(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にエンドトキシンを含まない可溶性融合タンパク質として精製した、ポリヒスチジンアフィニティタグ配列と配列番号４に示されるクロストリジウム・ボツリヌス毒素配列とを含む、可溶性組換えタンパク質、
但し、前記可溶性組換えタンパク質は配列番号２に示されるクロストリジウムボツリヌスＡ型毒素由来の全長配列を含むものではない。
【請求項２】
配列番号７に示される配列を含むものである、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項３】
ポリヒスチジンアフィニティタグ配列がクロストリジウム・ボツリヌス毒素配列に共有結合している、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項４】
大腸菌から取得された組換え発現タンパク質を含むものである、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項５】
水溶液環境下において可溶性である、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項６】
細菌の細胞質内の溶液中に存在するものである、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項７】
イオン性界面活性剤や変性剤を含まない溶液中に可溶化している、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性組換えタンパク質を含む組成物。
【請求項９】
組換え発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記ベクターが請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性組換えタンパク質をコードする配列を含み、コードされた可溶性組換えタンパク質を宿主細胞中において全細胞タンパク質の0.75％以上のレベルで発現することを特徴とする宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌細胞において、ポリヒスチジンアフィニティタグ配列と配列番号４に示されるクロストリジウム・ボツリヌス毒素配列を融合タンパク質として組換え発現させ、実質的にエンドトキシンを含まない可溶性融合タンパク質として精製し、当該大腸菌細胞より可溶性融合タンパク質を取得する工程を含む、請求項１に記載の可溶性組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は平成７年10月23日に国際出願された特願平8-514127からの分割出願である。親出願は既に特表2002-514886として公表ずみであるので、その全部を参照して本分割出願の開示に含めるものとする。なお、同公表の開示中の比較的関連が薄い部分は、本願の限定された特許請求対象に鑑みこの明細書では記載を省略したが、かかる部分も必要あれば参照できるものとする。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト及びその他の動物のクロストリジウム抗トキシン及びワクチン治療に関する。クロストリジウムトキシンの病理学上の効果を中和する抗トキシンを提供する。クロストリジウム疾患と関連する病的状態及び死亡を防ぐワクチンを提供する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
クロストリジウム属はグラム陽性の嫌気性有芽胞桿菌である。この生物の天然での住処は環境中、及びヒトやその他の動物の消化管である。実際、クロストリジウム菌は至る所におり、土、ほこり、糞尿、海洋沈殿物、腐食する草木、及び泥などによく見られる（例えば、P.H.A．Sneathら，"Clostridium"，Bergey's ManualTM of Systematic Bacteriology，Vol.2，pp.1141-1200，Williams & Wilkins，1986を参照）。クロストリジウム属には約１００種が同定されているが、医学及び獣医学的病原体として重要であると認識されたものは少数である。しかしながら、これらの種はボツリヌス中毒症、破傷風、嫌気性蜂巣炎、ガス壊疽、菌血症、偽膜性大腸炎及びクロストリジウム胃腸炎を含む非常に深刻な病気と関連する。表１に、医学及び獣医学的に重要な種とそれに関連する病気とを列挙する。実際にはこれらの種は全て、一見健康なヒトの糞から単離されたので、これらの単離物のいくつかはコロニー相の永久的にというよりも一過的に住みついたものである。
【０００４】
【表１】
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* P.G. Engelkirkら, "分類", Principles and Practice of Clinical Anaerobic Bacteriology, pp.22-23, Star Publishing Co., Belmont, CA (1992); J. Stephenと R.A. Petrowski, "膜を通過し、細胞を脱制御するトキシン", Bacterial Toxins,第2版, pp.66-67, American Society for Microbiology (1986); R. Berkow と A.J. Fletcher編, "細菌疾患", Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 第16版, pp.116-126, Merck Reseach Laboratories, Rahway, N.J. (1992); O.H. Sigmund と C.M. Fraser編, "クロストリジウム感染", Merck Veterinary Manual, 第5版, pp.396-409, Merck & Co., Rahway, N.J. (1979) から編集。
多くの場合、これらの生物の病原性は強力なエキソトキシン又は非常に破壊的な酵素の放出と関連する。実際、クロストリジウム属のいくつかの種は医学的及び獣医学的に重要なトキシン及びその他の酵素を産生する（C.L．Hatheway，Clin．Microbiol．Rev．3:66-98，1990）。
【０００５】
ヒト及び動物薬における重要性のために、これらのトキシン、特にクロストリジウム・ボツリヌス及びクロストリジウム・ディフィシルについては多くの研究が行われてきた。
【０００６】
クロストリジウム・ボツリヌス クロストリジウム・ボツリヌス（Clostridium botulinum）のいくつかの株はヒト及び動物の健康に重要なトキシンを産生する（C.L．Hatheway，Clin．Microbiol．Rev．3:66-98，1990）。これらのトキシンの影響は腸の破壊を引き起こしうる下痢症状から死を引き起こしうる麻痺効果までと広い。特にクロストリジウム疾患を発生する危険があるのは、新生児及び健康状態の悪いヒト及び動物（例えば、老年又は免疫不全疾患に関連する疾患に苦しむヒト及び動物）である。
【０００７】
クロストリジウム・ボツリヌスは知られているうちで最も毒性の強い生物学的トキシンを産生する。ヒトの致死量は血流中のトキシンがたったの１０-9ｍｇ／ｋｇ体重である。ボツリヌストキシンは筋肉への神経伝達をブロックし、弛緩性麻痺を引き起こす。トキシンが気道や呼吸筋に入ると、死を引き起こしうる呼吸障害を引き起こす（S．Arnon，J．Infect．Dis．154:201-206，1986）。
【０００８】
クロストリジウム・ボツリヌスの胞子はほこりによって運ばれ、また土から取られた野菜、新鮮な果物、及び蜂蜜などの農産物に見られる。この生物に好適な条件下で、胞子は発芽して栄養細胞となり、これがトキシンを産生する（S．Arnon，Ann．Rev．Med．31:541，1980）。
【０００９】
ボツリヌス中毒は血流中へのトキシンの導入の仕方に基づいて４つのタイプに分けられる。食品から生じるボツリヌス中毒は、ボツリヌストキシンを含む、正しく保存されないでかつ十分に加熱されなかった食品を食べることによって発生する。１９７６年から１９８４年の間にアメリカ合衆国では３５５件の食品によるボツリヌス中毒があった（K.L．MacDonaldら，Am．J．Epidemiol．124:794，1986）。クロストリジウム・ボツリヌス中毒による死亡率は１２％であり、特定のリスクグループではもっと高くなる（C.O．Tacketら，Am．J．Med．76:794，1984）。創傷によるボツリヌス中毒は、外傷を受けた組織にクロストリジウム・ボツリヌスが侵入してトキシンを産生し、血流中に吸収されることによって生じる。１９５０年以来、３０件の創傷ボツリヌス中毒が報告されている（M.N．Swartz，"嫌気性胞子形成バチルス：クロストリジウム属"，pp.633-646，B.D．Davisら(編集)，Microbiology，第4版J.B．Lippincott Co.，1990）。トキシンを吸入すると吸入ボツリヌス中毒が起こる。吸入ボツリヌス中毒は実験室で偶発的にさらされることによって生じると報告されており（E．Holzer，Med．Klin．42:1735，1962）、またトキシンが生物戦の兵器として用いられるときに生じ得る（D.R．Franzら，Botulinum and Tetanus Neurotoxins，B.R．DaGupta編集，Plenum Press，New York，1993，pp.473-476）。感染性幼児ボツリヌス中毒は、クロストリジウム・ボツリヌスが幼児の腸にすみつき、トキシンを産生し、これが血流に吸収されることによって生じる。胞子が吸い込まれ発芽することにより細菌が侵入すると思われる（S．Arnon，J．Infect．Dis．154:201，1986）。１９７６年に最初に認識されて以来、５００件が報告されている（M.N．Swartz,前出）。
【００１０】
幼児ボツリヌス中毒は、３週から１１ヶ月齢の幼児に起きる（９０％以上が６ヶ月未満の幼児である）（S．Arnon，J．Infect．Dis．154:201，1986）。幼児は、成人の腸内微生物相が十分に備わっていないために感受性になるのが大きな原因であると考えられている。成人の腸に存在する老成の微生物相がクロストリジウム・ボツリヌスによる定着に好ましくない酸性環境を提供する。幼児は滅菌状態の腸で生まれ、徐々に微生物相が定着する。幼児初期には存在する微生物相が限られているので、腸内環境は酸性ではなく、クロストリジウム・ボツリヌスの胞子が発芽、成長し、トキシンを産生するのを許してしまう。この点において、腸内微生物相を変える抗生物質治療を受けている成人がボツリヌス中毒に感受性となることがある。
【００１１】
感染性ボツリヌス中毒に対する幼児の感受性を説明するもう１つの要因は、幼児の免疫系が未熟なことである。成熟した免疫系は細菌抗原に対して感受性であり、防御的抗体を産生する。成人の腸内で産生される分泌性ＩｇＡは、クロストリジウム・ボツリヌスの栄養細胞を凝集する能力を有する（S．Arnon，J．Infect．Dis．154:201，1986）。分泌性ＩｇＡは腸内細菌及びその産物が腸内の細胞を横切るのを防ぐことによっても作用する（S．Arnon，Epidemiol．Rev．3:45，1981）。幼児の免疫系はこれを行うように初回免疫を受けていない。
【００１２】
幼児ボツリヌス中毒の臨床症状は軽い麻痺から、入院を要する中程度及び重い麻痺、さらには突然死に至る劇症麻痺まで様々である（S．Arnon，Epidemiol．Rev．3:45，1981）。
【００１３】
重症の幼児ボツリヌス中毒に対する主な治療は、機械的呼吸器を用いる呼吸補助と同時に下剤、浣腸、及び消化管洗浄を用いるトキシンの除去である。カリフォルニアでは１年間に幼児ボツリヌス中毒で６８人が入院したが、治療に要した費用の合計は４００万ドル以上であった（T.L．FrankovichとS．Arnon，West．J．Med．154:103，1991）。
【００１４】
クロストリジウム・ボツリヌスの種々の株はＡ−Ｇの文字で呼ばれる抗原的に異なるトキシンをそれぞれ産生する。血清型Ａトキシンは食品ボツリヌス中毒の２６％に関与しており；血清型Ｂ、Ｅ及びＦは食品ボツリヌス中毒により低い割合で関与している（H．Sugiyama，Microbiol．Rev．44:419，1980）。創傷ボツリヌス中毒はＡ型又はＢ型トキンンによってのみ引き起こされることが報告されている（H．Sugiyama,前出）。幼児ボツリヌス中毒のほとんど全てのケースがＡ型又はＢ型トキシンを産生する細菌によって引き起こされてきた（例外的に、ニューメキシコでの１件はＦ型トキシンを産生するクロストリジウム・ボツリヌスによるものであり、別の１件はＢ型−Ｆ型ハイブリッドを産生するクロストリジウム・ボツリヌスによって引き起こされた）（S．Arnon，Epidemiol．Rev．3:45，1981）。Ｃ型トキシンは水鳥、ウシ、ウマ及びミンクに影響する。Ｄ型トキシンはウシに影響し、Ｅ型トキシンはヒト及び鳥の両方に影響する。
【００１５】
ウマ血清由来の三価の抗トキシンは、トキシンＡ、Ｂ及びＥ型の治療としてConnaught Industries Ltd．から入手できる。しかしながら、この抗トキシンにはいくつかの欠点がある。第１に、極めて大量の用量を静脈内及び／又は筋肉内に注射しなければならない。第２に、抗トキシンには急性アナフィラキシーなどの深刻な副作用があり、死亡や血清病に至ることがある。最後に、抗トキシンの効果は確実でなく治療費用は高い（C.O．Tacketら，Am．J．Med．76:794，1984）。
【００１６】
抗体分子のＦ（ａｂ’）2部分のみを用いる七価のウマボツリヌス抗トキシンを米国軍が試験した（M．Balady，USAMRDC Newsletter，p.6，1991）。この抗トキシンはこれらの大型動物において精製されていないトキソイドを用いて作製されてものであり、力価は高くない。
【００１７】
幼児ボツリヌス中毒の治療用として免疫したヒト被験者から五価のヒト抗トキシンが回収された。この抗トキシンの供給は限られており、ボツリヌス中毒に襲われた全ての患者の必要を満たすことはできない。さらに、ヒト血清からの回収には、ＨＩＶやその他の深刻なヒト病原体を除くスクリーニングを行わなければならない（P.J．Schwarz and Arnon，Western J．Med．156:197，1992）。
【００１８】
幼児ボツリヌス中毒は幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ、ベッド死としても知られている）のいつくかのケースの死因であることが示唆されている。ＳＩＤＳは突然で予期できず、かつ死後の完全な検査にもかかわらず説明できない幼児の死亡であると公式には認識されている。ＳＩＤＳと幼児ボツリヌス中毒との関連は、ＳＩＤＳの幼児からの剖検で採取された便又は血液試料において、分析したケースの３−４％にクロストリジウム・ボツリヌス及び／又はトキシンが含まれていることが判明したことから問題となった（D.R．Petersonら，Rev．Infect．Dis．1:630，1979）。これとは対照的に、健康な幼児では１６０人中に１人だけ（０．６％）便の中にクロストリジウム・ボツリヌスが見られ、ボツリヌストキシンは全く見られなかった（S．Arnonら，Lancet，pp.1273-76，June 17，1978）。
【００１９】
先進国では、ＳＩＤＳは１カ月から１歳までの子供の死因の１位を占める（S．Arnonら，Lancet，pp.1273-77，June 17，1978）。生後１４年間のいかなる単独の死因よりも最初の１年間におけるＳＩＤＳで死ぬ子供の方が多い。米国では、毎年８０００−１００００人のＳＩＤＳによる犠牲者がいる（同上）。
【００２０】
危険な副作用がなく、妥当な価格で大量供給でき、しかも幼児への予防投与ができるように安全かつ穏やかに投与しうる幼児ボツリヌス中毒に対する有効な治療が必要とされている。
【００２１】
ボツリヌストキシンに対する免疫を誘導する試みとして、トキシン調製物による被験者の免疫感作が行われてきた。化学的に不活性化した（すなわち、ホルムアルデヒド処理した）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型トキシンを含むクロストリジウム・ボツリヌスワクチンがヒト用に市販されている。しかしながら、このワクチン調製物はいくつかの欠点をもっている。第１に、このワクチンの有効性は様々である（特に、初回接種の後、接種を受けた７８％のみが防御的レベルの抗Ｂ型抗体を生産した）。第２に、免疫感作は苦痛を伴う（投与には深部の皮下接種を必要とする）とともに、一般的に副作用を伴う（初回接種で約６％が中程度から重い局部反応を示し、この数字は追加接種を受けたヒトでは約１１％に上昇した）［五価（ＡＢＣＤＥ）ボツリヌストキソイドのための情報パンフレット、Centers for Disease Control］。第３に、活性トキシンを実験従事者が扱わねばならないので、ワクチン調製は危険である。
【００２２】
クロストリジウム・ボツリヌストキシンにさらされる危険性のあるヒトに投与するための安全かつ有効なワクチン調製物が必要とされている。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
定義 本発明を理解しやすくするために、多くの用語を以下で定義する。
【００２４】
本明細書中で用いる「中和」とは、抗トキシン、特にトキシン（このトキシンに対して抗トキシンが誘導される）の病理学的作用を抑制する能力がある抗体からなる抗トキシンに関して用いられる。
【００２５】
本明細書中で用いる「過剰生産」とは、宿主細胞におけるクロストリジウムトキシンポリペプチドの生産に関して用いられ、宿主細胞がクロストリジウムトキシンポリペプチドをコードする核酸配列を導入されたことによって、該核酸配列が導入されていない宿主細胞から発現されるよりも多くクロストリジウムトキシンを生産することを示す。宿主細胞により生産されたトキシンポリペプチドの精製を容易にするために、宿主細胞は該トキシンポリペプチドを宿主細胞培養物１リットルにつき１mgより多いレベルで該トキシンポリペプチドを発現または過剰生産することが望ましい。
【００２６】
本明細書中で用いる「融合タンパク質」とは、外因性タンパク質断片（無毒性タンパク質からなる融合相手）に結合された対象のタンパク質を含むキメラタンパク質をいう。融合相手は宿主細胞において発現されたクロストリジウムタンパク質の溶解度を高めるものであっても、宿主細胞または培養上清からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティータグを提供するものであっても、その両方であってもよい。所望により、融合タンパク質は当技術分野で知られた種々の酵素的または化学的手段によって免疫感作の前に対象のタンパク質（すなわち、トキシンタンパク質またはその断片）から分離することができる。
【００２７】
本明細書中で用いる「無毒性タンパク質」または「無毒性タンパク質配列」とは、細菌のトキシンタンパク質に由来するものではないタンパク質またはタンパク質配列からなる融合タンパク質の一部を指す。
【００２８】
本明細書中で用いる「対象のタンパク質」とは、その発現が望まれる融合タンパク質内のタンパク質を指す。融合タンパク質において、対象のタンパク質の溶解度を高めかつ／または融合タンパク質の精製を容易にするために、対象のタンパク質は別のタンパク質またはタンパク質ドメイン、つまり融合相手、と結合または融合される。
【００２９】
本明細書中で用いる「マルトース結合タンパク質」とは、大腸菌のマルトース結合タンパク質を指す。マルトース結合タンパク質の一部は融合タンパク質を得るために対象のタンパク質に付加され得る。マルトース結合タンパク質の一部は細菌宿主において発現された融合タンパク質の溶解度を高める一方で、アミロース樹脂上での融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にする。
【００３０】
融合タンパク質に関して本明細書中で用いる「ポリヒスチジン配列」(polyhistidine tract)とは、対象のタンパク質または融合相手のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、または両末端に２〜10個のヒスチジン残基が存在することを意味する。６〜10個の残基のポリヒスチジン配列が好適である。ポリヒスチジン配列は、ニッケルキレートカラムでの融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にする、対象のタンパク質に付加された多数の連続したヒスチジン残基である、と機能的に定義することもできる。
【００３１】
