(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へのポリアニオンの導入のための薬理組成物であって、
次式のカチオン化合物
0003887015.tif 000007
（式中、
Ｒ1及びＲ2は独立してＣ1〜Ｃ3アルキルであり；
Ｙ及びＺは独立して−CH2CH2CH2CH2CH2−，−CH＝CHCH2CH2CH2−，−CH2CH＝CHCH2CH2−，−CH2CH2CH＝CHCH2−，−CH2CH2CH2CH＝CH−，−CH＝CHCH＝CHCH2−，−CH＝CHCH2CH＝CH−及び−CH2CH＝CHCH＝CH−より成る群から選ばれる構成員であり、但しＹ及びＺは共に−CH2CH2CH2CH2CH2−でないことを条件とし；
ｎ及びｑは独立して３〜７の整数であり；そして
ｍ及びｐは独立して４〜９の整数であり；但しｎ＋ｍ及びｑ＋ｐの合計は10〜14てあることを条件とし；そして
Ｘ-はクロリド、ブロミド、フルオリド、ヨージド、ニトレート、スルフェート、ホスフェート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、グルタメート及びラクテートより成る群から選ばれる薬理学的に許容されるアニオンである）；
ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド及びスフィンゴミエリンより成る群から選ばれる少なくとも一種の中性脂質；並びに
薬理学的に許容される担体；
を含んで成る組成物。
【請求項２】
前記中性脂質が１，２−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｙ及びＺが独立して−CH＝CHCH2CH2CH2−，−CH2CH＝CHCH2CH2−，−CH2CH2CH＝CHCH2−及び−CH2CH2CH2CH＝CH−より成る群から選ばれる構成員である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｙ及びＺが共に−CH＝CHCH2CH2CH2−であり；ｎ及びｑが共に７であり、そしてｍ及びｑが共に５である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
Ｘ-がCl-である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
リポソーム組成物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記カチオン化合物がDODACであり、そして前記中性脂質が１，２−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
遺伝子治療は欠失タンパク質の発現を助長するように細胞に遺伝子材料を導入せしめることを包括する現在関心のもたれている分野である。これを成し遂げるのに現在５つの主要な方法がある。即ち、（ｉ）リン酸カルシウム沈殿、（ii）DEAE−デキストラン複合体、（iii）エレクトロポレーション、（iv）カチオン脂質複合体及び（v）再構成化ウィルス又はビロソーム、である（Changら、Focus 10：88（1988）を参照のこと）。カチオン脂質複合体はトランスフェクションを行うのに一般的に利用されている現在最も有効な手段である。
カチオン脂質を組込む多種多様な製剤が市販されている。即ち、（ｉ）LIPOFECTIN（商標）（これは１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド又はDOTMAを使用する；Eppsteinら、米国特許第4,897,355号参照のこと）；LIPOFECTAMINE（商標）（これはDOPSAを使用する；Hawley-Nelsonら、Focus 15（3）：73（1993）参照のこと）；及びLIPOFECTACE（商標）（これはＮ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド又はDDABを使用する；Rose米国特許第5,279,833号を参照のこと）。その他の研究者は、本質的に同様に作用するが、異なる効能をもって作用する別のカチオン脂質、例えば１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド又はDOTAP（Stomatatosら、Biochemistry 27：3917-3925（1988）参照のこと）；グリセロールベース脂質（Leventisら、Biochem.Biophys. Acta 1023：124（1990）を参照のこと）；リポポリアミン（Behrら、米国特許第5,171,678号参照のこと）及びコレステロールベース脂質（Epandら、WO 93／05162号参照のこと）を報告する。
その他の者は、DOTMA及び近縁の化合物が、その飽和型類似体よりもトランスフェクションアッセイにおいて有意に活性が強いことを示している（Felgnerら、WO 91／16024号参照のこと）。しかしながら、DOTMA及びDOSPAベース製剤は共に、トランスフェクションを行ううえで最も有効なカチオン脂質であるにもかかわらず、法外な価格である。一方、DDABは安価であり、そして化学メーカーから容易に入手できるが、しかしほとんどの細胞系においてDOTMAよりも効果が低い。
当業界に何が必要とされるかというと、トランスフェクションがより有効であり、且つより経済的な新規の組成物及び方法である。驚くべきことに、本発明はかかる組成物及び方法を提供する。
発明の概要
本発明は細胞へのポリアニオン性材料の導入にとって有用な組成物及び方法を提供する。この組成物はカチオン化合物と中性脂質との混合物であり、それらは一般にリポソームとして配合される。このカチオン化合物は四級アンモニウム化合物であり、その窒素は少なくとも２個の付加された長鎖アルキル基を有し、その少なくとも１個は不飽和である。細胞をトランスフェクションする方法は（ａ）このポリアニオン性材料を上記の組成物のリポソーム製剤と接触させて複合体を作り、そして（ｂ）この複合体とトランスフェクションすべき細胞とを接触させる、ことを包括する。
【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドDNAにより誘導したDOTMA：DOPE及びDODAC：DOPEの融合を示す。
図２は脂質／DNA複合体とRBCゴーストとの融合を示す。
図３は50モル％のDOPEと配合せしめたカチオン脂質小胞のトランスフェクション能力の事前検定を示す。
図４はBHK細胞におけるDOTMA：DOPE及びDODAC：DOPEトランスフェクション効能の負荷比力価を示す。
図５は血清の非存在下（Figure 5A）及び存在下（Figure 5B）での集密度50％のH9C2筋芽細胞についてのDODAC：DOPE複合体のトランスフェクション効能を示す。
図６は血清の非存在下（Figure 6A）及び存在下（Figure 6B）での集密度100％のH9C2筋芽細胞についてのDODAC：DOPE複合体のトランスフェクション効能を示す。
図７は血清の非存在下（Figure 7A）及び存在下（Figure 7B）でのH9C2筋管についてのDODAC：DOPE複合体のトランスフェクション効能を示す。
図８はICRマウスについてのDODAC：DOPE複合体のトランスフェクション効能を示す。
発明の詳細な説明
略語及び定義
本明細書において以下の略語を用いた：BHK：ベビーハムスターの腎臓；RBC：赤血球細胞；DDAB：Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド；DODAC：Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド；DOPE：１，２−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；DOSPA：２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；DOTAP：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド；DOTMA：１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド；OSDAC；Ｎ−オレイル−Ｎ−ステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド；RT：室温；HEPES：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；FBS：胎児牛血清；DMEM：ダルベッコ改良イーグル培地；PEG−Cer−Ｃ14：１−Ｏ−（２′−（ω−メトキシポリエチレングリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイル−スフィンゴシン；PEG−Cer−C20：１−Ｏ−（２′−（ω−メトキシポリエチレングリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−アラキドイル−スフィンゴシン；PBS：リン酸緩衝食塩水；THF：テトラヒドロフラン；EGTA：エチレンビス（オキシエチレンニトリリロ）−四酢酸；SF−DMEM：無血清DMEM；及びNP40：ノニルフェノキシポリエトキシエタノール。
