(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸イオンを還元可能な物質の存在下で、ポリメチン系色素を作用させることを特徴とする細菌の染色方法。
【請求項２】
亜硝酸イオンを還元可能な物質が、アスコルビン酸およびスルファミン酸からなる群より選択される１以上の化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリメチン系色素が、
【化１】
0003888876.tif 000018
で表される色素である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリメチン系色素を、さらに界面活性剤の存在下で作用させる請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
ポリメチン色素を酸性下で作用させる請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
ポリメチン系色素を、さらに硫酸塩又は硝酸塩のいずれかの無機塩の存在下で作用させる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
（１）試料中の細菌を、亜硝酸イオンを還元可能な物質の存在下で、ポリメチン系色素を作用させて染色し、
（２）得られた試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌の細胞一つ一つに光を照射し、これらの細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
（３）散乱光強度および蛍光強度または粒子の長さを反映するパルス幅によって、前記試料中の細菌を他の成分から分離し、計数する方法。
【請求項８】
工程（１）が、(a)細菌を含む試料を、亜硝酸イオンを還元可能な物質を含む水溶液で希釈し、細菌への色素の透過性を促進させ、
(b)得られた試料をポリメチン系蛍光色素を用いて一定時間染色する工程を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（３）において、（ｉ）前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅、
（ii）前方散乱光強度と蛍光強度、
（iii）前方散乱光パルス幅と蛍光強度の少なくとも１つによって前記試料中の細菌を他の成分から分離し、計数する請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
亜硝酸イオンを還元可能な物質（亜硝酸イオン還元可能物質）と、酸性を維持するための緩衝剤とを含有する細菌染色用希釈液。
【請求項１１】
亜硝酸イオン還元可能物質が、アスコルビン酸およびスルファミン酸からなる群より選択される１以上の化合物である請求項１０に記載の細菌染色用希釈液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌の染色方法、細菌の分類・計数方法及び細菌染色用希釈液に関し、より詳細には、臨床試料中の細菌、とくに好適には尿試料中に存在する細菌の染色方法、細菌の分類・計数方法及び細菌染色用希釈液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中細菌数は感染の有無を判定する上で臨床診断上、重要なパラメーターである。一般的に、尿路感染症(Urinary Tract Infection)の判定基準として、尿中細菌数が１０5個/ml以上出現した場合を陽性とする。また１０3個/ml以下では汚染尿(常在菌)であるとして陰性としている。１０4個/ml程度の場合は判定保留域であるが、再検領域とする場合が多い。
【０００３】
従来から行われている尿中細菌の確認方法としては、グラム染色した後顕微鏡下で確認する、無染色で顕微鏡下で確認する、蛍光染色した後顕微鏡下で確認する等の方法が挙げられる。
尿中には夾雑物と言われる臨床上有用ではない粘液糸、結晶、無晶性塩類、細胞の断片がしばしばみられ、これらが重要な測定粒子(特に細菌）の妨害となり、細菌数を正確に計数することは困難であった。現実的には１０4個/ml程度の菌数を精度良く計数する方法は存在しなかった。
【０００４】
例えば、グラム染色は、細菌と夾雑物が同時に染色されるため、顕微鏡下において数の少ない細菌の見落としが多い。また染色工程が複数あり、染色に時間を要する(約15分)ため、作業効率が悪かった。
無染色鏡検は、方法としては迅速であるが、特に球菌状の夾雑物が出現した場合には菌との弁別が不可能である。
蛍光染色鏡検については、細菌検出性能は上記二つの方法よりも高いが、細菌以外の夾雑物が混入した場合に、それらを効果的に除去し、さらに細菌を迅速に染色する方法については開示されていない。
なお、標準法である寒天培地法の場合は、菌数の測定に１６時間以上要し、迅速とは言い難い。
【０００５】
また、米国特許第４，６２２，２９８号、特開平９−１１９９２６号および特開平９−３２９５９６号には蛍光染色された尿試料をフローサイトメータで測定し細菌を検出する方法が提案されており、蛍光染色にはポリメチン系色素が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、細菌を染色するのにポリメチン系色素を用いた場合、細菌が十分に染色されない場合がある。硝酸還元能力のある細菌が増殖して亜硝酸塩を多量に生産しているような試料の場合、亜硝酸イオンがポリメチン系色素を分解してしまい、細菌の染色のために有効に作用しない。
