(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）で表される化合物と、正常な塩基対を形成することができない塩基との間に擬似的な塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の状態を測定することで、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなる、ＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法：
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは２−Ｒ１−１，８−ナフチリジン、２−アミノナフチリジン−４−オン、３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又は２−アミノナフチリジン−７−オンであり、Ｘは（１−ヒドロ−２−オキソ−１，８−ナフチリジン−７−イル）−メチル−アミノ−カルボニル基であり、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｌは１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されていてもよい炭素数１〜２０のアルキル基よりなる、Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡ及びＸとリンカー部分Ｌとの結合がカルボン酸アミド結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表される化合物が担体に固定化されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）で表される化合物が標識化されている請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための、次の一般式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは２−Ｒ１−１，８−ナフチリジン、２−アミノナフチリジン−４−オン、３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又は２−アミノナフチリジン−７−オンであり、Ｘは（１−ヒドロ−２−オキソ−１，８−ナフチリジン−７−イル）−メチル−アミノ−カルボニル基であり、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｌは１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されていてもよい炭素数１〜２０のアルキル基よりなる、Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）で表される化合物からなる試薬。
【請求項６】
試薬が、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための塩基対生成剤である請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
請求項５に記載の試薬、及び検出、同定用の資材からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の状態を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキット。
【請求項８】
次の一般式（II）、
【化２】
0004011937.tif 000009
（式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されていてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又はその固定化物。
【請求項９】
一般式（II）で表される化合物が次の一般式（III）、
【化３】
0004011937.tif 000010
である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対と次の一般式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは２−Ｒ１−１，８−ナフチリジン、２−アミノナフチリジン−４−オン、３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又は２−アミノナフチリジン−７−オンであり、Ｘは（１−ヒドロ−２−オキソ−１，８−ナフチリジン−７−イル）−メチル−アミノ−カルボニル基であり、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｌは１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されていてもよい炭素数１〜２０のアルキル基よりなる、Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）
で表される化合物との間に擬似的な塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の状態を測定することで、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなる、ＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の状態を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法、そのための試薬、それを含有するキット、その化合物、及びその方法を用いたＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の異常を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズして２本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えば、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）という具合になっている。そして、通常は全ての塩基がこのような対を形成してハイブリダイズしているのであるが、ときとして塩基配列の中の一部にこのような対を形成することができない場合がある。
