(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
窪みを有する本体部と、
上記本体部の上方から装着される上部カバーと、
上記本体部に上記上部カバーを装着した際に該本体部の窪みによって形成され、  サンプルＤＮＡを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部と、
上記空間部の底面に形成された測定極である多数の測定電極と、
上記空間部に配置された上記測定電極の対極である共通電極と、を備え、
上記共通電極と上記測定電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であり、
上記本体部及び上記上部カバーは、その両側部に、該本体部の窪みに連通可能な注入孔が形成されてなることを特徴とする遺伝子の検出用チップ。
【請求項２】
上記上部カバーは外部から観察できるように透明である、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項３】
上記測定電極がアレー状電極を形成してなる、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項４】
上記共通電極が上記測定電極と接触しないように配置された、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項５】
上記測定電極には、異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されてなる、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項６】
多数の上記測定電極が夫々配線に結合されており、該配線は、多数の上記測定電極それぞれに対応して一本ずつ接続しているか、又は多数の縦及び横の導線から成る格子状の配線として、アレー状に配置した上記測定電極を夫々近接する縦及び横の導線に接続するマトリックス構造とされている、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項７】
電流を検出可能とする測定装置に着脱自在に装着され、電気的に接続できるように構成されている、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項８】
カード又はカセット状のチップである、請求項１記載の検出用チップ。
【請求項９】
前記測定電極が金電極である、請求項１〜８の何れかに記載の検出用チップ。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載の遺伝子の検出用チップと、
遺伝子を検出し解析可能とする測定装置と、を備え、
上記検出用チップを、上記測定装置に着脱自在に装着し電気的に接続できるように構成されていることを特徴とする遺伝子の検出装置。
【請求項１１】
上記検出用チップの温度を、ペルチエ素子を用いて変化させ、温度条件をコントロール可能としたことを特徴とする請求項１０記載の遺伝子の検出装置。
【請求項１２】
請求項１〜９の何れかに記載の遺伝子の検出用チップの空間部内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成し、
その後、上記空間部内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、温度をコントロールして上記二本鎖に電気化学活性分子を結合させ、
そして、上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現など、遺伝子ＤＮＡの一塩基置換ＳＮＰ（シングル・ヌクレオチド・ポリモフィズム：人の遺伝コード中の変種）と点突然変異を検出し解析可能とする遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する方法、並びに検出装置及び検出チップ装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一塩基置換ＳＮＰとは、ヒトＤＮＡの１０００ｂｐから２０００ｂｐに１つあると言われている塩基配列の一塩基変化であり、正常人、病気の人問わず人には数十万から数百万のＳＮＰがあると考えられており、病因の解明、予防に有効なマーカーと期待されている。
【０００３】
点突然変異とは、すでに既知である遺伝子における塩基配列の一塩基の変化であり、これにより翻訳されるタンパク質の機能異常がみられ、疾患の原因になる場合がある。
【０００４】
遺伝子ＤＮＡの塩基配列の違いを検出、解析する手段としては、ＤＮＡシーケンス法（塩基配列決定法）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ法等が用いられている。
【０００５】
ＤＮＡシーケンス法は、マキサム・ギルバート法とサンガー（ダイデオキシ）法があるが、現在は主にダイデオキシ法が用いられている。ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ法（ポリミラーゼ連鎖反応法）で増幅したのち、ＰＣＲ法で用いたプライマー若しくは増幅ＤＮＡ内に設定したプライマーを用いてシーケンスを行い、当領域内の遺伝子配列を決定する。この操作を異なるサンプルＤＮＡを用いて行うことで、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する。
