(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子表面にカチオン交換性を有するポリマーが導入されてなるカチオン交換体において、カチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーにおいて部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマー重合体であり、該不飽和カルボン酸ポリマーが、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸及びイタコン酸からなる群から選ばれる１種以上と、ビニルスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸エステル及び３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる１種以上との、共重合体であることを特徴とするカチオン交換体。
【請求項２】
カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーが、水酸基、グリシジル基及びアミノ基からなる群より選ばれる１種以上の官能基を有することを特徴とする、請求項１に記載のカチオン交換体。
【請求項３】
前記水酸基を有するポリマーは、ポリビニルアルコール又は多糖類であることを特徴とする、請求項２に記載のカチオン交換体。
【請求項４】
前記アミノ基を有するポリマーは、ポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項２に記載のカチオン交換体。
【請求項５】
カルボン酸と反応可能である官能基を有するポリマー及び不飽和カルボン酸ポリマーの溶液に微粒子を分散させ、溶媒を留去し、その後、乾燥状態で加熱することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のカチオン交換体の製造方法。
【請求項６】
前記微粒子は、水酸基、グリシジル基及びアミノ基からなる群より選ばれる１種以上の官能基を有することを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１から４いずれかに記載のカチオン交換体からなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
請求項７に記載の充填剤をカラムに充填してなるクロマトグラフィー用充填カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、カチオン交換体及びそれを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カチオン交換基を有する微粒子は、液体クロマトグラフィーの分野において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、そして糖類等を分析したり、分取したりする際に広く用いられている。
【０００３】
カチオン交換体は、微粒子表面の官能基にカチオン交換基を直接結合させて導入することにより製造するのが普通である。具体的には、微粒子表面の水酸基に対しクロロ酢酸を作用させてカルボン酸を導入する方法、微粒子表面の水酸基にエポキシ基やアリル基を導入後、スルホン化する方法等が知られている。このように微粒子にカチオン交換基を導入して製造されたカチオン交換体は、その微粒子の表面積により（細孔を有する微粒子を用いた場合には細孔径とその表面積により）、表面に保持可能な分離・分析対象サンプルの量が一義的に定義される。しかもこのようなカチオン交換体は、分離・分析対象サンプルを微粒子表面に単層に吸着・保持するために、液体クロマトグラフィーに用いた場合、サンプルの吸脱着が早く、シャープな分離パターンが得られるという特徴を有している。
【０００４】
近年、液体クロマトグラフィーにおけるタンパク質等の分取において、処理速度を向上するため、吸着できる対象サンプル量（微粒子の吸着容量）が大きいカチオン交換体の開発が進められている。例えばアメリカ特許第５４５３１８６号公報には、イオン交換基を有するポリマー鎖を微粒子表面に導入することで、微粒子表面に多層にわたってサンプルを吸着できるカチオン交換体の製造方法が記載されている。またポリマー鎖を微粒子等の表面に導入する方法としては、上記以外にもアメリカ特許第３７２３３０６号公報、同第４１３７１３７号公報、同第４２９８６９８号公報、同第４６０５６８５号公報、そして同第４７２８６７８号公報等も知られている。これらは具体的には、放射線や、微粒子表面の水酸基をラジカル開始点とし、セリュウム塩やマンガン塩等を用いて該表面にポリマー鎖を成長させる方法（グラフト重合法）、微粒子表面に不飽和基を導入しモノマー溶液中で重合することによりポリマー鎖を導入する方法等である。