(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板上に固定化された、検出の目的とする標的塩基配列と相補性のある標的相補塩基配列よりも前記標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する複数種の第１準相補プローブを有し、前記複数種の第１準相補プローブは、前記標的塩基配列と相補性の無い非相補塩基数が互いに異なっている第１準相補プローブ群とを備えた塩基配列検出用チップと、
前記塩基配列検出用チップにおける各々の第１準相補プローブと検体塩基配列とのハイブリダイゼーション反応の発生率を検出する検出手段と、
前記ハイブリダイゼーション反応の反応条件を変更する変更手段と、
前記検出手段により検出されたハイブリダイゼーション反応の発生率を前記反応条件に関連づけて格納する記憶手段と、
前記各々の反応条件における前記ハイブリダイゼーション反応の発生率に基づいて最適な反応条件を検出する検出手段とを具備するハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項２】
さらに、前記基板上に固定化され、標的塩基配列と相補性のある標的相補塩基配列よりも前記標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する複数種の第２準相補プローブを有し、前記複数の第２準相補プローブは、前記非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる第２準相補プローブ群を具備する請求項１に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項３】
前記基板上に、スポッティング装置の１回の溶剤の滴下により溶剤が前記基板上に広がる領域であって、溶剤の他の滴下により溶剤が前記基板上に広がる他の領域と重なり部分を持たず、溶剤の各滴下位置の距離を最小とする領域を複数有し、前記領域のそれぞれに、前記準相補プローブが複数種形成されている請求項１に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項４】
前記検出手段により検出された発生率に基づき、第１及び第２の準相補プローブ群のうち、前記非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる複数の準相補プローブにおけるハイブリダイゼーション反応の発生率の平均値を算出し、該平均値から所定のしきい値φ以上外れた前記反応発生率を除外する第１の統計処理、前記非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる複数の準相補プローブにおけるハイブリダイゼーション反応の発生率を加算して代表値を算出する第２の統計処理、第１の統計処理により除外された結果得られる前記反応発生率の平均値を算出する第３の統計処理、第１の統計処理により除外された結果得られる前記反応発生率の分散値を算出する第４の統計処理の少なくとも一つを実行する統計処理手段をさらに備えることを特徴とする請求項２に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項５】
前記基板上に配置され、前記第１準相補プローブ又は第２準相補プローブを固定化する固定化電極と、対向電極とをさらに備え、
前記検出手段は、前記固定化電極から流れる電荷量に基づきハイブリダイゼーション反応の発生率を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項６】
前記基板上に配置され、前記第１又は第２準相補プローブを固定化する固定化電極と、対向電極とをさらに備え、
前記検出手段は、前記固定化電極と前記対向電極間の電圧あるいは電流に基づき得られるコンダクタンスに基づきハイブリダイゼーション反応の発生率を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション反応後の前記塩基配列検出用チップの第１又は第２準相補プローブを撮像する撮像手段をさらに備え、前記検出手段は、前記撮像手段により撮像される蛍光の明度に基づいてハイブリダイゼーション反応の発生率を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーションモニタリングシステム。
【請求項８】
基板と、前記基板上に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補性のある標的相補塩基配列よりも前記標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する複数種の第１準相補プローブを有し、前記複数種の第１準相補プローブは、前記標的塩基配列と相補性の無い非相補塩基数が互いに異なっている第１準相補プローブ群と、前記基板上に配置され、前記第１準相補プローブを固定化する固定化電極とを具備する塩基配列検出用チップを検体塩基配列を含む被験液に接触させることにより、前記準相補塩基配列と前記検体塩基配列とをハイブリダイゼーション反応させ、
前記各々の第１準相補プローブと前記検体塩基配列とのハイブリダイゼーション反応の発生率を検出し、
前記ハイブリダイゼーション反応を複数の反応条件で行い、前記各々の反応条件における前記ハイブリダイゼーション反応の発生率に基づいて最適な反応条件を検出することを特徴とするハイブリダイゼーション反応モニタリング方法。
【請求項９】
前記複数の反応条件は、前記塩基配列検出用チップの温度を変化させることにより与えられる温度条件であることを特徴とする請求項８に記載のハイブリダイゼーション反応モニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子検査などに用いられる塩基配列検出用チップ、ハイブリダイゼーションモニタリングシステム、ハイブリダイゼーションモニタリング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡ検出センサとしてＤＮＡチップを用いた遺伝子検査技術が注目を集めている。このＤＮＡチップを用いた検査では、ＤＮＡチップに設けられた複数のマトリクス状のアレイにＤＮＡプローブを配置する。そして、検体ＤＮＡとＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応の有無を検出することにより、検体ＤＮＡが有する塩基配列などの情報を取得することができる。
【０００３】
ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションを行う際に、反応条件が最適でないと、検体ＤＮＡが誤ったハイブリダイズする、すなわち無関係なＤＮＡプローブと結合する確率が増大する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ハイブリダイゼーション条件を確定する定量的な手法が無いため、ハイブリダイゼーション条件を変えた多くの実験を行う必要がある。このため、ＤＮＡチップの開発コストが高くなるという問題があった。
【０００５】
また、検出するＤＮＡやプローブＤＮＡの種類によって、最適なハイブリダイゼーション条件が異なる場合には、ＤＮＡチップの開発コストがさらに高くなるという問題もあった。