【０００６】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法はヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、熱変性で一本鎖にし、これを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行うことで、ＰＣＲ法で増幅した２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に２次構造（分子内水素結合）を形成させる。一塩基配列の違いによってとる２次構造（分子内水素結合）がことなるため、電気泳動距離の違いによって遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する。
【０００７】
アレル特異的ハイブリダイゼーション法では、解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、メンブレン（ナイロンフィルター）の領域内に２０塩基程度のＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを作成し、そこに放射性同位元素３２Ｐなどで標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。その際の温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、遺伝子の一塩基性ＳＮＰと点突然変異を放射性同位元素の強度の差で検出する。
【０００８】
ＤＮＡチップ法は、原理的にはアレル特異的ハイブリダイゼーション法とほぼ同じであるが、２０塩基程度のＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを固定相（基盤上）に並べ、そこに蛍光標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、ヒトの遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を蛍光強度の差によって検出するものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
アレル特異的ハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションの場合は、ＤＮＡを放射性同位元素で標識するために、放射性同位元素の取り扱いと管理に多大な費用が有することが問題である。又、ＤＮＡチップ法の場合は、蛍光色素で標識すると、蛍光色素の大きな分子構造のために十分な頻度で蛍光がＤＮＡにとりこまれないために、蛍光標識プローブの蛍光強度が高くないこと、さらに蛍光の退色及びガラス等の基盤の有する蛍光（背景部分の蛍光）が問題になる。
【００１０】
このような問題点を解決するために、簡単で感度の優れたＤＮＡハイブリッド形成の検出、二本鎖ＤＮＡを検出する方法として、プローブＤＮＡを電極に固定し、このプローブＤＮＡを、インターカレータ存在下においてサンプルＤＮＡと反応させて、二本鎖ＤＮＡの検出、ハイブリッド形成体の検出を電気化学的に行う方法が開示されている（特開平９−２８８０８０号公報及び第５７回分析化学討論会予稿集、Ｐ１３７−１３８、１９９６年、参照）。
【００１１】
しかしながら、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰや遺伝子の突然変異の数は莫大であり、例えばヒトの場合１５KBの密度（解像度）の一塩基置換ＳＮＰ地図を作成するためには、すくなくとも２００万の一塩基置換ＳＮＰを同定しなければならない。又、既知の疾患に関係する遺伝子の点突然変異の数もきわめて多い。一塩基置換や点突然変異を網羅的に解析することは従来の方法では現実的に不可能に近い。
【００１２】
本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、複数のサンプルＤＮＡを対象に、大量の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出、解析することが可能な、すなわちハイスループット（高速大量）の処理ができ、しかも高感度に検出と解析が可能な一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の同定装置を提供する。要するに、本発明は、特開平９−２８８０８０号公報に記載された二本鎖ＤＮＡの検出、ハイブリッド形成体の検出を電気化学的に行う原理に基づいて、大量かつ高感度な一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出・解析装置として実現しようとするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために、窪みを有する本体部と、
上記本体部の上方から装着される上部カバーと、
上記本体部に上記上部カバーを装着した際に該本体部の窪みによって形成され、  サンプルＤＮＡを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部と、
上記空間部の底面に形成された測定極である多数の測定電極と、
