(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、還元型補酵素、該コレステロールデヒドロゲナーゼにより変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質の存在下、コレステロールを基質としてサイクリング反応させることにより生じる過酸化水素の生成量を測定するコレステロールの定量方法であって、還元型補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型であり、第二のデヒドロゲナーゼが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼであることを特徴とするコレステロールの定量方法。
【請求項２】
コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、還元型補酵素、該コレステロールデヒドロゲナーゼにより変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質を含有するコレステロールの定量用試薬であって、還元型補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型であり、第二のデヒドロゲナーゼが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼであるコレステロールの定量用試薬。
【請求項３】
コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを含有する第１の試薬と、還元型補酵素、該コレステロールデヒドロゲナーゼにより変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質を含有する第２の試薬とからなるコレステロールの定量用試薬キットであって、還元型補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型であり、第二のデヒドロゲナーゼが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼであるコレステロールの定量用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主として臨床検査や食品検査の分野での使用を目的とする微量のコレステロールの定量方法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】
コレステロールは、日常の臨床や健康診断などで良く知られている検査対象であり、一般に動脈硬化の危険因子と言われている。このような成人病に対する総コレステロールの測定以外に、血清のリポ蛋白の分画であるＨＤＬ（高比重リポ蛋白）やＬＤＬ（低比重リポ蛋白）中のコレステロールも測定されている。最近ではレムナント様リポ蛋白分画中のコレステロールも注目されているが、コレステロール濃度が低いために感度良く測定される方法が要望されていた。また、血球などの細胞内の微量コレステロールについての研究も行われている。
【０００３】
一方、高コレステロールの人に対する食事療法の重要性が指摘されている。日常生活で摂取する食品中のコレステロールについて、以前よりもより正確な測定が要求されはじめた。特に、バター、牛乳、卵の無コレステロール化が進められている現在、より高感度のコレステロール測定方法が要求されてきている。
【０００４】
【従来の技術】
コレステロールを高感度に測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー法、コレステロールオキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素を蛍光・発光で測定する方法、コレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）で生じるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を蛍光・発光で測定する方法などがある。
【０００５】
しかし、これらの方法は有機溶媒による抽出操作が煩雑であったり、大量に試料が必要であったり、血清などでは内因性物質の干渉が大きく使用できないなどの欠点があった。
【０００６】
本発明者らは、先に酸化型補酵素、還元型補酵素及びＣＤＨを組み合わせたサイクリング反応による高感度測定方法（特開平８−７０８９４号公報）を開発し、この方法による微量コレステロールの測定を可能にした。この方法によれば、検体の前処理をすることなく、迅速に感度・特異性に優れたコレステロールの高感度定量が可能である。
【０００７】
しかしながら、第二のデヒドロゲナーゼがｔＮＡＤ（Ｐ）に作用して試薬ブランクが上昇する場合には、第二のデヒドロゲナーゼを添加しないで還元型補酵素を大量に添加することで対処している。そのような条件では、測定中経時的に還元型補酵素が減少して酸化型補酵素が増加するので、サイクリング率が低下して反応が直線的に進行しないため、初速度（レート測定）で測定する必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述のような従来の方法を改良して、極微量のコレステロールから血清などの高濃度のコレステロールまでの広範囲の濃度域のコレステロールを定量できる方法及びそのための試薬を提供することにより、とりわけ臨床検査や食品検査の分野に貢献することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特開平８−７０８９４号公報に示す方法を継続して検討している最中、別のコレステロールの高感度測定方法があることを見い出した。即ち、コレステロールオキシダーゼ、還元型補酵素、ＣＤＨ、該ＣＤＨにより変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質を組み合わせることにより、上記問題が解決できることを見い出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明のコレステロールの定量方法は、コレステロールオキシダーゼ、ＣＤＨ、還元型補酵素、該ＣＤＨにより変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質の存在下、コレステロールを基質としてサイクリング反応させることにより生じる過酸化水素の生成量を測定することを特徴とするものであり、特に該第二のデヒドロゲナーゼ及びその還元型基質を組み合わせることに特徴がある。還元型補酵素、ＣＤＨ及びコレステロールオキシダーゼを組み合わせただけでは高感度化が困難である。即ち、還元型補酵素から酸化型補酵素に変換されることにより、コレステロールはＣＤＨ及びコレステロールオキシダーゼの共通の基質になるので、サイクリング反応による高感度化が達成されないと考えられた。
