(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子が導入されたトランスジェニック植物細胞であって、以下の（１）から（５）のいずれかに記載のDNA分子が導入されたトランスジェニック植物細胞。
（１）  （ａ）植物細胞内で機能可能なプロモーター、（ｂ）P450モノオキシゲナーゼ遺伝子、および（ｃ）植物細胞内で機能可能なターミネーター、を機能可能な形で有するDNA分子
（２）  P450モノオキシゲナーゼ遺伝子がP450還元酵素遺伝子との融合遺伝子である、（１）に記載のDNA分子
（３）  P450モノオキシゲナーゼ遺伝子がCYP2ファミリーに属する遺伝子である、（１）または（２）に記載のDNA分子
（４）  CYP2ファミリーに属する遺伝子が、CYP2B6遺伝子、CYP2C9遺伝子、CYP2C18遺伝子、およびCYP2C19遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、（３）に記載のDNA分子
（５）  P450モノオキシゲナーゼ遺伝子が哺乳動物由来である、（１）から（４）のいずれかに記載のDNA分子
【請求項２】
前記複数種のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子が、CYP1A1遺伝子、CYP2B6遺伝子、およびCYP2C19遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求項１に記載の植物細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物体。
【請求項４】
イネ科植物またはナス科植物である、請求項３に記載のトランスジェニック植物体。
【請求項５】
外来化合物の酸化的代謝による分解能を有する、請求項３または４に記載のトランスジェニック植物体。
【請求項６】
外来化合物が環境負荷物質または外因性内分泌攪乱物質である、請求項５に記載のトランスジェニック植物体。
【請求項７】
除草剤耐性を有する、請求項５または６に記載のトランスジェニック植物体。
【請求項８】
請求項３から７のいずれかに記載の植物体の繁殖材料。
【請求項９】
請求項５または６に記載のトランスジェニック植物体を用いることを特徴とする、環境中の外来化合物を除去する方法。
【請求項１０】
除草剤に対し代謝能を有するP450モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子を選定する方法であって、
（ａ）  複数種のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子のそれぞれが導入され、これにより複数種のP450モノオキシゲナーゼのそれぞれを発現するトランスジェニック植物細胞から、それぞれミクロソーム画分を調製する工程、
（ｂ）  該ミクロソーム画分と除草剤の有効成分とを反応させる工程、
（ｃ）  該反応後の親化合物（除草剤の有効成分）および/または反応生成物（該除草剤の有効成分の代謝産物）を検出する工程、
（ｄ）  親化合物の量の減少および/または反応生成物の生成が検出された、P450モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子を選定する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、薬物等の代謝能が付与されたトランスジェニック植物及びその用途に関する。
背景技術
産業の発達・高度化に伴い、生態系を破壊する環境負荷物質の種類が増加し、さらに外因性内分泌攪乱物質といった非常に微量で生物の生殖機構を乱す物質も数多く報告されている。環境負荷物質や外因性内分泌攪乱物質等は、生物体内で濃縮され、食物連鎖を通じてさらに濃縮されて極めて重大な影響を生物体や生態系に及ぼす。このため、単にこれら物質を環境中から除去するだけでなく、これら物質を取り入れてしまった生物体内で代謝・無毒化することが必要である。
特に植物は食物連鎖の底辺に属する生物であり、これら物質が蓄積した植物は、生態系の破壊の源となるため、植物体内におけるこれら物質の代謝・無毒化が重要な課題となっている。
我々の食生活と密接な関係にある農作物に関しても、その栽培において、一般に、環境負荷物質である除草剤などの農薬が使用されており、その摂取による人体や家畜への悪影響を防止するために、農作物内の残留農薬を無毒化することが求められている。
ところでチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下「Ｐ４５０」と略記する）は、微生物から植物、哺乳動物に至るまで広く生物界に分布する酵素で、生体内に取り込まれた薬物を代謝し無毒化する働きを有している。Ｐ４５０がその活性を発揮するためには、Ｐ４５０に電子を供給するもう一つの酵素（以下「Ｐ４５０還元酵素」と略記する）、例えばＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素を必要とする。この酵素もまた生物界に広く存在するが、本発明者らはこれまでに種々のＰ４５０分子種とＰ４５０還元酵素との融合酵素遺伝子を構築することにより、非常に高い酸化活性を示す人工酵素を作出してきた（特開昭６３−４４８８８号公報、特開平２−２３８７０号公報、特開平２−２４９４８８号公報）。
近年、植物におけるＰ４５０研究が進展し、種々のＰ４５０分子種が広く植物に存在することが明らかとなってきている。しかし、植物に存在する多くの薬物代謝型Ｐ４５０分子種は活性が低く、環境負荷物質の代謝能力が極めて低い。このため、環境負荷物質等を代謝する能力が高められた新たな植物を作出する必要があった。
特に直接食糧や家畜の飼料として利用され、人類の生活に重要な役割を果たしている農作物に、農薬をはじめとする環境負荷物質や外因性内分泌攪乱物質を代謝・無毒化する能力を付与する必要があった。
発明の開示
本発明者らは、こうした状況に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、哺乳類の持つ薬物代謝型Ｐ４５０分子種を植物体内で発現させることにより、薬物などの代謝能が付与されたトランスジェニック植物体を作出することに成功した。本発明のトランスジェニック植物体は、発現するＰ４５０分子種に応じて、様々な除草剤を代謝する能力を有し、このためこれら除草剤に対し耐性を示す。特に、複数のＰ４５０分子種を発現させた個体は、広範な除草剤に対して相乗効果により強い耐性を示すことができる。このような特性から本発明のトランスジェニック植物は、除草剤耐性植物として極めて有用である。また、土壌に散布した除草剤を吸収し、代謝して、分解することができるため、極めて環境性にも優れている。さらに、これら除草剤のみならず、植物を利用して（光エネルギーを利用して）環境負荷物質や外因性内分泌撹乱物質を代謝、分解することにより環境浄化を行うことができるファイトレメディエーション植物として利用することも可能である。
従って、本発明は、Ｐ４５０に由来する一原子酸素添加活性、あるいはＰ４５０に由来する一原子酸素添加活性とＰ４５０還元酵素に由来するＮＡＤＰＨからの還元力供給能力を合わせ持つ融合酵素活性を発現し、環境負荷物質や外因性内分泌攪乱物質を代謝・分解することができるトランスジェニック植物およびその用途を提供する。
本発明は、より詳しくは、
（１）  （ａ）植物細胞内で機能可能なプロモーター、（ｂ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子、および（ｃ）植物細胞内で機能可能なターミネーター、を機能可能な形で有するＤＮＡ分子、
（２）  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子がＰ４５０還元酵素遺伝子との融合遺伝子である、（１）に記載のＤＮＡ分子、
（３）  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子がＣＹＰ２ファミリーに属する遺伝子である、（１）または（２）記載のＤＮＡ分子、
（４）  ＣＹＰ２ファミリーに属する遺伝子が、ＣＹＰ２Ｂ６遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１８遺伝子、およびＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、（３）に記載のＤＮＡ分子、
（５）  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が哺乳動物由来である、（１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡ分子、
（６）  （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子が導入されたトランスジェニック植物細胞、
（７）  複数種のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が導入された、（６）に記載のトランスジェニック植物細胞、
（８）  （６）または（７）に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物体、
（９）  イネ科植物またはナス科植物である、（８）に記載のトランスジェニック植物体、
（１０）  外来化合物の酸化的代謝による分解能を有する、（８）または（９）に記載のトランスジェニック植物体、
（１１）  外来化合物が環境負荷物質または外因性内分泌攪乱物質である、（１０）に記載のトランスジェニック植物体、
（１２）  除草剤耐性を有する、（１０）または（１１）に記載のトランスジェニック植物体、
（１３）  （８）から（１２）のいずれかに記載の植物体の繁殖材料、
（１４）  （１０）または（１１）に記載のトランスジェニック植物体を用いることを特徴とする、環境中の外来化合物を除去する方法、
