(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学修飾された基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する固定化ＤＮＡライブラリー作製装置であって、
前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、
前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする固定化ＤＮＡライブラリー作製装置。
【請求項２】
化学修飾された基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する遺伝子増幅装置であって、
前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、
前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする遺伝子増幅装置。
【請求項３】
遺伝子を固定化した基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する遺伝子増幅装置であって、
前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、
前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする遺伝子増幅装置。
【請求項４】
前記基体が、ダイヤモンド、シリコン、ガラス、金属又はプラスチックである請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記反応器を複数個設置して反応器本体とした請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかに記載の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を、前記遺伝子増幅装置から連続的に受けて、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施することにより遺伝子の解析をすることを特徴とする遺伝子増幅産物解析装置。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれかに記載の遺伝子増幅装置と、請求項８記載の遺伝子増幅産物解析装置と、これらの装置を制御するコンピュータ制御部と、を有する遺伝子診断装置。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれかに記載の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液し、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施し、その解析データをコンピュータに集積することを特徴とする、遺伝子診断装置。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の装置を制御する方法であって、第１温度測定部からの信号をコンピュータ制御部に入力し、コンピュータ制御部が、予め入力された値と比較して第２温度制御部と第３温度制御部とを駆動させることを特徴とする、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置又は遺伝子診断装置の制御方法。
【請求項１０】
請求項２〜５のいずれかに記載の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液し、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施する方法。
【請求項１１】
請求項２〜５のいずれかに記載の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液し、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施し、その解析データをコンピュータに集積する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学、蛋白質工学、細胞工学、免疫学等の分子生物学関連分野や生化学関連分野において、微量の試料溶液で加熱を伴う各種反応に使用する自動的反応装置及び自動的反応解析方法に関する。より詳しくは、固定化ＤＮＡライブラリー作製、遺伝子増幅、遺伝子解析、遺伝子診断等の一連の操作を完全自動化した装置及びそれらの装置の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子の変異・欠損等の遺伝子研究・遺伝子診断においては、ＤＮＡライブラリーの作製、ＤＮＡライブラリーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）による遺伝子増幅及び遺伝子増幅産物の解析の３種類の操作が別個に行われていた。
