(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードの(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。
【化１】
0003957386.tif 000005
【請求項２】
前記反応抑制剤において、有効成分であるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項１記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。
【請求項３】
前記反応抑制剤において、有効成分であるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項１又は２記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤。
【請求項４】
昆虫体液に、請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤が共存している、ペプチドグリカン特異的測定剤。
【請求項５】
下記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていないペプチドグリカン特異的測定剤。
【化２】
0003957386.tif 000006
【請求項６】
前記測定剤において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項５記載のペプチドグリカン特異的測定剤。
【請求項７】
前記測定剤において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項５又は６記載のペプチドグリカン特異的測定剤。
【請求項８】
昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のペプチドグリカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤を共存させて、この検体中のペプチドグリカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。
【請求項９】
検体と、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。
【請求項１０】
下記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的に(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法。
【化３】
0003957386.tif 000007
【請求項１１】
前記測定方法において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドの数平均分子量が５８００〜５８５０である、請求項１０記載のペプチドグリカンの特異的測定方法。
【請求項１２】
前記測定方法において、不溶性担体に固定化されるポリグルコシドが、担子菌類由来のポリグルコシドである、請求項１０又は１１記載のペプチドグリカンの特異的測定方法。
【請求項１３】
少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、ペプチドグリカン特異的測定用キット。
【請求項１４】
少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、細菌検出用キット。
【請求項１５】
少なくとも請求項１〜３のいずれかに記載の(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項４〜７のいずれかに記載のペプチドグリカン特異的測定剤を含む、細菌感染症診断用キット。
【請求項１６】
抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、又は、強アルカリ、を有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードのペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、ペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤。
【請求項１７】
昆虫体液に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体が共存している、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤。
【請求項１８】
抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていない(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤。
【請求項１９】
昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を、あるいは、検体中に強アルカリを共存させて、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。
【請求項２０】
検体と、請求項１７又は請求項１８記載の(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。
【請求項２１】
抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にペプチドグリカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法。
【請求項２２】
少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤を含む、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定用キット。
【請求項２３】
少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤を含む、真菌検出用キット。
【請求項２４】
少なくとも請求項１６記載のペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤、又は、請求項１７若しくは請求項１８記載の(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤を含む、真菌感染症診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫体液反応性物質の特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット等に関する技術分野の発明であり、具体的には下記二つに大別される。
一方は、ペプチドグリカンの特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット及びプロフェノールオキシダーゼカスケードにおける(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。より詳細には、昆虫体液中に認められるプロフェノールオキシダーゼカスケードにおける(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を抑制して、ペプチドグリカンのみを特異的に測定することが可能なペプチドグリカンの特異的測定剤、同測定方法並びに同測定用キット及びこれらのペプチドグリカンの特異的測定剤等に用い得る(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。
本明細書中においては、これらの一方の発明を単に「ペプチドグリカン関連発明」という。
【０００２】
他方は、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤、同測定方法、同測定用キット及びプロフェノールオキシダーゼカスケードにおけるペプチドグリカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。より詳細には、昆虫体液中に認められるプロフェノールオキシダーゼカスケードにおけるペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制して、(1→3)-β-D-グルカンのみを特異的に測定することが可能な(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤、同測定方法並びに同測定用キット及びこれらの(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定剤等に用い得るペプチドグリカン認識タンパク質系反応の反応抑制剤に関する発明である。
本明細書中においては、これらの他方の発明を単に「(1→3)-β-D-グルカン関連発明」という。
【０００３】
【従来の技術】
ペプチドグリカン（以下、ＰＧともいう）は細菌類の細胞壁構成成分で、Ｎ−アセチルムラミン酸又はＮ−グリコリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖ペプチドのポリマーで、熱に対して非常に安定な物質として知られている。ＰＧは発熱性、肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等、多くの生物活性を有しており、医学、薬学、微生物学等の分野で盛んに研究されている。
【０００４】
また、(1→3)-β-D-グルカン（以下、βＧともいう）類は、酵母、カビ、キノコ等の真菌類、植物などの細胞壁成分として、自然界に広く分布している多糖であり、構造も多様である(Aketagawa,J., Tamura,H.,and Tanaka,S., J.Antibact.Antifung.Agents, 23, 7, 413-419(1995)）。βＧはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導等を含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性等の多彩な生物活性を示す。さらに、βＧはアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、体内に入ったβＧ類がエンドトキシンの作用を増強するとの報告もあり、異物として血中に流入することは好ましいことではなく、医薬品並びに医療用具等への混入も医療上重大な問題になりつつある。
【０００５】
一方、昆虫体液には、体液のメラニン化に関与する、プロフェノールオキシダーゼ（以下、ＰｒｏＰＯともいう）カスケードと呼ばれる、一連の酵素群からなるカスケード系が存在していることが知られている。ＰＧ及びβＧがこのカスケード系の引き金となり、カスケード反応を経て、最終的にメラニンが生成する［Onishi,Annot.Zool.Jpn.,27,33-39(1954)；Ashida and Onishi,Arch.Biochem.Biophys.,122,411-416(1967)；Brunet,Insect Biochem.,10,467-500(1980)；Ashida and Yamazaki,Molting and Metamorphosis,239-265,Japan Sci.Soc.Press(1990)；Ashida and Dohke,Insect Biochem.,10,37-47(1980)］。
【０００６】
ＰｒｏＰＯカスケードを図１に示す。なお図１中の略号は以下の通りであり、本明細書中においても必要に応じて以下の略号を用いる。
ＰＧＲＰ      ：ペプチドグリカン認識タンパク質（分子量約19ｋＤａ）
βＧＲＰ      ：(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質（分子量約62ｋＤａ）
ＰｒｏＰＰＡＥ：プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素前駆体
ＰＰＡＥ      ：プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素
ＰｒｏＰＯ    ：プロフェノールオキシダーゼ
ＰＯ          ：フェノールオキシダーゼ
ＤＯＰＡ      ：L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン
【０００７】
ＰＧＲＰはＰＧを特異的に認識し、βＧＲＰはβＧを特異的に認識する。ＰＧＲＰやβＧＲＰによってＰＧやβＧの存在が認識されると、これらの認識タンパク質が活性化されて酵素活性が発現し、それに続くカスケードの一連の反応が開始する。なお本明細書中において、ＰＧがＰＧＲＰによって認識されることで開始されるカスケード反応をペプチドグリカン認識タンパク質系反応（以下、ＰＧＲＰ系反応ともいう）といい、βＧがβＧＲＰによって認識されることで開始されるカスケード反応を(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応（以下、βＧＲＰ系反応ともいう）という（図１参照）。
【０００８】
以下、本発明に最も近いと思われる先行技術について、ペプチドグリカン関連発明と、(1→3)-β-D-グルカン関連発明とに分けて説明する。
１．ペプチドグリカン関連発明に関する先行技術について
（１）カイコの血液中に存在するＰｒｏＰＯカスケードを利用した試薬が、和光純薬工業株式会社から「ＳＬＰ試薬」として発売されている。しかしこの試薬は、ＰＧ及びβＧのいずれにも反応するため、ＰＧを特異的に測定することができない。
【０００９】
（２）特公平７−１１４７０７号公報（特開平６３−１４１５９９号公報）には、「昆虫体液からβＧと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られる、βＧとは反応せずにＰＧと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るＰＧ測定用試薬」が開示されている。この試薬の調製方法の概略は以下の通りである：
まず、βＧＲＰを活性化して酵素活性を発現させるβＧの一種であるカードランを、種々の薬剤と器具を用い、種々の工程を経てビーズに固定化することによってカードランビーズカラムを調製する。このカードランビーズカラムに昆虫血漿を接触させて、昆虫血漿中のβＧＲＰをカードランビーズカラムに結合させ、素通り液を得る。この素通り液を飽和硫酸アンモニウム溶液中に滴下し、一晩撹拌し、遠心分離して沈殿を集め、その沈殿を緩衝液で再溶解し、その緩衝液に対して透析し、再び遠心分離して、その上清を得る。
【００１０】
このように、この試薬の調製には極めて多種類の薬剤、器具、装置を必要とし、操作も極めて煩雑であり、さらに非常に長い時間を要する。
また、(A)多種類の薬剤、器具、装置を用いるので、ＰＧ測定用試薬の調製中にＰＧやβＧが混入し、ＰｒｏＰＯカスケードが活性化されてしまう可能性が高いこと、(B)ＰＧ測定用試薬の調製の操作が煩雑なため、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下や酵素自体の損失の可能性が高いこと、(C)ＰＧ測定用試薬の調製に非常に多くの時間を費やすので、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下の可能性が高まることなど、種々の問題点を有している。
【００１１】
さらに都合の悪いことに、この試薬は、上記のように昆虫血漿をカードランビーズカラムに接触させてβＧＲＰをカードランビーズカラムに結合させ、次いで昆虫血漿からカードランビーズカラムに結合したβＧＲＰを除去することにより調製されるが、この試薬の調製過程において、カードランにβＧＲＰを結合させる際に、βＧＲＰが活性化され、これによってβＧＲＰ系反応が活性化されてしまうのである。
すなわち昆虫血漿中のＰｒｏＰＯカスケードを試薬調製の段階で進行させてしまうという点においてこの試薬は致命的であり、この試薬を用いてＰＧを測定することは極めて困難である。
このことは、後述する比較例の結果からも明らかであり、事実、このような試薬は現在に至るまで全く実用化されていない。
【００１２】
（３）ＷＯ９０／０２９５１号公報には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを有効成分とするカブトガニ・アメボサイト・ライセートＧ因子活性化阻害剤や、この特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドをカブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、ＬＡＬともいう）に添加してエンドトキシンに特異的なリムルステスト試薬を得る方法等が開示されている。
【００１３】
（４）特開平８−１２２３３４号公報には、βＧ類のポリカルボン酸誘導体またはグリセリル誘導体を有効成分とするカブトガニ・アメボサイト・ライセートＧ因子活性化阻害剤や、βＧ類のポリカルボン酸誘導体またはグリセリル誘導体をＬＡＬ試薬に共存させることを特徴とするエンドトキシンの特異的測定剤やその製造法等が開示されている。
【００１４】
（５）特開平４−１０２０６４号公報には、ＬＡＬに(1→3)-β-D-グルカン感受性因子に対する抗体を共存させてなる、エンドトキシン特異的な測定剤が開示されている。また、(1→3)-β-D-グルカン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、ＬＡＬを接触させて得た(1→3)-β-D-グルカン感受性因子不含ライセートからなる、エンドトキシン特異的な測定剤が開示されている。
【００１５】
