(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母を変異処理し、プロパルジルグリシン感受性を有し、且つトータル・ダイアセチル低蓄積性であることを特徴とする寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２２の新規変異酵母。
【請求項２】
請求項１に記載の寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２２の変異酵母を用いて酒類を製造することを特徴とする酒類の製造方法。
【請求項３】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母を変異処理し、プロパルジルグリシン又はα−アミノ酪酸又は４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシン又はＯ−メチルトレオニン又はイソロイシンヒドロキサメートを含む培地で、親株として用いた変異処理前の前記酵母に比して、増殖の抑制或いは遅延が見られる分岐鎖アミノ酸アナログ感受性変異株を分離し、更にこの感受性変異株から寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２２の変異酵母を分離することを特徴とする新規変異酵母の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酒類製造に関する新規変異酵母、その変異酵母の新規育種方法及びその酵母を用いた酒類の製造方法に関する。さらに詳細には、本発明は、トータル・ダイアセチルの蓄積を低減する酒類製造用酵母に属する変異酵母、その変異酵母の育種方法及びその酵母を用いた酒類、特に清酒の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酒類の香気成分の内、ダイアセチル臭はとりわけ清酒、ビール及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。ダイアセチル臭（清酒の官能表現ではツワリ香とも云う）は、ダイアセチルを主体としたビシナルジケトン類が製品中に閾値以上存在することによって発生する。清酒における閾値は１ｐｐｍ（日本醸造協会雑誌,５７,607（1962））、ビールにおける閾値は０．１ｐｐｍ（ジャーナル・オブ・ジ・インスティチュート・オブ・ブリューイング（Journal
of the
Institute of Brewing），７６,486（1970））と言われている。
【０００３】
酒類中のビシナルジケトン類はダイアセチルと２，３−ペンタンジオンに大別される。ダイアセチルと２，３−ペンタンジオンは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物α−アセトハイドロキシ酸であるα−アセト乳酸及びα−アセトハイドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない自動酸化によって生成される。また、ダイアセチルの一部は、酵母がα−アセト乳酸からアセトインを経て生成される。この他に汚染微生物によってもダイアセチルは生成される。
【０００４】
以上のことから、ビシナルジケトン類(ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオン)及びその前駆体でα−アセトハイドロキシ酸類（α−アセト乳酸及びα−アセトハイドロキシ酪酸）全体が製品にダイアセチル臭をもたらす可能性のあるものとして捉えられる。それらトータル・ダイアセチルを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。
【０００５】
ビール製造用酵母に対しては、ダイアセチル臭の発生を抑制する試みが報告されている。アメリカン・ソサイアティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ，プロシーディング（American Society of Brewing Chemists，Proceeding），９４（1973）には、バリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母が、第２１回ヨーロピアン・ブリュワリー・コンベンション，プロシーディング・コングレス，マドリッド（２１th European Brewery Convention，Proceeding Congress，Madrid），５５３（1987）にはＩＬＶ５遺伝子のコピー数を増大させた遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されているが、実用化には至っていない。特開昭６２−２２８２８２号公報、特開平２−２６５４８８号公報及び特開平７−１７１号公報にはいずれもα−アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖を用いた形質転換酵母が報告されており、実用性も認められているが、少なくとも国内では実用化されていない。ビール製造用酵母以外でも、清酒製造用酵母及びワイン製造用酵母を含めてダイアセチル臭の発生を抑制することを目的として育種された酵母の実用例は見られない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ダイアセチル臭の発生を抑制することのできる変異酵母を得ることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らの研究の結果、従来の酵母に比べトータル・ダイアセチルの蓄積が安定して低減される変異酵母を分離できる育種方法を開発し、この方法で得られた変異酵母の使用により、ダイアセチル臭の発生が安定的に抑制された酒類の製造に成功したものである。
