(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを出発原料とし、生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産する方法であって、グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物を用いたグルコースからリビトールを製造する段階と、リビトールからＬ−リブロースを生産する能力を有する微生物を用いたリビトールからＬ−リブロースを製造する段階と、Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生物を用いたＬ−リブロースからＬ−リボースを製造する段階を含み、リビトールがリビトール以外の物質を含有した未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであり、さらにＬ−リブロースがＬ−リブロース以外の物質を含有した未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであることを特徴とする、Ｌ−リボースの製造方法。
【請求項２】
グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物がトリコスポロノイデス属に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物がトリコスポロノイデス・マディダ、トリコスポロノイデス・ニグレスセンス、トリコスポロノイデス・エドセファリス、トリコスポロノイデス・メガチリエンシスおよび／またはトリコスポロノイデス・スパチュラータであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物がトリコスポロノイデス・エドセファリスおよび／またはトリコスポロノイデス・メガチリエンシスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリコスポロノイデス属に属する微生物が、ＣＢＳ２４０．７９、ＣＢＳ２６８．８１、ＣＢＳ２６９．８１、ＣＢＳ６４９．６６、ＣＢＳ５６８．８５、ＣＢＳ５６７．８５、ＣＢＳ２４１．７９、ＣＢＳ２４２．７９Ａおよび／またはＣＢＳ２４２．７９Ｂであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
トリコスポロノイデス属に属する微生物がＣＢＳ５６８．８５および／またはＣＢＳ５６７．８５であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
リビトールからＬ−リブロースを生産する能力を有する微生物がアセトバクター属、アルカリゲネス属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、アエロモナス属、オーレオバクテリウム属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クレブシエラ属、オクロバクトラム属、リゾビウム属、セラチア属、ロドバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、グルコノバクター属、ミクロコッカス属、パラコッカス属および／またはシュードモナス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リビトールからＬ−リブロースを生産する能力を有する微生物がグルコノバクター属に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リビトールからＬ−リブロースを生産する能力を有する微生物がグルコノバクター・フラテウリおよび／またはグルコノバクター・オキシダンスに属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生物がセルロモナス属および／またはアシネトバクター属に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生物が、セルロモナス・ゲリダ、セルロモナス・ビアゾテアおよび／またはセルロモナス・フラビゲナであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生物がＪＣＭ１４９０、ＡＴＣＣ４８６および／またはＡＴＣＣ４８２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
グルコースを出発原料とし、生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産し、得られたＬ−リボース含有液に有機溶媒を添加し、Ｌ−リボースを単独で析出させることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒が、低級アルコール類、アセトン、ヘキサン、アセトニトリルまたはトルエンであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安価な糖を出発原料とした多段階の生物反応によるＬ−リボースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、非天然型の糖類は医薬及び農薬の中間原料として注目されている。リボースに関しては天然型のＤ体はＤＮＡの構成糖としては勿論、種々のビタミンや補酵素の構成糖として全生物界に豊富に分布しているにもかかわらず、非天然型のＬ体はほとんど供給の目処が立っていないのが現状である。現在知られているＬ−リボースの主な生産方法としては、Ｌ−アラビノースを原料としたコバルト触媒による合成法が挙げられる。一方、微生物を用いてＬ−リボースを生産する方法としてはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus ）ＤＬ−２８株の産出する酵素がＬ−リブロースを異性化し、Ｌ−リボースを生産することが唯一報告されている（Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.81,No.6,493-497.1996 ）。
【０００３】
上記の酵素反応の原料であるＬ−リブロースの製造方法としては、Ｌ−アラビノースイソメラーゼによるＬ−アラビノースの異性化による方法（Methods Enzym. Anal.(3rd Ed.)(1984)vol.6 442-449）と精製されたリビトールを原料とした微生物反応により製造する方法（Biochem. J. vol. 64:385,1956）が知られているが、両方法とも原料であるＬ−アラビノースとリビトールは安価とは言い難く、工業的規模で安定的にＬ−リブロースを供給するプロセスまでは報告されていない。
