(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡマイクロアレイにおいて、正または負電荷をもつ半導体ナノ粒子を、サンプル生体高分子の持つ負または正電荷に静電的に結合させることにより、プローブ生体高分子との結合の有無および結合量を検出する生体高分子の検出反応の途中及び／または反応後に、基板上に前記半導体ナノ粒子を含む一定容量の溶液を滴下し、前記半導体ナノ粒子溶液を前記基板上で乾燥させ、半導体ナノ粒子の乾燥物に励起光を照射し、前記照射により発光する蛍光強度の総和を求めることで、前記照射による全発光量を求め、半導体ナノ粒子溶液の単位量当りの発光量を求めることを特徴とする反応測定方法。
【請求項２】
半導体ナノ粒子の乾燥物に励起光を照射し、前記照射により発する蛍光をスキャナーにより画像として取り込み、前記取り込んだ画像を処理・解析することにより、前記照射による発光強度を求めることを特徴とする請求項１に記載の反応測定方法。
【請求項３】
前記半導体ナノ粒子を用いる反応が、生体組織の染色反応であることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応測定方法。
【請求項４】
前記半導体ナノ粒子を用いる反応が、生体高分子の修飾反応であることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
半導体ナノ粒子の発光強度や発光特性などを解析して、評価する半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定方法、及び該反応測定方法を用いる半導体ナノ粒子の品質評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
粒径が１０ｎｍ以下の半導体ナノ粒子は、バルク半導体結晶と分子との遷移領域に位置することから、いずれとも異なった物理化学特性を示す。このような領域では、量子サイズ効果の発現により、粒径の減少に伴って半導体ナノ粒子のエネルギーギャップが増大する。さらにこれに付随して、バルク半導体で見られたエネルギーバンドの縮退が解け軌道が離散化し、伝導帯下端が負側に、価電子帯上端が正側にシフトする。
【０００３】
半導体ナノ粒子の製造方法は、ＣｄおよびＸ（ＸはＳ，Ｓｅ，Ｔｅ）の前駆体を等モル量溶解することで簡単に調製することができる。これらは、ＣｄＳｅ，ＺｎＳ，ＺｎＳｅ，ＨｇＳ，ＨｇＳｅ，ＰｂＳ，ＰｂＳｅなどにおける製造についても同様である。しかし、前記方法により得られた半導体ナノ粒子は、広い粒径分布を示すため、半導体ナノ粒子の特性を十分に利用することができない。このため、調製直後の広い粒径分布を有する半導体ナノ粒子から、化学的手法を用いて粒径分離を精密に行い、特定の粒子サイズの半導体ナノ粒子のみを分離・抽出することで単分散化することが試みられている。これまでに、ナノ粒子の有する表面電荷が粒径によって変化することを利用した電気泳動分離法、粒径による保持時間の差を利用した排除クロマトグラフィー、粒子サイズの違いによる有機溶媒中への分散性の差を利用したサイズ選択沈殿法があり、これらの手法とはまったく異なる方法として、半導体ナノ粒子溶液への単色光照射により粒径制御を行うサイズ選択光エッチング法などが報告されている。
【０００４】
以上のような方法により得られた半導体ナノ粒子は、比較的波長幅の狭いピークを持つスペクトルを示す。得られた半導体ナノ粒子の評価は、一般的に、前記スペクトル幅の狭さおよび全体的な強度を評価基準としており、これらは製造ロットあたりに毎々異なるものである。粒径がそろっているかどうかを調べるために吸光度を用いた計測も行われている。
【０００５】
しかしながら、既知の半導体ナノ粒子の品質評価はいずれも溶液中での発光又は吸光を調べるものであった。溶液中の半導体ナノ粒子に励起光を照射すると、励起光強度とそれによる蛍光発光強度は直線的に比例せず、半導体ナノ粒子の濃度に依存する。これは、半導体ナノ粒子の濃度が高いと励起光が全ての半導体ナノ粒子に等しく照射されないことや、発光した蛍光が他の半導体ナノ粒子によって遮蔽されることによる。同様に、吸光度についても吸光度は半導体ナノ粒子の濃度に依存している。このように、溶液中での半導体ナノ粒子の品質評価法は、操作性が悪く、得られた発光量、発光特性、吸光量、吸光特性の信頼性は充分ではなく、再現性にも劣るものであった。
【０００６】
そこで、従来の溶液中での半導体ナノ粒子の品質評価方法に代わる、操作性、信頼性、及び再現性に優れた新たな品質評価方法が必要となった。
また、従来の半導体ナノ粒子を用いる各種反応では、反応の進行状況を測定するために、溶液中の半導体ナノ粒子の蛍光強度や吸光度などの光学特性や光学的強度を求めていた。
【０００７】
しかしながら、上記と同様の理由で、溶液中での半導体ナノ粒子の測定法は、操作性が悪く、反応物から得られた発光量、発光特性、吸光量、吸光特性の信頼性は充分ではなく、再現性にも劣るものであった。
