(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップに試料生体高分子を結合させるステップと、
前記バイオチップの温度を上昇させながら個々のスポットにおけるハイブリダイゼーション反応を検出するステップと、
スポットからの検出量が急減する直前の検出量を測定するステップとを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項２】
請求項１記載のハイブリダイゼーション反応検出方法において、前記ハイブリダイゼーション反応を検出するステップでは前記バイオチップの反応領域に洗浄液を流すことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項３】
多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップを容器に収容するステップと、
前記容器内に試料生体高分子を注入するステップと、
前記容器内のバイオチップを一定温度に保持するステップと、
前記容器内に洗浄液を流しながら前記バイオチップの温度を予め設定した時間パターンに従って変化させるとともに、予め設定したタイミング毎に前記バイオチップの反応領域の画像を撮像するステップとを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項４】
請求項３記載のハイブリダイゼーション反応検出方法において、前記試料生体高分子には蛍光標識が付けられており、前記画像からスポット毎の蛍光強度を解析するステップを更に含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項５】
請求項４記載のハイブリダイゼーション反応検出方法において、各スポットにおける蛍光強度の時間変化の情報から当該スポットに固定されたターゲット生体高分子と試料生体高分子とのハイブリダイゼーション反応の程度を検出することを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載のハイブリダイゼーション反応検出方法において、スポットからの蛍光強度が急減したときの温度情報を取得することを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出方法。
【請求項７】
多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップを収容する容器と、
前記容器内に収容されたバイオチップの温度を時間とともに単調に上昇する時間パターンに従って制御する温度制御手段と、
前記容器に洗浄液を供給する手段と、
前記容器に収容されたバイオチップの反応領域を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段の撮像タイミングを制御する手段と、
前記撮像手段によって撮像された複数の画像を記憶する記憶手段とを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出装置。
【請求項８】
多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップを収容する容器と、
前記容器内に収容されたバイオチップの温度を予め定められた時間パターンに従って制御する温度制御手段と、
前記容器に洗浄液を供給する手段と、
前記容器に収容されたバイオチップの反応領域を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段の撮像タイミングを制御する手段と、
前記撮像手段によって撮像された複数の画像を記憶する記憶手段と、
個々のスポットにおけるハイブリダイゼーション反応を検出する検出手段と、
スポットからの検出量が急減する直前の検出量を測定する測定手段とを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出装置。
【請求項９】
