(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ｒ1Ｒ2Ｎ−ＣＨＸ−ＣＯ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｋ
［式中、
Ｒ1はメチルであり；
Ｒ2はメチルであり；
Ａはバリルであり；
ＢはＮ−メチル−バリル基であり；
Ｋが−ＮＨ2の場合、Ｄは３,４−デヒドロプロリル又は３−メチルプロリル基であり、Ｋが−ＮＨ−(ＣＨ2)v−フェニル（v＝１）の場合には、Ｄはアゼチジン−２−カルボニル又は５−メチルプロリル基であり；
Ｅはプロリル基であり；かつ
ＸはＣ2-5−アルキルである］
の新規ペプチド及び生理学的に認容性の酸との塩。
【請求項２】
医学において、特に腫瘍疾患の治療のために使用するための式Ｉの化合物又はその塩。
【請求項３】
薬学的に認容性の担体及び治療上有効な量の請求項１記載の化合物からなる医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍を患う哺乳動物（人を除く）に、請求項１に記載した式Ｉの化合物を腫瘍抑制量で投与することよりなる、哺乳動物（人を除く）の腫瘍の治療法。
【請求項５】
ペプチド化学で公知の方法で製造することを特徴とする、請求項１記載の式Ｉの化合物の製法。
【請求項６】
式Ｉにおいて：
Ｒ1はメチルであり；
Ｒ2はメチルであり；
Ａはバリル基であり；
ＢはＮ−メチル−バリル基であり；
Ｋが−ＮＨ2の場合、Ｄは３,４−デヒドロプロリル又は３−メチルプロリル基であり、Ｋが−ＮＨ−(ＣＨ2)v−フェニル（v＝１）の場合には、Ｄはアゼチジン−２−カルボニル又は５−メチルプロリル基であり；
Ｅはプロリル基であり；
Ｘは−ＣＨ(ＣＨ3)2である、請求項１記載の新規ペプチド及び生理学的に認容性の酸との塩。
【発明の詳細な説明】
海洋由来様ドラスタチン（dolastatin）−１０（ＵＳ  ４８１６４４４）及びドラスタチン−１５（ＥＰ−Ａ−３９８５５８）から単離されたペプチドが有効な細胞成長阻止活性を示すことは、公知である（Biochem.Pharmacology 40,no.8,1859-64,1990；J.Natl.Cancer Inst.85,483-88,1993及びこの中で引用された文献、参照）。生体内での、腫瘍システム中での実験における興味深い結果に基づき、これら天然物質の更なる前臨床学的評価付けが、癌患者における臨床学的研究を開始するために現在進められている。しかしながら、これらの天然生成物は水性溶剤中への溶解性が乏しいこと、及び合成のために必要なブロックの製造のために費用がかかるという欠点を有する。
本発明は、腫瘍疾患の治療のために、ドラスタチン−１５に比較して改良された治療効果を示す、新規ペプチド及びその誘導体を提供する。更に、本発明による化合物は以下に詳細に記載するように簡単に製造することができる。
本発明の化合物は式Ｉ：
Ｒ1Ｒ2Ｎ−ＣＨＸ−ＣＯ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｋ
［式中、
Ｒ1はメチルであり；
Ｒ2はメチルであり；
Ａはバリルであり；
ＢはＮ−メチル−バリル基であり；
Ｋが−ＮＨ2の場合、Ｄは３,４−デヒドロプロリル又は３−メチルプロリル基であり、Ｋが−ＮＨ−(ＣＨ2)v−フェニル（v＝１）の場合には、Ｄはアゼチジン−２−カルボニル又は５−メチルプロリル基であり；
Ｅはプロリル基であり；かつ
ＸはＣ2-5−アルキルである］
の新規ペプチド及び生理学的に認容性の酸との塩を包含する。本発明は式Ｉの化合物の製法、該化合物を薬学的に認容性の担体とともに含有する医薬組成物、及び哺乳動物（人を除く）中の癌を治療するためのその使用法をも提供する。
特にＫは、Ｃ1-4−アルコキシ、ベンジルオキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃ1-12−アルキル、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2ＣＮ、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＣＨ、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2Ｃ＝ＣＨ2、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ3-8−シクロアルキル、−ＮＨ−［３,３,０］−ビシクロオクチル、ノルエフェドリル、ノルプソイドエフェドリル、−ＮＨ−キノリル、−ＮＨ−ピラジル、−ＮＨ−ＣＨ2−ベンズイミダゾリル、−ＮＨ−アダマンチル、−ＮＨ−ＣＨ2−アダマンチル、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）−フェニル、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−フェニル、−Ｎ（Ｃ1-4−アルコキシ）−Ｃ1-4−アルキル、−Ｎ（Ｃ1-4−アルコキシ）−ＣＨ2−フェニル、−Ｎ（Ｃ1-4−アルコキシ）−フェニル、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＢｚｌ、−ＮＨ−（ＣＨ2）v−フェニル（v＝０、１、２、又は３）、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ナフチル（m＝０又は１）、−ＮＨ−（ＣＨ2）w−ベンズヒドリル（w＝０、１又は２）、−ＮＨ−ビフェニル、−ＮＨ−ピリジル、−ＮＨ−ＣＨ2−ピリジル、