(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載されたＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか一項に記載されたＤＮＡを含有するＤＮＡにより形質転換した細胞。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか一項に記載されたＤＮＡを含有するＤＮＡを組込んだトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列を用いて外来遺伝子を神経細胞、特に脳の神経細胞に発現させるDNAに関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳内の局所で、疾患に関連した遺伝子を発現させる遺伝子治療、例えばアルツハイマー病の治療のために、脳内の局所で神経細胞を増殖させるNGFを産生する遺伝子を発現させる、又はアセチルコリン合成に関与する遺伝子を発現させる、あるいはパーキンソン病の治療のために脳内の局所でセロトニン合成に関与する遺伝子を発現させる等の遺伝子治療は、これら疾病の有効な治療手段となりうる。
また、パーキンソン病・痴呆等脳の特定の領域が傷害される疾患のモデル動物を作製においても、脳の局所で神経細胞を傷害する物質を産生する遺伝子を発現させ、神経細胞を傷害する方法は、外科的な方法（Perese, D.A. et. Al. Brain Res. 494:285-293, 1989, Naritomi, H. Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 5:103-111, 1991）に代わる有力な方法であると考えられる。
一方で遺伝子の発現は、発現する場所（組織）・時期（発生段階）が厳密に制御されており、これらの発現制御は、遺伝子上流の転写制御配列、遺伝子近傍のエンハンサー・サイレンサー配列等の制御配列により行われていると考えられている。しかしながら、これまでに組織特に脳に強く発現させる配列は報告されているものの（Scott M.R. et. Al. Protein Sci. 1992 Aug;1:986-997, 1992）、脳に特異的に発現させる配列が明らかにされた例は少ない。
そこで、脳でのみ発現している遺伝子産物の転写制御配列を、外来遺伝子の上流に挿入し、外来遺伝子を脳に特異的に発現させることを考えた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、脳においてのみ発現している遺伝子の上流にある転写制御配列を用いて、外来遺伝子を脳特異的に発現させることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子が神経細胞、特に脳の神経細胞においてのみ発現していることに着目し、その転写制御配列を用いて脳特異的に発現するベクターを作製することを考えた。そして、マウスよりP/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列をクローニングし、塩基配列決定、構造決定を行ったところ、CAAT box様配列・NF1・NF-kB・AP1・E1A・AP2・E2F・Sp1の配列が見出され（配列番号１）、この配列がP/Q-type Ca channel a1A遺伝子の転写制御を担っていることが予想された。
そこで、 P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列及びその下流にアルカリフォスファターゼ遺伝子を含むベクターを構築したところ、アルカリフォスファターゼ遺伝子が培養繊維芽細胞には発現せず、培養神経細胞で発現させることが可能であることを見出した。
更に本発明者らは、 P/Q-type Ca channel a1A遺伝子の転写開始点より上流6.3 kbの配列（配列番号１）、上流3.0 kb の配列（配列番号２）、及び上流1.5 kb の配列（配列番号3）の下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組込んだDNAを導入したトランスジェニックマウスを作製したところ、β-ガラクトシダーゼが脳特異的に発現されることを見出した。
すなわち、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列が、それにより転写制御を受ける外来遺伝子を神経細胞、特に脳に特異的に発現させることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００５】
すなわち本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号３に記載の塩基配列からなるDNA、ならびに配列番号１〜３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAである。ここでストリンジェントな条件の一例は、65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで65℃で１時間0.1 X SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4 X SSCである。