(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性物質を単離することが可能な、人若しくは動物の体液、又は、それらの体液から誘導されたフラクションのような潜在的伝染性材料であって、その伝染性が非脂質外層を持つウイルスによるもののウイルス性伝染性の低減方法であって、
−前記生物学的活性物質を単離するための前記潜在的伝染性材料を
−植物油によって処理し、
−前記植物油が上記のように処理された潜在的伝染性材料から分離されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記潜在的伝染性材料が血液若しくは血漿または低温沈殿物のような加工された血液若しくは血漿である請求の範囲第１項の方法。
【請求項３】
前記生物学的活性物質を単離することが可能な前記潜在的伝染性材料が血液凝固系因子のようなタンパク質である請求の範囲１項または第２項のいずれか一つの方法。
【請求項４】
前記植物油が、ヒマシ油である請求項第１項〜第３項の少なくとも一つの方法。
【請求項５】
前記潜在的伝染性材料が、その伝染性低減効果を強めるために、非イオン性界面活性剤とトリ−Ｎ−ブチル リン酸（ＴＮＢＰ）のようなアルキルリン酸、またはトリトン誘導体のようなポリエーテルにより、前記植物油処理と同時または逐次に更に処理される請求の範囲第１項〜第４項の少なくとも一つの方法。
【請求項６】
前記植物油が前記潜在的伝染材料と激しく混合され、かつそれぞれの相が続く相分離により分離される請求の範囲第１項〜第５項少なくとも一つの方法。
【請求項７】
前記植物油で処理され、かつ伝染性が低減された前記材料がアフィニテイークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィーのような分離操作と疎水性逆相クロマトグラフィーによりフラクションに更に分離される請求の範囲第１項〜第６項の少なくとも一つの方法。
【請求項８】
血液凝固系因子のようなウイルスが不活性化された生物学的活性物質の回収のための請求の範囲第１項〜第７項の少なくとも一つの方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の対象は、生物学的活性物質を単離することが可能な、人若しくは動物の体液、又は、それらの体液から誘導されたフラクションのような潜在的伝染性材料（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｏｕｓ  ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、その伝染性が非脂質外層を持つウイルス（ｎｏｎ−ｌｉｐｉｄ−ｃｏａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ）によるもののウイルス性伝染性の低減方法である。
人又は動物の体液などの潜在的伝染性材料は、生物学的活性を持ち、そのため価値のある物質の宝庫である。しかし、これらの原料から生物学的活性物質を単離することが容易でないことは、特に、血漿からの回収された調製物によるＨＩＶ伝染の例にみられるように、既に以前から明白である。従って、このような調製物の投与における基本的必要条件は、それらがウイルスの存在を試験されていることである。即ち、これらの調製物はいかなる感染性粒子にも伝染されていてはならない。
脂質壁をもつウイルスは、非イオン性で生物適合性の溶媒や界面活性剤によって効果的に不活性化される。これらの方法はＥＰ  ０  １３１  ７４０で説明されている。これらの方法では非脂質性外層を持つウイルスを十分に不活性化することはできない。ＷＯ  ９４／１７８３４では、肝炎Ａ型ウイルスのような非脂質性外層を持つウイルスの十分な不活性化は、例えば、非イオン界面活性剤による処理と６０〜６５℃の熱処理との組み合によってのみ達成されると報告している。しかし、５〜３０時間以上である熱処理にかかる時間には欠点がある。なぜなら貴重な生物学的活性物質の大半はこような熱処理により変形又は時に破壊される複合構造を持つタンパク質だからである。これは、対応するフラクションの活性の減少をも意味する。従って、既知の方法では、結果としてこれらの生成物の可能回収量が低下する。
