(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンのＨ鎖領域遺伝子座の一部からなるミニ遺伝子座であって、十分に再配列された形態ではない遺伝子セグメントを含み、ヒト由来の免疫グロブリンの一部をコードする外来ＤＮＡを、ヒト以外の動物の生殖系列内に導入することにより、ヒト以外のトランスジェニック動物を生産し、
それにより、前記外来起源のＤＮＡを、免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、あるいはキメラの免疫グロブリン分子をコードする多様な再配列した遺伝子を生産するように、前記トランスジェニック動物のリンパ組織内において再配列または変異させ、
それにより、前記トランスジェニック動物を特定の抗原で攻撃することに続いて、前記再配列または変異されたＤＮＡにコードされた前記特定の抗原に対する前記免疫グロブリンを、前記動物の細胞内または体液内において発現させるステップと、
前記動物の細胞または適当な体液から免疫グロブリンを得るステップと、
を備える、特定の抗原に対する免疫グロブリンを生産する方法。
【請求項２】
前記免疫グロブリンを含むポリクローナル抗体が前記動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリンを含むモノクローナル抗体が前記動物から得られる細胞を用いて生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫グロブリンは前記動物の体液内または分泌液内において生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫グロブリンは前記動物から得られる細胞からインビトロで生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック動物はマウスである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記導入されたＤＮＡは単数のプラスミドまたはコスミド、複数のプラスミドまたはコスミド、酵母人工染色体、またはＤＮＡの断片を構成要素として含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡは受精卵に注射または他の方法により導入される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記動物は免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝物質を最初は保有していない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
この発明は抗体（または免疫グロブリン）の生産に関するものである。
【０００２】
【発明の概要】
この発明の１つの局面に従えば、外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするかまたは免疫グロブリンのレパートリーをコードするために再配列し得る遺伝物質をその生殖系列に挿入されたトランスジェニック動物の細胞または体液から免疫グロブリンを得ることを含む、免疫グロブリンを生産する方法が提供される。
【０００３】
外来起源の免疫グロブリンは、異なった動物源から誘導される免疫グロブリンを意味する。たとえばトランスジェニック動物がマウスの場合、挿入される遺伝物質は、たとえばヒトのようなマウス以外の起源のものである。
【０００４】
挿入される遺伝物質は、動物源から生産されてもよく、または人工合成により生産されてもよい。材料は、知られた免疫グロブリンの少なくとも一部をコードしてもよく、または改変された免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするよう修飾されてもよい。これらのプロセスのための適当な技術はよく知られている。
【０００５】
