(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＣＭ  Ｉ−１７８７として寄託された菌株ＭＳ１であることを特徴とする、生きた弱毒化マイコプラズマ・シノビアエ(Mycoplasma synoviae)。
【請求項２】
請求項１に記載の生きた弱毒化 Mycoplasma synoviaeを含む、微生物学的培養物。
【請求項３】
請求項１に記載の弱毒化 Mycoplasma synoviaeを含むことを特徴とする、家禽を Mycoplasma synoviae感染から保護するための生ワクチン。
【請求項４】
さらに、家禽に対して病原性である微生物またはウイルスに由来する他の抗原を少なくとも１種含むことを特徴とする、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
微生物またはウイルスが、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、ニワトリ貧血因子、トリレオウイルス、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、マイコプラズマ・ガリセプチクム、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）、パスツレラ・マルトサイダ（家禽コレラ）、オルニトバクテリウム・リノトラケアル(Ornithobacterium rhinotracheale)および大腸菌から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ワクチンが噴霧ワクチン接種に適する担体を含むことを特徴とする、請求項３〜５に記載の生ワクチン。
【請求項７】
ワクチンがアジュバントを含むことを特徴とする、請求項３〜６に記載の生ワクチン。
【請求項８】
ワクチンが凍結乾燥形態であることを特徴とする、請求項３〜７に記載の生ワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載の Mycoplasma synoviaeを薬学的に許容され得る担体と混合することを含むことを特徴とする、請求項３〜８に記載の生ワクチンの製造法。
【請求項１０】
請求項１に記載の Mycoplasma synoviae菌株の、家禽を Mycoplasma synoviae感染から保護するための生ワクチンの製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野および従来の技術】
マイコプラズマ・シノビアエ(Mycoplasma synoviae)は、家禽に対する伝染性が強いマイコプラズマである。Mycoplasma synoviae 感染は、非常に多くの養鶏業者にとって重大な問題である。この感染はシチメンチョウの群れでもしばしば認められる。
【０００２】
Mycoplasma synoviae によって引き起こされる病気により、体重は減少し、産卵数が低下する。ニワトリおよびシチメンチョウの罹患率はいずれも通常５〜１５％である。ニワトリの死亡率は通常低いが、シチメンチョウの場合は群れ同士の踏みつけや共食いのため、かなり高いと考えられる。
【０００３】
伝染性滑膜炎は、最初、1950〜1960年に米国の養鶏場において、主に４〜１２週齢の成長期のニワトリが大規模に罹患しているのが見られた。そのときに初めてこの病気が知られ、マイコプラズマと関連付けられた(Olsonら、Poult. Sci. 33: 1075 (1954) および Olsonら、Am. J. Vet. Res. 17: 747-754 (1956))。
【０００４】
この病気は、気道を介して伝染する。自然感染は、ニワトリでは１週齢のニワトリから見られ、シチメンチョウでは通常は１０〜２４週齢のシチメンチョウで見られる。Mycoplasma synoviae 感染は、無症状の上気道感染として生じると考えられるが、重い気嚢炎まで進行し得る。他のケースでは、Mycoplasma synoviae が全身に及び、ニワトリおよびシチメンチョウの急性〜慢性の伝染病である伝染性滑膜炎を生じる。この病気は、滲出性滑膜炎、腱鞘炎または滑液嚢炎を生じる関節および腱鞘の滑膜の感染を特徴とする。