【００１１】
本発明者らは、変換された酸化型補酵素を直ちに還元型補酵素に再生することにより、ＣＤＨによるコレステロールへの作用性を減じ、コレステロールオキシダーゼ反応を促進できることに想到した。還元型補酵素への変換方法として第二のデヒドロゲナーゼと第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質を添加することにより目的を達成することができた。
【００１２】
以下に反応式を示す。
【００１３】
【化１】
0003981190.tif 000002
【００１４】
本発明方法における、デヒドロゲナーゼとオキシダーゼとを組み合わせた基質サイクリング反応自体は公知である。しかしながら、デヒドロゲナーゼが優位に還元型基質（コレステロール）に作用し易い場合には充分な感度を得ることができないので、サイクリング反応による高感度化は行われていなかった。本発明方法においては、酸化型補酵素に優位に反応する第二のデヒドロゲナーゼと、第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質とを添加することにより、酸化型補酵素が還元型補酵素に直ちに再生されるので、コレステロールに対するＣＤＨの反応を遅くする、あるいは停止させることができる。これにより、コレステロールをコレステロールオキシダーゼに作用させやすくすることができるので、効率良く過酸化水素を生成させることができるようになり、高感度化が可能となる。
【００１５】
また、特開平８−７０８９４号公報に記載の方法の場合、第二のデヒドロゲナーゼを添加して、還元型補酵素量を下げようとすると、添加している酸化型補酵素に作用して試薬ブランクの上昇を引き起こす場合があるが、本発明方法では添加する補酵素が一種であり、過酸化水素の生成量を測定するので、第二のデヒドロゲナーゼのマイナス要因はない。それ故、長時間直線的に反応させることができるので、レート分析だけではなく一定時間経過後の吸光度変化量としてのエンドポイント分析も可能であり、定量性の高い高感度測定が可能となる。
【００１６】
本発明において用いられるコレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化してΔ４−コレステノンと過酸化水素とを生成する酵素であれば何れの酵素でも使用することができる。例えば、シュードモナス由来、ストレプトマイセス由来やノカルディア由来のコレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。
【００１７】
ＣＤＨとしては、還元型補酵素の存在下、Δ４−コレステノンをコレステロールに変換する酵素であれば何れの酵素も使用できる。例えば、ノカルディア由来のＣＤＨなどが挙げられる。
【００１８】
還元型補酵素としては、ＣＤＨ及び第二のデヒドロゲナーゼが補酵素にするＮＡＤアナログなら何れの補酵素でも使用できるが、好ましくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（チオＮＡＤＨ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（チオＮＡＤＰＨ）などが選択される。
【００１９】
第二のデヒドロゲナーゼとしては、還元型基質の存在下、酸化型補酵素を還元型補酵素に再生するものなら何れの酵素も使用できるが、ＣＤＨのような可逆反応を行う酵素を使用すると、直線性、感度などの低下が起こるおそれがあるので、不可逆性の酵素を添加する方が好ましく、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００２０】
第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質としては、用いるデヒドロゲナーゼが作用するものが選択され、例えば第二のデヒドロゲナーゼがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである場合には、グルコース−６−リン酸が用いられ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼである場合には、ホルムアルデヒドが用いられる。
【００２１】
本発明方法に使用するコレステロールオキシダーゼの必要量は０．１〜３０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜５Ｕ／ｍＬである。ＣＤＨの必要量は０．２〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬである。測定したいコレステロール濃度が低い場合には酵素量を増やし、多いときは酵素量を下げて感度調整することができる。第二のデヒドロゲナーゼの必要量は０．１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．３〜１０Ｕ／ｍＬである。
【００２２】
第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質は、測定されるコレステロール濃度、サイクリング反応時間などによって随時適量を添加すれば良いが、通常０．５〜５ｍＭ添加すれば良い。還元型補酵素の量は１００μＭ以下であれば良いが、好ましくは５〜５０μＭ添加する。
【００２３】
上記の試薬の存在下、コレステロールを基質としてサイクリング反応が進行して過酸化水素が生成する。過酸化水素の定量は、過酸化水素電極、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）やカタラーゼなどを用いて行うことができる。ＰＯＤを使用する場合には、４−アミノアンチピリンとカラーカプラーとの酸化縮合による色素を測定する方法、蛍光基質を用いてより高感度に測定する方法があるが、血清干渉などを考慮すれば色素定量の方が安心して採用できる。カタラーゼを使用する場合には、メタノール共存下、生成するホルムアルデヒドを公知の方法で測定することができる。
【００２４】
本発明方法において対象となる検体は、血清、リポ蛋白の分画、髄液、尿、唾液などの体液及び血球、細胞などの臨床検査に応用され得るものだけでなく、食品も含まれる。本発明方法によれば、かかる検体中の微量なコレステロールを精度良く定量することが可能となり、例えば血清のＨＤＬ分画中のコレステロールでは５０ｍｇ／ｄＬ以下、血清のレムナント様リポ蛋白分画中のコレステロールでは１０ｍｇ／ｄＬ以下、尿中のコレステロールでは５ｍｇ／ｄＬ以下の精度で定量することが要求されているが、本発明方法はかかる要求に応えることができる。
【００２５】
