(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（Ｉ）：
【化１】
0003883658.tif 000009
で示される新規フラクタン。
【請求項２】
アセトバクター(Acetobacter) 属またはグルコノバクター(Gluconobacter) 属に属する微生物の培養物、菌体または菌体処理物にてショ糖を処理することを特徴とする、請求項１記載の新規フラクタンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１１糖の新規フラクタンおよびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
６−ケストース〔６Ｆ（β−Ｄ−フルクトフラノシルシュクロース〕は、各種イネ科植物、具体的には、大麦や小麦、アスパラガスの葉、茎や根、チートグラスやオーチャードグラスの葉などに存在することが知られている [生化学データブックＩ、p.470 、東京化学同人 (1979年)]。また、大麦中には６−ケストースのほか、６，６−ケストテトラオースや６，６，６−ケストペンタオースなど６−ケストースのフラクトシル残基にフルクトースがβ−２，６結合で付加した６−ケストースオリゴ糖の存在も示唆される [Plant Physiol. vol.85, p.706 (1987) 、Plant Physiol. vol.107, p.1249 (1995)]。
【０００３】
フルクトースを構成糖とするフラクタンの植物体中の含量を分析した例として、大麦の葉の75％（乾燥重量）[Z. Planzenphysiol., vol.112, p.359 (1983)] 、アスパラガスの１％以下（湿重量） [Agric. Biol. Chem., vol.40, p.567 (1976)] があるが、フラクタンを構成する各オリゴ糖ごとには分析されていない。フラクタンはフルクトースを様々の結合様式や重合度で含むオリゴ糖の混合物であるので、それを構成する一部である上記６−ケストースオリゴ糖の植物体中の含量は数％以下と推定される。また、フラクタンから上記６−ケストースオリゴ糖のみを目的物質として採取するには複雑な精製工程を要する。
【０００４】
これまで６−ケストースを製造する方法として、ショ糖に植物由来の酵素を作用させる方法が知られている。例えば、大麦の葉から抽出精製した酵素でショ糖を処理することにより、６−ケストースだけでなく、６，６−ケストースや６，６，６−ペンタオースも生成されることが報告されている [Plant Physiol. vol.85 , p.706 (1987)、Plant Physiol., vol.107, p.1249 (1995)] 。しかしながら、各オリゴ糖の生成率については記載されておらず、ＨＰＬＣの分析チャートからは、６−ケストースがほとんどで、６，６−ケストテトラオースや６，６，６−ケストペンタオースは６−ケストースの１割以下と推定される。また、１，６−ケストテトラオースなどの構造的に類似したオリゴ糖の副生が著量認められる。また、ショ糖に微生物または微生物処理物を作用させて６−ケストースを製造する方法としては、ショ糖に酵母由来のインベルターゼを作用させる例 [Biochem. J. vol.57, p.320 (1954)] 、ショ糖にバチルス属由来のレバンスクラーゼを作用させる例 [応用糖質科学, 42巻, p.322 (1995)] が知られている。酵母のインベルターゼの場合には、３糖である６−ケストースとネオケストースをほぼ同程度に生成するが、４糖以上のオリゴ糖については生成は認められない[Plant Physiol. vol.85, p.706 (1987)] 。バチルス属のレバンスクラーゼの場合には、３糖から７糖の混合物が生成し、３糖としては６−ケストースと同時に、１−ケストースやネオケストースが生成されるが、４糖以上のオリゴ糖の生成については記載がない。
従って、４糖以上の６−ケストースオリゴ糖を微生物を用いて生産させた例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、新規フラクタン、およびその効率的な製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アセトバクター(Acetobacter) 属またはグルコノバクター(Gluconobacter) 属に属する微生物の培養物、菌体または菌体処理物にてショ糖を処理することにより、１１糖の新規フラクタンを高収率で製造できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
すなわち、本発明は、下記の構造式（Ｉ）：
【０００６】
【化２】
0003883658.tif 000002
で示される新規フラクタンである。
【０００７】
本発明はまた、アセトバクター(Acetobacter) 属またはグルコノバクター(Gluconobacter) 属に属する微生物の培養物、菌体または菌体処理物にてショ糖を処理することを特徴とする、上記の新規フラクタンの製造方法である。
【０００８】
本発明の新規フラクタンは上記構造式（Ｉ）で示される、Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド〕（化学式名）または６Ｆ（β−Ｄ−フルクトフラノシル)9 シュクロース（慣用名）である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる微生物は、アセトバクター(Acetobacter) 属またはグルコノバクター(Gluconobacter) 属に属する微生物であり、具体的には  アセトバクター・ポリサッカロゲネス (Acetobacter polysaccharogenes) MT-11-2（FERM BP-112)、グルコノバクター・アルビダス (Gluconobacter albidus) IFO3250である。
