(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
0003887109.tif 000011
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｒ3 はフェニルアルキル基、又は炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｒ4 は水素原子、フェニルアルキル基、又は炭素数１〜５のアルキル基を示す。）で表わされる化合物またはその塩を有効成分とする皮膚老化防止または改善剤。
【請求項２】
請求項１記載の一般式（１）で表わされる化合物またはその塩を有効成分とする発毛抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載の一般式（１）で表わされる化合物またはその塩を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚の老化防止、改善効果や発毛抑制効果等を有する皮膚外用剤、及びエラスターゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
皮膚老化の原因として、加齢、乾燥、酸化、太陽光（紫外線）等による影響が主な因子に挙げられている。皮膚老化は、皮膚真皮におけるコラーゲンやエラスチンの減少、ヒアルロン酸をはじめとするムコ多糖類の減少等により認知される。
【０００３】
しわ発生防止等については、例えば、コラーゲン配合化粧料では充分な効果は得られていない。又紫外線照射により生じた皮膚の老化については、未だに十分満足される紫外線吸収剤、紫外線防御剤含有化粧料が開発されていない。
【０００４】
またエラスターゼの過剰発現によってエラスチンが変性、破壊すると、皮膚の弾力性が低下し、しわ発生を促進すると考えられているが、エラスターゼ阻害剤１，１０−オルトフェナントロリンや、トウダイグサ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）科のフィランサス（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓｓ）属のメニラン（Ｐ．ｎｉｒｕｒｉ  Ｌ．）の抽出物（特開平９−８７１３６号公報）は、その効果は必ずしも十分でなかったり、抽出に長時間を要し安全性の面で問題を有していた。
【０００５】
美的外観から特に手足等における体毛の処理が行われており、例えば抜毛器等を用いる機械的除去方法、脱毛剤を用いた抜去方法等が利用されている。しかし、これらの除去方法は、皮膚に対して物理的又は化学的刺激を伴い、かつ体毛が再生するため、より好ましい体毛除去法が望まれている。
【０００６】
本発明は、しわの発生等の皮膚の老化防止又は改善効果や発毛抑制効果等を有する皮膚外用剤、及びエラスターゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次の一般式（１）
【０００８】
【化２】
0003887109.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は水素原子またはアルキル基を示し、Ｒ3 及びＲ4 は水素原子、アラルキル基、または置換基を有していてもよいアルキル基を示す。）で表わされる化合物またはその塩を有効成分とする皮膚外用剤を提供することにより上記目的を達成したものである。
本発明はまた、上記化合物またはその塩を有効成分とする皮膚老化防止または改善剤を提供するものである。
本発明はまた、上記化合物またはその塩を有効成分とする発毛抑制剤を提供するものである。
本発明はまた、上記化合物またはその塩を有効成分とするエラスターゼ阻害剤を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
一般式（１）中、Ｒ1 及びＲ2 は、水素原子及び炭素数１〜５のアルキル基が好ましく、水素原子、メチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基が特に好ましい。Ｒ1 とＲ2 は同一でも異なっていてもよい。Ｒ3 及びＲ4 は、水素原子、フェニルアルキル基（特にフェニルＣ1−Ｃ5アルキル基）、ナフチルアルキル基（特にナフチルＣ1−Ｃ5アルキル基）、またはヒドロキシル基、メチルチオ基、アミノ基もしくは３−インドリル基が置換していてもよい炭素数１〜５のアルキル基が好ましく、水素原子、ベンジル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−（メチルチオ）エチル基、４−アミノブチル基、３−インドリルメチル基が特に好ましい。Ｒ3 とＲ4 は同一でも異なっていてもよい。
