(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
0003967769.tif 000020
〔式中、
Ｒ1は、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基もしくはその荷電形、ホスホノ（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基もしくはその荷電形またはジメトキシホスホノイルオキシ基もしくはその荷電形；
Ｒ2およびＲ2'は、それぞれアシル基またはＹ基であるが、但し少なくともＲ2またはＲ2'がＹ基である；
Ｒ3およびＲ3'は、それぞれ水素、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基または（Ｃ1−Ｃ3）アシル基；
Ｒ4は、水素、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基または（Ｃ1−Ｃ3）アシル基；
Ｒ4'は、ジメトキシホスホノイル基またはホスホノ基またはその荷電形；および
Ｒ6'は、水素、ヒドロキシル基、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基、ヒドロキシスルホニルオキシ基、それらの荷電形、またはＺ基；
ここで、Ｙ基は、アシルオキシアシル基、アシルアミノアシル基、アシルチオアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルアミノアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルチオアシル基からなる群から選択される基；および
Ｚ基は、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシ基；（Ｃ1−Ｃ24）アシルオキシ基；３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソニックアシッド（ＫＤＯ）；（ＫＤＯ）n（ｎ＝１−１０）；ポリサッカライド側鎖；コア成分；およびアミノ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−カルボキシル基からなる群から選択される基である。〕
を有するβ（１→６）グルコサミンジサッカライドまたはその塩。
【請求項２】
Ｙ基がアシルオキシアシル基、３−アシルアミノアシル基および３−アシルチオアシル基を含む、請求項１記載のジサッカライド。
【請求項３】
Ｙ基が３−アシルオキシアシル基である、請求項１または２記載のジサッカライド。
【請求項４】
アシル基が脂肪酸残基、３−ヒドロキシ脂肪酸残基、３−オキソ脂肪酸残基である、請求項１〜３のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項５】
Ｙ基を形成するアシルオキシアシル基、アシルアミノアシル基およびアシルチオアシル基が、脂肪酸残基、３−ヒドロキシ脂肪酸残基、３−オキソ脂肪酸残基からなる群から選択されるアシル部分を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項６】
Ｙ基が、３−ヒドロキシ位で（Ｃ1−Ｃ20）−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシ（Ｃ4−C24）−脂肪酸−アシルエステルであるアシルオキシアシル基である、請求項３〜５のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項７】
アシルオキシアシル基が３−ヒドロキシ位でＣ12−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸−アシルエステルである、請求項６記載のジサッカライド。
【請求項８】
アシルオキシアシル基が３−ヒドロキシ位でＣ14−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸−アシルエステルである、請求項６記載のジサッカライド。
【請求項９】
Ｒ2'がＹ基である、請求項１〜８のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１０】
Ｒ2がＹ基である、請求項１〜８のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１１】
３−ヒドロキシ脂肪酸残基が、３−ヒドロキシ（Ｃ4−Ｃ24）−脂肪酸である、請求項５〜１０のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１２】
３−ヒドロキシ脂肪酸残基が、３−ヒドロキシ（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸である、請求項１１に記載のジサッカライド。
【請求項１３】
３−ヒドロキシ脂肪酸残基が３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸である、請求項１１または１２記載のジサッカライド。
【請求項１４】
Ｒ2が３−ヒドロキシ脂肪酸残基である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１５】
Ｒ2'が３−ヒドロキシ脂肪酸残基である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１６】
Ｒ2およびＲ2'が両方ともＹ基である、請求項１〜１０のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項１７】
Ｒ2およびＲ2'が両方とも、３−ヒドロキシル位で（Ｃ1−Ｃ20）−脂肪酸と結合したＮ結合３−ヒドロキシ（Ｃ4−Ｃ24）−脂肪酸−アシルエステルである、請求項１６記載のジサッカライド。
【請求項１８】
Ｒ2が３−ヒドロキシ位でＣ16−脂肪酸と結合したＮ結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルであり、Ｒ2'が３−ヒドロキシ位でＣ12−脂肪酸と結合したＮ結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルである、請求項１７記載のジサッカライド。
【請求項１９】
Ｒ4が水素である、請求項１〜１８のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２０】
Ｒ1がα配置である、請求項１〜１９のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２１】
Ｒ3が水素である、請求項１〜２０のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２２】
Ｒ3'が水素である、請求項１〜２１のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２３】
Ｒ6'がヒドロキシル基である、請求項１〜２２のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２４】
ジサッカライドが１個またはそれ以上のカチオンを含む塩形である、請求項１〜２３のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項２５】
カチオンがアルカリ金属イオンである、請求項２４記載のジサッカライド。
【請求項２６】
活性成分として請求項１〜２５のいずれかに記載のジサッカライドおよび製剤学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、免疫調節剤である医薬組成物。
【請求項２７】
活性成分として請求項１〜２５のいずれかに記載のジサッカライドおよび製剤学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、抗癌剤である医薬組成物。
【請求項２８】
活性成分として請求項１〜２５のいずれかに記載のジサッカライドおよび製剤学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、ワクチンである医薬組成物。
【請求項２９】
免疫調節剤および／または抗癌剤として使用するための、請求項１〜２５のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項３０】
ワクチン成分として使用するための、請求項１〜２５のいずれかに記載のジサッカライド。
【請求項３１】
ポリサッカライド側鎖が天然リポポリサッカライド由来の側鎖であり、コア成分が天然リポポリサッカライド由来の成分である、請求項１に記載のジサッカライド。
【請求項３２】
アシルオキシアシル基が、３−ヒドロキシ位で（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシ（Ｃ8−Ｃ18）−脂肪酸−アシルエステルである、請求項６に記載のジサッカライド。
【請求項３３】
Ｒ2およびＲ2'が両方とも、３−ヒドロキシル位で（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸と結合したＮ結合３−ヒドロキシ（Ｃ8−Ｃ18）−脂肪酸−アシルエステルである、請求項１７に記載のジサッカライド。
【発明の詳細な説明】
