(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症性疾患、血管新生依存性疾患、及び多発性硬化症からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素活性の阻害を必要とする疾病の治療用であって、但し、疾病は腫瘍又は癌ではない、hCG、hCG β-サブユニット、またはhCG β-コアを含む治療剤。
【請求項２】
hCGが組換え体である、請求項１記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
発明の属する分野
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素活性の阻害を必要とする疾病の予防および/または治療のための医薬の調製における、hCG、hCG β-サブユニット、その断片および活性な誘導体、またはhCG β-コアの使用に関する。
発明の背景
ある種の病理の過程には、腫瘍の浸潤、リウマチ関節炎および骨関節症における結合組織破壊、歯周炎、および血管新生依存性疾患、例えば、角膜血管新生、糖尿病網膜症、血管新生緑内障、血管腫、乾癬、硬皮症および固形腫瘍を含む、組織の改変または分解が含まれる。
腫瘍浸潤は複雑な多段階の過程であり、a）一次腫瘍からの腫瘍細胞の脱出および宿主の基底膜の通過、b）血管系を通した透過（血管内侵入）および輸送、c）血管内の遠位での停止および内皮基底膜の再透過による循環系からの脱出（血管外遊出）、d）標的組織への侵入および二次部位での増殖、を含む。
腫瘍細胞の通過を可能にするために必要である主要な事象の一つは、転移腫瘍細胞および/または腫瘍によって活性化された宿主基質細胞によって分泌されるECM分解酵素による、細胞外マトリクス（ECM）の除去である（D.J.Dodwellら,1993）。
ECMは基底膜および間質結合組織によって構成され、コラーゲン、プロテオグリカンおよび結合性糖タンパク質からなる。ECMは細胞および組織を物理的に支えており、細胞-ECM相互作用は細胞増殖、分化および移動を制御している。
ECM分解酵素にはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、ユーロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化分子、カテプシン、トリプシンおよびヘパラナーゼが含まれる。
MMPはプロ酵素として分泌され、活性化を必要とし、基質の選択性に基づいて3つのサブクラス（間質コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはIV型コラゲナーゼ、およびストロメリシン）からなる（総説:J.F.Woessner,1991、特に表1参照）。
MMPの過剰発現（多くはIV型コラゲナーゼおよびストロメリシン3）と腫瘍の攻撃性との正の相関が、ある種の型の腫瘍に関して確立されている（I.C.Andersonら,1995;B.L.Lockeshwarら,1993;W.C.Powellら,1993;およびJ.M.Ray,1995参照）。
リウマチ関節炎および骨関節症においては、浸潤性単球/マクロファージ、炎症性サイトカインによって活性化される滑液繊維芽細胞、および軟骨細胞が異常な量のコラゲナーゼを生産し、軟骨の分解および疾病の進行を促進する（A.M.M.Miltenburgら,1995）。
また、内皮細胞は親管から出て新規の細管ネットワークを作るためにはECMを分解しなくてはならないため、MMPは正常および病理的な血管新生にも関わる（R.B.Vernonら,1995）。
MMPはまた、血液−脳傷害損傷に関連した多数の硬化症に関与していることが示唆されている（G.A.Roenbergら,1996）。
上のデータから鑑みると、MMPは多くの疾患において治療の標的となり得ることが示唆される。従って、MMP活性を阻害するための、天然のまたは合成の化合物に基づいた様々の戦略が開発されつつある。
ECMの分解は緊密に制御された過程であり、コラゲナーゼによるタンパク質分解は天然に存在する阻害剤によって分泌後に制御されている。最も重要な阻害剤はMMPの組織インヒビター（TIMP）であり、宿主組織、さらに腫瘍細胞によって局所的に生産される（E.C.Kohnら,1995）。
TIMPはMMPと複合体を作り、プロ酵素活性およびMMPの分解活性を阻害する。
