(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９および配列番号１８からなるグループから選択されるヌクレオチド配列によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体のアミノ酸配列を有する腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸分子であって、前記単離核酸分子が配列番号９または配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がｃＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子がｇＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
その相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号９のヌクレオチド１−２８１５からなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする、単離核酸分子であって、ただし、前記相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号８とはハイブリダイズしない、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子に対して相補的である、単離ｍＲＮＡ分子。
【請求項７】
プロモーターに作用するように（operatively）リンクした請求項１に記載の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項８】
プロモーターに操作可能に（operably）リンクした、請求項３に記載の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが誘導性のプロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた、細胞系または細胞株。
【請求項１１】
請求項８に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた、細胞系または細胞株。
【請求項１２】
前記細胞系が真核細胞系である、請求項１０に記載の細胞系。
【請求項１３】
前記細胞系がげっ歯類細胞系およびサルの細胞系からなるグループから選択される、請求項１２に記載の細胞系。
【請求項１４】
前記細胞系がＣＯＳ細胞系およびＣＨＯ細胞系からなるグループから選択される、請求項１３に記載の細胞系。
【請求項１５】
前記細胞系が真核細胞系である、請求項１１に記載の細胞系。
【請求項１６】
前記細胞系がげっ歯類細胞系またはサルの細胞系からなるグループから選択される、請求項１５に記載の細胞系。
【請求項１７】
前記細胞系がＣＯＳ細胞系およびＣＨＯ細胞系からなるグループから選択される、請求項１６に記載の細胞系。
【請求項１８】
ＣＴＬ含有サンプルにおいてＨＬＡ分子と請求項１に記載の単離核酸分子によってコードされるタンパク質に由来するペプチドとからなる複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の存在を判定する方法であって、前記サンプルとその表面上に前記複合体を提示する細胞とを接触させる工程、および、（ｉ）細胞溶解性Ｔ細胞の増殖、または（ｉｉ）前記複合体を提示する細胞の溶解を、前記サンプルにおける前記細胞溶解性Ｔ細胞の判定として、判定する工程、を有する、ＣＴＬ含有サンプルにおいてＨＬＡ分子と請求項１の単離核酸分子によってコードされるタンパク質に由来するペプチドとからなる複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の存在を判定する方法。
【請求項１９】
腫瘍壊死因子放出を測定することによって細胞溶解性Ｔ細胞の増殖を判定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞からの放射能標識された物質の放出を測定することによって前記細胞の溶解を判定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記放射能標識された物質が51Ｃｒである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記複合体を提示する前記細胞が、（ｉ）ＨＬＡ分子をコードする核酸分子、および（ｉｉ）請求項１の単離核酸分子、の少なくともいずれかによってトランスフェクトまたはトランスフォームされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、（ｉ）ＨＬＡ分子をコードする核酸分子、および（ｉｉ）請求項１に記載の核酸分子、の両方によってトランスフェクトまたはトランスフォームされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の単離核酸分子によってコードされる、単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
【請求項２５】
請求項３に記載の単離核酸分子によってコードされる、単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
【請求項２６】
配列番号１のヌクレオチド１８−３４の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１のヌクレオチド２００−２１７に対して相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリメラーゼ連鎖反応を基礎とするアッセイにおいて有用なキット。
【請求項２７】
サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子の発現を判定するための方法であって、前記サンプルと、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１８−３４からなる配列を有するオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド２００−２１７に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、とを（ｉ）または（ｉｉ）の配列のＭＡＧＥ−Ｃ１コード配列へのハイブリダイゼーションに好適な条件下で接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、および、前記サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ１コード配列の存在を判定するために発現産物を判定する工程、を有する、サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子の発現を判定するための方法。
【請求項２８】
その相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号１８に示すヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする、単離核酸分子であって、ただし、前記相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号８とはハイブリダイズしない、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子。
【請求項２９】
サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の発現を判定するための方法であって、前記サンプルと、（ｉ）配列番号１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）配列番号１６に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、とを（ｉ）または（ｉｉ）の配列のＭＡＧＥ−Ｃ２コード配列へのハイブリダイゼーションに好適な条件下で接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、および、前記サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ２コード配列の存在を判定するために発現産物を判定する工程、を有する、サンプルにおけるＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の発現を判定するための方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の単離核酸分子でトランスフェクトまたはトランスフォームされた、細胞系または細胞株。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、１９９７年４月２５日出願で、参考文献として本出願にその内容を合体させる、出願番号第０８／８４５，５２８号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、核酸分子に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に関し、その腫瘍拒絶抗原前駆体は、とりわけ、ＨＬＡ−Ａ１およびその対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｃｗ*１６０１、ＨＬＡ−Ｂ４４などの多くのＭＨＣ分子によって提示されるペプチドへとプロセシングされ得るものである。１つの好適な実施態様である、ＭＡＧＥ−Ｃ１は、現在までに知られているＭＡＧＥファミリーのその他のメンバーと部分的なホモロジーを共有するものであるが、およそ２ｋｂ大きい。
ＭＡＧＥ−Ｃ２は、もう１つの好適な実施態様である。これらの核酸分子は様々な腫瘍においてと正常な精巣細胞において発現するが、その他の正常な細胞によっては発現されない。
背景および従来技術
哺乳類の免疫系が外来のまたは異質の物質を認識して、それらと反応するプロセスは複雑なものである。このシステムの重要な局面は、Ｔリンパ球、即ち“Ｔ細胞”応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“ＨＬＡ”）、または、主要組織適合遺伝子複合体（“ＭＨＣ”）と称される細胞表面分子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、その複合体と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセシングされるより大きな分子に由来する。この点に関しては、メール（Male）他，Advanced Immunology（J．P．Lipincott Company，1987），特にその６−１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体の相互作用は制限されたものである。即ち、ＨＬＡ分子とペプチドとの特定の組み合わせに対して特異的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在していても、それに特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対する免疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対する応答に関与している。タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研究がなされてきている。この事については、バリナガ（Barinaga），Science 257：880（1992）；フリーモント（Fremont）他，Science 257：919（1992）；マツムラ（Matsumura）他，Science 257：927（1992）；ラトロン（Latron）他，Science 257：964（1992）を参照。
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムはガンにも関係している。たとえば、１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公表で、参考文献として本出願にその内容を合体させるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、一つの遺伝子ファミリーが開示されており、それらはプロセシングされてペプチドとなり、次に細胞表面に発現され、特異的な細胞溶解性Ｔリンパ球（“ＣＴＬ”）によって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができる。これら遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体”即ち“ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われ、これら分子に由来するペプチドは、“腫瘍拒絶抗原”即ち“ＴＲＡ”と称される。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴァーサリ（Traversari）他，Immunogenetics 35：145（1992）；ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他，Science 254：1643（1991）を参照。また、参考文献として本出願にその内容の全体を合体させる、米国特許第５，３４２，７７４号および米国特許第５，４６２，８７１号も参照。
その開示内容を本出願に参考文献として合体させる、米国特許第５，４０５，９４０号において、プロセシングされてＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドになる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするＭＡＧＥ−１遺伝子が説明されている。ＨＬＡ−Ａ１に結合するノナペプチドは、あるモチーフを満足するという点で結合に関する“ルール”に従う。この事については、たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７４２１；フォーク（Falk）他，Nature 351：290-296（1991）；エンゲルハルト（Engelhard），Ann．Rev．Immunol．12：181-207（1994）；ルパート（Ruppert）他，Cell 74；929-937（1993）；レチュケ（Roetzschke）他，Nature 348：252-254（1990）；ビヨルクマン（Bjorkman）他，Nature 329：512-518（1987）；トラヴァーサリ（Traversari）他，J．Exp．Med．176：1453-1457（1992）を参照。前記参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分子に対して結合するが、他のＨＬＡ分子に対しては結合しないであろうと推測される、ということを教示している。異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するため、ある特定のペプチドが、ある特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであると同定されたことが、診断上および治療上の効果を有しているとしても、その効果はその特定のＨＬＡ表現型を有する個体のみに対するものである。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られるものではないため、また、標的化療法（targeted therapy）には、問題の異常細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、この分野において更なる研究を行う必要がある。