本発明は特定のグルコサミンジサッカライド、特に２−Ｎ−および／または２'−Ｎ−アシル化グルコサミンジサッカライド（ここで、少なくとも一つのアシル基は分枝鎖である）およびこれらのジサッカライドを含む化合物に関する。本発明は、更に、このジサッカライドを、リポポリサッカライドのリピドＡ分子を含む出発物質から製造する方法に関し、これらの出発物質は特異的アルカリ処理に付される。本発明は、これらのジサッカライドを活性成分として含む医薬組成物および、即ち治療および予防におけるこれらのジサッカライドの使用にも関する。
リポポリサッカライドは、グラム陰性細菌のような微生物の内毒素を構成し、ポリサッカライド部分と脂質部分を含む。この脂質部分は、またリピドＡとも呼ばれ、リポポリサッカライドの内毒素特性を決定する（リッチェル，Ｅ．Ｔh．ら、Immunobiology，Vol.186，169-190頁［1993］）。
米国特許第４，９１２，０９４Ａ号において、減少した内毒素特性を示すが、その抗原および免疫刺激特性は維持している修飾リポポリサッカライドが記載されている。これらの修飾リポポリサッカライドは、３−Ｏ−脱アシル化され、酸加水分解により３−Ｏ−脱アシル化ジサッカライドに変換し得る。これらの化合物の中で、モノホスホリル３−Ｏ−脱アシル化ジサッカライドはジホスホリル３−Ｏ−脱アシル化ジサッカライドよりも毒性が低い。
本発明は、３−Ｏ−脱アシル化および３'−Ｏ−脱アシル化されているかまたは３−Ｏ−位および／または３'−Ｏ−位に短いＯ−結合アルキルまたはアシル基を含み、少なくともＮ−結合、分枝アシル基を２位または２'位もしくは２位および２'位の両方に含む、ジサッカライドに関する。これらの化合物はなお低い内毒素性を示すが、（免疫調節のような）生物活性を維持し、抗癌活性を有する。
これらの特異的グルコサミンジサッカライドが低内毒素性と維持された生物活性の組み合わせを有するのは驚きであった。なぜなら、Ｎ−結合アシル基を２−および２'位に含む合成３−Ｏ−および３'−Ｏ−脱アシル化グルコサミンジサッカライド（化合物３０７、タカダ，Ｈら、CRC Critical Reviews in Microbiology，Vol.16，477-523頁［1989］；および化合物ＬＡ−１９−ＰＰ、リッチェルら、［1993］）はインビトロ検定で免疫生物活性を示すが、これらの活性は対照細菌リピドＡ標本より遥かに弱かった。それらはまた典型的内毒素活性を欠いた。
従って、本発明は、一般式
0003967769.tif 000002
〔式中、
Ｒ1は、ヒドロキシル基、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基またはその荷電形、（Ｃ1−Ｃ5）アシルオキシ基、（Ｃ1−Ｃ5）アルキルオキシ基またはＸ基；
Ｒ2およびＲ2'は、それぞれアシル基またはＹ基であるが、但し少なくともＲ2またはＲ2'がＹ基である；
Ｒ3およびＲ3'は、それぞれ水素、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基または（Ｃ1−Ｃ3）アシル基；
Ｒ4は、水素、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基または（Ｃ1−Ｃ3）アシル基；
Ｒ4'は、水素、（Ｃ1−Ｃ5）アシル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、ジメトキシホスホノイル基またはホスホノ基またはその荷電形；および
Ｒ6'は、水素、ヒドロキシル基、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基、ヒドロキシスルホニルオキシ基、それらの荷電形、またはＺ基；
ここで、Ｘ基はカルボキシ（Ｃ1−Ｃ5）アルキルオキシ基；−Ｏ−ＣＨ−［（ＣＨ2）mＣＯＯＨ］［（ＣＨ2）nＣＯＯＨ］基（ｍ＝０−５およびｎ＝０−５）、ホスホノ（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基；ジメトキシホスホノイルオキシ基；ヒドロキシスルホニルオキシ基；ヒドロキシスルホニル（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基；およびＸ基の荷電形からなる群から選択される基；
Ｙ基は、アシルオキシアシル基、アシルアミノアシル基、アシルチオアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルアミノアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルチオアシル基からなる群から選択される基；および
Ｚ基は、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシ基；（Ｃ1−Ｃ24）アシルオキシ基；３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソニックアシッド（ＫＤＯ）；（ＫＤＯ）n（ｎ＝１−１０）；天然リポポリサッカライド由来の側鎖のようなポリサッカライド側鎖；天然リポポリサッカライド由来の成分のようなコア成分；およびアミノ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−カルボキシル基からなる群から選択される基である。〕
を有するβ（１→６）グルコサミンジサッカライトおよびその塩に関する。
これらのグルコサミンジサッカライドは、カブトガニ変形細胞融解物（ＬＡＬ）試験で測定して、例えば、エシェリキア・コリ（E.coli）由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、リピドＡおよび米国特許第４，９１２，０９４Ａ号に従った修飾リピドＡよりも遥かに低い内毒素性を示す。更に、これらの本発明のグルコサミンジサッカライドは酸化窒素反応性中間体および、インターロイキン１−アルファ（ＩＬ−１アルファ）、ＩＬ−６、癌壊死因子（ＴＮＦ）およびプロスタグランジン（ＰＧＥ）のようなサイトカインを誘発する。
加えて、これらのジサッカライドは、例えば腹膜癌において抗癌活性を示す。
最後に、これらのジサッカライドの急性毒性は非常に低い。１００mgジサッカライド／体重kgの静脈内投与後、スイスマウスにおいて死亡は見られなかった。
本発明は、また、生物起源の出発物質を使用したグルコサミンジサッカライドの製造法にも関し、その出発物質はグラム陰性細菌のような微生物由来のポリサッカライドのリピドＡ分子を含む。本発明により、これらの出発物質は、少なくとも、糖Ｏ−結合アシルおよび／またはＯ−結合オキシアシル基が除去されるような、アルカリ処理に付す。必要とあれば、アルカリ処理出発物質は、（酸処理による）ポリサッカライドおよびコア成分を除去するため、および１位、２位、３位、４位、２'位、３'位、４'位および６'位の置換基を変換または交換するための更なる処理に付し得る。
しかしながら、本発明のグルコサミンジサッカライトは、また、対応するグルコサミンジサッカライトから出発して、２および／または２'位に目的の置換基を挿入することにより得ることができる。
上記生物活性と組み合わさったこの非常に低い内毒素性のために、本発明のこれらのジサッカライドは、医薬組成物の優れた活性成分を形成する。このような医薬組成物およびジサッカライドそれ自身は、免疫調節剤、抗癌剤およびワクチン成分として使用し得る。
本発明のグルコサミンジサッカライド（β（１→６）Ｄ−グルコサミン２量体）は、それぞれのグルコサミンが３および３'位に実質的に内毒素性および／または生物活性を変化せしめないヒドロキシル基または短Ｏ−結合アルキルまたはアシル基、更に、少なくとも一つのＮ−結合分枝アシル基を２または２'位または２および２'位の両方に有することを特徴とする。残った２'または２位はＮ−アシル化される。おそらく、少なくともひとつは分枝アシル基の形である２位および２'の２個の疎水性鎖の存在が、非常に低い内毒素性と維持された生物活性の組み合わせをジサッカライドに付与する。
本明細書では一般にＹ基と呼ぶ分枝アシル基は、アシルオキシアシル基、アシルアミノアシル基、アシルチオアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルアミノアシル基および（Ｃ1−Ｃ24）アルキルチオアシル基からなる群から選択される。
２個のアシル基が、アシルオキシアシル基の場合酸素原子を経由して、アシルアミノアシル基の場合ＮＨ基を経由して、およびアシルチオアシル基の場合硫黄原子を経由して結合している。他のＹ基である、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルオキシアシル基、（Ｃ1−Ｃ24）アルキルアミノアシル基および（Ｃ1−Ｃ24）アルキルチオアシル基は、対応する水酸化脂肪酸から出発して得られ得る。
好ましくは、Ｙ基は、３−アシルオキシアシル基、３−アシルアミノアシル基および３−アシルチオアシル基のような３位で枝別れしているＮ−結合アシル基を意味する。同様のものが上記（Ｃ1−Ｃ24）アルキル等価物に当てはまる。
好ましくはＹ基は、１個または２個のアシル分子を有し、好ましくは脂肪酸残基、水酸化脂肪酸残基および酸化脂肪酸残基から選択される。アシルオキシアシル基が好ましくは３−アシルオキシアシル基である場合、これらのアシル分子は３−ヒドロキシ脂肪酸残基またはエステル結合基において３−オキソ脂肪酸残基を有する。アシルオキシアシル基の典型的な例は、３−ヒドロキシ位で（Ｃ1−Ｃ24）カルボン酸とエステル結合している３−ヒドロキシ（Ｃ4−Ｃ24）−脂肪酸アシルである。好ましくはアシルオキシアシル基は、３−ヒドロキシ位で（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸とエステル結合している３−ヒドロキシ（Ｃ8−Ｃ18）−脂肪酸アシルである。このようなアシルオキシアシル基は、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ロードシクラス・ゲラチノサス（Rhodocyclus gelatinosus）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のようなグラム陰性細菌のリピドＡ成分に存在する。