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ピリジル、−ＮＨ−ベンゾチアゾリル、−ＮＨ−ベンゾイソチアゾリル、−ＮＨ−ベンゾピラゾリル、−ＮＨ−ベンゾオキサゾリル、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−フルオレニル（m＝０又は１）、−ＮＨ−ピリミジル、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−インダニル（m＝０又は１）、−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y−ＣＨ3（y＝０、１、２、３、４、又は５）、−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y−ＣＨ2ＣＨ3（y＝０、１、２、３、４、又は５）、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y−ＣＨ3（y＝０、１、２、３、４、又は５）、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）y−ＣＨ2ＣＨ3（y＝０、１、２、３、４、又は５）、−ＮＣＨ3−ＮＨＣ6Ｈ5、−ＮＣＨ3−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5であってよく；又はＫは次のものを表す、
0003957751.tif 000002
0003957751.tif 000003
0003957751.tif 000004
置換基Ｒ1、Ｒ2、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｘが次の意味を有する式Ｉの化合物が有利である：
Ｒ1はメチル又はエチルであり；
Ｒ2は水素、メチル又はエチルであり；
Ａはバリル、イソロイシル、２−ｔ−ブチルグリシル基であり；
ＢはＮ−メチル−バリル、−イソロイシル又は−２−ｔ−ブチルグリシル基であり；
Ｄは３,４−デヒドロプロリル、４−フルオロプロリル、アゼチジン−２−カルボニル、３−メチルプロリル、又は５−メチルプロリル基であり；
Ｅはプロリル、ホモプロリル、ヒドロキシプロリル、又はチアゾリジン−４−カルボニル基であり；
Ｘは−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｃ（ＣＨ3）3、又は−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3であり；
ｔは０又は１である。
Ｋの有利な意味は次のものである：
−ＯＣ（ＣＨ3）3、−ＮＨＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）3ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）6ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3。
Ｋの有利な意味は次のものを表す：
−ＯＣ（ＣＨ3）3、−ＮＨＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）3ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）6ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）2、−ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）2、−ＮＨＣ（ＣＨ3）3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）Ｃ（ＣＨ3）3、−ＮＨ−シクロプロピル、−ＮＨ−シクロブチル、−ＮＨ−シクロペンチル、−ＮＨ−シクロヘキシル、−ＮＨ−シクロヘプチル、−ＮＨ−シクロオクチル、−ＮＨ−ビシクロ［３,３,０］オクチル、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣＨ2ＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）ＯＣＨ2ＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5、−Ｎ（ＯＣＨ3）ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5、−Ｎ（ＣＨ3）ＯＣ6Ｈ5、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5、−ＮＨ（ＣＨ2）2Ｃ6Ｈ5、−ＮＨ（ＣＨ2）3Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨＣ（ＣＨ3）（ＣＨ2ＣＨ3）2、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣＨ2−シクロヘキシル、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＦ3、−ＮＨＣＨ（ＣＨ2Ｆ）2、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＮ、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2ＣＣＨ、ノルエフェドリル、ノルプソイドエフェドリル、−ＮＨ−キノリル、−ＮＨ−ピラジル、−ＮＨ−アダマンチル（２）、−ＮＨ−アダマンチル（１）、−ＮＨ−ＣＨ2−アダマンチル、−ＮＨ−ＣＨ2−ナフチル、−ＮＨ−ベンズヒドリル、−ＮＨ−ビフェニル、−ＮＨ−ピリジル、−ＮＨ−ＣＨ2−ピリジル、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ピリジル、−ＮＨ−ベンゾチアゾリル、−ＮＨ−ベンゾイソチアゾリル、−ＮＨ−ベンゾピラゾリル、−ＮＨ−ベンゾオキサゾリル、−ＮＨ−フルオレニル、−ＮＨ−ピリミジル、−ＮＨＣＨ2−（４−メチル）−チアゾリル（２）、−ＮＨ−ＣＨ2−フラニル（２）、−ＮＨ−ＣＨ2−チエニル（２）、−ＮＨ−ＣＨ2−（５−メチル）チエニル（２）、−ＮＨ−チアゾリル（２）、−ＮＨ−イソオキサゾリル（３）、−ＮＨ−（３−メチル）イソオキサゾリル（５）、−ＮＨ−（３−メチル）イソチアゾリル（５）、−ＮＨ−（２−トリフルオロメチル）−チアジアゾリル（５）、−ＮＨ−（２−シクロプロピル）チアジアゾリル（５）、−ＮＨＣ（ＣＨ3）2Ｃ＝ＣＨ2、又はＫは次のものであってもよい、
0003957751.tif 000005
これらの例は、本発明を明らかにするためのものであり、限定するものではない。
式ＩのペプチドはＬ−アミノ酸からなる。
新規化合物は生理学的に認容性の酸との塩であってもよい：例えば塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ピルビン酸、ムチン酸、安息香酸、グルクロン酸、蓚酸、アスコルビン酸及びアセチルグリシンである。
新規化合物は、ペプチド化学において公知の方法で製造することができる。こうして、このペプチドは連続的にアミノ酸から、又は好適な小さなペプチドフラグメントを結合することにより、組み立てることができる。連続的な組立において、Ｃ−末端で出発し、ペプチド鎖はその都度１個のアミノ酸で段階的に延長する。フラグメント結合においては、異なる長さのフラグメントを一緒に結合させることが可能であり、かつ言い換えるとこのフラグメントは、アミノ酸から連続的に組み立てることにより、又はそれ自体をフラグメント結合することにより、得ることができる。
連続的な組立においても、更にフラグメントでの結合においても、アミド結合を形成することよりユニットを結合することが必要である。このために、酵素的及び化学的方法が好適である。
アミド結合を形成するための化学的方法の詳細はミュラー（Mueller，Methoden der organischen Chenie Vol.XV/2,pp1-364,Thieme Verlag,Stuttgart,1974）；スチュワート、ヤング（Stewart,Young,Solid Phase Peptide Synthesis,pp31-34,71-82,Pierce Chemical Company,Rockford,1984）；ボダンスキー、クラウスナー、オンデッチ（Bodanszky,Klausner,Ondetti,Peptide Synthesis,pp85-128,John Wiley & Sons,New York,1976）及びその他のペプチド化学における標準的な文献において、詳細に記載されている。特に有利であるのは、アジド法、対称及び混合無水物法、その場で製造されるか又は予め形成された活性エステル、アミノ酸のウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物の使用、及び結合試薬／アクチベーターを使用するアミド結合の形成、特にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、ｎ−プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、Ｎ,Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）−アミドホスホリル クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏｐ）、ジフェニルホスホリル アジド（ＤＰＰＡ）、カストロ（Castro）の試薬（ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）、Ｏ−アザベンゾトリアゾリル−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウム塩（ＨＡＴＵ）、ジエチルホスホリル シアニド（ＤＥＰＣＮ）、２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオフェン ジオキシド（Steglichの試薬；ＨＯＴＤＯ）及び１,１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。結合試薬は単独で、又は添加物、例えばＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は２−ヒドロキシピリジンと組み合わせて適用することができる。
この際、通常酵素的ペプチド合成においては保護基なしで済ますことも可能であるのに対して、アミド結合の形成にかかわらない反応性基の可逆的な保護は、化学合成において両方の成分に必要である。３個の常用の保護基を使用する方法が化学的ペプチド合成にとって有利である：ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法。それぞれの場合において同一であるのは、連鎖延長ユニットのα−アミノ基上の保護基である。アミノ酸保護基の詳細はミュラー（Mueller，Methoden der organischen Chemie Vol.XV/1,pp20-906,Thieme Verlag,Stuttgart,1974）により、記載されている。ペプチド鎖を組み立てるために適用されるユニットは、溶液中で又は懸濁液中で、又はメリフィールド（Merrifield in J.Amer.Chem.Soc.85（1963）2149）により記載された方法と同様な方法で反応させることができる。特に有利な方法は、ペプチドをＺ、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ保護基法を用いて、連続的に又はフラグメント結合で組み立てる方法である。