例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個又は数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない場合がある。このような通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、以下ではミスマッチという。
【０００３】
一方、最近１個又は２個以上の塩基が異なることに起因する各種の遺伝病についての研究が行われてきている。例えば、１個の塩基が通常のものとは異なる遺伝子（ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism））を有する遺伝病などがあり、係る遺伝病の解明が注目されてきている。このような遺伝子を正常な遺伝子とハイブリダイズさせると、大部分の塩基は正常な塩基対を形成し得ることができるためにハイブリダイズすることはするが、１個の塩基対についてミスマッチが起こることになる。
現在、このようなミスマッチを検出する方法は、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。しかし、この方法を用いるためにはミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法もあるが、タンパクを用いる場合、低分子リガンドを用いる方法に比べて熱安定性や活性な構造（フォールディング）を維持する事が必要となり使用条件の制約が多く、また操作も煩雑となり効率的にミスマッチを検出ことは難しい。
【０００４】
このように、ハイブリダイズしたＤＮＡなどにおける一部のミスマッチを検出する方法は大変難しく、またその感度も不十分なものであり、これを簡便に且つ高感度で検出できる方法の確立が求められている。
ところで、本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特開２００１−８９４７８号）。このバルジ認識分子は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものである。
そして、本発明者らは、このような周辺の塩基の存在によるスタッキング効果を利用した不対塩基に対する作用についてさらに研究を行ってきたところ、塩基対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を２個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれる得ることを見出し、具体的にはビス（２−メチルナフチリジン）アミド誘導体がＧＧミスマッチやＧＡミスマッチを検出できることを示してきた（特開２００１−１４９０９６号）。しかし、このものは特定のミスマッチには極めて高感度で安定に取り込まれる得ることができるが、他のミスマッチに対しては取り込みが不十分であり、即ち特定のミスマッチに対する特異性が大きすぎて必ずしも実用的ではなかった。例えば、ＧＧミスマッチに対しては高い特異性を有するが、ＧＡミスマッチやＧＴミスマッチに対しては必ずしも十分な取り込みがなされなかった。
【０００５】
遺伝子の変異を調べる方法として、変異の有無を検査したい遺伝子とその変異の無い野生型遺伝子の５０塩基程度のオリゴマーＤＮＡを混合、加熱、冷却により二つの遺伝子をクロスハイプリダイゼーションする方法がある。検査する遺伝子に変異がある場合には遺伝子の融解温度や融解温度差に異常が見出される。この操作は比較的簡便ではあるが、変異があることが分かるだけであり、どの位置にどのような変異が生じているのかということを知ることはできない。
前記してきた本発明者が報告してきた方法によれば（特開２００１−１４９０９６号）、このクロスハイプリダイゼーションする方法により特定のミスマッチの存在を知ることはできるが、このミスマッチ認識分子は特異性が高く、例えば、グアニン塩基に対するミスマッチを調べる場合においても、ＧＧミスマッチ用のもの、ＧＡミスマッチ用のもの、ＧＴミスマッチ用のものと複数のミスマッチ認識分子を用意しなければならなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このようなハイプリダイゼーションの方法において、特定の塩基に対する塩基対のミスマッチをより簡便でしかも高感度で検出しうる方法を提供するものである。
また、本発明は、２本鎖ＤＮＡ鎖中に存在するミスマッチを高感度でしかも簡便に検出しうる方法及びそのための検出キットを提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ミスマッチ認識分子について更に検討を進めてきた結果、特定のミスマッチに特異的に取り込まれるミスマッチ認識分子ではなく、ある塩基に対する全てのミスマッチ、例えばグアニン塩基についてＧＧミスマッチのみではなく、ＧＧミスマッチ、ＧＡミスマッチ及びＧＴミスマッチのいずれのミスマッチに対しても取り込みがなされ、かつその取り込みの程度を検出できるミスマッチ認識分子を見出した。
本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対において、
次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｘは前記Ａの構造部分と対を形成する塩基と正常な塩基対を形成すべき塩基とは異なる塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）