参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９４年８月１１日出願で現在米国特許第５，６２９，１６６号となっている、米国特許出願第２８８，９７７号には、ＭＡＧＥ−１発現産物がプロセシングされて第２のＴＲＡになるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬＡ−Ｃｗ*１６０１分子によって提示される。この開示は所与のＴＲＡＰから複数のＴＲＡが生じることができ、そのそれぞれがＭＨＣ分子に対する結合に関するモチーフルールを満足する、ということを示している。
参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号には、いくらかの正常細胞（例えば、メラノサイト）によって産生される分子である、チロシナーゼが、腫瘍細胞中でプロセシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドを生じるということが教示されている。
参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼ由来ではない、第２のＴＲＡがＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるということが教示されている。このＴＲＡはＴＲＡＰ由来であるが、非−ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされている。この開示はある特定のＨＬＡ分子が異なるソースに由来するＴＲＡを提示することができるということを示している。
参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年６月１７日出願で現在１９９６年１月５日発行の米国特許第５，５７１，７１１号となっている、米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、関連のない腫瘍拒絶抗原前駆体である、いわゆる、“ＢＡＧＥ”前駆体が記載されている。ＢＡＧＥ前駆体はＭＡＧＥファミリーとは関連していない。
その両方を参考文献として本出願にその内容を合体させる、米国特許出願第０８／０９６，０３９号および第０８／２５０，１６２号には、非−ＭＡＧＥ  ＴＲＡＰ前駆体である、ＧＡＧＥも開示されている。
１９９４年９月３０日出願の米国特許出願第０８／３１６，２３１号には、さらに別の腫瘍拒絶抗原前駆体が開示されている。これらの腫瘍拒絶抗原前駆体は“ＤＡＧＥ”腫瘍拒絶抗原前駆体と称される。これらは、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、またはＧＡＧＥファミリーの遺伝子とはホモロジーを示さないものである。
先に引用した論文、特許、および特許出願に示されている研究は、大部分は、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＤＡＧＥファミリーの遺伝子について扱っている。本発明は、ＭＡＧＥ−関連腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２をコードする核酸分子、そして腫瘍拒絶抗原前駆体および腫瘍拒絶抗原自体に関するものである。本発明はまた、これら核酸とタンパク質分子両方の応用にも関するものである。
本発明を以下の開示においてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）−１（Ｆ）は、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。様々なヌクレオチドセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの位置が示されている。
図２（Ａ）−２（Ｆ）は、ＭＡＧＥ−Ｃ１とＭＡＧＥ−Ａ１のヌクレオチド配列の比較を示す。
図３は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１と、単離ｃＤＮＡクローンＭＡＧＥ−Ｃ１および公表された遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１との図による比較である。エキソンは、ＩからIII（ＭＡＧＥ−Ａ１）あるいはIV（ＭＡＧＥ−Ｃ１）と番号付けした箱で表す。イントロンは線で表す。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１と比較した場合にｃＤＮＡクローンにおいて欠失している部分は空白（ブランク）で表す。遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１とＭＡＧＥ−Ｃ１との間の広い箱（open box）は類似性のある領域を示す。オープンリーディングフレームは、エキソンの内側の斑点のある箱（stippled box）によって示す。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１における反復セグメントは斜線で示す箱として表す。重要な制限部位（Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｐｎＩＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｘ：ＸｂａＩ）、および、２対のオリゴヌクレオチド（ＳＬ３３／ＳＬ３４およびＳＬ３８／ＳＬ４３）の位置を示す。ＭＡＧＥ−Ｃ１のエキソンＩの上流の星印はＳｐ１および２つのＥｔｓコンセンサス認識配列の所在を示す。ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡプローブの位置も示す。
図４は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２およびＭＡＧＥ−Ａ１の図による表示である。エキソンは開箱で表し、イントロンは線で表す。オープンリーディングフレームは色が濃い箱によって表す。ＭＡＧＥ−Ｃ２とそれ以外の２つの遺伝子との間のホモロジーのある領域を陰を付けた部分（shaded area）で表す。重要なＰＣＲプライマーを矢印で示す。斜線で示す箱は遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１においてみられる反復領域を表す。
詳細な説明
いままでに同定されている多くのヒトの腫瘍抗原は、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥなどの遺伝子によってコードされ、それらは共通の発現パターンを共有している。これらは精巣において（そしてときには胎盤において）発現するが、その他の正常組織では発現せず、様々な腫瘍タイプにおいて再活性化される。このタイプの抗原は腫瘍免疫療法にとって特に興味の持たれるものである。
抗腫瘍性の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されることが知られている抗原をコードする遺伝子のクローニングによる腫瘍抗原の同定に代わるべき手段として、我々は、腫瘍において特異的に発現する新しい遺伝子を直接的に探索することにした。というのは、そのような遺伝子は腫瘍特異抗原のソースを提供する可能性があるからである。Representational Difference Analysis applied to cDNA（ｃＤＮＡに適用する表現差分析）（Hubank and Shatz，“Identifying Differences in mRNA Expression By Representational Difference Analysis of cDNA,”Nucleic Acids Res．22：5640-5648（1994））と称される、ＰＣＲに基づく差引き（subtractive）ハイブリダイゼーション技術を用いて、我々はここに記載するＭＡＧＥ遺伝子ファミリーの新しいメンバーを同定した。
本発明の諸例は、腫瘍拒絶抗原前駆体（“ＴＲＡＰ”）である、ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２をコードする核酸分子の単離を示す。これらＴＲＡＰをコードする分子は前述の参考文献において記載されたＭＡＧＥファミリーのコード配列と部分的なホモロジーを共有する。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号９に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離核酸分子および配列番号１８に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離核酸分子である。好ましくは、前記核酸分子はｃＤＮＡ分子である。配列番号９および配列番号１８は以前から知られているＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、またはＧＡＧＥコード配列ではない。そのことは、それ（配列番号９および配列番号１８）と、引用された参考文献に記載されているそれら（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、またはＧＡＧＥ）の遺伝子のあらゆる配列とを比較することによって理解されるであろう。
また、配列番号９のｎｔ１−２８１５およびｎｔ２８１６−４２２５のヌクレオチド配列を有する核酸分子も本発明の一部をなす。本発明の別の態様は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードし、かつ、ストリンジェントな条件下で、配列番号９のヌクレオチド配列１−２８１５を有する核酸分子にハイブリダイズするが、配列番号８のヌクレオチド配列、即ち図２に示すＭＡＧＥ−Ａ１ヌクレオチド配列、を有する核酸分子にはハイブリダイズしない核酸分子である。本発明のさらなる態様は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードし、かつ、配列番号９のヌクレオチド配列２６１−２８５６を有する核酸分子にハイブリダイズするが、配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸分子にはハイブリダイズしない核酸分子である。ここで使用する“ストリンジェントな条件”という用語は、６５℃で一晩の、５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５ｘデンハルト試薬でのハイブリダイゼーション、その後、室温で２０分間、２ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中での２回の洗浄、そして、６５℃で２０分間、２ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中での１回の洗浄、そして６５℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回の洗浄を指す。同じ、またはより高い程度のストリンジェンシーとなる、使用可能なその他の条件、試薬などもある。当業者であればそのような条件はよく知っているであろうからここでは記載しない。
正常細胞においてではなく、腫瘍細胞におけるＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２の発現の広範な分布は、前記単離核酸分子が、異常な、例えば腫瘍などの、ＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２に関連する配列を発現する細胞の存在を判定するための、診断上のプローブとして利用可能であることを示すものである。
ＭＡＧＥ−Ｃ１による精上皮腫の同定は１００％であった（表２）ので非常に基本的なレベルで、前記単離核酸分子を利用して精上皮腫が存在しているか否かを判定することができるであろう。ある腫瘍サンプルが精上皮腫であることを確認するための多くの方法が当業者に利用可能であることに注意されたい。そしてそれらはここでは繰り返す必要がない。
諸例から、原核（prokaryotic）であろうと（例えば、大腸菌）、あるいは真核（eukaryotic）であろうと（例えば、ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞）、宿主細胞および細胞系をトランスフォーム（形質転換）するために、または、トランスフェクト（形質移入）するために使用可能な、発現ベクター中での前記配列の利用も本発明に含まれるということが理解されるであろう。発現ベクターは適切な配列、即ち前述のもののような配列がプロモーターに操作可能にリンクしている（operably linked to a promoter）必要がある。発現ベクターは、例えば、１以上のＨＬＡ分子をコードする配列を含むものであってもよい。ベクターが両方のコード配列を含む場合、それは、通常はどちらの一方も発現しない細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトするのに利用可能である。腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例えば宿主細胞がすでにＨＬＡ−分子を発現するような場合、単独で利用することができるであろう。ここに記載した配列を発現するために好適な特定の宿主細胞は、例えば、大腸菌、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞または昆虫細胞などの原核または真核細胞を含む。
本発明のさらなる側面は、配列番号９または配列番号１８を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離である。そのようなｇＤＮＡは、当業者に周知の方法を用いて同定および単離することができる。例えば、配列番号９に由来するＭＡＧＥ−Ｃ１特異的プローブまたは配列番号１８に由来するＭＡＧＥ−Ｃ２特異的プローブを用いて、例えばＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞などから作成されたゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。当業者であれば、配列分析からＭＡＧＥ−Ｃ１および／またはＭＡＧＥ−Ｃ２に特異的な配列を判定することが可能であろう。当業者に周知の技術を用いてそのようなｇＤＮＡが位置する染色体を決定することも可能である。例えば、参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２２０３を参照。
本発明の別の態様は、当業者が所望の１つまたは複数の発現ベクターを調製することを可能にする、発現キットである。そのような発現キットは少なくとも先に記載したコード配列のそれぞれの別々の部分（separate portions）を含む。それは例えば、プロモーター（参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、デ・プレーン（DePlaen）他，Proc．Natl．Acad．Sci．85：2274-2278（1988），グロスヴェルド（Grosveld）他，Gene 10：6715-6732（1982），およびベイツ（Bates）他，Gene 26：137-446（1983））、Zemmour and Parham，Immunogenetics 37：239-250（1993）において記載されているようなＨＬＡコード配列のいずれか、ＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２コード配列、あるいは、ＨＬＡとＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２コード配列との両方、を含む細菌性のプラスミド、コスミド、またはウイルス性のベクターなどのベクターである。所望であれば、例えば当業者に周知の、抵抗性マーカー、エンハンサー、または誘導性のプロモーターなどの他の構成成分を加えてもよい。