また本発明には、配列番号１に記載された塩基配列の一部、すなわち配列番号１に記載された塩基配列中の連続した１０塩基、好ましくは１５塩基、更に好ましくは２５塩基からなるDNAをプライマーとして、genomic DNAからPCRにより増幅されるDNAで、かつ該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAも含まれるものである。更に本発明には、配列番号１に記載された塩基配列の一部、すなわち配列番号１に記載された塩基配列中の連続した８塩基、好ましくは１５塩基、更に好ましくは２５塩基からなるDNA、あるいはそれらDNAの組合せから成り、かつ該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAも含まれるものである。すなわち配列番号１に記載された塩基配列より、転写制御因子の結合配列（多くは８〜１２塩基からなる）を含み下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるのに必要な塩基配列を特定し、必要な塩基配列を組み合わせて、下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させることができるよう構築したDNAも含まれるものである。
【０００６】
「外来遺伝子」とは、 P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列を使って、神経細胞、特に脳の神経細胞で発現させたい遺伝子である。例えば脳神経系疾患の遺伝子治療に当たって、例えば神経細胞増殖に関与するNGF遺伝子、アポトーシスを抑制するp53遺伝子等、脳に発現させて脳神経系疾患の治療を目的とする遺伝子である。また例えば脳疾患のモデル動物作製に当たって、例えばジフテリア毒素等、脳に発現させて神経細胞に細胞死をもたらす遺伝子である。 また「外来遺伝子」とは、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列を含むクローンより、神経細胞特に脳の神経細胞で下流につながれた外来遺伝子を発現させるクローンを選択するに当たっては、検出の容易なβ-ガラクトシダーゼ・分泌型アルカリフォスファターゼ等の遺伝子である。これら「外来遺伝子」は目的に応じて自由に選択することができ、特に限定されるものではない。
「下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させる」とは、該DNAを適当な培養神経細胞株（例えばIMR32）にtransfectionして、その下流につながれた外来遺伝子を発現させることを指す。
或いは、「下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させる」とは、該DNAをトランスジェニックマウスに導入して、その下流につながれた外来遺伝子を神経細胞、好ましくは脳の神経細胞に発現させることを指す。
また本発明には、以上に述べた下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAを含むベクター、そのDNAにより形質転換した細胞、そのDNAを導入したトランスジェニックマウスを含むものである。ここでベクターとしては、例えばpBlueScript等が挙げられるが、本発明はこれに限られるものではない。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について、１．転写制御配列をクローニングする方法、２．神経細胞で発現させるためのベクター構築法、３．培養神経細胞で発現させる方法、４．トランスジェニックマウスの作製法を具体的に説明する。
尚、以下に記載する操作は適当なマニュアル、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY等に記載の方法に従って行うことができる。
【０００８】
１．転写制御配列のクローニング：配列番号４に記載のP/Q-type Ca channel a1AサブユニットcDNAプローブ、例えばpSPCBI-2（Mori, Y et. al., Nature, 350:398-402, 1991）HindIII-NotIフラグメント（配列番号５）・SalI-HincIIフラグメントをプローブとして、マウス又はマウス以外の哺乳類のgenomic DNAライブラリーをスクリーニングし、 塩基配列を調べてP/Q-type Ca channel a1Aサブユニットのcoding領域及びその上流配列を含むクローンを選択する。
場合によっては、得られたクローンをプローブとして、更に上流配列を含むクローンを拾い上げても良い。
また別法として、配列番号１に記載の塩基配列を元にPCRプライマーを設定し、マウスgenomic DNAを鋳型として、PCR を行いP/Q-type Ca channel上流領域を増幅する。この場合、PCRプライマーに制限酵素切断配列等の人工配列を付加して、転写制御領域を含むと思われるDNAを作製しても良い。
あるいは、配列番号１に記載の塩基配列を元に合成したDNAをプローブとして、或いは配列番号１に記載の塩基配列を元にPCRプライマーを設定し、マウスgenomic DNAを鋳型としたPCRで得られたDNAをプローブとして、マウス又はマウス以外の哺乳類のgenomic DNA libraryより、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを選択して、転写制御領域を含むと思われるDNAを得ても良い。ここでストリンジェントな条件の一例は、65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで65℃で１時間0.1 X SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4 X SSCである。
