(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基を有する担体分子と、前記アミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基に反応可能な少なくとも１つの官能基を有する蛍光剤との蛍光抱合体の製造方法であって、水溶性大環状化合物を１〜４０％（ｗ／ｖ）含む前記大環状化合物の水溶液と、前記担体分子及び前記蛍光剤とを接触させることからなる製造方法。
【請求項２】
水溶性大環状化合物は、所望により置換されたシクロデキストリン、及び、親水性基で置換されたカリックスアレーンから選択される請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
水溶性大環状化合物は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、及び、２，６−ジ−Ｏ−メチルヘプタキス−β−シクロデキストリンから選択されるシクロデキストリンである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
水溶性大環状化合物は、構造
0003955638.tif 000025
式中：
−Ｒa及びＲbはそれぞれ、Ｈ、（ＣＨ2）pＣＯ2Ｈ、（ＣＨ2）pＯＨ、（ＣＨ2）pＮＨ2、（ＣＨ2）pＳＯ3Ｈ及び（ＣＨ2）pＮ+ＲcＲdＲeから選択される親水性基である；
−Ｒc、Ｒd及びＲeはそれぞれ、水素又は（Ｃ1〜Ｃ3）アルキルである；
−ｐは、Ｒbについては０〜４の範囲であり、Ｒaについては１〜４の範囲である；及び
−ｔは１〜５の範囲である
のカリックスアレーンである請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
大環状化合物の水溶液は、大環状化合物を１０〜４０％（ｗ／ｖ）含有するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
蛍光剤は、１以上の芳香環を有し、高いモル吸光係数を有する発色団である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
蛍光剤は、
*下記構造のシアニン
0003955638.tif 000026
*下記構造のヘミシアニン
0003955638.tif 000027
*下記構造のメロシアニン
0003955638.tif 000028
又は
0003955638.tif 000029
*下記構造のスチリル化合物
0003955638.tif 000030
*下記構造のローダミン
0003955638.tif 000031
又は
0003955638.tif 000032
*下記構造のフルオレセイン
0003955638.tif 000033
*下記構造のナフトフルオレセイン
0003955638.tif 000034
以上の構造中：
−破線はそれぞれ、１〜３個の縮合環の形成に必要な炭素原子を表し、これらの環に基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9が結合する；
−Ｘ及びＹはそれぞれ、
0003955638.tif 000035
である；
−ｍは１、２、３又は４という値を持つ；
−基Ｒ1〜Ｒ7の少なくとも１つは、アミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基と反応可能なものであり、以下から選択される：
0003955638.tif 000036
式中、ｎは０〜８の範囲であり、ｐは０又は１に等しく、Ａｒは、１〜３個のヘテロ原子を有し所望によりハロゲン原子で置換された５又は６員のヘテロ環である、基Ｒ1〜Ｒ7のうち上記反応性基の１つを表さないものは、水素及び基−（ＣＨ2）r−Ｚから選択される、ここでｒは０〜４の範囲であり、Ｚは基ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3である、ここでＲ1、Ｒ2及びＲ3は上述したものである、そして、基Ｒ8及びＲ9の少なくとも１つは基ＳＯ3-又はＳＯ3Ｈであり、他の基は水素又は基ＳＯ3-若しくはＳＯ3Ｈである
から選択されるものである請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
蛍光剤は、構造
0003955638.tif 000037
式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は請求項７で規定したものである、のシアニンである請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
シアニンの構造中、Ｘ及びＹがそれぞれ基Ｃ（ＣＨ3）2である請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
シアニンの構造中：
−Ｒ1及びＲ2はそれぞれ、基
