(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨｅＬａ細胞に、ＨＩＶ−１レセプターであるＣＤ４とコレセプターＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５を安定に発現できるように形質転換した動物細胞に、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列の下流に、分泌型レポータータンパク質として分泌型アルカリホスファターゼＳＥＡＰをコードする遺伝子を有する発現ベクターを導入して形質転換することによって樹立された、ＨＩＶ―１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができるヒトＨｅＬａ細胞由来動物細胞株ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０７８を、被験薬剤の存在下においてＨＩＶ−１を含む試料と接触させ、ＨＩＶ−１感染により培養上清に分泌される
レポータータンパク質を検出することを特徴とする、ＨＩＶの薬剤耐性の試験方法。
【請求項２】
分泌型レポータータンパク質である分泌型アルカリホスファターゼＳＥＡＰの検出を、比色反応、蛍光発光又は化学発光の何れか１種以上の測定系で行なうことを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶの薬剤耐性の試験方法。
【請求項３】
被験薬剤が、逆転写酵素阻害剤又はプロテアーゼ阻害剤を含む抗ＨＩＶ薬剤であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＨＩＶの薬剤耐性の試験方法。
【請求項４】
被験薬剤として２種類以上の薬剤の組み合わせを使用することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のＨＩＶの薬剤耐性の試験方法。
【請求項５】
培養上清に分泌されるレポータータンパク質を比色反応、蛍光発光又は化学発光の何れか１種以上の測定系で検出することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のＨＩＶの薬剤耐性の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＩＶの薬剤耐性の試験方法に関する。より詳細には、本発明は、被験薬剤の存在下においてＨＩＶ―１を感染させた標的細胞が培養上清に分泌するレポータータンパク質を検出することによるＨＩＶの薬剤耐性の試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Human Immunodeficiency Virus type 1（HIV-1）はLentivirusに属するRetrovirusで、後天性免疫不全症候群ＡＩＤＳの病原体である。その発見から既に十数年を経て、当初は不可抗力的に感染宿主の免疫系を破壊し、感染者の殆どは免疫不全に陥り死に至る感染症として認識されていた。しかしながら近年に至り、ＨＩＶ―１のLife Cycleに必須な逆転写酵素とウイルス粒子形成に必要な成熟蛋白の開裂に関わるプロテアーゼに対する阻害剤が種々開発され、それらの組み合わせによる強力な抗ＨＩＶ−１薬剤の投与（いわゆる、ＨＡＡＲＴ療法（Highly Active AntiRetrovirus Therapy））により、感染者体内のウイルス量を高感度なＰＣＲ法による検出限界以下に抑えることが可能になり、一部の患者にとって、もはやＨＩＶ−１感染症は慢性感染症とみなされる程度までに至っている。
【０００３】
しかしながら、多剤投与を中止するとＨＩＶ−１の速やかな増殖を来し、さらにこのウイルスの特性である逆転写酵素の変異導入率の高さから、投与薬剤に対する耐性ウイルスが容易に出現し、不用意な薬剤の選択により、同一作用機序に基づく複数の薬剤に耐性のウイルスを惹起し、以後の治療に困難をきたすことも多く報告されている。
【０００４】
根治治療法が近い将来に得られる見込みが得られない現況では、抗ＨＩＶ―１療法戦略は如何に迅速に耐性ウイルスの出現を捉え、個々の患者のウイルスに最も効果的な薬剤を組み合わせ、患者のウイルス量を低い定常状態に保つかに、重心が移ってくるものと考えられる。新たに開発される抗ＨＩＶ−１薬剤を含め、多種多様な薬剤を用いて多様化するＨＩＶ治療法において、有効な薬剤選択の判定基準としてGenotypingとPhenotypingの薬剤耐性試験が挙げられる。
【０００５】
GenotypingはPrimer DesignとＰＣＲ法によるＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子領域の増幅とその塩基配列解析が既にキット化され、技術的に確立し普及している。しかしながら検体中のウイルスゲノムの逆転写酵素あるいはプロテアーゼをコードする遺伝子のアミノ酸変異による薬剤耐性変異と、患者ウイルスの生物学的な薬剤耐性に関する成績との乖離がしばしば指摘されている。
【０００６】
一方、Phenotypingは実際のウイルス耐性を反映するものの、現在標準法として用いられている末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いた方法は、その標準化においていまだ解決すべき問題点が多々あることが指摘されている。例えば、ヒトＰＢＭＣを用いた耐性試験では結果が得られるのにしばしば数ヶ月を要し、ＰＢＭＣのDonorのロットによるＨＩＶ感受性にばらつきが認められることから得られた結果の相互比較が困難であること、労力を要することから多検体を処理するには不向きであること、またＨＩＶ−１ ｇａｇ蛋白ｐ２４ ＥＬＩＳＡによるウイルス増殖の測定のため耐性試験に要する費用が嵩むことなどから限られた研究室でしかなされていないのが現況である。しかしながら、Phenotyping法はウイルスの生物学的耐性を反映していることから、薬剤選択の判断基準として欠かすべからざる情報を提供するものである。
【０００７】
