(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生ウイルスの感染を介さずに樹立される、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子を発現し得るヒト水晶体上皮細胞株であって、下記性質が３５継代以上維持される細胞株：
（１）増殖速度の低下がみられない
（２）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない
（３）遺伝学的に安定である
（４）α−クリスタリン産生能を有する。
【請求項２】
ヒト水晶体上皮細胞を、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子を機能的に担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
発現ベクターがプラスミドベクターである請求項２記載の細胞株。
【請求項４】
細胞増殖に関して温度感受性である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株。
【請求項５】
約３６℃以上で、遅くとも２週間以内に細胞の増殖が停止する請求項４記載の細胞株。
【請求項６】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子が温度感受性変異遺伝子である請求項４または５記載の細胞株。
【請求項７】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子がＳＶ４０温度感受性変異株由来である請求項６記載の細胞株。
【請求項８】
ヒト水晶体上皮細胞を、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子を機能的に担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む請求項１記載の細胞株を製造する方法。
【請求項９】
発現ベクターがプラスミドベクターである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ヒト水晶体上皮細胞を、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする温度感受性変異遺伝子を機能的に担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む請求項４〜６のいずれかに記載の細胞株を製造する方法。
【請求項１１】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする温度感受性変異遺伝子がＳＶ４０温度感受性変異株由来である請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト水晶体上皮細胞株およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
中途失明の最大の原因である白内障に関して従来より様々な研究がなされているが、真に有効な白内障の予防または治療薬は未だ開発されておらず、現在のところ、混濁した水晶体を外科的に除去し、人工の水晶体を移植する方法が唯一の白内障の治療法である。しかし、人工の水晶体はポリメチルメタクリレートやシリコーンなどを素材としているため、生体適合性または生体親和性に欠けることもあり、移植部位周辺で炎症や浮腫などを引き起こす場合がある。また、人工の水晶体として、単焦点レンズの他、遠見近見のいずれにおいても視力を獲得できる多焦点レンズなどの開発も進んではいるものの、真に調節力を有する生来の水晶体とは、その精度、形状などの点で著しく異なっているのが現状である。
一方、生体材料を利用した人工の水晶体を作製しようとする試みもあるが、透明でかつ屈折性を有するという水晶体組織の特殊性から、未だ生体材料を利用した人工の水晶体は開発されていない。
【０００３】
そこで、本発明者は、人工の水晶体の代わりにヒト由来の水晶体構成細胞を移植し、移植部位で当該細胞を増殖および分化させてヒト水晶体を再生させることによって白内障等の水晶体疾患を治療することを着想した。
【０００４】
水晶体は単一な細胞種、すなわち水晶体上皮細胞とそれが分化伸張した水晶体線維細胞から構成されており、全体がコラーゲンを主成分とするレンズカプセルで覆われている。水晶体線維細胞は全く増殖能を失っており、線維化に伴いＤＮＡおよび核の崩壊を生ずることが知られているので、現実に水晶体の再生を目的とした移植に用いることができるのは水晶体上皮細胞である。水晶体上皮細胞は、多くの動物種において、インビトロで水晶体線維に分化することが知られており、細胞の分化機構の解明や白内障の研究等に利用されてきた。
【０００５】
