(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも465位のAlaがLeuに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項２】
さらに、463位のPheがTrpに変異している、請求項１に記載の変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項３】
さらに、86位のMetがIleに変異している、請求項１又は２に記載の変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項４】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも465位のAlaがTrpに、463位のPheがIleに、そして86位のMetがIleに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している、変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項５】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも484位のAlaがGlyに変異し、且つ534位のIleがPheに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項６】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも134位のSerがGlyに変異し、且つ136位のValがLeuに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べて酸素に対する親和性Km（oxygen）が上昇している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項７】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、463位のPheがTrpに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてNaCl耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項８】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、86位のMetがIleに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比して耐熱性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項９】
（１）配列番号：１に示すアミノ酸配列において465位のAlaがLeuに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
（２）上記（１）において、さらに463位のPheがTrpに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ。
（３）上記（２）において、さらに86位のMetがIleに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
（４）配列番号：１に示すアミノ酸配列において、465位のAlaがTrpに、463位のPheがIleに、そして86位のMetがIleに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
（５）配列番号：１に示すアミノ酸配列において、484位のAlaがGlyに変異し、且つ534位のIleがPheに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Azide）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
（６）配列番号：１に示すアミノ酸配列において、134位のSerがGlyに変異し、且つ136位のValがLeuに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べて酸素に対する親和性Km（oxygen）が上昇している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
（７）配列番号：１に示すアミノ酸配列において、463位のPheがTrpに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比べてNaCl耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；あるいは、
（８）配列番号：１に示すアミノ酸配列において、86位のMetがIleに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるアスコルビン酸オキシダーゼに比して耐熱性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ；
において、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、86位のMetから90位のGlyまでのＢ領域、131位のPheから136位のValまでのＣ領域、461位のHisから470位のPheまでのＡ領域及び534位のIleから546位のLysまでのＤ領域以外の領域において、１又は数個のアミノ酸の除去、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列からなる修飾型アスコルビン酸オキシダーゼであり、且つ対応する修飾前の変異型アスコルビン酸オキシダーゼの改良された特性を維持している修飾型アスコルビン酸オキシダーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼをコードしているDNA。
【請求項１１】
請求項10に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
【請求項１２】
請求項11に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
【請求項１３】
請求項12に記載の宿主を培養し、該培養物から変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼを採取することを特徴とする、変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は改良された特性を有する変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼ、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスコルビン酸オキシダーゼ〔ＥＣ  １．１０．３．３〕は、アスコルビン酸を酸化し、デヒドロアスコルビン酸を生成する青色の銅含有酵素であり、１９３５年にH.Tauberによって発見されて以来、広くウリ科の高等植物に存在していることが知られている。その後、キュウリ（T.Nakamura, N.Makino, and Y.Ogura, J.Biochem., 64, 189-195 (1968))、カボチャ（M.H.Lee, C.R.Dawson, J.Biol.Chem., 246, 6596-6602 (1973)) 由来のアスコルビン酸オキシダーゼは精製され、詳細に酵素化学的性質や物理化学的性質を調べられ、商業的に利用されてきた。
【０００３】
また、カビ由来のアスコルビン酸オキシダーゼも、ミロセシウム・ベルカレア（G.A.White and R.M.Krupka, Arch.Biochem.Biophys., 110, 448-461 (1965)) 、アクレモニウム・ｓｐ．ＨＩ−２５（特許第２５１２５７８号、S.Murao, H.Itoh, S.Fukuyasu, K.Hirayama, and T.Shin, Agric.Biol.Chem., 55, 1693-1694 (1991))由来の酵素が発見され、特に、アクレモニウム由来のアスコルビン酸オキシダーゼ（以下では、ＡＳＯＭと略す）は商業的に実用化されている。
【０００４】
アスコルビン酸オキシダーゼは商業的には、食品分野でのアスコルビン酸の定量や臨床検査分野で検体中に存在するアスコルビン酸による測定値の負誤差を防止するためにサンプル中のアスコルビン酸消去用に利用されており（金井正光、金井泉編著、臨床検査法提要  改訂第２９版、金原出版  ｐ．４３６（１９８３））、特に、臨床検査分野では、最も広い市場を持つ酵素の１つとなっている。最近、芳陵らによって、ＡＳＯＭの構造遺伝子が発見され、そのＤＮＡ配列を決定し、このＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定した（特願平７−３３１４５９）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
