(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点が５以上のアルカリプロテアーゼ及びアルカリカルボヒドラーゼから選ばれる酵素を含有する水溶液に、炭素数５以上のビニル系炭化水素−無水マレイン酸共重合体であるポリカルボン酸類を、pH４〜６において添加し、生じた沈澱を回収することを特徴とする酵素の回収方法。
【請求項２】
炭素数５以上のビニル系炭化水素−無水マレイン酸共重合体が、ジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体又は１−オクテン−無水マレイン酸共重合体である請求項１記載の回収方法。
【請求項３】
ｐＨが４．５を超え６以下である請求項１又は２記載の回収方法。
【請求項４】
ｐＨが５〜６である請求項１又は２記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不純物を含有する酵素水溶液から酵素を失活させることなく、効率的に分離、回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を含有する水溶液から酵素を分離する方法として、従来、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等の無機塩類による塩析法、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーを用いた沈澱分画法、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等の有機溶媒による溶剤沈澱法等が提案されている。
【０００３】
しかし、塩析法及び水溶性ポリマーを用いた沈澱分画法では塩類及びポリマーを大量に使用するため、環境に対して問題があり、溶剤沈澱法ではコスト、安全性の点からこれらの使用に限界があることが知られている。
【０００４】
また、酵素の一つであるベータアミラーゼを回収する方法として、その溶液に、ポリアクリル酸、加水分解されたエチレン−無水マレイン酸共重合体及び加水分解されたメチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体からなる群より選ばれたポリカルボン酸をpH３〜４．５の範囲で混合し、生じた沈澱を分離、回収する方法が開示されている（特開昭５０−５５８８号公報）が、pH３という強酸性下では、多くの酵素は、その活性を失ってしまう。また、不純物を含有する溶液は通常着色しているが、その色相はこの方法では改善されず、得られる酵素も着色したものとなってしまうという問題があった。一方、酵素を含有する水溶液をその酵素の等電点以上のpHとし、高分子アニオン電解質と高分子カチオン電解質とを添加し、酵素を不溶化させ分離する方法が報告されている（特開昭６３−３０４９８３号公報）。
しかしながら、この方法は酵素含有水溶液のpHをその酵素の等電点以上にしなければならないため、洗剤に使用されるアルカリ酵素のうち等電点の高い酵素は、等電点を超えるpHすなわち強アルカリ下においては失活するおそれがあり、好ましくない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、酵素を失活させることなく、これを不純物を含有する溶液から効率的に分離、回収する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、酵素を含有する水溶液に、特定のポリカルボン酸類をpH４〜６において添加し、生じた沈澱を分離すれば、効率よく色相の改善された酵素を回収することができることを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、等電点が５以上のアルカリプロテアーゼ又はアルカリカルボヒドラーゼから選ばれる酵素を含有する水溶液に、炭素数５以上のビニル系炭化水素−無水マレイン酸共重合体であるポリカルボン酸類を、pH４〜６において添加し、生じた沈澱を回収することを特徴とする酵素の回収方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明が適用される酵素は、特に限定されないが、等電点が５以上のもの、特に洗浄剤等に使用されるアルカリ酵素が好ましい。このような酵素としては、アルカリプロテアーゼ、アルカリエステラーゼ、アルカリカルボヒドラーゼ、リアーゼ等が挙げられる。このうち、プロテアーゼの具体例としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ケラチナーゼ、エラスターゼ、ズブチリシン、パパイン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等を挙げることができる。
また、エステラーゼの具体例としては、ガストリックリパーゼ、パンクレアチックリパーゼ、植物リパーゼ類、ホスホリパーゼ類、コリンエステラーゼ類、ホスファターゼ類等が挙げられる。
カルボヒドラーゼとしては、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、α−及びβ−グリコシターゼ等が挙げられる。
リアーゼとしては、カルボキシ脱離酵素、アルデヒド脱離酵素、オキソ酸脱離酵素、ヒドロリアーゼ、多糖に作用する脱離酵素、アンモニアリアーゼ等が挙げられる。
【０００９】
