(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ導入しても非複製的であって、該哺乳動物細胞内で少なくとも２種の遺伝子産物の同時発現を誘導するプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチンであって、
ａ）真核細胞中で作用し第１のシストロンの上流に所在する第１の転写プロモーターの制御下にある第１のシストロンであって、該第１のシストロンはヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の免疫原性エピトープをコードし、当該ＨＩＶ免疫原性エピトープは、ＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）を有するかまたはＲＲＥを有するように変異させたＨＩＶ遺伝子によってコードされるものである第１のシストロン、
ｂ）該第１のシストロンよりも下流に配置され、第１の転写プロモーターの転写制御下にある第２のシストロンであって、ＨＩＶ  ＲＥＶ遺伝子産物をコードする第２のシストロン、
ｃ）任意要素として、該第２のシストロンの下流に所在し該第１の転写プロモーターの転写制御下にある第３のシストロンであって、サイトカインまたはＴ細胞同時刺激因子をコードする第３のシストロン、
ｄ）該第２のシストロン又は任意の第３のシストロンがある場合には該第３のシストロンに後続する転写ターミネーター、及び
ｅ）第２及び任意の第３のシストロンの各々の上流における内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の機能を有する配列、
を含む前記プラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項２】
ＨＩＶ免疫原性エピトープが、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｇａｇ／プロテアーゼ、ｅｎｖまたはそれらの免疫原性サブポーションからなる群から選択されるＨＩＶ遺伝子から発現される遺伝子産物である請求項１に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３】
ｅｎｖ免疫原性エピトープが、ＨＩＶｇｐ１６０、ＨＩＶｇｐ１２０及びＨＩＶｐｇ４１からなる群から選択されるｅｎｖ転写読み取り枠から発現される遺伝子産物である請求項２に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４】
ｇａｇ免疫原性エピトープが、ｐ１７、ｐ２４及びｐ１５からなる群から選択されるｇａｇ転写読み取り枠から発現される遺伝子産物である請求項２に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項５】
サイトカインがインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキンである請求項１に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項６】
Ｔ細胞同時刺激因子がＢ７タンパク質をコードする遺伝子である請求項１に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項７】
第２及び第３のシストロン各々の上流に配置されているＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、ブタ小水疱ウイルスＩＲＥＳ及びポリオウイルスＩＲＥＳから選択される請求項１〜６に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【請求項８】
第１のシストロンがＨＩＶｇｐ１６０をコードし、第１のシストロンの前にサイトメガロウイルスＩＥプロモーターが配置され、任意に存在する第３のシストロンがインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、又はＢ７タンパク質をコードする請求項１に記載のプラスミドＤＮＡポリヌクレオチドワクチン。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ポリシストロン性ポリヌクレオチド構築物を脊椎動物の組織に導入することにより、複数の外因遺伝子を単一細胞で同調的にインビボ発現させる方法に関する。この方法は、各外因遺伝子の発現の結果として生成される産物に対して免疫応答を生じる。本発明の方法とポリヌクレオチド構築物を脊椎動物で使用すると、単一細胞により発現される抗原エピトープに対して免疫応答を生じることができる。同調的発現の結果、他の方法では十分に発現できない遺伝子産物の発現が改善される。また、Ｔ細胞抗原を発現する同一細胞により、Ｔ細胞刺激シグナルが生じるため、細胞免疫応答も改善される。本発明の方法の１態様は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原をコードするポリヌクレオチド構築物である。
２．発明の背景
ウイルス、特にＨＩＶ等のように突然変異率の高いウイルスに対しては、中和及び防御免疫応答を誘導することが望ましいが、ウイルスエンベロープタンパク質が異なるウイルス分離体又は株間により多種多様であるため、ワクチン開発の大き障害となっている。マウスとヒトの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は保存された内部ウイルスタンパク質から誘導されるエピトープを認識することができ、ウイルスに対する免疫応答に重要と思われるので、種々のウイルス株に対して異種防御を誘導するＣＴＬワクチンの開発に関心が寄せられている。
ＣＤ８+ＣＴＬは、そのＴ細胞レセプターがＭＨＣクラスＩ分子と結合したウイルスペプチドを認識するとウイルス感染細胞を死滅させる。これらのペプチドは内因的に合成されたウイルスタンパク質から誘導される。このように、保存されたウイルスタンパク質からのエピトープを認識することによって、ＣＴＬは異株間の防御を提供し得る。ＣＴＬ認識のためにＭＨＣクラスＩと結合することが可能なペプチドは、細胞質又は小胞体中に存在するか又はその中を通るタンパク質に由来する。（ＭＨＣクラスII分子により発現される抗原の場合のように）エンドソームプロセシング経路に入る外因タンパク質は、ＣＤ８+ＣＴＬ応答を生じるには通常は有効でない。
ＣＴＬ応答を生じるための研究では、複製ベクターを使用して細胞内でタンパク質抗原を産生させたり、ペプチドをサイトゾルに導入したりしている。これらのアプローチにはワクチンとしての有用性を制限するという限界がある。レトロウイルスベクターは、組換えウイルスの複製能力を維持しながら融合タンパク質として発現可能なポリペプチドの寸法及び構造に制限がある。更に、ワクチニア等のベクターはその後の免疫の効力がベクター自体に対する免疫応答によって低下しかねない。また、ウイルスベクターや変異病原体は、ヒトで使用できないという固有の危険がある［Ｒ．Ｒ．Ｒｅｄｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，６７３（１９８７）；Ｌ．Ｍａｓｃｏｌａら，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，１５６９（１９８９）］。更に、発現させるペプチドエピトープの選択は個体のＭＨＣ抗原の構造に依存するので、ペプチドワクチンは異系交配集団中のＭＨＣハプロタイプの多様性により効力が制限され得る。
Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．とＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ，８３，９５５１−９５５５，（１９８６）］は、ＣａＣｌ2で沈殿させたＤＮＡをマウスに腹膜組織内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で導入して発現させることができたと報告している。ＤＮＡ発現ベクターをマウスに筋肉内注射すると、ＤＮＡは筋肉細胞により取り込まれ、ＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現される［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，８１５（１９９１）］。プラスミドはエピソームとして維持され、複製しなかった。その後、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋とラットの心筋にｉ．ｍ．注射後に持続的発現が観察された。核酸を治療薬として使用する方法はＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）に報告されており、この文献では裸のポリヌクレオチドを使用して脊椎動物にワクチン接種している。
この方法を成功させるためには筋肉内に免疫する必要がない。因にＴａｎｇら［Ｎａｔｕｒｅ，３５６，１５２−１５４（１９９２）］は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金微小発射体をマウスの皮膚に導入してマウスで抗ＢＧＨ抗体を産生させたと開示している。Ｆｕｒｔｈら［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５，３６５−３６８，（１９９２）］は生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織にトランスフェクトするために噴射式注射器を使用できることを示している。核酸導入方法については、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２７５−１２８１（１９８９）］が最近総説している。Ｒｏｂｉｎｓｏｎら［エイズの予防を含む新規ワクチンの最新手法に関する１９９２年会議で発表された論文の要約、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｐ９２］は、ニワトリインフルエンザＤＮＡをニワトリにｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．投与して致死攻撃に対する防御が得られたと報告している。しかし、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらはどのニワトリインフルエンザウイルスを使用したかを開示していない。更に、Ｈ７特異的免疫応答しか述べておらず、異株間の防御の誘導については記載していない。Ｚｈｕら［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２０９−２１１（１９９３年７月９日）；１９９３年１２月９日付けＷＯ９３／２４６４０も参照のこと］は、ＤＮＡ：カチオンリポソーム複合体をマウスに静脈内注射した結果、クローン化移入遺伝子の体系発現が生じたと報告している。最近では、Ｕｌｍｅｒら［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，（１９９３）］がインフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを注射してインフルエンザウイルス感染に対する異種防御を行ったと報告している。
本発明は、病原体及び腫瘍抗原に対する所望の免疫応答を生じることが可能な特定の治療及び予防薬の必要性に対処するものである。この治療手法で特に重要な点は、抗原遺伝子を取得する株とは異種のウイルス株により誘発される感染又は疾患をも予防可能な、Ｔ細胞免疫応答を誘導できることである。ＨＩＶは迅速に突然変異し、多数のビルレント分離体が同定されている［例えばＬａＲｏｓａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：９３２−９３５（１９９０）では２４５種の異なるＨＩＶ分離体を同定している］ので、このことはＨＩＶで有意義である。
この多様性に対して、研究者はペプチド免疫によりＣＴＬを生成するように試みている。因にＴａｋａｈａｓｈｉら［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３３３−３３６（１９９２）］は、ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）決定基を認識するほぼ交差反応性の細胞毒性Ｔ細胞の誘導について報告している。同著者らは真に交差反応性のＣＴＬ応答に達するのは困難であることを認め、非常に厳密なＴ細胞の特発又は再刺激と、既に刺激したＣＴＬからの細胞毒性を含むエフェクター機能の発現との間には対立関係があることを示唆している。
Ｗａｎｇら［Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９０：４１５６−４１６０（１９９３年５月）］は、クローン化ゲノム（非スプライス）ＨＩＶ遺伝子の筋肉内接種によりＨＩＶに対する免疫応答をマウスで誘導したと報告している。得られた免疫応答レベルは低く、この方法ではマウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）の長い末端繰返し配列（ＬＴＲ）プロモーターの一部とサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びターミネーターの一部を使用している。ＳＶ４０は細胞を形質転換することが知られており、これは恐らく宿主細胞ＤＮＡへの取り込みによると考えられる。従って、本明細書に記載する方法とは異なり、Ｗａｎｇらにより記載されている方法はヒトに投与するのには不適切であり得る。また、ＷａｎｇらのＤＮＡ構築物は隣接するＴａｔ／ＲＥＶ−ｇｐ１６０−Ｔａｔ／ＲＥＶをコードする配列をコードするＨＩＶのゲノム要素（図１）を含む。下記に詳述するように、これはｇｐ１６０の高レベル発現を得るための次善策である。１つの欠点は、Ｔａｔの発現がカポジ肉腫の進行の一因となると認められていることである［Ｙ．Ｎ．ＶａｉｓｈａｖとＦ．Ｗ．Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９１）］。
ＷＯ９３／１７７０６はウイルスに対する動物のワクチン接種方法を記載しており、この方法ではキャリヤー粒子を遺伝子構築物で被覆し、被覆粒子を動物の細胞に加速注入している。ＨＩＶに関しては、主に完全ゲノムからＬＴＲを除去したものを使用することが提案されている。この方法はレシピエントに実質的な危険を孕んでいる。ワクチンの安全性を確保するためには、ＨＩＶの構築物は一般にＨＩＶゲノムの含有率を約５０％未満にすべきである。このように、遺伝子送達技術から有用なヒトＨＩＶワクチンを開発する場合には多くの問題が残っている。
本発明はタンパク質の発現を誘導するために生組織にポリヌクレオチドを導入する公知方法を使用する。本発明は、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体を有効に産生するために、ＨＩＶ及び他のタンパク質を抗原プロセシング経路に導入するための免疫原を提供する。本発明の医薬は、細胞性及び体液性両者の抗ＨＩＶ及びＨＩＶ中和免疫応答を誘導するためのワクチンとして有効である。本発明は、動物に導入した際にこの種の方法に付随する危険を生じることなく、ＨＩＶタンパク質及びエピトープの有効な発現を導くポリヌクレオチド免疫原を提供することにより、問題の一部に対処するものである。生じる免疫応答はＨＩＶの認識、ＨＩＶの複製の阻止、ＨＩＶ感染細胞の同定と死滅に有効であり、多数のＨＩＶ株に対して交差反応性である。従って、本発明はＨＩＶに対する有用な免疫原を提供する。本発明は更に、単一細胞中で２種以上の遺伝子産物をインビボ同時発現させることが可能なポリヌクレオチド構築物も提供する。これは、第１の遺伝子の発現が同一細胞における第２の遺伝子産物の同時発現に依存するＨＩＶ遺伝子発現系で立証される。このインビボ同時発現の成功により、この型のポリヌクレオチド構築物は、非限定的な例として癌関連抗原及び免疫調節又は免疫刺激遺伝子産物等のように、ＨＩＶ関連抗原以外のウイルス抗原も含めた遺伝子産物の多数の組み合わせのインビボ同時発現に適用できると予想される。
発明の概要
本発明は、動物組織に直接導入すると２〜３個のシストロンの同調的発現を誘導することが可能な、ＤＮＡ構築物及びＲＮＡ転写産物を含む核酸を提供する。１態様では、ＨＩＶタンパク質をコードする２個のシストロンの同調的発現と２種以上の遺伝子産物に対するＨＩＶ特異的免疫応答の誘導を実証する。種々のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）株に応答するウイルス抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と、一般的に株特異的な抗体が産生される。このようなＣＴＬのインビボ産生には、通常はウイルス感染の場合のように抗原の内因発現が必要である。直接ペプチド送達又はウイルスベクターの使用の制約なしに免疫系に提供するためのウイルス抗原を産生させるために、ＨＩＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に直接インビボ導入し、組織の内部で細胞にポリヌクレオチドを取り込ませ、コード化タンパク質を産生させて免疫系に提供するように処理する。マウスでは、この結果としてＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体が産生された。同様の結果が霊長類で達せられる。これらの結果は、ＨＩＶ遺伝子産物、免疫刺激遺伝子産物、例えば非限定的な例としてＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、インターフェロン、及びＴ細胞同時刺激因子として機能するＢ７タンパク質をコード及び同時発現するビ又はトリシストロン核酸ポリヌクレオチドによって達せられる。本発明の方法及びポリヌクレオチドは、一般に任意の２又は３種の遺伝子の同調的インビボ発現に適用できる。従って、本発明の種々の態様は、ウイルス抗原及び免疫刺激遺伝子産物の同調的インビボ発現と、腫瘍抗原及び免疫刺激遺伝子の同調的発現を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１．ＨＩＶゲノムの概略図。
図２．３個のシストロン（Ｉ、II及びIII）の各々によりコードされる３種までの遺伝子産物の単一細胞における同調的インビボ発現を誘導することが可能な本発明のポリヌクレオチド構築物の概略図。セグメントＡ及びＢは転写終結シグナルとプロモーター又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む調節配列を表す。
図３．ＣＭＶ−ｉｎｔＡ転写プロモーター、５’−スプライスドナー、ＨＩＶ  ｇｐ１６０（ｇｐ１２０、ｇｐ４１及びＲＥＶ応答因子ＲＲＥを示す）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＲＥＶシストロン、ＢＧＨ転写ターミネーター、及び原核転写プロモーターにより誘導されるネオマイシン耐性マーカーを含むＨＩＶ  ｅｎｖポリヌクレオチド免疫原構築物の詳細図。
図４．特定調節因子を示すジシストロンＨＩＶ  ｅｎｖ及びｇａｇポリヌクレオチド免疫原の詳細図。
図５．ＨＩＶポリヌクレオチド免疫原により誘導されるｇｐ１６０発現のウエスタンブロット分析。この結果は、単一ポリヌクレオチド構築物からの２種以上の遺伝子産物が単一細胞中で同時発現されることを厳密に示し、即ちｇｐ１６０単独をコードするポリヌクレオチド（図５Ｂ、左から４列目参照）は検出可能なｇｐ１６０を発現せず、（ＲＥＶのみをコードする構築物の同時トランスフェクションにより）ＲＥＶをトランス位に加えると良好なｇｐ１６０発現が得られる（図５Ａ、左から４列目）ことを示す。ゲノムｔａｔ／ＲＥＶ／ｅｎｖ構築物は、ＲＥＶをトランス位に配置するか否かに拘わらず低レベルのｇｐ１６０しか発現しない（図５Ａ及びＢ、第３列）。他方、ジシストロンｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ構築物はｇｐ１６０を多量に発現する（図５Ａ及びＢ、左から５列目）。最良の発現は、ｇｐ１６０をコードする配列の５’にスプライスドナー（ＳＤ）をもつｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ＲＥＶをコードするジシストロン構築物で得られる（図５Ａ及びＢ、左端列）。付加的ＲＥＶをトランス位に加えても付加的発現は達せられない（図５Ａ、右端列）ので、系は発現されるＲＥＶのレベルによって制限されない。
図６．Ｖ１Ｊ配列。
図７．Ｖ１Ｊｎｅｏ配列。
図８．ＣＭＶｉｎｔＡＢＧＨ配列。
図９．Ｖ１Ｊ−ＳＩＶ−ｐ２８ポリヌクレオチド構築物ワクチン接種（ＲＥＶ非依存性）に応答してアカゲザルで産生される細胞毒性Ｔリンパ球。このＳＩＶ  ｐ２８はＨＩＶのｐ２４  ｇａｇと等価である。従って、ｇａｇをコードするポリヌクレオチド構築物を使用して基特異的抗原に特異的なＣＴＬを誘導することができる。
図１０．ワクチニア−ＳＩＶｐ２８核酸ワクチン接種に応答して産生される細胞毒性Ｔリンパ球。これは、ｇａｇをコードするポリヌクレオチド（図９）が同一抗原［Ｓｈｅｎ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４４０−４４３，１９９１参照］を発現する複製抗原（ワクチニア）と同様のＣＴＬを誘導することを実証するものである。
図１１．ベクターＶ１Ｒの配列。
図１２．マウスにＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０を２００μｇ／匹／回の割合で２回投与して誘導した抗体。
図１２Ａ及び１２Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０（ＭＮ）ＤＮＡをワクチン接種したミドリザルからの血清によるＨＩＶ−１（ＭＮ）ウイルスの中和。図１２Ａ及びＢは、ＨＩＶ−１（ＭＮ）に感染したＣ８１６６細胞が、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＤＮＡをワクチン接種したサルからの血清の指定希釈液に暴露後にｐ２４ｇａｇタンパク質の産生を低下したことを示す。データはウイルス接種から１０日後に組織培養物で得た（各サンプルのＴＣＩＤ50）。
図１３．長期抗原特異的Ｔリンパ球記憶応答を示すＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチン接種マウスからのＴ細胞。免疫したマウスは１．６μｇのワクチンＤＮＡを２回投与し、６カ月後に殺した。脾臓Ｔ細胞に５μｇ／ｍＬの組換えｇｐ１２０タンパク質を加えてインビトロ培養した。ｇｐ１２０特異的Ｔ細胞の増殖を刺激指数（ＳＩ：ｇｐ１２０で処理したＴ細胞と抗原を投与しなかったＴ細胞との3Ｈ−チミジン取り込みの比）で表す。
図１４．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０  ＤＮＡをワクチン接種したマウスからのＴ細胞によるタイプ１Ｔヘルパー（ＴH１）リンパ球サイトカイン分泌。図１２に示すサンプルからの細胞培養上清をｒｇｐ１２０で処理後にγインターフェロン及びインターロイキン４（ＩＬ−４）分泌から定量した。対照マウスのインターロイキン分泌は非常に少量であったが、ＩＬ−４レベルはバックグラウンドレベルである。
図１５．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０をワクチン接種したマウスにおける抗ｇｐ１２０細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性。２匹のマウス（２００６及び２００８）はｇｐ１２０  ＤＮＡワクチン接種後にｇｐ１２０ペプチド（ｐ１８）に特異的なＭＨＣ  Ｉに制限されたＣＴＬ活性を示した。Ｐ１８の不在下の同一マウス又は先にワクチン接種しなかった対照マウスでは活性は観察されなかった。
図１６．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ及びＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンを接種したアカゲザルによる抗ｇｐ１６０ＣＴＬ活性。これらのワクチンを接種した全４匹のサルからのＴリンパ球培養物は、ワクチニア−ｇｐ１６０で予め処理した自己由来のターゲット細胞のＭＨＣ  Ｉに制限された死滅を示した。「ブランク」ＤＮＡワクチン（遺伝子インサートを含まないＶ１Ｊｎｓ）で免疫した４匹の対照アカゲザルではＣＴＬ活性は観察されなかった。
発明の詳細な説明
本発明は、動物組織に直接導入すると２〜３個のシストロンの同調的発現を誘導することが可能な、ＤＮＡ構築物及びＲＮＡ転写産物を含む核酸を提供する。１態様では、ＨＩＶタンパク質をコードする２個のシストロンの同調的発現と２種以上の遺伝子産物に対するＨＩＶ特異的免疫応答の誘導を実証する。種々のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）株に応答するウイルス抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と、一般的に株特異的な抗体が産生される。このようなＣＴＬのインビボ産生には、通常はウイルス感染の場合のように抗原の内因発現が必要である。直接ペプチド送達又はウイルスベクターの使用の制約なしに免疫系に提供するためのウイルス抗原を産生するために、ＨＩＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に直接インビボ導入し、組織の内部で細胞にポリヌクレオチドを取り込ませ、コード化タンパク質を産生させて免疫系に提供するように処理する。マウスでは、この結果としてＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体が産生された。同様の結果が霊長類で達せられる。これらの結果は、ＨＩＶ遺伝子産物、免疫刺激遺伝子産物、例えば非限定的な例としてＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、インターフェロン、及びＴ細胞同時刺激因子として機能するＢ７タンパク質をコード及び同時発現する、ビ又はトリシストロン核酸ポリヌクレオチドによって達せられる。本発明の方法及びポリヌクレオチドは、一般に任意の２又は３種の遺伝子の同調的インビボ発現に適用できる。従って、本発明の種々の態様は、ウイルス抗原及び免疫刺激遺伝子産物の同調的インビボ発現と、腫瘍抗原及び免疫刺激遺伝子の同調的発現を包含する。
