(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモンおよび塩化亜鉛が、多孔性ヒドロキシアパタイトのカルシウム原子の一部を亜鉛に置換した、亜鉛含有多孔性ヒドロキシアパタイトに吸着されていることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤。
【請求項２】
亜鉛含有多孔性ヒドロキシアパタイトが含有する亜鉛の原子数は、多孔性ヒドロキシアパタイトのカルシウム１０原子に対して０．１〜２．０であることを特徴とする請求項１記載のヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤。
【請求項３】
亜鉛含有多孔性ヒドロキシアパタイト中のヒト成長ホルモン含有量が１０〜４０重量％であることを特徴とする請求項１記載のヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤。
【請求項４】
亜鉛含有ヒドロキシアパタイトの微粒子をヒト成長ホルモン含有の水中に撹拌・分散し、水溶液が亜鉛含有ヒドロキシアパタイト中に浸潤したのち塩化亜鉛を含む水溶液を添加し、塩化亜鉛を亜鉛含有ヒドロキシアパタイト中に浸潤させ、その後、凍結または真空乾燥させることによって製造されることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内で消失する多孔性アパタイト誘導体の微粒子を基剤とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水溶性薬物の長期間にわたる徐放性注射剤は、これまでポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）を基剤にしてその多くは検討されてきた（例えば、特許文献１，特許文献２，特許文献３参照）。又、ヒト成長ホルモン（hGH）を含有するPLGAを基剤とした徐放性マイクロカプセルが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。又、LHRHアゴニストであるリュープロレリンを含有するPLGAを基剤とした徐放性マイクロカプセルが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。PLGAは生体内で加水分解して消失する生体内消化性の基剤で注射剤の基剤としては好ましい性質を有している。しかし、一般的にPLGAを使用する徐放性製剤を製造する際には、それを溶解する有機溶剤を使用するが、hGHは、有機溶剤中で変性し、一部が失活する。このような活性の低下は、有効性を損なうのみならず、生体にもわるい影響をもたらす危険性がある。さらに、hGHは、水溶性が高く、PLGA製剤を用いると投与初期に過剰な放出をすることは避けられない。その他、ハイドロゲルなどの使用が報告されているが通常の注射投与は困難である。すなわち、ゲルが注入可能となる太い針を使用しなければならず、患者にとって好ましいものではない。また、ヒドロキシアパタイトと生物活性薬剤であるヒト成長ホルモンを用いた徐放性粒子についてすでに報告はある（例えば非特許文献３、非特許文献４参照）。しかし、いずれも２成分系であり、アパタイトの粒子径も40から80μm あるいは200μmと大きくそのため注射するのが困難であり、又、in vivoにおける徐放効果は不明である。又、アパタイト粒子に吸着したhGH量（封入量）も1% 以下と小さいものであった。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１１−２８６４０３（請求項１）
【特許文献２】
特開２０００−２３９１０４（請求項１）
【特許文献３】
特開２００２−３２６９６０（請求項１３，１５）
【非特許文献１】
Nature Medicine, 2: 795-799, 1996
【非特許文献２】
Chemical Pharmaceutical Bulletin, 36: 1095-1103, 1988
【非特許文献３】