請求項７又は８記載のハイブリダイゼーション反応検出装置において、選択されたスポットからの蛍光強度の時間変化を表示する機能を有することを特徴とするハイブリダイゼーション反応検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオチップ上にスポットしたプローブＤＮＡ等のプローブ生体高分子と蛍光標識あるいは化学発光標識したＤＮＡ等の試料生体高分子とのハイブリダイゼーション反応を検出するハイブリダイゼーション反応検出方法及び検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学や生化学の分野では、有用な遺伝子の探索や病気の診断などのために生体内の核酸や蛋白質などの生体高分子を同定・分画することが行われ、その際の前処理として、既知の配列をもつ核酸や蛋白質と試料中のターゲット分子とをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション反応が多用されている。このとき短時間で大量の試料を処理するために、表面に多数のフィーチャーをマトリックス状に設定したバイオチップが用いられる。バイオチップ上の各フィーチャーには、例えば、それぞれ異なるＤＮＡプローブがスポットされ固定されている。このバイオチップを試料ＤＮＡと共に反応容器の中に入れ、反応容器内でバイオチップの各フィーチャーに結合させたプローブと蛍光標識した試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行う。その後、バイオチップに励起光を照射し、各フィーチャーから発せられる蛍光の蛍光強度を測定することによって各プローブと試料ＤＮＡとの結合量を知り、それを必要な情報に変換するものである。
【０００３】
図１３は、バイオチップを用いた従来のハイブリダイゼーション反応の説明図である。まず、図１３（ａ）に示すように、多数のＤＮＡスポットが設定されたバイオチップ１１０のＤＮＡスポット部分１１２に試料ＤＮＡ溶液１１４をのせた後にカバーガラス１１６をかぶせる。次に、図１３（ｂ）に示すように、それを密閉容器１２０の中に閉じこめた状態で、温度コントローラを備えるチャンバー内にてハイブリダイゼーションを行う。このときにチャンバー内の温度は一定とされる。通常、ハイブリダイゼーションの最適温度はそれぞれのＤＮＡスポット毎に異なるが、その平均の温度に設定して全てのスポットに対してハイブリダイゼーションを行う。その後バイオチップを洗浄し、ハイブリダイゼーションしていない試料ＤＮＡを取り除いた後に、試料ＤＮＡにラベルしてある蛍光物質等による発光を蛍光読み取り装置で読み取る。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
従来の技術によると、ハイブリダイゼーションを行う際に、バイオチップの各スポット毎に最適温度は違うにもかかわらずその平均解離温度に設定してハイブリダイゼーションを行う。そのため、設定された平均温度より最適温度が低いスポットでは、相補的なＤＮＡ同士の結合が維持できないためハイブリダイゼーション効率が落ち、検出される信号強度は本来の強度より下がる。逆に、最適温度が平均温度より高いスポットの場合には非特異的な結合をまねき、実際に相補的なＤＮＡ以外のＤＮＡも結合することにより、検出される信号強度は本来の強度より上がる。このように、従来のバイオチップのハイブリダイゼーション検出方法では、スポット毎にハイブリダイゼーションの最適温度が違うにも拘わらず同一温度にてハイブリダイゼーションを行い、その後、蛍光読み取り装置により最終的に読み取った結果をもとにＤＮＡの量比を比べてきた。そのため、その定量性に疑問があった。
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、ハイブリダイゼーションによる特異的な結合のみの検出及び定量を行うことのできるハイブリダイゼーション検出方法及び検出装置を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明ではバイオチップの設定温度を時間毎にプログラムできる制御装置をもち、励起光源と検出用の冷却ＣＣＤカメラを搭載する。低温でバイオチップの全てのスポットのプローブ生体高分子に試料生体高分子をハイブリダイズさせた後に温度制御して徐々に温度を上げながら洗浄液を輸液し、各温度においてバイオチップ全面を撮像し、スポット毎の蛍光検出を行う。このように温度を低温側から高温側に変化させながらハイブリダイゼーションの状況を確認することで、プローブ生体高分子の種類に応じてスポット毎に異なるハイブリダイゼーションの最適温度の影響を受けることなく全てのスポットにおいてハイブリダイゼーションを高い信頼性を持って検出する。
【０００６】
