(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化部分に接合されたアビジン又はストレプトアビジンを有する内部移行モノクローナル抗体を含んでおり、該ビオチン化部分が細胞毒性蛋白質であり、該蛋白質がジェロニン、リシン、サポリン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ラヤラーゼ（rayalase）、過酸化ディスムターゼ、蛋白質チロシン・ホスホターゼ、蛋白質ホスファターゼ（ＰＰ−１またはＰＰ−２）、蛋白質キナーゼＡおよび蛋白質キナーゼＣで構成されるグループから選択されることを特徴とするアビジン−ビオチン相互作用を通じて接合される免疫接合体。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、表皮成長因子レセプタ、ｃ−erbＢ２抗原、ルイスＹ抗原、トランスフェリン・レセプタ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、インシュリン・レセプタ、ＣＤ45、ＣＤ33、ＧＰ240、ＧＤ２、ＧＤ３、繊維芽細胞成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタで構成されるグループから選択される抗原と特異的に結合する請求項１の免疫接合体。
【請求項３】
細胞に免疫接合体をインビトロ投与することを含む免疫接合体を特定の細胞内に導入する方法において、該免疫接合体がビオチン化部分に接合されたアビジン又はストレプトアビジンを有するモノクローナル抗体を含んでおり、該ビオチン化部分が細胞毒性蛋白質であり、該蛋白質がジェロニン、リシン、サポリン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ラヤラーゼ、過酸化ディスムターゼ、蛋白質チロシン・ホスホターゼ、蛋白質ホスファターゼ（ＰＰ−１またはＰＰ−２）、蛋白質キナーゼＡおよび蛋白質キナーゼＣで構成されるグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、表皮成長因子レセプタ、ｃ−erbＢ２抗原、ルイスＹ抗原、トランスフェリン・レセプタ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、インシュリン・レセプタ、ＣＤ45、ＣＤ33、ＧＰ240、ＧＤ２、ＧＤ３、繊維芽細胞成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタで構成されるグループから選択される抗原と特異的に結合する請求項３の方法。
【請求項５】
免疫接合体が、ビオチン化部分に接合されたアビジン又はストレプトアビジンを有する内部移行モノクローナル抗体を含み、ビオチン化部分が細胞毒性蛋白質であり、該蛋白質がジェロニン、リシン、サポリン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ラヤラーゼ、過酸化ディスムターゼ、蛋白質チロシン・ホスホターゼ、蛋白質ホスファターゼ（ＰＰ−１またはＰＰ−２）、蛋白質キナーゼＡおよび蛋白質キナーゼＣで構成されるグループから選択されることを特徴とする、アビジン−ビオチン相互作用を通じて接合される免疫接合体を細胞にインビトロ投与することを含む細胞に細胞毒性部分を伝達する方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、表皮成長因子レセプタ、ｃ−erbＢ２抗原、ルイスＹ抗原、トランスフェリン・レセプタ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、インシュリン・レセプタ、ＣＤ45、ＣＤ33、ＧＰ240、ＧＤ２、ＧＤ３、繊維芽細胞成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタで構成されるグループから選択される抗原と特異的に結合する請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には分子生物学および治療学の分野に関するものである。より具体的には、本発明は細胞に遺伝子情報を伝達するための、新しい非ウィルス性ベクターに関するものである。
関連技術の説明
現在の段階で、哺乳動物の細胞の分子的特性に影響を及ぼすことができる遺伝子物質の伝達のために最も一般的に用いられているメカニズムはウィルス、特にレトロウィルス性ベクターを用いる方法である。しかしながら、こうした形態の遺伝子治療または伝達にはいくつかの欠陥がともない、危険な状態につながる可能性もある。レトロウルス性ベクターはより一般的であるが、アデノウィルス性ベクターについても現在研究が進められており、両方共一定の可能性を持っている。残念なことに、ウィルス性ベクターは多くの欠陥をもっている。第一に、標的細胞、たとえば、ヒトの細胞は遺伝子情報伝達の対象である細胞や組織上では表現できない特殊な細胞表面要素の表現を通じてウィルスと相互作用できなければならない。第二に、遺伝子物質は標的、例えば、ヒトの細胞に取り込まれ、そこで表現されねばならず、このことは標的細胞が活発に分裂することを必要とするが、これはこの伝達システムの効率と均一性を阻害する状態である。うまく取り込まれたとしても、遺伝子はホスト細胞のメカニズムによっては転写的に何の作用を示さない場合もある。第三に、このシステムで許される遺伝子情報のサイズが限定されており、生物学的な活性を確保するために、非常に精密な技術が要求される。第四に、新しい感染性作用因子を形成する可能性のある内発性ウィルスとの再結合の危険性を減らすために、遺伝子治療の目的のためには複製不良ウィルスを用いる必要がある。複製不良ウィルスはこうした危険性を減らすかもしれないが、それをまったく排除することはできない。第五に、複製不良ウィルスはその構成上自己排除的なものではなく（not self-removing）、遺伝子配列をすべての細胞にうまく伝達させるためには繰り返し感染させることが必要となる。