そこで、従来の半導体ナノ粒子を用いる各種反応の進行状況を測定するために、溶液中での光学的測定法に代わる、操作性、信頼性、及び再現性に優れた新たな測定方法が必要となった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、半導体ナノ粒子を乾燥状態で、その光学的強度、光学的特性などを測定することにより解決されることを本発明者らは見出した。
即ち、本発明の半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定方法は、半導体ナノ粒子を用いる反応途中及び／または反応後に、基板上に一定容量の半導体ナノ粒子溶液を滴下し、前記半導体ナノ粒子溶液を前記基板上で乾燥させ、半導体ナノ粒子の乾燥物を光学的に処理し、その光学的データから、前記半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定を行うものである。具体的には、半導体ナノ粒子の乾燥物の光学的処理としては、蛍光発光測定と吸光度測定が挙げられる。また、その測定結果の処理法は限定されず、例えば、蛍光顕微鏡等を用いる画像処理とコンピュータによる解析や、感光フィルムを用いる感光法が例示される。
【０００９】
第１に、前記半導体ナノ粒子の乾燥物の光学的処理が、前記半導体ナノ粒子の乾燥物に励起光を照射し、前記照射により発光する蛍光強度を求めるものであることによって前記課題は解決される。
ここで、前記発光する蛍光強度の総和を求めることで、前記照射による全発光量を求め、単位量当りの発光量を求めることができる。
【００１０】
また、半導体ナノ粒子の乾燥物に励起光を照射し、前記照射により発する蛍光を画像としてスキャナーにより取り込み、前記取り込んだ画像を処理・解析することにより、前記照射による発光強度を求めることができる。
第２に、前記半導体ナノ粒子の乾燥物の光学的処理が、前記半導体ナノ粒子の乾燥物に光を照射し、前記照射による吸光度を求めるものであることことによって前記課題は解決される。
【００１１】
本発明において、前記半導体ナノ粒子を用いる反応は特に限定されない。例えば、正または負電荷をもつ半導体ナノ粒子を、サンプル生体高分子の持つ負または正電荷に静電的に結合させることにより、または、サンプルＤＮＡおよびＲＮＡを増幅させる反応を行い、前記反応中に表面が塩基等により修飾された半導体ナノ粒子を取り込むような操作を行い、または、半導体ナノ粒子表面を官能基修飾し化学結合によるサンプルＤＮＡの修飾を施すことで、プローブ生体高分子との結合の有無および結合量を検出する生体高分子の検出反応や生体観察を行うことが例示される。他に、前記半導体ナノ粒子を用いる反応として、細胞工学における生体組織の染色反応が例示される。
【００１２】
また、本発明は、上記の半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定方法を用いることを特徴とする半導体ナノ粒子の品質評価方法である。
更に、本発明は、上記の半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定方法を用いることを特徴とする半導体ナノ粒子の品質表示方法である。
【００１３】
上記のように、従来は、半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定や半導体ナノ粒子の品質評価は、溶液中にて行われており、乾燥状態における反応測定、及び評価・解析は行われていない。この度、半導体ナノ粒子は、その溶液をスライドグラスに滴下させた乾燥状態においても蛍光強度及び蛍光スペクトルなどの蛍光特性や、吸光強度（ａｂｓ．）や吸光スペクトルなどの吸光度特性を示すことに着目した。しかも、乾燥状態においては、半導体ナノ粒子の１個１個について、粒子間の電子移動のない状態で光学的測定を行うことができることに着目した。これにより、乾燥状態では溶液中で行う反応測定及び測定・評価以上の精度で、半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定及び評価・解析を行うことが可能となる。
【００１４】
本発明は、半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定、及び半導体ナノ粒子の品質評価方法であり、半導体ナノ粒子の製造方法は何ら限定されない。単分散化した半導体ナノ粒子の製造方法は様々な方法があり、半導体ナノ粒子を調製後、サイズに応じて分離・抽出を行う方法と、あらかじめ単分散化した半導体ナノ粒子を調製する方法の二つに大別される。前者の方法として、ナノ粒子の有する表面電荷が粒径によって変化することを利用した電気泳動分離法、粒径による保持時間の差を利用した排除クロマトグラフィー、粒子サイズの違いによる有機溶媒中への分散性の差を利用したサイズ選択沈殿法が挙げられる。後者の方法として、高温環境化において前駆体を反応・成長させ、反応時間により粒径を制御する高温成長法、半導体ナノ粒子溶液への単色光照射により粒径制御を行うサイズ選択光エッチング法、界面活性剤を利用し、有機溶媒と水溶媒の体積比により粒径を制御する逆ミセル法が挙げられる。
