(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクターに対する抗体を誘発することができる免疫原性組成物であって、
ｉ）配列番号４に記載した配列の、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭ  Ｉ−1356）のｈｓｐＡ遺伝子によってコードされる熱ショック蛋白質ＨＳＰ  Ａ、または
ii）前記ＨＳＰ  Ａのポリペプチドの変異体であって、１つもしくは数個のアミノ酸が置換され、または欠失され、または挿入されたアミノ酸配列を有し、前記変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するＨＳＰ  Ａのポリペプチドの変異体、
のいずれかを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
ｉ）配列番号４に記載した配列の、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭ  Ｉ−1356）のｈｓｐＢ遺伝子によってコードされる熱ショック蛋白質ＨＳＰ  Ｂ、または
ii）前記ＨＳＰ  Ｂのポリペプチドの変異体であって、１つもしくは数個のアミノ酸が置換され、または欠失され、または挿入されたアミノ酸配列を有し、前記変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するＨＳＰ  Ｂのポリペプチドの変異体、
のいずれかをさらに含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫原性組成物であって、ＨＳＰ  ＡのＣ末端配列：ＧＳＣＣＨＴＧＮＨＤＨＫＨＡＫＥＨＥＡＣＣＨＤＨＫＫＨを含むか、または該配列からなることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項４】
以下の(i)、(ii)または(iii)からなることを特徴とするポリヌクレオチド：
(i)配列番号４に記載したＨＳＰ  Ａをコードする配列またはその変異体であって、前記変異体の遺伝子産物が活性ウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強する変異体；
(ii)(i)の配列に相補的な配列；または、
(iii)(i)または(ii)の配列の断片であって、
−ヘリコバクター感染のインビトロにおける検出のための特異的なプローブとして使用するために適した、少なくとも45ヌクレオチドを含む断片、または
−増幅反応においてプライマーとして使用するために適した、少なくとも18個の連続したヌクレオチドからなり、かつ増幅されるｈｓｐ  Ａ遺伝子断片の５’末端および３’末端とハイブリダイズする断片、または
−活性ウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強する遺伝子産物をコードする断片、
のいずれかである断片。
【請求項５】
以下の(i)または(ii)からなることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド：
(i)配列番号４に記載したＨＳＰ  Ａをコードする配列、
および、配列番号４に記載したＨＳＰ  Ｂをコードする配列、
を含む、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭ  Ｉ−1356）の配列の全部もしくは一部、または、
(ii)(i)の配列に相補的な配列。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
ｈｓｐ  Ａ遺伝子を含むプラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭ  Ｉ−1356）。
【請求項８】
ｈｓｐ  Ａ遺伝子断片の核酸増幅反応におけるプライマーとしての利用に適したオリゴヌクレオチドであって、請求項４または５に記載の配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドからなり、かつ増幅されるｈｓｐ  Ａ遺伝子断片の5'または3'末端にハイブリダイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
適切な標識手段を有する、請求項４または５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを包含することを特徴とするヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
請求項６に記載の発現ベクターまたは請求項７に記載のプラスミドによって安定に形質転換された微生物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性物質に対する抗体またはその免疫学的活性を保持する断片であって、請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリのＨＳＰＡに対して特異的であるか、あるいはヘリコバクター以外のバクテリアに由来するＧｒｏＥＳ様蛋白質と免疫学的に交叉反応するかのいずれかであることを特徴とする抗体またはその断片。