H. Gautier et al: Journal of Biomedical Material Research, 40, 606-613, 1998
【非特許文献４】
J. Guicheux et al: Journal of Biomedical Material Research, 34, 165-170, 1997
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
hGHの徐放性製剤に関して、徐放性基剤には、投与後、薬物放出が終了する頃に生体内から消失するいわゆる生体内分解性あるいは生体内消失性の性質を有する素材を選定しなければならない。又、その製造に際しては、有機溶媒の使用を極力避けて徐放性製剤を調製し、hGHの変性を回避すると同時に投与初期に過剰の薬物が放出される初期バースト放出も小さいものでなければならない。又、微粒子製剤中の薬物封入量は10重量%以上とし、細い注射針でも容易に投与可能であり、薬物徐放期間は少なくとも３日間以上にわたる製剤を調製するものでなければならない。
【０００５】
本発明者らは、これらの問題を解決するために、多孔性アパタイト誘導体の微粒子を利用することによって、生体内分解性および徐放性能を併せもつ製剤が有機溶媒を使用することなしに得られることをみいだした。さらに、hGH及び水溶性２価金属化合物を併用することによって少なくとも３日間以上にわたりhGHが徐放されること、ならびに初期バースト放出が抑制されることをみいだした。さらに、hGH含有率も10% 以上とすることができ、最大20%のhGHを定量的に吸着含有させることができることを見いだした。また、得られた微粒子製剤は、分散性、通針性も良好で27Gの注射針を容易に通過することを見いだした。
【０００６】
そこで、本発明は、有機溶媒の使用を極力回避し生体内分解性および徐放性能を併せもち、３日間以上にわたりヒト成長ホルモンが徐放され、初期バースト放出が抑制され、ヒト成長ホルモン含有率も10% 以上とすることができ、最大20%のヒト成長ホルモンを定量的に吸着含有させることができ、かつ分散性、通針性も良好であるヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
ヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤は、
多孔性アパタイト誘導体と、その多孔性アパタイト誘導体に含有されるヒト成長ホルモンおよび水溶性多価金属化合物からなるものであり、水溶性多価金属化合物としては、塩化亜鉛、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、塩化鉄、水酸化鉄、塩化コバルト、塩化アルミニウム、酢酸亜鉛などがあげられるが、なかでも水溶性２価金属化合物が最も好ましい。水溶性２価金属化合物としては亜鉛化合物及びカルシウム化合物が好適であるが、塩化亜鉛が最も好ましい。その他酢酸亜鉛、塩化カルシウム等も好適である。
又、多孔性アパタイト誘導体がヒドロキシアパタイトの構成成分であるカルシウムの一部を製造時に亜鉛に置換または含有させた多孔性アパタイト誘導体であることが好適である。
又、多孔性アパタイト誘導体の亜鉛置換率が0.1〜2.0であることが好適である。
又、多孔性アパタイト誘導体中のヒト成長ホルモン含有量が10〜40％であることが好適である。
【０００８】
さらに、本発明のヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤の製造方法は、多孔性アパタイト誘導体の微粒子をヒト成長ホルモン含有の水中に撹拌・分散し、水溶液が該多孔性アパタイト誘導体中に浸潤した後、水溶性２価金属化合物を含む水溶液を添加し、水溶性２価金属化合物を該多孔性アパタイト誘導体中に浸潤させ、その後、安定剤などの添加物を加えて凍結または真空乾燥させることからなる。
【０００９】
