(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光化学治療に用いる治療剤、あるいは診断に用いる診断剤の製造のために、
【化１】
0003955093.tif 000005
（式中、R1は、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アミノ、アリール、オキソまたはフルオロ基により置換されてもよいアルキル、かつ、酸素、窒素、硫黄またはリン原子により中断されてもよいアルキルを表し；R2は、水素原子を表す）
の化合物、およびそれらの塩を使用する方法。
【請求項２】
上記アリール基がフェニルまたは単環状の5〜7員環の複素芳香環である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
R1が不飽和アルキル基を表すことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
上記アルキル基が10個以下の炭素原子を含むことを特徴とする請求項
1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記化合物が、ALA-メチルエステル、ALA-エチルエステル、ALA-プロピルエステル、ALA-ヘキシルエステル、ALA-ヘプチルエステルまたはALA-オクチルエステル、あるいはこれらの塩であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上記光化学治療または診断が、光化学治療に応答する身体の外部または内部表面の腫瘍、皮膚障害、または感染について行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を、少なくとも一つの表面浸透助剤および任意に1以上のキレート剤とともに含む、光化学治療に応答する身体の外部または内部表面の腫瘍、皮膚障害、または感染を処置または診断する際に同時に、別個にまたは連続的に使用するための組み合わせ調製物としての製品。
【請求項８】
上記表面浸透助剤がDMSOであることを特徴とする請求項7に記載の製品。
【請求項９】
以下の工程：
i）患者の体液または組織を、請求項1〜5のいずれかに記載された化合物と混合すること、
ii）この混合物を光に曝すこと、
iii）蛍光レベルを確かめること、および
iv）この蛍光レベルとコントロールレベルとを比較すること
の少なくとも一つを含む、患者の体液または組織のサンプルをアッセイすることによる腫瘍、皮膚障害、または感染のインビトロ検査方法。
【請求項１０】
a）請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその製薬上許容される塩を含有する第一の容器、
b）少なくとも一つの表面浸透助剤を含有する第二の溶液；および所望により
c）上記第一の容器または第三の容器のいずれかの中に含有される1以上のキ
レート化剤
を含む、身体の外部または内部表面の腫瘍、皮膚障害、または感染の診断または光化学治療に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、5-アミノレブリン酸（ALA）の誘導体に関し、特に光化学治療における光増感剤として用いるためのALAのエステルに関する。
光動力学的治療（PDT）としても知られる光化学治療は、近年において皮膚あるいは他の上皮器官または粘膜の様々な異常または障害、特に癌または前癌状態、並びにある非悪性の病訴、例えば乾せんなどの皮膚病の治療のための来たるべき技術である。光化学治療は、光増感（光化学治療）剤を身体の疾患領域に適用した後、光増感剤を活性化し、かつ、それらを細胞毒性形態に変換するために光活性化光線に露光することを包含し、これにより疾患細胞を殺すか、またはそれらの増殖能力を減少させる。
光増感剤の範囲は既知であり、特にソラレン類、ポルフィリン類、クロリン類およびフタロシアニン類が包含される。このような薬物は、光に露光されたときに毒性になる。
光増感薬物は、様々な機構で直接的にまたは間接的にその効果を発揮する。すなわち、例えばある光増感剤は光により活性化されると直接毒性になるが、他のものは毒性種、例えば細胞物質および生体分子、例えば脂質、タンパク質および核酸に対して極めて有害な酸化剤、例えば一重項酸素または他の酸素由来のフリーラジカルを生成するように作用する。ソラレン類は、直接作用する光増感剤の一例であり；光に露光されるとそれらはDNA分子の二本鎖の間でアダクトおよび架橋を形成し、これによりDNA合成を阻害する。この治療に伴う不都合な危険は、望まれない突然変異誘発性および発癌性の副作用が起きる可能性のあることである。
この不利は、もう一方の、間接的な反応様式を有する光増感剤を選択することで回避できる。例えば、毒性酸素種を生成することにより間接的に作用するポルフィリン類は、突然変異誘発性副作用を持たず、光化学治療のためのより有望な候補を代表する。ポルフィリン類は、ヘムの合成において自然に存在する前駆体である。特に、鉄（Fe3+）が酵素フェロケラターゼの反応によりプロトポルフィリンIX（Pp）に取り込まれると、ヘムが生産される。Ppは、極めてよくきく光増感剤であるが、ヘムには光増感効果がない。
このようなポルフィリンベースの薬物の一つであるフォトフリンは、近年において、特定の癌の治療における光増感剤として承認されている。その主な不利は、それを非経口的に、一般的には静脈内に投与する必要があるため、静脈内注射後2〜3週間続くことのある皮膚の光増感を引き起こすことである。フォトフリンは、ポルフィリンの大きなオリゴマーからなり、局所的に適用された場合、皮膚を容易には浸透しない。他のポルフィリンベースの光増感剤、例えば”ヘマトポルフィリン誘導体”（Hpd）と呼ばれるものについても同様の問題が存在する。これも、癌の光化学治療における使用について報告されている（例えば、S. Dougherty. J. Natl. Cancer Ins., 1974, 52; 1333; KellyおよびSnell, J. Uro1, 1976, 115: 150を参照）。Hpdは、ヘマトポルフィリンを酢酸および硫酸で処理し、その後アセチル化物をアルカリで溶解させることにより得られる複合混合物である。
これらの問題を克服するために、Ppの前駆体が光化学治療上の可能性について研究されている。特に、Pp前駆体5-アミノレブリン酸（ALA）が、ある皮膚癌のための光増感剤として研究されている。ヘム合成の第一段階においてスクシニルCoAおよびグリシンから形成されるALAは、限定された程度で皮膚に浸透し、Ppの局所化された強化（buidd-up）を導くことができ；フェロケラターゼ（金属化酵素）の反応がヘム合成における律速段階であるため、過剰のALAはPp、光増感剤の蓄積を生じさせる。従って、ALAを皮膚腫瘍に局所的に適用し、次いで数時間後にこの腫瘍を光に曝すことにより、有益な光化学治療効果を得ることができる（例えば、WO91/01727参照）。基底細胞癌および扁平上皮癌を覆う皮膚は健康な皮膚よりもALAを浸透しやすいため、また、皮膚腫瘍中ではフェロケラターゼ濃度が低いため、ALAの局所的適用は腫瘍中で選択的に増強されたPp生産を引き起こすことが見出された。
しかしながら、この技術においてALAの使用が重要な前進を示す一方、ALAを用いた光化学治療は必ずしも完全に満足されるとはかぎらない。ALAは、全ての腫瘍および他の組織を、広範囲の腫瘍または他の状態の治療を可能にするほど十分な効力で浸透することができず、かつALAは製薬処方物中で不安定である傾向を有する。従って、改良された光化学治療剤に対する必要性が存在している。
