(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ細胞ＬＡＭ−ＪＡ（１１Ｈ２．Ｆ９．Ｃ４）（国際寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２４２２）。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマ細胞に由来するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体を含む、体液またはコンパートメントにおけるテルビナフィン組織濃度および分布の測定のための免疫アッセイキット。
【請求項４】
爪におけるテルビナフィン組織濃度および分布の測定のための請求項３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体に関する。
【０００２】
本発明は、テルビナフィン(ラミシール(登録商標))、すなわち、遊離形または塩形、特に塩酸塩形の式Ｉ
【化１】
0003973424.tif 000002
の(Ｅ)−Ｎ−(６,６−ジメチルヘプタ−２−エン−４−イニル)−Ｎ−メチル−１−ナフタレンメタンアミンに対するモノクローナル抗体−以後簡単に“本発明の抗体”と呼ぶ−に関する。
【０００３】
テルビナフィンは経口および局所製剤の両方で、特に、皮膚、爪および髪の真菌感染の処置のために世界中に販売されている抗真菌剤である。臨床的に使用される他の抗真菌剤と化学的におよび機構的に区別される、代表的なアリルアミンクラスの合成抗真菌剤である。
【０００４】
テルビナフィンの利点の一つはその非常に低い免疫原性である。したがって、数年間販売されているが、それに対する強い免疫応答を記載した文献があるという報告は現在までない。これは臨床的利点であるが、免疫学的方法による医薬の検出を、免疫応答を促進するために免疫原性タンパク質に結合したときでさえ、困難にする。
【０００５】
更に、その広範な使用の観点から、患者の体液、組織またはコンパートメント（compartment）、例えば血清や爪におけるテルビナフィンの容易かつ迅速な検出を可能にする単純な免疫アッセイ法の開発が非常に望まれる。例えば、処置に失敗した患者（デルマトフィトーマ）におけるテルビナフィンの血液または爪におけるレベルのモニタリングは、爪真菌症における有益な薬理学的活性に十分な最少レベルを維持するための、投与量の細かい調節および作用形態の良好な理解に非常に望まれる。しかしながら、テルビナフィンを認識するモノクローナル抗体についての報告は、これまで存在していない。これは、恐らく上記の医薬の低い免疫原性のために、そのような抗体の製造に固有の困難性によるものであろう。
【０００６】
免疫原性タンパク質に共有結合的に結合するテルビナフィンの誘導体を使用して、テルビナフィンに驚くほど感受性の、テルビナフィンに対するモノクローナル抗体が製造できることが判明した。
【０００７】
このような誘導体は、例えばテルビナフィンの代謝産物または更に構造的に密接に関係する誘導体である。
テルビナフィンのエフェクター部分上のエピトープを認識するテルビナフィンに対するモノクローナル抗体が、それ自体薬理学的に不活性なテルビナフィンの代謝誘導体を使用して得ることができることも判明した。
【０００８】
したがって、本発明はテルビナフィン検出および投与のための免疫学をベースにした方法、例えば、ネガティブおよびポジティブサンプルの間のアッセイの区別の程度、すなわち、二つのシステムの相対的親和性に関して、非常に感受性であり特異的であるテルビナフィンのアッセイ(下記実施例参照)を可能にする。
【０００９】
本発明の抗体は、適当な動物、例えばマウスに、免疫原、例えば、免疫原性タンパク質に共有結合的に結合したテルビナフィンの適当な誘導体の免疫原性接合体を接種することにより調製する。これは、慣用法で、例えば、Koehler and Milstein (Nature 256 [1975] 495-497)に記載のものに沿って行ない得る。工程は、簡便に免疫原性接合体の投与、接合体に感受性の抗体産生細胞の回収、抗体産生細胞の、例えば、適当なミエローマとの融合による不死化、得られた不死化細胞系の選択およびそこからの得られた本発明の抗体の回収を含む。
【００１０】
免疫原性タンパク質は、例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、卵白アルブミン(ＯＶＡ)またはキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)である。
