(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ADP-リボース）合成酵素遺伝子のエクソン１を遺伝子対の双方において不活化させたことを特徴とする、マウス胚性幹細胞株。
【請求項２】
移植により合胞体性巨細胞が出現した腫瘍を形成することを特徴とする、請求項１に記載のマウス胚性幹細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ（ADP-リボース）合成酵素遺伝子（以下、「Parp遺伝子」という）の遺伝子対の双方に外来遺伝子が挿入され、ポリ（ADP-リボース）合成酵素生産能を持たない胚性幹細胞株（以下、「ES細胞株」という）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学療法剤の中で、三大疾病の一つであるがんに対する抗がん剤の開発は社会的に非常に重要である。多くの抗がん剤は標的細胞にDNA 鎖切断を起こし、死滅させることでその効果を発揮する。従って、抗がん剤のDNA 鎖切断作用及びそれに対する細胞応答が、これらの薬剤の効力及び副作用を左右する。
このような抗がん剤に対する細胞応答に密接に関連する酵素としてポリ（ADP-リボース）合成酵素が知られている。この酵素は、抗がん剤により切断されたDNA の修復に関与するだけでなく、細胞周期停止やアポトーシス誘導などに関係していることが最近明らかにされている。
【０００３】
Parp遺伝子の遺伝子対の双方が不活化され、ポリ（ADP-リボース）合成酵素生産能を全く持たないES細胞株があれば、種々に分化した細胞におけるポリ（ADP-リボース）合成酵素の機能を明らかにすることができ、新規の抗がん剤の開発のための重要な情報が得られる。
しかしながら、Parp遺伝子の遺伝子対の一方のみが不活化され、ポリ（ADP-リボース）合成酵素生産能が半減したES細胞株は既に知られているが（Genes & Dev. 9, 509-520 (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7303-7307 (1997) ）、遺伝子対の双方が不活化されたES細胞株は知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Parp遺伝子の遺伝子対の双方が不活化され、新規の抗がん剤の開発などに有用であるES細胞株を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ジーンターゲッテイングを二度繰り返すことによりParp遺伝子の遺伝子対の双方が不活化されたマウスES細胞株を作製できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、Parp遺伝子の遺伝子対の双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とするマウスES細胞株である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のマウスES細胞株は、以下のようにして作製することができる。
まず、マウスからParp遺伝子のエクソン部分を含むDNA を単離し、このDNA 断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスES細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためにはターゲッティングベクターにジフテリアトキシンＡフラグメント（DT-A）遺伝子などを結合させておくのが好ましい。これにより、非相同的な組換えを起こした細胞株を排除することができる。
【０００７】
上記操作により、Parp遺伝子の遺伝子対の一方が不活化された細胞株を得ることができる。この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用する。このような操作によりParp遺伝子の遺伝子対の双方が不活化された細胞株、即ち本発明のマウスES細胞株を得ることができる。
【０００８】
なお、本発明のマウスES細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-16356として寄託されている（寄託日：平成９年７月28日）。
本発明のマウスES細胞株は、例えば、DNA を標的とする抗がん剤の作用・副作用の感度の高い検出系、アポトーシス機序の解析系またはDNA 修復機序の解析系などに利用することができる。さらに抗がん剤の評価系に関して、具体的には次のように利用することができる。
【０００９】
１）抗がん剤の評価
本発明の細胞株と通常のマウスES細胞株とを培養し、マイトマイシンＣ、シスプラチン、ブレオマイシン、カンプトテシン等の抗がん剤で処理し、コロニー形成能やMTT assay 等で細胞障害性を検討する。本発明の細胞株でのみ顕著な有効性が認められれば、それらの抗がん剤にポリ（ADP-リボース）合成酵素阻害剤を併用することで抗がん剤の効果が増強されると期待される。
【００１０】
がんにおいては、ポリ（ADP-リボース）合成酵素発現が低いレベルのもの、また高レベルのものが存在する。従って、前述のように本発明の細胞株でのみ顕著な有効性を示す抗がん剤は、ポリ（ADP-リボース）合成酵素発現の低いレベルのがんに有効であると予想される。また、逆に本発明の細胞株より通常のマウスES細胞株に非常な有効性を示せば、ポリ（ADP-リボース）合成酵素発現レベルの高いがんに有効であると予想される。そのような評価は、これらES細胞株を129SV マウスあるいはヌードマウス皮下に移植し形成された腫瘍において検証できる。
【００１１】
さらに、転移性の腫瘍に対する抗がん剤の検出系にも利用することができる。より詳しくは、出血巣形成を特徴とする腫瘍種に対する抗がん剤の評価系に利用できる。
このように本発明の細胞株はがんの生物学的性質に基づいた抗がん剤の利用法の開発に有用と考えられる。
【００１２】
２）抗がん剤の開発
ポリ（ADP-リボース）合成酵素阻害剤が放射線療法や化学療法の増幅剤として有用な例がこれまで数多く報告されている。しかし、その作用点が本当にポリ（ADP-リボース）合成酵素であるかどうかの評価が困難である。本発明の細胞株を用いれば作用点の同定が可能になる。具体的には、本発明の細胞株及び通常のES細胞株を培養し、ブレオマイシン、シスプラチン、5-フルオロウラシル等の抗がん剤処理を増幅剤の存在下で行い、両細胞株間での増幅剤の効力の差を調べる。もし、本発明の細胞株で効果がなければ、その増幅剤がポリ（ADP-リボース）合成酵素を作用点とするものと考えられる。
