(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の測定を行う方法であって、
(ｉ) 分析物を含む可能性のある細胞試料を界面活性剤に基づく細胞溶解試薬と混合して細胞溶解液を提供する段階と、
(ii) この細胞溶解液を分析物の特異結合測定を行うために分析物に結合させるための特異結合相手を含む試薬と界面活性剤に基づく細胞溶解試薬の金属イオン封鎖剤の存在下で混合する段階と、そして
(iii) 分析物の特異的結合相手への結合を測定することにより細胞溶解液内に存在する分析物を測定する段階
とを含む方法。
【請求項２】
金属イオン封鎖剤がシクロデキストリンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属イオン封鎖剤の量が結合反応混合物の１〜５％の範囲内にあることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階(i)、段階(ii)、段階(iii)を全て単一反応容器中で行なうことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
マルチウェルプレートのウェル中で複数の測定法を平行して行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞を容器中で培養し、分析物をその容器中で測定するために細胞をその容器中で溶解することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階(iii)の測定が均一系測定であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階(iii)の測定がシンチレーション近接測定であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
段階(iii)の特異結合測定が免疫測定法であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階(iii)の測定が蛍光偏光免疫測定である、請求項１乃至７及び９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
分析物がアデノシン-３’，５’-環状リン酸であり、細胞溶解試薬がドデシルトリメチルアンモニウムブロミドであり、金属イオン封鎖剤がα-シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞を培地中に維持し、段階(i)を培地が存在する状態で行なうことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アデノシン-３’，５’-環状リン酸、インターロイキン-６及びプロスタグランジンＥ2から選択される分析物の細胞内又は総（細胞内プラス細胞外）濃度を測定することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法による分析物の測定に適したキットであって、洗浄剤、洗浄剤用の金属イオン封鎖剤、分析物の特異結合相手、トレーサー、及び結合トレーサーから未結合トレーサーを分離するための分離手段を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫測定法の分野に関する。本発明は細胞成分として現れる一連の様々なタイプの分析物の抽出及び測定に適した簡便な一段階、一容器の細胞抽出測定法を提供する。また、本発明は細胞抽出及び測定を一段階、一容器法として施行するのに適した試薬のキットをも提供する。
【０００２】
【従来の技術】
１．免疫測定技術
少量の生体物質を測定する技術として多くの技術が知られており記載されてきた。これらの技術のうち、免疫測定法の分野は大々的に検討され、その技術は製品化されている多くの測定用キットの基礎をなしている。
【０００３】
30年以上にわたって、免疫測定法は、複雑な生体液中の低濃度の分析物の測定のための特別上等の方法であった。この方法は薬剤、ステロイド等の低分子量化合物並びにタンパク質分子などの高分子量化合物の測定に同じく適用できる。
【０００４】
この技術には感受性と特異性が組み合わされている。免疫測定法は生物学の基礎研究に使用され、環状ヌクレオチド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、成長因子、ステロイドホルモン及びサイトカインを含む広範囲の強力な生理活性物質の生理学的役割と、ありうる病理学上の役割とを調べる基本的な生物学上の研究に使用される。かような研究は新しい治療剤の確認につながることが多い。免疫測定法は、医薬品業界において医薬品開発プロセスの多くの面で使用されることが多い。このプロセスは、薬物スクリーニング、毒性試験、薬理試験及び薬物動態試験から臨床試験までの範囲に及ぶ。免疫測定法は臨床診断テストの分野で最も強い影響力を持ってきた。この技術は長年のあいだ病院の臨床生化学検査室で疾患及び代謝障害の診断に使用されている。この技術は1959年にBerson 及びYalowにより導入された（Yalow, R.S.及びBerson S.A.の論文「免疫的方法によるヒト被験者における血漿インスリンの測定法」, Nature,(1959),184,1684）。検出可能なシグナルと対象の分析物に特異的かつ強く結合するタンパク質分子（抗体）との組合せがいずれの免疫測定法でも中核をなしている。測定法の設計は、様々なタイプのシグナル試薬及び検出系の急増と相まって過去30年間にわたって急増した。また、試料処理量を増やす目的でコンピュータ・ハードウェア装備の精巧な機器が開発された。さらに、免疫測定技術に関する背景の情報が「The Immunoassay Handbook」（Wild, D.G.編、Stockton Press社、ニューヨーク、1994年）に見られ、本発明と直接関係のある免疫測定技術に付随する概念の多くが取り扱われている。そこでは、例えば競合系（「標識分析物」又は「制限試薬」ともいう）及び免疫測定（「標識抗体」又は「試薬過剰」）系を検討している。
【０００５】
最も初期の方法は、結合分析物量が測定され得るようにするために結合分析物を遊離分析物から分離する段階を含むものであった。チャコール吸収法、硫安沈殿法、磁性粒子（「AmerlexTM」）等を含む種々の分離方法が記載されている。その後、マイクロプレートの側壁を含む固体支持体が免疫測定法に利用された。
【０００６】
さらにその後開発されたのは均一系放射免疫測定技術、特に米国特許第4,568,649号に取り扱われているシンチレーション近接測定法（ＳＰＡ：scintillation proximity assays）の導入であった。シンチレーション近接測定技術は、近年広く受け入れられ、放射免疫測定法並びに放射線受容体測定法及び酵素測定法に応用可能な放射性同位元素測定法である。この技術は放射性同位元素から放射されたβ粒子が水性環境（トリチウムβ粒子の場合、これは1.5μｍ）中ではエネルギー放散までに限定された距離しか進まないという観察に基づいている。ＳＰＡでは対象標的が蛍光剤を含む小微粒子に固定される。この微粒子近傍に放射性同位元素標識分子を近づけるとβ粒子エネルギーが蛍光剤に効果的に運搬され、それにより発光が引き起こされる。溶液中に遊離状態で残存する標識分子は、蛍光剤を含む微粒子から遠すぎるため検出されない。代表的な放射免疫測定法では、微粒子をプロテインＡなどの捕捉成分やロバ抗ウサギ抗体、ヒツジ抗マウス抗体などの二次抗体などで被覆する。被検分析物を含む試料、又は含むと疑われる試料（即ち抗原）をその分析物に特異的な抗体が存在する状態で若干の放射性同位元素標識分析物と共にインキュベートする。この抗体／分析物複合体は二次抗体により捕捉され、発光により検出される。抗体に結合しないまま残った標識抗原はいずれも溶液中で遊離しており、検出されない。従って、この測定法は分離段階を必要とせず、そのプロトコルには従来法、即ち分離に基づく放射免疫測定法と比較してピペット操作の段階が少ない。ＳＰＡに基づく測定法では、従来の分離に基づく測定法と比較して精度及び再現性が向上することが多いことが明らかにされた。もう一つの利点は試料処理量及び自動化機能向上の可能性にある（Cook, N.D.著「Drug Discovery Today」 (1996), 1, 287-294）。ＳＰＡのＲＩＡ法への応用は特定の分析又は特定の種類の分子に限定されず、原則的にこの技術は従来の分離に基づく測定法の代わりに適用できる。ＳＰＡを用いて開発したＲＩＡのいくつかの例を表１に示す。
表１．ＳＰＡを用いて開発した放射免疫測定法の例
測定法 参考文献
環状ＡＭＰ  Horton JK及びBaxendale PM(1995年)
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Kendall, DA及びHill, SJ編, Humana Press
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Biochemistry and Immunology」 pp. 98-102,
Moncada, S ら編, Portland Press社
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Research」pp. 303-306, の第21章、Samuelsson,
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アシクロビアTadepalli, SM, Topham, PA及びQuinn, RP.の論文
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血小板活性化因子  Sugatani, J らの論文(1990年), Life Sciences,
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アブシシン酸Whifford, PN.及びCroker, SJ.著(1991年)
「Phytochemical Analysis」134-136の第２章
アンドロステンジオン Fiet, J.らの論文 (1991年) Clin. Chem., 37,293
ラニチジン  Linacre, P.及びMorris, SE(1992年)
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第22章「抗喘息薬及び代謝物」pp.325
326 Reid, E.及びWilson ID.編、王立化学協会、ロンドン
【０００７】
その後、蛍光剤含有ビーズの代替物（蛍光微粒子）である近接測定法への使用が記載された。ＰＣＴ出願第WO90/03844号（Wallac）は結合測定法を目的とするマイクロタイタープレートを開示している。この試料プレートは真空熱成型法又は射出成型法により透明な蛍光剤含有プラスチックから製造される。原則として、このマイクロプレートの側壁は放射性同位標識反応物を用いる試験管内結合測定を行う目的で結合化合物により被覆しうる。
【０００８】
ＰＣＴ出願第WO94/26413号は実時間で細胞の生化学的プロセスを研究するための装置及び方法を開示している。一態様において、この出願はマイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートを記載しており、そのマルチウェルプレートはプレートの基部を蛍光プラスチック材料から形成し、プレートの側壁を不透明なプラスチック材料から形成し、側壁を細胞の接触又は成長に適合させてある。この蛍光マイクロプレートは細胞に伴う広範囲の現象の実時間分析に使用すべく設計され、輸送、細胞運動性、取込み、代謝及びその他の細胞に基づくプロセスの中での応用が具体的に説明されている。CytostarTM 蛍光マイクロプレートは細胞プロセス研究用としてアマシャム社により導入された新しい技術の基礎をなす。その他の応用では、蛍光マイクロプレートをリガンドの測定、分析等のための試験管内測定法に使用できる。この方式では、標識及び分析物と反応させるため結合化合物をマイクロタイタープレートの側壁に結合させる。