すなわち、本発明によるハイブリダイゼーション反応検出方法は、多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップに試料生体高分子を結合させるステップと、バイオチップの温度を上昇させながら個々のスポットにおけるハイブリダイゼーション反応を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【０００７】
ハイブリダイゼーション反応を検出するステップではバイオチップの反応領域に洗浄液を流すのが好ましい。洗浄液を流すことで、プローブ生体高分子にハイブリダイズしていない試料生体高分子あるいはプローブ生体高分子から解離した試料生体高分子はスポットから除去され、検出の際のノイズを低減することができる。
【０００８】
本発明によるハイブリダイゼーション反応検出方法は、また、多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップを容器に収容するステップと、容器内に試料生体高分子を注入するステップと、容器内のバイオチップを一定温度に保持するステップと、容器内に洗浄液を流しながらバイオチップの温度を予め設定した時間パターンに従って変化させるとともに、予め設定したタイミング毎にバイオチップの反応領域の画像を撮像するステップとを含むことを特徴とする。容器内のバイオチップを一定温度に保持するステップでは、バイオチップを比較的低温に比較的長時間保持して、注入された試料生体高分子をスポットのプローブ生体高分子にハイブリダイズさせる。容器内に洗浄液を流しながら変化させるバイオチップの温度は、時間とともに単調に上昇する時間パターンで変化させるのが好ましい。
【０００９】
試料生体高分子に蛍光標識を付けておき、前記画像からスポット毎の蛍光強度を解析するようにするのが好ましい。各スポットにおける蛍光強度の時間変化の情報から当該スポットに固定されたターゲット生体高分子と試料生体高分子とのハイブリダイゼーション反応の程度を検出することができる。また、蛍光強度が急減したときの温度情報を取得すると、その温度をプローブ生体高分子の分子構造から予想される解離温度と比較することでハイブリダイゼーション反応検出の信頼性を高めることができる。スポットからの蛍光強度が急減したときの温度がそのスポットに固定されたプローブ生体高分子の予想解離温度にほぼ等しい場合には特異的なハイブリダイゼーションが生じていたと判断でき、両者が明らかにかけ離れた値である場合は非特異的に試料生体高分子が結合していたと判断できる。
【００１０】
本発明によるハイブリダイゼーション反応検出装置は、多数のプローブ生体高分子が個別にスポットされた反応領域を有するバイオチップを収容する容器と、容器内に収容されたバイオチップの温度を予め定められた時間パターンに従って制御する温度制御手段と、容器に洗浄液を供給する手段と、容器に収容されたバイオチップの反応領域を撮像する撮像手段と、撮像手段の撮像タイミングを制御する手段と、撮像手段によって撮像された複数の画像を記憶する記憶手段とを含むことを特徴とする。
温度制御手段は、バイオチップの温度を時間とともに単調に上昇する時間パターンに従って制御するのが好ましい。また、選択されたスポットからの蛍光強度の時間変化を表示装置上に表示する機能を有することが好ましい。
【００１１】
【本発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。以下では、プローブ生体高分子（以下、単にプローブという）及び試料生体高分子としていずれもＤＮＡを用いる場合について説明する。ただし、本発明の適用はこのような組み合わせの場合のみに限られるものではなく、生体高分子がＲＮＡやアミノ酸（蛋白質）、糖鎖、またはそれらの複合物（糖蛋白質糖）である場合にも同様に適用可能である。
【００１２】
図１は、本発明で用いるバイオチップの一例を示す概略図である。図１（ａ）に示すように、バイオチップ１０は、スライドガラスなどの基板上に設定された反応領域１５にＤＮＡ等のプローブを多数スポットして固定したものである。バイオチップ１０上の各スポット１１にはそれぞれ異なるプローブがスポットされており、多種類のターゲットＤＮＡに対してそれぞれ特異的にハイブリダイゼーションを行う。
【００１３】
