(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を有効成分とする神経芽細胞腫の放射線感受性増強剤。
【請求項２】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有効成分とする神経芽細胞腫の放射線感受性増強剤。
【請求項３】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸を有効成分とする神経芽細胞腫の放射線感受性増強剤。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする神経芽細胞腫の放射線感受性増強剤。
【請求項５】
配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする神経芽細胞腫の放射線感受性増強剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、癌放射線治療における放射線感受性増強剤、並びに放射線感受性増強核酸およびタンパク質に関する。さらに詳しくは、ヒト神経芽細胞腫の第１番染色体短腕３６位（以下ｌｐ３６という）に共通に存在しうるホモ接合性欠失（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）領域内遺伝子の核酸情報、並びに該核酸、或いは該核酸がコードするタンパク質等の治療または診断用途（特に、癌放射線治療において癌細胞の放射線感受性増強）に関する。
背景技術
従来から、癌（悪性腫瘍）に対する治療として外科的療法、化学療法、免疫療法、温熱療法、および放射線療法が行われている。放射線療法は、単独で用いられるほか、前記他の療法と併用され、多くの悪性腫瘍において高い局所制御率を示し、有効な治療法である。
腫瘍細胞の放射線感受性は、酸素濃度が下がると、低下することが知られている。放射線治療が有効であるためには、治療される領域で放射線感受性に関して、腫瘍細胞＞正常細胞であることが前提であるので、酸素の代わりに、腫瘍細胞の放射線感受性を増強する薬剤の開発が進められている。このような薬剤の１例は、低酸素細胞放射線増感剤と呼ばれ、酸素性細胞（正常細胞）には放射線感受性の増強はなく、低酸素性細胞（腫瘍細胞）に対してのみ増強作用を有する。ニトロイミダゾール誘導体が前記放射線増感剤として知られており、ミソニダゾールおよびエタニダゾール等の化合物が開発されてきたが、増感活性が得られる用量では、神経毒性が強すぎることなどから、実用には至っていない。放射線抵抗性腫瘍の治療に放射線感受性を増強する薬剤の併用が望まれるが、報告されている放射線感受性増強剤（放射線増感剤等）の多くは、この神経毒性が開発上での問題となっている。
また、アクチノマイシンＤ、メトトレキセート、ヒューロマイシンのような核酸やタンパク質の合成阻害剤、５−フルオロウラシルのような核酸塩基のハロゲン誘導体などは、酸素の有無に拘わらず放射線感受性増強効果があることが知られているが、これらは細胞の正常な機能を阻害することによってその効果を呈する。
さらに、ある条件下では、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）により、ある種の腫瘍細胞が放射線に対する感受性を高め得ることが報告されている。Ｈａｌｌａｈａｎらは、インビトロで放射線照射の４〜８時間前に、ＳＣＣ−６１腫瘍細胞に対しＴＮＦを添加すると、腫瘍細胞の殺傷力が強められることを示した。Ｈａｌｌａｈａｎら，Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．７５−７６（１９９３）を参照。さらに、ＴＮＦによる前処理は、ヒト白血病細胞系ＨＬ−６０，Ｋ５６２，Ｕ９３７の放射線に対する感受性を高め得るという報告もある。Ｗｏｎｇら，Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ，Ｓ．Ｎｉｇａｍ，ｅｄ．（１９９３），Ｃｈ．７０  ｐｐ．３５３−３５７。しかし、ＴＮＦが特定の腫瘍細胞の放射線に対する感受性を果たして増強するか否かを含めて、そのメカニズムについては、不明のままである。
一方、「放射線感受性増強剤」と正反対の作用を有する「放射線防御剤」という薬剤も考えられている。これは、放射線によって生じる遊離基を中和し、放射線障害からの組織の回復を亢進する目的の薬剤である。具体的には、システイン等、ＳＨ基をもつ化合物群が探索されている。放射線防御剤は、放射線感受性を低下させ、実質的に耐容線量を増加させる。従って、このような薬剤は、内部被爆、または骨髄障害等の放射線障害の治療に役立つ可能性がある。
ヒト紳経芽細胞腫（以下、単に紳経芽細胞腫ともいう）は、胎児交感神経前駆細胞から発生する悪性腫瘍で、小児固形癌では、最も頻度の高いものである。この腫瘍に対する治療法は外科切除が基本であるが、進行した症例では化学療法や放射線療法が選択される。神経芽細胞腫は放射線感受性の高い腫瘍ではあるが、治療の経過により放射線感受性の低下が認められるようになる。しかしながら、紳経芽細胞腫についても放射線感受性のメカニズムに関しては、ほとんど解明されておらず、放射線治療が難航した場合の解決法は見出されていない。
発明の要約
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、放射線療法における悪性腫瘍細胞の放射線感受性低下のメカニズムを解明し、それに基づいて放射線感受性の低下を防止することを目的とする。さらに、前記メカニズムに関係する遺伝子の情報を明らかにし、その情報に基づいて悪性腫瘍細胞の放射線に対する感受性を増強し、放射線療法の治癒率を向上させる放射線感受性増強剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記目的に従い、鋭意研究を重ねた結果、ある種のヒト神経芽細胞腫細胞株が、他の細胞株と比べて放射線に対する感受性が極端に低いことを見出した。さらに、前者の細胞株に欠失している遺伝子類を同定し、これらの遺伝子の欠失が放射線感受性を低下させ、逆にこれらの遺伝子の導入は、放射線感受性を増大させることを確認した。その際、前記遺伝子類は、少なくともとＰＥＸ１４遺伝子と新規なＵＦＤ２関連タンパク質（以下、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２という）遺伝子とを含むことを見出した。ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のｃＤＮＡ配列（塩基配列）およびそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に、それぞれに示す。また、ＰＥＸ１４のｃＤＮＡ配列（塩基配列）およびそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号３および４に、それぞれ示す。
かかる知見に基づき、本発明者は、悪性腫瘍細胞の放射線感受性の制御を可能にして、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の１〜１６に記載の核酸、およびタンパク質（その部分ペプチドを含む）、またはその薬学的に許容できる塩の治療上または診断用上の用途を提供する。