更に、配列番号１に記載の塩基配列中の、例えばNF1等の転写因子が結合する塩基配列の周辺配列をプライマーとして設定し、マウス又はマウス以外の哺乳類のgenomic DNAを鋳型としたPCRを行って、転写制御配列を含むと思われるDNAをクローニングすることも許される。
場合によっては、配列番号１に記載の塩基配列中の一部で転写制御に関与していると思われる配列、例えばNF1等の転写因子が結合する塩基配列の周辺配列、あるいはそれら複数個を組み合わせた配列を、DNA合成によりあるいはDNA組換え技術により再構成して、転写制御領域を作製しても良い。
【０００９】
２．ベクターの構築：１でクローニングされたDNAに適当な制限酵素切断部位がある場合には制限酵素で切断し、無い場合はPCR primerに適当な制限酵素サイトを付加してPCRを行って制限酵素サイトを組み込んだ後に制限酵素で切断して、転写制御領域を含むと思われるDNAを得る。
得られた、転写制御配列を含むと思われるDNAを、適当なレポーター遺伝子、例えばCAT遺伝子・β-ガラクトシダーゼ遺伝子・アルカリフォスファターゼ遺伝子などの上流に挿入する。好ましくは、哺乳類細胞で発現し5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal：宝酒造社製）を基質した染色により、或いはortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）を基質とした細胞ホモジェネートの酵素活性測定により検出可能なβ-ガラクトシダーゼ遺伝子、哺乳類細胞で発現し細胞外に分泌されて培養上清の酵素活性測定により検出可能な分泌型アルカリフォスファターゼ例えばPLAP（Goto, M. et. al., Mol. Pharmacol. 49:860-873, 1996）が望ましい。
またこの場合、レポーター遺伝子の上流に既知のプロモーター配列、例えばTKプロモーター・アデノウイルスE1bプロモーター等が存在し、挿入した該転写制御配列がそのプロモーター活性に影響を与えて、神経細胞での発現を増強させるように転写制御することも許される。
ベクターには更に、薬剤耐性等の選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子を含んでも良い。
【００１０】
３．培養神経細胞での発現：２で構築された該転写制御配列及びレポーター遺伝子を含むDNAを、培養神経細胞、例えばIMR32にtransfectionする。transfectionの方法としては、DEAEデキストラン法・リン酸カルシウム法・リポフェクチン法等が挙げられるが、本発明はこれに限られるものではない。
transfectionされた細胞は適当な培地中で培養され、導入されたレポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子産物に対応した適当な方法により測定される。例えば、レポーター遺伝子がβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の場合は、X-galを基質として細胞を染色することにより、或いはONPGを基質として細胞ホモジェネート中の酵素活性を測定することにより測定する。
また、レポーター遺伝子が分泌型アルカリフォスファターゼPLAP遺伝子の場合は、培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性をルミステイン（住友化学社製）を基質として化学発光を測定することにより測定する。
導入されたベクターに薬剤耐性等の選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子が含まれる場合は、transfection後対応する薬剤、即ちネオマイシンを含む培地中で更に培養を続け、導入された遺伝子を構成的に発現するクローンを選択し、導入された遺伝子を構成的に発現する細胞株を樹立しても良い。
この様にして得られた形質転換細胞は、例えば遺伝子の神経細胞特異的な発現に影響を与える薬剤のスクリーニングに使用することができる。
【００１１】
４．トランスジェニックマウスの作製： 以下にトランスジェニックマウスの作製法について述べるが本発明はこれに限られるものではない。
トランスジェニックマウスは、遺伝子導入に用いるマウス受精卵の採取、２で構築された該転写制御配列及びレポーター遺伝子を含むベクターからの直鎖状DNAの精製、精製したDNAのマウス受精卵雄生前核への注入（マイクロインジェクション）、DNAを導入したマウス卵（以下、操作卵）の培養、精管結紮雄マウスと正常雌マウスとの交配による偽妊娠マウスへの操作卵の移植、偽妊娠マウスの出産と産仔の育成、PCR法による遺伝子導入マウスの選抜、導入遺伝子をもつマウスの系統樹立、のステップを経て作製する（Hong, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986）。また、操作卵はDNAをマウスES細胞にtransfectionして、その後薬剤耐性マーカーにより選択したクローンを注入したマウス卵（以下、操作卵）を使っても良い。
