(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したアミノ酸配列からなるα−グルコシダーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換し、前記置換に加えて、それ以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるα−グルコシダーゼに比較して転移反応活性は維持し、加水分解活性は１００００分の１以下に低下したことを特徴とするα−グルコシダーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のα−グルコシダーゼの存在下、グリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドを反応させることを含むオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
グリコシド誘導体が、pNP−β−グルコシド、pNP−α−キシロシド、pNP−α−マンノシド、pNP−α−マルトシドである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
オリゴ糖が２糖類誘導体である請求項３または４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、実質的に加水分解活性を示さないように改変したα−グルコシダーゼ、およびこの改変したα−グルコシダーゼを用いたオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼは、微生物から動植物まで広く天然界に存在する酵素であり、基質の非還元性末端のα−グルコシド結合を水解してα−Ｄ−グルコースを生成する酵素である。
このα−グルコシダーゼは、Ｂ.ヘンリサット(B. Henrissat)による酵素の一次配列による分類では、ファミリー１３とファミリー３１とに分類されている（B. Henrissat, Biochem. J. : 280, 309-316（1991））。また、千葉らは、α−グルコシダーゼの基質特異性に着目し、ファミリー１とファミリー２に分類している（Chiba et al., Biosci. Biotech. Biochem. : 61, 1233-1239 (1997)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
α−グルコシダーゼは、水解（加水分解）反応のみならず、糖転移反応をも触媒し、様々なオリゴ糖や配糖体の酵素合成にも用いられている。しかし、糖転移反応により生成されたオリゴ糖は、再度α−グルコシダーゼの基質となって水解されるために、生成されるオリゴ糖は糖転移反応の進行に伴い増加するものの、ある極大値をとった後に減少していく。そのために、あるオリゴ糖を糖転移反応により合成しようとしても３０〜５０％程度が限度であった。上記の現象は、糖転移反応を用いてオリゴ糖を合成する際に、α−グルコシダーゼのみならず、β−グルコシダーゼをはじめとする様々なグリコシダーゼで認められる。
【０００４】
このような状況の中で、マケンジー(Mackenzie)らとワン(Wang)らは、アグロバクテリウム属(Agrobacterium sp.)の生産するβ−グルコシダーゼについて、活性解離基の一つで解離型のカルボキシル基であるグルタミン酸３５８をアラニンに置換した改変酵素を調製し、α−グルコシルアジドやα−グルコシルフロライドをグルコシル供与体として、β−グルコシド結合を有するオリゴ糖の合成を報告している（Mackenzie et al., J. Am. Chem. Soc. : 116, 11594-11595 (1994)，Wang et al., J. Am. Chem. Soc. : 120, 5583-5584 (1998)）。
メイヤー(Mayer)らは、グルタミン酸３５８をセリンに置換した改変酵素を調製し、α−グルコシルフロライド及びα−ガラクトシルフロライドをグリコシル供与体として、β−グリコシド結合を有するオリゴ糖の合成を行っている（Mayer et al., FEBS Letters : 466, 40-44 (2000)）。モラッシ(Moracci)らも、マケンジー(Mackenzie)らとワン(Wang)らと同様な結果を、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)起源のβ−グリコシダーゼの改変酵素（グルタミン酸３８７→グリシン）とα−グルコシルアジドやα−グルコシルフロライドを用いて報告している。
【０００５】
しかしながら、これらの酵素はいずれもβ−グリコシド結合を加水分解する酵素であり、α−グリコシド結合を加水分解する酵素ではこのような改変酵素は知られていなかった。また、マケンジー(Mackenzie)らとワン(Wang)ら、及びモラッシ(Moracci)らが得た改変酵素を用いてオリゴ糖を合成した際のグルコシル供与体は、いずれもα−グルコシド型のものであり、生成されるオリゴ糖はβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖に限られていた。
【０００６】
