(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＢ含有物の毒性を評価するＰＣＢ含有物の毒性評価方法であって、
ＰＣＢ含有物を含む毒性評価試料からモノオルトハロポリクロロビフェニル（ｍｏＰＣＢ）を除去する除去工程を行なった後、前記毒性評価試料に対して抗原抗体反応工程を行うＰＣＢ含有物の毒性評価方法。
【請求項２】
前記除去工程が、活性炭もしくはアルミナを含有する担体を用いるカラム処理工程である請求項１に記載のＰＣＢ含有物の毒性評価方法。
【請求項３】
前記抗原抗体反応工程が、前記毒性評価試料に対して、ダイオキシン類に結合するレセプターを含んでなるレセプター複合体構成物質を混合する混合工程を行い、前記ダイオキシン類が前記レセプターに結合して形成されるレセプター複合体に特異的に結合可能な塩基配列を有するＤＮＡ断片部に対して、前記混合工程にて得られた混合液を作用させる結合工程を行なうものである請求項１〜２のいずれかに記載のＰＣＢ含有物の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
ＰＣＢ含有物の毒性を評価するＰＣＢ含有物の毒性評価方法に関する。
【従来の技術】
従来、この種の毒性評価方法としては、毒性評価対象となる評価対象液を調製し、その評価対象液中に含まれるダイオキシン類の化学量を求め、その毒性を基準となるダイオキシン類の毒性に換算した上で総和（ＴＥＱ、毒性等価量）を求め、評価対象液の毒性として算出し、評価することが行われている。ここで、前記ＴＥＱを求めるには、前記ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用することが行われている。つまり、前記ダイオキシン類を、認識して捕捉する抗体を結合させた担体に、前記ダイオキシン類を含有する評価対象液を晒し、前記担体に結合したダイオキシン類量を、前記抗原に施した蛍光標識等の発光度により求めるというものである。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のような技術によると、前記抗体として、抗原を認識する選択性が高すぎて、たとえば、２，３，７，８−ＴＣＤＤ（２，３，７，８−テトラクロジベンゾジオキシン）には結合するが、他の類似物質にはほとんど結合しないものや、毒性の高いダイオキシン類によく結合する一方あまり毒性の高くないダイオキシン類にまでよく結合し、人体に対する毒性とは全く無関係な選択結合性を示すものが用いられる場合が多く、その抗体に結合する化学物質の毒性の程度と、ダイオキシン類の結合量との相関が得られない場合が多かった。そのため、やはり、評価対象液の組成まで知らねば正確な毒性を評価することが出来ないという現状にある。
【０００３】
そこで、Ａｈレセプターを用いてダイオキシン類を検出し、その検出量に基づき毒性を評価しようという試み（イムノアッセイ）がなされている。
【０００４】
この方法は、本来Ａｈレセプターが、ダイオキシン類と結合した後、ＤＮＡと作用して毒性を発揮する事から、前記Ａｈレセプターに対するダイオキシン類の結合量を知ることによって、正確な毒性の評価を可能とするものとして期待されている。たとえば、このような測定を可能とする方法としては、Ａｈレセプターがダイオキシン類及びＡｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｃｅｌｏｃａｔｏｒ（ＡＲＮＴ）と複合体を形成可能な条件下で評価対象液を混合し、生成した複合体をその複合体のみに選択的に結合するＤＮＡに結合させ、その結合量を測定するものが知られている。
このように、前記Ａｈレセプターを用いた場合でも、特に燃焼生成物を分析する場合に、ダイオキシン類の人に対する毒性と、Ａｈレセプターに対する結合性とが一致しない場合が多く、毒性はほとんど無いが、前記Ａｈレセプターに結合してしまうような妨害物質を、あらかじめ毒性評価試料中から除外することが好ましいと考えられている。
【０００５】
