(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ポリペプチドおよび（２）ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール；およびジメチル−β−シクロデキストリンからなる群より選択される１種または２種以上である相分離誘起剤を含有する水溶液を凍結し、該凍結物に、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される１種または２種以上であるポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加し、凍結物中の相分離誘起剤および氷を溶解することを特徴とするポリペプチド微粒子分散液の製法。
【請求項２】
ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒がアセトン、メタノールおよびエタノールからなる群より選択される１種または２種以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
相分離誘起剤がポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリビニルピロリドン；およびジメチル−β−シクロデキストリンからなる群より選択される１種または２種以上である請求項２記載の方法。
【請求項４】
相分離誘起剤がポリエチレングリコールである請求項３記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの平均分子量が４００〜２０００００である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールの平均分子量が６０００〜７００００である請求項４記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液における相分離誘起剤／ポリペプチドの濃度比率が、０．２５以上である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液における相分離誘起剤／ポリペプチドの濃度比率が、１０2.7／Ｍ0.68（Ｍ：ポリペプチドの分子量）以上である請求項６記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチド微粒子が、平均粒子径が１０μｍ以下の球形微粒子である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により得られるポリペプチド微粒子分散液から、相分離誘起剤、水および水混和性有機溶媒を除去してポリペプチド微粒子を得る方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により得られるポリペプチド微粒子分散液から、相分離誘起剤、水および水混和性有機溶媒を除去して得られるポリペプチド微粒子を揮発性の水非混和性有機溶媒に生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液に分散させ、これを水相中に分散してＯ／Ｗエマルションを調製し、該水非混和性有機溶媒を留去することを特徴とするマイクロスフェアの製法。
【請求項１２】
揮発性の水非混和性有機溶媒が塩化メチレンである請求項１１のマクロスフェア製法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により得られるポリペプチド微粒子分散液から、相分離誘起剤、水および水混和性有機溶媒を除去して得られるポリペプチド微粒子、生体内分解性ポリマーおよびアセトンおよびテトラヒドロフランからなる群より選択される１種又は２種（溶媒Ａ）を含むポリマー溶液を、水およびエタノールからなる群より選択される１種又は２種（溶媒Ｂ）およびグリセリン（溶媒Ｃ）を含む均一混合液中に添加して乳化することによりポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去することを特徴とするマイクロスフェアの製法。
【請求項１４】
溶媒Ａがアセトンであり、溶媒Ｂが水である請求項１３記載のマイクロスフェアの製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチドの微粒子化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生理活性を有するポリペプチドが、ヒトまたは動物の種々の疾患に対する治療、予防に広く利用されている。
【０００３】
これらポリペプチドは、生体内での半減期が短いこと、経口投与により消化管から吸収させるのが困難なことなどから、従来、注射による多回投与が行われている。しかしながら、投与法の煩雑さ、患者への負担などの問題から、より簡便な投与方法が検討されている。
【０００４】
このような方法の一例として、経肺投与があげられる。しかしながら、経肺投与においては、ポリペプチドを肺胞内までに到達させるために、ポリペプチドを微粒子化する必要がある。
【０００５】
また、生体内分解性ポリマー中にポリペプチドを封入してマイクロスフェアとし、これを注射により生体内に埋め込み、ポリペプチドを長期にわたり生体内にデリバリーする検討も盛んに行われている。
【０００６】
このようなマイクロスフェアの製法としては、生体内分解性ポリマーを溶解させた塩化メチレン等の有機溶媒中に、ポリペプチドの水溶液を乳化してＷ／Ｏエマルションを調製し、これを水中に乳化してマイクロスフェアを得る方法が知られているが、この方法においては、ポリペプチドが変性を受け活性を失ってしまうという問題があり、一部のポリペプチドにしか適応できない。
【０００７】
この問題を回避するために、生体内分解性ポリマーを溶解させた有機溶媒中に、ポリペプチドを粉末のまま分散して油相とし、これを用いてマイクロスフェアを調製することも検討されているが、この方法においては、ポリペプチドの粒子径が大きいと、高い包含率が得られない上、溶出初期における多量放出（初期バースト現象）が生じるため、エアロゾル製剤同様、ポリペプチドを微粒子化する必要があった。
【０００８】
ポリペプチドの微粒子化方法としては、これまでに次の方法が知られている。
【０００９】
（Ｉ）ゼラチン等の水溶性高分子物質とポリペプチドを含む水溶液をスプレードライヤーにより微粒子化する方法（特開平４−３６２３３）。
【００１０】