ＤＥ  ４０  ２１  ５４２  Ａ１では、非感染性血漿の調製方法（組み合わせ法）を開示している。血漿は非イオンテンサイド（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）により処理され、脂質相の除去に先立って生物学的適合脂質が加えられる。その後、脂質相は除去され、非イオンテンサイドは疎水性材料を用いて固相抽出により除去される。
ＥＰ−Ａ  ０  ２３９  ８５９は、脂質溶解性加工化学物質（ｌｉｐｉｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む生物学的材料からの脂質溶解性加工化学物質の除去方法に関連している。この方法は、脂質溶解性加工化学物質を含む生物学的材料に、有効量の植物、若しくは、動物から抽出された天然油、又は、類似した化学構造をもつ合成化合物を接触させることを含む。得た混合物を攪拌し、沈殿させることにより上相と下相を分離させ上相を棄てる。この方法は、比較的ウイルスを含まない生理学的に適用可能な血漿の調製に特に有効である。
ヨーロッパ特許出願のＥＰ−Ａ  ０  ５２５  ５０２は、静脈内投与用のウイルスを不活性化した免疫グロブリン溶液の製造方法を開示している。免疫グロブリンは非イオンテンサイド処理され、その後、非イオンテンサイドは疎水性物質での固相抽出により除去される。
ヨーロッパ特許出願のＥＰ−Ａ  ０  １１２  ５６３は、血漿タンパク質生成物の溶媒処理を開示している。血漿タンパク質生成物は、乾燥した状態で有機溶媒を用いスラリーにしてウイルスの感染力を除去する。
ＷＯ−Ａ  ８３／０４３７１は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）と非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）からなる群から選ばれたタンパク質担体中の脂質ウイルスを不活性化する方法であって、前記ウイルスをハロ炭水化物処理剤、好ましくは５％ｖ／ｖから５０％ｖ／ｖの量のクロロホルムと過剰な時間及び包囲温度において接触させる方法を開示する。
本発明における解決すべき課題は、潜在的伝染性または実際伝染性である物質に含まれる非脂質外層ウイルスの伝染性の低減を達成する方法を提供することにある。
驚くべきことに、潜在的伝染性材料中の非脂質外層ウイルスによる伝染性は、前記の潜在的伝染性材料と二相形態（ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を形成することができる疎水相を持つ物質による処理とその形成された相の分離により低減されることが示された。
本発明における生物学的活性物質を単離することが可能な、人若しくは動物の体液、またはそれらから誘導されたフラクションであって、その伝染性が非脂質外層を持つウイルスによる潜在的伝染性材料のウイルス性伝染性の低減方法は、以下の手段により特徴付けられる。生物学的活性物質を単離するための潜在的伝染性材料は、基本的に水に溶解せず、前記の潜在的伝染性材料と二相形態を形成する疎水相により処理される。その後、疎水相は処理された潜在的伝染性材料から分離される。
以下、潜在的伝染性材料は、実際に伝染性である物質をも意味する。特に、血液や血漿等の体液、又は低温沈殿物等の加工された血液や血漿である。加えて、しかし、細胞ライゼイトや同様の天然素材等の潜在的伝染性材料等のどのような試料をも含む。
潜在的伝染性試料から単離され得る生物学的活性物質は、特に、ＶＩＩＩ因子やビタミンＫ依存因子のような血液凝固系因子、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、ガンマグロブリン、相補的因子、及びセリンプロテアーゼ阻害剤である。
特に、本発明により使用することができる潜在的伝染性材料と二相形態を形成可能な疎水相は、植物油のような室温で油状である液体のような非極性有機液体又は低温溶解性脂肪である。
本発明による方法は、非イオン界面活性剤とジアルキルリン酸または、トリアルキルリン酸による既知のウイルス不活性化の方法と両立するだけでなく、潜在的伝染性材料に非イオン界面活性剤とジアルキルリン酸またはトリアルキルリン酸、特に、トリ−ｎ−ブチル  リン酸（ＴＮＢＰ）による処理に加えて、疎水相処理を補充することでより有効であることが示された。この併合処理は、同時にまたは逐次行うことが出来る。