これらの問題点を克服するため、本発明者らは迅速簡便なＨＩＶ−１感染価測定細胞株ＭＡＧＩＣ−５Ａを用いた薬剤耐性試験について報告してきた（蜂谷敦子、相沢佐織、田中真理、高橋由紀子、平林義弘、井田節子、巽  正志、岡  慎一、ＣＣＲ５発現ＨｅＬａ／ＣＤ４−ＬＴＲ−βＧａｌ細胞（MAGIC5 clone 1-10）を用いた抗ＨＩＶ薬耐性検査に関する検討 第１３回日本エイズ学会 １９９９年１２月 東京、Hachiya, A., Aizawa-Matsuoka,S., Tanaka, M., Takahashi, Y., Ida, S., Gatanaga, H., Hirabayashi, Y., Kojima, A., Tatsumi,M. and Oka, S. : Rapid and simple phenotypic assay for drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 by using CCR5-expressing HeLa/CD4 cell clone 1-10 (MAGIC-5) Antimicrob. Agents Chemother. 45: 495 - 501, 2001.）。この細胞株ＭＡＧＩＣ−５ＡはＨＩＶ−１のレセプターであるＣＤ４とコレセプターＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５をヒト子宮頚癌細胞株ＨｅＬａに安定に発現させるように形質転換し、感染したＨＩＶ−１の産生するＴａｔ蛋白により、組み込まれたＬＴＲ下流のＳＶ４０核移行シグナルを付け加えたβ−Galactosidaseを駆動し、Ｘ−Ｇａｌ染色により迅速簡便に試料検体中のＨＩＶ−１の感染価を測定するように工夫したIndicator Cellである。この細胞株を用いることにより、患者血清からの迅速なウイルス分離と、それに引き続く、抗逆転写薬剤および抗プロテアーゼ薬剤に対する耐性株を２週間以内に検出しうることが報告されている。
【０００８】
またこの細胞株はＨＩＶ−１の感染価測定という基本的技術をなすことから多くのＨＩＶ−１研究領域に応用されうる可能性がある。現在までの所、薬剤耐性Phenotype Assayおよび抗ＨＩＶ薬剤スクリーニングなどにも応用されてきている。一般に用いられているＨＩＶ−１ ｇａｇ蛋白ｐ２４のＥＬＩＳＡによる測定もしくは逆転写酵素の活性測定に基づくものに比較して迅速、簡便、かつ経済的であるものの、この細胞株によるＨＩＶ感染価測定は顕微鏡下におけるＸ−ｇａｌにより青染した細胞核の計数に基づくので、多検体迅速処理には向いていなかった。今後、抗ＨＩＶ−１薬剤の開発が進展し、多くの薬剤が臨床応用されることが予測されることから、より迅速簡便な測定系が求められていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ＨＩＶ−１感染価測定細胞株を用いた迅速簡便な薬剤耐性試験方法を提供することを解決すべき課題とした。特に、本発明は、多検体を迅速に処理することができる薬剤耐性試験方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＭＡＧＩＣ−５Ａを用いたPhenotyping薬剤耐性試験をさらに迅速簡便および高感度に進化させることを目的として、インジケーター細胞ＭＡＧＩＣ−５ＡにＬＴＲ下流にＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）を組み込んだ発現ユニットをさらに組み込み、ＨＩＶ感染により培養上清に分泌されるアルカリホスファターゼを化学発光で検出することによりHigh throughputな測定系を確立することに成功した。さらにこの細胞を用いた薬剤耐性試験により、各種抗ＨＩＶ薬に対するＨＩＶの薬剤耐性を評価できることも判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、ヒトＨｅＬａ細胞に、ＨＩＶ−１レセプターであるＣＤ４とコレセプターＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５を安定に発現できるように形質転換した動物細胞に、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列の下流に、分泌型レポータータンパク質として分泌型アルカリホスファターゼＳＥＡＰをコードする遺伝子を有する発現ベクターを導入して形質転換することによって、ＨＩＶ―１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができるヒトＨｅＬａ細胞由来動物細胞株ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０７８を樹立することに成功したものであり、該樹立された動物細胞株を用いて、該動物細胞株を被験薬剤の存在下においてＨＩＶ−１を含む試料と接触させ、ＨＩＶ−１感染により培養上清に分泌されるレポータータンパク質を検出することにより、多検体を迅速、高感度に試験することができるＨＩＶの薬剤耐性の試験方法を確立することに成功したものである。
【００１２】
好ましくは、分泌型レポータータンパク質は比色反応、蛍光発光または化学発光の何れか１種以上の測定系で検出できるタンパク質である。特に好ましくは、分泌レポータータンパク質はアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼである。
【００１３】
本発明で用いる動物細胞は、ＨＩＶ―１  ＬＴＲ配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換することにより得られる細胞である。本発明で用いる動物細胞は、哺乳類動物細胞に由来する細胞であり、ヒトＨｅＬａ細胞に由来する細胞である。本発明で用いる動物細胞は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０７８を有する動物細胞株である。
【００１４】
好ましくは、被験薬剤は、逆転写酵素阻害剤又はプロテアーゼ阻害剤を含む抗ＨＩＶ薬剤であり、被験薬剤としては２種類以上の薬剤の組み合わせを使用することもできる。
好ましくは、培養上清に分泌されるレポータータンパク質を比色反応、蛍光発光または化学発光の何れか１種以上の測定系で検出する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の薬剤耐性の試験方法は、ＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞を被験薬剤の存在下においてＨＩＶ−１を含む試料と接触させ、ＨＩＶ−１感染により培養上清に分泌されるレポータータンパク質を検出することを特徴とする。先ず、本発明で用いる、ＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞について説明する。
【００１６】
本発明で用いる動物細胞株を樹立するための動物細胞としては、ＨＩＶ−１が感染することができる細胞であれば、その種類は特には限定されないが、通常、ＨＩＶ―１の感染には、ＨＩＶ−１ウイルスレセプターＣＤ４が必要とされることから、本発明で用いる動物細胞は、ＨＩＶ−１ウイルスレセプターＣＤ４を有していることが好ましい。また、本明細書中で上記した通り、ＨＩＶ−１の標的細胞への侵入過程には細胞側の主要ウイルスレセプターであるＣＤ４分子以外に、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１はＣＸＣＲ４を、マクロファージ指向性ＨＩＶ―１はＣＣＲ５をコレセプターとして用いていることから、本発明で用いる動物細胞もこれらのコレセプターを有していることが好ましい。広範なＨＩＶ−１の感染価を分析することを目的とする場合には、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の両方を発現している動物細胞を使用することが好ましい。