（１５）  除草剤に対し代謝能を有するＰ４５０モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子を選定する方法であって、
（ａ）  複数種のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子のそれぞれが導入され、これにより複数種のＰ４５０モノオキシゲナーゼのそれぞれを発現する形質転換細胞から、それぞれミクロソーム画分を調製する工程、
（ｂ）  該ミクロソーム画分と除草剤の有効成分とを反応させる工程、
（ｃ）  該反応後の親化合物（除草剤の有効成分）および／または反応生成物（該除草剤の有効成分の代謝産物）を検出する工程、
（ｄ）  親化合物の量の減少および／または反応生成物の生成が検出された、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子を選定する工程、を含む方法、を提供する。
なお、本発明において「環境負荷物質」とは、環境中に放出され、生態系に負荷を与える物質を指す。また、「外因性内分泌攪乱物質」とは、生物体外に存在し、生体内に取り込まれるとホルモン様作用を示す物質を指す。
本発明で用いるＰ４５０分子種としては一原子酸素添加活性を有するものであれば特に限定されることはないが、植物由来のＰ４５０と比較して高い活性を有する哺乳動物由来のものが好ましい。ここで「一原子酸素添加活性」とは、基質となる分子に酸素１原子を添加する反応を触媒する活性のことをいう。また、ＣＹＰ１，２，３，４ファミリーに属するＰ４５０分子種は、主として薬物、毒物、農薬を含めた環境負荷物質等の外来化合物の酸化的代謝に関与することが知られているため本発明に好適に利用しうる（今井嘉郎・鎌滝哲也、蛋白質核酸酵素４３，２０３−２１５，１９９８）。特に好ましいＣＹＰ１ファミリーに属する分子種としては、ヒト由来のもの、例えばヒトＣＹＰ１Ａ１およびヒトＣＹＰ１Ａ２が挙げられる。
Ｐ４５０分子種がどのような除草剤を代謝するかは、例えば、各種Ｐ４５０分子をそれぞれ発現させた組換え体からミクロソーム画分をそれぞれ調製し、該ミクロソーム画分と、各種除草剤の有効成分とを反応させ、次いで、親化合物（除草剤の有効成分）または反応生成物（該除草剤の有効成分の代謝産物）を検出し、分析することにより、決定することができる。
即ち、除草剤に対し代謝能を有するＰ４５０モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子の選定は、
（ａ）  複数種のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子のそれぞれが導入され、これにより複数種のＰ４５０モノオキシゲナーゼのそれぞれを発現する形質転換細胞から、それぞれミクロソーム画分を調製する工程、
（ｂ）  該ミクロソーム画分と除草剤の有効成分とを反応させる工程、
（ｃ）  該反応後の親化合物（除草剤の有効成分）および／または反応生成物（該除草剤の有効成分の代謝産物）を検出する工程、および
（ｄ）  親化合物の量の減少および／または反応生成物の生成が検出された、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼまたはその遺伝子を選定する工程、を含む方法により実施することが可能である。
選定に用いるＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の種類には、一原子酸素添加活性を有するものであれば特に制限はないが、植物に比して高い除草剤代謝能が期待しうるという点で、哺乳動物由来のものが好ましい。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が導入される細胞としては、例えば、酵母、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられるが、これらに制限されない。
ミクロソーム画分の調製は、当技術分野における技術者に公知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、酵母では［Ｏｅｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，４，２０３−２１０，１９８５」の方法等が挙げられる。また、ヒトＰ４５０の各分子種を発現した組換え体酵母菌株ミクロソーム画分が市販されている（例えば住友化学工業（株））。
反応に用いる除草剤に制限はない。除草剤としては、例えば、アトラジン等のトリアジン系化合物、クロロトルロン、デューロン、メタベンズチアズロン等の尿素系化合物、ノルフルラゾン等のダイアジン系化合物、ピリミノパックメチル等のピリミジニルオキシベンゼン系化合物、アセトクロール、アラクロール、メトラクロール等のアセトアニリド系化合物、トリフルラリン等のジニトロアニリン系化合物、ベンフレセート、エトフメセート等のベンゾフラニルアルカネスルホン酸系化合物、クロロスルフロン、イマゾスルフロン等のスルホニルウレア系化合物、ピリブチカルブ等のカーバメート系化合物が挙げられるが、これらに制限されない。
ミクロノーム画分と除草剤の有効成分との反応は、ミクロノーム画分中のＰ４５０量が一定になるようにｐＨ７付近のリン酸パッファーに懸濁し、Ｐ４５０還元酵素を介してＰ４５０に電子を供与するためのＮＡＤＰＨ、電子を供与して生成されたＮＡＤＰからＮＡＤＰＨを再生するための基質と酵素（例えばグルコース６リン酸とグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ）、および除草剤（除草剤の種類により濃度は異なる）を添加して行う。反応は、Ｐ４５０分子種の由来する生物の適温の範囲で（例えばヒトＰ４５０では３７℃）、良く振とうして空気と混和しながら、酵素が失活しない時間内（例えば１０〜６０分）で行う。
親化合物（除草剤の有効成分）または反応生成物（該除草剤の有効成分の代謝産物）の検出および分析は、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や液体クロマトグラフィー／マススペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ）により行うことができる。親化合物のピークが減少し、代わりに代謝物に由来するピークが認められれば、試験に用いた試料は除草剤代謝能を有すると判定される。そのピークの大きさから代謝量を求めることができる。
例えば、本発明者らは、ヒトＣＹＰ１Ａ１、ヒトＣＹＰ２Ｂ６、ヒトＣＹＰ２Ｃ１８、ヒトＣＹＰ１９が、各々下記の除草剤を代謝することを確認しており、これらは本発明に好適に利用しうる。
ヒトＣＹＰ１Ａ１；アトラジン等のトリアジン系化合物等のＮ−脱エチル化、Ｎ−脱イソプロピル化等、クロロトルロン、デューロン、メタベンズチアズロン等の尿素系化合物等のＮ−脱メチル化、環水酸化等、ノルフルラゾン等のダイアジン系化合物等のＮ−脱メチル化等、ピリミノパックメチル等のピリミジニルオキシベンゼン系化合物等の水酸化等。
ヒトＣＹＰ２Ｂ６；アセトクロール、アラクロール、メトラクロール等のアセトアニリド系化合物等のＯ−脱エチル化、Ｏ−脱メチル化等、トリフルラリン等のジニトロアニリン系化合物等のＯ−脱メチル化等、ベンフレセート、エトフメセート等のベンゾフラニルアルカネスルホン酸系化合物等のＯ−脱エチル化、水酸化等。
ヒトＣＹＰ２Ｃ９；クロロスルフロン、イマゾスルフロン等のスルホニルウレア系化合物等の環水酸化等。
ヒトＣＹＰ２Ｃ１８；尿素系化合物等のＮ−脱メチル化及び環水酸化等、アセトアニリド系化合物等のＯ−脱エチル化、Ｏ−脱メチル化等、ジニトロアニリン系化合物等のＯ−脱メチル化等、ベンゾフラニルアルカネスルホン酸系化合物等のＯ−脱エチル化、水酸化等。
ヒトＣＹＰ２Ｃ１９；トリアジン系化合物等のＮ−脱エチル化、Ｎ−脱イソプロピル化等、尿素系化合物等のＮ−脱メチル化、環水酸化等、ダイアジン系化合物等のＮ−脱メチル化等、アセトアニリド系化合物等のＯ−脱エチル化、Ｏ−脱メチル化等、ピリブチカルブ等のカーバメート系化合物等のチオエステル開裂等、ピリミジニルオキシベンゼン系化合物等のＯ−脱メチル化等。
また、本発明においては、複数種のＰ４５０遺伝子を同時に植物体内で発現させてもよく、これにより単独のＰ４５０遺伝子を発現させた場合よりも、広範な化合物の代謝能を植物体に付与することが可能である。また、Ｐ４５０遺伝子を単独で発現させただけでは代謝能が弱くて植物体が除草剤抵抗性を示さない場合でも、複数種のＰ４５０遺伝子を発現させ代謝能を高めることにより植物に除草剤抵抗性を与えることが可能である。
本発明で用いるＰ４５０還元酵素としては、Ｐ４５０へ電子を伝達する還元力供給活性を有するものであれば、特に限定することはなく、例えば、バクテリア等の微生物に由来するＮＡＤＨ−Ｐ４５０還元酵素、哺乳動物あるいは植物に由来するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素等をあげることができる（武森重樹・小南思郎、「チトクロムＰ−４５０」、東京大学出版会）。
本発明においては、植物体内でＰ４５０を単独で発現させてもよく、また、Ｐ４５０に電子を供給するＰ４５０還元酵素と共に発現させてもよい。Ｐ４５０還元酵素は、Ｐ４５０との融合タンパク質として発現させてもよい。Ｐ４５０遺伝子とＰ４５０還元酵素遺伝子との融合遺伝子の構築については、公報（特開昭６３−４４８８８号公報、特開平２−２３８７０号公報、特開平２−２４９４８８号公報）参照のこと。