本発明の好ましいグルコサミンジサッカライドの第１群において、アシルオキシアシル基は、Ｃ12−脂肪酸の３−ヒドロキシ位においてＣ12−脂肪酸、アシルオキシアシル基と２'位で結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸−アシルエステルである。他の好ましい本発明のグルコサミンジサッカライドにおいて、アシルオキシアシル基は、Ｃ14−脂肪酸と３−ヒドロキシ基で、およびアシルオキシアシル基と好ましくは２'位で結合したＮ−結合３ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルである。
他の好ましい本発明のグルコサミンジサッカライドにおいて、アシルオキシアシル基は、３−ヒドロキシ位においてＣ12−脂肪酸と、アシオルオキシアシル基と２位で結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルである。他の好ましい本発明のグルコサミンジサッカライドにおいて、アシルオキシアシル基は、３−ヒドロキシ位においてＣ12−脂肪酸と、アシオルオキシアシル基と２位および２'位の両方で結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルである。
Ｙ基がキラル中心を含む場合、本発明はすべてのＲおよびＳエナンチオマーおよび任意のラセミ混合物を含む。
他のＮ−結合置換基は、アシル基またはアシルオキシアシル基でもあり得る。本発明のジサッカライドの第２群により、アシル基は３−ヒドロキシ（Ｃ4−Ｃ24）−脂肪酸、好ましくは３−ヒドロキシ（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸である。本発明の好ましいジサッカライドにおいて、アシル基は２位または２'位の３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸である。
しかしながら、Ｎ−結合置換基は、また上記で定義のアシルオキシアシル基であり得、３−ヒドロキシ位で（Ｃ1−Ｃ20）カルボン酸とエステル結合したＮ−結合３−ヒドロキシ（Ｃ4−Ｃ24）−脂肪酸アシル、好ましくは３−ヒドロキシ基で（Ｃ10−Ｃ18）−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシ（Ｃ8−Ｃ18）−脂肪酸アシルエステルを含む。更に好ましくはＲ2が、３−ヒドロキシ位でＣ12−脂肪酸またはＣ16−脂肪酸と結合しているＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステル、Ｒ2'が３−ヒドロキシ位でＣ12−脂肪酸またはＣ14−脂肪酸と結合したＮ−結合３−ヒドロキシＣ14−脂肪酸アシルエステルである。
Ｙ基において、アシル基および／またはアシルおよびアルキル基が連結され得ることに注目する。
本明細書において、“脂肪酸残基”という語は：Ｃ2−Ｃ30の実質的に疎水性の鎖であり、鎖は１またはそれ以上の窒素、酸素、硫黄のようなヘテロ原子の挿入を有する直鎖、分枝鎖、飽和、モノまたはポリ不飽和で有り得、鎖はヒドロキシル、オキソ、アシルオキシ、アルキルオキシアミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲノ、スルヒドリルのような１個またはそれ以上の置換基で置換され得るが、ただし、生物活性は実質的に不利に影響を受けないことを意味する。置換脂肪酸残基（アミド結合置換基を含む）の例は、オノズカ，Ｋ．ら、Int.J.Immunopharmac，Vol.15，657-664頁［1993］に記載されている。
置換基Ｒ1は（Ｃ1−Ｃ5）アシルオキシ基または（Ｃ1−Ｃ5）アルキルオキシ基であり得、Ｒ4'は（Ｃ1−Ｃ5）アシル基または（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基であり得るが、ただし、グルコサミンジサッカライドの特性は不利に影響を受けない。更に、Ｒ1はヒドロキシル基およびＲ4は水素であり得る。好ましくはＲ1およびＲ4'はそれぞれホスホラス含有基であり得る。特に、１位または４'位のこのような基は、異なったサイトカイン刺激（タカダ，Ｈ．およびコタニ，Ｓ．、Bacterial Endotoxic Lypopolysaccharides、モリソン，Ｄ．Ｃ．およびリアン，Ｊ．、ＣＲＣプレス、Vol．１、107-134頁［1992］、特に123頁参照）のように生物活性に影響を与え得る。本発明の好ましいジサッカライドは、１位にジヒドロキシホスホノイルオキシ基および４'位にホスホノ基を有し、１位のこの基はα−配置が好ましい。
置換基Ｒ1はまたＸ基を意味する。Ｘ基は、通常、生理的ｐＨで陰性に荷電している。Ｘ基はカルボキシ（Ｃ1−Ｃ5）アルキルオキシ基であり得る。Ｘ基はまた式−Ｏ−ＣＨ−［（ＣＨ2）mＣＯＯＨ］［（ＣＨ2）nＣＯＯＨ］基（式中、ｍ＝０−１０およびｎ＝０−１０、例えばｍおよびｎ＝０、ｍおよびｎ＝１；およびｍ＝１およびｎ＝３）で示されるジカルボン酸でもあり得る。ｍおよびｎ＝１であるジカルボン酸の１位の置換基は、オノズカら、（1993）に記載されている。ジカルボン酸の代わりに、Ｘ基はホスホノメチル基またはホスホノエチル基のようなホスホノ（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基を意味する。
置換基Ｘはまた硫酸基またはヒドロキシスルホニルメチル基のようなヒドロキシスルホニルオキシ（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基の形を有し得る。
置換基Ｒ3およびＲ3'は、本発明のグルコサミンジサッカライドの内毒素性および／または生物活性に不利に影響を与えない短アルキル基または短アシル基である。例は、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基および（Ｃ1−Ｃ3）アシル基である。好ましくは、置換基Ｒ3およびＲ3'は両方とも水素であり、これは３位および３'位が両方ともアシル化されていないことを意味する。
４位の置換基Ｒ4は上記の意味を有する（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基または（Ｃ1−Ｃ3）アシル基である。４−Ｏ−アシル化ジサッカライドは、クスモト，Ｓ．ら、ACS Symposium Series，Vol.231，237-254頁（1983）に記載の方法を使用して合成し得る。しかしながら、好ましくは４位はヒドロキシル基である（Ｒ4＝Ｈ）。
置換基Ｒ6'は水素、ヒドロキシル基、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基、ヒドロキシスルホニルオキシ基、およびそれらの荷電形であり得る。
本発明のグルコサミンジサッカライドの水溶性を改善するために、６'位の置換基はＺ基により付与される促進された親水性を有し得る。Ｚ基は、直接リピドＡ成分に結合している天然ポリサッカライドの内部コアに存在するような３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソニックアシッド（ＫＤＯ）または数個のＫＤＯ分子であり得る。
Ｚ基は、天然リポポリサッカライド由来の側鎖のような完全または部分的ポリサッカライド鎖または天然リポポリサッカライド由来のコア成分でもあり得る。
Ｚ基はアミノ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−カルボキシル基でもあり得る。
本発明のジサッカライドの水溶性は、一方では荷電基、６'位の親水性特性の存在下で測定する。一方、水溶性は、グルコサミンジサッカライドが、塩の形の場合、または改善され得る。それらの塩は１個またはそれ以上のアルカリ金属カチオンおよび／またはアンモニウムイオンを含み、存在する場合、例えば、ジヒドロキシホスホノイルオキシ基、カルボキレート基、ホスホノ基、ヒドロキシスルホニルオキシ基およびヒドロキシスルホニルアルキル基と対を形成する。
任意のアルキルおよびアシル鎖または分子は、窒素、酸素、硫黄のような１個またはそれ以上のヘテロ原子の挿入を有する直鎖、分枝鎖、飽和、モノまたはポリ不飽和であり得、１個またはそれ以上の、ヒドロキシ、オキソ、アシルオキシ、アルコキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲノ、スルフィドリルのような置換基で置換され得るが、ただし、生物活性は不利には影響を受けない。
本発明のグルコサミンジサッカライドは、グラム陰性細菌のような微生物に存在するリポポリサッカライドのリピドＡ分子を含む出発物質から得られ得る。これらのリポポリサッカライドは、例えば、これらの微生物のフラクションを含む表面構造およびそれら由来のリポポリサッカライドに存在する。出発物質の源として使用するのに好ましいグラム陰性細菌は、エシェリキア・コリおよびヘモフィルス・インフルエンザエである。しかしながら、商業的に入手可能なＬＰＳまたはリピドＡも出発物質として使用し得る。