１．配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸。
２．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
３．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
４．配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を有効成分とする放射線感受性増強剤。
５．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有効成分とする放射線感受性増強剤。
６．配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸を有効成分とする放射線感受性増強剤。
７．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする放射線感受性増強剤。
８．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能的に有効な断片である部分ペプチド、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする放射線感受性増強剤。
９．配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする放射線感受性増強剤。
１０．配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能的に有効な断片である部分ペプチド、またはその薬学的に許容できる塩を有効成分とする放射線感受性増強剤。
１１．配列表の配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸を単独で、または作動的に連結された適当な調節および発現制御因子とともに含む組換えウイルスベクター。
１２．以下の（ａ）または（ｂ）の核酸を含む核酸プローブ：
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸。
１３．以下の（ａ）または（ｂ）の核酸を含む核酸プローブ：
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸。
１４．臨床的に単離したヒト神経芽細胞腫株から配列表の配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸、またはその断片の有無を検出することからなる、該ヒト神経芽細胞腫株の放射線療法への感受性を判定する方法。
１５．配列表の配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸に対するアンチセンス核酸を有効成分とする放射線防御剤。
１６．配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸、或いは配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効量、ヒト神経芽細胞腫の治療を要する患者に投与することからなる、該患者における放射線療法でのヒト神経細胞芽腫の放射線感受性を増強する方法。
１７．配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸、或いは配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を有効量、ヒト神経芽細胞腫の治療を要する患者に投与することからなる、該患者における放射線療法でのヒト神経芽細胞腫の放射線感受性を増強する方法。
１８．配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸と配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸、或いは配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩と配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩とを有効量、ヒト神経芽細胞腫の治療を要する患者に共投与することからなる、該患者における放射線療法でのヒト神経細胞芽腫の放射線感受性を増強する方法。
発明を実施するための最良の形態
本明細書で用いる、「配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質」とは、配列番号１に記載の核酸がコードするタンパク質のみならず、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、且つ該タンパク質と実質的に同等の活性（放射線感受性増強）を有するタンパク質をも意味する場合がある。前記実質的に同一のアミノ酸配列は、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列である。「配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質」も、全く同様の定義を有し、配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸がコードするタンパク質のみならず、それと実質的に同等の活性（放射線感受性増強）を有するタンパク質をも意味する場合がある。
また、本明細書で用いる、「配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸」とは、配列番号１に記載の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有し、且つ前記核酸と実質的に同等の活性（放射線感受性増強）を有する核酸をも意味する場合がある。前記実質的に同一の塩基配列は、例えば上記変異体タンパク質をコードする核酸である。「配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸」も、全く同様の定義を有し、配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有し、且つ前記核酸と実質的に同等の活性（放射線感受性増強）を有する核酸をも意味する場合がある。これら核酸およびタンパク質の変異体は、部位特異的突然変異等の当業者に公知の手法で、前記核酸の塩基配列情報に基づき、調製することができる。
さらに、本明細書で用いる、「タンパク質をコードする塩基配列」とは、縮退を考慮した表現であり、該タンパク質に対応するｃＤＮＡとして表わされる塩基配列と異なる塩基配列をも意味する。すなわち、１つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は、複数個存在するので、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列も単一ではなく、配列番号１に記載の塩基配列には限定されない。そこで、前記表現には、配列番号１に記載の塩基配列以外で、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列が包含される。