先行技術においては非ウィルス性ベクターが存在しない点で問題があった。本発明は先行技術におけるこうした長年にわたるニーズと要望を満たすものである。
発明の要約
本発明は、特に、悪性、または望ましくない表現特性を修正することができる遺伝子物質の伝達のための新しい非ウィルス性システムに関するものである。
したがって、本発明のひとつの実施態様においては、ビオチン化された部分に接合されたビオチン結合要素を有する細胞結合成分を含む非ウィルス性ベクターを提供する。
本発明の別の実施態様においては、遺伝子物質を特定の細胞の内部に導入する方法が提供され、この方法はヒトに対して非ウィルス性ベクターの投与を含んでおり、この非ウィルス性ベクターはビオチン化された部分に接合されたビオチン結合要素を有する細胞結合成分を含んでいる。
本発明の、更に別の実施態様においては、上記非ウィルス性ベクターをヒトへの投与を含む、細胞毒性部分を細胞に伝達する方法が提供される。
本発明の他の側面、特徴、および利点は、開示のために提供される、本発明の現時点での好ましい実施態様に関する以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は本発明の種々の側面を説明するために提供されるものである。この目的のために、これら図面の一部は図式的に示されているが、寸法は必ずしも実際通りではない。
図１は、Ｇ−25カラムでのＡ108/ＳＰＤＰからの遊離ＳＰＤＰの分離を示している。
図２は、Ｇ−25カラムでのアビジン/２−ＩＴからの遊離２−ＩＴの分離を示している。
図３は、Ｓ−200カラム（ＦＰＬＣ）上でのＡ108−アビジン接合体からの遊離アビジンの分離を示している。
図４は、Ｃon−Ａカラム上でのＡ108−アビジン接合体からの遊離抗体の分離を示している。
図５は、Ａ108−アビジン接合体の精製ステップを示す7.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲルを示している。
図６は、ビオチン化ジェロニンのアッセイに関する結合活性を示している。
図７は、Ａ108−アビジン・ジェロニン／ビオチン接合体に関するＧ−75（ＦＰＬＣ）のプロフィールと遊離アビジン・ジェロニンおよび一部のアビジン・サブユニットの分離を示している。
図８は、ビオチン化ジェロニンおよびＡ108−アビジン・ビオチン化ジェロニン接合体に関するエリサ結合活性を示している。
図９は、Ａ431細胞に関する、Ａ108−アビジン・ビオチン化ジェロニンとの比較におけるＡ108−ジェロニン接合体の細胞毒性を示している。
図10は、ＥＧＦレセプタ遺伝子プロモータ配列（ラベルされた抗センスＥＧＦr）に向けられた核酸配列を用いた細胞培養の効果を示している。
発明の詳細な説明
本発明はビオチン化部分に接合されたビオチン結合要素を有する細胞結合成分を含んだ非ウィルス性ベクターを提供するものである。
一般的に、本発明によるビオチン結合要素とは、ビオチンを結合させ、この技術分野の当業者が容易に識別できる化学物質を示している。好ましくは、このビオチン結合要素はアビジン、ストレプトアビジン、あるいはアビジンまたはストレプトアビジンの類似体で構成されるグループから選択される。
本発明による細胞結合要素はいくつかの異なった実施態様のひとつである。例えば、この細胞結合要素はモノクローナル抗体であってもよい。本発明による組成物および方法において有益なモノクローナル抗体は特にひとつの抗原と結合するものである。こうした抗体が結合する抗原の代表的な例は表皮成長因子レセプタ、ｃ−erbＢ２抗原、ルイスＹ抗原、トランスフェリン・レセプタ、ＭＤＲ１，ＭＤＲ３、インシュリン・レセプタ、ＣＤ45，ＣＤ33，ＧＰ240，ＧＤ２，ＧＤ３、腺維芽細胞成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタである。
さらに、細胞結合要素は細胞表面レセプタに特異的に結合するリガンドである。細胞表面レセプタに結合するリガンドの代表的な例は、形質変換成長因子−アルファ、ヘレグリン、腺維芽細胞成長因子、血小板成長因子レセプタである。
一般的に、ビオチン化部分は適切にビオチン化でき、特定の生物学的、あるいは薬学的効果を発揮させるために人が細胞内に導入することを望む化学品であれば、いかなる化合物であってもよい。したがって、ビオチン化された部分は蛋白質または核酸であってよい。
本発明による組成物および方法において有益な蛋白質の代表的な例はジェロニン、リシン、サポリン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ラヤラーゼ、過酸化チロシン・ホスファターゼ、蛋白質ホスファターゼ（ＰＰ−１またはＰＰ−２）、蛋白質キナーゼＡおよび蛋白質キナーゼＣである。
