(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応に応じて時間とともに変化する測定された変数Ｌ(ｔ)から最高反応速度ＶMaxLinを機器測定する方法であって、最高反応速度ＶMaxLinは最も直線性の良い反応領域での主過程の反応のタイムウィンドーにより決定されるものであり、
ｉ）予め決定された試験に特有な初期の反応のタイムウィンドーにより、初期の最大反応速度ＶMaxPreがまず決定され、試験に特有な初期の反応のタイムウィンドーの長さは、多数の測定およびバッチにわたる平均的にみて、濃度が測定範囲の上限にある試料の反応速度の直線状の反応部分の長さに一致するように設定され、次いで
ii）予め決定された試験に特有な、最適な反応のタイムウィンドーと初期の最大反応速度ＶMaxPreの関係によって、主過程の反応のタイムウィンドーが決定され、試験に特有な、最適な反応のタイムウィンドーと初期の最大反応速度ＶMaxPreの関係は、一群の試料の各ＶMaxPreに対して反応のタイムウィンドーを決定することにより決定され、各反応のタイムウィンドーはできるだけ多くの測定点を含むが、反応の直線部分にある測定点のみである、次いで
iii) 主過程の反応のタイムウィンドーを用いて最高反応速度ＶMaxLinが導出される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
反応に応じて時間とともに変化する測定された変数Ｌ(ｔ)から最高反応速度ＶMaxLinを機器測定する方法であって、最高反応速度ＶMaxLinは最も直線性の良い反応領域での主過程の反応のタイムウィンドーにより決定されるものであり、
ｉ） 関数Ｌ(ｔ)に対して多項式があてはまり、
ii） 見出された多項式の１次導関数をつくり、
iii) 試験に特有な積分面積がこの１次導関数曲線の下方にあてはめられ、この面積の下方の境界線とこの１次導関数曲線が交わる点により最適な反応のタイムウィンドーの上限と下限が示され、試験に特有な積分面積は、一群の試料に対して反応のタイムウィンドーを決定することにより決定され、各反応のタイムウィンドーはできるだけ多くの測定点を含むが、反応の直線部分にある測定点のみである
そして
iv） 最適な反応のタイムウィンドーに対して最高反応速度ＶMaxLinが導出される
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
最高反応速度ＶMaxLinが精度と正しさにおいてさらに適切な反応のタイムウィンドーにより決定される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試料と試薬との反応の結果、測定される変数Ｌ(ｔ)に時間依存性の変化が起こる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
試料中の分析対象物質と試薬とが、特異的結合ペアーのパートナーである請求項４記載の方法。
【請求項６】
試料中の分析対象物質と試薬とが、抗原と抗体とである請求項４記載の方法。
【請求項７】
測定される変数が濁度である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
測定される変数が光の散乱度である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
試料中の分析対象物質が血清蛋白質である請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分析対象物質がハプテンである請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
