(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)質量分析サンプル提示表面を有する質量分析サンプル提示装置；および
(b)該表面に固定化された複合体、該複合体は、少なくとも１の特定の位置で生体分子を選択的に開裂することによってか、又はサンプル中の少なくとも１の不純物を固定化することにより生体分子を精製することによって該生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含み、該生体分子はポリペプチド、DNA、炭水化物、RNAおよびそれらの組合せからなる群から選択される、
を含むサンプル提示装置。
【請求項２】
複合体が以下：
(a)つなぎ留め分子の少なくとも一端でサンプル提示表面に付着されるつなぎ留め分子；および
(b)生体分子を化学的に修飾する反応性分子、
を含む請求項１に記載のサンプル提示装置であって、つなぎ留め分子は反応性分子に付着される。
【請求項３】
生体分子がポリペプチドであり、反応性分子がタンパク質分解性酵素である、請求項２に記載のサンプル提示装置。
【請求項４】
タンパク質分解性酵素がトリプシン、α-キモトリプシン、ペプシンおよびカルボキシペプチダーゼ-Pからなる群から選択される、請求項３に記載のサンプル提示装置。
【請求項５】
質量分析サンプル提示装置表面を有する質量分析サンプル提示装置を提供し、複合体を該表面に結合させることを包含するサンプル提示装置を作製する方法であって、該複合体は、少なくとも１の特定の位置で生体分子を選択的に開裂することによってか、又はサンプル中の少なくとも１の不純物を固定化することにより生体分子を精製することによって該生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含み、該生体分子はポリペプチド、DNA、炭水化物、RNAおよびそれらの組合せからなる群から選択される方法。
【請求項６】
複合体をサンプル提示表面に結合する工程が、
(a)つなぎ留め分子の少なくとも一端を質量分析サンプル提示表面に結合し；および
(b)反応性分子をつなぎ留め分子に結合する、
ことを包含する請求項５に記載のサンプル提示装置を作製する方法であって、反応性分子は生体分子を化学的に修飾し、該生体分子はポリペプチド、DNA、炭水化物、RNAおよびそれらの組合せからなる群から選択される方法。
【請求項７】
(a)質量分析提示表面を提供する工程；
(b)少なくとも１の特定の位置で生体分子を選択的に開裂することによってか、又はサンプル中の少なくとも１の不純物を固定化することにより生体分子を精製することによって該生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含む少なくとも１種の複合体をサンプル提示表面に接触させて表面結合複合体を形成する工程；
(c)いかなる非結合複合体もサンプル提示表面から除去する工程；
(d)生体分子を表面結合複合体と接触させ、それにより生体分子を化学的に修飾する工程；
(e)サンプル提示表面にMALDIマトリックスを適用する工程、および
(f)質量分析計内の化学的に修飾された生体分子の分子量を測定する工程、
を包含する生体分子を分析する方法。
【請求項８】
生体分子がポリペプチド、DNA、炭水化物、RNAおよびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項７に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項９】
複合体が以下：
(a)つなぎ留め分子の少なくとも一端でサンプル提示表面に付着されるつなぎ留め分子；および
(b)生体分子を化学的に修飾する反応性分子、
を含む請求項８に記載の生体分子を分析する方法であって、つなぎ留め分子も反応性分子に付着される方法。
【請求項１０】
生体分子がポリペプチドであり、複合体がタンパク質分解性酵素を含む、請求項８に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１１】
タンパク質分解性酵素がトリプシン、α-キモトリプシン、ペプシンおよびカルボキシペプチダーゼ-Pからなる群から選択される、請求項１０に記載のポリペプチドを分析する方法。
【請求項１２】
ジスルフィド結合を開裂する還元剤が表面に添加される請求項１０に記載のポリペプチドを分析する方法。
【請求項１３】
ジスルフィド結合を開裂する還元剤が表面に付着される請求項１０に記載のポリペプチドを分析する方法。
【請求項１４】
生体分子を表面結合複合体に接触させる工程の後に表面結合複合体および生体分子を湿った雰囲気でインキュベートする、請求項８に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１５】
生体分子を複合体で修飾した後に生体分子を２回目に修飾する第２の試薬分子に生体分子を曝す、請求項８に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１６】
第２試薬分子が反応性分子と異なる、請求項１５に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１７】
第２試薬分子が表面に結合している複合体である、請求項１６に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１８】
複合体で修飾された生体分子の分析から得られた分子量データ、ならびに複合体および第２試薬分子の両方で修飾された生体分子から得られた分子量データを比較して生体分子の部分的構造を決定する、請求項１５に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項１９】
分子量データを使用してペプチドの限定されたアミノ酸配列を決定する、請求項１８に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項２０】
限定されたアミノ酸配列に対応する少なくとも１種の核酸配列を決定し、核酸配列を含むデータベースを該核酸配列のためにサーチすることをさらに包含する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
質量分析計が、
(a)質量分析提示表面を含む質量分析サンプル提示装置；
(b)サンプル提示表面を揮発化チャンバー内に導入する手段；
(c)化学的に修飾された生体分子を揮発化およびイオン化する手段；および
(d)質量分析計内のその軌跡に基づき化学的に修飾された生体分子イオンの分子量対荷電比を測定するための手段、
を含む請求項８に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項２２】
質量分析計がさらに電場を生じる手段を含み、該場は化学的に修飾された生体分子イオンのサンプル提示表面から検出手段への進行を生じるように向けられる、請求項２１に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項２３】
化学的に修飾された生体分子を揮発化およびイオン化する手段がレーザーである、請求項２１に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項２４】
化学的に修飾された生体分子の分子量を測定する手段が化学的に修飾された生体分子に関する飛行時間を測定する、請求項２１に記載の生体分子を分析する方法。
【請求項２５】
ポリペプチド・フラグメントの分子量を測定した後に該分子量を次のより低分子量のポリペプチド・フラグメントの重量から引き算し、どのアミノ酸が該より低分子量のポリペプチド・フラグメントに欠けているかを決定する、請求項１０に記載のポリペプチドを分析する方法。
【請求項２６】
アミノ酸を含むポリペプチドの限定配列がより低分子量のポリペプチド・フラグメントを連続的に分析して、それらがどのアミノ酸を欠いているかを決定し、限定されたアミノ酸配列に対応する少なくとも１種の核酸配列を決定し、核酸配列を含むデータベースを該核酸配列のためにサーチすることを更に包含する、請求項２５に記載のポリペプチドを分析する方法。
【請求項２７】
質量分析サンプル提示装置を含む質量分析計であって、該装置は下記を含む：
(a)質量分析サンプル提示表面；および
(b)該表面に固定化された複合体、該複合体は、少なくとも１の特定の位置で生体分子を選択的に開裂することによってか、又はサンプル中の少なくとも１の不純物を固定化することにより生体分子を精製することによって該生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含み、該複合体はMALDIマトリックスには組込まれず質量分析計内で揮発化されない。
【請求項２８】
さらに下記：
(a)サンプル提示表面を揮発化チャンバー内に導入する手段；
(b)化学的に修飾された生体分子を揮発化およびイオン化し、それにより化学的に修飾された生体分子イオンを形成する手段、該揮発化手段は(i)化学的に修飾された生体分子を溶解し、レーザーでアクセス可能な周波数で光エネルギーを吸収するマトリックス物質、ここで該マトリックス物質は複合体上に適用される、および(ii)マトリックス物質を揮発化する手段を含む；および
(c)その軌跡に基づき化学的に修飾された生体分子イオンの分子量対荷電比を測定する手段、
を含む、請求項２７に記載の質量分析計。
【請求項２９】
