(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に複数のプローブをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを用いてＤＮＡ結合蛋白質が結合するゲノムＤＮＡの遺伝子間領域を検出する、ＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、
前記ＤＮＡマイクロアレイに、前記ゲノムＤＮＡに含まれる複数の遺伝子を、プローブとして、それぞれ異なる位置にスポットし固定化するステップと、
前記ＤＮＡ結合蛋白質が結合する前記ゲノムＤＮＡの遺伝子間領域の少なくとも一部と、前記ゲノムＤＮＡ上で当該遺伝子間領域に隣接する遺伝子の少なくとも一部とを含むＤＮＡ断片をターゲットとして調製するステップと、
前記ＤＮＡマイクロアレイのプローブと前記ターゲットとのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、
前記ＤＮＡマイクロアレイのプローブである複数の遺伝子のうち前記ＤＮＡ断片が結合した遺伝子を検出するステップと、
前記ＤＮＡ断片が結合した遺伝子のうち前記ゲノムＤＮＡ上にて隣接する２つの遺伝子の間に挟まれた遺伝子間領域を前記ＤＮＡ結合蛋白質が結合する遺伝子間領域と判定するステップと、
を含むことを特徴とするＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、前記ＤＮＡ断片の長さは５００〜１５００塩基であることを特徴とするＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、前記ＤＮＡ断片の長さは１ｋ〜１００ｋ塩基であることを特徴とするＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、前記ＤＮＡ断片は、前記ＤＮＡ結合蛋白質が結合する前記ゲノムＤＮＡの遺伝子間領域の上流側に隣接する第１の遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡ断片と、下流側に隣接する第２の遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡ断片とを含むことを特徴とするＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、ＤＮＡ結合蛋白質が特異的に結合する遺伝子のＤＮＡ領域を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の転写は転写因子によって制御される。転写因子には、遺伝子上流のＤＮＡ領域に特異的に結合するＤＮＡ結合蛋白質と、直接ＤＮＡに結合せず、因子間相互作用を介して作用するものとがある。ＤＮＡ結合蛋白質が特異的に結合する遺伝子上流のＤＮＡ領域を検出する方法として、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法が知られている（"Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF", Nature, vol.409 (25 January 2001), pp.533〜538）。
【０００３】
図６は、この従来法の説明図である。まず、プローブを用意する。従来法においては、図６（ａ）に示すように、遺伝子ｂ１，ｂ２，…と遺伝子間領域ａ１，ａ２，…からなるゲノムＤＮＡ１０から遺伝子間領域のＤＮＡ配列ａ１，ａ２，ａ３，ａ４，ａ５をそれぞれ取得する。それをスライドガラス上にスポットして、図６（ｃ）に示すように複数のＤＮＡマイクロアレイ５０，６０，７０を作製する。図６（ｃ）における表示ａ１，ａ２，…は、ＤＮＡマイクロアレイ５０，６０，７０上に遺伝子間領域のＤＮＡ配列ａ１，ａ２，…を固定化したスポットを表している。
【０００４】
次に、ターゲットを用意する。図６（ｂ）に示すように、タグ付き転写因子Ｘ，Ｙ，Ｚを検出目的であるゲノムDNA１０の遺伝子発現誘導部位に結合後クロスリンクする。そして、このゲノムＤＮＡ１０を超音波破砕機などでバラバラに切断し、免疫沈降を用いてタグ付き転写因子Ｘ，Ｙ，Ｚが結合しているＤＮＡ断片のみを取り出す。さらに、クロスリンクをはずし転写因子とＤＮＡ断片を分離後、ＤＮＡ断片を蛍光ラベルしターゲットＸ，Ｙ，Ｚとする。
【０００５】