【０００４】
上記２通りのＬ−リブロース生産方法の一方の原料であるリビトールの微生物による製造方法としてＤ−リボースを原料として酵素反応により製造する方法（特公昭４５−２０７１号公報、特公昭４９−１２７１８号公報）、グルコースなどの発酵により製造する方法（特公平６−３０５９１号公報、特公平６−３０５９２号公報、特公平６−３０５９３号公報、特公平６−３０５９４号公報）、及び藻類の炭酸固定による方法（特公昭４４−１６３５０号公報）が報告されている。
しかしながら、いずれの方法も工業的規模でＬ−リボースを生産するに至ってはおらず、従って、工業的規模でＬ−リボースを製造し、かつ生産されたＬ−リボース含有液からＬ−リボースを高純度、高収率で単離精製する技術は全く知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
実際に従来の方法を用いて工業的規模でＬ−リボースを生物学的に生産しようとした場合、種々の問題点が生じる。つまり第１段階である、リビトールを製造するに当たって、従来法の中では安価な原料であるグルコースなどの発酵による方法が望ましいが、この従来法でもエリスリトールなどの他の糖アルコールは効率的に製造できても、リビトールに関しては必ずしも満足のいく生産性を得られてはいない。
【０００６】
第２段階である、リビトールをＬ−リブロースに変換する技術に関して、従来法では原料のリビトールは精製されたものでなければならなかった。結晶リビトールは原料としては極めて高価である。また上述の発酵リビトールを利用する場合には、エリスリトールやグリセロールといったポリアルコールが多く含まれ、この中から収率よくリビトールのみを分離精製することは極めて困難であった。そこで、工業的に安価にＬ−リブロースを生産するために、リビトールを含有した発酵液または粗精製リビトールからリビトールを精製することなく直接Ｌ−リブロースに変換させる方法が望まれていた。
【０００７】
第３段階である、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換する反応においても、従来の技術では原料のＬ−リブロースは精製されたものである必要があった。精製Ｌ−リブロースは極めて高価な原料であり、上述のＬ−リブロース含有液から単離精製することは極めて困難であった。そこで目的物質であるＬ−リボースを工業的規模で安価に生産するために、リビトールを含有した発酵液または粗精製リビトールからリビトールを精製することなく直接Ｌ−リブロースに変換させ、さらにそのＬ−リブロース含有反応液からＬ−リブロースを精製することなく直接Ｌ−リボースに変換する方法が望まれていた。
一方、多段階生物反応による夾雑物の極めて多いＬ−リボース含有液からのＬ−リボースの単離精製法は全く知られていないため、有効な方法を開発する必要があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、安価な原料であるグルコースを出発物質として用い、数段階の微生物反応と精製を組み合わせることにより、重要な医農薬中間体である非天然型のＬ−リボースを安価に効率よく製造できる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、グルコースを出発原料とし、数段階の生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴とするＬ−リボースの製造方法に存する。
【０００９】
本発明の好ましい態様として、生物学的手法がグルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物を用いた、グルコースからリビトールの製造方法（以下、「第１段階」と称することもある）を含むこと、生物学的手法がリビトールからＬ−リブロースを生産する能力を有する微生物を用いた、リビトールからＬ−リブロースの製造方法（以下、「第２段階」と称することもある）を含むこと、及び、生物学的手法がＬ−リブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生物を用いた、Ｌ−リブロースからＬ−リボースの製造方法（以下、「第３段階」と称することもある）を含むことが挙げられる。
さらに、本発明の好ましい態様として、上記の生物学的手法を用いて生産したＬ−リボース含有液をゲル型濾過材に接触させること、及び、該Ｌ−リボース含有液に有機溶媒を添加し、Ｌ−リボースを単独で析出させることも挙げられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、グルコースを出発原料とし、数段階の生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴とするが、上記で延べた第１段階、第２段階及び／または第３段階を経る方法がその一例として挙げられる。以下はその方法を例として説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の第１段階で使用する微生物としては、グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されないが、好ましくはトリコスポロノイデス(Trichosporonoides) 属に属する微生物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロノイデス・マディダ（Trichosporonoides.madida）、トリコスポロノイデス・ニグレスセンス（Trichosporonoides.nigrescens）、トリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides.oedocephalis）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides.megachillensis）、トリコスポロノイデス・スパチュラータ（Trichosporonoides.spathulata）の種に属する微生物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロノイデス・エドセファリスとトリコスポロノイデス・メガチリエンシスの種に属する微生物が挙げられる。例えばトリコスポロノイデス・マディダに属する微生物としてＣＢＳ２４０．７９が、トリコスポロノイデス・ニグレスセンスに属する微生物としてＣＢＳ２６８．８１、２６９．８１が、トリコスポロノイデス・エドセファリスに属する微生物としてＣＢＳ５６８．８５が、トリコスポロノイデス・メガチリエンシスに属する微生物としてＣＢＳ５６７．８５が、トリコスポロノイデス・スパチュラータに属する微生物としてＣＢＳ２４１．７９、ＣＢＳ２４２．７９Ａ、ＣＢＳ２４２．７９Ｂが挙げられる。なお、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。変異株の具体例としてはトリコスポロノイデス・メガチリエンシスＭＣＩ３４４２株（通産省工業技術院生命工学工業技術研究所  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１７６）が挙げられる。
【００１１】
本発明の製造方法においては、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。
次に、本発明の第１段階での製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法において微生物はグルコースを炭素源として定法通り培養される。つまり、微生物は６０％（W/v ）以下、好ましくは２０〜４５％のグルコースを含む培地に植菌される。炭素源としては本微生物が資化しうるフルクトースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などを適宜加えることができる。さらにこの培地には本微生物が資化しうる窒素源が含まれる。窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリカー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、魚肉エキス、肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましくは、酵母エキスやコーンスティープリカー、が適宜使用される。培地中に含まれる窒素源の初発濃度は好ましくは、酵母エキスの場合０．５〜４．０％、コーンスティープリカーやの場合、１．０〜８．０％である。好ましい窒素源の濃度はグルコースの濃度に影響される。上述の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。また、上述のグルコースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。
培養は好気的条件下で行う。本発明において、本微生物はリビトール以外にエリスリトールとグリセロールを副生する場合があるが、リビトールの生成比率を効率よくするためには十分な通気を行うことが重要である。
培養温度は２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で、２４時間から２週間行う。
【００１２】
本発明の第２段階で使用する微生物としては好気的反応条件下、リビトールをＬーリブロースに変換する能力を有する微生物であれば特に限定はされないが、リビトールからＬーリブロースを製造し、かつリビトール以外の副生産されたポリアルコールを資化する能力を有する微生物が好ましく、より好ましくは、アセトバクター(Acetobacter) 属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属、アシネトバクター(Acinetobacter )属、アグロバクテリウム(Agrobacterium) 属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、アエロモナス(Aeromonas) 属、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属, クレブシエラ(Klebsiella)属、オクロバクトラム(Ochrobactrum)属、リゾビウム(Rhizobium) 属、セラチア(Serratia)属, ロドバクター(Rhodobacter) 属、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属、エンテロバクター(Enterobacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter) 属、ミクロコッカス(Micrococcus) 属、パラコッカス(Paracoccus)属、シュードモナス（Pseudomonas ）属に属する微生物である。特にグルコノバクター属に属する微生物がポリアルコールの資化性の点からも好ましい。
本発明において使用するグルコノバクター（Gluconobacter ）属に属する微生物は、例えばGluconobacter  frateurii、Gluconobacter  oxydans等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてGluconobacter  frateurii IFO 2508 、Gluconobacter  oxydans IFO 3293 が挙げられる。
【００１３】
本発明において使用するアセトバクター属に属する微生物は、例えば、Acetobactor acinus等が挙げられ、具体的な菌株としては、Acetobactor acinus  ＦＥＲＭ  Ｐ−２５０７が挙げられる。
本発明において使用するアルカリゲネス属に属する微生物は、例えばAlcaligenes aquamarinus, Alcaligenes epoxylyticus, Alcaligenes margaritae, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidansが挙げられる. さらに具体的な代表株として Alcaligenes aquamarinu FERM P-4299, Alcaligenes epoxylyticus FERM P-2511, Alcaligenes margaritae FERM P-2512, Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans IAM 12684, Alcaligenes paradoxus Biotype I DSM66,  Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162が挙げられる。
【００１４】
本発明において使用するアシネトバクター属に属する微生物は、例えばAcinetobacter tartarogenesが挙げられる。さらに具体的には、Acinetobacter tartarogenesIFO13644が挙げられる。
本発明において使用するアルスロバクター属に属する微生物は、例えばArthrobacter atrocyaneus, Arthrobacter pascens,  Arthrobacter ramousus等が挙げられる。さらに具体的には Arthrobacter pascens IFO12139, Arthrobacter atrocyaneus JCM 1329, Arthrobacter ramousus JCM1334等が挙げられる。
