(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）モデル実験小動物としてのマウスまたはモルモットに、皮膚バリアー機能回復の遅れが有意に認められる程度まで拘束ストレスまたは過密ストレスを負荷する工程、
（Ｂ）ストレスを負荷した動物の所定の皮膚のバリアー機能を低下させる工程、
（Ｃ）前記低下部位における経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）を経時的に測定する工程、ならびに
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られるデータを、ストレスを負荷しない動物(対照)について工程（Ｂ）および（Ｃ）に準じて得られるデータと比較し、それらの差異を皮膚バリアー機能の回復能の指標として評価する工程、を含んでなる皮膚バリアー機能の回復能の評価方法。
【請求項２】
ストレスを負荷する工程が拘束ストレスにより実施される、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
被検薬物を請求項１または２に記載の評価方法におけるモデル実験小動物に適用することを特徴とする、前記被検薬物の皮膚バリアー機能の回復能に対する有効性の評価方法。
【請求項４】
前記被検薬物の適用が、皮膚バリアー機能の評価部位への外用である、請求項３記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚バリアー機能の回復能の評価方法、ならびに該評価方法を用いる前記回復能を亢進する薬物のスクリーニング法および該スクリーニング法により選択された薬物を含有する組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ストレスが皮膚に及ぼす影響については、既に、多角的な研究が行われ、興味ある結果も得られている。例えば、ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  １９６６−１１には、「ストレスと皮膚」に関する皮膚科学的、薬理学的研究の特集が掲載されている。これらの研究によれば、ストレスが皮膚機能に影響しうることが明らかにされている（例えば、その第２６〜３４頁参照）。概括すれば、
１）拘束ストレス後の生理的変動の範囲内でのテストスチロンレベルの低下が皮脂腺機能の低下をもたらす、２）ストレスは神経内分泌系に影響し、表皮細胞増殖活性を低下させる、３）ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）は細胞系でも、個体レベルでもランゲルハンス細胞の抗原提示機能に抑制的に作用する、４）皮膚に備わった感覚機能が冷刺激、ピンチ刺激などにより活性化し、ＣＧＲＰ、ランゲルハンス細胞を経由して皮膚の免疫機能に影響する可能性がある、ことが判明している。今後、これらの研究成果は適切な外用剤による皮膚状態の改善を行う上でおおいに役立つであろう。
【０００３】
ところで、皮膚器官の観点から適切な皮膚状態を維持するために重要な皮膚バリアー機能にも、ストレスが何等かの影響を及ぼし得るとの示唆も存在する。一方、皮膚バリアー機能と老化との関係については、数多くの研究成果がみられ、例えば脂質の代謝系の変化等から皮膚バリアー機能との関連性に言及があるものの、具体的にストレスと皮膚バリアー機能の変化に何等かの相関性が存在するか否かは明らかでない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
皮膚バリアー機能の変化が客観的かつ、簡易な方法で評価できれば、例えば、皮膚バリアー機能の保全または該機能を亢進させる手段を構築するのに資するであろう。したがって、本発明の目的は、皮膚バリアー機能の簡易な評価方法を提供するにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、モデル実験小動物に所定のストレスを負荷した後、該動物の皮膚バリアー機能を低下させた場合、その皮膚バリアー機能の回復能が、ストレスを負荷しない対照動物の前記回復能と有意に識別できることを見い出した。
【０００６】
したがって、本発明によれば、皮膚バリアー機能の回復能の評価方法であって、モデル実験小動物に所定のストレスを負荷した後、該動物の皮膚バリアー機能を低下させ、その皮膚バリアー機能の回復度を前記回復能の指標とする、方法が提供される。
【０００７】
本発明方法によれば、モデル実験小動物を用い、皮膚バリアー機能の回復能を促進しうる薬物の評価方法、特に有用薬物のスクリーニング法も提供できる。具体的には、被検薬物を前記皮膚バリアー機能の回復能の評価方法のモデル実験小動物に適用し、その適用の前記回復能への有効性を評価することにより、皮膚バリアー機能の回復能を亢進しうる薬物がスクリーニングできる。