【０００９】
免疫測定を行うための放射性同位元素に代わるものとして非放射性同位元素系が導入された。今日、酵素は最も広く使用されるトレーサーである。比色終点と組み合わせると、高感度で、頑健で、高精度で、正確で、簡便な免疫測定法が提供される。９６ウェルのマイクロタイタープレートの導入と共に大きな躍進が到来した。廉価な自動比色マルチウェルプレートリーダーが利用できる。その他多数の非放射性同位元素標識が記載され、その内発光標識と蛍光標識が最も普及している。
【００１０】
２．細胞抽出法
従来の免疫測定法は十分に適した状態、即ち十分に妨害因子の取り除かれた状態の試料に依存している。通常、これには細胞抽出法が含まれる。多くの方法が記載され、細胞からの細胞内分子の抽出が詳述されている。典型的な場合では、これらの方法には細胞溶解及び対象分子抽出のための酸、溶媒又は固相法が含まれる。かような抽出を施行する方法はいくつかの出版物に見られる。細胞抽出法に関する背景情報はさらにGoldberg及びO'Toole による総説（Goldberg, ND及びO'Toole, AG(1971年)「Methods of Biochemical Analysis」Glick D. 編pp 1-39の第20章、Interscience Publishers社, Wiley, ロンドン）に見いだされる。
【００１１】
細胞抽出法の実施例は次の通りである。
２．１  溶媒抽出（Horton及びBaxendale、1995年、表１参照）
氷冷エタノールを最終懸濁液量が65％（ｖ／ｖ）エタノールとなるように細胞培養物に添加し、懸濁物を沈降させた。試験管に上清を吸引して入れ、残った沈殿を氷冷65％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、洗液を適当な試験管に加えた。抽出物を４℃で2000ｇ、15分間遠心分離し、上清を新しい試験管に移した。次いで混合した抽出物を60℃、窒素気流下の真空乾燥器中で８時間、又は高温に設定した遠心蒸発器中で４時間終夜のいずれか一方で乾燥させた。この方法では、乾かしすぎる可能性があるため、試料の再構成が困難になりうる。分析の前に乾燥抽出物を適量の測定緩衝液に溶解する。
【００１２】
２．２  酸抽出
Hancock ら（J. of Receptor & Signal Transduction Research, 1995, 15, 557-579）は細胞に0.2Ｍ塩酸を添加し、各分離試料をボルテックスミキサーで１〜２分間混合する細胞内分子用の酸抽出法を記載している。2.5Ｍ水酸化ナトリウムの10μｌアリコートの段階的添加を用い、各アルカリ添加後ごとに試料のｐＨを測定するように注意しながらこの試料を免疫測定法に適合したｐＨに注意深く中和する。免疫測定法に非至適ｐＨを使用すると測定が不正確になったり試料中の分析物が測定されなかったりする可能性があるので、この段階は特に重要である。
【００１３】
Steiner（「Methods of Hormone Radioimmunoassay」,1979年, Jaffre, BM, & Behrman, HR編, pp. 3-17, Academic Press, ニューヨーク）は、４℃の６％（ｗ／ｖ）冷トリクロロ酢酸中で細胞試料をホモジナイズして10％（ｗ／ｖ）スラリーを得る代替アプローチを記載している。試料を４℃で2000ｇ、15分間遠心分離し、上清を残してペレットを棄てる。上清を５体積の水飽和ジエチルエーテルで４回洗浄し、各洗浄後に上層を棄てる。この水性抽出物を終夜凍結乾燥又は窒素気流中60℃で終夜乾燥し、分析の前に乾燥抽出物を適量の測定緩衝液に溶解する。
【００１４】
２．３  固体支持体（例えばイオン交換や「Amprep」カラム）
かつてディスポーザブルミニカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによる細胞内分子抽出のためのプロトコルが記載されたことがある（Horton及びBaxendale, 1995年、表１参照）。このカラム（例えばイオン交換ＳＡＸカラム）を真空マニホルド及び真空ポンプと併せて使用する。このカラムは、固体支持体を乾燥させないように、或いは流速が５ｍｌ／分を超えないように注意しながら、真空にしておき100％メタノール２ｍｌでリンスした後水２ｍｌで洗浄することにより調製する。このカラムに培養細胞を直接負荷し、100％メタノール３ｍｌで洗浄する。酸性化メタノール３ｍｌをカラムに添加し、溶出液を収集する。窒素気流を用いて、或いは真空乾燥機中でフラクションを終夜乾燥する（上記参照）。上記のように、測定前にこの試料を測定緩衝液に再構成する。
【００１５】
２．４ 洗浄剤法
ＡＴＰなどの核酸試料及びヌクレオチド抽出についてその他の方法が知られている。例えばLundin及びAnson（ＰＣＴ国際公開第WO92/12253号）は、細菌細胞を洗浄剤で溶解後、シクロデキストリンの添加により中和する細胞内成分抽出法を記載している。遊離した細胞成分（例えばＡＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）は、その後、ホタル・ルシフェラーゼやポリメラーゼ連鎖反応などの生化学又は分子生物学（非免疫測定法）技術を用いて測定又は処理する。この特許出願では一段測定法、シンチレーション近接測定法を含む均一系免疫測定法、或いは分離に基づく免疫測定技術への参照は一切行なっていない。
【００１６】
欧州特許第0 309 184号（Lumac）はＡＴＰ放出剤を用いて抽出し、得られた溶液から、後に行なうＡＴＰ測定法を歪ませる放出剤の影響をほぼ取り除く働きをする中和剤と接触させる、微生物からのＡＴＰ抽出法を記載している。欧州特許第0 309 184号では、この放出剤は、非イオン性界面活性中和剤と好ましくは接触する陽イオン界面活性剤であることが好ましい。
【００１７】
溶液及び界面と界面から界面活性剤を除去するのにシクロデキストリンを使用することはかつて欧州特許出願第301 847号（P. Khanna及びR. Dworschack）に記載されたことがある。この特許出願によると、生化学反応に使用された溶液及び容器から界面活性剤を固定化シクロデキストリンにより除去一掃することができる。欧州特許第286367号（Khannaら）は、酵素免疫測定法におけるトレーサーとして使用する酵素の貯蔵安定化剤として使用する界面活性剤の中和剤としてシクロデキストリンを記載している。ある総説では、生物反応及び化学反応におけるシクロデキストリンの様々な応用が記載されている（Szejtli著「Cyclodextrins in Diagnostics, Kontakte」[Darmstadt] 1988年 [1] 31-36）。
【００１８】
簡単な一段階抽出測定免疫測定系において、細胞内分子を遊離するため抽出剤として添加した界面活性剤を中和するためにシクロデキストリンを使用することは、未だかつて記載されたことがない。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
上記の先行技術の免疫測定法はいずれも多くの欠点があり、それには次のものが含まれる。
(ｉ)  多数の細胞試料を処理できないこと
(ii)  時間がかかること
(iii) 労働集約的であること
(iv)  段階が多いためミスを犯しやすいこと
(ｖ)  処理と測定をさらに行うには細胞抽出試薬を除去する必要があること
これを実行しない場合は正確な測定ができないか、或いは、実際に測定法全体が阻害され、従って細胞抽出物中の化合物の測定が妨げられうる。
【００２０】
従来の放射免疫測定法の試料調製法ではいずれも、これまでは試料をそれ以降の測定に適した形態で得るために溶解プロセスと抽出プロセスを別々に行う必要があった。従って、先行技術の方法には連続的に施行しなければならない独立した３つのプロセスが含まれ、それにより各免疫化学測定法の時間とコストが増大する。その上、細胞内成分測定法用の先行技術の方法には、多数の試料処理が要求される場合に必要となる高処理量スクリーニング法に適用できるものがない。本明細書では、細胞溶解試薬を免疫測定系に添加すると抗原抗体結合が抑制され、シクロデキストリンなどの複合糖質を混在させると抗原抗体結合事象が回復するというデータを提供する。本発明の好ましい実施態様では、細胞溶解試薬（抗原抗体結合を抑制）として１％ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）を用い、抗原抗体結合を回復する金属イオン封鎖試薬として2.5％α‐シクロデキストリンを使用する。これらの試薬によると、均一系免疫測定技術と相まって、正確な細胞内分子の測定用の協奏的な一段階、単一容器の細胞溶解免疫測定系の確立が初めて可能になった。
【００２１】
このように、本明細書中には細胞増殖、細胞内成分の抽出及びその後のかような成分の測定法を同じ容器中で行うことを可能にする、標的分子の新規、簡便、迅速な抽出定量法が記載されている。本技術は施行が簡単であり、ほとんど技術的介入なく実施できる。必要な操作はわずかしかないため、ロボットによる自動化に完全に適用することができる。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は分析物の測定を行う方法であって、
(ｉ)  分析物を含む可能性のある細胞試料を細胞溶解試薬と混合して細胞溶解液を提供する段階と、
(ii)  この細胞溶解液を分析物の特異結合測定を行うために分析物に結合させるための特異結合相手を含む試薬と混合する段階と、
(iii) この細胞溶解液を細胞溶解試薬の金属イオン封鎖剤と混合することにより段階(ii)の結合を金属イオン封鎖剤が存在する状態で行う段階と
を含む方法である。
【００２３】
この分析物は細胞成分である。その特異結合相手が利用できる細胞成分は原則としていずれも利用しうる。本発明での使用に適した代表的な特異結合相手の組合せは、ハプテン‐抗体、リガンド‐受容体、ＤＮＡ‐ＤＮＡ、ＲＮＡ‐ＲＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡ、ビオチン‐ストレプトアビジン、タンパク質‐抗体、ペプチド‐抗体、及びポリペプチド‐抗体の各相互作用から選択される。この特異結合測定法はタンパク質結合測定法、特に免疫測定法であることが好ましい。好ましい細胞成分としては、タンパク質、ペプチド、環状ＡＭＰや環状ＧＭＰなどの第２メッセンジャー、ホルモン、ステロイド、プロスタグランジン、リン酸イノシトール、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエンなどが含まれる。
【００２４】
本測定法は細胞内に存在する分析物を測定するために設計することができ、この場合、通常は細胞を溶解前に細胞培養培地から分離する。或いは、本測定法は細胞内と細胞外の両方に存在する分析物を測定するために設計することができ、この場合、通常は細胞を培養した培地が存在する状態で細胞を溶解する。
【００２５】
