(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オランダ国、バーン所在のthe Centraalbureau voor Schimmelculturesに受託番号 CBS 813.95 で寄託されているストレプトコックス  エキ（ Streptococcus equi）菌株TW 928。
【請求項２】
細菌を含む微生物学的に純粋な培養物において、該培養物が請求項１に記載のストレプトコックス  エキ菌株TW 928を含むことを特徴とする培養物。
【請求項３】
ウマのストレプトコックス感染を撲滅するための生ワクチンにおいて、該ワクチンが請求項１に記載のストレプトコックス  エキ菌株TW 928および薬剤的に許容されうる担体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項４】
鼻腔内投与に適することを特徴とする請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項３または４に記載のワクチン。
【請求項６】
さらに別の弱毒化された病原体または別の病原体に由来する抗原性物質を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
他の病原体が、ポトマック熱病因子、ロドコックス  エキ（ Rhodococcus equi）、クロストリジウム  テタニ（ Clostridium tetanii ）、ミコバクテリウム  シュウドマレイ（ Mycobacterium pseudomallei）、水泡性口内炎ウイルス、ボルナ病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカウマ病ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、感染性貧血ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルスおよび日本脳炎Ｂ型ウイルスから成る群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項３〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかに記載のワクチンの製造法において、該方法が、ストレプトコックス  エキ菌株TW 928の細菌および薬剤的に許容されうる担体を混合することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ウマのストレプトコックス感染を撲滅するためのワクチンを製造するための、オランダ国、バーン所在のthe Centraalbureau voor Schimmelculturesに受託番号CBS 813.95で寄託されているストレプトコックス  エキ菌株 TW 928 の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコックス  エキ（ Streptococcus equi）の新規菌株およびこの菌株を含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
Streptococcus equiは、かなり前からウマの上気道の急性疾患の原因であることが知られている（Sweeney ら、Compendium Equine 9:689-693 (1987)）。この感染性の強い病気は、熱、粘液膿性鼻汁、リンパ節腫脹ならびに続いて起こる頭および首のリンパ節の膿瘍を特徴とする（Sweeney ら、Compendium Equine 9:845-851 (1987)）。リンパ節の腫脹は、気道が閉塞されるほど重くなることが多い。その病気の一般的呼び名である腺疫は、この症状によって説明される。その病気が致命的となるのは、Sigmund （Sigmund, O.H. および Fraser, C.M. 編: The Merck Veterinary Manual,  第５版, Merck and Company Inc., Rahway, N.J.:313-315 (1979) ）が記載しているように、極少数のケースである。これに対して、罹患率は一般的に高く、感染しやすい集団では 100％と高くなる可能性がある。その病気に対するワクチンもかなり前から知られている（Bazely, P.L.; Austr. Ver. J.16:243 (1940) およびBazely, P.L.; Austr. Vet. J. 18:141-155 (1942)）。これまでに、２種類のワクチンのみが利用されている。すなわち、ａ）古典的バクテリン（bacterin）をベースとするワクチンおよびｂ）Ｍ−タンパク質である免疫原性タンパク質をベースとするサブユニットワクチンである。