(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有し、３６５８位のヌクレオチドがチミジンである、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
３６５８位のヌクレオチドを含む断片を増幅し、配列番号１のｄｓｐｐ遺伝子をテンプレートとして用いてヌクレオチド３６５８位でのＣ−Ｔ突然変異を検出するために用いられるプライマー、
１０×ＰＣＲ緩衝液、
ｄＮＴＰ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、
ＭｇＣｌ2、
制限酵素ＲｓａＩ、
制限酵素１０×緩衝液、及びＢＳＡ
を含む、遺伝性乳白色ゾウゲ質の検出キット。
【請求項３】
遺伝性乳白色ゾウゲ質の突然変異した遺伝子を検出するための、請求項２記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明分野
本発明は、遺伝性乳白色ゾウゲ質における突然変異遺伝子ｄｓｐｐの検出方法であり、この方法は、直接的配列決定、或いは制限酵素消化、或いはオリゴ核酸プローブとのハイブリダイゼーションを含む。更に詳しく言えば、本発明は、遺伝性乳白色ゾウゲ質を引き起こす突然変異遺伝子座をｄｓｐｐの第三エクソン（exon）中に位置づける方法である。加えて、本発明は、本発明の方法により製造されたキット及び遺伝性乳白色ゾウゲ質の検出と患者の治療方法におけるその使用に関する。
【０００２】
技術背景
遺伝性乳白色ゾウゲ質は、常染色体優性遺伝病であり、発病率は１／８０００で、１９７３年Shieldsにより、II型象牙質形成不全症（Dentinogenesis  Imperfect  TypeII）と分類された。患者としては、乳歯も永久歯も影響を受け、影響を受けた歯は、灰青色、或いは濃い褐色が現れ、それに乳白色光沢も伴うなっている。Ｘ線フィルムにおいて、歯冠は球形に現れ、歯根は小さくなったのが見られるし、髓室と歯根管は狭くなり、或いは完全閉鎖されている。歯エナメルの形成は、遺伝性乳白色ゾウゲ質によって直接影響は受けないが、歯質と歯エナメルの接触面は、貝状から平状に変わるので、歯エナメルは歯質から非常に脱落し易くなり、それが発育不全の歯質の摩耗を促進し、歯は著しく短くなって、最も短いのは、歯槽突起まで低くなる。過度の摩耗で、年齢が高い患者の場合は、歯槽骨の増殖と歯肉の増厚、及び繊維性変化が現れる。結果として、遺伝性乳白色ゾウゲ質患者は、止むを得ず多くの歯の看護と高額の治療を受けなければならない。
【０００３】
遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病遺伝子は、既に、４ｑ２１における２MBに広がる領域中に位置付けられ、この範囲において、４個の遺伝子は組職の鉱物化過程に関係することが証明されている。これらは、それぞれ、分泌されたリン酸タンパク質（Secreted  Phosphoprotein 1、ＳＳＰ１）と、歯質マトリックスタンパク質１（dentin matrix protein 1、ＤＭＰ1）と、歯質シアロリン酸タンパク質（dentin sialophospho protein、ＤＳＰＰ）と、骨シアロタンパク質（bone sialoprotein、ＩＢＳＰ）である。最近、ｄｓｐｐ遺伝子の配列決定が（ＡＦ１６３１５１）されている。Ｄｓｐｐは、ＤＳＰとＤＰＰの２個のタンパク質をコードしており、その中でも、ＤＰＰは、高度にリン酸化され、ヒドロキシアパタイト結晶体の形と大きさを調節し、ヒドロキシアパタイト結晶体の核形成過程においては、重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００４】
ｄｓｐｐ遺伝子は配列決定されているが、この分野においては、ｄｓｐｐの特定のエクソン中に遺伝性乳白色ゾウゲ質の突然変異部位を位置付けるために、直接配列決定、制限酵素消化又はオリゴ核酸を用いたハイブリダイゼーションは、まだ用いられていない。本発明者らは、本発明において、４ｑ２１に隣接する８個の短いタンデムリピート多型の連鎖解析を実施することによって、染色体４ｑ上に遺伝性乳白色ゾウゲ質ファミリーの発病遺伝子を位置付けた。ｄｓｐｐ遺伝子の、最初の４個のエクソン、及びそれらに隣接する配列を配列決定することにより、我々は、時間を繰り上げて翻訳を終了する結果となるナンセンス突然変異を一つ発見した。この突然変異は、RsaIで消化することによって検出され得、なぜなら制限酵素RsaIは突然変異と正常ＤＮＡ配列を識別する性質を有するからである。ナンセンス突然変異部位を検出することにより、本発明は、歯の鉱物化過程、遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病についての更なる研究ならびに臨床及び患者の出生前診断における利用の基礎を固めた。加えて、本発明の方法により、発明者らは正確かつ迅速な遺伝性乳白色ゾウゲ質患者の診断における使用のためのキットを提供する。