本発明は霊長類及びヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物に直接インビボ導入した際に、動物体内にコード化タンパク質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提供する。
本明細書中で使用するポリヌクレオチドとは、脊椎動物生細胞に導入すると、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされた翻訳産物を産生するように細胞機構に指令するに要する調節因子を含む核酸である。
本発明の１態様において、ポリヌクレオチドは転写プロモーターに作動的に結合したＨＩＶ遺伝子を含むポリデオキシリボ核酸である。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドワクチンは、真核細胞機構により翻訳可能なＨＩＶ遺伝子をコードするポリリボ核酸（リボソーム、ｔＲＮＡ及び他の翻訳因子）を含む。ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連するタンパク質や後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因物質のように、病理状態以外は通常では動物に存在しないタンパク質（即ち異種タンパク質）であるとき、動物の免疫系は防御免疫応答を開始するように活性化される。これらの外因タンパク質は動物自身の組織により産生されるので、発現されるタンパク質は関連生物ＨＩＶに実際に感染した場合と同じように主要組織適合系ＭＨＣによりプロセシングを受ける。その結果として、本明細書に示すように、同種病原体に対する免疫応答が誘導される。
従って、本発明者は生物系に導入するとＨＩＶタンパク質及びエピトープの発現を誘導する核酸を製造した。誘導される抗体応答は発現されるＨＩＶタンパク質に対して特異的であると同時にＨＩＶを中和する。更に、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識してこれを死滅させる細胞毒性Ｔリンパ球が誘導される。本発明者は、インビボ導入するとサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）遺伝子を有効に発現させるポリヌクレオチドも開発した。ヒト疾患であるＡＩＤＳに非常によく似た唯一の動物モデルはＳＩＶを用いる類人霊長類モデルであるので、この開発は有意義である。こうして、ＨＩＶ及びＳＩＶポリヌクレオチド免疫原を用いてインビボで得られる効果から類推し、本発明の免疫原のワクチンとしての効力を実証することができる。
当業者は本明細書に教示する個々の記載から本発明の多くの態様を理解できよう。即ち、本明細書に開示する本発明の成功に基づき、種々の転写プロモーター、ターミネーター、キャリヤーベクター又は特定遺伝子配列を首尾よく使用することができる。
本発明は、哺乳動物組織に導入すると、単一細胞中に２種以上の異なる別個の遺伝子産物のインビボ同時発現を誘導するポリヌクレオチドの使用方法を提供する。このような方法の１例では、ポリヌクレオチドを哺乳動物組織にインビボ導入すると、単一細胞中で２種以上の遺伝子産物の同時発現を示すＨＩＶモデルを使用する。ＨＩＶ遺伝子にはＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）として知られる配列を含むものもあるので、このモデルはストリンジェントである。これらの遺伝子は、ＲＲＥを含むＨＩＶ遺伝子を発現する細胞内にＲＥＶとして知られる別のＨＩＶ遺伝子が存在しない限り有効に発現されない。この現象をＲＥＶ依存性と呼ぶ。
ＰａｖｌａｋｉｓとＦｅｌｂｅｒは、ＷＯ９３／２０２１２に転写産物の不安定をもたらす恐れのある配列を除去し、特定ＨＩＶ遺伝子のＲＥＶ非依存性にある程度まで達し得る方法を記載している。この方法はこのようなすべての遺伝子に一般に適用できる訳でなく、時間消費的で多数の遺伝子改変を必要とする。更に、このような遺伝子の発現及び免疫原性レベルは、ＲＥＶ依存性をなくすことによって低下しかねない。
本発明は、ＲＥＶ非依存性を得るためにＲＥＶ依存性ＨＩＶ遺伝子の多重操作を必要としない別の解決方法を提供する。また、本発明はＲＥＶ非依存性遺伝子の発現とＲＥＶ依存性遺伝子の発現に適用できる。本明細書に記載するＲＥＶ依存性発現系はそれ自体としても有用であるし、単一細胞における２種以上の所望の遺伝子産物のインビボ同時発現を実証するためのストリンジェント系としても有用である。従って、本発明の方法及びポリヌクレオチド構築物は、所与の細胞中で２種以上の遺伝子産物の同時発現に達することが有益である任意の状況で使用することができる。
このような状況の１例としては、免疫原性エピトープと、Ｂ７として知られるＴ細胞認識因子のファミリーの１員との同時発現が挙げられる。最近では、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１１７−１１１９，１９９３］が、腫瘍を除去するためにＣＤ８+ＣＴＬを活性化する際に抗原発現細胞の表面でＢ７と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）形態のエピトープが果たす同調的役割について記載している。抗原発現細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣ分子がＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）にエピトープを提供すると、同一ＡＰＣの表面に発現されたＢ７はＣＴＬＡ−４又はＣＤ２８と結合することにより第２のシグナルとして機能する。その結果、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞が迅速に分裂し、ＣＤ８+Ｔ細胞が増殖してＡＰＣを死滅させる。従って、ＲＥＶの遺伝子を同調的に発現させることによりＲＲＥを含むＨＩＶ  ＲＥＶ依存性遺伝子に対する免疫応答を有効に発現及び発生するという本明細書の教示は、２個あるいは３個のシストロン（ポリペプチド鎖の情報をもつ核酸長として定義される）をコードするポリヌクレオチドを導入することによって２種以上の遺伝子を同調的に発現できることを確証するものである。
本発明の用途の多くは抗ウイルスワクチン接種であるので、本発明のポリヌクレオチドは多くの場合はポリヌクレオチドワクチン（ＰＮＶ）と呼ぶ。これは、免疫刺激及び抗腫瘍治療におけるこれらのポリヌクレオチドの付加的有用性を無視又は本発明の範囲から除外するものではない。
本発明の１態様では、ＨＩＶ遺伝子産物をコードする遺伝子を発現ベクターに組込む。ベクターは真核ＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写プロモーターと、ＨＩＶ遺伝子をコードする配列の末端の転写ターミネーターを含む。好適態様では、プロモーターはイントロンＡ配列をもつサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）であるが、当業者には強力な免疫グロブリンや他の真核遺伝子プロモーター等の多数の公知プロモーターを使用できることが理解されよう。好適転写ターミネーターの１例はウシ成長ホルモンターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＨＧターミネーターの組み合わせ（図８、配列番号１３）が特に好適である。更に、原核細胞でポリヌクレオチドの産生を助長するためには、抗生物質耐性マーカーも原核プロモーターの転写調節下で発現ベクターに加え、真核細胞で抗生物質が発現されないようにすることが好ましい。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は他の医薬的に許容可能な抗生物質耐性マーカーを使用することができる。本発明の好適態様では、抗生物質耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子産物をコードする。更に、原核生物で発酵によるポリヌクレオチドの高レベル産生を助長するためには、ベクターが原核複製起点を含み、高コピー数であると有利である。これらの効果は、市販の多数の原核クローニングベクターを利用して得られる。本発明の好適態様では、これらの機能はｐＵＣとして知られる市販ベクターにより得られる。但し、非必須ＤＮＡ配列を除去することが望ましい。従って、本発明の１態様ではｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコーディング配列を除去する。ベクターが真核細胞中で複製できないことも望ましい。こうすると、ポリヌクレオチドワクチン配列がレシピエントのゲノムに取り込まれる危険を最小限にできる。
別の態様では、ラウス癌ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲをプロモーターとして使用する発現ベクターｐｎＲＳＶを使用する。更に別の態様では、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ転写ターミネーターをクローニングした、突然変異ｐＢＲ３２２ベクターであるｖ１を使用する。本発明の特に好適な態様では、Ｖ１とｐＵＣ１９の成分を組み合わせてＶ１Ｊと呼ぶ発現ベクター（配列番号１２）を製造する。Ｖ１Ｊ又は別の望ましい発現ベクターにｂｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等のＨＩＶ遺伝子、又は抗ＨＩＶ免疫応答を誘導することが可能な他のＨＩＶ遺伝子（抗体及び／又はＣＴＬ）をクローニングする。ポリヌクレオチドワクチンでコードされた配列がレシピエントのゲノムに取り込まれる危険を最小限にするためには、ＨＩＶゲノムによりコードされる機能的逆転写酵素及びインテグラーゼ機能を排除することが望ましい。別の態様では、アンピシリン耐性遺伝子をＶ１Ｊから除去してネオマイシン耐性遺伝子で置換し、種々多数のＨＩＶ遺伝子を本発明に従って使用できるようにクローニングしたＶＩＪ−ｎｅｏ（配列番号１４）を製造する。更に別の態様では、ベクターはＶ１Ｊｎｓであり、これはＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４位の単一ＫｐｎＩ部位に固有ＳｆｉＩ制限部位を遺伝子工学によって組込んだ以外はＶ１Ｊｎｅｏと同一である。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉＩ部位の発生率は非常に低い（１００，０００塩基当たり１部位）。従って、このベクターは抽出したゲノムＤＮＡをＳｆｉＩ消化するだけで宿主ＤＮＡへの発現ベクター組込みを周到にモニターすることができる。別の改善案ではベクターはＶ１Ｒである。このベクターでは、高密度ベクターを製造するためにできるだけ多量の非必須ＤＮＡをベクターから「削除」した。このベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であり、図１１に示す（配列番号１００）。このベクターは、望ましくない配列がコードされる心配が少なく、より大型のインサートを使用することができ、特定インフルエンザウイルス遺伝子をコードする構築物を周囲組織に導入する際に細胞への取込みを最適にする。図１１ではＶ１Ｊｎｅｏ（図７）の欠失部分を空欄とし、ＶＩＪｎｅｏのナンバリングを変えずに挿入配列を本活字で書き込んだ。上記ベクター改変及び製造方法は当業者に公知の方法に従って実施することができる。上記特定産物は慣用手段により得られ、個々の適応する特定目的に特に有用である。
本発明の１態様は、ＨＩＶをコードする遺伝子であるｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇａｇ及び周知の実験室用ＨＩＶ株からの他の遺伝子産物（例えばＳＦ２、IIIＢ又はＭＮ等）を含み、このような実験室株については多量のデータがあるが、例えば、ＨＩＶ  IIIｂ  Ｖ３ループ特異的モノクローナル抗体を投与して［Ｅｍｉｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：７２８−７３０  １９９２］又はｇｐ１６０でなく組換えｇｐ１２０をワクチン接種して［Ｂｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：８２２−８２５，１９９０］、チンパンジーをＨＩＶ  IIIＢウイルスの致死攻撃から防御できることが示されている。当業者に理解されるように、ＨＩＶ−１からの遺伝子と類似の機能をもつＨＩＶ−２株からの遺伝子を使用してもＨＩＶ−１構築物について本明細書に記載すると同様の免疫応答が生じると予想される。これらの遺伝子を得るためのクローニング及び操作方法は当業者に周知である。
実験室用ＨＩＶ株に対する免疫応答の誘導ではＨＩＶの一次フィールド分離体の中和を提供するには不十分であることが最近判明した［例えばＣｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９８０−９８１，１９９３参照］。従って、本発明の別の態様ではＨＩＶのビルレント一次フィールド分離体からの遺伝子をポリヌクレオチド免疫原に組込む。これは、ウイルス遺伝子のｃＤＮＡコピーを調製した後、個々の遺伝子をポリヌクレオチド免疫原にサブクローニングすることにより達せられる。多数のＨＩＶ株の多数の遺伝子の配列が現在ＧＥＮＢＡＮＫで公的に入手可能であり、このようなＨＩＶの一次フィールド分離体は、これらの株を入手可能とするよう、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，［７５８１  Ｌｉｎｄｂｅｒｇｈ  Ｄｒｉｖｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８７９］と契約したＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。このような株は世界保険機構（ＷＨＯ）［Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｕｎｉｔ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｎ  ＡＩＤＳ，ＣＨ−１２１１  Ｇｅｎｅｖａ  ２７，スイス］からも現在入手可能である。本明細書の記載から当業者に理解される通り、本発明の利点の１つは、ＨＩＶ配列の多様性とＨＩＶ中和の血清学及び他のパラメーターとの相関を実施できるように、インビボ及びインビトロ試験及び分析用システムを提供することである。これらの種々の遺伝子の分離及びクローニングは当業者に公知の方法により実施できる。従って、本発明は更にワクチン製造のためのＨＩＶ株及び配列の体系的同定方法も提供する。ＨＩＶ株の一次分離体からの遺伝子を組込むことにより、ウイルスの臨床分離体に対する免疫応答を誘導し、こうしてフィールドでは未解決の要件を満たす免疫原を提供する。更に、ビルレント分離体は種々多様であるので、新規配列を反映するように必要に応じて免疫原を改変してもよい。
用語を統一するために、本明細書では「ベクター名−ＨＩＶ株−遺伝子−付加成分」の規則に従ってポリヌクレオチド免疫原構築物を命名する。例えば、ＭＮ株のｇｐ１６０遺伝子を発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏにクローニングした構築物は、本明細書では「Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＭＮ−ｇｐ１６０」と命名する。構築物に付加される付加成分については下記に詳述する。当然のことながら、ウイルスの病因株の種類によって、医薬に組込むために最適な厳密な遺伝子も異なる。しかし、下記に実証するように異種株に対して防御することが可能な細胞毒性リンパ球応答が誘導されるので、本発明の免疫原及びワクチンでは完全ウイルス又はサブユニットポリペプチドに基づくワクチンに比較して株の相違はさほど重大ではない。更に、新規遺伝子を挿入するために本医薬を容易に操作できるので、株の相違による調節は標準分子生物学技術により容易に実施できる。
本発明を十分に説明するために、ＨＩＶの背景を説明する。ヒト免疫不全症ウイルスは図１に示す構造のリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムをもつ。本明細書に教示する方法に従ってクローニング及び操作するためのｃＤＮＡコピーを製造するためには、このＲＮＡゲノムを当業者に公知の方法により逆転写しなければならない。ゲノムの両端にはプロモーターとして機能するＬＴＲが存在する。これらの末端の間でゲノムは種々の読み取り枠内で主要遺伝子産物としてｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖをコードし、ここでｇａｇは基特異的抗原であり、ｐｏｌは逆転写酵素即ちポリメラーゼであり、別の読み取り枠で同様にこの領域によりコードされ、例えばｇｐ１６０をｇｐ１２０及びｇｐ４１に翻訳後プロセシングするのに関与するウイルスプロテアーゼであり、ｅｎｖはエンベロープタンパク質であり、ｖｉｆはビリオン感染因子であり、ＲＥＶはビリオンタンパク質発現の調節因子であり、ｎｅｇは負の調節因子であり、ｖｐｕはビリオン産生因子ｕであり、ｔａｔは転写のトランスアクチベーターであり、ｖｐｒはウイルスタンパク質ｒである。これらの因子の各々の機能は文献に記載されている（ＡＩＤＳ  ８９，１９８９年６月４〜９日にモントリオールで開催された第５回国際会議要覧，Ａ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ参照、図１はこの文献に基づいて作成した）。
本発明の１態様では、ＨＩＶ又はＳＩＶタンパク質をコードする遺伝子を転写プロモーターに直接連結する。ｅｎｖ遺伝子は翻訳後にｇｐ４１及びｇｐ１２０に変性される大型の膜結合タンパク質ｇｐ１６０をコードする。ｇｐ１２０遺伝子はサイトメガロウイルス発現プロモーターの制御下におくことができる。他方、ｇｐ１２０は膜に結合せず、従って、発現されると細胞から分泌され得る。ＨＩＶは感染細胞中で潜伏し続ける傾向があるので、細胞結合ＨＩＶエピトープに対する免疫応答も発生するのが望ましい。この目的は、本発明では免疫系を特発するために細胞膜結合エピトープｇｐ１６０のインビボ発現により達せられる。他方、ｇｐ１６０はスプライスされていない遺伝子の核から運び出されないため、ＲＥＶの不在下では発現が抑制される。この機構を解明するためには、ＨＩＶの生活環を詳細に説明しなければならない。
ＨＩＶの生活環で宿主細胞に感染すると、ＨＩＶ  ＲＮＡゲノムはプロウイルスＤＮＡに逆転写され、宿主ゲノムＤＮＡに単一転写単位として組込まれる。ＬＴＲは５’→３’方向にＨＩＶ遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を転写するプロモーターを提供し、完全ゲノムの非スプライス転写産物を形成する。スプライスされていない転写産物はｇａｇ及びｐｏｌを翻訳するｍＲＮＡとして機能し、他方、ｅｎｖでコードされた遺伝子の翻訳には制限されたスプライシングが存在しなければならない。調節遺伝子産物ＲＥＶを発現させるためには、ゲノム配列では図１に示すようにＲＥＶとｅｎｖがオーバーラップするので２回以上のスプライシングが必要である。ｅｎｖの転写が行われるためには、ＲＥＶ転写が停止しなければならず、この逆も真である。更に、スプライスされていないＲＮＡが核から運び出されるためにはＲＥＶの存在が必要である。他方、ＲＥＶがこのように機能するためには、転写産物上にＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）が存在しなければならない［Ｍａｌｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２５４−２５７（１９８９）］。
本発明のポリヌクレオチドワクチンでは、完全にスプライスされた遺伝子を提供することにより、特定ＨＩＶ遺伝子を強制的にスプライスする必要がなくなる（即ち所望の遺伝子産物の完全な開放読み枠を提供するので、読み取り枠内の転換又は非コーディング領域の除去の必要がない。特定遺伝子をスプライスする際に得られる厳密な配列には多少の幅があるが、機能的コーディング配列が得られる限り、許容できることが当業者には理解されよう。）。従って、１態様ではｇｐ１６０の完全コーディング配列をスプライスし、ＲＥＶの配列をスプライスするので、各遺伝子産物を断続的に発現させる必要がなくなる。更に、ＲＥＶにより調節される発現の特徴を利用してＨＩＶによりコードされるＲＥＶ依存性免疫原性遺伝子産物の発現を最適化する。
ＲＥＶが転写産物を細胞質で翻訳するために核から運び出すためには、運び出すべき転写産物上のＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）の存在に加え、ＲＲＥを含む遺伝子の５’側に少なくとも１個のスプライスドナー部位が存在することが必要である［Ｌｕら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ８７：７５９８−７６０２，（１９９０年１０月）；ＣｈａｎｇとＳｈａｒｐ，Ｃｅｌｌ  ５９：７８９−７９５（１９８９年１２月１日）］。本発明者らは、スプライシングの必要なしにＲＥＶとＲＥＶ応答遺伝子の同時発現を生じるように、発現させる遺伝子と同一発現ベクター上の位置にＲＥＶコーディング配列を提供するポリヌクレオチドを想到した。従って、本発明の好適態様では、ＣＭＶプロモーター等の転写プロモーターのすぐ下流にＨＩＶ遺伝子を配置し、第１のコーディング配列の３’側（下流ともいう）の位置にスプライスしたＲＥＶコーディング配列を配置する。当然のことながら、これらの遺伝子の順序は変更できる。しかし、生成される全転写産物が完全シストロンをコードするように、免疫原性ＨＩＶシストロンを転写プロモーターに直接隣接させるのが好ましい。
遺伝子の同時発現に達する方法として、異なる遺伝子を発現する異なるベクターを用いて培養細胞の同時トランスフェクションを利用する方法がある。ＲＥＶ依存性遺伝子では、こうしてＲＥＶ遺伝子産物をトランス配置に提供することができる。しかし、ＲＥＶ依存性免疫原性ＨＩＶ遺伝子産物の強力な発現に必要な程度までＲＥＶを利用できるように所与の細胞の同時トランスフェクションがインビボで行われる確率は低いので、これは本発明の範囲外でないとしても本発明の目的には次善策である。別の方法は所与のベクター上に数個のプロモーターを提供し、各プロモーターに別個の遺伝子の発現を制御させることである。この場合は、ＲＥＶ遺伝子産物をシス配置で提供する。本発明に従ってこの方法を利用することもできる。このような態様では、種々のプロモーターと該プロモーターによって制御される遺伝子が逆向きにあることが好ましい。しかし、この型の多重遺伝子ベクターではプロモーター間の競合的干渉が知られているので、この態様も次善策であるとみなされる。
Ｇｈａｔｔａｓら［Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，Ｎｏ．１２：５８４８−５８５９（１９９１年１２月）］、Ｋａｕｆａｍａｎら［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，Ｎｏ．１６：４４８５−４４９０（１９９１）］及びＤａｖｉｅｓ［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，Ｎｏ．４：１９２４−１９３２（１９９２年４月）］は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）リーダーにおける内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）について記載している。同著者らの報告によると、上流プロモーターを使用してジシストロンｍＲＮＡの転写を開始する系は、２個の遺伝子間にＩＲＥＳを配置する場合に５’及び３’両者の開放読み枠を良好に発現させる。Ｃｈｅｎら（Ｊ．Ｖｉｒａｌ．，６７：２１４２−２１４５，１９９３）は、感染性ウイルスベクターからの１個の転写産物から２個の遺伝子を同時発現させるジシストロンウイルスを構築するために、ブタ小水泡病ウイルス（ＳＶＤＶ）からの５個の非翻訳領域（ＮＴＲ）を使用した系を報告している。
本発明者らは、ＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びＲＥＶコーディング配列を含むＨＩＶ遺伝子の同調的発現を実現する核酸構築物が、ＲＥＶ及びＲＥＶ依存性遺伝子産物の両者を有効に発現させることを発見した。本発明のこの態様は図２及び３を参照すればよりよく理解されよう。図２は一般化態様を示し、図３は上記命名法に従ってＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＲＲＥ）−ＩＲＥＳ−ＲＥＶである本発明の特定態様を示す。免疫原性ＨＩＶ遺伝子が由来するＨＩＶ株は本明細書の例示の目的には無関係であり、実際に本明細書の開示によると、ＲＥＶ及びＲＥＶ依存性遺伝子産物両者に対する免疫応答の誘導と同様に、任意のＲＥＶ依存性遺伝子産物の発現が有効であると予想される。図３に示す態様によると、ベクターは上記Ｖ１Ｊｎｓである。従って、このベクターは原核複製起点と共にプロモーター（ＣＭＶｉｎｔＡ）及びターミネーター（ＢＧＨ）を提供し、当業者に周知の方法に従い、構築物で形質転換した細菌の発酵によりＨＩＶポリヌクレオチドワクチンの大規模製造を可能とする。この構築物は真核複製起点がないため、真核組織では複製しない。天然に存在するｒｅｖ／ｔａｔスプライスドナーからのスプライスドナー部位をＨＩＶ遺伝子のすぐ前に配置する（ｒｅｖ／ｔａｔＳＤ）。ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖコーディング配列は、初期転写産物の形成後にＲＥＶがＲＥＶ依存性ｍＲＮＡと結合して核から該転写産物を運び出すために必要なシグナルを提供するＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）を含むか又は後続位置にもつ。次に、下流ＲＥＶコーディング配列が有効に翻訳されるように、翻訳再開のための配列を内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に配置する。こうして、ＲＥＶ依存性遺伝子産物と同一のポリヌクレオチドのシス配置にＲＥＶ遺伝子産物が提供される。
