(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３により同定されるＤＮＡ。
【請求項２】
乳酸桿菌（Lactobacilli）中のプロファージの存在を測定するための請求項１に記載のＤＮＡまたはその一部の使用。
【請求項３】
乳酸桿菌（Lactobacilli）殺滅の原因である活性ＤＮＡ配列を消滅させるための請求項１に記載のＤＮＡの使用。
【請求項４】
乳酸桿菌（Lactobacilli）中のいずれかのプロファージの存在または欠失を監視するための請求項１に記載のＤＮＡまたはその一部の使用。
【請求項５】
乳酸桿菌（Lactobacilli）中のプロファージ遺伝子の発現を監視するための請求項１に記載のＤＮＡまたはその一部の使用。
【請求項６】
乳酸桿菌（Lactobacilli）の最適発酵および成長条件を測定するための請求項１に記載のＤＮＡまたはその一部の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ラクトバシラス・ジョンソニイ(Lactobacillus Johnsonii)のプロファージＤＮＡ配列、特にラクトバシラス・ジョンソニイ 中のプロファージライシンおよび／またはホリン遺伝子に関し、および乳酸棹菌培養の不安定性を測定および／または消滅におけるそれらの使用に関する。
乳酸棹菌(Lactobacilli)は、ヨーグルト、乳飲料品およびホワイトチーズなどの乳製品の製造工場で使用される。このような菌種が工業的規模で用途に導入されて以来、実質的なファージ問題は報告されていない。しかしながら、用途が増加するに従い、細菌汚染が原因ではないことがあるより多くの発酵の失敗が報告されるようになった。
【０００２】
報告された問題点は初期の小発酵槽培養では見出されないが、大規模発酵中には、さらなる発酵中に、乳酸棹菌の数が初期細胞数の８０〜９０％にまで絶えず低下するレベルに達する。この生存細胞数の低下は、低ファージ力価では測定可能な問題を起こさないが、高ファージ力価では劇的な、９０％以上の損失をもたらす溶菌性ファージ感染によっては説明することはできない。
これらの問題は初期には、単に大規模発酵槽において優勢となる栄養条件、例えば大容量における成長因子の欠落などによるか、または技術的環境、例えば細胞の機械的処理に結び付くもの、によると仮定された。また、細胞の遺伝子発現は細菌自殺システムを誘発させることができる大量培養の条件下に変化するものと見做される(Lepeuple 等によるAppl.Environ.Microbiol.,64(1998),4142-4148)、遺伝的傾向も予想される。
【０００３】
従って、本発明の課題は、工場発酵における不安定性の原因である生物学的因子の測定および／または消滅のための手段を見出すことにある。
上記問題が、配列番号：１、２および３により同定されるラクトバシラス・ジョンソニイLa1 CNCM 1225に含まれるプロファージのヌクレオチド配列を提供することによって解決された。
これらの配列またはその一部は、乳酸棹菌中のプロファージの存在の測定に使用するために適し得る。
もう一つの好適態様による場合、上記配列またはその一部は、乳酸棹菌培養の安定性が改良されるように、乳酸棹菌ゲノムから活性プロファージを消滅させるために使用することができる。
図１、２および３は、ファージ配列およびそれらの各ポリペプチドに関与するオープンリーディングフレームの予測を示す。
【０００４】
プロファージは、中でも、誘発後に細胞からファージを遊離させるための溶菌酵素をコードする細菌ゲノム中に組み込まれたテンペレートファージのゲノムである。自己消化酵素は、このような溶菌酵素のグループの一つであり、細菌細胞壁上で酵素作用を発揮するポリペプチドである。ゲノムからの或る種のプロファージの遊離は、変異原、例えばＤＮＡ損傷剤（例えば、ミトマイシン(mitomycin) Ｃ）または紫外線光などによって誘発されることがあり、また細胞が別のストレス状況を体験すると、また活性化される。細菌ゲノムに存在するプロファージＤＮＡは不完全であることがあり、生きているファージ粒子を産生することができないが、これらは依然として溶菌酵素をコードし得る可能性がある。
本発明へと導いた実験中に、テンペレートファージが乳酸棹菌培養の不安定性の原因になりうるという可能性の排除のために、プロファージの存在に関してL.ジョンソニイのゲノムを調べることに決めた。L.ジョンソニイファージの構造に関する遺伝子情報は知られていなかったことから、このスクリーニングは自明ではない。
【０００５】