しかしながら、ヒトの水晶体上皮細胞は、ウシやニワトリなどの水晶体上皮細胞と比較してその増殖能が非常に低く、特に成人あるいは老人性白内障患者から得られた水晶体上皮細胞は、実質的に培養が不可能であるか、培養できたとしてもその増殖は極めて困難である。また、乳児から得られた水晶体上皮細胞では、比較的培養が容易で培養細胞の継代も数回は可能であるが、増殖能には制限があり、また、長期継代では細胞の巨大化や変性が起こると報告されている［Reddy V.N.ら, Exp. Eye Res., 47: 465-478 (1988); Ibaraki N. ら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36: 2304-2312 (1995) ］。
【０００６】
このため、ヒト水晶体上皮細胞の株化が試みられてきたが、未だ自然発生的な（spontaneous ）ヒト水晶体上皮細胞株は得られていない。一方、不死化遺伝子として知られるシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）の大型Ｔ抗原遺伝子を取り込んだアデノウイルス１２をヒト水晶体上皮細胞に感染させることにより、ヒト水晶体上皮細胞株が作製された［Andley U.P. ら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994) ］。しかし、この方法では不死化遺伝子導入の際に、生ウイルスを細胞に感染させるために、該細胞株からウイルスが産生される。このため、仮に水晶体の再生が実現されたとしても、該細胞株の移植によって患者がウイルスに感染する危険性を否定することはできない。
【０００７】
またこの方法では、ウイルスの感染効率が高いために単クローンの細胞株の分離が困難であり、結果として得られる細胞集団は、由来の異なる不均一な多クローンの細胞群となる可能性がある。
【０００８】
そのため、水晶体の生理学的・生化学的研究や白内障などの水晶体疾患の予防および治療薬の開発により有用な、性質の均一なヒト水晶体上皮細胞株であって、且つ生体に移植した際にウイルス感染を引き起こす危険のないヒト水晶体上皮細胞株の獲得が望まれている。
【０００９】
一方、株化されたヒト水晶体上皮細胞を生体に移植して水晶体を再生させるためには、ある時期において該ヒト水晶体上皮細胞の増殖が停止し、且つ水晶体上皮細胞から水晶体線維細胞への分化が起こることが必要である。そのため、所望の時期に増殖を停止させ、分化を誘導することができるヒト水晶体上皮細胞株を得ることが同時に求められている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、移植により患者にウイルス感染を引き起こす危険性がなく、また、水晶体の生理学的・生化学的研究や白内障などの水晶体疾患の予防および治療薬の開発のための研究手段として有用な、均一の性質を有する単クローンのヒト水晶体上皮細胞株を提供することである。また、本発明のもう一つの目的は、細胞増殖を容易に制御し得る上記ヒト水晶体上皮細胞株を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、不死化遺伝子を機能的に組み込んだプラスミド発現ベクターでヒト水晶体上皮細胞をトランスフェクトすることによって、生ウイルスの感染を介さずに水晶体上皮細胞にインビトロでの無限増殖能を付与し、半永久的に継代培養可能な単クローンのヒト水晶体上皮細胞株を樹立した。さらに、本発明者は、ウイルス温度感受性変異株由来の不死化遺伝子を同様にヒト水晶体上皮細胞に導入することにより、培養温度を変化させることによって細胞増殖を制御することができる温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株を樹立することに成功して本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に示す通りである。
（１）生ウイルスの感染を介さずに樹立される、外因性不死化遺伝子を発現し得るヒト水晶体上皮細胞株、特に下記性質が少なくとも３５継代以上維持される当該ヒト水晶体上皮細胞株；
ｉ）増殖速度の低下がみられない
ii）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない
iii)遺伝学的に安定である
iv）α−クリスタリン産生能を有する。
（２）ヒト水晶体上皮細胞を、外因性不死化遺伝子、特にウイルス由来不死化遺伝子、就中ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を機能的に担持する発現ベクター、特にプラスミドベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される、上記（１）の外因性不死化遺伝子を発現し得るヒト水晶体上皮細胞株。
（３）細胞増殖に関して温度感受性である上記（１）または（２）の外因性不死化遺伝子を発現し得るヒト水晶体上皮細胞株、特に約３６℃以上で、遅くとも２週間以内に細胞の増殖が停止する当該ヒト水晶体上皮細胞株。
（４）外因性不死化遺伝子が温度感受性変異遺伝子である上記（３）の外因性不死化遺伝子を発現し得るヒト水晶体上皮細胞株。