【０００５】
発明の要約
したがって、本発明の目的は、遺伝性乳白色ゾウゲ質の突然変異ｄｓｐｐ遺伝子の検出方法を提供することである。
【０００６】
本発明の一つの側面においては、本発明で用いられたファミリー中の発病遺伝子は、連鎖解析によって染色体４ｑ上に位置付けられた。患者の候補ｄｓｐｐ遺伝子中の最初の４個のエクソンを配列決定し、正常な対照と比較することによって、我々は、ｄｓｐｐのエクソン３中にナンセンス突然変異を発見し、これにより、遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病遺伝子が本発明によって発見されたのである。この突然変異が、制限酵素ＲｓａＩの制限認識部位を変化させることになるので、この方法で遺伝性乳白色ゾウゲ質を検出するのが便利である。そして、本発明は、歯の鉱物化過程、遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病についての更なる研究ならびに臨床及び患者の出生前診断における利用の基礎を固めた。さらに、本発明において、ｄｓｐｐは、遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病遺伝子であることが発見され、このことは、遺伝性乳白色ゾウゲ質のさらなるファミリーにおけるｄｓｐｐ遺伝子の他の発病性突然変異を探す前提条件となり、下記の診断キットの改善の基礎でもある。
【０００７】
本発明の別の目的は、遺伝性乳白色ゾウゲ質の治療におけるｄｓｐｐ突然変異遺伝子の適用を提供することである。上述のように、本発明のさらなる目的は、外側順方向プライマー、外側逆方向プライマー、内側順方向プライマー、内側逆方向プライマー、１０×ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ2、制限酵素ＲｓａＩ、１０×ＲｓａＩバッファー、及びＢＳＡを含むキットを提供することである。診断は、本発明において発見されたナンセンス突然変異に隣接する、デザインされたプライマーでのＰＣＲを実施し、ＰＣＲ産物を制限酵素ＲｓａＩで消化することにより、迅速かつ簡便に行われる。このキットは、遺伝性乳白色ゾウゲ質の臨床での診断をより正確にするだけでなく、出生前診断にも用いられる。
【０００８】
本発明の、更なる目的は、遺伝性乳白色ゾウゲ質の検出及び処置における該キットの適用を提供することである。
【０００９】
一方で、本発明は、病気とｄｓｐｐ遺伝子を関連付けることによって、遺伝性乳白色ゾウゲ質の処置における新規なアイデアを提供する。突然変異ｄｓｐｐ遺伝子の発病のさらなる理解の基礎の上に、遺伝性乳白色ゾウゲ質の処置のために歯の鉱物化を調節する関連医薬を合成することができる。
【００１０】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。下記実施例は、本発明を説明するにとどまり、本発明は、いかなる意味においてもそれに限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
実施例１
１．遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病遺伝子の位置付け
１．１  対象
研究した遺伝性乳白色ゾウゲ質家系は、天津医科大学口腔病院において発見された（図１）。この家系には３６個体あり、１５個体が病に冒されていた。発端者は、Ｖ２、男性、５歳であり、乳歯はまだ完全には脱落していないが、髄室は閉鎖傾向にあり、前歯はさらに明らかであった。患者の臨床的症状は遺伝性乳白色ゾウゲ質の主な特徴と合致した。この家族の他の患者もこの疾病の主な特徴を有していた。発病遺伝子の輸送原則は、常染色体優性遺伝の特徴に合致した。我々は、この家族の１３人（１０人の患者を含む）のＤＮＡを解析した。
【００１２】
１．２  連鎖解析
１．２．１  末梢血細胞からのＤＮＡの単離
