(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）とを有性交雑し、３０〜４０℃の温度帯での生育能およびメリビオース資化能を有する交雑株を選抜することにより、親株に変異処理を施すことなく選抜された１０℃以下で発酵可能なサッカロミセス・Ｈｙ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９５）。
【請求項２】
３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を胞子対胞子でランダムに交雑し、３０〜４０℃の温度帯での生育能およびメリビオース資化能を有する交雑株を選抜することを特徴とする、請求項１記載のサッカロミセス・Ｈｙ００１株の育種法。
【請求項３】
３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）のそれぞれの胞子懸濁液を混合して培養し、得られた混合培養液を寒天培地にて３５℃で培養し、生育したコロニーの中から微生物を採取し、メリビオース資化能を有する交雑株を選抜することを特徴とする、請求項２記載のサッカロミセス・Ｈｙ００１株の育種法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はビール酵母及び該ビール酵母の育種法に関し、詳しくは通常約２０℃で発酵する上面ビール酵母に、低温でも生育・発酵が可能でありメリビオース資化能を有する低温発酵性ワイン酵母を掛け合わせることにより、親株に変異処理を施すことなく選抜された、１０℃以下の低温でも麦汁を発酵できる新規な下面様ビール酵母及び該ビール酵母の育種法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビール酵母は、上面ビール酵母と下面ビール酵母に分類されており、ここで述べる上面ビール酵母は、ビール醸造に使用する酵母で、約２０℃で良好に発酵し、発酵中に酵母が塊を形成して浮かび上がってくる株と定義され、下面ビール酵母は、同じくビール醸造に使用する酵母で、１０℃以下の低温で良好に発酵し、かつ主発酵終了時に発酵槽の底に沈降する株と定義される。また、一般に上面ビール酵母は、メリビオース資化能を有していないのに対し、下面ビール酵母は、メリビオース資化能を有することにおいても識別される。
【０００３】
近年、酵母の育種が盛んに行われているが、ビール酵母、特に下面ビール酵母は、胞子形成能，接合能が弱いため、有性交雑による育種例は非常に少ない。
これまでの育種例として、Bilinskiらは上面ビール酵母と下面ビール酵母からそれぞれ単相栄養細胞を取得し、マニュピレーターを用いて細胞対細胞で交雑させ、交雑株を糖の資化性、ジャイアントコロニーの形態などで選択した(Bilinski,C.A. et al.: J.Inst.Brew.,92:594,1986)。この交雑株について、麦汁を用いて発酵試験を行った結果、交雑株は１５℃で良好な発酵能を示した。しかし、交雑株の１０℃以下の低温での発酵能に関して記載したものはない。また、この方法はあくまでも一部のビール酵母において適用可能であり、胞子形成能や接合能が弱い株並びにホモタリックな株に関しては適用することができない。
【０００４】
ところで、岸本らは、低温（約７℃）で良好に生育・発酵するワイン酵母ＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）またはＹＭ１２６株（ＲＩＦＹ１２１６）と、中温（約２８℃）で良好に生育・発酵するワイン酵母ＯＣ−２株（ＩＡＭ４２７４）を交配し、低温から中温で良好に生育・発酵するワイン酵母の育種を行っている（Kishimoto,M.: J.Ferment.Bioeng.77 (4): 432,1994)。この場合、ワイン酵母は高い胞子形成能を持つため、マニュピレーターを用いて胞子対胞子で交配し、人為的に付与したアミノ酸要求の相補により交雑株を取得している。
【０００５】
また、従来のRare-Mating や細胞融合では、交雑株の生じる頻度が極めて低いので、交配に使用する親株には、例えばそれぞれ異なる栄養要求性や薬剤耐性などの選択マーカーを付与し、交雑株のみが生育できる選択培地で交雑株を選択している。
しかし、一般にビール酵母を含む産業用酵母は、選択マーカーを持っていないため、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理や紫外線（ＵＶ）照射などの変異処理、遺伝子破壊などによって選択マーカーを持つ株が造成されるが、変異処理により実用的に優れた性質が失われたり、劣化する恐れがある。また、ビール酵母は高次倍数体であるため、容易に変異株が得られないという問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、親株に変異処理を施すことなく選抜された、１０℃以下の低温で発酵可能な下面様ビール酵母並びに該ビール酵母の有性交雑による育種法の提供を目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、接合能を持つ上面ビール酵母である、３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株に、低温発酵性ワイン酵母である、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を、有性交雑により掛け合わせ、３０〜４０℃の温度帯での生育能およびメリビオース資化能を有する交雑株を選抜することにより、上面ビール酵母に１０℃以下での生育・発酵能が付与された新規な下面様ビール酵母であるサッカロミセス・Ｈｙ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９５）を創製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）とを有性交雑し、３０〜４０℃の温度帯での生育能およびメリビオース資化能を有する交雑株を選抜することにより、親株に変異処理を施すことなく選抜された１０℃以下で発酵可能なサッカロミセス・Ｈｙ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９５）である。
