(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＲＥ及びＭＲＳＡの少なくとも一方に対する抗菌剤であって、下式
【化１】
0003981914.tif 000008
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ水素原子、水酸基、Ｂｒ又はＣｌを表し、Ｙ１及びＹ２は両者が水素原子であるか、その一方が水素原子で他方がメチルエステル基であるか、又はＹ１及びＹ２は結合する炭素とカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ１は水素原子、メチルエステル基又はハロゲン化されていてもよいメチル基を表す。）で表される化合物から成る抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＶＲＥ（バンコマイシン抵抗性腸球菌）及びＭＲＳＡ（メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌）に対する活性物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、多数の抗生物質に対して耐性を有する細菌による感染が顕著な問題になってきている。特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は世界中の病院に広まりつつある。新規な抗菌化合物の探索によって、トタロールがＭＲＳＡに対して強い抗菌活性を有することが発見されている１。エバンスはトタロール、フェルギノール及びこれらのアビエタン誘導体のＭＲＳＡに対する抗菌活性を報告している２。アビエタン型ジテルペンは植物界に広く分布する天然物であり、例えば、抗ウイルス活性３，４、抗菌活性４−９、抗マラリア活性１０、抗酸化活性１１及び抗腫瘍活性１２，１３などの様々な生物学的活性を有している。本発明者は様々な酸化アビエタン化合物（11-フェノール、11,12-カテコール、p-キノンメチド及びその６位及び７位がケトン／アルコール）を合成して、ＶＲＥ及びＭＲＳＡに対する構造と活性の関係を調べることを計画した。本発明者は以前ポリエン不斉環化反応による（＋）−及び（−）−フェルギノールの立体選択的合成について報告し１４、更に、ポリエン環化反応を用いた天然アビエタン型ジテルペンの合成並びにこれらの合成した天然ジテルペン及び関連化合物のＭＲＳＡ及びＶＲＥに対する抗菌活性について報告した１５（特願2000-265345）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、多数の抗生物質に対して耐性を有する細菌による感染が顕著な問題になってきており、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は世界中の病院に広まりつつある。このような状況で、ムピロシンはＭＲＳＡに対して有効な感染症治療軟膏として、1996年より認可されているが、既に耐性菌の出現が報告されている。
本発明者らは既に、高度に酸化されたアビエタン型骨格を有するジテルペンを系統的に効率よく合成する方法を確立し１４，１５、これを用いて１２種類の天然物を合成し、これらの中でキノンメチド型化合物は、メシチレン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)及びバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)に対して極めて強い抗菌作用を示すことを見出していた（特願2000-265345）。
【０００４】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明においては、この合成法を用いて、メシチレン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)及びバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)に対して極めて強い抗菌作用を示すことを新たに見出した。
【０００５】
即ち、本発明は、ＶＲＥ及びＭＲＳＡの少なくとも一方に対する抗菌剤であって、下式
【化１】
0003981914.tif 000002
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ水素原子、水酸基、Ｂｒ又はＣｌを表し、Ｙ１及びＹ２は両者が水素原子であるか、その一方が水素原子で他方がメチルエステル基であるか、又はＹ１及びＹ２は結合する炭素とカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ１は水素原子、メチルエステル基又はハロゲン化されていてもよいメチル基を表す。）で表される化合物から成る抗菌剤である。