３位および３'位の選択的脱アシル化は、アルカリ処理を使用して行う。アルカリ処理の条件は、両方のグルコサミンが３−ヒドロキシ脱アシル化するように選択する。アシル処理は、水酸化ナトリウムまたは炭酸カリウムのようなヒドロキシド、カルボネートおよびホスフェートを使用して行い得る。例示的有機アルカリ剤は、ジエチルアミンおよびトリエチルアミンのようなアルキルアミンである。アルカリ処理は通常、水性または有機媒体中で行う。ｐＨは、典型的には１０−１４の範囲、例えば１１−１３であり、実際的な条件下ではｐＨは例えば１２．２である。アルカリ処理は、通常、環境温度から７０℃の間、例えば３７℃で行う。時間は出発物質のタイプに依存する。微生物から出発して、時間は１時間から１０日、例えば８時間から５日の間で変化するが、通常８−４０時間の間である。リポポリサッカライドまたはリピドＡから出発して、時間は０．２−１０時間、例えば１−５時間であり得る。実施において、時間は約１．５−３時間である。
出発物質が６'位に除去すべきコア成分を含む場合、出発物質をコア成分を除去するための酸処理に付す。この酸処理は、上記アルカリ処理の前または後に行い得る。酸処理は、１−５のｐＨ、好ましくは２．５−４．５のｐＨ、通常３より高く、４より低いｐＨ、例えば３．５で行う。ｐＨ１またはそれ以下では、グルコサミンジサッカライドは脱ホスホリル化し、モノホスホリル化形になる。使用すべき酸は、塩酸および氷酢酸のような無機および有機酸である。酸処理の時間は、約３０分から５時間、例えば１−２時間である。酸処理の間、温度は約７０−１００℃、例えば８０−１００℃、実施において９５℃に上昇させる。連続して、温度を環境温度まで下げる。
本発明のグルコサミンジサッカライドは、対応する脱、モノまたはジホスホリル化グルコサミン２量体から出発して、アシルオキシアシル基、アシルアミノアシル基および／またはアシルチオアシル基を２位および２'位の両方に結合させて得られ得る。
これらのグルコサミンジサッカライドの本発明による部分的脱アシル化および生産物の分離に続いて、２位または２'位に分枝アシル基を有するグルコサミンジサッカライドが得られる。
本発明のグルコサミンジサッカライドは、医薬組成物または医薬中で使用し得、酸化窒素反応性中間体およびサイトカインの産生の阻害、刺激または寛容性の誘発のための免疫調節剤として、適用頻度および用量に依存して、抗癌剤として、例えばＴ細胞再活性のための、ワクチン成分として、内毒素結合部位競合剤としておよびインターロイキンの調節剤として使用し得る。非常に低い内毒素性のため、これらのジサッカライドはほとんどまたは実質的に副作用がない。
本発明のジサッカライドは、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射等を使用して全身または局所的に投与し得る。用量は、動物またはヒト患者、年令、体重、処置すべき症状または病気、所望の治療効果、投与経路、処理期間等に依存して変化する。充分な効果が、１回またはそれ以上の一日量、または持続性放出形態として、０．００１−５００mg／体重kgを使用して得られる。
医薬組成物は、例えば、非経口投与用の薬理学的に許容可能な担体または希釈剤、水性または非水性懸濁液または乳濁液を含み得る。水性溶液または懸濁液は、蒸留水または生理食塩水を含み得る。非水性溶液はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、アルコールを含み得る。組成物は他の添加剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳濁化剤、分散剤等を含み得る。
本発明を更に完全に理解するために、以下の実施例に例を記載し、これは本明細書に説明の目的のみで提供し、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例１
エシェリキア・コリＩ−1147（Ｉ−1147の受託番号でＣＮＣＭに１９９１年１０月３日に寄託）を、組成が下記表１に記載の培養培地で培養した。
0003967769.tif 000003
オリゴメタル貯蔵溶液：ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  ２．５ｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ、ＮａＭｏＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ、ＮｉＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ、Ｈ3ＢＯ4  ０．０５ｇ、ＣｕＳＯ4  ０．０５ｇ、次いでＨ2Ｏ  １．０ｌを加え、混合し、Ｈ2ＳＯ4（８５％）１．１mlを加える。
培養培地のｐＨを５Ｎ  ＮａＯＨ、５％アンモニアまたは２５％ＨＣｌを使用して調節した。通気および撹拌（５００rpm）下で、エシェリキア・コリＩ−1147を３７℃、ｐＨ６．９で培養した。
続いて、発酵器の内容物を温度処理（１０５℃、２分）により不活性化した。
発酵器の不活性内容物を限外濾過（分離１０００ｋＤ）し、残った細菌を水性０．６％ＮａＣｌ溶液で洗浄した。洗浄細菌懸濁液を限外濾過により濃縮した。バイオマス収率乾燥重量７６４ｇ。
バイオマスを７．０ｇ／ｌに希釈し、１０．７７Ｎ  ＮａＯＨ３４５mlを加え、３７℃、４０時間（ｐＨ１２．２）でインキュベーションすることによりアルカリ処理した。
アルカリ抽出物を、第１限外濾過（分離１０００ｋＤ）および濾液の第２限外濾過（１０ｋＤ）に付す。第２限外濾過の保持物（retentate）を酸処理に付した。
保持物を水７．０ｌで希釈し、氷酢酸３７０mlを使用して酸性化した（最終ｐＨ３．５２）。混合物を１２０分間９５℃に撹拌しながら加熱した。続いて、酸性懸濁液を２５℃に冷却した。沈殿を遠心（４０００×ｇ、５０分）により分離した。ペレットを水（３．７ｌ）に再懸濁し、プロパン−２−オール（４．３ｌ）を使用した抽出に付し、６０分後、２５℃でトリエチルアミン２５２mlを加え（ｐＨ９．０）、撹拌を２４時間続けた。
上清を遠心（４０００×ｇ、２５℃、５０分）により回収し、ペレットを２回９０％プロパン−２−オールを使用して再抽出した。上清を合わせ、逆相クロマトグラフィー（ウォーターズ（Waters）Ｎo.10001、分取（preparative）Ｃ18、１２５Å）に付した。
別法として、酸処理抽出物を限外濾過に付し、保持物（＞１０００ｋＤ）を濃縮し、５容量の水に対して透析した。透析保持物を９容量のプロパン−２−オールで希釈し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）でｐＨ９に調節した。抽出は撹拌しながら、２時間行った。
上清を上記のように回収し、沈殿をプロパン−２−オールで再抽出した。上清を合わせ、真空濃縮（４０℃、１２トール）に付し、最後に逆相クロマトグラフィーＣ18プレプ・セップ・パック（Prep Sep Pak）（ウォーターズＮo.10001）に付した。
２つの上清それぞれを２容量の水で希釈し、５mＭテトラブチルアンモニウムホスフェート（ＴＢＡＰ）と混合し、ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰ２５０mlで予め調整した２５０ml逆相Ｃ18プレプ・セップ・パック（ウォーターズＮo.10001、分取Ｃ18、１２５Å）５０ｇを含むカラムにかけた。カラムを６０％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰおよび４０％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰで洗浄した。本発明のジサッカライドは、３０％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰおよび７０％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：９（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰの分画中で溶出した。
逆相クロマトグラフィーで得たジサッカライドフラクションを水１：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰで希釈し、分取ＨＰＬＣカラム（ミリポア−ウォーターズ・ボンドパックＣ１８  ３００Å  １５Ｍ、３００mm×４７mmφ）にかける。本発明のジサッカライドフラクションは、６７％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰおよび３３％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰで溶出した。このフラクションは本発明のジサッカライドＡ５５mgを含んだ。
ジサッカライドの脱塩
塩は、アリコートのジサッカライドＡから、下記のようにして除去した。セップ・パック・バック（Sep Pak Vac）Ｃ18プラス・カラム（シリカＣ18、０．６ml、ウォーターズＮo.20515）を、連続して、ＣＨＣｌ3−ＣＨＯＨ２：１（v/v）５ml、ＣＨ3ＣＮ５mlおよびＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）５mlを注ぐことにより調整した。ＨＰＬＣフラクショを３容量のＨ2Ｏで希釈して、全量６mlの希釈サンプルを得た後、サンプルをカラムにかけた。次いで、ＴＢＡＰはＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋１０mＭ  ＨＣｌ１０ml、続いてＣＨ3ＣＮ１０mlで溶出した。純粋ジサッカライドＡを、次いで、ＣＨＣｌ3−ＣＨ3ＯＨ２：１（v/v）５mlで回収した。
フラクションを３５℃の真空（１２トール）蒸発により乾燥した。脱塩ジサッカライドＡを、生理的および生化学的試験のためにＨ2Ｏ：ＴＥＡ１０００：１（v/v）に、またはＦＡＢ−ＭＳのためにクロロホルム：メタノール２：１（v/v）に溶解した。