図１（ｂ）に示すように、ＤＮＡは４種類の塩基、すなわちＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）を含む核酸から構成されており、このうちＡ（アデニン）はＴ（チミン）に対して、Ｃ（シトシン）はＧ（グアニン）に対して水素結合を形成する。ＡとＴは２本、ＣとＧは３本の水素結合を形成し、これら以外の組み合わせでは水素結合を形成しない。ハイブリダイゼーションとはＤＮＡが相補的なＤＮＡとお互いに水素結合し、化学的に結合することを示し、このときの結合エネルギーはＤＮＡの構成塩基により推測できる。そのために、ハイブリダイゼーション反応で特異的に結合したＤＮＡ同士の解離温度Ｔｍも以下の〔数１〕により推測することができる。ＡとＴの水素結合は２本、ＣとＧの水素結合は３本であるので、ＣＧの含有量が高いと通常結合エネルギーは高くなる。〔数１〕には、そのことが考慮されている。
【００１４】
【数１】
Tm(℃)=81.5＋16.6×log[S]＋0.41×(%GC)−(500/n)
【００１５】
ここで、［Ｓ］は塩のモル数、（％ＧＣ）はオリゴヌクレオチド中のＧＣ含量（％）、ｎはオリゴヌクレオチドの長さ（ｐｂ）である。ただし、前記〔数１〕はあくまでも目安であり、通常、隣の分子（ここではＤＮＡ）等などからも影響を受けるため、あるいはＤＮＡの内部にお互いの相補鎖部分を持ち、その部分で水素結合を形成してしまう現象（自己相補鎖）等により誤差が生じることもある。
【００１６】
図２は、本発明によるチップハイブリダイゼーション反応検出装置の一例の概要を示す図である。このハイブリダイゼーション反応検出装置は、ハイブリダイゼーション反応部と蛍光検出部を備える。ハイブリダイゼーション反応部は、チップケース２０内のバイオチップ１０上に洗浄液を供給する加圧式輸液装置２３、チップケース２０内のバイオチップ１０を加熱するためのヒートブロック３１、加圧式輸液装置２３内の溶液を加熱するためのヒートブロック３２、バイオチップ１０の温度を計測する温度計測器３３、加圧式輸液装置２３内の溶液温度を計測する温度計測器３４等を備える。温度計測器３３，３４の出力はコンピュータ４０に入力され、コンピュータ４０はヒートブロック３１，３２の制御を行う。蛍光検出部は、励起光源５０、励起用光学フィルター５１、受光用光学フィルター５２、受光光学系５３、撮像装置（冷却ＣＣＤカメラ）５５等を備える。励起光源５０、光学フィルター５１，５２、撮像装置５５はそれぞれコントローラ５６，５７，５８を介してコンピュータ４０によって制御される。コンピュータ４０は、装置各部の制御に加えて、内部に組み込んだデータ解析プログラムによって撮像装置５５で撮像した画像の画像処理、データ解析、解析結果の表示等の処理を行う。
【００１７】
図３は、コンピュータの表示画面の一例を示す概略図である。この表示画面４１には設定値表示部６０、読み取り画像表示部６１、動作状況表示部６２、操作用のボタン７１〜７５、及び各種ツール８１〜８５が表示されている。設定値表示部６０には撮影の設定値等が表示され、読み取り画像表示部６１には一番最近に撮影したバイオチップ１０の蛍光画像が表示されている。動作状況表示部６２には、現在の装置の状態が表示されている。また、表示画面４１には、表示ウィンドウを切り替えることで図１１に示すグラフや図１２に示す表等も表示することができる。
【００１８】
チップ温度制御ボタン７１は、バイオチップ１０の温度設定を行うためのボタンである。このボタン７１を押して図示しないチップ温度制御ウィンドウを開き、そのウィンドウ内でバイオチップの温度の時間変化パターンを設定する。コンピュータ４０は温度計測器３３，３４により読み取った現在の温度と設定温度とを比較してペルチェ式ヒートブロック３１，３２により加熱制御を行う。ＣＣＤカメラボタン７２は、冷却ＣＣＤカメラ５５の制御を行うためのボタンである。ＣＣＤカメラボタン７２を押して図示しないカメラ設定ウィンドウを開き、そのウィンドウ内で冷却ＣＣＤカメラ５５の冷却温度、撮影の間隔、シャッタースピード等の設定を行う。フィルターボタン７３を押すと図示しないフィルター設定ウィンドウが開き、そのウィンドウ内で標識蛍光物質の種類に合わせて励起用光学フィルター５１及び受光用光学フィルター５２の選択を行うことができる。フィルター切り替えユニット５７は、フィルターボタン７３を押して行った設定に従って目的とする蛍光物質に適合するように励起用光学フィルター５１と受光用光学フィルター５２を同時に選択し切り替える。送液ポンプボタン７４を押すと図示しない設定ウィンドウが開き、加圧式輸液ポンプ２３内の洗浄液の温度設定や流量の設定、輸液のオン・オフ設定を行うことができる。ハロゲンランプボタン７５を押すとランプ条件の設定ウィンドウが開き、励起光源であるハロゲンランプ５０の電源電圧を設定できる。ハロゲンランプコントローラ５６はこの設定に従ってハロゲンランプ５０を制御して励起光の強さを調整する。
