(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されていることを特徴とするエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法であって、
前記人工タンパク質をコードするＤＮＡとして、塩基配列の読み枠を異にした場合に、該塩基配列の少なくとも１つの読み枠にペプチド性エピトープがコードされ、他の読み枠に該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるαヘリックス形成能力、βシート形成能力、疎水性度向上能力に関する性質、又は、クラスＩ、クラスIIのＭＨＣ分子との親和性向上能力に関する性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡの重合体を用い、
この人工タンパク質をコードするＤＮＡを発現させる
ことを特徴とする人工タンパク質の製造方法。
【請求項２】
ペプチドタグ又はマーカータンパク質が融合している人工タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法。
【請求項３】
ペプチドタグがポリヒスチジン残基であることを特徴とする請求項２記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法。
【請求項４】
ペプチド性エピトープのアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法。
【請求項５】
ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、配列番号２４〜４７のいずれかに示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られる、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されていることを特徴とするエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質。
【請求項７】
塩基配列の読み枠を異にした場合に、該塩基配列の少なくとも１つの読み枠にペプチド性エピトープがコードされ、他の読み枠に該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるαヘリックス形成能力、βシート形成能力、疎水性度向上能力に関する性質、又は、クラスＩ、クラスIIのＭＨＣ分子との親和性向上能力に関する性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡの重合体からなり、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されており、エピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質や、該人工タンパク質を含んでなる免疫応答の誘導剤や、該人工タンパク質を抗原として用いる抗体の製造方法や、該人工タンパク質を有効成分として含有する機能性食品や、該人工タンパク質を発現する腸内細菌からなる脱感作・免疫寛容状態の誘導剤や、該人工タンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる免疫応答誘導用ＤＮＡワクチン等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子進化工学の誕生により、生命反応の根幹を形成するタンパク質あるいはそれらをコードする遺伝子ＤＮＡを、実験室の中で人工的に創り出すことが行われている。この技術により、自然には存在しない新たな活性を持った酵素・タンパク質や、天然のタンパク質とは大きく構造の異なるタンパク質を産み出すことが可能となり、医療領域や工学領域への様々な応用が期待されている。分子進化工学では、タンパク質又はそれをコードする遺伝子を構成するアミノ酸又はヌクレオチドのブロック単位のランダムな重合体プールの中から、目的とする活性を持つ分子を選び出す操作が行われる。例えば、Szostakらのグループは、１００塩基の長さをもつランダムな配列をもったＤＮＡ集団をＤＮＡ合成機で作製し、このＤＮＡ集団をインビトロでＲＮＡに転写し、１０13の多様性をもつＲＮＡ集団を用意し、このＲＮＡ集団の中から特定の色素に特異的に結合するＲＮＡ分子を選択し、どのような配列構造を有するＲＮＡ分子が与えられた機能を満足するかについて報告している（Nature,346:818-822,1990）。Szostakらのグループはさらに同様のアプローチで、リガーゼ活性といったより複雑な活性をもつＲＮＡ分子を創出することに成功している（Science,261:1411-1418,1993）。
【０００３】
一方、遺伝子は小さな遺伝子が繰り返し重合して誕生したのではないかという仮説があり（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:3391-3395,1983）、また、繰り返し構造に富むポリペプチドは安定な高次構造を取りやすいと考えられるので、大きなタンパク質や遺伝子を対象とする分子進化工学では、短い構造単位を繰り返し重合させ巨大分子を合成する技術が要求されている（Nature,367:323-324,1994）。短いＤＮＡ単位の繰り返し重合体を得る方法として、ローリング・サークル合成法が報告されている（Proc,Natl,Acad.Sci.USA,92:4641-4645,1995）が、この方法はリン酸化反応、連結反応、重合反応、二本鎖形成反応などのステップを何段階も経なければならないため、反応系が複雑である。
【０００４】
そこで本発明者らは、効率的かつ単純にマイクロ遺伝子の繰り返し重合体を作製する方法として、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて重合反応を行うことを特徴とするマイクロ遺伝子重合法（特開平９−３２２７７５号公報）を提案している。
【０００５】
また、絹タンパク質やエラスチン等の天然タンパク質の反復単位に類似する反復単位を有するアミノ酸ポリマーをコードするＤＮＡ（特開平１０−１４５８６号公報）や、繰返しアミノ酸配列を有する人工タンパク質をコードする遺伝子カセット（米国特許第５０８９４０６号明細書）や、アミノ酸の繰返し配列を有する大ポリペプチド作製用の合成反復ＤＮＡ（米国特許第５６４１６４８号明細書）や、アミノ酸の繰返し単位を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列（米国特許第５７７０６９７号明細書）や、アミノ酸の反復配列を含む大ポリペプチド作製用の合成反復ＤＮＡ（米国特許第５８３０７１３号明細書）が知られている。また、６つの読み枠の１つがαヘリックス構造を形成しやすいＤＮＡ断片をデザインし、そこから作成したライブラリーが高頻度に安定なタンパク質をコードすることや、同様に、６つの読み枠の中の１つがβストランド構造を形成しやすいＤＮＡ断片をデザインすることが報告（Proc,Natl,Acad.Sci.USA,94:3805-3810,1997）されている。