（５）ヒト水晶体上皮細胞を、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む上記（１）または（２）のヒト水晶体上皮細胞株を製造する方法。
（６）ヒト水晶体上皮細胞を、温度感受性変異不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む上記（３）または（４）のヒト水晶体上皮細胞株を製造する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、外因性不死化遺伝子を含有し、該不死化遺伝子の発現の結果として、インビトロでの無限増殖能を獲得した細胞群であり、しかも、不死化遺伝子の導入過程において生ウイルスの感染を介さずに樹立された単クローンの細胞株である。
【００１４】
ここで「不死化遺伝子」とは、細胞を不死化し、無限増殖能を獲得させる遺伝子をいい、例えばｃ−ｍｙｃ，ｒａｓ等の癌遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ、ＳＶ４０由来の大型Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子）およびポリオーマウイルスの大型Ｔ抗原遺伝子などが挙げられる。また、本発明において「外因性不死化遺伝子」とは、本発明のヒト水晶体上皮細胞株の起源となるヒト水晶体上皮細胞が生来有していない、細胞外から新たに導入される不死化遺伝子を意味する。したがって、ヒト以外に由来する不死化遺伝子のほか、たとえば、ヒト癌遺伝子であっても、標的細胞内で発現可能な（すなわち、正常の内因性ヒト癌遺伝子が受けている発現抑制を受けない）形態に改変されたものも外因性不死化遺伝子に属するものとする。本発明の外因性不死化遺伝子として、好ましくは、ウイルス由来の不死化遺伝子、より好ましくはＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子が用いられる。
【００１５】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、好ましくは、組織より分離されたヒト水晶体上皮細胞を、上記の外因性不死化遺伝子を機能的に担持する、すなわち標的細胞内で発現可能な形態で担持する発現ベクターでトランスフェクトし、該細胞を適当な培地中で継代培養することによって樹立することができる。使用されるヒト水晶体上皮細胞の由来としては、例えば、白内障手術や硝子体手術などの眼科的手術時に採取された水晶体上皮、好ましくは未熟児網膜症に対する硝子体手術時に得られた乳児の水晶体上皮が挙げられる。
【００１６】
水晶体上皮細胞は、例えば、摘出された水晶体組織から上皮細胞をレンズ・カプセルとともに剥離し、ＥＤＴＡおよび／またはトリプシンで処理することにより、カプセルから剥がれるとともに解離した単一細胞として調製される。得られた遊離ヒト水晶体上皮細胞を、ウシ胎児血清や仔ウシ血清１０〜２０％を含む適当な液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等に懸濁し、ＣＯ2 インキュベーター中で１４〜２１日間前培養したものがトランスフェクションに供される。
【００１７】
本発明で使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが例示される。より好ましくは、プラスミドベクターである。ヒトウイルスゲノムをベクターとして使用する場合は、該ベクターが導入された細胞内で、少なくとも完全なウイルス粒子が産生されないように遺伝子の一部を欠失または変異させておくことがより好ましい。
【００１８】
外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターの構築方法として、例えば、外因性不死化遺伝子にＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を使用する場合には、以下の方法が例示される。
ＳＶ４０ゲノミックＤＮＡの初期領域に存在する不死化遺伝子（すなわち、大型Ｔ抗原遺伝子）を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、ヒト細胞中で該遺伝子を発現可能なプロモーターを含有するプラスミドベクターに挿入する。プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭｕＭＬＶ  ＬＴＲ等が挙げられる。ＳＶ４０初期プロモーターを用いる場合、ＳＶ４０ゲノミックＤＮＡから該プロモーターと大型Ｔ抗原コード領域の両方を含むＤＮＡ断片を切り出してもよい。
【００１９】
プラスミドベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ等が挙げられる。また、さらに転写終結シグナル、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子の発現をエンハンスする特異的な配列などを当該ベクターの適当な位置に配することもできる。このようにして構築された外因性不死化遺伝子発現ベクターは、適当な宿主中、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等で大量に合成させ、常法により回収精製した後、常用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等によりヒト水晶体上皮細胞に導入される。