ゲノムプロジェクトから入手することができるLa1 ゲノムデータセットを、公知のラクトバシラス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスおよびバシラスのファージのバクテリオファージ配列により、BLAST アルゴリズムを用いてスクリーニングした。最初のスクリーニングプローブとして、下記ファージ配列を使用した：
・バクテリオファージＬＬ−Ｈ、受入番号：M96254
(Vasala 等によるAppl.Environ.Microbiol.,61(1995),4004-4011)
・バクテリオファージＳＰＰ１完全ヌクレオチド配列、X97918
(Becker 等によるJ.Mol.Biol.,268(1997),822-839)
・B.サチリス(subtilis)ＤＮＡ（28kb PBSX/皮膚要素領域) 、Z70177
(Krogh等によるMicrobiology,142(1996),2031-2040)
・ラクトバシラスバクテリオファージ phigle完全ゲノムＤＮＡ、X98106
(Kodaira等によるGene,187(1997),45-53) 。
【０００６】
La1 ゲノムデータベースを、開示されている一組のファージ配列を用いて調査すると、３種の相違するコンティグ(contigs) がファージ関連配列を示した（La1 ＤＮＡデータセットは、大きさが約500bp から約50kbの範囲にある「コンティグ」と称されるセグメントに組織化されている）。これらコンティグをデータベースから取り出し、次いでさらに分析した。これらの種々の長さの３個のコンティグの中に、相違する量のバクテリオファージ関連配列が見出された。
L965と称されるコンティグ（全長約35kb）（配列番号：１）において、連続ファージ配列の25kbセグメントを同定した。これは、S.テルモフィラスファージ Sfi11に最も密接に関連するテンペレートシホビリダエ(Siphoviridae)を含むパク(pac)-部位の形態形成及び溶菌モジュールの完全パッケージをコードする。
【０００７】
コンティグ L771 （約16kb) （配列番号：２）は、B.サチリスプロファージPBSXに最も密接に関連する8kb のファージ関連配列を含有する。コンティグ L771 ではまた、溶菌モジュールと見做されるものを同定することができた。
コンティグ L928 （11kb) （配列番号：３）は、複製領域からパッケージ領域までにわたる連続ファージ配列をコードする。このコンティグを下記段落で詳細に検討する。
【０００８】
プロファージコンティグ L965
コンティグ L965 は、35.6kbの長さを有し、32のオープンリーディングフレームを含有する。データベース相同性調査は、15の高度に有意な一致(significant matches) および３つの限界有意(borderline significance)の一致を示した。これらの調査の結果を表１にまとめて示す。
【０００９】
表１
L965オープンリーディングフレームおよびデータベース類似性。灰色バーは、このファージ関連配列の末端を示す。ORF は予想されるタンパク質中のアミノ酸の数により命名され、BLAST P 値およびスコアが示されており、また同一性は、aaレベルに基づく。
0003899377.tif 000002
【００１０】
0003899377.tif 000003
【００１１】
0003899377.tif 000004
イタリック体で示されているBLAST スコアおよび同一性は、PAM 250 「置換マトリックス」(substitution matrix) により誘導され、これはいずれか可能な残基対の配列用スコアを指定する。BLAST 中の欠落(default)置換マトリックスは通常、BLOSUM 62 である。
【００１２】
バクテリオファージからの公知タンパク質を用いて、16の一致が見出された。これらの一致は、当該コンティグの左80% に集合していた。類似性は、ストレプトコッカス、バシラスおよびラクトバシラスからのファージに対し見出された。５個の予測される隣接ORF （オープンリーディングフレーム）は、S.テルモフィラスファージfSfi11および01205 との類似性を示した。２個のさらなる非隣接遺伝子はそれぞれ、S.テルモフィラスファージfSfi11およびfSfi21との類似性を示した（図１）。さらに、４個の隣接遺伝子はそれぞれ、L.デルブリュッキイ亜種ラクチスバクテリオファージ fLL-Hおよびラクトバシラス gasseri fadh  からの遺伝子と類似性を示した。１個の遺伝子は、潜在バシラス・サチリスプロファージ PBSX に対して有意な類似性を示す。当該コンティグの右20% に位置する３個の遺伝子は、細菌タンパク質に有意な類似性を示した。