ナトリウム塩形の製造
逆相Ｃ18プレプ・セップ・パック（ウォーターズＮo.10001、分取Ｃ18、１２５Å）１０ｇ含有カラムを、連続してＣＨ3ＣＮ５０mlおよびＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）５０mlで予備調整した。
サンプル（ＨＰＬＣフラクション）を１容量のＨ2Ｏで希釈後カラムにかけた。吸着後、カラムをＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰ１００mlで洗浄した。次いで、ジッサカライドを、プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰ５０mlで回収した。
得られたフラクションを下記のようにして精製した。Ｑ−セファロース・ファソト・フロー（ファルマシア17-0510-01）２０ml含有カラムを、連続して１Ｍ  ＮａＯＨ３０ml、中和のためにＨ2Ｏで洗浄、１Ｍ  ＨＣｌ３０mlおよび中和のためにＨ2Ｏで洗浄して調整した。
サンプルを直接カラムにかけた。吸着後、非吸着物質がＨ2Ｏ２００mlおよびプロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）１００mlで溶出した。ジサッカライドは、０．９％ＮａＣｌ：イソプロパノール１：１（v/v）１００mlで溶出した。
最終精製は、下記のように行った。逆相Ｃ18プレプ・セップ・パック１０ｇを、連続してＣＨ3ＣＮ５０ml、ＣＨＣｌ3−ＣＨ3ＯＨ２：１（v/v）５０ml、ＣＨ3ＣＮ５０ml、５０％ＣＨ2ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）５０mlで予め調整した。Ｈ2Ｏ１容量で希釈後、サンプルをカラムにかけた。吸着後、カラムを連続してＨ2Ｏ２００ml、プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）２００mlおよびＣＨ3ＣＮ５０mlで洗浄した。ジサッカライドはＣＨＣｌ3−ＣＨ3ＯＨ２：１（v/v）５０mlで溶出した。フラクションを３５℃の真空（１２トール）蒸発により乾燥した。
ナトリウム塩は非常に水溶性である（１００mg／mlまで）。
実施例２
ヘモフィルス・インフルエンザエ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズから購入（ATCC9795））を組成が下記表２に記載の培養培地で培養した。
0003967769.tif 000004
培養培地にヘミン（１０mg／ｌ）およびＮＡＤＨ（４mg／ｌ）を添加した。ｐＨを、５Ｎ  ＮａＯＨまたは２５％ＨＣｌを使用して７．０±０．３に調節する。静止相形成の開始後、培養を中断し、発酵器の内容物を温度処理（１００℃、１００秒）により不活性化した。不活性培養物を遠心に付し、分離バイオマスを０．６％水性ＮａＣｌ溶液で希釈した（約６０ｇ／ｌ）。１０Ｎ  ＮａＯＨを加え、最終濃度０．２Ｎ  ＮａＯＨにしてアルカリ処理を行った。処理は、撹拌しながら３７℃で５日間行った。
アルカリ処理融解物は、氷酢酸を使用してｐＨ３．５に酸性化した後、直接、酸処理に付した。混合物を９５℃で１２０分加熱し、続いて室温に冷却する。
沈殿を遠心（１０，０００×ｇ、３０分、４℃）し、上清を廃棄した。
沈殿をＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）に再懸濁し、ＴＦＡを使用してｐＨを９に調節した。遠心（１５，０００×ｇ、１０分）後上清を５mＭ  ＴＢＡＰに調節した。上清を、ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）を使用して調整したセップ・パック・バックＣ18カラム（シリカＣ18１０ｇ、３５ml、ウォーターズＮｏ．４３３４５）にかける。本発明のジサッカライドＢを含むフラクションをプロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰ５０mlで溶出した。
本フラクションを蒸発（３５℃、１２トール）により約２mlまで濃縮した。本フラクションを遠心（１５，０００×ｇ、５分）し、上清を半分取（semi-preparative）ＨＰＬＣ  Ｃ18カラム（マシェリー−ナゲル（Macherey-Nagel）Ｎo.715806、２５０mm×１０mmφ、ヌクレオシル300-7C18）にかけた。本発明のジサッカライドＢを含むフラクションは、２８％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰおよび７２％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰを含むフラクションで溶出した。
ジサッカライドＢは、実施例１と同様の方法を記載して脱塩した。
実施例３
エシェリキア・コリ０１１１：Ｂ４（シグマ、製品番号L3024）を０．２Ｍ  ＮａＯＨ中、３７℃、１．５時間のアルカリ処理に付した。溶液を１Ｍリン酸を使用して中和した。
アルカリ処理ＬＰＳ溶液４００μlを限外濾過（ミリポア・ウルトラフリーＭＣ、UFC3LGC00、分離１０ｋＤ）により濃縮した。
保持物（＞１０ｋＤ）をＨ2Ｏ４００μlで希釈し、氷酢酸を使用して０．２Ｍ酢酸に調節することによる酸処理に付した。酸性化溶液を、９５℃、１２０分加熱した。２５℃に冷却後、沈殿を遠心（１５，０００×ｇ、１０分）により沈殿させ、上清を廃棄した。沈殿をＨ2Ｏ：ＴＥＡ１０００：１（v/v）２０μlに溶解し、本溶液を分析ＨＰＬＣ  Ｃ18カラム（スペルコＮo.58985、スペルコシルLC-18、３μm、１５０mm×４．６mmφ）にかけた。本発明のジサッカライドフラクションは、４２％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰおよび５８％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰを含むフラクションで溶出した。
実施例４
エシェリキア・コリF-583のリピドＡ（シグマ、商品番号L5399）２mg／mlの溶液をＨ2Ｏ：ＴＥＡ１０００：１（v/v）で製造し、本溶液を、０．２Ｍ  ＮａＯＨ、３７℃で２．５時間アルカリ処理に付した。本溶液を１Ｍリン酸を使用して中和した。
中和溶液を分析ＨＰＬＣカラム（スペルコＮo.58958、スペルコシルLC-18、３μm、１５０mm×４．６mmφ）にかけた。本発明のジサッカライドは、４２％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＡＢＰおよび５８％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰで溶出した。
実施例５
２−アミノ−２−デオキシ−６−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート［ホルストら、Eur.J.Biochem．214（1993）695-701］をナトリウムメトキシド（正確に４．０mol当量）含有メタノールで処理し、次いで（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸無水物（２．２mol当量）［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸とＤＣＣ（０．５mol当量）の無水ジクロロメタン中での反応により製造、シャロンら、J.Chem.Soc.Perkin.Trans.I.（1984）2291-2295］で処理する。室温で１２時間後、水（２×メタノール量）を添加し、混合物をジエチルエーテルで抽出（３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸の除去のため）する。水相を濃縮し、本発明の粗ジサッカライドＣを逆相ＨＰＬＣに付す。生産物をＨ2Ｏ：ＴＥＡ１０００：１（v/v）に溶解し、テトラブチルアンモニウムホスフェート［ＴＢＡＰ］を添加し、５mＭの濃度にする。この溶液を、次いで、分取ＨＰＬＣカラム（ミリポア−ウォーターズ・ボンドパックＣ１８  ３００Å  １５Ｍ、３００mm×４７mmφ）にかける。ジサッカライドＣはＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰ（溶媒Ａ）およびプロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰ（溶媒Ｂ）（５０％Ａ／５０％Ｂから０％Ａ：１００％Ｂ、１％／分、流速８０ml／分）の勾配で溶出する。脱塩は下記のように行う。ジサッカライドＣを含むＨＰＬＣフラクションを水で希釈し、次いでＣ18セプ・パック・バック・プラス・カラム（ウォーターズ）［Ｃ１８逆相シリカゲル、連続してＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ２：１（v/v）、ＣＨ3ＣＮ、ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）で予備調整］にかける。ＴＢＡＰは、連続してＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）、１０mＭ  ＨＣｌおよびＣＨ3ＣＮで洗浄することにより溶出する。純粋ジサッカライドＣはＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ２：１（v/v）で溶出する。
実施例６