【００１７】
これらのＨＩＶ−１ウイルスレセプターＣＤ４とＨＩＶ−１ウイルスコレセプターは出発となる動物細胞がもともと保持し、かつ発現している場合にはそれらをそのまま利用すればよい。また、出発となる細胞がこれらを発現していない場合には、好適な発現ベクターに上記レセプターまたはコレセプターをコードする遺伝子を組み込んだ組み換え発現ベクターを出発動物細胞に導入することにより、当該レセプターまたはコレセプターを当該動物細胞中に発現させることができる。
【００１８】
本発明で用いる動物細胞を樹立するために用いることができる出発細胞の種類は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒトまたはサルなどの霊長類や、マウス、ラット又はハムスターなどのげっ歯類など）の動物細胞であり、より具体的には、ヒト由来ＨｅＬａ細胞又はヒト由来ＨＯＳ細胞などが挙げられる。
【００１９】
目的のレセプター又はコレセプターを発現している細胞を選択するための手法としては、当該レセプター又はコレセプターを含む組み換え発現ベクター中に抗生物質耐性遺伝子を当該レセプター又はコレセプターと一緒に発現され得るように組み込んでおき、当該抗生物質を含む培地中で培養することにより、目的のレセプター又はコレセプターを発現する細胞を選択することができる。また、目的の細胞を一つの細胞に由来する単一の細胞としてクローニングするための手法としては限界希釈法を挙げることができる。
【００２０】
例えば、構成的にＣＸＣＲ４を発現しているＨｅＬａ細胞は出発細胞として使用する場合には、このＨｅＬａ細胞に抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性遺伝子）を乗せたマウスレトロウイルスベクターを形質転換してＣＤ４を発現させ、所望によりＬＴＲ−βＧａｌ発現ユニットをハイグロマイシン（Hygromycin）耐性遺伝子とともに形質転換し、生育細胞を選択する。さらに、ＣＤ４発現増強のためのＣＤ４発現とPuromycin耐性を形質転換体に付与する発現ベクター、並びにＣＣＲ５発現とBlasticidin耐性を形質転換体に付与する発現ベクターを上記細胞に形質転換し、限界希釈法により目的とする細胞をクローニングする。この操作でクローニングされる目的細胞は、Ｇ４１８、Hygromycin、PuromycinおよびBlasticidinの合計４種の選択薬剤に対して耐性を有している。
【００２１】
本発明で用いる動物細胞は、ＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができることを特徴とする。本発明で用いる動物細胞はＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現し、発現した分泌型レポータータンパク質は細胞外に分泌され、培養液中に放出される。本発明で用いる動物細胞を含む培養系にＨＩＶ−１を含む試料を添加し、その培養液を採取し、該培養液中に分泌されたレポータータンパク質を適当な方法で検出又は分析することにより、試料中のＨＩＶ−１の感染価を測定することができる。
【００２２】
培養液中に分泌されたレポータータンパク質の検出方法は特に限定されないが、例えば、比色反応、蛍光発光または化学発光などにより検出する方法が挙げられる。分泌レポータータンパク質の種類は特に限定されないが、種々の酵素活性基質が入手しやすく、測定感度が高く、測定手技の簡略化が可能なものが好ましく、例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼなどが挙げられ、この中でもアルカリホスファターゼが特に好ましい。
【００２３】
本発明によるＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現する動物細胞を作成するための好ましい方法の一つとしては、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に形質転換する方法が挙げられる。上記方法で用いる発現ベクターには、所望の細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００２４】
例えば、本明細書中で上記したようなＧ４１８、Hygromycin、PuromycinおよびBlasticidinの合計４種の選択薬剤に対して耐性を有し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４およびＣＣＲ５を発現する細胞に対して、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換することにより、本発明で用いる動物細胞を作成することができる。この場合、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクター中に組み込むことができる薬剤耐性遺伝子としては、上記４種の薬剤耐性遺伝子以外であればよく、例えば、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子などが挙げれる。
【００２５】
より具体的には、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ＨＩＶ−１ウイルスレセプターＣＤ４とＨＩＶ−１ウイルスコレセプターとを有する細胞にトランスフェクションし、薬剤で選択し、生存コロニーを得ることができる。これらを増殖させたクローン細胞をマイクロプレートに２重に播き、一方はＨＩＶ−１を感染させ、他方は非感染対照とする。感染２日後、培養上清を採取し、６５℃で１５分間処理して内在性アルカリホスファターゼとＨＩＶの不活化する。培養上清に分泌されたＳＥＡＰは例えば、p-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応で測定し選別することができる。ＨＩＶ非感染ではＳＥＡＰ活性が低く、ＨＩＶ感染により高いＳＥＡＰ活性を示すクローンを選別することにより、目的の細胞を樹立することができる。
上記した方法で樹立することができる細胞の一例としては、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８０７８を有する細胞が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いる動物細胞の培養方法、培養条件は細胞の種類、性質などに応じて適宜選択することができる。例えば、ＨｅＬａ細胞に由来する細胞株の場合には、抗生物質（例えばＫａｎａｍｙｃｉｎ等）を含み、５％ＦＣＳを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium（High glucose ; Gibco）中で３７℃で５％ＣＯ2で培養することができる。