受精卵は、雌マウスに過剰排卵を誘発させるため、例えば妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン（pregnant mare's serum gonadotropin,PMSG：セロトロピン： 帝国臓器, 東京）5国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin, hCG：ゴナトロピン：帝国臓器,東京）2.5国際単位をそれぞれ腹腔内投与して、卵管―子宮還流法により採取する。ここで、マウス卵培養用培地は、例えばBrinster' BMOC-3培地（Gibco BRL）を用いることが望ましい。
導入するDNAは、１で構築された該転写制御配列及びレポーター遺伝子を含むベクターを制限酵素で切断し、目的とする該転写制御配列及びレポーター遺伝子を含む直鎖状DNAを、例えばアガロース電気泳動・超遠心等により精製して用いる。
マイクロインジェクションは、例えばノマルスキー微分干渉装置を取り付けた倒立顕微鏡（ダイアフォトTMD：日本光学工業,東京）下で、マイクロマニピュレータ（粗動電動マニピュレータに懸架式ジョイスティック3次元油圧マイクロマニピュレータを装着：ナリシゲ,東京）、マイクロインジェクター（ナリシゲ,東京）、インジェクションピペットおよびホールディングピペットを用いて行う。インジェクション用ディッシュには、例えば（Falcon 3002：Becton Dickinson Labware, New Jersey,U.S.A.）に培地5μlの液滴およびDNA溶液0.5μlの液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いる。
偽妊娠マウスへの操作卵移植は、ます、マウスを50mg/kg体重のペントバルビタールナトリウム（Nembutal：Abbott Laboratories, Illinois,U.S.A.）にて全身麻酔を行い、両けん部を約1cm切開して卵巣および卵管を露出し、実体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し卵管采を露出させる。次に卵管あたり7〜8個の操作卵を卵管采に送り込む。この時、操作卵とともに入れた微小気泡によって、卵管内に移植されたことを確認する。このあと卵管および卵巣を腹腔に戻し両切開部を縫合し、マウスを麻酔から覚醒させる。
多くの場合、移植後20日目には仔マウスが得られる。マウスの尾から抽出したDNAを鋳型として導入遺伝子をPCRで増幅できることにより、導入遺伝子を確認する。
更に、導入遺伝子を持つことが確認されたマウスの各組織で発現したβ-ガラクトシダーゼの活性は、マウスの各組織を適当な緩衝液、例えば0.25M Tris-HCl buffer pH8.0でホモゲナイズした後、適当な基質、例えばortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）を基質として測定し、組織特異的な発現を確認する。
また、 各組織で発現したβ-ガラクトシダーゼ活性を、X-galによる組織染色法により検出しても良い。マウスの組織を適当な固定液、例えば0.5% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, 0.1 M リン酸bufferで固定し、OCT compound（Sakura FineTek社製）に包埋後切片に切断し、染色液例えば0.5 mg/ml X-gal, 5 mM フェロシアン化カリウム, 5 mMフェロシアン化カリウム, 1 mM MgCl2, 0.1 Mリン酸bufferに37℃一晩浸して、nuclear fast red（VECTOR社製）で染色・脱水後、顕微鏡で観察して、組織特異的な発現を確認する。
【００１２】
【発明の効果】
P/Q-type Ca channel a1A遺伝子の上流にある転写制御配列を用いることにより、外来遺伝子を神経細胞、特に脳の神経細胞に特異的に発現させることが可能となった。
【００１３】
【実施例】
以下に、本発明の実施について具体的に記すが、本発明はこれに限られるものではない。
実施例１   P/Q-type Ca channel上流配列のクローニング
TT2細胞のgenomic DNAライブラリー約9 x 105クローンの組換えファージをウサギa1AサブユニットcDNAプローブ、pSPCBI-2（Mori, Y et. al., Nature, 350:398-402, 1991）のHindIII-NotIフラグメント・SalI-HincIIフラグメントをプローブとしてスクリーニングし、13.5-kbのクローンTT2-5を分離し塩基配列を決定した。
続けて、CBA mouse genomic DNAライブラリーをZAP express vector（Stratagene社製）に構築し、CBA mouse genomic DNAライブラリーより、TT2-5のBglII-ApaIフラグメントをプローブとしてスクリーニングして、8.4-kbのクローンCBA-104を分離した。CBA-104のBglII-EcoRIフラグメント(8,397 bp）をBluescript-IIKS-（Stratagene社製）にサブクローニングしpBS104とした。図１にpBS104の制限酵素地図を示した。また、配列番号１にはBglII siteより翻訳開始点までの配列を、配列番号２にはEcoRV siteより転写開始点までの配列を、配列番号３にはStuI siteより転写開始点までの配列を載せた。
【００１４】
実施例２  P/Q-type Ca channel上流配列による神経細胞での発現調節