本発明は、この必要性を扱うもので、特に、腫瘍または他の異常をより良く浸透することができ、かつ、先行技術において記載された効果よりも増強された光化学治療効果を有する光化学治療剤を提供することを目的としている。
従って、一つの観点において本発明は、光化学治療または診断に使用するため5-アミノレブリン酸のエステルまたは製薬上許容されるそれらの塩である化合物を提供する。
本発明のエステルにおいて、5-アミノ基は置換されてもいても未置換であってもよく、後者の場合はALAエステルである。
より詳細には、本発明により用いられる化合物は、所望により置換されたアルカノールとの5-アミノレブリン酸のエステル、すなわちアルキルエステルまたは置換アルキルエステルである。
従って、別の観点において本発明は、光化学治療または診断に使用するための、式I
0003955093.tif 000002
（式中、R1は、所望によりヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アミノ、アリール、オキソまたはフルオロ基により置換され、かつ、所望により酸素、窒素、硫黄またはリン原子により中断されたアルキルを表してよく；R2は、それぞれ同一でも異なってもよく、水素原子または基R1を表す）の化合物、およびそれらの塩を提供することが分かる。
置換アルキルR1基は、一置換であっても多置換であってもよい。従って、好適なR1基としては、例えば未置換アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ヒドロキシポリアルキレンオキシアルキルなどが挙げられる。ここで用いられる”アシル”という語は、カルボキシレートおよびカルボネート基の両方を包含し、従って、アシルオキシ置換アルキル基は、例えばアルキルカルボニルオキシアルキルを包含する。このような基において、アルキレン部分はアルキル基に関して定義したよりも少ない数の炭素原子部有することが好ましい。好ましいアリール基としては、フェニルおよび単環状の5〜7員環の複素芳香環、特にフェニルが挙げられ、このような基それ自体は、所望により置換されていてもよい。
典型的な置換アルキル基R1としては、アルコキシメチル、アルコキシエチルおよびアルコキシプロピル基、またはアシルオキシメチル、アシルオキシエチルおよびアシルオキシプロピル基、例えばピバロイルオキシメチルが挙げられる。
本発明により用いられる好ましい化合物としては、R1が未置換のアルキル基を表し、および／または各R2が水素原子を表す化合物が挙げられる。
ここで用いられるように、”アルキル”という語は、全ての長鎖または短鎖の、直鎖状または分岐状脂肪族の、飽和または不飽和の炭化水素基を包含する。不飽和アルキル基は、モノ−またはポリ−不飽和であってよく、かつ、アルケニルおよびアルキニル基の両者を包含する。このような基は、40個以下の炭素原子を含有することができる。しかしながらアルキル基は、好ましくは10個以下、例えば8個、より好ましくは6個以下、特に好ましくは4個以下の炭素原子を含有する。
特に、ALA-メチルエステル、ALA-エチルエステル、ALA-プロピルエステル、ALA-ヘキシルエステル、ALA-ヘプチルエステル、およびALA-オクチルエステルおよびそれらの塩を挙げることができ、これらは本発明により用いられる好ましい化合物を代表する。
本発明で用いる化合物は、当該技術において公知の多官能化合物の誘導化、特にエステル化のための標準的な方法および手順を用いて製造することができる。この技術において知られているように、化合物のこのようなエステル化は、要求される基のみが反応性を残し、エステル化条件下で反応に参加するように、適当な基を保護および脱保護することを伴う。従って、例えばエステルを製造するために用いられる置換アルカノールの置換基は、エステル化の間保護することができる。同様に、式Ｉの化合物にNR22基を寄与させる化合物上のこの基も、反応の間保護し、その後脱保護することができる。このような保護/脱保護の手順は、誘導体の製造、特に公知アミノ酸のエステルの製造のために当該技術において公知であり、例えばMcomieの"Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum, 1973およびT.W. Greeneの"Protective Groups in Organic Chemistry", Wiley-Interscience, 1981が参照される。
従って、もう一つの観点において、本発明は、5-アミノレブリン酸のカルボキシ基のエステルを形成することを含む、本発明で用いる化合物の製造方法を提供する。
従って、本発明は、5-アミノレブリン酸またはそのエステル化可能な誘導体を、アルカノールまたはそのエステル形成誘導体と反応させることを含む、本発明で用いる化合物の製造方法を提供することが分かる。
より詳しくは、本発明のこの観点は、以下の工程：
（a）式II
0003955093.tif 000003
（式中、Ｘは脱離基、例えばヒドロキシ基、ハロゲン原子またはアルコキシ基を表すか、あるいはCOXは酸無水物基を表し、R2は上記で定義したものである）の化合物を、式III
0003955093.tif 000004
（式中、R1は上記で定義したものである）の化合物と反応させること、および
（b）式Iの化合物をその製薬上許容される塩に変換することの少なくとも一つを含む、式Iの化合物の製造方法を提供する。
工程（a）の反応は、溶媒または溶媒混合物、例えば水、アセトン、ジエチルエーテル、メチルホルムアミド、テトラヒドロフランなどの中で、混合物の沸点までの温度、好ましくは室温において、都合良く行うことができる。
エステル化反応の条件は、用いるアルコールに依存し、この条件はエステルの最大収量が得られるように選ぶことができる。エステル化反応は可逆平衡反応であるため、反応条件はエステル化生成物の最大収量が得られるように選択することができる。このような条件は、水と共沸混合物を形成することにより典型的なエステル化反応において生成される水を除去することができる溶媒を選択することにより得ることができる。このような溶媒としては、水と共沸混合物を形成することが可能な芳香族炭化水素または他のもの、例えばクロロホルムなどの塩素化炭化水素を例示できる。5-ALAの低級エステルを形成するために、大過剰のアルコールを用いることにより、平衡反応をエステル側に向けてもよい。他のエステルに関しては、大過剰の酸を用いることにより、平衡をエステル化生成物に向けてもよい。
エステル化反応は当該技術において公知であり、例えばSaul Pataiの"The chemistry of the carboxylic acids and esters",（Ch. 11, p.505, Interscience 1969）に、およびHouban Weyl,（Methoden der Organische Chemie, Band E5, "Carbonsauren und carbosauren-derivate", p.504, Georg Thieme Verlag, 1985）に記載されている。アミノ酸誘導体の形成は、同じシリーズのXI/2（Houben Weyl, Methoden der Organische Chemie, Band XI/2, "Stickstoffverbindungen", p.269, Georg Thieme Verlag, 1958）に記載されている。
