(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の特異的結合物質がそれぞれ配置された、標識物質で標識された生体由来物質を前記特異的結合物質に結合させて各位置ごとに前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号を検出して前記生体由来物質を定量する解析に用いられる試験片であって、前記特異的結合物質が標識物質で標識され、前記生体由来物質を標識する標識物質が、前記特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質であることを特徴とする試験片。
【請求項２】
前記特異的結合物質がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の試験片。
【請求項３】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が蛍光色素であることを特徴とする請求項１または２記載の試験片。
【請求項４】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が放射性同位体であることを特徴とする請求項１または２記載の試験片。
【請求項５】
担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の標識特異的結合物質がそれぞれ配置されている試験片の、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、前記特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質で標識された生体由来物質を前記特異的結合物質に結合させて、結合した前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、前記特異的結合物質と結合した生体由来物質を定量することを特徴とする生体由来物質の定量方法。
【請求項６】
前記特異的結合物質がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項５記載の生体由来物質の定量方法。
【請求項７】
前記定量がさらにｃＤＮＡに関する特性値に基づいて定量するものであることを特徴とする請求項５または６記載の生体由来物質の定量方法。
【請求項８】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が蛍光色素であることを特徴とする請求項５、６または７記載の生体由来物質の定量方法。
【請求項９】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が放射性同位体であることを特徴とする請求項５、６または７記載の生体由来物質の定量方法。
【請求項１０】
担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の標識特異的結合物質がそれぞれ配置されている試験片の、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号を検出する検出手段と、前記特異的結合物質に結合した、該特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質で標識された生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出する検出手段と、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、前記特異的結合物質と結合した生体由来物質を定量する解析手段とを備えたことを特徴とする生体由来物質の定量装置。
【請求項１１】
前記特異的結合物質がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の生体由来物質の定量装置。
【請求項１２】
前記解析手段がさらにｃＤＮＡに関する特性値に基づいて定量するものであることを特徴とする請求項１０または１１記載の生体由来物質の定量装置。
【請求項１３】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が蛍光色素であることを特徴とする請求項１０、１１または１２記載の生体由来物質の定量装置。
【請求項１４】
前記特異的結合物質を標識している標識物質が放射性同位体であることを特徴とする請求項１０、１１または１２記載の生体由来物質の定量装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの解析や免疫学的解析に用いられる試験片とその試験片によって生体由来物質を定量する方法及びその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
