(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸残基２４〜９４のアミノ酸配列を有するヒトＣＣ型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつＣＣＲ４を発現させた２９３／ＥＢＮＡ−１細胞に対して遊走活性を示す、その変異体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸残基１〜９４のアミノ酸配列を有するヒトＣＣ型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつＣＣＲ４を発現させた２９３／ＥＢＮＡ−１細胞に対して遊走活性を示す、その変異体。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸残基２４〜９３のアミノ酸配列を有するマウスＣＣ型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつＣＣＲ４を発現させた２９３／ＥＢＮＡ−１細胞に対して遊走活性を示す、その変異体。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸残基１〜９３のアミノ酸配列を有するマウスＣＣ型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつＣＣＲ４を発現させた２９３／ＥＢＮＡ−１細胞に対して遊走活性を示す、その変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質又はその変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項８】
宿主細胞がカイコ細胞である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７記載の形質転換株を培養し、生産されたタンパク質を培養地から回収することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質又はその変異体の製造法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質またはその変異体を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質またはその変異体に対する単クローン抗体。
【請求項１２】
請求項１１記載の単クローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、該アゴニスト又はアンタアゴニストを含有すると推定される試料、該タンパク質を分泌する細胞及びタンパク質の分泌を誘導するサイトカインを混合し、該タンパク質の分泌量を測定する工程を含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、該アゴニスト又はアンタアゴニストを含有すると推定される試料と、ＣＣＲ４とを反応させ、その結合活性及び／又は反応性を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規なCC型ケモカイン様のタンパク質、それをコードするDNA、該DNAを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体に関する。さらに、本発明は、上記の新規なタンパク質の使用に関し、それを含有する医薬組成物、例えば抗炎症剤、免疫応答調節剤、炎症及び／又は免疫に関連する病気の診断薬に関する。本発明はまた、該タンパク質の単クローン抗体及び該抗体を産生し得るハイブリドーマに関する。
背景技術
物理的、化学的、又は生物学的な機序により起こる、外来性又は内因性の様々な組織障害、侵襲、抗原暴露などは、強い炎症反応や免疫反応を誘導する。これらの反応は重要な生体防御反応であるが、ときには急性又は慢性の疾患の原因ともなりうる。炎症反応や免疫反応を誘発する原因が組織に加えられると、まず好中球、顆粒球、リンパ球、あるいはマクロファージなどのような炎症性細胞あるいは免疫担当細胞の、血管内皮細胞への吸着及び血管外への移動、さらには侵襲あるいは障害された組織や抗原の存在する組織での集積が起こる。このような一連の細胞遊走反応を誘導する物質として一群のケモタクティック・サイトカイン、いわゆるケモカイン、が存在する。ケモカインは遊走反応（ケモタクティック反応）を誘導する一群のサイトカインであり、これまでにヒトでは少なくとも18種のケモカインが報告されている。これらケモカインはアミノ酸配列の類似性から構造的にも相互に密接に関係していることが分かっている。
共通に保存された４個のシスティン残基のうちの最初の２個の並び方から、ケモカインは、αあるいはCXC型（２個のシステインが1個のアミノ酸で隔てられている）とβあるいはCC型（２個のシステインが隣り合っている）に大別される。CXC型ケモカインとして、ヒトでは、IL-8、β-TG、PF-4、MGSA/GRO、ENA-78、NAP-2、GCP-1、GCP-2、IP-10などが知られており、これらは主に好中球の活性化と遊走を誘導する。一方、CC型ケモカインとして、ヒトでは、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、I-309、などが知られており、これらは主にモノサイト／マクロファージの活性化と遊走を誘導する。さらにCC型ケモカインには、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球などに対して活性化と遊走誘導を示すものが知られている（J. J. Oppenheimら、Annu. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991; M. Baggiolini & C. A. Dahinden、Immunol. Todey 15: 127-133, 1994）。さらに、最近では、これら２種類のケモカイングループのいずれにも属さないγ型あるいはＣ型と考えられるケモカインSCM-1の存在が報告されている（T. Yoshidaら、FEBS Letters 360:155-159,1995）。
既述のごとく、ケモカインは、生体の防御反応に深く関与していることから、新規なケモカインを同定し、活性を明らかにすることは、そのケモカインが関与する免疫応答の解明のみならず、関連する症状や異常の治療、予防又は診断方法の開発等に大きく貢献しうる。そのような目的には、ヒト由来のケモカインが有用であるが、必要な動物実験を行うためには、ヒト以外の動物、好ましくはマウス由来のケモカインを用いる必要がある。従って、新規なヒト由来ケモカイン並びに、対応するマウス由来のケモカインを得ることが望ましい。しかしながら、微量で活性を示す多くの生理活性物質と同様、新規なケモカインを得ることは容易でない。
本発明者らは、ケモカインが構造上の類似性を有する分泌タンパクであることに着目し、シグナル配列トラップ法により新規なケモカインを得るために、鋭意研究を重ねた。
即ち、独自に作製したシグナル配列トラップベクター（Yoshidaら、FEB S Letters 360: 155-159, 1995）を用いてマイトージェンで刺激した正常人末梢血単核球（単核細胞）から分泌タンパク質やＩ型膜タンパク質をコードするcDNA断片を多数分離し、その塩基配列を既存のデータベースと比較してCC型ケモカインに特徴的な配列をコードする可能性のあるcDNA断片を見出した。次いで、そのcDNA断片を用いて全長cDNAを分離して塩基配列を決定し、同定を行った。このようにして、最終的に、シグナル配列を有し、シグナル配列が分離された後は成熟型のCC型ケモカインに属する分泌タンパク質をコードするDNAを得ることに成功した。
この新規なDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養すると、該形質転換体は、HUT78細胞等に対して細胞遊走活性を示す、CC型ヒトケモカイン様タンパク質を産生した。次いで、このヒト由来ケモカイン様タンパク質をコードするDNAを用いて、対応するマウスのゲノムDNA及びcDNAを得、最終的に形質転換体に発現させることに成功した。新規なヒト由来のCC型ケモカイン様タンパク質をコードするDNAの塩基配列及び推定のアミノ酸配列は配列番号１に、マウス由来のCC型ケモカイン様タンパク質をコードするDNAの塩基配列及び推定のアミノ酸配列は配列番号２に、それぞれ記載されている。
発明の開示
本発明は下記の特徴:
1）免疫学的な刺激の存在下で末梢血単核細胞から発現が誘導され、
2）非刺激下で胸腺から主として発現され、かつ脾臓からは発現されず、そして
3）ＣＣ型ケモカインに特徴的な隣り合った２個のシステイン残基を有している
を有するタンパク質を提供するものである。
本発明の新規なCC型ケモカイン様のタンパク質は、免疫学的な刺激の存在下、末梢血単核球から発現されるが、フィトヘマグルチニン（PHA）及び液性免疫の誘導条件下でより良く発現される。特に、単球からの発現は、液性免疫の誘導に関与するGM-CSF、IL-3及びIL-4から選択されるサイトカインの存在下で、最も良く誘導される。しかし細胞性免疫を誘導するサイトカインであるTFN-α、INF-γでは誘導されず、又はLPSでも誘導されないという特徴を有する。
本発明者らは、本発明の新規なタンパク質を構成的に発現している臓器が胸腺であること、及び免疫学的刺激に応答してその産生が誘導されるという性状に基づいて、該タンパク質を「TARC」（Thymus and Activation-Regulated Chemokine）と命名した。従って、本明細書中、この新規なタンパク質をTARC又はTARCタンパク質、それをコードするDNAをTARC DNAと呼称する。「TARC」は、ヒト及びマウス由来のTARCを包含するが、必要に応じてヒト由来のTARCをヒトTARC又はhTARC、マウス由来のTARCをマウスTARC又はmTARCと呼称する。また、これらのタンパク質をコードするDNAをそれぞれヒトTARC DNA、hTARC DNA、マウスTARC DNA、mTARC DNAと呼称する。しかしながら、ヒトTARC及びそれをコードするDNAを指す場合には、単にTARC及びTARC DNAと称することもある。なお、本明細書では、TARCに関して、それをコードするDNA又は遺伝子なる語句を相互変換可能に用いる。さらに、DNAは、合成されたDNA又は天然のDNAのいずれであってもよい。
また、本発明によってTARCをコードするDNAが明らかにされたので、当業者ならば、当該技術分野で既知の方法により、容易に１又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって、上記アミノ酸配列を有するTARCと実質的に同等の機能又は活性を有するTARC変異体を得ることができる。従って、そのようにして得られた変異体もまた本発明のTARCに包含されるものとする。
従って本発明はまた、配列番号１のアミノ酸残基２４〜９４のアミノ酸配列を有するヒトCC型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつ該ヒトCC型ケモカイン様タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有する、その変異体を提供するものである。
さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸残基１〜９４のアミノ酸配列を有するヒトCC型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつ該ヒトCC型ケモカイン様タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有する、その変異体を提供するものである。
さらに本発明は、配列番号２のアミノ酸残基２４〜９３のアミノ酸配列を有するマウスCC型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつ該マウスCC型ケモカイン様タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有する、その変異体を提供するものである。
さらに本発明は、配列番号２のアミノ酸残基１〜９３のアミノ酸配列を有するマウスCC型ケモカイン様タンパク質、又はこの配列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、挿入、欠失を含む配列を有し、かつ該マウスCC型ケモカイン様タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有する、その変異体を提供するものである。本明細書中、TARCの「変異体」は、明細書記載のアミノ酸配列を有するTARCと、機能又は活性が実質的に同等であれば、化学的又は生化学的な改変、又は天然もしくは非天然のアミノ酸を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１はヒトTARCのcDNAの塩基配列と、推定のアミノ酸配列とを示す図である。
図２は本発明のヒトTARCタンパク質と、既知の７種のヒトCC型ケモカインとのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
図３において、Ａは正常人末梢血球単核球をPHAで刺激した後の時間及びhTARC mRNAの発現をノーザンブロットにより解析した結果、Ｂは各種のヒト組織でのhTARCmRNAの発現をノーザンブロットにより解析した結果を、それぞれ示す写真である。
図４は組換えベクターpVL-TARCの遺伝子地図である。
図５において、Ａは昆虫細胞で産生したヒトTARCの最終精製品のコスモシル5C4-300カラム（ナカライテスク）からの溶出パターンを示し、ＢはSDS-PAGEの結果を示す電気泳動の写真である。
図６は発現ベクターpGEMX-TARCの遺伝子地図である。
図７は大腸菌で発現したヒトTARCの精製の各段階におけるSDS-PAGEの結果を示す電気泳動の写真である。
図８はマウスTARCのcDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。
図９は組換えベクターpVL-mTARCの遺伝子地図である。
図１０において、Ａは昆虫細胞で産生したマウスTARCの最終精製品のコスモシル5C4-300カラム（ナカライテスク）からの溶出パターンを示す図であり、ＢはSDS-PAGEの結果を示す電気泳動の写真である。
図１１は昆虫細胞で産生し、精製したマウスTARCをBalb/Cマウスの皮下に注射して２４時間後の細胞浸潤像をヘマトキシリン・エオジンで染色した組織の形態を示している。
図１２はPBSのみをBalb/Cマウスに皮下注射し、２４時間後の細胞浸潤像をヘマトキシリン・エオジンで染色した場合の組織の形態を示す写真である。
図１３は125I標識TARCの様々な種類の細胞への特異的結合の結果を示す棒グラフ図である。
図１４において、Ａは125I標識TARCの濃度を変化させた場合のJurkat細胞への特異的結合量の変化を示すグラフであり、Ｂはそのスキャッチャードグラフである。
図１５において、Ａは125I標識TARCの濃度を固定し、非標識TARCの濃度を変化させた場合のJurkat細胞への特異的結合量の変化を示すグラフであり、Ｂは125I標識TARC濃度を一定とした場合において、非標識ケモカイン非存在下もしくは200nMの他のケモカイン又はTARCの存在下でのJurkat細胞への125I標識TARCの結合量を示すグラフである。
図１６は125I標識TARCの濃度を固定し、非標識の他のケモカインあるいはTARCの濃度を変化させた場合の赤血球への特異的結合量の変化を示すグラフである。
図１７は図１６に示したグラフのスキャッチャードグラフである。