従って、これらの個々の操作に対しては、各段階毎に目的ＤＮＡの抽出・精製過程が含まれていて、多大な時間を要するという問題点がある。また、固定化ＤＮＡライブラリー作製に用いた反応器から反応溶液を完全に除去しないと、引き続き行われるＰＣＲの効率に多大な影響をもたらす。
【発明が解決使用とする課題】
【０００３】
本発明は、上記問題点に鑑み、一連の操作が簡単で自動的に実施することができる固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置及び遺伝子診断装置を提供することを技術的課題とする。
また、これらの装置を機能的に連結するシステムを提供することを課題とする。さらに、フローセル型方法によって固定化ＤＮＡライブラリー作製後の試料精製過程を簡便で確実に実施できることを技術的課題とする。そして、ＰＣＲによる遺伝子増幅産物の解析をＰＣＲ直後に連続的に、しかもデータ解析も含めて自動的に行える装置を提供することを課題とする。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置は、化学修飾された基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する固定化ＤＮＡライブラリー作製装置であって、前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする。
本発明の遺伝子増幅装置は、
化学修飾された基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する遺伝子増幅装置であって、
前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、
前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする。
本発明の遺伝子増幅装置は、
遺伝子を固定化した基体で形成された反応器と、前記反応器の温度を制御する加熱・冷却手段と、前記加熱・冷却手段を制御する第１温度制御部と、前記反応器へ試料溶液を送液する試料送液部と、を有する遺伝子増幅装置であって、
前記反応器は上下蓋なしの筒状に形成したフローセルホルダーの側壁に窓を開けて該窓に前記基体を固定・取外し可能に設置したものであり、
前記基体は、その表面に、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基又はアミノ基で化学修飾されたものであることを特徴とする。
上記固定化ＤＮＡライブラリー作製装置や遺伝子増幅装置においては、前記基体が、ダイヤモンド、シリコン、ガラス、金属又はプラスチックであることが望ましい。
また、前記反応器を複数個設置して反応器本体としたものであることが望ましい。
本発明の遺伝子増幅産物解析装置は、上記の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を、前記遺伝子増幅装置から連続的に受けて、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施することにより遺伝子の解析をすることを特徴とする。
本発明の遺伝子診断装置は、上記の遺伝子増幅装置と、遺伝子増幅産物解析装置と、これらの装置を制御するコンピュータ制御部と、を有することを特徴とする。
本発明の遺伝子診断装置は、上記の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液し、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施し、その解析データをコンピュータに集積することを特徴とする。
本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置又は遺伝子診断装置の制御方法は、上記の装置を制御する方法であって、第１温度測定部からの信号をコンピュータ制御部に入力し、コンピュータ制御部が、予め入力された値と比較して第２温度制御部と第３温度制御部とを駆動させることを特徴とする。
本発明の遺伝子増幅産物の電気泳動を実施する方法は、上記の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液することを特徴とする。
本発明の解析データをコンピュータに集積する方法は、上記の装置によって増幅された遺伝子増幅産物を遺伝子増幅産物解析装置に送液し、遺伝子増幅産物の電気泳動を実施することを特徴とする。
【０００５】
本発明の自動化された固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置及び遺伝子診断装置を、図面を用いて説明する。