遺伝子を植物細胞内で発現させるためには、（１）植物細胞内で機能可能なプロモーター、（２）遺伝子、（３）植物細胞内で機能可能なターミネーター、を機能可能な形で有するＤＮＡ分子（発現カセット）を作製し、植物細胞に導入する。このようなＤＮＡ分子は、プロモーターに加え、転写をさらに増強するためのＤＮＡ配列、例えば、エンハンサー配列を含んでいてもよい。用いられるプロモーターとしては、植物細胞内で機能するものであれば特に制限はないが、例えば、３５Ｓ（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１１７６−１１８３）、Ｎｏｓ（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１１７６−１１８３）、ｒｂｃＳ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、ＰＲ１ａ（Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｍ．ら，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：９５−１０６）、ＡＤＨ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、ｐａｔａｔｉｎ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、Ｃａｂ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、およびＰＡＬ（Ｌｉａｎｇ，Ｘ．ら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２８４−９２８８）等が挙げられる。このようなＤＮＡ分子としては、遺伝子を発現させるための各種ベクターが含まれる。
植物細胞への遺伝子の導入は、当技術分野における技術者に公知の種々の方法を用いて行うことが可能である。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスやアグロバクテリウム・リゾゲネスを利用した間接導入法（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４、Ｔａｋａｉｗａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１１，３９−４９，１９９５）や、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，８０，４７５，１９９０）、ポリエチレングリコール法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２０，６１９−６２９，１９９２）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，２７５−２８１，１９９２、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，８３３−８３９，１９９０）などに代表される直接導入法を用いることが可能である。本発明において遺伝子導入を行う「植物細胞」としては、植物体に再生可能であれば特に制限はなく、例えば、懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉の切片などが含まれる。
形質転換された植物細胞は、再生させることにより植物体を作出することができる。本発明で作出する植物種としては特に制限はないが、例えばイネ、ムギ、トウモロコシ、イネ科牧草、シバ等のイネ科植物、タバコ、トマト、バレイショ等のナス科作物、ナタネ等のアブラナ科作物、ヒマワリ、アルファルファ等の植物は、薬物などの代謝能を付与する標的植物として特に好適である。植物体の再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、代表的な方法としては、例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｌｅｔｔ．，２，７４，１９９５）、コムギであれば文献（Ａｋｂａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，２６：１８５−１８７；Ａｌｔｐｅｔｅｒ，Ｆ．ら，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１６：１２−１７）に記載の方法、オオムギであれば文献（Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｒ．，ら，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，４９：１２１−１２７）に記載の方法、トウモロコシであればＡｒｍｓｔｒｏｎｇらの方法（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，２８，３６３−３６９，１９８８）、イタリアンライグラスであれば文献（Ｄａｌｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，２２：４６−６８）に記載の方法、シバであれば文献（Ａｓａｎｏ，Ｙ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，８：１４１−１４３）に記載の方法、タバコであれば文献（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．ら，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４０）に記載の方法、バレイショであれば文献（Ｓｈｅｅｒｍａｎ，Ｓ．およびＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：１３−１６）に記載の方法、ナタネであれば文献（Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ，Ｊ．ら，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：１１１５−１１２４）に記載の方法、ヒマワリであれば文献（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ，Ｂ．ら，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，９：５５−６０）に記載の方法、そしてアルファルファであれば文献（Ｓｈａｈｉｎ，Ｅ．Ａ．ら，１９８６，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．２６：１２３５−１２３９）に記載の方法が挙げられる。
本発明で作出した植物体またはその繁殖材料（例えば、種子、塊根、塊茎、果実、切穂など）から得た植物体は、外来化合物、例えば、薬物、毒物、農薬を含めた環境負荷物質および外因性内分泌撹乱物質等の酸化的解毒代謝能を有する。
得られたトランスジェニック植物については、単独あるいは複数の除草剤に対する耐性を検査して、より耐性の強い耐性個体を選抜することができる。選抜個体については、目的のＰ４５０  ｃＤＮＡの染色体ＤＮＡへの導入、ｍＲＮＡの生成、導入遺伝子に対応するＰ４５０蛋白質の生成、Ｐ４５０酵素活性の測定などを行い導入遺伝子が機能していることを確認することが好ましい。
本発明の植物体により酸化的解毒代謝を行う薬物および毒物の具体例としては、これらに制限されないが、例えば、ＣＹＰ１Ａ１はベンゾピレン（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６３０４−６３１２）等、ＣＹＰ２Ｂ６はニコチン（Ｆｌａｍｍａｎｇ，Ａ．Ｍ．ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｒｃｈ．，８：１−８）等、ＣＹＰ２Ｃ９はＩｂｕｐｒｏｆｅｎ（Ｌｅｅｍａｎ，Ｔ．ら，１９９３，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５２：２９−３４）やＴｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ（Ｂｒｉａｎ，Ｗ．Ｒ．ら，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９９３−４９９９）等、ＣＹＰ２Ｃ１８はトルブタミド（Ｆｕｒｕｙａ，Ｈ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３７５−３８２）等、ＣＹＰ２Ｃ１９はＭｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．ら，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：９０９−９２１）やＯｍｅｐｒａｚｏｌ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｔ．ら，１９９０，Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，１２：４１５−４１６）等が挙げられる。
また、農薬としては、これらに制限されないが、例えば、アラクロール（モンサント等）、メトラクロール（チバガイギー，現ノバルティス等）、トリフルラリン（イーライ・リリー等）、アセトクロール（モンサント等）などのアセトアニリド系またはジニトロアニリン系除草剤等、クロロスルフロン（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．等）、イマゾスルフロン（武田薬品等）などのスルホニルウレア系除草剤等、ピリブチカルブ（東ソー等）などのカーバメート系除草剤等、シマジン（チバガイギー，現ノバルティス等）、アトラジン（ガイギー，現ノバルティス等）などのトリアジン系除草剤等、ノルフルラゾン（サントス，現ノバルティス等）などのダイアジン系除草剤等、クロロトルロン（チバ，現ノバルティス等）、メタベンズチアズロン（バイエル等）などの尿素系除草剤等を挙げることができる。
従って、本発明の植物体をこうした外来化合物と直接あるいは間接的に接触させることにより、環境負荷を軽減させたり、該化合物に対する抵抗性を付与させることができる。また、生体内への外来化合物の蓄積や、残留農薬を減らしたりすることができる。
発展途上国等では、適切な水管理の難しい水田地帯が多く、この様な水田では雑草防除が難しい。本発明で作出した薬物代謝能を付与したイネは、除草剤を代謝することにより該除草剤に対する抵抗性を獲得している。この様なイネの栽培は、環境負荷を増大せずに雑草防除を効率化できる。また、同様に直播栽培イネの初期雑草防除にも有効である。