【００１９】
図４は、コンピュータへのデータの流れとコンピュータによる装置各部の制御の関係を示す概略図である。図中、コンピュータ４０に向かう矢印はコンピュータ４０へのデータ入力を表し、コンピュータ４０から出る矢印はコンピュータ４０からの機器各部への指令、制御を表す。コンピュータ４０は、設定値表示部６０に表示されている設定条件に従って、ヒートブロック３１，３２の温度、冷却ＣＣＤカメラ５５の温度を制御し、ハロゲンランプコントローラ５６及びフィルター切り替えコントローラ５７を制御する。また、加圧式輸液装置２３のポンプ及び吸引式排液装置２４を制御する。バイオチップ１０及び加圧式輸液ポンプ２３の温度データは温度計測器３３，３４からコンピュータ４０に取り込まれ、動作状況表示部６２に表示される。更に、コンピュータ４０は、設定された撮影間隔でカメラコントローラ５８から出力されるバイオチップ１０の蛍光画像データを順次取り込み、記憶装置に保存する。
【００２０】
次に、このチップハイブリダイゼーション反応検出装置によるハイブリダイゼーション反応及びハイブリダイゼーション検出のための操作及び制御について説明する。
まず、予め用意しておいたバイオチップ１０をチップケース２０内にセットし、加圧式輸液装置２３からチップケース２０への輸液経路の途中に設けられた溶液注入孔２７に蛍光標識した試料ＤＮＡ溶液を注入する。注入された試料ＤＮＡ溶液は、加圧式輸液装置２３から送られるハイブリダイゼーション溶液（洗浄液としても用いる）の流れに乗ってチップケース２０内に流れ込む。試料ＤＮＡ溶液がチップケース２０内に入ったら加圧式輸液装置２３の運転を停止してハイブリダイゼーション溶液の流れを止め、ヒートブロック３１を制御してチップケース２０及びバイオチップ１０を比較的低温（３７℃ぐらい）に保持し、長時間ハイブリダイゼーションを行う。
【００２１】
その後、蛍光検出部によってバイオチップ１０のハイブリダイゼーションの状態を確認するときには、加圧式輸液装置２３からバイオチップ１０を入れたチップケース２０に洗浄用の溶液を設定された流量で送液し、バイオチップ１０のプローブＤＮＡとハイブリダイズしていない試料ＤＮＡを洗浄液とともに吸引式排液装置２４によって汲み出す。洗浄液としては、ハイブリダイゼーション溶液と同じ溶液を用いることができる。チップケース２０への洗浄液流入部と流出部には逆流防止弁２５，２６が設けられており、洗浄液の逆流を防いでいる。その後、励起光源５０からバイオチップ１０の全域に励起光が照射される。この例では励起光源５０としてハロゲンランプを用い、励起用光学フィルター５１を通して試料ＤＮＡに標識された蛍光物質の励起に最適な波長の光のみをバイオチップ１０に照射する。なお、化学発光等を用いて検出を行う場合は励起光を必要としないので、励起光源５０を切って使用する。
【００２２】
図５は、蛍光検出部によるハイブリダイゼーション状態確認の際に、チップハイブリダイゼーション反応装置のハードウェアを制御しているプログラムによって実行される処理のフローチャートである。図の右側には、各制御に対応する表示画面（図３参照）４１上の表示部あるいは設定ボタンを示す。
【００２３】
まず、温度計測器３３によってバイオチップ１０の温度測定を行う（Ｓ１１）。計測結果は、動作状況表示部６２に表示する。次に、計測された温度とチップ温度制御ボタン７１を用いて予め設定された各時刻毎の温度とを比較し、計測された温度がその時刻の設定温度と等しくなるようにヒートブロック３１を制御する（Ｓ１２）。温度計測器３４によって加圧式輸液装置２３の温度計測を行い、計測結果を動作状況表示部６２に表示する（Ｓ１３）。同様に、加圧式輸液装置２３の温度が設定温度になるようにヒートブロック３２を制御する（Ｓ１４）。次に、加圧式輸液装置２３のポンプを制御して、送液ポンプボタン７４を介して設定された流量に従って洗浄液をバイオチップケース２０内に送液する（Ｓ１５）。それとともに吸引式排液装置２４を制御して余分の洗浄液を吸引除去する（Ｓ１６）。
【００２４】