カビ由来の生来の酵素であるＡＳＯＭは、溶液中での安定性が高く長期保存が可能になるなどの利点を有していたが、臨床検査試薬としては、保存剤として用いられるアジ化ナトリウムに対する感受性がやや高いといった欠点も有していた。また、生来の酵素に比べて耐熱性が向上した酵素、あるいは生来の酵素に比較して酵素に対する親和性が向上した酵素も実用的見地から求められている。
【０００６】
従って本発明は、アクレモニウム由来の生来のアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＭ）に比べて、アザイド（Ａｚｉｄｅ）、具体的には特にアジ化ナトリウムに対する耐性が向上した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、生来のアスコルビン酸オキシダーゼに対して耐熱性が向上した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、生来のアスコルビン酸オキシダーゼに比して酸素に対する親和性が上昇した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、生来のアスコルビン酸オキシダーゼに比してＮａＣｌ耐性が向上したアスコルビン酸オキシダーゼ等、並びにその製造手段を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも４６５位のＡｌａがＬｅｕ又はＴｒｐに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド（Ａｚｉｄｅ）に対する耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
上記の変異型アスコルビン酸オキシダーゼに含まれる態様としては、４６５位の変異に加えてさらに４６３位のＰｈｅがＩｌｅ又はＴｒｐに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、並びに、上記４６５位の変異に加えて、又は４６５位と４６３位の変異に加えて、さらに８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼが挙げられる。
【０００８】
本発明はまた、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも４８４位のＡｌａがＧｌｙに変異しており、且つ５３４位のＩｌｅがＰｈｅに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイド耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
本発明はさらに、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、少なくとも１３４位のＳｅｒがＧｌｙ又はＡｌａに変異しており、且つ１３６位のＶａｌがＬｅｕに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するアスコルビン酸オキシダーゼに比べて酸素に対する親和性Ｋｍ（ｏｘｙｇｅｎ）が上昇している変異型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、４６３位のＰｈｅがＴｒｐに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するアスコルビン酸オキシダーゼに比べてＮａＣｌ耐性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
本発明はさらに、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するアスコルビン酸オキシダーゼに比して耐熱性が向上している変異型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
【００１０】
本発明によれば、ＡＳＯＭの活性中心を構成する銅イオンの結合部位は、配列番号：１に示すアミノ酸配列中、８６位のＭｅｔから９０位のＧｌｙまでの領域（Ｂ領域と称する）、１３１位のＰｈｅから１３６位のＶａｌまでの領域（Ｃ領域と称する）、４６１位のＨｉｓから４７０位のＰｈｅまでの領域（Ａ領域と称する）、及び５３４位のＩｌｅから５４６位のＬｙｓまでの領域（Ｄ領域と称する）に存在すると推定される。
【００１１】
従って本発明は、前記の変異を有し、且つ、上記のＡ〜Ｄ領域以外の領域において１〜複数個のアミノ酸の除去、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有する修飾型アスコルビン酸オキシダーゼであって、且つ対応する修飾前の変異型アスコルビン酸オキシダーゼの改良された特性を維持している修飾型アスコルビン酸オキシダーゼを提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ＡＳＯＭの活性中心である銅イオンの結合部位は、既知のカボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼのＸ線結晶解析結果（A.Messerschmidt, H.Luecke, and R.Huber, J.Mol.Biol., 230, 997-1014 (1993))、及び、アミノ酸配列（M.Esaka, T.Hattori, K.Fujisawa, S.Sakajo, and T.Asahi, Eur.J.Biochem., 191, 537-541 (1990)) の比較から、本発明者らは、アミノ酸位置８６から９０位（Ｂ領域）、１３１から１３６位（Ｃ領域）、４６１から４７０位（Ａ領域）、５３４から５４６位（Ｄ領域）の４つのドメインに存在していると推測した。
そこで、本発明者らは、上記の推定銅イオン結合部位における種々のアミノ酸置換変異を行った。実施例に具体的に示す変異型酵素とその特性との関係を次の表１に示す。
【００１３】
【表１】
0003969797.tif 000002
【００１４】
上記の表において、ＡＳＯＭはアクレモニウムが生産する生来アスコルビン酸オキシダーゼを示し、Ａｎ−ＡＳＯＭは、組換法によりアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）により生産したＡＳＯＭを示す。
【００１５】
アザイド（Ａｚｉｄｅ）耐性
上記の表１から、配列番号：１に示すアクレモニウム由来の生来のアスコルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列において、４６５位のＡｌａがＬｅｕに変異している（変異型酵素ＭＡ１，ＭＡ３及びＭＡＢ１）か又はＴｒｐに変異している（変異型酵素ＭＡＢ２）酵素はアザイドに対する耐性が向上している。従って、本発明は、少なくとも４６５位のＡｌａがＬｅｕ又はＴｒｐに変異しているアザイド耐性変異型アスコルビン酸オキシダーゼを含む。上記の４６５位の変異に加えて、さらに４６３位のＰｈｅがＴｒｐに変異している（変異型酵素ＭＡ３及びＭＡＢ１）か、又はＩｌｅに変化している（変異型酵素ＭＡＢ２）酵素もアザイド耐性を有する。従って本発明は、上記の４６３位の変異に加えて、４６３位のＰｈｅがＴｒｐ又はＩｌｅに変異しているアザイド耐性変異型酵素を含む。
【００１６】
表１から明らかなごとく、上記４６５位の変異及び４６３位の変異に加えて、さらに８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼもアザイド耐性を有する。従って本発明は、上記４６５位の変異及び４６３位の変異に加えて、８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼも含む。
【００１７】
さらに、上記のごとく、４６５位のみが変異しているアスコルビン酸オキシダーゼがアザイド耐性を有し、且つ４６５位、４６３位及び８６位の３個所の変異を有する変異型アスコルビン酸オキシダーゼがアザイド耐性を有することから、４６３位及び８６位に上記の変異を有する変異型アスコルビン酸オキシダーゼもアザイド耐性を有すると合理的に推定される。従って、４６５位のＡｌａがＬｅｕ又はＴｒｐに変異しており、且つ８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼも本発明に含まれる。
【００１８】
さらに、表１によれば、４８４位のＡｌａがＧｌｙに変異しており、且つ５３４位のＩｌｅがＰｈｅに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ（変異型酵素ＭＤ１）もアザイド耐性を有する。従って本発明はまた、領域Ａに変異を有し、領域Ｂに更なる変異を有してもよい前記のアザイド耐性変異型アスコルビン酸オキシダーゼとは異るタイプのアザイド耐性アスコルビン酸オキシダーゼとして、Ｄ領域に変異を有する変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、すなわち、少なくとも、４８４位のＡｌａがＧｌｙに変異しており、且つ５３４位のＩｌｅがＰｈｅに変異しているアザイド耐性変異型アスコルビン酸オキシダーゼをも含む。