このメリフィールド法において、反応成分の１つは不溶性のポリマー支持体（以降、樹脂とも呼ぶ）に結合している。これは、典型的にペプチドがＢｏｃ又はＦｍｏｃ保護基法を用いてポリマー支持体上に連続的に組み立てられ、成長するペプチドが不溶性樹脂粒子にＣ末端で共有結合していることを必要とする（図１及び図２参照）。この方法は濾過により試薬及び副生成物を除去することを可能とし、かつこうして中間生成物の再結晶を必要としない。
保護されたアミノ酸は任意のポリマーに結合していてよく、このポリマーは使用される溶剤中に不溶性であるだけでなく、濾過を容易にする安定な物理的な形態を有していなければならない。このポリマーは、最初の保護されたアミノ酸が共有結合によりこれに堅固に結合することのできる官能基を有していなければならない。この目的に好適であるポリマーは非常に幅広い、例えば、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、スルホン化ポリスチレン、クロルメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（メリフィールド樹脂）、４−メチルベンジルヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセトアミドメチル樹脂（Ｐａｍ−樹脂）、ｐ−ベンジルオキシ−ベンジル−アルコール−樹脂、ベンズヒドリル−アミン−樹脂（ＢＨＡ−樹脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシ−メチル−樹脂、ブライポール（Breipohl）等の樹脂（Tetrahedron Letters 28（1987）565;BACHEMより提供）、４−（２,４−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシ−樹脂（Novabiochemより提供）又はｏ−クロロトリチル−樹脂（Biohellasより提供）である。
溶液中でのペプチド合成に好適であるのは、反応条件下に不活性である全ての溶剤である、特に水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１,４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び該溶剤の混合物である。ポリマー支持体上でのペプチド合成は、使用されるアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で実施することができる。しかしながら、有利な溶剤は付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、例えばＤＭＦ、ＤＣＭ、ＮＭＰ、アセトニトリル及びＤＭＳＯ、及びこれらの溶剤の混合物である。合成が完了した後、このペプチドをポリマー支持体から開裂分離する。種々の樹脂型がどのような条件下に開裂分離可能であるかは、文献中に記載されている。最も通常に使用される開裂条件は、酸触媒及びパラジウム触媒された、特に液体無水フッ化水素中で、無水トリフルオロメタンスルホン酸中で、希釈又は濃トリフルオロ酢酸中での開裂、モルホリンのような弱塩基の存在下でのＴＨＦ又はＴＨＦ−ＤＣＭ混合物中でのパラジウム触媒開裂、又は酢酸−ジクロロメタントリフルオロエタノール混合物中での開裂である。選択した保護基により、これらの保護基は開裂条件下に保持されるか又は同様に開裂除去される。ある一定の誘導体化反応を実施しなければならないとき、ペプチドの部分的な脱保護も価値がある。Ｎ−末端でジアルキル化したペプチドは、ａ）溶液中又はポリマー支持体上で、好適なＮ,Ｎ−ジアルキルアミノ酸を結合させることにより、ｂ）ＤＭＦ／１％酢酸中でＮａＣＮＢＨ3及び好適なアルデヒド又はケトンとともに樹脂結合ペプチドを還元的にアルキル化することにより、ｃ）アルデヒド又はケトン及びＰｄ／Ｃの存在下に、溶液中でペプチドを水素化することにより、製造することができる。
本発明において開示されている種々の非天然由来のアミノ酸は市販されているか、又は市販の材料から公知法を用いて合成することができる。アゼチジン−２−カルボン酸、３−メチル−Ｌ−プロリン、５−メチル−Ｌ−プロリン、及びＢｏｃ−又はＦｍｏｃ−保護３,４−デヒドロプロリンは市販されている出発材料である（ACROS,NOVABIOCHEM,BACHEM）。シス−及びトランス−４−フルオロプロリンはパナシック等（N.Panasik，E.S.Eberhardt，A.S.Edison，D.R.Powell，R.T.Raines，Int.J.Peptide Protein Res．44,1994,262-269）により記載された方法でヒドロキシプロリンから製造することができる。
本発明の化合物は、哺乳動物（人を除く）にこの化合物を投与することにより、固体腫瘍（例えば、肺の腫瘍、胸部、結腸、前立腺、膀胱、直腸、又は子宮の腫瘍）又は血液学的癌（例えば、白血病、リンパ腫）を阻止又は他の方法で治療するために使用することができる。
この新規化合物の特別な利点はドラスタチン−１５に比較して酵素分解に対してより抵抗性である。
