(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンアミノ酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲまたはその異性化および／またはラセミ化変異体に位置する第一のエピトープと反応性を有する第一の抗体と、コラーゲン断片中に位置する第二のコラーゲンエピトープと反応性を有する第二の抗体とを使用するサンドウイッチ測定法によって、試料中におけるコラーゲン断片集団の量を測定するステップを含むＩ型コラーゲン吸収速度を測定する方法。
【請求項２】
前記第二のエピトープが、同一または異なるコラーゲン鎖の前記第一のエピトープを基準としてＮ−アミノ末端の方向に位置する、請求項１において記載された方法。
【請求項３】
該第二のエピトープが、アミノ酸配列ＦＤＦＳＦの少なくとも一部を含むものである、請求項２において請求された方法。
【請求項４】
該測定法が、サンドウイッチ放射線免疫測定法であるかまたはサンドウイッチＥＬＩＳＡ測定法である、請求項１〜３のいずれかに記載された方法。
【請求項５】
該測定法において検出される断片の分子量が１５００Ｄａ（ダルトン）を上回る、請求項１〜４のいずれかに請求された方法。
【請求項６】
該測定法において検出される断片の分子量が２５０００Ｄａ（ダルトン）を上回る、請求項１〜５のいずれかに請求された方法。
【請求項７】
前記第二のコラーゲンエピトープも、アミノ酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲまたはその異性化および／またはラセミ化変異体に位置する、請求項１において請求された方法。
【請求項８】
前記エピトープの各々が、架橋に結合したそれぞれのアミノ酸に存在する、請求項７において請求された方法。
【請求項９】
前記エピトープの各々が、アミノ酸配列ＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲに位置する、請求項７において請求された方法。
【請求項１０】
各抗体が、アミノ酸配列ＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲを含むペプチド類縁体に対して産生せしめたモノクローナル抗体である、請求項９において請求された方法。
【請求項１１】
特異性が実質的に同一である抗体をサンドウイッチの両側において使用するコラーゲン分解生成物のためのサンドウイッチ測定法。
【請求項１２】
試料中におけるコラーゲン分解産物の濃度を測定する方法であって、生体内でのコラーゲン分解に際して生成するＮ−末端テロペプチド断片内のエピトープと免疫学的反応性を有する第一および第二の免疫学的結合パートナーを用いたサンドウイッチ測定法を実施するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記第一および第二の免疫学的結合パートナーが、相互に同一かまたは異なる、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、体液中のコラ−ゲン断片の測定法に係る。
コラ−ゲンとコラ−ゲン代謝疾患
骨粗しょう症は、ヒトにおける最もありふれた骨疾病である。原発性骨粗しょう症は、骨折受傷性が増大する疾病であり、骨格骨量の漸進的な減少に起因し、アメリカ合衆国単独で１５００万ないし２０００万人が罹患していると推定される。この疾病の根拠は、骨の再構築、即ち骨組織の形成速度と吸収速度とが年齢依存的に均衡を失することにある。アメリカ合衆国においては、毎年ほぼ１２０万件の骨粗しょう症関連骨折が高齢者において発生しており、これにはほぼ５３万８０００件の脊椎圧迫骨折、ほぼ２２万７０００件の股関節骨折および相頭数の末梢骨早発性骨折が含まれる。このような股関節骨折の１２％ないし２０％は、重度の傷害と出血を伴うため致命傷となり、また生存患者の半数は、ナ−シングホ−ムのケア−を必要とする。骨粗しょう症に関連した負傷に起因した全費用は今や、アメリカ合衆国において毎年少なくとも１００億ドルに昇っている（Ｒｉｇｇｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２７：６２０−６２７（１９９２））。
骨粗しょう症は、平均して閉経後１０年以内において骨量の損失が１５％にもなる閉経後婦人に最も多い疾病である。この疾病はまた、男性にも加齢に応じて発生し、また無月経症の若い女性運動競技者においても発生する。骨粗しょう症が持つ社会的かつ経済的重要性が増大しているにも拘らず、患者のみならず健常人の骨吸収速度を信頼度よく測定する方法を利用出来る可能性は極めて低く、限られているのである。コラ−ゲン代謝の異常を伴うまたはこのことに関連した他の疾病としては、パジェット病、マ−ファン症候群、骨形成不全症、コラ−ゲン組織での新生物増殖、関節リュ−マチ、骨関節炎や脈管炎が挙げられる。
ヒトコラ−ゲンには三種類のクラスものが今日までに記載、報告されている。クラスＩコラ−ゲンは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩ型に細分類され、線維を形成することが知られている。ＩないしＩＩＩ型のアミノ酸配列は（これまでに解明されている限り）、ＷＯ  ９５／０８１１５の付属書類に示されている。
Ｉ型コラ−ゲンは、骨の有機マトリックスの９０％以上を占めている。従って、原則としてＩ型コラ−ゲンの分解をモニタ−することによって骨吸収速度を推定することが可能である。同様に、結合織を含む他の疾病の種々の病状も、コラ−ゲンの分解を測定することによってモニタ−することができる。そのいくつかの例としては、関節リュ−マチや骨関節炎に関連したＩＩ型コラ−ゲンおよび脈管炎症候群におけるＩＩＩ型コラ−ゲン分解がある。
ヒトＩＩＩ型コラ−ゲンやヒトプロａｌ（ＩＩ）コラ−ゲンのアミノ酸配列およびヒトＩＩＩ型コラ−ゲンのプレプロａｌ（ＩＩＩ）全鎖及びこれらの相当するｃＤＮＡクロ−ンが、いくつかの研究グル−プによって研究され、その配列が決定されている；Ｌｏｉｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：９３８３−９３９４（１９８４）：Ｓａｎｇｉｏｒｇｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：２２０７−２２２５（１９８４）：Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２６２：５２１−５２８（１９８９）；およびＡｌａ−Ｋｏｋｋｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２６０：５０９−５１６（１９−８９）。
Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ−ゲンは，全て生物においては，Ｎ−末端およびＣ−末端ペプチド配列とがコア−コラ−ゲン分子に結合して成るプロコラ−ゲン分子として存在している。プロペプチドは生体内においてはコラ−ゲン合成の過程で発生するが、かかるプロペプチドを除去すると、コラ−ゲン分子中の残存するコア−部の大半は、三重らせん構造を持たない末端テロペプチド配列を有する三重らせん領域から構成される。これらのテロペプチド配列は、分子の外部においてコラ−ゲン線維の分子間架橋部位として重要な機能を有している。このアルファらせん領域もまた、架橋可能な部位を有している。
分子間架橋は、コラ−ゲン線維に生物機械的な安定強度を付与するものであり、かかる架橋の形成は、リジンとヒドロキシリジン残基が相当するアルデヒドに修飾されることによって開始される。隣接するコラ−ゲン鎖に位置するこのような残基の幾つかが、自発的に異なる分子間架橋を形成することになる。コラ−ゲンテロペプチド上の架橋部位とらせん領域からの架橋部位との正確な位置は既に報告されている。例えば、Ｋｕｅｈｎ、Ｋ．−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、１：１−２９、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８２）、Ｅｙｒｅ、Ｄ．Ｒ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３：７１７−４８（１９８４）またはアメリカ合衆国特許第５１４０１０３および第５４５５１７９を参照のこと。更には、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ−ゲンにおける潜在的架橋可能部位のアミノ酸配列が、以下に掲げる表Ｉに示してある。