融合タンパク質に関して本明細書中で用いる「チオレドキシンタンパク質」とは、大腸菌のチオレドキシンタンパク質を指す。本発明はチオレドキシンタンパク質の供給源により制限されず、大腸菌のチオレドキシンタンパク質が特に好ましいものの、チオレドキシンタンパク質はいくつかの供給源から得ることができることに留意されたい。チオレドキシンタンパク質の一部は融合タンパク質を得るために対象のタンパク質に付加され得る。チオレドキシンタンパク質の一部は細菌宿主において発現された融合タンパク質の溶解度を上げることができる。
【００３２】
本明細書中で用いる「精製された」または「精製する」とは、サンプルからの汚染物質の除去を意味する。例えば、抗トキシンは混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製される。また、それらはトキシンと結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／またはトキシンと結合しない免疫グロブリンの除去は、サンプル中のトキシン反応性免疫グロブリンの比率を増加させる。抗トキシンの精製は、ポリエチレングリコールを用いて卵からトリ抗トキシンを抽出・精製することを含めて種々の方法により行うことができる。また、抗クロストリジウム抗トキシンの精製は、クロストリジウムトキシンタンパク質の一部を含む樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーにより行うことも可能である。別の例では、組換えトキシンポリペプチドを細菌宿主細胞において発現させ、該トキシンポリペプチドを宿主細胞タンパク質の除去により精製する。これにより、サンプル中の組換えトキシンポリペプチドの比率が増加する。さらに、組換えトキシンポリペプチドはリポ多糖（例：エンドトキシン）のような宿主細胞成分の除去により精製される。
【００３３】
本明細書中で用いる「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的手法により一緒に結合されたＤＮＡのセグメントから成るＤＮＡ分子をいう。
【００３４】
本明細書中で用いる「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子のことである。
【００３５】
本明細書中で用いる「天然のタンパク質」とは、組換え法によるタンパク質の生産とは対照的に天然の供給源から単離されるタンパク質のことである。
【００３６】
本明細書中でタンパク質に関して（「所定のタンパク質の一部」のように）用いる「一部」とは、そのタンパク質の断片を指す。かかる断片は４個のアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス１アミノ酸までの大きさでありうる。
【００３７】
組換えＤＮＡ法により宿主細胞において産生されたタンパク質に関して本明細書中で用いる「可溶性」とは、宿主細胞の細胞質中に溶解状態で存在するタンパク質を指す。このタンパク質がシグナル配列を含むのであれば、可溶性タンパク質は細菌宿主の周辺腔に輸送され、そして分泌能のある真核細胞によりまたは適当な遺伝子（すなわち、kil遺伝子）を保持する細菌宿主により培地中に分泌される。これに対して、不溶性タンパク質は宿主細胞の（封入体と呼ばれる）細胞質顆粒内に変性形態で存在するものである。組換えタンパク質の高レベル発現（すなわち、細菌培養物１リットルあたり組換えタンパク質が10〜20mg以上）は、しばしば細菌宿主細胞の封入体中に発現タンパク質を存在させる。可溶性タンパク質は宿主細胞内の封入体中に存在しないか、または細胞質と封入体の両方に存在する（この場合にはタンパク質が細胞質中に高レベルまたは低レベルで存在しうる）タンパク質である。
【００３８】
可溶性タンパク質（すなわち、宿主細胞において発現されたとき可溶性形態で産生されるタンパク質）と「可溶化」タンパク質とは区別される。封入体中に存在する不溶性の組換えタンパク質は、精製された封入体を塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの変性剤で処理することで可溶化する（すなわち、可溶性形態にする）ことができる。その後、これらの変性剤を可溶化タンパク質調製物から除去し、回収されたタンパク質を復元（再生）させる必要がある。変性剤による可溶化および変性剤の除去後に、すべてのタンパク質が活性型のコンフォメーションに再生されるとは限らない。多くのタンパク質は変性剤の除去の際に沈殿する。ＳＤＳは封入体の可溶化に用いられ、タンパク質を低濃度の溶解状態に維持するだろう。しかし、透析によってＳＤＳがすべて除去されるとは限らない（ＳＤＳは透析で除去されないミセルを形成しうる）。それゆえ、ＳＤＳで可溶化した封入体タンパク質は可溶性であるが、再生されない。
【００３９】
多量のイオン性界面活性剤（例：ＳＤＳ）または変性剤（例：尿素、塩酸グアニジン）を含まない溶液に可溶性である（すなわち、溶解する）タンパク質と、該溶液中に分散された不溶性タンパク質分子の懸濁体として存在するタンパク質とは区別される。可溶性タンパク質は、液体媒質中に存在する細菌を除去するのに十分な条件下での遠心分離（すなわち、5000×g、４〜５分の遠心）により、該タンパク質を含有する溶液から分離されないだろう。例えば、２種類のタンパク質、タンパク質Ａとタンパク質Ｂが溶液中に可溶か不溶かを試験するためには、PBS-NaCl(0.5M NaClを含むPBS)、0.2% Tween 20を含むPBS-NaCl、PBS、0.2% Tween 20を含むPBS、PBS-C(2mM CaCl2を含むPBS)、0.1または0.5% Tween 20を含むPBS-C、0.1または0.5% NP-40を含むPBS-C、0.1または0.5% Triton X-100を含むPBS-C、0.1%デオキシコール酸ナトリウムを含むPBS-Cより成る群から選ばれる溶液中に２種類のタンパク質を入れる。その後、タンパク質ＡおよびＢを含む混合物を5000×gで５分遠心する。続いて、遠心により形成されたペレットと上清にタンパク質ＡおよびＢが存在するかを調べる。タンパク質Ａが上清に存在してペレットに含まれない〔捕捉の結果としての少量（すなわち、10%未満）を除く〕場合、該タンパク質は試験した溶液に可溶性であるといえる。タンパク質Ｂの大部分がペレット中に存在する（すなわち、９０％以上）場合は、タンパク質Ｂは試験した溶液中に懸濁状態で存在しているといえる。
【００４０】
本明細書中で用いる「治療的量」とは、被検者における１以上のクロストリジウムトキシンの病理学的作用を中和するのに必要とされる抗トキシンの量のことである。
【００４１】
抗トキシンの混合物に関して用いるときの「治療用混合物」とは、被検者における１以上のクロストリジウムトキシンの病理学的作用を中和するのに必要とされる量の抗トキシンをいう。
【００４２】
１以上の組換えクロストリジウムトキシン融合タンパク質を含有するワクチンに関して用いるときの「治療用ワクチン」とは、該ワクチンが免疫的に有効な量の融合タンパク質（すなわち、免疫原）を含んでいることを意味する。
【００４３】
本明細書中で用いる「免疫原として有効な量」とは、ワクチンを接種した際に宿主（すなわち、被検者）において防御レベルの抗体の産生を引き出すのに必要な免疫原の量をいう。
【００４４】
本明細書中で用いる「発熱物質」とは、発熱を誘導する物質を指す。発熱物質は宿主に内因性のもの（例：プロスタグランジン）であったり、外因性の化合物（例：細菌のエンドトキシンおよびエキソトキシン、抗原やある種のステロイド化合物のような非細菌性の化合物など）であったりする。医薬用の溶液中の発熱物質の存在は米国薬局方（ＵＳＰ）ウサギ発熱試験を用いて検出できる（米国薬局方第XXII巻(1990)United States Pharmacopeial Convention，Rockville，MD，p．151）。
【００４５】
本明細書中で用いる「エンドトキシン」とは、グラム陰性細菌の外膜と関連した高分子量の複合体を指す。未精製のエンドトキシンは脂質とタンパク質と炭水化物を含んでいる。高度に精製されたエンドトキシンはタンパク質を含まず、リポ多糖（ＬＰＳ）と呼ばれる。未精製のエンドトキシンは医薬用化合物（例えば、組換えＤＮＡ法を用いて大腸菌で産生されるタンパク質）の生産と重要な関係にあるので、ここで用いるエンドトキシンという用語は未精製のエンドトキシンを指す。細菌のエンドトキシンは公知の発熱物質である。
【００４６】
宿主に非経口投与（髄腔内投与を除く）される組成物に関して本明細書中で用いる「エンドトキシンを含まない」とは、送達される用量が５EU/kg(体重)未満を含むことを意味する〔非経口薬剤に関するＦＤＡガイドライン（1987年12月）〕。成人の体重を70kgと仮定すると、非経口投与のＦＤＡガイドラインを満たすためには投薬量が350EU未満を含まねばならない。エンドトキシンのレベルは本明細書ではリムルス・アメーバ様細胞分解産物（ＬＡＬ）試験を用いて測定される（Limulus Amebocyte Lysate PyrochromeTM，Associates of Cape Cod．Inc.，Woods Hole，MA）。組換えタンパク質の調製物中に含まれるエンドトキシンのレベルを測定するには、50mM NaPO4，pH7.0，0.3M NaClおよび10%グリセロール中に精製組換えタンパク質0.5mgを含む溶液0.5mlを用いて、ジアゾカップリング法なしで色素を生じるエンドポイントを製造業者の説明書に従ってＬＡＬアッセイで測定する。精製組換えタンパク質１mgあたり450エンドトキシン単位(EU)以下を含む組成物を本明細書では「実質的にエンドトキシンを含まない」と定義する。一般的に、ワクチン接種の目的で成人に細菌トキシンまたはトキソイドを投与する場合、１回につき約10〜500μgのタンパク質が必要である。したがって、精製組換えタンパク質調製物が450EU/mg(タンパク質)を含むとすると、70kgのヒトに10〜500μgの精製組換えタンパク質を投与することは、結果的に4.5〜225EU（すなわち、１回の非経口投与につき最大許容エンドトキシン量の1.3〜64.5%）ほどを導入することとなる。
【００４７】
ＬＡＬ試験は細菌のエンドトキシン検出法として米国ＦＤＡにより認可されている(21 C.F.R．§§660.100-105)。ＬＡＬ試験はエンドトキシン検出用のＵＳＰウサギ発熱物質試験と同等であるかまたはそれより優れており、かくして動物における発熱物質研究の代替法として使用できることが研究により示された［F.C．Perason，Pyrogens:endotoxins，LAL testing and depyrogenation，Marcel Dekker，New York(1985)，pp.150-155］。用いるＬＡＬアッセイがウサギ発熱物質試験と同程度にまたはそれ以上に感受性であることが明らかであるから、ＦＤＡ生物学局はＵＳＰウサギ発熱物質試験の代わりにＬＡＬアッセイを認可している[Fed．Reg.，38，26130(1980)]。
【００４８】
クロストリジウムワクチンに関して用いるときの「１価」とは、宿主動物（すなわち、被検者）においてただ１つの型のクロストリジウムトキシンに対する免疫応答を誘発することができるワクチンを指す。例えば、C．difficileＡ型トキシンワクチンによる宿主の免疫感作が、免疫した宿主をＡ型トキシンによるチャレンジから防御するがＢ型トキンンによるチャレンジから防御しない抗体を誘導するのであれば、そのＡ型ワクチンは１価であるとされる。これに対して、「多価」ワクチンは数種類（すなわち、１種類より多い）クロストリジウムトキシンに対する免疫応答を宿主動物において引き出す。例えば、C．difficileＡ型およびＢ型トキシンを含むワクチンによる宿主の免疫感作が、Ａ型とＢ型の両トキシンによるチャレンジから宿主を防御する抗体の産生を誘導する場合、そのワクチンは多価であるといえる（特に、この仮想的ワクチンは２価である）。
【００４９】
本明細書中で用いる「凝集する」および「凝集」とは、物質の集合体、群または塊を形成することを意味する。この用語は特定のタイプの集合に限定されるものではない。むしろ、この用語は、多数の物質が一緒に集まって密着するようなあらゆる状況を包含すべく最も広い意味で用いられる。かくして、この用語はあらゆるタイプの凝集（ラテックス凝集、赤血球凝集反応、または凝集させるために免疫学的反応が用いられる他の方法を含むが、これらに限らない）を包含する。この用語はまた非免疫学的方法にも適用され、多数の成分間の非特異的関係をも包含する。要求されることは個々の成分が一緒に集合することだけである。
【００５０】
抗トキシンまたはワクチンを含有する組成物の投与に関して用いるときの「被検者」とは、抗トキシンまたはワクチンが投与される受容動物のことである。被検者は哺乳動物を含めたどのような動物であってもよく、特に該組成物をヒトに投与することが望ましい。
【００５１】
本明細書および請求の範囲中の「サンプル」とは、最も広い意味で用いられる。一方では、それは検体または培養物（例：微生物学的培養物）を含むものである。他方では、それは生物学的サンプルと環境サンプルの両方を含むものである。
【００５２】
生物学的サンプルはヒトを含めた動物、体液、固形物（例：糞便）または組織、ならびに乳製品、野菜、肉および肉加工品、廃物などの液体および固体の食物および食料品でありうる。生物学的サンプルはさまざまな科の家畜、および有蹄動物、クマ、魚類、ウサギ、げっ歯類などの動物を含むがこれらに限らない食用または野生動物のすべてから得ることができる。
【００５３】
環境サンプルは表面物質、土壌、水、産業上のサンプルなどの環境物質、ならびに食品および乳製品の加工器具、装置、設備、用具、使い捨ておよび使い捨てでない物品を含むものである。これらの例は本発明に適用できるサンプルの種類を制限するものと解釈されるべきでない。
【００５４】
本明細書中で用いる「培養」とは、細菌を含むがこれのみに限らない生物のin vivoまたはin vitro成長に関して用いられる。この用語は微生物培養のあらゆる形態を包含するものである。この用語は成長を助ける環境および培地での微生物または他の生細胞の増殖を包含する。かかる培養物は寒天プレート、ブロス、半固形培地を含むがこれらに限らない任意の様式で成長させてよく、また、培養すべき生物に適したどのような環境（すなわち、好気性、嫌気性、微好気性など）で成長させてもよい。
【００５５】
本明細書中で用いる「上清」という用語は液体または流体のあらゆる溶液に対して用いられる。この液体または流体はタンパク質（例：抗体またはトキシン分子）のような可溶性粒子を含んでいてもいなくてもよい。この用語は沈殿した不溶性物質の上にある液体のみならず、微生物または細胞の培養物から回収される液体培地のような液体をも包含する。これはまた、遠心中に溶液中に残存し得る粒子から遠心中に溶液中に残存し得ない不溶性粒子を分離するために遠心されたサンプルの液体部分をも包含する。しかし、この用語は遠心分離を採用する場合に限定されるものではない。
【００５６】
細菌トキシンを含む免疫原で宿主を免疫した際に誘導される抗体のレベルに関して用いるときの「防御レベル」とは、致死量のトキシンによるチャレンジから宿主を防御するのに十分な循環抗体のレベルを意味する。
【００５７】
本明細書中で用いる「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で連結されたアミノ酸からなる化合物をいい、これらの用語は相互交換可能に用いられる。
【００５８】
クロストリジウム属のメンバー（すなわち、種および株）により産生されたトキシンに関して用いられる「毒素（トキシン）」とは、組織に対して有毒なタンパク質のことである。例えば、C．difficileにより産生されるトキシンは腸の組織に有毒であり、C．botulinum（ボツリヌス菌）により産生されるトキシンは神経組織に対して有毒である。
【００５９】
「カプセル化」または「カプセル化する」という用語は、抗トキシンの固体形態（例えば、凍結乾燥形態）の被覆を意味する。被覆は腸溶コーティングまたはカプセルを含みうる。「腸溶コーティング」または「腸溶剤皮」は相互交換可能に用いられ、胃の中のｐＨのような酸性ｐＨに抵抗性の物質または化合物（すなわち、酸抵抗性化合物）を指す。固体に腸溶コーティングをかけると、胃の中での該固体の溶解が防止される。
【００６０】
固体組成物をカプセル化するための標準的な技法は当技術分野で公知である。こうした技法として、腸溶コーティングを固体組成物にかける固体組成物のマイクロカプセル化がある。当技術分野で公知の医薬用懸濁溶液中にマイクロカプセル化粒子を懸濁すると、コーティングした物質を被検者に経口投与することができる。
【００６１】
固体の抗トキシンを腸溶コーティングでカプセル化しようとする場合、固体の抗トキシンに腸溶剤皮を直接かける１工程コーティング法を用いて腸溶コーティングをかけることができる。コーティングされた抗トキシンは腸溶剤皮でオーバーコーティングされたことになる。また、２工程コーティング法を用いることもでき、この場合は、最初に固体の抗トキシンをノン-パリール（non-pariel、すなわち約40〜60メッシュのサイズの砂糖粒子）でオーバーコーティングし、続いて抗トキシンをコーティングしたノン-パリールを腸溶剤皮でオーバーコーティングする。抗トキシンの投与に適した腸溶剤皮としてポリメタクリレート類、例えばEudragit（R） L300 (Rohm Tech, Inc.)がある。
【００６２】
固体の抗トキシンは、所望量の抗トキシンをカプセル内に挿入することにより経口投与用に製剤化することができ、そのカプセルは好ましくは胃の中で溶解に抵抗するが腸の中で溶解する性質をもつだろう。多数の適当なカプセル製剤が当技術分野で入手可能であり、さらに、固体の治療用組成物をカプセルに充填するときの十分なかさ（容積）を得るための不活性充填剤の使用を含めて、カプセル充填のための標準的な技法が利用可能である。マイクロカプセル化抗トキシンおよびカプセル内に保持させた抗トキシンの使用に加えて、固体の抗トキシンは錠剤または丸剤の剤形で経口的に投与することもできる。固体の抗トキシンを不活性物質と混合して、錠剤や丸剤に圧縮するのに十分なかさとする。成型した後、胃の中での溶解を防止しかつ腸の中での溶解を高める腸溶剤皮でその錠剤または丸剤をコーティングする。
【００６３】
「経口投与」という用語は、抗トキシンを含有する組成物のような組成物を口から投与することを意味する。
【００６４】
「非経口投与」という用語は、抗トキシンまたはワクチンを含有する組成物のような組成物を胃腸管経路（例えば、経口投与）または肺経路以外の経路で投与することを意味する。特に、非経口投与は静脈内、皮下、筋肉内または髄内（すなわち、髄腔内）注射により行われる。
【００６５】
本発明は、トキシン（毒素）に由来するポリペプチドの生産に関する。一実施態様において、本発明はポリヒスチジン配列とトキシンの一部とを含んでなる融合タンパク質を提供する。本発明は該トキシンの型または性質により制限されるものではない。例として、クロストリジウム属のメンバーにより産生されるトキシンの一部が、ポリヒスチジン配列を含む融合タンパク質として発現される。
【００６６】
好適な実施態様では、トキシンポリペプチドがクロストリジウム・ボツリヌス(Clostridium botulinum) の神経毒からなる。本発明はワクチンおよび抗トキシン生産用の免疫原としてのC. botulinumトキシン由来のポリペプチドの使用を意図している。C. botulinumのワクチンおよび抗トキシンはヒトや他の動物に用いられる。一実施態様において、本発明は非トキシンタンパク質配列とClostridium botulinumＡ型トキシンの一部を含んでなる融合タンパク質を提供する。好適な実施態様では、C. botulinumＡ型トキシン配列が配列番号２の配列の一部からなる。さらに他の好適な実施態様では、C. botulinumＡ型トキシン配列が配列番号４の配列の一部からなる。本発明は融合タンパク質の性質により制限されるものではない。例えば、融合タンパク質は配列番号４に示したClostridium botulinumＡ型トキシン配列とポリヒスチジン配列とを含んでなる。
【００６７】
また、本発明は組換え発現ベクターを含有する宿主細胞を提供し、ここで該ベクターは非トキシンタンパク質配列および配列番号２のClostridium botulinumＡ型トキシン配列の一部を含んでなる融合タンパク質をコードしている。この実施態様では、宿主細胞はコード化されたClostridium botulinumＡ型トキシンタンパク質を可溶性タンパク質として全細胞タンパク質の0.25〜10％のレベルで、好ましくは全細胞タンパク質の0.75％以上のレベルで発現することができる。本発明は宿主細胞内の組換えベクターにより発現される融合タンパク質の性質により制限されるものではない。例えば、融合タンパク質は配列番号４に示したClostridium botulinumＡ型トキシン配列とポリヒスチジン配列とを含んでなる。
