(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーマトリックスに酵素を固定化する酵素固定化方法であって、
少なくとも１つの酵素が、水の存在下で、水溶性の又は助剤なしで水に乳化可能なプレポリマーに混合され、
前記プレポリマーは、主鎖、前記主鎖に直接形成されるか又は側鎖に形成されている極性の親水基、及び架橋可能な反応基を有し、
前記主鎖は、ポリエステル、ポリアミド、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリアクリレート、ポリメタクリレートのグループから選択される疎水性の鎖を有し、
前記極性の親水性基は、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、ヒドロキシル基、アルコキシル基のグループから選択され、
前記架橋可能な反応基は、β−ジケト基、第２級アミノ基、保護されたイソシアネート基、エポキシ基、シラノール基、エステル基から選択され、
混合させられた前記プレポリマーは、室温以上７０℃以下の反応温度で、前記反応基を介して架橋し、前記水の蒸発の後、３次元に架橋した疎水性ポリマーマトリックスを生成し、その中に前記酵素が埋め込まれる酵素固定化方法。
【請求項２】
前記反応温度が４０℃以下である請求項１に記載の酵素固定化方法。
【請求項３】
前記プレポリマーと前記酵素とが、前記酵素の機能に悪影響を及ぼさないで架橋することを特徴とする請求項１又は２に記載の酵素固定化方法。
【請求項４】
前記主鎖が、重合したアクリル酸、重合したメタクリル酸、ポリヒドロキシアルキルアクリレート及びポリヒドロキシメタクリレートとからなる群から選ばれる極性の鎖を有する請求項１〜３のいずれかに記載の酵素固定化方法。
【請求項５】
プレポリマーとしてエナミン架橋するプレポリマーが用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵素固定化方法。
【請求項６】
前記プレポリマーが、ポリアクリレート又はポリメタアクリレートである請求項５記載の酵素固定化方法。
【請求項７】
酵素としてオキシドレダクターゼのグループから選択された酵素が用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の酵素固定化方法。
【請求項８】
酵素としてグルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4)、ラクテートオキシダーゼ(EC1.1.3.2)又はアスコルベートオキシダーゼ(EC1.10.3.3)が用いられることを特徴とする請求項７に記載の酵素固定化方法。
【請求項９】
酵素としてヒドロラーゼのグループから選択された酵素が用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の酵素固定化方法。
【請求項１０】
酵素としてウレアーゼ(EC3.5.1.5)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)又はクレアチニナーゼ(EC3.5.4.21)が用いられることを特徴とする請求項９に記載の酵素固定化方法。
【請求項１１】
ポリマーマトリックスに酵素を固定化してある固定化物質において、
前記ポリマーマトリックスを構成するためのプレポリマーが、水溶性又は助剤なしで水に乳化可能であるとともに、
前記プレポリマーは、主鎖、前記主鎖に直接形成されるか又は側鎖に形成されている極性の親水基、及び架橋可能な反応基を有し、
前記主鎖は、ポリエステル、ポリアミド、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリアクリレート、ポリメタクリレートのグループから選択される疎水性の鎖を有し、
前記極性の親水性基は、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、ヒドロキシル基、アルコキシル基のグループから選択され、
前記架橋可能な反応基は、β−ジケト基、第２級アミノ基、保護されたイソシアネート基、エポキシ基、シラノール基、エステル基から選択され、
前記架橋可能な反応基が、室温以上７０℃以下の反応温度により反応して、その中に前記酵素が埋め込まれた３次元架橋構造を形成することを特徴とする固定化物質。
【請求項１２】
前記反応温度が４０℃以下である請求項１１に記載の固定化物質。
【請求項１３】