挿入された遺伝物質はトランスジェニック動物において発現することができ、少なくとも一部は挿入された材料から誘導される免疫グロブリンの生産をもたらす。遺伝物質はトランスジェニック動物において再配列され、それにより、たとえ挿入された遺伝物質が生殖系列において間違った位置にまたは間違った形態構造で組込まれたとしても、挿入された遺伝物質からの一つの部分または複数の部分で免疫グロブリンのレパートリーが生産され得ることが見出された。挿入された物質の性質によって、動物は、たとえば混合されたマウス／ヒト起源のキメラの免疫グロブリンを生産し得、そこでは外来起源の遺伝物質は免疫グロブリンの一部だけをコードする。あるいは動物は、たとえばまったくヒト起源の、完全に外来の免疫グロブリンを生産し得、そこでは外来起源の遺伝物質は、免疫グロブリン全体をコードする。ヒトでの使用に適する可能性のある治療上有益な免疫グロブリンは、こうしてこの発明の使用によって生産できる。
【０００６】
ポリクローナル抗血清が、免疫感作に続いてトランスジェニック動物から生産されてもよい。その代わりに、たとえば骨髄腫細胞と動物からの脾臓細胞を融合しかつ所望の抗体を生産するものを選択するために結果として生じたハイブリドーマをふるい分けることによって、モノクローナル抗体がトランスジェニック動物から生産されてもよい。このようなプロセスのための適当な技術は当業者によく知られている。
【０００７】
代替のアプローチにおいて、遺伝物質は、血清のような体液または乳汁、初乳もしくは唾液のような動物の外部分泌物において所望の抗体が産出されるように動物に組込まれてもよい。たとえば、外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝物質を乳タンパク質をコードする哺乳動物の遺伝子にインビトロで挿入し、かつそれから、たとえば注入によって、その遺伝子を哺乳動物の受精卵に導入することによって、その卵は、少なくとも一部は挿入された遺伝物質から誘導される免疫グロブリンを含む乳汁を生産する成熟した雌の哺乳動物に発育することができる。次いで所望の抗体が乳汁から採収できる。このようなプロセスを実施するための適当な技術は当業者に知られている。
【０００８】
別の可能な方法は、遺伝物質の挿入後動物によって生成された免疫グロブリン生産細胞を動物から除去した後、対象の免疫グロブリンを生産する細胞をインビトロで選択することを含む。次いで免疫グロブリンは知られた態様において選択された細胞からインビトロで生産できる。
【０００９】
トランスジェニック動物はその後動物に導入される免疫原に応答してキメラのまたは外来の免疫グロブリン（挿入された遺伝物質から誘導される）を生産できるということが発見された。したがって、免疫グロブリンの種特異的な全領域を実質的にコードする外来の、たとえばヒトの遺伝物質を導入することによって、動物に導入される任意の抗原に対して外来の免疫グロブリンを生産するよう動物を刺激することが可能になり得る。こうしてトランスジェニック動物は、広範囲の抗原に対するヒトの免疫グロブリンの非常に有益で、便利でかつ価値のある源を提供することができるであろう。
【００１０】
しかしながら、挿入される遺伝物質は、うまく再配列させるために近接ゲノムに組込まれるということが重要であるかもしれない。そこで、挿入される遺伝物質はプラスミドおよびコスミドのような原核生物のベクタにクローン化されたＤＮＡの形態とすることができる。複数のプラスミドまたはコスミドもまた使用されてもよく、しかしこれらがゲノム上に近接して組込まれることがおそらく必要である。酵母の人工染色体ベクタを使用することによって（１９８７年、バーク（Burke)、ＤＴ、カール（Carle)、ＧＦおよびオルソン（Olson)、ＭＶの「人工染色体ベクタによる酵母への外因性ＤＮＡの大きなセグメントのクローニング」(Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artifical chromosome vectors)サイエンス(Science) 、２３６号、８０６頁ないし８１２頁を参照）、または染色体断片の導入によって（リッチャー（Richer) 、ＪおよびＬｏ、ＣＷ、１９８９年「全裂ヒト染色体断片の注入によるヒトＤＮＡのマウス卵への導入」(Introduction of human DNA into mouse eggs by injection of dissected human chromo some fragments) サイエンス（Science)２４５号、１７５頁ないし１７７頁を参照）、より大きいＤＮＡ断片を挿入することもまた可能であると判明し得る。
【００１１】
挿入される遺伝物質は、たとえば受精卵または胚幹細胞への注入または他の方法による従来の態様で宿主に導入することができる。
