(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソラムネチン３−Ｏ−ロビノビオシドあるいはその薬学的に許容せられる溶媒和物を有効成分として含有するテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
排尿障害、前立腺肥大症または前立腺癌のいずれかの予防若しくは治療に用いられるためのものであることを特徴とする請求項１記載のテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は，イソラムネチン３−Ｏ−ロビノビオシドあるいはその薬学的に許容せられる溶媒和物を有効成分として含有するテストステロン５α−リダクターゼ阻害剤、更にはそれらを用いた排尿障害、前立腺肥大症または前立腺癌の予防剤若しくは治療剤に関する。
【０００２】
ここで薬学的に許容せられる溶媒としては水，エタノール，ｎ−プロパノール，イソプロパノール，ｎ−ブタノール，イソブタノール，第２ブタノール，第３ブタノール等炭素数２〜４のアルコール，またはこれらの混合物であることが好ましい。
【０００３】
【従来の技術】
従来，日本人は欧米人に比べ前立腺疾患の頻度は低いとされてきたが，近年，前立腺肥大症，前立腺癌等の患者は増加している。前立腺肥大症は，男性の加齢と共に前立腺が肥大する疾患で，夜間頻尿，尿勢の減弱，頻尿，排尿中断，残尿感などを伴う。排尿障害の主原因は，前立腺肥大症に伴う肥大した前立腺による尿道の機械的圧迫と，交感神経活性の亢進による前立腺及び尿道の機能的収縮によると考えられる。前立腺肥大症の患者数は，潜在患者を含めると５５歳以上の５人に１人といわれるくらい多く，平均寿命の延長，高齢化社会の到来と共に増加傾向にあり，平成７年７月１０日の薬事日報によると，２００５年の前立腺肥大症患者は１９９０年の２８９％に達すると予測されている。そして，前立腺肥大症患者における前立腺癌になる確率は，対照に比べ４倍であるとの報告もある［Ａｒｍｅｎｉａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２，ｐ１１５（１９７４）］。
【０００４】
前立腺肥大症，前立腺癌等の発症または憎悪には過剰なジヒドロテストステロンが関与し，この高いアンドロゲン作用を有するジヒドロテストステロンは，テストステロン５α−リダクターゼの代謝によって男性ホルモンの一種テストステロンがら生じる。また，前立腺及び尿道の機能的収縮に伴う排尿障害は，交感神経の緊張，特に前立腺に多く分布するα１Ｃ−レセプターによる作用であることがわかっている。よって，テストステロン５α−リダクターゼの阻害及びα１Ｃ−サブタイプを選択的にブロックする薬剤は，これら前立腺疾患の治療剤として有用である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで前立腺疾患の治療は，ステロイド性の抗アンドロゲン剤による薬物療法か，α１阻害剤など肥大に伴う自覚症状を改善する対症療法，または手術しかなかった。しかし，抗アンドロゲン剤は女性化するために長期使用が不可能であり，性欲の減退やインポテンスを高頻度に併発したり，注射部位の硬結等を高頻度に発現する。また，α１遮断剤では，血管のα１受容体の阻害によるめまい，血圧降下等が報告されている［薬局，４５（６），ｐ１３８５（１９９４）；ｉｂｉｄｅｍ，４５（６），ｐ１３９３（１９９４）］。
【０００６】
最近，特異的なα１遮断薬としてタムスロシンが開発されたが［化学と工業，４８（９），ｐ１０６０（１９９５）］，急速な薬物血中濃度の上昇を避けるための投与形態の問題が指摘されている。また，ステロイド構造を有する薬物，フィナステリド（ＭＫ−９０６，Ｍｅｒｃｋ，米国特許４７６００７１）が開発中であるが，好ましくないホルモン様副作用がある。よって，ステロイド構造を有さない非ステロイド性の治療剤として，テストステロン５α−リダクターゼ阻害剤は，血中テストステロンが低下，中枢抑制，性生活に及ぼす影響の副作用が少なく，効果が優れ，かつ投与形態の適用が容易等の理由で，開発が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは，長年にわたる天然の抽出物中の有効成分やその薬理作用の研究に基づき，前立腺肥大症の原因酵素であるテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を有する物質を提供すべく鋭意研究を重ねた結果，臨床で前立腺肥大症治療に効果を示した生薬サボテン［Opuntia