキシダーゼと西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここではヒドロゲンペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化し；
（ii）色素生産性基質としてパラ−ニトロフェニルホスファートとアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および
（iii）β−Ｄ−ガラクトシダーゼと、色素生産性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生的基質、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
多くの他の酵素−基質の組み合わせを当業者は利用することができる。これらの一般的な概説についは、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号参照。
標識は時には抗体と間接的に結合される。当業者はこれを実現するための種々の技術を知っている。例えば、抗体はビオチンと結合させることができ、上記の３種の広範なカテゴリーの標識物のいくつかはアビジンと結合させることができ、またその逆も可能である。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、かくして、標識物は抗体と間接的に結合することができる。標識物と抗体の間接的結合を行うために、別法として、抗体は小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合し、上記の別の種類の標識物の１つが抗−ハプテン抗体（例えば、抗−ジゴキシン抗体）と結合する。かくして、標識物と抗体の間接的結合が実現される。
本発明の別の態様では、抗−ＶＥＧＦ抗体は標識される必要がなく、その存在はＶＥＧＦ抗体に結合している標識抗体を用いて検出され得る。
本発明の抗体は公知の試験方法、競合的結合試験法、直接および間接サンドイッチ法および免疫沈降試験法に用いられ得る。Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp.147-158（CRC Press, Inc. 1987）
競合的結合試験法は、限定量の抗体に対する結合について、被験試料分析物と競争する標識標準物の能力に依存するものである。被験試料中のＶＥＧＦ蛋白質の量は抗体に結合している標準物の量に逆比例する。結合している標準物の量の測定を容易にするために、抗体は一般に、競合前に不溶化され、抗体に結合している標準物と分析物は都合よく、未結合のままの標準物と分析物から分離され得る。
サンドイッチ法は２個の抗体の利用を含み、それぞれは、検出されるべき蛋白質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る。サンドイッチ法では、被験試料分析物は、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、かくして、不溶性の３個の複合体を形成する。米国特許第４，３７６，１１０号参照。第２の抗体はそれ自体検出可能な分子成分で標識され得るか（直接サンドイッチ法）、または、検出可能な分子成分で標識されている抗−イムノグロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチ法）。例えば、サンドイッチ法の１種はＥＬＩＳＡ法であり、ここでは検出可能な分子成分は酵素である。
免疫組織化学については、腫瘍試料は新鮮か、冷凍されているか、またはパラフィン中に包埋されており、例えば、ホルマリンなどの保存剤で固定することができる。
抗体はインビボ診断試験にも用いられる。一般に、抗体は放射性核種（111Ｉｎ、99Ｔｃ、14Ｃ、131Ｉ、125Ｉ、3Ｈ、32Ｐまたは35Ｓなど）で標識されており、免疫シンチノグラフィーにより、癌部位を特定することができる。
Ｅ．診断キット
便利さからいえば、本発明の抗体はキット、すなわち、診断試験を行うための指示書とともに予め定められた量の試剤の包装された組合せ、で提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合は、キットは基質と酵素に必要な共同因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定化剤、緩衝液（遮断緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加物を含んでいてもよい。種々の試剤の相対的な量は実質的に試験法を最適化する試剤の溶液濃度を提供するために大きく変化する。具体的には、試剤は、通常は凍結乾燥されている乾燥粉末として提供され、溶解時に試剤に適当な濃度になるように賦形剤を含む。
Ｆ．抗体の治療的用途
治療的用途については、本発明の抗−ＶＥＧＦ抗体は、上記で検討した形態などの医薬的に許容され得る投与形態で、哺乳動物、好ましくはひと、に投与される。それらには、大量瞬時投与としてひとに静脈内、ある期間にわたる連続的点滴、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、経口的、局所的、または吸入経路により投与されるものを含む。抗体はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、または病巣周囲経路より適切に投与され、局所および全身の治療効果を発揮する。例えば、卵巣腫瘍治療には、腹腔内経路は特に有効である。
疾患の予防および治療のために、抗体の適当な投与量は、上記で定義された治療されるべき疾患の種類、疾患の重篤性および疾患、抗体が予防的または治療的目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴、抗体への応答および担当医の処方などにより変化する。抗体は一度にまたは一連の治療中に患者に適切に投与される。
抗−ＶＥＧＦ抗体は種々の腫瘍性または非腫瘍性疾患または障害の治療に有用である。治療可能な腫瘍および関連症状には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、きょう膜癌、男性胚腫、子宮頚癌、子宮体癌、子宮体過形成、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、空洞性血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、グリア芽細胞腫、シュワン細胞腫、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路腫、甲状腺腫、ウイルムス腫瘍、腎細胞腫、前立腺腫、母斑症関連異常性血管増殖症、浮腫（脳腫瘍と関連など）およびメイグ症候群が含まれる。
治療可能な非腫瘍症状には、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、未熟網膜症を含む糖尿病性および増殖性網膜症、水晶体後線維増殖症、新生血管緑内障、年齢関連性黄斑変性症、甲状腺過形成（グレイブス病を含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（心外膜炎と関連する）、および胸水などが含まれる。
年齢関連性黄斑変性症（ＡＭＤ）は老年世代の重篤な視覚損傷の主たる原因である。ＡＭＤの浸出性態様は脈絡叢の新血管新生および網膜色素上皮細胞剥離に特徴がある。脈絡叢の新血管新生は予後の劇的な悪化に関係する。本発明のＶＥＧＦ抗体はＡＭＤの重篤性の軽減に特に有効なことが期待される。
疾患の種類および重篤性に従って、抗体の約１μg／kgから約５０μg／kg（例えば、０．１−２０mg／kg）が患者に対する最初の候補投与量であり、例えば、１回または数回に分けて、または連続的注入のいずれかにより投与される。典型的な１日または１週の投与量は約１μg／kgから約２０mg／kgまたはそれ以上であり、上記因子により変化する。数日またはそれより長くにわたる反復投与については、症状により、所望の疾患抑制の兆候が生じるまで治療がくり返される。しかし、他の投与計画も有効である。治療の経過は、通常の技術および試験、例えば、Ｘ線撮影腫瘍画像により容易に観察される。
本発明の他の態様では、疾患の予防および治療における抗体の有効性は連続的に抗体を投与するか、それらの目的に有効な他の試剤、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性または塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の血管形成活性を阻害または中和し得る抗体、組織因子の血液凝固活性を阻害または中和し得る抗体、プロテインＣ、またはプロテインＳ（Esmon et al., １９９１年２月２１日に刊行されたＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ ９１／０１７５３）、ＨＥＲ２受容体に結合し得る抗体（Hudziak et al., １９８９年７月２７日に刊行されたＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ ８９／０６６９２参照）、または１またはそれ以上の常套的治療剤、例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、またはコルチコステロイドなどと組合せて投与される。このような他の試剤は投与される組成物中に含まれていてもよいし、別に投与することもできる。また、抗体は連続的に、または放射線照射または放射性物質などの何であれ放射線医学治療と組合せて適当に投与することもできる。
１つの態様において、腫瘍の血管新生は組み合わせ処置で治療する。抗体および１またはそれ以上の他の抗−ＶＥＧＦ抗体を、例えば、腫瘍の壊死またはもしあれば、その転移巣が診られることによって定められた治療的有効量を腫瘍患者に投与する。この治療はそれ以上の有利な効果が観察されなくなるか、臨床試験が腫瘍またはその転移巣の痕跡を示さなくなるまで継続される。ＴＮＦが投与されるとき、単独または、α−、β−、γ−インターフェロン、抗−ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン（heregulin）、抗−ヘレグリン抗体、Ｄ−因子、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）または、例えば、抗−プロテインＣ抗体、抗−プロテインＳ抗体、またはＣ４ｂ結合蛋白質（Esmon et al., １９９１年２月２１日に刊行されたＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ ９１／０１７５３）などの腫瘍の微小血管凝集を促進する薬剤などの補助剤、または加熱または照射と組合せて投与される。