で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｘ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＸを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、前記の正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｘは前記Ａの構造部分と対を形成する塩基と正常な塩基対を形成すべき塩基とは異なる塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）
で表される化合物からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための試薬に関する。
本発明は、前記した本発明の試薬、及び検出、同定用の資材からなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットに関する。
【０００９】
また、本発明は、次の一般式（II）、
【００１０】
【化４】
0004011937.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又は当該化合物がプレートや機器分析用の検出装置などに固定化され得る化学構造に修飾された固定化物に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、検体となる１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡと、それに対応する正常な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡとをハイブリダイズさせ、次いで当該ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡにおける正常な塩基対を形成することができない塩基の対を次の一般式（Ｉ）、
Ａ−Ｌ−Ｘ                            （Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｘは前記Ａの構造部分と対を形成する塩基と正常な塩基対を形成すべき塩基とは異なる塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＸを結合するリンカー構造を示す。）
で表される塩基対のミスマッチ認識分子であって、特定の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び前記Ａの構造部分と対を形成する塩基と正常な塩基対を形成すべき塩基とは異なる塩基と対を形成し得る化学構造部分Ｘ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＸを結合するリンカー部分Ｌを有することを特徴とする化合物を用いて、当該正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の状態を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定することからなるＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基配列の異常を検出する方法に関する。
なお、以下の説明においては、前記した「正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＸの部分）」のことを単に「塩基認識部位」ということもある。
【００１３】
本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特開２００１−８９４７８号）。このバルジ認識分子は、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものであるが、本発明者らはこのようなバルジ認識分子を２分子、リンカーのような結合鎖で結合させることにより各々のバルジ認識分子が、塩基対のミスマッチ部分においてバルジ塩基と同様な塩基対を形成し、しかもこれらのバルジ認識分子の両者が２本鎖を形成しているＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることを見出してきた（特開２００１−１４９０９６号）。このような比較的大きな分子種がＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることは驚くべきことであり、かつこのような特性を利用することにより、ハイブリダイズしている核酸の中で塩基対がミスマッチを生じている箇所を簡便に特定し得ることを見出し、これをミスマッチ認識分子として示してきた。
【００１４】
しかし、このものは塩基に対する特異性が強く、特定のミスマッチにのみ強く取り込まれるものであった。そこで、本発明者らは塩基に対する結合が、正常な塩基対を形成するよりは弱いが、同定や検出のためには十分な対を形成し得る分子種の開発を行ってきたところ、このような分子種を製造することができることを見出した。例えば、次式（III）で示される、
【００１５】
【化５】
0004011937.tif 000003
【００１６】
分子種の右側部分（一般式（Ｉ）におけるＸ部分に相当する部分）のナフチリドンはいずれの塩基とも比較的弱く結合し、いずれのミスマッチ塩基に対しても適度の結合能により取り込まれことを見出した。
前記式（III）の左側部分（一般式（Ｉ）におけるＡ部分に相当する部分）は、以前に報告してきたグアニンと水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とスタッキング効果により安定化され得る２−置換−１，８−ナフチリジン構造であり、この構造がグアニン（Ｇ）と対を形成することは、既に報告してきたとおりである。
【００１７】
核酸の２本鎖中においてグアニンに対するミスマッチが存在している場合において、前記式（III）のミスマッチ認識分子が各々のミスマッチに対する取り込みついて検討した。
