(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サプレッサーＴ細胞により産生される可溶性Ｔ細胞レセプターα鎖であるＶα１４Ｊα２８１とイムノグロブリンＧの定常領域部分ペプチドとが結合して成るキメラ蛋白を有効成分とする自己免疫疾患であるインスリン依存性糖尿病の予防治療剤。
【請求項２】
キメラ蛋白がＶα１４Ｊα２８１Ｃγ３である請求項１のインスリン依存性糖尿病の予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、自己免疫疾患の予防治療剤に関する。さらに詳しくは、サプレッサーＴ細胞が産生する可溶性Ｔ細胞レセプターα鎖を有効成分とする当該サプレッサーＴ細胞に特異的な抗原とは異なった広範な自己抗原に対する自己免疫疾患の予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自己免疫疾患とは、自己の組織由来の抗原に対して自己抗体が生成され種々の障害をもたらす免疫疾患の総称である。この自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、全身性硬化症、皮膚筋炎／多発性筋炎、シェーグレン症侯群等の臓器非特異的疾患や、糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブ病、多発性硬化症、特発性アジソン病、重症筋無力症、悪性貧血、糖尿病等の臓器特異的疾患、それに原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎等の混合性疾患があり、潜在的な患者数も加えればこれらの患者総数は膨大なものとなっている。
【０００３】
これら自己免疫疾患の治療のために従来実施されていた治療法には免疫抑制作用を期待した、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、シクロフォスファミド、アザチオプリン、メトトレキセート等の治療薬の投与、またはＸ線照射、胸腺切除等があり、また、免疫調整作用を期待した、インターフェロン、γ−グロブリン、リンパ球細胞表面マーカーに対する抗体、金製剤、Ｄ−ペニシラミン等の投与が挙げられる。
【０００４】
これらの免疫抑制剤の多くは、免疫系細胞をはじめとする各種細胞のＤＮＡ、ＲＮＡを傷害するために、使用法を誤れば重篤な副作用を示した。さらに、妊婦への投与は、奇形児出産の原因となることもあり、また、広汎な免疫抑制が誘導されるために、日和見感染の危険性が高まることも指摘されていた。他方、免疫調整剤の詳しい作用機序は未だに不明で、治療効果を厳密に予測するのは困難であり、更に、影響を与える細胞群が広汎に渡るため、やはり副作用の危険性が高いことが指摘されていた。
【０００５】
以上のように、現存する自己免疫疾患の治療法には不満足な点が多々あった。また、自己免疫疾患の発症機構にも未解決な点が多く、このことが、自己免疫疾患を誘導することになる、免疫系の異常な箇所にのみ特異的に作用する治療薬の開発を妨げている大きな原因となっていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
自己免疫疾患に特異的に効果を示す治療薬が開発されれば、副作用の少ない、しかも標的となる免疫系の異常な箇所如何では、根治療法の確立が期待できると考えられる。こうして、特異的な治療法の確立を目的とし、本発明者らは、免疫系の異常亢進を局所的に抑制する、Ｔ細胞サプレッサー因子（T-cell derived suppressor factor：以下ＴｓＦと略す）としての可溶性Ｔ細胞レセプター（T-cell receptor：以下ＴＣＲと略す）α鎖を作製し、自己免疫疾患を治療する方法の確立を試みた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明におけるサプレッサーＴ細胞（suppressor T-cell：以下Ｔｓと略す）とは、免疫抑制作用を示す一連の細胞群であり、免疫反応の初期の抑制の誘導の段階では抗原特異的に、最終的に抑制効果を示す段階では抗原非特異的に作用を示す。即ち、サプレッサーＴ細胞とは、免疫反応を抗原特異的に亢進するヘルパーＴ細胞（helper T-cell：以下Ｔｈと略す）と正反対の作用を有するＴ細胞のサブグループである。