サンプル提示表面が金属であり、且つ、つなぎ留め分子がジチオスレイトール、ジメチルアジピミデート・2HCl、ジメチルピメリミデート・HCl、ジメチルスベリミデート・2HCl、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート・2HCl、ジスクシニミジルグルタレート、ジスクシニミジルスベレート、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコビス（スルホスクシニミジルスクシネート）、ジスクシニミジルタータレート、ジスルホスクシニミジルタータレート、ビス[2-(スクシニミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、ビス[2-(スルホスクシニミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、スクシニミジル4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホ-スクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシニミジル4-(p-マレイミド-フェニル）-ブチレート、スルホスクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート、ビスマレイミドへキサン、N-(λ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル、N-(λ-マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドエステル、N-スクシニミジル(4-イオドアセチル)アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル(4-イオドアセチル)-アミノベンゾエート、1,4-ジ-[3'-2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド)ブタン]、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシニミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシニミジル-3(2-ピリジルジチオ)-プロピオナート、スクシニミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジン、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロリド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、4-(p-アジドサリチルアミド)-ブチルアミン、アジドベンゾイルヒドラジン、N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド、p-アジドフェニルグリオキサールモノハイドレート、4-(p-アジドサリチル-アミド)ブチルアミン、1-(p-アジドサリチルアミド)-4-(イオドアセトアミド)ブタン、ビス[β-4-アジドサリチルアミド]エチル]ジスルフィド、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート、n-ヒドロキシスルホスクシニミジル4-アジドベンゾエート、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、N-ヒドロキシスルホスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、スルホスクシニミジル-(4-アジドサリチルアミド)-ヘキサノエート、p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオナート、2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロ-プロピオナート、N-スクシニミジル-(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル-(4-アジドフェニルジチオ)プロピオナート、スルホスクシニミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート、スルホスクシニミジル2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、N-スクシニミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニル-アミノ)ヘキサノエート、スルホスクシニミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート、スルホスクシニミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル4-(p-アジドフェニル)-ブチラート及びその混合物からなる群より選択される、請求項２に記載のサンプル提示装置。
【請求項３０】
サンプル提示表面が金であり、且つ、つなぎ留め分子がジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）、1,4-ジ-[3'-2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド)ブタン]、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシニミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオナート、スクシニミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジン、N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド、p-アジドフェニルグリオキサールモノハイドレート、ビス-[β-4-アジドサリチルアミド]エチル]ジスルフィド、N-スクシニミジル-(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル-(4-アジドフェニルジチオ)プロピオナート、スルホスクシニミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート及びその混合物からなる群より選択される、請求項２に記載のサンプル提示装置。
【請求項３１】
サンプル提示表面が金属であり、且つ、つなぎ留め分子がジチオスレイトール、ジメチルアジピミデート・2HCl、ジメチルピメリミデート・HCl、ジメチルスベリミデート・2HCl、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート・2HCl、ジスクシニミジルグルタレート、ジスクシニミジルスベレート、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコビス（スルホスクシニミジルスクシネート）、ジスクシニミジルタータレート、ジスルホスクシニミジルタータレート、ビス[2-(スクシニミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、ビス[2-(スルホスクシニミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、スクシニミジル4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホ-スクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシニミジル4-（p-マレイミド-フェニル）-ブチレート、スルホスクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート、ビスマレイミドへキサン、N-(λ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル、N-(λ-マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドエステル、N-スクシニミジル(4-イオドアセチル)アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル(4-イオドアセチル)-アミノベンゾエート、1,4-ジ-[3'-2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド)ブタン]、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシニミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシニミジル-3(2-ピリジルジチオ)-プロピオナート、スクシニミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジン、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロリド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、4-(p-アジドサリチルアミド)-ブチルアミン、アジドベンゾイルヒドラジン、N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド、p-アジドフェニルグリオキサールモノハイドレート、4-(p-アジドサリチル-アミド)ブチルアミン、1-(p-アジドサリチルアミド)-4-(イオドアセトアミド)ブタン、ビス-[β-4-アジドサリチルアミド]エチル]ジスルフィド、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート、n-ヒドロキシスルホスクシニミジル4-アジドベンゾエート、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、N-ヒドロキシスルホスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、スルホスクシニミジル-(4-アジドサリチルアミド)-ヘキサノエート、p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオナート、2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロ-プロピオナート、N-スクシニミジル-(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル-(4-アジドフェニルジチオ)プロピオナート、スルホスクシニミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート、スルホスクシニミジル2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、N-スクシニミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニル-アミノ)ヘキサノエート、スルホスクシニミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート、スルホスクシニミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル4-(p-アジドフェニル)-ブチラート及びその混合物からなる群より選択される、請求項６又は９に記載の方法。
