(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質であるエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ断片。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１記載のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列と６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下でハイブリダイズし、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列において塩基番号１〜４４１からなる配列又はプロモーター活性を有するその一部の配列をさらに含み、該配列によってチロシンリプレッサーの発現が調節される請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エルビニア属細菌のチロシンリプレッサー遺伝子に関し、詳しくはチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ断片に関する。このＤＮＡ断片は、組換え微生物を用いて、Ｌ−ドーパ（ＤＯＰＡ）あるいはＬ−チロシンを製造する際に有用なチロシンフェノールリアーゼ（「β−チロシナーゼ」とも言う）を大量に発現生産するために使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
種々のアミノ酸が微生物の直接発酵により生産されているが、直接発酵が比較的困難なアミノ酸については、微生物由来等の酵素を利用するアミノ酸の製造法（Ｌ−ドーパ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン等）が知られている。
【０００３】
上記アミノ酸の中で、Ｌ−ドーパはチロシンフェノールリアーゼを用いて製造されている。本酵素は、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロモバクター属、エアロバクター属、エルビニア属、プロテウス属、サルモネラ属、シトロバクター属、エンテロバクター属など広範な微生物によって生産されることが知られており（特許第２５２１９４５号公報、特公平−９８００３号公報）、酵素学的諸性質についても明らかにされている（Biochem. Biophys. Res. Commun.,33,10(1963))。
【０００４】
Ｌ−ドーパを製造するのに有用なチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現は、チロシンリプレッサー(TyrR)の関与によって誘導されることが、エルビニア・ヘルビコーラ由来の遺伝子で示唆されている（H.Suzuki et al., Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2339-2341 (1995),）。Suzukiらはこの報告において、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の転写調節領域に、チロシンリプレッサーの結合部位のコンセンサス配列が存在することを示しており、チロシンリプレッサーは前記遺伝子の転写に対し正の調節に関与していると考えている。
【０００５】
一方、Smithらは、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の転写調節領域をレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）に結合して得られるＤＮＡを、チロシンリプレッサーを保持するエシェリヒア・コリと、チロシンリプレッサーを欠失したエシェリヒア・コリに導入して、チロシンリプレッサーがチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の正の転写調節を行っていることを示している（H.Q.Smith et al., J. Bacteriol., 179, 5914-5921 (1997)）。
【０００６】
また、チロシンリプレッサーはチロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成を負に制御することが知られており、さらに、チロシンリプレッサー遺伝子の構造は既にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）では明らかになっている（E. C. Cornish et al., J. Biol. Chem., 261, 403-410 (1986)）。
【０００７】
しかしながら、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子を有する微生物、特にチロシンフェノールリアーゼを高発現することが知られているエルビニア（Erwinia）属細菌においては、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の構造遺伝子と上流域の塩基配列は知られているが（H.Suzuki et al., J, Ferment. Bioeng., 75, No.2, 145-148 (1993)）、チロシンリプレッサー及びそれをコードする遺伝子については未だ明らかにされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、エルビニア属細菌のチロシンリプレッサーとチロシンフェノールリアーゼ遺伝子発現との関係を明らかにし、Ｌ−ドーパ生産に応用すべくチロシンリプレッサー遺伝子を取得することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)のチロシンリプレッサー遺伝子(tyrR)を破壊し、さらにその染色体上に、エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子(tpl)のプロモーター・エンハンサー領域とその下流にラクトースオペロン(lac)を連結した遺伝子断片を導入した。そして、得られた株を宿主として利用して、エルビニア・ヘルビコーラの染色体遺伝子ライブラリーからチロシン存在下にβ−ガラクトシダーゼ活性を強く発現するクローンを取得し、エルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンリプレッサー遺伝子を含む遺伝子断片を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質であるエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ断片である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正（ポジティブ）に調節する活性を有するタンパク質。