本発明で用いられる炭素数５以上のビニル系炭化水素−無水マレイン酸共重合体の炭素数５以上のビニル系炭化水素としては、ヘキセン、ジイソブチレン、スチレン、１−オクテン、２−オクテン、１−デセン、１−ドデセン、１−テトラデセン等が挙げられ、メタクリル酸エステル−無水マレイン酸共重合体のメタクリル酸エステルとしては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸ドデシル等が挙げられ、このうちジイソブチレン、スチレンが好ましい。これら、ポリカルボン酸類の平均分子量は１０００〜１０万、特に２０００〜５万の範囲のものが好ましい。またこれらポリカルボン酸類は、１種でも２種以上を混合して用いてもよく、その添加量は、酵素に対し２０重量％以上、特に５０〜１００重量％とすることが好ましい。この添加量は多くなるほど回収率は高くなるが、回収物の酵素濃度は低くなるので好ましくない。
【００１０】
上記の如く、特定のポリカルボン酸類を添加し、pHを４〜６にすると、等電点がこれより高い酵素はカチオン性の高分子となり、これにポリカルボン酸類が吸着し、不溶化し、沈澱を生じると考えられる。一方、溶液中の不純物はアニオン性のものが多いため沈澱せず溶液中に残存すると考えられる。
【００１１】
溶液のpHは４〜６であるが、４．５を超え６以下がより好ましく、５〜６が特に好ましい。当該pHが４未満の場合には、酵素の失活が激しいのに対し、４〜６の範囲内では比較的安定である。また、不純物を含む酵素溶液の色相は、pH４〜６、特に５〜６の範囲で前記処理をすると酵素沈澱物側から残存溶液側に移行するので色相の改善された酵素を得ることができる。
【００１２】
なお、pHの調整は、前記のポリカルボン酸の添加により自動的になされるが、必要に応じて塩酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酪酸、リン酸等のpH調整剤を添加してもよい。
【００１３】
ポリカルボン酸類を添加し、pHを４〜６とすることにより徐々に沈澱が生じる。このようにして得られた沈澱は、遠心分離や簡単な濾過等の手段により容易に分離することができ、これは懸濁状で酵素活性を有するため、そのまま利用することができる。
【００１４】
また、分離された沈澱をアルカリ溶液中に溶解すれば、ポリカルボン酸類が遊離するため酵素のみを分離精製することができる。ここでアルカリ溶液のpHは、８以上、特に８〜１０が好ましい。酵素の具体的な分離方法としては、イオン交換クロマトグラフ、ゲル濾過クロマトグラフ、透析、膜分離等が容易であり好ましい。
【００１５】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素を含有する水溶液から、酵素を失活させることなく色相の改善された酵素を効率的に分離、回収することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例、試験例においてジイソブチレン、無水マレイン酸共重合体はすべて花王（株）製デモールＥＰを用いた。
【００１７】
実施例１
（１）酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（Bacillus sp. KSM-K16(FERM P-3367)由来、等電点１０．６）を含む水溶液（酵素蛋白質濃度：１．５重量％）を用いた。この水溶液に、水溶液中の酵素蛋白質量に対し、重量比で０．３〜１倍となるようにアニオン性高分子としてジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体（表１中Ａと略す）を添加し、クエン酸でpHを５にし、サンプルを調製した。
（２）液中に沈澱物が形成されたので、これを遠心分離により沈澱物と上清にわけ、それぞれの酵素活性を測定して活性収率を計算により求めた。この結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
サンプル（添加剤、酵素蛋白質量：添加剤量（重量比））  活性収率（％）
コントロール                                              ０
サンプル１（Ａ，１：０．３）                            ６８
サンプル２（Ａ，１：０．６）                            ９０
サンプル３（Ａ，１：０．９）                            ９０
【００１９】
実施例２
（１）酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（Bacillus sp. KSM-K16(FERM P-3367)由来）を含む水溶液（酵素蛋白質濃度：１．５重量％）を用いた。この水溶液に、水溶液中の酵素蛋白質量に対し、重量比で０．１〜０．５倍となるようにアニオン性高分子としてスチレン−無水マレイン酸共重合体（花王（株）製、デモールＳＴ）（表２中Ａと略す）を添加し、クエン酸でpHを５にし、サンプルを調製した。
（２）液中に沈澱物が形成されたので、これを遠心分離により沈澱物と上清にわけ、それぞれの酵素活性を測定して活性収率を計算により求めた。この結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
サンプル（添加剤、酵素蛋白質量：添加剤量（重量比）    活性収率（％）
コントロール                                              ０