また、検出すべき標識蛍光物質の励起波長及び蛍光波長に適合するように、フィルター切り替えコントローラ５７を制御して、フィルターボタン７３で設定された通りに励起用光学フィルター５１及び受光用光学フィルター５２をセットする（Ｓ１７）。続いて、ハロゲンランプボタン７５にて設定されたように、ハロゲンランプコントローラ５６を制御して光源強度を設定する（Ｓ１８）。次に、ＣＣＤカメラボタン７２で設定された設定に従ってＣＣＤカメラコントローラ５８を制御し、設定条件に従って冷却ＣＣＤカメラ５５によってバイオチップ１０を撮影する（Ｓ１９）。撮影した画像はコンピュータ４０の記憶装置に保存するとともに、表示装置の読み取り画像表示部６１に表示する（Ｓ２０）。このような流れで測定のための制御が行われ、最終的にコンピュータ４０の記憶装置に冷却ＣＣＤカメラ５５で撮影されたバイオチップ１の画像ファイルが順次保存されていく。
【００２５】
通常、低温でハイブリダイゼーションを行うと、プローブＤＮＡに対して相補性の低い試料ＤＮＡもハイブリダイズする。本発明では、バイオチップ１０及びその周囲の温度を予め定められた時間パターンに従って時間とともに徐々に上昇させながら、ハイブリダイゼーションの検出を行う。時間とともに変化させるべきバイオチップ１０の温度の時間パターンはチップ温度制御ボタン７１によって予めコンピュータ４０に設定されている。コンピュータ４０は、温度計測器３３によって測定した現在の温度を設定温度と比較し、バイオチップ１０の温度が設定された時間パターンに従って変化するようにペルチェ式ヒートブロック３１を制御して温度調整を行う。コンピュータ４０はまた、温度計測器３４によって加圧式輸液装置２３から送液される溶液の温度を計測し、その温度がチップケース２０内のバイオチップ１０と同じ温度になるようにペルチェ式ヒートブロック３２を制御する。こうして、加圧式輸液装置２３はバイオチップ１０と同じ温度に制御された溶液をポンプによってチップケース２０に送液する。加圧式輸液装置２３からの溶液の送液と同時に、吸引式排液装置２４によってチップケース２０内から廃液が吸引される。
【００２６】
洗浄液とバイオチップ１０の温度を次第に上昇させてゆくと、相補性の低い試料ＤＮＡほど低い温度で早期に解離していく。最後には相補性の高い試料ＤＮＡ、すなわち目的とするターゲットＤＮＡのみがプローブに結合した状態になると考えられるが、それもバイオチップ１０及びその周囲温度がその解離温度を超えると結合を維持できなくなるため解離する。すると、そのスポットからの蛍光強度は急激に低下する。このように、解離温度近く（解離温度よりわずかに低い温度）で検出されたハイブリダイゼーションがターゲットとのハイブリダイゼーションであると考えられる。
【００２７】
ここでは、蛍光物質としてＣｙ３（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）を標識した試料ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行った。蛍光物質が発する蛍光は受光用光学フィルター５２で選択的に透過され、受光レンズ５３により集光され、高感度の冷却ＣＣＤカメラ５５により撮像される。ＣＣＤカメラ５５の出力はカメラコントローラ５８を介してコンピュータ４０に送られる。なお、この装置では多種の蛍光物質に対応できるように、励起用光学フィルター５１及び受光用光学フィルター５２は切り替えコントローラ５７により交換可能になっている。
【００２８】
冷却ＣＣＤカメラ５５によるバイオチップ１０の全面の像は、設定値表示部６０に示されている条件（図の例では５分間隔）に従って自動的に撮像され画像表示部６１に表示されると共に、画像データとしてコンピュータ４０の記憶装置に順次記憶される。次に、バイオチップ１０の蛍光画像から得られた情報を解析して時間、温度の変化とともに表示する手順について以下に説明する。
【００２９】
図６は、データ解析プログラムの処理内容を説明するブロック図であり、コンピュータからのデータの取り出し及び各サブプログラムへの制御の概略を示してある。図の左向きの矢印はデータ読み込み処理を表し、右向きの矢印は指令や制御を表す。
【００３０】
解析プログラムは、スポット指定、バックグラウンド計算、スポット強度計算、スポット有効強度計算、Ｔｍ値（予想解離温度）計算、判定、及び結果表示のためのサブプログラムを含んでいる。スポット指定はキーボードやマウス等の入力機器を用いて行われ、読み込まれた時間毎の画像データ、プローブＤＮＡの塩基配列データに基づいて解析が行われる。解析結果はディスプレイ等の表示装置にグラフや表等の形で表示される。
【００３１】