補助剤はその有効性か変化するから、常套手段で材料スクリーニングによって腫瘍に対する影響を比較するのが好ましい。抗−ＶＥＧＦ抗体およびＴＮＦの投与は所望の臨床的効果が達成されるまで繰り返す。別法として、抗−ＶＥＧＦ抗体はＴＮＦおよび、所望により、補助剤とともに投与される。固形腫瘍が四肢または他の全身循環から分離しやすい部位に発見された場合、ここに記載の治療剤が隔離された腫瘍または組織に投与される。他の態様において、抗−ＦＧＦまたは抗−ＰＤＧＦ中和抗体などのＦＧＦまたは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストを、抗−ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて患者に投与する。抗−ＶＥＧＦ抗体での治療は所望により、傷の治癒または望ましい血管新生の期間中継続される。
Ｇ．製造部材
本発明の他の態様は、上記の疾患の処置に有用な材料を含む製造部材を提供する。製造部材は容器およびラベルを含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から製造される。容器には、症状を処置するのに有効な組成物が入っており、無菌の出入口を有する（例えば、容器は静脈溶液袋であるか、または皮下注射針によって突き刺し可能な栓のあるバイアルであってもよい）。組成物中の活性薬剤は抗−ＶＥＧＦ抗体である。容器上またはそれに関連して、ラベルは、組成物が特定の症状の治療のために用いられることを示す。製造部材はさらに、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液などの医薬的に許容され得る緩衝溶液を含む第２の容器を含んでいてもよい。さらに、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、注射筒および使用説明書とともに包装挿入物を含む、市場および使用者の立場から望ましい他の材料を含んでいてもよい。
実施例１
この実施例は、治療上の観点から望ましい特性を有するヒト化抗ＶＥＧＦの製造を記載する。
材料および方法
ネズミＡ４．６．１ＭＡｂのクローニングおよびマウス−ヒトキメラＦａｂの構築：
ネズミ抗ＶＥＧＦ ＭＡｂ Ａ４．６．１は、Kimら, Growth Factors 7:53（1992）およびKimら, Nature 362:841（1993）に以前記載された。全ＲＮＡを、RNAsol（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ）を用いて、抗ＶＥＧＦ ＭＡｂ Ａ４．６．１を産生するハイブリドーマ細胞から単離し、オリゴ−ｄＴプライマーおよびSuperScriptIIシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ, Gaithersburg, ＭＤ）を用いてｃＤＮＡへ逆転写した。抗体の軽鎖および重鎖のＮ末端アミノ酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを合成し、フォワードプライマーとして使用した。リバースプライマーは、ネズミ軽鎖サブグループｋＶおよび重鎖サブグループＩＩから得られたフレームワーク４配列に基づいた（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の後、ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター（Invitrogen, San Diego, CA）にライゲーションした。軽鎖および重鎖それぞれの８個のクローンを配列決定した。軽鎖ＶＬドメインのコンセンサス配列を有する１つのクローンおよび重鎖ＶＨドメインのコンセンサス配列を有する１つのクローンを、ヒトＣＬおよびＣＨ１ドメインを含むｐＥＭＸ１ベクター（Wether, J. Immunol. 157;4986-4995（1996））にそれぞれサブクローニングし、マウス-ヒトキメラを作成した。このキメラＦ（ａｂ）は、アミノ酸ＳｅｒＨ１１３でヒトＣＨ１ドメインに融合した全ネズミＡ４．６．１ＶＨドメインとアミノ酸ＬｙｓＬ１０７でヒトＣＬドメインに融合した全ネズミＡ４．６．１ＶＬドメインから構成された。キメラＦ（ａｂ）の発現と精製は、ヒト化Ｆ（ａｂ）の発現と精製と同じであった。キメラＦ（ａｂ）を結合アッセイの標準として用いた。
ネズミおよびヒト化Ｆ（ａｂ）のコンピューターグラフィックスモデル：ＶＬおよびＶＨドメインの配列（図１Ａおよび図１Ｂ）を、ネズミＡ４．６．１ＶＬ−ＶＨドメインのコンピュータグラフィックスモデルの構築に使用した。このモデルは、どのフレームワーク残基をヒト化抗体に導入すべきかを決めるために使用した。ヒト化Ｆ（ａｂ）のモデルも、ネズミフレームワーク残基の正確な選択を確かめるために構築した。モデルの構築は、以前に記載されたように行った（Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289（1992）およびEigenbrotら, J. Mol. Biol. 229:969-995（1993））。
ヒト化Ｆ（ａｂ）の構築：突然変異誘発およびE. coliにおけるＦ（ａｂ）の発現に使用したプラスミドｐＥＸＭ１は、以前に記載された（Wertherら,前掲）。簡潔にいえば、このプラスミドには、コンセンサスヒトｋサブグループＩ軽鎖（ＶＬｋＩ−ＣＬ）およびコンセンサスヒトサブグループＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ−ＣＨ１）をコードするＤＮＡフラグメントとアルキルホスファターゼプロモーターが含まれている。ＶＬおよびＶＨのコンセンサス配列の使用は、以前に記載されている（Carterら,前掲）。
ヒト化Ａ４．６．１の第１Ｆ（ａｂ）変異体、Ｆ（ａｂ）−１を構築するために、ｐＥＭＸ１のデオキシウリジン含有テンプレートで部位特異的突然変異誘発を行った（Knkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492（1985））。Kabatら，前掲にしたがって６個のＣＤＲをネズミＡ４．６．１配列に変えた。したがって、Ｆ（ａｂ）−１は６つの完全なネズミＣＤＲ配列を有する完全なヒトフレームワーク（ＶＬｋサブグループＩおよびＶＨサブグループＩＩＩ）から構成された。他のすべてのＦ（ａｂ）変異体のためのプラスミドは、Ｆ（ａｂ）−１のプラスミドテンプレートから構築した。２本鎖および１本鎖ＤＮＡを調製するために、プラスミドをE. coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅ株（Stratagene, San Diego, CA）へ形質転換した。各変異体について、軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、ジデオキシヌクレオチド法（Sequenase, U.S. Biochemical Corp. Cleveland, OH）を用いて完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である、E.coli １６Ｃ９株に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むLuriaブロスプレートに蒔き、タンパク質の発現について単一のコロニーを選択した。単一のコロニーは、５ｍＬのLuriaブロス−１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリン中で、５〜８時間３７℃にて培養した。この培養液５ｍＬを、５００ｍＬのＡＰ５−５０μｇ／ｍＬカルベニシリンに加え、４ＬのBaffled振盪フラスコ中３０℃にて２０時間培養した。ＡＰ５培地は、以下よりなる：１．５ｇグルコース、１１．０ｇHycase SF、０．６ｇ酵母抽出物（保証）、０．１９ｇＭｇＳＯ4（無水）、１．０７ｇＮＨ4Ｃｌ、３．７３ｇＫＣｌ、１．２ｇＮａＣｌ、１２０ｍＬの１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ７．４）を１Ｌの水に溶解し、０．１ｍｍのSealkeenフィルターで滅菌濾過する。１Ｌの遠心管中で細胞を３０００×ｇで遠心し、上清を除いて細胞を回収した。１時間凍結した後、ペレットを冷却した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２０％スクロース（ｐＨ８．０）２５ｍＬに再懸濁した。タンパク質分解を阻害するために２５０ｍＬの０．１Ｍベンズアミジン（Sigma, St.Louis,MO）を加えた。氷上で穏やかに３時間撹拌した後、試料を４０，０００×ｇで１５分間遠心した。次いで，上清を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＧ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia, Uppsala, Sweden）カラム（ベッド体積０．５ｍＬ）に注いだ。カラムを１０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で洗浄し、３ｍＬの０．３ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で溶出し、１．２５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）にとった。次いで、Ｆ（ａｂ）を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Amicon, Beverly, MA）を使用してＰＢＳに緩衝液交換し、最終体積０．５ｍＬに濃縮した。すべてのＦ（ａｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行って純度を確かめ、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析により確かめた。