ここで得られるhGHの徐放性微粒子製剤は、水にゆっくりと溶解する多孔性アパタイト誘導体（ヒドロキシアパタイトの構成成分であるカルシウムの一部を他の金属に置換した多孔性アパタイト誘導体、好ましくは亜鉛置換体）、hGHおよび水溶性２価金属化合物からなる該hGHの徐放性微粒子製剤である。さらに好ましくは、水に溶解する多孔性アパタイト誘導体のうちカルシウムの亜鉛置換または含有率が0.1〜2.0である上記の徐放性微粒子製剤で、このとき、水溶性２価金属化合物が亜鉛化合物である上記のhGHの徐放性微粒子製剤である。
【００１０】
上記のhGH徐放性微粒子製剤の基本的な製造方法は、多孔性アパタイト誘導体の微粒子をhGH含有の水中に分散し、十分に水溶液が該多孔性アパタイト誘導体中に浸潤したのち水溶性２価金属化合物を含む水溶液を添加し、水溶性２価金属化合物を十分に該多孔性アパタイト誘導体中に浸潤させる。その後、適当な安定剤などの添加物を加えて凍結または真空乾燥することによってhGHを含む多孔性アパタイト誘導体微粒子を基剤とする粉末の徐放性微粒子製剤を得る。実際に投与するときには、この粉末を適当な分散媒中に分散させて、皮下または筋肉内などに注射投与する。
【００１１】
このようにして得られた微粒子を室温で多量の精製水中に分散させることによって封入したhGHの脱離を測定すると、多孔性アパタイト誘導体類により異なるが、多孔性アパタイト誘導体類に対するhGHの量が一定量以下の場合にはhGHは脱離しなかった。すなわち、hGHは、多孔性アパタイト誘導体類の細孔内に浸潤して吸着しているものと考えられる。
【００１２】
ここで使用する多孔性アパタイト誘導体の微粒子は、既知の方法で得ることができる。たとえば、「山口喬・柳田博明編、牧島亮男・青木秀希著：セラミックスサイエンスシリーズ７バイオセラミックス.技報堂出版株式会社、7-9ページ,1984」に記載されている方法などが挙げられる。多孔性アパタイト誘導体としては、ヒドロキシアパタイトの組成としてCaの一部を亜鉛（Zn）で置換したものが最も好ましい。その置換率または含有率（ヒドロキシアパタイトのCa10原子に対する置換されたZnの原子数）は、0.1〜5.0が好ましく、0.5〜2.0がより好ましい。このとき、(Ca+Zn)/Pの比率によって生体内での消失速度が異なり、1.67よりも小さい方が水に溶けやすく、すなわち生体内で消失する速度が速くなる。(Ca+Zn)/Pの比が1.67〜1.51の範囲内であることが好ましい。また、ヒドロキシアパタイトを製造するときの処理温度は、低い方が水に溶けやすく、したがって生体内での消失速度も速くなる。処理温度は、室温〜800℃が用いられるが、150℃〜600℃が好ましい。さらには150℃〜400℃がより好ましい。800℃以上で焼成されると生体内で消失しなくなる。また、100℃以下で処理すると粒子同士が凝集しやすくなり、通常の注射投与が困難となる。微粒子の粒子径は、処理温度で制御できるが0.1μm〜１00μmの範囲で使用できる。このうち、0.1μm〜20μmが好ましい。さらには、0.2μm〜10μmがより好ましく利用できる。
【００１３】
hGHの多孔性アパタイト誘導体への吸着率はZn置換率または含有率の大きい誘導体の方がはるかに大きかった。これは亜鉛を置換または含有させることで、有意に比表面積・気孔率が高くなるためである。吸着率が大きいほど徐放性製剤の総投与量が少なくなり好ましい。好ましい吸着率は、hGHの徐放期間によって異なるが、一般的には、多孔性アパタイト誘導体の2〜30重量%である。このうち5〜25重量％が好ましく用いられる。さらには10重量%以上吸着するものがより好ましい。
【００１４】
多孔性アパタイト誘導体にhGHを吸着させた後、添加する水溶性２価金属化合物は、ZnまたはCa化合物が好ましい。なかでもZn化合物がもっとも好ましい。その使用量は、塩化亜鉛換算で多孔性アパタイト誘導体の10〜100重量%の範囲が好ましく、十分な徐放性を維持させるには、20〜70重量%が好ましい。使用される水溶性２価金属化合物は、塩化物、有機酸の塩が好んで用いられる。たとえば塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００１５】