前記主鎖が、重合したアクリル酸、重合したメタクリル酸、ポリヒドロキシアルキルアクリレート及びポリヒドロキシメタクリレートとからなる群から選ばれる極性の鎖を有する請求項１１又は１２に記載の固定化物質。
【請求項１４】
前記ポリマーマトリックスはポリアクリレート又はポリメタクリレートであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の固定化物質。
【請求項１５】
酵素としてオキシドレダクターゼのグループから選択された酵素が用いられることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに記載の固定化物質。
【請求項１６】
酵素としてグルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4)、ラクテートオキシダーゼ(EC1.1.3.2)又はアスコルベートオキシダーゼ(EC1.10.3.3)が用いられることを特徴とする請求項１５に記載の固定化物質。
【請求項１７】
酵素としてヒドロラーゼのグループから選択された酵素が用いられることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに記載の固定化物質。
【請求項１８】
酵素としてウレアーゼ(EC3.5.1.5)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)又はクレアチニナーゼ(EC3.5.4.21)が用いられることを特徴とする請求項１７に記載の固定化物質。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれかに記載の固定化物質を、担体層に備えたバイオセンサーにおいて、
前記担体層が、前記固定化物質のプレポリマーとの架橋に関して反応性の少なくとも１つの架橋可能基を有するように化学的に変性され、固定化物質との間の結合を良好にしてあるバイオセンサー。
【請求項２０】
固定化物質が複数層状に配置されて設けられており、夫々の固定化物質を、異なる酵素を備えている以外は、同じポリマー材料で構成してあることを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
層状に配置された固定化物質の少なくとも１つが複数の酵素を含んでいることを特徴とする請求項２０に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
前記固定化物質内に触媒活性を有する粒子又は荷電伝導する伝導性粒子、或いはその両方の粒子が含まれていることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
前記触媒活性を有する粒子が貴金属コロイドや貴金属顔料であることを特徴とする請求項２２に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
前記伝導性粒子が、黒鉛、ガラス状カーボン、又は活性炭からなることを特徴とする請求項２２又は２３に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリマーマトリックスに酵素を固定化するための方法と、この方法によって製造された固定化物質と、この固定化物質を用いたバイオセンサーとに関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素及び他の反応性生体物質の固定化とこれに関連する診断用センサー素子への実用化のためには複数の方法があり、以下に簡単に提示する。
次の固定化方法が今日までに知られており、課題に応じて技術的に利用されている：
Ａ）化学的結合による生体物質の固定化
1)担体に対して
2)２官能架橋剤を用いたクロス架橋により
3)ポリマー架橋法で
Ｂ）活性表面への生体物質の吸着結合
Ｃ）物理的な埋め込みによる生体物質の固定化
Ｄ）ハイブリッド法
以下、Ｃ）項による物理的な埋め込みによる固定化の種々な方法に重き関心をもち、その方法に内在する問題に詳しく立ち入ることにする。これは本発明がこの領域に適用されるからである。
【０００３】
この種の固定化の際、生体物質、例えば酵素が肉眼視できるレベルから分子レベルまでの埋め込みマトリックスの空洞に入れられる。
次の方法が知られている：
ａ）酵素にとって非浸透性の２つの膜（例えばセロファン）の間に酵素を入れる。
ｂ）架橋可能なポリマーに酵素溶液の乳化物を与える−この酵素溶液はポリマーマトリックス内での架橋の後液滴形状となる。
