(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたバクテリオファージであって、該改変されたバクテリオファージは、
（i）バクテリオファージ表面タンパク質由来の第１の成分；および
（ii）細菌の抗原結合部位を提供するための抗体の可変領域配列を含み、前記バクテリオファージにHelicobacter pylori感染症の病因に関与する細菌細胞への結合能を付与して該細菌細胞の増殖の阻害能を与える第２の成分、を含む組換えタンパク質をその表面に提示するM13バクテリオファージであり、前記組換えタンパク質の前記第１の成分がg3pタンパク質に由来する前記バクテリオファージの非改変型の細菌の線毛への吸着を担うタンパク質に由来し、前記組換えタンパク質の前記第２成分がg3p-ScFv融合タンパク質の形でScFvポリペプチドを含み、前記組換えタンパク質の抗体可変領域配列が、ハイブリドーマ細胞株5F8（ECACC受託番号95121524）、2H6（ECACC受託番号95121526）および5D8（ECACC受託番号95121527）のモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体の可変領域配列である、改変されたバクテリオファージ。
【請求項２】
受託番号NCIMB40779でNCIMBに寄託された名称B8のバクテリオファージまたはHelicobacter pyloriへの結合および感染能力を保持するその誘導体である、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
Helicobacter pyloriに起因する粘膜細菌感染症を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項１または２に記載のバクテリオファージの使用。
【請求項４】
請求項１または２に記載のバクテリオファージを含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、細菌感染、特にHelicobacter pylori感染等の粘膜細菌感染の処置に有用なバクテリオファージに関する。
【背景技術】
［バクテリオファージおよび抗生物質耐性］
抗生物質に対する耐性は世界的な問題であり、医学的および経済的にも重要性が増している。従って、このような抗生物質耐性の問題を回避するために、細菌を撲滅するための別の方法が必要であるとされている。
バクテリオファージまたはファージは、細菌に特異的に感染するウイルスである。ファージは、その宿主細菌に接着し、そして種々のファージタンパク質をコードする遺伝子を転移させる。それらは宿主細胞から提供されるタンパク質合成機構、アミノ酸等を利用し、さらに複製のためのエネルギーを利用する（Maloyら（編）：Microbial genetics. Jones and Bartlett Publishers, 1994）。
ほとんどのファージは特定の細菌株を溶菌するか、または他の機構によって破壊する。本発明は、ファージ（特に、線状バクテリオファージ）の遺伝的改変によって、特定の細菌（例えば、Helicobacter pylori）を撲滅することが可能な新規の細菌特異的ファージを設計するための手段を提供し、そして抗生物質耐性に関連する問題を克服する可能性を備えた手段を提供する。
［線状ファージ］
毛様のF線毛を有するE. coli細胞は、M13、fd、およびf1のような線状ファージの宿主である。これらのFf（Ｆ線毛、線状）ファージは、配列および挙動においてほとんど同一である（RashedおよびOberer（1986）Microbiological reviews 50, 401-427; KornbergおよびBaker、DNA Replication中の557-570頁、W. H. Freeman and Co.、New York 1992）。細菌ウイルスの中でFfファージだけが溶菌性の感染を生じず、むしろ感染した宿主細胞が溶菌することなくファージ粒子を生産し、そして分泌する状態を誘導する。
M13ファージの１本鎖ゲノムは、10個の異なるタンパク質をコードする。DNAは、約2700コピーの遺伝子８タンパク質（g8p）からなるタンパク質外殻中に封入されている。生存能力のあるM13ファージはまた、５コピーの43kDaの遺伝子３タンパク質（g3p）を、その先端で発現する。このタンパク質は、E. coliの線毛への吸着を担う。遺伝子３タンパク質は、ポリペプチド鎖のＣ末端部分を介してウイルス外殻につなぎ留められ、一方、Ｎ末端の球状ドメインは露出し、宿主のF線毛の先端へのファージの付着を媒介する。電子顕微鏡法によって、吸着複合体はファージの１方の端で「ノブ−オン−ステム（knob-on-stem）」構造として出現する。感染の間、g3pおよびg8pのリーダー配列は、これらのタンパク質の細菌細胞の内膜への輸送を指示する。