【００１３】
また、本発明の細胞株を用いれば、同様の方法で増幅剤の作用濃度範囲を決定することも可能である。
さらに、本発明の細胞株及び通常のES細胞株を129SV マウス、あるいはヌードマウスの皮下に注入し、個体で腫瘍を形成させた後、増幅剤の存在下で放射線療法や化学療法を行うことにより、その増幅剤の個体における作用点と作用濃度範囲を決定することができる。
【００１４】
【実施例】
〔実施例１〕
Ａ．方法
1)マウスES細胞株の培養
マウスES細胞J1は、DMEM（Gibco ）+20%牛胎児血清培地でCO2 インキュベータを用いて37℃にて培養を行った。
【００１５】
2)Parp遺伝子の遺伝子対の双方が不活化された細胞株の樹立
129SvJマウス肝臓genomic DNA library より、Parp遺伝子エクソン１を含む約10kbp のgenomic DNA 断片を単離し、制限酵素部位のマッピングを行った。Parp遺伝子エクソン１を含む6kb 断片の3'下流側にDT-A発現カセットを結合し、Parp遺伝子エクソン１内部にネオマイシン耐性（Neo r ）遺伝子発現カセットを挿入したターゲティングベクターを作製した。これをエレクトロポレーションによりマウスES細胞JIに導入し、G418による選別後、Parp+/- ES細胞株を複数得た。
【００１６】
更に同様にピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを挿入したターゲティングベクターを作製し、Parp+/- ES細胞に導入後、G418とピューロマイシンによる選別を行った。
【００１７】
3)ポリ（ADP-リボース）合成酵素活性の測定
Extaction buffer(0.6 M NaCl, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.5mM DTT, 10mM NaHSO3, 1mM PMSF) をトリプシン処理後、PBS で洗浄したES細胞に加え、超音波破砕（50W で5 秒間３回）氷水中で行い、15,000xg 10 分間遠心し、上清を粗抽出液とした。この粗抽出液をProtein assay kit(Bio-rad)でbovine serum albuminをstandardとして蛋白質の定量を行った。ポリ（ADP-リボース）合成酵素はNAD + を基質としてADP-リボースのポリマーを合成する。そこで、基質NAD + の酸不溶性画分への取り込みを以下のように測定した。すなわち、100 μl のreaction mixture(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 100μM ［32P ］-NAD +(314 cpm/pmol, New England Nuclear), 20 μg/ml histone(Sigma), 1mM DTT) に粗抽出液を加え、25℃で20分間反応を行った。次に１mlの10％TCA と10mg/ml bovine serum albuminを１滴加え、氷上に10分間置いた後、直径2.5 cmのグラスフィルター（Whatman, GF/C ）によりろ過を行い、これを５％TCA-2 ％Sodium pyrophosphateにて洗浄し、液体シンチレーションカウンター(Beckman) によりCerenkov法で放射活性を測定した。
【００１８】
Ｂ．結果
Parp-/- ES細胞株は致死性を示さず、複数の細胞株を単離できた。ポリ（ADP-リボース）合成酵素活性は、Parp+/- 細胞株では親株に比較して半減し、Parp-/- 細胞株では消失していた。
【００１９】
〔実施例２〕
メチルメタンスルフォネート（MMS ）及びγ線に対するES細胞の感受性を、コロニー形成能によって検討した。
３種類のES細胞（Parp+/+ 、Parp+/- 、Parp-/- ）をトリプシンで処理した後、計数し、一定数のES細胞を一穴あたり５×105 個のフィーダ細胞をあらかじめ播いた６穴プレートに植え込んだ。フィーダー細胞としては、STO 細胞を使用した。MMS 及びγ線で処理した後、CO2 インキュベーターで７日間培養し、生じたコロニー数より生存率を計算した。この結果を図１及び図２に示す。
これらの図が示すように、Parp-/- ES細胞は、Parp+/- ES細胞及びParp+/+ ES細胞に比較して、MMS 及びγ線に対して高い感受性を示した。
【００２０】
〔実施例３〕
８週齢雌ヌードマウスの皮下にそれぞれ３種類のES細胞（Parp+/+ 、Parp+/- 、Parp-/- ）を移植し、移植から３週間後の各ES細胞の造腫瘍性を検討した。
Parp+/+ 、Parp+/- 及びParp-/- の３種類のES細胞すべてに造腫瘍性が認められたが、Parp-/- ES細胞の場合、他のES細胞に比べ、腫瘍サイズの平均値が小さかった（図３）。
【００２１】
Parp-/- ES細胞を移植した場合にも、Parp+/+ 及びParp+/- ES細胞と同様に、外、中、内胚葉系組織への分化が認められ、その分化度は未熟から成熟まで多彩な組織像を呈した。Parp-/- ES細胞に由来する腫瘍では、他のES細胞に由来する腫瘍に比べ、生じた多くの腫瘍で腫瘍に占める出血巣の割合が高かった（図４、実線で示す領域）。更に出血巣の中に巨核及び多核性を示す合胞体性巨細胞（STGC）の出現が顕著に認められた（図５、矢印）。更にまた、Parp-/- ES細胞由来腫瘍では、出血部位周囲の血管増生と血管内皮細胞の腫大化、異型性を認めた。
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、Parp遺伝子の遺伝子対の双方に外来遺伝子が挿入され、ポリ（ADP-リボース）合成酵素生産能を持たないマウスES細胞株を提供する。この細胞株は、抗がん剤の評価や開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  MMS 濃度と細胞の生存率の関係を示す図である。
【図２】γ線の線量と細胞の生存率の関係を示す図である。
【図３】移植したES細胞の種類と生じた腫瘍のサイズとの関係を示す図である。
【図４】  ES細胞の移植により生じた腫瘍の顕微鏡写真である。
【図５】  Parp-/- ES細胞の移植により生じた腫瘍の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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