【００２０】
トランスフェクション後の細胞は、液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等で培養する。培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ2 濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。２〜３日ごとに新鮮な培地に交換し、細胞増殖が飽和点に達した時に継代する。一旦、細胞増殖が止まってからも培養を続け、再増殖を始めた細胞群を単クローンの細胞群として分別する。クローンの分離は以下のようにして行う。トリプシンとＥＤＴＡ溶液を浸染させた小径の濾紙を目的のクローン細胞群上に静置し、培養容器より細胞を剥離して濾紙に付着させる。濾紙小片に付着したクローン細胞群を、濾紙ごと別の培養容器に移す。
【００２１】
上記のようにして得られたヒト水晶体上皮細胞株は一般的な動物細胞培養技術により継代培養することができる。細胞の増殖能の指標として、下式により算出される細胞集団倍加数（cell population doubling level；ＰＤＬ）が用いられる。
ＰＤＬ＝ｌｏｇ10（Ｎi ／Ｎ0 ）／ｌｏｇ10２
Ｎi ＝第ｉ継代培養終了時の細胞数
Ｎ0 ＝第１継代培養開始時の細胞数
【００２２】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、３５継代以上、好ましくは７０継代以上にわたり下記性質が安定に維持されている。
１）増殖速度の低下がみられない
２）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない
３）遺伝学的に安定である
４）α−クリスタリン産生能を有する
ここで、「細胞の巨大化・変性が実質的にみられない」とは、細胞の顕微鏡観察により、一部に伸張した細胞がみられることはあっても、その大多数は本来のヒト水晶体上皮細胞の形態的特徴を示すことを意味する。「遺伝学的に安定である」とは、少なくとも染色体数および性染色体において継代培養の過程で変化が認められないことを意味する。また、α−クリスタリンを産生することは、水晶体上皮細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。
【００２３】
本発明の温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株は、その発現が温度感受性である不死化遺伝子発現カセットを含む発現ベクターで、ヒト水晶体上皮細胞をトランスフェクトし、該細胞を適当な培地中で継代培養することによって樹立することができる。使用される温度感受性不死化遺伝子発現カセットとしては、例えば、温度感受性変異ＳＶ４０の大型Ｔ抗原構造遺伝子が挙げられる。本発明の温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株は、好ましくは、約３６℃以上で、遅くとも約２週間以内に細胞増殖を停止するものであり、それよりも低温、好ましくは、約３３℃付近で安定に増殖し続けることを特徴とする。
【００２４】
本発明の細胞株は、生ウイルスの感染ではなく不死化遺伝子を含む発現ベクターのトランスフェクションを介して不死化遺伝子が導入されるので、細胞内で少なくとも完全なウイルス粒子が産生されることがない。したがって、該細胞株をヒトに移植してもウイルス感染を引き起こす危険がない。また、該細胞株は単クローンであるので均一の性質を有し、従来不均一な水晶体上皮細胞を用いて行われていた水晶体の生理学的・生化学的研究、白内障の病因解明および予防・治療薬の開発等のための有用なモデル細胞となり得る。且つ当該細胞は安定な供給が可能であるから、水晶体再生を目的とした移植や人工水晶体の有用な材料となり得る。また、本発明の細胞株は水晶体特異的蛋白質であるα−クリスタリン、およびβ−クリスタリンの産生能を有することから、該細胞株の大量培養により該蛋白質を大量に製造することもできる。さらに、本発明の温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株は、ヒトの眼中温度付近で細胞増殖を停止することから、ヒト水晶体のインビボでの再生のための移植細胞の有力な候補となり得る。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例および試験例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。なお、実施例で得られたヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４株は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５４を付され、平成８年３月８日付で、また、温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０１株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８５８を付され、平成９年３月７日付で、それぞれ通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に国際寄託されている。