Ffファージは、パッケージングされ得るDNAの長さを制限する物理的拘束がなく、１本鎖DNAの精製が容易であるため、クローニングベクターとして人気を得てきた。ファージミドは、M13（１本鎖）およびプラスミド（２本鎖）の両方の複製起点を有するベクターである。ファージミドはプラスミドとして増殖し得るか、またはM13K07のようなヘルパーファージの助けによって組換えM13ファージとしてパッケージングされ得る（VeiraおよびMessing（1987）Methods in Enzymol. 153, 3-11）。
［組換え抗体の産生］
抗体分子は、プロテアーゼ消化によって単離され得るか、または組換え技術によって生成され得る別々のフラグメントを含む。このようなフラグメントの１つとしてFv（可変フラグメント）があり、これは抗体のＶLおよびＶH領域のみで構成される。米国特許第4,946,778号には、２つの可変領域が中性のリンカーで人工的に結合され、そして単一のポリペプチド鎖として発現する、単鎖Fv（ScFv）と呼ばれるFvフラグメントの組換え体が記載されている。
組換え抗体産生のための技術は、McCaffertyおよび共同研究者によって開発されている（McCafferty（1990）Nature 348, 552-554; WinterおよびMilstein（1991）Nature 349,293）。このアプローチはファージディスプレイシステムに頼っており、そこではＶH（可変重鎖）およびＶL（可変軽鎖）の遺伝子をファージベクター内にクローニングし、その後抗体フラグメントをファージ表面に表示される融合タンパク質として発現する。このアプローチによって、規定された特異性およびアフィニティーの抗体を、母集団から選択することができる。原核生物系で単離され、そして製造された抗体は、「コリクローナル（coliclonal）」抗体と呼ぶべきであると提唱されている（ChiswellおよびMcCafferty（1992）Trends in Biotechnology 10, 80-84）。
市販のファージミドであるpCANTAB5は、抗体の可変領域遺伝子がM13遺伝子３のリーダー配列と主要部との間にクローニングされ得るように設計されている。g3pのリーダー配列は、生じた融合タンパク質のE. coliの内膜および／またはペリプラズムへの輸送を指示し、そこで、主要なg3pドメインによって、組み立てられたファージの先端にこの融合タンパク質が付着する。抗体−g3p遺伝子の発現は、ファージミド上の誘導性lacプロモーターによって制御される。
［Helicobacter pyloriの感染］
細菌Helicobacter pyloriは、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の主因であり、報告された症例のうち、それぞれ84％および95％の症例における原因となっている（Kuipers E. L.ら（1995）Aliment. Pharmacol. Ther. 9（増補２）59-69）。H. pyloriは、胃壁の内側を覆う粘液の層によって、および生物が酸を中和するためにアンモニアを分泌することができる代謝プロセスによって、酸性環境から保護されている胃の壁にコロニーを作る。
従来の抗生物質処置は、H. pyloriに対してほとんど効果がないようである。これはおそらく、（i）血液循環に直接さらされない生物に対しては抗菌剤が十分に接近できないため；そして（ii）多くの経口の抗生物質が胃を素早く通過してしまうため、または胃の酸性状態によりこのような抗生物質が分解されてしまうためである。
【発明の目的】
本発明の目的は、細菌を撲滅するため、特に、Helicobacter pyloriのような粘膜細菌感染の原因となる細菌を撲滅するための新しい処置形態を提供することである。詳細には、本発明は、治療に使用するために別の細菌宿主に対する結合特異性を有するように遺伝的に改変された線状バクテリオファージを提供する。
組換えファージに基づく粘膜細菌感染の処置方法は、いくつかの理由のために、従来の抗生物質処置よりも優れていると考えられる。例えば、以下の理由が挙げられる：