0003955638.tif 000038
であり；
−Ｒ3、Ｒ4及びＲ7はそれぞれ水素であり；
−Ｒ8及びＲ9はそれぞれ基ＳＯ3-であり；そして
−ｍは２に等しい
請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
シアニンの構造中：
Ｒ1は基
0003955638.tif 000039
であり；
Ｒ2はエチルであり；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ7はそれぞれ水素であり；
Ｒ8及びＲ9はそれぞれ基ＳＯ3-であり；そして
ｍは２に等しい
請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
担体分子は、抗体、抗原、たんぱく質、ペプチド、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、リボヌクレアーゼ、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、薬剤、重合体、重合体粒子、ガラス、ガラス粒子、又は、ガラス若しくは重合体表面である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法で得られる蛍光抱合体。
【請求項１４】
水溶性大環状化合物及び蛍光剤から形成される包接会合体が担体分子に結合して生成する請求項１３記載の蛍光抱合体。
【請求項１５】
包接会合体が抱合体の最終構造中に残留し、安定なロタクサンを形成する請求項１４記載の蛍光抱合体。
【請求項１６】
水溶性大環状化合物及び担体分子から形成される包接会合体が蛍光剤に結合して生成する請求項１３記載の蛍光抱合体。
【請求項１７】
包接会合体が抱合体の最終構造中に残留し、安定なロタクサンを形成する請求項１６記載の蛍光抱合体。
【請求項１８】
蛍光トレーサーとしての請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の蛍光抱合体の使用。
【請求項１９】
被検体を含有する可能性のある媒体中での蛍光によるその検出及び／又は定量のための請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーでの請求項１８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、非凝集性蛍光抱合体の製造方法に関する。また本発明は、この方法で得られる非凝集性蛍光抱合体、及び、蛍光トレーサーとしてのその使用にも関する。
J. Am. Chem. Soc. 63, 69（1941）に記載されているように、チオニン又はメチレンブルー等の疎水性染料が高濃度の水溶液中で自己凝集を起こすことはよく知られている。この凝集は吸収スペクトルに変化をもたらし、上記染料の蛍光を減少させる。
シアニンも凝集して蛍光を失うことが知られている（J. Phys. Chem. 69, 1894（1965））。
この凝集という現象は蛍光抱合体の製造において特に増大する。すなわちWaggonerらは、抗体とシアニンイソチオシアネートとの複合後に凝集が起こることを発見した。この同じ著者達は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを介してカップリングし、たんぱく質複合体に弱く凝集するという特性（この性質を著者達はシアニン環上のスルホネート基の存在に起因するものと考えている）を有するシアニンアリールスルホネート（ＵＳ特許５２６８４８６号）、及び、ナフタレンスルホネートに基づくシアニン（Bioconjugate Chemistry 7, 356-362（1996））を記載している。後者の記事では、非凝集プロセスにおけるスルホネートの数の重要性を明らかにしている。
しかしながら、ＵＳ特許５２６８４８６号で開示されているＣＹ５．１８という名のシアニンと抗ＨＣＧ抗体との抱合体（モル比＝１．７）の蛍光が、遊離のシアニンと比較すると失活することが報告されている（Anal. Biochem. 217, 197-204（1994））。
また本出願人は、同ＵＳ特許５２６８４８６号（実施例１及び２）で開示された化合物ＣＹ５．１８及びＣＹ５．２９で標識した抗前立腺癌及び抗甲状腺特異ホルモン抗体について実験を行った。これらの実施例は最終的な標識の度合に関わらず、シアニンの大幅な失活を示した。
最後に、同ＵＳ特許５２６８４８６号で著者達はフィコビリたんばく質の有用な代替物としてのシアニンの重要性を強調し、以下の利点：
−安定性
−低価格
−単純な標識化方法
−小分子の認識に適した大きさ
を強調している。
しかしながら、これらの利点はシアニンが抱合体に凝集するのが発見されて無意味となった。
シアニンの凝集という欠点を緩和するため、特許出願ＷＯ９６／００９０２号はその構造へのイミニウム基の導入を提案している。しかしながら上記特許出願は、低及び高濃度の含塩溶液中でＵＶスペクトルを比較することによる、そこに記載された構造の非凝集能力の評価に限定しており、抱合体に関する結果は示されていない。