【００２７】
本発明の薬剤耐性の試験方法は、上記したような動物細胞を被験薬剤の存在下においてＨＩＶ−１を含む試料と接触させ、ＨＩＶ−１感染により培養上清に分泌されるレポータータンパク質を検出することを特徴とする。
被験薬剤としては、抗ＨＩＶ薬が好ましく、より具体的には、逆転写酵素阻害剤又はプロテアーゼ阻害剤を含む抗ＨＩＶ薬剤が好ましい。逆転写酵素阻害剤としては、ＡＺＴ／ＺＤＶ（zidovudine：3'-Azido-3'-deoxythymidine）、ｄ４Ｔ（sanilvudine：2',3'-didehydro-3'-deoxy-thymidine）、３ＴＣ（lamivudine：2'-deoxy-3'-thiacytidine）、ＣＯＭ（ＺＤＶ／３ＴＣ合剤）、ｄｄＩ（didanosine：2',3'-dideoxyinosine）、ｄｄＩＥＣ（didanosine：2',3'-dideoxyinosine）、ｄｄＣ（zalcitabine：2',3'-dideoxycytidine）、ＡＢＣ（abacavir）、ＮＶＰ（nevirapine）、ＥＦＶ（efavirenz）、ＤＬＶ（delavirdine）などが挙げられ、またプロテアーゼ阻害剤としてはＲＴＶ（ritonavir）、ＳＱＶ（saquinavir）、ＮＦＶ（nelfinavir）、ＩＤＶ（indinavir）、ＡＰＶ（amprenavir）、ＬＰＶ（ritonavir）などが挙げられる。
また、被験薬剤としては２種類以上の薬剤の組み合わせを使用することもできる。
【００２８】
本発明の方法を実施するには、先ず、ＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞をマイクロプレートに接種し、ＨＩＶ−１を含む試料を培地で段階的に希釈し、各穴に添加する。さらに適当な希釈系列の抗ＨＩＶ薬を添加し、適当な培養条件（例えば、温度３７℃で５％ＣＯ2）で一定時間インキュベートした後、各穴の上清を回収する。次いで、内在性レポータータンパク質とＨＩＶの不活化のために６５℃で１５分間加熱する。この上清を用いて常法に従って、レポータータンパク質のアッセイを行うことができる。レポータータンパク質がアルカリホスファターゼの場合には、例えば、ｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応、ＭＵＰを基質とした蛍光発光、及びＣＳＰＤを基質とした化学発光測定系などを利用することができる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２９】
【実施例】
実施例１：ＨＩＶ−１感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞の樹立
全てのＨｅＬａ細胞由来細胞株は、抗生剤として５０μｇ／ｍｌのＫａｎａｍｙｃｉｎを含み、５％ＦＣＳを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium（High glucose ; Gibco）で３７℃で５％ＣＯ2で培養した。既に本発明者が樹立したＣＣＲ５発現ＭＡＧＩ細胞株ＭＡＧＩＣ−５Ａは、元来の親株ＨｅＬａ細胞にＮｅｏ耐性遺伝子を乗せたマウスレトロウイルスベクターによりＣＤ４を発現し、ＬＴＲ―βＧａｌ発現ユニットはＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子とともに乗せて選択されＦＡＣＳ（Fluorescent Activated Cell Sorter）で選別された細胞株であるＭＡＧＩ細胞株にさらにＣＤ４発現増強のための発現ベクターpEFBOSpacCD4（ＣＤ４発現とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性をＴｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔに与える）、ＣＣＲ５発現のため発現ベクターpEFBOSbsr（ＣＣＲ５発現とBlasticidin耐性をTransformantに与える）により形質転換され限界希釈法によりクローニングされ樹立した細胞株で、Ｇ４１８、Hygromycin、PuromycinおよびBlasticidinの合計４種の選択薬剤に耐性になっていた。
【００３０】
HIV-1 subtype B由来のＬＴＲの下流にpSEAP2-Basic（Clontech）からTranscriptional Blockerとともにレポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を組み込み、さらに新たな選択遺伝子としてＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を載せた発現ベクターを構築した。この発現ベクターをＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞株にトランスフェクション後、Ｚｅｏｃｉｎで選択培養し生残したコロニー１６５個を得た。これらの増殖させたクローン細胞を９６穴マイクロプレートに２重に播き、一方はＨＩＶ−１を感染させ一方は非感染対照とした。感染２日後培養上澄１００μｌ採取し、内在性アルカリホスファターゼとＨＩＶの不活化のため６５℃で１５分間処理し測定まで−２０℃で保存した。検体中の分泌されたＳＥＡＰはL-Homoarginineを内在性アルカリホスファターゼ阻害剤として添加したｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応で測定し選別した（Berger J. et al., Secreted placental alkaline phosphatase : a powerull new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66 : 1-10, 1988）。
【００３１】
ＨＩＶ非感染ではＳＥＡＰ活性が低く、ＨＩＶ感染により高いＳＥＡＰ活性を示すクローンを選別し、選択薬剤非存在下で連続２回の限界希釈法を行った。即ち、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ存在下の選択培養で総計１６２個の生残コロニーが得られた。しかしながら生残した殆どのコロニーはＨＩＶ感染の有無にかかわらず高いＳＥＡＰを分泌していた。２個の数少ないコロニーから、ＨＩＶ非感染ではBackgroud程度のＳＥＡＰしか検出せず、ＨＩＶ感染により多量のＳＥＡＰを分泌する細胞群から２度にわたる限界希釈法で安定したＨＩＶ−１感受性を示したクローンＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ ３−１−１を樹立した。
ＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ ３−１−１は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７８として、平成１２年１０月１６日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
【００３２】
実施例２：薬剤耐性試験
（方法）
１．対象者及びウイルス分離
１９９７年１２月から１９９９年１月までに国立医療センターエイズ治療研究開発センターに通院した患者１３７名２４５検体について検査を行った。同意を得た患者から採血し、ｐｌａｓｍａを分離した。分離前日に５％ＦＣＳを添加したDulbecco's MEM培地に懸濁したＭＡＧＩＣ５Ａ（巽  正志、小島朝人：ＨＩＶ−１感染価測定に適したＣＣＲ５発現ＨeＬａ／ＣＤ４-LTR-beta Gal細胞の樹立と応用について  第１０回日本エイズ学会総会、１９９７年１２月、熊本。Tsumi,M. and Kojima,A.: Establishment of HeLa/CD4-LTR=bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998）を４８穴マイクロプレートに２０,０００個／ｗｅｌｌ播き、終夜培養で細胞を付着させた。感染当日患者由来のｐｌａｓｍａ １ｍｌを微量遠心機で１５,０００ｒｐｍ ４０分間遠心してウイルスを沈殿させ、上澄９００μｌを取り除き、４００μｌのInfection Medium（２０μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｒａｎ  ５％ＦＣＳ−Ｄ’ＭＥＭ）を加え、懸濁後ＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞に接種した。３７℃ ５％ＣＯ2インキュベーターで２時間培養し、５％ＦＣＳ−Ｄ’ＭＥＭ培地に交換後、ウイルス分離陽性まで観察培養を継続した。分離したウイルスは使用するまで−８０℃に保存した。
【００３３】
１．薬剤耐性試験
感染価測定：
感染前日に９６穴マイクロプレートにＭＡＧＩＣ―５Ａ細胞を１０,０００個／ｗｅｌｌ播き培養し、感染当日、ウイルスを融解しInfection Mediumにて１倍から１０００倍まで段階希釈し、各ウェルに１００μｌずつ接種し、２時間培養し、洗浄後新鮮な培養液を加えさらに培養した。４８時間後培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、固定液（１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド、ＰＢＳ中）を１００μｌ／ウェル加え、室温で５分間固定し、再度ＰＢＳで洗浄後染色液（４ｍＭ フェロシアン酸カリウム、４ｍＭ フェリシアン酸カリウム、１６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４００μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ、ＰＢＳ中）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃で２時間インキュベートし、顕微鏡下で細胞核が青く染まった細胞数を計測し、試料検体中のＨＩＶ−１感染価とした。以後の薬剤耐性試験では９６穴マイクロプレートの各穴に１００〜３００ｂｃｃ（Blue cell count）になるように検体を希釈し用いた。
【００３４】
逆転写酵素阻害剤：
感染前日に９６穴マイクロプレートにＭＡＧＩＣ−５ＡもしくはＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を１０，０００個／ｗｅｌｌ播き、培養してあらかじめ細胞を付着させた。感染当日、１００〜３００ｂｃｃのウイルスをInfection Mediumにて希釈し、１００μｌずつ加えた。さらに１０倍希釈系列を作製した抗ウイルス薬を１００μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて培養した。４８時間後、ＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞の方は上記のように染色を行い、Blue cell数をかぞえ、一方ＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７８）の方は培養上澄を採取し、そのアルカリホスファターゼ活性をReporter Assay Kit-SEAP-(SAK-101；Toyobo Co. Japan)を用いて化学発光をLuminometerにより計測し、またｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応では波長４０５ｎｍで測定した。薬剤を加えていないウェルの値を１００％とし、５０％増殖阻止が得られた濃度をＩＣ５０とした。
【００３５】
プロテアーゼ阻害剤：
１００〜３００ｂｃｃとなる濃度のウイルスをInfection Mediumにて希釈し、９６穴マイクロプレートに予め播いておいたＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞に１００μｌずつ加えた。さらに１０倍希釈系列を作製した抗ウイルス薬を１００μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて培養した。７２時間後、前日用意しておいたＭＡＧＩＣ−５ＡおよびＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞の９６穴のプレートに上清１００μｌとInfection Medium  １００μｌを加え培養した。４８時間後、逆転写酵素阻害剤薬剤の項と同様にして、阻害剤を加えていないウエルの値を１００％とし、５０％増殖阻止が得られた濃度をＩＣ５０とした。
なお、全ての耐性試験には阻害剤感受性ウイルスの対照として感染性分子クローンＨＩＶ−１ ＮＬ４３２株を平行してアッセイし、この株のＩＣ５０値に対して何倍の耐性として、臨床分離株の耐性を表現した。
【００３６】
Genotype（遺伝子型）での耐性検査：
患者血漿１００ｍｌからハイピュアＲＮＡアイソレーションキット（Roche）を用いてＲＮＡの抽出を行い、One Step RNA PCR Kit（Perkin Elmer）を用い、ＨＩＶ−１のｐｏ１領域を増幅した。Wizad TM PCR Prep DNA Purification System（Promega）を用いてＰＣＲ反応産物を濃縮し、電気泳動した後、目的のフラグメントを含むゲル部位を切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（Takara Co.）を用いて精製を行った。こうして得られた各サンプルの塩基配列をAuto sequencer（ABI model 310）を用いて決定した。アミノ酸配列は、塩基配列より推定し、耐性の有無を調べた。
【００３７】
（結果）