ｃ）架橋したないしは架橋していないポリマー内での酵素結晶懸濁。
ｄ）架橋していないポリマー内で酵素ミクロ領域がポリマー−水−格子に酵素を溶解することにより作ることが可能、その際少なくとも高分子ポリマーは乾燥時に軟化剤に似た膜形成助剤の添加により広範囲に、酵素ミクロ滴に通過される、一様な熱可塑性層に変化させられる（例えば、WO89/07139のポリマー分散を参照）。
ｅ）膨潤化された樹脂マトリックス（ポリＨＥＭＡ、ポリアクリルアミド架橋体）へ移動による生体物質の送り込み。
ｆ）水性の酵素−ポリマーシステムでのポリマー沈殿による生体物質の送り込み。
ｇ）重合化による架橋可能な水溶性親水性ポリマー（例えば、ＵＶ硬化ポリビニルアルコール）への酵素の注入による生体物質の固定化。
ｈ）ナノレベルのカプセル及び細胞ゴーストでの生体物質のカプセル化。
【０００４】
これらの方法は生体物質の種類と適用に応じて短所と長所がある。一般的な短所として次のことが挙げられる：
ａ）スリット内での一様な酵素分布と密封性、トランジューサへの固定、膜特性への依存性
ｂ，ｃ）触媒やモノマーなどのような架橋助剤による酵素の不活性化、さらに埋め込みにとって問題となるポリマー材料は親水性基体に対して難浸透性である  ｄ）この種の固定化に対してｂ）とｃ）で述べた同じ欠点が言える、さらに長時間液体接触すると多かれ少なかれ膜形成過程の強い逆戻りが起きる、すなわちポリマー層がにごり、バイオポリマーに対して浸透性となり、さらには再びラテックス懸濁に変わる。
ｅ，ｆ）膨潤化に適する溶剤がたいてい酵素不活性化を導くか、或いは同様なポリマーが本来極性をもつはずであるから、水内でも酵素移動に関して無視できない膨潤を起こす。ここで用いられているポリマーでは架橋されていないシステムが用いられているので、移動はマトリックス緩和過程において分子鎖の方向転換によりすでに生じる。
ｇ）架橋化反応のために必要なラジカル発生剤ないしは架橋の開始時に用いられる大きなエネルギー放射は酵素活性に大きな悪影響を与える。この関係でこれまで知られた親水性ポリマーは、−その際まず変性されたポリビニルアルコールが挙げられる−架橋化された状態できわめて強い膨潤を起こし、さらにその架橋度は酵素プレポリマー膜の水分含有量に依存する。
ｈ）この方法は文献から知られており、いずれにしても大きな技術的負担が要求される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
長期にわたって安定するバイオセンサーは、一方では高い活性度を有し、他方では湿気状態に置かれても良い安定性を有する酵素層を必要とする。従って、生体物質の固定化のためには次の仕様が要求される：
１）この種の反応層への生体物質の大量注入可能なこと
２）固定化の際、活性損失がないこと（又はわずかなこと）、すなわち反応性架橋剤、ラジカル発生剤、重金属触媒を避けること、及び悪影響を与えるモノマーや溶剤を避けること
３）慎重な条件下での固定化、すなわちできるだけ低い温度で、及び大きなエネルギー放射を避ける
４）酵素移動を同時に最小にする際できるだけ高い分析体浸透性を保証すること
５）酵素の機能のために最適な第３構造の保持
６）微生物被害の可能性を排除すること
７）生体媒体との互換性の保証
８）接着問題（酵素固定化物質−検出ユニット）の最小化、固定化の高い再生度
９）簡単な製造技術の保証
１０）この製造技術を改変可能なものとすること
【０００６】
本発明の課題はできるだけ全ての上記要求を広範囲に満たすことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明に係る酵素固定化方法の特徴手段は、請求項１に記載しているように、ポリマーマトリックスに酵素を固定化する酵素固定化方法であって、少なくとも１つの酵素が、水の存在下で、水溶性の又は助剤なしで水に乳化可能なプレポリマーに混合され、前記プレポリマーは、主鎖、前記主鎖に直接形成されるか又は側鎖に形成されている極性の親水基、及び架橋可能な反応基を有し、前記主鎖は、ポリエステル、ポリアミド、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリアクリレート、ポリメタクリレートのグループから選択される疎水性の鎖を有し、前記極性の親水性基は、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、ヒドロキシル基、アルコキシル基のグループから選択され、前記架橋可能な反応基は、β−ジケト基、第２級アミノ基、保護されたイソシアネート基、エポキシ基、シラノール基、エステル基から選択され、混合させられた前記プレポリマーは、室温以上７０℃以下の反応温度で、前記反応基を介して架橋し、前記水の蒸発の後、３次元に架橋した疎水性ポリマーマトリックスを生成し、その中に前記酵素が埋め込まれる点にある。