【００６８】
本発明はさらに、配列番号２のClostridium botulinumＡ型トキシン配列に由来するタンパク質をコードしている組換え発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。この実施態様では、宿主細胞はコード化されたClostridium botulinumＡ型トキシンタンパク質を全細胞タンパク質の10〜40％のレベルで、好ましくは全細胞タンパク質の20％以上のレベルで発現することができる。本発明は宿主細胞内の組換えベクターにより発現される融合タンパク質の性質により制限されるものではない。例えば、融合タンパク質は配列番号４に示したClostridium botulinumＡ型トキシン配列とポリヒスチジン配列とを含んでなる。
【００６９】
一実施態様において、本発明は、非トキシンタンパク質配列および配列番号２のClostridium botulinumＡ型トキシン配列の一部を含んでなる精製された可溶性融合タンパク質を得、この精製された融合タンパク質で宿主を免疫して天然のClostridium botulinumＡ型トキシンを中和しうる抗体を産生させることを含んでなる、Clostridium botulinumＡ型トキシンに対する中和抗トキシンの産生方法を提供する。単なる例として、該融合タンパク質は配列番号４に示したClostridium botulinumＡ型トキシン配列の一部とポリヒスチジン配列とを含んでなる。この方法はさらに宿主から抗体を採集する追加の工程を含むことができる。また、採集した抗体を精製することも意図される。本発明は上記の方法により誘導された、組成物としての、抗体を提供する。
【００７０】
さらに、本発明は、Clostridium botulinumＡ型トキシンから誘導された組換え融合タンパク質の精製方法を提供する。この実施態様では、組換え融合タンパク質はポリヒスチジン配列を含み、ポリヒスチジン配列と配列番号２の Clostridium botulinumＡ型トキシン配列の一部を含んでなる融合タンパク質を含有する溶液、および固相支持体に共有結合された２価カチオンを含むクロマトグラフィー樹脂を（任意の順序で）用意する。この実施態様では、融合タンパク質をクロマトグラフィー樹脂に結合させるため、該溶液をクロマトグラフィー樹脂に添加する。この実施態様はさらに、融合タンパク質を結合させたクロマトグラフィー樹脂を洗浄してクロマトグラフィー樹脂から非融合タンパク質を除き、洗浄したクロマトグラフィー樹脂から融合タンパク質を溶出する工程を含みうる。
【００７１】
好適な実施態様において、クロマトグラフィー樹脂は固相支持体に固定化されたニッケルイオンを含むものである。市販されているニッケルイオンカラムの例として、His・BindＲ樹脂 (Novagen)およびNi-NTAアガロース樹脂 (Qiagen) がある。Ni-NTAアガロース樹脂はポリヒスチジン配列を含む結合タンパク質に対して非常に高い親和性を有するので、好ましいクロマトグラフィー樹脂である。
【００７２】
本発明は、ポリヒスチジン配列と配列番号２のClostridium botulinumＡ型トキシン配列の一部を含んでなる融合タンパク質を含有する溶液の性質によって制限されるものではない。一実施態様において、この溶液は組換え融合タンパク質を含む宿主細胞の細胞ペレットから誘導される可溶性の抽出物を含有する。さらに他の実施態様において、この可溶性抽出物を細胞ペレットから生成させるために、細胞ペレットを結合緩衝液中に懸濁し、該懸濁液を破砕して宿主細胞の膜を破壊させることにより可溶性タンパク質と不溶性細胞破片を含む混合物を生成させる。別の実施態様において、Clostridium botulinumＡ型トキシンから誘導される組換え融合タンパク質（ポリヒスチジン配列を含む）の精製方法はさらに、破砕した細胞懸濁液から不溶性の細胞破片を除いて澄明な可溶性溶解物を生成させる追加の工程を含む。さらに別の実施態様において、組換え融合タンパク質の精製方法は澄明な可溶性溶解物への非イオン界面活性剤の添加を伴う。好ましい非イオン界面活性剤はノニデット(Nonidet) P-40である。組換え融合タンパク質の精製方法の他の好適な実施態様は、非イオン界面活性剤を含む澄明な可溶性溶解物をクロマトグラフィー樹脂とともに４℃で１時間以上インキュベートして、融合タンパク質をクロマトグラフィー樹脂に結合させる追加の工程を含む。約３時間のインキュベーション工程が特に好適である。
【００７３】
本発明は、実質的にエンドトキシンを含まないC. botulinum神経毒から誘導されたヒトおよび他の動物のポリペプチドをワクチン接種することを意図している。これらのボツリヌスペプチドは抗トキシンの産生にも有用である。抗ボツリヌストキシン抗トキシンはC. botulinumトキシンの作用による症状を示したまたは該症状を示す危険のある患者を治療するのに有用である。これらの生物、トキシンおよび本発明の個々の工程を以下に別々に記載する。
【００７４】
Ｉ．クロストリジウム種、クロストリジウム疾患および関連トキシン
本発明の好適な実施態様は、クロストリジウム種、それらのトキシン、酵素もしくは他の代謝産物、細胞壁成分、またはこれらの化合物の合成物もしくは組換え体に対する抗体を得ることに向けられる。こうした抗体をヒトまたは他の動物の免疫感作によって作ることが意図される。本発明はいかなる特定のトキシンまたは生物種にも制限されない。一実施態様において、すべてのクロストリジウム種由来のトキシンが免疫原として意図される。こうしたトキシンの例として、C. botulinumのノイラミニダーゼトキシン、C. botulinumのトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの多数のトキシン類がある。以下の表２に数種のクロストリジウム種、それらのトキシン類および疾病と関連した抗原のいくつかを示してある。
【００７５】
【表２】
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一つのトキシンに対して産生された抗体はそのトキシンに対してのみ使用されるものではない。一つのトキシンに対する抗体は、クロストリジウム属の他のメンバーまたは他のトキシン産生生物（例えば、Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcusmutans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa と他のシュードモナス種など）により産生された１以上のトキシンに対して有効な治療薬として使用できると考えられる。これらの膜結合ドメインを合成的に製造して免疫原として使用することが意図される。
【００７６】
II.   非哺乳動物から抗体を得ること
抗体を得るための本発明方法の好適な実施態様は免疫感作を含む。しかし、免疫感作なしで非哺乳動物から抗体を得ることも意図される。免疫感作を行わない場合には、本発明は、トキシンに対する既存の抗体を有する非哺乳動物および投与抗原との反応のおかげで全生物に対する抗体を有する非哺乳動物を使用することができる。後者の例は全生物の構成成分とエピトープを共有する合成ペプチドまたは組換えタンパク質による免疫感作を伴う。
【００７７】
特に好適な実施態様は、分子生物学的手段により産生された細菌のトキシンタンパク質（すなわち、組換えトキシンタンパク質）またはトキシンタンパク質の断片の使用を伴う。
【００７８】
免疫感作を用いる場合、好適な非哺乳動物はトリ綱 (Aves) からのものである。あらゆるトリが意図される（例：アヒル、ダチョウ、エミュー、シチメンチョウなど）。好ましいトリはニワトリである。重要なことだが、ニワトリの抗体は哺乳動物の補体と結合しない [H.N. Benson ら, J. Immunol. 87:616 (1961) 参照] 。したがって、ニワトリの抗体は通常は補体依存的反応を引き起こさないだろう [A.A. Benedict と K. Yamagaによる「トリ種における免疫グロブリンおよび抗体産生」, Comparative Immunology (J.J. Marchaloni 編), pp.335-375, Blackwell, Oxford (1966)]。こうして、本発明の好適な抗トキシンは既知の抗トキシンを用いたときに観察される補体関連副作用を示さないだろう。
【００７９】
トリを用いる場合、抗体はトリの血清または卵から得られると予想される。好適な実施態様では、卵から抗体が採集される。産卵するニワトリは免疫グロブリンを血清濃度またはそれを越える濃度で卵黄（ＩｇＹ）に輸送する [R. Pattersonら, J. Immunol. 89:272 (1962);および S.B. Carroll と B.D. Stollar, J. Biol. Chem. 258:24 (1983) 参照] 。その上、莫大な量で生産された大量の卵黄は、所定の期間にわたってトリから安全に得ることができる血清の量を越えている。最後に、卵から得られる抗体はより純粋で、より均質である。すなわち、（血清と比べて）非免疫グロブリンタンパク質がはるかに少なく、ただ一つのクラスの免疫グロブリンが卵黄に輸送されるだけである。
【００８０】
トキシンによる免疫感作を考慮するとき、毒性を低下させるために該トキシンを修飾することが考えられる。この点に関して、本発明は修飾トキシンを用いた免疫感作により制限されない。未修飾（天然）トキシンも免疫源として意図される。
【００８１】
また、修飾が用いられる場合、本発明はその修飾のタイプにより制限されない。本発明はトキシンの化学的および熱処理を含めてあらゆる種類のトキシン修飾を意図している。しかし、好適な修飾はホルムアルデヒド処理である。
【００８２】
本発明は特定の免疫感作様式に制限されるものではない。本発明は免疫原の経口投与のみならず皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内または脈管内注射を含めてあらゆる免疫感作様式を意図している。
【００８３】
本発明はさらにアジュバントを用いたまたは用いない免疫感作を意図している。（アジュバントは他の抗原とともに投与するとき他の抗原に対する免疫応答を増強することが知られた物質と定義される。）アジュバントを用いる場合、本発明は特定のタイプのアジュバントに制限されず、また、同一のアジュバント（一回使用したもの）をその間ずっと用いるものでもない。本発明は、別個に用いようと組み合わせて用いようと、あらゆるタイプのアジュバントを意図しているが、アジュバントの好適な使用は完全フロイントアジュバントの使用である（あとで時々、不完全フロイントアジュバントを用いる）。アジュバントの他の好適な使用はGerbu アジュバントの使用である。本発明はまたRIBIトリアジュバントとQuil Aアジュバントの使用も考えられる。
【００８４】
免疫感作を用いる場合、本発明には多種多様な免疫感作計画が含まれる。一実施態様では、０日目にニワトリにトキシン（類）を投与し、その後ニワトリは間隔をおいてトキシン（類）を受け取る。本発明は特定の間隔または投与回数により制限されるものではない。同様に、本発明は抗体を採集するための特定の計画に制限されるものではない。好適な採集時期は１００日以後のいつかである。
【００８５】
トリを使用して、抗体の採集を卵から行う場合、抗体の処理を行う前に卵を貯蔵することができる。卵は４℃で１年未満貯蔵することが好ましい。
【００８６】
この方法で産生されたニワトリの抗体を緩衝液で抽出し、分析に使用する。この調製物は未精製のままで該抗体の活性の基準として、その後の操作（例えば、イムノアフィニティー精製）に先立って使用することができる。
【００８７】
III.  抗体の有効性を高めること
精製を行う場合、本発明は非哺乳動物の抗トキシンと哺乳動物の抗トキシンの両方の有効性を高めるように精製することを意図している。とりわけ、本発明はトキシン反応性免疫グロブリンの割合を増加させようとするものである。トリ抗体の好適な精製法はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分離である。
【００８８】
本発明は、簡便で安価な方法を使ってトリ抗体を初めに精製することを意図している。一実施態様において、卵からのニワトリ抗体はＰＥＧを用いた抽出・沈殿により精製される。ＰＥＧ精製は、高濃度のＰＥＧ８０００への脂質（卵黄に豊富に存在する）と卵黄タンパク質の溶解度が異なっていることを利用するものである [Polsonら, Immunol. Comm. 9:495 (1980)]。この手法は迅速、簡便で、比較的安価であり、哺乳動物血清およびウマ抗体の同様の硫酸アンモニウム画分よりも非免疫グロブリンタンパク質による汚染の点で著しく純化された免疫グロブリン画分をもたらす。ＰＥＧの大部分は沈殿したニワトリ免疫グロブリンからエタノール処理により分離される。実際、ＰＥＧ精製抗体は、本発明が中毒したヒトや動物の受動免疫感作においてＰＥＧ精製抗トキシンの使用を考えるほど十分に純粋である。
【００８９】
本発明はさらに、第IV(C) 節で後述するように、抗トキシンの固体形態を腸溶的にコーティングして胃腸管での抗トキシンの残存（すなわち、腸管安定性）を向上させることによって抗トキシンを含有する組成物の有効性を高めることを意図している。
【００９０】
IV.   治療
本発明は、細菌トキシンで中毒を起こしたヒトおよび他の動物の抗トキシンによる治療を意図している。好適な治療法は抗トキシンの経口投与によるものである。別の好適な治療法は抗トキシンの非経口投与によるものである。
【００９１】
Ａ．治療用製剤および組合せ剤
本発明は抗トキシンの治療用組成物を用いることを意図している。抗トキシン組成物は固体または液体形態の抗トキシンを含みうる。
【００９２】
本発明は治療用製剤の特定の性質によって制限されるものではない。例えば、この種の組成物は生理学的に許容される液体、ゲルまたは固体の担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤とともに提供され得る。さらに、抗トキシンは抗生物質を含めた他の治療薬と一緒に用いてもよい。
【００９３】
上述したとおり、これらの治療用製剤は、家畜などの獣医学的使用とヒトへの臨床的使用のために他の治療薬と同様の方法で哺乳動物に投与され得る。一般的に、治療効能にとって必要な投薬量は、各宿主の詳細な要件のみならず使用のタイプと投与方法により変化するだろう。
【００９４】
投与方法に関して、抗トキシンは経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または髄腔内投与のために使用される。かかる投与に適した製剤は滅菌水または生理食塩溶液中に有効量の抗トキシンを含みうる。
【００９５】
一方、製剤は結合剤、充填剤、担体、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、賦形剤、例えば医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの普通に用いられる添加剤を含むことができる。これらの組成物は一般に１〜９５％、好ましくは２〜７０％の有効成分を含有する。
【００９６】
本組成物は好ましくは経口投与用の溶液または懸濁液として調製され、また、投与前に液体中に溶解もしくは懸濁するのに適した固体剤形を含めた固体剤形としても調製され得る。抗トキシンの固体剤形は腸溶コーティングをさらに含んでいてよい。本組成物はまた注射可能な溶液または懸濁液として調製され、さらに、投与前に液体中に溶解もしくは懸濁するのに適した固体剤形としても調製され得る。
【００９７】
本発明の抗トキシンはしばしば生理学的に許容される相溶性の希釈剤または賦形剤と混合される。適当な希釈剤および賦形剤は例えば水、食塩水、栄養処方物（例：Ensure（R）、Enfamil（R）など）、デキストロース、グリセロールなど、およびこれらの組合せである。さらに、所望により、この組成物は湿潤剤、乳化剤、安定剤、ｐＨ緩衝剤といった補助物質を少量含んでいてもよい。
【００９８】
Ｂ．抗トキシンの投与量
通常、ウマのような大型動物から産生される現在入手可能な抗トキシンを投与する場合はバランスをとる必要があることがバックグラウンドからわかる。すなわち、トキシンを中和するのに十分な抗トキシンを投与しなければならないが、望ましくない副作用の危険を増すほど多量の抗トキシンを投与してはならない。こうした副作用は、i）外来（例：ウマ）タンパク質に対する患者の感受性、ii）非免疫グロブリンタンパク質のアナフィラキシー特性または免疫原性、iii）哺乳動物抗体の補体結合特性、および／またはiv）投与された外来タンパク質の全体的な量によって引き起こされる。上記したように、中毒の程度（それゆえ、必要とされる抗トキシン治療のレベル）のおおよその見当がつくにすぎないとき、このバランスをとることは非常に難しいことである。
【００９９】
本発明はこのバランスがもっと容易に達成されるように副作用を著しく低減させることを意図している。本発明による治療はトリから得られたＰＥＧ精製抗トキシンを用いることによって副作用を減らそうとするものである。
【０１００】
一実施態様において、本発明の治療はトリから得られたＰＥＧ精製抗トキシンを使用する。卵黄由来のＰＥＧ精製抗体の抗トキシンとしての使用は、１）非（哺乳動物）補体結合性のトリ抗体、２）それほど不均質でない非免疫グロブリンタンパク質の混合物、および３）現在入手できる抗トキシン中に存在する活性抗体の等量を投与するための総タンパク質のより少ない量、の投与を可能にする。抗トキシンの非哺乳動物源はウマや他の哺乳動物の血清に対して敏感な患者を治療するのに有用である。
【０１０１】
抗トキシンを非経口的に投与しようとする場合、患者への抗トキシンの投与には約１０ｍｌ量の免疫グロブリン（約１ｇ以下の総タンパク質）の初回注射が必要であると予想される。好適な実施態様では、初回注射の少なくとも５０％が免疫グロブリンからなるだろう。また、より精製された免疫グロブリンも治療に使用でき、その場合は初回注射の約９０％が免疫グロブリンからなるだろう。より精製された免疫グロブリン（例：精製ＩｇＹ）を用いる場合、総タンパク質は約１００ｍｇ以下であると予想される。
【０１０２】
抗トキシンを経口的に投与しようとする場合、患者への抗トキシンの投与には約５０ｇの抗トキシン、より好ましくは約４〜５ｇの抗トキシンを含有する治療用組成物を投与することからなる治療法（すなわち、初回および後続の投薬）が必要であると予想される。
【０１０３】
Ｃ．抗トキシンの投与
本発明は、投与経路を限定するものではないが、抗トキシンを非経口または経口投与する細菌性中毒の抗トキシンによる治療法を意図している。
【０１０４】
一実施態様では、抗トキシンを水溶液として被検者に非経口投与する。非経口投与は特定の経路に制限されるものではない。実際、あらゆる非経口投与経路を使用することができる。一実施態様では、非経口投与が筋肉内注射により行われる。別の実施態様では、非経口投与が静脈内注射により行われる。
【０１０５】
一実施態様において、抗トキシンは固体剤形（例：錠剤、カプセル剤）で投与される。別の実施態様では、抗トキシンが水溶液として投与される。水溶液を用いる場合、該溶液は抗体タンパク質を可溶化するのに十分なイオン強度を有するが、経口投与に適するような味にされる。また、デリバリー溶液は緩衝化され（例えば、炭酸塩緩衝液 pH 9.5 ）、これにより胃酸を中和しかつ経口投与された抗体を安定化することができる。一実施態様において、デリバリー溶液は水溶液である。別の実施態様において、デリバリー溶液は栄養処方物である。好ましくは、デリバリー溶液は小児用処方物である。さらに別の実施態様は、酸抵抗性化合物内にカプセル化またはマイクロカプセル化された凍結乾燥抗体の投与を含む。
【０１０６】
医薬化合物に腸溶コーティングを施す方法は当技術分野で公知である [医薬化合物のコーティングを専門に行っている会社を利用できる；例えば、The Coating Place (Verona, WI)および AAI (Wilmington, NC)]。胃液に抵抗性で、その放出（すなわち、コーティングの溶解による医薬化合物の放出）がｐＨ依存的である腸溶コーティングが市販されている [例えば、ポリメタクリレート、Eudragit（R） LおよびEudragit（R）S (Rohm GmbH)] 。Eudragit（R） SはｐＨ７．０からの腸液に可溶で、このコーティングを用いて凍結乾燥抗トキシン抗体をマイクロカプセル化することができ、それらの粒子を経口投与用のｐＨ７．０より高いまたは低いｐＨの溶液に懸濁させる。マイクロカプセルはそれらが腸に達するまで溶解せずに完全なままで存在し、腸において腸ｐＨがそれらを溶解させ、それにより抗トキシンを放出させる。