本明細書において用いる語「アルキル」とは、飽和炭化水素基を意味し、それは直鎖でも枝分れしていてもよい（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）。一部の置換基にとって好適なアルキル基は１〜３個の炭素原子を含む低級アルキル基である。その他のアルキル基置換基については、16〜20個の炭素原子を含む長鎖アルキル基が好ましい。本明細書及び請求の範囲における数値範囲は全て上限値及び下限値を含むことを意図する。
「アシル」なる語はヒドロキシル基の除去により有機酸から出来る基を意味する。アシル基の例にはアセチル、ペンタノイル、パルミトイル、ステアロイル、ミリストイル、カプロイル及びオレオイルが含まれる。
本明細書において用いる語「薬理学的に許容されるアニオン」とは、薬理製剤において無毒な塩を供する有機酸又は無機酸のアニオンを意味する。かかるアニオンの例にはクロリド、ブロミド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、グルタメート及びラクテートが含まれる。薬理学に許容される塩の調製は、引用することで本明細書に組入れるBergeらJ.Pharm.Sci. 66：1-19（1977）に記載されている。
本明細書において用いる語「ポリアニオン」とは、複数のアニオン基を有する物質を意味する。例えば、ポリアニオンはDNA及びRNAの双方の核酸を意味するように用いており、それらは核酸骨格伝いに複数個のアニオン性ホスホジエステル基を有するポリアニオン形質において存在する。「ポリアニオン」なる語は中性pHにおいて複数個のアニオン基を有する薬剤も意味する。かかる薬剤には多重のカルボン酸官能基（即ち、Glu，Asp）をもつペプチドが含まれる。
「中性脂質」なる語は生理学的pHにおいて無荷電又は中性双イオン形態で存在する種々の脂質物質を意味する。かかる脂質には、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロミドが含まれる。
「トランスフェクション」及び「形質転換」は本明細書において同義語として用いており、そしてポリアニオン性材料、特に核酸の細胞への導入を意味する。「リポフェクチン」なる語はリポソーム複合体を用いてかかる材料を導入することを意味する。ポリアニオン性材料は、細胞への侵入後の遺伝子発現を助長するように発現ベクターに連結されたDNA又はRNAの形態であってよい。即ち、本発明において用いられるポリアニオン性材料は、構造タンパク質、レセプター及びホルモンについてのコード配列を有するDNA、並びに転写及び翻訳調節セグメント（即ち、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びシグナル配列）、並びにベクターを含むことを意味する。発現ベクターへの特定の核酸の組込みの方法は当業界に公知であるが、しかし例えば共に引用することで本明細書に組入れるSambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual（第２版）Vol １〜３, Cold Spring Harbor Laboratory,（1989）又はCurrent Protocds in Molecular Biology, F.Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（1987）に詳しく記載されている。
「発現ベクター」、「クローニングベクター」又は「ベクター」は往々にして選定の宿主細胞の中で複製できるプラスミド又はその他の核酸分子である。発現ベクターは自己複製できうるか、又は当業界公知の方法により宿主細胞のゲノムの中に挿入されることにより複製できうる。自己複製するベクターは複製起点を有するか又は選定の宿主細胞の中で機能的な自己複製配列（ARS）を有するであろう。往々にして、ベクターは、複数の宿主細胞において、例えばクローニング及び構築のためにＥ．コリ（E.coli）において、且つ発現のために哺乳細胞において有用であることが所望される。
詳細な説明
本発明は細胞へのポリアニオン性材料の導入のための組成物及び方法を提供する。この組成物は式Ｉのカチオン化合物及び少なくとも一種の中性脂質を含んで成る。
0003887015.tif 000002
式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＣ1〜Ｃ3アルキルである。Ｙ及びＺはアルキル又はアルケニル鎖であり、そしてそれぞれ独立して−CH2CH2CH2CH2CH2−，−CH＝CHCH2CH2CH2−，−CH2CH＝CHCH2CH2−，−CH2CH2CH＝CHCH2−，−CH2CH2CH2CH＝CH−，−CH＝CHCH＝CHCH2−，−CH＝CHCH2CH＝CH−又は−CH2CH＝CHCH＝CH−であり、ただしＹ及びＺは共に−CH2CH2CH2CH2CH2−でないことを条件とする。文字ｎ及びｑは３〜７の整数を示し、一方文字ｍ及びｐは４〜９の整数を示し、ただしｎ＋ｍ及びｑ＋ｐはそれぞれ10〜14の整数である。記号Ｘ-は薬理学的に許容されるアニオンを意味する。上記の式において、二重結合の配向はcis又はtransのいづれでもよいが、しかしながらcis異性体が一般に好ましい。
好適な態様の一群において、このカチオン化合物は、Ｒ1及びＲ2がメチルであり、そしてＹ及びＺがそれぞれ独立して−CH＝CHCH2CH2CH2−，−CH2CH＝CHCH2CH2−，−CH2CH2CH＝CHCH2−又は−CH2CH2CH2CH＝CH−である式Ｉの化合物である。本発明の特に好適な態様においては、Ｒ1及びＲ2はメチルであり；Ｙ及びＺはそれぞれ−CH＝CHCH2CH2CH2−であり；ｎ及びｑは共に７であり、そしてｍ及びｑは共に５である。最も好適な態様において、カチオン化合物はDODAC（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）である。DODACは洗剤及びシャンプーの添加剤としてかなり利用されている公知の化合物である。リポソーム組成物におけるその他の洗剤との共存脂質（colipid）としてのその用途も報告されている（Takahashiら、GB 2147243号を参照のこと）。
本組成物の一部である天然脂質は洗剤の中に又はミセルもしくはリポソームの形成のために一般に利用されている任意の様々な中性脂質であってよい。本組成物において有用な中性脂質の例はジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドである。好適な態様において、本組成物は１又は複数種の中性脂質を含んでよく、それはジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド又はスフィンゴミエリンである。これらの中性脂質におけるアシル基は好ましくはＣ10−Ｃ24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、このアシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルである。特に好適な態様において、この中性脂質は、１，２−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。
アニオンＸ-も同様に任意の様々な薬理学的に許容されるアニオンでありうる。これらのアニオンは有機系又は無機系、例えばBr-，Cl-，Ｆ-，Ｉ-、スルフェート、ホスフェート、アセテート、ニトレート、ベンゾエート、シトレート、グルタメート及びラクテートでありうる。好適な態様において、Ｘ-はCl-及びAcO-である。
上記の成分に加えて、本発明の組成物は薬理学的に許容される担体も含むであろう。薬理学的に許容される担体は当業者に公知であ担体の選択は投与する特定の組成物及びこの組成物を投与する特定の方法によりある程度決定されるであろう。好ましくは、この薬理担体は水又は食塩水である。
本発明の組成物において、カチオン化合物、対、中性脂質の比は約25：75（カチオン化合物：中性脂質）〜75：25（カチオン化合物：中性脂質）、好ましくは約50：50の範囲に属するであろう。
上記の組成物において用いられるカチオン化合物は標準の合成反応を利用して当業者に公知の方法により調製されうる（March, Advanced Organic Chemistry第４版、Wiley-Interscience, NY NY（1992）を参照のこと；引用することで本明細書に組入れる）。例えば、OSDACの合成はまずオレイルアミンをホルムアルデヒド及びナトリウムシアノボロヒドリドでアミンの還元的アルキル化が生ずる条件下で処理することにより実施できる。これはジメチルオレイルアミンを供し、これは次にステアリルブロミドでアルキル化されて対応のアンモニウム塩となりうる。アニオン交換はOSDACの形成をもたらす。ジメチルオレイルアミンはオレイルブロミドの大過剰量のジメチルアミンによる処理によっても合成でき、そして上記の通りに更に誘導化する。双方の脂肪酸鎖が不飽和となっているカチオン化合物（即ちDODAC）に関しては、以下の一般手順が利用できる。不飽和酸（即ち、オレイン酸）はオキサリルクロリド、チオニルクロリド、PCl3又はPCl5の如き試薬によりその対応の酸クロリドに変換されうる。アシルクロリドは対応のアミドを供するように不飽和アミン（即ち、オレイルアミン）により処理してよい。例えばリチウムアルミニウムヒドリドによるアミドの還元は双方のアルキル基が不飽和長鎖アルキル基である第二級アミンを供する。次いでこの第二級アミンをアルキルハライド、例えばヨウ化メチルで処理して四級アンモニウム化合物にすることができる。次いでアニオン交換を行って所望の薬理学的に許容されるアニオンを有するカチオン化合物を供することができる。アルキルアミン前駆体は似たようにして合成できる。例えば、アルキルハライドの大過剰量のアンモニアメタノール性溶液による処理は、精製後に必要なアミンを供するであろう。他方、適当なカルボン酸のオキサリルクロリドによる処理によって生成されるアシルクロリドはアンモニアと反応してアミドを供しうる。アミドのLiAlH4による還元は必須のアルキルアミンを供するであろう。