さらに、寄生植物Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ（和名ハマウツボ）やＣｕｓｃｕｔａ（和名ハマネナシカズラ）等は、タバコ、トマト、バレイショ、ヒマワリ、アルファルファ等多くの作物に寄生するが、現在のところこの寄生植物と宿主とを区別できる除草剤はない。これら宿主にＣＹＰ２Ｃ９等のＰ４５０遺伝子を導入することにより、少量の薬剤で寄生植物の防除が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更を行うことができる。
［実施例１］  バイナリープラスミドｐＩＪ２Ｂ６の構築
図１に、構築したバイナリープラスミド、ｐＩＪ２Ｂ６を示した。まず、ｐＵＣＡ２Ｂ６（Ｉｍａｏｋａ，Ｓ．ら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１：１０４１−１０５０）のヒトＣＹＰ２Ｂ６をコードする領域をＸｂａＩとＳａｃＩで切り出し、同様にＸｂａＩとＳａｃＩで消化してイントロンＧＵＳ遺伝子をのぞいたバイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｈｍ（Ｏｈｔａ，Ｓ．ら，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３１：８０５−８１３；名古屋大学の中村研三博士より譲り受けた）へ挿入することにより、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）により発現するｐＩＪ２Ｂ６プラスミドベクターを構築した。
［実施例２］  アグロバクテリウムへのバイナリープラスミドの導入
構築したプラスミド、ｐＩＪ２Ｂ６はＢＴＸ社の２ｍｍ幅のキュベットを用いて１２９Ω、２．５ｋｖｏｌｔｓ、５０μＦの条件で電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００、ＢＴＸ社）を行うことにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄ，Ｅ．Ｅ．ら，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１）に導入した。このバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、および５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＬＢ寒天培地上で選抜した。そこから調製したプラスミドを各種の制限酵素で切断し、その断片長からそれらの存在を確認した。
［実施例３］  イネへの感染
アグロバクテリウムのイネへの感染は１９９４年の樋江井らの方法に基づいて行った（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６：２７１−２８２）。籾をはずし、滅菌したイネ（日本晴）完熟種子を２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ固形培地（Ｔｏｋｉ，Ｓ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１５：１６−２１）上で２〜３週間培養し胚盤由来カルスを得た。このカルスに実施例２に記載の方法で形質転換したアグロバクテリウムを感染させ、２Ｎ６ＡＳ固形培地（Ｔｏｋｉ，Ｓ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１５：１６−２１）上で３日間共存培養した後、カルベニシリンを含む滅菌水で除菌した。これらのカルスは５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＮ６Ｄ固形培地上で２週間選抜培養し、増殖してきたカルスをさらに同様の固形培地上で２週間選抜した後、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＭＳ再分化培地（Ｔｏｋｉ，Ｓ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１５：１６−２１）上で再分化させ、形質転換植物体（Ｒ０）を得た。
［実施例４］  イネ染色体ＤＮＡの調製とサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法による目的遺伝子の確認
イネの葉の染色体ＤＮＡは、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）を用い、ＣＴＡＢ法（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｏ．およびＢｅｎｄｉｃｈ，Ａ．Ｊ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａ６：１−１０）により調製した。約３００ｍｇの葉を乳鉢中で液体窒素で凍結させ、乳棒で粉末状になるまで破砕し、２×ＣＴＡＢ溶液で抽出した粗抽出液をフェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収しＴＥに懸濁した。これらの染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで切断しアガロースゲル電気泳動した後、ナイロンメンブレンに吸着させた。プラスミドｐＩＪ２Ｂ６より目的遺伝子の約６０％を含むＳａｃＩ断片（８６９ｂｐ）を切り出し、これをプローブとして、抽出したイネの染色体ＤＮＡを吸着させたメンブレンとサザンハイブリダイゼーションを行いアマシャム社のＥＣＬ核酸標識検出キットを用いて検出し、イネの染色体中に目的の遺伝子が導入されていることを確認した。
さらに数多くの系統について遺伝子導入を確認するためにイネの葉から簡易法で染色体ＤＮＡを抽出し、ヒトＣＹＰ２Ｂ６に特異的にアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃５分間、９４℃／６３℃／７２℃を１分間、１分間、２分間を３５サイクル）を行い、大部分の組換え植物体の染色体ＤＮＡに目的のＤＮＡが組み込まれたことを確認した。
［実施例５］  イネミクロソーム画分の調製とウエスタンブロットによる目的酵素の発現の確認
組換え植物体当代（Ｒ０）より種子を得、それらを播種しＲ１個体を得た。ＰＣＲ法により目的のＣＹＰ２Ｂ６遺伝子を含むＲ１個体を選抜し、それらの葉よりミクロソーム画分を調製した。イネの葉は液体窒素で凍結させ、乳鉢中で破砕した後、ミクロソーム画分調製用バッファー（Ｓｈｉｏｔａ，Ｎ．ら，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７−２３）を加え、１，０００×ｇ、１０分間の遠心を２回繰り返し、その上清を１００，０００×ｇで１時間遠心して、沈殿をミクロソーム画分とした。この画分を０．１％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて可溶化した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に吸着させた。ニトロセルロース膜を４％乳タンパク質および０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ブロッキング液）中で１時間インキュベーションした後、ブロッキング液で３，０００倍に希釈した抗−ラットＣＹＰ２Ｂ１抗体（Ｇｅｎｔｅｓｔ社）（抗−ラットＣＹＰ２Ｂ１抗体はヒトＣＹＰ２Ｂ６と反応する）と１時間インキュベーションした。ニトロセルロース膜をブロッキング液で３回洗浄した後、ブロッキング液で５，０００倍に希釈したペルオキシダーセ標識抗−ウサギＩｇＧ−抗体と１時間インキュベーションした。ブロッキング液で２回、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、アマシャム社のＥＣＬウェスタンブロッティング検出キットを用い３０分から１時間Ｘ線フィルム上に感光させて目的のタンパク質のバンドを検出した。なおＣＹＰ２Ｂ６タンパクの標準品として、Ｇｅｎｔｅｓｔ社のヒトＣＹＰ２Ｂ６ＷＢ用スタンダードを用いた。その結果、いずれの組換えイネ植物体においても抗−ラットＣＹＰ２Ｂ１抗体と反応する約４８キロダルトンの位置にバンドが検出され、組換えイネ植物体で目的とする酵素が産生され、ミクロソーム画分に局在することが確認された。
［実施例６］  イネＲ１種子による除草剤抵抗性の発芽試験
組換えイネ植物体（Ｒ０個体）を育成し、Ｒ１種子を得た。得られたＲ１種子を、イネ科植物に除草効果を示すメトラクロール、アラクロール、トリフルラリンを含むホルモンフリーのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地上に播種し、発芽時の耐性を調べた。各種除草剤をそれぞれ終濃度で２．５μＭ、２．５μＭ、１５μＭ含む１０ｍｌのＭＳ固形培地に籾をはずして次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌した種子を各々４粒ずつ播種した。およそ４日から７日後に遺伝子を導入していない日本晴の種子では発芽が阻害されシュート、根ともに伸長しなかった。一方、組換えイネ植物体の種子では除草剤を全く含まない培地と同様にシュート、根ともに正常な伸長が見られる個体が分離された。各系統の除草剤耐性の結果を表１および表２に示した。なお、アラクロール、トリフルラリンについては抵抗性を示した分離個体の値のみを記した。
表中の耐性程度（表１）または除草剤耐性（表２）の値は以下の状態を表す：
１；コントロール（日本晴）と同じ
２；やや強い
３；強い
４；除草剤なしの時と同様の成長
0003914388.tif 000002
0003914388.tif 000003
［実施例７］  バイナリープラスミドｐＨＵ２Ｃ９の構築
