(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）β−コングリシニンα'−サブユニットプロモーター領域；及び
（ii）（ｉ）のプロモーターに対してセンスの向きに置かれる、ダイズのデルタ−１２デサチュラーゼの全長をコードする核酸フラグメント；及び
（iii）フォゼオリン３'末端領域；
を含んでなるキメラ遺伝子を構築し、
（ｂ）（ａ）のキメラ遺伝子をダイズ種子中に導入することによりトランスジェニックダイズ種子を作製し、そして
（ｃ）工程（ａ）のキメラ遺伝子の発現をもたらす条件下で工程（ｂ）のトランスジェニックダイズ種子を生育する
ことを含んでなり、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子を含有しないダイズに比較した場合に、β−コングリシニンのα−及びα'−サブユニットの量、並びに、ダイズのデルタ−１２デサチュラーゼの量が減少している、３種のダイズ遺伝子の発現を同時に減少するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現がトランスジェニック植物の種子貯蔵タンパク質特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）の変化をもたらすように改変されているトランスジェニックダイズ系統の構築に関する。そのように改変されたトランスジェニックダイズ系統は独特で有益な機能特性を有する新規なダイズタンパク質製品の製造のために用いられる。
【０００２】
【発明の背景】
ダイズ種子は乾量に基づいて３５％から５５％までのタンパク質を含有する。このタンパク質の大部分は貯蔵タンパク質であり、それは発芽中に加水分解され、発生中の実生により必要とされるエネルギー及び代謝中間体を与える。収穫され、家畜類の飼料として利用される場合にダイズ種子の貯蔵タンパク質は重要な栄養供給源である。さらに、ダイズはヒト消費のためのタンパク質の最も経済的な供給源であることが現在一般的に認識されている。ダイズタンパク質またはタンパク質単離物はすでに世界の様々な地域で食品のために広く用いられている。ダイズ種子中の貯蔵タンパク質の量及び質を向上するために多くの努力が捧げられている。
【０００３】
大部分の植物種の種子は当該技術分野で種子貯蔵タンパク質として知られているものを含有する。これらはそれらの大きさ及び溶解性に基づいて分類されている（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｔ．Ｊ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１）。全てのクラスが全ての種で見いだされるわけではないが、大部分の植物種の種子は１クラスより多くからのタンパク質を含有する。通常、特定の溶解性または大きさのクラス内のタンパク質は同じ種内の異なるクラスのメンバーよりも他の種の同じクラスのメンバーに構造的に相関している。多くの種において、一定のクラスの種子タンパク質はしばしば多重遺伝子ファミリーによりコードされ、時折、それらのファミリーを配列相同性に基づいてサブクラスに分けることができるように複雑である。
【０００４】
２種の主要なダイズ種子貯蔵タンパク質：グリシニン（１１Ｓグロブリンとしても知られている）及びβ−コングリシニン（７Ｓグロブリンとしても知られている）がある。これらは合わせて種子の全タンパク質の７０ないし８０％または種子の乾量の２５ないし３５％を構成する。グリシニンは約３６０ｋＤａの分子量を有する大きなタンパク質である。それはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５と同定された（一般的にサブユニットと呼ばれる）５個の主要なアイソフォームの各種組み合わせからなるヘキサマーである。各サブユニットは今度はジスルフィド結合によりつながれた１個の酸性及び１個の塩基性ポリペプチドからなる。単一のサブユニットの酸性及び塩基性ポリペプチドの両方が単一の遺伝子によりコードされる。従って、５個のグリシニンサブユニットをコードする５個の非対立遺伝子がある。これらの遺伝子はＧｙ１、Ｇｙ２、Ｇｙ３、Ｇｙ４及びＧｙ５と命名され、それぞれサブユニットＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５に対応する（Ｎｉｅｌｓｅn、Ｎ．Ｃ．等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：３１３−３２８）。
【０００５】
グリシニンサブユニット遺伝子のゲノムクローン及びｃＤＮＡはシークエンスされており、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性に基づいて２つの群に分かれる。群ＩはＧｙ１、Ｇｙ２及びＧｙ３からなり、一方、群IIはＧｙ４及びＧｙ５からなる。群内の遺伝子間には８５％より高い類似性がある（すなわち、Ｇｙ１、Ｇｙ２及びＧｙ３のヌクレオチドの少なくとも８５％が同一であり、Ｇｙ４及びＧｙ５のヌクレオチドの少なくとも８５％が同一である）が、群Ｉと群IIの遺伝子間では４２％ないし４６％の類似性があるのみである。
【０００６】
β−コングリシニン（７Ｓグロブリン）は１５０ないし２４０ｋＤａの範囲の分子量を有するヘテロ糖タンパク質である。それはα、α’及びβと同定された３個の非常に負に荷電したサブユニットの各種組み合わせからなる。α及びα’サブユニットをコードする遺伝子のコーディング領域に相当するｃＤＮＡクローンはシークエンスされており、それらは類似した大きさのものであり、配列同一性は８５％に限定される。しかしながら、βサブユニットのコーディング領域に相当するｃＤＮＡの配列はα及びα’ｃＤＮＡよりほぼ０.５ｋｂ小さい。この欠失を除いて、α及びα’サブユニットに対する配列同一性は７５−８０％である。３クラスのβ−コングリシニンサブユニットがゲノムダイズ内のいくつかの領域に集まる全部で１５のサブユニット遺伝子によりコードされる（Ｈａｒａｄａ、Ｊ．Ｊ．等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４１５−４２５）。
【０００７】
タンパク質濃縮物、単離物及び人造肉（ｔｅｘｔｕｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）製品のような新規なダイズに基づく製品は伝統的な東洋のダイズに基づく食品を必ずしも受け入れない国々でますます利用される。しかしながら、食品用途におけるこれらの新規な製品の使用は、局所的嗜好及び製法条件に関連したタンパク質製品の機能特性による。過去１０年にわたって、ダイズタンパク質の機能特性の理解にかなりの努力が向けられている。機能特性の例は水吸着パラメーター、湿潤性、膨潤、水分保持、溶解性、増粘、粘性、凝固、ゲル化特性及び乳化特性を含む。この研究の本体の大部分はβ−コングリシリン及びグリシニンタンパク質の個々の研究並びにこれらのタンパク質の各々が全体としてダイズタンパク質系にどのように影響を及ぼすかに集中している（Ｋｉｎｓｅｌ１ａ、Ｊ．Ｅ．等（１９８５）Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｏｄｓ ５：１０７−１７９；Ｍｏｒｒ、Ｃ．Ｖ．（１９８７）ＪＡＯＣＳ ６７：２６５−２７１；Ｐｅｎｇ、Ｌ．Ｃ．等（１９８４）Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ ６１：４８０−４８９）。機能特性はタンパク質の物理化学特性に直接関係するので、β−コングリシリン及びグリシニンの構造的違いにより著しく異なる機能特性を有するこれら２つのタンパク質が生じる。熱凝集、乳化特性及び水分保持能力の違いが報告されている。さらに、ゲル化特性も同様に異なり、グリシニンはより大きい引張歪、応力及び剪断強度、より優れた溶媒保持能力並びにより低い濁度を有するゲルを形成する。しかしながら、現在製造されているダイズタンパク質製品はグリシニン及びβ−コングリシリンの両方のブレンドであり、それ故、グリシニン及びβ−コングリシリンの個々の特性のブレンドによる機能特性を有する。例えば、グリシニンは１００℃に加熱されると約５０％のタンパク質が可溶性凝集体に迅速に転化される。さらなる加熱は凝集体の増大及びそれらの沈殿を生じる。沈殿物はグリシニンの塩基性ポリペプチドからなり、酸性ポリペプチドは可溶性のままである。β−コングリシリンが存在すると塩基性ポリペプチドと可溶性複合体を形成することによりそれらの沈殿を防ぐ。熱変性が望ましいかどうかは意図される用途による。ただ１種または他の貯蔵タンパク質を含有するダイズタンパク質製品を製造できる場合、特定のダイズタンパク質に由来する特定の物理特性を必要とする製品が利用できるようになり、またはそれらは製造するためにより経済的である。
【０００８】
過去２０年にわたって、各種貯蔵タンパク質サブユニットの１種またはそれ以上を欠いているダイズ系統（ヌル突然変異）がダイズ胚原質で同定されるかまたは突然変異育種技術を用いて製造されている。突然変異事象を組み合わせる育種努力により、通常の約半分量のβ−コングリシニンを種子が含有するダイズ系統が生じている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．等（１９９４）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４４：６５−６６；Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｊ．（１９９５）ＪＡＲＱ ２９：１−８）。β−コングリシニンの減少は３種の独立した劣性突然変異により制御される。グリシニンサブユニットヌル突然変異の組み換えにより、著しく減少した量のグリシニンを種子が含有する系統が生じている（Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｊ．（１９９５）ＪＡＲＱ ２９：１−８）。ここでも、減少は３種の独立した劣性突然変異により制御される。上記の系統から作物栽培学的に生育できるダイズ変種で、種子がグリシニンまたはβ−コングリシニンのみを含有するものを開発することは時間がかかり、多大の費用を要する。各異種交配は３種の突然変異事象の独立した分離を生じる。さらに、各突然変異事象はホモの状態であることが必要である。高収率の作物栽培学的に優れたダイズ系統の開発は多世代にわたる非常に多数の子孫のスクリーニング及び分析を必要とする。
【０００９】
アンチセンス技術が種子の特定の貯蔵タンパク質を減少するために用いられている。ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）において、ナピン（２Ｓアルブミン）及びクルシフェリン（１１Ｓグロブリン）はそれぞれ全種子タンパク質の約２５％及び６０％を構成する２つの主要な貯蔵タンパク質である。ナピンタンパク質は１６遺伝子までの大きな多重遺伝子ファミリーによりコードされ、いくつかのｃＤＮＡ及びゲノムクローンがシークエンスされている（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ、Ｌ．−Ｇ．等（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６２：１２１９６−１２２０１；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、Ｓ．及びＣｒｏｕｎｃｈ、Ｍ．Ｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２２０２−１２２０８）。これらの遺伝子はそれらのコーディング及び隣接領域の両方で９０％より高い配列同一性を示す。クルシフェリン遺伝子ファミリーは同様に複雑であり、全部で８遺伝子を有する３サブファミリーを含んでなる（Ｒｏｄｉｎ、Ｊ．等（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５５９−５６３）。Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ等（（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１１１５−１１２４）は、ｎａｐ Ａプロモーターにより導かれるｎａｐＡ遺伝子を用いるナピンアンチセンス遺伝子を用いて種子がナピンをほとんどまたは全く含有しないトランスジェニック植物を構築できることを示した。
