(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ｏ−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）一β−Ｄ−グルコピラノシルインドールからなる新規インドール配糖体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エビネラン（Ｃａｌａｎｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ  Ｌｉｎｄｌ．）から単離したインドール配糖体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
エビネランのアルコール溶液抽出物が、発毛・育毛剤として著効を示すことは知られている（特開平５−２９４８１３号公報）。しかしながら、エビネラン抽出液含有成分は、まだ十分に解明されてなく、有効成分の特定にいたっていない現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エビネランからのアルコール抽出液の分画成分を精査し、生理的に有用な活性をもつ新規インドール配糖体を単離することに成功し、本発明にいたった。
【０００４】
すなわち、本発明は、エビネランから単離した血流促進作用及び美白作用のある新規インドール配糖体を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成した本発明の新規インドール配糖体は、化１で示す３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルインドール（３−ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｙｌ  ｉｎｄｏｌ）（以下「カラントサイドＡ／ｃａｌａｎｔｈｏｓｉｄｅ  Ａ」という）からなることを特徴としている。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のカラントサイドＡは、次のようにして製造できる。エビネランの根茎を細切りした後、例えばメタノールで熱時抽出し、メタノール抽出エキスを得る。得られたメタノール抽出エキスを酢酸エチルと水（１：１）で分配抽出する。次いで水移行部を逆相シリカゲルカラムクロマトガラフィーに付し、水、メタノールで順次溶出し、メタノール溶出部を得る。メタノール溶出部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、さらに順相シリカゲルカラムガスクロマトグラフィーで分画し、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて繰り返し分離することにより、カラントサイドＡが単離される。
【０００８】
カラントサイドＡは、後述する試験例１から明らかなように、ラットの皮膚血流促進作用を有意に増加させることが明らかとなり、育毛剤等の用途が期待できる。また皮膚美白作用は、皮膚が黒くなるのを防ぐ意味で、皮膚でのメラミン産生の抑制をみるのがひとつの指標となる。メラニンはチロシンあるいはドーパからチロシナーゼという酵素によって産生されるので、この酵素活性を抑制することが美白につながる。後述の試験例２に示すように、この酵素活性を抑制する抗チロシナーゼ活性を測定した結果、カラントサイドＡは、比較的強い抗チロシナーゼ効果を示し、美白乳液、クリーム等の化粧料としての利用が期待できる。
【０００９】
【実施例】
（単離）
宮崎産エビネ新鮮根茎（７．５ｋｇ）を細切りした後、ＭｅＯＨ（１８リットル）で熱時抽出を計３回おこなった。ＭｅＯＨ抽出液３回分をあわせて減圧下溶媒留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（３３０ｇ，４．４％）を得た。エビネＭｅＯＨ抽出工キス（３００ｇ）をＡｃＯＥｔ−Ｈ２Ｏ（１：１）で分配して、ＡｃＯＥｔ層移行部（７５ｇ，１．０％）、Ｈ２Ｏ層移行部（２２５ｇ，３．０％）を得た。得られたＨ２Ｏ層移行部エキスを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．０ｋｇ，Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ］で糖除去し、ＭｅＯＨ流出部エキス（１３ｇ，１．７％）を得た。ＭｅＯＨ流出部エキス１３ｇを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー｛１．０ｋｇ，［ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１０：１→３：１→１：１］→［ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：３５：１０（下層）→６：４：１］→ＭｅＯＨ｝で分離し、Ｆｒ．１（１７０ｍｇ，０．００２３％）、Ｆｒ．２（４１ｍｇ，０．０００５％）、Ｆｒ．３（４８ｍｇ，０．０００６％）、Ｆｒ．４（２３４ｍｇ，０．００３１％）、Ｆｒ．５（４１００ｍｇ，０．０５５％）、Ｆｒ．６（２７００ｍｇ，０．０３６％）、Ｆｒ．７（２０００ｍｇ，０．０２７％）、Ｆｒ．８（４０００ｍｇ，０．０５３％）を得た。Ｆｒ．７（４３００ｍｇ，０．０５７％）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［４０ｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７：３：１（下層）→６５：３５：１０（下層）→６：４：１］で分画し、さらに逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ（３０：７０，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍ  ｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（２５：７５，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］で繰り返し分離精製し、カラントサイドＡ（８１．９ｍｇ，０．００１１％）を得た。