図２に、構築したバイナリープラスミド、ｐＨＵ２Ｃ９を示した。ＸｂａＩとＳａｃＩで切り出したヒトＣＹＰ２Ｃ９（Ｉｍａｏｋａ，Ｓ．ら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１：１０４１−１０５０）を、同様にＸｂａＩとＳａｃＩで消化したｐＢＩ１２１（東洋紡）由来のバイナリーベクターｐＵＴＲ１２１Ｈへ挿入することにより、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）により発現するｐＨＵ２Ｃ９プラスミドベクターを構築した。
［実施例８］  アグロバクテリウムへのバイナリープラスミドの導入
構築したプラスミド、ｐＨＵ２Ｃ９は凍結−融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株（東洋紡）に導入した。このバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で選抜した。そこから調製したプラスミドを各種の制限酵素で切断し、その断片長からそれらの存在を確認した。
［実施例９］  タバコへの感染
アグロバクテリウムのタバコへの感染はＲｏｇｅｒｓらの方法（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．ら，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４０）に基づき、リーフディスクを用いて行った。１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ再分化培地上で再分化させ、形質転換植物体（Ｒ０）を得た。得られたＲ０植物を５０ｎＭのクロロスルフロンを含むＭＳ培地で生育させ、生育の旺盛な個体を選抜した。
［実施例１０］  タバコ染色体ＤＮＡの調製とサザンハイブリダイゼーション法による目的遺伝子の確認
タバコ葉の染色体ＤＮＡは、実施例４と同様にヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）を用い、ＣＴＡＢ法により調製した。調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断しアガロースゲル電気泳動した後、ナイロンメンブレンに吸着させた。プラスミドｐＨＵ２Ｃ９より目的遺伝子の約６０％を含むＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（８５１ｂｐ）を切り出し、これをプローブとして、抽出したタバコの染色体ＤＮＡを吸着させたメンブレンとサザンハイブリダイゼーションを行いアマシャム社のＥＣＬ核酸標識検出キットを用いて検出し、タバコの染色体中に目的の遺伝子が導入されていることを確認した。
［実施例１１］  タバコ全ＲＮＡの調製とノーザンハイブリダイゼーション法による目的遺伝子のｍＲＮＡの確認
タバコ葉の全ＲＮＡは、ＡＴＡ法（Ｎａｇｙ，Ｆ．ら，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ４：１−２９）により調製した。約１ｇの葉を乳鉢中で液体窒素で凍結させ、乳棒で粉末状になるまで破砕し、ＲＮＡ抽出バッファーで抽出した粗抽出液をフェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収した。２５μｇの全ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動した後、ナイロンメンブレンに吸着させた。プラスミドｐＨＵ２Ｃ９より切り出した２Ｃ９遺伝子のＸｂａＩ−ＳａｃＩ断片をプローブとして、抽出したタバコの全ＲＮＡを吸着させたメンブレンとノーザンハイブリダイゼーションを行いＥＣＬ核酸標識検出キット（アマシャム社）を用いて検出し、タバコの葉で目的の遺伝子のｍＲＮＡが発現されていることを確認した。
［実施例１２］  タバコミクロソーム画分の調製とウェスタンブロットによる目的酵素の発現の確認
サザンブロット分析およびノーザンブロット分析により、目的遺伝子の存在とｍＲＮＡの発現を確認した個体を選抜し、増殖した培養植物体全体を用いてミクロソーム画分を調製した。ミクロソーム画分調製用バッファー中で破砕した後、１，０００×ｇ、１０分間、１０，０００×ｇ、２０分間遠心した後、ＭｇＣｌ２を添加、４，０００×ｇ、２０分間遠心し、ミクロソーム画分を沈殿させた。この画分を抽出バッファー（Ｓｈｉｏｔａ，Ｎ．ら，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７−２３）中でホモジェナイズし、１００，０００×ｇ、６０分間遠心し、懸濁バッファー（Ｓｈｉｏｔａ，Ｎ．ら，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７−２３）に懸濁した。５０μｇのミクロソームタンパクを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に吸着させた。タンパク質の検出はＣＹＰ２Ｃ９のポリクローナル抗体をプローブとし、ＢＣＩＰおよびＮＢＴの発色により行った。その結果、いずれの組換えタバコ植物体においてもＣＹＰ２Ｃ９抗体と反応する約５６キロダルトンの位置にバンドが検出され、組換えタバコ植物体で目的とする酵素が産生され、ミクロソーム画分に局在することが確認された。
［実施例１３］  タバコＲ０植物の除草剤抵抗性検定
腋芽増殖した形質転換タバコおよび非形質転換タバコを、クロロスルフロンを０，２０，５０，１００，２００ｎＭ含むホルモンフリーのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地上に移植し、生育時の耐性を調べた。非形質転換体は５０ｎＭのクロロスルフロンで生育が完全に抑制されたが、形質転換体は、２００ｎＭの濃度でも生育した（表３）。
表中の値は以下の状態を表す：
１；殆ど枯死
２；生育が著しく阻害される
３；やや生育劣る
４；除草剤非散布と同様の生育
0003914388.tif 000004
［実施例１４］  タバコＲ０植物の除草剤代謝
移植３週間後のタバコＲ０植物を用い、Ｓｗｅｅｔｓｅｒら（Ｓｗｅｅｔｓｅｒ，Ｐ．Ｂ．ら，１９８２，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７：１８−２３）の方法により、クロロスルフロンの代謝を測定した。１４Ｃラベルした０．５ｍＭクロロスルフロン２０μｌを葉の表面に塗布した。５０時間後処理葉の表面をアセトンで洗浄した後、アセトン抽出により代謝産物を抽出した。ロータリーエバポレーターで濃縮・乾燥した抽出物をメタノールに溶かし、ベンゼン：アセトン：ギ酸（３０：１０：１）を展開質とした薄層クロマトグラフにより分析した。その結果、形質転換植物では非形質転換植物に比べてクロロスルフロン量は差が無いものの、植物体内での代謝産物と思われるＩＩＩ分画がほとんど無く、展開原点部分に残った水溶性物質が増加していた。
［実施例１５］  バイナリープラスミドｐＵＨＣ１９の構築
図３に、構築したバイナリープラスミドｐＵＨＣ１９を示した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切り出したヒトＣＹＰ２Ｃ１９（住友化学より分譲を受けた）を同時にＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化したｐＵＴＲ１２１Ｈへ挿入することにより、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）により発現するｐＵＨＣ１９プラスミドベクターを構築した。
［実施例１６］  アグロバクテリウムへのバイナリープラスミドの導入
構築したプラスミド、ｐＵＨＣ１９はＢＴＸ社の２ｍｍ幅のキュベットを用いて１２９Ω、２．５ｋｖｏｌｔｓ、５０μＦの条件で電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００、ＢＴＸ社）を行うことにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−１８０）に導入した。このバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で選抜した。そこから調製したプラスミドを各種の制限酵素で切断し、その断片長からそれらの存在を確認した。
［実施例１７］  バレイショへの感染と形質転換体の取得
アグロバクテリウムのバレイショへの感染はＩｓｈｉｇｅらの方法（Ｉｓｈｉｇｅ，Ｔ．ら，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７３：１６７−１７４）に基づき、マイクロチューバディスクを用いて行った。１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む３Ｃ５ＺＲ再分化培地（Ｓｃｅｅｒｍａｎ，Ｓ．およびＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｖ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：１３−１６）上で再分化させ、形質転換植物体を得た。得られた植物より染色体ＤＮＡを抽出し、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９に特異的にアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＣＹＰ２Ｃ１９が染色体中に導入されたバレイショ（メイクイーン）形質転換体を選抜した。
［実施例１８］  バレイショ形質転換体におけるウエスタンブロットによる目的酵素の発現の確認
実施例１７で得られたバレイショ形質転換体より抽出したミクロソームタンパク５０μｇを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲル中のタンパクをＰＶＤＦ膜に吸着させた。タンパク質の検出は、ＣＹＰ２Ｃ１９ポリクローナル抗体をプローブとして行った。その結果、ＣＹＰ２Ｃ１９抗体と反応する約５８キロダルトンの位置にバンドが検出され、バレイショ形質転換体で目的とする酵素が産生され、ミクロソーム画分に局在することが確認された。