本発明の改善案では、第３のシストロンをＰＮＶに含み得る。本発明は、Ｂ７抗原発現細胞表面タンパク質等の免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子、ヒト顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子、及びサイトカイン遺伝子（例えばインターロイキンやインターフェロン）、組織特異的転写プロモーター及びエンハンサーの使用のすべてを意図する。ＲＥＶの後で且つＢ７遺伝子の前にＩＲＥＳを挿入するか、又はジシストロンＲＥＶ依存性ＨＩＶ遺伝子と同一のベクター構築物即ちＩＲＥＳ−ＲＥＶ構築物上に第２のプロモーターを提供することによって、Ｂ７又はＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をシス配置に提供することや、別の構築物を用いてトランス配置に提供することも、いずれもＲＥＶ及びＲＥＶ依存性遺伝子に関する上記教示から敷延される。これらの遺伝子産物の一般的免疫刺激効果は、これらの遺伝子産物がトランス配置に提供される場合であっても、本発明の免疫原によりコードされるＨＩＶ遺伝子産物に対する免疫応答を強化するために十分であり得る。特にＢ７については、ＭＨＣ−Ｉ分子の裂け目にＨＩＶエピトープを発現する同一細胞がＢ７も発現することが好ましい。抗原エピトープとＢ７の両者のこの同時発現は、Ｔ細胞活性化に必要なスイッチを「閉じる」。サイトカイン、特にＩＬ−２は主に体液性又は細胞性のどちらの免疫応答を誘導するかを調節し［Ａｆｏｎｓｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：２３５−２３７，１９９４］、ＰＮＶの導入と同時に静脈内投与するか、又はＰＮＶに第３のシストロンとして加えることにより、インターロイキンの局在産生を確保する。ＧＭ−ＣＳＦ（ＳｈａｗとＫａｍｅｎ，Ｃｅｌｌ ４６：６５９−６６７，１９８６参照）、インターロイキン−１２（Ｗｏｌｆ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：３０７４−３０８１，１９９１参照）及びＢ７（Ｇｏｒｄｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２７１４−２７２２，１９８９参照；タンパク質のＢ７ファミリーの新規構成員のクローン及び配列についてはＡｚｕｍａ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６−７９，１９９３；及びＦｒｅｅｍａｎ，Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９−９１１，１９９３も参照されたい）を含むこれらの免疫刺激及び免疫調節タンパク質の遺伝子は公知であり、当業者に公知の方法を使用して本発明に従ってＰＮＶに容易にクローニング及び組込むことができる。好ましくは、これらの目的に使用する遺伝子はヒト遺伝子であり、これらのタンパク質に対する免疫応答を最小限にし、発現されるタンパク質がその免疫調節及び免疫刺激機能を発揮できるようにする。ＨＩＶ遺伝子がＲＥＶ非依存性になると、ＲＥＶシストロンを完全に除去し、Ｂ７遺伝子ファミリーメンバーをコードする第２のシストロンとＩＬ−１２等の更に別の遺伝子産物をコードする第３のシストロンを構築することができる。
望ましい場合には常に、組織特異的プロモーター又はエンハンサー、例えば筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサー因子を使用することが望ましい。例えば、ミオサイトは分裂しない末端分化細胞である。染色体に外来ＤＮＡを組込むには、細胞分裂とタンパク質合成の両者が必要であると思われる。従って、ミオサイト等の非分裂細胞にタンパク質発現を制限するのが好ましい。しかし、ＰＮＶを導入する多くの組織で発現させるにはＣＭＶプロモーターを使用するのが適切である。
以下に記載する本発明の種々の態様では、上記基本パラダイムを使用する。基本構築案から離れたり、追加又は削除しながら本発明の種々の態様の特徴を明示する。
本発明は、体液性免疫と異株間細胞性抗ウイルス免疫を生じるための、ポリヌクレオチドワクチンＰＮＶとしてジ又はトリシストロンＨＩＶポリヌクレオチド免疫原を実証する。しかし、この系は、単一細胞でコード化遺伝子産物のインビボ同時発現を必要とする２又は３個のシストロンに有用であり、シストロンがＨＩＶに関連するか否かは問わない。もっとも、ＨＩＶは感染集団内及び感染個体で突然変異する傾向があるので、本発明により発現される体液性及び細胞性両者の免疫応答はＨＩＶ感染を阻止するのに特に有意義である。有効なＨＩＶ防御ワクチンを処方するためには、ＨＩＶ上の主要中和ターゲットである例えばｇｐ１６０（ｅｎｖは米国ヒト集団で主要な株である種々のＨＩＶ−１クレードＢ株間で約８０％保存されている）に対して多価抗体応答を生じると共に、ｇｐ１６０の保存部分及びｇａｇによりコードされる内部ウイルスタンパク質に対して反応性の細胞毒性Ｔ細胞を産生することが望ましい。本発明者らは慣用実験室株；感染集団内に見られる主要な一次ウイルス分離体；異株間中和抗体エピトープを明らかにするように突然変異させたｇｐ１６０；ｇａｇ遺伝子（ＨＩＶ分離体間の保存率≧９５％）等の他の代表的ＨＩＶ遺伝子；並びにＨＩＶ  ＰＮＶを試験するための動物モデルを提供し、ウイルス負荷と疾患への進行を試験するために非ヒト霊長類を免疫及び攻撃できるＳＩＶから選択されるｇｐ１６０遺伝子を含む、ＨＩＶワクチンを製造した。
免疫不全状態まで進行していないＨＩＶ血清陽性患者のほぼ全員が抗ｇａｇＣＴＬを保有し、これらの患者の約６０％がｇｐ１６０に特異的な異株間ＣＴＬを示す。他方、エイズとして知られるような疾患状態まで進行している感染個体に存在するＨＩＶ特異的ＣＴＬの量はこれよりも著しく低く、異株間ＣＴＬ応答を誘導できるという本発明の知見の意義が裏付けられる。ＨＩＶ後期遺伝子発現はＲＥＶ依存性であるので、本発明のｇｐ１６０及びｇａｇワクチン接種ベクターは、ＲＥＶ依存性遺伝子発現を助長するようにＲＥＶ（保存率〜９０％）も産生するように設計される。本発明の付加的な利点は、抗ＲＥＶ免疫応答も生じることである。ＲＥＶは細胞感染後の非常に初期で後期遺伝子産物の合成よりもずっと前に多量に生産されるので、本発明のワクチンは更に有利となり、こうしてＣＴＬ及びＴヘルパー細胞を含むワクチンにより誘導されるＴ細胞応答を早期にもたらす機会が得られる。
本発明の別の態様では、異なるＨＩＶ  ＲＥＶ依存性遺伝子構築物を相互に混合し、免疫原性ＨＩＶ  ＲＥＶ依存性遺伝子産物に対する抗体及びＣＴＬの産生に加え、抗ＲＥＶ  ＣＴＬ応答を生じるカクテルワクチンを製造する。この態様によると、１個のプロモーターと２個のＩＲＥＳ配列をもつトリシストロン構築物でｇｐ１６０、ＲＥＶ、Ｂ７を順にコードする一方のポリヌクレオチドを、ｇａｇ遺伝子産物、ＲＥＶ及びＢ７又は別の免疫調節もしくは免疫刺激遺伝子産物（例えばＩＬ−１２又はＧＭ−ＣＳＦ）をコードする別のポリヌクレオチドと混合する。このようにしてポリヌクレオチドを１回又は数回注射すると、数種のＨＩＶ関連免疫原に対する免疫応答を誘導することができる。同様に、ＷＯ９３／２０２１２に記載されているようなＲＥＶ非依存性遺伝子産物Ｂ７、及び別の免疫調節又は免疫刺激遺伝子（例えばＩＬ−１２又はＧＭ−ＣＳＦ）を含む一方のポリヌクレオチドを、別のＲＥＶ依存性又はＲＥＶ非依存性ビ又はトリシストロン発現構築物と混合する。更に、ＨＩＶ又は他の抗原をコードする複数のビ又はトリシストロン構築物を調製及び混合し、多価複合ポリヌクレオチドワクチンを製造することもできる。
本発明のｅｎｖ、ＲＥＶ及びｇａｇポリヌクレオチドワクチン構築物により誘導される免疫応答は、マウス、ウサギ及び霊長類で実証される。マウスでｅｎｖに対する抗体産生をモニターすると、所与の構築物が適切な免疫原性であり、即ちワクチン接種した動物が高率で抗体応答を示すことを確認できる。マウスは、本発明の構築物によるＣＴＬ誘導を試験するのに適した最も手軽な動物モデルでもあるので、特定の構築物がこのような活性を発現できるか否かを評価するために使用される。他方、マウス細胞系は有効なＲＥＶ又はｔａｔ機能をもたないことが知見されている。この知見はＨＩＶ  ＬＴＲにより誘導される後期遺伝子の発現に関して得られ、異種プロモーターがマウス細胞でＲＥＶ機能をもたらすことを示したデータは限られている。ウサギとサル（ミドリザル、アカゲザル、チンパンジー）は、より大型の非齧歯動物における抗体評価のための霊長類を含む付加種を構成する。これらの種は、マウス血清中で観察されるレトロウイルスに対する内因中和活性レベルが高いため、抗血清中和アッセイにもマウスより好適である。これらのデータは、チンパンジー／ＨＩＶIIIB攻撃モデルでの実験で防御を得るために本発明のワクチンによって十分な免疫原性が生じることを実証するものである。科学界に広まり認められつつある防御の定義は、ＨＩＶ感染からの完全な防御を示す所謂「滅菌免疫」から疾患予防に移っている。この目的の多数の相関因子としては、ＨＩＶ逆転写酵素活性、血清サンプルの感染性、ｐ２４又は他のＨＩＶ抗原の血中濃度のＥＬＩＳＡアッセイにより測定した血中ウイルス力価の低下、ＣＤ４+Ｔ細胞濃度の増加、生存率の延長などが挙げられる［抗ＨＩＶワクチン効力の定義の進化については例えばＣｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１８２０−１８２１，１９９３参照］。本発明の免疫原はＨＩＶの感染性（臨床、一次フィールド）分離体に対する中和免疫応答も生じる。
免疫特性
Ａ．ｅｎｖに対する抗体応答
１．ｇｐ１６０及びｇｐ１２０。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、分泌ｇｐ１２０又は膜結合ｇｐ１６０を発現するワクチンベクターがｅｎｖ特異的抗体の産生に有効であるか否かを決定する。本発明のワクチン接種ベクターによるｅｎｖ発現の初期インビトロ特性決定は、ｇｐ１６０をトランスフェクトした細胞溶解物のイムノブロット分析により得られる。これらのデータから抗ｇｐ４１及び抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を使用したｇｐ１６０発現を確認及び定量し、トランスフェクト細胞ｇｐ１６０の発現を視認する。本発明の１態様では、次の理由でｇｐ１６０のほうがｇｐ１２０よりも好ましい。（１）初期ｇｐ１２０ベクターはマウスでの免疫原性が一定せず、ミドリザルでは応答性が非常に低いか又は非応答性であった。（２）ｇｐ１６０はｇｐ４１を含むので約１９０アミノ酸残基長く、付加的中和抗体及びＣＴＬエピトープを提供する。（３）ｇｐ１６０発現は四量体構成及び全体配置の点でウイルスｅｎｖによく似ている。（４）膜結合インフルエンザＨＡ構築物がマウス、白イタチ及び非ヒト霊長類で中和抗体応答を生じるのに成功したように［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，１９９３；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ． １２：７７７−７８３，１９９３］、抗ｇｐ１６０抗体産生は抗ｇｐ１２０抗体産生よりも優れていることがわかった。ｅｎｖの型の選択、又はｅｎｖサブフラグメントのカクテルのほうが好ましいか否かは以下に要約する実験によって決定する。
２．中和活性の存在及び範囲。ウサギ及びサルからのＥＬＩＳＡ陽性血清を試験すると、これらの血清は同種及び異種ＨＩＶ株の両者を中和することが示される。
３．Ｖ３及び非Ｖ３中和抗体の比較。ｅｎｖ  ＰＮＶの主な目的は広範な中和抗体を製造することである。Ｖ３ループに対する抗体は非常に株特異的であることが今般判明したので、この応答の血清特性を使用して株を定義した。
ａ．非Ｖ３中和抗体は、ＣＤ４結合に関与するｇｐ１２０内の不連続構造エピトープを主に認識すると思われる。この領域に対する抗体はポリクローナルであり、交差中和対象が広く、これは恐らくウイルスがその細胞リガンドに結合する必要があることから突然変異が制約されるためであると思われる。インビトロアッセイを使用し、免疫動物からの血清が９６穴プレートに固定したＣＤ４とのｇｐ１２０結合を阻止する能力を試験する。第２のインビトロアッセイでは、プラスチックに固定した選択されたＶ３領域に相当する合成ペプチドとの直接抗体結合を検出する。これらのアッセイは本発明で使用する動物種からの抗血清に適合可能であり、本発明のワクチンから産生された中和抗体の型を決定すると共に、ウイルス中和とのインビトロ相関を提供する。
ｂ．ｇｐ４１は、広い中和２Ｆ５モノクローナル抗体（Ｔｅｘａｓ  Ｃｏｍｍｅｒｃｅ  Ｔｏｗｅｒ，６００  Ｔｒａｖｉｓ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｕｉｔｅ  ４７５０，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ７７００２−３００５（米国）に所在のＶｉｒａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ．又はＢｏｌｔｚｍａｎｇａｓｓｅ  １１，Ａ−１０９１  Ｗｉｅｎ，オーストリアに所在のＷａｌｄｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ  ＧｍｂＨの市販品）により認識される高度に保存された線状エピトープに対応する少なくとも１個の主要中和決定基と、ｇｐ４１のＮ末端に位置する十分に保存された「融合ペプチド」領域を含む他の潜在部位を含む。上記のようにｇｐ４１に対する抗体をイムノブロットにより検出する以外に、インビトロアッセイ試験も使用し、プラスチックに固定したこれらの領域に相当する合成ペプチドと結合する抗体を検出する。
４．抗体応答の成熟。ＨＩＶ血清陽性患者では、中和抗体応答は主に抗Ｖ３から進行して、ｇｐ４１エピトープを含む上記構造ｇｐ１２０ドメインエピトープ（＃３）を含む、より広い中和抗体に及ぶ。これらの型の抗体応答を経時的及びその後のワクチン接種の間モニターする。
Ｂ．ｅｎｖ、ＲＥＶ、ｎｅｆ及びｇａｇに対するＴ細胞反応性
１．ＣＴＬ応答の生成。細胞内で合成されるウイルスタンパク質はＭＨＣ  Ｉで制限されたＣＴＬ応答を生じる。これらのタンパク質の各々は血清陽性患者でＣＴＬを誘導する。本発明のワクチンはマウスでもＣＴＬを誘導することができる。マウス系の免疫原性は、インフルエンザＮＰで実証されるようにこの試験に役立つ［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，１９９３参照］。Ｂａｌｂ／ｃマウスではＨＩＶタンパク質ｅｎｖ、ＲＥＶ、ｎｅｆ及びｇａｇについて数種のエピトープが決定されているので、インビトロＣＴＬ培養及び細胞毒性アッセイに役立つ。更に、ＣＴＬ及びインビトロ抗原特異的再刺激のターゲットを提供するためには、これらの遺伝子をトランスフェクトしたマウス肥満細胞腫Ｐ８１５等の同系腫瘍系を使用すると有利である。ＭＨＣクラスＩに制限された細胞毒性Ｔリンパ球を誘導することが可能な免疫原の決定方法は知られており［Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（９）：９７４−９７８，１９９３参照；特にＥｒｉｋｓｓｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（８）：８５９−８６５，１９９３参照。後者文献ではＨＩＶｇｐ１２０上のＴ細胞活性化エピトープが霊長類でマッピングされ、ｇｐ１２０アミノ酸１４２〜１９２、２９６〜３４３、３６７〜４００及び４１０〜４５３を含む数個の領域が各々リンパ増殖を誘導すること、更に別々の領域である２４８〜２６９及び２７０〜２９５がリンパ増殖性であることが確認された。アミノ酸１５２〜１７６を含むペプチドもＨＩＶ中和抗体を誘導することが確認された。］、これらの方法を使用して本発明のＰＮＶに加える免疫原性エピトープを同定することができる。あるいは、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、プロテアーゼ又はｇａｇをコードする完全遺伝子も使用できる。この点についての詳細な考察は、例えばＳｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８；１６５７−１６６７，１９９２；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：５６９−５７４，１９９１；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：５７５−５８３，１９９１；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：８７６−８８４，１９９１を参照されたい。本明細書中では、Ｔ細胞エフェクター機能は成熟Ｔ細胞表現型、例えば細胞毒性、Ｂ細胞活性化のためのサイトカイン分泌、及び／又はマクロファージ及び好中球の漸増又は刺激に結び付けられるものとする。
２．ＴH活性の測定。ワクチン接種した動物に由来する脾細胞培養物に組換えタンパク質又はペプチドエピトープを加え、特異的抗原に対する応答を試験する。付随脾臓抗原発現細胞ＡＰＣ等のこれらの抗原によるＴ細胞の活性化をこれらの培養物の増殖又はサイトカイン産生によりモニターする。サイトカイン産生パターンからＴH応答をタイプ１又はタイプ２として分類することもできる。優勢なＴH２応答は免疫妥協血清陽性患者で細胞性免疫が生じないことと相関すると思われるので、所与のＰＮＶが患者に引き起こす応答の型を決定することができ、その結果として生じる免疫応答を処置することができる。
３．遅延型過敏性（ＤＴＨ）。ｉ．ｄ．注射後のウイルス抗原に対するＤＴＨは主にＭＨＣ  IIに制限された細胞性免疫を示す。公知エピトープの組換えＨＩＶタンパク質及び合成ペプチドは市販されているので、これらの試薬を用いてワクチン接種した脊椎動物でＤＴＨ応答を容易に決定し、細胞性免疫を誘導する付加的なインビボ相関を提供することができる。
防御
上記免疫学的試験に基づき、本発明のワクチンは脊椎動物でビルレントＨＩＶによる攻撃に対して有効であると予想できる。これらの試験は、ＰＮＶ構築物、又はｇｐ１６０IIIB、ｇａｇIIIB、ｎｅｆIIIB及びＲＥＶIIIBから構成されるＰＮＶ構築物のカクテルでこれらの動物を十分にワクチン接種後にＨＩＶIIIB／チンパンジー攻撃モデルで行われる。IIIＢ株の致死量のチンパンジー力価は確立されているので、この点ではIIIＢ株が有用である。しかし、任意ＨＩＶ株及び所与の株に対して特異的又は異種のエピトープを使用しても同一結果が予想される。チンパンジー以外の第２のワクチン接種／攻撃モデルはｓｃｉｄ−ｈｕ  ＰＢＬマウスである。このモデルでは、後でＨＩＶ攻撃してマウス宿主でヒトリンパ球免疫系及び本発明のワクチンを試験することができる。この系は任意のＨＩＶ株で使用するように容易に改造でき、ＨＩＶの一次フィールド分離体の複数株に対する防御を立証できるので有利である。第３の攻撃モデルはハイブリッドＨＩＶ／ＳＩＶウイルス（ＳＨＩＶ）を利用し、このようなハイブリッドのいくつかはアカゲザルに感染して致死性の免疫不全症に至ることが示されている［Ｌｉ，Ｊ．ら，Ｊ．ＡＩＤＳ ５：６３９−６４６，１９９２参照］。アカゲザルに本発明のポリヌクレオチドワクチン構築物を接種すると、その後の致死量のＳＨＩＶの攻撃に対して防御できる。
ＰＮＶ構築物の概要
ポリヌクレオチドワクチン接種に特に最適化させた発現ベクターに、ＨＩＶ及び他の遺伝子を連結するのが好ましい。本発明の開示によると、数種のこのようなベクターの製造方法が可能になる。ほぼ全部の外因性ＤＮＡが除去され、上述のように（図２参照）転写プロモーター、免疫原性エピトープ及び付加的シストロンをコードする免疫増強又は免疫調節遺伝子という必須要素が、それ自体のプロモーター又はＩＲＥＳ、転写ターミネーター、細菌複製起点及び抗生物質耐性遺伝子と共に残る。本発明のＤＮＡ対応物によりコードされる多重シストロンｍＲＮＡを製造するためにインビトロ転写されたＲＮＡを導入することも本発明の一部であることが当業者には理解されよう。この目的には、Ｔ７又はＳＰ６プロモーター等の強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを転写プロモーターとして使用し、直鎖化ＤＮＡ鋳型で連続転写を行うのが望ましい。これらの方法は当業者に周知である。
ｅｎｖ及びｇａｇ等のＨＩＶ後期遺伝子の発現はＲＥＶ依存性であり、ウイルス遺伝子転写産物上にＲＥＶ応答因子（ＲＲＥ）の存在が必要である。ｇｐ１２０リーダーペプチドをｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）に由来するような異種リーダー、好ましくは免疫グロブリンリーダーペプチド等の高度発現哺乳動物タンパク質中に存在するようなリーダーペプチドで置換すれば、ＲＥＶの不在下でも分泌形態のｇｐ１２０を産生させることができる。本発明者らはトランスフェクトした細胞（ＲＤ、ヒト横紋筋肉腫系）で分泌ｇｐ１２０を有効に発現するＶ１ＪｎｓにｔＰＡ−ｇｐ１２０キメラ遺伝子を挿入した。本発明者らは更に、（ＲＲＥをもつ）ｇｐ１６０とＲＥＶの両者を含み、トランスフェクトした細胞系（２９３、ヒト胚腎細胞系及びＲＤ）でｇｐ１６０を有効に発現するＩＲＥＳ（ＩＲＥＳ＝内部リボソーム侵入部位）に基づくジシストロンＶ１Ｊｎｓベクターも開発した。モノシストロンｇｐ１６０はＲＥＶ発現ベクターを加えずにトランスフェクトするとタンパク質を産生しない。ジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶは同時トランスフェクトしたｇｐ１６０及びＲＥＶモノシストロンベクターと匹敵する量のｇｐ１６０を産生する。これらの試験から、ジシストロンは構造的に長い多核筋肉細胞内でｇｐ１６０構築物とＲＥＶを接近させることができるので、ジシストロンベクターはインビボ筋肉内導入後にｇｐ１６０及びＲＥＶベクターの混合物よりも有効にｇｐ１６０を発現すると予想できる。このジシストロンによる方法は、ベクターの転写産物領域の内側にＲＲＥを加えた後にｇａｇを発現させるのにも役立つ。更に、この方法はＨＩＶ免疫原性エピトープ、インフルエンザウイルス免疫原性エピトープ、癌関連抗原及び免疫調節遺伝子（例えばインターロイキン、Ｂ７及びＧＭ−ＣＳＦ）の同時発現といったように、無関連の遺伝子をジ又はトリシストロンＰＮＶで発現させるのにも役立つ。
代表的構築物成分の例（但しこれらに限定されない）（図２、シストロンＩ、II及びIII参照）：
１．ｔＰＡ−ｇｐ１２０MN。
２．ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ＲＥＶIIIB。
３．ｇｐ１６０IIIB。
４．ＲＥＶIIIB。
５．ｔａｔ／ＲＥＶ／ｇｐ１６０（ｇｐ１６０を弱く発現するゲノムIIIBクローン）。
６．ＲＥＶ／ｇｐ１６０。
７．ｇｐ１６０MN。
８．臨床的に関連する一次ＨＩＶ分離体からのｇｐ１６０。
９．臨床的に関連する株からの遺伝子を使用するｎｅｆ。
１０．抗ｇａｇＣＴＬの場合にはｇａｇIIIB。
１１．チンパンジー試験の場合にはｔＰＡ−ｇｐ１２０IIIB。
１２．臨床的に関連するＨＩＶ株からのＶ３ループ置換、数個の構築物上の可変ループ除去等の数個の突然変異、構造的中和抗体エピトープに対する立体炭水化物障害を除去するためのＡｓｎ突然変異、及びＣＤ４部位ノックアウト突然変異体等の構造的突然変異をもつｇｐ１６０。
１３．ｇｐ４１。抗ｇｐ４１中和抗体、特に膜貫通領域のすぐ前に配置され、多数の株にわたって広く保存された２Ｆ５モノクローナル抗体エピトープを特異的に誘導するために用いる。このペプチドをｇｐ１２０の不在下で発現させるのは困難であり、いくつかの手段が必要であり、例えば最近の報告によると、２Ｆ５エピトープをインフルエンザＨＡループ先端にスプライスするとＨＩＶ中和抗体を誘導することができ、あるいはｔＰＡシグナルペプチドリーダー配列のように適当なリーダー配列を配置すると、この遺伝子産物を発現させることができる。
１４．臨床的に関連する株からの遺伝子を使用する上記＃５からの構築物に類似するｇａｇ。
１５．ｇｐ１６０及びｇａｇジシストロンの場合にはｒｅｖ。
１６．Ｂ７をコードする配列。
１７．ＧＭ−ＣＳＦ配列。
１８．インターロイキン配列、特にＩＬ−１２をコードするもの。
１９．腫瘍関連抗原。
２０．非限定的な例としてインフルエンザウイルス核タンパク質、血球凝集素、マトリックス、ノイラミジナーゼ及び他の抗原タンパク質等のＨＩＶ以外の病原体により発現される抗原；単純疱疹ウイルス遺伝子；ヒト乳頭腫ウイルス遺伝子；結核抗原；Ａ、Ｂ又はＣ型肝炎ウイルス抗原；並びに前記及び他の抗原の組み合わせであって、前記病原体又は腫瘍抗原の全てに対する免疫応答を誘導することが可能なカクテル組成物を提供するために複数の他のポリシストロン構築物と組み合わせることができる少なくともジシストロン構築物を形成するこのような組み合わせをコードする遺伝子。
ＨＩＶ  ｅｎｖ構築物では、種々のｅｎｖ  Ｖ３ループアミノ酸配列をコードする核酸を発現させるのが望ましいことが当業者に理解されよう。１例として、下記アミノ酸配列もしくはその一部が本発明のＨＩＶポリヌクレオチド免疫原によりコードされ得る。
ＰＮＶ構築物のｇｐ６０  Ｖ３ループ配列要約
北米／ヨーロッパコンセンサス，配列番号１：
0003967374.tif 000002
ＭＮ，配列番号２：
0003967374.tif 000003
IIIＢ（ＨＸＢ２Ｒ），配列番号３：
0003967374.tif 000004
１１６−ｖ，配列番号４：
0003967374.tif 000005
４５２−ｐ，配列番号５：
0003967374.tif 000006
１４６−ｖ，配列番号６：
0003967374.tif 000007
その後のウイルス攻撃に対するポリヌクレオチドＨＩＶ免疫原の防御効力は、本発明の非複製プラスミドＤＮＡで免疫することにより実証される。本発明は、感染性物質を使用せず、ウイルス粒子のアセンブリが不要であり、決定基選択が可能であるという理由で有利である。更に、ｇａｇ及びプロテアーゼ及び他のウイルス遺伝子産物のいくつかの配列は種々のＨＩＶ株間で保存されるので、クローン化遺伝子の起源である株に対して異種であるか同種であるかに拘わらず、ビルレントＨＩＶ株によるその後の攻撃から防御することができる。
ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ発現ベクターのｉ．ｍ．注射は、その後のウイルス攻撃に対して有意な防御免疫をもたらす。特に、ｇｐ１６０特異抗体及び一次ＣＴＬが産生される。保存されたタンパク質に対する免疫応答は、種々のエンベロープタンパク質の抗原の相違にも拘わらず有効であり得る。ＨＩＶ遺伝子産物の各々はある程度の保存を示し、細胞内発現とＭＨＣプロセシングに応答してＣＴＬが産生されるので、多くのウイルス遺伝子はｇｐ１６０で得られると同様の応答を生じると予想することができる。即ち、これらの遺伝子の多くは、これらの構築物が利用可能な形態の免疫原性物質となるように発現ベクター（下記参照）にクローニングされており、このことはクローニング接合部位の配列決定により実証される。