（６）特開平６−２５８３２６号公報には、ＬＡＬにアプロチニンを共存させてなる、エンドトキシン特異的測定剤が開示されている。
（７）特開平７−１０３９８２号公報には、ＬＡＬにアルキルグルコシドを共存させてなる、エンドトキシンの特異的測定剤が開示されている。
【００１６】
（８）ＷＯ９６／０６８５８号公報には、ＬＡＬ及び／又は検体に(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質を共存させることを特徴とする、エンドトキシンの特異的測定方法が開示されている。
【００１７】
（９）特開平４−１３４２６５号公報には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、ＬＡＬを接触させることを特徴とする、エンドトキシンに特異的に反応するＬＡＬの調製法が開示されている。
【００１８】
上記（３）〜（９）の公知文献は、いずれも「エンドトキシンに特異的なＬＡＬやその調製法」に関するものであり、「ペプチドグリカンに特異的な昆虫体液由来の試薬やその調製法」等については記載もないし示唆もない。なお、ＬＡＬにもカスケード系が存在しているが、昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとは以下の点で全く異なっている。
【００１９】
(A)ＬＡＬに存在するカスケードは血液凝固に関係するものであり、ＰｒｏＰＯカスケードは体色変化に関係するものである。
(B)ＬＡＬに存在するカスケードはエンドトキシンに反応するが、ＰｒｏＰＯカスケードはエンドトキシンに反応しない。またＬＡＬに存在するカスケードはＰＧに反応しないが、ＰｒｏＰＯカスケードはＰＧに反応する。
【００２０】
(C)ＬＡＬに存在するカスケードと昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとでは、カスケードを構成する酵素（因子）が完全に異なる。
(D)ＬＡＬに存在するカスケードはその詳細が明らかにされているが、昆虫体液に存在するカスケードはその一部しか明らかにされておらず、未知の部分が多い。
【００２１】
このように、ＬＡＬに存在するカスケードと昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとでは、カスケードの存在意義、カスケードを活性化する物質、カスケードを構成する酵素（因子）等が完全に異なっている。
従って、上記（３）〜（９）に開示されている特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドやβＧの誘導体を、ＬＡＬの代わりに昆虫体液に適用してＰＧ特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することは不可能と考えられてきた。事実、昆虫体液に特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドや、βＧの誘導体等を適用してＰＧ特異的試薬を得ることについては全く報告がなく、またこのような試薬も全く知られていない。
【００２２】
２．(1→3)-β-D-グルカン関連発明に関する先行技術について
（１）カイコの血液中に存在するＰｒｏＰＯカスケードを利用した試薬が、和光純薬工業株式会社から「ＳＬＰ試薬」として発売されている。しかしこの試薬は、ＰＧ及びβＧのいずれにも反応するため、βＧを特異的に測定することができない。
【００２３】
（２）特公平７−１１４７０６号公報（特開平６３−１４１５９８号公報）には、「昆虫体液からＰＧと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られる、ＰＧとは反応せずにβＧと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るβＧ測定用試薬」が開示されている。
【００２４】
この試薬の調製方法は、上記した特公平７−１１４７０７号公報（特開平６３−１４１５９９号公報）と同様に、極めて多種類の薬剤、器具、装置を必要とし、操作も極めて煩雑であり、さらに非常に長い時間を要する。よって、(A)多種類の薬剤、器具、装置を用いるので、βＧ測定用試薬の調製中にＰＧやβＧが混入し、ＰｒｏＰＯカスケードが活性化されてしまう可能性が高いこと、(B)βＧ測定用試薬の調製の操作が煩雑なため、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下や酵素自体の損失の可能性が高いこと、(C)βＧ測定用試薬の調製に非常に多くの時間を費やすので、ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の活性低下の可能性が高まることなど、種々の問題点を有している。
【００２５】
さらに都合の悪いことに、この試薬は、前記のように昆虫血漿をＰＧビーズカラムに接触させてＰＧＲＰをＰＧビーズカラムに結合させ、次いで昆虫血漿からＰＧビーズカラムに結合したＰＧＲＰを除去することにより調製されるが、この試薬の調製過程において、ＰＧにＰＧＲＰを結合させる際に、ＰＧＲＰが活性化され、これによってＰＧＲＰ系反応が活性化されてしまうのである。
【００２６】
すなわち昆虫血漿中のＰｒｏＰＯカスケードを試薬調製の段階で作用させてしまうという点において、この試薬は致命的であり、この試薬を用いてβＧを測定することは極めて困難である。
このことは、後述する比較例の結果からも明らかであり、事実、このような試薬は現在に至るまで全く実用化されていない。
【００２７】
（３）特開平４−５２５５８号公報には、ＬＡＬにエンドトキシン感受性因子に対する抗体を共存させてなる、βＧ特異的な測定剤が開示されている。また、エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、ＬＡＬを接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセートからなる、βＧ特異的な測定剤が開示されている。
【００２８】
（４）特開平７−１２８３３７号公報には、三重らせん構造を主体とするβＧを含みうる試料(検体)を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドトキシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付すことを特徴とするβＧの測定方法が開示されている。
【００２９】
上記（３）及び（４）の公知文献は、いずれもＬＡＬに関するものであり、「(1→3)-β-D-グルカンに特異的な昆虫体液由来の試薬やその調製法」については記載もないし示唆もない。なお、ＬＡＬにもカスケード系が存在しているが、上述した通り、昆虫体液に存在するＰｒｏＰＯカスケードとは全く異なっている。
【００３０】
従って、上記（３）における「ＬＡＬ」を「昆虫体液」に置換し、かつ「エンドトキシン感受性因子に対する抗体」を「抗ＰＧＲＰ抗体」に置換することによって、ＰｒｏＰＯカスケードを活性化することなく、βＧに特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することは不可能と考えられてきた。また上記（４）における「ＬＡＬ」を「昆虫体液」に置換することによって、ＰｒｏＰＯカスケードを活性化することなく、βＧに特異的な昆虫体液由来の試薬を調製することも不可能と考えられてきた。
事実、昆虫体液に抗ＰＧＲＰ抗体やアルカリ金属水酸化物等を適用して、βＧ特異的試薬を得ることについては全く報告がなく、またこのような試薬も全く知られていない。
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、昆虫体液を用いて検体中のＰＧを測定するに際し、昆虫体液添加に伴うβＧＲＰ系反応の影響を受けずに、ＰＧＲＰ系反応のみを利用して、ＰＧを実用的で簡便、迅速、高感度かつ特異的に測定する手段を、従来技術のような不都合なしに提供することである。
【００３２】
また本発明のもう一つの目的は、昆虫体液を用いて検体中のβＧを測定するに際し、昆虫体液添加に伴うＰＧＲＰ系反応の影響を受けずに、βＧＲＰ系反応のみを利用して、βＧを実用的で簡便、迅速、高感度かつ特異的に測定する手段を、従来技術のような不都合なしに提供することである。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の目的を達成するために、鋭意検討を重ねた。その結果、これまでβＧＲＰの「活性化」にのみ関与すると考えられてきたβＧのうち、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、全く意外にもβＧＲＰを阻害する作用を示し、かつＰＧＲＰ系反応が実質的に阻害されないこと等を見出して、本発明を完成した。
【００３４】
また、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド等を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に昆虫体液を接触させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードを実質的に活性化することなく、昆虫体液中のβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を特異的に吸着除去できること等を見出して、本発明を完成した。
【００３５】
また、本発明者らは、（１）抗ＰＧＲＰ抗体が、ＰＧによるＰＧＲＰの活性化を阻害する作用を示し、かつβＧＲＰ系反応が実質的に阻害されないこと、（２）強アルカリがＰＧを特異的に不活化する作用を示し、強アルカリで不活化されたＰＧはＰＧＲＰに認識されず、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されないこと等を見出して、本発明を完成した。
【００３６】
また、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に昆虫体液を接触させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードを実質的に活性化することなく、昆虫体液中のＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を特異的に吸着除去できること等を見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明者は本願において以下の発明を提供する。
【００３７】
まず、下記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードの(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応抑制剤（以下、本発明βＧＲＰ抑制剤ともいう）を提供する。
【化４】
0003957386.tif 000002
【００３８】
また、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤が共存している、ペプチドグリカン特異的測定剤（以下、本発明ＰＧ測定剤(1)ともいう）を提供する。
【００３９】
また、上記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていないペプチドグリカン特異的測定剤（以下、本発明ＰＧ測定剤(2)ともいう）を提供する。
【００４０】
また、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のペプチドグリカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、上記本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、この検体中のペプチドグリカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法(1)ともいう）を提供する。
【００４１】
また、検体と、上記のペプチドグリカン特異的測定剤(1)〜(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法(2)ともいう）を提供する。
【００４２】
また、上記式（Ｉ）にて示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が、連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的に(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のペプチドグリカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のペプチドグリカンを測定する、ペプチドグリカンの特異的測定方法（以下、本発明ＰＧ測定方法(3)ともいう）を提供する。
【００４３】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤(1)〜(2)を含む、ペプチドグリカン特異的測定用キット（以下、本発明ＰＧ測定キットともいう）を提供する。
【００４４】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤(1)〜(2)を含む、細菌検出用キット（以下、本発明細菌検出キットともいう）を提供する。
【００４５】
また、少なくとも、上記の本発明βＧＲＰ抑制剤、又は、上記のペプチドグリカン特異的測定剤(1)〜(2)を含む、細菌感染症診断用キット（以下、本発明細菌診断キットともいう）を提供する。
【００４６】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、又は、強アルカリ、を有効成分として含有し、昆虫体液中のプロフェノールオキシダーゼカスケードのペプチドグリカン認識タンパク質系反応を抑制する作用を有する、ペプチドグリカン認識タンパク質系反応抑制剤（以下、本発明ＰＧＲＰ抑制剤ともいう）を提供する。
【００４７】
また、昆虫体液に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体が共存している、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤（以下、本発明βＧ測定剤(1)ともいう）を提供する。
【００４８】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にプロフェノールオキシダーゼカスケードが活性化されていない(1→3)-β-D-グルカン特異的測定剤（以下、本発明βＧ測定剤(2)ともいう）を提供する。
【００４９】
また、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を、あるいは、検体中に強アルカリを共存させて、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法（以下、前者の抗体を用いる方法を本発明βＧ測定方法(1)ともいい、後者の強アルカリを用いる方法を本発明βＧ測定方法(2)ともいう）を提供する。
【００５０】
また、検体と、前記本発明βＧ測定剤(1)〜(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法（以下、本発明βＧ測定方法(3)ともいう）を提供する。
【００５１】
また、抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にペプチドグリカン認識タンパク質系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中の(1→3)-β-D-グルカンによって惹起される変化を特定することにより、この検体中の(1→3)-β-D-グルカンを測定する、(1→3)-β-D-グルカンの特異的測定方法（以下、本発明βＧ測定方法(4)ともいう）を提供する。
【００５２】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤(1)〜(2)を含む、(1→3)-β-D-グルカン特異的測定用キット（以下、本発明βＧ測定キットともいう）を提供する。
【００５３】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤(1)〜(2)を含む、真菌検出用キット（以下、本発明真菌検出キットともいう）を提供する。
【００５４】
また、少なくとも、上記の本発明ＰＧＲＰ抑制剤、又は、上記の本発明βＧ測定剤(1)〜(2)を含む、真菌感染症診断用キット（以下、本発明真菌診断キットともいう）を提供する。
【００５５】
なお、本発明において「実質的に」とは、この言葉のかかる状態が、いわゆる当業者において、その状態であると認識するのに十分な実質を具えている状態を意味するものである。例えば、「実質的にＰｒｏＰＯカスケード，ＰＧＲＰ系反応又はβＧＲＰ系反応を活性化しない（若しくはされていない）」とは、これらが全く活性化しない（若しくはされていない）、又は活性化している（若しくはされている）としても、その活性化の度合いが極僅かであって、いわゆる当業者において検出できない，若しくは検出できたとしても極微量であって、測定誤差範囲内と認識される状態であることを意味するものである。
【００５７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
１．本発明測定剤について
＜１＞本発明測定剤