線維性タンパク質であるコラ−ゲンおよびエラスチンは、リジンとヒドロキシリジン側鎖からのアルデヒド生成に依拠した特異的機構によって架橋されている。四つの相同架橋位置がＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ−ゲンの分子において明らかにされている（総説としてＫｕｅｈｎ、Ｋ．−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、１：１−２９（１９８２）を参照）。二つはアルデヒド部位であり、その内の一つは各テロペプチド中にある。残りの二つの部位は、ヒドロキシリジンであり、これは分子の各端末からほぼ９０個の残基に対称的に位置している。コラ−ゲン分子がパックして線維を形成した場合、らせん領域に存在する後者の部位は、一列に配列して隣接する分子中のテロペプチドアルデヒドと反応する。３−ヒドロキシピリジニウム残基がヒドロキシリジン由来アルデヒドに起因する成熟架橋であるという強力な証拠がある。しかしながら、もう一つの経路たるリジン残基からのアルデヒド生成に由来する成熟架橋残基は知られていない。
以下において議論するＥＰ−０３９４２６に示された式で図示される様に、かかる二つの３−ヒドロキシピリジニウム架橋は、ヒドロキシリジジルピリジノリン（また単に”ピリジノリン”としても知られている）およびリジルピリジノリン（また”デオキシピリジノリン”としても知られている）であることが判明している。これらの架橋化合物は、当然のことながら蛍光を有する。いくつかのヒドロキシリジルピリジノリン架橋は、例えばＥＰ−Ａ−０４２４４２８において議論されているように糖化されていることが知られている。
しかしながら、Ｌａｓｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．６、ｐｐ  ５５９−５６４、１９９０において報告されているように、その他の架橋もコラ−ゲン中に存在している。
従来技術によるコラ−ゲン分解測定法
これまでに、種々の生化学的マ−カ−を測定することによる生体内でのコラ−ゲン分解をモニタ−する方法が幾つか開発されてきたが、かかる生化学的マ−カ−の幾つかはコラ−ゲンの分解生成物であった。
例えば、大半がコラ−ゲンや骨および他の全ての結合織での主要構造タンパク質に限定されたアミノ酸であるヒドロキシプロリンが、尿中に排出される。その排出速度は、下記において議論するようにいくつかの症状、特に骨交代が大幅に増大する代謝性骨疾病であるパジェット病において増加することが知られている。
このような理由によって、尿中のヒドロキシプロリンが、コラ−ゲン分解のアミノ酸マ−カ−として汎く使用されてきた；Ｓｉｎｇｅｒ、Ｆ．Ｒ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｖｏｌ．ＩＩ（ｅｄｓ．Ａｖｉｏｌｉ、Ｌ．Ｖ．およびＫａｎｅ、Ｓ．Ｍ．）、４８９−５７５（１９７８）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
アメリカ合衆国特許第３６００１３２号においては、コラ−ゲン代謝の変動をモニタ−するために、例えば血清、尿、腰椎液やその他の細胞間液等の体液中のヒドロキシプロリンを測定するための方法が開示されている。この特許は、ヒドロキシプロリンがパジェット病、マ−ファン症候群、骨形成不全症、コラ−ゲン組織での新生物増殖や種々の小人症などの病理症状に関連したコラ−ゲンの同化または異化が増大したことと相関関係がある旨陳述している。
パジェット病に関連した骨吸収はもまた、骨コラ−ゲンの分解後に尿中に排出されるヒドロキシプロリン含有小型ペプチドを測定することによってモニタ−されてきた；Ｒｕｓｓｅｌら、Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓ．ａｎｄ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．４  ａｎｄ  ５、２２５０２６２（１９８１）、およびＳｉｎｇｅｒ、Ｆ．Ｒ．ら、上記。
パジェット病の場合、尿中のヒドロキシプロリンが増大することは、その大半が骨分解に由来する；しかしながらヒドロキシプロリンは、通常は骨分解の特異的指標としては使用することは出来ない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新しいコラ−ゲンの合成に由来するものであり（新たに合成されたタンパク質の相当量は、分解され、組織織に組み込まれることなく排出される）、またいくつかの血液タンパク質やそのたヒドロキシプロリンを含有するタンパク質の交代に由来するのである。更には、タンパク質分解に由来した遊離のヒドロキシプロリンのほぼ８０％は、肝臓で代謝され、決して尿中には現れることはない。Ｋｉｖｉｒｉｋｏ、Ｋ．Ｉ．、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．５：９３（１９７０），およびＷｅｉｓｓ、Ｐ．Ｈ．およびＫｌｅｉｎ、Ｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４８：１（１９６９）。ヒドロキシプロリンは、骨吸収に特異的ではないとしても、骨中のコラ−ゲンに特異的であると同様に骨粗しょう症の優れた一つのマ−カ−であるが、取り扱いが面倒である。
ヒドロキシプロリンとその糖化誘導体は、何れもコラ−ゲン性タンパク質に特有のものであり、コラ−ゲン分解のマ−カ−としてはヒドロキシプロリンよりも正確であるものと考えられてきた。しかしながら、ヒドロキシプロリンについて上記した同じ理由によって、ヒドロキシプロリンとその糖化物は、骨吸収については同程度に非特異的マ−カ−であろう；Ｋｒａｎｅ、Ｓ．Ｍ．およびＳｉｍｏｎ、Ｌ．Ｓ．、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：１８５（１９８１）。
他の研究者は、関節疾病におけるコラ−ゲン分解の指標として尿中での架橋性化合物である３−ヒドロキシピリジニウムを測定している。その背景事情については例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｅｙｒｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１８５０（１９８４）：Ｂｌａｃｋら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１６：９６４（１９８９）を参照のこと。本発明とは異なって、これらの先行研究者らは、体液由来のペプチドを加水分解し、次いで遊離の３−ヒドロキシピリジニウム残基を探索、測定しているのである。
Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ−ゲンの分解を測定するための方法が、ＥＰ−０３９４２６９およびアメリカ合衆国特許第４９７３６６６号および５１４０１０３号において開示されている。しかしながら、これらの特許は、架橋物である３−ヒドロキシピリジニウムを含むコラ−ゲン断片に限定されたものである。更には、上記した測定法は、当該方法において抗体の製造と抗原のために使用する３−ヒドロキシピリジニウムを尿から精製するには面倒で、複雑な操作を必要とする。