細胞溶解試薬は洗浄剤、即ち陽イオン性、陰イオン性、両性イオン性又は非イオン性の各界面活性剤であることが好ましい。適当な洗浄剤の例としてはドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びＮ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニノ‐１‐プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）などが含まれる。ＤＴＡＢ、ＣＰＣ及びＢＺＣは陽イオン性洗浄剤であり、ＤＤＡＰＳは両性イオン性洗浄剤であり、ＳＤＳは陰イオン性洗浄剤である。これらの洗浄剤を細胞溶解剤として使用することは、当分野では周知である。代表的な濃度は細胞溶解液重量の0.4〜４重量％の範囲にある。洗浄剤の使用量が少なすぎると、細胞溶解の速度が遅くなったり溶解が不完全になることがある。洗浄剤は、細胞内成分を細胞溶解液中に遊離させるために細胞を溶解するだけではなく、測定法のために段階(ii)中で添加した、その細胞内成分の特異結合相手への結合に悪影響をも及ぼす。この好ましくない悪影響を抑制又は除去するために金属イオン封鎖剤を使用する。
【００２６】
本発明の重要な特徴は細胞溶解試薬に金属イオン封鎖剤を使用することである。金属イオン封鎖剤は細胞溶解試薬が分析物とその特異結合相手との結合反応に悪影響を及ぼすのを防止するように作用する。金属イオン封鎖剤はこれを例えば細胞溶解試薬と化学的に反応することにより、或いはその試薬を物理的に吸収することにより行う。好ましい金属イオン封鎖剤はシクロデキストリンなどの糖質である。シクロデキストリンは６個、７個、又は８個のグルコース単位から成るドーナツ形の分子である（α、β、及びγ‐シクロデキストリン）。環の内側は界面活性剤などの分子の疎水性末端と結合する。得られた包接複合体は一般に界面活性剤とシクロデキストリンとの１：１の化学量論比で形成される。γ‐シクロデキストリンと、特にα‐シクロデキストリンが本発明の使用に好ましい。存在する全ての細胞溶解試薬を金属イオン封鎖、即ち不活性化できるように十分な金属イオン封鎖剤を使用することが好ましい。金属イオン封鎖剤の量は反応混合物重量を基準にして0.5〜10重量％、特に１〜５重量％であることが好ましい。
【００２７】
本明細書中に記載した方法は、従来の分離、非均一系免疫測定法、及び二段階法にも容易に適用可能であり、それにより免疫測定法測定を行う容器とは別の容器で細胞を培養しうることは明らかである。
【００２８】
単一の反応容器中で段階(ｉ)、(ii)及び(iii)をいずれも好ましく施行できることが本発明の一利点である。段階(ｉ)で分析物を抽出した細胞は死滅してもよいが、生存するほうが好ましい。測定を行う予定の反応容器中で細胞を培養することが簡便であろう。マイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートのウェル中で複数の測定法を平行して行うことが好ましい。望むならば、マルチウェルプレートの各ウェルの内容物は、本方法の施行中のいずれの段階でも別のマルチウェルプレートの各ウェルに移しうる。
【００２９】
段階(ｉ)から得られた細胞溶解液は、中間で分離も精製も一切行わないで段階(ii)及び段階(iii)の施行に使用することが好ましい。また、段階(ii)において細胞溶解液と混合する試薬の一つに金属イオン封鎖剤を含ませることが好ましい。従って、本発明による測定法中の成分試薬は典型的には
ａ）分析物を含む可能性又は疑いのある細胞原料
ｂ）細胞溶解試薬
ｃ）固体支持体に固定された、又は固定しうる、分析物の非標識特異結合相手
ｄ）標識されているか、又は標識されていないが標識しうる、分析物の特異結合相手又は類似体
を含む。
【００３０】
成分ｃ）と成分ｄ）の一方又は両方に金属イオン封鎖剤を含ませるが、成分ｃ）と成分ｄ）の添加順序は重要ではない。
【００３１】
本発明の一つの形式において、免疫測定法はシンチレーション近接測定法である。この態様では、成分ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）がマイクロタイタープレートのウェル中に含まれ、成分ｄ）が被検化合物の放射性同位元素標識類似体である。シンチレーション近接測定法による測定は二次抗体やプロテインＡなどの結合試薬で被覆したＳＰＡ蛍光微粒子をウェルに添加することにより開始する。
【００３２】
これに代わるものとして、二次抗体やプロテインＡなどの結合試薬でウェルの基部及び／又は側壁を被覆した、この目的に適した蛍光剤マイクロタイタープレートのウェル中で細胞を培養してもよい。適当な時間が経過した後、残りの測定法成分ｂ）、ｃ）、ｄ）をウェルに添加する。
【００３３】
本発明の第二の形式において、免疫測定法は酵素免疫測定法である。この形式では、成分ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）をマイクロタイタープレートのウェルに含ませ、成分ｄ）を被検化合物の酵素標識特異結合相手とする。この測定法による測定は酵素標識の検出に適した検出試薬をウェルに添加することにより開始される。
【００３４】
適当な金属イオン封鎖試薬はシクロデキストリンを含む複合糖質から成る群から選ばれる。好ましい形式においては、本発明の方法にα‐シクロデキストリンを用いる。
【００３５】
この方法は細胞を細胞溶解緩衝液とインキュベートする段階と、溶解細胞の混合物に対象物質の標識特異結合相手を添加した後に非標識特異結合相手を添加する段階であって、このときこれらの試薬を両方とも金属イオン封鎖剤を含む緩衝液に溶解しておく段階と、試薬の全量が同時に反応容器に存在する状態で標識特異結合相手が発生したシグナルを物質又は成分の測定として測定する段階とを含む。得られたシグナルは、平行法を用いた標準量の物質の組を用いて得られるシグナルと測定法用標準曲線を作成することにより比較しうる。
【００３６】
別の一態様において、本発明は、記載した方法により分析物の測定を行うためのキットであって、洗浄剤、洗浄剤用の金属イオン封鎖剤、分析物の特異結合相手、トレーサー、及び結合トレーサーを未結合トレーサーから分離するための分離手段を含むキットを提供する。このトレーサーは分析物の特異結合相手又はその他の測定法試薬であってよい標識測定法試薬である。考えられる分離手段には、例えばＳＰＡや磁気ビーズや測定法容器の内部表面などに固定された測定法試薬が含まれる。このキットには分析物及び緩衝液なども含めてよい。
【００３７】
一つの形式において、免疫測定法は特異結合相手が放射性同位元素を含む放射免疫測定法である。本発明の測定法で使用する適当な放射性同位元素には、トリチウムやオージェ電子を放射する125Ｉなどのβ放射性同位元素を含む。
【００３８】
別の形式において、免疫測定法は標識特異結合相手を酵素標識に結合した、又は結合しうる酵素免疫測定法である。本発明で使用するのに適した代表的な酵素標識はアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース‐６‐ホスフェートデヒドロゲナーゼである。セイヨウワサビペルオキシダーゼは本発明による酵素免疫測定法での使用に特に好ましい酵素標識である。
【００３９】
別の形式において、標識特異結合相手には蛍光標識を含ませうる。本発明での使用に適した蛍光標識はフルオレセイン、ローダミン、シアニンの各染料から選択しうる。
【００４０】
厳密な測定形式、特異結合相手の選択、検出標識、及び被検物質の性質は本発明に重要ではない。むしろ本発明は、先行法に固有であり、その特色である、細胞試料に関して行う分離抽出及び／又は精製法を行わずに、細胞内成分の厳密な測定ができるとの予期せぬ観察に基づく。
【００４１】
本発明に利用しうる免疫測定法の実例となるのは次の測定形式である。
【００４２】
Ｉ．放射性同位元素測定法
蛍光剤ビーズを用いるシンチレーション近接測定法
この方法は細胞内成分の簡単な一段階溶解測定法を提供する。細胞の増殖に使用する同一ウェルに免疫測定法試薬（抗血清、トレーサー、ＳＰＡビーズ）を添加する。この方法はそれ以上技術介入を行わずに単一ウェル中で行う。本発明のこの態様では、適当な容器で培養した細胞が必要である。本発明の好ましい態様では、細胞の顕微鏡検査を可能とするため、不透明な側壁と透明な基部を備え、細胞培養処理が施されたマイクロプレートが必要である。培養細胞に溶解試薬を添加した後、金属イオン封鎖剤を含む緩衝液中で調製した標識特異結合相手、非標識特異結合相手及び二次抗体誘導体化蛍光剤ビーズを添加する。同一マイクロタイタープレート上の空のウェルに標準品を添加する。β‐シンチレーションカウンターで計数する前にこのマイクロプレートを適当な時間インキュベートする。試料中の分析物濃度は補間法により標準曲線から求められる。
【００４３】
別法として、溶解事象の後、蛍光剤ビーズに結合した特異結合相手を第二の特異結合相手と共に抗原とインキュベートする。この第二の特異結合相手は標識せず、その検出は標識された結合試薬を通じて行う。
【００４４】
別法として、溶解事象の後、抗原／第二の特異結合相手複合体を蛍光剤ビーズに結合させる。この際、第二の特異結合相手は標識せず、その検出は標識された結合試薬を通じて行う。
【００４５】
蛍光マイクロプレートを用いるシンチレーション近接測定法
上記の測定系の代替法では、Cytostar-Tプレート（又は均等物）を使用する。本発明の好ましい実施態様では、細胞の顕微鏡検査を可能とするため、不透明な側壁と透明な底部を備え、無菌であり、組織培養処理が施された蛍光剤マイクロプレートが必要である。この方法では、マイクロプレートに特異抗体又は二次抗体による予備被覆を施す。上記同様にこの方法もCytostar-Tプレート（又は均等物）中で培養した培養細胞の細胞内成分の簡単な一段階溶解測定方法を提供する。細胞の増殖に使用する同一ウェルに免疫測定法試薬（トレーサー、＋／−抗血清）を添加する。培養細胞に溶解試薬を添加した後、金属イオン封鎖剤を含む緩衝液に溶解したトレーサー（或いはプレート被覆に一次抗体を使用したか、二次抗体を使用したかにより抗血清）を添加する。同一マイクロプレート上の空のウェルに標準品を添加する。β‐シンチレーションカウンターで計数する前にこのマイクロタイタープレートを適当な時間インキュベートする。補間法により標準曲線から試料中の分析物濃度を求める。
【００４６】
ＩＩ．酵素免疫測定法
「ＥＭＩＴ」タイプ（Rubenstein KE.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 47; 846、1972年）
酵素のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルコース‐６‐ホスフェートデヒドロゲナーゼはＥＭＩＴ（酵素増幅免疫測定法）により例示される均一系免疫測定法において広く使用されてきた。両酵素は340ｎｍの分光光度計で補因子ＮＡＤのＮＡＤＨ2への変換によりモニターされる。この測定系では、抗体結合部位について分析物が標識抗原と競合する。この酵素の活性は抗体が標識抗原に結合すると変化する。
【００４７】
細胞を無菌で透明な、組織培養処理が施されたマイクロタイタープレート中で培養し、溶解した後、均一系ＥＭＩＴＥＩＡを金属イオン封鎖剤（シクロデキストリン）を含む緩衝液に溶かして添加する。光学密度を測定し、補間法により標準曲線から試料中の分析物濃度を求める。標準品は同一マイクロプレート上の細胞培養に使用しない空のウェルに添加する。
【００４８】
「ＣＥＤＩＡ」タイプ（Henderson DRら、1986年、Clin. Chem.32,1637-1641）
クローン化酵素供与体免疫測定法では、β‐ガラクトシダーゼの二つの不活性フラグメントを遺伝子工学により合成する。大フラグメント、即ち酵素受容体は酵素の95％を含み、小フラグメント、即ち酵素供与体は残る５％から成る。混合すると、これら二つのフラグメントは凝集してβ‐ガラクトシダーゼ酵素活性を有する四量体となる。この測定法では、抗体が抗原に結合すると酵素供与体との凝集が阻害されるように抗原を酵素供与体に結合する。分析物が存在すると、結合体に結合する酵素が少なくなり、酵素活性が刺激される。分析物が存在しないと、結合体に結合する酵素が活性酵素の形成を阻害する。