（ＩＩ）ポリペプチドと水溶性高分子物質を含む水溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物をジェットミルにより微粉砕する方法（特開平８−２２５４５４）。
【００１１】
（ＩＩＩ）ポリペプチド水溶液をアセトン中に添加し、ポリペプチド微粒子を晶析させる方法（ジャーナル・オブ・マイクロエンカプスレーション［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ］，１４（２）巻，２２５−２４１頁，１９９７年）。
【００１２】
（ＩＶ）界面活性剤とポリペプチドとを水中で混合し、これを急速乾燥する方法（特開平９−３１５９９７）。
【００１３】
（Ｖ）ポリペプチド水溶液に、水混和性有機溶媒もしくは揮発性塩類を添加し凍結乾燥する方法（特開平１１−３２２６３１）。
【００１４】
（ＶＩ）ポリペプチドとポリエチレングリコールの混合水溶液を凍結乾燥し、有機溶媒にてポリエチレングリコールを溶解する方法（特開平１１−３０２１５６）。
【００１５】
しかしながら、いずれの方法においても、ポリペプチドが活性を失ってしまう、回収率が低い、再分散性が悪い、調製所要時間が長い、などのいずれかの問題点があり、これらの問題点を全て解決した方法は、未だ見出されていなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便迅速で回収率が高く、変性を伴わずにポリペプチドを微粒子化する方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
ポリペプチドと相分離誘起剤を含有する水溶液を凍結させると、その過程において両者の間で相分離が起こり、ポリペプチド水溶液の微小液滴が相分離誘起剤の水溶液中に分散した状態の凍結物が得られる。この凍結物にポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加すると、相分離誘起剤および氷は有機溶媒中に溶解し、結果、ポリペプチド微粒子が分散液として得られることを、本発明者らは見出した。
【００１８】
本発明方法によれば、簡便迅速に高い回収率でポリペプチドの微粒子が得られる上、得られた微粒子は、高い活性を保持しており、再分散性にも優れているという特徴を有する。
【００１９】
すなわち、本発明は、ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液の凍結物に、ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加し、凍結物中の相分離誘起剤および氷を溶解することを特徴とするポリペプチド微粒子分散液の製法に関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まずポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液（以下、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液と称す）を調製する。
【００２１】
ポリペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることができる種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該ポリペプチドは、その分子量がモノマーとして、例えば１０００〜２０００００のものが用いられ、特に好ましくは５０００〜７００００のものが汎用される。これらポリペプチドには、生化学の分野で高次構造を有すると云われるタンパク質に分類される高分子も含まれる。本発明で用いられるポリペプチドの種類は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、ある一定の水溶性を有するものが好ましく、その溶解度は水に対して、２０℃で約０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ以上である。
【００２２】
ポリペプチドの具体例としては、例えばホルモン類、酵素類、サイトカイン類、成長因子類などが挙げられる。より具体的には、例えば以下のポリペプチドが挙げられる。
【００２３】
ホルモン類としては、例えば成長ホルモン（ＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、インスリン、グルカゴン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、カルシトニンなどが挙げられる。
【００２４】
酵素類としては、例えば組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）、第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２５】
サイトカイン類としては、例えばインターフェロン類（ＩＦＮ−α，−β，−γなど）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１など）、カケクチン、オンコスタチン、コロニー刺激因子類（Ｇ−，Ｍ−，ＧＭ−ＣＳＦなど）、トロンボポエチン（ＴＰＯ），エリスロポエチン（ＥＰＯ）などが挙げられる。
【００２６】
成長因子類としては、例えば神経成長因子（ＮＧＦ−１，ＮＧＦ−２など）、神経栄養因子（ＮＴＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ−３など）、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ）、骨形成原成長因子（ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４など）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ）、軟骨誘導因子などが挙げられる。
【００２７】
これらのポリペプチドは糖鎖を有していてもよく、またその糖鎖構造が異なっていてもよい。さらに、これらはムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントなども含む。
【００２８】
本発明で用いられるポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組換え技術によって得られたものいずれでもよい。
【００２９】