キメラおよびヒト化ＩｇＧの構築および発現：キメラおよびヒト化されたＡ４．６．１のヒトＩｇＧ１変異体（ｃｈＩｇＧ１およびｈｕＩｇＧ１）の作製のために、適当なネズミまたはヒト化されたＶＬおよびＶＨ（Ｆ（ａｂ）−１２、表２）ドメインを、別個の、以前に記載されたｐＲＫベクター（Eatonら, Biochemistry 25:8343-8347（1986））にサブクローニングした。各変異体の全軽鎖および全重鎖をコードするＤＮＡをジデオキシヌクレオチド配列決定によって確かめた。
変異体の一過性発現のために、重鎖および軽鎖プラスミドを、高効率法（Gormanら, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10（1990））を用いて、ヒト２９３細胞（Grahamら, J. Gen. Virol. 36: 59-74（1977））に同時トランスフェクトした。培地を血清不含培地に変え、５日目まで毎日回収した。プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia）を用いて、プールした上清から抗体を精製した。溶出した抗体を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Amicon）を使用してＰＢＳに緩衝液交換し、０．５ｍＬに濃縮し、Millex-GV（Millipore, Bedford, MA）を用いて滅菌濾過し、４℃にて保存した。
最終のヒト化ＩｇＧ１変異体（ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ）の安定な発現のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、重鎖および軽鎖の両方を同時発現させるために設計したジシストロニック（dicisronic）ベクター（Lucasら, Nucleic Acid Res. 24:1774-79（1996））によりトランスフェクトした。プラスミドを、L. Chasin（コロンビア大学）により開発されたＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸＢ１１細胞系の固有誘導体であるＤＰ１２細胞に、リポフェクションにより導入し、ＧＨＴ不含培地での生育について選択した（Chisholm,V. High efficiency gene transfer in mammalian cells. In: Glover, DM, Hames, BD. DNA Cloning 4.Mammalinan systems. Oxford Univ. Press. Oxford pp 1-41（1996））。約２０個の未増幅クローンをランダムに選択し、９６ウェルプレートに再び加えた。各コロニーの比特異的産生能力をＥＬＩＳＡを用いてモニターし、３日後に各ウェルに蓄積した完全長のヒトＩｇＧおよびウェルあたりの生存細胞数の代理マーカーとしての蛍光染料Calcien AMを定量した。これらのデータに基づいて、いくつかの未増幅クローンを、増加する濃度のメトトレキセートの存在下でさらに増幅するために選択した。１０、５０および１００ｎＭメトトレキセートで生存した個々のクローンを選択して、産生能力スクリーニングのために９６ウェルプレートに移した。再現的に高い特異的産生能力を示した１つのクローンをＴ−フラスコ中で増殖させ、撹拌培地に接種するために使用した。数回継代した後、懸濁液に順応させた細胞を、種々のホルモンとタンパク質加水分解物を添加した、ＧＨＴ含有、血清不含培地中で製造培地に接種するために使用した。ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦを含む回収した培養細胞液を、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂを用いて精製した。この工程後の純度は約９９％であった。次いで、単一にするためイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて精製を行った。最終の精製された抗体の内毒素含量は、＜０．１０ｅｕ／ｍｇであった。
Ｆ（ａｂ）およびＩｇＧ定量：Ｆ（ａｂ）分子を定量するため、ＥＬＩＳＡプレートを５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中、２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ（Organon Teknika, Durham, NC）で１晩４℃にてコーティングし、ＰＢＳ−０．５％ウシ血清アルブミン（ブロッキング緩衝液）で室温にて１時間ブロックした。標準（０．７８〜５０ｎｇ／ｍＬヒトＦ（ａｂ））は、Chemicon（Temecula,CA）より購入した。ＰＢＳ−０．５％ウシ血清アルブミン−０．０５％ポリソルベート２０（アッセイ緩衝液）中の試料の希釈列を、プレート上で２時間インキュベーションした。結合したＦ（ａｂ）を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）（Organon Teknika）を使用し、次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Geithersburg, MD）を基質として検出した。プレートは工程の間で洗浄した。４５０ｎｍでの吸収を、Ｖｍａｘプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）で読み取った。標準曲線を４パラメーター非線形回帰曲線適合プログラムを使用して適合させた。標準曲線の範囲に入ったデータ点を、試料のＦ（ａｂ）濃度の計算に使用した。完全長抗体の濃度は、捕捉用のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Cappei, Westchester,PA）および検出用の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＦｃ（Cappei）を使用して測定した。ヒトＩｇＧ１（Chemicon）を標準として使用した。
ＶＥＧＦ結合アッセイ：Ｆ（ａｂ）のＶＥＧＦ結合活性を測定するため、ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＩｇＧＦｃに対するウサギＦ（ａｂ’）2（Jacson Immuno Research, Wesat Grove, PA）２μｇ／ｍＬでコーティングし、ブロッキング緩衝液（上記）でブロックした。ブロッキング緩衝液中に３ｎｇ／ｍＬのＫＤＲ−ＩｇＧ（Parkら,J. Biol. Chem. 269:25646-25645（1994））を含む希釈状態の培地を、１時間プレート上でインキュベーションした。標準（６．９〜４４０ｎｇ／ｍＬキメラＦ（ａｂ））および試料の２倍希釈列を、２ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦと試験管中１時間インキュベーションした。次いで、試験管から溶液をＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間インキュベーションした。洗浄後、ＫＤＲに結合したビオチン化ＶＥＧＦを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプタビジン（Zymed, South San Francisco, CAまたはSigma, St. Louis, MO）を使用し、次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを基質として検出した。滴定曲線を４パラメーター非線形回帰曲線適合プログラム（KaleidaGraph, Synergy Software, Reading PA）を使用して適合させた。標準の滴定曲線の吸収の中点に対応するＦ（ａｂ）変異体の濃度を計算した後、標準の滴定曲線の吸収の中点に対応する標準の濃度で割る。完完全長ＩｇＧについてのアッセイは、アッセイ緩衝液が１０％ヒト血清を含むこと以外はＦ（ａｂ）についてのアッセイと同じであった。
BIAcoreTMバイオセンサーアッセイ：ヒト化およびキメラＦ（ａｂ）のＶＥＧＦ結合を、BIAcoreTMバイオセンサー（Karlssonら, Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108（1994））を用いて比較した。Ｆ（ａｂ）の濃度を、定量的アミノ酸解析により測定した。製造元（Pharmacia）の説明書にしたがって、ＣＭ−５バイオセンサーチップにＶＥＧＦを１級アミン基を介してカップリングした。オフレート（off-rate）キネティックスは、Ｆ（ａｂ）によりチップを飽和した後（２μＭＦ（ａｂ）３５μＬを流速２０μＬ／ｍＬで）、緩衝液（ＰＢＳ−０．０５％ポリソルベート２０）に交換することにより測定した。０〜４５００秒のデータ点を、オフレートキネッティック解析に使用した。解離速度定数（ｋoff）を時間に対する１ｎ（Ｒ０／Ｒ）のプロットの傾きから求めた。ここでＲ０は、ｔ＝０におけるシグナルであり、Ｒは各時間でのシグナルである。
オンレート（on-rate)キネティックスは、Ｆ（ａｂ）の２倍希釈系列（０．０６２５〜２ｍＭ）を使用して測定した。傾きＫsは、ファルマシアバイオセンサーマニュアルに記載されたBIAcoreTMキネティックス評価ソフトウウエアを使用して、各Ｆ（ａｂ）濃度についての時間に対する１ｎ（−ｄＲ／ｄｔ）のプロットから求めた。Ｒは、時間ｔにおけるシグナルである。８０秒と、１６８、１４８、１２８、１１４、１０２、および９２秒との間のデータを、それぞれ０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１および２ｍＭのＦ（ａｂ）について使用した。会合速度定数（ｋon）を、Ｋs対Ｆ（ａｂ）濃度プロットの傾きから求めた。各サイクルの終わりで、５０ｍＭ ＨＣｌ ５μＬを、２０μＬ／分の流速で注入してチップを再生することにより、結合したＦ（ａｂ）を取り除いた。