両方の種類のワクチンには重大な欠点がある。バクテリンはその有害反応に関しては周知であり、保護力があまりないことが知られている（Subcommittee on the Efficacy of Strangles Bacterin, Report, American Association of Equine Practitioners）。Ｍ−タンパク質は、弱い抗原であると考えられ、多数回注射して初めて十分な免疫反応が得られる (Shrivastava, S.K. および Barnum, D.A.; Can. J. Comp. Med. 49:351-356 (1985))（Woolcock, J.B.; Austr. Vet. J. 51:554-559 (1975)）。さらに、これらのワクチンによって得られる免疫維持期間は比較的短く、少なくとも年に１回は追加免疫のためのワクチン接種を行うべきである（Sweeney ら、Compendium Equine 9:845-851 (1987)）。細菌またはサブユニットをベースとする古典的ワクチンは、例えば、Forth Dodge Laboratoriesおよび Coopers Animal Healthから入手できる。さらに、Mobay Company は、例えば、あるバクテリンを開示した米国特許第 4,944,942号を所有している。
【０００３】
ウマが生きた有毒の Streptococcus equi菌株により自然に感染を受けると、長期にわたる免疫を獲得する。これは、感染が臨床上の徴候を示さないで経過した場合もそうである（Woolcock, J.B.; Austr. Vet. J. 51:554-559 (1975)）。このことは、原則として、生きた弱毒化菌株によるワクチン接種であれば、現在使用されている不活性化またはサブユニットワクチンによるワクチン接種よりもかなり有益であることを意味する。しかし、この事実にもかかわらず、現在、弱毒化した生ワクチンは市販されていない。特定の生きた弱毒化 Streptococcus equi菌株をベースとするワクチンがクレームされた特許は１件だけ知られている（EP 0.230.456）。この特許に基づくワクチンはまだ市場に出ていないが、特許された菌株は現在10年間存続している。EP 0.230.456のワクチンは、既存のバクテリンおよびサブユニットワクチンよりも良好であるが、いくつかの欠点がある：
ａ）弱毒性は、ワクチン菌株のゲノムにおいて化学的に誘発された非限定突然変異に基づく。これらの突然変異は、使用される免疫原であるニトロソグアニジンにより、ほぼ間違いなく点突然変異である。点突然変異は、復帰変異し、従って有害に転換する傾向にある。従って、弱毒化が十分規定されたかなりの大きさの不可逆欠失によって引き起こされ、有害に転換する可能性がない弱毒化菌株であれば、非常に好ましい。
【０００４】
ｂ）そのワクチンは、被包されていない菌株をベースとし、スクリーニングは、被包されていないコロニーに対して行っている。有害性の低下がそのワクチンの基本である。その結果、それに基づくワクチンは、一つのみかけの有害因子、すなわち包被（capsule ）に対しては保護力がない。従って、さらに包被を含み、従ってより完全な保護力を付与する生ワクチンが好ましい。
【０００５】
ｃ）そのワクチンは、子ウマにおける安全性が完全ではない、しかし、子ウマはその病気に最も罹りやすいので、非常に若い年齢でワクチン接種すべきである。従って、子ウマにおいて完全に安全であるワクチンであれば、かなり有利であるはずである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、野生型単離物から得られた新規菌株が上記した有利な特性を有することが見いだされた。この新規菌株は、有害な野生菌株である菌株TWに由来し、臨床的症状のあるウマから単離された。新規菌株は、そのゲノムにおいて大きい欠失を含み、親TW菌株と比較して弱毒性を引き起こすという事実に基づいて選択した。欠失は約１kbであるので、有害への転換が生じる確率はごく僅かである。その菌株はさらに包被を保持している。また、実施例で示すように、子ウシに対して安全である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、the Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. box 273, 3740 AG バーン（Baarn ），オランダ国に受託番号CBS 813.95で寄託されている Streptococcus equi菌株TW 928を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、寄託した菌株に係る細菌を含む微生物学的に純粋な培養物に関する。寄託した菌株に由来する次世代の細菌も含まれることは言うまでもない。培養物は、例えば、該細菌を30〜41℃の温度で増殖させることにより得ることができる。細菌は、例えば M17培地（1 l 中に 5g のトリプトース、5 g の中和された大豆ペプトン、2.5 g の酵母エキス、5 g のビーフエキス、10 gのグルコース、0.5 g のアスコルビン酸、19 gの（Ｂ−）グリセロリン酸二ナトリウム、0.25 gのＭｇＳＯ4 （７Ｈ2 Ｏ）、ｐＨ 7.0〜7.2 を含む。）で増殖させることができる。