【００１９】
酸素に対する親和性
表１によればまた、Ｃ領域に特定の変異を有するアスコルビン酸オキシダーゼ、すなわち１３４位のＳｅｒがＧｌｙに変異しており、且つ１３４位のＶａｌがＬｅｕに変異しているアスコルビン酸オキシダーゼ（変異型酵素ＭＣ１）は酸素に対する親和性が上昇（Ｋｍ（ｏｘｙｇｅｎ）値が低下）している。また、１３４位のＳｅｒがＡｌａに変異しており、且つ１３６位のＶａｌがＬｅｕに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ（変異型酵素ＭＣ２）は、アザイド耐性、ＮａＣｌ耐性及び耐熱性のいずれもＭＣ１と同様に変化している。
【００２０】
従って、ＭＣ１とＭＣ２では変異した活性中心は同様の構造を有すると考えられるから、ＭＣ２もＭＣ１と同様に酸素に対する親和性が上昇していると合理的に推定される。従って本発明は、少なくとも、１３４位のＳｅｒがＧｌｙ又はＡｌａに変異しており、且つ１３６位のＶａｌがＬｅｕに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼをも含む。
なお、ＭＣ１はＬ−アスコルビン酸に対する親和性（Ｋｍ（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ））も上昇している。従って、少なくとも１３４位のＳｅｒがＧｌｙ又はＡｌａに変異しており、且つ１３６位のＶａｌがＬｅｕに変異しており、Ｌ−アスコルビン酸に対する親和性が上昇している変異型アスコルビン酸オキシダーゼも本件発明の範囲に含まれる。
【００２１】
さらに、Ａ領域に特定の変異を有する変異型アスコルビン酸オキシダーゼ（変異型酵素ＭＡ３）も酸素に対する親和性が上昇している。従って本発明はまた、少なくとも、４６５位のＡｌａがＬｅｕに変異しており、且つ４６３位のＰｈｅがＴｒｐに変異しており、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する、酸素に対する親和性が上昇している変異型アスコルビン酸オキシダーゼをも含む。
これらの、酸素に対する親和性が上昇したアスコルビン酸オキシダーゼは低い溶存酸素濃度下での酸素の除去効率の上昇において有用であり、Ｌ−アスコルビン酸に対する親和性が上昇したアスコルビン酸オキシダーゼは臨床検査薬におけるアスコルビン酸の低い濃度下での消去効率の上昇において有用である。
【００２２】
ＮａＣｌ耐性
表１から明らかなごとく、４６３位のＰｈｅがＴｒｐに変異している変異型アスコルビン酸オキシダーゼ（変異型酵素ＭＡ２）では塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に対する耐性が向上している。従って本発明は、４６３位のＰｈｅがＴｒｐに変異しているＮａＣｌ耐性変異型アスコルビン酸オキシダーゼを含む。
ＮａＣｌ耐性が向上したアスコルビン酸オキシダーゼは高食塩を含む食品中のアスコルビン酸量の定量において有用である。
【００２３】
耐熱性
表１によれば、Ｂ領域に特定の変異を有する変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、すなわち８６位のＭｅｔがＩｌｅに変異した変異型アスコルビン酸オキシダーゼは耐熱性が向上している。従って、８６位のＭｅｔがＩｌｅに変化している耐熱性変異型アスコルビン酸オキシダーゼも本発明に含まれる。
【００２４】
前記のごとく、アスコルビン酸オキシダーゼの活性中心を構成する銅イオン結合部位は、配列番号：１のアミノ酸配列において、８６位のＭｅｔから９０位のＧｌｙまでの領域（Ｂ領域）、１３１位のＰｈｅから１３６位のＶａｌまでの領域（Ｃ領域）、４６１位のＨｉｓから４７０位のＰｈｅまでの領域（Ａ領域）、及び５３４位のＩｌｅから５４６位のＬｙｓまでの領域（Ｄ領域）に存在すると推定され、この推定は前記のごとき、この領域での種々の変異により確認された。従って上記の領域Ａ〜Ｄ以外の領域において１〜複数個のアミノ酸の除去、付加及び／又は他のアミノ酸による置換によりアミノ酸配列を修飾しても、本発明の改良された特性は維持されると推定される。
【００２５】
従って本発明は、領域Ａ〜Ｄ中に前記のごとき変異を有し、且つ領域Ａ〜Ｄ以外の領域において１〜複数個のアミノ酸の除去、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ前記の変異により改良された特性を維持している修飾アスコルビン酸オキシダーゼをも含む。上記のアミノ酸配列の修飾の程度は本件出願前に周知であった技術、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により実施可能なものである。
【００２６】
本発明はまた、上記種々の変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼをコードするＤＮＡに関する。このＤＮＡは、例えばアクレモニウムから公知の方法に従ってＡＳＯＭをコードする生来のＤＮＡをクローニングし、次に変異プライマーを用いる部位特定変異誘発又はＰＣＲ法等により前記生来のＤＮＡに変異を導入することにより得られる。
本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクターに関する。この発現ベクターは、該ＤＮＡを発現させるための宿主に依存して選択される。
【００２７】
宿主細胞としては、原核生物又は真核生物のいずれでもよい。原核生物は好ましくは細菌であり、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス属細菌、例えばバシルス・ズブチリス（Bacillus subtilis ）等が使用可能である。また真核生物としては、下等真核生物、例えば真菌類、例えば酵母や糸状菌で使用され、酵母としてはサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）、等が使用され、糸状菌としては、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus orizae）等が使用される。
【００２８】
さらに動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、昆虫、例えばカイコの細胞等が使用される。
これらの宿主に従って、前記発現ベクター中のプロモーターとしては、例えば、細菌用発現ベクターに使用するプロモーターとしては、大腸菌由来ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、Ｔ７ファージのプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば酵母由来アルコールデヒドロゲナーゼII遺伝子のプロモーター、酵母由来酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター等が使用され、アスペルギルス用プロモーターとしては、アスペルギルス・ニドランス由来アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーター、アスペルギルス・オリゼー由来α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター等が使用される。また、動物細胞用のプロモーターとしては、ファージプロモーター、例えばシミアンウィルス４０由来初期遺伝子プロモーター、アデノウィルス由来主要後期プロモーター等が使用される。
【００２９】
本発明のベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができる。
本発明はまた、上記の形質転換体を培養し、該培養物から変異型又は修飾型アスコルビン酸オキシダーゼを採取することを特徴とする新規アスコルビン酸オキシダーゼの製造方法を提供する。培養及び酵素の採取のためには常法を用いることができ、その具体例を実施例に記載する。
【００３０】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．アクレモニウム由来のアスコルビン酸オキシダーゼ発現用ベクターｐＰＡＴＧの構築
遺伝子の組換えの方法、すなわち、一般的なベクターの構築、大腸菌への形質転換などの組換え技術は、Sambrook et.al. のMolecular Cloning : A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Labotatory Press, New York (1986) や、制限酵素や各種ｋｉｔの販売会社のマニュアルの手法に従った。
【００３１】
１．ｐＤＪＢ１−ＸｈｏＩの作製
