(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の免疫系と相互作用する形で腫瘍関連抗原の発現を引き起こす核酸配列を含有する、該腫瘍関連抗原に対する個体の免疫応答を調節するための免疫調節組成物であって、前記腫瘍関連抗原がＢ細胞リンパ腫由来のイディオタイプ決定基であり、前記核酸配列がＶＨおよびＶＬドメインの両方を発現するものである、免疫調節組成物。
【請求項２】
前記核酸はキャプシドに包まれない形である、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項３】
前記腫瘍関連抗原に対する個体の免疫応答をさらに調節するために、さらなる免疫調節ポリペプチドの発現を引き起こす第２の核酸配列をさらに含む、請求項１または２に記載の免疫調節組成物。
【請求項４】
前記第２の核酸配列は、請求項１に記載の核酸配列と同じ核酸分子上に構成されたものである、請求項３に記載の免疫調節組成物。
【請求項５】
前記腫瘍関連抗原および前記さらなる免疫調節ポリペプチドは、個体において同時に発現するまたは融合ポリペプチドとして発現する機能を有する、請求項３または４に記載の免疫調節組成物。
【請求項６】
前記さらなる免疫調節ポリペプチドは、サイトカインまたは外来アミノ酸配列を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の免疫調節組成物。
【請求項７】
前記核酸配列または前記第２の核酸配列は、前記腫瘍関連抗原および／または前記さらなる免疫調節ポリペプチドを膜結合性にさせる配列を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の免疫調節組成物。
【請求項８】
前記核酸配列および／または前記第２の核酸配列はＤＮＡを含む、請求項３〜７のいずれかに記載の免疫調節組成物。
【請求項９】
腫瘍関連抗原をコードする核酸配列と、配列番号５８に示す配列のヌクレオチド６０６〜７１６の核酸配列を含むベクターを含む、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１０】
前記ベクターが、配列番号５８に示す配列のヌクレオチド６０６〜７８０のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の免疫調節組成物。
【請求項１１】
腫瘍関連抗原をコードする核酸配列と、配列番号５８に示す配列のヌクレオチド７７５〜１（５′から３′への方向）のヌクレオチド配列を含むベクターを含む、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１２】
前記ベクターが、配列番号５８に示すｐＶＡＣ１のヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の免疫調節組成物。
【請求項１３】
患者からの好適な試料を分析することにより腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を同定するステップと、そこから前記腫瘍関連抗原を細胞外でクローン化するステップと、前記核酸配列を適切なベクターに挿入するステップとを含み、前記腫瘍関連抗原がＢ細胞リンパ腫由来のイディオタイプ決定基であり、前記核酸配列がＶＨおよびＶＬドメインの両方を発現するものである、請求項１に記載の免疫調節組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記腫瘍関連抗原をコードする核酸配列はＰＣＲにより患者からクローン化されたものである、請求項１３に記載の免疫調節組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、個体の免疫応答を修飾する方法に関連し、また、本発明の方法を実施するための新規な組成物および前記組成物を生産する方法に関する。
発明の背景
レトロウィルスベクターに詰込まれたＤＮＡの哺乳動物宿主への導入を記載する幾つかの報告がこれまでにあった。より最近では、Wolffら（1990 Science 297, 1465−1468）が、ＲＮＡおよびＤＮＡ発現ベクター（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を運搬する）をウィルス性のパッケージベクターを使用せずにマウスの骨格筋に注入した実験を報告した。様々なアッセイによって、レポーター遺伝子が筋肉細胞の幾つかに発現されたことが示された。
続いて、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ（1991 Nature 349, 351-352）が外来遺伝子の発現を導くために注入されるＤＮＡ（パッケージされたものおよびそのままのものの両方）の使用を伴った様々な実験の結果を追試験し、免疫調節のために注入ＤＮＡを用いる考えを示唆した。特定的には彼らは、「ヒト免疫不全ウィルスｇｐ１２０タンパク質の分泌形のための遺伝子を含み、かつサイトメガロウィルス［ＣＭＶ］プロモーターによって駆動されるプラスミドを用いることによって、これらのコンセプトの幾つかが試験された。」と述べた。彼らは、ＤＮＡの単なる注入が外来性タンパク質に対して高いＩｇＧ抗体力価を誘発したことを発見した。
１９９２年にTangら（Nature 356, 152-154）は「遺伝子免疫感作」の概念をさらに発展させた。彼らはプラスミドＤＮＡで被覆された金微粒子を用いて、ヒトβ−アクチンまたはＣＭＶプロモーターのいずれかの制御下でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現をコードする遺伝子をマウスに導入した。マウスはこの後ｈＧＨに対する血清抗体反応を発生したことが示された。
まとめると、強い免疫原性のある外来性タンパク質に対する免疫応答をマウスに発生させるのに、遺伝子免疫感作を用いることが可能であることが示された。これまでは、実質的に免疫原性のない「自己」または「変更された（部分的に変えられた）自己」のポリペプチドに対する免疫応答を調節するのにそのような方法が用いられ得るということは示唆もされなければ可能であるとも考えられていなかった。
発明の概要
第１の局面においてこの発明は、個体の免疫系と相互作用する形態で前記自己のまたは変更された（部分的に変えられた）自己のポリペプチドの発現を導く核酸配列をインビボで生きた細胞に配達することを含む、自己のまたは変更された自己のポリペプチドに対する個体の免疫応答を修飾する方法を提供する。
好ましくは核酸配列は細胞外でクローン化されたものである。
自己のまたは変更された自己のポリペプチドは（たとえばグリコシル化によって）合成後に処理されるポリペプチドであってもよい。
この明細書のために、自己のポリペプチドは、同じ種の少なくともある割合の個体のゲノムに通常存在する核酸配列によってコードされるポリペプチドとして定義される。そのような自己のポリペプチドはたとえば（Ｂ細胞リンパ腫の表面で発現される）免疫グロブリンのイディオタイプ抗原決定基であってもよい。
変更された自己のポリペプチドは、個体において、インビボで生じる、前記自己のポリペプチドをコードする核酸配列を変更させるプロセスによって、自己のポリペプチドから誘導される。このようなプロセスはたとえば、欠失、付加、置換および転座を含むであろう。典型的には、変更された自己のポリペプチドは腫瘍結合抗原である。
好ましくは核酸配列はそれが配達される個体から得られたサンプルからクローン化される。
好ましくは核酸配列はキャプシドに被包されていない（つまり、ウィルス粒子または他のパッケージ内に封じ込められていない）形態で配達される。しかしながら、核酸はパッケージまたは粒子（たとえばリポソーム）の外表面と結合してもよい。
個体への配達の後、自己のまたは変更された自己のポリペプチドは独自に発現されてもよい。しかしながらより好ましくは、自己のまたは変更された自己のポリペプチドは、さらなる免疫調節ポリペプチドとともに、同時に発現されるかまたは融合として発現される。
自己のまたは変更された自己のポリペプチドに対する免疫応答をさらに調節する目的で、さらなる免疫調節ポリペプチドの発現を導く、個体への第２の核酸配列の配達を、この方法がさらに含むことは、したがってこの発明の好ましい特徴である。この第２の核酸配列は第１の核酸配列と同じ核酸配列分子上で構成されてもよく、または第２の核酸分子に存在してもよい。
このさらなる免疫調節ポリペプチドはたとえばサイトカインまたは外来性ポリペプチド（たとえばウィルスエンベロープタンパク質）であってもよい。
第１および第２の核酸配列が両方とも同じ核酸分子に存在する場合には、自己のまたは変更された自己のポリペプチドおよびさらなる免疫調節ポリペプチドの両方を含む融合ポリペプチドの発現を与えるように配列が構成されてもよい。
第１および第２の核酸分子が異なる分子に存在する場合には、構成は好ましくは、自己のまたは変更された自己のポリペプチドが個体に導入された場合同時に発現されるような構成である。さらに構成は、自己のまたは変更された自己のポリペプチドおよびさらなる免疫調節ポリペプチドが同じ個体で発現される場合には（間接的にまたは直接的に）結合するであろうような構成であってもよい。典型的には核酸配列はデオキシリボ核酸配列である。
特定の自己のまたは変更された自己のポリペプチドに対する免疫応答を促進または抑制するためにこの発明の方法が用いられてもよいことは当業者にとって明らかである。自己のまたは変更された自己のポリペプチドが腫瘍関連抗原である場合には、腫瘍の増殖を停止または低減するよう、抗原に対する免疫応答を促進することが明らかに望ましい。以下の自己のまたは変更された自己のポリペプチド、つまり、Ｂ細胞悪性腫瘍の表面に発現される免疫グロブリン上のイディオタイプ抗原決定基、Ｔ細胞悪性腫瘍の表面に発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のイディオタイプ抗原決定基、腫瘍の表面に発現される突然変異した癌遺伝子または他の自己のポリペプチド、および胎児腫瘍性抗原、に対する免疫応答の促進が好ましいであろう。
しかしながら、特定の自己のまたは変更された自己のポリペプチドに対する免疫応答を減少させることを望むような状況に直面することもさらにあり得る。たとえば、自己のポリペプチドは有害な自己免疫疾患（たとえば、リウマチ様関節炎、多発硬化症、糖尿病）となる不適当な免疫応答の対象となり得る。代替的には、治療の効力を下げる、治療タンパク質（たとえば、抗体、糖尿病患者に投与されるインシュリン、血友病患者に与えられる第VIII因子）への免疫応答を患者が起こすこともあり得る。さらなる可能性はＭＨＣ抗原に対する免疫応答の抑制であり、それによって移植片拒絶反応に伴う問題が減少し、ＭＨＣ不適合性バリアを超えた移植の可能性が与えられるであろう。サイトカイン、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は免疫抑制効果を発揮することが示され、したがって、この発明の方法に基づいて患者に自己のまたは変更された自己のポリペプチドをＩＬ−１０を用いて同時に発現することは望ましいアプローチであるかもしれない。
第２の局面において、この発明は、疾患マーカーに対して免疫応答を調節するために免疫調節組成物をつくる方法を提供し、それは、患者からの適当なサンプルの分析によって疾患マーカーをコードする核酸配列を同定しそれから細胞外でクローン化するステップと、前記核酸配列を適当なベクターに挿入し前記ベクターを患者に投与して、免疫系と相互作用する形態で疾患マーカーの発現を引き起こすステップとを含む。
この明細書のために、疾患マーカーはポリペプチドを意味することが意図され、その発現および／またはそれに対する免疫応答は個体における疾患または感染を示す。
好ましくは疾患マーカーは自己のまたは変更された自己のポリペプチドである。典型的には前記疾患マーカーをコードする核酸はＰＣＲによって患者からクローン化される。
典型的には、疾患マーカーは、Ｂ細胞悪性腫瘍の表面に発現される免疫グロブリンからのイディオタイプ抗原決定基かまたはＴ細胞悪性腫瘍の表面に発現されるＴ細胞レセプターからのイディオタイプ抗原決定基である。代替的には疾患マーカーは（胎児腫瘍性抗原のような）別の腫瘍関連抗原であってもよい。
第３の局面において、この発明は、自己のまたは変更された自己のポリペプチドに対する個体の免疫応答を修飾するためにインビボで生きた細胞に配達するための組成物を提供し、その組成物は、個体の免疫系と相互作用する形態で自己のまたは変更された自己のポリペプチドの発現を導く核酸配列を含む。
特定の具体例において、この発明は、悪性腫瘍ヒトＢ細胞の表面に提示されるイディオタイプ抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むタンパク質をコードするイディオタイプマーカーを提示する形質転換されたヒトリンパ球に対して免疫応答を誘発するのに使用されることができるワクチン核酸を提供する。
この発明は例によって、および以下の図面への参照によってさらに記載される。
図１は、ｓｃＦｖを発現するＰＣＲアセンブリの方法の概略図である。
図２は、ｓｃＦｖイディオタイプ免疫グロブリンを発現し精製するのに用いられるベクターの配列を示す。
図３は、プラスミドｐＮｉｐｅｎｖを生成するのに用いられる方法の概略図である。
図４は、プラスミド構成物ｐＮｉｐｅｎｖ、ｐＳＶ２  Ｎｉｐｅｎｖ、ｐＳＶ２  Ｎｉｐストップｅｎｖ、およびｐＳＶ２  ＢＣＬｅｎｖの概略図である。
図５は、ベクターｐＶＡＣ１のＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントの配列を示す。
図６は、免疫感作実験の結果を示すグラフである。
