(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳生理活性物質類の不活性剤として、(-)エピカテキン・ガレート（ＥＣｇ）および(-)エピガロカテキン（ＥＧＣ）のいずれか或いはこれらの２種類を使用して得られる百日咳ワクチン。
【請求項２】
百日咳生理活性物質類と、不活性剤としての(-)エピカテキン・ガレート（ＥＣｇ）および(-)エピガロカテキン（ＥＧＣ）のいずれか或いはこれらの２種類とを混合して前記百日咳生理活性物質類を不活性化させた後、不活性剤を除去して百日咳トキソイドを得、該百日咳トキソイドをアジュバンドに吸着させる工程を備えた百日咳ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、百日咳菌（Bordetella  pertussis ）の感染により発症する急性呼吸器系伝染病としての百日咳のワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
百日咳ワクチンに関しては、従来我が国では百日咳菌に由来の感染防御抗原、生物活性物質、或いは菌体成分などを主成分とする百日咳生理活性物質類を「不活性化剤」で不活性化（無毒化）して得られた百日咳トキソイドを有効成分として含有した百日咳ワクチンが各種認可され、既に市販されている。これら百日咳ワクチンの製造については、例えば特公昭５７−５２０３号、特公平１−９２８号、特公平１−９３１号、特開昭６２−５９２２号、特開昭６４−３４９１２５号等に開示されている。
【０００３】
ところで、百日咳ワクチン製造の際の「不活性剤」としては、従来から「ホルマリン」が汎用されてきたが、このホルマリンによる不活性化には抗原タンパク質の凝集が起こりやすくワクチンの安定性に関して不十分であるという問題があった。
【０００４】
この点に関しては、ホルマリンに代わる「不活性剤」として、例えば特開昭６２−５９２２号においてカルボジイミドが開示されていたが、かかるカルボジイミドの安全性を疑問視する指摘もあった。
【０００５】
そこで、本発明は、ホルマリンに代わる百日咳生理活性物質類の不活性剤であって、不活性化の際に抗原タンパク質の凝集を生じることがなく、しかも人体に対して安全であるものを見出し、かかる不活性剤を用いて安全かつ安定した百日咳ワクチンを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる目的達成するために、本発明者らが鋭意研究を行なった結果、カテキン類、特に茶類を抽出して得られる茶カテキン類に百日咳生理活性物質類に対する優れた不活性作用を発見し、かかる知見に基づいて本発明を想到するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明の百日咳ワクチンは、百日咳生理活性物質類の不活性剤として「カテキン類」特に茶カテキン類を含有するものである。
カテキン類は、従来汎用されてきた「ホルマリン」の不活性効果と比較して、１／１０００以下の低濃度で百日咳生理活性物質類を有効に不活性化（無毒化）することができ、しかも、従来の製造方法で問題となっていた抗原タンパク質の変性によるワクチン力価の低下、沈澱形成、変色等を防ぐことができ、更にはワクチン製造にあたり百日咳毒素の類毒素化を有効に進めることもできる。したがって、本発明よれば、高い抗原性を持ちしかも安定な百日咳ワクチンを提供することができる。
【０００８】
ここで、本発明における「百日咳生理活性物質類」とは、百日咳菌に由来の感染防御抗原、生物活性物質、菌体成分などを包含する意であり、例えば繊維状赤血球凝集素（以下「ＦＨＡ」という。）、百日咳毒素（以下「ＰＴ」という。）、６９ｋＤａ外膜タンパク質（以下「６９ｋ」という。）、易熱性毒素間または皮膚破壊毒素、易熱凝集原、内毒素又はリポ多糖類、ヒスタミン増感因子、白血球又はリンパ球増多因子、アジュバンド活性因子、アデニル酸サイクラーゼ、インスリン分泌活性増強因子などのいずれか、或いはこれらの２種類以上を混合してなるものである。本発明などにおいては、特にＦＨＡ及びＰＴを含有する混合物、中でもＦＨＡ、ＰＴ及び６９ｋからなる混合物をワクチンの主要成分とするのが好ましい。
【０００９】
本発明における「カテキン類」とは、ツバキ科に由来する茶の生葉（茶生葉）、これを処理して得られる緑茶、烏龍茶又は紅茶を、水、熱水、各種アルコール類或いは酢酸エチルで抽出して得られた抽出物を分離精製して得られる、(-)エピカテキン・ガレート（ＥＣｇ）および(-)エピガロカテキン（ＥＧＣ）のいずれか或いはこれらの２種類の混合物を包含する意である。なお、ＥＣｇ、ＥＧＣの分離精製手段は公知の各種方法によればよく、例えば茶乾燥葉、緑茶、烏龍茶又は紅茶を、熱水、温水又は冷水で抽出し（茶：水＝１：５０、５〜６０ｍｉｎｍｉｎ）、得られた抽出物をカラム・クロマトグラフィーにより分離する。すなわち、セファデクスＬＨ２０樹脂を詰めたカラムに前記抽出物を載せて水洗した後、０〜６５％濃度のエタノール水溶液にて樹脂吸着部を溶出し、０〜３０％エタノール溶出分画と３５〜６５％エタノール溶出分画を得る。そして、そのうちの３５〜６５％エタノール溶出分画部を更にＨＰＬＣ（カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ３１２（ＯＤＳ）、移動層；０．０５％リン酸（８８V ）＋アセトニトリル（１０V ）＋酢酸エチル（２V ）、波長；２８０ｎｍ、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ）により、ＥＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣを分離精製すればよい。