本発明において使用するアグロバクテリウム属に属する微生物は、例えばAgrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium viscosumが挙げられる。さらに具体的な代表株としてAgrobacterium radiobacter NRRL B-11291, Agrobacterium tumefaciens IAM13129, Agrobacterium viscosum IFO13652 が挙げられる。
【００１５】
本発明において使用するオーレオバクテリウム属に属する微生物は、Aureobacterium testaceumが挙げられる。さらに具体的な代表株として Aureobacterium testaceum JCM1353 が挙げられる。
本発明において使用するバチルス属に属する微生物は、例えばBacillus alvei, Bacillus coagulansが挙げられる。さらに具体的な代表株としてBacillus alvei IFO3343, Bacillus coagulans AHU 1631 が挙げられる。
本発明において使用するブレビバクテリウム属に属する微生物は、Brevibacterium busillum が挙げられる。さらに具体的な代表株としてBrevibacterium busillum IAM1489 が挙げられる。
【００１６】
本発明において使用するコリネバクテリウム属に属する微生物は、 Corynebacterium flaccumfaciens が挙げられる。さらに具体的な代表株として Corynebacterium flaccumfaciens ATCC12813 が挙げられる。
本発明において使用するエンテロバクター属に属する微生物は、Enterobacter aerogenesが挙げられる。さらに具体的な代表株としてEnterobacter aerogenes IFO13534 が挙げられる。
本発明において使用するクレブシエラ属に属する微生物は、例えばKlebsiella planticola, Klebsiella oxytoca , Klebsiella terrigenaが挙げられる。さらに具体的な代表株としてKlebsiella planticola NCIB11885, Klebsiella oxytoca JCM1665, Klebsiella terrigena JCM1687 が挙げられる。
【００１７】
本発明において使用するミクロコッカス属に属する微生物は、例えばMicrococcus roseusが挙げられる。さらに具体的な代表株としてMicrococcus roseus IFO 3764 が挙げられる。
本発明において使用するオクロバクトラム属に属する微生物は、Ochrobactrums anthropiが挙げられる。
さらに具体的な代表株としてOchrobactrums anthropi IAM 13993が挙げられる。
本発明において使用するパラコッカス属に属する微生物は、例えばParacoccus denitrificansが挙げられる。さらに具体的な代表株としてParacoccus denitrificans IFO13301 が挙げられる。
本発明において使用するシュードモナス属に属する微生物は、例えばPseudomonas fluorecens, Pseudomonas synxantha が挙げられる。さらに具体的な代表株としてPseudomonas fluorecens IFO 3903, Pseudomonas fluorecens ATCC13525, Pseudomonas synxantha IAM13256 挙げられる。
【００１８】
本発明において使用するアエロモナス属に属する微生物は、例えばAeromonas panctata、具体的には、Aeromonas panctata IF013288 が挙げられる。
本発明において使用するリゾビウム属に属する微生物は、例えばRhizobium validum IF013648が挙げられる。
本発明において使用するセラチア属に属する微生物は、例えばSerratia marcescens が挙げられ、例えばSerratia marcescens IF03054 、Serratia marcescens ATCC13880 が挙げられる。
本発明において使用するロドバクター属に属する微生物は、例えばRhodobacter sphaeroides が、例えばRhodobacter sphaeroides IF012003が挙げられる。
【００１９】
なお、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチルーＮ’ーニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理などによる変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝的手法により誘導される組み換え株などいずれの株であってもよい。上記微生物はリビトール以外の副生されたポリアルコールを資化し、リビトールを効率的にＬーリブロースに変換できるので、その後のＬーリブロースの分離・精製工程における負荷を著しく軽減することが出来る。
本段階においては、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。
【００２０】
次に、本発明の第２段階での製造方法について具体的に説明する。
本段階で用いるリビトール発酵液は菌体を含んでいても良いし、遠心分離などにより菌体を除去したものでもよい。またリビトールの発酵に用いた微生物を蒸気滅菌などにより殺菌したものでも良いし、殺菌を行っていない発酵液でも良い。またこの発酵液を簡便な方法を用いて精製させたものでもよい。例えば発酵液を除菌後、濃縮し晶析させたものでも良いし、また、カラムクロマトグラフィーなどで部分精製させたものでも良い。また発酵液を適当な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッファー、等、あるいは水を用いて希釈しても良い。あるいは濃縮させても良い。
これらの発酵液に微生物を好気的条件で作用させ、Ｌーリブロースを生成させる。
【００２１】