［実施例１９］  バレイショ形質転換体の除草剤抵抗性検定
腋芽増殖し、発根させたバレイショ形質転換体および非形質転換体を、野菜用培養土を詰めたポットに鉢上げし、鉢上げ１週間後に除草剤メトラクロール、アセトクロールを各々散布し、枯死程度を測定した。その結果、表４に示すように非形質転換体のメイクイーンに比べ、形質転換体は強い耐性を示した。
表中の値は以下の状態を表す：
１；殆ど枯死
２；生育が著しく阻害される
３；やや生育劣る
４；除草剤非散布と同様の生育
0003914388.tif 000005
［実施例２０］  バレイショ形質転換体の除草剤代謝
腋芽増殖し、約１０ｃｍに伸びたバレイショ形質転換体を用い、１４Ｃラベルしたピリブチカルブを１０μＭ濃度になるよう培地に加え培養した。８日間培養した後、植物体から代謝産物を抽出し（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．ら，１９９７，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ．Ｓｃｉ．，２２：２２２−２２５）、培養液とともに薄層クロマトグラフにより分析（Ｓｈｉｏｔａ，Ｎ．ら，１９９６，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５４：１９０−１９８）した。その結果、植物体および培地中のピリブチカルブ量は非形質転換体のメイクイーンに比べ、形質転換体では明らかに減少していた。
［実施例２１］  バイナリープラスミドｐＩＪ２Ｃ９，ｐＩＪ２Ｃ１８及びｐＩＪ２Ｃ１９の構築、アグロバクテリウムへの導入、およびイネへの感染
図４に、構築したバイナリープラスミド、ｐＩＪ２Ｃ９，ｐＩＪ２Ｃ１８及びｐＩＪ２Ｃ１９を示した。ＸｂａＩとＳａｃＩで切り出したヒトＰ４５０２Ｃ９，ヒトＰ４５０２Ｃ１８或いはヒトＰ４５０２Ｃ１９を、同様にＸｂａＩとＳａｃＩで消化したｐＢＩ１２１由来のバイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｈｍへ挿入することにより、カリフラフーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターにより発現するｐＩＪ２Ｃ９，ｐＩＪ２Ｃ１８及びｐＩＪ２Ｃ１９プラスミドベクターを構築した。
構築したバイナリープラスミド、ｐＩＪ２Ｃ９，ｐＩＪ２Ｃ１８，ｐＩＪ２Ｃ１９は実施例２と同様の方法で、アグロバクテリウムへ導入し、確認した。
実施例３と同様にして、アグロバクテリウムのイネへの感染を行った。
［実施例２２］  ヒトＰ４５０２Ｃ９導入イネＲ１種子による除草剤抵抗性の発芽試験
組換えイネ植物体（Ｒ０個体）を育成し、Ｒ１種子を得た。得られたＲ１種子を、イネ科植物に除草効果を示すクロロスルフロンを含むホルモンフリーのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地上に播種し、発芽時の耐性を調べた。クロロスルフロンを終濃度で２５０ｎＭ含む２ｍｌのＭＳ固形培地に籾をはずして次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌した種子を各々４粒ずつ播種した。およそ４日から７日後に遺伝子を導入していない日本晴の種子では発芽が阻害されシュート、根ともに伸長しなかった。一方、組換えイネ植物体の種子では除草剤を全く含まない培地と同様にシュート、根ともに正常な伸長が見られる個体が分離した。結果を表５に示した。
［実施例２３］  ヒトＰ４５０２Ｃ１８導入イネ及びヒトＰ４５０２Ｃ１９導入イネＲ１種子による除草剤抵抗性の発芽試験
組換えイネ植物体（Ｒ０個体）を育成し、Ｒ１種子を得た。得られたＲ１種子を、イネ科植物に除草効果を示すメトラクロールを含むホルモンフリーのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地上に播種し、発芽時の耐性を調べた。メトラクロールを終濃度で４μＭ含む２ｍｌのＭＳ固形培地に籾をはずして次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌した種子を各々４粒ずつ播種した。およそ４日から７日後に遺伝子を導入していない日本晴の種子では発芽が阻害されシュート、根ともに伸長しなかった。一方、組換えイネ植物体の種子では除草剤を全く含まない培地と同様にシュート、根ともに正常な伸長が見られる個体が分離した。結果を表５に示した。
0003914388.tif 000006
［実施例２４］  ヒトＰ４５０の１１分子種を各々発現した組換え体酵母菌株ミクロソームにおける各種除草剤の代謝
０．１Ｍカリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にヒトＰ４５０の１１分子種を各々発現する各種酵母菌株から調製したミクロソーム画分（住友化学工業（株）から入手）をＰ４５０量が２５ｐｍｏｌになるように添加し、また終濃度０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５ｍＭグルコース６リン酸、１Ｕ／ｍｌグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、０．１ｍＭ下記の各々の除草剤（販売試薬を使用）を添加し、全量を１００μｌとした。反応混液を３７℃、６０分間振盪後、有機溶媒を添加して抽出を行った。抽出液を高速液体クロマトグラフィーに供し、代謝物を測定した。その結果、ヒトＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９は以下の各種除草剤を代謝することが判明した。
ヒトＣＹＰ１Ａ１：アトラジン、クロロトルロン、メタベンズチアズロン、ノルフルラゾン
ヒトＣＹＰ２Ｂ６：アセトクロール、メトラクロール
ヒトＣＹＰ２Ｃ１９：アセトクロール、アトラジン、クロロトルロン、メタベンズチアズロン、メトラクロール、ノルフルラゾン、ピリブチカルブ
［実施例２５］  ヒトＰ４５０分子種発現プラスミド
本実施例で用いた材料は以下のとおりである。ヒトＣＹＰ１Ａ１  ｃＤＮＡは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから既知配列をもとにしたＰＣＲプライマーを合成し、ＰＣＲ法でクローニングし、取得した。ヒトＣＹＰ２Ｂ６  ｃＤＮＡは、実施例１に記載のものを使用した。ヒトＣＹＰ２Ｃ１９  ｃＤＮＡは、実施例１５に記載のものを使用した。抗ヒトＣＹＰ２Ｂ６抗体、抗ヒトＣＹＰ２Ｃ９抗体は住友化学工業株式会社から供与された。抗ラットＣＹＰ１Ａ１抗体は第一化学工業株式会社から購入した。プラスミドＢ１００は農林水産省農林水産技術会議事務局石毛光雄博士より供与された。また、プラスミドｐＢＩ１２１は東洋紡より購入した。制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ライゲーションキット、Ｓａｌ  ＩＤＮＡリンカー、Ｘｈｏ  Ｉ  ＤＮＡリンカー、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、アルカリフォスファターゼは宝酒造より購入した。ＩＳＯＰＬＡＮＴは和光純薬工業株式会社から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔはアマシャム・ファルマシアバイオテック株式会社から購入した。除草剤アセトクロール、アトラジン、クロロトルロン、メタベンズチアズロン、メトラクロール、ノルフルラゾンは林純薬工業株式会社より購入した。除草剤ピリブチカルブは大日本インキ株式会社から供与された。
（１）植物発現ベクターｐＳＮＴＬＸの構築
図５に示すように、Ｂ１００プラスミドとｐＢＩ１２１プラスミドを用いて植物発現ベクターｐＳＮＴＬＸを構築した。このベクターにはＬＢ側にＮＰＴ  ＩＩ発現ユニットを持つことから目的遺伝子導入個体を取得する確率が高く、しかも様々な組み合わせのＰ４５０  ｃＤＮＡを複数種導入することが可能であるマルチクローニングサイトを持っている。以下にその構築の手順を示す。
まず、Ｂ１００ベクターをＥｃｏＲ  Ｉで消化し、その切断部位を自己結合させることによりｐＢＭＣＳを構築した。さらにこのベクターをＳｍａ  Ｉで消化し、そこにｐＢＩ１２１ベクターをＳａｃ  ＩＩとＡｓｅ  Ｉで消化して得られたフラグメントを平滑末端化し、挿入することによりｐＢＮＴＬを得た。ｐＢＮＴＬをＸｂａ  Ｉで消化後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いて平滑末端化処理を行い、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化を行い、Ｓａｌ  Ｉリンカーを挿入し、結合した。このようにして構築したｐＳＮＴＬベクターをＢａｍＨ  Ｉを用いて消化後、同様の方法を用いてＸｈｏ  Ｉリンカーを結合し、ｐＳＮＴＬＸベクターを得た。
（２）ヒトＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、及びＣＹＰ２Ｃ１９の植物発現プラスミドｐＩＫＢＡＣの構築
最初に、図６、７に示す発現プラスミドｐＵＨＡ１、ｐＵＨＢ６をそれぞれ構築した。次いで、図１１に示すプラスミドｐＩＫＢＡＣを構築するためにさらに図８、９、１０に示すｐＳＸＡ１、ｐＳＳＡ１、ｐＸＸＢ６、ｐＳＳＣ１９を構築した。
（２−１）ヒトＣＹＰ１Ａ１発現用プラスミドｐＵＨＡ１の構築
図６に示すように、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化したｐＵＴＲ１２１ＨベクターにｐＢＨ１Ａ１をＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、得られたヒトＣＹＰ１Ａ１ｃＤＮＡを含むフラグメントを挿入し、ｐＵＨ１Ａ１を得た。