一の態様の群において、本発明の薬理組成物はミセル又はリポソームとして配合されるであろう。
本発明のカチオン化合物及び中性脂質を含むミセルは当業者に公知の方法により調製できる。本組成物のミセル製剤に加えて、本発明はその他の物質、例えばリソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン・コンジュゲート、セラミド−ポリオキシエチレン・コンジュゲート又はホスファチジル酸−ポリオキシエチレン・コンジュゲートを含むミセル製剤も提供する。本発明の組成物において使用するポリオキシエチレンコンジュゲートは接合基（即ち、ホスファチジン酸又はホスファチジルエタノールアミン）を適当な官能化ポリオキシエチレン誘導体と組合せることにより調製できる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンをω−メトキシポリエチレングリコールスクシネートと組合せてホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン・コンジュゲートにすることができる。引用することで本明細書に組入れるParrら、Biochim.Biophys. Acta 1195：21-30（1994）を参照のこと。
本薬理組成物のカチオン化合物及び中性脂質からリポソームも形成できる。中性脂質の選択は一般に、例えばリポソームのサイズ及び血流中のリポソームの安定性により導かれる。
前述の通り、リポソーム中の中性脂質成分は２個のアシル基を有する脂質である（即ち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）。様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が入手可能であるか、又は公知の技術により単離もしくは合成できうる。一般に、濾過除菌のために特にリポソームが約0.3ミクロンより小さくなくてはならないとき、飽和度の低い脂質の方がより簡単にサイズ選別できる。一の態様の群において、Ｃ14〜Ｃ22の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。別の態様の群において、Ｃ14〜Ｃ22の範囲の炭素鎖長を有するモノ又はジ不飽和脂肪酸をもつ脂質が使用される。更に、飽和と不飽和の脂肪酸鎖の混合をもつ脂質が利用できる。本発明において有用なリポソームはスフィンゴミエリン、又はセリン及びイソシトールの如きその他の頭部基をもつリン脂質より成っていてもよい。本発明において有用なその他のリポソームにはコレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン・コンジュゲート、ホスファチジン酸−ポリオキシエチレンコンジュゲート又はポリエチレングリコール−セラミド・コンジュゲート（例えばPEG−Cer−Ｃ14又はPEG−Cer−Ｃ20）が含まれであろう。リポソームをサイズ選別及び濾過除菌する方法を以下に述べる。
様々な方法がリポソームの調製のために有用であり、例えばSzokaらAnn.Rev.Biophys.Bioeng. 9：467（1980），米国特許第4,235,871、4,501,728、4,837,028号、論文Liposomes, Marc J.Ostro，編Marcel Dekker, Inc., New York, 1983，第Ｉ章及びHopeらChem.Phys.Lip.40：89（1986）に記載されている。これらは全て引用することで本明細書に組入れる。一の方法は不均質なサイズの多重層小胞を供する。この方法においては、小胞形成性脂質を適当な有機溶媒又は溶媒系の中に溶かし、そして真空又は不活性ガス下で乾燥させて脂質薄膜を形成する。所望するなら、この膜を適当な溶媒、例えば第三ブタノールの中に溶かし、次いで凍結乾燥して一層水和し易い粉末様形態にする一層均質な脂質混合物にする。この膜を水性緩衝溶液で覆い、そして一般に撹拌しながら15〜60分かけて水和させる。得られる多重層小胞のサイズ分布は一層強力な撹拌条件下での脂質の水和により、又はデオキシコレートの如き可溶化性洗浄剤の添加により一層小さいサイズにシフトしうる。
リポソーム調製の後、リポソームをサイズ選別にかけて所望のサイズ範囲及び比較的狭い分布のリポソームサイズを得るようにしてよい。約0.2〜0.4ミクロンのサイズ範囲はリポソーム懸濁物を慣用のフィルター、一般には0.22ミクロンのフィルターで濾過除菌することを可能にする。
いくつかの技術がリポソームを所望のサイズにサイズ選別するために有用である。一のサイズ選別法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,737,323号に記載されている。浴槽又はプローブ音波処理のいづれかによるリポソーム懸濁物の音波処理は約0.05ミクロン未満のサイズの小型の単層小胞に至る連続的なサイズ減少を供する。ホモジネーションがその他の方法であり、それは大型リポソームを小型のものに断片化する剪断エネルギーを頼りとする。一般的なホモジネーション手順において、多重層小胞を選定のリポソームのサイズにまで標準のエマルションホモジナイザーに再循環させる。一般に約0.1〜0.5ミクロンが観察される。両方の方法において、粒子サイズ分布は慣用のレーザービーム粒子サイズ標識によりモニターできる。
小孔ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を通じるリポソームの押出もリポソームのサイズを比較的よく規定されたサイズ分布に減少させるための有効な方法である。一般に、懸濁物を膜に１又は数個、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで循環させる。これらのリポソームは、リポソームのサイズの暫進的な減少を達成するために小孔膜に連続して押出してよい。本発明における用途のため、約0.05ミクロン〜約0.15ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。
本発明の組成物は細胞へのポリアニオン性材料の導入のために有用である。従って、本発明は細胞へのポリアニオン性材料の導入のための方法も提供する。この方法は、in vitroでポリアニオン性材料を少なくとも一種の中性脂質及び式Ｉのカチオン化合物の組成物と接触させることにより実施する。このポリアニオン性材料をリポソーム製剤と接触させて複合体を形成した後、この複合体を細胞とトランスフェクションが起こるのに十分な時間接触させる。
0003887015.tif 000003
式Ｉにおいて、記号Ｒ1、Ｒ2，Ｙ，Ｚ，ｎ，ｍ，ｐ，ｑ及びＸは本発明の組成物に関して上記した通りである。一の好適な態様の群において、本方法において用いたカチオン化合物はＲ1及びＲ2がメチルであり、そしてＹ及びＺがそれぞれ独立して−CH＝CHCH2CH2CH2−，−CH2CH＝CHCH2CH2−，−CH2CH2CH＝CHCH2−又は−CH2CH2CH2CH＝CH−である式Ｉの化合物である。特に好適な態様において、Ｒ1及びＲ2はメチルであり；Ｙ及びＺはそれぞれ−CH＝CHCH2CH2CH2−であり；ｎ及びｐは共に７であり；そしてｍ及びｑは共に５である。より好ましくは、カチオン化合物はDODAC（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）である。本発明の方法のその他の好適な態様は上記の好適な組成物を包括するであろう。
上記の通り、このポリアニオン性材料はまず中性脂質及びカチオン性化合物を含んで成る組成物を接触させてポリアニオン性材料−リポソーム複合体を供する。この接触は（中性脂質及びカチオン化合物からの）リポソーム形成の前に、又は一次リポソーム形成の後に行ってよい。好適な態様においては、中性脂質及びカチオン化合物のリポソームをまず形成し、次いでポリアニオン性材料と接触させる。このポリアニオン性材料は一般に負に帯電したポリアニオン性材料と正に帯電したリポソームの表層との間でのイオン性吸引力の結果、リポソームの表層に結合するであろう。一般に、複合体の形成をもたらしめるポリアニオン性材料とリポソームとの接触は約15℃〜約45℃の温度、好ましくは約25℃で実施されるであろう。複合体の形成を完了するのにかかる時間の長さは温度、並びにポリアニオン性材料及びリポソーム自体の種類に依存するであろう。約25℃の接触温度を利用した場合、リポソームと核酸との複合体を形成するための時間の長さは約15分〜約２時間であろうが、一定の状況ではより長い時間が必要とされうる。他方、このポリアニオン性材料は当業者に公知の慣用の薬剤を負荷するために利用されている方法によりリポソームの内部に組込むことができる。リポソームに薬剤を負荷するための一の方法は封入を含み、そして様々な技術により実施できる。