しかし、除外すべき妨害物質としてどのようなものが含まれるかは、サンプルの種類、生成条件によって大きく異なり、一般的に酸処理、アルカリ処理、カラムクロマトグラフィー等の手法で妨害物質が十分に除去されうるか否かは不明で、結局は、信頼性の十分ではない毒性評価になっていたのではないかと考えられる場合がある。しかも、サンプルをむやみに妨害物質除去の処理に供した場合は、工程が煩雑になるほど評価すべきダイオキシン類の損失が大きくなるとともに、作業に要する時間がかかり、作業効率が低下するという問題がある。
また、このような問題は、Ａｈレセプターを用いる場合に限らず、抗原抗体反応を利用した技術一般に起こりえるものとして認識されており、対策が望まれている。
【０００６】
一般に、ＰＣＢ含有廃油、ＰＣＢ汚染魚介類、ＰＣＢ汚染土壌、ＰＣＢ汚染排水、ＰＣＢを摂取した動物の脂肪及び乳汁等、およびそれらの焼却灰、排ガス等のＰＣＢ汚染物を燃焼させて発生する燃焼生成物には、ＰＣＢに由来してビフェニル骨格を有する生成物が多数含まれることが知られている。さらに、ビフェニル骨格を有する毒性物質は、主に、構造異性体中、２つのベンゼン環を構成する炭素原子が同一平面上に配置されやすい、いわゆるコプラナーＰＣＢ（ｃｏＰＣＢ）であり、これらについてもダイオキシン類同様毒性評価対象物質として取り扱われている。また、一部モノオルトハロポリクロロビフェニル（ｍｏＰＣＢ）にも毒性が認められており、これらのｍｏＰＣＢについても、毒性に関してｃｏＰＣＢとして同様に扱われる場合がある。（以下、本発明において、ｍｏＰＣＢはｃｏＰＣＢに含まれないものとして扱っている。）
しかし、このようなｍｏＰＣＢ、ｃｏＰＣＢを含む毒性評価試料の毒性は、時に実際の毒性とは大きく異なる値として評価される場合があることが判っている。
【０００７】
従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑み、特にＰＣＢ含有物の毒性を、より正確に測定することのできる技術を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記ＰＣＢ含有物には、ＰＣＢに由来してビフェニル骨格を有する生成物が多数含まれ、このような生成物には、ｃｏＰＣＢが含まれており、高い毒性を発揮する。そのため、ｃｏＰＣＢは、毒性を評価する対象となる物質としてダイオキシン類と同様に取り扱われている。このような物質についても、抗原抗体反応により検出することが出来るため、ダイオキシン類と同様の工程で毒性を評価することが出来る。しかし、上述のＰＣＢ含有物中にはｃｏＰＣＢの外に、ｍｏＰＣＢ等も含まれ、本発明者らは、このようなｍｏＰＣＢが、上述のイムノアッセイにおいて、もっとも毒性の高いダイオキシン類に比べて高い活性で抗原に結合するものの、比較的低い毒性しか示さない場合があり、毒性の高いダイオキシン類に対してアンタゴニストとして働いている事を見出した。
【０００９】
ｍｏＰＣＢがアンタゴニストとして働くと、他の毒性評価対象の物質の毒性が低く算出されてしまうため、ｍｏＰＣＢが大量に含まれる可能性のある毒性評価試料の毒性が、そのｍｏＰＣＢの影響を受けて、実際の毒性値とはおおきく異なるものとして算出される可能性があることになる。
そこで、ＰＣＢ含有物中におけるこれらのｍｏＰＣＢの影響を除去すべく鋭意研究の結果、本発明に想到した。
【００１０】
即ち、この目的を達成するための本発明のＰＣＢ含有物の毒性評価方法の特徴手段は、
ＰＣＢ含有物の毒性を評価するＰＣＢ含有物の毒性評価に際して、
ＰＣＢ含有物を含む毒性評価試料からモノオルトハロポリクロロビフェニル（ｍｏＰＣＢ）を除去する除去工程を行なった後、前記毒性評価試料に対して抗原抗体反応を行う点にある。
【００１１】
また、前記除去工程としては、活性炭もしくはアルミナを含有する担体を用いるカラム処理工程を行なうことができる。
【００１２】