本発明測定剤は、第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質の両方に反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液（本明細書中において単に「昆虫体液」と称した場合、「昆虫体液及び／又はその成分」を意味する）に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードの第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、第２の昆虫体液反応性物質の特異的測定剤である。
【００５８】
第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質に反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液は、後述の＜３＞において記載される昆虫体液が挙げられる。第１の昆虫体液反応性物質及び第２の昆虫体液反応性物質はそれぞれ異なる物質であり、具体的にはＰＧ及びβＧのいずれかである。すなわち第１の昆虫体液反応性物質がＰＧの場合は第２の昆虫体液反応性物質はβＧであり、第１の昆虫体液反応性物質がβＧの場合は第２の昆虫体液反応性物質はＰＧである。また、第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質系反応とは、第１の昆虫体液反応性物質が第１の昆虫体液反応性物質認識タンパク質によって認識されることで開始されるカスケード反応を意味する。
【００５９】
すなわち、本発明測定剤には下記２つの態様が包含されている。
(1)βＧ及びＰＧに反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードのβＧ認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、ＰＧの特異的測定剤。
【００６０】
(2)ＰＧ及びβＧに反応するプロフェノールオキシダーゼカスケードが存在する昆虫体液に、このプロフェノールオキシダーゼカスケードのＰＧ認識タンパク質系反応の抑制剤が共存している、βＧの特異的測定剤。
本発明測定剤の実施の形態は、後述の＜３＞及び＜１２＞において述べられる測定剤の実施の形態と同様である。
【００６１】
２．ペプチドグリカン関連発明について
＜２＞本発明βＧＲＰ抑制剤
本発明βＧＲＰ抑制剤はβＧＲＰ系反応の抑制剤であり、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有する。より好ましくは、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつＰＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないβＧＲＰ抑制剤である。
【００６２】
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、βＧＲＰを活性化するβＧに競合してβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応因子に結合し、βＧＲＰ系反応を抑制し得る「競合的阻害物質」と、βＧＲＰを活性化するβＧ自体に結合してこれを失活させるか又はβＧを分解して失活させ、βＧＲＰを活性化させない「失活性阻害物質」とに大別される。
【００６３】
（１）本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる競合的阻害物質
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる競合的阻害物質は、上記の競合的な阻害作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲１▼〜▲５▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【００６４】
▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド
本明細書において「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」とは、
【化１】
0003957386.tif 000003
【００６５】
で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位（Ｉ）が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドを意味する。このポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分としては、(1→3)-β-D-グルコシド構造単位（Ｉ）が連続して３〜３１０個結合したものがより好ましく、４〜１８０個結合したものが特に好ましい。
【００６６】
なお、この特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドである限り限定されず、(1→3)-β-D-グルコシド結合のみから構成されるポリグルコシドのみならず、このポリグルコシドを主鎖とし、この主鎖中あるいは分岐構造中に(1→6)-β-D-グルコシドや(1→4)-β-D-グルコシドなどの構造を含むポリグルコシド等も含まれる。
【００６７】
これらの特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのうち、(1→6)-β-D-グルコシル分岐を有するポリグルコシドは、天然からは主に褐藻類やサルノコシカケ科等に属する担子菌類から得ることができる。具体例としてはLaminaria（コンブ属）やEisenia（アラメ属）由来のラミナリン、Sclerotinia属由来のスクレロタン、Schizophyllum属（スエヒロタケ）由来のシゾフィラン、Sclerotium属, Corticium属, Stromatinia属等に由来するスクレログルカン類、Lentinus属（シイタケ）由来のレンチナン等が挙げられる。
【００６８】
また、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのうち、(1→4)-β-D-グルコシド構造を有するポリグルコシドとしては、天然に存在するCetraria属、Usnea属、Evernia属等に由来するリケナンやオオムギ胚乳中に含まれるβ-グルカン等が挙げられる。
【００６９】
特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドとして、より具体的には下記の物質が挙げられ、かつ好ましい。
・分子量３４２〜１,６３８のラミナリオリゴ糖
・分子量１,８００〜３,２５８のラミナリデキストリン
・平均分子量２,０００〜６０,０００の(1→3)-β-D-グルカン
・平均分子量３,０００〜２３,０００のラミナリン
・平均分子量３,０００〜２０,０００のスクレロタン
・平均分子量５００,０００以下のシゾフィラン
・平均分子量１,１００,０００以下のレンチナン
・平均分子量１２,０００以下のパン酵母グルカン水可溶物
・平均分子量３３,０００以下のリヒエナン
・平均分子量２００,０００以下のオオムギβ−グルカン
【００７０】
これらの特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドは、その製造方法も限定されず、天然物由来のもの（これには、天然物由来の糖類から水で抽出される低分子性ポリグルコシドも含まれる）、天然物由来のポリグルコシドを酸又は酵素分解等により低分子化したもの、人工的に合成したもの等のいずれでもよい。
【００７１】
なお、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの具体的な製造方法はＷＯ９０／０２９５１号公報に開示されており、この方法に従って特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドを製造することができる。
また、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」は、１種類の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」であってもよく、また２種類以上の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド」の混合物であってもよい。
【００７２】
▲２▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体
本明細書において「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」とは、上記した式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して２〜３７０個結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドの誘導体を意味する。
【００７３】
より具体的には、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドのポリカルボン酸誘導体、グリセリル誘導体、グルコース残基の任意の水酸基（−ＯＨ）が、−ＯＲ〔Ｒはメチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、スルホプロピル基、硫酸基、リン酸基等又はそれらの塩（金属塩、アンモニウム塩若しくは有機アミン塩等）を表す〕としてして化学修飾されているもの等が挙げられ、かつ好ましい。
【００７４】
特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体として、より具体的には下記の物質が挙げられ、かつ好ましい。
・平均分子量４０,０００〜２４０,０００の部分カルボキシメチル化(1→3)-β-D-グルカンおよびその塩（置換度：０．００３〜１．０）
・平均分子量２３,０００以下の部分カルボキシメチル化ラミナリンおよびその塩（置換度：１．０以下）
・平均分子量８０,０００以下の部分メチル化(1→3)-β-D-グルカン（置換度：０．００３〜１．０）
・平均分子量２３,０００以下の部分硫酸化ラミナリンおよびその塩（置換度：１．０以下）
【００７５】
この「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」の具体的な製造方法は、ＷＯ９０／０２９５１号公報および特開平８−１２２３３４号公報に開示されており、これらの方法に従って特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体を製造することができる。
【００７６】
なお、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」は、１種類の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」であってもよく、また２種類以上の「特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体」の混合物であってもよい。
【００７７】
上述した特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド及びその誘導体は、昆虫体液中に存在するβＧＲＰに対して、このβＧＲＰを活性化する物質であるβＧよりも速く強く結合して、βＧＲＰの活性型βＧＲＰへの変換を阻害する。よって、特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド又はその誘導体を用いることによって、たとえβＧＲＰを活性化するβＧが混在していても、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００７８】
▲３▼抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体
抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体（以下、抗βＧＲＰ抗体ともいう）は、βＧＲＰに対する抗体であり、この抗体が昆虫体液中に存在するβＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、βＧＲＰを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗βＧＲＰ抗体は、βＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、βＧＲＰを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００７９】
ポリクローナル抗βＧＲＰ抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を、精製したβＧＲＰを抗原として免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。なお、被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので好ましい。
【００８０】
モノクローナル抗βＧＲＰ抗体は、例えば以下のようにして得られる。すなわち、▲１▼精製したβＧＲＰを抗原として、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから上記抗原に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。▲２▼こうして選別された細胞株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗βＧＲＰ抗体が得られる。
【００８１】
あるいは、マウスの腹腔等の生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗βＧＲＰ抗体を大量に製造することができる。
上記のハイブリドーマの調製を目的とした細胞融合に用いることができる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞、末梢血中のリンパ細胞等が挙げられる。またミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８２】
このようにして得られたポリクローナル抗βＧＲＰ抗体又はモノクローナル抗βＧＲＰ抗体の精製法としては、例えば硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱、ポリエチレングリコールや等電点による選択的沈澱分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法、超遠心法等の公知の手段を挙げることができる。
【００８３】
なお、抗βＧＲＰ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体の結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理して得られるＦａｂを含むフラグメントを使用することもできる。また、抗βＧＲＰ抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗βＧＲＰ抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（抗βＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することが可能であり、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
【００８４】
なお、これら抗βＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗βＧＲＰ抗体」に含まれる。
抗βＧＲＰ抗体を、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００８５】
▲４▼アプロチニン
アプロチニン(aprotinin)は、塩基性膵臓トリプシンインヒビターとも呼ばれ、ウシの肺、膵臓または耳下線から抽出されるアミノ酸５８残基の塩基性ポリペプチド(等電点10.5)で、カリクレイン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、その他各種の細胞内プロテアーゼを阻害するインヒビターであり、既に市販されている。
このアプロチニンを用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００８６】
▲５▼アルキルグルコシド
アルキルグルコシドは、特開平７−１０３９８２に記載された如く、グルコースとアルキル基がグルコシド結合によって結合したものである。本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いられ得るアルキルグルコシドは、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応の活性化阻害作用を有するものであれば特に限定されない。
【００８７】
これらのアルキルグルコシドは、α−グルコシド、β−グルコシドのいずれであってもよいが、特にβ−グルコシドが好ましい。また、グルコースとアルキル基とが酸素原子を介して結合したグルコシド(O-グルコシド)だけでなく、硫黄原子を介して結合したチオグルコシド(S-グルコシド)であってもよく、その他セレン(Se)、テルル(Te)等を介して結合したものであってもよい。グルコースと結合するアルキル基の炭素数は、アルキルグルコシドが水溶性または水分散性である限り特に限定されないが、通常炭素数１〜３０程度、特に６〜１２程度が好ましい。
【００８８】
また、還元末端がアルキルグルコシドである限り、グルコースにさらに他の糖が結合したオリゴグリコシドやポリグリコシドも、本明細書中における「アルキルグルコシド」に含まれる。