MMPの生産および/または活性を阻害すると、in vitroおよびin vivoにおいて腫瘍の増殖および浸潤（I.C.Andersonら,1996;X.Wangら,1994;A.Albiniら,1995;A.Melchioriら,1992;A.Albiniら,1994;R.Benelliら,1994）、血管新生（R.E.Galardyら,1994;M.A.Moses,1993）、および関節炎における軟骨/骨の破壊（J.G.Conwayら,1995;E.M.O'Byrneら,1995;L.J.Bonassarら,1995）が阻害されることが示されている。
ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）は、胎盤および他の正常および腫瘍組織により分泌される糖タンパク質ホルモンである。hCGは分泌されるため、ホルモン様およびパラ分泌様の両方に作用する。hCGは非共有結合したαおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体である。hCG結晶構造の解析から最近示されたように、サブユニットはどちらも、hCGまたは糖タンパク質ホルモンファミリーとは近縁でないシスチン-ノットファミリー増殖因子（血小板由来増殖因子PDGF、血管内皮増殖因子VEGF、神経成長因子NGFその他）と構造上の相同性を有する。
解離したhCGサブユニットは尿中に見られ、多くは膀胱、膵臓、子宮頚、肺、肝臓および胃、さらには栄養膜腫瘍および精巣生殖細胞腫瘍によって生産される。
解離したサブユニットの他に、種々の代謝形態が特に尿中に存在し、種々の程度でグリコシル化されたhCGアイソフォーム、ニックの入ったhCG、および典型的なhCG-β分解断片であって、β-コアと呼ばれ、hCG-βサブユニットの残基6-40および55-92を含む、ジスルフィド結合した2本鎖ポリペプチドを包含する。
上述したアイソフォームに加えて、例えばKalyanおよびBahl（Kalyanら,1983参照）によって記載されたように異なる化学的および/または生命技術の方法によって、脱グリコシル化したhCGが得られ得る。
脱グリコシル化したhCGまたは単独でのサブユニットとしてのβ-コアはhCG様の生物活性を示さないが、免疫活性のあるhCGの主要な形態であり、尿中のhCGの薬剤調製物に混入し得る。
Lunardi-Iskandarら（Lunardi-Iskandarら,1995）は、hCGおよびhCG-βサブユニットがカポジ肉腫由来のKS細胞系列を阻害し、ヌードマウス中でのそのような細胞系列による腫瘍の生産を阻害し得ることを示した。2人の女性の妊娠中において、このホルモンのレベルが高い場合にカポジ肉腫が緩解することが示されている。
また本出願者は、上で定義したKS細胞膜にはβ-コアおよびグリコシル化hCGが含まれることを以前に発見しており（イタリア特許出願番号RM96A309参照）、β-コア自身および/またはグリコシル化hCGがLunardi-Iskandarによって発見されたin vivoまたはin vitro生物活性の原因の試薬であることが結論されている。
発明の説明
本発明の目的は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素活性の阻害を必要とする疾病の予防および/または治療のための医薬の調製における、hCG、hCG β-サブユニット、その断片および活性な誘導体、またはhCG β-コアの使用である。このような疾病の例には、腫瘍、慢性の炎症性疾患（例えばリウマチ関節炎）、骨関節症、歯周炎、多種の硬化症、および他の血管新生関連疾患が含まれる。
本発明の別の目的は、MMP酵素活性の阻害を必要とする疾病の予防および/または治療のための、1つ以上の薬理的に受容可能な賦形剤を含み、hCG、hCG β-サブユニット、その断片および活性な誘導体、またはhCG β-コアからなる薬剤組成物である。
本発明のさらなる目的は、hCG、hCG β-サブユニット、その断片および活性な誘導体、またはhCG β-コアの効果量を薬理的に受容可能な賦形剤と併せて投与することからなる、コラゲナーゼ酵素活性の阻害を必要とする疾病の予防および/または治療のための方法である。
ヒトの治療のためには、活性成分の好ましい投与量は10,000から500,000ユニットの間である。
この活性成分の投与経路は、経静脈、筋内、および皮下であり得る。活性成分の望ましい血中レベルを保証する他の投与経路も同様に本発明に含まれる。
hCGは好ましくは組換え体であり、例えば欧州特許160,699に記載された技術に従って、対応するDNAで適当にトランスフェクションされたCHO（Chinese Hamster Ovary）細胞からの発現によって調製され得る。
hCGを含む適当な凍結乾燥した薬剤組成物は、開示されたPCT特許出願WO93/11788に記載されており、本発明に従ってより良く使用され得る。
