(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエートを含有する細胞を、次亜塩素酸塩を少なくとも含有する酸化剤で処理する工程と、
前記処理された細胞を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程と、
前記水不溶性画分をチオ硫酸塩水溶液を用いて２０℃から７０℃の洗浄処理温度で洗浄することにより、前記水不溶性画分に残留する塩素を低減させる工程とを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２】
前記次亜塩素酸塩の濃度が、有効塩素濃度として1.5％から5.0％の範囲内であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記次亜塩素酸塩が、次亜塩素酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ-３-ヒドロキシ酪酸であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエートを含有する細胞を、次亜塩素酸塩を少なくとも含有する酸化剤で処理するための手段と、
前記処理された細胞を水溶性画分と水不溶性画分とに分離するための手段と、
前記水不溶性画分をチオ硫酸塩水溶液を用いて２０℃から７０℃の洗浄処理温度で洗浄することにより、前記水不溶性画分に残留する塩素を低減させるための手段とを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す)を生産しそれを細胞内に蓄積する能力を有する微生物や、ＰＨＡ合成遺伝子を組み込むことによりＰＨＡの生産が可能となった植物細胞等の高等生物を用いた、ＰＨＡの製造方法に関する。より具体的には、ＰＨＡを含有する細胞を次亜塩素酸塩で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去したのち、得られたＰＨＡをチオ硫酸塩水溶液で洗浄処理することにより、当該ＰＨＡに保持された残留塩素を低減させることを特徴とする、ＰＨＡの製造方法に関する。
【０００２】
また本発明は、前記のＰＨＡの製造方法を実施し得る装置に関する。
【０００３】
【背景技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合が有る)或いはその他のＰＨＡを生産し、細胞内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、従来用いられている多くの合成高分子化合物の様に自然環境に残留して汚染を引き起こすことがなく、また、焼却処分を行なう必要もない為、大気汚染や地球温暖化防止の観点からも有用な材料となり得る。更に、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００４】
微生物生産ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、この様な組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ16株(Ａlcaligenes eutrophus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報等)。特開平５-74492号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を生産させる方法が開示されている。特開平９-191893号公報では、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans ＩＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３-ヒドロキシ酪酸ユニットと４-ヒドロキシ酪酸ユニットとを有するポリエステルを生産することが開示されている。
【０００６】
一方、特許公報第2642937号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から 12 までの３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを有するＰＨＡを生産することが開示されている。特開平５-93049号公報、及び、特開平７-265065号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシヘキサン酸との２成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００７】
これらはいずれも、微生物による炭化水素等のβ酸化や糖からの脂肪酸合成により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【０００８】
一方、ある種の微生物では、アルキル基以外の様々な置換基が側鎖に導入されたＰＨＡ、即ち、「unusual ＰＨＡ」を生産することが報告されており、この様な手法によって微生物生産ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされ始めている。更に、微生物生産ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」が極めて有用である。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等が挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【０００９】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,191，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,24，5256-5260(1991)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が、５-フェニル吉草酸を基質として、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。Ｍacroｍolecules,29，1762-1766(1996)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。Ｍacroｍolecules,32，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス・オレオボランスが３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１０】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672(1994)には、シュードモナス・オレオボランスが、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットと３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸ユニットとのＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。特許公報第2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニット或いは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニット或いは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー、これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ、シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、その効果として、融点が高く良好な加工性を保持しながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。更に、特開2000-72865号公報では、シュードモナス・プチダ・27Ｎ01株(Ｐseudoｍonas putida 27Ｎ01)が、各種の３-ヒドロキシフルオロフェノキシ吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産するとの報告がなされている。