図７は、画像データを解析するプログラムによる処理の概略を示すフローチャートである。画像データは撮影時間別にファイルとして保存されており、それを逐次読み出しながら解析を行い、バイオチップ上のスポット毎の蛍光強度をバックグラウンドを引いた値で数値化していく。次に、読み取り画像表示部６１を表す図８を用いてデータ解析プログラムの処理内容について説明する。
【００３２】
まず、バイオチップ１０のハイブリダイゼーションの状態を示した図８（ａ）の画像データを読み込む（Ｓ３１）。読み込んだ画像に対して虫めがね拡大ツール８３を使うことにより、画像を図８（ｂ）に示すように適度な大きさに拡大する。次に、図８（ｃ）に示すように、バックグラウンドの部分に適度な大きさで選択範囲ツール８１，８２で範囲を選択し、バックグラウンド計算ツール８５を使用することによりバックグラウンドの計算を行う。このことにより、今後の蛍光強度計算は時間毎にバックグラウンドを引いた値を計算することになる。バックグラウンドを計算した後に、図８（ｄ）に示すようにサンプルの部分を選択範囲ツール８１，８２で範囲選択し（Ｓ３２）、強度計算ツール８４を使用してスポットの蛍光強度を計算する（Ｓ３３）。設定された時間間隔で撮影された画像中の同一スポットに対する蛍光強度を時間毎に計算し、そのスポットの蛍光強度の時間変化をグラフとして表示する（Ｓ３４）。
【００３３】
図８において、実際の計算は例えば次のように行われる。画像上は白黒２値で表現してあるが、実際は１画素あたり１６ビットもしくは８ビットで検出された蛍光強度を表している。虫めがね拡大ツール８３によって拡大した後の画像は、数値で表現すると例えば図９のようになる。いま、この画像の試料スポット以外の部分、すなわちバックグラウンドの部分の強度を計算すると１画素あたりの平均値は２０であるので、今後の計算は１画素あたり２０を引くことになる。すなわち、バックグラウンド補正後の蛍光強度画像は図１０のようになる。蛍光強度計算では、範囲選択ツールで囲った部分の数字を合計することにより蛍光強度を算出する。図示した例の場合、３つのスポットからなるが、それぞれのスポットの蛍光強度はそれぞれ左から３３２２１、９１１８、９５７７７となる。このような画像が設定された時間毎（図３の例の場合、５分毎）に撮影されていき、コンピュータ４０内に蓄積されていく。
【００３４】
上述のように、スポット毎の蛍光強度及びそのときのバックグラウンドは各画像に対してその都度計算され、その値をもとに蛍光強度の時間変化（温度に対する変化）を表すグラフが作成される。なお、選択範囲ツール８１，８２を用いたバックグラウンド計算のための範囲選択及びサンプルの部分の範囲選択は、１つの画像に対して行った選択範囲が他の画像に対しても適用されるので、１度だけ行えばよい。また、この範囲選択は、バイオチップ１０上における各スポットの座標データ等に基づいて自動的に行うことも可能である。
【００３５】
図１１は、こうしてコンピュータ４０に蓄積されたデータをもとに作成されたグラフの一例である。このグラフは、バイオチップ１０上のある一つのスポットからの蛍光強度の時間変化をバイオチップの温度変化と共に表示したものである。横軸は時間、縦軸は蛍光強度あるいは温度である。図中、実線のグラフは蛍光強度を表し、破線のグラフは温度を表す。蛍光強度は、通常は最初に低温でハイブリダイゼーションを行ったときの蛍光強度が一番強いはずであるので、このときの強度を１００％として表している。この例では、バイオチップ１０の温度を５℃ずつステップ的に上昇させて試料スポットからの蛍光強度の変化を観察している。温度が上昇するとプローブＤＮＡと相補性の低い（結合力の弱い）試料ＤＮＡから解離を始め、解離した試料ＤＮＡは洗浄液によってスポットから除去されるため、時間ごとにハイブリダイズしている蛍光標識試料ＤＮＡが少なくなって、蛍光強度は減少していくことになる。図１１にはスポットの蛍光強度と共に温度のグラフも一緒に表示してあり、蛍光強度の急減が起こった温度から実際に何℃の温度のところで試料ＤＮＡがプローブＤＮＡから解離したかが分かるようになっている。図１１の例では、７０℃前半で試料ＤＮＡが解離しているのが分かる。この場合、この注目しているスポット部分にハイブリダイゼーションしている試料ＤＮＡの解離温度は７０℃前半であると判断される。このグラフは、必要があれば表示装置１１上に表示して確認することができる。
【００３６】
また、通常ＤＮＡは構成されている塩基の数と種類によって前記〔数１〕のようにハイブリダイゼーションの最適温度（解離温度）を計算できる。従って、図１１から判断される解離温度が計算で求められた解離温度とがほぼ等しい場合には確実にハイブリダイゼーションしたことが示され、両者が明らかにかけ離れた値である場合は非特異的に試料ＤＮＡが結合していたことが分かる。