またポリマー重合末端に官能基を導入し、微粒子表面の官能基と結合させて導入する方法も報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のようにして製造されたカチオン交換体は、対象サンプルの吸着容量が大きく、また分取に使用した場合には処理速度を向上できるものである。しかしながらこれらのイオン交換体は、微粒子の表面に直鎖状のポリマー鎖が導入されているためにカラムに充填して液体クロマトグラフィーで用いた場合は送液圧力を高くしなければならないという通液特性上の課題があった。このため、液体クロマトグラフィーにおいては、送液ポンプから検出器に至る各装置・手段はもとより、これらを連結する流路系に耐圧性に優れた管を用いなければならず、装置コストが上昇してしまうという課題や、各装置・手段におけるシーリング材の劣化が早まって頻繁に部品を交換しなければならないという課題や、液漏れが発生し易いという課題の他に、イオン交換体自体が高圧によってつぶされてしまい、分析等を行えなくなるという重大な課題を生じてしまう。通液特性は粒子径と相関があり、上記のようにして製造したカチオン交換体であって粒子径を大きくすれば改善できる。しかし、粒子径が大きくなると液体クロマトグラフィーで用いた場合に分離能の低下を招くため、結局のところ、セミ分取の様な高い分離能と吸着容量を必要とする用途に対しては上記のようにして製造したカチオン交換体は事実上使用困難なものであった。
【０００６】
微粒子表面に導入したポリマー鎖を架橋することによる、通液特性の改善についても試みられているが（例えばアメリカ特許第４１００１４９号公報、同４３７６０４７号公報等）、製造されたカチオン交換体に関して分離・分析又は分取対象サンプルの吸着容量が大きなカチオン交換体が製造されたとの報告はない。これは、微粒子表面に導入されたポリマー鎖を架橋したため、その表面に形作された被覆（イオン交換層）が収縮してしまい、結果的に吸着容量が低下してしまうものと考えられる。
【０００７】
そこで本願発明の第１の目的は、分離・分析又は分取対象サンプルの吸着容量が大きく、送液特性が良好な微粒子のカチオン交換体を提供することにある。そして本願発明の第２の目的は、かかるカチオン交換体の製造方法を提供することにある。そして本願発明の第３の目的は、対象サンプルの吸着容量の大きなカチオン交換体からなるクロマトグラフィー用充填剤又はかかる充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用カラムを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、微粒子表面にカチオン交換性を有するポリマーが導入されてなるカチオン交換体において、カチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマー、又はポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体であることを特徴とする、カチオン交換体である。また本発明は、イ）カルボン酸と反応可能である官能基を有するポリマー及び不飽和カルボン酸ポリマーの溶液、又は、ロ）ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体の溶液に、微粒子を分散させ、溶媒を留去し、その後、乾燥状態で加熱することを特徴とする、上述のカチオン交換体の製造方法である。更に本発明は、上述のカチオン交換体からなるクロマトグラフィー用充填剤である。また本発明は、上述の充填剤をカラムに充填してなるクロマトグラフィー用充填カラムである。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本願発明のカチオン交換体は、カチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマー、又はポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体であることを特徴とするものである。このように本願発明のカチオン交換体は、微粒子とこれを被覆する重合体とを結合することにより、大きな対象サンプルの吸着容量と優れた通液特性を実現した、従来にないカチオン交換体である。また本願発明のカチオン交換体では、サンプル吸着容量が大きく、かつ、通液特性が良好であるため、その粒子径を小さくすることが可能となり、高い分離能を発揮できる。しかも、上記のように微粒子であり、かつ、高い対象サンプルの吸着容量を有するにもかかわらず、対象サンプルの交換速度が低下することはない。
【００１０】
本願発明における微粒子の粒径には特に制限はないが、液体クロマトグラフィーにおいて使用した場合に良好な分離能を発揮し得る、粒径が１から１０００マイクロメータ程度、特に好ましくは１から１００マイクロメータ程度の微粒子であることが好ましい。また微粒子は、その表面に細孔を有していないいわゆる非多孔性微粒子であっても、細孔を有する多孔性粒子であっても、特に制限はない。