【請求項３２】
サンプル提示表面が金であり、且つ、つなぎ留め分子がジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）、1,4-ジ-[3'-2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド)ブタン]、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシニミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオナート、スクシニミジル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、スルホスクシニミジル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジン、N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド、p-アジドフェニルグリオキサールモノハイドレート、ビス-[β-4-アジドサリチルアミド]エチル]ジスルフィド、N-スクシニミジル-(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル-(4-アジドフェニルジチオ)プロピオナート、スルホスクシニミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオナート及びその混合物からなる群より選択される、請求項６又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、契約書に基づき、アメリカ合衆国エネルギー省から授与されたアメリカ合衆国からの資金に全体的および部分的に負って為された。アメリカ合衆国政府は、契約書の条件に従い、本発明に特定の権利を有する。
発明の背景
本発明は、一般に、誘導体化質量分析サンプル提示装置、より詳細には、生体分子を修飾する少なくとも１種の分子を含む複合体で誘導体化された質量分析サンプル提示装置に関する。
従来、質量分析法は、分析物をその分子量を測定して確認するのに使用される技術である。通常、質量分析法は、サンプル提示装置を分析物でコーティングし、サンプル提示装置を質量分析計に導入し、分析物を揮発させイオン化し、イオンを電場および／または磁場に曝すことによりイオン化分析物を検出器に向かって加速し、特定の分析物イオンの質量対電荷の比率を測定するためにデータを分析する工程を包含する。
分析物が、このプロセスを通じて無傷で維持されるならば、完全な無傷分析物イオンに関する分子量に対応するデータが得られる。しかしながら典型的には、分析物の様々なフラグメントの分子量に対応するデータを更に得ることが有利である。不純物が存在するときでも、純粋な分析物にのみ対応するデータを得ることも有利である。従って、それらの分子量測定に先立ち、分析物を精製および／または開裂することにより、それらを修飾できることは利点である。
慣用されている質量分析法では、分析物は、サンプル提示装置上でコートされる前に、或いは質量分析計の内部で起こる揮発化およびイオン化工程の間に、修飾される。生体分子（例えば、ポリペプチド、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、または炭水化物）は、それらを固定化された複合体に曝すことにより特定の位置で選択的に消化できることが公知である。しかしながら、分析物がサンプル提示装置上でコートされる前に分析物を修飾することは、この余分な工程がプロセス全体を遅らせ、分析物の損失を招き、そして恐らく不純物を導入し得るので、不利である。さらに、分析物と試薬との反応で溶液中にフラグメントが生じる場合、反応の動力学はかなり遅くなり、よって更なる遅延を招くかもしれない。揮発化およびイオン化工程の間にフラグメントを生じることも、典型的にはそのような方法が、分析物の開裂部位に亘り殆どコントロールできず、また分析物の過剰な分解をもたらし得るので、不利である。
さらに、質量分析計の中で生体分子を揮発化しイオン化するマトリックス-アシスティッド・レーザー脱着／イオン化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization（"MALDI"））技術を使用することが公知である。この技術は、特定のマトリックス物質中で生体分子を包囲することを包含する。レーザー・ビームは、マトリックスが吸収する周波数に調和され、マトリックス物質上で標的化される。レーザーは、小部分のマトリックス物質を揮発させるのに十分なエネルギーを伝える。少数の分析物分子は、こうして質量分析計内でマトリックス物質とともに気相中に送られる。
MALDIが開発される以前は、質量分析法による生体分子の分析は、無傷の生体分子をいかなる分解またはフラグメント化もさせずに揮発させるのに十分に穏やかな技術が利用できなかったので、不可能でないにしても非常に難しかった。MALDI技術は、生体分子を揮発するのに有利な技術を提供するが、この技術は、分析物をサンプル提示装置上に導入する前に分析物フラグメントの発生または分析物の精製に手段を講じない。特に、余分なフラグメント化または精製工程に対する必要性は、プロセス全体を遅らせ、価値ある分析物を無駄にし、不純物を導入し得る。
レーザー脱着およびイオン化による質量分析のためにサンプル提示装置を使用することはPCT国際公開No.94/28418から公知であり、そこでは、サンプル提示装置は生体分子の脱着およびイオン化を促進するための表面結合分子で誘導体化される。そのような表面結合生体分子法では、表面結合分子は生体分子に結合し、その後、それらがレーザー放射に曝されるとき生体分子の脱着を促進する。生体分子フラグメントは、表面結合生体分子を溶液中の試薬に曝し、その後に試薬を洗い去ることによって生じる。この手順は、不純物混入を導き、それが集めたデータの質を低下させるので問題がある。具体的には、洗浄プロセス後に任意の試薬が表面上に残る場合、それはレーザービームで揮発される最初の物質となり、興味ある物質からのシグナルを非常に十分に沈め、よってデータに悪影響する。
さらに、そのようなプロセスは、生体分子を揮発する新規で未実証のシステムに依拠しているので困難である。対照的に、MALDIマトリックス・システムは、十分に研究されており、生体分子を効果的に穏やかに揮発することが公知である。MALDIマトリックスは、そのマトリックスが表面結合分子をカバーしており、よって有用データの獲得を完全に妨害するであるろうから、表面結合分子法とともに使用できない。
さらに、生体分子をサンプル提示表面に直接結合させることも、これをすると修飾された生体分子を、他の修飾化試薬に曝すことが可能である提示表面上の第２領域または第２提示表面に移す可能性を排除するであろうから、不利である。従って、表面結合分析物の方法による任意の化学反応は、並行してよりも連続的に為されるべきである。そのような連続的方法では、結合分析物は、１つの試薬と反応され、質量分析計に導入され、除去され、続いて第２試薬と反応させなければならない。これらの工程のそれぞれは、サンプルに不純物を混入させる機会を与え、さらなる遅延を招くので、不利である。
以上の理由から、実証ずみの有利なMALDIマトリックスを使用して生体分子を分析する、迅速で効率的な方法を提供する質量分析サンプル提示装置が必要とされている。
発明の概要
従って、従来技術の不利な点を克服するサンプル提示装置、質量分析法、および質量分析計を提供することが、本発明の目的である。
本発明の他の目的は、生体分子を修飾することが可能な複合体を含む改善されたサンプル提示装置を提供することであり、そこでは、修飾された生体分子から得られるデータへの不純物混入を妨げるために、修飾生体分子からいかなる試薬を分離することも必要でない。
本発明の他の目的は、サンプル損失を最少にし、従って極めて少量の生体分子を用いて効果的に機能する、改善された誘導体化質量分析サンプル提示装置を提供することである。
さらに他の本発明の目的は、生体分子を高い有効濃度で化学的に修飾することが可能な複合体を提示し、こうして生体分子修飾反応の速度を増大させる、質量分析サンプル提示装置を提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子を消化および／または精製する質量分析サンプル提示装置を提供することである。
本発明のさらなる目的は、既存の最適なMALDIマトリックス・システムを活用できる誘導体化質量分析サンプル提示装置を提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子を１つの試薬と反応させ、その後に反応させた生体分子の一部分を他の試薬と反応させる、質量分析法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、従来技術の不利な点を克服する質量分析サンプル提示装置を作製する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、生体分子を分析する方法を提供することであり、そこでは、生体分子はサンプル提示装置の誘導体化表面に曝され、その後、湿潤雰囲気でインキュベートされる。続いて、MALDIマトリックス物質が加えられ、最後にサンプル提示装置が質量分析計に導入される。
本発明の他の目的は、ポリペプチドを分析する方法を提供することであり、そこでは、分子量データはペプチドの限られたアミノ酸配列を決定するのに使用される。この方法で得られた限定アミノ酸配列は、続いて、対応する核酸配列を得るために使用し得る。これらの核酸配列は次に、公知の核酸配列を含むコンピューター・データベースをサーチするのに使用し得る。マッチすれば、ポリペプチドをコードする公知の核酸配列を同定し得る。
本発明のさらなる目的は、改善された質量分析サンプル提示装置を組込む、改善された質量分析計を提供することである。
本発明のこれらの目的は、質量分析サンプル提示表面を含む質量分析サンプル提示装置を提供することによって得られ、そこでは、生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含む表面に複合体が結合される。
