(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン類1分子当たり、少なくとも3原子の鉄を保持した鉄‐ラクトフェリンを有効成分とする細菌性エンテロトキシン中和剤。
【請求項２】
鉄‐ラクトフェリンが、ラクトフェリン類に炭酸及び／又は重炭酸と鉄とが結合した鉄‐ラクトフェリン結合体及び／又は鉄‐ラクトフェリン複合体である請求項1記載の細菌性エンテロトキシン中和剤。
【請求項３】
鉄‐ラクトフェリンが、ラクトフェリン類1g当たり、15mg以上の炭酸及び／又は重炭酸と、10〜700mgの鉄とが結合した鉄‐ラクトフェリン結合体及び／又は鉄‐ラクトフェリン複合体である請求項1記載の細菌性エンテロトキシン中和剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレラ菌、毒性大腸菌、サルモネラ菌等により生産される細菌性エンテロトキシン中和剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、コレラ菌による食中毒は腹痛を伴う激しい下痢を引き起こす。このため、コレラ菌感染者は、下痢により極端な脱水症状を呈し、極端な場合はこの為に死亡する例もある。コレラ菌による食中毒の場合にみられる激しい下痢は、コレラ菌が菌体外に生産するコレラトキシンと呼ばれるエンテロトキシンによることが明らかになっている。コレラトキシンは、分子量84,000のタンパク質でＡサブユニット１個とＢサブユニット５個からなっている。そして、コレラトキシンのＢサブユニットが小腸粘膜細胞に存在するレセプターに結合し、細胞内のサイクリックＡＭＰ量を増大させることにより、膜透過性が変化し、細胞内の水分及び塩類が細胞外に浸出して下痢を引き起こすといわれている。なお、コレラトキシンのような細菌性エンテロトキシンは、毒性大腸菌やサルモネラ菌等からも分離されており、食中毒の原因となっている。
【０００３】
ところで、上述した小腸粘膜細胞に存在するレセプターとして糖脂質が確認されており、コレラトキシンのレセプターとしてガングリオシドＧＭ1 が同定されている。既に、このガングリオシドＧＭ1 をコレラ毒素の中和剤として利用する試みがなされている。例えば、コレラトキシンの中和作用を有するガングリオシドＧＭ1 等のガングリオシドをラテックス等に固定した中和剤 (特開昭 56-500138号公報）や牛乳脂肪球皮膜を熱処理して脂肪球皮膜に含まれるガングリオシドＧＤ3 、ガングリオシドＧＭ3 等を抽出することなく使用する毒素中和剤 (特開昭60-72819号公報) 等が提案されている。しかし、ガングリオシドＧＭ1 は、ウシ等の脳や乳から微量にしか得られないという問題があり、また、乳脂肪球皮膜中のガングリオシド含量は一定でなく、かつ組成も安定していないという問題があった。
【０００４】
また、細菌毒素がシアル酸含有複合糖質に結合して中和活性を示すことを利用し、牛乳由来のラクトフェリン等を有効成分とする中和剤（特開平2-207089号公報）が提案されている。なお、ラクトフェリンは、鉄２分子をその分子内に結合することができる分子量約80,000の糖蛋白質である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ラクトフェリンの薬理作用について研究を行っていたところ、コレラ菌、毒性大腸菌、サルモネラ菌等の産生する細菌性エンテロトキシンに対して、鉄−ラクトフェリンが通常のラクトフェリンに比べ、強い細菌毒素中和活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、鉄−ラクトフェリンを有効成分とする細菌性エンテロトキシン中和剤を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ラクトフェリンは、通常、１分子当たり鉄を２原子キレート結合する能力を有している。本発明で使用する鉄−ラクトフェリンは、ラクトフェリンに特定の処理を行うことにより、ラクトフェリン１分子当たり少なくとも３原子の鉄を安定に保持できるようにしたものである。このような鉄−ラクトフェリンは従来より知られている。例えば、ラクトフェリン溶液に鉄塩を添加し、アルカリを加えて溶液のpHを高めることにより得られる、鉄を安定に保持したラクトフェリン粉末（特開平7- 17825号公報）、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄複合体（特開平6-239900号公報）、あるいは炭酸、重炭酸及びラクトフェリンを含む溶液に鉄を含有する溶液を混合して得られる炭酸又は重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体（特開平7-304798号公報）等が知られている。
【０００７】
本発明で使用することができる鉄−ラクトフェリンは、これらいずれの鉄−ラクトフェリンであっても良い。鉄−ラクトフェリンは、鉄とラクトフェリンとが結合した状態のものであって、鉄とラクトフェリンとが結合しているか、あるいは他の物質を介して鉄とラクトフェリンとが結合しているものであって、いわゆる、鉄がイオン状態で存在していないものであれば良い。特に、ラクトフェリン類に炭酸及び／又は重炭酸と鉄とが結合した状態の鉄−ラクトフェリン結合体や鉄−ラクトフェリン複合体を例示することができ、これらの鉄−ラクトフェリンを使用することが望ましい。これらの鉄−ラクトフェリンは、耐熱性を有しているので、医薬品や飲食品に添加し、加工する際に加熱処理しても、細菌性エンテロトキシン中和能の低下が起こり難いという特徴を有している。また、これらの鉄−ラクトフェリンは、鉄の収斂味や金属味等が全くしないという特徴を有しているので、風味上の問題も全くない。