【０００９】
本発明者らの研究結果１５から、Ｃ環の構造が他のＡ環やＢ環の構造よりも抗菌活性に大きく影響していることを示唆する結果が得られている（このＡ〜Ｃ環については、例えば化１に関し下記化９を参照されたい。）。
【化９】
0003981914.tif 000003
従って、上記化１の化合物において、Ｂ環やＡ環の構造が多少異なっていても、Ｃ環に同様な部分構造を有することにより、市販の天然ジテルペン化合物から容易に誘導できる化合物も同様な抗菌活性を有するものと考えられる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
製造例
本実施例で用いる化合物を下記方法にて合成した。
合成した化合物について以下の方法でその構造を確認した。ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを含むＣＤＣｌ３、Ｃ５Ｄ５Ｎ又はＤＭＳＯ−ｄ６中のサンプルについてJEOL JNM-EX270分光計(1H: 270 MHz, 13C: 67.8 MHz) 及びJEOL JNM AL400 (1H: 400MHz, 13C: 100MHz) で測定し、Ｊ値はＨｚで表す。赤外スペクトルはJEOL JIR-WINSPEC 50赤外分光計出測定し、紫外スペクトルはJASCO UVDEC-460分光計で測定した。質量スペクトルはJEOL JMS-SX102A分光計で記録した。M.p.sはMEL-TEMP (Laboratory Device)で測定し、修正されていない。薄層クロマトグラフィ（TLC）はKiesel-gel GF254 (厚さ0.25 mm)で行った。カラムクロマトグラフィーにはシリカゲル60 (70-230メッシュ ASTM)を用いた。
【００１２】
化合物３３（8,13-abietadiene-7,11,12-trione)の合成
文献１５に記載の方法により得た化合物３１ (338 mg, 0.073 mmol)をMeOH：H2O（6：1, 7 ml）に溶解して，NaHCO3 (82 mg)を加え，空気中2時間refluxした。常温に戻し，EtOAcで液−液抽出した。有機層をbrineで洗浄した後，MgSO4で乾燥し，濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（hexane:EtOAc=5:1）で精製し，化合物３３ (5 mg, 0.016 mmol)を21.9％収率で得た。そのほかに，化合物３２ (14 mg, 0.044 mmol)を60.2％収率で得た。合成経路を以下に示す。
【化１２】
0003981914.tif 000004
【００１３】
化合物３３の分析結果を以下に示す。8,13-abietadiene-7,11,12-trione (33)  oily solid；  1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ 7.44 (1H, s), 2.93 (1H, sept, J=6.8Hz), 2.70 (1H, br d, J=13.2Hz), 2.70 (1H, dd, J=17.6, 2.9Hz), 2.52 (1H, dd, J=17.6, 14.8Hz), 1.77 (1H, dd, J=14.8, 2.9Hz), 1.72-1.67 (1H, m), 1.61-1.43 (2H, m), 1.37 (3H, s), 1.30-1.17 (2H, m), 1.13 and 1.12 (each 3H, d, J=6.8Hz), 0.96 and 0.93 (each 3H, s);  13C-NMR (CDCl3, 100MHz)δ 198.48, 185.27, 180.25, 154.38, 147.71, 135.85, 130.46, 49.39, 40.79, 39.66, 35.14, 33.17, 32.83, 27.55, 21.51, 21.45, 21.32, 18.50, 18.34;  IR (NaC) cm-1 2915, 2848, 1733, 1683, 1662, 1558, 1457, 1241; EIMS m/z (% rel. int.) 314 (M+, 15), 259 (20), 245 (23), 234 (20), 210 (20), 106 (21), 98 (28), 84 (31), 82 (33), 70 (95), 58 (78), 56 (100);  HREIMS m/z calcd for C20H26O3 314.1882, found 314.1906;UV λmax nm (EtOH, ε) 226 (1.97×104), 417 (1.61×103).