核酸の代表的な例は三重らせんオリゴヌクレオチド、例えば、三重ＥＧＦレセプタ・オリグヌクレオチド、例えばＥＧＦまたはmycに関する抗センス・オリゴヌクレオチド、部分遺伝子配列、例えばｃ−srcまたはＥＧＦなどいくつかのドメイン（domain）を有する蛋白質の単一のドメインをコード表現する配列、およびレトロウィルス・ゲノムの統合ユニットから取り出した遺伝子全体などである。
本発明はまた、ヒトに対して非ウィルス性ベクターを投与することを含む特定の細胞内部に遺伝子物質を導入する方法を提供するものであり、該非ウィルス性ベクターはビオチン化部分に接合されたビオチン結合要素を有する細胞結合成分を含んでいることを特徴としている。
本発明はまた、ヒトに対して非ウィルス性ベクターを投与することを含む、細胞に対して細胞毒性部分を伝達する方法を提供するものである。
本発明はまた、ウィルス感染やトランスフェクション成分を用いずに、細胞の特定のサブセットに核酸を導入することを可能にする組成物および方法に関するものである。細胞表面成分に向けられたモノクローナル抗体が修正されて、細胞内の特定の部位に、遺伝子表現を修正したり、標的細胞内部で表現される蛋白質のレベルを特異的に増大させたり減少させたりすることができる核酸を運ぶために使われる。本発明はヒトにおける抗センス核酸技術に対して適用できる。
細胞表面成分に向けられたモノクローナル抗体はビオチン結合部分およびゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡ配列と結合する核酸配列によって、遺伝子表現が変更されるように修正され、核酸配列のビオチン化誘導物を用いたアビジン：ビオチン相互作用を介して結合される。抗体：抗原複合体の内部移行を通じて、活性を有する核酸配列が共内部化され、これらの配列の細胞内での含有率を高めてくれる。本発明を用いることによって、（１）ウィルス性ベクターに関連しているもの以外のメカニズムによって、あるいは血漿膜を通じての単純な、あるいは容易にされた拡散を介して核酸配列を調整する遺伝子配列の細胞内含有率が増大し、（２）これらの配列が細胞内に入り込むメカニズムとしての血漿膜を通じての単純な拡散の必要性をなくすことによって、小さな分子サイズの活性核酸配列（−20−mers）を制約を回避することが可能になり、そして（３）活性核酸配列の細胞内含有率を増大させるために、全体的な伝達、あるいはウィルス感染の方法以外の抗体：抗原作用を介しての、必要な配列を細胞に対して特異的に、あるいは選択的に伝達することが可能になる。
本発明のひとつの実施態様においては、mＲＮＡ翻訳開始コドンの上流および下流のヌクレオチド（10）にまたがる腫瘍形成性蛋白質に対するアンチセンスＤＮＡが合成される。そして次に、上に合成されたアンチセンスＤＮＡの最初の５つのヌクレオチドに対して相補的なＤＮＡが合成される。そして、その配列に対してビオチン−ヌクレオチド部分が導入される。これら二つのストランドがハイブリダイズされる。そして、ＭＡbアビジン／ストレプトアビジンを腫瘍に向かわせる腫瘍を介しての伝達が行われる。
以下の実施例は、本発明の種々の実施態様を説明する目的のためだけに提供されるものであって、いかなる意味においても本発明を限定するためにものではない。
実施例１
抗体Ａ108の修飾
Ａ108は表皮成長因子に対するヒトの受容体を認識するものである。リン酸緩衝食塩水2.2mlに10mgのＡ108を溶かしたものを12×75mmガラス・チューブに加えた。ジメチルフォルミアミド内に３mg/mlの割合で溶かしたストックからの抗体とＳＰＤＰ（Ｎ−サクシニミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）2.5倍モル強のアリコット9.35μlを撹拌しながらゆっくりとチューブに加えた。この混合物を５分毎に撹拌しながら３０分間室温で培養した。
過剰な未反応ＳＰＤＰは0.5mm ＥＤＴＡを含む100mmリン酸緩衝駅（pH7.0）のカラム（1.5×37cm）上でゲルろ過クロマトグラフイによってサンプルから取り除かれた。緩衝液溶離中にギルソン・フラクション・コレクタ上で１mlフラクションが集められた。ブラッドフォード染色結合アッセイを用いて、96−ウェルマイクロタイタ−・プレート（Falcon社製）を通じて蛋白質の含有率を調べるためのフラクションの分析が行われた。各ウェルは120μlのＰＢＳ、40μlの染色濃縮物、および40μlのサンプルを含んでいた。バイオテック・マイクロプレート・オートリーダーを用いて540nmで吸着度の読み取りが行われた。フラクション30〜38が４℃の温度でプールされ、保存された。
図１は共有結合を通じてのＳＰＤＰの抗ＥＧＦr抗体（Ａ108）への付加を示している。Ａ108の修飾はＳＰＤＰを用いてリシンおよびＮ−末端アミノ酸修飾を介して行われた。未反応物質はゲルろ過によって高分子量Ａ108から除去された。ＳＰＤＰで修飾したＡ108の溶離特性を図１に示す。図１は修飾Ａ108がＳＰＤＰ接合後に回収されることを示している。
実施例２
アビジン−卵白の修飾