上記特徴手段において、請求項２に記載しているように、前記反応温度が４０℃以下であることが好ましく、
又、請求項３に記載しているように、前記プレポリマーと前記酵素とが、前記酵素の機能に悪影響を及ぼさないで架橋することが好ましく、
又、請求項４に記載しているように、前記主鎖が、重合したアクリル酸、重合したメタクリル酸、ポリヒドロキシアルキルアクリレート及びポリヒドロキシメタクリレートとからなる群から選ばれる極性の鎖を有することが好ましく、
又、請求項５に記載しているように、プレポリマーとしてエナミン架橋するプレポリマーが用いられることが好ましく、
又、請求項６に記載しているように、前記プレポリマーが、ポリアクリレート又はポリメタアクリレートであることが好ましく、
又、請求項７に記載しているように、酵素としてオキシドレダクターゼのグループから選択された酵素が用いられることが好ましく、
ここで、請求項８に記載しているように、酵素としてグルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4)、ラクテートオキシダーゼ(EC1.1.3.2)又はアスコルベートオキシダーゼ(EC1.10.3.3)が用いられることが好ましく、
又、請求項９に記載しているように、酵素としてヒドロラーゼのグループから選択された酵素が用いられることが好ましく、
ここで、請求項１０に記載しているように、酵素としてウレアーゼ(EC3.5.1.5)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)又はクレアチニナーゼ(EC3.5.4.21)が用いられることが好ましい。
本発明に係る固定化物質の特徴構成は、請求項１１に記載しているように、ポリマーマトリックスに酵素を固定化してある固定化物質において、前記ポリマーマトリックスを構成するためのプレポリマーが、水溶性又は助剤なしで水に乳化可能であるとともに、前記プレポリマーは、主鎖、前記主鎖に直接形成されるか又は側鎖に形成されている極性の親水基、及び架橋可能な反応基を有し、前記主鎖は、ポリエステル、ポリアミド、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリアクリレート、ポリメタクリレートのグループから選択される疎水性の鎖を有し、前記極性の親水性基は、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、ヒドロキシル基、アルコキシル基のグループから選択され、前記架橋可能な反応基は、β−ジケト基、第２級アミノ基、保護されたイソシアネート基、エポキシ基、シラノール基、エステル基から選択され、前記架橋可能な反応基が、室温以上７０℃以下の反応温度により反応して、その中に前記酵素が埋め込まれた３次元架橋構造を形成する点にある。
上記特徴構成において、請求項１２に記載しているように、前記反応温度が４０℃以下であることが好ましく、
又、請求項１３に記載しているように、前記主鎖が、重合したアクリル酸、重合したメタクリル酸、ポリヒドロキシアルキルアクリレート及びポリヒドロキシメタクリレートとからなる群から選ばれる極性の鎖を有することが好ましく、
又、請求項１４に記載しているように、前記ポリマーマトリックスはポリアクリレート又はポリメタクリレートであることが好ましく、
又、請求項１５に記載しているように、酵素としてオキシドレダクターゼのグループから選択された酵素が用いられることが好ましく、
ここで、請求項１６に記載しているように、酵素としてグルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4)、ラクテートオキシダーゼ(EC1.1.3.2)又はアスコルベートオキシダーゼ(EC1.10.3.3)が用いられることが好ましく、
又、請求項１７に記載しているように、酵素としてヒドロラーゼのグループから選択された酵素が用いられることが好ましく、
ここで、請求項１８に記載しているように、酵素としてウレアーゼ(EC3.5.1.5)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)又はクレアチニナーゼ(EC3.5.4.21)が用いられることが好ましい。