図７は、ベクターｐＶＡＣ１の全体の配列を示す。
図８は、ｐＶＡＣ１制限地図を示す。
図９は、ｐＶＡＣ１の主な特徴の概略図を示す。
図１０は、免疫感作実験の結果を示すグラフである。
図１１（ａ，ｂ）はＦＡＣＳ分析の結果を示す。
あるタイプのＢ細胞非（Ｎｏｎ）ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）リンパ腫（ＮＨＬ）に発現される表面免疫グロブリンのイディオタイプ抗原決定基は独自の腫瘍特異抗原である。したがって、それらは様々な免疫治療の抗リンパ腫戦略のための適当な標的であるはずである。Ｂ細胞ＮＨＬのイディオタイプ抗原決定基に対して生成されたネズミのモノクロナール抗体（ＭＡｂ）はヒトの治療の試みにおいて与えた抗力は限られたものであった。部分的なおよび完全な応答が観察されたが、ネズミＭＡｂはヒトのエフェクター機能を非効率的に回復させる傾向にあり、かつそれ自体がヒト抗マウス抗体反応の標的である。さらに、表面Ｉｇネガティブリンパ腫細胞の派生が治療の後に観察された。これらの制限を、個々の患者のためのＭＡｂを発生する費用および不便さと併せて考えて、このアプローチは広く採用されてこなかった。しかしながら、抗イディオタイプ抗体がＢ細胞ＮＨＬにおいて治療上の可能性を有することは明らかである。
受動的抗イディオタイプ免疫血清療法に対する１つの代替法は、寛容を破り患者における強い抗イディオタイプ抗体反応を誘発することを目的とする能動的免疫感作である。このアプローチのさらなる利点は、リンパ腫に対してＴ細胞媒介免疫応答を刺激する可能性をさらに有することである。問題は、寛容を破り有効な抗リンパ腫免疫応答を刺激するのに、どのように抗原（イディオタイプ抗体）を最もよく提示するかということである。調節された腫瘍細胞ワクチンを用いて細胞免疫性を刺激する努力は限られた成功しかみなかった。免疫原性の高い担体タンパク質に化学的に結合されるイディオタイプ免疫グロブリンを用いることに基づく特定のワクチンは、動物モデルで予防および治療効果の両方を与えることにおいてより成功することがわかった（GeorgeおよびStevenson, 1989 Intern. Rev. Immunol. 4, 271-310）。
免疫グロブリンをほとんど分泌しないリンパ腫にとって、イディオタイプをつくることは大きな問題である。本発明者は、イディオタイプ免疫グロブリンの遺伝子を同定するためＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法を用いて、個々の患者ごとにつくることのできる単純で効果的なワクチンを開発するための様々な戦略を調べた。
特定の具体例において、この発明は、ＢまたはＴ細胞、抗体またはＴＣＲ、イディオタイプマーカーを提示するヒトリンパ球に対して免疫応答を誘発するのに用いられる核酸ワクチンを提供し、そこにおいて、該核酸は、両方の可変領域（ＶＨ／ＶＬ；Ｖａ／Ｖｂ；Ｖｇ／Ｖｄ）を含むポリペプチドをコードする。
Ｂ細胞リンパ腫の細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）において発現されるイディオタイプ抗原決定基は腫瘍結合抗原として作用し得る（追試験のためにＧｅｏｒｇｅおよびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ，１９８９を参照されたい）。同様に、細胞表面ＴＣＲはＴ細胞リンパ腫において腫瘍結合抗原としてさらに作用し得る（Jansonら、1989 Cancer Immunol. Immunother. 28,225-232）。したがって、それらは、患者に対する受動的抗イディオタイプ抗体の投与に対して顕著に、治療のための魅力的な標的を提示する（Millerら、1982 New Engl. J. Med. 306,517-522）。標的悪性腫瘍Ｂ細胞の体細胞突然変異は、標的が抗イディオタイプ抗体から逃避する結果となり得るが（Levyら、1987 J. Immunol. Rev. 96, 43-；GahlerおよびLevy, 1992 PNAS 89, 6770-6774）、免疫グロブリン発現の完全な欠如は稀である（Meekerら、1985 New Engl. J. Med. 312, 1658-1665；Zelentzら、1990 Ann. Oncol.2, 115-122）。別のアプローチは能動的免疫療法のためにイディオタイプ抗原決定基を用いることであり、つまり、腫瘍細胞からのイディオタイプＩｇで腫瘍を有する宿主を免疫処置し、それによって自己抗イディオタイプ応答を発生させることである（GeorgeおよびStevenson, 1989を参照されたい）。この応答はポリクロナールであるため、標的Ｂ細胞が選択を逃避することはより困難であり、さらに、この応答は継続的に提示され、後遺の疾患を制御することができるかもしれない。事実、腫瘍攻撃前のイディオタイプＩｇでの能動的免疫感作は、動物において典型的なＢ細胞腫瘍を抑制することにおいて有効であり（StevensonおよびGordon, 1983 J. Immunol. 130, 970-973；Georgeら、1987 J. Immunol. 138, 628-634；Campbellら、1987 J. Immunol. 139, 2825-2833）、初期腫瘍を有する動物を治療するのに有効であることがわかっている（Georgeら、1988 J. Immunol.141, 2168-2174）。さらに、リンパ腫を有する患者から分離されたヒトＩｇでのイディオタイプ免疫感作は持続的な腫瘍退縮と関連している（Kwakら、1992 New Engl. J. Med. 327, 1209-1215）。しかしながら、非ホジキンリンパ腫に関してイディオタイプヒト抗体を分離することは困難でかつ時間がかかり、それはリンパ球の表面にあるものの、免疫グロブリンをほとんど分泌しない。免疫感作のための十分なイディオタイプ抗体をつくるために、ヘテロハイブリドーマがマウス細胞系との融合によって調製され、その抗体は精製されなければならない（Carrollら、1985 J. Immunol. Methods 89, 61-67）。この収率は低いことがしばしばであり、この結果、融合がヒトＢ細胞腫瘍に由来することを確認しなければならない。
特定の具体例においては、この発明は、腫瘍抗体のイディオトープ（およびパラトープ）を発現するために、腫瘍Ｂ細胞からのＶ遺伝子の分離を必要とする。したがってまず患者からのＢ細胞のサンプルで、重鎖および軽鎖の両方の再配列されたＶ遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応および「万能」プライマーを用いて増幅される（Orlandiら、1989 PNAS 86, 3833-3837；Marksら、1991 J. Mol. Biol. 222, 581-597；表1 Seq. ID Nos. 1-48をさらに参照されたい）。増幅されたＶ遺伝子はクローン化されて配列決定される（Sangerら、1977 PNAS 74, 5463-5467）。悪性腫瘍Ｂ細胞からのＶ遺伝子は反復ＶＨおよびＶＬ遺伝子配列として同定される。何人かの患者では、重鎖および軽鎖の両方に関し、共通の反復配列を同定することが可能であった。これらの配列はこのあと、３人の患者の例において、ヘテロハイブリドーマから遺伝子を配列決定することによって確認された。重鎖および軽鎖の組合せは腫瘍のイディオトープを明らかにする（例１）。原理的には、イディオトープを明らかにする連結された重鎖および軽鎖配列の主な組合せを同定するために、同じ細胞内で再配列されたＶ遺伝子を増幅し連結することも可能であろうが（Embletonら、1992 Nucl. Acids Res. 20, 3831-3837）、ここではＶ、ＨおよびＶＬは別々に同定されＰＣＲアセンブリによって連結される。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、機能抗体フラグメント、たとえば連結された単鎖ＦｖフラグメントとしてのＶドメインの両方の発現のため、ベクターにクローン化される（以下を参照されたい）。
以前の研究では、リンパ腫のためのマウスのモデルにおいて、腫瘍イディオタイプのＶ遺伝子は、細菌において軽鎖および重鎖の融合タンパク質としてクローン化され発現された。この後分離している鎖が免疫原として用いられた。しかしながら、分離した鎖は変性され、任意の例において、抗体のパラトープを与えるよう同時発現されなかった。事実、著者らは「組換えＦｖタンパク質を精製するのに、細菌におけるＶＨおよびＶＬ遺伝子の同時発現がそうであろうように、天然タンパクに存在するエピトープと同様の固定された立体配置を有するペプチドに関するさらなる研究は有用であることがわかるであろう。」と示唆した（Campbellら、1987、上記に引用される）。しかしながら、著者らはイディオトープのＶ遺伝子をどのようにして分離するかを教示しなかった。さらに著者らは組換えＦｖフラグメントをワクチンにどのように組入れるかも教示しなかった。理想的には、ワクチンは、抗原特異Ｂ細胞、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびヘルパーＴ細胞を刺激することができるべきである。Ｂ細胞刺激は、目的とする抗原がＢ細胞表面上の特異的抗原レセプター（表面Ｉｇ）と十分に高い親和性をもって結合することを必要とする。ある多価抗原はＢ細胞増殖を直接、より頻繁に、刺激することができるが、有効な既応反応を与えるために、ヘルパーＴ細胞によって与えられる付加的なシグナルが要求される（以下を参照されたい）。
ＣＴＬのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）は標的細胞表面で提示される特定のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを認識する。このようなペプチドは一般的には、標的細胞内で製造されるより大きなポリペプチドまたはタンパク質の処理によって誘導される。したがって、効率的なＣＴＬ刺激のためには、標的抗原はＭＨＣクラスＩ発現細胞において細胞内で合成されるべきである。発現のレベルは、通常はＭＨＣペプチド結合溝で（恐らくは高い親和性を持って）結合されるそれらの自己のペプチドを置換するために十分なペプチドを発生するよう、十分に高いものであるべきである（Ohno, 1992 PNAS 89, 4643-4647）。抗原特異的Ｂ細胞と同様、増殖および増大される細胞障害能力のために、ＣＴＬは抗原認識の後に（サイトカインの形態での）付加的なシグナルを必要とし、それらはヘルパーＴ細胞によって与えられる。
Ｔ細胞ヘルパーは最適Ｂ細胞およびＣＴＬ反応のために必要とされる。ＣＤ４−ポジティブヘルパーＴ細胞は（それらの独自のＴＣＲを介して）特定の細胞表面ＭＨＣクラスII結合ペプチドと相互作用し、そのようなペプチドは一般には、分化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内在化されるタンパク質抗原のタンパク質開裂によって誘導される。マクロファージ、樹枝状細胞、およびＢリンパ球は、このような方法で抗原を提示することができる細胞の一部である。したがって、Ｂリンパ球はそれらの表面Ｉｇに結合される抗原を内在化して処理し、続いてＭＨＣクラスII結合誘導ペプチドを提示する。表面ペプチドを認識するＣＤ４−ポジティブＴヘルパー細胞は様々な免疫刺激サイトカインを放出し、さらなるＢ細胞活性化、増殖および抗体生成を刺激することができる。同様に、局所的炎症反応の部位に存在するマクロファージは、食作用を受けた抗原を処理しＴヘルパー細胞によるサイトカイン放出を刺激し得て、局所的に存在するＣＴＬの活性化、増殖、および細胞障害性を促進するに至る。
したがってワクチン抗原は理想的には、１）ＭＨＣクラスＩポジティブ宿主細胞によって細胞内で合成され、２）宿主細胞クラスＩ  ＭＨＣによって提示されると、ＴＣＲを介して宿主ＣＴＬのサブセットを刺激することができるペプチドを生じさせ、３）宿主細胞クラスII、ＭＨＣによって提示されると、ＴＣＲを介して宿主ヘルパーＴ細胞のサブセットを刺激することのできるペプチドを生じさせ、４）マクロファージおよび抗原特異的Ｂ細胞の両方を含む宿主ＡＰＣによって内在化され処理され、５）天然の形態で、宿主Ｂリンパ球との相互作用のために利用可能であるべきである。
さらなる特定の具体例では、この発明は、哺乳動物細胞内での腫瘍抗体のイディオトープの再配列されたＶＨおよびＶＬ遺伝子の発現を与え、宿主ＭＨＣと組合せて細胞表面上での提示のための、および（折り畳まれた抗体フラグメントとしての）パラトープの提示（または分泌）のためのペプチドの生成を可能にして、抗イディオタイプ抗体の生成を誘発する。抗体フラグメントはそれをコードする組換えウィルスの感染によって哺乳動物細胞に導入されてもよい。原理的には、抗体フラグメントは、感染された（形質移入）された細胞の表面上にそれらを分泌または提示するためのシグナル配列を与えられてもよい。代替的にはフラグメントは、たとえばウィルスの被覆タンパク質のような、例２に記載されるような細胞の表面上に提示される別のタンパク質と連結されてもよい。（単鎖Ｆｖフラグメントとしての）抗体フラグメントはウィルスの被覆タンパク質に付加される機能形態で提示されて、それらはさらに折り畳まれ、かつ感染された細胞の表面に天然の形態であることを示す（Russellら、1993 Nucl. Acids Res. 21,1081-1085）。抗体フラグメントはそれをコードする核酸を用いて哺乳動物細胞にさらに導入されてもよい。例としては、（上述のような）ウィルスの被覆タンパク質と抗体フラグメントとの間の融合タンパク質をコードする遺伝子が（皮下にまたは筋肉内に、例３を参照）直接注入によってマウスを免疫処置するのに用いられた。