約３０億ｂｐという巨大なヒトゲノムの全塩基配列を決定し、それらを解析しようというヒトゲノム計画は、当所の予定から早まり２００３年までに決定されるのではないかとの見解がなされ、ヒトゲノム計画はシステマティックな塩基配列からシステマティックな機能解析へと焦点が移ってきている。
【０００３】
遺伝情報の具体的内容は、いかなるタンパクがいかなる条件で合成されるかという点につきるものであるが、前者すなわちいかなるタンパクが合成されているかという点については、従来より、ウエスタン・ブロット法、ノーザン・ブロット法やサザン・ブロット法などの解析方法が広く用いられている。しかしながらこれらの方法は、取り出された特定のタンパクやＤＮＡ、ＲＮＡなどがいかなるものであるかという点については解析できても、細胞から抽出されたすべてのタンパクやＤＮＡ、ＲＮＡを一度に解析するには必ずしも適さなかった。
【０００４】
一方、後者すなわちタンパクがいかなる条件で合成されるかという点に関しては、転写のレベルで制御されているために従来の解析方法では充分な解析ができなかったが、その最大の原因は、ＤＮＡにおける制御配列と対応する制御内容の双方のデータが不足していたためであった。
【０００５】
しかしここにきて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイと呼ばれる、１センチ四方程度の担体表面上に高密度に任意のオリゴヌクレオチドを固定する技術の進歩によって、遺伝子の発現情報の解析が飛躍的に進歩することが期待されている。ＤＮＡチップは、シリコンチップをフォトリソグラフィー技術によって多くの区画に分割し、それぞれの区画上に特定の塩基配列を持った一本鎖ＤＮＡを直接合成したものである。ＤＮＡマイクロアレイは、従来メンブレン上にブロットされたスポットサイズが約３００μあるいはそれ以上であったＤＮＡマクロアレイを、スポットサイズを約２００μあるいはそれ以下にしてスライドグラス上にブロットしたものである。ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、信号読取装置とコンピュータシステムにつながれ、チップ上、マイクロアレイ上に配置されたＤＮＡがどのプローブとハイブリダイズしたかを知ることができるようになっている。ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ上に配置されるＤＮＡの種類とその配置しだいで、遺伝子ＤＮＡの変異解析、多型解析、塩基配列解析、発現解析などさまざまな用途に用いることが可能なものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このＤＮＡマイクロアレイを用いた解析は、マイクロアレイの作製やその検出装置の議論がなされ始めたばかりであり、まだかなりの問題点を抱えている。たとえば、マイクロアレイはスポッター装置といわれるものでｃＤＮＡをブロットして作製するが、その作製方法としては、図４ａに示すようにスライドグラス４２上にピン４１を直接接触させてｃＤＮＡ４３を配置する接触プリンティング法や、図４ｂに示すようにスライドグラス４２上にシリンジ４４を接触させないでｃＤＮＡ４３をブロットする非接触プリンティング法があるが、いずれの作製方法であっても、ブロットされるスポットとスポットの間にはスポットされる量にばらつきがあり、最も良い場合であっても、接触プリンティング法で５〜１０％ＣＶ、非接触プリンティング法で３〜５％ＣＶのばらつきとなっている。さらには欠陥スポットの存在すらある。このため、図５に示すように同じＤＮＡマイクロアレイ５１のａ点とｂ点とで、また同じａ点でもＤＮＡマイクロアレイ５１と同じように作製したＤＮＡマイクロアレイ５２とではスポットされているＤＮＡのサンプル量が異なり、このため１つの細胞から調整された互いに異なるＤＮＡの定量や、同じ細胞で時期によって発現量が異なるようなＤＮＡの定量的な比較が、実はかなり誤差を含んだものとなるといった問題が起こっている。
【０００７】
この問題を解決するために、まず第一に考えられるのはスポッター装置の改良であるが、スポットされるサンプル量の再現性を向上させるための改良には限界があると考えられる。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、スポッター装置の改良によってブロットされる各スポットの再現性の向上に頼ることなく、担体に配置される物質の方に着目し、スポット間でブロット量のばらつきがあっても、正確に定量をおこなうことができるＤＮＡマイクロアレイなどの試験片を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の試験片は、担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の特異的結合物質がそれぞれ配置された、標識物質で標識された生体由来物質の解析に用いられる試験片であって、前記特異的結合物質が標識物質で標識されていることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明の生体由来物質の定量方法は、担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の標識特異的結合物質がそれぞれ配置されている試験片の、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、