P/Q-type Ca channel上流配列の下流にPLAP遺伝子を含むpa1A6.3-PLAP は以下のように作製した。PCR法を用いてpBS104内にあるNotI siteをHindIII siteに、また翻訳開始配列をHindIII siteに改変したベクター、pBS104HHを構築した。pBS104HHベクターよりHindIIIフラグメントを得、このHindIIIフラグメントを、胎盤性アリカリフォスファターゼ遺伝子（PLAP）をレポーター遺伝子として含むプラスミドpUG-BGH-PLAP（Goto, M. et. al., Mol.Pharmacol. 49:860-873, 1996）のHindIII siteに導入してpa1A6.3-PLAPを構築した。
また、 P/Q-type Ca channel転写開始点より上流3kbから 6 kbの間にある配列の下流にTKプロモーター、続いてPLAP遺伝子を含むp6-3a1ATK-PLAP を以下のように作製した。最初にp6-3BS104をpBS104よりEcoRV-EcoRV断片を取り除くことにより作製した。次にTKプロモーターより転写されるPLAP遺伝子を含むpTK-PLAP（Goto, M. et. al., Mol.Pharmacol. 49:860-873, 1996）のXbaI siteにXhoI linkerを挿入し（pTK-PLAPI） 、p6-3BS104のSpeI-XhoI断片をpTK-PLAPIのSpeI-XhoI siteに挿入して、p6-3a1ATK-PLAPを作製した。
神経細胞株IMR32、副腎髄質細胞株PC12と線維芽細胞株NIH3T3にpa1A6.3-PLAP 又はp6-3a1ATK-PLAPをDEAE-デキストラン法により遺伝子導入した。遺伝子導入24時間後に培地交換を行い、培地交換24時間後に培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性（Goto, M. et. al., Mol. Pharmacol. 49:860-873, 1996）を測定した。
図２には、それぞれの細胞について、 pa1A6.3-PLAP を導入した細胞の培養上清中のPLAP活性値を、pTK-PLAPを導入した時のPLAP活性値で割った値を示した。図２に示すように、IMR32ではTKプロモーター以上の、PC12ではTKプロモーターと同等のPLAPの活性が認められたが、 NIH3T3ではPLAP活性はほとんど認められなかった。この結果より、 P/Q-type Ca channel上流配列が、神経細胞においてのみプロモーター活性を持つことが明らかとなった。
図３には同様に、それぞれの細胞について、 p6-3a1ATK-PLAP を導入した細胞の培養上清中のPLAP活性値を、 pTK-PLAPを導入した時のPLAP活性値で割った値を示した。図３に示すように、PC12ではTKプロモーター単独と比較して約２倍のPLAP活性上昇が認められたが、 NIH3T3ではPLAP活性の上昇は認められなかった。 この結果より、P/Q-type Ca channel上流3kbから6 kbの間にある配列が、神経細胞においてのみプロモーター活性を上昇させる活性を有することが明らかとなった。
【００１５】
実施例３  トランスジェニックマウスに導入するベクターの構築
pBS104をHincIIで切断しXhoI siteを導入してpBS104Xh6.3を得た。pBS104Xh6.3のXhoI siteにNeomycin耐性遺伝子を導入し、更にEcoRV-BamHI siteにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入してpa1A6.3-lacZを作製した。 a1Aサブユニット遺伝子の翻訳開始siteの構造が保たれるように、β-ガラクトシダーゼ遺伝子はP/Q-type Ca channel a1Aサブユニット遺伝子の第一エクソンの中央から接続されている。
pBS104Xh6.3をNot1/EcoRVで切断しBglII siteを導入後再びligationしてpBS104Xh3.0を得た。pBS104Xh3.0のXhoI siteにNeomycin耐性遺伝子を導入し、更にEcoRV-BamHI siteにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入してpa1A3.0-lacZを作製した。
【００１６】
実施例４  トランスジェニックマウスの作製
pa1A6.3-lacZをNotI/BamHIで切断してa1A6.3-lacZ（配列番号１）を、 pa1A3.0-lacZをBglII/BamHIで切断してa1A3.0-lacZ（配列番号２）を、 pa1A3.0-lacZをStuI/BamHIで切断してa1A1.5-lacZ（配列番号３）を、 pa1A3.0-lacZをPstI/BamHIで切断してa1A0.5-lacZを作製した。
それぞれa1A6.3-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1A1.5-lacZ・a1A0.5-lacZを、ICRマウスの受精卵の雄生前核に注入し（Hong, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986）、擬妊娠させたICRマウスに移植して、妊娠・出産させた。
導入した遺伝子を持っているかどうかは、出産したマウスの尾より抽出したDNAよりβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をPCRで増幅することにより確かめた。また、挿入されたコピー数・DNA再配列の有無は、 β-ガラクトシダーゼ遺伝子をプローブとしたSouthern blot解析により調べた。