特に問題となるのは、ほとんど全てのニワトリ生産国において一般的に実施されている、ニューカッスル病または伝染性気管支炎（または家禽の他の呼吸器系病原体）に対するワクチンを接種する際に、M. synoviae 感染した動物に対してもワクチン接種がなされることである。これらのM. synoviae 感染した動物では、ＮＤ−およびＩＢＶ−ワクチン接種により、しばしば呼吸器感染および肺包嚢感染が生じる(Kleven ら、; Avian Dis. 16:915-924 (1972), Springerら; Infect. Immun. 10:578-589 (1974)) 。M. synoviae 感染が、滑膜感染としても呼吸器感染としても、家禽産業に大きな経済的損害を引き起こすことは明らかである。従って、M. synoviae に対して有効なワクチンがあれば、かなり高く評価されるであろう。
【０００５】
今まで当業界では、不活化Mycoplasma synoviae ワクチンのみが使用されている。米国特許 No. 3,917,819は、マイコプラズマ感染に対する不活化ワクチンを開示している。しかし、これらのワクチンは、十分な免疫応答を引き出すのに比較的大量の抗原物質が必要であるため、高価である。さらに、不活化ワクチンは全て、例えば点眼または非経口投与によって手動で適用されなければならず、個々の動物を個別に取り扱う必要がある。これは、非常に労力の要るワクチン接種法である。弱毒化生ワクチンは、不活化ワクチンに比していくつかの利点があるので、より望ましい。第一に、生ワクチンは、自己複製するので、抗原物質をあまり含まなくてよい。さらに、生ワクチンは、自然感染を厳密に模倣するので、より良好な保護を付与する。Mycoplasma synoviae 生ワクチンのベースとして、生きた弱毒化Mycoplasma synoviae 菌株が必要である。特定の生きた弱毒化菌株が１種のみ記載されている(Nonomura ら、Avian Dis. 26:763-775 (1982)) が、この菌株をベースとした弱毒化生ワクチンは市販されていない。Nonomuraによる生きた弱毒化菌株、ならびに野生菌株には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含む培地で増殖させなければならないという欠点がある。これは、高価な成分であり、さらに、加熱による滅菌ができないので、培地の調製がより複雑になる。従って、ＮＡＤ−非依存性ということが、かなり有利な特徴となる。
【０００６】
ＮＡＤの代わりにニコチンアミド（ＮＩＣ）に適合させた菌株が、DaMassa (DaMassa, A.J.および Adler H.E.; Avian Diseases 19:544-555 (1975))によって記載されている。しかし、これらの菌株は、元の毒力を有しており、弱毒化生ワクチンのベースとしては適切でないという欠点がある。
【０００７】
さらに、Nonomuraが記載した生きた弱毒化菌株は、不活化ワクチンと同様に、各動物の外鼻孔への点鼻により投与しなければならないという欠点を有する。前述したように、これは非常に労力を要するワクチン接種法である。
【０００８】
従って、噴霧投与しても有効であり且つＮＡＤを含まない培地での増殖が可能な生きた弱毒化菌株が、非常に望まれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、そのようなＮＡＤ−非依存性の生きた弱毒化Mycoplasma synoviae 菌株を提供することである。本発明の別の目的は、そのような菌株をベースとするワクチンを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
これらの目的は、フランスのthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismes of the Institut Pasteur (25, Rue du Docteur Rous, 75724 Paris CEDEX 15)に No 1-1787として寄託されている菌株ＭＳ１の生きた弱毒化Mycoplasma synoviae を提供する本発明によって達成される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ＮＡＤ−依存性菌株に由来するこの菌株を、ＮＡＤを含まないマイコプラズマ増殖培地で増殖するように適合させた。
【００１２】