【００１３】
ジョンソニイ La-1からの６個の連続遺伝子は、S.テルモフィラス fSfi11からの相当する遺伝子に類似するトポロジー配列(arrangement)を示すばかりでなく（図１）、また（１個の予想タンパク質を除いて）、アミノ酸（aa）レベルで高度に有意な配列類似性を示した。この発見は、S.テルモフィラスファージからの他のゲノムセグメント（尾部モジュール、溶菌原モジュール）の比較分析から従来指摘されたように、進化上関連した細菌宿主に感染するファージ間の密接な進化上の関係を示している。
【００１４】
引き続く１０個の遺伝子にわたり、非常に類似したトポロジー配列がまた、両方のファージ間で見出された：非常に大型の遺伝子に続く８個の比較的小さい遺伝子の非常に特徴的なパターンが、L.ジョンソニイ La-1ゲノム配列およびSfi11 ファージ配列の両方に、ORF 長さにおける顕著な類似性を伴い見出された（図１）。しかしながら、両方の遺伝子グループ間の配列類似性は見出されなかった。以前、低ＧＣグラム−陽性細菌からのファージおよびファージラムダにおける類似のゲノム体制が見出されている（Chandry 等によるMol.Microbiol.,26,(1997),49-64）。この平行性は、ファージラムダの詳細な知識に基づく遺伝子機能の仮説的予測を可能にした。これらの予測のうちの数種は、S.テルモフィラスファージゲノムの分析において確認されている。かなり多くの細菌遺伝子からのシホビリダエ（尾部ファージ）間の遠い進化上の関係の仮説に基づく、この新しいファージ生物情報の概念(bioinformatic concept) に従い、下記の新しく開示されたL.ジョンソニイLa-1 ORF にかかわる機能を予測することができた（表１）。４種の場合、この機能の仮説的関与は、感受性PAM 250 スコアリングマトリックス(scoring matrix)を用いた場合、生物情報上の関係により支持された（下記参照）。ラムダモデルに従い、ORF 159Lは、L.ジョンソニイ La-1 からのプロファージ L965 の主要尾部タンパク質をコードするものと予測される。
【００１５】
表２
ファージラムダ遺伝子地図との比較によるLa-1 ORFにかかわる遺伝子機能の予測
0003899377.tif 000005
【００１６】
第一列は、La-1プロファージ遺伝子の長さをaaで示している。この遺伝子は、遺伝子地図に沿うように記されている。
第二列は、２種のファージゲノムを配列させた場合の対応するラムダ遺伝子を示している。最適配列では、Ｗ遺伝子がラムドイド(lambdoid)ファージ P21中に見出されるトポロジー順序で引用される。
第三列は、対応するラムダ遺伝子のaa長さを示している。
第四列は、対応するラムダタンパク質の生物学的機能を示している。
第五列は、データベース調査からの生物情報関連性が仮説的遺伝子関与を確証したか否かを示している。
【００１７】
一緒になって、18 ORFs （ORF 285 - ORF 482 ）を含むコンティグL965の一番左の17kbは、種々の細菌宿主からの多くのシホビリダエのゲノム組織に対して明白なトポロジー類似性を示した。このゲノムセグメント全体にわたる配列類似性は、主としてS.テルモフィラスファージからの予測されたタンパク質によるものであった。S.テルモフィラスファージのコス(cos) −部位およびパク(pac) −部位の両方からのタンパク質との結合が興味深い面であった。L965プロファージの頭部遺伝子は、fSfi11またはfO1205などのS.テルモフィラスファージのパク−部位に対して類似性を示すが、尾部遺伝子(ORF 482) はコス−部位ファージとの配列類似性を示した（表１）。
溶菌カセットに到達する前に、S.テルモフィラスファージにおいて、大型の少割合の尾部タンパク質遺伝子の次に、4 から 6個の遺伝子（パク−部位ファージ) が続く。L.ジョンソニイ La-1プロファージにおいて、L965の6 個の遺伝子が、少割合の尾部タンパク質の相同体と溶菌カセットとの間に見出された。
【００１８】
ORF 115gp は、L.デルブリュッキイファージ LL-H からホリンまで、27%のaa 同一性を示した。両方のタンパク質が、ほぼ同一の予測膜貫通プロファイルを示した。