図１に本発明で用いる反応器（フローセル）の概略図を示す。反応器は、本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置などで用いるフローセルを構成する。
図２は、フローセルホルダーの概略図である。図３は、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置の反応器本体の分解概略図である。下記に示すいくつかの実施例では、フローセルホルダーにダイヤモンド基体等を設置して、その基体を加熱・冷却手段のペルチェ素子等で固定して、さらに反応器の上下部に試料溶液の出入口を設置する場合を説明する。
図４は、本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置及び遺伝子診断装置の送液制御システムを示す概略図である。この送液制御システムは、固定化ＤＮＡライブラリー作製用の試料溶液、ＤＮＡ固定化後のセル洗浄溶液、遺伝子増幅用の試料溶液、遺伝子増幅産物溶液など、あるいは、各装置間で自動的に試料溶液を送液するための自動制御システムである。
図５は、遺伝子増幅産物を解析するための遺伝子増幅産物解析装置の主要部を示す概略図である。図６は、試料送液部、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置などを機能的に連結した遺伝子診断装置の概略図である。
図７は、図６に示す装置の自動制御システムを示す概略図である。この自動制御システムは、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置と、それらの装置の温度を制御するシステムと、それらの装置への試料溶液の送液を制御するシステムと、遺伝子増幅産物解析装置への試料溶液の送液を制御するシステムなどからなる。
【０００６】
なお、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置に用いる反応器を設置するフローセルホルダーは、いわゆる取付け・取外しが容易なカセット型にすることも出来る。
また、ダイヤモンド基体等で構成された２個の反応器（フローセル）を１個のフローセルホルダー内に設置して、そのフローセルホルダー５個を一組にして、さらにその一組のフローセルホルダーを、６個のペルチェ素子等で挟み固定する構成とすることも出来る（図７参照）。
図３、図６或いは図７において、１０は固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置の反応器本体である。反応器本体１０において反応器９を構成する基体１１は、熱伝導性の良い基体、例えばダイヤモンド基体、或いはアルミニウムやステンレススチール等の金属基体を使用することが好ましい。また、シリコンやガラス、セラミックスなども使用できる。さらに、ポリカーボネートやフッ素樹脂等のプラスチック基体等の単一種類のもの、これらを組み合わせたもので形成されたものも使用することができる。また、基体１１の表面に特定の基を付加（化学修飾）させたものを用いることが好ましい。この化学修飾によって、ＤＮＡが基体の表面に固定化されやすくなる。基体表面に付加（化学修飾）され、末端に極性基を有する特定の基としては、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基、アミノ基などの基が該当する。また、この他、有機カルボン酸も含まれる。
【０００７】
反応器９の形状は、円筒状、多角形筒状のものなどが好適である。また、基体１１は、片状（板状）のものが好適である。フローセルホルダー１２は、化学的に安定な、例えばテフロン樹脂、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂等の高分子材料で形成されることが望ましい。図３に示すように、反応器本体１０内には、２個の反応器９を保持固定するフローセルホルダーを２個以上複数個設置するとライブラリー作製又は遺伝子増幅効率を高めることが出来る。
また、反応器９は、基体１１の側壁を分解型にしておくことも好ましく、例えば図１に示すように、反応器９を四角柱状の上下蓋なしの筒状に形成し、側壁を４枚の片状基体１１に分解できる構造とすることができる。この基体１１の大きさや形状は、例えば一辺が１０ｍｍ程度で厚みが０．１ｍｍ程度のものとすることが好ましい。
【０００８】
そしてこの基体１１を、例えば、合成樹脂製のフローセルホルダー１２の側壁に開けられた窓１２０を塞ぐように、前後・左右の側壁（４枚の片状基体）の一部を構成するように設置して、反応器９とすることができる。図２においては、基体１１が左右の側壁に設置する場合を示すが、前後の側壁にも設置する。そして、基体１１の後部から基体１１に接するように加熱・冷却手段１３を設置する。さらにフローセルホルダー１２の上下Ｍ，Ｎ方向に試料溶液が流通可能な構成となっており、フローセルホルダー１２内に設置された基体１１は、試料溶液と接触することが出来る。この場合、反応器の側壁の少なくとも１枚は基体１１上に遺伝子を固定化できるもの（未だ遺伝子を固定化していないもの）、或いは遺伝子を固定化したもの、のどちらかを用いることが望ましい。基体１１に遺伝子を固定化していないものを用いる場合においては、反応器は固定化ＤＮＡライブラリー作製装置の反応器として作用し、基体１１に遺伝子を固定化したものを用いる場合においては、反応器は遺伝子増幅装置の反応器として作用する。