同様に、発色団を含有する媒体へのシクロデキストリンの添加が誘発する蛍光の増大が、文献（J. Chromatog. 452（1988）; Macromolecules 10（3）,676-681（1977年5月〜6月））に記載されている。
逆に、シクロデキストリンの添加により失活する蛍光分子もある（Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry 18, 385-396（1994）, Kluwer Academic Publishers）。
シアニン−シクロデキストリン包接会合体の形成が文献（J. Am. Chem. Soc. 112, 5824-5830（1990））に記載されている。条件及びシクロデキストリンの性質に応じて単量体又は二量体の会合体を見ることができるが、これはシアニンの凝集に有利に作用するのでその蛍光は失活することになる。
包接会合体の蛍光特性を保つために、先行技術はシクロデキストリンの官能基が関係する共有結合について記載している（ＷＯ９１／０２０４０号）。
特許出願ＷＯ９１／０１０９０号は、シクロデキストリンに共有結合的に結びつき、次にたんぱく質に結合したユウロピウムのキレート体を記載している。
しかしながらこの種の結合は、シクロデキストリンの化学修飾（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレインイミド、チオール又はアミンの形に）を必要とするために形成が困難であり、また、以下の欠点を有する：
−包接会合体の性質を劣化させ、従って蛍光特性を減少させる；
−シクロデキストリンを生体適合性の官能基で標識化するとたんばく質の性質が劣化する。
本発明は、これらの欠点を克服しつつ、担体分子と蛍光剤との抱合体の特性を維持することを提案するものである。
すなわち本発明の第一の目的は、蛍光の強力な非凝集性抱合体を得ることにある。
本発明の別の目的は、上記蛍光抱合体を容易かつ迅速に得ることにある。
本発明の第一の側面によれば、以上の目的は、少なくとも１つのアミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基を有する担体分子と、上記アミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基に反応可能な少なくとも１つの官能基を有する蛍光剤との蛍光抱合体の製造方法であって、水溶性大環状化合物を１〜４０％（ｗ／ｖ）含む上記大環状化合物の水溶液と、上記担体分子及び上記蛍光剤とを接触させることからなる製造方法によって達成される。
その反応機構は以下のスキームで表すことができる：
0003955638.tif 000002
式中：
Ｆは蛍光剤であり、
Ｐは担体分子である。
担体分子Ｐは蛍光剤Ｆの官能基と反応する。これは分子間距離を保持し、蛍光剤が担体分子に近づくのを防ぐ効果があり、その結果として蛍光剤の凝集を減少させる。
大環状化合物の水溶液における大環状化合物の濃度は、好適には１０〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲である。
用いられる水溶性大環状化合物は、好適には、所望により置換されたシクロデキストリン、又は、親水性基で置換されたカリックスアレーンである。
本発明の製造方法で用いることができるシクロデキストリンの例としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、又は、２，６−ジ−Ｏ−メチルヘプタキス−β−シクロデキストリンを挙げることができる。
本発明の製造方法で用いることができるカリックスアレーンは、構造
0003955638.tif 000003
式中：
−Ｒa及びＲbはそれぞれ、Ｈ、（ＣＨ2）pＣＯ2Ｈ、（ＣＨ2）pＯＨ、（ＣＨ2）pＮＨ2、（ＣＨ2）pＳＯ3Ｈ及び（ＣＨ2）pＮ+ＲcＲdＲeから選択される親水性基である；
−Ｒc、Ｒd及びＲeはそれぞれ、水素又は（Ｃ1〜Ｃ3）アルキルである；
−ｐは、Ｒbについては０〜４の範囲であり、Ｒaについては１〜４の範囲である；及び
−ｔは１〜５の範囲である
を有するものである。
水溶性大環状化合物は蛍光剤又は担体分子のいずれかと包接会合体を形成することで、安定なロタクサン構造を形成する。この包接会合体は、本発明の製造方法で得られる蛍光抱合体の最終構造中に残留していてよい。
用いられる蛍光剤は一般に、１以上の芳香環を有する発色団であり、この発色団は２００００より上、好ましくは５００００より上という高いモル吸光係数を有するものである。
本発明のある好ましい態様によれば、上記蛍光剤は以下から選択される：
*下記構造のシアニン
0003955638.tif 000004
*下記構造のヘミシアニン
0003955638.tif 000005
*下記構造のメロシアニン
0003955638.tif 000006
又は