被験者の同意を得た後、家族構成員の１３人の血管から５mlの血液を採取し、抗血液凝固剤を添加し、混合した。混合物を１５分間遠心分離し（４℃、３０００rpm）、ピペットで上清の血漿を除去した。５〜１０倍量のｄｄＨ2Ｏを、その結果物の溶液に添加した後、その混合物を室温で10分間温置し、15分間遠心分離（4℃、３５００rpm）した。上清を真空ポンプで除去し、ＴＥＳ（Tris-HCl pH 8.0 １５mmol/l, EDTA pH 8.0 15 mmol/l, 15mmol/l NaCl 4ml）を１５mmol/lを添加し、沈殿物を再懸濁した。１０％ＳＤＳを２７０μl添加し、混合した後、プロテインキナーゼＫ（１０mg/ml）４０μlを添加し、混合した。５０℃で2時間温置した後、混合物を３７℃で一晩温置した。氷上で０℃に冷却した後、１倍量のフェノールを添加し、混合して、１５分間遠心分離（４℃、３５００rpm）した。上清をフェノールで抽出した。上清をとり、１倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、混合し、室温で５分間温置した後、５分間遠心分離（４℃、３５００rpm）した。上清をクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で再度抽出した。上清をとり、あらかじめ氷で冷却した２．５倍量の９５％エタノールを添加した後、ＤＮＡが出現し、球状になるまで軽く振った。ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、１．５mlのエッペンドルフチューブに入れ乾燥した後、１．０mlのＴＥに溶解した。ＴＥに完全に溶解した後、ＤＮＡの量をＵＶ分光光度計で測定した。
【００１３】
１．２．２  ＳＴＲＰｓ蛍光標識ＰＣＲおよびＰＣＲ産物のスキャニング分析（１）ＳＴＲＰｓプライマーの選択
８個の選択されたＳＴＲＰｓを用いた連鎖解析を４ｑ２１について行った。それらは、Ｄ４Ｓ２９１５、Ｄ４Ｓ２９３２、ＧＡＴＡ６２Ａ１１、Ｄ４Ｓ２４０９、ＤＳＰ  ＳＴＲＰ、ＳＰＰ１、Ｄ４Ｓ１５６３およびＤ４Ｓ１５４４である。８個のＳＴＲＰｓのプライマー配列は、表１に列挙した。ＰＣＲ増幅は、上記８個のプライマーで、Perkin Elmer 9600 Thermal Cyclerで実施した。反応系は、１２．５μlの；１０×ＰＣＲバッファー  １．２５μl、２mmol/l  ｄNTP  ０．５μl、１％  ＦｄＮＴＰ  ０．５μl、２U/μl  Taqポリメラーゼ（元原平晧生物技術有限会社から入手）０．２５μl、５pmol/μl  プライマー  ０．２５μl、４０ng/μl  ゲノムＤＮＡ  １．０μl、である。サイクルプログラムは以下のようにした：９４℃での変性を５０秒、アニーリングを１分（アニーリング温度は、表１に示した）、７2℃での伸長を５０秒、で３５回、および最後の伸長は７２℃で５分間行った。
【００１４】
ＳＴＲＰｓの対立断片の分析
ＰＡＧＥゲルでＰＣＲ産物を単離した後、同じ個体の異なった部位からのものを混合し、その後、混合物２μlをＡＢＩ  ＲＯＸ−４００分子マーカー０．４μl、ホルムアミド２．１μl、色素０．４μlと混合し、９５℃２分で変性し、即座に氷上で冷却し、その後、電気泳動を、ＡＢＩ３７７シーケンサー（Perkin Elmer社）上で、４％ＰＡＧＥおよび３６％尿素で、２時間実施した。データの収集、レーンの補正、内部分子量マーカーの補正、および断片サイズの測定は、GENESCAN2.1ソフトウエアで実施した。
【００１５】
【表１】
0003886901.tif 000002
【００１６】
１．２．３  連鎖解析
Ｌｏｄスコアは、ＬＩＮＫＡＧＥソフトウエアパッケージ中のＭＬＩＮＫ連鎖解析ソフトウエアで、以下の条件で計算した：常染色体優性遺伝の２対立遺伝子系のモードにおいて、ヘテロ接合体における発現遺伝子頻度および発現遺伝子の表現率は、それぞれ０．００００１および０．９９に設定した；対立断片の頻度を同様に設定した、その後、組換え頻度をそれぞれ０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３および０．４としてＬｏｄスコアを計算した。結果を表２に示す。１を超すＬｏｄスコアに従って、遺伝性乳白色ゾウゲ質の発病遺伝子は、染色体４ｑ上に位置づけられた。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
実施例２  候補遺伝子の突然変異スクリーニング