反応は、触媒、例えば無機酸または有機酸あるいは塩基のような酸結合剤の存在下で都合良く行われる。
出発物質として用いられる化合物は文献から既知であり、多くの場合に市販されているか、あるいはそれ自体既知の方法を用いて得ることができる。ALAは、例えばSigmaまたはPhotocure, Oslo, Norwayから入手可能である。
上述したように、本発明により用いられる化合物は、製薬上許容される塩の形態をとることができる。このような塩は、製薬上許容される有機酸または無機酸との酸付加塩であることが好ましい。好適な酸としては、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒右酸、琉珀酸、マレイン酸、フマル酸およびアスコルビン酸などが挙げられる。塩形成のための手順は、この技術において慣習的である。
上述したように、本発明により用いられる化合物およびそれらの塩は、価値ある薬理学的性質を有し、すなわちこれらを光化学治療剤として有用にする光増感剤である。
ALAのように、本化合物はPpの産生を増強することによりその効果を発揮し；望まれる反応部位へ送出されると、標的細胞中に存在する加水分解酵素、例えばエステラーゼがエステルを元のALAに分解し、次いでこのALAがヘムの合成経路に入り、Pp強化を導く。しかしながら、本発明により用いられる化合物は、ALA自身と比べて多くの利点を有する。第一に、該化合物は、ALAと比較して皮膚および他の組織をよりよく浸透でき；この浸透はより深く、より速い。これは、特に局所的投与のために重要な利点である。第二に、本エステルは、驚くことにALAよりもPp産生のよりよい増強剤であることが見出され；ALAエステルの投与後のPp産生レベルは、ALA単独の場合よりも高い。第三に、本発明で用いる化合物は、治療される標的組織に対して向上した選択性を示し、すなわちPp産生増強効果は所望の標的病巣に局在化され、周囲の組織には広がらない。これは、特に腫瘍について顕著である。最後に、該化合物は、投与の際に標的組織においてよりよく局在化するようである。これは、他のポルフィリンベースの光増感剤に関して文献に報告されているような望まれない光増感効果を低減または回避できることを意味するため、全身的な適用にとって特に重要である。
従って、本発明の更なる観点は、本発明の化合物またはその製薬上許容される塩を、少なくとも一つの製薬上のキャリアまたは賦形剤とともに含有する製薬組成物を提供する。
更にもう一つの観点において、光化学治療に用いられる治療剤、特に光化学治療に応答する身体の外部または内部表面の障害または異常を治療するための治療剤の製造に前述の化合物またはその製薬上許容される塩を使用する方法も提供する。
本発明に従って治療しうる異常および障害としては、光化学治療に応答する悪性、前悪性および非悪性の異常または障害、例えば腫瘍または他の成長、乾せんまたは紫外線角化症、皮膚剥離などの皮膚障害、および他の疾患または感染、例えば細菌性、ウイルス性または真菌性感染、例えばヘルペスウイルス感染などが挙げられる。本発明は、分離した病巣が形成され、そこに本組成物を直接適用できる疾患、障害または異常の処置に特に適している（ここで、病巣は腫瘍などを含めた広い意味で用いられる）。
本発明に従って治療される内部および外部の身体表面としては、皮膚および他の全ての上皮および漿膜表面が挙げられ、例えば、粘膜、器官、例えば気道、胃腸管および尿生殖路などのライニング、およびこのような表面に注ぐ管を有する腺（例えば肝臓、脂腺を有する毛包、乳腺、唾液腺および精のう）を包含する。皮膚に加えて、このような表面としては、例えば膣、子宮内膜および尿道乳頭のライニングが挙げられる。また、このような表面としては、病的または癌性組織を切除した後に身体内に形成される空洞、例えばグリオームなどの腫瘍を切除した後の脳の空洞を挙げることもできる。
従って、典型的な表面としては、（i）皮膚および結膜；（ii）口、咽頭、食道、胃、腸および腸付属物、直腸、および肛門管のライニング；（iii）鼻腔、鼻腔洞、鼻咽頭、気管、気管支、および細気管支のライニング；（iv）尿管、膀胱および尿道のライニング；（v）膣、子宮頚、および子宮のライニング；（vi）壁側胸膜および臓側胸膜；（vii）腹膜腔および骨盤腔のライニング、およびこれらの腔内に含有される器官の表面；（viii）硬膜および髄膜；（iｘ）例えば外科術時に直接に、または針を通して挿入された光学繊維を介して、光活性化光線が近づきうる固形組織中の全ての腫瘍が挙げられる。
本発明の組成物は、常法により1以上の生理的に許容されるキャリアまたは賦形剤とともに、公知の技術に従って処方することができる。本組成物は局所的、経口的、または全身的に投与できる。局所組成物が好ましく、例えばゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、ローション剤、ロウ膏剤、粘着剤、石鹸剤、粉末剤、膣坐剤、エアロゾール剤、滴剤および他のこの技術において普通の製薬形態が挙げられる。
軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、水性または油性基剤を用いて好適な濃縮剤および/またはゲル化剤を添加して処方することができる。ローション剤は、水性または油性基剤を用いて処方され、一般的に、1以上の乳化剤、分散剤、懸濁剤、濃縮剤または着色剤も含有する。粉末剤は、好適な粉末基剤を用いて形成することができる。滴剤は、水性または非水性基剤を用いて処方され、同様に1以上の分散剤、可溶化剤または懸濁剤も含有する。エアロゾールスプレー剤は、加圧包装から好適な噴射剤を用いて放出することが好都合である。
あるいは、本組成物は経口的または非経口的投与、例えば皮内、皮下、腹腔内または静脈内注射に適する形態にて提供することができる。従って、別の製薬形態としては、活性成分を、所望により1以上の不活性な従来のキャリアおよび/または希釈剤、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、微晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、クエン酸、酒石酸、水、水/エタノール、水/グリセロール、水/ソルビトール、水/ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ステアリルアルコール、カルボキシメチルセルロースまたは硬化脂肪などの脂肪物質またはそれらの混合物とともに含有する、無被覆のまたは被覆した錠剤、カプセル剤、懸濁剤および溶液剤が挙げられる。
上記組成物における前述の化合物の濃度は、化合物の性質、組成、投与様式および患者に依存し、選択により変更または調節することができる。しかしながら、一般的に、1〜50%（w/w）の濃度範囲が好適である。治療用途のためには、10〜50%、例えば15〜30%（w/w）の濃度範囲が好適であることが分かった。
表面への投与後、治療される領域を光に曝して、光化学治療効果が達成される。露光が行われる投与後の時間は、本組成物の性質および投与の形態に依存する。一般的に、これは、0.5〜48時間、例えば1〜10時間のオーダーである。
照射は、一般的に40〜200ジュール／cm2、例えば100ジュール／cm2の用量レベルで適用される。