0003955638.tif 000007
*下記構造のスチリル化合物
0003955638.tif 000008
*下記構造のローダミン
0003955638.tif 000009
又は
0003955638.tif 000010
*下記構造のフルオレセイン
0003955638.tif 000011
*下記構造のナフトフルオレセイン
0003955638.tif 000012
以上の構造中：
−破線はそれぞれ、１〜３個の縮合環の形成に必要な炭素原子を表し、これらの環に基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9が結合する；
−Ｘ及びＹはそれぞれ、
0003955638.tif 000013
である；
−ｍは１、２、３又は４という値を持つ；
−基Ｒ1〜Ｒ7の少なくとも１つは、アミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基と反応可能なものであり、以下から選択される：
0003955638.tif 000014
式中、ｎは０〜８の範囲であり、ｐは０又は１に等しく、Ａｒは、１〜３個のヘテロ原子を有し所望によりハロゲン原子で置換された５又は６員のヘテロ環である、基Ｒ1〜Ｒ7のうち上記反応性基の１つを表さないものは、水素及び基−（ＣＨ2）r−Ｚから選択される、ここでｒは０〜４の範囲であり、Ｚは基ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3である、ここでＲ1、Ｒ2及びＲ3は上述したものである、そして、基Ｒ8及びＲ9の少なくとも１つは基ＳＯ3-又はＳＯ3Ｈであり、他の基は水素又は基ＳＯ3-若しくはＳＯ3Ｈである。上記式においてｐは好ましくは０に等しい。
より具体的に、下記構造のシアニン
0003955638.tif 000015
式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は上述したものである、が好適に用いられる。
シアニンの好ましい種類は、式中のＸ及びＹがそれぞれ基Ｃ（ＣＨ3）2である上記シアニンからなる。
これらシアニンの中でも、式中：
（ｉ）Ｒ1及びＲ2はそれぞれ５−（スクシンイミドオキシカルボニル）ペンチル基であり；Ｒ3、Ｒ4及びＲ7はそれぞれ水素であり；Ｒ8及びＲ9はそれぞれスルホネート基であり；そしてｍは２に等しい；あるいは
（ｉｉ）Ｒ1は５−（スクシンイミドオキシカルボニル）ペンチル基であり；Ｒ2はエチルであり；Ｒ3、Ｒ4及びＲ7はそれぞれ水素であり；Ｒ8及びＲ9はそれぞれスルホネート基であり；そしてｍは２に等しい
ものが好ましい。
少なくとも１つのアミノ基、水酸基、カルボキシル基及び／又はスルフヒドリル基を持つ担体分子は、一般に診断又は検出を目的とした生体分子である。この生体分子自身を、他の分子、特にたんぱく質の標識化に用いることができる。挙げることができる例としては、抗体、抗原、たんぱく質、ペプチド、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、リボヌクレアーゼ、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、薬剤、重合体、重合体粒子、ガラス、ガラス粒子、又は、ガラス若しくは重合体表面である。
本発明の製造方法には以下の利点がある：
−シクロデキストリンの官能基化を行わないことで時間と費用を節約できる；
−水溶性大環状化合物と蛍光剤との包接会合体を不可逆的に安定化させることができる（包接会合体は通常低い平衡定数を持つ）；
−得られた抱合体の蛍光の失活を、蛍光剤の化学構造に影響を与えずに回避することができる。実際、水溶性大環状化合物の会合特性は系中で蛍光剤を遠ざけることを可能にし、その分子間距離は抱合化及び抱合体の精製後にも保たれる。このように担体分子から蛍光剤を遠ざけると、凝集という現象が回避され、従って蛍光の失活が回避される。
本発明は別の側面によれば、上述した製造方法で得られる蛍光抱合体にも関する。
水溶性大環状化合物及び蛍光剤から形成される包接会合体並びに担体分子が、蛍光抱合体の最終構造中に残留する場合、蛍光剤は、蛍光剤の疎水性部分が大環状化合物内部を通るような形で、担体分子と結合する。
担体分子Ｐと蛍光剤Ｆがかさ高い基である場合、生じる会合体は安定であり、ロタクサンを形成しうる：
0003955638.tif 000016
得られる会合体は、シクロデキストリンが蛍光剤又は担体分子との共有結合を有しないので新規なものである。
上述したように、本発明の蛍光抱合体、特にロタクサン会合体は、担体分子から蛍光剤が遠ざかっているので蛍光の失活を示さない。
本発明の蛍光抱合体は優れた蛍光トレーサーであることが分かった。