また、本発明で用いられるポリペプチドとしては、金属塩であってもよく、かかる金属塩における金属としては、例えばアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）、亜鉛（II価）、鉄（II価、III価）、銅（II価）、スズ（II価、IV価）、アルミニウム（II価、III価）などが挙げられ、本明細書では、これら金属塩になっているものも含めて、ポリペプチドと称する。
【００３０】
本発明において用いられる相分離誘起剤としては、ポリペプチドおよび相分離誘起剤を高濃度で水に溶解させると（例えば、ポリペプチド２００ｍｇ／ｍｌ以上、相分離誘起剤５０ｍｇ／ｍｌ以上）、ポリペプチドに富んだ相と相分離誘起剤に富んだ相との相分離を誘起するようなものであれば特に限定されず、例えば、非ペプチド性水溶性高分子があげられる。
【００３１】
非ペプチド性の水溶性高分子としては、平均分子量４００〜２０００００、好ましくは６０００〜７００００のものが好適に使用でき、このような非ペプチド性水溶性高分子の具体例としては、ポリオキシエチレン類、セルロース誘導体、ポリビニル誘導体、シクロデキストリン誘導体などがあげられる。
【００３２】
ポリオキシエチレン類としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどがあげられる。
【００３３】
セルロース誘導体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどがあげられる。
【００３４】
ポリビニル誘導体としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどがあげられる。
【００３５】
シクロデキストリン誘導体としては、ジメチル−β−シクロデキストリンなどがあげられる。
【００３６】
中でもとりわけ好ましい相分離誘起剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンがあげられ、最も好ましくは、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールとしては、平均分子量４００〜２０００００の範囲内が好ましく、６０００〜７００００の範囲内が特に好ましい。
【００３７】
相分離誘起剤は、１種のみならず、２種以上を組合わせて用いてもよい。
【００３８】
ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液の調製方法は、水にポリペプチド、相分離誘起剤の両者を一度に溶解させてもよいし、一方を溶解させたのちもう一方を溶解させてもよく、またポリペプチド水溶液と相分離誘起剤水溶液とを混合してもよい。要は、最終的にポリペプチドと相分離誘起剤が水に溶解していればよく、調製法はとくに制限されない。
【００３９】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液におけるポリペプチド濃度は、ポリペプチドが溶解する範囲内であれば特に限定されないが、あえて例示するとすれば、０．０１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００４０】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液における相分離誘起剤の濃度は、相分離誘起剤が溶解する範囲内であれば特に限定されないが、好ましい相分離誘起剤の濃度をあえて例示するとすれば、０．０２５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
次いで、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させ、得られた凍結物に、ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加し、相分離誘起剤および氷を溶解させることにより、目的のポリペプチド微粒子が分散液として得られる。
【００４２】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させるにあたっては、水溶液の温度が急激に降下するような条件よりも、徐々に降下するような条件が好ましい。このような条件は、設定温度が−８０〜−２０℃の通常用いられる冷凍庫もしくは凍結乾燥機を用いて凍結させれば容易に達せられるが、より具体的にこのような条件を明示するとすれば、初期降温速度（冷却開始後１分当たりの水溶液の降下温度）が約２〜４０℃／分、好ましくは約１０〜３０℃／分である。
【００４３】
本発明方法の凍結過程においては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の水から最初に凝固を開始するため、非氷晶の部分においてポリペプチドおよび相分離誘起剤濃度の濃縮が起こり、その結果、ポリペプチドに富んだ相と相分離誘起剤に富んだ相との相分離が起こる。
【００４４】
この相分離現象は、相分離誘起剤に富んだ相の中にポリペプチドに富んだ相が微小液滴を形成する場合と、ポリペプチドに富んだ相の中に相分離誘起剤に富んだ相が微小液滴を形成する場合があり、どちらの相分離形態になるかは、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の相分離誘起剤／ポリペプチドの濃度比率（以下、濃度比率と称す）によって決定される。この濃度比率が、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類により決定されるある一定値（以下、転相比率と称す）以上であれば、相分離誘起剤に富んだ相の中にポリペプチドに富んだ相が微小液滴を形成することとなる。
【００４５】
一般に、濃度比率を転相比率以上にすると、より粒子径の小さな球形の微粒子が得られる。一方、濃度比率が転相比率以下の場合は、粒子は得られるものの、形状は不定形であり、粒子径もやや大きい。したがって、より粒子径の小さな微粒子、例えば、平均粒子径が１０μｍ以下の微粒子を得るには、濃度比率を転相比率以上にすることが好ましい。
【００４６】
転相比率は、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類によって変動するが、適宜、種々の濃度比率のポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を用いて微粒子を調製し、その粒子径およびその形状を調べることにより、容易に決定することができる。