本発明に係る菌株ＭＳ１は、Adler の改変培地(H.E. Adler, R. Yamamotoおよび S. Bankowski, (1954) Am. J. Ver. Res. 15:463-465)で増殖させることができる。改変は、Bacto PPLO培養ブロスをプロテアーゼペプトン(Difco) で置き換え、ウマ血清をブタ血漿で置き換え、ニコチンアミドを０．０１％の最終濃度まで添加することから成る。
【００１３】
本発明はまた、本発明に係る菌株の生きた弱毒化Mycoplasma synoviae を含む微生物学的培養物にも関する。そのような微生物学的培養物は、上記した培地を調製し、この培地に、寄託した２、３個のマイコプラズマ菌株を接種することにより、容易に得ることができる。また、当技術分野で公知の他の適する培地も、本発明に係る菌株の増殖に使用できることは明らかである。また、本発明の菌株はＮＡＤ−非依存性であるが、所望により、培地にＮＡＤを添加することも可能である。
【００１４】
本発明はまた、本発明に係る生きた弱毒化Mycoplasma synoviae を含むという独特な特徴を有する、家禽をMycoplasma synoviae 感染から保護するための生ワクチンも提供する。本発明に係るワクチンは、動物に１日齢から接種することができる。マイコプラズマの別の種類である M. gallisepticum に対するワクチン接種は６週齢で行われ、従って、本発明に係る M. synoviaeワクチンと効果的に組み合わせることができる。従って、本発明に係るワクチンは、６週齢で効果的に接種することができる。
【００１５】
別の態様では、本発明に係るワクチンが、家禽に対するウイルスまたは微生物病原体に由来する他の抗原を少なくとも１種含む。そのような混合ワクチンは、１回のワクチン接種で多数の病原体に対する免疫感作が得られるという利点を有する。
【００１６】
抗原は、免疫系において応答を引き出すことができる、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、リポ多糖類もしくは他の抗原またはそれらの組み合わせであってもよい。また、生きた弱毒化または不活化生物全体を抗原物質として使用することもできる。
【００１７】
特に、他の家禽病原体は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、ニワトリ貧血因子(Chicken Anaemia agent)、トリレオウイルス、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、マイコプラズマ・ガリセプチクム(Mycoplasma gallisepticum)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)（コリーザ）、パスツレラ・マルトサイダ(Pasteurella multocida)（家禽コレラ）、オルニトバクテリウム・リノトラケアル(Ornithobacterium rhinotracheale)および大腸菌から成る群から選択される。
【００１８】
ワクチンは、公知の生ワクチンの投与方法で接種できる。例えば、眼内、鼻腔内、気管内または経口投与できる。非経口投与も可能である。感染は気道を介して伝播されるので、気道によるワクチン接種は、自然の感染経路を厳密に模倣するものである。菌株ＭＳ１のMycoplasma synoviae をベースとする生ワクチンの利点は、噴霧によるワクチン接種が可能なことである。噴霧によるワクチン接種は、気道によるワクチン接種を行う際の最も簡単な投与法であり、ワクチン接種したい複数の動物にワクチン菌株を単に噴霧するだけで、多数の動物を同時にワクチン接種することができる。噴霧によるワクチン接種の最も簡単な方法は、生ワクチンのネブライザーによる噴霧である。そのようなネブライザーにより、生ワクチンを含む細小滴が形成される。ワクチン接種したい動物がこれらのワクチン小滴を吸入すると、小滴は気道に浸透し、従って、自然感染を有利に模倣する。家禽のワクチン接種に通常使用される種類のネブライザーが使用される。この方法はまた、時間を要する、ワクチン接種したい動物を個別に取り扱うことを必要としないので、非常に有効な方法である。従って、より好ましい形態では、本発明に係るワクチンは、噴霧によるワクチン接種に適する担体を含む。そのような担体は、水のように単純なものでもよく、または、例えば生理学的塩溶液または培地であってもよい。１ｍ3の隔離された小屋での噴霧に非常に適するMycoplasma synoviae の量は、１０6〜１０11 Colour Changing単位(CCU) である。