さらに、サンプル提示装置を作製する方法が提供され、そこでは、生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含む複合体が、サンプル提示装置表面に結合される。
本発明の目的は、生体分子を分析する方法によって更に達成され、該方法は下記の工程を包含する：
（a）質量分析サンプル提示表面を提供する工程；
（b）少なくとも１種の複合体を前記表面に結合させる工程、そこでは該複合体は、生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含んでいる；
（c）前記生体分子を前記表面と接触させ、それにより生体分子を化学的に修飾する工程；および
（d）前記化学的に修飾された生体分子の分子量を質量分析計中で測定する工程。
本発明の目的は、質量分析計により更に得られる。質量分析計は、生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含む表面結合複合体を有するサンプル提示表面を有する。質量分析計はまた、表面を機械内に誘導する真空連動装置、化学的に修飾された生体分子を揮発させイオン化する装置、電場発生器、検出器および修飾された生体分子イオンの分子量対電荷比を測定するエレクトロニクスを有する。
本発明のサンプル提示装置、サンプル提示装置を作製する方法、生体分子を分析する方法および質量分析計は、これまでに可能であったものより容易に得られ質がより高度である、生体分子に関する質量分析情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、表面結合トリプシンで10分間消化したニワトリ卵リゾチーム10ピコモルのMALDI質量スペクトルである。
図２は、ニワトリ卵リゾチーム・フラグメントに関する、計算された質量と観察された質量との相関関係を例示する一覧である。
図３は、表面結合トリプシンで10分間消化したニワトリ卵リゾチーム1ピコモルのMALDI質量スペクトルである。
図４は、等モル量の非結合トリプシンで10分間消化したニワトリ卵リゾチーム1ピコモルのMALDI質量スペクトルである。
図５は、等量のスラリー化アガロースで固定化したトリプシンで消化したニワトリ卵リゾチームの500μM溶液2μlのMALDI質量スペクトルである。
図６は、遊離トリプシンおよびアガロース固定化トリプシンで10分間消化した後に得られたニワトリ卵リゾチーム1ピコモルの残渣の一覧である。
図７は、α-コブラトキシンのアミノ酸配列の図式的説明である。
図８は、非消化α-コブラトキシンのMALDI質量スペクトルである。
図９は、表面結合トリプシン・サンプル提示装置で30分間消化したα-コブラトキシン約10ピコモルのMALDI質量スペクトルである。
図１０は、還元剤の存在下に、表面結合トリプシン・サンプル提示装置で30分間消化したα-コブラトキシン約10ピコモルのMALDI質量スペクトルである。
図１１は、m/z範囲が1,000-5,000Paでの図１０のMALDI質量スペクトルの拡大図である。
図１２は、非消化ヒト副甲状腺ホルモン1-34（hPTH）の陽イオンMALDI質量スペクトルである。
図１３は、表面結合α-キモトリプシン質量サンプル提示装置上で10分間消化されたhPTHのMALDI質量スペクトルである。
図１４は、表面結合α-キモトリプシン・サンプル提示装置上で10分間消化され、その後に約5にpH調整され、カルボキシペプチダーゼP（cpp）を添加したhPTHのMALDI質量スペクトルである。挿入図は、最終残基決定のための興味ある領域を例示する。
図１５は、α-キモトリプシンおよびα-キモトリプシン／カルボキシペプチダーゼP（cpp）フラグメントからの質量分析データを分析して得たhPTHの部分ペプチド配列を示す。
図１６は、45℃でpH8.1に維持した表面結合トリプシン・サンプル提示装置上で5分間消化したhPTHのMALDI質量スペクトルである。
図１７は、図１６の消化されたサンプルにcppを添加して生じたタンパク質ラダー配列である。
図１８は、トリプシンおよびトリプシン／cppフラグメントからの質量分析データを分析して得た部分ペプチド配列の一覧を示す。
図１９は、配列決定を伸長させるための、大規模かつラダーな情報の使用を例示するトリプシンおよびトリプシン／cppフラグメントの質量スペクトルのオーバーレイである。
図２０は、45℃でpH3.4に維持した表面結合ペプシン・サンプル提示装置上で8分間消化したhPTHのMALDI質量スペクトルである。
図２１は、45℃でpH3.4に維持した表面結合α-キモトリプシン質量サンプル提示装置上で10分間消化したhPTHのMALDI質量スペクトルである。
図２２は、45℃でpH3.4に維持した表面結合α-キモトリプシン質量サンプル提示装置上で10分間消化し、その後35℃でpH5に維持した表面結合cppで10分間消化したhPTHのMALDI質量スペクトルである。
好ましい実施態様の説明
本発明は、生体分子を化学的に修飾する複合体で誘導体化された表面を有する、慣用されている質量分析サンプル提示装置を提供する。この装置は、代表的には、生体分子に曝されインキュベートされて、複合体が生体分子を修飾させるようにする。インキュベーション後、修飾生体分子は、好ましくは、MALDIマトリックス物質で包囲され、続いて質量分析計に導入される。本発明はまた、そのようなサンプル提示装置を組込んだ質量分析計のような実施態様も更に含む。さらなる実施態様は、質量分析を行い、およびサンプル提示装置を作製する方法を提供する。
本明細書中で使用されるとき、用語「誘導体化された」は、結合された複合体を有する質量分析サンプル提示装置を指すことを意味する。本発明による誘導体化サンプル提示装置は、任意の好適な物質から構成され得る。物質は、固体または液体であることができる。好適な固体物質は、石英のような絶縁体、ドープされたケイ素などのような半導体、および鋼鉄、金などのような金属を含む導体を含むが、それに限定されない。様々な絶縁性または伝導性のポリマーも使用され得る。サンプル提示装置の表面は、装置の残りの部分と同じ物質からなる必要はない。複合体が表面に接着し得るように、表面は清浄であることが好ましい。
提示装置表面に付着する複合体は、２つの異なる機能性を有する。本明細書中で使用されるとき、用語「複合体」は、生体分子を化学的に修飾する少なくとも１種の分子を含む化学物質を指す。複合体は、「つなぎ留め（tethering）」機能を有し、そこではそれは、少なくとも１つの末端でそれ自身を表面に付着し得る。さらに、それは、「反応性」機能も有し、そこではそれは、分析物を化学的に修飾し得る。本明細書中で使用されるとき、用語「化学的に修飾する」は、分析物の精製または消化を指すことが意味されるが、分析物を結合することは意味しない。複合体はさらに、表面に結合するつなぎ留め分子、およびつなぎ留め分子に結合して生体分子を修飾する反応性分子を含むことができる。
代表的には、「つなぎ留め」機能は、１つの原子団（即ち、つなぎ留め分子）に関連し、他方、「反応性」機能は、異なる原子団（即ち、反応性分子）に関連する。複合体は、サンプル提示表面に結合するつなぎ留め分子およびつなぎ留め分子に結合して生体分子を修飾する反応性分子の両方を含み得る。しかしながら、機能のこの分離は必ずしも必要ではない。つなぎ留め分子は、好ましくは、固定化リガンドとして有用であることが実証されたクラスの分子から選択される。そのような分子の多くの具体的な例は、1995ピアース・コーポレーション・カタログ（ピアース・コーポレーション（Pierce Corp.）、P.O.Box 117、ロックフォード、イリノイ州61105）のT-156〜T-200ページにリストされている。好適なつなぎ留め分子に含まれるのは：ジチオスレイトール、ジメチルアジピミデート-2★HCL、ジメチルピメリミデート★HCL、ジメチルスベリミデート2★HCL、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート2★HCL、ジスクシニミジルグルタレート、ジスクシニミジルスベレート、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコビス（スルホスクシニミジルスクシネート）、ジスクシニミジルタータレート、ジスルホスクシニミジルタータレート、ビス［2-（スクシニミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［2-（スルホスクシニミドオキシ-カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシニミジル4-（N-マレイミド-メチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホ-スクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシニミジル4-p-マレイミド-フェニル）-ブチレート、スルホスクシニミジル4-（p-マレイミドフェニル）-ブチレート、ビスマレイミドへキサン、N-（λ-マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル、N-（λ-マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル、n-スクシニミジル（4-イオドアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル（4-イオドアセチル）-アミノベンゾエート、1,4-ジ-［3'-2'-ピリジルジチオ（プロピオンアミド）ブタン］、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α（s-ピリジルジチオ）トルエン、スルホスクシニミジル-6-［α-メチル-α-（2-ピリジルジチオ）-トルアミド］ヘキサノエート、n-スクシニミジル-3（2-ピリジルジチオ）-プロピオナート、スクシニミジル6-［3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド］ヘキサノエート、スルホスクシニミジル-6-［3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド］ヘキサノエート、スルホスクシニミジル6-［3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド］ヘキサノエート、3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオニルヒドラジン、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミドハイドロクロリド、n,n'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、4-（p-アジドサリチルアミド）-ブチルアミン、アジドベンゾイルヒドラジン、N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、n-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、n-［4-（p-アジドサリチルアミド）ブチル］-3'���2'-ピリジルジチオ）プロピオンアミド、p-アジドフェニルグリオキサールモノハイドレート、4-（p-アジドサリチル-アミド）ブチルアミン、1-（p-アジドサリチルアミド）-4-（イオドアセトアミド）ブタン、ビス［β-4-アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、n-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート、n-ヒドロキシスルホスクシニミジル4-アジドベンゾエート、n-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、n-ヒドロキシスルホスクシニミジル-4-アジドサリチル酸、スルホスクシニミジル-（4-アジドサリチルアミド）-ヘキサノエート、p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオナート、2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロ-プロピオナート、n-スクシニミジル-（4-アジドフェニル）1,3/-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル-（4-アジドフェニルジチオ）プロピオナート、スルホスクシニミジル-2-（7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド）エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート、スルホスクシニミジル2-（m-アジド-o-ニトロベンズアミド）-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、n-スクセイニミジル（succeinimidyl）-6-（4'-アジド-2'-ニトロフェニル-アミノ）ヘキサノエート、スルホスクシニミジル6-（4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルホスクシニミジル2-（p-アジドサリチルアミド）エチル-1,3'-ジチオプロピオナート、スルホスクシニミジル4-（p-アジドフェニル）-ブチラート。そのようなリガンドを使用する様々なプロトコールが、グレック  ティー．ヘマンソン（Greg T.Hemanson）ら（1992）による"Immobilized Affinity Ligand Techniques"に説明されており、それは本明細書中に参考として援用される。
複合体は、生体分子分析物を様々な異なる様式で化学的に修飾し得る。本明細書中で使用されるとき、用語「生体分子」は、DNA、RNA、ポリペプチド、炭水化物およびそれらの組合せを指すことを意味する。例えば、複合体は、生体分子を消化、または精製し得る。本明細書中で使用されるとき、用語「消化する」は、生体分子をフラグメントに化学的または酵素的に開裂することを指すことを意味し、用語「精製する」は、生体分子を含む溶液から望ましくない物質を除去することを意味する。本明細書中で使用されるとき、用語「フラグメント」は、化学的または酵素的試薬を使用して、生体分子の残りから開裂された生体分子の一部分を指すことを意味する。幾つかの様々な反応性分子が、生体分子を消化するために利用できる。生体分子がポリペプチドである場合、複合体は好ましくは、化学的開裂剤または酵素性プロテアーゼを含む。
酵素性プロテアーゼは、ポリペプチドを開裂する特異的ポリペプチドである。プロテアーゼは、自己消化として公知のプロセスにより、それら自身を開裂し得る。幾つかの酵素性プロテアーゼは、特定のアミノ酸残基間でポリペプチドを開裂する。非特異的に開裂するプロテアーゼの例には、ズブチリシン、パパインおよびサーモリシンが含まれる。少なくとも、幾分か特異的に開裂するプロテアーゼの例に含まれるのは：アミノペプチダーゼ-M、カルボキシペプチダーゼ-A、カルボキシペプチダーゼ-P、カルボキシペプチダーゼ-B、カルボキシペプチダーゼ-Y、キモトリプシン、クロストリパイン、トリプシン、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、因子Xa、フィシン、ペプシン、プラスミン、黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼ、プロテインキナーゼKおよびトロンビンである。
特定のアミノ酸残基間でポリペプチドを開裂する化学的開裂剤は、臭化シアン、O-イオドソベンゾエートまたはO-イオドソ安息香酸、希塩酸、N-ブロモスクシンイミド、ヒドラジンナトリウム、水酸化アルミニウムリチウム、ヒドロキシルアミンおよび2-ニトロ-5-チオシアノベンゾエートを含む。好適な化学的開裂剤はまた、サンガー試薬（2,4-ジニトロフルオロベンゼン）、エドマンド試薬（フェニルイソチオシアネート）、およびこれらの試薬の固定化誘導体を含む。さらに、テトラデンテートCo（III）錯体、β-[Co（トリエチレンテトラミン）-OH（H2O）]のような配位遷移金属錯体も、有効な開裂剤として使用され得る。バッキンガム（Buckingham）ら、89 J.A.C.S.1082（1967）を参照のこと。
分析されるべき生体分子がポリペプチドであるとき、アミノ酸間の任意のジスルフィド結合を切断する還元剤を加えることが有利であり得る。これらの結合の切断は、ペプチドのさらなるフラグメント化を生じ、この結果、ペプチド構造に関してより多くの情報をもたらす。ジスルフィド還元剤は、サンプル提示表面上に結合され、または溶液中で使用され得る。好適なジスルフィド還元剤は、β-メルカプトエタノール、システイン、およびジチオスレイトール（DTT）を含む。カルボキシペプチダーゼ-P、ジチオエリスリトール（DTE）リポミドおよびN-アセチルホモシステインは、表面結合ジスルフィド還元剤として使用し得る。
DNAまたはRNAのような生体分子のために、制限エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼをサンプル提示装置表面に加えることは有利であり得る。これらの酵素は、特異的ヌクレアーゼ間でDNAおよびRNAを開裂し得、DNAまたはRNAのフラグメントを作る。特異的な制限エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、当業者に周知である。DNAおよびRNAの両方を開裂する酵素の例は、ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよび脾臓ホスホジエステラーゼを含むが、それに限定されない。DNAのみを開裂する酵素は、テオキシ-リボヌクレアーゼＩおよびIIを含むが、それに限定されない。リボヌクレアーゼＩ（膵臓）およびＴ．（カビ）は、RNAを開裂する。
炭水化物を含む生体分子を分析するとき、フカーゼ（fucase）、O-またはN-グリカナーゼ、マンナーゼ、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼまたはグルコシダーゼを表面に加えることは有利であり得る。これらの酵素は、質量分析計で測定できる特定の分子量の炭水化物フラグメントを生じる。
サンプル提示表面に付着した複合体も、生体分子を精製し得る。例えば、複合体は、デタージェント、脂質、エンドトキシンまたはプロテアーゼのような一般的な不純物に非可視的に結合する反応性分子を含み得る。
本発明は、上記の誘導体化質量分析サンプル提示装置を作製するための方法も提供する。この方法では、生体分子を修飾する複合体は、サンプル提示装置の表面に結合することが必須である。１つの実施態様では、複合体全体が先ず合成あるいは精製され、その後に表面と反応される。別の好ましい実施態様では、複合体は、先ずサンプル提示表面をつなぎ留め分子と反応させ、その後に、つながれた分子を反応性分子と反応させることによって形成される。
本発明の他の実施態様は、生体分子を分析するための方法を提供する。具体的には、該方法は、（1）質量分析サンプル提示表面を提供し、（2）少なくとも１種の複合体を表面上で結合させ、そこでは該複合体は、化学的に生体分子を修飾する少なくとも１種の分子を複合体が含んでいる、（3）生体分子を表面と接触させ、それにより生体分子を化学的に修飾し、（4）MALDIマトリックスを表面に適用し及び（5）質量分析計内の生体分子の分子量を測定する、ことを包含する。生体分子は、溶液中または気相中にある間に表面と接触させ得る。
接触工程は、反応速度を速めるために、好ましくは室温以上で、最も好ましくは55℃までで行われる。しかしながら、それは、分析物または複合体の分解を生じるのに十分な高い温度で行われるべきではない。特定の複合体のためには、接触工程を室温以下で、最も好ましくは、-10℃以上で行うことが有利であり得る。この接触工程は十分な時間、代表的には5-30分間、進められる。実際の反応時間は、特定の複合体および生体分子に依存する。プロテアーゼがポリペプチドの生体分子を消化するのに使用されるとき、接触工程は好ましくは、湿潤雰囲気で行われる。そのような雰囲気は、例えば、水貯蔵器を備え、それを閉鎖系内でサンプル提示表面および生体分子とともに囲い込むことにより、作られ得る。
続いて、MALDIマトリックスは、反応された分子に加えられる。MALDIマトリックスは、生体分子を溶解し、レーザーで容易にアクセス可能な周波数で光エネルギーを吸収し、生体分子に関して非反応性である任意の物質であり得る。好適なマトリックスは、ニコチン酸、ピロジノイック酸（pyrozinoic acid）、バニリン酸、コハク酸、カフェー酸、グリセロール、尿素またはトリス緩衝液（pH7.3）を含む。好ましいマトリックスは、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、フェルラ酸、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン（またはシナピニン）酸、3,5-ジメトキシ、4-ヒドロキシ-トランス-ケイ、他のケイ誘導体、ゲンチシン酸およびそれらの組合せを含む。
