(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のアミノ酸配列のN末端に、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−リンカーを介して一つのパルミトイル部分を結合させてなる、リポペプチドＣＬＰ−１７５。
【請求項２】
配列番号９のアミノ酸配列のN末端に、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−リンカーを介して一つのコレステロール部分を結合させてなる、リポペプチドＣＬＰ−１７６。
【請求項３】
宿主においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生起する際の医薬としての用途に利用可能な請求項１または２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
宿主においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生起する用途の医薬の製造において、
該医薬に含有される成分として、
宿主の免疫系において、Ｔヘルパー細胞の活性化を引き起こす、ＨＬＡクラスＩＩ結合ヘルパーＴエピトープを含んでなるペプチドである、Ｂ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原由来の配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチドＣＬＰ−２４３と組み合わせて、
細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子として、請求項１に記載のリポペプチドＣＬＰ−１７５または請求項２に記載のリポペプチドＣＬＰ−１７６を使用する
ことを特徴とする請求項１または２に記載のリポペプチドを使用する方法。
【請求項５】
宿主においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生起する用途の医薬の製造において、
該医薬に含有される成分として、
宿主の免疫系において、Ｔヘルパー細胞の活性化を引き起こす、ＨＬＡクラスＩＩ結合ヘルパーＴエピトープを含んでなるペプチドである、Ｂ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原由来の配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチドＣＬＰ−２４３と組み合わせて、
細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子として、請求項１に記載のリポペプチドＣＬＰ−１７５または請求項２に記載のリポペプチドＣＬＰ−１７６を使用する方法であって、
該医薬を使用する、該宿主におけるＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の生起は、
前記ペプチドＣＬＰ−２４３を投与して、宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺激することと、
続いて、宿主に、前記リポペプチドＣＬＰ−１７５またはリポペプチドＣＬＰ−１７６と、前記ペプチドＣＬＰ−２４３との混合物を投与して、宿主でＨＩＶ特異的なＴ細胞応答を生起することによりなされ、
該医薬は、
前記宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺激する過程において使用される、前記ペプチドＣＬＰ−２４３を含有する第一の医薬と、
前記宿主でＨＩＶ特異的なＴ細胞応答を生起する過程において使用される、前記リポペプチドＣＬＰ−１７５またはリポペプチドＣＬＰ−１７６と、前記ペプチドＣＬＰ−２４３との混合物を含有する第二の医薬とで構成される
ことを特徴とする請求項１または２に記載のリポペプチドの使用方法。
【請求項６】
前記宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺激する過程において使用される、前記ペプチドＣＬＰ−２４３は、アジュバントと共に投与される
ことを特徴とする請求項５に記載の使用方法。
【請求項７】
前記混合物は、アジュバントと共に投与される
ことを特徴とする請求項５または６に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫学に関し、詳細には、宿主においてＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を生起することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染の究極的な結果である疾患である。現在、人類をＨＩＶ感染から防護できる有効なワクチンはなく、したがって、有効なＨＩＶワクチンおよびＨＩＶワクチンを投与するプロトコールの開発が緊急に必要とされている。これまで、化学的処理により徹底的に不活化されたＨＩＶ−１粒子、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質全体（ｇｐ１６０）をコードするワクシニアベクターおよび精製した組換えｇｐ１２０がＨＩＶワクチンの候補として評価されてきた。不活化ＨＩＶ−１ウィルス製剤はヒトでＴ細胞を介した遅延型過敏症（ＤＴＨ）を引き起こし、ワクシニア／ｇｐ１６０およびｇｐ１２０組換えワクチン候補物質はウィルス中和抗体を誘導したが、これらの免疫原のいずれも有効なヒトＨＩＶワクチンであることは示されていない。本発明者らのＨＩＶワクチンにおける関心事は、合成ＨＩＶ−１ペプチドワクチンを開発することにあり、その単独使用または他のＨＩＶ−１ワクチン候補物質との併用により、ＨＩＶ−１に対しより有効な免疫応答を誘起できると考えている。