（２−２）ヒトＣＹＰ２Ｂ６発現プラスミドｐＵＨＢ６の構築
図７に示すように、Ｘｂａ  ＩとＳａｃ  Ｉで消化したベクターｐＵＴＲ１２１ＨにヒトＣＹＰ２Ｂ６ｃＤＮＡを含むｐＵＣＡ２Ｂ６のＸｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ部分消化フラグメントを挿入し、ｐＵＨＢ６を構築した。
（２−３）ヒトＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９の３種同時発現プラスミドの構築
図８に示すように、ｐＳＸＡ１、ｐＳＳＡ１を構築するために、ｐＵＨＡ１をＡｓｅ  Ｉ処理後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いることにより、切断断面を平滑化し、Ｓａｌ  Ｉリンカーを挿入し結合した。得られたｐＵＨＳＡ１を同様にＤｒａ  ＩＩＩで切断後、Ｘｈｏ  Ｉリンカーを用いて新たな制限酵素切断部位を作製し、ｐＳＸＡ１とした。また、同様にＤｒａ  ＩＩＩ切断後、Ｘｈｏ  Ｉリンカーを用いてｐＳＳＡ１を作製した。
図９に示すように、ｐＸＸＢ６を構築するために、ｐＵＨＢ６をＡｓｅ  Ｉ処理後、平滑末端化し、Ｘｈｏ  Ｉリンカーを挿入し、ｐＵＨＸＢ６を得た。次に、ＣＹＰ２Ｂ６のターミネーター近傍にあるＥｃｏＲ  Ｉで切断するために、ＣＹＰ２Ｂ６ｃＤＮＡ内部のＳａｃ  Ｉサイトで切断し、自己結合した。得られたｐＵＨＸ２をＥｃｏＲ  Ｉで完全消化し、平滑末端化処理後、Ｘｈｏ  Ｉリンカーを結合した。得られたｐＸＸ２２のＸｂａ  ＩとＳａｃ  Ｉサイトで切断し、それにｐＵＣＡ２Ｂ６をＸｂａ  ＩとＳａｃ  Ｉ部分消化断片をライゲーションし、ｐＸＸＢ６を得た。
図１０に示すように、ｐＳＳＣ１９を構築するために、図８で構築したｐＳＳＡ１をＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断したベクター部分に、ｐＹＨＣ１９をＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化したヒトＣＹＰ２Ｃ１９ｃＤＮＡを含むフラグメントを挿入し、ｐＳＳＣ１９を取得した。
（２−４）ｐＩＫＢＡＣの構築
図１１に示すように、Ｓａｌ  ＩとＸｂａ  Ｉで消化した１２ｋｂのベクターｐＳＮＴＬＸと３．２ｋｂのｐＳＸＡ１フラグメントをライゲーションし、ｐＩＫＡ１を得た。Ｓａｌ  Ｉで切断したｐＩＫＡ１とＸｈｏ  Ｉで切断した２．８ｋｂのｐＸＸＢ６フラグメントを同様にライゲーションし、ｐＩＫＢＡ１３を得た。Ｓａｌ  Ｉで切断した３．８ｋｂのｐＳＳＣ１９フラグメントとＸｈｏ  Ｉ処理したｐＩＫＢＡ１３ベクターをライゲーションし、ｐＩＫＢＡＣを得た。
［実施例２６］  植物の形質転換
植物発現プラスミドｐＩＫＢＡＣ、ｐＵＨＡ１、ｐＵＨＢ６、ｐＵＨＣ１９（実施例１５参照）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株にエレクトロポレーション法を用いることによりそれぞれ導入した。
アグロバクテリウムの植物への感染は、無菌培養したバレイショＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎのマイクロチューバーを用いて行った。マイクロチューバーは植物体を光照射下、２０℃において２％シュークロース濃度の液体培地５ｍｌで２週間培養した後、１５％のシュークロース濃度の液体培地６．５ｍｌを添加し、暗下、１８℃で１．５〜２ケ月間培養し、作製した。マイクロチューバーをスライスし、皮をむいてアグロバクテリウム菌液に浸した。ＩＳ１培地上で３日間培養し、その後プラスミドを保持するアグロバクテリウムで感染したマイクロチューバーについて抗生物質カナマイシンとセフォタキシムをそれぞれ１００ｍｇ／ｌ、３００ｍｇ／ｌ含むＩＳ２培地上で２〜３ケ月間培養した。カルスから再生したシュートをカナマイシン、セフォタキシムを１００ｍｇ／ｌ、２００ｍｇ／ｌ含むＩＳ１５培地上に植え継ぎ、発根を確認した。発根した再生植物をカナマイシン耐性個体とした。
［実施例２７］  Ｐ４５０高発現形質転換体の選抜
Ｐ４５０高発現形質転換体の選抜のために薬物代謝型Ｐ４５０の標準基質である７−エトキシクマリンを用いた７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化活性とミクロソーム画分を用いたウエスタンブロット分析を行った。また、導入したＰ４５０遺伝子の発現を確認するために、サザンブロット分析、ノザンブロット分析を行った。
（１）７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化活性による選抜
カナマイシン耐性個体の葉０．１ｇを２０ｍＭの７−エトキシクマリンを１００μｌ含む２％シュークロース含有液体培地５ｍｌで３日間培養した。培養後、０．１Ｍカリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌで葉を磨砕し、その上清にクロロホルムを添加し混合した。クロロホルム層に０．０１Ｎ  ＮａＯＨ／０．１Ｍ  ＮａＣｌを添加し、日立蛍光光度計で励起波長３６６ｎｍ、発光波長４５２ｎｍで測定した。これらの結果、コントロールより高い活性を示した３種Ｐ４５０同時発現個体Ｔ１９７７、Ｔ１９７９を選抜した。また、同様にＣＹＰ１Ａ１発現個体Ｓ１９６５、ＣＹＰ２Ｂ６発現個体Ｓ１９７２をそれぞれ選抜した。
（２）ミクロソーム画分を用いたウエスタンブロット分析による選抜
植物からのミクロソーム画分の調製は塩田らの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０６，１７−２３，１９９４）に準じて行った。２０μｇのミクロソーム画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後ニトロセルロース膜に移した。Ｐ４５０タンパクを特異的に検出するために一次抗体として実施例２５に記載の抗ラットＣＹＰ１Ａ１抗体、抗ヒトＣＹＰ２Ｂ６抗体、抗ヒトＣＹＰ２Ｃ９抗体（抗ヒトＣＹＰ２Ｃ９抗体は、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９と反応する）をそれぞれ用いた。二次抗体にはシグマ社より購入した抗ヤギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ抗体、抗ウサギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ抗体を用いた。
その結果、いずれの抗体を用いた場合においてもヒトＣＹＰ１Ａ１、ヒトＣＹＰ２Ｂ６、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９に相当するタンパク質のバンドを確認した。これらの結果から、植物体内で３種のＰ４５０タンパクが合成されていることが判明した。また、Ｔ１９７７植物体において、より多くのＰ４５０タンパクを蓄積していることから以後の実験に用いた。また、同様にＣＹＰ２Ｃ１９発現個体Ｓ１９７４を選抜した。これらの結果を図１２に示す。
（３）ミクロソーム画分を用いた７−エトキシレゾルフィンＯ−脱エチル化活性の測定
終濃度０．１Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍｇ／ｍｌミクロソーム画分を含む反応液に１０μＭになるように７−エトキシレゾルフィンを添加することにより反応を開始した。３７℃で３０分間インキュベーション後、氷冷アセトンを添加、氷上で１０分間放置した後、その上清を蛍光光度計（励起波長５５０ｎｍ、発光波長５８６ｎｍ）を用いて測定した。
その結果、Ｔ１９７７、Ｓ１９６５はコントロールに比べそれぞれ約２７倍、５３倍高い活性を示した。これはＴ１９７７、Ｓ１９６５においてヒトＣＹＰ１Ａ１が機能的に発現していることを示している。また、一酸化炭素の添加、ＮＡＤＰＨ非添加により活性が阻害されたことからＰ４５０依存性であることが判明した。一方、Ｓ１９７２、Ｓ１９７４において活性の上昇は見られなかった。これらの結果を表６に示す。表中、ａの「ＥＲＯＤ活性」は７−Ｅｔｈｏｘｙｒｅｓｏｌｕｆｉｎ  Ｏ−ｄｅｅｔｈｙｌａｓｅ活性（ｐｍｏｌ／分／ｍｇ  タンパク質）を示し、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。ｂにおいては、一酸化炭素存在下での活性を示す。ｃにおいては、ＮＡＤＰＨ非存在下での活性を示す。ｄは測定していないことを示す。
0003914388.tif 000007
（４）ゲノムＤＮＡを用いたサザンブロット分析
植物からのゲノムＤＮＡの調製はＩＳＯＰＬＡＮＴにより行った。サザンブロット分析は乾らの方法（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４８（２），１３５−１４３，１９９８）に準じて行った。
その結果、Ｔ１９７７のゲノムＤＮＡは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９のすべてのプローブに反応し、バンドが検出されたことからゲノムＤＮＡへのこれら３種のＰ４５０  ｃＤＮＡの挿入が示された。一方、Ｓ１９６５、Ｓ１９７２、Ｓ１９７４についても同様にそれぞれのｃＤＮＡの挿入が確認された。これらの結果を図１３に示す。
（５）ｍＲＮＡを用いたノザンブロット分析
植物からのｍＲＮＡの調製はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより行った。ノーザンブロット分析は乾らの方法（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４８（２），１３５−１４３，１９９８）に準じて行った。
その結果、Ｔ１９７７において３種のＰ４５０  ｍＲＮＡに相当するバンドを検出した。一方、Ｓ１９６５、Ｓ１９７２、Ｓ１９７４についても同様にそれぞれのｍＲＮＡへの転写が確認された。これらの結果を図１４に示す。