内皮細胞増殖活性：ウシ副腎皮質由来毛細内皮細胞を、１０％胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質を加えた低グルコースDulbecco修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）（生育培地）の存在下に、本質的に以前に記載されたように（Leungら, Science 246:1306-1309（1989））培養した。マイトジェニックアッセイのために、内皮細胞を、６ウェルプレートに、生育培地中ウェルあたり６×１０3細胞の密度で加えた。次いで、ｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１またはｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦを、１〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で加えた。２〜３時間後、精製した、E. coli発現させたｒｈＶＥＧＦ１６５を加えて最終濃度３ｎｇ／ｍＬした。特異性の対照として、各抗体を、内皮細胞に５０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、単独でまたは２ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦの存在下に加えた。５または６日後、細胞をトリプシンにさらすことにより解離し、Coluterカウンター（Coulter Electronics, Hialeah,FL）により計数した。平均からの変動は、１０％を越えなかった。４パラメーター曲線適合プログラム（KaleidaGraph）によってデータを解析した。
インビボ腫瘍試験：ヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞
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中で、以前に記載されたとおりに培養した。６〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、２×１０6の腫瘍細胞を背面部に２００μＬの容量で皮下注射した。次いで、動物をｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１、ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ、またはｇｐ１２０タンパク質を標的とする対照ＭＡｂ（Kimら, Nature 362:841（1993））で処置した。両方の抗ＶＥＧＦ ＭＡｂを、用量０．５および５ｍｇ／ｋｇで投与し、対照ＭＡｂは用量５ｍｇ／ｋｇで投与した。各ＭＡｂを１００μＬの容量で週２回腹腔内投与し、腫瘍細胞接種後２４時間後から開始した。各群を１０匹で構成した。腫瘍の大きさを週ごとに計測した。腫瘍細胞接種後４週間目で、動物を安楽死させ、腫瘍を取り出して計量した。統計的解析をＡＮＯＶＡにより行った。
結果
ヒト化：ヒト重鎖サブグループＩＩＩおよび軽鎖サブグループｋＩのコンセンサス配列をヒト化のためのフレームワークとして使用した（Kabatら，前掲）（図１Ａおよび図１Ｂ）。このフレームワークは、他のネズミ抗体のヒト化に都合良く使用されてきた（Wertherら，前掲、Carterら，前掲、Prestaら, J. Immunol. 151:2623-2632（1993）；およびEigenbrotら, Proteins 18:49-62（1994））。ＣＤＲ−Ｈ１は、残基Ｈ２６−Ｈ３５を含んでいた。他のＣＤＲは、Kabatら，前掲にしたがった。すべてのヒト化変異体を最初に作成し、E. coli内で発現したＦ（ａｂ）として結合についてスクリーニングした。５００ｍＬ振盪フラスコからの典型的な収量は、０．１〜０．４ｍｇＦ（ａｂ）であった。
キメラＦ（ａｂ）を結合アッセイの標準として使用した。初代変異体、Ｆ（ａｂ）−１では、ＣＤＲ残基はネズミ抗体からヒトフレームワークに転換されており、ネズミおよびヒト化されたＦ（ａｂ）のモデルに基づけば、Ｈ４９番の残基（ヒトではＡｌａ）はネズミのＧｌｙに変わっていた。さらに、キメラ重鎖／Ｆ（ａｂ）−１軽鎖からなるＦ（ａｂ）（Ｆ（ａｂ）−２）、およびＦ（ａｂ）−１重鎖／キメラ軽鎖からなるＦ（ａｂ）（Ｆ（ａｂ）−３）を作成し、結合について試験した。Ｆ（ａｂ）−１は、キメラＦ（ａｂ）から換算して１，０００倍よりも大きな結合親和性を示した（表２）。Ｆ（ａｂ）−２とＦ（ａｂ）−３の結合親和性の比較は、結合を増強させるためにＦ（ａｂ）−１ＶＨドメインのフレームワーク残基を変える必要があることを示唆した。
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Ｆ（ａｂ）−４において、ヒトの残基Ｈ７１およびＨ７１を、それらが対応するネズミの残基に変えることにより、結合は４倍改善された（表２）。ネズミおよびヒト化Ｆ（ａｂ）のモデルの観察は、ＶＬ−ＶＨ界面で隠れ、ＣＤＲ−Ｈ３と相互作用している残基Ｌ４６は（表２）、ＣＤＲ−Ｈ３のコン−メーションの決定および／またはＶＬとＶＨドメインの関係に対する影響のいずれかにおいて役割を担っているかもしれないということを示唆した。Ｌ４６でヒトのＬｅｕをネズミのＶａｌに交換したとき（Ｆ（ａｂ）−５）、結合アフィニティーは、ほぼ４倍増加した（表２）。他の３つの隠れたフレームワーク残基：Ｈ４９、Ｈ６９およびＨ７８を分子モデルに基づいて評価した。Ｈ６９の位置は、ＣＤＲ−Ｈ２のコンフォメーションに影響を与え得るが、Ｈ７８の位置はＣＤＲ−Ｈ１のコンフォメーションを変え得る（図２）。それぞれを個々にヒトからネズミの対応残基に変更したとき、結合は、それぞれの場合において（Ｆ（ａｂ）−６およびＦ（ａｂ）−７、表２）２倍改善された。両方を同時に変えたとき、結合における改善は８倍であった（Ｆ（ａｂ）−８、表２）。残基Ｈ４９は元々、ネズミではＧｌｙとして含まれていた。ヒトのコセンサス対応残基のＡｌａに変えたとき、結合は１５倍減少した（Ｆ（ａｂ）−９、表２）。
Ｆ（ａｂ）−１０およびＦ（ａｂ）−１１では、フレームワークループ３、即ちＦＲ−３内の２つの残基をそれらのネズミの対応残基に変えた：ＡｓｎＨ７６をネズミＳｅｒへ（Ｆ（ａｂ）−１０）およびＬｙｓＨ７５をネズミＡｌａへ（Ｆ（ａｂ）−１１）。両者とも結合における改善は比較的小さかった（表２）。最後に、Ｈ９４の位置でヒートおよびネズミの配列は、Ａｒｇを有していることが最も多い（Kabatら，前掲）。Ｆ（ａｂ）−１２では、このＡｒｇを、ネズミ抗体にみられるまれなＬｙｓに変更したところ（図１Ａ）、結合について得られた結果は、キメラＦ（ａｂ）の２倍よりも小さかった（表２）。Ｆ（ａｂ）−１２もまた、ＢＩＡｃｏｒｅTMシステム（Phamacia）を使用してキメラＦ（ａｂ）と比較した。この技術を用いて、ヒト化Ｆ（ａｂ）−１２のＫdは、より遅いｋonとより速いｋoffのために、キメラＦ（ａｂ）のＫdと比較すると２倍弱かった（表３）。
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完全長ｍＡｂは、キメラＦ（ａｂ）および変異体Ｆ（ａｂ）−１２のＶＬおよびＶＨドメインを、ヒトｋ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に融合することにより構築した。完全長の１２ＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１に融合したＦ（ａｂ）−１２）は、キメラＩｇＧ１よりも１．７倍弱い結合を示した（表４）。１２−ＩｇＧ１およびキメラＩｇＧ１は、もとのネズミｍＡｂ Ａ４．６．１よりも若干弱く結合した（表４）。
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生物学的試験：ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦおよびｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１を、ＶＥＧＦの近最大有効濃度（３ｎｇ／ｍＬ）に応答するウシ毛細内皮細胞増殖を阻害する能力について比較した。図３に示すように、２つのＭＡｂは、力価および効力の両方において本質的に同等であった。ＥＣ５０値は、それぞれ５０±５ｎｇ／ｍＬおよび４８±８ｎｇ／ｍＬ（約０．３ｎＭ）であった。いずれの場合においても、５００ｎｇ／ｍＬの濃度（約３ｎＭ）で９０％阻害が達成された。ｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１およびｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦのいずれも、基底のまたはｂＦＧＦ刺激の毛細内皮細胞の増殖に対する効果は有しておらず、阻害がＶＥＧＦに対して特異的であることが確認された。
そのような同等性がインビボ系にもあてはまるのかどうかを決定するために、２つの抗体を、ヌードマウスにおいてヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞の増殖を抑制する能力について比較した。以前の試験では、ｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１は、この腫瘍モデルにおいて劇的な阻害効果を有することが示されている
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図４に示されるように、試験した投与量の両方で（０．５および５ｍｇ／ｋｇ）、細胞接種後４週目の腫瘍重量の測定値により評価されるように、２つの抗体は腫瘍の増殖を顕著に抑制した。対照群と比較した腫瘍重量におけるこの減少は、ｍｕＭＡｂＶＥＧＦ Ａ４．６．１で処置した動物において、各投与量でそれぞれ８５％および９３％であったのに対し、ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦで処置した動物では９０％および９５％であった。同様の結果が、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ４３５についても得られた。
実施例２
この実施例では、アフィニティーベースでの選択による高アフィニティーフレームワーク配列を同定するため、小セットのフレームワーク残基をランダム化し、線状ファージの表面において抗体分子の得られたライブラリーの１価ディスプレイにより、上記のネズミ抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１をヒト化した。
材料および方法