さらに、前記抗原抗体反応としては、前記毒性評価試料、及び、ダイオキシン類に結合するレセプターを含んでなるレセプター複合体構成物質を混合する混合工程を行い、前記ダイオキシン類が前記レセプターに結合して形成されるレセプター複合体に特異的に結合可能な塩基配列を有するＤＮＡ断片部に対して作用させるものであることが好ましい。
【００１３】
〔作用効果〕
つまり、本発明者らによると、ＰＣＢ含有物に含まれるダイオキシン類中には、上述のようにダイオキシン類と同様の毒性評価対象となるＰＣＢの外に、ｍｏＰＣＢが含まれ、これらのｍｏＰＣＢがＡｈレセプターに結合することによって、他のダイオキシン類がそのレセプターに結合するのを阻害する事がある。たとえば、表１、表２、表３、表４に示すように、ＰＣＢ１２６のように毒性の高いｃｏＰＣＢおよび２３７８ＴＣＤＤのように毒性の高いＰＣＤＤに対して、ＰＣＢ１１８のような毒性の低いｍｏＰＣＢが、アンタゴニストとして働き、少量の存在でＰＣＢ１２６および２３７８ＴＣＤＤの毒性を過小評価させてしまう。（化合物名の略称記載については表６参照）
【００１４】
【表１】
0003888920.tif 000002
【００１５】
【表２】
0003888920.tif 000003
【００１６】
【表３】
0003888920.tif 000004
【００１７】
【表４】
0003888920.tif 000005
【００１８】
そのため、前記ＰＣＢ１２３、ＰＣＢ１１８、ＰＣＢ１１４，ＰＣＢ１０５，ＰＣＢ１５６、ＰＣＢ１５７、ＰＣＢ１８９に代表されるｍｏＰＣＢを除去したうえで毒性の評価を行なえば、毒性の少ない物質がアンタゴニストとして働いて毒性の高い物質の毒性を過小評価させるのを防止しながら、毒性の高い物質に基づく毒性の評価を正確に行なえるようになる。
具体的に詳述すれば、たとえば、表１の２の成分の毒性評価試料の毒性評価値は、ＰＣＢ１２６；２０ｐｇ／μｌの毒性（７８９ｍＯＤ）とＰＣＢ１２３；８ｎｇ／μｌの毒性とを足し合わせたもの（７８９ｍＯＤより大きな値）になるべきところが、実際には６７８ｍＯＤと過小評価されている。これに対して、前記毒性評価試料中のＰＣＢ１２３を除去して毒性を評価すれば、毒性評価値が７８９と評価される事になるから、真の毒性評価値により近い毒性値を示すものであると評価することが出来る。
【００１９】
従って、ｍｏＰＣＢを除去する除去工程を行なった後の毒性評価試料は、アンタゴニストを除去されたものとなり、その毒性評価試料に対して抗原抗体反応工程を行うと、前記アンタゴニストの影響を排除した、毒性の高い物質を優先する毒性評価が可能になるため、より正確な毒性評価が可能となる。
【００２０】
前記除去工程としては、前記ｃｏＰＣＢとｍｏＰＣＢとの混合物からｍｏＰＣＢを選択的に吸着除去可能なカラムを用いたカラム処理工程を行なうことが有効であると考えられる。本発明者らは、このようなカラム処理として活性炭もしくはアルミナを含有する担体を用いた場合、特に前記ｃｏＰＣＢとｍｏＰＣＢとの混合物から特にアンタゴニストとして働くｍｏＰＣＢを選択的に吸着除去可能であることを見出している。
【００２１】
さらに、前記抗原抗体反応を行う場合に、前記毒性評価試料（具体的には、たとえば、ＰＣＢ含有物からサンプリングしたダイオキシン類含有溶液等）に対して、ダイオキシン類に結合するレセプターを含んでなるレセプター複合体構成物質（具体的には、Ａｈレセプターと、そのＡｈレセプターと対をなし、前記Ａｈレセプターが、前記ダイオキシンと結合したときに、複合体を形成する要素となるＡＲＮＴとの混合液の組み合わせ等）を混合する混合工程を行い、前記ダイオキシン類が前記レセプターに結合して形成されるレセプター複合体に特異的に結合可能な塩基配列を有するＤＮＡ断片部に対して作用させる結合工程を行なうと、その混合系内では以下の反応が起きる。
【００２２】
まず、ダイオキシン類が前記Ａｈレセプターと結合する。すると、前記ダイオキシン類と結合したＡｈレセプターが、前記ＡＲＮＴと結合し、特有のＤＮＡ断片部と結合可能なレセプター複合体を形成する。