ＡＳＯＭ遺伝子に含まれるＸｈｏＩサイトをユニークなサイトとして使いたいため、ｐＤＪＢ１（ｐＢＲ３２５に由来し、ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩサイトに、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa ）由来遺伝子ｐｙｒ４（オルニチン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードする）が挿入されている（D.J.Balance, G.Turner, Gene, 36, 321-331 (1985))のＸｈｏＩサイト（ｐｙｒ４遺伝子のプロモーター領域内：開始コドンより上流約８０bpに位置する）を以下の方法で欠損させてｐＤＪＢ１−ＸｈｏＩを作製した。すなわちｐＤＪＢ１を制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、Mung Bean Nucrease（東洋紡社製）を用いて一本鎖部分を削り平滑末端にし、DNA ligation kit（宝酒造製）を用いて連結した。得られたｐＤＪＢ１−ＸｈｏＩは従来の形質転換ベクターｐＤＪＢ１よりも６bp減少した形となっている。
【００３２】
２．ｐＵＣ１８−ＨＢの作製
ｐＵＣ１８（宝酒造製）のＨｉｎｄIII サイトをＢｇｌIIサイトに、以下の方法で変換した。ｐＵＣ１８を制限酵素ＨｉｎｄIII で消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（DNA Blunting kit：宝酒造製）を用いて一本鎖部分に塩基を付加し、平滑末端にし、DNA ligation kit（東洋紡社製）を用いて、BglII linker（１０mer 、脱リン酸化型；宝酒造製）を挿入した。
【００３３】
３．ｐＴＧ１の作製
大腸菌においてｐＢＲ系よりも使いやすい、ｐＵＣ系ベクターをもとにした、ｐｙｒ４遺伝子を含む、形質転換ベクターを作製した。すなわち、以下の方法で、ｐＤＪＢ１−ＸｈｏＩのＣｌａＩ−ＳｐｈＩ断片（２kbp 、ｐｙｒ４遺伝子部分に相当）を、ｐＵＣ１８−ＨＢのＳｓｐＩサイトに挿入した。ｐＤＪＢ１−ＸｈｏＩを、制限酵素ＣｌａＩ及びＳｐｈＩで、二つの断片に消化した。０．７％アガロースゲル電気泳動に流し両者を分離した。ｐｙｒ４遺伝子部分が含まれる約２kbp の断片をゲルから切り出し、電気溶出法により、ＣｌａＩ−ＳｐｈＩ断片を回収した。この断片をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（DNA Blunting kit：宝酒造製）を用いて平滑末端にし、制限酵素ＳｓｐＩで消化したｐＵＣ１８−ＨＢに挿入した。
【００３４】
４．ｐＡＳＯＭ４．０の作製
ＡＳＯＭタンパク質コード領域とその５′上流側約７８０bp及び３′下流側約１４００bpを含むＥｃｏＲＩ〜ＸｈｏＩの４kbの断片を、以下に示す方法により、ｐＵＣ１１８へクローニングした。ｐｃＡＳＯＭ１（旭化成工業株式会社製）（ＡＳＯＭ遺伝子のうち、制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出される、約２．５kbp の断片が、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトにクローニングされているもの。
【００３５】
ＡＳＯＭ遺伝子のコード領域および、５′上流側約０．８kbが含まれている。特願平７−３３１４５９）を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで、二つの断片に消化した。０．７％アガロースゲル電気泳動に流し両者を分離した。ベクター部分に相当する、約５．４kbp の断片をゲルから切り出し、電気溶出法により、ＡＳＯＭ遺伝子のプロモーター領域および、コード領域の上流領域が含まれるＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を回収した。そして、細菌アルカリホスファターゼ（東洋紡社）を用いて末端部分を脱リン酸化した（ＢＡＰ処理）。
【００３６】
一方、ｐｃＡＳＯＭ２（旭化成工業株式会社製）（ＡＳＯＭ遺伝子のうち、制限酵素ＳａｃＩで切り出される約３．８kbp の断片が、ｐＵＣ１１８のＳａｃＩサイトにクローニングされているもの。ＡＳＯＭ遺伝子のコード領域の一部および、３′下流側約２．２kbp が含まれている。特願平７−３３１４５９）を、制限酵素ＸｈｏＩで、二つの断片に消化した。０．７％アガロースゲル電気泳動に流し両者を分離した。
【００３７】
ＡＳＯＭ遺伝子コード領域の下流領域および３′非コード領域が含まれる約１．８kbp の断片をゲルから切り出し、電気溶出法により、ＸｈｏＩ断片を回収した。
それぞれのプラスミドから切り出した二つの断片を、DNA ligation kit（東洋紡社）を用いて、連結した。なお、３′下流側のＸｈｏＩとＳａｌＩによる連結により、どちらの制限酵素サイトも消失し、新たにＢｓｐＭＩサイトができている。
【００３８】
５．ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔの作製
プロモーターとして、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来タカアミラーゼ（TaaG2, N.Tsukagoshi 、ら Gene, 84, 319-327 (1989))のプロモーターを用い、開始コドン（ＡＴＧ）の位置でＡＳＯＭ遺伝子と融合させた。
両遺伝子を融合するために、以下の４つのプライマーをデザインした。
【００３９】
0003969797.tif 000003
【００４０】
プライマーＰＡ（１）は、ＴａａＧ２遺伝子の開始コドンより上流約６２０bpに位置するＥｃｏＲＩサイト近辺に結合するようにデザインしてある。プライマーＰＡ（２）及びＰＡ（３）は、互いに相補的な構造をしており、中央部分に存在する開始コドン：ＡＴＧより上流側にはＴａａＧ２遺伝子プロモーターの配列が、下流側にはＡＳＯＭ遺伝子コード領域の配列が含まれている。プライマーＰＡ（４）は、ＡＳＯＭ遺伝子の開始コドンより下流約１８０bpに位置するＳａｃＩサイト近辺に結合するようにデザインしてある。
【００４１】
これら４種類のプライマーを用いて、以下に示す方法で、ＴａａＧ２−ＡＳＯＭ融合遺伝子を作製した。まず、プラスミドｐＭＦ１６００〔アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来タカアミラーゼ（ＴａａＧ２）の構造遺伝子がｐＵＣ１９にクローニングされているもの。N.Tsukagoshi、ら Gene, 84, 319-327 (1989) 〕を鋳型にし、プライマーＰＡ（１）及びＰＡ（３）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００４２】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １０ng、プライマー５０pmol、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ、０．２mM  ｄＮＴＰｓ、１．５mM  ＭｇＣｌ2 、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH９．０）、５０mM  ＫＣｌで、反応液量は５０μｌとした。反応条件は、Gene Amp PCR System 2400（パーキンエルマー社）を用いて、プレヒート（９２℃、５min ）後、変性（９２℃、１min ）、アニーリング（５２℃、１min ）、伸長（７２℃、３min ）反応を３０サイクルで行った。これにより、ＴａａＧ２遺伝子プロモーター領域およびＡＳＯＭ遺伝子の一部、６３９bpを増幅した。
【００４３】
同様に、プラスミドｐｃＡＳＯＭ１を鋳型にし、プライマーＰＡ（２），ＰＡ（４）を用いて、ＰＣＲ反応を行い、ＴａａＧ２遺伝子プロモーターの一部およびＡＳＯＭ遺伝子コード領域の一部、２０９bpを増幅した。それぞれの増幅断片は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に流し、目的の長さのバンドを切り出した後、電気溶出法により、増幅断片を回収した（１st  ＰＣＲ増幅産物）。１st  ＰＣＲ増幅産物を、それぞれ約５０ngを用いて、アニーリング及び伸長反応、さらに、２nd  ＰＣＲを、以下の方法で行った。
【００４４】
ＰＣＲ用のチューブに、鋳型ＤＮＡとして１st  ＰＣＲ増幅産物を、それぞれ約５０ngずつ、１．２５mM  ｄＮＴＰｓ  ８μｌ、２５mM  ＭｇＣｌ2   ３μｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH９．０）５μｌ、５００mM  ＫＣｌ  ５μｌを加え、さらに滅菌水を加えて液量を４７μｌにする。ＰＣＲ用のミネラルオイルを重層した。９４℃で１０分間インキュベーションして変性させた後、約３０分かけて３７℃まで温度を下げ、さらに３７℃で１５分間インキュベーションした。この温度操作により、プライマーＰＡ（２），ＰＡ（３）に相当な、３４bpの部分で、２種類の１st  ＰＣＲ増幅産物をアニーリングさせた。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ（１μｌ）を加えて、７２℃で３分間反応させ、８１４bpに伸長させた。