直ちに使用可能な液体薬理製剤は、PCT特許出願95/EP/1778に記載されており、同様に本発明に従ってより良く使用され得る。
今、本発明を実施例により記載するが、実施例は何れにせよ本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例は、特定されるとおり図面を引用する。
図面の説明
図１：r-hCG20μg/mlなし（A）またはあり（B）、hCG-βサブユニット10μg/mlあり（C）、β-コア断片あり（D）のコラゲナーゼ緩衝液中で保温した、カポジ肉腫細胞KS-IMMによって分泌されるタンパク質の電気泳動図を示す。KS-IMM細胞は72kDのMMP-2活性型を分泌することが、相当する分子量の位置の分解の白いバンドによって確認される（A）。r-hCG（B）、hCG-βサブユニット（C）、β-コア断片（D）と共に保温した場合、MMP-2バンドは消失する。
レーン１：分子量マーカー；レーン２：無処理試料；レーン３：u-hCG（40μg/ml）で前処理された試料。
図２：コラゲナーゼ緩衝液のみ（a）、またはr-hCGを加えて（b）保温したClostridium histolyticum由来のI型コラゲナーゼの電気泳動分析の結果である。r-hCGが存在する場合の分解バンドは、コラゲナーゼ緩衝液のみの場合よりも非常に薄かった。
レーン１：分子量マーカー；レーン２：トロンビン（25U）；レーン３：I型コラゲナーゼ（5μg）。
図３ａ：ヌードマウス中に（MGと共に）接種された、KS IMM細胞の増殖を示す（対照、1次実験）。
図３ｂ：1μg/マウスのhCG β-コアで処理されたヌードマウス中に（MGと共に）接種された、KS IMM細胞の増殖を示す（1次実験）。
図４ａ：ヌードマウス中に（MGと共に）接種された、KS IMM細胞の増殖を示す（対照、2次実験）。
図４ｂ：7.8μg/マウスのβ-サブユニットで処理されたヌードマウス中に（MGと共に）接種された、KS IMM細胞の増殖を示す。
図４ｃ：12.5μg/マウスのr-hCGで処理されたヌードマウス中に（MGと共に）接種された、KS IMM細胞の増殖を示す。
図５ａ：hCG β-コアまたはr-hCGで処理されたヌードマウス中に接種された、KS IMM細胞の増殖を示す（3次実験）。特に、接種後13日目までの増殖の差異を示す。
図５ｂ：hCG β-コアまたはr-hCGで処理されたヌードマウス中に接種された、KS IMM細胞の増殖を示す（3次実験）。特に、対照および処理群で腫瘍の増殖が同様に進行したことを示す。
図６ａ：ヌードマウス中に対照として接種された、KS IMM細胞の増殖を示す。13日目での腫瘍の進行が示される。
図６ｂ：16μg/マウスのr-hCGで処理されたヌードマウス中に接種された、KS IMM細胞の増殖を示す。13日目での腫瘍の進行が示される。
図６ｃ：5μg/マウスのhCG β-コアで処理されたヌードマウス中に接種された、KS IMM細胞の増殖を示す。13日目での腫瘍の進行が示される。
図７：コラゲナーゼ分解緩衝液に加えられた（濃度16μg/ml）r-hCGの非存在下（-）または存在下（+）での、5つの細胞系列の電気泳動分析の結果を示す。
レーンａ：KS-IST XX細胞の上清（総タンパク質5μg）。
レーンｂ：KS-IST XXVI細胞の上清（5μg）。
レーンｃ：滑液腫瘍細胞（5μg）。
レーンｄ：KS-IMM細胞の上清（10μg）。
レーンｅ：MRC5細胞の上清（10μg）。
レーンmw：分子量マーカー。
左の矢印は、ゼラチナーゼA（A）およびゼラチナーゼB（B）の電気泳動移動度を示す。
実施例
実施例１：r-hCG、hCG βサブユニットおよびβ-コア断片は、カポジ肉腫細胞により生産されるIV型コラゲナーゼをin vitroで阻害する。
KS-IMMは、HIV陰性ヒトカポジ肉腫由来の不死化細胞系列である。
KS-IMMは10%FCSを添加したDMEM中で80%集合化条件で培養し、次にFCSを含まないDMEM中で24時間保温した。保温の最後に条件培地を回収し、1000rpmで5分遠心分離し、99%エタノールで1/5に希釈し、少なくとも2時間、-20℃で保管した。
エタノール沈澱したタンパク質は4℃で10,000rpmで20分遠心分離することにより回収し、乾燥した。
沈澱したタンパク質は、0.1倍体積の40mM Tris-HCl（pH7.5）に溶解した。総タンパク質濃度は、市販キット（Bio-Rad）を用い、対照としてBSAを用いてBradford法により決定した。
条件培地中でKS−IMM細胞により分泌されるコラゲナーゼ活性を検査するために、沈澱されたタンパク質は電気泳動解析に供された。