【０００６】
従来また、ペプチド性エピトープの抗原性を増強する手法としては、ペプチド性エピトープをタンデムにいくつも連結し、得られる種々のペプチド性エピトープのタンデム重合体を免疫原として用いる手法が知られており（J. Immunol. 153:5634-5642, 1994）、例えば米国特許第５，９５１，９８６号明細書には、ＨＩＶのエピトープを多価にもつペプチドの免疫原としての利用について開示されている。また、枝状に連結し多価にエピトープをもつ巨大分子を作製する方法（米国特許第５，２２９，４９０号明細書、特表平０８−５１１００７号公報）や、ペプチド性エピトープを提示するファージを免疫原として利用する方法（Nature Biotechnology, 18:873-876, 2000）なども知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記、ペプチド性エピトープをタンデムに重合する手法は簡便ではあるが、かならずしも全てのエピトープで有効に機能するわけではない（Mol. Immunol. 34:599-608, 1997）。例えばＨＩＶのｇｐ１２０ループ３ペプチドは、タンデムに重合して、さらにキャリアータンパク質と融合させた型ではマウスでの免疫誘導反応の改善が見られるが、キャリアータンパク質と融合しない状態では単独のペプチドを用いた免疫との有意な差は見られない(Vaccine 17:2392-2399, 1999)。このような免疫原性の極めて弱いペプチド性エピトープについて、強い免疫原性を与える新しい手法の開発が望まれていた。本発明の課題は、従来の手法からは十分な免疫応答誘導活性が得られないペプチド性エピトープに関しても、強い免疫応答誘導能力を付与する手法を提供することにある。より具体的には、エピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質や、該人工タンパク質を含んでなる免疫応答の誘導剤や、該人工タンパク質を抗原として用いる抗体の製造方法や、該人工タンパク質を有効成分として含有する機能性食品や、該人工タンパク質を発現する腸内細菌からなる脱感作・免疫寛容状態の誘導剤や、該人工タンパク質ををコードするＤＮＡを含んでなる免疫応答誘導用ＤＮＡワクチン等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ペプチド性エピトープが十分な抗原性をもつためには、そのペプチド性エピトープが、免疫担当細胞に取り込まれ、プロセシングを受けた後に、ＭＨＣ分子によりＢ細胞、Ｔ細胞へと効率よく提示される必要がある。このような「取り込み」「プロセシング」「ＭＨＣによる提示」反応が効率よく進むためには、ペプチド性エピトープが、天然のタンパク質に近いコンテクストの中に存在する必要があると考えられる。このような考えのもとに、「ペプチド性エピトープを少なくとも１コピーもつような天然のタンパク質に近い性質をもった人工タンパク質」をデザイン・作製し、この人工タンパク質の免疫原性を調べる実験をまず実施した。
【０００９】
エイズウイルスのもつｇｐ１２０タンパク質のループ３と呼ばれる領域は、中和エピトープとして知られており、このエピトープに対する抗体のいくつかは、ウイルスの増殖を抑えるといった中和活性をもち、エイズ治療に利用できる重要な抗体となる。エイズウイルスは、急速に自身の遺伝子配列を変化させることにより、ループ３領域のアミノ酸配列を変化させ、この中和抗体からの攻撃を逃れることが知られている。中和抗体の臨床利用の観点から考えると、このようにして新たに出現したエイズウイルス変異体に対する新しい中和抗体の迅速な作製が必要となるが、ｇｐ１２０タンパク質そのものを免疫原としても、あるいは、ループ３領域に相当するペプチドを免疫原としても、十分な免疫誘導が引き起こすことができないことも知られており、中和抗体の新たな作製には多大の時間と労力が必要であるのが現状であった（Nature 376:115, 1995）。そして、従来用いられているようなエピトープ配列のタンデム重合体を抗原として用いても、ループ３ペプチド配列に対する十分な免疫を誘導できないことが報告されている（Vaccine 17:2392-2399, 1999）。ｇｐ１２０タンパク質そのものを免疫原としてもループ３領域に対する抗体ができない理由は、ループ３ペプチドが、ｇｐ１２０タンパク質の内部に埋もれているからと考えられている。ループ３領域に相当するペプチドが弱い免疫原性しかもたないのは、免疫担当細胞による「取り込み」「プロセシング」「ＭＨＣによる提示」反応が、このペプチドでは効率よく進まないためだと考えられる。
【００１０】
そこで、「全体としては天然のタンパク質に近い性質」をもちながら、その構造上に少なくとも１コピーのループ３ペプチド配列をもつような人工タンパク質を作製し、これを用いた効率の良い免疫誘導法を試みた（図１）。なお、人工タンパク質の作製には「多機能塩基配列及びそれを含む人工遺伝子」（特願２０００−１８０９９７）や、「マイクロ遺伝子重合法」（特開平９−３２２７７５号公報）に記載された方法を用いた。
【００１１】
まず、エイズウイルスの中和抗原として知られているループ３ペプチド「ＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＴＦＶＴＩＧＫＩ」を読み枠の１つにコードするマイクロ遺伝子をデザインすることとした。例えば、最初のＲ（アルギニン）には「ＣＧＴ」「ＣＧＣ」「ＣＧＡ」「ＣＧＧ」「ＡＧＡ」「ＡＧＧ」の６つのコドンが対応するがこの中から特定のコドンを選択し、次のＫ（リシン）には「ＡＡＡ」「ＡＡＧ」の２つのコドンが対応するがこの中から特定のコドンを選択し、以下同様にして特定のコドンを順次選択しマイクロ遺伝子をデザインする場合、上記中和抗原ペプチドを読み枠の１つにコードする塩基配列は、コドンの縮重から約１，６５１億種あることになる。また、単一マイクロ遺伝子はプラス鎖及びマイナス鎖に各３種の読み枠をもつことから、６種の異なるペプチドをコードすることができることになり、例えば、同じ方向の異なる２つの読み枠では、上記中和抗原ペプチドとは全く異なる２つのペプチドがコードされることになる。そこで、同じ方向の他の読み枠２つのいずれかで「二次構造を形成しやすい」という性質を有するペプチドをコードする塩基配列を、上記約１，６５１億種の塩基配列の中から計算機により検索することにした。