【００１２】
初めは免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝物質を持たない宿主動物を使用することが便利となり得、それにより得られるトランスジェニック動物は、免疫グロブリンを生産するとき、挿入された外来の遺伝物質だけを使用するであろう。これは、関連する遺伝物質を欠く自然に発生した突然変位体宿主を使用することによって、または関連する遺伝物質が取り除かれた宿主を最後に作るために、突然変位体をたとえば細胞系において人工的に作ることによってのどちらかで達成され得る。
【００１３】
宿主動物が免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝物質を持つ場合、トランスジェニック動物は、本来生じる遺伝物質および挿入された遺伝物質を持つであろうし、かつ本来生じる遺伝物質、挿入された遺伝物質および遺伝物質の両方の型の混合物から誘導される免疫グロブリンを生産するであろう。この場合において、所望の免疫グロブリンは、トランスジェニック動物から誘導されるハイブリドーマをふるい分けることによって、たとえば示差的染色体喪失または抗体遺伝子発現の対立遺伝子排除の現象を活用することによって得ることができる。
【００１４】
さらに他の局面において、この発明は、特にヒト以外の哺乳動物のトランスジェニック動物を生産し、その動物は、その生殖系列に外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするか、または免疫グロブリンのレパートリーをコードするために再配列できる遺伝物質を挿入されたものである。
【００１５】
この発明はまた、その範囲において、この発明に従うトランスジェニック動物から生産されたまたはこの発明の方法によって生産された免疫グロブリンも含む。
【００１６】
１つの例において、生殖系列配置免疫グロブリンＶＨ遺伝子、Ｄセグメントのいくつか、およびすべてのＪＨおよびＣｍｕ遺伝子セグメントを含み、その生殖系列に導入されたＤＮＡセグメントを持つトランスジェニックマウスの系統が確立された。ＶＨ遺伝子の１つ、すべてのＪＨセグメントおよびＩｇＭ抗体の分泌されるＨ鎖定常領域をコードするエキソンは、ヒト起源であり、残りの物質はマウス起源であった。遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスのリンパ組織において生産的ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合を受け、血清において結果として生じるヒト／マウスキメラのＩｇＭ抗体の合成を伴う。
【００１７】
免疫感作に続いて、ＮＳＯ骨髄腫とトランスジェニックマウスからの脾臓細胞との間での融合によりハイブリドーマが確立された。ハイブリッドの多くはヒトキメラのＩｇＭモノクローナル抗体を分泌する。したがって、トランスジェニックマウスのこれらの系統は、キメラのヒト抗血清またはモノクローナル抗体の生産のために使用できる。
【００１８】
さらに、マウスは、ヒト抗原による免疫感作に続いて、導入された抗原に対してキメラの抗体を生産する応答をし、したがってこのアプローチはヒトのおよび異種の抗原に対して向けられる通常のヒトのまたはキメラのヒト抗体のレパートリーを生産するためにも有益であることが判明するはずであり、なぜならトランスジェニックマウスはヒト抗原の決定基に対して寛容でないであろうからである。
【００１９】
別の例においては、ヒトＶＨ、Ｄ、ＪＨおよびＣｍｕ配列を独占的に持つトランスジェニックマウスが、受精マウス卵にヒトＶＨ遺伝子、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣｍｕ定常領域を含むコスミドを注入することによって生産された。得られたマウスは、マウスＩｇＭが約２００ｕｇ／ｍｌで存在する状態で、その血清においてヒトｍｕ鎖を含む抗体を１０〜１００ｕｇ／ｍｌの間で生産した。
【００２０】
【実施例】
この発明はさらに添付の図面に関連する以下の例において例示として説明される。
【００２１】
例１
トランスジーン