【００２６】
実施例１
ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を含んだプラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇの調製
ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を含んだプラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇは、市販のプラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）（プロメガ社）にＲＳＶプロモーターならびに大型Ｔ抗原遺伝子を導入したものである。
その方法は、まずＲＳＶプロモーターを市販のゲノミックＤＮＡから作成し、これをプラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入し、市販のＳＶ４０ゲノミックＤＮＡ（ギブコ社）から制限酵素ＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩを用いて大型Ｔ抗原遺伝子を含む２６５７ｂｐ断片を切り出し、プラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、目的のプラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇを得た。このプラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇの物理的地図を図１に示す。
以上のプラスミドの構築におけるＤＮＡの消化、ＤＮＡ断片の単離、結合等の操作は、Maniatis, T.ら, Molecular Cloning, A Laboratory manual(1982), Cold Spring Harbor Laboratory に記載の方法に準じて行った。
【００２７】
実施例２
遊離ヒト水晶体上皮細胞の調製
未熟児網膜症に対する硝子体手術時に得られた乳児の水晶体上皮細胞を使用した。水晶体上皮細胞が付着している水晶体前嚢を２０（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清（ギブコ社製）を含む抗生物質、抗真菌剤無添加のダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培養液（ギブコ社製）の培地内で静置培養した（初代培養）。培養環境は、５（ｖ／ｖ）％のＣＯ2 、温度３６．５℃、湿度１００％で、培地交換は週３回行った。約２週間培養後に細胞がほぼ飽和状態に増殖したことを確認し、０．０５（ｗ／ｖ）％のトリプシンと０．０２（ｗ／ｖ）％のＥＤＴＡで培養細胞を剥離、分離し、７０±５個／ｍｍ2 培養容器の密度で細胞を継代培養した。この継代（第１継代）培養細胞がほぼ飽和状態に達した時点で、プラスミドＤＮＡの導入に使用した。
【００２８】
実施例３
トランスフェクション
次いで、実施例１で得られたプラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇはリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ギブコ社製、リン酸カルシウム共沈法）を用いてＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体とし、複合体溶液を上記のヒトの水晶体上皮細胞の継代培養細胞に、ＤＮＡ量として５μｇ／５×１０5 細胞となるように添加した。導入前と同様の条件で約２４時間培養後、ＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体の白濁液を除去し、培養を継続した。培養細胞が飽和状態になった時点で、継代を行った。第３継代で細胞の増殖が止まった後も、培養を継続した。ＤＮＡ導入後約３か月後に再増殖を開始したクローンを分離した。クローンの分離は以下のようにして行った。０．０５（ｗ／ｖ）％のトリプシンと０．０２（ｗ／ｖ）％のＥＤＴＡ溶液を浸染させた小径の濾紙をクローン上に静置し、培養容器より細胞を遊離させ、濾紙に細胞を付着させた。濾紙小片に付着したクローン細胞群は、別の培養容器に濾紙ごと移した。