【０００９】
本発明はさらに、ウマのストレプトコッカス（ Streptococcus）感染を撲滅するための生ワクチンを提供する。該ワクチンは、オランダ国、バーン所在のthe Centraalbureau voor Schimmelculturesに受託番号CBS 813.95で寄託されている Streptococcus equi菌株TW 928の弱毒化した生きた細菌および薬剤的に許容されうる担体を含む。該担体は、水のような単純なものでよいが、例えば、細菌を培養した培養液も含むことができる。別の適する担体は、例えば、生理学的塩濃度の溶液である。
【００１０】
本発明に係るワクチンは、種々の形態で投与することができる。例えば、非経口的（例えば、筋肉内、皮下または皮内）に投与することができ、また、経口的または鼻腔内的に投与することもできる。鼻の粘膜は、 Streptococcus equi感染を最も一般的に受け易い場所である。従って、鼻は、本発明に係る弱毒化生ワクチンを投与するための最も自然な場所である。さらに、この投与部位は、容易に到達し、ワクチンの例えば噴霧による投与が可能であるという利点を有する。すなわち、好ましい態様では、本発明のワクチンは、鼻腔内投与に適している。
【００１１】
ワクチンは、免疫反応を引き出すのに十分である、どんな用量の細菌も含むことができる。例えば、103 〜109 の範囲の用量の細菌が非常に適している。そのワクチンを使用すると、その弱毒性のために、新生ウマを含むどんな年齢のウマも保護することができる。実際的理由のため、ワクチンは、通常、例えば 1〜12月齢の若い年齢で接種する。
【００１２】
生きた微生物の保存法はいくつかある。例えば、冷蔵庫での保存は周知の方法である。また、グリセロールを含む緩衝液に入れて−70℃で保存する方法もよく使用される。また、細菌を液体窒素中で保存することもできる。凍結乾燥も別の保存法である。凍結乾燥した細菌は、長い年月、生きたままで保存することができる。凍結乾燥した細菌の保存温度は、生存力に害がないならば、０度以上でもよい。凍結乾燥は、周知の標準的凍結乾燥法に従って行うことができる。所望により、例えばスキムミルク、トレハロース、ゼラチンまたはウシ血清アルブミンなどの有益な添加剤を凍結乾燥工程で添加することができる。従って、より好ましい態様では、ワクチンが凍結乾燥形である。
【００１３】
別の実施態様では、本発明のワクチンは、さらに別の弱毒病原体または別の病原体に由来する抗原性物質を含む。該病原体は、例えば、別の細菌または寄生虫であってもよい。また、ウイルス起源のものでもよい。通常、他の病原体またはその抗原性物質は、ウマ病原体である。そのような別の弱毒病原体または別の病原体に由来する抗原性物質も含む本発明に係るワクチンは、同時にいくつかの感染に対する保護を生じるという利点がある。有利に添加することができるウマ病原体またはその抗原性物質は、例えば、ポトマック熱病因子、ロドコックス  エキ（ Rhodococcus equi）、クロストリジウム  テタニ（ Clostridium tetanii ）、ミコバクテリウム  シュウドマレイ（ Mycobacterium pseudomallei）、水泡性口内炎ウイルス、ボルナ病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、アフリカウマ病ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス１〜４、感染性貧血ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルスおよび日本脳炎Ｂ型ウイルスである。
【００１４】
ワクチンはまた、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激剤である。アジュバントは、進入する病原体に対する宿主の免疫反応を高める。周知のアジュバントの例としては、フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えば EP 109942参照）、Quill A 、鉱油、植物油ならびにCarbopol（ホモポリマー）が挙げられる。粘膜投与に特に適するアジュバントは、例えば、大腸菌非耐熱性毒素（ＬＴ）またはコレラ毒素（ＣＴ）である。
【００１５】