本発明のコレステロールの定量用試薬は、上述のコレステロールオキシダーゼ、ＣＤＨ、還元型補酵素、第二のデヒドロゲナーゼ及び第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質を含有し、各試薬が測定対象に適した濃度となるように配合された試薬キットとして通常提供される。提供される際の試薬の形態は、乾燥状、液状など特に限定されるものではない。試薬キット中には、酵素の活性化剤などが配合されていてもよく、また試薬キットが、例えば第一反応用試薬と第二反応用試薬との組合せのように、反応液中に添加する時期が異なる複数の種類の試薬を組み合わせたものであってもよい。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、検体中に存在するコレステロール量自体が微量な場合、または検体量自体がごく少量の場合であっても、コレステロールを正確に定量できるようになり、臨床検査や食品検査の分野での有用性が高い。
【００２７】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例及び比較例を挙げるが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
以下の試薬を調製した。
【００２９】
0003981190.tif 000003
ＴＯＯＳ：Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−３−メチルアニリン
【００３０】
β−ＮＡＤＨの濃度（Ｘ）が１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０μＭの各試薬を調製した。これらの試薬４００μＬに０、１、２、４、８、１６、３２、６４ｍｇ／ｄＬのコレステロール水溶液（１０％トリトンＸ含有）各々を検体として１０μＬ添加し、３７℃で５分間反応後の吸光度を波長５４６ｎｍで測定した。コレステロール濃度に対して吸光度をプロットした結果を図１に示す。
【００３１】
〔比較例１〕
実施例１の試薬からグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸二ナトリウムを除き、実施例１と同様に操作して、コレステロール濃度に対する吸光度をプロットした。その結果を図２に示す。
【００３２】
比較例１の試薬組成のサイクリング反応では、効率の良いサイクリング反応が進行しないことが分かった。
【００３３】
一方、実施例１の試薬組成では、第二のデヒドロゲナーゼ及び第二のデヒドロゲナーゼの基質として、それぞれグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸二ナトリウムが添加されているので、サイクリング効率が上昇し、生成する過酸化水素量が増え、感度が上がることが分かった。さらに、使用する補酵素の濃度を調整することにより、より高感度な測定が可能になることが分かった。
【００３４】
〔実施例２〕
以下の試薬を調製した。
【００３５】
試薬Ａ
0003981190.tif 000004
【００３６】
試薬Ｂ
緩衝剤                      ５０    ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    ８    Ｕ／ｍＬ
ＣＤＨ                      １６    Ｕ／ｍＬ
トリトンＸ−１００            ０．３％
４−アミノアンチピリン        ４    ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ                          ７．５
【００３７】
ヒト血清を生理食塩水で希釈し、約５０、４０、３０、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１のコレステロールを含有する各検体を調製した。
【００３８】
試薬Ａ２８８μＬに検体１０μＬを加え３７℃で５分間反応させた後、試薬Ｂ７２μＬを加え３７℃で５分間反応させ、試薬ブランクを対照に波長５４６ｎｍの吸光度を測定した。
【００３９】
比較対照試薬として、特開平８−７０８９４号公報の〔実施例〕に記載の試薬５及び試薬４を調製し、〔実施例−４〕に記載の方法に従い操作した。なお、各操作法における反応液中のコレステロール濃度を同じにするために、試薬容量／検体容量の比を３６／１とした。その結果を図３（本法）及び図４（特開平８−７０８９４号公報の方法、以下、「従来法」ともいう。）に示す。
【００４０】
また、約１．２５ｍｇ／ｄＬのコレステロール濃度の検体について１０回測定したときの平均値、標準偏差、変動係数を求め、表１にまとめた。
【００４１】
図３及び図４に示されるように、本発明方法によれば、従来法の感度を５分間の吸光度変化量に換算しても同等以上の感度を有することから、高感度にコレステロールを測定することが明らかである。また表１に示されるように、約１．２５ｍｇ／ｄＬのコレステロールを測定するとき、従来法と同等以上の良好な再現性を示した。
【００４２】
【表１】
0003981190.tif 000005
【００４３】
〔実施例３〕
以下の試薬を調製した。
【００４４】
試薬Ａ
0003981190.tif 000006
【００４５】
試薬Ｂ
緩衝剤                      ５０    ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    ８    Ｕ／ｍｌ
ＣＤＨ                      １６    Ｕ／ｍｌ
トリトンＸ−１００            ０．３％
４−アミノアンチピリン        ４    ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ                          ７．５
【００４６】
生理食塩水で１００倍希釈したヒト血清１０例を検体として、実施例２の操作方法によりコレステロール濃度を測定した。また、希釈をしない検体を国際試薬株式会社製のＴ−ＣＨＯ試薬・Ｋ「コクサイ」で測定した。結果を表２に示した。
【００４７】
１００倍希釈検体を測定した本法と、すでに臨床検査に応用されているＴ−ＣＨＯ試薬・Ｋ「コクサイ」による方法とは極めて良い相関性を示した。これは本法が高感度に測定できることを示すものである。
【００４８】
【表２】
0003981190.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のコレステロール濃度に対する吸光度を示す図である。
【図２】比較例１のコレステロール濃度に対する吸光度を示す図である。
【図３】実施例２の本法におけるコレステロール濃度に対する吸光度を示す図である。
【図４】実施例２の従来法におけるコレステロール濃度に対する吸光度変化量を示す図である。
【図１】
0003981190.tif 000008
【図２】
0003981190.tif 000009
【図３】
0003981190.tif 000010
【図４】
0003981190.tif 000011