【０００９】
さらに、反応器本体内に複数の反応器を設置して作業の効率化を図ることも出来る。図７には反応器を１０個設置した例を示す。また、複数個の反応器を並列的に連結収納した反応器本体を、ワンタッチで取付け・取外しができるカセット型にして、操作の効率化を図ることもできる。このカセット型の具体的な態様については後述の固定化ＤＮＡライブラリーの部分で詳述する。
【００１０】
図３は、本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置及び遺伝子増幅装置の反応器本体の組立部品を系統的に配列した分解概略図である。図３において、フローセルホルダー１２の上下方向中央部に位置する基体挿入部８に、四角柱状の上下蓋なしの筒状形状の反応器９が形成されるように４枚の基体１１を設置する。そして、基体１１の後部から、加熱・冷却手段１３（例えばペルチェ素子等）を接触させて押さえつけ固定する。この加熱・冷却手段１３は基体１１の加熱・冷却を直接行う。なお、基体１１は、フローセルホルダー１２に容易に固定・取外し出来る構成とすることが望ましい。そして、反応器本体１０の上下部には試料溶液をフローセルへ出入させるための出入口７が設けられており、オーリング１４と試料溶液のフローセルへの出入口固定用ネジ型コック１５を用いて、テフロン製送液用キャピラリーチューブ１６を反応器本体１０に固定する。
【００１１】
加熱・冷却手段１３は、反応器９を形成する基体１１の背中部に直接接触し、反応器９を加熱・冷却する手段であり、ペルチェ素子、電熱ヒータ、赤外線ランプ等を用いることが好ましい。この加熱・冷却手段１３は、反応器９と直接的に接触させて設置することによって反応器９の温度を直接的に制御できるので、従来の遺伝子増幅装置よりも温度制御精度が極端に良くなる。この加熱・冷却手段１３は、ペルチェ素子用の第２温度制御部６２によって温度制御され（図７参照）、第２温度制御部６２は、予め入力されたプログラムを記憶させたコンピュータ制御部６０によりコントロールされる。
【００１２】
図７は、反応器本体の概略を示す平面図である。図７において、反応器本体１０内に反応器（１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９）を１０個設置して、固定化ＤＮＡライブラリー作製装置又は遺伝子増幅装置として使用する例を示す。
【００１３】
反応器本体１０内に設置された反応器（１００〜１０９）の温度制御は、反応器に接して設けられた温度センサー１１０（例えばサーミスタなど）を介して、第１温度測定部６１と、加熱・冷却手段１３を駆動させる第２温度制御部６２と、反応器本体１０の冷却をする冷却手段（例えば冷却水等を通過させる冷却用空洞を設けるなど）の温度等を制御する第３温度制御部６３とによって行われる。すなわち、反応器９の側部に接して設けられた温度センサー１１０を介して第１温度測定部６１からの信号がコンピュータ制御部６０に入力されると、コンピュータ制御部６０は、予め入力されているプログラムチャート（昇温温度、昇温時間、保持時間、降温温度、降温時間等）と比較し、加熱・冷却手段１３を駆動させる第２温度制御部６２と、反応器本体１０の冷却をするように、第３温度制御部６３とを駆動させる。
【００１４】
温度センサー１１０は、図７ではＳ８に設置してあるが、代表的な反応器１個にのみ温度センサーを設置し、この情報に基づき反応器本体１０全体の温度制御を行うことができる。また、温度センサーを複数の反応器に設置して、反応器ごとの情報をコンピュータ制御部６０に入力して演算処理して反応器本体１０全体の温度制御を行うこともできる。
さらに、図７に示すように、２個の反応器を１セットにして、この左右両側に加熱・冷却手段１３を設置し、この加熱・冷却手段１３で１セットの反応器を挟むようにすることもできる。そして、加熱・冷却手段１３のそれぞれに、第２温度制御部６２から反応器の温度を制御する情報を入力する。
【００１５】
反応器本体１０を冷却するために冷却用空洞を用いる場合の冷却手段は、この空洞に冷却水や冷風を流通させるパイプや冷却ファンを設置したユニットなどが好適に採用される。そして第３温度制御部６３からの指示でこのユニットなどを駆動させて反応器９を急速に冷却することができる。また、この場合の冷却手段は、加熱・冷却手段１３の側面にも直接接していて、加熱・冷却手段１３の冷却効果を促進することもできる。
【００１６】
次に、図４，図６及び図７を用いて、本発明の遺伝子診断装置への送液制御システムについて説明する。図４に示す送液制御システムは、次のような送液制御を行う。