つい最近になるまでは、アメリカ合衆国特許第４９７３６６６号および５１４０１０３号において記載された問題解決法を用いた臨床デ−タは殆ど入手・利用可能ではなかった。特に、Ｉ型コラ−ゲンの３−ヒドロキシピリジニウム含有テロペプチドの尿中濃度（上記した特許において記載された方法で測定された）と現実の骨損失（骨デンシトメトリによる反復測定結果から測定）との相関関係に関するデ−タは、これまでに全く報告されていない。しかしながら、つい最近ＭｃＣｌｕｎｇら（ＪＢＭＲ（１９９６）１１：１２９）は、かかる特許に基づいた実用的・商業的ＮＴｘ測定法が骨損失とは相関しない旨結論ずけている。より具体的に言えば、ＮＴｘは、健常な人においては骨損失とは相関関係がなく、また治療に応答した骨変化を予見することが出来なかった。Ｇｅｒｔｚら（ＪＢＭＲ（１９９４）９（２）：１３５−１４２）は、ベ−スラインＮＴｘ測定値と骨損失との間には有意の相関関係が全くないことおよび抗骨吸収治療の過程においてＮＴｘの変化と骨損失との間には全く有意の相関関係がないことを報告している。
Ｇａｒｎｅｒｏら（ＪＢＭＲ（１９９６）１１（１０）：１５３１−１５３７）は、ＮＴｘは、股関節骨折を予見するものではないが、他の生化学的マ−カ−は股関節骨折のリスクがほぼ１００％増大することと関連している旨報告している。
３−ヒドロキシピリジニウム含有テロペプチドが尿中に存在することは、骨吸収プロセスの前の種々の時点でかかる特異的架橋構造が骨組織において適当に形成されることを必要とする。かかるプロセスに関しては殆ど情報が得られておらず、架橋構造の正確な形成に依存することを回避することが望ましいことになろう。
英国特許出願第２２０５６４３号は、ＩＩＩ型コラ−ゲンに由来するＮ−末端テロペプチドの体液中濃度を測定することによって体液中でのＩＩＩ型コラ−ゲン分解を定量的に測定することができる旨述べている。この方法は、ＩＩＩ型コラ−ゲンを最近コラゲナ−ゼで分解することによって遊離させたＮ−末端テロペプチドに対して生成せしめた抗体を使用するものであるが、かかるテロペプチドは標識化して、本方法に使用するものである。
Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ−Ｋｅｒｍａｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９：４７５−４９１（１９９０）は、ＩおよびＩＩ型コラ−ゲンのＢＮＢｒ断片を用いた免疫学的測定システムを記載している。ペプシン−可溶化コラ−ゲンを利用し、当該テロペプチドを組織中に残しておくのである（上記英国特許出願第２２０５６４３号を参照）。従って、かかる断片と断片から生成せしめた抗体との間に一意関係は全くない。更には、この参考文献は、抽出組織標本に関する測定結果を記述しているにすぎない。
ペプシン−可溶化Ｉ型コラ−ゲンに対して生成させたモノクロ−ナル抗体の開発は、Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７：４３９−４４３（１９９０）に記載されている。この抗体は、いくつかの組織区域の免疫組織化学的染色を行うため及び細胞培養液中のコラ−ゲン含量を測定するために使用するのである。かかる測定は体液については行われない。
ヨ−ロッパ特許出願第０５０５２１０号は、Ｉ型コラ−ゲンから生成した架橋Ｃ−末端テロペプチドで免疫処理することによって抗体試薬を開発することを記載している。この免疫抗原は、ヒト骨コラ−ゲンを最近性コラゲナ−ゼで可溶化することによって作成する。かくして調製された抗体は、架橋しているまた架橋していないテロペプチドの双方およびピリジノリン以外の架橋化合物と反応する能力を有する。
コラ−ゲン分解は、いくつかのプロコラ−ゲンペプチドを定量測定することによって測定することができることを示す報告が多数存在する。プロペプチドは、テロペプチドやコラ−ゲンコア−のアルファらせん領域とからはプロコラ−ゲン分子中での位置および生体内での解裂のタイミングとによって識別・分別される；アメリカ合衆国特許第４５０４５８７号；アメリカ合衆国特許第４３１２８５３号；Ｐｉｅｒａｒｄら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４１：１２７−１−３６（１９８４）；Ｎｉｅｍｅｌａ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１／８：１３０１−１３０４（１９８５）；およびＲｏｈｄｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９：４５１−４５９（１９７９）。
ヨーロッパ特許出願第０２９８２１０号および第０３３９４４３号の双方が、ＩＩＩ型プロコラ−ゲンペプチドおよびその断片の免疫学的測定を記載している。更には、プロコラ−ゲンの測定に基づいた方法が、ヨーロッパ特許出願第０４６５１０４号において開示されている。
免疫学的試薬を開発するためにＩＸ型コラ−ゲンから誘導された配列を有する合成ペプチドを使用することが、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ  ９０／０８１９５号に開示されている。同様に、この出願においては、体液中のＩＸ型コラ−ゲン断片を測定するためにかくして産生せしめた抗体を使用する用途が記載されている。
アメリカ合衆国特許出願第４７７８７６８号は、滑液試料中のプロテオグリカンモノマ−またはその抗原性断片を定量することからなる、関節軟骨の変化を測定する方法に係る。
Ｄｏｄｇｅ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：６４７−６６１（１９８１）は、巻きが解けたアルファ鎖とヒトとウシＩＩ型コラ−ゲンの臭化シアン誘導ペプチドと特異的に反応するポリクロ−ナル抗体を使用したＩＩ型コラ−ゲン分解を解析する方法を開示している。コラ−ゲンの分解生成物は、体液には検出されていないが、但し組織化学的に細胞培養物の染色することによって、即ち”インシツ”検知法によった場合である。
ＷＯ  ９４／０３８１３は、試料中のコラ−ゲンまたはコラ−ゲン断片を検出するに際して、コラ−ゲンの非らせんＣ−末端またはＮ−末端領域に相当する合成線状ペプチドを含む結合パ−トナ−を当該合成線状ペプチドに対する抗体と試料と共に一緒に培養することおよびこの結合パ−トナ−とに抗体との結合量を測定することからなる、前記コラ−ゲンまたはコラ−ゲン断片を検出するための競争的免疫測定法を記載している。
ＷＯ  ９５／０８１１５は、体液中のコラ−ゲン断片を合成ペプチドと反応性を有する抗体と反応させることによって測定する測定方法に係る。この測定法は、試料とかかるペプチドとが一種の抗体、可能ならばコラ−ゲンのコラ−ゲナ−ゼによる分解によって得られたコラ−ゲン断片に対して産生させたポリクロ−ナル抗体を目指して競争する競争測定法であってもよい。又はその代わりに、かかる合成ペプチドに対して産生させた抗体、可能ならばモノクロ−ナル抗体を使用する測定法であってもよい。
ＷＯ  ９１／０８４７８において開示しているように、体液中、特に尿中に認められるある特定の種類のペプチド断片は、下記する式で表される：
0003913787.tif 000002
上式において、Ｋ−Ｋ−Ｋは、ヒドロキシピリジニウム架橋を表すものと開示されているが、現実には、天然に存在する如何なる架橋であってもよく、具体的には、Ｌａｓｔらの上記にて参照した報告書において議論された如何なるものであってもよい。
さらに以下において議論するように、上記したよりもの小型のペプチドを含むより大型のペプチド断片も、この文献に開示されている。
体液中でのかかる”ペプチド”断片の割合は、等しいアミノ酸配列を有するペプチド、例えば式１で表されるペプチドに、式中のアスパラギン酸をイソアスパラギン酸に異性化することによって関連ずけられる。本発明者らは本明細書においては、当然ながら異性化は、かかる化学種がもはやペプチドとは正当に見なされないのであるから、”ペプチド”を引用符で表すこととする。
アスパラギン酸を含むタンパク質の異性化は、以前に生理学的条件下で生起する自発反応であると報告されている。