本発明の第２段階での微生物培養に用いる培地は微生物が生育でき、Ｌーリブロース生産能を誘導しかつポリアルコールの資化性を誘導する培地であれば、いずれでもよい。さらに培地は液体状でも良いし固体培地でも良い。炭素源としては本微生物が資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などが挙げられ、適宜一種あるいは２種以上が選ばれる。好ましくはポリアルコールの資化性を誘導するグリセロールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては本微生物が資化しうる窒素源であればいずれでも良いが、好ましくは、酵母エキス、コーンスティープリカー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキス、その他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源が適宜１種あるいは２種使用される。培地中に含まれる炭素源及び窒素源の濃度は０．０１％〜２０％の間で用いられる。炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、その他金属イオン類等が適宜数種類用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられ、適宜用いられる。また、上述のグルコースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。
【００２２】
培養は好気的条件下で行う。培養温度は４度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から４０度の範囲である。通気量は0.001vvm〜2vvm好ましくは0.5 〜1.5vvmの範囲で行われる。ｐＨは２〜１０、好ましくは３〜９の間である。
培養は１０時間から２日間行う。
培養後菌体をリビトール含有反応液に作用させる。このとき培養液を直接用いても良いし、遠心分離などにより菌体を培養液から分離させたものを用いても良い。またこの菌体をカラギーナン、ポリアクリルアミドゲル、イオン交換樹脂、珪藻土、活性炭等に固定化させたものを使用しても良い。また、菌体を超音波破砕機などで菌体を破砕したものを用いてもよい。
【００２３】
反応は好気的条件下で行う。反応温度は４度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から４０度の範囲である。ｐＨは２〜１０、好ましくは３〜８の間である。攪拌が十分に行われていれば特に通気の必要は無いが、好ましくは０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍの間で通気する。反応に用いる菌体量は湿潤菌体量換算でリビトール含有発酵液に対し０．００１％〜５０％（重量／体積）の間で用いられる。リビトールの濃度は特に限定されないが、好ましくは０．１から１５％の間である。含有されるポリアルコールの濃度は特に限定されない。反応は１時間から２週間行う。
【００２４】
反応により得られたＬーリブロースは、上記で得られた培養液を精製せずにそのまま用いても良いし、培養終了液から公知の方法により分離精製した後に第３段階の反応に供することもできる。即ち、培養終了後まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で除去する。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え、殺菌を行ってもよい。除菌された液は通常の分離方法、即ちクロマトグラフィーなどを用いることで容易に精製できる。工業的には、イオン交換樹脂を用いた疑似移動相型クロマトグラフィーにより分離することも可能である。分離精製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の糖の精製における操作を加えることもできる。
【００２５】
本発明の第３段階で使用する微生物としては、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されないが、好ましくはアシネトバクター属またはセルロモナス属に属する微生物であり、更に好ましくは、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus ）もしくはセルロモナス・ゲリダ（Cellulomonas gerida ）、セルロモナスビアゾテア（Cellulomonas biazotea ）またはセルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）の種に属する微生物が挙げられる。アシネトバクター属に属する微生物としてアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus ）ＤＬ−２８株、セルロモナス・ゲリダ（Cellulomonas gerida ）に属する微生物としてＪＣＭ１４９０が、セルロモナス・ビアゾテア（Cellulomonas biazotea ）に属する微生物としてＡＴＣＣ４８６が、セルロモナス  フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）に属する微生物としてＡＴＣＣ４８２等が挙げられる。また上記微生物は、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。また、欧州公開第８０７６８２号公報に記載のような酵素を用いてもよい。
なお、上記微生物は、紫外線照射やＮ- メチル- Ｎ'-ニトロ- Ｎ- ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等通常知られた方法による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝的手法により誘導される組み換え株などいずれの株であってもよい。
【００２６】
本発明の製造方法においては、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。
次に、本発明の第３段階の製造方法について具体的に説明する。
微生物は定法通り培養される。つまり、炭素源としては本微生物が資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸など、好ましくはグルコース、グリセロール、スクロース等が、更に好ましくはスクロースが用いられる。またこれらの炭素源は培養中に必要に応じて１種類あるいは複数種類適宜加えることができる。さらにこの培地には本微生物が資化しうる窒素源が含まれる。窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、大豆ペプチド、大豆粉末、コーンスティープリカー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましくは、酵母エキスや大豆ペプチド、ポリペプトンが適宜使用される。上述の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。また、上述のスクロースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。
【００２７】