【００１１】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)及びＰolyｍer International,39，205-213(1996)には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス・プチダ・ＫＴ 2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１２】
これらの報告は、側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００１３】
また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００１４】
例えばＭacroｍolecules,31，1480-1486(1996)及び、Journal of Ｐolyｍer Ｓcience:Ｐart Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,36，2381-2387(1998)等では、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成したと報告されている。またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるチオエーテルを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,32，8315-8318(1999)においては、シュードモナス・プチダ・27Ｎ01株が 11-チオフェノキシ吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-チオフェノキシ吉草酸ユニット及び３-ヒドロキシ-７-チオフェノキシヘプタン酸ユニットからなるＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００１５】
ところで、微生物は、生産したＰＨＡを粒子の形態でその細胞内に蓄積することが知られている。この細胞内に蓄積されたＰＨＡを微生物細胞から分離精製する方法として、ＰＨＡをクロロホルムやジクロロメタン等の塩素系有機溶剤で抽出する方法と、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させて除去することによりＰＨＡ粒子を得る方法とが有る。前者の溶媒抽出法は、簡便かつ高純度にＰＨＡを抽出・分離することができる優れた方法であるものの、工業生産レベルにおいては、処理量が多くなる結果、大量の有機溶剤を使用する必要が有る等の課題が生じる(利用されるクロロホルム等の塩素系有機溶剤は、揮発・蒸散すると、環境や健康上の問題を引き起こすことが指摘されている)。また、ＰＨＡを粒子の形態のままで取得したい際には、この溶媒抽出を利用する方法を採用することはできない。
【００１６】
一方、後者のＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させて除去する方法として、次亜塩素酸塩、過酸化水素などの薬剤による処理によって、ＰＨＡ以外の細胞成分を可溶化して、固-液分離により、不溶性のＰＨＡ粒子を回収する方法が知られている。例えば、Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiology,19，198-209(1958)には、微生物細胞を次亜塩素酸ナトリウムのアルカリ性溶液で処理することにより、ポリマーを分離精製する方法が報告されている。特表平８-508881号公報には、ＰＨＡ蓄積菌体をタンパク質分解酵素処理した後、適当なキレート剤で処理し、更に過酸化水素処理を行なうことでＰＨＡを菌体から分離する方法が開示されている。また、別の方法として、特開昭57-174094号公報には、ＰＨＡ蓄積菌体を加温加圧し、圧力を開放することにより菌体を破砕して微生物菌体からＰＨＡを分離する方法が開示されている。特開昭63-226291号公報には、菌体をスフェロプラストヘ変換し、音波振動処理によってこれらを破砕し、遠心分離した後に形成される最上層のＰＨＡを分離する方法が記載されている。
【００１７】
これらの方法は、ＰＨＡを粒子の形態のままで取得したい際にも、極めて有効である。
【００１８】
特に、次亜塩素酸塩を利用する処理方法は、他処理剤を利用する方法と比較して、処理条件が温和で、工程も簡便である上に、細胞由来の不純物の混入が少なく、高純度のＰＨＡを粒子状で取得することが可能であり、実用上も低コストである等の多くの長所を有する優れた方法である。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、次亜塩素酸ナトリウム等の次亜塩素酸塩による細胞処理を利用して、その細胞内に蓄積されているＰＨＡを粒子の形態で回収する方法は、ＰＨＡの構造によっては分子量の低下を伴うこと、回収したＰＨＡに無視できない量の塩素が残留すること(例えば、特開平７-177894号公報を参照)から実用には適さないと考えられてきた。
【００２０】
本発明者らの検討によれば、この残留塩素は、ＰＨＡを加熱する際、急速に放出されることがわかった。従って、かかる次亜塩素酸塩処理を利用して取得されるＰＨＡ粒子を所望の加工品とする際、加熱処理する工程で放出される塩素量が多量であると、作業環境汚染等の要因となることが強く懸念される。加えて、本発明者らが検討したところでは、このＰＨＡ粒子に含まれる残留塩素は、水による洗浄を施す程度の通常の処理では、十分に除去できないことも判明した。即ち、残留塩素は、ＰＨＡ粒子に強固に保持されているものの、加熱処理を施すことで一時にその放出がなされる結果、前記の多量の塩素量が観測されたと結論された。
【００２１】
従って、製造工程に次亜塩素酸塩による処理を利用するＰＨＡの製造方法において、ＰＨＡ粒子に強固に保持されている残留塩素を低減する手段の開発は、商業的規模でのＰＨＡの開発や利用を図る上で、特には、ＰＨＡを粒子の状態で取得し利用することを目指す上で、極めて重要な課題となる。
【００２２】
従って、本発明の目的は、次亜塩素酸塩を含有してなる酸化剤による処理を利用してＰＨＡを製造する際、回収されるＰＨＡ粒子に残留する塩素を、簡便な手段で再現性良く除去・低減することが可能な処理工程を設けるＰＨＡの製造方法を提供することに有る。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＨＡ含有細胞からからＰＨＡ以外の細胞構成成分を、少ない工程数で安価かつ効率良く除き、純度の高いＰＨＡを高収率で得る為のＰＨＡの製造方法に関して鋭意検討を行なった結果、以下の様な発明に至った。
【００２４】
即ち、本発明は、ＰＨＡを含有する細胞を酸化剤で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する工程を含むＰＨＡの製造方法であって、次亜塩素酸塩を少なくとも含有してなる酸化剤で該細胞を処理する工程と、該処理された細胞を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程と、該水不溶性画分に残留する塩素を低減させる工程とを含むことを特徴とする。さらに、好ましくは、前記の塩素を低減させる工程は、前記水不溶性画分を塩素が可溶な液中で洗浄する工程であることを特徴とする。
【００２５】
具体的には、本発明の一態様は、ＰＨＡを含有する細胞を酸化剤で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する工程を含むＰＨＡの製造方法であって、次亜塩素酸塩を少なくとも含有してなる酸化剤で該細胞を処理する工程と、該処理された細胞を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程と、該水不溶性画分を温水で洗浄する工程とを含むことを特徴とする。