【００１１】
微粒子としては、例えば有機系微粒子や無機系微粒子を用いることができるが、例えば後述する方法によって本願発明のカチオン交換体を製造しようとする場合には、当該方法において実施する加熱に耐え得る構造のものを用いる。微粒子表面に導入されたカチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマーの場合、微粒子の表面にカルボン酸と反応可能である官能基を有しているものが、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合の耐久性の面から特に好ましいが、必ずしもかかる微粒子に限定されるものではない。カチオン交換性を有するポリマーがポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体である場合は、微粒子表面にカルボン酸と縮合可能な水酸基、グリシジル基、アミノ基などの官能基を少なくとも一種以上有した方が好ましい。
【００１２】
微粒子としては、例えば有機系微粒子や無機系微粒子を用いることができる。有機系微粒子としては、例えば単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーを組み合わせた微粒子や架橋多糖微粒子等を例示することができる。単官能ビニルモノマーとしては、例えば２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリル酸エステル、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリル酸エステル等の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸グリシジルエステル、アクリル酸、メタクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、、ビニルベンジルアルコール、ビニルベンジルグリシジルエーテル、ヒドロキシスチレンなどのスチレン誘導体、酢酸ビニル等をあげることができる。また多官能ビニルモノマーの例としては、エチレングリコールジ（メタ）アクリル酸エステル、グリセロールジ（メタ）アクリル酸エステルなどのポリオール（メタ）アクリル酸エステル、ジビニルベンゼン、トリアリルイソシアヌレート等を挙げることができる。また架橋多糖微粒子の多糖としては、セルロース、アガロース、デキストラン、マンノースなどを挙げることができる。無機系微粒子としては、シリカ、ゼオライト、チタニアなどを挙げることができる。
【００１３】
微粒子表面に導入されたカチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマーの場合、不飽和カルボン酸ポリマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸及びケイ皮酸からなる群より選ばれる単位構造を１種類以上有するポリマーを例示できる。例えば後述する製造方法においては、不飽和カルボン酸ポリマーの使用量は微粒子に対して０．０５−０．３重量部が好適である。また、ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体の場合、ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体としては、対象サンプルの吸着容量を大きくするという観点から、分子量１００００以上のものであることが特に好ましい。またその使用量は微粒子に対し０．０５から０．３重量部のポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体を用いることが好ましい。
【００１４】
本願発明のカチオン交換体において、微粒子表面に導入されたカチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマーの場合、例えばスルホン酸型のカチオン交換体は、上記単量体と不飽和スルホン酸の共重合ポリマーを用いることにより製造できる。ここでスルホン酸基を有するビニルモノマーの例としては、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸エステル、３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリル酸エステル、３−スルホプロピル（メタ）アクリルアミド、ビニルスルホン酸を例示できる。このように、スルホン酸型のカチオン交換体としては、前記ポリマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸及びイタコン酸からなる群より選ばれる１種以上とビニルスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸エステル及び３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリル酸エステルからなる群より選ばれる１種以上との共重合体が特に好ましい。なお、この場合の共重合比はカルボン酸モノマーを２ｍｏｌ％以上とすることが好ましい。