凝固分析のための方法としての請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は時間とともに変化する測定された変数Ｌ(ｔ)を機器測定する方法に関するものであり、反応プロフィルが直線状である領域においてＬ(ｔ)の最大値、時間並びに反応のタイムウィンドー（time window）の大きさを決定することを目的とし、ここで反応のタイムウィンドーは直線状領域で変化しそして反応の性質および反応条件に依存するものであるものとする。とりわけ本発明は、均一溶液内で特異抗体により発生される光の散乱による蛋白質濃度の測定に関する。特に本発明は、緩慢に生起しそして比較的長い時間にわたっておおむね直線状であるプロフィルを有し、反応の直線状部分における抗原−抗体複合体の生成速度が測定変数として決定される反応に関するものである。
【０００２】
均質な媒体中の粒子上での光の散乱現象は、散乱された光線の強度を測定すること（比濁分析）および媒体を通過する光線ビームの強度損失を測定すること（濁度測定）の双方によって、濃度の決定のために用いられる。
可溶性抗原と２価または多価の抗体との間の免疫化学反応は、光線を著しく散乱する分子の大群を生み出す。このような反応の時間プロフィルは、連続する１次反応の一般的な反応動力学論プロフィルに極めてしばしば合致し、また屈曲点を有するので、反応の経過中には最大反応速度は現れない（例えば図１〜３参照）。図１〜３の信号−時間曲線からは、濃度に関係する測定信号を様々な方法で得ることができる。
【０００３】
信号変化の強さは、例えば技術上熟達する者にとってそれ自体知られた「粒子増強アッセイ」（“particle-enhanced assays"）において反応しあう物質の一つを粒子に結合することにより増大させることができる。
終点法においては、測定信号は遅すぎる時点で測定されるので、経験上、信号はもはや変化していなく、沈澱は何ら起きない。「固定時間」法における実際の測定方法は、予め設定された異なる時間で測定される二つの信号の差による。
動的な「尖端速度法（peak rate method）」においては、最大反応速度（ＶMAX）すなわち単位時間（δｔ）あたりの信号（ｓ）の最大変化（δ）が、
ａ）  十分に短い時間間隔（δｔ）でδｓを測定しそしてδｓ／δｔの最大の比を決定する、
ｂ）  δｓ／δｔを電子工学的に微分しそして最大値を決定する、
ｃ）  信号／時間曲線への接線をとりそして最大勾配（ｓ＝信号、ｔ＝時間）を決定する
ことにより決定される。
【０００４】
原則として、本発明の方法は、測定値の変化が部分的領域においてのみ直線状でありまたそれを直線状部分を評価するのに使用することが意図される限り、時間とともに変化する測定値のすべての決定のために使用することができる。
ここに述べる方法を使用すると、直接的または間接的な散乱光の測定により多くの分析対象物質の定量を行うことが今や可能である。反応パートナーの一方を一定濃度で使用する際に、適当な測定信号が、反応パートナーの他方例えば抗原の濃度に依存すると考えるならば、免疫化学反応の場合、低濃度の分析対象物質と高濃度の分析対象物質との双方によって同一の測定信号が発せられることがありうるということを認めることができる。このことは、抗原過剰現象、「高投与量フック（“high-dose hook"）」あるいはHeidelperger曲線として技術上熟達する者にとって知られた、信号と濃度との関係のあいまいさを生む。このあいまいさは、反応に関与する物質の一方または他方の量が過剰であるのに左右されて異なる化学量論による複合体が可能であり、またこれらの複合体の信号特性が異ならない、例えば散乱光が異ならない場合は、原則的に認められる。
【０００５】
このような免疫化学的定量法はそれ自体、例えば EP 0 252 127 から、技術上熟達する者にとって知られている。
信号と濃度との関係にあいまいさがありうることに加えて別な問題は、低い濃度の測定および緩慢に起きる反応の評価である。抗原−抗体結合の反応プロフィルには、出発時における遅延相、反応速度が最大の領域および飽和領域がある（図１〜３）。これらの三つの相が顕著である程度は、抗体の抗原の濃度に極めて大きく依存し、さらに温度および希釈媒体といった多数の別な要因を試験システムにおいてできるだけ一定に保持するにしても、これらの要因に依存する。
以上のことから、本発明は特定の抗原によって生み出される光の散乱の助けをかりる免疫化学的定量法を提供することに関する技術的問題に基礎をおいたものであった。この方法は極めて低い濃度の測定を可能とするのみならず、「高投与量フック」効果に対して高水準の保護を与える。