また、これらのオリゴ糖の生成率が８０％以上となり得ることが、米国特許第５，７１６，８１２号に示されている。しかるに、ここで示された生成率は、オリゴ糖混合物としての数値であり、２糖類誘導体としての生成率は最大でも５４％でしかなかった。これに対して、２糖類誘導体の生成率を上昇させるためには、α−ガラクトシルフロライドなどの糖鎖の再延長を起こさないグリコシル供与体を用いることが必要である。しかし、再延長を起こさないグリコシル供与体を用いると、得られるオリゴ糖がヘテロオリゴ糖になるという問題点があった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、α−グリコシド結合を加水分解する酵素であって、転移反応活性は維持しつつ、水解（加水分解）反応を弱めたか、あるいは実質的に消滅させた改変酵素を提供することにある。さらに本発明は、このような改変酵素を用いて、２糖類誘導体の生成率が高い、オリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、α−グルコシダーゼについて鋭意研究し、通常水解反応に必須である解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換し、水解活性を示さないように改変したα−グルコシダーゼを見出し、さらにこの改変したα−グルコシダーゼとグルコシル供与体としてβ−グルコシルフロライドを用いたオリゴ糖の製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
ここで、「水解活性を示さない」とは、改変前の酵素をマルトースやp-フェニルα−グルコシド等を基質として生成するグルコース量と比較して、生成するグルコース量が１００００分の１以下であることを示す。
【０００９】
上記本発明の目的を達成する本発明は、以下の通りである。
［請求項１］配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したアミノ酸配列からなるα−グルコシダーゼ。
［請求項２]配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換し、前記置換に加えて、それ以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるα−グルコシダーゼに比較して転移反応活性は維持し、加水分解活性は１００００分の１以下に低下したことを特徴とするα−グルコシダーゼ。
［請求項３］請求項１または２に記載のα−グルコシダーゼの存在下、グリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドを反応させることを含むオリゴ糖の製造方法。
［請求項４］グリコシド誘導体が、pNP−β−グルコシド、pNP−α−キシロシド、pNP−α−マンノシド、pNP−α−マルトシドである請求項３に記載の製造方法。
［請求項５］オリゴ糖が２糖類誘導体である請求項３または４に記載の製造方法。
【００１０】
【発明の実施の態様】
本発明の改変α−グルコシダーゼは、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼであって、前記アミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したことを特徴とする。アミノ酸が改変されていない配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼは、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼである。そして、配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換する。アミノ酸の置換は、転移反応活性を維持し、加水分解活性が配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するようにおこなう。具体的には、４８１番目のアスパラギン酸を側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換する。そして、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、グリシンである。
【００１１】
本発明のα−グルコシダーゼは、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼであって、前記アミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換したことを特徴とする。
【００１２】
本発明の改変α−グルコシダーゼは、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであって、該α−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を、転移反応活性を維持し、加水分解活性が野生型の酵素に比較して１００００分の１以下に低下するように側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換したことを特徴とする。
【００１３】