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、ハイブリダイゼーション条件を最適化するための塩基配列検出用チップ、ハイブリダイゼーションモニタリングシステム、ハイブリダイゼーションモニタリング方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明のある観点によれば、基板と、基板上に固定化され、検出の目的とする標的塩基配列と相補性のある標的相補塩基配列よりも標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する複数種の第１準相補プローブを有し、複数種の第１準相補プローブは、標的塩基配列と相補性の無い非相補塩基数が互いに異なっている第１準相補プローブ群とを備えた塩基配列検出用チップと、塩基配列検出用チップにおける各々の第１準相補プローブと検体塩基配列とのハイブリダイゼーション反応の発生率を検出する検出手段と、ハイブリダイゼーション反応の反応条件を変更する変更手段と、検出手段により検出されたハイブリダイゼーション反応の発生率を反応条件に関連づけて格納する記憶手段と、各々の反応条件におけるハイブリダイゼーション反応の発生率に基づいて最適な反応条件を検出する検出手段とを具備するハイブリダイゼーションモニタリングシステムが提供される。
【０００９】
このような構成によれば、ハイブリダイゼーション反応時に、誤ったハイブリダイゼーション反応の発生率を、ハイブリダイゼーション反応条件と関連づけて定量的にモニタリングできるため、少ないハイブリダイゼーション実験により最適なハイブリダイゼーション反応条件を容易に求めることができる。
【００１１】
また、本発明の別の一の実施形態によれば、さらに、基板上に固定化され、標的塩基配列と相補性のある標的相補塩基配列よりも標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する複数種の第２準相補プローブを有し、複数の第２準相補プローブは、非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる第２準相補プローブ群を具備する。これにより、モニタリングに最適な準相補プローブを選択する必要が無く、また準相補プローブを誤って選択するなどによる測定精度の低下などの測定のばらつきを低減できる。
【００１２】
また、本発明の別の一の実施形態によれば、基板上に、スポッティング装置の１回の溶剤の滴下により溶剤が基板上に広がる領域であって、溶剤の他の滴下により溶剤が基板上に広がる他の領域と重なり部分を持たず、溶剤の各滴下位置の距離を最小とする領域を複数有し、領域のそれぞれに、準相補プローブが複数種形成されている。これにより、準相補プローブをスポッティング装置の分解能以上の密度で実装できるので、塩基配列検出用チップを小型化することができる。また、複数のプローブから得られる出力結果を用いて統計処理等行うことにより、エラー検定に用いることができる。
【００１３】
また、本発明の別の一の実施形態によれば、検出手段により検出された発生率に基づき、第１及び第２の準相補プローブ群のうち、非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる複数の準相補プローブにおけるハイブリダイゼーション反応の発生率の平均値を算出し、該平均値から所定のしきい値φ以上外れた反応発生率を除外する第１の統計処理、非相補塩基数が同一でかつ互いに塩基配列の異なる複数の準相補プローブにおけるハイブリダイゼーション反応の発生率を加算して代表値を算出する第２の統計処理、第１の統計処理により除外された結果得られる反応発生率の平均値を算出する第３の統計処理、第１の統計処理により除外された結果得られる反応発生率の分散値を算出する第４の統計処理の少なくとも一つを実行する統計処理手段をさらに備える。これにより、ハイブリダイゼーション状態のモニタリング精度を向上させることができる。
【００１４】
また、本発明の別の一の実施形態によれば、基板上に配置され、第１又は第２準相補プローブを固定化する固定化電極と、対向電極とをさらに備え、検出手段は、固定化電極から流れる電荷量に基づきハイブリダイゼーション反応の発生率を算出する。また、本発明の別の一の実施形態によれば、基板上に配置され、第１又は第２準相補プローブを固定化する固定化電極と、対向電極とをさらに備え、検出手段は、固定化電極と対向電極間の電圧あるいは電流に基づき得られるコンダクタンスに基づきハイブリダイゼーション反応の発生率を算出する。また、本発明の別の一の実施形態によれば、ハイブリダイゼーション反応後の塩基配列検出用チップの第１又は第２準相補プローブを撮像する撮像手段をさらに備え、検出手段は、撮像手段により撮像される蛍光の明度に基づいてハイブリダイゼーション反応の発生率を算出する。
【００１５】
また、装置に係る本発明は、その装置により実現される方法の発明としても成立する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。
【００１７】
（第１実施形態）
図１は本発明の第１実施形態に係るハイブリダイゼーション状態モニタリングシステムの全体構成を示す図である。図１に示すように、塩基配列検出用チップとしてのＤＮＡチップ１と、ＤＮＡチップ１の出力に基づき信号処理する信号処理部２と、信号処理部２で信号処理された信号を表示させる表示部３と、ＤＮＡチップ１の各電極に電圧を印加する等の制御を行い各電極におけるハイブリダイゼーション反応等の反応を制御する電極制御部４から構成される。また、信号処理部２は記憶部２ａを有しており、この記憶部２ａに信号処理部２で信号処理され取得されたハイブリダイゼーション率やハイブリダイゼーション反応条件などのデータが格納される。
【００１８】
図２はＤＮＡチップ１の詳細な構成を示す図である。図２に示すように、基板１１に複数のプローブ電極１２１，１２２が設けられている。１２１は相補プローブ電極であり、１２２は準相補プローブ電極である。また、基板１１上もしくは基板１１上以外に対向電極（図示せず）が設けられている。
【００１９】
相補プローブ電極１２１には、標的塩基配列１２０と相補性のある塩基配列（標的相補塩基配列）の相補プローブ１２１ａが固定される。準相補プローブ電極１２２は複数あり、それぞれには相補プローブ１２１ａよりも標的塩基配列１２０との相補性が低い準相補プローブ１２２ａが固定される。これら相補プローブ電極１２１と準相補プローブ電極１２２、対向電極はそれぞれ信号処理部２に接続されている。プローブ電極１２１，１２２と対向電極間に電圧が印加された際にプローブ電極１２１，１２２に流れ出す電荷は、信号処理部２に出力され、信号処理部２でその電荷量を検出することによりハイブリダイゼーション率（プローブと検体塩基配列が結合する反応が発生する率）を測定することができる。
【００２０】
各プローブ電極に電圧を印加するに当たり、対向電極に加えて参照電極を使用した３電極方式としてもよい。
【００２１】
標的塩基配列とは、検出の目的とされる塩基配列である。検体塩基配列は、検査の対象となる試料塩基配列であり、この検体塩基配列と相補プローブや準相補プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、ハイブリダイゼーション反応をモニタリングする。
【００２２】
相補プローブとは、検体塩基配列が標的塩基配列を含んでいるか否かを検出する目的で利用されるプローブであり、標的塩基配列とは相補性のある塩基配列（標的相補塩基配列）を有する。また、相補プローブのハイブリダイゼーション反応を準相補プローブのハイブリダイゼーション反応と比較するため、検体塩基配列が標的塩基配列を有しているか否かの検出用のみならず、ハイブリダイゼーション状態のモニタリングに用いることもできる。
【００２３】
準相補プローブとは、ハイブリダイゼーション状態のモニタリングを行うことによりハイブリダイゼーション反応条件を最適化するために利用されるプローブであり、標的塩基配列と相補性のある塩基配列（標的相補塩基配列）の少なくとも１つ（始点塩基から終点塩基までの塩基のうちのいずれか一つ以上）の塩基を他の塩基に置換した塩基配列を有する。
【００２４】
なお、以下の実施形態で、ハイブリダイゼーション反応条件とは、ある塩基配列と他の塩基配列のハイブリダイゼーション反応を生じさせる条件のみならず、このハイブリダイゼーション反応が生じた二本鎖を検出するまでに必要な工程における処理条件も含まれる。
【００２５】