【００１９】
所望により、アジュバント活性を有する化合物１種以上をワクチンに添加することができる。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激剤である。それらは、侵略してくる病原体に対する宿主の免疫応答を高める。従って、さらにより好ましい形態では、本発明に係るワクチンはアジユバントを含む。当技術分野で公知のアジュバントの例としては、フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体；例えば、欧州特許 EP 109942を参照）、サポニン、鉱物油、植物油および Carbopol （ホモポリマー）が挙げられる。粘膜投与に特に適するアジュバントとしては、例えば、大腸菌易熱性トキシン（ＬＴ）またはコレラトキシン（ＣＴ）が挙げられる。他の適するアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油性エマルジョン（例えば、Bayol F(R) または Marcol 52(R)）、サポニンまたはビタミンＥ溶解物が挙げられる。
【００２０】
本発明に係る生ワクチンは、菌株ＭＳ１のMycoplasma synoviae を薬学的に許容され得る担体と混合することにより調製できる。ワクチンは、しばしば、例えば、分解しがちなポリペプチドを分解から保護し、ワクチンの寿命を高め、または凍結乾燥効率を改善するために、さらに安定剤と混合する。有用な安定剤としては、ＳＰＧＡ(Bovarnik ら; J. Bacteriology 59: 509 (1950)) ；炭水化物、例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、ショ糖、デキストランまたはグルコース；アルブミンもしくはカゼインまたはそれらの分解産物などのタンパク質；およびアルカリ金属リン酸塩などの緩衝剤が挙げられる。化合物を添加することによりワクチンを安定化するための他の方法も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２１】
本発明に係るワクチンは、生ワクチンを保存するための当技術分野で公知の方法を使用して保存することができる。保存は、例えば、氷点下の温度で行うことができる。
【００２２】
凍結乾燥も、生ワクチンの保存に適する公知の方法である。凍結乾燥は、非凍結乾燥ストックの保存に必要な温度よりもかなり高い温度でワクチンを保存できるようにワクチンを安定化するという利点がある。
【００２３】
本発明に係る生ワクチンは、非常に効率的に凍結乾燥することができ、凍結乾燥の前に上記したような安定剤と組み合わせるときは特にそうである。従って、最も好ましい態様の生ワクチンは凍結乾燥形態である。凍結乾燥ワクチンをすぐに使用できるようにするためには、凍結乾燥ワクチンに水を加えるだけで十分である。
【００２４】
さらに、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質をワクチンに添加することもできる。
【００２５】
さらに、本発明は、Mycoplasma synoviae 生ワクチンの製造法を提供する。そのような方法は、本発明に係るMycoplasma synoviae を薬学的に許容され得る担体と混合することを含む。薬学的に許容され得る担体としては、健康に害を及ぼさない担体が挙げられ、さらに、健康に対するマイナスの影響がワクチン接種の有益な効果により相殺される担体が挙げられる。薬学的に許容され得る担体としては、例えば、生理学的塩溶液が挙げられる。
【００２６】
さらに、本発明は、本発明に係るMycoplasma synoviae の、家禽をMycoplasma synoviae 感染から保護するための生ワクチンの製造における使用に関する。
【００２７】
【実施例】
実施例１：ワクチンバッチの製造
１０7CCU の凍結乾燥したＭＳ１を含む１アンプルを使用して、Adlerの改変培地（上記参照）２０mlに接種した。３７℃で一夜インキュベートした後、１：１０および１：１００の継代培養物を１００mlの培地において調製し、37℃で一夜インキュベートした。次いで、１:１０および １:１００の継代培養物を混合し、噴霧ワクチンとして使用した。