図１８はHUT78細胞の遊走活性に対するTARC濃度の影響を示すグラフである。
図１９は顆粒球の遊走活性に対するTARC濃度の影響を示すグラフである。
図２０は単球の遊走活性に対するTARC濃度の影響を示すグラフである。
図２１はPHA、抗CD3抗体及びLPSによる刺激下の正常人末梢血単核球からのTARCの発現の経時変化を示すグラフである。
図２２は各種のサイトカイン［IL-1α（R&D社製）、IL-2（シオノギ製薬社製）、IL-3（ゼンザイム社製）、IL-4（ペプロテック社製）、IL-7（ペプロテック社製）、IL-10（ゼンザイム社製）、GM-CSF（ゼンザイム社製）、TNF-α（ペプロテック社製）、IFN-γ（シオノギ製薬社製）、M-CSF及びPHA（R&D社製）]の刺激下における正常人末梢血単核球からのTARCの発現量を示すグラフである。
図２３はサイトカインの濃度と正常人末梢血単核球からのTARC発現量との関係を示すグラフである。
図２４は正常人末梢血単核球から分離したCD14陽性単球とCD14陰性リンパ球における、PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4によるTARCの発現誘導効果を示すグラフである。
図２５はヒト末梢血単核球をPHA（GIBCO-BRL社製）、LPS（L4391、シグマ社製）、IL-4（ペプロテック社製）、IL-3（ゼンザイム社製）又はGM-CSF（ゼンザイム社製）で刺激した場合の、該細胞におけるTARC mRNAの発現をノーザンブロットで解析した結果を示す。
図２６のＡはサイトカイン（IL-4、IL-3又はGM-CSF）による刺激下に、正常人末梢血単球から分泌されるTARCの、Ｔ細胞株HUT78に対する遊走活性を示すグラフであり、図２６のＢはHUT78に対する遊走活性が抗TARC抗体でのみ消失することを示すグラフである。
図２７はサイトカイン刺激下の正常人末梢血単核球からのTARC発現に対するサイトカインIFN-γ及びIL-10の発現抑制効果を示すグラフである。
図２８はTARCをSEAPとの融合蛋白として発現させるための組換えベクターpDREF-TARC-SEAP（His）6の遺伝子地図である。
図２９はTARC-SEAPの濃度を1nMに固定し、非標識TARCの濃度を変化させた場合のCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞へのTARC-SEAPの特異的結合量の変化を示すグラフである。
図３０はTARC-SEAPの濃度を1nMに固定した場合の、CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞へのTARC-SEAPの結合に対するTARCを含む各種の非標識ヒトケモカイン200nMによる阻害作用を示すグラフである。
図３１はCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞の遊走活性に対するTARC、RANTES及びMIP-1α濃度の影響を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のTARCについて、種々検討を加えた結果、下記のごとく既知のCC型ケモカインと異なる性質を有する、新規なタンパク質であることが明らかになった。
（１）ヒトTARCは遺伝子レベルでは９４個のアミノ酸からなるタンパク質であるが、構造上の解析から、成熟蛋白では２３番目と２４番目のアラニンの間でシグナル配列が切断されて、７１個のアミノ酸からなる分子量約8kDaの塩基性タンパク質であると推定される。
（２）成熟型のTARCはCC型のケモカインと有意の相同性を示し、特にCC型ケモカインで保存されている４個のシステインはすべて保存されている（図２参照）。
（３）既存のCC型ケモカインとの相同性は３０％に満たず、最も高いＲＡＮＴＥＳに対しても２９％程度である。
（４）組織としては、既存のCC型ケモカインと異なり、ほとんど胸腺でのみ構成的に発現する。
（５）免疫学的な刺激下、末梢血単核球（PMBC）により発現される。
（６）PMBCによる発現に関連し、例えば以下の特徴的な性質を有する。
１）Ｔ細胞特異的な抗ＣＤ３抗体よりも非特異的なフィトヘマグルチニン（PHA）により、より強く刺激されるが、通常のケモカインに対して発現誘導活性を有するLPSでは誘導されない。
２）生理的条件の濃度のサイトカイン（GM-CSF,IL-3,IL-4）で発現が誘導される。
３）既知のケモカインの発現を誘導するTNF-α、IFN-γでは、誘導されない。
４）TARC mRNAの発現もPHA、GM-CSF、IL-3及びIL-4で誘導される。
５）GM-CSF、IL-3、IL-4刺激により単球のみから分泌され、PHA、PHA/PMA刺激では逆にリンパ球のみから分泌され、PHA刺激による発現誘導はPMAを加えることにより著しく抑制される。
６）TARCのmRNAは未刺激及びLPS刺激のヒト末梢血単核球ではほとんど発現していないが、GM-CSF、IL-3刺激で約400倍、IL-4、PHA刺激で約40倍の発現誘導が認められる。
（７）マウスTARCは、ヒトTARCと同様の特徴を有するが、遺伝子レベルでは９３個のアミノ酸からなるタンパク質であり、構造上の解析から、成熟蛋白では２３番目と２４番目のアラニンの間でシグナル配列が切断されて、７０個のアミノ酸からなる分子量約８kDaの塩基性タンパク質であると推定される。
（８）ヒトTARCとマウスTARCとの相同性は高く、約６４．４％である。
（９）白血球侵潤作用を有する（ケモカイン様活性を示す）。
（１０）TARCのレセプターはある種のＴ細胞（Jurkat、Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102）、末梢血リンパ球、活性化末梢血T細胞に発現している。
（１１）細胞上のTARCレセプターは、他のケモカインのレセプターと独立しており、TARCの結合は他のケモカインによって阻害されない。
（１２）赤血球上のケモカインレセプターの１つであるDARCと特異的に結合する。
（１３）IL-3及びGM-CSFで刺激した正常人末梢血単球の培養液はHUT78細胞の強い遊走を引き起こすが、未刺激あるいはIL-4で刺激した培養液は遊走を引き起こさない。また、GM-CSF処理の培養上清のHut78細胞に対する遊走活性はモルモット抗TARC抗体処理で殆ど消失する。
（１４）IL-4により誘導される液性免疫を抑制するIFN-γ、免疫反応全般を抑制するIL-10によって、GM-CSF、IL-3、IL-4刺激による末梢血単核球でのTARCの発現誘導は抑制される。
（１５）MIP-1α、RANTES、MCP-1のレセプターであると報告されているCCR4（C.A.Power et al., J. Biol. Chem. vol. 270, No. 33, 19495-19500, 1995）と特異的に結合する（この文献では、アフリカツメガエル卵細胞に発現されたCCR4の実験が報告されている）。
（１６）CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞に対して遊走活性を示す。
以上から、本発明のTARCはCC型ケモカインに属する新規のサイトカインであることが明らかである。また、TARCは、免疫学的刺激により産生が誘導され、しかも殆ど胸腺でのみ構成的に発現しており、また、末梢では、ある種のサイトカイン（GM-CSF、IL-3又はIL-4）により刺激された末梢血単球から発現される。
従って、TARCは未熟なT細胞の胸腺組織への遊走や胸腺組織でのT細胞の分化成熟に関与していることが推測される。また末梢の単核球を免疫刺激することによって産生が誘導されてくることから、炎症および免疫反応で重要な働きをしていることが推測される。従って、TARCは生体内の炎症反応及び免疫反応において白血球の遊走と活性化を誘導すると共に、胸腺でのＴ細胞の分化成熟等にも重要な役割をはたす、医学上重要なタンパク質であると考えられる。
上記のTARCの発現における、既存のCC型ケモカインとの顕著な相違は、TARCの生理学的機能の特異性を示すものである。例えば、Ｔ細胞特異的な抗ＣＤ３抗体よりも非特異的なフィトヘマグルチニン（PHA）により、より強く刺激されることは、TARCがＴ細胞から直接分泌されるというよりむしろ、Ｔ細胞から分泌されたサイトカインの刺激下に、末梢血単核球（ＰＭＢＣ）から発現されることを示している。このことは、既知のケモカインの殆どの発現を誘導する、単球へのLPS刺激では、TARCが発現されなかったことからも明らかである。
具体的には、TARCの発現は、種々のサイトカインにより誘導され、特にGM-CSF、IL-3及びIL-4によって強く誘導される。これらのサイトカインの内、前２者はまた恒常的な免疫系の維持に関与し、IL-4はアレルギーなどの液性免疫の誘導に関与していることから、TARCもそのような液性免疫を誘導する状況下で機能していると推測される。なお、既知のケモカインの発現を誘導するTNF-α、IF-γでは、誘導されないことも、TARCが他のケモカインとは異なる状況で発現し機能していることを示している。しかしながら、これらの事実は、正常人末梢単球以外に、リンパ球でもTARCが発現される可能性を否定するものではない。
さらに、多くのケモカインはPHAに加えてPMA（ホルボールミリステートアセテート）を加えると発現がより強く誘導されるが、TARCの場合には発現が減少した。このことは、TARCの発現がIL-4の発現と同様の制御下にあることを示唆しており、IL-4と同様の液性免疫に関与するとの推測を裏付けるものである。
また、正常人末梢血単球をGM-CSF、IL-3刺激して得られた培養液は、組換えTARCと同様にHUT78細胞に対して細胞遊走活性を示した。また、GM-CSF刺激して得られた培養液の遊走活性は抗TARC抗体によって中和された。このことは、組換えTARCと同様、正常人末梢血単球から分泌されるTARCも、TARC特異的レセプターを発現している細胞に対して細胞遊走活性を持つことを示唆している。
既述のごとく、TARCは、他のケモカインと異なり、末梢血単核球を液性免疫誘導した時に発現が誘導される。液性免疫はIL-4で誘導され、IFN-γで抑制され、逆に細胞性免疫はIFN-γで誘導され、IL-4で抑制される。また、免疫全般はIL-10により抑制される。TARCのGM-CSF、IL-3及びIL-4による正常人末梢血単球からの発現がIFN-γ及びIL-10で抑制されたことは、TARCが免疫反応の誘導で発現し、しかも液性免疫状態で誘導され、逆に細胞性免疫状態では抑制されることを示している。従って、TARCは、特にアレルギー、アトピー、喘息などの液性免疫状態で発現し、機能していると考えられる。
本発明のTARCは、その機能の解明により、胸腺の機能、T細胞の分化と成熟、炎症反応及び免疫反応の制御等を解明するのに有用であり、それにより、炎症反応又は免疫反応を誘導したりあるいは抑制するための新たな手段を提供するために有用である。また、本発明のTARCをコードする遺伝子（DNA）、及び抗-TARC抗体は、TARCの遺伝子変異およびそのmRNAおよびタンパク質の発現状態を解析するのに有用であり、血液系疾患および免疫系疾患の原因究明や診断に新たな手段を提供し得、それによって血液系疾患および免疫系疾患の診断および治療方法の新たな開発に有用である。
また、本発明のTARCをコードする遺伝子（DNA）は適当なベクターに挿入されエクスビボで培養細胞に導入してからあるいは直接に体内に投与されることにより、TARCの遺伝子の異常による遺伝性疾患、各種の癌、およびエイズなどの致死的性感染性疾患、等を対象にした遺伝子治療の開発に有用であり得る。
その他、TARCの血中濃度を測定することにより、アレルギー、アトピー、喘息などの診断も可能と考えられる。また、TARCの発現や活性を抑制することで、アレルギー、アトピー、喘息などの治療又は予防、及びTARCの発現や活性を誘導することにより、液性免疫状態を誘導し、細胞性免疫を抑制することも可能と考えられる。
従って、本発明はまた、本発明のTARC又はその変異体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、予防薬、治療薬及び診断薬を包含し、その投与量及び投与経路は通常の方法によって、使用目的、投与される対象の病状等から適時決定することができる。なお本発明のTARCタンパク質は、本来、生体内活性物質であることから、該タンパク質の活性が生じる量、すなわち本発明の医薬組成物の使用量の範囲内では、その急性毒性は問題とならないことは容易に理解されるであろう。
これらの様々な目的には、TARC及びその活性部分を含む断片、該TARC又はその断片に対するモノクローナル（単クローン）又はポリクローナル抗体、TARCと特異的に結合する受容体等も有用と考えられる。
従って、本発明はまた、TARCに特異的なモノクローナル抗体及びそれを生産するハイブリドーマを提供するものである。そのような抗体及びハイブリドーマは、後述の実施例に記載のごとく、当該技術分野で確立された既知の方法で製造することができる。
また、本発明のTARCタンパク質の作用に鑑み、該タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストを検出することができれば、TARCに関連する疾患や異常の治療、予防又は診断に有用と考えられる。そのような物質のスクリーニングは、本発明で明らかにされた、TARCタンパク質の定量法、レセプター特異性等を利用して行うことができる。
従って、本発明はまた、TARCタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、該アゴニスト又はアンタゴニストを含有すると推定される試料、該タンパク質を分泌する細胞及び該タンパク質の分泌を誘導するサイトカインを混合し、該タンパク質の分泌量を測定する工程を含む方法を提供するものである。
TARCタンパク質の定量は、例えば、後述の実施例に示されているタンパク定量法に従って行うことができる。
また、上記の方法に用いうるサイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−４を例示することができ、TARCを分泌する細胞としては、末梢血単核球を挙げることができる。
さらに、本発明は、TARCタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、該アゴニスト又はアンタゴニストを含有すると推定される試料と、該タンパク質に特異的なレセプターとを反応させ、その結合活性及び／又は反応性を測定する工程を含む方法を提供するものである。
上記の方法に用いうるレセプターとしては、CCR4を挙げることができ、結合活性又は反応性の測定は、後述の実施例に記載の方法で行う二とができる。
次に、本発明のTARCの製造法、同定法等を説明する。以下の記載は例示にすぎず、特に指示しない限り、当業者既知の遺伝子組換え技術、宿主細胞の形質転換及び形質転換体による組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法及び分析法、及び免疫学的手法等を、適宜用いることができる。
Ｉ．TARCタンパク質をコードするDNAの配列決定
本発明のTARCタンパク質をコードするDNAを含むDNA断片は、例えば、フィトヘマグルチニン（PHA）で刺激した正常人末梢血単核球（PBMC）由来のcDNAライブラリーから得ることができる。
（１）プローブの調製
cDNAライブラリーからTARCタンパク質をコードする遺伝子をクローニングするためのプローブを以下の方法で調製する。
TARCは分泌タンパク質であるから、そのmRNAの５’端にはシグナル配列をコードする領域がある。そこで、まずPHA刺激PBMCからquickprep mRNA精製キット（Pharmacia社製）を用いてpoly（A）+RNAを抽出する。このmRNAよりランダムプライマー（GIBCO-BRL社製）を用いて一本鎖DNAを作製し、３’端にオリゴ（dC）アンカーを結合する。