【００４９】
細胞を無菌で透明な組織培養処理を施したマイクロプレート中で培養し、溶解した後、均一系ＣＥＤＩＡのもう一方の成分（抗体、酵素‐供与体／リガンド結合体、酵素受容体単量体）を金属イオン封鎖剤（シクロデキストリン）を含む緩衝液に溶かして添加する。光学密度を測定し、補間法により標準曲線から試料中の分析物濃度を求める。標準品は同一マイクロタイタープレート上の細胞培養に使用しない空のウェルに添加する。
【００５０】
ＩＩＩ．蛍光免疫測定法方式
蛍光偏光法
【００５１】
蛍光偏光法は分離を必要とせずに遊離分析物から識別する技術である。競合測定法では、小分子に対して蛍光標識抗原（例えばフルオレセイン、ローダミン、シアニンの各染料試薬を使用して）をトレーサーとする。シグナル発生及び検出段階で蛍光測定器が蛍光剤の励起波長の垂直偏光を発生する。
【００５２】
ストークスシフトのため、それより低波長で放射された光は、垂直偏光フィルターを通じて検出する。遊離トレーサーは極めて高速で回転するため、放射された光は入射光と常に異なる平面内にあり、偏光フィルターを通じて検出される光の量が最小となる。しかしながら、はるかに大きな抗体分子を結合したトレーサーはかような高速回転が抑止され、放射された光が入射光と同一平面内にある。細胞を無菌で透明な組織培養処理を施したマイクロプレート中で培養し、溶解した後、均一系蛍光測定法のもう一方の成分（抗体、蛍光標識抗原）を金属イオン封鎖剤（シクロデキストリン）を含む緩衝液に溶かして添加する。光学密度を測定し、補間法により標準曲線から試料中の分析物濃度を求める。標準品は同一マイクロプレート上の細胞培養に使用しない空のウェルに添加する。
【００５３】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
異なる蛍光剤は異なる励起スペクトルと発光スペクトルを持つことが多い（表２参照）。しかしながら、ある蛍光剤の励起ピークは別のある蛍光剤の発光ピークと重なりうる。第二の蛍光剤を第一の蛍光剤のすぐ近くに置くと、エネルギーの移動により蛍光発光の消失が起こる。この原理は、一方の蛍光剤を抗体に、もう一方の蛍光剤を抗原に結合することにより、ＦＲＥＴにおいて使用されてきた。抗原が抗体へ結合すると極めて接近し、その後消失が起こる。そのため、代替系には同一の抗原に対して作成され二種類の蛍光剤で標識された抗体の二集団が含まれる。二つの抗体が結合すると極度の接近が起こり、次いでその二つの間でエネルギー移動が起こり、蛍光が消失又は減衰する。細胞を無菌で透明な組織培養処理を施したマイクロタイタープレート中で培養し、溶解した後、均一系蛍光測定法のもう一方の成分（抗体、蛍光標識抗原）を金属イオン封鎖剤（シクロデキストリン）を含む緩衝液に溶かして添加する。光学密度を測定し、補間法により標準曲線から試料中の分析物濃度を求める。標準品は同一マイクロプレート上の細胞培養に使用しない空のウェルに添加する。
表２．シアニン蛍光染料のスペクトル特性
蛍光剤 励起（ｎｍ） 発光（ｎｍ）
Cy2        489        506
Cy3        550        570
Cy3.5      581        596
Cy5        649        670
Cy5.5      675        694
Cy7        743        767
FluorX     494        520
【００５４】
時間分解蛍光
バックグラウンド蛍光は蛍光免疫測定法の使用における主要な問題の一つであり、それが存在するとこの方法の使用が限定される。しかしながら、ほとんどの生体材料に存在するバックグラウンド蛍光は数ナノ秒の短い寿命を有する。寿命の長い蛍光剤については、ほぼ全てのバックグラウンド蛍光が消失した時点で蛍光を測定することが可能である。これは本質的に時間分解蛍光の原理であり、この方法は蛍光エネルギー移動及び蛍光偏光技術と組み合わせて使用できる。
【００５５】
ＩＶ．その他の方法
本発明に記載した方法は、ルミネセンス、比濁分析、ラテックス凝集測定法及びそれらの変形体など、その他の多種多様な均一系（非分離）免疫測定技術に適用できる。
【００５６】
【実施例】
Ａ．予備実験
アデノシン‐３'５'‐環状リン酸のシンチレーション近接放射免疫測定法
一般測定条件
細胞内分子の溶解測定検討用のモデル系として、アデノシン‐３'５'‐環状リン酸（ｃＡＭＰ）の測定を選択した。真核細胞から内容物を溶解、遊離することが知られている種々の界面活性剤の中から抽出剤となる可能性のあるものを数個選んだ。使用に最適な試薬を決定するため、一連の実験で溶解試薬を金属イオン封鎖剤と組み合わせて使用した。溶解試薬及び金属イオン封鎖剤中のｃＡＭＰの標準曲線を作成した。測定感度、標準曲線の希釈範囲、抗原抗体結合などのパラメーターを使用して溶解試薬と金属イオン封鎖剤両方の最適な試薬及び至適濃度を設定した。標準曲線は次のようにして作成した。
【００５７】
全ての測定法をマイクロプレート用βシンチレーションカウンター対応のマイクロプレート中で行なった。標準品（50μｌ、0.2〜12.8pmol／ウェル）、抗血清（50μｌ、１：11,000希釈）、トレーサー（50μｌ、10,000〜20,000ｃｐｍ）を抗ウサギ被覆ＳＰＡビーズ（50μｌ、20ｍｇ／ｍｌ）に添加する。特異的なウサギ抗血清が存在しない状態で非特異結合を測定した。ピペット操作前に確実に均一な懸濁液となるようにＳＰＡ抗ウサギ試薬をマグネチックスターラーの上に置いた。全てのウェルを全量200μｌとした。このマイクロプレートを密封し、室温（15〜30℃）で15〜20時間インキュベートした。マイクロタイタープレート用βシンチレーションカウンター中で２分間計数することによりＳＰＡ蛍光微粒子と結合した［125Ｉ］ｃＡＭＰ量を測定した。
【００５８】
実験を次のように設定した。
ａ）希釈標準溶液（４〜256pmol／ｍｌ、0.2〜12.8pmol／ウェル）を測定緩衝液のみ（対照）又は種々の濃度の溶解試薬（例えばＤＴＡＢ、ＣＰＣ、ＳＤＳ）を含む測定緩衝液の溶液として調製した。
ｂ）測定緩衝液のみ（対照）又は実験により種々の濃度の金属イオン封鎖剤を含む測定緩衝液の溶液として調製したウサギ抗ｃＡＭＰ血清。
ｃ）測定緩衝液のみ（対照）又は実験により種々の濃度の金属イオン封鎖剤を含む測定緩衝液の溶液として調製した放射性トレーサー：アデノシン‐３'５'‐環状リン酸２'‐Ｏ‐スクシニル‐３‐［125Ｉ］ヨードチロシンメチルエステル。
ｄ）測定緩衝液のみ（対照）又は実験により種々の濃度の金属イオン封鎖剤を含む測定緩衝液の溶液として調製した、シンチレーション近接蛍光微粒子に結合したロバ抗ウサギＩｇＧ。
【００５９】
実験１．数種類の溶解試薬による抗原抗体結合の抑制
方法
この実験では、上記のＳＰＡ免疫測定技術を用いてｃＡＭＰの標準曲線を作成した。このときｃＡＭＰの希釈標準溶液は終濃度が１％（ｗ／ｖ）又は２％（ｗ／ｖ）となるように数種類の溶解試薬の溶液として調製した。検討を行なった洗浄剤は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ、シグマケミカルD8638）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣアルドリッチ社B470-8）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、シグマケミカル社C9002）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、シグマケミカル社L4509）、及びＮ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニノ‐１‐プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ、シグマケミカル社D4516）を含んだ。
【００６０】
結果
表３ａ）。抗原抗体結合（金属イオン封鎖剤ゼロ濃度）。示したデータはTopCountTMマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターで得られたカウント毎分（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000002
表３ｂ）。数種類の溶解試薬濃度の上昇が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000003
【００６１】
考察
以上のデータはｃＡＭＰに溶解試薬が含まれる場合には抗原抗体結合（ｃｐｍ）が有意に低下することを明らかに示す。
【００６２】
実験２．金属イオン封鎖剤（2.5％シクロデキストリン）添加による抗原抗体結合の回復
方法
この実験では、上記のＳＰＡ免疫測定技術を用いてｃＡＭＰの標準曲線を作成したが、但し、ｃＡＭＰの希釈標準溶液は終濃度が１％（ｗ／ｖ）、1.5％（ｗ／ｖ）又は２％（ｗ／ｖ）となるように数種類の溶解試薬（ＤＴＡＢ、ＳＤＳ又はＣＰＣ）の溶液として調製した。対照は溶解試薬もシクロデキストリンも無添加とした。2.5％α‐シクロデキストリン（α‐ＣＤ）（シグマケミカル社C 4642）の含有が抗原抗体結合に及ぼす影響を調べた。ここでは、2.5％α‐ＣＤ（ｗ／ｖ）を含む測定緩衝液に溶解してトレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズを調製した。第二対照には溶解試薬を無添加として2.5％α‐ＣＤ（ｗ／ｖ）が標準曲線に及ぼす影響を調べた。
【００６３】
結果
表４ａ）。金属イオン封鎖剤を添加した場合と無添加の場合に溶解試薬（１％ＤＴＡＢ）が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000004
表４ｂ）。溶解試薬（１％ＳＤＳ）が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000005
表４ｃ）。溶解試薬（１％及び２％ＣＰＣ）が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000006
表４ｄ）。数種類の溶解試薬が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000007
表４ｅ）。1.5％溶解試薬が存在する状態で様々な濃度のα‐シクロデキストリンが抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000008
【００６４】
考察
以上のデータはｃＡＭＰ標準溶液に溶解試薬が添加され、トレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズが金属イオン封鎖剤中で調製される場合には抗原抗体結合（ｃｐｍ）が有意に回復することを明らかに示している。α‐ＣＤのみでは標準曲線に及ぼす影響がほとんどなかった。
【００６５】
実験３．金属イオン封鎖剤の至適濃度
方法
この実験では、上記のＳＰＡ放射免疫測定法を用いてｃＡＭＰの標準曲線を作成したが、但し、ｃＡＭＰの希釈標準溶液は１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢの溶液として調製した。１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、2.5％（ｗ／ｖ）及び５％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンの含有が抗原抗体結合に及ぼす影響を調べた。ここでは、上記の濃度のα‐ＣＤ（ｗ／ｖ）を含む測定緩衝液に溶解してトレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズを調製した。対照は溶解試薬もシクロデキストリンも測定に無添加とした。