ficus - indica (L.) Miller］の花から単離・精製された化合物の中のフラボノイド誘導体であるイソラムネチン３−Ｏ−ロビノビオシドに，前立腺肥大症の原因酵素であるテストステロン５α−リダクターゼを強く阻害する作用があることを見出し，本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明が対象とする化合物はフラボノイド誘導体であって，化学名イソラムネチン３−Ｏ−ロビノビオシド（Isorhamnetin 3- O- robinobioside）であり，この化合物は，強力なテストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を有し，また利尿作用，抗炎症作用等も有している。よって，前立腺肥大症及びそれに伴う排尿障害，前立腺癌等の治療並びに予防に有用である。
【００１１】
テストステロン５α−リダクターゼ阻害作用を有するフラボノイド誘導体は既にいくつか報告されているが（特開平 1-96126号，特開平 7-17858号），本発明化合物は，これらと構造的に異なった化合物である。
【００１２】
すなわち，本化合物の特徴は，フラボノイドの２位フェニル置換基の３’−メトキシ基の存在にあり，この置換基が無いか或いは水酸基である対応化合物，例えば，ケンフェリン，ケンフェロール，ムルチフロリン，ケルセチン，ケルシトリン，ルチン，ヒペリン等のフラボノイド誘導体より数段高い活性を有する。
【００１３】
このフラボノイド誘導体は，天然の植物から単離・精製したものであっても，化学的に合成したものであっても同等のテストステロン５α−リダクターゼ阻害活性を有している。
【００１４】
天然の植物から単離・精製する場合には，一般に，植物を０〜１００℃，好ましくは室温から３５℃で，極性溶媒例えば水，エタノール，ｎ−プロパノル，イソプロパノール，ｎ−ブタノール，イソブタノール，第２ブタノール，第３ブタノール等炭素数２〜４のアルコール類，アセトン，酢酸メチル，酢酸エチル，酢酸イソアミル等の酢酸エステル，アセトニトリル，ジメチルホルムアミド，ジメチルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，Ｎ−メチルピロリドン，ヘキサメチルホスファミド等、とくに好ましくは水、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物で抽出し，カラムクロマトグラフィーにより分画した後，ペーパークロマトグラフィー，薄層クロマトグラフィー，又は，高速液体クロマトグラフィーにより単離・精製する方法が用いられる（一般のフラボノイド類の抽出単離法［Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，４５ｃ，１０８１（１９９０）］）。この場合，所望により薬学的に許容せられる溶媒中で再結晶して精製することが出来、また結晶は溶媒和物として得られることもある。
【００１５】
合成する場合は，一般に対応する有機酸等から縮合剤の存在下でフラボノイド骨格を構築し，次いで，特異酵素を使ってフラボノイドアグリコンから対応する配糖体を容易に合成することができる（フラボノイド類の合成一般法［Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，４６ｃ，ｐ１００３（１９９１）；ｉｂｉｄｅｍ，４８ｃ，ｐ５６３（１９９３）；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（５），ｐ１１３９（１９９４）］）。
【００１６】
本化合物はそのままか，あるいは慣用の製剤担体と共に動物および人に投与することができる。投与形態としては，特に限定がなく，必要に応じ適宜選択して使用され，錠剤，カプセル剤，顆粒剤，細粒剤，散剤等の経口剤，及び注射剤，坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００１７】
以下，本発明についてさらに説明するために具体例を示す。
【００１８】
【実施例１】
単離，同定：
Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｙａｎｇの方法［Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，４５ｃ，ｐ１０８１（１９９０）］に従って，生薬サボテン［Ｏｐｕｎｔｉａｆｉｃｕｓ−ｉｎｄｉｃａ（Ｌ．）Ｍｉｌｌｅｒ］の乾燥した花（７００ｇ）をメタノール２ｌ抽出し濃縮した。その残渣（６３．１８ｇ）を石油エーテル１．５ｌ，次いでジエチルエテル２ｌで洗浄した後，水を溶媒としてポリアミドを担体としたカラムクロマトグラフィーに付し，主波長３６０ｎｍのＵＶランプの紫外線で黄色に発色する画分を分取した。得られた画分に対して０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶媒として，ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを担体としたカラムクロマトグラフィーに付し，前記と同様に紫外線で発色する画分を分取した。更に得られた画分を，東洋ろ紙（Ｎｏ．５１Ａ）を用いてペーパークロマトグラフィーに付し，６０％酢酸を溶媒として展開した後，Ｒｆ値０．８５付近を切取り、その画分を更に薄層クロマトグラフィーに付し，ｎ−ブタノール；酢酸：水（４：１：５）の溶液で展開し，Ｒｆ値０．６７付近のスポットをかきとった。このかぎとり部分にメタノールを加えて混和した後，濾過し，ろ液を濃縮乾固し，６．０９ｇ  の乾固物を得た。この乾固物をジオキサン：水（１：１）の溶液で４回再結晶を行い，淡黄色針状結晶６７０ｍｇの目的物を得た。
【００１９】
構造決定は，完全加水分解により得られたアグリコンと結合糖の同定，ペーパークロマトグラフィー，及び薄層クロマトグラフィーにおけるＲｆ値，ＵＶ吸収スペクトル，部分加水分解等による糖結合位置とその結合様式の同定，及び元素分析，紫外吸収スペクトル，赤外分光分析，１Ｈ−核磁気共鳴分析，１３Ｃ−核磁気共鳴分析，質量分析（ＳＩＭＳ），熱分析等により，イソラムネチン３−Ｏ−ロビノビオシドと同定した。
【００２０】
この化合物の物理化学性質を以下に示す。
融点：１６３．４〜１６８．５℃
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【００２１】
0003978250.tif 000004
【００２２】
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【００２３】
【実施例２】
（１）テストステロン５α−リダクターゼの調製：
成熟したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄性ラット（１１週齢以上）を屠殺して腹部切開し，前立腺を摘出した。前立腺周囲の脂肪組織及び皮膜を取り除いた後，０．３２Ｍ  ショ糖，１．０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む２００ｍＭ  カリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え，細胞破砕機でホモジナイズした。得られたホモジネートを遠心分離により分画して，３，０００×ｇと１４７，６００×ｇのミクロソーム画分を得，それぞれを２０％グリセロール２ｍｌ，０．２５Ｍ  ショ糖及び０．１ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭカリウムーリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し粗酵素液とした。これをそれぞれセファデックスＧ−１００カラムで精製し，酵素液，としてテストステロン５α−リダクターゼの活性測定に供した。
【００２４】
（２）テストステロン５α−リダクターゼの活性測定：
５０ｎＭ  ＮＡＤＰＨ，０．６７ｎＭ  ［１４Ｃ］テストステロン，２０μｌ酵素液，２０ｍＭカリウムーリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）及び本化合物を加え，総量を１２０μｌとした。反応は酵素液を加える時点からスタートし，３０℃で２時間反応させた。２０μｌの６Ｎ塩酸で反応を終了させた後，４００μｌの酢酸エチル（またはｎ−ヘキサン）を加え，反応物と生成物を抽出した。薄層クロマトグラフィーで［１４Ｃ］テストステロンと［１４Ｃ］５α−ジヒドロテストステロン  を分離し，液体シンチレーションカウンターで，［１４Ｃ］テストステロンと［１４Ｃ］５α−ジヒドロテストステロンの放射活性をそれぞれ測定した。
【００２５】
（３）阻害率の計算法：
阻害率（％）は，本化合物を加えない以外は上記と同様にしたものを対照として．下式により算出した。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