【００４７】
相分離誘起剤として、平均分子量６０００以上のポリエチレングリコールを用いた場合には、転相比率がポリペプチドの分子量によってある程度推測できる。すなわち、ポリペプチドの分子量（Ｍ）と転相比率（Ｔ）との間には近似的に次の関係式
Ｔ＝１０2.7／Ｍ0.68
が成り立ち、上記の式において、用いるポリペプチドの分子量を代入することにより、転相比率を求めることができる。
【００４８】
上記の如く、転相比率はポリペプチド、相分離誘起剤の種類等により変動するが、平均粒子径が１０μｍ以下の微粒子が得られるような濃度比率をあえて例示するとすれば、０．２５以上、好ましくは０．５以上、より好ましくは１以上である。
【００４９】
本発明においては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させた段階で、ポリペプチド相が相分離誘起剤相中に分散した状態となっているため、凍結物中の氷および相分離誘起剤のみを溶解することにより、ポリペプチドが微粒子として得られる。凍結物中の氷および相分離誘起剤を溶解するため、該凍結物にポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加する。該有機溶媒の添加により、凍結物中の氷は、（ａ）直接有機溶媒中に溶解する場合、および（ｂ）融解して水となった後、有機溶媒中に混和する場合、が起こりうるが、本発明において氷の溶解とは、（ａ）の場合のみならず、即座に水が有機溶媒中に混和するかぎり、（ｂ）の場合も含まれる。
【００５０】
ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒としては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液の凍結物に添加した際、ポリペプチドは溶解せず、氷および相分離誘起剤は溶解するようなものであれば特に制限されない。このような有機溶媒としては、例えば、水と完全に混和し、２０℃におけるポリペプチドの溶解度が１ｍｇ／ｍｌ以下であり、１００ｍｇ／ｍｌの相分離剤水溶液に５倍量の当該有機溶媒を添加しても相分離誘起剤が析出しないようなものであればよく、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類に応じて適宜選択すればよい。このような有機溶媒の具体例をあえて例示するとすれば、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの低級価アルコール類、アセトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類などの他、アセトニトリル、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどがあげられ、これらの内、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどが好ましく、特に好ましくは、アセトンである。これら有機溶媒は２種以上混合して用いてもよい。
【００５１】
水混和性有機溶媒の添加量は、最終的に凍結物中の氷が水混和性有機溶媒中に溶解して形成される含水有機溶媒の含水率が、ポリペプチドを再溶解しえない含水率となるのに十分な量とする必要がある。このような量は、ポリペプチド、相分離誘起剤、水混和性有機溶媒の種類などにもよるが、通常、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の水の１〜１００倍量とすればよく、好ましくは、２〜２０倍量である。
【００５２】
本発明においては、水混和性有機溶媒の添加により、相分離誘起剤および氷を溶解させるが、有機溶媒添加後、攪拌することにより、速やかに溶解を完了することが出来る。また、攪拌下に有機溶媒を添加してもよい。攪拌は、マグネティックスターラー、プロペラ、タッチミキサー、超音波などの既知の攪拌手段を用いて行うことが出来る。
【００５３】
得られたポリペプチド微粒子分散液は、必要であれば、透析、遠心分離・洗浄、濾過・洗浄等の既知の手段を用い、分散媒の交換あるいは分散液中に溶解している相分離誘起剤および水の除去を行うこともできる。また、濾取あるいは遠心分離等の手段を用いて分散液より分散媒（水および相分離誘起剤が溶解している水混和性有機溶媒）を除去し、乾燥させることによって微粒子を粉体として取出すことも可能である。
【００５４】
得られたポリペプチド微粒子は、噴霧製剤、マイクロスフェア製剤等にすることができる。
【００５５】
噴霧製剤は、分散液から粉体として取出したポリペプチド微粒子単独で、もしくは、微粒子の分散性向上のため界面活性剤を添加して調製される。界面活性剤としては、例えば、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイルアルコール、硬化ヒマシ油誘導体などがあげられ、その配合量はポリペプチド重量に対し、０．００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲であり、好ましくは０．０５〜２％（ｗ／ｗ）である。
【００５６】
また、必要に応じ、安定化剤、賦形剤などが添加されていてもよい。安定化剤としては、人血清アルブミン、ゼラチンなどがあげられ、その配合量はポリペプチド重量の０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）が好ましい。賦形剤としては、ラクトース、マルトース、ソルビトース、トレハロース、キシロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトースなどの糖もしくは糖アルコールがあげられ、その配合量は、ポリペプチド重量に対して０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）の範囲内であり、好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）である。
【００５７】
さらには、本来生体に存在する浸透圧維持に必要な鉱物イオン、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、クロルイオンなどが適宜配合されていてもよく、また、生体に対する刺激性を抑えるために、肺胞由来の界面活性剤も必要に応じ配合されていてもよい。
【００５８】