とくに、酸性ｐＨにおいては、細菌が良く染色され、また尿試料のように粘液糸が共存する場合はその影響を少なくすることができるが、亜硝酸イオンによる影響は、酸性ｐＨにおいて顕著である。
【０００７】
本発明は、試料中に亜硝酸イオンが高濃度で存在しても、細菌を迅速に効率よく検出できるような染色方法、細菌の分類・計数方法及び細菌染色用希釈液を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、亜硝酸イオンを還元可能な物質の存在下で、ポリメチン系色素を作用させることからなる細菌染色方法である。
また、本発明によれば、（１）試料中の細菌を、亜硝酸イオンを還元可能な物質の存在下で、ポリメチン系色素を作用させて染色し、
（２）得られた試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌の細胞一つ一つに光を照射し、これらの細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
（３）散乱光強度および蛍光強度または粒子の長さを反映するパルス幅によって、細菌を分類・計数する方法が提供される。
さらに、本発明によれば、有効量の亜硝酸イオン還元可能物質と、酸性を維持するための緩衝剤とを含有する細菌染色用希釈液が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明を実施する際、試料は、細菌の有無あるいは、細菌が含まれている場合にはその数を計数するためのものであれば、特に制限されず、例えば、尿試料、血液、髄液などの臨床試料のずべてに適用することができる。なかでも、尿試料が有効である。ここで、細菌とは、硝酸還元力をもち亜硝酸を産生する細菌、例えば、Staphyrococcus aureusのような腸内菌、E. coli, Klebsiella sp.又はProteus sp.等のグラム陰性通性桿菌、Staphyrococcus sp., Pseudomonas sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Enterococcus sp., Streptpococcus sp. 及びCitrobacter sp.等が挙げられる。  試料は、例えば、水などによって４〜１５倍、好ましく４〜１０倍程度に希釈されたものでもよい。
【００１０】
亜硝酸イオンを還元可能な物質としては、例えば、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、スルファミン酸、スルファニル酸、アミノメタンスルフォン酸、アミノエタンスルフォン酸、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン、グルタチオン、システイン、メルカプト酢酸、3-メルカプトプロピオン酸、亜硫酸、ピロ亜硫酸、ヒドロキシルアミン、ホスフィン酸及びこれらの塩ならびにスルファニルアミド、アミノメタン、メルカプトエタノール、チオフェノール、尿素からなる群より一種またはそれ以上の物質を組み合わせて選択することができる。塩としては、アルカリ金属塩等が挙げられ、ヒドロキシルアミンの場合には、塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩等が挙げられる。濃度の目安としては、試料を希釈するための希釈液中で、１０ｍＭ以上の濃度で使用でき５０００ｍＭ以下が適当である。具体的には、アスコルビン酸の場合では、８５〜１１５ｍＭ、スルファミン酸では４０〜２００ｍＭ、システイン、グルタチオン及び亜硫酸ナトリウムでは１０〜５０ｍＭ、尿素では０．５Ｍ以上が適当であり、さらに、５Ｍ以下が好適である。尿素は濃度が高すぎると細胞の変性が起こる可能性があるからである。一般に、硝酸還元細菌１０5個／ｍｌ存在下で、亜硝酸イオンが０．０６ｍｇ／ｍｌ産生されるといわれている。また、一般に細菌の増殖は、１０8〜１０9個／ｍｌで上限となり、それ以上に増殖しない（できない）といわれている。そのため、１０5〜１０8個／ｍｌの細菌が産生する亜硝酸イオンを還元できる量が好ましい。
【００１１】
本発明の細菌染色方法において、染色時のｐＨは細菌が染色されるｐＨであれば、特に制限されないが、試料が尿試料の場合、染色時のｐＨを酸性にすることで、（１）細菌が中性やアルカリ性よりも良く染色されること、（２）粘液糸の非特異染色を抑え、かつ粘液糸をある程度溶解させることができるので有利である。
【００１２】
酸性を維持するために、酸あるいはpKa1〜5の緩衝剤を使用することができる。好ましくはpH2.0〜3.0を維持できるものであれば、緩衝剤としては特に限定されないが、好適には、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、グリシン、コハク酸、乳酸、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸及びフマル酸ならびにこれらのアルカリ、アルカリ土類金属塩などが使用できる。使用量は、前記ｐＨ範囲を維持できる量で使用でき、１０〜５００ｍＭの範囲で好適に使用できる。
【００１３】