上記空間部に配置された上記測定電極の対極である共通電極と、を備え、
上記共通電極と上記測定電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であり、
上記本体部及び上記上部カバーは、その両側部に、該本体部の窪みに連通可能な注入孔が形成されてなることを特徴とする遺伝子の検出用チップを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、上記課題を解決するために、上記の遺伝子の検出用チップと、
遺伝子を検出し解析可能とする測定装置と、を備え、
上記検出用チップを、上記測定装置に着脱自在に装着し電気的に接続できるように構成されていることを特徴とする遺伝子の検出装置を提供する。
【００１５】
上記内部空間、上記金電極及び上記共通電極を検出チップ内に含まれるように形成し、上記検出チップを、上記検出測定装置に着脱自在に装着し電気的に接続できるような構成としてもよい。
【００１６】
上記検出チップの温度をペルチエ素子を用いて変化させ、上記ハイブリダイゼーションの温度条件をコントロール可能としてもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、上記課題を解決するために、上記の遺伝子の検出用チップの空間部内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成し、
その後、上記空間部内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、温度をコントロールして上記二本鎖に電気化学活性分子を結合させ、
そして、上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする遺伝子の検出方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出方法、並びに検出装置及び検出チップの実施の形態を実施例に基づいて図面を参照して、以下説明する。図１において、本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出装置１は、ハイブリダイゼーション用の検出チップ２と、この検出チップ２を差し込んで、ハイブリダイゼーションにより生じる二本鎖ＤＮＡを検出し解析可能とする測定装置３とから構成される。
【００１９】
図２において、検出チップ２は、セラミックスや合成樹脂材等により、カードあるいはカセット状のチップとして形成されており、本体部４と、該本体部４に上方から装着される上部カバー５（図中想像線で示される）とから構成される。この検出チップ２は、酸及びアルカリに耐性を有する材料で形成されており、特に、上部カバー５はする外部から観察できるように透明であることが好ましい。
【００２０】
本体部４のほぼ中央には、矩形の窪み６が形成されている。これにより、本体部４に上部カバー５を装着して一体とすると、その窪みの部分が、密閉された空間部Ｓとなる。空間部Ｓの底面、即ち、窪み６の底面７には、金のスポットをマトリックス状に配列して蒸着し、多数の金電極８から構成されるアレー状金電極９が形成されている。
【００２１】
図２の右側に金電極８の拡大図を示しているが、この拡大図で示されているように、金電極８上には、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール化してＳＨ基を導入したＳＨ化オリゴヌクレオチド１０が固定されている。ＰＣＲ産物は二本鎖ＤＮＡであるが、一方の鎖の５’末端をチオール化し、ＳＨ基を導入してあるこのオリゴヌクレオチドは、２０〜５０塩基含む長さを有し、その基端に導入したチオール基を介して金電極８上に固定されている。
【００２２】
検出チップ２の先端部１１には、多数のターミナル端子１２が並設されている。金電極８は、夫々配線１３に結合され、該配線の他端は、ターミナル端子１２の夫々と結合するように伸設されている。
【００２３】
なお、図４（ａ）に示すように、金電極９に対する配線は、金電極８それぞれに対応して一本づつ接続してそれぞれターミナル端子１２に接続してもよいが、図４（ｂ）に示すように、液晶表示装置等に利用されている、多数の縦及び横の導線１４、１５から成る格子状の配線として、アレー状に配置した金電極９を夫々近接する縦及び横の導線に接続するマトリックス配線構造とする。この場合、縦及び横の導線の一端がターミナル端子１２に接続されることとなる。
【００２４】
本実施例では、窪み６の底面でマトリックス状に配列してある金電極９と接しない位置に対極である共通電極１６が配列されている。共通電極１６の配線は金電極同様に金の蒸着によって形成される。共通電極１６は、共通電極用ターミナル端子１７に接続されるように伸設されている。さらに、それぞれの金電極９と対極である共通電極１６の間の電流値は、窪み６内の空間に接する形で配線された参照電極２８の値を基準に測定され、測定ごとに正確な電流値が得られる構造となっている。
【００２５】
検出チップ２の本体部４の及び上部カバー５の両側部に、窪み６に連通する左右の注入孔１８、１９（図２中の上方に示された要部拡大図参照。）が形成されており、通常はキャップ栓により閉鎖されており、密閉空間Ｓを形成している。キャップをはずし、この注入孔１８、１９にディスポーザルの注射器２０、２１を挿入できる。これにより、窪み６と上部カバー５により画成される密封された空間部Ｓ内へ溶液を注入したり、あるいは空間部Ｓ内の溶液の交換や混合を迅速に行うことができる。