【００１２】
計算機としてＳｕｎのＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅ２５０を用いて実行したところ、約１，６５１億種の塩基配列全てを同時に計算するには無理があることがわかったので、上記中和抗原ペプチドの両端を削除した「ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＴＦＶＴ」の１３個のアミノ酸からなるペプチドについて計算することとした。１つの読み枠でこのペプチドをコードする可能性のある塩基配列を全て計算機内に書き出したところ、約５億種の塩基配列が作成された。これら５億種の塩基配列の、同じ方向の他の２つの読み枠を翻訳し、終止コドンが現れて翻訳が途中でストップするものや、ペプチド配列として重複するものを除いた、約１，５０６万種のペプチド配列の集団を計算機の中に作成した。次に、この約１，５０６万種のペプチドの中から「二次構造を形成しやすい」という性質をもつペプチドを、二次構造予測プログラムを用いて個別に計算してスコアづけを行った。この計算に１週間以上要したが、得られた結果をスコアの高い順にソートしたところ、第２読み枠でαヘリックスを非常に形成しやすい塩基配列として、「ＡＴＡＣＧＣＡＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴ」を選択することができた。
【００１３】
上記計算は、エイズウイルス中和抗原ペプチド２０アミノ酸残基の真ん中部分１３アミノ酸残基について実施したので、未計算の両端部分についても同様の計算をおこない、それらの結果を合わせてマイクロ遺伝子「デザイン−２５」を得ることができた。このマイクロ遺伝子「デザイン−２５」は、その読み枠の１つに中和抗原配列をコードし、他の読み枠２つに終止コドンをもたず、さらに、そのうちの１つにαヘリックスを形成しやすい性質のペプチドをコードし、「エイズウイルス中和抗原性」と「構造形成能力」といった２つの生物機能構造が潜源化したマイクロ遺伝子ということができる。次に、かかるマイクロ遺伝子「デザイン−２５」を、前記本発明者によるマイクロ遺伝子重合法（特開平９−３２２７７５号公報）を利用して重合し、「中和抗原配列」と「αヘリックスを形成しやすい配列」とが複雑に組み合わさった種々の人工遺伝子からなる人工遺伝子ライブラリーを作製した。これら人工遺伝子ライブラリーを用いて種々の人工タンパク質を大腸菌で発現させ、全体としてはαヘリックスの構造に支えられながら、その中のところどころにエイズウイルス中和抗原配列をもつ人工タンパク質が得られた。かかる人工タンパク質を用いてマウスを免疫し、ｇｐ１２０タンパク質のループ３領域に対する抗血清を効率よく作製することができることや、対照実験としてのループ３領域に相当する合成ペプチドを用いた免疫からは有意な免疫誘導が生起しないことを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されていることを特徴とするエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法であって、前記人工タンパク質をコードするＤＮＡとして、塩基配列の読み枠を異にした場合に、該塩基配列の少なくとも１つの読み枠にペプチド性エピトープがコードされ、他の読み枠に該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるαヘリックス形成能力、βシート形成能力、疎水性度向上能力に関する性質、又は、クラスＩ、クラスIIのＭＨＣ分子との親和性向上能力に関する性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡの重合体を用い、この人工タンパク質をコードするＤＮＡを発現させることを特徴とする人工タンパク質の製造方法（請求項１）や、ペプチドタグ又はマーカータンパク質が融合している人工タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法（請求項２）や、ペプチドタグがポリヒスチジン残基であることを特徴とする請求項２記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法（請求項３）や、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法（請求項４）や、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、配列番号２４〜４７のいずれかに示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質の製造方法（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られる、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されていることを特徴とするエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質（請求項６）に関する。
【００１５】
また本発明は、塩基配列の読み枠を異にした場合に、該塩基配列の少なくとも１つの読み枠にペプチド性エピトープがコードされ、他の読み枠に該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるαヘリックス形成能力、βシート形成能力、疎水性度向上能力に関する性質、又は、クラスＩ、クラスIIのＭＨＣ分子との親和性向上能力に関する性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡの重合体からなり、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成されており、エピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項７）に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質としては、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むアミノ酸配列から構成されているタンパク質又はペプチドであれば特に制限されるものではなく、ここで人工タンパク質とは、天然に存在しないタンパク質又はペプチドであって、例えば前記文献(Vaccine 17:2392-2399, 1999)に記載された、ＨＩＶのｇｐ１２０ループ３ペプチドのタンデム重合体とキャリアータンパク質との融合体など、公知のペプチド性エピトープのタンデム重合体や、公知のペプチド性エピトープ又は公知のペプチド性エピトープのタンデム重合体と公知のキャリアタンパク質との融合タンパク質や融合ペプチドは除かれる。かかるエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質としては、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、タンパク質の高次構造形成を補助する性質が付与されたアミノ酸配列から構成されている人工タンパク質や、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、免疫担当細胞による抗原提示処理を補助する性質が付与されたアミノ酸配列から構成されている人工タンパク質を好適に例示することができる。