次にオリゴ（dG）プライマーで２本鎖DNAを合成し、超音波処理により分解し、T4ポリメレースで修復する。これをUni-ampアダプター（Clontech社製）と結合し、アガロース電気泳動に供した後、５’側配列に富む300-600bpの断片を抽出する。得られた断片をシグナル配列トラップベクターpDREF-CD4ST（Yoshidaら、FEBS Letters360: 155-159, 1995）に挿入する。このベクターはエプシュタイン・バールウイルス（EBV）の複製起点を持つシャトルベクターであり、EBNA-1タンパク質の存在下で自己複製ができる。また強力なEF-1αプロモーターの下流にシグナル配列を欠くヒトのCD4をコードするDNAが挿入されており、この間にシグナル配列をコードする未知のcDNA断片が正しくフレームも合って挿入された場合、トランスフェクトされたRaji細胞でCD4が発現してくるという特徴を有する。
上記断片を挿入したベクターpDREF-CD4STでRaji細胞をトランスフェクトし、CD4陽性となったRaji細胞をソーティングにより濃縮し、そこからプラスミドを回収する。次いで、個々のプラスミドを再度Raji細胞に導入し、CD4の発現を確認することにより、最終的にシグナル配列をコードすると考えられるcDNA断片が挿入されたプラスミドを分離する。これらのプラスミドの挿入cDNAの塩基配列を決定し、既存のデータベースと比較することにより、CC型ケモカインに特徴的な配列をコードするcDNA断片を選択する。このものは、目的の新規タンパク質をコードしている可能性があり、全長鎖cDNAを得るために、32Pなどで標識して通常のPHA刺激ヒトPBMC由来のcDNAライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして用いる。
cDNAライブラリーは、例えば、以下の方法で常法通り構築される。PHA刺激ヒトPBMCよりquickprep micro mRNA精製キット（Pharmacia社製）を用いてpoly（A）+RNAを抽出し、このpoly（A）+RNAからオリゴ（dT）をプライマーとして逆転写酵素によりcDNAを合成し、例えばpSPORT１ベクター（GIBCO-BRL社製）に挿入する。ライブラリーのスクリーニングは、上記の項で得られたプローブを用い、組換えファージプラークのプラークハイブリダイゼーション及び組換え大腸菌のコロニーハイブリダイゼーション等の当業者既知の任意の方法で行われる。
次いで、得られた組換えプラスミドの挿入cDNAの塩基配列を決定する。配列決定は、例えば以下のように行われる。まず、挿入断片を該断片の内部に存在する制限酵素部位を用いて切断し、各cDNA断片を、それぞれ適当なシークエンスベクター、例えばpBluescript（Stratagene社製）にサブクローニングする。次にクローニングした断片の塩基配列を、例えばSanger法（F. Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977）によって決定する。
ＩＩ．組換え型TARCタンパク質の発現
本発明のTARCタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞に導入して、形質転換体を得る。
本発明のTARC DNAの発現に適切な発現ベクターとして、宿主細胞が細菌の場合には、pRSET, pGEMEX及びpKK233-2、酵母の場合には、pYES2、昆虫細胞の場合にはpVL1393、そして動物細胞の場合にはpEF-BOS, pSRα及びpDR2等が例示されるが、これらに限定されない。
TARC DNAは、大腸菌等の原核微生物の場合には、強力なプロモーター（例えばT7プロモーター）の支配下に、原核微生物によって分泌されるタンパク質の天然前駆物質に由来するシグナル配列（例えばシグナルペプチドOMPa）と、成熟型TARCタンパク質からなる前駆体タンパク質として、強力なプロモーター（例えばT7プロモーター）の支配下に発現させることができる。
酵母の場合には、酵母によって分泌されるタンパク質の天然前駆物質に由来する配列（例えばフェロモンαのプレプロ配列）と成熟型TARCタンパク質からなる前駆体タンパク質として発現させることができる。
動物細胞の場合には、TARCタンパク質遺伝子を適当な発現ベクターの強力なプロモーター（例えばEF-1αプロモーター）の下流に挿入し、効果的な選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）と共に動物細胞（例えばCHO dhfr-細胞）に導入し、薬剤（この場合はメトトレキセート）に対する耐性により細胞を選択することにより、高発現の細胞株を樹立することができる。
ヒト細胞の場合には、TARCタンパク質遺伝子をウイルス又はレトロウイルスに組込み、この組換えウイルスを細胞に感染させる。このようにして得られた形質転換体を、TARCの発現に適した条件下で培養すると、形質転換体によってTARCタンパク質が産生される。また、成熟型TARCタンパク質は、例えば固相法を用いて、及び2個のジスルフィド結合の存在に必要な注意を払って、公知の方法で全合成することも可能である。
従って、本発明は、上記の遺伝子工学的に、又は化学的に合成されたTARCを包含する。
III．抗TARC抗体の作製
既述のごとく、本発明のTARCに特異的な抗体は、TARCが関与する生理学的な事象の解明、TARC活性が関与する異常や疾患の治療、予防又は診断に有用である。従って、本発明はまた、TARCタンパク質に対する抗体を提供するものである。
タンパク質に対する抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）の製造方法は当該技術分野で周知である。
例えば、配列番号１又は２に記載のTARCのアミノ酸配列の一部に基づいて、通常のペプチド合成機で合成した合成ペプチドや、TARCを発現するベクターで形質転換した細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、などにより産生されたTARCタンパク質を通常のタンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの動物を免疫することにより、その血清由来のポリクローナル抗TARC抗体を作製し得る。
又は、免疫したマウスやラットの脾臓又はリンパ節から細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合させてKohlerとMilsteinの方法[Nature,256,495-497（1975）]又はその改良法であるUedaらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,4386-4390（1982）]に従ってハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマから単クローン（モノクローナル）抗TARC抗体を産生させることができる。単クローン抗体調製のための工程を以下に例示する。
（ａ）TARCタンパク質によるマウスの免疫；
（ｂ）免疫マウスのヒ臓の除去及びヒ臓細胞の分離；
（ｃ）分離されたヒ臓細胞及びマウスミエローマ細胞との融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記のKohlerらに記載の方法による融合；
（ｄ）未融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地での得られたハイブリドーマ細胞の培養；
（ｅ）ELISA法及び免疫電気移転法などによる所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選択及び限定希釈法等によるクローニング；及び
（ｆ）TARC単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞の培養、及び培養物からの単クローン抗体の分離。
（ＩＶ）TARC mRNA及びTARCタンパク質の検出
本発明のTARC mRNA及びTARCタンパク質の存在は、それぞれ、通常の特異的なmRNA検出法、及びタンパク質検出法を用いて行うことができる。
mRNAは、例えば、アンチセンスRNAやcDNAをプローブに用いたノーザンブロット解析やインサイツ・ハイブリダイゼーション法により検出できる。また、mRNAを逆転写酵素でcDNAに変換したのち、適当なプライマーの組み合わせによるポリメレースチェインリアクション法（以下、ＰＣＲと称する）によっても検出することができる。
タンパク質は、上記（I1I）で得られたTARC特異抗体を用いた通常の免疫沈降法やウエスタンブロット法により、その存在を確認することができる。
Ｖ．TARCタンパク質の免疫学的定量法
例えば、放射性アイソトープ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼのような酵素、あるいは蛍光色素などで標識した一定量のTARCに、濃度既知の非標識TARC、及び血清由来の抗TARCポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を加えて、抗原抗体競合反応を行わせる。非標識抗原の濃度を適当に変化させた後、抗体と結合した標識抗原と抗体に結合していない標識抗原とを適当な方法で分離して、抗体と結合した標識抗原の放射能量、酵素活性、又は蛍光強度を測定する。非標識抗原量が増すにつれ、抗体と結合する標識抗原の量は減少する。この関係をグラフにして標準曲線を得る。またTARCタンパク質上の異なるエピトープを認識する２種類の単クローン抗体の一方を固相化し、他方を上記のいずれかの方法でラベルし、固相化抗体に結合したTARCの量をラベル抗体で検出定量する、いわゆるサンドイッチ法によっても可能である。
次に、上記の反応系に濃度既知の非標識抗原の代わりに未知量の抗原を含む試料を加え、これを反応させた後に得られる、放射能量、酵素活性、又は蛍光強度、を標準曲線にあてはめれば、試料中の抗原、すなわちTARCタンパク質の量を知ることができ、炎症反応や免疫反応又はT細胞の分化成熟をモニターするための新しい方法が提供され得る。
ＶＩ．TARCタンパク質のケモカイン活性の確認
本発明のTARC蛋白のケモカイン活性は、例えば、試験管内では、一定の口径のポアを有するフィルターを介在させて仕切った培養容器の一方の側にTARCを入れ、他方の側に標的細胞を入れて、一定時間後にフィルターのポアを通過してTARCの存在する側へ移動した細胞数をランダムな移動数と比較することにより、確認できる。また、生体内では、精製したTARC蛋白質を動物の皮下に投与して細胞の浸潤と集合を組織的方法で検出することによっても確認し得る。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１ ヒトTARCをコードするDNAの単離
Ｉ．ヒトTARC cDNAのクローニング
（１）フィトフェマグルチニン刺激ヒト末梢血単核細胞由来のcDNAライブラリーの作製
フィトフェマグルチニン（PHA）で刺激した正常人末梢血単核細胞のcDNAライブラリーは、GIBCO-BRL社製のcDNA合成システム及びcDNAクローニングシステムを用い、文献（J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））既知の常法に従い、以下のように作製した。
まず、quickprep micro mRNA精製キット（Phamacia社製）を用いて、PHAで刺激した正常人末梢血単核細胞よりpoly（A）+RNAを抽出した。PHAで72時間刺激したヒト末梢血単核細胞2x107個を付属の細胞溶解液により溶解した。次に、oligo-dT樹脂を加えて3分混和し、poly（A）+RNAをoligo-dT樹脂に結合させた後、TOMY遠心機MRX-150（トミー精工社製）で12000回転で1分間遠心分離した。得られた沈殿物を高塩濃度洗浄液で3回、低塩濃度洗浄液で5回洗浄した後、溶出液で溶出した。この溶出液に、0.1倍量の3M酢酸ナトリウムと2倍量のエタノールを加えて-80℃で1時間冷却し、TOMY遠心機MRX-150（トミー精工社製）で12000回転で5分間遠心分離して、沈殿したpoly（A）+RNAを滅菌蒸留水に溶解した。そして、波長260nmでの吸光度を測定することにより、回収したpoly（A）+RNA量を計算した。PHA刺激ヒト末梢血単核細胞より10μgのpoly（A）+RNAが得られた。
次に、精製したpoly（A）+RNAを鋳型として、cDNAの合成を以下のように行った。まず、4μgのpoly（A）+RNAを鋳型として逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT（GIBCO-BRL社製）を用いて、反応緩衝液（50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、500μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、50μg/ml NotIプライマー−アダプター（GIBCO-BRL社製）、及び2万U/ml逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT）中で、37℃で1時間反応させて、1本鎖DNAを合成した。なお、NotIプライー−アダプターの配列を配列表の配列番号３に示す。この1本鎖DNAを鋳型として、反応緩衝液（25mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM KCl、5mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、1.2mM DTT、0.15nM β-NAD+、250μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、65U/ml DNAリガーゼ、250U/ml DNAポリメラーゼI、及び13U/ml RNase H）中で、16℃で2時間反応させてcDNAを合成した。次に、T4 DNAポリメラーゼを、最終濃度が65U/mlとなるように加えて、さらに16℃で5分間反応させて2本鎖DNAとした。この2本鎖DNAを、反応緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 7.6、10mM MgCl2、1mM DTT、1mM ATP、5% PEG 8000、200μg/ml SalIアダプター（GIBCO-BRL社製）、及び100U/mlのT4 DNAリガーゼ）中で、16℃で16時間反応させて、Sa1Iアダプターに結合させた。なお、SalIアダプターは、配列表の配列番号4及び5に示すDNAがアニーリングした２本鎖である。こうして完成したcDNAをpSPORT1ベクターのNotIとSalI部位の間に挿入してcDNAライブラリーを作製した。
（２）シグナルシークエンストラップ用cDNAライブラリーの作製
シグナルシーケンストラップライブラリーは、PHA刺激ヒト末梢血単核細胞からmRNAの５’末端近傍を濃縮したcDNAを調製し、GIBCO-BRL社製のcDNA合成システム、5’RACEシステム、及びcDNAクローニングシステムを用いて、文献（J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））記載の常法に従い、作製した。