【００６６】
結果
表５：溶解試薬及び種々の濃度の金属イオン封鎖剤が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られた毎分のカウント（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000009
【００６７】
考察
以上のデータはｃＡＭＰ標準溶液に溶解試薬が添加され、トレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズが金属イオン封鎖剤中で調製される場合には抗原抗体結合（ｃｐｍ）が有意に回復することを明らかに示している。１％（ｗ／ｖ）及び２％（ｗ／ｖ）α‐ＣＤは一定限度内で結合を回復した。５％（ｗ／ｖ）α‐ＣＤは抑制した。2.5％（ｗ／ｖ）α‐ＣＤでは最適な結果が得られた。
【００６８】
実験４．最適な金属イオン封鎖剤
方法
この実験では、上記のＳＰＡ放射免疫測定技術を用いてｃＡＭＰの標準曲線を作成したが、但し、ｃＡＭＰの希釈標準溶液は１％（ｗ／ｖ）溶解試薬（ＤＡＴＢ）の溶液として調製した。2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリン、2.5％（ｗ／ｖ）β‐シクロデキストリン（β‐ＣＤ）（シグマケミカル社C4767）、2.5％（ｗ／ｖ）γ‐シクロデキストリン（γ‐ＣＤ）（シグマケミカル社4892）の含有が抗原抗体結合に及ぼす影響を調べた。ここでは、上記の濃度のα‐ＣＤ（ｗ／ｖ）を含む測定緩衝液に溶解してトレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズを調製した。対照は溶解試薬もシクロデキストリンも測定に無添加とした。
【００６９】
結果
表６：種々の金属イオン封鎖剤が抗原抗体結合に及ぼす影響。示したデータはTopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで得られたカウント毎分（ｃｐｍ）である。他のマルチヘッドβカウンターの効率はこれから変動し、異なる結果をもたらしうる。非特異結合（ＮＳＢ）データは特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で得た。
0004012301.tif 000010
【００７０】
考察
以上のデータはｃＡＭＰ標準溶液に溶解試薬が添加され、トレーサー、抗血清及びＳＰＡビーズがそれぞれ金属イオン封鎖剤中で調製される場合には抗原抗体結合（ｃｐｍ）が有意に回復することを明らかに示している。α‐シクロデキストリンとγ‐シクロデキストリンは結合を最も適度にまで回復したが、一方β‐シクロデキストリンはそれより効果が少なかった。
【００７１】
総括的結論
これらの予備実験から、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）の、細胞溶解のための好ましい界面活性剤としての有用性が立証された。
【００７２】
同様に、予備実験ではα‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン及びγ‐シクロデキストリンを含む数種類の金属イオン封鎖剤が評価された。α‐シクロデキストリンが好ましい金属イオン封鎖剤として立証立された。
【００７３】
Ｂ．最適化測定系
実施例１．フォルスコリン刺激チャイニーズハムスター卵巣細胞からのアデノシン‐３'５'‐環状リン酸の一段階抽出測定
【００７４】
試薬、緩衝液及び装置
次の溶液を調製した。
１）測定緩衝液：0.01％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液。
２）溶解試薬：測定緩衝液に溶解したＤＴＡＢ（10％ｗ／ｖ）（非付着細胞に有用）。
３）溶解試薬：測定緩衝液に溶解したＤＴＡＢ：（１％ｗ／ｖ）（本実施例のチャイニーズハムスター卵巣細胞などの付着細胞株に有用）。
４）金属イオン封鎖剤：測定緩衝液に溶解したα‐シクロデキストリン（2.5％ｗ／ｖ）。
５）アデノシン‐３'５'‐環状リン酸（ｃＡＭＰ）標準溶液：１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ（256pmol／ｍｌ）を含む２ｍｌの測定緩衝液の溶液として調製し、測定には512pmolを0.2〜12.8pmol／ウェルの範囲で使用する（下記参照）。
６）放射性トレーサー：2.5％α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製したアデノシン‐３'５'‐環状リン酸２'‐Ｏ‐スクシニル‐３‐［125Ｉ］ヨードチロシンメチルエステル。
７）2.5％α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製したウサギ抗ｃＡＭＰ抗血清。
８）2.5％α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製した、シンチレーション近接蛍光微粒子に結合したロバ抗ウサギＩｇＧ。
【００７５】
さらに必要とされる材料及び装置は次の通りである。
(ｉ)  不透明な側壁を備えた透明マイクロタイタープレート、組織培養処理済み（例えばパッカード社のViewplatesTM又はアマシャム社のCytostar-Tプレート）。
(ii)  マイクロプレートシンチレーションカウンター。
(iii)  プレートシーラー。
(iv)  ポリプロピレン又はポリスチレン製希釈標準溶液調製用ディスポーザブル試験管。
(ｖ)  ピペット及びピペッター
(vi)  実験質用ガラス器具。
(vii)  蒸留水。
(Viii)  ボルテックスミキサー。
(ix)  マグネチックスターラー
(ｘ)  １％（ｗ／ｖ）トリパンブルー水溶液。
(xi)  血球計算盤
(xii)  ＨＡＭ培地
(xiii)  ジメチルスルホキシド
(xiv)  フォルスコリン
(xv)  およそ106個／ｍｌの培養チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【００７６】
方法
10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＨＡＭ培地中でチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養した。ｃＡＭＰの測定を行なうため、96ウェル組織培養プレート（材料参照）中にＨＡＭ培地に懸濁した細胞を100μｌ／ウェル（105個／ウェル）播種した。この細胞を37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。翌日、金属イオン封鎖溶解緩衝液（測定緩衝液に溶解した2.5％α‐シクロデキストリン及び１％ＤＴＡＢ）を調製した。抗血清（１／11,000希釈 ）、トレーサー（10,000〜20,000ｃｐｍ）及びＳＰＡビーズ（20ｍｇ／ｍｌ）を2.5％α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製した。１％ＤＴＡＢを含む測定緩衝液を用いてポリプロピレン製試験管中に希釈標準溶液（４〜256pmol／ｍｌ、0.2〜12.8pmol／マイクロタイターウェル）を調製した。希釈標準溶液各50μｌを細胞培養に使用した同一マイクロタイタープレートの空のウェルに添加した。フォルスコリン（１ｍｇ）（ｃＡＭＰ生成刺激用）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解し、10％ＦＣＳ含有ＨＡＭ培地で希釈を行なって１μＭから10μＭの種々の濃度のフォルスコリンを得た。同様にして測定対照（ブランク）を調製した。これにはＤＭＳＯ（測定）ブランクと培地（試料）のみのブランクから成った。フォルスコリン溶液及びブランク溶液（100μｌ）を培養細胞に添加し、上記のように37℃で20分間インキュベートした。この段階で、トリパンブルー除外試験法を用いて細胞の生存を調べた。刺激した側壁から培地を吸引し（細胞は培養容器表面に付着したまま）、溶解試薬（測定緩衝液に溶解した１％ＤＴＡＢ）の添加によりインキュベーションを停止させた。２回目のトリパンブルー除外試験法により細胞溶解を調べた。
【００７７】
一次抗体、トレーサー、ＳＰＡビーズ（2.5％（ｗ／ｖ）α‐ＣＤを含む緩衝液の溶液として調製）50μｌを96ウェル培養プレート中の標準溶液及び試料に添加した。このプレートを密封し、室温で終夜インキュベートした。インキュベーション後、プレートをTopCountTMシンチレーションカウンターに直接移して放射活性を測定した。また、特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で非特異結合を測定した。標準曲線を参照し、対数／線形解析を用いて環状ＡＭＰレベルを求めた。レベルは補間法により推定した。
【００７８】
この方法は非付着性細胞（例えばＨＬ６０細胞）中のｃＡＭＰの抽出測定用として容易に修正される。この修正法に関しては、10％溶解試薬（測定緩衝液に溶解した10％ＤＴＡＢ）を終濃度が１％（ｗ／ｖ）となるように培養細胞に加える。この方法の残りの部分については上に記載してある。
【００７９】
結果
フォルスコリン刺激ＣＨＯ細胞から一段階で原位置測定を行なうための用量反応曲線を作成した。Viewplates及びCytostar-Tプレートに関して作成した代表的な標準曲線をそれぞれ図１、図２に示す。図３では、１，５，10μＭフォルスコリンが96ウェル‐プレート中で培養した細胞に関して一段階原位置測定法により測定した細胞内ｃＡＭＰレベルに及ぼす影響を示す。ＣＨＯ細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、方法の項に記載したように96ウェルのプレート中で終夜インキュベートした。細胞を種々の濃度のフォルスコリンに20分間暴露し、上記のようにしてｃＡＭＰを測定した。ｃＡＭＰの基底レベルは、添加フォルスコリンが存在しない状態では10pmol／106個であり、フォルスコリン濃度の上昇により増大した。
【００８０】
考察
これらのデータは本特許明細書に記載する発明の有用性を説明するが、本発明により細胞内分子が協奏的な単一容器溶解測定免疫測定系中で測定される。実際、図３に示したデータはフォルスコリン刺激チャイニーズハムスター卵巣細胞中のｃＡＭＰが溶解、測定されていることを立証する。この環状ヌクレオチドの測定レベルは、ｃＡＭＰがより複雑な方法により求められた他の発表データと一致する（Hancockら、1995年参照）。さらに、我々は別に行なった実験の結果を集積したが、それらの実験によりｃＡＭＰレベルが本特許明細書に記載する方法によって測定された後、従来の方法（エタノール抽出法、Horton及びBaxendale, 1995年）により推定された。（データ示さず）。これら二つの方法により得られた結果は細胞内ｃＡＭＰレベルについて極めて類似した数値を提供する。
【００８１】
実施例２．フォルスコリン刺激チャイニーズハムスター卵巣細胞からの「総」細胞ｃＡＭＰの一段階抽出測定
この実験では「総」細胞分析物レベルの測定法を記載する。この方法は細胞培養系に適用でき、細胞内フラクション及び細胞培養上清中の成分を測定する。標的分析物の正確な測定が達成され、この方法には細胞培養培地の吸引もデカンテーションも必要がないという利点がある。従って、この技術は細胞外液中に盛んに分泌される分子の検出及び測定に有用である（実施例４も参照）。