【００１８】
上記タンパク質の高次構造形成を補助する性質としては、αヘリックス形成能力、二次構造形成能力、疎水性度向上能力に関する性質を例示することができ、また、免疫担当細胞による抗原提示処理を補助する性質としては、クラスＩ、クラスIIのＭＨＣ分子との親和性向上能力に関する性質を例示することができるが、その他、天然のタンパク質に類似させた種々の性質を付与することもできる。そして、これらの有用な性質を有するアミノ酸配列は、アミノ酸組成や配列の繰り返し性を調整することにより、あるいは、かかる性質を保持した既知の配列を参考にすることにより調製することができる。また、本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質のエピトープのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列以外のアミノ酸配列として、上記タンパク質の高次構造形成を補助する性質を付与しうるペプチド配列や免疫担当細胞による抗原提示処理を補助する性質を付与しうるペプチド配列の他、例えば、糖の付加シグナルをもったペプチド配列を用いることもでき、かかるペプチド配列を加えることにより、合成された天然タンパク質は糖修飾され、タンパク質−糖のハイブリッド人工タンパク質などとすることもできる。
【００１９】
本発明の人工タンパク質として、具体的には、免疫原性のきわめて弱いペプチド性エピトープであるＨＩＶのｇｐ１２０ループ３に強い免疫原生を付与することができる、該ペプチド性エピトープループ３の全部又はその一部を含むアミノ酸配列、例えば配列番号２４〜４７のいずれかに示されるアミノ酸配列から構成される人工ペプチドあるいは人工タンパク質を挙げることができる。これら人工ペプチドあるいは人工タンパク質を含め、本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質は、生体おける体液性免疫や細胞性免疫等の免疫応答を誘導するための免疫応答の誘導（薬）剤として用いることができる。
【００２０】
本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質をコードするＤＮＡとしては、塩基配列の読み枠を異にした場合、該塩基配列の少なくとも１つの読み枠にペプチド性エピトープがコードされ、他の読み枠に該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるような性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡや、同じ読み枠にペプチド性エピトープと該ペプチド性エピトープの抗原性を高めるような性質を付与しうるペプチドがコードされているＤＮＡを例示することができ、例えばかかるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターは細胞性免疫や体液性免疫等の免疫応答誘導用ＤＮＡワクチンとして用いることができる。
【００２１】
本発明はまた、上記本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関し、宿主細胞としては、サルモネラ菌、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができるが、サルモネラ菌等の腸内細菌を好ましく例示することができる。かかる人工タンパク質を発現する腸内細菌を生体に投与すると、脱感作・免疫寛容状態を誘導することができることから、これら腸内細菌は脱感作・免疫寛容状態の誘導剤として期待できる。
【００２２】
また、発現系としては、上記本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、読み枠を変えて翻訳することができる発現ベクターシリーズも有利に用いることができる。
【００２３】
本発明の人工タンパク質をコードするＤＮＡや該人工タンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれた発現系の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２４】
本発明の人工タンパク質の製法としては、従来公知のタンパク質の製造方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、該人工タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより、あるいはペプチド合成法により得ることができる。上記人工タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば実施例に説明されているようなマイクロ遺伝子重合法を用いることにより作製することができ、その際エピトープをコードする塩基配列に付加する人工タンパク質の性質は、マイクロ遺伝子の同じ読み枠に存在していても異なる読み枠に存在していてもよいが、人工タンパク質をコードするＤＮＡの作製はこれらの方法に限定されるものではない。また、上記発現ベクター由来の翻訳領域に、ポリヒスチジン残基をコードする塩基配列を存在させるなどして、該人工タンパク質のアミノ酸配列の一部にポリヒスチジン残基等の分離精製用のペプチドタグを存在させることもできる。
【００２５】
また、本発明の人工タンパク質を、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグと結合させた融合タンパク質や融合ペプチドとすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質や融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明の人工タンパク質の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、本発明の人工タンパク質に対する抗体の定量、免疫不全症の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２６】