実施例５で得られるジサッカライドＣを含む水相（精製前）を水性水酸化ナトリウム（正確に１．０mol当量、濃度は最初のｐＨ１２．５を導く）で処理する；室温で２４時間後、混合物のｐＨを６．５から７に調整し、分取ＨＰＬＣカラム（ミリポア−ウォーターズ・ボンドパックＣ１８  ３００Å  １５Ｍ、３００mm×４７mmφ）にかける。ジサッカライドＡおよびＤは、ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰ（溶媒Ａ）およびプロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋２５mＭ  ＴＢＡＰ（溶媒Ｂ）（１％／分で７５％Ａ：２５％Ｂから０％Ａ：１００％Ｂ、流速８０ml／分）の勾配で溶出する。ジサッカライドＡおよびＤを含むＨＰＬＣフラクションを実施例５でジサッカライドＣについて記載したように脱塩する。
比較試験（本発明によるものではない）
エシェリキア・コリF-583（シグマ、製品番号L5399）由来リピドＡ１０mg／mlをＨ2Ｏ：トリエチルアミン１０００：１（v/v）中に製造し、続いて、０．２Ｍ  ＮａＯＨ、３７℃で２０分のアルカリ処理に付した。この時間は、３−Ｏ脱アシル化リピドＡにとってのみ充分であった（メイヤーら、Cellular and Molevular Aspects of Endotoxin Reactions，145-156頁［1990］、エルセビアー・サイエンス・パブリッシャーズ）。
溶液をオルトリン酸で中和した。生理学的検定のために、０．１％ＴＥＡ／０．９％ＮａＣｌで希釈し、更に精製することなく使用した。
ＦＡＢ−ＭＳのために、このアルカリ処理リピドＡサンプルを逆相ＨＰＬＣ（スペルコＮo.58985、スペルコシルLC18、３μm、１５mm×４．６mmφ）で精製した。１８％ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰおよび８２％プロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ９：１（v/v）＋５mＭ  ＴＢＡＰで溶出した主要ピークを、実施例１に記載の条件で脱塩した。ＦＡＢ−ＭＳ分析は１５７０．１質量単位（計算１５６９．１質量単位）の分子イオンを提供した。
本発明のジサッカライドの物理化学的特性
実施例１および２で得られたジサッカライドＡおよびＢを物理化学的特徴付に付す。
グルコサミンを酸加水分解（４Ｍ  ＨＣｌ、１６時間、１００℃、アルゴン雰囲気）およびフェニルチオイソシアネートを使用した誘導体化後測定し、続いてＨＰＬＣにより量的分析をした（アヌムラ，Ｋ．Ｒ．ら、Analytical Biochemistry，Vol.179，113-122頁［1991］参照）。
全脂肪酸を酸加水分解（４Ｍ  ＨＣｌ、４時間、１００℃）後、メタノール存在下ＢＦ3を使用したメチル化およびガスクロマトグラフィー（カラムＯＶ−１、ヒューレット・パッカード）（ミラー，Ｌ．、Gas-Liquid Chromatography of Cellular Fatty Acids as a Bacterial Identification Aid，Gas Chromatography Application Note，228-237頁［1984］参照）による定量により測定した。
エステル結合脂肪酸は、ＮａＯＣＨ3を使用した処理後ガスクロマトグラフィーにより測定した（レイチェル，Ｅ．Ｔ．ら、European Journal of Biochemistry，Vol.28，166-173頁［1972］参照）。
リン酸は、エームス（エームス，Ｂ．Ｎ．、Methods in Enzymology，Vol.8，115-118頁［1966］参照）の方法により測定した。
３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソニックアシッド（ＫＤＯ）をカラカニス，Ｙ．Ｄ．ら（Analytical Biochemistry，Vol.58，595-601頁［1978］）の方法を使用して測定した。
ジサッカライドＡの溶液は、リン酸２．１μmol／ml、グルコサミン１．９μmol／ml、Ｃ12:0脂肪酸１．０μmol／mlおよび３ＯＨ−Ｃ14:0脂肪酸２．２μmol／mlを含んだ。Ｃ12:0脂肪酸のみがエステル結合脂肪酸残基の放出後検出され、３ＯＨ−Ｃ14:0脂肪酸残基がアミド結合であることを示した。ＫＤＯは検出されなかった（＜１mol／ジサッカライドＡ１０mol）。
したがって、ジサッカライドは１mol当たり、リン酸２mol、グルコサミン２mol、３ＯＨ−Ｃ14:0脂肪酸２molおよびＣ12:0脂肪酸１molを含む。
高速原子衝撃質量分析法（FAB-MS）、ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ（v/v）、濃度１mg／ml中のサンプルの陰性モード。Ｖacc  ８ｋＶに設定したVG ZAB-2SEマス・スペクトロメーターを、３０ｋＶのスペクトルおよび１μＡの励起電流を産生するために使用した。ＦＡＢ−ＭＳスペクトルは図１に示す。ジサッカライドＡは、分子ピーク１１３３．５５質量単位（計算質量１１３３．３）を示す。他のピークは、分析中の生産物の分画を示唆する。ピーク１０５３．５はリン酸基の損失および９５１．３はＣ12脂肪酸の損失を意味する。
ジサッカライドＢのＦＡＢ−ＭＳスペクトルは図２に示し、分子ピーク１１６１．８質量単位（計算質量１１６１．３）を示す。ピーク１１８３．８質量単位はナトリウムの添加を意味する。ピーク９７３．６はＣ14脂肪酸の損失を意味する。ピーク９７３．６質量単位は、ピーク９５１．６とナトリウムイオンのフラグメントを意味する。
ジサッカライドＡ（Ｄ2Ｏ中のナトリウム塩）の1Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（ブルカー３６０MHz）を図３に示し、その13Ｃ−ＮＭＲ−スペクトル（ブルカー９０MHz）を図４および５に示す（拡大）。
以下のβ−Ｄ−グルコサミン−（１−６）−α−Ｄ−グルコサミンジサッカライド：
＊ジサッカライドＡ（２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）；
＊ジサッカライドＢ（２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−テトラドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）；
＊ジサッカライドＣ（２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）；
＊ジサッカライドＤ（２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）；
を後記する。
0003967769.tif 000005
本発明のジサッカライドの内毒素性および生物活性
ジサッカライドＡ（実施例１）およびジサッカライドＢ（実施例２）の内毒素性および生物活性を測定し、ＨＰＬＣの精製なしに、エシェリキア・コリ0111:Ｂ4由来のリポポリサッカライド（シグマ、製品番号L3024）、リピドＡ（シグマ、製品番号L5399、実施例４の出発物質として使用）およびエシェリキア・コリF583のリピドＡ由来の３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ（比較実施例に記載のように製造）と比較した。
１．内毒素性
内毒素性は、カブトガニ変形細胞融解物（ＬＡＬ）試験により測定した。この試験は内毒素が、リムルス・ポリフェムス（Lomulus polyphemus）の血リンパの凝集を誘発するという観察に基づく。
ゲル化試験において、試験化合物の連続希釈をＬＡＬと１：１（v/v）で混合し（Haemachem Inc.，感受性０．０６内毒素単位／ml）、混合物を１時間３７℃でインキュベーションした。次いで、ゲル形成を４０５nmの光学密度を測定することにより追跡した。ゲルを形成する最後の希釈を、反応マイクロプレートを回転させることにより測定した。サンプルの内毒素活性は、リポポリサッカライド標準（１内毒素単位＝０．１ng  ＬＰＳ）の希釈との比較により測定した。
内毒素性を、また、ＬＡＬ中のプロテアーゼのＬＰＳによる活性が、色素源（Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA；バイオ・ホイッターカー・キット（Bio Whittaker Kit）No.50-650U）を使用して測定される、色素産生性試験により測定した。色素形成（ｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリン）の遊離）を４０５nmで測定した。
サンプルを１０分間３７℃でインキュベーションし、続いて色素含有ＬＡＬを加えた。４０５nmでの０．２の光学密度に達するために必要な時間を測定した。内毒素活性は、ＬＰＳ標準で得られた参考曲線と比較して計算した。
結果は、ＬＰＳng／生産物ngとして表３に示す。
0003967769.tif 000006
従って、表３は本発明のジサッカライドＡおよびＢが、特に米国特許第４，９１２，０９４Ａ号の３−Ｏ−脱アシル化リピドＡに関して、最も低い内毒素性を示すことを示す。
２．Ｃ５７ＢＬ／６マウスのマクロファージで誘発されるインビトロ生物活性
骨髄を、６週齢C57BL/6マウスの臀部、大腿骨および脛骨から回収した。骨髄懸濁液をダルベッコ修飾培地中で均質化し、遠心後、ペレットをダルベッコ修飾培地に再懸濁し、細胞を、３０％L-929線維芽細胞上清（コロニー刺激因子１［ＣＳＦ−１のための慣用源］のための慣用の源）および２０％ウシ血清を添加した同培地で４×１０5細胞／mlの濃度で培養した。