準相補プローブ１２２ａと標的塩基配列１２０の概念図を図３に示す。図３に示すように、標的塩基配列１２０が、始点塩基から終点塩基までＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａとなっている場合に、この標的塩基配列１２０と相補性がある塩基配列は、塩基の相補性により、始点塩基から終点塩基までＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔである。従って、相補プローブ１２１ａは、この塩基配列“Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ”を有するプローブとなる。
【００２６】
また、準相補プローブ１２２ａは複数種あり、これらの複数種の準相補プローブを第１準相補プローブ群とする。第１準相補プローブ群を構成する各第１準相補プローブとしては、標的塩基配列１２０と相補的な塩基配列（標的相補塩基配列）と１つの塩基が異なるＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔの塩基配列を有する第１準相補プローブ（１）１２２１と、２つの塩基が異なるＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔの塩基配列を有する第１準相補プローブ（２）１２２２と、３つの塩基が異なるＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａの塩基配列を有する第１準相補プローブ（３）１２２３というように、標的相補塩基配列と塩基の数（非相補塩基数）がｉ個（ｉは自然数であって、標的塩基配列の塩基数と同じあるいはそれ以下）異なる塩基配列を有する第１準相補プローブ（ｉ）１２２ｉを有する。
【００２７】
第１準相補プローブ（２）１２２２は、第１準相補プローブ（１）１２２１のうちの標的相補塩基配列とは異なる塩基と隣接する塩基が、標的相補塩基配列とは異なる塩基となるような塩基配列を有する。従って、相補プローブ１２１ａ中の標的相補塩基配列のうち２つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列を第１準相補プローブ（２）１２２２が有し、かつその２つの塩基は隣接している。
【００２８】
また、第１準相補プローブ（３）１２２３は、第１準相補プローブ（２）１２２２のうちの標的相補塩基配列とは異なる２つの塩基と隣接する１つの塩基が、標的相補塩基配列とは異なる塩基となるような塩基配列を有する。従って、相補プローブ１２１ａ中の標的相補塩基配列のうち３つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列を第１準相補プローブ（３）１２２３が有し、かつその３つの塩基は隣接している。
【００２９】
同様に、第１準相補プローブ（ｉ）１２２ｉは、第１準相補プローブ（ｉ−１）１２２（ｉ−１）のうちの標的相補配列とは異なる（ｉ−１）個の塩基と隣接する１つの塩基が、標的相補塩基配列とは異なる塩基となるような塩基配列を有する。第１準相補プローブ群の各プローブはそれぞれ異なる電極上に固定化されている。
【００３０】
図３に示した第１準相補プローブ（１）１２２１〜第１準相補プローブ（３）１２２３は、一例を示したものである。第１準相補プローブ（ｉ）１２２ｉの場合、標的相補塩基配列とは異なる塩基はｉ個であり、このｉ個の塩基を塩基配列中のいずれとするか、またそのｉ個の塩基を、標的相補塩基配列として選択されているＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのうちの特定の塩基以外の３つの塩基から自由に定められる。これら考えられ得るすべての種類や複数種類についてＤＮＡチップ１の各電極１２２に固定してもよいし、代表的な１種類のみをＤＮＡチップ１の各電極１２２に固定してもよい。また、塩基の相違する数ｉは、２以上の数であればいくつでもよい。
【００３１】
本実施形態では説明の便宜のため、第１準相補プローブ（１）１２２１，第１準相補プローブ（２）１２２２，第１準相補プローブ（３）１２２３のそれぞれについて代表的な塩基配列のもの１種のみを用いて説明する。
【００３２】
次に、上記図１乃至図３に示したハイブリダイゼーション状態モニタリングシステムを用いたハイブリダイゼーション状態モニタリングの第１の手法を説明する。
【００３３】
まず、検体塩基配列を含む被験液をＤＮＡチップ１内の各電極１２１，１２２に注入して接触させ、注入した被験液に含まれる検体塩基配列と相補プローブ１２１ａ、準相補プローブ１２２ａとでハイブリダイゼーション反応を生じさせる。ここでは説明の便宜のため、検体塩基配列が標的塩基配列と同一の塩基配列を有するとして説明する。反応溶液の溶媒は、所定のｐＨの緩衝液などが用いられる。また、反応は被験液を所定の温度で例えば１分以上行う。また、このハイブリダイゼーション反応の際、電極制御部４によりプローブ電極１２１，１２２の固定化電極及び対向電極に所定の電圧を印加することにより、従来数時間から数日必要であった反応を数分程度に短縮することができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション反応が終了すると、プローブ電極１２１，１２２を所定の緩衝液で洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分（相補プローブ１２１ａ，準相補プローブ１２２ａと検体塩基配列による二本鎖部分）に選択的に結合する挿入剤を作用させる。そして、挿入剤が作用したプローブ電極１２１，１２２の固定化電極及び対向電極に所定の電圧を印加し、挿入剤に由来する各電極１２１，１２２の電荷量を信号処理部２で測定する。得られた測定結果はハイブリダイゼーション率として表示部３に表示される。
【００３５】
図４は表示部３に表示される測定結果の一例を示す図である。ＲＴＯ0は、相補プローブ電極１２１について検出された電荷量に基づき得られるハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ1，ＲＴＯ2，ＲＴＯ3は、準相補プローブ電極１２２について検出された電荷量に基づき得られるハイブリダイゼーション率である。ＲＴＯ1は第１準相補プローブ（１）１２２１のハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ2は第１準相補プローブ（２）１２２２のハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ3は第１準相補プローブ（３）１２２３のハイブリダイゼーション率である。
【００３６】
図４（ａ）と図４（ｂ）は異なるハイブリダイゼーション反応条件による測定結果である。異なるハイブリダイゼーション反応条件とは、例えば反応温度、反応させる準相補プローブの塩基配列、被験液のイオン強度やｐＨ、ハイブリダイゼーション促進剤の種別やその諸条件、攪拌、振とうなどの条件、反応時間、挿入剤の種別、濃度、挿入剤の緩衝液のイオン強度、ｐＨやその諸条件などである。
【００３７】
図４（ａ）に示すように、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数に従ってハイブリダイゼーション率が減少している。従って、ハイブリダイゼーション反応は正常に行われていることが分かる。一方、図４（ｂ）も、図４（ａ）と同様に、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数（非相補塩基数）に従ってハイブリダイゼーション率が減少している。従って、ハイブリダイゼーション反応は正常に行われていることが分かる。
【００３８】
図４（ａ）と図４（ｂ）を比較すると、図４（ａ）の場合の不一致の塩基数（非相補塩基数）の増加に伴うハイブリダイゼーション率の減少率は図４（ｂ）の測定結果に比較して小さくなっている。従って、図４（ｂ）のハイブリダイゼーション反応の方が、図４（ａ）のハイブリダイゼーション反応よりも最適化されているのが分かる。