サンプル１（Ａ，１：０．１）                            ４６
サンプル２（Ａ，１：０．３）                            ８０
サンプル３（Ａ，１：０．５）                            ８０
【００２１】
実施例３
（１）酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（Bacillus sp. KSM-K16(FERM P-3367)由来）を含む水溶液（酵素蛋白質濃度：１．５重量％）を用いた。この水溶液に、水溶液中の酵素蛋白質量に対し、重量比で０．２〜１倍となるようにアニオン性高分子として１−オクテン−無水マレイン酸共重合体* （表３中Ａと略す）を添加し、クエン酸でpHを５にし、サンプルを調製した。
＊１−オクテン−無水マレイン酸共重合体は下記条件で合成した共重合体を使用した。
１−オクテン／無水マレイン酸＝１：１重量比
過酸化ベンゾイル：１−オクテンと無水マレイン酸の総量に対し０．０１重量％
反応温度：８０〜８５℃
反応時間：４時間
（２）液中に沈澱物が形成されたので、これを遠心分離により沈澱物と上清にわけ、それぞれの酵素活性を測定して活性収率を計算により求めた。この結果を表３に示す。
【００２２】
【表３】
サンプル（添加剤、酵素蛋白質量：添加剤量（重量比））  活性収率（％）
コントロール                                              ０
サンプル１（Ａ，１：０．５）                            ６２
サンプル２（Ａ，１：１）                                ７３
【００２３】
実施例４
（１）酵素水溶液として、アミラーゼ活性を有する粗酵素（Bacillus sp. KSM-AP1378(FERM BP-3048)由来、等電点９．２）を含む水溶液（酵素蛋白質濃度：０．３重量％）を用いた。この水溶液に、水溶液中の酵素蛋白質量に対し、重量比で０．２〜０．５倍となるようにアニオン性高分子としてジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体（表４中Ａと略す）を添加し、クエン酸でpHを５にし、サンプルを調製した。
（２）液中に沈澱物が形成されたので、これを遠心分離により沈澱物と上清にわけ、それぞれの酵素活性を測定して活性収率を計算により求めた。この結果を表４に示す。
【００２４】
【表４】
サンプル（添加剤、酵素蛋白質量：添加剤量（重量比））  活性収率（％）
コントロール                                              ０
サンプル１（Ａ，１：０．２）                            ７５
サンプル２（Ａ，１：０．４）                            ８０
【００２５】
実施例５
プロテアーゼ粗酵素水溶液（１．５重量％）１００mlに、ジイソブチレン−無水マレイン酸（重量比０．５倍）添加後クエン酸によりpH５に調整し、遠心分離により沈澱物を得た。
この沈澱物を回収し、１００mMグリシンＮａＯＨ緩衝液（pH９．５）を１００ml加え、沈澱物を溶解した。この結果、プロテアーゼ活性の７６％が回収され、色素成分の７０％が除去された。
【００２６】
試験例１
酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（実施例１で得られたもの）を用いた。この水溶液に、水溶液中の酵素蛋白質量に対し、重量比で０．５倍になるようジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体を添加し、pHをクエン酸で３〜５に調整し、沈澱を得、これを水溶液と分離した。この沈澱を分離した水溶液と等量の１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．５）に再溶解し、上清の吸光度（ＡＢＳ５００）を測定した。結果を表５に示す。
【００２７】
【表５】
0003887054.tif 000002
【００２８】
この結果から、反応時のpHを下げれば着色した不純物が沈澱側に移行することがわかる。従って、本発明のpH範囲で回収された酵素は色相が改善される。
【００２９】
試験例２
酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（実施例１で得られたもの）に、ジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体（花王（株）製デモールＥＰ）を０．３％（重量／体積）添加し、５０℃１０分の熱処理後の残存活性を測定した。結果を表６に示す。なおpHはクエン酸で調整した。
【００３０】
【表６】
0003887054.tif 000003
【００３１】
試験例３
酵素水溶液として、プロテアーゼ活性を有する粗酵素（実施例１で得られたもの）に、ジイソブチレン−無水マレイン酸共重合体（花王（株）製デモールＥＰ）を０．３％（重量／体積）添加し、下記温度で３日間保存後の残存活性を測定した。結果を表７に示す。なおpHはクエン酸で調整した。
【００３２】
【表７】
0003887054.tif 000004
【００３３】
上記試験例２及び３から、本発明方法によって得られた沈澱は、ポリカルボン酸類を分離しなくとも、安定な酵素として用いることができることが判る。