【００４５】
上記操作により生成した８１４bpの断片を、ＰＣＲにより、さらに増幅した（２nd  ＰＣＲ）。伸長反応の終わった反応液に、プライマーＰＡ（１），ＰＡ（４）を５０pmol（１μｌ）ずつ加え、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は、Gene Amp PCR System 2400（パーキンエルマー社）を用いて、プレヒート（９２℃、５分）後、変性（９２℃、１分）、アニーリング（５６℃、１分）、伸長（７２℃、３分）反応を３０サイクルで行った。
【００４６】
２nd  ＰＣＲ増幅断片は、１．２％アガロースゲル電気泳動に流し、目的の長さの８１４bpのバンドを切り出した後、電気溶出法により、増幅断片を回収した（２nd  ＰＣＲ増幅産物）。２nd  ＰＣＲ増幅産物は、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化して８０４bpの断片にした後、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩサイトに挿入してｐＦ８００を作製した。
ｐＦ８００については、ABI PRISM TM Cycle Sequencing Kits Dye Primer Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kits およびABI DNA Sequencing System 373A（パーキンエルマー社）を用いてシークエンスを行い、ＴａａＧ２−ＡＳＯＭ融合遺伝子が正しい配列でできていることを確認した。
【００４７】
次に、ｐＦ８００を、制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄIII で消化した後に、ＢＡＰ処理をし、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔ作製のためのベクターとした。一方、ｐＡＳＯＭ４．０を、制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄIII で二つの断片に消化した後、０．７％アガロースゲル電気泳動に流し両者を分離した。ＡＳＯＭ遺伝子コード領域の後半部分と３′側領域が含まれる約３kbの断片をゲルから切り出し、電気溶出法により、ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII 断片を回収した。この断片を先のベクターに挿入し、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔを作製した。
【００４８】
６．ｐＰＡＴＧの作製
上述のｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔを改良したもので、いくつかの制限酵素サイトをユニークサイトとして使えるようにしたものである。ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで消化し、約１．１kbp の断片を切り出し、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入し、ｐＰＡ−ＥＰを作製した。ｐＰＡ−ＥＰをＥｃｏＲＩ消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、ＫｐｎＩリンカー（８mer 、脱リン酸化型；宝酒造社）を挿入し、ＥｃｏＲＩサイトをＫｐｎＩサイトに変換したｐＰＡ−ＫＰを作製した。
【００４９】
ｐＰＡ−ＫＰをＰｓｔＩ消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、ＸｂａＩリンカー（８mer 、脱リン酸化型；宝酒造社）を挿入し、ＰｓｔＩサイトをＸｂａＩサイトに変換したｐＰＡ−ＫＸｂを作製した。
さらに、ｐＡＳＯＭ４．０を制限酵素ＳｐｈＩで消化した後切り出した約１．４kbp の断片を、ｐＰＡ−ＫＸｂのＳｐｈＩサイトに挿入し、ｐＰＡ−ＫＸｂ２．４を作製した。
一方、ｐＵＣ１８−ＨＢを作製したときと同様の方法で、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔのＨｉｎｄIII サイトをＢｇｌIIサイトに換え、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔ−ＨＢを作製した。
【００５０】
次に、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔ−ＨＢを、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化して約２．１kbp の断片を切り出し、ｐＴＧ１のマルチクローニングサイト中のＸｂａＩ−ＢｇｌIIサイトに挿入してｐＴＧ１−３′を作製した。なお、この時、ＸｂａＩ−ＮｈｅＩ連結により、両制限酵素サイトは消失している。ｐＴＧ１−３′をＳｐｈＩ消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、ＳｍａＩリンカー（８mer 、脱リン酸化型；宝酒造社）を挿入し、ＳｐｈＩサイトをＳｍａＩサイトに変換したｐＴＧ１−３′Ｓｍを作製した。
【００５１】
最後に、ｐＴＧ１−３′ＳｍをＫｐｎＩ，ＸｈｏＩで消化した後切り出して得られる約６．４kbp の断片をベクターとし、ｐＰＡ−ＫＸｂ２．４から切り出した、約２kbp のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入して、ｐＰＡＴＧを作製した。
以上のようにして作製したｐＰＡＴＧでは、ＫｐｎＩ，ＸｂａＩ，ＳｐｈＩ，ＸｈｏＩ，ＳｍａＩ及びＢｇｌIIがユニークサイトとなっている。
【００５２】
実施例２．ＡＳＯＭの組換法による生産
アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）Ｇ１９１株を用いた形質転換法
１．プロトプラストの調製
アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus. nidulans ）Ｇ１９１株（D.J.Balance, G.Turner, Gene, 36, 321-331 (1985))を、完全培地（２％マルトエキス、０．１％バクトペプトン、２％グルコース、０．１％ウリジン、０．０００２％  ｐ−アミノ安息香酸、ＫＯＨにてpH６．５に調整）に植菌し、３０℃で２４時間、通気培養した。菌体は、滅菌ガーゼでろ過することにより回収した。
【００５３】
菌体をプロトプラスト調製液（０．８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＨ2 ＰＯ4 （pH５．８）、０．０２Ｍ  ＣａＣｌ2 、１５０mg／４０ml  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ２３４（ノボノルディスクバイオインダストリー社））に懸濁し、３０℃で２時間、ゆっくりと振とうし（７０min -1）、細胞壁を分解した。目の細かい滅菌ガーゼでろ過することにより、未分解の菌体を除いたプロトプラスト懸濁液は、遠心分離（１５００rpm 、５min 、室温）を行い、プロトプラストを回収した。プロトプラストは、０．８Ｍ  ＮａＣｌで２回、０．８Ｍ  ＮａＣｌ−５０mM  ＣａＣｌ2 で１回洗浄した後、０．８Ｍ  ＮａＣｌ−５０mM  ＣａＣｌ2 に懸濁し、形質転換に用いた。
【００５４】
２．形質転換
プロトプラスト懸濁液５０μｌ（約１０7 個）を試験管に分注し、精製したＤＮＡ溶液を５μｌ（プラスミドＤＮＡとして１０μｇ以上）、ＰＥＧ溶液（２５％  ＰＥＧ６，０００、５０mM  ＣａＣｌ2 、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５））を１２．５μｌ加え、良く混合した後、氷上で２０分間インキュベーションした。さらに、ＰＥＧ溶液を５００μｌ加え、良く混合した後、氷上で５分間インキュベーションした。
【００５５】
０．８Ｍ  ＮａＣｌ−５０mM  ＣａＣｌ2   １mlを加え、良く混ぜ、適当量をシャーレ上で再生培地（０．６％  ＮａＮＯ3 、０．１５２％  ＫＨ2 ＰＯ4 、０．０５２％  ＫＣｌ、０．０００２％  ｐ−アミノ安息香酸、１．２Ｍソルビトール、０．０５２％  ＭｇＳＯ4 、１％グルコース、２％バクトアガー、ＫＯＨにてpH６．５に調整）と混釈した。３７℃で３〜４日間培養し、形質転換株を菌体に再生させ、酵素生産アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）を得た。