【請求項１２】
ＨＳＰ  ＡのＣ末端配列を特異的に認識することを特徴とする、請求項１１に記載の抗体またはその免疫学的活性を保持する断片。
【請求項１３】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の製造方法であって、請求項１０に記載の形質転換された微生物を培養し、請求項６に記載の発現ベクターまたは請求項７に記載のプラスミドによって提供されるヘリコバクターＨＳＰ物質を収集して精製し、およびこれらの物質を適切な賦形剤、アジュバント、および任意にはその他の添加剤と組み合わせることを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
生物学的試料中の、ヘリコバクターによる感染をインビトロで検出するための方法であって、請求項９のヌクレオチドプローブの使用を含む方法。
【請求項１５】
ヘリコバクター感染のインビトロ検出のためのキットであって：
−請求項９に記載のヌクレオチドプローブ；
−ヘリコバクターの核酸と該プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための適切な培地；および、
−形成されるあらゆるハイブリッドを検出するための試薬、
を包含することを特徴とするキット。
【請求項１６】
蛋白質物質であって、少なくとも
(i)以下のアミノ酸配列を有するヘリコバクター・ピロリの熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）Ａ：
0003955317.tif 000034
または、
(ii)前記ＨＳＰ  Ａの変異体であって、上記アミノ酸配列の１つもしくは数個のアミノ酸が置換され、または欠失され、または挿入されたアミノ酸配列を有し、前記変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するＨＳＰ  Ａの変異体、
を含む融合または混合タンパク質を包含することを特徴とする蛋白質物質。
【請求項１７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭ  Ｉ−1355）のｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子によってコードされるヘリコバクター・フェリスのウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも1つのサブユニット；または１つもしくは数個のアミノ酸が置換され、または欠失され、または挿入されたアミノ酸配列を有するウレアーゼ変異体であって、前記ウレアーゼ変異体はヘリコバクター・ピロリと反応する抗体によって認識されるウレアーゼ変異体をさらに含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は、ヘリコバクター種［Helicobacter spp.］感染に対する防御抗体を誘導する免疫組成物に関する。また、ヘリコバクター由来の蛋白様物質、およびそれらをコードする核酸配列にも関する。これらの蛋白様物質に対する抗体もまた、この発明に含まれる。
Ｈ．ピロリ［H．pylori］はヒト胃粘膜に感染する微生物であり、進行性慢性胃炎に関連付けられている。それはまた、胃十二指腸潰瘍の病因であることが示されており（Peterson，1991）、最近の２つの研究では、Ｈ．ピロリに感染した人間は胃ガン発生の危険性が高いことが報告されている（Nomura et al，1991；Parsonnet et al，1991）。
この菌のイン・ビボにおける研究、並びに、その結果として適当な予防または治療剤の開発についての研究は、ヘリコバクター・ピロリが非常に小数の動物宿主に由来する胃タイプの上皮とのみ関連し、それらの中で研究所でのモデルとして適したものがないという事実によって妨げられてきた。
ネコの胃粘膜から単離され（Lee et al，1988，1990）、ヘリコバクター属の一員であると同定された螺旋菌を用いて、胃コロニー形成のマウスモデルが開発されている。この菌は、Ｈ．フェリス［H．felis］と命名されている（Paster et al，1990）。
現時点では、Ｈ．フェリスに関する限られた情報とそのＨ．ピロリとの類似および相違の程度しか入手できない。したがって、Ｈ．ピロリ感染の治療を開発するためのマウスモデルの信頼性は不明である。近年、Ｈ．ピロリウレアーゼがＨ．フェリス／マウスモデルにおける保護抗原であることが示された（Davin et al，1993；Corthesy-Theulaz et al）。