【０００６】
この技術的問題は特許請求の範囲に記載する実施態様を提供することにより解決される。
本発明の方法の必須的な部分は、直線状領域および時間依存性反応の反応速度が最大である領域における評価が信頼できるように、それぞれの反応の測定上のタイムウィンドーが、然るべき技術的手段によって調節されるということである。このような評価の結果は、時にはＸlinとも称されるＶMaxLinである。
本発明の方法は様々な技術的態様によって確実なものにすることができる。
本発明の目的のための分析対象物質は、フェリチン、ＰＳＡ、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＤ−Dimerや凝固因子特にその遺伝学的変異体のように凝固の分野に帰することのできる蛋白質、そしてさらにホルモンおよびメッセンジャーペプチドのようなハプテンのような血漿蛋白質である。
【０００７】
本発明の方法は、迅速試験およびＡＰＴＴのように、凝固系の官能性を測定するのに使用するのがやはり有利である。
従って以下の本文に記載する定量方法は低濃度の測定を可能にするのみならず、「高投与量フック」効果に対する一層の保護を確実にもする。
本発明の方法は２段階で実施され、試料が測定されそして保存されている反応速度（kinetic）が各段階に対して用いられる。反応の初期の最大速度を決定するために第１段階には比較的短いタイムウィンドーが用いられる。タイムウィンドーｔTestの長さは、それが、平均的にみてそして多数の測定およびバッチにわたって、濃度が測定範囲の上限にある試料の反応速度の直線状の反応部分の長さに一致するように設定するのが好ましい。このことから、初期の反応ウィンドーの大きさは、分析対象物質および用いられる試験システムまたは検証システムに特に依存する試験にとって特定的なパラメータであることも明らかとなる。このようにして決定されるＶMaxPreは、最適な反応タイムウィンドーを決定するのに用いられる。ＶMaxPreと最適の反応タイムウィンドーｔLinとの依存関係は予備実験において試験に特有な仕方で決定せねばならない（図４）。この場合重要な事柄は、一方ではできるだけ多くの測定点を含むが、他方、反応の直線部分にある測定点のみを対象とする反応のウィンドーがそれぞれのＶMaxPreについて決定されることである。
【０００８】
試験にとって特有な依存関係を決定するのに種々の方法を用いることができる。この場合重要な事柄は、ＶMaxPreと反応のタイムウィンドーとの依存関係が、精度と正しさとが最適になるように規定されることである。この依存関係は例えば分析対象物質濃度の異なる血清試料のプール、あるいは希釈度の異なる血清標本について測定することにより規定することができる。この場合濃度は所望とする測定範囲の全体にわたっているのが好ましい。第１段階においてすべての試料が測定され、反応速度が保存されそしてＶMaxPreの値が決定される。反応のウィンドーを段階的に変化させることにより、それぞれの試料測定について異なる相関係数がこの時得られる。最も良い相関係数を有するウィンドーの大きさは、反応の直線状部分をやはり最も良くとり込む大きさである。直線性に関する好適な別な指標は、測定点と１次回帰線との平均距離である。従ってまず第１に特定のＶMaxPreを有する各試料について直線性の最も良いｔLinが得られる。ＶMaxPreの異なるすべての試料に関して得られる結果は、反応ウィンドーにおける直線性を最良とする、ＶMaxPreと主過程（main run）の反応ウィンドーの大きさｔLinとの関係である。例をあげるなら、図４は最良の相関係数について、主過程の反応ウィンドーの大きさｔLinとＶMaxPreとの関係を示す。
【０００９】
この関係は標準の血清を既知の濃度に希釈する諸段階に関する反応曲線をつくるのに用いられる（ＶMaxPre→主過程の反応ウィンドーの大きさ→主過程のＶMax）。
直線性という基準が、精度の測定および対照物の回収に関して最良の結果をやはり与えるということは確実ではないので、主過程の反応ウィンドーとＶMaxPreとの関係が次いで微調整される。本例では、同時にあまり多くのパラメータを変更するのを避けるため上記に得た参照曲線は変更されない。