更に、本発明に係るバイオセンサーの特徴構成は、請求項１９に記載しているように、請求項１１〜１８のいずれかに記載の固定化物質を、担体層に備えたバイオセンサーにおいて、前記担体層が、前記固定化物質のプレポリマーとの架橋に関して反応性の少なくとも１つの架橋可能基を有するように化学的に変性され、固定化物質との間の結合を良好にしてある点にある。
上記特徴構成において、請求項２０に記載しているように、固定化物質が複数層状に配置されて設けられており、夫々の固定化物質を、異なる酵素を備えている以外は、同じポリマー材料で構成してあることが好ましく、
又、請求項２１に記載しているように、層状に配置された固定化物質の少なくとも１つが複数の酵素を含んでいることが好ましく、
又、請求項２２に記載しているように、前記固定化物質内に触媒活性を有する粒子又は荷電伝導する伝導性粒子、或いはその両方の粒子が含まれていることが好ましく、
又、請求項２３に記載しているように、前記触媒活性を有する粒子が貴金属コロイドや貴金属顔料であることが好ましく、
又、請求項２４に記載しているように、前記伝導性粒子が、黒鉛、ガラス状カーボン、又は活性炭からなることが好ましい。
つまり、少なくとも１つの酵素が水溶性の又は助剤なしで水に乳化可能なプレポリマーに混合され、前記プレポリマーは少なくとも広い連鎖にわたって疎水性の主鎖を有し、前記主鎖に直接又は側鎖において極性の親水性基が付着しており、かつ前記酵素と混合されたプレポリマーが室温〜７０℃好ましくは４０℃までの温度で水の蒸発の後、架橋可能な基を介して反応し、３次元に架橋して疎水性ポリマーマトリックスとなり、前記疎水性ポリマーマトリックス内に前記酵素が埋め込まれる。
【０００８】
特に、本発明では、重縮合樹脂や重付加樹脂や重合樹脂のグループから選択されたプレポリマーが用いられ、その主鎖はポリエステル、ポリアミド、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリアクリレート、ポリメタクリレートのグループに属し、その極性親水性基はカルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、ヒドロキシル基、アルコキシル基のグループに属し、その架橋可能な基はモノ又はポリ不飽和の脂肪酸エステル、β−ジケト基、第２級アミノ基、保護されたイソシアネート基、エポキシ基、シラノール基、エステル基である。さらに、場合によって、結果的に極性である主鎖の連鎖は、重合したヒドロキシアルキル−アクリレートないしメタクリレート等及びアクリル酸やメタクリル酸のグループに属する。
【０００９】
ｇ）によるクロス架橋している親水性ポリマーと区別するため、本発明で挙げられた低重合体やプレポリマーは疎水性の、或いは広い連鎖にわたって疎水性とするポリマー主鎖からなり、このポリマー主鎖に直接又はこの主鎖に結合している腺毛状の側鎖のかなり近いところに、そのプレポリマーがなお水溶性、水希釈性、つまり助剤なしで水に乳化する程度に多くの、イオン性（第４級アンモニウム基、アミノ基、カルボキシル基）、または極性（-OH,-O[-(CR2)n-0]m - (n=2-5,m=1-100,R=H, アルキル、アクリル))等をもつ基が存在し、さらに穏やかな条件下で触媒なしでかつ大きなエネルギー放射を使用せず、溶剤の蒸発後自ら弱極性、疎水性で水中にて多少膨潤する３次元架橋されたマトリックスポリマーになるような反応基を含んでいる。
【００１０】
その架橋自体に酵素は関与しないので、本発明によれば、プレポリマーの架橋反応において、酵素の機能に悪影響を及ぼさない酵素の周辺領域も、架橋タイプに応じて、含ませることが可能である。このことは、また、バイオポリマーとイオン基をもつポリマーマトリックスとの間に塩ブリッジを形成し、バイオポリマー安定性効果を与えることも可能である。
【００１１】
ポリマーマトリックスに固定化された酵素からなる固定化物質は、本発明によれば、ポリマーマトリックスの根底となっているプレポリマーが水溶性の又は助剤なしで水に乳化可能であるとともに、少なくとも広い連鎖にわたって疎水性の主鎖を有し、この主鎖に極性親水性基が直接形成されるか又は側鎖内に形成されており、かつプレポリマーが重合化の後３次元網目を形成する架橋可能な基を使っており、この網目内に前記酵素が埋め込まれることによって得られる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この種のバイオポリマー固定化のためには、例えばその分子構造が図１で模式的に示されている、水溶性で架橋可能なラッカー樹脂が特に適していることがわかった。この図示において、疎水性オリゴマー鎖部分には図番１が、親水性連鎖には図番２が、架橋に関する反応基には図番３が付けられている。この物質クラスは、本発明によるプレポリマー特性に相当する特性をもち、すなわちこのプレポリマーは水溶性ないしは水による希釈が可能で、水の蒸発の後膜を形成し、さらなる過程において溶剤を失うことで外部からの助けなしで、つまり、わずかに温度を上げるという穏やかな条件下で機械的に安定であるとともに、わずかに又は適度に膨潤する程度の耐水性を有する、それ自身疎水性のポリマーへと架橋反応する。