・従来の抗生物質に耐性を有する細菌を撲滅することが可能である；
・特定の細菌種に対する組換えファージの高い特異性；
・ファージの増殖が自己制限的である；
・Helicobacter pyloriの感染の場合、Helicobacter pyloriの運動性により、胃粘膜の全ての部分へのファージの分布が促進され得る。
【発明の開示】
本発明の説明および実施例において、用語「標準的なプロトコル」および標準的な手順」は、Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.（1989）Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY等の通常の実験マニュアルに記載されているプロトコルおよび手順を意味する。
第１の態様において、本発明は、細菌感染症の治療または予防に使用するための改変されたバクテリオファージを提供し、該バクテリオファージは、その表面上で、
（ｉ）  バクテリオファージ表面タンパク質由来の第１の成分；および
（ii）  細菌の抗原結合部位を提供するための抗体の可変領域配列を含む第２の成分であって、前記第２の成分は、前記バクテリオファージに、前記感染症の病因に関与する細菌細胞への結合能を付与し、それによって該細菌細胞の増殖の阻害能を付与する、前記第２の成分、を含む組換えタンパク質を提示する。
前記改変されたバクテリオファージは、例えば、改変されたM13ファージなどの改変された線状ファージであり得る。
前記細菌感染症は、例えば、Helicobacter pylori感染症などの粘膜細菌感染症であり得る。しかし、本発明は、Helicobacter pylori細胞を無能にすることができるファージに限定されず、むしろ広範囲の細菌を無能にするために使用され得る変更された特性を有するファージを含む。本発明によるファージは任意の細菌種に特異的であり、当業者は本発明の開示内容に基づき該ファージを調製することができる。本発明によるファージは、外界との接触が簡単な任意の粘膜細菌感染症の治療に適切である。そのような粘膜上皮の例としては、鼻腔、肺、消化管、膀胱および膣が挙げられる。
本発明によるファージによる治療が可能なその他の細菌感染症の例としては：
・E. coli、Straphylococcus saprophyticus、Klebsiella spp、Proteus sppまたはPseudomonas aeruginosaによる尿路での感染症；
・Clamydiaによる膣感染症；
・Streptoccus、Straphylococcus、Haemophilus influence、PneumococcusまたはMycoplasma pneumonicによる鼻腔／扁桃／肺感染症；
・Salmonella、Shigella、Yersinia、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Helicobacter、Vibrio choleraまたはE. coli消化管での感染症；
が挙げられる。
上記組換えタンパク質の前記第１の成分は、前記バクテリオファージの非改変型が細菌の線毛に吸着する原因となっているタンパク質、例えば、M13ファージ由来のg3pタンパク質から好適に誘導することができる。
前記組換えタンパク質の前記第２の成分は、例えば、組換え単一鎖のFv（ScFv）ポリペプチドを含めることができる。したがって、前記組換えタンパク質はg3p-ScFv融合タンパク質であり得る。
好適な形態では、本発明のバクテリオファージは、Helicobacter pylori感染症の治療または予防に使用するためのバクテリオファージであり、ここで、前記組換えポリペプチドの抗体可変領域配列は、ハブリドーマ細胞株5F8（ECACC受託番号95121524）、2H6（ECACC受託番号95121526）および5D8（ECACC受託番号95121527）のモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体の可変領域配列である。
したがって、本発明によるバクテリオファージは、受託番号NCIMB 40779でNCIMBに寄託されたB8と呼ばれる改変されたM13バクテリオファージか、またはHelicobacter pyloriへの結合および感染能を保持しているM13バクテリオファージ誘導体であり得る。
所望の特性を有するファージは、例えば、以下の方法の１つにより得ることができる：