【００１１】
本発明の好ましい態様は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
本発明の他の態様は、上記ＤＮＡ断片において、配列表の配列番号１に記載の塩基配列において塩基番号１〜３０３からなる配列又はプロモーター活性を有するその一部を含み、該配列によってチロシンリプレッサーの発現が調節されるＤＮＡ断片である。
また本発明は、上記ＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡを提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡ断片は、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失し、さらにエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサー支配下にラクトースオペロンを発現するエシェリヒア・コリを宿主に用いることにより、エルビニア・ヘルビコーラの染色体遺伝子ライブラリーから選択することができる。
【００１４】
上記エシェリヒア・コリに、チロシンリプレッサー遺伝子を含むエルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体ＤＮＡ断片が導入されると、この遺伝子により発現されるチロシンリプレッサーにより、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサーに支配されるラクトースオペロンの発現が正に調節され、β−ガラクトシダーゼが発現する。β−ガラクトシダーゼの発現は、例えばＬ−チロシン（５ｍＭ）を添加したマッコンキー−ラクトース（MacConkey-Lactose）培地を用い、該培地上でコロニーが赤色に発色することにより検出することができる。
【００１５】
チロシンリプレッサー遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリは、欠失型の表現型を示す変異を有するチロシンリプレッサー遺伝子（例えばtyrR366(H.Camakaris et al.,J. Bacteriol., 115, 1135-1144 (1973))）を、Ｐ１トランスダクション等によって導入することにより、得ることができる。チロシンリプレッサー遺伝子を欠失すると３−フルオロチロシン耐性を示すので、それによって該遺伝子の欠失を確認することができる。また、この性質を指標として、変異処理を行ったエシェリヒア・コリから選択することによっても、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリは取得され得る。
【００１６】
また、エルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサー支配下にラクトースオペロンを発現させるには、前記プロモーター・エンハンサー領域の下流にラクトースオペロン遺伝子を連結して得られるＤＮＡを、エシェリヒア・コリ細胞内に保持させればよい。
【００１７】
エルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサー領域は、これを含むプラスミドpSH768（H.Suzuki et al., J. Ferment. Biol., 75, 145-148(1993)）から調製することができる。また、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子及びその上流領域は、その塩基配列が報告されているので（H.Suzuki et al., J. Ferment. Biol., 75, 145-148(1993)）、その配列に基づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼーションにより、エルビニア・ヘルビコーラの染色体ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリーから取得することができる。
尚、エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物は、現在ではパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）に分類されている。エルビニア属及びパントエア属は非常に近縁であり、本発明のＤＮＡは、エルビニア属及びパントエア属のいずれに属する微生物からも取得され得る。
【００１８】
また、ラクトースオペロン及びその中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ末端コード領域を一部欠失した遺伝子（'lacZ）は、pRS552（R.W.Simons et al., Gene, 53, 85-96 (1987)）から切り出すことによって得ることができる。
【００１９】
プロモーター・エンハンサー領域とラクトースオペロンとの連結は、これらを直接連結することによって行ってもよいが、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子のコード領域のＮ末端部分（tpl'）を介し、これとＮ末端部分を欠失したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコード領域を、両者のフレームが一致するように連結して融合遺伝子（tpl'-'lac 融合遺伝子）とし、チロシンフェノールリアーゼとβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質（tpl'-'lac 融合タンパク質）として発現させるようにしてもよい。
【００２０】