前記本発明の課題は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母を変異処理し、プロパルジルグリシン感受性を有し、且つトータル・ダイアセチル低蓄積性であることを特徴とする寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２２の変異酵母を利用して解決することができる。
本発明の新規変異酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母を変異処理し、プロパルジルグリシン又はα−アミノ酪酸又は４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシン又はＯ−メチルトレオニン又はイソロイシンヒドロキサメートを含む培地で、親株として用いた変異処理前の前記酵母に比して、増殖の抑制或いは遅延が見られる分岐鎖アミノ酸アナログ感受性変異株を分離し、更にこの感受性変異株から寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１２２の変異酵母を分離することによって育種できる。
【０００８】
すなわち、本発明は、ダイアセチル臭の原因物質であるビシナルジケトン類が主に酵母のバリン・ロイシン・イソロイシンのいわゆる分岐鎖アミノ酸生合成経路の中間産物であるα−アセトハイドロキシ酸類に由来することに着目し、分岐鎖アミノ酸アナログに対する感受性が従来の酵母に比べて強くなっている酵母では分岐鎖アミノ酸の生合成系及び／又は取り込み系に何らかの変異を生じている可能性が高いことから、分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母を分離するという方法を新規に開発し、目的とする変異酵母を効率的に分離することに成功した。
【０００９】
突然変異酵母としては、自然発生的に生じた突然変異株のほか、紫外線や放射線を照射する物理的変異誘導原を用いる物理的手法或いはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチルーＮ一ニトローＮ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学的変異誘導剤に接触させる化学的手法による人為的突然変異株など、いかなる方法によって得たものでもよい。
【００１０】
変異処理をする場合に親株として用いる酵母は、酒類製造用酵母であればよく、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母などいずれの酵母でもトータル・ダイアセチルの蓄積が安定して低減される変異酵母を取得できる。
【００１１】
分岐鎖アミノ酸アナログとしてはプロパルジルグリシン、α−アミノ酪酸、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、Ｏ−メチルトレオニン及びイソロイシンヒドロキサメートが利用できるが、その他の分岐鎖アミノ酸アナログでも、少なからず酵母の増殖を抑制或いは阻害するものであれば適宜利用可能である。
【００１２】
分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母を分離・育種する方法は、酒類製造用酵母をそのまま或いはそれを変異処理した酵母を、親株において増殖が完全に阻害されない濃度の分岐鎖アミノ酸アナログを含む培地中で培養し、増殖しない或いは親株に比して増殖の遅い分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母を分離し、さらに分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母の中からトータル・ダイアセチル低蓄積性変異酵母を分離するものである。
【００１３】
具体的には、酒類製造用酵母をそのまま又はそれを変異処理した後、分岐鎖アミノ酸アナログを含まない固体培地に接種し、３０℃で約２日間培養し、コロニーを形成させる。次に、分岐鎖アミノ酸アナログを含む寒天平板最少培地（Yeast Nitrogen Base without amino acids（Difco社製）０．６７％、グルコース２％、寒天２％、ｐＨ６.０）を調製し、これにレプリカして、３０℃で培養する。日本醸造協会清酒用７号酵母を用いる場合の各分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度の目安と、それぞれの培養日数の目安は以下の通りである。ＤＬ−プロパルジルグリシンを用いる場合は１０μＭ以下の濃度で、２乃至３日間の培養を目安とする。Ｌ−α−アミノーｎ−酪酸を用いる場合は２５０μＭ以下の濃度で、グルコースの代わりにグリセロールを炭素源とし、５乃至６日間の培養を目安とする。４−アザーＤＬ−ロイシンを用いる場合は１０ｍＭ以下の濃度で、３乃至４日間の培養を目安とする。
【００１４】
５，５，５−トリフルオローＤＬ−ロイシンを用いる場合は７５μＭ以下の濃度で、３乃至４日間の培養を目安とする。Ｏ−メチルーＬ−トレオニンを用いる場合は１００μＭ以下の濃度で、グルコースの代わりにグリセロールを炭素源とし、５乃至６日間の培養を目安とする。Ｌ−イソロイシンヒドロキサメートを用いる場合は５００μＭ以下の濃度で、グルコースの代わりにグリセロールを炭素源とし、５乃至６日間の培養を目安とする。いずれの分岐鎖アミノ酸アナログを用いる場合においても、添加の目安として示した濃度以下のできるだけ低い濃度の培地において生育阻害が認められる変異酵母の方がより分岐鎖アミノ酸アナログ感受性の強いものである可能性が高い。また各分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度は親株として使用する酒類製造用酵母によって、多少の加減を要するものである。
【００１５】