【００８２】
試薬、緩衝液及び装置
次の溶液を調製した。
１）測定緩衝液：0.01％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液。
２）溶解試薬：測定緩衝液に溶解したＤＴＡＢ（10％ｗ／ｖ）。
３）溶解試薬：測定緩衝液に溶解したＤＴＡＢ（１％ｗ／ｖ）。
４）金属イオン封鎖剤：測定緩衝液に溶解したα‐シクロデキストリン（2.5％ｗ／ｖ）。
５）アデノシン‐３'５'‐環状リン酸（ｃＡＭＰ）標準溶液：１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ（256pmol／ｍｌ）を含む２ｍｌの測定緩衝液の溶液として調製した512pmol（測定範囲0.2〜12.8pmol／ウェル）（方法参照）。
６）放射性トレーサー：2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製したアデノシン‐３'５'‐環状リン酸２'‐Ｏ‐スクシニル‐３‐［125Ｉ］ヨードチロシンメチルエステル。
７）2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製したウサギ抗ｃＡＭＰ抗血清。
８）2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製した、シンチレーション近接蛍光微粒子に結合したロバ抗ウサギＩｇＧ。
【００８３】
さらに必要とされる材料及び装置は次の通りである。
(ｉ)  不透明な側壁を備えた透明マイクロタイタープレート、組織培養処理済み（例えばパッカード社のViewplatesTM又はアマシャム社のCytostar-Tプレート）。
(ii)  マイクロプレートシンチレーションカウンター。
(iii)  プレートシーラー。
(iv)  ポリプロピレン又はポリスチレン製希釈標準溶液調製用ディスポーザブル試験管。
(ｖ)  ピペット及びピペッター
(vi)  実験質用ガラス器具。
(vii)  蒸留水。
(viii)  ボルテックスミキサー。
(ix)  マグネチックスターラー
(ｘ)  １％（ｗ／ｖ）トリパンブルー水溶液。
(xi)  血球計算盤
(xii)  ＨＡＭ培地（シグマ社、Ｎ-4888）
(xiii)  ジメチルスルホキシド
(xiv)  フォルスコリン
(xv)  およそ106個／ｍｌの培養チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【００８４】
方法
10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＨＡＭ培地中でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を培養した。ｃＡＭＰの測定を行なうため、不透明な側壁を備えた透明底96ウェル組織培養プレート（組織培養グレ−ド、材料参照）中にＨＡＭ培地（実験５参照）に懸濁した細胞を40μｌ／ウェル（104個／ウェルから106個／ウェルの間）播種する。細胞を37℃、95％空気、５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養する。翌日、金属イオン封鎖溶解緩衝液（測定緩衝液に溶解した2.5％α‐シクロデキストリン、１％及び10％ＤＴＡＢ）を調製した。抗血清（１／11,000希釈 ）、トレーサー（10,000〜20,000ｃｐｍ）及びＳＰＡビーズ（20ｍｇ／ｍｌ）を2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製した。１％ＤＴＡＢを含む測定緩衝液を用いてポリプロピレン製試験管中に希釈標準溶液（４〜256pmol／ｍｌ、0.2〜12.8pmol／マイクロタイターウェル）を調製した。希釈標準溶液各50μｌを細胞培養に使用したマイクロタイタープレートの空のウェルに添加した。フォルスコリン（１ｍｇ）（ｃＡＭＰ生成刺激用）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解し、10％ＦＣＳ含有ＨＡＭ培地で希釈を行なって、10μＭから1,000μＭの種々の濃度のフォルスコリンを得た（フォルスコリン終濃度１μＭから100μＭ）。アゴニスト又は細胞刺激剤（この場合はフォルスコリン）の５μｌアリコートを培養細胞に直接添加した。この細胞を室温でで20分間インキュベートした。培地はインキュベーション後に吸引もデカントも行なわなかった。同様にして測定対照（ブランク）を調製した。これにはＤＭＳＯ（測定）ブランクと培地（試料）のみのブランクから成っていた。この段階で、細胞生死判別（トリパンブルー除外）試験法を用いて細胞の生存を調べた。刺激した細胞に細胞溶解試薬（測定緩衝液に溶解した10％ＤＴＡＢ）５μｌを添加した。終濃度は50μｌであり、各ウェルには１％細胞溶解試薬（終濃度）が含まれていた。細胞溶解試薬を添加した後、続けて激しくピペット操作を行なうことにより細胞を攪拌した。このプレートを室温で５分間インキュベートした。２回目のトリパンブルー除外試験法により細胞溶解を調べた。抽出したｃＡＭＰを直ちにＳＰＡ放射免疫測定法に向けて処理した。（この実施例では、アリコートを測定用の二つ目のプレートに移さなかった。）
【００８５】
非特異的結合ウェルにＤＴＡＢ（100μl、１％（ｗ／ｖ）測定緩衝液中）を加えた。また、ゼロ標準溶液ウェルにＤＴＡＢ（50μl、１％（ｗ／ｖ））測定緩衝液中）を加えた。さらに、適当なウェルに各標準溶液（１％ＤＴＡＢを含む測定緩衝液の溶液として調製）を加えた。一次抗体、トレーサー、ＳＰＡビーズ（2.5％（ｗ／ｖ）α-シクロデキストリンを含む緩衝液の溶液として調製）50μlを標準溶液及び試料に添加した。このプレートを密封し、室温で終夜インキュベートした。インキュベーション後、プレートをTopCountTMシンチレーションカウンターに直接移して放射活性を測定した。また、特異的ウサギ抗血清が存在しない状態で非特異結合を測定した。標準曲線を参照し、対数／線形解析を用いて環状ＡＭＰレベルを求めた。レベルは補間法により推定した。
【００８６】
この方法は非付着性細胞（例えばＨＬ６０細胞）中のｃＡＭＰの抽出測定用として容易に修正される。この修正法にするには10％溶解試薬（測定緩衝液に溶解した10％ＤＴＡＢ）を終濃度が１％（ｗ／ｖ）となるように培養細胞に加える。細胞培養上清を除去するための遠心分離若しくはデカンテーション及び吸引の段階はなかった。この方法の残りの部分については上に記載してある。
【００８７】
結果
１μＭから100μＭのフォルスコリンがＣＨＯ細胞中の「総」細胞ｃＡＭＰレベルに及ぼす影響を図４に示す。この実験では、方法の項に記載したようにＣＨＯ細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、96ウェル‐プレート中で終夜増殖させた。細胞を種々の濃度のフォルスコリンに20分間暴露し、上記のようにして総ｃＡＭＰを測定した。ｃＡＭＰの基底レベルは、添加フォルスコリンが存在しない状態では10pmol／106個未満であった。100μＭのフォルスコリンが存在する状態では、総細胞ｃＡＭＰレベルは170pmol／106個より上まで上昇した。
【００８８】
実施例３．酵素リンク免疫溶媒測定法による細胞内インターロイキン‐６の直接測定
この実験では細胞内インターロイキン‐６（サイトカイン）レベルの直接測定用の簡単な直接法を記載する。ｃＡＭＰに関する上記実施例とは異なり、ここに記載する方法は、従来の組織培養プレート上で細胞を培養、刺激、溶解し、溶解産物のアリコートを測定用の二つ目のプレートに移す二段階法である。
【００８９】
内皮細胞をインターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）で終夜刺激し、ＤＴＡＢで溶解した。ＥＬＩＳＡによりインターロイキン‐６（ＩＬ‐６）の存在を調べるため、この溶解産物を分析した。金属イオン封鎖剤（３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリン）を含む緩衝液に溶解してＥＬＩＳＡの決定的成分（ビオチニル化抗体）を調製した。この方法は、迅速、容易であり、１ウェルあたりほんのわずかの細胞（＜105個）には十分な感度を有する。
【００９０】
試薬、緩衝液及び装置
１）ヒトインターロイキン‐６ＥＬＩＳＡキット、アマシャム社RPN 2754
２）α‐シクロデキストリン、ＵＳＢ社13979
３）ＤＴＡＢ、シグマ社D8638
４）ＩＬ‐１βアマシャム社ARM 17005
５）ＥＣＶ３０４細胞、新生児（日本人、女）由来ヒト内皮細胞。
【００９１】
その他の材料及び装置は次の通りである。
ａ）標準的96ウェル組織培養プレート
ｂ）希釈標準溶液調製用ディスポーザブル試験管
ｃ）ピペット類及びピペッター
ｄ）実験室用ガラス器具
ｅ）蒸留水
ｆ）ボルテックスミキサー
ｇ）マグネチックスターラー
ｈ）１％（ｗ／ｖ）トリパンブルー水溶液
ｉ）血球計算盤
ｊ）Ｍ‐１９９培地、シグマ社M-7653
ｋ）マイクロタイタープレート洗浄器
ｌ）マイクロタイタープレート読み取り装置
【００９２】
方法
10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭ‐１９９培地中でＥＣＶ３０４細胞を培養した。ＩＬ‐６の測定を行なうため、100μｌに懸濁した細胞を標準的96ウェル組織培養プレート中に播種した（105〜106個／ｍｌ）。この細胞を37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。ＩＬ‐６の産生を刺激するため、２日目にＩＬ‐１βの希釈標準溶液（終濃度2〜500ｐｇ／ｍｌ）を調製した。ＩＬ‐１βが存在しない状態で増殖させた培養細胞で培地ブランクを調製した。細胞を再び37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。３日目にＤＴＡＢの１％（ｗ／ｖ）溶液を標準希釈液の溶液として調製した。この試薬を細胞の溶解と希釈標準溶液の調製に使用した。終夜インキュベーション後、細胞培養上清をデカントした（細胞は培養容器表面に付着したまま）。この細胞をリン酸緩衝食塩水で穏やかに３回洗浄した。３回目の洗浄後、細胞損失がないことを確認するため細胞を調べた。溶解試薬（標準希釈液に溶解した１％ＤＴＡＢ）100μｌを細胞に添加した。細胞溶解はトリパンブルー除外法により調べた。
【００９３】
１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢを含む測定緩衝液を用いてポリプロピレン試験管中で希釈標準溶液（10.24〜400ｐｇ／ｍｌのＩＬ‐６）を調製した。３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む緩衝液に溶解してビオチニル化抗体を調製した。ビオチニル化抗体（シクロデキストリンを含む）50μｌを抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加した。希釈標準溶液50μｌ及び細胞溶解産物をピペットで抗ＩＬ‐６被覆プレートの別々のウェルに移した。ＩＬ‐６が存在しない状態で非特異結合を測定した（ゼロＩＬ‐６標準溶液）。ビオチニル化抗体と試料／標準溶液を添加する順序はこの方法にとって重要ではない。しかしながら、この実施例では、標準溶液又は試料添加前にビオチニル化抗体を抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加すると良好な結果が得られた。ビオチニル化抗体と試料／標準溶液を含む抗ＩＬ‐６プレートを室温で２時間インキュベートした。このプレートを完全に洗浄した後、希釈した（ストレプトアビジン希釈緩衝液12ｍｌに対して濃縮液30μｌ）ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン100μｌ／ウェルを添加した。プレートを室温で30分間インキュベートした後、完全に洗浄した。プレートの各ウェルにＴＭＢ基質100μｌを添加した後、室温で30分間インキュベートした。100μｌ／ウェル硫酸を添加することにより反応を停止させた。450ｎｍに設定したマイクロタイタープレート分光光度計で光学密度を求めた。標準曲線を参照し、対数／線形解析を用いてインターロイキン‐６レベルを求めた。レベルは補間法により推定した。