投与は薬学的、有利に腫瘍学的薬剤に関して常用の任意の手段で実施することができ、これは経口及び非経口、例えば皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内適用を含む。
この化合物は単独で、又は所望の投与経路に好適な薬学的に認容性の担体と共に、一般式Ｉの化合物を含有する医薬組成物の形で投与することもできる。そのような医薬組成物は組合せ製品であってもよい、即ち他の治療活性成分を含有してもよい。
哺乳動物（人を除く）に適用すべき用量は活性成分の効果的腫瘍阻止量を含有しており、これは適用した個別の化合物の生物学的活性；投与法；患者の年齢、健康状態及び体重；症状の性質及び程度；治療の頻度；他の治療の適用；及び所望の効果を含む、通常のファクターに依存する。典型的な日用量は経口投与の場合体重１ｋｇあたり約０.５〜５０ｍｇであり、非経口投与の場合は約０.０５〜２０ｍｇである。
新規化合物は従来の固体又は液体投与剤形で投与することができる、例えば非被覆又は（膜）被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、座薬又は溶液。これらは常用の方法で製造される。この目的のために、活性物質を従来の医薬助剤、例えば錠剤結合剤、充填剤、保存剤、錠剤崩壊剤、流動調節剤、可塑剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶剤、持続放出組成物、抗酸化剤及び／又は噴射ガス（H.Sucker et al.:Pharmazeutische Technologie，Thieme-Verlag,Stuttgart,1978参照）と一緒に加工することができる。投与剤形は活性物質１〜９０重量％を通常含有する。
次の実施例は、本発明を詳細に説明することを意図する。蛋白質を構成するアミノ酸は実施例において公知の三文字記号を用いて省略した。他の使用した省略形は、Ｍｅ2Ｖａｌ＝Ｎ,Ｎ−ジメチルバリン、ＭｅＶａｌ＝Ｎ−メチルバリン、Ｚ＝ベンジルオキシカルボニルである。
Ａ．一般的方法
Ｉ．請求項１で請求されたペプチドは前記のように、標準Ｚ−及びＢｏｃ−法を用いて、標準的な溶液合成法によって合成するか、又はＢｏｃ及びＦｍｏｃ保護基法を用いて標準固相合成法により合成する。
ａ）Ｆｍｏｃ保護基法に関する合成サイクル
１．ＤＭＦ洗浄                      １×１分
２．ＤＭＦ中２０％ピペリジン      １×４分
３．ＤＭＦ中２０％ピペリジン      １×１６分
４．ＤＭＦ洗浄                      ５×１分
５．前活性化保護アミノ酸の添加
（ＤＭＦ中、ＴＢＴＵ１当量及び
ＤＩＰＥＡ５当量での活性化）；
ペプチド結合                        １×６１分
６．ＤＭＦ洗浄                      ３×１分
７．変換が不完全の場合、結合工程の反復
（５．に戻る）
８．ＤＭＦ洗浄                      ３×１分
９．２に戻る
ＢＯＰ−Ｃｌ及びＰｙＢｒｏｐはＮ−メチルアミノ酸に続くアミノ酸の結合のための試薬として使用された。反応時間は二重の結合を含めて相応して増大した。溶液合成法においては縮合剤として、Ｂｏｃ−保護アミノ酸ＮＣＡ’ｓ（Ｎ−カルボキシ無水物）、Ｚ−保護アミノ酸ＮＣＡ’ｓ（Ｎ−カルボキシ無水物）の使用も、塩化ピバロイルの使用もそれぞれ、このタイプの結合にとって最も有利である。
ＩＩ．Ｎ末端の還元アルキル化
ＡＩａにおけるように製造したペプチド樹脂をＮ末端で脱保護し（ＡＩａ中の工程２〜４）、次いで３倍モル過剰のアルデヒド文はケトンと、ＤＭＦ／１％酢酸中で、ＮａＣＮＢＨ3３当量を添加して、反応させた。反応の完了後（カイザー（Kaiser）テスト・マイナス）、この樹脂を水、イソプロパノール、ＤＭＦ及びジクロロメタンで数回洗浄した。
溶液中での還元アルキル化は、例えばＮａＣＮＢＨ3又は水素−Ｐｄ／Ｃを用いて、Ｎ−末端脱保護ペプチド、ペプチドフラグメント、又はアミノ酸と相応するアルデヒド又はケトンとの反応により達せられる。
ＩＩＩ．Ｉｂ及びＩＩにおけるようにして得られたペプチド−樹脂の処理
ペプチド−樹脂を減圧下に乾燥し、次いでＴＦＡ／水混合物（９５：５）で１.５時間処理した（Wade,Tregear,Howard Florey Fmoc Workshop Manual,Melbourne 1985）。次いで、この樹脂を濾別し、ＴＦＡ及びＤＣＭで洗浄した。濾液及び洗浄液を濃縮し、かつペプチドをジエチルエーテルを添加することにより沈殿させた。氷浴中で冷却後、沈殿を濾別し、かつ３０％酢酸中に取り込み、凍結乾燥した。
ＩＶ．ｏ−クロロトリチル−樹脂（Biohellasが提供）を使用するとき、酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（１：１：３）混合物中のペプチド−樹脂の懸濁液を、室温で１時間撹拌する。次いで、この樹脂を吸引濾別し、開裂溶液で完全に洗浄する。合した濾液を真空中で濃縮し、エーテルで処理する。沈殿した固体を、濾過又は遠心分離により分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、かつ減圧下に乾燥する。
Ｖ．ペプチドの精製及び特徴付け
精製はゲルクロマトグラフィー（SEPHADEX G 10,G-15/10% HOAc，SEPHADEX LH20/MeOH）及び／又は中圧クロマトグラフィー（固定相：HD-SIL C-8,20-45μ,100Å；移動層：A=0.1%TFA/水、B=0.1%TFA/MeOHでの傾斜溶液）又は分取ＨＰＬＣ（固定相：Water Delta-Pak C-18,15μ,100Å；移動層：A=0.1%TFA/水、B=0.1%T-FA/MeOHでの傾斜溶液)により実施した。