分離したクローンごとに培養を行い、蛍光抗体法で不死化遺伝子の発現を確認し、さらに電気泳動法によりヒトのアイソザイムを確認できたクローン、およびウェスタンブロット分析で水晶体上皮細胞の特異的蛋白質であるα−クリスタリン、およびβ−クリスタリンの産生の認められたクローンを選択することによりヒト水晶体上皮細胞株として継代することができた。（蛍光抗体法、アイソザイム分析およびウェスタンブロット分析については後記試験例１、２および３において詳述する。）
【００２９】
実施例４
細胞の継代
実施例３で得られたヒト水晶体上皮細胞株（第３継代；本細胞株をＳＲＡ０１／０４株と命名した）を実施例２と同様の培養条件で第７９継代まで培養した。各継代での最終細胞密度を、計算盤を使用して細胞数を計測することにより測定し、ＰＤＬを算出した。その結果、図２に示すように７９継代においても安定した増殖能を示した。
倒立位相差顕微鏡を用いて各継代における細胞の形態的変化を観察した。第２６継代目の細胞株の形態を図３に示す。細胞は単層から成り、一部に伸長した細胞があるもののほぼ上皮細胞の形態を示した。第７９継代においても細胞の巨大化や変性は認められなかった。
【００３０】
試験例１
ＳＶ４０大型Ｔ抗原の発現
蛍光抗体法により、該細胞株における不死化遺伝子導入を確認した。すなわち、第１次抗体としてマウス抗ＳＶ４０大型Ｔ抗原抗体（ＡＴＣＣ，抗体Ｎｏ．ＰＡＢ１０１）を、第２次抗体としてＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた蛍光抗体法により細胞株を標識した。標識された細胞株の蛍光顕微鏡写真を図４に示す。この結果から、導入した不死化遺伝子の発現が確認された。
【００３１】
試験例２
ヒト水晶体上皮細胞株のアイソザイム分析
得られた細胞株について、市販のキットを用いて以下の方法でアイソザイムを分析した。アイソザイムは、ＬＤＨ，Ｇ６ＰＤＨ，ＰＧＭ１，ＰＧＭ３，ＥＳＤ，ＡＫ−１およびＧＬＯ−１についてそのタイプを調べた。
０．０５（ｗ／ｖ）％のトリプシンと０．０２（ｗ／ｖ）％のＥＤＴＡを用いて細胞を容器から遊離させ、酵素抽出液〔５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％トライトンＸ−１００〕０．１ｍｌを加え氷上にて酵素を抽出する。次いで、抽出液をアガロースゲルを用いて電気泳動し、市販のキット（コーニング社、オーセンティキット）を用いて該細胞株の由来を検定した。電気泳動後にアガロースゲルに酵素基質溶液を流し、発色させる。対照としてヒト由来のＨｅｌａ細胞とマウス由来のＬ９２９細胞から抽出した酵素標品に同様に処理を行い、バンドパターンを比較して、該細胞株がヒト由来であるかどうかの判定を行った。得られたバンドパターンは、いずれのアイソザイムについても正常ヒト細胞と一致した（表１）。したがって、該細胞株はマウス等の他の動物由来ではなく、ヒト由来の細胞であることが確認された。
【００３２】
【表１】
0003916294.tif 000002
【００３３】
試験例３
染色体分析
細胞株をコルヒチン処理して細胞分裂を停止させた後、細胞を押しつぶし法によりスライドグラス上に塗り広げ、風乾、エタノール：酢酸（３：１）で固定し、酢酸オルセインで染色し、光学顕微鏡観察した。細胞株の染色体分析の結果（核型）を図５に、染色体数及び性染色体を調べた結果を表２に示す。
染色体数は、正常のヒト本来の２倍体を示さず、細胞株（不死化細胞）特有の４倍体を示した。性染色体はこの例では、ＸＸＹ／ＸＸＹＹで男性由来であることを示しているが、この細胞の元の細胞が男児より得られているので、性染色体もよく一致する。
【００３４】
【表２】
0003916294.tif 000003
【００３５】
試験例４
細胞株のα−およびβ−クリスタリン産生の確認
細胞株をＳＤＳローディングバッファー〔終濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１００ｍＭ  ジチオスレイトール，２％  ＳＤＳ，１０％グリセロールおよび０．１％  ＢＰＢ〕中に溶解し、Laemmli の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（２％  ＳＤＳ，５％ＰＡＧ）を行った。次いで、ウサギ抗α−クリスタリン抗体及びマウス抗β−クリスタリン抗体をプローブとして常法に従ってウェスタンブロッティングを行った。
このウェスタンブロット解析により、α−およびβ−クリスタリンの検出を行った結果を図６に示す。これらの結果から、該細胞株が水晶体上皮細胞に特異的なα−クリスタリン、およびβ−クリスタリンを産生していることが示され、この細胞株が水晶体上皮細胞であることが確認された。
【００３６】
実施例５
温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株の樹立
ＳＶ４０温度感受性変異株（ｔｓＡ５８）の全長ゲノミックＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、同じくＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ３２２にライゲーションして、プラスミドベクターを調製した。以上のプラスミドの構築におけるＤＮＡの消化、ＤＮＡ断片の単離、結合等の操作は、Maniatis, T.ら, Molecular Cloning, A Laboratory manual(1982), Cold Spring Harbor Laboratory に記載の方法に準じて行った。