【００２６】
また本発明の一態様は、ＰＨＡを含有する細胞を酸化剤で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する工程を含むＰＨＡの製造方法であって、次亜塩素酸塩を少なくとも含有してなる酸化剤で該細胞を処理する工程と、得られたＰＨＡをチオ硫酸塩水溶液で洗浄する工程とを含むことを特徴とする。
【００２７】
また本発明の一態様は、ＰＨＡを含有する細胞を酸化剤で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する工程を含むＰＨＡの製造方法であって、次亜塩素酸塩を少なくとも含有してなる酸化剤で該細胞を処理する工程と、得られたＰＨＡを、該ＰＨＡが溶解性を有しない有機極性溶媒を少なくとも含有してなる極性溶媒溶液で洗浄する工程とを含むことを特徴とする。
【００２８】
また本発明の一態様は、ＰＨＡを含有する細胞を酸化剤で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する工程を含むＰＨＡの製造方法であって、ポリヒドロキシアルカノエートを含有する細胞を破砕して破砕物を得る工程と、該破砕物を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程とを含み、該水不溶性画分を、前記の次亜塩素酸塩を少なくとも含有してなる酸化剤で処理する工程に供することを特徴とする。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡの製造方法では、目的とするＰＨＡは、かかるＰＨＡ生産能を有する微生物は勿論のこと、その微生物が有するＰＨＡ合成遺伝子を遺伝子組み換え技術を利用して導入した結果、ＰＨＡの生産が可能となった植物細胞等の高等生物を利用して、その細胞内に生合成させ、蓄積させることもできる。従って、本発明における「細胞(生体細胞、生物細胞ともいう)」とは、微生物細胞のみならず、ＰＨＡ合成遺伝子を組み込むことによりＰＨＡの生産が可能となった植物細胞等の高等生物の細胞をも含んでいる。
【００３０】
前記の如き、ＰＨＡ生産能を有する微生物としては、所望のＰＨＡの生産能を有するものであればいかなる微生物を用いることもできるが、例えば、本発明の実施例で用いるＰＨＡ生産菌である、ラルストニア・ユウトロファ・ＴＢ64株(Ｒalstonia eutropha ＴＢ64)、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347、Ａｍerican Ｔype ＣultureＣollectionより分譲)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２)、アルカリゲネス属・ＴＬ２株(Ａlcaligenes sp.ＴＬ２)等を用いることができる。
【００３１】
ＴＢ64株は特開2000-166587号公報に開示されており、寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-6933」として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(旧経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター)に国際寄託されている。
【００３２】
ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(旧経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター)に国際寄託されている。ＹＮ２株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
【００３３】
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
(１)形態学的性質
0004007580.tif 000002
(２)生理学的性質
カタラーゼ                      :陽性
オキシダーゼ                    :陽性
Ｏ/Ｆ試験                       :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元                    :陰性
インドールの生成                :陽性
ブドウ糖酸性化                  :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ        :陰性
ウレアーゼ                      :陰性
エスクリン加水分解              :陰性
ゼラチン加水分解                :陰性
β-ガラクトシダーゼ             :陰性
Ｋing's Ｂ寒天での蛍光色素産生  :陽性
４％ＮaＣlでの生育              :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積    :陰性(＊)
Ｔｗeen 80 の加水分解           :陽性
＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖                      :陽性
Ｌ-アラビノース               :陽性
Ｄ-マンノース                 :陰性
Ｄ-マンニトール               :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン   :陰性
マルトース                    :陰性
グルコン酸カリウム            :陽性
n-カプリン酸                  :陽性
アジピン酸                    :陰性
dl-リンゴ酸                   :陽性
クエン酸ナトリウム            :陽性
酢酸フェニル                  :陽性
ＴＬ２株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-6913」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(旧経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター)に国際寄託されている。
【００３４】
本発明の方法では、これらの細胞中に生産された不水溶性のＰＨＡは、粒子状の形状で蓄積されるが、このＰＨＡ粒子を固-液分離により回収する際、その他の細胞構成成分からなる挟雑不純物を次亜塩素酸塩による処理で可溶化させることで、不水溶性のＰＨＡ粒子のみを固相成分として分離している。
【００３５】
即ち、本発明の方法においては、培養後、ＰＨＡを蓄積した細胞を培養液から回収し、この細胞を次亜塩素酸塩を含む処理液中に懸濁し、この処理液中で一定時間、一定条件下で反応させることによって、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させて除去し、該細胞からＰＨＡ粒子を分離する手段を用いる。
【００３６】
本発明の方法で用いる次亜塩素酸塩としては、次亜塩素酸カリウム(ＫＣlＯ)、次亜塩素酸カルシウム(Ｃa(ＯＣl)2)、次亜塩素酸ナトリウム(ＮaＣlＯ)等の中から、適宜選択して用いることができる。