次に、図６（ｃ）に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ５０，６０，７０上のＤＮＡ配列ａ１，ａ２，ａ３，ａ４，ａ５をプローブとして固定化したスポットに、先ほど調整したターゲットＸ，Ｙ，Ｚをハイブリダイズさせる。このとき、ＤＮＡマイクロアレイ５０上には転写因子Ｘが結合したターゲットＸを反応させた。同様にＤＮＡマイクロアレイ６０上にはターゲットＹを反応させ、ＤＮＡマイクロアレイ７０上にはターゲットＺを反応させた。
【０００６】
図６（ｃ）のＤＮＡマイクロアレイ５０上ではＤＮＡ配列ａ１とターゲットＸがハイブリダイズし、その結果、転写因子ＸはゲノムＤＮＡ１０上の遺伝子ｂ１と遺伝子ｂ２の間の領域である遺伝子間領域ａ１に結合することがわかる。同様に、ＤＮＡマイクロアレイ６０上ではＤＮＡ配列ａ３とターゲットＹが反応していることにより、転写因子ＹはゲノムＤＮＡ１０上の遺伝子ｂ３と遺伝子ｂ４の間の領域である遺伝子間領域ａ３に結合することが分かる。ＤＮＡマイクロアレイ７０上ではＤＮＡ配列ａ５とターゲットＺが反応していることより、転写因子Ｚは遺伝子ｂ５と遺伝子ｂ６の間の遺伝子間領域ａ５に結合することがわかる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ結合蛋白質の結合部位検出方法では、図６（ａ）に示すように遺伝子間領域の配列をすべて用意し、それをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを新たに作製する必要がある。
また、ＤＮＡマイクロアレイを用いた検出法は、ハイブリダイゼーションの際の条件により実験誤差が生じやすい。例えば、前記した従来法で、ターゲットＸを反応させたＤＮＡマイクロアレイ５０のアレイイメージデータをスキャナで読み取り、横軸に遺伝子間領域名をとり、縦軸にスポットの蛍光強度をとった棒グラムを作ったとき、図７に示すような結果が得られることがある。図７では、ＤＮＡ配列ａ１とＤＮＡ配列ａ５のデータが規定値を超えている。この場合、ＤＮＡ配列ａ５の蛍光強度が閾値を超えているのは実験誤差によるものであるが、図７の結果からだけでは、どちらが正しいデータで、どちらが実験誤差なのか判断できない。
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、新たに遺伝子間領域ＤＮＡマイクロアレイを作製する必要がなく、さらに実験誤差の生じにくいＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
タグ付きＤＮＡ結合蛋白質を結合・クロスリンクさせたゲノムＤＮＡを複数のＤＮＡ断片に切断後、免疫沈降により目的のDNA断片のみを取り出す。クロスリンクをはずし、ＤＮＡ断片を蛍光ラベルしてターゲットとする。このとき、ターゲットには遺伝子間領域と両端の遺伝子の一部を含むものとする。このターゲットを「遺伝子間領域のＤＮＡ配列」ではなく「遺伝子のＤＮＡ配列」がスポットしてあるＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせる。ターゲットはＤＮＡマイクロアレイ上の２個所のスポットにおいて検出される。これにより、ＤＮＡ結合蛋白質の結合領域が、その２つの遺伝子の遺伝子間領域に存在することが検出できる。
【０００９】
本発明によるＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法は、基板上に複数のプローブをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを用いてＤＮＡ結合蛋白質が結合するゲノムＤＮＡの遺伝子間領域を検出する、ＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、ＤＮＡマイクロアレイにスポットする複数のプローブとしてゲノムＤＮＡ中の複数の遺伝子を用い、ターゲットとして、ＤＮＡ結合蛋白質が結合する遺伝子間領域の少なくとも一部と、ゲノムＤＮＡ上でＤＮＡ結合蛋白質が結合する遺伝子間領域に隣接する遺伝子の少なくとも一部とを含むＤＮＡ断片を用いることを特徴とする。
【００１０】