このように調製された噴霧製剤用ポリペプチド組成物は、そのまま、あるいは圧縮空気、圧縮炭酸ガスなどを噴霧ガスとして、またあるいは適当なプロペラント中に分散して、口腔内または鼻腔内を経由して咽頭部あるいは肺内に吸入させる。使用可能なプロペラントとしては、クロロフルオロカーボン（フロン１１、１２、１１４など）、水素を含有したクロルフルオロカーボン（フロン１２３、１２４、１４１ｂなど）、塩素を含まないフルオロカーボン（フロン１２５、１３４ａなど）などがあげられる。
【００５９】
マイクロスフェア製剤とする場合には、次の方法で調製することが可能である。
【００６０】
（Ａ）噴霧乾燥法
ポリペプチド微粒子を分散させた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、スプレーノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥機）の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に噴霧液滴内の有機溶媒を蒸発させる（特開平１−１５５９４２、特開平８−１５１３２１、特開平９−２２１４１７、ドラッグ・デベロップメント・アンド・インダストリアル・ファーマシー［Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ］，２４（８）巻，７０３〜７２７頁，１９９８年（以下、単に文献１と称す）など）
（Ｂ）相分離法（コアセルベーション法）
ポリペプチド微粒子を分散させた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、コアセルベーション剤を攪拌下徐々に加え、マイクロスフェアを析出固化させる（特開昭６０−６７４１７、特開平８−１５１３２１、特開平９−２２１４１７、前記文献１など）
（Ｃ）液中乾燥法
揮発性で水非混和性の有機溶媒に生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液にポリペプチド微粒子を分散させ、これを水相中に分散してＯ／Ｗエマルションを調製し、該有機溶媒を留去するか（特開昭４９−１２０２４、特開昭６３−９１３２５、特開平８−１５１３２１、前記文献１など）、もしくは、２種以上の生体内分解性ポリマーを、それぞれ同一または相違なる揮発性で水に混和しない有機溶媒に溶解し、一方にポリペプチド微粒子を分散させた後、両者を混合してＯ／Ｏエマルションを調製する。次いでこれを水相中に分散してＯ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、該有機溶媒を留去する（特開平６−２１１６４８）。
【００６１】
（Ｄ）水混和性有機溶媒を用いたマイクロスフェア調製法
ポリペプチド微粒子、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）を含むポリマー溶液を、溶媒Ａと混和する前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｂ）と溶媒Ａと混和しない前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｃ）を含む均一混合液中に添加して乳化することによりポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去することによってもマイクロスフェアを調製することができる（特願２００１−１２４４５７）。
【００６２】
（Ｄ）の方法によりマイクロスフェアを調製するにあたっては、まず、ポリペプチド微粒子、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）を含むポリマー溶液を調製する。
【００６３】
ポリマー溶液中のポリペプチド微粒子量は、０．００１〜９０重量％、好ましくは、０．０１〜５０重量％である。
【００６４】
生体内分解性ポリマーとしては、製剤分野で一般に使用される生体内分解性ポリマーをいずれも使用することができ、好ましくは、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体である。ポリマー溶液中の生体内分解性ポリマー濃度は、通常１〜８０重量％、好ましくは、２０〜６０重量％である。
【００６５】
水と混和する生体内分解性ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）としては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに要する量が２５ｇ未満であり、水と完全に混和する性質のものであれば特に限定されず、例えば、アセトン、テトラヒドロフランが好ましく、アセトンが最も好ましい。これら溶媒は、１種のみならず、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６６】
次いで、調製したポリマー溶液を、溶媒Ａと混和する生体内分解性ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｂ）と溶媒Ａと混和しない生体内分解性ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｃ）を含む均一混合液中に添加して乳化することにより、ポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製する。
【００６７】
溶媒Ｂとしては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに２５ｇ以上要し、溶媒Ａと完全に混和するようなものであれば特に制限はなく、具体例としては、水、エタノールが好ましく、とりわけ水が好ましい。
【００６８】
また、溶媒Ｃとしては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに２５ｇ以上要し、溶媒Ｃ１００重量部に混和する溶媒Ａが２５重量部以下であり、溶媒Ｂと完全に混和して均一な混合液を形成するようなものであれば特に制限はなく、具体例としては、グリセリンがあげられる。
【００６９】
均一混合液における溶媒Ｂと溶媒Ｃとの重量比は、１０：９０〜５０：５０の範囲内が好ましく、２０：８０〜４０：６０の範囲内が最も好ましい。
【００７０】
また、該均一混合液には、乳化安定剤を含んでいてもよく、乳化安定化剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