【００１０】
本発明における「カテキン類の濃度」は、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、特に０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭとなるように調整するのが好ましい。
【００１１】
カテキン類は、百日咳生理活性物質類中の生体高分子と結合してかかる生理活性物質を変性させてこれらの活性を有効に失活させていると考えることができる。また、カテキン類は、上述のように古来より日常的に飲用されてきたお茶から抽出される成分であるため、その安全性についても保証されている。
【００１２】
百日咳ワクチンの製造方法としては、上述の百日咳生理活性物質類若しくは百日咳生理活性物質類混合溶液にカテキン類を添加混合して不活性化反応させ、この反応溶液を透析などによって不活性剤としてのカテキン類を除去して百日咳トキソイドを得、かかる百日咳トキソイドにアジュバンドを添加混合して当該アジュバンドに百日咳トキソイドを吸着させることにより百日咳ワクチンを製造することができる。
得られた百日咳ワクチンは、アンプルやバイアル瓶などに分注し、必要に応じて乾燥凍結した後、密封するなどすればよい。
【００１３】
アジュバンドとしては、水酸化アルミニウム（Ａｌ（０Ｈ）3 ）ゲルのほか、リン酸アルミニウムゲルやリン酸カルシウムゲル等の抗原徐放性の沈降性アジュバンド、ムラミルペプチド誘導体やポリヌクレオチド等の抗体産生誘起性アジュバンドを使用することができる。
【００１４】
なお、上記の製造方法の過程において、百日咳トキソイドに公知の安定化剤を添加することにより百日咳ワクチンをより一層安定化させることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の好適な実施例としてのワクチン製造方法の一例を説明する。
【００１６】
（百日咳ワクチン製造例）
ＦＨＡ、ＰＴ及び６９ｋを、ＦＨＡ：ＰＴ：６９ｋ＝９：２：１であって蛋白質濃度２５０μｇ／ｍｌとなるように混合して百日咳菌生理活性物質混合液を調製する。
次いで、この百日咳菌生理活性物質混合液に、カテキン類（すなわちＥＣｇおよびＥＧＣのいずれか或いはこれらの２種類の混合物）Ｏ．２ｍＭ添加し、３７℃、１時間反応させ、この反応液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で２日間透析して未反応の前記カテキン類を分離除去する。そして、これにアジュバンドとしてＡｌ（０Ｈ）3 ゲル及びＡｌＰＯ4 ゲルをそれぞれ最終濃度９０μｇ／ｍｌとなるように添加して４℃で１晩放置後、タンパク質濃度１５０μ／ｍｌに調整すれば百日咳ワクチンを得ることができる。
【００１７】
（百日咳毒素不活化検討試験）
百日咳菌(B.pertussis東浜株Ｉ相菌）を２．８％カザミノ酸加 Stainer- Sholte培地で３６℃、５日間静置培養した。培養後、遠心して培養上清を得、この上清をAF-heparin Toyopearl 650M カラム(25X27mm) に載せてＦＨＡを吸着させ、このカラムをリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、０．５ＭＮａＣｌ加１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を流して「ＦＨＡ」を溶出した。
【００１８】
他方、上記AF-heparin Toyopearl 650M カラムを通過した画分をｐＨ６．０に調整し、これをAffi-Gel Blue 樹脂に加えて４℃、４８時間放置した。このAffi-Gel Blue 樹脂をカラムに詰め、０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）と０．０５ＭのTris- 塩酸緩衝液；ｐＨ７．２（ｂｕｆｆｅｒＡ）で洗浄し、０．７５ＭのＭｇＣｌ2 加ｂｕｆｆｅｒＡを流して溶出させ、得られた溶出画分を０．５Ｍの食塩加ｂｕｆｆｅｒＡに対して透析し、これをFetuin-conjugated Toyoperl 650M カラム(25X50mm) に流した後、このカラムを０．５ＭのＮａＣｌ加ｂｕｆｆｅｒＡ、１ＭのＮａＣｌ加ｂｕｆｆｅｒＡ、１ＭのＮａＣｌ及び２Ｍのｕｒｅａ加ｂｕｆｆｅｒＡ、０．５ＭのＮａＣｌ加ｂｕｆｆｅｒＡの順で洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌ加５０ｍＭ diethanol-amineを流して「ＰＴ」を溶出した。