培養は好気的条件下で行う。本発明において、Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産するイソメラーゼを高活性に発現させるために通常０．１〜２．０ｖｖｍ、好ましくは０．５〜２．０ｖｖｍで通気を行う。
培養温度は２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で、１２時間から４８時間行う。
培養により得られた菌体及び／または菌体処理物を第２段階で得られたＬ−リブロース含有発酵液および／または反応液と接触させ、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させる。Ｌ−リブロース含有発酵液および／または反応液はそのままこの第３段階の反応基質として用いてもよいし、遠心分離などにより第１および第２段階で用いた菌体を除去したものでもよい。またこれらの菌体を蒸気滅菌などにより殺菌したものでもよいし、殺菌を行っていない発酵液または反応液でもよい。またこの発酵液または反応液を公知の簡便な方法を用いて精製したものでもよい。水または適当な緩衝液を用いて希釈してもよいし、あるいは濃縮してもよい。
【００２８】
次に、異性化反応に供する菌体は培養液そのままを用いてもよいし、遠心分離等により集菌したものであってもよい。培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理、凍結乾燥処理、界面活性剤処理あるいはトルエン処理など菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、Ｌ−リブロースに作用し、Ｌ−リボースを生産する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体および／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。特に好ましい実施形態としては菌体をトルエン処理することが挙げられる。Ｌ−リブロース液に菌体とトルエンを加えてもよい。好ましくは、培養終了液から菌体を濃縮分離しトルエン処理を行って後、異性化反応に供する。
【００２９】
異性化反応は、ｐＨ４〜９．５、好ましくはｐＨ８．５〜９．０に調整したＬ−リブロース水溶液に上記菌体あるいは菌体処理物をリブロース１ｇ当たり、２ユニット以上、好ましくは６ユニット以上になるように添加し、温度１０℃〜５０℃、好ましくは、２０℃〜４０℃で行う。反応が進行するにつれ、反応液のｐＨが低下するため、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液にてｐＨを９．０付近に制御することが好ましい。用いた菌体の量により、反応は数秒から数日でＬ−リボースとＬ−リブロースが平衡に達して終了する。
【００３０】
以上３段階の工程により生成したＬ−リボースを精製する。本発明者らは鋭意検討の結果、通常の種々の精製技術をある順序、条件に従って組み合わせることにより、分離精製するに至った。本発明の製造方法において、Ｌ−リボースはグルコースを出発原料として例えば、３段階の生物反応により得られるが、この様に多段階の生物反応を行った場合、得られたＬ−リボース含有液は、未反応のＬ−リブロース以外にも微生物由来のタンパク質等の高分子物質、塩類、副反応で生成したと思われる有機酸類や、ジヒドロキシアセトン、その他少量の糖類、着色成分等の夾雑物を含む。これらの夾雑物は精製の早い時期に出来るだけ取り除いておくことが、その後の精製にとって望ましい。
【００３１】
反応終了後まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で除去する。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え、酵素失活および澱下げを行ってもよい。さらに除菌前または除菌後に炭酸飽充を行うことはその後の精製に大変有効である。除菌された液はＬ−リボース以外に未だ上述の夾雑物が多く含まれる。これらは通常の方法、即ちクロマトグラフィーや晶析技術を用いることで除去できる。夾雑物が多い場合は特に晶析に先立ってゲル型濾過材に接触させ、夾雑物の多くを除去することが好ましい。本発明で用いるゲル型濾過材としては、Ｌ−リボースと他の成分とを効率よく分離することが出来るものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン系イオン交換体が挙げられ、更に好ましくは架橋度４〜８％のアルカリ金属またはアルカリ土類金属型のカチオン系イオン交換体が挙げられる。かかるイオン交換体の具体例としては、ＵＢＫ−５３０、ＵＢＫ−５３５、ＵＢＫ−５５０、ＵＢＫ−５５５（いずれも三菱化学製）等が挙げられる。これらを用いてクロマト分離を行うことが好ましい。
【００３２】
具体的な精製手段としては、例えば上述したゲル型濾過材を脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡を除去した後分離カラムに充填する。該カラムに、充填した濾過材容量の１／２〜１／１００、好ましくは１／５〜１／２０量の粗Ｌ−リボース含有液を送入し、次いで水で溶出させてＬ−リボース画分とその他の画分とに分画する。このＬ−リボース画分を、通常知られた方法により脱塩脱色後、晶析を行うことにより高純度のＬ−リボースを得ることができる。
また工業的には分離効率を上げ、溶離水の使用量を減らす目的で、公知の種々のクロマト分離手法や疑似移動床法を用いることにより、さらに効果的な分画を行うこともできる。
分離精製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の糖の精製における操作を加えることもできる。
【００３３】
最終的に精製されたＬ−リボース液には未反応のＬ−リブロースが混在するが、この混合液よりＬ−リボース結晶得るには、晶析によりＬ−リボースのみを析出させる方法が好ましい。Ｌ−リボース含有液は十分にの濃縮され、好ましくはブリックス６０以上、さらに好ましくはブリックス８５以上、さらに好ましくはブリックス９０以上に濃縮される。この濃縮シロップを４℃に放置するとＬ−リボースのみが析出する。しかしこのような低温晶析では析出するまでの時間が長く、また析出率も満足のいくものではない場合が多く、好ましくは有機溶媒添加による方法が挙げられる。つまり、上述の十分に濃縮されたＬ−リボース含有シロップに、シロップの１／２〜１０倍量好ましくは１〜３倍量の有機溶媒を加え、十分に攪拌後、微量のＬ−リボース結晶を加え、４℃で２４時間放置する。添加する有機溶媒としては、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、アセトン、ヘキサン、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられ、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、更に好ましくはエタノールが挙げられる。晶析に先立って再度クロマト分離を行い、Ｌ−リボース含有液中からＬ−リブロースを除いておけば、さらに晶析率は上昇する。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