抗ＶＥＧＦファージミドベクターｐＭＢ４−１９の構築：ネズミ抗ＶＥＧＦ ＭＡｂ Ａ４．６．１は実施例１に記載されている。ヒト化したＡ４．６．１の初代Ｆａｂ変異体、ｈｕ２．０は、ヒトＶLκＩ−Ｃκ1軽鎖およびヒトＶHＩＩＩ−ＣH１γ1重鎖ＦｄフラグメントをコードするプラスミドｐＡＫ２（Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289（1992））のデオキシウリジン含有テンプレートを用いて部位特異的突然変異誘発によって構築した。残基２６〜３５を含むＣＤＲ−Ｈ１以外は、移植したＡ４．６．１ＣＤＲ配列は、Kabatら（前掲）の配列の定義にしたがって選択した。Ｆａｂコード配列をファージミドベクターｐｈＧＨａｍｇ３（Bassら, Proteins 8: 309-314（1990）およびLowmanら, Biochemistry 30: 10832-10838（1991））にサブクローンした。この構築物ｐＭＢ４−１９は、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のカルボキシル部分に精密に融合した重鎖のＣ末端を有する、初代のヒト化されたＡ４．６．１Ｆａｂ、ｈｕ２．０をコードする。ｐＭＢ４−１９は、Ｆａｂフラグメントの１価ディスプレイのための以前に記載されたプラスミドｐＤＨ１８８（Garrardら,Biochemistry 9: 1373-1377（1991））と構造が類似している。ｐＭＢ４−１９とｐＤＨ１８８との間の顕著な違いには、より短かいＭ１３遺伝子ＩＩＩセグメント（コドン２４９−４０６）および抗体重鎖Ｆｄフラグメントの直後のアンバー終止コドンの使用が含まれる。これは、E. coliのｓｕｐＥサプレッサー株における、分泌重鎖または重鎖−遺伝子ＩＩＩ融合体両方の発現を可能する。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂフラグメントの発現および精製：非サプレッサーのE. coli株３４Ｂ８を、ファージミドｐＭＢ４−１９またはその変異体で形質転換した。単一のコロニーを３７℃で、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む５ｍＬの２ＹＴ中で一晩培養した。培養液を、２０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＡＰ５培地（Changら, Gene 55:189-196（1987））２００ｍＬ中で希釈し、３０℃で２６時間インキュベーションした。細胞を４０００×ｇでペレットにし、−２０℃で少なくとも２時間凍結した。次いで、細胞ペレットを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５ｍＬに再懸濁し、４℃で９０分間振盪し、１０，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を１ｍＬのstreptococcalプロテインＧ−セファロースカラム（Pharmacia）に注ぎ、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）１０ｍＬで洗浄した。結合したＦａｂフラグメントを１００ｍＭ酢酸２．５ｍＬで溶出し、素早く１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．７５ｍＬで中和した。Ｆａｈ調製物をＰＢＳへ緩衝液交換し、Centricon-30濃縮器（Amicon）を用いて濃縮した。プロテインＧ精製後の典型的なＦａｂの収量は、約１ｍｇ／ｍＬ培養液であった。精製したＦａｂ試料をエレクトロスプレー質量分析により特徴付け、濃度をアミノ酸解析により決定した。
抗ＶＥＧＦＦａｂファージミドライブラリーの構築：ヒト化Ａ４．６．１ファージミドライブラリーを、Kunkelら, Method Enzymol. 204:125-139（1991）の方法にしたがって部位特異的突然変異誘発により構築した。ＶHコドン２４、３７、６７および９３でＴＡＡ終止トリプレットを含むｐＭＢ４−１９の誘導体を、突然変異誘発テンプレートとして使用するために調製した（すべての配列の番号付けはKabatら，前掲にしたがった）。この修飾は、野生型配列によるその後のバックグラウンド汚染を阻止するためのものであった。ランダム化のための標的とするコドンは４および７１（軽鎖）および２４、３７、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８、９３および９４（重鎖）であった。
重鎖コドン６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８、９３および９４を、１つの突然変異誘発オリゴヌクレオチドでランダム化するために、２つの１２６マーのオリゴヌクレオチドを、テンプレートでアシストされた酵素的ライゲーションにより、６０マーと６６マーフラグメントから最初に前構築した。具体的には、１．５ｎｍｏｌの５’リン酸化オリゴヌクレオチド５０３−１
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または５０３−２
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を、１．５ｎｍｏｌの５０３−３
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と混合した（ランダム化したコドンに下線を付した；Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｗ＝Ａ／Ｔ；Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ；Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。次いで、５０３−１／２の５’末端および５０３−３の３’末端に対する相補配列を有する１．５ｎｍｏｌのテンプレートオリゴヌクレオチド
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を加えて、ライゲーションの連結点のそれぞれの末端にハイブリダイズさせた。Ｔａｑリガーゼ（New England Biolabsより得た熱安定性リガーゼ）および緩衝液を加え、反応混合物を、４０回の熱処理サイクル（９５℃、１．２５分；５０℃、５分）に付し、ライゲーションされた連結点とライゲーションされていない連結点の間でテンプレートオリゴヌクレオチドを循環させるようにした。生成物の１２６マーのオリゴヌクレオチドは、６％尿素／ＴＢＥポリアクリルアミドゲルにより精製して緩衝液中でポリアクリルアミドから抽出した。２つの１２６マー生成物を同比率で混合し、エタノール沈殿を行い、最後に１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。混合された１２６マーのオリゴヌクレオオチド生成物は、標識された５０４−１であった。
選択フレームワークコドン（ＶL４、７１；ＶH２４、３７、６７、６９、７１、７３、７５、７６、９３、９４）のランダム化を２工程で行った。最初に、ＶLランダム化を、修飾されたｐＭＢ４−１９テンプレートの３つのさらなる誘導体を調製することにより達成した。軽鎖のフレームワークコドン４および７１を、２つの突然変異誘発オリゴヌクレオチド
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を使用して、個々にまたは一緒に置換した。デオキシウリジン含有テンプレートを、これらの新たな誘導体のそれぞれから調製した。もとのテンプレートとともに、これら４つの構築物は、４つの可能性のある軽鎖フレームワーク配列組合わせのそれぞれをコードした（表５）。
２つの１２６マーのオリゴヌクレオチド（上記参照）の混合物である、オリゴヌクレオチド５０４−１および
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を、いま上で記載した４つのテンプレートのそれぞれを使用して重鎖フレームワークコドンをランダム化するために使用した。４つのライブラリーを、E. coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene）中へエレクトロポレーションし、混合した。個々の形質転換体の総数は、＞１．２×１０8であると推定され、ライブラリーのＤＮＡ配列の最大数の約１５００倍よりも多かった。
線状ファージの表面における抗体フラグメントの機能的ディスプレイのために様々な系が開発されている。Winterら, Ann. Rev. Immunol. 12, 433（1994）。これらは、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質のいずれか一方との融合物としての、Ｆａｂまたは１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントのディスプレイを含む。ここで選択される系は、Ｆａｂフラグメントが遺伝子ＩＩＩ融合物として１価ディスプレイされている、Garrardら, Biochem. 9, 1373（1991）に記載されたものと同様である（図７）。この系は、２つの顕著な特徴を有している。具体的には、ｓｃＦｖとは異なり、Ｆａｂフラグメントは、その存在が、アビディティー効果によって、最も強固な結合の選択が阻害し得る二量体種を形成する傾向を持たない。さらに、ディスプレイされたタンパク質の１価性によって、それがなければ各ファージミド粒子におけるタンパク質のマルチプルコピーの存在から生じ得るアビディティー効果の第２の潜在的供給源が排除される。BassおよびWells, Proteins 8:309（1990）およびLowmanら, Biochemistry 30: 10832-10838（1991）。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂフラグメントをディスプレイしているファージミド粒子を、E. coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞中で増殖させた。簡潔にいえば、ランダム化されたｐＭＢ４−１９構築物を含む細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび約１０10Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Vieira & Messing，ら, Method Enzymol. 153:3-11（1987）を含む２５ｍＬの２ＹＴ培地中で３７℃に一晩培養した。ファージミドストックを、食塩水ポリエチレングリコール溶液による沈殿によって培養上清から精製し、１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁した（約１０14ファージミド／ｍＬ）。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体の選択：精製したＶＥＧＦ121（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬを１００μＬ）を、マイクロタイタープレートウェル上に４℃にて一晩コーティングした。コーティング溶液を捨て、このウェルを、コーティングされていないウェルも一緒に６％スキムミルクで１時間ブロックし、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０TM（洗剤）を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、０．１％ＢＳＡおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ２０TMを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１００μＬに希釈したファージミドストック１０μＬを、各ウェルに加えた。２時間後ウェルを洗浄し、結合したファージを１００μＬの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）で溶出し、２５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和した。このアリコートを、溶出したファージ数の滴定に使用した。ＶＥＧＦコートされたウェルから溶出した残りのファージを、次の選択サイクルに使用するために増殖させた。合計８回の選択を行った後、２０個の独立したクローンを選択し配列決定した（Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467（1977））。