【００１０】
【分析例１】
（同定）
カラントサイドＡは正の旋光性を示す淡黄色粉末で、分析結果は下記のとおりである。
カラントサイドＡ：非晶粉末
旋光性：［α］Ｄ２５＋１６４．０゜（ｃ＝０．０１，ＭｅＯＨ）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）
次式計算値    Ｃ２０Ｈ２８ＮＯ１１（Ｍ＋Ｈ）＋：４５８．１６３８
実測値                                        ：４５８．１６５０
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：
３４９０，１６１８，１５５４，１４５８，１０２８
ＵＶ（ｃ＝０．０００６，ＭｅＯＨ，ｎｍ，ｌｏｇ  ε）：
２８２（４．７），２２４（５．４）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ）：
４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１”−Ｈ），
４．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１’−Ｈ）
６．９７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．３，６．９，７．９Ｈｚ，５−Ｈ），
７．０７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．３，６．９，８．３Ｈｚ，６−Ｈ）
７．１５（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ），
７．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．３Ｈｚ，７−Ｈ），
７．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，７．９Ｈｚ，４−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ，δｃ）：
Ｃ−１                ，    Ｃ−２      １１２．２，
Ｃ−３      １３８．８，    Ｃ−４      １１８．６，
Ｃ−５      １１９．５，    Ｃ−６      １２２．８，
Ｃ−７      １１２．４，    Ｃ−８      １３５．４，
Ｃ−９      １２１．３，    Ｃ−１０              ，
Ｃ−１’    １０５．４      Ｃ−２’      ７５．０，
Ｃ−３’      ７７．９      Ｃ−４        ７１．５，
Ｃ−５’      ７７．３      Ｃ−６’      ６９．９，
Ｃ−１”    １０４．７      Ｃ−２”      ７５．１，
Ｃ−３”      ７７．９      Ｃ−４”      ７１．５，
Ｃ−５”      ７７．９      Ｃ−６”      ６２．７，
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ  ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
４８０（Ｍ＋Ｎａ）＋
Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ  ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
４５６（Ｍ−Ｈ）−
【００１１】
【分析例２】
（糖の同定）
カラントサイドＡ（３ｍｇ）の５％Ｈ２ＳＯ４−ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）（１：１，ｖ／ｖ，１．０ｍｌ）溶液を窒素気流下、加熱還流し、２時間攪拌した。反応液を陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４００（ＯＨ−ｆｏｒｍ）で中和し、樹脂を濾別後、溶媒を減圧留去し、粗生成物（２．８ｍｇ）を得た。粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．２ｇ，Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ）で分離精製し、溶媒を減圧留去し、粗生成物（１．０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物のピリジン溶液に、Ｌ−システィンメチルエステルヒドロクロライド（０．３ｍｇ）を加え６０℃で１時間攪拌し、つづいてＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（０．３ｍｌ）を加え６０℃で１時間攪拌し、濾別後、ＧＣ用サンプルとして以下に示す条件でＧＣ分析を行った。