［実施例２８］  形質転換体の除草剤耐性試験
無菌的に育成した形質転換体を鉢上げし、１週間順化させ、さらに１週間栽培後、除草剤を散布した。栽培条件は、２０℃、８時間日長で行った。光合成阻害型除草剤アトラジン、クロロトルロン、メタベンズチアズロンをそれぞれ１．２、１７．６、１０μｍｏｌ散布した。タンパク質合成阻害型除草剤アセトクロール、メトラクロールをそれぞれ、２０、３０μｍｏｌ散布した。カロチノイド生合成阻害型除草剤ノルフルラゾンを１２μｍｏｌ散布した。脂質生合成阻害型除草剤ピリブチカルブを培地に２０μＭ添加した。
その結果、Ｔ１９７７はすべての除草剤に対し強い耐性を示した。Ｓ１９６５は、アトラジン、クロロトルロン、メタベンズチアズロン、ノルフルラゾンに対し、Ｓ１９７２はアセトクロール、メトラクロールに対し、Ｓ１９７４は、アセトクロール、アトラジン、メトラクロールに対し強い耐性を示した。これらの結果を図１５、１６、１７、１８に示す。
産業上の利用の可能性
本発明のＰ４５０遺伝子あるいはＰ４５０還元酵素遺伝子との融合酵素遺伝子が導入されたトランスジェニック植物は、除草剤などの農薬を含む薬物の代謝能を有する。このため農業分野において、各種除草剤との組み合わせで除草剤耐性植物として用いれば、農作物の収量の増加を図ることができる。また、除草剤や殺虫剤、殺菌剤等農薬を植物体内において代謝し、無毒化することができるため、それを食べる人間や家畜にとって安全である。さらに、除草剤等農薬やその他土壌に散布された有害物質を吸収し、分解することができるため、極めて環境性にも優れており、ファイトレメディエーション用植物としても有用である。
【図面の簡単な説明】
図１はバイナリープラスミドｐＩＪ２Ｂ６の構築図である。ＮＯＳ：Ｎｏｓプロモーター、ＮＰＴ  ＩＩ：カナマイシン抵抗性遺伝子、ＴＮＯＳ：Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＨＰＴ：ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子。
図２はバイナリープラスミドｐＨＵ２Ｃ９の構築図である。ＮＯＳ：Ｎｏｓプロモーター、ＮＰＴ  ＩＩ：カナマイシン抵抗性遺伝子、ＴＮＯＳ：Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＡＭＶ−ＵＴＲ：アルファルファモザイクウイルス５’非翻訳領域。
図３はバイナリープラスミドｐＵＨＣ１９の構築図である。ＮＯＳ：Ｎｏｓプロモーター、ＮＰＴ  ＩＩ：カナマイシン抵抗性遺伝子、ＴＮＯＳ：Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＡＭＶ−ＵＴＲ：アルファルファモザイクウイルス５’非翻訳領域。
図４はバイナリープラスミドｐＩＪ２Ｃ９、ｐＩＪ２Ｃ１８、ｐＩＪ２Ｃ１９の構築図である。ＮＯＳ：Ｎｏｓプロモーター、ＮＰＴ  ＩＩ：カナマイシン抵抗性遺伝子、ＴＮＯＳ：Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＨＰＴ：ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子。
図５はプラスミドベクターｐＳＮＴＬＸの構築方法を示す図である。図中の符号は、次ぎの通りである。
ｒｂｃＳ−Ｐ：リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットプロモーター
ｂａｒ：ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼのコーディング領域  Ｎｏｓ−Ｔ：ノバリン合成酵素ターミネーター
Ｎｏｓ−Ｐ：ノバリン合成酵素プロモーター
ＮＰＴ  ＩＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩのコーディング領域
ＣａＭＶ  ３５Ｓ−Ｐ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター
ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼのコーディング領域
Ｓ  ＩＩ：制限酵素Ｓａｃ  ＩＩによる切断部位
Ｂｔ：制限酵素ＢｓｔＸ  Ｉによる切断部位
Ｅｇ：制限酵素Ｅａｇ  Ｉによる切断部位
Ｎ：制限酵素Ｎｏｔ  Ｉによる切断部位
Ｘ：制限酵素Ｘｂａ  Ｉによる切断部位
Ｓｅ：制限酵素Ｓｐｅ  Ｉによる切断部位
Ｂ：制限酵素ＢａｍＨ  Ｉによる切断部位
Ｓａ：制限酵素Ｓｍａ  Ｉによる切断部位
Ｐ：制限酵素Ｐｓｔ  Ｉによる切断部位
ＥＩ：制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉによる切断部位
ＥＶ：制限酵素ＥｃｏＲ  Ｖによる切断部位
Ｈ：制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによる切断部位
Ａ：制限酵素Ａｓｅ  Ｉによる切断部位
Ｓｌ：制限酵素Ｓａｌ  Ｉによる切断部位
Ｘｏ：制限酵素Ｘｈｏ  Ｉによる切断部位
図６はヒトＣＹＰ１Ａ１発現プラスミドｐＵＨＡ１の構築方法を示す図である。図中の黒い箱はアルファルファモザイクウイルス５’非翻訳領域、斜線の箱（細い線）はヒトＣＹＰ１Ａ１のコーディング領域を表す。
図７はヒトＣＹＰ２Ｂ６発現プラスミドｐＵＨＢ６の構築方法を示す図である。図中の斜線の箱はヒトＣＹＰ２Ｂ６のコーディング領域を表す。
図８はプラスミドｐＳＸＡ１とｐＳＳＡ１の構築方法を示す図である。図中の「Ｄ  ＩＩＩ」は制限酵素Ｄｒａ  ＩＩＩによる切断部位を表す。
図９はプラスミドｐＸＸＢ６の構築方法を示す図である。
図１０はプラスミドｐＳＳＣ１９の構築方法を示す図である。
図１１はヒトＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、及びＣＹＰ２Ｃ１９発現プラスミドｐＩＫＢＡＣの構築方法を示す図である。
図１２は形質転換体ミクロソーム画分のウエスタンブロット分析を示す。
（Ａ）は抗ヒトＣＹＰ１Ａ１抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。各レーンの試料は以下の通りである。
レーン１；ヒトＣＹＰ１Ａ１を発現した組換え酵母菌株のミクロソーム画分
レーン２；Ｓ１９６５のミクロソーム画分
レーン３；Ｓ１９７２のミクロソーム画分
レーン４；Ｓ１９７４のミクロソーム画分
レーン５；非形質転換体のミクロソーム画分
レーン６；Ｔ１９７９のミクロソーム画分
レーン７；Ｔ１９７７のミクロソーム画分
レーン８；Ｔ１９７８のミクロソーム画分
（Ｂ）抗ヒトＣＹＰ２Ｂ６抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。レーン１はヒトＣＹＰ２Ｂ６を発現した組換え酵母菌株のミクロソーム画分であり、レーン２から８は上記（Ａ）と同じである。
（Ｃ）抗ヒトＣＹＰ２Ｃ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。レーン１はヒトＣＹＰ２Ｃ１９を発現した組換え酵母菌株のミクロソーム画分であり、レーン２から８上記（Ａ）と同じである。
図１３は形質転換体のサザンブロット分析を示す。
（Ａ）はヒトＣＹＰ１Ａ１プローブを用いた。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９６５の結果である。
（Ｂ）はヒトＣＹＰ２Ｂ６プローブを用いた。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９７２の結果である。
（Ｃ）はヒトＣＹＰ２Ｃ１９プローブを用いた。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９７４の結果である。
図１４は形質転換体のノザンブロット分析を示す。
（Ａ）はヒトＣＹＰ１Ａ１プローブを用いた。レーン１は非形質転換体、レーン２はＳ１９６５、レーン３はＳ１９７２、レーン４はＳ１９７４、レーン５はＴ１９７７の結果である。
（Ｂ）はヒトＣＹＰ２Ｂ６プローブを用いた。レーン１から５は（Ａ）と同様である。
（Ｃ）はヒトＣＹＰ２Ｃ１９プローブを用いた。レーン１から５は（Ａ）と同様である。
図１５は形質転換体の光合成阻害型除草剤に対する耐性試験を示す。
（Ａ）は除草剤アトラジン散布試験の結果を示す。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９６５、レーン４はＳ１９７２、レーン５はＳ１９７４の結果である。
（Ｂ）は除草剤クロロトルロン散布試験の結果を示す。レーン１から５は（Ａ）と同様である。
（Ｃ）は除草剤メタベンズチアズロン散布試験の結果を示す。レーン１から５は（Ａ）と同様である。
図１６は形質転換体のタンパク質合成阻害型除草剤に対する耐性試験を示す。
（Ａ）は除草剤アセトクロール散布試験の結果を示す。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９６５、レーン４はＳ１９７２、レーン５はＳ１９７４の結果である。
（Ｂ）は除草剤メトラクロール散布試験の結果を示す。レーン１から５は（Ａ）と同様である。
図１７は形質転換体のカロチノイド生合成阻害型除草剤ノルフルラゾンに対する耐性試験を示す。レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９６５、レーン４はＳ１９７２、レーン５はＳ１９７４の結果である。
図１８は形質転換体の脂質生合成阻害型除草剤ピリブチカルブに対する耐性試験を示す。
（Ａ）：レーン１は非形質転換体、レーン２はＴ１９７７、レーン３はＳ１９６５、レーン４はＳ１９７２、レーン５はＳ１９７４の結果である。
（Ｂ）：レーン１と２の拡大図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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