【００１０】
同じグループ（Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ等（１９９５）Ｔｈｅｏｒ ｅｔ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９１：６２７−６３１）は、ｎａｐ Ａプロモータの制御下でクルシフェリン遺伝子（ｃｒｕＡ、α２／３アイソフォームをコードする）のアンチセンス型を発現することによりブラシカ・ナプスにおいてクルシフェリン（１１Ｓグロブリン）を減少しようと試みた。この場合、結果はより複雑であった。クルシフェリンは配列同一性に基づいて３つのサブクラス（α１、２／３及び４）に分けられ、これらのクラスは各々相互に６０−７５％の配列同一性がある（Ｒｏｄｉｎ、Ｊ．等（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５５９−５６３）。α２／３アイソフォームをコードするアンチセンス遺伝子の発現はより低いレベルのα１及び２／３型を生じた。しかしながら、α４クラスの発現の減少はなかった。
【００１１】
コメでは種子貯蔵タンパク質、グルテリンのレベルを減少するためにアンチセンス技術が用いられた。全長のアンチセンスグルテリンコーディング領域に機能的に連結された種子特異的グルテリンプロモータの発現はグルテリンタンパク質レベルの約２５％の減少をもたらした（米国特許番号第５,５１６,６６８号）。
【００１２】
【発明の要約】
本発明はダイズにおいてグリシニンまたはβ−コングリシニン（それぞれ、１１Ｓまたは７Ｓグロブリン）種子貯蔵タンパク質の量を減少するための方法を提供する。一つの態様として、種子タンパク質遺伝子の７Ｓ−グロブリンクラスをコードする遺伝子の発現を抑制するために共抑制技術が用いられた。７Ｓグロブリンの２個（α及びα’）または３個全てのサブクラス（α、α’及びβ）をコードする遺伝子は、β−コングリシニンの単一のサブクラス（α）をコードする遺伝子の発現により抑制され、改変された種子貯蔵特性を有するダイズ系統を生じた。別の態様として、片方のみが種子タンパク質遺伝子である２個の全く異なる遺伝子を抑制するための方法が提示され、種子組成の複数の変化を与える。意外にも、発現がトランスジェニックダイズ種子の脂肪酸特性を変えるダイズ遺伝子のコーディング領域に機能的に連結されたダイズ種子貯蔵タンパク質のプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子の発現により、２つの異なる表現型形質：種子貯蔵タンパク質特性及び種子油特性が同時に改変された。
【００１３】
本明細書に教示されるダイズ種子貯蔵タンパク質の量を減少するための方法は以下の工程：
（ａ）（ｉ）ダイズ種子の細胞において機能できるプロモーターをコードする核酸フラグメント、（ii）（ｉ）のプロモーターに対してセンスまたはアンチセンスの向きに置かれたダイズ種子貯蔵タンパク質の全部または一部をコードする核酸フラグメント及び（iii）転写終結領域を含んでなるキメラ遺伝子を構築し、
（ｂ）（ａ）のキメラ遺伝子をダイズ細胞中に導入することによりトランスジェニックダイズ細胞を作製し、そして
（ｃ）工程（ａ）のキメラ遺伝子の発現を生じる条件下で工程（ｂ）のトランスジェニックダイズ細胞を生育する
ことを含んでなり、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子を含有しないダイズに比較した場合にダイズ種子貯蔵タンパク質サブユニットのあるクラスの１個またはそれ以上のメンバーの量が減少している。
【００１４】
【発明の詳述】
配列表の説明：
以下の詳細な説明及び本出願の一部を形成する配列表から本発明をより完全に理解することができる。配列表は引用することにより本明細書に組み込まれる３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１.８２２に定義されるようなアミノ酸の３文字コードを含む。
配列番号１はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のαサブユニットをコードする５'→３'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号２はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα’サブユニットをコードする５'→３'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号３はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のβサブユニットをコードする５'→３'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号４及び５はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする核酸フラグメントを単離するために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎＳ及びＣｏｎｌ．４ａ（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６及び７はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする核酸フラグメントを区別するために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎ．０９及びＣｏｎ．８（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８及び９はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを単離するために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎＳａ及びＣｏｎ１．９ａ（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを確認するために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎ．１．０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１、１２及び１３は群Ｉグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のＧｙ１、Ｇｙ２及びＧｙ３サブユニット（それぞれ）をコードする５'→３'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４及び１５は群IIグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のＧｙ４及びＧｙ５サブユニット（それぞれ）をコードする５'→３'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６、１７及び１８は群Ｉグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のサブユニットをコードするｃＤＮＡを単離するために用いられるＰＣＲプライマーＧ１−１、Ｇ１−１０３９及びＧ１−１４７５（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９、２０及び２１は群IIグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のサブユニットをコードするｃＤＮＡを単離するために用いられるＰＣＲプライマーＧ４−７、Ｇ４−１２５１及びＧ４−１６７０（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
添付図面において：
図１は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＭＬ７０の制限地図である。
図２は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＣＷ１０９の制限地図である。
図３は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＫＳ１８ＨＨの制限地図である。
図４はプラスミドｐＪｏ１の制限地図である。このプラスミドは植物転写単位ＫＴｉプロモーター／β−コングリシニンの欠失したαサブユニット／ＫＴｉ３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより得られた。
図５はｐＪｏ１で形質転換された体細胞胚から抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
図６はプラスミドｐＢＳ４３の制限地図である。このプラスミドはダイズβ−コングリシニンプロモーターの転写制御下にグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ミクロソームのデルタ−１２デサチュラーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
図７はｐＢＳ４３で形質転換された植物より得られたダイズ種子から抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
図８はプラスミドｐＪｏ３の制限地図である。このプラスミドは植物転写単位ＫＴｉプロモーター／β−コングリシニンのαサブユニットの全長ｃＤＮＡ／ＫＴｉ３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉｎｄIII部位にクローニングすることにより得られた。
図９はプラスミドｐＲＢ２０の制限地図である。このプラスミドは転写単位β−コングリシニンプロモーター／ファゼオリン３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉｎｄIII部位にクローニングすることにより得られた。これは本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられる。
【００１６】
生物学的寄託物
以下のプラスミドはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２にブダペスト条約の条件下で寄託されており、以下の登録番号を有する。
プラスミド   登録番号        寄託日      
ｐＪｏ１       ＡＴＣＣ９７６１４    １９９６年６月１５日
ｐＢＳ４３     ＡＴＣＣ９７６１９    １９９６年６月１９日
ｐＪｏ３       ＡＴＣＣ９７６１５    １９９６年６月１５日
【００１７】
定義