【０００８】
自己免疫疾患にかかっているヒトや動物においては、Ｔｓの量的あるいは質的な異常がいくつか知られている（McIntosh and Drachman，Science，vol．232，p.401，1986；Isenberg et al.，Br．Med．Bull，vol．10，p.262，1984）。Ｔｓ機能が異常になると、ＴｓＦの産生は低下し、Ｔｈ活性が相対的に亢進する。そのために、傷害性細胞誘導Ｔ細胞、そして自己傷害性Ｔ細胞が誘導、活性化されるものと思われる。自己抗体産生Ｂ細胞も、同様にして活性化される。したがって、ある自己免疫疾患において、特定の生体内細胞や生物活性因子が免疫系によって攻撃されている場合、標的になっている抗原に特異的なＴｓが産生するＴｓＦを患者に投与してやれば、その自己免疫疾患の異常のもとになっている箇所が修復されて、疾患は完治することが期待される。
【０００９】
本発明で例示されるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin：以下ＫＬＨと略す）を抗原として免疫したマウスから得られるＫＬＨ特異的なＴｓは、１９７９年、谷口ら（Taniguchi et al.，Nature，vol．278，p.555）によってＴｓハイブリドーマとして分離された。Ｔｓハイブリドーマの選別は、ＫＬＨ特異的抗体の抑制を指標に実施した。谷口らはこのＴｓハイブリドーマが可溶性ＴｓＦを産生していることを確認した。このＴｓＦは、ＫＬＨで被った免疫吸着剤（immunoadsorbent）により吸収され、また、インビトロ（in vitro）でＫＬＨの抗体産生を特異的に抑制した。１９８６年、今井ら（Imai et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．83，p.8708）は、ＫＬＨ特異的Ｔｓが表現している抗原に対するＴＣＲが、このＴｓハイブリドーマ細胞の遺伝子解析の結果、ＴＣＲα鎖であり、抑制機能の発現のためには、ＴＣＲα鎖が重要な役割を果たしていることを示唆した。
【００１０】
さらに、１９８９年、小関ら（Koseki et al.，Int．Immunol．vol．1，p.41）は、これらのＴｓハイブリドーマからα鎖レセプター遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡをクローン化し、塩基配列を決定した。この結果、今までに知られているどのα鎖の可変領域（variable region of α-chain：以下Ｖαと略す）ファミリーとも異なる全く新しいＶα遺伝子ファミリーを発見し、これをＶα１４と命名した。Ｖα１４の９０％以上はα鎖のＪ領域（joining region of α-chain：以下Ｊαと略す）の一種であるＪα２８１と遺伝子再構成していた。
【００１１】
最近の研究成果（Batchelor et al.，Immunol．Today，vol．10，p.37，1989）により、サプレッサーＴ細胞由来のＴｓＦの実体は明らかになってきている。即ち、ＴｓＦが抗原へ結合する機能は、ＴＣＲα鎖によって担われており、このα鎖がＴｓから遊離されてＴｓＦとなる。したがって、可溶性のα鎖を、特異的に免疫反応抑制を誘導するＴｓＦとして、自己免疫疾患の治療に使うことができるはずである。ＴｓのＴＣＲα鎖の構造はＴｈや傷害性Ｔ細胞のα鎖とは異なると考えられるので（Imai et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．83，p.8708，1986）、Ｔｈまたは傷害性Ｔ細胞由来のα鎖を使っても目的は達成できないものと思われる。Ｔｓが産生するα鎖に限定するのが、治療薬の開発として考えられる最も妥当なアプローチである。
【００１２】
しかしながら、今までの報告からは抗原特異的なＴｓＦをその抗原に対する抗体の産生抑制に用いることは考え得るが、抗原特異性を越えてまで、抗体産生抑制、すなわち、自己免疫疾患の治療に用いることは、とうてい予想しえなかった。
【００１３】