したがって、この発明の目的は、ヘリコバクター感染において用いられ、さらに実験動物において試験することが可能な、治療および予防組成物を提供することにある。
Ｈ．ピロリがウレアーゼ活性を発現すること、並びにウレアーゼが細菌性コロニー形成および特定の病原性プロセスの介在に重要な役割を果たすことは周知である（Ferrero and Lee，1991；Hazel et al，1991）。
Ｈ．ピロリのウレアーゼ構造ポリペプチドをコードする遺伝子（ＵＲＥ  Ａ、ＵＲＥ  Ｂ）は、Ｈ．ピロリにおけるウレアーゼ活性に必要な“アクセサリー”ポリプチドをコードする遺伝子を含む（国際特許出願WO 93/07273）ものとして、クローン化および配列決定がなされている（Labigne et al，1991；およびフランス特許出願FR 8813135）。
Ｈ．ピロリウレアーゼ遺伝子クラスター由来の核酸配列を、プローブとして、Ｈ．フェリス中のウレアーゼ配列の同定に用いる試みがなされている。しかしながら、これらの試みは１つも成功していない。さらに、イン・ビトロにおけるＨ．フェリスクラスターの確立および維持は非常に困難であり、細菌中に存在する大量のヌクレアーゼがＤＮＡの抽出を繁雑にしている。
しかしながら、本発明者らは、Ｈ．フェリスのウレアーゼ構造ポリペプチド並びにアクセサリーポリペプチドの遺伝子のクローン化および配列決定に成功した。これにより、この発明において、Ｈ．フェリスとヘリコバクター・ピロリとのｕｒｅ遺伝子産生物のアミノ酸配列データの比較が可能となり、ウレアーゼサブユニット間の高度の保存性が見出された。この２つのウレアーゼの間には免疫学的な関係が存在し、ウレアーゼサブユニットまたはそれらの断片を免疫原として用いてヘリコバクター感染に対する防御抗体を誘導することができる。
実際、個々のウレアーゼサブユニットが粘膜免疫原［mucosal immunogens］として作用する能力を解明するために、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスのそれぞれのウレアーゼサブユニット（ＵｒｅＡおよびＵｒｅＢ）をコードする遺伝子が発現ベクター（ｐＭＡＬ）にクローンされ、大腸菌［Escherichia coli］中で翻訳融合蛋白質［translational fusion proteins］として発現されている。組換えＵｒｅＡおよびＵｒｅＢ蛋白質は、アフィニティおよび陽イオン交換クロマトグラフィー技術により精製され、それぞれ分子量約68および103ｋＤａであると予想された。ウェスタン・ブロットでの研究により、この融合蛋白質のウレアーゼ成分が強度に免疫原性であり、ポリクローナルウサギ抗-ヘリコバクター血清により特異的に認識されることが示された。マウスを、粘膜アジュバント［mucosal ajuvant］（コレラ毒）と組合せて、50μｇの組換えＨ．フェリスＵｒｅＢでオロガストリック免疫［orogastric immunization］することにより、60％のマウス（ｎ＝7；ｐ＜0.005）が4ヶ月にわたってＨ．フェリス菌による胃コロニー形成から保護された。これを異種Ｈ．ピロリＵｒｅＢ抗原に対する25％（ｎ＝8；ｐ＞0.05）という値と比較した。組換えサブユニット抗原が胃のヘリコバクター感染に対して免疫防御応答を誘発することが初めて示された。
本発明者らはまた、この発明において、ヘリコバクター中に、ウレアーゼ活性に対する増強効果を有する新規熱ショック蛋白質、すなわちシャペロニンを同定した。したがって、免疫性組成物中でシャペロニンを用いることにより、防御の増強を誘発することができる。
実際、ヘリコバクター・ピロリのＨｓｐＡおよびＨｓｐＢポリペプチドの各々をコードする遺伝子がクローニングされ、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）に対する融合蛋白質として別々に発現させ、大規模に精製されている。これらの蛋白質は組換え抗原としてウサギの免疫に、並びに、ＥＬＩＳＡの他にウェスタン免疫ブロット検定法において、ＨＰに感染した患者（ＨＰ+）におけるそれらの免疫活性を決定するために用いられている。ＭＢＰ−ＨｓｐＡおよびＭＢＰ−ＨｓｐＢ融合蛋白質は、それらの抗原特性を保持することが示されている。（ＨＰ+）患者血清におけるＨｓｐＡおよび／またはＨｓｐＢに対する体液性免疫応答を比較することにより、ＨｓｐＢだけではなくＨｓｐＡも（ＨＰ+）患者血清により認識されることが示された（それぞれ、29/38および15/38）。非感染患者14人の中には、Ｈｓｐと反応する抗体を有する者はいなかった。
この発明は、ヘリコバクター感染に対する抗体を誘発することが可能な免疫組成物あって、
i）ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片；
ii）および／またはヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、すなわちシャペロニン、もしくはこの蛋白質の断片、
を含有することを特徴とする免疫組成物に関する。
好ましくは、この免疫組成物は防御抗体を誘発することが可能である。