【０００８】
また、こうしてスクリーニングできる薬物は、特にストレスに基づく皮膚バリアー機能の低下、ストレスによる皮膚疾患を改善するのに役立つ。
【０００９】
【発明の具体的な態様】
本発明で使用しうるモデル実験小動物は、ヒト以外の各種試験の実験動物として常用されており、かつ本発明の目的に沿うものであれば、いかなる動物であってもよいが、通常、ラット、モルモット、ウサギ等を挙げることができる。
【００１０】
これらの小動物に対して負荷するストレスは、当該技術分野で有効な手段として確立されている拘束ストレスおよび過密ストレスを挙げることができる。拘束ストレスの負荷方法は、例えば、Ｐａｒｅ，Ｗ．Ｐ．Ｇｌａｖｉｎ，Ｇ．Ｂ．，（１９８６）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ−Ｒｅｖ．１０、ｐ．３３９〜３７０に記載の方法に準じて行うことができる。ラットを使用する場合を概述すれば、個別に動物を柔軟な金網等で全身をくるみ、皮膚に損傷を与えないよう留意しながら所定期間固定することにより、ストレスを負荷できる。一方、過密ストレスは、マウスの場合通常、１ケージ（１７×２８ｃｍ2）当り５匹で飼育しているが、同ケージにおける動物の飼育数を、増加、特に、１０匹とすることによりストレスを負荷することができる。これらのストレスの負荷は、動物をストレス状態にするのに十分な期間行えばよいが、ラットの場合、３日間程度の負荷が、評価方法全体に要する時間を少しでも短縮するためには好ましい。本発明によれば、ストレスの負荷が十分でない場合（例えば、上記ラットを使用する際の１日負荷）には皮膚バリアーの回復能を、対照動物のそれと有意に識別できないときがあるので注意を要する。
【００１１】
こうしてストレスの負荷された動物は、ストレス状態（ストレスの影響がみられる状態）に到った後、皮膚バリアー機能を低下する手段にかけられる。かかる手段は、効率よく皮膚バリアー機能を低下できる方法であれば、その手段の様式を問うことなく使用することができる。このような低下をもたらすには、皮膚のテープストリッピングによる角質層除去や界面活性剤［例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］もしくはアセトン等の有機溶媒処理による脂質の除去によることが都合よい。この処理時期は、ラットの場合、ストレス負荷終了後から約１２時間以降に行うのが、実験動物に十分なストレス状態をもたらす上で好ましい。
【００１２】
以上による皮膚バリアーの低下部位における皮膚バリアー機能の回復度を経時的にまたは所定期間後に検出する。前記低下をもたらす部位は、皮膚バリアー機能の回復度を検出できる部位であれば、実験動物のいかなる部位でもよいが、通常、耳介を選ぶのが好ましい。
【００１３】
検出方法は、一般に、皮膚バリアー機能の指標とされている経表皮水分損失または経皮不感知蒸泄量（以下、ＴＥＷＬという）を測定するのがよいが、上記指標としうる他のファクターも使用できるかも知れない。ＴＥＷＬの測定は、それ自体常用されている市販の機器によって行うことができる。機器の典型的なものとしては、エバポリメーター、テヴァメーター、ミーコ水分測定機などを挙げることができる。
【００１４】
本発明によれば、上記操作をストレスが負荷されていない実験動物に繰り返し、同様にして得られるＴＥＷＬ値と、ストレスが負荷された実験動物の前記ＴＥＷＬ値が比較される。なお、例えば、実験動物として、ラットを使用する場合、皮膚バリアー低下前の実験動物では、ストレスを負荷したものと負荷しないものとのＴＥＷＬおよび皮表温度には、有意差が認められなかったことを付記しておく。また、実験動物のＴＥＷＬ値について性差は認められない。
【００１５】
すなわち、本発明の方法に従って、初めて、ストレスと実験動物のＴＥＷＬ値との間の相関性が認められるのである。具体的には、前記ＴＥＷＬ値は、本発明に従ってストレスを負荷した動物では、対照動物に比べて、ＴＥＷＬ値の回復度が有意に遅延する。したがって、本発明によればこのような回復度の遅延現象に基づいて、皮膚バリアー機能の回復能を評価することができる。
【００１６】
さらに、本発明によれば、前記評価方法の系にある薬物を組み合わせて使用し、その薬物による皮膚バリアー機能の回復度を評価することにより、薬物が皮膚バリアー機能の亢進または回復の促進に役立ちうるかを評価することができる。この評価方法によれば、ある一定の薬物が、特にストレスにより皮膚バリアー機能の低下を回復、さらには亢進する作用を有するか、否かが評価でき、皮膚状態の改善に有用な薬物のスクリーニングを行うことができる。