本明細書で用いる「核酸」とは、上記で定義したタンパク質または該タンパク質の機能的に有効な断片である部分ペプチドをコードするか、或いはそのようなタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸に相補的であるか、さらにそのような核酸に「ストリンジェント」な条件下、ハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。このような核酸の形態としては、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられる。「核酸」がＤＮＡを指す場合、上記配列番号で示されるように一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）を通常、意味するが、それに相補的な一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、さらに、これらの両者を含む二本鎖ＤＮＡも「核酸」の定義に含まれる。
また、上記「ストリンジェント」な条件とは、サムブルックらの成書（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣｌｏｎｅｄＧｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５−１１．６１）に記載されている。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行なった後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することをいう。ストリンジェンシーの選択のために、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温（約２２℃）から高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
また、本明細書で用いる、「放射線感受性」とは、放射線によって腫瘍細胞がどの程度殺傷されるかを意味する。「放射線感受性増強剤」とは、作用機序のいかんに拘わらず、放射線感受性を増強（向上）する薬剤（放射線増感剤または放射線感作剤ともいう）を指し、低酸素細胞放射線増感剤に限らない。「放射線防御剤」とは、作用機序のいかんに拘わらず、放射線感受性を低下させる薬剤を指す。
以下、本発明の構成および好ましい実施の形態について、詳しく説明する。
神経芽細胞腫では、ｌｐ３６の欠失が高頻度に起こっており、このｌｐ３６領域に癌制御遺伝子が存在することが予想されていた。本発明者は、神経芽細胞腫の約４００症例について、ｌｐ３６でのＬＯＨ（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：ヘテロ接合性の喪失）解析を行った。その結果、共通の欠失領域（約８〜１０Ｍｂ）が見出された。さらに、多数の神経芽細胞腫由来の細胞株からゲノムＤＮＡを抽出し、スクリーニングしたところ、２つの細胞株（ＮＢ１およびＭＡＳＳ−ＮＢ−ＳＣＨ−１株）で前記共通の欠失領域内にホモ接合性欠失が見出された。そこで、この共通の欠失領域に神経芽細胞腫の発生および生物学的特性を制御する重要な遺伝子が存在すると考えた。
前記共通の欠失領域のシークエンシングを含めて、遺伝子情報を得るためにＰＡＣクローンを用いてコンティングを作成した。国際出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０５９３０号にその詳細が開示されている。さらに、コンティングの作成に使用した幾つかのプライマーセットをキーワードとして、遺伝子マップデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ９９／）およびＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を検索したところ、数々の既知の遺伝子がヒットし、これらが共通の欠失領域に存在することが確認された。該遺伝子の塩基配列情報を表１に整理して示す。
0003979939.tif 000002
本発明者は、これらの遺伝子群のなかで、ＰＥＸ１４とＵＦＤ２とに着目し、神経芽細胞腫の細胞でのそれらの機能について、検討した。その過程で得られた、これら２種類の互いに全く異なる生理活性を有する蛋白をコードする遺伝子が共に前記細胞の放射線に対する感受性に深く係っているという知見に本発明は基づく。
ヒトＰＥＸ１４（ＨｓＰＥＸ１４）は、ヒトペルオキシゾーム結合蛋白（ＨｓＰｅｘ１４ｐ）をコードする遺伝子であり、同蛋白はペルオキシゾーム蛋白のトランスポート機構に関与する中心的なタンパク質であることが知られている。さらに、ヒトＰＥＸ１４は、ペルオキシゾーム−バイオジェネシス関連疾患の候補遺伝子とみなされている。ヒトＰＥＸ１４の全ｃＤＮＡ配列およびＨｓＰｅｘ１４ｐの推定アミノ酸配列はともに、Ｇ．Ｋ．Ｗｉｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９  ２２６５−２２７７（１９９９）に報告されている。さらに、同一の配列がＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）に登録されている（登録番号ＮＭ００４５６５）。
ＵＦＤ２は、酵母で分離されたユビキチン経路に関与する蛋白であるが、そのはっきりした機能は不明であった。近年、ユビキチン連結システム内でユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン連結酵素（Ｅ３）とともに働くユビキチン化因子Ｅ４と同一であることが示された（Ｋｏｅｇｌら、Ｃｅｌｌ，９６，６３５−６４４（１９９９））。ＵＤＦ２（Ｅ４）は、標的タンパク質が前記酵素群によってユビキチン化されるとき、ポリユビキチン鎖を延長する作用を担っているとされる。ポリユビキチン化されたタンパク質は、次いでプロテアソームによって分解される。かくして、ユビキチン／プロテアソーム系は、細胞内タンパク質の分解において、中心的な役割を果たす。酵母ＵＤＦ２のヒトホモローグとして、Ｎａｇａｓｅらによって登録されているＫＩＡＡ０６８４蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．：登録番号ＡＢ０１４５８４）が特定されたが（Ｋｏｅｇｌら、上掲）、より長鎖のヒトＵＤＦ２のアミノ酸配列の全長、およびそれをコードするｃＤＮＡ配列は、同じくＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）に登録されている（登録番号ＡＦ０４３１１７、Ｂ．Ｌｕｂｙｏｖａら）。
しかしながら、本発明者が、神経芽細胞腫の細胞株の数種でその発現を確認した遺伝子は、ＡＦ０４３１１７として登録された配列の一部が欠失しており、該配列よりも３８７ｂｐ短かった。さらに、この欠失領域を除いて、該遺伝子の配列は前記登録配列と完全な同一性を示した。そこで、これをＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２と名付けた。注目すべきは、調べた神経芽細胞腫細胞株（ＣＨＰ１３４、ＧＯＴＯ／Ｐ３、ＳＫＮ−ＳＨ、ＴＧＷ）でＬｕｂｙｏｖａらのヒトＵＤＦ２の発現が全く見られず、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の発現のみが観察されたことである。