好ましい態様によると、この発明の免疫組成物は、ヘリコバクター・ピロリおよび／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニットを主要活性成分として含有する。この発明において、“ウレアーゼ構造ポリペプチド”という表現は、ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリスの酵素を示す。これは、恐らく、２つの繰り返しモノマー性サブユニット、メジャーサブユニット（ｕｒｅ  Ｂ遺伝子の産生物）およびマイナーサブユニット（ｕｒｅ  Ａ遺伝子の産生物）、からなる主要表面抗原であり、ウレアーゼ遺伝子クラスターのアクセサリー遺伝子の産生物の存在によって補われている、場合には、２つのヘリコバクター種における加水ウレアーゼ活性、すなわち遊離ＮＨ4+への尿素の加水分解、の原因である。アクセサリー遺伝子産物の非存在下においては、ウレアーゼ構造ポリペプチドは酵素活性を表わさないものの、Ｈ．フェリスまたはＨ．ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されることは理解されるであろう。
この発明において、“免疫組成物”という用語は、上に定義される主要活性成分を、免疫応答を確実にするか、もしくは最適化するために必要なあらゆる成分、例えば粘膜アジュバントのようなアジュバント、と共に含有する組成物を表わす。
ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ構造ポリペプチドは、Labigne et al，1991に記述され、配列決定されている。この論文に記載されるポリペプチドは、この発明の組成物における使用に特に適している。しかしながら、抗ヘリコバクター・フェリスウレアーゼ抗体との交叉反応性が関与する範囲内でその免疫学的特徴が維持されるのであれば、核酸置換、欠失または挿入を含む、この公開された配列と機能的な相同性を示す変異体を用いることもできる。一般的に述べると、このポリペプチド変異体は、包含される配列と少なくとも75％、好ましくは約90％の相同性を示す。
ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ構造ポリペプチドの断片もまた、その断片がヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるのであれば、使用することができる。そのような断片には、一般に、少なくとも6個のアミノ酸からなる断片、例えば6ないし100個、好ましくは約20-25個のアミノ酸からなる断片が含まれる。この断片がヘリコバクターに独特のエピトープを担持していると好都合である。
この発明において、核酸およびアミノ酸配列は、遺伝子暗号およびアミノ酸略語をそれぞれ示す図11および12を参照することにより説明される。
この発明に用いるに適切なヘリコバクター・フェリスウレアーゼ構造ポリペプチドは、（ＣＮＣＭ  Ｉ−1355という番号で1993年8月25日にＣＮＣＭに寄託された）プラスミドｐＩＬＬ205の一部によってコードされ、図３（サブユニットＡおよびＢ）にそのアミノ酸配列が示されるものが好ましい。さらに、図３の配列についてアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、この配列の変異体も、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼとの免疫学的交叉関係［cross-relationship］を維持する限りにおいて用いることもできる。このような変異体は、図３の配列との少なくとも90％の相同性、もしくは同一性を示す。Ｈ．フェリスウレアーゼＡおよびＢサブユニットと、それぞれ80％および92％の同一性を有することが示されているヘリコバクター・ヘイルマンニー［Helicobacter heilmannnii］（Solnick et al，1994）由来のウレアーゼＡおよびＢサブユニットはそのような変異体の一例である。
このウレアーゼまたは変異体の断片も、この断片がヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識される限りにおいて、免疫組成物こ用いることができる。さらに、この断片の長さは通常少なくともアミノ酸6個、例えば6ないし100であり、好ましくは約20ないし25である。好ましくは、この断片は、ヘリコバクターに独特のエピトープを担持している。
この発明の免疫組成物に天然ウレアーゼ配列の変異体または断片が用いられる場合には、この断片または変異体を抗体、好ましくは天然もしくは組換えウレアーゼのいずれか、あるいは全ヘリコバクターに対して生じたポリクローナル抗体と接触させることにより、他のヘリコバクター種由来のウレアーゼと反応する抗体との交叉反応性を試験することができる。好ましくは、これらの変異体および断片は、Ｈ．ヘイルマンニーウレアーゼとも反応し得る抗体を生じる。したがって、この発明の免疫組成物によって、Ｈ．ヘイルマンニーによる感染に対する父叉防御［cross protection］も得ることができる。