【０００３】
本発明者らは、許可された米国特許第５８１７３１８号（欧州特許第４７０９８０号）および同第５６３９８５４号において、特に、ＨＩＶ−１のコアタンパク質のＴ細胞エピトープ、ｐ２４Ｅ、の同定および特性付け、ならびにＨＩＶ−１のエンベロープまたはコアタンパク質の様々なＢ細胞エピトープのアミノ酸配列と連結したｐ２４Ｅを含む免疫原性の合成キメラペプチドの構築へのその利用について既に記載しており、それらの開示は参照として本明細書に組み込むものとする。
【０００４】
現在の努力は、細胞性免疫（ＣＭＩ）を誘発することができるＨＩＶワクチンならびにその利用のためのプロトコールのデザインに向けられている。この観点で、本発明者らは、カルボキシ末端部分はヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）モチーフに富むことから、ＨＩＶウィルスの生活環の初期に発現されるウィルス・タンパク質Ｒｅｖに着目した。従って、Ｒｅｖタンパク質を含む適切に構築されたワクチンを用いた免疫により生成されるペプチドは、主要組織抗原複合体（ＭＨＣ）クラス１分子の一部として提示され、早期にウィルスに感染した細胞を殺すことができるＣＴＬエフェクター応答を誘導し、ウィルスの蔓延を制限することができる。しかし、ここに提供する免疫プロトコールは、他のＨＩＶタンパク質由来のペプチドを含むＴ細胞エピトープにも適用できる。
【０００５】
（発明の概要）
本発明の１つの形態において、宿主でＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生起する方法であって、
宿主にヘルパーＴ分子を投与して、宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺激することと、
続いて、宿主に、前記ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物を投与して、宿主でＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を生起することと
を含む方法を提供する。
【０００６】
したがって、ヒト宿主とすることができる宿主の免疫系を任意の簡便なヘルパーＴ分子で予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子をＴ細胞誘導性分子と共に投与する。このようにして、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を得る。
【０００７】
ヘルパーＴ分子は、Ｔ細胞ヒトＤＰ、ＤＲ、ＤＱ特異的Ｔ細胞エピトープを含む、免疫系でこのようなＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供することがよく知られている物質のいずれでもよい。本明細書に記載の実験でヘルパーＴ分子として使用する物質は、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）として同定される、Ｂ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原の一部に対応するペプチドである。所望であれば、ヘルパーＴ分子はアジュバントと共に投与することができる。
【０００８】
Ｔ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子は一般に、ＨＩＶ−１抗原の一部に対応し、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有するペプチドを含む。特に、ペプチドは、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質の配列、特に、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ（ＣＬＰ−１６４）のアミノ酸５２から１１６（配列番号９）（表２）に対応することができる。Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸配列はＬＡＩ分離株のアミノ酸配列である。本発明は、一次分離株を含む他のＨＩＶ−１分離株からのＲｅｖタンパク質からの対応のペプチド配列の使用も含む。
【０００９】
本明細書に記載の実験では、ペプチドは、リポペプチドの形で提供されたとき、特に脂質がパルミトイルまたはコレステロールであるときに、本明細書に記載のプロトコールで有効であった。本発明に使用する２つの特定のリポペプチドは、ＣＬＰ−１６４のそれぞれパルミトイルおよびコレステロール誘導体であるＣＬＰ−１７５およびＣＬＰ−１７６である。
【００１０】
ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物は適切なアジュバントと共に投与することができる。
【００１１】