本発明の抗体の製造方法としては、エピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を抗原として用いる方法であれば特に制限されるものではなく、かかる抗体の種類としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、特にエイズウイルスの増殖に対する中和活性をもったモノクローナル抗体がより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、エイズ等の免疫不全症等の治療ばかりでなく、エイズ等の免疫不全症の発症機構を明らかにする上で有用である。
【００２７】
また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質又はその一部を、あるいはかかる人工タンパク質の一部とＭＨＣとの複合体を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２８】
本発明の上記人工タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、エイズ等の免疫不全症の診断や治療に使用できる可能性がある。また本発明の上記抗体を産生する細胞としては、株化した培養細胞が好ましく、例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、株化Ｂ細胞等を例示することができる。
【００２９】
本発明の機能性食品としては、本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を有効成分として含有するものであればどのような食品でもよく、かかる人工タンパク質を飲食品原料の一部として用いたり、あるいは製造工程又は製造後に添加・配合することにより得ることができる。かかる機能性食品としては特に制限されるものではなく、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、ラムネ菓子等などの錠菓、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、チーズ、バターなどの乳製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ、スープ、シチュー等の各種総菜や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料などを具体的に例示することができる。
【００３０】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１
ＨＩＶウイルスの一群の亜種がもつｇｐ１２０タンパク質の部分配列である、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を読み枠の１つとし、かつ同方向の他の読み枠２つのうちの少なくとも１つの読み枠で２次構造を形成しやすいアミノ酸配列からなるペプチドをコードすることができるマイクロ遺伝子をデザインするために、図２に示すフローチャートにしたがってマイクロ遺伝子を構築した。計算機の処理能力を考慮して、配列番号１に示される２０アミノ酸残基を、互いに一部重複する部分配列である３つのアミノ酸配列、すなわち配列番号２、配列番号３、配列番号４にそれぞれ示される３つのアミノ酸配列からなるペプチドに分割し、それぞれについて計算を実行した。
【００３１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列の場合、まず読み枠の１つに配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードすることのできる全ての塩基配列（塩基長は１３×３＝３９）である約５億種の塩基配列を計算機内に作成し、この配列集団の中から、同方向の他の２つの読み枠に終止コドンをもたない約１，１３５万種の塩基配列を計算機内で選び出した。次に、これら選び出された塩基配列の読み枠１と同方向の他の２つの読み枠のコードする全てのアミノ酸配列約２，２７０万種を計算機内に作成し、このアミノ酸配列からなるペプチド集団の中から同じアミノ酸配列をもった重複配列を除き、それぞれ異なる配列をもつペプチド集団約１，５０６万種を選び出した。このそれぞれのペプチド集団に対して、そのαヘリックス、あるいは、βシートの二次構造形成能力を前記の二次構造予測プログラムを用いたスコアーによって評価し、二次構造形成能力が高いと予想されるペプチドの中から、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを選定した。このペプチドは、配列番号６に示される塩基配列の第２読み枠にコードされるアミノ酸配列であり、αヘリックス構造を形成しやすい配列と予想された。
【００３２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列についても、上記同様の計算を実行し、第１読み枠で、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、第２読み枠でαヘリックスを形成する可能性が高いペプチドをコードし、かつ、そのペプチドの４番目から６番目のアミノ酸配列が、上記配列番号５に示されるアミノ酸配列の１番目から３番目のアミノ酸配列に一致する、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを選び出した。このペプチドは、配列番号８に示される塩基配列の第２読み枠にコードされるアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号４についても上記同様の計算を実行し、第１読み枠で、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、第２読み枠でαヘリックスを形成する可能性が高いペプチドをコードし、かつ、そのペプチドの１番目から３番目のアミノ酸配列が、配列番号５の１１番目から１３番目のアミノ酸配列に一致する、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを選び出した。このペプチドは、配列番号１０に示される塩基配列の第２読み枠にコードされるアミノ酸配列である。
【００３４】