例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３、２、３３１−３３８、Ｇａｌｌｅｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５、３０６、３１３−３２５、Ｌｏｗｅｎｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １９８８、１４、１０３−１１７およびＯｌｉｙａら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１１、Ｎｏ．５、１９９４、ｐ．７５１を参照のこと。
かかる異性化は、健常なタンパク質においてはペプチド結合を介して結合しているアスパラギン酸のアルファカルボン酸から見てカルボキシ末端の方向にアスパラギン酸残基の下流に位置するペプチド鎖を下記に図示するように非ペプチドアミド中の側鎖カルボン酸に転位させる効果を有する：
0003913787.tif 000003
この非ペプチド結合アスパラギン酸残基は、”イソアスパラギン酸”即ちβ−アスパラギン酸（βＤ）と称する。
同様の異性化が、アスパラギン残基を含むタンパク質においても生起し得る（即ち、上記反応様式において出発タンパク質の−ＯＨの代わりに−ＮＨ2と共に生起する）
上記した発見が行われた結果、かかる異性化が骨組織においても生成し得ることおよび異性化の程度・度合いが関連する骨組織の年齢のマ−カ−となることが期待されることが明らかとなった。
更には、骨ペプチド断片中にかかる異性化ペプチドが存在することによって、当該断片が現実に骨分解に由来するものであって、何らかの他の原因、例えば決して骨に組み込まれることがない、新たに形成されたコラ−ゲンの分解などに由来しないことが確認されたことになる。
Ｊ．ＭａｃｅｋおよびＭ．Ａｄａｍ、”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ”、Ｚ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．４６：２３７−２４０（１９８７）は、分子量が１０、０００以上のピリジノリンを含有したコラ−ゲン架橋結合ペプチドが尿中に存在することを報告しているが、かかるペプチド鎖のアミノ酸配列に関する情報や当該断片が属するコラ−ゲンの種類について報告は全く行っていない。
上記したように、ＷＯ９１／０８４７８は、Ｉ型コラ−ゲンの断片が多数尿中において発見され得ることを開示している。かかる断片には、ヒドロキシリジルピリジノリンまたはリジルピリジノリンの何れかであり得るピリジニウム架橋が含まれる。この架橋に結合しているのが、コラ−ゲン分子に由来する特定の配列を有するペプチド鎖であり、この架橋には、ペプチド鎖を有する三つの点がある。上記式Ｉで表される断片は（ＷＯ９１／０８４８７における式ＩＶ）、二つの鎖を有しており、それぞれの鎖はＥＫＡＨＤＧＧＲなる配列を持つ。他の二つの断片は、ＷＯ９１／０８７４８に記載されているが、それぞれこの明細書の式ＩＶで表される、式Ｖのものよりもアミノ酸数が７つ長いこと以外は同一配列を有する第三番目の鎖を有している。Ｉ型コラ−ゲンのこれらの鎖のアミノ酸配列は既に、上記した他の文献において報告されており、コラ−ゲン分子の間に三価架橋の箇所を有する。ＷＯ９１／０８７４７の式ＩＣおよびＶにおいて示されたかかる三番目の鎖は、架橋箇所でのコラ−ゲン鎖に相当するものではなく、使用された単離操作の結果に起因した過ちであるものと信じられている。
信頼のおける式が与えられている唯一の断片は、二つの同一のペプチド鎖を有する式ＶＩ（本明細書における式１と同等）で表される断片である。
ＤＥ−Ａ−４２２５０３８は、体液中のコラ−ゲン分解生成物のサンドウイッチ測定法を開示している。抗体は、アミノ酸の線状配列を含むハプテンで免疫することによって産生することができる。提案された一つの配列は、ＦＤＦＳＦＬＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）であり、もう一つは、ＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）である。但し、これら二つの配列は、このサンドウイッチ測定法い使用する二種類の骨愛を産生させるために組合せて使用しないよう示唆されている。実際のところＰＰＱＥＫＡＨＤＧＧＲなる配列が記載されているものの、この配列に対して産生させた抗体は、一切具体的に記載されておらず、従ってこれら配列の現実の有用性について一切記載されていない。唯一記載された具体的なサンドウイッチ測定法は、Ｃ−末端配列であるＦＤＦＳＦＬＰに対する抗体を配列ＧＭＫＧＨＲＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）（螺旋領域架橋部位に由来する）に対する抗体と組合せるものである。しかしながら、ＤＥ−Ａ−４２２５０３８は、配列ＦＤＦＳＦＬＰに基づいた測定法とＩＣＴＰ測定法として知られている商業的測定法とを使用して得られた二つの結果の間には近似した相関関係が存在する旨主張している。しかし、血清でのＩＣＴＰ測定法は、得られた結果が治療処置の効果をうまく追跡できないという点で骨吸収を反映していないように思われる（Ｈａｓｓａｇｅｒｅ  ａｌ．Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ．Ｉｎｔ．（１９９４）５４：４０−３３）。このことは勿論、配列ＦＤＦＳＥＬＰを含む分子の血清中の数は、有用な態様で骨吸収を反映しないことを意味するのであろう。
ところで本発明者らは今や、体液が現実に配列ＥＫＡＨＤＧＧＲのみならず更なるアミノ酸残基をも含有するより大型のコラ−ゲン断片を含んでいることを確認したのである。これらの断片は、架橋に結合した三番目の鎖に存在する可能性があるが、二つの鎖は配列ＥＫＡＨＤＧＧＲを組み込んでおりおよび／または配列ＥＫＡＨＤＧＧＲのＮ−アミノ酸の延長として、これら二つの鎖の一つまたは双方ともかかる配列を含有している。
本発明者らはさらに、驚くべきことに単一のコラ−ゲン分解断片に対する二つの異なる抗体を結合することが可能であり、しかも抗体の双方が配列ＥＫＡＨＤＧＧＲのエピトープまたはその変異体に対して特異的であることを見出したのである。
従って本発明は、コラ−ゲンアミノ酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲまたはその異性化および／またはラセミ化変異体に位置する第一のエピト−プと反応性を有する第一の抗体およびコラ−ゲン断片中に位置する第二のコラ−ゲンエピト−プと反応性を有する第二の抗体とを使用するサンドウイッチ測定法によって、試料（例えば一種の体液）中において前記コラ−ゲン断片集団の量を測定することからなるＩ型コラ−ゲン吸収速度を測定する方法を提供するものである。
好ましくは、この測定法を実施する体液は、尿以外のものである。
好ましくは前記エピト−プは、配列ＡＨＤＧＧＲまたは前記したその変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）において処理するのである。
選択的には、前記した第二のエピト−プは、同一または異なるコラ−ゲン鎖の前記第一のエピト−プを基準としてＮ−アミノ末端の方向に位置する。その場合、少なくともアミノ酸配列ＦＤＦＳＦの一部を含む可能性がある。
この測定法は従って、配列ＦＤＦＳＥＬＰおよび配列ＥＫＡＨＤＧＧＲとに依拠することができる。
好ましくは、この測定法で検出される断片の分子量は、１５５０Ｄａ以上であり、粗に好ましくは５０００Ｄａである。しかしながら、当該断片の分子量は、１０００Ｄａまたは２５０００Ｄａを上回っていてもよい。
前記第二のコラ−ゲンエピト−プは、好ましくはアミノ酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲまたはその異性化および／またはラセミ化変異体にも位置する。前記エピト−プのそれぞれは従って、好ましくは架橋に結合した各々のアミノ酸鎖の中に存在する。好ましくは前記した各エピト−プは、アミノ酸配列ＥＫＡ−βＤ−ＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）内に位置する。使用する抗体は、好ましくはそれぞれの場合、アミノ酸配列ＥＫＡ−βＤ−ＧＧＲを含むペプチド類縁体に対して産生せしめたモノクロ−ナル抗体である。