最終的に得られた徐放性微粒子製剤の粒子径は、通常の投与に用いられる注射針を通過すればよい。実際には、注射針の径は細いほど患者に対する恐怖心も小さい。注射針の太さをあらわす国際基準で25G以下（数字が大きいほど細くなる）の太さの針を通過することが好ましい。さらには27G以下の太さの針を通過することがより好ましい。このため、徐放性微粒子製剤の粒子径は小さいほど好ましいが、極端に小さくすると薬物の保持量が少なくなり、かつ、初期バースト放出が大きくなる。したがって粒子径は、0.5μm〜20μmが好ましく、さらに0.5〜10μmがより好ましい。以上のようにして得られたhGHを含有する徐放性微粒子製剤の徐放期間は、HAP誘導体の焼成温度、２価金属化合物の使用量により制御でき、３日間以上にわたりhGH徐放が可能である。1週間以上にわたる徐放も可能で、実用的には1週間以上の徐放が好ましい。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を詳細に記載するがもちろんこの例に限定されるものではない。
（実施例1）
180℃で焼成した多孔性ヒドロキシアパタイト粒子(HAP)あるいは多孔性アパタイト誘導体（HAP-Zn-0.5： カルシウム9.5原子に対して亜鉛が0.5原子）50mgにPD-10カラム(Amersham Pharmacia)を用いて脱塩処理したヒト成長ホルモン（hGH）溶液（25mg/mL）をHAPに対しては200μL, HAP-Zn-0.5に対しては700μL添加し、タッチミキサーで1分間攪拌した。次に、水を最終液量が2.5mLとなるようにそれぞれ添加し、さらに1分間攪拌した。3分静置させた後、3,000 rpm， 3分間の遠心処理を行い、得られた沈殿に水2.5mLを添加し、1分間攪拌した。再度、3,000 rpm, 3分間の遠心処理を行い、得られた沈殿に10.2mg/mL塩化亜鉛（和光純薬, 大阪）水溶液0.333mL（塩化亜鉛25mmol）, 1mL(75mmol), 2mL(150mmol)を加え、タッチミキサーで攪拌した後、凍結乾燥して粉末状のサンプルを調製した。コントロールとして塩化亜鉛溶液のかわりに水を添加したサンプルも調製した。得られたサンプルの平均粒子径（体積換算）は、6〜8μmで、最大20μmであった。得られたHAP-hGHおよびHAP-Zn-0.5-hGHサンプル中のhGH含量は、micro BCA protein assay kit (Pierce)により定量した。さらに、得られたサンプルのin vitroにおける放出性を比較した。放出性の評価方法は、以下の通りである。得られたそれぞれのサンプルを5mg精秤し、これにPBS（生理的食塩リン酸緩衝液）を0.250mL添加し、37℃で攪拌した。3000rpm, 3min遠心処理によって経時的に上清を回収し、ゲル濾過HPLC分析(TOSO G2000SW-xl)により上清中に放出されたhGH量を定量し、サンプル中に含まれる総hGH量に対する割合を算出した。この結果を表1 に示す。コントロールとして作製したhGHのみをHAPに作用させたサンプルに対して、塩化亜鉛を添加したサンプルでは塩化亜鉛の添加量に応じて、PBS中へのhGHの放出が顕著に抑制された。
【００１７】
表１    hGHを吸着させた多孔性アパタイト類微粒子製剤のin vitroにおける放出性に及ぼす塩化亜鉛の効果
0003915001.tif 000002
【００１８】
(実施例2)
HAP中のカルシウムの一部を亜鉛に置換した3種類の多孔性アパタイト誘導体（HAP-Zn-0.1：カルシウム9.9原子に対して亜鉛が0.1原子； HAP-Zn-0.5：カルシウム9.5原子に対して亜鉛が0.5原子； HAP-Zn-1.0：カルシウム9.0原子に対して亜鉛が1.0原子）及びHAP（すべて180度焼成品）10mgに対して、PD-10カラムを用いて脱塩処理したhGH溶液（10mg/mL）をそれぞれ50μL、100μL、200μL、400μL添加し、タッチミキサーで1分間攪拌した。さらに、水を最終的に 500μLとなるように添加し1分間タッチミキサーで攪拌した。