すなわち、本発明は別の側面によれば、上述した蛍光抱合体の蛍光トレーサーとしての使用に関する。このトレーサーは、例えば、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー又は蛍光免疫診断で、好ましくは蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーで適用可能である。また本発明の蛍光抱合体は、被検体を含有する可能性のある媒体中での蛍光によるその検出及び／又は定量にも用いることができる。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、これらは単に例示にすぎない。
実施例１：抱合体の製造及びＵＶ分析
0003955638.tif 000017
0003955638.tif 000018
１／シクロデキストリンの存在の影響
抱合体ｎｏ．１
ｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液中に膵臓癌標識抗体（参照記号：ＣＡ１９−９）１ｍｇ／ｍＬを含有する試料を、構造１のスルホインドジカルボシアニン１７／１モル過剰と室温で混合した。２時間後、この試料をＳｅｐｈａｄｅｘ▲Ｒ▼Ｇ２５ゲルでろ過して精製した。
最終モル比シアニン／抗体は３．９０であった。
ＵＶラインは６５０と６０５ｎｍに見られた。比ＯＤ650／ＯＤ605は１．６２であった。６０５ｎｍラインの出現は凝集及び蛍光分子の失活を示している。
抱合体ｎｏ．２
ｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液を調製し、ここにヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン４０％（ｗ／ｖ）を溶かした。
抱合体ｎｏ．１の調製で用いた抗体をこの緩衝液に透析し、ここに構造１のスルホインドジカルボシアニンの溶液を加えた。
初期モル比シアニン／抗体は１７／１であった。
２時間後、この試料をＳｅｐｈａｄｅｘ▲Ｒ▼Ｇ２５ゲルで精製した。
ＵＶ分析で６５０と６０５ｎｍにラインが見られた。
最終モル比シアニン／抗体は５．８９であり、３．１８というＯＤ650／ＯＤ605比が得られた。
この実施例は、シアニン−シクロデキストリン複合体の使用が、抱合体ｎｏ．１の場合に見られる凝集という現象の回避を可能にすることを明らかにしている。
抱合体ｎｏ．３
抗ＰＳＡ抗体（ＰＳＡ＝前立腺特異抗原）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に透析した。
抗体０．８５ｍｇ／ｍＬを含有する溶液を構造１のスルホインドジカルボシアニンと接触させた。初期モル比シアニン／抗体は１５／１であった。
２時間後、この試料をＳｅｐｈａｄｅｘ▲Ｒ▼Ｇ２５ゲルで精製した。
生成物をＵＶで分析した。６５０と６０５ｎｍにラインが見られた。最終モル比シアニン／抗体は４．５４であり、１．４０というＯＤ650／ＯＤ605比が得られた。
抱合体ｎｏ．４
この製造方法は、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン１５％（ｗ／ｖ）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に加えたこと以外は、抱合体ｎｏ．３の製造で記載したものと同様である。
この抱合体はＵＶ分析で以下の結果を与えた：
ＯＤ650／ＯＤ605＝２．６０
最終モル比シアニン／抗体＝０．９６
抱合体ｎｏ．３と比べて比ＯＤ650／ＯＤ605に大幅な増加が見られた。このことは、凝集の著しい減少及び大きく減少した失活を意味する。
抱合体ｎｏ．５と６
この製造方法は、抗コリオゴナドトロピンホルモン抗体を３ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、蛍光マーカーとして構造３のフルオレセインを使用するが、それぞれ抱合体ｎｏ．１と２のものと同様である。カップリングｐＨは９であり、インキュベーション時間は３０分である。
ＵＶ分析で４９７と４６２ｎｍにラインが見られた。
結果を表１にまとめた：
0003955638.tif 000019
フルオレセイン誘導体のカップリング時におけるシクロデキストリンの存在は、光学密度比ＯＤ497／ＯＤ462を増加させ、従って凝集という現象を低減することを可能にした。（フルオレセイン誘導体自身のＵＶスペクトルはライン比が２．４であった。）
抱合体ｎｏ．６はフルオレセインの点でより性能が優れている。
２／シクロデキストリンの性質の影響
偽ライン：シアニンの場合は６０５ｎｍ及びローダミンの場合は５２２ｎｍの出現に対するシクロデキストリンの性質の影響を評価するために、別種のシクロデキストリン（抱合体７〜１２）について試験を行った。比較のため、シクロデキストリンを含まない２つの参考抱合体（抱合体ｎｏ．１３と１４）についても試験を行った。
以下の実験条件を適用して、抱合体ｎｏ．２の製造で記載した方法で抱合体７〜１０及び１３を得た：
抗体の性質：抗ＰＳＡ抗体
抗体の濃度：０．７５ｍｇ／ｍＬ
ｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液中のシクロデキストリンの濃度：１３（又は０）％（ｗ／ｖ）