また、処理液中に溶解させる次亜塩素酸塩の濃度は、処理液中の有効塩素濃度として、0.5％から 12.0％、望ましくは 1.5％から 5.0％の範囲内に選択するのが好ましい。例えば、次亜塩素酸塩として市販の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いる場合は、次亜塩素酸ナトリウムの濃度は４％(有効塩素濃度として約1.7％)から６％(有効塩素濃度として約2.5％)程度が望ましい。また、細胞の乾燥重量１g当たり、処理液の液量を 50ｍlから 300ｍlの範囲内に選択して、処理を行なうことが好ましい。処理温度は、室温(20℃程度)以上になると、ＰＨＡ自体にも作用して部分的に加水分解等を起こし、ＰＨＡの分子量低下を招く恐れが有る為、処理温度を０℃から 10℃の範囲内に選択して処理を行なうことが望ましい。なお、細胞に次亜塩素酸ナトリウムが接触した際に発熱することが有るので、その際は特に注意が必要である。前記の次亜塩素酸塩の濃度、温度条件を選択する際、処理時間は、１時間から５時間の範囲内、通常、２時間程度に選択すると十分に可溶化処理が達成できる。１時間未満であるとＰＨＡ成分以外の細胞成分の可溶化が不十分となり、５時間以上処理を行なうとＰＨＡの分子量低下の原因となるので注意が必要である。
【００３７】
前記の可溶化処理の反応を終了した後、処理液中のＰＨＡ粒子を回収する手段としては、ＰＨＡ粒子を、共存する可溶化された細胞成分と効果的に分離できる限り、いかなる固-液分離手段をも利用することができるが、例えば、遠心分離法を利用して、ＰＨＡ粒子を可溶性画分と分離することができる。この時点でのＰＨＡの様態は水溶液に懸濁された微粒子状になっているが、その後の脱塩素処理の効率が高くなるようにＰＨＡ微粒子の様態を保ったまま遠心分離操作を行なう事が必要である。つまり、遠心分離の際の温度は０℃から 10℃程度、好ましくは０℃から５℃で行なうことが望ましい。
更に、遠心分離法で回収したＰＨＡ粒子を脱イオン水、蒸留水、純水等の精製水で更に洗浄し、僅かに混入する可能性を有する挟雑成分の十分な除去を図る工程を加えることがより望ましい。前記の洗浄する工程は２回から３回程度行なうことが望ましい。
【００３８】
特に高純度のＰＨＡを得る必要が有る際には、ＰＨＡの分離及び洗浄操作の後に、例えば、酵素、酸化剤、界面活性剤またはこれらを組み合わせた化学的処理等を行なうこともできる。
【００３９】
前記の次亜塩素酸塩による処理の工程の前に、細胞を破砕する工程を更に加えることで、ＰＨＡを更に効果的に分離することができる。この細胞を破砕する工程では、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法(ガラス粉末やアルミナ粉末等の助剤を加えて乳鉢中で磨り潰す方法)、凍結融解法等の薬剤を使用しない方法を用いることが望ましい。更に、この再懸濁液について、遠心分離等の方法により固体成分と可溶成分とを分離し、ＰＨＡ成分が含まれている固体成分を次亜塩素酸塩で処理する。
【００４０】
ところで、前記した通り、本発明においては、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させる酸化剤として次亜塩素酸塩を好適に用いることができる。この次亜塩素酸塩による処理では、消費される次亜塩素酸イオンに起因する塩素が副生され、その一部が不水溶性のＰＨＡ粒子表面に付着して分離される。弱く付着する部分は、次亜塩素酸塩による処理を行ない,固-液分離した後、水洗浄をおこなうことで溶出除去されるものの、強固に付着している一部の塩素は残留塩素となり、加熱を伴う加工を行なう際に初めて離脱するものとなる。この様な残留塩素は、得られたＰＨＡの利用を考える上で問題となり得る。
【００４１】
この様な残留塩素を除去するために、本発明においては、前記の次亜塩素酸塩による処理とその後の固-液分離工程の後に、以下の様な、塩素が可溶な液中で洗浄処理を更に施す工程を付け加えた。液中での洗浄処理は、懸濁、攪拌など工程として簡便で、かつ洗浄後の回収が容易であり、回収率や純度を低下させないので、微小な粒子の処理方法として適格である。洗浄液としては、塩素が可溶であるほか、ＰＨＡを溶解しないことが要求されることは言うまでもない。残留塩素を除去する洗浄処理として、得られたＰＨＡを更に精製水に懸濁し、30℃から 60℃に昇温し攪拌しながら、回収したＰＨＡに残存する塩素を脱離させる手段を用いることができる。この場合の温水の量は脱離した塩素が十分溶解し得る量、すなわちＰＨＡ１g(乾燥重量)当たり 50ｍl以上であることが望ましく、処理時間は６時間以上(処理温度を低くするにつれて処理時間を長くすることが望ましい)が望ましく、更に本処理は温水を新たなものに換えて２回以上行なう事が望ましい。
【００４２】
上記洗浄の終了後、洗浄液中のＰＨＡ粒子を回収する方法としては、ＰＨＡ粒子を、共存成分から効果的に分離精製し得る方法であれば、いかなる方法をも用いることができるが、例えば、遠心分離法を用いることができる。
【００４３】
残留塩素を除去する別の洗浄処理として、下記の如き残留塩素をチオ硫酸塩水溶液で洗浄して低減させる手段を用いることができる。
【００４４】
チオ硫酸塩としては、チオ硫酸カリウム(Ｋ2Ｓ2Ｏ3)、チオ硫酸カリウム・３水和物(Ｋ2Ｓ2Ｏ3・３Ｈ2Ｏ)、チオ硫酸カルシウム・６水和物(ＣaＳ2Ｏ3・６Ｈ2Ｏ)、チオ硫酸第一鉄(ＦeＳ2Ｏ3)、チオ硫酸ナトリウム(Ｎa2Ｓ2Ｏ3)、チオ硫酸ナトリウム・５水和物(Ｎa2Ｓ2Ｏ3・５Ｈ2Ｏ)、チオ硫酸アンモニウム((ＮＨ4)2Ｓ2Ｏ3)等からなる群より適宜選択して用いることができる。また、上記のチオ硫酸塩を含む溶液や混合物を用いることもできる。
【００４５】
チオ硫酸塩のうち、チオ硫酸ナトリウム・５水和物(Ｎa2Ｓ2Ｏ3・５Ｈ2Ｏ、通称「ハイポ」)は、従来、主に水道水の「カルキ抜き剤」として使用されてきた。チオ硫酸ナトリウム・５水和物は水溶液中で塩素を吸収する作用を有しており、そのメカニズムは、下記式[１]に示す通りである。
【００４６】
Ｎa2Ｓ2Ｏ3＋４Ｃl2＋５Ｈ2Ｏ→２ＮaＣl＋２Ｈ2ＳＯ4＋６ＨＣl[１]
チオ硫酸塩水溶液でＰＨＡを洗浄処理することによって、当該ＰＨＡに保持された残留塩素は,上記[１]の反応によって除去される。
【００４７】
チオ硫酸塩による洗浄処理における温度は、当該ＰＨＡの物性等に応じて適宜設定するものではあるが、通常、０℃から 100℃、望ましくは 20℃から 70℃に設定するのが良い。また、本洗浄処理における洗浄時間は、５分間から 24時間、望ましくは、１時間から３時間とするのが良い。
【００４８】
終了後の、洗浄液中のＰＨＡ粒子を回収する方法としては、ＰＨＡ粒子を、共存成分から効果的に分離精製し得る方法であれば、いかなる方法をも用いることができるが、例えば、遠心分離法を用いることができる。また、本洗浄処理で洗浄したＰＨＡ粒子を、精製水等で更に洗浄する処理を加えれば、なお望ましい。
【００４９】
また、残留塩素を除去するさらに別の洗浄処理として、下記の如き残留塩素を有機極性溶媒で洗浄して低減させる手段を用いることができる。
【００５０】
この極性溶媒溶液による洗浄処理は、ＰＨＡ粒子表面に付着している残留塩素を、目的のＰＨＡ自体に対する溶解性を有しない有機極性溶媒を全体積の 50％以上の濃度で含む極性溶媒溶液で洗浄して、この極性溶媒溶液中に溶出させ低減させるものである。
【００５１】
不水溶性のＰＨＡ粒子表面に強固に付着している一部の塩素に対して、前記の如き有機極性溶媒を利用する洗浄を施すことで、その大部分を除去することができる。なお、本方法で得られるＰＨＡ粒子においては、残留塩素の絶対量が大幅に低減されている為、かかるＰＨＡ粒子を原材料として加工品を作製する際、熱を加えても、放出される塩素量は、作業環境汚染等の要因とはならない程度に抑制できる。
【００５２】
この極性溶媒溶液による洗浄処理に用いる有機極性溶媒としては、アルコール、ケトン等を用いることができる。より具体的には、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン等の中から適宜選択して用いることができる。なお、これら有機極性溶媒は、単独で利用することが一般的であるが、複数種を含む混合溶媒を用いることもできる。更に、前記アルコール、ケトン等の有機極性溶媒は水との高い親和性を有するので、水と均一に混和させた混合溶媒として用いることもできる。水と均一に混和させた混合溶媒として用いる際には、有機極性溶媒の含有率(濃度)を高くすることが望ましく、例えば、含有率(濃度)を 99％以上とすると、単一溶媒を用いる際と遜色の無い洗浄効果が達成できる。