本発明はさらに、別の形態で、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質由来のある種の新規なペプチドも提供する。したがって、本発明のこの形態では、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質の配列のアミノ酸５２〜１１６（配列番号９）に対応するアミノ酸配列を有し、アミノ酸６５〜７５（配列番号３）、７８〜８７（配列番号５）および１０２〜１１０（配列番号８）（表１）内にＴ細胞エピトープを含むペプチドが提供される。このようなペプチドは、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６を含むリポペプチドの形態で提供することができる。配列番号９を有するペプチドの具体的なアミノ酸配列はＨＩＶ−１のＬＡＩ分離株のものである。一次分離株を含む、他のＨＩＶ−１分離株に由来するＲｅｖタンパク質の対応のペプチド配列および対応のＴ細胞エピトープの利用も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
本発明の利点には、
宿主でＴ細胞応答を誘導するための免疫手順、
このような手順に使用する免疫原性ペプチド
を含む。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖタンパク質のＣＬＰ−１７７（配列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番号８）と表す２つのナノマーペプチド、ＣＬＰ−１７８（配列番号３）と表すヘキサマー、ＣＬＰ−１８２（配列番号７）と表す１２マー（各ペプチドのアミノ酸配列は表１に示す）はそれぞれ、白人で見られる主要なＨＬＡクラス１サブタイプである、膜結合型ヒト主要組織適合性複合体（ＨＬＡ）クラス１分子であるＨＬＡ−Ａ２に結合し、これを安定化させることができることを発見した。本発明者らはまた、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸残基５２から１１６を含み、ＫＳＳリンカーを介してそのアミノ（Ｎ）末端に１つのコレステロールまたはパルミトイル部分を結合させて、それぞれリポペプチド、ＣＬＰ−１７６およびＣＬＰ−１７５を形成するよう構築した長鎖ペプチド（配列番号９）は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェックマウスでＣＴＬおよび抗体応答を誘発できることを発見した。
【００１４】
本明細書に提供された実験をベースとして、本発明により、最初にヘルパーＴ分子を投与して、宿主の免疫系を予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子とＨＩＶ抗原の一部に対応するＴ細胞エピトープ含有ペプチドの混合物を投与することにより、宿主でＨＩＶ特的な胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための新規な免疫プロトコールが提供される。
【００１５】
本明細書では、ヘルパーＴ分子として、Ｂ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原の一部に対応するペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、免疫系でＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供するものなどの他のヘルパーＴ分子も使用できる。
【００１６】
本明細書では、ＨＩＶ  Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドとして、Ｒｅｖタンパク質由来のある種のリポペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、任意の他のＨＩＶタンパク質由来のペプチドを含有するＨＩＶ  Ｔ細胞エピトープも使用することができる。
【００１７】
最近、一次配列に基づいてヒトＣＴＬ抗原決定基を予想するために１つのモデルが使用されている（参考文献１から３参照のこと。本明細書を通じ、本発明が属する技術分野の状況をより完全に記述するためにカッコ内に様々な参考文献を引用する。各引用文献についての完全な書誌的情報は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直後に示す。これらの参考文献の開示は参照して本明細書の開示に含むものとする）。ＨＬＡ−Ａ２などのヒトＭＨＣクラス１分子のペプチド結合グルーブに最も好ましく結合し、収まりやすいＣＴＬエピトープは一般に９アミノ酸長であることが提案されている。しかし、ＨＬＡクラス１分子と相互作用できる８から１３個のアミノ酸を含むペプチドも報告されている。多くの場合、これらのペプチドは２位にロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）残基を含み、カルボキシ末端にＬまたはバリン（Ｖ）を含むことが知られている。
【００１８】
ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖタンパク質の潜在的なＣＴＬ含有モチーフの部位は、報告されたペプチド結合モチーフアルゴリズムで予想してきた。表１は、このように予想したペプチドのアミノ酸配列を示している（配列番号１から８）。これらのモチーフを含むペプチドの膜結合型合ＨＬＡ−Ａ２分子への結合能およびその安定化能はＴ２細胞株を使用して評価した。この細胞株は、欠陥のあるＴＡＰトランスポータ機能を有しており、その結果、新たに合成されたＨＬＡクラス１分子、すなわちＨＬＡ−Ａ２との会合するため、細胞内で生成されたペプチドの大部分が小胞体に運搬されることが不可能になることが十分立証されている（参考文献４、５参照）。したがって、Ｔ２細胞の表面に提示されたＨＬＡ−Ａ２分子の大部分はからであり（すなわち、ペプチドを含んでおらず）、不安定である。外部から導入された適切なペプチドと相互作用すると、ＨＬＡ−Ａ２分子の安定性は回復される。
【００１９】