【００１１】
本発明の抗体は、慣用の方法で、例えばテルビナフィンとその代謝物および誘導体とを区別する能力により、例えば相対的交差反応性を決定することにより、スクリーニングおよび特徴付けされる。それらは更に他の既知の抗菌剤、例えばアゾールまたはアンホテリシンＢに対する相対的結合親和性により特徴付けされてもよい。交差反応性は、テルビナフィンおよび下記代謝誘導体１）から５）に対する抗体応答の測定およびテルビナフィンとその代謝誘導体を区別する能力により決定される［The Immunoassay Handbook, D. Wild, Ed. (1994), Stockton Press, p. 89］。相対的交差反応性は、シグナルの低下がアナライトの非存在下におけるシグナルの５０％に対応する点における、５０％を与えるアナライトの濃度（５０％のＢ／Ｂ０比）であって、シグナルの同じ低下を与えるアナライト濃度％として表される。
【００１２】
テルビナフィンの以下の誘導体を製造する：
１)(Ｅ)−２,２−ジメチル−７−[メチル(ナフタレン−１−イルメチル)アミノ]ヘプタ−５−エン−３−イン酸、すなわち、Pestic. Sci. 31 (1991) 437-455の４４３頁の化合物XXIX、以後簡単に“カルボキシ−テルビナフィン”と命名；
２)(Ｅ)−Ｎ−(６,６−ジメチルヘプタ−２−エン−４−イニル)−１−ナフタレンメタンアミン、すなわち、Arzneim. F./Drug Res. 39 (1989) 527-532の５２８頁の化合物(２)、以後簡単に“デスメチル−テルビナフィン”と命名；
３)(Ｅ)−２,２−ジメチル−７−[メチル(ナフタレン−１−イルメチル)アミノ]ヘプタ−５−エン−３−イン−１−オール、すなわち、Pestic. Sci.(前掲)の４４３頁の化合物XXX、以後簡単に“ヒドロキシ−テルビナフィン”と命名；
４)(Ｅ)−２,２−ジメチル−７−[(ナフタレン−１−イルメチル)アミノ]ヘプタ−５−エン−イン酸、すなわち、Arzneim. F./Drug Res.(前掲)の５２８頁の化合物(４)、以後、簡単に“デスメチル−カルボキシ−テルビナフィン”と命名；
および
５)(Ｅ)−２,２−ジメチル−７−[(ナフタレン−１−イルメチル)アミノ]ヘプタ−５−エン−イン−１−オール、すなわち、Pestic. Sci.(前掲)の４４３頁の化合物XXXII、以後簡単に“デスメチル−ヒドロキシ−テルビナフィン”と命名。
【００１３】
誘導体は遊離形または塩形、例えば、塩酸付加塩形であり得る。テルビナフィンの特に適した誘導体は上記カルボキシ−テルビナフィンである。
【００１４】
出発物質および中間体化合物は、既知であるかまたは実施例に記載のまたは類似の方法で製造できる。
【００１５】
カルボキシテルビナフィンのＢＳＡタンパク質接合体で免疫化したマウスにおけるＰＡＩ−０ミエローマから製造されるLAM-JA(11H2.F9.C4)と命名されるハイブリドーマ細胞系(下記実施例１参照)は、ブダペスト条約の下、１９９９年１１月２５日にDeutsche Sammlung con Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託しており、受託番号DMS ACC2422を付されている。
【００１６】
本発明は、したがってまた：
−テルビナフィンのエフェクター部分上のエピトープを認識する、特にテルビナフィンを認識する本発明の抗体；
−カルボキシ−テルビナフィンから製造される本発明の抗体；
−ハイブリドーマLAM-JA(DSM ACC2422)から製造される本発明の抗体；
−本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマ；
−ハイブリドーマLAM-JA(DSM ACC2422)；
−免疫原に共有結合的に結合したテルビナフィンの誘導体を含む、本発明の抗体の製造に適した免疫原接合体；
−適当な動物に免疫原に共有結合的に結合したテルビナフィンの適当な誘導体の免疫原性接合体を投与し、接合体に感作された抗体産生細胞を回収し、抗体産生細胞を不死化し、得られた不死化細胞系を選択し、そしてそこから得られた抗体を回収することを含む、本発明の抗体の産生法；
−本発明の抗体を含む、体液またはコンパートメント、特に爪におけるテルビナフィン組織濃度および分布の測定のための免疫アッセイキット
に関する。