【００５６】
酵素の製造方法及び特性決定
１．培養方法
ＡＳＯＭ遺伝子（ｐＰＡＴＧ）を導入したアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）Ｇ１９１形質転換株は、ＡＳＯＭ発現用液体培地（１％ポリペプトン、０．５％  ＫＨ2 ＰＯ4 、０．１％  ＮａＮＯ3 、０．０５％  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２％マルトース・１水和物、２μｇ／ml  ｐ−アミノ安息香酸、０．００２％  ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ）に胞子を植菌し、３０℃で、４８〜９６時間通気培養して、ＡＳＯＭを発現させた。
【００５７】
この培養で、ＡＳＯＭは、４０Ｕ／ml程度生産させることができた。
尚、アスコルビン酸オキシダーゼ酵素活性測定は、以下の方法で測定した。試験管に、０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．０）０．９５ml、適宜希釈した酵素液０．０５ml（約４０mU）を加え、３０℃でプレインキュベーションした。これに、基質溶液、５mMアスコルビン酸ナトリウム（同緩衝液に溶解）０．１mlを加え、３０℃で５分間反応させた後、０．２Ｎ  ＨＣｌ  ３．０mlを加えて反応を停止させた。２４５nmの吸光度を測定し（アスコルビン酸のε245nm ＝１０）、アスコルビン酸の減少量を算出した。活性の定義は、１分間あたり、１μmol のアスコルビン酸を酸化する酵素量を１ユニット（１Ｕ）とした。
【００５８】
２．Ａｎ−ＡＳＯＭの免疫学的確認
ＡＳＯＭに対する抗体を次のように作製した。
抗原としては、アクレモニウム由来アスコルビン酸オキシダーゼの精製品を用いた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：０．２３４ｇ／ｌ  ＮａＨ2 ＰＯ4 、３．０４ｇ／ｌ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、８．７７ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）に溶解した後、ＰＢＳに対して透析したものを、抗原サンプルとした。
【００５９】
ウサギ（ニュージーランドホワイト、メス、１５週齢：日本エスエルシー社）は、２週間ほど慣らし飼いした後、抗原ＡＳＯＭサンプル約４００μｇを、完全フロイントアジュバンド（ケミコン社）を使用し、一回目の免疫注射を皮内に行った。約２週間後に、抗原ＡＳＯＭ約１mgを、不完全フロイントアジュバンド（ケミコン社）を使用し、同様に、二回目の免疫注射を行った。
二次免疫から約２週間たってから、全採血を行い、最終的に、約３０mlの抗ＡＳＯＭ抗血清を得た。
【００６０】
次に、疎水性樹脂（Butyl-Toyopearl 650M：東ソー社）を、４０％飽和硫安を含む２０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）で平衡化した。平衡化した樹脂を、１．５mlマイクロテストチューブに約１００μｌずつ分注した。菌体を除去した培養上清液（約１０ml）を、pHが５〜７であることを確認した後、４０％飽和になるように硫安を添加した。遠心分離（１２，０００rpm 、１０min 、４℃）により不溶化物を除去してから、以下の樹脂吸着に用いた。
４０％飽和硫安中の培養上清液１mlを、樹脂に吸着させた後、４０％飽和硫安を含む２０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）で洗浄し、蒸留水１mlで酵素を溶出した。
【００６１】
この操作後のサンプル１μｌをウエスタンブロッティングを行うために用いた。従来のアクレモニウム由来ＡＳＯＭ（約４０mU）、および分子量マーカー（プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｌｏｗ）、日本バイオラッド社）とともに、ウエスタンブロッティングのサンプルとした。
上記サンプルを用いて、Laemmli の方法（U.K.Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)) に準じて、ゲル濃度１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動の終わったゲルは、ＰＶＤＦ膜、Blot Absorbent Filter Paper ２枚（ともに日本バイオラッド社）とともに、Blotting buffer （５８．２ｇ／ｌ  Ｔｒｉｓ、２９．３ｇ／ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に浸し、５分間振盪した。
【００６２】
ブロッティング用の機器（Trans-Blot SD Cell：日本バイオラッド社）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に、電気的に転写した。ブロッティングの終わったＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ緩衝液（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、pH７．５）でリンスした後、１％  ＢＳＡを添加したＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％  Tween 20 in TBS 緩衝液）中で振盪し（室温、６０分間）、ブロッキングを行った。
ブロッキング後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳＴ緩衝液でリンスした後、抗ＡＳＯＭ抗血清を１／３００濃度（ｖ／ｖ）で添加したＴＢＳＴ緩衝液２０ml中で振盪し（室温、６０分間）、一次抗体結合反応を行った。
【００６３】
一次抗体反応後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した（振盪、５分間）後、anti-rabbit IgG AP conjugate（生化学工業）２μｌを添加したＴＢＳＴ緩衝液１５ml中で振盪し（室温、３０分間）、二次抗体結合反応を行った。
二次抗体反応後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄、ＴＢＳ緩衝液でリンスした後、NBT solution  １００μｌ、BCIP solution   ５０μｌ（ともに生化学工業）を添加したＡＰ緩衝液（１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ2 、pH９．５）１５ml中で発色反応を行った。反応は蒸留水で停止させた。
【００６４】
その結果、分子量８０，０００の位置にＡｎ−ＡＳＯＭとＡＳＯＭは同様のバンドを示し、免疫的にも分子量的にもアクレモニウムが生産した酵素とほぼ同様の酵素が組換えアスペルギルス・ニドランス（A. nidulans ）から生産されていることが確認できた。
【００６５】
３．酵素の精製と性質
Ａｎ−ＡＳＯＭを８０％飽和の硫安沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィ、疎水カラムクロマトグラフィにより、精製を行い、比活性、Ｋｍ値などの性質についての検討をした。
菌体を除去した培養上清液（約７５０ml）を８０％飽和の硫安沈殿を行い、沈殿を２０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）１００ml程度に懸濁した後、透析チューブに入れて、同緩衝液に透析した。透析を行った液は、遠心分離（１２，０００rpm 、１０分、４℃）により不溶化物を除いて、イオン交換カラムへ供した。
【００６６】
イオン交換カラム樹脂Q-Sepharose Fast Flow （ファルマシア  バイオテク社）は、同緩衝液で平衡化し、カラム（内径３．２cm、高さ１９．５cm）に充填した。先のサンプルを供与し、同緩衝液５倍量で洗浄した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出した。
活性画分を回収し、４０％飽和になるように硫安を添加した。
次に、疎水性樹脂（Butyl-Toyopearl 650M、東ソー社）を、４０％飽和の硫安を添加した２０mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH５．０）で平衡化し、カラム（内径２．０cm、高さ５．５cm）に充填した。先の４０％飽和になるように硫安を添加したサンプルを、遠心分離（１２，０００rpm 、１０分、４℃）により不溶化物を除いてから、カラムに供与した。４０％飽和の硫安添加同緩衝液５倍量で洗浄した後、４０→０％飽和硫安のLinear gradient により溶出した。
【００６７】