【００５３】
この極性溶媒溶液による洗浄処理における温度は、目的とするＰＨＡの物性、例えば、有機極性溶媒に対する溶解度、軟化点、融点等に応じて適宜選択するものでもあるが、通常、利用する有機極性溶媒が液体状態であり、かつ、その蒸散が少ない温度領域、例えば、０℃から 50℃の範囲に選択することが望ましい。また、この洗浄処理における洗浄時間は、用いる有機極性溶媒の種類や温度に依存するものの、５分間から 24時間の範囲内、好ましくは、１時間から３時間の範囲内に選択することで、十分な洗浄・除去が達成できる。
【００５４】
この極性溶媒溶液を用いる洗浄処理を終了した後、有機極性溶媒を含む液中から洗浄処理済みのＰＨＡ粒子を回収する手段としては、ＰＨＡ粒子と、有機極性溶媒を含む極性溶媒溶液中に溶解している共存成分とを効果的に分離できる限り、いかなる固-液分離方法をも用いることができる。例えば、遠心分離法を用いて、有機極性溶媒を含む液に溶解する成分と、ＰＨＡ粒子との分離を図ることができる。また、有機極性溶媒を用いる洗浄処理後、回収したＰＨＡ粒子を、再度精製水等で洗浄し、有機極性溶媒の残留分を除去する処理を加えれば、なお望ましい。
【００５５】
なお、前記の極性溶媒溶液による洗浄処理における洗浄効果は、ＰＨＡ粒子の種類に依存せず、汎用性を有し、また、再現性も高いことが見出されている。また、ＰＨＡ粒子の量は、元の細胞自体の嵩に比較すると格段に少ないので、前記の有機極性溶媒を利用する洗浄に用いる有機極性溶媒は、有機溶媒抽出法で使用される有機溶媒の量とは比較にならない程僅かな量である。しかも、ＰＨＡ自体は溶解させず、その表面に付着する塩素のみを溶出させ、固-液分離法を利用して、洗浄されたＰＨＡ粒子を再回収する為、かかる工程において、揮発・蒸散する有機溶媒量を極めて少なくすることも可能となる。加えて、有機溶媒抽出のように、水層中にも若干量の有機溶媒が残留しその回収処理が必要となることや、有機相からＰＨＡを回収する際に溶媒留去等で排除する多量の有機溶媒の回収処理を行なう必要が有ること等、規模が増すにつれてますます困難となる有機溶媒の回収作業も、本発明の方法ではより簡単に実施できる。
【００５６】
以上説明したように,本発明の洗浄とは,通常用いられると同様の意味であって,液中にＰＨＡ粒子を懸濁させ,攪拌し,洗浄液とＰＨＡ粒子を分離する一連の工程である。しかし,同様の洗浄効果が得られるものであれば,攪拌を省略したり,分離がなく,洗浄液を連続的に排出・追加するものであったり,必要に応じて,この工程を変化させてもよい。
【００５７】
上記の残留塩素を除去する工程で得られたＰＨＡ粒子を乾燥する工程においては、自然乾燥、真空乾燥法、凍結乾燥法等、当該ＰＨＡの物性や取得しようとする形態等に応じて適宜選択するものとする。
【００５８】
前記の方法でＰＨＡを製造する為の装置としては、通常の微生物生産や化学合成等に用いる装置を単独または複数組み合わせて用いることができるが、更に、下記の様な構成を備えたＰＨＡの製造装置を、本発明のＰＨＡの製造方法に最適な製造装置の一形態として例示することができる。
【００５９】
ＰＨＡを含有する細胞を、前記の次亜塩素酸塩で処理して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を除去する手段と、該処理された細胞を水溶性画分と水不溶性画分(ＰＨＡ)とに分離する手段と、該水不溶性画分から残留塩素を除去する洗浄手段とが備わっている。残留塩素を除去する手段としては、該水不溶性画分を温水で洗浄処理する手段、該水不溶性画分をチオ硫酸塩水溶液で洗浄処理する手段、該水不溶性画分を、前記ＰＨＡ自体に対する溶解性を有しない有機極性溶媒を含有してなる極性溶媒溶液で洗浄処理する手段からなる群より選択される、少なくとも一つ以上の手段よりなる。更に必要に応じて、前記の次亜塩素酸塩で処理する手段の前に、ＰＨＡを含有する細胞を破砕して破砕物を得る手段と、該破砕物を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する手段とを備えた構成の製造装置とすることもできる。
【００６０】
【実施例】
以下に、実施例を示して、本発明を更に具体的に説明する。これら実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例における「％」は特に標記した以外は重量基準である。また、各実施例で用いたＭ９培地は下記の組成を有するものである。
【００６１】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4   6.2g
ＫＨ2ＰＯ4    3.0g
ＮaＣl       0.5g
ＮＨ4Ｃl     1.0g
(培地１リットル中、pＨ7.0)
(実施例１)
リンゴ酸ナトリウム 0.1％を含有するＭ９寒天培地上のＴＢ64株のコロニーを、500ｍl容振盪フラスコ中の、リンゴ酸ナトリウム 0.5％を含有するＭ９培地 50ｍlに植菌し、30℃で振盪培養した。24時間後、培養液５ｍlを、窒素源であるＮＨ4Ｃlのみ１/10 濃度に調製したＭ９培地にリンゴ酸ナトリウム 0.5％を含有した培地１リットルに加え、同様に振盪して菌体にＰＨＢを蓄積させた。52時間後、ＰＨＢ蓄積菌体を遠心分離によって収穫し、蒸留水 30ｍlに再懸濁して３等分した(各 10ｍl)。これらに１から３まで番号を付け、以下の処理を行なった。
【００６２】
１:対照:更に遠心分離後メタノールで洗浄し、凍結乾燥して秤量した後、クロロホルムで 60℃、24時間抽出操作を行ない、抽出液を濾過、濃縮後、メタノールで再沈殿させ、減圧乾燥して対照ポリマー(試料１とする)を得た。
【００６３】
２:４℃に冷却した脱イオン水を 30ｍl加え、４℃に冷却した次亜塩素酸ナトリウム溶液(キシダ化学社製；次亜塩素酸ナトリウム 12％(有効塩素濃度５％以上)含有)を 20ｍl加えて、４℃で２時間反応させた。反応終了後、反応液に４℃に冷却した脱イオン水 140ｍlを加え、４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間遠心分離を行なった。得られた沈殿物に４℃に冷却した脱イオン水 80ｍlを加え、超音波処理にて粒子を十分分散させた後、遠心分離を行なった(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)。更にこの操作を２回繰り返し、得られた沈殿物を凍結乾燥した。これを試料２とする。
【００６４】
３:２の操作の脱イオン水による洗浄を行なった試料を、50ｍlの脱イオン水に懸濁し、50℃で６時間攪拌したのち、上澄を遠心分離(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)によって除去した。この温水洗浄処理をもう１度繰り返した。得られた沈殿物に４℃に冷却した脱イオン水 40ｍlを加え、超音波処理にて粒子を十分分散させた後、遠心分離を行なった(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)。更にこの操作を１回繰り返し、得られた沈殿物を凍結乾燥した。これを試料３とする。
【００６５】
＜残留塩素の測定＞
試料２及び試料３については以下の様にして残留塩素を測定した。
【００６６】
図１に示す１:三角フラスコ(全容量 637ｍl)と、２a:中心部に穴をあけた外蓋(スクリューキャップ)、２b:中心部に穴をあけたテフロン製内蓋、及び２c:内蓋と同じ大きさのアルミ箔で構成された蓋をオーブン中で予め 150℃に加熱しておき、３:アルミ箔上に載せた４:試料 0.3gを入れて蓋を密閉し、同じく 150℃で加熱した。３分後、蓋の穴から６:検知管(ガステック社製；塩素ガス検知管・品番８Ｌa；検出範囲濃度:0.5ppｍから８ppｍ或いは、品番８Ｈ；検出範囲濃度:0.5ppｍから８ppｍ)を差込み、100ｍlを吸引して塩素濃度を測定した。
【００６７】
その結果、温水処理を行なっていない試料２の塩素濃度が約50ppｍであったのに対し、温水処理を行なった試料３では約４ppｍであった。試料３は試料２に比べて塩素低減の効果が見られる。