【００３９】
また、図４（ａ）や図４（ｂ）の場合とはさらに異なるハイブリダイゼーション反応条件の下で得られた測定結果の例を図５（ａ）及び（ｂ）に示す。図５（ａ）及び（ｂ）のいずれの場合も、ＲＴＯ0＞＞ＲＴＯ1＞ＲＴＯ2＞ＲＴＯ3の関係が不成立であり、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数（非相補塩基数）とハイブリダイゼーション率との因果関係が見られない。ＲＴＯ0の値が、正常なハイブリダイゼーション反応が起こっていることを示す場合のハイブリダイゼーション率である。従って、これよりもＲＴＯ1、ＲＴＯ2、ＲＴＯ3の値を大きい場合、少なくとも異常ハイブリダイゼーション反応が生じていることが分かる。異常ハイブリダイゼーション反応の原因は、不純物の混入や、ハイブリダイゼーション反応温度が低すぎる等ののハイブリダイゼーション条件が不適であるという問題が考えられる。
【００４０】
また、図４や図５の場合とさらに異なるハイブリダイゼーション反応条件の下で得られた測定結果の例を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。図６（ａ）の場合、ＲＴＯ0≒ＲＴＯ1＞＞ＲＴＯ2＞ＲＴＯ3の関係が成立している。図６（ｂ）の場合、ＲＴＯ0≒ＲＴＯ1≒ＲＴＯ2≒ＲＴＯ3の関係が成立している。いずれの場合も、図４（ａ）や図４（ｂ）の場合のように、ハイブリダイゼーション率と不一致塩基数（非相補塩基数）との因果関係が無いか、あるいはあまり見られないため、異常ハイブリダイゼーション反応が生じていることが分かる。図５（ａ）や図５（ｂ）の場合と同様に、異常ハイブリダイゼーション反応の原因は、不純物の混入や、ハイブリダイゼーション反応温度が低すぎる等のハイブリダイゼーション条件が不適であるという問題が考えられる。
【００４１】
次に、ハイブリダイゼーション状態モニタリングの第２の手法を説明する。用いられる装置や、第１の手法と共通する部分についての詳細な説明は省略する。
【００４２】
ハイブリダイゼーション状態モニタリングの第１の手法と異なるのは、この第２の手法は不一致塩基数（非相補塩基数）の異なる複数の第１準相補プローブを用いたハイブリダイゼーション率の測定において、非相補塩基数に応じたハイブリダイゼーション率を温度条件と関連づけて解析する点である。
【００４３】
まず、検体塩基配列を含む被験液をＤＮＡチップ１内の各電極１２１，１２２に注入する。次に、注入した被験液に含まれる標的核酸鎖と相補プローブ１２１ａ、準相補プローブ１２２ａとでハイブリダイゼーション反応を生じさせる。ここでは、説明の便宜のため、検体塩基配列が標的塩基配列と同一の塩基配列を有するとして説明する。反応溶液は、所定のｐＨの緩衝液などが用いられる。また、反応は被験液を例えば１分以上行う。また、このハイブリダイゼーション反応の際、電極制御部４によりプローブ電極１２１，１２２に所定の電圧を印加する。また、他の測定条件を同一にし、温度条件を変化させた複数の反応を生じさせる。
【００４４】
ハイブリダイゼーション反応が終了すると、プローブ電極１２１，１２２を所定の緩衝液で洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分（相補プローブ１２１ａ，１２２ａと検体塩基配列）に選択的に結合する挿入剤を作用させる。そして、挿入剤が作用したプローブ電極１２１，１２２に所定の電圧を印加し、挿入剤に由来する各電極１２１，１２２の電荷量を信号処理部２で測定する。得られた測定結果はハイブリダイゼーション率として表示部３に表示される。この第２の手法では、他の測定条件を同一にし、温度条件を変化させた複数の反応を生じさせているため、異なる温度条件で反応した複数の測定結果が得られる。
【００４５】
図７は表示部３に表示される測定結果の一例を示す図である。ＲＴＯ0は、相補プローブ電極１２１について検出された電荷量に基づき得られるハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ1，ＲＴＯ2，ＲＴＯ3は、準相補プローブ電極１２２について検出された電荷量に基づき得られるハイブリダイゼーション率であり、ＲＴＯ1は第１準相補プローブ（１）１２２１のハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ2は第１準相補プローブ（２）１２２２のハイブリダイゼーション率、ＲＴＯ3は第１準相補プローブ（３）１２２３のハイブリダイゼーション率である。図７（ａ）と図７（ｂ）は異なる温度条件でハイブリダイゼーション反応を生じさせた測定結果である。具体的には、図７（ｂ）の方が図７（ａ）よりも低い温度でハイブリダイゼーション反応を生じさせた場合に対応している。
【００４６】
図７（ａ）に示すように、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数（非相補塩基数）に従ってハイブリダイゼーション率が減少している。従って、ハイブリダイゼーション反応は正常に行われていることが分かる。一方、図７（ｂ）は、図７（ａ）と同様に、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数（非相補塩基数）に従ってハイブリダイゼーション率が減少している。従って、ハイブリダイゼーション反応は正常に行われていることが分かる。図７（ａ）と図７（ｂ）を比較すると、図７（ｂ）の場合の不一致の塩基数（非相補塩基数）の増加に伴うハイブリダイゼーション率の減少率は図７（ａ）の測定結果に比較して小さくなっている。従って、図７（ｂ）のハイブリダイゼーション反応の方が、図７（ａ）のハイブリダイゼーション反応よりも最適化されているのが分かる。これら図７（ａ）及び（ｂ）の測定結果により、ハイブリダイゼーション反応温度を下げることで、ハイブリダイゼーション反応を最適化できることがわかる。
【００４７】
また、図７（ａ）や図７（ｂ）の場合とさらに異なるハイブリダイゼーション反応条件の下で得られた測定結果の例を図８（ａ）及び（ｂ）に示す。図８（ａ）及び（ｂ）のいずれの場合も、ＲＴＯ0＞＞ＲＴＯ1＞ＲＴＯ2＞ＲＴＯ3の関係が不成立であり、標的塩基配列の相補的な塩基配列と不一致の塩基数とハイブリダイゼーション率との因果関係が見られない。ＲＴＯ0の値が、正常なハイブリダイゼーション反応が起こっていることを示す場合のハイブリダイゼーション率である。従って、これよりもＲＴＯ1、ＲＴＯ2、ＲＴＯ3の値を大きい場合、少なくとも異常ハイブリダイゼーション反応が生じていることが分かる。異常ハイブリダイゼーション反応の原因は、ハイブリダイゼーション反応温度が低すぎる等の問題が考えられるので、ハイブリダイゼーション反応温度を高める対応などが考えられる。
【００４８】
また、図７や図８の場合とさらに異なるハイブリダイゼーション反応条件の下で得られた測定結果の例を図９（ａ）及び（ｂ）に示す。図９（ａ）の場合、ＲＴＯ0≒ＲＴＯ1＞＞ＲＴＯ2＞ＲＴＯ3の関係が成立している。図９（ｂ）の場合、ＲＴＯ0≒ＲＴＯ1≒ＲＴＯ2≒ＲＴＯ3の関係が成立している。いずれの場合も、図７（ａ）や図７（ｂ）の場合のように、ハイブリダイゼーション率と不一致塩基数（非相補塩基数）との因果関係が無いか、あるいはあまり見られないため、異常ハイブリダイゼーション反応が生じていることが分かる。図８（ａ）や図８（ｂ）の場合と同様に、異常ハイブリダイゼーション反応の原因は、ハイブリダイゼーション反応温度が低すぎる等の問題が考えられるので、ハイブリダイゼーション反応温度を高める対応などが考えられる。
【００４９】
次に、ハイブリダイゼーション状態モニタリングの第３の手法を説明する。
【００５０】