この検討のために、次の３種のオリゴマーを用いた。
0004011937.tif 000004
オリゴマー（３）は正常な塩基対を有するものであり、オリゴマー（１）及び（２）は前記の塩基配列の上の＊印を示した部分においてミスマッチが生じているものである。
【００１８】
これらのオリゴマー（１）及び（２）、並びにオリゴマー（３）のそれぞれについて、前記式（III）のミスマッチ認識分子の存在下、又は非存在下における二本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を調べた。
その結果を次の表１に示す。
0004011937.tif 000005
【００１９】
表１は左から、試験をしたオリゴマーの塩基配列、式（III）のミスマッチ認識分子の非存在下での融解温度（Ｔｍ）（℃）、式（III）のミスマッチ認識分子の存在下での融解温度（Ｔｍ）（℃）、各融解温度（Ｔｍ）（℃）の差（ΔＴｍ）（℃）を示している。ここに、融解温度（Ｔｍ）の差（ΔＴｍ）は、
ΔＴｍ＝（式（III）存在下でのＴｍ）−（式（III）非存在下でのＴｍ）
から算出されたものである。
この結果からも明らかなように、ミスマッチが存在していた場合にはΔＴｍの値が大きく相違することになり、ミスマッチの存在を確認することができる。
そして、ミスマッチの種類によりΔＴｍの値が相違してくるだけでなく、式（III）のミスマッチ認識分子の非存在下での融解温度（Ｔｍ）も相違している。さらに本発明で重要なことは、式（III）のミスマッチ認識分子が存在した場合における融解温度（Ｔｍ）の相違である。例えば、オリゴマー（１）の場合にはこのＴｍの値は４０．４℃であり、この値は正常なオリゴマー（３）の値４０．５℃とほぼ同じ値になっているのに対して、オリゴマー（２）のこのＴｍの値は３６．１℃極めて低い温度になっている。これは式（III）の分子種における右側部分（一般式（Ｉ）におけるＸ部分に相当する部分）に対する各塩基との結合能が反映された結果である。即ち、式（III）の分子種の場合にはアデニン（Ａ）塩基とはほぼ正常な対に近い結合能を有するが（オリゴマー（１）の場合）、グアニン（Ｇ）塩基とは結合はするが比較的弱い結合能しか有さない（オリゴマー（２）の場合）結果が反映されたものであり、このことにより、本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、調べようとする遺伝子にミスマッチ（例えば、ＳＮＰなど）が存在していることが判明するだけではなく、当該ミスマッチにおける相手側の塩基を知ることが可能となることがわかった。
【００２０】
本発明のミスマッチ認識分子の基本的なことについては前記した特開２００１−１４９０９６号に記載されているが、本発明のミスマッチ認識分子は、一方の塩基を認識する部分を塩基の種類に対して非特異的にし、かつ正常な塩基対に対しては影響を与えない分子種であることを特徴とするものである。
したがって、本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位（一般式（Ｉ）におけるＡ及びＸの化学構造部分）において、Ａ部分は塩基の種類に対して特異性が強い構造を有する部分であり、Ｘ部分は塩基の種類に対して比較的非特異的な結合ができることを特徴とするものである。
【００２１】
このように、本発明は、２個の異なる塩基認識部位を適当な長さでかつ適当な自由度を有するリンカーで結合させた化合物が、２本鎖の核酸における塩基対のミスマッチ部分において、一方は特異的にかつ安定に対を形成し、他方は比較的に非特異的に結合するという特徴により、簡便な方法でミスマッチの存在を判定することができるだけでなく、ミスマッチの種類も判定することができるという基本的なミスマッチ判定法を提供するものであり、前記に例示したグアニン（Ｇ）に対するミスマッチに限定されるものではない。
前記した例では、グアニン（Ｇ）に対するミスマッチを例に取り、グアニン塩基と安全な水素結合を形成する１，８−ナフチリジン誘導体を一方の塩基認識部位に用いたミスマッチ認識分子を示したが、ミスマッチの認識はグアニン（Ｇ）に対するミスマッチに限定されるものではない。本発明にミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、ミスマッチの塩基の片方を認識し当該塩基とワトソン−クリック（Watson-Crick）型の塩基対を形成することができ、周囲の塩基によるスタッキング効果を得られる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と塩基対を形成し得ることができる構造を使用することができる。例えば、ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体などが、ミスマッチの塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体などが、また、ミスマッチの塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体などが用いられる。
【００２２】
特定のミスマッチの塩基に特異的に認識される本発明のミスマッチ認識分子における塩基認識部位は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基にスタッキングされるための平面構造を有している複素環式芳香族基を有するものが好ましい。
【００２３】
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物におけるリンカー部Ｌとしては、２個の塩基認識部位を適当な長さで適当な自由度を与えるものであれ特に制限されるものではないが、例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１２の直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和のアルキル基であって、当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基が挙げられる。好ましいリンカーとしては、前記した式（III）の化合物のように両端がアミド結合の部分を有し、中央部に窒素原子を有するものが挙げられる。