１）リビトール発酵上清の製造
３０Ｌ容量のジャーにグルコース３０％、魚肉エキス２％からなる培地１８Ｌを入れ、トリコスポロノイデス  メガチリエンシス（ＭＣＩ３４４２）の種培養１８０ｍＬを接種した。種培養液は、予めバッフル付きフラスコを用いてグルコース３０％、酵母エキス１％からなる培地中で３０℃、２日間、１６０ｒｐｍの振とう培養により得られた。ジャーは３３０ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、５日間培養を行った。得られた培養液から遠心分離により清澄な培養上清１２Ｌを得た。この発酵を５回行い、リビトール発酵上清６０Ｌを得た。各成分の濃度はリビトール８０ｇ／Ｌ、エリスリトール４ｇ／Ｌ、グリセロール４０ｇ／Ｌであった。
【００３５】
２）粗Ｌ−リブロース液の製造
グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateurii)(IFO2508) を１％グリセロール、０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトンよりなる培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌバッフル付きフラスコ２本に接種した。１６０ｒｐｍで回転する振とう培養機にセットし、３０℃で１日間培養を行った。３０ｌジャーファーメンターに３％グリセロール、０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトンよりなる培地を２０ｌ仕込み、１２０度２０分殺菌した。これに先の培養液を２００ｍｌ植菌し、３０度で、ｐＨを５以下にならないように５Ｎ水酸化ナトリウムでコントロールしながら１日培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して、培養上清除き、グルコノバクター・フラテウリの菌体を得た。
上記１）で製造したリビトール発酵上清液を１５ｌ仕込んだ３０ｌジャーファーメンターに入れ、得られたグルコノバクターの菌体を入れ、３０度、通気１ｖｖｍ、攪拌３３０ｒｐｍの条件で反応した。反応１日後、反応液１ｍｌを遠心分離にかけて菌体を除き、反応上清を下記の高速液体クロマトグラフィー分析した。リビトールは完全に変換され、エリスリトール及びグリセロールは検出されなかった。生成したＬーリブロースは７８．２ｇ／Ｌであった。グリセロールはジヒドロキシアセトンに変換されており、生成量は２３．３ｇ／ｌであった。エリスリトールはエリスルロースに変換されていたが、生成量の測定はスタンダードの試薬が、純度不明瞭のため、正確な測定ができなかった。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
３）粗Ｌ−リボース液の製造
上記２）で得られたＬ−リブロース含有発酵液に引き続き異性化反応に供する菌体のトルエン処理物が加えられた。即ち、２）で得られたＬ−リブロース液は、除菌その他の処理を施すことなく、同一ジャー内で連続して異性化反応が行われた。具体的には２）の反応終了時点でＬ−リブロース含有発酵液を水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ９．０に調整し、続いて下記４）で得られたトルエン処理菌体１Ｌを加えて、異性化反応を開始した。ジャーは反応温度２８℃、１１２ｒｐｍに制御され、ｐＨは１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて８〜８．５の間で緩やかに制御された。２４時間後Ｌ−リボースとＬ−リブロースの混合比が約７：３に達し、反応は終了した。
遠心分離により反応終了液から菌体を除き清澄な粗Ｌ−リボース液１５．１Ｌを得た。含有するＬ−リボースは３９．１ｇ／Ｌ、Ｌ−リブロースは１６．０ｇ／Ｌ、ジヒドロキシアセトンは７ｇ／Ｌであった。
【００３８】
４）異性化反応用トルエン処理菌体の製造
アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus ）ＤＬ−２８株の種培養液をスクロース  ２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ、大豆ペプチド  ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ／Ｌ、リジン一塩酸塩５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地２０Ｌを入れた３０Ｌジャーに１％接種した。種培養は予め同一培地を用いてバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１２時間振とう培養して得られた。ジャーは３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１６時間培養を行った。得られた培養終了液を遠心分離して上清を除き、１０倍濃縮菌体液を１．７Ｌを得た。この濃縮菌体１．７Ｌトルエンを２７ｍＬ加え、１５分間激しく混合した。
【００３９】
５）粗Ｌ−リボース液の精製
３）で得られた粗リボース液をエバポレーターにてブリックス４０まで濃縮した後、カラムクロマトグラフィーの原料に供した。
特開昭６３−１５８１０５号公報に記載された疑似移動床型のクロマト分離系（充填材が充填された充填床の前端と後端とが流体通路で連結され、流体の循環を可能にしたもの）において、充填材としてＮａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ−５３０，三菱化学社製）を使用し、脱着剤として水を使用した。内径２８ｍｍ、充填層高５００ｍｍの直列に連結した４本のカラムに前記充填材を合計で１２４０ｍＬ充填した充填床を６５℃に保ち、床内を容積流速６００ｍＬ／ｈｒで通液し、供給はすべて第１カラム、抜き出しはすべて第４カラムとし、下記表１に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表２に示す。Ｌ−リボースの回収率は８１．８％であった。また、原料に含まれていた着色成分も多くはＬ−リボース以外のその他の画分に分離されており、Ｌ−リボース画分の着色はクロマト分離前に比べて大幅に軽減されていた。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【００４２】
