(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超短パルスレーザーとしてのフェムト秒レーザーまたはピコ秒レーザーを生細胞群の細胞に直接照射することなく生細胞群の分散液に照射して衝撃波を発生させ、この衝撃波により前記生細胞群から単一の細胞もしくはより少数の細胞からなる細胞群を生きたまま局所的に分離することを特徴とする超短パルスレーザー細胞分離方法。
【請求項２】
フェムト秒レーザーを顕微鏡により集光して照射し、衝撃波を発生させることを特徴とする請求項１の超短パルスレーザー細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、超短パルスレーザー細胞分離方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、超短パルスレーザーを顕微鏡に導入し、顕微鏡下で細胞を分離する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明の課題】
従来より、レーザーを顕微鏡により集光することで、細胞を光操作して、これを切断するという、いわばレーザーを“はさみ”(Laser scisaors)代わりに使うことが知られている。バイオテクノロジーによって、このようなレーザー技術と従来型のマイクロマニビュレーション技術を組み合わせることにより、細胞融合、細胞分離、単一細胞遺伝子操作などの手法に革新をもたらすことが期待される。
【０００３】
しかしながら、従来パルスレーザーもしくは連続発振のレーザーを用いた場合、レーザー照射により発生する熱により細胞は大きな損傷を及ぼすため、バイオテクノロジーへのレーザー応用への妨げとなっていた。この出願発明は以上の事情を鑑みたものであり、生細胞を低い損傷で分離することを実現する細胞分離方法を提供することを課題としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するためのものとして、第１には、超短パルスレーザーとしてのフェムト秒レーザーまたはピコ秒レーザーを生細胞群の細胞に直接照射することなく生細胞群の細胞からなる分散液に照射して衝撃波を発生させ、この衝撃波により前記生細胞群から単一の細胞もしくはより少数の細胞からなる細胞群を生きたまま局所的に分離することを特徴とする超短パルスレーザー細胞分離方法を提供する。
【０００５】
また、この出願の発明は、上記方法について、第２にはフェムト秒レーザーまたはピコ秒レーザーを顕微鏡により集光して照射し、衝撃波を発生させることを特徴とする超短パルスレーザー細胞分離方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【０００７】
この出願の発明は、これまでに知られているレーザー照射による細胞操作とは本質的に相違して、超短パルスレーザーを用い、これを細胞群もしくはその分散液に照射して励起し、非線形現象により発生する衝撃波、つまり応力上昇により、前記細胞群より単一の細胞、もしくはより少ない数の細胞により構成されているコロニー（細胞群）を分離することを特徴としている。このような衝撃波による分離によって、生細胞はダメージを与えることなく、これを生きたまま分離することがより大きな可能性として実現される。
【０００８】
対象とする細胞の種類に特に限定はない。この出願の発明が対象とする細胞は、細胞群として、コロニーや組織等を構成しているものである。細胞群は、液体に分散されていることが実際的には好ましい。液媒体は、水性で、細胞の生存に必要な栄養分等を含むものであってもよい。
【０００９】
これらの細胞群やその分散液に照射される超短パルスレーザーの波長については、レーザーを照射する細胞群もしくはその分散液が実質的吸収をもたないか、ほとんどもたない波長、極力吸収が少ない波長とすることが望ましい。
【００１０】
使用することのできる超短パルスレーザーとしては各種のものであってよいが、たとえば、ピコ秒レーザーもしくはフェムト秒レーザーが代表的なものとして挙げられる。
【００１１】
実際の操作においては、たとえば後述の実施例にも説明したように、顕微鏡システムとして実施することが考慮される。また、分離の効率やその特徴は、衝撃波の発生とそれによる応力上昇の大きさが細胞の種類や状態によって考慮されることになるが、その際の条件設定のファクターとしては、たとえば実施例にも例示したように、レーザー励起光のパルス幅や、対象とする細胞群に対しての集光位置の高さ（距離）が細胞の種類や状態との関連で考慮されることになる。
【００１２】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。
【００１３】
【実施例】
図１は、フェムト秒レーザーを用いた細胞分離法の実験模式図を例示したものである。励起光としてチャープ増幅による高出力フェムト秒チタンサファイアレーザー（８００ｎｍ，１２０ｆａ）を用いている。
【００１４】
図中の符号は次のものを示している。
【００１５】
Ａ：フェムト秒  Ｔｉ：Sapphire Laser
（１２０ｆｓ，７８０ｎｍ，５００ｍＷ）
Ｂ：正立型顕微鏡
Ｃ：ダイクロイックミラー
Ｄ：対物レンズ