ここで、この系内には、レセプター複合体に結合可能な塩基配列を有するＤＮＡ断片部が設けられていると、前記レセプター複合体は、前記ＤＮＡ断片部に結合する。すると、そのＤＮＡ断片部の質量増加分を定量する事によって、前記レセプター複合体を定量する事ができ、前記毒性評価試料中に含まれるダイオキシン類の毒性が評価できることになる。
【００２３】
さらに、具体的には、一対の電極を備えて振動部を形成してある圧電振動子を設け、前記ＤＮＡ断片部を前記圧電振動子の振動部に固定して毒性評価装置を構成した場合には、上述の反応により、前記圧電振動子は前記レセプター複合体の結合量だけ重量が増えることになる。
【００２４】
すると、前記圧電振動子を発振器により振動させたときに基本振動数（Ｆ）と振動数変化度（ΔＦ）、増加質量（Δｍ）の関係は、ΔＦ／Ｆ＝Δｍ／Ｋ（Ｋは振動子によってきまる固有の定数）として表されるから、増加質量（Δｍ）は、Δｍ＝（ΔＦ／Ｆ）＊Ｋとなり、振動数変化度（ΔＦ）に比例する事になるから、前記振動数変化度を周波数測定装置等により調べれば、前記増加質量を知ることが出来る。また、この増加質量分のダイオキシン類は、毒性の高いものほど多く含まれ、毒性の少ないものほど少ないことになるので、ここで得た質量は、まさに毒性の大小を現したものになっているものといえる。
そのため、前記評価対象液の毒性を短時間、簡単かつ正確に評価出来ることになる。
【００２５】
また、前記レセプターが、マウスまたはモルモット由来のアリールハイドロカーボン（Ａｈ）レセプターであれば、他の生物由来のものに比べ、ダイオキシン類を高感度に検出可能である。
また、前記レセプターが、ヒト由来アリールハイドロカーボン（Ａｈ）レセプターであれば、種々の環境から採取した評価対象液に基づき、特に問題視されやすい人体に対する影響を簡便に知る事が出来るので特に有用である。
【００２６】
ダイオキシン類を含有する評価対象液を供給してレセプターに前記ダイオキシン類を結合させるとともに、前記ダイオキシン類と結合したレセプター重量によって、前記評価対象液の毒性を評価すると、従来知られている発色による吸光度による評価を行う場合に比べ、簡単かつ正確な評価を可能とする。
【００２７】
特に、先述の毒性評価装置を用いる場合、前記毒性評価装置にダイオキシン類を含有する評価対象液を供給する混合工程、及び、前記圧電振動子の振動周波数により前記レセプター複合体の量を測定する測定工程を行えば、特にダイオキシン類の種類ごとの量を定量することなく毒性を直接的に測定出来る。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
〔毒性評価装置〕
図１に示すように、本発明の毒性評価方法に用いる毒性評価装置は、圧電振動子１の表面に電極２を形成し、その電極２の表面に、毒性物質の非結合状態の非活性化レセプターには結合せず、かつ、前記毒性物質が前記レセプターに結合して形成されるレセプター複合体に結合可能な塩基配列を有するＤＮＡ断片部３を結合してある振動部Ａを設けて構成してある。前記電極２には、前記圧電振動子１を所定の周波数で発振させるために発振器４を設け、前記レセプター複合体Ｒｈａの定量時の発振周波数の変化は、発振周波数測定器５を使用して測定可能に構成する。
前記電極２は、金を用いる。この電極２としては、白金、金及び銀から選択された少なくとも１種の金属であることが好ましい。前記圧電振動子１には、水晶振動子を用いる。この圧電振動子１としては、チタン酸バリウム、酒石酸カリウムナトリウム、水晶から選択される振動子を用いることが好ましい。これらの電極２、圧電振動子１の種類、大きさ、形状の組み合わせは、使用の目的及び環境に応じて適宜選択する。
電極２は慣用の作製方法、例えばメッキ法、蒸着法、塗布法等により作製してよい。
また、前記発振器４及び前記発振周波数測定器５は適宜公知のものを選択してよい。
【００２９】
前記ＤＮＡ断片部３としては、たとえば配列表記載の配列１、配列２の塩基配列を有するものが利用でき、アニーリングによりＡｈレセプター認識サイトを形成させられる。また、他に、ＵＳＰ５５２９８９９号公報等に記載の種々の塩基配列を合成あるいは単離して用いることが出来る。
【００３０】