前記特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質で標識された生体由来物質を前記特異的結合物質に結合させて、結合した前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、
前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、前記特異的結合物質と結合した生体由来物質を定量することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の生体由来物質の定量装置は、担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の標識特異的結合物質がそれぞれ配置されている試験片の、前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号を検出する検出手段と、
前記特異的結合物質に結合した、該特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質で標識された生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出する検出手段と、
前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、前記特異的結合物質と結合した生体由来物質を定量する解析手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１２】
「担体」とは、特異的結合物質を安定に結合、点着できるものであればよく、たとえばメンブレンフィルターやスライドグラス板などである。これらの担体は特異的結合物質を安定に結合するために、前処理がなされているものであってもよい。
【００１３】
「特異的結合物質」とは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、生体由来物質と特異的に結合可能な物質を意味する。「既知の」とは、特異的結合物質によって異なるが、たとえば核酸であればその塩基配列や塩基の長さなどが、タンパクであればアミノ酸の組成などがわかっていることを意味する。ここで、担体の所定の位置に配置される特異的結合物質は、各位置ごとに１種類の特異的結合物質が配置されていることを意味する。
【００１４】
「生体由来物質」とは、担体上の所定の位置に配置された既知の特異的結合物質と特異的に結合する物質であって、生体から抽出、単離等された物質を意味するが、生体から直接抽出されたものだけでなく、これらを化学処理、化学修飾等したものも含まれる。たとえばホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの物質である。
【００１５】
特異的結合物質が「標識物質で標識されている」（標識物質で標識されている特異的結合物質を単に標識特異的結合物質ともいう）とは、特異的結合物質のたとえば鎖状分子の片方の末端のように１ヶ所を標識していてもよいし、数ヶ所を標識していてもよい。通常は特異的結合物質の１ヶ所が標識されていれば、担体上の各位置に配置されている特異的結合物質の量は検出可能であるが、検出感度を上げたい場合や、特異的結合物質の１ヶ所だけを標識することが技術上困難だったり、あるいは技術上複雑となったりするような場合には標識箇所が複数であってもよい。
【００１６】
生体由来物質を標識する標識物質は、特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質を選択することが好ましい。生体由来物質を標識する標識物質が放出する標識信号と、特異的結合物質を標識する標識物質が放出する標識信号を同時に、それぞれを別々に検出することができるからである。生体由来物質を標識する標識物質は、生体由来物質を１ヶ所標識するものでもよいし、数ヶ所標識するものであってもかまわないが、１ヶ所であることが好ましい。生体由来物質の場合には、構成している物質が既知でない場合もあり、標識物質の取り込まれ方の確認などが必要となり技術的に複雑化するからである。但し既知の物質であれば特異的結合物質と同様に、数ヶ所であっても差し支えない。