【００２６】
測定装置３は、検出チップ２を差し込む挿入口２２を有している。挿入口２２の内部には、図４（ｃ）で示すように、共通電極用ターミナル端子１７及び各金電極用ターミナル端子１２に接続して、共通電極用ターミナル端子１７及び各金電極用ターミナル端子１２間に電圧を印加する回路２３が配設されている。そして、共通電極用ターミナル端子１７と各金電極用ターミナル端子１２間に電圧が印加された際に、共通電極１６と各金電極８の間に流れる電流を、回路２３に設けられた検出器２４で検出して測定できるように構成とされている。
【００２７】
この検出した電流に基づく測定データは、検出器２４に接続するＡ−Ｄ変換器２５等でデジタル化され、パソコン２６によりサンプルの解析、同定等の処理データとして利用される。さらに、測定装置３には、ペルチェ素子から成る温度コントロール装置が装備されいる。
【００２８】
以上のような構成から成る本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出装置１の作用について説明する。検出チップ２は、本体部４に上部カバーが一体に結合され密閉されている。そして、図３に示すように、注入孔１８、１９に注射器２０、２１を挿入してサンプルＤＮＡを含む溶液を注入する。
【００２９】
なお、サンプルＤＮＡは、生物材料から抽出したＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素もしくは超音波処理で分解したもの、又は特定の遺伝子からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって増幅したＤＮＡを用いる。これらのサンプルＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの直前に熱処理によって変性しておく。
【００３０】
固定されたＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドのＤＮＡ（一本鎖の状態）にサンプルＤＮＡ（一本鎖の状態）が添加されると、互いに相補的な塩基配列を持つＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドのＤＮＡとサンプルＤＮＡは、ハイブリダイゼーションが行われる。この際、検出チップ２を測定装置３内の挿入口２２に挿入して装着し、測定装置３内に装備されたペルチェ素子により、温度をコントロールし、ハイブリダイゼーションの温度条件にコントロールする。
【００３１】
このハイブリダイゼーションが行われた後、検出チップ２を測定装置３から抜いて、一方の注入孔１８から注射器で洗浄液を注入し、他方の注入孔１９から空間部Ｓ内の液を吸引して、ハイブリダイゼーションしなかったサンプルＤＮＡを洗い流して洗浄する。
【００３２】
このような洗浄を行った後に、電気化学活性分子を含む電解質溶液を注射器により注入孔１８、１９から空間部Ｓ内に注入する。電気化学活性分子は、ハイブリダイゼーションにより二本鎖ＤＮＡの抵抗値等の電気的特性を変化させる機能を奏する。この点については、特開平９−２８８０８０号公報に詳細に説明されている。
【００３３】
このような処理を行った検出チップ２を測定装置３に再度装着し、検出チップ２の共通電極用ターミナル端子１７及び各金電極用ターミナル端子１２を電圧回路２３に接続し、共通電極１６と各金電極８の間に弱い電圧をかけると、ハイブリダイゼーションにより生じた二本鎖ＤＮＡと接続された金電極８には、電圧回路２３及び共通電極１６を通して微弱電流が流れる。測定装置３内に装備されたペルチエ素子により温度をコントロールし、異なる温度での電流値を測定する。
【００３４】
測定装置３では、図４（ｃ）に示すように、各金電極用端子１２に対して走査端子２７が自動的に切り替えられることにより、順次ハイブリダイゼーションの後の二本鎖ＤＮＡに電流が流れて検出され、この検出結果が、ＡーＤ変換器等によりデジタルデータに変換されて、パソコンで測定データとしてメモリ等に蓄積される。この測定データにより、サンプルＤＮＡの同定や解析が行われる。例えば、予め蓄積されている各種類のＤＮＡデータ等と比較することにより、サンプルＤＮＡの解析や同定が可能となる。
【００３５】
次に本発明に係わる遺伝子の塩基置換、点突然変異等の電気化学的検出装置の実験例を説明する。
【００３６】
（実験例１）
遺伝子p53の72番目のコドンにおける一塩基置換SNPの検出の実験例を示す。以下の２種類のポリモルフィズム（遺伝的多型）に相当する塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを金電極それぞれにスポットすることにより固定化した。
p53Pro（コドン72番目がPro）
p53Arg（コドン72番目がArg）
【００３７】
これにp53のコドン72番目がProであるの正常人の末梢血から採取したDNA、及びこのDNAからp53のエキソン４に存在するコドン72を含む領域を増幅したPCR産物を熱変性後ハイブリダイゼーション反応を行った。測定電解質溶液として0.1M AcOH-AcOK (pH5.6), 0.1M KCl, 0.05mM NFc中で20度で470 mV (Ag/AgCl参照電極基準)のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