本発明は、自律複製物質又はアジュバントを必要とせずに異株間防御免疫を誘導するための手段を提供する。更に、本発明のポリヌクレオチドによる免疫は多数の他の利点を提供する。まず第１に、ＣＤ８+ＣＴＬ応答は腫瘍と感染性物質の両方の病態生理学的プロセスに重要であるので［Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３５９（１９８８）］、このワクチン接種アプローチは腫瘍と感染性物質に適用できると思われる。従って、形質転換プロセス重要なタンパク質に対する免疫応答を誘導することが有効な癌防御又は免疫療法手段であり得る。第２に、ウイルスタンパク質及びヒト成長ホルモンＤＮＡの注射後に発現されるタンパク質に対して高力価の抗体が産生されるので［例えばＤ．−ｃ．Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２，１９９２参照］、保存された抗原を標的とする細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンと併用するか又は別個に、抗体に基づくワクチンを製造する容易で高度に有効な手段であると思われる。
また、従来のタンパク質精製と同等の容易さでＤＮＡ構築物を製造及び精製できるので、複合ワクチンを製造し易い。こうして、例えばｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又は他の任意のＨＩＶ遺伝子をコードする多重構築物を製造、混合及び同時投与することができる。最後に、ＤＮＡ注射後にタンパク質発現が維持されるので［Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］、Ｂ及びＴ細胞記憶の持続を強化することができ［Ｄ．ＧｒａｙとＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，９６９（１９９１）；ｓ．Ｏｅｈｅｎら，同誌１７６，１２７３（１９９２）］、それにより長期的な体液性及び細胞性免疫を生じることができる。
本発明のＤＮＡ免疫原は、ＤＮＡ構築物を製造及び精製するための標準分子生物学技術により製造できる。本発明の産物を製造するには標準分子生物学技術で十分であるにも拘わらず、本明細書に開示する特定構築物は、異株間及び一次ＨＩＶ分離体中和を生じるという驚くべき効果をもつポリヌクレオチド免疫原を提供し、従来からの標準不活性化完全ウイルス又はサブユニットタンパク質ワクチンでは得られなかった成果をもたらす。
ワクチン受容者に導入する発現可能なＤＮＡ又は転写ＲＮＡの量は、使用する転写及び翻訳プロモーターの力価と、発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、約１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇの免疫学的又は予防薬として有効な薬量を筋肉組織に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚圧入、及び他の投与方法（例えば腹膜組織内、静脈内又は吸入送達）も考えられる。ブースターワクチン接種も考えられる。ＨＩＶポリヌクレオチド免疫原をワクチン接種後に、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇａｇ遺伝子産物等のＨＩＶタンパク質免疫原で補助刺激することも考えられる。本発明のＰＮＶの非経口導入と同時又はその後に、静脈内、筋肉内、皮下又は他の投与手段でインターロイキン−１２タンパク質を非経口投与すると有利である。
ポリヌクレオチドは裸でもよく、即ち受容者の免疫系に影響を与えるタンパク質、アジュバント又は他の物質と結合していなくてもよい。この場合には、ポリヌクレオチドは非限定的な例として滅菌塩類溶液又は滅菌緩衝塩類溶液等の生理的に許容可能な溶液であることが望ましい。あるいは、ＤＮＡはＤＮＡ−リポソーム混合物としてリポソーム（例えばレシチンリポソーム又は当業者に公知の他のリポソーム）と結合していてもよいし、ＤＮＡはタンパク質又は他のキャリヤー等のように免疫応答を刺激することが当業者に知られているアジュバントと結合していてもよい。非限定的な例としてカルシウムイオン等のようにＤＮＡの細胞取り込みを助ける物質も使用すると有利である。これらの物質を本明細書では一般にトランスフェクション助長剤及び医薬的に許容可能なキャリヤーと呼ぶ。微小発射体をポリヌクレオチドで被覆する技術は当業者に公知であるが、このような技術も本発明では有用である。
従って、本発明の１態様は、哺乳動物組織に導入すると単一細胞中で２種又は３種の異なる別々の遺伝子産物のインビボ同時発現を誘導するポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドは、
真核細胞中で第１のシストロンの上流に所在して、該第１のシストロンの転写制御に有効に機能する第１の転写プロモーターと、
第１のシストロンの下流に配置され、第１の転写プロモーターの転写制御下又は第２の転写プロモーターの制御下にある第２のシストロンと、
任意要素として、第２のシストロンの下流に配置され、第１の転写プロモーターの転写制御下、第２の転写プロモーターの制御下又は第３の転写プロモーターの制御下にある第３のシストロンと、
第１、第２及び第３のシストロンに後続する転写ターミネーターを含み、但しそれ自体の転写プロモーターを欠失する別のシストロンが後続しないものとする。
別の態様において本発明は、真核細胞で複製することができず且つ当該ポリヌクレオチドを真核細胞組織にインビボ導入すると遺伝子産物を産生するように発現されることが可能な、連続核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。コード化遺伝子産物は免疫刺激物質として又は免疫応答を発生することが可能な抗原として機能することが好ましい。従って、この態様における核酸配列はスプライスされたＲＥＶ遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原性エピトープ、及び場合によってはサイトカイン又はＴ細胞同時刺激因子（例えばＢ７ファミリータンパク質の１員）をコードする。
別の態様において、本発明は単一細胞中で２又は３種の異なる別々の遺伝子産物をインビボ同時発現させるための方法を提供し、該方法は約０．１μｇ〜１００ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入する段階を含む。
別の態様において、本発明は免疫応答をインビボ誘導するためのＲＥＶ依存性ＨＩＶ遺伝子の使用方法を提供し、該方法は
ａ）ＲＥＶ依存性ＨＩＶ遺伝子を分離する段階と、
ｂ）生組織に導入すると遺伝子の転写開始とその後の翻訳を誘導する制御配列に作動的に連結され、該遺伝子を発現できるような制御配列に分離した遺伝子を連結する段階と、
ｃ）発現すべき遺伝子を生組織に導入する段階と、
ｄ）ＨＩＶ  ＲＥＶをコードする遺伝子をＨＩＶ  ＲＥＶ依存性遺伝子にトランス又はシス配置に導入する段階と、
ｅ）場合により、発現可能な付加的ＨＩＶ遺伝子で追加刺激する段階を含む。
本発明の別の態様は、ＨＩＶ抗原に特異的な細胞毒性Ｔ細胞増殖を刺激するために抗原発現細胞を誘導する方法を提供する。この方法は、抗原性ＨＩＶエピトープ（抗原性ＨＩＶエピトープが有効な発現のためにＲＥＶに依存する場合にはＲＥＶ）とＢ７コーディング配列から構成されるポリヌクレオチドに脊椎動物の細胞をインビボ暴露する段階を含む。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
材料の説明
ベクターｐＦ４１１及びｐＦ４１２：これらのベクターはＲ．Ｇａｌｌｏの実験室で構築されたベクターｐＳＰ６２からサブクローニングした。ｐＳＰ６２はＢｉｏｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な試薬である。ｐＳＰ６２はλＨＸＢ２からサブクローニングされたＨＸＢ２ゲノムの１２．５ｋｂＸｂａＩフラグメントをもつ。ｐＳＰ６２をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化すると、６．５ｋｂの５’側のＸｂａＩ／ＳａｌＩと６ｋｂの３’側ＳａｌＩ／ＸｂａｌからなるＨＸＢ２フラグメントが得られる。これらのインサートをｐＵＣ１８のＳｍａＩ及びＳａｌＩ部位にサブクローニングし、ｐＦ４１１（５’側ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）とｐＦ４１２（３’側ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）を得た。ｐＦ４１１はｇａｇ／ｐｏｌを含み、ｐＦ４１２はｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖ／ｎｅｆを含む。
Ｒｅｐｌｉｇｅｎ試薬：組換えｒｅｖ（IIIＢ），＃ＲＰ１０２４−１０、組換えｇｐ１２０（IIIＢ），＃ＲＰ１００１−１０、抗ｒｅｖモノクローナル抗体，＃ＲＰ１０２９−１０、抗ｇｐ１２０ｍＡＢ、＃１Ｃ１，＃ＲＰ１０１０−１０。エイズ研究及び参照試薬プログラム：抗ｇｐ４１ｍＡＢハイブリドーマ，Ｃｈｅｓｓｉｅ  ８，＃５２６。
実施例１
ワクチン製造用ベクター
Ａ）Ｖ１：  ｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ［Ｙ．Ｗｈａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，１７９６（１９８７）］から発現ベクターＶ１を構築した。ベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自己連結させることによりＡＫＩ及びＤＨＦＲ遺伝子を除去した。このベクターはＣＭＶプロモーター中にイントロンＡを含まないので、これを欠失内部ＳａｃＩ部位をもつＰＣＲフラグメントとして［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，３９７９（１９９１）の番号によると１８５５位に］加えた。ＰＣＲ反応に使用した鋳型はｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであり、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ６ａ１２０［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，前出参照］からのＨｉｎｄIII及びＮｈｅＩフラグメントをｐＢＬ３のＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位に連結し、ｐＣＭＶＩｎｔＢＬを生成することにより作成した。ＲＳＶ−Ｌｕｘ［Ｊ．Ｒ．ｄｅ  Ｗｅｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，７２５，１９８７］からの１８８１塩基対ルシフェラーゼ遺伝子フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ充填したＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ）をｐＣＭＶＩｎｔＢＬのＳａｌＩ部位にクローニングし、Ｋｌｅｎｏｗ充填し、ホスファターゼで処理した。
イントロンＡにまたがるプライマーは以下の通りである。
５’プライマー（配列番号７）：
0003967374.tif 000008
３’プライマー（配列番号８）：
0003967374.tif 000009
ＳａｃＩ部位を除去するために使用したプライマーは以下の通りである。
センスプライマー（配列番号９）：
0003967374.tif 000010
アンチセンスプライマー（配列番号10）：
0003967374.tif 000011
ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ及びＢｇｌIIで切断し、同一酵素で予め切断しておいたベクターに挿入した。
Ｂ）Ｖ１Ｊ発現ベクター（配列番号12）：
Ｖ１Ｊを作成する本実施例の目的は、本発明のベクターＶ１からプロモーター及び転写終結エレメントを除去し、より限定された状況に置いてより高密度のベクターを作成し、プラスミド精製収率を改善することにある。
Ｖ１ＪはベクターＶ１（実施例１参照）と市販プラスミドであるｐＵＣ１８から誘導される。Ｖ１をＳｓｐＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、２個のＤＮＡフラグメントを生成した。ＣＭＶｉｎｔＡプロモーターと異種遺伝子の発現を制御するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結因子を含むこれらのフラグメントの小さいほう（配列番号13）を、アガロース電気泳動ゲルから精製した。次ににＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、このＤＮＡフラグメントの両端を「平滑化」し、別の「平滑末端」ＤＮＡフラグメントに連結できるようにした。
発現ベクターの「バックボーン」を提供するためにｐＵＣ１８を選択した。これは高収率のプラスミドを生成することが知られており、配列と機能が十分に解析されており、最小寸法をもつ。本実施例の目的には不要であり且つプラスミド収率と異種遺伝子発現に有害であり得るｌａｃオペロンの全部を、ＨａｅII制限酵素で部分消化してこのベクターから除去した。残ったプラスミドをアガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、上記ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨエレメントに連結した。ｐＵＣバックボーン内にプロモーター因子の２つの可能な向きのいずれか一方で含むプラスミドを得た。これらのプラスミドの一方が大腸菌で著しく高収率のＤＮＡを産生し、Ｖ１Ｊと命名した（配列番号12）。このベクターの構造は接合領域の配列分析により確認され、Ｖ１と同等以上に異種遺伝子を発現することが後に判明した。
Ｃ）Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター（配列番号14）：
アンピシリンは大規模発酵器で使用しないので、Ｖ１Ｊの抗生物質選択に使用した細菌のａｍｐr遺伝子を除去することが必要であった。ＳｓｐＩ及びＥａｍｌ  １０５Ｉ制限酵素で消化することにより、Ｖ１ＪのｐＵＣバックボーンからａｍr遺伝子を除去した。残ったプラスミドをアガロース電気泳動ゲルにより精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３から誘導され、ｐＵＣ４Ｋプラスミドに含まれる市販ｋａｎr遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素で切り出し、アガロース電気泳動ゲルにより精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。このフラグメントをＶ１Ｊバックボーンと連結し、いずれかの向きにｋａｎr遺伝子をもつプラスミドを得、これをＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名した。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ配列決定により確析し、Ｖ１Ｊと同等量のプラスミドを産生することが判明した。これらのＶ１Ｊｎｅｏベクターでは異種遺伝子産物の発現もＶ１Ｊと同等であった。本発明ではＶ１Ｊ中にａｍｐr遺伝子と同一の向きにｋａｎr遺伝子を含むＶ１Ｊｎｅｏ＃３の方を発現構築物として任意に選択し、以下の文中ではこれをＶ１Ｊｎｅｏ（配列番号14）と呼ぶ。
Ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ発現ベクター：
組込み試験を容易にするために、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加えた。ベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に、市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加える。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直鎖化し、ゲル精製し、Ｔ４  Ｄ部分ＮＡポリメラーゼで平滑にし、平滑ＳｆｉＩリンカーと連結した。制限マッピングによりクローン分離体を選択し、リンカー部分の配列決定により確認した。新規ベクターをＶ１Ｊｎｓと命名した。（ＳｆｉＩをもつ）Ｖ１Ｊｎｓにおける異種遺伝子の発現は（ＫｐｎＩをもつ）Ｖ１Ｊｎｅｏにおける同一遺伝子の発現と同等であった。
Ｅ）ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ：  脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を２つの遺伝子間に並置すると、単一ｍＲＮＡ転写産物の内側でこれらの遺伝子を有効に発現することができる。この非コーディング遺伝子セグメントを利用して、ポリヌクレオチドワクチン用ジシストロン発現ベクターを作成した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳセグメントは、ｐＣＩＴＥ−１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）からの０．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢｓｓＨII消化フラグメントとしてサブクローニングした。このフラグメントをアガロースゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した後、予めＸｂａＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化してホスファターゼで処理しておいたｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。ｐＧＥＭ−３の内側のこのＤＮＡの２つの可能な向きのいずれかで含むクローンを得、各接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。その後のジシストロンベクターの構築のために好適な向きは、ｐＧＥＭ−３の内側のＢａｍＨＩ部位に近接するＩＲＥＳの内側にＮｃｏＩ部位が位置するものであった。このベクターをｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳと呼ぶ。
Ｆ）ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ*：  ＩＲＥＳにより誘導される発現を野生型ＩＲＥＳに比較して最適化するよう、ＰＣＲオリゴマーにより付与される突然変異をそのＩＲＥＳ配列（ＩＲＥＳ*）中に含む、第２のＩＲＥＳベクターを調製した。それぞれ以下のセンス及びアンチセンスオリゴマー：5′-GGT ACA AGA TCT ACT ATA GGG AGA CCG GAA TTC CGC-3′（配列番号11）及び5′-CCA CAT AGA TCT GTT CCA TGG TTG TGG CA A TAT TAT CAT CG-3′（配列番号15）をもつｐＣＩＴＥ−１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ＩＲＥＳ*のＰＣＲ増幅を行った。アンチセンスコドン中に下線で示した突然変異残基により、ＩＲＥＳの３’末端のＮｃｏＩ／Ｋｏｚａｋ配列に含まれる好適ＡＴＧよりも上流にあるＡＴＧは除去される。
Ｇ）ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ／ＲＥＶ：  合成オリゴマーを用いてｐＣＶ−１（カタログ＃３０３，ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）からＨＩＶIIIbＲＥＶをＰＣＲ増幅した。センス及びアンチセンスオリゴマーはそれぞれ5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC AGC-3′（配列番号16）及び5′-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GCA CTA TTC TTT AGC TCC TGA CTC C-3′（配列番号17）であった。これらのオリゴマーは翻訳開放読み枠の各末端にＢｇｌII部位を提供し、ｒｅｖの３’末端のＢｇｌII部位のすぐ上流にＥｃｏＲＶ部位を提供する。ＰＣＲ後にＲＥＶ遺伝子をＮｃｏＩ（Ｋｏｚａｋ配列内に所在）及びＢｇｌII制限酵素で処理し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で予め処理しておいたｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳと連結した。各連結接合部位と０．３ｋｂ  ＲＥＶ遺伝子の全長をＤＮＡ配列決定により確認した。
Ｈ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ：  分泌及び／又は膜タンパク質に異種リーダーペプチド配列を提供するために、ヒト組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーを含むようにＶ１Ｊｎを改変した。２種の合成相補的オリゴマーをアニールした後、ＢｇｌIIで予め消化しておいたＶ１Ｊｎに連結した。センス及びアンチセンスオリゴマーは5′-G ATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3′（配列番号18）及び5′-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3′（配列番号19）であった。Ｋｏｚａｋ配列はセンスオリゴマー中に下線で示す。これらのオリゴマーはＢｇｌIIで切断した配列と連結するのに適する突出塩基をもつ。連結後、上流ＢｇｌII部位は失われるが、下流ＢｇｌIIはその後の連結のために維持される。接合部位とｔＰＡリーダー配列全長の両者をＤＮＡ配列決定により確認した。更に、本発明の共通最適化ベクターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位をもつＶ１Ｊｎｅｏ）と一致するように、ＫｐｎＩ部位をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後にＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と連結することにより、Ｖ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫｐｎＩ部位にＳｆｉＩ制限部位を配置した。この改変を制限消化及びアガロースゲル電気泳動により確認した。
Ｉ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIbＲＥＶ：  ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ／ＲＥＶについて上述したように、ＲＥＶをＰＣＲにより増幅し、ＢｇｌII制限酵素で消化し、予めＢｇｌII及びウシ腸アルカリホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎｓに連結した。連結接合部位をＤＮＡ配列決定により確認し、ＲＥＶの発現をＲＤ細胞のインビトロトランスフェクションとイムノブロット分析により確認した（１０6細胞当たり＞１μｇのＲＥＶが得られた）。
Ｊ）ｐＧＥＭ−３−ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ：  ＲＥＶ依存性発現を生じるのにＲＮＡ転写産物上に必要なＲＥＶ応答因子含（ＲＲＥ）から構成されるカセットを作成するために、下記合成オリゴマー即ちセンスオリゴマー：5′-GGT ACA TGA TCA GAT ATC GCCC GGG C CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AG-3′（配列番号20）及びアンチセンスオリゴマー：5′-CCA CAT TGA TCA G CTT GTG TAA TTG TTA ATT TCT CTG TCC-3′（配列番号21）を使用して、ＨＩＶ株ＨＸＢ２からのＲＲＥをＰＣＲにより得た。これらのオリゴマーはインサートの両末端にＢｃｌＩ制限部位を提供し、インサートの５’末端にＥｃｏＲＶ及びＳｒｆＩ部位を提供する。このＲＲＥをＩＲＥＳの前のＨｉｎｃII制限部位でｐＧＥＭ−３−／ＩＲＥＳ／ＲＥＶに平滑末端連結した。連結産物を制限酵素マッピング及び連結接合部位間のＤＮＡ配列決定により確認した。
実施例２
ｇｐ１２０ワクチン：
ｇｐ１２０としてのＲＥＶ依存性ｅｎｖ遺伝子の発現を次のように行った。天然リーダーペプチド配列（Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１２０）をもつＨＩＶのＭＮ株から、又は天然リーダーペプチドに代え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーペプチドとの融合体（Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０）として、ｇｐ１２０をＰＣＲクローニングした。ｔＰＡ−ｇｐ１２０発現はＲＥＶ非依存性であることが報告されている［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，３９７９（１９９１）；他のリーダー配列もｇｐ１２０遺伝子をＲＥＶ非依存性にする同様の機能を提供することに留意されたい］。上記ベクターを使用して以下のｇｐ１２０構築物を調製した。
Ｉ．ｇｐ１２０ワクチン構築物：