各10μgの4つのタンパク質試料は、非還元および非変性条件下で0.1%ゼラチンを含む7%SDS-PAGEゲルに載せた（Stetler-Stevensonら,1989）。電気泳動の終わりに、SDS除去のためにゲルは2.5%Triton X-100で洗浄し、各試料を含む4つの断片に切断し、20μg/ml r-hCGまたは10μg/ml hCG-βサブユニットまたは5μg/ml β-コア断片の存在下または非存在下で、40mM Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM CaCl2（pH7.4）中で37℃で18時間保温した。
ゲル断片は次に10%酢酸、50%メタノールおよび12%の1%クマジーブリリアントブルー（CBB）溶液で1時間染色され、7.5%酢酸、25%メタノールで脱染された。
コラゲナーゼ活性は青い背景中の白いバンドで検出された。結果を図1に示す。
実施例２：r-hCGはin vitroでI型コラゲナーゼを阻害する。
Clostridium histolyticum由来のI型コラゲナーゼ（SigmaコードC0130）の２つの試料（各5μg）を、実施例１に記載されたように電気泳動解析に供した。実施例1と同様に、電気泳動の終わりにゲルは2つの断片に切断し、20μg/ml r-hCGの存在下または非存在下で保温し、処理した。結果を図２に示す。
実施例３：r-hCG、そのβ-サブユニットおよびβ-コア断片はin vivoで血管新生を阻害する。
材料と方法
動物
C57BL/6マウスおよび37（CD-1）BRヌードマウスはCharles River（Calco,Como,イタリア）から入手した。
試薬
マトリゲル（C57BL/6マウス中で培養したマウスEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）腫瘍の抽出物）は、以前に記載されたように生産した（Kleinmanら,1986）。
簡単に言えば、EHS腫瘍物質を、高塩濃度緩衝液（3.4M NaCl、50mM Tris-HCl（pH7.4）、4mM EDTA、2mM N-エチル-マレイミド）中でポリトロンホモゲナイザーでホモゲナイズした。
ホモジェネートは遠心分離により上清から分離し、この過程は３回繰り返された。最後に生じた沈殿物は2mol/l尿素（2M尿素、50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl）中で一晩可溶化した。
上清は遠心分離により透明になり、Tris-塩溶液に対して大量に透析され、最後にDulbecco's Modified Eagles Medium（DMEM）に対して大量に透析した。生じた物質であるマトリゲルは、基底膜組成物に富む（Siegalら,1993）。用いたヘパリンはClarisco（Shwarz Pharma S.p.A.,San Grato-Lodi,イタリア）製である。
細胞上清
KS 紡錘細胞培養液が、上清の調製に用いられた。KS細胞はグルタミン（300μg/ml）、ヘパリン（60mg/500ml）およびECGS（30mg/500ml）を添加された10%ウシ胎児血清を含むRPMl-1640中で培養した。
in vivo血管新生
再構成された基底膜であるマトリゲル（MG、12mg/ml）は4℃では液体であるが、皮下に接種された場合には固形化して、マウスの皮下で固体ゲルになる。
2500U/mlヘパリンおよび12μl KS上清（20μ1/ml）を最終体積600μlになるように加えることにより、強い血管新生応答が生じ、マトリゲル中に血管新生が起きる。マトリゲル単独ではいかなる反応も生じない。
我々はhCGおよび誘導体の効果を、注射前にマトリゲル混合液に直接加えることにより検査した。注射後4日目に被験動物を屠殺し、ゲルを回収して秤量した。
血管新生の直接の指標としてヘモグロビン含量を測定した。回収されたゲルは粉砕し、水に懸濁し、Drabkin試薬キット525（Sigma）を用いて遊離したヘモグロビンを測定し、標準曲線から濃度を計算し、100mgの回収ゲルに対して標準化した。
in vivoでのKS細胞の増殖
4つの別個の実験が異なる条件下で行われた。
１）KS IMM細胞培養液は、ヌードマウスへの注射前にin vitroでβ-コア0.5μg/mlで96時間前処理した。
２つの動物群を用いた。対照群（8匹）には生理溶液を腹腔内注射し、2番目の群（9匹）には1μg/30grマウスのβ-コアを細胞接種の96時間前注射した。
１次実験でのβ-コアの投与量は、ヒトにおける投与に基づいて、ヒトとマウスの体重間の関係およびhCGとβ-コア間の化学量比を考慮し、等価な投与量を用いて計算した。