いろいろな濃度水準の試料、標本および対照物に対してイントラ−アッセイおよびインター−アッセイ（イントラアッセイ＝一連のアッセイ、インター−アッセイ＝日程の異なるアッセイ）の精度測定が行われ、主過程の反応のＶMaxの決定は大きさの異なる反応ウィンドーを用いて実施される。この結果、各測定について、従って各々のＶMaxPreについて、最良の精度（precision）を与える主過程の反応ウィンドーの大きさが得られる。すべての測定を組合わせると、直線性の場合におけるのと類似した依存関係が得られる。
【００１０】
対照用物質を測定するための、原理的に同じ手順によって最良の正しさ（correctness）が得られる（図４）。
良好な精度を確保するのみならず、対照物の公称値の良好な回収を確実にもする、ＶMaxPreへの主過程の反応ウィンドーの大きさｔLinの割付けを選定することが今や可能となる。表１はフェリチンに関する結果を示す。
ｔLinとＶMaxPreとのこの関係が一旦規定されると、参照曲線の計算は新しい基準を用いて反復されねばならない。この新規な方法は、フェリチンの例を用いて表１に要約の形で示されるように、今や完全に特徴づけることが可能になる。
【００１１】
【表１】
フェリチンの例を用いるＶMaxLin法
フェリチンに関するＶMaxLinパラメータ
最小の反応ウィンドー：４０秒
初期過程の反応ウィンドー：８０秒
ＶMaxLin                   ｔLin
＞２５ビット／秒          ８０秒
２０〜２５ビット／秒      ２４０〜１６０秒
１０〜２０ビット／秒      ３６０〜２４０秒
＜１０ビット／秒          ３６０秒
ａ）最小値を有する低濃度試料（図５）
最小値の見つかった時間：３８秒
ＶMaxPre：０.２７０ビット／秒（３８〜１１８秒）
ｔLin：３６０秒
ＶMaxLin：０.１２３ビット／秒（３８〜３６０秒）
ｂ）最小値のない通常濃度試料（図５）
最小値の見つかった時間：０秒
ＶMaxPre：２４.０２ビット／秒（０〜８０秒）
ｔLin：１７５秒
ＶMaxLin：２３.６４ビット／秒
【００１２】
このようにして決定されるパラメータは試験システムにとって極めて特定的であることを強調せねばならない。試験システムには分析器、測定に関する指示およびバッチに特有な差異を必要なら有する特定の分析対象物質を測定するための試薬、そして勿論試料物質が含まれる。
【００１３】
数学的直線性の基準を用いて各測定についての測定曲線の直線性を評価しそしてこの予め決めた基準に合致する曲線部分のみを評価することも可能である。しかしながらこれによると、低濃度の分析対象物質に対してさえ、得られる精度は低い。
ＶMaxを決定するための別に選択される方法は、所与の試料の測定曲線に多項式をあてはめそして多項式の１次導関数をつくることであろう。１次導関数の最大値は最大の反応速度を示すが、ただし高水準の散乱を伴う反応においては特に、このようにして決定されるＶMaxは例えば表２（多項式）から知りうるように信頼できることが判っている。
【００１４】
【表２】
0004015726.tif 000002
【００１５】
多項式の１次導関数の下方にある試験にとって特定的である面積を調節することにより、１次回帰を用いて測定曲線を評価しうる測定期間ｔLinを決定することができ、またこの測定期間によって、直線性、精度および正しさに関して上記した方法と同等な結果が得られる。積分された面積の大きさは試験にとって特定的である。つまり面積は各々の試験方法および各々の分析対象物質に関して、そしておそらくはやはり試験装置に関連させて経験的に決定されるのが好ましい。
例えばフェリチンおよび前立腺特異性抗原についての（図６および７）、特定の装置（MarburgのBehringwerke AGのBN II）を用いる様々なラテックス増強試験に関して、積分面積１００で最良の結果が得られることが例えば見出されている。同じ装置について、ラテックス増強されていない試験に関して得られた最良の積分面積は１０である（図９および１０）。別な装置（MarburgのBehringwerkeのBCS）の場合、測光学的測定を伴うラテックス増強試験に関して得られる最良の面積は２０である（図８）。