まず、PHA刺激ヒト末梢血単核細胞より得られたpoly（A）+RMを鋳型として、mRNAの５’末端近傍を濃縮したcDNAを以下のように合成した。５μgのpoly（A）+RNAを鋳型として、逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT（GIBCO-BRL社製）を用いて、反応緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、500μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、150ngランダムプライマー（GIBCO-BRL社製）、及び2万U/ml逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT）中で、37℃で1時間反応させて1本鎖DNAを合成した。この反応液に6N NaOHを最終濃度が0.4Nとなるように加えて、さらに65℃で30分間反応させて、鋳型poly（A）+RNAを加水分解した後、6N酢酸を最終濃度が0.4Nとなるように加えて中和した。次に、等量の10mM Tris-HCl、pH 8.0飽和フェノールとクロロホルム混合液（1:1）を加えて撹拌した後、TOMY遠心機MRX-150で12000回転で5分間遠心分離した。その水層を取り出して、0.2倍量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを加えて、-80℃で1時間冷却後、再びTOMY遠心機MRX-150（トミー精工社製）で12000回転で5分間遠心分離して、その沈殿物を滅菌蒸留水に溶解した。この1本鎖DNAを、反応緩衝液（20mM Tris-HCl、pH 8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dCTP、及び400U/mlターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）中で、37℃で10分間反応させて、３’端にオリゴdCテールを結合させた。さらに70℃で5分間処理してターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを失活させた。このオリゴdCテールを結合させた1本鎖DNAを、反応緩衝液（25mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM KCl、5mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、1.2mM DTT、0.15mM β-NAD+、250μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、500ngアンカープライマー（配列表の配列番号6）、65U/ml DNAリガーゼ、250U/ml DNAポリメラーゼI、及び13U/ml RNase H）中で、16℃で2時間反応させて、2本鎖DNAを合成した。なお、アンカープライマーはDNA合成機（Cyclone Plus DNA Synthesizer、ミリジェン／バイオサーチ社製）で合成した。合成にはミリジェン／バイオサーチ社のβ-リンク・ベータシアノエチルホソホアミダイド試薬を用いた。合成後、アンモニア水（28%、ナカライテスク社製）2mlで合成カラムから合成オリゴヌクレオチドを溶出した後、60度C、5時間処理することにより保護基を離脱させた。脱保護したオリゴヌクレオチドを10倍量のブタノールを加えてTOMY遠心機（トミー精工社製）で3000回転で10分間遠心分離することにより沈殿させて回収した。回収したオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、波長260nmでの吸光度を測定することにより、その量を決定した。
この2本鎖DNAを、氷上で冷却しながら、TOMY超音波破砕装置UD-201（トミー精工社製）で150秒間最大出力で部分分解し、T4 DNAポリメラーゼを、最終濃度が65U/mlとなるように加えて、16℃で5分間反応させた後、反応寺緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 7.6、10mM MgCl2、1mM DTT、1mM ATP、5% PEG 8000、200μg/ml UNI-Ampアダプター、及び100U/mlのT4 DNAリガーゼ）中で、さらに16℃で16時間反応させて、DNI-Ampアダプター（Clontech社製）に結合させた。なお、UNI-Ampアダプターは、配列表の配列番号7及び8に示すDNAがアニーリングしたものである。このようにしてできた部分分解2本鎖DNAを鋳型として、反応緩衝液（10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1%ゼラチン、200μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、400nM UAPプライマー（GIBCO-BRL社製）、400nM UNI-Ampプライマー（Clontech社製）、及び100U/ml AmpliTaq DNAポリメラーゼI）中で、ＰＣＲ反応を行った。なお、UAPプライマーとUNI-Ampプライマーの配列を配列表の配列番号9と10に各々示す。ＰＣＲは宝酒造から購入したAmpliTaq Kitを用い、DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）で行った。反応は、94℃で3分間前処理した後、94℃で45秒間、58℃で45秒間、72℃で2分間の反応サイクルを30回繰り返し、最後に72℃で3分間処理して行った。
こうして完成したmRNAの５’末端近傍を濃縮したcDNAを別途に作製したpDREF-CD4STベクター（Yoshidaら、FEBS Letters 360: 155-159, 1995）のSalIとXbaI部位の間に挿入して、シグナルシーケンストラップライブラリーを作製した。このシグナルシーケンストラップライブラリーを以下のように、ヒトB細胞株Rajiに導入し、細胞表面にCD4を発現させ得るクローーンを同定することにより、シグナルシーケンスを持つ遺伝子の断片を選択した。
（３）シグナルシークエンストラップ
上記（２）で調製した、PHA刺激ヒト末梢血単核細胞由来の、mRNAの５’末端近傍を濃縮したcDNAからなるシグナルシークエンストラップcDNAライブラリー10μgを、500μlのPBSに懸濁した、1x107個のRaji細胞に、エレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションは、バイオラッド社のGene Pulserで、電圧250V、静電容量500μFで行った。cDNAライブラリーが導入されたRaji細胞は、ハイグロマイシン（200μg/ml）存在下で１週間培養し、薬剤耐性を示す細胞を選択することにより得られた。この薬剤耐性を示す細胞を、マウス抗ヒトCD4抗体（OKT4、ATCCより入手）と4℃で30分間反応させ、洗浄した後、さらに、磁気ビーズ標識ヒツジ抗マウスIgG抗体（Dynabeads、ダイナル社より購入）と4℃で30分間反応させた。この磁気ビーズで標識した、細胞表面にCD4を発現する細胞を、磁気分離器を用いて分離した。この磁気分離を3回行い、最終的に45%の細胞が、細胞表面にCD4を発現する細胞集団が得られた。
この細胞集団から、Magic Minipreps DNA精製システム（プロメガ社製）によって、プラスミドDNAを回収し、再び、大腸菌DH10Bに導入した。この大腸菌をLB-アンピシリン-アガープレート（10gトリプトン、5gイーストエキストラクト、10g NaCl、15gアガー、50μg/mlアンピシリン/蒸留水１リッター）に播き、一晩37℃で培養した。プレートに生えた大腸菌の各々のコロニーを、5mlのLB-アンピシリン培地（10gトリプトン、5gイーストエキストラクト、10g NaCl、50μg/mlアンピシリン/蒸留水１リッター）で、一晩37℃で培養した。これら培養液から、Magic Minipreps DNA精製システム（プロメガ社製）によって、プラスミドDNAを精製し、再び、500μlのPBSに懸濁した1x107個のRaji細胞に、エレクトロポーレション法を用いて導入した。これらのRaji細胞を、マウス抗CD4抗体（OKT4、ATCCより入手）と4℃で30分間反応させ、洗浄した後、さらに、FITC標識ウサギ抗マウスIgG（Fab'）2抗体（Dako社より購入）と4℃で30分間反応させた。このFITCで標識した、細胞表面にCD4を発現する細胞を、FacStar Plus（Becton-Dickinson社製）を用いて同定した。100個の大腸菌のコロニーを調べ、最終的に、細胞表面へのCD4の発現を誘導した42クローンを得た。
これらのクローンの塩基配列を、Sanger法により、pharmacia社製のAutoread Sequence kitとA.L.F. II自動シーケンサーを用いて決定した。これらのクローンの配列を既存のデータベースと比較した結果、クローン98は、推定上のシグナルシーケンス切断部位の9アミノ酸下流に、２つの連続したシステインを有しており、細胞遊走性サイトカインの１種である、CC型ケモカインの特徴と一致する構造上の特徴を有することが分かった。
（４）ヒトTARCの完全長cDNAのクローニング
次に、クローン98の完全長cDNAを得るために、207bpのクローン99のcDNA断片をプローブとして、マルチプライムDNA標識システム（Amersham Japan社製）により32Pで標識し、これを用いて、（1）で作製したPHA刺激ヒト末梢血単核細胞のcDNAライブラリーをコロニーハイブリダイゼション法によりスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼション法は文献（J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））に記載の既知の方法で行った。
ヒトPHA活性化末梢血単核細胞cDNAライブラリーの入った大腸菌DH10BをLB-アンピシリン-アガープレート（10gトリプトン、5gイーストエキストラクト、10g NaCl、15gアガー、50μg/mlアンピシリン/蒸留水１リッター）に播き、一晩37℃で培養した。プレートに生えた大腸菌のコロニーをナイロン膜（Hybond-N+、Amersham Japan社製）に転写した後、SDS処理（10% SDS）、アルカリ変性（0.5N NaOH、1.5M NaCl）、そして洗浄（2x SSC）の操作を行った。この膜を、32P標識クローン98をプローブとしてハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液は、6x SSC（1x SSCは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウムからなる）、50%ホルムアミド、0.5% SDS、5倍のデンハート溶液、及び100μg/mlサケ精子DNAを用い、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で室温で10分間、0.2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で60℃で30分間を2回行った後、X線フィルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して、プローブと反応するコロニーを同定し、最終的に1つのcDNAクローン（clone D3A）を得た。このクローンD3Aに挿入されているcDNAの配列をSanger法により、Pharmacia社の、Autoread Sequence kitとA.L.F. II自動シーケンサーを用いて決定し、さらに後述の様々な検討を加えた結果、該cDNAは、目的の新規なCC型ケモカイン様タンパク質（TARC）をコードしていることを確認した。
ＩＩ．ヒトTARCの構造決定
（１）hTARC cDNAの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列の解析
上記のI.（4）で得たクローンD3Aの塩基配列を、Sanger法により、Phamacia社の、Autoread Sequence kitとA,L.F. II自動シーケンサーを用いて決定した。cDNAクローンD3Aの塩基配列および内部に翻訳終了コドンを持たないオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を図１に示す。
図１に示されているように、クローンD3Aに挿入されている遺伝子は94個のアミノ酸よりなるオープンリーディングフレームを有し、N末端にシグナルペプチドに特徴的な、疎水性の強いアミノ酸配列を有する遺伝子であることが明らかとなった。この94個のアミノ酸からなるタンパク質の分子量計算値は、10,507である。また、推定上のシグナルペプチド切断部位は、計算によると、Ala-23とAla-24の間であり、図１には縦棒で表示されている。この切断部位から９アミノ酸下流にCC型ケモカインの特徴である２つの連続するシステインが示されている。
さらに、シグナルペプチド切断後の、71個のアミノ酸からなる、推定上の成熟型タンパク質は分泌タンパク質であると推定される。この71個のアミノ酸からなる、推定上の成熟型分泌タンパク質の分子量計算値は8,083であり、等電点は、計算によると9.7である。
（２）CC型ケモカイン類との配列上の類似性
FASTAおよびClustalVプログラムを用い、hTARCのアミノ酸配列と、既知のCC型ケモカインのアミノ酸配列とを比較した。結果を図２に示す。図２中、hTARCを含めてすべてのCC型ケモカインで保存されているアミノ酸は影づけをしたうえに太線で囲み、一方ほとんどのケモカインで保存されているアミノ酸には影づけのみを行っている。またhTARCと他のCC型ケモカインとの相同性の程度を%で右側に示している。
図２から、hTARCの成熟型分泌タンパク質のアミノ酸配列はCC型ケモカインに属するRANTESと29%、MIP-1aと26%、MIP-1bと28%、I-309と24%、MCP-1と24%、MCP-2と24%、MCP-3と28%の相同性があることが明らかとなった。また、全てのCCケモカインで保存されている、4つのシステインはhTARCでも保存されていることが明らかとなった。以上の結果は、得られたアミノ酸配列が新規のヒトCC型ケモカインのものであることを示唆している。
III．ノーザンプロット解析によるhTARC mRNAの発現解析
各種のヒト組織より単離したpoly（A）+RNA 2μgを、アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写したもの（マルチプルティッシュブロット）はClonetech社より購入した。またヒト末梢血単核細胞をPHAで刺激し、0、4、24、および72時間後に、quickprep micro mRNA精製キット（Pharmacia社製）を用いて、poly（A）+RNAを抽出した。単離したpoly（A）+RNA 1μgを、0.66Mホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル中で電気泳動にかけ、ナイロン膜（Hybond-N+）（Amersham Japan社製）に転写した。これらの膜を、マルチプライムDNA標識システム（Amersham Japan社製）により32Pで標識したhTARCのcDNAクローンD3AのSmaI-PstI断片をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーショ溶液は5x SSPE（1x SSPEは、0.18M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.5、1mM EDTAよりなる）、50%ホルムアミド、2% SDS、10xデンハート溶液、100μg/mlサケ精子DNAを用い、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で室温、10分間、0.2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で60℃、30分間を2回行った後、X線フィルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して解析した。PHAで刺激した後の時間及びTRACmRNAの発現の結果を図3Aに、各種のヒト組織でのTRACmRNAの発現を図3Bに示す。
