(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のキャピラリーカラムが配列され、複数の試料が１つずつ前記キャピラリーカラムに注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気泳動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、前記マルチキャピラリーアレイ泳動部でキャピラリーに光を照射し、その照射された部分の試料による吸光度や試料からの蛍光を測定する光学的測定部とを備えたマルチキャピラリー電気泳動装置において、
高圧電源により高電圧を印加して前記キャピラリーカラムに試料を導入する際、高電圧のかけ始めでは電圧を連続的に上げ、高電圧のかけ終りでは電圧を連続的に下げるように前記高圧電源を制御する印加電圧制御部を備えたことを特徴とするマルチキャピラリー電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は複数のキャピラリーカラムが配列され、複数の試料が１つずつキャピラリーカラムに注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気泳動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部、及びマルチキャピラリーアレイ泳動部でキャピラリーに光を照射し、その照射された部分の試料による吸光度や試料からの蛍光を測定する光学的測定部を備えたマルチキャピラリー電気泳動装置に関するものである。
このようなマルチキャピラリー電気泳動装置は、タンパク質の分離やＤＮＡの塩基配列決定に用いられている。ＤＮＡの塩基配列決定のためのマルチキャピラリー電気泳動装置では、サンガー反応を用い、プライマー又はターミネータを蛍光物質で標識したＤＮＡフラグメント(断片)試料を電気泳動させ、泳動途中でＤＮＡフラグメント試料からの蛍光を検出して塩基配列を決定する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配列したマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサが提案されている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少なく高感度検出ができるのである。
【０００３】
キャピラリー電気泳動におけるキャピラリーカラムへの試料導入は、圧力を用いる方法や、電圧を印加する電気泳動的方法が行われている。そのうち、電気泳動的に試料を導入する方法は、装置構成の簡便さ、操作の容易さ、パラメータの制御性の良さの点から広く一般的に採用されている。
【０００４】
図１は試料導入時に印加する電圧と時間の一例を表す図である。縦軸は電圧(ｋＶ)を表し、横軸は時間(秒)を表す。
この例では７．６ｋＶの電圧を３０秒間印加している。従来の試料導入時の電圧印加では、電圧のかけ始めは所定の高電圧が数秒以内にかかるようにし、切る際には数秒以内に高電圧を０に落している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリーカラムに高電圧を印加すると、発熱などによりキャピラリーカラム端に位置するゲルに大きなストレスがかかり、キャピラリーカラムへの試料の導入に支障を来し、泳動分離時に分離できる塩基数が制約を受けるなどの悪影響が出るという問題があった。
また、急激に高電圧を印加すると、電気浸透流によりキャピラリーカラム端からゲルがずり出すことがあり、そのずり出したゲルが損傷を受けると泳動分離状態が悪化するという問題もあった。
【０００６】
そこで本発明は、試料導入時におけるキャピラリーカラム端に位置するゲルのストレスを軽減したり、キャピラリーカラム端からのゲルのずり出しを抑制することによって、マルチキャピラリー電気泳動装置における泳動分離能を向上させることを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明のマルチキャピラリー電気泳動装置は、複数のキャピラリーカラムが配列され、複数の試料が１つずつキャピラリーカラムに注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気泳動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、マルチキャピラリーアレイ泳動部でキャピラリーに光を照射し、その照射された部分の試料による吸光度や試料からの蛍光を測定する光学的測定部とを備えたマルチキャピラリー電気泳動装置であって、高圧電源により高電圧を印加してキャピラリーカラムに試料を導入する際、高電圧のかけ始めでは電圧を連続的に上げ、高電圧のかけ終りでは電圧を連続的に下げるように高圧電源を制御する印加電圧制御部を備えたものである。