2.5mlの二重蒸留水に10mgのアビジンを溶かしたものを60mMのＴＥＡ/ＨＣl（トリエタノールアミン、pH8.0）および１mMのＥＤＴＡを含むように、300ulの0.5mM ＴＥＡ/ＨＣlおよび２８μlの0.1mM ＥＤＴＡストック溶液を加えて希釈した。最終的な体積は2.8mlであった。次に、２−イミノ−チオレーン（２−ＩＴ）ＴＥＡ/ＨＣl（pH8.0）を17ul加えて、最終的な濃度が３mMとなるようにした。このサンプルを窒素ガス流の下で４℃の温度で90分間培養した。過剰な未反応２−ＩＴは50mM ＮａＣlと１mMのＥＤＴＡを含んだ５mMビス−トリス／酢酸緩衝液（pH5.8）を用いて予め均衡化したＧ−25セファデックス・カラム（1.5×38cm）を用いてゲルろ過クロマトグラフイで取り除いた。溶離されたフラクションの蛋白質濃度はブラッドフォード染色結合アッセイで判定された。吸着度はバオイテック・マイクロプレート・オートリーダーを用いて540nmで読み取られた。フラクション（各１ml）27〜38をプールした。図２に示すように、ゲルろ過によって２−イミノチオレーンによって修飾されたアビジンが回収された。
実施例３
抗体Ａ108およびアビジンの複合
修飾抗体および修飾アビジン・フラクションを窒素ガス流の下で４℃の温度で一緒に20時間培養した。0.1Ｍヨードアセトアミド溶液（0.310ml）を加えて最終濃度を２mMとして残留遊離スルフヒドリル基がないようにし、室温で１時間培養を続けた。ＳＰＤＰ−修飾Ａ108および２−イミノチオレーン修飾アビジンを、Ａ108がＳＰＤＰ：２−イミノチオレーン化学反応によって供給されるスルフヒドリル・リンケージを介して共有結合でアビジンに結合されるように、一緒に培養した。
Ａ108−アビジン（図３で接合体としてラベルされたもの）で構成された免疫接合体をゲルろ過で未反応アビジンから分離した。フラクション７〜９に溶出した蛋白質のピークは未修飾Ａ108と回収され、さらに精製されたＡ108−アビジンを示している。
実施例４
接合体の精製
非接合アビジンを20mMトリスおよび150mM ＮaＣl（pH7.4）で予め平衡化させたファーマシアＦＰＬＣスーパーデックスＳ−200カラム（2.6×60cm）上でゲルろ過で反応混合物から取り除かれた。［図３］
抗体−アビジン接合体および遊離抗体フラクション（６〜10）をプールして、４℃の温度下で１昼夜、ＰＢＳに対して透析された（Spectra/Ｐar分子多孔性膜チューブ＃２ＭＷＣＯ  12,000〜14,000）。遊離抗体はコンカバリン−Ａ（ベクター）アガロース結合親和性を利用してその混合物から取り除いた。カラムはＰＢＳ（20mM Ｎａ−Ｋ−ホスフェート、150mM ＮaＣl，pH7.0）で予め平衡化された。サンプル付加後、カラムを１Ｍ ＮaＣl（pH7.0）を含んだＰＢＳ40mlで一度洗浄し、200mMのメチル−Ｄ−マンノース（pH7.0）（フラクション34〜38）（各２ml）を含んだＰＢＳで接合体を溶出した。溶出されたフラクションの蛋白質含有量をVarianスペクトル分光計で280mmで測定した。
アビジンの含水炭素部分の結合を介して、アルファ−メチルマンノシド（アビジン上に存在している）に結合する植物レクチン・コンカナバリンＡ（Ｃon Ａ）の不動態化基質に対する結合を利用して、Ａ108からＡ108−アビジンを分離した。遊離抗体はアルファ−メチルマンノシドを持っておらず、Ｃon Ａカラムを介して洗浄した（図４で遊離Ａbとして示す）。（接合体としてラベルされた）Ａ108−アビジンは溶液中でアルファ−メチルモンノシドを用いて溶出液を使うＣon Ａ−セファロース・カラムから置換された。この接合体はこの手順で回収され、未修飾Ａ108は含んでいなかった。
Ａ108−アビジン接合体の純度は蛋白質をその分子サイズにしたがって分離するナトリウム・ドデシル・スルフェート・ポリアクリルアミド・ゲルろ過（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって観察された。7.5％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ・ゲルを操作して接合体の接合ステップを検査した。図５に示すように、Ａ108、アビジン、またはＡ108−アビジン接合体を示す蛋白質を分解して、ポリアクリルアミド・ゲル内でCooomasieブルー染色剤で染色し、背景色をなくすために脱染すると、視覚化された。レーン７に示されているサンプル（Ｃon Ａカラムからの溶出液）は以下の調査で用いられた精製免疫接合体（Ａ108−アビジン）を示している。
Ａ108−アビジンのビオチンと結合して真核細胞内に内部化する能力は細胞に内部移行された場合だけに毒性を示すビオチン化蛋白質（例えば、植物蛋白質、ジェロニン）を用いて実際に示すことができる。精製ジェロニン蛋白はビオチンを用いて（ジェロニン上のリシン残基を介してＮＨＳ−ビオチンと共有結合することによって）化学的に修飾され、ゲルろ過によって未結合ビオチンから精製される。
実施例５
ジェロニンのビオチン化