本開示の文脈上多数の用語が用いられる。「核酸」という用語は、糖、リン酸及びプリンまたはピリミジンのいずれかを含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる、一本鎖または二本鎖であってもよい高分子をさす。「核酸フラグメント」は与えられた核酸分子の断片である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡ中の情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は生物の各細胞中に含まれる遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中に取り込むことができる合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を場合により含有していてもよい、一本鎖または二本鎖であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの配列をさす。
【００１８】
本明細書に用いられる場合、「相同な」という用語は２個の核酸分子のヌクレオチド配列間または２個のタンパク質分子のアミノ酸配列間の相関性をさす。そのような相同性の見積もりは当業者によく理解されているようなストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリダイゼーション（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ、編集（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ等（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）の方法のような２個の核酸またはタンパク質間の配列類似性の比較により与えられる。
【００１９】
本明細書に用いられる場合、「本質的に類似した」はコードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変化を含む可能性があるか、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸を変える可能性があるがＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変化を含むＤＮＡ配列をさす。従って、本発明は特定の代表的な配列より多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性を実質的に変えないサイレント変化を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配列の改変も意図される。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するかまたは与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変も意図され、従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンをグリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンのような別の疎水性アミノ酸残基をコードするコドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のようなある負に荷電した残基の同種のものでの置換、またはアルギニンの代わりにリシンのようなある正に荷電した残基の同種のものでの置換を生じる変化も生物学的に同等な産物を生じると予想することができる。タンパク質分子のＮ末端及びＣ末端部分の変化を生じるヌクレオチド変化もタンパク質の活性を変えると予想されない。ある場合では、実際、タンパク質の生物学的活性に対する改変の影響を研究するために配列の突然変異体を作製することが望ましいことがある。コードされる産物の生物学的活性の保持の測定のように、提示される改変の各々は当該技術分野の慣例技術の十分範囲内である。さらに、本発明により包含される「本質的に類似した」配列を厳しい条件下（０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃）で本明細書に例示される配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても特定できることを当業者は認識する。
【００２０】
「遺伝子」はコーディング領域の前（５'非コーディング）及び後ろ（３'非コーディング）の調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをさす。「天然の」遺伝子は天然に見いだされるそれ自体の調節配列を有する単離された遺伝子をさす。「キメラ遺伝子」は天然に見いだされない異種の調節及びコーディング配列を含んでなる遺伝子をさす。「内在性」遺伝子はゲノム中のその天然の位置に通常見いだされ、単離されていない天然の遺伝子をさす。「外来」遺伝子は宿主生物で通常見いだされないが、遺伝子導入により導入される遺伝子をさす。
【００２１】
「コーディング配列」または「コーディング領域」は特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をさし、非コーディング配列を除く。それは「遮断されないコーディング配列」を形成してもよく、すなわち、イントロンを欠いているか、または適切なスプライス連結部により境界を定められた１個もしくはそれ以上のイントロンを含んでもよい。「イントロン」は一次転写産物中に転写されるが、タンパク質に翻訳することができる成熟ｍＲＮＡを生じるために細胞内でＲＮＡの開裂及び再連結により除かれるヌクレオチド配列である。
【００２２】
「開始コドン」及び「終止コドン」はタンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始及び鎖の終結を特定するコーディング配列中の３個の隣接するヌクレオチドの単位をさす。「読み枠」はアミノ酸配列をコードする開始及び終止コドン間のイントロンにより遮断されないコーディング配列をさす。
【００２３】
「ＲＮＡ転写産物」はＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写から生じる産物をさす。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合にそれは一次転写産物と呼ばれ、またはそれは一次転写産物の転写後プロセシングから得られるＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」はイントロンを含まず、細胞によりタンパク質に翻訳することができるＲＮＡをさす。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でそれから得られる二本鎖のＤＮＡをさす。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写産物をさす。「アンチセンス」ＲＮＡは標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物をさす。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写産物のあらゆる部分、すなわち、５'非コーディング配列、３'非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列とであってもよい。
【００２４】
本明細書に用いられる場合、「好適な調節配列」は本発明の核酸フラグメントの発現を制御する、本発明の核酸フラグメントの上流（５'）、内部または下流（３'）に位置する天然またはキメラ遺伝子中のヌクレオチド配列をさす。「発現」という用語は、本発明に用いられる場合、細胞のタンパク質装置と連係して改変された表現型形質をもたらす本発明の核酸フラグメントから得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積をさす。遺伝子の発現は遺伝子の転写及び前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は標的タンパク質の発現を防ぐことができるアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産をさす。「過剰発現」は通常または非形質転換生物における生産のレベルを上回るトラスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。「共抑制」は外来及び内在性遺伝子の両方の発現の抑制をもたらす、内在性遺伝子に実質的に相同な外来遺伝子の発現をさす。「改変されたレベル」は通常または非形質転換生物のものと異なる量または割合のトラスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。通常または非形質転換生物に比較してトラスジェニック生物において生産される遺伝子産物のレベルを改変することで本発明により意図される表現型の結果、すなわち、アンチセンス抑制または共抑制によりもたらされる遺伝子発現の減少を達成できることを当業者は認識する。
【００２５】
「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写のために必要な他の因子の認識を与えることによりコーディング配列の発現を制御する、通常そのコーディング配列の上流（５'）の、遺伝子中のＤＮＡ配列をさす。人工ＤＮＡ構築物において、アンチセンスＲＮＡを転写するためにプロモーターを用いることもできる。また、プロモーターは生理的または発生条件に反応して転写開始の効力を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含んでもよい。また、エンハンサー成分を含んでもよい。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列である。それはプロモーターの本来の成分かまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された異種起源の成分であってもよい。「構成的プロモーター」は全ての組織でいつでも遺伝子発現を導くものをさす。本明細書に関係する「組織特異的」または「発生特異的」プロモーターは、それぞれ、葉もしくは種子のような特定の組織または初期もしくは後期胚発生のような組織の特定の発生段階でほとんど限定的に遺伝子発現を導くものである。
【００２６】
「３'非コーディング配列」はポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるあらゆる他の調節シグナルを含む遺伝子のＤＮＡ配列部分をさす。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３'末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００２７】
「機能的に連結された」という用語は、片方の機能がもう片方により影響を受けるように結合されている単一核酸分子上の核酸配列を指す。例えば、プロモーターが構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、構造遺伝子がプロモーターの転写制御下にある）場合、それはその構造遺伝子と機能的に連結されている。
【００２８】
「形質転換」は宿主生物のゲノム中への核酸フラグメントの導入をさし、遺伝的に安定な継承をもたらす。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
【００２９】
本発明はトランスジェニック植物の種子貯蔵タンパク質特性の変化をもたらすように種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現が改変されているトランスジェニックダイズ系統の構築に関する。種子貯蔵タンパク質特性の改変により独特で有益な機能特性を有する新規なダイズタンパク質製品を製造することができる。