照射に用いられる光の波長は、より有効な光化学治療効果を達成するように選択することができる。従来、ポルフィリン類を光化学治療に用いる場合は、ポルフィリンの吸収極大付近の光で照射される。すなわち、例えば皮膚癌の光化学治療にALAを用いる先行技術の場合には、350〜640nm、好ましくは610〜635nmの領域の波長が採用された。しかしながら、照射のために、ポルフィリンの吸収極大を超えて拡張された広範囲の波長を選択することにより、光増感効果を増強することができる。理論に束縛されることを望むわけではないが、これは、Ppおよび他のポルフィリン類がその吸収スペクトル内の波長を有する光に曝されると、それが特に光プロトポルフィリン（PPp）を含む様々な光生成物へ分解するという事実によるものであると考えられる。PPpは1種のクロリンであり、相当な光増感効果を有し；その吸収スペクトルは、Ppが吸収する波長を超えて長波長側に伸び、すなわち、ほとんど700nmまでに伸びる（Ppは650nm以上の光をほとんど全く吸収しない）。従って、従来の光化学治療において、用いる波長はPPpを励起せず、それゆえに、その追加の光増感効果の利益は得られない。500〜700nmの波長範囲の光を用いて照射すると、特に有効であることが分かった。630〜690nmの波長を含むことは特に重要である。
従って、本発明の更なる観点は、疾患表面に上述で定義した組成物を投与すること、および上記表面を光、好ましくは波長範囲300〜800nm、例えば500〜700nmの光に曝すことを含む、身体の外部または内部表面の障害または異常を光化学療法により処置する方法を提供する。
例えばランプまたはレーザにより身体の異なる領域を照射する方法は、この技術において公知である（例えば、Van den Bergh, Chemistry in Britain, May 1986 p. 430-439）。
本発明で用いる化合物は、他に光増感剤、例えばALAまたはフォトフリンとともに、あるいは光化学治療効果を増強することができる他の活性成分とともに処方および／または投与することができる。例えば、Ppの蓄積を増強するためにキレート化剤を有利に含めることができ；このキレート化剤による鉄のキレート化は、酵素フェロケラターゼの作用によりヘムを形成するためのPpへの鉄の取込みを妨げ、これによりPpの蓄積が生じる。こうして、光増感効果が増強される。
これに関し、アミノポリカルボン酸キレート化剤の使用が特に好適であり、金属の解毒または磁気共鳴コントラスト剤における常磁性金属イオンのキレート化に関して文献中に記載された全てのキレート化剤が挙げられる。特に、EDTA、CDTA（シクロヘキサンジアミン四酢酸）、DTPAおよびDOTAを挙げることができる。EDTAが好ましい。鉄キレート化効果を達成するために、デスフェリオキサミン（desferrioxamine）および他の親鉄剤も、例えばアミノポリカルボン酸キレート化剤、例えばEDTAとともに用いることができる。
キレート化剤は、1〜20%、例えば2〜10%（w/w）の濃度で都合良く用いることができる。
さらに、表面浸透助剤、および特にジアルキルスルホキシド、例えばジメチルスルホキシド（DMSO）が光化学治療効果の増強において有益な効果を有することが分かった。これは、我々の同時係属中の出願PCT/GB94/01951（明細書のコピを添付する）中に詳しく記載されている。
表面浸透助剤は、薬学の文献、例えばHPE-101（Hisamatsuより入手可能）に記載された全ての皮膚浸透助剤、DMSOおよび他のジアルキルスルホキシド、特にn-デシルメチルスルホキシド（NDMS）、ジメチルスルフアセトアミド、ジメチルホルムアミド（DMFA）、ジメチルアセトアミド、グリコール、様々なピロリドン誘導体（Woodford et al., J. Toxicol. Cut & Ocular Toxicology, 1986, 5: 167-177）およびAzone▲Ｒ▼（Stoughton et al., Drug Dpv. Ind. Pharm. 1983, 9: 725-744）またはこれらの混合物であってよい。
しかしながら、DMSOは多数の有益な効果を有し、著しく好ましい。従って、表面浸透補助効果（DMSOは活性剤が組織内に浸透する深さを向上させるのに特に有効である）に加えて、DMSOは、抗ヒスタミンおよび抗炎症活性を有する。さらに、DMSOは酵素ALA-シンターゼおよびALA-デヒドロゲナーゼ（それぞれ、ALAを形成する酵素およびALAをポルホビリノーゲンに縮合させる酵素）の活性を増加させ、これにより活性形態のPpの形成を増強することが分かった。
表面浸透剤は、2〜50%（w/w）、例えば約10%（w/w）の濃度範囲で都合良く提供することができる。
処置される条件および組成物の性質に応じて、本発明で用いる化合物は、例えば単一の組成物において、このような他の任意の剤と同時に投与してもよく、あるいは連続的にまたは別個に投与してもよい。実際に多くの場合、特に有益な光化学治療効果は、本発明の化合物の投与前に、別の工程において表面浸透助剤で前処理することにより得ることができる。さらに、幾つかの状況では、表面浸透助剤で前処理した後、表面浸透助剤とともに光化学治療剤を投与することが有益な場合がある。表面浸透助剤を前処理に用いるときは、高い濃度、例えば100%（w/w）以下で用いることができる。このような前処理工程を採用するならば、光化学治療剤は続いて、前処理後数時間までに、例えば前処理後5〜60分の間隔で投与できる。
従って、更なる観点から見ると、本発明は、前述の化合物またはその製薬上許容される塩を、少なくとも一つの表面浸透助剤、および所望により1以上のキレート化剤とともに含む、光化学治療に応答する身体の外部または内部表面の障害または異常を処置する際に同時に、別個にまたは連続的に使用するための組み合わせ調製物としての製品を提供する。
あるいは、本発明のこの観点は、
a）前述の化合物またはその製薬上許容される塩を含有する第一の容器、
c）少なくとも一つの表面浸透助剤を含有する第二の容器；および
所望により
c）上記第一の容器または第三の容器中に含有される1以上のキレート化剤を含む、
身体の外部または内部表面の障害または異常の光化学治療に用いるためのキットも提供する。
表面浸透剤が別個の前処理工程で適用される場合、これはより高い濃度、例えば100%（w/w）以下で適用できる。
前述の化合物を用いる治療方法は、処置される障害および異常の蛍光を必然的に必要とすることが理解される。この蛍光強度は異常細胞を評価するのに用いることができる一方、蛍光の局在化は異常または障害のサイズ、程度および状態を視覚化するのに用いることができる。これは、ALAエステルが非正常組織に優先的に局在化するという驚くべき能力によって可能にされる。
こうして、調査部位で同定または確認された異常または障害は、次いで他の治療技術、例えば外科的または化学的治療により、あるいは蛍光の連続的蓄積による本発明の治療方法により、あるいは適当な部位に本発明の化合物をさらに適用することにより、処置することができる。診断技術は、治療処置に用いられるよりも低いレベルの視覚化用の蛍光を必要とすることが理解される。従って一般的に、1〜50%、例えば1〜5%（w/w）の濃度範囲が好適である。投与の部位、方法および様式は、これまで以前治療的使用に関して考慮してきたが、ここで記載した診断的使用にも当てはめることができる。本発明で用いる化合物は、インビトロの診断技術、例えば体液中に含有される細胞の試験のために用いることもできる。非正常組織に関する比較的高い蛍光は、異常または障害の好都合な指標でありうる。この方法は極めて感度が高く、異常または障害、例えば尿または唾液サンプル中の上皮細胞の試験により、それぞれ膀胱または肺癌腫の早期検出に用いることができる。尿および唾液に加えて、診断に用いることのできる他の有用な体液としては、血液、精液、涙、脊髄液などが挙げられる。例えば、生検組織または骨髄サンプルなどの組織サンプルまたは調製物も評価することができる。従って本発明は、上記の光化学治療方法に準じて診断するための、本発明の化合物またはそれらの塩の用途、およびこの診断を行うための製品およびキットにまで拡張される。