用いられたビオチンはＮ−ヒドロキシ・サクシンイミド・エステル長鎖（ＮＨＳ−ＬＣ）ビオチン（Pierce Chemical Co．）の形態であった。ジェロニンに対してモル数で５倍のビオチン（＝0.1mgビオチン：１mgジェロニン）が用いられた。ジェロニン・ストックは50mM炭酸緩衝液（pH8.5）２mlに２mgのジェロニンを溶かしたものであった。５mgビオチンを500μl乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、すぐにこのビオチン溶液20μl（0.2mg）を清潔で、乾燥した13×100mmガラス・チューブ内でジェロニンに加えた。このサンプルを撹拌して、氷上で２時間培養した。２時間後、遊離ビオチンをＰＢＳ（pH7.0）で平衡化させた1.5cm×37cm  Ｇ−25カラム上でゲルろ過クロマトグラフィで分離された。１mlフラクションをギルソン・フラクション・コレクタ内に集めて、ブラッドフォード染料結合アッセイで蛋白質含有量に関するアッセイを行った。フラクション21〜27がプールされた。
ビオチンがジェロニンに組み入れられたことを実証するために、ビオチン化ジェロニンをジェロニン蛋白質に向けられた抗体を用いてポリスチレン基質上で不動態化した。示されている量の未修飾ジェロニンまたはビオチン化ジェロニンを抗ジェロニン抗体を含んだウェル内で培養した。ジェロニンによるビオチンの保持は、ウェルを洗浄して、無色のホースラディッシュ基質（ＡＢＴＳ）で培養されると緑色になり、405ナノメータの波長で分光計で測定可能になる酵素ホースラディッシュ・ペロキシダーゼに化学的に接合されたストレプトアビジンを加えることによって検出された。405nmでの吸着量はジェロニン分子に組み込まれたビオチンの量と直接比例している。図６に示すように、ビオチン化されたジェロニンはアッセイに入れられたビオチン化ジェロニンの量を増大することによって、緑色が増大したので、ビオチンを保持することが確認された。この結果は、ビオチンがジェロニン分子に組み込めること、およびビオチンに対する親和性を有する蛋白質によって識別できることを実証している。
実施例６
ビオチン化ジェロニンの活性
0.583mg/mlハツカネズミ・モノクローナル抗−ジェロニン抗体（10Ci）（10μl）のストック溶液を12mlコーティング緩衝液（500mm ＮＨＣＯ3（重炭酸ナトリウム、pH9.6）（１μg/ml溶液）12ml内で希釈した。マルチ−チャンネル・ピペターを用いて、ファルコン96−ウェル・マイクロタイター・プレートの各ウェルを50μlコーティングした（50ng/ウェル）。これらのサンプルを蓋で覆い、一昼夜冷蔵した。約12時間後に、サンプルをＰＢＳ−0.05％ツイーン−20で３回リンスして、ＰＢＳ中で５％仔ウシ血清アルブミンを用いて室温で1.5時間ブロックした。このサンプルをＰＢＳおよび0.05％ツイーン−20で３度リンスした。
ＰＢＳにジェロニンを溶かした溶液を２mg/mlの濃度で調製した。次に、ＰＢＳにビオチン化ジェロニンを溶かした溶液を、これも２mg/mlの濃度で調製した。ＰＢＳ内にＢＳＡを溶かした１mg/ml溶液100μlをこのプレートに加えて、最初の列は空のままにしておいた。この列の最初の半分に対して、１ウェルあたり200μlのストック・ジェロニン溶液を加え、この列の後半の半分に対しては１ウェルあたり200μlのビオチン化ストック溶液を加えた。マルチ−チャンネル・ピペッターを用いて、この最初の列から100μlを引き出し、第二の列の100μlのＢＳＡ−ＰＢＳを混合した。この手順をプレートの左から右に向かって繰り返したところ、蛋白質が連続的に希釈された。このプレートに蓋をして、室温で1.5時間培養した。このプレートのウェルをＰＢＳ−0.05％ツイーン−20で三度洗浄した。次に、１mg/ml ＢＳＡ−ＰＢＳ内で１：6000の割合で希釈したアビジン・ペロキシダーゼ（Boehinger-Mannheim）100μlを加えた。そして、プレートを室温で1.5時間培養した後、ＰＢＳ−0.05％ツイーン−20で三度洗浄した。最後に、ＡＢＴＳ（２，２1−アミノ−ビス（３−エチル・ベンズ・チアゾリン−６−スルホン酸））過酸化水素100μlを加えた。このプレートをバイオテック・ラボライトリーズ・マイクロプレート・オードリーダーで405nmで読み取った。［図６Ｂ］
実施例７
Ａ108−アビジンによるビオチン化ジェロニンの接合
Ａ108−アビジンに対してモル数で５倍のビオチン化ジェロニンを用いた。１ml（250μg）のＡ108−アビジンを175ul（175μg）のビオチン化ジェロニンと組み合わせた。このサンプルを撹拌して、室温で１時間共に培養した。
この混合物から未接合ジェロニンを取り除くために、この混合物を0.5Ｍ ＮaＣl（pH7.4）を含んだ20mmトリスで予め平衡化させたファーマシアＦＰＬＣ Ｇ−75（1.6×60cm）ゲルろ過カラムにかけた。１mlフラクションを集めて、Varian分光計で280nmで読み取りを行った。Ａ108−アビジン・ビオチン化ジェロニン標識化接合体を示すピークを図７に示し、未結合ジェロニンまたは遊離アビジン・サブユニットは含んでいなかった。
Ａ108−アビジンのビオチン化ジェロニンとの接合体をビオチン化ジェロニンに関連して上に述べたのと同じエリサ・アッセイを用いて調べた。図８に示すように、ビオチン含有率は、ビオチン化ジェロニンまたはビオチン化ジェロニン：アビジン−Ａ108のいずれかをそのアッセイでテストした場合の緑色形成で検出することができた。このように、この接合体は実際にビオチン化ジェロニンを含んでいる。
実施例８
ａ431細胞に対するＡ108−アビジン／ビオチン化ジェロニンの細胞毒性