【００１７】
以下の実施例は本発明を説明する。全ての温度は摂氏である。化合物は特記しない限り遊離塩基形である。以下の略語を使用する：
0003973424.tif 000003
【００１８】
実施例１：カルボキシ−テルビナフィンのタンパク質接合体
４.０２mgカルボキシ−テルビナフィン(ｍ.ｐ.  １１８−１２０°)を２００μlのＤＭＳＯに溶解し、８００μlの接合緩衝液(Imject(登録商標)EDC Conjugation Kit, Pierce)をハプテン溶液に注意深く添加する。５００μlのこの混合物をＢＳＡまたはＯＶＡの適当なタンパク質溶液(タンパク質濃度２mg／ml)に激しく撹拌しながら滴下する。得られるタンパク質−ハプテン溶液(５００μl)の各々を１０mg  ＥＤＣに添加する。反応混合物を３時間室温で撹拌し、得られた接合体を４°で４ｌのＰＢＳに対して、２回２４時間にわたり透析することにより精製する。得られた接合体(テルビナフィン−ＯＶＡ；テルビナフィン−ＢＳＡ)を分け、−１８°に貯蔵する。
【００１９】
実施例２：モノクローナル抗体の製造
雌Balb/Cマウス（２０−２５ｇ）の各々に対し、実施例１に従ってＯＶＡに共有結合させたカルボキシ−テルビナフィン接合体１００μｇを、完全フロイントアジュバント中、ｉ.ｐ.注射により投与する。５および１０週後、最初の半量の免疫原性接合体の不完全フロイントアジュバント乳化物を含む第１および第２ブーストを、ｉ.ｐ.注射により投与する。直接ＥＬＩＳＡ（下記参照）を使用して動物血清中の抗原に反応性の抗体の存在を確認する。１３週後、マウスに対してｉ.ｐ.注射により第３ブーストを投与し、１０日後、５０μｇの抗原を含むブースター注射を、ｉ.ｖ.で−３、−２および−１日目に投与する。＋１日目にマウスを殺し、脾臓細胞を単離し、例えばＰＡＩ−０細胞または他の適当なミエローマ細胞と融合させる。得られたハイブリドーマを培養し、テルビナフィンに対する高い親和性を有する抗体の発現に関して、ＥＬＩＳＡを使用して選択する。最高の産生率の細胞系の選択後、分泌された抗体を、Streamline-Protein Aを充填したSteamline 25カラムシステムで、拡張床吸着クロマトグラフィーにより精製する。
【００２０】
実施例３：テルビナフィンに対する直接ＥＬＩＳＡによる抗体の選択
マイクロタイタープレートを、カーボネート緩衝液中の５μg／mlテルビナフィン塩酸塩−タンパク質(ＢＳＡ)接合体で一晩４°でコートし、ついで遮断試薬[SuperBloc(登録商標)緩衝液(Pierce)]で飽和し、３回０.０５％(v/v)Tewwn(登録商標)−ＰＢＳで洗浄する。スクリーニングするハイブリドーマ上清をＰＢＳ−Tween(登録商標)の１％(w/v)溶液で希釈し、２時間、３７°でインキュベートする。結合抗体のレベルを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗−マウスＩｇＧウサギ免疫グロブリンにより、ＯＰＤを基質として測定する。１時間、室温でインキュベーション後、酵素基質を加水分解し、４９０／６５０nmの吸光度を暗所で１５分インキュベーション後に測定する。
【００２１】
この試験に基づいて、実施例２で得たLAM-JA(11H2.F9.C4)(サブクラスＩｇＧ２ａλの抗体を産生)と命名されたハイブリドーマ細胞系が抗体産生のために選択された。
【００２２】
実施例４：テルビナフィン誘導体用競合ＥＬＩＳＡ
上記実施例３の直接ＥＬＩＳＡを、競合物質をモノクローナル溶液に添加する競合ELISAに変え、競合物質の存在下および非存在下におけるｍＡＢの接合体への結合を測定する。選択抗体のテルビナフィンおよびその誘導体に対する交差反応性を決定する標準曲線を、既知の濃度のテルビナフィンおよび適当な誘導体（例えば、緩衝液中１０μg／mlから０.０００１μg／ml）を含む溶液を使用して調製する。
【００２３】
ハイブリドーマ細胞系LAM-JA由来の精製抗体のこのような競合アッセイの結果は、下記の通りである(ここで、使用した免疫原はＯＶＡに結合したカルボキシ−テルビナフィンであった)：
【表１】
0003973424.tif 000004
およびまた図１においてグラフ形で提示する。
【００２４】
アナライト以外の物質に対する抗体応答を測定したものが交差反応性である。それは“シグナルの低下がアナライト不存在下のシグナルの５０％に対応する点（Ｂ／Ｂ０＝５０％）における、シグナルの同じ低下を与えるアナライト濃度のパーセント”として表わされてよい［The Immunoassay Handbook, David Wild, Stockton Press, USA, 1994］。