【００１７】
「標識物質」とは、特異的結合物質や生体由来物質から情報を得るためにこれらの一部を改変し、あるいはこれらに直接付加される、目印となる物質を意味する。標識物質は、標識物質から放出される標識信号が検出でき、かつ特異的結合物質や生体由来物質に取り込まれる規則性があらかじめわかっているものであれば特に限定されるものではない。たとえばサイバーグリーンIIＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光色素や３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性同位体を用いることが好ましい。「標識信号」とは、たとえば標識物質が蛍光色素である場合には蛍光、標識物質が放射性同位体である場合には放射線のように、標識物質から放出、あるいは出力されるようなものをいう。この場合特異的結合物質に同位体を生体由来物質に蛍光色素を用いてもよいし、特異的結合物質に蛍光色素を生体由来物質に同位体を用いてもよいし、また特異的結合物質と生体由来物質ともに蛍光色素を用いてもよい。但し、特異的結合物質と生体由来物質ともに蛍光色素を用いる場合には、発光波長帯域が互いに重複しないものあるいは、重複しても少なくとも主要な検出帯域においては重複しない蛍光色素を用いることが必要である。一方放射性同位体を用いる場合には、担体に配置された放射性同位体で標識された特異的結合物質を、特公平５−２０７１２号（オートラジオグラフィーにおける放射性同位元素の定量測定法）のごとく、輝尽性蛍光体シートに密着露光しそのシートをレーザで読み取る。特異的結合物質や生体由来物質に取り込まれる規則性があらかじめわかっているとは、たとえば蛍光色素のサイバーグリーンIIであれば、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに弱結合し、その取り込まれ方は塩基の長さに対応するという規則性が、また同じく蛍光標識されたヌクレオチドであればＤＮＡやＲＮＡにランダムに又は末端に取り込まれるという規則性がある。一方３２Ｐのような同位体は、同位体で標識する対象によって異なるが、たとえばｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する際に基質として用いる４種類のヌクレオチドのいずれかにα位が３２Ｐで標識されたものを用いれば、３２Ｐはランダムに取り込まれ、標識されているヌクレオチドに含まれる塩基に比例して３２Ｐが取り込まれるという規則性がある。
【００１８】
「生体由来物質を特異的結合物質に結合」とは、たとえばＤＮＡやＲＮＡなどで見られる相補的なヌクレオチド配列の間に安定な二重鎖が形成されるような場合（ハイブリダイゼーション）や、抗原と抗体、ビオチンとアビジンなどのように、特定の物質とのみ選択的に反応する極めて特異性の高い結合を意味する。
【００１９】
「前記特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、前記生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、前記特異的結合物質と結合した生体由来物質を定量する」とは、担体上の１つの位置の特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量は、その位置に配置されている特異的結合物質の量に比例するので、特異的結合物質に結合した生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量をこれと対応させて、特異的結合物質のばらつきに関係なく生体由来物質の量（濃度）を定量することができることを意味する。特異的結合物質がｃＤＮＡである場合を例にとると、たとえば、担体のｎ番という位置にｃＤＮＡ（特異的結合物質）の片方の末端が蛍光標識されたｃＤＮＡがｓ個あるときの蛍光量（標識物質から放出される標識信号の量）をＰｓとし、一方分子の片方の末端を蛍光標識されたプローブＤＮＡ（生体由来物質）がｃ個、ｎ番のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションしたときの蛍光量をＰｃとする。液相系ではｃＤＮＡとハイブリダイゼーションするプローブＤＮＡはそのハイブリダイゼーションするｃＤＮＡや条件にもよるが、約１／１００程度といわれている。担体上の場合は完全な液相系とはいえないが、少なくともプローブＤＮＡの濃度ｍはｎ番に存在しているｃＤＮＡの数ｓに比例する。従って、ＰｃはＰｓとｍに比例し、以下の関係が成り立つ。
【００２０】
Ｐｃ∝ｍＰｓ
従ってＰｓとＰｃを測定すればｎ番の位置に結合した生体由来物質の濃度ｍが求められる。
【００２１】