一の封入技術において、この薬剤及びリポソーム成分は、全ての物質が混和性であり、且つドライフィルムへと濃縮されるようにする有機溶媒に溶かす。次いでこのドライフィルムにバッファーを加え、そしてポリアニオン性材料が小胞壁の中に組込まれたリポソームが形成される。他方、このポリアニオン性材料をバッファーの中に入れ、そして脂質成分のみのドライフィルムに添加してよい。このようにして、ポリアニオン性材料はリポソームの水性内部に封入されるようになるであろう。リポソームの形成において用いるバッファーは例えば等張性食塩水、リン酸緩衝食塩水又はその他の低イオン強度バッファーの任意の生物適合性バッファー溶液でありうる。一般に、ポリアニオン性材料は約0.01ng／ml〜約50mg／mlの量で存在するであろう。水性内部又は膜の中にポリアニオン性材料の組込まれた得られるリポソームを次に上記の通りにして任意的にサイズ選別にかける。
一の好適な態様の群において、このポリアニオン性材料：リポソーム複合体は約0.5〜約4.0の帯電率（＋／−）を有するであろう。このような帯電率を達成せしめるため、この複合体はカチオン脂質及び少なくとも一種の中性脂質の水性リポソーム製剤であってその中のカチオン脂質が全脂質濃度の約25％〜約75％で存在しているものを調製することにより形成する。上記の通りにしてリポソームをサイズ選別した後、ポリアニオン性材料の水性溶液をリポソーム懸濁物で処理する。得られる調製品を次に生物適合性バッファーで好ましくは約５倍希釈し、約0.5〜約4.0の帯電率を有する0.05〜1.0μg／mlの最終濃度のポリアニオン性材料：リポソーム複合体を供する。
ポリアニオン性材料：リポソーム複合体の形成後、この複合体をトランスフェクションすべき細胞と接触させる。リポソームはほとんど全ての細胞タイプに吸着する。一旦吸着したら、リポソーム（先に記載の複合体を含む）は細胞の一部により食作用を受け、細胞膜と脂質交換するか、又は細胞と融合しうる。複合体のポリアニオン性部分の輸送又は組込みはこれらの任意のいづれかの経路を介して行われうる。特に、融合が起こるとき、リポソーム膜は細胞膜に組込まれ、そしてリポソームの内容物は細胞内流体と組合わさる。細胞とポリアニオン性材料−リポソーム複合体との接触は、in vitroで行われるとき、生物適合性媒体の中で行われるであろう。脂質の濃度は特定の用途に依存して様々であってよいが、しかしながら一般には約１μmol〜約10mmolである。ポリアニオン性材料：リポソーム複合体による細胞の処理は一般に生理学的温度（約37℃）で約１〜６時間、好ましくは約２〜４時間にわたって実施されるであて。in vitro用途において、ポリアニオン性材料の輸送は培養物の中で増殖させている任意の細胞（植物又は動物起源、脊椎動物又は無脊椎動物）及び任意の組織又はタイプに対して行ってよい。好適な態様において、これらの細胞動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、そして最も好ましくはヒト細胞であろう。
一の好適な態様の群において、このポリアニオン性材料：リポソーム複合体を約103〜105細胞／ml、より好ましくは約２×104細胞／mlの細胞密度を有する60〜80％の集密度のプレート細胞に加える。複合体の濃度は好ましくは約0.01〜0.2μg／ml、より好ましくは約0.1μg／mlであろう。
一般の適用には、治療的に有用なポリペプチドをコードするDNA又はmRNA配列の細胞内輸送を供する公知のトランスフェクション手順の利用を含む。しかしながら、この組成物は発現された遺伝子生成物又はタンパク質自体の輸送のためにも利用できる。このようにして、欠失又は非存在遺伝子生成物を供給することによる遺伝子疾患のための（即ち、DuchenneジストロフィーについてはKunkelら、Brit.Med.Bull. 45（3）：630-643（1989）を、そして嚢胞性線維芽症についてはGoodfellow, Nature 341：102-103（1989）を参照のこと）治療法が提供される。本発明の組成物についてのその他の用途には細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれる（Bennetteら、Mol.Pharm. 41：1023-1033（1992）参照のこと）。
他方、本発明の組成物は当業者公知の方法を利用し、細胞のin vivoトランスフェクションのためにも利用できる。特に、引用することで本明細書に組入れるZhuらScience 261：209-211（1993）はDOTMA-DOPE複合体を利用するサイトメガロウイルス（CMV）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）発現プラスミドの静脈内輸送を述べる。引用することで本明細書に組入れるHydeらNature 362：250-256（1993）は、リポソームを利用したマウスの気路の上皮に至る及び肺胞に至る嚢胞線維芽症トランスメンブラン伝搬調節因子（CFTR）遺伝子の輸送を述べている。引用することで本明細書に組入れるBrighamら、Am.J.Med.Sci. 298：278-281（1989）は細胞内酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードする機能性の原核系遺伝子によるマウスの肺のin vivoトランスフェクションを述べている。
本方法において利用するポリアニオン性材料が核酸であるとき、それらは天然起源から単離されたもの、ATCCもしくはGen Bankライブラリーの如きソースから入手したもの、又は合成法により調製したものでありうる。合成核酸は様々な溶液又は固相方法により調製できる。一般に、固相合成が好ましい。ホスフィット−トリエステル、ホスホトリエステル及びＨ−ホスホネート化学による核酸の固相合成のための手順の詳細な説明は幅広く入手できる。例えば、Itakura米国特許第4,401,796号；Caruthersら米国特許第4,458,066及び4,500,707号；BeaucageらTetrahedron Lett., 22：1859-1862（1981）；MatteucciらJ.Am.Chem.Soc., 103：3185-3191（1981）；CaruthersらGenetic Engineering, 4：1-17（1982）；Jones第２章、Atkinsonら第３章及びSproatら第４章Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, Gait（編），IRL Press, Washington D.C.（1984）；FroehlerらTetrahedron Lett., 27：469-472（1986）；FroehlerらNucleic Acids Res., 14：5399-5407（1986）；SinhaらTetrahedron Lett., 24：5843-5846（1983）；及びSinhaらNucl.Acids Res., 12：4539-4557（1994）を参照のこと。これらは引用することで本明細書に組入れる。
本発明はまた細胞にその他のポリアニオン性材料、特にタンパク質を導入するのにも有用である。細胞への外生又は内生タンパク質の導入はmRNAの翻訳を行うことのできない細胞を有する個体のための適当な治療法を担いうる。
以下の実施例は単に例示の目的のために提供し、本発明を限定又は規定するものではない。
実施例
材料
オレイルアミンはFluka Chemical Company, St.Louis, Missouri, USAより入手し、そして下記の方法によって合成もした。40％のホルムアルデヒド溶液はFischer Scientific, Ottawa, Canadaから入手した。ナトリウムシアノボロヒドリド、ステアリルブロミド、オレイン酸、オキサリルクロリド、リチウムアルミニウムヒドリド、ヨウ化メチル及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HEPES）はSigma Chemical Company, St.Louis, Missouri, USAより入手した。Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（NBD−PE）、Ｎ−（リッサミンローダミン８スルホニル）ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（Rho−PE）及び１，２−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）はAvanti Polar Lipids, Alabster, Alabama, USAより入手した。Lipex押出機はLipex Biomembranes, Vancouver, Canadaより入手した。pCMVβ発現ベクター（β−gal）はClonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Califomia, USAより入手した。シリカゲルはBDH, Canadaより入手した。PEG−Cer−Ｃ14，PEG−Cer−Ｃ20及びその他のPEG修飾脂質はParrら、Biochim.Biophys. Acta 1195：21-30（1994）及び同時係属出願第08/486,214号に供されている方法により調製できる。
実施例１
本実施例はオレイルアミンの調製を例示する。この合成は、商業用のオレイルアミンが往々にしてエライジルアミンにより汚染されているため、開発した。