細菌を効率よく染色するために、細菌の細胞膜（細胞壁）を損傷させて、色素が効率よく入りこめるようにするとよい。例えば、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤等を添加することによってその目的を達成することができる。また、界面活性剤以外でも防菌防腐剤（抗菌剤）、アルコール等の有機溶媒等でも同様の結果が得られる。さらに、例えば、熱による効果やマイクロ波（電子レンジ等）による損傷でも十分な染色性が得られる。なかでもカチオン界面活性剤は、細菌の染色性のみならず、試料中に存在する粘液糸、赤血球、細胞破片等を溶解・収縮することにより細菌の検出への影響を低減する効果が大きいため、好適に用いることができる。
【００１４】
カチオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、以下の式で示される第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【化１１】
0003888876.tif 000002
（式中、Ｒ10は炭素数６〜１８のアルキル基又は（C6H5）−CH2−；Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基またはベンジル基；Ｙ-はハロゲンイオンである）。
【００１５】
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。炭素数６〜１８のアルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。ハロゲンとしては、フッ素、臭素、ヨウ素、塩素が挙げられる。
具体的には、ヘキシルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩が好適に用いられる。
【００１６】
また、カチオン界面活性剤の別の例として、ピリジニウム塩が挙げられる。
[(C5H5)N+−(CH2)n−CH3]Y-    
（式中、nは7〜17、Ｙ-はハロゲンイオンである）。
具体的には、オクチルピリジニウム塩、デシルピリジニウム塩、ドデシルトリメチルピリジニウム塩、テトラデシルトリメチルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルピリジニウム塩等が好適に使用される。
カチオン界面活性剤の濃度は10〜50000mg/ml、好ましくは100〜3000 mg/mlが好適である。
【００１７】
アニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、N-アシルアミノ酢酸塩としてラウロイルサルコシン酸塩、ココイルサルコシン酸塩、ミリストイルサルコシン酸塩、オレイルサルコシン酸塩等が好適に用いられる。
アニオン界面活性剤の濃度は0.1mg/ml〜10mg/ml、好ましくは0.5mg/ml〜5mg/mlが好適である。
【００１８】
両性界面活性剤は、特に限定されないが、好適には以下の酢酸ベタイン系のものがあげられれる。
【化１２】
0003888876.tif 000003
（式中、Ｒ14は炭素数８〜２０のアルキル基；Ｒ15及びＲ16は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数２〜３のアルケニル基又はアルキニル基である）。
【００１９】
炭素数１〜３のアルキル基は上記と同様のものが挙げられる。炭素数２〜３のアルケニル基としては、ビニル、アリル等が挙げられる。炭素数２〜３のアルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等が挙げられる。
具体的には、ドデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、ヘキサデシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン、デシルジメチルアンモニウム酢酸ベタイン等が挙げられる。
両性界面活性剤の濃度は1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは5mg/ml〜20mg/mlが好適である。
【００２０】
ノニオン界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン(n)アルキルエーテルでは、アルキル基の炭素数C10〜C20、n：10〜20のものがあげられる。ポリオキシエチレン(n)アルキルフェニルエーテルでは、アルキル基の炭素数C8〜C10、n：2〜20のもの、例えばPOE(10)オクチルフェニルエーテル等が好適である。
【００２１】
また、上記以外の界面活性剤で膜蛋白を可溶化する性質が認められているものとして、トリトンＸ−100（polyethylene-glycol-mono[p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether）、CHAPS（3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]propanesulfonic acid）、CHAPSO（3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonic acid）、BIGCHAP（N,N-bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide）、deoxy-BIGCHAP（N,N-bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide）、シュクロースモノメルカプレート（sucrose monocaprate）、シュクロースモノコレート（sucrose monocholate）、n-オクチル-α-D-グルコピラノシド（n-octy-α-D-glucopyranoside）、n-ヘプチル-α-D-チオグルコピラノシド（n-heptyl-α-D-thioglucopyranoside）、n-オクチル-α-D-チオグルコピラノシド（n-octyl-α-D-thioglucopyranoside）、n-ドデシル-α-D-マルトピラノシド（n-dodecyl-α-D-maltopyranoside）、n-ノニル-α-D-チオマルトピラノシド（n-nonyl-α-D-thiomaltopyranosider）等が挙げられる。
これらの界面活性剤濃度は、0.5〜50mg/ml、好ましくは1.0〜10 mg/mlが好適である。
【００２２】
さらに、界面活性剤以外のものとして、例えば、防菌防腐剤（抗菌剤）等があげられる。防菌剤としては例えば、イソチアゾリン系防菌剤、ビグアニド系防腐剤が好適に使用される。防菌剤の濃度は、1.0〜30mg/mlが好適である。
アルコール等の有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソブチルアルコール、フェノキシエタノール、メトキシエタノール、エトキシエタノール、ブトキシエタノール等が好適である。これらアルコールの濃度は、1.0〜100mg/mlが好適である。
【００２３】
色素については、細菌を染色できるものであれば特に制限されないが、試料が尿試料の場合には上述の理由により、酸性域で細菌を染色できるものが好ましい。濃度については、色素ごとに好適な濃度は異なるが、例えば、0.1〜100ppm（最終濃度）の範囲で使用できる。なお、細菌の検出能力の点から、使用する色素は、少なくとも細菌を構成する成分の一つと結合し、蛍光を発する蛍光色素を使うのが有利である。この点で、ポリメチン系色素が好ましく、例えば、以下の（１）〜（１１）の色素が使用できる。
【００２４】
（１）チアゾールオレンジ
【００２５】
（２）
【化１３】
0003888876.tif 000004
【００２６】
（３）
【化１４】
0003888876.tif 000005
【００２７】
（４）
【化１５】
0003888876.tif 000006
【００２８】
（５）
【化１６】
0003888876.tif 000007
【００２９】
（６）
【化１７】
0003888876.tif 000008
【００３０】
（７）
【化１８】
0003888876.tif 000009
【００３１】
（８）
【化１９】
0003888876.tif 000010
【００３２】
（９）
【化２０】
0003888876.tif 000011
【００３３】
（１０）以下の一般式で表される化合物：
【化２１】
0003888876.tif 000012
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は炭素数１〜３のアルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）
（１１）以下の一般式で表される化合物：
【化２２】
0003888876.tif 000013
（式中、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｒ7びＲ8は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ9は水素原子、アシル基、又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｚは硫黄、酸素あるいは炭素数１〜３のアルキル基を有する炭素であり；ｎは０、1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００３４】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手できる。（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手できる。（５）〜（９）は、Molecular Probes,Inc.より入手できる。また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に製造方法が記載されている。
【００３５】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化２３】
0003888876.tif 000014
【００３６】
また、（１１）の一般式で示される色素のうち、特に次の色素；
【化２４】
0003888876.tif 000015
が好適である。
【００３７】
さらに、試料が尿試料の場合、硫酸塩または硝酸塩のうちいずれかの無機塩の共存下で染色を行うことで、細菌の蛍光染色性を増大させ、夾雑物の非特異染色を抑制することができるので好ましい。使用量としては、10〜500mM、好ましくは50〜200mMの濃度範囲で使用できる。
【００３８】