本発明の核酸分子およびＴＲＡＰおよびＴＲＡを、以前に記載されたＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥのものから区別するため、本発明のものを、ＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子、ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ＴＲＡＰおよびＴＲＡ、そして、ＭＡＧＥ−Ｃ２  ＴＲＡＰおよびＴＲＡと称することにする。したがって、本出願でＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２という語が用いられる場合、それは以前には知られていなかった核酸配列によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体、およびそれらに由来するＴＲＡのことを指す。“ＭＡＧＥ−Ｃ１コード配列”、“ＭＡＧＥ−Ｃ２コード配列”およびそれに類似する用語は核酸分子自体を記載するために使用される。
ここで記載した本発明には多くの利用法があるが、それらのいくつかをここに記載する。まず、本発明により、当業者が、ＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２メッセンジャーＲＮＡ、そして、ＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２  ＴＲＡＰおよびＴＲＡの発現によって特徴づけられる疾患を診断することが可能となる。これらの方法は、ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２核酸分子そしてそれらに関連する分子からのｍＲＮＡの発現、および／または、ＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２そしてそれらに関連する核酸分子によってコードされるＴＲＡＰに由来するＴＲＡの存在を判定することを含む。前者の場合、そのような判定はポリメラーゼ連鎖反応または標識化ハイブリダイゼーションプローブでのアッセイを含む、いずれの標準的核酸判定アッセイによっても行うことができる。後者の場合、例えば抗体などのような結合パートナーを用いて、ＴＲＡＰまたはＴＲＡ単独についてアッセイすること、または、ＴＲＡとＨＬＡとからなる複合体についてアッセイすることより、ＴＲＡＰおよびＴＲＡを検出することができる。本発明の別の態様は、ＨＬＡ分子と請求項１の単離核酸分子によってコードされるタンパク質に由来するペプチドとからなる複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の存在を、ＣＴＬ−含有サンプルにおいて検出することであって、前記サンプルを、その表面上に前記複合体を提示する細胞と接触させる工程、および（ｉ）細胞溶解性Ｔ細胞の増殖、または（ｉｉ）前記複合体を提示する細胞の溶解を、前記サンプルにおける前記細胞溶解性Ｔ細胞の判定として、判定する工程、を有するものである。ＣＴＬ増殖はＴＮＦ放出、または、例えば参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２２０３において記載されているように、51Ｃｒなどの放射能標識された物質の放出を、アッセイすることによって検出することができる。さらに、ＣＴＬは、その両方を参考文献として本出願にその内容を合体させる、シュミット（Schmitt）他，J．Immunol．Meth．，210：167-179（1997）およびラルヴァーニ（Lalvani）他，J，Exp．Med．，186：859（1997）によるＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、あるいは、ＭＨＣクラスＩ／ペプチドの蛍光発生四量体複合体のＦＡＣＳ分析（ダンバー（Dunbar）他，Current Biology，8：713-716（1998））によって検出することができる。
これらＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２核酸分子の単離によって、それらＴＲＡＰ分子自身、特に、配列番号９または配列番号１８によってコードされるアミノ酸配列からなるＴＲＡＰ分子を単離することも可能となる。ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２核酸分子の単離によって、以下により詳細に記載するＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２に独得のＴＲＡを同定することも可能となる。
さらに、配列番号９のヌクレオチド配列２５７−３６８２によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１８のヌクレオチド配列３３０−１４４９によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそれらに由来するポリペプチドも本発明の一部をなす。これらのポリペプチドは単独で、またはその他のＴＲＡＰ分子からの他のポリペプチドと組み合わせて、例えば、当業者に周知のアジュバント等の物質と組み合わせて、前記分子の発現によって特徴付けられる疾患の治療に有用なワクチンを作ることができる。例えば参考文献として本出願にその内容を合体させる、ケンシル（Kensil）他の米国特許第５，０５７，５４０号またはこれも参考文献として本出願にその内容を合体させる、スコット（Scott）他のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３５７９を参照。
ＭＨＣ分子によって提示され、ＣＴＬによって認識される、配列番号９のヌクレオチド配列２５７−３６８２によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および、配列番号１８のヌクレオチド配列３３０−１４４９によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、に由来するペプチドは、その他の腫瘍拒絶抗原からのペプチドと組み合わせて“ポリトープ（polytopes）”を形成することができる。例となるペプチドは、すべてを参考文献として本出願にその内容を合体させる、米国特許出願第０８／６７２，３５１号；現在は米国特許第 号となっている米国特許出願第０８／７１８，９６４号；現在は米国特許第 号となっている米国特許出願第０８／４８７，１３５号、米国特許出願第０８／５３０，５６９号、そして米国特許出願第０８／８８０，９６３号においてリストされているようなものが含まれる。
さらに、すべて参考文献として本出願にその内容を合体させる、以下の参考文献において記載されているペプチドも利用することができる：米国特許第５，４０５，９４０号；５，４８７，９７４号；５，５１９，１１７号；５，５３０，０９６号；５，５５４，５０６号；５，５５４，７２４号；５，５５８，９９５号；５，５８５，４６１号；５，５８９，３３４号；５，６４８，２２６号；および５，６８３，８８６号；ＰＣＴ国際公報第９２／２０３５６号；９４／２０３５６号；９６／１０５７７号；９６／２１６７３号；９７／１０８３７号；９７／２６５３５号；および９７／３１０１７号、そして係属中米国特許出願第０８／７１３，３５４号。
ポリトープは、２以上の潜在的に免疫原性または免疫刺激性のペプチドのグループであり、様々な方法で結合させることができ、このタイプの分子が免疫応答を刺激するか、および／または、引き起こすかが判定される。
これらのペプチドは、直接的に、または隣接配列の使用を介して結合することができる。トムソン（Thomson）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92（13）：5845-5849（1995）（参考文献として本出願にその内容を合体させる）を参照すると、関連するエピトープ（epitopic）配列の直接的な結合が教示されている。ポリトープのワクチンとしての利用もよく知られている。例えば、すべてを参考文献として本出願にその内容を合体させる、ギルバート（Gilbert）他，Nat．Biotechnol．，15（12）：1280-1284（1997）：トムソン（Thomson）他，前出、トムソン（Thomson）他，J．Immunol．，157（2）：822-826（1996）；タム（Tam）他，J．Exp．Med．，171（1）：299-306（1990）を参照。タム（Tam）他は特に、ポリトープをマウスモデルにおいて用いた場合、抗体の産生および感染防御免疫の発生の両方において有用であることを示している。さらに、前記参考文献は、ポリトープを消化した場合、ＭＨＣによって提示されることができ、そして提示されるペプチドが生じることを示している。タム（Tam）他はこれをポリトープの“列（strings）”からプロセシングされた個々のエピトープの、ＣＴＬによる認識を実証することによって示している。このアプローチを利用して、例えば、ポリトープにおいていくつのエピトープが結合することができるのか、および認識を引き起こすことができるのかを判定すること、さらに異なるエピトープの組み合わせの有効性を判定することができる。異なる組合せは特定の腫瘍拒絶抗原のサブセットを発現する患者に対して“特別誂えの（tailor-made）”ものであるだろう。これらのポリトープをポリペプチド構造として、または核酸送達システムの使用によって導入することができる。更に詳しく述べると、当該技術分野では個々のエピトープ、または上述のようなポリトープをコードするＤＮＡを導入する様々な多くの方法を利用することができる。例えば、参考文献として本出願にその内容を合体させる、オールソップ（Allsopp）他，Eur．J．Immunol．26（8）：1951-1959（1996）を参照。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様（Ty-virus like）粒子、プラスミド、細菌などが利用可能である。これらのシステムをマウスモデルにおいてテストして、どのシステムが所与のヒトにおける匹敵する状況にとって最も適切であるかを判定することができる。これらはまた、ヒトにおける臨床試験においてもテストすることができる。
さらに、非増殖性のガン細胞、非増殖性のトランスフェクタントなどの、その表面上にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞からワクチンを作ることが可能である。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合において、細胞は、ＣＴＬ応答を与えるのに必要な前記構成成分の一つまたは両方に対するコード配列、即ちＴＲＡＰ、ＴＲＡおよびＨＬＡ分子を、当業者に周知の技術を用いてトランスフェクトされたトランスフェクタント（形質移入体）、とすることができる。様々なＨＬＡ分子の配列については、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２２０３およびZemmour前出参照。あるいは細胞は、トランスフェクション無しでＨＬＡおよびＴＲＡＰ／ＴＲＡ分子の両方を発現するものとすることができる。さらに、ＴＲＡＰ分子、その関連ＴＲＡ、および、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体は、当該技術において周知の標準的技法を利用して、抗体を産生するのに使用することができる。
ここで“疾患”という用語が用いられた場合、それは、腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するすべての病的な状態を指す。このような疾患の一例は、ガン、特に精上皮腫である。
本開示に基づく治療上のアプローチは、ＨＬＡ／ＴＲＡ提示細胞の溶解を導く、対象（患者：subject）の免疫系による応答を前提としている。そのようなアプローチの一つは、問題の表現型の異常細胞を有する対象に、ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体に対して特異的なＣＴＬを投与することである。そのようなＣＴＬをイン・ヴィトロで開発することは当業者の技術の範囲内に含まれる。例えば、ヘリン（Herin）他、前出を参照。例えば、血液細胞のような、細胞のサンプルを、ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示する標的細胞に接触させると、特異的なＣＴＬの増殖を引き起こすことができる。標的細胞は、前述の特定のＨＬＡおよびＴＲＡＰをトランスフェクトされて発現するＣＯＳ細胞のような、トランスフェクタントとすることができる。その表面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントは、問題のＣＴＬと結合すると、その（ＣＴＬの）増殖を刺激する。ここで用いたようなＣＯＳ細胞は、限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｉｔｅｒａ  ｆｕｒｊｉｐｅｒｄａ、大腸菌、バチルス属（Bacillus）等を含む、他の適当な宿主細胞と同様に、広く入手可能である。
１つの治療の方法に養子移入（養子免疫細胞移入）と呼ばれるものがある（グリーンバーグ（Greenberg）,J.Immunol.136（5）:1917（1986）；リッデル（Riddel）他，Science 257：238（7-10-92）；リンチ（Lynch）他，Eur．J．Immunol．21：1403-1410（1991）；カスト（Kast）他，Cell 59:603-614（11-17-89））。養子移入において、所望のＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示する細胞を、ＣＴＬと結合させると、その結果、その複合体に対して特異的なＣＴＬが増殖する。増殖したＣＴＬは、次に、特定の複合体を提示するいくらかの異常細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する対象に投与される。すると、前記ＣＴＬが異常細胞を溶解し、それによって所望の治療目的が達成される。
前述の療法は、少なくともいくらかの対象（患者）の異常細胞が、関連するＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示することを仮定している。このことは簡単に判定できる。というのは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法、および、適切な配列のＤＮＡ、この場合はＭＡＧＥ−Ｃ１またはＭＡＧＥ−Ｃ２および関連する配列、を発現する細胞をどのように同定するかということについて、当業者は非常によく精通しているからである。もし、患者の異常細胞が関連するＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示するとすると、その患者は前述の治療上のアプローチに対して適切な候補であるといえる。
