(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞に傷を付け、この植物細胞にアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する際に使用する遺伝子導入用の植物細胞処理装置であって、この装置は開口部を有する容器であり、この容器の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面が設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器は前記植物細胞から誘導したカルスを前記微細凹凸面に擦り付けることで該植物細胞の表面に傷を付けるものであることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項３】
請求項１〜２いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器は前記植物細胞と培養液とを収納して震盪することにより前記微細凹凸面に前記植物細胞を擦り付けて該植物細胞の表面に傷を付けるものであることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器の内壁には紙ヤスリが付設され、この紙ヤスリのヤスリ面が前記微細凹凸面に設定されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記紙ヤスリとして、耐水性のものが採用されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項６】
請求項４，５いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記紙ヤスリとして、♯１５０乃至８００程度の紙ヤスリが採用されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器の開口部を閉塞する蓋体が設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項８】
請求項７記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器は筒状であり、前記蓋体は前記容器の開口部に螺着脱自在に設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記植物細胞の表面に付ける傷は、前記植物細胞が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記植物細胞は単子葉植物の細胞であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記単子葉植物はユリ科植物であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞に外来の遺伝子を導入して遺伝子操作する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
植物細胞に外来の遺伝子を導入することによって、交雑育種では付加できない有用な形質を植物に付与することは、今後の農作物の改良と農業の発展に極めて意義がある。
【０００３】
この遺伝子を導入する技術には、微小な金属粒子に外来の遺伝子を付着しておき、この金属粒子を空気銃で植物細胞に打ち込むパーティクルガン法（例えば、特表平５−５０８３１６号）等の物理的な方法や、土壌細菌であるアグロバクテリウムの感染作用を利用したアグロバクテリウム法（例えば、特開昭６０−７００８０号や特開平６−２０９７７９号）等の生物的な方法が提案されている。
【０００４】
上記の方法の内、物理的な方法は、遺伝子の導入の際、所望の遺伝子以外の遺伝子の断片が植物細胞に導入されてしまうおそれがあり、植物を目的通りとすることができない場合が多い。従って、植物細胞に遺伝子を導入する際には、生物的な方法であるアグロバクテリウム法が採用される場合が多い。
【０００５】
このアグロバクテリウム法について説明する。
【０００６】
先ず、アグロバクテリウムに物理的な方法によって目的の遺伝子を導入しておく。
【０００７】
一方、遺伝子を導入したい植物にメス等で傷を付けておく。この傷は植物細胞壁を損傷させる程度としておく。
【０００８】
続いて、アグロバクテリウムと植物細胞とを一緒に培養する。この際、前記植物細胞の傷にアグロバクテリウムが接近して感染し、該植物細胞の細胞膜を通して内部の染色体に目的の遺伝子が組み込まれる。
【０００９】
これにより、植物細胞の遺伝子に目的の遺伝子を導入することができる。
【００１０】
ところで、このアグロバクテリウム法にも下記の問題点がある。
【００１１】
アグロバクテリウムは双子葉植物の細胞には感染し易いという性質を有しているが、単子葉植物（例えば、ユリ科植物）の細胞には感染しにくい。従って、単子葉植物にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入しようとする場合、成功率が低いという問題点がある。
【００１２】
更に、前述のようにアグロバクテリウムを感染させる為には植物にメス等で傷を付けなければならないが、細胞が非常に弱い場合、例えば、ユリ科植物の場合、この傷が原因で植物細胞が死んでしまうことがある。
【００１３】
尚、細胞が非常に弱い場合は、物理的な方法による遺伝子の導入も、当然難しい。
【００１４】
