(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質がミセル構造体を形成している水溶液中に、金属陽イオンおよび前記１本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を添加し、ミセル構造体上のＤＮＡ鎖の二重らせん形成によりミセル構造体同士を自律的に凝集させて、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項２】
１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質におけるＤＮＡ鎖の含有率が０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下であることを特徴とする請求項１の遺伝子検査方法。
【請求項３】
金属陽イオンが、マグネシウムイオン、またはナトリウムイオンのいずれかから選択されることを特徴とする請求項１または２いずれかの遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、遺伝子検査方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液に遺伝子を添加する遺伝子検査方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
近年の遺伝子工学の発展により、遺伝子診断は、医療分野における病原菌やウィルスの検出のみならず、犯罪捜査、親子鑑定、考古学研究、生物学などの様々な分野において頻繁に用いられるようになっている。
【０００３】
従来、遺伝子診断を行うためには、ハイブリダイゼーションが一般的に行われてきた。この方法は、検体をナイロン膜などの固相に固定し、目的の遺伝子配列に相補的な遺伝子の結合を調べる方法であるが、その特異性が必ずしも高くないという問題が指摘されていた。また、数時間から１日という長い時間を要する上、遺伝子結合を検知するために、放射性同位元素を用いたり、酵素反応を利用した複雑な化学反応を必要とするため、より精度の高い、簡便な方法が求められていた。
【０００４】
そこで、最近になって、遺伝子チップを用いる遺伝子診断方法が研究、報告されているが、この方法も、前述の問題点を解決するものではなかった。
【０００５】
さらに、ラテックス微粒子や金コロイドとＤＮＡの複合体の凝集を用いる遺伝子診断（Chemistry Lett., 1999, 1041-1042, J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 1959-1964）が報告され、簡便な方法として注目された。しかし、このような複合体の凝集では、図１（ａ）に示すように、検体として添加されたＤＮＡ（ないしＲＮＡ）が複数の微粒子を架橋することにより凝集を促しているため、検体ＤＮＡの複数の箇所に結合する複数種類のＤＮＡ固定化微粒子を用意する必要があり、複雑で、汎用性がなかったのが実状である。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、簡便に、高い精度で遺伝子の相違を検査する汎用的な方法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質がミセル構造体を形成している水溶液中に、金属陽イオンおよび前記１本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を添加し、ミセル構造体上のＤＮＡ鎖の二重らせん形成によりミセル構造体同士を自律的に凝集させて、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することを特徴とする遺伝子検査方法を提供する。
【０００８】
第２には、この出願の発明は、上記遺伝子検査方法の態様として、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質を結合させたＤＮＡコンジュゲート物質におけるＤＮＡ鎖の含有率が０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下であることを提供する。
【０００９】
また、第３には、金属陽イオンが、マグネシウムイオンまたはナトリウムイオンのいずれかから選択されることを、該遺伝子検査方法の態様として提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液に遺伝子を添加し、溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化から、遺伝子を確認する遺伝子検査方法に関するものである。以下のこの発明をさらに詳しく説明する。
【００１１】
発明者らは、１本鎖ＤＮＡとビニルポリマーの複合体（つまりコンジュゲート）を合成し、新規物質として報告している（Chem.Commun., 1998, 1433-1434）。この物質は、水中でＤＮＡ鎖を親水部位、ビニルポリマー鎖を疎水部位として、ミセルを形成することが分かっている。
【００１２】
その後、発明者らの鋭意研究により、１本鎖ＤＮＡ鎖と疎水性物質が結合したさまざまなＤＮＡコンジュゲート物質が、水中でミセル構造体を形成しているとき、該１本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を水溶液中に添加すると、ミセル構造体表面でＤＮＡ鎖が二重らせんを形成し、ミセルの自律的な凝集が生じることが明らかになった。この出願の発明は、以上の成果を基に、さらなる条件の検討等を行い、考案されたものである。
【００１３】
この出願の発明の遺伝子検査方法において、該ＤＮＡコンジュゲート物質は、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質が結合し、複合体を形成していればよく、その構造は、とくに限定されない。つまり、１本鎖ＤＮＡ部位と疎水性部位を有し、水中で安定なミセル構造を形成することができるものであればよい。１本鎖ＤＮＡは、検査したいＤＮＡ（目的配列）の１本鎖であれば、長さ、末端などの配列はとくに限定されない。また、疎水性物質の構造は、水中で凝集しうる構造であればどのようなものであってもよく、限定されない。例えば、ビニルポリマーなどの疎水性高分子鎖、ラテックス微粒子、金コロイド、無機微粒子などが例示される。
【００１４】
また、この出願の発明の遺伝子検査方法で使用されるＤＮＡコンジュゲート物質においては、安定なミセル構造を形成できれば、１本鎖ＤＮＡの含有率は限定されない。あまり低い含有率では、相補的遺伝子の添加による光分散強度の変化が確認されにくいばかりでなく、ミセルが形成されないことも考えられるので好ましくない。また、１本鎖ＤＮＡ含有率が高すぎる場合には、ＤＮＡコンジュゲートがミセルとなりにくく、ミセルが形成されても不安定となる場合が多いため、好ましくない。したがって、０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下程度が好ましい。この範囲では添加された遺伝子と容易に二重らせんを形成できる安定なミセルが得られる。しかし、１本鎖ＤＮＡの含有率は、１本鎖ＤＮＡの鎖長や疎水性物質の構造に応じて変更することが望ましいため、上記の範囲に限定されない。
【００１５】
この出願の発明の遺伝子検査方法では、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液中には、マグネシウムやナトリウムなどの金属陽イオンを共存させる。
【００１６】
一般に、イオン性界面活性剤のミセル形成や高分子ミセルでは、溶液中の対イオン濃度の増大に伴って、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の低下と会合数の増大が起こることが知られている。つまり、対イオンが増大すると、少量の界面活性剤でもミセルを形成できるようになったり、ミセルの粒子径が増大したりするのである。