全てのマウスは250μlのMG中に懸濁した5×106のKS IMM細胞を注射された。
処理は実験の最後まで毎日継続された。
２）KS IMMは、ヌードマウスへの接種24時間前にin vitroでr-hCG 1.6μg/mlまたはβ-サブユニット7.8μg/mlで前処理した。
動物（各群8匹ずつ）は、接種24時間前に生理溶液またはr-hCG 12.5μg/30grマウスまたはβ-サブユニット1μg/30grマウスでも前処理された。
次に、動物は5×106のKS IMM細胞をMG非存在下で皮下接種された。病変内処理のためには、12.5μg/30grマウスのr-hCGが48時間ごとに、または7.8μg/30grマウスのβ-サブユニットが３週間の間毎日用いられた。
対照は毎日生理溶液を病変内注射（intralesional injection）により処理した。投与量はLunardi-Iskandarら（Lunardi-Iskandarら,1995）の論文に基づいて選択されたが、当該論文中では12.5μg/30grマウスのu-hCGが用いられている。
我々は、r-hCGに関しては同じ投与量を、そしてβ-サブユニットに関して対応する化学量（7.8μg/30grマウス）を用いた。
３）細胞およびヌードマウスは前処理しなかった。動物（各群8匹）は、MGを添加した0.2mlの非血清培地（250μl、10mg/ml）中の5×106のKS IMM細胞を皮下接種した。
動物は16μg/30grマウスのr-hCGまたは5μg/30grマウスのβ-コアで最初の週に3回、その後毎日腹腔内処理された。この実験は21日間必要であった。
４）この実験は３のように行われたが、腫瘍増殖の前期（13日目）で中止した。
我々は、対照として７匹のマウスを、10μg/マウスのβ-サブユニット処理群について６匹のマウスを、5μg/マウスのβ-コア処理群について７匹のマウスを用いた。
β-コアで処理したマウスの１匹は接種後８日目に死亡したため、我々の結果には含まれていない。このマウスは触診可能な腫瘍はほとんど示さなかった。
13日目に腫瘍を切除し、血管新生判定のために秤量・処理し、ヘモグロビン含量を測定した。
ゼラチン電気泳動解析
特徴的なゼラチナーゼ活性をも有するIV型コラゲナーゼ（ゼラチナーゼAおよびB）を可視化するためにゼラチン電気泳動解析が用いられ、HeussenおよびDowdle（HeussenおよびDowdle,1980）に従って、一部を変更して行われた。
最終濃度0.6mg/mlまたは0.6%w/vの共重合したゼラチンを含む7%SDS-PAGEゲルが調製された。タンパク質試料（KA IMMおよびMRC5細胞系列について10μg、KS紡錘細胞系列および滑液腫瘍細胞について5μg）は40mM Tris-HCl（pH7.5）に再けん濁され、0.1%の共重合したゼラチンを含む7%SDS-PAGEゲル中で電気泳動された。
電気泳動後に、SDS除去のためにゲルを2.5%Triton X-100で4回（各30分）洗浄し、等しい小断片に切断し、16μg/ml r-hCGの存在下（+）または非存在下（-）で、40mM Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM CaCl2（pH7.4）緩衝液中で37℃で18時間保温した。
ゲル断片は消化後に10%酢酸、50%メタノールおよび12%の1%クマジーブリリアントブルー（CBB）溶液で1時間染色し、7.5%酢酸、25%メタノールで脱染色した。
酵素消化された部分は青い背景中の白いバンドで検出された。
結果
r-hCGおよびβ-サブユニットはマトリゲル（MG）スポンジ中での血管新生応答を阻害する。
この実験モデルでは、MG単独は負の対照として用いられ、ゲル中での血管新生を誘導するKS-上清およびヘパリンは正の対照として用いられた。
KS-上清およびヘパリンを含むMG中にhCGを加えることにより、新生血管の形成が減少した。この阻害効果は、ヘモグロビン含量を測定することによっても判定された。
MG注射4日後、動物は屠殺され、血管新生の判定のためにゲルが抽出された。
ここで、我々は最初の実験（16μg/mlのr-hCGまたは10μg/mlのβ-サブユニットによる試験）の結果を報告する。データを表１に総括する。
hCGおよび誘導体は血管新生を制御することによりin vivoで早期にKS細胞の増殖を減少させる。
ヌードマウスへのKS IMM細胞の皮下接種により、腫瘍の形成が促進される。このモデルを用いて４つのアッセイが行われた。
１次実験はマトリゲルと共にKS IMM細胞を接種することにより行われた。