ここで実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−Ａ２安定化実験の結果は、２つのナノマー、すなわちＣＬＰ−１７７（配列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番号８）；ならびに、すなわちＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１８２（配列番号４）でそれぞれ表される１１マーおよび１２マーは、Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２に結合することができることを示した。この結果は、添付の図１に示されるように、細胞上に提示されたクラス１分子の密度が高いために、それぞれの蛍光ピークが右側に移動していることにより示された。各蛍光係数の比較から、ペプチドの強度はＣＬＰ−１７７＞ＣＬＰ−７２＞ＣＬＰ−１７８＞ＣＬＰ−１８２の順であることが明らかとなった。
【００２０】
調べた脂質化Ｒｅｖペプチドの構築を表２に示す。図２に示す結果は、脂質化したＲｅｖの５２〜１１６（配列番号９）ペプチド、ＣＬＰ−１７５およびＣＬＰ−１７６ならびにその非脂質化対象物であるＣＬＰ−１６４は、Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスに１００．０μｇ投与量で３回注射したときに、ＩｇＧタイターで判定して免疫原性であったことを示している（参考文献６）。不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）で製剤化したＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１６４を投与した動物では、Ｒｅｖの５２〜１１６ペプチド（ＣＬＰ−１６４）に対する高いＩｇＧ抗体が検出された（パネルＡ、ＢおよびＣ）。ＩＦＡに入れたＣＬＰ−２４３の投与により予備的刺激した後、ＩＦＡで製剤化したＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１６４の混合物で２回追加免役することにより、別な実験条件で試験したマウスは、同様に高い抗ＣＬＰ−１６４抗体応答を誘発した（パネルＤからＦ）。ＣＬＰ−２４３はＢ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原のアミン酸残基１２８〜１４０（ＴＰＲＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ、配列番号１０）を含むＩ−Ａb結合ペプチドである（参考文献６）。
【００２１】
リポペプチドＣＬＰ−１７６およびＣＬＰ−１７５がＣＴＬ誘導性であることを示す免疫原性実験の結果は図３に示す。Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３の投与により皮下的に予備的刺激し、同じ免疫経路を使用し、ＩＦＡ中にプライム用量のＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５を１００．０μｇを含む混合物で追加免疫したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスは、ナノマーＣＬＰ−１７７で惹起されたＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ標的細胞を殺すエフェクター細胞を生成することが判った（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）。ＣＬＰ−１７７を負荷しなかったＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ細胞は殺されなかったことから、このエフェクターの細胞傷害性活性は特異的であった（パネルＣ、Ｄ、ＧおよびＨ）。対照的に、同様にＣＬＰ−２４３／ＩＦＡ接種物を１回、ついでＩＦＡに溶かしたＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１６４を２回注射したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスでは、有意なＣＬＰ−１７７特異的エフェクター応答は誘発しなかった（パネルＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。
【００２２】
Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３で予備的刺激し、次いでＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５の混合物で追加免役すると、各リポペプチド単独で免役したときに比べ、ＣＴＬ応答の誘導に対してより効果的であったことを示す免役実験の結果は、図３に示す。ＩＦＡに溶かしたＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１６４（非脂質化Ｒｅｖ５２〜１１６）を１００．０μｇ投与量で３回皮下注射し、ＣＬＰ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａｔ  Ａ２ｋｂ細胞および１５．０μｇ/ｍｌの濃度で外部から添加したＣＬＰ−１７５により再刺激したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスの脾細胞は、ＣＬＰ−１７７ペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ細胞を殺すことができるエフェクターは生成しなかった（パネルＭからＸ）。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの再刺激実験の結果は、ＣＬＰ−２４３ペプチドを加えることにより達成されたＣＬＰ−２４３特異的Ｉ−Ａb結合ヘルパーＴ細胞と、ＣＬＰ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａｔ  Ａ２ｋｂ細胞との共存培養により達成されたＣＬＰ−１７７特的エフェクターの同時再刺激は、ＣＬＰ−１７７特異的エフェクターの増加を高めて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣＴＬアッセイで検出できるようにするのに必要であることを示した。