【００１７】
本発明によれば、こうしてスクリーニングされる薬物を皮膚状態を改善するための有効成分として使用する組成物も提供できる。限定されるものでないが、かかる薬物の一例としては、既に抗プラスミン作用を有することにより、再生不良性貧血症や炎症を治療するための医薬組成物の成分としても使用されているトランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（以下、ＴＡと略記する）またはその塩を挙げることができる。したがって、本発明に従う、有効成分としてＴＡまたはその塩を含有する組成物は、特に、ストレスに起因する皮膚機能低下や皮膚疾患等の処置に適する。
【００１８】
かかる組成物は、外用剤に通常使用されている担体、希釈剤または他の活性成分をともに含めて製剤化することができる。剤形は、ローション、クリーム、その他の皮膚外用に適するいずれの形態であってもよい。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を具体例を挙げてさらに詳細に説明する。
【００２０】
例１：拘束ストレスの負荷
１群６匹のラット（Ｗｉｓｔａｒ、オス６〜１０週齢）を、それぞれ柔軟な金網（２０ｃｍ×２０ｃｍ）で全身をくるみ、金網の端部をクリップを用いて固定した。固定操作を１日６時間行い、この操作を３日間続けて動物にストレスをかけた。対照動物は、上記のような固定操作を施すことなく、通常のケージ飼育を行った。
【００２１】
例２：過密ストレスの負荷
通常、マウス５匹を飼育するのに用いるケージ（１７×２８ｃｍ2）内に上記と同様のラットを１匹、５匹および１０匹１４日間にわたり飼育した。なお、１０匹飼育する例が過密ストレス負荷例である。
【００２２】
例３：皮膚バリアーの低下
上記例１および２によってストレスを負荷した動物および対照動物のそれぞれの耳介に、ストレス負荷後１２時間経過後、粘着性テープ片（耳の場合：１×１ｃｍ2、胴部場合２×３ｃｍ2）を貼付し、そのテープ片を慎重に剥がすことにより（テープストリッピング）、表皮を損傷させることなく皮膚バリアー機能を低下させた。
【００２３】
一方、前記耳介を、０１〜５％ＳＤＳ水溶液で清浄処理し、皮膚バリアー機能を低下させた。
【００２４】
前記皮膚バリアー機能の低下処理を施した各動物（対照を含む）の処理部位におけるＴＥＷＬをエバポリメーターＥＰ−１（サーボメッド社）で測定し、かかる処理を行わなかった動物の対応する部位におけるＴＥＷＬを１００％として換算した値を、経時的にプロットしたグラフを、それぞれ図１（テープストリッピング処理）および図２（ＳＤＳ処理）に示す。なお、これらの結果は拘束ストレスを負荷した例であり、実験動物４匹の平均値である。
【００２５】
また、ケージ当り、１匹、５匹および１０匹飼育した動物の皮膚バリアー機能の低下処理後３時間経過したときの、同様に換算したＴＥＷＬ値を図３に示す。
【００２６】
以上の図から、ストレス負荷動物の皮膚バリアー機能の回復度が、対照動物の回復度から有意に遅延することが認められる。
【００２７】
例４：薬物の皮膚バリアー機能回復度への影響
例３のストレス負荷動物に対し、テープストリッピングにより皮膚バリアーを低下させた動物の処置部位へ、水およびＴＡ（５重量％水溶液を５０μｌ／ｃｍ２塗布）をそれぞれ適用した例、ならびに対照例について測定したＴＥＷＬの換算量を図４に示す。
【００２８】
ＴＡは、対照動物の皮膚バリアー機能の回復度さえも陵駕する回復度を示すことがわかる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、皮膚バリアー機能の客観的、かつ簡易な評価方法が提供される。この評価方法は、心と身体を包括した総合的な皮膚状態改善剤の開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は拘束ストレス負荷後のテープストリッピングにより皮膚バリアー機能を損傷させた動物（黒丸印）とストレスを負荷していない対照動物（白ぬき丸印）の前記機能の経時的回復度を示すグラフである。
【図２】図２は図１のテープストリッピングに代えＳＤＳ処理した場合の、図１と同様の皮膚バリアー機能の回復度を示すグラフである。
【図３】図３は図１の拘束ストレス負荷に代え、過密飼育の皮膚バリアー機能回復度への影響を示す、グラフである。
【図４】図４は皮膚バリアー機能の低下がＴＡにより回復、さらには回復能が亢進する結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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