（ａ）ファージ、または多数の可変抗体フラグメントを発現するファージを含むファージライブラリーのスクリーニング。ファージライブラリーは、例えば、免疫細胞、多くの個体から入手してもよい。非常に広範な遺伝的変異性のため、そのような大きなファージライブラリーには、既に以前に個体に曝されている細菌に対して特異的に発生した所望のファージが含まれると思われる。
（ｂ）既存のファージにおける変異の発生。変異は、ファージを含むすべての生存している生物に生じる。変異の頻度は、例えば、化学的手段により、または短波長の電磁は照射によって増大させてることもできる。
（ｃ）天然または組換えファージの所望の特性を増大させるための、１つ以上のアミノ酸の特異的遺伝子改変、あるいは他の炭水化物または脂質成分、ファージの結合領域の改変。このアプローチの例については、実施例で更に説明する。本発明によるバクテリオファージは、（ａ）細菌細胞に対する抗体を単離する工程；（ｂ）前記抗体の重鎖および軽差の可変領域をコードするDNAを単離する工程；および（ｃ）前記DNAをファージDNAに導入して、前記抗体領域がファージ表面上で発現されるようにする工程を含む方法によって生産することができる。
もう１つの態様において、本発明は、本発明によるバクテリオファージを薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤との混合で含む薬学的組成物を提供する。
本発明によるファージの適切な投与手段の例としては：
・鼻腔およびは胃への投与のための噴霧；
・消化管粘膜処置のための、オメプラゾール、続く重炭酸緩衝液中に懸濁したファージによる前処置；
・胃粘膜および膣粘膜のための粘液−粘着ゲル（すなわち、セルロース基剤のゲル、ポリカルボフィル、ポロキサマ等）の混合物；
・膀胱において使用するための重炭酸緩衝液；
が挙げられる。
投与すべきファージの数は、当業者が決定することができる。感染症のタイプにより、投与すべきファージの数は、104〜1010の範囲とすることができる。
さらにもう１つの態様において、本発明は、哺乳動物における細菌感染症を治療するための方法を提供し、該方法は、本発明によるバクテリオファージまたは薬学的組成物を投与する工程を含む。前記細菌感染症としては、例えば、Helicobacter pylori感染症などの粘膜細菌感染症が含まれる。粘膜細菌感染症、例えば、Helicobacter pylori感染症を治療または予防するための医薬品の製造における本発明によるバクテリオファージの使用もまた本発明に含まれる。
本発明の更なる態様は、5F8（ECACC受託番号95121524）、2H6（ECACC受託番号95121526）および5D8（ECACC受託番号95121527）から選択されるハブリドーマ、ならびに前記ハブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術とは、免疫動物由来の抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ、得られた細胞株から所望の抗体を産生するものを選択する技術であり、当該分野において周知である。
【実施例】
実施例１：H. pyloriに対するモノクローナル抗体の産生
1.1  抗原の調製
H. pylori株17874、25、66、253および1139（Astra Hassle、Swedenより供与）を8.5％ウマ血液、10％ウマ血清、1％イソビタレックスを補充したコロンビア寒天上で、AnaerocultＣを用いて微好気条件下におき、＋37℃で培養した。
Ma J-YらがScand. J. Gastroenterol. 29, 961-965（1994）に記述した手法に従い、H. pyloriの表面タンパク質を調製した。簡単に説明すると、合計４ｇのH. pylori ５株を0.2Mグリシン-HCl（pH2.2）100ml中に15分間、室温でインキュベートした。pHは１M NaOHで中和した。抗原調製物は10,000×ｇ、10分間、＋４℃で遠心分離した。沈殿を捨て、上清を一晩、＋４℃で蒸留水で透析し、「H. pylori抗原調製物」あるいは「H. pylori表面タンパク質」として後に使用した。
1.2  モノクローナル抗体の産生
