(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ１２、またはメチルコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよび補酵素型ビタミンＢ１２から選択されるビタミンＢ１２誘導体を含有する水溶液に、晶析で回収しようとするビタミンＢ１２またはビタミンＢ１２誘導体よりも水に対する溶解度が高い水溶性のイオン性化合物を添加した後、晶析することを特徴とするビタミンＢ１２またはビタミンＢ１２誘導体の精製方法。
【請求項２】
水溶性のイオン性化合物が、ギ酸、シュウ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、フマル酸、オキサミン酸、グルコン酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ジエチルバルビツル酸、乳酸、酪酸、ケイ皮酸、グリシン、グリオキシル酸、ジメチルグリシンおよびエチレンジアミン四酢酸から選択される有機化合物のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩あるいはマグネシウム塩、ＡｇＦ、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３、Ａｌ（ＮＯ３）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、ＢａＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＣｌＯ４）２、Ｃａ（ＮＯ２）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２、Ｃｏ（ＣｌＯ３）２、Ｃｏ（ＣｌＯ４）２、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｃｒ（ＮＯ３）３、Ｃｒ（ＮＯ３）３、ＣｒＯ３、ＣｓＣｌ、Ｃｓ２ＳＯ４、ＣｕＢｒ２、ＣｕＣｌ２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＢｒ２、ＦｅＣｌ３、ＫＣｌＯ４、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＣｌ、Ｋ２ＣｒＯ４、ＫＦ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＩ、ＫＮＯ３、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＳＯ３、ＬｉＢｒ、ＬｉＣｌ、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＣｌＯ３）２、Ｍｇ（ＣｌＯ４）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ＮＨ４Ｂｒ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４Ｆ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＢｒ、ＮａＢｒＯ３、ＮａＣｌ、ＮａＣｌＯ、ＮａＣｌＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＮＯ２、ＮａＮＯ３、ＮａＯＨ、ＮｉＢｒ、ＮｉＣｌ２、ＮｉＳＯ４、ＳｂＣｌ３、ＳｅＯ２、ＳｒＢｒ２、ＳｒＣｌ２、ＺｎＢｒ２、ＺｎＣｌ２、Ｚｎ（ＣｌＯ３）２、Ｚｎ（ＮＯ３）２およびＺｎＳＯ４から選択される１種または２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
ビタミンＢ１２またはビタミンＢ１２誘導体を含有する水溶液に対する水溶性のイオン性化合物の添加量が、１０〜８０重量％であることを特徴とする請求項１または２に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＢ12やその誘導体は、近年合成または抽出により多量に製造され市販されているが、各種の方法で製造された粗製のビタミンＢ12やメチルコバラミン、ヒドロキソコバラミン、補酵素型ビタミンＢ12等のビタミンＢ12誘導体を精製するに際しては、最終工程として一般に再結晶法が採用されている。