ORF 376gp は、その全長にわたりラクトバシラス・gasseri ファージadhからのライシン(lysin)と59%のaa同一性を示し（P=10-101）、またＮ−末端220aa 全体にわたりL.デルブリュッキイファージLL-Hと45%aa の同一性を示した（P=10-58 ）。LL-HのライシンがL965ライシンに比較して約80aa短いことに留意すべきである。多くのその他のファージライシン（Lb.デルブリュッキイファージ mv4、mv1;S.ニュウモニエファージ CP-1;CP-7;CP-9;L.ラクチスファージ Tuc2009、LC-3;TP21; P値は全部が <10-8）との有意の類似性およびClostridium acetobutylicum（ORF 324;P=10-5) からの自己分解性リゾチームが検出された。
【００１９】
認められるように、プロファージL965のORF 977 〜ORF領域 376 は、溶菌モジュールおよびL.デルブリュッキイファージLL-H中のその先行遺伝子として同様に組織化されていた（図１）。これらのORF の類似するトポロジー的組織化(topological organisation)に加えて、３個の非隣接遺伝子により、対応するLL-Hタンパク質に類似する配列を有するタンパク質を予測させた。
L965プロファージは、ホリンおよびラクトバシラスファージからのタンパク質と密接に類似しているライシンタンパク質をコードする。ファージライシンは通常、分泌シグナルに欠けている。このことはまた、２種のLa-1プロファージについて予測されるライシンの場合にもあてはまる。従って、ファージライシンは、それらの酵素作用の標的；グラム陽性細菌の細胞壁に到達することはできない。ファージライシンの輸出は、ホリンによって媒介される（Krogh 等によるJ.Bacteriol.,180(1998),2110-2117）。ホリンは、細胞内タンパク質の輸出を可能にする孔形成性タンパク質である。ホリンは相違する形態で存在する。
【００２０】
クラス Iホリンは、同定することができ、細胞質膜を３回わたっている。ホリンの発現は、ライシン発現の不存在下でも、細胞に対して致死的である。
ORF 376 の後には、約800bp の比較的長い非コード性領域が続き、次いでclp プロテアーゼのClpAタンパク質(P=10-19) およびClpCタンパク質(P=10-44) 、２個の無属性遺伝子(unattributed genes)およびＤＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子(P=10-125)をコードする細菌宿主起源の２個の遺伝子が続く。
【００２１】
プロファージコンティグ L771
コンティグ L771 は、15.5kbの配列情報からなる。試験的遺伝子地図（図２）が確立され、またファージ関連配列はコンティグ L771 の左部分（0-7kb ）に見出されたが、決定的な細菌遺伝子は7kb から先に同定された（ORF 131gp:PemK,P=10-9;ORF 206gp:ペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ、P=10-51 ）。第一部分は、B.サチリスプロファージPBSXの後期遺伝子領域に対してトポロジー的に非常に類似した組織を示した。この領域は、溶解(lysis)カセットを伴う多くの無属性遺伝子（xkdTからxkdX）を包含する。L771プロファージ配列からの数個の遺伝子により、対応するPBSXプロファージタンパク質と配列類似性を示すタンパク質も予測されることから、類似性はこれらの遺伝子のトポロジー的配列に制限されなかった。
【００２２】
明白な生物情報的連鎖が、この領域の遺伝子について確立された。この適合は、これらの遺伝子を対応するPBSX遺伝子との関連を可能にした。ORF 231 9Pは、Clostridium acetobutylicumの自己分解的リゾチームの66aaセグメント全体にわたり37% の同一性を示した（P=10-4）。ORF 227gp は、多くのバクテリオファージからのアミダーゼ群のライシンに対して、75aaセグメント全体にわたり高度の類似性を示した（ラクトバシラスファージ adh,gle;Tp-21; 全部のP 値<10-10）。最高の類似は、ファージadh との類似であった（75%の同一性、P=10-31 ）。この高度に保存されているファージライシンセグメントはまた、L.ジョンソニイ La-1のプロファージL965からの推定ライシンにも見出され、特に両方のL.ジョンソニイ La-1プロファージからのライシン遺伝子の330bp セグメントは、70%bpの同一性を共有した。
それらの位置に従い、ライシン遺伝子ORF 93およびORF 92の上流は、ホリン遺伝子としてそれら自体を明白に同定した。二つの議論は、ORF 93へのホリン属性を支持した:クラスＩホリン遺伝子は約100aa 長さのタンパク質をコードし、またこれらのタンパク質は、３つの膜貫通セグメントを示す。
【００２３】
コンティグL928