本発明の改変α−グルコシダーゼでは、基礎とするα−グルコシダーゼは、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに限らず、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであればよい。そして、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を側鎖にカルボキシル基を含まない他のアミノ酸で置換する。他のアミノ酸で置換するアミノ酸は、例えば、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸である。配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼも、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであることから、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ以外のジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼも、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列と高い相同性を有し、配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸は容易に見い出すことができる。
【００１４】
アミノ酸の置換は、転移反応活性を維持し、加水分解活性が野生型の酵素、即ち、野生型のジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するようにおこなう。また、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、グリシンである。
【００１５】
上記本発明の改変酵素の調製法は常法により調製することができる。例えば、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ遺伝子、または、ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼ遺伝子に、目標とする解離型カルボキシル基を有するアミノ酸残基をポイントミュテーションにより他のアミノ酸に置換することにより調製できる。改変酵素は、これらの改変酵素を、微生物を培養することにより調製し、その上清もしくは菌体破砕物としても利用可能であるが、必要に応じて各種クロマトグラフィーにて精製して用いることもできる。
【００１６】
ジゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼは、すでにその精製方法や酵素化学的諸性質、糖転移反応について千葉らにより報告されている（Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 29, 540-547 (1965)、Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 30, 536-540 (1966)）。また、その遺伝子も取得されており、活性解離基の同定も行なわれている（日本農芸化学会誌７２巻、１９９８年度大会講演要旨集p.134）。このジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)由来のα−グルコシダーゼの改変酵素の取得方法の具体例は、後述する実施例に示す。
【００１７】
本発明は、上記本発明の改変α−グルコシダーゼの存在下、グリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドを反応させることを含むオリゴ糖の製造方法を包含する。
上記製造方法に使用されるβ−グルコシルフロライドは、グルコシル供与体であって、これまでにも酵素反応機構の解明を目的として利用されている。その調製方法についてはペンタアセチルD−グルコースに無水弗化水素を反応させて、2,3,4,6−テトラアセチル− D−グルコシルフロライドを調製し、これから結晶化、シリカゲルカラム、TLCなどを用いてα−体とβ−体を分離し、ナトリウムメトキサイドを用いて脱アセチルして調製する方法や（Arch. Biolchem. Biophys. : 142, 382-393 (1971)）、N−グルコシルトリアゾール誘導体を用いる方法（Carbhydr. Res. : 327, 5-14 (2000)）等がある。また、試薬としてシグマアルドリッチジャパン(株)より販売されている。
【００１８】
グリコシド誘導体は、グルコシル受容体であり、グリコシド誘導体としては、特に限定はない。例えば、非還元性末端側にグリコシル残基を有するものであれば良いが、より好ましくはｐNP−グリコシドのようなアグリコンを有するグリコシドが好ましい。
グリコシド誘導体としては、上記以外に例えば、pNP−β−グルコシド、pNP−α−キシロシド、pNP−α−マンノシド、pNP-α−マルトシドを挙げることができる。
【００１９】
反応の条件は、例えば、以下のようすることができる。
(1)グリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドのモル比の範囲
グリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドのモル比は、特に限定されるものではないが、グルコシル供与体であるβ−グルコシルフロライドのモル比が高い方が好ましく、例えば、１：３〜１：１０などのモル比で反応を行なえばよい。