【００３０】
植物における遺伝子発現はそのような植物において機能できる調節配列を用いる。植物における外来遺伝子の発現は確立されている（ＤｅＢｌａｅｒｅ等（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２７７−２９１）。本発明のフラグメントの発現を導くために選択されるプロモーターの供給源は、標的種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現を減少することにより本発明を成し遂げるために十分な転写活性を有するならば重要ではない。好ましいプロモーターはカリフラワーモザイクウイルスにおいて１９Ｓ及び３５Ｓ転写産物を導くもの（Ｏｄｅｌｌ）Ｊ．Ｔ．等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６：４８２−４９３）のような強力な構成的植物プロモーターを含む。特に好ましいプロモーターは種子特異的発現をさせるものである。種子特異的プロモーターの例は多くの植物において全種子タンパク質の９０％までに相当することがある種子貯蔵タンパク質のプロモーターを含むがそれらに限定されない。種子貯蔵タンパク質は厳密に調節され、非常に組織特異的及び発生段階特異的にほとんど種子においてのみ発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１４９−１６０）。さらに、異なる種子貯蔵タンパク質を種子発生の異なる段階で発現することができる。
【００３１】
種子特異的遺伝子の発現は非常に詳細に研究されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１４９−１６０及びＨｉｇｇｉｎｓ等（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１）による概説を参照）。現在、トランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子（天然またはキメラ）の種子特異的発現の多数の実施例があり、通例、時間的及び空間的発現パターンが維持されている。そのような実施例に用いられるプロモーターを本発明に影響を及ぼすために用いることができる可能性がある。これらはインゲンマメ β−ファゼオリン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ等（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３３２０−３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７−７２９）、インゲンマメ レクチン（Ｖｏｅｌｋｅｒ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３５７１−３５７７）、ダイズレクチン（Ｏｋａｍｕｒｏ等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２４０−８２４４）、ダイズクニッツ型トリプシンインヒビター（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：０９５−１１０９）、ダイズβ−コングリシニン（Ｂｅａｃｈｙ等（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）、エンドウマメ ビシリン（Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６８３−６９５）、エンドウマメ コンビシリン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ等（１９９０）Ｐｌａｎｔａ １８０：４６１−４７０）、エンドウマメ レグミン（Ｓｈｉｒｓａｔ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１５：３２６−３３１）、ナタネ ナピン（Ｒａｄｋｅ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５−６９４）及びシロイヌナズナ ２Ｓアルブミン（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ等（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９２９−９３２）の双子葉植物からの遺伝子を含む。
【００３２】
本発明の核酸フラグメントの発現に特に有用なものはクニッツ型トリプシンインヒビター（ＫＴｉ；Ｊｏｆｕｋｕ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１０７９−１０９３）、グリシニン（Ｎｉｅｌｓｏｎ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：３１３−３２８）及びβ−コングリシニン（Ｈａｒａｄａ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４１５−４２５）のもののようないくつかのダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種起源のプロモーターである。異なる種子プロモーターが有する時間的調節の違いに注意を払わなければならないことを当業者は認識する。例えば、α−サブユニット遺伝子のプロモーターはβ−サブユニット遺伝子のものより数日前に発現され（Ｂｅａｃｈｙ等（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）、従って、β−サブユニット遺伝子の使用はα−サブユニット発現を抑制するためには有用性が低いと思われる。
【００３３】
同様に有用な可能性があるが、優先度が低いものは脂質または炭水化物生合成のような種子代謝の他の面に関与する遺伝子のプロモーターである。要約すると、十分な強さ及び適切な時間的発現パターンのあらゆるプロモーターを本発明を実施するために用いることができる可能性があることを当業者は容易に認識する。同様に、本発明の天然またはキメラの核酸フラグメントのプロモーター領域中にエンハンサーまたはエンハンサー様成分を導入することは、本発明を達成するために増加した発現をもたらす。これは３５Ｓプロモーターに見いだされるもののようなウイルスのエンハンサー（Ｏｄｅｌｌ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６３−２７２）、オピン遺伝子からのエンハンサー（Ｆｒｏｍｍ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９７７−９８４）または本発明の核酸フラグメントに機能的に連結されたプロモーター中に置かれた場合に増加した転写をもたらすあらゆる他の供給源からのエンハンサーを含む。
【００３４】
特に重要なものは構成的プロモーターに対して４０倍の種子特異的増大を与えることができるβ−コングリシニンのα−サブユニットをコードする遺伝子から単離されたＤＮＡ配列成分である（Ｃｈｅｎ等（１９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２２）。トランスジェニック植物においてプロモーターで種子特異的増大発現を達成するために当業者はこの成分を容易に単離し、それをあらゆる遺伝子のプロモーター領域内に挿入することができる。β−コングリシニン遺伝子と異なる時に通常発現されるあらゆる種子特異的遺伝子中にそのような成分を挿入することにより、種子発生中にトランスジェニック植物においてより長い期間その遺伝子の発現が生じる。
【００３５】
本発明を成し遂げるためにポリアデニル化シグナル及び本発明の核酸フラグメントの適切な発現のために必要な可能性がある他の調節配列を与えることができるあらゆる３'非コーディング領域を用いることができる。これは天然の脂肪酸デサチュラーゼ、３５Ｓまたは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写産物からのようなウイルス遺伝子、オピン合成遺伝子、リブロース１,５−ビスホスフェートカルボキシラーゼまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質からの３'末端を含む。異なる３'非コーディング領域の有用性を教示する当該技術分野の多数の実施例がある。
【００３６】
本発明の高等植物の細胞を形質転換する様々な方法を当業者は利用できる（欧州特許公開ＥＰ−Ａ−第２９５,９５９号及びＥＰ−Ａ−第３１８,３４１号を参照）。そのような方法はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のＴｉ及びＲｉプラスミドを利用する形質転換ベクターに基づくものを含む。これらのベクターのバイナリー型を用いることが特に好ましい。Ｔｉ由来のベクターは単子葉及び双子葉植物を初めとする多種多様な高等植物を形質転換する（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ等（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２０９−２１６；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３）。外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み（欧州特許公開ＥＰ−Ａ−第２９５，９５９号を参照）、エレクトロポレーションの技術（Ｆｒｏｍｍ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１）または核酸構築物で被覆された金属粒子での高速弾動打ち込み（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０）のような他の形質転換方法を当業者は利用できる。いったん形質転換されると、それらの細胞を当業者は再生することができる。特に関係するものはＭｃＣａｂｅ等（（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）、Ｆｉｎｅｒ等（（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１７５−１８２）及びＨｉｎｃｈｅｅ、Ｍ．Ａ．Ｗ．（（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５−９２２）を初めとする、ダイズを形質転換するために最近記述された方法である。いったんトランスジェニック植物が上記の方法のいずれかにより得られると、個々のトランスジェニック体を適切な表現型を最も効果的に示すものに関して選別することが必要である。同じ構築物を保有する個々のトランスジェニック植物が発現レベルにおいて異なる可能性があることは当業者によく知られており、この減少は一般的に「位置効果」と呼ばれる。従って、本発明において異なる個々の形質転換体が標的種子タンパク質の抑制の効果において異なる可能性がある。特定の遺伝子の発現を減少するためにアンチセンスまたは共抑制技術を用いることに特別な考慮が伴うことを当業者はよく理解している。米国特許番号第５,１９０,９３１号、第５,１０７,０６５号及び第５,２８３,３２３号はこれらの技術の実現可能性を示唆しているが、それらの有効性が予測できないことはよく知られている。当該技術分野は特定の遺伝子に対して最も有効である予測方法を教示していないので、従って、当業者は抑制される遺伝子の１種またはそれ以上の異なる部分を含有する多数の遺伝子構築物を作製する。さらに、最も有効な構築物でさえ、単離された個々のトランスジェニック系統の一部においてのみ効果的な抑制表現型を与える。例えば、国際特許公開ＷＯ第９３／１１２４５号及びＷＯ第９４／１１５１６号は、カノラにおいて脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制しようと試みた場合に、実際の抑制が試験された系統の１％未満で得られたことを教示している。他の種ではパーセンテージは幾分高いが、いずれの場合でもパーセンテージは１００に達しない。こ���ことは本発明に対する制限としてではなく、代わりに当業者により理解され、前以て考慮される実際問題として考えられるべきである。従って、当業者は非常に多数の形質転換体をスクリーニングするための方法を開発する。通常、これらのスクリーニングの種類は実際の場で選択され、本発明の固有の部分ではない。サンプルの大部分が陰性であると予想されるので、好ましい方法は非常に多数のサンプルを迅速に処理することができるものである。