ＶＥＧＦ結合アフィニティーの測定：ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体のＶＥＧＦ121への結合に関する、会合（ｋon）および解離（ｋoff）速度定数を、Pharmacia BIAcore装置で表面プラズモン共鳴（Karlssonら, J. Immun. Methods 145:229-240（1991））によって測定した。ＶＥＧＦ121を１級アミノ基を介してバイオセンサーチップに共有結合的に固定化した。ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体の結合は、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０TM中のＦａｂ溶液を、流速２０μＬ／分の流速でチップに流すことによって測定した。各結合測定の後、残留したＦａｂは、３μＬ／分にて５μＬの５０ｍＭ ＨＣｌ水溶液で洗浄することにより、固定化したリガンドから取り除いた。単純な１価結合モデルを用いて非線形回帰式（ＢＩＡ評価ソフトウエアｖ２．０；ファルマシア）により結合プロファイルを解析した。
結果
ヒト化Ａ４．６．１の構築：Ａ４．６．１由来のＣＤＲがヒトＶLκＩ−ＶHＩＩＩフレームワークに移植されている初代ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂフラグメントを構築した（ｈｕ２．０、図５Ａおよび５Ｂ）。ｈｕ２．０における他のすべての残基は、ヒト配列として維持された。この変異体のＶＥＧＦに対する結合は弱すぎて検出できなかった。他の弱く結合しているヒト化Ａ４．６．１変異体の相対的アフィニティーに基づいて、ｈｕ２．０の結合についてのＫDは＞７μＭであると評価した。これはネズミＡ４．６．１からの未変化なＶLおよびＶHドメインとヒトの定常ドメインとからなるキメラＦａｂ構築物のアフィニティーである１．６ｎＭとは対照的である。このようにｈｕ２．０のＶＥＧＦへの結合はキメラ体と比べて少なくとも４０００倍弱かった。
抗体ライブラリーの設計：本明細書に記載のヒトフレームワーク配列へのフレームワーク変更の群を表５および表６に示す。
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ヒト化Ａ４．６．１ファージミドライブラリーの設計における懸念は、ランダム化の標的とした残基が、ＶLとＶH配列にまたがって広く分布しているということであった。合成ヌクレオチドの長さにおける制限があるために、これらフレームワークの位置のそれぞれにおける同時的ランダム化には多重のオリゴヌクレオチドの使用が必要で、それによってのみ達成され得ることになった。しかし、オリゴヌクレオチドの総数が増加するにつれて、突然変異誘発の効率（即ち、すべての突然変異誘発オリゴヌクレオチドから得られる配列を挿入して得られた突然変異体の割合）が低下する。この問題を回避するために、２つの改良をライブラリー構築に導入した。第１に、可能なＶLフレームワークのそれぞれをコードする４つの異なる突然変異誘発テンプレートを調製することである。これにより、軽鎖フレームワークの限定された多様性（４つの異なる配列のみ）を得るには簡単であったが、これは突然変異誘発法からのオリゴヌクレオチド２種についての必要性を排除したという点で有益であった。第２に、第二に小さな合成断片を予め結合させて１２６塩基のオリゴヌクレオチドとした。これで短いオリゴヌクレオチド２個でなくて長いオリゴヌクレオチド１個を用いてＶＨのコドン６７、６９、７１、７３、７５、７６、９３および９４をランダム化できた。そこで最終的なランダム化突然変異誘発の戦略には異なる鋳型４個に同時にたった２個のオリゴヌクレオチドを採用した。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂの強固な結合の選択：ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂファージミドライブラリーから得られた変異体をそれでＶＥＧＦとの結合に基づいて選択した。ＶＥＧＦ被覆マイクロタイタープレートウェルと非被覆マイクロタイタープレートウェルとから溶離したファージの力価を比較することによって測定される機能的ファージミドの豊富化は７回目の親和性選択まで進行した。さらに１回区分した後、２０個のクローンを配列決定してランダム化した各位置で選択された好適なフレームワーク残基を確認した。表６に示すこれらの結果は選択したクローンの中の強固な共通点を示した。クローン２０個の中で１０個はｈｕ２．１０と命名した同一のＤＮＡ配列を持っていた。ｈｕ２．１０ではランダム化されたフレームワーク位置１３個の中で８個の置換が選択されていた（ＶＬ：７１；ＶＨ：３７、７１、７３、７５、７６、７８および９４）。興味深いことに、ＶＨ３７（Ｉｌｅ）残基および７８（Ｖａｌ）残基はヒトのＶＨＩＩＩ配列またはネズミＡ４．６．１配列のいずれにおいても選択されなかった。この結果はあるフレームワーク位置が標的とするヒトのおよび元のネズミのフレームワーク配列を超えて多様性を拡大することから利益が得られるかもしれないことを示唆する。
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解析した残り１０個のクローンにある４つの他の独特なアミノ酸配列はｈｕ２．１、ｈｕ２．２、ｈｕ２．６およびｈｕ２．７であった。ｈｕ２．１０に加え、これらクローンはすべて、ＶH３７（Ｉｌｅ）、７８（Ｖａｌ）、および９４（Ｌｙｓ）において同一のフレームワーク置換を含んでいたが、２４および９３の位置でヒトＶHＩＩＩコンセンサス配列を維持していた。４つのクローンは、軽鎖コード配列を失なわれ、ファージＥＬＩＳＡアッセイ（Cunninghamら, EMBO J. 13:2508-251（1994））で試験したときＶＥＧＦに結合しなかった。このような人為的産物は選択サイクル数の減少によって、またはライブラリーを固相で増殖させることによって削減できることが多い。
ヒト化Ａ４．６．１変異体の発現および結合アフィニティー：ファージ選択変異体ｈｕ２．１、ｈｕ２．２、ｈｕ２．６、ｈｕ２．７およびｈｕ２．１０を、振盪フラスコを使用してE. coliにおいて発現させ、Ｆａｂフラグメントを、プロテインＧアフィニティーカラムクロマトグラフィーによりペリプラズム抽出物から精製した。これら５つのクローンのＦａｂの回収された収率は、０．２（ｈｕ２．６）〜１．７ｍｇ／Ｌ（ｈｕ２．１）に分布した。これら変異体のそれぞれの抗原（ＶＥＧＦ）に対するアフィニティーを、BIAcore装置（実施例７）で表面プラズモン共鳴によって測定した。この結合データの解析により、コンセンサスクローンｈｕ２．１０は、試験した５つの変異体のうちＶＥＧＦに対して最も高いアフィニティーを有することが判明した。こうして、われわれのＦａｂファージミドライブラリーは最も強固に結合するクローンを選択的に豊富化した。ｈｕ２．１０の算出されたＫＤは５５ｎＭであり、フレームワーク変化を含まないｈｕ２．０（ＫＤ＞７μＭ）よりも少なくとも１２５倍強固であった。その他の選択した変異体４種は全てＶＥＧＦに対して最低ＫＤ３６０ｎＭまでの範囲の弱い結合を示した。ｈｕ２．６のＫＤ、６７ｎＭはｈｕ２．１０のものよりも僅かに弱かったが、このクローンは配列決定された２０クローンの中で１コピーが見出されたのみであったことは興味深い。これはこの変異体の可溶性変異体を発現する場合と同様に発現およびディスプレイのレベルが低いためかも知れない。しかしながら、発現速度が小さいがこの変異体はヒト化抗体として有用である。
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ヒト化変異体ｈｕ２．１０の追加的な改良：最初のヒト化変異体に行った抗原親和性の大きな改良にも拘らず、ｈｕ２．１０のＶＥＧＦに対する結合はまだネズミＡ４．６．１ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むキメラＦａｂ断片より３５倍も弱かった。このかなり大きい相違はヒト化フレームワークのさらなる最適化が追加的突然変異によって可能であることを示唆していた。Ｆｏｏｔｅほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９９２年）が確認した補助的残基について、Ａ４．６．１フレームワークとヒトＶＬκＩ−ＶＨＩＩＩフレームワークとの間ではＶＬ４６、ＶＨ２およびＶＨ４８の残基のみが相違していたが、われわれのファージミドライブラリーではここはランダム化しなかった。ヒト化Ａ４．６．１Ｆｖ断片の分子モデルではＶＬ４６はＶＬ−ＶＨ界面に存在しており、ＣＤＲＨ３の立体配座に影響を与えることがあるかも知れないことが示された。さらにその上、多くのＶＬκフレームワークではこのアミノ酸はほとんど常にロイシンである（Ｋａｂａｔほか著、前出）が、Ａ４．６．１ではバリンである。そこで、ｈｕ２．１０を背景にしてこの位置でＬｅｕ→Ｖａｌ置換を行った。この新変異体ｈｕ２．１０Ｖの結合機構を分析した結果ＶＥＧＦ結合のＫＤにさらに６倍の改善を示し、抗体Ａ４．６．１のＶＬ４６の位置におけるバリンの重要性が実証された。ｈｕ２．１０ＶのＫＤ（９．３ｎＭ）はキメラの６倍以内となった。ＶＬ４６とは対照的に、ＶＨ２またはＶＨ４８のいずれか−方の、ネズミＡ４．６．１に由来する対応する残基による置換に関しては、ｈｕ２．０における結合アフィニティーの改善はみられなかった。