本発明のさらなる実施態様は、上記のサンプル提示装置を組み込んだ質量分析計を提供する。本発明による質量分析計はさらに、サンプル提示装置を揮発化チャンバーに導入するための真空連動装置、分析物を揮発化およびイオン化するための装置、生体分子イオンが検出器に向かって動くように向けられている任意の電場発生器、およびその軌跡に基づいて特定イオンに関する分子量対電荷比を測定するためのエレクトロニクスを含む。
この質量分析計は、分析物を揮発化およびイオン化するために通常使用される全ての技術と両立する。そのような技術は、エレクトロスプレーイオン化、カリフォルニウム252プラズマ  ディソープション、フィールド・ディソープション、高速原子衝撃、液体二次イオンMS、レーザ−脱着およびサーモスプレーイオン化を含むが、それに限定されない。好ましくは、MALDI技術は、生体分子を揮発化し分析するために使用される。これらの技術の中で要求される機械的構造または装置は、当業者に周知である。
分析器は通常、イオンが生じる分析計内の領域と検出器との間に荷電した金属構造を有する電場発生器を含む。これらの構造物は、それらがイオンを引きつけるが、イオンはそれらを通過して進み検出器に到達し得るようにデザインされなければならない。好ましくは、構造物は、幾つかのイオンを通過させ検出器に向かって移動させる開口部を備えた荷電金属グリッドである。構造物は、イオン発生領域と検出器との間に位置しなければならない。それらは、イオンを検出器に向かって加速するように作用する電位差を有しなければならない。
幾つかの質量分析計では、イオンが検出器に向かって進むときにイオンを偏向させるように磁場を使用する。そのような装置は、磁場中でのその偏向に基づいてイオンの質量を測定する。しかしながら、生体分子の質量を測定するには、飛行時間型質量分析計を使用するのが好ましい。
その軌跡に基づいてイオンの分子量対電荷比を測定するためのエレクトロニクスは代表的には、イオン衝撃検出器、データ収集エレクトロニクス、およびコンピューターのようなデータ分析エレクトロニクスを含む。
多くのタイプの検出器が、本発明と両立する。検出器の幾つかの具体例は、ファラデー・カップ、電子増倍管、電気光学イオン検出器および写真乳剤を含む。
本発明に従う具体的な実施態様を、詳細に説明する。これらの実施例は、例示することを意図し、本発明は、これらの実施態様に記載される物質、方法または装置に限定されない。
実施例１
サンプル提示装置の作製
ジョンソン・マットゼイ（Johnson Matthey）から入手できる金（Au）ホイル（99.9%）の円形物、直径2.5mmおよび厚さ0.01mmを打ち抜き、ポリエチレン製ミクロ遠心分離チューブに入れた。金ホイル円形物には、いかなる不純物混入も避けるように注意を払った。金ホイルを、カッツ（Katz）の方法に従い、活性化した。カッツ，イー．ワイ．（Katz,E.Y.）、J.Electroanal.Chem.、Vol.291、p.257（1990）を参照のこと。円形物を、架橋またはつなぎ留め分子である、ピアース（Pierce）から入手されるジチオビス［スクシニミジルプロピオナート］（DSP）をイソプロパノールに約0.1Mに溶解した溶液で処理した。DSP/イソプロパノール溶液は、本質的にこの濃度で飽和した。時々、ボルテックス・ミキサーを用いて混合しながら、円形物を、DSP/イソプロパノール溶液で15分間処理した。このつなぎ留め分子溶液を注ぎ出し、金円形物を純粋なイソプロパノールで繰り返しリンスし、その後に純粋なエタノールで３回リンスした。金円形物を真空乾燥し、反応性分子または生体分子で処理する前に新しいミクロ遠心分離チューブに移した。
実施例２
表面結合トリプシンを有するサンプル提示装置の作製
質量分析サンプル提示装置は、装置の表面に下記のようにトリプシンを結合させることにより作製した。誘導体化サンプル提示装置の作製に使用するために、シグマ（Sigma）から入手されるウシ膵臓からの、トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）処理されたトリプシンXIII型を、20mMリン酸緩衝液、pH7.8に1mg/mLの濃度に溶解した。実施例１で調製された金ホイル円形物上の架橋またはつなぎ留め分子に酵素を付着させるために、円形物を、20mMリン酸緩衝液中、pH7.8の1mg/mL酵素溶液とともに終夜、冷蔵庫の中で時々攪拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、金ホイル円形物を、リン酸緩衝液で、その後にトリトン-X100の0.1%水溶液で激しくリンスし、両方のリンスともボルテックス・ミキサーを使用した。次に、金ホイル円形物を真空乾燥し、ポリエチレン製ミクロ遠心分離チューブに保存した。ルーチンなMALDI分析に慣用的に用いられているステンレススチール製サンプル提示装置への金ホイル円形物表面の物理的付着は、慣用されているサンプル提示表面またはプローブ・チップに少量の噴霧接着剤を適用して達成され、続いてそれを金ホイル円形物の１つに押しつけた。付着する前に、慣用されているステンレススチール（304）製の質量分析サンプル提示装置を電解研磨し、脱イオン水中で完全にリンスし、その後、メタノール中で超音波洗浄した。接着剤を用いて結合させる間、等しい圧力をプローブ・チップと金ホイル上に維持した。次に、結合トリプシンを有するサンプル提示装置を、後述するように、タンパク質消化のために使用した。実際には、複数のチップが作られ、必要とされるまで室温でポリエチレン製チューブに保存された。
実施例３
リゾチームと接触したＡｕ／トリプシンサンプル提示表面
消化は、実施例２で作製されたAu/トリプシン活性表面を用いて、250nMリゾチームニワトリ卵溶液（20mMリン酸；10mMジチオスレイトール（DTT）；pH8.1緩衝液に溶解させた）のアリコート（4μLまたは400nLのいずれか）をサンプル提示装置表面に直接適用して行なった。表面を、40℃に維持した湿気のある包囲区域内に静置した。表面上の溶液の体積をモニターし、液体の体積が2μL未満に見えた場合には、1-2μLのリン酸緩衝液の追加アリコートを加えた。10分後、装置を湿気のある環境から除去し、2μLのMALDIマトリックス、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（1.3%トリフルオロ酢酸水溶液：アセトニトリル（ACCA）の２：１溶媒混合物中の飽和溶液として調製された）を適用し、表面を風乾した。
比較例４
遊離トリプシンを用いたタンパク質消化／サンプル作製
トリプシン対リゾチームの1:1モル比は、2μLの500nMリゾチームを2μLの500nMトリプシン（両方とも、20mMリン酸；10mM DTT;pH8.1緩衝液中で調製された）とともに添加して調製した。混合量を、600μLミクロ遠心分離チューブ内に入れ、40℃で10分間インキュベートした。反応は、2μLのMALDIマトリックスACCAを添加して止め、消化物／マトリックス混合物の全量を不活性な質量分析サンプル提示装置上に置き、風乾した。
比較例５
アガロース固定化トリプシン
リゾチーム対アガロース／トリプシンの1:1体積比は、2μLの500nMリゾチームを2μLのスラリー化したアガロース／トリプシン（両方とも、20mMリン酸；10mM DTT;pH8.1緩衝液中で調製された）とともに添加して調製した。スラリー化アガロースは、約1μLのビーズ化試薬（beaded reagent）を含んでいた。混合量を、600μLミクロ遠心分離チューブ内に入れ、40℃で10分間インキュベートした。反応は、2μLのACCAマトリックスを添加して止め、消化物／マトリックス混合物の全量を（ビーズ化試薬とともに）不活性な質量分析計の慣用されているサンプル提示装置またはプローブ・チップ上に置き、風乾した。
実施例６
飛行時間型質量分析
質量分析は、直線的な飛行時間型質量分析計を用いて実施例３、比較例４、および比較例５で作製されたサンプル提示装置を使用して行なった。脱着およびイオン化は、Nd:YAGレーザー（コンティニュームスレライトＩ（Continuum Surelite I））の第３高調波（355nm）出力を用いて行った。レーザーの光路は、様々なアテニュエーター（ニューポート935（Newport 935））、直角ビーム・ステアリングプリズムおよび、サンプル・ターゲットから約300mmに置かれた250mm焦点距離の石英レンズを含んでいた。マトリックス／分析物サンプルから発生したイオンは、２段階加速ソース（トータルの距離＝1.5cm）を用いて、30kVの電位に加速した。静電粒子ガイドを使用して、飛行経路に亘るイオン伝送をアシストした。検出は、ハイブリッド、マイクロチャンネルプレート／離散ダイノード、電子増倍管を用いて行なった。イオン化の閾値は経験的に、50Mhzオシロスコープ（テクトロニクス（Tektronix）TDS310）でイオンシグナル実時間をモニターしながら、サンプル表面でレーザー光の強度を増大させることにより測定した。安定なイオンシグナルの観察により、50個のレーザー・ショットを、500MS/sデジタル蓄積オシロスコープ（テクトロニクスTDS520A）を用いてシグナル平均化し、IBM互換性486コンピューターに転送した。データは、PC互換性ソフトウェアLabCalc（ガラクティック・インダストリーズ（Galactic Industries））を用いて分析した。全ての質量スペクトルは、陽イオンモードで得られた。外部的質量較正は、ウシインシュリン（MW=5,733.5 Da）の一重および二重荷電ピークを用いて行なった。消化フラグメントの質量は、公知のニワトリ卵リゾチームのアミノ酸配列とペプチドデータ操作ルーチンPROCOMPを用いて計算した。このプログラムは、ミシガン48104、アンアーバー、ユニヴァーシティ・オブ・ミシガン  メディカルセンター、フィリップ・シー・アンドリューズ博士から公に入手される。