ベンゼン中のオレイン酸（５ｇ）の溶液を室温で１時間撹拌しながらオキサリルクロリド（１ml）で処理した。溶媒を蒸留により除去した。その残渣を塩化メチレンに溶かし、そして濃アンモニアを加えた。得られるエマルションを室温で２ｈ撹拌した。真空でアンモニアを除去後、その溶液を塩酸で酸性にし、そして塩化メチレンで抽出した。得られる残渣をジエチルエーテルに溶かし、そして過剰のリチウムアルミニウムヒドリドを粉末として強く撹拌しながらゆっくり加えた。ゼラチン状の懸濁物が形成し、そしてそれを更に４ｈ撹拌した。次にメタノールを水素の発生が終るまで加えた。過剰の希塩酸を全ての固体が溶解し、且つ更なる水素発生が観察されなくなるまで加えた。この混合物を塩化メチレンで抽出した。有機相を飽和ブラインで洗い、そして溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。この残差をシリカゲルカラム（Merck, Art. 9385, 20ｇのゲル／反応生成物ｇ）に、塩化メチレン中の２％のメタノール（容量）を用い、不純物（オレイルアルコール及び未反応のオレオイルアミド）が全て溶出するまで通した。次いでメタノール濃度を溶出液250ml当り２％づつ、24％の濃度が達成されるまで上昇させた。このカラムをメタノールでフラッシングした。生成物含有画分からの溶媒の除去は1H NMRスペクトルにおいてエライジルアミンの徴候を示さず３ｇのオレイルアミンを供した。
実施例２
本実施例はＮ−ステアリル−Ｎ−オレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（OSDAC）の合成を示す。
0003887015.tif 000004
２．１．Ｎ，Ｎ−ジメチルオレイルアミンの合成
アセトニトリル（100ml）及びエタノール（50m）中のオレイルアミン（6.7ｇ）の溶液を40％の水性ホルムアルデヒド（10ml）及びナトリウムシアノボロヒドリド（2.7ｇ）により室温で２時間処理した。酢酸（５ml）をゆっくり加え、そしてその溶液を更に１時間撹拌した。この反応混合物を水で希釈し、水性水酸化ナトリウムで塩基性にし、そして塩化メチレンで抽出し、有機画分を硫酸マグネシウムで乾かし、濾過し、そして溶媒を真空で除去した。その残渣をシリカゲルカラム（150ｇ）に、溶出液として塩化メチレン中の15％のメタノールを用いて通し、淡黄色油（５ｇ）を得た。
２．２．OSDACの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルオレイルアミン（１ｇ）及びステアリルブロミド（5.4ｇ）の溶液を塩化メチレン（50ml）に溶かし、そして水性水酸化ナトリウム溶液（５Ｍの溶液５ml）で室温にて一夜撹拌しながら処理した。その反応混合物を水で洗い、次いで希塩酸で洗った。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（15×）で洗い、そして溶媒を除去した。その残渣をメタノール性塩酸に溶かし、そして水及び塩化メチレンから抽出した。これを更に３回繰り返した。有機溶媒を真空下で除去し、そしてその残渣をシリカゲルカラム（150ｇ）に溶出液として塩化メチレン中の５％のメタノールを用いて通し、ベンゼン中の10％のメタノールから凍結乾燥後に0.6ｇのOSDACが白色粉末として得られた。
実施例３
本例は還元アミド化を利用するＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）の合成を例示する。
0003887015.tif 000005
３．１．Ｎ−オレイルオレイルアミドの合成
ベンゼン（50ml）中のオレイン酸（５ｇ）の溶液をオキサリルクロリド（２ml）で室温において１時間処理した。この溶媒及び過剰量のオキサリルクロリドを真空下で除去し、そしてその残渣をベンゼン（20ml）に溶かした。ベンゼン（10ml）中のオレイルアミン（７ｇ）の溶液をゆっくり加え、次いでトリエチルアミン（３ml）を加えた。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで過剰の希塩酸で中和した。この混合物を塩化メチレンで抽出し、次いで合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾かし、濾過し、そして溶媒を除去した。その残渣をシリカゲルカラム（150ｇ）に塩化メチレン中の５％のメタノールを溶出液として用いて通し、白色固体としてのＮ−オレイルオレイルアミドを得た。
３．２．ジオレイルアミンの合成
THF（100ml）中のＮ−オレイルオレイルアミド（上記で調製）の溶液を40℃にまで温めた。リチウムアルミニウムヒドリドを気体の過激な発生が止むまでゆっくりと加えた。この反応混合物を１時間還流加熱し、次いで室温にまで冷却した。メタノール（100ml）をゆっくりと加え、次いで水（200ml）を加えた。塩化メチレンを加え、そして得られる懸濁物を15分撹拌した。このスラリーを濾過し、そしてその沈殿物をエタノール／塩化メチレン（50：50、50ml、２×）で洗った。合わせた濾液を塩化メチレンで抽出した。有機画分を硫酸マグネシウムで乾かし、濾過し、そして溶媒を真空で除去した。その残渣をシリカゲルカラム（150ｇ）に塩化メチレン中の５％のメタノールを溶出液として用いて通し、淡黄色油としてのジオレイルアミンが得られた。
３．３．Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドの合成
クロロホルム（50ml）中の上記で調製したジオレイルアミンの溶液をヨウ化メチル（100ml）により室温で１時間処理した。次いで水性水酸化ナトリウム（５Ｍの溶液１ml）及びヨウ化メチル（５ml）を加え、そしてその混合物を更に１時間撹拌した。この有機溶媒を真空下で除去し、そして得られるスラリーを希塩酸で中和した。水を加え、そしてその反応混合物を塩化メチレンで抽出した。この有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗い（１５×）、その後溶媒を真空下で有機相から除去した。その残渣をウェットエタノールにおいて濃塩酸溶液に溶かし、水で希釈し、そして塩化メチレンで抽出した。この方法を更に３回繰り返した。この生成物を、溶媒の除去後、シリカゲルカラム（150ｇ）に塩化メチレン中のメタノールの溶出液として用い（メタノールの量を５容量％から32容量％にまで増やしながら）通した。純粋な画分を合わせ、そしてその溶媒を除去し、白色のワックス状固体又は放置すると固化する無色の油のいづれかとしてのＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（５ｇ）を得た。DODACはベンゼン中の10％のメタノールからの凍結乾燥により白色粘質粉末として充密となりうる。
実施例４
本例はアルカリ化経由によるＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）の合成を例示する。
ジメチルアミンの溶液をドライメタノール（200ml）に無水ジメチルアミンガスを30分吹き込むことにより調製した。オレイルブロミド（５ｇ）を加え、そしてこの溶液を暗所の中で室温で16時間撹拌した。この溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そして残留ジメチルアミンを無水エタノール（50ml）の２回の添加、そして続くロータリーエバポレーターでの溶媒の除去により除去した。オレイルブロミド（10ｇ）をこの残渣に加え、そしてこの混合物をクロロホルム（40ml）に溶かした。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ 10ml）を加え、そして得られる溶液を暗所の中で静かに16時間還流した。
有機溶媒をロトバップで除去し、そして残渣をエタノール（50ml）に溶かした。濃HCl（33％、10ml）を加え、次いで水（100ml）を加えた。得られるエマルションをクロロホルム（３×50ml、次いで２×25ml）で抽出した。その抽出物を合わせ、そして洗浄／抽出手順に更に５サイクル再びかけた。次いで有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そしてその残渣を飽和塩化ナトリウム溶液に懸濁した。この溶液をクロロホルム（３×50ml、２×25ml）で抽出した。この工程を繰り返した。この有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そしてその残渣をドライエタノールの２回の添加、それに続くロータリーエバポレーターでの溶媒の除去により乾燥させた。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（200ｇのシリカゲル）及びクロロホルム中のメタノール勾配溶出（２％から12％のメタノール）を利用して精製した。純粋DODACを含む画分を合わせ、そしてその溶媒を除去して７ｇの無色のゴムを得た。ベンゼン中の10％のメタノールからの凍結乾燥は無色の粘質粉末のDODACを供した。
実施例５
本例はカチオン小胞／DNA複合体と生体膜との紡錘原性（fusogenicity）を例示する。
５．１．小胞−小胞融合