生じた生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ(固定相：100 2.1mm VYDAC C-18,300Å；移動層：アセトニトリル−水傾斜溶液、０.１％ＴＦＡで緩衝、４０℃）で決定した。特徴付けは高速原子衝撃質量分析及びＮＭＲ分析で実施した。
Ｂ．個別の方法
実施例１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−３,４−デヒドロプロリル−Ｐｒｏ−アミド
Ｆｍｏｃ−ＲＩＮＫ−樹脂（置換０.４６ｍｍｏｌ／ｇ）０.５３ｇ、バッチの量０.２５ｍｍｏｌに相当する、をＡＩａにおけると同様にして、それぞれ０.４ｍｍｏｌの
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−３,４−デヒドロプロリン、
Ｆｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、
と反応させた。
Ｎ−メチルアミノ酸に続くアミノ酸は結合試薬としてＰｙＢｒｏｐで二重の結合で、結合した。反復合成サイクルが終了した後、このペプチド−樹脂をＮ−末端脱保護（ＡＩａ中の工程２〜４）処理し、及びＡＩＩにおけるように水性ホルムアルデヒド溶液と更に反応させ、次いで減圧下に乾燥した。生じた樹脂をＡＩＩＩにおけると同様に、ＴＦＡ開裂に晒した。粗生成物（１３２ｍｇ）を分取中圧クロマトグラフィーにより精製し、所望の純粋なペプチド３２ｍｇが得られた（１０分かけてＡ１０−４０％；２００分かけてＡ４０−９０％）。この化合物を高速原子衝撃質量分析で特徴付けした（［Ｍ+Ｈ］+＝５４８）。
実施例２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
ａ）Ｚ−（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボン酸
（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボン酸１.５ｇ（１１.６ｍｍｏｌ）を水４ｍｌ及び５Ｎ ＮａＯＨ２．３３ｍｌ中に溶かした。４℃で１時間かけて、ベンジルクロロギ酸エステル（Ｚ−Ｃｌ）２.１２ｍｌ（１２.８ｍｍｏｌ）及び２Ｎ ＮａＯＨ６.５ｍｌを添加した。反応混合物を室温で１夜撹拌した後、ｐＨを１０に調節した。水性層をジクロロメタン（４×）で抽出し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に調節し、かつジクロロメタン（２×）で抽出した。合した有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で蒸発させると、油状物質として所望の生成物１.７５ｇが得られた。
ｂ）Ｚ−（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル−Ｌ−プロリルベンジルアミド（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボン酸１.７５ｇ（６.６２ｍｍｏｌ）及びプロリンベンジルアミドヒドロクロリド１.５９ｇ（６.６２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン６６ｍｌ中に溶かし、４℃に冷却した。Ｎ−メチルモルホリン０.８９ｍｌ（７.９４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ０.３０４ｇ（２.２１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ １.２８ｇ（６.６２ｍｍｏｌ）の添加後、反応混合物を室温で一夜撹拌し、ジクロロメタン１５０ｍｌで希釈し、かつ飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３×）、水（１×）、５％クエン酸（３×）、水（１×）及び飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ減圧下に濃縮することにより、高粘性油状物質２.６３ｇが得られた。
ｃ）（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル−Ｌ−プロリルベンジルアミド
Ｚ−（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル−Ｌ−プロリルベンジルアミド２.６３ｇ（５.８ｍｍｏｌ）をメタノール４３ｍｌ中に溶かした。１０％パラジウム／木炭１０５ｍｇを添加した後、反応混合物を一夜水素化した。濾過及び蒸発乾固により、脱保護ジペプチド１.８８ｇが得られた。
ｄ）Ｚ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
Ｚ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ１.５４（５.８ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル−Ｌ−プロリル ベンジルアミド１.８８ｇ（５.８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５８ｍｌ中に溶かし、４℃に冷却した。Ｎ−メチルモルホリン０.７８ｍｌ（６.９６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ０.２６６ｇ（１.９３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ １.１２ｇ（５.８ｍｍｏｌ）の添加後、反応混合物を室温で一夜撹拌し、ジクロロメタン１２０ｍｌで希釈し、かつ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１回（３×）、水（１×）、５％クエン酸（３×）、水（１×）及び飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ減圧下に濃縮することにより、乾燥白色フォームとして生成物３.０１ｇが得られた。