第３の手法では、まず、検体塩基配列を含む被験液をＤＮＡチップ１内の各電極１２１，１２２に注入して、検体塩基配列とプローブとを接触させる。次に、注入した被験液に含まれる検体塩基配列と相補プローブ１２１ａ、準相補プローブ１２２ａとでハイブリダイゼーション反応を生じさせる。ここでは、説明の便宜のため、検体塩基配列が標的塩基配列と同一の塩基配列を有するとして説明する。反応溶液は、所定のｐＨの緩衝液などが用いられる。また、反応は被験液を所定の温度で例えば１分以上行う。また、このハイブリダイゼーション反応の際、電極制御部４によりプローブ電極１２１，１２２に所定の電圧を印加することにより、従来数時間から数日必要であった反応を数分程度に短縮することができる。
【００５１】
ハイブリダイゼーション反応が終了すると、プローブ電極１２１，１２２を所定の緩衝液で洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に選択的に結合する挿入剤を作用させる。そして、挿入剤が作用したプローブ電極１２１，１２２に所定の電圧を印加する。挿入剤に由来する各電極１２１，１２２の電荷量を変化する各温度において信号処理部２で測定する。得られた測定結果はハイブリダイゼーション率として表示部３に表示される。
【００５２】
図１０は得られた第３の手法のハイブリダイゼーション状態モニタリングの概念と測定結果を示す図である。図１０（ａ）は第３の手法のハイブリダイゼーション状態モニタリングの概念図、図１０（ｂ）〜（ｅ）は測定結果である。
【００５３】
図１０（ａ）の最上段、上から２段、上から３段、最下段にいくにつれて、温度が低くなっていった場合の反応の概念図を示している。また、左端は相補プローブ１２１ａと検体塩基配列のハイブリダイゼーション反応の模式図、左端から２番目が第１準相補プローブ（１）１２２１と検体塩基配列のハイブリダイゼーション反応の模式図、左端から３番目が第１準相補プローブ（２）１２２２と検体塩基配列のハイブリダイゼーション反応の模式図、右端が第１準相補プローブ（３）１２２３と検体塩基配列のハイブリダイゼーション反応の模式図である。この図１０（ａ）より、温度が高い場合に比較して温度が低い場合の方が挿入剤の作用により相補プローブ１２１ａあるいは準相補プローブ１２２ａとのハイブリダイゼーション反応が生じやすくなっているのが分かる。また、標的塩基配列の塩基配列と相補的な塩基配列に対して不一致塩基数（非相補塩基数）の多いプローブほどハイブリダイゼーション反応が生じにくく、不一致塩基数（非相補塩基数）の少ないプローブほどハイブリダイゼーション反応が生じやすくなっているのが分かる。
【００５４】
これら図１０（ａ）で示す各測定条件で得られた測定結果は図１０（ｂ）〜（ｄ）に示される。
【００５５】
図１０（ｂ）〜（ｄ）に示すように、温度が最も高い最上段の測定結果（図１０（ｂ））では、全体的にハイブリダイゼーション率が低く、各プローブ同士のハイブリダイゼーション率の比較が困難で、また標的塩基配列と相補的な塩基配列との不一致塩基数（非相補塩基数）とハイブリダイゼーション率との因果関係は見られない。
【００５６】
次に温度が高い時の図１０（ａ）の上から２段目の測定結果（図１０（ｃ））では、相補プローブ１２１ａのハイブリダイゼーション率が最も高く、標的塩基配列と相補的な塩基配列との不一致塩基数（非相補塩基数）が増加するに従ってハイブリダイゼーション率が大きく減少しており、またハイブリダイゼーション率の減少率は、不一致塩基数（非相補塩基数）の増大に伴い減少している。これより、不一致塩基数（非相補塩基数）とハイブリダイゼーション率との因果関係が極めて明確に現れている。
【００５７】
次に温度が高い時の図１０（ａ）の上から３段目の測定結果（図１０（ｄ））では、相補プローブ１２１ａのハイブリダイゼーション率が最も高く、標的塩基配列と相補的な塩基配列との不一致塩基数（非相補塩基数）が増加するに従ってハイブリダイゼーション率が大きく減少している点は、２番目に温度が高い図１０（ａ）の上から２段目の測定結果と同じである。２番目に温度が高い測定結果と異なるのは、不一致塩基数（非相補塩基数）の増大に伴ってハイブリダイゼーション率の減少率はあまり変わらない点である。２段目の測定結果と比較すると、２段目の方がハイブリダイゼーション率と不一致塩基数（非相補塩基数）との因果関係が明確に現れているといえる。
【００５８】
最も温度が低い時の図１０（ａ）の最下段の測定結果（図１０（ｅ））では、不一致塩基数（非相補塩基数）とハイブリダイゼーション率との因果関係は見られず、相補プローブ１２１ａのハイブリダイゼーション率よりも準相補プローブ１２２ａのハイブリダイゼーション率の方が高くなっている場合も見受けられる。
【００５９】
得られた測定結果のうち、ＲＴＯ0＞＞ＲＴＯ1＞ＲＴＯ2＞ＲＴＯ3の関係が成立する温度は、上から２段目の温度の場合である。従って、上から２段目の場合の測定結果が得られた温度条件をハイブリダイゼーション最適温度として検出する。
【００６０】
本実施形態のハイブリダイゼーション状態モニタリングを実現するためのＤＮＡチップ１の詳細な構造を図１１に示す。図１１に示すように、基板１１上には、複数のスポットブロック９１がマトリクス状に配置されている。スポットブロックとは、１種のプローブを固定するプローブ電極を少なくとも備え、さらには参照電極、対向電極の少なくとも一つを備える電極セットを備えた領域でかつ各ブロックの領域が互いに重なり領域を有しない領域であって、検体塩基配列と挿入剤を含む混合剤を各電極に滴下するためのスポッティング装置が１点として処理する単位に対応している。従って、スポットブロックは、スポッティング装置の最小分解能に応じて各ブロック間の距離などが定められており、あるスポットブロックにはスポッティング装置によりある１点検体塩基配列と挿入剤を含む混合剤が滴下され、他のスポットブロックにはスポッティング装置により他の１点検体塩基配列と挿入剤を含む混合剤が滴下される。スポッティング装置の最小分解能とは、スポッティング装置の１回の溶剤の滴下により溶剤が基板上に広がる領域であって、かつ溶剤の他の滴下により溶剤が基板上に広がる他の領域と重なり部分を持たず、溶剤の各滴下位置の距離を最小とする領域を指し、例えば１００μｍ角以下の領域や直径１００μｍ径以下の領域である。
【００６１】
この最小分解能に対応してスポットブロックを配置することにより、あるスポットブロックに対する混合剤の滴下により、他のスポットブロックに対しては混合剤が滴下されない。すなわち、混合剤が互いに混合しないように、各スポットブロック毎に独立した滴下操作を行うことができる。
【００６２】
各スポットブロック９１には、同一種のプローブを固定化する固定化電極のみ、あるいは固定化電極と参照電極の組み合わせ、あるいは固定化電極、参照電極及び対向電極の組み合わせのいずれかの電極セットが配置される。固定化電極とは、相補プローブ１２１ａや準相補プローブ１２２ａを固定化させ、検体塩基配列とハイブリダイズさせるための電極である。対向電極とは、固定化電極との間で電極制御部４を用いて所定の電圧を与えることにより酸化還元反応などを生じさせるために配置された電極である。参照電極とは、固定化電極と対向電極の基準となる電極であり、例えばこの参照電極を基準とすることにより、参照電極に対する固定化電極の電位や対向電極の電位が測定される。
【００６３】
図１１（ａ）では、複数の固定化電極９１１からなる電極セット９２１が複数のスポットブロック９１のうちのいくつかのブロックにｐ×ｑ個マトリクス状に配置されている。この複数の固定化電極９１１は、前述した通りスポッティング装置のスポッティング機能の最小分解能に対応しているため、一回のスポッティングによりこの１つのスポットブロック９１内のすべての固定化電極９１１に混合液が滴下される。
【００６４】
図１１（ａ）の例の場合、電極セット９２１が配置されたスポットブロック９１にスポッティング装置により混合剤を滴下すると、ｐ×ｑ個の固定化電極９１１に一括して混合剤が供給される。
【００６５】
また、この固定化電極９１１のみならなる電極セット９２１が配置されたスポットブロック９１以外のブロックは、固定化電極９１１と参照電極９１２の組み合わせからなる電極セット９２２が配置されたブロックや、固定化電極９１１、参照電極９１２及び対向電極９１３の組み合わせからなる電極セット９２３が配置されたブロックである。電極セット９２２は、ＤＮＡチップ１上の複数のスポットブロック９１のうち、最も外側の領域に配置されたブロック（例えば図１１（ａ）ではマトリクス状のスポットブロックの最右列）に配置されている。