【０１０７】
本発明は治療用抗トキシンの腸管安定性を高めることに向けられる〔腸管安定性は胃腸管を通過する間の抗トキシンの安定性として定義され、腸管安定性は所望の部位（すなわち、腸）に機能的または活性形態で運搬される経口投与された抗トキシンの量が増えることにより向上する〕。抗体、特にトリ抗体は酸性溶液（例えば、胃液）にさらされたとき著しく変性することが知られている。抗体の変性は機能性の低下（すなわち、特異的ターゲットと結合する能力の低下）にむすびつく。胃腸管のある部分に見られる低ｐＨによる抗体の変性に加えて、酵素による消化のために抗トキシンの加水分解切断が起こりうる。本発明は腸溶コーティングを抗トキシンにかけることにより治療用抗トキシンの腸管安定性を向上させるものである。腸溶コーティングは抗トキシンの酸による変性を防止し、かつ胃腸管の上方部分に存在する酵素と抗トキシンとの接触を防止する。
【０１０８】
酸抵抗性の腸溶コーティングをかけると、模擬胃液へのマイクロカプセル化抗トキシン（例えば、腸溶コーティングを施した抗トキシン）の放出が防止される一方で、模擬腸液への抗トキシンの放出が可能となる。また、治療用抗トキシンの腸管残存は賦形剤（希釈剤としての、または治療用化合物が錠剤の形で提供されるときは形状または稠度を与えるために該化合物に添加されるほぼ不活性の物質）の使用によっても改善されうる。約ｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液や栄養処方物（例：Ensure（R）、Enfamil（R）など）のような賦形剤は、胃のｐＨを上げることによって、または胃の酵素による分解について競合する追加のタンパク質を供給することによって、胃での抗トキシンの変性を間接的に少なくすることができる。これに対して、抗トキシン組成物への腸溶コーティングの使用は、腸溶コーティングを施した粒子が塩基性ｐＨをもつ腸液に達するまで該粒子からの抗トキシンの放出を防止することによって、胃での抗トキシンの変性または消化を直接防止する。腸溶コーティングの使用は本発明の治療用抗トキシンの酸安定性を高めるための特に好適な手段である。
【０１０９】
本発明は急性中毒の治療のために投与され得る治療方法を意図している。一実施態様において、抗トキシンはデリバリー溶液か錠剤のいずれかで、細菌トキシン（抗トキシン生産用の免疫原として使用されたもの）による中毒を起こした被検者に治療的量で経口投与される。
【０１１０】
本発明はまた予防的に投与され得る治療方法を意図している。一実施態様において、抗トキシンは、細菌トキシン（抗トキシン生産用の免疫原として使用されたもの）による被検者の中毒を予防するために、デリバリー溶液にて治療的量で被検者に経口投与される。別の実施態様において、抗トキシンは錠剤のような固体剤形でまたはマイクロカプセル化粒子として経口投与される。広範囲のｐＨ単位で溶解するEudragit（R） (Rohm Tech. Inc.)やポリエチレングリコールなどの化合物を用いる凍結乾燥抗体のマイクロカプセル化は、錠剤の投与に耐えられない患者（例：子供または栄養管をつけた患者）に液体剤形（すなわち、懸濁液の剤形）で固体の抗トキシンを経口投与することを可能にする。好適な実施態様では、凍結乾燥抗体がEudragit（R） L30D (Rohm Tech. Inc.) でコーティングされ、被検者が子供である。別の実施態様では、全細菌に対して誘導された抗体がデリバリー溶液にて治療的量で被検者に経口投与される。
【０１１１】
Ｖ．  クロストリジウム種に対するワクチン
本発明は数種類のクロストリジウム種から動物（特にヒト）を防御するための１価および多価ワクチンの製造を意図している。特に、ヒトにおいてC. botulinumに対する体液性免疫応答の出現を刺激するワクチンは興味がもてる。ワクチン製剤を構成する抗原は、上に列挙したクロストリジウム種由来の天然トキシンタンパク質または組換え的に産生されたトキシンタンパク質でありうる。トキシンタンパク質が免疫原として用いられる場合、一般的にそれらは毒性を低下させるように修飾される。この修飾は化学的または遺伝子的（すなわち、組換えＤＮＡ法）手段により行うことができる。一般的に、宿主細胞での無毒性断片の発現は最終調製物における完全な活性トキシンの存在を排除するので、遺伝子的解毒（すなわち、宿主細胞における無毒性断片の発現）が好適である。しかしながら、化学的修飾が望まれる場合、好適なトキシン修飾はホルムアルデヒド処理である。
【０１１２】
一般的に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化水素などの薬剤を用いた細菌トキシンの化学的解毒は、ワクチンや抗トキシンの生産にとって最適とはいえない。過度の化学的修飾と過少の化学的修飾との間でデリケートなバランスをとる必要がある。処理が不十分であると、ワクチンは残留毒性を保持する。処理があまりに過度であると、ワクチンは天然の免疫原性決定基の破壊のため効力を失う。抗トキシンまたはワクチン製造用にボツリヌストキソイドを用いることのもう一つの主な制限は製造コストが高いことである。こうした理由のために、無毒性でありしかも免疫原性のあるトキシンタンパク質の製造方法の開発が望まれている。
【０１１３】
グラム陰性細菌（例：大腸菌）において産生された組換えクロストリジウムトキシンタンパク質をワクチンとして用いる場合、それらは宿主動物への投与に先立ってエンドトキシンを除くべく精製される。宿主にワクチンを接種するためには、免疫原として有効な量の、実質的にエンドトキシンを含まない、精製された組換えクロストリジウムトキシンタンパク質を、当技術分野で公知の生理学的に許容される多数の担体のいずれかと共に投与する。ワクチン接種の目的で投与する場合、実質的にエンドトキシンを含まない精製された組換えクロストリジウムトキシンタンパク質は単独で、あるいはミョウバンカリウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Gerbu アジュバント (GMDP; C.C. Biotech Corp.) 、RIBIアジュバント (MPL; RIBI Immunochemical Research. Inc.)、QS21 (Cambridge Biotech)を含めた公知のアジュバントとともに使用することができる。ワクチンをヒトに投与するときには、ミョウバンおよびアルミニウムをベースとしたアジュバントが特に好適である。免疫感作の経路は鼻腔内、経口、筋肉内、腹腔内または皮下でありうる。
【０１１４】
VI.   トキシンの検出
本発明はサンプル中の細菌トキシンを検出することを意図するものである。本明細書および請求の範囲にでてくる「サンプル」という用語は最も広い意味で用いられる。その意味は、一方では検体または培養物を含み、他方では生物学的サンプルと環境サンプルを含む。
【０１１５】
生物学的サンプルはヒトを含めた動物、体液、固形物（例：糞便）または組織、ならびに乳製品、野菜、肉および肉加工品、廃物などの液体および固体の食品および成分でありうる。環境サンプルは表面物質、土壌、水、産業上のサンプルなどの環境物質、ならびに食品および乳製品の加工器具、装置、設備、使い捨てできるまたはできない物品を含むものである。これらの例は本発明に適用できるサンプルの種類を制限するものと解釈されるべきでない。
【０１１６】
本発明は、組換えトキシンＡおよびＢタンパク質、組換え細菌トキシンタンパク質に対する抗体を使用する競合イムノアッセイ法により細菌トキシンを検出することを意図している。一定量の組換えトキシンタンパク質を固相支持体（例：マイクロタイタープレート）に固定し、その後細菌トキシンを含む疑いのある生物学的サンプルを添加する。生物学的サンプルは最初にアフィニティー精製されたまたはＰＥＧで分画化された組換えトキシンタンパク質に特異的な抗体と混合する。次いで、固定化トキシンタンパク質に結合した抗体の存在を検出し得るリポーター試薬を添加する。リポーター物質は抗トキシンに対する結合特異性を有する抗体で、該リポーター物質の存在を同定するために用いられる分子が結合されている。トキシンがサンプル中に存在すると、このトキシンは抗組換え抗体との結合に関して固定化組換えトキシンタンパク質と競合し、それによりリポーター試薬の添加後に得られるシグナルが低下する。抗体がサンプルと混合されない対照を使用し、これが最高（または基準）のシグナルを与える。
【０１１７】
本発明はまた、組換え細菌トキシンタンパク質に対する抗体を使用する「サンドイッチ」イムノアッセイ法により細菌トキシンを検出することを意図している。組換え細菌トキシンタンパク質に特異的なアフィニティー精製抗体を固相支持体（例：マイクロタイタープレート）に固定する。その後、細菌トキシンを含む疑いのある生物学的サンプルを添加し、次に洗浄して実質的にすべての未結合抗トキシンを除去する。続いて、生物学的サンプルを抗トキシンに結合するリポーター物質にさらし、その後洗浄して実質的にすべての未結合リポーター物質を除く。リポーター物質は、そのリポーター物質の存在を同定するために用いられる分子に結合された、抗トキシンに対する結合特異性を有する抗体でありうる。生物学的組織中でのリポーター物質の同定が細胞トキシンの存在を示す。
【０１１８】
さらに、細菌トキシンに特異的な固定化抗体に液体（例えば、ヒトや他の動物用の栄養補給物質を含めたスープおよび他の流動食品）を注入することにより細菌トキシンを検出することも意図される。固定化抗体はカートリッジ、カラム、ビーズ、他の固相支持体のような担体中または担体上に存在しうる。一実施態様では、固定化抗体に該液体をさらした後、洗浄により未結合トキシンを実質的に除く。続いて、結合トキシンの存在を検出するリポーター物質にさらす。好適な実施態様では、リポーター物質はトキシンに特異的な抗体に結合された（すなわち、「サンドイッチ」イムノアッセイにおける）酵素、蛍光色素または放射性化合物である。検出系は適宜に発現されるだろう（例えば、酵素系では酵素基質の添加；蛍光色素系では蛍光光線を用いた観察；および放射系では放射能の定量）。
【０１１９】
【実施例】
実施例１〜２  削除
実施例３ メンドリにおけるC．botulinumA型抗トキシンの産生
クロストリジウム疾患の治療に有効なクロストリジウム病原体によって生産されるトキシンに対して抗体が産生されるかを決定するために、C．botulinumＡ型トキシンに対する抗トキシンを作製した。この実施例には、（ａ）トキシンの修飾；（ｂ）免疫感作；（ｃ）抗トキシンの回収；（ｄ）抗原性の評価；及び（ｅ）抗トキシン力価のアッセイを含む。
【０１２０】
ａ）トキシンの修飾 C．botulinumＡ型トキソイドはB．R．DasGuptaから得た。これから活性Ａ型ニューロトキシン（分子量が約１５０ｋＤ）を文献記載の方法に従って９９％純度以上に精製した（B.R．DasGupta & V．Sathyamoorthy，Toxicon，22:415，1984）。このニューロトキシンを文献記載の方法に従ってホルムアルデヒドで脱毒化した（B.R．Singh & DasGupta，Toxicon，27:403，1989）。
【０１２１】
ｂ）免疫感作 免疫感作用C．botulinumトキソイドをＰＢＳに溶解（１ｍｇ／ｍｌ）し、初回免疫用には約等容量のＣＦＡ（GIBCO）で、または追加免疫用にはＩＦＡで乳化した。地方の交配業者から入手した２羽の白色レグホン種のメンドリのそれぞれに、０日目にＣＦＡ１ｍｌ中に乳化した不活化トキソイド１ｍｌを複数部位（筋肉内及び皮下）に注射した。次いで以下の日数とトキソイド量のスケジュールに従い追加免疫感作を行った：１４日及び２１日−０．５ｍｇ；１７１日−０．７５ｍｇ；３９４日、４０１日、４０９日−０．２５ｍｇ。１羽のメンドリには５４４日目に０．１５０ｍｇの追加免疫をさらに行った。
【０１２２】
ｃ）抗トキシンの回収  特表2002-514866実施例１（ｃ）に記載のようにして全卵黄免疫グロブリン（ＩｇＹ）を抽出し、ＩｇＹペレットを元の卵黄量のチメロサール含有ＰＢＳ中に溶解した。
【０１２３】
ｄ）抗原性の評価 トキソイドが抗体産生に十分なほどに抗原性であるかを評価するために、４０９日から４２３日までの卵を回収した。２羽のメンドリからの卵を集めて、標準ＰＥＧプロトコール（特表2002-514866実施例１（ｃ））に記載した方法で抗体を回収した。ボツリヌストキシンの抗原性をウエスタンブロットで評価した。１５０ｋＤの脱毒化Ａ型ニューロトキシンと未修飾の毒性３００ｋＤボツリヌスＡ型複合体（動物の消化管の中和実験で消化管経路に投与したトキシン：実施例６参照）とをＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元ゲルで分離した。ウエスタンブロットはTowbinの方法により行った（H．Towbinら，Proc．Natl．Avad．Sci．USA，76:4350，1979）。
【０１２４】
C．botulinum複合体とトキソイドとの試料１０μｇをＳＤＳ還元試料バッファー（１％ＳＤＳ、０．５％２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８、１０％グリセロール、０．０２５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、１０％β−メルカプトエタノール）に溶解し、９５℃で１０分加熱し、１ｍｍ厚さの５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した（K．WeberとM．Osborn，"タンパク質及びドデシル硫酸ナトリウム:ポリアクリルアミドゲルでの分子量決定及び関連技術"、The Proteins，第3版，H．Neurath & R.L．HIII，編集，pp． 179-223，Academic Press，NY，1975）。ゲルの一部を切り取り、タンパク質をクーマシーブルーで染色した。ゲルに残ったタンパク質をＭｉｌｌｉｂｌｏｔ−ＳＤＥ電気ブロッティングシステム（Millipore）を用いて製造者の指示に従いニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを１０％ポンソーＳで一時的に染色してレーンを可視化し（S.B．CarrollとA．Laughon，"β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の外来セグメントに対するポリクローナル抗体の産生と精製"、DNA Cloning:A Practical Approach，Vol.III，D．Glover編集，pp.89-111，IRLPress，Oxford，1987）、次いでブロット上に蒸留水を数分穏やかに流して脱染色した。ニトロセルロースを３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に４℃で一晩浸けて残っているタンパク質結合部位をブロックした。
【０１２５】
ブロットをストリップ状に切り、各ストリップを適当な一次抗体とインキュベートした。トリ抗C．botulinum抗体（（ｃ）に記載）及び免疫前ニワトリ抗体（対照）を室温で２時間、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＰＢＳに１：１２５で希釈した。ブロットをそれぞれ大量のＰＢＳ、ＢＢＳ−Ｔｗｅｅｎ及びＰＢＳで順次２回洗浄（１０分／洗浄）した。ヤギ抗ニワトリＩｇＧアルカリホスファターゼを結合した二次抗体（Fisher Biotech）を１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳに１：５００で希釈し、室温で２時間ブロットとともにインキュベートした。ブロットをそれぞれ大量のＰＢＳ及びＢＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、次いでＰＢＳ及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５で１回洗浄した。ブロットを新たに調製したアルカリホスファターゼ基質バッファー（５０ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3，ｐＨ９．５中の１００μｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム（Sigma）、５０μｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Sigma）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）中で発色させた。
【０１２６】
ウエスタンブロットを図１に示す。抗C．botulinumＩｇＹはトキソイドと反応して還元ゲル上に約１４５−１５０ｋＤの幅広の免疫反応性バンドを与えた。このトキソイドはホルマリン架橋のために還元剤によるジスルフィド切断に対して抵抗性である。免疫ＩｇＹは活性トキシン複合体である９７ｋＤのC．botulinumＡ型のＨ鎖及び５３ｋＤのＬ鎖と反応した。免疫前ＩｇＹはウエスタンブロットでC．botulinum複合体又はトキソイドと反応しなかった。
【０１２７】
ｅ）抗トキシンの抗体力価 ４０９日から４２３日の間に回収された卵のC．botulinumＡ型トキソイドに対するＩｇＹ抗体の力価を以下の方法によるＥＬＩＳＡで評価した。９６ウエルのFalcon Pro-bindプレートを、０．００５％チメロサール含有ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に２．５μｇ／ｍｌのトキソイド１００μＬ／ウエルを用いて４℃、一晩コーティングした（B.R．Singh & B.R．DasGupta，Toxicon 27:403，1989）。翌日ウエルを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３７℃、１時間ブロックした。免疫卵又は免疫前卵からのＩｇＹを１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で希釈し、プレートを３７℃、１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回、ＰＢＳのみで３回洗浄した。アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Fisher Biotech）を１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中に１：７５０で希釈し、プレートに加えて３７℃、１時間インキュベートした。プレートを上述のように洗浄し、０．０５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3，ｐＨ９．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中にｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma）を１ｍｇ／ｍｌで加えた。
【０１２８】
結果を図２に示す。トキソイドで免疫したニワトリは免疫原に対して高い力価の抗体を産生した。重要なことは、どちらの免疫したメンドリから回収した卵も免疫前の対照卵と比較して、有意な抗免疫原抗体力価をもっていたことである。
【０１２９】
抗C．botulinumＩｇＹは１：９３７５０又はそれ以上の希釈でも有意な活性をもっていた。
【０１３０】
実施例４〜５  削除
実施例６ トリ抗トキシン抗体によるC.botulinum型Ａ型ノイロトキシンのin vivo中和
この実施例は実施例３に記載されたようにして回収されたPEG精製抗トキシンのマウス中でC.botulinumノイロトキシンＡ型の致死効果を中和する能力を実証した。トキシンＡの経口致死量(LD100)を測定するために、BALB/cマウスのグループに単位体重（24グラムの平均体重）当たり異なる用量のトキシンを投与した。経口投与について、トキシンＡ複合体（これはその他の無毒タンパク質と混在したノイロトキシンを含む）を使用した。この複合体は経口経路により投与された時に精製ノイロトキシンよりも著しく毒性である［I.Ohishiら，Infect．Immun.，16:106（1977）］。Eric Johnson（University Of Wisconsin，Madison）から得られたC.botulinum毒素Ａ型複合体は50mMクエン酸ナトリウム、pH5.5中250μg/ml、非経口投与で比毒性3×107マウスLD50/mgであった。約40-50ng/gm体重が通常の食物および水で管理したマウスでは48時間以内に通常致死性であった。マウスにEnfamil(登録商標)のみの随時の食事を与えた時、致死性を生じるのに必要とされた濃度は約2.5倍高かった(125ng/gm体重)。約200ng/gm体重のBotulinal毒素濃度が前免疫IgY(初期の卵黄容積でEnfamil(登録商標)中に再度懸濁された)を含むEnfamil(登録商標)で給餌されたマウスで致死性であった。