（以下の）例は主としてリンパ球悪性腫瘍におけるイディオタイプマーカーの分離に関連するものであるが、もしＶ遺伝子対を同定することが可能であれば、同じ方法で、自己免疫疾患に伴われるＢおよびＴ細胞イディオタイプに対して免疫処置を行なうことがさらに可能であるはずである。もちろん、自己抗原に対して反応性を有するモノクロナール抗体が自己免疫疾患患者のＢ細胞から既に作られている。恐らく、Ｂ細胞内で重鎖および軽鎖の組合せをともに連結し（Embletonら、1992）、その後、ファージにクローン化し（McCaffertyら、1992 Nature 348, 552-554）、続いて自己特異性を有するファージのための選択により、関連する抗体の同定が容易となり、抗イディオタイプ療法のためのそれらの使用が可能となる。他の自己免疫疾患では、あるＴＣＲ族が過剰に示されることが知られており（Marguerieら、1992 Immunol. Today 13, 336-338）、したがって配列決定の後の細胞内ＰＣＲアセンブリは、関連するレセプターを同定し、かつ抗（ＴＣＲ）イディオタイプ免疫感作のためにそれらを引続いて使用することを可能にするはずである。
例
例１−Ｂ細胞リンパ腫の生検からのＶ遺伝子の同定
生検材料の調製
病理学的に確認された濾胞性リンパ腫を有する５人の患者から生検試料が得られた。それらは通常の診断法の間に得られた。軽鎖は免疫組織化学によってカッパまたはラムダとして同定された。悪性でないコントロールとして、クローン病を有する患者からの小腸リンパ節と、脾摘出を行なった患者からの脾臓のサンプルとが得られた。生検材料は単細胞懸濁物として調製され、細胞はこの後凍結されて−７０℃で保存された。
ＰＣＲのためのＤＮＡの調製
ＰＣＲのために、ＤＮＡは簡単なプロテイナーゼ  Ｋ／トゥイーン（Tween）２０溶解法を用いて調製された（Innisら、1990 PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications；Academic Press Inc., p147）。簡単に言うと、細胞はマイクロ遠心分離機で１３，０００ｒｐｍでの２０秒間の遠心分離によってペレット化された。この後細胞は、Ｋ−緩衝液（１０ｍＭ  トリスＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５％  トゥイーン２０、１００ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）中で約１０6／ｍｌで再懸濁される前に、１ｍｌ  ＰＢＳで２度洗浄されて、細胞を溶解させてＤＮＡを放出するために５６℃で６０分間インキュベートされた。プロテイナーゼＫはこの後９５℃での３０分間のインキュベーションによって不活性化された。こうして放出されたＤＮＡはＰＣＲ反応に直接用いられ、またはそれに続く使用のために−２０℃で保存された。
ＰＣＲプライマー
ＰＣＲプライマーは再配列された重鎖カッパおよびラムダ軽鎖遺伝子を増幅するよう設計された。５’プライマーはＶ遺伝子のフレームワーク１に基づく。ＶＨおよびＶｋプライマーはＭａｒｋｓら（１９９１）によって記載されるものと同様である。しかしながら、（ｃＤＮＡに対立するものとしての）ゲノムＤＮＡからの増幅では、３’末端で塩基１つ分短くされたプライマーが用いられた場合は、生成物はよりクリアであることがわかった（データは示さず）。加えて、使用されるプライマーの数は同様のプライマーを１つのコンセンサスプライマーとして組み合わせることによって減少された。ＪＨプライマーにおける１つの変化を除いて、共通のＢｓｔＥＩＩ部位を導入するために、制限部位を導入するための変化はなされなかった。Ｖλプライマーをベースとする制限ＤＮＡ配列の情報は利用可能であったが、プライマーは利用可能な配列データからＶλ１、Ｖλ２、Ｖλ３、およびＶλ４族に作られた（Songsivilaiら、1990 Eur. J. Immunol. 20, 2661-2666；Alexandreら、1989 Nucl. Acids Res. 17, 3975；Bernardら、1990 Nucl. Acids Res. 18, 7139；Chuchanaら、1990 Eur J. Immunol. 20, 1317-1325）。他の族も存在することが知られているが（Chuchanaら、1990）、利用可能なヌクレオチド配列データがなく、プライマーは作られなかった。Ｊ領域プライマーは重鎖（Ravetchら、1981 Cell 27、583-591）、カッパ鎖（Hieterら、1982 J. Biol. Chem. 257, 1516-1522）およびラムダ鎖（UdeyおよびBlomberg 1987 Immunogenetics 25, 63-70；Dariavach 1987 PNAS 84, 9074-9078；BauerおよびBlomberg 1991 J. Immunol. 146, 2813-2820；CombriatoおよびKlobeck、1991 Eur. J. Immunol. 21, 1513-1522；Frippiat, 1990 Nucl. Acids Res. 18, 7134）のための生殖細胞系Ｊ領域のゲノム配列に対して相補的に作られた。Ｊλ遺伝子はそれらのそれぞれのＣλ遺伝子と組合わされ、Ｃλ４、Ｃλ５（Dariavach, 1987）および恐らくＣλ６（BauerおよびBlomberg、1991；CombriatoおよびKlobeck、1991）は偽遺伝子であるため、それらは発現されるタンパク質としては現われないはずである。この結果、これらのＪλ遺伝子に対するプライマーは作られなかった。２つのＪ領域プライマーを組合せることによって、全部で３つのＪ１プライマーＪλ１、Ｊλ２／３、Ｊλ７が作られた。表１は最初のＰＣＲプライマーの完全なリストを示す。
再配列された免疫グロブリン可変領域のＰＣＲ増幅
Ｖ遺伝子族およびＪ領域プライマーは表１に示される個別のプライマーの等モル混合物として用いられた。ＶＨＢＡＣＫおよびＪＨＦＯＲは重鎖ＰＣＲ反応のために用いられた。同様の混合物がカッパまたはラムダ鎖ＰＣＲ増幅のために用いられた。ＰＣＲ増幅は５０μｌ容量でハイベイド・サーマル・リアクタ（Hybaid Thermal Reactor）（ハイベイド（Ｈｙｂａｉｄ））を用いて行なわれた。反応混合物は１  ｘ  ＰＣＲ緩衝液（プロメガ（Promega）、10mM  トリスCl［Ph 8.8］、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％  トリトン（Triton）X-100）中に20pmolの各々のプライマー混合物、250μＭのdNTP（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン（Sweden））を含む。いかなる汚染の危険性をも最小限にするために、さらに注意が払われた。混合物はＰＣＲ反応をセットアップするために特に指定された室内で層流フードにセットアップされた。この後サンプルはＵＶオーブン（アンプリラッド（Amplirad）、ジェネテッィクリサーチ（Genetic Research）、ダンモウ（Dunmow）、イギリス（UK））で５分間ＵＶ処理された。この後鋳型（５μｌ）が加えられ、反応混合物を鉱油（シグマ（Sigma））で覆い、サンプルは９４℃で５分間加熱された。この段階で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、２．５ユニットが添加された。増幅は３５サイクルで、９４℃１分、６５℃、１分アニール；７２℃１分伸長で行なわれた。増幅された可変領域は１．５％ＬＭＰアガロース／ＴＡＥゲルで分析され、臭化エチジウムを用いて視覚化された。サイズ３２０／３５０塩基対のバンドが摘出され、製造業者の指示に基づいてジェネクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）IIキット（バイオ（Ｂｉｏ）１０１）を用いて精製された。Ｖ領域の少なくとも２つの独立したＰＣＲ増幅がすべての患者のサンプルから行なわれ、リンパ節ＤＮＡのＰＣＲがヘテロハイブリドーマからの対応するＰＣＲの前に行なわれた。
ＰＣＲ生成物のクローン化および配列決定
Ｍａｒｃｈｕｋによって記載されるＴベクタークローン化システム（Marchukら、1991 Nucl. Acids Res. 19, 1154）が用いられた。簡単にいうと、ベクターが、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）IIＫＳ＋ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））から、平滑末端を生成するための（ＮＢＬからの）ＥｃｏＲＶを用いた消化、およびその後の、２ｍＭのｄＴＴＰを含むＰＣＲ緩衝液（プロメガ）中での７０℃で２時間のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）を用いての処理によって調製された。精製されたＶ遺伝子ＰＣＲ生成物はＴベクターに結合され、受容能のあるＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１に形質転換された（Gibson、1984  博士号論文、ケンブリッジ大学（University of Cambridge）、英国（United Kingdom））。組換えクローンはイソプロピル−β−チオガラクトシドピラノシド（ＩＰＴＧ、シグマ）を用いて青色／白色選別によって同定された。ランダムな組換えクローンが採取され、ｓｓＤＮＡがヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７、ストラタジーン）を用いた重複感染の後に調製された（VieiraおよびMessing、1987 Methods Enzymol. 153、3-11）。クローンはジデオキシ法（Sangerら、1997）によってＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、USB、クリーブランド（Cleveland）、アメリカ合衆国（USA）を用いて配列決定された。各患者からの多数のクローンが配列決定され、その配列が比較された。
ｓｃＦｖとしての腫瘍Ｖ遺伝子のアセンブリ
図１に示されるアセンブリ法はＤａｖｉｓらによって記載されるそれに基づく（1991 Bio/Technology 9、165-169）。アセンブリプロセスはプライマーの第２のセットを用いる。ＶＨＳｆｉＢＡＫプライマーはＳｆｉＩクローン化部位をコードし、さらにＶＨＢＡＫプライマーの元のセットと交雑する。ｓｃＪＨＦＯＲおよびｓｃＶｋ／Ｖλ  ＢＡＫプライマーはそれらのそれぞれの初期プライマリーと交雑するのみならず、ｓｃリンカーをコードして単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の生産を可能にする（Hustonら、1988 PNAS 85、5879-5883）。ＮｏｔＪｋ／ｌＦＯＲプライマーはそれらのそれぞれの初期プライマーと交雑するのみならず、ＮｏｔＩ制限部位を含む。これらのプライマーは表１にさらにまとめられる。アセンブリは２つの段階で実行される。まず、Ｖ遺伝子（重鎖および軽鎖）がオリゴタクレオチドの新しいセットを用いて配列決定鋳型から増幅された。ＰＣＲ混合物は上述のようにして作られたが、使用されたプライマーは前の配列決定によって同定される関連のＶ遺伝子族およびＪ領域プライマーのみであった。鋳型は１００ｎｇのｓｓＤＮＡ配列決定鋳型であった。ＰＣＲの条件は、１０サイクルの増幅で、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７４℃で１分間であった。ＰＣＲの完了時に、さらなるｄＮＴＰ（５μｌの２．５ｍＭ原液）がクレノウ（Klenow）ポリメラーゼ（Boehringer、2.5ユニット）とともに添加され、その後平滑末端を生成するために２０℃で１５分間インキュベートされた。このステップの後、生成物は上述のようにゲル精製され、２５μｌの水中で再懸濁された。この後、重鎖生産物からの５μｌと軽鎖生産物からの５μｌとがアセンブリに用いられた。このプロセスでは、ＰＣＲ反応は２つのステップで実行された。まず、プライマーは添加されず、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７４℃で１分間のサイクルが７サイクルで用いられて重鎖および軽鎖を連結した。上述の第２のＰＣＲの間に、重鎖および軽鎖は単鎖リンカーをコードするプライマーとともにタグ（Ｔａｇ）を付けられる。このタグは、互いに相補的な重鎖および軽鎖の各々に１５のヌクレオチドを含み、それらを互いにアニールさせることができる。延長反応の間に、全長が連結されたｓｃＦｖ分子が形成される。これらの７サイクルの終わりで、温度は９４℃で３分間維持され、関連の外側プライマー（ＳｆｉＶＨＢＡＣＫ／ＮｏｔＪＦＯＲ）が「通過（pull-through）」増幅のために添加される。この増幅は９４℃で１分間、７４℃で２分間の１０サイクルからなり、形成された少量の連結された生産物を増幅する働きをする。
発現のためのクローン化ならびにｓｃＦｖの発現および精製
アセンブリの後、ｓｃＦｖは記載されるようにＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで消化され（Marksら、1992）、ｐＵＣ１１９に基づいて（VieiraおよびMessing、1987）ｓｃＦｖ発現ベクター（Hawkinsら、1992 J.Mol.Biol.226、889-896）にクローン化された。金属アフィニティークロマトグラフィーを用いての精製を可能にする、ヘキサヒスチジンタグによって置換されたＭｙｃタグを有する新しい発現ベクターｐＲＨ２が作られた。これは突然変異誘発に向けられる反転ＰＣＲ部位によって作られた（Hemsleyら、1989 Nucl.Acids Res.17、6545-6551）。このベクターは図２に示される（配列ＩＤ番号５９−６２）。