他方、フェアチャイルドら（Fairchild et al.，J．Immunol．vol．141，p.3342，1988；Fairchild et al.，J．Immunol．vol．145，p.2001，1990）によれば、ジニトロフェノール（dinitrophenol：以下ＤＮＰと略す）抗原特異的ＣＤ（cluster of differentiation）８陽性Ｔｓはα鎖、β鎖から成る二量体の可溶性ＴｓＦを産生した。また、ライダーら（Lider et al.，Science，vol．239，p.181，1988）は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（experimental allergic encephalomyelitis：以下ＥＡＥと略す）の脳炎誘発性（encephalitogenic）Ｔ細胞において高頻度でみられるα鎖、β鎖から成る二量体のＴＣＲの解析を行い、Ｖβ８領域（Vandenbark et al.，Nature，vol．341，p.541，1989）やβ鎖ＶＤＪ領域とＪ領域（Howell et al.，Science，vol．246，p.668，1989）の合成ペプチド鎖を用いたワクチネーションを成功したとされている。しかし、全く同じ条件で行った追試験の結果はしばしば正反対となった（Desquenne-Clark et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．88，p.7219，1991）。すなわち、デスケン−クラークらの実験によると、上記の脳炎誘発性Ｔ細胞由来合成ペプチド鎖によるラットへのワクチネーションは、ＥＡＥを抑制するどころか、しばしばＥＡＥ症状の悪化を来すことになったのである。
【００１４】
さらに、ＴＣＲβ鎖は主要組織適合性（major histocompatibility complex：以下ＭＨＣと略す）拘束に関係するので、β鎖単独では勿論、α鎖とβ鎖の二量体としても治療薬に使うには不適当である。なぜならば、ヒトはひとりひとり異なるＭＨＣを持っており、患者ひとりひとりのＭＨＣに合った治療薬を作るのは不可能ではないが、非現実的である。本発明のＴＣＲα鎖は抗原のみを認識するので、このα鎖を患者に投与することにより、ＭＨＣの拘束を受けずに治療効果を期待できる。したがって、本発明によって作られるひとつの治療薬はある自己免疫疾患にかかっている全ての患者に個人のＭＨＣの違いを考えずに使用できる。
【００１５】
上記の考察をまとめると、Ｔｓが産生、遊離するＴｓＦとしてのＴＣＲα鎖が、免疫抑制作用を発揮することにより、自己免疫疾患の治療薬として有効に薬効を発揮するものと期待できる。抗原特異的に誘導した免疫抑制作用も、最終的には病巣局所においてＴＧＦ（transforming growth factor）−βかＩＬ（interleukin）−１０等のサイトカインを介した抗原非特異的な免疫抑制となって終結するものと考えられる。当発明において使われているこの概念は、すべての自己免疫疾患の治療薬の開発に適用可能である。
【００１６】
【発明の構成】
そこで、我々は、以上の概念の有効性を実際の実験で確かめるために、ＴＣＲの機能部位であるＶα１４Ｊα２８１を組換え蛋白法によって生産、可溶化してインスリン依存性糖尿病（insulin dependent diabetes mellitus：以下ＩＤＤＭと略す）自然発症ＮＯＤマウスに投与し、ＩＤＤＭに対する治療効果を調べた。すなわち、外来抗原であるＫＬＨをマウスに免疫し、in vitroの反応でＫＬＨ特異的なＴｓハイブリドーマを作製後、そのＴｓハイブリドーマからＴＣＲをコードするｃＤＮＡをクローン化して、本発明で使ったＶα１４Ｊα２８１のｃＤＮＡを得た。次に、マウスＣγ３を含む発現用プラスミドにＶα１４Ｊα２８１ｃＤＮＡを導入し、キメラ蛋白としてミエローマ細胞で発現させた。このようなキメラ化により、Ｖα１４Ｊα２８１は構造的に安定となり、可溶性蛋白としてこの形質転換ミエローマ細胞の培養上清から得られた。Ｃγ３はマウス由来なので、マウスの系の実験においてハプテンに対する担体のようには機能せず、したがって、このキメラ蛋白のＣγ３に対する免疫反応は誘導されない。