0003888920.tif 000006
【００３１】
0003888920.tif 000007
【００３２】
前記Ａｈレセプターとしては、種々の生物由来のものが利用できるが、たとえば、ヒト由来のＡｈレセプターを用いることができる。このようなヒト由来のＡｈレセプターは、ヒト肝癌由来細胞を増殖させ、ＨＥＤＧバッファーを加えホモジェナイズし、遠心分離を行い、上澄液から得られる。もしくは、遺伝子組換え大腸菌を用いて合成も可能である。また、マウスまたはモルモット由来のＡｈレセプターは、肝臓を取り出してミンチにし、ＨＥＤＧバッファーを加えホモジェナイズし、遠心分離を行い、上澄液から得られる。
【００３３】
前記ＤＮＡ断片部を前記電極に結合させるには、３，３’−ジチオジプロピオン酸（化１参照）、及び、アビジン、ビオチンを用いて結合させることが出来る。
【００３４】
【化１】
ＨＯＯＣ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ
【００３５】
〔毒性評価方法〕
本発明の毒性評価方法は、
（１）  ＰＣＢ含有物を含むサンプル中に含まれる物質を有機溶媒で定法により抽出する（抽出工程）。すると、この抽出液には、ＰＣＢ由来の骨格を有する種々の化合物を含有することになる。この中には、ダイオキシン類に加えて毒性を評価しなければならない対象となるｃｏＰＣＢや、ｍｏＰＣＢ、さらには、毒性を評価する必要のないｍｏＰＣＢや、芳香族炭化水素類等が含まれることになる。
【００３６】
（２Ａ）  抽出された抽出液が無色になるまで分液漏斗中で濃硫酸を作用させ、二液分離する。（硫酸処理工程）
（２Ｂ）  抽出された抽出液を５〜１５ｗｔ％の硝酸銀を含有するシリカゲルに接触させ、毒性評価試料の有機溶液を得る。（硝酸銀処理工程）
（２Ｃ）  抽出された抽出液を２０〜５０ｗｔ％の濃硫酸を含有するシリカゲルに接触させ、毒性評価試料の有機溶液を得る。（硫酸処理工程（カラム））
【００３７】
これら工程により、毒性をほとんど持たないがＡｈレセプターに結合可能な芳香族炭化水素類を可溶化し、除去可能な形態に変化させられる。（２Ａ）〜（２Ｃ）の工程は、本発明において必須というわけではないが、いずれかの工程を行うことが好ましく、複数行っても良い。
【００３８】
（３）  次に、前記毒性評価試料の有機溶液にｍｏＰＣＢを除去する除去工程を行なう。
この除去工程には活性炭を含有するシリカゲルを担体としてカラム処理を行なうことが好ましい。前記活性炭が層状構造を有するという特徴に起因して、2つのベンゼン環が同一平面に位置しやすいｃｏＰＣＢほど前記活性炭に吸着しやすい特性を有することから、この工程を行なうと、極性の低い溶媒による画分ほど、オルト置換ハロゲン数の多いＰＣＢが溶出し、溶媒量を増やし、溶媒の極性を増につれ、順にジオルト体、モノオルト体、そしてノンオルト体（ｃｏＰＣＢ）が溶出する事になる。そのため、毒性評価試料から毒性の評価対象となるモノオルト体の画分を容易に得ることが出来る。
【００３９】
（４）  次に、得られた毒性評価試料に対して抗原抗体反応工程を行う。この際、必要が有れば、溶媒留去、ＤＭＳＯ等への再溶解による溶媒交換を行い、ダイオキシン類をより選択的に溶解させる。
【００４０】
上記（４）における抗原抗体反応としては、ダイオキシン類を含有する毒性評価試料を供給してレセプターに前記毒性物質を結合させ、前記毒性物質と結合したレセプター重量によって、前記評価対象液の毒性を評価する、いわゆるＡｈイムノアッセイ（ＡｈＩＡ）を行う。具体的には以下の通りである。
【００４１】
（４Ａ）  ダイオキシンを含有する環境からサンプリングしたダイオキシン溶液、及び、ＡｈレセプターとそのＡｈレセプターと対をなし、前記Ａｈレセプターが、前記ダイオキシンと結合したときに、複合体を形成する要素となるＡＲＮＴ（前記複合体を構成させるレセプター複合体構成物質）との混合液に上記毒性評価装置の電極部分を浸漬する。（混合工程）
（４Ｂ）  前記電極に連設された圧電振動子を発振させ、その振動周波数を測定する。（周波数測定工程）