分岐鎖アミノ酸アナログを含む寒天平板最少培地における、分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母の出現頻度を向上させる場合には、ナイスタチン濃縮法（ネイチャー（Nature），２１１，206（1966））を用いる。すなわち、酒類製造用酵母をそのまま又はそれを変異処理した後、分岐鎖アミノ酸アナログを含まない固体培地に接種する前にナイスタチン処理を行う。
【００１６】
具体的には、酒類製造用酵母をそのまま又はそれを変異処理した後、液体最少培地（Yeast Nitrogen Base without amino acids（Difco社製）０．６７％，グルコース２％，ｐＨ４．５）に−部を接種し、３０℃で振とう培養する。培養菌体は窒素欠損最少培地（Yeast Carbon Base（Difco社製）１．１７％、ｐＨ５．５）に全量を移植し３０℃で窒素飢餓培養する。窒素飢餓培養菌体は分岐鎖アミノ酸アナログを含む液体最少培地に一部を接種し、３０℃で振とう培養する。この培養液にナイスタチンを最終濃度で１０ｐｐｍとなるように添加し、３０℃で振とうしながら、ナイスタチン処理を行う。
【００１７】
すなわち、ナイスタチン処理を行う液体最少培地に含まれる分岐鎖アミノ酸アナログの濃度は、わずかな増殖遅延が認められる程度に設定しておき、その濃度において増殖の早いものをナイスタチンで淘汰することにより分岐鎖アミノ酸アナログ感受性株を濃縮していくものである。日本醸造協会清酒用７号酵母を用いる場合の各分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度は、ＤＬ一プロパルジルグリシンが１００〜２５０μＭ、Ｌ−α−アミノーｎ一酪酸が１００〜１０００ｍＭ、４−アザーＤＬ−ロイシンが１〜１０ｍＭ、５，５，５−トリフルオローＤＬ−ロイシンが１００〜２５０μＭ、Ｏ−メチルーＬ−トレオニンが５〜５０ｍＭ、Ｌ−イソロイシンヒドロキサメートが１０〜１００ｍＭを目安とする。分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度は親株として使用する酒類製造用酵母によって、多少の加減を要するものである。
【００１８】
次に、これら分岐鎖アミノ酸アナログ感受性変異酵母を液体培地に接種し、適宜培養した後、培養液上清中のトータル・ダイアセチルを定量することにより、目的とする分岐鎖アミノ酸アナログ感受性であり、且つトータル・ダイアセチル低蓄積性の変異酵母が取得できる。
【００１９】
このようにして得られるトータル・ダイアセチル低蓄積性酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＹ−２１４２株を例示する。この変異酵母は日本醸造協会清酒用７号酵母を親株として、エチルメタンサルフォネートによる突然変異処理により得られたプロパルジルグリシン感受性変異株である。ＭＹ−２１４２株は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−  １８１２２として寄託してある。
【００２０】
この分離・育種方法によって得られるトータル・ダイアセチル低蓄積性酵母は、清酒、ビール、ワインを含む各種酒類の一般的製造方法に用いることが可能である。とりわけ、ダイアセチル臭の発生が散見される低アルコール濃度清酒の製造にトータル・ダイアセチル低蓄積性酵母を用いることで、ダイアセチル臭の発生を容易に防ぐことが可能となるばかりでなく、低アルコール濃度清酒の品質を容易に多様化することができる。
【００２１】
【実施例１】
日本醸造協会清酒用７号酵母をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した。この変異処理前洗浄菌体を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、菌濃度を１．０×１０8 cells／ｍｌに調製した。リン酸緩衝液菌体懸濁液２ｍｌに４０％グルコース水溶液０．５ｍｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）７．５ｍｌ、エチルメタンサルフォネート０．３ｍｌを加え、３０℃で４５分間緩やかに振とうしながら変異処理を行った。変異処理後の菌体をチオ硫酸ナトリウム水溶液１０ｍｌで１回と滅菌水１０ｍｌで２回洗浄した後、最少液体培地１０ｍｌに懸濁した。
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
【００２２】
液体最少培地菌体懸濁液０．２ｍｌを液体最少培地９．８ｍｌに加え、３０℃で２４時間振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した。変異処理後洗浄菌体を窒素欠損最少培地１０ｍｌに懸濁し、３０℃で６時間窒素飢餓培養した。窒素飢餓培養菌体を無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した後、ＤＬ−プロパルジルグリシン２５０μＭを含む液体最少培地に懸濁し、菌濃度を１．０×１０7 cells／ｍｌに調製した。ＤＬ−プロパルジルグリシン含有液体最少培地菌体懸濁液９ｍｌを３０℃で４時間振とう培養した後、１００ｐｐｍナイスタチン溶液（１，０００ｐｐｍのナイスタチンを含む９５％エタノール溶液を滅菌水で１０倍に希釈したもの）１ｍｌ添加して、さらに３０℃で１時間振とうしながら、ナイスタチン処理を行った。このＤＬ−プロパルジルグリシン含有液体最少培地培養とナイスタチン処理を合計３回繰り返した。
【００２３】