活性画分を回収し、蒸留水に対して透析した後、最終的に、２０mMリン酸緩衝液（pH７．０）に対して透析し、精製サンプルを得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、前述の方法と同じ方法で、分子量マーカーにＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｌｏｗ）（日本バイオラッド社）を用い、泳動後、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色したところ、ＡＳＯＭとＡｎ−ＡＳＯＭは同じ位置にバンドが検出でき、電気泳動的均一に精製できていることが確認できた。
精製Ａｎ−ＡＳＯＭを用いて、その性質を検討した。
【００６８】
（１）アザイドに対する耐性
アジ化ナトリウムによる酵素活性の阻害の検討については、アジ化ナトリウムと酵素とをあらかじめインキュベーションしてから、基質と反応させた。
試験管に、酵素との反応時に０〜０．５mMになるようにアジ化ナトリウムを溶解した０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）０．９５mlを入れて、３０℃でプレインキュベーションした。適宜希釈した精製酵素液０．０５ml（約６０mU）を加え、３０℃で１０分間インキュベーションした。５mMアスコルビン酸ナトリウム（０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）に溶解）０．１mlを加えて、３０℃で５分間酵素反応を行い、０．２Ｎ
ＨＣｌ  ３．０mlを加えて反応を停止させた。
【００６９】
２４５nmの吸光度を測定して、アスコルビン酸の減少量を算出した。各アジ化ナトリウム濃度下における、アジ化ナトリウム  ０mM時に対しての残存活性を算出した。
アジ化ナトリウムによる酵素活性阻害の程度評価は、アジ化ナトリウム  ０．１mM添加時残存活性で評価した。
なお、Ａｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭではアジ化ナトリウム  ０．１mM添加時の残存活性は、４２％であり、完全に一致した。
【００７０】
（２）ＮａＣｌ耐性
酵素反応時にＮａＣｌを添加したときの酵素活性への影響について、検討した。試験管に、０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．０）０．９ml、１．１Ｍ  ＮａＣｌまたは蒸留水０．０５ml、適宜希釈した酵素液０．０５ml（約４０mU）を加え、３０℃でプレインキュベーションした。これに、５mMアスコルビン酸ナトリウム（０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．０）に溶解）０．１mlを加え、３０℃で５分間反応させた後、０．２Ｎ  ＨＣｌ  ３．０mlを加えて反応を停止させた。
【００７１】
２４５nmの吸光度を測定してアスコルビン酸の減少量を算出した。
ＮａＣｌ  ５０mM存在下での活性は、ＮａＣｌ非添加時に対する残存活性を算出した。
なお、Ａｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭではＮａＣｌ  ５０mM添加時の残存活性は、それぞれ、８５％と８４％であり、ほぼ一致した。
【００７２】
（３）耐熱性
次に、酵素の耐熱性の確認を行った。１．５mlマイクロテストチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）中、酵素濃度２Ｕ／ml、ＢＳＡ濃度０．０２％となるように、Ｅｎｚｙｍｅ−ＢＳＡ溶液を調製した。Ｅｎｚｙｍｅ−ＢＳＡ溶液について、未処理のまま、あるいは、一定温度で３０分間加熱処理した後、蒸留水で６倍に希釈し、これを希釈酵素液とし、活性測定を行った。
加熱処理後の残存活性を算出して、耐熱性の評価をした。
なお、Ａｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭでは６０℃、３０分間の処理時の残存活性は、それぞれ、７９％と８６％であり、ほぼ一致した。
【００７３】
（４）Ｋｍ値
次に、酵素の基質に対するＫｍ値を測定した。アスコルビン酸に対しては、酵素約１２mUを用い、０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．０）中、３０℃、飽和酸素濃度下（０．２７mM）で、アスコルビン酸濃度０〜２mMの範囲で、吸光度計（３００nm）を用いて、アスコルビン酸の減少量を測定した。各アスコルビン酸濃度における活性について、Linewever-Barkプロットを行い、Ｋｍ値を算出した。
【００７４】
なお、Ａｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭのＬ−アスコルビン酸に対するＫｍ値は、それぞれ、０．１４４mMと０．１７４mMであり、ほぼ一致した。
酸素に対しては、酵素約１００mUを用い、０．５mM  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．０）中、３０℃、アスコルビン酸濃度２mMで、酸素濃度０〜０．６mMの範囲で酵素反応を行い、溶存酸素電極により酸素の減少量を測定した。各酸素濃度下における反応速度を算出し、Linewever-Barkプロットを行い、Ｋｍ値を算出した。
【００７５】
なお、Ａｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭの酸素に対するＫｍ値は、それぞれ、０．４０７mMと０．４５６mMであり、ほぼ一致した。
その他の酵素化学的な性質（作用最適pH、pH安定性、作用最適温度、基質特異性など）もＡｎ−ＡＳＯＭ及び、ＡＳＯＭはほぼ一致し、A. nidulans G191の形質転換株が生産するアスコルビン酸オキシダーゼは、アクレモニウム由来の酵素と同じ性質を有しており、酵素生産に用いることができることが判明した。
【００７６】
実施例３．変異型酵素発現ベクターの構築方法
１．変異型酵素ＭＡ１発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１）の作製
ＭＡ１変異（Ａｌａ465 →Ｌｅｕ）を導入するために、以下の４つのプライマーをデザインした。
0003969797.tif 000004
【００７７】
プライマーＫｐｎ１は、ＰＣＲによる増幅のための５′側のプライマーであり、ＡＳＯＭタンパク質コード領域に位置する制限酵素サイトＸｈｏＩの上流約２０bpの位置に結合するようにデザインした。ＰＣＲ増幅後に、ｐＵＣベクターへクローニングする際に使えるように、制限酵素ＫｐｎＩ認識部位を作出してある。プライマーＳｍａ１は、ＰＣＲによる増幅のための３′側のプライマーであり、ｐＰＡＴＧを作る際に新たに作出した制限酵素サイトＳｍａＩの下流約２０bpの位置に結合するようにデザインしたものである。
【００７８】
プライマーＭＡ１−１及びＭＡ１−２は、ＭＡ１変異（Ａｌａ465 →Ｌｅｕ）を導入するためにデザインしたもので、互いに相補的な配列をしている。ＡＳＯＭ遺伝子上での配列ＧＣＴコドン（Ａｌａ）を、ＣＴＴコドン（Ｌｅｕ）に変化させ、さらに、プライマーとしての安定性を保持させるために、前後に１０bpほどのＡＳＯＭ遺伝子の配列と一致する構造を持っている。
以上の４種類のプライマーを用いて、以下に示す方法で、ＡＳＯＭ遺伝子にＭＡ１変異を導入したＰＣＲ増幅断片を作製した。
【００７９】
まず、プラスミドｐＴＧ１−３′Ｓｍを鋳型にし、プライマーＫｐｎ１とＭＡ１−２および、プライマーＭＡ１−１とＳｍａ１を用いて、１st  ＰＣＲ反応を行った。反応液組成、反応液量、反応条件は、前述した、ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔ作製時の１st  ＰＣＲ反応と同じであるが、アニーリング温度のみ、５６℃で行った。これにより、１０２bp、および４６６bpの断片を増幅した。
それぞれの増幅断片は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に流し、目的の長さのバンドを切り出した後、電気溶出法により、増幅断片を回収した（１st  ＰＣＲ増幅産物）。
【００８０】
１st  ＰＣＲ増幅産物を、それぞれ約５０ngを用いて、前述（ｐＰ−ＡＳＯＭｉｎｔ作製時）と同様な方法で、アニーリング及び伸長反応、さらに、２nd  ＰＣＲを行った。なお、２nd  ＰＣＲ時には、プライマーＫｐｎ１，Ｓｍａ１を用いた。この操作により得られる、５４４bpの２nd  ＰＣＲ増幅断片は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に流し、切り出した後、電気溶出法により回収した（２nd  ＰＣＲ増幅産物）。
【００８１】
２nd  ＰＣＲ増幅産物は、制限酵素ＫｐｎＩ，ＳｍａＩで消化して、４９４bpの断片にした後、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイト中のＫｐｎＩ−ＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＭＰＡ１を作製した。