【００７１】
溶媒Ａは、溶媒Ｂと溶媒Ｃを含む均一混合液と部分的に混和するが、混和する速度が制限されているため、薬物、生体内分解性ポリマー及び溶媒Ａを含むポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを形成することができる。そして、エマルション形成と同時に、もしくはエマルション形成と平行して、溶媒Ａが、ポリマー溶液から均一混合液へ徐々に除去され、マイクロスフェア形成も開始される。
【００７２】
ポリマー溶液と均一混合液との重量比は、好ましくは１：２〜１：２００の範囲内、とりわけ好ましくは１：３〜１：７５の範囲内である。
【００７３】
ポリマー溶液の均一混合液への乳化は、プロペラ式攪拌機、タービン型乳化機、高圧乳化機、超音波分散装置、スタティックミキサーなどの既知の乳化装置による攪拌下、ポリマー溶液を均一混合液中に添加することにより容易に実施可能である。乳化に要する時間は、用いる乳化装置、液量などによって異なるが、１〜１０分間程度である。乳化は、膜乳化、噴霧などの方法によっても好適に実施することが出来る。
【００７４】
乳化後、得られたエマルションを適当な方法で流動させ、分散相より残りの溶媒Ａを除去する。これにより、分散相の溶媒Ａが連続相へ除去され、分散相の生体内分解性ポリマーが完全に固化し、マイクロスフェアが得られる。
【００７５】
流動の方法は、循環または攪拌によって行うことができる。循環は、ポンプを用いて、エマルションの下部よりエマルションの一部を吸引し、パイプを通してこれをエマルションの上部に戻すことにより行うことが出来る。攪拌は、攪拌翼、マグネチックスターラーなどの通常の攪拌手段により行うことができる。
【００７６】
また、乳化後、一旦形成されたエマルションの連続相を増量すれば、分散相からの溶媒Ａの除去を促進でき、加えて、増量により、乳化中に連続相へ除去された溶媒Ａを希釈できるため、連続相中の溶媒Ａが形成段階のマイクロスフェアに悪影響を及ぼすことも防止できる。
【００７７】
更に、乳化後、エマルションの分散相から残った溶媒Ａを除去する際、加温、減圧等を行えば、溶媒Ａの除去を更に促進することができる。
【００７８】
得られたマイクロスフェアは遠心分離または濾過などの方法により分取し、蒸留水にて洗浄を行い、風乾または真空乾燥などにより溶媒を完全に除去すればよい。
【００７９】
上記（Ａ）〜（Ｄ）など、各方法により得られたマイクロスフェアは、そのまま埋込剤として生体に投与することができる。また、種々の製剤を製造する際の原料としても用いることができる。そのような製剤としては、例えば注射剤、経口投与剤、経皮投与剤、坐剤、経鼻投与剤、口腔投与剤および眼内投与剤などがあげられる。
【００８０】
以下、実施例により、更に本発明を詳細に説明する。
【００８１】
【実施例】
実施例１
（１）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、分子量６７０００、シグマ製）濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００（ポリエチレングリコール６０００、平均分子量７５００、和光純薬製）濃度０〜７０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡの濃度比率が０〜７）をそれぞれ１ｍｌずつ調製した。
【００８２】
（２）これら水溶液を−２０℃で凍結させた後、−２０℃で予め冷却しておいたアセトン５ｍｌを添加し、室温においてタッチミキサーを用いて攪拌を行い、ＰＥＧ６０００および氷をアセトン中に溶解させ、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、アセトン２ｍｌを添加しＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００８３】
（３）レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−１１００、島津製作所製）を用い、（２）で得られた分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）中の微粒子の平均粒子径を測定し、結果を図１に示した。ＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液の濃度比率（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡ）が０．２５以上において、平均粒子径が約１０μｍ以下の微粒子が得られた。
【００８４】
（４）（２）で得られたＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を除去後、１晩減圧乾燥を行いＢＳＡ微粒子を乾燥粉末として回収した。
【００８５】
（５）（４）で得られたＢＳＡ微粒子（濃度比率３）の電子顕微鏡写真を図２に示す。図２より、本発明により得られたＢＳＡ微粒子は、球形であることがわかる。
【００８６】
（６）（４）で得られたＢＳＡ微粒子（濃度比率３）をアセトンに分散したところ、速やかに再分散した。再分散したＢＳＡ微粒子の平均粒子径は２．８５μｍであり、減圧乾燥前、すなわち（２）で得られた微粒子分散液時（２．０９μｍ）とほぼ同程度であった。また、粒度分布も減圧乾燥前後でほとんど変化なかった（図３）。
【００８７】
実施例２
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ１０００（ポリエチレングリコール１０００、分子量９５０〜１０５０、日本油脂製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ１０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．５０μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ１０００および水除去済）を得た。
【００８８】
実施例３
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール２０００、分子量１８００〜２２００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ２０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．０６μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ２０００および水除去済）を得た。