上記は、ｃＤＮＡの１ヶ所のみが標識されている場合であるが、この場合にはＰｓの値はｃＤＮＡの塩基配列や塩基の長さなどは何ら関係せず、ｎ番の位置に配置されたｃＤＮＡの数にのみ比例する。しかし、標識物質が特定の塩基を標識したり、塩基の長さに比例して標識するように、標識物質が１分子のｃＤＮＡに対し数ヶ所（場合によっては数十ヶ所）を標識するような場合には、塩基の長さによっても蛍光量が異なるため、１枚の担体上の全ての位置が同じ蛍光量を示していても、ｃＤＮＡの塩基の長さが異なるために全ての位置において、等量のｃＤＮＡがブロットされているとは言えなくなる。従って、この場合には更に、「ｃＤＮＡに関する特性値」を求めておく必要がある。すなわち、担体上に配置されたｃＤＮＡの塩基の割合や塩基の長さ、担体の１つの位置にＮ個のｃＤＮＡが含まれている時の蛍光量などのｃＤＮＡに関する特性値を、各位置についてコンピュータに登録しておく必要がある。いかなる特性値が必要となるかは、用いた標識物質によって異なるが、プローブＤＮＡの蛍光量Ｐｃは、プローブＤＮＡの濃度ｍと、ｃＤＮＡの蛍光量Ｐｓに比例し、１本のｃＤＮＡを標識している標識物質の数に反比例する。従って、プローブＤＮＡの濃度ｍは、下記の式で表され、１本（１分子）のｃＤＮＡを標識している標識物質の数をもとめることができる特性値が必要となる。
【００２２】
ｍ∝Ｐｃ／Ｐｓ×（１本のｃＤＮＡを標識している標識物質の数）
例えば、ｃＤＮＡの４つの塩基のうち１つの塩基を標識した場合には、ｃＤＮＡ１分子に含まれる標識された特定の塩基の数が、また、塩基の長さに比例する場合には、塩基の長さと標識物質が１つ取り込まれる塩基の割合（何塩基ごとに１つの標識物質がとりこまれるか）といった特性値が必要となる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の試験片によれば、担体上の所定の複数位置に配置される、互いに異なる複数の既知の特異的結合物質を標識物質で標識しているので、特異的結合物質が担体上に配置されるときのばらつきに関係なく、試験片上に配置される特異的結合物質の量を特定可能である。
【００２４】
本発明の生体由来物質の定量方法及び定量装置によれば、担体上の所定の複数位置に、互いに異なる複数の既知の標識特異的結合物質がそれぞれ配置されている試験片の、特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質で標識された生体由来物質を特異的結合物質に結合させて、結合した生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量を各位置ごとに検出し、特異的結合物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果と、生体由来物質の標識物質から放出される標識信号の量の検出結果に基づいて、特異的結合物質に結合している生体由来物質を定量するので、ブロットされている特異的結合物質の量のばらつきに関係なく、生体由来物質の定量を行うことが可能である。また、生体由来物質を標識する標識物質を、特異的結合物質を標識している標識物質とは異なる標識物質とすることにより、試験片上の特異的結合物質と生体由来物質の読取を同時に行うことが可能となる。
【００２５】
なお、本発明の試験片、その定量方法及び定量装置を用いれば、細胞内で転写されたｍＲＮＡから、転写のレベルで制御されているタンパク合成の制御内容やメカニズムの解明、あるいは疾病過程で合成される特殊なタンパクの定量の実現により、たとえば癌の進行状態に対応して発現されるさまざまなタンパクを定量することで効果的な薬の選択が可能となったり、あるいはＥＳＴの機能解析など幅広い利用が可能である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。
【００２７】
図１は、本発明の試験片及びその作製方法の一実施の形態を示すフローチャートである。ここでは、試験片としてＤＮＡマイクロアレイチップを、特異的結合物質にｃＤＮＡを、生体由来物質に細胞から抽出したｍＲＮＡを例にとって説明する。
【００２８】
本発明のＤＮＡマイクロアレイ１０は、ポリ−Ｌ−リジン溶液で表面を前処理したスライドグラス（担体）３の所定の位置に、互いに異なる複数の、塩基配列がわかっているｃＤＮＡ（特異的結合物質）１が、蛍光色素５（フルオレセインイソチオシアネート以下ＦＩＴＣと略す、蛍光色素５は特異的結合物質を標識する標識物質である）で標識されて配置されているものである。
【００２９】
ｃＤＮＡは既知のＤＮＡ、ｍＲＮＡなどから、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法によって調整されるが、この際ＦＩＴＣで標識されたｄＣＴＰを用いれば、ＤＮＡの４つの塩基のうちＣ（シトシン）の位置をＦＩＴＣが標識したｃＤＮＡ（以下Ｆ−ｃＤＮＡ（標識特異的結合物質）という）２が調整できる。調整されたＦ−ｃＤＮＡ２をスライドグラス３上の所定の位置にスポッター装置によってスポッティングして、ＤＮＡマイクロアレイ１０を作製する。