【００３７】
共抑制の機構は不明のままであり（一つの概説及び考察として、Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３４９０−３４９６を参照）、それ故、必要な場合にそれを誘導するための厳密な条件もはっきりしない。文献で見いだされる大部分の実施例は適切な反応を引き起こすために共抑制される遺伝子の転写領域の全部または大部分の使用を含む。しかしながら、少なくとも一つの場合（Ｂｒｕｓｓｌａｎ等（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：６６７−６７７：Ｂｒｕｓｓｌａｎ及びＴｏｂｉｎ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：８０９−８１３）、シロイヌナズナのｃａｂ１４０遺伝子の場合で、全く関係のない遺伝子に融合された（１.３ｋｂフラグメントとしての）プロモーター及びわずか１４ｂｐの転写領域の使用が内在性ｃａｂ１４０遺伝子及び導入されたキメラ遺伝子の共抑制を生じるために十分であった。多数の他のプロモーター−リーダー（５'非翻訳リーダーは転写の開始と翻訳開始コドンの間の領域として定義される）単位がキメラ遺伝子を導くためにうまく用いられているので、この結果は例外的で明らかに全く予測できない。Ｆｌａｖｅｌｌは（種子タンパク質をコードするもののような多重遺伝子ファミリーのメンバーを初めとする）いくつかまたは多数の遺伝子は共抑制の機構を回避するように進化した可能性があり、一方、別のものはそうではなく、ゲノムが進化するにつれて可能性のあるさらなるレベルの調節を生じると予測する。従って、コングリシニン遺伝子のプロモーター及びリーダーを用いて内在性コングリシンの発現を抑制することができ、一方、（開始コドンを越える）導入遺伝子の他の部分を用いて全く関係のない遺伝子を抑制することができる本結果は独特である。
【００３８】
【実施例】
本発明は以下の実施例によりさらに特定される。これらの実施例は例示のためだけに与えられ、本発明は実施例に記述される用途に限定されないと理解される。改変されたレベルの各種種子貯蔵タンパク質を有するトランスジェニックダイズ植物を生成するために本発明を用いることができる。上記の説明及び以下の実施例から当業者は確認することができ、そして本発明をその趣旨及び範囲からそれずに様々に変形及び改変し、それを各種用途及び条件に適用することができる。全てのそのような改変は意図される請求の範囲内に入ると考えられる。
【００３９】
制限エンドヌクレアーゼ酵素、他の修飾酵素の使用、アガロースゲル電気泳動、核酸ハイブリダイゼーション及びプラスミドＤＮＡでの大腸菌の形質転換のようなＤＮＡ操作の詳細な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）に記述されている。全ての制限酵素及び他の修飾酵素をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。
【００４０】
実施例１
発生中のダイズ子葉におけるβ−コングリシニンの発現が共抑制の標的となり得るかどうかを決定するために、β−コングリシニンのα及びα’サブユニットの欠失ｃＤＮＡフラグメントを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応キット（ＧｅｎｅａｍｐTM（商標）ＲＮＡＰＣＲキット：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて調製した。上流プライマーＣｏｎＳはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースから得られたα及びα’サブユニットｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５−１９に相同である。クローニングを容易にするために、ＮｃｏＩ制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドを５'末端に付加した。下流プライマーＣｏｎ１．４ａは、それぞれα及びα’ｃＤＮＡの配列に相当する配列番号１のヌクレオチド１３７０−１３５４及び配列番号２の１４７２−１４５６に相補的である。クローニングを容易にするために、ＫｐｎＩ制限部位を導入するようにさらなるヌクレオチドを５'末端に付加した。ＰＣＲプライマーＣｏｎＳ及びＣｏｎ１．４ａのヌクレォチド配列を以下に示す。
0003928848.tif 000002
【００４１】
発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡをキットに供給されるランダムヘキサマーまたはＣｏｎ１．４ａのいずれかを用いて製造業者のプロトコルに従って逆転写した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＣｏｎＳ及びＣｏｎ１．４ａの混合物を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応で増幅した。反応物濃度は製造業者のプロトコルに記述されたとおりであった。以下のプログラム：ａ）９５℃で２分を１サイクル；ｂ）５０℃で１.５分（アニーリング）、７０℃で５分（伸長）、９５℃で１.５分（変性）を３５サイクル；及びｃ）５０℃で２分を１サイクル、続いて６８℃で１０分を用いた。ＰＣＲ反応混合物の各々の１５μＬをアガロースゲル電気泳動で分析した。反応は予想される大きさ：α’には１.４７ｋｂそしてαには１.３７ｋｂのＰＣＲ産物を生じた。反応混合物の残りから欠失ｃＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣＲＰｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。
【００４２】
用いたプライマーのために５'末端にＮｃｏＩ制限部位及び３'末端にＫｐｎＩ制限部位を含むα及びα’フラグメントを含有する精製された反応混合物をＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で消化した。α ｃＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動後に回収し、フラグメントＦ８と称し、ｐＣＷ１０９（図１）及びｐＭＬ７０（図２）中に両プラスミドに存在するＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ部位を用いて指向的（センス方向）にクローン化した。Ｃｏｎｓ及びＣｏｎ１．４ａの内側のネスティッドプライマー組（Ｃｏｎ．０９及びＣｏｎ．８）を用いてＰＣＲによりＦ８をαと確認し、ｐＣＷ１０９／Ｆ８プラスミドをＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化することによりα’と区別した（αはＰｓｔＩ部位を含まず、一方、α’は含む）。
0003928848.tif 000003
【００４３】
ＢａｍＨＩでの制限消化によりプラスミドＰＭＬ７０／Ｆ８から転写単位ＫＴｉプロモーター／欠失α／ＫＴｉ３'末端を遊離し、ゲル単離し、Ｆ１１と称した。次に、Ｆ１１をＢａｍＨＩ部位でｐＫＳ１８ＨＨ（図３）中にクローン化した。ｐＫＳ１８ＨＨは以下の遺伝子成分：（ｉ）Ｔ７プロモーター／ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）／Ｔ７ターミネーター配列；（ii）カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター／ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）／アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）３'；及び（iii）β−ラクタマーゼコーディング領域が除かれたｐＳＰ７２プラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するプラスミド構築物である。分子生物学の分野の当業者はよく知られているプロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いて単一のプラスミドベクター中に上記の３成分を連結することができる。
【００４４】
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子をクレブシエラ菌由来のプラスミドｐＪＲ２２５（Ｇｒｉｔｚ Ｌ．及びＤａｖｉｅｓ Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８）を含有する大腸菌株Ｗ６７７からＰＣＲ増幅により単離した。ｐＫＳ１８ＨＨはダイズのような植物におけるＨＰＴ酵素の構成的発現のためにＣａＭＶ ３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳカセットを含有する。また、ｐＫＳ１８ＨＨプラスミドは（ｌａｃＵＶ５制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する）ラムダＤＥ３に溶原性であるＮｏｖａＢｌｕｅTM（ＤＥ３）（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような大腸菌のある株におけるＨＰＴ酵素の発現のためにＴ７プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ７ターミネーターカセットも含有する。ｐＫＳ１８ＨＨはこのベクター中に遺伝子をクローニングするために好適な３種の唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位も含有する。
【００４５】
従って、ｐＫＳ１８ＨＨプラスミドベクタ−は大腸菌及び植物の両方で選択のためにハイグロマイシンＢを用いることができる。ＨｉｎｄIIIでの消化によりＦ１１フラグメントの挿入及び方向を確認した。Ｆ１１フラグメントを右回りの向きに含むクローンを選択し、ｐＪｏ１（図４）と称した。
【００４６】
体細胞胚培養物の形質転換
ダイズ体細胞胚の形質転換及び増殖のために以下のストック溶液及び培地を用いた。
【００４７】
【表１】
0003928848.tif 000004
【００４８】
ダイズ胚懸濁培養物を１６／８時間の昼／夜スケジュールを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて２８℃で回転式振盪機（１５０ｒｐｍ）で３５ｍＬの液体培地（ＳＢ５５）中で維持した。約３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地中に接種することにより培養物を２ないし３週毎に継代培養した。
【００４９】