（１）固定化ＤＮＡライブラリーを作製するため試料溶液チューブ２３から反応器本体１０へ送液すること、
（２）固定化ＤＮＡライブラリーを作製した後の溶液を、反応器本体１０からポリエチレン製キャピラリーチューブ３４を通して廃液するために送液すること。
（３）作製された固定化ＤＮＡライブラリーを精製するために洗浄液を反応器本体１０へ送液すること、
（４）ＤＮＡライブラリーを固定化した反応器９へＰＣＲ用反応溶液を送液すること、ＰＣＲ後に遺伝子増幅産物溶液を遺伝子増幅産物溶液用チューブ３０へ送液すること、
（５）遺伝子増幅産物溶液チューブ３０中に予め添加してあったローデイング緩衝液（電気泳動用のマーカーを含む緩衝液）と遺伝子増幅産物溶液との混合のために窒素ガスの吹き込みをすること、
（６）混合後の遺伝子増幅産物溶液をキャピラリー型電気泳動部５０の試料注入口へ送液すること、等の送液切換制御及び／又は流路切換制御を行う。
【００１７】
これらの制御は、予めプログラムされたコンピュータ制御部６０からの指令により、送液・流路切換制御部６４を介して電磁バルブ４０及び切換バルブ（４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８）を駆動させることによって行う。すなわち、図４に示した概略図の左下側部分について説明する。
まず、挿入ブロック本体２１のチューブ挿入穴２２，２４に、ＤＮＡライブラリー用の試料溶液の入ったチューブ２３及びＤＮＡライブラリー用の洗浄溶液の入ったチューブ２５をそれぞれ挿入する。そして、挿入ブロック本体２１の上に、シリコンラバー３１及び挿入ブロック本体２１を密封するための密封用蓋３２を被せる。そして、このシリコンラバー３１及び密封用蓋３２の一部に設けられた挿入孔３００を通して溶液吸排用のエッペン型チップ３３，３３を、それぞれＤＮＡライブラリー用の試料溶液チューブ２３及びＤＮＡライブラリー用の洗浄溶液チューブ２５内に浸漬固定する。
そして、ホース３６の一端を挿入ブロック本体２１の上部に接続し、チューブ２３又はチューブ２５の上面をガス圧によって加圧し、溶液がエッペン型チップ３３内に導入される構成となっている。また、ホース３６の他端をガス用二方切換バルブ４３に接続し、さらにガス用二方切換バルブ４２，４１を間に挿入し窒素ガス供給用電磁バルブ４０に接続する。
【００１８】
次に、挿入ブロック本体２１の上部側を説明する。
２本の溶液の吸排用のエッペン型チップ３３，３３を、テフロン製などのエッペン型チップホルダー３５，３５にそれぞれ固定した後に、溶液用二方切換バルブ４４に接続する。さらに、溶液用二方切換バルブ４４を、ホース３４を介して溶液用二方切換バルブ４５、送液用キャピラリーチューブ１６に接続し、フローセル型の固定化ＤＮＡライブラリー作製用の反応器本体１０に接続する。
【００１９】
次に、反応器本体１０を遺伝子増幅装置として用いる場合の送液制御システムについて説明する。すなわち、図４の右下側を説明すると、挿入ブロック本体２６のチューブ挿入穴２７，２９に、ＰＣＲ用の反応溶液チューブ２８及び遺伝子増幅産物用溶液チューブ３０をそれぞれ挿入する。そして、挿入ブロック本体２６の上に、シリコンラバー３１及び密封用蓋３２をを被せる。そして、このシリコンラバー３１及び密封用蓋３２の一部に設けられた挿入孔３００を通して溶液吸排用のエッペン型チップ３３，３３を、それぞれチューブ２８及びチューブ３０内に浸漬固定する。そして、ホース３６の一端を挿入ブロック本体２６の上部に接続し、チューブ２８又はチューブ３０の上面をガス圧によって加圧し、溶液がエッペン型チップ３３内に導入される構成となっている。また、ホース３６の他端をガス用二方切換バルブ４２，４８に接続し、さらにガス用二方切換バルブ４１を間に挿入し窒素ガス供給用電磁バルブ４０に接続する。
【００２０】
次に、挿入ブロック本体２６の上部側を説明する。２本の溶液の吸排用のエッペン型チップ３３，３３を、テフロン製などのエッペン型チップホルダー３５，３５にそれぞれ固定した後に、溶液用二方切換バルブ４４に接続する。さらに、溶液用二方切換バルブ４４を、ホース３４を介して溶液用二方切換バルブ４５、送液用キャピラリーチューブ１６に接続し、フローセル型の固定化ＤＮＡライブラリー作製用の反応器本体１０に接続する。また、ＰＣＲ用の反応溶液チューブ２８の側は溶液用二方切換バルブ４５に接続し、遺伝子増幅産物溶液チューブ３０の側は溶液用二方切換バルブ４７に接続する。そして、ＰＣＲ用の反応溶液のチューブ２８側は、溶液用二方切換バルブ４５を介してフローセル型の反応器本体１０に接続している。
【００２１】
フローセル型の固定化ＤＮＡライブラリー及び遺伝子増幅部を兼ねる反応器本体１０に溶液用二方切換バルブ４６を接続することによって、廃液したい時にはバルブを１の方向に切り換えることにより、排出口４００より排出することができ、遺伝子増幅産物を保存したい時には二方切換バルブ４６を２の方向に切り換え、溶液用二方切換バルブ４７を介して電気泳動用ローディング緩衝液の入っている遺伝子増幅産物溶液チューブ３０に送液できるように接続する。