【００２０】
(2)グリコシド誘導体またはβ−グルコシルフロライドに対する改変α−グルコシダーゼ量の範囲
グリゴシド誘導体またはβ−グルコシルフロライドに対する改変α−グルコシダーゼの添加量は、特に限定されるものではなく、ごく少量の改変グルコシダーゼを含む反応液でもその反応条件を調整することにより所望の反応生成物を得ることができる。
【００２１】
(3)反応液液中のグリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドの濃度
反応液中のグリコシド誘導体とβ−グルコシルフロライドの濃度は、グリコシド誘導体、β−グルコシルフロライドが溶解する濃度であれば特に限定されるものではない。
【００２２】
(4)反応温度及び時間
反応温度は１０℃〜６０℃が好ましく、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃が好ましい。反応時間は特に限定されるものではない。
(5)生成物の精製方法
成物の精製方法は、ゲルろ過、イオン交換、吸着などのクロマトグラフィーや有機溶媒や塩類を用いた沈殿法など従来より知られている糖質の精製方法を用いることができる。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：改変酵素の調製
α−グルコシダーゼの活性測定法
α−グルコシダーゼの活性測定は、以下の方法によって行った。即ち、氷冷した試験管に0.1M酢酸緩衝液(pH4.5 ) 200μlおよび50mM 酢酸緩衝液(pH4.5),0.05% トリトン(Triton) X-100に溶解した酵素溶液100μl を加え、35℃にて3分間保持した後、0.5%マルトース 200μlを添加することにより反応開始とした。一定時間反応させた後、2M Tris−HCl緩衝液(pH7.0)を1ml加え反応を停止した。基質のマルトースより遊離したグルコースをグルコスタット(Glucostat)試薬(グルコースAR−II発色剤、和光純薬工業(株)製)にて発色させた後、波長505nmの吸収を測定することによりグルコース量を定量した。なお、1分間に1μmolの基質を加水分解する酵素活性を酵素1単位と定義する。
【００２５】
SPG (G2444C)の作成
SPG (G2444C)を図5に示すスキームに従って作成した。
変異酵素発現ベクター構築をする際、変異の導入されたDNA断片をベクターへ戻す操作が煩雑であるため、配列番号1に示すジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)由来のα−グルコシダーゼ cDNAの2444番目の塩基をアミノ酸置換の起こらないサイレント変異により（469Ser TCG(TCC）グアニンからシトシンに変換することで、BamHI認識部位をメガプライマー PCR法により変異を導入し設けた。
即ちファーストPCRとして、ジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のcDNAのEcoRV （1224 nt）からPstI (2546 nt)のDNA断片をブルースクリプト(Bluescript) II KS (ストラタジーン(STRATAGENE))にサブクローニングしたプラスミド10ngを鋳型として、ポリメラーゼ1単位（東洋紡製、KOD DNA polymerase）、プライマーにはBam (5'- ct ttt gga tcg aat ggt act gt、 センスプライマー)、M13 リバース(reverse)ユニバーサルプライマーをそれぞれ20pmol用い、ポリメラーゼに添付されている緩衝液を用いて、98 ℃、10秒間−53 ℃、2秒間− 74℃、30秒間の反応を20サイクルを行った。PCR産物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット(QIAquick PCR purification kit)(キアゲン(QIAGEN))を用い精製し、メガプライマーとした。
【００２６】
セカンドPCRは、ポリメラーゼ1単位（東洋紡製、KOD DNAポリメラーゼ）、鋳型としてEcoRVからPstIのDNA断片をブルースクリプト(Bluescript) II KS (ストラタジーン(STRATAGENE))にサブクローニングしたものを10 ng、メガプライマーとしてファーストPCR反応液9μl、ポリメラーゼに添付されている緩衝液を用いて94 ℃, 1分間−74℃, 2分間の反応を5サイクル行った。74℃のときアンチセンスプライマーとして、プライマーM13 ？20ユニバーサルプライマー20 pmolを加え、94 ℃, 30 秒間−55 ℃, 30秒間− 74 ℃, 1分間の反応を20サイクルを行った。その結果、得られた増幅断片の変異の導入、即ちBamHIサイトの導入をシーケンスにより確認した。BamHIサイトの導入された断片をBglII (1415 nt)とPstIでジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)由来のα−グルコシダーゼのcDNAに戻し、これをSPG (G2444C)と名付けた。サイレント変異による発現への影響のないことをジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)での発現系の粗抽出液のmaltase活性で確認した（SPG/pYES形質転換体 2.6 U/mg、SPG (G2444C)/pYES形質転換体 2.5 U/mg）。