ｅ）ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
Ｚ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド３.０１ｇ（５.３３ｍｍｏｌ）をメタノール３９ｍｌ中に溶かした。１０％パラジウム／木炭９６ｍｇを添加した後、反応混合物を３時間水素化した。濾過及び蒸発乾固により、脱保護トリペプチド２.１８ｇが得られた。
ｆ）Ｚ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
Ｚ−Ｖａｌ−ＯＨ１.２８ｇ（５.１１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍｌ中に溶かした。トリエチルアミン０.７３ｍｌ（５.７３ｍｍｏｌ）を添加し、−１０℃に冷却した後、塩化ピバロイル０.６６ｍｌ（５.３７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。該混合物を−１０℃で１.５時間撹拌し、引き続きジクロロメタン１０ｍｌ中のＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド２.１８ｇ（５.１１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０.７３ｍｌ（５.３７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を−１０℃で１.５時間撹拌し、室温で一夜放置し、ジクロロメタンで希釈し、かつ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×）、水（１×）、５％クエン酸（３×）、水（１×）及び飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ真空中で濃縮することにより、乾燥フォームとして生成物２．７５ｇが得られた。
ｇ）Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
Ｚ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド２.７５ｇ（４.１３ｍｍｏｌ）をメタノール３０ｍｌ中に溶かした。濃ＨＣｌ０.３４ｍｌ（４.１３ｍｍｏｌ）及び１０％パラジウム／木炭７８ｍｇを添加した後、反応混合物を３時間水素化した。濾過及び蒸発乾固により、脱保護トリペプチド２.２３ｇが乾燥白色フォームとして得られた。粗生成物を水５０ｍｌ中に溶かし、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで２〜３に調節した。この水層をジクロロメタン（３×）で抽出し、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１０とし、かつジクロロメタン（３×）で抽出した。合した有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ減圧下に濃縮すると、脱保護テトラペプチドベンジルアミド１.７１ｇが得られた。
ｈ）Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド
Ｍｅ2Ｖａｌ−ＯＨ０.４７ｇ（３.２４ｍｍｏｌ）及びＶａｌ−ＭｅＶａｌ−［（２Ｓ,３Ｓ）−３−メチル−ピロリジン−２−カルボニル］−Ｐｒｏ−ベンジルアミド１.７１ｇ（３.２４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ３２ｍｌ中に溶かした。４℃に冷却した後、ＤＥＰＣＮ１.０７ｍｌ（６.４８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１.８８ｍｌ（１２.９６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一夜撹拌し、かつＤＭＦを減圧下に蒸発させた。残分をジクロロメタン１００ｍｌ中に溶かし、かつ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×）、水（１×）、５％クエン酸（３×）、水（１×）及び飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ減圧下に濃縮することにより、無色油状物質として生成物０.８８ｇが得られた。粗生成物を沸騰ジイソプロピルエーテル中に溶かし、冷却の際に沈殿した。この沈殿を集め、乾燥すると純粋な生成物０.５６ｇが得られた。更に、この化合物を高速原子衝撃質量分析により特徴付けした（［Ｍ+Ｈ］+＝６５５.６）。
次の化合物を製造した。これは実施例１及び２と同様にして製造することができた。
0003957751.tif 000006
0003957751.tif 000007
合成した新規化合物のＭＳ−特徴付けに関する例を次の表に記載した。
例                高速原子衝撃ＭＳ分析