【００２２】
次に、図５、図７を用いて本発明の遺伝子増幅産物解析装置を説明する。本発明の遺伝子増幅産物解析装置を用いての遺伝子解析は、遺伝子増幅産物溶液をキャピラリー型電気泳動部５０の試料注入口（誘導用キャピラリー）５６を通してＤＮＡ分析用キャピラリーカラム５１のゲル界面に注入した後に、コンピュータ制御部６０からの信号に基づき電気泳動制御部６５の高圧電源５８のスイッチを作動させて、キャピラリー型電気泳動部５０の駆動と同時に分光型ＤＮＡ検出器５５も駆動させる。さらに、分光型ＤＮＡ検出器５５の駆動開始に伴って、コンピュータ制御部６０は、分光型ＤＮＡ検出器５５からの分光学的データを電気泳動データ測定部６６を通して集積・解析して、各試料解析に対応したリアルタイムな電気泳動パターンをコンピュータ制御部６０のディスプレイ上に表示し、さらにそれらの電気泳動パターン・データを記憶する。
【実施例】
【００２３】
本発明の実施例を図面を用いてさらに詳細に説明する。実施例において、固定化ＤＮＡライブラリー作製、遺伝子増幅、遺伝子増幅産物を解析する各操作において、送液・流路切換の自動制御に関わる電磁バルブ・切換バルブの作動状況との関連性を、図６、図７及び図８を用いてさらに詳細に説明する。
反応器として１０ｍｍ四方（厚さ約０．１ｍｍ）のダイヤモンドチップ１１をダイヤモンド基体として用い、図２に示すようにフローセルホルダー１２の側壁に４枚使用した。すなわち図の手前側１枚、向こう側１枚、左右側壁側２枚である。反応器として使用したダイヤモンドチップ１１にはすでに有機カルボン酸で化学修飾済みのものを用いた。フローセル型の反応器本体１０の上下の出入口に、テフロン製送液用キャピラリーチューブ１６をオーリング１４と固定用ネジコック１５とで固定し、液漏れのない固定化ＤＮＡライブラリー作製装置を組み立てた。この固定化ＤＮＡライブラリー作製装置は、遺伝子増幅装置をも兼ねること示できる。
【００２４】
（固定化ＤＮＡライブラリー作製装置）
まず、反応器が１個の場合の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置の操作概要について、図６を用いて説明する。固定化ＤＮＡライブラリーの作製操作において、電磁バルブ４０と二方切換バルブ（４１〜４８）とで構成される送液制御システムの一連のバルブ操作作動状況を図８に示す。
すなわち、図８には、電磁バルブ４０の作動状況（ＯＮかＯＦＦか）及び二方切換バルブ（４１〜４８）の作動状況の方向性を示す（１の方向か、２の方向か）。符号「不」は、二方切換バルブを「不使用」であることを示す。なお、このときのダイヤモンドチップ１１には、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ）に対してはオリゴ−ｄＴ１６−２０が、化学的なペプチド結合によって固定化されているものを使用した。
一方、ｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ：染色体ＤＮＡ）に対しては、目的の制限酵素部位をすでに形成させている二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の部分が化学的なペプチド結合によって固定化されているものを使用した。
【００２５】
次に、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを作成するために、必要な試薬溶液と、全ＲＮＡ試料を含む試料溶液チューブ２３からの反応溶液とを、加熱・冷却手段１３によって室温以下の所定温度に設定されている反応器本体に、送液制御システムの駆動によって誘導し、固定化されているオリゴ−ｄＴ１６−２０とｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを行った。その後、加熱・冷却手段１３によってダイヤモンドチップ１１を３７〜６０℃の範囲内での適当な一定温度に固定し、逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡ合成を行った。このときのｃＤＮＡは、固定化オリゴ−ｄＴ１６−２０の３’方向へ延長反応したところの固定化した状態である。従って、引き続き反応器９を加熱・冷却手段１３によって８０〜９０℃に昇温させ、ハイブリダイゼーションしているｍＲＮＡをｃＤＮＡから解離させた状態で、送液制御システムを駆動させて洗浄溶液チューブ２５からの洗浄用アルコール溶液（７０％）を反応器本体１０内に通過させてｍＲＮＡとその他の残った反応試薬を洗い流した。さらに、反応器本体１０内に窒素ガスを所定時間送り続けて、作製した固定化ｃＤＮＡライブラリーの完全な洗浄・乾燥を完了した。その後、反応器９の温度を、引き続いて行われるＰＣＲのために要求される温度に設定した。
【００２６】