さらに、ワクチンは、１種以上の安定剤を含むことができる。また、ワクチンは、１種以上の適する乳化剤（例えば、Spanまたは Tween）を含むことができる。
【００１６】
本発明はまた、ワクチンの製造法を提供する。これらの方法は、例えば、 Streptococcus equi菌株TW 928の細菌および薬剤的に許容されうる担体を混合することを含む。
【００１７】
本発明はさらに、ウマの Streptococcus感染に対するワクチンを製造するための、オランダ国、バーン所在の the Centraalbureau voor Schimmelcultures に受託番号CBS 813.95で寄託されている Streptococcus equi菌株TW 928の使用に関する。
【００１８】
【実施例】
実施例Ｉ
突然変異菌株の選択
Streptococcus equiの野生菌株を、腺疫の臨床的徴候のあるウマから単離した。この菌株を、血液寒天培地上、37℃で好気的に一夜増殖させた後、M17 培地（１l 中に 5g のトリプトース、5 g の中和された大豆ペプトン、2.5 g の酵母エキス、5 g のビーフエキス、10 gのグルコース、0.5 g のアスコルビン酸、19 gの（Ｂ−）グリセロリン酸二ナトリウム、0.25 gのＭｇＳＯ4 （７Ｈ2 Ｏ）、ｐＨ 7.0〜7.2 を含む。）に接種し、種々のＤＮＡ突然変異法にかけた。古典的な突然変異法は、例えば、Carlton, B.C. およびBrown, B.J., in Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhardtら編) American Society for Microbiology, Washington D.C., p.226 (1981)に記載されている。組換えＤＮＡ法に基づく突然変異法は、Maniatis (Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989)) に記載されている。親TW菌株と比較して、標準的な制限断片ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出可能な欠失を有する突然変異菌株を選択した。1 kbの欠失を有する菌株を選択してTW 928と命名し、下記実施例に記載するように、その弱毒性をテストした。
【００１９】
実施例 II 
ワクチンの製造
Streptococcus equi菌株 TW 928 および野生型の親TW菌株を血液寒天培地上、37℃で好気的に一夜増殖させた後、M17 培地に接種した。ワクチン接種／チャレンジ試験のために、菌株を100 mlの M17培地中、37℃、ｐＨ 7.4で６時間培養し、遠心分離して、ＰＢＳに再懸濁した。総数を計数室で測定し、生きている数をプレート計数により検出した。ワクチン接種／チャレンジに使用した培養物は、約109 細菌／mlまたはその 10 倍の希釈物を含んでいた。
【００２０】
実施例 III
マウスにおけるワクチン菌株TW 928の安全性試験
この実施例では、S. equi突然変異体 TW 928 の弱毒化の割合を野生型菌株TWと比較してマウスで試験した。突然変異菌株および親 TW 野生型菌株の種々の濃度のＣＦＵをマウスに鼻腔内または腹腔内投与して、死亡率を記録した。
【００２１】
動物
IFFA-Credoから入手したBALB/cマウス（８週齢）を実験に使用した。
【００２２】
処理
８週齢のマウス19匹の１群をS. equi菌株TWで鼻腔内チャレンジし（50μl)、マウス20匹の１群をS. equi菌株TW 928で鼻腔内処理した（表１参照）。８週齢のマウス 10 匹を１群とし、その６群をS. equi菌株TW培養物の10倍希釈物 250μl で腹腔内チャレンジし、10匹を１群とするマウス６群をS. equi菌株TW 928培養物の10倍希釈物 250μl で腹腔内チャレンジした（表１参照）。処理後、死亡率を35日間記録した。
【００２３】
ワクチン接種／チャレンジ培養物
S. equi菌株TWおよびTW 928を、血液寒天培地上、37℃で好気的に一夜増殖させた後、M17 培地に接種した。ワクチン接種／チャレンジ試験のために、約109 細菌／mlを含む新鮮な培養物（５〜６時間経ったもの）またはその10倍の希釈物を使用した。総数を計数室で測定し、生きている数をプレート計数により決定した。実際のワクチン接種／チャレンジの用量に関しては、表１参照のこと。
【００２４】
結果