【０１３１】
また、C.botulinum毒素の経口LD100を、給餌ニードルを通して経口的に送りこんだ既知量の前免疫IgY-Ensure（登録商標）の混合物を受けたマウス中で測定した。22ゲージ給餌ニードルを使用して、botulinal毒素を投与する１時間前およびその投与の0.5時間後および５時間後に前免疫IgY-Ensure（登録商標）混合物（前免疫IgYを初期の1/4の卵黄容積に溶解した）それぞれ250μlをマウスに投与した。経口投与した毒素濃度は約12〜312ng/gm体重(マウス当たり0.3〜7.5μg)の範囲であった。約40ng/gm体重(マウス当たり１μg)のBotulinal毒素複合体濃度が36時間未満で全てのマウスで致死性であった。
【０１３２】
BALB/cマウスの二つのグループ、グループ当たり10匹に50mMクエン酸ナトリウムpH5.5 100μl中botulinal毒素複合体それぞれ１μgの単一用量をそれぞれ経口投与した。マウスはbotulinal毒素投与の１時間前および0.5時間後、４時間後、および８時間後にEnsure（登録商標）中の前免疫または免疫IgYの混合物（初期の卵黄容積の1/4）250μlの処理を受けた。マウスは２日以上にわたって毎日３回の処理を受けた。マウスを96時間観察した。生存度および死亡率を表11に示す。
【０１３３】
前免疫IgY-Ensure（登録商標）混合物で処理した全てのマウスは毒素投与後46時間以内に死亡した。マウスの平均死亡時間は毒素投与後32時間であった。前免疫IgY-Ensure（登録商標）混合物の処理は、このグループのマウスの口の広範囲の麻痺のために24時間を越えては続かなかった。対照的に、免疫抗botulinal毒素IgY-Ensure（登録商標）混合物で処理した10匹の全てのマウスが96時間経過して生存した。このグループ中の４匹のマウスのみがbotulism毒性の症候を示した（毒素投与の約２日後に２匹のマウスおよび４日後に２匹のマウス）。これらのマウスは最終的に５日後および６日後に死亡した。この免疫グループ中のマウスの６匹が毒素に対し副作用を示さず、長期間生存して残り、健康であった。こうして、トリ抗botulinalトキシン抗体は実験マウスで毒素の致死作用からの非常に良好な保護を示した。
【０１３４】
実施例７〜２１  削除
実施例２２ C.botulinum C断片融合タンパク質の構築と発現
C.botulinumＡ型ニューロトキシン遺伝子はクローン化され、配列が決定されている［Thompsonら，Eur.J.Biochem.,189:73(1990)］。トキシン遺伝子のヌクレオチド配列は登録番号X52066でEMBL/GenBank配列データバンクから入手しうる。コーディング領域のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。C.botulinumＡ型トキシンのアミノ酸配列を配列番号２に示す。Ａ型ニューロトキシン遺伝子は単一のポリペプチド鎖として合成され、ジスルフィド結合でつながれた重鎖と軽鎖からなる二量体を形成するようにプロセスされる。重鎖のカルボキシ末端の５０ｋＤの部分をＣ断片又はＨｃドメインという。
【０１３５】
C.botulinumＡ型トキシンのＣ断片を含むポリペプチドを天然型ポリペプチドとして(例えば融合タンパク質としてではなく)大腸菌で発現させようと、他の人々によって以前に試みられたがうまく行かなかった［H.F.LaPenotiereら，Botulinum and Tetanus Neurotoxins，DasGupta編，Plenum Press．New York(1993)，pp.463-466］。大腸菌のMBPと融合させた形でのＣ断片の発現は不溶性タンパク質の産生をもたらしたと報告された(H.F.LaPenotiereら，同上文献)。
【０１３６】
可溶性の組換えＣ断片タンパク質を大腸菌中で産生させるために、C.botulinumＡ型トキシン由来の合成Ｃ断片遺伝子及びC．difficileトキシンタンパク質の一部又はMBPのどちらかを含む融合タンパク質を構築した。この実施例はa)Ｃ断片融合タンパク質をコードするプラスミドの構築及びb）C.botulinumＣ断片融合タンパク質の大腸菌中での発現を含む。
【０１３７】
a)Ｃ断片融合タンパク質をコードするプラスミドの構築  特表2002-514866実施例１１において、C．difficileトキシンＡリピートドメインは大腸菌中で天然型(クローンpMA1870-2680中のpET 23aベクター中に発現)又は融合タンパク質(クローンpMA1870-2680中で大腸菌MBPとの融合物としてpMALcベクター中で発現)として効率的に発現し精製されうることを示した。MBP、C．difficileトキシンＡリピートドメインの一部(可溶性融合タンパク質として発現されることが示されている)、及びC.botulinumＡ型トキシンのＣ断片を含む融合タンパク質が構築された。C.botulinumＡ型トキシンのＣ断片及びMBPを含む融合タンパク質も構築された。
【０１３８】
図３はボツリヌス融合タンパク質を産生させるために用いたC．difficileトキシンＡ配列又はC.botulinumＣ断片配列を含むドナー構築物と共に、ボツリヌス融合タンパク質を図示している。図３において、黒四角はC．difficileトキシンＡの遺伝子配列を示し、白四角はC.botulinumＣ断片の配列を、黒楕円は大腸菌MBPを示している。制限酵素の名称がカッコ内に記載されているものは制限酵素切断部位が構築中に壊されていたことを示す。制限酵素の名称にアスタリスクを付したものは、その制限酵素切断部位がクローニング結合部(junction)で再生されたことを示す。
【０１３９】
図３はC．difficileトキシンＡリピートドメイン由来の配列を含むpMA1870-2680及びpPA1100-2680構築物(特表2002-514866実施例１１に記載)の制限酵素地図を示す：これらの構築物は、C.botulinumＣ断片遺伝子とC．difficileトキシンＡ遺伝子との融合物をコードするプラスミドの構築のためのC．difficileトキシンＡ遺伝子配列のソースとして用いられた。pMA1870-2680発現構築物は高レベルの可溶性でインタクトな融合タンパク質(20mg/リットル培養液)を発現し、そのタンパク質はアミロースカラムでアフィニティー精製しうる(特表2002-514866実施例１１ｄに精製法を記載)。
【０１４０】
pAlterBot構築物(図３)は、ボツリヌス融合タンパク質産生のためのC.botulinumＣ断片遺伝子配列のソースとして用いられた。pAlterBotは米国国防総省のJ.MiddlebrookとR.Lemleyから得られた。pAlterBotは合成C.botulinumＣ断片をpALTER-1（登録商標）ベクター(Promega)に挿入したものを含む。この合成Ｃ断片遺伝子は天然のＣ断片遺伝子と同じアミノ酸をコードする。天然のＣ断片配列は他の大多数のクロストリディウムの遺伝子と同様A/T含量が極めて高い(Thompsonら、同上文献)。この高いA/T含有量のため大腸菌及び酵母中での発現がコドン使用頻度の変化及び偶発性のポリアデニル化部位にそれぞれ起因して困難となる。
【０１４１】
Ｃ断片タンパク質の大腸菌中での発現を改善するため、好ましくないコドンを好ましいコドンと置き換えた合成遺伝子を作製した。
【０１４２】
pAlterBot中に含まれる、C.botulinumＣ断片遺伝子配列のヌクレオチド配列を配列番号３に記載している。最初の６個のヌクレオチド(ATGGCT)はメチオニン及びアラニン残基をそれぞれコードしている。これら２個のアミノ酸は、C.botulinumＣ断片配列をpALTER（R）ベクターに挿入したために生じた。pAlterBot中に含まれる配列によってコードされるC.botulinumＣ断片のアミノ酸配列を配列番号４に示す。最初の２個のアミノ酸(Met Ala)はベクター由来の配列によりコードされている。第３番目のアミノ酸残基(Arg)から先のアミノ酸配列はC.botulinumＡ型トキシン遺伝子中に見出される配列と同一である。
【０１４３】
C．difficileトキシンＡリピートドメインの断片が、C.botulinumＣ断片遺伝子との遺伝子融合物として、pMAL-c発現ベクター(New England BioLabs)を用いて発現されている発現構築物を作製するために、pMA1870-2680、pPA1100-2680、及びpAlterBot構築物は元となる(progenitor)プラスミドとして用いられた。そのpMAL-c発現ベクターはMBPをタンパク質のアミノ末端に含む融合タンパク質を産生する。C.botulinumＣ断片遺伝子がMBPのみとの融合物として発現されている構築物pMBotを構築した(図３)。融合タンパク質の発現は上記のプラスミドをその内部に含んでいる大腸菌株から誘導され、その誘導されたタンパク質はアミロース樹脂カラムでアフィニティーで精製した。
【０１４４】
i) pBlueBotの構築 C.botulinumＣ断片遺伝子配列の多数の望ましい構築物へのクローニングを容易とするため、ボツリヌス遺伝子配列をpAlterBotから除去して、pBluescriptプラスミド(Stratagene)に挿入してpBlueBotを作成した(図３)。pBlueBotは次のように構築した。pAlterBotプラスミドを有するバクテリアをテトラサイクリンを含む培地で増殖させ、QIAprep-spin Plasmid Kit(Qiagen)を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。1μgのpAlterBot ＤＮＡをNcoIで消化し、その結果できた3'で引っ込んでいる付着末端(3'recessed sticky end)をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片(以下単にクレノウ断片と呼ぶ)で平滑末端とした。次いでpAlterBot ＤＮＡをHindIIIで消化してボツリヌス遺伝子配列(Botインサート)を平滑(NcoI部位を満たした)HindIII断片として放出させた。pBluescriptベクターＤＮＡは200ngのpBluescriptＤＮＡをSmaI及びHindIIIで消化して調製した。２種のプラスミドの消化産物をアガロースゲル上で分析した。適当な断片をゲルから除き、混合し、Prep-a-Geneキット(BioRad)を用いて精製した。溶出したＤＮＡをT4ＤＮＡリガーゼで連結し、コンピテントDH5α細胞(Gibco-BRL)を形質転換するために用いた。宿主細胞はSambrookら(同上文献)の塩化カルシウムプロトコール(1.82-1.83)を用いて形質転換のためにコンピテントとした。標準的な組換え分子生物学的技法(Sambrookら、同上文献)を用いて、組換えクローンを単離し、制限酵素消化によって確認した。その結果得られたクローン、pBlueBotは図３に示すようにいくつかの有用かつユニークなBotインサート(すなわちpAlterBot由来のC.botulinumＣ断片配列)と隣り合う制限酵素切断部位を含んでいる。
【０１４５】
ii) C．difficile/C.botulinum/MBP融合タンパク質の構築 C．difficileトキシンＡ遺伝子、C.botulinumＣ断片遺伝子、及びMBP間の融合物の構築は上述したと同様な組換えＤＮＡ技法を用いて行った。これらの融合タンパク質は種々の量のC．difficileトキシンＡリピートドメインを含んでいた。
【０１４６】
pMABotクローンはBotインサート(すなわちpAlterBot由来のC.botulinumＣ断片配列)に融合させたC．difficileトキシンＡ遺伝子に由来する2.4kbインサートを含んでいる。pMABot(図３)はNotI/HindIIIで消化したpBlueBot(1.2kbBot断片)、SpeI/NotI消化pPA1100-2680(2.4kb C．difficileトキシンＡリピート断片)、及びXbaI/HindIII消化pMAL-cベクターからゲルで精製したＤＮＡを混合することにより構築した。組換えクローンを単離し、制限酵素消化で確認し、QIAprep-spin Plasmid Kit(Qiagen)で精製した。このクローンはトキシンＡリピート及びボツリヌスＣ断片タンパク質をMBPとのフレーム内融合物として発現している。
【０１４７】
pMCABot構築物はBotインサート(すなわちpAlterBot由来のC.botulinumＣ断片配列)に融合させたC．difficileトキシンＡ遺伝子由来の1.0kbインサートを含んでいる。pMCABotは、C．difficileトキシンＡのリピートの5'末端を除去するために、pMABotクローンをEcoRIで消化することにより構築した(図３参照、このpMAL-cベクターはpMABotクローン中に5'からC．difficileインサートへ向かうEcoRI部位を含む)。制限酵素切断部位はゲル精製後ふさぎ、再連結させた。この結果できたクローン(pMCABot，図３)はBot遺伝子に融合したC．difficileトキシンＡリピートドメインの残存する3'部分とMBPとのフレーム内融合物を作り出した。
【０１４８】
pMNABotクローンはC．difficileトキシンＡリピートドメイン(クローンpPA1100-2680由来)からの1kb SpeI/EcoRI(ふさがれた)及び1.2kb C.botulinumＣ断片遺伝子をNcoI(ふさがれた)/HindIII断片(pAlterBot由来)として含んでいる。これらの２種の断片はXbaI/HindIIIで消化したpMAL-cベクターに挿入した。この２種の挿入断片は適当なプラスミドをEcoRI(pPA1100-2680)又はNcoI(pAlterBot)で消化した後、クレノウ断片で処理することにより作製した。クレノウ断片で処理した後、プラスミドを第２番目の酵素(SpeI又はHindIIIのどちらか)で消化した。３種の断片全てをゲルで精製し、混合し、連結前にPrep-a-Geneで精製した。連結及び形質転換後、組換え体と推定されるものを制限酵素分析で分析した。EcoRI部位は、ふさがれたEcoRI部位及びNcoI部位間の融合物で予測されていたとおり、融合物の結合部に再形成されていたことがわかった。
【０１４９】
ボツリヌスＣ断片及びMBP遺伝子間の融合タンパク質をコードする構築物(すなわちこの融合物はC．difficileトキシンＡの遺伝子配列を全く欠除する)を構築し、pMBotと名付けた。pMBot構築物はpMABot構築物からC．difficileトキシンＡ配列を除去し、Ｃ断片遺伝子配列をMBPに融合させることにより作製した。これはpMABotＤＮＡをStuI(pMALcポリリンカーの5'からXbaI部位に位置している)及びXbaI(3'からトキシンＡ−Bot融合物結合部NotI部位に位置している)で消化し、クレノウ断片を用いてXbaI部位をふさぎ、目的の制限酵素切断断片をゲルで精製し、平滑末端を連結してプラスミドを環状とすることで作製した。連結と形質転換の後、組換え体と推定されるものをBotインサート(すなわちC.botulinumC断片配列)の制限酵素地図で分析した。
【０１５０】
b) 大腸菌中でのC.botulinumＣ断片融合タンパク質の発現 pMAL-cベクター、及び上記(a)に述べた各組換え構築物を大規模(1リットル)培養で増殖させ、誘導し、可溶性タンパク質画分を特表2002-514866実施例１８に述べたとおりに単離した。組換え融合タンパク質を単離するため、可溶性タンパク質抽出物をアミロースアフィニティーカラムでクロマトグラフィーした。精製した組換え融合タンパク質をSDS-PAGEゲルに試料を流し、次いでクーマシー染色及びウエスタンブロット分析を文献(Williamsら、(1994)同上文献)に記載されているように行うことにより分析した。簡単に記せば、抽出物を調製し、アミロース樹脂(New England Biolabs)でカラム緩衝液(10mM Na2PO4，0.5M NaCl，10mM β-メルカプトエタノールpH7.2)中でクロマトグラフィーし、10mMのマルトース含有のカラム緩衝液で文献(Williamsら、(1994)同上文献)記載のとおり溶出させた。クーマシーブルーで染色した精製タンパク質試料を含むSDS-PAGEゲルを図４に示す。
【０１５１】
図４では、次の試料をロードした。レーン1-6は、それぞれpMAL-c、pPA1870-2680、pMABot、pMNABot、pMCABot、及びpMBotプラスミドを含む大腸菌から精製したタンパク質を含む。レーン7は広範囲分子量タンパク質マーカー(BioRad)を含む。
【０１５２】
5μlの溶出タンパク質を5μlの2×SDS-PAGE試料緩衝液(0.125mM Tris-HCl、pH6.8、2mM EDTA、6%SDS、20%グリセロール、0.025%ブロモフェノールブルー；β-メルカプトエタノールを使用前に5%となるように加える)と混合することにより、タンパク質試料を電気泳動用に調製した。試料は95℃で５分間加熱し、冷却し、7.5%アガロースSDS-PAGEゲルにロードした。広範囲分子量タンパク質マーカーも同定した融合タンパク質の分子量を見積もるためにロードした。電気泳動後、タンパク質の検出は通常はゲルをクーマシーブルーで染色することによって行った。
【０１５３】
全ての場合において、収率は培養液1リットルあたり融合タンパク質20mgを超えており(表３参照)、pMCABotタンパク質を除き、溶出した融合タンパク質の高比率(総溶出タンパク質の20-50%以上)が完全長の融合タンパク質の分子量と予測される分子量をもつものであった(図４)。肉眼観察によれば、10%未満のpMCABot融合タンパク質が完全長の融合タンパク質として発現されているものと見積もられた。
【０１５４】
【表３】
0003914484.tif 000006
これらの結果はpMAL-c発現系を用いて大腸菌中での高レベルのインタクトなC.botulinumＣ断片/C．difficileトキシンＡ融合タンパク質の発現が可能であることを示している。これらの結果はH.F.LaPenotiereら(1993)、同上文献、の報告した結果と対照的である。さらに、これらの結果は可溶性の融合タンパク質をpMAL-c系を用いて大腸菌中で産生させるために、ボツリヌスＣ断片遺伝子とC．difficileトキシンＡ遺伝子を融合させる必要のないことも示している。
【０１５５】
上記のボツリヌス融合タンパク質が抗C.botulinumトキシンＡ抗体に認識されるか調べるために、ウエスタンブロット法を行った。pMABot、pMCABot、pMNABot、pMBot、pMAl870-2680又はpMAL-cプラスミドを含む大腸菌から得た、アフィニティーで精製したタンパク質を含む試料を分析した。SDS-PAGEゲル(7.5%アクリルアミド)に各発現構築物から精製したタンパク質試料をロードした。電気泳動後、ゲルをブロットしタンパクの転移をポンソ−Ｓ染色で確認した(特表2002-514866実施例12bに記載の方法による)。
【０１５６】
タンパク質転移後、ブロットをブロッキング緩衝液［PBST(0.1%Tween 20及び5%ドライミルク含有のPBS)］中で20℃で1時間インキュベートしてブロックした。ブロットを一次抗体を含む溶液10ml中でインキュベートした。この溶液はブロッキング緩衝液中に1/500希釈の抗C.botulinumトキシンＡIgY PEG prep(実施例３に記載)を含むものである。ブロットを一次抗体存在下で室温で1時間インキュベートした。ブロットを洗い、ウサギ抗ニワトリアルカリホスファターゼコンジュゲート(Boehringer Mannheim)を二次抗体として使用して次のように発色させた。ウサギ抗ニワトリ抗体をブロッキング緩衝液で1μg/mlとなるように希釈し(ブロットあたりの最終容量は10ml)、ブロットを二次抗体存在下で室温で1時間インキュベートした。次いで、ブロットをPBST、BBS-Tween、及び50mM Na2CO3，pH9.5で順次洗った。次いでブロットを新たに調製したアルカリホスファターゼ基質緩衝液(100μg/mlニトロブルーテトラゾリウム、50μg/mlリン酸5-ブロモ-クロロ-インドリル、5mM MgCl2を50mM Na2CO3 pH9.5中に含む)中で展開した。発色の停止はブロットを蒸留水で溢れさせて行い、ブロットを空気乾燥した。
【０１５７】
このウエスタンブロット分析でpMABot、pMCABot、pMNABot及びpMBotタンパク質試料(図４においてクーマシー染色によって上記のように同定された完全長のタンパク質からの予測に対応している)中ではC.botulinumトキシンに反応性のタンパク質が検出されたが、pMA1100-2680又はpMAL-cタンパク質試料では検出されなかった。