【００６８】
次に、以下に示す「回収率」及び「純度」を評価する為、次の操作を行なった。
【００６９】
乾燥した１から３までの試料にクロロホルム 30ｍlを加え、60℃で 24時間攪拌抽出操作を行なった。ＰＨＢが抽出されたクロロホルム溶液を 0.45μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して 10倍量のメタノールに注加しＰＨＢを沈殿、回収した。これらを減圧乾燥して秤量した。
【００７０】
対照である１に対する、２及び３の試料のクロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を「回収率」とし、各試料の、クロロホルム抽出前の試料に対するクロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を「純度」として、表１に示す。
【００７１】
【表１】
0004007580.tif 000003
【００７２】
試料３は、温水処理をしているにもかかわらず、回収率及び純度は、温水処理を行なっていない試料２とほぼ同等であった。したがって、温水処理は、回収率と純度を高く保ったまま、残留塩素を減少させる効果がある。
【００７３】
(実施例２)
n-ノナン酸 0.1％を含有するＭ９寒天培地上のシュードモナス・オレオボランスのコロニーを、n-ノナン酸 0.3％を含有するＭ９培地 50ｍlに植菌し、30℃で振盪培養した。40時間後、培養液５ｍlをn-ノナン酸 0.2％及び５-フェニル吉草酸 0.05％を含有するＭ９培地１リットルに加え、振盪培養した。更に 36時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、窒素源であるＮＨ4Ｃlを含まず、n-ノナン酸 0.05％及び５-フェニル吉草酸 0.2％を含有するＭ９培地１リットルに再懸濁し、同様に振盪して菌体に３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシ吉草酸、及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを蓄積させた。48時間後、ＰＨＡ蓄積菌体を遠心分離によって収穫し、以下の処理を行なった。
【００７４】
４:対照:更に遠心分離後メタノールで洗浄し、凍結乾燥して秤量した後クロロホルムで 60℃、24時間抽出操作を行ない、抽出液を濾過、濃縮後、メタノールで再沈殿させ、減圧乾燥して対照ポリマー(試料４とする)を得た。
【００７５】
５:４℃に冷却した脱イオン水を 30ｍl加え、４℃に冷却した次亜塩素酸ナトリウム溶液(キシダ化学社製；次亜塩素酸ナトリウム 12％(有効塩素濃度５％以上)含有)を 20ｍl加えて、４℃で２時間反応させた。反応終了後反応液に４℃に冷却した脱イオン水 140ｍlを加え、４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間遠心分離を行なった。得られた沈殿物に４℃に冷却した脱イオン水 80ｍlを加え、超音波処理にて粒子を十分分散させた後、遠心分離を行なった(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)。更にこの操作を２回繰り返し、得られた沈殿物を凍結乾燥し,試料５を得た。
【００７６】
６:５の操作の脱イオン水による洗浄を行なった試料を、50ｍlの脱イオン水に懸濁し、30℃で 12時間攪拌した。更に上澄を遠心分離(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)によって除去し、50ｍlの脱イオン水に再懸濁し、30℃で 12時間攪拌した。処理終了後上澄を遠心分離(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)によって除去し、得られた沈殿物に４℃に冷却した脱イオン水 40ｍlを加え、超音波処理にて粒子を十分分散させた後、遠心分離を行なった(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)。更にこの操作を１回繰り返し、得られた沈殿物を凍結乾燥し、試料６を得た。
【００７７】
試料５及び試料６は実施例１と同様に方法で残留塩素を測定した。その結果、温水処理を行なっていない試料５の塩素濃度が約20ppｍ(検知管８Ｌaの 30ｍl引きから換算)であったのに対し、温水処理を行なった試料６では約２ppｍであった。試料６は試料５に比べて塩素低減の効果が見られる。
【００７８】
更にこれらの試料を実施例１と同様にクロロホルム抽出し、回収率及び純度を求めた。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
0004007580.tif 000004
【００８０】
温水処理試料６の回収率及び純度は、温水処理を行なっていない試料５とほぼ同等であった。実施例１のＰＨＢに対すると同様,本実施例のような芳香環を有するＰＨＡに対しても、温水処理は、回収率と純度を高く保ったまま、残留塩素を減じさせる効果がある。
【００８１】
(実施例３)チオ硫酸ナトリウム水溶液による洗浄(１)
酵母エキス(オリエンタル酵母工業(株))0.5％を含むＭ９培地 200ｍlに、ＹＮ２株を植菌し、500ｍl容振盪フラスコ中で 30℃、125 ストローク/分の条件下で振盪培養した。８時間後、前記培養液を、ポリペプトン(日本製薬(株))0.5％と５-チオフェノキシ吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 25リットルに添加し、50リットル容ジャーファーメンター中で、30℃で 48時間通気攪拌培養した。
【００８２】
上記培養液のうち 200ｍlを遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)して微生物細胞を回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行ない、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析してＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、当該培養液中の微生物細胞には表３に示すモノマーユニット組成を有するＰＨＡが含まれていることがわかった。
【００８３】
【表３】
0004007580.tif 000005
【００８４】
上記の分析操作に用いた以外の培養液より、遠心分離によって微生物細胞を回収した。得られた細胞は精製水 1.6リットルに懸濁し、次亜塩素酸ナトリウム溶液(有効塩素濃度５％以上)0.8リットルを添加した。これを４℃で２時間振盪してＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させた後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収した。得られたＰＨＡを精製水 200ｍlに懸濁し、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収する操作を３回繰り返して水洗浄を行ない、ＰＨＡ粒子(試料７とする)を得た。
【００８５】
当該ＰＨＡ粒子に保持された残留塩素は、以下の方法で評価した。
【００８６】
(１)官能評価
室温放置されたＰＨＡ粒子の塩素臭を官能的に判定し、塩素臭の強いものから順に、
＋＋＋(強),＋＋(中),＋(低),±(微弱),−(なし)
の５段階で評価した。
【００８７】
(２)濃度測定
500ｍl容蓋付きフラスコ中に上記のＰＨＡ粒子を入れて密封し、150℃雰囲気中で１時間加熱して、残留塩素を放出させた後、ガス検知管を用いてフラスコ内の塩素濃度を測定した。
【００８８】
残留塩素の評価の結果を表４に示した。表４より、当該ＰＨＡ粒子における塩素の残留が認められた。
【００８９】
【表４】
0004007580.tif 000006
【００９０】