次に、ｇＤＮＡでの固定化ｇＤＮＡライブラリー作製について説明する。まず、目的の制限酵素での切断によって断片化されたｇＤＮＡとライゲースを含むライゲーションに必要な試薬とを混合した試料溶液を、試料溶液チューブ２３から送液制御システムの駆動によって、室温以下の所定温度に設定されている反応器本体１０に誘導した。その後、加熱・冷却手段１３によって反応器９の温度を３７℃にまで昇温させて、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、反応器９の温度を３７℃に保った状態で、送液制御システムを駆動させて洗浄溶液チューブ２５から洗浄用アルコール溶液（７０％）を反応器本体１０内を通過させて、未反応のｇＤＮＡと残った反応試薬とを洗い流し、さらに窒素ガスを所定時間送り続けて、固定化ｇＤＮＡライブラリーの完全な洗浄・乾燥を完了した。その後、反応器９の温度を、引き続いて行われるＰＣＲのために要求される温度に設定した。
【００２７】
（遺伝子増幅装置）
上記のようにして作製された、固定化ｃＤＮＡライブラリー或いは固定化ｇＤＮＡライブラリーを用いて、引き続き遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行った。この遺伝子増幅装置への送液は、図８に示すように電磁バルブ４０及び二方切換バルブ（４１〜４８）の作動状況を変動させることによって送液制御システムを駆動させて行った。ＰＣＲを開始するために要求される温度にまで加熱・冷却手段１３によって昇温させた反応器９に、ＰＣＲに必要なＤＮＡポリメラーゼ、目的プライマー・セット、４種のヌクレオチド等を含むＰＣＲ試薬溶液を試料溶液チューブ２８から送り込み、加圧条件下で二本鎖のＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる熱変性温度（９５℃で１．５分）、一本鎖ＤＮＡとＤＮＡプライマーとをハイブリダイズさせるアニーリング温度（４５℃で１分）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長反応を行わせるＤＮＡ増幅温度（７４℃で２分）に、それぞれ順に温度制御し、これらの温度変化を３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
上記のようにして増幅した、固定化ｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子増幅産物或いは固定化ｇＤＮＡライブラリーからの遺伝子増幅産物を、図８に示すように電磁バルブ４０及び二方切換バルブ（４１〜４８）の作動状況の変動によって送液制御システムを駆動させて、次段階操作のために送液した。
【００２８】
（遺伝子増幅産物解析装置）
次に、ＰＣＲによって得られた遺伝子増幅産物を、電気泳動用のローディング緩衝液を予め加えていた遺伝子増幅産物溶液チューブ３０に送り込んだ。その後も所定時間、溶液チューブ３０に窒素ガスを供給して、遺伝子増幅産物とローディング緩衝液との完全な混合を行った。そして、遺伝子増幅産物とローディング緩衝液との混合溶液の一部を、キャピラリー型電気泳動部５０に誘導し、遺伝子増幅産物の解析を行った。
図５は本発明の遺伝子増幅産物解析装置の主要部であるキャピラリー型電気泳動部５０を示す概略図である。遺伝子増幅産物解析装置は、キャピラリー型電気泳動部５０と、ＤＮＡ検出器５５と、これらのキャピラリー型電気泳動部５０及び分光型ＤＮＡ検出器５５とを制御する電気泳動制御部６５と、電気泳動データ測定部６６とを有する。ローデイング緩衝液と混合された遺伝子増幅産物の一部は、適量な窒素ガス圧によって溶液用二方切換バルブ４７（図４或いは図６参照）のもう一方の出口よりポリスチレン製キャピラリーチューブ３４を通じて、遺伝子増幅産物解析用キャピラリー型電気泳動部５０の入口である遺伝子増幅産物の誘導用キャピラリー５６に導入される。
図５に示すキャピラリー型電気泳動部５０は、一つの試料液（Ｓ０）に接続させた実施例を示しているが、電気泳動部５０は多数の試料液に接続させることが出来る。本発明のキャピラリー型電気泳動部５０は、複数個の試料の固定化ＤＮＡライブラリー作製および遺伝子増幅産物を同時に得ることによって、それらの電気泳動も同時に行えるようになっている。例えば、図５及び図６では、Ｓ０からＳ９までの１０個の試料が一度に処理できるものを示しているが、実際には必要に応じて何十種類の試料にも適応できる形のものが可能である。１０個の試料を一度に処理する場合には、図４に示す固定化ＤＮＡライブラリー作製装置および遺伝子増幅装置を１０個電気泳動部５０に接続する必要がある。
【００２９】