Ａ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶMNｇｐ１２０：  ペプチドリーダー配列の最初から３０個のアミノ酸を除去し、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡにクローニングできるように設計されたオリゴマーを使用して、ＨＩＶMNｇｐ１２０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）をＰＣＲ増幅し、ｔＰＡリーダーペプチドと、それに続くアミノ酸残基３０より先のｇｐ１２０配列から構成されるキメラタンパク質を作成した。この設計によりＲＥＶ非依存性ｇｐ１２０発現が生じ、このプラスミドをもつ細胞から可溶性ｇｐ１２０が分泌される。使用したセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、5′-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3′（配列番号22）及び5′-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3′（配列番号23）であった。翻訳停止コドンを下線で示す。これらのオリゴマーは翻訳開放読み枠の一端のＢａｍＨＩ制限酵素部位と、センスオリゴマーのＢａｍＨＩの３’に位置するＢｃｌＩ部位を含む。ＰＣＲ産物をＢｃｌＩ次いでＢａｍＨＩで順次消化し、予めＢｇｌIIで消化した後にウシ腸アルカリホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡに連結した。得られたベクターを配列決定してｔＰＡリーダー一とｇｐ１２０コーディング配列が枠内で融合しているのを確認し、トランスフェクトしたＲＢ細胞のイムノブロット分析によりｇｐ１２０発現及び分泌を確認した。従って、ｔＰＡ−ＨＩＶMN−ｇｐ１２０をコードするこのベクターは、ｇａｇ、Ｂ７又は他の抗原を発現するジ又はトリシストロン構築物に組み込むのに有用である。
Ｂ）Ｖ１−ｔＰＡ−ＨＩＶMN−ｇｐ１２０：  本発明の基本ワクチン発現ベクターの初期型Ｖ１（核酸医薬特許参照）を使用して、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡについて記載したと多少異なるｔＰＡペプチドリーダー配列を含む、上記キメラｔＰＡ−ＨＩＶMN−ｇｐ１２０ベクターとは多少異なるベクターを作成した。
上記ＰＮＶ構築物のいずれかで、翻訳終止コドンの後にＩＲＥＳ配列を配置し、Ｂ７等の免疫調節遺伝子をその下流にクローニングすると、本発明の方法により有用なジ又はトリシストロンポリペプチドが得られる。これらのＰＮＶはどちらの遺伝子産物も有効に発現する。
Ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶIIIBｇｐ１２０：  このベクターは、ｇｐ１２０配列にＨＩＶIIIB株を使用した以外はＩ．Ａ．と同様である。使用したセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、それぞれ5′-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3′（配列番号24）及び5′-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3′（配列番号25）であった。これらのオリゴマーはインサートの一端にＢｃｌＩ部位を提供し、３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏＲＶを提供する。５’末端ＢｃｌＩ部位はＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌII部位に連結することができ、ｔＰＡリーダー配列を持ち天然リーダー配列を欠くｇｐ１２０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１２０遺伝子を作成することができる。連結産物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により確認した。
II．インビトロｇｐ１２０ワクチン発現：
トランスフェクトしたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞でこれらの構築物のインビトロ発現を試験した。トランスフェクトしたＲＤ細胞から分泌されたｔＰＡ−ｇｐ１２０を定量した処、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターは分泌ｇｐ１２０を産生することが判明した。
III．インビボｇｐ１２０ワクチン接種：
図12参照（マウスデータ）：
分泌gp120*により誘導される抗gp120 ELISA力価種GMT（範囲）
マウス
（各回200μgずつ2回後）5,310（1.8×103〜1.5×104）
ウサギ
（各回2mgずつ3回後）143（75〜212）
ミドリザル
（各回2mgずつ2回後）171（＜10〜420）
＊接種ベクターとしてV1Jns-tPA-gp120IIIBを筋肉内使用。
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０MNＰＮＶにより誘導されるクラスII  ＭＨＣに制限されたＴリンパ球ｇｐ１２０特異的抗原反応性。Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０MN２００μｇを２回ワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスを殺し、脾臓を抽出して組換えｇｐ１２０に対するヘルパーＴリンパ球反応性をインビトロ定量した。Ｔ細胞増殖アッセイは、ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）で濃度５μｇ／ｍｌの組換えｇｐ１２０IIIB（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、カタログ＃ＲＰ１０１６−２０）を４×１０5細胞／ｍｌの割合で用いて実施した。培地単独で細胞を培養することによりこれらの細胞による3Ｈ−チミジン取り込みの基底レベルを得、２μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激を使用して最大増殖を誘導した。ＣｏｎＡで誘導した反応性は〜３日でピークに達するので、この時点で培地対照サンプルを回収し、抗原処理サンプルは付加培地対照と共に５日目に回収した。ワクチン接種したマウスの応答を同年齢の非免疫同系マウスと比較した。ＣｏｎＡ陽性対照は予想通り非免疫及び免疫マウスの両者で非常に高い増殖を与えた。ワクチン接種したマウスではｇｐ１２０処理により非常に強いヘルパーＴ細胞記憶応答が得られたが、非免疫マウスは応答しなかった（特異的反応性の閾値は刺激指数（ＳＩ）＞３〜４；ＳＩはサンプルｃｐｍ／培地ｃｐｍの比として計算する）。ワクチン接種したマウスでは６５及び１４のＳＩが得られ、これらの値はそれぞれのマウスで５６４３及び１１，９００の抗ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ力価に等価である。興味深いことにこれらの２匹のマウスのうち、抗体力価の低いマウスに比べ、抗体応答の高いマウスの方が有意に低いＴ細胞反応性を与えた。この実験は、分泌ｇｐ１２０ベクターがヘルパーＴ細胞を有効にインビボ活性化すると共に、強力な抗体応答を生じることを実証するものである。更に、接種ＰＮＶによりコードされる抗原に対して異種の抗原（IIIＢとＭＮ）を使用してこれらの免疫応答の各々を定量した。
V1Jns-tPA-gp120MNをワクチン接種後のrgp120に対する脾臓Ｔ細胞増殖応答
平均CPM（刺激指数）
0003967374.tif 000012
上記データは、ポリヌクレオチドワクチン抗原で関連ＨＩＶ抗原が有効にインビボ発現され、発現された遺伝子産物に対して特異的免疫応答が誘導されることを明白に実証するものである。この構築物は、ＲＥＶ、Ｂ７、ｇａｇ又はＨＩＶに無関係の他の抗原（例えばインフルエンザ核タンパク質又は血球凝集素をコードする遺伝子）をコードする第２又は第３のシストロンをｇｐ１２０翻訳停止コドンの下流に加えることにより、本発明のビシストロンＰＮＶを形成するように容易に改変される。
実施例３
ｇｐ１６０ワクチン
分泌ｇｐ１２０構築物に加え、完全長膜結合ｇｐ１６０の発現構築物も調製した。ｇｐ１２０に加えてｇｐ１６０構築物を調製した理由は、（１）ｇｐ４１に対する強力なＨＩＶ中和モノクローナル抗体（２Ｆ５、上記参照）を含む中和抗体産生とＣＴＬ刺激の双方のために、さらに多くのエピトープを利用でき、（２）ウイルスにより産生されたｇｐ１６０に比較してより天然のタンパク質構造が得られ、（３）膜結合インサルエンザＨＡ構築物が免疫原性に成功している［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，１９９３；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．， １２：７７７−７８３，１９９３］ためである。
ｇｐ１６０は異種リーダーペプチド配列の支配下でも実質的なＲＥＶ依存性を維持する。そこで、ｇｐ１２０発現に使用した方法とは別に、次の２つの方法を使用してｇｐ１６０発現ベクターを調製した。（１）ｔａｔ、ＲＥＶ及びｇｐ１６０を完全な形で含む異種ｇｐ１６０発現に有効であると報告されているゲノムＨＩＶ  ＤＮＡフラグメントをＶ１Ｊｎｓにサブクローニングする（Ｖ１Ｊｎｓ−ｔａｔ／ＲＥＶ／ｅｎｖ）［Ｗａｎｇら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ９０：４１５６−４１６０（１９９３年５月）；この論文で報告された全データは核酸注入よりも約２４時間前にブピバカイン注入を用いて生成された。ブピバカインは筋肉損傷を生じることが知られているので、これはヒトを免疫するには明らかに使用できない方法である］。（２）ＲＥＶをコードする第２のシストロンのｇｐ１６０翻訳後に翻訳を有効に再開するためにＥＭＣＶ内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の前にジシストロンベクターに最小ｇｐ１６０ＯＲＦをＰＣＲクローニングする。この構築物はｇｐ１６０及びＲＥＶタンパク質両者の有効な同時産生を確保する（Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ）。これらのベクターの各々、並びにモノシストロンベクターＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０及びＶ１Ｊｎｓ−ＲＥＶを調製した。文献及び本発明者自身の実験（下記参照）から明らかなように、ｅｎｖ  ｍＲＮＡは異種発現系におけるｔａｔ／ＲＥＶスプライスドナー（ＳＤ）部位の安定性を必要とするので、更にこのＳＤをｅｎｖ  ＯＲＦの上流に挿入してＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０及びＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ＲＥＶを調製した。これらのワクチン構築物は次のように調製した。
Ｉ．ｇｐ１６０ワクチン構築物：
２種のｇｐ１６０発現ベクター、Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０とＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ（下記Ａ及びＢ参照）は、Ｖ１Ｊｎｓの内側のＰｓｔＩ部位（これはこれらのベクターの両者にある唯一のＰｓｔＩ部位である）でｇｐ１６０配列のすぐ上流にｔａｔ／ｒｅｖスプライスドナー（ＳＤ）を挿入して調製した。ＳＤをコードする合成相補的オリゴマーはＰｓｔＩ部位に連結するように設計し、連結後にもインサートの５’末端に元の部位を維持するが、３’末端のＰｓｔＩ部位は破壊するようにした。使用したオリゴマー配列は、5′-GTC ACC GTC CTC TAT CAA AGC AGT AAG TAG TAC ATG CA-3′（配列番号26）及び5′-TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT AGA GGA CGG TGA CTG CA-3′（配列番号27）であった。得られたプラスミドを制限消化マッピングとＳＤ／ＰｓｔＩ領域全長のＤＮＡ配列決定により確認した。
Ａ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇｐ１６０：  ＨＩＶIIIBクローンＨＸＢ２から誘導されるＨＩＶIIIBゲノムの３’末端側半分を含むプラスミドｐＦ４１２から、ＰＣＲ増幅によりＨＩＶIIIBｇｐ１６０をクローニングした。ＰＣＲセンス及びアンチセンスオリゴマーはそれぞれ5′-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3′（配列番号28）及び5′-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3′（配列番号29）であった。Ｋｏｚａｋ配列と翻訳終止コドンを下線で示す。これらのオリゴマーは、ｅｎｖ遺伝子の両端の翻訳開放読み枠よりも外側にＢｃｌＩ制限酵素部位を提供する。（ＢｃｏｌＩ消化部位はＢｇｌII消化部位との連結に適合可能であり、それにより、両制限酵素に対する感受性を失う。ＢｃｌＩをｇｐ１６０のＰＣＲクローニングに選択したのは、この遺伝子が内部ＢｇｌII及びＢａｍＨＩ部位を含むからである）。アンチセンスオリゴマーは更に、ＰＣＲにより誘導される他の遺伝子について上述したようにＢｃｌＩ部位の直前にＥｃｏ  ＲＶ部位も挿入する。増幅ｇｐ１６０遺伝子をアガロースゲル精製し、ＢｃｌＩで消化し、予めＢｇｌIIで消化してウシ腸アルカリホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎｓに連結した。クローニングした遺伝子は約２．６ｋｂの寸法であり、ｇｐ１６０とＶ１Ｊｎｓの各接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。
Ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ：  ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ／ＲＥＶを（ｐＧＥＭ−３多重リンカー領域に含まれる）ＨｉｎｄII及びＳｍａＩ制限酵素で消化し、ＩＲＥＳ／ＲＥＶ配列全長（〜０．９ｋｂ）を除去した後、予めＥｃｏＲＶで消化してホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇｐ１６０と連結した。この手順により、ｇｐ１６０とそれに続くＩＲＥＳ及びＲＥＶを含み、これらのＨＩＶ遺伝子産物の両者の発現を誘導する８．３ｋｂのジシストロンＶ１Ｊｎｓが得られた。全接合領域をＤＮＡ配列決定により確認した。
Ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶIIIBｇｐ１６０：  このベクターは、天然リーダー配列をもたない完全長ｇｐ１６０をＰＣＲにより得た以外は上記実施例２（Ｃ）と同様である。センスオリゴマーはＩ．Ｃ．で使用したものと同一であり、アンチセンスオリゴマーは5′-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3′（配列番号30）であった。これらのオリゴマーはインサートのいずれかの一端にＢｃｌＩ部位を提供し、３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏＲＶを提供する。５’末端側にＢｃｌＩ部位があると、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌII部位に連結し、ｔＰＡリーダー配列とその天然リーダー配列をもたないｇｐ１６０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１６０遺伝子を生成することができる。連結産物を制限消化とＤＮＡ配列決定により確認した。
Ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖIIIB：この発現ベクターは、スプライスしていないｔａｔ、ｒｅｖ及びｅｎｖをその完全な形で含むＨＩＶ−１  IIIＢクローン（ＨＸＢ２）の「ゲノム」セグメントを使用して、Ｄ．Ｒｅｋｏｓｈら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，３３４（１９８８）］に記載されているベクターと同様に調製した。Ｖ１ＪｎｓをＢｇｌIIで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。ｐＦ４１２の内側に含まれるIIIＢゲノムのＳａｌＩ／ＸｈｏＩフラグメントを制限消化により得、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。連結産物を制限消化マッピングとＤＮＡ配列決定により確認した。
Ｅ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖIIIＢ：  このベクターは上記Ｄに記載したベクターの変形であり、エキソン１の完全ｔａｔコーディング領域をＲＥＶ開放読み枠の始点まで欠失している。Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIB（上記Ａ参照）をＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化してｇｐ１６０遺伝子の５’領域を除去した。ＰＣＲ増幅を使用してＨＸＢ２ゲノムクローンからのｇｐ１６０でＫｐｎＩ部位までの第１のＲＥＶエキソンをコードするＤＮＡセグメントを得た。センス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、それぞれ5′-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3′（配列番号31）及び5′-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3′（配列番号32）であった。これらのオリゴマーはＤＮＡフラグメントの５’及び３’末端にそれぞれＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を提供する。得られたＤＮＡをＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、アガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ）と連結した。得られたプラスミドを制限酵素消化により確認した。
II．ｇｐ１６０ワクチンのインビトロ発現：
ＲＤ及び２９３細胞に、ｇｐ１６０及びＲＥＶ発現構築物を一時的にトランスフェクトした。抗ｇｐ４１モノクローナル抗体（Ｃｈｅｓｓｉｅ  ８，ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＃５２６）を用いて図５に示すウエスタンブロット分析を行った処、Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＳＤ）によるｇｐ１６０発現にはＶ１Ｊｎｓ−ＲＥＶ（このベクターは一時的トランスフェクションで細胞１０6個当たりＲＥＶ＞１μｇを生成する）を加える必要があることが判明した。Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ＲＥＶは付加的ＲＥＶをトランス配置に加えなくともｇｐ１６０を有効に発現したので、ジシストロンの機能が確認された。抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（１Ｃ１，Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，＃ＵＰ１０１０−１０）のイムノブロット可視化でも同様の結果が認められた。ｇｐ１６０から成熟ｇｐ１２０及びｇｐ４１形態へのタンパク分解プロセシングが各ベクターで観察された。ジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶベクターにＲＥＶをトランス配置で付加してもそれ以上ｇｐ１６０発現は生じず、ＲＥＶ発現がこのベクターでのｇｐ１６０発現を制限しないことが判明した。ｔａｔ／ＲＥＶ  ＳＤをジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶ構築物に加えた場合はｇｐ１６０の発現が改善され、この部位が最適ＲＥＶ依存性ｇｐ１６０発現に重要であることが分かる。更に驚くべきことには、ジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶは一時的トランスフェクションではゲノムｔａｔ／ＲＥＶ／ｅｎｖ構築物の１０倍を越えるｇｐ１６０を発現することが発見され、ここでもこのベクターがｇｐ１６０発現に非常に有効なことが裏付けられる。
これらのベクターは別個プラスミド又は同一プラスミドに担持したｇｐ１６０及びＲＥＶ遺伝子でｇｐ１６０プラスミドワクチン接種するのための核酸構築物を提供する。ｔｐａ−ｇｐ１６０構築物の場合には、有効なｇｐ１６０発現に達するためにＲＥＶをシス又はトランスに配置する必要はないので、他の遺伝子をジシストロン構築物に組込むことができる。
ＲＥＶ依存性構築物では、筋肉内注射後に非常に少量のＤＮＡしか筋肉細胞に取り込まれず、個々の筋肉細胞（各々数百の核をもつ）が細胞内の近接位置で異なるプラスミドのコピーを受容することができないので、ワクチン接種後に有効なｇｐ１６０発現を得るために同一プラスミド上にＲＥＶが存在する必要があるか否か、を試験することが重要である。
III．インビボｇｐ１６０ワクチン接種：
次の３種の異なるベクター即ち（１）Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ（ＳＤ）を用いるジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶ、（２）ゲノムｇｐ１６０構築物Ｖ１Ｊｎｓ／ｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖIIIB、及び（３）モノシストロンベクターＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIB（ＳＤ）とＶ１Ｊｎｓ−ＲＥＶの混合物がｇｐ１６０をコードするＰＮＶを使用して非ヒト霊長類で抗ｇｐ１２０抗体応答を誘導する能力を比較した。２ｍｇ／動物のワクチン接種用量を１カ月おきに３回まで使用し、併行して採血した。これらのベクターの各々をワクチン接種したサルについて、組換えｇｐ１２０IIIBを使用して抗ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ力価を示す。ジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶはアカゲザルとミドリザルで抗体応答を誘導したが、ゲノムｇｐ１６０と混合モノシストロンベクターは２回接種後（即ち第２回目のワクチン接種から１カ月後）に検出可能な抗体を誘導しなかった。ジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶを接種した全４匹のサルは、固定基質として組換えｇｐ４１（ＡＢＴ）を使用してＢＩＡコアアッセイにより測定した処、特異的抗ｇｐ４１反応性も示した（データは示さず）。これらのサルから得た血清は〜５０〜１００の力価で抗Ｖ３IIIBＥＬＩＳＡ反応性も示した。これらの結果から明らかなように、多重シストロンのＰＮＶにより誘導されるインビボ発現は、全３種のベクターでｇｐ１６０発現を示したインビトロトランスフェクション法により得られる結果と一致しない。特に、インビトロトランスフェクションでは混合モノシストロンｇｐ１６０及びＲＥＶベクターがジシストロンｇｐ１６０／ＲＥＶ（図５参照）と等価の発現を生じたことに留意されたい。これらの実験から明らかなように、本発明のジシストロンＰＮＶはインビボワクチン接種後に有効な同調的発現を生じるが、他の多重シストロンワクチン接種法ではこれは不可能であった。２匹のミドリザルと２匹のアカゲザルと１匹のウサギの免疫応答を示す図９を参照されたい。
非ヒト霊長類で各回DNA2mgのgp160PNVにより誘導される抗gp120 ELISA力価
0003967374.tif 000013
非ヒト霊長類で各回DNA2mgのgp160/revジシストロン*により誘導される抗V3IIIBELISA力価
0003967374.tif 000014
*接種ベクターとして、Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ｒｅｖを使用
実施例４
ＳＩＶワクチン
ＳＩＶMAC251ウイルス分離体のゲノムクローンからＰＣＲクローニングによりＳＩＶｅｎｖ構築物Ｖ１Ｊｎｓ−ＳＩＶｇｐ１５２を調製し、ベクターとの両接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。この株はアカゲザルへの感染性ＳＩＶ攻撃に、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＰＣ）で使用されているウイルスと同族である。リーダーペプチド領域をコードするＤＮＡが別のコドンを使用する以外は天然アミノ酸配列を維持する、同様のＳＩＶｇｐ１５２構築物を調製する。こうしてこの構築物のＲＥＶ依存性を弱め、より安定なｍＲＮＡ転写産物を作成する。これらのワクチン構築物は次のように調製した。
Ｉ．ＳＩＶワクチン構築物：
Ａ）．Ｖ１Ｊ−ＳＩＶMAC251ｐ２８ｇａｇ：  ＳＩＶｇａｇの中心ペプチド（ｐ２８ｇａｇ）をポリヌクレオチドワクチンに選択し、非ヒト霊長類におけるＣＴＬ産生を試験した。ｇａｇのこの領域は、Ｍａｍｕ−Ａ０１として知られるＭＨＣクラスＩハプロタイプをもつマカクザルの公知ＣＴＬエピトープをコードする。従って、このハプロタイプをもつサルは、適当なｇａｇプラスミドのワクチン接種後にこのｇａｇエピトープに対してＣＴＬ反応性を示す筈である。ＳＩＶ及びＨＩＶｇａｇ両遺伝子はＲＥＶ依存性の調節配列を含むが、ｐ２８ｇａｇ発現はＲＥＶ依存性が低いと思われるので、ＲＥＶの不在下でも少なくとも多少の発現は得られると考えられる。