毒性の危険性を最少にしつつ全ポリペプチドの免疫学的特性を保全することができるので、ウレアーゼ構造遺伝子の断片を用いることが特に好ましい。
この発明の免疫組成物の活性成分は、それぞれｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ遺伝子のサブユニットＡまたはサブユニットＢ産生物のいずれかである、ウレアーゼ構造ポリペプチドのただ１つのサブユニットからなるものでもよい。Ｈ．ピロリもしくはＨ．フェリスのいずれかのウレアーゼサブユニットＵｒｅ  Ｂ、または上述の変異体および断片のみを含む組成物が特に好都合である。それに対する防御が求められている微生物からウレアーゼサブユニット、特にサブユニットＢ、例えば、Ｈ．フェリス感染に対するＨ．フェリスサブユニットＢが誘導される相同系が最も好ましい。しかしながら、この組成物は、通常別のポリペプチドとして存在するサブユニットＡおよびＢの両者を含んでいてもよい。しかしながら、ポリペプチドが組換え手段によって生成される場合には、隣接する２つのコーディング配列を分け隔てる停止コドンを抑制することによってＡおよびＢ遺伝子産物の全配列を含む融合蛋白質を用いることもできる。
免疫組成物のウレアーゼ成分は、それがサブユニットＡであろうとサブユニットＢであろうと、例えばマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）との翻訳融合蛋白質［translational fusion proteins］の形で用いることができる。他の適切な融合は、国際特許出願ＷＯ 90/11360に例示されている。蛋白コーディング配列の５′または３′末端で6×Ｈｉｓ  ｔａｇ配列を置換することが可能な、QIAGEN，USAより市販されている“QIAexpress”が、他の適切な融合蛋白質の例である。しかしながら、活性成分を融合蛋白質の形で用いることは完全に任意である。
さらに好ましい態様によると、この発明の免疫組成物は、上述のウレアーゼ構造ポリペプチドに加えて、あるいはそれに替えて、“シャペロニン”としても知られるヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質を含んでいてもよい。これらのシャペロニンは、本願明細書において発明者らにより明らかにされている。好ましくは、シャペロニンはヘリコバクター・ピロリに由来する。このＨＳＰは、図６に示されるアミノ酸配列を有する、ウレアーゼ関連ＨＳＰ  ＡまたはＨＳＰ  Ｂまたはこの２つの混合物であってもよい。これらのポリペプチドは、（1993年8月25日にＣＮＣＭ  Ｉ−1356という番号でＣＮＣＭに寄託されている）プラスミドｐＩＬＬ689によってコードされる。単独もしくはＨｓｐ−Ｂとの組合せでのＨ．ピロリＨＳＰ−Ａ蛋白質が特に好ましい。
この発明によると、ＨＳＰ成分として、図６に示される配列のアミノ酸が置換され、挿入され、もしくは欠失し、天然ＨＳＰと通常少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％の相同性を示すポリペプチド変異体を用いることもできる。この変異体は、好ましくは、天然Ｈｓｐと少なくとも75％、例えば少なくとも85％の同一性を示す。
この変異体は、さらに、天然ポリペプチドとの機能的相同性を示してもよい。ＨＳＰ成分の場合、“機能的相同性”は、活性ウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強する能力、および／またはヘリコバクター、特にＨ．フェリスおよびＨ．ピロリによる感染を妨げる能力を意味する。ウレアーゼ活性を増強する性質は、下記実施例に記載される定量ウレアーゼ活性アッセイを用いて試験することができる。好ましくは、少なくとも6個のアミノ酸を有する、ＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂポリペプチドのいずれかもしくは両者の断片を組成物に用いることができる。この発明の免疫組成物に用いられるＨＳＰ成分の断片もしくは変異体は、好ましくは、ＨＳＰによって通常示されるウレアーゼ増強効果を妨げる抗体を産生することが可能である。この性質も、実施例に記述される定量アッセイによって試験することができる。組成物中にシャペロニン類が存在することにより、ヘリコバクター・ピロリおよびフェリスに対する防御が増強される。
免疫組成物のＨｓｐ成分は、ＨｓｐＡであろうとＨｓｐＢであろうと、例えばマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）との翻訳融合蛋白質の形で用いることができる。ウレアーゼ成分については、他の適切な融合相手が国際特許出願ＷＯ 90/11360に記載されている。QIAGEN，USAの“QIAexpress”システムを用いることもできる。さらに、蛋白質を融合蛋白質の形態で用いることは完全に任意である。