Ｅ：生細胞試料
Ｆ：ステージ
Ｇ：コンデンサーレンズ
Ｈ：ランプ
Ｉ：ＣＣＤカメラ（透過像撮影用）
以上の構成において、レーザーパルスは強度をλ／２板と偏光子を用いて調節し、正立型顕微鏡の光軸上にのせ、１００倍の油浸対物レンズ（開口数１．２５）により１μｍ以下の領域に集光する。繰り返し周波数が１０Ｈｚのレーザーパルスを機械式シャッターにより単発に選別し、単発のレーザーパルス照射で実験を行った。この場合の試料としては、溶液中で培養した分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe （ｈ´）を用い、その中から細胞分裂している細胞を選びレーザーを照射した。酵母細胞は楕円形をしており、短径が約４μｍ、長径が約８μｍである。透過顕微鏡像により、その様子をレーザー光強度および集光位置と細胞対との接合部の距離の関数として観察した。
【００１６】
図２は、顕微鏡下での細胞分離の様子の模式図を示した。分裂中の細胞集合部にフェムト秒レーザーを集光し、細胞を強制的に分離させることが模式的に示されている。図３は、細胞が分離できた確率の励起光強度依存性を例示したものである。実験ではレーザーの集光位置の高さとレーザーのパルス幅を変数として行った。パルス幅が１２０ｆｓの励起光を細胞結合部上方１２μｍに集光して実験を行った結果、０．２４μＪ／ｐｕｌｓｅ以下のときに０％の確立で、０．２８μＪ／ｐｕｌｓｅ以上のときには１００％の確率で分離できた。励起光焦点の高さを細胞結合部に近づけていくと分離のしきい値は低下し、励起光を細胞結合部に直接照射したときには、０．１８μＪ／ｐｕｌｓｅ以上で分離が起こり、０．２４μＪ／ｐｕｌｓｅ以上のときに１００％の確率で分離することができた。レーザーが細胞結合部に直接的に集光されている条件では、細胞を直接励起されて細胞内に発生した力により分離が起こる。一方、レーザーが細胞結合部の上方で集光されている条件では、培養液のアプレーションにより発生する衝撃波により間接的細胞が分離されている。励起光のパルス幅を５２０ｆｓにした時、パルス幅が１２０ｆｓの時と同様に励起光の高さを細胞結合部に近づけていくと分離のしきい値が低下することが確認された。しかし、それぞれの励起光の高さでの分離のしきい値は、パルス幅が１２０ｆｓのときの約２倍となった。つまり、レーザーのパルス幅が短いほど分離のしきい値が低くなることから、分離のしきい値は瞬間的に到達する光子数に関係していると言える。従って、このような分離は超短パルスレーザーに特有のものであると結論づけられる。
【００１７】
図４は、レーザーの集光位置と細胞の生存確率の関係を示したものである。ここでは、個々の細胞をレーザー照射後５時間観測し続け、図２ｃの様に細胞分裂が起きたものを生きていると見なした。このとき、励起光強度０．３２μＪ／ｐｕｌｓｅ、パルス幅１２０ｆｓのフェムト秒レーザーを単発で細胞結合部付近に照射している。レーザー未照射で細胞分裂を起さない細胞と同様の形状を持つ物を除外した場合、フェムト秒レーザーを細胞接合部の４μｍ上方に集光した時、ほぼ１００％の確率でその後に細胞分裂が確認された。しかし、フェムト秒レーザーを細胞に直接照射する条件では細胞の生存確率は減少した。また、この励起光強度で細胞の横方向数μｍの位置にレーザーを集光したときにも、分裂中の細胞を非破壊で分離することができた。つまり、細胞を直接励起して分離するよりも、培養液のアプレーションにより発生する衝撃波により間接的に細胞を分離した場合のほうが、細胞を生きた状態で分離できることがわかる。
【００１８】
表１は、以上の実例の結果を要約したものである。この結果から、パルス幅と焦点位置の選択によって、レーザー光強度と細胞が受ける力（応力）を最適化することで、１００％の分離が可能となることがわかる。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
以上より、フェムト秒レーザーを直接照射した場合には酵母細胞が破壊されるが、フェムト秒レーザーを細胞から数μｍ離して集光することにより、分裂中の酵母細胞を非破壊で分離できること、分離にはしきい値があり、これはパルス幅に依存し、分離がフェムト秒レーザーの非線形効果による衝撃波で起こることが確認された。数１０ｎＮ／μｍ2（１０4Ｐａ）の衝撃波により細胞を分離することができると見積られた。
【００２１】
【発明の効果】
この出願の発明によって以上詳しく説明したとおり、顕微鏡下で損傷を少なく、高速かつ高精度に生細胞を分離することのできる新しい細胞分離方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の方法のための顕微鏡システムの構成を例示した構成図である。
【図２】生細胞の分離を示した概念図である。
【図３】実施例としての、フェムト秒レーザー照射による生細胞の分離の結果について、集光位置高さ（Ｚ）とパルス幅の異なる場合として分離確率を例示した図である。
【図４】図３と同様に分離の結果を細胞の生存の観点より例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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