【００３０】
一方測定しようとするｍＲＮＡ（生体由来物質）４を細胞から抽出し、さらにｍＲＮＡから３’末端にポリＡを有するＲＮＡを抽出する。ポリＡを末端に有するＲＮＡからｃＤＮＡを合成する際に、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（Ｃｙ５、生体由来物質を標識する標識物質）を存在させて、Ｃｙ５で標識されたＣｙ５−ｃＤＮＡ（プローブＤＮＡ）ができる。また、標識プライマーを用いれば末端標識も可能である。
【００３１】
Ｃｙ５−ｃＤＮＡを所定の溶液に調整し、ＤＮＡマイクロアレイ１０上に静かにのせて、通常のハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
次に図２を用いて、図１に示したＤＮＡマイクロアレイ１０の上にハイブリダイゼーションしたＣｙ５−ｃＤＮＡを定量する装置について説明する。図２は本発明の定量装置の一実施の形態の構成を示す図である。図示の定量装置１００は、ＦＩＴＣで標識されたＦ−ｃＤＮＡが分布するＤＮＡマイクロアレイ１０を載置して所定の位置に設置する透明な試料台２０と、ＦＩＴＣを励起するのに適した発光波長のレーザ光Ｌ１を発光する励起波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ（またはＳＨＧレーザ（励起波長４７３ｎｍ））２１と、Ｃｙ５を励起するのに適した発光波長のレーザ光Ｌ２を発光する励起波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザ（または半導体レーザ（励起波長６３５ｎｍ））２２と、レーザ光Ｌ１を透過しレーザ光Ｌ２を反射する第一のダイクロイックミラー２３と、ＤＮＡマイクロアレイ１０の蛍光色素が励起されて発光した蛍光を光電的に検出するフォトマルチプライヤ（以下ＰＭＴという）９０と、各レーザ２１、２２から出射されたレーザ光を、試料台２０に載置されたＤＮＡマイクロアレイ１０に照射させるとともに、この照射によりＤＮＡマイクロアレイ１０から出射する蛍光をＰＭＴ９０に導光させる光学ヘッド５０と、光学ヘッド５０からＰＭＴ９０までの光路上に配設された、２種類のバンドパスフィルタ８１、８２を切替可能に備えたフィルタセット８０と、光学ヘッド５０を矢印Ｘ方向に等速移動させる主走査手段６０と、各レーザ２１、２２、光学ヘッド５０、フィルタセット８０およびＰＭＴ９０を一体的に矢印Ｙ方向（矢印Ｘ方向に直行する方向）に移動させる副走査手段７０と、ＰＭＴ９０により検出された検出信号を対数増幅する増幅機９１と、この増幅された検出信号をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換器９２と、Ａ／Ｄ変換されたデータと予め入力されているＤＮＡマイクロアレイ１０上のデータとを照らして解析する解析装置９３と、レーザ光Ｌ１、Ｌ２を出射させる制御を行うとともに、フィルタセット８０のうち一方のバンドパスフィルタ８１、８２を選択して、選択されたバンドパスフィルタが上記光路上に配されるように制御するコントロールユニット９５をそなえた構成である。
【００３３】
次に本実施形態の定量装置１００の動作について説明する。
【００３４】
試料台２０上に、ＦＩＴＣで標識されたｃＤＮＡおよびこれにＣｙ５で標識されたＣｙ５−ｃＤＮＡがハイブリダイズしたＤＮＡマイクロアレイ１０が載置され、コントロールユニット９５は、レーザ光Ｌ１およびレーザ光Ｌ２を選択して出射させるようにレーザ２１、２２を制御し、これにより、レーザ２１からレーザ光Ｌ１がレーザ２２からレーザ光Ｌ２が出射される。一方、コントロールユニット９５は、第一のフィルタ８１が、光学ヘッド５０とＰＭＴ９０との間の光路上に配置されるように、フィルタセット８０を制御し、フィルタセット８０は、第一のフィルタ８１をその光路上に配置する。
【００３５】
レーザ２１から出射されたレーザ光Ｌ１は、ダイクロイックミラー２３を透過して矢印Ｘ方向に進む。光学ヘッド５０の平面ミラー５１に入射したレーザ光Ｌ１は図示上方に反射され、孔開きミラー５２の小孔５２ａを通過してレンズ５３に入射し、レンズ５３を通って試料台２０上に載置されたＤＮＡマイクロアレイ１０の微小領域を照射する。このとき光学ヘッド５０は、主走査手段６０により、高速にかつ等速度で矢印Ｘ方向に移動させられており、レーザ光Ｌ１はＤＮＡマイクロアレイ１０を矢印Ｘ方向に主走査するため、この主走査中に、レーザ光Ｌ１が照射された微小領域に存在するＦ−ｃＤＮＡに対しては、照射されたレーザ光Ｌ１によりＦＩＴＣが励起されて蛍光Ｋ１を発光する。
【００３６】