全長ｓｃＦｖの発現をチェックするために、個々のコロニーが取られ、３０℃で１ｍｌ  ２ｘＴＹ／０．１％グルコース／１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）中で恒常的に振とうする状態で４時間増殖させられた。この段階でＩＰＴＧが１ｍＭの最終濃度で添加され、振とうは１８時間継続された。５分間のマイクロ遠心分離機における１３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって上清が採収された。細菌ペレットがプラスミドＤＮＡの調製のために−２０℃で凍結され、上清は９Ｅ１０抗Ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロッティング法によって分析された（Wardら、1989 Nature 341、544-546）。この後プラスミドＤＮＡはコロニーの細菌ペレットから調製され、全長ｓｃＦｖを発現することが示された。このプラスミド調製物から、ｓｃＦｖはＳｆｉＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＲＨ２にサブクローン化された。１リットルの細菌培養物が恒常的な振とうでもって、２ｘＴＹ／０．１％グルコース／１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２リットルのフラスコで、３０℃において、０．９のＡ６００ｎｍまで増殖させられた。この段階で、ＩＰＴＧが１ｍＭの最終濃度で添加され、インキュベーションはさらに４時間継続された。この後細菌は遠心分離によってペレット化され、周辺質のフラクションが、スカーラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら（1991 Bio/Technology 9、273-278）により記載されるようにして調製された。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントはヘキサヒスチジンタグ（標識）を利用して周辺質のフラクションから精製された。この方法はスカーラらによって記載される方法に基づく（Skerraら、上記を引用）が、６つのヒスチジンおよびニッケルの使用のほうが５つのヒスチジンおよび亜鉛よりもむしろ好ましいことがわかった（データは示さず）。１リットル培養物からの周辺質調製物が、製造業者の指示に基づいてニッケルイオンと前もって結合されたキレート化セファロースファストフロー（Chelating Sepharose Fast Flow）（ファーマシア）の１ｍｌカラムにかけられた。カラムはこの後１０ｍｌのＰＢＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄され、続いて５ｍｌ  ＰＢＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ／７５ｍＭ  イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ｐＨ７．２）で洗浄された。保持されたｓｃＦｖはこの後５ｍｌ  ＰＢＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ／３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．２）で溶離され、１ｍｌフラクションとして捕集された。ピークタンパク質フラクションはＡ２８０ｎｍを測定することによって同定され、これらはこの後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析前にＰＢＳに対して透析された。
濾胞性リンパ腫および正常なリンパ節からのＶ遺伝子のＰＣＲ、クローン化および配列決定
生検試料のＤＮＡからのＰＣＲ増幅は、患者番号５番からのラムダ軽鎖を別にして、すべての例において成功した。各患者からの多数のクローンが配列決定された。反応性リンパ節および正常な脾臓由来の配列の分析から、反復配列は全くないことが明らかにされた。腫瘍を有するリンパ節の各々からは、単一の反復配列があった。配列決定結果をまとめたものが表２に示される。反復配列の中で、ＰＣＲエラーから生じたと推定される２つまでの塩基の変化があった。しかしながら、コンセンサス配列は容易にはっきりとなり、各例においてこのコンセンサス配列を有するクローンが存在した。この配列を確認するために、第２の独立した増幅が行なわれ、さらなるＶ遺伝子が配列決定された。同じコンセンサス配列が同定された。反復Ｖ遺伝子配列はクローン伸長を示唆し、したがって腫瘍Ｖ遺伝子を明らかにする。ここで分析された５つの腫瘍生検のうち３つに関して、ヘテロハイブリドーマが利用可能であった。ＰＣＲ増幅、クローン化および配列決定はリンパ節から直接同定される配列を確認した。
腫瘍に由来するＶ遺伝子の絶対百分率にはばらつきがあり、これにはいくつかの理由がある。第１に、生検は（ここで検査されるすべての例では悪性腫瘍Ｐ細胞は存在する全細胞の＞５０％を構成するが、）腫瘍侵入の度合においてばらつきがある。第２に、プライマーは任意の特定の遺伝子を増幅する有効性においてばらつきがあり、極端な例では患者４のラムダ軽鎖の場合のように鎖は全く増幅されないかもしれない。第３に、いくつかの偽遺伝子がこれらのプライマーによって増幅される可能性があり、このことは腫瘍由来のＶ遺伝子の全体の百分率を下げるかもしれない。
アセンブリ、発現および精製
ＰＣＲアセンブリの使用はＶ遺伝子を内的部位で切断するかもしれない複数の制限酵素の使用を回避する。ここで用いられるこのプロセスは有効なようであり、リンカーフラグメントの別々の調製を必要としない（Clacksonら、1991 Nature 352、624-628）。アセンブリプロセスをチェックするために、連結された生産物はＭｙｃタグを含む発現ベクターにクローン化された（図２）。ランダムに取られたクローンが既に記載されたように増殖させられ誘導された（HawkinsおよびWinter、1992）、Ｍｙｃタグに対してモノクロナール抗体９Ｅ１０を用いたウエスタンブロッティング法（Wardら、1989）は、クローンの８０％が正しく発現されたことを示した。精製を容易にするために、ｓｃＦｖフラグメントはヘキサヒスチジンタグを含む発現ベクターｐＲＨ２にサブクローン化された。患者５からのクローンが、周辺質から精製されたｓｃＦｖフラグメント１Ｌ容量中で成長させられた。収率は、１ｍｇ／ｍｌ溶液に対して１．４のＡ２８０ｎｍに基づき０．５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００と推定された。
例２−融合タンパク質の構成
プラスミドの構成
中間プラスミドｐｅｎｖＢａｍ／Ｃｌａを生成するために、ｐＣＲＩＰ（O.Danos,Danos & Mulligan 1988 PNAS 85,6460-6464からの寄贈）からのＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ  ｅｎｖフラグメント（nt6537-7674、Shinnick他、1981 Nature 293,543-548からのnt番号付け）をｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ）（R.Mulligan,Cepko他、1984 Cell 37,1053-1062からの寄贈）のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩバックボーンフラグメントにクローン化した。
成熟ＭｏＭＬＶｅｎｖポリペプチドにおいてリーダーペプチド配列を超えて（Ｎ−末端から）６番目および７番目のアミノ酸に対応するコドンの間にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を導入した。オリゴヌクレオチド対ｅｎｖＮｏｔｒｅｖ（５′−ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＡＴＣ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＮｏｔＩ部位をコードする３３ｎｔ５′オーバーハングとともにＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ  ｎｔｓ５８９４−５９１４に相補的なもの、およびｅｎｖＳｆｉｆｏｒの５′テールに相補的な２１ｎｔ）およびｅｎｖｓｅｑ７（５′−ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  Ｃ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ  ｎｔｓ６５８１−６６００の逆相補体）を、ｅｎｖコドン６の７３９ｂｐフラグメント下流の（プラスミドｐＣＲＩＰからの）最初の増幅に用いた。第２のオリゴヌクレオチド対、ｅｎｖＳｆｉｆｏｒ（５′−ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳｆｉＩ部位をコードする３６ｎｔ５′オーバーハングとともにＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ  ｎｔｓ５８７３−５８９３の逆相補体、およびｅｎｖＮｏｔｒｅｖの５′テールに相補的な２１ｎｔ）およびｒｅｖＭＬＶｐｏｌ（５′−ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＣＣ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＭｏＭＬＶ  ｐｏｌ  ｎｔｓ５２７７−５２４９に相補的なもの）を、ｅｎｖコドン７の７０２ｂｐフラグメント上流の（ｐＣＲＩＰからの）最初の増幅に用いた。Ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて増幅を行ない、反応物を９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１分間のＰＣＲサイクルに１５サイクルさらした。７０２および７３９ｂｐのゲル精製されたＰＣＲ生成物の相補的な２１ｎｔテールによりＰＣＲ連鎖が可能となり、所望の位置にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を組込むｅｎｖ遺伝子フラグメントを生成した。２つのフラグメントを混合し、ＰＣＲサイクル（９４℃で１分間、４０℃で１分間、７２℃で２分間）に３回さらし、その後オリゴヌクレオチドｅｎｖｓｅｑ７およびＢｇｌｅｎｖｒｅｖ（５′−ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＧＴ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＢｇｌＩＩ制限部位を組込む５′テールとともにＭｏＭＬＶ  ｐｏｌヌクレオチド５７６６−５７８５に相補的なもの）を添加してからさらなる増幅サイクル（９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間）に１７回さらした。生成物の９０５ｂｐフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、順方向の配向でｐｅｎｖＢａｍ／ＣｌａのＢａｍＨＩ部位（上を参照）にクローン化すると、プラスミドｐＳｆｉ／Ｎｏｔｅｎｖが得られた。このプラスミドの正しいアセンブリを、制限分析およびジデオキシ配列決定法（Sanger他，1977 PNAS 74,5463-5467）によって確認した。その後、機能的Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体を、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしての原核発現ベクター（Hawkins他，1992 J.Mol,Biol.226,889-896���からｐＳｆｉ／Ｎｏｔ．ＥｎｖのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位にサブクローン化し、プラスミドｐＮＩＰ．ｅｎｖを生成した（図３）。ｐＮＩＰｅｎｖの結合部の配列は、図４に示されている（配列ＩＤ  Ｎｏ．６３−６６、ヌクレオチド配列の翻訳を含む）。
最後に、修飾されたレトロウィルスエンベロープ発現カセットをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして修飾されたｐＳＶ２Ｎｅｏプラスミド（Ashok Venkitaraman,MRC Centre,Cambridge）からの寄贈）にサブクローン化し、プラスミドｐＳＶＮＩＰｅｎｖを生成した（図４）。
細胞のトランスフェクシン
ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞およびエコトロピックなレトロウィルスパッケージ細胞系ｐｓｉ２（Mann他，1983 Cell 33,153-159）を、６０μｇ／ｍｌのベンジルペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳにおいて３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で維持した。単層を破壊するためにトリプシンなしのＥＤＴＡを用いてこれらの細胞を毎週１回ずつ２回にわたって再プレート培養した。