【００２８】
実施例２：安全試験およびワクチン攻撃試験
菌株ＭＳ１の安全性を試験するために、ニワトリに対してワクチン接種を次のように実験的に行った。
【００２９】
ニワトリに、塗料噴霧器を使用してワクチンを噴霧した。噴霧器には、上記したワクチン１００mlを入れた。１ｍ3の隔離された小屋に対して、約１００mlのワクチンを噴霧した。ニワトリ１羽に対しては、約１０mlのワクチンを噴霧した。
【００３０】
実験動物
３５羽のＳＰＦ産卵鶏（Intervet）および３５羽のHyline brown産卵鶏（Interbroed）を隔離した小屋に入れた。それらの動物を毎日観察した。
【００３１】
実験計画
６群のニワトリを使用した。
【００３２】
【表１】
0003945885.tif 000002
【００３３】
６週齢のとき、ＢおよびＥ群の動物に、実施例１のＭＳ１培養物を噴霧によりワクチン接種した。１０日後、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ群の５羽のニワトリを検死して、ＭＳ１の安全性を評価した。
【００３４】
攻撃試験
Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ群のニワトリに９週齢で毒性Ｆ１０菌株を投与し、１０日後に全動物の検死を行った。それらの動物には、M. synoviae 投与の３日前にニューカッスル病菌株を初期投与した。M. synoviae 菌株Ｆ１０は、S.H. Kleven 博士（ジョージア大学、Athens GA ）から入手し、Freyの培地 (Freyら、Am. J. Vet. Res. 29:2163-2171 (1963)) で培養した。１アンプルのＦ１０（26-10-1995 P2, １ml, −７０℃で凍結保存）を使用して１０mlの培地に接種した。３７℃で４８時間インキュベートした後、１:１０、１:１００および１:１０００の継代培養物を１００mlの培地で調製し、３７℃で一夜インキュベートした。攻撃培養物を、１:１０および１:１００継代培養物を混合することにより調製し、塗料噴霧器によって投与した（隔離小屋毎に１００ml）。攻撃混合物のCCU数を測定した。
【００３５】
ＡおよびＤ群の動物には、ＮＤウイルスを投与した後、３日後にFreyの培地５０mlを噴霧した。
【００３６】
血清学的試験
ワクチン接種の１週間前、攻撃時および検死時に血清サンプルを採取した。それらのサンプルを、M. synoviae 抗原 Nobilis(Intervet,バッチ MSG508)によるM. synoviae 凝集抗体に対して試験した。
【００３７】
ＣＣＵ測定
M. synoviae 培養物中の生きた生物の数を、１mlの培地において順次１０倍希釈物を調製することにより滴定し、次いで、３７℃で１０日間インキュベートして測定した。培地中で指示薬の色が変化した最高希釈物を使用して、CCU/mlを計算した。
【００３８】
死後の検査
検死の際に、ニワトリの気管炎および滑膜炎の兆候について調べ、気嚢炎を、公知の方法(Kleven ら、Avian Dis. 16:915-924 (1972))に従って採点した：
０：病変がない
１：気嚢膜がわずかに曇っている
２：チーズ様滲出液の小さい集まりがある、肥大した膜
３：１個の気嚢にチーズ様滲出液の大きい集まりがある、肥大した膜
４：３と同様であるが、チーズ様滲出液の大きい集まりが２個以上の気嚢に見られる。
【００３９】
気管、気嚢および踵関節スワブをM. synoviae に対して培養した。M. synoviae の再単離を、ＰＣＲによって確認した(Lauerman ら、Avian Dis. 37:829-834 (1993)) 。
【００４０】
結果
ＭＳ１の安全性
ワクチン接種の７日前に、全動物のM. synoviae に対する抗体を調べたが、陽性は認められなかった。６週齢のとき、ＢおよびＥ群のニワトリに、１０9CCU/mlを含むＭＳ１培養物を噴霧によりワクチン接種した。ワクチン接種後に、臨床上の異常は認められなかった。ワクチン接種から１０日目に、ＢおよびＥ群の５匹の動物、ならびにＡおよびＤ群のワクチン接種していない５匹の対照動物の検死を行った。気管炎、気嚢炎（得点＝０）、滑膜炎または他の異常の兆候は認められなかった。Ｅ群の全１５羽のニワトリおよびＢ群の１５羽のうちの１３羽は、血清平板凝集により測定されるように、ワクチン接種から１０日後にM. synoviae に対する抗体を生じた（表１）。