【００１６】
最適な積分面積の経験的な決定は、ＶMaxPreとｔLinとの間の依存関係の決定として別個な操作で実施されるが、この変形操作に関して決定される積分面積は、あらゆる濃度にあてはまる定数である。図６〜１０の実施例はそれぞれ極めて高いおよび極めて低い濃度を示す。従って例えば、Behringの比濁計（MarburgのBehringwerke AG）を使用する様々なラテックス増強試験の精度を決定するために各参照点について一連の精度測定が実施された。各測定について、一次回帰の相関係数によって直線性が得られた。対照用血清を測定することにより正しさが決定されそして積分法を用いて参照曲線についてのたたみ込み（convolution）が同様に評価された。
このようにして決定された積分面積は、多項式の１次導関数がこの面積の上部限界であり、そして下方においては、下部の限界である直線の曲線との交点が、測定期間の開始と終了の位置をＸ軸上で示すように、各測定の１次導関数の下方にあてがわれる（図１１）。
【００１７】
多項式は最小二乗原理を用いて、一対の反応動力学値から計算される。正規化された方程式の系はガウスアルゴリズム、つまり非線形回帰を解くために技術上熟達する者にとってそれ自体知られている方法によって解かれる。あてはめられる多項式は３次式であるのが有利であるが、より高次の多項式も使用されてよい。
【００１８】
以下の実施例は本発明を例示する。
【実施例】
比較例：
ａ）尖端速度法
BehringwerkeのTurbi Time Systemは動的評価法（DE 33 47 162）の良い例である。この装置は測定チャンバーを有し、その中で各々の場合、単一セル内で反応が起きる。測定結果である最大反応速度ＶMaxに達するまで光学濃度の測定が続けられ、次いで終了される。
系のための反応剤が急速な反応を可能にしそして理想的な場合にはたった数秒後に測定を終了することができる。ＶMaxに到達する時間もまた評価される。これによって、関与するHeidelberger曲線の側から決定することができ、また過度に低い、正しくない結果を事実上排除できる。
【００１９】
ｂ）固定時間法
Behringwerkeの比濁計（ＢＮ、ＢＮ１００、ＢＮ II）は光散乱として濁度の増加を測定する。この評価方法は固定した反応時間に基礎をおく「固定時間法」と称される。測定結果は濁度の初期値と最終値との差である。比濁計は大きな処理量を可能とするように多数のセル内で試料が同時にインキュベートされる全自動装置である。測定値を記録するために、測定用光学系を通過するようにセルがローターにより規則的な時間間隔で移動される。ＢＮ IIの場合は従って、比較的長い時間間隔例えば１６秒毎の測定点において反応速度が得られる。
【００２０】
実施例１
２段階評価を伴う新規のＶMaxLin法
この方法は二つの段階を有する（図５、表１）。
１．主過程の反応ウィンドー（ｔLin）の最適長さの決定
第１の操作において、初期過程の短い反応ウィンドーを用いることにより全体の反応動力学のプロフィルにわたって最大反応速度ＶMaxPreを探索した。ウィンドーの大きさは、それが抗原濃度が高い場合でさえ、反応の直線状領域内に未だあるようにそれぞれの試験について特定的に規定した。このようにして決定した反応速度はまだ比較的不正確であった。
それは、この抗原濃度に対して、主過程の反応ウィンドー（ｔLin）の理想的な大きさを規定するのに用いられる。この関係からいうと、理想的なとは、反応速度を規定するために、反応の直線状のプロフィルを有する領域が事実上すべて用いられることを意味する。反応速度に主過程の反応ウィンドーの大きさを割付けるための参照表は試験にとって特定的な基準に基づいて同様に経験的に決定される（図４、表１）。
【００２１】
２．最高反応速度（ＶMaxLin）の決定
ａ）最小値の同定
反応動力学的な過程が始まる時、反応が実際に始まる以前に濁度が低下することがありうる。この結果、長いｔLin（例えば３６０秒）に対して過度に低くて正しくないＶMaxLinが決まるであろう。これによって最小値が同定されるのが防がれた。