【００１７】
この出願の発明の遺伝子検査方法において用いられる１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質でも、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質の濃度が小さくてもミセルが形成されるようになる、ミセルの粒子径が大きくなり、光散乱の測定が容易になる等という理由からも金属陽イオンの共存が好ましい。しかし、そればかりでなく、発明者らの研究によれば、この出願の発明の遺伝子検査方法では、金属陽イオンが共存しない場合、相補的遺伝子が添加されても、溶液の透明度に変化（つまり白濁）が見られないため、金属陽イオンの添加は必須である。
【００１８】
使用する金属陽イオンはとくに限定されないが、好ましくはマグネシウムイオン、またはナトリウムイオンである。マグネシウムイオンとしては、ＭｇＣｌ2等が考慮され、その濃度は、２０〜１００ｍＭとすることが好ましく、より好ましくは、３０〜５０ｍＭである。また、ナトリウムイオンとしては、ＮａＣｌ等が適用でき、その濃度は０．１〜２Ｍ、より好ましくは、０．５〜１．５Ｍとする。これらの金属陽イオンが１本鎖ＤＮＡの水溶液中に共存することにより、相補的遺伝子を添加した際に、ミセル表面のＤＮＡ鎖と二重らせんが形成され、ミセルどうしの凝集が円滑に生じるのである。
【００１９】
また、一般に、同じ物質濃度の溶液におけるミセル形成は、温度に左右されることが知られている。つまり、相転移温度より低い温度と、それ以上では、ミセルの挙動が異なるのである。この出願の発明の遺伝子検査方法で使用されるＤＮＡコンジュゲート物質でも同様のことが考慮されるが、この温度は、水溶液中の１本鎖ＤＮＡの濃度、対イオンの濃度等と関連するため、各系の相転移温度に応じて選択されるものである。例えば、前述のＤＮＡ含有率（０．１〜０．５ｍｏｌ％）の範囲において、Ｍｇ2+イオンを３０ｍＭ添加した、ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）の系では、水溶液の温度を相転移温度以上の３０℃以上とすることが好ましい。より好ましくは、３０〜４０℃である。
【００２０】
さらに、この出願の発明の遺伝子検査方法では、１本鎖ＤＮＡと相補鎖の二重らせん形成や光散乱強度の測定を妨げない範囲で、水溶液中に、１本鎖ＤＮＡコンジュゲートと金属陽イオン以外の物質を添加してもよい。例えば、緩衝液などが考慮される。
【００２１】
したがって、この出願の発明の遺伝子検査方法は、図１（ｂ）に示されるように、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質が水溶液中でミセルを形成し、相補遺伝子の添加によって、ミセル粒子上のＤＮＡが単体で二重らせんを形成し、自律的に凝集するため、１種類の微粒子でオン・オフ的に結果を出力できる、簡便で汎用性の高い検査方法だといえる。
【００２２】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２３】
【実施例】
参考例１  ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートの合成（化学式１）
１．５ｍｌの試験管内に、ＮＩＰＡＡｍを１４０ｍＭ、５’末端をビニル化したＤＮＡ（癌遺伝子として知られるラスタンパク質のコドン(c-K-ras codon)：ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ）を６００μＭとした溶液を調製した。この溶液の窒素置換を行なった後、開始剤として過硫酸アンモニウム（１．３ｍＭ）と、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン８６ｍＭを加え、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、１ｍｌ）を緩衝液とし、室温にて１時間重合した。
【００２４】
各サンプルについて、３Ｌの超純水に対する２４時間の透析（ＳｐｅｃｔｒＰｏｒｅ６；ＭＷＣＯ １０００）を行なって、未反応のＮＩＰＡＡｍを除去し、さらにゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００）により、未反応のビニル化ＤＮＡを除去した（逆相ＨＰＬＣ分析により確認）。凍結乾燥後、純水に溶解させ、複合体の組成を、ＤＮＡ由来の吸光度と複合体の乾燥重量から算出した。
【００２５】
得られたＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲートのＤＮＡ含有率は、０．３５ｍｏｌ％、収率は８１％であった。
【００２６】
また、水中において、このＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲートは、安定なミセル構造をとることが確認された。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
実施例１  ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いた遺伝子検査
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ2を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ）を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が２％以下となった。光透過率測定の結果を図２に示す。
比較例１
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ2を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ）に対する相補鎖の１塩基変異体（ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＧＧＣ）を添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された（図２）。
【００２９】
以上より、この出願の発明の遺伝子検査方法を用いることにより、オリゴヌクレオチドにおける、わずか１塩基の違いをも明瞭に識別できることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、簡便に、精度高く、遺伝子の識別を行うことが可能な遺伝子検査方法が提供される。この遺伝子検査方法は、ミセル粒子上のＤＮＡが単体で二重らせんを形成し、自律的に凝集するため、１種類の微粒子でオン・オフ的に結果を出力できる、簡便で汎用性の高い検査方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この出願の発明の遺伝子検査方法と従来の方法を比較した概略摸式図である。（ａ）従来法、（ｂ）この出願の発明の遺伝子検査方法
【図２】  この出願の発明の実施例における、相補的遺伝子の添加による光透過率の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
１  ミセル凝集体（従来法）
２  架橋部位
３  １本鎖ＤＮＡコンジュゲートミセル構造体
４  １本鎖ＤＮＡ
５  疎水性部位
６  相補的遺伝子
７  ミセル凝集体（本願記載の方法）
８  ＤＮＡ二重らせん
【図１】
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【図２】
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