【００１５】
カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーとしては、例えば水酸基、アミノ基及びグリシジル基からなる群より選ばれる１種類以上の官能基を有するものが好ましい。水酸基を有するポリマーとしては、ポリビニルアルコール、デキストラン、アルキルセルロース、アガロース、プルラン、イヌリン、キトサン、ポリ２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート等が例示でき、中でもポリビニルアルコール又は前記多糖が好ましい。グリシジル基を有するポリマーとしてはポリグリシジル（メタ）アクリレート、ソルビトールポリグリシジルエーテル、フェノール系エポキシ樹脂等のグリシジル基含有ポリマーを例示することができる。そしてアミノ基を有するポリマーとしてはポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリ３−アミノプロピル（メタ）アクリレート、ポリ３−アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、キトサン等を例示できるが、中でもポリエチレンイミンが好ましい。これらのポリマーは、後述する製造方法においては前記した不飽和カルボン酸ポリマーに対して０．０５−０．２重量部使用することが好適である。なお、取扱いの容易性という観点からは、上記したポリマーの中でも水酸基を有するポリマーが特に好ましい。
【００１６】
本願発明のカチオン交換体は、微粒子表面に導入されたカチオン交換性を有するポリマーが、カルボン酸と反応可能な官能基を有するポリマーによって部分架橋した不飽和カルボン酸ポリマーの場合、溶媒留去により微粒子表面に不飽和カルボン酸ポリマーとカルボン酸と反応可能である官能基を有するポリマーで被覆した後、乾燥状態で加熱することにより容易に製造できる。即ち、不飽和カルボン酸ポリマー及びカルボン酸基と反応可能である官能基を有するポリマーが溶解可能である溶媒中にこれらを溶解しておき、該溶媒に微粒子を分散させた後、溶媒を留去して微粒子表面を２種のポリマーで同時に被覆するのである。その後、乾燥状態で加熱し、被覆ポリマー中のカルボン酸基と前記カルボン酸基と反応可能である官能基を反応させ、架橋させる。またカチオン交換体が、ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体の場合も溶媒留去により微粒子表面に被覆した後、乾燥状態で加熱することにより容易に製造できる。
【００１７】
溶媒としては、水や低級アルコール等、溶媒除去が比較的容易な低沸点溶媒が好ましい。そして溶媒除去は、微粒子の表面が均一にポリマーで被覆されるように、エバポレータ等を用い、真空で例えば８０℃から９０℃に加熱して蒸留を行うことによって実施することが好ましい。蒸留に引き続き、微粒子表面での前記ポリマーの架橋反応を行う。架橋反応は、乾燥状態で微粒子を加熱することからなるが、加熱温度は１６０℃から２００℃未満が好ましい。このようにして製造されたカチオン交換体は、必要によりアルカリ水溶液や純水等で洗浄して精製する。
【００１８】
以上に説明した本願発明のカチオン交換体は、クロマトグラフィー用の充填剤として有用であり、例えばガラス、金属製のカラムに充填すれば、クロマトグラフィー用カラムとしてアニオン性タンパク質等の分離、分析又は分取のために使用することができる。そして液体クロマトグラフィー用の充填剤として使用すれば、前記したような優れた効果を奏するものである。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本願発明を更に具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
２リットルナス型フラスコに以下の試薬を入れ、冷却管及び窒素吹き込み管を取り付けた後、６０℃に設定したオイルバスに浸けて窒素気流下で６時間反応させた。沈殿した重合物は溶媒をデカンテーションして取得し、メタノールを加え更にデカンテーションして精製した。精製重合物を真空乾燥し、白色重合物を得た。得られた重合物を以下実施例１重合物と称する。
【００２１】
３−スルホプロピルメタクリル酸エステル  １２５ｇ
アクリル酸  １２ｇ
重合開始剤（商品名Ｖ−６５、和光純薬工業（株）製）  １．２ｇ
メタノール  １２００ｇ
蒸留水  １８０ｇ
実施例１重合物の分子量を、以下の液体クロマトグラフィー装置、条件で分析したところ、Ｍｗ  １８６０００、Ｍｗ／Ｍｎ  ３．５であった。
【００２２】