図3Aには、hTARCのmRNAは未刺激のヒト末梢血単核細胞では発現していないが、PHAで刺激すると、4時間後ではまだ検出されないものの、24時間後にはほぼ最大になるように誘導され、72時間後でも小量の発現が持続することが示されている。
また、図３Ｂには、hTARCのmRNAは胸腺において大量に発現し、肺、大腸、および小腸ではごく少量発現しているが、他の組織ではほとんど検出されないことが分かる。
これらの結果は、ｈTARCが、他のCC型ケモカインと異なり、胸腺でのみ構成的に発現しており、その産生が免疫学的刺激により誘導されることを示している。
実施例２ 組換えヒトTARCのカイコ細胞での発現
（１）カイコ細胞におけるｈTARC DNAの発現のための組換えベクターpVL-TARCの構築
両端にEcoRIおよびNotI部位を持ち、ｈTARCの翻訳開始コドンから翻訳終了コドンまでを含む0.5kbのDNA断片を、実施例１記載のクローンD3AをEcoRIとNotIで同時に消化することにより得た。このDNA断片を、組換え型バキュロウイルスの作製に用いるpVL1393（Invitrogen社製）のEcoRI部位とHotI部位の間に挿入し組換えベクターpVL-TARCを得た。この組換えベクターpVL-TARCの遺伝子地図を図４に示す。
（２）形質転換体の培養
次に、組換えベクターpVL-TARCと、致死的な欠失を持つ、直線状の、AcNPVのDNAをSf9昆虫細胞に同時に導入し、組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスは、限界希釈法により純化し、さらに、Sf9昆虫細胞にM.O.I.＝0.1で感染させて、種ウイルスを得た。この種ウイルスを、Tn5B-4昆虫細胞（Invitrogen社製）（150cm2のフラスコあたり1.2x107個）にM.O.I.＝10から20で感染させて、EX-CELL 400無血清培地（JRH Biosciences社製）（150cm2のフラスコあたり30ml）で、27℃で2日間培養した。
（３）生成物の単離、精製
培養上清を回収し、0.22μmのフィルターメンブランでろ過した。このろ液に1/10容の500mM MES（pH 6.5）を加え、A緩衝液（50mM MES（pH 6.5）/100mM NaCl）で平衡化した1mlのResouce-Sカラム（Pharmacia社製）にかけた。このｈTARCタンパク質の結合したカラムをA緩衝液で洗浄後、A緩衝液およびB緩衝液（50mM MES（pH 6.5）/1.0 M NaCl）を用いたNaClの塩濃度の勾配により溶出した。ｈTARCタンパク質を含むフラクションはSDS-PAGEと銀染色を用いて同定した。SDS-PAGEの結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ中、ＦはFPLCフラクション（最終段階の１つ前の精製段階）、ＨはHPLCフラクションについての結果を各々示している。
このｈTARCタンパク質を含むフラクションに最終濃度が0.1%となるようにTFAを加えた後、A緩衝液（0.1% TFA）で平衡化したコスモシル5C4-300カラム（ナカライテスク社製）にかけ、A緩衝液およびB緩衝液（0.1% TFA、60%アセトニトリル）を用いたアセトニトリルの濃度勾配により溶出した。ｈTARCタンパク質の溶出パターンを図５Ａに示す。ｈTARCタンパク質を含むフラクションを集めて、真空乾燥でアセトニトリルを揮発させ、エンドトキシンフリーのPBSに対して透析して最終的な精製品を得た。タンパク質の濃度はBCA kit（Pierce社製）を用いて、BSAを対照として決定した。培養上清300mlから300μgの精製hTARCタンパク質が得られ、発現量は良好であった。混入しているエンドトキシン量はLimulus amoebocyte lysateassay（QCL-1000、Bio Whitaker社製）を用いて定量し、4pg/μg以下であった。精製ｈTARCタンパク質のN末端アミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサー（島津社製）を用いて決定し、ARGTNVGREであった。図５Ｃに示される様に、このアミノ酸配列は、塩基配列から予測されたシグナルペプチドが切断されたのちの、71個のアミノ酸からなる成熟型分泌タンパク質のN末端アミノ酸配列と一致した。
実施例３ 組換えヒトTARCの大腸菌での発現
（１）大腸菌におけるｈTARC DNAの発現のための組換えベクターpGEMEX-TARCの構築
両端にNdeIおよびNotI部位を持ち、ｈTARCの成熟型の開始コドンから翻訳終了コドンまでを含む0.2kbのDNA断片を、実施例１記載のクローンD3Aを鋳型としてPCR法により得た。PCRに用いた２つのオリゴヌクレオチドの配列を、配列表の配列番号１１および１２に示す。PCRは宝酒造から購入したAmpliTaq Kitを用い、DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）で行った。反応は、クローンD3AのDNAを鋳型として、反応緩衝液（10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1%ゼラチン、200μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、400μMプライマー、および100U/ml AmpliTaq DNAポリメラーゼI）中で行った。反応は、94℃で3分間前処理した後、94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で1分間の反応サイクルを15回繰り返し、最後に72℃で3分間処理して行った。この反応生成物をNdeIとNotIで同時に消化し、pGEMEX1（プロメガ社製）のNdeI部位とNotI部位の間に挿入し、発現ベクターpGEMEX-TARCを得た。このベクターの遺伝子地図を図６に示す。
（２）形質転換体の培養
発現ベクターpGEMEX-TARCを導入した大腸菌BL21株を用いて、成熟型hTARCのアミノ末端にメチオニンが付加したタンパク質として発現させた。大腸菌BL21株の培養はIPTGを1mMとなるように加えたLB培地で行い、37℃で３時間培養した。
（３）生成物の単離、精製
大腸菌をトリス緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、1mM 2-ME、50mM NaCl、0.2mM PMSF）に懸濁し、凍結融解を5回行った。次いで、DNaseIを10μg/ml、MgCl2を10mMとなるように加え、室温で10分間放置した。10,000回転、15分間、4℃の条件で遠心分離し、沈殿したhTARCタンパク質を洗浄液（0.5% Triton X-100、10mM EDTA）で3回洗浄し、部分精製した組換え型hTARCタンパク質を得た。hTARCの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動の結果を図７に示す。図７中、Ｓは遠心分離した上清について、Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３は遠心分離により得られた沈殿を洗浄液で各々１、２及び３回洗った際の溶出物について、ＰはhTARCを含む洗浄後の沈殿についての結果である。
実施例４ マウスTARCをコードするDNAの単離
Ｉ．マウスTARCゲノムDNAのクローニング
マウスTARCのゲノムDNAを得るために、実施例１に記載のヒトTARCのcDNAクローンD3AのSmaI-PstI断片をプローブとして、マルチプライムDNA標識システム（Amersham Japan社製）により32Pで標識し、これを用いて、Balb/Cマウス由来のゲノムDNAライブラリー（Clontech社製）をプラークハイブリダイゼション法によりスクリーニングした。プラークハイブリダイゼション法は文献（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））記載の方法に従って行った。
Balb/Cマウス由来のゲノムDNAライブラリーのファージ液と大腸菌LE392をLB-プレート（10gトリプトン、5gイーストエキストラクト、10g NaCl、15gアガー/1L蒸留水）に播き、一晩30℃で培養した。プレートに生えたファージのプラークをナイロン膜（Hybond-N+、Amersham Japan社製）に転写した後、SDS処理（10% SDS）、アルカリ変性（0.5N NaOH、1.5M NaCl）、そして洗浄（2X SSC）の操作を行った。この膜を、32Pで標識したhTARCのcDNAクローンD3AのSmaI-PstI断片をプローブとしてハイブリダイゼションした。ハイブリダイゼーション溶液は、5x SSPE（1x SSPEは、0.18M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.5、1mM EDTAよりなる）、30%ホルムアミド、2% SDS、10xデンハート溶液、100μg/mlサケ精子DNAを用い、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は2x SSC、0.1% SDSで室温で10分間、2x SSC、0.1% SDSで60℃で30分間を2回行った後、X線フィルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して、プローブと反応するプラークを同定した。最終的に8つのゲノムDNAクローンが得られた。
その内1つのクローン（clone #3）の4234個の塩基配列を、Sanger法により、pharmacia社の、Autoread Sequence kitとA.L.F. II自動シーケンサーを用いて決定した。3つの領域において、ヒトTARCと同一性の高い部位が認められた。この3つの領域をエクソンと推定し、連結した塩基配列は、93個のアミノ酸よりなるオープンリーディングフレームを有し、ヒトTARCと64.4%の高い同一性を示した。従って、このDNAを、マウスTARCのゲノムDNAであると判断した。
ＩＩ．マウスTARC cDNAのクローニング
（１）PHA刺激Balb/Cマウス脾細胞由来のcDNAライブラリーの作製
PHAで刺激したBalb/Cマウス脾細胞由来のcDNAライブラリーは、文献（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））の記載に従い、GIBCO-BRL社製のcDNA合成システムおよびcDNAクローニングシステムを用いて以下のように作製した。
まず、quickprep micro mRNA精製キット（Pharmacia社製）を用いて、PHAで刺激したBalb/Cマウス脾細胞よりpoly（A）+RNAを抽出した。PHAで24時間刺激したBalb/Cマウス脾細胞2x107個を付属の細胞溶解液により溶解した。次に、oligo-dT樹脂を加えて3分混和し、poly（A）+RNAをoligo-dT樹脂に結合させた後、TOMY遠心機MRX-150（トミー精工社製）で12000回転で1分間遠心分離した。得られた沈殿物を高塩濃度洗浄液で3回、低塩濃度洗浄液で5回洗浄した後、溶出液で溶出した。この溶出液に、0.1倍量の3M酢酸ナトリウムと2倍量のエタノールを加えて-80℃で1時間冷却し、TOMY遠心機MRX-150（トミー精工社製）で12000回転で5分間遠心分離して、沈殿したpoly（A）+RNAを滅菌蒸留水に溶解した。そして、波長260nmでの吸光度を測定することにより、回収したpoly（A）+RNA量を計算した。PHA刺激Balb/Cマウス脾細胞より10μgのpoly（A）+RNAが得られた。
次に、精製したpoly（A）+RNAを鋳型として、cDNAの合成を以下のように行った。まず、4μgのpoly（A）+RNAを鋳型として逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT（GIBCO-BRL社製）を用いて、反応緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、500μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、50μg/ml NotIプライマー−アダプター（GIBCO-BRL社製）、および20000U/ml逆転写酵素SUPER SCRIPT II RT）中で、37℃で1時間反応させて1本鎖DNAを合成した。なお、NotIプライマー−アダプターの配列を配列表の配列番号３に示す。この1本鎖DNAを鋳型として、反応緩衝液（25mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM KCl、5mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、1.2mM DTT、0.15mM β-NAD+、250μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、65U／ml DNAリガーゼ、250U/ml DNAポリメラーゼI、および13U/ml RNase H）中で、16℃で2時間反応させてcDNAを合成した。次に、T4 DNAポリメラーゼを、最終濃度が65U/mlとなるように加えて、さらに16℃で5分間反応させて2本鎖DNAとした。この2本鎖DNAを、反応緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 7.6、10mM MgCl2、1mM DTT、1mM ATP、5% PEG 8000、200μg/ml EcoRIアダプター（Pharmacia社製）、および100U/ml T4 DNAリガーゼ）中で、16℃で16時間反応させて、EcoRIアダプターに結合させた。なお、EcoRIアダプターは、配列表の配列番号１３および１４に示すDNAがアニーリングした２本鎖である。こうして完成したcDNAをλExCellベクター（Pharmacia社製）のNotIとEcoRI部位の間に挿入して、cDNAライブラリーを作製した。
（２）プローブの作製
上記（１）で調製したPHA刺激Balb/Cマウス脾細胞由来のcDNAライブラリーを鋳型として、反応緩衝液（10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1%ゼラチン、200μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、400nM mG98 exon upperプライマー、400nM mG98 exon lowerプライマー、および100U/ml AmpliTaq DNAポリメラーゼI）中で、ポリメレースチェインリアクション（PCR）反応を行った。なお、mG98 exon upperプライマーとmG98 exon lowerプライマーは、上記Ｉで得たマウスゲノムＤＮＡに基づいて設計された。これら各プライマーの配列を、それぞれ配列表の配列番号１５と１６に示す。mG98 exon upperプライマーとmG98 exon lowerプライマーはDNA合成機（Cyclone Plus DNA Synthesizer、ミリジェン／バイオサーチ社製）で合成した。合成にはミリジェン／バイオサーチ社のβ-リンク・ベータシアノエチルホソホアミダイド試薬を用いた。合成後、アンモニア水（28%、ナカライテスク社製）2mlで合成カラムから合成オリゴヌクレオチドを溶出した後、60度、５時間処理することにより保護基を離脱させた。脱保護したオリゴヌクレオチドを10倍量のブタノールを加えてTOMY遠心機（トミー精工社製）で3000回転で10分間遠心分離することにより沈殿させて回収した。回収したオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、波長260nmでの吸光度を測定することにより、その量を決定した。PCRは宝酒造から購入したAmpliTaq Kitを用い、DNA Themal Cycler（Perkin-Elmer社製）で行った。反応は、94℃で3分間前処理した後、94℃で45秒間、60℃で45秒間、72℃で1分間の反応サイクルを40回繰り返し、最後に72℃で3分間処理して行った。得られた321bpのDNA断片はマウスTARCの完全長cDNAを得るためのプローブとして用いた。