リン酸カルシウムの沈澱により、プラスミドｐＮＩＰｅｎｖを（ｐＤＣｎｅｏ、ネオマイシン耐性マーカーを含むプラスミドで）ｐｓｉ２細胞にトランスフェクトした。簡単にいうと、２×１０5個の細胞を９０ｍｍの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）に置き、一晩培養し、洗浄して、１０ｍｌの新しい培地を与えた。１０μｌのプラスミドＤＮＡと５０μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ2（０．２μｍでろ過処理済）とを、４００μｌの体積になるまで滅菌した水で希釈した。ＣａＣｌ2／ＤＮＡ混合物を同じ体積の０．２μｍでろ過処理済の２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（２８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4．２−Ｈ2Ｏ、１２ｍＭのデキストロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨを０．５ＮのＮａＯＨで７．０５に調製した）に１滴ずつ加え、室温で２０分間放置した。１６時間培養し、洗浄し、再び培地を与えた細胞に、トランスフェクション溶液（８００ｍｌ）を添加した。２４時間後にＧ４１８選別（１ｍｇ／ｍｌ）を開始し、約２週間継続した。
表面Ｂ１．８一本鎖抗体を発現するトランスフェクトされたコロニーを、ＮＩＰ．ＢＳＡ被覆ビーズを用いたパンニング（panning）によって同定した。簡単にいうと、トシル活性化常磁性ビーズ（Dynal,Oslo,Norway、製品番号14004）を、ＮＩＰ１０．ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン分子の各々に結合された約１０個のＮＩＰ−カプロエート−Ｏ−スクイシンイミド分子、Hawkins他，1992）で被覆し、ＰＢＳ中で広範囲に洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳでブロックした。５０にのぼるＧ４１８耐性ｐｓｉ２コロニーを含む９０ｍｍの組織培養プレートを４０℃で１時間静かに振とうし、その後５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳにおいて２×１０7個（５０μｌ）のビーズを加え室温で１時間振とうした。ＰＢＳ中で５回洗浄すると、陽性コロニー（常磁性ビーズで高度に被覆されている）は簡単に同定され、それを個々に移して細胞上清のさらなる増殖、凍結保存および採収を行なった。
したがって、抗体の特異性が細胞表面に提示され、ゆえに抗体が折り畳まれることがわかった。
可溶性タンパク質発現ベクターの構成
可溶性発現ベクターを形成するために、抗体遺伝子とＭｏＭＬＶエンベロープ遺伝子の３′部分との間にストップコドンとフレームシフト変異とを挿入した。Ｂ１．８ｓｃＦｖフラグメントを、ＳｆｉＶＨＢＡＫ（５′−ＴＡＣ  ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＴＳＭ  ＡＲＣ  ＴＧＣ  ＡＧＳ  ＡＧＴ  Ｃ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５４）とストップコドンおよびＮｏｔＩ部位のフレームシフト５′を生成するためのヌクレオチド挿入物をコードする前進プライマＮｏｔ．ＳＴＯＰ（５′−ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  Ｃ−３′、配列ＩＤ  Ｎｏ．５５）とを用いてＰＣＲで増幅した（９４℃で１分間、５５℃で１分間、７４℃で１分間を１０サイクル）。その後、このフラグメントをＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＳｆｉ／Ｎｏｔ．Ｅｎｖにクローン化し、プラスミドｐＮＩＰｓｔｏｐを形成した（図４）。Ｂ１．８ｓｃＦｖを、ＢＣＬ１マウスリンパ腫からＰＣＲによりクローン化されたコントロールｓｃＦｖ遺伝子と置き換えることによって、ｐＳＶＮＩＰｅｎｖからプラスミドｐＳＶＢＣＬｅｎｖ（図４）を誘導した。ＶＨおよびＶλ遺伝子をＰＣＲによりクローン化し、標準的なプロトコルを用いて、ＢＣＬから誘導されたＤＮＡから組立てた。
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１（Gibson,1984）において増幅し、アルカリ溶解によって抽出し、商標プロネガ・マジック・マクシプレップス（Promega Magic Maxipreps）ＤＮＡ精製システム（Promega,Madison,WI,USA）を用いてカラム精製した。ＤＮＡを水において溶離した。プラスミド調製物の純度を、アガロースゲル電気泳動によって、およびＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比（いずれの場合もこの比は１．７を上回った）を測定することによって確認した。精製されたプラスミドを−２０℃で貯蔵した。プラスミドを、用いる前に、２００ｍＭのＮａＣｌ中１６０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。
Ｂ１．８ｓｃＦｖタンパク質の調製
バクテリア発現のため、Ｂ１．８ｓｃＦｖ遺伝子をＰｓｔＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてベクターｐＲＨ２にクローン化した。フラグメントは、６つのヒスチジンの尾部をｓｃＦｖのＣ−末端に結合し、逆ＰＣＲ突然変異誘発によって誘導されたものである。このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１に形質転換し、ｓｃＦｖタンパク質を発現させ、上述のようにＮＰ−セファロースカラムで精製した（HawkinsおよびWinter,1922 Eur.J.Immunol.22,867-870）。精製されたタンパク質は、上述のＥＬＩＳＡ（HawkinsおよびWinter,1992）を用いてＮＩＰ−ＢＳＡに強く結合したことが示されている。陰性のコントロールｓｃＦｖＤ１．３（Hawkins他,1992）を発現ベクターｐＲＨ２にクローン化し、発現させ、その後Hawkins他によって示されるようなリゾチームカラム（1992、上で引用）で精製した。
予防接種プロトコル
１０週間のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作のために用いた。免疫感作前の血液試料は、尻尾から採血することによって得たものである。この血液をマイクロ遠心分離機において２分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を分離した。その後、この血清を−２０℃で貯蔵し、その後アッセイを行なった。２つのグループのマウスを、何匹かをＤＮＡで、何匹かをタンパク質で免疫処置した。これらの２つのグループのマウスの免疫処置法は以下のとおりである。
ａ）  タンパク質ワクチン：Ｂ１．８ｓｃＦｖタンパク質をＰＢＳ中２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、同じ体積のＣＦＡと混合した。マウスの２つの別々の部位にこのワクチン１００ｍｌ（１２．５μｇのｓｃＦｖ）を皮下注射した。２週間後と４週間後とに同じ追加免疫を投与した。最後の追加免疫の十日後に、尻尾から２００μｌの採血を行なった。その血液サンプルを上述のように処理した。
ｂ）  ＤＮＡワクチン：５０μｌ（８μｇ）のＤＮＡを用いて、１つのグループが３匹のマウスからなる２つのグループのマウスに、両脇腹に皮下（ｓｃ）経路で、または筋内（ｉｍ）経路で（右および左の四頭筋、各マウスの関する全ＤＮＡは１６μｇである）免疫性のテストをした。１週間おきに２回同一の追加免疫接種を行なった。最初の免疫性テスト、２回目の免疫性テスト、および３回目の免疫性テストの直前と、最後の追加免疫の１週間後とに尻尾から２００μｌの採血を行なった。血清を分離し上述のように貯蔵した。
免疫応答の分析
フレキシブルな９６ウェルアッセイプレート（Falcon 3912 MicroTest III）で底部が平坦になった個々のウェルを、室温で一晩ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌのＢ１．８．Ｈｉｓまたはコントロール（Ｄ１．３．Ｈｉｓ抗リゾチーム）ｓｃＦｖタンパク質で被覆した。ヒスチジン標識（タグ）を付けられたｓｃＦｖを用いてプレートを被覆すると、より多くのタンパク質がその抗原結合能を保持することが発見された。プレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、３７℃で２時間ＰＢＳ中３％のＢＳＡでブロックし、ＰＢＳ中で３回洗浄した。テスト血清を添加し（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中１：１００または１：１０００に希釈）、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、１：１０００の希釈で第２層ＨＲＰ−結合ポリクローンヤギ抗マウスＦｃ抗体（Sigma,cat.no.A0168）を用いて室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中で４回洗浄し、ＡＢＴＳで展開し、３０分後に商標テルモマックス（Thermomax）マイクロプレートリーダー（Molecular devices,Menlo Park,USA）を用いてＡ４０５ｎｍを測定した。
結果
タンパク質ワクチンに対する免疫応答
最初は、マウスにＣＦＡにおけるｓｃＦｖネズミ抗体で免疫性のテストを行なう際に、マウスに効果的な抗イディオタイプ体液性免疫応答が得られるかどうかを確証しようとする努力がなされた。６匹のマウスに、ＣＦＡ中２５μｇのＢ１．８抗ＮＩＰｓｃＦｖを皮下注射し、２週間後と４週間後とに追加免疫を行なった。最後の接種の１０日後に、これらの動物からの血清は、１：１００の血清希釈において陽性のＥＬＩＳＡシグナルを示すのには不十分な抗Ｂ１．８抗体を含んでいた。
ＤＮＡワクチンに対する免疫応答
プラスミドｐＮＩＰｅｎｖ（図３、構成の詳細に関する材料および方法参照）は、Ｎ−末端から６つのアミノ酸を挿入したｓｃＦｖ抗ＮＩＰ抗体フラグメント（Ｋｄ  ４×１０-8Ｍ）とともにエコトロピックＭｏＭＬＶエンベロープポリペプチドＰｒ８０ｅｎｖから構成されるキメラ融合タンパク質をコードする。３３アミノ酸ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖリーダー配列が、リーダー開裂部位が破壊されることなく保持される。ｓｃＦｖは、ＭｏＭＬＶエンベロープタンパク質からの６つのＮ−末端アミノ酸だけではなく、Ｎ−末端に残存するｐｅｌＢリーダーに由来する６つのアミノ酸をさらに有する。発現は、５′ＭｏＭＬＶロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）においてプロモータ／エンハンサー配列から駆動される。３′ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲによって、ポリアデニル化シグナル配列が得られる。ｐＮＩＰｅｎｖは、マウスの繊維芽細胞（上で説明した）にトランスフェクトされると、ＭｏＭＬＶｅｎｖタンパク質と融合した機能的Ｂ１．８ｓｃＦｖが細胞表面で安定して発現することが発見された。
２００ｍＭのＮａＣｌ中１６μｇのｐＳＶＮＩＰｅｎｖをマウスに皮下経路（３匹のマウス）または筋内経路（３匹のマウス）で注射し、１週間後と２週間後とに追加免疫を行なった。コントロールマウスにｐＳＶＢＣＬｅｎｖでワクチン注射をした。ワクチン注射の前と、追加免疫の前と、ワクチン注射の１週間後とに、ＥＬＩＳＡによって血清サンプルのＢ１．８ｓｃＦｖに対する体液性応答をテストした。２回目の追加免疫の前に、ｐＳＶＮＩＰｅｎｖでワクチン注射された６匹のマウスのうちの３匹、すなわち筋内経路で接種された２匹のマウス、および皮下経路で接種された１匹のマウスにおいて、１：１００の血清希釈において抗Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体が検出された。２回目の追加免疫の１週間後、６匹のマウスすべてに関して、Ｄ１．３ｓｃＦｖと交差反応しない抗Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体を容易に検出できた。コントロールであるｐＢＣＬｅｎｖでワクチン接種されたマウスからの血清は、抗Ｂ１．８ＥＬＩＳＡにおいて陰性のままであった。
ＤＮＡワクチン後のタンパク質ワクチンに対する既往症反応
８週間後に、ｐＳＶＮＩＰｅｎｖで免疫処置されたマウスの抗Ｂ１．８抗体の力価が低下した。この時点で、最初にｐＮＩＰｅｎｖを筋内注射した３匹のマウスに、ＰＢＳ中２０μｇの精製されたＢ１．８ｓｃＦｖを皮下注射した。５日後、これらのマウスからの血清における抗Ｂ１．８抗体の力価はかなり増加しており、平均上昇率は１２倍で、すべてのマウスの抗体は１：１０００希釈で明らかに検出できた。
可溶性ｓｃＦｖ発現ベクター（ｐＮＩＰｓｔｏｐ）を用いた二次免疫