ポンプ  ＣＣＰＭ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）
オートサンプラー  ＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）」
カラム  Ｇ５０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬ（いずれも商品名、東ソー（株）製、この順に直列接続）
検出器  ＲＩ−８０２２（商品名、東ソー（株）製）
溶離液  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流速  ０．８ｍｌ／分
データ処理装置  ＳＣ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）
２リットルナス型フラスコに、実施例１重合物５０ｇ、デキストラン５ｇ（シグマ社製、分子量２万）、蒸留水１リットルを入れ溶解した。これに表面に径が１０００オングストロームの細孔径を有し、粒子径が７マイクロメータである多孔性の親水性ビニルポリマー粒子５００ｇを加え分散した。エバポレータにナス型フラスコをセットし、温度を９０℃に設定したバスに３時間浸して溶媒を留去してイオン交換体を製造した。製造されたカチオン交換体を正方形バットに入れた後、１８０度に設定した温風循環加熱器中で３時間加熱した。加熱後、バットを冷却し、得られたカチオン交換体を純水中に分散し、ガラスフィルターを用いて洗浄をおこなった。なお前記多孔性の親水性ビニルポリマー粒子は、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌＧ５０００ＰＷＸＬ、商品名、東ソー（株）製）から抜き出し、分級して本実施例に使用した。
【００２３】
得られたカチオン交換体を４．６ｍｍＩ．Ｄ．×５ｍｍＬカラムに充填し、タンパク質吸着容量をブレークスルー法にて測定した。ブレークスルー法による測定条件及び測定装置は以下の通りである。
【００２４】
ポンプ            ＣＣＰＭ−ＩＩ  （商品名、東ソー（株）製）
オートサンプラー  ＡＳ−８０２０  （商品名、東ソー（株）製）
検出器            ＵＶ−８０２０  （商品名、東ソー（株）製）
サンプル          １０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（シグマ社製）
サンプル注入量    ５ｍｌ
測定波長          ＵＶ２５１ｎｍ
溶離液            ２０ｍＭナトリュウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
タンパク質溶出による吸光度変化の１０％高さをブレーク点としてタンパク質（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の吸着容量を計算したところ、９８ｍｇ／ｍｌであった。
【００２５】
上記のようにして製造したカチオン交換体を５．０ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍＬ．カラムに充填し、タンパク質の分離を行った。測定装置は上記と同一であり、分離条件は以下の通りである。
【００２６】
0003972662.tif 000002
図１に上記測定結果を示す。図１から、実施例１のカチオン交換体はタンパク質吸着容量が大きく、かつ、高い分離能を発揮することが分かる。また上記測定を実施した際の流路系の圧力（送液圧力）は１．２ＭＰａであったことから、このカチオン交換体は通液特性が良好で、かかる吸着容量と分離能を低い送液圧力で発揮し得ることも分かる。
【００２７】
実施例２
実施例１重合物を用い、微粒子として、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、商品名、東ソー（株）製）から抜き出した粒子径が４マイクロメータのシリカ微粒子を用いた以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造し、そのタンパク質吸着容量を測定したところ、１１０ｍｇ／ｍｌであった。またこのカチオン交換体を用いて実施例１と同様にタンパク質の分離をおこなった。図１に結果を合わせて示す。図１から、本実施例で製造したカチオン交換体も高い分離性能を有していることが分かる。なお本実施例を行った際の流路系の圧力（送液圧力）は４．０ＭＰａであった。
【００２８】
実施例３
実施例１重合物を用い、微粒子として、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ２０００、商品名、東ソー（株）製）から抜き出した粒子径が４マイクロメータのシリカ微粒子を用いた以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造した。このカチオン交換体を５．０ｍｍＩＤ×５０ｍｍＬカラムに充填し、ペプチドの分離を下記条件下で行った。測定装置は上記と同一であり、分離条件は以下の通りである。