本発明は、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２（配列番号２）またはＰＥＸ１４（配列番号４）（以下、特に、両者を区別する必要のないとき、個別にまたは総称として本発明に係るタンパク質という）、或いはそれぞれをコードする遺伝子（以下、特に、両者を区別する必要のないとき、個別にまたは総称として本発明に係る遺伝子という）の核酸（配列番号１または配列番号３）（以下、特に、両者を区別する必要のないとき、個別にまたは総称として本発明に係る核酸という）を癌放射線治療において、放射線感受性増強剤として用いることを要旨とする。
さらに、本発明に係る遺伝子のいずれか、または両方がｌｐ３６ホモ接合性欠失領域において欠失していると、そのような神経芽細胞腫株の放射線に対する感受性が低いことが見出された。
従って、本発明に係るタンパク質（その機能的な断片である部分ペプチドを含む）、本発明に係る核酸（その断片を含む）、および該核酸に対するアンチセンス核酸は、以下に詳述するように神経芽細胞腫およびその他の癌に関しての診断、および放射線療法に用いることが可能である。
（１）診断上の有用性
本発明に係るタンパク質、核酸、並びに前記タンパク質に対する抗体は、以下の診断上の有用性を備える。
すなわち、これらの分子は、種々の検定法により神経芽細胞腫での発現量のレベルを測定することで、その神経芽細胞腫の放射線に対する感受性の判定に使用することが可能である。
本発明に係るタンパク質に対する抗体を用いる検定法としては、特に限定はされないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドウィッチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテインＡ免疫検定法をはじめとする種々の技法を使用した競合的、非競合的な検定法が挙げられる。
また、本発明に係る核酸を診断に用いる場合は、ハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用し、試料神経芽細胞腫細胞中の遺伝子（すなわち、本発明に係る遺伝子）発現のレベルを調べることにより、該細胞の放射線への感受性を判定することが可能である。遺伝子発現の増強の有無を調べるには、例えば、本発明に係る核酸の任意の配列とハイブリダイズし得る塩基配列をプローブとして使用する全て方法が考慮される。好ましくは、放射性同位元素等で標識されたプローブをサザン、またはノーザンブロッティングに用い、検定する。また、ＰＣＲのプライマーとして使用する場合は、例えば、検定したい試料（細胞）からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することも可能である。
（２）治療上の有用性
本発明に係る核酸およびタンパク質は、放射線感受性増強剤であることから癌（特に、神経芽細胞腫）放射線治療における補助剤としての有用性を備える。
典型的には、本発明に係る核酸またはタンパク質を含む医薬組成物を、治療を要する患者に対して、放射線治療の前に有効量（すなわち、適当な投与量）、投与する。配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸および配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸は、それぞれ単独で医薬組成物に含めて投与されてもよいし、両方の合剤として医薬組成物に含めて投与されてもよい。同様に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩および配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩も、それぞれ単独で医薬組成物に含めて投与されてもよいし、両方の合剤として医薬組成物に含めて投与されてもよい。
本発明に係るタンパク質の発現量が増加している場合、アンチセンス核酸、中和抗体、または前記タンパク質に対する競合的阻害剤等を含む医薬組成物を投与し、該タンパク質発現量の抑制、或いは機能阻害を行うことも可能となる。結果として、このような医薬組成物を投与された患者は、放射線に対する感受性の低下を経験する。
特に、上記の目的で本発明に係る核酸を放射線感受性増強剤として用いる場合は、該核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子として治療を要する患者の体内で発現させ、続いて放射線治療を行なう。配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸および配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸は、それぞれ単独で前記ベクターに導入されてもよいし、両方同時に導入されてもよい。
前記核酸が導入されうるベクターは、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。このようなウイルスベクターの種類は特に限定されないが、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等が用いられる。
また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質で置換する、或いは遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの核酸配列で置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ２６３−（１９９６））。
さらに、遺伝子導入を可能にするウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス由来でないベクターとしては、リン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに、遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
前記のようなベクターに本発明に係る核酸を導入して、遺伝子発現させるのに、発現プロモーターを備えた発現カセットを用いるのが好ましい。
発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく、いかなるものでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができるが、好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットが選択される。