ｐＭＰＡ１については、ABI PRISM TM Cycle Sequencing Kits Dye Primer Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kits およびABI DNA Sequencing System 373A（パーキンエルマー社）を用いて、ＰＣＲ増幅断片の塩基配列のシークエンスを行い、デザインした変更が正しく導入されていること、および他の増幅部分に変異が入っていないことを確認した。
次に、ｐＭＰＡ１をＸｈｏＩ，ＳｍａＩ消化して得られる４８５bpのＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片をｐＰＡＴＧ中のＸｈｏＩ−ＳｍａＩ相当部分と入れ換えることにより、ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１を作製した。
【００８２】
２．Ａ及びＤ領域の変異導入
Ａ及びＤ領域を変化させた変異株を作製するためのプライマーおよび変異箇所について、以下の表２にまとめた。なお、括弧書きにしたＭＡＢ２変異については、後に言及してある。
下の表２に示したようなプライマーを用いて、上記に示した、ＭＡ１変異導入時と同様な方法で、各変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｓ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｖ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｉ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ２，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ３，ｐＰＡＴＧ−ＭＤ１，ｐＰＡＴＧ−ＭＤ２）を作製した。
なお、ＭＤ１変異のＡ484 →Ｇの変異は、もともとデザインした変異ではなく、ＰＣＲ増幅時に入った変異である。
【００８３】
３．Ｂ領域の変異導入について
Ｂ領域を変化させた変異株を作製するためのプライマーおよび変異箇所について、以下の表２にまとめた。
ＭＡ１変異導入時と同様な方法で、表に示したようなプライマー、および、鋳型ＤＮＡとしてｐＰＡ−ＫＸｂ２．４を用いて、ＸｂａＩ−ＳｍａＩ断片に変異を導入し、さらに、ｐＰＡＴＧの相当領域と入れ換えて、変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＢ）を作製した。
【００８４】
４．Ａ及びＢ領域の変異導入
ＭＡＢ１変異導入ＡＳＯＭ発現用ベクターは、上記２．により作製される、ＭＡ３変異導入ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片および、上記３．により作製されるＭＢ変異導入ＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を、ｐＰＡＴＧのそれぞれの相当領域と入れ換えることにより変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＡＢ１）を作製した。
【００８５】
同様に、ＭＡＢ２変異導入ＡＳＯＭ発現用ベクターは、上記２．により作製される、ＭＡＢ２変異導入ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片および、上記３．により作製されるＭＢ変異導入ＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を、ｐＰＡＴＧのそれぞれの相当領域と入れ換えることにより変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＡＢ２）を作製した。
【００８６】
５．Ｃ領域の変異導入について
Ｃ領域を変化させた変異株を作製するためのプライマーおよび変異箇所について、以下の表２にまとめた。
ＭＡ１変異導入時と同様な方法で、表２に示したようなプライマー、および、鋳型ＤＮＡとしてｐＰＡ−ＫＸｂ２．４を用いて、ＸｂａＩ−ＳｍａＩ断片に変異を導入した。この場合、３′側のプライマーに変異の導入がデザインされているので、１回のＰＣＲで、増幅断片中に、変異は導入される。さらに、ｐＰＡＴＧの相当領域と入れ換えて、変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＣ１，ｐＰＡＴＧ−ＭＣ２）を作製した。
【００８７】
【表２】
0003969797.tif 000005
次に表３に上記プライマーの具体的な塩基配列を示す。
【００８８】
【表３】
0003969797.tif 000006
【００８９】
変異導入ＡＳＯＭ発現ベクターを用いた形質転換株の生産するアスコルビン酸オキシダーゼ
変異導入ＡＳＯＭ発現ベクター（ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｓ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｖ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ１−Ｉ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ２，ｐＰＡＴＧ−ＭＡ３，ｐＰＡＴＧ−ＭＤ１，ｐＰＡＴＧ−ＭＤ２，ｐＰＡＴＧ−ＭＢ，ｐＰＡＴＧ−ＭＡＢ１，ｐＰＡＴＧ−ＭＡＢ２，ｐＰＡＴＧ−ＭＣ１及びｐＰＡＴＧ−ＭＣ２）を用いて、実施例２に記載の方法（ｐＰＡＴＧ及びＡｎ−ＡＳＯＭ）と同様な方法でアスペルギルス・ニドランス（A. nidulans ）Ｇ１９１への形質転換、形質転換株の生産する変異アスコルビン酸オキシダーゼ（ＭＡ１，ＭＡ１−Ｓ，ＭＡ１−Ｖ，ＭＡ１−Ｉ，ＭＡ２，ＭＡ３，ＭＤ１，ＭＤ２，ＭＢ，ＭＡＢ２，ＭＣ１及びＭＣ２）の培養生産、及び、免疫学的確認、及び、変異酵素の精製と性質の確認を行い、次のような結果を得た。
【００９０】
形質転換株の生産する変異アスコルビン酸オキシダーゼ（ＭＡ１，ＭＡ１−Ｓ，ＭＡ１−Ｖ，ＭＡ１−Ｉ，ＭＡ２，ＭＡ３，ＭＤ１，ＭＤ２，ＭＢ，ＭＡＢ１，ＭＡＢ２，ＭＣ１及びＭＣ２）はすべてＳＤＳ−ＰＡＧＥからのウエスタンブロッティングによって抗ＡＳＯＭ抗体と反応し、そして、変異酵素は、ほぼ分子量８０，０００であった。
また、すべての変異酵素で、アスコルビン酸オキシダーゼ活性を有し、作用最適pH、pH安定性、作用最適温度、基質特異性もＡｎ−ＡＳＯＭやＡＳＯＭとほぼ一致していた。
その他の変異酵素の性質の異なった部分の一欄を次の表４に示す。
【００９１】
【表４】
0003969797.tif 000007
【００９２】
【発明の効果】
上記のごとく、本発明によれば、アクレモニウム由来の生来のアスコルビン酸オキシダーゼに比べてアザイドに対する耐性が向上した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、ＮａＣｌ耐性が向上した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、耐熱性が向上した変異型アスコルビン酸オキシダーゼ、及び基質Ｌ−アスコルビン酸及び／又は酸素に対する親和性が上昇した変異型アスコルビン酸オキシダーゼが得られる。
【００９３】
【配列表】
0003969797.tif 000008
0003969797.tif 000009
0003969797.tif 000010
0003969797.tif 000011
0003969797.tif 000012
【００９４】
0003969797.tif 000013
【００９５】
0003969797.tif 000014
【００９６】
0003969797.tif 000015
【００９７】
0003969797.tif 000016
【００９８】
0003969797.tif 000017
【００９９】
0003969797.tif 000018
【０１００】
0003969797.tif 000019
【０１０１】
0003969797.tif 000020
【０１０２】
0003969797.tif 000021
【０１０３】
0003969797.tif 000022
【０１０４】
0003969797.tif 000023
【０１０５】
0003969797.tif 000024
【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
0003969797.tif 000029
【０１１１】
0003969797.tif 000030
【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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