上記のようなエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーター・エンハンサー支配下で発現するラクトースオペロン（以下、単に「ラクトースオペロン」ともいう。）をエシェリヒア・コリに保持させるには、例えば、該ラクトースオペロンを含むプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、該遺伝子を相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込めばよい。尚、このラクトースオペロン遺伝子の組み込みと、上記チロシンリプレッサー遺伝子の欠失は、どちらを先に行ってもよい。
【００２１】
上記のようにして、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失し、ラクトースオペロンが染色体ＤＮＡに組み込まれたエシェリヒア・コリは、エルビニア・ヘルビコーラの染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング用の宿主として用いられる。
【００２２】
エルビニア・ヘルビコーラの染色体遺伝子ライブラリーは、通常遺伝子ライブラリーの作製に用いられる方法と同様にして作製することができる。例えば、Current protocols in molecular biology 2.4.1(A.M.Frederick et al., Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, John Wiley & Sons, Inc., 1994)の方法に従って、エルビニア・ヘルビコーラより染色体ＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、これを適当なベクターに連結して組換えベクターを調製することによって、染色体遺伝子ライブラリーが得られる。制限酵素としては、通常Sau3AI等が用いられるが、後記実施例に示すように、エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプレッサー遺伝子はSalI-SspI断片（約2.4 kb）に含まれていることがわかったので、SalIやSspIを用いてもよい。また、ベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００２３】
上記のようにして得られる染色体遺伝子ライブラリーを用いて、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失し、ラクトースオペロンが染色体ＤＮＡに組み込まれたエシェリヒア・コリを形質転換する。形質転換体に導入された組換えベクターにチロシンリプレッサー遺伝子が含まれていると、β−ガラクトシダーゼが発現する。β−ガラクトシダーゼの発現は、例えば形質転換体をマッコンキー−ラクトース培地上で生育させた場合、コロニーが赤色に発色することで検出することができる。
【００２４】
上記のようにしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が検出される株には、エルビニア・ヘルビコーラ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子がクローニングされる場合等も考えられるので、選択された候補株にチロシンリプレッサー遺伝子が導入されたことを確認しておくことが好ましい。この確認は、例えば、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーターの上流域にあるチロシンリプレッサーなどの調節タンパク質が結合すると考えられる調節領域（regulatory region）を除去した、tpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子を保持する菌株を作製し、該菌株を候補株から回収した組換えベクターで形質転換したときに、β−ガラクトシダーゼが発現しないことによって、行うことができる。
【００２５】
また、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリ（tyrR-）は３−フルオロチロシン耐性を示すが、チロシンリプレッサー遺伝子を保持するエシェリヒア・コリ（tyrR+）は３−フルオロチロシンに感受性を示すので、この表現型によっても、チロシンリプレッサー遺伝子がクローニングされたことを確認することができる。
【００２６】
上記のようにして得られるチロシンリプレッサー遺伝子を含むＤＮＡ断片（SalI-SspI断片）の塩基配列を配列番号１に示す。この配列にはオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が存在し（塩基番号４４２〜２００４）、これから予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリのチロシンリプレッサーと約７２％のホモロジーを示した。また、上記ＤＮＡ断片は、エシェリヒア・コリ細胞内でチロシンリプレッサーを発現したことから、配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１〜３０３には、プロモーター領域が含まれていると推定される。
【００２７】
本発明により、エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプレッサー遺伝子の構造が明らかとなったので、その配列に基づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼーションによって、エルビニア・ヘルビコーラの染色体ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリーからチロシンリプレッサー遺伝子を取得することもできる。
【００２８】
本発明のＤＮＡは、コードされるチロシンリプレッサーの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むチロシンリプレッサーをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。
【００２９】
上記のようなチロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエルビニア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３０】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、エルビニア属細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００３１】