【００２４】
成分は投与処方に適した方法で、免疫プロトコールで治療上有効であり、免疫原性であり、保護的であるような量で投与する。投与すべき物質の量は、例えば、各人の免疫系の抗体合成能および細胞性免疫応答生成能を含め、投与する対象に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。しかし、適切な用量範囲は、当業者には容易に決定でき、物質マイクログラムからミリグラムのオーダーとすることができる。用量は投与経路に依存する可能性があり、宿主の大きさによって変化する。
【００２５】
抗原をアジュバントと共に投与すると、抗原性を顕著に改善することができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を増強するが、それ自体抗原性である必要はない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に保持して、抗原が免疫系の細胞にゆっくりと、持続的に放出されることを促進するデポー作用を生じるよう作用することができる。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原デポーに引きつけ、このような細胞を刺激して免疫応答を誘発することもできる。
【００２６】
免疫刺激剤またはアジュバントは長年にわたり、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するために使用されてきた。リポ多糖などの内因性アジュバントは通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化した細菌の成分である。外因性アジュバントは、典型的には、非共有的に抗原と結合し、宿主の免疫応答を増強するように処方された免疫調節剤である。したがって、アジュバントは、非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を増強するものと同定されてきた。しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、望ましくない副作用を引き起こし、ヒトや多くの動物への使用に不適切となる可能性がある。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（集合的に一般にアラムと呼ばれている）のみがヒトおよび動物用のワクチンに日常的にアジュバントとして使用されている。トキソイド中のアラムの効果は十分確立されており、ＨＢｓＡｇワクチンは、アラムでアジュバントされている。
【００２７】
広範な外因性アジュバントが抗原に対する強力な免疫応答を誘発することができる。これらには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、それらの誘導体および成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭ  マトリックス、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡ、および他のアジュバントならびに細菌毒素、その成分および誘導体が含まれる。特に有利な組合せは、本発明の譲受人に譲渡された、同時係属の１９９４年６月１３日出願の米国出願第０８／２５８，２２８号および１９９５年６月７日出願の米国出願第０８／４８３，８５６号に記載されており、これらの開示は参照して本明細書に組み込むものとする（ＷＯ９５／３４３０８）。特定の状況下では、Ｔｈ１応答を誘導するアジュバントが望ましい。
【００２８】
本発明を下記実施例によりさらに説明する。
【００２９】
上記の開示は一般に本発明を記載している。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全に理解することができる。これらの実施例は、単に説明のためのものであって、何ら本発明の技術的範囲を限定する意図のものではない。状況により手段が示唆または示されるため、形態の変化ならびに均等物の置換は企図される。本明細書で具体的な用語が使用されているものの、このような用語は説明的なものであり、限定する目的を持って、使用する意図はない。
【００３０】
（実施例）
この開示に明確に示されていないペプチドおよびリポペプチドの合成、細胞培養、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ＣＴＬアッセイおよび他の試験手順の方法は、学術文献に詳細に報告されており、十分当業者の範囲である。
【００３１】
実施例１：
この実施例はペプチドおよびリポペプチドの合成を説明する。
【００３２】
固相ペプチド合成はメーカーの標準プロトコールに従ってＡＢＩ４３０Ａ自動ペプチド合成装置で実施した。合成したペプチドのアミノ酸配列は下記表１に示す。
【００３３】