図１において示される構造を有するプラスミドＤＮＡがマウス卵に注入された。この図において、ヒト配列は塗りつぶされた棒によって表わされ、マウス配列は塗りつぶされていない棒によって表わされ、ベクタは交差する斜線が引かれた棒によって表わされ、かつＤ要素は斜線が引かれた棒によって表わされる。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位は以下のように、ＢｇｌＩＩがＢｇに、ＰｖｕｌがＰに、ＥｃｏＲＩがＲに、ＫｐｎｌがＫに、ＢａｍＨＩがＢに、ＸｂａＩがＸに、ＨｉｎｄＩＩＩがＨに略されている。
【００２２】
成分たるＤＮＡセグメントの起源は以下のとおりである。
ベクタ  充填されたＮａｒＩ部位にクローン化されたＢｇｌＩＩリンカを含むｐＵＣ１２誘導体のＥｃｏＲＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間に全「ミニＩｇＨ遺伝子座」がクローン化された。
【００２３】
ＶＨ遺伝子  ミニ遺伝子座においては２つのＶＨ遺伝子がある。ＶＨ２６は、ヒト起源のものでありかつファージラムダＶＨ２６からＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ０．８５Ｋｂ断片として得られた（１９８０年、マティセンズ・アンド・ラビッツ(Matthyssens & Rabbitts)ＰＮＡＳ、７７巻、６５６１頁ないし６５６５頁）。ＶＨ−１８６．２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの生殖系列ＶＨ遺伝子であり、かつ２．５ＫｂのＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片として得られた（ボースウェル（Bothwell) 、パスキンド(Paskind) 、リース(Reth)、イマニシ−カリ（Imanishi-Kari)、ラジェウスキ(Rajewsky)およびバルチモア(Baltimore) １９８１年、セル(Cell)、２４巻、６２５頁ないし６３７頁）。
【００２４】
Ｄセグメント  ＢＡＬＢ／ｃマウスＤ−Ｑ５２要素は、２２１ ｎｔ ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片として得られた。Ｍ１３ｔｇ１３１のＳａｃＩ部位とＳａｌＩ部位との間でのクローン化に続き、オリゴヌクレオチド
５′−ＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１）、または５′−ＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２）
のどちらかでの位置指定突然変異誘発が、マウスＳＰ２およびＦＬ１６系統群のものにそれぞれ関連するＤ要素をもつＭ１３ｔｇ１３１クローンをつくるために使用された。これらのＤ系統群はマウスおよびヒトの両方において見出される。別のＤ要素−ヒトＤ−Ｑ５２−はヒトＪＨクラスタ（以下を参照）内において含まれた。
【００２５】
ＪＨクラスタ  ６つの機能的なヒトＪＨセグメント、３つの擬似ＪＨおよびヒトＤ−Ｑ５２要素を含む、ヒトＤＮＡからの３．５Ｋｂ  ＢｇｌＩＩ断片が使用された（ラベッチ(Ravetch) 他、１９８１年、セル(Cell)、２７巻、５８３頁ないし５９１頁）
ＩｇＨエンハンサ  ヒトＩｇＨエンハンサの部分は、ＪＨクラスタを含むＢｇｌＩＩ断片内に含まれる。マウスエンハンサの完全な複製物は１Ｋｂ  ＸｂａＩ断片内に含まれる。
【００２６】
Ｓ（スイッチ）領域およびＣｍｕ領域  ヒトＤＮＡの７．５Ｋｂ  Ｘｂａｌ断片がｍｕＳ（スイッチ）領域およびｍｕＨ鎖定常領域のエキソン１〜４を含む。ｍｕ膜エキソンおよびＣｍｕ４エキソンとＣｍｕＭｌ膜エキソンとの間のイントロンの塊が、マウスｍｕＣＨ遺伝子の２．５Ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片によって与えられ、そこにおいてＳｐｈＩ部位はリンカの使用によってＢｇｌＩＩ部位に変換された。
【００２７】
トランスジェニックマウス
プラスミドＤＮＡはＢｇｌＩＩで線状にされ、アガロースゲルにおける電気泳動の後精製されかつ既に説明されているようにＣ５７ＢＬ／６Ｊ×ＣＢＡ／Ｃａマウスの受精卵の雄性前核の中に注入された（レイク(Reik)他、１９８７年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur.J.Immunol.)１７巻、４６５頁ないし４６９頁）。尾部ＤＮＡのサザンブロット分析が、生まれた３２匹のマウスのうち１２匹がミニ遺伝子座を持っていたことを明らかにした。最終的な研究は、それらすべてがミニ遺伝子座の少数の複製物（２ないし５）を持つ３匹の基礎となるマウス−ＨＩｇ１７、１９および２９の子孫において行なわれた。