本発明によるＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法は、また、ＤＮＡ結合蛋白質が結合するゲノムＤＮＡの遺伝子間領域を検出するＤＮＡ結合蛋白質の結合領域検出方法において、ＤＮＡ結合蛋白質が結合するゲノムＤＮＡの遺伝子間領域の少なくとも一部と、ゲノムＤＮＡ上で当該遺伝子間領域に隣接する遺伝子の少なくとも一部とを含むＤＮＡ断片を調製するステップと、ゲノムＤＮＡに含まれる複数の遺伝子をそれぞれ異なる位置に固定化したＤＮＡマイクロアレイを用いて前記固定化された遺伝子と前記ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション反応を行うステップと、ＤＮＡマイクロアレイに固定化した複数の遺伝子のうち前記ＤＮＡ断片が結合した遺伝子を検出するステップと、ゲノムＤＮＡ上において前記ＤＮＡ断片が結合した２つの遺伝子に隣接し当該２つの遺伝子によって挟まれた遺伝子間領域をＤＮＡ結合蛋白質が結合する遺伝子間領域と判定するステップとを含むことを特徴とする。
【００１１】
ターゲットとするＤＮＡ断片の長さは、細菌ゲノムの場合には、遺伝子間領域の長さが３００〜８００であるため、両端の遺伝子の一部を含ませるためには５００〜１５００塩基とするのが好ましい。一方、高等生物ゲノムの場合は、遺伝子間領域の長さが数ｋ〜数十ｋであるため、ターゲットを１ｋ〜１００ｋの長さにする必要がある。つまり、プローブとする生物により遺伝子間距離が異なるため、作成するターゲットの長さを変える必要がある（The Sequence of the Human Genome ：Science Vol.291, No.5507, Issue of 16 Feb 2001, pp. 1304-1351.）。
【００１２】
ＤＮＡマイクロアレイと反応させるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ結合蛋白質が結合するゲノムＤＮＡの遺伝子間領域の上流側に隣接する第１の遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡ断片と、下流側に隣接する第２の遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡ断片とを含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。ここでは、ＤＮＡマイクロアレイ上に貼り付けるＤＮＡ断片をプローブ、プローブにハイブリダイズ反応を行なうＤＮＡ断片をターゲットと呼ぶことにする。
【００１４】
図１は、本発明によるＤＮＡ結合蛋白質（転写因子Ｘ，Ｙ，Ｚ）の結合部位検出方法の手順を示すフローチャートである。図２は、各ステップの説明図である。
ステップ１０では、ＤＮＡマイクロアレイを作製する。図２（ａ）に示すように、ゲノムＤＮＡ１０は遺伝子ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｂ５，ｂ６と遺伝子間領域ａ１，ａ２，ａ３，ａ４，ａ５からなる。ここでは、遺伝子ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｂ５，ｂ６のＤＮＡ配列をプローブとして取得する。これは、酵母のように全遺伝子が決定されている場合にはプライマーを用いて遺伝子のｃＤＮＡを作成し、これをＰＣＲで増幅させてプローブとする。プローブをスライドガラス上にスポットすることにより、複数のＤＮＡマイクロアレイ２０，３０，４０を作製する。
【００１５】
次のステップ１１ではターゲットを調製する。まず、図２（ｂ）に示すようなタグ付き転写因子Ｘ，Ｙ，ＺをゲノムＤＮＡ１０に結合後クロスリンクさせる。そしてタグ付き転写因子Ｘ，Ｙ，Ｚが結合したゲノムＤＮＡを超音波破砕機で破砕し、転写因子Ｘ，Ｙ，Ｚのタグをもとに免疫沈降によりＤＮＡ断片をそれぞれ分別して抽出する。さらに、クロスリンクをはずし転写因子とＤＮＡ断片を分離後、ＤＮＡ断片を蛍光ラベルしターゲットＸ、Ｙ、Ｚとする。このとき、従来の遺伝子間領域のみを取り出す方法では３００〜８００ｂｐに切断していたが、本発明では５００〜１５００ｂｐ程度、好ましくは１０００ｂｐ前後になるよう切断する（細菌ゲノムの場合）。これによりＤＮＡ断片には、遺伝子間領域だけでなく、両脇の遺伝子の一部まで含まれるようになる。
【００１６】
なお、高等生物ゲノムの場合は、遺伝子間領域の長さが数ｋ〜数十ｋであるため、両端に遺伝子の一部を含めるためにはターゲットを１ｋ〜１００ｋの長さにする必要がある。つまり、プローブとする生物により遺伝子間距離が異なるため、作成するターゲットの長さを変える必要がある。
【００１７】