【００９４】
結果
溶解試薬の含有がＩＬ‐６ＥＬＩＳＡ系に及ぼす影響を図５及び図６に示す。また、図５に１％ＤＴＡＢをＩＬ‐６測定系に添加すると抗体結合が抑制されることを示す。３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを添加すると結合が回復した（図６）。さらに、ＩＬ‐１βによるＥＣＶ３０４細胞の刺激及び細胞内ＩＬ‐６の測定の結果を図７に示す。ＩＬ‐６の基底レベルは、ＩＬ‐１βが存在しない状態では30ｐｇ／106個未満であった。500ｐｇ／ｍｌのＩＬ‐１βが存在する状態では、細胞内ＩＬ‐６レベルは400ｐｇ／106個より上まで上昇した。
【００９５】
実施例４．ＩＬ‐１β刺激ＥＣＶ３０４細胞由来の「総」細胞インターロイキン‐６の測定
この実験では「総」細胞インターロイキン‐６レベルの測定方法を記載する。この方法は細胞培養系に適用可能であり、細胞培養液中に分泌された分子（サイトカインなど）の測定に適する。
【００９６】
試薬、緩衝液及び装置
１）ヒトインターロイキン‐６ＥＬＩＳＡキット、アマシャム社RPN 2754
２）α‐シクロデキストリン、ＵＳＢ社13979
３）ＤＴＡＢ、シグマ社D8638
４）ＩＬ‐１βアマシャム社ARM 17005
５）ＥＣＶ３０４細胞、新生児（日本人、女）由来ヒト内皮細胞。
【００９７】
その他の材料及び装置は次の通りである。
ａ）標準的96ウェル組織培養プレート
ｂ）希釈標準溶液調製用ディスポーザブル試験管
ｃ）ピペット類及びピペッター
ｄ）実験室用ガラス器具
ｅ）蒸留水
ｆ）ボルテックスミキサー
ｇ）マグネチックスターラー
ｈ）１％（ｗ／ｖ）トリパンブルー水溶液
ｉ）血球計算盤
ｊ）Ｍ‐１９９培地、シグマ社M-7653
ｋ）マイクロタイタープレート洗浄器
ｌ）マイクロタイタープレート読み取り装置
【００９８】
方法
10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭ‐１９９培地中でＥＣＶ３０４細胞を培養した。ＩＬ‐６の測定を行なうため、100μｌに懸濁した細胞を標準的96ウェル組織培養プレート中に播種した（105〜106個／ウェル）。この細胞を37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。ＩＬ‐６の産生を刺激するため、２日目にＩＬ‐１βの希釈標準溶液（終濃度2〜500ｐｇ／ｍｌ）を調製した。ＩＬ‐１βが存在しない状態で増殖させた培養細胞で培地ブランクを調製した。細胞を再び37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。３日目に溶解緩衝液（３％α‐シクロデキストリン、１％及び10％ＤＴＡＢ）に溶解して金属イオン封鎖溶解緩衝液を調製した。溶解試薬は標準希釈液の溶液として調製した。10％ＤＴＡＢ溶液は細胞溶解に、１％ＤＴＡＢ溶液は希釈標準溶液に調製に使用した。
【００９９】
細胞溶解試薬（10％ＤＴＡＢ）10μｌを刺激した細胞に添加した。細胞を攪拌し、プレートを室温で５分間インキュベートした。ウェル中の終濃度は110μｌであった。トリパンブルー除外法により細胞溶解を調べた。ＥＬＩＳＡで直ちに「総」細胞ＩＬ‐６を測定した。
【０１００】
１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢを含む測定緩衝液を用いてポリプロピレン試験管中で希釈標準溶液（10.24〜400ｐｇ／ｍｌのＩＬ‐６）を調製した。３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む緩衝液に溶解してビオチニル化抗体を調製した。ビオチニル化抗体（シクロデキストリンを含む）50μｌを抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加した。希釈標準溶液50μｌ及び細胞溶解産物をピペットで抗ＩＬ‐６被覆プレートの別々のウェルに移した。ＩＬ‐６が存在しない状態で非特異結合を測定した（ゼロＩＬ‐６標準溶液）。ビオチニル化抗体と試料／標準溶液を添加する順序はこの方法にとって重要ではない。しかしながら、この実施例では、標準溶液又は試料添加前にビオチニル化抗体を抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加すると良好な結果が得られた。ビオチニル化抗体と試料／標準溶液を含む抗ＩＬ‐６プレートを室温で２時間インキュベートした。このプレートを完全に洗浄した後、希釈した（ストレプトアビジン希釈緩衝液12ｍｌに対して濃縮液30μｌ）ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン100μｌ／ウェルを添加した。プレートを室温で30分間インキュベートした後、完全に洗浄した。プレートの各ウェルにＴＭＢ基質100μｌを添加した後、室温で30分間インキュベートした。100μｌ／ウェル硫酸を添加することにより反応を停止させた。450ｎｍに設定したマイクロタイタープレート分光光度計で光学密度を求めた。標準曲線を参照し、対数／線形解析を用いてインターロイキン‐６レベルを求めた。レベルは補間法により推定した。
【０１０１】
結果
ＩＬ‐１βによるＥＣＶ３０４細胞の刺激が細胞内ＩＬ‐６、総細胞ＩＬ‐６及び細胞培養上清中のＩＬ‐６の測定に及ぼす影響を図８に示す。細胞培養上清と比較すると、有意に高いレベルのＩＬ‐６が「総」溶解産物フラクション中に検出された。
【０１０２】
実験５．Ｄ‐ミオ‐イノシトール１，４，５‐トリスホスフェート（ＩＰ3）の放射線受容体結合測定法
１．  既成のイノシトール１，４，５‐トリスホスフェート（ＩＰ3）測定用細胞の調製法には、測定前にアルカリで注意深く中和する必要のある酸抽出法が含まれている。ここに記載した技術は、試料又は標準溶液中における、ウシ副腎皮質から調製した結合タンパク質に対する［3Ｈ］イノシトール１，４，５‐トリスホスフェート（トレーサー）の非標識ＩＰ3との競合に基づいている。前記の実験同様、溶解試薬としてＤＴＡＢを、金属イオン封鎖剤としてα‐シクロデキストリンを使用した。この方法はＩＰ3の細胞内測定に適用することが可能であり、従来のＩＰ3の測定前抽出技術に対して多くの利点を有することは明らかである。
【０１０３】
試薬、緩衝液及び装置
１）Ｄ‐ミオ‐イノシトール１，４，５‐トリスホスフェート（ＩＰ3）放射線受容体キット：アマシャム社TRK1000
２）α‐シクロデキストリン、ＵＳＢ社13979
３）３）ＤＴＡＢ、シグマ社D8638
４）10％（ｗ／ｖ）酢酸
５）0.15Ｍ水酸化ナトリウム
【０１０４】
その他の材料及び装置は次の通りである。
ａ）ピペット類及びピペッター
ｂ）ポリプロピレン製試験管
ｃ）蒸留水
ｄ）ボルテックスミキサー
ｅ）冷却遠心分離機
ｆ）βシンチレーションカウンター
ｇ）蛍光剤
ｈ）計数バイアル
ｉ）氷浴
ｊ）デカンテーションラック
【０１０５】
方法
ウシ副腎を取り出し、結合タンパク質調製まで20℃で保存した。副腎から皮質を切り取り、ＮａＨＣＯ3（20ｍＭ）中でジチオスレイトール（１ｍｌ）と共にホモジナイズし、ホモジネートを5,000ｇで15分間遠心分離した。上清を35,000ｇで20分間遠心分離し、得られたペレットを均質化緩衝液に再懸濁し、再び35,000ｇで20分間遠心分離した。最終のペレットをタンパク質濃度が20〜40ｍｇ／ｍｌとなるように均質化緩衝液に再懸濁した。
【０１０６】
この測定を行なうため、４ｍＭ ＥＤＴＡ及び４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む0.1Ｍトリス緩衝液（ｐＨ9.0）（100μｌ）中でウシ副腎皮質ミクロソーム調製物のアリコート（100μｌ）をインキュベートした。最終体積0.4ｍｌの［3Ｈ］イノシトール１，４，５‐トリスホスフェート（100μｌ、6,000ｃｐｍ）試料又は標準溶液（100μｌ、0.19〜25ｐＭイノシトール１，４，５‐トリスホスフェート／測定官）中で15分間インキュベーションを行なった。１ｎＭイノシトール１，４，５‐トリスホスフェート／測定官が存在する状態で非特異結合を求めた。遠心分離（12,000ｇ、４℃、10分間）によりインキュベーションを停止し、穏やかにデカントすることにより上清を取り除いた。0.15Ｍ水酸化ナトリウムに懸濁後10％酢酸で中和した後、液体シンチレーション計数により特異結合の放射活性を分析した。
【０１０７】
実験を次のように設定した。
１）希釈標準溶液（0.19〜25ｐＭＩＰ3／管）は水溶液（対照）又は溶解試薬（0.5％、ｗ／ｖ）を含む水溶液とした。
２）上記のようにして調製した結合タンパク質（対照）又は２％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む均質化緩衝液の溶液とした結合タンパク質。
３）水溶液（対照）又は２％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む均質化緩衝液の溶液とした放射活性トレーサー。
【０１０８】
結果
溶解試薬をＩＰ3標準溶液に、金属イオン封鎖剤をトレーサー及び結合タンパク質に添加した効果を図９に示す。溶解試薬（0.5％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ）を含む標準曲線では、受容体に対する調製物の結合が完全に抑制された。α‐シクロデキストリン（最終２％（ｗ／ｖ））をトレーサーと副腎皮質調製物の両方に添加すると結合が回復した。
【０１０９】
実施例５．マウス３Ｔ３細胞中の細胞内プロスタグランジンＥ2の直接測定
この実験では、刺激したマウス・スイス３Ｔ３アルビノ胚線維芽細胞中の細胞内プロスタグランジンＥ2の細胞内レベル直接測定用の簡便法を記載する。プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）はアラキドン酸代謝とシクロオキシゲナーゼ経路の産物である。ここに記載した方法には、従来の組織培養プレート上で細胞を培養、刺激、溶解し、競合的酵素免疫測定（ＥＩＡ）技術による測定のために溶解産物のアリコートを二つ目のプレートに移す二段階法が含まれる。マウス３Ｔ３細胞をカルシウムイオノホアA23187で５分間刺激し、洗浄し、ＤＴＡＢで溶解した。ＥＬＩＳＡによりＰＧＥ2の存在を調べるため、この溶解産物を分析した。測定にとり重要な成分（ＰＧＥ2ペルオキシダーゼ結合体及びＰＧＥ2抗血清）は金属イオン封鎖剤（2.5％α‐シクロデキストリン）を含む緩衝液の溶液として調製した。この方法は極めて迅速、容易であり、１ウェルあたりほんのわずかの細胞（＜105個）には十分な感度を有する。
【０１１０】
試薬、緩衝液及び装置
１）プロスタグランジンＥ2酵素免疫測定法（ＥＩＡ）キット：アマシャム社RPN 222
２）α‐シクロデキストリン、ＵＳＢ社13979
３）ＤＴＡＢ、シグマ社D8638
４．カルシウムイオノホア A23187：シグマ社C-7522
５）マウス３Ｔ３細胞：ＥＣＡＣＣ