本発明の更なる観点は、少なくとも以下の工程：
i）患者の体液または組織を、上述したような化合物と混合すること、
ii）この混合物を光に曝すこと、
iii）蛍光レベルを確かめること、および
iv）この蛍光レベルとコントロールレベルとを比較すること
の少なくとも一つを含む、患者の体液または組織サンプルのアッセイによる異常または障害のインビトロ診断方法に関する。
本発明を、図面を参照して、以下の非限定的実施例により詳細に説明する。各図は以下の通り。
図１は、投与後0.5、1、1.5、2.5、3、3.5および14時間後における、
（A）遊離ALA
（B）ALAメチルエステル
（C）ALAエチルエステル
（D）ALAプロピルエステル
を局部的投与した後のマウス正常皮膚でのPpIXの蛍光強度（相対単位対波長(nm)）を示す。
図２は、マウス正常皮膚への局部的投与後14時間の、脳、真皮、耳、肝臓および筋肉における蛍光強度（相対単位対波長(nm)）として測定されたPpIX分布を示す：
（A）遊離ALA
（B）ALAメチルエステル
（C）ALAエチルエステル
（D）ALAプロピルエステル
図３は、ALAメチルエステルの腹腔内注射（150mg/kg）後、15分間、1時間、4時間および10時間のマウス皮膚におけるPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す。
図４は、ヒト患者の皮膚の基底細胞癌腫（BCC）病変に対するALAメチルエステルの局部的投与後、（A）1.5時間および（B）4時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す（-癌腫；---正常皮膚）。
図５は、ヒト患者の皮膚の基底細胞癌腫（BCC）病変に対するALAエチルエステルの局部的投与後、（A）1.5時間および（B）4時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す（-癌腫；---正常皮膚）。
図６は、ヒト患者の皮膚の基底細胞癌腫（BCC）病変に対するALAプロピルエステルの局部的投与後、（A）1.5時間および（B）4時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す（-癌腫；---正常皮膚）。
図７は、ヒト患者の皮膚の基底細胞癌腫（BCC）病変に対するALAの局部的投与後、（A）1.5時間および（B）4時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す（-癌腫；---正常皮膚）。
図８は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCおよび周囲正常皮膚におけるALAメチルエステルの局部的投与後のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図９は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCおよび周囲正常皮膚におけるALAの局部的投与後のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）
を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図10は、ヒト患者のBCC病変および正常皮膚に対するALAメチルエステルの局部的投与後、24時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す。
図11は、ヒト患者のBCC病変および正常皮膚に対するALAの局部的投与後、24時間のPpIX蛍光（蛍光強度、相対単位対波長(nm)）を示す。
図12は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCにおけるALAメチルエステルの局部的投与後4.5時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図13は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒト正常皮膚におけるALAメチルエステルの局部的投与後4.5時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図14は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCにおけるALAメチルエステルの局部的投与後24時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図15は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒト正常皮膚におけるALAメチルエステルの局部的投与後24時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図16は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCにおける遊離ALAの局部的投与後24時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図17は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒト正常皮膚における遊離ALAの局部的投与後24時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図18は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒトBCCにおける遊離ALAおよび20% DMSOの局部的投与後4.5時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図19は、生検のCCD顕微鏡検査による、ヒト正常皮膚における遊離ALAおよび20% DMSOの局部的投与後4.5時間のPpIX産生の測定、（A）蛍光強度対深さ（μm）を示すグラフ表示および（B）顕微鏡写真を示す。
図20は、ALAメチルエステル単独（-●-）、ALAメチルエステル+DMSO（-▲-）、ALAメチルエステル+デスフェリオキサミン（DF）（-■-）、またはALAメチルエステル+DFおよびDMSO（-▼-）の局部投与後での、マウス皮膚におけるALAメチルエステル-誘導（PpIX）蛍光の時間経過（蛍光強度：相対単位対波長(nm)）を示す。各点は、少なくとも3匹のマウスからの測定値の平均である。
図21は、遊離ALA単独（A）、ALAメチルエステル（B）、ALAエチルエステル（C）およびALAプロピルエステル（D）の局部投与後1時間で撮影したマウス皮膚の蛍光写真を示し、表皮（Ep）、上皮毛包帯および皮脂腺（矢示）においては蛍光を示すが、真皮（De）においては蛍光を示さない。当初の倍率はx250である。