【００１１】
一般式（１）で表わされる化合物（以下、「本化合物」という）の塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩、アミノ酸塩等が挙げられる。なお本化合物は光学活性を有していてもよく、立体配置はＲ、Ｓのいずれでも、またラセミ体でもよい。また本化合物は水和物の形態であってもよい。
【００１２】
本化合物の例として次の化合物が挙げられる。
【００１３】
【化３】
0003887109.tif 000003
【００１４】
本化合物は例えば、ジペプチド類にハロゲン化ぎ酸エステルをアミン等の塩基存在下で反応させることにより製造できる。
【００１５】
本化合物またはその塩の、本発明の皮膚外用剤、皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤またはエラスターゼ阻害剤中の配合量は、０．０００１〜４０重量％（以下、単に％で示す）が好ましく、０．０１〜２０％が特に好ましい。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤は、皮膚の老化で生じるしわ、たるみ、はりの減少等の改善、防止、または発毛抑制の目的で投与することが特に好ましい。本発明の皮膚老化防止・改善剤及び発毛抑制剤は皮膚外用剤、経口剤、注射剤等として投与できる。このうち皮膚外用剤が好ましい。
【００１７】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、エラスチンの変性、過剰生成等による種々の症状・疾患、例えば皮膚の弾力やはりの改善、むだ毛の抑制、炎症の改善、狼瘡や乾癬の治療、リュウマチ関節炎の治療、呼吸器系疾患（肺気腫、肺線維症、肺炎、気管支炎、気管支拡張症、喘息等）の改善、循環器系疾患（動脈硬化、動脈炎、心筋梗塞等）の治療、腎不全・肝不全の改善、歯周炎の改善、臓器移植拒絶反応の抑制等の目的で皮膚外用剤、経口剤、注射剤等として投与できる。
【００１８】
又、本発明の皮膚外用剤、皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤、及びエラスターゼ阻害剤には、上記有効成分以外に、その目的に応じて従来用いられる製剤成分を配合できる。
【００１９】
本発明の皮膚外用剤、皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤、及びエラスターゼ阻害剤は、常法により種々の形態にできるが、ローション状、乳液状、クリーム状、軟膏状、スティック状、有機溶媒や精製水等による溶液状、パック状、ゲル状等とするのが好ましい。また本発明の皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤は、上記形態の他、錠剤、顆粒剤、水剤、飲食物、水性注射剤、非水性注射剤、乳濁性または懸濁性注射剤等の形態とすることができる。
【００２０】
本発明の皮膚外用剤及びエラスターゼ阻害剤は、本化合物またはその塩、及びその他の添加物を常法により混合、攪拌等することにより得ることができる。
【００２１】
【実施例】
合成例１  化合物１の合成
Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル１．００ｇ（３．９mmol）及びトリエチルアミン０．７８ｇ（７．８mmol）をクロロホルム５０mlに溶解し、氷冷で５℃まで冷却した。そのままの温度でクロロぎ酸イソブチル０．５９ｇ（４．３mmol）を滴下し、滴下終了後、薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、８５％リン酸０．４９ｇ（４．３mmol）を加えて反応を終了した。有機層を蒸留水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。次いで溶媒を留去し残留物をカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒で溶出した。溶媒を留去して化合物１  ０．９１ｇ（収率６５％）を得た。
【００２２】
NMR(DMSO-d6)δ：0.83-0.90(m,18H), 1.01-1.93(m,7H), 3.61(s,3H),
3.73(d,2H,J=7Hz), 4.00-4.12(m,1H), 4.24-4.30(m,1H),
7.09(d,1H,J=8Hz), 8.12(d,1H,J=8Hz).