【００８９】
実施例４
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール４０００、分子量２７００〜３４００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ４０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．５８μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ４０００および水除去済）を得た。
【００９０】
実施例５
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール２００００、平均分子量１９０００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ２００００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．３３μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ２００００および水除去済）を得た。
【００９１】
実施例６
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ７００００（ポリエチレングリコール７００００、平均分子量７００００、和光純薬製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ７００００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．３０μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ７００００および水除去済）を得た。
【００９２】
実施例７
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、アセトンに代えてメタノールを用いた以外は実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．９６μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００９３】
実施例８
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、アセトンに代えてエタノールを用いた以外は実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．７２μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００９４】
実施例９
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレン（平均重合度約１６０）−ポリオキシプロピレン（平均重合度約３０）共重合物、分子量５９００〜１２５００、旭電化工業製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．１５μｍのＢＳＡ微粒子分散液（プルロニックＦ６８および水除去済）を得た。
【００９５】
実施例１０
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＨＰＣ−ＳＬ（ヒドロキシプロピルセルロース、日本曹達製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径３．６９μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＨＰＣ−ＳＬおよび水除去済）を得た。
【００９６】
実施例１１
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、コリドンＫ３０（ポリビニルピロリドン、平均分子量４００００、ＢＡＳＦ製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．７２μｍのＢＳＡ微粒子分散液（コリドンＫ３０および水除去済）を得た。
【００９７】
実施例１２
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ジメチル−β−シクロデキストリン（ナカライテスク製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径９．２４μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ジメチル−β−シクロデキストリンおよび水除去済）を得た。
【００９８】
実施例１３
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、和光純薬製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．７７μｍのＢＳＡ微粒子分散液（Ｔｗｅｅｎ２０および水除去済）を得た。
【００９９】
実施例１４
ＨＲＰ（わさびペルオキシダーゼ、分子量約４００００、和光純薬製）濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度１００ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率１０）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．４２μｍのＨＲＰ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、室温下、３時間減圧乾燥を行い、ＨＲＰ微粒子を乾燥粉末として回収した。
【０１００】
スミロン「ペルオキシダーゼ用発色キットＯ」（住友ベークライト製）を用いて、ＨＲＰ微粒子の活性を測定したところ、ほぼ１００％活性が保持されていた。
【０１０１】
実施例１５