【００１４】
化合物５２の合成
文献１４に記載の方法により得た化合物２１(100 mg, 0.387 mmol)を4 mlの蒸留したCH2Cl2に溶解し，アルゴン気流下0℃でBBr3 (1.14ml, 1.161 mmol)を加えて4時間撹拌した。水を加えて反応を停止させ，EtOAcで液−液抽出した。有機層をbrineで洗浄した後，MgSO4で乾燥し，濃縮した。シリカゲルカラムクロマグラフィ−で（hexane:EtOAc=10:1）で精製し、目的化合物５２(85.6 mg, 0.351 mmol)を収率90.7％で得た。合成経路を以下に示す。
【化１３】
0003981914.tif 000005
【００１５】
化合物５２の分析結果を以下に示す。oily solid, 1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 6.89(1H, d, J=8.0Hz), 7.73 (1H, d, J=2.4Hz), 6.57 (1H, dd, J=8.0, 2.4Hz), 4.79 (1H, br s), 2.89-2.71(2H, m), 2.18 (1H, br d, J=12.8Hz), 1.86 (1H, m), 1.74-1.57 (3H, m), 1.46 (1H, d, J=13.2Hz), 1.40-1.20 (3H, m), 1.17 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.92 (3H, s); 13C-NMR (CDCl3, 100MHz) δ 153.30, 151.60, 129.89, 127.38, 112.54, 110.95, 50.29, 41.71, 38.85, 37.95, 33.54, 33.37, 29.65, 24.79, 21.73, 19.38, 19.22.
【００１６】
化合物５３、５４、５７の合成
上記で合成した化合物５２ (13.8 mg, 0.056 mmol)を3 mlの蒸留したCH2Cl2に溶解し，Pyridinium bromide perbromide (95 mg)を加え，室温で6時間反応した。ろ過して、得られた液体を濃縮した。TLCで（hexane:EtOAc=10:1）で精製し、化合物５３(6 mg, 0.017 mmol, 収率33.3%)，化合物５４(3 mg, 0.008 mmol, 収率14.3%)及び化合物５７(3.6 mg, 0.009 mmol, 収率15.6%)をそれぞれ得た。合成経路を以下に示す。
【化１４】
0003981914.tif 000006
【００１７】
化合物５３の分析結果を以下に示す。oily solid, 1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 7.12 and 6.91 (each 1H, s), 5.23 (1H, s), 2.88-2.70 (2H, m), 2.19 (1H, br d, J=12.0Hz), 1.87-1.82 (1H, m), 1.79-1.57 (3H, m), 1.50-1.46 (1H, m), 1.40-1.33 (1H, m), 1.27 (1H, dd, J=12.4, 2.2Hz), 1.22 (1H, dd, J=13.4, 4.2Hz), 1.16 (3H, s), 0.94 and 0.92 (each 3H, s); 13C-NMR (CDCl3, 100MHz) δ 151.60, 149.74, 131.44, 129.18, 111.73, 106.80, 50.00, 41.52, 38.72, 37.84, 33.43, 33.22, 29.26, 24.62, 21.60, 19.18, 18.94; IR (NaCl) cm-1 3442, 2925, 1704, 1596, 1483, 1365, 1267, 1220, 1081, 875; EIMS m/z (% rel. int.) 324 (M+2, 98), 322 (M+, 100), 309 (56), 307 (55), 244 (67), 239 (70), 229 (40), 227 (66), 225 (82), 172 (41), 159 (80), 158 (89), 145 (74), 144 (90), 131 (55), 128 (59), 115 (85), 69 (82); HREIMS m/z calcd for C17H23BrO 322.0932, found 322.0930.
化合物５４の分析結果を以下に示す。oily solid, 1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 7.19 and 6.15 (each 1H, s), 3.50 (1H, dt, J=13.2, 3.9Hz), 2.82 (2H, m), 1.82 (1H, dd, J=13.2, 5.6Hz), 1.75-1.64 (1H, m), 1.43 (3H, s), 1.25-1.09 (3H, m), 0.97 and 0.93 (each 3H, s); 13C-NMR (CDCl3, 100MHz) δ 147.43, 147.01, 132.77, 131.90, 110.67, 106.29, 53.27, 41.41, 40.60, 35.77, 33.98, 33.53, 32.66, 22.51, 19.42, 19.10, 18.55; IR (NaCl) cm-1 3457, 2925, 2854, 1675, 1457;
EIMS m/z (% rel. int.) 404 (M+4, 11), 402 (M+2, 24), 400 (M+, 8), 317 (21), 171 (23), 158 (43), 149 (56), 144 (42), 128 (68), 115 (87), 105 (25), 91 (42), 81 (43), 77 (77), 69 (100), 55 (76); HREIMS m/z calcd for C17H22Br2O 400.0037, found 400.0034.