したがって、この発明によると、免疫組成物は上述のウレアーゼ構造ポリペプチド、またはヘリコバクターＨｓｐ、特にＨｓｐＡ、あるいはこれらの免疫源の組合せのいずれかを含めばよい。
好ましい態様によると、この免疫組成物には、ヘリコバクター・フェリスのＡおよびＢサブユニットの両者が（すなわち、Ｈ．ピロリウレアーゼなしで）、ウレアーゼ成分として、ヘリコバクター・ピロリのＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂと共に含まれる。あるいは、ヘリコバクター・フェリスウレアーゼのＡおよびＢサブユニットを、Ｈ．ピロリのＡおよびＢサブユニットと共に、ただしシャペロニン成分は含めずに用いることができる。
２種の異なるヘリコバクター種のウレアーゼ間の免疫学的交叉反応性が、組成物中でのただ１種のウレアーゼ、好ましくはヘリコバクター・フェリスのウレアーゼの使用を可能にする。しかしながら、共通のエピトープによって誘発される防御抗体は、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスの両者に対して活性である。この組成物は、ウレアーゼポリペプチドまたは断片が他の種にも生じるエピトープを担持する場合には、他の種のヘリコバクターに対する防御抗体をも誘発することが可能である。
この発明の組成物は、生理学的に許容し得る賦形剤および担体、並びに、任意のアジュバント、ハプテン、担体、安定化剤等と共に、免疫組成物またはワクチンとして有益に用いられる。適切なアジュバントには、ムラミルジペプチド［muranmyl dipeptide］（ＭＤＰ）、完全もしくは不完全フロインドアジュバントおよびミョウバンが含まれる。ワクチン組成物は、通常、経口投与用に処方される。
このワクチンは好ましくはヒトに用いられるものであるが、非ヒト動物に投与することもでき、例えば、家畜治療用、またはマウス、ネコおよびイヌのような実験動物に用いることができる。
動物体内に注入された免疫組成物は、治療の目的、例えば受動免疫において用いることができる特異性抗体のイン・ビボにおける合成を惹起する。
この発明はまた、免疫組成物に用いられる蛋白様物質およびＡおよびＢウレアーゼ構造サブユニット以外のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされる蛋白様物質にも関する。“蛋白様物質”は、精製され、もしくは他の蛋白様もしくは非蛋白様物質との混合物のいずれかの形態の、他のアミノ酸鎖、例えばペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質、融合もしくは混合蛋白質（すなわち、２種以上の蛋白様物質の関連であり、それらの全てもしくは幾らかは免疫原性または免疫調節特性を有していてもよい）を意味する。“ポリペプチド”は、その長さにかかわらず、アミノ酸の鎖を表わし、“ペプチド”という用語を包含［englobes］する。“断片”という用語は、親の配列よりも少なくともアミノ酸１個だけ短く、親の配列において連続している、例えば少なくとも6残基の長さのアミノ酸を含む、いかなるアミノ酸配列をも意味する。
この発明のペプチド配列は、例えば、メリーフィールド［Merrifield］法のような技術およびアプライド・バイオシステム社［Applied Biosystems］より市販されているタイプのシンセサイザーを用いて、化学合成により得ることができる。
特には、この発明は、プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭ  Ｉ−1355）のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリスポリペプチドの少なくとも１つを含むことを特徴とする蛋白質様物質であって、構造およびアクセサリーウレアーゼポリペプチド、または前記ポリペプチドと少なくとも90％の相同性を有するポリペプチド、またはそれらの断片を含む蛋白質様物質に関する。特に興味深いのは、図３に示されるｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ遺伝子の遺伝子産物、または少なくとも90％の相同性を有するそれらの変異体もしくは少なくともアミノ酸６個を有する断片である。この断片および変異体は、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識される。