【００２８】
血清のアッセイ
基礎となるマウスの血清は、ヒトＩｇＭの抗原決定基特性を含む抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより検査された。免疫感作されていないトランスジェニックマウスは、それらの血清において１０〜１００ｕｇ／ｍｌの間でキメラのヒトＩｇＭを含むことが判明した。末梢血におけるリンパ球の蛍光抗体分析もまた、ビオチニル化された種特異的な抗ヒトＩｇＭ抗体およびフルオレセイン結合されたストレプトアビジンによる細胞染色の存在を明らかにした。
【００２９】
トランスジェニックマウスからのハイブリドーマ
トランスジェニックマウスは、ヒト赤血球細胞またはヒツジ赤血球細胞のどちらかで腹膜内で免疫処置された。脾臓が免疫感作の後様々な時期に取り除かれ、ＨＡＴ培地において選択されたハイブリッドおよびＮＳＯ骨髄腫を用いて融合が行なわれた。これらのハイブリッドの多くはＥＬＩＳＡアッセイによって明らかにされるとおりキメラのヒトＩｇＭを作った。
【００３０】
ミニ遺伝子座のＤＮＡ再配列
ハイブリドーマからと同様にトランスジェニックマウスからの組織からのＤＮＡのサザンブロット分析は、トランスジェニックマウスのリンパ組織におけるミニＩｇ遺伝子座内において高頻度のＤＮＡ再配列があることを明らかにした。
【００３１】
トランスジェニックマウスから確立された組織またはハイブリドーマからのＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化され、かつミニ遺伝子座におけるヒトＪ６要素とマウスＩｇＨエンハンサとの間の領域に対してハイブリッド形成するヒトＩｇＨエンハンサプローブ（ＢａｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片）とハイブリッド形成された。ＤＮＡのサザンブロット分析の結果は図２に示される。標識断片のＫｂによるサイズが図に与えられている。
【００３２】
ミニ遺伝子座の転写
トランスジェニックマウスからのハイブリドーマからのまたはＮＳＯ融合のパートナーからの細胞質ＲＮＡ（５ｕｇ）が、ヒトＣｍｕ、ヒトＶＨ２６またはマウスＶＨ１８６プローブでプローブされた。細胞質ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果は図３に示され、それは、ハイブリドーマがＶＨ２６、ＶＨ１８６Ｖ遺伝子のどちらかまたは両方に対すると同様にヒトｍｕに対するプローブとハイブリッド形成するｍＲＮＡを含んでいたことを明らかにしている。こうしてヒトＶＨ２６およびマウスＶＨ１８６の両方は再配列できかつ従ってキメラのヒトＩｇＭ抗体を分泌する細胞系を造ることができる。
【００３３】
トランスジェニックマウスからのハイブリドーマによる抗体分泌
クローン化されたハイブリドーマ細胞系によるタンパク質生産は、Ｌ−［3 5 Ｓ］メチオニンによる生合成標識の使用およびその後の抗ヒトｍｕ抗血清での精製により分析された。特に、細胞は、Ｌ−［3 5 Ｓ］メチオニンおよび免疫沈降により培養上澄みから精製されたＩｇＭ抗体ならびに抗ヒトｍｕ抗血清を含む培地にてひと晩インキュベートされた。トランスジェニックハイブリドーマ３５．５および２４ａの上澄みからの精製は、図４において「＋」によって示されるように非放射性の、精製されたマウスモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｂ１−８）の大過剰（５０ｕｇ）の存在下で達成された。マウスＩｇＭ分泌細胞系を使用して見られるように、抗ヒトｍｕ抗血清はマウスｍｕと交差反応するが、この交差反応は非放射性のマウスＢ１−８ＩｇＭ抗体によって競争され得る−図４の左の４つのレーンを参照。
【００３４】
これは、異なったヒトｍｕ鎖を有する抗体を分泌するこれらのトランスジェニックマウスからのハイブリドーマを確立することが可能であることを示す。
【００３５】
例２
それらの体液および外部分泌物において特異的な抗体を生産するトランスジェニック動物をつくることができる。例示として、この例は、抗原特異的キメラのヒトＩｇＡ２抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子をそれらの生殖系列に組込まれて保有するトランスジェニックマウスに関するものである。