【００３７】
この計算による予想解離温度を用いた判定のために、ここでは有効強度の計算を行う（Ｓ３５）。図１１に示すように、予想解離温度の前後でスポットの蛍光強度が急激に減少しているところがあれば、急減直前の蛍光強度が目的とする試料ＤＮＡの蛍光強度であると考えられる。低温でハイブリダイゼーションを行ったときの蛍光強度の数値を１００％として、予想解離温度付近で下がった蛍光強度を有効強度として全体の％で表示すると、プローブＤＮＡが完全に特異的にハイブリダイゼーションしている場合は１００％付近のはずである。このため、有効強度を％表示することにより、バイオチップ１０上のスポットに対する信頼度の目安とすることができる。
【００３８】
図１２に示すように、バイオチップ１０上の各スポットのスポットＩＤ９１に対応させて、スポットに固定されている既知のプローブＤＮＡの塩基配列から計算された予想解離温度９２と有効強度９３をスポット毎に表示し（Ｓ３６）、ハイブリダイゼーションが生じていたかどうかの判定９４を表の形にまとめて表示する（Ｓ３７）。図１２の例では、判定結果は、有効強度が８０％以上のときは◎を、６５％以上のときは○を、４０％以上の時は△を、それ以下の時は×で表示した。このように有効強度に基づいて判定表示することで、各スポット毎のハイブリダイゼーションを高い信頼性を持ってい検出することができる。各スポットの有効強度の数値を明るさや色に対応させて、あるいは判定結果の◎、○、△、×を明るさや色に対応させてバイオチップの各スポット位置に表示することで、バイオチップの各スポットのハイブリダイゼーションの様子を視覚的に認識することができる。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によると、バイオチップにおける１スポット毎のハイブリダイゼーションの検出を定量性をもって従来の方法に比較して高い信頼度で行うことが可能になる。
【００４０】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いるバイオチップの一例を示す概略図。
【図２】本発明によるチップハイブリダイゼーション反応検出装置の一例の概略図。
【図３】モニター画面を説明する図。
【図４】コンピュータへのデータの流れとコンピュータによる装置各部の制御の関係を示す概略図。
【図５】ハイブリダイゼーション状態確認処理の流れを説明するフローチャート。
【図６】データ解析プログラムの処理内容を説明するブロック図。
【図７】画像データを解析するプログラムによる処理の概略を示すフローチャート。
【図８】読み取り画像表示部を表す図。
【図９】バックグラウンドを含む画像を数値で表現した図。
【図１０】バックグラウンドを除去した画像を数値で表現した図。
【図１１】一つのスポットからの蛍光強度の時間変化をバイオチップの温度変化と共に表示したグラフ。
【図１２】バイオチップの１スポット毎の信頼性を確認する方法を説明する図。
【図１３】従来の方法を説明する図。
【符号の説明】
１０…バイオチップ、１１…スポット、１５…反応領域、２０…チップケース、２３…加圧式輸液装置、２４…吸引式排液装置、２５，２６…逆流防止弁、２７…溶液注入孔、３１，３２…ヒートブロック、３３，３４…温度計測器、４０…コンピュータ、４１…表示画面、５０…励起光源、５１…励起用光学フィルター、５２…受光用光学フィルター、５３…受光レンズ、５５…冷却ＣＣＤカメラ、５６…ハロゲンランプコントローラ、５７…切り替えコントローラ、５８…カメラコントローラ、６０…設定値表示部、６１…画像表示部、６２…動作状況表示部、７１…チップ温度制御ボタン、７２…ＣＣＤカメラボタン、７３…フィルターボタン、７４…送液ボタン、７５…ハロゲンランプボタン、８１…選択範囲ツール（四角）、８２…選択範囲ツール（丸型）、８３…虫めがね拡大ツール、８４…強度計算ツール、８５…バックグラウンド計算ツール、９１…スポットＩＤ、９２…予想解離温度、９３…有効強度、９４…判定、１１０…バイオチップ、１１２…ＤＮＡスポット部分、１１４…試料ＤＮＡ溶液、１１６…カバーグラス、１２０…密閉容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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