（１）ＢＳＡ２００ｍｇを水１４ｍｌに溶解し、これに１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００水溶液６ｍｌを添加・混合した後、−２０℃で凍結した。−２０℃で予め冷却しておいたアセトン１００ｍｌを添加し、室温においてマグネチックスターラーを用いて攪拌を行い、ＰＥＧ６０００および水（氷）をアセトン中に溶解させ、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、さらにアセトン４０ｍｌを添加して遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去して１晩減圧乾燥し、平均粒子径４．１５μｍのＢＳＡ微粒子１９５．１ｍｇを乾燥粉末として得た。
【０１０２】
（２）得られたＢＳＡ微粒子２５ｍｇを塩化メチレン１３５０ｍｇに分散させた後、ＰＬＧＡ５０２０（乳酸−グリコール酸コポリマー、平均分子量２００００、乳酸／グリコール酸のモル比が５０／５０、和光純薬製）４７５ｍｇを添加・溶解させた。これを、１５℃の０．２５％（ｗ／ｗ）メチルセルロース（メトローズＳＭ−４０００、信越化学製）水溶液４ｍｌ中に添加し、ポリトロンホモジナイザー（キネマティカ・アーゲー・リタウ製、８０００ｒｐｍ、３分間）を用いて乳化した。得られたエマルションを１５℃、４００ｍｌの水中に添加し、プロペラ式攪拌機（スリーワンモーターＢＬ６００、ヘイドン製、４００ｒｐｍ）で攪拌しながら、３時間かけて３０℃まで昇温して液中乾燥を行い、マイクロスフェアを形成させた。得られたマイクロスフェア分散液を、目開き１５０μｍのフィルターで濾過し、さらに目開き２０μｍのフィルターでマイクロスフェアを濾取し、これを凍結乾燥した。
【０１０３】
（３）得られたマイクロスフェアのＢＳＡ取込率を、ミクロＢＣＡタンパク定量キット（ＰＩＥＲＣＥ製）にて測定したところ、仕込量の８４．９％のＢＳＡがマイクロスフェア中に包含された。
【０１０４】
（４）マイクロスフェア１０ｍｇを栓付き試験管に入れ、ＰＢＳ（９．６ｍＭリン酸化生理食塩水）１０ｍｌを添加し、回転培養器（タイテック製、２５ｒｐｍ、３７℃）を用いて溶出試験を行った。経時的に試験管を回転培養器から取出し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行って上清９ｍｌを採取し、新たにＰＢＳ９ｍｌを添加して溶出試験を継続した。採取した上清中のＢＳＡ量をミクロＢＣＡタンパク定量キットにて測定し、マイクロスフェアより放出されたＢＳＡ量を求めた。結果を図４に示した。
【０１０５】
実施例１６
実施例１５（１）で得られたＢＳＡ微粒子２５ｍｇをアセトン８００ｍｇに分散させた後、ＰＬＧＡ５０２０（乳酸−グリコール酸コポリマー、平均分子量２００００、乳酸／グリコール酸のモル比が５０／５０、和光純薬製）４７５ｍｇを添加・溶解させ、ポリマー溶液を調製した。これを、ポリビニルアルコール（１．０重量％）を含有させたグリセリン−水混合液（グリセリンと水の重量比が７０：３０）４ｇ中に添加し、プロペラ式攪拌機（スリーワンモーターＢＬ６００、ヘイドン製、１５００ｒｐｍ、３分間）を用いて乳化し、ポリマー溶液を分散相、グリセリン−水混合液を連続相とするエマルションを得た。このエマルションをグリセリン−水混合液（グリセリンと水の重量比が７０：３０）１４ｇ中に添加し、マグネチックスターラーにて２．５時間攪拌し、さらに水１０ｍｌを添加して０．５時間攪拌し、アセトンをエマルションの分散相から除去し、マイクロスフェアの分散液を得た。この分散液を１５０μｍのフィルターで濾過し、さらに２０μｍのフィルターでマイクロスフェアを濾取した後、凍結乾燥を行い、マイクロスフェアを回収した。
【０１０６】
得られたマイクロスフェアのＢＳＡ取込率を、実施例１５（３）と同様の方法で測定したところ、仕込量の７９．１％のＢＳＡがマイクロスフェア中に包含された。
【０１０７】
比較例
（１）ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製した。−２０℃で予め冷却しておいたアセトン５ｍｌを添加し、室温においてタッチミキサーを用い攪拌し、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、アセトン２ｍｌを添加しＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。得られた微粒子の平均粒子径は、２．５８μｍであった。
【０１０８】
（２）（１）で得られたＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を除去後、１晩減圧乾燥を行いＢＳＡ微粒子を乾燥粉末として得た。
【０１０９】
（３）得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真を図５に示す。図５より、凍結処理を行わないと、球形微粒子が得られないことがわかる。
【０１１０】
さらに、得られたＢＳＡ微粒子のアセトンへの分散を試みたが、全く分散しなかった。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便迅速に、失活を伴うことなくポリペプチドを微粒子化することができ、得られたポリペプチド微粒子は、非常に高純度であり、再分散性も良好である。
【０１１２】
また、本発明方法は、微粒子回収時にほとんどロスが生じることはないので、回収率はほぼ１００％である。
【０１１３】
さらに、本発明により得られたポリペプチド微粒子を用いれば、長期間にわたりポリペプチドを一定の速度で放出でき、かつ初期バースト率の非常に低い高含量マイクロスフェア製剤が容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液の濃度比率（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡ）と、得られたＢＳＡ微粒子粒子径との関係を示すグラフ。
【図２】  本発明方法（実施例１）により得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真。
【図３】  本発明方法により得られたＢＳＡ微粒子分散液、およびそれから粉末として取り出したＢＳＡ微粒子を再分散させた分散液におけるＢＳＡ微粒子の粒度分布を示すグラフ。
【図４】  本発明方法により得られたＢＳＡ微粒子を用いて調製したマイクロスフェア（実施例１５）の溶出試験結果を示すグラフ。
【図５】  比較対照方法（比較例１）により得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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