Ａ431細胞を５％胎仔ウシ血清および５％仔ウシ血清を用いて、重要でないアミノ酸、100mMグルタミンおよび50ul/ジェンタミシン（Tri-Bio Laboratories）を含む成長培養液（ＭＥＭ−最小限基本培養液）で３×104細胞/mlに希釈した。この溶液100μlを96−ウェル・マイクロタイター・プレート（Falcon）の各ウェルに入れて、５％ＣＯ2培養器内で37℃の温度で培養した。次の日、Ａ108−ジェロニン接合体（Ａ108−アビジンを作成するのに用いられたのと同じ化学反応を通じて共有結合で相互に結合されたＳＰＤＰ修飾Ａ108および２−ＩＴ修飾ジェロニンを用いたＡ108−ジェロニン直接接合体）を成長培養液に溶かしたもの２μg/mlを作成して、0.22ミクロン・Acrodisc（Gilman）注射器フィルターを用いてろ過殺菌し、続いて、10本の15ml遠心分離チューブに希釈して入れた。Ａ108−アビジン：ビオチン化ジェロニンを同様に作成して、各希釈液100μlを３つ一組でプレートに入れた。プレート内にはすでに100μlの培養液を入れてあったので、最終的な濃度は各接合体とも１μg/mlであった。コントロールとして、それぞれにモル数で百倍（100μg/ml）の抗体Ａ108を加えて同じ方法で接合体を作成した。これらの細胞を３日間培養して、20％メタノール内で0.5％クリスタル・バイオレットで染色し、蒸留水内ですすいでから、150μlのSorenson緩衝液を加えて細胞から染料を抽出した。このプレートをマイクロプレート・オートリーダーで540nmで読み取った。
図９はジェロニンを細胞内部に導入し、そこで細胞毒性を示すことができるこの接合体の能力を示している。この接合体をその細胞表面でＥＧＦレセプタを表現することができる細胞（Ａ431）で培養した。この接合体の内部移行によってジェロニンの細胞内効果、つまり細胞毒性の発現が可能になる。図９に示すように、接合体をこれらの細胞で培養した場合、ナノ・モル程度の濃度（１×10-6モル）でＡ431細胞が殺され、このことはＡ108−アビジンがビオチン化ジェロニンのＡ431細胞への侵入を可能にすることができることを実証している（白丸）。細胞が（免疫接合体濃度と比較して）大量に過剰の遊離Ａ108抗体で共培養されると、Ａ431細胞内に入り込むＡ108−アビジン：ビオチン化ジェロニンの能力が阻害される。遊離Ａ108は細胞表面に存在するすべてのＥＧＦレセプタと結合し、したがって、免疫接合体がＥＧＦレセプタと結合してジェロニンをＡ431細胞の内側に入り込むのを阻止する。図９に示すように、免疫接合体と比較して100倍の量で存在する場合（黒丸）、Ａ431細胞は生きのびることができるので、免疫接合体が細胞内に入り込んでそこで細胞毒性を発揮する唯一の方法はＥＧＦレセプタと結合して、内部移行する能力を通じてであることが示された。Ａ108−ジェロニンの直接共有結合接合体も、ジェロニンのＡ431細胞の細胞内部位への導入によってＡ431を殺す上で活性を示した（白い三角形）。この直接接合体にモル数で100倍程度の遊離Ａ108を入れた場合も、細胞はジェロニンによる毒性から護られ、このことはＡ108−ジェロニンが、ＥＧＦレセプタとの相互作用および内部化する能力によって細胞内部に導入されることを示している。したがって、アビジン：ビオチンの相互作用の利用が、内部化される細胞上の抗原を識別し、その抗原（この場合はＥＧＦレセプタ）と結合することができる抗体を用いてその細胞内領域に向けられ、運ばれた場合に、分子を細胞の内部領域に導入することができる。
実施例９
ＥＧＦレセプタ蛋白質の表現に対する三重らせん形成核酸の影響
三重らせん形成オリゴヌクレオチドまたは核酸の完全な細胞におけるＥＧＦレセプタ蛋白質の表現を抑制する能力が実証された。Ａ431細胞を、ＥＧＦレセプタ遺伝子プロモータ領域あるいはナンセンス・コントロール配列（同じ核酸を含んではいるがランダム配列で含んでいる）を結合させることができる40μM ＥＧＦレセプタ遺伝子核酸配列（＃５ ＥＧ Ｆr）を用いて72時間培養した。
＃５ ＥＧＦrおよびコントロール核酸を２〜５分間95℃に加熱し、フィルター殺菌によって培養液内で調製した。２×105 Ａ431細胞を含む細胞培養皿から成長培養液を取り除いた。最終濃度が40umとなるように２ml培養液で希釈した＃５ ＥＧＦrを１つの皿に加えた。コントロール核酸配列は最終濃度が40uMとなるように２ml培養液で希釈し、Ａ431細胞の第二の皿に加えた。第三の皿には２mlの培養液だけを加えた。培養は72時間続けられた。氷冷ＰＢＳを用いて各皿を三回洗浄して細胞を収穫した。細胞および抽出蛋白質を安定化させるために、１ml ＲＩＰＡ緩衝液を付加してから、細胞を細胞スクレーパでリリースして、遠心チューブに移した。各チューブはKontes細胞ディスラプタを用いて超音波処理し、Sorvallウルトラ遠心分離装置で１時間、４℃の温度で100,000×ｇで遠心分離にかけた。遠心分離後、上澄液を取り除き、ＢＣＡ蛋白質アッセイ（Pierce）で蛋白質含有量を判定した。
これらの抽出物内のＥＧＦレセプタをＡ108抗体および不溶性抗体結合試薬パンソルビンで免疫沈降させた。200μgの蛋白質を含んだ上澄液を抗体Ａ108 2.5μgを用いて４℃の温度で２時間培養した。各サンプルにパンソルビン50μlを加えて撹拌し、４℃の温度で30分間培養した。Ａ108−パンソルビンに結合したＥＧＦレセプタを洗浄して他の蛋白質を取り除いた。Sorvallマイクロ遠心分離装置で12,000rpmの速度で１分間（４℃）遠心分離を行って、上澄液を静かに取り出した。ペレットを0.1％トリトンを含むＰＢＳに三回再懸濁させて洗浄し、再懸濁させる度に遠心分離を行って再ペレット化させた。最終的に洗浄、遠心分離した後、上澄液を取り出した。