上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物のチロシンリプレッサー活性（チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を正に調節する活性）を調べることにより、チロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、チロシンリプレッサー活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、チロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３２】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎチロシンリプレッサー活性を前記の方法で調べることによって容易に取り除くことができる。
【００３３】
本発明のチロシンリプレッサー遺伝子は、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現調節に利用することができる。例えば、本発明のチロシンリプレッサー遺伝子を適当なベクターに連結して得られる組換えＤＮＡで微生物を形質転換すると、チロシンフェノールリアーゼの発現量が増大すると考えられる。チロシンフェノールリアーゼは、酵素法によるＬ−ドーパの生産に利用することができる。
【００３４】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
【実施例１】
＜１＞エルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝子ライブラリーの調製
Current protocols in molecular biology 2.4.1(A.M.Frederick et al., Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, John Wiley & Sons, Inc., 1994)の方法に従って、エルビニア・ヘルビコーラ AJ2985株(ATCC21434)より染色体ＤＮＡ 1.45mgを抽出した。得られたＤＮＡの43.5μgを50μlの反応系でSau3AI 6 unitsで１０分間および１５分間部分分解した後、アガロース電気泳動を行い、約４〜８kbのＤＮＡ断片5.1μgを回収した。
【００３６】
また、pBR322（東洋紡(株)）の５μgをBamHI 10 unitsで２時間消化し、アガロース電気泳動解析で完全に切断されているのを確認した後、アルカリフォスファターゼ（東洋紡(株)）2 unitsで37℃、１時間処理で5'末端の脱リン酸化を行い、約3μgのpBR322のBamHI切断DNAを得た。
【００３７】
上記のように調製したpBR322 DNA 1.4μgと約４〜８kbのDNA断片の1.7μgをＤＮＡ連結キット（TAKARA ligation kit Ver.2（宝酒造(株))）を用いて80μlの反応系で、16℃で１時間ライゲーションし、エルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝子ライブラリーとした。
【００３８】
＜２＞スクリーニング用宿主(E. coli TK453)の作製
チロシンリプレッサー遺伝子（tyrR）を含むプラスミドクローンを選択するためのスクリーニング用宿主として、チロシンリプレッサー遺伝子を欠失し、さらにエルビニア・ヘルビコーラ由来のチロシンフェノールリアーゼ遺伝子（tpl）のプロモーター・エンハンサー支配下にラクトースオペロンを発現する遺伝子を染色体上に保持するエシェリヒア・コリを作製した。
【００３９】
ラクトースオペロンは、pRS552(R.W.Simons et al., Gene, 53,85-96(1987))から調製した。pRS552は、ラクトースオペロン中のlacZのＮ末端が一部欠失している不完全なlacオペロンを保持するプラスミドである。これにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子（tpl）のＮ末端及び上流域を含む遺伝子断片をフレームを合わせて連結することで、tplの制御下でチロシンフェノールリアーゼのＮ末端部分（tpl'）とβ−ガラクトシダーゼの一部のＮ末端を欠いたＣ末端部分（'lacZ）との融合タンパク質（tpl'-'lac 融合タンパク質）を発現する融合遺伝子が形成される。これによって、tplの転写調節をエシェリヒア・コリ内でβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として検討することが可能である。
【００４０】
tplのプロモーター・エンハンサー領域は、これを含むプラスミドpSH768(H.Suzuki et al., J.Ferment. Biol., 75, 145-148(1993))から調製した。はじめに、上記融合遺伝子をエシェリヒア・コリに導入するためのプラスミドを構築した（図１〜３）。まず、pSH768中のtplのＮ末端にあたるatgaactatcc配列（配列番号３）を部位特異的変異によってatgaaggatcc（BamHIサイト導入）（配列番号４）とし、またＮ末端より約480bp上流にあたるttaacattcgc配列（配列番号５）をttagaattcgc（EcoRIサイト導入）（配列番号６）とした。具体的には次のようにして行った。pSH768をSmaIとPstIで切断し、SmaI-PstIの2.2Kb断片を調製し、この断片をpTZ19R(Pharmacia社)のSmaIとPstIサイトの間に挿入した（図１）。そして、Kunkelの方法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 488-492(1985)、Kunkel,T.A., Methods in Enzymology, 154, 367-382(1987))により、部位特異的変異導入キット（Muta-gene phagemid in vitro mutagenesis kit instruction manual(Bio-Rad社））を用いて、部位特異的変異を導入した（図１及び図２上部）。BamHIサイト、及びEcoRIサイトの導入に使用したオリゴヌクレオチド配列はそれぞれ5'-tcggcaggatccttcatgttta-3'（配列番号７）と5'-agcggcgaattctaatgacgtg-3'（配列番号８）である。