このリンカー部分は、２個の塩基認識部位を結合させるだけでなく、このリンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させることもできる。例えば、リンカー中央部付近の窒素原子の箇所からさらに末端に担体と結合するための官能基などを有するアルキレン基のような枝を延ばして、必要に応じて担体に固定化することもできる。
【００２４】
本発明の一般式（Ｉ）における塩基認識部位Ａ又はＸとリンカー部Ｌとの結合は、炭素−炭素結合であってもよいが合成の簡便さから官能基による結合が好ましい。官能基による結合としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、リン酸による結合など種々のタイプのものを選択することができるが、アミド結合が好ましい。
本発明のミスマッチ塩基認識分子における、グアニン（Ｇ）に対するミスマッチに好ましい一般式（Ｉ）の化合物として、次の一般式（II）、
【００２５】
【化６】
0004011937.tif 000006
【００２６】
（式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
Ｒ２は、炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキル基を示す。）
で表される化合物又はその固定化物が挙げられる。ここにおける「固定化物」とは、前記した化合物が担体に固定化されている状態のもの又は固定化され得るように前記した「枝」をのばした状態の化合物をいう。
本発明の一般式（II）における置換基Ｒ１としては、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシ基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。これらのアルキル基、アルコキシ基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子又は窒素原子で置換されていてもよい。
また、Ｒ２におけるアルキル基は前記したアルキル基であって、一般式（II）に示されているように２価のアルキル基である。
【００２７】
また、本発明のミスマッチ塩基認識分子はこれを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入するなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。
さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００２８】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができる。例えば、前記した１，８−ナフチリジン誘導体は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
このようにして得られた塩基認識部位を、両末端にカルボキシル基又はその反応性誘導体基を有するリンカー用の化合物と反応させることにより目的のミスマッチ塩基認識分子を得ることができる。この際に、リンカー用化合物の分子中に窒素原子などの反応性の基が存在している場合には、前記した保護基などで適宜保護して使用することができる。
【００２９】
本発明のミスマッチ塩基認識分子は、これをミスマッチの塩基の対の検出するための試薬又は検出剤として使用することができ、また、適当な担体と組み合わせることによりミスマッチの塩基の対を検出するための組成物とすることができる。また、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させるための塩基対生成剤として使用することもできる。ここに、「擬似的な塩基対」というのは、天然に存在する塩基の対とは異なる塩基の対であるという意味であり、塩基対の強度を意味するものではない。なお、本明細書において使用される「正常な塩基対」とは天然に存在する塩基の対であって、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ、又はＡ−Ｕの塩基対をいう。
本発明は、さらに前記した本発明のミスマッチ塩基認識分子、及び検出、同定用の資材、例えば化学発光や蛍光のための試薬や緩衝液などの資材からなる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定することからなる正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するためのキットを提供するものである。
さらに、本発明は、本発明のミスマッチ塩基認識分子又は標識化若しくは固定化された本発明のミスマッチ塩基認識分子を使用して、ＤＮＡ中のミスマッチしている塩基の対を検出、同定又は定量するための方法を提供するものである。
【００３０】
本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位を用いることにより、例えばクロスハイブリダイゼーション法において、調べようとしている遺伝子又はその断片と正常な遺伝子又はその断片における１個又は２個以上のミスマッチの塩基の対（例えば、遺伝子における一塩基変異（ＳＮＰ）など）を簡便に、その有無及びミスマッチにおけるミスマッチ塩基の種類を判定することができる。例えば、式（III）に示される本発明のミスマッチ認識分子を用いて、調べようとする遺伝子の断片、例えば１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基、１０〜３０塩基程度の断片とし、これに対応する正常な塩基配列を有する遺伝子の断片を用意し、正常な遺伝子の断片と調べようとする遺伝子の断片を、式（III）に示される本発明のミスマッチ認識分子の存在下及び非存在下のそれぞれにおいてハイブリダイズさせて、それらの融解温度（Ｔｍ）を測定することによりミスマッチの有無（この例ではＳＮＰなどの有無）や、ミスマッチの塩基の種類を判定することができることになる。この場合に一般式（Ｉ）におけるＡ構造の部分は特定の塩基、例えばグアニン（Ｇ）と対を形成することになることから、この例の場合ではミスマッチは正常な塩基配列を有する遺伝子の断片のグアニン（Ｇ）塩基の箇所で起きていることも判明することになる。