１．ＭＡＧＩＣ−５Ａとウイルス量の相関
ＭＡＧＩＣ−５Ａを用いて、２１０検体中１２９検体からウイルスを分離した。また患者plasma中のウイルス量とウイルス分離率を調べたところ、ウイルス量が４乗以上で分離率７７％、４乗未満で８％であった。このことからウイルス量が４乗以上であれば、この方法を用いてウイルス分離が可能であると認められた。
【００３８】
２．ＮＬ４３２における再現性
逆転写酵素阻害剤としてＡＺＴ（3'-Azido-3'deoxythymidine）、ｄ４Ｔ（2',3'-didehydro-3'-deoxy-thymidine）、および３ＴＣ（2'-deoxy-3'-thiacytidine）で、またプロテアーゼ阻害剤としてＲＴＶ（ritonavir）、ＳＱＶ（saquinavir）、およびＮＦＶ（nelfinavir）についてHIV-1 Wild株感受性ウイルスとしてＮＬ４３２での薬剤耐性試験の再現性（triplicate×５回）を調べたところ、表１に示す通り良好な再現性が示された。
【００３９】
【表１】
0004011881.tif 000002
【００４０】
３．表現型（phenotype）と遺伝子型（genotype）の比較
このＭＡＧＩＣ−５Ａを用いて、得られた臨床分離株１２９検体と実験室株２検体を用いて、各薬剤の耐性検査を行った。さらに臨床分離株は、ＡＺＴ４６検体、ｄ４Ｔ４７検体、３ＴＣ４８検体、ＲＴＶ４１検体、ＳＱＶ４１検体、およびＮＦＶ４３検体について、遺伝型と解析結果と比較した。また無治療での各薬剤に対するＩＣ５０の値をＴａｂｌｅ．２に示した。無治療であるにもかかわらず、ＡＺＴ、ＲＴＶ、ＳＱＶ、ＮＦＶについては、ＮＬ４３２と比べ４倍以上耐性に傾いていることが認められた。
【００４１】
【表２】
0004011881.tif 000003
【００４２】
以下、それぞれの薬剤に対する耐性検査結果を記載する。
ＡＺＴ（図１を参照）：ＮＬ４３２を用いて得られた値を１倍とし、無治療群でのＡＺＴに対するphenotypeでの耐性の度合いは、０．１〜５倍（平均１．２倍）であった。それに比べgenotypeでの耐性変異がアミノ酸配列番号４１，２１５位の単独もしくは、両者の組合わさった変異が認められた場合、２．６倍〜１０６倍（平均７０倍）と耐性に傾くことがわかった。また以前から報告があるように、４１，２１５，１８４位が変異すると耐性ではなく、０．５３〜１４倍（平均６．７倍）と感受性を取り戻していることが確認された。そしてこの３つの組み合わせに、６７，２１９位の耐性変異が加算された場合には、２．６〜１０６倍（１１２倍）となり、再び高度耐性を獲得していることがわかった。
【００４３】
３ＴＣ（図２を参照）：無治療群での３ＴＣに対するphenotypeでの耐性の度合いは、０．１２〜３．８６（平均１．４倍）であった。それに比べgenotypeで１８４位の耐性変異が認められた場合、すべての検体において１２０倍以上の高度耐性を獲得していた。また１８４位がwild typeであっても他の逆転写酵素阻害剤や３ＴＣの治療歴がある場合は０．１２〜３１倍（平均９．５倍）と低い耐性が認められた。
【００４４】
ｄ４Ｔ（図３を参照）：無治療群でのｄ４Ｔに対するphenotypeでの耐性の度合いは、０．４〜３．２倍（平均１倍）であった。ｄ４Ｔでは耐性に関連するアミノ酸置換は不明な部分が多く、現在知られている７５位の変異との相関を調べてみたが、当センターにおいて７５位に対する変異を獲得したウイルスは見つかっているものの、耐性変異と報告されているアミノ酸置換ではなかった。しかし３ＴＣと同様，７５位がwild typeであっても他の逆転写酵素阻害剤や３ＴＣの治療歴がある場合は０．０４〜８．１８倍（平均２．３倍）と低い耐性が認められた。
【００４５】
ＲＴＶ（図４を参照）：無治療群１５名、またＲＴＶの治療歴があるがgenotypeでの耐性変異が全く認められない６名に対するphenotypeでの耐性変異の度合いは、０．３３〜２．５３倍（平均０．８倍）であった。primary mutationである８２位がwild typeであり、secondary mutationが１つ（３６か７１位）の変異があれば０．３３〜１．３３倍であるが、２つ以上の変異が伴うと１２〜１０６倍（平均７２倍）と中等度耐性から高度耐性を獲得していた。そしてprimary mutationである８２位の耐性変異が伴うと、secondary mutationの数にかかわらず、すべて１００倍前後（平均１０５倍）の高度耐性を獲得していた。
【００４６】
ＳＱＶ（図５を参照）：無治療群１６名、またＳＱＶの治療歴があるがgenotypeでの耐性変異が全く認められない１２名に対するphenotypeでの耐性変異の度合いは、０．１〜１０倍（平均１．９倍）であった。またsecondary mutationが１つ（１０か８２位）の変異であれば、０．３４〜３．２倍であるが、primary mutationである９０位に耐性変異が認められると６．６〜１００倍（平均６０．７倍）と中等度耐性から高度耐性を獲得していた。
【００４７】
ＮＦＶ（図６を参照）：無治療群４名、またＮＦＶの治療歴があるがgenotypeでの耐性変異が全く認められない２名に対するphenotypeでの耐性変異の度合いは、０．３３〜１０倍であった。そして無治療であるにもかかわらず、secondary mutationである３６、６３、７７位の単独変異もしくは６３，７７位の組合わさった変異については、ウイルスのpolymorphismであると考えられた。そのため無治療群ではsecondary mutationが１つであれば、０．３〜４．６倍（平均１．２倍）、２つ同時に認められれば０．３〜１．５倍（平均１．３倍）とどちらも感受性を示しているのに対して、治療群については１つであれば、０．６〜１０３倍（平均２１．３倍）、２つ同時に認められれば１０．６〜３３３倍（平均１１５倍）と中等度耐性から高度耐性を獲得していた。またprimary mutationである３０位に耐性変異が認められると５３〜３３３（平均１６５倍）と高度耐性を獲得していた。
【００４８】