ダイズ胚懸濁培養物をパーティクルガン打込みの方法（Ｋｌｅｉｎ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０）によりｐＪｏ１で形質転換した。ＤｕＰｏｎｔ ＢｉｏｌｉｓｔｉｃTM（商標）ＰＤＳ１０００／Ｈｅ装置をこれらの形質転換のために用いた。
【００５０】
５μＬのｐＪｏ１プラスミドＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、５０ｐＬ ＣａＣｌ2（２.５Ｍ）及び２０μＬスペルミジン（０.１Ｍ）を５０μＬの６０ｍｇ／ｍＬ １ｍｍ金粒子懸濁液に添加した。粒子調製物を３分間撹拌し、微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１０秒間回転させ、上清を除いた。次に、ＤＮＡで被覆された粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、４０μＬの無水エタノールに再懸濁した。ＤＮＡ／粒子懸濁液を各１秒間３回超音波処理した。次に、５μＬのＤＮＡ被覆金粒子を各マクロ担体ディスク上に添加した。
【００５１】
約３００ないし４００ｍｇの２週齢の懸濁培養物を空の６０ｍｍ×１５ｍｍペトリ皿に置き、残っている液体をピペットで組織から取り除いた。組織を保持スクリーンから約３.５インチ離して置き、２回打込んだ。膜破壊圧力を１０００ｐｓｉに設定し、室を−２８インチのＨｇまで排気した。実験当たり構築物当たり２枚のプレートに打込んだ。打込み後に組織を半分に分け、液体培地中に戻し、上記のように培養した。
【００５２】
打込みの１５日後に液体培地を５０ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する新しいＳＢ５５に交換した。選択培地を毎週新しくした。打込みの６週後に緑色の形質転換された組織を単離し、フラスコに接種して新しい形質転換された胚懸濁培養物を生成させた。
【００５３】
形質転換された胚培養物を液体培養培地から取り出し、０.５％の木炭を加えた固体寒天培地ＳＢ１０３上に置いて成熟を開始した。１週後に木炭を欠いたＳＢ１０３培地に胚を移した。ＳＢ１０３培地上で３週後に成熟中の胚を分離し、ＳＢ１４８培地上に置いた。胚成熟中の条件は１６／８時間の昼／夜スケジュールを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて２６℃であった。ＳＢ１４８培地上で６週後に胚をβ−コングリシニンサブユニットタンパク質の発現に関して分析した。各胚集団は５ないし２０個の体細胞胚を生じた。
【００５４】
形質転換された体細胞胚の分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により体細胞胚成熟中にいつβ−コングリシニンのα、α’及びβサブユニットを可視化することができるかを決定するために最初の実験を実施した。（打込みを受けなかったことを除いて上記のように生成された）非形質転換胚の子葉を成熟を開始した後６、８、１０及び１２週で胚から切断し、分析するまで−８０℃で凍結保存した。子葉組織の重さを量り、組織１ｍｇ当たり１０μＬの抽出バッファーを添加し、ペレット乳棒使い捨てミキサー（Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｍｉｘｅｒ）（Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ）で組織をすりつぶした。抽出バッファーは５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７.５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭＥ）及び０.１％ＳＤＳからなった。次に、サンプルを１２,０００ｒｐｍで１０分間微量遠心分離し、上清をピペットで新しい微量遠心管へ取り出した。使用するまで抽出物を−２０℃で凍結保存した。
【００５５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために８μＬの（２×）ローディングバッファーを８μＬのサンプル抽出物に添加した。（２×）ローディングバッファーは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、４％ＳＤＳ、０.２％ブロモフェノールブルー、１５％グリセロール及び２００ｍＭ βＭＥからなった。混合物を９５℃で４分間加熱した。次に、サンプル混合物を微量遠心分離し（１２,０００ｒｐｍ、２０秒間）、ミニ−プロテインII電気泳動セル（ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ II Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中に取り付けられた１０％プレキャストＲｅａｄｙ ＧｅｌTM（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファーを泳動バッファーとして用い、電圧は一定の１２５Ｖであった。サンプル抽出物に加えて、各ゲルは分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準、低範囲）を含有する１レーン及び市販の脱脂ダイズ粉から抽出された全ダイズ種子タンパク質を含有する１レーンを含んだ。終了時にタンパク質を可視化するためにゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色した（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。ゲルの写真をとり、水を含むシールバッグに入れ、冷蔵庫で保存した。結果は、成熟の開始後８ないし１０週の間で体細胞胚の子葉においてβ−コングリシニンのα、α’及びβサブユニットを検出できることを示した。
【００５６】
上記の方法を用いて成熟の開始後１０週で形質転換された胚の分析を実施した。クローン当たり２個の胚をまず分析した。これら２個の胚でβ−コングリシニンサブユニットの抑制が観察された場合はさらなる胚を分析した。表１にこの分析の結果を示し、ここで、各β−コングリシニンサブユニットの存在または欠如はそれぞれ（＋）または（−）で示される。
【００５７】
【表２】
0003928848.tif 000005
【００５８】
７個のトランスジェニッククローンが、α及びα’発現が抑制された胚を生じた。さらに、１個のクローン（Ｊｏ１−４）は３種全てのβ−コングリシニンサブユニットが抑制された胚を生じた。欠失したα導入遺伝子配列は全部で１.３２ｋｂのβサブユニットｃＤＮＡの０.７５ｋｂの部分のみと重複するので、この結果は意外である。全体的に見て、欠失したα導入遺伝子とβサブユニットｃＤＮＡの間には５２％の類似性があるだけである。知るかぎりでは、欠失したα導入遺伝子はβ−コングリシニン遺伝子のβサブユニットを「共抑制」するために十分な構造の類似性を有すると考えられない。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の例を図５に示す。レーン１−３はクローンＪｏ１−１より生じた胚から切断された３枚の子葉の抽出物である。レーン４及び５はそれぞれタンパク質分子量標準及び種子から得られたダイズタンパク質標準である。レーン６−８はクローンＪｏ１−４より生じた胚から切断された子葉の抽出物である。レーン２のタンパク質パターンはα及びα’の両方が共抑制されている胚の例である。レーン６及び８のタンパク質パターンはβ−コングリシニンを構成する全てのサブユニットが抑制されている胚の例である。
【００６０】
実施例２
β−コングリシニンプロモーター領域を用いる共抑制により発生中の子葉においてβ−コングリシニンの発現を抑制することができるかどうかを決定するために、ダイズβ−コングリシニンプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ等、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）の制御下にグリシンマックスミクロソームのデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡ（ＧｍＦａｄ２−１）配列（Ｈｅｐｐａｒｄ等、（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：３１１−３１９；ジーンバンク登録番号Ｌ４３９２０）を含有するｐＢＳ４３と称するプラスミドを構築した。このベクターの構築は以下のプラスミド：ｐＭＨ４０、ｐＣＳＴ２及びＢＳ１３を用いることにより促進された。以下に詳しく述べられるプラスミド構築物は米国特許出願番号ＵＳＳＮ第０８／２６２,４０１号及び国際特許公開番号ＷＯ第９４／１１５１６号に部分的に記述されており、それらの両方は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００６１】
ｐＭＨ４０ベクターは、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼ遺伝子に連結されたＣａＭＶからの１.４ｋｂ３５Ｓプロモーター領域（Ｏｄｅｌｌ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：８１０−８１２；Ｈａｒｐｓｔｅｒ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１２：１８２−１９０）を挿入することにより市販されているクローニンベクター、プラスミドｐＧＥＭ９ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から得られた。これは酵素β−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：８４４７−８４５１）をコードする１.８５ｋｂフラグメント及びアグロバクテリウムツメファシエンス（Ｆｒａｌｅｙ等（１９８３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８０：４８０３−４８０７）のＴｉ−プラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子からの転写ターミネーターを含有する０.３ｋｂ ＤＮＡフラグメントであった。
【００６２】
ベクターｐＣＳＴ２はベクターｐＭＬ１８及びｐＣＷ１０９Ａから得られた。プラスミドｐＣＷ１０９Ａはダイズβ−コングリシニンプロモーター配列及びファゼオリン３'非翻訳領域を含有し、市販されているプラスミドｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）から得られたベクターｐＣＷ１０９の改変された型である。ベクターｐＣＷ１０９はクローニンベクターｐＵＣ１８のＨｉｎｄIII部位にβ−コングリシニン遺伝子の（プロモーター領域を含む）５５５ｂｐの５'非コーディング領域並びにそれに続くＮｃｏＩ、ＳａｍＩ、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するマルチクローニング配列を挿入し、次にそのＨｉｎｄIII部位に１１７４ｂｐの共通のインゲンマメ ファゼオリン３'非翻訳領域を挿入することにより作製された。用いられるβ−コングリシニンプロモーター領域は２７ヌクレオチドの位置での違いのために公表されたβ−コングリシニン遺伝子（Ｄｏｙｌｅ等、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８）の対立遺伝子である。この遺伝子のさらなる配列の記述を国際特許公開ＷＯ第９１／１３９９３号に見いだすことができる。
【００６３】
アンチセンス構築物における使用を容易にするために、ＮｃｏＩでの消化、マングビーンエキソヌクレアーゼ消化及び平滑部位の再連結によりプラスミドｐＣＷ１０９中のＮｃｏＩ部位及び可能性のある翻訳開始部位を破壊して改変プラスミドｐＣＷ１０９Ａを生ぜしめた。