本発明は、コラ−ゲン分解生成物のサンドウイッチ測定法であって、特異性が実質的に同等である抗体、例えばコラ−ゲン、特にＩ型若しくはＩＩ型またはＩＩＩ型コラ−ゲンのＣ−またはＮ−テロペプチド領域内部の同一アミノ酸配列に対してそれぞれ特異的である抗体ををサンドウイッチの両側で使用する前記サンドウイッチ測定法をも含む。
抗体の一つまたは双方は、ＷＯ９６／３６６４５において記載されているｍＡｂ１Ｈ１１であるかまたはこの抗体に対する特異性が類似している、例えば前記ｍＡｂ１Ｈ１１が免疫学的な反応性を有する代謝物に含まれたエピト−プに対して特異性が類似していてもよい。
また別の局面において、本発明は、試料中におけるコラ−ゲン分解産物の濃度を測定する方法において、生体内でのコラ−ゲン分解に際して直ちに生成するＮ−末端テロペプチド断片内のエピト−プと免疫学的反応性を有する第一と第二の免疫学的結合パ−トナ−（これらは相互に同一かまたは異なる）を用いたサンドウイッチ測定法を実施することからなる前記測定方法を含む。かかるＮ−末端断片は、アメリカ合衆国特許第Ａ−５４５５１７９号に記載されているものであってもよくまた抗体の一つまたは双方ともｍＡｂ１Ｈ１１であるかまたは特異性が同一であってもよい。第二の抗体は、ｍＡｂ１Ｈ１１エピト−プ配列を有するＩ型コラ−ゲン分解生成物中のエピト−プ含有アミノ酸配列架橋と反応性を有していてもよい。従って、当該断片はＩ型コラ−ゲン断片であってもよい。好ましくは、かかる抗体の少なくとも一つは、異性化アスパラギン酸またはアスパラギン残基を含むエピト−プに対して特異的である。
抗体の構造
配列ＥＫＡＨＤＧＧＲに反応性を持つ抗体の製造は、モノクロ−ナル抗体を製造する方法を含めＷＯ９５／０８１１５において記載されている。ＷＯ／９６／３０７６５において記載されているように、かかる配列は、アスパラギン酸残基において異性化していて、そのβカルボン酸基を介して次のグリシンと結合していてもよく、かかる異性化配列に対するモノクロ−ナル抗体の製造も前記文献に教示されている。ＰＣＴ／ＥＰ９７／０４３７２において記載されているように、直鎖配列または異性化配列の何れもアスパラギン酸残基においてラセミ化していて、一つまたは二つの鎖とも直鎖状にまたはβカルボン酸基を介して結合したＤ−アスパラギン酸を含むことになっていてもよい。直鎖またはイソ−Ｄ型の配列に対するモノクロ−ナル抗体の生産は、ＷＯ９５／０８１１５またはＷＯ９５／３０７６５において記載された方法に類似した方法によって実施すればよい。このようなモノクロ−ナル抗体はいずれも、特異性が同一である前記抗体のいずれかまたはその双方として本発明において使用することができる。一般的にいって、一つの抗体をある基質、即ち固体または粒状の支持体に結合させ、残りの抗体を直接的または間接的標識に結合させる。
本発明に使用する第二の抗体は、細菌性コラゲナ−ゼで処理したコラ−ゲン（ＣＴＣ）で免疫化し、次いで選別した一種のペプチド配列、例えば下記するような、配列ＥＫＡＨＤＧＧＲの上流（即ち、Ｎ−末端方向に）位置するコラ−ゲン配列から選別したペプチド配列と反応性を有する抗体を分泌させることによって産生せしめたモノクロ−ナル抗体であってもよい。この場合好ましくは、当該配列は免疫原性配列ＦＤＦＳＥＬを包含するものである。かかる目的のために好ましいペプチドは、この配列ＦＤＦＳＥＬにその一端またはより好ましくはその両端においていくつか付加的アミノ酸をプラスしたもの、例えばＣＳＡＧＦＤＦＳＦＬＰＱＰＰＱＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）を含むペプチドである。
またはその代わりに、免疫化を公知の技法に従って当該ペプチドそれ自体を適当なキャリア−に複合させたもので実施してもよい。
エピト−プが二つとも同一のアミノ酸配列、例えばＥＫＡＨＤＧＧＲまたはその変異体に含まれている場合は、抗体は二つとも同一であるかまたは同一の態様で産生させればよい。
モノクロ−ナル抗体の製造方法は、当該技術分野においてすでに公知となっている。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａ．Ｍ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＶｏＩ．１２（１９８６）を参照のこと。合成ペプチドまたはその異性化若しくはラセミ化変異体に対する抗体を免疫化によって製造することも可能である。しかし、かかる化合物の分子量は比較的小さいためにハプテンをキャリア−分子に複合させることが好ましい。適当なキャリア−分子としては、以下に限定されないが、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイドやキ−ホルリンペットヘモシアニンなどが挙げられる。好ましいキャリア−は、ウシ血清アルブミンである。かかるハプテンをその最も免疫原性の強い形で免疫化動物の抗体産生細胞に提示するためには、多数の抗体結合プロトコ−ルを使用することができる。適当な方法としては、以下に限定されないが、グルタルアルデヒド、カルボジイミドや過ヨ−ソ酸が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒドおよびカルボジイミドである。・
抗体の製造はまた、自然免疫化を含むコラ−ゲンまたは注入アジュバントによる免疫化を含む従来公知の方法によって実施してもよい。アジュバントの例としては、以下に限定されないが、水酸化アルミニウム、フロインドアジュバントおよび免疫促進複合体（ＩＳＣＯＭｓ）が挙げられる。ＩＳＣＯＭｓは、Ｍｏｒｅｉｎ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：４５７−４６０（１９８４）によって報告されている方法に従って製造することができる。
ハプテン−キャリア−分子に対するモノクロ−ナル抗体またはポリクロ−ナル抗体のいずれも製造することができる。モノクロ−ナル抗体の製造のためには、マウスを免疫化することが好ましい。免疫化した動物の脾臓細胞を採取し、ホモジネートとし、次いでポリエチレングリコ−ルの存在下でガン細胞と融合せしめコラ−ゲン由来の異性化ペプチド断片に対して特異的なモノクロ−ナル抗体を産生する雑種細胞を作成する。適当なガン細胞としては、以下に限定されないが、骨髄腫、肝ガン、ガン腫および肉腫細胞が挙げられる。モノクロ−ナル抗体製造のついての詳細な記載説明は、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ．Ｗ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ、（１９８６）において述べられている。好ましい予備探索プロトコ−ルは、合成ペプチドまたは異性化若しくはラセミ化ペプチドをキャリア−に複合させるかまたはマイクロタイタ−プレ−トの固体表面に塗布したものを使用することからなる。
ポリクロ−ナル抗体の製造については、ことなる動物種を免疫化すればよい。適当な動物種としては、以下に限定されないが、ヒヨコ、ウサギやヤギが挙げられる。ヒヨコとウサギが好ましい。
かくして製造した抗体は、適当な配列を有する合成ペプチドまたはペプチド類縁体を用いて反応性を試験することによって本発明に従って使用するための適否について検索すればよい。
抗体断片は、当該技術分野において公知である方法によって製造される（Ｅ．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ３：２０９−３２７（１９８３）を参照のこと）。
架橋部位の配列に対して相当する天然のコラ−ゲン断片を認識する抗体を産生せしめる能力を実質的に失わせることなく、一つ以上のアミノ酸残基を欠失させるかまたはこ付加させることが可能である。より長いコラ−ゲン断片および／またはキメラペプチド類縁体を使用して、かくしてかかる抗体を産生させることも可能である。また、抗体認識にとって重要ではない一つ以上のアミノ酸を置換することも可能である。