各免疫沈降物内に存在するＥＧＦレセプタを放射性（32Ｐ）ラベル化ＡＴＰを用いてそれを培養することによって検出した。ペレットを20mMヘペス緩衝液（pH7.4）に0.4mM  バナジン酸ナトリウムを溶かしたもの25μl内に再懸濁させた。次に、32ＰでラベルしたＡＴＰ（10μCi）と12mM  ＭnＣl2を含んだ20mMヘペス緩衝液25μlを付加した。サンプルを室温で５分間培養した。ＥＧＦレセプタは32ＰをＡＴＰからＥＧＦレセプタ自体に移すことができる酵素活性を有しており、ＥＧＦレセプタに移される32Ｐの量は各細胞溶解物（lysate）からの免疫沈降物内に存在するＥＧＦレセプタの量の尺度となる。ＥＧＦレセプタ上の放射活性の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて遊離32Ｐ ＡＴＰからＥＧＦレセプタを単離し、市販のＸ線フィルムを用いたポリアクリルアミド・ゲルのオートラジオグラフィによって放射性ＥＧＦレセプタを測定することによって比較することができる。
サンプルに５Ｘ−ラエムリ・サンプル緩衝液15μlを加え、サンプルを95℃に５分間加熱してから、7.5％ポリアクリルアミド・ゲルに負荷した。これらの蛋白質を14mAで１昼夜電気泳動にかけた。電気泳動装置からゲルを取り出して40％メタノール、10％酢酸、50％ddＨ2Ｏ内に１時間固定した。このゲルをバイオラッド583ゲル乾燥機で80℃の温度で２時間乾燥させた。
図10に見られるように、ＥＧＦレセプタ遺伝子プロモータ配列（ラベル化抗センスＥＧＦr）に向けられた核酸配列によって細胞を培養すると、ランダムな核酸配列（ラベル化非センスＥＧＦr）または緩衝液だけ（ラベル化コントロール）と比較したＡ431細胞内のＥＧＦレセプタのレベルを５分の１に引き下げた。したがって、高濃度のＥＧＦレセプタ遺伝子のウロモータ領域と相互さようする三重らせん形成核酸配列を用いて細胞を培養すると完全なＡ431細胞内におけるＥＧＦレセプタの表現が抑制される。
実施例10
Ａ108：核酸配列をアビジン・ビオチン連鎖を通じてＡ431細胞内に導入する。核酸配列がＥＧＦレセプタ遺伝子に向けられることを実証するために、遺伝子プロモータ配列をＡ108抗体を使ってＡ431細胞に組み込み、Ａ108−アビジン化学結合接合体を作成し、精製する。核酸配列は合成されるが、ビオチン化ヌクレオチドがその配列のひとつのポジション（好ましくはその配列の末端か頭）で正常なヌクレオチドを置換する。これらの配列をＡ108−アビジンで培養して、Ａ108−アビジン：ビオチン−核酸配列を含んだ複合体が形成されるようにする。これらのハイブリッド分子を精製して遊離核酸配列を取り除き、Ａ108−アビジンと組み合わさった核酸の量を測定し、Ａ431細胞で培養する。遺伝子表現抑制核酸配列がＡ431細胞の正しい細胞内領域に組み込まれた場合は、生化学的に測定可能なはずである。この核酸配列がＥＧＦレセプタ表現を阻害する特異性はアンチセンスＥＧＦr、またはナンセンスＥＧＦrとＡ108−アビジンとの間で形成される免疫接合体をテストし、実施例９で述べたようにＥＧＦレセプタホスホリル化を測定することによって判定される。さらに、Ａ108：ＥＧＦレセプタ複合体の形成を通じて細胞に入り込むその核酸配列の能力はＡ431細胞による培養混合物内に遊離Ａ108をモル数でかなり過剰に含めることによってテストされる。抗体：核酸配列で構成されるハイブリッド分子の抑制効果は遊離Ａ108の存在によって抑止され、核酸が内部移行可能な細胞表面抗原、つまりＥＧＦレセプタとの係合を通じての抗体を一緒に内部移行されることによって細胞内に導入されることが確認される。
実施例11
より大型のビオチン化核酸を用いて、その細胞内への侵入がＡ108−アビジン・メカニズムによって媒介されるのかどうかについての判定を行う。ＥＧＦレセプタ・レベルを変えるために必要な、Ａ108−アビジン・メカニズムを介して細胞に提供される核酸配列の濃度を、溶液内で遊離している通常の核酸配列と比較する。特定の抗原表現細胞（例えばＥＧＦレセプタ）に対して活性核酸配列を向ける能力を、こうした抗原を表現しない細胞を用いて調べる。こうした抗原を表現する細胞を保有する動物の特定の細胞に対するこれらの核酸の伝達について調査する。ＥＧＦレセプタの抑制を測定する。Ａ108−アビジンと複合体化したアンチセンスおよびナンセンス核酸配列の両方を、この伝達システムの特性およびその細胞内での生化学的特性の尺度として（その特殊な抗原を表現しない細胞に加えて）用いる。
実施例12