７日後、成熟マクロファージを回収し、５％ウシ胎児血清含有ダルベッコ修飾培地に７×１０6細胞／mlの濃度で再懸濁する。この細胞懸濁液を同培地で希釈したサンプルと１：１（v/v）で混合し、７０，０００細胞／ウェルでマイクロプレートで行う生物試験に使用する（３７℃、２２時間インキュベーション、湿度１００％および８％ＣＯ2）。
酸化窒素（ＮＯ）生産
酸化窒素（ＮＯ）を、細菌感染、特にＬＰＳに応答してマクロファージにより産生させる。ＮＯは細胞増殖抑制性および細胞毒性であるように思える。ＮＯは非常に反応性で急速に酸化により亜硝酸および硝酸に変わる。
亜硝酸形成は、グライス（Griess）試験（１：１（v/v）Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン塩酸塩［水中１ｇ／ｌ］およびｐ−アミノベンゼンスルホンアミド［５％Ｈ3ＰＯ4中１０ｇ／ｌ］の添加）を使用して測定した。活性マクロファージ上清中の亜硝酸濃度はＮａＮＯ2標準と比較して計算した。
結果は表４に示す。
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ＬＰＳは最も高いＮＯ産生を誘発する。リピドＡ、３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ、ジッサカライドＡおよびジッサカライドＢは同程度のＮＯ産生を誘発する。
従って、ジッサカライドＡおよびＢは、リピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡと同じ程度に強くＮＯ産生をマクロファージで誘発する。
インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）の産生
ＩＬ−１αは、ＬＰＳで刺激された場合、マクロファージを含む多くの細胞で産生される。ＩＬ−１αはＴ細胞の活性化、Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体発現およびサイトカイン遺伝子発現の誘発、Ｂ細胞増殖およびＩｇ分泌の共刺激、およびＮＫ媒介細胞毒性のＩＬ−２およびＩＦＮ誘発活性化の増加、急性相タンパク質合成および熱伝導の導入を含むことが報告されている。
マクロファージ上清のＩＬ−１αの濃度はELISA試験（キット・ジェンザイム（Kit GENZYME）、インターテスト−１α（Intertest-1α））により測定した。
結果を表５に要約する。
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製造が使用した最大濃度でもまだ増加していたため、ＩＬ−１αの最大産生を測定するのは不可能であった。
５００μg／mlの濃度でのＩＬ−１α生産物の誘導は、リピドＡ、３−Ｏ−脱アシル化リピドＡおよびジサッカライドＡと有意には異ならない。ＬＰＳはＩＬ−１α産生をより強く誘導する。
ジサッカライドＡによるＩＬ−１αの産生は、少なくともリピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡと同程度強い。
インターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生
ＩＬ−６は活性化単核球またはマクロファージ、ＴおよびＢリンパ球により産生される。ＩＬ−６は数ある中である細胞型の増殖、あるメラノーマ細胞計の成長阻害、Ｂリンパ球の分化およびＩｇＧ分泌刺激、細胞毒性Ｔ細胞の分化および弱い抗ウイルス活性を誘発する。
マクロファージ上清のＩＬ−６濃度をELISAにより測定した（キット・エンドーゲン（Kit ENDOGEN）、EM-IL-6）。
結果を表６に要約する。
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ＩＬ−６分泌のジサッカライドＡによる刺激は、ＬＰＳより有意に低い。しかしながら、ジサッカライドＡはリピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡよりも強くマクロファージでＩＬ−６産生を誘発する。
癌壊死因子αの製造（ＴＮＦ−α）の産生
ＴＮＦ−αは、主にＬＰＳ刺激マクロファージおよび単核球により産生される。ＴＮＦ−αにより誘発される活性は、とりわけ、抗ウイルス活性、ある細胞型の細胞溶解および細胞増殖抑制、ある細胞系の成長、主要組織適合抗原系クラスＩおよびIIのような抗原発現、メチルコララントレン誘発サルコーマ、多形核白血球（ＰＭＮ）、破骨細胞活性化および骨吸収である。ＴＮＦ−αはまた毒性ショックおよび化膿の主メディエーターである。
マクロファージ上清中のＴＮＦ−αの濃度をELISA試験（キット・ゲンザイム（Kit GENZYME）、ファクター−試験mTNF-α（Facotr-test mTNF-α））により測定した。
結果は表７に列記する。
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試験した最大濃度で産生がまだ増加していたため、ＴＮＦ−αの最大産生の測定は不可能であった。
他の試験と比較して、ＬＰＳによい誘発されるＴＮＦ−α産生は、ジサッカライドＡよりも低かった。ジサッカライドＡは、リピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル化リピドＡと同じか、またはより強くＴＮＦ−αを誘発した。
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生
ＰＧＥ１およびＰＧＥ２は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１で刺激されたマクロファージにより産生される主要アラキドン酸代謝物である。ＴおよびＢリンパ球においてＰＧＥは免疫調節活性を示す。Ｔｈ２の刺激およびＴｈ１Ｔリンパ球亜集団の阻害および免疫グロブリンのイソタイプへのスイッチを誘発するように思える。
マクロファージ上清のＰＧＥ２濃度はＲＩＡ試験（キット・パーセル＋ロライ（Kit PAESEL+LOREI）、36-104-6001プロスタグランジンE2 3H-RAEキット）により測定した。
結果は表８に要約する。
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製造が使用した最大濃度でもまだ増加していたため、ＰＧＥ２の最大産生を測定するのは不可能であった。ジサッカライドＡによるＰＧＥ２の産生は、ＬＰＳより有意に低い。しかしながら、ジサッカライドＡはリピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡよりも活性であった。リピドＡはＰＧＥ２産生を誘発せず、３−Ｏ−脱アシル化リピドＡは使用した最大濃度でのみであった。
結論
本発明のジサッカライドはインビトロで活性であり、ＮＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２の産生を誘発する。本発明のジサッカライドは、リピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡと同程度またはより活性ですらあるが、ＬＡＬ試験で示されるように、実質的に減少された内毒素を示す。リピドＡおよび３−Ｏ−脱アシル化リピドＡの最小活性は純度によって異なる。ジサッカライドＡおよびＢはＨＰＬＣで生成し、リピドＡは商業製品（シグマL-5399）および３−Ｏ−脱アシル化リピドＡは、リピドＡの商業製品から出発して米国特許第４，９１２，０５４Ａ号により製造する。高い活性の製品はＬＰＳのみであり、それは一般に高い反応を誘発し、有意な信号を誘発するために低い濃度を必要とする。
３．インビボ生物活性
ジサッカライドＡのインビボ生物活性を、ＢＤＩＸラットに誘発した腹膜癌に対する抗癌活性により試験した。マーティン（マーティン，Ｆ．ら、International Journal of Cancer，Vol.32，623-627［1983］）の方法に従い得たＰro b細胞をラットに腹腔内注射した（１０6細胞／ラット）。１０日後、多くの固体小瘤が乳状スポットで腸に現れ、腹腔洞に進行的に浸透した（ラガデック，Ｐ．ら、Invasion and Metastasis，Vol.7，83-95頁［1987］）。出血性腹水が４−５週間以内に現れ、全てのラットが８−１２週間で死亡する。
免疫治療は、癌Ｐro b細胞注射後１４日に開始した。処置は、ジサッカライドＡ：用量０．１、０．３および０．８mg／体重kgの腹腔内注射からなる。ジサッカライドＡを０．９％ＮａＣｌおよび０．１％トリエチルアミンの水性溶液に溶解した。ラットは３．５日毎に５回の注射を受けた。対照群は水性溶液を注射した。両方の群は１０匹のラットからなる。
癌細胞注射後６週間で剖検を行った。腹膜癌の程度を盲目的に評価し、ラットを癌の増加の程度により分類した。
小瘤の分類は以下の通りである：
０群：小瘤は見られない；
１群：数個の０．２cm以下の小瘤；
２群：０．５cmまでの大きさの数え切れない小瘤；
３群：１cmまでの大きさの癌；
４群；完全に癌に浸入された癌性洞、数cmの大きさ。
結果は表９に記載する。
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抗癌活性の統計的有意は、相違分析（variance analysis）を使用してクラスカル・ウォーリス（Kruskal Wallis）試験（１）または（２）で計算した。
明らかに、ジサッカライドＡは用量依存的抗癌作用を有する。
４．急性毒性
ジサッカライドＡを雄および雌ＮＭＲＩラット（６−７週齢）の仙骨静脈に注射した。１００mg／体重kgまでの用量は死を導かなかった。