合成ペプチドペプチド類縁体を調製することは、当該技術分野において公知である手法に従って、例えば一般的に”メリフィ−ルド合成”と称される固相ペプチド合成技法によって実施すればよい。また古典的な液相技法も使用出来る。
本発明に従ったサンドウイッチ測定法は、これまで公知のサンドウイッチ測定法の型式の何れによっても実施することができる。かかる方式としては、一種の抗体を固体の支持体に付与し、もう一つの抗体をラジオ−アイソト−プ標識の使用を含む多くの公知の方法の一つで標識化する方式が含まれる。例えばラジオアイソト−プ標識化、蛍光標識化またはＥＬＩＳＡなどの標準的検知プロトコ−ルを用いた免疫測定法を実施するため用いられる抗体および表示試薬は、当該測定法対して必要な成分と使用上の注意を含むキットとして販売供給されているものが好都合である。本発明の一つの実施態様においては、かかるキットは、該当する抗体で塗布されたマイクロタイタ−プレ−ト、標準曲線を作成するための標準溶液、分析試験の品質検査を行うための体液（例えば血清）対照液、セイヨウワサビパ−オキシダ−ゼなどの酵素と複合化するかまたは標識化処理された、検知するべき断片中の第二のエピト−プと反応性を示す第二の抗体、基質溶液、停止液、洗浄緩衝溶液および標準操作法を含んでなる。
二つの抗体とも、例えばラテックスエマルジョンで微小粒子に結合せしめられており、その結果抗体とタ−ゲットとの結合が起きると凝集反応が生起し、光の透過または散乱測定など公知の方法によって観察することができる。
しかしながら、これら二つの抗体は、一つの抗体がマイクロタイタ−またはマイクロビ−ズなどの他の形状固体支持体など捕捉基質と結合する前に試料と混合することもできる。このような使用を行うために、一つの抗体を捕捉基質に親和性を有しているためこれに捕捉される捕捉部位と結合させればよい。もう一つの抗体は直接または間接標識に結合させておくことが好ましい。
かかる捕捉部位は、例えばビオチンであってもよい。ビオチン化された抗体は、アビジンまたはストレプタビジンを有する捕捉基質に捕捉される。
かかる方式を使用することは、各抗体の特異性が同一化または重複していて、検出するべきコラ−ゲン分解断片のそれぞれにおいて同一化または相互に干渉するエピト−プが存在する場合に特に適当である。タ−ゲット断片をかかる抗体のうちの一つに添加すると、エピト−プの双方が第一の抗体に結合し、その結果第二の抗体はこれを添加しても結合することはない。このことは、第一の抗体を固体表面に固定化した場合でも起こり得る。抗体の双方とも同時にタ−ゲット断片と混合した場合、第一の抗体、タ−ゲット断片および第二の抗体とを含むサンドウイッチを生成させることができる。このサンドウイッチを次に一つの抗体の表面に存在する捕捉部位を介して捕捉基質に結合せしめられ、かくして捕捉されたサンドウイッチを他の抗体の標識を介して検出することができる。従って本発明は、また別の局面において下記することからなるサンドウイッチ測定法を実施する方法を提供する：即ち、
−抗原として少なくとも二つの類似したエピト−プを含む一つのタ−ゲット抗原を前記二つのエピト−プと反応性を有し、捕捉部位と結合してある第一の抗体と混合し、次いで前記二つのエピト−プと反応性を有し、標識と結合してある第二の抗体と混合し、その結果第一の抗体／タ−ゲット抗原／第二の抗体であるサンドウイッチを形成せしめ、前記第一の抗体の前記捕捉部位に対して親和性を有する捕捉基質に前記サンドウイッチを捕捉させること−および
−第二の抗体の標識を検出することによって前記サンドウイッチの捕捉を測定すること。
免疫測定法は、合成した異性化および／またはラセミ化ペプチド類縁体を使用して構築するため、適当な生物学的液中における相当するコラ−ゲン断片配列の割合・比率を、その個別の数値と全体の数値と合わせて測定することが出来るのである。即ち、かかる測定法を抗体を含めるよう設計し、その結果いくつかのイソアスパラギン酸および／またはラセミ化ペプチド類縁体および選択的には天然のペプチド配列を含む断片を測定するかまたは単一のイソアスパラギン酸および／またはラセミ化ペプチド類縁体の配列またはこれらの如何なる所望の組合せをも測定することが出来るようにしてもよい。
本明細書において特定したペプチドを骨吸収の指標として使用する以外に、同一人から採取した同一のまたは他の適当な生物学的液体中において骨形成のマ−カ−を実質的に同時に測定することによって、骨の代謝平衡を遊離に測定できるのである。”実質的に同時に”なる表現は、同一日、好ましくは４時間以内を意味する。例えば、このようなマ−カ−としては、オステオカルシン（ＢＧＰの骨ＧＬＡタンパク質としても知られている）、Ｉ型プロコラ−ゲンのプロペプチド、骨アルカリ性ホスファタ−ゼおよび全アルカリ性ホスファタ−ゼが挙げられる。これらのマ−カ−を測定する方法は、例えばＤｅｌｍａｓ、Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．（１９８６）１：３３３−３３７において見出すことができる。
本発明の測定法は、分解が生起した場合コラ−ゲン由来ペプチドおよび異性化および／またはラセミ化ペプチド類縁体を生成する組織の代謝状態を決定するための一つの指標を提供するものであり、多くの状況において有用である。かかる測定法は、過剰の骨吸収を示す被験者の異常な病状を判定するために使用してもよい。このことは、骨粗しょう症の症状または悪性疾患の転移進行の存在を明らかにする可能性もある。過剰の骨吸収によって特徴ずけられる他の病状としては、パジェット病や上皮小体機能亢進症が挙げられる。
添付する図面は本発明の方法によって得られた結果を示すものである。：
図１は、実施例５において得られた補正曲線を示す；
図２は、実施例６において本発明に従って測定した結果を示す；
図３は、実施例６において得られた比較デ−タを示す。
本発明の実施を下記する実施例によって具体的に説明する。
実施例１
本発明は、血清中においては、ＥＫＡＨＤＧＧＲなる配列または上記したごときその変異体に存在するエピト−プを包含しかつその分子量が以前尿中において確認された断片よりも大きいコラ−ゲン断片がいくつか存在するため、かかる血清断片がサンドウイッチ測定法において第二の抗体の対象となる付加的なアミノ酸残基を含むことが証明される、という知見に部分的に基づくものである。かくして発見された上記したコラ−ゲン断片は、骨吸収の過程において産生されるものであり、従ってかかる断片の定量は、骨損失の速度を推定するために利用可能である。かかるテロペプチド断片の副集団は、これまでに測定されたことはなかった。
このようなコラ−ゲンのより大きい抗原断片が存在することを、本実施例において証明することとする。
非異性化Ｌ−アスパラギン酸を含有するアミノ酸配列であるＥＫＡＨＤＧＧＲに対して産生させたモノクロ−ナル抗体ＭａｂＡ７と反応性を有する抗原は、前記抗体を用いて親和性により精製した。かかる抗原の供給源として血清と尿を用いて、別の精製も行った。
親和性により精製した尿抗原２００μｌを４℃にてス−パ−デックスＴＭ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ＨＲに適用した。溶出は、流速をほぼ０．３ｍｌ／ｍｉｎとして行ったが、１ミリリットルフラクションを集め、各フラクションの１５μｌを被覆したプレ−トに移し、ＣｒｏｓｓＬａｐｓTM尿ＥＬＩＳＡにて測定した。
用いたＣｒｏｓｓＬａｐｓTM測定法は、ポリクロ−ナル抗体血清を利用した競合測定法であって、ＥＫＡＨβＤＧＧＲなる配列を有するペプチドを、マイクロタイタ−プレ−トのウエルに固定化し、試料のコラ−ゲン断片に対して産生させた血清中の抗体に対して競合する測定法である。血清抗原は、同様にして分析した。
ヒト尿抗原は、１７ｍｌ当りの充分に限定された（狭い）ピ−クに溶出されるように思われた。相当する血清抗原（６Ｅ−セファロ−スデ親和性精製された）は、それより直前に１６ｍｌにて溶出されたが、ピ−クはより幅が広かった（１３−１８ｍｌ）。