このようなオリゴグリコシドもしくはポリグリコシドとしては、ＷＯ９０／０２９５１号公報に開示された(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が特定個数結合したポリグリコシド等が例示される。特に非イオン性界面活性剤として市販されているｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド等は、入手が容易である。
【００８９】
アルキルグルコシドを用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
これらの競合的阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、昆虫体液に共存させることが、βＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
【００９０】
（２）本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる失活性阻害物質
本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる失活性阻害物質は、βＧＲＰを活性化するβＧ自体に結合してこれを失活させるか又はβＧを分解して失活させ、βＧＲＰを活性化させない作用を発揮し得る物質であり、例えば下記▲６▼〜▲８▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【００９１】
▲６▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質
(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質は、ＷＯ９６／０６８５８号公報に記載されている通り、カブトガニの血球抽出液から得ることが可能であり、非還元条件下におけるゲル濾過法において分子量約５８０ｋＤａを示す塩基性タンパク質である。
【００９２】
(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質を用いることによって、このタンパク質がβＧに結合して複合体を形成し、これによってβＧのβＧＲＰ活性化能が失われ、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９３】
▲７▼抗(1→3)-β-D-グルカン抗体
抗(1→3)-β-D-グルカン抗体（以下、抗βＧ抗体ともいう）は、βＧに対する抗体であり、この抗体が検体中に存在するβＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、βＧを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗βＧ抗体は、βＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、βＧを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００９４】
ポリクローナル抗βＧ抗体及びモノクローナル抗βＧ抗体は、精製したβＧを抗原として、βＧとウシ血清アルブミン等のタンパク質との複合体を形成させて抗原として用いる等、前記▲３▼抗(1→3)-β-D-グルカン認識タンパク質抗体の調製方法と同様の調製方法を用いて調製することができる。
【００９５】
なお、抗βＧ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、Ｆａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（Ｆａｂ部分を含むキメラ抗体等）を調製して本発明において用いることができることも、前記▲３▼と同様である。
また、これら抗βＧ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗βＧ抗体」に含まれる。
【００９６】
抗βＧ抗体を用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９７】
▲８▼(1→3)-β-D-グルカン分解酵素
(1→3)-β-D-グルカン分解酵素（以下、βＧ分解酵素ともいう）は、βＧ類を分解することができる限り特に限定されるものではないが、例えばArthrobacter luteus由来のβＧ分解酵素（Obayashi,T. et al., J.Med.Vet.Mycol., 30,275-280(1992)）等が挙げられる。
βＧ分解酵素を用いることによって、βＧが分解され、βＧのβＧＲＰ活性化能が失活し、ＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつＰＧＲＰ系反応は阻害されない。
【００９８】
これらの失活性阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、検体に共存させることが、βＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
なお、共存させることができる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、後述の＜３＞に記載される方法により、いわゆる当業者が適宜決定することができる。
上記した、本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、単独で有効成分とすることも可能であり、複数を組合わせて有効成分として配合することも可能である。
【００９９】
本発明βＧＲＰ抑制剤は、上記した本発明βＧＲＰ抑制剤の有効成分をそのまま用いることもできるが、本発明βＧＲＰ抑制剤の作用を実質的に害さない限り他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有させることもできる。また、例えば、式（Ｉ）で示される(1→3)-β-D-グルコシド構造単位が連続して３７１個以上結合したポリ(1→3)-β-D-グルコシド構造部分を少なくとも１つ含有するポリグルコシドが混在していてもよい。
【０１００】
＜３＞本発明ＰＧ測定剤(1)
本発明ＰＧ測定剤(1)は、昆虫体液に、上記＜２＞で説明した本発明βＧＲＰ抑制剤が共存している、ＰＧ特異的測定剤である。
本発明で用いることができる昆虫体液の供給源として使用され得る昆虫類は、特に限定されないが、飼育方法の確立しているものを選択することが望ましい。
【０１０１】
例えば、特開平７−１８４６９０号公報、特公平７−１１４７０７号公報等に記載された如く、カイコガ、タバコスズメガなどの鱗翅目、イエバエ、センチニクバエなどの双翅目、トノサマバッタ、エンマコウロギなどの直翅目、センノキカミキリなどの鞘翅目などが挙げられる。これらの昆虫類には、幼生、成体等を問わず、全ての形態のものが包含される。鱗翅目、双翅目及び鞘翅目などの完全変態類に属する昆虫については、取得の容易性から、成虫よりも幼虫の方が一般的に好ましい。
【０１０２】
これらの昆虫から採取する体液としては、その取得の容易性から一般に昆虫の体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。ヘモリンパの取得法は特に限定されず、好ましくは、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース、アミノ酸等からなる高分子物質）を不純物として含む庶糖、又はトウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射し、その後しばらく放置してから体腔から集める方法が挙げられる。さらに、上記のような方法で集めたヘモリンパを遠心分離にかけ、血球を除去した後、透析により得られる血漿を用いることもできる。さらに昆虫体液を原料に調製されたＰＧとβＧの両方に反応する市販の試薬（例えば、ＳＬＰ試薬（和光純薬工業（株）製））も使用することができる。なお、このような試薬は液体、粉末、固形物等のいずれの形態であってもよい。
【０１０３】
このようにして得られた昆虫体液に、上記＜２＞で述べた本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、ＰＧを特異的に測定することが可能な本発明ＰＧ測定剤(1)を得ることができる。
昆虫体液と本発明βＧＲＰ抑制剤との共存方法は、ＰＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
ここで、昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、βＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、例えば、次のようにしていわゆる当業者が適宜決定することができる。
【０１０４】
氷冷下で、一定量の昆虫体液に種々の量の本発明βＧＲＰ抑制剤（ＰＧを含有しないもの）を加えて混合する。次いでこれにβＧＲＰ系反応を充分に活性化できる一定量のβＧ（ＰＧを含有しないもの）を加えて、後述する＜５＞に記載されるインキュベート条件に準じてインキュベートし、測定する。これによってβＧによる活性化を完全に阻害する本発明βＧＲＰ抑制剤の量を求めることができる。
なお、本発明ＰＧ測定剤(1)を用いて検体中のＰＧを測定する場合、あらかじめ検体中にも本発明βＧＲＰ抑制剤を添加しておいてもよい。
【０１０５】
＜４＞本発明ＰＧ測定剤(2)
本発明ＰＧ測定剤(2)は、＜２＞で説明した「競合的阻害物質」の一部を除く物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されていないＰＧ特異的測定剤である。
【０１０６】
本発明ＰＧ測定剤(2)の調製において、＜２＞で説明した「競合的阻害物質」の一部を除く物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物を用いることによって、βＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素（因子）を、前記不溶性固定化物で吸着除去することができる。
【０１０７】
本発明ＰＧ測定剤(2)において、不溶性担体への固定化に用いることができる物質は、▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド、▲２▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドの誘導体又は▲３▼アルキルグルコシドであり、▲２▼および▲３▼についてはそれぞれ＜２＞において既に記載した内容（具体例，製造方法等を含む）と全く同一である。なお、ここで用いることができる▲１▼特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシドについては以下の通りである。
【０１０８】
・分子量３４２〜１,６３８のラミナリオリゴ糖
・分子量１,８００〜３,２５８のラミナリデキストリン
・平均分子量２,０００〜６,８００の(1→3)-β-D-グルカン
これらの▲１▼〜▲３▼の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法は、公知の方法、例えば特開平８−１２２３３４号公報記載の方法に基づいて行うことができる。
【０１０９】
例えば、水酸基やカルバモイル基などの親水性の基を有する不溶性担体であれば何れも使用できる。これらの不溶性担体として具体的には、セルロース（例えば、セルロースパウダー(アドバンテック東洋販売)、セルロファイン(生化学工業(株)販売)、アビセル(フナコシ薬品販売)、セレックス(バイオラッド販売)など）、アガロース（例えば、セファロース(ファルマシア販売)、バイオゲルＡ(バイオラッド販売)、クロマゲルＡ(同仁化学販売)、サガバック(セラバックラボラトリーズ販売)、ゲラロース(リテックス販売)、Ｐ−Ｌアガロース(Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売)など）、架橋デキストラン（例えば、セファデックスＧ、セファクリル(ファルマシア販売)、Ｐ−Ｌデックス(Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売)など）、ポリアクリルアミド（例えば、バイオゲルＰ(バイオラッド販売)、クロマゲルＰ(同仁化学販売)など）、多孔質ガラス（例えば、バイオグラス(バイオラッド販売)など）、親水性ポリビニル系合成ポリマー（例えば、トヨパール(東ソー販売)など）などが挙げられる。
【０１１０】
これらの不溶性担体に特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド又はその誘導体を固定化するためには、不溶性担体を活性化する必要がある。この方法としては種々のものがあり、例えば、水酸基を有する担体に対しては、臭化シアンによる方法（R.Axen, J.Porath and S.Ernback, Nature, 214, 1302(1967)）やオキシラン類による方法（J.Porath and N.Fornstedt, J.Chromatogr.,51, 479(1970)およびL.Sundberg and J.Porath, J.Chromatogr., 90, 87(1974)、又、カルバモイル基を有する担体に対しては、アルキルジアミンを用いてアミノアルキルアミン誘導体とする方法やヒドラジンを用いてヒドラジド誘導体とする方法（共にJ.K.Inman and H.M.Dintzis, Biochemistry, 8, 4074(1969)）などが挙げられるが、安定でかつ非特異的吸着の少ない方法としては、エピクロルヒドリンやビスオキシラン類を用いてエポキシ活性化し、得られたエポキシ活性化不溶性担体をさらに抱水ヒドラジンあるいはジヒドラジド化合物と反応させて得たヒドラジン誘導体又はヒドラジド誘導体を活性化体として用いる方法（松本勲武ら、特公平５−５３８０２号公報）が優れている。
【０１１１】
▲４▼抗βＧＲＰ抗体
ここでは、前記＜２＞で説明した「中和抗体」のみならず、βＧＲＰに結合するがβＧによるβＧＲＰの活性化を阻害しない抗体（結合抗体）も用いることができる。
【０１１２】
▲５▼アプロチニン
▲４▼及び▲５▼で述べた、抗βＧＲＰ抗体又はアプロチニンを固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法としては、例えばポリスチレン系およびポリプロピレン系等の不溶性担体に物理的に抗βＧＲＰ抗体又はアプロチニンを結合させて固定化する方法、あるいはポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートとの多孔性共重合体）等の不溶性担体に抗βＧＲＰ抗体またはアプロチニンを化学的に結合させて固定化する方法等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
この化学的な結合方法は、不溶性担体の芳香族アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化法、不溶性担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合させるＣＮＢｒ法、不溶性担体のヒドラジン誘導体等を用いてペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む不溶性担体の官能基を利用してタンパク質をアルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ基と反応する架橋試薬によって不溶性担体とタンパク質の遊離のアミノ基の間を架橋する方法、カルボジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスペーサーを介して結合させる方法等、公知の結合方法から不溶性担体の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
【０１１４】
このようにして上述の▲１▼〜▲５▼の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、昆虫体液を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、本発明ＰＧ測定剤(2)が得られる。
【０１１５】
この不溶性固定化物と昆虫体液との接触は、公知の固液接触手段により行うことが可能であり、特に限定されないが、例えば膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）の不溶性固定化物に昆虫体液を通液させる方法や、粒状の不溶性固定化物を充填したカラムに昆虫体液を通液させる方法や、ビーズ状、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形等の不溶性固定化物と昆虫体液を混合し、一定時間浸盪するか静置し、通常の固液分離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーション等）によって不溶性固定化物から分離する方法等が挙げられる。
【０１１６】
このようにして得られる本発明ＰＧ測定剤(2)は、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されておらず、ＰＧを特異的に測定することができる。
【０１１７】
＜５＞本発明ＰＧ測定方法(1)