【００４１】
ＭＳ１の効力
攻撃時（すなわち、ワクチン接種から２１日後）ワクチン接種したニワトリの抗体レベルは高かった（表１）。Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ群のニワトリの攻撃に対しては、１０8CCU/mlを含むＦ１０培養物を使用した。表２に示すように、ワクチン接種したニワトリ（ＢおよびＥ群）では気嚢炎の得点は、攻撃対照群のニワトリよりもかなり低かった。気管炎は、Ａ群の２羽およびＣ群の２羽のニワトリで認められた。脾臓の腫れは、Ａ群の２羽、Ｂ群の１羽、Ｃ群の７羽、Ｄ群の１羽およびＦ群の５羽で認められた。Ｅ群のニワトリは、脾臓の腫れを示さなかった。Ｃ群の２羽およびＦ群の１羽は、肺炎に罹った。
【００４２】
M. synoviae は、攻撃した全群のニワトリの気管および気嚢から再単離できた（表３）。ワクチンまたは攻撃菌株の再単離に差異はなかった。にもかかわらず、Ｃ群の１羽およびＦ群の３羽における陽性の培養物と比較して、ワクチン接種したニワトリの踵関節からは、M. synoviae が単離されなかった。マイコプラズマ属の他の種も単離されなかった。
【００４３】
【表２】
0003945885.tif 000003
【００４４】
【表３】
0003945885.tif 000004
【００４５】
【表４】
0003945885.tif 000005
【００４６】
実施例３：投与量に応答するワクチン効力
広い範囲の用量にわたってワクチンの効力を試験するために、次の実験を行った。
【００４７】
実験計画
４群のニワトリを使用した。
【００４８】
【表５】
0003945885.tif 000006
【００４９】
６週齢のときに、ＡおよびＢ群のニワトリにＭＳ１ワクチンを噴霧により接種した。ワクチン接種から３週間後、Ａ、ＢおよびＣ群のニワトリに、上記したようにＮＤウイルスを初期投与した後、毒性Ｆ１０菌株を投与した。全ニワトリを、攻撃から１０日後に検死した。
【００５０】
実験動物
34羽のＳＰＦ産卵鶏(Intervet)を隔離した小屋に入れた。それらの動物を毎日観察した。Ｂ群の１羽およびＣ群の１羽は、攻撃前に死亡した。
【００５１】
ワクチン接種
菌株ＭＳ１の培養物を凍結乾燥してワクチンを調製した。ワクチンの噴霧接種前に、凍結乾燥したワクチンの１バイアルの内容物を１００mlのリン酸緩衝塩類溶液（１:１００に希釈したワクチン）に再懸濁した。このワクチンから、１:１００希釈物を、リン酸緩衝塩類溶液（1:10,000に希釈したワクチン）を用いて調製した。ニワトリに対して、微小噴霧によってワクチン接種した（隔離した小屋毎に１００mlのワクチン希釈物）。最終ワクチン希釈物中のＭＳ１濃度を、ＣＣＵ数によって測定した。
【００５２】
結果
ニワトリに、１０6CCU/ml（Ａ群）および１０3CCU/ml（Ｂ群）を含むワクチンを接種した。ワクチン接種から３週間後、ワクチン接種したニワトリおよびワクチン接種していない対照ニワトリに、１０7CCU/mlを含むM. synoviae Ｆ１０培養物を投与した。検死すると、ワクチン接種した両群で気嚢炎が予防されていることが認められた（表４）
【００５３】
【表６】
0003945885.tif 000007
【００５４】
結論
本発明に係るＮＡＤ−非依存性菌株は、ワクチンを噴霧接種した後の６週齢のニワトリで無発病性であった。これは、１０9CCU/mlを含む培養物によるワクチン接種から１０日後の検死において、臨床上の異常が何ら見られなかったことで実証される。他方、９週齢のときに毒性Ｆ１０菌株の培養物１０8CCU/mlを投与すると、攻撃の１０日後には、ワクチン接種しなかったニワトリで重い気嚢炎が生じた。
【００５５】
Ｆ１０菌株による攻撃に対する保護は、ＳＰＦおよび市販の Hyline brown ニワトリの両方で、非常に広い用量範囲にわたって認められた。気嚢炎の得点は減少し、ワクチン接種したニワトリの関節からはM. synoviae は単離されなかった。巨脾腫を示したニワトリの数も、ワクチン接種していない攻撃対照ニワトリの方が多かった。従って、本発明に係るMycoplasma synoviae 菌株をベースとするワクチンは安全であり、かつ有効であると結論付けることができる。