【０００８】
本発明では、細菌性エンテロトキシン中和剤の有効成分として、鉄−ラクトフェリンを使用する。
【０００９】
なお、上述したような鉄−ラクトフェリンを製造する際に使用することができるラクトフェリン類としては、哺乳類の乳等の分泌液から分離して得られるラクトフェリンを例示することができるが、血液や臓器等から分離されるトランスフェリンや卵から分離されるオボトランスフェリン等も同様の特性を有しており、ラクトフェリン類として同様に使用することが可能である。また、ラクトフェリン類は、完全に単離されている必要はなく、他の成分が含まれているものであっても構わない。さらに、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物から生産されたラクトフェリン類も、その安全性が保証されているものであれば、使用することが可能である。そして、ラクトフェリン類をタンパク質分解酵素で分解したものを使用することもできる。
また、上述したような鉄−ラクトフェリンを製造する際に使用することができる鉄としては、硫酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、乳酸鉄、クエン酸鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄等を例示することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の細菌毒素中和剤は、乳から簡単な処理により得られる、あるいは既に比較的安価に市販されているラクトフェリンに、特定の処理を行うことにより得られる鉄−ラクトフェリンを有効成分として使用する。
【００１１】
細菌毒素中和剤の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散在、粉剤等にすれば良く、経口的に投与することが望ましい。また、これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができる。例えば、製剤の製造上許可される担体や賦形剤等と混合して成型する。
【００１２】
また、本発明の細菌毒素中和能を賦与した飲食品については、鉄−ラクトフェリンを前記したような剤型とし、経口剤に配合したり、あるいは鉄−ラクトフェリンを牛乳、乳飲料、コーヒー牛乳、ジュース、ゼリー、ビスケット、飴、パン、麺、ソーセージ等の飲食品、さらには各種粉乳の他、乳児、幼児及び低出生体重児などを対象とする栄養組成物に配合したりする。
【００１３】
これらの飲食品は、細菌性エンテロトキシンに対する中和能を有しているので、細菌性エンテロトキシンに起因する疾病を予防し、治療する用途に用いることができる。
【００１４】
本発明において、細菌毒素中和能を発揮させるためには、成人の場合、鉄−ラクトフェリンを一日当たり 0.1〜5,000mg 摂取できるよう配合量等を調整すれば良い。
次に実施例及び試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１５】
【実施例１】
水 10 l に市販のラクトフェリン (ＤＭＶ社製) 90g と塩化第二鉄 52gを溶解し、撹拌機で撹拌しながら重炭酸ナトリウム5gを添加して鉄−ラクトフェリンを含む溶液を調製した。この溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮した後、水を加えて容量 10 l の溶液とした。なお、この鉄−ラクトフェリンを含む溶液について、誘導結合プラズマ発光分光分析器 (ＩＣＰ) で測定したところ、溶液中に含まれる鉄量は 102mg/100mlであった。次に、この溶液を凍結乾燥して鉄−ラクトフェリン粉末100gを得た。なお、この鉄−ラクトフェリン粉末は、鉄を多く含んでいるにも関わらず、無味、無臭であった。
【００１６】
【実施例２】
水 2 lに重炭酸ナトリウム400gを添加し、撹拌機で撹拌して調製した重炭酸ナトリウム過飽和溶液中に、水 8 lに市販ラクトフェリン (ＤＭＶ社製) 90g と塩化第二鉄 52gを溶解した溶液を撹拌しながら添加し、鉄−ラクトフェリン複合体を含む溶液を調製した。この溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮した後、水を加えて容量 10 l の溶液とした。なお、この鉄−ラクトフェリン複合体を含む溶液について、ＩＰＣで測定したところ、溶液中に含まれる鉄量は 101mg/100mlであった。次に、この溶液を凍結乾燥して鉄−ラクトフェリン複合体粉末100gを得た。なお、この鉄−ラクトフェリン複合体粉末は、鉄を多く含んでいるにも関わらず、無味、無臭であった。
【００１７】
【試験例１】
実施例１で得られた鉄−ラクトフェリン及び市販のラクトフェリン（ＤＭＶ社製）を試料として、毒素原性大腸菌エンテロトキシン又はコレラトキシンによるチャイニーズハムスター卵巣細胞の形態変化に対する阻止効果を調べた。なお、試験は次のように行った。
【００１８】
（１）チャイニーズハムスター卵巣細胞の形態変化活性を測定する際に用いるコレラトキシン及びエンテロトキシン濃度の決定