【００３６】
図５に示されているＤＮＡの生殖系列組込み物を保有する９つのトランスジェニックマウス系統が確立された。図５において、太く塗られた線はマウスＩｇＤＮＡを示し、斜線が引かれた部分はヒトＤＮＡを、空白の部分はマウスＩｇＨおよびＳＶ４０エンハンサを、かつ細く塗られた線はｐＳＶ２ｇｐｔベクタを示す。制限部位の略語は図１と同様である。プラスミドは、既に説明されているｐＳＶ−ＶＮＰＨα２の誘導体であり（ブルゲマン(Bruggemann)他、J.Exp.Med 、１９８７年、１６６巻、１３５１頁ないし１３６１頁）かつマウスＨＯＰＣ２０２０形質細胞腫の再配列されたラムダ１遺伝子を含む７．４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片を含んでいる（バーナード(Bernard) 他、１９７８年、セル(Cell)１５巻、１１３３頁ないし１１４０頁）。プラスミドＤＮＡは、ベクタにおけるＰｖｕＩ部位において線状にされ、既に説明されているようにトランスジェニックマウスが誘導された（レイク(Reik)他、Eur. F. Immunol 、１９８７年、１７巻、４６５頁ないし４６９頁）。
【００３７】
トランスジェニックＩｇＡ２ラムダ抗体は、ハプテン４−ヒドロキシ−３−ニトロフェンアセチル（ＮＰ）に対して特異性を有する。トランスジェニック抗体の発現は、プラスチックプレートに結合されたＮＰウシ血清アルブミンを使用しかつビオチニル化された抗ヒトアルファ抗血清で展開するＥＬＩＳＡアッセイによって測定された。Ｉｇ全体は、抗マウスＩｇ被覆されたプラスチックを使用しかつビオチニル化された抗マウスカッパ抗血清で展開して測定された。キメラの抗ＮＰＩｇＡ２の濃度は、７匹のトランスジェニックマウスおよび１匹の対照マウスからの初乳、血清および乳汁において測定され、その結果は表１に示される。初乳は出産から２４時間以内にホルモン注射に続いて母親からとられ、かつ乳汁は同腹子が生後１３〜１５日目であったとき母親からとられ、血清は乳汁と同じときに得られた。
【００３８】
これらのデータから、トランスジェニック動物は、特定の抗体の生産のために使用することができ、そして特定の有用な抗体が混ざった乳汁を生ずる動物の繁殖が可能になるとともに、乳汁、初乳、血清、唾液等からの大規模な生産が可能になるということが明らかである。トランスジェニック抗体の濃度は乳汁においてよりも初乳においての方がより高いということもまた明らかである。さらに、トランスジーンの存在は、大量の内因性の抗体を作るという動物の能力に影響を及ぼさない。動物は著しく免疫不全または不健康な状態の徴候を示さない。
【００３９】
例３
この例において、トランスジェニックマウスからヒトｍｕ鎖を使用して抗原特異的ハイブリドーマが生産された。例１に記載されるトランスジェニックマウスが、抗原結合部位に対するＨ鎖の寄与がトランスジェニックヒトＨ鎖ミニ遺伝子座によってもたらされる抗原特異的抗体を生産するために使用できることを示すために、該トランスジェニックマウスは１０7 のヒツジ赤血球（ＳＲＣ）で免疫処置された。脾臓細胞が６日後ＮＳＯ形質細胞腫と融合された（ケーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)、ネイチャ(Nature)、２５６号、４９５頁ないし４９７頁、１９７５年）。細胞は、予期される播種頻度がウェルあたり１ハイブリドーマであるように９６−ウェルコスタープレートで培養された。ヒトｍｕ陽性ハイブリッドが、ビオチニル化された抗ヒトＩｇＭを使用しＥＬＩＳＡにおいて検出された。抗原特異的ハイブリッドは、ヒツジ赤血球を使用し赤血球凝集において同定された。ＥＬＩＳＡによって決定されたように、ヒツジ赤血球に特異的な抗体を含み、かつヒトｍｕを含み、しかしマウスｍｕまたはマウスガンマＨ鎖のどちらも含まないウェルが選ばれた。
【００４０】