【００２９】
0003972662.tif 000003
図２に上記測定結果を示す。図２に示されたように、本実施例で製造したカチオン交換体はペプチドに対する良好な分離能を有し、クロマトグラムは良好なピーク形状を示す。ペプチドの分離においても、実施例３のカチオン交換体は、高い分離能を発揮することが分かる。また上記測定を実施した際の流路系の圧力（送液圧力）は４．０ＭＰａであったことから、このカチオン交換体は通液特性が良好で、かかる吸着容量と分離能を低い送液圧力で発揮し得ることも分かる。
【００３０】
実施例４
実施例１重合物に代えてポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体（アルドリッチ社製、分子量７万）１００ｇを使用し、そしてデキストランの使用量を１０ｇに変更した以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造した。得られたカチオン交換体のタンパク質の吸着容量を実施例１と同様にして測定したところ、９２ｍｇ／ｍｌであった。また実施例１と同様にしてタンパク質の分離を行った。結果を図１に合わせて示す。図１からは、本実施例のカチオン交換体も実施例１のカチオン交換体と同様に高い分離性能を有していることが分かる。なお、上記測定を実施した際の流路系の圧力（送液圧力）は１．５ＭＰａであった。
【００３１】
実施例５
デキストランをポリエチレンイミン（分子量１００００）２ｇに代えた以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造した。得られたカチオン交換体のタンパク質の吸着容量を実施例１と同様にして測定したところ、９４ｍｇ／ｍｌであった。また実施例１と同様にしてタンパク質の分離を行った。結果を図１に合わせて示す。図１からは、本実施例のカチオン交換体も実施例１のカチオン交換体と同様に高い分離性能を有していることが分かる。なお、上記測定を実施した際の流路系の圧力（送液圧力）は２．０ＭＰａであった。
【００３２】
実施例６
実施例１重合物に変えポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体（分子量５００００）１００ｇを使用し、デキストランを使用せずに作成した以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造した。
【００３３】
得られたカチオン交換体を４．６ｍｍＩ．Ｄ．×５ｍｍＬカラムに充填し、タンパク質吸着容量をブレークスルー法にて測定した。ブレークスルー法による測定条件及び測定装置は以下の通りである。
【００３４】
ポンプ            ＣＣＰＭ−ＩＩ（東ソー（株）製）
オートサンプラー  ＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）
検出器            ＵＶ−８０２０（東ソー株  ２５１ｎｍ）
サンプル          １０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ファルマシア社製）
サンプル注入量    ２ｍｌ
測定波長          ＵＶ２８０ｎｍ
溶離液            ２０ｍＭナトリュウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
タンパク質溶出による吸光度変化の１０％高さをブレーク点としてタンパク質の吸着容量を計算したところ、９８ｍｇ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ｍｌであった。
【００３５】
実施例１と同様にしてタンパク質の分離を行った。また比較のため、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ、商品名、東ソー（株）製）から抜き出したカチオン交換体を上記と同一のカラムに充填してタンパク質の分離をおこなった。図３に上記測定の結果を示す。図３から、本実施例のカチオン交換体もタンパク質の吸着容量が大きく、かつ、高い分離能を発揮することが分かる。また本願発明のイオン交換体充填カラムを用いて上記測定を実施したときの流路系の圧力（送液圧力）は１．７ＭＰａと低圧であったことから、該イオン交換体は通液特性が良好で、かかる高い吸着容量と高い分離能を低い送液圧力で発揮し得ることも分かる。
【００３６】
実施例７
微粒子として市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００ＷＸＬ、商品名、東ソー（株）製）から抜き出した粒子径が４マイクロメータのシリカ微粒子を用いた以外は実施例６と同様にしてカチオン交換体を製造し、そのタンパク質吸着容量を実施例６と同様に測定したところ、１１３ｍｇ／ｍｌであった。またこのカチオン交換体を用いて実施例１と同様にタンパク質の分離をおこなった。図３に結果を合わせて示す。図３から、本実施例で製造したカチオン交換体も高い分離性能を有していることが分かる。なお本実施例を行った際の流路系の圧力（送液圧力）は４．０ＭＰａであった。