上記の方法で得られる、乾燥重量で 1.0gに相当するＰＨＡ粒子を、精製水または 10％チオ硫酸ナトリウム・５水和物水溶液各 50ｍlに懸濁した。これらの懸濁液を 50℃で６時間攪拌した後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収した。得られたＰＨＡを精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収する操作を３回繰り返した。得られたＰＨＡを精製水 10ｍlに懸濁して凍結乾燥し、ＰＨＡの洗浄粒子を得た。精製水を用いた洗浄ＰＨＡ粒子を試料８、10％チオ硫酸ナトリウム・５水和物水溶液を用いた洗浄ＰＨＡ粒子を試料９とする。
【００９１】
当該洗浄粒子に保持された残留塩素は、以下の方法で評価した。
【００９２】
(１)官能評価
室温放置されたＰＨＡ粒子の塩素臭を官能的に判定し、塩素臭の強いものから順に、
＋＋＋(強),＋＋(中),＋(低),±(微弱),−(なし)
の５段階で評価した。
【００９３】
(２)濃度測定
500ｍl容蓋付きフラスコ中に上記の洗浄粒子を入れて密封し、150℃雰囲気中で１時間加熱して、残留塩素を放出させた後、ガス検知管を用いてフラスコ内の塩素濃度を測定した。
【００９４】
残留塩素の評価の結果を表５に示した。表４と表５の比較により、精製水による温水洗浄でも塩素濃度減少効果はあるが、チオ硫酸ナトリウム水溶液による洗浄によって、ＰＨＡの洗浄粒子の残留塩素がさらに低減されることが明らかになった。
【００９５】
【表５】
0004007580.tif 000007
【００９６】
(実施例４)チオ硫酸ナトリウム水溶液による洗浄(２)
実施例３の方法で得られた試料７の、乾燥重量で 1.0gに相当するＰＨＡ粒子を、０％、0.1％、1.0％、または、10％のチオ硫酸ナトリウム・５水和物水溶液各 50ｍlに懸濁した。これら４種類の懸濁液を 50℃で６時間攪拌した後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収した。得られたＰＨＡを精製水 50ｍlに懸濁し、更に 50℃で６時間攪拌した後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収した。得られたＰＨＡを精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、30分間)によりＰＨＡを回収する操作を３回繰り返した。得られたＰＨＡを精製水 10ｍlに懸濁して凍結乾燥し、ＰＨＡの洗浄粒子を得た。チオ硫酸ナトリウム水溶液の濃度が０％、0.1％、1.0％、10％であったものをそれぞれ、試料10，11，12，13 とする。
【００９７】
当該洗浄粒子に保持された残留塩素は、以下の方法で評価した。
【００９８】
(１)官能評価
室温放置された洗浄粒子の塩素臭を官能的に判定し、塩素臭の強いものから順に、
＋＋＋(強),＋＋(中),＋(低),±(微弱),−(なし)
の５段階で評価した。
【００９９】
(２)濃度測定
500ｍl容蓋付きフラスコ中に上記の洗浄粒子を入れて密封し、150℃雰囲気中で１時間加熱して、残留塩素を放出させた後、ガス検知管を用いてフラスコ内の塩素濃度を測定した。
【０１００】
残留塩素の評価の結果を表６に示した。表４と表６により、精製水(０％チオ硫酸ナトリウム水溶液)の温水洗浄でも,塩素濃度を減少させる効果はあるが,チオ硫酸ナトリウム水溶液による洗浄によって、官能評価による微妙な差異であるが,ＰＨＡの洗浄粒子の残留塩素が低減されること,その効果も,チオ硫酸ナトリウムの濃度が高いほど大きいことが明らかになった。
【０１０１】
【表６】
0004007580.tif 000008
【０１０２】
(実施例５)  アルコールによる洗浄処理
乳酸ナトリウム 0.5％を添加したＭ９培地 1.6リットルに、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)・ＴＬ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、培地から細胞を遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)によって回収した。
【０１０３】
上記の培養操作により得られた細胞を精製水 80ｍlに懸濁し、次亜塩素酸ナトリウム溶液(有効塩素濃度５％以上)40ｍlを添加した。この懸濁液を４℃で２時間振盪して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化した後、遠心分離(59000ｍ/s2(6000×g)、４℃、20分間)によりＰＨＡを回収した。回収したＰＨＡを再び精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)によりＰＨＡ粒子を回収する操作を、計２回繰り返して、ＰＨＡの水洗浄処理を行なって、ＰＨＡ粒子を得た。
【０１０４】
得られたＰＨＡの一部は、凍結乾燥した後、常法に従ってメタノリシスを行ない、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析して、ＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その同定の結果、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとするＰＨＢであった。
【０１０５】
上記工程で得られた、乾燥重量で 0.3gに相当するＰＨＡ粒子を、精製水、メタノール、エタノール、並びに、イソブタノール 各 40ｍlにそれぞれ懸濁した。この懸濁液を４℃で１時間振盪した後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、20分間)によりＰＨＡ粒子を回収した。回収したＰＨＡ粒子を再び精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)によりＰＨＡ粒子を回収した。この洗浄処理を終えたＰＨＡ粒子を精製水 10ｍlに懸濁して凍結乾燥し、ＰＨＡの洗浄処理済み粒子を得た。上記洗浄液が、精製水、メタノール、エタノール、イソブタノールであったＰＨＡ粒子を、それぞれ、試料14，15，16，17 とする。
【０１０６】
室温放置時と加熱時について、前記洗浄処理済みＰＨＡ粒子(試料14-17)から放出される塩素量を、それぞれ以下の方法で測定した。50ｍlバイアル瓶に前記の洗浄処理済み粒子を入れて密封し、室温で１晩放置した後、ガス検知管を用いてバイアル瓶内の気相中に含まれる塩素量を測定した。次に、当該バイアル瓶をホットプレート上で 150℃、２分間加熱した後、ガス検知管を用いてバイアル瓶内の気相中に含まれる塩素量を測定した。
【０１０７】
表７に、その測定結果を示す。表７に示す結果より、アルコールによる洗浄を施した際(試料15-17)には、精製水による洗浄を施した場合(試料14)と比較して、洗浄処理済みのＰＨＡ粒子から放出される塩素量が、室温放置下、加熱下、いずれにおいても約半分またはそれ以上に減少していることが明らかになった。
【０１０８】
【表７】
0004007580.tif 000009
【０１０９】
(実施例６)  ケトンによる洗浄処理
乳酸ナトリウム 0.5％を添加したＭ９培地 1.6リットルに、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)・ＴＬ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、培地から細胞を遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)によって回収した。
【０１１０】
上記の培養操作により得られた細胞を精製水 80ｍlに懸濁し、次亜塩素酸ナトリウム溶液(有効塩素濃度５％以上)40ｍlを添加した。この懸濁液を４℃で２時間振盪して、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化した後、遠心分離(59000ｍ/s2(6000×g)、４℃、20分間)によりＰＨＡを回収した。回収したＰＨＡを再び精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)によりＰＨＡ粒子を回収する操作を、計２回繰り返して、ＰＨＡの水洗浄処理を行なって、ＰＨＡ粒子を得た。