次いで、実施例２で得られた遊離ヒト水晶体上皮細胞を、実施例３の方法と同様にして上記のプラスミドベクターでトランスフェクトし、細胞を培養温度を３３℃に変更する以外は、実施例１と同様の方法で第３０継代まで継代培養した（本細胞株をＳＲＡ０１／０１株と命名した）。実施例４と同様にしてＰＤＬを算出した。その結果、図７に示すように第３０継代においても安定した増殖能を示した。また、倒立位相差顕微鏡で各継代での形態的変化を観察したが、第３０継代においても、水晶体上皮細胞特有の形態を示し、細胞の巨大化や変性は認められなかった。さらに、試験例２と同様の方法でアイソザイム分析を行った結果、調べられた全てのアイソザイムについて正常ヒト細胞の表現型とよく一致した（表３）。また、試験例３と同様にして該株化細胞の染色体分析を行った結果、染色体数は株化細胞に特有の高異数性四倍体性を示した（表４）。性染色体はＸＸＹＹであり、該細胞株の起源が男児の細胞であることとよく一致した。さらに、試験例４と同様の方法で、α−およびβ−クリスタリンの産生を調べた結果、該細胞株は両方のクリスタリンを産生していることが確認された。これらの結果より、該細胞株はヒト水晶体上皮細胞の機能を有することが示された。
【００３７】
【表３】
0003916294.tif 000004
【００３８】
【表４】
0003916294.tif 000005
【００３９】
試験例５
温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株の温度感受性の確認
実施例５で得られたＳＲＡ０１／０１株細胞の一部を３群に分け、それぞれ培養温度３３℃、３６．５℃および４１℃で培養した（その他の培養条件は実施例１の方法に従った）。その結果を図８に示す。３３℃では４週間後においても安定に増殖し続けたのに対し、３６．５℃では約２週間で増殖が停止した。４１℃では全く増殖能が失われた。以上の結果より、本細胞株が、温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のヒト水晶体上皮細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、白内障の病因解明、白内障の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。また、トランスフェクションにより不死化遺伝子を導入しているので、生ウイルス感染による方法で危惧されるウイルス粒子の産生の可能性がなく安全に使用できる。さらに、該細胞株は単クローン細胞群であるので、個々の細胞の性質が均一であり、水晶体の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工水晶体の生体材料として利用できる可能性がある。
また、本発明の温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株は、ヒトの眼中温度付近で細胞増殖を停止することから、ヒト水晶体のインビボでの再生のための移植細胞の有力な候補細胞となり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＲＳＶ−Ｂ−ＴＡｇの物理的地図を示すである。
【図２】ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４のＰＤＬを示す図である。
【図３】ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４（第２６継代）の倒立位相差顕微鏡像（生物の形態）である。
【図４】ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４（第１１継代）におけるＳＶ４０Ｔ抗原の発現を示す蛍光顕微鏡像（生物の形態）である。
【図５】ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４（第７継代）の核型を示す図（生物の形態）である。図中の数字は染色体番号を示す。
【図６】ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０４（第１１継代）におけるα−およびβ−クリスタリンの産生を示すウェスタンブロット分析の電気泳動像である。
【図７】温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０１のＰＤＬを示す図である。
【図８】温度感受性ヒト水晶体上皮細胞株ＳＲＡ０１／０１の種々の培養温度での増殖曲線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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