【００３１】
また、本発明のミスマッチ認識分子は、塩基認識部位（一般式（Ｉ）におけるＡ構造の部分）がミスマッチの特定の塩基と安定な対を形成し、当該塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりミスマッチの塩基の対が安定化されたミスマッチ塩基対を含有するＤＮＡを提供するものである。
本発明のこのＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対が本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位と水素結合により塩基対と同様な「対」（擬似的な塩基対）を形成し、かつミスマッチの塩基と「対」を形成している本発明のミスマッチ認識分子の塩基認識部位が近傍、好ましくは隣接の塩基対を形成している塩基にサンドイッチ状に挟まれてスタックされている安定なＤＮＡを提供するものである。
【００３２】
本発明のミスマッチ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないミスマッチの塩基の対を高感度でかつ簡便に検出、同定又は定量することが出来、ミスマッチの塩基の対に特異的でかつ安定なＤＮＡを形成することから、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に応用することが可能である。
また、本発明のＤＮＡは、ミスマッチの塩基の対を有した状態で比較的安定に存在することができることから、ミスマッチの塩基の対を含有するＤＮＡの安定化や、ミスマッチの発生原因やミスマッチの修復機構の解明などの研究材料として利用することも可能である。
【００３３】
前記した新たな対（本発明のミスマッチ認識分子とミスマッチの塩基との対）を測定するための手段としては、融解温度（Ｔｍ）を指標とすることができるが、これに限定されるものではなく、例えば化学発光や蛍光、放射性同位体などの標識化によっても行うことができる。本発明のミスマッチ認識分子は低分子有機化合物であり、新たな対を形成した場合にはこの分子が核酸中に取り込まれるので、未反応の本発明のミスマッチ認識分子と核酸類の両者を比較的簡便に分離することができる。
また、前記したように本発明のミスマッチ認識分子を担体に固定化して使用することもできる。例えば、本発明の各種のミスマッチに特異的なミスマッチ認識分子をタイタープレートなどのプレートに固定化し、これに前記の２本鎖の核酸、好ましくは標識化された核酸を加え、数分間インキュベートした後、核酸類を除去すると本発明のミスマッチ認識分子と特異的に反応した核酸は固定化された本発明のミスマッチ認識分子にトラップされ、標識により検出、同定することができることになる。
【００３４】
また、本発明のミスマッチ認識分子を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の検出用チップの金属薄膜上に固定化することも可能である。このＳＰＲによる場合には、前記の２本鎖の核酸を含有する試料液を検出用チップの表面に流すだけで、ミスマッチの有無を特異的に検出することが可能となる。
さらに、他の多くの検出手段に本発明のミスマッチ認識分子を応用することも可能であり、本発明はこれらの特定の検出手段に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】
次に、具体的な試験例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１（式（III）の化合物の合成）
次式に示す化学反応に従って標記の化合物を合成した。
【００３６】
【化７】
0004011937.tif 000007
【００３７】
（ＤＭＦはジメチルホルムアミドを示し、Ｅｔはエチル基を示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
（１）Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルイミノ−３，３’−ビス（ペンタフルオロフェニルプロピオネート）（N-(tert-Butoxycarbonyl)imino-3,3’-bis(pentafluorophenyl propionate) ）(1.5 g, 2.53mmol)のＤＭＦ(5 mL)溶液に２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン(180 mg, 1.14 mmol) とジイソプロピルエチルアミン(163 mg, 1.26 mmol)を加え、室温で１５時間撹拌した。溶媒を留去した後、残差をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、モノナフチリジン置換体(1.29 g, 90%)を得た:
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）  δ：
9.01 (br, 1 H), 8.44 (d, 1 H, J = 8.8 Hz),
8.12 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 7.99 (d, 1 H, J = 8.0 Hz),
7.26 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.66 (m, 4 H), 2.90 (m, 2 H),
2.74 (m, 2 H), 2.73 (s, 3 H), 1.42 (s, 9 H);
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ）、ｍ／ｅ  ：  ５６９［（Ｍ＋Ｈ）＋，  ］，