反応の開始時間を規定するために極めて短い反応のウィンドーを用いた。図５および表１における実施例では、これは４０秒の期間であった。反応ウィンドーは時刻零から始まり、そして勾配が負である限り続いた。ウィンドーが最初の正値に達するやいなや、反応ウィンドーの最初の測定点もまた、ＶMaxLinの計算のために考慮に入れることのできる最初の値であった。
ｂ）ＶMaxLinの探索
プロフィル全体にわたって最大反応速度を探すために、初期過程で決定される主過程の反応ウィンドー（ｔLin）を用いた。（ｔLin）が実際の反応継続時間より長いならば、反応全体にわたって（最小値から反応時間の終了まで）、反応速度の平均をとった。
このようにして決定される反応速度ＶMaxLinは、参照曲線を作成するのに用い、また参照曲線は濃度を計算するために用いた。
【００２２】
実施例２
フェリチン試験のための、積分評価を伴うＶMaxLin法
本例ではフェリチンに対して実施例１と同じ対の測定を用いた。
ａ）最小値の同定
実施例１について２ａ）で述べたように最小値の同定を行った。つまり、低濃度の試料については（表１）、最小値はやはり３８秒で見出され、高濃度の試料については０秒で見出された。最小値より前のすべての測定点はもはや考慮にいれなかった。
ｂ）多項式のあてはめ（matching）
最小値より後の曲線に３次の多項式をあてはめ、そしてその１次導関数をつくった（やはり図１１を参照）。１次導関数の最大値は低濃度試料の場合は１５３秒にまた高濃度試料の場合は８７秒にあった。
ｃ）評価領域ｔLinを見出すこと
１次導関数の最大値の下方の積分面積を、この例では１００である限界値に到達するまで繰り返し拡大した（やはり図１１を参照）。同時に、公称面積に到達するまで、１次導関数を最大とする時刻の左および右の面積を別個に拡大した。このようにして反応のタイムウィンドーを得た。右側の公称面積が最後の測定点まで延びない場合、右側の評価領域を最後の測定点まで延ばした。左側の公称面積が最小値まで延びない場合、そこの反応のタイムウィンドーは最小値まで延ばした。
低濃度の場合、反応のタイムウィンドーは２段階の評価を伴うＶMaxLin法の３８〜３６０秒と同じであり、また高濃度の場合、反応のタイムウィンドーは０秒から１９６秒に至った。
ｄ）生の値の決定
反応のタイムウィンドー内での一次回帰により生の値を得た。この値は低濃度の場合０.１２３ビット／秒でありまた高濃度の場合、例１での２３.６４ビット／秒と比べ、２３.４６ビット／秒であった。
この値は参照曲線に入力するかあるいは濃度を決定するために既存の参照曲線とともに使用した。
【００２３】
ＶMaxLin法の従来の技術を上まわる基本的な利点は、経験的に規定された、試験にとって特定的なパラメータを使用する２段階法または積分法によって、個々の反応の動力学に対して反応ウィンドーを理想的に適合させることである。必要なら上記のパラメータはバッチに特有な基準に基づいて規定することさえできるだろう。
この極めて特定的な適合により、評価しようとする各々の場合に最大数の測定点が使用されることが確実になった。この利点は、ＢＮIIでのラテックス増強試験の場合におけるように信号対騒音比が大きい場合、そして殊にこの場合に分析対象物質の濃度が低いとき、特に明白であった。信号の精度は、初期値と最終値との間の差だけを用いる（図１２）固定時間法によるものより良かった。
【００２４】
尖端速度法は、遅延相、反応速度が最大の領域および飽和領域の間が離れているプロフィルを有する反応動力学に適合している（米国特許第4,157,871号）。ＢＮIIでのラテックス試験に関する反応プロフィル（例えばＮラテックスフェリチン）の場合、遅延相および飽和相をほとんど同定できないことがしばしばあった（図１〜３）。反応の出発時に最初の測定を行うのは遅きにすぎ、そして測定を行う頻度もまた未だ記録すべき遅延相にとっては低すぎた。６分後飽和領域にははるかに到達しなかった。
三つの領域が明白に分かれていずまた加えて測定を行う頻度が比較的低いならば、尖端速度法によって過度に高い速度が不正確に与えられる危険がある。例えば図１〜３におけるように特に低濃度の試料の場合、反応速度が低水準で一定であるので、尖端速度を決定する利益はなかった。このことは、それを用いて尖端速度の検出が依然行われる８０秒という短いタイムウィンドーによる正確さを３６０秒のタイムウィンドーによるそれと比較することによっても示された（図１３）。