８週齢のマウスの菌株TWまたは菌株TW 928による腹腔内および鼻腔内チャレンジ後の結果を表２に示す。突然変異菌株の腹腔内チャレンジ後のＬＤ50は、野生型菌株と比較して、約104 倍高いことが確認された。同様に、鼻腔内投与後の突然変異菌株は、野生型と比較して、かなり弱毒化されていることが確認された。両方の菌株の用量を高くすると、マウスは24時間以内に死亡した。これは、恐らく、毒性物質の過剰用量による。野生菌株の用量を低くすると、ほとんどのマウスがチャレンジの５〜９日後に死亡した。これは、恐らく、感染による（表２）。反対に、突然変異菌株の用量を低くすると、チャレンジの２日以降でもほとんどのマウスは死亡しなかった（60匹のマウス中、３匹を除く）。これは、突然変異菌株が、ほとんどの場合で、致命的な感染を引き起こさない（および、野生型と比較してほとんど感染性がない）ことを示す。野生型による鼻腔内チャレンジ後は、ほとんどのマウスが全て、重い神経的徴候を示したので、処理の５〜８日後に感染により死亡した。反対に、突然変異菌株による鼻腔内チャレンジ後は、20匹のマウスのうちたった３匹が24時間以内に死亡したにすぎなかった。この死亡原因は、恐らく、感染というより、むしろ毒性物質の過剰用量による（表２）と思われる。
【００２５】
実施例 IV 
マウスにおけるワクチン菌株TW 928の保護試験
この実施例では、S. equi突然変異体の潜在的免疫原性をマウスで試験した。
鼻腔内ワクチン接種後に突然変異菌株によって生じる免疫を、鼻腔内致死用量の親 TW 野生型菌株によって誘発した。突然変異菌株および親TW野生型菌株の種々の濃度のＣＦＵをマウスに鼻腔内投与し、死亡率を記録した。菌株TW 928による２回の鼻腔内ワクチン接種によって生じる免疫を、野生型菌株TWによって誘発した（追加免疫の１週間後）。
【００２６】
動物
IFFA-Credoから入手したBALB/cマウス（６週齢）を実験に使用した。
【００２７】
ハウジング
実験を開始する１週間前に、マウスを負圧アイソレーターにある檻に入れて（10匹／檻）順応させた。21匹のマウスの１群を９週齢（チャレンジ日）になるまできれいな部屋に入れた＝ワクチン接種していない対照群。
【００２８】
処理
６週齢のマウス10匹を１群とし、その４群を種々のS. equi菌株TW製剤50μl で鼻腔内処理した。すなわち、１）全培養物、２）全培養物を培養培地で10倍に希釈したもの、３）ＰＢＳに懸濁した細胞（培養物の濃度）または４）培養物の濃度に対してＰＢＳで10倍に希釈した細胞である。同じ方法を、S. equi菌株TW 928に対して行ったが、培養物の濃度の細胞／ＰＢＳの場合は、30匹のマウスを使用した（表３参照）。マウス21匹の１群（きれいな部屋に隔離して入れた）は未処理のままにした。処理後、14日間にわたって死亡率を記録した。８週齢で、菌株TW 928処理群の生存マウスを、新しく作った製剤による初回免疫に対して記載した方法と同様にして、突然変異菌株で再び鼻腔内処理した（追加免疫）。追加免疫の後、死亡率を７日間記録した。９週齢（追加免疫の１週間後）で、生存マウスを未処理対照群とともにS. equi菌株TWにより鼻腔内チャレンジし、死亡率を14日間記録した（表３参照）。
【００２９】
ワクチン接種／チャレンジ培養物
両方のS. equi菌株を血液寒天培地上、37℃で好気的に一夜増殖させた後、 M17培地に接種した。ワクチン接種／チャレンジのために、新鮮な培養物（５〜６時間経ったもの）または約109 細菌／mlを含む培養物濃度でＰＢＳに懸濁した（新たに遠心分離した）細胞もしくはその10倍希釈物を使用した。総数を計数室で測定し、生きている数をプレート計数により測定した。実際のワクチン接種／チャレンジの用量は表３を参照のこと。
【００３０】
結果
野生型または突然変異菌株による鼻腔内処理後の結果を表４に示す。種々の野生型TW製剤でチャレンジしたマウスはほとんど全てが死亡したが、突然変異菌株TW 928により鼻腔内処理した後のマウスは、60匹（24時間以内の１匹を除く全て）のうち７匹のみが死亡した（表４）。突然変異菌株による処理群の生存マウスを、初回免疫の２週間後に追加免疫した。追加免疫したマウスは、TW 928／ＰＢＳ群の３匹を除く全てが、チャレンジまで生存した。追加免疫の１週間後、生存マウスならびに週齢および供給源が同じ21匹の対照マウスを野生型菌株で鼻腔内チャレンジした。チャレンジ後、全ての対照マウスは死亡したが、ワクチン接種した種々の群は、91％までの種々の度合いの保護を示した（表５）。10倍に希釈した製剤によりワクチン接種したマウスはより少ない保護を示したので、保護力は、用量に依存すると考えられる。チャレンジの２週間後、ワクチン接種した生存マウスの半分以上は喉からチャレンジ菌株が取り除かれ、ほとんどの場合、脳は無菌であることが確かめられた（表６）。
【００３１】
結論
実施例 IIIおよび IV の結果から、S. equi菌株TW 928は、マウスで試験すると（鼻腔内投与および腹腔内投与）、親野生型菌株TWと比較して、かなり弱毒化されていると結論することができる。さらに、突然変異菌株による２回の鼻腔内ワクチン接種は、野生型菌株による鼻腔内致死性チャレンジに対して保護を誘発する。
【００３２】
【表１】