【００６６】
電極セット９２３は、ＤＮＡチップ１上の複数のスポットブロック９１のうち、最も内側の領域に配置されたブロックに配置されている。電極セット９２１は、電極セット９２２及び電極セット９２３が配置された以外のブロックに配置されている。
【００６７】
なお、図１１（ａ）の電極セット９２２が配置されるスポットブロック９１を参照電極９１２のみからなる電極セットに置換し、電極セット９２３が配置されるスポットブロック９１を対向電極９１３のみからなる電極セットに置換してもよい。
【００６８】
図１１（ｂ）は、電極セットの別の配置例を示したものである。すべてのスポットブロック９１内には固定化電極９１１、参照電極９１２及び対向電極９１３からなる同一の電極セット９２３がそれぞれ配置されている。各スポットブロック９１内には、ブロック内の最も内側の領域に対向電極９１３が配置されている。また、この対向電極９１３を取り囲むように参照電極９１２が配置されている。そして、最も外側の領域に固定化電極９１１が配置されている。
【００６９】
これら図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、スポッティング装置の最小分解能に対応してそれぞれスポットブロックを配置し、そのスポットブロック内に複数の電極からなる電極セットを配置することにより、各スポッティング領域に複数種の塩基配列プローブを配置することができる。従って、塩基配列プローブをスポッターの分解能以上の密度で実装し、ＤＮＡチップを小型化する。なお、上記実施形態において、検体核酸鎖と挿入剤は混合剤の形でＤＮＡチップ１上に供給されているが、これらは別々の溶剤で供給されてももちろん構わない。
【００７０】
なお、図１１（ａ）及び（ｂ）に示した電極セットの配置はあくまで一例である。例えば、対向電極９１３を基板１１上の周辺領域に配置した上で、電極セット９２１からなるスポットブロック９１を対向電極９１３に囲まれた領域内にマトリクス状に配置してもよい。また、電極セット９１３を配置するスポットブロック９１ａと電極セット９１１を配置するスポットブロック９１ｂを列毎に交互に配置した構成としてもよい。その他、電極セットの配置を種々変更することができる。
【００７１】
以上に示されたスポットブロック９１のうち、固定化電極９１１と対向電極９１３の間に電圧を印加し、その電圧の印加により生じた電気分解などの反応により、ハイブリダイゼーション反応が生じたプローブと反応が生じないプローブとで異なる大きさの電流がこれら電極間に流れる。信号処理部２は、その電流を電気信号に変換し、表示部３に表示することにより、ハイブリダイゼーション率を確認することができる。ハイブリダイゼーション率を算出するために必要な信号を取得するためには、酸化還元電流変化、酸化還元電位変化、電気容量変化、コンダクタンスの変化、電気化学発光変化を指標にすることができる。例えばコンダクタンスの変化を得るためには、固定化電極９１１と対向電極９１３の間に一定電圧を印加して得られる電流量を測定し、あるいは一定電流を流して得られる電圧を測定することにより得られる。
【００７２】
そして、得られたハイブリダイゼーション率のうち、標的相補塩基配列に対する不一致の塩基数（非相補塩基数）との因果関係が明らかな測定結果として得られたハイブリダイゼーション反応条件における相補プローブ１２１ａのハイブリダイゼーション率を信頼できる測定結果として利用することができる。
【００７３】
以上のハイブリダイゼーション率の測定を統計処理を用いて測定精度を向上させる手法の一例を以下説明する。
【００７４】
統計処理を用いたモニタリングシステムを図１２に示す。基本的な構成は図１のモニタリングシステムと同様であるが、信号処理部２と統計処理部５が接続されており、この統計処理部５に表示部３が接続されている。信号処理部２での信号処理により得られたハイブリダイゼーション率は、統計処理部５に出力される。統計処理部５は、得られたハイブリダイゼーション率に基づき統計処理を行い検定結果を導出し、その結果を表示部３に表示させる。また、統計処理部５には、統計処理部５で算出された統計処理結果を格納する記憶手段５ａを有する。
【００７５】
統計処理を用いた手法では、まず、標的塩基配列と相補性の無い塩基をｉ個有する第１準相補プローブＲＴi（ｉは１〜ｎの自然数）からなる第１準相補プローブ群の各プローブを固定化した電極と、第２準相補プローブ群の各第２準相補プローブを固定化した電極とをＤＮＡチップ１に配置する。
【００７６】
第２準相補プローブ群を構成する複数の第２準相補プローブは、標的塩基配列に対して相補性の低い準相補塩基配列を有する。さらに、その塩基配列は標的塩基配列と相補性の無い塩基の数（非相補塩基数）が前記第１準相補プローブの少なくとも１種と同一である。また、第２準相補プローブ群を構成する複数種の第２準相補プローブは、それぞれその塩基配列が異なっている。
【００７７】
ここでは、第１準相補プローブＲＴi（ｉは１〜ｎの自然数）ｎ種と、各第１準相補プローブＲＴiと非相補塩基数が同じで塩基配列の異なる第２準相補プローブを、塩基配列の異なる種類が第１準相補プローブとあわせてｍ種ずつ、合計ｍ×ｎ種の準相補プローブを固定化した電極をＤＮＡチップ１に配置した。また、標的塩基配列と相補性のある塩基配列（標的相補塩基配列）を有する相補プローブも固定化されている。
【００７８】
次に、これらｍ×ｎ種の準相補プローブと、相補プローブとが配置されたＤＮＡチップ１に対し上述した検体塩基配列の供給、ハイブリダイゼーション反応、挿入剤の滴下、信号処理部２での信号検出を行う。ここでは、説明の便宜のため、検体塩基配列と標的塩基配列は同一とする。
【００７９】
得られた信号処理結果はハイブリダイゼーション率として統計処理部５に出力される。以下、標的塩基配列と相補性の無い塩基をｉ個有するｍ個のプローブのうちのｊ番目のプローブＲＴijのハイブリダイゼーション率をＲＴＯijとする。
【００８０】
具体的には、標的塩基配列と相補性の無い塩基を０個有する相補プローブＲＴ0jのハイブリダイゼーション率は、ＲＴＯ00、標的塩基配列と相補性の無い部分を１個有する準相補プローブＲＴ1jのハイブリダイゼーション率は、ＲＴＯ11〜ＲＴＯ1m、標的塩基配列と相補性の無い部分をｎ個有する準相補プローブＲＴnjのハイブリダイゼーション率は、ＲＴＯn1〜ＲＴＯnmで与えられる。
【００８１】
統計処理部５は、得られたハイブリダイゼーション率ＲＴＯijに基づき以下の統計処理手法（１）〜（４）の少なくとも一つを行う。
【００８２】
統計処理手法（１）では、不一致の塩基数が等しいハイブリダイゼーション率ＲＴＯij（ＲＴＯi1〜ＲＴＯim）の平均値を算出する。そして、この平均値から、予め定められたしきい値φ以上外れたハイブリダイゼーション率ＲＴＯijを除外し、しきい値φの範囲内のハイブリダイゼーション率ＲＴＯijのみを抽出する。しきい値φは、不一致の塩基数に応じて定められていてもよいし、すべての不一致の塩基数に対して共通して与えられていてもよい。そして、抽出されたハイブリダイゼーション率ＲＴＯijのみを表示部３に表示させてモニタリングを行う。
【００８３】
これにより、異常ハイブリダイゼーション反応を除外することができ、チップ出力値の信頼性を向上させることができる。
【００８４】
統計処理手法（２）では、不一致の塩基数が等しいハイブリダイゼーション率ＲＴＯi1〜ＲＴＯimをそれぞれ加算し、不一致の塩基数が等しいハイブリダイゼーション率の合計値Ｓ
Ｓ＝ＲＴＯi1＋ＲＴＯi2＋…＋ＲＴＯim
を算出する。そして、得られた合計値Ｓをその不一致の塩基数に対するハイブリダイゼーション率の代表値としてモニタリングを行う。これにより、各ハイブリダイゼーション率が微小な場合であっても信頼性の高いモニタリングが可能となる。
【００８５】