本質的にはCabero, J. L.らがActa Physiol. Scand. 144, 369-378（1992）に記述したような免疫化手順を行った。簡単に説明すると、２mg/mlのH. pylori表面タンパク質と等容量のフロイント完全アジュバントを＋４℃で乳化した。DBA/1雌マウス２匹の後肢肉球に、単回量50μlの抗原乳剤を注射した。免疫後11日目に、50％（w/w）のPEG4000を用いて膝窩リンパ節のリンパ球をマウス骨髄腫細胞（sp２系）と融合させた。次に、細胞融合浮遊液を５つのマイクロタイタープレートに分注した。50μg/mlゲンタマイシン添加10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地中で全細胞を増殖させた。
1.3.  酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）
指標抗原（10μg/ml）を含む0.05M Na2CO3/NaHCO3緩衝液、pH9.8の50μlでイムノプレートをコートし、＋４℃で一晩インキュベートした。遊離結合部位は0.05％ Tween-20を含有するPBS（PBS-T）を用いて、＋37℃で１時間ブロックした。一次抗体の上清を加え、＋37℃で１時間インキュベートした。二次抗体としてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgGを使用した。0.1Mクエン酸/0.2M NaHPO4、pH５中の0.04％（w/v）OPDおよび14mM過酸化水素で、結合ペルオキシダーゼを検出した。プレートは２M H2SO4を加え反応を停止させた後、492nmで読み取った。PBS-Tでの洗浄は、それぞれのインキュベーションの間で３回行った。
1.4.  初期スクリーニング
リンパ節細胞と骨髄腫細胞の融合から、45のハイブリドーマクローンがH. pylori表面タンパク質に対しELISAにおいてポジティブとなった。そのうち８つは、免疫組織学的手法により、寒天プレートで培養し採取したH. pyloriを顕著に染色した。ハイブリドーマクローンは2H6（ECACC受託番号95121526）、5D8（ECACC受託番号95121527）および5F8（ECACC受託番号95121524）と命名した。これらはH. pyloriに対して他のハイブリドーマクローンよりも強い反応を示したことから、これらを選択して以後の研究に用いた。
実施例２：H. pyloriに対する組換えM13ファージの産生
2.1.  材料
QuickPrep mRNA精製キットTM、マウスScFvモジュールキットTM、発現モジュールキットTM、検出モジュールキットTM、SfiI、NotI、T4 DNAリガーゼおよび抗M13ヒツジ抗体は、Pharmacia Biotech（ファルマシア バイオテック）社（Uppsala、Sweden）より入手した。dNTP混合物、10×PCR緩衝液およびAmpliTaq DNAポリメラーゼは、Perkin Elmer（パーキン エルマー）社より購入した。Bacto-酵母抽出物、Bact-トリプトン、Bacto寒天は、Difco Laboratories（ディフコ ラボラトリーズ）社（Detroit、Michigan USA）より購入した。コロンビア寒天プレートおよびブルセラ菌の両方は、Department of Microbiology（デパートメントオブマイクロバイオロジー）（Linkoping University、Sweden）より入手した。AnaerocultRCは、Merck（メルク）社（Germany）より入手した。SlowFadeTMアンチフェード（antifade）キットは、Molecular Probes Inc.（モレキュラープローブス）社（U.S.A.）より入手した。
2.2.  ファージ抗体ライブラリーの構築
組換えファージ抗体システムTM（Pharmacia（ファルマシア）社）を用いて、抗体のフラグメントをファージ表面上に提示される融合タンパク質として発現させた。
総mRNAはハイブリドーマ細胞株（2H6、5D8、および5F8）より単離し、QuickPrep mRNA精製キットTM（Pharmacia（ファルマシア）社）を用いてオリゴ（dT）-セルロース上でアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
マウスScFvモジュールキットTMを用いて、以下の工程を行った。
・マウスScFvモジュールキットTMによって提供される逆転写酵素およびプライマー混合物を用いて、ハイブリドーマmRNAから第１鎖cDNAを合成した。