その突然変異をスクリーニングするため、ｄｓｐｐを候補遺伝子として選択した。nested−PCR法の実施のため、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエアで、最初の４個のエクソンの８組のＰＣＲプライマーを設計した。Ｅ１out、Ｅ２out、Ｅ３４ｆoutおよびＥ３４ｌoutは、ＰＣＲ増幅の最初のサイクルのためのプライマーであり、Ｅ１in、Ｅ２in、Ｅ３４ｆinおよびＥ３４ｌinは、ＰＣＲ増幅の第二のサイクルのためのプライマーである。最初の３組のプライマーでの、ＰＣＲの最初のサイクルの反応系は５０μlである。
【００１９】
１０xＰＣＲ  バッファー             ５μl
２mmol/L  ｄＮＴＰs                 ５μl
５pmol/μl  プライマー              ５μl
２U/μl  Taqポリメラーゼ            １μl
５０ng/μl  ゲノムＤＮＡ            １μl
【００２０】
５０μlの最終量までｄｄＨ2Ｏを添加した。反応条件は、９４℃３０秒、アニーリング３０秒および７２℃で伸長（アニーリング温度および伸長時間は、表２に示した）。続けて７２℃５分で伸長した。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
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【００２３】
さらにMix１とMix２を混合する。反応条件は、
９４℃    １０秒、  ５５℃  ３０秒、  ６８℃  ２分、  １０サイクル
９４℃    １０秒、  ６３℃  ３０秒、  ６８℃  ２分+２０秒/サイクル、２０サイクル、
続いて６８℃で７分間伸長する。ＰＣＲ産物５μlを９０Ｖで１５分間電気泳動し、写真撮影した後、映像を保存した。最初のサイクルのＰＣＲ産物を２５０〜１２５０倍に希釈したものを第二のサイクルのＰＣＲに用いた。反応条件は、９４℃１０秒、アニーリング３０秒および７２℃での伸長を２５サイクルである（アニーリング温度および伸長時間は、表３に示した）。ＰＣＲ産物を電気泳動し、写真撮影した後、映像を保存した。第二のサイクルのＰＣＲ産物を、シーケンシングプライマーとしてＰＣＲプライマーを用いた直接配列決定に付した。得られた配列地図を解析した。ヘテロ接合性の２つのピークが現れた場合は、その部位がヘテロ接合状態であることを示唆し、更なる解析が必要となる。ヘテロ接合部位を含む配列をＧｅｎＢａｎｋの配列と比較し、通常のリーディングフレームにしたがって翻訳した。その結果、ナンセンス突然変異が、患者の第三のエクソンに存在した、ここで、ｄｓｐｐの第三のエクソンのヌクレオチド３６５８位でのＣ−Ｔ転移が起こり、この突然変異が、通常の、Ｇｌｎ４５をコードする、コードＣＡＧから終止コードＴＡＧへの変化を作り出しており、そのため、ｄｓｐｐの翻訳が事前に止まり、発現産物の一つ、ｄｓｐｐ遺伝子のＤＰＰが産性され得なくなる（図２）。
【００２４】
実施例３  制限酵素消化による同定
３．１  ＰＣＲ増幅
最初のサイクルのＰＣＲを、Ｅ３４ｆoutプライマーで実施し、電気泳動の後、写真撮影し、画像を保存した。その後、最初のサイクルのＰＣＲ産物を２５０倍に希釈したものをＥ３４ｌoutプライマーでの第二のサイクルのＰＣＲに用いた。反応系は１００μlであり、反応条件は、突然変異スクリーニングのものと同じである。第二のサイクルのＰＣＲ産物を電気泳動した後、写真撮影し、画像を保存した。
【００２５】
３．２  ＰＣＲ産物の回収（ＰＣＲ回収キットは、Life Technology社のConcert Papid PCR Purification Systemである）
洗浄バッファー４mlに９５％エタノール１０mlを添加し、完全に混合した。
【００２６】
ＰＣＲ産物９０μlに結合バッファー４００μlを添加し、完全に混合した。
【００２７】
混合物をカートリッジの中央に担荷した。混合物を１１９００G、２８℃で１分間遠心分離した。流出した液体は捨てた。
【００２８】
洗浄バッファー（エタノール含有）７００μlをカートリッジに添加した。１１９００G、２０℃で１分間遠心分離した。流出した液体は捨てた。１１９００G、２０℃で１分間再度遠心分離した。
【００２９】