統計処理手法（３）では、不一致の塩基数が等しいハイブリダイゼーション率ＲＴＯij（ＲＴＯi1〜ＲＴＯim）の平均値を算出する。そして、この平均値から予め定められたしきい値φ以上外れたハイブリダイゼーション率ＲＴＯijを除外し、しきい値φの範囲内のハイブリダイゼーション率ＲＴＯijのみを抽出する。しきい値φは、不一致の塩基数（非相補塩基数）に応じて定められていてもよいし、すべての不一致の塩基数（非相補塩基数）に対して共通して与えられていてもよい。そして、抽出されたハイブリダイゼーション率ＲＴＯij’のうち、不一致の塩基数（非相補塩基数）が等しいハイブリダイゼーション率（ＲＴＯi0’〜ＲＴＯim’）の平均値（抽出平均値）を算出する。そして、得られた抽出平均値を不一致の塩基数（非相補塩基数）に対するハイブリダイゼーション率の代表値としてモニタリングを行う。これにより、不一致の塩基数（非相補塩基数）が等しいハイブリダイゼーション率を平均化することができ、信頼性の高いモニタリングが可能となる。
【００８６】
統計処理手法（４）では、不一致の塩基数が等しいハイブリダイゼーション率ＲＴＯij（ＲＴＯi1〜ＲＴＯim）の平均値を算出する。そして、予め定められたしきい値φ以上外れたハイブリダイゼーション率ＲＴＯijを除外し、しきい値φの範囲内のハイブリダイゼーション率ＲＴＯijのみを抽出する。しきい値φは、不一致の塩基数に応じて定められていてもよいし、すべての不一致の塩基数（非相補塩基数）に対して共通して与えられていてもよい。そして、抽出されたハイブリダイゼーション率ＲＴＯij’のうち、不一致の塩基数（非相補塩基数）が等しいハイブリダイゼーション率（ＲＴＯi1’〜ＲＴＯim’）の平均値（抽出平均値）を算出する。そして、得られた抽出平均値を用いて不一致の塩基数（非相補塩基数）が等しいハイブリダイゼーション率の分散値ｓiを算出する。分散値ｓiは以下の式により算出される。
【００８７】
なお、ＲＴＯi＿’は、予め定められたしきい値φ以上外れたハイブリダイゼーション率を除外した後に算出され、不一致の塩基数（非相補塩基数）ｉが等しいハイブリダイゼーション率ＲＴＯij’（ＲＴＯi1’〜ＲＴＯim’）の抽出平均値であり、ＲＴＯi＿’＝（ＲＴＯi1’＋ＲＴＯi2’＋…＋ＲＴＯim’）／ｍで示される。
【００８８】
ｓi＝｛（ＲＴＯi1’−ＲＴＯi＿’）2＋（ＲＴＯi2’−ＲＴＯi＿’）2＋…＋（ＲＴＯim’−ＲＴＯi＿’）2｝／（ｍ−１）
そして、抽出された分散値ｓiの検定を行い、得られた各ハイブリダイゼーション率が一定範囲に収まっているか否かを判定する。一定範囲に収まっていると判定される場合には、そのハイブリダイゼーション反応条件が採用可能であることを示し、一定範囲に収まっていないと判定される場合には、そのハイブリダイゼーション反応条件が採用できないことを示している。
【００８９】
なお、統計処理手法（１）〜（４）は本発明にそれぞれ別個適用してもよいし、それぞれを複数組み合わせて適用してもよい。また、統計処理手法（１）〜（４）では、相補プローブは１種のみを用い、その１種のプローブのハイブリダイゼーション率ＲＴＯ00を用いて統計処理を行う場合を示したが、これに限定されるものではない。例えば、標的塩基配列と相補性の無い塩基を０個有するが、異なる種類の相補プローブを第２準相補プローブと同様にｍ個準備して統計処理を行ってもよい。上記統計処理手法（１）〜（４）では、標的塩基配列と相補性の無い塩基数を示すiの値を１〜ｎとして計算したが、ｍ個の種類の相補プローブを用いた場合、iの値を０〜ｎとして計算すればよい。
【００９０】
以上説明したように本実施形態によれば、ハイブリダイゼーション反応時に、少なくとも一つのハイブリダイゼーション反応条件をリアルタイムで変更しつつ、誤ったハイブリダイゼーション反応の発生率を、変更するハイブリダイゼーション反応条件と関連づけて定量的にモニタリングできるため、少ないハイブリダイゼーション実験により最適なハイブリダイゼーション反応条件を容易に求めることができる。その結果、ＤＮＡチップの開発コストを低減できる。
【００９１】
なお、上記実施形態では、固定化電極９１１と対向電極９１３の間の電圧や、固定化電極９１１に流れる電荷量、電流などに基づいてハイブリダイゼーション率を検出する例を示したが、これに限定されるものではない。例えば、図１２に示すモニタリングシステムと信号処理部２を直接接続せず、別途撮像手段６を信号処理部２に接続する構成としてもよい。撮像手段を用いてハイブリダイゼーション状態を検出するには、検体塩基配列に蛍光物質等で標識を付したものを使用し、ハイブリダイゼーションが生じたプローブに蛍光が生じるようにする。ハイブリダイゼーション状態モニタリングシステムの一例を図１３に示す。
【００９２】
図１３に示すように、撮像手段６により撮像されたＤＮＡチップ１の各プローブ１２１ａや１２２ａのハイブリダイゼーション反応により生じる蛍光の明度を示す信号、あるいは蛍光の明度を撮像した画像データを信号処理部２に出力する。そして、信号処理部２は、受信した信号や画像データを信号処理することにより、各プローブ１２１ａや１２２ａ毎にハイブリダイゼーション率を算出することができる。もちろん、図１に示すモニタリングシステムにもこの撮像手段６を適用することができる。
【００９３】
また、準相補プローブの構成は図３に示したものに限定されない。第１準相補プローブの変形例を図１４に示す。図１４に示すように、第１準相補プローブ（１）１２２１の塩基配列は図３と同様である。
【００９４】
第１準相補プローブ（２’）１２２２’の塩基配列は、第１準相補プローブ（１）１２２１のうちの標的相補塩基配列とは異なる塩基と隣接しない塩基が、標的相補塩基配列とは異なる塩基となるような塩基配列を有する。従って、相補プローブ１２１ａ中の標的相補塩基配列のうちの２つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列を第１準相補プローブ（２’）１２２２’が有し、かつそれら２つの塩基は互いに隣接していない。
【００９５】
第１準相補プローブ（３’）１２２３’の塩基配列は、第１準相補プローブ（２’）１２２２’のうちの標的相補塩基配列とは異なる２つの塩基と隣接しない１つの塩基が、標的相補塩基配列とは異なる塩基となるような塩基配列を有する。従って、相補プローブ１２１ａ中の標的相補塩基配列のうちの３つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列を第１準相補プローブ（３’）１２２３’が有し、かつその３つの塩基はそれぞれ互いに隣接していない。
【００９６】
このように、第１準相補プローブ（ｉ’）１２２ｉは、第１準相補プローブ（（ｉ＋１）’）１２２（ｉ＋１）と標的相補塩基配列に対する不一致の塩基数が一つ異なり、かつその不一致の塩基はそれぞれ塩基配列中で互いに隣接していなくてもよい。
【００９７】
（第２実施形態）
本実施形態は第１実施形態の変形例に関わる。第１実施形態では、一塩基多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Polymorphism）を考慮しない例を示したが、本実施形態は、標的塩基配列が一塩基多型を有する場合の実施形態に関する。第１実施形態と共通する部分の説明は省略する。
【００９８】
図１５は本実施形態のＤＮＡチップ１の詳細な構成を示す図である。図１５に示すように、基板１１に複数のプローブ電極２０１，２０２が設けられている。プローブ電極２０１は相補プローブ電極であり、４種類の相補プローブ２０１１ａ〜２０１１ｄが各相補プローブ電極２０１ａ〜２０１ｄにそれぞれ固定される。プローブ電極２０２は準相補プローブ電極であり、準相補プローブ２０２ａが固定される。相補プローブ電極２０１ａ〜２０１ｄは、塩基Ａ検出用相補プローブ電極２０１ａ、塩基Ｔ検出用相補プローブ電極２０１ｂ、塩基Ｃ検出用相補プローブ電極２０１ｃ、塩基Ｇ検出用相補プローブ電極２０１ｄである。
【００９９】