抗原性の異なる２種類のエンテロトキシンであるCFA/I(LT-I) とエンテロトキシンCFA/II(LT-II) を生産する２種類の病原性大腸菌（都立衛生研究所より分譲された血清型 H-10407-p株）を普通ＣＡＹＥ培地で振盪培養した。この培養液を遠心分離し、得られた上清を1/10〜1/1000まで段階的に希釈し、それぞれの希釈液を氷上に置いたLab-Tek8チャンバー（フローラボラトリーズ社製）に入れた。また、コレラトキシン（リストバイオロジカルラボラトリーズ社製）についても同様に希釈し、Lab-Tek8チャンバー（以下、８チャンバーと記す）に入れた。次いで、８チャンバーの各穴に１％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＦＣＳ／ＤＭＥＭ） 400μl を入れ、これに10％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで培養したチャイニーズハムスター卵巣K1細胞(CHO-K1 細胞、ATCC-CCL6)を 5,000cells/mlになるように10％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中に懸濁させた細胞懸濁液を50μl 入れ、５％二酸化炭素濃度のインキュベーター中で37℃、一夜培養した。その後、培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水 (ＰＢＳ(-))で８チャンバー内を洗浄し、さらに、８チャンバー内の細胞を染色し、風乾した。
【００１９】
顕微鏡により、一つの試料について 200〜400 個の細胞を観察し、変形した細胞数の割合を数え、各毒素について各濃度当たりのCHO-K1細胞の形態変化率を算出した。コレラトキシンでは10μg/ml、毒素原性大腸菌エンテロトキシンLT-I、LT-II では培養上清そのものでCHO-K １細胞を少なくとも70％以上形態変化させ得ることが判明した。以下の実験では、この濃度の各毒素を用いることとした。
【００２０】
（２） CHO-K1 細胞の形態変化に対する阻止効果
市販のラクトフェリン（ＤＭＶ社製）又は実施例１で得られた鉄−ラクトフェリンを用いて、細胞の形態変化に対する阻止効果を調べた。
10μg/mlのコレラトキシン及び毒素原性大腸菌エンテロトキシンLT-I、LT-II に培養上清をそれぞれ10μl ずつ氷上に置いた８チャンバーに入れ、これに各試料を必要濃度にＰＢＳ(-) で溶解した溶液50μl を加え、振盪し反応させた。その後、メタノール固定、ギムザ染色を行い、形態変化率を算出した。
【００２１】
これによると、鉄−ラクトフェリンは、ラクトフェリンと比べて、CHO-K1細胞の形態変化に対する阻止効果を強く有しており、コレラトキシン、毒素原性大腸菌エンテロトキシンLT-I及びLT-II の毒性を強く中和することが判った。
【００２２】
（３）コレラトキシンのＢサブユニットとガングリオシドＧＭ1 の結合に対する阻害効果
先に述べたように、コレラトキシンはＢサブユニットが細胞表面のガングリオシドＧＭ1 レセプターを介し結合し、細胞内にＡサブユニットが侵入し、毒性を発現する。ガングリオシドＧＭ1 とコレラトキシンＢサブユニットの結合阻害性を試験した。すなわち、96穴平底プラスチックプレートにガングリオシドＧＭ1 のエタノール溶液(1μg/ml) を50μl 入れ、エタノールを蒸発乾固し、ガングリオシドＧＭ1 をプレートに吸着させた。これに１％牛血清アルブミンのＰＢＳ溶液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）を満たし、１時間放置後、0.05％ツィーン20を含むＰＢＳ（ＰＢＳツィーン20）で３回洗浄した。
【００２３】
一方、鉄−ラクトフェリン及びラクトフェリンの各試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液とし、これらの各試料25μl をパーオキシダーゼラベルコレラトキシンＢサブユニット(PO-CT-B) の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ(1μg/ml) 25μl と予め混合し、30分間室温でインキュベートして混合液を調製した。
【００２４】
そして、この混合液を上述したガングリオシドＧＭ1 吸着プレートに加え、30分放置後、ＰＢＳツィーン20で６回洗浄し、２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−２アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を0.3mg/ml濃度に溶解した 0.006％過酸化水素を含む0.2Mクエン酸緩衝液(pH 4.0) 100μl を加え、10分後に 405nmで吸光度を測定することでガングリオシドＧＭ1 とコレラトキシンＢサブユニットの結合率を評価した。
【００２５】
これによると、鉄−ラクトフェリンは、ラクトフェリンに比べて、コレラトキシンＢサブユニットとガングリオシドＧＭ1 との結合をより強く阻害することが判った。
【００２６】
【実施例３】
表１に示した配合で原料を混合した後、打錠機で打錠して、細菌性エンテロトキシン中和能を賦与したタブレットを製造した。
【００２７】
【表１】
0003887704.tif 000002
【００２８】
【実施例４】
表２に示した配合で原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、細菌性エンテロトキシン中和能を賦与した飲料を製造した。
【００２９】
【表２】
0003887704.tif 000003
【００３０】
【発明の効果】
本発明の細菌性エンテロトキシン中和剤は、細菌性エンテロトキシンに対して優れた中和能を示す。しかも、本発明の細菌性エンテロトキシン中和剤の有効成分である鉄−ラクトフェリンは、乳由来の成分を原料とし、安全かつ安価に大量に調製し得るので実用性が高い。