【００２５】
交差反応％は、図１から下記のように計算できる：
【数１】
0003973424.tif 000005
【００２６】
上記結果から、カルボキシ−テルビナフィン（元の免疫原）およびヒドロキシ−テルビナフィンに対して強い交差反応性（＞６７％）であり、デスメチル−ヒドロキシ−テルビナフィンに対して弱い交差反応性（４．５％）であり、デスメチル−カルボキシ−テルビナフィンおよびデスメチル−テルビナフィンに対してほとんど無に等しい交差反応性（検出不可能）であることが明らかである。
【００２７】
抗体特異性は、目的のアナライトに対してのみ測定可能な応答を産生する抗体の能力を指すものであって、上記結果は、本願発明の抗体が非常に特異的な抗体であることを示すものである。
【００２８】
本発明の抗体は、医学的背景における、例えば、適当なアッセイ、特に、真菌感染における、特に、体液またはコンパートメント、例えば爪におけるテルビナフィンの正確な測定をするための爪甲真菌症における、テルビナフィン組織濃度および分布の測定のための本発明の抗体を含むキットにおける使用が意図される。このような測定は、特に爪真菌症において、処置失敗を特に参照して示される(デルマトフィトーマ)。
【００２９】
一つの試みは、本発明の抗体およびテルビナフィントレーサーを使用したエキソビボ競合アッセイである。例えば、マイクロタイタープレートを抗体でコートし、標識テルビナフィン、例えば蛍光標識、放射能標識、例えばユーロピウム標識または酵素標識、特にビオチニル化テルビナフィンに、テルビナフィンを含むと考えられる物質、例えば、患者からの血漿、血液、組織または爪の存在下および非存在下で曝す。プレートを濯ぎ、抗体に結合した標識競合物質の量を測定する。この量は、試験流体におけるテルビナフィンの量と逆に変化する。
【００３０】
他の試みは、抗体、テルビナフィン接合体およびマウスＩｇＧを認識する標識、例えば酵素標識トレーサー抗体を使用したＥＬＩＳＡである。例えば、マイクロタイタープレートをテルビナフィン−タンパク質接合体、例えば免疫原性ＢＳＡ−カルボキシ−テルビナフィン接合体(実施例１)でコートし、ついで試験物質の存在下および非存在下に抗体に曝し、濯ぎ、テルビナフィン接合体に結合する抗体を、テルビナフィン接合体に結合する抗体に対するトレーサー抗体の結合により検出する。また、結合抗体の量は、試験サンプル中のテルビナフィンの量と逆に変わる。
【００３１】
いずれの場合も、アッセイは既知の濃度のテルビナフィンを含む試験溶液で標準化する。
【００３２】
したがって。本発明はまた本発明の抗体を、好ましくは凍結乾燥形で、またはマイクロタイタープレート上にコートされて含むアッセイキットを含む。キットは所望により更に、所望によりプレート上にコートされているテルビナフィンタンパク質接合体および／または標識テルビナフィン誘導体のいずれかを含む。また所望により標準化のためのテルビナフィン溶液および使用指示書を含む。あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、特別あつらえのＥＬＩＳＡまたは他のアッセイ系において使用し得る。
【００３３】
爪における上記アッセイの適用、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)での分析およびＵＶ検出は、爪マトリックスにおけるテルビナフィンの極性代謝物の存在のヒントを与えず、すなわち、ヒドロキシ−テルビナフィンもデスメチル−ヒドロキシ−テルビナフィンもカルボキシ−テルビナフィンも見られないが、デスメチル−テルビナフィンは測定可能であった。したがって、上記代謝物との本発明の抗体の交差反応性に関して(実施例４参照)、検出妨害は同様に爪におけるテルビナフィンと遭遇しないようである。
【００３４】
他の試みにおいて、酵素標識テルビナフィン抗体を、組織または細胞に存在する成分を局在化するために、あるいは、患者の血清または他のコンパートメントにおいて、細胞性分に対する抗体の存在を証明するために、酵素に特異的な細胞化学着色剤の検出を、マーカーとして使用し、蛍光検出に代える以外、免疫蛍光法と同じ基本原則に基づいて、使用する。
【表２】
0003973424.tif 000006
【表３】
0003973424.tif 000007
【図１】
0003973424.tif 000008