上記の操作で得られた配列番号６、配列番号８、配列番号１０にそれぞれ示される塩基配列を、重複を考慮しながら連結し、配列番号１１に示される塩基配列を有するマイクロ遺伝子「デザイン−２５」を得た。このデザインされたマイクロ遺伝子は、図３に示すように、第１読み枠でＨＩＶウイルスの一群の亜種がもつｇｐ１２０タンパク質の部分配列をコードし、第２読み枠で、αヘリックス構造を形成しやすいペプチドの配列をコードする。なお、マイクロ遺伝子デザイン−２５の場合、マイクロ遺伝子のマイナス鎖（配列番号１１に示される塩基配列に対して相補的な配列）に関しては、終止コドンの出現の回避などの制限を加えていない。
【００３５】
上記のデザインされたマイクロ遺伝子「デザイン−２５」を出発材料とし、前記特開平９−３２２７７５号公報記載の高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法の技術を用いて、マイクロ遺伝子重合体ライブラリーを作製した。なお、重合の基礎となるオリゴヌクレオチドＡとして、配列番号１２に示される塩基配列からなるＫＹ−１１９７を、オリゴヌクレオチドＢとして、配列番号１３に示される塩基配列からなるＫＹ−１１９８をそれぞれ合成して用いた。これら３４ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＡの３′側１０残基と、３６ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＢの３′側１０残基とが、ともに３′端を除いて互いに相補的な配列として構成されている。
【００３６】
上記オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌクレオチドＢとを用いた重合反応の条件は、５０μＬの反応容量では以下の通りである。
ＫＹ−１１９７                 ２０ｐｍｏｌ
ＫＹ−１１９８                 ２０ｐｍｏｌ
ＫＣｌ                         １０   ｍＭ
(ＮＨ4)2ＳＯ4                   １０   ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．８)   １０   ｍＭ
ＭｇＳＯ4                        ２   ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００         ０．１   ％
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ             ７    μＬ
上記反応液を９４℃で１０分間処理した後、ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製「ＶｅｎｔR」）を５．２ユニット加えた。
【００３７】
重合反応は、パーキン・エルマー社の２４００ジーンアンプＰＣＲシステムを用いて行った。反応条件は、９４℃で１０秒間熱変性させ、６６℃で６０秒間アニーリングと伸張反応を行うというサイクルで５５サイクル繰り返し、最後の伸張反応を６６℃で７分間行った。重合反応産物として得られた本発明の人工遺伝子をプラスミドベクターｐＴＺ１９Ｒ(Protein Eng.,1:67-74,1986)にクローニングし、その挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンサー（パーキン・エルマー社）を用いて決定した。クローニングした１０種類のＤＮＡ断片、すなわちｐＴＨ１２７、ｐＴＨ１３３、ｐＴＨ１３６、ｐＴＨ１４２、ｐＴＨ１４３、ｐＴＨ１４５、ｐＴＨ１５５、ｐＴＨ１６７、ｐＴＨ１７１及びｐＴＨ１７６を図４及び図５に示す。このうち、ｐＴＨ１３３、ｐＴＨ１４２、ｐＴＨ１４３及びｐＴＨ１６７は、その挿入断片が長く、また繰り返し配列といった性質をもつために、その全長の塩基配列を決定することができないので、その部分配列が図４及び図５に示している。これら図４及び図５に示される各挿入塩基配列を配列番号１４〜２３にそれぞれ示す。
【００３８】
上記マイクロ遺伝子重合体である人工遺伝子を大腸菌内で発現させるために、プラスミドベクターｐＴＺ１９Ｒにクローニングした１０種の挿入ＤＮＡ断片を切りだし、方向、読み枠などを考慮しながら、方向、読み枠を選んで発現させることができる発現プラスミドベクターシリーズｐＫＳ６００〜ｐＫＳ６０５のいずれか１つに再クローニングした。この６種の発現プラスミドベクターｐＫＳ６００〜ｐＫＳ６０５は、キアゲン社から発売されている読み枠を１つずつずらした発現ベクターシリーズであるｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１０、ｐＱＥ−１１のクローニングサイトを改変したもので、プラス鎖とマイナス鎖のそれぞれ３読み枠、合計６種の読み枠のいずれかにより翻訳産物を大腸菌の中で大量発現させることができるように作製したものである。
【００３９】
これら人工遺伝子が挿入された２４種類の発現プラスミドベクターｐＴＨ１７７〜ｐＴＨ２００、すなわち、ｐＴＨ１２７の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１７７、ｐＴＨ１３３の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１７８、ｐＴＨ１３６の挿入配列をｐＫＳ６００に移し変えたｐＴＨ１７９、ｐＴＨ１４３の挿入配列をｐＫＳ６００に移し変えたｐＴＨ１８０、ｐＴＨ１４５の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１８１、ｐＴＨ１５５の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１８２、ｐＴＨ１６７の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１８３、ｐＴＨ１７１の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１８４、ｐＴＨ１７６の挿入配列をｐＫＳ６０１に移し変えたｐＴＨ１８５、ｐＴＨ１２７の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１８６、ｐＴＨ１３３の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１８７、ｐＴＨ１４２の挿入配列をｐＫＳ６０２に移し変えたｐＴＨ１８８、ｐＴＨ１４３の挿入配列をｐＫＳ６０２に移し変えたｐＴＨ１８９、ｐＴＨ１５５の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１９０、ｐＴＨ１６７の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