【００１８】
化合物５５の合成
化合物５３ (13 mg, 0.041 mmol)を2 mlのTolueneに溶解し，DDQ (18 mg)を加えて室温で4時間反応した。水を加えてEtOAcで液−液抽出した。有機層をbrineで洗浄した後，MgSO4で乾燥し，濃縮した。TLCで（hexane:EtOAc=10:1）で精製し，化合物５５(3.5 mg, 0.010 mmol)を収率25.4％で得た。
化合物５５の分析結果を以下に示す。 oily solid, 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ 8.16 (1H, s), 6.99 (1H, s), 5.96 (1H, s), 2.69 (1H, dd, J=18.3, 4.2Hz), 2.56 (1H, dd, J=18.3, 13.6Hz), 2.24 (1H, br d, J=12.0Hz), 1.84 (1H, dd, J=13.6, 4.2Hz), 1.23 (3H, s), 0.99 and 0.94 (each 3H, s);
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) δ 196.83, 158.17, 156.45, 131.73, 125.82, 110.91, 108.70, 49.17, 41.20, 38.20, 37.75, 35.81, 33.29, 32.50, 23.16, 21.32, 18.75; IR (NaCl) cm-1 3301, 2937, 1868, 1652, 1577, 1560, 1508, 1305, 1286, 1218, 902; EIMS m/z (% rel. int.) 338 (M+2, 100), 337 (M+, 90), 336 (90), 323 (72), 321 (72), 255 (46), 253 (81), 251 (50), 241 (42), 239 (49), 158 (32), 115 (28), 69 (60); HREIMS m/z calcd for C17H21BrO2 336.0725, found 336.0724.
【００１９】
実施例
上記のようにして合成されたアビエタン型ジテルペン及びその誘導体のＭＲＳＡ及びＶＲＥに対する抗菌活性を評価した。
抗菌活性は以下の方法で測定した。試験微生物、即ちＭＲＳＡの３種の菌株（ＭＲＳＡ−６６４、ＭＲＳＡ−７３０及びＭＲＳＡ−９９６）並びにＶＲＥの３種の菌株（ＶａｎＡ、ＶａｎＢ及びＶａｎＣ）は国立感染症研究所の細菌・血液製剤部から入手した。各化合物をＤＭＳＯに溶解し、ミュラー−ヒルトン液体培地で級化濃度に希釈した。最低阻害濃度（ＭＩＣ）は培地ミクロ希釈法により決定した。一晩この培地で培養した培養物を水で約１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）ｍｌ−１に希釈し、更に水で約１０７ＣＦＵｍｌ−１に希釈した。スポットあたり１０７ＣＦＵｍｌ−１（５ｍｌ）の試験接種原を、級化濃度の各化合物を０．１ｍｌ含む９６ウェルのミクロプレートに塗布した。３７℃で１８〜２０時間培養した後、試験化合物を含まない標準品と比べてバクテリアの増殖が見られない試験化合物の最低濃度をＭＩＣとした。培地中のＤＭＳＯの濃度は、試験したいずれの微生物の増殖にも影響を及ぼさなかったことに注意すべきである。各化合物のＭＩＣを少なくとも２回測定した。
【００２０】
試験結果を表１に示す。これらから分かるように、実験番号３３、５２、５３、５４、５５で表される化合物はいずれもＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して高い抗菌作用を有していることが分かる。特に実験番号５２、５３及び５５の化合物は極めて高い抗菌作用を有している。
【表１】
0003981914.tif 000007
表中、＊は未測定を表す。
【００２１】
参考文献及びノート
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