本発明は、上記問題点を解決するもので、植物細胞にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物細胞に遺伝子を導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導入技術を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１６】
植物細胞１に傷７を付け、この植物細胞１にアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する際に使用する遺伝子導入用の植物細胞処理装置であって、この装置は開口部５を有する容器３であり、この容器３の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２が設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００１７】
また、請求項１記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器３は前記植物細胞１から誘導したカルスを前記微細凹凸面２に擦り付けることで該植物細胞１の表面に傷７を付けるものであることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００１８】
また、請求項１〜２いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器３は前記植物細胞１と培養液とを収納して震盪することにより前記微細凹凸面２に前記植物細胞１を擦り付けて該植物細胞１の表面に傷７を付けるものであることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００１９】
また、請求項１〜３いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器３の内壁には紙ヤスリ４が付設され、この紙ヤスリ４のヤスリ面が前記微細凹凸面２に設定されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２０】
また、請求項４記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記紙ヤスリ４として、耐水性のものが採用されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２１】
また、請求項４，５いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記紙ヤスリ４として、♯１５０乃至８００程度の紙ヤスリ４が採用されていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２２】
また、請求項１〜６いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器３の開口部５を閉塞する蓋体６が設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２３】
また、請求項７記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記容器３は筒状であり、前記蓋体６は前記容器３の開口部５に螺着脱自在に設けられていることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２４】
また、請求項１〜８いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記植物細胞１の表面に付ける傷７は、前記植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２５】
また、請求項１〜９いずれか１項に記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記植物細胞１は単子葉植物の細胞であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２６】
また、請求項１０記載の遺伝子導入用の植物細胞処理装置において、前記単子葉植物１はユリ科植物であることを特徴とする遺伝子導入用の植物細胞処理装置に係るものである。
【００２７】
【発明の作用及び効果】
本発明は繰り返した実験の結果、得られた効果を請求項としてまとめたものである。
【００２８】
植物細胞１を表面に鋭利な微細凹凸が設けられた微細凹凸面２に当接すると、該植物細胞１の表面に多数の傷７が形成される。
【００２９】
植物細胞１は、この多数の傷７の修復にエネルギーを消費し、細胞全体としての感染抵抗力が低下する。
【００３０】
この感染抵抗力が低下した状態の植物細胞１は、アグロバクテリウムに感染し易く、よって、アグロバクテリウム法により該植物細胞１に遺伝子を良好に導入することができる。
【００３１】
また、この植物細胞１に形成される傷７は、擦り傷と呼べるものであり、該植物細胞１の致命傷とはなりにくく、よって、植物細胞１が死ぬこと（細胞分裂不能な状態になること）は可及的に防止されることになる。
【００３２】
本発明は上述のように構成したから、植物細胞１にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物細胞１に遺伝子を導入できる実用性に秀れた遺伝子導入用の植物細胞処理装置となる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