【００１３】
乾燥過程と架橋化過程の際、プレポリマーは非常に多くの水を含んでおり、酵素が最適な水和体の形で、すなわち理想的に効果的な形で一体化される。場合によっては起こり得る周辺の固着はこの物質の活性を低下させず、むしろ、目の粗い架橋構造であっても移動化傾向が付加的に減少するということに寄与する。その際、本発明によれば、酵素の分子直径が３次元架橋したポリマーマトリックスのメッシュ幅より１０倍以上大きく、酵素がポリマーマトリックス内に移動阻止されて押さえ込まれる場合、利点をもたらす。
【００１４】
本発明の実施形態において、プレポリマーとしてエナミン架橋しているプレポリマー、好ましくはポリアクリレート又はポリメタクリレートが用いられ、これらは溶媒である水の蒸発により架橋される。
エナミン架橋するポリマーは実質的に多官能第２級アミンで中和されたカルボキシル基やβ−ジケト基をもつポリアクリレートやポリメタクリレートであり、その際そのオリゴマーは水性エマルジョンの形で存在する。それから作られるオリゴマー−バイオポリマー層は溶剤の蒸発でフィルム化して厚みのある無孔マトリックスとなり、これは室温ないしは少し上げた温度（５０℃）で架橋反応して酵素を内在した透明でわずかに膨潤した（２時間湿気にさらして重量増加が最大１５％）ポリマーフィルムとなる。この架橋化の模式図は第２図に示されている。
【００１５】
用いられる酵素としてオキシドレドクターゼのグループから選択された酵素が適しているが、中でもグルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4)、ラクテートオキシダーゼ(EC1.1.3.2)又はアスコルベートオキシダーゼ(EC1.10.3.3)が特に好ましく、さらにヒドラーゼのグループから選択された酵素も適しており、中でもウレアーゼ(EC3.5.1.5)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)又はクレアチニナーゼ(EC3.5.4.21)が特に好ましい。
【００１６】
架橋度及び膨潤性が最小の酵素移動において基質透過性の改良の方向で架橋可能な領域又はグループの含有に関して及びオリゴマー鎖の極性と無極性の比に関して制御可能であること、つまりポリマー鎖及び架橋ブリッジのメッシュ幅と水和性とに関して影響を受けやすいということは、容易に理解できる。
【００１７】
穏やかな架橋化反応の過程で疎水化される、水分蒸発可能な、つまり水で拡散可能なオリゴマーの大きなファミリーとして以下のものが挙げられる：
保護されたシソシアネート基をもつイソシアネート樹脂、加水分解より保護されたエポキシ反応性をもつエポキシ樹脂、本発明によるバイオポリマーの固定化のための能力をもつオリゴマーに相当する特徴をもつハイブリッド樹脂の全て。
既に述べたように、架橋化反応は溶剤を失った後、すなわち反応性基の接近過程において室温ですでに起こっており、いずれにしても付加的に触媒反応を起こさせる必要はない。例えばエナミン架橋するβ−ジケト変性ポリ（メタ）アクリレートのような縮合架橋するシステムでは、少し上げられた温度で明白に強制的な乾燥がみられる。真空処理、ないしは相対的な空気中の湿度の低下は速度及び架橋度にプラスの影響を与える。
【００１８】
水性システムでの長期安定性を有するバイオセンサーの開発にあたっての一般的な問題は、固定化物質と基体との間の接着であり、その際、基体の場合担体表面だけでなく検出素子の表面も問題となる。本発明によるバイオセンサーは、そのセンサーが固定化物質と担体層との間の接着性を良くする目的で固定化物質のプレポリマーとの架橋に関して反応性の架橋可能な基を少なくとも１つ備えるように、化学的に変性が行われた担体層を備えている点で優れている。
【００１９】
酸化乾燥しているプレポリマーの場合、接着性の向上は、例えば基体をエステル又はアミドを介した不飽和脂肪酸（２重結合をもった脂肪酸）の固定化により変性することによって実現する。