【０１５８】
これらの結果は上記のa)節に記載された、アミロース樹脂で精製された関連の融合タンパク質が、免疫反応性のC.botulinumＣ断片タンパク質を予測されたとおり含んでいたことを示している。
【０１５９】
実施例２３ pMBotタンパク質の経鼻投与による中和抗体の産生
実施例２２で産生させた組換えボツリヌストキシンタンパク質のボツリヌストキシンエピトープに対する全身的免疫応答を刺激する能力について調べた。本実施例は、a)ボツリヌストキシン含有C．difficileトキシンＡ融合タンパク質の経鼻又は経口投与による血清IgG抗体価の誘導の評価、及びb)抗組換えC.botulinumＣ断片抗体によるC.botulinumＡ型ニューロトキシンのin vivoでの中和を含む。
【０１６０】
a)ボツリヌストキシン含有C．difficileトキシンＡ融合タンパク質の経鼻又は経口投与による血清IgG力価の誘導の評価 １群あたり５匹の６週令CFラット(雌、Charles River)、６群を実施例２２で調製したタンパク質を用いた下記の３種の組み合わせの内の１種で、経鼻又は経口的に免疫した。(1)ラット１匹あたり250μgのpMBotタンパク質(経鼻又は経口)(2)ラット１匹あたり250μgのpMABotタンパク質(経鼻又は経口)（3）ラット１匹あたり125μgのpMA1870-2680を混合した125μgのpMBot(経鼻又は経口)。第２番目の５群のセットは１群あたり３匹のCFラット(雌)で、次の組み合わせの内の１つで経鼻又は経口的に免疫した。(4)ラット１匹あたり250μgのpMNABotタンパク質(経鼻又は経口)または(5)ラット１匹あたり250μgのpMAL-cタンパク質(経鼻又は経口)。
【０１６１】
免疫用の融合タンパク質は次のとおり調製した。タンパク質(10mMマルトース含有のカラム緩衝液中)を0.1M炭酸塩緩衝液pH9.5で希釈し、200μl容量を経口的あるいは経鼻的に投与した。投与前にラットをエーテルで軽く鎮静させた。経口投与は20ゲージの給餌針で行った。経鼻投与はp-200マイクロピペッター(Gilson)を用いて行った。初回免疫の14日後、上述の方法でラットをブーストし、その7日後に採血した。各群のラットを軽くエーテル麻酔し、尾から採血した。採取した血液を37℃で1時間凝固させ、血清を採取した。
【０１６２】
個々のラットの血清の抗C.botulinumＡ型トキシンIgG血清力価をELISAを用いて分析した。ここで用いたELISAのプロトコールは特表2002-514866実施例13cに記載した方法を改変したものである。簡単に述べれば、C.botulinumＡ型トキソイド(2.5μg/ml、0.005%チメロサール含有のPBS中)を各ウエルに100μl入れ、4℃で一晩インキュベートすることにより、96ウエルのマイクロタイタープレート(Falcon，Pro-Bind Assay Plates)をC.botulinumＡ型トキソイド(特表2002-514866実施例１３aの記載のとおり調製)でコートした。翌朝、コーティング懸濁液を傾斜して除き、全ウエルをPBSで３回洗った。
【０１６３】
非特異的結合部位をブロックするため、ブロッキング液(PBS中に0.5%BSAを含有)を100μl、各ウエルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。ブロッキング液を傾斜して除き、希釈ラット血清150μl(重複試料)を希釈シリーズの第１番目のウエルに添加した。初回試験血清希釈は0.5%Tween20含有のブロッキング液で1:30の希釈とし、次いでこの液で順次5倍希釈とした。これは30μlを取り、順次120μlの0.5%Tween20含有のブロッキング液に移し、混合し、この希釈をさらに新しいウエルに反復することによって行った。最終希釈後、ウエルから30μlを除去して全ウエルの最終液量が120μlとなるようにした。このような希釈を計３回行った(計４ウエル)。プレートを37℃で1時間インキュベートした。このインキュベート後、段階希釈した試料を傾斜して棄て、ウエルを0.5%Tween20含有のPBS(PBST)で６回洗った。0.5%Tween20含有ブロッキング緩衝液中のウサギ抗ラットIgGアルカリホスファターゼ(Sigma)100μlを各ウエルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。コンジュゲート液を傾斜して除き、プレートを上述のやり方で洗った。最終洗浄においてはPBSTに替えて50mM Na2CO3，pH9.5を用いて行った。プレートの発色は1mg/mlの濃度でリン酸パラニトロフェニル(Sigma)を50mM Na2CO3，10mM MgCl2，pH9.5に溶解した液を各ウエルに100μl加え、室温暗所で5-45分間インキュベートすることによって行った。各ウエルの吸光度は410nmでDynatech MR700プレートリーダーを用いて測定した。結果は表４及び５に要約されており、個々のマウスの血清の反応性を平均値を表示してある。
【０１６４】
【表４】
0003914484.tif 000007
【表５】
0003914484.tif 000008
上記のELISAの結果は、投与経路が経鼻の場合ボツリヌス融合タンパク質に対する反応性は最も強く、経口的に投与した場合には弱い応答性しか見られないことを示している。経鼻的に送達されたpMBot、及びpMA1870-2680を混合したpMBotは最も大きな血清IgG応答を引き起こした。これらの結果は、この応答を誘発するためにはpMBotタンパク質のみが必要であることを示している。何故ならばpMA1870-2680の添加は抗体応答を増強させなかったからである(表４)。C．difficileトキシンＡ断片をMBPとC.botulinumＣ断片タンパク質の間に置くことは、抗botIgG力価を劇的に低下させる(pMABot、pMCABot及びpMNABotタンパク質を用いたときの結果を参照)。
【０１６５】
この研究は、pMBotタンパク質は経鼻投与したときC.botulinumＡ型トキシンに対する強い血清IgG応答を誘起することを示している。
【０１６６】
b) 抗組換えC.botulinumＣ断片抗体によるC.botulinum Ａ型ニューロトキシンのin vivoでの中和 組換えボツリヌス融合タンパク質(実施例２２、ラット中)の経鼻投与で産生された抗C.botulinumＡ型トキシン抗体のC．botulinumＡ型トキシンを中和する能力をマウス中和モデルで調べた。マウスモデルは体液中のボツリヌス毒素の検出及び抗ボツリヌス抗体の評価に受け入れられている方法である［E.J.Schantz and D.A.Kautter，J.Assoc.Off.Anal.Cem.,61:96(1990)、及び陸軍省軍医総監から米国食品医薬品局へのIND(BB-IND-3703)申請］。抗C.botulinumＡ型トキシン抗体は下記のように調製した。
【０１６７】
経鼻的にpMBotタンパク質を投与した群のラットに、１匹あたり250μgのpMBotタンパク質で２回目のブーストを行い、その７日後に血清を集めた。この群のラットの内の１匹と免疫前のラットの１匹から血清を採取し、抗C.botulinumＡ型トキシン中和活性を下記のマウス中和モデルで調べた。
【０１６８】
Dr.Eric Johnson(University of Wisconsin，Madison，USA)から入手した精製C.botulinumＡ型トキシン複合体のLD50をSchatz and Kautterの腹腔内投与法［J．Assoc．Off．Anal．Chem.，61:96(1978)］で18-22gの雌ICRマウスを用いて測定したところ3500LD50/mlであった。LD50の決定は次のとおり行った。精製Ａ型トキシン複合体を25mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.8に溶解し、3.15×107LD50/mgのストックトキシン溶液を作ることにより、Ａ型トキシン標準品を調製した。その溶液のOD278を測定し、濃度を10-20μg/mlに調整した。トキシン溶液はゲル-リン酸塩(30mMリン酸塩、pH6.4:0.2%ゼラチン)で1:100に希釈した。トキシン溶液を下記の表６に示すとおりさらに希釈した。２匹のマウスに各希釈を0.5ml腹腔内投与し、ボツリヌス症の症状を72時間観察した。
【０１６９】
【表６】
0003914484.tif 000009
表６に示した結果からトキシン力価は2560LD50/mlと5120LD50/mlの間(又は約3840LD50/ml)と推定される。この値は計算の都合上、小さい数を切り捨て3500LD50/mlとする。
【０１７０】
pMBotタンパク質で経鼻的に免疫したラットの血清中の中和抗体の量を測定した。上述のやり方でpMBotタンバク質でブーストしたラット２匹の血清及び免疫前の１匹のラットの血清を次のとおり試験した。トキシン標準品をゲル-リン酸塩で1:100に希釈して最終濃度を350LD50/mlとした。希釈したトキシン標準品1mlを３匹の各ラットの各々の血清25μl、及びゲル-リン酸塩0.2mlと混合した。混合物を室温で30分間時々混合しながらインキュベートした。２匹のマウスそれぞれに混合物0.5mlを腹腔内に注射した。マウスのボツリヌス症の徴候を72時間観察した。pMBotタンパク質で免疫したラットから得た血清の投与を受けたマウスはこのチャレンジ投与を中和した。免疫前のラットの血清を投与されたマウスは24時間以内に死亡した。
【０１７１】
pMBotタンパク質で免疫したラットの血清中に存在する抗トキシン中和抗体の量を定量した。血清抗体の力価測定は、各抗体希釈液0.1mlを(表７参照)0.1mlの1:10希釈のストックトキシン溶液(3.5×104LD50/ml)及び1.0mlのゲル-リン酸塩と混合し、１希釈あたり0.5mlを２匹のマウスに腹腔内投与することによって行った。マウスのボツリヌス症の徴候を3日間(72時間)観察した。結果は表６にまとめた。
【０１７２】
表７に示すとおり、pMBot血清は1:320又はそれ未満の希釈で用いた場合はC.botulinumＡ型トキシン複合体を中和した。pMBot血清での平均中和値は168IU/mlであった(1IUは10,000マウスLD50と定義される)。この値は循環血清力価としては3.7IU/mg血清タンパク質と換算される。この中和力価は市販の瓶入り濃縮ウマ抗C.botulinum抗血清(Connaught Laboratories，Ltd.)に比肩しうるものである。Connaught社の10mlバイアルの抗血清は約200mg/mlのタンパク質を含有し、その1mlは750IUのC.botulinumＡ型トキシンを中和することができる。1バイアルをヒトに投与した後、Connaught社製品の循環血清力価は平均血清量を3リットルと仮定すると約25IU/mlとなる。このように、pMBotタンパク質で経鼻的に免疫したラットで見られた循環抗C.botulinum力価(168IU/ml)は、ヒトの防御のために必要な抗C.botulinum抗体の循環力価より6.7倍高い。
【０１７３】
【表７】
0003914484.tif 000010
これらの結果は、大腸菌で産生させた組換えC.botulinumＣ断片融合タンパク質を免疫原として用いたとき、C.botulinumＡ型トキシンを中和できる抗体が誘導されることを示している。
【０１７４】
実施例２４ 実質的にエンドトキシン汚染のない可溶性C.botulinumＣ断片の産生
実施例２３は、大腸菌中で発現させたpMBotタンパク質での免疫によって中和抗体が産生されることを示している。これらの結果は、pMBot融合タンパク質がワクチンの良い候補であることを示している。しかし、ワクチンとしての使用に適した免疫原は中和抗体を誘導する能力に加え、実質的に発熱性物質のないものでなければならない。ワクチンとして用いるためのC.botulinumＣ断片タンパク質の生産を容易にする発現クローン及び発現条件を開発した。
【０１７５】
本実施例は（a）pMBotタンパク質中の発熱性物質含量の測定、（b）MBP不含のC.botulinumＣ断片タンパク質の産生、（c）C.botulinumＣ断片タンパク質の種々の発現ベクターを用いた発現、及び(d)顕著なエンドトキシン汚染が実質的にない可溶性C.botulinumＣ断片の精製を含む。
【０１７６】
a) pMBotタンパク質の発熱性物質含量の測定 組換え抗原をヒトあるいはその他の動物のワクチンとして用いるためには、その抗原調製品が発熱性物質を持たないことを示さねばならない。大腸菌のようなグラム陰性菌中で組み換えタンパク質を産生させて調製するとき最も重要な発熱性物質はエンドトキシンである(F.C.Pearson，Pyrogens:endotoxins，LAL testing and depyrogentation(1985)  Marcel Dekker，New York，pp.23-56)。pMBotタンパク質のワクチン候補品としての有用性を評価するため、MBP融合タンパク質中のエンドトキシン含量を測定した。
【０１７７】
組換えタンパク質試料中のエンドトキシン含量はLimulusアッセイ(LAL kit:Associates of Cape Cod)を用い、製造者の使用説明書に従って行った。アフィニティーで精製したpMal-cタンパク質及びpMA1870-2680の試料は高レベルのエンドトキシン［＞50,000EU/mgタンバク質；EU(エンドトキシンユニット)］を含有していた。このことはMBP又はトキシンＡリピート含有のボツリヌスＣ断片との融合物も高レベルのエンドトキシンを含んでいるはずであることを示唆している。
【０１７８】
このため、アフィニティー精製pMal-c及びpMBotタンパク質調製品からのエンドトキシンの除去を次のように試みた。
【０１７９】
pMal-c及びpMBotタンパク質試料をポリミキシンで脱発熱性物質処理しエンドトキシンが容易に除去しうるか調べた。次の量のタンパク質を処理した；pMal-cは4.8 OD280/mlの濃度のものを29ml、pMBotは1.44 OD280/mlのものを19ml．タンパク質試料はPBSに対して十分透析し、50ml試験管(Falcon)中で0.5mlPBS平衡化ポリミキシンＢ(Affi-Prep Polymyxin，BioRad)と混合した。試料は試験管を一晩4℃で回転させながら混合した。ポリミキシンを小型ベンチトップ遠心機の最高速度(約2000×g)で30分間遠心してペレットとし、上清は除いた。回収されたタンパク質(上清中)は、OD280で定量し、エンドトキシン活性をＬＡＬでアッセイした。どちらの場合も投入したタンパク質の約1/3が回収されたに過ぎずポリミキシン処理したタンパク質は依然としてエンドトキシン汚染が著しい状態であった(約7000EU/mg pMBot)。
【０１８０】
発熱性物質を取り除く実験を、上記とは別に精製したpMal-cタンパク質調製品を用いて繰り返したが結果は同様であった。これらの研究結果から、アミロース樹脂を用いると多量のエンドトキシンがMBP融合タンパク質と共に精製されてしまうことが結論された。さらにこのエンドトキシンはポリミキシン処理では容易に除去し得ない。
【０１８１】
これらの結果は、融合タンパク質上のMBP配列の存在がpMBotタンパク質調製品からのエンドトキシンの除去を面倒なものとしていることを示唆している。
【０１８２】
b) MBPを含まないC.botulinumＣ断片タンパク質の産生 上記a)節においてpMBot融合タンパク質を、汚染しているエンドトキシンから精製することは容易でないことが示された。発熱性物質を含まない(例えばエンドトキシンを含まない)、可溶性ボツリヌスＣ断片タンパク質(MBPタグを含有していない)を産生する能力を調べた。pMBot発現構築物は、MBPとボツリヌスＣ断片との間に存在する加工した因子Xa切断部位を用いて融合タンパク質の切断を行うことによってMBPタグからボツリヌスＣ断片を精製するのが容易となるように設計した。因子Xa切断は次のように行った。
【０１８３】
各種の緩衝液条件で［例えばＰＢＳ-NaCl(0.5M NaClを含有するＰＢＳ)、0.2% Tween20含有のＰＢＳ-NaCl、ＰＢＳ、0.2% Tweenを含有のＰＢＳ、ＰＢＳ-Ｃ(2mM CaCl2含有ＰＢＳ)、0.1又は0.5%Tween20含有のＰＢＳ-Ｃ,、.1又は0.5%NP-40含有のＰＢＳ-Ｃ、0.1又は0.5%Triton X-100含有のＰＢＳ-Ｃ、0.1%デオキシコール酸ナトリウム含有のＰＢＳ-Ｃ、0.1%SDS含有のＰＢＳ-Ｃ］pMBotタンパク質に、因子Xa(New England Biolabs)を、0.1-1.0％因子Xa/pMBotタンパク質の比となるように加えた。因子Xa消化物は室温で12-72時間インキュベートした。
【０１８４】
切断の程度は実施例２２に記載の方法で変性SDS-PAGEゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロット法又はクーマシーブルーによるタンパク質染色で調べた。切断反応物(及び非切断pMBotタンパク質の対照試料)を2分間マイクロ遠心機で遠心して、ゲルに試料をロードする前に不溶性タンパク質を除去した。因子Xaで処理した試料を非切断、非遠心のpMBot試料と同じゲル上で比較した。この分析の結果は下記に要約している。
【０１８５】
1) 大部分の(約90%)pMBotタンパク質は、非切断の対照試料を用いた場合でも、遠心によって除去し得た。このことはpMBot融合タンパク質が完全には可溶性でないこと(すなわちそれが溶液ではなく懸濁液として存在していること)を示している。［この結果は、大部分のアフィニティー精製pMBotタンパク質が長期間(2週間以上)4℃で保管すると沈殿するという観察結果と符合する。さらに、誘導されたpMBotタンパク質の大きな割合（すなわち75％）が、誘導された大腸菌の超音波処理及び清澄化の後にできるペレット中に残存する。PBS中にこれらの不溶性のペレットを再懸濁した後、超音波処理するとペレット中の不溶性pMBotタンパク質の部分的可溶化が起こる。）
2) 完全に溶液中にあるpMBotタンパク質の一部pMBotタンパク質の約10％は因子Xaにより完全に切断されるが、切断された（放出された）ボツリヌスＣ断片は比較的不溶性で切断されたMBPのみが十分に溶液中に残る。
【０１８６】
3) 上記の反応条件のどれもが、効果的な切断を減少させることなく溶解性を向上し得なかった。切断されたボツリヌスＣ断片を効果的に可溶化させる条件は見出せなかった。
【０１８７】
4) 因子Xa切断に用いる緩衝液中に0.1%SDSを用いることによりpMBotタンパク質の溶解性が向上した(pMBotタンパク質は全て可溶性であった)。しかし、SDSの存在は融合タンパク質の因子Xaによるいかなる切断も妨害する。
【０１８８】
5) 切断反応で生じたペレット化したタンパク質の分析から、完全長のPMBot(すなわち非切断)及び切断ボツリヌスＣ断片タンパクの双方ともインキュベーション中に沈殿したことが示された。
【０１８９】
これらの結果はpMBot融合タンパク質の切断後の可溶性ボツリヌスＣ断片タンパク質の精製は、pMBotタンパク質及び切断ボツリヌスＣ断片タンパク質の双方の不溶性によって面倒になっていることを示唆している。
【０１９０】
c) 各種の発現ベクターを用いたC.botulinumＣ断片の発現 ボツリヌスＣ断片の溶解性が、Ｃ断片タンパクを天然型の、Ｎ末端ヒスチジンタグつきのタンパク質として、又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることにより増加するか調べるため、別の発現プラスミドを構築した。これらの発現用構築物は実施例２２に記載の方法を用いて作製した。図５は下記のベクターを図で表したものである。
【０１９１】
図５においては、次の略語を用いている。pPはpET23ベクター、pHISはpETHisaベクター、pBlueはpBluescriptベクター、pMはpMAL-cベクター及びpGはpGEX3Tベクター(特表2002-514866実施例11に記載)を表す。黒の実線はC.botulinumＣ断片の遺伝子配列を示し、黒の楕円はMBPを示し、平行斜線を引いた楕円はGSTを示し、HHHHHはポリヒスチジンタグを示す。図５において、制限酵素名がカッコ内にあるときは制限酵素切断部位が構築中に壊されていることを示している。制限酵素にアスタリスクを付したものは制限酵素切断部位がクローニング結合部に再形成されたものであることを示している。
【０１９２】