次の脂質化のために設計されたリジン残基は、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎε−フルオレニルメトキシカルボニル−リジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｅｍｏｃ）−ＯＨ）を使用してペプチドに導入した。脂質部分は、側鎖Ｆｍｏｃ保護基を手動で除去し、次いで、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でジイソプロピルエチルアミンおよびＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化した適切なカルボン酸でアシル化することにより、導入した。チオクレゾール、アニソールおよび硫化メチルの存在下で、液体フッ化水素で処理することにより固体支持体からリポペプチドを切り離した。粗生成物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で抽出し、ジエチルエーテルで沈殿させた。リポペプチドならびに脂質化されていないペプチドを表２に示す。
【００３４】
実施例２：
この実施例は、ペプチドのＨＬＡ−Ａ２結合および調整を示すために使用した方法を説明する。
【００３５】
ＨＬＡ−Ａ２分子を発現するＴ２細胞株はエール大学、Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｅｔｅｒ  Ｃｒｅｓｗｅｌｌ博士から入手した。細胞はＩｓｃｏｖｅの完全培地（１０％加熱不活化ウシ血清、ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの培地）で増殖させた。実施例１に記載のように調製し、表１で同定される８〜１３マーの各ペプチドの、Ｔ２細胞上のＡ２分子への結合能およびその安定性調整能は、Ｙｕｐｉｎｇ  Ｄｅｎｇらが記載したプロトコール（参考文献６）を改良したペプチド誘導ＭＨＣクラス１アセンブリー・アッセイを使用して判定した。
【００３６】
本質的に、１×１０6個のＴ２細胞を、３７℃で、一晩、滅菌したエッペンドルフ管中、Ｉｓｃｏｖｅの無血清培地（ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの培地）２５０．０μｌ中の所定濃度の被験ペプチドと共にインキュベートした。次いで、細胞を氷上で３０分間インキュベートした後、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ  ５．０μｇ/ｍｌ、アニソマイシン１２．５μｇ/ｍｌおよびシクロへキサミド５．０μｇ/ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの完全培地１．０ｍｌを加えた。次いで、サンプルを３７℃のＣＯ2インキュベータ中で３．０時間インキュベートした。
【００３７】
薬剤の存在下では、それ以上のタンパク質の合成およびＨＬＡ−Ａ２分子の細胞表面への細胞内送達は阻害され、生理学的温度では、膜結合型クラス１分子のコンフォーメーションの脱安定化が起こる。
【００３８】
次いで、細胞を氷冷ＰＢＡ（０．９％塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファ）で２回洗浄した。次いで、コンフォメーション感受性のＨＬＡ−Ａ２特異的マウスモノクローナル抗体ＢＢ７．２（参照７）を５．０μｇ/ｍｌ含むＰＢＡ１００．０μｌを各被験サンプルに加えた。氷上で４５分間反応させた。次いで、細胞を氷冷ＰＢＡで３回洗浄した。
【００３９】
次いで、各細胞サンプルに、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合体を１．０μｇ/ｍｌ含有するＰＢＡを１００．０μｌ加えることにより、ＢＢ７．２の結合を検出した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＡで２回、さらにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。１．０％パラホルムアミド１００．０μｌを細胞ペレットに加えて洗浄を終了させた直後に、細胞を固定した。細胞を緩和に再縣濁し、通常は、実験終了後３日以内にＦＡＣＳ分析した。
【００４０】
膜結合型Ａ２分子の密度上昇の指標である蛍光係数は、実験サンプル（ペプチド処理したＴ２細胞）の平均蛍光を対照サンプル（ペプチドで処理していないＴ２細胞）の平均蛍光で除して計算した。得られた結果は図１に示す。
【００４１】
実施例３：
この実施例は、ペプチドおよびリポペプチドの免疫原性を調べるために使用した予備的刺激および追加免疫のプロトコールを記載する。
【００４２】
ＡｓＫｂキメラ遺伝子についてトランスジェニックなＢ１０バックグラウンドのマウスを購入し、米国カリフォルニアのＳｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃからライセンスを取得した。コロニーは、カナダ、コンノートのＰａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘの動物サービス施設で維持されている。
【００４３】
第１グループのマウスには、ＩＦＡ中に乳濁させたＩＦＡ製剤化ペプチドまたはリポペプチド１００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、次いで、３０日後と４２日から４８日後に同じ接種物で追加免役した。第２グループのマウスには、ＩＦＡ製剤化ＣＬＰ−２４３  １００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、次いで同量のプライム免疫原と、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１６４  １００．０μｇとのＩＦＡ製剤化混合物で追加免役した。