これらの実験のために用いた小胞は従来記述の押出手順により作った（Hopeら、Biochim.Biophys. Acta 812：55（1985）；引用することで本明細書に組入れる）。簡単には、等モル比のカチオン脂質とDOPEとより成るカチオン脂質混合物をクロロホルムから窒素ガスの気流下で乾燥させた。残留溶媒を真空で２時間除去した。乾燥脂質フィルムを蒸留水で水和し、そして得られる多重相小胞（MLV）懸濁物を液体窒素及び温水サイクルを利用して５回凍結融解した。大量の単層小胞がこのMLV懸濁物をLipex押出機を用いて２枚重ねの孔径100nmのフィルターに押し通すことにより成形された。
小胞融合は本明細書に引用することで組入れるStruckらBiochemistry 20：4093（1981）に記載の通りにして共鳴エネルギー伝達を利用してモニターした。簡単には、未ラベルの小胞を20mMのHEPES pH 7.4のバッファー中の0.5mole％づつのRho−PE（Ｎ−（リッサミンローダミンＢスルホニル）ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン）及びNBD−PE（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含む類似の小胞と10：１で混合した。後者の膜蛍光プローブはエネルギー供与体を担い、そして前者はエネルギー受容体を担う。ラベル化小胞と未ラベル小胞との融合はプローブの希釈をもたらす。即ち、Rho−PE小胞の減少に基づくNBD−PE蛍光の上昇は膜融合の指標である。カチオン小胞の融合を誘導するのに７kBのβ−galプラスミドを用いた。。図１はDOTAP：DOPE及びDODAC：DOPEとプラスミドDNAとの融合実験より得た結果を示す。帯電率は325の平均ヌクレオチド分子量に基づいて計算した。図１に示す通り、DOTMA：DOPE及びDODAC：DOPE小胞は共に全ての帯電率において同程度に融合し、そして１の帯電率において最適な紡錘原性を示し、これは双方の物質のトランスフェクションにとっての最適帯電率に相当する（図４参照）。
５．２．赤血球（RBC）ゴーストとの脂質−DNA複合体の融合
0.5％づつのRho−PE及びNBD−PEでラベルされたカチオン小胞を20mMのHEPES pH 7.4バッファー中の７kBのβ−galプラスミドと混合した。この脂質DNA複合体をRBCゴースト溶液に加えた。ゴースト膜との融合はプローブ希釈及びNBD蛍光の上昇をもたらす。RBCゴーストは文献に記載の通りにして調製した（Wood, Methods in Enzymology, 149：271-280 Academic Press（1987）参照）。図２は３通りの帯電率及び４種のカチオン脂質（DDAB, DOTMA, OSDAC及びDODAC）を利用する脂質／DNA複合体−RBCゴースト融合実験の結果を示す。図２に示す通り、不飽和誘導体DOTMA, DODAC及びOSDACは飽和誘導体DDABよりも生物膜に対して優れた融合特性を有する。更に、DODAC及びOSDACは、最も一般的に利用されている商業的トランスフェクション脂質であるDOTMAよりRBCゴーストとの優れた紡錘原特性を示した。
実施例６
本例はβ−gal（プラスミドを用いてBHK細胞とトランスフェクションする一の手順を提供し、そして更にはDODAC−，DDAB−，DOTMA−及びOSDAC−含有小胞の相対トランスフェクション効能の対比を供す。
６．１．カチオンリポソームの調製
カチオンリポソームは実施例５記載の方法によりDOPEとDODAC, DDAB, DOTMA又はOSDACとから調製した。カチオン脂質をそれぞれDOPEと混合して0.25, 0.5, ３及び４（４組の混合物それぞれに関して）の帯電率を有する小胞を形成した。
６．２．BHK細胞のトランスフェクション
一般的なリポフェクションプロトコールの下記の通りに実施した：
１日目、BHK細胞を0.5mlの培地（DMEM中５％のFBS）の中で104細胞／24穴プレートウェルでプレート培養した。２日目、ウェルの中にまずH2Oを分注し、次いで脂質を加えることにより脂質：DNA複合体を24穴プレートの中に調製した。このDNAをH2Oの中で調製し、次いでウェルに加え、混合するように撹拌し、そして室温で30分インキュベートした。インキュベーション期間中、培地を細胞から除去し、そして細胞をPBSの中で洗った。洗浄後、750μｌのSF−DMEMを加えた。
脂質：DNA複合体（200μｌ）をBHK細胞を含む適当なウェルに加え、そしてこのプレートをゆらして混合し、次いで37℃で４時間インキュベートした。トランスフェクション培地をDMEM中の５％のFBS 0.5mlと交換した。３日目、培地を除去し、そして細胞をβ−ガラクトシダーゼについての組織化学染色のための標準手順に従って染色した。４日目、染色液を除去し、そして細胞をPBSで洗い、70％のエタノールをかぶせ、そしてカウントした。
６．３．β−ガラクトシダーゼについての組織化学染色
組織化学染色のために必要な溶液はストックバッファー、固定剤、洗浄液及び染色液を含む。これらの溶液は下記の通りに調製及び保存した。
１．ストックバッファーを蒸留、脱イオン水を用いて水性溶液として調製した。保存温度は表示の通りとした。この溶液は、47％のグルタルアルデヒド、４℃；１ＭのMgCl2、RT；100mMのEGTA、pH 7.2、RT；10％のナトリウムデオキシコレート、RT；10％のNP40、RT；１ＭのHEPES、４℃；50mMのK3Fe（CN）6、４℃：暗所で３ヶ月まで保存；50mMのK4Fe（CN）6、４℃：暗所で３ヶ月まで保存；５ＭのNaCl、RT；及びＸ−gal、固体、−20℃で保存。
２．固定溶液は0.2％のグルタルアルデヒド、２mMのMgCl2及び５mMのEGTAの最終濃度を有し、そして220μｌの47％のグルタルアルデヒド、100μｌのMgCl2溶液及び2.5mlの100mMのEGTA、pH 7.2を合わせ、そして全容量をPBSで50mlに合わせることにより調製した。
３．洗浄溶液は100μｌのMgCl2溶液、500mlの10％のナトリウムデオキシコレート及び100μｌの10％のNP40を合わせ、次いで全容量を50μｌに合わせることにより調製した。これは2mMのMgCl2、0.1％のナトリウムデオキシコレート及び0.02％のNP40の最終濃度をもたらした。
４．染色液は2.2mlの１ＭのHEPES、3.0mlの50mMのK3Fe（CN）6、3.0mlの50mMのK4Fe（CN）6、150μｌの５ＭのNaCl、65μｌの１ＭのMgCl2及び全容量を50mlにするH2Oを合わせることによって調製した。この溶液を42℃にまで温め、そして100μｌのDMF中の12.5mgのＸ−gal（0.4％の最終容量）を加え、そして溶解させた。他方、Ｘ−galをDMFの中で125μg／μｌにし、そしてホイルの中で−20℃で保存してよい。溶液中の物質の最終濃度は44mMのHEPES、３mMのK3Fe（CN）6、３mMのK4Fe（CN）6、15mMのNaCl、1.3mMのMgCl2及び0.5mg／mlのＸ−galであった。
細胞は以下の通りに染色した：
細胞をPBSで１回洗った。固定剤（５ml）を各プレートに加え、そして細胞をRTで５分インキュベートした。固定剤を除去し、そして細胞を浸透化溶液で２回（３分づつ）洗った。Ｘ−gal染色液（500μｌ/ウェル）を細胞に加え、これを二酸化炭素の雰囲気下で37℃で一夜インキュベートした。全ての溶液のpHは内生β−ガラクトシダーゼに由来するバックグランド妨害を回避するために7.5〜8.0に維持した。
６．４．結果
図３は４種の脂質DDAB, DOTMA, OSDAC及びDODACの４通りの帯電率（0.25, 0.5, ３及び４）での相対トランスフェクション効能の概要を示す。相対トランスフェクション効能は細胞プレート上の25の任意領域に関するトランスフェクションされた細胞の平均数である。DODACは１を超える帯電率において有意に優れた相対トランスフェクション効能を示し、一方DDAB, DOTMA及びOSDACは全て類似であった。全ての調製品が１未満の帯電率で低いトランスフェクション効能を有していた。DDABとDODACとの比較は極めて重要であり、なぜならそれはトランスフェクション効能に対して不飽和化の作用を示すからである。
様々な帯電率でのDODAC及びDOTMAの全細胞数に対するトランスフェクションされた細胞数で表示するトランスフェクション効能を図４に示す。双方の系についての最適トランスフェクションは１〜２の帯電率で認められ、そしてより高い帯電率で低下しはじめた。１未満の帯電率でのトランスフェクション効能は著しく低く、図３に示す結果と一致した。
実施例７
本例は培養筋芽細胞のトランスフェクションを供するための様々なカチオンリポソーム小胞の利用を例示する。
遺伝病、例えばDuchenne筋ジストロフィー又はＡ型もしくはＢ型血友病の処置のための遺伝子改変筋芽細胞療法の利用における著しい関心がもたれている。この生体外手法は、骨格組織に注射したときの筋管と融合する筋芽細胞の能力の利点を有する。このようにして、遺伝子改変筋芽細胞は筋繊維に修復遺伝子を供するために用いられうる。ウィルスベクター又は裸DNAが筋細胞をトランスフェクションするのに最も一般的に利用されている。ウィルスベクターの利用に由来するこの強力な免疫反応はその用途を制約する。裸DNA注入は筋細胞をトランスフェクションするのにおいて非常に非効率的である。
７．１．細胞及び培養条件