前記発現カセットには、本発明の核酸の他、遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および／または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノムＤＮＡ配列内に効率よく該遺伝子を挿入するためのウイルス由来の遺伝子配列、遺伝子発現により産生されるタンパク質を細胞外に分泌および／細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、いかなる配列でも用いることが可能である。
発現カセットに用いられるプロモーターとしては、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーター等が挙げられる。
（３）医薬組成物
本発明に係る核酸およびタンパク質は、適当な医薬組成物として放射線療法に供される。このため、該核酸等を下記の調剤方法に従い、製剤化し、好ましい投与経路を設定して、望ましい放射線感受性増強効果を達成するように投与量を決定する。
（調剤法）
本発明に係る核酸、またはタンパク質を含む医薬組成物は、特に限定はされないが、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への被包、組換え細胞による発現、レセプター媒介飲食法、レトロウイルスまたは他のベクターの部分としての医薬品への構築が可能である。
より具体的には、本発明に係る核酸を含む組換えウイルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明に係る核酸を含む組成物を調製できる。また、本発明に係るタンパク質を水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明に係るタンパク質を含む組成物を調製できる。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して、調製してもよい。さらに、前記組成物は、所望ならば薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等を含み、これが好ましい場合が多い。これらの製剤化の助剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６（１９８０）（Ｍａｃｋ出版社）に詳しく記載がある。
本発明に係るタンパク質は、その薬学的に許容できる塩として塩形態で医薬組成物に製剤化されてもよい。薬学的に許容できる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるもののようにタンパク質、またはヘプチドの遊離のアミノ基と形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるもののようにタンパク質、またはヘプチドの遊離のカルボキシル基と形成されるものが含まれる。
（投与法、投与量）
本発明に係る医薬組成物は、適切な投与経路を設定して、患者に投与されると望ましい放射線感受性増強効果をもたらす。医薬組成物を生体へ投与するとき、その投与方法については、特に制限はない。しかし、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内へ注射投与することが好ましい。または、連続して、血流内に投与できるように注入等の他の投与方法も好ましい。特に好ましい投与の形態は、静脈内への投与である。本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、投与を受ける患者の状態、年齢、体重、性別、その他により異なるが、処置する医者は、該患者に最適な投与量を決定することが可能である。例えば、注射投与する場合には、１日用量約０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましくは、１日用量約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
（４）放射線療法
本発明で企図される放射線療法は、当該技術分野で一般に用いられており、当業者に知られているプロトコルに従って、実施することができる。例えば、セシウム、イリジウム、ヨード、またはコバルト照射が前記放射線療法に含まれる。放射線療法は、全身照射（急性白血病、悪性リンパ腫、一部の固形癌に対して）であってもよいが、腫瘍のある箇所、組織（固形癌に対して腹部、肺、肝臓、リンパ節、頭部等）に局所的に照射するのが好ましい。典型的には、放射線療法は、一日２〜３分で、２５〜３０回（約５〜６週間）に分けて行われる。
好ましい実施の形態においては、本発明に係る医薬組成物が、放射線療法に先立って、患者に投与される。放射線療法が連続して施される場合、前記投与も連続的であり得る。
本発明の放射線感受性増強剤は、元来放射線感受性の高くない悪性腫瘍、或いは放射線治療の結果として放射線耐性を取得した悪性腫瘍の放射線療法において、補助剤として併用できる。
また、本発明の放射線感受性増強剤は、腫瘍細胞の放射線感受性を増強することによって、治療に適用される線量を下げることができ、治療期間（暴露時間）を通常のプロトコルで定められた期間よりも延長できる。さらに、放射線療法に必然的に伴う、放射線障害による副作用（例えば、口内炎、骨髄障害、放射線潰瘍、放射線肺炎）を軽減できる。
（５）対象癌
本発明の放射線感受性増強剤が放射線療法の補助剤として、有効に使用できる対象は、通常放射線療法が行なわれ得る癌であれば、特に制限はない。特に、放射性感受性の高いとされる癌に適しているが、感受性の低いとされる癌でも本発明の増感剤は、放射線感受性を高めうるので放射線治療効果の向上が期待できる。
本発明の放射線感受性増強剤によって治療の対象とされる悪性腫瘍としては、以下のものが代表的である。すなわち、急性白血病、慢性白血病、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、ウイルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫、悪性リンパ腫、Ｈｏｄｇｋｉｎｓ病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、胸腺腫、基底細胞癌、偏平上皮癌（子宮頚癌）、乳癌、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）腫、肺癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、卵巣癌、唾液腺癌、奇形腫、悪性黒色腫、神経膠腫、胃癌、大腸癌、直腸癌、腎細胞癌、骨肉腫等である。
（６）アンチセンス核酸
本発明の別の実施の形態に従えば、本発明に係る遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を使用して、治療効果が達成される。ここで、「アンチセンス核酸」とは、配列のある程度の相補性により、本発明に係る遺伝子のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部とハイブリダイズしうる核酸をいう。