図22は、ヌードマウスに皮下移植されたWiDrヒト結腸癌腫をALAまたはALAメチルエステル+DFで処理した後の、時間（日数）に対する相対腫瘍体積を示すグラフである；（-▲-）コントロール、（-▼-）DF単独、（-■-）ALA+DF+DMSO、（-●-）ALAメチルエステル+DF+DMSO。
図23は、ALAまたはそのエステルの局部的投与後のBCC病変および周囲正常皮膚間のPpIX蛍光比を示す。
実施例１
5-アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩の製造
200mlのメタノールを含む500mlガラス反応器に、1gの5-アミノレブリン酸塩酸塩と、1滴の濃HClを加えた。次いで、反応混合物を、60℃で一夜攪拌した。エステル化の進行は、1H-NMRで追跡した。過剰のメタノールを蒸留で除去し、生成物を更に真空下30〜40℃で乾燥し、5-アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例２
5-アミノレブリン酸エチルエステル塩酸塩（ALAエチルエステル）の製造
攪拌器、還流冷却器および温度計を備えた250mlガラス反応器中で、1〜2滴の濃塩酸を含む200mlの乾燥エタノールに、1gの5-アミノレブリン酸塩酸塩を加えた。エステル化を、還流下一夜（70〜80℃）行なった。反応が完了した後、エタノールを真空下除去した。最後に、生成物を高真空下30〜40℃で乾燥し、0.94gの5-アミノレブリン酸エチルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例３
5-アミノレブリン酸n-プロピルエステル塩酸塩（ALAプロピルエステル）の製造
攪拌器、還流冷却器および温度計を備えた250mlガラス反応器中で、1〜2滴の濃塩酸を含む100mlの乾燥ｎ-プロパノールに、0.5gの5-アミノレブリン酸塩酸塩を加えた。反応混合物を、70〜80℃でほぼ20時間攪拌した。全ての5-アミノレブリン酸がそのn-プロピルエステルに転換された後（1H-NMRで追跡）、過剰のプロパノールを除去し、生成物を高真空下（<1mBar）40〜50℃で乾燥した。反応により、0.49gの5-アミノレブリン酸n-プロピルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例４
5-アミノレブリン酸ヘキシルエステル塩酸塩（ALAヘキシルエステル）の製造
還流冷却器および温度計を備えた50mlガラス反応器中で、5〜6滴の濃塩酸を含む25gの乾燥n-ヘキサノールに、2gの5-アミノレブリン酸塩酸塩を溶解した。反応混合物を、50〜60℃にほぼ3日間維持した。過剰のヘキサノールを真空下除去し、最後に生成物を高真空下乾燥して、2.4gの5-アミノレブリン酸n-ヘキシルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例５
5-アミノレブリン酸n-ヘプチルエステル塩酸塩（ALAヘプチルエステル）の製造
攪拌器、還流冷却器および温度計を備えた100mlガラス反応器中で、5滴の濃塩酸を含む30gの乾燥n-ヘプタノールに、0.5gの5-アミノレブリン酸塩酸塩を加えた。全ての5-アミノレブリン酸が溶解した後、反応混合物を、70〜80℃でほぼ48時間攪拌した。全ての5-アミノレブリン酸がそのn-ヘプチルエステルに転換された後（1H-NMRで追跡）、過剰のアルコールを除去し、生成物を高真空下（<1mBar）70℃で乾燥した。反応により、1.5gの5-アミノレブリン酸n-ヘプチルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例６
5-アミノレブリン酸n-オクチルエステル塩酸塩（ALAオクチルエステル）の製造
還流冷却器、攪拌器および温度計を備えた50mlガラス反応器中で、5〜6滴の濃塩酸を含む30gの乾燥n-オクタノールに、1gの5-アミノレブリン酸塩酸塩を加えた。反応混合物を、65〜70℃でほぼ2日間攪拌した。過剰のn-オクタノールを真空下除去し、最後に生成物を高真空下乾燥して、1.5ｇの5-アミノレブリン酸n-オクチルエステル塩酸塩を得た。構造は、DMSO-d6中、1H-NMRによって確認した。
実施例７
処方
活性成分、ALA、ALAメチルエステル、ALAエチルエステル、またはALAプロピルエステル（各々実施例1〜3に従って製造した）を、二酸化珪素、液状パラフィン、ワセリン、アルブム（album）、セトステアロール（cetostearol.）、ポリソルベート．40、グリセロールモノステアレート、ミグリオール▲Ｒ▼812（Myglyol ▲Ｒ▼812：植物脂肪酸の混合物）、ポリプロピレングリコール、および精製水からなる「Urguentum Merck」クリーム基材（Merckから入手可能）と混合して20%クリームを製造した。
更に3〜20%のDMSOを含む対応するクリームをも製造した。
実施例８
CCD顕微鏡バイオプシーによるマウス皮膚におけるプロトポルフィリンIX産生の決定
化合物（遊離ALA、ALAメチルエステル、ALAエチルエステル、またはALAプロピルエステル）（実施例1参照）（20%w/w）を含む市販の水中油型クリームを、nu/nuヌードマウスの正常皮膚に、0.5、1、3および6時間塗布し、次いで生検し、感光性熱-電冷却型荷電結合素子（CCD）カメラを組み込んだ顕微鏡蛍光測光によって評価した。その結果、遊離ALAおよびその三つのエステル誘導体は皮膚組織に取込まれ、エステル化ALA誘導体は皮膚中で脱エステル化されて、局所塗布後0.5時間でプロトポルフィリンIX（PpIX）に変換された。皮膚におけるPpIXの蛍光強度は塗布時間とともに増加し、蛍光の最大量は、全てのケースにおいて、塗布後約6時間（研究された最も遅い時点）で観察された。
実施例９
光学ファイバー型システムによるマウス皮膚におけるプロトポルフィリンIX産生のその場での測定
この研究の目的は、ALAエステル誘導体の局所投与後または全身投与後におけるin vivoのヌードマウス正常皮膚におけるエステル化ALAエステル-誘導ポルフィリン蛍光の強化（build-up）を調査することにある。
材料および方法
化合物
5-アミノレブリン酸（ALA）メチル-、エチル-およびプロピル-エステル（H2N-CH2COOCH2-CH2COO-R; RはCH3、CH2-CH2-CH3であり得る）は、Norsk Hydro Research Center（Porsgrunn、Norway）により、実施例1〜3で説明されたようにして製造された。遊離ALA塩酸塩およびデスフェリオキサミンメシレート（DF）は、Sigma Chemical Company（St. Louis, Mo, USA）から購入した。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、Janssen Chimica（Geel， Belgium）から得た。20%のALAエステル誘導体の一つ（w/w）、20%の遊離ALA、20%のALAメチルエステルと5%のDF、20%のALAメチルエステルと20%のDMSO、または20%のALAメチルエステルと5%のDFと20%のDMSOを含む市販の油-水クリーム（Unguentum Merck, Darmstadt, Germany）を使用前新たに製造した。全てのクリームが、norwegian radium Hospitalの薬局で製造された。腹腔内注射のため、ALAおよびそのメチルエステルを、新たに食塩水に溶解した。用いられた全ての他の化合物は、購入し得る最も高純度のものであった。
動物