ラットの胎児の心臓に由来する筋細胞系H9C2（２−１）をATCCから入手した。この細胞を10％の胎児牛血清（FBS）及び10mg／mlのゲンタマイシン（正常増殖培地）の添加したα−最少必須培地（α−MEM）の中で増殖させた。培養物を５％のCO2の雰囲気下で37℃で維持した。トランスフェクションは24穴プレート（表面積２cm2）の中で行った。細胞を３通りの段階でトランスフェクションした：集密度50％の筋芽細胞、集密度100％の筋芽細胞及び分化筋管。筋芽細胞をトランスフェクションの一日前に半集密及び集密密度のそれぞれについて約３×104及び７×104細胞/cm2でプレート培養した。筋管形成は細胞が集密なときに正常増殖培地を融合培地（２％のFBS及び10mg／mlのゲンタマイシンを含むα−MEM）で交換することにより誘導した。融合培地の中で４日後、筋管をトランスフェクションにかけた。
７．２．プラスミド
pCMVβ（Clonetech由来）は、CMVプロモーター及びSV40エンハンサーにより駆動するβ−ガラクトシダーゼを含むプラスミドである。pCMVβを以下の標準技術を利用して増殖させ、そしてQiagen Maxiカラム（Qiagen, Chatworth, Califonia, USA）により精製した。
７．３．カチオンリポソーム
リポソーム製剤は２又は５モルはのPEG−Cer−Ｃ14を含むDODAC：DOPE（３：７モル／モル）又はDODAC：DOPE（３：７モル／モル）より成る。商業的に入手できるLIPOFECTAMINE（商標）（Gibco由来；DOSPA（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）及びDOPEを３：１のモル比で含むポリカチオンリポソーム）を比較のために用いた。
７．４．トランスフェクション
15μｌの20mMのHepes、pH 7.4バッファー中のプラスミドDNA（290ng）の10μｌの無血清培地（α−MEM）に加えた。得られた混合物を所望量のカチオンリポソームを含む20μｌの無血清培地に加えた。この混合物を室温で45分インキュベートし、次いで無血清培地、又は筋芽細胞もしくは筋管のそれぞれのための12.5％もしくは2.5％のFBSを含むα−MEMにより全容量200μｌにまで希釈した。24穴組織培養プレートの中で成育する細胞を無血清培地で２回すすぎ、そしてトランスフェクション混合物の存在下で５ｈインキュベートした。５ｈのインキュベーションの後、正常量の２倍量のFBSを含むα−MEM 200μｌを加えた。24ｈ後、この培地を500μｌの新鮮培地と交換した。更に２４ｈ後、細胞をリン酸緩衝食塩水で２回すすぎ、次いで100μｌの細胞溶解バッファー（Promega, Madison, Wisconsin, USA）で溶解した。β−ガラクトシダーゼ活性は上記の通りにして測定した。Bradfordタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, Illinois, USA由来）をこのリゼートのタンパク質濃度の評価のために用いた。β−gal活性は各サンプルのタンパク質濃度に対して標準化した。
７．５．結果
図５〜７に示す通り、DODAC含有リポソームはH9C2筋芽細胞及び筋管をトランスフェクションすることが可能である。トランスフェクションは細胞に加えるカチオンリポソームの量並びに集密度及び分化の状態に依存する。更に、トランスフェクションは血清の存在下で行えうる。更に、トランスフェクションを血清の存在下で行ったとき、DODAC含有リポソームは最適量の商業的に入手できるLIPOFECTAMINE（商標）よりも筋芽細胞及び筋管のトランスフェクションにおいてより効率的である。現在まで、LIPOFECTAMINE（商標）が血清の存在下で細胞をトランスフェクションする能力を有する唯一の認識されたカチオンリポソーム製剤であった。このような発見、特に血清の存在下で筋管をトランスフェクションする能力の発見は、DODAC含有系がin vivoで直接遺伝子を筋細胞に導入できうることを示唆する。
実施例８
本例はin vitroでリンパ球及びマクロファージ細胞タイプをトランスフェクションする様々なカチオンリポソーム小胞の利用を例示する。
ウィルス感染症、例えばHIV−１（AIDS）の処置のための手法はin vivoでの長期効能を示す薬剤又はワクチンの欠如に基づく遺伝子療法手段として注目を浴びている。HIV−Ｉ複製を阻害するように機能するポリTAR／抗−Tat抗−HIV−Ｉ遺伝子系が開発されている（Lisziewiczら、J.Virol. 69：206-212（1995）を参照のこと）。にもかかわらず、標的部位に対する遺伝子の導入は問題が残っている。主要細胞標的はCD4+Ｔリンパ球及びマクロファージであり、その理由は、これらの細胞のウィルスを担持するからである本例は、培養物におけるこれらの細胞タイプに対して遺伝子を導入するカチオンリポソームの能力を例示する。
８．１．動物
同系C57 BL／6雌マウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA）をこの研究に用いた。マウスを生後５週目において購入し、そしてコロニー室の中でケージ当り５匹で飼育し（ストレス条件なし）、人工照明を介して昼−夜（12hr）のサイクルを維持した。この実験の間動物は食餌及び水を自由に取れるようにし、そして実験操作前に少なくとも１週間順化させた。
８．２．トランスフェクション複合体の形成
水中のDODAC：DOPE（１：１モル／モル）リポソーム（１mMの濃度）を上記の押出手順により調製した。pCMVβ（InVitrogen, San Diego, California, USA）をQiagen法（Qiagen, Chatworth, Califonia, USA）を利用してＥ．コリリゼートから精製した。
トランスフェクション複合体の形成のため、500μｌの水の容量の中の20μｇのpCMVβ（62nmolのリン酸塩）を500μｌの水中の186nmolのDODAC：DOPEに加えた。この脂質：DNAの比は1.5（±）の帯電率をもたらした。この懸濁物を室温で20〜30分インキュベートした。
８．３．マイトジェン刺激アッセイ
生後７週目のマウスを断頭により犠牲にした。脾臓、脳腺及び骨髄を取り出し、そして単一の細胞懸濁物を調製した。これらのリンパ管の細胞質をトリパンブルー排除検査により評価した。細胞懸濁物を所望の濃度に調整し（脾臓については５×106／ml；胸腺については１×107／ml；そして骨髄については２×106／ml）、そして48穴プレートの中に0.5ml／ウェルでプレート培養した。細胞を直ちに50μｌのDODAC：DOPE/pCMVβによりトランスフェクションするか、又は48時間後にコンカナバリンＡ（１, 2.5及び５μｇ／ml；Sigma）及びリポ多糖（2.5及び５μｇ／ml；Sigma）で有糸分裂刺激した。細胞をトランスフェクション因子の存在下で48hインキュベートし、その後それらを上記の通りにしてβ−gal発現について染色した。適切なコントロールのために独立のウェルを用意した：処理なし、裸pCMVβ、又はプラスミドの非存在下でのDODAC：DOPE。
８．４．結果
カチオンリポソームを利用する一次脾臓細胞、胸腺細胞及び骨髄細胞のトランスフェクションは低レベルのβ−gal陽性細胞（＜５％）をもたらした。達成されるレベルはわずかなβ−gal陽性細胞（＜0.01％）を有し、そして未処理細胞と同等な裸DNAコントロールにより得られたものよりも有意に高かった。ある実験においては、非接着脾臓細胞を固定及びβ−gal活性についての染色前に接着細胞から分離させた。少なくとも２通りの実験において、＞80％の接着脾臓細胞（形態的にマクロファージを擬態）がβ−gal活性について陽性染色された。非接着細胞画分においてはわずかな細胞しかβ−gal活性について染色されなかった。小さくて丸いこれらの細胞はリンパ球を擬態していた。非刺激及び刺激細胞は共に類似の低レベルのトランスフェクションを示した。一次細胞中のpCMVβ発現ベクターからの発現レベルはかなり低いと推定された（細胞が青色になるのにかかる時間に基づき）。β−galアッセイは比較的に鈍感であり、青色細胞が検出されるには細胞当り数百のコピーを必要とした。従って、少なくとも一次細胞に関し、より強力な哺乳発現ベクターがβ−galリポーター遺伝子発現の測定を助長するために必要とされた。細胞の免疫学的特性決定がトランスフェクションされた細胞の同定のために必要である。完全器官に由来する一次複合細胞培養物を利用するこのin vitroアッセイは、抗HIV遺伝子治療プログラムにとっての標的細胞であるマクロファージ及びCD4+Ｔリンパ球への遺伝子導入のためにこれら紡錘原性カチオンリポソーム系を最適化するのが非常に有用である。
実施例９
本例はDODAC：DOPE脂質混合物及びDOTMA：DOPE脂質混合物のトランスフェクション特性の対比を供する。
遺伝子構築体のin vivo細胞間輸送を媒介するのにカチオン脂質を使用するとき、この標準手順は予備成形した小胞をDNA溶液に加え、次いで小胞／DNA複合体を動物に注射することを含む。以下はDOTMA：DOPE（LIPOFECTIN（商標）脂質混合物に対するDODAC：DOPE脂質混合物の対比である。
９．１．カチオン脂質
モノカチオン脂質、ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（DODAC、mw＝584.6ｇ／mol）及び１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド（DOTMA、mw＝670ｇ／mol）を本明細書記載の方法により、及び米国特許第4,946,787号における方法の適用により合成した。簡単には、米国特許第4,946,787号記載の方法において、塩化メチルを過剰の水性水酸化ナトリウムの存在下でヨウ化メチルと交換した。ヨウ素イオンをこの生成物から除去し、そしてその生成物をHCl、次いでブラインで洗うことにより塩素イオンと交換した。DOPEはAvanti Polar Lipids及びNorthern Lipidsより購入した。