【００２３】
合成例２  化合物２の合成
Ｌ−イソロイシル−Ｌ−イソロイシン１．００ｇ（４．１mmol）及びトリエチルアミン０．８３ｇ（８．２mmol）をテトラヒドロフラン２０ml及び蒸留水１０mlの混合溶媒に溶解し、氷冷で５℃まで冷却した。そのままの温度でクロロぎ酸メチル０．４３ｇ（４．５mmol）を滴下し、滴下終了後、薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、８５％リン酸０．９８ｇ（８．２mmol）を加えて反応を終了した。
反応混合物からテトラヒドロフランを減圧留去した後、酢酸エチル１００mlを加えて抽出し、有機層を蒸留水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。溶媒を留去し、残留物をエタノール２０mlに溶解し、よく攪拌しながら水酸化カリウム０．４６ｇ（８．２mmol）を蒸留水２０mlに溶解したものを加え、７０℃で３時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、８５％リン酸０．８０ｇ（８２mmol）を加えて反応を終了した。酢酸エチル３００mlを加えて抽出し、有機層を蒸留水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。溶媒を留去し、残留物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンで再結晶し、白色結晶の化合物２を０．６０ｇ（収率５１％）得た。
【００２４】
NMR(DMSO-d6)δ：0.77-0.90(m,12H), 1.02-1.46(m,4H), 1.66-1.86(m,2H),
4.01-4.14(m,1H), 4.20-4.27(m,1H), 6.31(d,1H,J=9Hz),
6.41(d,1H,J=9Hz), 12.47(br.s,2H).
【００２５】
合成例３〜５
化合物３〜５を、表１に示すジペプチド及びクロロぎ酸エステルを用い、合成例１の方法に準じて合成した。
【００２６】
【表１】
0003887109.tif 000004
【００２７】
試験例１  ヘアレスマウスによるしわ形成抑制試験
ヘアレスマウス（ＨＲ／ＩＣＲ，実験開始時６週齢）の背部に、健康線用ランプ（東芝製，ＳＥ２０）で、１回の照射量が１ＭＥＤ以下となるように調節してＵＶ−Ｂ光の照射を行った。直後に化合物１〜５を表２に示す量含有する８０％エタノール溶液を１００μｌを塗布した（試験番号２〜６）。この作業を２０週間にわたって行った。また対照として本発明化合物を含有しない８０％エタノール溶液を同様に塗布した（試験番号１）。照射エネルギー量はＵＶ−Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（ＴＯＫＹＯＯＰＴＩＣＡＬ社製、ＵＶＲ−３０５／３６５Ｄ）を用いて測定した。試験終了後、形成されたしわの度数を肉眼により下記の基準（しわ指数）で評価した。結果を表２に示す。
◎しわ指数
０：しわが無形成
１：しわがかすかに形成
２：しわが微量形成
３：しわが若干形成
４：しわが強固に形成
【００２８】
【表２】
0003887109.tif 000005
【００２９】
化合物１〜５は顕著なしわ形成抑制作用を有し優れた皮膚老化防止・改善効果を示した。
【００３０】
試験例２  マウスによる発毛抑制試験
生後６週齢のＣ３Ｈマウス６匹の背部毛を、電気バリカン及び電気シェーバーを用い、皮膚を傷つけないように２×４cm2 にわたり剃毛した。剃毛部位に化合物１〜５を表３に示す量含有する８０％エタノール溶液を１日２回１００μｌづつ４週間にわたり塗布した（試験番号７〜１１）。対照として本発明化合物を含有しない８０％エタノール溶液を同様に塗布した（対照群）。３週間後、試験番号７〜１１及び対照群の剃毛部分を一定倍率で撮影し、画像解析装置を用いて再生毛を観察し、再生毛面積比（再生毛面積／剃毛面積）を求め、発毛抑制率（１−（各試験番号の再生毛面積比／対照群の再生毛面積比））×１００（％）を算出した。結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
0003887109.tif 000006