メスBalb/c nu/nu無胸腺ヌードマウスを、Norwegian Radium Hospitalの動物研究所から入手し、特定無菌状態（specific-pathogen-free condition）に保った。実験開始時に、マウスは6〜7週令で18〜24gの体重であった。実験の間、暗室中で、オートクレーブ処理したカバーを備えたケージ毎に3匹のマウスを入れた。
処理手順
クリームの一つを各マウスの右脇腹領域の正常皮膚に塗り、その場での蛍光測定前または顕微鏡蛍光画像のために生検する前の様々な時間間隔（0.25〜24時間）、半透過包帯（3M, St Paul, MN, USA）で覆った。約0.2gのクリームを、ほぼ2.25cm2の皮膚領域に塗布した。i.p. 注射の場合では、マウスに、150mg/kgの投与量で、ALAまたはそのメチルエステルを与えた。各条件毎に、少なくとも3匹のマウスを用いた。
その場での蛍光分光測定
赤感性光電子増倍管（Hamamatsu R 928）を備えたperkin Elmer LS-50蛍光分光計を用いた。この装置は、パルス化キセノンアーク光源および位相感応検波を有し、蛍光を容易に測定できるものである。励起されたビーム（蛍光測定のために408nmにセット）の一部を、手で持ったプローブを介して検体上に照射するために、鏡によって600μmコアマルチモード光学石英ファイバー（No. 3501 393, Dornier Medizintechnik, GmbH, Germering, Germany）内に反射させた。550〜750nmの範囲における放射を、プローブを介して情報を収集する放射ファイバーを介して測定した。
蛍光顕微鏡検査
クリームを（上記したような）様々な時間マウスの皮膚に局部的に塗布した後に、皮膚を生検し、凍結組織切片をクリオスタットで厚さ8μmに切断した。蛍光顕微鏡検査を、100W水銀ランプを備えたAxioplan顕微鏡（Zeiss, Germany）を用いて行なった。蛍光画像は、感光性熱-電冷却型荷電結合素子（CCD）カメラ（解像度：画素毎に16ビットのダイナミックレンジを有する385x578画素）（Astromed CCD 3200, Cambridge, UK）によって記録し、ビデオプリンター（ソニーマルチスキャンビデオプリンターUP-930）にハードコピーした。ポルフィリン蛍光の検出に用いたフィルターコンビネーションは、390-440nm励起フィルター、460nmビームスプリッターおよび>600nm放射フィルターから構成されていた。
結果
遊離ALAまたは上述したようなそのエステル誘導体の一つの局部的塗布後0.5、1、1.5、2.5、3、3.5および14時間のヌードマウス正常皮膚において、PpIX蛍光を、光学ファイバー型システムを用いて、その場で測定した。図1に示すように、PpIX蛍光は、全ての誘導体の場合において、局部的塗布後の1時間で既に強化されていたが、一方遊離ALAの塗布後では1.5時間で蛍光が見られた。最高蛍光強度は、全ての場合において塗布後14時間で見られたが、皮膚内でALAエステルから誘発されたPpIX蛍光は遊離ALAよりも強かった。さらに、図2に見られるように、塗布後14時間では、ALA-エステル-誘発PpIXの蛍光は、皮膚の他の領域および内部器官（耳、真皮、筋肉、脳および肝臓を含む）には検出されなかった。しかしながら、遊離ALAの場合には、強い蛍光が、皮膚の他の領域と同様に、耳にも観察された。即ち、局部的塗布の後、ALA-エステル-誘発PpIXは皮膚に局所的に発見されたが、一方遊離ALA-誘発PpIXは、局所的のみならず、皮膚の他の領域にも分布した。我々は、ALAが血液中に移送され、次にPpIXがヘム合成経路の酵素を含む全ての器官で形成され、かつ／またはPpIXが皮膚で形成され、次いで血液循環を介して他の組織に移送されたことを示唆する。後者の状況は、遊離ALAが非局部的に塗布された領域において、皮膚感光性を導くかもしれない。加えて、150mg/kgの投与量でのALAメチルエステル腹腔内注射の後では、マウスの皮膚におけるPpIX蛍光は注射後15分間で強化され、ピーク値は4時間付近に見られ、この蛍光は注射後10時間以内で消えた（図3）。この動力学的パターンは、同一投与量のi.p. 注射に続く皮膚における遊離ALA-誘発ポルフィリンの蛍光のものと同様であるが、蛍光はエステルの場合に、遊離ALAの場合よりも早く減少した。
実施例10
光学ファイバー型システムによるヒト基底細胞癌腫（BCC）および周囲正常皮膚におけるプロトポルフィリンIX産生の測定
ヒト患者のBCC病変および周囲正常皮膚におけるPpIX蛍光を、様々な時間間隔での20%遊離ALAおよびその誘導体の局部的塗布後に、光学ファイバー型システムによってその場で計測した。
図4、5、6および7は、遊離ALAと比較して、ALA誘導体-誘発PpIXがより早く強化され、かつより選択的にBCC病変に形成および局在化されたこと（即ち周囲正常皮膚ではより低い蛍光であったこと）を示し、特にALAメチルエステルの場合にそうである。
実施例11
生検のCCD顕微鏡検査によるヒトBCCおよび周囲正常皮膚におけるPpIX産生のインビボ蛍光表面測定
複合潰瘍性結節（multipe ulcero-nodular）を示す78才の白人男性において、BCC病変を、ALA単独（20%w/w）またはALAメチルエステル（20%w/w）を含む市販の水中油型クリーム（実施例7で説明したとおり）に暴露し、24時間半透過包帯で覆った。包帯およびクリームを除去した後、インビボ蛍光を、癌組織および隣接する正常皮膚の表面で分光蛍光計によって測定した。同じ領域のパンチ生検を分離し、サンプルを速やかに液体窒素に浸漬した。組織切片をクリオスタットミクロトームで厚さ8μmに切断した。組織切片におけるポルフィリン蛍光の局在パターンを、蛍光顕微鏡検査によって直接観察した。次に、同じ凍結切片を、組織学的同定のためのルーチンのH&E染色で染色した。蛍光顕微鏡検査は、Axioplan顕微鏡（Zeiss, Germany）を用いて行なった。蛍光画像および定量測定は、感光性熱-電冷却型荷電結合素子（CCD）カメラ（Astromed CCD 3200, Cambridge, UK）および画像プロセッシングユニット（Astromed/Visilog, PC 486DX2 66 MHz VL）によって行なった。このような定量測定の主な目的は、組織表面から癌病変基底層へのALA-誘発ポルフィリンの正確な浸透を決定することにある。結果は図8および9に示され、ここで蛍光強度は癌病変の深さの関数で示されている。
図8および9に示されるように、遊離ALAまたはそのメチルエステルの使用後、BCC病変全体の頂部から底部にわたって、PpIX蛍光の均一な分布が見られる。これは、ALAメチルエステルが、BCC病変での浸透およびPpIX産生について、遊離ALAと少なくとも同等に良好であることを示唆する。加えて、ALAメチルエステルの局部的塗布の後、PpIX蛍光は周囲正常皮膚では見られず、これはALA-メチルエステル-誘発PpIXが、非常に選択的にBCC病変においてのみ生じたことを示す。
24時間後のインビボ蛍光は、選択された腫瘍に対し、ALAと比較して、ALAメチルエステルに付いて少なくとも2倍の蛍光強度を示すとともに、周囲正常組織に対して増加を示したが、これは約50%のみであった。腫瘍および正常組織間の比は、ALAに付いて1.2：1、ALAメチルエステルに付いて2：1であった。結果を図10および11に示した。
処理後1週間のコントロールで、全ての処理区域が、腫瘍に対応する中央壊死領域を示した。クリームおよび光照射に曝された隣接正常皮膚において、ALAについては顕著な紅斑が観察されたが、一方ALAメチルエステルについては軽度の紅斑だけが観察された。