ＭＡＧＩＣ−５ＡとＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いた薬剤耐性試験の相関：上記で基本的にＭＡＧＩＣ−５Ａを用いたBlue Cell Countで計測した検体を同時に、ＭＡＧＩＣ−５ＡとＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いた感染価測定系で平行してその薬剤耐性を検討した。ＡＺＴ，ＮＶＰおよびＮＦＶについてそれぞれ２６検体を、横軸にＳＥＡＰ、縦軸にBlue Cell Countで得られた各薬剤のＩＣ５０を示す濃度をプロットすると、高濃度域から低濃度域にわたる広い濃度域で高い相関を示した。またこの相関は、実験室株ＨＩＶ−１  ＮＬ４３２に対する相対的な耐性度としてプロットしても同様に、高い相関を示した（図７及び図８を参照）。ＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞を用いたBlue Cell CountとＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いたChemiluminescence測定は、途中の培養過程に係わる労力はほとんど変わらないが、最終段階の測定の際、Blue Cell CountはComputer Softによる画像処理によりその労力は軽減するもの、マイクロプレート１枚を読み切るには１時間弱の時間がかかるのに対して、マイクロプレート対応のLuminometerを用いれば数十秒で測定が終了するのは、多検体処理が必要な際は、かかる労力は大きくことなる。検出感度の点では、例えば９６穴マイクロプレートの穴に接種された検体中に感染性ＨＩＶ−１が十数個の時でも、ＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞では固定して直接顕微鏡下で判定できる利点があるが、ＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰでもＨＩＶ−１非感染のバックグラウンドの数倍の有意な化学発光値が得られ、なおかつ培養を継続して翌日にはより明確な計測値が得られる利点もある。しかしながら、薬剤耐性試験に関しては、培養の初めに充分な感染価（１００〜３００ｂｃｃ／ｗｅｌｌ）のウイルスを接種するので実際には問題にはならない。またデータには示さないが、ｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応でも化学発光での測定系と比べて感度の点では劣るものの、充分実用に耐える成績が得られた。
【００４９】
次に、新たに許可された抗ＨＩＶ薬であるアバカビア（ＡＢＣ）、ネビラピン（ＮＶＰ）およびアンプレナビア（ＡＰＶ）について、標準ウイルス株としてＨＩＶ―１ＮＬ４３２を用いて薬剤耐性試験の再現性を検討した。その結果、表３に示すように良好な再現性が得られた。以下、それぞれの薬剤に対する耐性試験結果を記載する。
【００５０】
【表３】
0004011881.tif 000004
【００５１】
アバカビア（ＡＢＣ）（図９を参照）：逆転写酵素阻害剤であるアバカビア（ＡＢＣ）は、６５，７４，１１５，１８４の耐性変異が知られている。無治療者では平均して１６．２倍と耐性に傾いた。さらに１８４に７４の耐性変異が加わると２６．１倍と耐性度が上昇した。
【００５２】
ネビラピン（ＮＶＰ）（図１０を参照）：非拡散系逆転写酵素阻害剤であるネビラピン（ＮＶＰ）は１０３，１０６，１０８、１８１，１９０の耐性変異が知られている。これらはすべてＮＶＰに対するprimary mutationである。無治療者が１．０５倍であり、逆転写酵素阻害剤を使用したことがある患者においても１．５１倍と感受性の範囲であった。つまり逆転写酵素阻害剤とネビラピンでは交差耐性は認められなかった。また１８１の変異の２７．６倍を除いて、そのほか全ての（１０６、１０３、１９０）耐性度が１００倍以上と値が振り切れており、高度耐性を獲得していた。また、非拡散系逆転写酵素阻害剤のほとんどの耐性変異は交差耐性として認められているが、唯一ＮＶＰの１０６の耐性変異はＥＦＶ（エファビレンツ）に対して交差耐性が認められていない。今回測定した１０６の耐性変異が認められた検体は、ＮＶＰに対して１３１倍以上と高度耐性であるが、ＥＦＶに対して５．７倍と耐性を獲得していないことがわかった。
【００５３】
アンプレナビア（ＡＰＶ）（図１１を参照）：無治療者では１．４７倍であり、また無治療でありながらポリモフィズムとして１０に変異を獲得している検体でも１．０４倍と感受性の範囲であった。しかし同じ１０に変異が認められ、治療を行っているものについては１９．６倍と耐性度が上昇していることがわかった。さらにアンプレナビアのsecondary mutationである１０，４６，８４がそろうと、平均して２３２倍と耐性度が上昇していた。プロテアーゼ阻害剤であるアンプレナビアは、primary mutationである５０が他のプロテアーゼ阻害剤に対する耐性変異ではないため交差耐性の少ない薬剤として知られていたが、しかし、secondary mutationだけでも複数存在すれば他のプロテアーゼ同様耐性に傾くことがわかった。また以前にＰａｒｋｉｎらによると過去にＩＤＬ、ＮＦＶを使用した患者の２０％で見られるＮ８８Ｓの変異は、ＡＰＶに対しても感受性が戻ると報告（Journal of Viorology, 2000, 4414-4419）していた。今回のアッセイにおいても４６の耐性変異が認められる群では２４．２倍耐性であるのに対し、４６にＮ８８Ｓが認められていると５．５倍と感受性が戻り、これらの患者は過去にＮＦＶによる治療を受けていたことがわかった。
【００５４】
（考察）
現在、薬剤耐性変異ウイルスを検出するためには、（１）薬剤作用領域の塩基配列の変異を調べる遺伝子型（genotype法）と（２）直接ＨＩＶを薬剤存在下で培養し、増殖を抑えることのできる濃度（ＩＣ５０、ＩＣ９０）を求めて評価する表現型（phenotype法）、そして（３）組換え（recombinant）ＤＮＡ技術を利用し、患者由来の感染性recombinant ＨＩＶを作り、phenotype法を行うrecombinant virus assayの３つが挙げられる。このうち短時間で、操作性にも優れ、比較的容易に結果が得ることができるgenotype法が主流となっているが、その反面、報告されていない耐性変異の出現や複数の変異蓄積した場合での総合的な判断は難しいとされている。それに比べ、耐性度を総合的に判断することができるphenotype法での検出方法は、現在急速に改善されつつあるとはいえ、いまだに時間や費用、労力が必要であると考えられ、一般的には行われていない。またrecombinant virus assayについても、患者由来のウイルスの薬剤作用領域をＨＩＶベクタープラスミドに組み込む技術が非常に熟練を要し、得られた組換えウイルスが増殖しないことも多く、さらにｐｏ１遺伝子などの薬剤作用領域以外の領域がＨＩＶ−１粒子形成に関与していることが知られており、得られた組換えウイルスが実際の患者体内のウイルスの性状を反映しているか判明していないことからphenotype法と同様、一般的にはおこなわれていない。
【００５５】
そこで今回本発明者らは、ＭＡＧＩＣ−５ＡとＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞株によるphenotype法を用いて、これらの問題を解決し、臨床分離株から直接、感受性試験を迅速に行うことを目的とし、検査を行った。従来でのＰＢＭＣを用いたphenotype法では、結果が得られるまでに数ヶ月を要し、また判定するのにｐ２４を測定するという点でコストがかかるが、この細胞を用いることによりウイルス分離から薬剤感受性試験までわずか２週間ほどで結果が得ることができ、細胞の染色もしくは培養上澄の酵素活性測定により感染の有無を迅速に判定することができた。
【００５６】