【００３２】
化合物１〜５は優れた発毛抑制効果を有していた。
【００３３】
試験例３  ラットによる皮膚弾力性維持試験
３週齢のＳＤ系雄性ラットの両足底を４群に分けた。第３，４群にはＵＶ−Ｂ光（１ＭＥＤ以下）を照射後、化合物２または４を表４に示す量含有する８０％エタノール溶液を１足当たり１０μｌ塗布した。この作業を、１日または２日おきに週３回、６週間にわたって行った（試験番号１４、１５）。第２群には本発明化合物を含有しない８０％エタノール溶液を同様に塗布した（試験番号１３）。第１群には何も塗布しなかった（試験番号１２）。皮膚の弾力性測定はキュートメーターＳＥＳ５７５（クレージュ・カザカ社製）を用い、５００mbで３秒間吸引後、開放し、その後３秒間の計６秒間の変位を測定した。測定は１足当たり５回行い、Ｕｅ値及びＵＦ値を求めた。
次いでラット足底をメルコックス（大日本インキ（株））にて還流固定し、ぎ酸消化を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により弾性繊維の直線性の解析を行った。解析はＳＥＭ写真の画像解析を用いたＩｍｏｋａｗａらの方法（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５，２５４−２５８（１９９５））によった。すなわち、各試料ごとに採取１０００倍のＳＥＭ写真からそれぞれ代表的な１０枚を抽出し、拡大コピーをした後、均等に１６分割した。各領域で任意の弾性繊維を一本抽出し、透明フィルム上に一定太さの線（８ピクセル幅）でトーレスした。この弾性繊維をトーレスした線の占める面積をＡ、トーレスが囲まれる最小面積の長方形の縦長をＢ、横長をＣとして、弾性繊維の直線性はＡ／（Ｂ×Ｃ）で表わされる。例えば、弾性繊維のトーレスが直線であれば直線性は１となる。結果を表４に示す。
【００３４】
【表４】
0003887109.tif 000007
【００３５】
化合物２または４はＵＶ−Ｂ光による皮膚の弾力性低下及びその原因となる弾性繊維の３次元構造の変性を強く予防する効果が認められ、皮膚のはりを保持することができる。
【００３６】
試験例４  培養ヒト繊維芽細胞のエラスターゼ活性抑制試験
大日本製薬社より市販されている正常ヒト繊維芽細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継代培養し、本試験に供した。ラバーポリスマンを用いてシャーレからはがした細胞を、生理食塩水に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集め、生理食塩水で３回洗浄した。細胞は、０．１％  Triton X-100/0.2M Tris-HCl buffer〔pH８．０〕に浮遊させ超音波破砕し、酵素液とした。
酵素活性測定の基質には１２５mM  Ｎ−Ｓｕｃ−（Ａｌａ）3−ｐ−ニトロアニリドを用いた。化合物１〜５を表５に示す値となるようにそれぞれ添加した酵素液１００μｌに該基質１μｌ添加して、３７℃で１時間反応させ、５μｌの酢酸を加えて反応を停止させた（試験番号１６〜２０）。生成したニトロアニリン量は分光光度計で４０５nmにおける吸光度を測定しエラスターゼ活性抑制率を測定した。結果を表５に示す。
【００３７】
【表５】
0003887109.tif 000008
【００３８】
化合物１〜５はエラスターゼ活性を顕著に阻害した。
【００３９】
実施例１
表６に示す配合で常法に従い、皮膚老化防止、改善用クリームを製造した。得られたクリームは優れた皮膚老化改善効果を示した。
【００４０】
【表６】
0003887109.tif 000009
【００４１】
実施例２
表７に示すＡに属する成分を溶解し、これとは別にＢに属する成分を溶解し、ＡにＢを添加して均一に攪拌混合し、発毛抑制ローションを得た。得られたローションは優れた発毛抑制効果を示した。
【００４２】
【表７】
0003887109.tif 000010
【００４３】
【発明の効果】
本発明の皮膚外用剤は特にしわ発生等の皮膚老化防止、改善や発毛抑制に優れた効果を発揮する。また、本発明の皮膚老化防止・改善剤は優れた皮膚老化防止・改善効果を、発毛抑制剤は優れた発毛抑制効果を、エラスターゼ阻害剤は優れたエラスターゼ阻害効果を発揮する。