コンティグL928は、配列データの11kbを含有する。この配列から、S.テルモフィラス、B.サチリスおよびラクトバシラスバクテリオ−ファージに対して類似性を示す19タンパク質が予測される（図３）。
右の7kb は、S.テルモフィラスファージSfi11 のpac−部位領域のトポロジー的組織化に対して若干の類似性を示すが、この配列類似性は、推定ポルタル(portal)タンパク質についてのみ有意であった。さらにまた、このターミナーゼの潜在的小型および大型サブユニットが同定された。
ここで、提供された配列情報をLactobacilli ジョンソニイ以外のLactobacilli中の関連配列の存在の測定に利用することができる。この目的には、開示されたコンティグの一つの配列の一部、好ましくはホリンまたはオートライシンにかかわるORF を包含する配列を、種々のストリンジェンシー条件を用いるハイブリド形成または実験におけるプローブとして使用することができる。さらにまた、ポリメラーゼ連鎖反応の技術は、この目的に良好に使用することができる。
【００２４】
同様に、配列情報はLactobacilliの成長に有害な配列の消滅に使用することができる。特に、オートライシンおよび／またはホリンをコードする遺伝子はそれぞれ、相同組換えを使用して問題の乳酸棹菌のゲノムから脱活性化または削除することができる。各コンティグまたは削除／脱活性化させる各遺伝子のそれぞれのフランキング領域は、各「フランキング配列」間に脱活性化遺伝子またはマーカー遺伝子を含有するＤＮＡ配列を細菌ゲノムに挿入することによって、相同組換えを行うために使用することができる。次いで、このＤＮＡセグメントを染色体中の相同配列の場所に挿入し、次いで内在配列を削除する。この目的には、クローンの選択のためにマーカー遺伝子を使用することが適当であり、この場合、内在コンティグまたはＤＮＡ配列は、組換えたものにより置き換えられる。
【００２５】
さらにまた、この配列またはその一部、特に短いオリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリド形成またはＰＣＲ反応による乳酸菌中のいずれかのプロファージの存在または消滅を監視することができる。同様に、本発明により提供されるＤＮＡ配列またはその一部、例えば所望の長さのオリゴヌクレオチドを使用して、相違する成長条件、乳酸菌について最適の発酵及び成長条件を選択するために、異なる成長条件下でプロファージ遺伝子発現を監視することができる。
下記の例は、本発明を例示するものであり、本発明を制限するものではない。
【００２６】
例
断片クローニングおよびクローンバンクの構築
L.ジョンソニイ La1 染色体ＤＮＡの試料 1mgを、大きい、すなわち8kb およびそれより長いＤＮＡ断片を支配的に生成する消化の捜査において、 6塩基対配列認識制限酵素により消化させた。この方法で同定された７種の制限酵素、BamHI 、Sacl、SphI、BsrGI 、Nhel、KpnlおよびMluIを、クローニング用に選択した。染色体ＤＮＡ 0.3mgを７種の制限酵素のそれぞれにより完了まで消化し、次いで適当に調製されたpUC19 0.1mg とリゲートした（Yanisch-Perron等によるGene,33(1985),103-119 ）（特異なMluI部位を含有する、RDP 未公開の結果）。これらのリゲーションを、E.coli株BZ234 中に電気−形質転換(electro-transform) し、次いでアンピシリン100mg/ml（Boehringer Mannheim 、製品番号：835 242 ）、X-gal （５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Boehringer Mannheim 、製品番号：1 680 293 ）およびＩＰＴＧ（イソプロピル-b-D- チオガラクトシド、Boehringer Mannheim 、製品番号：1 411 446 ）を補給したＬＢプレート上に直接にプレート形成した。これらのプレートを、37℃で 16 時間にわたりインキュベートし、次いで挿入体含有クローンを青−白色反応によって同定した。ここで、白色コロニーが挿入体を含有する。白色コロニーを、アンピシリン100mg/mlを補給したＬＢ培地150ml を含有する96ウエル微量定量プレートに取り入れ37℃でインキュベートしミニ培養を製作した。
【００２７】