実施例７
出発物質はシュードモナス・アエルギノーザ由来リポポリサッカライド（シグマ、製品番号L7018）である。リピドＡの構造式は既に既知である（カールシンら、Eur.J.Biochem．198（1991）697-704参照）。エシェリキア・コリ由来のリピドＡと比較して、優勢種はアシルオキシアシル残基をジグルコサミン二リン酸骨格の両方のアミノ基に含む。加えて、３'位に３−ヒドロキシ−デカン酸があるが、同脂肪酸残基は少ないフラクションの３位に存在するのみである。
この３'位の脂肪酸残基の除去は、ジサッカライドＣ同族体を導く。更に、加水分解は２または２'位のいずれかのアシルオキシアシル基のエステル化脂肪酸残基の損失を導く。これらの構造はジサッカライドＣおよびＤに類似である。
シュードモナス・アエルギノーザ由来リポポリサッカライド（シグマ、製品番号L7018）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０に５mg／mlで溶解し、１２０分、１００℃に加熱した。冷却後、テトラブチルアンモニウムホスフェート（ＴＢＡＰ）に続いて０．５用量のプロパン−２−オールを添加し、最終濃度２５mＭにした。トリエチルアン（ＴＥＡ）を添加し、ｐＨ９．０（約、ｐＨ紙による）した。混合物を、再生しながら（１０回）Ｃ１８セップ−パック（ウォーターズ）にかけた。セップ−パックをアセトニトリル１０ml、続いてアセトニトリル：Ｈ2Ｏ１：１（v/v）中の５mＭ  ＴＢＡＰ１０mlで洗浄した。吸着物質をクロロホルム：メタノール２：１（v/v）４mlで溶出した。
２個の主要ピーク、ＰｓＡ１およびＰｓＡ２（図６）がＨＰＬＣおよび脂肪酸分析により精製された。脂肪酸組成はクルシンら記載の分子に対応する（下記表）。カラムから短い保持時間（Ｒt）で溶出するように、ＰｓＡ１はＰｓＡ２より疎水性が低い。これは２ＯＨ−Ｃ１２：Ｏ酸残基を有する分子に対応する。ＰｓＡ２は２ＯＨ−Ｃ１２：ＯおよびＣ１２：Ｏの両方を有する。
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溶媒を回転エバポレーターにより蒸発させ、残渣を水中０．２％ＴＥＡに再溶解させた。
水酸化ナトリウムをシュードモナス・アエルギノーザリピドＡの溶液に０．２Ｍの濃度まで添加し、溶液を室温で６０分インキュベーションした。次いで、溶液を、（８．５％）オルトリン酸で中和した。次いで、それを、７５％溶媒Ａ（アセトニトリル：水１：１（v/v）中５mＭ  ＴＢＡＰ）および２５％溶媒Ｂ（プロパン−２−オール：水９：１（v/v）中５mＭ  ＴＢＡＰ）で平衡化した逆相ＨＰＬＣ系（スペルコＬＣ１８を有するＨＰ１０５０、３μm逆相カラム、プレカラム付）にかけ、２％溶媒Ｂ／分から１００％Ｂの勾配で溶出した。ピークを２１０nmの吸収で検出した。主要ピークを回収した（図７参照）。これらを２用量の水で希釈し、溶媒Ａで平衡化したＣ１８セプ−パックカートリッジにかけた。セプ−パックをプロパン−２−オール：Ｈ2Ｏ１：３（v/v）中の０．４５％塩化ナトリウム１０ml、水１０mlおよびアセトニトリル１０mlで洗浄した。吸着物質をクロロホルム：メタノール２：１（v/v）４mlで溶出し、溶媒を窒素下除去した。フラクションを、水１００μlに再溶解した。
フラクションの脂肪−アシル含量を４Ｍ  ＨＣｌ、１００℃、４時間で加水分解した後ガスクロマトグラフィーにより分析した。放出脂肪酸をミラー（ミラー，Ｌ．、Gas Chromatography application note 228-37［ヒューレット・パッカード］）に従ってメチルエステルに変換し、標準脂肪酸メチルエステル（スペルコ）を参考として、融合シリカカラム（スペルコ2-4026）を伴うヒューレット・パッカード５８９０ガスクロマトグラムで分析した。
リピドＡ抽出物の加水分解後、多くのピークが逆相クロマトグラフィーで観察される。主要ピーク（PsAOH１、２、４および６）をＨＰＬＣから回収した。各々のフラクションで同定された脂肪酸を下記に示す。
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これらのジサッカライドの構造は下記の通りである：
＊PsAOH１：２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−［（Ｓ）−２−ヒドロキシドデカノイルオキシ］−ドデシルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシドデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート；
＊PsAOH２：２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシドデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−［（Ｓ）−２−ヒドロキシドデカノイルオキシ］−ドデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート；
＊PsAOH４：２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシドデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシドデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート；
＊PsAOH６：２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシドデカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−［（Ｓ）−２−ヒドロキシドデカノイルオキシ］−ドデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）；
を後記する。
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フラクションはまた、陰性モードで電子噴霧マススペクトル（electro-spray mass spectrometry）（ＥＳ−ＭＳ）で分析した。ＶＧバイオテックＢＩＯ−Ｑ装置を３重４重極性分析機（quadrupole analyser）と共に使用した。それぞれのサンプル２−４μlをアセトニトリル：水：２５％アンンモニア溶液５０：５０：１（v/v）１０μlに希釈した。次いで、１０μlを直接マススペクトロメーターの源に注入した。アセトニトリル：水：２５％アンモニア溶液５０：５０：１（v/v）、７μl／分を溶出液として使用した。主イオンの分裂の分析のために、最初の４重極由来の親イオンを、アルゴンを衝突ガスとして使用した第２の４重極の衝突活性化分解に付した。娘イオンを第３の４重極で検出した。
各々のピークについて計算された質量およびＥＭ−ＭＳで観察された質量を下記に記載する。
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それぞれ非常に良好な対応がある。
PsAOH１とPsAOH２の場合、質量は同じである。これは、これらが分子の２つの異性体を示すことを示唆し、リピドＡは質量分析のある条件下でフラグメントであることが知られている（クルシン、1991；およびコッターら、Biomed.Encl.Mass Spectom.，14（1987），591-598）。イオンが産生され、それらは１０２質量単位の添加を伴った分子の非還元半分を示す。従って、２つの縦のＭＳにより、第１ＭＳ中の種イオンは分裂でき、“娘”イオンが第２ＭＳで検出される。これは、観察された第２イオンが不純物である可能性を除く：それは分裂により最初のイオンに由来していなければならない。娘イオンのそれぞれのフラクションで予期される質量およびＭＳ−ＭＳで観察された質量を下記に示す。
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これらの観察は、ジサッカライドＥ、Ｆ、ＧおよびＨと明らかに同一である。
内部比較のために、ジサッカライドＡをまたＥＳ−ＭＳで分析した。計算質量は７６８．９およびフラグメントの観察質量は７６８であった。
フラクションの生物活性を、前記のように、マウス腹腔マクロファージにおける亜硝酸産生の刺激により試験した。
貯蔵溶液のそれぞれの同族体の質を、ジサッカライドＡを参考にしてＨＰＬＣで測定した。フラクションはジサッカライドＡと同定度の活性を示す（図８）。２つのアシルオキシアシル基を有し、他の脂肪酸残基を有さないジサッカライドＨが最も活性である。アシルオキシアシルの位置、２対２'は活性にほんの僅かな差を有した。
活性がＬＰＳのような他の物質によるサンプルの汚染物によるものであるという可能性を除くために、ジサッカライドＥ、Ｆ、ＧおよびＨを逆相ＨＰＬＣで再精製し、ピークの直前および直後のＨＰＬＣ基底ライン領域をまた回収し、材料のピークを含むフラクションと同様に処理した。ジサッカライドＥ、Ｆ、ＧおよびＨを含むピークは最初の測定と同じ活性を示す。リピドＡ同族体ピーク直前および直後のＨＰＬＣプロフィール領域ブランクサンプルは不活性であった。
ジサッカライドＥ、ＦおよびＧの内毒素性は色素ＬＡＬ試験（上記参照）を使用して測定した。しかしながら、１mg／mlウシ血清アルブミンの変わりに、０．１mg／mlを使用した。結果（ｎ＝４および６）を実験２回で得、以下に示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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