上記の数式において，Ａは本化合物を加えない場合の５α−ジヒドロテストステロン生成量，Ｂは本化合物を加えた場合の５α−ジヒドロテストステロン生成量である。
【００２８】
【発明の効果】
本化合物は，フラボノイドの２位のフェニル置換基の３’位にメチル基の無い対照化合物，ケンフェロール，ケルセチンより数段高い活性を有し，前立腺肥大の原因酵素であるテストステロン５α−リダクターゼを用量依存的に強力に阻害した（表１）。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
【実施例３】
ラット前立腺に対する縮小作用：
老齢雄性ＳＤラット（３６週齢，６５０ｇ）に本化合物を２１日間経口投与した。その結果，前立腺の腹部葉及び背部葉の重量は，投与量１．８ｍｇ／ｋｇ／日以上で，対照群に比し有意に減少した（表２）。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【実施例４】
テストステロン５α−リダクターゼの阻害作用：
本化合物を老齢雄性ＳＤラット（３６週齢，６５０ｇ）に２１日間，投与量０．０，０．６，１．８，５．４ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与し，前立腺の腹部葉及び背部葉を摘出し，それぞれのテストステロン５α−リダクターゼの酵素活性を測定した。その結果，投与量０．６ｍｇ／ｋｇ／日以上で，酵素活性は対照群に比し有意に減少した（図１）。
【００３４】
一方，他の臓器（精嚢，副腎，脳下垂体等）の重量，体重及び病理組織学的所見に著変は認めらず，本化合物は内因性及び外因性テストステロンによる前立腺肥大を特異的に抑制することが示された。
【００３５】
【実施例５】
摘出膀胱に対する作用：
摘出した膀胱の自動運動に対して，本化合物は、１０−５Ｍの濃度では明かな影響を及ぼさなかったが，１０−３Ｍに濃度で膀胱の緊張性は軽度低下した。また，本化合物１０−５Ｍを，収縮剤であるアセチルコリン（１０−５Ｍ）と同時に添加すると，その収縮強度はアセチルコリン単独添加より１．５〜２倍高かった。
更に，５．４ｍｇ／ｋｇ／日の用量で本化合物を２１日間経口投与した老齢雄性ＳＤラットの膀胱を摘出して，その自動運動を測定した。その結果，生理食塩水だけ投与した対照群より２倍以上の弛緩強度が見られた。
【００３６】
以上の結果から，本化合物は，膀胱に対しては直接的に作用して弛緩させ，尿容量が増加できると同時に，コリン作動性及び筋親和性の作用と異なる機序で膀胱の収縮を促し，排尿機能を改善させるものと考えられる。
【００３７】
【実施例６】
浮腫に対する作用：
本化合物をＳＤラットに経口投与し，１時間後に起炎物質である卵白アルブミンを皮下投与して，容積法を用いて浮腫を測定した結果，卵白アルブミンの急性浮腫に対し，本化合物５．４ｍｇ／ｋｇの経口投与により，４．６〜１２．２％の抑制作用を示した。
【００３８】
【実施例７】
肉芽増殖抑制作用：
１．５ｍｇのカナマイシンを含有する０．３ｍｌの生理食塩液を浸漬した濾紙ペレットをＳＤラットに皮下挿入した後，本化合物を７日間経口投与した結果，濾紙ペレット法による肉芽増殖に対し，本化合物５．４ｍｇ／ｋｇ日により，湿潤重量で１７．６％，乾燥重量で１５．１％の抑制作用を認めた。
【００３９】
【実施例８】
毒性試験：
次に，本化合物の急性毒性試験をＩＣＲ系雄性マウスを用いて行った結果，１．０ｇ／ｋｇの経口投与で死亡例はなく，安全性の高い薬物であった。
このように，本化合物は極めて毒性が低く，安全性の高いものである。
【００４０】
【実施例９】
カプセル剤の製造例：
【００４１】
【表３】
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【００４２】
本化合物，乳糖及びデキストリンを均一に混合し，圧縮成型したのち粉砕し，ステアリン酸マグネシウムを混ぜた表３に示す処方の混合物を３号硬ゼラチンカプセルに充填し，カプセル剤を製造した。この１カプセルには，本化合物２０ｍｇが含有されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，ＳＤラットに，本化合物を投与量，０．０，０．６，１．８，５．４ｍｇ／ｋｇ／日で２１日間経口投与した後，前立腺の腹部葉及び背部葉を摘出し，それぞれのテストステロン５α−リダクターゼの酵素活性を測定した時の結果である。
【図１】
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