これらの結果から、尿抗原の分子量は均質性が高いことおよび血清は分子量が尿中のものより大きい抗原の集団を含んでいることが明らかとなった。これらの血清抗原は、下記する実施例において更に詳細に検討することとする。
実施例２
健常な２４才の男性ドナ−から採取したヒト血清（ＨＳ）９０ｍｌをうず巻き混合器で混合し、それぞれが５ｍｌずつの均等量のプ−ル１８個に分注した。三つの分注液をＥＬＩＳＡ測定を行うまで４℃に保持した。残りの１５個の分注液は、ＳｐｅｃｔｒｕｍTM透析チュ−ブ（ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒTM）にて４℃で四日間ＰＢＳに対して強度に透析処理した。
三つの分注液を分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１０００Ｄａのチュ−ブで透析し、また三つの分注液をＭＷＣＯが３５００Ｄａのチュ−ブで透析し、さらに三つの分注液をＭＷＣＯが５０００Ｄａのチュ−ブで透析し、三つの分注液をＭＷＣＯが１００００Ｄａのチュ−ブで透析しまた三つの分注液をＭＷＣＯが２５０００Ｄａのチュ−ブで透析した。血清試料を透析の前後で秤量して試料の容量変化を測定した。最後に、全ての分注液を二種類の血清ＥＬＩＳＡ（α−ＣＬＳ、β−ＣＬＳ）で測定し、保持液中での抗原回収量を測定した。このα−ＣＳＬ測定法は直鎖のペプチドであるＥＫＡＨＤＧＧＲを含む断片を測定するものであいＲ、他方β−ＣＳＬは異性化型を含む断片に対して特異的である。
ＣｒｏｓｓＬａｐｓＴＭ血清（β−ＣＳＬ）による抗原性は、ＭＷＣＯが１０００Ｄａのチュ−ブでの透析後に得られた保持液中では有意に減少しなかった（５％以下の減少）ので、全てのβ−ＣＳＬによる抗原は大半が分子量が１ｋＤａ以上であることおよび如何なる抗原も透析膜への付着で”失われる”ことはなかったことが明らかとなった。逆に、β−ＣＳＬによる抗原性の６０パ−セントは、ＭＷＣＯが５０００Ｄａであるチュ−ブでの透析後に失われ、また７０パ−セント以上がＭＷＣＯが１００００Ｄａであるチュ−ブでの透析で失われ、またβ−ＣＳＬによる抗原性の８０パ−セントがＭＷＣＯが２５０００Ｄａである場合に失われたので、その結果ＣｒｏｓｓＬａｐｓTM血清抗原の副集団（２０％）は高分子量部であることが明らかとなった。同様に、ある程度のα−ＣＳＬ抗原（ほぼ１０−１５％）がＭＷＣＯが２５０００であるチュ−ブ内に残留しているので、高分子量のα−ＣＳＬの抗原が存在することが明らかとなった。しかしながら、α−ＣＳＬ抗原性の７０パ−セント以上は、ＭＷＣＯが５０００ダルトンのチュ−ブでの透析を行った後失われおり、α−ＣＳＬ抗原の少なくとも７０パ−セントが低分子量部（＜５ｋＤａ）であることが明らかとなった。
以前の研究結果から、ＣｒｏｓｓＬａｐｓTM測定法で反応性を有する、尿中のコラ−ゲン断片の分子量はほぼ２０００Ｄａであることが判っている。
実施例３
ＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲ特異的モノクロ−ナル抗体の製造
モノクロ−ナル抗体を産生する二種の細胞系を、下記する方法で別々に得た：即ち、メスのＢａｌｂ／Ｃ  ｘ  ＣＦ１マウス（８−１２週令）をフロイント完全アジュバントおよびカルボジイミド法でＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲをチログロブリン（１００ｍｇ／Ｌ）に複合接合させたものとの乳化液の２０ｕｌを腹腔内投与して免疫化した。この複合体とアジュバントとは、当容量で混合した。免疫化は、二週間ごとにフロイント不完全アジュバントを用いて６回繰り返した。注入の三日前に、ＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲをチログロブリンに複合接合させたもの１００ｕｌを用いて腹腔内注入してマウスに対して追加免疫刺激した。脾臓細胞とＡＴＣＣ  Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｋｅｒａｎｅｙ、ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−５０（１９７９））骨髄種細胞とを、ヒト内皮細胞培養上澄液をフィ−ダ−細胞（Ａｓｔａｌｄｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１４１１−１（１９８））の代わりに使用した以外は前記した同様に５０％ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ  ４０００  ＧＫ）によって融合した。
モノクロ−ナル抗体の探索
ハイブリド−マ上澄液を測定緩衝液（３００ｍｍｏｌ／ｌ  ＴＲＩＳ、１０ｇ／ｌウシ血清アルブミン、５ｇ／ｌトウエ−ン２０；ｐＨ＝８．０）で希釈し、グルタルアルデヒド法でＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲをＢＳＡに複合結合させたものかまたはヒト骨由来の非複合コラ−ゲナ−ゼ処理コラ−ゲン（ＣＴＣ）で被覆したマイクロタイタ−ウエル（Ｎｕｎｃ、Ｋａｍｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）内で培養した。抗体の結合を次いで、ペルオキシダ−ゼ複合ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて検出した。ＥＫＡＨ−βＤ−ＧＧＲとＣＴＣとに結合する抗体を産生するハイブリド−マをクロ−ンし、次いで増殖させてから、得られたモノクロ−ナル抗体をプロテイン−Ａクロマトグラフィ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して精製した。二種の相異なる融合体から得た二種のモノクロ−ナル抗体を選択し、これらをそれぞれＦ１１０３およびＦ１２と命名した。これら二つのモノクロ−ナル抗体について特異性の検討を行った結果、ＥＫＡＨＤＧＧＲのβ−異性化体に対して同様の反応性を有することが明かとなった。
実施例４
Ｆ１１０３のビオチニル化およびＦ１２の西洋ワサビペルオキシダ−ゼとの結合
ビオチンアミドカプロン酸エステル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢｘＮＨＳ）（０．５９）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液（４ｍｇ／ｍｌ）１４９μｌをプロテイン−Ａで精製したモノクロ−ナル抗体Ｆ１１０３（２．０，ｇ／ｍｌ、ＰＢＳに溶解した）の溶液の５０００μｌ（１９ｍｇ）を添加した．次いで、１ｍｏｌ／ｌのＮａＣＯ3／ＮａＨＣＯ3；ｐＨ＝９．６の５５０μｌを添加して、ｐＨ調節のため最終濃度を０．１ｍｏｌ／ｌとする。抗体とＢｘＮＨＳとの重量比は、１６：１である。この混合物をｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ回転（１２ｒｐｍ）で室温にて２時間培養する。０．２ｍｏｌ／ｌのエタノ−ルアミン９００μｌ（１．５ｍｌ／ｍｇ  ＢｘＮＨＳ）を添加して反応を停止し、室温で１時間培養する。ＰＢＳ緩衝液（１５ｍｌ）を添加し、この調製液を２  ｘ  ５リットルのＰＢＳ緩衝液に対して４℃にて２日間透析する（カットオフ値：１２，０００−１４，０００）。汚濁物質を０．２２μｍの使い捨てシリンジフィルタ−ホルダ−（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて滅菌濾過することによって除去する。西洋ワサビペルオキシダ−ゼとの結合は、ＮａｋａｎｅおよびＫａｗａｏｉの方法（１９７４）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２、１０８４によって行う。この結合体を−２０℃にて保存する。
実施例５
サンドウイッチ測定法の方法