養子移入（養子免疫細胞移入）のみが本発明に従って利用できる唯一の治療形態であるわけではない。ＣＴＬを、数々のアプローチを利用して、イン・ヴィヴォで誘発することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性の細胞のワクチンとしての利用方法については先に詳述した。このアプローチにおいて用いられる細胞は、照射を受けた精上皮腫細胞、または、前記複合体を提示するのに必要な一方または両方の遺伝子をトランスフェクトされた照射を受けた細胞のような、通常前記複合体を発現する細胞であってよい。チェン（Chen）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：110-114（１９９１年１月）は、治療法（therapeutic regime）における、ＨＰＶ  Ｅ７ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の利用を示しており、このアプローチを例証している。様々な細胞タイプが利用可能である。
同様に、ＨＬＡまたはＴＲＡＰあるいはＴＲＡのいずれか、またはそれらの組み合わせをコードする核酸分子を保有するウイルス性または細菌性のベクターなどのベクターが利用可能である。これらのシステムにおいて、前記核酸分子は、たとえば、ワクシニアウィルスまたは細菌ＢＣＧによって伝えられ、これらは宿主細胞に“感染”する。感染した細胞はＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示し、自己ＣＴＬによって認識され、そしてそのＣＴＬは増殖する。
ＣＴＬは、ＨＬＡ提示細胞への取り込みを促進するために、ＴＲＡまたはＴＲＡＰ自体とアジュバントとを組み合わせることによって、インヴィヴォでも誘発することができる。細胞は、ＴＲＡＰをさらにプロセシングしてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを産生することによって、問題となるＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する。代わりとして細胞は、さらなるプロセシングの必要なくＴＲＡを提示することもできる。例えば、ブラチアレ，ティ・ジェイ（Braciale，T．J．）およびブラチアレ，ヴィ・エル（Braciale，V．L．），Immunology Today 12：124-129（1991）；ティ・エリオット（T．Elliot），Immunology Today 12：386-388（1991），および：マデルボイム（Madelboim）他，Nature 369：67-71（1994）を参照。
また、本発明の特徴は、ＭＨＣ分子による提示のためのルールに従う、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ＴＲＡＰまたはＭＡＧＥ−Ｃ２  ＴＲＡＰに由来する単離ペプチドである。例えば、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７４２１号において、いくつかのモチーフが種々のＭＨＣ分子と結合するものとして記載されている。参考文献として本出願にその内容を合体させるこれらのモチーフ、および、以下のすべて参考文献として本出願にその内容を合体させる、例えば、フォーク（Falk）他，Nature 351:290-296（1991）；エンゲルハルト（Engelhard），Ann．Rev．Immunol．12：181-207（1994）；ルパート（Ruppert）他，Cell 74：929-937（1993）；レチュケ（Roetzshke）他，Nature 348：252-254（1990）；ビヨルクマン（Bjorkman）他，Nature 329：512-518（1987）およびトラヴァーサリ（Traversari）他，J．Exp．Med．176：1453-1457（1992）によって教示されているモチーフは、ＭＡＧＥ−Ｃ１アミノ酸配列およびこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列から得られる、または由来する、適切なペプチドを同定するための基礎として役立つ。本発明のさらなる側面において、これらのペプチドは単独で、または混合物中で、ＣＴＬ増殖を刺激するのに使用することができる。これらのペプチドはまた、ワクチンとしても有用である。
腫瘍を患う個体の血液は、頻繁にＭＨＣ分子と提示ペプチドとからなる複合体を認識する細胞溶解性Ｔ細胞（“ＣＴＬ”）を含むということは、よく証明されている。例えば、すべて参考文献として本出願にその内容を合体させる、ロビンズ（Robbins）他，Canc．Res．54：3124-3126（1994）；トポリアン（Topolian）他，J．Immunol．142：3714-3725（1989）；クーリ（Coulie）他，Int．J．Cancer 50：289-297（1992）を参照。また、すべて参考文献として本出願にその内容を合体させる、カワカミ（Kawakami）他，J．Exp．Med．180：347-352（1994）；ホム（Hom）他，J．Immunother．10：153-164（1991），ダロウ（Darrow）他，J．Immunol．142（9）：3329-3335（1989）；スロヴィン（Slovin）他，J．Immunol．137（9）：3042-3048（1986）も注目されたい。これらの論文はすべてガンの可能性を診断するためのＣＴＬ増殖アッセイの有用性を証明するものである。
一般的に、ある患者は、少なくともいくらかのその患者自身の細胞が特定のＴＲＡとＨＬＡとからなる複合体を発現している場合にのみ、その特定のＴＲＡとＨＬＡとからなる複合体を提示する標的細胞と接触させた場合に応答してその複合体を認識して増殖するＣＴＬを有しているであろう。もし、例えば腫瘍細胞などの異常細胞を有すると思われる患者から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）含有サンプルを採取し、そしてそのＣＴＬ−含有サンプルを、関連するＭＨＣ分子とＭＡＧＥ−Ｃ１あるいはＭＡＧＥ−Ｃ２由来ペプチドとからなる複合体を提示する標的細胞と接触させたとすると、その複合体に対して特異的なＣＴＬの増殖しかみることができないであろう。したがって患者のＰＢＬサンプルにおけるＣＴＬの増殖は、その患者がおそらくその特定のＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を発現する腫瘍細胞を有していることを示すものである。標的細胞は、問題のＭＨＣ分子を通常提示する細胞、またはＨＬＡコード配列によってトランスフェクトされた細胞とすることができる。標的細胞は、おそらく腫瘍細胞、あるいは正常細胞とすることができる。
本発明の一つの態様は、標的細胞サンプルを、（１）ＭＡＧＥ−Ｃ１  ＴＲＡＰまたはＭＡＧＥ−Ｃ２  ＴＲＡＰ由来であってその標的細胞のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドまたは複数のペプチドの混合物、および（２）評価すべき対象のＰＢＬサンプルと混合することを含む。その混合物を次にＣＴＬ増殖についてテストする。ＣＴＬ増殖を判定するための様々な方法が当該技術分野において知られている。例えば、ＴＮＦ放出アッセイおよび51Ｃｒ放出アッセイがある。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２２０３を参照。
本発明の一つまたは複数のペプチドは、一以上のアジュバントと組み合わせて、より明白なＣＴＬ応答を刺激することもできる。そのようなアジュバントの例には、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ケンシル（Kensil）他の米国特許第５，０５７，５４０号、またはこれも参考文献として本出願にその内容を合体させる、スコット（Scott）他のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３５７９によって開示されているような、サポニンおよびその誘導体が挙げられる。もちろん、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントなどの標準的なアジュバントも利用することができる。
本発明の他の態様は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要はない。
ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用されたものであり、従って、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載された特徴構成またはその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能であると理解される。
例１  腫瘍ＬＢ３７３−ＭＥＬおよび精巣についてのＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＤＰ）の作製
目的の細胞タイプ、即ち“テスター（tester）”細胞にのみ存在して、他の細胞タイプ、即ち“ドライバー（driver）”細胞には存在しない配列について濃縮されたｃＤＮＡライブラリーを、参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、Hubank and Schatz，Nucl．Acid．Res．22：5640-5648（1994）に基本的に記載されている方法で作製した。簡単に説明すると、テスター細胞とドライバー細胞とから、トータルＲＮＡを調製した。ここでは、テスター細胞にはメラノーマ細胞ＬＢ３７３−ＭＥＬを用い、ドライバー細胞には正常な皮膚細胞を用いた。ポリ−Ａ＋ＲＮＡを周知の技術によってオリゴ−ｄＴカラムを用いてトータルＲＮＡから単離した。次にポリ−Ａ＋ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩＩで消化した。ＤｐｎＩＩはＤＮＡをＧＡＴＣ部位において切断するものであり、この消化によって５’−ＧＡＴＣオーバーハングを備えた二本鎖ＤＮＡの短い断片が生じた。５’−ＧＡＴＣオーバーハングを備えた二本鎖ＤＮＡアダプター（Ｒ−Ｂｇｌ−１２およびＲ−Ｂｇｌ−２４オリゴヌクレオチド、それぞれ配列番号２および配列番号１１、がアニールしたものからなるＲ−Ｂｇｌアダプター）を、ＤｐｎＩＩで消化したテスター細胞およびドライバー細胞から調製したｃＤＮＡに結合させた。アダプターに結合させたｃＤＮＡを次に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。増幅産物は、それぞれテスターおよびドライバーの“代表物（representation）”である。テスターとドライバーの両方の代表物（representations）を、ＤｐｎＩＩで消化した。消化されたテスターを新しいアダプター分子（Ｊ−Ｂｇｌ−１２およびＪ−Ｂｇｌ−２４オリゴヌクレオチド、それぞれ配列番号３および配列番号１２、がアニールしたものからなるＪ−Ｂｇｌアダプター）に結合した。次に差引きハイブリダイゼーションの最初のラウンドを、１００／１の比率で、消化したドライバーｃＤＮＡと、消化してＪ−Ｂｇｌアダプターに結合させたテスターｃＤＮＡとを、混合することによって行った。混合したドライバーとテスターとのｃＤＮＡサンプルを９８℃で５分間変性させ、次に６７℃で２０時間インキュベートして変性させたサンプルを再ハイブリダイズ（rehybridize）させた。この結果、ハイブリッド二本鎖ｃＤＮＡの混合物が生じた。このハイブリッドｃＤＮＡには３つのタイプがあった。１つのハイブリッドタイプは、テスターｃＤＮＡ２分子からなり、テスター細胞に独特のヌクレオチド配列を表すものであり、第２のハイブリッドタイプは、ドライバーｃＤＮＡ２分子からなり、そして第３のハイブリッドタイプは、テスターｃＤＮＡ１分子とドライバーｃＤＮＡ１分子とからなる。ハイブリダイゼーションの後、サンプルを一本鎖Ｊ−Ｂｇｌアダプター、Ｊ−Ｂｇｌ−２４配列番号１２を用いてＰＣＲ増幅した。ドライバーｃＤＮＡ２分子からなるハイブリッドｃＤＮＡは、Ｊ−Ｂｇｌアダプターを含んでいないので増幅されなかった。テスターｃＤＮＡ１分子とドライバーｃＤＮＡ１分子とからなるハイブリッドｃＤＮＡは、直線的にしか増幅しなかった。テスターｃＤＮＡ２分子からなる二本鎖ｃＤＮＡのみが、指数関数的に増幅した。
前述のようなＰＣＲ増幅１０サイクルの後、サンプルをMung Beanヌクレアーゼ（直線的増幅によって生じた一本鎖ＤＮＡを特異的に消化する）で処理し、そして更に１８サイクルＰＣＲを行った。その結果得られた濃縮された産物を、ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  １（ＤＰ１）と命名した。ＤＰ１−精巣［−ＨＬＬＫ］およびＤＰ１−ＬＢ３７３［皮膚］の両方を作製した。
ＤＰ１に対するＪ−Ｂｇｌアダプターを、Ｎ−Ｂｇｌ−１２／２４アダプター（Ｎ−Ｂｇｌ−１２：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ−３’；Ｎ−Ｂｇｌ−２４：５’−ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ−３’）即ち、Ｎ−Ｂｇｌ−１２およびＮ−Ｂｇｌ−２４オリゴヌクレオチド、それぞれ配列番号４および配列番号１３、がアニールしたものからなるアダプターに変更し、そして差引きハイブリダイゼーションのプロセスと選択的増幅を繰り返して第２のｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓを作製した（ＰＣＲ反応におけるアニーリングと伸長を７２℃で行ったことを除く）。テスター対ドライバー比を１／８００としてＤＰ２．精巣（−ＨＬＬＫ）を作製し、１／１００としてＤＰ２．ＬＢ３７３（−皮膚）を作製した。第３のｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＤＰ３．精巣（−ＨＬＬＫ）を、テスターとしてＪ−Ｂｇｌを結合させたＤＰ２．精巣（−ＨＬＬＫ）を、ドライバーとしてＨＬＬＫ代表物（representation）を用いてプロセスを繰り返して作製し、最後の増幅は２２サイクル行った。
例２  ＤＰ２．ＬＢ３７３［−皮膚］とＤＰ３．精巣［−ＨＬＬＫ］とに共通の配列の検索
多くの既知の腫瘍抗原は、腫瘍および精巣においてのみ発現する遺伝子によってコードされている。前述の、ＤＰ３．精巣［−ＨＬＬＫ］（精巣細胞に独特の核酸配列を表すもの）とＤＰ２．ＬＢ３７３［−皮膚］（メラノーマ細胞に独特の核酸配列を表すもの）との両者に共通の配列を検索することによって、精巣および腫瘍細胞においてのみ発現し、以前には同定されていなかった腫瘍抗原をコードする核酸配列が同定された。
ＤＰ３．精巣［−ＨＬＬＫ］ＤＮＡをクローニングするために、ＤＰ３．精巣［−ＨＬＬＫ］をＤｐｎＩＩで消化し、消化されたＤＮＡを市販のプラスミドｐＴＺ１８ＲのＢａｍＨＩ消化物に結合させた。細菌ＤＨ５αＦ’ＩＱ（市販されている）を、結合させたＤＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細菌を選抜し、ランダムプライマー、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、およびα−32Ｐ−ｄＣＴＰ、を用いてＤＰ２．ＬＢ３７３［−皮膚］を標識することによって作製したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
ＤＰ２．ＬＢ３７３［−皮膚］プローブにハイブリダイズする形質転換体からプラスミドを単離しそのインサートについて分析した。２８３ｂｐのインサートを含む１つのクローンを精製し、当業者に周知の技術によって配列決定した。この２８３ｂｐのインサートの配列は、ＭＡＧＥ遺伝子ファミリーと部分的なホモロジーを共有していた。参考文献として本出願にその内容を合体させる、ＭＡＧＥ４ａゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１０６８７）から予測される、ＭＡＧＥ−４ａ  ｃＤＮＡのヌクレオチド９８９５から１００４１に対応する１４７ヌクレオチド配列と、最大のホモロジー（７４％）が得られた。これらのデータは、２８３ｂｐのインサートがこれまで同定されていなかったＭＡＧＥファミリーメンバーの一部であることを示唆するものであった。このファミリーメンバーを、ＭＡＧＥ−Ｃ１と命名した。