本発明ＰＧ測定方法(1)は、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のＰＧを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に上記＜２＞において説明した本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させて、この検体中のＰＧによって惹起される、この共存させた試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１１８】
本発明ＰＧ測定方法(1)は、後述する実施例において実証されるように、本発明βＧＲＰ抑制剤が昆虫体液中に存在するβＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、βＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のＰＧを特異的に検出・測定し得る方法である。
【０１１９】
本発明ＰＧ測定方法(1)において、本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させる対象は、(A)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）、(B)検体、(C)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）と検体の両方、のいずれであってもよい。
【０１２０】
昆虫体液を原料として調製された試薬と本発明βＧＲＰ抑制剤との共存の態様は、ＰＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液を原料として調製された試薬に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１２１】
ここで、昆虫体液を原料として調製された試薬中及び／又は検体中に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量は、βＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、前記＜３＞において説明した、昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量の決定方法と同様に行うことができる。すなわち、昆虫体液を原料として調製された試薬中に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量を、前記＜３＞に記載した方法で求め、求めた本発明βＧＲＰ抑制剤の量を試薬中又は検体中に共存させることができる。あるいは、求めた本発明βＧＲＰ抑制剤の量の半分程度を試薬中及び検体中の両方に共存させてもよい。
【０１２２】
共存させる時期は、昆虫体液を原料として調製された試薬と検体とを接触させる前であることが好ましい。すなわちＰＧの測定前に、あらかじめ本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させた試薬及び／又はあらかじめ本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させた検体を用意しておき、用いることが好ましい。
【０１２３】
このようにして試薬と検体とを接触させ、好ましくはさらに混合し、一定時間インキュベートし、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することによって、この検体中のＰＧを測定することができる。インキュベートの温度と時間はいわゆる当業者が適宜決定することができる。またインキュベートは静置状態で行っても、振とう状態で行ってもよい。
【０１２４】
インキュベート中及び／又はインキュベート終了後、試薬中における昆虫体液における、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
検体中のＰＧによって惹起される変化は、発現するベンゾイルアルギニンエチルエステル分解酵素（ＢＡＥＥａｓｅ）、ＰＰＡＥ、ＰＯ、その他ＰｒｏＰＯカスケードに関与する酵素の酵素活性の有無や強度、あるいはこれらの酵素活性の発現時間として特定することができる。また、生成するドーパクロムやメラニンの色素の有無や強度として特定することもできる。
【０１２５】
具体的には、例えば特開平７−１８４６９０号公報に記載された如くＰＰＡＥ活性を測定する方法や、特開平１−１４２４６６号公報及び特公平７−１１４７０７号公報に記載された如くＰＯの活性化度を測定する方法（生成するキノリン色素を測定する方法、ＤＯＰＡの酸化によって生成するメラニン色素を測定する方法等）、ＢＡＥＥａｓｅ活性を測定する方法等によって、検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することができる。
【０１２６】
このような酵素活性、酵素活性発現時間又は色素の変化は、一定時間のインキュベート後に特定してもよく、またインキュベート中の変化速度やその積分値として特定しても良く、その方法は特に限定されない。
【０１２７】
また、このような酵素活性、酵素活性発現時間又は色素の変化を特定し、この変化の有無とＰＧの存在の有無、又はこの変化の程度（強度）とＰＧ量とを関連づけることにより、検体中のＰＧを特異的に測定することができる。
例えば、上記の変化がなかった場合には検体中にＰＧが存在しない、上記の変化があった場合には検体中にＰＧが存在するといったような定性的な測定も可能である。また既知量のＰＧとそれに対応する上記変化をあらかじめ検量線等によって関連づけておき、検体を測定した時の上記変化からＰＧを特異的に定量することもできる。
【０１２８】
上記の変化は、色素の変化を利用するものであれば、肉眼的に特定してもよく、またスペクトロフォトメーターやマイクロプレートリーダーを用いて特定してもよい。また色素以外の変化を利用する場合は、それが検出できる手段を用いて特定すればよく、その手段はいわゆる当業者が適宜決定することができる。
本発明ＰＧ測定方法(1)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１２９】
＜６＞本発明ＰＧ測定方法(2)
本発明ＰＧ測定方法(2)は、検体と、本発明ＰＧ測定剤(1)又は本発明ＰＧ測定剤(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１３０】
本発明ＰＧ測定方法(2)においては、検体と、本発明ＰＧ測定剤(1)又は本発明ＰＧ測定剤(2)とを混合し、上記＜５＞に記載したと同様にインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様に、この混合した検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
【０１３１】
なお、本発明ＰＧ測定方法(2)において、検体中に本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明測定剤を共存させる方法、共存させる本発明測定剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
本発明ＰＧ測定方法(2)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１３２】
＜７＞本発明ＰＧ測定方法(3)
本発明ＰＧ測定方法(3)は、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にβＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定する、ＰＧの特異的測定方法である。
【０１３３】
▲１▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質
▲２▼抗(1→3)-β-D-グルカン抗体
▲３▼(1→3)-β-D-グルカン分解酵素
上記▲１▼〜▲３▼の物質の物質についての説明は、すでに＜２＞において行った。
本発明ＰＧ測定方法(3)において用いる、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化法は、前記の＜４＞において説明した抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンと同様である。
【０１３４】
このようにして上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、検体を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、実質的にβＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。なお、この不溶性固定化物と検体との接触は、前記＜４＞に記載した接触方法に準じて行うことができる。
【０１３５】
このようにして得られる検体と混合することができる、昆虫体液を原料として調製された試薬は、ＰＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞（本発明ＰＧ測定方法(1)）に記載したと同様にインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様にこの検体中のＰＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のＰＧを測定することができる。
【０１３６】
なお、本発明ＰＧ測定方法(3)において、検体中に本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明測定剤を共存させる方法、共存させる本発明測定剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
本発明ＰＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のＰＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、ＰＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１３７】
上記＜２＞〜＜７＞に詳述した通り、本発明のうちペプチドグリカン関連発明においては本発明ＰＧ測定剤がその中心的な役割を果たしている。本発明ＰＧ測定剤等を用いる特に代表的な態様としては、例えば、下記(a)〜(i)等の態様を例示することができる。下記に示す態様は、本発明をさらに具体的に説明するための例示にすぎず、本発明の実施態様がこれらに限定されるものではない。
【０１３８】
(a)昆虫体液を採取する際及び／又はその体液から成分を調製する際に、本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(b)予め採取・調製された昆虫体液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(c)昆虫体液の凍結乾燥品を本発明βＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
【０１３９】
(d)昆虫体液の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解した溶液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(e)本発明βＧＲＰ抑制剤を添加して採取・調製した昆虫体液、又は昆虫体液に予め必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解した本発明ＰＧ測定剤(1)を使用する態様。
(f)昆虫体液と合成基質の凍結乾燥品又は市販のＳＬＰ試薬を本発明βＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解するか、又は適当な溶液で溶解して調製した溶液に本発明βＧＲＰ抑制剤を添加する態様。
【０１４０】
(g)昆虫体液と合成基質の混合液中に予め必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解して用いる態様。
(h)必要量の本発明βＧＲＰ抑制剤を検体に添加する態様。
(i)測定時に、本発明βＧＲＰ抑制剤、検体、合成基質及び昆虫体液を混合する態様。
これらの実施態様は、上記＜２＞〜＜７＞に詳述した本発明のいずれかに包含される。
【０１４１】
＜８＞本発明ＰＧ測定キット
本発明ＰＧ測定キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、ＰＧ特異的測定用キットである。
本発明ＰＧ測定キットの構成成分として用いることができる本発明βＧＲＰ抑制剤、本発明ＰＧ測定剤(1)及び本発明ＰＧ測定剤(2)は、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のいずれの状態でも提供され得るが、凍結乾燥状態で提供されることが好ましい。
【０１４２】
また本発明ＰＧ測定キットには、必要に応じてさらに本発明βＧＲＰ抑制剤、本発明ＰＧ測定剤(1)及び本発明ＰＧ測定剤(2)の凍結乾燥物の溶解に用いる溶解液、酵素基質、酵素基質の溶解に用いる溶解液、標準ＰＧ、ＰＧフリーのマイクロプレート等の反応・測定容器等を構成成分として加えることもできる。なお、酵素基質は合成基質であることが好ましい。本発明ＰＧ測定キットは、上記＜５＞に記載した方法と同様の方法でＰＧの特異的測定に用いることができる。
【０１４３】
＜９＞本発明細菌検出キット
本発明細菌検出キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、細菌検出用キットである。
本発明細菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜８＞に記載したと同様であり、ＰＧを特異的に測定することによって細菌を検出することができる。
【０１４４】
これは細菌の細胞壁にＰＧが含まれていることを利用したものであり、細菌の有無を検出するという定性的な検出も可能であり、また細菌の量を検出するという定量的な検出も可能である。検出できる細菌は、ＰＧを細胞壁成分とする細菌であれば特に限定されず、例えばグラム陽性菌（例えばStaphylococcus aureus、Streptococcus pyrogenes、Micococcus lysodeikticus等）、グラム陰性菌（例えばEscherichia coli、Salmonella typhimurium、Pseudomonas aeruginosa等）等が例示される。本発明細菌検出キットでは、真菌（例えばCandida albicans、Aspergillus flavus、Cryptococcus neoformans等）は検出されないので、グラム陽性菌やグラム陰性菌を特異的に検出することができる。
【０１４５】
＜１０＞本発明細菌診断キット
本発明細菌診断キットは、少なくとも本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を含む、細菌感染症診断用キットである。
本発明細菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜９＞に記載したと同様であり、体液中のＰＧを特異的に測定することによって体液中の細菌を検出し、これにより細菌感染症を鑑別して診断することができる。本発明細菌診断キットが適用できる体液は、哺乳類の体液であることが好ましく、特に細菌感染症の治療方法が確立しているという観点からも、ヒトの体液であることが好ましい。体液として具体的には血清、血漿、全血、尿、髄液、乳汁等が好ましい。
【０１４６】
本発明細菌診断キットを用いることによって体液中の細菌の有無を検出し、細菌感染症の鑑別診断を行うことができる。すなわち本発明細菌診断キットを用いて体液中にＰＧが検出されれば、細菌感染症であると診断される。また体液中のＰＧの量を検出することにより、細菌感染症の重症度を診断することもできる。例えば体液中に検出されるＰＧ量が多ければ、重症の細菌感染症と診断される。
【０１４７】
また本発明細菌診断キットを用いて体液中のＰＧの量を検出することによって、治療に用いた薬剤の効果を判定することもできる。すなわち体液中のＰＧ量が減少すれば、治療に用いた薬剤が効果を奏していることがわかる。
本発明細菌診断キットを用いて診断できる細菌感染症は、ＰＧを細胞壁成分とする細菌の感染症であり、より具体的にはグラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症が例示される。本発明細菌診断キットでは真菌は検出されないので、グラム陽性菌感染症やグラム陰性菌感染症を鑑別診断することができる。
【０１４８】
３．(1→3)-β-D-グルカン関連発明について
＜１１＞本発明ＰＧＲＰ抑制剤
本発明ＰＧＲＰ抑制剤はＰＧＲＰ系反応の抑制剤であり、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有する。より好ましくは、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつβＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないＰＧＲＰ抑制剤である。
【０１４９】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、ＰＧＲＰを活性化するＰＧに競合してＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応因子に結合し、ＰＧＲＰ系反応を抑制し得る「競合的阻害物質」と、ＰＧＲＰを活性化するＰＧ自体に作用してこれを失活させ、ＰＧＲＰを活性化させない「失活性阻害物質」とに大別される。
【０１５０】
（１）本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる競合的阻害物質