初期モル比シアニン／抗体：１７／１
インキュベーション時間：２ｈ
２時間後、遊離のシアニンを４０００ｇ５分間の遠心分離によりＡｍｉｃｏｎコーンで抽出した。次にこの試料をＳｅｐｈａｄｅｘ▲Ｒ▼Ｇ２５ゲルで精製した。
以下の実験条件を適用して、抱合体ｎｏ．２の製造で記載した方法で抱合体１１、１２及び１４を得た：
蛍光マーカー：構造４のローダミン
抗体の性質：抗コリオゴナドトロピンホルモン抗体
抗体の濃度：４ｍｇ／ｍＬ
ｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液中のシクロデキストリンの濃度：１０（又は０）％（ｗ／ｖ）
初期モル比ローダミン／抗体：１７／１
インキュベーション時間：３０分
結果を表２にまとめた。
0003955638.tif 000020
２つのβ−シクロデキストリンで得られた比ＯＤ650／ＯＤ605（２．６と２．５５）の高い値は、構造１のシアニンを凝集させない能力を示している。これらの値は高い安定定数をも反映している。
構造４のローダミン誘導体に関して、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用は、著しく光学密度比を増加させた結果、凝集効果を減少させることを可能にした。
３／カップリング濃度の影響
濃度は凝集という現象で重要な因子である。
従って、異なる濃度の抗体について試験を行った。
以下の実験条件を適用して、抱合体ｎｏ．２の製造で記載した方法で抱合体を得た：
抗体の性質：抗ＰＳＡ抗体
初期モル比シアニン／抗体：１７／１
カップリング時間：２ｈ
シクロデキストリンの性質：ジメチル−β−シクロデキストリン
ｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液中のシクロデキストリンの濃度：１３％（ｗ／ｖ）
結果を表３にまとめた：
0003955638.tif 000021
３ｍｇ／ｍＬという濃度で、高い最終モル比シアニン／抗体（２．３）が良好な比ＯＤ650／ＯＤ605（２．４５）とともに得られた。
これらの値を、２．６という最終モル比シアニン／抗体が低い比ＯＤ650／ＯＤ605（１．４５）とともに得られた表２の値と比較すべきである。
従って本発明の製造方法は、良好な比ＯＤ650／ＯＤ605を保ちつつ、最終モル比シアニン／抗体を増加させることを可能にする。
４／シクロデキストリンの濃度の影響
以下の実験条件を適用して、抱合体ｎｏ．２の製造で記載した方法で抱合体を得た：
抗体の性質：抗ＴＳＨ抗体（ＴＳＨ＝甲状腺刺激ホルモン）
初期モル比シアニン（構造２の）／抗体：１７／１
カップリング時間：１ｈ
シクロデキストリンの性質：ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
Ａｍｉｃｏｎコーンで抽出した後、抱合体をＳｅｐｈａｄｅｘ▲Ｒ▼Ｇ２５ゲルで精製した。
結果を表４にまとめた。
0003955638.tif 000022
表４はシクロデキストリンの割合の影響を明らかに示している。
質量作用の法則は、シクロデキストリンの濃度が増加すると抱合体の形成の方向に移動させる。
実施例２：抱合体の蛍光性能特性
選択した被検体はＰＳＡである。
ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ  ＬＳ５０蛍光分析機で測定を行った（発光のλｍａｘ＝６６０ｎｍ）。
２つの媒体で試験した。
−媒体１：ｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液
−媒体２：媒体１＋１／３新生子ウシ血清
抱合体ｎｏ．２１は抱合体ｎｏ．２の調製で記載した方法で製造した。
抱合体ｎｏ．２２と２３は、抗体濃度がそれぞれ０．１と０．３ｍｇ／ｍＬであること以外は、抱合体ｎｏ．１の調製で記載した方法で製造した。
結果を表５にまとめた：
0003955638.tif 000023
表５の試験は本発明の製造方法の全ての利点を示した：
−全ての場合で、会合体シアニン＋シクロデキストリンと製造した抱合体（抱合体ｎｏ．２１）は、シアニンと製造しシクロデキストリンを含まない抱合体（抱合体ｎｏ．２２と２３）よりも蛍光が優れている。
−血清の存在下で、製造した抱合体の失活がなかった。
実施例３：イムノアッセイでの性能
イムノアッセイは、G. Mathis in Clin. Chem., vol.39, no.9, 1993に記載された均一法で行った。
異なる濃度の抗原を含む標準試料を使用して、抱合体２１、２２及び２３の性能特性を互いに比較した。
結果を表６にまとめた：
0003955638.tif 000024
量は蛍光単位で表示した。
この表は明らかに、抱合体２２及び２３と比較して抱合体２１で見られた蛍光の増加分（表５）がイムノアッセイにも反映されたことを示している。
従ってシクロデキストリンとともに製造した抱合体は、イムノアッセイの測定感度を上昇させることができる。