【００４２】
ここで測定された振動周波数（振動数変化度（ΔＦ））により、前記レセプター複合体の量は、増加質量（Δｍ）として次式により求められる。
Δｍ＝（ΔＦ／Ｆ）＊Ｋ  （Ｋは定数）
ここで、Ｆは前記圧電振動子を発振器により振動させたときの基本振動数である。
【００４３】
従って、前記毒性評価装置により、評価対象溶液による振動数変化度（ΔＦ）をもって、前記レセプター重量の相対値を比較できることになり、毒性を評価できるようになった。
【００４４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
〔毒性評価装置〕
まず、水晶振動子（直径５ｍｍ）に蒸着法により一対の金電極を設ける（直径３ｍｍ）。この金電極を超音波洗浄した後 、前記３，３’−ジチオジプロピオン酸溶液（１ｍＭ、ｐＨ６．４）に室温で１時間浸漬し、前記金電極にＤＮＡ断片部の結合サイトを形成する。このとき、前記３，３’−ジチオジプロピオン酸は、一端が金の結晶界面に取り込まれ、他端が溶液内に露出した状態に保持され、強固に固定されることになる。
次に前記３，３’−ジチオジプロピオン酸の他端に、卵黄由来のアビジンの１０ｍＭ溶液を室温で１時間作用させて、前記アビジンを結合させ、前記金電極表面にアビジンを修飾する。
一方、アニーリングによりＡｈレセプター認識サイトを形成させたＤＮＡ断片部（の５’末端）にはビオチンを結合させておく。この反応は、前記ＤＮＡ断片部の１０ｍＭ溶液に、ビオチン１０ｍＭ溶液を４℃で１時間で滴下して作用させる。
次に、前記アビジンを修飾した金電極に、前記ビオチンを結合したＤＮＡ断片部溶液（１ｍＭ、ｐＨ７．５）を４℃で２４時間作用させる。すると、アビジン−ビオチンの強い相互作用により、前記金電極の表面に、前記ＤＮＡ断片部を、３，３’−ジチオジプロピオン酸−アビジン−ビオチンを介して、結合固定することが出来る。
こうして形成された一対の電極に発振器及び発振周波数測定器を接続して毒性評価装置が得られる。
【００４５】
〔毒性評価方法〕
（１Ａ）  抽出工程は、定法により行なうが、ここでは、抽出工程により得られる毒性評価試料として、ＷＥＬＬＩＮＧＴＯＮ社製の標準試料からダイオキシン類混合液を表５のように調整して用いた。
【００４６】
【表５】
0003888920.tif 000008
【００４７】
尚、ＰＣＤＤのうち、ＴＣＤＤはｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｅを指し、ＰＣＤＤ，ＨｘＣＤＤ，ＨｐＣＤＤ，ＯＣＤＤは順にｐｅｎｔａ，ｈｅｘａ，ｈｅｐｔａ，ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｅを指す。また、左記化合物のｄｉｏｘｉｎｅ骨格をｆｕｒａｎ骨格に交換したものをＴＣＤＤに対してＴＣＤＦ，ＰＣＤＤに対してＰＣＤＦ等と記している。また、ＰＣＢの化合物名称として用いているＩＵＰＡＣ  Ｎｏ．とＩＵＰＡＣ名とは下表６のように対応しており、それぞれ毒性評価係数の与えられているものについては、ＴＥＦ値を併せて示す。
【００４８】
【表６】
0003888920.tif 000009
【００４９】
（２Ａ）〜（２Ｄ）の各処理工程は、たとえば、特願２００１−３５４９６３に記載の手法を採用することが出来るが、ここでは、標準試料を毒性評価試料とするため、省略する。
【００５０】
（３）  前記毒性評価試料の有機溶液にｍｏＰＣＢを除去する除去工程を以下の工程に従って行なった。
【００５１】
（３Ａ）  無水硫酸ナトリウム０．５ｇ、和光純薬社製活性炭埋蔵シリカゲル１ｇ、無水硫酸ナトリウム０．５ｇを順に乾式充填して積層したカラムに、前記毒性評価試料の濃縮液（前記毒性評価試料の全量を０．５ｍｌに濃縮したもの）を供給する。１５分放置後ヘキサンによる溶出を開始する。まず、ヘキサン６０ｍｌで溶出した画分を第一画分とし、以下、ジクロロメタン／ヘキサン＝２５／７５（ｖ／ｖ）の混合溶媒４０ｍｌ、トルエン２００ｍｌで溶出し、第２、第３画分を得る。
【００５２】