【００１５】
半導体ナノ粒子の材質としては何ら制限されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ2、ＷＯ3、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅ等が好ましく例示される。
以上のような方法により調製された半導体ナノ粒子は、一般的に溶液中における吸光度および蛍光強度を測定することで測定や評価が行われてきた。本発明では、溶液中ではなく乾燥状態で半導体ナノ粒子の測定及び評価・解析を行うことを特徴とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
ここでは、半導体ナノ粒子の評価方法および解析方法を例示する。
ここで測定・評価を行う半導体ナノ粒子は、ヘキサメタリン酸ナトリウム（０．１ｍｍｏｌ）とか塩素酸カドミウム（０．２ｍｍｏｌ）の水溶液を１０００ｍｌ作成し、ｐＨ１０．３に調整した後、硫化水素ガス（０．２ｍｍｏｌ）を激しく攪拌させながら溶液中に注入することで調製した。得られた半導体ナノ粒子を、光エッチング法により単分散化した。このように調製および製造された単分散化ＣｄＳ半導体ナノ粒子の水溶液をスライドガラス等の基板上に滴下し、乾燥させた（図１）。その後、波長約３５０ｎｍの励起光を照射した。
【００１７】
蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製  ＢＸ６０）等からなる読取装置により画像化を行い、コンピュータ上で画像解析を行い、蛍光領域の積算処理を行った。これにより、スライドガラス上の半導体ナノ粒子の総発光量を求めることができ、滴下した半導体ナノ粒子溶液量と相関させることで、単位量あたりの発光量を求めることができた（図２）。
あるいは、ある指定領域に励起光を照射し、光学的スペクトルを取ることにより評価を行うことも可能である。さらに、吸光度と蛍光量の相関、および複数のスペクトルの相関により、さらに正確な評価が可能となる。
【００１８】
（実施例２）
ここでは、半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定方法（半導体ナノ粒子を用いた生体高分子解析方法）を示す。
従来、半導体ナノ粒子を用いた生体高分子の検出においては、主に溶液中による光学的スペクトルを取ることにより評価されてきた。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイに代表される生体高分子マイクロアレイによる解析においては、溶液中で行うことは非常に困難であった。
【００１９】
本発明においては、乾燥状態下における半導体ナノ粒子量を測定することにより、生体高分子マイクロアレイにおける解析を可能とするものである。
ところで、先に本出願人は、表面を化学修飾した半導体ナノ粒子をたんぱく質やＤＮＡの検出試薬として用いる発明を出願した（特願２００２−２７６１６号）。図３を参照して、表面を化学修飾した半導体ナノ粒子を用いて、生体高分子を検出するメカニズムを説明する。図３において、平面又はビーズ状を形成する表面基板１が有する正電荷とプローブＤＮＡ２の燐酸側鎖の負電荷との結合により、基板１に対してプローブＤＮＡ２が固定化されている。プローブＤＮＡ２とサンプルＤＮＡ３は互いに水素結合でハイブリダイズする。これによりサンプルＤＮＡ３の燐酸側鎖の負電荷が上昇する。このサンプルＤＮＡ３の負電荷に正電荷を有する半導体ナノ粒子４が結合し、その結合量によりハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ３に関する情報を信号として提供する。図３の場合は、プローブＤＮＡ２が負電荷で半導体ナノ粒子４が正電荷であったが、逆であっても良い。たんぱく質等では、等電点が存在し、ＰＨの高低によってサンプルＤＮＡ３の電荷も正負に変化する。サンプルＤＮＡ３の電荷が正の場合は負電荷を有する半導体ナノ粒子４を用いれば良い。
【００２０】
半導体ナノ粒子への官能基修飾は、半導体ナノ粒子溶液中へチオール化合物を混合させることにより、半導体ナノ粒子表面とチオール化合物の置換反応を起こさせることで容易に行うことができる。ここでは、官能基により修飾された半導体ナノ粒子を用いたＤＮＡマイクロアレイによる解析方法を例示する。例として、チオコリン（（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウム）により反応表面を修飾することによる応用例を示す。
【００２１】