３回目のナイスタチン処理を終えた菌体を無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した後、滅菌水で適宜希釈してから寒天平板最少培地に塗沫し、３０℃で２日培養したものをマスター・プレートとした。マスター・プレート上のコロニーを寒天平板最少培地と１０μＭ  ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地にレプリカし、３０℃で３日間培養した。寒天平板最少培地においては親株並みの増殖を示すが、１０μＭ ＤＬ一プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地においては増殖のできないもの、及び増殖の極端に弱いものを一次選抜対象とした。一次選抜対象株を集めたマスター・プレートを作成し、寒天平板最少培地と５μＭ  ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地にレプリカし、３０℃で２日間培養した。
【００２４】
寒天平板最少培地においては親株並みの増殖を示すが、５μＭ  ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地においては増殖のできないもの、及び増殖の極端に弱いものを二次選抜対象とした。二次選抜対象株を集めたマスター・プレートを作成し、寒天平板最少培地と５μＭ  ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地にレプリカし、３０℃で３日間培養した。寒天平板最少培地においては親株並みの増殖を示すが、５μＭ ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地においては増殖のできないもの、及び増殖の極端に弱いものを三次選抜対象とした。
【００２５】
次に三次選抜対象株をＹＰＤ培地にて３０℃で２日間振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した菌体を３％カザミノ酸（Difco社製）含有液体最少培地（ｐＨ４．５）４０mｌに初発菌濃度１．０×１０7 cells/mlになるように加え、２０℃で３日間静置培養した。この培養上清液中のトータル・ダイアセチル濃度を蒸留法（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ（Journa1
of the American Society of Brewing Chemists），３６，139（1978））により測定した。ここで親株に比べ、安定したトータル・ダイアセチル低蓄積性が認められたＭＹ−２１４２株を得た。この変異株は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 ＦＥＲＭ  Ｐ−  １８１２２として寄託してある。この時の結果を第１表に示す。
【００２６】
【表１】
0003972123.tif 000002
【００２７】
【表２】
0003972123.tif 000003
【００２８】
またＭＹ−２１４２株の５μＭ ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地における増殖阻害が、バリン添加によって解除されたことから、ＭＹ−２１４２株におけるプロパルジルグリシン感受性がバリン・アナログとしてのプロパルジルグリシンによるものであることが確認された。この結果を第２表に示す。
【００２９】
【実施例２】
ＭＹ−２１４２株及び親株である日本醸造協会清酒用７号酵母を用いて、第３表に示す仕込配合で清酒を製造した。高温糖化酒母を製造し、もろみの仕込温度を初添１４℃、仲添１０℃、留添８℃とし、最高品温を１４℃として発酵させた。このもろみにおける各アルコール度数帯における成分を第４表に示す。
【００３０】
【表３】
0003972123.tif 000004
【００３１】
【表４】
0003972123.tif 000005
【００３２】
本発明者らは市販低アルコール濃度清酒におけるトータル・ダイアセチル濃度の調査（宮城県工業技術センター研究報告，２８，74（1997））を行い、その結果において低アルコール濃度清酒におけるダイアセチル臭に係るトータル・ダイアセチルの認知閾値を０．５ｐｐｍ、ダイアセチル臭の発生を予防するトータル・ダイアセチルの管理目標値を０．２ｐｐｍと示した。ＭＹ−２１４２株は発酵期間を通してトータル・ダイアセチル濃度が０．２０ｐｐｍ以下であり、安定したトータル・ダイアセチル低蓄積性が認められた。このことから、従来は困難であった発酵中のもろみを任意の時期に上槽することが可能となり、例えば第４表に示すように、多様な品質の低アルコール濃度清酒を従来の一般的な製造方法からも得られるようになつた。
【００３３】
【実施例３】
実施例２と同じ仕込配合で、仕込温度及び発酵温度を変えて清酒を製造した。高温糖化酒母を製造し、もろみの仕込温度を初添１２℃、仲添８℃、留添６℃とし、最高品温を１３℃として発酵させた。このもろみにおける各アルコール度数帯における成分を第５表に示す。ＭＹ−２１４２株は発酵期間を通してトータル・ダイアセチル濃度が０．２０ｐｐｍ以下であり、実施例２と同様に安定したトータル・ダイアセチル低蓄積性が認められた。このことから、従来は困難であった発酵中のもろみを任意の時期に上槽することが可能となり、例えば第５表に示すように、さらに多様な品質の低アルコール濃度清酒を従来の一般的な製造方法からも得られるようになった。
【００３４】
【表５】
0003972123.tif 000006
【００３５】
実施例２及び実施例３に示した発酵温度の異なるいずれのもろみにおいてもＭＹ−２１４２株はトータル・ダイアセチル濃度を低く抑えたことから、ＭＹ−２１４２株が清酒製造におけるダイアセチル臭の発生防止に役立つのみでなく、低アルコール濃度清酒の製造管理を容易なものとし、また低アルコール濃度清酒の品質の多様化に貢献し得ることが確認された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の変異酵母を使用すれば、酒類製造においてダイアセチル臭の発生を容易に抑えることができる。