慣用合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用するプラスミドｐ２３９ＳｐＳｐ５’（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手、カタログ＃８２９）から、ＰＣＲ増幅によりＢｇｌII制限酵素部位を用いてＳＩＶｐ２８ｇａｇを発現ベクターＶ１にクローニングした。このプラスミドはＳＩＶMAC239ゲノムの５’末端側半分をコードする。ＳＩＶMAC239は親ウイルスに比較して多少の突然変異を受けたＳＩＶMAC251の後続インビトロ継代系である。しかし、これらのウイルス間のｐ２８ｇａｇのアミノ酸配列は同一である。ＰＣＲセンス及びアンチセンスオリゴマーは、5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT GGT AAC-3′（配列番号33）及び5′-CCA CAT AGA TCT TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC C-3′（配列番号34）であった。これらのオリゴマーは翻訳開放読み枠の外側にＢｇｌII制限酵素部位を提供し、共通Ｋｏｚａｋ翻訳開始コドン領域（下線部分）と、翻訳終止コドン（下線部分）も提供する。ＰＣＲにより生成したｐ２８ｇａｇをアガロースゲル精製し、ＢｇｌIIで消化し、予めＢｇｌIIで消化してホスファターゼで処理しておいたＶ１に連結した。この遺伝子をその後、ＢｇｌII制限酵素部位を用いて本発明の最適化発現ベクターＶ１Ｊにサブクローニングし、Ｖ１Ｊ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇと命名した。クローン化遺伝子は約０．７ｋｂ長であった。Ｖ１Ｊ  ＣＭＶプロモーターとｐ２８ｇａｇの５’末端の接合部位を各構築物のＤＮＡ配列分析により確認した。ＳＩＶに感染したマカクザルからの血漿を使用してｇａｇタンパク質を検出するウエスタンブロッティングにより、Ｖ１Ｊ及びＶ１構築物のＳＩＶｐ２８タンパク質のインビトロ発現を比較した。Ｖ１Ｊ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇ構築物は一貫して適切な分子量位置で最多量の産物を生じた。更に最適化したＶ１Ｊｎｅｏ、Ｖ１Ｊｎｓ及びＶ１Ｒベクターではこれと同等又は更に改善された結果が得られる。
Ｂ）．ＶＩＪ−ＳＩＶMAC251ｎｅｆ：  完全ＳＩＶMAC251ゲノムをコードするプラスミドｐＢＫ２８（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤに所在のＮＩＡＩＤ．ＮＩＨのＶａｎｅｓｓａ  Ｈｉｒｓｃｈ博士の寄贈品、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍの現カタログ＃１３３）から、ＰＣＲ増幅によりＳＩＶｎｅｆをクローニングした。ＰＣＲセンス及びアンチセンスオリゴマーは、5′-GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATG AGG-3′（配列番号35）及び5′-CCT AGG TTA GCC TTC TTC TAA CCT CTT CC-3′（配列番号36）であった。Ｋｏｚａｋ部位と翻訳終止コドンを下線で示す。増幅したｎｅｆ遺伝子をアガロースゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、Ｔ４  ＤＮＡキナーゼを使用して５’末端をリン酸化し、予めウシ腸アルカリホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊの平滑化ＢｇｌII制限酵素部位にクローニングした。クローン化遺伝子は約０．７６ｋｂ長であった。Ｖ１Ｊ  ＣＭＶプロモーターとｎｅｆの５’末端の接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。ウエスタンブロット分析とＨＩＶ  ｎｅｆ抗血清（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ、カタログ＃３３１）を使用してインビトロ発現を調べた。
Ｃ）．Ｖ１Ｊｎ−ＳＩＶMAC251ｇｐ１５２：  プラスミドｐＢＫ２８からＰＣＲ増幅によりｇｐ１５２と呼ぶＳＩＶｅｎｖをＶ１Ｊｎｅｏ（核酸医薬特許参照）にクローニングした。ＰＣＲセンス及びアンチセンスオリゴマーは、5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA TGT CTT GGG AAT CAG C-3′（配列番号37）及び5′-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GTA TGA GTC TAC TGG AAA TAA GAG G-3′（配列番号38）であった。Ｋｏｚａｋ部位とアンバー翻訳終止コドンを下線で示す。ＰＣＲ産物は両端の翻訳開放読み枠の外側にＢｇｌII制限酵素部位をもち、３’末端ＢｇｌII部位の直前で且つアンバー終止コドンの後に付加的ＥｃｏＲＶ部位をもつ。こうしてその後のクローニング段階に好都合な制限酵素部位が提供される。増幅したｇｐ１５２遺伝子をアガロースゲル精製し、ＢｇｌIIで消化し、予めＢｇｌIIで消化してホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎと連結した。クローン化遺伝子は約２．２ｋｂ長であった。ｇｐ１５２との各末端Ｖ１ＪｎＣＭＶプロモーター及びＢＧＨターミネーター領域の接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。
II．インビボＳＩＶワクチン接種：
２種のＳＩＶ遺伝子構築物をアカゲザルのワクチン接種に使用した処、非ヒト霊長類で特異的ＣＴＬ応答を生じることが判明した（図４参照）。
ｇａｇの比較的ＲＥＶ非依存性の中心ペプチドを発現するＶ１Ｊ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇとＶ１Ｊ−ＳＩＶｎｅｆをマカカ・ムラッタサルに１カ月おきに３ｍｇずつ３回ｉ．ｍ．注射した。Ｍａｍｕ−Ａ０１  ＭＨＣ  Ｉハプロタイプをもつアカゲザルのｇａｇ特異的ＣＴＬ応答は、主にｐ２８ｇａｇの内側の単一ペプチドエピトープに制限される。Ｖ１Ｊ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇを投与したＭａｍｕ−Ａ０１+サルは第２回目の注射から１カ月後にｇａｇ特異的ＣＴＬ活性が開始したが、このＤＮＡを投与したＭａｍｕ−Ａ０１-サルとＶ１Ｊ対照ＤＮＡを投与したサルはＣＴＬ応答を示さなかった。それぞれ第２及び第３回目のワクチン接種後に、ｇａｇペプチドで再刺激したＣＴＬと一次ＣＴＬがいずれもインビトロで検出された。これらのＣＴＬ活性レベルはワクチニア−ｇａｇ接種により生じたレベルと同等であった。その後、応答動物のＣＴＬレベルは低下した。これらの動物に再びワクチンを接種し、初期ＣＴＬ応答を誘導する。Ｖ１Ｊ−ＳＩＶｎｅｆをワクチン接種した動物は特異的ＣＴＬ応答を示さなかったが、ｇａｇＣＴＬ検出に使用するようなより精密なアッセイでは別の結果が得られると思われる（即ち主要なＭＨＣ  Ｉハプロタイプ／ｎｅｆペプチド関係がアカゲザルでは確立されていないので、未知効力のペプチドを刺激に使用することとなり、陽性対照が存在しない）。
実施例５
他のワクチン構築物
Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ／ｐｏｌ−ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ：  いくつかの変異を含むＨＩＶIIIBｇａｇ−ｐｏｌ配列のＰＣＲ増幅により、ｐｏｌのプロテアーゼ領域をもつか又はもたないｇａｇをコードするジシストロン発現ベクターを調製した。ｐｏｌのプロテアーゼセグメント（ｐｒｔ）を加えることにより、成熟キャプシド粒子を含む種々のペプチド（例えばｐ１７、ｐ２４、ｐ１５等）にｇａｇをタンパク分解プロセシングすることができ、他方、この酵素の不在下では非成熟キャブシド粒子形態のｐ５５が合成される。ｐｏｌの逆転写酵素及びインテグラーゼ酵素活性の故の危険性を避けるために、ｐｏｌのもっと長い配列は加えなかった。成熟形態にプロセシングされるか否かに拘わらず、ｇａｇキャプシド粒子を細胞から押出すためには、最初のＭｅｔから２位後のグリシンアミノ酸のミリストイル化が生じなければならない。このグリシン残基の突然変異誘発はミリストイル化を妨げ、ｇａｇ粒子は細胞から押出されない。ｇａｇのこれらの変異に基づき、このようなｇａｇベクターによるワクチン接種後の抗ｇａｇＣＴＬの産生がタンパク分解プロセシング及び／又は細胞からのキャプシドの押出し影響されるか否かを決定することができる。以下に挙げるベクターのいくつかはｇａｇ開放読み枠の上流にスプライスドナー（ＳＤ）部位を含む。最適なｇｐ１６０発現にはｔａｔ／ｒｅｖＳＤを加える必要があったが、それと同様にｇａｇの最適なｒｅｖ依存性発現にもこのＳＤが必要か否かをこれらのベクターにより決定することができる。
１）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ−ｐｒｔ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＦ：  次のセンス及びアンチセンスオリゴマーそれぞれ5′-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GGT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3′（配列番号39）及び5′-CCA CAT GGA TCC GC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC TAA TGC-3′（配列番号40）を使用して、ＰＣＲ増幅によりｇａｇ−ｐｒｔをコードするＤＮＡセグメントを得た。これらのオリゴマーはセグメントのいずれかの一端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、ＮｃｏＩ部位を含むＫｏｚａｋ翻訳開始配列及び３’末端のＢａｍＨＩ部位のすぐ上流のＳｒｆＩ部位を提供する。ＥｃｏＲＶ制限酵素を使用して切り出したｐＧＥＭ−３−ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶからｇａｇ−ｐｒｔのすぐ下流にＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶカセットをクローニングするために、ＳｒｆＩ部位を使用した。全連結接合部位をＤＮＡ配列により確認し、構築物を更に制限酵素マッピングにより確認した。
２）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ−ｐｒｔ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ（ＳＤ）：  このベクターは、ＰＣＲセンスオリゴマー5′-GGT ACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3′（配列番号41）を使用した以外は上記ベクター１と全く同様に調製した。これは、ｇａｇ配列の始点の上流ＳＤ部位に加えることができる。この構築物を制限酵素マッピングと連結接合部位のＤＮＡ配列決定により確認した。
３）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ−ｐｒｔ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ（ミリストイル化なし）：  このベクターは、ＰＣＲセンスオリゴマー5′-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TAA AGC-3′（配列番号42）を使用した以外は上記ベクター１と全く同様に調製する。
４）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ：  このベクターは、ＰＣＲセンスオリゴマー5′-CCA CAT GGA TCC GCC CGG GCC TTT ATT GTG ACG AGG GGT CGT TGC-3′（配列番号43）を使用した以外は上記ベクター１と全く同様に調製する。
５）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ（ＳＤ）：  このベクターは、ＰＣＲセンスオリゴマー5′-GGT ACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3′（配列番号44）を使用した以外は上記ベクター４と全く同様に調製する。
６）Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶIIIBｇａｇ／ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ＲＥＶ（ミリストイル化なし）：  このベクターは、ＰＣＲセンスオリゴマー5′-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3′（配列番号45）を使用した以外は上記ベクター５と全く同様に調製する。
Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶｎｅｆ：  このベクターはＳＩＶｎｅｆに使用したと同様のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーを使用して、感染集団中で代表的なウイルス株からのｎｅｆ遺伝子を使用する。
Ｃ．ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−Ｂ７：（Ｘ＝任意の抗原遺伝子）  免疫原をコードする遺伝子と免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子の同調的発現を提供するジシストロンワクチン構築物の１例として、Ｂリンパ腫細胞系ＣＨ１（ＡＴＣＣから入手）からマウスＢ７遺伝子をＰＣＲ増幅した。Ｂ７は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及びIIで抗原による必須同時刺激Ｔ細胞活性化を提供するタンパク質ファミリーの１員である。ＣＨ１細胞は構成的に活性化される表現型をもち、Ｂ７はＢ細胞やマクロファージ等の活性化抗原発現細胞により主に発現されるので、ＣＨ１細胞はＢ７ｍＲＮＡの良好な資源を提供する。これらの細胞を更にｃＡＭＰ又はＩＬ−４でインビトロ刺激し、標準チオシアン酸グアニジニウム手順を使用してｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡを使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）とＢ７翻訳開放読み枠の下流に配置したＢ７に特異的なプライミングオリゴマー（5′-GTA CCT CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3′、配列番号46）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。次のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーそれぞれ5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3′（配列番号47）及び5′-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAG GAA GAC GGT CTG TTC-3′（配列番号48）を使用してＰＣＲによりＢ７を増幅した。これらのオリゴマーはインサートの両端のＢｇｌII制限酵素部位と、ＮｃｏＩ制限部位を含むＫｏｚａｋ翻訳開始配列と、３’末端ＢｇｌII部位の直前に配置された付加的なＮｃｏＩ部位を提供する。ＮｃｏＩで消化し、予めＮｃｏＩで消化しておいたｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳへのクローニングに適したフラグメントを得た。得られたベクターｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ−Ｂ７は、Ｖ１Ｊｎｓ−Ｘ（Ｘは抗原をコードする遺伝子を表す）に容易に移入可能なＩＲＥＳ−Ｂ７カセットを含む。
Ｄ．ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦ：（Ｘ＝任意の抗原遺伝子）  このベクターは、Ｂ７でなく免疫刺激サイトカインＧＭ−ＣＳＦの遺伝子を使用する以外は、上記Ｃに記載したと同様のカセットを含む。ＧＭ−ＣＳＦは、強力なインビボ抗腫瘍Ｔ細胞活性を誘導することが示されているマクロファージ分化及び刺激サイトカインである［Ｇ．Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，３５３９（１９９３）］。
Ｅ．ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−ＩＬ−１２：（Ｘ＝任意の抗原遺伝子）  このベクターは、Ｂ７でなく免疫刺激サイトカインＩＬ−１２の遺伝子を使用する以外は上記Ｃに記載したと同様のカセットを含む。ＩＬ−１２は、免疫応答を体液性応答でなく細胞性のＴ細胞指向経路に向けるのに主要な役割をもつことが実証されている［Ｌ．Ａｌｆｏｎｓｏら，ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，２３５，１９９４］。
Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶxｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖIIIB（ＳＤ）：  このベクターは、実験室株IIIＢに由来するｇｐ１６０ではなく、種々の臨床株に由来するｇｐ１６０遺伝子を使用する以外はＩ．Ｂ．に記載したと同様である。
Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＲ８／３４／ＨＡ−ＩＲＥＳ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇ：  この構築物は、ＩＲＥＳ因子を介する同調的発現のために、ＳＩＶｐ２８ｇａｇ遺伝子と協同してインフルエンザ血球凝集遺伝子（ＨＡ）を提供する。次のセンス及びアンチセンスオリゴマーそれぞれ5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG AAG GCA AAC CTA CTG GTC CTG-3′（配列番号49）及び5′-CCA CAT AGA TCT GAT ATC CTA ATC TCA GAT GCA TAT TCT GCA CTG C-3′（配列番号50）を使用して、ＰＣＲによりＰＲ８／３４／ＨＡ遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡセグメントは各末端にＢｇｌII制限酵素部位をもち、３’末端にＥｃｏＲＶ部位をもつ。ＢｇｌII消化後、予めＢｇｌIIで消化した後にアルカリホスファターゼで処理しておいたＶ１Ｊｎｓにこの遺伝子をクローニングした。Ｖ１Ｊ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇからＮｃｏＩ及びＢｇｌII消化によりＳＩＶｐ２８ｇａｇを切り出した。ｐＧＥＭ−ＩＲＥＳをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐ２８ｇａｇ／ＮｃｏＩ／ＢｇｌIIと指向的に連結した。ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIIで制限消化してＩＲＥＳ−ｐ２８ｇａｇカセットを除去し、Ｖ１Ｊｎｓ−Ａ／ＰＲ８／ＨＡのＥｃｏＲＶ部位に連結した。これらの遺伝子の同調的インビボ発現は、ＰＮＶワクチン接種（ＨＡ）により強力な抗体応答を生じ、局所環境に必要なヘルパーＴ細胞を提供して第２の遺伝子産物（ＳＩＶｐ２８ｇａｇ）のＣＴＬ応答を助長する。この構築物は更に、ＨＩＶに関連するか否かに拘わらず多重抗原に対する免疫応答を生じるために本発明のＰＮＶ及び方法を使用できることを立証するものである。この型の構築物を他のビ又はトリシストロン構築物と混合して多価コンビネーションポリヌクレオチドワクチンを製造できることは当業者に理解されよう。
Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ＳＩＶｐ２８ｇａｇ：  Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０IIIBをＥｃｏＲＶで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、予めＳｍａＩ及びＨｉｎｄIIで制限酵素消化してｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ−ＳＩＶｐ２８から取出しておいたＩＲＥＳ−ＳＩＶｐ２８ｇａｇと連結した。これらの遺伝子の同調的インビボ発現により、強力なヘルパーＴ細胞応答を発生するタンパク質（ｇｐ１６０）を、クラスＩ  ＭＨＣ関連ＣＴＬエピトープを提供するタンパク質（ＳＩＶｐ２８ｇａｇ）と結合することができる。このワクチンをアカゲザルの免疫に使用し、抗ｅｎｖ中和抗体及びＣＴＬ並びに抗ＳＩＶｇａｇＣＴＬを産生させる。その後、これらのサルを適当なＳＨＩＶウイルスで攻撃する［Ｊ．Ｌｉら，Ｊ．Ａ．Ｉ．Ｄ．Ｓ． ５，６３９−６４６（１９９２）参照］。
Ｉ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０IIIB／ＩＲＥＳ／ＳＩＶｐ２８ｇａｇ：  このベクターは、ｇｐ１６０の代わりにＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０IIIBを使用する以外はＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ＳＩＶｐ２８ｇａｇと全く同様に構築する。上述のようにワクチン接種とＳＨＩＶ攻撃を行う。
Ｊ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０IIIB／ＩＲＥＳ／ＨＩＶｇａｇ／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ：  このベクターは、ｇｐ１２０に加えてトリシストロンによってｇａｇ及びｒｅｖ発現も提供する以外は上記と同様のベクターである。
Ｋ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０IIIB／ＩＲＥＳ／ＨＩＶｇａｇ／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ：このベクターは、ｇｐ１６０に加えてトリシストロンによってｇａｇ及びｒｅｖ発現も提供する以外は上記と同様のベクターである。
実施例６
ＨＩＶ細胞毒性Ｔリンパ球のアッセイ：
本実施例に記載する方法はワクチン接種したマウスに使用する場合のアッセイの例である。本質的に同様のアッセイを霊長類でも使用することができるが、その場合には各動物のターゲット細胞として使用するために自己由来のＢ細胞系を樹立しなければならない。これは、ヒトの場合にはエプスタイン・バールウイルス、アカゲザルの場合にはヘルペスＢウイルスを用いて実施することができる。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心により赤血球を白血球から分離することにより、新たに採取した血液又は脾臓から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る。マウスではリンパ核も使用できる。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）中で６〜１２日間インビトロ培養するか又は同数の照射抗原提供細胞を用いる特異的抗原を使用することにより、ＰＢＭＣからエフェクターＣＴＬを調製することができる。特異的抗原は、使用する動物のＭＨＣハプロタイプのＣＴＬ認識用公知エピトープである合成ペプチド（通常は９〜１５アミノ酸）又は適当な抗原を発現するように遺伝子工学的に調製したワクチニアウイルス構築物から構成され得る。ターゲット細胞は同系でもよいし、ＣＴＬのインビトロ刺激について記載したように適当な抗原を発現するように処理したＭＨＣハプロタイプ適合細胞系でもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、Ｐ１８ペプチド（Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn、配列番号51、ＨＩＶ  ＭＮ株）を１０μＭの濃度で使用して、照射同系脾細胞によりＣＴＬをインビトロ再刺激することができ、細胞毒性アッセイ中にターゲット細胞を感作するためには、アッセイ前約２時間３７℃でインキュベートすることにより１〜１０μＭで使用することができる。これらのＨ−２dＭＨＣハプロタイプマウスでは、マウス肥満細胞腫細胞系Ｐ８１５が良好なターゲット細胞となる。抗原で感作したターゲット細胞にＮａ51ＣｒＯ4を負荷するが、これは、ターゲットを３７℃で１〜２時間インキュベーション（〜５×１０6細胞では０．２ｍＣｉ）後にターゲット細胞を数回洗浄することによりＣＴＬを死滅させると、ターゲット細胞の内部から放出される。ＣＴＬ集団を１００：１、５０：１、２５：１等の種々のエフェクター対ターゲット比でターゲット細胞と混合し、相互にペレット化し、３７℃で４〜６時間インキュベートした後、上清を回収し、次いでγカウンターを用いて放射能の放出を定量する。（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理を用いて得られる）ターゲット細胞からの放出可能な合計カウントから、ターゲット細胞からの同時放出を差し引いた百分率として細胞毒性を計算する。
実施例７
ＨＩＶ特異抗体のアッセイ：