【００１０】
本発明に用いる微生物は、アセトバクター属またはグルコノバクター属に属する公知の微生物と同様な方法により培養することができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解能を向上させるため、培地に誘導剤等を少量添加することも可能である。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行うことが好ましい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行う場合もある。
【００１１】
培養温度は、20〜35℃が好適であり、培地のpHは塩酸や水酸化ナトリウム水溶液等によりpH５〜７に維持することが好ましい。このような条件で培養を行うと培養開始から５〜48時間で充分な量の微生物が得られる。
上記の微生物にて処理する場合には、培養して得られる培養液をそのまま、または、培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体もしくはその処理物を用いることができる。
【００１２】
菌体外に酵素が遊離する場合は遠心分離等の除菌操作した後の培養液をそのまま用いることもできるが、硫安処理等の濃縮精製操作を実施することがより有効である。菌体処理物としてはアセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液等が挙げられる。さらにこれら酵素あるいは微生物を適当な担体に固定化して用いることができ、これにより反応を行った後に回収再利用することも容易になる。例えば、固定化は架橋したアクリルアミドゲルなどに包括したり、イオン交換樹脂、ケイソウ土などの固体担体に物理的、化学的に固定化することができる。
【００１３】
本発明の目的とする新規フラクタンを製造させるには、反応溶媒に基質となるショ糖を溶解し、上記微生物の培養液、菌体、または菌体処理物を加えて必要により反応温度、反応液のpHを制御しながら反応させる。
反応液の基質濃度は5 〜80％の間で特に制限はないが、基質となるショ糖の溶解度、生産性などを考慮すると10〜50％で実施するのが好ましい。  基質濃度は、高い方が逆反応（分解反応）が起こりにくく、少液量で済むことから好ましい。
【００１４】
反応時間は、通常２〜96時間、好ましくは６〜24時間で反応が終了する条件を選択することが好ましい。
反応pHは、用いる微生物酵素の至適pHに依存するが、一般的にはpH４〜８の範囲で、特に５〜７が例示される。また、反応温度は微生物酵素が失活しない条件であればよく、20〜60℃が好ましいが、30〜45℃がより好ましい。また温度は30℃以下にすると生産菌自体や雑菌の生育が起こる可能性があり、好ましくない。
反応溶媒は通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用する。
【００１５】
尚、以上のような基質濃度、反応温度、反応時間、反応ｐＨ、反応溶媒、その他の反応条件は、目的とする新規フラクタンが最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
上記反応後の反応液には目的とする１１糖の新規フラクタン（ショ糖のフラクトシル残基の６位にβ-2,6結合でフルクトースが９個結合した11糖のオリゴ糖）のほか、６−ケストース（３糖）、６，６−ケストテトラオース（４糖）、６，６，６−ケストペンタオース（５糖）含まれる。
【００１６】
得られた反応液からの目的とする新規フラクタンを単離するには、抽出、カラム分離等の一般的な分離方法を用いることができる。
本発明により製造された新規フラクタンは、公知のフラクトオリゴ糖と同様に、整腸作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収促進作用等を示し、医薬品や機能性食品への適用が期待される。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
〔実施例１〕  新規フラクタン（11糖）の製造
(1)  使用菌株
アセトバクター・ポリサッカロゲネス (Acetobacter polysaccharogenes) MT-11-2（FERM BP-112)
当該MT-11-2 株の菌学的性質は、特公昭58-56640号公報に記載されている。
(2)  培養菌体の取得
上記の菌株をＹＰＳ培地（ショ糖30g/L 、酵母エキス５g/L 、ポリペプトン２g/L 、pH６）に植菌し、30℃20時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離（6000rpm 、30分) し、集菌した。得られた菌体をマクイルバイン・バッファー（pH６）で洗浄した。
(3) ショ糖との反応
上記菌体3.2g（湿重量）をショ糖を40％を含む20倍希釈マクイルバイン・バッファー（pH６）に十分懸濁させ、ゆるやかに攪拌させながら30℃で16時間反応させた。この反応終了液を遠心分離し（5,000rpm, 10分間) 、菌体を除去した後、活性炭カラムにて分画した。
【００１８】