【００３７】
実施例８
ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体として分子量７００００のものを使用した以外は実施例６と同様にしてカチオン交換体を製造した。製造されたカチオン交換体のタンパク質吸着容量を実施例６と同様に測定したところ１０２ｍｇ／ｍｌであった。
【００３８】
実施例９
ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体を分子量３０００のものを使用した以外は実施例６と同様にしてカチオン交換体を製造した。製造されたカチオン交換体のタンパク質吸着容量を実施例６と同様に測定したところ５７ｍｇ／ｍｌであった。
【００３９】
比較例１
デキストランを用いなかった以外は実施例１と同様にしてカチオン交換体を製造した。得られたカチオン交換体のタンパク質の吸着容量を実施例１と同様にして測定したところ、１２０ｍｇ／ｍｌであった。またまたこのカチオン交換体を５．０ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍＬカラムに充填し、実施例１と同様にしてタンパク質の分離を試みたが、流路系の圧力（送液圧力）が高圧となって充填剤が操作中に圧潰し、測定は不可能であった。
【００４０】
比較例２
実施例１で用いた微粒子と同一の多孔性の親水性ビニルポリマー粒子を用いて製造されたカチオン交換体を用い、実施例１と同様にしてタンパク質の吸着容量を測定したところ４１ｍｇ／ｍｌであった。また実施例１と同様にしてタンパク質分離を行った。結果を図１に合わせて示す。このときカラム操作圧は１．２ＭＰａであった。なお本比較例で用いた微粒子は、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ、商品名、東ソー（株）製）から抜き出したものである。
【００４１】
比較例３
ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体に代えてポリアクリル酸（分子量９００００）を使用した以外は実施例６と同様にしてカチオン交換体を製造した。製造されたカチオン交換体のタンパク質吸着容量を実施例６と同様に測定したところ１６ｍｇ／ｍｌであった。
【００４２】
比較例４
ポリ（アクリル酸−マレイン酸）共重合体に代えてポリアクリル酸（分子量２０００）を使用した以外は実施例６と同様にしてカチオン交換体を製造した。製造されたカチオン交換体のタンパク質吸着容量を実施例６と同様に測定したところ３４ｍｇ／ｍｌであった。
【００４３】
【発明の効果】
本願発明のカチオン交換体は、微粒子でありながら、タンパク質等の対象サンプルに対して大きな吸着容量を示すものである。また液体クロマトグラフィー用充填剤として使用した場合には、微粒子であるため通液特性が良好かつ高い分解能を発揮し得るという効果もある。しかも通液特性が良好であるため、低い送液圧力でかかる効果を発揮できる。
【００４４】
従って本願発明のカチオン交換体を充填したカラムを用いてタンパク質分析等を行えば、操作圧力（送液圧力）を高める必要なしに大量のサンプルを一度に処理することも可能である。大量のサンプルを導入できるため、分取の場合以外にも、大量の共存物質中の微量成分分析も有利に実施することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１、２、４、５及び比較例２における実験結果、即ちタンパク質分離を行ったときに得られたクロマトグラムを示す図である。図中横軸は資料を測定装置に注入してからの時間（分）を示す。
【図２】図２は実施例３における実験結果、即ちペプチド分離を行ったときに得られたクロマトグラムを示す図である。図中横軸は資料を測定装置に注入してからの時間（分）を示す。また図中、ＩはアンジオテンシンＩを、ＩＩはアンジオテンシンＩＩを、ＩＩＩはアンジオテンシンＩＩＩを、（Ｖａｌ5）−ＩＩ、（Ｓａｒ1，Ｖａｌ5，Ａｌａ8）−ＩＩ、（Ｓａｒ1，Ｔｈｒ8）−ＩＩ、（Ｓａｒ1，Ｉｌｅ6）−ＩＩ、（Ａｓｎ1，Ｖａｌ5）−ＩＩ及びＤｅｓ−Ａｓｐ1−（Ｉｌｅ8）−ＩＩはアンジオテンシンＩＩの変異体を、（Ｖａｌ5）−ＩはアンジオテンシンＩの変異体をそれぞれ示す。
【図３】図３は実施例６及び実施例７における実験結果、即ちタンパク質分離を行ったときに得られたクロマトグラムを示す図である。図中横軸はサンプルを測定装置に注入してからの時間（分）を示す。
【図１】
0003972662.tif 000004
【図２】
0003972662.tif 000005
【図３】
0003972662.tif 000006