請求項２に記載の本発明は、３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を胞子対胞子でランダムに交雑し、３０〜４０℃の温度帯での生育能およびメリビオース資化能を有する交雑株を選抜することを特徴とする、請求項１記載のサッカロミセス・Ｈｙ００１株の育種法である。
請求項３に記載の本発明は、３５℃の温度で生育可能でありメリビオース資化能を有さないサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と、３５℃の温度で生育不可能でありメリビオース資化能を有するサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）のそれぞれの胞子懸濁液を混合して培養し、得られた混合培養液を寒天培地にて３５℃で培養し、生育したコロニーの中から微生物を採取し、メリビオース資化能を有する交雑株を選抜することを特徴とする、請求項２記載のサッカロミセス・Ｈｙ００１株の育種法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
一般に、ワイン酵母は高い子嚢胞子形成能を持っているが、ビール酵母のうち特に下面ビール酵母はほとんど胞子を形成しない。また、上面ビール酵母で胞子を形成する株の場合でも、その胞子形成能はワイン酵母に比べると非常に低く、胞子の発芽率も低いことが知られている。
そこで、本発明者らは、ビール酵母とワイン酵母を交雑するに際して、マニュピレーターを用いた１対１の交雑は行わないで、ランダムに胞子対胞子で交雑を行う方法を採用した。すなわち、上面ビール酵母と低温発酵性ワイン酵母をそれぞれ胞子形成培地で培養して子嚢胞子を形成させ、胞子対胞子でランダムに交雑を行い、その後の交雑株の選択は、生育温度と糖の資化性の相違を利用して行った。
このようにして得られた交雑株については、パルスフィールド電気泳動による核型解析を行い、交雑株であることを確認した後、低温（１０℃）の条件で、麦汁を用いた発酵試験を行った。その結果、低温での生育・発酵能を有することを知見したのである。また、この交雑株はメリビオース資化能を有し、主発酵終了時に発酵槽の底に沈降するという性質も備えていることが判明した。
【００１０】
本発明に用いる上面ビール酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するものがあり、特にサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株が好適である。この酵母は３５℃で生育可能であり、メリビオースを資化しない。
また、低温発酵性酵母としては、サッカロミセス属に属し、メリビオース資化性を有するワイン酵母が用いられ、サッカロミセス・バイヤナスに属するもの、具体的にはサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４），同ＹＭ１２６株（ＲＩＦＹ１２１６）等があり、特にサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）が好適である。酵母ＹＭ８４株は低温発酵性であり、３５℃で生育不可能であるが、約７℃という低温で生育・発酵することができ、メリビオースを資化する能力を有する。
上記のように、これら親株は、生育温度と糖の資化性において明らかに相違している。すなわち、上面ビール酵母は３５℃で生育可能であるが、低温発酵性酵母はこの温度では生育しない。また、前者はメリビオースを資化しないが、後者はメリビオースを資化する。
【００１１】
交雑株の育種は、前記したように、上面ビール酵母と低温発酵性ワイン酵母をそれぞれ胞子形成培地で培養して子嚢胞子を形成させ、胞子懸濁液を混合し、胞子対胞子でランダムに交雑を行い、適当に希釈した混合培養液を寒天培地に蒔いて３０〜４０℃、好ましくは３５℃で４０〜５０時間、好ましくは４８時間培養し、生育したコロニーの中からなるべく大きいものを選択する。低温発酵性酵母は、この温度では生育できないので、除かれる。
【００１２】
次に、釣菌した菌株のメリビオース資化能を調べるため、メリビオースを唯一の炭素源として含む培地に植菌して判定する。上面ビール酵母は、メリビアーゼ活性がなくメリビオースを資化できないので、この段階で除かれる。
メリビオースを含む培地での生育の有無によって判定する方法は、約３〜４日という長時間を要するので、特定の物質を用いてメリビアーゼ活性の有無を判定する方法を採用することが望ましい。このため、本発明では５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトピラノシド(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-α-galactopyranoside、以下X-α-galと略す。）を使用した。本物質は、酵母菌体内に入ると、メリビアーゼにより加水分解され、青色に変化する性質がある。つまり、コロニーが青色に染まればメリビオースの資化能があることが明らかである。この染色判定法によれば、僅か一晩の培養で判別が可能である。このメリビアーゼ活性を判定する方法は文献(Tubb,S.Roy et al.: J.Inst.Brew.,92: 588-590,1986)に記載されている。
この方法によれば、例えば直径８．５ｃｍのシャーレを用いた場合、一度に約１００株のメリビアーゼ活性の有無を短時間で調べることができる。因みに、上面ビール酵母サッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株はX-α-galを含む培地上で白色であり、ワイン酵母サッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株はメリビオースの資化能を持つため青色に染まる。なお、本手法は他の上面ビール酵母とメリビオースの資化能を持つサッカロミセス・バイヤナス株間の有性交雑にも適用することができる。通常、この培養は１８〜２５℃、好ましくは２０℃の温度で行う。コロニーが青色に染まった菌株についてパルスフィールド電気泳動による核型解析を行い、交雑株であることを確認する。さらに、低温下での発酵試験を行う。
このように、本発明によれば、両親株の菌学的性質の相違を利用して、親株に変異処理を施さないで、交雑株の選択を行うことができる。