ウレアーゼ遺伝子クラスターのアクセサリー遺伝子によってコードされるポリペプチドの中でも、図９に示されるｕｒｅ  Ｉの遺伝子産物もこの発明の一部を形成する。少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％の相同性を有するｕｒｅ  Ｉ産物の変異体、または少なくともアミノ酸６個を有する、この遺伝子産物もしくは変異体の断片もまた含まれる。この変異体は、好ましくはｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ遺伝子産物を、残りのウレアーゼアクセサリー遺伝子産物の存在下において活性化する能力を有する。この機能的相同性は、以下の試験を用いて検出することができる；ｕｒｅ  Ｉ遺伝子産物変異体を有する細菌109個を尿素−インドール培地1ｍｌに懸濁させ、37℃でインキュベートした。尿素が加水分解することによりアンモニウムが放出され、これがｐＨを増加させてオレンジ色から暗赤色への色の変化を誘発する。そのような色変化が観察されることは、試験中のｕｒｅ  Ｉ遺伝子産物の変異体がｕｒｅ  ＡおよびＢ遺伝子産物を活性化し得ることを示している。
ｕｒｅ  Ｉ遺伝子産物の断片もまた、それが、例えば少なくともアミノ酸70ないし100個の長さを有しているならば、この全ポリペプチドとの機能的相同性を表わすことが可能である。
ｕｒｅ  Ｉポリペプチドまたは変異体の断片は、ウレアーゼ熟成プロセスを妨げる抗体の形成を誘発することが可能である。換言すると、この断片は、ｕｒｅ  Ｉとｕｒｅ  Ａ／ｕｒｅ  Ｂ遺伝子産物との間の相互作用において決定的な役割を果たすエピトープを担持する。
この発明はまた、熱ショック蛋白質またはヘリコバクター・ピロリのシャペロニン類またはそれらの断片の少なくとも１種を含む蛋白質様物質にも関する。図６に示されるＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂポリペプチド、またはこのポリペプチドと少なくとも75％、好ましくは80もしくは90％の相同性または同一性を有するポリペプチドが特に好ましい。ヘリコバクター・ピロリＨＳＰ  Ａポリペプチドの特に好ましい断片は、Ｃ−末端配列：
0003955317.tif 000002
または、少なくとも６個の連続したアミノ酸を有するこの配列のサブ断片である。このＣ−末端配列は、例えばニッケルの結合を可能にする、金属結合ドメインとして作用することが教示されている。
この発明の蛋白質様物質はまた、Ｈ．ピロリおよび／またはＨ．フェリスのウレアーゼ構造ポリペプチド、または上に定義されるそれらの断片もしくは変異体の少なくとも１種を含む融合もしくは混合蛋白質からなり、あるいはそれらを包含することもできる。特に好ましい融合蛋白質は、上に定義されるＭａｌ−Ｅ融合蛋白質およびQIAexpressシステム融合蛋白質（QIAGEN，USA）である。融合または混合蛋白質には、ウレアーゼサブユニットに代えて、あるいは加えて、上に定義される熱ショック蛋白質またはそれらの断片もしくは変異体が含まれる。
この発明はまた、上述の蛋白質様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体にも関する。より詳細には、この発明は、構造およびアクセサリーウレアーゼポリペプチド、すなわち、構造遺伝子ｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ、並びにｕｒｅ  Ｃ、ｕｒｅ  Ｄ、ｕｒｅ  Ｅ、ｕｒｅ  Ｆ、ｕｒｅ  Ｇ、ｕｒｅ  Ｈおよびｕｒｅ  Ｉとして知られるアクセサリー遺伝子を有するプラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭ  Ｉ−1355）のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリスポリペプチドの１種に対する抗体またはそれらの断片に関する。これらの抗体は、前記ウレアーゼポリペプチドとの少なくとも90％の相同性を有するポリペプチド、または、好ましくは少なくとも6個のアミノ酸を有するそれらの断片にも向けられる。この発明の抗体は、ウレアーゼ遺伝子クラスターによって発現されるヘリコバクター・フェリスポリペプチドを特異的に認識することができる。この場合には、この抗体によって認識されるエピトープはヘリコバクター・フェリスに独特のものである。あるいは、この抗体は、ヘリコバクター・フェリスウレアーゼポリペプチドおよびヘリコバクター・ピロリウレアーゼポリペプチドに共通のエピトープに対する抗体からなり、またはそれを含んでいてもよい。この抗体がアクセサリー遺伝子産物を認識する場合には、それらがヘリコバクター・ピロリアクセサリー遺伝子産物と交叉反応することが特に都合がよい。このようにして、ウレアーゼ熟成プロセスを阻害することにより、ヒトにおけるヘリコバクター・ピロリ感染の治療処置にこの抗体を用いることができる。
この発明の特に好ましい抗体は、ヘリコバクター・フェリス ｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子産物、すなわちＡおよびＢウレアーゼサブユニットを認識する。好ましくは、これらの抗体はまた、ヘリコバクター・ピロリＡおよびＢウレアーゼサブユニットと交叉反応するが、他の尿素分解バクテリア［ureolytic bacteria］とは交叉反応しない。このような抗体は、ヘリコバクターに独特のエピトープ（図４参照）に対して調製し、あるいは全ポリペプチドに対して調製した後に他の尿素分解バクテリアと反応するあらゆる抗体をスクリーニングで除外すればよい。