アンチセンス核酸は、二本鎖、一本鎖、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡ（該ＲＮＡをコードする）であるオリゴヌクレオチド、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、またはそれらのキメラ混合物のいずれの形態でも使用可能である。また、アンチセンス核酸は、特に限定はされないが、好ましくは５〜２００個の範囲のオリゴヌクレオチドからなる。このようなオリゴヌクレオチドは、その塩基部分、糖部分、リン酸骨格のいずれの部分が修飾されていてもよい。
また、具体的な一形態として、アンチセンス核酸は触媒ＲＮＡ、リボザイム、あるいはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体としても使用可能である。
アンチセンス核酸は、当業者に公知の方法で、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用することにより合成することが可能である。
特定的には、このようなアンチセンスＤＮＡは、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ配列を有する。またこのようなアンチセンスＲＮＡは、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするＲＮＡのすくなくとも一部に相補的なＲＮＡ配列を有する。
本発明に係るアンチセンス核酸は、本発明に係る遺伝子からタンパク質が製造される過程（転写、翻訳等）で、遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズして、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて、該タンパク質の生合成を阻害する。従って、本発明に係る遺伝子が存在する細胞は、前記アンチセンス核酸の導入によって、その放射線感受性の低下がもたらされる。
アンチセンス核酸を放射線防御剤として治療目的で使用するとき、前述のように他の核酸と同様に、医薬組成物として、患者に投与できるが、特に好ましくは、特定の細胞に直接投与することもできる。さらに、アンチセンス核酸であるＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターで細胞を形質転換、またはトランスフェクションして、転写により該アンチセンス核酸を細胞内で生成させることもできる。
（７）抗体
本発明のさらに別の実施の形態に従えば、本発明に係るタンパク質に対する抗体、或いはその結合ドメインを有する断片を上述のように診断薬として用いることも可能である。すなわち、抗体が本発明に係るタンパク質等を検出、測定する様々な免疫検定法に使用可能である。
前記抗体は、当業者に公知の手法に従い、本発明に係るタンパク質、部分ペプチド、それらの断片、類似体または誘導体を免疫原として作製することができる。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリー由来の抗体が挙げられる。
（実施例）
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
（実施例１）  ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のクローニング
データベースより得たＳＴＳマーカー  ＳＧＣ３０３４３の配列をもとに、５’−ＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＧ−３’と５’−ＴＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＡＡＡ−３’の２種類のプライマーを設計し、ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をプローブに用いて前記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ＳＧＣ３０３４３（クローン３１）をクローニングした。
ＳＧＣ３０３４３（クローン３１；３８０３ｂｐ）の配列をもとに５’側方向に２４ｍｅｒのＲＡＣＥ用プライマー（５’ｒａｃｅ１（ｎ．ｔ．１２４）、５’ｒａｃｅ２（ｎ．ｔ．６０））を２本作製した。神経芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリーのベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのクローニングサイトのＴ７側にプライマーを設計した（ｖｅｃｔｏｒ−Ｔ７）。前記ｒａｃｅプライマーとＴ７プライマーを用いて、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行なった。すなわち、第一増幅反応では、テンプレートＤＮＡ（神経芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリー）、プライマー（ｖｅｃｔｏｒ−Ｔ７、５’ｒａｃｅ１）、その他ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等を用いて、常法に従い、ＰＣＲを行なった。第二増幅反応では、テンプレートＤＮＡ（第一増幅反応産物を１／１００に希釈して使用）、プライマー（ｖｅｃｔｏｒ−Ｔ７、５’ｒａｃｅ２）、その他ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等を用いて、同様に常法に従い、ＰＣＲを行なった。
得られた５つのＰＣＲ産物のうちの１つが予想されたＳＧＣ３０３４３のＲＡＣＥプライマー５’上流部分を含んでいた。このようにして５’上流８４０ｂｐが単離できた。そのアミノ酸配列からインフレーム終止コドンが見つかり（Ｍｅｔから１３５ｂｐ上流）、その結果ＳＧＣ３０３４３は、４６３６ｂｐ（１１７３アミノ酸）であることが判明した。このＰＣＲ産物から制限酵素で開始コドンを含む断片を切り出し、前記クローン３１と連結して、完全長のＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２を得た。ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の塩基配列を５’非翻訳領域を含めて配列番号１に、翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示してある。なお、配列番号１に記載の塩基配列をＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬに登録した（登録番号：ＡＢ０２８８３９）。配列番号１に記載の塩基配列は、公表されているヒトＵＦＤ２（ＡＦ０４３１１７、上掲）の配列と比較して、３８７ｂｐ短い。ヒトＵＦＤ２では、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の２７０番目のコドン以降に１２９個のアミノ酸がインフレームに挿入されている。この領域での両者間のアミノ酸配列をアライメントした比較を図１に示す。また、配列番号１に記載の塩基配列は、マウスＵＦＤ２の登録されている塩基配列と９７．４％の相同性を示す。
（実施例２）  ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子発現の組織依存性