得られたＬ−リボース含有画分を分子量分画１００００の中空糸型限外濾過膜にて濾過した後、カチオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、続いてアニオン交換樹脂を充填したカラムに通液した。以上の脱塩脱色工程を経たＬ−リボース含有液は無色透明であるが、場合により若干の着色成分の残ることがあった。その場合は少量の活性炭を加え６０℃で１時間攪拌後、ケイソウ土濾過により活性炭を除くことで残る着色成分を除いた。このようにして得られた無色透明のＬ−リボース含有液をエバポレーターにてブリックス８７まで濃縮後、シロップの２倍容量のエタノールを添加し、微量のＬ−リボース結晶を種晶として加え、４℃で２４時間静置したところ、Ｌ−リボース結晶が析出した。この結晶を冷エタノールで数回洗浄した後乾固し、純度９９．９％の結晶を得た。晶析率は７０％であった。
尚、晶析後の母液からエタノールを留去し、再度濃縮してエタノールおよび種晶を加え、低温で放置することで２番晶、３番晶を得ることができた。
【００４３】
実施例２
１）リビトール発酵上清の製造
実施例１の１）と同様に培養を行い、培養上清１２Ｌを得た。各成分の濃度はリビトール８０ｇ／Ｌ、エリスリトール５ｇ／Ｌ、グリセロール５０ｇ／Ｌであった。
【００４４】
２）粗Ｌ−リブロース液の製造
グルコノバクター・フラテウリ（ＩＦＯ２５０８）を実施例１と同様に培養して、培養液１８Ｌを得た。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を除き、菌体を１００ｍＭのリン酸緩衝液バッファー（ｐＨ７．０）１．８Ｌに懸濁した。
３０Ｌジャーに１）で得られたリビトール発酵上清１２Ｌを入れ、グルコノバクター懸濁液を１．８Ｌを加えて、３０℃にて３００ｒｐｍで攪拌し、通気１ｖｖｍで１日間反応を行った。反応終了液を遠心分離して菌体を除き清澄な粗Ｌ−リブロース液１２．５Ｌを得た。生成したＬ−リブロース濃度は７５ｇ／Ｌ、ジヒドロキシアセトン２９ｇ／Ｌであった。
【００４５】
３）粗Ｌ−リボース液の製造
セルロモナス・ゲリダ（ＪＣＭ１４９０）をスクロース  ２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ、大豆ペプチド  ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ／Ｌ、Ｌ−リボース１５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地１８Ｌを入れた３０Ｌジャーに１％接種した。種培養は予め同一培地を用いてバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１８時間振とう培養して得られた。ジャーは３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１８時間培養を行った。得られた培養終了液を遠心分離し、集菌した。菌体ペレットにグリシン−塩酸緩衝液（５０ｍＭ・ｐＨ８．５）を１．８Ｌを加え均一に懸濁した後、トルエンを６０ｍＬ加え、１５分間激しく混合した。このように調整したトルエン処理菌体１．２Ｌを２）で得られた粗Ｌ−リブロース液１２．５Ｌに加え、均一になるよう緩やかに攪拌しつつ３０℃で２４時間反応を行った。途中、１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨ８．５に制御した。得られた反応終了液を遠心分離して菌体を除き、さらに０．２２μｍ孔径の精密濾過膜を通して清澄な粗Ｌ−リボース液１２Ｌを得た。Ｌ−リボース濃度は３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リブロース濃度は１３ｇ／Ｌであった。
【００４６】
４）粗Ｌ−リボース液の精製
３）で得られた粗リボース液をエバポレーターにて濃縮し、２．７Ｌの粗リボースシロップを得た。このシロップの濃度はブリックス６３、Ｌ−リボースの対固形分比率はＨＰＬＣのピーク面積換算で約３８％、Ｌ−リブロースの比率は１５％であった。このシロップをカラムクロマトグラフィーの原料に供した。即ちイオン交換樹脂ＵＢＫ−５５０（三菱化学社製）３２０ｍＬを充填したカラム４本を直列に接続し、カラム温度を６５℃に保った状態でその一方の端から流速６００ｍＬ／ｈｒで粗リボースシロップ６４ｍＬを供給した。次いで水を流速６００ｍＬ／ｈｒで送入し、シロップをカラム内で展開、分離させながらカラム末端に移動させた。水を送入して７８分後から目的とするＬ−リボースが流出し始めた。さらに１２分してから流出液をＬ−リボース含有画分として採取を開始した。水の送入開始から１２４分後Ｌ−リボースの流出がほぼ終わったので、サンプル回収を停止した。このＬ−リボース含有画分中のＬ−リボースの対固形分比率はＨＰＬＣのピーク面積換算で８０％、Ｌ−リブロースの比率は１４％であり、Ｌ−リボースの回収率は８０．１％であった。このＬ−リボース画分をさらに実施例１記載と同様の脱塩脱色処理をした後、ブリックス９０まで濃縮し４℃で１ヶ月静置したところ、Ｌ−リボース結晶が析出した。この結晶を冷アルコール等で洗浄し、乾固したところ純度９９％のＬ−リボース結晶が得られた。
【００４７】
実施例３
実施例１の疑似移動床法にて得られたＬ−リボース含有画分をさらにカラムクロマトグラフィーの原料に供した。
実施例１と同様のクロマト分離系を用い、充填材としてＣａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ−５５５，三菱化学社製）を使用した。下記表３に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表４に示す。Ｌ−リボースの回収率は７２．４％であった。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【００５０】
得られたＬ−リボース画分を実施例１と同様に脱塩脱色処理した後、ブリックス８７まで濃縮し、２−プロパノールを２倍量と微量のＬ−リボース結晶を加え、４℃で１２時間攪拌したところ純度９９．５％のＬ−リボース結晶が得られた。
なお、各実施例において得られた培養上清に含まれるリビトールなどの糖類含量は高速液体クロマトグラフィーにより各々下記の条件で測定した。各糖質の保持時間は下記分析条件Ａにおいて、グルコース１０．５７分、リビトール１２．２２分、エリスリトール１３．３６分、グリセロール１５．０９分である。また、下記分析条件Ｂにおいて、Ｌ−リブロース２２．８分、Ｌ−リボース２４．０分である。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、数段階の生物学的反応により、安価なグルコースを出発原料としてＬ−リボースを効率よく生産することができる。