【００４１】
この後、EcoRI、BamHIで切り出される約480bpの遺伝子断片をpUC18のEcoRIとBamHI部位に挿入し(pTK311)、挿入断片部分の塩基配列を決定し、正しく目的の位置にEcoRIやBamHIが造成されていることを確認した（図２）。確認後、このEcoRI、BamHIで切り出される約480bpの遺伝子断片をpRS552のEcoRI、BamHIサイトに挿入し、tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を搭載したプラスミド(pTK312)を作製した（図３）。
【００４２】
次に、このtpl'-'lac 融合遺伝子を搭載したpTK312でE. coli TE2680(T.Elliott, J.Bacteriol., 174, 245-253(1992))を形質転換した。形質転換法及びそれに用いたコンピテントセルの作製法は、井上浩明、野島博「遺伝子ライブラリーの作製法」、p19-26, 1995（羊土社）に従って行った。pTK312(由来はpRS552)とTE2680の染色体上には相同な領域（カナマイシン耐性遺伝子とlac遺伝子）が存在するために、ある頻度で相同組換えを起こし、結果として染色体上にtpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子がシングルコピーとして組み込まれた菌株を作製できる。このようにして得られた菌株をTK314とした。
【００４３】
上記TK314は、recD（エクソヌクレアーゼ Vのエクソヌクレアーゼ活性を欠失しており、細胞内で直鎖状のＤＮＡは切断を免れる）を保持しており、このような菌株内ではプラスミドが安定に複製されないため、これをエルビニア・ヘルビコーラ由来の染色体遺伝子ライブラリーの宿主として使用することは困難である。そこで、TK314中のtpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を含む周辺の遺伝子をP1トランスダクション(A Short Course in Bacterial Genetics, J.H.Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. 1992)により、E. coli JM107に形質導入した。
【００４４】
また、tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子がE. coliのチロシンリプレッサー（TyrR）によって活性化されることが示唆された(H.Suzuki et al.,Biosci.Biotech.Biochem.,59,2339-2341(1995), H.Q.Smith et al.,J.Bacteriol.,179,5914-5921(1997))ため、E. coli JM107の染色体tyrRの機能を不活化するために、P1トランスダクションによりtyrR366(H.Camakaris et al.,J.Bacteriol.,115,1135-1144(1973))を導入した。そして最後に、recA-とするために、MV1184（Methods in Enzymology,153,3-11(1987)）よりΔ(srl-recA)306::Tn10を導入し、これをTK453とした。このTK453でコンピテントセルを作製し、エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)由来の染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング用の宿主として用いた。
【００４５】
＜３＞tpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子の発現を活性化する染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記のように作製したライブラリー8μlを用いて、TK453を形質転換した後、5 mMＬ−チロシンを含むMacConkey-Lactose(Difco社)培地にプレーティングし、約20,000個のコロニーを得た。この中で23個のコロニーがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の発現の指標である赤色の表現型を示した。この表現型からは、これらのコロニー細胞に導入されたプラスミドに挿入された染色体ＤＮＡ断片に、目的とするtyrRか、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が含まれていると考えられるが、あるいはその他不明のものが含まれている可能性もある。
【００４６】
そこで、さらに確認のために、tplのプロモーターの上流域のTyrRなどの調節タンパク質が結合すると考えられる調節領域（regulatory region）を除去した、tpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子を持つ菌株(TK481)を作製した。すなわち、プラスミドpTK311をBssHII処理した後、末端を平滑末端化し、さらにBamHIで消化し、BssHII-BamHI 180bp断片を切り出した。この断片を、pUC18のSmaIとBamHI部位に挿入し、得られたプラスミドをEcoRIとBamHIで消化し、約190bpの断片を調製した。
この断片と、EcoRIとBamHI消化を行ったpRS552を連結した(pTK475)（図２）。次に、こうして得られたpTK475でE. coli TE2680を形質転換し、先に述べたのと同じ方法で、染色体相同組換えを行い、TK481を得た。
【００４７】