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって、ヒト正常組織ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）におけるＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子発現の組織依存性を調べた。
まず、実施例１で得られたＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子の一部を用いて、適当なＰＣＲプライマーを合成した。別途、前記ｍＲＮＡを常法に従い、ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ反応は、ｒＴａｑ（宝酒造社製）を使用して、以下の条件で行った。すなわち、２μｌのｃＤＮＡ、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０ｘｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃（１５秒間）、５８℃（１５秒間）、７２℃（２０秒間）を１サイクルとして、３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で２０分間放置した。また、陽性対照として、ＧＡＰＤＨを用いて、同様のＰＣＲ反応を行った。これらの反応液を２．５％アガロースゲルで電気泳動した。結果を図２に示す。図中、上段部分は、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子の検出結果を表し、下段部分は対照ＧＡＰＤＨの検出結果を表わす。ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子発現は、特に組織依存性が見られず、ほぼ全てのヒト臓器で現れた。
（実施例３）  ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のユビキチンリガーゼ活性
ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のユビキチンリガーゼ活性をインビトロユビキチン付加再構成系で試験した。具体的には、ＡＴＰ、大腸菌の細胞抽出物（代用基質、粗Ｅ２）、大腸菌由来Ｅ２（ＵｂｃＨ７精製体）、酵母から抽出したＥ１、およびユビキチン（蛋白精製）、さらにＥ３（ユビキチンリガーゼ）を３７℃で２時間、チューブ内でインキュベートした。反応系は、ユビキチン酵素の他に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  ＡＴＰを含んでいた。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下、分離して抗ユビキチン抗体でブロットした。Ｅ３活性がある場合、低分子領域から高分子領域にかけてスメア様のバンドが検出されることになる。Ｅ３は、陽性対照に比較的強いユビキチンリガーゼ活性が知られているＮＥＤＤ４、およびＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２をＧＳＴ融合蛋白として使用した。後者については、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のＣ末端に位置するＵ−ｂｏｘ領域をＧＳＴ融合蛋白とした。結果を図３に示す。図中、レーン１はＮＥＤＤ４を用いたときの結果であり、スメア様バンドが検出されている。レーン２もＮＥＤＤ４を用いたときの結果であり、ここでは代用基質としての大腸菌抽出液を除いてインキュベーションした。スメア様バンドが検出されている。レーン３はＧＳＴ蛋白のみを用いたとき（陰性対照）の結果であり、スメア様バンドが検出されていない。レーン４はＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２を用いたときの結果であり、レーン全域にわたってスメア様バンドが検出されている。これらの結果から、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の強いユビキチンリガーゼ活性が明らかとなった。Ｅ４は、Ｅ３が存在しないユビキチン合成系で、Ｅ３と同様の活性を示すことが知られており（Ｋｏｅｇｌら、前掲、図３）、上記の結果はこれと矛盾しない。
（実施例４）  神経芽細胞腫細胞株Ｃ２０１へのＰＥＸ１４またはＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子の導入
組換えウイルスベクター
レトロウイルスベクターｐＬＸＮのＨｐａＩ部位に、ＰＥＸ１４（九州大学理学部生物学科藤木幸男教授より入手し、その配列を決定した）、ＨＤＮＢ−１／ＵＤＦ２（実施例１）の全長ＯＲＦをｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化後、Ｔａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２を用いてそれぞれ組み込み、組換えウイルスベクターを作製した。同様に、大腸菌ＤＨ５αにＰＥＸ１４、またはＨＤＮＢ−１／ＵＤＦ２をトランスフォームし、アンピシリン耐性遺伝子を発現しているコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素で挿入された遺伝子の方向性を確認して、以下の実験に供した。
トランスフェクション
６ｃｍ  ｄｉｓｈにｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるように培養した、ｅｃｏｔｒｏｐｈｉｃなパッケージング細胞Ψ２に、前記それぞれの組換えウイルスベクターを、ｇｉｂｃｏＢＲＬ  ｆｕｇｅｎｅ６を用いてトランスフェクションした。
インフェクション
Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）で２週間選択したΨ２細胞ウイルスをａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃなパッケージング細胞ＰＡ３１７に感染させ、高力価ウイルス液を得た。前記ウイルスをＣ２０１株に感染させ、Ｇ４１８で選択しｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性のクローンを複数個得た。得られたクローンをそれぞれＣ２０１（ＰＥＸ１４）、Ｃ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）と名付けた。
ノーザンブロット解析