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる競合的阻害物質は、上記の競合的な阻害作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲１▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【０１５１】
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体（以下、抗ＰＧＲＰ抗体ともいう）は、ＰＧＲＰに対する抗体であり、この抗体が昆虫体液中に存在するＰＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、ＰＧＲＰを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗ＰＧＲＰ抗体は、ＰＧＲＰを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、ＰＧＲＰを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【０１５２】
ポリクローナル抗ＰＧＲＰ抗体は及びモノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体は、精製したＰＧＲＰを抗原として、前記＜２＞に記載の抗βＧＲＰ抗体の調製方法と同様の方法で得ることができる。またその精製方法も、前記の抗βＧＲＰ抗体の場合と同様である。
【０１５３】
なお、抗ＰＧＲＰ抗体はそのまま使用することもできるが、前記＜２＞に記載の抗βＧＲＰ抗体と同様に、フラグメント化したものを使用することも可能であり、抗ＰＧＲＰ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗ＰＧＲＰ抗体」に含まれる。
【０１５４】
抗ＰＧＲＰ抗体を用いることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１５５】
この競合的阻害物質は、昆虫体液及び／又は検体中に共存させることができるが、昆虫体液に共存させることが、ＰＧＲＰ系反応を効率的に阻害できることから好ましい。
なお、共存させることができる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量は、前記＜３＞に記載の方法に準じて、いわゆる当業者が適宜決定することができる。
【０１５６】
（２）本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いる失活性阻害物質
本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる失活性阻害物質は、ＰＧＲＰを活性化するＰＧ自体に作用してこれを失活させ、ＰＧＲＰを活性化させない作用を発揮し得る物質である限り特に限定されるものではないが、例えば下記▲２▼〜▲５▼に示す物質が挙げられ、かつ好ましい。
【０１５７】
▲２▼強アルカリ
強アルカリは、ＰＧに作用するがβＧにはほとんど作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、強アルカリによって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
【０１５８】
ここで用いることができる強アルカリとしては、アルカリ金属水酸化物（例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）が挙げられ、かつ好ましい。
強アルカリを検体に適量共存させることによって、強アルカリがＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。なお、強アルカリを共存させた検体は、昆虫体液を用いるβＧ測定の前に、適当な酸（例えば塩酸、硫酸、硝酸等）で中和しておくか、水や緩衝液等で希釈しておくことが好ましい。
【０１５９】
なお、中和した場合、白濁や反応阻害等が起きることもあるため、これを回避するために、必要に応じて脱塩等の塩を除去するための手段を講じることがより好ましい。
検体に強アルカリを共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６０】
▲３▼リゾチーム
リゾチームは、ＰＧに作用するがβＧには作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、リゾチームによって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
ここで用いることができるリゾチームは、ＰＧを特異的に失活できる限り特に限定されるものではなく、例えばニワトリ卵白由来のリゾチームを例示することができる。このようなリゾチームは市販されているので、それを用いることができる。
【０１６１】
リゾチームを検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に適量共存させることによって、リゾチームがＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
検体及び／又は昆虫体液にリゾチームを共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６２】
▲４▼タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素は、ＰＧに作用するがβＧには作用しないので、ＰＧを特異的に失活させることができる。かつ、タンパク質分解酵素によって失活したＰＧは、ＰＧＲＰを活性化しないのはもちろんであるが、βＧＲＰ系反応には全く影響を与えない。
【０１６３】
ここで用いることができるタンパク質分解酵素は、ＰＧを特異的に失活できる限り特に限定されるものではないが、エンド型のタンパク質分解酵素で、特にＬ−アラニンを分解することができるタンパク質分解酵素が好ましい、このような酵素としては、例えばStreptomyces griseus由来のプロテアーゼ，市販品として具体的にはプロテアーゼＰ（科研製薬製），Streptomyces griseusプロテアーゼ３（プロナーゼＰから精製）等を挙げることができる。
【０１６４】
タンパク質分解酵素を検体に適量共存させることによって、タンパク質分解酵素がＰＧに作用し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
【０１６５】
なお、検体中のタンパク質分解酵素は、昆虫体液を用いるβＧ測定の前に失活させておく必要がある。タンパク質分解酵素の失活方法は、検体中のタンパク質分解酵素が失活され、かつ検体中のβＧが失活されない方法であれば特に限定されないが、例えば煮沸（例えば１００℃で数分程度）処理等が例示され、かつ好ましい。
【０１６６】
検体にタンパク質分解酵素を共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
【０１６７】
▲７▼抗ペプチドグリカン抗体
抗ペプチドグリカン抗体（以下、抗ＰＧ抗体ともいう）は、ＰＧに対する抗体であり、この抗体が検体中に存在するＰＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉することにより、ＰＧを不活化し得る抗体（中和抗体）である。抗ＰＧ抗体は、ＰＧを抗原抗体反応に基づいて捕捉し、ＰＧを不活化することができる限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【０１６８】
ポリクローナル抗ＰＧ抗体及びモノクローナル抗ＰＧ抗体は、精製したＰＧを抗原として、上記＜２＞の抗βＧＲＰ抗体と同様の方法で調製することができる。
なお、抗ＰＧ抗体はそのまま使用することもできるが、中和抗体としての作用を失わない限り、Ｆａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（Ｆａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することが可能であり、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
【０１６９】
また、これら抗ＰＧ抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗ＰＧ抗体」に含まれる。
抗ＰＧ抗体を検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に適量共存させることによって、抗ＰＧ抗体がＰＧに結合して複合体を形成し、これによってＰＧのＰＧＲＰ活性化能が失活し、ＰＧＲＰ系反応が抑制される。
【０１７０】
検体及び／又は昆虫体液（好ましくは検体）に抗ＰＧ抗体を共存させることによって、ＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を阻害することが可能であり、かつβＧＲＰ系反応は阻害されない。
上記した、本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分として用いることができる物質は、単独で有効成分とすることも可能であり、複数を組合わせて有効成分として配合することも可能である。
【０１７１】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤は、上記した本発明ＰＧＲＰ抑制剤の有効成分をそのまま用いることもできるが、本発明ＰＧＲＰ抑制剤の作用を実質的に害さない限り他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有せしめることもできる。
【０１７２】
＜１２＞本発明βＧ測定剤(1)
本発明βＧ測定剤(1)は、昆虫体液に、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質が共存している、βＧ特異的測定剤である。
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
▲２▼リゾチーム
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
【０１７３】
本発明で用いることができる昆虫体液の供給源として使用され得る昆虫類、その体液の採取方法、及び昆虫体液を原料に調製されたＰＧとβＧの両方に反応する市販の試薬については、前記＜３＞において説明したと同様である。
本発明βＧ測定剤(1)において、昆虫体液に共存させることができる物質は以下の通りである。なお、それぞれの物質については、前記＜１１＞において既に説明した。
【０１７４】
昆虫体液に、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を共存させて、βＧを特異的に測定することが可能な本発明βＧ測定剤(1)を得ることができる。
昆虫体液と上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質との共存方法は、βＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、昆虫体液に上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１７５】
ここで、昆虫体液に共存させる上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質の量は、ＰＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、その量は上記＜３＞に記載された方法に準じて決定することができる。
【０１７６】
＜１３＞本発明βＧ測定剤(2)
本発明βＧ測定剤(2)は、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、昆虫体液又はそれを原料として調製された試薬を接触させることによって得られる、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されていないβＧ特異的測定剤である。
【０１７７】
すなわち、本発明βＧ測定剤(2)の調製過程において、抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物を用いることによって、ＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素を、前記不溶性固定化物で吸着除去することができる。
【０１７８】
本発明βＧ測定剤(2)において用いることができる抗ＰＧＲＰ抗体については、前記＜１１＞において既に説明した。
抗ＰＧＲＰ抗体を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化は、前記＜４＞の抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンについて述べたと同様に行うことができる。
【０１７９】
このようにして抗ＰＧＲＰ抗体を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、昆虫体液を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、本発明βＧ測定剤(2)が得られる。
この不溶性固定化物と昆虫体液との接触方法は、前記＜４＞において説明した接触方法と同様である。
このようにして得られる本発明βＧ測定剤(2)は、実質的にＰｒｏＰＯカスケードが活性化されておらず、ＰＧを特異的に測定することができる。
【０１８０】
＜１４＞本発明βＧ測定方法(1)
本発明βＧ測定方法(1)は、昆虫体液を原料として調製された試薬を用いて検体中のβＧを測定するに際し、この試薬中及び／又は検体中に下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を共存させて、この検体中のβＧによって惹起される、この試薬中に含まれる昆虫体液の変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１８１】
▲１▼抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体
▲２▼リゾチーム
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
本発明βＧ測定方法(1)は、後述する実施例において実証されるように、上記▲１▼〜▲３▼の物質が昆虫体液中に存在するＰＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、ＰＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のβＧを特異的に検出・測定し得る方法である。
【０１８２】
本発明ＰＧ測定方法(1)において、上記▲１▼〜▲３▼の物質を共存させる対象は、(A)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）、(B)検体、(C)昆虫体液を原料として調製された試薬（例えばＰＧ及びβＧの両者に反応する市販の試薬(ＳＬＰ試薬等)）と検体の両方のいずれでもよい。
【０１８３】
昆虫体液を原料として調製された試薬及び／又は検体と、上記▲１▼〜▲３▼の物質との共存方法は、βＧを特異的に測定することが可能である限り特に限定されないが、この試薬及び／又は検体に上記▲１▼〜▲３▼の物質を添加することによって共存させる方法が極めて簡便であることから好ましい。
【０１８４】
ここで、昆虫体液を原料として調製された試薬中及び／又は検体中に共存させる上記▲１▼〜▲３▼の物質の量は、ＰＧＲＰ系反応を完全に阻害するのに必要な量であり、前記＜３＞に記載した昆虫体液に共存させる本発明βＧＲＰ抑制剤の量の決定方法に準じて行うことができる。また、共存させる時期、インキュベート条件等は、前記＜５＞に記載したと同様である。
【０１８５】
インキュベート中及び／又はインキュベート終了後、試薬中における昆虫体液における、検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
検体中のβＧによって惹起される変化の特定方法、この変化とβＧ量との関連づけ、それによる検体中のβＧの測定方法も、前記＜５＞において記載した測定方法と同様である。
【０１８６】
本発明βＧ測定方法(1)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１８７】
＜１５＞本発明βＧ測定方法(2)
本発明βＧ測定方法(2)は、下記▲１▼〜▲４▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を検体に共存させることによって得られる実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１８８】
▲１▼強アルカリ
▲２▼リゾチーム
▲３▼タンパク質分解酵素
▲４▼抗ペプチドグリカン抗体
上記▲１▼〜▲４▼の物質の物質の詳細な説明は、上述した本発明ＰＧ抑制剤と同様である。
【０１８９】
本発明βＧ測定方法(2)は、後述する実施例において実証されるように、上記▲１▼〜▲４▼の物質が、検体中のＰＧのＰＧＲＰ活性化能を不活化することによって、昆虫体液中に存在するＰＧＲＰの活性化を強力に阻害する作用を有することを活用して、ＰＧＲＰ反応系による影響を受けずに検体中のβＧを特異的に検出・測定し得る方法である。上記▲１▼〜▲４▼の物質を検体に共存させることによって、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。
【０１９０】