図面は本発明の一実施例を図示したものであり、以下に説明する。
【００３４】
本実施例は、アグロバクテリウム法により植物細胞１に遺伝子を導入する装置であって、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２に植物細胞１を当接して該植物細胞１の表面に傷７を付け、この植物細胞１にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入するための装置である。
【００３５】
植物細胞１の表面に付ける傷７は、植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７とする。具体的には、植物細胞１の表面に存在する細胞壁10には傷７が付き、この細胞壁10の内側に存在する細胞膜11には傷７が付かない程度に設定する。
【００３６】
また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、該植物細胞１からカルス（植物細胞１の塊）を誘導し、このカルスを前記微細凹凸面２に擦り付けることで前記植物細胞１の表面に傷７を付ける方法を採用すると良い。
【００３７】
具体的には、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、以下に説明する植物細胞処理装置を使用すると良い。
【００３８】
この植物細胞処理装置は、開口部５を有する容器３の内壁に鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２が設けられているものである。
【００３９】
容器３は筒状のものが採用されている。
【００４０】
また、容器３の開口部５には、該開口部５を閉塞する蓋体６が螺着脱自在に設けられている。
【００４１】
微細凹凸面２は、容器３の内壁に紙ヤスリ４が付設されることで形成されている。
【００４２】
この紙ヤスリ４は、耐水性のものを採用すると良い。また、この紙ヤスリ４は、＃１５０乃至８００程度のものを採用すると良い。また、傷７を付けようとする植物細胞１の細胞壁10の厚さに対応して使用する紙ヤスリ４を適宜選択すると良い。
【００４３】
植物細胞１に傷７を付ける際には、前記容器３に植物細胞１と培養液とを収納し、蓋体６を取り付けた後、震盪することにより前記微細凹凸面２に植物細胞１を擦り付ける方法を採用すると良い。この方法によれば、培養液の存在により、植物細胞１が微細凹凸面２に強く擦り付けられることがなく、植物細胞１の表面に該植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７が多数良好に付けられることになる。
【００４４】
また、震盪の際には、ボルテックス等の撹拌装置を用いると良い。また、震盪時間は、植物細胞やカルスによって適宜設定する。
【００４５】
植物細胞１の表面に傷７を付けた後は、該植物細胞１とアグロバクテリウムとを一緒に培養して該植物細胞１にアグロバクテリウムを感染させ、該植物細胞１の染色体に遺伝子を導入する。
【００４６】
この際、前記微細凹凸面２に植物細胞１を擦り付けることにより、植物細胞１の表面には多数の傷７が付けられており、よって、植物細胞１の感染抵抗力が低下し、アグロバクテリウムが良好に感染して植物細胞１に遺伝子が導入される。
【００４７】
本実施例は上述のように構成されているから、植物細胞１にアグロバクテリウムが良好に感染して該植物細胞１に遺伝子を導入できる実用性に秀れた遺伝子導入用の植物細胞処理装置となる。
【００４８】
以下、本実施例の効果を確認した実験例について説明する。
【００４９】
実験例１（ユリへの遺伝子導入）
【００５０】
１．植物細胞処理装置の作製
＃１５０の耐水性紙ヤスリ４を縦８．５ｃｍ横９ｃｍに切断して円筒状とし、遠沈    管（容量５０ｍｌ、容器３）の内壁に配設した。
【００５１】
２．導入遺伝子とアグロバクテリウム
遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子，イントロンを含んだβ−ｇ    ｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子（以下、ＧＵＳという。）及びハイグロマイシン耐    性遺伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１−Ｈｍを用いた（図４参照）。
このベクターを保持するアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株を用いて遺伝子操作を行    った。
【００５２】
３．ユリのカルス誘導
ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ’Ａｃａｐｕｌｃｏ’）の一部を切り出し、２ｐｐｍ  Ｐｉ    ｃｌｏｒａｍ及び０．３％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含むＭＳ培地に置き、カルスを    誘導した。
【００５３】
４．カルスの傷付け
上記３．で誘導したカルス３０個（１個は約０．０７ｇ）を、２ｐｐｍ  Ｐｉｃｌ    ｏｒａｍ及び２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅを含むＭＳ液体培地（２０    ｍｌ）と共に前記１．で作製した植物細胞処理装置に入れ、ボルテックスミキサーを    用いて１０秒間激しく撹拌震盪した。
【００５４】