・mAbsの重鎖および軽鎖の可変領域に対応するcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により異なるプライマー（ＶHおよびＶL鎖プライマー、キットより供与）を用いて増幅した。1.5％アガロースゲル上での電気泳動により、ＶHおよびＶL鎖を分析した。ＶH（340 bp）およびＶL（325 bp）鎖に対して正確なサイズで単一なバンドが得られた。
・増幅したＶHおよびＶL鎖を１％アガロースゲル上で精製および単離し、次いでキットより供与されたDNAリンカーフラグメントを用いてこれらを単一鎖Fv（ScFv）遺伝子に組み立てた。リンカーフラグメントを構築して、一方の末端を重鎖の3'末端にアニールさせ、他方は軽鎖の5'末端とハイブリダイズさせた。電気泳動後、ScFv遺伝子（750 bp）に対して正確なサイズで単一なバンドが観察された。
・組み立てた抗体ScFv DNAフラグメントを、NotIおよびSfiI制限部位が導入された１セットのオリゴヌクレオチドプライマー（キットより供与）を用いて増幅した。フラグメントをスパンカラム（キットより供与）上で精製して、リンカー、dNTPおよびTaq DNAポリメラーゼを除去した。ScFvフラグメントをNotIおよびSfiIで消化して、pCANTAB5ベクターに連結のための付着末端を形成した。
発現モジュールキットTMを用いて、以下の工程を行った：
・ScFvフラグメントを、予めNotIおよびSfiIで消化したファージミドベクターpCANTAB5（キットより供与）に連結して、粘着末端を作成した。T4 DNAリガーゼを用いて、フラグメントの末端をファージミドの対応する末端と結合させた。次に、ScFv g3p融合タンパク質の発現のために、ScFvフラグメントを適切な位置でM13遺伝子３に隣接しかつインフレームとなるように配向させた。
・E. coli TG1細胞（キットより供与）をコンピテントにし、lacプロモーターおよびアンピシリン耐性マーカーを含む組換えファージミドを用いて形質転換した。形質転換細胞を、グルコースおよびアンピシリンを含有する倍地中、30℃で増殖させた。3.2×104個のScFvクローンを得た。アンピシリン耐性のコロニーをかきとって培地に植え、ライブラリーストックを作製した。
・アンピシリン耐性細胞に、カナマイシン耐性マーカーを含むヘルパーファージM13K07（キットより供与）を感染させ、アンピシリンおよびカナマイシンを含有しグルコース非含有の培地中で増殖させた。グルコース非存在下では、ファージミド上に存在するlacプロモーターはもはや抑制されなかった。組換え抗体フラグメントを提示するファージ粒子が産生され、細胞から放出された。
・抗原を作用させてH. pylori抗原に結合可能な抗体を提示したファージを選択した。培養フラスコを５mlのH. pylori表面タンパク質（50 mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中15μg/ml）で一晩コートした。PBSで３回洗浄後、PBS中１％（w/v）BSAの10mlを含むフラスコを＋37℃で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄後、フラスコをにファージ上清（ファージを含有する倍地）を加えて＋37℃で２時間インキュベートした。次いで、フラスコを0.1％（w/v）Tween-20を含有するPBSで20回洗浄し、その後PBSで20回洗浄した。次いで、10分間穏やかに振盪しながら１mlの100 mMトリエチルアミンを添加し、0.5 mlの１M Tris-HCl（pH 7.4）で直ちに中和することにより、結合したファージ粒子を溶出させた。
２％ Bacto-トリプトン、0.5％ Bacto-酵母抽出物、0.05％ NaCl、0.01M MgCl2、0.01％グルコースおよび0.01％アンピシリンを含有するSOBAG寒天上で対数増殖期のE. coli TG1細胞に上記において溶出したファージを感染させた。コロニーを拾い出し、形質転換し、増殖させて、M13K07で再度回収した。
１回目の選択において100コロニーを計数し、このマイクロタイタープレートレスキュー由来のコロニーのうち6％がELISAにおいてH. pyloriの抗原調製物に対してポジティブであった。マイクロタイタープレートレスキューからの3回目の選択では、個々のコロニーに由来するファージ抗体の95％がH. pylori抗原と反応した。
H. pylori抗原調製物を抗原として用いたファージELISAでは、組換えファージB8は、ヘルパーファージ（ワイルドファージ）より10倍高い力価を有する。このファージB8（NCIMB受託番号40779）を更なる分析のために選択した。