【０００８】
キャピラリーカラムへの試料注入時には、試料導入用の容器にそれぞれ試料を入れ、容器内の試料にそれぞれのキャピラリーカラムの一端を浸す。容器内の試料とキャピラリーカラムの他端側のバッファ液との間に高圧電源により高電圧を印加して試料を電気泳動的にキャピラリーに注入する。このとき、印加電圧制御部により、かけ始めでは電圧を所定の高電圧まで連続的に上げ、かけ終りでは電圧を所定の高電圧から連続的に下げるように高圧電源を制御する。その結果、急激な熱の発生及び減退を抑制してキャピラリーカラム端に位置するゲルのストレスを軽減することができる。さらに、大きな電気浸透流の発生を抑制し、キャピラリーカラム端からのゲルのずり出しを抑制することができる。
【０００９】
【実施例】
図２は、一実施例を表す概略斜視図である。
一対のリザーバ１１０と１２０にそれぞれバッファ液１１２と１２２が収容されており、両バッファ液中にそれぞれ電極１３０と１３２が設けられている。サンプルプレート１００は絶縁性の材質にてなり、平面状の表面と、それにつながるコネクタ部１０６とを備えている。サンプルプレート１００の表面には複数個のウェル１０２が縦方向と横方向にそれぞれ一定間隔で配列されている。ウェル１０２は底をもつ穴であり、各ウェル１０２にはその底からベースプレート表面を経てコネクタ部１０６に至る個別の電極パターンが形成されている。サンプルプレート１００の各ウェル１０２に試料を入れ、コネクタ部１０６に高圧配線ケーブルを接続する。
【００１０】
リザーバ１１０とサンプルプレート１００とは配線が切り換えられるように高圧切換え部１３６で切換え可能に接続され、高圧電源１３４がその高圧切換え部１３６と他方のリザーバ１２０に設けられた電極１３２との間に接続されている。高圧電源１３４には、試料導入用と泳動用の印加電圧及び時間を制御する印加電圧制御部１３８が接続されている。印加電圧制御部１３８はマイコンなどにより実現される。
【００１１】
試料注入時にはキャピラリーアレイ２の一端部２ａはサンプルプレート１００の各ウェル１０２に一本ずつ挿入され、試料注入後はリザーバ１１０に切り換えられて一端部２ａがバッファ液１１２に浸される。キャピラリーアレイ２の他端部２ｂが他方のリザーバ１２０のバッファ液１２２に浸され、その他端側には吸光度や蛍光により試料を検出する光学的測定部１０から測定光や励起光が照射され、吸光度や蛍光が測定される被検出部２ｃが設けられている。
【００１２】
キャピラリーアレイ２は一端側２ａではサンプルプレート１００のウェル１０２の配列に対応した二次元的な配列を持ち、被検出部２ｃではキャピラリーカラムが一列に配列され、そのキャピラリーカラムの配列面に垂直な方向から測定光や励起光が照射される。
【００１３】
キャピラリーカラムは、石英ガラスやホウケイ酸ガラス(例えばパイレックス)等を材質とするものであり、外形が２００〜３００μｍ、内径が７５〜１００μｍのものである。キャピラリーカラムはその外周をＳｉＯ2など、紫外領域から近赤外領域の励起光によっては蛍光を発生しないか、発生しても蛍光測定の妨げにならない程度である無蛍光材質の被膜により被覆されたものが好ましい。その場合には、被検出部２ｃでも被膜を除去する必要がない。それに対し、キャピラリーカラムが被膜として蛍光を発する樹脂被膜をもったものである場合は、被検出部２ｃではその被膜を除去しておく。キャピラリーアレイ２にはそのようなキャピラリーカラムが複数本配列されている。
【００１４】
キャピラリーカラム内には分離媒体のゲルとして、ポリアクリルアミドゲル、リニアアクリルアミドゲル、ポリエチレンオキサイド(ＰＥＯ)ゲルなどが充填されている。各キャピラリーカラムには末端塩基別に異なる螢光物質ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｒ６Ｇ、Ｒ−１１０などの螢光物質から選ばれた４種類のそれぞれの蛍光物質により標識され、又は２種類以上の蛍光物質を割合を異ならせて４種類に標識された４種類のＤＮＡフラグメントを含む試料がそれぞれ注入され、同時に電気泳動がなされる。
サンプルプレート１００とリザーバ１１０は移動機構(図２では図示略)によっていずれかが選択的にキャピラリー端２ａと接触するように切り換えて配置される。
【００１５】
次に本実施例の動作を説明する。
サンプルプレート１００のウェル１０２にそれぞれ試料をいれる。ウェル１０２には、すでに処理された試料が入れられる場合だけでなく、ウェル１０２を用いてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法により試料を処理した後に、そのウェル１０２内の試料にキャピラリーカラム端を挿入して試料注入を行なうように用いることもできる。ＰＣＲ法はＤＮＡのうちの目的とする一部分のみを大幅に増幅させる方法である。ＰＣＲ法では試料のＤＮＡにプライマーを加え、温度を上げて二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解離させ、次に温度を下げてプライマーをＤＮＡ鎖に結合させ、少し温度を上げてＤＮＡを合成させ、さらに温度を上げて一本鎖にする。このように温度を上下に変化させる操作を繰り返すことにより、ＤＮＡの所定部分を大量に増幅合成する方法である。