【００６４】
ベクターｐＭＬ１８は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｃｋ等（１９８２）Ｇｅｎｅ １９：３２７−３３６）の発現を導く非組織特異的で構成的なカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ）プロモーター（Ｏｄｅｌｌ等、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６：４８２−４９３）及びそれに続くヌクレトチド８４８〜１５５０を含むノパリンシンターゼ遺伝子の３'末端（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７４）からなる。この転写単位を市販のクローニンベクターｐＧＥＭ９ｚ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中に挿入し、それは３５Ｓプロモーターの５'末端で制限部位ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩにその順で隣接する。さらなるＳａｌＩ部位がＮＯＳ ３'配列の３'末端に存在し、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位は唯一である。ＸｂａＩ部位を除くために、プラスミドｐＭＬ１８をＸｂａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて一本鎖の末端を埋め、生成物を連結した。得られたプラスミドをｐＢＳ１６と称した。
【００６５】
プラスミドｐＣＷ１０９ＡをＨｉｎｄIIIで消化し、β−コングリシニン／アンチセンスデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡ／ファゼオリン３'非翻訳領域を含有する得られた１.８４ｋｂフラグメントをゲル単離した。この１.８４ｋｂフラグメントをｐＢＳ１６のＨｉｎｄIII部位中に連結した。適切な向きにインサートを含有するプラスミドはＫｐｎＩで消化した場合に３.５３ｋｂ及び４.４１ｋｂフラグメントを生じ、このプラスミドをｐＣＳＴ２と称した。
【００６６】
ダイズミクロソームのデルタ１２−デサチュラーゼをコードし、ジーンバンク登録番号Ｌ４３９２０に開示されるような配列を保有するＧｍＦａｄ２−１ ｃＤＮＡの供給源としてベクターｐＢＳ１３を用いた。ベクターｐＢＳ１３はベクターｐＭＬ７０（図１）から得られ、それはＫＴｉ３プロモーター及びＫＴｉ３３'非翻訳領域を含有し、市販されているベクターｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から中間プラスミドｐＭＬ５１、ｐＭＬ５５、ｐＭＬ６４及びｐＭＬ６５を経て得られた。５'非翻訳領域の２０３９ヌクレオチド全て及びＪｏｆｕｋｕ（Ｊｏｆｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：１０７９−１０９３）に記述された配列の塩基７５５〜７６１に相当するＥｃｏＲＩ部位で終わるＫＴｉ３遺伝子のコーディング配列の３９０塩基を含有する、完全なダイズＫＴｉ３遺伝子（Ｊｏｈｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、上記）の２.４ｋｂ ＢｓｔＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＴＺ１８ＲのＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結してプラスミドｐＭＬ５１を作製した。ＫＴｉ３インサートの５'非翻訳領域の真ん中のＮｃｏＩ部位を破壊するためにプラスミドｐＭＬ５１をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて一本鎖の末端を埋め、生成物を再連結してプラスミドｐＭＬ５５を生ぜしめた。プラスミドｐＭＬ５５をＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩで部分消化して上に引用した配列の塩基７３２〜７５５に相当する０.４２ｋｂフラグメントを遊離し、それを廃棄した。ＸｍｎＩ部位（５'−ＴＣＴＴＣＣ−３'）及びＮｃｏＩ部位（５'−ＣＣＡＴＧＧＧ−３'）それに直接続くＥｃｏＲＩ部位の一部（５'−ＧＡＡＧＧ−３'）のコーディング配列からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作製することによりＮｃｏＩ部位を含有する合成のＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩリンカーを構築した。ＸｍｎＩ及びＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位を短い介在配列（５'−ＡＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡＡ−３'）で連結した。この合成リンカーを４.９４ｋｂフラグメントのＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結してプラスミドｐＭＬ６４を作製した。プライマーＭＬ５１及びＭＬ５２を用いて標準的なＰＣＲプロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット）によりＪｏｆｕｋｕ（上記）に記述された配列からＫＴｉ３遺伝子の３'非翻訳領域を増幅した。プライマーＭＬ５１は上に引用した配列の塩基１０７２〜１０９１に相当する２０ヌクレオチドを含有し、プライマーの５'末端にはＥｃｏＲＶ（５'−ＧＡＴＡＴＣ−３'）、ＮｃｏＩ（５'−ＣＣＡＴＧＧ−３'）、ＸｂａＩ（５'−ＴＣＴＡＧＡ−３'）、ＳｍａＩ（５'−ＣＣＣＧＧＧ−３'）及びＫｐｎＩ（５'−ＧＧＴＡＣＣ−３'）部位に相当するヌクレオチドが付加されている。プライマーＭＬ５２は上に引用した配列の塩基１２４２〜１２５９に相当するヌクレオチドの完全な相補物を含有し、プライマーの５'末端にはＳｍａＩ（５'−ＣＣＣＧＧＧ−３'）、ＥｃｏＲＩ（５'−ＧＡＡＴＴＣ−３'）、ＢａｍＨＩ（５'−ＧＧＡＴＣＣ−３'）及びＳａｌＩ（５'−ＧＴＣＧＡＣ−３'）部位に相当するヌクレオチドが付加されている。ＰＣＲ増幅されたＫＴｉ３遺伝子の３'末端をｐＭＬ６４のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結してプラスミドｐＭＬ６５を作製した。ＰｓｔＩ（５'−ＣＴＧＣＡ−３'）、ＳａｌＩ（５'−ＧＴＣＧＡＣ−３'）、ＢａｍＨＩ（５'−ＧＧＡＴＣＣ−３'）及びＰｓｔＩ（５'−ＣＴＧＣＡ−３'）部位からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作製することにより合成のマルチクローニング部位リンカーを構築した。そのリンカーをｐＭＬ６５のＰｓｔＩ部位（ＫＴｉ３プロモーター領域の直接５'）に連結してプラスミドｐＭＬ７０を作製した。
【００６７】
ダイズデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡ、ＧｍＦａｄ２−１（ジーンバンク登録番号Ｌ４３９２０）からの１.４６ｋｂ ＳｍａＩ／ＫｐｎＩフラグメントをｐＭＬ７０の対応する部位に連結してプラスミドｐＢＳ１０を生ぜしめた。デサチュラーゼｃＤＮＡフラグメントはｐＢＳ１０中のＫＴｉ３プロモーターに対して逆（アンチセンス）向きであった。プラスミドｐＢＳ１０をＢａｍＨＩで消化し、ＫＴｉ３プロモーター／アンチセンスデサチュラーゼｃＤＮＡ／ＫＴｉ３３'末端転写単位に相当する３.４７ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。ベクターｐＭＬ１８は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｃｋ等（１９８２）Ｇｅｎｅ １９：３２７−３３６）の発現を導く非組織特異的で構成的なカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ）プロモーター（Ｏｄｅｌｌ等、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６：４８２−４９３）及びそれに続くヌクレオチド８４８〜１５５０を含むノパリンシンターゼ遺伝子の３'末端（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７４）からなる。この転写単位を市販のベクターｐＧＥＭ９ｚ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に挿入し、それは３５Ｓプロモーターの５'末端で制限部位ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩにその順で隣接する。さらなるＳａｌＩ部位がＮＯＳ ３'配列の３'末端に存在し、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位は唯一である。ｐＢＳ１０から遊離された３.４７ｋｂ転写単位をベクターｐＭＬ１８のＢａｍＨＩ部位に連結した。得られたプラスミドをＳｍａＩ及びＫｐｎＩで消化した場合に適切な向きにインサートを含有するプラスミドは５.７４、２.６９及び１.４６ｋｂの３フラグメントを生じた。正しい向きに転写単位を含むプラスミドを選択し、ｐＢＳ１３と称した。
【００６８】
ｐＢＳ１３（上記）からの１.４６ｋｂ ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントをベクターｐＣＳＴ２（上記）のＳｍａＩ／ＸｂａＩ部位に指向的にクローン化してｐＢＳ３９と称するプラスミドを生ぜしめた。プラスミドｐＢＳ３９の３.３ｋｂ ＨｉｎｄIIIフラグメントをプラスミドｐＭＨ４０（上記）のＨｉｎｄIII部位にクローン化して植物発現ベクターｐＢＳ４３（図６）を生ぜしめた。
【００６９】
ベクターｐＢＳ４３でのダイズの形質転換及びトランスジェニック「トランスイッチ（Ｔｒａｎｓｗｉｔｃｈ）」系統の同定
ダイズ分裂組織のパーティクル打込みの方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４５−１５１）を用いてベクターｐＢＳ４３をダイズ分裂組織中に形質転換した。形質転換された植物（すなわち、ＧＵＳ活性に関して陽性と同定された植物から）の種子を脂肪酸組成に関して選別した。脂肪酸メチルエステルを少量（約１０ｍｇ）の種子片のヘキサン抽出物から調製した（Ｂｒｏｗｓｅ等（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１４１−１４５）。１０個の異なるトランスジェニック系統からの種子片を分析し、２６０−０５と称するこれらの系統の１つからのＲ１種子のいくつかはコントロール種子の約２０％に比較して８０−８５％の全オレイン酸含有量であった。この表現型は内在性Ｆａｄ２−１遺伝子の共抑制により引き起こされ、「トランスイッチ遺伝子座」（Ｋｉｎｎｅｙ、Ａ．Ｊ．（１９９５）「Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」中、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ、Ｖｉｅｎｎａ）と呼ばれるダイズゲノムの遺伝子座への２コピーのｐＢＳ４３の挿入の結果である。トランスイッチ遺伝子座を含有する系統２６０−０５からの高オレイン酸Ｒ１種子を自殖させ、トランスイッチ遺伝子座がホモであるＲ２種子を選択した。これらのＲ２ホモ種子の２つ（Ｇ９４−１、Ｇ９４−１９）並びにＧ９４−１及びＧ９４−１９のさらなる世代から得られた種子（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５）をさらなる分析のために選択した。