例３  完全なＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡ
完全なＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡを得るために、ＬＢ３７３−ＭＥＬ  ＲＮＡから調製してｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにサブクローニングされた、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調製した。
トータルＲＮＡをＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞からグアニジンイソチオシアナート法（Davis L．G．，M．D．，Dibner and J．F．Battery，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York，pp．130-135（1986））によって抽出した。ポリ−Ａ＋ＲＮＡをオリゴ−ｄＴカラム（Pharmacia）で精製し、オリゴ−ｄＴ（ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ）プライマー配列番号５を用いてｃＤＮＡへと変換した。当業者に周知の方法を用いて、このｃＤＮＡをＢｓｔＸＩアダプター（配列番号６）に結合させ、ＮｏｔＩで消化し、そしてＢｓｔＸＩとＮｏｔＩとで消化された市販の発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに結合させた。この結合させた組換えプラスミドをＴｏｐ１０Ｆ’大腸菌細菌にエレクトロポレーションし、そして形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜した。このライブラリーを前に単離した２８３ｂｐインサート由来の32Ｐ−放射能標識したプローブでスクリーニングした。
細菌の形質転換体を当業者に周知の方法によってＭＡＧＥ−Ｃ１配列についてスクリーニングした。簡単に説明すると、およそ１４０，０００の細菌をナイロンメンブランフィルターに蒔いた（plated）。デュプリケートの（duplicate）ナイロンメンブランフィルターを作り、変性処理して細菌ＤＮＡを固定した。テンプレートとしてＬＢ３７３−ＭＥＬ  ＲＮＡ、そしてＭＡＧＥ−Ｃ１特異的プライマー、即ち、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２６６６からｎｔ２６８７に対応するセンスプライマーＳＬ２６：５’−ＣＣＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴ−３’および配列番号１のｎｔ２８１７からｎｔ２８３３の相補的配列であるアンチセンスプライマーＳＬ２７：５’−ＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴ−３’を用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）によって１６８ｂｐのＭＡＧＥ−Ｃ１特異的プローブを作製した。配列番号１のｎｔ２６６６からｎｔ２８３３に対応する、この１６８ｂｐのＭＡＧＥ−Ｃ１  ＰＣＲ産物をセファロースＣＬ−６Ｂカラムで精製し、そして前述のように（例３）、ランダムプライマー、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、およびα−32Ｐ−ｄＣＴＰ、を用いて標識した。処理されたデュプリケートのメンブランフィルターをＭＡＧＥ−Ｃ１特異的プローブとハイブリダイズさせ（５００，０００ｃｐｍ／ｍｌ；５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５Ｘデンハルト試薬中、６５℃、一晩のインキュベーション）、次にストリンジェントな条件で洗浄し、そして、室温で７０時間オートラジオグラフィーを行った。ここで記載されるストリンジェントな条件とは、０．１ｘから０．５ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで６５℃、２０分間の条件を指す。ＭＡＧＥ−Ｃ１プローブにハイブリダイズする２つのコロニーが同定された。これらのコロニーを精製し、これらがプローブにハイブリダイズすることを検証するためにもう一度スクリーニングを行った。これらのコロニーからプラスミドを単離し、そしてそれらのインサートを当業者に周知の方法を用いて配列決定および分析した。１つのクローンを選択し、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡインサートを詳細に分析した。この分析されたクローンは４０３１ｂｐ長のＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡ分子（図１）、配列番号１、を含んでいた。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はほぼｃＤＮＡ全体に広がっており、最初のＡＴＧはｎｔ２５７に位置し、周知のＫｏｚａｋルールに従うものであり、そして終止コドンはｎｔ３４７３にあった。このＯＲＦは１０７２アミノ酸からなる推定上のタンパク質をコードするものであった。
ＭＡＧＥ−Ａ１  ｃＤＮＡとのアラインメントにより、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）と、ＭＡＧＥ−Ａ１エキソン２および３との間の有意なホモロジーが明らかになった。しかし、ＭＡＧＥ−Ｃ１のオープンリーディングフレームは、ＭＡＧＥ  Ａ１のものよりも約２ｋｂ長く、この差の大部分は大きな反復配列によって説明される。
例４  ＭＡＧＥ−Ｃ１発現
配列番号１のｎｔ１８−３４のセンスプライマーＳＬ３３（５’−ＣＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡ−３’）および配列番号１のｎｔ２００−２１７に対して相補的なアンチセンスプライマーＳＬ３４（５’−ＴＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＡＧＧ−３’）を図１に示す。これらのプライマーは異なるエキソンに位置するものである。このことは、ｃＤＮＡからのＰＣＲ産物（２０２ｂｐ）または正常組織および腫瘍細胞から調製したゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物（およそ１．１ｋｂ）の異なるサイズによって判定される。正常組織および腫瘍サンプルの標準的なＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＭＡＧＥ−Ｃ１メッセンジャーＲＮＡの発現パターンを判定した。このデータはＭＡＧＥ−Ｃ１発現が精巣を例外として、テストした正常組織においては検出されないことを示している（表１）。腫瘍細胞サンプルについてはＭＡＧＥ−Ｃ１発現は、メラノーマ（４６％）、精上皮腫（１００％）、膀胱移行上皮癌（１８％）、乳癌（１６％）、および非小細胞肺癌（１６％）においては頻繁に検出される。肉腫、頭頚部癌および前立腺癌においても有意な割合で検出される（表２）。
例５  ノーザンブロット分析
グアニジンイソチオシアナート法（デイヴィス（Davis）他，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York，pp．130-135（1986））によって抽出した１０μｇのトータルＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によって分離し、キャピラリートランスファーによってナイロンメンブランにトランスファーし、そしてＵＶ照射によって固定した。配列番号１のヌクレオチド５８９から１９０４に対応するＭＡＧＥ−Ｃ１  １．３ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩプローブ（［α−32Ｐ］ｄＣＴＰによって放射能標識されている）へのハイブリダイゼーションを、１０％デキストラン硫酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中にて一晩６０℃で行った。このメンブランを連続的に、室温で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、６０℃で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、そして最後に６０℃で５分０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄した。オートラジオグラフィーをＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルム（Kodak）を用いて７日間行った。同じメンブランを、洗浄を室温で１０分２ＸＳＳＣ中で２回行い、オートラジオグラフィーを一晩行ったことを除いて同じ条件にてβ−アクチン特異的プローブに対してハイブリダイズさせた。正常な精巣およびいくつかの腫瘍細胞系からのトータルＲＮＡにおいて、約４ｋｂ移動するＭＡＧＥ−Ｃ１メッセンジャー種が観察された。正常な肺からのトータルＲＮＡにおいては、ＭＡＧＥ−Ｃ１メッセンジャー種は検出されなかった。
例６  ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡの構造
配列番号１の配列決定およびアラインメント（図２および図３）により、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡはＭＡＧＥ−Ａ１（ファン・デア・ブルッゲン（Van der Bruggen）他，Science 254：1643（1991））とその３’の３分の１（third）においてのみ相同的であることが明らかになった。ＭＡＧＥ−Ａ１の第２エキソンに対してホモロジーを示すもう１つの短いストレッチを除くと、ＭＡＧＥ−Ｃ１は、ＭＡＧＥファミリーにも、データバンクにおいて報告されているいずれの配列にも関連の無い配列から構成されている。その他のＭＡＧＥ  ｃＤＮＡと比較したところ、ＭＡＧＥ−Ｃ１は、図３において大きな斜線で示す箱によって表されるおよそ２．４ｋｂの挿入を含んでおり、これは３タイプのタンデムな反復配列：４２ｂｐ−リピート、６３ｂｐ−リピート，および４８ｂｐ−リピートを含むものである。
例７  サザンブロット分析
メラノーマ細胞系ＬＢ３７３−ＭＥＬ,ＳＫ２９−ＭＥＬ、およびＬＢ３３.Ａ−１（クーリ（Coulie）他,J.Exp．Med．180：35-42（1994）；クーリ（Coulie）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:7976-7980（1995）;レーマン（Lehmann）他,Eur．J.Immunol．25:340-347（1995））からのいくつかのゲノムＤＮＡによって調製したサザンブロットを、他のＭＡＧＥ  ｃＤＮＡからｃＤＮＡクローンＭＡＧＥ−Ｃ１を区別するものである挿入のほとんどの部分を含む、配列番号１に由来する１．３ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。制限酵素で消化した１０μｇのゲノムＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、キャピラリートランスファー法によってナイロンメンブランにトランスファーし、そしてＵＶ照射によって固定した。これは（参考文献として本出願にその内容を合体させる、サムブルック（Sambrook）他，Molecular Cloning．A Laboratory Manual，N．Y．Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp．9．31-9.58）に記載されているようにして行った。［α−32Ｐ］ｄＣＴＰによって放射能標識されたＭＡＧＥ−Ｃ１  １．３ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩプローブへのハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、０．１％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中にて１２から２４時間６８℃で行った。このメンブランを連続的に、室温で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、そして６８℃で２０分０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄した。オートラジオグラフィーをＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルム（Kodak）を用いて３日間行った。
５つの異なる制限酵素によって消化されたＳＫ２９メラノーマ系統からのＤＮＡにおいて単一のハイブリダイズするバンドが存在しており、これはＭＡＧＥ−Ｃ１がＭＡＧＥ−ファミリーにおいてその型が唯一の遺伝子であることを示唆していた。しかし、１１人の男性患者の末梢血リンパ球から単離したＰｓｔＩで消化したＤＮＡは、それぞれ唯一の（独特の）ＭＡＧＥ−Ｃ１バンドを含んでいたが、それらは異なるサイズのものであり、そのことは遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１において対立遺伝子の多型（allelic polymorphism）が存在することを示唆していた。ＬＢ３７３−ＭＥＬおよびＬＢ３３−ＭＥＬ．Ａ−１からの、ＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡは、同一のサイズの唯一の（独特の）ＭＡＧＥ−Ｃ１バンドを含んでいた（プローブと制限部位の位置については図３を参照）。
例８  ＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子の単離
ＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子を単離するために、メラノーマ系統ＬＢ３３−ＭＥＬ．Ａ−１からのゲノムＤＮＡで調製したコスミドライブラリーをスクリーニングした。メラノーマ系統ＬＢ３３−ＭＥＬ．Ａ−１からのゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで部分的に消化し、そして参考文献として本出願にその内容を合体させる、（ラークウィン，シー（Lurquin，C．）他，Cell 58：293-303（1989））に記載されているようにしてベクターｃ２ＲＢのコスミドアーム（arm）に結合させた。結合させたＤＮＡをλファージの頭部にパッケージングし（GIGAPACK，Strategene）、大腸菌ＥＤ８７６７に対してタイター測定した。このライブラリーは４０グループの７０，０００の独立したコスミドを代表するものであった。それぞれのグループを用いてＥｄ８７６７細菌に感染させ、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地において増幅させた。１６時間−培養のアリコットを凍結し、一部はタイター測定してライブラリーの増幅（１０5ｘ）を評価し、そして残りの培養をさらに増幅させて（参考文献として本出願にその内容を合体させる、デ・プレーン（De Plaen），Immunology Methods Manual Academic Press Ltd．，9.9：691-718（1997））に記載されているようにして、トータルコスミドＤＮＡを単離するのに用いた。