【００１７】
このＴＣＲのＶα１４Ｊα２８１は、インビボ（in vivo）の系では抗原非特異的な免疫抑制反応にも関与していることを示唆するような結果が、Ｖα１４に対するモノクローナル抗体を使った間接的な動物実験から得られた。また、Ｖα１４Ｊα２８１をコードするｍＲＮＡの発現が、ＮＯＤマウスにおいて、糖尿病発症の時期が近づくにつれて抑制されることも、Ｖα１４Ｊα２８１の抗原非特異的免疫抑制への関与を強く示唆する結果となった。このようにして、可溶性のＶα１４Ｊα２８１のＩＤＤＭに対する治療効果が期待されるようになり、ＩＤＤＭモデルマウスによる動物実験が実施された結果、著明な抑制効果が確認された。
【００１８】
Ｖα１４Ｊα２８１は、もともとＫＬＨ特異的ＴｓのＴＣＲ機能部位なので、このように抗原非特異的な免疫抑制効果を示すためには、ＫＬＨが種々の自己抗原と交叉する可能性や、上述したように、抗原特異的に免疫抑制系を起動させても、最後は抗原非特異的な抑制作用が自己と反応する効果細胞（effector cell）に伝えられること等がその説明としてあげられる。
【００１９】
いずれにしても、Ｖα１４Ｊα２８１の抗原非特異的免疫抑制効果から、この可溶性ＴＣＲが、ＩＤＤＭのみならず、他の全ての自己免疫疾患にも広く治療効果を示すことが予想される。
【００２０】
野性マウスの系統間で、ＴＣＲ Ｖα１４遺伝子はよく保存されている（Koseki et al.，Prod．Natl．Acad．Sci．USA，vol．87，p.5248，1990）。マウスのＴＣＲ Ｖα１４のアミノ酸シークエンスとヒトの同じＴＣＲ Ｖαファミリーのアミノ酸シークエンスとの間の相同性は７６％と高いのに対し、Ｖαファミリーは約１００個あるが、知られている限りでは、他のメンバーの相同性は７０％かそれ以下である。このように高い相同性から、ヒトの該ファミリーも、同じような免疫抑制効果の機能を示すものと思われる。更に、数あるＶαファミリーの中でも免疫抑制という特殊な機能を有するマウスのＶα１４を、ヒトの種々の自己免疫疾患に治療薬として使うことができるものと思われる。
【００２１】
以下に本発明のＶα１４Ｊα２８１レセプターが免疫抑制反応に関与していること、および、ＮＯＤマウスを使いＩＤＤＭに対する治療効果について実施例により詳述する。
【００２２】
【実施例】
〔実施例１〕  ＴＣＲ Ｖα１４Ｊα２８１ ｍＲＮＡの自己免疫疾患マウスにおける発現抑制
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（RNase protection assay）（Koseki，et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．87，p.5248，1990）を使って、ＮＯＤマウスの脾臓リンパ球におけるＶα１４Ｊα２８１をコードするｍＲＮＡの発現を定量的に調べた。この目的のために、市販のｐＧＥＭプラスミド（プロメガ社製）にＶα１４Ｊα２８１とＴＣＲα鎖の定常領域（constant region ofα-chain：以下Ｃαと略す）を連結したＶα１４Ｊα２８１ ＣαをコードするｃＤＮＡを組み込み、Ｓｐ６プロモーターを用いて、アイソトープで標識したＶα１４Ｊα２８１ Ｃαリボプローブを合成した。このプローブとリンパ球から抽出したＲＮＡをハイブリダイズし、ハイブリダイズされていない部分を１本鎖特異的リボヌクレアーゼ（RNase）によって消化した。これをアガロースゲル電気泳動法によって分画し、Ｃαにのみハイブリダイズするバンドの濃度を１００％としてこれに対するＶα１４Ｊα２８１のバンドの濃度を％で比較計算し、Ｖα１４Ｊα２８１をコードするｍＲＮＡの発現頻度を求めた。また、対照群では、Ｖα１４を含むがＪα２８１以外のＪ領域を有するＶα１４ＪｘＣαグループおよび、Ｊα２８１は含むがＶα１４以外のＶ領域を有するＶｘＪα２８１Ｃαグループを各々コードするｍＲＮＡの発現頻度を測定した。この結果、ＮＯＤマウスにおけるＶα１４Ｊα２８１ ｍＲＮＡの発現は、発症前は２％を越えるのに対して発症の時期には、加齢と共に減少することが分った。他方、対照群では加齢による変化はみられなかった（図１）。
【００２３】