上記で得られたクローン（Ｃ２０１（ＰＥＸＴ４）およびＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２））からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出して、その３０μｇをホルマリン含有１％アガロースゲルで電気泳動した。その後、ナイロンメンブレンにトランスファーした。ＰＥＸ１４およびＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のｃＤＮＡを３２Ｐでラベルしたプローブを作製し、これらをメンブレンに６５℃でハイブリダイズさせた。メンブレンを、ＳＳＣ／Ｓａｒｃｏｓｉｎｅを用いて、５０℃で洗浄した。乾燥後、メンブレンを−７０℃でフィルムに感光させたところ、目的の遺伝子（ＰＥＸ１４およびＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）が発現していることが確認された。
（実施例５）  Ｘ線照射試験およびＭＴＴアッセイ
実施例４で得られたＣ２０１（ＰＥＸ１４）およびＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）の培養液を、６０Ｇｙガンマ線を用いて、放射線照射した。照射の条件は、メバトロンＫＤＺＩＩを用いて、出力１０ＭＶ、Ｄｍａｘ２５ｍｍ、照射野４０ｘ４０ｃｍであった。対照として、他の神経芽細胞腫細胞株（ＧＯＴＯ、ＣＨＰ１３４、ＳＹ５Ｙ）、さらに上記のレトロウイルスベクターのみをウイルス細胞に感染させた細胞株（Ｃ２０１（ｎｅｏ））の培養液を調製し、前記と同一の条件で放射線照射した。
放射線照射後、試験培養液と対照培養液のそれぞれについて、水溶性ホルマザンの発色を利用するＭＴＴ法を用いて、生細胞数を測定した。具体的には、まず対数増殖期にある付着細胞を分散させて、５ｘ１０４／ｍｌになるように計測調整した。次いで、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに細胞分散液を１００μｌずつ播種した。プレートを炭酸ガスインキュベーターの中で一晩培養した。培養後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）溶液を各ウエル１０μｌずつ添加し、さらにインキュベーター中で、２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。測定は、３回行い、平均値および標準偏差をグラフ化した。
測定結果を細胞の生存率として放射線照射後の経過日数に対して、プロットしたものが図４である。図４から明らかなように、試験したＣ２０１以外の神経芽細胞腫細胞株では放射線照射後、２日以内にほとんどの細胞が死滅した。対照的に、細胞株Ｃ２０１（ｎｅｏ）は、放射線照射後、１週間経過しても約６０％の細胞が生存していた。
しかしながら、Ｃ２０１細胞にＰＥＸ１４またはＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の遺伝子をトランスフェクトにより導入した、Ｃ２０１（ＰＥＸ１４）およびＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）細胞は、放射線照射後、６日目に約８０％近い細胞が死滅していた。従って、前記遺伝子導入Ｃ２０１細胞の放射線感受性が、対照であるＣ２０１（ｎｅｏ）に比較して有意に増加したことが分かった。
放射線感受性における有意差をさらに検証するために、複数のＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）クローンと対照Ｃ２０１（ｎｅｏ）（これも複数）間での放射線感受性を比較、検討した。すなわち、上記のようにそれぞれのクローンについて、放射線照射後、生細胞数をＭＴＴ法で測定した。測定結果を図５に示す。Ｃ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）の細胞生存率は、対照より明らかに低下していた。これは、調べたＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）組胞株の放射線感受性がいずれも改善され、対照より有意に増加したことを示す。加えて、細胞生存率は、これらのＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）細胞株においてほぼ一定のパターンで減少していた。従って、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子の導入の結果、細胞株によらず放射線感受性の増強は、Ｃ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）で普遍的に起こり、この遺伝子またはその発現が増強作用をもたらすことが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明の核酸の一つであるＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２は、神経芽細胞腫のなかで発現されるＵＦＤ２関連タンパク質であり、本発明は、１つのＵＦＤ２関連遺伝子の塩基配列情報を明らかにした。
本発明の核酸またはその断片は、プローブ或いはプライマーとして、各種ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法に使用でき、その核酸が一部をなす遺伝子をヒト神経芽細胞腫株から検出することによって、該ヒト神経芽細胞腫株の放射線療法への感受性の判定を可能とする。
本発明に係る遺伝子（ＰＥＸ１４またはＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）を放射線感受性の低下したヒト神経芽細胞腫株に導入すると、その放射線感受性が顕著に増強されるので、このようなヒト神経芽細胞腫を患う患者に前記遺伝子またはそれがコードするタンパク質等を投与し、放射線治療を行なうと治療効果が向上する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係る遺伝子であるＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２の推定アミノ酸配列とデータベースに登録されているヒトＵＦＤ２（ＡＦ０４３１１７）の推定アミノ酸配列との比較を表わすアライメント図である。
図２は、ヒト正常組織におけるＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出した結果を示す電気泳動図である。
図３は、ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２のユビキチンリガーゼ活性を示すイムノブロットした電気泳動図である。
図４は、本発明に従い、ＰＥＸ１４およびＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２遺伝子を導入した神経芽細胞腫細胞株Ｃ２０１、並びにその他の神経芽細胞腫細胞株を放射線照射し、各細胞株の細胞生存率を放射線照射後の経過日数に対して、プロットした図である。
図５は、複数のＣ２０１（ＨＤＮＢ−１／ＵＦＤ２）細胞株と対照Ｃ２０１（ｎｅｏ）株を放射線照射し、各細胞株の細胞生存率の経時変化を各株についてプロットして、それぞれの放射線感受性の比較を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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