再結晶を行う場合、ビタミンＢ12やその誘導体は、水への溶解度が非常に大きいため、純水を溶媒に使用した冷却晶析法を採用すると、回収率が低下し、製造コストが高くなるという問題がある。
熱を加えて濃縮率を上げ、水単独溶媒から晶析することも理論的には可能であるが、実際には、濃縮後半の高濃度雰囲気下では加熱による分解が生じたり、あるいは水溶液の粘度が上がりすぎて晶析槽への仕込みおよび濾過操作が煩雑になるといった問題がある。
そのため、通常は水とメタノール、アセトン、ジオキサンといったような水溶性有機溶媒を併用した冷却晶析あるいは再沈殿が行われているのが現状である。例えば、メタノールを使う方法は、特公昭４６−８８６２号公報、特公昭４６−４３３８９号公報などに、アセトンを使う方法は、特公昭４５−３８０５９号公報、特公昭４６−１４６６４号公報、特公昭４７−３４７２０号公報、特公昭５０−３８１２０号公報、特公昭５１−１２０号公報、特開昭６４−１６５９７号公報などに開示されている。
しかし、有機溶媒を併用した場合には、得られた結晶中に有機溶媒が混入し、これが人体に悪影響を与える懸念がある。こうしたことから、結晶から有機溶媒を除去する方法等も提案されている。例えば、特開昭４９−１８８９６公報には、水蒸気を飽和させた密閉容器中にアセトンを含有する補酵素型ビタミンＢ12の結晶を入れ、室温または加熱しながら数時間〜数日間放置したり、あるいは水蒸気飽和の空気を通風することによりアセトン含有量を０．１％に低減させる方法が記載されている。
しかしながら、そのような手段を採っても、結晶に含まれる有機溶媒を完全に除去することは実際上不可能であり、コスト的にも割高になってしまうのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは上記した従来技術の実状に鑑みて、有機溶剤を全く使用することなく、溶剤に水だけを使い、かつ、回収率の高いビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体の精製方法を開発すべく鋭意検討した結果、遂に本発明を完成させた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る精製方法は、ビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体を含有する水溶液に、水溶性のイオン性化合物を添加した後、晶析することを特徴とする。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明の方法で精製されるビタミンＢ12、すなわち、シアノコバラミンは、通常、補酵素型ビタミンＢ12生産菌を用いて発酵により生産された補酵素型ビタミンＢ12をシアン化処理することにより得られるが、本発明の方法はこれ以外の方法で得られたビタミンＢ12の精製にももちろん適用可能である。
本発明で言うビタミンＢ12誘導体には、メチルコバラミン、ヒドロキソコバラミン、補酵素型ビタミンＢ12等が含まれる。
補酵素型ビタミンＢ12は、工業的には、通常シアノコバラミンまたはヒドロキソコバラミンを原料にして化学的に製造される。シアノコバラミンを原料にする場合には、５'−トシルアデノシンと反応させて合成する方法がある（特公昭４５−３８０５９号公報、特公昭５２−２４０４０号公報参照）。また、ヒドロキソコバラミンを原料にする場合には、５'−デオキシ−５'−ハロゲノアデノシンと反応させて合成する方法(特公昭４５−６２７３号公報、特公昭４６−２９１５４号公報参照)や、５'−トシルアデノシンと反応させて合成する（特公昭５２−２４０４０号公報参照）がある。
ヒドロキソコバラミンは、工業的には、シアノコバラミンを原料にして化学的に合成するか、発酵液から直接製造される。シアノコバラミンを原料にする場合には、亜鉛と接触させる方法(特公昭３９−１８４１８号公報、特公昭４６−１４６６４号公報)と、Pd触媒と接触させる方法がある。また、発酵液から直接製造方法は、特開平５−８６０８９号公報に記載されている。
メチルコバラミンの製造方法としては、特開昭４７−３４７２０号公報、特開昭５７−２７１１９号公報に記載されているように、シアノコバラミンを原料にするか、特開昭４７−３４７２０号公報、特開昭５０−３８１２０号公報、特開昭５１−１２０号公報に記載されているように、ヒドロキソコバラミンを原料にして、亜鉛等の還元剤とCH3MgBr、あるいはシュウ酸モノメチルエステルを反応させて化学的に合成する方法が例示できる。