これらの微量定量プレートから、20mlのアリコートを特定の列に12のウエルのそれぞれから採取し、８個の別々のエッペンドルフ試験管にプールし、列のプール(pools of row)（すなわち、A1〜12 など）を得た。これらの収集列から、40mlのアリコートを、新しいエッペンドルフ試験管に入れ、「プレートのプール」(pools of plates) を得た。最後に、この微量定量プレートおよびエッペンドルフ試験管中のプールに、グリセロールを添加し、混合した後、-20 ℃で凍結させた。
７種のリゲーションのそれぞれからのコロニーを、８個の微量定量プレートに接種し、5000以上の個別のクローンを得た。
【００２８】
クローン−バンク試験
微量定量プレート中のクローン−バンクの品質を、単離したプラスミドの制限分析により試験し、挿入したL.ジョンソニイ La1 断片の大きさおよび断片反復度を推定した。この微量定量培養物30mlを、アンピシリン100mg/mlを補給したＬＢ培地 3ml中に接種し、次いで撹拌しながら37℃でインキュベートした。Genomed mini prep kit （製品番号：200200）を指示印刷物に記載されているとおりに使用し、小規模プラスミド単離体を調製し、次いでTE緩衝液50mlに懸濁した。７種のクローン−バンクのそれぞれから、100 までのプラスミドを調製し、制限酵素EcoRI+HindIII により消化させ、次いでこれらの断片を1%アガロースゲル上に溶解した。これらの制限酵素は、pUC プラスミドのクローニング列の２つの末端で切断し、従ってこれらの部位が挿入ＤＮＡ内に存在する場合、さらに消化することができるLa1 クローン形成した挿入体からベクターを放出する。これにより、プラスミド消化パターンまたはコード−バー(code-bar)パターンの種が作製される。これは、L.ジョンソニイ La1 からクローン形成されたＤＮＡ断片の数および大きさの点で特異である。これらのパターンを直接比較すると、挿入したＤＮＡの配向に関係なく、クローン−バンクで１回以上示されるクローンを迅速に除去することができる。そのLa1 挿入体の総合的大きさを得るために、La1 EcoRI+HindIII 制限断片の大きさをまた総合することができる。これらのデータから、我々は平均4-5kb の挿入体の大きさにかかわる保存的推定を、この大きさよりも小さい数種のクローンおよび10kbおよびそれ以上に達するかなりのクローンとともに有している。我々は、７種のクローン−バンクのそれぞれが約 2倍のLa1 ゲノム補体を含有するものと推定する。
【００２９】
このプラスミドはまた、印象的な物理的安定性およびクローン形成した挿入体の性質に依存したコピー数の高度の変化度を示した。pUC19 およびpUC21 は、750 コピー／細菌まで複製することができるが（大部分のクローンはまた、この高度のコピー数を示した）、若干のクローンはクローン形成したＤＮＡのE.coli関連毒性を反映して、大幅に減少されたコピー数を展示した。これらの減少したコピー数のプラスミドは、これらがEcoRI+HindIII 試験消化に際もはや目視することができない点、コピー数が50コピー／細菌またはそれ以下と推定される、まで変化した。
【００３０】
ＤＮＡ配列決定
L.ジョンソニイ La1 クローン形成挿入体の配列決定は、7-deaza-dGTP（Amersham、製品番号：RPN 2538）およびIRD-800 標識したpUC 正および逆プライマーを用いたThermo Sequenase 蛍光標識したプライマーサイクル配列決定キットを用いて、常習的に行った。プライマー／鋳型ミックスは、25ml容積中の1 pMol/ml で標準鋳型 4mlおよびプライマー 4mlを含有していた。ストリップ型の200ml 用量の試験管 4本のそれぞれに（すなわち、 A反応に対しては Aなど）、プライマー／鋳型ミックス 6mlおよび配列決定ミックス 2mlを添加した。これらの試験管をシールし、混合し、次いでOmniサーモサイクラーで下記条件を用いて、配列決定を行った：95℃で 5分間、次いで95℃で30秒間、95℃で30秒間、72℃で 1分間のサイクルを25回、次いで最後に室温に維持した。停止溶液 3mlを添加し、次いでこれらの試料を-20 ℃で凍結させた。
試料容積0.8ml を、66cmのプレートおよび0,25mmゲル厚さを有するLicorDNA配列決定装置モデルL4000 に充填した。電気泳動および配列読取りは、Licor 配列決定装置により行った。配列は、配列収集および分析にかかわるプログラムのGCG スーツに対してダウンロードした。
【００３１】
クローンバンクのPCR スクリーニング