本発明の染色法は、試料、亜硝酸イオンを還元可能な物質を含む水溶液、色素を含む溶液を混合することで実施できる。なお、色素は亜硝酸イオンを還元可能な物質を含む水溶液中に含有させてもよいが、使用する色素が水溶液中では不安定な場合には、色素をメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒中に溶解しておき、使用時に亜硝酸イオンを還元可能な物質を含む水溶液と混合するようにしておけば、色素の保存安定性を向上させることができる。
【００３９】
反応温度・時間は特に限定されないが、温度は、１５〜５０℃、時間は、混合直後から１５分間で実施できる。
【００４０】
本発明の染色法により染色された試料は、顕微鏡や画像認識装置で観察して細菌を検出することもできるが、フローサイトメトリによって細菌を高精度で検出・計数することができる。
すなわち、▲１▼細菌を含む試料を、亜硝酸イオンを還元可能な物質を含む水溶液で希釈し、▲２▼該試料をポリメチン系蛍光色素を用いて一定時間染色反応させ、
▲３▼前記工程で処理された試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌の細胞一つ一つに光を照射し、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
▲４▼測定した散乱光及び蛍光の信号強度または、粒子の長さを反映するパルス幅に基づいて細菌と他の成分を分離・計数することによって細菌を検出することができる。
【００４１】
とくに試料が尿試料の場合、細菌以外に様々な成分が共存するため、そのような場合に細菌と他の成分を分離・計数するには、測定によって得られた信号を組み合わせて行うことができる。信号の組み合わせとして例えば、前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅、前方散乱光強度と蛍光強度、前方散乱光パルス幅と蛍光強度の組み合わせが挙げられる。好適には、例えばまず前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅の組み合わせで２次元分布図（スキャッタグラム）を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行い、主に粘液糸を分離し、さらに、ゲーティングされた集団に対して、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで、さらに２次元分布図を作成し、蛍光強度の違いから細菌と他の成分（結晶や細胞の破片など）を分離する。概念図を図４に示す。なお、試料中に細菌のみが含まれる場合には、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで２次元分布図を作成し、細菌を計数することができる。
【００４２】
【実施例】
以下に好適な実施例を示すが、本発明はこれに限定されない。
0003888876.tif 000016
【化２５】
0003888876.tif 000017
【００４３】
亜硝酸イオンを多量に含む試料（細菌濃度5.0×106個／ｍｌ；病院尿）140μに、上記組成の希釈液952μl及び染色液を色素Ａの最終濃度が1ppmになるように添加し、40℃、20秒間反応させ、赤色半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで散乱光及び蛍光の測定を行い（分析尿量8.0μl）、横軸に蛍光強度を、縦軸に前方散乱光強度をとって二次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。結果を図１に示す。対照として、アスコルビン酸を含まない試薬を用いて測定を行った（図２）。
アスコルビン酸を含まない試薬を用いた場合には、細菌が染色されず、蛍光強度が０であったのに対し、アスコルビン酸を添加した場合には、細菌が染色され、検出できることが確認できた。
【００４４】
実施例２
上記実施例の希釈液において、アスコルビン酸の代わりにスルファミン酸１００ｍＭを用いて、同様の測定を行った。結果を図３に示す。実施例１と同様に細菌が染色され検出できることが確認された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の細菌の染色方法によれば、亜硝酸イオンを還元できる物質を添加したので、試料中で、硝酸還元力のある細菌が亜硝酸イオンを産生していてもその影響を受けることなく、細菌を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例１において、還元剤としてアスコルビン酸を使用した場合の蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図２】本発明の実施例１において、還元剤を含まない場合の蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図３】本発明の実施例２において、還元剤としてスルファミン酸を使用した場合の蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の細菌染色法を実施後、細菌を分離・計数する方法を表した概念図である。
【図１】
0003888876.tif 000019
【図２】
0003888876.tif 000020
【図３】
0003888876.tif 000021
【図４】
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