（３）マウスTARCの完全長cDNAのクローニング
マウスTARCの完全長cDNAを得るために、上記（２）で得た321bpのDNA断片をプローブとして、マルチプライムDNA標識システム（Amersham Japan社製）により32Pで標識し、これを用いて、（１）で作製したPHA刺激Balb/Cマウス脾細胞由来のcDNAライブラリーをプラークハイブリダイゼション法によりスクリーニングした。プラークハイブリダイゼション法は文献（T. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1989））記載の方法に従い、以下のように行った。
PHA刺激Balb/Cマウス脾細胞由来のcDNAライブラリーのファージ液と大腸菌LE392をLB-プレート（10gトリプトン、5gイーストエキストラクト、10g NaCl、15gアガー/1L蒸留水）に播き、一晩30℃で培養した。プレートに生えたファージのプラークをナイロン膜（Hybond-N+、Amersham Japan社製）に転写した後、SDS処理（10% SDS）、アルカリ変性（0.5N NaOH、1.5M NaCl）、そして洗浄（2X SSC）の操作を行った。この膜を、32P標識した321bpのDNA断片をプローブとしてハイブリダイゼションした。ハイブリダイゼーション溶液は、5x SSPE（1x SSPEは、0.18M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.5、1mM EDTAよりなる）、50%ホルムアミド、2% SDS、10xデンハート溶液、100μg/mlサケ精子DNAを用い、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は2x SSC、0.1% SDSで室温で10分間、0.2x SSC、0.1% SDSで60℃で30分間を2回行った後、X線フィルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して、プローブと反応するプラークを同定した。最終的に1つのcDNAクローン（clone ＃1）を得た。このクローン＃１に挿入されているcDNAの塩基配列を、Sanger法により、phamacia社の、Autoread Sequence kitとA.L.F. II自動シーケンサーを用いて決定し、さらに後述の様々な検討を加えた結果、該cDNAは、目的の新規なCC型ケモカイン様タンパク質（mTARC）をコードしていることを確認した。
III．マウスTARCの構造決定
（１）mTARC cDNAの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列の解析
上記のII．（３）で得たマウスcDNAクローン＃１の塩基配列および内部に翻訳終了コドンを持たないオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を図８に示す。
図８に示されているように、クローン＃１に挿入されている遺伝子は93個のアミノ酸よりなるオープンリーディングフレームを有し、N末端にシグナルペプチドに特徴的な、疎水性の強いアミノ酸配列を有する遺伝子であることが明らかとなった。この93個のアミノ酸からなるタンパク質の分子量計算値は10,466であり、推定上のシグナルペプチドの切断部位は、計算によると、Ala-23とAla-24の間であり、図８には縦棒で表示されている。この切断部位から９アミノ酸下流にCC型ケモカインの特徴である２つの連続するステインが示されている。
さらに、シグナルペプチド切断後の、70個のアミノ酸からなる、推定上の成熟型タンパク質は、分泌タンパク質であると推定された。この70個のアミノ酸からなる、推定上の成熟型分泌タンパク質の分子量計算値は7,916である。この70個のアミノ酸からなる、推定上の成熟型分泌タンパク質の等電点は、計算によると10.2である。
（２）ヒトTARCとの類似性
成熟型分泌マウスTARCタンパク質のアミノ酸配列はヒトTARCと65%の同一性があることが明らかとなった。また、マウスTARCのオープンリーディングフレームの塩基配列はヒトTARCと74%の同一性があることが明らかとなった。全てのCCケモカインで保存されている、4つのシステインはマウスTARCでも保存されていることが明らかとなった。これらの事実は、マウスTARCがヒトTARCのマウス相同遺伝子およびタンパク質であることを示唆している。
実施例５ 組換えマウスTARCのカイコ細胞での発現
（１）カイコ細胞におけるｍTARC DNAの発現のための組換えベクターpVL-ｍTARCの構築
両端にEcoRIおよびNotI部位を持ち、マウスTARCの翻訳開始コドンから翻訳終了コドンまでを含む0.5kbのDNA断片を、クローン＃１をEcoRIとNotIで同時に消化することにより得た。このDNA断片を、組換え型バキュロウイルスの作製に用いるpVL1393（Invitrogen社製）のEcoRI部位とNotI部位の間に挿入し組換えベクターpVL-mTARCを得た。このベクターの遺伝子地図を図９に示す。
（２）形質転換体の培養
次に、組換えベクターpVL-mTARCと、致死的な欠失を持つ、直線状の、AcNPVのDNAをSf9昆虫細胞に同時に導入し、組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスは、限界希釈法により純化し、さらに、Sf9昆虫細胞にM.O.I.＝0.1で感染させて、種ウイルスを得た。この種ウイルスを、Tn5B-4昆虫細胞（Invitrogen社製）（150cm2のフラスコあたり1.2x107個）にM.O.I.＝10から20で感染させて、EX-CELL 400無血清培地（JRH Biosciences社製）（150cm2のフラスコあたり30ml）で、27℃で2日間培養した。
（３）生成物の単離、精製
培養上清を回収し、0.22μmのフィルターメンブランでろ過した。このろ液に1/10容の500mM MES（pH 6.5）を加え、A緩衝液（50mM MES（pH 6.5）/100mM NaCl）で平衡化した1mlのResouce-Sカラム（Pharmacia社製）にかけた。このmTARCタンパク質の結合したカラムをA緩衝液で洗浄後、A緩衝液およびB緩衝液（50mM MES（pH 6.5）/1.0M NaCl）を用いたNaClの塩濃度の勾配により溶出した。マウスTARCタンパク質を含むフラクションはSDS-PAGEと銀染色を用いて同定した。SDS-PAGEの結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂ中、ＦはFPLCフラクション（最終段階の１つ前の精製段階）、ＨはHPLCフラクションについての結果を各々示している。
このマウスTARCタンパク質を含むフラクションに最終濃度が0.1%となるようにTFAを加えた後、A緩衝液（0.1% TFA）で平衡化したコスモシル5C4-300カラム（ナカライテスク社製）にかけ、A緩衝液およびB緩衝液（0.1% TFA、60%アセトニトリル）を用いたアセトニトリルの濃度勾配により溶出した。
マウスTARCタンパク質の溶出パターンを図１０Ａに示す。マウスTARCタンパク質を含むフラクションを集めて、真空乾燥でアセトニトリルを揮発させ、エンドトキシンフリーのPBSに対して透析して最終的な精製品を得た。タンパク質の濃度はBCA kit（Pierce社製）を用いて、BSAを対照として決定した。培養上清300mlから168μgの精製マウスTARCタンパク質が得られた。混入しているエンドトキシン量はLimulus amoebocyte lysate assay（QCL-1000、Bio Whitaker社製）を用いて定量し、2pg/μg以下であった。精製mTARCタンパク質のN末端アミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサー（島津社製）を用いて決定し、ARATNVGRE**LDYFであった。このアミノ酸配列は、図１０Ｃに示される様に、塩基配列から予測されたシグナルペプチドが切断されたのちの、70個のアミノ酸からなる成熟型分泌タンパク質のN末端アミノ酸配列と一致した。
実施例６ マウスTARCによる白血球侵潤の誘導
実施例５で得たマウスTARCのマウス皮内投与による白血球侵潤の誘導を調べた。
精製したマウスのTARCタンパク質を、Balb/cマウスの背中に皮内投与し、白血球侵潤の有無を調べることにより、mTARCのケモカイン様活性を確認した。詳細にはマウスTARCの精製品50ngをエンドトキシンを含まないPBSに溶解し、50μlとして、Balb/cマウスの背中皮内に投与した。陰性コントロールとして、エンドトキシンを含まないPBS 50μlを用いた。投与後、4、24時間後に、頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、投与部位の皮膚を切り出し、10%ホルマリンで固定した。その後、固定した皮膚を、パラフィンに包埋し、マイクロトームで厚さ5μmの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。この結果をmTARCについては図１１に、コントロールについては図１２に各々示す。図１１及び図１２中、Ａは倍率１００の、Ｂは倍率４００の投与24時間後の顕微鏡写真である。図１１Ａ及びＢに示される様に、マウスのTARCを投与した皮下組織ではリンパ球およびモノサイトの浸潤がTARC投与の24時間後に見られた。一方、図１２Ａ及びＢに示される様にPBSのみではそのような変化はみられなかった。
実施例７ TARCレセプターを発現する細胞の検出
ヨード標識したヒトTARCを用いてTARCレセプターを発現している細胞を検出した。実施例２に記載の様に昆虫細胞で発現させ精製したヒトTARCタンパク質を、125I標識Bolton-Hunter試薬（Amersham Japan社製）を用いて125Iで標識した。バイオーゲル（Bio-Gel）P6（バイオラッド社製）を用いてゲルろ過で125I標識hTARCを精製し、比活性を求めたところ81.6μCi/μgであった。この標識hTARCを用いて様々な種類の細胞への結合実験を行った。
1x106〜8x106の被検細胞を結合緩衝液（PRMI-1640、20mM HEPES（pH7.4）、1% BSA、0.02% NaN3）で洗浄後、100μlの結合緩衝液に懸濁した。この細胞懸濁液に125I標識ｈTARCを最終濃度0.66nMとなるように加えた100μlの結合緩衝液を加え、室温で1時間結合を行った。結合反応を行った後、反応液を300μlのジブチルフタル酸：オリーブ油（4:1）溶液に重層し、遠心により細胞に結合した125I標識TARCと非結合の125I標識TARCを分離した後、細胞に結合した125I標識TARCの放射線量をガンマカウンターを用いて測定を行った。ｈTARCの細胞への特異的結合は非標識TARC非存在下で結合した125I標識TARCの値から、200nMの非標識ｈTARC存在下に非特異的に結合した125I標識TARCの値を差し引いて求めた。125I標識TARCの様々な種類の細胞106個あたりの特異的結合を図１３に示す。
図１３から明らかなように、かなりの特異的結合が一部のT細胞株（Jurkat、Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102）、末梢血リンパ球、活性化末梢血T細胞で認められる。その他のT細胞株（Molt4、HPB-ALL、TCL-Kan、TLOml）、単球細胞株（U937、THP1）、赤芽球細胞株（K562）、末梢血単球では極めてわずかな特異的結合しか認められなかった。B細胞株（Raji）、胎児腎臓由来の細胞株（293E）、末梢血顆粒球では殆ど特異的結合は認められなかった。
以上の結果は、TARCのレセプターがある種のT細胞に多く発現していることを示している。
実施例８ TARCとレセプターとの結合特性
T細胞株Jurkatを用いて、TARCのレセプターについて更に詳しく解析を行った。（１）結合定数とレセプター数
結合定数とレセプター数を求めるために、結合が平衡に達する条件を検討した。その結果、125Iで標識したヒトTARCのJurkat細胞への特異的結合は15℃、1時間で平衡に達するとわかった。そこで、125I標識TARCの濃度を変化させた場合の4x106個のJurkat細胞への特異的結合量の変化を調べた。特異的結合量は、非標識TARC非存在下で結合した125I標識TARCの値から、１Ｍの非標識TARC存在下に非特異的に結合した125I標識TARCの値を差し引いて求めた。その結果を図１４Ａに示す。125I標識TARCのJurkat細胞への特異的結合は飽和曲線を描いた。更にそのスキャッチャード（Scatchard）解析の結果を図１４Ｂに示す。125I標識TARCのJurkat細胞への特異的結合部位は1種類で、結合定数は計算によると2.1nM、1個の細胞あたりの結合数は603であった。
次に、125I標識TARCの濃度を2nMに固定し、非標識TARCの濃度を変化させた場合の4x106個のJurkat細胞への特異的結合量の変化を調べた。特異的結合量は、種々の濃度の非標識TARC存在下で結合した125I標識TARCの値から、1μMの非標識TARC存在下に非特異的に結合した125I標識TARCの値を差し引いて求め、非標識TARC非存在下での特異的結合量を100%として計算した。その結果を、図１５Ａに示す。スキャッチャード解析の結果、125I標識TARCのJurkat細胞への特異的結合部位は1種類で、結合定数は計算によると2.1nM、1個の細胞あたりの結合数は948であった。
（２）他のCC型ケモカインによる結合阻害
TARCのJurkat細胞への結合が他のケモカインで競合されるかを調べた。125I標識hTARCの濃度を0.66nMとし、非標識ケモカイン非存在下もしくは200nMのIL-8、RANTES、MCP-1、MIP-1α（全てペプロテック社製）あるいはTARCの存在下での4x106個のJurkat細胞への結合を室温で１時間行った。その結果を図１５Ｂに示す。125I標識TARCの結合は非標識TARCでのみ競合阻害され、他のケモカインでは結合阻害は認められなかった。従って、Jurkat細胞上のTARCのレセプターは他のケモカインのレセプターとは異なる独立のレセプターであることがわかった。
（３）赤血球上のレセプターとの結合活性
赤血球には様々なケモカインが結合できるレセプター、ダッフィ抗原／ケモカイン受容体（Duffy antigen/receptor for chemokine（DARC））、が存在することが知られている。そこで、125I標識TARCの濃度を0.66nMに固定し、非標識の他のケモカインIL-8、RANTES、MCP-1、MIP-1αあるいはTARCの濃度を変化させた場合の108個の赤血球への特異的結合量の変化を調べた。特異的結合量は、種々の濃度の非標識ケモカイン存在下で結合した125I標識TARCの値から、1μMの非標識TARC存在下に非特異的に結合した125I標識TARCの値を差し引いて求め、非標識TARC非存在下での特異的結合量を100%として計算した。その結果を、図１６に示す。125I標識TARCの結合は非標識TARC、IL-8、RANTES、MCP-1で競合阻害され、IP-1αではほとんど結合阻害は認められなかった。更にそのスキャッチャード解析の結果を図１７に示す。125I標識TARCの赤血球への特異的結合部位は1種類で、結合定数は計算によると17nMであった。TARCの結合定数および競合阻害様式は他のケモカイン、例えばIL-8のDARCへの結合定数および競合阻害様式と同様であり、従ってTARCは赤血球上のDARCに結合することが明らかになった。