実施例３
この実施例では、ＣＤＲランダム化、１価のＦａｂファージディスプレイによるアフィニティー成熟、および成熟の追加的組合せを、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体のアフィニティーを増強させるために使用した。
ヒト化抗体ｐＹ０１０１の構築：ファージディスプレイ抗体ベクターｐｈＭＢ４−１９−１．６（図８Ａ−Ｅ参照）を親として使用した。この構築物において、抗ＶＥＧＦは、先端が切り取られたｇ３ｐのＮ末端に融合したその重鎖を有するＦａｂフラグメントとして発現する。軽鎖および重鎖の両方が、ペリプラズムへの分泌のための上流のｓｔＩＩシグナル配列を有するｐｈｏＡプロモーターの制御下にある。以下の表８に示したオリゴヌクレオチドＨＬ−２４２、ＨＬ−２４３、ＨＬ−２４５、ＨＬ−２４６、ＨＬ−２５４、ＨＬ−２５６、ＨＬ−２５７を用い、部位突然変異誘発によりＣＤＲの外側の点突然変異を作製して、ＶＥＧＦに対するアフィニティーを改善した。
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得られた変異体をＹ０１０１と呼ぶ（図９Ａおよび９Ｂ）。
抗体ファージ−ライブラリーの第１世代の構築：野生型配列による汚染を阻止するために、ランダム化のために標的化した部位でＴＡＡ終止コドンを有するテンプレートを、調製し、飽和突然変異誘発のための縮重ＮＮＳコドン（ここでＮはＡ、Ｇ、ＣおよびＴの混合に等しく、ＳはＧおよびＣの混合に等しい）を使用してオリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発によりライブラリーの構築のために使用した。アフィニティー増強の可能な候補としてＶＬ１およびＶＨ３を選択した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＤＲのうち、２つのライブラリーをｐＹ０１０１テンプレートから構築した。ＶＬ１は、終止テンプレートオリゴヌクレオチドＨＬ−２４８およびＨＬ−２４９（表９）並びにライブラリーオリゴヌクレオチドＨＬ−２５８およびＨＬ−２５９（表１０）を使用して変異させた。同様に、３つのライブラリーを終止テンプレートオリゴヌクレオチドＨＬ−２５０、ＨＬ−２５１およびＨＬ−２５２（表９）、およびライブラリーオリゴヌクレオチドＨＬ−２６０、ＨＬ−２６１およびＨＬ−２６２（表１０）を使用して、ＶＨ３について構築した。ライブラリーの構造を以下の表９および１０にまとめる。
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ランダム突然変異誘発反応の生成物をＸＬ−１ＢｌｕｅE. coli細胞（Stratagene）中にエレクトロポレーションし、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージで１５〜１６時間培養することにより増幅した。カルベニシリンプレートでの最初の形質転換のプレーティングに基づいて、各ライブラリーの複雑度は、２×１０7〜１．５×１０8と推定した。
イニシャルアフィニティー選択：選択の各ラウンドのために、約１０9〜１０10のファージを、５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（組換え；９〜１０９残基バージョン）でコートし、５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の５％インスタントミルクでブロックしたプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｓｏｒｐ ９６ウェル）に対する結合についてスクリーニングした。ＰＢＳ中、０．５％のウシ血清アルブミンおよび０．５％ＴＷＥＥＮ２０TMの存在下で室温で１〜２時間結合させた後、ファージ溶液を除き、プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ２０TM（ＰＢＳ緩衝液中の０．０５％ＴＷＥＥＮ２０TM）で１０回洗浄した。典型的には、低い解離速度を有するアフィニティー変異体を選択するために、プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ２０TM緩衝液と、選択の各ラウンドを徐々に長くする時間（選択の第１ラウンドの０分から第９ラウンドの３時間まで）でインキュベーションした。ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ２０TM緩衝液を除いた後、残ったファージを０．１ＭＨＣｌで溶出し、素早く１／３体積の１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和した。ＸＬ−１ＢｌｕｅE. coli細胞（Stratagene）を次の選択サイクルのために感染させることにより溶出したファージを増殖させた。
配列のデータは、両方のＶＬ１ライブラリーが、第８／第９ラウンドのソーティングの後でさえ、ランダム化した部位において、異なった耐性のある様々なタイプの残基が残っていることが判明した。対照的に、ＶＨ３ライブラリーは、野生型の残基のみを維持するかまたは非常に保存的な置換を有していた。このことは、ＶＬ１がより溶媒にさらされており、結合界面の外側に位置していることを示唆するものである。対照的に、ＶＨ３は異なる側鎖の置換を劇的には示さなかったので、抗原結合に対して関係がより深いのであろう。
結合アフィニティーのファージ−ＥＬＩＳＡアッセイ：これらライブラリーのそれぞれから，代表的なクローン（豊富（abundant）配列によって示されるクローン）を、ファージ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、親のクローンｐＹ０１０１のアフィニティーと比較したそれらのアフィニティーについて分析した。このようなアッセイでは、ファージを最初に連続希釈して、後で一定に維持する機能的な飽和力価を測定し、ＶＥＧＦの種々の濃度（初め２００ｎＭ〜０ｎＭ）とインキュベーションするために使用した。次いで、混合物を、ＶＥＧＦ（２μｇ／ｍＬ）で予めコートしたプレートに移し、５％のインスタントミルクでブロックし、室温で１時間平衡化した。次いで、ファージ溶液を除き、残った結合したファージを、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギと混合したウサギ抗ファージ抗体の溶液で検出した。１時間室温でインキュベーションした後、プレートを発色物質、ｏ−フェニレンジアミン（シグマ）で展開した。１／２体積の２．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて反応を止めた。４９２ｎｍにおける工学密度を分光光度プレートリーダーで測定した。
これら５つのライブラリーから選択したクローンのすべてが、ファージ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、野生型ｐＹ０１０１よりも弱いかまたは同様のアフィニティーを示したが、ライブラリーＨＬ−２５８に由来する１つの特定の変異体（ｐＹ０１９２）は、ｐＹ０１０１に対して発現レベルまたはファージディスプレイにおいて明らかな有用性を示した（約１０倍）。このクローンは、ＶＬドメインにおいて突然変異Ｓ２４Ｒ、Ｓ２６Ｎ、Ｑ２７Ｅ、Ｄ２８ＱおよびＩ２９Ｌを含んでいた（図９Ａ）。さらに、この変異体は、擬似の突然変異Ｍ３４ＩをＶＨに有することが分かった。この変異体は、ｐＹ０１０１変異体と比較してＶＥＧＦに対する結合アフィニティーにおける有意な差異は示さなかった。ファージにおけるＦａｂ−ディスプレイおよびファージ−ＥＬＩＳＡアッセイのシグナル対ノイズ比を改善するために、ＶＬ１でのｐＹ０１９２における対応する置換を、ＣＤＲＡｌａ変異体および第２世代の抗ＶＥＧＦライブラリーの両方の構成のためのテンプレートバックグラウンドに導入した。
抗ＶＥＧＦのＣＤＲのＡｌａスキャンニング：ＣＤＲドメインにおける各アミノ酸が寄与するエネルギー特性を決定し、ランダム化のための選択標的残基を改善するために、各残基をアラニンで置換することによりＣＤＲドメインをスクリーニングした。各Ａｌａ変異体を、特異的なアラニン置換をコードする合成オリゴヌクレオチドをによる部位特異的突然変異誘発を使用して構築した。Ａｌａが野生型残基である場合は、Ｓｅｒを置換して側鎖置換の効果を試験した。１つのＡｌａ変異を有するファージクローンを、精製し、ファージ−ＥＬＩＳＡにおいて上記のとおり分析した。Ａｌａスキャンの結果は、様々な位置におけるＡｌａ置換が、ｐＹ０１９２と比較して抗原結合アフィニティーにおいて、２〜＞１５０倍の減少に分布する効果を有することを示した。さらに、ＶＬ１ではなくＶＨ３が抗原結合に関与しているという以前の観察結果を確認した。ＣＤＲＡｌａスキャンの結果を以下の表１１にまとめる。
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すべての変異体はｐＹ０１９２のバックグラウンドにある（“ｗｔ”；図９Ａ−Ｂ参照）。ＩＣ５０は、競合的ファージ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定した。
Ａｌａ置換の最も大きい効果は、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３においてみられ、Ｙ２７Ａ（３４倍のアフィニティーの減少）、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｗ５０Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１０６Ａ、およびＷ１０８Ａ（それぞれ＞１５０倍の減少）、Ｎ３５Ａ（６６倍の減少）、Ｐ１００Ａ（３８倍の減少）およびＦ１１０Ａ（２５倍の減少）を含んでいる。対照的に、１つのＶＬ置換、Ｗ９６Ａ（＞１５０倍の減少）のみが、結合アフィニティーに対し大きな影響を与えた。これらの結果は、３つのＶＨ ＣＤＲが、ＶＥＧＦに対するＦａｂ結合の主要な大きな決定因子であり、ＶＬ３からの寄与が若干あることを示している。