レーザ光Ｌ１で発光した蛍光Ｋ１はＤＮＡマイクロアレイ１０の下面から拡がって出射し、出射した蛍光Ｋ１は、光学ヘッド５０のレンズ５３により、図示下方のビームとされ、同じく光学ヘッド５０の孔開きミラー５２に入射する。蛍光Ｋ１は孔開きミラー５２の反射面で反射され、矢印Ｘ方向に沿った方向に進行する。矢印Ｘ方向に進行した蛍光Ｋ１は第一のバンドパスフィルタ８１によって、蛍光Ｋ１以外の光の透過を阻止されて蛍光Ｋ１のみが通過してＰＭＴ９０に入射する。ＰＭＴ９０に入射した蛍光Ｋ１は、それぞれＰＭＴ９０により増幅されて光電検出され、対応する電気信号として読み取られ、対数増幅器９１により増幅され、Ａ／Ｄ変換器９２によりデジタル信号化されて、解析装置９３に出力される。
【００３７】
このようにして１主走査による読取が終了すると、光学ヘッド５０は主走査手段６０により元の位置まで戻され、一方その間に、副走査手段７０が、レーザ２１、２２、ダイクロイックミラー２３、光学ヘッド５０、フィルタセット８０及びＰＭＴ９０を一体的に矢印Ｙ方向に副走査させる。そして、以上の主走査、副走査とを繰り返すことにより、ＤＮＡマイクロアレイ１０の全面に亘ってレーザ光Ｌ１が照射され、ＤＮＡマイクロアレイ１０の各位置に対応した蛍光Ｋ１がデジタル信号化され取得される。
【００３８】
主走査、副走査を終えＤＮＡマイクロアレイ１０の最後の位置まで蛍光Ｋ１のデータが取得されると、光学ヘッド５０は最初の位置まで戻され、次に同様にレーザ２２から出射されたレーザ光Ｌ２で発光した蛍光Ｋ２を、蛍光Ｋ２以外の光の透過を阻止する第二のバンドパスフィルタ８２を用いてＰＭＴに入射させる。以下上記蛍光Ｋ１と同様に主走査、副走査とを繰り返すことによって蛍光Ｋ２がデジタル信号化され取得される。なおここでは、ＤＮＡマイクロアレイ１０の全ての位置についての蛍光Ｋ１を読み取りこれをデータとして保存しておいて、次に蛍光Ｋ２を読み取るという場合について説明したが、もちろんＤＮＡマイクロアレイ１０の各位置ごとに、レーザＬ１を照射して蛍光Ｋ１を読み取った後同じ位置にレーザＬ２を照射して蛍光Ｋ２を読み取るという動作をすべての位置について繰り返し行っても差し支えない。
【００３９】
ＤＮＡマイクロアレイ１０の各位置に対応したデジタル信号を取得した解析装置９３には、図３に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ１０の各位置に配置されているＦ−ｃＤＮＡの一本当たりの塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）の割合のデータが登録されている。従って、登録されているＦ−ｃＤＮＡ１本当たりの塩基の割合とＦ−ｃＤＮＡの蛍光量のデータと、測定されたＦ−ｃＤＮＡの蛍光量とＣｙ５ｃＤＮＡの蛍光量からその位置のＣｙ５−ｃＤＮＡの濃度を求めることができる。例えば、１−１番の位置のＦ−ｃＤＮＡの蛍光量をＰ１  、Ｃｙ５−ｃＤＮＡの蛍光量をＰ２  とすると、Ｃｙ５−ｃＤＮＡの濃度ｍは、ｍ∝Ｐ２／Ｐ１×２０となる。ＤＮＡマイクロアレイ１０のすべての位置について同様に解析すればＣｙ５−ｃＤＮＡの各位置の濃度が求められる。
【００４０】
ここでは、蛍光色素としてＦＩＴＣとＣｙ５を用いたが、その他の蛍光色素を用いることも、また同位体を用いることも可能である。その場合には、解析装置９３に予め、各位置における既知のｃＤＮＡの塩基の長さや構成している塩基の割合、既知量のｃＤＮＡの蛍光量あるいは放射線量などを標識物質に応じて登録しておけば、新たに作製されたＤＮＡマイクロアレイのｃＤＮＡの蛍光量または放射線量と、プローブＤＮＡの蛍光量または放射線量を測定することで、各位置のプローブＤＮＡの濃度を求めることが可能である。
【００４１】
尚、本発明の実施の形態では、試験片としてＤＮＡマイクロアレイを、特異的結合物質としてｃＤＮＡを、生物体由来物質として細胞から抽出したｍＲＮＡを用いて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試験片及びその作製方法の一実施の形態を示すフローチャート
【図２】本発明の定量装置の一実施の形態の構成を示す図
【図３】本発明の定量装置が保持しているデータの一実施の形態を示す図
【図４】ＤＮＡマイクロアレイのスポッターとブロットの一実施の形態を示す図
【図５】従来のＤＮＡマイクロアレイの斜視図
【符号の説明】
１    ｃＤＮＡ（特異的結合物質）
２    標識特異的結合物質
３    スライドグラス（担体）
４    ｍＲＮＡ（生体由来物質）
５    蛍光色素（標識物質）
６    蛍光色素（標識物質）
１０    ＤＮＡマイクロアレイ
９３    解析装置（解析手段）
１００    定量装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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