検量物質、比較対照物質および未知の試料（血清または血漿）をストレプタビジンを塗布したマイクロタイタ−ウエルにピペットで移し、ビオチニル化抗体とペルオキシダ−ゼ結合抗体を混合する。次いで、試料中の分析物、ビオチニル化抗体とペルオキシダ−ゼ結合抗体との複合体を精製させ、ビオチン結合体を介してストレプタビジンに結合させる。室温で一段階培養を行ったあと、ウエルを空にし、洗浄する。発色性基質を添加し、次いで硫酸で発色反応を停止し、４５０ｎｍで測定する。
全ての溶液は、使用に先立って室温（１８−２５℃）にて平衡化する。測定を開始する前に、ビオチニル化抗体とペルオキシダ−ゼ結合抗体とを測定用緩衝液（５０ｍＭ  りん酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、％ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；ｐＨ＝７．０）で希釈する。検量物質、比較対照物質または未知の試料の何れかの５０μｌをストレプタビジンを塗布したマイクロタイタ−ウエルにピペットで移し、次いで抗体溶液を１００μｌを加える。この混合物を室温で１２０分間培養する。マイクロウエルを２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、８０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ＝７．５で洗浄する。発色性基質溶液（例えば、ＴＮＢまたはＡＴＢＳＲ０）の１００μｌを各マイクロウエルにピペットで移す。この基質溶液を１５分間培養し、０．１８ｍｏｌ／ｌの硫酸１００μｌで反応を停止する。４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
ビオチニル化抗体Ｆ１１０３とペルオキシダ−ゼ結合抗体ＰＯＤ−Ｆ１２を用いて上記した手順をたどって実施する。この測定法を添付図面の各図においては”一段階ＣｒｏｓｓＬａｐｓ（またはββＸＬ）ＥＬＩＳＡ”と称する。試料として、尿のＨＭＣから分別したフラクションを使用したが、各フラクションは、式Ｉで表される架橋断片の異性体であって、ペプチドまたはペプチド類縁体鎖が（１）二つともＤにおいてα結合しているか、（２）一つはαであってもう一つはβ結合しているかまたは（３）二つともβ結合している異性体型の一つを含んでいる。
この測定法は実質的に、式Ｉで表される化合物のα、αまたはα、β型に応答する能力を全く有していないのであるが、β、β型に対しては試料の濃度依存的態様で応答したのである。
検量物質としてコラゲナ−ゼ処理コラ−ゲン溶液（ＣＴＣ）を使用して作成した検量線を図１に示し、また式１で表される三種類の異性体を二種の濃度で含有する試料を試験した結果を下記する表１に示す。
0003913787.tif 000004
実施例６
治療前と９カ月間のビホスホネ−ト治療を受けた閉経婦人から採取した尿試料を実施例５の方法（β−βＥＬＩＳＡ）に従ってまたアミノ酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲのβ異性体型を認識するポリクロ−ナル抗体血清を使用する競合測定法である公知の測定法（ＣｒｏｓｓＬａｐｓTM）によって測定した。
得られた結果を図２および図３に示す。本発明に従ったＥＬＩＳＡ法は、骨吸収低減療法の効果を成功裡に追跡することが明かである。
配列表
（１）  一般情報
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：オステオメ−タ−  ビオテク  Ａ／Ｓ
（Ｂ）町名：オステオパ−ク、フルレフフ−ヘトガ−デ  ２０７
（Ｃ）市：フルレフ
（Ｄ）国名：デンマ−ク
（Ｅ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＤＫ−２７３０
（ｉｉ）発明の名称：Ｉ型コラ−ゲン断片のサンドウイッチ測定法
（ｉｉｉ）配列の数：７
（ｉｖ）コンピュ−タ読み出し可能型式：
（Ａ）媒体型：フロッピディスク
（Ｂ）コンピュ−タ：ＩＢＭ  ＰＣ互換型
（Ｃ）オペレ−ティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア−：パテントインＲｅｌｅａｓｅ  ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＃１．３０（ＥＰＯ）
（ｖｉ）先行出願デ−タ：
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９７０５６８７．３
（Ｂ）出願鼻：１９９７年３月１９日
（ｖｉ）先行出願デ−タ：
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９６２５５５９．１
（Ｂ）出願日：１９９７年１２月９日
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸８個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（Ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003913787.tif 000005
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸７個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003913787.tif 000006
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸１１個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003913787.tif 000007
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸８個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ〇
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003913787.tif 000008
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸８個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｉｘ）  特徴
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｔｅ
（Ｂ）  ＬＯＣＡＴＩＯＮ：６
（Ｃ）その他の情報：／ｐｒｏｄｕｃｔ−”ＸａａはＤ−アスパラギン酸はである”
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003913787.tif 000009
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸１６個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003913787.tif 000010
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：アミノ酸６個
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：一本鎖
（Ｄ）トポロジ−：線状
（ｉｉ）分子種：ペプチド
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）断片種：ｉｎｔｅｒｎａｌ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003913787.tif 000011
【図１】
0003913787.tif 000012
【図２】
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【図３】
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