【００１６】
ウェル１０２に試料をいれた後、サンプルプレート１００のウェル１０２内の試料にキャピラリーカラム端２ａが１本ずつ浸され、リザーバ１２０のバッファ液１２２にキャピラリーカラム端２ｂがまとめて浸される。そして、高圧切換え部１３６を介して、コネクタ１０６及び電極パターンを介してウェル１０２と高圧電源１３４を接続する。
【００１７】
高電圧電源１３４によりウェル１０２とバッファ液１２２との間に高電圧を印加してキャピラリーカラムに試料を注入する。このとき印加される電圧及び時間は印加電圧制御部１３８により制御される。図３は印加電圧制御部により制御される試料導入時に印加する電圧と時間の一例を表す図である。縦軸は電圧(ｋＶ)を表し、横軸は時間(秒)を表す。
印加電圧制御部１３８により高電圧電源１３４を制御して、試料導入の開始から１５秒後に電圧が７．６ｋＶになるように徐々に電圧を上げる。その後１５秒間は７．６ｋＶの電圧を印加する。さらに１５秒をかけて電圧を７．６ｋＶから０Ｖに落して試料導入時の電圧印加を終了する。ここで印加する電圧と時間の積は、図１に示した印加する電圧と時間の積に相当する。ここで、印加する電圧と時間は試料の種類や装置の種類などにより異なるものであり、この例に限定されるものではない。
【００１８】
このように印加する電圧と時間を制御することにより、キャピラリーカラム中のゲルにおける急激な熱の発生及び減退を抑制することができ、キャピラリーカラム端に位置するゲルのストレスを柔らげることができる。さらに、大きな電気浸透流の発生を抑え、キャピラリーカラム端からゲルがずり出すことを抑制することもできる。さらに、高電圧を急激に印加することにより生じる電流のオーバーシュートを抑制することもできる。
上記のようにしてキャピラリーカラムに試料を導入することにより、泳動分離能を向上させることができ、従来１００ベース(塩基)程度の泳動分離能を２００〜３００ベースに向上させることができた。
【００１９】
試料注入後、移動機構によりサンプルプレート１００とリザーバ１１０を動かすことにより、試料側のキャピラリー端２ａをリザーバ１１０のバッファ液１１２中に浸す。その後、両リザーバ１１０と１２０間に高電圧を印加して電気泳動分離を行なう。泳動用の電源電圧は例えば３０ｋＶで、電流容量は１０〜３０ｍＡである。
【００２０】
移動機構はサンプルプレート１００とリザーバ１１０を水平面内で移動させ、キャピラリー端２ａを垂直方向に移動させるようにするものでもよい。
サンプルプレート１１０のウェルの数はキャピラリーアレイの本数に合わせて任意に設定することができる。
また、リザーバ１１０もサンプルプレート１００のように複数のウェルにバッファ液を収容する形式とし、各ウェルに個別の電極パターンを設けることにより、ウェルごとに独立した電圧を印加できるようして、異なる条件での電気泳動を同時に行なうようにしてもよい。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のマルチキャピラリー電気泳動装置は、高圧電源により高電圧を印加してキャピラリーカラムに試料を導入する際、印加電圧制御部により高圧電源を制御して高電圧のかけ始めでは電圧を連続的に上げ、高電圧のかけ終りでは電圧を連続的に下げるようしたので、急激な熱の発生及び減退を抑制してキャピラリーカラム端に位置するゲルのストレスを軽減することができる。さらに、急激な電気浸透流の発生を抑制し、キャピラリーカラム端からのゲルのずり出しを抑制することもできる。その結果、泳動分離能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来の試料導入時に印加する電圧と時間の一例を表す図であり、縦軸は電圧(ｋＶ)を表し、横軸は時間(秒)を表す。
【図２】  一実施例を表す概略斜視図である。
【図３】  同実施例の印加電圧制御部により制御される試料導入時に印加する電圧と時間の一例を表す図であり、縦軸は電圧(ｋＶ)を表し、横軸は時間(秒)を表す。
【符号の説明】
２      キャピラリーアレイ
１０      光学的測定部
１００      サンプルプレート
１０６      コネクタ部
１０２      ウェル
１３６      高圧切換え部
１３４      高圧電源
１３８      印加電圧制御部
【図１】
0003888788.tif 000002
【図２】
0003888788.tif 000003
【図３】
0003888788.tif 000004