窒素で飽和させた２ｍｏｌ・ｄｍ-3ＨＣｌ水溶液１．２ｃｍ3にヨウ化アセチルチオコリン３５０ｍｇを溶かし、１２時間室温で放置した。これに窒素雰囲気下２８％アンモニア水を０．２ｃｍ3加え中和し、弱アルカリ性の０．８６ｍｏｌ・ｄｍ-3チオコリン（（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウム）水溶液を作成した。これによってナノ粒子表面を修飾することによって、正電荷を粒子表面に有するチオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子を調整した。この溶液をサイズ選択光エッチング後のＣｄＳナノ粒子溶液中に４．６５ｍｌ加え、溶液を攪拌させながら、室温にて２４時間放置した。これによって得られた半導体ナノ粒子は、正電荷を持ち、負電荷に帯電したＤＮＡやたんぱく質等に容易に吸着する。ここでは、この性質を利用したＤＮＡマイクロアレイへの応用例について説明する。ＤＮＡマイクロアレイとは、基板上に化学的に固定された多数の既知のプローブＤＮＡに対し、検定を行いたいサンプルＤＮＡをプローブ上に展開させ、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡの結合の有無および結合量により、サンプルの配列特性を知る方法である。今まで、ＤＮＡの結合の有無および結合量については、サンプルに対して蛍光物質あるいは放射性物質を修飾し、それらを光学的に検出することによって、結合の有無および結合量の測定を行う方法が一般的であった。本発明によれば、前もってサンプルに対して修飾する必要がないため、ＲＮＡ逆転写反応やＰＣＲ反応によるサンプルの前処理が不要であるという特徴をもつ。
【００２２】
ＤＮＡマイクロアレイ上にサンプルＤＮＡ溶液を滴下し、カバーグラスを静置した後、ＣＨＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いて、密閉環境下で１６時間反応させた。
反応後、スライドガラスを取り出し、２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中にスライドガラスを浸漬してカバーグラスを取り除いた後、ＣｄＳ半導体ナノ粒子濃度１．２×１０17個ｍｏｌ・ｄｍ-3を含む２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中に２時間浸漬した。その後、２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて２０分間振とうし、０．２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて２０分間振とうをおこなった。さらに非特異吸着サンプルを除去するために、０．２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中で５５℃にて２０分間振とうし、同様な操作を再度繰り返した。その後０．２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて数回振とうを行い、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣのそれぞれの溶液中で室温にて数回振とうさせた。以上の浸漬および洗浄工程は、いずれも染色壷を用いて行った。その後、遠心乾燥させたスライドガラスは、落射式蛍光顕微鏡を用い、半導体ナノ粒子の蛍光波長のみをフィルタリングして解析を行った。その結果、ＤＮＡマイクロアレイの各スポットから鮮やかな赤色の蛍光発光が測定された。本実施例により、半導体ナノ粒子を用いる各種反応において、乾燥状態での半導体ナノ粒子の光学的測定が反応測定に役立つことが分かった。
本方法は、生体高分子マイクロアレイ全般に応用することができ、ＤＮＡマイクロアレイだけでなく、たんぱく質マイクロアレイ等の同様の原理を持った他の生体高分子マイクロアレイおよびセンサーへ応用可能である。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、半導体ナノ粒子を用いる反応の反応測定を、簡便にかつ再現性良く行うことが可能となった。また、半導体ナノ粒子の品質評価を簡便に行うことが可能となり、品質指標を明示することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】半導体ナノ粒子溶液の基板への滴下のイメージ図。
【図２】コンピュータによる解析画面例。
【図３】化学的に修飾された半導体ナノ粒子を用いてＤＮＡを検出することを説明する模式図。
【符号の説明】
１：基板、２：プローブＤＮＡ、３：サンプルＤＮＡ、４：正電荷を持った半導体ナノ粒子。
【図１】
0003955225.tif 000002
【図２】
0003955225.tif 000003
【図３】
0003955225.tif 000004