活性炭300g( クロマトグラフ用、和光純薬製) をガラスカラム（半径5cm)に充填し、あらかじめ脱イオン水で十分洗浄し、反応終了液1.2Lをチャージし、活性炭を水2.8Lで洗浄し、その後12 v/v% エタノール4Lで溶出し、混在する重合度５までのオリゴ糖を溶出させた。次に、25% エタノール4Lで溶出した。溶出速度は20ml/ 分とした。この25% エタノールで溶出させた画分をＡ−２とした。この画分を濃縮し、一部をゲルろ過（TSK-oligo-PW、検出器RI) にて分析した。溶出時間約6.3 分にピークが認められた（図１）。
【００１９】
〔実施例２〕  新規フラクタン（11糖）の製造
アセトバクター・ポリサッカロゲネス (Acetobacter polysaccharogenes) MT-11-2（FERM BP-112)に代えてグルコノバクター・アルビダス (Gluconobacter albidus) IFO3250を用いる以外は、実施例１と同様にして反応を行い、反応終了液を分析したところ、1.6g/LのＡ−２の生成が認められた。
【００２０】
〔実施例３〕  反応生成物の分析
構造解析
実施例１で得られたＡ−２について構造解析を以下のようにして行った。
(1)  方法
▲１▼  構成糖および構成糖比
試料を0.25N HCl に溶解した２％濃度溶液を90℃、30分間加熱処理し、加熱処理物をHPLC [アミドカラム; SHODEX ASAHIPAK NH2P-50-4E、溶出液；アセトニトリル−水（65：35）、検出器 RI]] にて分析した。
▲２▼  重合度
各種重合度のマルトオリゴ糖を重合度マーカーとして、ゲルろ過（TSK-oligo-PWおよびSHODEX GS-310-7G1)によって分析した。
▲３▼  還元性
ソモギーネルソン法にて分析した。
▲４▼  酸部分加水分解
試料を0.１N HCl 溶液にて、30℃で５時間分解した。分解産物は、構成糖と同じＨＰＬＣおよびＴＭＳ化してガスクロマトグラフィーにて分析した。
▲５▼  インベルターゼ分解
試料にインベルターゼを30℃、16時間反応させた後、構成糖と同じくＨＰＬＣで分解産物を分析した。
▲６▼  α−グルコシダーゼ分解
試料にα−グルコシダーゼを30℃、80時間反応させた後、構成糖と同じくＨＰＬＣで分解産物を分析した。
▲７▼  13Ｃ−ＮＭＲ解析
13Ｃ−ＮＭＲ解析（条件：観測周波数  125.8MHz、溶媒  重水、基準  ジオキサン、室温）を行った。
【００２１】
(2)  結果
以下に、上記(1) ▲１▼〜▲６▼各項目についての結果を示す。
【００２２】
【表１】
0003883658.tif 000003
【００２３】
Ａ−２の13Ｃ−ＮＭＲ解析結果を図２に示す。13Ｃ−ＮＭＲ解析により、Ａ−２はショ糖のフラクトシル残基の６位にβ-2,6結合でフルクトースが９個結合した11糖のオリゴ糖と決定された。
【００２４】
〔実施例４〕  反応条件の検討
アセトバクター・ポリサッカロゲネス (Acetobacter polysaccharogenes) MT-11-2（FERM BP-112)を用い、実施例１と同様の操作を、反応条件（pH、温度、ショ糖濃度、時間）を変えて行った。反応液を一部採取し、ＨＰＬＣ（使用カラム； SHODEX ASAHIPAK NH2P-50-4E 、溶出液；アセトニトリル−水（65：35) 、検出器 RI)及びゲルろ過（SHODEX GS-310-7G1 、検出器RI) にて反応生成物を定量した。
【００２５】
【表２】
0003883658.tif 000004
【００２６】
0003883658.tif 000005
【００２７】
0003883658.tif 000006
【００２８】
0003883658.tif 000007
【００２９】
以上の結果より、温度は30と42℃で最終蓄積量に差はないが、温度が高い方が反応は速い。ショ糖濃度の高い方が生成量は多く、また反応時間は24時間で十分である。
【００３０】
〔試験例１〕  整腸作用（ビフィズス菌資化性）
(1)  方法
実施例１で得られた本発明の新規フラクタンを0.５％(w/v) 添加したＰＦＹ培地（培地１Ｌあたり、ポリペプトン10g 、酵母エキス10g 、Fildes  Enrichment 40ml 、塩類溶液40ml、Ｌ−システイン塩酸塩0.5g、pH7.6)に、各種腸内細菌に属する被験菌を植菌し、37℃で嫌気的に７日間培養し、培養液の濁度（OD660nm)を測定して被験菌の生育の有無を調べた。また、培地のpHを測定し、酸生成の有無を調べた。
【００３１】
(2)  結果
結果を下表に示す。
【００３２】
【表３】
0003883658.tif 000008
【００３３】
上記結果に示されるように、本発明の新規フラクタンは、ビフィズス属細菌によって選択的に資化された。よって、本発明の新規フラクタンは、ビフィズス属細菌に特異的に利用されることから、腸内でビフィズス菌を優先的に増殖させ、整腸作用を発揮しうると考えられる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、整腸作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収性促進作用などを発揮しうる１１糖の新規フラクタン、およびその効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応生成物（Ａ−２）のＨＰＬＣでの分析結果を示す。
【図２】Ａ−２の13Ｃ−ＮＭＲ解析を示す。
【図１】
0003883658.tif 000010
【図２】
0003883658.tif 000011