なお、上記▲１▼又は▲３▼の物質を検体に共存させることによって得られる、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体は、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合する前に、上記＜１１＞において記載したと同様に、適宜煮沸、中和、希釈等の操作を行う必要がある。
【０１９１】
このようにして得られる検体と混合することができる、昆虫体液を原料として調製された試薬は、βＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
【０１９２】
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞において記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
本発明βＧ測定方法(4)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１９３】
＜１６＞本発明βＧ測定方法(3)
本発明βＧ測定方法(3)は、検体と、本発明βＧ測定剤(1)又は本発明βＧ測定剤(2)とを混合し、この測定剤中に含まれる昆虫体液における、混合した検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１９４】
本発明βＧ測定方法(3)においては、検体と、本発明βＧ測定剤(1)又は本発明βＧ測定剤(2)とを混合し、上記＜１３＞に記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜１３＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
【０１９５】
なお、本発明βＧ測定方法(3)において、検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させる方法、共存させる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量、共存させる時期等は、前記＜５＞に記載したと同様である。
【０１９６】
本発明βＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０１９７】
＜１７＞本発明βＧ測定方法(4)
本発明βＧ測定方法(4)は、下記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、検体を接触させることによって得られる実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、この試薬中に含まれる昆虫体液における、前記不溶性固定化物に接触させた検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定する、βＧの特異的測定方法である。
【０１９８】
▲１▼リゾチーム
▲２▼タンパク質分解酵素
▲３▼抗ペプチドグリカン抗体
上記▲１▼〜▲３▼の物質の物質の詳細な説明は、上述した本発明ＰＧ抑制剤と同様である。
【０１９９】
本発明βＧ測定方法(4)において用いる、上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を固定化するために用いることができる不溶性担体及び固定化は、前記＜４＞の抗βＧＲＰ抗体及びアプロチニンについてと同様に行うことができる。
【０２００】
このようにして上記▲１▼〜▲３▼の物質群から選ばれる１又は２以上の物質を不溶性担体に固定化することによって得られる不溶性固定化物に、検体を接触させて、この不溶性固定化物を除去すれば、実質的にＰＧＲＰ系反応を活性化しない検体が得られる。なお、この不溶性固定化物と検体との接触方法は、前記＜４＞に記載した接触方法に準じて行うことができる。
【０２０１】
ここで得られる検体と混合することが可能な、昆虫体液を原料として調製された試薬は、βＧ特異的な試薬のみならず、ＰＧとβＧの両方に反応する試薬であってもよい。
上記のようにして得られる検体と、昆虫体液を原料として調製された試薬とを混合し、上記＜５＞に記載したと同様の方法でインキュベートし、さらに上記＜５＞に記載したと同様の方法でこの検体中のβＧによって惹起される変化を特定することにより、この検体中のβＧを測定することができる。
【０２０２】
なお、本発明βＧ測定方法(4)において、検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させておいてもよい。検体中に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させる方法、共存させる本発明ＰＧＲＰ抑制剤の量、共存させる時期等は、上記＜５＞に記載したと同様である。
【０２０３】
本発明βＧ測定方法(4)は、昆虫体液中のβＧＲＰ系反応が目的に合った感度及び測定範囲で機能し、βＧの定性若しくは定量的測定が可能である限り、その具体的な態様が限定されるものではない。
【０２０４】
上記＜１１＞〜＜１７＞に詳述した通り、本発明のうち(1→3)-β-D-グルカン関連発明においては、本発明βＧ測定剤がその中心的な役割を果たしている。本発明βＧ測定剤等を用いる代表的な態様としては、例えば、下記(a)〜(i)等の態様を例示することができる。下記に示す態様は、本発明をさらに具体的に説明するための例示にすぎず、本発明の実施態様がこれらに限定されるものではない。
【０２０５】
(a)昆虫体液を採取する際及び／又はその体液から成分を調製する際に、本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(b)予め採取・調製された昆虫体液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(c)昆虫体液の凍結乾燥品を本発明ＰＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
【０２０６】
(d)昆虫体液の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解した溶液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して調製した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(e)本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加して採取・調製した昆虫体液、又は昆虫体液に予め必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解した本発明βＧ測定剤(1)を使用する態様。
(f)昆虫体液と合成基質の凍結乾燥品又は市販のＳＬＰ試薬を本発明ＰＧＲＰ抑制剤含有溶液で溶解するか、又は適当な溶液で溶解して調製した溶液に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を添加する態様。
【０２０７】
(g)昆虫体液と合成基質の混合液中に予め必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解して用いる態様。
(h)必要量の本発明ＰＧＲＰ抑制剤を検体に添加する態様。
(i)測定時に、本発明ＰＧＲＰ抑制剤、検体、合成基質及び昆虫体液を混合する態様。
これらの実施態様は、上記＜１１＞〜＜１７＞に詳述した本発明のいずれかに包含される。
【０２０８】
＜１８＞本発明βＧ測定キット
本発明βＧ測定キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、βＧ特異的測定用キットである。
本発明βＧ測定キットの構成成分として用いることができる本発明ＰＧＲＰ抑制剤、本発明βＧ測定剤(1)及び本発明βＧ測定剤(2)は、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のいずれの状態でも提供され得るが、凍結乾燥状態で提供されるのが好ましい。
【０２０９】
また、本発明βＧ測定キットには、必要に応じてさらに本発明ＰＧＲＰ抑制剤、本発明βＧ測定剤(1)及び本発明βＧ測定剤(2)の凍結乾燥物の溶解に用いる溶解液、酵素基質、酵素基質の溶解に用いる溶解液、標準βＧ、βＧフリーのマイクロプレート等の反応・測定容器等を構成成分として加えることもできる。なお、酵素基質は合成基質であることが好ましい。本発明βＧ測定キットは、上記＜５＞に詳述した方法と同様にβＧの特異的測定に用いることができる。
【０２１０】
＜１９＞本発明真菌検出キット
本発明真菌検出キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、真菌検出用キットである。
本発明真菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜８＞に記載したと同様であり、βＧを特異的に測定することによって真菌を検出することができる。これは真菌の細胞壁にβＧが含まれていることを利用したものであり、真菌の有無を検出するという定性的な検出も可能であり、また真菌の量を検出するという定量的な検出も可能である。
【０２１１】
検出できる真菌は、βＧを細胞壁成分とする真菌であれば特に限定されず、例えばCandida albicans、Aspergillus flavus、Saccharomyces cerevisiae等が例示される。本発明真菌検出キットでは、細菌（例えばStaphylococcus aureus、Streptococcus pyrogenes、Micococcus lysodeikticus等のグラム陽性菌、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Pseudomonas aeruginosa等のグラム陰性菌等）は検出されないので、真菌を特異的に検出することができる。
【０２１２】
＜２０＞本発明真菌診断キット
本発明真菌診断キットは、少なくとも本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を含む、真菌感染症診断用キットである。
本発明真菌検出キットの構成成分、その使用方法等は上記＜１９＞に記載したと同様であり、体液中のβＧを特異的に測定することによって体液中の真菌を検出し、これにより真菌感染症を鑑別して診断することができる。本発明真菌診断キットが適用できる体液は、哺乳類の体液であることが好ましく、特に真菌感染症の治療方法が確立しているという観点からも、ヒトの体液であることが好ましい。体液として具体的には血清、血漿、全血、尿、髄液、乳汁等が好ましい。
【０２１３】
本発明真菌診断キットを用いることによって体液中のβＧの有無を検出し、真菌感染症の鑑別診断を行うことができる。すなわち本発明真菌診断キットを用いて体液中にβＧが検出されれば、真菌感染症であると診断される。また体液中のβＧの量を検出することにより、真菌感染症の重症度を診断することもできる。例えば体液中に検出されるβＧ量が多ければ、重症の真菌感染症と診断される。
【０２１４】
また本発明真菌診断キットを用いて体液中のβＧの量を検出することによって、治療に用いた薬剤の効果を判定することもできる。すなわち体液中のβＧ量が減少すれば、治療に用いた薬剤が効果を奏していることがわかる。
本発明真菌診断キットを用いて診断できる真菌感染症は、βＧを細胞壁成分とする真菌の感染症である。本発明細菌診断キットではグラム陽性菌やグラム陰性菌等の細菌は検出されないので、真菌感染症を鑑別診断することができる。
【０２１５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を記載し、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【０２１６】
〔実施例Ａ〕  ペプチドグリカン関連発明の実施例
〔実施例Ａ１〕βＧＲＰ系反応抑制剤をカイコ血漿に添加して調製した、本発明ＰＧ測定剤を用いるＰＧ測定方法の例
（方法）
カイコ血漿1.OmLに、本発明βＧＲＰ系反応抑制剤（ラミナリン；Laminaria digitata由来の数平均分子量(Mn)５,８５０のポリ(1→3)-β-D-グルコシド；シグマ社販売）0.5mgを添加した後、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して本発明ＰＧ測定剤を得た。
また、カイコ血漿1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して、ポリ(1→3)-β-D-グルコシドを含まない比較用の測定剤を得た。
【０２１７】
これら測定剤それぞれ50μLを、ふた付き96ウエルマイクロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ；生化学工業(株)販売）の所定のウエルに分注し、0.1Mリン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、蒸留水(ブランク)、所定濃度のＰＧ(Micrococcus luteusから、熱トリクロロ酢酸(TCA)及びトリプシン処理により調製されたＰＧ(以下、ＰＧＭＬともいう)；和光純薬工業(株)販売)または、βＧ（ＷＯ９０／０２９５１号公報記載の方法に準じ、カードランから分子篩により得たMn＝216,000のβＧ（以下、βＧ216ともいう）を別々に50μL加え、ふたをして、恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレートリーダー（ウエルリーダーＳＫ６０１；生化学工業(株)販売）にセットして、30℃で60分間、カイネティック法（反応時間法）で測定した。ＰＧ及びβＧによる活性化に伴って生じる色素量が吸光度の変化として捉えられ、測定終了後、その吸光度がしきい値に達するまでの反応時間（Ｔa）が自動的に算出され、ＰＧ及びβＧの各濃度に対するＴa値の関係が自動的に図示される。
【０２１８】
（結果）
図２及び図３に、ＰＧ濃度及びβＧ濃度とＴa値との関係を、横軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
本発明ＰＧ測定剤を用いた場合、ＰＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつβＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値（Ｔa＞６０分）と同一であった（図２）。
【０２１９】
一方、ポリ(1→3)-β-D-グルコシドを含まない比較用の測定剤では、ＰＧのみならずβＧにも反応し、ＰＧ及びβＧの濃度に依存していずれも良好な直線性が得られた（図３）。
これらの結果から、本発明ＰＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明ＰＧ測定剤によりＰＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２０】
〔実施例Ａ２〕βＧＲＰ系反応抑制剤を固定化して調製した、カイコ血漿からの本発明ＰＧ測定剤を用いるＰＧ測定方法の例
（方法）
特開平８−１２２３３４号公報に記載の方法に従ってそれぞれ調製したβＧＲＰ系反応抑制剤（WO90/02951号公報に記載の方法に従って、カードラン(和光純薬工業(株)販売)をギ酸で加水分解し、分子篩によって得たMn 5,800のポリ(1→3)-β-D-グルコシド）固定化セルロファイン（生化学工業(株)販売）を本発明例として用い、カードラン固定化セルロファインを比較例として用いた。これらをそれぞれカラム(1.2 x 3.0cm)に充填し、0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した。これらのカラムそれぞれに、カイコ血漿5.0mLを負荷して溶出させた（溶出液：0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液, pH6.5、溶出速度：9.0mL/時間）。
【０２２１】
カイコ血漿をカラムに負荷してから、最初の1.0mLの溶出液は捨て、その後の5.0mLの溶出液を集め、それぞれＰＧ測定剤を得た。
それぞれのＰＧ測定剤1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合後、それらの50μLをトキシペット９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有, pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のＰＧＭＬまたはβＧ216を別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２２２】
（結果）
図４及び図５に、ＰＧ濃度及びβＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明ＰＧ測定剤を用いた場合、ＰＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつβＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値(Ta＞６０分)と同一であった（図４）。
一方、カードラン固定化セルロファインカラム処理により得た比較用のＰＧ測定剤では、ＰＧ及びβＧのどの濃度においても、その測定値(Ta値)は５．２分で、かつブランクのTa値（５．２分）と同一であった（図５）。
【０２２３】
カードランと接触したカイコ血漿は、ProPOカスケードが活性化されてしまっているため、ＰＧやβＧを加えなくても、すなわちブランクでも反応してしまい、ＰＧやβＧを加えてもその濃度に関係なく一定の値を示し、ＰＧ量を測定することはできない。