５．アグロバクテリウムとカルスの共培養
前記４．で傷７を付けたカルスを前記２．で得たアグロバクテリウムと混合し、２    ｐｐｍ  Ｐｉｃｌｏｒａｍ及び０．３％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含むＭＳ培地に置    き、７日間培養した。
【００５５】
６．ＧＵＳ染色
前記５．の共培養後、Ｋｏｓｅらの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２（１９９０）    ３７９−３９２）により、カルスの染色を行った。その結果、カルス表面積の約４０    乃至５０％が青色に変色した。この変色した部分の植物細胞１に遺伝子が導入されて    いるから、この実験例１によれば、カルスの約４０乃至５０％にアグロバクテリウム    法によって遺伝子を組み込めることが確認された。
【００５６】
即ち、実験例１によれば、アグロバクテリウムに感染しにくいといわれる単子葉植    物のユリの植物細胞１に、アグロバクテリウム法によって良好に遺伝子を組み込める    ことが確認された。
【００５７】
比較例１（従来のアグロバクテリウム法によるユリへの遺伝子導入）
ＧＵＳ染色によるカルスの変色面積は約１乃至２％であった。即ち、アグロバクテ    リウムが殆ど感染せず、効率が非常に悪いことが確認された。
【００５８】
実験例２（ベゴニアへの遺伝子導入）
【００５９】
１．植物細胞処理装置の作製
＃１５０の耐水性紙ヤスリ４を縦８．５ｃｍ横９ｃｍに切断して円筒状とし、遠沈    管（容量５０ｍｌ、容器３）の内壁に配設した。
【００６０】
２．導入遺伝子とアグロバクテリウム
遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子，イントロンを含んだＧＵＳ    及びハイグロマイシン耐性遺伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１−Ｈｍ    を用いた。このベクターを保持するアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株を用いて遺伝    子操作を行った。
【００６１】
３．ベゴニアの無菌培養
ベゴニア（Ｂｅｇｏｎｉａ  ｓｅｍｐａｒｆｌｏｒｅｎｓ）の葉片を０．１ｐｐｍ    ＮＡＡ，１ｐｐｍ  ＢＡ及び０．４％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含む１／２ＭＳ培地    （ＫＮＯ３とＮＨ４ＮＯ３の濃度を通常より１／２に希釈）上で無菌的に培養し、得    られた不定芽を０．４％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含むＭＳ培地上で無菌的に栽培し    た。
【００６２】
４．葉片の傷付け
前記３．で培養した葉片を１ｃｍ角で切り出し、２ｐｐｍ  ＮＡＡ及び１ｐｐｍ      ＢＡを含む１／２ＭＳ液体培地（２０ｍｌ）と共に前記１．で作製した植物細胞処理    装置に入れ、ボルテックスミキサーを用いて５秒間激しく撹拌震盪した。
【００６３】
５．アグロバクテリウムと葉片の共培養
前記４．で傷を付けた葉片を前記２．で得たアグロバクテリウムと混合し、０．１    ｐｐｍ  ＮＡＡ，１ｐｐｍ  ＢＡ及び０．４％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含む１／２    ＭＳ培地に置き、４日間培養した。
【００６４】
６．ＧＵＳ染色
前記５．の共培養後、前記Ｋｏｓｅらの方法により、葉片の染色を行った。その結    果、葉片表面積の約５０乃至６０％が青色に変色した。この変色した部分の植物細胞    １に遺伝子が導入されているから、この実験例２によれば、葉片の約５０乃至６０％    にアグロバクテリウム法によって遺伝子を組み込めることが確認された。
【００６５】
即ち、実験例２によれば、双子葉植物でありながらアグロバクテリウムに感染しに    くいといわれるベゴニアの植物細胞１に、アグロバクテリウム法によって良好に遺伝    子を組み込めることが確認された。
【００６６】
比較例２（従来のアグロバクテリウム法によるベゴニアへの遺伝子導入）
ＧＵＳ染色による葉片の変色面積は約１乃至２％であった。即ち、アグロバクテリ    ウムが殆ど感染せず、効率が悪いことが確認された。
【００６７】
以上の実験結果によれば、本実施例を採用することにより、これまでアグロバクテリウムの感染効率が悪い為に、アグロバクテリウム法による遺伝子導入効率が低かった植物においても、遺伝子導入効率が向上し、形質転換体を作出できることが確認された。
【００６８】
従って、本実施例によれば、これまでよりも多くの植物に交雑育種では得られない新規な有用形質を付与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本実施例の植物細胞１の説明図である。
【図２】  本実施例の植物細胞処理装置の説明側断面図である。
【図３】  本実施例の植物細胞処理装置の説明平断面図である。
【図４】  ｐＩＧ１２１−Ｈｍのマップである。
【符号の説明】
１  植物細胞
２  微細凹凸面
３  容器
４  紙ヤスリ
５  開口部
６  蓋体
７  傷
【図１】
0003887658.tif 000002
【図２】
0003887658.tif 000003
【図３】
0003887658.tif 000004
【図４】
0003887658.tif 000005