〔実施例２〕  可溶性ＴＣＲ  Ｖα１４Ｊα２８１の作製
マウスＩｇＧの定常部分Ｃγ３を含むｐＳＶＥＰプラスミドをまず構築し（Kameyama et al.，FEBS Letters，vol．244，p.301，1989）、そこへＶα１４Ｊα２８１ ｃＤＮＡをＳａｌ Ｉ部位で挿入した（図２）。このベクター３０μｇを２×１０6個のＪ５５８Ｌマウスミエローマ株化細胞へ電気穿孔法により導入した。導入された細胞は、２０ｍｇ／ｍｌのマイコフェノール酸を含む２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で選択し、ＥＬＩＳＡによって上清中のＶα１４Ｊα２８１ Ｃγ３キメラ蛋白の分泌を確認した。これら上清中に分泌産生された可溶性のＶα１４Ｊα２８１ Ｃγ３キメラ蛋白は、プロティンＧを使ったアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、培養上清から精製した。
【００２４】
〔実施例３〕  抗Ｖα１４モノクローナル抗体の抗体産生に対する抑制効果
Ｖα１４Ｊα２８１でマウスを免疫し、常法に則ってＶα１４に対するモノクローナル抗体を作製した。
【００２５】
１００μｇのＶα１４Ｊα２８１モノクローナル抗体は、ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫を始める２週間前から、毎週マウスの腹腔に投与した。更に、１００μｇのＤＮＰ−ＫＬＨ、百日咳ワクチン（Pertussis vaccine：以下ＰＶと略す）（千葉県血清研究所）、それに水酸化アルミニウム（和光純薬社製）の混液を準備して、図３と図４に示す週０にマウスに免疫した。抗Ｖα１４Ｊα２８１モノクローナル抗体のマウスへの投与は、ＤＮＰ−ＫＬＨの免疫後３週目まで継続した。マウスによって産生された抗ＫＬＨ抗体と抗ＤＮＰ抗体の量は、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００２６】
図３と図４から明らかなように、抗Ｖα１４モノクローナル抗体未投与の対照群のマウスにおいては、ＫＬＨとＤＮＰに対する抗体がよく産生された。Ｖα１４に対するモノクローナル抗体を投与したマウスにおいては、抗ＫＬＨ抗体および抗ＤＮＰ抗体のいずれの産生も抑制された。これらの結果は、抗Ｖα１４Ｊα２８１モノクローナル抗体が非特異的にＴｓを刺激し、その免疫抑制作用を促進していることを示している。
【００２７】
〔実施例４〕  ＩＤＤＭ動物モデルに対する治療効果
ＩＤＤＭ動物モデルはベンデラックらの方法（Bendelac et al.，J．Exp．Med.，vol．166，p.823，1987；Yasunami and Bach，Eur．J．Immunol.，vol．18，p.481，1988；Pankewycz et al.，vol．21，p.873，1991）に準じて準備した。すなわち、１２週齢のＮＯＤマウスに、サイクロフォスファマイドを４ｍｇの量で投与した。２〜３週後に５０％のマウスが尿糖試験陽性となった。これらマウスの脾臓からリンパ球を分離し、その３×１０7個を８００ラドで放射線照射した５週齢のＮＯＤマウスに静脈内注射した。リンパ球を移植されたマウスは、２〜３週後に高い割合で尿糖陽性となることが分った。
【００２８】
Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を投与するために、メスのマウスを８匹準備した。これらのマウスを２群に分け、そのうちの１群４匹は陰性対照群として何も投与せず、他の１群４匹にＶα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を投与した。投与は、１００μｇのＶα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白とアルミニウムゲルを混和し、リンパ球を移植したＮＯＤマウスの腹腔内へ行った。その後、週２回、Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白のみを５０μｇの量で腹腔内へ投与した。この投与を３週間半（合計７回）継続した。