塩基Ａ検出用相補プローブ電極２０１ａには塩基Ａ検出用相補プローブ２０１１ａが固定され、塩基Ｔ検出用相補プローブ電極２０１ｂには塩基Ｔ検出用相補プローブ２０１１ｂが固定され、塩基Ｃ検出用相補プローブ電極２０１ｃには塩基Ｃ検出用相補プローブ２０１１ｃが固定され、塩基Ｇ検出用相補プローブ２０１ｄには塩基Ｇ検出用相補プローブ２０１１ｄが固定される。
【０１００】
図１６は本実施形態の相補プローブ２０１１ａ〜２０１１ｄ、準相補プローブ２０２ａ及び標的塩基配列２００の塩基配列の概念図である。標的塩基配列２００は、ＳＮＰｓ塩基２００１を有している。
【０１０１】
塩基Ａ検出用相補プローブ２０１１ａは、標的塩基配列２００のＳＮＰｓ塩基２００１をＡとした場合の標的塩基配列とは相補的な塩基配列（標的相補塩基配列：Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ）を有する。塩基Ｔ検出用相補プローブ２０１１ｂは、標的塩基配列のＳＮＰｓ塩基２００１をＴとした場合の標的塩基配列とは相補的な塩基配列（標的相補塩基配列：Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ）を有する。塩基Ｃ検出用相補プローブ２０１１ｃは、標的塩基配列のＳＮＰｓ塩基２００１をＣとした場合の標的塩基配列とは相補的な塩基配列（標的相補塩基配列：Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ）を有する。塩基Ｇ検出用相補プローブ２０１１ｄは、標的塩基配列のＳＮＰｓ塩基２００１をＧとした場合の標的塩基配列とは相補的な塩基配列（標的相補塩基配列：Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ）を有する。
【０１０２】
準相補プローブ２０２ａは、標的塩基配列２００のうち、ＳＮＰｓ塩基２００１をＴとした場合の標的相補塩基配列のうち、１つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列（Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ）を有する第１準相補プローブ（１）２０２１，２つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列（Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ）を有する第１準相補プローブ（２）２０２２，３つの塩基を他の塩基に置換した塩基配列（Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ）を有する第１準相補プローブ（３）２０２３というように、塩基がｉ個異なる塩基配列を有する第１準相補プローブ（ｉ）２０２ｉを有する。
【０１０３】
以上に示したプローブ、プローブ電極を有するＤＮＡチップを用いて第１実施形態と同様の処理を行う。検体塩基配列が標的塩基配列のＳＮＰがＴである配列であったとすると、本実施形態の場合、塩基Ｔ検出用相補プローブ２０１１ｂのハイブリダイゼーション率が最大となった場合において、塩基Ｔ検出用相補プローブ２０１１ｂのハイブリダイゼーション率をＴＯ、準相補プローブ２０２ｉのハイブリダイゼーション率をＲＴＯiとした場合、ＴＯとＲＴＯiの関係を測定することにより、ハイブリダイゼーション反応の異常や適切なハイブリダイゼーション反応温度の指標を得ることができる。
【０１０４】
このように本実施形態によれば、標的塩基配列にＳＮＰｓ塩基を有する場合であっても、第１実施形態と同様にハイブリダイゼーション反応のモニタリングを行うことができる。
【０１０５】
なお、準相補プローブ２０２ａは、標的塩基配列２００のＳＮＰｓ塩基２００１に対応する塩基がＴとした場合について説明したが、他の塩基Ａ，Ｃ，Ｇに置換された場合には別途同様に設定する。また、標的塩基配列２００のＳＮＰｓ塩基２００１に対応する塩基をＴ，Ａ，Ｃ，Ｇの４種類設定し、それぞれについて準相補プローブ２０２ａ〜２０２ｄを準相補プローブ電極２０２に固定してモニタリングを行ってもよい。
【０１０６】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【０１０７】
上記実施形態では、検体塩基配列としてＤＮＡの塩基配列を検出することにより、ハイブリダイゼーション反応の最適化を図る例を示したが、ＤＮＡ以外にも他のＲＮＡなどの塩基配列に広く適用可能である。
【０１０８】
また、出力手段の一例として表示部３により測定結果を表示する例を示したが、これに限定されることなく、最適なハイブリダイゼーション反応条件を音声により知らせてもよい。
【０１０９】
また、ハイブリダイゼーション反応の発生率の検出は、電荷量算出やコンダクタンス算出、蛍光撮像などにより行う例を示したが、これらに限定されない。
【０１１０】
また、図１１に示すＤＮＡチップ１の詳細な構成例では、固定化電極９１１、参照電極９１２、対向電極９１３の３種の電極を基板１１上に配置する例を示したが、参照電極９１２や対向電極９１３は測定手法などに応じて適宜省略し、固定化電極９１１のみを配置しても本発明を適用できることはもちろんである。参照電極９１２や対向電極９１３を省略した場合、固定化電極９１１が配置された基板とは異なる基板上にこれら参照電極９１２や対向電極９１３を配置してもよい。
【０１１１】
相補プローブ、準相補プローブ、また検体塩基配列の構成材料は特に限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、メチルホスホネート骨格等の核酸、その他核酸類似体を用いることが可能である。
【０１１２】
【発明の効果】
以上詳述したように本発明によれば、ハイブリダイゼーション条件を最適化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態に係るハイブリダイゼーション状態モニタリングシステムの全体構成を示す図。
【図２】同実施形態に係るＤＮＡチップの詳細な構成を示す図。
【図３】同実施形態に係る準相補プローブと標的塩基配列の概念図を示す図。
【図４】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図５】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図６】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図７】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図８】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図９】同実施形態に係る測定結果の一例を示す図。
【図１０】同実施形態に係るハイブリダイゼーション状態モニタリングの概念と測定結果を示す図。
【図１１】同実施形態に係るＤＮＡチップの詳細な構造を示す図。
【図１２】同実施形態に係る統計処理を用いたモニタリングシステムの一例を示す図。
【図１３】同実施形態に係る統計処理を用いたモニタリングシステムの変形例を示す図。
【図１４】同実施形態に係る準相補プローブの変形例を示す図。
【図１５】本発明の第２実施形態のＤＮＡチップの詳細な構成を示す図。
【図１６】同実施形態に係る相補プローブ、準相補プローブ２０２ａ及び標的核酸鎖の塩基配列の概念図
【符号の説明】
１…ＤＮＡチップ
２…信号処理部
３…表示部
４…電極制御部
９１…スポットブロック
１２０…標的塩基配列
１２１…相補プローブ電極
１２１ａ…相補プローブ
１２２…準相補プローブ電極
１２２ａ…準相補プローブ
９２１〜９２３…電極セット
１２２１…第１準相補プローブ（１）
１２２２…第１準相補プローブ（２）
１２２３…第１準相補プローブ（３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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