実施例３：ELISA
検出モジュールキットTMを用いて、組換え抗体を提示したファージを酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）において検出および単離した。
96ウェルマイクロタイタープレートを200μlのH. pylori抗原（50 mM Na2CO3/NaHCO3、pH9.6中10μg/ml）でコートし、一晩、＋4℃でインキュベートした。ウェルを、0.05％ Tween-20を含有するPBS（PBS-T）で3回洗浄し、次に１％ BSAを含有するPBSを300μl分注して1時間、＋37℃でブロックした。組換えファージ抗体を等容量の１％ BSA/PBSで希釈し、室温で20分間インキュベートした。洗浄後、５×1010ファージ導入単位を添加（200μl/ウェル）し、＋37℃で２時間インキュベートした。
ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、次いで検出モジュールキットにおいて補充され１％ BSA/PBSにおいて１：5000に希釈されたHRP／抗M13結合体を添加し、＋37℃で１時間インキュベートした。ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、次いで2',2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）ジアンモニウム（ABTS）およびＨ2Ｏ2をペルオキシダーゼの基質として添加し、室温で30分間インキュベートした。コンピュータELISAリーダーを用い、405 nmで吸光度を読み取った。オブアルブミン（PBS中10μg／ml）をコントロール抗体として使用した。ヘルパーファージをネガティブコントロールとして使用した。この結果より、組換えファージB8はH. pylori表面抗原に特異的に結合したことが確認された。
実施例４：イムノブロッティング
H. pylori抗原調製物のタンパク質を、SDS-PAGEにおいてポリアクリルアミドゲル電気泳動（10μgタンパク質重量／ウェル）によって分離し、次いでミニトランス-ブロット電気泳動トランスファーセル（BioRad（バイオラド）社、Richmond、CA、USA）においてニトロセルロースペーパーに移した。ニトロセルロースペーパーを、穏やかに振盪しながら0.1％ Tweenを含有するPBS中の10％ BSAで１時間、室温でブロックした。次に、ファージB8（1011導入単位／ml）を添加し、ニトロセルロースペーパーとともに穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。一次抗体を除いたものをネガティブコントロールとして使用した。PBS-0.1％ Tween 20で洗浄後、ニトロセルロースペーパーをHRP／抗M13結合体（ブロッキング緩衝液において1：5000に希釈）とともに振盪しながら1時間インキュベートした。ECL検出キット（Amersham（アマシャム）社、UK）を用いることによって、結合の検出を行った。
アミドブラックでニトロセルロースペーパーを染色後、主要なバンドは64 kDa、36 kDa、31kDaおよび27 kDaのタンパク質に対応した。プールしたMAbs（ファージの構築のために使用したハイブリドーマに対応する2H6、5D8、および5F8）は、32 kDaおよび64 kDaのバンドと反応した。同様の染色が、ファージ抗体B8でイムノブロッティングすることにより得られた。この結果は、H. pylori特異的モノクローナル抗体に対応する可変の重鎖および軽鎖の遺伝子がファージ上で正確に発現されたことを示した。
実施例５：細菌に対する組換えファージの効果
以下の実験では、細菌を、５％ウシ胎児血清を含有するBrucella液体培地（ブロス）中において＋37℃、10％CO2および５％ Ｏ2を含有する大気下で培養した。
細菌ストックから２０μlを10mlブロスと混合した時点（「時間０」）で実験を開始した。PBSに培養物のアリコートを希釈し、希釈液を寒天プレート上に広げることによって、１ml培養物あたりのCFU（コロニー形成単位）を指標時間ポイントで測定した。プレートを2日間、＋37℃でインキュベートし、各プレートのコロニー数を計数した。
5.1.  時間依存的効果