本実施例の結果から、無治療の患者ではコントロールであるＮＬ４３２に比べ、耐性の度合いが平均して１倍前後であったが、中には１０倍という検体が認められた。これらのウイルスは、genotype法でも耐性変異が認められていないにもかかわらず、phenotype法では低度耐性を獲得していることが判明し、今後臨床において治療開始時の薬剤選択の判断に参考となるデータであることがわかった。さらにgenotype法とphenotype法を比較したところ、アミノ酸配列番号７５位の耐性変異を検出出来なかったｄ４Ｔを除く薬剤については、良好な相関が得られた。しかし３ＴＣ、ｄ４Ｔについては、wild typeであっても、逆転写酵素阻害剤の治療歴があるものでは、低度耐性が認められた。
【００５７】
またＡＺＴについても４１，１８４，２１５位のアミノ酸変異が同時に認められた場合は、感受性が復帰していることも、この細胞を用いて確認された。しかしこのようなアミノ酸変異によって起こる感受性の変化が、酵素と基質との反応、相互作用という点からどのように起こっているかについては、現段階の技術と知識では明らかにされていない。さらにプロテアーゼ阻害剤では、primary mutationが認められると１００倍前後の高度耐性を示し、genotype法とphenotype法で得られた結果が一致したことが認められた。ＨＩＶ−１ウイルスは薬剤投与下に適応するためsecondary mutationを獲得することが知られている。他のプロテアーゼ阻害剤で治療歴のある患者では、ＮＦＶに対する反応が５０％程度しかないということが報告されたが、今回のこのようなケースにおいてＮＦＶに対するprimary mutationが認められなくてもsecondary mutationが見つかった。このsecondary mutationは、無治療の患者では感受性に示しているものの、プロテアーゼ阻害剤に治療歴がある患者については、耐性を示しているということが、phenotype法により示唆された。これらの成績からＭＡＧＩＣ−５Ａを用いたphenotype法は、genotype法で判断できなかった耐性の度合いを明確にし、今後の多剤併用療法で使用する薬剤選択の判断の一つとして有用であると考えられた。
【００５８】
薬剤耐性試験におけるＭＡＧＩＣ−５ＡとＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いた成績の比較から、両者間では高い相関が得られた。このことはＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞がＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞を親株としてさらにＨＩＶ−１感染によりＳＥＡＰを細胞外に分泌するように改変したことからも予測された。しかもReporterとしてはＳＥＡＰを用いた系の方がβ−ガラクトシダーゼに比べ、化学発光試薬を加えたあとの安定性及び操作の迅速簡便性においても格段に優れていた。検出感度の点についてもＳＥＡＰの方が優れていたため、接種するウイルス量が少なくても測定が可能であった。またＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰを用いたＡｓｓａｙ系は、細胞を播き、薬剤と同時にウイルスを接種し、培養上澄を採取して酵素基質液を添加して測定機にかけるのみで実測値が得られ、現在用いられているｐ２４ ＥＬＩＳＡあるいはＲＴ Ａｓｓａｙとくらべ操作手順は格段に簡略化されており、Work Stationによるロボット化への変換も可能であると考えられる。ＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞株による患者検体からのウイルス分離とＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰによる薬剤耐性Phenotyping Assayにより概略２週間程の短期間で薬剤耐性が判明することは、早期の耐性ウイルスの検出と、感受性薬剤の選定に有用であり、今後新たに承認される薬剤についても測定を行い、Conbination Therapyとして様々な薬剤の組み合わせに対応しえるHigh Throughputな薬剤耐性試験系の構築になくてはならない測定系となることが期待される。
【００５９】
また、新たに許可された抗ＨＩＶ薬であるＡＢＣ、ＮＶＰおよびＡＰＶについても本試験法により、効率的なおかつ鋭敏に耐性ウイルスを検出しえることが判明した。このことは今後、さらに開発され臨床応用が期待されている様々な抗ＨＩＶ薬についても本試験が対応しえる柔軟性をもつことを意味する。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、ＨＩＶ−１感染価測定細胞株を用いた迅速簡便な薬剤耐性試験方法、特に多検体を迅速に処理することができる薬剤耐性試験方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、表現型でのＡＺＴ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図２】図２は、表現型での３ＴＣ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図３】図３は、表現型でのｄ４Ｔ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図４】図４は、表現型でのＲＴＶ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図５】図５は、表現型でのＳＱＶ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図６】図６は、表現型でのＮＦＶ耐性と遺伝型との相関関係を示す図である。
【図７】図７は、ＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いた化学発光アッセイとＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞を用いたBlue Cell Countとにおける、抗ＨＩＶ−１剤濃度に対する相関関係を示す図である。
【図８】図８は、ＭＡＧＩＣ−５／ＳＥＡＰ細胞を用いた化学発光アッセイとＭＡＧＩＣ−５Ａ細胞を用いたBlue Cell Countとにおける、抗ＨＩＶ−１剤濃度に対する相関関係を示す図である。
【図９】図９は、表現型でのＡＢＣ耐性と遺伝子型との相関関係を示す図である。
【図１０】図１０は、表現型でのＮＶＰ耐性と遺伝子型との相関関係を示す図である。
【図１１】図１１は、表現型でのＡＰＶ耐性と遺伝子型との相関関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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