１９１、ｐＴＨ１７１の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１９２であり、ｐＴＨ１７６の挿入配列をｐＫＳ６０３に移し変えたｐＴＨ１９３、ｐＴＨ１２７の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ１９４、ｐＴＨ１３３の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ１９５、ｐＴＨ１４３の挿入配列をｐＫＳ６０４に移し変えたｐＴＨ１９６ｐＴＨ１５５の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ１９７、ｐＴＨ１６７の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ１９８、ｐＴＨ１７１の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ１９９、ｐＴＨ１７６の挿入配列をｐＫＳ６０５に移し変えたｐＴＨ２００、が導入された大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ株を、発現誘導剤であるＩＰＴＧ存在下で培養することにより、ＨＩＶｇｐ１２０のループ３ペプチド配列の全部、あるいは一部をもつ人工タンパク質が得られた。
【００４０】
上記ｐＴＨ１７７〜ｐＴＨ２００翻訳産物であり、それらのＮ末とＣ末には発現プラスミド由来ペプチド配列が融合している２４種類の人工タンパク質のアミノ酸配列を図６〜９に示す。なお、図６〜９には、その重合体塩基配列の部分配列しかわからないものについては、Ｎ末領域のペプチド配列のみが示されている。図６〜９に示されるｐＴＨ１７７の挿入ペプチド配列を配列番号２４に、ｐＴＨ１７８の挿入ペプチド配列を配列番号２５に、ｐＴＨ１７９の挿入ペプチド配列を配列番号２６に、ｐＴＨ１８０の挿入ペプチド配列を配列番号２７に、ｐＴＨ１８１の挿入ペプチド配列を配列番号２８に、ｐＴＨ１８２の挿入ペプチド配列を配列番号２９に、ｐＴＨ１８３の挿入ペプチド配列を配列番号３０に、ｐＴＨ１８４の挿入ペプチド配列を配列番号３１に、ｐＴＨ１８５の挿入ペプチド配列を配列番号３２に、ｐＴＨ１８６の挿入ペプチド配列を配列番号３３に、ｐＴＨ１８７の挿入ペプチド配列を配列番号３４に、ｐＴＨ１８８の挿入ペプチド配列を配列番号３５に、ｐＴＨ１８９の挿入ペプチド配列を配列番号３６に、ｐＴＨ１９０の挿入ペプチド配列を配列番号３７に、ｐＴＨ１９１の挿入ペプチド配列を配列番号３８に、ｐＴＨ１９２の挿入ペプチド配列を配列番号３９に、ｐＴＨ１９３の挿入ペプチド配列を配列番号４０に、ｐＴＨ１９４の挿入ペプチド配列を配列番号４１に、ｐＴＨ１９５の挿入ペプチド配列を配列番号４２に、ｐＴＨ１９６の挿入ペプチド配列を配列番号４３に、ｐＴＨ１９７の挿入ペプチド配列を配列番号４４に、ｐＴＨ１９８の挿入ペプチド配列を配列番号４５に、ｐＴＨ１９９の挿入ペプチド配列を配列番号４６に、ｐＴＨ２００の挿入ペプチド配列を配列番号４７に示す。
【００４１】
前記２４種類の人工遺伝子が挿入された発現ベクターｐＴＨ１７７〜ｐＴＨ２００の翻訳産物の中で、発現量の多いｐＴＨ１７７、ｐＴＨ１７８、ｐＴＨ１８０、ｐＴＨ１８１、ｐＴＨ１８３、ｐＴＨ１８４、ｐＴＨ１８５、ｐＴＨ１８６、ｐＴＨ１８７、ｐＴＨ１８８、ｐＴＨ１８９、ｐＴＨ１９０、ｐＴＨ１９２、ｐＴＨ１９４、ｐＴＨ１９５、ｐＴＨ１９６、ｐＴＨ１９７、ｐＴＨ１９８、ｐＴＨ１９９、ｐＴＨ２００の各人工タンパク質について、発現ベクターに由来するＮ末端のポリヒスチジン残基を利用することによって次のように精製した。各発現プラスミドをもつ大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ株の５００ｍｌスケールの培養を３７℃で開始し、培養液のＯＤ660が０．２に達した時点で発現誘導剤であるＩＰＴＧを０．２４ｇ／ｌになるように加え、さらに３時間培養を続け、培養液を３，０００ｇで１０分間遠心し、集菌した。
【００４２】
上記集菌した菌体を４０ｍｌの溶菌バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６Ｍの塩酸グアニジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ）に懸濁し、３７℃で１時間インキュベートし、７，０００ｇ×３０分間遠心して得られた上清を、溶菌バッファーで平衡化前処理した５０％ＴＡＬＯＮ樹脂（クロンテック社）液４ｍｌと混合し、室温で２０分間緩やかに攪拌した後、７００ｇ×５分間遠心した。次いで、上清を捨て、２０ｍｌの溶菌バッファーで洗浄し、室温で１０分間緩やかに攪拌した後、７００ｇ×５分間遠心して上清を捨て溶菌バッファーによる洗浄を繰り返した。次に、２ｍｌの溶菌バッファーを加え、voltexで懸濁し、カラムに充填し、６ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール）で洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．０）、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．０）、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）でＴＡＬＯＮ樹脂に結合した精製タンパク質を溶出させた。精製タンパク質を含む溶出分画を５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ４．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで透析（ピアス社、分画分子量１万）し、限外濾過膜（アミコン社、セントリップ、分画分子量１万）で濃縮後、濃度を測定し精製標本とした。
【００４３】
実施例２