１６グループのおよそ７０，０００の独立したコスミドから抽出したＤＮＡを、ＭＡＧＥ−Ｃ１プライマーを用いたＰＣＲ増幅にかけた。１２のグループが陽性であることが判明し、そのうち１つをＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。１つの陽性のコスミド、Ｃ７．２が同定された。切断解析およびサザンブロットによって、このコスミドは、それぞれ１，１．４，１．６および２ｋｂの４つのＥｃｏＲＩフラグメントと１つの２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを保有し、全体のＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡクローン（配列番号１）に対応するプローブにハイブリダイズする、およそ４２ｋｂのインサートを含んでいることが明らかになった。これらの５つのフラグメントをファージミドｐＴＺ１９Ｒにサブクローニングし、そしてそれらのヌクレオチド配列を決定した。これらの配列とｃＤＮＡクローンとの比較によって、ＭＡＧＥ−Ｃ１は４つのエキソンからなること（図３）が示された。３４２６塩基対のオープンリーディングフレームがエキソンIIIの端に位置するＡＴＧにて開始し、エキソンIVのほとんどの部分にわたって広がっている。後者にはすべての反復モチーフが含まれるが、この反復領域の長さはｃＤＮＡクローンにおいて見られるものと比較してｇＤＮＡクローンにおいて見られるものの方が長かった。ｃＤＮＡとゲノムクローンは、異なる起源（それぞれ亜系統ＬＢ３７３−ＭＥＬおよびＬＢ３３−１５ＭＥＬ．Ａ−１）のライブラリーから得られたものであるが、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩプローブでのサザンブロット分析によって示されるように、この矛盾を対立遺伝子の変異（variation）によってはほとんど説明することができなかった。サザン分析の結果を確かめるために、両方の細胞系からのゲノムＤＮＡを、配列番号１のｎｔ５２１から５３６に対応するプライマーＳＬ３８（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴ−３’）および配列番号１のｎｔ１８６２から１８８２に対応するＳＬ４３（５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’）を用いてＰＣＲによって増幅したところ、同一サイズの産物が得られた。これらＰＣＲ産物の部分的な配列決定によって、２つの細胞系の間にヌクレオチドレベルでの差がないことが示され、ＬＢ３３−ＭＥＬ細胞には存在しない、ＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞におけるスプライス部位の存在は除外された。
逆転写のアーチファクト（人為的結果）がｇＤＮＡクローンとｃＤＮＡクローンとにおける反復領域の長さが異なることの原因であるかどうかを判定するために、トータルＲＮＡの逆転写から得られたｃＤＮＡをプライマーＳＬ３８およびＳＬ４３を用いてＰＣＲによって増幅した。
転写インヴィトロシステム（Transcription in vitro Systems（Promega））を用いてｃＤＮＡからのＭＡＧＥ−Ｃ１反復領域のＰＣＲ増幅とクローニングのためのＭＡＧＥ−Ｃ１  ＲＮＡを作製した。１μｇの、ＭＡＧＥ−Ｃ１  ｃＤＮＡクローンを含有するＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、４μｌの５ｘＳＰ６バッファー、１μｌの各１０ｍＭのＮＴＰ、２μｌの０．１Ｍのジチオトレイトール、０．５μｌ（２０ユニット）のＲＮａｓｅインヒビター、および１μｌ（１５ユニット）のＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、とともに希釈して最終容積２０μｌとした。２．４μｌの０．１ｍＭのＣＴＰを用いたこと以外は、上記の転写混合物と同一の混合物に、５μｌの［α−32Ｐ］ＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加したものをコントロール反応とした。３７℃で１時間インキュベートして反応を行った。１μｌ（１Ｕ）のＲＱ１ＤＮａｓｅを混合物に添加し、再び３７℃で１時間インキュベートした。放射能標識されたＲＮＡの１／１０をホルムアルデヒドアガロースゲルでの電気泳動によって分析し、ゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーにかけて全長の産物のみが得られていることを確かめた。非−放射性のＲＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、そして１０μｌの水に再懸濁した。１μｌのＲＮＡ溶液をトータルＲＮＡについての条件と同一の条件で逆転写した（参考文献として本出願にその内容を合体させる、ウェイナンツ（Weynants）他，Int．J．Cancer 56：826-829（1994））。プラスミドＤＮＡによるコンタミネーションを除外するために、ＭｏＭＬＶ逆転写酵素を添加しないコントロール反応も行った。完了した反応の１／４０について、ＳＬ３８センスプライマーとＳＬ４３アンチセンスプライマーとを用いた３７サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。コントロール反応においては検出可能な産物は検出されなかった。
配列番号１のｎｔ５２１から５３６に対応するセンスプライマーＳＬ３８（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴ−３’）および配列番号１のｎｔ１８６２から１８８２に対応するアンチセンスプライマーＳＬ４３（５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＴ−３’）を用いて、ｃＤＮＡ（２μｇのトータルＲＮＡからの逆転写産物の１／４０）、または、メラノーマ系統ＬＢ３７３−ＭＥＬおよびＬＢ−３３−ＭＥＬ．Ａ−１からの５００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、５μｌの１０ｘＤｙｎａＺｙｍｅバッファー、１μｌの各１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５ピコモル（pmoles）の各プライマー、および２ユニットのＤｙｎａＺｙｍｅ（FynnZymes Oy）を用いて最終容積５０μｌで、３０サイクル（ゲノムＤＮＡについて）または３７サイクル（ｃＤＮＡについて）行った。１サイクルは９４℃で１分、６５℃で１分そして７２℃で２分であった。
ＰＣＲ産物を真核ＴＡクローニングキット（the Eukaryotic TA Cloning Kit（Invitrogen））を用いてプラスミドｐＣＲ３に結合させ、そしてライゲーション産物をＴｏｐ１０Ｆ’細菌にエレクトロポレーションした。１．６から０．３５ｋｂの範囲にわたるサイズの複数の産物が得られた。それに対して、単一の産物が、プライマーＳＬ３８とＳＬ４３とを用いたＰＣＲによって増幅されたゲノムＤＮＡから得られた。複数のＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡクローンＭＡＧＥ−Ｃ１（配列番号１）からインヴィトロで転写された全長ＲＮＡの逆転写から得られたテンプレートｃＤＮＡを用いた場合にも得られた。これらの結果は、逆転写アーチファクトがゲノムＤＮＡとｃＤＮＡクローンとの間の矛盾の原因であるということ、そしてメラノーマ系統ＬＢ３７３−ＭＥＬにおけるＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子から転写された天然の（natural）ｍＲＮＡ種は、上述のコスミドＣ７．２において見られた全体の反復領域を含んでいるはずであるということを示唆している。この天然のｍＲＮＡの全長ｃＤＮＡの配列を配列番号９に示す。
反復領域は、全部で１８個の１４アミノ酸（ａａ）のダイレクト（direct）リピート、２１ａａの１７個のリピート、そして１６ａａの１６個のリピートに対応するものである。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１は遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１０と最大の全体的なホモロジーを共有している。しかし、図２と図３に示すように、ＭＡＧＥファミリーのなかで最もよく特徴づけられている遺伝子であるＭＡＧＥ−Ａ１との比較およびアラインメントを行った。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１のエキソン１は、その他のＭＡＧＥにおいて相同的な対応物がないが、ＭＡＧＥ−１（デ・スメット（De Smet）他，Immunogenetics 42：282-290，（1995）；デ・スメット（De Smet）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93：7149-7153，（1996））およびいくつかのＭＡＧＥ−４プロモーター（デ・プレーン（De Plaen）投稿されている）において記載されているように、第１エキソンの直前に、１つのＳｐ１および２つのＥｔｓコンセンサス結合部位が先行していることは注目すべきである。
例９  ＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子の染色体の所在（局在化）
プローブとしてコスミドＣ７．２を用いた蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験により、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１はＸ染色体の長腕上の、Ｘｑ２７バンド上に位置するということが示された。
ＭＡＧＥ−Ｃ１に対するヒトゲノムコスミドプローブを、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いた。全体のＭＡＧＥ−Ｃ１コスミドクローンを蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、ビオチン−１４  ｄＡＴＰおよびビオチン−１４  ｄＣＴＰ（Gibco BRL）を用いてニックトランスレーションし、２つの独立の実験において正常なヒトの中期（分裂中期）スプレッド（spreads）にハイブリダイズさせた。
染色体標本は、７２時間培養したフィトヘマグルチニン−刺激された正常な末梢血リンパ球から得た。Ｒ−バンディング（Ｒ−バンド形成）を誘発するために、培養の一部をチミジンによって４８時間後に同調させ、３７℃でインキュベートし、そして最終的な後期Ｓ期の間に、翌朝５’ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で処理し、そして６時間後に収集した（Jackey，P．B．，Raven Press，p．89，（1991））。細胞遺伝学的な収集およびスライドガラスの調製は標準的方法を用いて行った。そのスライドガラスを使用前まで−８０℃で保存した。
中期（分裂中期）染色体に対する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをピンケル（Pinkel）他（参考文献として本出願にその内容を合体させる、ピンケル（Pinkel）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：2934-2938，（1986））に記載されているようにして行った。簡単に説明すると、ビオチン−標識化プローブ（５０−１００ｎｇ）をハイブリダイゼーション混合物（５０％  ホルムアミド、１０％  デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ、０．１μｇ  ＣＯＴ−１  ＤＮＡ（Gibco BRL）、キャリアとして１０μｇの共用（shared）サケ精子ＤＮＡ）中に溶解し、そして３７℃で６０分間インキュベートしてプローブにおける反復配列に対してＣＯＴ−１  ＤＮＡをアニールさせた。プローブ混合物を次にスライドガラスにのせてスライドガラス暖熱装置で８０℃にて１０分間共−変性させた。ハイブリダイゼーションを湿性チャンバー（humid chamber）中で３７℃で一晩進行させた。スライドガラスを、ＦＩＴＣ−ビオチン検出キットによってホルムアミド洗浄手順を用いて洗浄し、そして適切な場合は二色ＦＩＳＨ（Oncor）のための増幅プロトコールを用いた。ビオチン−標識化プローブ検出はＦＩＴＣ−アビジン結合体（conjugate）とのインキュベーションによって達成し、そしてジゴキシゲニン−標識化染色体Ｘ特異的α−サテライトリピートプローブは抗−ジゴキシゲニン−ローダミン結合体（conjugate）を用いて検出した。
染色体の同定は染色体Ｘ特異的α−サテライトリピートプローブ（Oncor）を用いた同時ハイブリダイゼーション、または５−ブロモデオキシウリジンを用いたＲ−バンディング（Ｒ−バンド形成）によって行い、Ｒ−バンディングパターンを形成させるための対比染色（後染色counterstain）として０．０１μｇ／ｍｌのよう化プロピジウムを含有するｐ−フェニレンジアミン（ｐＨ１１）の修飾抗退色（antifade）封入（mounting）溶液中にスライドガラスを封入（マウンティング）した（レミュー（Lemieux）他，Cytogenet．Cell Genet．59：311-312（1992））。スライドガラスをＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡および適切なＵＶ−フィルターの組み合わせを用いて調べ、撮影した。３５ｍｍスライドガラスを、Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｓｃａｎを用いてスキャンし、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ４．０を用いて加工し、そしてＦｕｊｉｘ  Ｐｉｃｔｒｏｇｒａｐｈｙ  ３０００を用いてプリントした。
ヒトＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子座の染色体の所在（局在化）は、はじめにここでは記載しない実験において体細胞ハイブリッドマッピングによって得、そして独立的に上述の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって確認し、そしてさらに正確にした。これらの実験において、正常リンパ球からの４７のＲ−バンドのある中期（分裂中期）スプレッド（spreads）をハイブリダイゼーションの特異的シグナルについて調べた。シグナルは、それらが単一の染色体の各染色分体において検出された場合にのみ特異的であるとみなした。調べた４７の中期のうち１５において（３２％）特異的シグナルがみられた。各場合において、ハイブリダイゼーションシグナルはＸ染色体の末端の（中心から遠い）部分に位置していた。染色体のＲ−バンディングパターンによって、ＭＡＧＥ−Ｃ１遺伝子座がＸｑ２６−ｑ２７にあるという、より明確な局在化がなされた。
興味深いことに、ＭＡＧＥファミリーのその他のメンバーもＸ染色体の長腕および短腕の両方に局在している。１２のＭＡＧＥファミリーの遺伝子がＸ染色体の長腕の末端領域にマッピングされており（デ・プレーン（DePlaen）他，Immunogenetics 40：360-369，（1994）；オークス（Oaks）他，Cancer Research 54：1627-1629，（1994））、そしてＭＡＧＥ−Ｘｐは領域における短腕のＸｐ２１．３領域に位置している（ムスカテッリ（Muscatelli）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92：4987-4991（1995））。