実施例９ TARCの免疫学的定量法
Ｉ．固相化抗TARC抗体の作製
（１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとTARCとの融合タンパクの調製
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）とTARCとの融合タンパクを、該融合タンパクの発現ベクターpGEX-TARCを用いて調製した。
両端にBamH1及びNotI部位を持ち、TARC成熟型の開始コドンから翻訳終了コドンまでを含む0.2kbのDNA断片を、実施例１に記載のクローンD3Aを鋳型としてPCR法により得た。PCRに用いた２つのオリゴヌクレオチドの配列を、配列表の配列番号１７及び１８に示す。PCRは宝酒造から購入したAmpliTaq Kitを用い、DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）で行った。反応は、クローンD3AのDNAを鋳型として、反応緩衝液（10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1%ゼラチン、200μM dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、400μMプライマー、及び100U/ml AmpliTaq DNAポリメーラーゼI）中で行った。反応は、94℃で3分間前処理した後、94℃で45秒間、。57℃で45間、72℃で1分間の反応サイクルを15回繰り返し、最後に72℃で3分間処理して行った。この反応生成物をBamH1とNotIで同時に消化し、pGEX 4T-3（ファルマシア社製）のBamH1部位とNotI部位の間に挿入し、発現ベクターpGEX-TARCを得た。
発現ベクターpGEX-TARCを導入した大腸菌JM109株を用いて、成熟型TARCのアミノ末端にGST付加したタンパク質として発現させた。大腸菌JM109株の培養はIPTGを0.1mMとなるように加えた0.2% glucoseを含む2xYT培地で行い、37℃で4時間培養した。その後大腸菌をSTE衝液（10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、100mM NaCl、1mM PMSF、100μg/ml lysozyme）に懸濁し、氷上で15分間放置した。次いで、DTTを5mM、sarkosylを1.4%となるように加え、氷上で冷却しながら、TOMY超音波破砕装置UD-201（トミー精工社製）で300秒間最大出力で処理を行った。10,000回転、5分間、４℃の条件で遠心分離し、上清にTriton X-100を2.5%となるように加えた後、gultathione Sepharose 4B樹脂を加え、４℃で一晩結合反応を行った。GST-TARC融合タンパク質が結合した樹脂はPBSで5回洗浄した後、樹脂と等容積の1% SDSを含むPBSを加え、100℃で5分間処理し、GST-TARC融合タンパク質を樹脂から解離させた。得られたGST-TARC融合タンパク質溶液には9倍容積のPBSを加えて抗原として用いた。
（２）抗TARC抗体の作製
抗体の作製にはモルモットを使用し、100μgのGST-TARC融合タンパク質を等容積のフロイントコンプリートアジュバントと混合した後、皮下に投与した。追加免疫は2週間ごとに行い、100μgのGST-TARC融合タンパク質を等容積のフロイントインコンプリートアジュバントと混合した後、皮下に投与した。合計3回免疫を行い、血清を採取した。
（３）抗TARC抗体の精製と標識
ビオチン化抗TARC抗体の作製は以下のように行った。Affi-Gel15樹脂（バイオラッド社製）に3倍容積の精製したGST-TARC融合タンパク質又はGSTタンパク質溶液を加え、４℃で一晩放置した。タンパク質溶液を除去した後、樹脂にブロッキング溶液（10mM ethanolamine、pH 8.0）を加え、４℃で１時間放置した。樹脂は20倍容積のPBSで洗浄した後、結合緩衝液（20M Tris-HCl、pH 7.2、0.5M NaCl）を加えた。得られた血清に等容積の飽和硫安を加え、４℃で一晩放置した後、12,000回転、20分間、４℃の条件で遠心分離した。得られた沈殿はPBSに溶解させ、更に等容積の飽和硫安を加え、４℃で２時間放置した後、12,000回転、20分間、４℃の条件で遠心分離した。得られた沈殿にPBSを加えて溶解し、結合緩衝液に対して透析し、まずGSTタンパク質結合樹脂にかけて室温で２時間放置し、GSTに対する抗体を除去した。この得られた素通り溶液を、GST-TARC融合タンパク質結合樹脂にかけて４℃で一晩放置し、樹脂は20倍容積の結合緩衝液で洗浄した後、TARC対する抗体を0.1M glycineで溶出した。この抗体溶液に1M Tris-HCl、pH 9.5を加えて、0.1M NaHC03に対して透析し、NHS-LC-Biotin（ピアス社製）を加えて４℃で2.5時間放置した。このビオチン化抗体は50mM Tris-HCl、pH 7.5に対して透析し、次にPBSに対して透析した。
固相化用抗TARC抗体の精製は以下のように行った。抗血清にTris-HCl、pH 8.0を100mMになるように加え、Hitrap-protein Aカラムにかけて、カラムの10倍容積の100mM Tris-HCl、pH 8.0、つづいてカラムの10倍容積の10mM Tris-HCl、pH 8.0で洗浄した。結合した抗体は0.1M glycineで溶出し、1M Tris-HCl、pH 9.5を加えた後、PBSに対して透析した。
ＩＩ．TARCタンパク質の免疫学的定量法
TARCタンパク質の定量は固相化抗体に結合したTARCの量をビオチン化抗体で検出定量する、いわゆるサンドイッチ法で以下の様に行った。まず、固相化用抗体を10μg/mlとなるように50mM Tris-HCl、pH 8.0緩衝液に溶解し、96穴プレート（マキシソーブ、ヌンク社製）に1穴あたり50μlずつ加え、４℃で一晩放置した。抗体溶液を除去した後、1mg/mlのBSA含むPBS 100μlを加えて、室温で1時間放置し、0.02% Tween-20を含むPBSで１回洗浄した。濃度既知の昆虫細胞で発現させ精製した組換えヒトTARC又は未知量の抗原を含む試料にTriton X-100を0.5%となるように加えた後、1穴あたり50μlずつ加え、室温で１時間放置した。Tx-PBS溶液（0.5% Triton X-100）で３回洗浄した後、ビオチン化抗TARC抗体をTx-PBS溶液で1000倍希釈し、1穴あたり50μlずつ加え、室温で30分間放置した。Tx-PBS溶液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ベクター社製）をTx-PBS溶液で4000倍希釈し、1穴あたり50μlずつ加え、室温で30分間放置した。Tx-PBS溶液で３回洗浄し、PBSで１回洗浄した後、基質溶液（100mM NaOAc、pH 5.5、1mM EDTA、6.72mg/ml TMBZ、0.03% H2O2）を100μl加え呈色反応を行った。1N H2SO4を50μl加えて反応を停止した後、450nmでの吸光度を測定した。次に、濃度既知の組換えヒトTARCを用いて標準曲線を作製し、これにあてはめ、試料中のTARCタンパク質の量を知ることができる。検出感度は50pg/mlであった。
実施例１０ TARC誘導活性を有する物質
（１）TARCタンパク質を誘導する刺激の同定
正常人末梢血単核球を96穴プレート（コースター社製）に１穴あたり2.5x105個ずつ加え、刺激物質なし、あるいは刺激物質としてPHA（GIBCO-BRL社製）を100倍希釈、抗CD3抗体（OKT3）を10μg/mlもしくはLPS（L4391、シグマ社製）を100ng/mlとなるように加え、250μlのRPMI-640/10% FCSで培養した。６、１２、２４、３６、４８、７２時間後に培養液を回収し、0.45μmのフィルターでろ過を行い、得られたろ液を用いてTARCタンパク質の定量を行った。その結果を図２１に示す。図２１に示される様にTARCタンパク質はPHA、抗CD3抗体刺激により時間依存的に発現し、発現量は72時間まで直線的に増加した。発現はPHA刺激で12時間、抗CD3抗体刺激で24時間から検出され、72時間ではPHA刺激で16ng/ml、抗CD3抗体刺激で2.5ng/mlに達した。LPSや未刺激では発現はほとんど検出できなかった。
（２）TARCタンパク質を誘導するサイトカインの同定
PHAの方が抗CD3抗体より強いTARC発現誘導作用を有することから、この誘導にはサイトカインの関与が考えられる。
そこで、正常人末梢血単核球を96穴プレート（コースター社製）に1穴あたり2.5x105個ずつ加え、サイトカインなしあるいはサイトカインとして10ng/ml IL-1α（R&D社製）、100U/ml IL-2（シオノギ製薬社製）、50ng/ml IL-3（ゼンザイム社製）、50ng/ml IL-4（ペプロテック社製）、50ng/ml IL-7（ペプロテック社製）、50ng/ml IL-10（ゼンザイム社製）、10ng/ml GM-CSF（ゼンザイム社製）、50ng/ml TNFα（ペプロテック社製）、1000U/ml IFN-γ（シオノギ製薬社製）、10ng/ml M-CSF（R&D社製）を加え、250μlのRPMI-640/10% FCSで培養した。48時間後に培養液を回収し、0.45μmのフィルターでろ過を行い、得られたろ液を用いてTARCタンパク質の定量を行った。その結果を図２２に示す。図２２に示される様にTARCタンパク質はGM-CSF、IL-3、IL-4により発現が誘導され、発現量はそれぞれ12、6、2ng/ml程度であった。
同様にGM-CSF、IL-3、IL-4の濃度依存性を調べた。その結果を図２３に示す。図２３に示される様にGM-CSFではED50は0.7ng/mlで、発現は3.3ng/mlで最大に達し、更に高い濃度では逆に誘導がかからなくなった。IL-3、IL-4では飽和曲線を描き、ED50は0.5、0.8ng/mlであった。
上記の結果は、TARCの発現は、多くのケモカインの発現がTNF-α、IFN-γで誘導されることと対照的に極めて特徴的であることを示している。
実施例１１ TARCタンパク質を発現する細胞の同定
（１）TARCを発現する細胞を同定するために正常人末梢血単核球をCD14陽性単球とCD14陰性リンパ球に分離して、PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4で刺激した。正常人末梢血単核球を2x107/mlとなるように氷冷した分離緩衝液（5mM EDTA、1% FCS、PBS）に懸濁し、FITCで標識した抗CD14抗体（Becton-Dickinson社製）を1/50量加え、氷上で30分放置した。分離緩衝液で洗浄し、107細胞/80μlとなるように分離緩衝液に懸濁し、107細胞あたり20μlの磁気ビーズ標識抗マウスIgG抗体（Miltenyi-Biotec社製）を加え、４℃で15分放置した。分離緩衝液で洗浄し、500μlの分離緩衝液に懸濁し、MACS（Miltenyi-Biotec社製）を用いてCD14陽性単球とCD14陰性リンパ球に分離した。96穴プレート（コースター社製）１穴あたり正常人末梢血単核球とCD14陰性リンパ球は2.5x105個、CD14陽性単球は1.8x105個ずつ加え、刺激なしあるいは刺激として100倍希釈PHA（GIBCO-BRL社製）、100倍希釈PHA（GIBCO-BRL社製）と50ng/ml PMA、50ng/ml IL-4（ペプロテック社製）、50ng/ml IL-3（ゼンザイム社製）、10ng/ml GM-CSF（ゼンザイム社製）を加え、250μlのRPMI-1640/10% FCSで培養した。48時間後に培養液を回収し、0.45μmのフィルターでろ過を行い、得られたろ液を用いてTARCタンパク質の定量を行った。その結果を図２４に示す。図２４のグラフに示される様にTARCはGM-CSF、IL-3、IL-4刺激により単球のみから分泌された。PHA、PHA/PMA刺激では逆にリンパ球のみから分泌され、PHA刺激による発現誘導はPMAを加えることにより著しく抑制されることが示された。
（２）ノーザンブロット解析によるTARC mRNAの発現解析
ヒト末梢血単核細胞を未刺激あるいは100倍希釈PHA（GIBCO-BRL社製）、100ng/ml LPS（L4391、シグマ社製）、10ng/ml IL-4（ペプロテック社製）、10ng/ml IL-3（ゼンザイム社製）、4ng/ml GM-CSF（ゼンザイム社製）で刺激し、24時間後に、TRIZOL RNA精製試薬（GIBCO-BRL社製）を用いて、RNAを抽出した。単離したRNA 5μgを、0.66Mホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲル中で電気泳動にかけ、ナイロン膜（Hybond-N+）（Amersham Japan社製）に転写した。これらの膜を、マルチプライムDNA標識システム（Amersham Japan社製）により32Pで標識したTARCのcDNAクローンD3AのSmaI-PstI断片をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液はQuickHyb液（Stratagene社製）、100μg/mlサケ精子DNAを用い、68℃で1.5時間ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で室温、10分間、0.2x SSC、0.1% SDSの緩衝液で55℃、30分間を2回行った後、X線フィルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して解析した。図２５の結果から、TARCのmRNAは未刺激及びLPS刺激のヒト末梢血単核細胞ではほとんど発現していないが、GM-CSF、IL-3刺激で約400倍、IL-4、PHA刺激で約40倍のmRNAの発現誘導が認められた。
以上の結果は、TARCのGM-CSF、IL-3、IL-4刺激による末梢血単核球での発現誘導は分泌顆粒等に蓄積されたタンパクの放出によるものではなく、主にmRNAの増加によることを示している。
実施例１２ ヒトＰＢＭＣ由来TARCのＴ細胞株に対する遊走活性
サイトカイン刺激で正常人末梢血単球から分泌されるTARCのＴ細胞株に対する遊走活性を以下の方法で調べた。
細胞遊走活性は48ウェルの走化性チャンバー（chemotaxis chamber、Neuro Probe社製）を用いて測定した。ヒト末梢血単球を未刺激あるいは、50ng/ml IL-4（ペプロテック社製）、50ng/ml IL-3（ゼンザイム社製）、10ng/ml GM-CSF（ゼンザイム社製）で刺激し、36時間後に培養液を回収し、0.45μmのフィルターでろ過を行い、得られたろ液を用いて細胞遊走活性を測定した。培養ろ液を下ウェルに加え、一方、緩衝液[RPMI-1640、20mM Hepes（pH 7.4）、1% BSA]に懸濁した4x105個のT細胞株HUT78を上ウェルに加えた。
Type IVコラーゲン溶液（5μg/ml水溶液）で室温、1時間コートしたポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜（口径5μm、Neuro Probe社製）で上下ウェルの分離を行った。37℃で2時間培養後、膜を取り外し、PBSで上側を洗浄し、固定及び染色を行った。