【０１１１】
得られたＰＨＡの一部は、凍結乾燥した後、常法に従ってメタノリシスを行ない、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析して、ＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その同定の結果、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとするＰＨＢであった。
【０１１２】
上記工程で得られた、乾燥重量で 0.3gに相当するＰＨＡ粒子を、精製水またはアセトン 40ｍlに懸濁した。この懸濁液を４℃で１時間振盪した後、遠心分離(29400ｍ/s2(3000×g)、４℃、20分間)によりＰＨＡ粒子を回収した。回収されたＰＨＡ粒子を再び精製水 40ｍlに懸濁し、遠心分離(78000ｍ/s2(8000×g)、４℃、10分間)により、ＰＨＡ粒子を回収した。この洗浄処理を終えたＰＨＡ粒子は精製水 10ｍlに懸濁して凍結乾燥し、ＰＨＡの洗浄処理済み粒子を得た。上記２回の洗浄が、ともに精製水洗浄であったものを試料18、１回目がアセトン洗浄であったものを試料19 とする。
【０１１３】
室温放置時と加熱時について、前記洗浄処理済みＰＨＡ粒子から放出される塩素量を、それぞれ以下の方法で測定した。50ｍlバイアル瓶に前記の洗浄処理済み粒子を入れて密封し、室温で１晩放置した後、ガス検知管を用いてバイアル瓶内の気相中に含まれる塩素量を測定した。次に、当該バイアル瓶をホットプレート上で 150℃、２分間加熱した後、ガス検知管を用いてバイアル瓶内の気相中に含まれる塩素量を測定した。
【０１１４】
表８に、その測定結果を示す。表８に示す結果より、アセトンによる洗浄を施した際(試料19)には、精製水による洗浄を施した場合(試料18)と比較して、洗浄処理済みのＰＨＡ粒子から放出される塩素量が格段に少なくなっており、即ち、洗浄処理済みＰＨＡ粒子になお残留している塩素量が大幅に低減されていることが明らかになった。
【０１１５】
【表８】
0004007580.tif 000010
【０１１６】
(実施例７)破砕処理
リンゴ酸ナトリウム 0.1％を含有するＭ９寒天培地上のＴＢ64株のコロニーを、500ｍl容振盪フラスコ中の、リンゴ酸ナトリウム 0.5％を含有するＭ９培地 50ｍlに植菌し、30℃で振盪培養した。24時間後、培養液５ｍlを、窒素源であるＮＨ4Ｃlのみ１/10 濃度に調製したＭ９培地にリンゴ酸ナトリウム 0.5％を含有した培地１リットルに加え、同様に振盪して菌体にＰＨＢを蓄積させた。48時間後、ＰＨＢ蓄積菌体を遠心分離によって収穫し、蒸留水 50ｍlに再懸濁して５等分した(各10ｍl)。これらに以下の 20-24 の５種類の処理を行なった。
【０１１７】
20:対照:上記５等分した懸濁液の１つを遠心分離後メタノールで洗浄し、凍結乾燥して秤量した後クロロホルムで 60℃、24時間抽出操作を行ない、抽出液を濾過、濃縮後、メタノールで再沈殿させ、減圧乾燥して対照ポリマー(試料 20 とする)を得た。
【０１１８】
21:上記５等分した懸濁液の他の１つに 31％過酸化水素水(三菱瓦斯化学社製；ＪIＳ Ｋ-8230)を 40ｍl添加し、80℃で１時間処理を行なった。
【０１１９】
22:上記５等分した中のまた別の懸濁液を蒸留水で 50ｍlにメスアップし、フレンチプレス(大岳製作所社製:フレンチプレス 5501)を行なった後、４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で30分間遠心分離を行なった。その後更に蒸留水 40ｍlを加え、４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間遠心分離を行なって洗浄した。
【０１２０】
23:上記５等分した中のさらに別の懸濁液に 22 と同様の操作を行なった後、沈殿部分を 10ｍlの蒸留水に懸濁し、31％過酸化水素水を 40ｍl添加し、80℃で１時間処理を行なった。
【０１２１】
24:上記５等分した懸濁液の最後の１つに 22 と同様の操作を行なった後、沈殿部分を 10ｍlの蒸留水に懸濁し、５ｍlの次亜塩素酸ナトリウム溶液(キシダ化学社製；次亜塩素酸ナトリウム 12％(有効塩素濃度５％以上)含有)を加えて、４℃で２時間処理を行なった。
【０１２２】
番号 21 から 24 の処理をおこなったそれぞれを、遠心分離(４℃、29400ｍ/s2(3000×g)で 30分間)し、更に再度４℃に冷却した後蒸留水 40ｍlを加え良く攪拌した後、同条件で２回遠心分離し、沈殿物を凍結乾燥して秤量した。これをそれぞれ試料 21 から 24 とする。
【０１２３】
以下に示す「回収率」及び「純度」を評価する為、次の操作を行なった。
【０１２４】
凍結乾燥した 20 から 24 までの試料にクロロホルム 30ｍlを加え、60℃で 24時間攪拌抽出操作を行なった。ＰＨＢが抽出されたクロロホルム溶液を 0.45μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して 10倍量のメタノールに注加しＰＨＢを沈殿、回収した。これらを減圧乾燥して秤量した。
【０１２５】
対照である 20 に対する、21 から 24 の試料のクロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を「回収率」とし、各試料の、クロロホルム抽出前の試料に対するクロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を「純度」として、表９に示す。
【０１２６】
【表９】
0004007580.tif 000011
【０１２７】
回収率はそれ程変わらないが、純度は,フレンチプレスを経ないで過酸化水素水処理した試料 21 と,フレンチプレスのみ行ない過酸化水素水処理をしなかった試料 22 に比べて,フレンチプレス処理とその後の過酸化水素処理を行なった試料 23,及びフレンチプレス処理とその後の次亜塩素酸処理を行なった試料 24 が良好であった。破砕処理と酸化剤処理を組み合わせることで純度が改善されることがわかる。
【０１２８】
得られたＰＨＢは、ゲルパーミエーションクロマトグラフイー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分子量を測定した。結果を表 10 に示す。
【０１２９】
【表１０】
0004007580.tif 000012
【０１３０】
各試料の分子量の差は殆ど見受けられなかった。従来法のクロロホルム抽出に比べて,破砕処理や酸化剤処理による分子量変化はない事がわかる。
【０１３１】
試料24 は、さらに、残留塩素を低減する工程を経ることにより、塩素濃度を減少させ、最終的なＰＨＡ粒子を得る。塩素低減工程としては、実施例１と同様に、温水洗浄を用いることができるが、その他の実施例２ないし６のいずれかの塩素低減工程を用いてもよい。
【０１３２】
本発明の方法により、微生物等の細胞内に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエートを、簡便な方法で、かつ本来の分子量をほぼ保ったままで、高い回収率で回収することが可能となった。また、本発明のＰＨＡの製造方法を用いることをにより、有機溶媒抽出の手段を利用しなくとも、残留塩素を低減させたＰＨＡ粒子を工業的規模で効率的に製造できる。
【０１３３】
本発明の方法により得られるポリヒドロキシアルカノエートの粒子は、生分解性素材、生体適合性素材、各種機能性材料等として有用な原材料となり、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１及び実施例２における塩素濃度測定方法を表す。
【符号の説明】
１:三角フラスコ
２:蓋
２a:外蓋
２b:内蓋
２c:アルミ箔
３:アルミ箔
４:試料
５:検知管吸引部
６:検知管
【図１】
0004007580.tif 000013