酵素的開裂の前に、リゾチーム・サンプルの完全性を、いかなる結合複合体も有しないサンプル提示装置を用いて、MALDI分析により証明した。リゾチーム・イオンによるもの以外のシグナル、一重および多重荷電シグナルも、これらの分析の際には観察されなかった。図１は、実施例３に記載されるように、金表面に結合したトリプシンを有するサンプル提示装置を使用して10ピコモルのリゾチームを10分間消化（40℃）した結果を示す。いかなるシグナルも、m/z=6,000を超えて観察されず、それは高いトリプシン活性を示す。67個の可能性のある消化産物のうち33個でイオンシグナルが観察される（6,000Daまでの質量範囲で）。マトリックスからの妨害の可能性ゆえに、m/z=1,000Da未満のシグナルは、一般に考慮されなかった。シグナルの強度および質は、レーザー脱着条件を、m/z=1424.8、1429.6および1435.5Daで、トリプシンによるフラグメントの分析を可能にさせるようなものであった（挿入図）。図２は、酵素開裂されたフラグメントの計算された質量と質量分析計で観察されたものとの相関関係を示す。
図３は、表面に適用された1ピコモルの酵素のみで行われた、同じ手順を用いて得られた質量スペクトルを示す。実質的に同じフラグメント化パターンが、データのシグナル対ノイズ比の予測された犠牲を伴って観察された。
比較のために、1ピコモルのリゾチームを、比較例４および５に記載されるように、等モル比の遊離トリプシンまたは等しい体積のアガロース固定化トリプシンのいずれかを用いて、消化した。遊離トリプシンを用いた消化の結果を、図４に示す。トリプシンで生じたフラグメントと両立する多くの低質量シグナルが観察され、それは図６に示されている。しかしながら、m/z1177、1459、1498、2166、2191、および2275での強いシグナルは、図６に示されるようにこれらのフラグメントがトリプシンのMALDI質量分析の間にも観察されるので、トリプシンの自己消化産物に起因する。
さらに、トリプシン全体の分子シグナル（一重および多重荷電シグナル）も、スペクトル中に見られる。自己消化および親シグナルは、これらのフラグメントがマトリックス中に組み込まれるので、データを汚染する。消化で使用されるトリプシンは、表面には結合せず、従って、トリプシン分子イオンおよび自己消化産物がマトリックス結晶に取り込むのを妨げるものはない。さらに、図３に比較すると、シグナル対ノイズ比の減少も観察され、移転および操作中のサンプル損失に起因する。
トリプシン自己消化産物によるバックグラウンド寄与を減らす試みで、アガロース固定化トリプシンを使用した。比較例５に記載されるように約1μLのビーズ化アガロースを用いて、1ピコモルのリゾチームの10分間、40℃消化から得られた結果を図５に示す。シグナルは、９個のリゾチーム消化フラグメントに関して得られ、m/z2164および3371で２個のみ、自己消化産物ピークが見られる。誘導体化サンプル提示装置および遊離トリプシン消化物の両方を対比すると、消化フラグメントに対応するピークは殆ど観察されない。しかしながら、全体的なシグナル強度の顕著な減少が観察される。アガロースは多孔性媒体であるので、消化フラグメントは、媒体への取込み、固定化酵素周辺での分析物の乏しい局在によるゆっくりとした消化、および少量のマトリックスを使用する不十分な溶出の組合せによって失われると考えられる。
Au/トリプシン誘導体化サンプル提示装置を用いて得られたスペクトルを、固定化および遊離トリプシン消化物のものと比較すると、誘導体化サンプル提示装置を用いて行われた消化物は、酵素自己消化産物によるバックグラウンド・シグナルが顕著に無く、高レベルの活性を維持することが明らかである。トータルな消化の程度を示す消化パターンから、本発明による誘導体化表面の活性が、アガロース固定化および遊離トリプシンの間の何処かに（それぞれ、約0.05および0.15TAME単位）あることが推測される。このレベルの誘導体化表面活性は、もし同様な調製条件、例えば、インキュベーション時間、温度、および緩衝液が使用されるならば、バッチ毎に適度に一定性を維持することが見い出される。しかしながら、もし表面が、不注意にさわってしまいオイルの沈着を生じたり、或いは、Au/トリプシンホイルを慣用されているサンプル提示装置に固定する際に接着剤が混入されるならば、活性は甚だしく損なわれることが見い出される。表面作製の最終工程では、注意を払わなければならない。或いは、不純物混入のリスクは、表面を金でスパッター・コーティングし、トリプシンを直接この金コーティングにカップリングすることにより、完全に排除される。この方法を用いたトリプシン活性は、金ホイル方法のそれとほぼ等しいことが見い出された。
実施例７
α-コブラトキシンと接触したＡｕ／トリプシンサンプル提示表面
α-コブラトキシンを、実施例２に記載されるように、固定化トリプシン・サンプル提示装置を用いて分析した。
最初に、非フラグメント化α-コブラトキシンをMALDI法を用いて分析した。無傷のペプチドの一重または二重荷電イオンに対応するシグナルが得られた。図７および図８からわかるように、残基1-71に対応する一重および二重荷電イオンが、7,823および3,912Daでそれぞれ観察される。m/z約1,000Da未満のシグナルは、ACCAマトリックスによる。
次に、10ピコモルのα-コブラトキシンが、実施例２により作製されたトリプシン表面で30分間消化された。α-コブラトキシンを、10mMリン酸緩衝液（pH7.8）3μL体積で表面に適用した。反応は、等しい体積のACCAマトリックスを添加して止める前に、室温で30分間、高度に湿った雰囲気で進められた。混合物は、質量分析計に挿入する前に乾燥させた。得られた質量スペクトルは、図９に示されるように、分子量7,445、7,575および7,823Daを有するペプチドに関する一重および二重荷電イオン・シグナルを示す。これらの重量は、図７に示されるように、ペプチド配列1-68、1-69および1-71にそれぞれ対応する。これらは、非減少ペプチドのトリプシン処理から予測される主要なフラグメントである。５つの他の開裂部位が可能であり、それぞれが異なる分子量フラグメントを生じる。しかしながら、これらの部位は、立体的に障害され、トリプシンに利用できない。従って、これら５個の他の可能なピークは観察されなかった。
α-コブラトキシンはさらに、還元剤（3μL-10mMリン酸；10mM DTT中10ピコモルのα-コブラトキシン）の存在下に表面結合トリプシンによって、上記の10ピコモルのα-コブラトキシン消化を繰り返すことにより分析した。図７からわかるように、還元剤はジスルフィド結合を壊し、より多くのフラグメント生成を可能にした。図１０および１１に示される得られたスペクトルは、還元されたコブラトキシンを表示する１セットのペプチド・フラグメントを示す。
実施例８
表面結合α-キモトリプシンを用いたサンプル提示装置の作製
質量分析サンプル提示装置は、装置の表面に下記のようにα-キモトリプシンを結合させることにより作製した。α-キモトリプシンまたはTPCKで処理したα-キモトリプシンを、実施例２に記載されるように誘導体化サンプル提示装置の作製に使用するために、20mMリン酸緩衝液、pH7.8に溶解して、1mg/mLの濃度にした。
実施例９
核酸プローブのデザインおよび遺伝子同定のための配列決定
表面固定化および遊離ペプチダーゼの組合せを使用して、下記のようにオリジナルのペプチドから異種フラグメント混合物を生じさせた。
酵素的に活性なトリプシンおよびα-キモトリプシンの質量分析サンプル提示表面を、実施例２および８に記載されるように作製した。
合成ペプチドであるヒト副甲状腺ホルモン1-34（hPTH）を、分析用のテスト・ペプチドとして選択した。ペプチドの配列は、以下のようである：
0003879030.tif 000002
消化は、下記のように行なった。hPTHの0.01mg/mL溶液（20mM NaHPO4、pH8.1の緩衝液中）の３マイクロリットルのアリコートを、実施例２または８に従って作製された誘導体化質量分析計サンプル提示装置に適用した。消化は、40〜50℃の温度で、高い湿度雰囲気で行われた。反応混合物の0.5-1.0μLアリコートを表面から除去する前に、消化を5〜10分間実施した。これらのアリコートを、エンドペプチダーゼ・マッピングのためにMALDI分析した。20mM NH4COOCH3のアリコートを添加してpHを約5に低下させ、アリコートの体積は残っている反応混合物のものに等しかった。次に、酢酸緩衝液中の0.001mg/mLカルボキシペプチダーゼP（CPP）の500nLアリコートを反応混合物に加えた。表面を加熱化高湿度雰囲気から除去し、反応を等体積のMALDIマトリックス添加して止める前に、タンパク質ラダー消化を１〜３分間実施した。マトリックス／反応混合物を風乾し、酵素的に活性な表面を質量分析計に直接挿入した。
図１２は、2.5ピコモルのhPTHのACCA-MALDI質量スペクトル、下記の酵素分析のための参照の開始点である。強い一重プロトン化シグナルが、4,119.0Daの質量対電荷比（m/z）で、二重荷電がm/z=2.019.7Daで観察され、およびm/z＜500Daではマトリックス・イオンシグナル以外は殆ど観察されなかった。
hPTHはさらに、40℃でpH8.1に維持したAu/α-キモトリプシン表面上で10分間消化した後に分析した。この消化の結果を図１３に示す。1,398.5、1,706.2、1850.0および2,738.7Daで４個の主要なシグナルが、図１３に示されるように観察される。
図１３に示される質量スペクトルを得るためにMALDIマトリックスを加える前に、消化されたペプチドの一部を第２の慣用されているサンプル提示装置表面に移した。第２の慣用されているサンプル提示表面上の消化ペプチドの部分を、約5のpHに調整し、さらにcppに曝した。図１４は、この第２サンプルから得られたMALDI質量スペクトルを示す。cpp消化による一連のイオン・シグナルが、1,800-2,800Daの範囲のm/zで観察され、m/z=2,738.7でのAu/α-キモトリプシン消化シグナル由来のものであると推定される。最初の残基は、α-キモトリプシンに関する好ましい開裂部位である。図１５は、図１４で観察されたシグナルの質量を要約しており、隣接するシグナルの間の質量の差および残基はその差から決定される。図１５に示されるように読める）N-からC-末端への部分配列が、連続的質量差によって決定され、（ｐｅｐ）−ＭＥＲＶＥＷ−ＣＯＯＨを与える。
hPTHの第２の同様な分析が、Au/トリプシン・サンプル提示表面を用い、その後cpp消化して行なわれた。図１６は、45℃の温度（pH8.1）５分間後のAu/トリプシン消化の結果を示す。図１８は、その消化について観察された質量を要約する。図１６に示されるトリプシン消化は、幾つかの出発フラグメントの産生を生じ、短い配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓの存在を示した。