例１０潜在的（potential）ＨＬＡクラスＩ−結合性ＭＡＧＥ−Ｃ１ペプチドの同定
ＨＬＡクラスＩ−結合性ペプチドについてのＭＡＧＥ−Ｃ１タンパク質配列の検索を、Ｗｅｂサイト上：http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio（参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、Parker，K．C．，M．A．Bednarek，and J．E．Coligan，“Scheme for Ranking Potential HLA-A2 Binding Peptides Based on Independent Binding of Individual Peptide Side-Chains，”J．Immunol．152：163（1994））で行った。表３は、表示したＨＬＡクラスＩ分子に結合することが予想され、かつ、ＭＡＧＥ−Ｃ１タンパク質において１回以上みられるペプチドの一覧表である。
例１１
Ａ．メラノーマ腫瘍ＬＢ３７３−ＭＥＬからのＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓの作製
テスターと称するメラノーマ細胞にのみ存在する配列について濃縮されたｃＤＮＡライブラリーを、ドライバーと称する正常な皮膚細胞によって共有されている配列を除くことによって作製した。その濃縮結果をＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＤＰ）と称する。
より具体的には、メラノーマＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞（テスター細胞）および正常な皮膚サンプル（ドライバー細胞）からトータルＲＮＡを調製し、オリゴ−ｄＴカラムで精製してポリ−Ａ＋ＲＮＡを得た。ポリ−Ａ＋ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製した。その結果得られたｃＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩＩで消化した。ＤｐｎＩＩはＤＮＡをＧＡＴＣ部位において切断するものであり、この消化によって５’−ＧＡＴＣオーバーハングを備えた二本鎖ＤＮＡの短い断片が生じた。５’−ＧＡＴＣオーバーハングを備えた二本鎖アダプター（Ｒ−Ｂｇｌ−１２およびＲ−Ｂｇｌ−２４、それぞれ配列番号２および４、がアニールしたものからなるＲ−Ｂｇｌアダプター）を、消化されたｃＤＮＡに結合させた。アダプターに結合させたｃＤＮＡを次に、プライマーとしてＲ−Ｂｇｌアダプターの一方の鎖であるＲ−Ｂｇｌ−２４を用いてＰＣＲによって増幅させた。その結果得られた産物は、それぞれテスターおよびドライバーの代表物（representation）と称する。両方の代表物（representations）を、ＤｐｎＩＩで消化した。消化されたテスターを新しいアダプター分子（Ｊ−Ｂｇｌ−１２およびＪ−Ｂｇｌ−２４、それぞれ配列番号３および１２、がアニールしたものからなるＪ−Ｂｇｌアダプター）に結合した。次に差引きハイブリダイゼーションの最初のラウンドを、１００／１の比率で、消化されたドライバーｃＤＮＡと、このＪ−Ｂｇｌアダプター結合した消化されたテスターｃＤＮＡとを混合し、サンプルを変性させ、６７℃で２０時間インキュベートして変性させたサンプルを再ハイブリダイズ（rehybridize）させることによって行った。ハイブリダイゼーションの後、サンプルをＪ−Ｂｇｌアダプターの一方の鎖、Ｊ−Ｂｇｌ−２４をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した。ドライバー集団から生じた２本のＤＮＡ鎖からなるハイブリッドは、Ｊ−Ｂｇｌアダプターに結合していないので増幅されなかった。各起源（テスターおよびドライバー）からのそれぞれ一方のＤＮＡ鎖からなるハイブリッドは、直線的にしか増幅しなかった。２本のテスター鎖からなる二本鎖（テスターに独特の配列を表すもの）のみが、指数関数的に増幅した。１０サイクルのＰＣＲ増幅後、サンプルをMung Beanヌクレアーゼ（直線的増幅によって生じた一本鎖ＤＮＡを特異的に消化する）で処理し、そして更に１８サイクルＰＣＲを行った。
その結果得られた産物を、ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  １（ＤＰ１）と称する。ＤＰ１に対するＪ−Ｂｇｌアダプターを、Ｎ−Ｂｇｌ−１２／２４アダプター（Ｎ−Ｂｇｌ−１２：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ−３’；Ｎ−Ｂｇｌ−２４：５’−ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ−３’）即ち、Ｎ−Ｂｇｌ−１２およびＮ−Ｂｇｌ−２４オリゴヌクレオチド、それぞれ配列番号４および配列番号１３、がアニールしたものからなるアダプターに変更し、そして差引きハイブリダイゼーションのプロセスと選択的増幅を繰り返して第２のｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓを作製した（ＰＣＲ反応におけるアニーリングと伸長を７２℃で行ったことを除く）。テスター対ドライバー比を１：８００としてＤＰ２．ＬＢ３７３（−皮膚）を作製した。
ＤＰ２．ＬＢ３７３［−皮膚］をファージミドベクターｐＴＺ１８Ｒにクローニングし、メラノーマにおいて発現するが正常な皮膚においてはサイレントな（silent）配列が濃縮されたｃＤＮＡライブラリーを作製した。
Ｂ．個々のクローンの配列決定によるメラノーマ濃縮ライブラリーの分析
濃縮メラノーマライブラリーから単離された４９の個々のクローンについて配列決定した。これらは２７種類の遺伝子に対応していた。データバンクにおいて報告されている配列とのホモロジーについての検索により、これら２７遺伝子の内１６が以前に同定されている遺伝子に対応することが示された。注目すべきことに、それらの内２つは、腫瘍および精巣において独占的に発現していることが知られている、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ３および遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１０にそれぞれ対応していた。１１の配列は未知であり、ＲＴ−ＰＣＲを用いてそれらが異なる正常組織のパネルにおいて発現しているかどうかを判定した。これら１１の新規な遺伝子の内２つだけが、精巣を除く正常組織においては発現しないものであった。このうち第１のものをＬＡＧＥ−１と命名した。これは米国特許出願第０８／７９１，４９５号に記載されている。第２のものはＭＡＧＥ遺伝子ファミリーのメンバー、より具体的には遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１と有意なホモロジーを共有していた。したがってこれをＭＡＧＥ−Ｃ２と命名した。
Ｃ．完全なＭＡＧＥ−Ｃ２  ｃＤＮＡの検索
濃縮メラノーマライブラリーから単離されたＭＡＧＥ−Ｃ２クローンは、完全なＭＡＧＥ−Ｃ２メッセンジャーの、ＤｐｎＩＩ制限酵素断片である。完全なＭＡＧＥ−Ｃ２  ｃＤＮＡを単離するために、我々はＭＡＧＥ−Ｃ２プローブによってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
前述のようにして、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ中にＬＢ３７３−ＭＥＬ  ＲＮＡによってｃＤＮＡライブラリーを作成した。およそ８４，０００の細菌をナイロンメンブランに蒔いた（plated）。デュプリケート（duplicate）を作り、変性処理して細菌ＤＮＡを固定した。部分的ＭＡＧＥ−Ｃ２クローンに対して、特異的プライマー、ＳＬ１０２およびＳＬ１０３（ＳＬ１０２：５’−ＡＧＧＣＧＣＧＡＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧ−３’、配列番号１５；ＳＬ１０３：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ−３’、配列番号１６）を用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＡＧＥ−Ｃ２特異的プローブを作成した。２０６ｂｐのＭＡＧＥ−Ｃ２  ＰＣＲ産物をセファロースＣＬ−６Ｂカラムで精製し、そして、ランダムプライマー、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、およびα−32Ｐ−ｄＣＴＰ、を用いて標識した。処理されたデュプリケートをＭＡＧＥ−Ｃ２特異的プローブとハイブリダイズさせ（５００，０００ｃｐｍ／ｍｌ；６５℃、一晩のインキュベーション）、次にストリンジェントな条件で洗浄し（最後の洗浄をＳＳＣ  ０．２ｘ、ＳＤＳ  ０．１％で６５℃で行った）、そして、７０時間オートラジオグラフィーを行った。その結果８つの陽性のスポットが得られた。二次スクリーニングを行い、そしてＭＡＧＥ−Ｃ２に対する大きなオープンリーディングフレームを含む１つの細菌のクローンが得られた。
ＭＡＧＥ−Ｃ２  ｃＤＮＡは１９８３ｂｐ−長（配列番号１８）である。オープンリーディングフレームは、位置３３０のＡＴＧで始まり、位置１４４９の終止コドンで終わるものであり、３７３アミノ酸からなる推定上のタンパク質（配列番号１９）をコードするものである。
Ｄ．ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の構造
ＭＡＧＥ−Ｃ２  ｃＤＮＡのいくつかの領域に対して相補的なＰＣＲプライマーを選択し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの増幅後に得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。プライマー対ＡおよびＢ（図４）によるゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ｃＤＮＡの増幅によって得られた産物よりもサイズの大きな産物が生じ、このことは、ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子において少なくとも２つのイントロンが存在することを明らかにするものである。これら２つのイントロンの配列はＰＣＲ産物の配列決定によって決定した。プライマー対ＣおよびＤ（図４）によるＰＣＲ増幅では、テンプレートとしてｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを用いた場合、同じサイズの産物が生じ、このことは、ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子においてさらなるイントロンが存在しないことを示唆している。ｃＤＮＡクローンの配列から、および、イントロンの配列から推定された、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２の配列を、配列番号２０に示す。
遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ａ１の概略表示を図４に示す。全体のＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１配列に対して相同的である。にもかかわらず、ＭＡＧＥ−Ｃ２は遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１のコード領域にみられる、大きい反復領域を含んでいない。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２のエキソン−イントロン構造は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１のもの（エキソン−イントロン構造）と、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１によって図４において代表されるＭＡＧＥ−Ａ遺伝子のもの（エキソン−イントロン構造）との中間である。ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子のように、ＭＡＧＥ−Ｃ２は３つのエキソンからなるが、ＭＡＧＥ−Ｃ２のエキソン１および２は、ＭＡＧＥ−Ｃ１のエキソン１および２に対して相同的である。ＭＡＧＥ−Ｃ２の第３エキソンは、ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の第３エキソンの構造と共通点のある構造を有している。それは、全体のオープンリーディングフレームを含み、そして類似の位置から開始する。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２のコード配列は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１のコード配列よりも長く、これは、開始コドンのすぐ後の、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１においてはみられない１０８ｂｐ−配列の挿入によるものである。
Ｅ．遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２の発現
ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の発現パターンを正常組織および腫瘍サンプルのＲＴ−ＰＣＲ分析によって判定した。選択したセンスプライマーＳＬ１０２（配列番号１５）およびアンチセンスプライマーＳＬ１０３（配列番号１６）は、異なるエキソンに位置する（図４：プライマー対Ａ）。ＭＡＧＥ−Ｃ２は、精巣を例外として、テストした正常組織のパネル（表４）においては発現していない。腫瘍のサンプルについては、ＭＡＧＥ−Ｃ２は、メラノーマおよび膀胱移行上皮癌において頻繁に発現している。また、頭頸部癌、乳癌、非小細胞肺癌、および肉腫においても有意な割合で発現している（表５）。ＭＡＧＥ−Ｃ２の発現は、その他のＭＡＧＥ遺伝子の発現と相関している。３２６の腫瘍サンプルをテストした。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２を発現する６３のサンプルの内、６２が少なくとも１つのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子も発現している。ＭＡＧＥ−Ｃ２の発現について陽性であるのにその他のすべてのＭＡＧＥ遺伝子については陰性である、唯一の腫瘍サンプルは乳房腫瘍サンプルである。後者のような腫瘍を有する癌患者のための、ＭＡＧＥ抗原による特異的な免疫療法は、もっぱらＭＡＧＥ−Ｃ２由来抗原の使用に頼ることになるであろう。
Ｆ．ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の染色体の位置
