(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス(Pseudomonas)属細菌のプロトプラストの再生時に、ミクロコッカス(Micrococcus)属、バチルス(Bacillus)属、エシェリヒア(Escherichia)属、又はスポロサルシナ(Sporosarcina)属に属し、プロトプラストの再生率を向上させる微生物を共存させることを特徴とする、シュードモナス属細菌のプロトプラストの再生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞融合による育種などに用いられるプロトプラストの再生率を向上させる微生物、及びこれを用いるプロトプラストの再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロトプラスト(Protoplast)は、細菌、菌類、植物細胞などの細胞壁を酵素処理等によって取り除いた原形質体であり、適当な浸透圧条件下では細胞としての諸活性を維持すると共に、高分子物質や粒子の導入、あるいは細胞融合等の操作が可能であるという優れた特性を有している。このため、プロトプラストは、外来性ＤＮＡの導入による形質転換体の作成や細胞融合による育種、特定の遺伝形質を有する細胞の選別等に広く用いられている。
【０００３】
これらの方法を用いて目的の生物体を得るためには、各種操作を行った後、プロトプラストに細胞壁を再生させる必要がある。プロトプラストの再生には、一般的に浸透圧の調整のために高張培地が用いられ、さらに植物、菌類、細菌などの生物種や株によってそれぞれの最適条件が検討されている。例えば、バチルス属間のプロトプラスト融合[Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 2147-2150, 2151-2155 (1976)]、ストレプトミセス属間のプロトプラスト融合 [J. Gen. Microbiol., 80, 389-400 (1974)]、ストレプトミセス属とノカルジア属間のプロトプラスト融合（特開昭54-14580）、好アルカリ性バチルス属細菌の形質転換法（特開平8-107784）などの中にはそれぞれの微生物のプロトプラストの再生法が記述されている。しかしながら、プロトプラストは一般的に再生率が低く、特にグラム陰性細菌においては外膜を有するためにプロトプラスト化及びその再生が難しい[Cytobios, 76, 91-95 (1993)]。例えば、グラム陰性菌の一種であるプロビデンス属菌のスフェロプラスト（細胞壁が一部残存しているプロトプラスト）の再生率は10％前後という報告がある[J. Gen. Microbiol., 114, 313-322 (1979)]。
【０００４】
プロトプラストの再生率を向上させる手段として、例えば特開平6-217759にはカラジーナン及びポリアミンを含有する固体培地を用いる酵母プロトプラストの再生法が述べられているが、細菌プロトプラストの再生についての記述はない。また、特開平8-56654には疎水化多糖含有培地で培養することにより植物プロトプラストが安定化されることが述べられているが、再生率の向上についての記述はない。一方、大腸菌を長期間培養することによって自然に生じるプロトプラスト様細胞の再生が、グラム陽性細菌サルシナ・ルテア ［Sarcina lutea , 現在名ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）］を添加することによって促進されることが報告されている［Nature, 181,566-567 (1958)］。しかし、その詳細は明らかにされておらず、大腸菌以外の細菌のプロトプラストへの適用やサルシナ（ミクロコッカス）属以外の微生物による促進についての記述はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、プロトプラストを用いる技術においては再生率の低さが１つの障害となっており、微生物、特にグラム陰性細菌のプロトプラスト再生に関しては有効な技術が確立されていない。そこで、本発明の目的は、グラム陰性細菌を含む微生物のプロトプラストの再生率を向上させる技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決する手段としてプロトプラストの再生率を向上させる微生物に着目し、鋭意検討を重ねた結果、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、スポロサルシナ属に属する微生物が、細菌プロトプラストの再生率を向上させることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、あるいはスポロサルシナ属に属し、プロトプラストの再生率を向上させる微生物を、シュードモナス属細菌のプロトプラストの再生時、共存させることを特徴とするプロトプラストの再生方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、スポロサルシナ属に属し、プロトプラストの再生時に共存させることによってその再生率を向上させることができるものであればいずれでもよく、このような微生物は保存菌株の中から選択することができ、また自然界から新たに分離することもできる。本発明のミクロコッカス属に属する微生物としては、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus) IFO 3763, IFO 13867, IAM 1099 、ミクロコッカス・ピロゲネス(Micrococcus pyrogenes) IFO 3340、ミクロコッカス・バリアンス(Micrococcus varians) IFO 3765 を挙げることができる。バチルス属に属する微生物としては、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis) IFO 3026、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) IAM 1166、バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus) IFO 3525 を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) IFO 3208 を挙げることができる。スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサルシナ・ウレアエ(Sporosarcina ureae) SCRC-R04 (FERM P-8178) を挙げることができる。これらの菌株は、それぞれの番号のもとに菌株保存施設で保存されており、各々の施設より自由に入手することができる。