２０種の精製タンパク質を３週ごと３回にわけて、２０〜２５μｇをそれぞれ５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）、合計１００匹の脾臓に注射することにより免疫し、最終免疫から５日目に血液をマウス網膜血管から採取した。また、ＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドＩＮＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＴＦＮＴＩＧＫＩＧＮＭＲＱＡＨＣＮＩ（配列番号４８）を用いて同様に免疫した５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）から採取した血液を対照（Ｖ３）として用いた。次に、常法により、ＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ実験を行い、免疫誘導能力を評価した。ＥＬＩＳＡは、９６穴プレート（ファルコン社、3539）に上記合成ペプチド（配列番号４８）を固相化した後、マウス血清を一次抗体として吸着させ、洗浄の後、二次抗体としてペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を加え、洗浄の後、ＯＰＤ（o-Phenylenediamine）を基質として発色させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。
【００４４】
ｐＴＨ１７７、ｐＴＨ１７８、ｐＴＨ１８０、ｐＴＨ１８１、ｐＴＨ１８４、ｐＴＨ１８５、ｐＴＨ１８６、ｐＴＨ１８８、ｐＴＨ１９０、ｐＴＨ１９２からの精製タンパク質及び対照としてのＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドを免疫原として用いた免疫実験の、それぞれ５匹の免疫マウスから得た血清を２５００倍希釈し、ＥＬＩＳＡを行った。結果を図１０に示す。図１０に示される結果は、これらの人工タンパク質がマウスの生体内で異物として認識され、免疫反応を誘導することを示している。また、対照実験であるＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドで免疫したマウスからは該合成ペプチドに対する抗血清は予想通りの結果が得られなかった。
【００４５】
図１０の実験で用いた同一サンプルを、同一抗原の５匹のマウス内で混合し、いろいろな希釈の後にＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの配列をもつ合成ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ実験を行った結果を図１１に示す。この結果は、人工タンパク質のｇｐ１２０ループ３配列に相当する部分に対する抗体が多くのマウスで作られていることを示している。
【００４６】
ｐＴＨ１９４、ｐＴＨ１９５、ｐＴＨ１９６、ｐＴＨ１９８、ｐＴＨ１９９からの精製タンパク質を用いた免疫実験の、それぞれ５匹の免疫マウスから得た血清を別々に４０００倍希釈し、ＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡの結果を図１２に示す。この結果は、人工タンパク質のｇｐ１２０ループ３配列に相当する部分に対する抗体が多くのマウスで作られていることを示している。
【００４７】
ｐＴＨ１８３、ｐＴＨ１８７、ｐＴＨ１８９、ｐＴＨ１９７、ｐＴＨ２００からの精製タンパク質を用いた免疫実験の、それぞれ５匹の免疫マウスから得た血清を５０００倍希釈し、ＨＩＶｇｐ１２０ループ３領域を含む４０ｍｅｒの合成ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡの結果を図１３に示す。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のエピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質を用いると、生体での体液性免疫を誘導することができる。また、かかる人工タンパク質を用いてマウスその他の動物を免疫することにより、前記エピトープに対する抗体を簡便かつ効率的に製造することができ、得られた抗体は、抗体を用いた治療や抗体を用いた診断に利用できる。前記人工タンパク質をコードするＤＮＡをＤＮＡワクチンとして用いることにより、生体での細胞性免疫を誘導することができる。そして、これらの体液性免疫、細胞性免疫の誘導は、マラリアなど広い抗原に対するワクチンとして利用できることを示している。さらに、人工タンパク質を発現する腸内細菌等は脱感作・免疫寛容の誘導にも利用できる他、生体内で免疫寛容状態のタンパク質（癌抗原や胎児抗原など）に免疫反応を引き起こさせる手法としても利用できる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質が強い免疫誘導能力を獲得することを説明するための図である。
【図２】マイクロ遺伝子の自動デザインの計算作業のフローの一例を示す図である。
【図３】デザインされた２本鎖多機能ＤＮＡ配列からなるマイクロ遺伝子とそれがコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図４】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質をコードするＤＮＡの一例を示す図である。
【図５】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質をコードするＤＮＡの一例を示す図であり、図４の続きである。
【図６】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質の一例を示す図である。
【図７】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質の一例を示す図であり、図６の続きである。
【図８】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質の一例を示す図であり、図７の続きである。
【図９】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質の一例を示す図であり、図８の続きである。
【図１０】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質を用いて得られた抗血清のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１１】本発明のエピトープの免疫原生が増強された人工タンパク質を用いて得られた抗血清の種々の希釈物のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１２】本発明のエピトープの免疫原生が増強された他の人工タンパク質を用いて得られた抗血清のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１３】本発明のエピトープの免疫原生が増強された他の人工タンパク質を用いて得られた抗血清のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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