【００１９】
上記のようにして得られた「ＦＨＡ」又は「ＰＴ」に各種カテキン（０．２ｍＭ）又はホルマリン（２００ｍＭ）を添加し、３７℃、１時間反応させてＦＨＡ活性及びＰＴ活性を測定した。
なお、各種のカテキンとしては、緑茶茶葉から分離精製した純度９５％以上のエピカテキン（ＥＣ）、エピカテキン・ガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキン・ガレート（ＥＧＣｇ）を用いた。
ＦＨＡ活性は、ニワトリ赤血球凝集法にて測定し、赤血球凝集が観察される最大希釈倍率でその活性を表示し、また、ＰＴ活性は、ＣＨＯ(Chinese hanmster ovary)細胞の凝集程度（clustering）の有無を判定し、全ての細胞のclusteringが観察された最大希釈倍率でその活性を表示し、これら各種カテキン及びホルマリンの百日咳毒素不活性度を下記表１に示した。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
この結果、エピカテキン以外のカテキンは、従来から不活性剤として汎用されてきたホルマリンの約１／１０００の濃度でＦＨＡ及びＰＴを効果的に不活性化することが明らかになった。
【００２２】
（ＰＴからの中和抗体誘導）
ＰＴ溶液(30 μg/ml) に(-) エピガロカテキン（ＥＧＣ）を最終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、３７℃、１時間反応させた後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。
他方、ＰＴ溶液(250μg/ml) に最終濃度２００ｍＭとなるようホルマリンを添加し、３７℃、１時間反応後、０．５ＭＮａＣｌ加０．１ＭのTris- 塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。
こうして得られたＰＴ不活性化抗原（トキソイド）１５μg/mouse をマウス（dd-Y, ♂、３５週令）に、１週間間隔にて計３回免疫し、最終免疫日から１週間後に採血し血清を得た。
【００２３】
次に、各血清中のＰＴ中和抗体価をＣＨＯ細胞を細胞凝固法で測定した。
先ず、Ham's F-123 培地を希釈液としてサンプルカップ(200μl/tube) にＰＴ標品(200CU/ml)を２００μｌずつ加えて３７℃、１時間静置した。このサンプルカップ内の液を細胞培養用９６−ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、さらＣＨＯ細胞懸濁液を各ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ加え, 培養後（５％ＣＯ2 、３７℃、２４時間）ＣＨＯ細胞の細胞凝固の様子を検鏡し、正常増殖像の見られるｗｅｌｌの血清最大希釈率を中和抗体価（１ＣＵ：９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅのｗｅｌｌ中のＣＨＯ細胞を１００％凝固するに必要な最小抗原タンパク質質量）とし、この結果を下記表２に示した。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
この表２より、茶カテキンは百日咳菌毒素に対して中和抗体を強く誘導し、有効で有用なワクチン製造が可能であることが明らかとなった。
【００２６】
（カテキン不活性化百日咳ワクチンの効果）
ワクチン製造法に準じて、各種カテキン、ホルマリンで不活性化した抗原（ワクチン）を調製し、このワクチン類のＰＢＳ希釈液をマウス（dd-Y，３．５週令、♀）の腹腔内に接種し、接種３週間後のマウスを網ゲージに入れて噴霧感染箱に吊るし、百日咳菌懸濁液のエアゾールを箱内に噴霧導入して噴霧感染処理を行った。噴霧感染処理２週間後、頚堆脱臼致死させたマウスの肺を摘出し、その摩砕物の希釈液をBordet-Gengou 培地に塗布して、３６℃、４日培養後の、コロニー数から肺内生菌数を調査し、この結果を図１に示した。
【００２７】
カテキン不活性化ワクチンは、図１に示すように、ホルマリン不活性化ワクチンと同等か、それ以上の強い百日咳感染防御活性を示した。
【００２８】
【発明の効果】
上述の試験結果より、茶カテキンは極めて優れた百日咳毒素不活化を示し、更にこれを含有してなる百日咳ワクチンは、従来の方法で調整されたワクチンよりも優れた感染防御効果を発揮することが確かめられた。これより、本発明のワクチンは、従来の方法で造られたワクチンと比較しても優れた百日咳免疫効果を示し、新しいワクチンとして極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種カテキン、ホルマリンで不活性化した各種抗原（ワクチン）の百日咳ワクチンの免疫効果を示したグラフである。
【図１】
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