図３は同一タグで分離されたＤＮＡ断片の集合を示す説明図である。ここには、タグ付き転写因子Ｘが遺伝子ｂ１と遺伝子ｂ２との遺伝子間領域に結合したものを示した。分離されたＤＮＡ断片の中には、図示するようなものが含まれ、これをターゲットとする。ＤＮＡ断片Ｉは、両端に遺伝子ｂ１の一部ｂ１’と遺伝子ｂ２の一部ｂ２’を含み、中央に遺伝子間領域Ｘが存在する。ＤＮＡ断片IIは、遺伝子間領域Ｘの一部Ｘ’と遺伝子ｂ２の一部ｂ２’を含む。ＤＮＡ断片IIIは、遺伝子ｂ１の一部ｂ１’と遺伝子間領域Ｘの一部Ｘ’を含む。ＤＮＡ断片IVは、遺伝子間領域Ｘの一部Ｘ’を含む。
【００１８】
次に、ステップ１２において、ステップ１０で作製したＤＮＡマイクロアレイ上にステップ１１で調製したターゲットをふりかけてハイブリダイゼーション反応させる。このとき、図３に示したＤＮＡ断片Ｉ，II，IIIからなるターゲットは、図４に示すようにスライドガラス上のプローブとハイブリダイズする。つまり、図３に示したＤＮＡ断片Ｉからなるターゲットは遺伝子ｂ１からなるプローブ又は遺伝子ｂ２からなるプローブとハイブリダイズする。図３に示したＤＮＡ断片IIからなるターゲットは、遺伝子ｂ２からなるプローブとハイブリダイズする。同様に、図３に示したＤＮＡ断片IIIからなるターゲットは、遺伝子ｂ１からなるプローブとハイブリダイズする。
【００１９】
また、図２（ｃ）においては、ＤＮＡマイクロアレイ２０に対しターゲットＸ（ＤＮＡ断片ｂ１’−Ｘ−ｂ２’）を反応させた。ここでは、遺伝子ｂ１からなるプローブに対しＤＮＡ断片ｂ１’−Ｘ−ｂ２’のｂ１’部分がハイブリダイズしており、遺伝子ｂ２からなるプローブに対しＤＮＡ断片ｂ１’−Ｘ−ｂ２’のｂ２’部分がハイブリダイズしている。同様に、ＤＮＡマイクロアレイ３０対しターゲットＹ（ＤＮＡ断片ｂ３’−Ｙ−ｂ４’）を反応させた。このとき、遺伝子ｂ３から鳴るプローブに対しＤＮＡ断片ｂ３’−Ｙ−ｂ４’のｂ３’部分がハイブリダイズし、遺伝子ｂ４からなるプローブに対しＤＮＡ断片ｂ３’−Ｙ−ｂ４’のｂ４’部分がハイブリダイズしている。更に、ＤＮＡマイクロアレイ４０対しターゲットＺ（ＤＮＡ断片ｂ５’−Ｚ−ｂ６’）を反応させた。このとき、遺伝子ｂ５からなるプローブに対しＤＮＡ断片ｂ５’−Ｚ−ｂ６’のｂ５’部分がハイブリダイズしており、遺伝子ｂ６からなるプローブに対しＤＮＡ断片ｂ５’−Ｚ−ｂ６’のｂ６’部分がハイブリダイズしている。
【００２０】
次のステップ１３では、ステップ１２で得られた結果を検討することにより、転写因子結合位置の決定を行う。いま、図２（ｃ）に示したＤＮＡマイクロアレイ２０のハイブリダイゼーション反応の結果をイメージデータとしてスキャナで読み取り、図５に示すように横軸を遺伝子名、縦軸を蛍光強度とした棒グラフを作成したところ、ｂ１，ｂ２，ｂ５のデータが閾値を超えていたとする。ＤＮＡ結合蛋白質が結合する目的の遺伝子間領域は、隣り合った遺伝子間に存在する。そして、本発明の方法によると、ターゲットはゲノムＤＮＡの隣り合った遺伝子からなる一対のプローブとハイブリダイズするはずである。図５において閾値をこえた遺伝子ｂ１，ｂ２，ｂ５のうちゲノムＤＮＡ上で隣り合っているのはｂ１とｂ２である。従って、図５の結果から、ｂ５は実験誤差に基づくものであり、転写因子Ｘは遺伝子ｂ１と遺伝子ｂ２の間に結合することがわかる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によると、ゲノムＤＮＡの遺伝子間領域をすべて用意し、ＤＮＡマイクロアレイにスポットする必要はなく、遺伝子がスポットしてある市販のＤＮＡマイクロアレイを利用できるようになる。これによって遺伝子間領域のＤＮＡマイクロアレイを新たに作成する必要がなくなり、コストダウンが見込まれる。また、ゲノムＤＮＡ上で隣り合った遺伝子からなる２つのプローブの反応をみることにより、ハイブリダイゼーション反応時に生じる誤差を解消できるため、実験誤差が生じにくい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＤＮＡ結合蛋白質の結合部位検出方法の手順を示すフローチャート。
【図２】図１の各ステップの説明図。
【図３】同一タグで分離されたＤＮＡ断片の集合を示す説明図。
【図４】ハイブリダイゼーション反応のイメージ図。
【図５】ＤＮＡマイクロアレイの反応結果を示す図。
【図６】従来法の説明図。
【図７】ＤＮＡマイクロアレイの反応結果を示す図。
【符号の説明】
１０…ゲノムＤＮＡ、２０〜４０…ＤＮＡマイクロアレイ、５０〜７０…ＤＮＡマイクロアレイ、ａ１〜ａ５…遺伝子間領域、ｂ１〜ｂ５…遺伝子、Ｘ，Ｙ，Ｚ…転写因子及びターゲット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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