i) pPBotの構築 C.botulinumＣ断片を天然型(すなわち非融合型として)タンパク質として発現させるために、pPBotプラスミド(図５に図式的に示す)を下記のとおり構築した。pAlterBotをNcoI及びHindIIIで消化することにより、pAlterBot中に存在するＣ断片配列を除去した。NcoI/HindIIIＣ断片インサートを、NcoI及びHindIIIで消化したpETHisaベクター(特表2002-514866実施例１８bに記載)に連結した。この連結によって、ボツリヌスＣ断片のNcoIによってコードされたメチオニンが開始コドンで、天然型のボツリヌスＣ断片を直接発現する発現構築物が創出される。この連結産物はコンピテントなBL21(DE3)pLysS細胞(Novagen)を形質転換するために用いた。
【０１９３】
組換えクローンは制限酵素地図により同定した。
【０１９４】
ii) pHisBotの構築 組換えタンパク質のアミノ末端にポリヒスチジンタグを含むC.botulinumＣ断片を発現させるため、pHisBotプラスミド(図５で図式的に示している)を下記のように調製した。pAlterBotからのNcoI/HindIIIボツリヌスＣ断片インサートを、NheI及びHindIIIで消化したpETHisaベクターに連結した。NcoI(Ｃ断片インサート上)及びNheI(pETHisaベクター上)部位を連結前にクレノウ断片を用いて塞いだ。これらの部位は平滑末端で連結された(予測どおり、NdeI部位はクローン接合部で再形成された)。連結してできた産物を、コンピテントなBL21(DE3)pLysSを形質転換するために用い、組換えクローンは制限酵素地図で同定した。
【０１９５】
この結果得られたpHisBotクローンは以下の配列をもつヒスチジンタグ付きＮ末端拡張部(extension)を有するボツリヌスＣ断片タンパク質を発現する。
【０１９６】
MetGlyHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisSerSerGlyHislleGluGlyArgHisMetAla(配列番号５).ボツリヌスＣ断片遺伝子によってコードされるアミノ酸に下線を引き、ベクターがコードするアミノ酸をplain typeで示した。pHisBot融合タンパク質をコードするpETHisaベクターに存在するヌクレオチド配列を配列番号６に示す。pHisBotのアミノ酸配列は配列番号７に示している。
【０１９７】
iii) ｐＧＢｏｔの構築 ボツリヌスＣ断片タンパク質を、pGBotプラスミド（図５に模式的に示す）を構築することによって、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質との融合体として発現させた。この発現構築物は、pBlueBot（実施例２２）中に存在しているNotI/SalI C挿入断片を、SmaIならびにXhoIで消化しておいたpGEX3Tベクターにクローニングすることによって作出した。NotI部位（ボツリヌス断片上に存在）は、ライゲーションの前に、クレノウ断片を使用して平滑化しておいた。ライゲーション生成物を使用して、コンピテントなBL21細胞を形質転換した。
【０１９８】
上記発現構築物のそれぞれを、制限消化によって調べ、構築物の完全性を確認した。
【０１９９】
pPBot[BL21(DE3)pLysS宿主]、pHisBot［BL21(DE3)pLysS宿主］、ならびにpGBot(BL21宿主)の大量培養物（１リットル）を、2× YT培養液で生育させ、実施例２２に記載したようにして、（０．８−１．０mMのＩＰＴＧを使用して）３時間にわたって誘導した。各大量培養物のうちの１mlから、全タンパク質調製物、可溶性タンパク質調製物、ならびに不溶性タンパク質調製物を調製し（Williamsら、（1994）、上掲）、SDS-PAGEで分析した。クーマシー染色を行ったところ、pPBotならびにpHisBotの試料では、はっきりとした誘導バンドが検出されなかったのに対し、pGBotの試料では、はっきりとした推定分子量の不溶性バンドが検出された。pGBotの大量培養物（PBSに再懸濁）、あるいはpHisBotの大量培養物［Novagen 1×結合緩衝液（５mMイミダゾール、０．５M NaCl、２０mM Tris-HCl、pH7．9)に再懸濁］の可溶性溶解産物を調製し、これらの溶解産物を、以下のようにして、可溶性アフィニティタグ付きタンパク質をアフィニティ精製する際に使用した。
【０２００】
pGBot溶解産物は、グルタチオン−アガロース樹脂（Pharmacia）上で、SmithおよびCorcoran［Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 28(1994)．pp．16.7.1-16.7.7］の記載に正確にしたがってアフィニティ精製した。pHisBotタンパク質は、His-bind緩衝液キット（Novagen）を製造業者の記載に正確にしたがって使用することにより、His-Bind樹脂（Novagen）上で精製した。
【０２０１】
pGBotならびにpHisBotタンパク質（非誘導タンパク質、誘導タンパク質、全タンパク質、可溶性タンパク質、ならびにアフィニティ精製溶離タンパク質を含む）の精製物の試料を、SDS-PAGEゲル上で展開した。電気泳動の後、タンパク質を、クーマシー染色、あるいはニワトリ抗クロストリジウム・ボツリヌス（C.botulinum）Ａ型トキソイド抗体（実施例２２に記載）を使用したウェスタンブロット法によって分析した。
【０２０２】
こうした研究によって、実施条件下では、pGBotタンパク質がほぼ全面的に不溶性であるのに対し、pHisBotタンパク質は可溶性であることがわかった。この第一の試みでのpHisBotタンパク質のアフィニティ精製は、収量の点からも（免疫反応性ボツリヌスタンパク質の大半が、His-Bind樹脂に結合しなかったこと）、純度の点からも（ボツリヌスタンパク質が、全溶離タンパク質の約２０％であると推定されたこと）、非効率的であった。
【０２０３】
ｄ）エンドトキシンが実質的に非混入である可溶性クロストリジウム・ボツリヌス（C.botulinum）Ｃ断片タンパク質の精製 上記の研究から、pHisBotタンパク質が、E．Coli中では、可溶性タンパク質として発現されていることがわかった。しかし、His-Bind樹脂でのこのタンパク質のアフィニティ精製は、極めて非効率的であった。可溶性pHisBotタンパク質のアフィニティ精製を（収量に関しても、純度に関しても）改善する目的で、His-Bind樹脂でなく、ポリヒスチジン結合アフィニティ樹脂（Ni-NTA樹脂、Qiagen）を使用した。このNi-NTA樹脂は、His-Bind樹脂よりも優れた結合アフィニティ（pH８．０で、Kd＝1×10-13；Qiagenのユーザーマニュアル）を有することが報告されている。
【０２０４】
誘導を行った１リットルの2× YT培養物の可溶性溶解産物（Novagen 1X結合緩衝液）を、上述のようにして調製した。略述すると、pHisBot[B121(DE3)pLysS宿主]の培養物を、１００μg/mlのアンピシリン、３４μg/mlのクロラムフェニコール、及び０．２％のグルコースを含有する2× YT培養液１リットル中で、３７℃にて、OD600が０．７となるまで生育させた。ＩＰＴＧを１．０mMとなるまで加えることによって、タンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加の３時間後に、細胞を氷浴中で１５分間冷却し、JA１０ロータ（Beckman）中で、４°Ｃにて、５０００rpmで、１０分間にわたって遠心分離した。ペレットを、合計容積で４０mlのNovagen 1×結合緩衝液（５mMイミダゾール、０．５M NaCl、２０mM Tris-HCl、pH７．９）に再懸濁し、３５mlのOakridgeチューブ２本に移し、-７０℃で１時間以上凍らせた。このチューブを溶かし、細胞を超音波処理（Branson Sonifier 450を、パワー設定６−７で使用し、４×20秒で破壊）によって氷浴上で破壊した。懸濁液を、JA１７ロータ（Beckman）中で、９０００rpm（１０、０００×g）で２０分間にわたって遠心分離することによって、清澄化した。
【０２０５】
可溶性溶解産物を、０．１％NP40とし、４℃で１時間にわたって攪拌することによって、７mlのNi-NTA樹脂：結合緩衝液の１：１スラリーにバッチ吸収させた。このスラリーを、内径が１又は２．５cm（BioRad）カラムに注いだ。次に、カラムを、０．１％NP40含有Novagen 1×結合緩衝液１５ml、Novagen 1X結合緩衝液１５ml、洗浄緩衝液（６０mMイミダゾール、０．５M NaCl、２０mM Tris-HCl、pH７．９）１５ml、ならびにNaHPO4洗浄緩衝液（５０mM NaHPO4、pH７．０、０．３M NaCl、１０％グリセロール）１５mlで逐次洗浄した。結合タンパク質は、溶離緩衝液（５０mM NaHPO4、pH４．０、０．３M NaCl、１０％グリセロール）を使用した樹脂のプロトン化によって溶離した。溶離タンパク質を４℃で保存した。
【０２０６】
全タンパク質、可溶性タンパク質、および溶離タンパク質の試料を、SDS-PAGEによって展開した。タンパク質試料は、実施例２２ｂに記載したようにして、電気泳動用に調製した。２枚のゲルをクーマシーブルーで染色して、展開したタンパク質を可視化し、実施例２２ｂで記載したようにしてウェスタンブロット分析を行うことによって、クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシン反応性のタンパク質を検出した。代表的なクーマシー染色ゲルを、図６に示す。図６は、１２．５％のアクリルアミドゲルに、以下の試料をローディングしたものである。レーン１−４は、それぞれ、全タンパク質、可溶性タンパク質、Ni-NTAカラムの流出液中に存在する可溶性タンパク質、ならびにアフィニティ精製pHisBotタンパク質（すなわち、プロトン化によってNi-NTA樹脂から溶離されたタンパク質）を含んでいる。レーン５は、高分子量タンパク質マーカー（BioRad）を含んでいる。
【０２０７】
pHisBotタンパク質の精製によって、pHisBotプラスミドを含むBL21(DE3)pLysS細胞の出発培養物１リットルから、７mgのアフィニティ精製タンパク質が得られた。精製pHisBotタンパク質の収量は、誘導培養物中の全可溶性タンパク質の約０．４％であった。精製pHisBotタンパク質をSDS-PAGEで分析したところ、９０−９５％以上のタンパク質が、推定分子量（５０kD）を有する単一のバンド（図６）として存在していた。この５０kDのタンパク質のバンドは、抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシン抗体に対して免疫反応性であった。タンパク質調製物の吸光係数を測定したところ、１mg/mlの溶液あたりのＯＤ280が、１．４（ピアスＢＣＡアッセイ）あるいは１．４５（ローリーアッセイ）であった。
【０２０８】
ｐＨを中和した溶離pHisBotタンパク質の試料を、KB 803ＨＰＬＣカラム（Shodex）で展開した。Hisタグ付きタンパク質は、このサイズ分離カラムによって保持されたものの（おそらく、このタンパク質が本来有している金属結合能力によるものと考えられる）、pHisBotタンパク質の相対的な移動度は、溶液中の非凝集タンパク質について予測されるもとの一致していた。誘導pHisBotタンパク質の大半は、上記過程で使用した生育条件ならびに可溶化条件で、可溶性であると判定された（すなわち、pHisBotプラスミドを含むBL21(DE3)pLysS細胞から調製した全タンパク質ならびに可溶性タンパク質の試料で観察されるpHisBotタンパク質レベルの比較によって判定したところ、pHisBotタンパク質の９０％以上が可溶性であることが見いだされた）。遠心分離、−２０℃での長期保存、少なくとも２サイクルの凍結・解凍を行った後に得られた試料をSDS-PAGEで分析したところ、（沈殿による）タンパク質の損失は検出されず、pHisBotタンパク質が溶離緩衝液（すなわち、５０mM NaHPO4、pH４．０、０．３M NaCl、１０％グリセロール）に可溶性であることが示唆された。
【０２０９】
アフィニティ精製pHisBot調製物（pH中和後）へのエンドトキシンの混入を、LALアッセイ（Associates of Cape Cod）で調べたところ、エンドトキシンの有意な混入は検出されなかった。このアッセイは、製造業者の指示にしたがって、終点発色法（endpoint chromogenic method）（ジアゾカップリングなし）を使用して行った。この方法で検出可能なのは、濃度が０．０３EU/ml（EUは、エンドトキシン単位（endotoxin unit））以上のエンドトキシンである。LALアッセイは、０．５mgのpHisBotタンパク質を５０mMNaHPO4、pH７．０、０．３M NaCl、１０％グリセロールに溶解してなる０．５mlの溶液を使用して行った。０．５mlの試料中で３０−６０EUが検出された。したがって、アフィニティ精製したpHisBot調製物は、タンパク質１mgあたり６０−１２０EUを含有していることとなる。非経口薬剤の投与について定めたＦＤＡのガイドラインでは、ヒト投与用組成物の含量が、体重１kgあたり５EU未満であることが要求されている（ヒトの平均体重は７０kgなので、非経口投与１回あたり３４９EU単位までが許容含量だということになる）。ワクチン製剤で投与されるタンパク質の量は極めて少ないので（通常、タンパク質１０−５００μgの範囲）、タンパク質１mgあたり６０−１２０EUを含有するアフィニティ精製pHisBotを投与しても、エンドトキシンの許容ローディング量のうちのごくわずかな割合が投与されるだけである。たとえば、１０−５００μgの精製pHisBotを７０kgのヒトに導入した場合（タンパク質製剤は、６０EU/mgのタンパク質を含有）、ヒトに導入されるエンドトキシンは、０．６−３０EU［すなわち、エンドトキシンの非経口投与の場合の最大許容負荷量の０．２−８．６％（体重１kgあたり５EU未満）］のみということになる。
【０２１０】
上述の結果から、上記精製スキームを使用した場合、エンドトキシン（ＬＰＳ）がpHisBotタンパク質と同時に精製されることはないことが実証された。エンドトキシンの含有レベルがさらに低い（組換え型タンパク質１mgあたり２EU未満）組換え生成pHisBotタンパク質製剤は、Ni-NTAカラムを、洗浄緩衝液で、ＯＤ280が基底レベルに復帰するまで、（すなわち、紫外線吸収性物質が、それ以上カラムから流出しなくなるまで、）洗浄することによって生成することができる。
【０２１１】
上述の結果によって、エンドトキシンを実質的に含有しない可溶性のボツリヌスＣ断片タンパク質の生成ならびに精製方法が例示されるものである。
【０２１２】
実施例２５ pHisBotタンパク質の発現ならびに精製の最適化
実施例２４ｄの結果から、pHisBotタンパク質は、E．coli内で可溶性タンパク質として製造することができ、精製によって発熱物質活性のない状態とすることができるので、ワクチンとして使用するにあたっての優れた候補となりうることが実証された。pHisBotタンパク質の発現ならびに精製を最適化するために、各種の生育ならびに精製条件を調べた。
【０２１３】
ａ）生育のパラメータ
ｉ）宿主の系統 使用する宿主の系統が、可溶性pHisBotタンパク質の生成に及ぼす影響を調べた。BL21(DE3)pLysS宿主でなく、BL21(DE3)宿主（Novagen）を使用して、［上記実施例２４ｄに記載したようにして］pHisBotの大量精製を行った。BL21(DE3)宿主からpLysSプラスミドを欠失させた結果、プラスミドのT7-lacプロモーターが抑制解除されることにより、発現レベルが上昇した。しかし、上記実施例２４ｄに記載したのと同じ条件下で精製した場合には、アフィニティ精製可溶性組換え型タンパク質の収量は、極めて低かった（培養物１リットルあたり、約６００μg）。こうした結果となったのは、BL21(DE3)宿主での発現の結果、pHisBotタンパク質が不溶性の封入体として極めて高レベルで発現したことによるものであり、このことは、誘導を行ったBL21(DE3)培養物から調製したタンパク質のSDS-PAGEでの分析結果に示されている（図７、レーン１−７、後述）。こうした結果から、pHisBotタンパク質がE．coli細胞にとって本来毒性というわけではなく、適切なプロモーター／宿主の組み合わせを使用すれば、高レベルでの発現が可能であることが実証された。
【０２１４】
図７は、pHisBotプラスミドを含むBL21(DE3)細胞から調製した抽出物をローディングしたSDS-PAGEのゲル（１２．５％のアクリルアミド）をクーマシーブルーで染色したものを示す。各レーンには、２．５μｌのタンパク質試料を２．５μｌの２×SDS試料緩衝液と混ぜたものをローディングした。試料は、実施例２２ｂに記載したようにして取り扱った。ゲルには、以下の試料を加えた。レーン１−７は、BL21(DE3)宿主から単離したタンパク質を含む。レーン８−１４は、BL21(DE3)pLysS宿主から単離したタンパク質を含む。全タンパク質を、レーン１、２、４、６、８、１０、及び１２にローディングした。可溶性タンパク質を、レーン３、５、７、９、１１、及び１３にローディングした。レーン１は、非誘導宿主細胞から得たタンパク質を含む。レーン２−１３は、３時間にわたって誘導した宿主細胞から得たタンパク質を含む。ＩＰＴＧは、最終濃度が０．１mM（レーン６−７）、０．３mM（レーン４−５）、１．０mM（レーン２、３、８−１３）となるまで加えた。培養物は、LBブロス（レーン８−９）、2X YTブロス（レーン１０−１１）、あるいはテリフィックブロス（レーン１−７、１２−１３）中で生育させた。レーン３、５、及び７に見られるpHisBotタンパク質は、それぞれレーン２、４、及び６からまぎれ込んだ不溶性タンパク質である。レーン１４には、高分子量タンパク質マーカー（BioRad）をローディングした。
【０２１５】
BL21(DE3)宿主を利用して、十分に高レベル（すなわち、約１０mg/ml）の可溶性pHisBotタンパク質を発現させることができるかどうかを判定する目的で、各種の発現条件を調べた。変更した条件は、温度（３７又は３０℃での生育）、培養液（2× YTブロス、LBブロス、又はテリフィックブロス）、ならびに誘導物質のレベル（０．１、０．３、又は１．０mMのＩＰＴＧ）である。これらの変数についての全ての組み合わせを調べ、次に、［上掲のWilliamsら（１９９４）に記載されたようにして、１mlの試料から調製した］全抽出物ならびに可溶性抽出物をSDS-PAGEで分析することによって、誘導レベルならびに可溶性を評価した。
【０２１６】
培養物は、いずれも、１５mlのチューブ（Falcon #2057）で生育させた。培養液は、いずれも、適当な温度であらかじめ一晩暖め、１００μg/mlのアンピシリンと０．２％のグルコースを加えておいた。テリフィックブロスは、１２g/lのバクト−トリプトン、２４g/lのバクト−酵母抽出物、及び１００ml/lの、０．１７M KH2PO4および０．７２M K2HPO4を含有する溶液を含有している。培養物は、（確実に空気が混入するよう）回転ホイールに載置して、インキュベータ中で、ＯＤ600が約０．４となるまで生育させ、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。いずれの場合も、温度、培養液、誘導物質の濃度にかかわりなく、不溶性pHisBotタンパク質が高レベルで発現するのが観察された。
【０２１７】
次に、２３℃で生育させた2× YTの培養物で、ＩＰＴＧの濃度を変化させた場合の効果を調べた。ＩＰＴＧは、最終濃度が、１mM、０．１mM、０．０５mM、あるいは０．０１mMのいずれかとなるまで加えた。この温度では、１mMのＩＰＴＧが存在しても、０．１mMのＩＰＴＧが存在しても、同様のレベルのpHisBotタンパク質が誘導され、この発現レベルは、さらに高温の場合に観察されるレベルよりは低かった。（２３℃にて、１．０mMならびに０．１mMのＩＰＴＧで誘導した場合と比べると、）誘導されるタンパク質のレベルは、ＩＰＴＧを０．０５mMとすると低減し、０．０１mMとすると、誘導が生じなくなった。しかし、この宿主中で、誘導されたpHisBotタンパク質が可溶性となるような条件は観察されなかった。このように、BL21(DE3)宿主を使用すると、（BL21(DE3)pLysS宿主の場合と比較して、）発現レベルが上昇するものの、この宿主中では、可溶性タンパク質がうまく生成するような条件を特定することができなかった。
【０２１８】
こうした結果から、可溶性pHisBotタンパク質の生成は、T7-lacプロモーターとともにBL21(DE3)pLysS宿主を使用することによって達成されていることが実証された。
【０２１９】