【００７０】
アイオワ及びプエルトリコの両方で生育されたＧ９４−１及びＧ９４−１９植物のＲ５種子をひいて粉末にし、約１ｇを５ｍＬのヘキサンで抽出した。遠心分離後にヘキサンを注ぎ出し、フラスコを風乾させた。約１０ｍｇの脱脂粉末を上記のように抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。両方の場所から得られた両方のトランスジェニック系統において、β−コングリシニンのα’及びαサブユニットの発現はコントロールダイズ系統及び標準的なダイズ粉に比較して抑制されていた（図７）。
【００７１】
実施例３
アンチセンス技術を用いてβ−コングリシニン発現を抑制できるかどうかを試験するために、上記のように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いてα及びα’の全長ｃＤＮＡを作製した。上流プライマーＣｏｎＳａはα及びα’の両方のｃＤＮＡ配列の領域４−１９に相同であり、ＫｐｎＩ制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドが５'末端に付加されている。用いた下流プライマーＣｏｎ１．９ａはαアイソフォームに相当する配列番号１の領域１８１８−１８０１及びα’アイソフォームに相当する配列番号２の１９２０−１９０３にそれぞれ相同である。次のクローニング工程を容易にするために、ＮｃｏＩ制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドを５'末端に付加した。
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【００７２】
逆転写及び次のＰＣＲ反応を上記のように実施した。発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡをランダムヘキサマーまたはＣｏｎ１．９ａのいずれかを用いて逆転写した（上に詳細に記述したような方法）。上に詳細に記述したプロトコルを用いてＣｏｎＳａ及びＣｏｎ１．９ａを用いてＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅した。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。αに対して予想される分子量の１.８ｋｂバンドが観察された。残りの反応混合物をＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。用いたプライマーのために５'末端にＫｐｎＩ部位及び３'末端にＮｃｏＩ部位を含むα ｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化した。得られたα ｃＤＮＡをゲル単離し、Ｆ１０と称し、ｐＣＷ１０９中にプラスミドに存在するＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ部位を用いて指向的（アンチセンス方向）にクローン化した。ネスティッドプライマー（上流：Ｃｏｎ．０９（配列番号６）；下流：Ｃｏｎ１．４ａ（配列番号５）及びＣｏｎ１．０（配列番号１０））を用いてＰＣＲによりＦ１０をαと確認した。
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【００７３】
ＨｉｎｄIIIでの部分消化によりｐＣＷ１０９／Ｆ１０から転写単位β−コングリシニンプロモーター／α ｃＤＮＡアンチセンス／ファゼオリン３'末端を遊離した。部分消化の条件は６フラグメント（５.１ｋｂ、３.８ｋｂ、３.６ｋｂ、２.６ｋｂ、２.４ｋｂ及び１.２ｋｂ）を生じるようにであった。転写単位を含有する３.６ｋｂフラグメントをゲル単離し、Ｆ１４と称した。次に、Ｆ１４をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉｎｄIIIにクローン化した。形質転換された細胞から作製したプラスミドＤＮＡ調製物のＨｉｎｄIIIでの消化により挿入を確認した後、陽性培養物からのプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩで消化してそれらがｐＣＷ１０９／Ｆ１０のＨｉｎｄIIIでの部分消化からの３.６ｋｂ Ｆ１４フラグメントを含有するが３.８ｋｂフラグメントを含有しないことを確かめた。Ｆ１４はＫｐｎＩ部位を含むが、一方、３.８ｋｂフラグメントは含まない。確認時にｐＫＳ１８ＨＨ／Ｆ１４をｐＪｏ３（図８）と称した。ダイズ胚懸濁培養物を上に詳細に記述したようにｐＪｏ３で形質転換した。形質転換は５個の形質転換されたクローンを生じ、成熟時に各クローンは４ないし８個の体細胞胚を生じた。
【００７４】
形質転換された体細胞胚のタンパク質抽出物を先に詳細に記述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果を表２に示す。トランスジェニッククローンは全てα及びα’の両方の発現が抑制されている少なくとも１個の体細胞胚を生じた。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
実施例４
グリシニンサブユニットをコードする５個の非対立遺伝子がある。ゲノムクローン及びｃＤＮＡのシークエンシングからこれらのサブユニット遺伝子は配列類似性に基づいて２つの群に分けられる。群ＩはＧｙ１（配列番号１１）、Ｇｙ２（配列番号１２）及びＧｙ３（配列番号１３）からなり、一方、群IIはＧｙ４（配列番号１４）及びＧｙ５（配列番号１５）からなる。群内の遺伝子間には８５％より高い類似性があるが、異なる群の遺伝子間は４２ないし４６％の類似性があるのみである。共抑制技術を用いることにより発生中の子葉においてグリシニンの発現を抑制できるかどうかを決定するために、上記のように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて群Ｉ及び群IIのｃＤＮＡを調製した。
【００７７】
群Ｉ反応のために用いる上流プライマー（Ｇ１−１）は全ての群ＩｃＤＮＡの領域１−１９に相同である。２種の下流プライマー：Ｇｙ１の領域１０３８−１０２２、Ｇｙ２の１００８−９９２及びＧｙ３の９９６−９８０と相同であるＧ１−１０３９またはＧｙ１の領域１４７５−１４６０、Ｇｙ２の１４４５−１４３０及びＧｙ３の１４３３−１４１８と相同であるＧ１−１４７５を用いた。後のクローニングを容易にするために、全てのプライマーはそれらの５'末端にＮｏｔＩ制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有した。
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【００７８】
発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡを反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまたはＧ１−１４７５またはＧ１−１０３９のいずれかを用いて逆転写した。Ｇ１−１０３９またはＧ１−１４７５のいずれかとＧ１−１の混合物を用いてｃＤＮＡフラグメントを増幅した。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ反応はプライマー組Ｇ１−１／Ｇ１−１０３９及びＧ１−１／Ｇ１−１４７５に対してそれぞれ約１ｋｂ及び１.４−１.５ｋｂの予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残りからｃＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。次に、精製されたｃＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル精製により単離した。
【００７９】
群IIのＲＴ−ＰＣＲのために用いる上流プライマー（Ｇ４−７）は群IIの両方のｃＤＮＡの領域７−２２に相同である。２種の下流プライマー：Ｇｙ４の領域１２５１−１２３４及びＧｙ５の１１５３−１１３５と相同であるＧ４−１２５１またはＧｙ４の領域１６６８−１６５３に相同であるＧ４−１６７０を用いた。Ｇｙ５に類似領域はない。後のクローニングを容易にするために、全てのプライマーはそれらの５'末端にＮｏｔＩ制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有した。
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【００８０】
発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡを反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまたはＧ４−１２５１またはＧ４−１６７０のいずれかを用いて逆転写した。Ｇ４−１２５１またはＧ４−１６７０のいずれかとＧ４−７の混合物を用いてｃＤＮＡフラグメントを増幅した。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ反応はプライマー組Ｇ４−７／Ｇ４−１２５１及びＧ４−７／Ｇ４−１６７０に対してそれぞれ約１.２５ｋｂ及び１.７ｋｂの予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残りからｃＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。次に、精製されたｃＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、ゲルから単離した。
【００８１】
単離された群ＩｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位でｐＲＢ２０（図９）にクローン化した（センス方向）。ＮｏｔＩでの部分制限消化及び単一切断されたｐＲＢ２０／群Ｉ直鎖状フラグメントの単離後に群IIｃＤＮＡを添加して最終的な転写単位β−コングリシニンプロモーター／群ＩｃＤＮＡ（センス方向）／ファゼオリン３'末端及びβ−コングリシニンプロモーター／群IIｃＤＮＡ（センス方向）／ファゼオリン３'末端を作製した。次に、得られたプラスミドを用いて体細胞胚懸濁培養物を上に詳細に記述した方法を用いて形質転換する。
【００８２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＭＬ７０の制限地図である。
【図２】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＣＷ１０９の制限地図である。
【図３】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＫＳ１８ＨＨの制限地図である。
【図４】プラスミドｐＪｏ１の制限地図である。
【図５】ｐＪｏ１で形質転換された体細胞胚から抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図６】プラスミドｐＢＳ４３の制限地図である。
【図７】ｐＢＳ４３で形質転換された植物より得られたダイズ種子から抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図８】プラスミドｐＪｏ３の制限地図である。
【図９】プラスミドｐＲＢ２０の制限地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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