ＭＡＧＥ−Ｃ２遺伝子の染色体の位置を、the GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel（参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、ウォルター（Walter）他，Nature Genet，7：22-28（1994））のＰＣＲ分析によって判定した。このパネルからのそれぞれのＤＮＡに対して、プライマーＳＬ１０２およびＳＬ１０３、配列番号１５および１６を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブランにブロットし、そして放射能標識したプライマーＳＬ１１８（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＡＧＡ−３’配列番号１７）とハイブリダイズさせた。プライマーＳＬ１１８は、遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ２の最初のイントロンの配列に対して相補的である。ＰＣＲの結果を、Ｗｅｂサイト上：http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.plで分析にかけた。この分析によってＭＡＧＥ−Ｃ２は、Ｘ染色体上のマーカーＤＸＳ１２２７とＤＳＸ７０８７の間に位置することが明らかになった。遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１は、細胞遺伝学的バンドＸｑ２６−Ｘｑ２７に対応する、これらの同じマーカーの間に位置する。
Ｇ．ＭＡＧＥ−Ｃ２とその他のＭＡＧＥタンパク質
ＭＡＧＥ−Ｃ２タンパク質はその他のＭＡＧＥタンパク質と類似性を共有している。すべての既知のＭＡＧＥタンパク質の複数のアラインメントにより、最大のホモロジーはそれらのＣＯＯＨ−末端において観察されることが示されている。
ＭＡＧＥ−Ｃ２のＣ−末端の３分の２と、その他のＭＡＧＥタンパク質の対応するセグメントとの間の対の比較の結果を表６に示す。ＭＡＧＥ−Ａタンパク質のＣ−末端セグメントは、５２から９４％のアミノ酸アイデンティティを共有しており、それら同士でのアイデンティティの方がＭＡＧＥ−Ｂタンパク質とのものよりも近く、ＭＡＧＥ−Ａタンパク質はＭＡＧＥ−Ｂタンパク質とは３９から５５％のアミノ酸アイデンティティを共有している。同様に、ＭＡＧＥ−Ｂタンパク質はＭＡＧＥ−Ａタンパク質とよりも、それら同士でのアイデンティティの方が近く、それら同士では５２から６７％のアミノ酸アイデンティティを共有している。配列類似度の判定基準によると、ＭＡＧＥ−Ｃ１とＭＡＧＥ−Ｃ２とは第３のサブファミリーに属する：これらは互いに６８％のアミノ酸アイデンティティを共有しているのに対し、ＭＡＧＥ−Ａタンパク質とは４３から５５％のアミノ酸アイデンティティ、および、ＭＡＧＥ−Ｂタンパク質とは３９から４６％しか共有していない。
Ｈ．潜在的（potential）ＨＬＡクラスＩ−結合性ＭＡＧＥ−Ｃ２ペプチドの同定
ＨＬＡクラスＩ−結合性ペプチドについてのＭＡＧＥ−Ｃ２タンパク質配列の検索を、Ｗｅｂサイト上：http://bimas.dcrt.nih.gov/molbioで行った。表７は、表示したＨＬＡクラスＩ分子に結合することが予想されるＭＡＧＥ−Ｃ２ペプチドの一覧表である。これらのＨＬＡクラスＩ分子は、以前にＭＡＧＥファミリーの遺伝子によってコードされるペプチドを、いくつかの腫瘍上に提示することが示されたものである。
Ｉ．サザンブロット分析
メラノーマ細胞系ＬＢ３７３−ＭＥＬ，ＳＫ２９−ＭＥＬ、およびＬＢ３３．Ａ−１からのゲノムＤＮＡによって調製したサザンブロットを、配列番号１８に由来する１．９ｋｂ  ＰＣＲ増幅プローブとハイブリダイズさせた。ブロットの調製は、上述（例７）のようにして行った。［α−32Ｐ］ｄＣＴＰによって放射能標識されたＭＡＧＥ−Ｃ２プローブへのハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、０．１％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中にて１８時間６８℃で行った。このメンブランを連続的に、室温で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、そして、６８℃で２０分２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄した。オートラジオグラフィーを１０日間行った。
３つのメラノーマ系統から得られたゲノムＤＮＡにおいて、いくつかのハイブリダイズするバンドが見られた。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限酵素によって消化した。ＥｃｏＲＩで消化されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＡＧＥ−Ｃ２プローブとハイブリダイズする少なくとも５つのバンドを認めることができた。それらの内２つはそれぞれ遺伝子ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２のフラグメントを表すものであった。これらの結果は、ここに記載したＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２が、より大きなＭＡＧＥ−Ｃファミリーのメンバーであることを示唆するものである。
0003915076.tif 000002
0003915076.tif 000003
0003915076.tif 000004
0003915076.tif 000005
0003915076.tif 000006
0003915076.tif 000007
0003915076.tif 000008
0003915076.tif 000009
配列リスト
(1)一般情報：
(i)出願人：ルーカス，ソフィー；
デ・スメット，チャールズ；および
ブーン-ファラー，ティエリー
(ii)発明の名称：腫瘍拒絶抗原前駆体MAGE-C1およびMAGE-C2をコードする単離核酸分子とその利用方法
(iii)配列の数：20
(iv)連絡先：
(A)宛名：フェルフェ・アンド・リンチ
(B)通り名：サード・アベニュー805
(C)都市名：ニューヨーク・シティ
(D)州名：ニューヨーク
(E)国名：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10022
(V)  コンピュータ読み取り可能フォーム：
(A)  媒体型式：3.5インチ フロッピーディスク，360kbメモリ
(B)  コンピュータ：IBM PS/2
(C)  オペレーティング・システム：PC-DOS
(D)  ソフトウェア：ワードパーフェクト（Wordperfect）
(vi)  現在の出願データ：
(A)  出願番号：付与される予定である
(B)  出願日：これと同時
(C)  分類：435
(vi)  先の出願データ：
(A)  出願番号：08/845,528
(B)  出願日：1997年４月25日
(viii)  弁理士／代理人情報：
(A)  氏名：メアリー・アン・スコフィールド
(B)  登録番号：36,669
(C)  参照／書類番号：LUD5455.2PCT
(ix)  通信情報：
(A)  電話：(212)688-9200
(B)  ファックス：(212)838-3884
(2)配列番号１の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：4031塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号1：
0003915076.tif 000010
0003915076.tif 000011
0003915076.tif 000012
(2)配列番号２の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：12塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号2：
0003915076.tif 000013
(2)配列番号３の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：12塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号3：
0003915076.tif 000014
(2)配列番号４の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：12塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号4：
0003915076.tif 000015
(2)配列番号５の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：45塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号5：
0003915076.tif 000016
(2)配列番号６の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：12塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(ix)  特徴：
(D)  その他の情報：BstX1アダプター上側鎖
(xi)  配列の記述：配列番号6：
0003915076.tif 000017
(2)配列番号７の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：1142
(B)  タイプ：アミノ酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号7：
0003915076.tif 000018
0003915076.tif 000019
0003915076.tif 000020
0003915076.tif 000021
(2)配列番号８の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：1691塩基対
(B)  タイプ：ヌクレオチド
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号8：
0003915076.tif 000022
0003915076.tif 000023
(2)配列番号９の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：4225塩基対
(B)  タイプ：ヌクレオチド
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号9：
0003915076.tif 000024
0003915076.tif 000025
0003915076.tif 000026
(2)配列番号10の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：310
(B)  タイプ：アミノ酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号10：
0003915076.tif 000027
0003915076.tif 000028
(2)配列番号11の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：24塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号11：
0003915076.tif 000029
(2)配列番号12の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：24塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号12：
0003915076.tif 000030
(2)配列番号13の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：24塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号13：
0003915076.tif 000031
(2)配列番号14の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：８塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(ix)  特徴：
(D)  その他の情報：BstX1アダプター下側鎖
(xi)  配列の記述：配列番号14：
0003915076.tif 000032
(2)配列番号15の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：18塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号15：
0003915076.tif 000033
(2)配列番号16の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：18塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号14：
0003915076.tif 000034
(2)配列番号17の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：20塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号17：
0003915076.tif 000035
(2)配列番号18の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：1983塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号18：
0003915076.tif 000036
0003915076.tif 000037
(2)配列番号19の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：373
(B)  タイプ：アミノ酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号19：
0003915076.tif 000038
0003915076.tif 000039
(2)配列番号20の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：2940塩基対
(B)  タイプ：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列の記述：配列番号20：
0003915076.tif 000040
0003915076.tif 000041
0003915076.tif 000042
配列番号：18
MAGE-C2 cDNAクローンのヌクレオチド配列
0003915076.tif 000043
配列番号：19
MAGE-C2タンパク質の推定アミノ酸配列
0003915076.tif 000044
配列番号：20
MAGE-C2遺伝子のヌクレオチド配列
0003915076.tif 000045
【図１（Ａ）】
0003915076.tif 000046
【図１（Ｂ）】
0003915076.tif 000047
【図１（Ｃ）】
0003915076.tif 000048
【図１（Ｄ）】
0003915076.tif 000049
【図１（Ｅ）】
0003915076.tif 000050
【図１（Ｆ）】
0003915076.tif 000051
【図２（Ａ）】
0003915076.tif 000052
【図２（Ｂ）】
0003915076.tif 000053
【図２（Ｃ）】
0003915076.tif 000054
【図２（Ｄ）】
0003915076.tif 000055
【図２（Ｅ）】
0003915076.tif 000056
【図２（Ｆ）】
0003915076.tif 000057
【図３】
0003915076.tif 000058
【図４】
0003915076.tif 000059