ＧＣ条件
ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｌｕｃｏ  ＳＴＢＴＭ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
Ｉｎｊｅｃｔｏｒ  ｔｅｍｐ：２３０℃
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｔｅｍｐ：２３０℃
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ：２３０℃
Ｈｅ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１５ｍｌ／ｍｉｎ
保持時間（ｔｒ）
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：２４．１５
Ｌ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：２５．４６
【００１２】
前記分析例１及び分析例２から、カラントサイドＡは、ＦＡＢ−ＭＳ及び高分解能ＦＡＢ−ＭＳにより、分子式Ｃ２０Ｈ２７ＮＯ１１を有することが明らかになった。またＩＲスペクトルにおいて、水酸基（３４９０ｃｍ−１）及びピロール環（１５５４ｃｍ−１）の存在が示唆され、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの解析により、β結合した２個のグルコース［δ４．４０（ｄ，Ｊ＝７．６），δｃ１０４．７］、［δ４．７４（ｄ，Ｊ＝７．３），δｃ１０５．４］の存在が確認された。カラントサイドＡを、Ｈ２ＳＯ４−ジオギサンで酸加水分解すると、ｄ−グルコース（ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）が得られ、カラントサイドＡの１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを文献記載の化２に示すインディカン（ｉｎｄｉｃａｎ）と比較すると、グルコースの６位炭素のシグナルが低磁場に、５位炭素のシグナルが高磁場にグルコシル化シフトしていたことから、カラントサイドＡは、化１に示すように、インディカンのグルコースの６位水酸基にもう１分子のグルコースが結合している化合物であることが示唆された。
【００１３】
またカラントサイドＡの１Ｈ−１Ｈ，１３Ｃ−１ＨＣＯＳＹ及び１Ｈ−１Ｈ，１３Ｃ−１ＨＯＨＡＨＡスペクトルの解析の結果、糖部のシグナルが完全に帰属され、糖の結合様式はアノメリック水素のカップリング定数及びアノメリック炭素の化学シフト［δ４．４０（ｄ，Ｊ＝７．６），δｃ１０４．７］、［δ４．７４（ｄ，Ｊ＝７．３），δｃ１０５．４］の考察から、２個のグルコースはともにβ結合していることが明らかとなった。さらに、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、グルコースのアノメリック水素（δ４．７４，１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３）とインドール環部の３位炭素（δｃ１３８．８）、もう一方のグルコースのアノメリック水素（δ４．４０，１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６）とグルコース６’位炭素（δｃ６９．９）との間に相関が観測されたことから、カラントサイドＡはインディカンのグルコースの６’位にグルコースが結合した３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルインドール（化１）であると決定した。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【参考例】
（単離）
宮崎産エビネ新鮮葉（２．９ｋｇ）をＭｅＯＨ（８リットル）で熱時抽出を計３回行った。ＭｅＯＨ抽出液の３回分をあわせて、減圧下溶媒流去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（１５０ｇ，５．２％）を得た。エビネＭｅＯＨ抽出エキス（１５０ｇ）をＡｃＯＥｔ−Ｈ２Ｏ（１：１）で分配し、ＡｃＯＥｔ移行部（６２ｇ，２．１％）を得た。得られたＡｃＯＥｔ移行部エキスを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー｛１．０ｋｇ，ＣＨＣｌ３→［ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：１→１０：１→５：１］→ＭｅＯＨ｝で分離し、Ｆｒ．１（１０．５ｇ，０．３６％）、Ｆｒ．２（５．４ｇ，０．１９％）、Ｆｒ．３（１４．２ｇ，０．４９％）、Ｆｒ．４（８．０ｇ，０．２８％）、Ｆｒ．５（１０．７ｇ，０．３７％）、Ｆｒ．６（１０．３ｇ，０．３６％）を得た。Ｆｒ．３（１４．２ｇ）をさらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１→１０：１→５：１→ＭｅＯＨ］、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１→１０：１→５：１→ＭｅＯＨ］で順次分画し、インジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、化３）（１２８．０ｍｇ，０．００４４％）、トリプタントリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化４）（６．