可溶性タンパク質発現ベクターで二次免疫注射しても抗体の力価が増加するかどうかをテストするために、マウスにｐＮＩＰｓｔｏｐを接種した。最初の免疫処置の１０週間後に、ｐＮＩＰｅｎｖを用いて皮下経路で免疫処置した３匹のマウスに、２００ｍＭのＮａＣｌ中８μｇを皮下経路で、８μｇを筋内経路で接種した。追加免疫の５日後に、テスト血液を取出し抗体活性について検定した。血清の力価は平均で１０倍増加しており、それらはこの場合もすべて１：１０００希釈において陽性であった。
一次免疫応答の発生の際の可溶性ｐＮＩＰｓｔｏｐおよびｐＮＩＰｅｎｖの比較
免疫応答を高めるために融合タンパク質がどれほど重要であるかを示すために、本発明者は、一次免疫応答を刺激する際の２つのベクターの効果を比較するためのコントロール実験を行なった。１つのグループが２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから構成される２つのグループのマウスを以前と同様に用いた。以前と同様に血清は尻尾の採血によって得られ、その後マウスに適切なプラスミドを週に１回ずつ３週間にわたって接種した。免疫処置開始から２８日後に、尻尾の採血により再び血清を取出し、抗Ｂ１．８活性に関して検定した。ｐＮＩＰｅｎｖプラスミドを接種したグループのうち２／２は１：１００希釈において陽性であり、ｐＮＩＰｓｔｏｐを接種したグループのうち２／２は陽性であった。明らかに、免疫応答を刺激するのにｅｎｖタグ（標識）は必要でない。
免疫応答が本来の抗原を認識することの確認
融合されていないＢＣＬ１  ｓｃＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ（ｐＳＶ２−ＢＣＬ１）で４回免疫処置した５匹のマウスからなるグループも、ＥＬＩＳＡにおいてＢＣＬ１  ＩｇＭフラグメントに結合させることによって検出されるように、イディオタイプに対して体液性応答を生じた（図示せず）。さらに、治療に必要な形態の本来の抗原を認識するそれらの能力を明確に示すものとして、ＦＡＣＳ分析によって、これらの抗イディオタイプ抗血清が表面ＢＣＬ１  Ｉｇを有するリンパ腫細胞に結合することが示された。ＢＣＬ１細胞を１：２０希釈の血清で予めインキュベートした後にＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Sigma）で着色し、その後ＦＡＣＳ分析を行なった。実際に、その免疫応答は、ＣＦＡ中のＢＣＬ１  ＩｇＭ抗体についての免疫応答に匹敵するものであった（図１１）。これは、ＢＣＬ１リンパ腫に弱くしか結合しないｐＳＶ２−Ｂ１．８で免疫処置されたマウス由来の抗血清とは対照的であった（図１１）。
例３−ヒト受容体に用いるのに適切なベクターの構成
ベクターの構成
例２に用いた最初のベクターは、モロニー（Moloney）ネズミ白血病ウィルスベクターに基づくものであり、長く伸びる修飾されていないウィルス配列（Russell他,1993 Nucl.Acids Res. 21,1081-1085）を含む。これらのベクターが抗イディオタイプ応答を増加させるのに効果的であることが示されており、接種したマウスに不都合な影響を与えなかった。そのようなベクターがヒトに対して危険であるという証拠はないが、いかなる潜在的なリスクをも防ぐためにベクターを修飾することにした。最初のベクターの２つの特徴、すなわち、レトロウィルスエンベロープ遺伝子（理論的には別のレトロウィルスに再結合され、その親和性を変える可能性があるような）と、パッケージングシグナル（注入したＤＮＡを既存のヒトレトロウィルスにパッケージングし得るような）とに関してはいくらか懸念があった。ベクターを変えながら、ヒトに用いるためのベクターを改良する変化を組込むことにした。すなわち、イディオタイプｓｃＦｖの発現を駆動するために用いたプロモータを、直接ヒト以外の霊長類の筋肉に注射すると発現することがわかっているようなラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターに変えた（Jiao他,1992 Hum.Gene Ther3,21-33）。本発明者は、患者に注射する前に、ベクターのｓｃＦｖ部（その個々の患者に特異的である）の配列決定を促進するｓｓＤＮＡを生産できるようにするため、バクテリアの１本鎖複製オリジンを含むベクターも用いた。用いたベクターは、市販のベクターｐＲｃ／ＲＳＶ（British Biotechnology/Invitrogen）に基づくものである。
このベクターのバックボーンを遺伝子免疫処置に適切なベクターに変えるためには、リーダー配列および終止シグナルを導入し、融合タンパク質の生産ができるようにすることが望ましい。融合タンパク質は抗イディオタイプ応答を得るのに必要であるようには見えないが、免疫応答を高めるための一つの方法としては、適切なタンパク質、おそらくは外来タンパク質またはおそらくはサイトカイン（Tao & Levy,1993 Nature 362,755-758）を付着させることが可能である。融合タンパク質が動物のモデルにおいては必要でなかったため、ヒトの最初のテストでは短いペプチドタグ（標識）しか用いないが、これは将来なされる可能性のあるプロトコルの変更のための１領域にすぎない。
ｐｅｌＢリーダーを、アミノ酸配列を変えずにＳｆｉＩクローニング部位のコード化を可能にするヒト免疫グロブリンＶＨ１リーダー配列と置き換えるよう、ベクターｐＳｆｉ／Ｎｏｔ．Ｔａｇ１を修飾した。これをＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ  Ｉクローニング部位を用いてオリゴヌクレオチドとともに導入し、配列決定方法よって確認した。
その後、これをＥｃｏＲＩ／Ｂｌｕｎｔ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＮｏｔ  Ｉ／Ｂｌｕｎｔ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断ベクターｐＲｃ／ＲＳＶにクローン化し、図５に示されるようなＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位間の配列（配列ＩＤ  Ｎｏ．５６）を得た。個々の患者に関してｓｃＦｖを∧で示される部位に挿入することができる。
その後ベクターを以下に示す２つの方法でテストした。
（ｉ）  ｓｃＦｖ  Ｂ１．８をベクターにクローン化し、その後、結果として得られた構造物を２つの細胞系、すなわちＮＳＯ（骨髄細胞系）およびＮＩＨ３Ｔ３（繊維芽細胞系）にトランスフェクトした。ｐＲｃ／ＲＳＶにおけるネオマイシン耐性遺伝子を用いて、安定した形質転換体を分離し、上清のｓｃＦｖ  Ｂ１．８抗原結合活性を検定した。どちらの場合にも、抗体フラグメントが発現し、ハプテンＮＩＰ、モノクローナル抗体Ｂ１．８によって認識される抗原に結合した。クローンはＮＳＯトランスフェクトされた細胞から分離し、消費された培養上清において１−３ｍｇ／Ｌの機能的ｓｃＦｖを生成することがわかった。
（ii）  プラスミドを遺伝子免疫処置実験において用い、ｐＳＶ２−Ｂ１．８と比較した。それらは同等の結果を示し、Ｎｏｔ  ＩとＸｂａ  Ｉ部位との間のＦｄバクテリオファージ遺伝子８をコードするさらなるベクターよりも優れていると思われる（図６）。これに対する説明として、トランスフェクションの実験において、ｓｃＦｖ  Ｂ１．８−遺伝子８の融合に関する発現のレベルが１０−１００倍低かったということをあげることが可能である。ウィルスタンパク質に対する免疫応答を高めるために遺伝子免疫処置を用いると発現のレベルと免疫応答との間に強い相関関係があることが他の研究者により発見されている（G.Rhodes,personal communication）。したがって、抗イディオタイプ免疫応答を高めるには短いペプチドタグ（標識）で十分であるように思われ、本発明者のテストにおいてもそのようなペプチドタグ（標識）を用いようと考えている。このタグは、細胞培養における発現に関するテストにも有用であろう。現在まで用いられているタグ（標識）はウィルス由来またはヒト由来のいずれかであり、それらが不可欠なものであってそれらの間に確かに違いがないことは明らかではない。起こり得るいかなる危険をも防ぐために、インビトロでの発現を検出するのに有用であろうと思われるため、ストレプトアビジンを結合するように誘導された合成標識を用いる（Schmidt & Skerra,1993 Protein Engineering 6,109-122）。上述のように、これは、必要であればサイトカイン等の他のタンパク質を含むように容易に変更できる１つの特徴である。
図６（ＲＳＶプロモータを用いたベクターによるマウスの免疫処置）は、ｓｃＦｖ  Ｂ１．８に対するイディオタイプ免疫処置の結果を示している。個々のマウスの応答を１：１００の血清希釈においてＥＬＩＳＡにより判断したものを示している。０週目、１週目、および２週目にマウスに筋内経路で免疫処置を行なった。ストップベクター（ｐＳＶ２−Ｂ１．８）で免疫処置を行なった１匹のマウスの応答は乏しく、遺伝子８融合ベクターで免疫処置を行なったマウスの応答も乏しく（ＶＩＩＩ１およびＶＩＩＩ２）、一方、ペプチドタグ（標識）で免疫処置を行なったマウスの応答はともに優れたものであった（Ｔａｇ１およびＴａｇ２）ことに注目されたい。
最終ベクターｐＶＡＣ１の配列（配列ＩＤ  Ｎｏ．５８）を図７に示しており、それとともにその独自の制限部位の地図を示している（図８）。図７の小文字で示した配列は、図５に示した配列Ｌから２つのストップコドンまでに対応する。ベクターｐＶＡＣ１は本発明者（the Cambridge Centre for Protein Engineering,Cambridge,United Kingdom）から入手可能である。
図９は、ベクターｐＶＡＣ１を示しており、重要な制限部位と重要な遺伝子とを示している。
図１０は、（ＤＮＡの直接の注入によって）Ｂ１．８ｓｃｆｖを発現するｐＶＡＣベクター（ｐＶＡＣ１．Ｂ１−８）で免疫処置を行なったオスおよびメスのマウスに関する時間対Ｏ．Ｄ．（４０５ｎｍ）のグラフである。このグラフは、個々のマウスに関して、免疫処置を行なった後に明らかに力価が増加したことを示している。
ネオマイシン耐性遺伝子はインビトロでのテストに有用であるが、ヒトの免疫処置には必要でない。ネオマイシン耐性遺伝子を駆動するのに用いられるＳＶ４０プロモーターも、他の強いプロモーターと同じ危険性を伴っている。したがって、ヒトにおけるテストのために用いるべきプラスミドでは、ＳｆｉＩ／Ｂｓｔ  ＢＩで消化した後、連結反応を行なうことによってネオマイシン遺伝子を欠失させる。これにより、いかなるそのような危険性をも防ぐことができる。
議論
本発明者は、１本鎖ネズミ抗体／レトロウィルスエンベロープ融合タンパク質をコードするプラスミドワクチンがＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗体成分に対して強い体液性免疫応答を引起こし、完全フロイントアジュバントと混合した精製されたｓｃＦｖタンパク質でワクチン接種を行なっても検出可能な応答が得られないことを示している。可溶性タンパク質または可溶性ｓｃＦｖ発現ベクターで追加免疫を行なう際に生じると思われるＢ細胞メモリーの誘導は、抗体の力価を急速に上昇させるのに効果的であった。
プラスミドワクチンによってコードされるタンパク質に対して体液性免疫応答があれば、細胞による摂取とプラスミドの発現とがインビボで起こったはずであるということを意味している。筋肉に直接接種された遺伝子の発現に関しては以前に論証されているが（上で引用したWolff他,1990）、本発明者の知る限りでは、これはそのままのＤＮＡを直接注入した後の自己または変更した自己のポリペプチドに対する免疫応答に関する最初の証拠である。ＤＮＡを金粒子の上に被覆し粒子銃によって組織に入れると、細胞摂取および遺伝子の発現が増加する（以前に引用したTang他,1992）。さらに関連する遺伝子導入法には、ウィルスベクターを用いること、ＤＮＡをリポソーム内にカプセル化すること、およびＤＮＡを陽イオンリポソームまたはウィルスの外側に結合することが含まれる（Miller,1992 Nature 357,45-46参照）。これらの方法には、転移の効率がよくなるという利点があるが、精製されたプラスミドＤＮＡの直接の注入と比較すると、これらの代替的なアプローチはいくぶん複雑であり安全面に関する問題がより大きくなる。
プラスミドワクチンｐＮＩＰｅｎｖに対する体液性抗Ｂ１．８応答は、完全フロイントアジュバントと混合した精製されたＢ１．８ｓｃＦｖタンパク質に対して増加したものよりも明らかに優れていた。ここに開示したアプローチにはいくつかの利点がある。遺伝子導入の後、おそらく標的抗原が絶えず供給され、何日間または何週間にわたって減少し、注入されたタンパク質の半減期は非常に短くなるかもしれない。プラスミドワクチンを用いると、Ｂ１．８ｓｃＦｖは少なくとも部分的に細胞表面に固定され、おそらくオリゴマーｅｎｖタンパク質構造に組込まれるであろう。ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖの２つの成分（ｐ１５ＴＭおよびｇｐ７０ＳＵ）間の結合はその大部分が疎水的相互作用によって安定化され、ｇｐ７０ＳＵをｐ１５ＴＭから解離することができる。したがって、遺伝子導入の後、融合タンパク質は、オリゴマー多価（１細胞当たり複数のコピー）細胞結合抗原として、または可溶性抗原として免疫系に提示される。このように新しく合成された抗原に長い間さらすことは、最適な免疫応答を得るのに重要であり、この議論は死滅したウィルスワクチンと比べて生きたウィルスワクチンのほうが優れていることを説明するのに用いられてきた。