ＣＤＲ変異体ライイブラリーの第２世代の設計：抗ＶＥＧＦバージョンＹ０１９２に存在する残基をランダム化する２つのさらなるライブラリーを結晶構造の観察に基づいて設計した。ＶＨ２では、ＶＥＧＦとの結合界面内に位置しているため、残基５２〜５５をランダム化した。“ＣＤＲ７”と呼ばれるＦａｂのさらなるドメイン（図１０Ｂ参照）も、このループにおけるいくつかの残基が、ＶＥＧＦと接触しないがその抗体のＶＨループと接触してしまうので、ランダム化の標的とした。これらは、界面残基に対する２次効果によるアフィニティー改善のための可能性を秘めた残基を示した。残基Ｌ７２、Ｔ７４およびＳ７７を、このＣＤＲライブラリーにおいてランダム化した。
さらに、結晶構造に基づいて、元のＣＤＲライブラリーの１つを再構築して、ＶＨ１ ＣＤＲにおけるアフィニティー変異に関する可能性を再試験した。新たなＹ０１９２バックグラウンドを用いて、残基２７、２８、３０〜３２をランダム化した。
抗ＶＥＧＦライブラリーの第２世代選択：Ａｌａスキャンの結果並びに抗原−抗体（Ｆ（ａｂ）−１２）複合体の結晶構造に基づいて、１７個のライブラリーの総数をｐＹ０１９２テンプレートおよび終止テンプレートオリゴヌクレオチド（ランダム化について標的化された部位での終止コドンをコードする）ＹＣ−８０、ＹＣ−１００、ＹＣ−１０２、ＨＬ−２６３、およびＨＬ−２６４（上記図９）を用いて構築した。対応するランダム化オリゴヌクレオチド（ランダム化について標的化した部位でＮＮＳを用いる）は、ＹＣ８１、ＹＣ−１０１、ＹＣ−１０３、ＨＬ−２６５、およびＨＬ−２６６であった（上記表１０）。得られた形質転換体によって、６×１０7〜５×１０8の範囲に分布する複雑度のライブラリーが得られ、これはそのライブラリーが可能な変異体のすべてをカバーすることにおいて包括的なものであることを示唆した。ファージライブラリーを、以下の表１２に記載した条件を用いて７〜８回ソーティングした。
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ＥＬＩＳＡ緩衝液は、ＰＢＳ中、０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．５％ＴＷＥＥＮ２０TMを含有した。ＶＥＧＦをインキュベーション緩衝液中でインキュベーションしてファージのプレートの表面でコートされたＶＥＧＦへの再結合を最小限にした。これらのライブラリーのソーティングにより、７〜８回の選択でファージ豊富化物を得た。
第２世代クローンのファージ−ＥＬＩＳＡアッセイ：８回の選択の後、各ライブリーから１０〜１２個のクローンを、溶出したファージプールで感染させたE. coli（ＸＬ１）コロニーを含むカルベニシリン含有プレートから単離した。コロニーを単離してヘルパーファージで生育させてバックグラウンド決定のための１本鎖ＤＮＡを得た。より好ましいＶＥＧＦへの結合のために選択したＣＤＲ置換を、ファージミドクローンのＤＮＡ配列から推定した。選択したクローンのサンプリングを以下の表１３に示す。
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ランダム化した領域の配列はＤＮＡ配列から推定されるもののみを示す。
クローンの数を、親クローンｐＹ０１９２とともに、ファージ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験し、親クローンと比べるとはっきりとした改善はみられなかった。これは、分析を行った時間の長さによって説明されるだろう（＜３時間）。
抗原結合における親クローンに対する改善を定量するために、いくつかの抗ＶＥＧＦ変異体のＤＮＡをE. coli ３４Ｂ８株に形質転換し、Ｆａｂとして発現させ、上記実施例２に記載のとおり、ペリプラズムショッケート（shockate）をプロテインＧカラム（Pharmacia）に通した。
ＣＤＲ複合変異体：ＶＥＧＦ結合アフィニティーを改善するために、異なるＣＤＲにおいて、ファージディスプレイによって見い出された変異体を組み合わせて、多重ＣＤＲ突然変異体を作製した。具体的には、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３ライブラリーに由来する、最もアフィニティーが改善されたファージ変異体において同定された突然変異を、結合アフィニティーに対するそれらの寄与の能力を試験するために組み合わせた（表１４）。
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表示した親ベクター由来の突然変異体を、部位特異的突然変異誘発により、示されたオリゴヌクレオチドから得られた突然変異体と組み合わせて、記載の組み合わせ変異体を得た。
バージョンＹ０３１７は、ＶＬ１におけるバックグラウンド突然変異が除かれており、その配列がｐＹ０１０１のものに復帰していることを除いては、Ｙ０３１２−１と等しい。Ｈ１０１ＹおよびＳ１０５Ｔの突然変異の効果を、Ｙ０２３８−３由来の復帰突然変異体を構築することによって試験した。
BIAcore解析：ＦａｂフラグメントのＶＥＧＦ結合アフィニティーを、BIAcore-2000TM表面プラズモン共鳴システム（BIAcore,Inc.,Piscataway, NJ）を用いて計算した。バイオセンサーチップを、供給元（BIAcore,Inc.,Piscataway, NJ）の指針にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、ＶＥＧＦの共有結合カップリングのために活性化した。ＶＥＧＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）中で緩衝液交換し、約５０μｇ／ｍＬに希釈した。アリコート（３５μＬ）を、２μＬ／分の低流速で注入し、カップリングしたタンパク質の約７００〜１４００応答単位（ＲＵ）を達成した。最後に、１Ｍのエタンールアミンをブロッキング剤として注入した。
キネティックスの測定については、Ｆａｂの２倍希釈列を、２５℃、流速１０μＬ／分でＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ２０TM緩衝液（リン酸緩衝食塩水中の０．０５％ＴＷＥＥＮ２０TM）に注入した。会合速度および解離速度を標準的なプロトコル（Karlssonら, J. Immun. Methods 145:229-240（1991））を用いて計算した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定から，平衡解離定数Ｋｄを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。データを以下の表１５に示す。
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観察された解離速度は、オフレートがBIAcoreによる検出限界に近づいているので、恐らくこれらの実験における真の解離速度の上限を反映しているのであろう。
表１５におけるBIAcoreTMデータは、いくつかの変異によってアフィニティーがＹ０１９２のよりも改善されたことを示している。例えば、突然変異Ｔ２８ＤおよびＮ３１Ｈの結果生じたＣＤＲＨ１変異体、Ｙ０２４３−１は、４．１倍増強されたアフィニティーを示した。変異体Ｙ０２３８−３は、Ｙ０１９２に対して少なくとも１４倍の結合アフィニティーの改善を示した。両方のＣＤＲＨ３突然変異体は、Ｔ１０５のＳへの復帰（変異体Ｙ０３１３−３）がＹ０２３８−３のアフィニティーを０．１５ｎＭから０．６５ｎＭに減少させたので、Ｙ０２３８−３のアフィニティーの改善に寄与している（表１５参照）。Ｙ０１９２と比べてより大きなアフィニティーの増加は、ＣＤＲＨ１突然変異と組み合わせたＣＤＲＨ３突然変異を含んでいたＹ０３１３−１にみられた。
ＶＥＧＦ阻害の細胞ベースアッセイ：Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ抗体のいくつかのバージョンを、ＨｕＶＥＣｓ（ヒト臍静脈内皮細胞）の増殖の誘発においてＶＥＧＦ（組換えバージョン１−１６５）を拮抗するその能力について試験した。９６ウェルプレートにウェルあたり１０００ＨｕＶＥＣｓを加え、アッセイ培地（１．５％透析濾過したウシ胎児血清を加えたＦ１２：ＤＭＥＭ５０：５０）中２４時間固定した。細胞を誘発するために使用したＶＥＧＦの濃度は、最大のＤＮＡ合成の８０％を刺激し得るＶＥＧＦの量を最初に滴定することにより決定した。固定した量（最終濃度０．２ｎＭ）のＶＥＧＦ、および増加する濃度の抗ＶＥＧＦＦａｂまたはＭＡｂを含む新しいアッセイ培地を加えた。４０時間インキュベーションした後、ＤＮＡ合成を三重水素化チミジンの取りこみによって測定した。細胞をウェルあたり［３Ｈ］−チミジン０．５μＣｉで２４時間パルスし、ＴｏｐＣｏｕｎｔガンマカウンターを使用する計測のために回収した。
結果（図１１）は、Ｆ（ａｂ）−１２由来の完全長のＩｇＧが、Ｆａｂ形態よりもＶＥＧＦ活性の阻害が有意に強いことを示している（ここではＹ０１９２を使用した）。しかし、両方の変異体Ｙ０２３８−３およびＹ０３１３−１はいずれも、Ｙ０１９２ＦａｂまたはＦ（ａｂ）−１２ＭＡｂのいずれかよりもさらに強いＶＥＧＦ活性の阻害を示した。Ｆａｂ形態を比較すると変異体Ｙ０３１３−１は、野生型Ｆａｂよりも＞３０倍もより強力であるようであった。このアッセイで使用したＶＥＧＦの量（０．２ｎＭ）は、突然変異体の正確なＩＣ５０の測定を制限するかもしれない。例えば、突然変異体の結合アフィニティー（Ｋｄ）は、実際は＜０．２ｎＭであり、この実験におけるＩＣ５０は、低いＶＥＧＦ濃度の条件下では、見かけ上高くなるようである。したがって結果は、アフィニティーが改善された変異体は、ＶＥＧＦに対するアフィニティーが少なくとも３０倍改善され、インビトロでＶＥＧＦ活性を効果的にブロックするという結論を支持している。Ｙ０３１７変異体はＶＬ１配列の野生型への復帰においてのみ、Ｙ０３１３−１と異なっているので（図１０Ａ）、Ｙ０３１７はＹ３１３−１と同様の活性を有すると予想される。
変異体Ｙ０３１７（Ｆａｂ）および実施例１のヒト化変異体Ｆ（ａｂ）−１２（完全長およびＦａｂ）を、実施例１に記載したアッセイを使用して、ＶＥＧＦの近最大有効濃度に応答したウシ毛細内皮細胞増殖を阻害する能力について比較した。図１２に示したように、このアッセイにおいて、Ｙ０３１７は、Ｆ（ａｂ）−１２の完全長およびＦａｂ形態よりも著しく効果的であった。Ｙ０３１７アフィニティー成熟したＦａｂは、このアッセイにおいて、Ｆ（ａｂ）−１２よりも少なくとも約２０倍低いＥＤ５０値を示した。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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