【００２７】
D481G変異型酵素の作成
D481G変異型酵素は、SPG (G2444C)のDNA断片の一部（BamHI,2439 nt ？ EcoRI, 3315 nt）をベクター ブルースクリプト(Bluescript) II SK (ストラタジーン(STRATAGENE))のBamHIとEcoRIサイトに連結したプラスミドBamHI ？ EcoRI / SKを鋳型として、メガプライマー法により作成した。
即ち、ファーストPCRとしてプラスミドBamHI ？ EcoRI / SK 10ngを鋳型として、ポリメラーゼ1単位（東洋紡製、KOD DNA ポリメラーゼ）、センスプライマーM13 reverseユニバーサルプライマー（g gaa aca gct atg acc atg）20 pmol、アンチセンスプライマーD481G（5'-cgc aga acg agc tcg gtt cgt tca ttc cag tcc aaa t） 20 pmolにポリメラーゼに添付されている緩衝液を用いて、98 ℃, 10秒間−55℃, 2秒間− 74℃, 30秒間の反応を20サイクルを行った。尚、プライマーD481Gは、配列番号２(一次配列)の481番目のアスパラギン酸をグリシンに変換するよう、配列番号１(cDNA塩基配列)の2479番目のアデニンをグアニンに変換するようにアンチセンスに設計した。得られた173 bpの増幅断片は、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット(QIAquick PCR purification kit)(キアゲン(QIAGEN))を用い精製した。精製した増幅断片は、配列番号１(cDNA塩基配列)から予想されるプライマーの位置関係と一致し、その塩基配列が、配列番号２(一次配列)  の481番目のアスパラギン酸をグリシンに変換するよう変換されていたため、メガプライマーとした。
【００２８】
セカンドPCRは、ポリメラーゼ１単位（東洋紡製、KOD DNAポリメラーゼ）、鋳型としてBamHI ？ EcoRI / SKを10 ng、メガプライマーとしてファーストPCR反応液9μl、ポリメラーゼに添付されている緩衝液を用いて94 ℃, 1分間−74℃, 2分間の反応を5サイクル行った。74℃のときアンチセンスプライマーとして、プライマーM13 ？20ユニバーサルプライマー（gta aaa cga cgg cca gt）20 pmolを加え、94 ℃、30 秒間−55 ℃、30秒間− 74 ℃、1分間の反応を20サイクルを行った。その結果、得られた1084bpの増幅断片は、配列番号１(cDNA塩基配列)から予想されるプライマーの位置関係と一致し、その塩基配列が、配列番号２(一次配列)の481番目のアスパラギン酸をグリシンに変換するようシーケンスにより確認されたため、変異型ジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)由来のα−グルコシダーゼのcDNA断片と同定した。このcDNA断片と、ベクターpPICZA（インビトロゲン(Invitrogen)製）のAOX1プロモーター下流に野生型ジゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)由来のα−グルコシダーゼのcDNAが連結されたプラスミドSPG / pPICZのcDNA部分のBamHIからEcoRI部分を入れ替えることで、D481G変異型酵素発現ベクターSPG (D481G) / pPICZを得た。
【００２９】
形質転換体の培養及び酵素の誘導
発現ベクターpPICZA（インビトロゲン(Invitrogen)製）のAOX1プロモーター下流に野生型α−グルコシダーゼのcDNA断片を連結したプラスミドSPG / pPICZと変異型α−グルコシダーゼのcDNA断片を連結したプラスミドSPG (D481G) / pPICZをピチア・パストリス(Pichia pastoris)GS115株へ電気穿孔法によって導入し、ゼオシン(zeocin)耐性を選択マーカーとしてそれぞれ形質転換体wt SPG / PPとd481g SPG / PPを得た。
【００３０】
それぞれの形質転換体の種菌体は、2mlのBMGY培地[1% バクト酵母抽出物(Bacto yeast extract)(ディフコ(Difco))、2% バクトペプトン(Bacto peptone) (ディフコ(Difco))、100mM リン酸カルシウム緩衝液 pH6.0, 1.34% 酵母にトロゲン塩基(yeast nitrogen base)(ディフコ(Difco))、 0.00004% ビオチン、1％グリセロール]に植菌し、30℃で20時間振盪培養して得た。この種菌体800 μlを800 mlのBMGY培地に植菌後、30℃で24時間振盪培養し、菌体濁度(600nm)が8.8になったところで、25℃にて1,500×g、5分間遠心分離することにより集菌し、その一部を１LのBMMY誘導培地[1% バクト酵母抽出物(Bacto yeast extract)、2% ポリペプトン(polypeptone)、100mM リン酸カルシウム緩衝液 pH6.0、1.34% 酵母ニトロゲン塩基(yeast nitrogen base)、0.00004% ビオチン、1％メタノール]に移し、組換え酵素の誘導を行った。