抗原特異的Ｔヘルパー細胞は、直接的な細胞相互作用によって、および適切な刺激サイトカインを与えることによって体液性免疫応答および細胞免疫応答を増幅することができる。プラスミドワクチンがより効率的にヘルパーＴ細胞を回復し得るいくつかの機構を考えることができるが、そのうちの１つに特に言及する価値がある。抗原特異的Ｔヘルパー細胞の活性化および増殖は、Ｂリンパ球、マクロファージおよび他の抗原を与える細胞の表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドによって引起こされる。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、接種された抗原から得られる。Ｂ１．８ｓｃＦｖにおいて特異的にエピトープを認識するＢ細胞は、抗原を取入れ、ペプチドを生成して表面で提示するように処理する。Ｂ１．８ｓｃＦｖをウィルスエンベロープタンパク質に融合すると、いかなるＢ１．８特異的Ｂ細胞も、ヘルパーＴ細胞を回復できるペプチド（その多くは免疫原性の高いｅｎｖタンパク質から得られる）を生成するための余地をより多く有するであろう。そのようなアプローチに関しては免疫原性の弱いＢ１．８に対するＴ細胞記憶が向上せず、その結果既往症免疫が弱いまたはそれがない体液性免疫応答しか得られないかもしれないということが懸念される。しかしながら、これは、皮下経路で与えられる可溶性ｓｃＢ１．８Ｆｖタンパク質および抗体の力価を急速に上昇させたプラスミド、ｐＮＩＰｓｔｏｐ可溶性発現ベクターと同様に問題ではなかった。
細胞障害性Ｔ細胞は、腫瘍およびウィルスに対する細胞媒介免疫において重要である可能性があり（GreenburgおよびRiddell,1992 J.Natl.Cancer Inst. 84,1059-1061参照）、ここでも、この研究において用いたタンパク質ベースのワクチンとプラスミドワクチンとの間に潜在的に重要な違いがある。ＭＨＣクラス１陽性形質導入細胞は、種々の形態で融合タンパク質を発現させる（上を参照）だけではなく、細胞障害性Ｔリンパ球によって認識できる範囲のＢ１．８ｓｃＦｖおよび／またはｅｎｖ由来のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを提示する。これは、効果的な抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激するのに役立つはずである。
必要な機構にかかわらず、この研究に用いるワクチン接種戦略により、免疫原性の低い１本鎖抗体フラグメントに対する強い体液性免疫応答が得られ、この戦略は精製されたタンパク質にアジュバントを加えたものでワクチン接種するよりも優れていた。この研究に用いたｓｃＦｖ遺伝子を、免疫原性の低い自己または変更した自己のタンパク質をコードする種々の遺伝子または遺伝子フラグメントと置き換えることもできる。そのような治療のための最初の適切な標的抗原は、独自の細胞表面免疫グロブリンならびにあるＢ細胞およびＴ細胞悪性腫瘍によって発現されるＴ細胞レセプターに対する患者に特定のワクチンである。細胞表面免疫グロブリン陽性ヒトＢ細胞リンパ腫組織からの抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子の急速なＰＣＲクローニングおよびアセンブリは既に論証されている。１本鎖Ｔ細胞レセプターもクローン化されかつ発現されており（Soo Hoo他，1992 PNAS 89,4759-4763）、そのため、原則としては、そのようなアプローチもＴ細胞悪性腫瘍に適用できるであろう。Ｔ細胞およびおそらくＢ細胞のレセプターの用途が多発性硬化症、リューマチ様関節炎等の自己免疫疾患に制限されることが確認されれば、悪性でない疾患にもそのようなアプローチを用いることが可能であるかもしれない（Marguerie他,1992 Immunol.Today 13,336-338参照）。そうすれば、細胞内ＰＣＲアセンブリ（Embleton他,1992 Nucl.Acids Res. 20, 3831-3837）を用いて、Ｂ／Ｔ細胞レセプターにおけるオリゴクローンの使用を確認し、したがって適切なワクチンを生成することが可能であるかもしれない。このアプローチはまた、ＨＩＶ−１、インフルエンザウィルス等の可変性の大きいウィルスに対する株特異的ワクチンをすみやかに生成するためにも有用であろう。
抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答の生成はこのアプローチを用いれば理論的に可能であるはずであり、これから研究を続けていくための課題でもある。このことが可能であることが証明されれば、さらなる用途も考えられる。ますます、成長調節タンパク質は突然変異された形で、または悪性細胞における融合タンパク質（トランスロケーションの結果生じる）として発見されている（UrbanおよびSchreiber,1992 Ann.Rev.Immunol. 10,617-644参照）。そのような異常な細胞内タンパク質は、細胞障害性Ｔ細胞に対して潜在的に腫瘍特異的な標的である（GreenburgおよびRiddell,1992、上で引用）。いずれかの個々の腫瘍において影響を受けている１つ以上のガン遺伝子を有する変化のスペクトルがしばしば発見される。したがって、突然変異遺伝子のＰＣＲクローニングおよびここに示すようなベクターの使用は、個々の患者ごとに腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を発生させる実用的な方法であり得る。
ここに記載した構造物に対する改良例がいくつか可能である。この研究ではＭｏＭＬＶ  ｅｎｖタンパク質との融合を用いたが、他の免疫原性タンパク質を融合相手として置き換えることも可能である。他の包み込まれたウィルスおよび免疫原性細胞表面の被覆タンパク質、またはいかなる病原性生物もしくはヒト以外の種から得られる分泌タンパク質も適切な代替物として可能である。実際には、融合タンパク質の免疫原性の高い部分が最終的に真の（免疫原性の低い）標的抗原に対するいかなる応答をも圧倒し得るという免疫応答の理論的な問題を解消するのに役立つよう、いくつかの抗原融合相手を用いることが重要である。
ワクチン接種の遺伝子的アプローチにおける１つの利点は、このアプローチにより抗原を提示する本来の方法を効率的に用いることが潜在的に可能であり、これが広範囲のエフェクター系を保証するはずであることである。さらに、得られる応答を操作したり向上させたりすることが比較的容易であるはずであり、たとえば、免疫原とともに同時的刺激活性を用いて分子を発現させることによってＴ細胞に抗原をより効率的に与えることが可能である。同時的刺激に伴う１つの重要な分子はＢ７であり、これはＴ細胞によって発現されるＣＤ２８と相互作用し、それによってＴ細胞活性化のための補助信号を与える（Galvin他,1992 J.Immunol.12,3802-3808）。Ｂ７およびイディオタイプＩｇを発現させる新しいベクターが構成されるであろう。マウスおよびヒトのＢ７の配列が公表されており（Freeman他,1989 J.Immunol.8,2714-2722）、遺伝子はＰＣＲによってクローン化される。その後、イディオタイプ配列を発現させる本発明者のベクターに発現カセットを挿入する。
抗原をより効果的に与えることができるようにするための多数のサイトカインが既知であり、サイトカイン遺伝子を含む発現ベクターを直接的に配達することによりワクチンの効力を高めることができるであろう。インターフェロンガンマは、ＭＨＣ発現が増加するように調節するその特性のため有用であろう一例である（Gaczynska他，1993 Nature 365,264-267）。遺伝子は別々のベクターにおいてコードされることが可能であり、その量をベクターに応じて変えることが可能である。
ＥＢＶまたはパポーバウィルスベースのベクター等のエピソームベクターは現在のベクターよりも有利な点を有し得る。これらのエピソームベクターを用いることによりエピソームの転写数の大きい複製を得ることができるはずであり、より効果的となる。ｐＶＡＣｌ  ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ１挿入を用いた新しいベクターが、複製のＥＢＶオリジンおよびＥＢＮＡを含む発現プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロゲン）を用いて構成されている。これらの新しいベクターにより、ヒトの骨肉腫系７９１Ｔを用いた細胞培養実験において発現のレベルが向上しかつ発現の安定性がより大きくなっており、さらに、これらの新しいベクターはヒトに用いる場合新たな安全性の問題を引起こすがインビボではより効率的である。リポソーム媒介配達、レセプター媒介配達等のより効率的な形質転換法によっても、プロセスの効率を向上させることができる。
直接的なＤＮＡ配達は柔軟性がありかつ単純であるため、上で提案したような種々の戦略をより迅速にテストすることができる。この直接的な配達を、抗体の生成を理解するために現在もなされている進歩と組合せると、活性な抗腫瘍免疫を発生させることがさらにできるようになるはずである。このアプローチには明らかに非常に柔軟性があり、多数の他の腫瘍抗原を用いて免疫処置するのに有用である。これらの腫瘍抗原は、頸管ガン腫に含まれるヒトのパピローマウィルスＥ６／Ｅ７タンパク質、多くのガンに含まれる突然変異体ｐ５３／ｒａｓ、およびおそらくはガン胎児性抗原等の腫瘍胎児抗原を含み得る。さらに、ここに示したアプローチは、インビボで高い割合で突然変異を起こし個体間でコードされる抗原にかなりのばらつきが生じるＨＩＶ等のウィルスに有用であろう。
要するに、本発明は、免疫原性の低い自己または変更した自己のタンパク質を用いて免疫処置するための単純で効果的なワクチン戦略を提供する。特定の具体例では、標的遺伝子にＰＣＲ増幅（およびアセンブリ）を行なった後、ＰＣＲ生成物を制限し、適切に消化された発現プラスミドにクローン化する。その後、結果として得られるプラスミドＤＮＡの大量の調製物をそのまま接種のために用いる。発現プラスミドは、他の免疫調節ポリペプチドとの融合または結合の際に疾患マーカーを生成して、治療上の目標を達成するように免疫応答を調節することができる。コストが高いインビトロでのタンパク質発現および精製システムは必要でなくなり、種々の疾患、特に個々の患者または同様な症状の患者のサブグループにあわせて、ワクチンを作らなければならない疾患のためのワクチンの開発が促進される。
上述において、配列ＩＤ  ＮＯ．４９−６６は、以下のリストに示す２番目の配列リストにおいて配列ＩＤ  Ｎｏ．１−１８として示している。
配列リスト
（１）  一般情報
0004011105.tif 000002
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0004011105.tif 000003
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0004011105.tif 000004
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0004011105.tif 000005
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0004011105.tif 000006
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0004011105.tif 000007
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0004011105.tif 000008
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0004011105.tif 000009
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0004011105.tif 000010
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0004011105.tif 000011
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0004011105.tif 000012
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0004011105.tif 000013
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0004011105.tif 000014
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0004011105.tif 000015
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0004011105.tif 000016
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0004011105.tif 000017
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：
0004011105.tif 000018
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（xi）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0004011105.tif 000019
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0004011105.tif 000020
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９：