【００４４】
最後の注射後１０日目または１１日目に採取した実験動物の血清を標準的なＥＩＡを用いてＣＬＰ−１６４特異的ＩｇＧ抗体についてアッセイした。得られた結果は図２に示す。実験に使用したマウスの脾細胞を同時に培養してＣＴＬを増加させたが、下記のようにエフェクター活性についてアッセイした。
【００４５】
実施例４：
この実施例は、ＣＴＬエフェクターを増加させるのに使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養法とＣＴＬアッセイについて説明している。
【００４６】
２５ｃｍ2の組織培養フラスコ当たり１５．０ｍｌの完全培地（１０．０％の５６℃で加熱不活化したウシ血清、ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０．０μｇ/ｍｌおよびＬ−グルタミン０．３５ｍｇ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ１６４０）中で、実施例３からの実験に使用したＡ２Ｋｂトランスジェニックの脾細胞３．０×１０7個を、ペプチドＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６で惹起したＡ２Ｋｂ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞１．３×１０7個と共存培養した。培養開始時に、Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３も１５．０μｇ/ｍｌの濃度で加えた。培養物はＣＯ2インキュベータ内で３７℃に７日間維持し、次いで、応答体を次のように、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ４時間ＣＴＬアッセイでペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ感染体に対して試験した。
【００４７】
応答体を７日間培養物から回収し、完全培地で２回洗った。３７℃のＣＯ2インキュベータでＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ細胞１×１０6個を所定のペプチド１００．０μｇと伴に一晩インキュベートすることにより陽性の標的を作製した。次いで、同じ被験ペプチド２５．０μｇの存在下で、１×１０6個当たり２５０．０μＣｉの51Ｃｒで標的細胞を標識した。完全培地で２回洗浄して、過剰の51Ｃｒを除去したのち、標的細胞２．５×１０3個を様々な数の応答細胞と共に３７℃のＣＯ2インキュベータ中で４時間インキュベートした。次いで、上清の半量を取り出し、放射活性を計測した。得られた結果は図３に示す。
【００４８】
（開示の概要）
この開示を要約すると、本発明は、ヘルパーＴ分子とＨＩＶタンパク質の脂質化ペプチドならびに新規ペプチドおよびリポペプチドを利用する予備的刺激／追加免疫手順により、ヒト宿主を含む宿主で、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を達成する新規のプロトコールを提供する。本発明の技術的範囲内で部分的な変形を行うことも可能である。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＦＡＣＳ（蛍光抗体細胞分離）による、ある種のＲｅｖ由来ペプチドを使用して実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−Ａ２安定化実験の結果を示す図である。Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２に結合したペプチドＣＬＰ−７２（配列番号８）、ＣＬＰ−１８２（配列番号７）、ＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１７７（配列番号２）はそれぞれの蛍光ピークのシフトで示される。
【図２】  パネルＡからＦを含み、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）で予備的刺激し、または予備的刺激せずに、ＣＬＰ−１７５、１７６および１６４（配列番号９）を使用した、Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ免疫原の免疫原性を示す図である。
【図３】  パネルＡからＸを含み、上記と同様に様々なプロトコールを使用した、Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ特異的ＣＴＬ誘導を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｈ】
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【図３Ｉ−Ｌ】
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【図３Ｍ−Ｐ】
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【図３Ｑ−Ｔ】
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【図３Ｕ−Ｘ】
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