【０００６】
本発明の精製方法を実施するに際し、ビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体を含有する水溶液が有機溶媒を含む場合には、蒸留や膜分離などの手段で、あらかじめ水溶液中の有機溶媒含有量を１０００ｐｐｍ以下に減少させておくことが好ましい。また、水溶液中に含まれるビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体の濃度が著しく低い場合には、濃縮しておくことも好ましく採用される。水溶液中に含まれるビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体の量は、水溶液１リットル当たり、通常は１０〜５００ｇ、好ましくは５０〜３００ｇの範囲に調整される。
本発明によれば、ビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体を含有する水溶液は、通常４０〜９０℃、好ましくは、５０〜８０℃に加温され、これに水溶性のイオン性化合物が添加される。水溶性イオン性化合物の添加量は、特に限定されないが、ビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体を含有する水溶液に対して、通常１０〜８０重量％、好ましくは２０〜７０重量％の範囲で選択される。水溶性イオン性化合物の添加量を選定するに際しては、晶析で最終的に到達する最低温度でも添加したイオン性化合物が析出しない量を、予め見積もっておくことが好ましい。
また、イオン性化合物を添加した後に水溶液が強アルカリ性になっている場合には、塩酸、硫酸、酢酸、シュウ酸、ギ酸等の酸類を添加して水溶液を中性付近に維持することが好ましい。
【０００７】
本発明で用いられる水溶性のイオン性化合物としては、イオン性有機化合物および／またはイオン性無機化合物が挙げられる。
これらの水溶性のイオン性化合物は、晶析で回収しようとするビタミンＢ12および／またはその誘導体よりも、水に対する溶解度または分散性が高かく、結晶性が乏しければ、特に制限はないが、通常は１００℃以下でそれ自身が分解や重合等の変性を起こさず、かつ、ビタミンＢ12またはその誘導体との反応性を持たないものが好ましい。
イオン性有機化合物としては、例えば、ギ酸、シュウ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、フマル酸、オキサミン酸、グルコン酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ジエチルバルビツル酸、乳酸、酪酸、ケイ皮酸、グリシン、グリオキシル酸、ジメチルグリシン、エチレンジアミン四酢酸等のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩あるいはマグネシウム塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、イオン性無機化合物としては、例えば、AgF, AgNO3, AlCl3, Al(NO3)3, Al2(SO4)3, BaCl2, CaCl2, Ca(ClO4)2, Ca(NO2)2, Ca(NO3)2, CdCl2, CoCl2, Co(ClO3)2, Co(ClO4)2, Co(NO3)2, Cr(NO3)3, Cr(NO3)3, CrO3, CsCl, Cs2SO4, CuBr2, CuCl2, Cu(NO3)2, FeCl2, FeBr2, FeCl3, KClO4, KBr, K2CO3, KCl, K2CrO4, KF, K2HPO4, KI, KNO3, K3PO4, K2SO3, LiBr, LiCl, MgBr2, Mg(ClO3)2, Mg(ClO4)2, Mg(NO3)2, MgSO4, NH4Br, NH4Cl, NH4F, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO3, (NH4)2SO4, NaBr, NaBrO3, NaCl, NaClO, NaClO4, NaH2PO4, NaNO2, NaNO3, NaOH, NiBr, NiCl2, NiSO4, SbCl3, SeO2, SrBr2, SrCl2, ZnBr2, ZnCl2, Zn(ClO3)2, Zn(NO3)2, ZnSO4等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