これらの結果から、本発明ＰＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明ＰＧ測定剤によりＰＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２４】
〔実施例Ｂ〕  (1→3)-β-D-グルカン関連発明の実施例
〔実施例Ｂ１〕ＰＧＲＰ系反応抑制剤をカイコ血漿に添加して調製した、本発明βＧ測定剤を用いたβＧ測定方法の例
（方法）
カイコ血漿1.0mLに、ＰＧＲＰ系反応抑制剤（特開平４−５２５５８号公報に記載の方法に準じて調製した、ポリクローナル抗ＰＧＲＰ抗体）3.0mgを添加した後、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、よく混合して本発明βＧ測定剤を得た。またカイコ血漿1.0mLに80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合して抗ＰＧＲＰ抗体を含まない比較用の測定剤を得た。それらの50μLをトキシペットプレート９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のβＧ216またはＰＧＭＬを別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２２５】
（結果）
図６及び図７に、βＧ濃度及びＰＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明βＧ測定剤を用いた場合、βＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつＰＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値（Ta＞６０分）と同一であった（図６）。一方、抗ＰＧＲＰ抗体を含まない比較用の測定剤では、βＧのみならずＰＧにも反応し、βＧ及びＰＧの濃度に依存していずれも良好な直線性が得られた（図７）。
【０２２６】
これらの結果から、本発明βＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明βＧ測定剤によりβＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２２７】
〔実施例Ｂ２〕  ＰＧＲＰ系反応抑制剤を固定化して調製した、カイコ血漿からの本発明βＧ特異的測定剤を用いたβＧ測定方法の例
【０２２８】
（方法）
特公平７−１１４７０６号公報に記載の方法に従って、それぞれ調製したＰＧＲＰ系反応抑制剤（特開平４−５２５５８号公報に記載の方法に準じて調製した、モノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体）固定化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を本発明例として用い、ペプチドグリカン固定化セファロース４Ｂを比較例として用いた。
【０２２９】
これらをそれぞれカラム(1.2 x 3.0cm)に充填し、0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した。これらのカラムそれぞれに、カイコ血漿5.0mLを負荷して溶出させた（溶出液：0.01M トリス−リンゴ酸緩衝液, pH6.5、溶出速度：9.0mL/時間）。
カイコ血漿をカラムに負荷してから、最初の1.0mLの溶出液は捨て、その後の5.0mLの溶出液を集め、それぞれβＧ測定剤を得た。
【０２３０】
それぞれのβＧ測定剤1.0mLに、80mM 塩化カルシウム溶液0.1mLを添加し、混合後、それらの50μLをトキシペット９６Ｆの所定のウエルに分注し、0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有, pH6.0)50μLを加え、蒸留水（ブランク）、所定濃度のＰＧＭＬまたはβＧ216を別々に50μL加えてふたをし、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットして、実施例Ａ１と同様にして測定した。
【０２３１】
（結果）
図８及び図９に、βＧ濃度及びＰＧ濃度とTa値との関係を横軸、縦軸ともに対数軸を用いて示した。本発明βＧ測定剤を用いた場合、βＧとはその濃度に依存して良好な直線性が得られ、かつＰＧに対してはいずれの濃度でも全く反応せず、ブランク値(Ta＞６０分)と同一であった（図８）。
一方、ペプチドグリカン固定化セファロース４Ｂカラム処理により得た比較用のβＧ測定剤では、βＧ及びＰＧのどの濃度においても、その測定値(Ta値)は５．６分で、かつブランクのTa値（５．６分）と同一であった（図９）。
【０２３２】
ペプチドグリカンと接触したカイコ血漿は、ProPOカスケードが活性化されてしまっているため、βＧやＰＧを加えなくても、すなわちブランクでも反応してしまい、βＧやＰＧを加えてもその濃度に関係なく一定の値を示し、βＧ量を測定することはできない。
これらの結果から、本発明βＧ測定剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないことが示された。また、本発明βＧ測定剤によりβＧを特異的、高感度かつ定量性良く測定できることが示された。
【０２３３】
〔実施例Ｂ３〕検体にＰＧＲＰ系反応抑制剤を共存させることによってβＧを特異的に測定する方法の例
【０２３４】
（方法）
検体として、βＧ216(8.4ng/mL)、ＰＧＭＬ(8.4ng/mL)、及びそれぞれ２倍濃度のβＧ216とＰＧＭＬの等量混合液各々0.5mLを用意した。それらにＰＧＲＰ系反応抑制剤（0.6M 水酸化ナトリウム水溶液；強アルカリ)0.5mLを加え、10分間煮沸した。それらの50μLに0.3Mの塩酸を50μL加えて中和後、蒸留水2.0mLを加えて希釈した。それらまたは蒸留水(ブランク)をトキシペットプレート９６Ｆの所定のウエルに50μL分注し、それらに８mM 塩化カルシウムを含有するカイコ血漿50μL及び0.1M リン酸緩衝液(20mM DOPA含有、pH6.0)50μLを加え、ふたをして、ウエルリーダーＳＫ６０１にセットし、実施例Ａ１と同様にして測定した。また検体に水酸化ナトリウム水溶液や塩酸の代わりに蒸留水を同量使用して、反応性を比較検討した。
【０２３５】
（結果）
結果を第１表に示す。
0003957386.tif 000004
【０２３６】
この結果から、検体に強アルカリを共存させることによって検体中のＰＧは失活するがβＧは失活せず、この検体を用いると昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応は活性化されず、かつβＧＲＰ系反応には実質的に影響を及ぼさないことが示された。また本発明βＧ測定方法により、ＰＧの影響を受けずに、βＧを特異的に測定できることが示された。
【０２３７】
〔製造例１〕本発明ＰＧ測定キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明ＰＧ測定キットを製造した。
１．本発明ＰＧ測定剤(1)（(1→3)-β-D-グルカン結合性蛋白質含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
【０２３８】
〔製造例２〕本発明細菌検出キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明細菌検出キットを製造した。
１．本発明ＰＧ測定剤(1)（アプロチニン含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
４．ＰＧフリー蒸留水  １バイアル（２mL）
５．ＰＧ              １バイアル
【０２３９】
〔製造例３〕本発明βＧ測定キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明βＧ測定キットを製造した。
１．本発明βＧ測定剤(1)（モノクローナル抗ＰＧＲＰ抗体含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
【０２４０】
〔製造例４〕本発明真菌検出キットの製造例
下記構成試薬からなる本発明真菌検出キットを製造した。
１．本発明βＧ測定剤(1)（リゾチーム含有）１バイアル（２mL）
２．基質剤（40μmol DOPA含有）１バイアル
３．基質溶解液（0.1M リン酸緩衝液、pH6.0）（２mL）
４．βＧフリー蒸留水  １バイアル（２mL）
５．βＧ              １バイアル
【０２４１】
【発明の効果】
本発明βＧＲＰ抑制剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を活性化させることなくβＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつＰＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないので、本発明βＧＲＰ抑制剤を用いることによってＰＧを高感度に定量性良く、かつ再現性良く測定することができる。また、ＰＧ特異的測定剤を調製する際に本発明βＧＲＰ抑制剤を用いると、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価にＰＧ特異的測定剤を調製することができる。
【０２４２】
本発明ＰＧ測定剤(1)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ系反応が抑制されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。またその調製も、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価に行うことが可能であり、極めて実用的である。
【０２４３】
本発明ＰＧ測定剤(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素が除去されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４４】
本発明ＰＧ測定方法(1)及び(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応が活性化されることなくβＧＲＰ及び／又はβＧＲＰ系反応に関与する酵素が抑制又は除去されており、かつＰＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていない試薬を用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４５】
本発明ＰＧ測定方法(3)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのβＧＲＰ系反応を実質的に活性化しない検体を用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４６】
本発明ＰＧ測定キットは、本発明βＧＲＰ抑制剤又は本発明ＰＧ測定剤(1)若しくは本発明ＰＧ測定剤(2)を構成成分として用いるので、ＰＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２４７】
本発明細菌検出キットは、本発明ＰＧ測定キットをさらに細菌検出用キットとして応用したものであり、真菌は検出しないことから、グラム陽性菌やグラム陰性菌等を特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に検出することができる。例えば水質調査、環境モニタリング、衛生管理、食品管理、その他医学、薬学等の分野において利用することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２４８】
本発明細菌診断キットは、本発明細菌検出キットをさらに細菌感染症診断用キットとして応用したものであり、真菌は検出しないことから、グラム陽性菌感染症やグラム陰性菌感染症の鑑別診断を高感度に、再現性良く、簡便かつ迅速に行うことができる。これによって治療方針の決定や、治療剤の選択、治療効果の確認等にも極めて有用な情報を提供することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２４９】
本発明ＰＧＲＰ抑制剤は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を活性化させることなくＰＧＲＰ系反応を抑制する作用を有し、かつβＧＲＰ系反応を実質的に阻害しないので、本発明ＰＧＲＰ抑制剤を用いることによってβＧを高感度に定量性良く、かつ再現性良く測定することができる。また、βＧ特異的測定剤を調製する際に本発明ＰＧＲＰ抑制剤を用いると、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価にＰＧ特異的測定剤を調製することができる。
【０２５０】
本発明βＧ測定剤(1)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ系反応が抑制されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。またその調製も、多くの薬品、器具、装置等を用いることなく、極めて簡便、迅速かつ安価に行うことが可能であり、極めて実用的である。
【０２５１】
本発明βＧ測定剤(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素が除去されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていないので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５２】
本発明βＧ測定方法(1)及び(2)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応が活性化されることなくＰＧＲＰ及び／又はＰＧＲＰ系反応に関与する酵素が抑制又は除去されており、かつβＧＲＰ系反応は実質的に阻害されていない試薬を用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５３】
本発明βＧ測定方法(3)及び(4)は、昆虫体液中のＰｒｏＰＯカスケードのＰＧＲＰ系反応を実質的に活性化しない検体を用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５４】
本発明βＧ測定キットは、本発明ＰＧＲＰ抑制剤又は本発明βＧ測定剤(1)若しくは本発明βＧ測定剤(2)を構成成分として用いるので、βＧを特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に測定することができる。
【０２５５】
本発明真菌検出キットは、本発明βＧ測定キットをさらに真菌検出用キットとして応用したものであり、細菌は検出しないことから、真菌を特異的に、高感度に、定量性良く、再現性良く、簡便かつ迅速に検出することができる。例えば水質調査、環境モニタリング、衛生管理、食品管理、その他医学、薬学等の分野において利用することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２５６】
本発明真菌診断キットは、本発明真菌検出キットをさらに真菌感染症診断用キットとして応用したものであり、細菌は検出しないことから、真菌感染症の鑑別診断を高感度に、再現性良く、簡便かつ迅速に行うことができる。これによって治療方針の決定や、治療剤の選択、治療効果の確認等にも極めて有用な情報を提供することが可能であり、有用性が極めて高い。
【０２５７】
本発明は上記したような優れた効果を有するものであり、実用性が極めて高く、ＰＧ及びβＧの特異的測定、真菌及び細菌の特異的検出、細菌及び真菌感染症診断分野における有用性が極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】カイコ血液のプロフェノールオキシダーゼカスケードを示す。
【図２】実施例Ａ１において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを用いたときの結果を示す。
【図３】実施例Ａ１において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図４】実施例Ａ２において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを用いたときの結果を示す。
【図５】実施例Ａ２において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図６】実施例Ｂ１において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図７】実施例Ｂ１において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図８】実施例Ｂ２において本発明品を用いて得られた検量線を示す。但し、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図９】実施例Ｂ２において比較品を用いて得られた検量線を示す。但し、●は試料としてＰＧを、○は試料としてβＧを用いたときの結果を示す。
【図１】
0003957386.tif 000008
【図２】
0003957386.tif 000009
【図３】
0003957386.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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