図１６に示される質量スペクトルを得るためにMALDIマトリックスを加える前に、消化ペプチドの一部分を、第２の慣用されているサンプル提示装置表面に移した。続いて、cppを、この第２部分に加えた。約5にpH調整した後、ラダー消化は、ACCAをサンプル提示表面に加えて止める前に、３分間進めさせた。図１７は、得られた配列ラダーを示す。図１８に要約される観察された質量差から、配列は（ｐｅｐ）−ＮＳＭＥＲＶＥＷ（Ｌ／Ｉ）ＲＫ−ＣＯＯＨであることが決定された。cppによって開裂された最初の残基は、Ａｒｇのものである。Ａｒｇは、トリプシンに関する好ましい開裂部位である。これは明らかに、Au/α-キモトリプシン/cppを用いて決定された部分配列の伸長である。
大きいスケールの配列、（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、ラダー配列と正しい質量でオーバーラップする。これは、追加的なＬｙｓによる配列伸長のために、両方のスペクトルが結合するのを可能にする。ｃ-末端からのAu/α-キモトリプシン/cppシリーズで観察される最初の残基は、トリプトファンであると決定された。トリプトファンがα-キモトリプシン開裂の好ましい部位の１つであるので、これは予測される。
図１５、挿入図、からわかるように、Au/α-キモトリプシン/cpp消化の最後の開裂の領域から選択される２つのイオン・シグナルがあり、曖昧さの可能性を導く。２つの質量の差は、最終残基として、セリンまたはプロリンのいずれかの可能性を示す。シリーズ全体で観察された質量帰属の誤差（平均、約0.15Da）に基づくと、-0.1Daの誤差を有してセリンであるとの最終決定が、プロリンである（-2.2Daの誤差を有して）という最終決定を上回って為された。得られた配列は、（ｐｅｐ）−ＳＭＥＲＶＥＷ−ＣＯＯＨであると決定された。
128Daという名目上の質量差が、Au/トリプシン/cpp分析の最初のトリプシン開裂から得られたスペクトルの幾つかのポイントで観察された。トリプシンがリシンまたはアルギニンでのみ開裂することを考慮すると、128Daの質量差は、C-末端のリシンから、もう１つのリシンまたはアルギニンまでのいずれかから生じることが高度にあり得る。同様に、3,000〜3,300Da領域で観察されるような、128Daという２つの隣接する質量差は、配列中にＬｙｓ−Ｌｙｓの存在を示し、その第３残基は、もう１つのリシンまたはアルギニンのいずれかである。この情報は、エンド-およびエキソペプチダーゼのスペクトルのオーバーラップの認識と組合せると、２つのスペクトルを組合せて使用することを可能にし、配列決定を伸長させる。図１９は、ラダー配列のＡｒｇ−Ｌｙｓとオーバーラップするトリプシン・スペクトル中に観察された（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓから決定された追加的リシンにより伸長されたラダー配列を示す。このように観察された128Daの質量差は、同じ分子量を有するＧｌｎと対立して、Ｌｙｓであると疑う余地なく帰属され得る。結果は、配列の12残基が、（ｐｅｐ）−ＮＳＭＥＲＶＥＷ（Ｌ／Ｉ）ＲＫＫ−ＣＯＯＨであると決定された。
このデータ収集では、約0.2Da以内の相対分子質量を測定するのに十分優れた質とシグナル対ノイズを有する４個の50〜100のレーザー・ショット質量スペクトルが、トータルで約15ピコモルのサンプルを用いて得られた。MALDIプロセスに典型的に、サンプル提示は、等しい質の何千という単一のレーザー・ショット質量スペクトルが可能であった。サンプル提示表面装置に適用されるサンプル量を最少にするよう特別な努力は払われず、装置の表面面積は十分に大きいので、表面面積の減少やより少ない分析物サンプルを適用してプロセス全体を単純に縮小化することにより、質を犠牲にすることなく分析物サンプル量を減らすことが可能であり得る。
これらの消化を迅速に行うために、誘導体化サンプル提示表面を高温で維持することが重要であった。エンド-およびエキソペプチダーゼの両方の消化に使用された温度は、約55℃までの高い温度で行われ、タンパク質分解性消化で代表的に使用される温度、つまり37℃よりも幾分高い。これは、酵素的に活性なサンプル提示表面の高い相対活性と組合せると、迅速な分析時間に関連すると考えられる。全てのケースで認められるわけではないが、hPTHの例で実証された15分という分析時間は、１分当たり丁度１残基という分析速度を示す。
ペプチド配列が上記プロセスで決定された後、縮重のルールを使用してペプチド配列をコードする多くの核酸配列を同定できる。例えば、Biochemistry、ストライヤー（Stryer）、pp.91-115（1988）を参照のこと。多くの異なる核酸配列が単一ペプチドをコードしているので、幾つかの核酸配列がペプチド配列から得ることができる。核酸配列を使用して、核酸配列のデータベース、例えばジーンバンク（Genbank）をサーチし、特定のポリペプチドをコードする遺伝子を同定できる。
実施例１０
表面結合ペプシンを有するサンプル提示装置の作製
質量分析サンプル提示装置は、ペプシンを装置の表面に下記のように結合させて作製した。金ホイルを先ず、実施例１に示される方法により、DSPで活性化させた。DSPで活性化した金を次に、エチレンジアミン（イソプロパノール中20%v/v）と室温で30分間反応させた。インキュベーション後、金ホイルをイソプロパノールで完全にリンスし、その後で20mMリン酸緩衝液中0.1M［1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］、pH4.5と、30分間室温で反応させた。続いて、ホイルを、リン酸緩衝液で完全にリンスした。次に、リン酸緩衝液中10mg/mLペプシン溶液を表面に加え、４時間４℃でインキュベートさせた。インキュベーション後、ホイルをリン酸緩衝液で繰り返しリンスし、最後に真空乾燥した。
実施例１１
ペプシンと接触したＡｕ／ペプシン・サンプル提示表面
10mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH3.4）中、約5ピコモルのhPTH1-34を適用して、実施例１０で調製したAu/ペプシン活性表面を用いて、消化を行った。ACCAマトリックスを加えて反応を止める前に、hPTHを8分間45℃で消化した。続いて、飛行時間型質量分析を行なった。図２０に示される得られたスペクトルは、アミノ酸4-18、9-24、8-24、および18-34に対応する、ペプシンで生じたペプチドに関するイオン・シグナルを含む。
実施例１２
２つの異なる複合体による生体分子の連続的処理
２つの異なる表面結合複合体の組合せを使用して、下記のように生体分子を順々に修飾した。先ずhPTHを、10分間35℃、pH8.1で、実施例２に記載されるように、固定化Au/α-キモトリプシン・サンプル提示装置を用いて消化した。次に、消化混合物の一部分を実施例２に記載されるように作製したcpp活性化装置に移し、溶液のpHを約5に調整した。cpp消化は、ACCAマトリックス添加で止める前に、10分間35℃で進めた。
最初のAu/α-キモトリプシン消化の結果の質量スペクトルを、図２１に示す。hPTHのα-キモトリプシン開裂から得られるイオン・シグナルが、観察される。α-キモトリプシン消化混合物のAu/cpp消化の結果の質量スペクトルを、図２２に示す。星印「★」で表示される新しいイオン・シグナルが観察される。これらの新しいシグナルは、オリジナルのペプチド種のC-末端消化に対応する。
実施例１３
生体分子の精製
本発明は、下記のように生体分子を精製するのに使用できる。多くの生物学的研究のために、望ましくないプロテアーゼを生物学的溶液から除去することが必須である。アプロチニンは、プロテアーゼに対し多価阻害作用を有する、分子量6512ダルトンのシングル鎖で塩基性の58アミノ酸ポリペプチドである。具体的には、それは、酵素の活性部位に結合しタイトな複合体を形成して、セリン・プロテアーゼのファミリーに属する様々な酵素を阻害する。質量分析サンプル提示装置は、実施例２に記載されるものと同様に、アプロチニンを表面につなぎ留めることにより作製される。ポリペプチドとプロテアーゼの溶液を、表面に加える。プロテアーゼを、アプロチニンによって溶液から除去する。質量分析が行われ、精製されたポリペプチドのみ観察されるべきである。
実施例１４
生体分子をイオン交換によって精製するサンプル提示装置の作製
ジエチルアミノエチル誘導体、t-ブチルアミノ誘導体（陰イオン交換用）、亜硫酸誘導体、カルボン酸誘導体（陽イオン交換用）のようなイオン交換機能物、あるいは上記のものの組合せを、実施例１により作製されたサンプル提示表面に固定化する。
実施例１５
イオン交換による生体分子の精製
生体分子を含む溶液を、実施例１４により作製された表面に加える。サンプル提示表面に結合したイオン交換機能物を、生体分子を含む溶液中の不純物として存在する不用なイオン種と、イオン交換する。
実施例１６
サンプル提示装置を用いたＤＮＡの分析
最初に、ヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼをサンプル提示装置表面に付着させる。この付着は、実施例２に記載されるものと同様に、つなぎ留め分子を用いて達成され得る。次に、DNAを表面に加える。ホスホジエステラーゼがDNAフラグメントを生じた後に、MALDIマトリックスを加え、MALDI飛行時間型質量分析を行う。
実施例１７
サンプル提示装置を用いた炭水化物の分析
炭水化物を消化するマンナーゼのような酵素を、サンプル提示装置表面に付着させる。この付着は、実施例２に記載されるものと同様に、つなぎ留め分子を用いて達成され得る。次に、炭水化物を表面に加える。マンナーゼが炭水化物フラグメントを生じた後に、MALDIマトリックスを加え、MALDI飛行時間型質量分析を行う。
本発明の多くの他の変形および修飾が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者に明らかである。従って、上記の実施態様は例示のみを意図しており、全てのそのような変形および修飾は、クレームの範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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