【００１３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
上面ビール酵母としてサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株、低温発酵性酵母としてワイン酵母サッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を選択し、これら親株の胞子を用いて育種を行った。
なお、交雑株の取得にあたり、第１表に示した生育温度と糖の資化性の違いを選択マーカーとして利用した。
まず、両親株をそれぞれMcClary らの胞子形成培地（酢酸ナトリウム０．８２％, グルコース０．１％, 酵母エキス０．２５％, 塩化カリウム０．１８％, 寒天２％) に２０℃で３〜４日培養し、子嚢胞子の形成を誘導した。
その後、細胞壁溶解酵素（商品名：ザイモリエース２０Ｔ、生化学工業製）１０００ｐｐｍを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で子嚢壁を溶解した後、超音波処理を行い、胞子懸濁液０．２ｍｌを得た。
このようにして得た両親株の胞子懸濁液０．０１ｍｌずつを混合し、ＹＰＤ培地（グルコース２％，ペプトン２％，酵母エキス１％を含む）０．５ｍｌを加え、２５℃で一晩培養した。
【００１４】
混合培養液を適当に希釈してＹＰＤ寒天プレート（寒天２％）に蒔き、３５℃で２日間培養した。
生育してきたコロニーのうち、なるべく大きいものを選択し、５００ｐｐｍのX-α-galを含むＹＰＤ寒天プレートに移し、２０℃で培養した。
菌体が青く染まった菌株については、パルスフィールド電気泳動による核型解析を行い、交雑株であることを確認した。図１に実験スキームを示した。図２はパルスフィールド電気泳動による核型解析の結果を示す電気泳動写真である。これは、クロスフィールド電気泳動装置（ＡＴＴＯ社）を用いて定法にしたがって行った（Takata, Y et al.: J. Am. Soc. Brew. Chem., 47(4): 109,1989) 。なお、レーン１はサッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株、レーン２はサッカロミセス・Ｈｙ００１株、レーン３はサッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を示す。泳動条件は次の通りである。パルスタイム  ７０秒、泳動時間  ５４時間、電圧  １８０Ｖ一定、温度  １２℃、緩衝液  ０．５×TBE buffer(45mM Tris, 45mM Boric acid, 1.3mM EDTA)
このようにして、上面ビール酵母サッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と低温発酵性ワイン酵母サッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）の交雑株を５株得た。このうちの１株をサッカロミセス・Ｈｙ００１と命名した。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９５である。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
実施例２
実施例１で創製された交雑株サッカロミセス・Ｈｙ００１及びその親株である上面ビール酵母サッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と低温発酵性ワイン酵母サッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）について、麦汁（サッポロビール株式会社、パイロットブリュワリー製）を用いた発酵試験を行った。
発酵試験はＥＢＣ（European Brewery Convention)チューブを用い、２リットルスケール，発酵温度１０℃一定で行った。酵母菌体の添加量は９．６ｇ（湿重量）である。なお、ＥＢＣチューブは円筒形のガラス製チューブであり、台にクランプで固定して用いた。
第２表にそれぞれの菌株の発酵中のエキスの切れを示した。いずれも発酵中のエキスはアントンパール社の密度計（ＤＭＡ５５）を用い、仮性エキスとして測定した。また、参考として菌株保存機関であるＡＪＬ（デンマーク）とＮＣＹＣ（イギリス）より入手した下面ビール酵母についても同一条件下におけるエキスの切れを示した。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
表から明らかなように、交雑株サッカロミセス・Ｈｙ００１は、その親株である上面ビール酵母サッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株よりも１０℃において良好な発酵能を示した。さらに、本交雑株は参考として示した下面ビール酵母と同等レベルの発酵能を持つことが分かった。この結果は、上面ビール酵母サッカロミセス・セレビシエ  Ｄｏｅｍｅｎｓ  Ｎｏ．３３８株と低温発酵性ワイン酵母サッカロミセス・バイヤナスＹＭ８４株（ＲＩＦＹ１１１４）を掛け合わせることにより、交雑株に低温（１０℃）での発酵能が付与されたことを示している。
また、交雑株の発酵形態は、発酵中に酵母が塊になり浮かび上がる上面発酵ではなく、主発酵終了時に酵母が沈降する下面発酵的な特徴を持っていた。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、有性交雑株である下面様ビール酵母、特に１０℃以下で発酵可能な交雑株、サッカロミセス・Ｈｙ００１株が提供される。この交雑株は、主発酵終了時に酵母が沈降する下面発酵的な特徴を有している。また、交雑株の育種にあたり、親株に変異処理を施すことなく両親株の菌学的性質の相違を利用して交雑株を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の交雑株の取得方法を示した図である。
【図２】  核型解析を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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