必要に応じてこれらのイオン性有機化合物または無機化合物を２種類以上混合して使用してもよい。
【０００８】
イオン性化合物が添加された溶液は、次に、液温を通常０〜３０℃、好ましくは５〜２５℃の範囲に徐々に冷却され、これによってビタミンＢ12および／またはビタミンＢ12誘導体が晶析する。
なお、結晶の粒径を揃えるために晶析前に種晶を溶液に添加しておいてもよい。
冷却によって析出した結晶は吸引濾過し、結晶の周りに付着している水が乾燥しないうちに、すみやかに冷水で洗浄するのが好ましい。洗浄した結晶は通常減圧乾燥して製品化する。
このようにして精製したビタミンＢ12またはその誘導体は、結晶中に有機溶媒を全く含まず、しかも水を単独溶媒に使用する方法と比べて著しくビタミンＢ12またはその誘導体の回収率を向上させることができるので、本発明の工業的な価値は極めて高い。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を述べるが、本発明はこれらに制限されるものではない。
実施例１
ビタミンＢ12を１５．５ｇ含む水溶液９３０mlを加熱して６０℃に昇温したあと、攪拌しながらゆっくりフタル酸ナトリウム０．５水和物７４０ｇを加えた。そのまま攪拌を続けながら、１Ｎ塩酸水溶液を添加してpH７に調整した。攪拌しながら１０時間かけて６０℃から１０℃まで冷却し、さらに１０℃で３時間放置した。析出した結晶を１０ミクロンメッシュフィルターを使って吸引濾過したあと、直ちに８℃冷水３０ｍｌで洗浄し、４０℃で１０時間減圧乾燥した。回収率は８９％であった。日本薬局方に基づいて製品純度を求めた結果、９７％で合格品であった。
比較例１
フタル酸ナトリウムと１Ｎ塩酸水溶液の添加を省略した以外は実施例１と同様にしてビタミンＢ12の回収を行った。その結果、回収率が３６％にとどまった。
実施例２
補酵素型ビタミンＢ12を１３．０ｇ含む水溶液６２０mlを加熱して６０℃に昇温したあと、攪拌しながらゆっくり酢酸ナトリウム３水和物５４０ｇを加えた。そのまま攪拌を続けながら、酢酸を添加してpH７に調整した。攪拌しながら１０時間かけて６０℃から１０℃まで冷却し、さらに１０℃で３時間放置した。析出した結晶を１０ミクロンメッシュフィルターを使って吸引ろ過したあと、直ちに８℃冷水３０ｍｌで洗浄し、４０℃で１０時間減圧乾燥した。回収率は７３％であった。シアン化して製品純度を求めた結果、９６％であった。
比較例２
酢酸ナトリウムと酢酸の添加を省略した以外は実施例２と同様にして補酵素型ビタミンＢ12の回収を行った。その結果、回収率は２５％にとどまった。
実施例３
ヒドロキソコバラミン１２．５ｇ含む水溶液３１０mlを加熱して６０℃に昇温したあと、攪拌しながらゆっくり塩化ナトリウム７５ｇを加えた。そのまま攪拌を続けながら、酢酸を添加してpH６に調整した。攪拌しながら１０時間かけて６０℃から１０℃まで冷却し、さらに１０℃で３時間放置した。析出した結晶を１０ミクロンメッシュフィルターを使って吸引濾過したあと、直ちに８℃冷水３０ｍｌで洗浄し、４０℃で１０時間減圧乾燥した。回収率は７１％であった。日本薬局方に基づいて酢酸定性試験を行った結果、酢酸の存在が確認され、さらに同方法に基づいて製品純度を求めた結果、９８％で合格品であった。
比較例３
塩化ナトリウムの添加を省略した以外は実施例３と同様にしてヒドロキソコバラミンの回収を行ったところ、結晶は全く回収されなかった。
実施例４
メチルコバラミン１１．０ｇ含む水溶液６９０mlを加熱して６０℃に昇温したあと、攪拌しながらゆっくり酪酸カルシウム１水和物１２２ｇを加えた。攪拌しながら１０時間かけて６０℃から１０℃まで冷却し、さらに１０℃で３時間放置した。析出した結晶を１０ミクロンメッシュフィルターを使って吸引濾過したあと、直ちに８℃冷水３０ｍｌで洗浄し、４０℃で１０時間減圧乾燥した。回収率は９１％であった。シアン化して製品純度を求めた結果、９７％であった。
比較例４
酪酸カルシウムの添加を省略した以外は実施例４と同様にしてメチルコバラミンの回収を行った。その結果、回収率は４１％にとどまった。
【００１０】
【発明の効果】
本発明の精製方法により精製されたビタミンＢ12および／またはその誘導体は、結晶中に有機溶媒を全く含まない。また、本発明の精製方法は、水のみを溶媒に使用する従来法に比較して、ビタミンＢ12および／またはその誘導体の回収率が著しく高い。