８ｍｇ，０．０００２％）を得た。Ｆｒ．５（１０．７ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（４０：６０→５０：５０→８０：２０，ｖ／ｖ），逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍ  ｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＯＨ（４５：５５，ｖ／ｖ）流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］で順次分画し、ヴォミフォリオール（ｖｏｍｉｆｏｌｉｏｌ、化５）（３８．６ｍｇ，０．００１３％）を得た。ここで得られた化合物は、１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲデータ及びＴＬＣを比較し同定した結果、いずれも前述の既知化合物であることが明らかになった。
【００１６】
【化３】
【００１７】
【化４】
【００１８】
【化５】
【００１９】
【試験例１】
（ラット皮膚血流促進作用）
実験動物として、ＳＬｃ：ウィスター系雄性ラット（体重１８０〜２００ｇ）を用いた。皮膚血流量は、レーザードップラー血流計（Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ  ＰＦ２Ｂ，Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて測定した。ラットの背部を剪毛し、翌日にウレタン（１ｇ／ｋｇ）麻酔下でラットの皮膚血流量を測定し、前値とした。前値測定直後に被験液２５μｌ（５０％エタノール溶液）を前値測定部位に塗布し、その２０分、４０分、及び６０分後に塗布部位の皮膚血流量を再度測定し、前値に対する増加率を算出した。なお、対照群には５０％エタノール溶液を塗布した。被験液には、実施例のエビネＭｅＯＨ抽出エキス（ＣＤＭ−ｅｘｔ）（０．５％，２．０％）、本発明のカラントサイドＡ（ＣＤＨ２）（０．２％）、参考例の既知物質インジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ）（０．２％）を用いた。結果を表１及び図１に示す。
【００２０】
【表１】
0003890544.tif 000002
【００２１】
表１から明らかなように、エビネＭｅＯＨ抽出エキスは、０．５％、２．０％のいずれにおいても、ラット皮膚血流量を顕著に増加させた。また図１に示すように、本発明のカラントサイドＡは、２０分で皮膚血流量を有意に増加させた。インジルビンにも同様の促進作用は認められるが、有意ではなかった。
【００２２】
【試験例２】
（美白作用）
ＭａｓｏｎとＰｅｔｅｒｓｏｎの方法に準じて、以下の通り実験した。すなわち、被験液０．５ｍｌにＬ−ドーパ溶液（ｐＨ６．８ＰＢＳ中、０．０３％）０．５ｍｌを加え、２５℃、１０分間インベキュートし、さらにマッシュルーム由来のチロシナーゼ溶液（ｐＨ６．８ＰＢＳ中、４５Ｕ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、２５℃５分間インベキュートした。反応後４７５ｎｍにおける吸光度（Ｄ１）を測定した。別に、Ｌ−ドーパ溶液を添加せずに同様な操作を行い、吸光度（Ｄ２）を測定し、被験薬無添加におけるドーパクロムの生成量としての吸光度（Ｄ３）を測定した。このＤ１、Ｄ２、Ｄ３を用いで、下記の式によりドーパクロム生成阻害率を求め、チロシナーゼ活性の指標とした。被験液には、実施例のエビネＭｅＯＨ抽出エキス（ＣＤＭ−ｅｘｔ）、実施例の酢酸エチル層移行部（ＡｃＯＥｔｐｈａｓｅ）、水層移行部（Ｈ２Ｏｐｈａｓｅ）、本発明のカラントサイドＡ（ＣＤＨ２）、及び対照群として陽性対照薬のコウジ酸（ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた。結果を表２に示す。
【００２３】
【式１】
【００２４】
【表２】
0003890544.tif 000003
【００２５】
表２から明らかなように、エビネＭｅＯＨ抽出エキス、酢酸エチル層移行部、水層移行部は、ともに用量依存的に強い抗チロシナーゼ活性を示した。陽性対照群のコウジ酸も強い抗チロシナーゼ活性を示した。収率から考えあわせると、抗チロシナーゼ活性有効成分は、主として水層移行部にあると考えられるが、本発明のカラントサイドＡも、表３に示すように、比較的強い抗チロシナーゼ活性を示した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、新規カラントサイドＡは皮膚血流促進作用を有し、育毛剤等の有用な用途が期待できる。また皮膚の美白作用も認められ、化粧料等への利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】エビネランから単離されたカラントサイドＡとインジルビンのラット皮膚血流促進効果を示すグラフである。
【化１】0003890544.tif 000004
【化２】0003890544.tif 000005
【化３】0003890544.tif 000006
【化４】0003890544.tif 000007
【化５】0003890544.tif 000008
【数１】0003890544.tif 000009
【表１】0003890544.tif 000010
【表２】0003890544.tif 000011
【表３】0003890544.tif 000012
【図１】
0003890544.tif 000013