TK481は、上流の調節領域（regulatory region）が除去されているために、tplの発現調節に関与するタンパク質は作用できず、その結果としてtpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子の発現がほとんど起こらないものと考えられる。そこで、一次スクリーニングで赤色の表現型を示した株よりプラスミドを調製し、該プラスミドでTK481を形質転換し、今度は白色の表現型を示すものを選択した。この二次スクリーニングにより20株が得られた。これらの株のプラスミドはすべてEcoRI処理で約1.6KbのＤＮＡ断片が検出された。またこれらの形質転換体はすべて３−フルオロチロシン（3-fluorotyrosine）に感受性を示し（E. coliでtyrR-は３−フルオロチロシン耐性となる。H. Camakaris et al., J. Bacteriol., 115, 1135-1144(1973)）、E. coliでのtyrR+の表現型と同一の性質を示した。これらの結果から、これらのクローンはある同一のＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を有し、エルビニア・ヘルビコーラ由来のtyrRを含むことが強く示唆された。
【００４８】
上記の候補株の中で、tyrRを有する一つのプラスミドをpTK-#20と命名し、以降の操作に使用した。tyrRを含むＤＮＡ断片をさらに短くするために種々の制限酵素（EcoRI, BssHII, EcoRV, HpaI, SalI, SphI, NruI等）で処理して得られた約2 kb以上の遺伝子断片をpBR322にサブクローニングして、TK453を形質転換し、上記と同じ要領で5 mMＬ−チロシンを含むMacConkey-Lactose(Difco社)培地で赤くなるものを選択した。その結果、選択された株が保持するＤＮＡ断片として、SalIおよびSphIで消化した各々3.5Kbの断片を得ることができた。この中で、SalI 3.5 kb断片をpUC18に乗せ換えて、該断片の塩基配列を塩基配列決定装置(Shimadzu DSQ-1000L)を用いて決定した（配列番号１）。このＤＮＡ断片中にはオープン・リーディング・フレームが存在し（塩基番号４４２〜２００４）、これから予想されるアミノ酸配列（配列番号２）は、E. coliのTyrRと約72%のホモロジー（相同性）を有していた。
【００４９】
【実施例２】
E. coliにおけるE. coli由来tyrRとエルビニア・ヘルビコーラ由来tyrRの発現及び機能の比較
E. coli由来tyrRとエルビニア・ヘルビコーラ由来tyrRのtplのプロモーター・エンハンサーに対する機能の比較を、β−ガラクトシダーゼ発現を比較することで検討した。
【００５０】
E. coli由来tyrRの発現プラスミドの構築は次のようにして行った。E. coli由来tyrRを含むプラスミドpMU400（C.Edwina et al., J.Bacteriol., 152,1276-1279(1982)）から、NdeIおよびHindIII処理により約2.6kbの断片を得、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後にpBR322（東洋紡(株)）の EcoRV部位に挿入し、pTK559を作製した。同様にして、エルビニア・ヘルビコーラ由来tyrRの発現プラスミドの構築を行った。実施例１で得たpTK-#20をSspIおよびSalI処理して得られる約2.4kbの断片を平滑末端化し、pBR322のEcoRV部位に挿入し、pTK561を作製した。
【００５１】
これらpTK559およびpTK561を用いて、実施例１の＜２＞で作製したコンピテントセルTK453を形質転換し、それぞれTK564およびTK565を得た。この両株を用いて、β−ガラクトシダーゼ発現を検討した。 2g/L グリセロール, 1mM チアミン,0.1mMＬ−トリプトファン, 30μg/mlカナマイシン, 15μg/L テトラサイクリン, 100μg/L アンピシリンを含むM9培地（A Short Course in Bacterial Genetics, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. 1992）と、この培地にさらに2mM Ｌ−チロシンを添加した培地が10ml入った大型試験管に、それぞれTK564とTK565を植菌し、37℃で、600nmにおける吸光度(OD600)が0.6〜0.9程度まで培養して、J. H. Millerら(A Short Course in Bacterial Genetics, 71-80, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1992))の方法に従って、β−ガラクトシダーゼ活性（ミラー単位(Miller units)）を測定した。その結果、表１に示すようにTK564およびTK565は、2mMのＬ−チロシン添加によってβ−ガラクトシダーゼ活性は約１０〜２０倍に上昇した。またE. coli由来tyrRを持つTK564に比し、エルビニア・ヘルビコーラ由来tyrRを持つTK565の方が約２倍の誘導効果が認められた。
【表１】
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【００５２】
以上の結果から、上記のようにして得られたSalI-SspI 2.4 kb断片は、エルビニア・ヘルビコーラ由来のtyrRを含むことが確認された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、エルビニア・ヘルビコーラのチロシンリプレッサー遺伝子が提供される。該遺伝子は、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現調節に利用することができ、Ｌ−ドーパの生産に応用することができる。
【００５４】
【配列表】
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【００５６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示す図。
【図２】  tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示す図。
【図３】  tpl'-'lac 融合タンパク質をコードする遺伝子を搭載したプラスミド(pTK312)の構築過程の一部を示す図。
【図４】  調節領域（regulatory region）が除去されたtpl'-'lac 融合タンパク質遺伝子を含むプラスミド(pTK475)の構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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