なお、BMMY誘導培地に植え換えた直後の菌体濁度(600nm)は3.5であった。24時間ごとに終濃度0.5 %になるよう培地にメタノールを添加し、102時間誘導培養を行った。その後、4℃にて5,500×g、5 分間遠心分離により培養上清を回収した。このときの菌体濁度(600nm)は15.8であった。形質転換体wt SPG / PPの培養上清の活性は、全活性900 U、比活性11.8 U / mgであったのに対して、形質転換体d481g SPG / PPの培養上清には活性が見られなかった。なお、タンパク質の定量をブラッドフォード(Bradford)法によって行った。
【００３１】
酵素の精製方法
形質転換体wt SPG / PPおよびd481g SPG / PPの培養上清925 mlに、あらかじめ−20℃に冷やしておいた1,850 mlのエタノールを攪拌しながら徐々に加え、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を4℃にて15,000×g、30分間遠心分離することにより回収し、約100 mlの溶解用緩衝液（500 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.5)）を加え、一晩攪拌し沈殿を溶解した。溶解後4℃にて15,000×g、30分間の遠心分離により上清を回収した。残った沈殿へ再度溶解用緩衝液約30 mlを添加攪拌し、同様に遠心分離を行い上清を回収した。得られた2つのエタノール沈殿溶解液をそれぞれ20 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.5)に対して透析した。野生型酵素の回収した溶解液には、560単位の活性を回収し、比活性は53.8 単位/mgであった。タンパク質の定量をブラッドフォード(Bradford)法により行った。また、変異型酵素は、活性は確認されなかったが、SDS−PAGEにより予想された180 kDaのタンパク質が存在することを確認し、タンパク量 約12 mgであった。これらを粗酵素液とした。
【００３２】
得られた野生型の粗酵素液を20 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.5)で平衡化したDEAE−セファロース(Sepharose) CL-6Bカラム（φ 1.8 x 30 cm, 76 ml）に供し吸着させた。0〜1 MのNaCl直線濃度勾配により溶出を行うことにより、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。21 mlの活性画分を回収し2 mlにまで濃縮し、50 mM NaClを含む50 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.5)に対して透析した。次に、50 mM NaClを含む50 mM 酢酸緩衝液(pH 4.5)で平衡化したSepharose 6Bカラム（φ 1.6 x 102 cm, 204 ml）に濃縮・透析した酵素溶液を供しゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行った。得られた20 mlの活性画分を回収し、20 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.5)に対して透析した。透析した酵素溶液を20 mM 酢酸緩衝液(pH 4.5)で平衡化したDEAE−セファロース(Sepharose) CL-6Bカラム（φ 1.4 x 9 cm, 14 ml）に吸着させ、0〜0.6 MのNaCl直線濃度勾配により溶出を行うことにより、再度陰イオン交換カラムクロマトグラフィー行った。このとき、タンパク質の溶出パタンは連続した二つのピークとして得られた。活性画分は1つめのピークに含まれ、後半のピークは夾雑タンパクを含むことをSDS-PAGEにより確認した。後半のピーク由来の夾雑タンパクを除くため、活性画分の頂点から前半を比活性を指標に3ml回収した。この精製酵素画分は、204単位の活性を回収し、比活性は104 U/mg、回収率23％であった。
また、変異型の粗酵素液は、野生型酵素と同様なカラムクロマトグラフィーにより精製を行い、3 mgを回収した。ただし、酵素活性がないため精製の指標はSDS−PAGEにより行った。
なお、いずれの酵素の精製にも、特に記載がない限りタンパク質はUV法により定量した。
【００３３】
実施例２：オリゴ糖の調製
１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ ４.５）０.１ｍｌ、２６０μＭの実施例１で調製した改変酵素０.５ｍｌ、１０ｍＭ ｐＮＰ−α−グルコシド１ｍｌ、５５ｍMβ−グルコシルフロライド（シグマアルドリッチジャパン(株)製）０.９ｍｌを混合して、３０℃にて２〜２０時間反応を行なった。