カートリッジを１．５ml回収チューブ中に置き、６５℃まで暖めたＴＥバッファー（ｐH８．０、１０mmol/l  Tris．Cl、1mmol/l  ＥＤＴＡ）５０μlをカートリッジ中央に直接添加した。室温で１分間温置した。その後１１９００Gで２分間遠心分離した。回収された産物５μlをアガロース（BIOWEST社）電気泳動の後、写真撮影し、映像を保存した。
【００３０】
３．３  ＲｓａＩ消化
反応系は１５μlである：
ＢＳＡ（１０mg/ml）                  ０．１５μl
１０×バッファー                       １．５μl
ＲｓａＩ（Promega）（１０U/μl）           １μl
ＰＣＲ産物                         １２．３５μl
【００３１】
３７℃で２時間消化した。消化の後、反応液１５μlを電気泳動した後、写真撮影し、映像を保存した。結果は、この家族の、通常個体のＰＣＲ産物はＲｓａＩで完全に消化される、しかし、病に冒されている個体の反応混合物中には、アガロース電気泳動後、より大きなバンドが現れる、なぜなら、ＲｓａＩ認識部位が、ナンセンス突然変異により破壊されているからである（図３）。無作為の５１の正常個体のＰＣＲ産物もまたＲｓａＩで完全に消化された。
【００３２】
実施例４  遺伝性乳白色ゾウゲ質の診断キットおよびその適用
キットは以下のもの：
外側５′プライマー            （５pmol/μl）
外側３′プライマー            （５pmol/μl）
内側５′プライマー            （５pmol/μl）
内側３′プライマー            （５pmol/μl）
１０×ＰＣＲバッファー
ｄＮＴＰ                      （２mmol/μl）
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ      （２Ｕ/μl）
ＭｇＣｌ2
制限酵素ＲｓａＩ              （１０Ｕ/μl）
制限酵素１０×バッファー
ＢＳＡ                        （１０mg/ml）
を含む。
【００３３】
ＰＣＲ増幅の最初のサイクルは、外側５′および外側３′プライマーで行われ、反応後、ＰＣＲ産物を電気泳動に付し、写真撮影をして映像を保存した。その後、２５０倍に希釈した、最初のサイクルのＰＣＲ産物を、内側５′および内側３′プライマーを用いる第二のサイクルのＰＣＲを実施するためのテンプレートとして用い、電気泳動の後、第二のサイクルのＰＣＲ産物を写真撮影し、映像を保存した。ＰＣＲ産物のイオン強度は、ＭｇＣｌ2で調節し、制限酵素ＲｓａＩを添加した後、混合物を３７℃で２時間反応させた（１０mg/ml  ＢＳＡ  ０．１５μｌ、１０×バッファー  １．５μl、ＲｓａＩ（１０U/μl）  １μl、ＰＣＲ産物  １２．３５μl）。消化後、反応混合物１５μlを電気泳動後、写真撮影し、映像を保存した。正常個体のＰＣＲ産物はＲｓａＩで完全に消化されたが、病に冒された個体の反応混合物には、電気泳動後、より大きいバンドがあわられた、なぜなら、ＲｓａＩの認識部位が、ナンセンス突然変異によって破壊されているからである。したがって、遺伝性乳白色ゾウゲ質の患者は、被験個体の部分的配列マッピングによって診断されうるのである。
【００３４】
当業者であれば本発明の上記の内容を読んだ後、いくらかの変更や修正をすることができるが、均等の変更又は修正はもまた、本発明の添付の請求項の限定された範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、遺伝性乳白色ゾウゲ質家族系図である。図面における発端者は、左上の矢印で示され、黒色図標識は、病に冒された個体を示す。
【図２】  図２は、遺伝性乳白色ゾウゲ質患者のｄｓｐｐ遺伝子と正常対照の部分的配列マッピングの図である。左側の図は、正常個体のｄｓｐｐの部分の図で、右側は、患者の突然変異ｄｓｐｐ遺伝子の部分的配列マッピングの図である。
【図３】  図３はＰＣＲ産物のＲｓａＩ酵素による制限酵素地図である。左側の最初の＋／＋は対照（Cont.）の酵素地図であり、＋／−は、病に冒された個体の制限酵素地図であり、その他の＋／−は、正常個体の制限酵素地図である。ｄｓｐｐのナンセンス突然変異により、ＲｓａＩの認識部位が破壊されたので、アガロース電気泳動後、一本の比較的大きいバンドが現れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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