【０００８】
この発明が対象とするプロトプラストは、細菌や菌類、あるいは植物細胞のプロトプラストであるが、これにはスフェロプラストやプロトプラスト様細胞も包含される。その調製は公知の方法に従って行うことができる。例えば細菌のプロトプラストを調製する場合には、まず一般的な細菌用培地（普通栄養培地、ＬＢ培地など）に該細菌を接種して培養し、菌体を得る。次いでこの菌体を、浸透圧を調整する物質（スクロース、ソルビトールなど）を含む高張緩衝液に懸濁し、細胞壁分解酵素（リゾチームなど）を作用させて細胞壁を除去する。このようにして調製したプロトプラストは細胞融合などの処理を行ったあと、同じく公知の方法で再生させるが、その再生用培地に本発明の再生率を向上させる微生物を添加することにより、再生率を向上させることができる。
【０００９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
【００１１】
実施例１.  各種菌株の菌体添加によるシュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラスト再生率の向上
（１）プロトプラストの調製
LB平板培地（酵母エキス0.5％、トリプトン1％、食塩1％、寒天2％、pH7）にシュードモナス・プチダ PpG7 株を塗布し、30℃で24時間培養した。一白金耳分の菌体をLB液体培地（酵母エキス0.5％、トリプトン1％、食塩1％、pH7）5mlに接種し、30℃で振盪培養した。11時間後、培養液10μlをLB液体培地50mlが入った三角フラスコに接種し、25℃で12時間振盪培養した。培養液の濁度 (OD610) は6.22であった。この培養液から9.6mlを採取して遠心分離により菌体を集め、これをプロトプラスト調製用緩衝液［ビシン｛N,N-ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン｝30mM、ショ糖20％、エチレンジアミン２酢酸ナトリウム3mM、塩化カリウム33mM、pH7］10mlに懸濁した。これに最終濃度が0.5mg/mlとなるようにリゾチームを加え、4℃で30分間、60往復／分で振盪したのち、25℃で7時間静置した。
【００１２】
（２）プロトプラスト再生率を向上させる微生物菌体の調製
プロトプラスト再生率を向上させる微生物菌体の調製は次のようにして行った。すなわち、LB液体培地10mlに微生物を接種し、30℃で24〜48時間振盪培養した。培養液の濁度(OD610) を表１に示す。
【００１３】
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【００１４】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、1mlのLB液体培地に懸濁して菌体サンプルとした。
【００１５】
（３）プロトプラスト再生率の測定
（１）で調製したプロトプラスト懸濁液の細胞濃度を、検鏡により細菌用計算盤を用いて算出し、プロトプラスト調製用緩衝液で希釈して、細胞濃度を1.25×105個／mlに調製した。この希釈液100μlと、（２）で調製した菌体サンプル250μl、LB液体培地150μlを混合し、そのうちの100μlずつを再生用プレート（LB平板培地にショ糖5％、塩化マグネシウム10mM、塩化カルシウム10mMを添加した培地）４枚に塗布して、23℃で培養した。なお、この再生用プレートには菌体サンプルの増殖を抑えるため、アンピシリン 50μg/mlを添加した。シュードモナス・プチダ PpG7 株は、この濃度のアンピシリンに対して耐性である。４日後、再生用プレート上に出現したコロニーの数を測定し、再生率を算出した。再生率は出現コロニー数÷播種した細胞数×100で算出される。各種菌株の菌体サンプルを添加した時の再生率を図１に示す。いずれの菌株においても、コントロールのサンプル無添加に比べて明らかな再生率の向上がみられた。
【００１６】
実施例２.  ミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株の、プロトプラスト再生率向上活性と菌体濃度との関係
LB液体培地5mlにミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株を接種し、25℃で48時間振盪培養した後、全量をLB液体培地100mlに接種して、25℃で24時間振盪培養した。培養液の濁度(OD610)は10.98であった。この培養液から遠心分離により菌体を集め、LB液体培地10mlに懸濁した。この菌体サンプルをLB液体培地で10倍、100倍、1000倍、10000倍に希釈したものを用い、実施例１の（３）の方法に従って活性試験を行った。その結果を図２に示す。菌体濃度とプロトプラスト再生率には相関関係がみられ、菌体濃度が低くなるほど活性は低下したが、1000倍希釈液を用いた場合でも、対照（菌体無添加）に比べて約1.33倍の再生率を示した。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、再生率の低いプロトプラストを高頻度に再生することができ、これによって例えば細胞工学やバイオテクノロジー分野におけるプロトプラストを用いる技術の有用性を高めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラストの再生率と、これに各種菌株の菌体を添加した時の再生率を示す。
【図２】 シュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラストの再生率と、これにミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株の各希釈段階の菌体を添加した時の再生率を示す。
【図１】
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【図２】
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