６．ＤＭＥＭ培地：シグマ社D-6546
【０１１１】
その他の材料及び装置は次の通りである。
ａ）標準的９６ウェル組織培養プレート
ｂ）希釈標準溶液調製用ディスポーザブル試験管
ｃ）ピペット類及びピペッター
ｄ）実験室用ガラス器具
ｅ）蒸留水
ｆ）ボルテックスミキサー
ｇ）マグネチックスターラー
ｈ）１％（ｗ／ｖ）トリパンブルー水溶液
ｉ）血球計算盤
ｊ）マイクロタイタープレート洗浄器
ｋ）マイクロタイタープレート読み取り装置
【０１１２】
方法
10％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地中でマウス３Ｔ３細胞を培養した。ＰＧＥ2の測定を行なうため、100μｌに懸濁した細胞を標準的96ウェル組織培養プレート中に播種した（105〜106個／ｍｌ）。細胞を37℃、95％空気／５％ＣＯ2雰囲気中で終夜培養した。この段階で、トリパンブルー除外試験法を用いて細胞の生存を調べた。
【０１１３】
ＰＧＥ2の産生を刺激するため、２日目にA23187の希釈標準溶液（終濃度1〜100μＭ）をＤＭＥＭ培地の溶液として調製した。二種類の対照を調製した（ＤＭＳＯと、培地のみの対照）。ここでA23187が存在しない状態で細胞を培養した。試験細胞培養物をカルシウムイオノホアA23187 により室温で５分間刺激した。培養上清をデカントし、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、測定緩衝液の溶液として調製した0.5％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ100μｌ／ウェルで溶解した。２回目のトリパンブルー除外試験により細胞溶解を調べた。
【０１１４】
0.5％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢを含む測定緩衝液を用いてポリプロピレン試験管中でＰＧＥ2希釈標準溶液（2.5〜320ｐｇ／ウェル）を調製した。2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液でＰＧＥ2抗体‐ＰＧＥ2結合体を調製した。希釈標準溶液50μｌ及び細胞溶解産物をピペットでヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートの別々のウェルに移した。ＰＧＥ2が存在しない状態で非特異結合を測定した。ゼロ標準ＰＧＥ2は0.5％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢのみから成るようにした。抗血清50μｌ及び結合体（2.5％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンを含む測定緩衝液の溶液として調製）をピペットで適当な試験ウェルに移した（標準溶液及び試料細胞溶解産物を含む）。このプレートを一定に振盪しながら室温で１時間インキュベートした後、完全に洗浄した。プレートの各ウェルにＴＭＢ基質150μｌを添加し、室温で30分間インキュベートした。100μｌ／ウェル硫酸を添加することにより反応を停止させた。450ｎｍに設定したマイクロタイタープレート分光光度計で光学密度を求めた。標準曲線を参照し、対数／線形解析を用いて細胞内ＰＧＥ2レベルを求めた。レベルは補間法により推定した。
【０１１５】
結果
カルシウムイオノホアによる３Ｔ３細胞の刺激と細胞内ＰＧＥ2の直接測定の結果を図10に示す。ＰＧＥ2の基底レベルは、A23187が存在しない状態ではおよそ50ｐｇ／106個であった。100μＭのA23187が存在する状態では、細胞内ＰＧＥ2レベルは400ｐｇ／106個より上まで上昇した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、培養チャイニーズハムスター卵巣細胞からアデノシン‐３’，５’‐環状リン酸を推定するための協奏的な単一容器抽出測定免疫測定法の代表的な標準曲線に関する。
測定曲線は方法の項に記載したようにViewplates（パッカード社）上で作成した。
パーセントＢ／Ｂ0関数は次の式から計算した。
［（標準カウント毎分）−（非特異結合カウント毎分）］÷［（ゼロ標準カウント毎分）−（非特異結合カウント毎分）］×100％。
典型的な場合では、ゼロ線量に対するカウント毎分の値は2,200である。非特異抗体が存在しない状態（非特異結合ウェル）で得られたカウント毎分の値はおよそ200であった。通常、トレーサーが存在しない状態での値は25ｃｐｍ未満であった。
【図２】図２は、培養チャイニーズハムスター卵巣細胞からアデノシン‐３’，５’‐環状リン酸を推定するための協奏的な単一容器抽出測定免疫測定法の代表的な標準曲線に関する。
測定曲線は方法の項に記載したようにCytostar-T上で作成した。
パーセントＢ／Ｂ0関数は次の式から計算した。
［（標準カウント毎分）−（非特異結合カウント毎分）］÷［（ゼロ標準カウント毎分）−（非特異結合カウント毎分）］×100％。
典型的な場合では、ゼロ線量に対するカウント毎分の値は2,200である。非特異抗体が存在しない状態（非特異結合ウェル）で得られたカウント毎分の値はおよそ200であった。通常、トレーサーが存在しない状態での値は25ｃｐｍ未満であった。
【図３】図３は、単一容器抽出ＳＰＡ放射免疫測定法により求められる培養チャイニーズハムスター卵巣細胞から生成したフォルスコリン刺激ｃＡＭＰに関する。
方法の項に記載したように、ＣＨＯ細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、透明底のCytostar-T又はViewplates 中で集密になるまで終夜増殖させた。細胞を種々の濃度のフォルスコリンに暴露し、ｃＡＭＰを抽出しレベルをＳＰＡ放射免疫測定法により測定した。ｃＡＭＰの基底レベルは10pmol／106個未満であり、フォルスコリンによる刺激に際して有意に増大していた。
【図４】図４は、培養チャイニーズハムスター卵巣細胞からの培養「総」細胞ｃＡＭＰの測定に関する。
方法の項に記載したようにチャイニーズハムスター卵巣細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、Viewplates 中で集密になるまで終夜増殖させた。細胞を種々の濃度のフォルスコリン（１μＭ〜100μＭ）に室温で20分間暴露した。溶解試薬（10％ＤＴＡＢ添加、終濃度１％）の添加により細胞を原位置で溶解した。培養上清は細胞溶解の段階以前には除去しなかった。ＳＰＡ放射免疫測定法によりｃＡＭＰレベルを測定した。ｃＡＭＰの基底レベルは10pmol／106個未満であり、細胞をフォルスコリンで刺激すると総細胞ｃＡＭＰレベルは有意に上昇した。
【図５】図５は、溶解試薬によるＩＬ‐６ＥＬＩＳＡにおける結合抑制に関する。
溶解試薬（１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ）が存在する状態（四角）か存在しない状態（黒丸）のいずれかでインターロイキン‐６標準溶液（10.24〜400ｐｇ／ｍｌ）を標準希釈液の溶液として調製した。ビオチニル化抗体（無シクロデキストリン）のアリコート（50μｌ）を抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加した後、標準溶液（50μｌ）を添加した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、方法の項に記載したように光学密度を測定した。
【図６】図６は、金属イオン封鎖剤によるＩＬ‐６ＥＬＩＳＡにおける結合の回復に関する。
溶解試薬（１％（ｗ／ｖ）ＤＴＡＢ）が存在する状態（四角）か存在しない状態（黒丸）のいずれかでインターロイキン‐６標準溶液（10.24〜400ｐｇ／ｍｌ）を標準希釈液の溶液として調製した。シクロデキストリン（３％（ｗ／ｖ））が存在する状態（四角）か存在しない状態（黒丸）のいずれかで調製したビオチニル化抗体のアリコート（50μｌ）を抗ＩＬ‐６被覆プレートに添加した後、標準溶液（50μｌ）を添加した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、方法の項に記載したように光学密度を測定した。
【図７】図７は、ＩＬ‐１β刺激ＥＣＶ３０４細胞からのＩＬ‐６の細胞内測定に関する。
方法の項に記載したようにＥＣＶ３０４細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、標準的な96ウェル組織培養プレート中で集密になるまで終夜増殖させた。細胞を種々の濃度のＩＬ‐１β（２〜500ｐｇ／ｍｌ）に終夜暴露し、上清をデカントした。細胞を完全に洗浄し、溶解試薬（１％ＤＴＡＢ）100μｌを添加した。細胞溶解産物のアリコート（50μｌ）を測定用の二つ目の抗ＩＬ‐６抗体被覆96ウェル‐プレートに移した。同一試料につきＩＬ‐６のレベルをＥＬＩＡＳで測定した（ビオチニル化抗体は３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンが存在する状態で調製した）。
【図８】図８は、ＥＣＶ３０４細胞からのインターロイキン‐６の測定に関する。
方法の項に記載したようにＥＣＶ３０４細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、標準的な96ウェル組織培養プレート中で集密になるまで終夜増殖させた。細胞をＩＬ‐１β（に終夜暴露し、細胞内フラクション（実験７参照）、細胞培養上清（従来のＥＬＩＳＡ技術により）、及び「総」細胞フラクション中のＩＬ‐６を測定した。総細胞測定のため、溶解試薬（10％ＤＴＡＢ添加、終濃度１％）の添加により細胞を原位置で溶解した。細胞培養上清は細胞溶解の段階以前には除去しなかった。「総」細胞溶解産物のアリコート（50μｌ）を測定用の二つ目の抗ＩＬ‐６抗体被覆96ウェル‐プレートに移した。同一試料につきＩＬ‐６のレベルをＥＬＩＳＡで測定した（ビオチニル化抗体は３％（ｗ／ｖ）α‐シクロデキストリンが存在する状態で調製した）。
【図９】図９は、ＩＰ3放射線受容体測定法のための標準曲線に関する。
低濃度から高濃度までのイノシトール１，４，５‐トリスホスフェートをウシ副腎皮質結合タンパク質との結合に関して４℃で15分間［3Ｈ］イノシトール１，４，５‐トリスホスフェートと競合させた。溶解試薬と金属イオン封鎖剤が両方とも存在しない状態（対照、黒丸）、溶解試薬のみ（四角）、金属イオン封鎖剤のみ（三角）、溶解試薬と金属イオン封鎖剤の両方とも（星印）存在する状態で曲線を作成した。溶解試薬は受容体調製物との特異結合を完全に抑制した。トレーサー及び結合タンパク質を金属イオン封鎖剤で調製すると結合は回復した。
【図１０】図１０は、３Ｔ３細胞からの細胞内ＰＧＥ2の測定に関する。
３Ｔ３細胞を100,000個／ウェルの密度で播種し、方法の項に記載したように96ウェルのプレート中で終夜インキュベートした。細胞を種々の濃度のカルシウムイオノホアA23187 （１〜100μＭ）に５分間暴露し、上清をデカントした。細胞を完全に洗浄し、溶解試薬（0.5％ＤＴＡＢ）100μｌを添加した。細胞溶解産物のアリコート（50μｌ）を測定用の二つ目のヤギ抗マウスＩｇＧ被覆96ウェル‐プレートに移した。この細胞溶解産物をＥＩＡによりＰＧＥ2の存在について分析した。測定にとり重要な成分（ＰＧＥ2ペルオキシダーゼ結合体及びＰＧＥ2抗血清）は金属イオン封鎖剤（2.5％α‐シクロデキストリン）を含む緩衝液の溶液として調製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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