H. pylori株17874の増殖に対する組換えファージB8の時間依存的（経時的）効果についてファージ添加または非添加における3日間のCFU測定によって調べた（表１）。106のファージを10mlの培地に時間０で添加した（「＋ファージ」）。コントロール（「−ファージ」）では、ファージを添加しなかった。
３日後、CFUは、組換えファージ非存在下で約５桁の単位で増加した。ファージ存在下では１日後、約１桁の割合でCFUの低下が認められ、両培養物とも外観が混濁からやや混濁の溶液に変化した。
5.2.  様々な細菌株に対する効果
H. pylori実験用株17874、1139および244、とともにStaphylococcus aureus、ATCC 29213、およびE. coli TG1をファージ（10mlの培地に対して106のファージ）を存在下または非存在下で24時間培養した。時間０および24時間でCFUを分析した。組換えファージは、試験した３つのH. pylori株のCFUを減少させたが、StaphylococcusまたはE. coliには影響を及ぼさなかった。H. pylori17874は、コントロールとして用いたヘルパーファージM13K07の影響を受けなかった。
5.3.   H. pylori株に対する効果
第２の実験（表３）では、H. pylori株17874、1139、253、25および66をStreptococcus（Raf M87）とともに試験した。ファージが非存在の場合、CFUは24時間のインキュベーションの間、試験したすべての細菌において増加した。しかし、組換えファージが存在する（10mlの培地に対して106のファージ）培養系では、H. pylori株17874、1139および25のCFU数は減少し、株253および66の増殖速度はコントロールに比べて顕著に減少した。このように、試験したH. pylori株はファージの影響を受けることが示された。
実施例６：H. pyloriの免疫蛍光染色
ファージ抗体B8をPEG沈殿によって濃縮し、培養物から採取したH. pylori（17874株）について免疫蛍光染色を行った。
以下のストック試薬を調製して、免疫蛍光染色を行った：
試薬Ａ：1012導入単位／mlのファージ抗体を１％ BSA/PBSで1:1に希釈した；
試薬Ｂ：１％ BSA/PBSで希釈したヒツジ抗M13 IgG；
試薬Ｃ：１％ BSA/PBS中１：100で希釈した抗ヒツジIgFITC結合体；
試薬Ｄ：PBS中１mg（w/v）のプロナーゼ。
培養３日後、H. pylori（５つの異なる株）、Staphylococcus aureus（ATCC 219213）、およびStreptococcus（Raf M87）を個別に、１％ BSAを含有するPBS中に懸濁した。各細菌懸濁液の20μlをスライドガラス上に添加した。細菌を空気乾燥させ、中性ホルマリンで２分間固定し、次いでスライドを６回水に浸けることによって洗浄し、室温で空気乾燥させた。試薬Dでの処置が短いと、サンプルスライドにおいてコントロールと比較したときのシグナル対ノイズ比が増大した。スライドを、30μlの試薬Ａ、ＢおよびＣとともにそれぞれ30分間連続してインキュベートし、インキュベートとインキュベートとの間はPBSで洗浄した。スライドを空気乾燥し、カバーする前に１滴のSlowFadeを添加した。すべてのインキュベーションは室温で行った。ネガティブコントロールは、一次抗体を除くことによって行った。
結果は、H. pyloriがファージ抗体によってポジティブに染色されたことを示した。結果は、培養実験から得られたCFU値との良好な一致を示す。したがって、細菌表面上の特異的抗原の発現は、ファージB8による生物学的効果の実行に対して不可欠であるようである。
生物学的材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞は、ブダペスト条約に基づきザ  ヨーロピアン コレクション オブ アニマル セル カルチャーズ（ECACC）、Salisbury、Wiltshire、U.K.に1995年12月15日付で寄託されている：
2H6（ECACC受託番号95121526）
5D8（ECACC受託番号95121527）
5F8（ECACC受託番号95121524）
組換えファージB8は、ブダペスト条約に基づきザ  ナショナル コレクションズ オブ インダストリアル マリーン バクテリア（NCIMB）、Aberdeen、Scotlandに受託番号NCIMB 40779で1995年12月15日付で寄託されている。
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