ＩＤＤＭの発症は、尿中のグルコース量を尿ブドウ糖試験紙法に従って調べることによって判定した。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白とアルミニウムゲルを混和して投与した実験において、Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白未投与マウス４匹のうちの３匹は、リンパ球移植後２週目に発症した。残りの１匹も２.５週目に発症した。これに対して、リンパ球を移植し、かつ、Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を投与した４匹は４週目まで未発症だった。Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白の投与を中止して１週間後、すなわち、リンパ球の移植後４.５週目に後者の群のマウスのうちの１匹が発症した。これらのマウスは７週目まで観察されたが、これ以上の変化は認められなかった。
【００３１】
また、アルミニウムゲルの影響を除くためＶα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白のみをＮＯＤマウスへ投与する実験を行った。即ち、１群３匹のマウスに５０μｇのＶα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を、他の１群３匹のマウスにはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。キメラ蛋白またはＰＢＳの投与は、リンパ球を移植した日に一回行った。
Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を、アルミニウムゲルと混和せずにマウスに投与した結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
判定は尿中のグルコース濃度を調べることでおこない、＋は２００ｍｇ／ｄｌ以上、−は２００ｍｇ／ｄｌ以下、±はその両者のほぼ中間の値の各々尿中グルコース濃度を示す。Ｖα１４Ｊα２８１Ｃγ３キメラ蛋白を投与したマウス３匹は、１２週間の観察期間中、全てが未発症だった。これに対してＰＢＳを投与した対照群のマウス３匹においては、この期間中に一匹では第２週目以降全期間にわたり、また２匹では一時的に発症がみられ、結局全例で軽〜重度の発症がみられた。
【００３４】
このようにして、ＫＬＨ特異的Ｔｓハイブリドーマから得た可溶性Ｖα１４Ｊα２８１が、ＴｓＦとして抗原非特異的にＮＯＤマウスの糖尿病発症を抑制することがわかった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によって例示されるサプレッサーＴ細胞レセプターのα鎖が、本来、このサプレッサーＴ細胞の特異的な抗原とは特異性の異なる広範な自己抗原に対する自己免疫疾患の予防治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＯＤマウスの脾臓リンパ球画分における、Ｔ細胞レセプターα鎖、Ｖα１４Ｊα２８１をコードするｍＲＮＡの発現の程度を週齢ごとに測定した結果を示す図。黒丸は、本発明のＶα１４Ｊα２８１Ｃαに対応するｍＲＮＡの変化、白丸および白四角は各々、対照群として使用したＶｘ１４Ｊα２８１ＣαおよびＶα１４Ｊｘ２８１Ｃαに対応するｍＲＮＡの変化を示す。
【図２】Ｔ細胞レセプターα鎖とイムノグロブリン定常領域とのキメラ蛋白質をコードする遺伝子の発現ベクタープラスミドの構築を示す図。
【図３】抗Ｖα１４モノクローナル抗体で前処置したマウスのＫＬＨ抗原に対する抗体産生の抑制を示す図。黒丸は、抗Ｖα１４モノクローナル抗体投与群、白丸は対照群を示す。
【図４】抗Ｖα１４モノクローナル抗体で前処置したマウスのＤＮＰ抗原に対する抗体産生の抑制を示す図。黒丸は、抗Ｖα１４モノクローナル抗体投与群、白丸は対照群を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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