７種のクローンバンクの構造をそれらの生成する収集物と共にデザインし、PCR によるクローンの迅速スクリーニングを容易にした。配列決定されたクローンの末端から得た公知ＤＮＡ配列を使用し、400 〜600 塩基対のPCR 増幅生成物を生成するために、一対のPCR プライマーをデザインした。プレートのプールからの試料 1mlを、dNTPs 、酵素緩衝液およびSuperTag1.25単位とともに、8 × 200mlストリップで50ml容積中でPCR プライマーと混合した。この反応体を、パーキン−エルマー9700 PCR装置で95℃において 5分間加熱し、次いで95℃で 1分間、40℃で 1分間、72℃で 2分間のサイクル30回により増幅し、最後に4℃に維持した。ゲル充填染料10mlを添加し、混合し、次いで1.5%アガロースゲル上に加え、次いで100mA で1-2 時間にわたり電気泳動に付した。L.ジョンソニイ La1 染色体ＤＮＡ200ng を有する陽性対照を、PCR 反応用として用い、また増幅生成物用のサイズマーカーとしておよびPDR 反応の対照として使用した。微量定量プレート中の96個のクローンの混合物中の１個の陽性クローンの存在は、L.ジョンソニイ La1 のサイズと同一のサイズのPCR 生成物の存在によって直接に見ることができる。この技法は、放射線を用いることなく、5 時間よりも短い時間での全部のクローン−バンクの迅速なスクリーニングを可能にする。一旦、陽性クローンが同定された時点で、PCR 検出を、微量定量プレートの８本の「列のプール」で、次いで同定された列の12個のウエルで反復する。
【００３２】
プラスミドが直接に配列決定しようとするコピイ数よりも非常に少ない場合、これらのプラスミドは検出反応からの相当するプライマーおよびオリゴヌクレオチド6617（ 5´ACGCCAGCTGGCGAAAGGGGG3´）（配列番号：4 ）または6618（ 5´GCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC3 ´）（配列番号：5 ）（これは挿入体に向かってpUC19 ベクターから増幅する）を用いる長距離(long-range)PCR 用の鋳型として使用される。このPCR 生成物を次いで、ゲル精製し、ＤＮＡを溶出し、次いでプセスミドについて開示されているとおりに直接に配列決定する。
【００３３】
配列分析
Genetics Computer Group 配列分析パッケージ（University of Wisconsin ）を使用し、配列を分析した。ヌクレオチド（nt）および予測アミノ酸（aa）配列を、FastA （Pearson and Lipman,1988 ）およびBLAST （Altschul等、1990）プログラムを用いて、データベース（GenBank,Release 105;EMBL(Abridged),Release 53;PIR-Protein,Release 55;SWISS-PROT,Release 35;PROSITE,Release 14.0 ）のものと比較した。
オープンリーディングフレーム（ORF)は、ATG およびGTGを用いるClonemanagerバージョン5.0 を使用して可能な出発コドンとしておよび90aaの最小サイズと予測されている。
【００３４】
ミトマイシンＣ誘導試験
この試験は、Arber 等によるLambda II （Hendrix,R.W.Ed.),Cold Spring Harbour Laboratory(1983),443-445 から応用した。新鮮な培地0.1ml を、ラクトース(10%w/v)0.5ml を補給したM17 培地10mlを含有する試験管中に接種した。この培地を次いで、40℃で 1時間にわたりインキュベートした。ミトマイシンＣを次いで、0.1 μg/mlの最終濃度まで添加した。6 時間のさらなるインキュベーション後、この培養物を、光学濃度およびプラーク評価を測定することによって検査した。
ＰＣＲ
ファージＤＮＡ（このファージＤＮＡはファージタンパク質によって保護されている）の抽出前に培養上清をＤＮＡｓｅで処理し、汚染となる、溶解した細菌からの裸の染色体ＤＮＡを破壊した。ＰＣＲは、L965プロファージに対して特異性のプライマーを用いて行った。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ファージ配列およびそれらの各ポリペプチドに属するオープンリーディングフレームの予測を示す。
【図２】  ファージ配列およびそれらの各ポリペプチドに属するオープンリーディングフレームの予測を示す。
【図３】  ファージ配列およびそれらの各ポリペプチドに属するオープンリーディングフレームの予測を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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