以下に示される誘導体は、非イオン界面活性剤とされるものであり、最低０．１重量％の量が、使用されなければならない：胆汁酸塩、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール部分エステルの無水物、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、とポリソーバット（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ）８０の名称で取引されている製品、及び非イオン性、油溶解性界面活性剤、特に商品名トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（エトキシル化アルキルフェノール類）などである。さらに使用可能なものに、両性イオン試薬、例えば、Ｎ−ドデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−２−アンモニア−１−エタンスルホン酸または、その誘導体などのスルホベタイン、また、非イオン性界面活性剤、例えば、オクチル−β−Ｄ−グルコピラサイドなどである。界面活性剤の量は、０．０１％から１０％が好ましい。好ましい処理として、ＴＮＢＰ、トウイーンとトリトン、または、ナトリウム  コレイト／ＴＮＢＰなどの組み合わせがある。
潜在的伝染性材料の疎水相での処理は、ＷＯ  ９４／１７８３４で要求されているように非脂質外層ウイルスを不活性化する熱処理と非イオン性界面活性剤及びアルキル  リン酸との組み合わせとによってある程度置換することが出来る。
非脂質外層ウイルスとして、特に、Ａ型肝炎、コクサッキー、ポリオとパルボウイルスが考えられる。
本発明による方法は、疎水相が潜在的伝染性材料と十分に混合された場合に、特に有効である。それは、例えば、超音波、高性能かき混ぜ、激しい攪拌などの機械的な作用により達成される。
二相物質が形成された後、特に遠心や濾過により疎水相は除去することが出来る。疎水相として、特に、大豆油及び／またはヒマシ油などの植物油が用いられる。油相は疎水フィルターを通して除去することが出来る。必要な疎水相の分離度合いは、主にその後に続く工程により左右される。もしも、非脂質外層ウイルスによる伝染性が低減された材料が、陰イオン交換またはアフィニテイークロマトグラフィーなどにより更に精製された場合、疎水相の定量分離は必要ない。従って、疎水相に抽出したであろう伝染性粒子が分離除去されたことを確実にする必要がある。しかし、定量除去が必要な場合、上記の相は、ＤＥ  ４０  ０８  ８５２に記載されている類似の方法により排除することもできる。分離操作法として、電気泳動を含む生化学において一般的な分離操作法を使用することができる。
本発明の方法は、血液凝固系の因子、例えば、ＶＩＩＩ因子、ビタミンＫ依存性凝固因子などの生物学的活性物質の単離に特に適している。
本発明は、以下実施例においてより詳細に説明される。
実施例
潜在的伝染性血漿フラクションに脂質外層を持たないウイルスが加えられた。それぞれのウイルスの量は表からで明らかである。非外層ウイルスとして、コクサッキー  Ｂ６とポリオ  １が使用された。脂質外層ＰＲＶウイルスは対照として使用された。実験は、非脂質外層ウイルスを用い、非イオン性界面活性剤とＴＮＢＰ（ＳＤ）または、それなしの処理（表のＳＤ欄の（−））を含んで行われた。サンプルは、油で処理された。
それぞれ約２０ｍｌに分配された血漿（例、ＶＩＩ因子含有）に、コクサッキー、ポリオ、または擬狂犬病ウイルスを表に示される伝染性ウイルスレベルまで加える。
直後に激しく攪拌し、
１．  １９．７４ｍｌの血漿フラクションに、０．２ｍｌのトゥイーン８０と０．０６ｍｌのＴＮＢＰを加えるか、または、
２．  １９．６ｍｌの血漿フラクションに、０．２ｍｌのトリトンＸ１００と０．２ｍｌのＴＮＢＰを加える。
調製液１と２のそれぞれに１ｍｌのヒマシ油を加え、その後、室温で１時間激しく抽出された。
３．  別に２０ｍｌのウイルス含有血漿フラクションを、先の界面活性剤処理なし（ＳＤ−）で直ちに１ｍｌのヒマシ油を用いで上記の方法で処理する。
それぞれの相分離を遠心で行う。伝染性の対象として、それぞれ水溶性フラクション液から繰り返し１ｍｌの試料が採取される。
0003911524.tif 000002