酵素固定化層とイオン感応電極との組み合わせは、例えば臨床に関連する物質の酵素分解の際、適当なイオン感応電極で測定できるイオンが生じるなら、意味をもつ。普通の方法ではこの種の電極の反応素子はＰＶＣ、可塑剤、そして適したイオン物質の混合から構成される。もしこの種のイオン感応膜を酵素層のプレポリマーとの架橋に関係して反応性にする場合は、その膜のＰＶＣ成分を変性した、すなわち普通のＰＶＣの代わりに反応性にしたＰＶＣ（例えばAldrich-Artikel のNo.18,955-3のカルボキシ化されたポリ塩化ビニール）を用い、それを仕様通りに変性する。
【００２０】
もしカルボキシ−ＰＶＣをクラスH2N-(R-NH-)n R-NH2 ここでR=(CH2)m ；n=1 以上、特に1 〜3 、m=1 〜10）のポリアミンで分解、ないしは他の少なくとも１つの第２級アミノ基を含んだ物質クラスをカルボジイミドで分解するなら、エナミン架橋する低重合システムがその種のイオン感応膜と良好に接着（結合）することがわかった。ＰＶＣが低カルボキシル化である場合そのような変性によって選択性や膜抵抗やイオン透過担体濾過性などのような電極特性に悪影響を与えない（図３参照）。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、複数層状に配置された固定化物質が設けられており、この固定化物質は、同じマトリックス材料であるが異なる酵素であるものを備えているものもある。広範囲に架橋化された固定化物質に酵素を含んだプレポリマー層を与えると、このプレポリマーは水の蒸発の後、下層との間で行われた架橋反応の過程において連続的に３次元架橋したポリマーマトリックスに一体化する。
この方法で、埋め込みポリマーに関して一様な層結合を得ることができ、その際層状に配置された固定化物質の１つ又はそれぞれに複数の酵素を順次含ませることができる。この方法により、１つの層に複数のバイオ触媒性ないしは反応性領域を空間的に分離して配置することができる。この固定化物質の少なくとも１つに、この方法で触媒活性な又は荷電伝導性の粒子、或いはその両方の粒子、例えば貴金属コロイド、反応性ないしは触媒作用をする無機粒子、金属顔料及び遮光性顔料、さらに黒鉛のような炭素顔料、活性炭、ガラス状カーボン、貴金属組み込み炭素なども注入することができる。この種の方策の目的は、バイオ触媒性の及び分析物の決定のために関連するつまり電気化学的活性でかつ電子移動可能な領域を何層にも重ねた状態で位置決めさせながら含む層の生成である。
図４に示されているように、この種のバイオセンサーは担体層４に複数の固定化物質S1〜S4が設けられており、これらの固定化物質は架橋の後一体的なポリマーマトリックス５を構成する。個々の固定化物質は酵素Enz1〜Enz3を備えており、固定化物質S4には触媒活性な又は荷電伝導性の或いはその両方の性質をもつ粒子を内在させることができる。
【００２２】
この方策により、酵素触媒反応された反応カスケードが本来のセンサー素子にまで進行することができる層を作り出すことができ、例えばグルコース（図５参照）のような物質の電流滴定の場合、酵素反応で生じる生成物に感応する電気触媒作用をもつ電極素子を層S4内に組み込むことが可能である。（Enz1= カタラーゼおよびEnz2＝ＧＯＤ）固定化物質S4は白金と炭素粒子を含んでいる。
付加的に電気触媒作用を持つ電極素子を含む酵素を有する固定化物が、特に利点があることがわかった。この目的のために、白金や炭素粒子を有する酵素システムを含む水性オリゴマーが充填され、水の蒸発の後とオリゴマーの架橋の後に伝導性の酵素含有層が生じる。この実施形態において、酵素は炭素−電極表面に吸着結合しているのではなく、３次元架橋した担体ポリマーの多孔性電極材料の中間空間内に分子分散で入れられる。このための特別な実施形態は浸漬、つまり電気触媒反応する炭素紙であり、その場合貴金属含有炭素（例えばガラス状カーボン）が層状に担体フリース（Vlies）上に設けられる（例２参照）。
【００２３】
【実施例】
以下に、本発明による酵素固定化のいくつかの例を示す：
例１
例えば血液のような生体媒質中の尿素の検出のためのセンサー素子
尿素の酵素による分解時にアンモニアが生じることから、ＢＵＮ感応センサーを、pH-やNH4+センサーに本発明によるウレアーゼ−固定化物質を設けるといった形で作ることができる。この例では、ウレアーゼ固定化物質とアンモニア電極の組み合わせが示される。
ａ）第２級アミノ基で変性させたＰＶＣの製造