基質抗原として特異的組換えタンパク質又は合成ペプチドを使用して、ＨＩＶに対して産生された抗体を検出すべくＥＬＩＳＡを実施した。振とうプラットフォーム上でＰＢＳ（リン酸緩衝塩類）溶液中濃度２μｇ／ｍｌの組換え抗原を５０μｌ／穴の割合で使用して、９６穴マイクロタイターを４℃で一晩被覆した。抗原は組換えタンパク質（ｇｐ１２０，ｒｅｖ：Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；ｇｐ１６０，ｇｐ４１：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）又は合成ペプチド（IIIＢ等からのウイルス分離体配列に対応するＶ３ペプチド：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；モノクローナル抗体２Ｆ５のｇｐ４１エピトープ）から構成した。プレートを洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で濯いだ後、１時間室温で振とうしながらブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中１％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ練乳溶液）２００μｌ／穴を加えた。免疫前の血清と免疫血清をブロッキング緩衝液で所望の希釈範囲に希釈し、１００μｌ／穴ずつ加えた。プレートを１時間室温で振とう下にインキュベートした後、洗浄用緩衝液で４回洗浄した。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体（抗アカゲザルＩｇ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；抗マウス及び抗ウサギＩｇ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をブロッキング緩衝液で１：２０００に希釈して各サンプルに１００μｌ／穴ずつ加え、１時間室温で振とう下にインキュベートした。プレートを洗浄用緩衝液で４回洗浄した後、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）溶液１００μｌ／穴を加えて展開させた。プレートの４５０ｎｍの吸光度を動的（最初の１０分間の反応）並びに１０及び３０分の終点で読み取った（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
実施例８
ＨＩＶ中和抗体のアッセイ：
ワクチン接種した動物からの血清を使用してＨＩＶ分離体アッセイのインビトロ中和を次のように行った。試験血清及び免疫前の血清を５６℃で使用前６０分間熱不活化した。滴定定量したＨＩＶ−１を試験血清の１：２連続希釈液として加え、６０分間室温でインキュベートした後、９６穴マイクロタイタープレート中の１０5個のＭＴ−４ヒトリンパ球様細胞に加えた。ウイルス／細胞混合物を７日間３７℃でインキュベートし、培養物をテトラゾリウム染料で染色してウイルス性細胞死滅を定量した。ウイルス性細胞死滅の阻止によりウイルスの中和が観察される。
実施例９
ビルレントＨＩＶ−１攻撃によるチンパンジーの防御：
従来の動物ＨＩＶ攻撃モデルは、チンパンジーのみであるとされている。チンパンジーはＨＩＶ関連免疫不全症を発病しないが、ある種のＨＩＶウイルス分離体に感染させることができる。このモデルでこれまでに最も一般に使用されている株はIIIＢ株（ＢＨ１０）であるが、例えばＳＦ２のように他の分離体の攻撃ストックも開発されつつある。本発明者らは、抗ＨＩＶ体液性及び細胞性応答を得るために、本明細書に記載するようなＨＩＶ−１  IIIＢ株から誘導されるＨＩＶｅｎｖ及びｇａｇ−ｐｏｌ構築物（ＨＸＢ２クローン）を用いて、他の非ヒト霊長類でのワクチン接種と同様にチンパンジーにワクチン接種できると予見する。チンパンジーのＢＨ１０攻撃ウイルスは本発明のワクチン接種構築物遺伝子と同様にIIIＢから誘導されるが、このウイルスは単一ではないので、ＨＸＢ２はウイルス接種材料中に存在する少なくとも３種のIIIＢの１種に過ぎない。従って、ＨＸＢ２遺伝子でワクチン接種したサルのIIIＢ攻撃実験は完全に均一ではない。
本実施例ではチンパンジーにポリヌクレオチドＨＩＶ遺伝子ワクチンを各回プラスミド０．１〜３ｍｇの用量で３〜５回ワクチン接種する。ワクチンにより誘導された体液性及びＣＴＬ抗ＨＩＶ応答の特性決定後、使用直前に生理的食塩水で１：２５に希釈したＨＩＶ−１IIIB接種材料を静脈内投与してこれらのサルを１０〜１４０ＣＩＤ50（５０％チンパンジー感染用量）で攻撃する。試験チンパンジーから得たＰＢＭＣからのＤＮＡを使用してＨＩＶ−１ウイルス特異的ＤＮＡ配列を検出することによりチンパンジーの感染をモニターする（詳細については実施例１０参照）。ワクチンによる防御は、完全滅菌免疫（感染後にウイルスを検出できない）から攻撃ストックにより誘導されるウイルス血症の有意減少及び／又は遅延に至るまでの攻撃ウイルスに対する一連の応答として表すことができる。滅菌免疫がワクチン接種に対する最適応答であることは明白であるが、ウイルス血症の減少又は遅延もヒトワクチンにおける免疫不全症の発病に有意に影響し得る。
実施例１０
臨床ＨＩＶ分離体からの遺伝子の分離：
ＣｏｎＡ処理により活性化しておいた感染ＰＢＭＣからＨＩＶウイルス遺伝子をクローニングした。ウイルス遺伝子を獲得するための好適方法は、所望の遺伝子の両側に特定オリゴマーを使用して感染細胞ゲノムからＰＣＲ増幅する方法である。ウイルス遺伝子を獲得する第２の方法は、感染細胞の上清からウイルスＲＮＡを精製し、この材料からＰＣＲによりｃＤＮＡを調製する方法である。この方法は、ｃＤＭＡを調製するために特定プライミングオリゴマーでなくＰＣＲオリゴマーとランダムヘキサマーを使用する点以外は、マウスＢ７遺伝子のクローニングについて上述した方法と極めて類似していた。
プロテイナーゼＫ及びＳＤＳをそれぞれ最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５％まで加えた、ＳＴＥ溶液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解させることにより、感染細胞ペレットからゲノムＤＮＡを精製した。この混合物を一晩５６℃でインキュベートし、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）０．５容量で抽出した。次に最終濃度０．３Ｍまでの酢酸ナトリウムと冷エタノール２容量を加えて水相を沈殿させた。溶液からＤＮＡをペレット化した後、ＤＮＡを０．１×ＴＥ溶液（１×ＴＥ＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。この時点でＳＤＳを０．１％まで加え、２ＵのＲＮＡｓｅＡと共に３０分間３７℃でインキュベートした。この溶液を前記と同様にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した後、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．１×ＴＥに懸濁し、２６０ｎｍでその紫外線吸光度を測定することにより定量した。サンプルをＰＣＲに使用するまで−２０℃で保存した。
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓキットとｇｐ１６０の下記センス及びアンチセンスオリゴマーそれぞれ5′-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3′（配列番号52）及び5′-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3′（配列番号53）を使用する手順によりＰＣＲを実施した。これらのオリゴマーは、得られるＤＮＡフラグメントの３’末端にＳｒｆＩ部位を加える。ＰＣＲにより誘導されたセグメントをＶ１Ｊｎｓ又はＶ１Ｒワクチン接種用ベクターにクローニングし、Ｖ３領域と連結接合部位をＤＮＡ配列決定により確認する。
実施例１１
ワクチン構築物接合部位間の配列：
実施例１０に従って遺伝子をクローニングした。各場合に、コーディング配列の配列を生成するＣＭＶｉｎｔＡプライマー5′-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3′（配列番号54）を使用して、５’プロモーター領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）とクローン化遺伝子の接合配列を配列決定した。この配列はターミネーター／コーディング配列と連続しており、その接合部位も示す。この配列は、非コーディング鎖の配列を生成するＢＧＨプライマー5′-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3′（配列番号55）を使用して生成した。各場合に、上記又は他のＨＩＶ分離体からクローニングし、配列決定した遺伝子の配列をＧＥＮＢＡＮＫからの公知配列と照合した。接合位置を「／」で区切るが、これは配列が不連続という意味ではない。各配列に最初に現れる「ＡＴＧ」がそれぞれのクローン化遺伝子の翻訳開始コドンである。下記各配列は、指定ＨＩＶ遺伝子の完全な使用可能で発現可能なＤＮＡ構築物に相当する。命名法は「ベクター名−ＨＩＶ株−遺伝子」の規則に従う。これらの構築物の各々の生物学的効力は上記実施例と同様に示される。
異なるHIV株及びタンパク質を使用した場合のCMVintAの5′接合部位とHIV遺伝子間及びHIV遺伝子の3′接合部位とBGHターミネーター発現構築物間の配列：
１．Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖIIIＢ：
配列番号５６：
0003967374.tif 000015
（配列はＰＣＲオリゴマー内の５′末端で開始する。完全なｒｅｖ５′末端配列については下記＃７参照。）
配列番号５７：
0003967374.tif 000016
２．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIＢ：
配列番号５８：
0003967374.tif 000017
配列番号５９：
0003967374.tif 000018
３．ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ：［SP6（5′-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3′，配列番号６０：）及びT7（5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′，配列番号６１：）プライマー（Promega Biotech）を使用して配列決定］
配列番号６２：
0003967374.tif 000019
配列番号６３：
0003967374.tif 000020
４．ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ／ｒｅｖIIIＢ：［rev3′末端にT7配列決定用プライマー（Promega）、IRES/rev接合部位にIRES 3′-オリゴマー（5′-GG GAC GTG GTT TTC C-3′，配列番号６４）を使用して配列決定］
配列番号６５：
0003967374.tif 000021
配列番号６６：
0003967374.tif 000022
５．ｐＧＥＭ−３−ＲＲＥ／ＩＲＥＳ／ｒｅｖIIIＢ：［SP6配列決定用オリゴマー（Promega）とIRES 5′-オリゴマー5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′，配列番号６７を使用］
配列番号６８：
0003967374.tif 000023
配列番号６９：
0003967374.tif 000024
６．Ｖ１Ｊｎｓ−（ｔａｔ／ｒｅｖＳＤ）：［V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)及びV1Jns-gp160IIIB(SD)に使用；CMVintA内のgp160の5′未満に向かってgp160と相補的なオリゴマー5-CCA TCT CCA CAA GTG CTG-3′，配列番号：７０を使用して配列決定］
配列番号７１：
0003967374.tif 000025
７．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０IIIＢ／ＩＲＥＳ／ｒｅｖIIIＢ（ＳＤ）：［gp160/IRES接合部はIRES 5′-オリゴマー，5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′，配列番号７２を用いて配列決定］配列番号７３：
0003967374.tif 000026
配列番号７４：
0003967374.tif 000027
８．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇａｇ−ｐｒｔIIIＢ（ＳＤ）：
配列番号７５：
0003967374.tif 000028
配列番号７６：
0003967374.tif 000029
９．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇａｇ−ｐｒｔIIIＢ：
配列番号７７：
0003967374.tif 000030
配列番号７８：
0003967374.tif 000031
１０．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ：
配列番号７９：
0003967374.tif 000032
１１．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０MN：
配列番号８０：
0003967374.tif 000033
配列番号８１：
0003967374.tif 000034
１２．Ｖ１Ｊ−ＳＩＶMAC251ｐ２８ｇａｇ
配列番号８２：
0003967374.tif 000035
配列番号８３：
0003967374.tif 000036
１３．Ｖ１Ｊ−ＳＩＶMAC251ｎｅｆ
配列番号８４：
0003967374.tif 000037
配列番号８５：
0003967374.tif 000038
１４．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖ：
配列番号８６：
0003967374.tif 000039
配列番号８７：
0003967374.tif 000040
実施例１２
Ｔ細胞増殖アッセイ：
ＰＢＭＣは上記実施例６に記載したように獲得し、ＰＢＭＣ集団内の増殖により特異抗原に対する誘導応答を試験することができる。回収に先立つ１８〜２４時間のインキュベーションの間に細胞培養物に3Ｈ−チミジンを加えて、増殖をモニターする。増殖が生じた場合には細胞ハーベスターのフィルターに同位体を含むＤＮＡが残るが、休止細胞は同位体を含まないので遊離形態でフィルター上に保持されない。齧歯動物又は霊長類のいずれかで４×１０5個の細胞を９６穴マイクロタイタープレート中の合計２００μｌの完全培地（ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清）に接種する。バックグラウンド増殖応答はＰＢＭＣ及び培地単独を使用して決定し、非特異的応答は、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等のレクチンを１〜５μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照として使用することにより生じる。特異抗原は公知ペプチドエピトープ、精製タンパク質又は不活化ウイルスから構成される。抗原濃度はペプチドで１〜１０μＭ、タンパク質で１〜１０μｇ／ｍｌである。レクチンにより誘導される増殖は３〜５日間の細胞培養インキュベーションでピークに達し、抗原特異的応答は５〜７日がピークである。特異的増殖が発生するのは、培地バックグラウンドの少なくとも３倍の放射能カウントが得られるときであり、多くの場合にはバックグラウンドに対する比即ち刺激指数（ＳＩ）として与えられる。ＨＩＶｇｐ１６０はｇｐ１６０／ｇｐ１２０で免疫するか又はＨＩＶに感染した個体のＴ細胞増殖を生じるとして知られている数種のペプチドを含むことが知られている。これらのうちで最も一般に使用されているのは、Ｔ１（Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala、配列番号88）、Ｔ２（His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys、配列番号89）、及びＴＨ４（Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Aal Tyr Arg Ala Ile Arg、配列番号90）である。これらのペプチドは抗原で感作したマウス、非ヒト霊長類及びヒトからのＰＢＭＣの増殖を刺激することが実証されている。
参考文献：
Ｌ．Ａｒｔｈｕｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，５０４６（１９８９）［チンパンジー／ＨＩＶ攻撃モデル／ウイルス中和アッセイ］。
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃ．ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂ．ｍａｎｕａｌ，ｐ．２８０  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，ＣＳＨ，ＮＹ（１９８２）［ゲノムＤＮＡ精製］。
Ｅ．Ｅｍｉｎｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，３６７４（１９９０）［チンパンジー攻撃、中和アッセイ］。
実施例１３
ベクターＶ１Ｒ調製
本発明の基本ワクチン接種ベクターを引き続き最適化しようとし、本発明者らがＶ１Ｒと命名するＶ１Ｊｎｓの誘導体を調製した。このベクター構築の目的は最小寸法のワクチンベクター、即ちＶ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓから得られる最適化異種遺伝子発現特性及び高プラスミド収率を完全に維持しながら、不要なＤＮＡ配列を含まないベクターを得ることであった。本発明者らは文献と実験に基づき、（１）細菌からのプラスミド収率を悪化せずに大腸菌複製起点を含むｐＵＣバックボーン内の領域を除去することができ、（２）細菌ターミネーターを挿入して代替させれば、カナマイシン開放読み枠に続くｋａｎr遺伝子の３’領域を除去することができ、（３）その調節機能を悪化せずに（ＢＧＨ因子内の元のＫｐｎＩ制限酵素部位に続く）ＢＧＨターミネーターの３’側半分から〜３００ｂｐを除去することができると結論した。
ＰＣＲを使用してそれぞれＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＧＨターミネーター、複製起点及びカナマイシン耐性因子に相当するＶ１Ｊｎｓからの３つのＤＮＡセグメントを合成することによりＶ１Ｒを構築した。ＰＣＲオリゴマーを使用して各セグメントに固有の制限酵素を各セグメントに加え、即ちＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨにはＳｓｐＩとＸｈｏＩ、ｋａｎr遺伝子にはＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ、ｏｒｉrにはＢｃｌＩとＳａｌＩを加えた。これらの酵素部位を選択したのは、ＰＣＲにより誘導されるＤＮＡセグメントの各々を指向的に連結すれば各部位が失われるためであり、ＥｃｏＲＶとＳｓｐＩは連結に適合可能な平滑末端化ＤＮＡを残し、ＢａｍＨＩとＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩと同様に相補的突出部を残す。ＰＣＲによりこれらのセグメントを得た後に、各セグメントを上記適当な制限酵素で消化し、次いで全３種のＤＮＡセグメントを含む単一反応混合物として相互に連結する。ｏｒｉrの５’末端は、この領域に通常存在するＴ２ρ非依存性ターミネーター配列を含むようにしたので、カナマイシン耐性遺伝子に終結情報を提供することができた。連結産物を制限酵素消化（＞８種の酵素）と連結接合部位のＤＮＡ配列決定により確認した。Ｖ１Ｒ内でウイルス遺伝子を使用するＤＮＡプラスミド収率と異種発現はＶ１Ｊｎｓと同様であると思われる。達せられたベクター寸法の正味減少は１３４６ｂｐであった（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２ｋｂ）。図１１、配列番号45参照。
Ｖ１Ｒを合成するために使用したＰＣＲオリゴマーを以下に示す（制限酵素部位を下線で示し、配列の後の大括弧内に明記する）。
（1）5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3′［SspI］（配列番号91）
（2）5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3′［Xhol］（配列番号92）
（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨセグメント用）。
（3）5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3′［EcoRV］（配列番号93）
（4）5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3′［BamHI］（配列番号94）
（カナマイシン耐性遺伝子セグメント用）。
（5）5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3′［BclI］（配列番号95）
（6）5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3′［SalI］（配列番号96）
（大腸菌複製起点用）。
Ｖ１Ｒの連結接合部位は下記オリゴマーを使用して配列決定した。
5′-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3′（配列番号97）［ＣＭＶｉｎｔＡ／ｋａｎr接合部位］
5′-CAA TAG CAG GCA TGC-3′（配列番号98）［ＢＧＨ／ｏｒｉ接合部位］
5′-G CAA GCA GCA GAT TAC-3′（配列番号99）［ｏｒｉ／ｋａｎr接合部位］。
実施例１４
ＰＮＶ開発に最も重要であると思われるＨＩＶ遺伝子はｅｎｖとｇａｇである。ｅｎｖとｇａｇはいずれもウイルス又は異種発現のためにＨＩＶ調節タンパク質ｒｅｖが必要である。これらの遺伝子産物の有効な発現はＰＮＶ機能に不可欠であるので、ｒｅｖ依存性とｒｅｖ非依存性の２種類のベクターをワクチン接種の目的で試験した。特に指定しない限り、全遺伝子はＨＩＶ−１（IIIＢ）実験室分離体から得た。
Ａ．ｅｎｖ：  使用する遺伝子セグメントの大きさに依存して、ｅｎｖの天然リーダーペプチドを組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）遺伝子からのリーダーペプチドで置換え、ＣＭＶイントロンＡと共にＣＭＶプロモーターの後にキメラ遺伝子を発現させることにより、種々の効率のｒｅｖ非依存性ｅｎｖｙ発現に達することができる。このように構築され、ワクチン接種したマウス及びサルで抗ｇｐ１２０免疫応答を生じるように機能する分泌ｇｐ１２０ベクターの１例がＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０である。
公開文献によると、膜に結合したタンパク質は分泌タンパク質よりも実質的な抗体応答を誘導するらしい。膜結合タンパク質は付加的免疫エピトープに対する抗体応答も誘導するらしい。この仮説を試験するために、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０とＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖを調製した。ｔＰＡ−ｇｐ１６０ベクターは、インビトロトランスフェクトしたＲＤ細胞のイムノブロット分析によると、ｒｅｖを加えずに検出可能な量のｇｐ１６０とｇｐ１２０を産生したが、発現レベルはｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミドであるｒｅｖ／ｅｎｖで得られるよりも著しく低かった。これは、阻害領域の存在がｇｐ４１のＣＯＯＨ末端を含むｇｐ１６０内の多重部位でｇｐ１６０転写産物にｒｅｖ依存性を付与するためであると思われる。
これらの阻害配列を除去してｅｎｖの全体的発現を増加するように構成した截頭形のｔＰＡ−ｇｐ１６０、ｔＰＡ−ｇｐ１４３及びｔＰＡ−ｇｐ１５０を含むベクターを調製した。截頭ｇｐ１６０ベクターは、細胞表面よりもリソソームに膜タンパク質を向けることが知られているペプチドモチーフ（例えばＬｅｕ−Ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域を欠失する。従って、ｇｐ１４３及びｇｐ１５０はＤＮＡワクチン接種後にこれらのタンパク質が抗ｇｐ１６０抗体を良好に誘導することができる完全長ｇｐ１６０に比較して、細胞表面へのタンパク質の輸送を増加すると予想することができる。
トランスフェクト細胞におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０発現の定量的ＥＬＩＳＡを実施し、これらのベクター及びｔＰＡ−ｇｐ１６０とｒｅｖ／ｅｎｖの特徴を兼備する付加的ベクター（ベクターｒｅｖ／ｔＰＡ−ｇｐ１６０）の相対発現能を調べた。２９３個の細胞をインビボトランスフェクション後に細胞に結合したｇｐ１２０と分泌／放出ｇｐ１２０を定量した処、以下の結果を得た。
（１）ｒｅｖ／ｅｎｖとｒｅｖ／ｔＰＡ−ｇｐ１６０の類似プラスミド対では、ｇｐ１６０の天然リーダーペプチドをｔＰＡリーダー配列で置換してもｇｐ１６０の合計発現又はｇｐ１２０の放出量は増加しなかった。これは、リーダーペプチドがこれらの細胞で細胞表面へのｇｐ１６０の無効な輸送に関与しないことを示唆している。
（２）ｔＰＡ−ｇｐ１６０はｒｅｖ／ｅｎｖの５〜１０分の１しかｇｐ１６０を発現せず、細胞内に保持される量と細胞表面に輸送される量の比率は同様である。
（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３は細胞結合ｇｐ１４３レベルが極めて低いｒｅｖ／ｅｎｖに比較して３〜６倍のｇｐ１２０を分泌したので、ｇｐ１６０の細胞質尾部はこの配列の部分的欠失により克服され得るｇｐ１６０の細胞内保持をもたらすことが確認される。
（４）ｔＰＡ−ｇｐ１５０は細胞及び培地の両者で低レベルのｇｐ１６０しか発現せず、この構築物の問題即ち截頭タンパク質の固有の不安定性が判明した。
一次ＨＩＶ分離体（北米共通Ｖ３ペプチドループを含む；マクロファージ向性及び非シンシチア誘導表現型）から得たｔＰＡ−ｇｐ１２０はトランスフェクトした２９３個の細胞でｇｐ１２０の高い発現／分泌を与えたので、機能的形態にクローニングされたことが実証された。
実施例１５
血清学的アッセイ
Ａ．抗体応答：
１．ｇｐ１２０ＰＮＶ
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０（１００、１０、１μｇ：３×）を使用してマウスでＩＤ及びＩＭワクチン接種実験を行った。初回後はＩＤワクチン接種は低用量のほうが優れていると思われたが、３回接種後は全用量とも等価であった。