ii）温度、培養液、ＩＰＴＧ濃度、誘導時間の変化によって生じる効果 ［BL21(DE3)pLysS宿主中での］pHisBot発現構築物からの、組換え型ボツリヌスタンパク質の発現に、各種培養液中で宿主細胞を生育させることが及ぼす効果を調べた。pHisBotプラスミドを含むBL21(DE3)pLysS細胞を、LBブロス、2× YTブロス、又はテリフィックブロスのうちのいずれかの中で、３７℃にて生育させた。１mMのＩＰＴＧを３時間の誘導時間にわたって使用することによって、細胞を誘導した。pHisBotタンパク質の発現は、細胞を2× YTブロス中で生育させた場合に、最も高いことが見いだされた（図７、レーン８−１３を参照されたい）。
【０２２０】
次に細胞を、2× YTブロス中で３０℃にて生育させ、ＩＰＴＧの濃度を１．０mM、０．３mM、０．１mMと変化させ、誘導時間を３時間あるいは５時間とした。pHisBotタンパク質の発現は、誘導物質の３種の使用濃度のいずれでも同様であり、誘導タンパク質のレベルは、３時間の誘導を行った場合より、５時間の誘導を行った場合の方が高かった。
【０２２１】
pHisBotタンパク質の発現について最適であることが見いだされた条件を使用して、大量培養を行い、pHisBotタンパク質の大量精製を行ううえで十分な材料を得た。１リットルの培養物３つを、１００μg/mlのアンピシリン、３４μg/mlのクロラムフェニコール、０．２％のグルコースを含有する2× YT培養液で生育させた。培養物は、３０℃で生育させ、１．０mMのＩＰＴＧで５時間にわたって誘導した。培養物を集め、特表2002-514866実施例１８に記載したようにして可溶性の溶解産物を調製した。可溶性溶解産物のバッチ吸収を１時間でなく３時間にわたって行った以外は、実施例２４ｄに記載したようにして大量精製を行った。最終的に、培養物１リットルあたり１３mgのpHisBotタンパク質が得られた。このpHisBotタンパク質は、全可溶性タンパク質の０．７５％であった。
【０２２２】
上記結果によって、可溶性のpHisBotタンパク質が生成する生育条件が実証された。（すなわち、BL21(DE3)pLysS宿主、2× YT培養液、３０℃、５時間にわたる１．０mMのＩＰＴＧの使用。）
ｂ）精製パラメータの最適化 精製条件の最適化のために、上述のようにして、大量培養物（３×ｌリットル）を３０℃で生育させ、１mMのＩＰＴＧで５時間にわたって誘導した。実施例２４ｄに記載されたようにして、培養物をプールし、遠心用ボトルに分注し、冷却し、ペレット化した。細胞ペレットは、使用時まで−７０℃で凍結したままとした。各細胞ペレットは、１リットルの出発培養物の１／３に相当するものとし、各ボトルを、以下に記載する最適化実験のそれぞれで使用した。こうすることにより、各実験で使用する細菌が標準化され、アフィニティ精製pHisBotタンパク質の収量を各種最適化実験間で比較することが可能となった。
【０２２３】
ｉ）結合特異性（ｐＨプロトン化）
pHisBot培養物の溶解産物をＰＢＳ（pH８．０）中で調製し、Econoクロマトグラフィーシステム（BioRad）を使用し、流量を０．２ml／分（３−４カラム容積／時）として、ＰＢＳ（pH８．０）で平衡化しておいた３mlのNi-NTAカラムに加えた。溶出液の吸光度（ＯＤ280）が基底レベルに復帰するまで、カラムをＰＢＳ（pH８．０）で洗浄した。次に、流量を２ml／分に増やし、カラムをＰＢＳ（pH７．０）で平衡化した。ｐＨ勾配（ｐＨ７．０から４．０へ、ＰＢＳを使用）をかけ、結合したpHisBotタンパク質をカラムから溶離させた。分画を集め、その一部をSDS-PAGEゲルで展開した。PAGEゲルをウェスタンブロッティングし、実施例２２に記載したようにして、ニワトリ抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイド抗体を使用して、pHisBotタンパク質を検出した。
【０２２４】
ウェスタンブロット分析によって、pHisBotタンパク質は、pH６．０で、Ni-NTAカラムから溶離しはじめると判定された。この結果は、Hisタグ付きタンパク質モノマーの推定溶離pHである５．９と符合する。
【０２２５】
こうした結果から、ＰＢＳ中でNi-NTA樹脂からpHisBotタンパク質がプロトン化（溶離）されるのがpH６．０であることが実証された。
【０２２６】
ii）結合特異性（イミダゾール競合）
未変性のE．coliタンパク質をNi-NTAカラムから除去し、なおかつ、pHisBotタンパク質はカラムに結合したまま残しうるような精製条件を決定するために、以下の実験を行った。pHisBot培養物の溶解産物を、５０mM NaHPO4、０．５M NaCl、８mMイミダゾール（pH７．０）中で調製した。この溶解産物を、Econoクロマトグラフィーシステム（BioRad）を使用し、５０mM NaHPO4、０．５M NaCl（pH７．０）で平衡化しておいた３mlのNi-NTAカラムに加えた。０．２ml／分（３−４カラム容積／時）の流量を使用した。溶出液の吸光度が基底レベルに復帰するまで、５０mM NaHPO4、０．５M NaCl（pH７．０）でカラムを洗浄した。次に、流量を２ml／分に増やした。
【０２２７】
イミダゾールのステップ勾配［５０mM NaHPO4、０．５M NaCl（pH７．０）への溶液］を使用して、カラムを溶離させた。イミダゾールの溶離ステップは、２０mM、４０mM、６０mM、８０mM、１００mM、２００mM、１．０Mとし、溶離後は、（カラムからニッケルを取り除き、残りのタンパク質をすべて除去するために）０．１mM EDTAで洗浄を行った。各ステップとも、ＯＤ280が基底レベルに復帰するまで、洗浄を行った。画分をSDS-PAGEゲルで展開し、ウェスタンブロッティングし、pHisBotタンパク質の検出を、ニワトリ抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイド抗体を使用し、実施例２２に記載したようにして行った。２枚のゲルをクーマシーブルーで染色して、各画分中の溶離タンパク質を検出した。
【０２２８】
PAGE分析の結果に示されているように、非特異的に結合している細菌タンパク質の大半が、２０mMのイミダゾールによる洗浄によって除去され、残りの細菌タンパク質が、４０mMならびに６０mMのイミダゾールによる洗浄によって除去されている。pHisBotタンパク質は、イミダゾール濃度が１００mMの時点で溶離しはじめ、イミダゾール濃度が２００mMのときに定量的に溶離した。
【０２２９】
こうした結果によって、E．coliタンパク質がカラムから最適なかたちで除去され、しかも、pHisBotタンパク質がこの緩衝液中に特異的に保持されるようなイミダゾール洗浄強度の範囲を正確に特定することができた。こうした結果から、pHisBotタンパク質の精製を、宿主タンパク質の混入なしに行いうる条件が判明した。
【０２３０】
iii）精製用緩衝液、及び最適化した精製プロトコール 可溶性pHisBotタンパク質のバッチ精製に際しての最適化したプロトコールを開発するにあたって、各種の精製パラメータについて調べた。分析結果を、以下にまとめて示す。
【０２３１】
数種の緩衝液を使用して（実施例２４ｄに記載されたようにして）バッチ精製を行い、pHisBotタンパク質をNi-NTAカラムに結合する際に、もっと別の緩衝液を使用できるか否かを判定した。その結果、Tris-HCl（pH７．９）又はNaHPO4（pH８．０）緩衝液を用いた場合でも、pHisBotタンパク質をNi-NTA樹脂に定量的に結合させうることが判明した。NaHPO4緩衝液中のpHisBotタンパク質の結合は、５mM、８mM、あるいは６０mMのイミダゾールを使用しても阻害されることはなかった。５０mMNaHPO4、０．３M NaCl（pH３．５−４．０）を含有し、１０％グリセロールも含有する／しない緩衝液中では、結合したpHisBotタンパク質を定量的に溶離させることができた。しかし、凍結・解凍（アフィニティ精製溶離液を−２０℃で数週間保存後）の前後に可溶性のアフィニティ精製pHisBotタンパク質を定量したところ、グリセロール含有緩衝液を使用した場合には、タンパク質の９４％が回収されるのに対し、グリセロール非含有緩衝液を使用した場合には、６８％のタンパク質しか回収されないことが明らかとなった。このことは、溶離タンパク質を冷凍温度（たとえば、−２０℃）で保存した場合、こうした低ｐＨの緩衝液中では、グリセロールが、pHisBotタンパク質の可溶性を増強していることを実証するものである。NaH2PO4緩衝液を加えてｐＨを中和しても、タンパク質の明らかな沈殿は生じなかった。
【０２３２】
バッチ形式を使用した場合、pHisBotタンパク質が定量的に結合しはじめるのは、４℃で結合（結合の間は樹脂を撹拌）してから１時間後ではなく、３時間後であることがわかった（図８）。図８は、BL21(DE3)pLysS宿主で調製した溶解産物からpHisBotタンパク質を精製する間に単離したタンパク質試料を含むSDS-PAGEゲル（７．５％アクリルアミド）をクーマシーブルーで染色したものを示す。各レーンには、５μｌのタンパク質試料を５μｌの２×試料緩衝液と混ぜたものをローディングし、実施例２２ｂに記載したようにして処理を行った。レーン１は、高分子量タンパク質マーカー（BioRad）を含む。レーン２および３は、Ni-NTA樹脂から溶離したタンパク質を含む。レーン４は、Ni-NTA樹脂とともに３時間のバッチインキュベーションを行った可溶性タンパク質を含む。レーン５および６は、それぞれ、可溶性タンパク質と全タンパク質を含む。図８からは、pHisBotタンパク質が完全に可溶性であることがわかる［レーン５とレーン６を比較のこと。双方のレーンに、同じような量の５０kDのpHisBotタンパク質が認められる。もし、実質的な量（２０％以上）のpHisBotタンパク質が宿主中で部分的に不溶性であったとすれば、レーン６（全タンパク質）には、レーン５（可溶性タンパク質）より多量のpHisBotタンパク質が認められるはずである］。図８からは、Ni-NTA樹脂で３時間にわたってバッチ吸収を行った後は、pHisBotタンパク質が溶解産物から完全に除去されていることもわかる（レーン４とレーン５を比較のこと）。
【０２３３】
すでに報告されているように、Ni-NTA樹脂とHisタグ付きタンパク質とが、高アフィニティ（pH８．０で、Kd＝1×1013）の相互作用を生じることから、樹脂−タンパク質複合体を、結合タンパク質の有意な溶離を生じることなく扱いうるはずであることが示唆された。実際、組換え型タンパク質をNi-NTA樹脂に結合させた後は、この樹脂−pHisBotタンパク質複合体は高度に安定で、１６００×gで２分間の遠心を繰り返しても、結合が維持されることが示された。この遠心分離過程を５０mlのチューブ（Falcon）中で実施すると、密な樹脂ペレットが生成し、用済みの可溶性溶解産物を上清を捨てることによって除去し、ペレットを洗浄緩衝液に再懸濁することが可能となった。遠心分離によって、さらに洗浄を行うことも可能である。このように、さらに洗浄を行うことが可能なので、組換え型タンパク質を樹脂に結合させておいてから遠心分離を行うだけで溶解産物を除去できる、大量の溶解産物のバッチ吸収用のプロトコールを開発することが可能となる。
【０２３４】
以下のような簡略化された統合プロトコールを開発した。誘導を行った細胞のペレットを結合緩衝液［５０mM NaHPO4、０．５M NaCl、６０mMイミダゾール（pH８．０）］に再懸濁し、４×２０秒間超音波処理し、１０，０００×gで２０分間遠心分離することによって、可溶性溶解産物を調製した。NP-40を０．１％となるまで加え、（結合緩衝液で平衡化しておいた）Ni-NTA樹脂を加えた。出発培養物１リットルあたり、１：１スラリー（樹脂：結合緩衝液）８mlを使用した。
【０２３５】
混合物を、４℃で３時間にわたって攪拌した。スラリーを、内径１cmのカラム（BioRad）に加え、０．１％のNP-40を含有する結合緩衝液で洗浄し、さらに、基底レベルとなるまで結合緩衝液で洗浄した（これらの過程のかわりに、樹脂を遠心し、NP-40を含有する結合緩衝液に再懸濁し、さらに遠心分離ならびに結合緩衝液への再懸濁を行うことも可能である）。５０mM NaHPO4、０．３M NaCl（pH７．０）で樹脂を洗浄することにより、イミダゾールを除去した。pHが低い（pH３．５−４．０）以外は同一の緩衝液（５０mM NaHPO4、０．３M NaCl）を使用して、樹脂に結合したタンパク質を溶離した。
【０２３６】
このプロトコールに従って、パイロット精製を実施したところ、１８mg/lのアフィニティ精製pHisBotが得られた。SDS-PAGEゲルのクーマシーブルー染色によって推定したところ、pHisBotタンパク質の純度は９０％以上であった。この値は、アフィニティ精製した可溶性pHisBotタンパク質の収量の観察値としてはもっとも高く、また、このプロトコールを用いると、イミダゾール含有結合緩衝液ならびに洗浄緩衝液を別途用いる必要がなくなる。上記結果は、組換え型pHisBotタンパク質をアフィニティ精製する際の簡潔かつ高効率のプロトコールばかりでなく、そうしたpHisBotタンパク質の単離に際して使用しうる各種精製条件も示している。
【０２３７】
実施例２６ pHisBotタンバク質は有効な免疫原である
実施例２３では、pMBotタンパク質で鼻から免疫感作を行うと、マウス血清中で中和抗体が生成されることが明らかとなった。しかし、pMBotタンパク質を精製すると、有意量のエンドトキシンも同時に精製されてしまい、このエンドトキシンの除去が容易ではないことも見いだされた。その点、pHisBotタンパク質は、エンドトキシンの有意な混入を生じることなく単離することができるので、ワクチン生成用候補物質として、pMBotタンパク質より優れている。pHisBotのワクチンとしての適性をさらに調べるために、pHisBotタンパク質の免疫原性を以下のようにして判定し、マウスでのpMBotタンパク質とpHisBotタンパク質の相対的な免疫原性を比較した。
【０２３８】
GerbuGMDPアジュバント（CC Biotech）を使用して、pMBotタンパク質又はpHisBotタンパク質で、２群の８匹のBALBcマウスを免疫感作した。pMBotタンパク質（１０mMのマルトースを含有するＰＢＳへの溶液）又はpHisBotタンパク質（５０mMNaHPO4、０．３M NaCl、１０％グリセロール（pH４．０）への溶液）は、Gerbuアジュバントと混合してから、マウスの免疫感作に用いた。各マウスは、０日目に、１００μｌの抗原／アジュバント混合物（５０μgの抗原＋１μgのアジュバント）の腹腔内注射を受けた。マウスは、１４日目ならびに２８日目に、投与経路を筋肉内注射とした以外は上述のようにして、追加免疫を行った。これらのマウスを、７７日目に出血させ、各群の個々のマウスから採取した血清を使用して、抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイドの力価を（実施例２３に記載したようにして）測定した。結果を表８に示す。
【０２３９】
【表８】
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上記表８に示された結果によって、各群の１００％のマウス（８／８）が、非免疫状態から免疫状態へのセロコンバージョンを示したことに見られるように、pMBotタンパク質及びpHisBotタンパク質のいずれも、マウスに対して免疫原性を有することが実証された。この結果からは、抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイドＩｇＧの平均力価が、pHisBotタンパク質による免疫感作を行った場合の方が、pMBotタンパク質による免疫感作を行った場合より、２−３倍高いことも示された。このことから、pHisBotタンパク質の方が、pMBotタンパク質より免疫原として優れている可能性が示唆された。
【０２４０】
実施例２７ 組換え型pHisBotタンパク質による免疫感作により、中和抗体が生成する
実施例２６で示された結果から、pHisBotタンパク質及びpMBotタンパク質のいずれも、免疫感作を行った宿主中で、高力価の抗クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイド反応性抗体を誘導しうることが実証された。pHisBotタンパク質又はpMBotタンパク質のどちらかで免疫感作したマウス由来の免疫血清が、クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイドをin vivoで中和する能力を、実施例２３ｂに記載されたマウス中和アッセイを使用して判定した。
【０２４１】
実施例２６で、pMBotタンパク質又はpHisBotタンパク質で免疫感作した８匹のBALBcマウス２群に、７７日目に出血させてから１週間の経過後に、追加免疫を行った。追加免疫は、実施例２６に記載したようにして、pMBotタンパク質（１０mMのマルトースを含有するＰＢＳへの溶液）又はpHisBotタンパク質（５０mMNaHPO4、０．３M NaCl、１０％グリセロール（pH４．０）への溶液）をGerbuアジュバントと混合することによって行った。各マウスは、１００μｌの抗原／アジュバント混合物（５０μgの抗原＋１μgのアジュバント）の腹腔内注射を受けた。各マウスは、この追加免疫の６日後に出血させ、同一グループ内のマウスの血清をプールした。前免疫マウスからの血清も集めた（この血清は、表７の脚注に記載したのと同じ血清である。）
プール血清、あるいは前免疫血清中に中和抗体が存在するか否かは、マウスに、５ＬＤ50単位のＡ型トキシンを１００μｌのプール血清と混合したものを投与してみることによって調べた。すなわち、（投与対象マウス１匹について、）各プールの血清１００μｌを、精製したＡ型トキシン標準（５０ＬＤ50／ml、実施例２３ｂに記載されたとおりに調製）１００μｌならびにゲルーリン酸塩５００μｌと混ぜることによって調べた。混合物を、ときどきかきまぜながら、室温で３０分間インキュベートした。４匹のマウスのそれぞれに、混合物（０．７ml/匹）を腹腔内注射した。マウスは、７２時間にわたって、ボツリヌス中毒の徴候に関して観察を行った。トキシンを、pHisBotタンパク質又はpMBotタンパク質のいずれかで免疫感作したマウスから採取した血清と混ぜたものの投与を受けたマウスは、ボツリヌス中毒症状を示さなかったのに対し、前免疫血清の投与を受けたマウスは、２４時間以内に死亡した。
【０２４２】
こうした結果から、組換え型クロストリジウム・ボツリヌスＣ断片タンパク質であるpHisBotならびにpMBotのいずれかを免疫原として使用した場合、クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシンを中和しうる抗体が誘導されることが実証された。
【０２４３】
実施例２８〜５３  削除
【０２４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ウエスタンブロットによる抗クロストリジウム・ボツリヌスＩｇＹの反応性を示す。
【図２】 図２は、ＥＬＩＳＡで測定した卵中のクロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキソイドに対するＩｇＹ抗体の力価を示す。
【図３】 図３は、クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシンの発現構築体であり；クロストリジウム・ボツリヌス又はクロストリジウム・ディフィシル配列を提供するのに用いた構築体も示す。
【図４】 図４は、組換えクロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシン融合タンパク質の精製を示す、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図５】 図５は、クロストリジウム・ボツリヌスＡ型トキシンの発現構築体であり；
クロストリジウム・ボツリヌス配列を提供するのに用いた構築体も示す。
【図６】 図６は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いたｐＨｉｓＢｏｔタンパク質の精製を示す、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図７】 図７は、ＢＬ２１（ＤＥ３）［及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞中におけるｐＨｉｓＢｏｔタンパク質の発現を示す、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図８】 図８は、バッチ吸収法を用いたｐＨｉｓＢｏｔタンパク質の精製を示す、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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