迅速な腫瘍増殖が得られた。しかし、結果（図３）からは対照とβ-コア処理群とで差異は見られなかった。これは恐らくβ-コア腹腔内投与量が低すぎた（1μg/マウス）ためである。
２次実験（図４）においては、物質の病変内接種を試験するためにマトリゲル無しでKS IMM細胞が注射された。マトリゲルが存在しないことにより、腫瘍増殖は遅れ、不規則的であった。対照群およびβ-サブユニット処理群においては、8匹中4匹のマウスで腫瘍が見られなかった。r-hCG処理群においては、8匹中2匹のマウスで腫瘍が見られなかった。
適当な全体条件が決定されたため、３次実験（図５a-bおよび図６）においては、r-CG（16μg/30grマウス、0.5mg/kgに相当）およびβ-コア（5μg/30grマウス）が試験された。早期における腫瘍増殖の減少が確かに観察された。
同じ条件を用いた次の実験では、r-CG（16μg/30grマウス）およびβ-コア（5μg
/30grマウス）が試験された。13日目の腫瘍試料の解析から、hCGおよび誘導体がin vivoでKS病変の血管新生を制御し得、早期の腫瘍増殖およびヘモグロビン含量を減少させることが確認された（表2-3）。
腫瘍試料のヘモグロビン測定はin vivo血管新生アッセイと同様に行われた。
hCGおよび誘導体はMMP2のゼラチン分解活性を部分的に阻害する。
5つの細胞系列（KS IMM細胞系列、HIV+患者由来のKS IST XX紡錘細胞系列、HIV-患者由来のKS IST XXVI紡錘細胞系列、滑液腫瘍細胞系列、およびMRC5ヒト繊維芽細胞系列）由来の上清が、hCGおよび誘導体のコラゲナーゼ緩衝液の存在下または非存在下でゼラチン電気泳動解析により解析された。
コラゲナーゼ緩衝液に加えられたr-hCG（20μg/ml）、β-サブユニット（10μg/ml）、およびβ-コア断片（5μg/ml）は、KS IMMの72kDa IV型コラゲナーゼ（MMP2）のゼラチン分解活性を完全に阻害した（表１）。低投与量（（r-hCG 1.6μg/ml）、β-サブユニット1μg/ml、およびβ-コア断片0.5μg/ml）は部分的阻害を生じる。
大量のゼラチナーゼAを生産する、試験された他の細胞系列（KS紡錘細胞系列および滑液腫瘍細胞系列）では、16μg/mlのr-hCGによる阻害は部分的であった（図７）。これらの系列では、より高い投与量が必要であった。
考察
in vivo試験の最善の方法を判定するために、ヌードマウス中でのKS細胞の増殖の4つの実験が異なる条件で実施された。1次実験では（図3）、KS細胞はMGと共に接種された。2次実験では（図4）、物質を病変内接種することの安全性のため、細胞はMG無しで接種された。
２つの対応するグラフを比較することにより、MGと共にKS細胞を接種することは腫瘍の開始を促進することがわかる。従って、この条件を以後の実験に用いた。前処理が無効果だった１次および２次実験の後、前処理は繰り返さなかった。
３次実験では、接種後13日目までの増殖の減少が観察された（図５aおよび６）。対照と処理群のサイズの差異は有意であり、11日目でr-hCGについて69%、β-コアについて57%、13日目でr-hCGについて66%、β-コアについて75%減少している。その後、すべての群は同様な進行を示した（図5b）
同様の現象は別の抗血管新生物質であるトロンボスポンディン-1について観察されている（P.Boukamp,1996参照）。
hCGおよび誘導体の抗血管新生活性を確認するために、4次実験（結果は表１-３参照）が同様の方法で実施された。ただし、マウスは腫瘍増殖が早期にある時に屠殺した。
表中の試料数は測定のために用いた腫瘍断片数（各動物につき一）を示す。腫瘍重量および腫瘍試料中ヘモグロビン含量の解析から、腫瘍増殖の阻害は実際に血管新生の減少と相関していることが示された。
ゼラチン電気泳動解析の結果から、メタロプロテアーゼ活性の阻害のためには大量の物質が必要であることが確認された。in vitroでの増殖を阻害する投与量（1.6μg/ml r-hCG、0.5μg/ml β-コア）では、KS IMM細胞により生産されるコラゲナーゼ活性の阻害は観察されなかった。しかし、より多い投与量（（20μg/ml r-hCG、10μg/ml β-サブユニット、5μg/ml β-コア）によって完全な阻害が達成され得る。KS紡錘細胞系列および滑液腫瘍系列（より多量のMMP2を発現する）の場合には、酵素活性が高いために阻害は部分的である。
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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