アカゲザル（ＲＨＭ）及びミドリザル（ＡＧＭ）にＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０（ＭＮ）ＰＮＶをワクチン接種した。ｇｐ１２０抗体のピークＧＭＴはこれらの２種の霊長類種で１７８０（ＡＧＭ）と３１０（ＲＨＭ）であり、５倍以上の差があった。これらの結果は、ＲＨＭよりもＡＧＭのほうが実質的に高い抗体力価を誘導できることを示すと共に、ＡＧＭワクチン接種のほうが高いＨＩＶ中和力価が得られることを示唆している。
２．ｇｐ１６０ＰＮＶ：  マウスにＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖをワクチン接種（ＩＭ）したが、３回の注射までｇｐ１６０に対する抗体は産生されず、他方、ＩＤワクチン接種では１回後に応答が生じ、実験全体を通してＩＭにより生じるよりも高い応答が維持された（ＧＭＴ＝２１１５（ＩＤ）及び９５（ＩＭ）；２００μｇ／マウス）。これは、ｒｅｖ依存性構築物がＩＤ経路のほうが免疫原として良好に機能できることを示唆している。
Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖをＩＤ又はＩＭ接種したＲＨＭは４〜５回接種（２ｍｇ／回）後にそれぞれピークＧＭＴ＝７９０及び１４０を示した。これらの結果はマウスで検出された結果に一致し、このｒｅｖ依存性ＰＮＶはＩＤワクチン接種のほうが高い抗体産生効力をもつが、ｒｅｖ非依存性構築物Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ではそうでなかったことと示す。ｔＰＡ−ｇｐ１６０ＤＮＡを接種（ＩＭ）したＲＨＭはｒｅｖ／ｅｎｖを接種したＲＨＭよりも低レベルでばらつきのある応答を示し、このベクターがｒｅｖ／ｅｎｖの４〜７分の１しかｇｐ１６０を発現しないという本発明者らの結論が裏付けられる。
Ｂ．インビトロウイルス中和
ウイルス源としてＨＩＶ（ＭＮ）を使用する感染性低下中和アッセイ（ｐ２４ｇａｇ産生読み取り）をＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＱＢＩ）で実施した。低ウイルス量（１００ＴＣＩＤ50）では全３種の抗血清で１／１０希釈度の血清で完全な中和が見られ、対応する採血前の血清に比較して１／８０希釈度までの全サンプルで少なくとも８０〜９０％のウイルス産生低下が観察された。他方、ウイルス量が高いと（１０００ＴＣＩＤ50）、どのサンプルでも中和は観察されなかった。
ｔＰＡ−ｇｐ１２０（IIIＢ）ＤＮＡをワクチン接種後に１００ＴＣＩＤ50のウイルス量を使用してＲＨＭのＨＩＶ（IIIＢ）中和を試験した（ＱＢＩ）。２回の異なる実験で１０倍の血清希釈度で最良の結果が得られ（ｐ２４ｇａｇが４０〜９９％減少）、サンプルによっては８０倍といった高い希釈度でもｇａｇ減少が観察された。このアッセイで最も安定したサンプルは少なくとも２０００〜３０００の抗ｇｐ１２０抗体ＥＬＩＳＡ終点力価をもっていた。
ｒｅｖ／ｅｎｖＤＮＡをワクチン接種後に同様にＲＨＭのＨＩＶ（IIIＢ）中和を試験した（ＱＢＩ）。全般に低レベルの中和が観察され、３匹のＲＨＭのうち２匹は１０倍の血清希釈度で８４％までの中和を示し、更に２０又は４０倍に希釈するとｐ２４ｇａｇの減少が観察されたが、１匹のサンプルは中和の徴候を示さなかった。これらのサンプルは７００〜８００の抗ｇｐ１２０抗体ＥＬＩＳＡ力価をもち、従って、これが中和アッセイにおけるｇｐ１６０ＤＮＡワクチン実験から得られる血清を試験するための最小の有用な力価範囲であると判断される。
Ｃ．免疫増強促進剤
ワクチン接種後にＤＮＡ取り込みを増強し、マウス又はサルワクチンでリポーター遺伝子発現又は免疫応答を増加することが報告されているプラスミドＤＮＡ調合物を試験するために数種の実験を行った。高張スクロース（２０〜２５％ｗ／ｖまで）ＤＮＡ溶液は、リポーター遺伝子発現により実証される結果としてより均一なＤＮＡ取り込み分布を与えることが報告されているので、ｒｅｖ／ｇｐ１６０プラスミドをワクチン接種した齧歯動物及び非ヒト霊長類で実質的なｇｐ１６０特異抗体を誘導する実験ではこのような溶液を使用した。麻酔薬であるブピバカイン（０．２５〜０．７５％ｗ／ｖ）も、ＩＭ注射の前処理として又は等張塩類溶液中のＤＮＡと同時注射により使用する場合にマウス及び非ヒト霊長類でＤＮＡワクチンにより誘導される免疫応答を有意に増強することが報告されている。
ブピバカインによる本実施例の初期結果は、０．５％溶液でＩＭ処理により相当の死亡率が生じることを示した。死亡率は溶液の使用容量と、マウスに麻酔下で注射したか否かにより異なった（≧０．１ｍＬ麻酔薬不使用で死亡率は最高であった）。本実施例の実験では０．２５％溶液を使用し、前処理又は同時処理及びｇｐ１２０又はｒｅｖ／ｅｎｖＰＮＶのどちらを使用しても有意死亡率を生じなかった。ブピバカインを３回のワクチン接種の前処理として使用した予備実験では対照マウスに比較して免疫応答の増強を示さず、前処理又は同時処理としてＩＤ及びＩＭの両部位を使用する大規模実験では１回の注射後に抗体レベルの増加を示さず、群によっては抗体応答が低下することが判明した。本試験では３回のワクチン接種とする。
このスクロース調合物実験では、文献に記載されている種々の条件を試験した。０．１ｍｇ／ｍＬのｔＰＡ−ｇｐ１２０プラスミドを含有する塩水又はＰＢＳ溶液中１０、１５、２０及び２５％のスクロース濃度を試験した。２５％スクロース／ＰＢＳ群にはＩＭ  ＤＮＡ／ＰＢＳ注射から１５〜３０分前にこの溶液を投与したが、その他の全サンプルはＩＭ又はＩＤ経路で同時注射として試験した。最初のワクチン接種後の採血から得た血清データは抗体応答の増強を示さなかった。
実施例１６
Ｔリンパ球応答：
Ａ．サイトカイン分泌の増殖
抗原でインビボ特発したＴリンパ球は、特発抗原の外因添加後のインビトロ細胞培養中にサイトカインを増殖及び分泌することができる。応答するＴ細胞は通常はＭＨＣクラスIIに制限されたＣＤ４＋（ヘルパー）表現型をもつ。ヘルパーＴ細胞は抗原による刺激後に該細胞が分泌するサイトカインの型に従って機能的に分類することができ、ＴH１細胞は主にＩＬ−２とｇ−インターフェロンを分泌し、ＴH２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０分泌に結びつけられる。ＴH１リンパ球とサイトカインはＣＴＬ及びＤＴＨ応答を含む細胞性免疫を促進し、ＴH２細胞とサイトカインは体液性免疫のためにＢ細胞活性化を促進する。本発明者らはこれらの応答については、ＨＩＶｔＰＡ−ｇｐ１２０ＰＮＶをワクチン接種後に抗原にｒｇｐ１２０IIIBをインビトロ使用してマウス及び非ヒト霊長類（ＡＧＭ及びＲＨＭ）で既に試験しており、両種のワクチンからのＴ細胞がｇｐ１２０にインビトロ増殖応答を示し、これらの応答がマウスではＴH１に似ており、長期的（＞６カ月）であることを示した。これらの試験を引き続きｒｅｖＰＮＶで行った。
１．マウス試験：  Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ２００μｇを３回又は１回ワクチン接種したマウスの組換えｒｅｖ（ｒ−ｒｅｖ）タンパク質に対するインビトロ増殖を試験した。３回ワクチン接種したマウスは９〜１２の刺激指数（ＳＩ：免疫細胞のうちで免疫抗原をもつものともたないものの増殖比）を示したが、１回接種したマウスはバックグラウンドと同一であった（ＳＩ＝２〜３）。対照マウスを除く全ｒｅｖワクチンからの脾臓Ｔ細胞はｒ−ｒｅｖ抗原（２．４〜２．８ｎｇ／ｍｌ、３回；０．４〜０．７ｎｇ／ｍｌ、１回）に応答してｇ−インターフェロンを分泌したが、培養上清中にＩＬ−４は検出されず（それぞれｇ−インターフェロン及びＩＬ−４の検出感度＝４７ｐｇ／ｍｌ及び１５ｐｇ／ｍｌ）、これらのＴ細胞応答がｇｐ１２０ＤＮＡワクチンで検出したと同様に本来ＴH１に似ていることを示す。サイトカイン分泌はＴ細胞記憶応答を決定するために特異抗原に対する増殖よりも高感度のアッセイであると思われる。ワクチン接種後少なくとも６カ月に試験したマウスでも同様の結果が検出された。ｒｅｖに対する抗体はこの細胞内タンパク質に予想される通り、どのワクチン血清からも検出されなかった。
２．サル試験：  ３匹のＲＨＭはＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖを２回ワクチン接種後にｒ−ｒｅｖに対して強いインビトロＴ細胞増殖（ＳＩ＝９〜３０）を示した。抗ｒｅｖ抗体はどのサルからも検出されなかった。これらの結果は上記マウス／ｒｅｖ実験を裏付け、抗体応答の同時誘導なしにｒｅｖＰＮＶにより強力なＴ細胞応答を誘導できることを確証するものである。
ＲＨＭにｔＰＡ−ｇｐ１２０ＤＮＡをワクチン接種して更に実験した処、（ｉ）１回ワクチン接種後にｒｇｐ１２０に対してインビトロＴ細胞増殖が得られ、（ii）２回目のワクチン接種後に二次応答が誘発され、（iii）これらのワクチンではＳＨＩＶに感染したＲＨＭと同様の増殖が得られた（それぞれＳＩ＝５〜７０及び５〜３５）。
Ｂ．抗ｅｎｖ細胞毒性Ｔリンパ球
ｔＰＡ−ｇｐ１２０（ＩＭ）及びｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ（ＩＤ）ＰＮＶをワクチン接種した４匹のＲＨＭサルのうちの２匹は、１回ワクチン接種から６週間後に同種ターゲット細胞に対して有意ＣＴＬ活性（１０：１Ｅ／Ｔで溶解率＞２０％）を示した。２回目のワクチン接種から２週間後に全４匹のサルは２０：１Ｅ／Ｔで溶解率２０〜３５％の細胞毒性を示した。このアッセイ法における全ＣＴＬ活性はＭＨＣクラスＩに制限され、ＣＤ８＋Ｔ細胞を除去すると、全４匹のサルで細胞毒性は完全に失われた。ＣＴＬ応答は数カ月かかって徐々に衰えたので、後から再ワクチン接種して元のレベル以上まで引き上げた。これらのＣＴＬ活性は、ＲＨＭで観察されるワクチンに誘導される応答のうちで最も強力であると判断された。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：両形態
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
フラグメント型：中間部
配列
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配列番号：2
配列の長さ：35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：両形態
配列の種類：ペプチド
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アンチセンス：NO
フラグメント型：中間部
配列
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配列の型：アミノ酸
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フラグメント型：中間部
配列
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配列番号：4
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フラグメント型：中間部
配列
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配列番号：5
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配列
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配列
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配列番号：7
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
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配列
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配列番号：8
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列番号：42
配列の長さ：42
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：43
配列の長さ：45
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：44
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：45
配列の長さ：42
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：46
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配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：48
配列の長さ：42
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：49
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配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：50
配列の長さ：46
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
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配列
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トポロジー：直鎖状
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フラグメント型：中間部
配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
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アンチセンス：NO
配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
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配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
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配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：57
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配列の型：核酸
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トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：58
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配列の型：核酸
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トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：59
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配列の型：核酸
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トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
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配列
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配列の長さ：19
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
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配列
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配列番号：61
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配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
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アンチセンス：NO
配列
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配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
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配列
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配列番号：63
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配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：65
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：66
配列の長さ：90
配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：67
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配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：68
配列の長さ：87
配列の型：核酸
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配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：69
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配列の型：核酸
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ハイポセティカル配列：NO
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配列
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配列番号：70
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：71
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配列の型：核酸
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トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：72
配列の長さ：16
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：73
配列の長さ：62
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：74
配列の長さ：42
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：75
配列の長さ：42
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：76
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配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：77
配列の長さ：70
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：78
配列の長さ：70
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：79
配列の長さ：118
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：80
配列の長さ：43
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：81
配列の長さ：43
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：82
配列の長さ：80
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：83
配列の長さ：44
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：84
配列の長さ：80
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：85
配列の長さ：85
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000131
配列番号：86
配列の長さ：90
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：87
配列の長さ：41
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000133
配列番号：88
配列の長さ：16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
フラグメント型：中間部
配列
0003967374.tif 000134
配列番号：89
配列の長さ：13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
フラグメント型：中間部
配列
0003967374.tif 000135
配列番号：90
配列の長さ：15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
フラグメント型：中間部
配列
0003967374.tif 000136
配列番号：91
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：92
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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配列番号：93
配列の長さ：38
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000139
配列番号：94
配列の長さ：37
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000140
配列番号：95
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000141
配列番号：96
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000142
配列番号：97
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000143
配列番号：98
配列の長さ：15
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000144
配列番号：99
配列の長さ：16
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
0003967374.tif 000145
配列番号：100
配列の長さ：3547
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：両形態
配列の種類：cDNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
配列
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0003967374.tif 000147
0003967374.tif 000148
【図１】
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【図２】
0003967374.tif 000150
【図３】
0003967374.tif 000151
【図４】
0003967374.tif 000152
【図５Ａ】
0003967374.tif 000153
【図５Ｂ】
0003967374.tif 000154
【図６Ａ】
0003967374.tif 000155
【図６Ｂ】
0003967374.tif 000156
【図６Ｃ】
0003967374.tif 000157
【図６Ｄ】
0003967374.tif 000158
【図６Ｅ】
0003967374.tif 000159
【図７Ａ】
0003967374.tif 000160
【図７Ｂ】
0003967374.tif 000161
【図７Ｃ】
0003967374.tif 000162
【図７Ｄ】
0003967374.tif 000163
【図７Ｅ】
0003967374.tif 000164
【図８Ａ】
0003967374.tif 000165
【図８Ｂ】
0003967374.tif 000166
【図９】
0003967374.tif 000167
【図１０】
0003967374.tif 000168
【図１１Ａ】
0003967374.tif 000169
【図１１Ｂ】
0003967374.tif 000170
【図１１Ｃ】
0003967374.tif 000171
【図１１Ｄ】
0003967374.tif 000172
【図１２】
0003967374.tif 000173
【図１２Ａ】
0003967374.tif 000174
【図１２Ｂ】
0003967374.tif 000175
【図１３】
0003967374.tif 000176
【図１４】
0003967374.tif 000177
【図１５】
0003967374.tif 000178
【図１６】
0003967374.tif 000179