0003911058.tif 000002
【００３３】
【表２】
0003911058.tif 000003
【００３４】
【表３】
0003911058.tif 000004
【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
0003911058.tif 000006
【００３７】
【表６】
0003911058.tif 000007
【００３８】
実施例Ｖ
ウマにおけるワクチン菌株 TW 928 の安全性試験
Streptococcus equi菌株TW 928の安全性を、６匹の血清学的に陰性のウマで試験した。
【００３９】
動物
腺疫に罹ったことがない７〜８カ月齢の６匹のウマを使用した。
【００４０】
ワクチン接種／チャレンジ
Ｔ＝０で、６匹のウマ全部に、マウスアダプターの付いた Devilbiss噴霧器（最大設定で操作）を使用して、菌株TW 928のエーロゾルを連続噴霧した。各ウマに、10分間、エーロゾルを噴霧した（約109 CFU/mlを含む６時間培養物の希釈物約20mlを各ウマに使用した。）。その後、シリコンチューブ（約25cm）および10mlの注入器を使用して、その培養物を、鼻腔内投与した（５ml／鼻孔）。培養物は、 2.3×109 CFU/mlを含む M17培地での６時間培養物から成り、使用直前に滅菌ＮａＣｌで３倍に希釈した。この希釈は、良好なエーロゾルを得るために必要であった。10分間で、この培養物の約 23 mlがエーロゾル投与された。
【００４１】
臨床検査
ワクチン接種前およびワクチン接種後の毎週２回、ウマの臨床検査を行った。
【００４２】
死後の検査
ワクチン接種後のＴ＝４ｗで、全てのウマを屠殺し、死後の検査を行った。各ウマから、細菌学的検査のためのスワブを、喉嚢、喉頭、気管、顎下リンパ節、咽頭後リンパ節、耳傍リンパ節および気道気管支リンパ節、ならびに腺疫に典型的であってもなくても上記以外の全ての異常部位（病巣）から取った。喉嚢、喉頭および気管は、直接スワブ（swab）を得て、血液寒天培地上で画線培養した。組織サンプル（すなわち、リンパ節）は、焼灼し、滅菌メスを使用して切開し、綿棒を挿入し、その物質を血液寒天培地上で画線培養した。血液寒天プレートを37℃で18〜24時間、好気的にインキュベートした。（存在するならば、種々の形態学的種類の）いくつかの溶血性コロニーをクローン化し、ＡＰＩ−strep および４種類の糖チューブ（ソルビトール、リボース、ラクトースおよびトレハロース）でテストした。組織学的検査のための組織サンプルを、喉嚢、顎下リンパ節、咽頭後リンパ節、耳傍リンパ節および気道気管支リンパ節ならびに異常がある場合はさらに気道または肺の組織から取った。
【００４３】
結果
臨床的徴候
親 TW 野生型菌株を使用したエーロゾル安全性試験モデルにおいて、感染しやすいウマは、５〜７日以内に腺疫の典型的徴候を示し、それは、突然の高熱（＞40℃）ならびに下顎リンパ節および咽頭リンパ節の膿瘍生成を特徴とする。ワクチン接種した後の本実験のウマでは、そのような徴候は認められなかった。ワクチン接種の18日後に39.7℃であったウマ97を除いて、熱は39.5℃を越えなかった。全てのウマの顎下リンパ節は、ワクチン接種の２日後および16日後に左の顎下リンパ節のわずかな肥大が確認され、ワクチン接種の11日後に右の顎下リンパ節のわずかな肥大が確認されたウマ 101を除いて、実験中は正常であることが確認された。顎下リンパ節とは対照的に、咽頭後リンパ節は、間接的に触診できるだけである。全てのウマの咽頭後リンパ節は、ウマ No.98を除いて、２、３日間、中位の肥大がわずかに確認された。
【００４４】
鼻洗液からの細菌の単離
ワクチン接種後、S. equiはウマからほとんど単離されなかった。ウマ 100および 101から、その細菌が、実験中に鼻洗液から再単離され、ウマ96からは１回だけ再単離されただけである（表７参照）。
【００４５】
死後の検査および細菌学
ワクチン接種の４週間後、６匹のウマ全てを屠殺し、死後の検査および細菌学検査を行った。どのウマも、腺疫の徴候は示さなかった。すなわち、リンパ節は正常であることが確認され、どのウマからも（２匹のウマの検死日における鼻洗液を除く）、 Streptococcus equiは再単離されなかった。
【００４６】
【表７】
0003911058.tif 000008
【００４７】
組織学的検査
下顎リンパ節、咽頭、耳傍および気道気管支リンパ節の組織学的検査は、肉眼により確認した。腺疫の徴候はなく、すなわち、膿瘍の形成はなかった。検査したほとんど全てのリンパ節は、上気道での抗原刺激に対して弱〜中位の小胞（胚中心）過形成を示す、反応性リンパ系組織として記載された。
【００４８】
結論
上記結果から、S. equi菌株TW 928欠失突然変異体はウマにおいて安全であることがはっきり示される。