【００２５】
この新規な評価方法の価値を比較しながら比べるために、ある範囲の基準が使用された（表３）。すべての実験において、慣用の固定時間法およびこの新規な方法を用いて同一の反応動力学を評価した。この場合、試験時間をＶMaxLinのための以前の１２分から６分に短縮し、そして参照曲線を延長した。この結果、５〜３５０μｇ／ｌの代わりに２.５〜７００μｇ／ｌの測定範囲が得られた（試料の最初の希釈度は１：５、図１７）。
次の表３は、フェリチン−固定時間法とＶMaxLin評価法とを比較するための試験特性を示す。両法のための参照曲線のためにＬｏｇｉｔＬｏｇ関数を用いた。各々の結果は、測定の平均回数が１０であることを示す。一層の詳細は試験において示す。
【００２６】
【表３】
0004015726.tif 000003
【００２７】
分析対象物質の濃度が高い場合および中程度である場合について、精度は一連のアッセイ（イントラアッセイ）および日程の異なるアッセイ（インターアッセイ）の双方で同様に良かった。分析対象物質の濃度が低い場合、ＶMaxLinに関する精度は慣用的方法に関するそれよりかなり良かった（表３）。
希釈率の正しさはＶMaxLinの場合かなり良かった（表３、図１５）。特に、濃度が測定範囲の上端にある場合、次に大きい試料の希釈率（１：２０）での測定を反復すると、平均して１６％大きい値が得られた。拡大された測定範囲に対して濃度を２倍にして同じ実験をすると、ＶMaxLinについてたった７％大きい濃度が得られた。図１５もまた希釈の正しさが改善したことを示す。
【００２８】
対照物の回収は両方の評価法について同様に良かった（表３）。この場合、公称値の決定は固定時間法を用いて実施したので、その場合、転化によってさらに良い回収を期待できることを想起せねばならない。
両法での結果は極めて良く相関した（図１６）。
過剰抗原での確かさは固定時間については約２５,０００ｇ／ｌまでまたＶMaxLinについては約５０,０００ｇ／ｌまで確保された（図１７）。
別な例としてＰＳＡ（前立腺特異性抗原）に関する試験を用いることができる。図１４からわかるように、ＶMaxLinを用いることにより同様に良い参照曲線をつくることができ、この曲線は測定範囲が上方に延びうることを確かにする。この場合ＶMaxLinに関する測定時間は固定時間法についての１８分と比べただの６分であった。
【００２９】
表４は様々なラテックス増強試験のために固定時間、積分および２段階の各評価を用いて標本を１０回測定したものからのイントラアッセイの精度（ＣＶ，％）を比較する。
ＶMaxLin法の二つの変形は大まかにみると同等でありまた低濃度に関する固定時間法よりかなり良い正確さを与えた。
【００３０】
【表４】
0004015726.tif 000004
【００３１】
実施例３（図１８）
ａＰＴＴ試験のための、積分評価を伴うＶMaxLin法
光吸収の特定の閾値を超える時間が決定される（固定吸収率評価）ように、Behringのもともとの試験に関して評価を行った。積分評価を伴うＶMaxLin法も同様に用いうることを示すことができた。標本および標本を１：３に希釈したものとの間の信号の差（１２５.７mE／秒に対して２８.２mE／秒）は、固定吸収率評価での差（３３.９秒に対して８１.４秒）より大きかった。ＶMaxLin評価〔試験システム：BCS、Behring反応剤OQGS、Behring試験番号：28、公称面積：10、多項式次数：５、評価範囲：30〜100秒（希釈しない標本）、70〜150秒（１：３に希釈した標本）、図１８〕に対して、閾値を越えることが必要でないのは有利であった。
【００３２】
遅延相が長い試験でのＶMaxLin評価のためには、評価のための開始時間を可変に保たねばならない。これは例えば、最小値を探索するのと似た仕方で正の限界勾配を探索するアルゴリズムによって行われ、この限界勾配の値は規定可能なものでなければならずそして試験システムに依存する。限界勾配に到達する時、探索タイムウィンドーの開始点が、ＶMaxLin評価のための開始時間を与える。