3分間静置させた後、3,000 rpm 3分間の遠心処理を行い、得られた沈殿中に含まれるhGH量を、micro BCA protein assay kit (Pierce)により定量し、各サンプル中のhGH量を比較した。この操作によって各サンプル中には多孔性アパタイト誘導体類中に吸着したhGHのみが検出されることになる。その結果を表2に示す。得られたサンプルの平均粒子径（体積換算）は、6〜8μmで、最大20μmであった。亜鉛を置換した多孔性アパタイト誘導体では、亜鉛を置換していないHAPと比較してhGHの吸着量が有意に増加し、また導入された亜鉛の割合が増加するにつれ、hGHの吸着量は大きく増大した。HAP-Zn-1.0を10mg用いたときhGH作用量が2mgまでは作用したhGH量の全てが吸着した。このときのhGH含有率は20％である。
【００１９】
表2    多孔性アパタイト誘導体類中に吸着したhGH量の比較
0003915001.tif 000003
【００２０】
(実施例3)
HAPまたはHAP-Zn-0.5, 50mgに対してhGH溶液（10mg/mL）をHAPに対しては0.5mL, HAP-Zn-0.5に対しては1.75mL添加し、タッチミキサーで1分間攪拌した。次に、水を最終液量が2.5mLとなるようにそれぞれ添加しさらに1分間タッチミキサーで攪拌した。3分間静置させた後、3,000 rpm， 3分間の遠心処理を行い、得られた沈殿に水2.5mLを添加し、再度1分間攪拌した。再度、3,000 rpm， 3分間の遠心処理を行い、得られた沈殿に10.2mg/mL塩化亜鉛（WAKO）水溶液をHAP-hGHには1mL (75mmol) 、HAP-Zn-hGHには2.25mL(188mmol)を加え、タッチミキサーで攪拌した後、凍結乾燥してサンプルを調製した（HAP-hGH -塩化亜鉛, HAP-Zn-hGH -塩化亜鉛と記す）。コントロールとして塩化亜鉛溶液のかわりに水を添加したサンプルも調製した（HAP-hGHあるいはHAP-Zn-hGHと記す）。得られたサンプルの平均粒子径（体積換算）は、コールターカウンターで測定したときいずれも6〜8μmであった。得られたHAP-hGHおよびHAP-Zn-hGHサンプル中のhGH含量は、micro BCA protein assay kit (Pierce)により定量した。HAP-hGH, HAP-hGH-塩化亜鉛, HAP-Zn-hGH-塩化亜鉛を0.5％CMC-Na, 5%mannitol, 0.1% Tween 80で懸濁し、雄性SD系ラットの背部皮下に10IU/kg (1IU: 0.35mg)で投与した。またhGHを同じ溶媒で溶解させたものもコントロールとして投与を行った。
まず、投与時の各製剤の分散性及び通針性を表3に示す。HAP-hGHでは分散性が悪く、27Gの注射針を通過しなかった。それに対し、HAP-Zn-hGHや塩化亜鉛を添加した製剤では、分散性、通針性は改善された。27Gの注射針の通過性は、とりわけHAP-Zn-hGH-塩化亜鉛が他の通過した2製剤に比べてより容易に通過した。
投与後、1,2,4,8時間後、以後1日毎に尾静脈より採血を行い、hGHの血中濃度をEテスト「TOSOH」  II (HGH)を用いて測定した（全自動EIA装置AIA-6000 （東ソー株式会社））。この結果を表４に示す。hGH溶液を投与した場合、hGHは速やかに血中から消失し、投与8時間後には血中にhGHは検出されなかった。また、HAP-hGHの場合、初期に高いバーストが認められた。これに対し、HAP-hGH-塩化亜鉛では、著しく初期のバーストが抑えられ、1週間にわたる徐放効果が認められた。さらに、HAP-Zn-hGH-塩化亜鉛ではhGH含量を高められるとともに、血中hGH濃度の持続性も高まることが確認された。また、投与20日目に皮下に残存する製剤を肉眼で観察したところほとんどが消失していることが認められた。
【００２１】
表3    hGHを含有する多孔性アパタイト類微粒子製剤の通針性および分散性の比較
0003915001.tif 000004
【００２２】
表4    多孔性アパタイト類微粒子製剤をラット皮下に投与後の血中hGH濃度推移
0003915001.tif 000005