選択されたハイブリドーマによって分泌される抗体が本当にヒトｍｕ／マウスＬ鎖抗ＳＲＣ免疫グロブリンであることを示すために、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）における分析が使用された。ＦＡＣＳ分析のために、１０7 のヒツジ赤血球が３０分間２０ｕｌ培養上清とともにインキュベートされ、リン酸塩緩衝生理食塩水で一度洗われ、さらにビオチニル化された抗ヒトｍｕＨ鎖抗血清、ビオチニル化された抗マウスｍｕ抗血清またはビオチニル化された抗マウスカッパＬ鎖抗血清のどれかとともにインキュベートされた。３０分後細胞は、前のように洗われ、かつＦＩＴＣ結合されたストレプトアビジンとともにインキュベートされた。細胞は３０分後に洗われ、ゆるやかな破壊の後、分析のための用意ができた。
【００４１】
ヒツジ赤血球抗原に対して向けられるＩｇＭを生産する３つの異なったハイブリッドに対する結果が図６、図７および図８のＦＡＣＳヒストグラムにそれぞれ示されている。
【００４２】
これらの図における文字Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは異なった染色を表示する。図６Ａ、図７Ａ、図８Ａは、ヒツジ赤血球だけ、抗体とともにインキュベートされたヒツジ赤血球、またはフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）第２の抗体（抗ヒトｍｕ抗マウスｍｕ、抗マウスカッパのどれか）とともにインキュベートされたヒツジ赤血球を使用した陰性のコントロールに対する結果である。図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂは、ハイブリッド培養上清およびフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）抗ヒトｍｕとともにインキュベートされたヒツジ赤血球を使用した結果である。図６Ｃ、図７Ｃ、図８Ｃは、トランスジェニックハイブリッドからの培養上清およびフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）抗マウスｍｕとともにインキュベートされたヒツジ赤血球を使用した結果である。図６Ｄは、ハイブリッド培養上清およびフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）抗マウスカッパとともにインキュベートされたヒツジ赤血球を使用した結果である。
【００４３】
図６および図８において細胞の固定数の蛍光強度が細胞数に対してプロットされる。図７においては、細胞の固定数の蛍光強度が散点に対してプロットされ、各点は細胞を表わす。
【００４４】
プロファイルの右へのシフト（増加される蛍光）は、ヒトｍｕＨ鎖およびマウスカッパＬ鎖を含む抗体に対してのみ見ることができるが、マウスｍｕＨ鎖またはマウスガンマＨ鎖を含む抗体に対しては見ることができない（図示せず）ポジティブ染色を示している。
【００４５】
0003871997.tif 000002
【配列表】
0003871997.tif 000003
0003871997.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドＤＮＡの構造を表わす図である。
【図２】  図１のＤＮＡが生殖系列に組込まれたトランスジェニックマウスから誘導されるハイブリドーマからのおよび組織からのＤＮＡのサザンブロット分析を表わす図である。
【図３】  トランスジェニックマウスからのハイブリドーマからの細胞質ＲＮＡのノーザンブロット分析を表わす図である。
【図４】  トランスジェニックマウスから確立されたハイブリドーマの２つによって分泌された免疫グロブリンの分析を表わす図である。
【図５】  ＩｇＡラムダプラスミドＤＮＡの構造を表わす図である。
【図６】  細胞数に対してプロットされた細胞の固定数の蛍光強度を示す一連のＦＡＣＳヒストグラムを表わす図である。
【図７】  散点に対してプロットされた細胞の固定数の蛍光強度を示す一連のＦＡＣＳプロファイルであり、各点は細胞を表わす図である。
【図８】  図６と同様のさらに他の一連のＦＡＣＳヒストグラムを表わす図である。
【図１】
0003871997.tif 000005
【図２】
0003871997.tif 000006
【図３】
0003871997.tif 000007
【図４】
0003871997.tif 000008
【図５】
0003871997.tif 000009
【図６】
0003871997.tif 000010
【図７】
0003871997.tif 000011
【図８】
0003871997.tif 000012