遊走した細胞は800倍の顕微鏡下で、1ウェルにつき無作為に選んだ5視野（HPF）について数を測定した。その結果を図２６に示す。図２６のグラフに示される様に、IL-3及びGM-CSFで刺激した培養液はHUT78細胞の強い遊走を引き起こしたが、未刺激あるいはIL-4で刺激した培養液は遊走を引き起こさなかった。
また、GM-CSF処理の培養上清のHut78細胞に対する遊走活性は10μg/mlモルモット抗TARC抗体（TARC Ab）処理で殆ど消失した。
これらの結果は、遊走活性を持つTARCがサイトカインの刺激により単球から分泌されることを示している。
実施例１３ サイトカインによるTARC発現の抑制
液性免疫の誘導に関与するTh2タイプのサイトカインIL-4でTARCが誘導されることから、Th2の誘導を抑制するTh1タイプのサイトカインエIFN-γ、免疫反応全般を抑制するサイトカインIL-10の発現誘導に及ぼす影響を調べた。正常人末梢血単核球を96穴プレート（コースター社製）に1穴あたり2.5x105個ずつ加え、サイトカインとして、10ng/ml IL-4（ペプロテック社製）、10ng/ml IL-3（ゼンザイム社製）、5ng/ml GM-CSF（ゼンザイム社製）を加え、さらに50ng/ml IL-10（ゼンザイム社製）あるいは1000U/ml IF-γ（シオノギ製薬社製）250μlのRPMI-1640/10% FCSで培養した。48時間後に培養液を回収し、0.45mのフィルターでろ過を行い、得られたろ液を用いてTARCタンパク質の定量を行った。その結果を図２７に示す。図２７のグラフに示される様にGM-CSF、IL-3、IL-4刺激による末梢血単核球でのTARCの発現誘導はIFN-γ、IL-10で抑制された。従ってTARCの分泌は液性免疫の誘導の刺激により誘導され、細胞性免疫の誘導状態では抑制されると考えられる。
実施例１４ CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞に対するTARCの結合活性
TARCをsecreted alkaline phosphatase（SEAP）-（Histidine）6との融合蛋白として産生し、これを用いて293/EBNA-1細胞表面に発現させたCCR4レセプターとの結合を検討した。
（１）融合タンパク（TARC-SEAP）の調製
TARCをSEAPとの融合蛋白として発現させるためのベクターpDREF-SEAP（His）6を図２８に示す。まずこのベクターの作製法を説明する。Clontech社製のプラスミドpSEAP-Enhancerを鋳型として、ヒスチジンが６個つながった配列、（His）6部分をコードする領域を5'-XbaI-APプライマー（配列番号１９）と3'-AP（HIS）6-NotIプライマー（配列番号２０）を用いたPCRにより増幅し、得られたPCR産物を制限酵素XbaIとNotIで分解後、pDREF-Hyg（Yoshidaら、FEBS Letters 360: 155-159, 1995）のXbaIとNotIサイトの間に導入して、pDREF-SEAP（HIS）6を作製した。
次に、図２８に示すように、pDREF-SEAP（His）6ベクターのSalIとXbaIサイトの間にTARC cDNAのORFを挿入し、TARCが５個のアミノ酸からなるリンカー（Ser-Arg-Ser-Ser-Gly）を介してSEAP-（HIS）6と融合した蛋白をコードするベクターpDREF-TARC-SEAP（HIS）6を作製した。このベクターの作製法を次に説明する。
TARCをコードする塩基配列をTARC cDNAを鋳型として、TY98Fプライマー（配列番号３）とTY98Rプライマー（配列番号４）を用いたPCRで増幅し、得られたPCR産物を制限酵素SalIとXbaIで分解後、pDREF-SEAP（HIS）6のSalIとXbaIサイトの間に導入して、pDREF-TARC-SEAP（HIS）6を作製した。このベクターを293/EBNA-1細胞（Invitrogen社製）にlipofectamin（Gibco-BRL社製）を用いて導入した。培養３−４日後、培養上清を回収し、0.45mmのポアサイズのフィルターを通し、20mM HEPES（pH 7.4）と0.02% sodium azideを加えて４℃に保存した。
（２）融合タンパク（TARC-SEAP）のアッセイ
産生された融合蛋白（TARC-SEAP）の分析はサンドイッチ型の酵素−結合イムノソルベントアッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA）により行った。
すなわち、96穴マイクロテストプレート（Maxsorb）（Nunc社製）を単クローン型抗胎盤性アルカリホスファターゼ（placental alkaline phosphatase）（anti-PLAP）（Medix Biotech社製）（2mg/ml, 50mM Tris-HCl, pH 9.5）でコートし、ウシ血清アルブミン（BSA）（1mg/ml, phophate buffered saline）でブロックした。検体は希釈液（0.02% Tween-20を含むPBS）で希釈し、マイクロプレートに加えて室温で１時間反応後、希釈液で洗浄後、500倍に希釈したビオチン化ウサギ抗PLAP抗体を加えて１時間反応した。さらに洗浄後、パーオキシダーゼ-結合ストレプトアビジン（Vector社製）を加えて３０分間反応した。洗浄後、結合したパーオキシダーゼの活性を3.3'-5,5'-テトラメチルベンジジンで検出した。反応を1N H2SO4で停止し、450nmの吸光度を測定した。
アルカリホスファターゼ（AP）の活性をGreat EscApe Detection Kit（Clontech社製）を用いたケミルミネセンス法で測定し、relative light unit（RLU）/sとして求めた。AP標準曲線の作製は精製PLAP（Cosmo Bio社製）を用いて行った。用いたSEAPとTARC-SEAPは1pmol当たりそれぞれ8.7x107 RLU/sと1.2x108 RLU/sであった。
（３）CCR4を発現する293/EBNA-1細胞の調製
ヒト胎盤ゲノムDNA（Clontech社製）を鋳型として、CCR4をコードする領域をCKR4-XbaFプライマー（配列番号２３）とCKR4-XbaRプライマー（配列番号２４）を用いたPCRにより増幅し、得られたPCR産物を制限酵素XbaIで分解後、pBluescript SK+（Stratagene社製）のXbaIサイトに導入した。得られたプラスミドから、CCR4をコードする領域をSa1IとNotIで分解後、pDREF-Hyg（Yoshidaら、FEBS Letters 360: 155-159, 1995）のSalIとNotIサイトの間に導入して、pDREF-CCR4を作製した。このベクターを293/EBNA-1細胞（Invitrogen社製）にリポフェクタミン（Gibco-BRL社製）を用いて導入した。CCR4が導入された293/EBNA-1細胞は、ハイグロマイシン（200μg/ml）存在下で１週間培養し、薬剤耐性を示す細胞を選択することにより得られた。
（４）TARC-SEAP融合タンパクのCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞への特異的結合
TARC-SEAPの濃度を1nMに固定し、非標識TARCの濃度を変化させた場合のCCR4を発現させた293/EBMA-1細胞への特異的結合量の変化を調べた。結合実験は20mM HEPES（pH 7.4）, 1% BSA, 0.02% sodium azideを含むRPMI-1640、200μl中で行った。排除型の結合実験では4x105の細胞に1nMのTARC-SEAPと各種の濃度の非標識TARCを加え、室温で１時間反応させ、洗浄後、細胞を50μlの1% Triton X-100を含む10mM Tris-HCl（pH 8.0）で溶解し、細胞に由来するフォスファターゼを65℃10分間の処理で不活化し、遠心後、25μlの上清中のAP活性を測定した。非特異的結合は1nMのSEAPを用いて測定した。特異的結合量は、種々の濃度の非標識TARC存在下で結合したTARC-SEAPの値から、非特異的に結合したSEAPの値を差し引いて求め、非標識TARC非存在下での特異的結合量を100%として計算した。その結果を、図２９に示す。結合の強さを表す50%阻害濃度は約3nMであり、従って、TARCはCCR4に強く結合するとわかった。
（５）TARC-SEAP融合タンパクのCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞への特異的結合に対する他のケモカインの影響
TARCのCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞への結合が他のケモカインにより競合されるか否かを調べた。
TARC-SEAPの濃度を1nMとし、非標識ケモカイン非存在下もしくは200nMのMCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、（全てペプロテック社製）、LARCあるいはTARCの存在下での4x105個のCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞への結合を室温で１時間行った。その結果を図３０に示す。TARC-SEAPの結合は非標識TARCでのみ競合阻害され、他のケモカインでは結合阻害は認められなかった。この結果は、CCR4が他のケモカインとは強く結合せず、TRACとのみ強く結合するレセプターであることを示している。
実施例１５ CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞に対するhTARCの遊走活性
ヒトTARCの、CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞に対する遊走活性を48ウェルの走化性チャンバー（chemotaxis chamber、Neuro Probe社製）を用いて測定した。実施例２の記載に従い、昆虫細胞で発現させ精製した組換えヒトTARCは緩衝液[RPMI-640、20mM Hepes（pH 7.4）、1% BSA]で希釈し、下ウェルに加え、1x105個のCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞を上ウェルに加えた。コラーゲンIV溶液（20μg/ml水溶液）で37℃、4時間コートしたポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜（口径8μm、Neuro Probe社製）で上下ウェルの分離を行った。37℃で4時間培養後、膜を取り外し、PBSで上側を洗浄し、固定及び染色を行った。
遊走した細胞は400倍の顕微鏡下で、1ウェルにつき無作為に選んだ5視野（HPF）について数を測定した。その結果を図３１に示す。図３１のグラフに示される様に、CCR4を発現させた293/EBNA-1細胞はTARCに対して濃度依存的に遊走した。なお縦軸上の四角の印はTARCを添加しないコントロールの結果を示している。一方TARCとは異なる他のケモカインであるRANTES及びMIP-1αはCCR4を発現させた293/EBNA-1細胞に対し有意の遊走活性を示さなかった。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：582
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA  to  mRNA
起源
生物名：ヒト
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：53..334
特徴を決定した方法：S
配列
0003996191.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：558
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：
起源
生物名：マウス
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：2..280
特徴を決定した方法：S
配列
0003996191.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：４５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003996191.tif 000004
配列番号４
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003996191.tif 000005
配列番号：５
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003996191.tif 000006
配列番号：６
配列の長さ：４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：７
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：８
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：９
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号１９
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号２０
配列の長さ：５３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号２１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号２２
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
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配列番号２３
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003996191.tif 000024
配列番号２４
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003996191.tif 000025
【図１】
0003996191.tif 000026
【図２】
0003996191.tif 000027
【図３】
0003996191.tif 000028
【図４】
0003996191.tif 000029
【図５】
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【図６】
0003996191.tif 000031
【図７】
0003996191.tif 000032
【図８】
0003996191.tif 000033
【図９】
0003996191.tif 000034
【図１０】
0003996191.tif 000035
【図１１】
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【図１２】
0003996191.tif 000037
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0003996191.tif 000041
【図１７】
0003996191.tif 000042
【図１８】
0003996191.tif 000043
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
0003996191.tif 000049
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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