実施例４（図１８）
ＡＴIII試験のための、積分評価を伴うＶMaxLin法
ＡＴIIIによって阻害されていないトロンビンによって色原体物質が転化されるＡＴIII試験もまたＶMaxLin（試験システム：BCS、Behring反応剤OWWR、Behring試験番号：28、評価範囲：０〜45秒、公称面積：１、多項式次数：５）を用いて評価することができる。測定を１０回実施した時、正確さは慣用的な評価でのそれとおおまかにみて丁度同じであった（１５〜４５秒の勾配）。
【００３３】
実施例５（図１８）
血小板凝集試験のための、積分評価を伴うＶMaxLin法
血小板の凝集に関しては大巾に異なる反応の動力学が認められるであろう。血漿の光透過は凝集が進むにつれ増加する。図１８の実施例を用いるとし、プロフィルは血液の採取後２時間および１０時間にして試料の細胞の凝集を示した。両方のプロフィルにおいて、積分評価を伴うＶMaxLinでは直線状部分が極めてよく認められそして新規な試料については２２.４、そして古い試料については１４.５の凝集速度が測定された（試験システム：ＢＣＴ、試料：１５０μｌの血小板に富む血漿と混合された、米国、St. LouisのSigma社の５０μｌ ＡＤＰ（１.２５μＭ）、評価範囲：７〜８０秒、公称面積：５、多項式次数：５）。
【００３４】
実施例６（図１９）
Von-Willebrand試験のための、積分評価を伴うＶMaxLin法
固定された血小板とリストセチンとを含有する反応剤を用い、Behring Von-Willebrand試験によりVon-Willebrand因子による血小板の凝集を定量化した。光吸収の特定的閾値（１００mE）に到達しない時間を決定する（固定吸収率評価）ように、Behringのもともとの試験を用いて評価を行った。慣用の固定吸収率評価による参照曲線の決定はリストセチン共因子の濃度２０％（ヒトの血漿の標準的な希釈度）の点までしか行わなかった。なぜなら、これを下回ると反応が弱いためもはや閾値には到達せず、従って何らかの結果を得ることはもはや不可能であるからである。これとは対照的に、積分評価を伴うＶMaxLinは、同じ測定（試験システム：BCT、Behring反応剤OUBD、Behring試験番号390、評価範囲７〜80秒、公称面積：５、多項式次数：５）について約５％までの参照曲線を可能とした。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なった濃度のフェリチンを用いる抗原−抗体結合の反応プロフィルを示す。
【図２】異なった濃度のフェリチンを用いる抗原−抗体結合の反応プロフィルを示す。
【図３】異なった濃度のフェリチンを用いる抗原−抗体結合の反応プロフィルを示す。
【図４】最良の相関係数について主過程の反応ウィンドーの大きさｔLinとＶMaxPreとの関係を示す。
【図５】最小値を有する低濃度試料と最小値のない通常濃度試料とについての光散乱（ビット）と時間との関係を示す。
【図６】非常に高いまたは低い濃度のフェリチンについてのラテックス増強試験の結果を示す。
【図７】非常に高いまたは低い濃度の前立腺特異抗原ＰＳＡについてのラテックス増強試験の結果を示す。
【図８】非常に高いまたは低い濃度のＤ−Dimerについての試験結果を示す。
【図９】非常に高いまたは低い濃度のＩｇＡについての試験結果を示す。
【図１０】非常に高いまたは低い濃度のＩｇＧについての試験結果を示す。
【図１１】最適な積分面積の決定方法を示す。
【図１２】信号精度の比較を示す。
【図１３】ヒトＮ−フェリチン標本の一連の希釈における測定からの変動係数および測定変数の決定の仕方を示す。
【図１４】ＰＳＡの参照曲線を示す。
【図１５】３つの血清試料の直線性を示す。
【図１６】両方法の相関性の良さを示す。
【図１７】過剰抗原での確かさを示す。
【図１８】実施例３、４および５における測定の結果を示す。
【図１９】実施例６における測定の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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