ＨＲＭＳ  ：
計算値  Ｃ２６Ｈ２６Ｏ５Ｎ４Ｆ５  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］  ５６９．１８２１，
実測値                                      ５６９．１８２７
【００３８】
（２）前記（１）で得たノナフチリジン置換体(300 mg, 0.53 mmol) のＤＭＡ(2 mL)溶液に７−アミノメチル−（２Ｈ）ヒドロ−８−アザキノリン−２−オン（7-(aminomethyl)hydro-8-azaquinolin-2-one）(93 mg, 0.53 mmol)とジイソプロピルエチルアミン(77 mg, 0.6 mmol)を加え、室温で１５時間撹拌した。溶媒を留去した後、残差をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、ナフチリジン−ナフチリドン−Ｎ−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル基）保護体(227 mg,
77%) を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）  δ：
11.29 (br, 1 H), 9.08 (br, 1H), 8.38 (d, 1 H, J = 8.8 Hz),
8.06 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.95 (d, 1 H, J = 8.0 Hz),
7.81 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.64 (d, 1 H, J = 9.6 Hz),
7.27 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.22 (d, 1 H, J = 8.0 Hz),
6.64 (d, 1 H, J = 9.6 Hz), 4.63 (d, 2 H, J = 6.0 Hz),
3.58 (t, 2 H, J = 6.8 Hz), 3.57 (t, 2 H, J = 6.8 Hz),
2.71 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.70 (s, 1 H),
2.54 (t, 2 H, J = 6.8 Hz), 1.36 (s, 9 H) ;
ＦＡＢＭＳ  （ＮＢＡ），ｍ／ｅ：  ５６０  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ  ；
計算値  Ｃ２９Ｈ３４Ｏ５Ｎ７  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］   ５６０．２６２１，
実測値                                    ５６０．２６１８
【００３９】
（３）前記（２）で得たＢｏｃ保護体 (62 mg, 0.11 mmol)のＣＨＣｌ３（３ｍＬ）溶液に、４ＭＨＣｌ（２ｍＬ）の酢酸エチル溶液を加え、室温で３０分撹拌した。溶媒を留去目的物（収率定量的）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）  δ：
11.45 (br, 1 H), 8.67 (t, 1 H, J = 5.6 Hz),
8.31 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 7.98 (d, 1 H, J = 8.8 Hz),
7.88 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.65 (d, 1 H, J = 7.6 Hz),
7.53 (d, 1 H, J = 9.6 Hz), 7.15 (d, 1 H, J = 7.6 Hz),
7.14 (t, 1 H, J = 8.0 Hz), 6.58 (d, 1 H, J = 9.6 Hz),
4.65 (d, 2 H, J = 5.6 Hz), 3.08 (t, 2 H, J = 6.0 Hz),
3.06 (t, 2 H, J = 6.0 Hz), 2.65 (t, 2 H, J = 6.0 Hz),
2.58 (t, 2 H, J = 6.0 Hz), 2.57 (s, 3 H).
【００４０】
実施例２  （ミスマッチＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）の測定）
次の（１）〜（３）の３種の１１塩基からなるヌクレオチドオリゴマーの各々１００μＭを、１００ｍＭのＮａＣｌ及び式（III）の化合物２００μＭを含む１０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に添加して、実施例１で製造した一般式（III）のミスマッチ認識分子の存在下及び非存在下における融解温度（Ｔｍ）をそれぞれ測定した。
0004011937.tif 000008
オリゴマー（３）は正常な塩基対を有するものであり、オリゴマー（１）及び（２）は前記の塩基配列の上の＊印を示した部分においてミスマッチが生じているものである。
結果を表１に示す。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の一般式（Ｉ）で示されるミスマッチ認識分子を用いることにより、当該ミスマッチ認識分子の一方の側（一般式（Ｉ）のＡ構造の部分）において特定のミスマッチ塩基を認識し、他方の側（一般式（Ｉ）のＸ構造の部分）においてミスマッチのいずれの種類の塩基とも塩基の種類に応じて結合することができることから、融解温度（Ｔｍ）を測定することによりミスマッチの有無及びミスマッチの塩基種類を簡便な手段により、迅速に、且つ確実に判定することができる。  本発明のミスマッチ認識分子を使用することにより、遺伝子の断片におけるＳＮＰの存在の有無や種類の判定を迅速にかつ大量に処理することが可能となる。