各画分に溶出する成分を回収しＧＣ−ＭＳにより分析したところ、回収率は表７のようになった。
【００５３】
【表７】
0003888920.tif 000010
【００５４】
前記（３Ａ）の除去工程を行なった場合、ＰＣＢ１２６や、２，３，７，８−ＴＣＤＤに対してアンタゴニストとして働く物質が主に第一、第二画分に含まれるのに対して、ＴＥＦ値が高く、主に毒性評価対象となる物質が第三画分に含まれることがわかる。そのため、前記第三画分のみをＡｈＩＡに供すれば、毒性の評価が合理的なものとなる。
【００５５】
（３Ｂ）  前記除去工程をアルミナカラムによって行なうことも出来る。
１０ｍｍ径のガラス管ににアルミナを１４ｇ充填するとともに、硫酸ナトリウムを１０ｍｍ充填してアルミナカラムを作製する。カラムを５０ｍｌのヘキサンで洗浄後（１Ａ）の表５に記載のダイオキシン混合液を毒性評価試料として供給し、溶出する物質をＧＣ／ＭＳによって分析したところ表  のようになった。
尚、試料の溶出は、ジクロロメタン／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）の混合溶媒１００ｍｌを用いて、Ｆｒ１として２０ｍｌづつ順に採取し、次に、ジクロロメタン／ヘキサン＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶媒１６０ｍｌを用い、Ｆｒ２として１０ｍｌづつ順に採取して行なった。得られたＦｒ１，２は、分取した順にＦｒ１−１、Ｆｒ１−２のように分類して分析を行なったが、Ｆｒ１については表中分析値の総和として示してある。また、空欄は分析値が検出限界以下である事を示しており、Ｆｒ２−１０以降は、どの成分についても検出されていない。
【００５６】
【表８】
0003888920.tif 000011
【００５７】
表８より、平面性の低いＰＣＢほど、極性の低い溶媒で早く溶出しやすく、Ａｈレセプターと反応してアンタゴニストとして働くＰＣＢについてもＦｒ２−２までには溶出し尽くしていることがわかる。これに対して、平面性の高いｃｏＰＣＢは、溶出が遅く、ｍｏＰＣＢとｃｏＰＣＢとは、溶媒、担体の選択によって分離可能であることが読みとれる。従って、上述の除去工程を経た毒性評価試料に基づいてＰＣＢ含有物の毒性を評価すれば、アンタゴニストの影響を低減させながら、的確な毒性評価を行なえることがわかった。
【００５８】
（４）  抗原抗体反応工程は、毒性評価試料として、（３Ａ）における前記第三画分や、（３Ｂ）におけるＦｒ２−２〜Ｆｒ２−９を、溶媒留去した後ＤＭＳＯ４０μｌに溶解させ、ＡｈＩＡに供して行なうと、ｍｏＰＣＢの影響をあまり受けずに毒性の評価が行なえる。
【００５９】
上述の毒性評価装置を用いない場合には、ＤＮＡ断片部３を固定したウエルに上述のＡｈレセプターおよびＡＲＮＴを供給し、前記ＤＮＡ断片部に結合した複合体を酵素による発色反応で定量する事により同様の結果を得ることができる。この際、発色度は、既知濃度の標準物質に対する吸光度と、複合体の酵素発色に対する吸光度とを比較して行う。
【００６０】
尚、ＴＥＦとは、生体試験等により人為的に取り決められている毒性等価計数であって、所定量の２３７８ＴＣＤＤの毒性を１としたときに同量の毒性物質が示す毒性値を示すものである。
【００６１】
また、ここでは、Ａｈレセプターと前記ＡＲＮＴ混合液としては、モルモットから肝臓を取り出しミンチにし、肝臓１ｇ当り５ｍｌのＨＥＤＧバッファーを加えホモジェナイズし、遠心分離を行い（１２５００ＲＰＭ、４℃、２０分間）、脂質を取り除き上澄液を取り、さらに遠心分離（３７０００ＲＰＭ、４℃、６０分間）を行い、脂質を除いて得られた上澄液を用いた。
【００６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】毒性評価装置の概略図
【符号の説明】
１  圧電振動子
２  電極
３  ＤＮＡ断片部
【図１】
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