このサンプルを、薄層クロマトグラフィーにより分析した結果を図１に示した。薄層板はシリカゲル６０（メルク(Ｍｅｒｃｋ)社製）を用い、標準サンプルとしてグルコースおよびマルトオリゴ糖、ｐＮＰ−グルコシド及びｐＮＰ−マルトシドを、更にグルコシル供与体として用いたβ−グルコシルフロライド、上記反応系のうち改変酵素を除いたものとともに、反応液を添着し、１-ブタノール：２-プロパノール：水＝１０：５：４（v/v/v）の展開溶媒にて２回展開した後、アニスアルデヒド試薬を用いて発色させた。その結果、反応液においてｐＮＰ−マルトシドとほぼ同様な位置に反応生成物のスポットが認められた。そこで、この反応液をＯＤＳカラム（YMC-Pack ODS-AP AP-303）を用いて、ＨＰＬＣにて分析を行った。移動相には９％アセトニトリルを用い、カラム温度５０℃、流速１ｍｌ／minで、ＵＶ検出器を用いて３０３ｎｍにおける吸収を測定した。その結果を図２に示した。反応液中には３つのピークが認められ、溶出順にピーク１〜３とした。
【００３４】
オリゴ糖の解析
上記のＨＰＬＣ分析で認められたピーク１〜３を分取し、薄層クロマトグラフィーにより分析した結果を図３に示した。薄層板はシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、標準サンプルとしてグルコースおよびマルトオリゴ糖、ｐＮＰ−グルコシド、ｐＮＰ−マルトシドおよびｐＮＰ−マルトトリオシドを、サンプルとしてピーク１〜３を添着し、１-ブタノール：２-プロパノール：水＝１０：５：４（v/v/v）の展開溶媒にて２回展開した後、アニスアルデヒド試薬を用いて発色させた。その結果、ピーク３はグルコシル受容体として用いたｐＮＰ−グルコシドと、ピーク２はｐＮＰ−マルトシドとほぼ同様な移動度を示した。ピーク１については標準サンプルと一致する移動度を示すものはなかった。
【００３５】
ピーク１〜３のサンプルに、０.１％ＴＦＡを添加して、１００℃にて３時間処理を行い、部分加水分解したサンプルを上記と同様に薄層クロマトグラフィーで分析した結果を図４に示した。薄層板はシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、標準サンプルとしてグルコースおよびマルトオリゴ糖、イソマルトース、ｐＮＰ−グルコシド、ｐＮＰ−マルトシドおよびｐＮＰ−マルトトリオシドを、サンプルとしてピーク１〜３を部分加水分解したものを添着し、２−プロパノール：１−ブタノール：水＝１２：３：４（v/v/v）の展開溶媒にて添加した後、アニスアルデヒド試薬を用いて発色させた。その結果から、ピーク１はｐＮＰ−イソマルトシド、ピーク２はｐＮＰ−マルトシド、ピーク３は未反応のｐＮＰ−グルコシドと同定された。
以上の構造解析よりピーク１から３の紫外部吸収と分子量の比率、実施例２のＨＰＬＣ分析より、オリゴ糖生成物の生成量を求めた結果、その生成量は７０％であった。
【００３６】
図１は、反応液を薄層クロマトグラフィーで分析したものであり、１がグルコースをマルトオリゴ糖の標準サンプルを、２が反応液を、３が反応系から改変酵素を除いた液を、４がグルコシル供与体として用いたβ−グルコシルフロライドを、５がｐＮＰ−グルコシドとｐＮＰ−マルトシドの標準サンプルを添着して分析したものである。
図２は、ＯＤＳカラムを用いてＨＰＬＣ分析を行った際の、クロマトグラムを示した。
図３は、ピーク１〜３を薄層クロマトグラフィーで分析したものであり、１がグルコースをマルトオリゴ糖の標準サンプルを、２がピーク１を、３がピーク２を、４がピーク３を、５がｐＮＰ−グルコシド、ｐＮＰ−マルトシドとｐＮＰ−マルトトリオシドの標準サンプルを添着して分析したものである。
図４は、ピーク１〜３を部分加水分解したものを薄層クロマトグラフィーで分析したものであり、１がグルコースをマルトオリゴ糖の標準サンプルを、２がイソマルトースを、３がピーク１の部分加水分解物を、４がピーク２の部分加水分解物を、５がピーク３の部分加水分解物を、６がｐＮＰ−グルコシドの部分加水分解物を、７がｐＮＰ−マルトシドの部分加水分解物を、８がｐＮＰ−マルトトリオシドの部分加水分解物を、９がｐＮＰ−グルコシド、ｐＮＰ−マルトシドｐＮＰ−マルトトリオシドの標準サンプルを添着して分析したものである。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の改変酵素を用いてβ−グルコシルフロライドをグルコシル供与体として用いて、オリゴ糖が合成できることが明らかとなり、この改変酵素は加水分解活性を示さないことから、合成されたオリゴ糖は加水分解されることなく反応系に蓄積される。このような反応によりオリゴ糖や配糖体を合成させることは、工業的な利用価値も高いものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】反応液を薄層クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図２】ＯＤＳカラムを用いてＨＰＬＣ分析を行った際の、クロマトグラムを示した。
【図３】ピーク１〜３を薄層クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図４】ピーク１〜３を部分加水分解したものを薄層クロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図５】SPG (G2444C)の作成スキーム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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