0004011105.tif 000021
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０：
0004011105.tif 000022
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：
0004011105.tif 000023
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：
0004011105.tif 000024
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３：
0004011105.tif 000025
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４：
0004011105.tif 000026
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５：
0004011105.tif 000027
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６：
0004011105.tif 000028
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７：
0004011105.tif 000029
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８：
0004011105.tif 000030
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９：
0004011105.tif 000031
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０：
0004011105.tif 000032
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５０塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１：
0004011105.tif 000033
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５０塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２：
0004011105.tif 000034
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５０塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３：
0004011105.tif 000035
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５０塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４：
0004011105.tif 000036
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５：
0004011105.tif 000037
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４９塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６：
0004011105.tif 000038
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４９塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７：
0004011105.tif 000039
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８：
0004011105.tif 000040
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９：
0004011105.tif 000041
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０：
0004011105.tif 000042
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１：
0004011105.tif 000043
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２：
0004011105.tif 000044
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３：
0004011105.tif 000045
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４：
0004011105.tif 000046
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４９塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５：
0004011105.tif 000047
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６：
0004011105.tif 000048
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：
0004011105.tif 000049
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８：
0004011105.tif 000050
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９：
0004011105.tif 000051
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１９塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０：
0004011105.tif 000052
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５７塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１：
0004011105.tif 000053
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２：
0004011105.tif 000054
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：３３塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３：
0004011105.tif 000055
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４：
0004011105.tif 000056
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：３１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５：
0004011105.tif 000057
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１７２塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６：
0004011105.tif 000058
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４７アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ペプチド
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（ｖ）  フラグメントのタイプ：インターナル
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７：
0004011105.tif 000059
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４３４１塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：環状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８：
0004011105.tif 000060
0004011105.tif 000061
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１８９塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９：
0004011105.tif 000062
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４８アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ペプチド
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（ｖ）  フラグメントのタイプ：インターナル
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０：
0004011105.tif 000063
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１７４塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１：
0004011105.tif 000064
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：４３アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ペプチド
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（ｖ）  フラグメントのタイプ：インターナル
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２：
0004011105.tif 000065
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：５７塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３：
0004011105.tif 000066
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ペプチド
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（ｖ）  フラグメントのタイプ：インターナル
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４：
0004011105.tif 000067
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：３６塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５：
0004011105.tif 000068
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）  長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の状態：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子のタイプ：ペプチド
（iii）  仮説：なし
（iii）  アンチセンス：なし
（ｖ）  フラグメントのタイプ：インターナル
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６：
0004011105.tif 000069
0004011105.tif 000070
【図１】
0004011105.tif 000071
【図２】
0004011105.tif 000072
【図３】
0004011105.tif 000073
【図４】
0004011105.tif 000074
【図５】
0004011105.tif 000075
【図６】
0004011105.tif 000076
【図７（ｉ）】
0004011105.tif 000077
【図７（ｉｉ）】
0004011105.tif 000078
【図７（ｉｉｉ）】
0004011105.tif 000079
【図８】
0004011105.tif 000080
【図９】
0004011105.tif 000081
【図１０】
0004011105.tif 000082
【図１１（ａ）】
0004011105.tif 000083
【図１１（ｂ）】
0004011105.tif 000084