a1A6.3-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1A1.5-lacZ・a1A0.5-lacZそれぞれのb-ガラクトシダーゼ遺伝子を持ったマウスより、３系統、２系統、７系統、４系統のトランスジェニックマウスを樹立した。また、それぞれのトランスジェニックマウスは、２〜３０コピーの導入遺伝子を持ち（表１）、導入された位置で DNA再配列は起こって異なかった。
【００１７】
実施例５  発現したβ-ガラクトシダーゼの検出
トランスジェニックマウスの各組織で発現したβ-ガラクトシダーゼの活性は、10週齢マウスの各組織を0.25M Tris-HCl buffer pH8.0でホモゲナイズした後、ortho-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside（ONPG）を基質として測定した。
その結果、元のICRマウス・ a1A0.5-lacZを導入したマウスでは、何れの臓器にも発現は観察されなかった。これに対しa1A1.5-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1A6.3-lacZを導入したマウスではそれぞれ1/2・3/7・3/4のマウスで脳に発現が見られた。また、これらのマウスの心臓・脾臓・肺・肝臓・腎臓には発現が見られなかった（表１）。
【表１】
P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御を受けるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の各臓器における発現
0004011232.tif 000002
トランスジェニックマウスの脳で発現したβ-ガラクトシダーゼは、X-galによる染色法により検出した。具体的には、10週齢マウスの脳を固定液（0.5% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, 0.1 M リン酸buffer）で固定し、OCT compound（Sakura FineTek社製）に包埋後、15 mmの厚さの切片に切断した。切片は染色液（0.5 mg/ml X-gal, 5 mM フェロシアン化カリウム, 5 mMフェロシアン化カリウム, 1 mM MgCl2, 0.1 Mリン酸buffer）に37℃一晩浸し、nuclear fast red（VECTOR社製）で染色・脱水後、顕微鏡で観察した。
その結果、a1A1.5-lacZを導入したマウスでは、嗅球、大脳皮質、海馬でβ-ガラクトシダーゼの活性が検出された。a1A3.0-lacZを導入したマウスでは、嗅球、大脳皮質、扁桃核、海馬、手綱部、中隔、黒質、後四丘体、橋、小脳でb-ガラクトシダーゼの活性が検出された。また、a1A6.3-lacZを導入したマウスでは、嗅球、大脳皮質、海馬、後四丘体、小脳でβ-ガラクトシダーゼの活性が検出された。（表２）
【表２】
P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御を受けるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の各臓器における発現
0004011232.tif 000003
【００１８】
【配列表】
0004011232.tif 000004
0004011232.tif 000005
0004011232.tif 000006
0004011232.tif 000007
0004011232.tif 000008
0004011232.tif 000009
【００１９】
0004011232.tif 000010
0004011232.tif 000011
【００２０】
0004011232.tif 000012
0004011232.tif 000013
【００２１】
0004011232.tif 000014
0004011232.tif 000015
0004011232.tif 000016
0004011232.tif 000017
0004011232.tif 000018
0004011232.tif 000019
0004011232.tif 000020
0004011232.tif 000021
0004011232.tif 000022
0004011232.tif 000023
0004011232.tif 000024
0004011232.tif 000025
0004011232.tif 000026
0004011232.tif 000027
0004011232.tif 000028
【００２２】
0004011232.tif 000029
0004011232.tif 000030
【００２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】pBS104の制限酵素地図
【図２】P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御を受けるPLAP遺伝子の培養細胞での発現。
【図３】P/Q-type Ca channel上流配列及びTKプロモーターにより転写制御を受けるPLAP遺伝子の培養細胞での発現。
【図１】
0004011232.tif 000031
【図２】
0004011232.tif 000032
【図３】
0004011232.tif 000033