末梢血から採取したDNA
p53Proの電流変化(%)  52％
p53Argの電流変化(%)  15％
PCR産物
p53Proの電流変化(%)  65％
p53Argの電流変化(%)  13％
【００３８】
さらにp53のコドン72番目がArgである正常人の末梢血から採取したDNA、及びこのDNAからp53のエキソン４に存在するコドン72を含む領域を増幅したPCR産物を同様にハイブリダイゼーション反応を行った。
末梢血から採取したDNA
p53Proの電流変化(%)  46％
p53Argの電流変化(%)  17％
PCR産物
p53Proの電流変化(%)  53％
p53Argの電流変化(%)  11％
【００３９】
これらの電流変化は、完全にマッチした塩基配列の場合とミスマッチの場合では明らかな差が認められた。
【００４０】
（実験例２）
塩基置換の数によって測定する電流値が異なり、これによりミスマッチの量が測定できることを示した実験例を説明する。dT20, dT10dAdT9, dT8dA4dT8, dAdT19, dA3dT17, dT19dA, dT17dA3の７種のオリゴヌクレオチドを金電極それぞれにスポットすることにより固定化した。これにdA20をハイブリダイゼーション反応を行った。
【００４１】
測定電解質溶液として0.1M AcOH-AcOK （pH５．６）、 0.1M KCl, 0.05mM NFc中、２０度で、４７０mV (Ag/AgCl参照電極基準)で、ハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。この測定結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0003888807.tif 000002
【００４３】
表１における電流変化は、ほぼミスマッチ塩基の量に依存した変化であった。特に末端部にミスマッチが存在する場合は、Tm値より大きな変化が見られた。従来のSSCPでは、このような系は検出できなかったが本手法で初めて明らかとなった。
【００４４】
以上、本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する方法、並びに検出装置及び検出チップについて、その実施例で説明したが、本発明は、特にこのような実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内で、いろいろな実施の態様があることは言うまでもない。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する方法、並びに検出装置及び検出チップは、以上のような構成であるから、複数のサンプルＤＮＡを対象に、大量の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を高感度でもって、検出、解析することが可能になる。
【００４６】
このように、高感度、ハイスループット（高速大量）の処理ができる本発明に係る検出装置は、生物学、医学分野での遺伝子、表現形質との相関の解析に有効な手段である。薬剤代謝酵素、がん抑制遺伝子などの特定の遺伝子を、本発明に係る一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出・解析装置よって、解析することにより、遺伝子診断の分野にも利用できる。
【００４７】
例えば、本発明に係る検出装置では、高感度、ハイスループット（高速大量）の処理が可能であるから、日本人の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異のデータを収集し、病気の発症と関連する一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を同定し、がん、高血圧などの成人病の予防等に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する検出装置の実施例の全体構成を説明する斜視図である。
【図２】本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出に利用される検出チップの実施例の全体構成を説明する斜視図である。
【図３】図２の検出チップの使用状態を説明する斜視図である。
【図４】本発明に係る遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出装置及び検出チップの電極、配線等の構成を説明するための図である。
【符号の説明】
１    遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する検出装置
２    検出チップ
３    測定装置
４    窪み
８    （各）金電極
９    金電極（群）
１０    オリゴヌクレオチド
１２    金電極用ターミナル端子
１６    共通電極
１７    共通電極用ターミナル端子
１８、１９  注入孔
２２    挿入口
２６    パソコン
【図１】
0003888807.tif 000003
【図２】
0003888807.tif 000004
【図３】
0003888807.tif 000005
【図４】
0003888807.tif 000006