１０ｇのカルボキシ−ＰＶＣ（カルボキシ含有量１．８％−Aldrich  Chem.社）が１５０ｍｌのＴＨＦ（Flukapuriss.pa）に溶かされ、６００ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（Fluka）及び５００ｍｇのビスヘキサメチレントリアミン（Merck）と混ぜられる。室温での４８時間の撹拌の後、この反応溶液は１０００ｍｌのアセトンに入れられ、その変性されたポリマーが２５０ｍｌの蒸留水の添加により充填される。この充填物は濾過され、アセトン、エタノール、蒸留水で洗われ、エタノールでの２時間の懸濁の後濾過される。真空乾燥の後にベージュ色の綿状沈殿した粉末が得られる。
【００２４】
ｂ）アンモニア感応膜の製造
３００ｍｇのアミノ−ＰＶＣが３．５ｇのテトラヒドロフラン（Fluka puriss.pa）中で１０ｍｇのノナクチンとともに溶かされ、６６０ｍｇのビス（１−ブチルペンチル）アジペートと混ぜられる。
この膜流体は、例えば電極ハウジングの膜窓（ドイツ特許公報2854444C2）内に入れられたり、平らな伝導性の基体としっかりと接触させられる。
ｃ）酵素の固定化
１ｍｌの生理的燐酸緩衝剤（ｐＨ  ７．４）に０．５ｍｌの水性ケチミン架橋するポリアクリレートエマルジョン（樹脂成分＝４０％）が入れられ、１００ｍｇのウレアーゼ（Shwertbohne-124U/mg から；Fluka）と混ぜられる。この混合物は貯蔵安定性であり、０〜４℃で２、３週間保存することができる。この混合物はディスペンサーを使ってアンモニア感応膜に滴下され、室温で１週間又は３５〜４０℃で２日保存される。
【００２５】
酵素活性テストでは、架橋化プロセスの間１０〜１５％の活性損失が観察され、さらに生理的緩衝システムの湿気中に放置した際はこれ以上の活性損失は認められなかった。膜ポリマーとして変性されていないＰＶＣをもつアンモニウム感応膜と比較して、本発明による電極膜と固定化物質との結合は緩衝剤中で湿気にさらされても良好な接着性を示し、アンモニア感応膜の固定化物質層はそれ自身が同時に破壊のすることでしか剥離されない。固定化物質層の膨潤による水分吸収は大きく、生理的緩衝システム中への数時間の放置で１４％となる。この事実は良好なアンモニア透過性を保証しており、そのセンサー安定性により真の酵素固定化を実現することができる。図６は本発明によるＢＵＮ（血液  尿素  窒素）電極の特性曲線を示しており、ＢＵＮ濃度と電位差の関係が表されている。
【００２６】
例２
図７に示すように、なべ状の凹部７もつ人工材料担体６が金でスパッタリングされ、凹部領域の表面はセンサーキャリヤの接点部８と電気的につながる。この凹部７内に、白金−炭素からなる板片９が担体フリースに押し付けられる。１００ｍｇのラクテートオキシダーゼv.Pediococusspecies(L0638Sigma-30ユニット/mg）が１ｍｌの生理的燐酸塩緩衝剤中に溶かされ、０．５ｍｌのエナミン架橋するポリアクリレート−プレポリマー（４０％水溶液）と混合される。
押し付けられた白金−炭素電極は酵素／プレポリマー溶液をしみこまされ、室温で乾燥され、架橋される。その拡大図において１１は酵素ポリマーを示している。
出来上がったセンサー素子（図７）は電流に関して乳酸塩濃度が１５ｍｍｏｌ／ｌのところまで直線性を示しており、同じ白金−炭素電極材料に乳酸塩オキシダーゼを吸着結合したセンサー素子に比べて５倍以上高い稼働耐久性を備えている。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による方法に適したプレポリマーの模式図
【図２】エナミン架橋するプレポリマーの架橋反応を示す模式図
【図３】ＰＶＣの表面変性を示す模式図
【図４】本発明による層状に形成されたバイオセンサーの模式図
【図５】図５によるバイオセンサーの変形例（グルコースセンサ）の模式図
【図６】本発明により作られたＢＵＮ（血液、尿素、窒素）センサーの特性曲線
【図７】本発明によるバイオセンサーの変形例を示す模式図
【符号の説明】
１    疎水性オリゴマー鎖部分
２    親水性連鎖
３    反応基
４    担体層
５    ポリマーマトリックス
８    接点部
【図１】
0003981163.tif 000002
【図２】
0003981163.tif 000003
【図３】
0003981163.tif 000004
【図４】
0003981163.tif 000005
【図５】
0003981163.tif 000006
【図６】
0003981163.tif 000007
【図７】
0003981163.tif 000008