実施例12
生検のCCD顕微鏡検査によるヒトBCCおよび周囲正常皮膚におけるPpIX産生のインビボ蛍光表面測定
ここにあるデータは、患者の結節性基底細胞癌腫（BCC）および周囲正常皮膚での、4.5および24時間の遊離ALAおよびその誘導体の一つ（メチルエステル）の局部的塗布後におけるポルフィリン（主にプロトポルフィリンIX(PpIX)）の局在パターンおよび生産を示す。試験は、実施例11で説明されたように行なった。
以下の図の各々は、（B）BCC病変の基底層または周囲正常皮膚の蛍光画像の両方を示している。BCC病変または周囲正常皮膚の深さの関数として蛍光強度を示す曲線を、（A）に示した。
図12は、局部的塗布後4.5時間でのBCC基底層においてALAメチルエステルによって生成されたPpIX蛍光の均一な分布を示す。正常皮膚においても幾らかのポルフィリン蛍光がある（図13）。BCCおよび正常皮膚間の蛍光強度比は約2である。さらに、ALAメチルエステルで誘発された蛍光の絶対量は、以下に示されるように、遊離ALAおよび20%DMSOによって局部的塗布後に4.5時間で誘発された蛍光絶対量よりも高い。
図14および15は、BCC基底層および周囲正常皮膚において、24時間のALAメチルエステルの局部的塗布によって生成されたポルフィリン蛍光の均一な分布を示す。BCCにおける蛍光強度および正常皮膚における蛍光強度の比は約2である。さらに、BCCにおけるALAメチルエステル誘発ポルフィリンの蛍光強度は、以下に示されるように、遊離ALAだけの24時間局部的塗布後のBCCにおける蛍光強度の約2倍であった。
図16および17は、局部的塗布後24時間でのBCC基底層および周囲正常皮膚における、遊離ALA-誘発ポルフィリンの均一な分布を示す。しかしながら、BCCおよび正常皮膚間における蛍光強度の比は約1であり、これは、この処理の低い選択性を示す。さらに、BCCにおけるポルフィリン産生は、ALAメチルエステルの場合より低かった。
図18および19は、4.5時間の遊離ALAおよび20%DMSO局部的塗布後でのBCC基底層および周囲正常皮膚におけるALA-誘発ポルフィリンの均一な分布を示す。しかしながら、BCCおよび正常皮膚間における蛍光強度の比は1よりやや高いだけであり、これは、DMSOが多分、産生されたポルフィリンの癌腫選択性を減少させたことを示す。さらに、この場合においても、BCCにおけるポルフィリン産生は、ALAメチルエステル塗布の場合より低かった。
実施例13
キレート化剤デスフェリオキサミン（DF）および／またはDMSOの効果および皮膚の蛍光の調査
I．その場でのマウス正常皮膚における蛍光の強化に対するDFおよび／またはDMSOの効果を、ALA-メチルエステルの局部的投与後の様々な時間で確認した。方法は、実施例9で説明したように行なった。
結果
DMSOだけを含むクリームの局部的塗布では、正常マウス皮膚において如何なる蛍光も示されなかったが、DFのみが塗布された後にはPpIXの幾らかの蛍光があった。
DFまたはDFプラスDMSO（公知皮膚透過増強剤）は、ALAメチルエステル-誘導PpIXの産生を有意に増強させた。
II．3種の誘導体で処理した皮膚の蛍光イメージング（実施例9で説明したように実施）は、局部塗布後1時間の表皮、上皮毛包および皮脂腺におけるエステル誘導体-誘発ポルフィリンの蛍光を示した（図21）。ポルフィリンの蛍光強度は、塗布後時間とともに増加した。
概要
基底細胞癌腫（BCC）を有する多くの患者を、過去5年間にわたって我々の病院において、ALA-ベースPDTで局部的に処理してきたが、表面BCCの90%以上が完全な病状軽減を示した。しかしながら、結節性BCCは、ALA保持が劣っているために低い完全反応率しか有さず、その結果、病変の深層における低いALA-誘発ポルフィリン産生しか有さなかった。この技術を改善するために、我々は遊離ALAの代わりにALAエステル誘導体を用いた。ここで得られたデータは、その場での蛍光顕微鏡測定および組織生検の蛍光顕微鏡検査の両方によるこの実施例および実施例9にあり、研究された3種のエステル誘導体全てが、ヌードマウスの表皮、上皮毛包および皮脂腺において取り込まれ、脱エステル化され、最後に、遊離ALAよりも高いポルフィリン生産にて、ポルフィリンに転換されることを示す。これは、ALAエステル-誘発ポルフィリンの蛍光が、病変において、遊離ALA-誘発ポルフィリンよりも速く、高い強度で、かつより均一な分布で強化されたことを示すヒト結節性基底細胞癌腫の研究に関する前述の実施例と合致する。
この研究はまた、DFが、局部塗布後のマウス正常皮膚におけるALAメチルエステル誘導PpIX産生の増強において有意な効果を有することを示す。
興味深いことに、遊離ALA-誘発ポルフィリンの強い蛍光が、クリームを局部的に塗布した領域の以外の皮膚領域において発見された（図2）。これは、局部的塗布後に、遊離ALAが血液中に移送され、次にポルフィリンがヘム合成経路の酵素を有する全ての器官で形成されるか、或いはポルフィリンが最初に皮膚および／または肝臓で形成され、次いで血液循環を介して他の組織に移送されることを示す。これは、遊離ALAが局部的に塗布されなかった領域においても皮膚光感応性を導くかもしれない。しかしながら、研究されたどのエステル誘導体も、皮膚の他の部分でのポルフィリン蛍光を誘発させなかった。
実施例14
WiDrヒト結腸癌腫-移植ヌードマウスでの腫瘍成長に対するALAメチルエステルまたはALA、DFおよびDMSO PDTの効果
ヌードマウスに、WiDrヒト結腸癌腫細胞を、右脇腹領域への皮下注射によって移植した。上述の実施例において説明されたように処方した以下のクリーム：10%DFのみ；20%ALA+10%DF+20%DMSO；または20%ALAメチルエステル+10%DF+20%DMSOを、腫瘍部位に局部的に塗布し、14時間後レーザ光照射（632nm、150mW/cm2、15分間）を行なった。同じ腫瘍モデルを有し、クリームの局部塗布を受けなかった動物の別グループを、コントロールとして役立てた。処理された腫瘍の反応は、腫瘍退行／再成長時間で評価した。腫瘍が光照射日の体積の5倍に達したときに、マウスが殺された。結果を図22に示した。（棒：各グループにおける3〜5個体の動物に基づく平均の標準誤差（SEM））。結果は、腫瘍が光照射直前の日の体積の5倍に達するのに、ALAメチルエステル+DF+DMSOで処理された癌腫については34日間かかるのに対し、遊離ALA+DF+DMSOの場合には、処理腫瘍が5倍サイズに成長するのに24日間かかったことを示す。したがって、ALAメチルエステルは、癌腫再成長において、ALAよりも効果的である。
実施例15
ヒト以外の組織に対するALAエステル（メチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル）の選択性
ALAまたはそのエステルの局部的塗布（20%4時間）後のBCC病変および周囲正常細胞間におけるPpIX蛍光比を、上記実施例で説明した方法で試験した。結果は、図23に示され、全てのエステルが、BCC病変において遊離ALAよりも選択的にPpIXを誘発できることを示し、これは特にALA-メチルエステルおよびALA-ヘキシルエステルの場合にそうであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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