９．２．小胞形成
脂質薄膜はまず脂質をCHCl3の中で混合し、次いで溶媒を窒素ガス流下で除去することにより形成した。この膜を真空下に２hr置いて残留有機溶媒を除去した。多重層小胞懸濁物をこの脂質膜を蒸留水で水和することにより形成した。MLV懸濁物を液体窒素及び60℃の湯のサイクルで５回凍結融解後、その小胞を孔径100nmの２枚重ねNucleporeフィルターに押し通した。
９．３．カチオン脂質／DNA複合体の形成
カチオン小胞及びDNAを５％のグルコース（最終濃度）に等容量（600μｌ）となるまで希釈した。この小胞及びDNAをすばやく混合し、そして注射前少なくとも30分放置したが、しかしながら混合の３hr以内に使用した。ガラス製試験管の利用はDNAがガラスに付着するので避けた。1.2mlより多くの複合体が必要なとき、複合体を1.2mlに小分けし、そしてプールした。その理由は、小胞とDNAを大量に一緒に添加することは不均一な場合に基づく粒状溶液をもたらすからである。この複合体は一般に50μｇ／DNA／400μｌにした。
９．４．帯電率の計算
複合体の物理特性（融合及びDNA縮合）並びにin vitroトランスフェクションデーターを（＋／−）帯電率で表示する。例えば、DODAC：DOPE（１：１、モル比）の分子量は664ｇ／molであり、そしてDNAヌクレオチドの予約分子量は325ｇ／molである。１個のDNAヌクレオチドは１個の負電荷を有するため、50μｇのDNA及び0.92μmol又は0.61mgのDODAC：DOPEより成る複合体は３の帯電率を示す。
９．５．CATアッセイ
pCMV4CAT（Dr.Hugh O'Brodovitch The Sick Children's Hospital of Toronto, Toronto, Ontario, Canadaからの贈呈品）をこれらの研究におけるリポーター遺伝子として用いた。放射能相分配CAT酵素アッセイ（以下記載）をトランスフェクション度を決定するために用いた。
材料：
250mMのトリスHCl／５mMのEDTAバッファーpH 7.8；ロイペプチン及びアプロチニン（Boeringer）ストック溶液（0.1％）を0.0025ｇづつ秤量し、そして両者を2.5mlの蒸留水に加えた：混合、分注及び６ヶ月まで−20℃で保存又は４℃で１週間保存；フェニルメチルスルホニルフルオリドストック溶液（PMSF）10mg／ml：0.05ｇのPMSF及び５mlのイソプロパノールより調製（暗所で室温にて１年まで保存）；完全ホモジネーションバッファー（トリスHCl／EDTAバッファー（100ml）、PMSFストック（350μｌ、35μｇ／mlの最終濃度）及びロイペプチン／アプロチニンストック（50μｌ、0.5μｌ／mLの最終濃度）より調製；BSAバッファー、完全ホモジネーションバッファー＋２mg／mlのBSA画分Ｖより調製；ｎ−ブチリル補酵素Ａ（Sigma B1508凍結乾燥粉末、５mg／mlに希釈、そしてよけいな凍結融解を避けるために小分けして−20℃で保存）；CAT酵素（Sigma C8413クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）；14Ｃ−クロラムフェニコール（NEN NEC-408Aクロラムフェニコール、Ｄ−スレオ−〔ジクロロアセチル−１，２−14Ｃ〕−CATアッセイグレート（TLCベース）、４℃で保存、そして使用直前にBSAバッファーで１：10に希釈）；混合キシレン（Aldrich）；パラオキソン（ジエチル−ｎ−ニトロフェニルホスフェート、Sigma由来；90％の純度の液体）ストック溶液は原液をイソプロパノールで１：80に希釈することにより調製（備考：130μｌの反応混合物中で５μＭの最終パラオキソン濃度を達成するため、ホモジナイゼーションバッファーでの更なる１：20の希釈を行い、そしてこの0.8mMのパラオキソン溶液3.3μｌをこの反応混合物に加えた）；BCAタンパク質試薬。
方法：
Ａ．組織ホモジナイゼーション手順：
マウスを二酸化炭素で充満した容器の中に入れることにより安楽死させた。適当な組織を集め、そして氷上で保存するか又は液体窒素の中で凍結した。ホモジナイゼーションバッファーを組織に加え、そしてこの混合物をホモジナイズし、脾臓及び肝臓組織を有する25％（0.25ｇ／ml）の溶液又は肺組織を有する40％の溶液を作った。これらの混合物を直ちにマイクロ遠沈管に移し、そして液体窒素の中で凍結した。肝臓サンプルは、50％の溶液をホモジナイズするのが簡単あり、25％の溶液を得るためにそのアリコートを２倍希釈した。細胞抽出物を液体窒素及び37℃の水のサイクルを利用する３回の凍結融解により組織ホモジネート品から形成した。得られる抽出物を10,000rpm（マイクロ遠心機で高／全速）で10分遠心して細胞塊をペレット化した。その上清液を新しいマイクロ遠沈管に移し、そして65℃で15分加熱不活性化した。その上清液を上記の通りに遠心し（10,000rpmで10分）、そして新しいマイクロ遠沈管に移し、そしてCAT活性についてのアッセイが整うまで−70℃で保存した。
Ｂ．細胞抽出物のタンパク質アッセイ
タンパク質アッセイはCAT活性の値を標準化するのに必要である。BCAタンパク質アッセイ及び標準品としてBSAを利用して、組織抽出物の一般のタンパク質濃度は肝臓については５〜10mg／ml、そし肺については10mg／mlであった。従って、肺抽出物は20倍希釈し、そして肝臓及び脾臓抽出物は蒸留水で15倍希釈した。BSA標準品は0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7及び0.8mg／mlの濃度で調製した。10μｌの標準品又はサンプルを48穴プレートに加え（二重又は三重で）、そして190μｌのBCA試薬をウェルに加えた。20分後、540nmでの吸収をプレートリーダーを用いて読み取った。
Ｃ．CAT標準曲線
Sigmaより供給されるCAT酵素は10μｌ当り110単位の活性を有する（一単位のCATはpH 7.8、25℃で１分当り１nmのクロラムフェニコール及びアセチル−CoAをクロラムフェニコール３−アセテート及びCoAに変換するであろう）。
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CATアッセイのため、インキュベーション混合物は25μｌのｎ−ブチリルCoA、50μｌの希釈14Ｃ−クロラムフェニコール、55μｌのBSAバッファー又はコントロール組織抽出物及び3.3μｌの0.8mMのパラオキソンを合わせることにより調製した。標準曲線は更に10μｌの様々なCAT標準品をインキュベーション混合物に加えることにより作製した。この混合物を37℃で２ｈインキュベートした。キシレン（300μｌ）を加え、そしてこの混合物を30秒ボルテックスにかけ、次いで、10,000rpmで３分遠心した。キシレン上相を、750μｌのホモジネーションバッファーを含む新しいマイクロ遠沈管に移し、そして上記の通りにボルテックス及び遠心した。上相のアリコート（125μｌ）をシンチレーションバイアルにとり、そしてカウントした。
９．６．結果
静脈内投与の後、カチオン脂質／DNA複合体のin vivoトランスフェクション活性を評価した。DODAC：DOPE（１：１のモル比）、２％のPEG−Cer−Ｃ20を伴うDODAC：DOPE（１：１のモル比）、DODAC：DOPE（３：７）及びDOTMA：DOPEは全て2.5の帯電率においてトランスフェクションを媒介することが見い出せた。CAT活性は注射後２〜３日目に決定した。更に、2.5及び3.0の帯電率にした複合体は全て活性であったが、0.5の帯電率で調製したものは活性でなかった。
必要なDNAの量に関し、25μｇのDNAが測定可能なCATを供すことが見い出せた（脾臓においてバックグランドより500〜2000dpm高い）。組織mg当りのCAT活性に関し、トランスフェクション活性を示す器官には脾臓>>肺及び心臓＞肝臓が含まれた。２日後には血液の中で活性は検出されなかった。その他の競合アセチル化酵素のレベルの高さに基づき、CAT活性の測定が可能となるのにパラオキサン（1μＭ）を肝臓組織抽出物の中に含ませなくてはならなかった。
一般に、複合体は３の帯電率で作り、そして350〜400μｌの容量において50μｇのDNAを含む。この濃度で、この複合体は直径が200〜400nmである。複合体をより高い濃度で作ると、粒状（＞１μｍの直径）溶液が形成される。しかしながら、血漿の添加はこのような大凝集物を崩壊し、そしてin vitroでトランスフェクション的に活性な粒子を形成する。粒状溶液（50μｇのDNA／100μｌ）又はより希薄な溶液（50μｇのDNA／400μｌ）のいづれかの注射はin vivoで同等なCAT活性を供すことが見い出され（図８参照）、大沈殿物は循環系の中で解離するようであることが示唆される。
本明細書に挙げる文献は全て引用することで本明細書に組入れる。
本発明を幾分詳細に説明してきたが、本発明はその範囲を逸脱することなく改良されうることが当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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