乳房悪性腫瘍を表現した抗原ＨＥＲ２/Ｎeu（例えば、ＴＡb250）に対するモノクローナル抗体をＡ108抗体に関して実施例１〜４で述べたように化学的にアビジンに接合させる。抗原ｃ−myc（５′−ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３′）に対するアンチセンス核酸配列をアデノシンを末端５′ポジションで置き換えるビオチン化アデニン・ヌクレオチドを用いて合成する。このビオチン化アデニン核酸配列をＴＡb−250−アビジンで培養し、ＴＡb−250：アンチセンスｃ−mycで構成された抗体−核酸複合体を精製する。これらの複合体をＨＥＲ２/Ｎeuを表現する乳房腫瘍細胞、例えばＢＴ−474細胞、あるいはこの抗原に対してはネガティブな細胞、例えばＢＴ−20細胞を用いて培養する。アンチセンス核酸によるｃ−mycの抑制を粗細胞溶解物からのｃ−myc蛋白質に関するウェスターン・ブロッティングで測定する。ｃ−myc表現はＨＥＲ２/Ｎeuポジティブ細胞内では変わるが、抗原ネガティブ細胞内では変わらない。さらに、かなり過剰な（100倍程度の）未修飾ＴＡb−250が抗原ネガティブ細胞内のｃ−myc上での抗体−核酸複合体の抑制効果を阻止する場合は、その特異性が示唆される。配列内でのビオチン化ヌクレオチドの位置を変えるか、あるいはｃ−myc mＲＮＡ上での転写開始部位または最初のスプライス接合部に対して相補的な、あるいはそれにまたがる配列のサイズを増大させることで、ビオチン化核酸配列を変えることができる。ｃ−myc表現を抑制するＨＥＲ２/Ｎeu抗原を表現する乳房悪性腫瘍細胞に伝達可能な、最も特異的で敏感なアンチセンス配列を得るために、これら修飾のテストを行う。
実施例13
実施例１〜４で述べたように、モノクローナル抗体Ａ108をアビジンに化学的に接合する。基本線維芽細胞成長因子（bＦＧＦ）mＲＮＡ翻訳開始部位（５′−ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ−３′）に対する相補的配列を示すアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、５′−末端ポジションで未修飾ヌクレオチドに代えてビオチン化グアノシンを用いて合成する。これらの配列をＡ108−アビジンを用いて培養し、抗体：核酸複合体を形成して、複合体化されていない核酸と分離精製する。これらの複合体を、ＥＧＦレセプタを表現し、それら自体の成長を促進するためにそれら細胞自体のbＦＧＦ合成に基本的に依存しているヒト神経膠腫細胞（ＳＮＢ−19）で培養する。この接合体による培養後、ＳＮＢ細胞成長を測定して、これら標的細胞内におけるbＦＧＦの表現を妨害することによって成長抑制の程度を判定する。上に述べたように、特異性について評価し、抗原内部移行を通じての抗センス配列の侵入のメカニズムを確認するために、過剰なＡ108がＡ108：核酸複合体と共培養された。
実施例14
いくつかのヒト悪性腫瘍のルイスＹ抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体ＢＲ96を上に述べたのと同様の手順で、アビジンに接合する。ｃ−Ｈa−ras ５′ブランキングmＲＮＡ配列に対して相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは化学的に合成された５′−ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣ−３′で、５′ポジションに未修飾シトシンに代わってビオチン化シトシン・ヌクレオチドを有している。ＢＲ96−アンチセンスrasオリゴヌクレオチドを、ルイスＹ抗原を表現し、ｃ−Ｈa−rasオンコジーンも含んでいるＴ24膀胱悪性腫瘍細胞によって培養することにより形成する。Ｔ24細胞で免疫：核酸複合体を培養した後、ras腫瘍遺伝子の生産物であるp 21をモニターする。細胞成長についても観察する。ルイスＹ抗原の内部移行を通じてのアンチセンス分子の細胞内伝達によるras腫瘍遺伝子の効果の中性化が実証される。
実施例15
Ａ108−アビジン化学接合体を上に述べたように合成して、特定の悪性腫瘍細胞に対して細胞毒性を示す合成二重鎖ＲＮＡを内部移行するのに用いられる。イノシンのポリマー（ＰＩ）を化学的に合成して（40mer）、ビオチンで誘導した末端シトシンを有するポリシトシン（ＰＣ）３９merにハイブリダイズさせる。この二重鎖ＲＮＡ分子をＡ108−アビジンで培養して、Ａ108−アビジン：ビオチン−ＰＣ：ＰＩ複合体を精製し、ＥＧＦレセプタを表現し、ＰＩ：ＰＣ（dsＲＮＡ）に対して細胞毒性的に感作性を有するＭＥ−180子宮頸部悪性腫瘍細胞の成長培養液に負荷する。ＥＧＦレセプタの内部移行を通じてdsＲＮＡの細胞内伝達を、この構成物による培養後に細胞の成長性を観察することによって測定する。この接合体の培養によってもたらされた細胞毒素は、核酸が非ウィルス性ベクターで特定の細胞群に伝達されることができることを示すものである。
本明細書において述べられたすべての特許および出版物は本発明が関連する分野の当業者が理解できるレベルである。すべての特許および出版物は、個々の出版物が具体的、個別的に引用文献によって本明細書に組み入れられているのと同じ程度に、引用文献によってここに組み入れられる。
当業者は本発明が上に述べられた目的や利点、およびそれらと本質的に付随した目的や利点を達成するのに適していることを容易に理解できるであろう。これらの実施例は、ここに述べられている方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物は現段階で好ましい実施態様を代表しており、具体例であって、本発明の範囲を限定することは意図していない。特許請求の範囲で述べられている発明の範囲内での変更は当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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