［Ｎｏ］          ［分子量（測定）］
４５              ６２７
５３              ６５５
0003957751.tif 000008
0003957751.tif 000009
0003957751.tif 000010
0003957751.tif 000011
0003957751.tif 000012
0003957751.tif 000013
0003957751.tif 000014
0003957751.tif 000015
本発明の化合物は従来の方法により抗癌活性を効力検定することができ、例としてその方法を以下に記載する。
Ａ．試験管内法
細胞毒性を付着細胞列に関する標準法、たとえばマイクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＴ）を用いて測定した。このアッセイの詳細は公開されている（Alley,MC et al，Cancer Research 48:589-601,1988）。指数関数的に成長する腫瘍細胞の培養、例えばＨＴ−２９結腸癌又はＬＸ−１肺腫瘍をマイクロタイタープレート培養を作るために使用した。細胞を９６穴プレート中の１穴あたり細胞５０００〜２００００個を播種し（培地１５０μｌ中）、かつ３７℃で一夜培養した。試験化合物を添加し、１０倍希釈で１０-4〜１０-10Ｍで変化させる。次いで、細胞を４８時間インキュベートする。次いで、各穴中の成長可能な細胞の数を決定するために、ＭＴＴ色素を添加する（食塩水中の３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液３ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）。この混合物を３７℃で５時間インキュベートし、次いで２５％ＳＤＳ、ｐＨ２５０μｌを各穴中に添加する。一夜インキュベートした後、５５０ｎｍでの各穴の吸光度をＥＬＩＳＡ読みとり装置を用いて読みとる。複製した穴からのデータの平均+/- ＳＤに関する値を、式Ｔ／Ｃ％（処理した成長細胞／コントロール成長細胞（％））を用いて、計算した。
処理細胞のＯＤ／コントロール細胞のＯＤ×１００＝Ｔ／Ｃ％
成長抑制５０％を示すＴ／Ｃを与える、試験化合物の濃度をＩＣ50値として示した。
例の化合物              ＩＣ50［Ｍ］
１                      １×１０-9
２                      １×１０-9
４５                    １×１０-7
５３                    １×１０-8
Ｂ．生体内法
更に、本発明の化合物を臨床上の有用性を示す生体内活性に関して、前臨床アッセイにおいて試験した。そのようなアッセイは、この分野においては十分に公知である、腫瘍組織、有利にヒト由来の腫瘍組織が移植された（異種移植）ヌードマウスで実施した。試験化合物は、異種移植を受けたマウスへの投与による、その抗腫瘍効果に関して評価された。
更に詳細には、無胸腺ヌードマウス中で成長したヒト乳房腫瘍（ＭＸ−１）を、約５０ｍｇの大きさの腫瘍片を用いて、新しい受容マウスに移植した。移植日を０日として示した。６〜１０日後に、各投与量ごとに５〜１０匹のマウスの群で、静脈内注射で投与することにより、試験化合物でマウスを処理した。１日おきに３週間の間、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。腫瘍の直径及び体重を週に２回測定した。腫瘍容積をバーニアー・キャリパースで測定した直径及び式：
（長さ×幅２）／２＝腫瘍容積、ｍｍ3
を用いて計算した。
平均腫瘍容積を各処理群に関して計算し、未処理コントロール腫瘍に比較して、各群に関してＴ／Ｃ価を決定した。
新規化合物は良好な腫瘍抑制特性を有する。
配列リスト
（1）一般的情報：
（i）出願人：
（A）名称：BASFアクチエンゲゼルシャフト
（B）町：カール-ボッシュ-シュトラーセ38
（C）市：ルードウイッヒスハーフェン
（E）国：ドイツ連邦共和国
（F）郵便コード（ZIP）：D-67056
（G）電話：0621/6048526
（H）テレファックス：0621/6043123
（I）テレックス：1762175170
（ii）発明の名称：新規ペプチド、その製法及び使用
（iii）配列の数：４
（iv）コンピューター読み取り可能形：
（A）媒体型：ディスケット、3.5インチ、２ＤＤ
（B）コンピューター：IBM ＡＴコンパチブル、80286プロセッサー
（C）オペレーテイング  システム：MS-DOSバージョン5.0
（D）ソフトウエア：ワードパーフェクト
（2）SEQ ID NO：1に関する情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：SEQ ID NO：1：
0003957751.tif 000016
（2）SEQ ID NO：2に関する情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：SEQ ID NO：２：
0003957751.tif 000017
（2）SEQ ID NO：３に関する情報：
（i）配列特徹：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：SEQ ID NO：３：
0003957751.tif 000018
（2）SEQ ID NO：４に関する情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：SEQ ID NO：４：
0003957751.tif 000019