次に、図５を用いて電気泳動部５０を詳しく説明する。誘導用キャピラリー固定カセット５７で固定された誘導用キャピラリー５６の先端は、電気泳動用緩衝液が満たされている上部（一極側）緩衝液タンク５２中のＤＮＡ分析用キャピラリーカラム５１の上部入口に接続し、遺伝子増幅産物溶液を静かにゆっくりとカラム上層部に重層した後に、静かに取り除く。上部（−極側）緩衝液タンク５２と同様に、電気泳動用緩衝液が満たされた下部（＋極側）緩衝液タンク５３の両タンクの底部には電極用白金線５４が固定されていて、それらの白金線５４はキャピラリー型電気泳動用の高圧電源５８に接続されている。高圧電源５８のスイッチ投入後、−極側から＋極側へと泳動する各試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ分析用キャピラリーカラム５１の先端近くに設置されている分光型ＤＮＡ検出器５５にて、その分析地点での通過時間を測定することによって遺伝子増幅産物の増幅長および増幅量をコンピュータ解析する。
【００３０】
分光型ＤＮＡ検出器５５は、レザー光源、ハロゲン光源、キセノン光源等からの光ファイバーを通して誘導される照射光がＤＮＡ試料あるいはＤＮＡ試料と特異的に結合している蛍光色素によって吸収された量、あるいは照射光によって誘導された蛍光量を、同じく光ファイバーを通してフォトダイオードで測定できるシステムを採用している。それらの一連の操作も図７の電気泳動制御部６５と電気泳動データ測定部６６を通してコンピュータ制御部６０でコントロールする。
【００３１】
次に、図７を用いて反応器を反応器本体に複数個設けた例を示す。たとえば、１０個の反応器（１００〜１０９）を反応器本体１０内に設けた例での一連の操作例を示す。反応器９を複数個設置する場合は、次の箇所に切換バルブを増設すればよい。すなわち、前述した二方切換バルブ４８（図６参照）の白丸口と、挿入ブロック本体２６との間に切換バルブを１カ所設け、二方切換バルブ４２と、挿入ブロック本体２６との間にさらに１カ所設け、そして、二方切換バルブ４２と、挿入ブロック本体２１との間にさらに１カ所設ける。例えば、１０個の反応器（１００〜１０９）を設置する場合は、三カ所に、入り口一方・出口１０方の切換バルブをそれぞれ１個設置する。この増設によって、図７に示すような１０個の反応器を設けた遺伝子増幅産物解析装置の送液制御システムを同時に制御することができる。
【００３２】
本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置を組み合わせて、多検体の遺伝子診断を一度に短時間で行える遺伝子診断装置とすることができる。すなわち、本発明の固定化ＤＮＡライブラリー作製装置、遺伝子増幅装置、遺伝子増幅産物解析装置を組み合わせて、必要な数だけ並列的に配置することによって、多検体遺伝子診断装置を提供することができる。また、本発明の遺伝子診断装置は、遺伝子増幅産物解析装置の電気泳動データ測定部６６に集積された遺伝子解析データを、コンピュータ制御部６０等に送信することでＤＮＡデータバンクとしての機能を持たせることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の装置を用いれば、固定化ＤＮＡライブラリー作製のための温度制御が簡単なだけではなく、作製された固定化ＤＮＡライブラリーの精製・乾燥も容易に行える。つまり、半永久的に利用可能なカセット型固定化ＤＮＡライブラリーが非常に短時間で作製できる。また、固定化ＤＮＡライブラリーを作製した直後にすぐに、或いは保存されていた固定化ＤＮＡライブラリーを反応器本体にセットアップするだけで、ＰＣＲ効率の非常に優れた遺伝子増幅とその遺伝子増幅産物の解析が自動的に、しかも極く短時間で可能になる。従って、本発明の遺伝子診断装置を用いれば、遺伝子診断を自動的に行う上で技術的に重要な要求項目である、半永久的に利用可能なカセット型固定化ＤＮＡライブラリーの作製、効率・特異性の優れた遺伝子増幅、さらには遺伝子増幅産物の連続的な自動解析、といったことをすべて自動化できる。
また、これからの本格的な自動化遺伝子診断装置の開発においては、本発明の装置を中心にすえて、その前後に、検体試料の前処理用装置、遺伝子変異・欠陥等の遺伝子診断に必要なシークエンス用ＰＣＲのための遺伝子増幅産物の精製・乾燥過程とシークエンス用遺伝子増幅装置、集積された遺伝子解析データをインターネット等でオンライン化することによるＤＮＡデータバンクとの比較解析装置、等を付け加えることによって、より完全な形に近い自動化遺伝子診断装置とすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
図１は本発明の基体を用いた反応器（フローセル）の概略図である。図２はフローセルホルダーの概略図である。図３は反応器本体の概略分解図である。図４は本発明の送液制御システムを示す概略図である。図５は本発明の遺伝子増幅産物解析装置の主要部を示す概略図である。図６は本発明の遺伝子診断装置の概略図である。図７は本発明の遺伝子診断装置の自動制御システムの概略図である。図８はバルブの作動状況を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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