この発明はまた、ＨＳＰ類またはそれらの断片、特に、図６に示されるＨＳＰ  Ａおよび／またはＨＰＳ  Ｂ蛋白質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体にも関する。ＨＳＰ類と少なくとも75％、好ましくは80％、または90％の相同性を有するポリペプチドもまた、抗体形成の誘発に用いることができる。これらの抗体は、認識されるエピトープにより、ヘリコバクター・ピロリシャペロニン類に特異的であっても、あるいはヘリコバクター以外のバクテリアに由来するＧｒｏＥＬ様蛋白質もしくはＧｒｏＥＳ様蛋白質と交叉反応してもよい。図７は、それぞれ種々のバクテリアに由来するＧｒｏＥＳ様蛋白質およびＧｒｏＥＬ様蛋白質とのＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂの相同領域を示す。特に好ましい抗体は、ＨＳＰ  ＡまたはＨＳＰ  Ｂシャペロニンのいずれかについて特異的な抗体、または金属結合機能を有するＨＳＰ  ＡのＣ末端配列を特異的に認識する抗体である。さらに、抗体誘発に特異的な配列を使用することにより、ヘリコバクター特異的抗体の産生が確実となる。
この発明の抗体は、古典的な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により、もしくはヒト抗体を調製するための周知技術により、あるいはMarks et al（Journal of Molecular Biology，1991，222，p581-597）に記述される方法により生成させることができる。
この発明はまた、動物、例えば哺乳動物を、この発明の免疫組成物、蛋白様物質もしくは断片、または融合もしくは混合蛋白質で免疫し、次いで抗体もしくは血清を精製することにより得られる、精製された抗体もしくは血清にも関する。また、Ｈ．ピロリ感染のイン・ビトロ検出のための試薬であって、少なくともこれらの抗体または血清を包含し、さらにこれらの抗体を標識するための試薬、例えば抗−抗体等を任意に伴う試薬にも関る。
この発明は、さらに、ペプチドを包含する上記のあらゆる蛋白質様物質をコードする核酸配列に関する。特には、この発明は、
i)ヘリコバクター・フェリスウレアーゼおよび上記アクセサリーポリペプチドをコードする配列、および上述のＨ．ピロリのＨＳＰをコードする配列；
またはii)配列(i)に相補的な配列；
またはiii)過酷な条件下において、配列(i)もしくは(ii)とハイブリダイズし得る配列；
またはiv)少なくとも10個のヌクレオチドを含む配列(i)、(ii)もしくは(iii)の断片、
を包含することを特徴とする核酸配列に関する。
好ましい核酸配列は、プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭ  Ｉ−1355）の配列の全部または一部、例えば図３の配列、特にｕｒｅ  Ａの遺伝子産物およびｕｒｅ  Ｂをコードする配列、または図９（ｕｒｅ  Ｉ）の配列、または過酷な条件下でこれらの配列とハイブリダイズし得る配列、またはこれらの配列に相捕的な配列、またはこれらの配列の少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む断片を包含する配列である。
他の好ましい配列は、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭ  Ｉ−1356）の配列の全部もしくは一部、例えば図６の配列、特にはＨＳＰ  Ａおよび／またはＨＳＰ  Ｂをコードする配列、またはこの配列に相補的な配列、または過酷な条件下でこの配列とハイブリダイズし得る配列、またはそれらの断片を包含する配列である。
この発明における、非常に過酷なハイブリダイゼーション条件とは以下の通りである：
−5×ＳＳＣ；
−50％ホルムアミド、37℃；
または：
−6×ＳＳＣ；
−デンハード［Denhard］培地、68℃。
この発明の配列には、非過酷条件下、すなわち：
−5×ＳＳＣ；
−0.1％ＳＤＳ；
−30もしくは40％、好ましくは30％ホルムアミド、42℃、において上述の配列(i)、(ii)および(iii)と反応する配列が含まれる。
この発明において、“相補的配列”という用語は、“相補的”および“逆［reverse］”および“逆［inverse］”配列を意味する。
核酸配列はＤＮＡであっても、あるいはＲＮＡであってもよい。
この発明の配列は、適切な標識手段と関連付けて、核酸プローブとして用いることができる。そのような手段には、放射活性同位体、酵素、化学的もしくは化学発光マーカー、蛍光色素、ハプテン、または抗体が含まれる。このマーカーは、任意に固体支持体、例えば膜もしくは粒子、に固定することができる。
このプローブ配列の５′末端に、好ましいマーカーとして、放射活性リン（32Ｐ）が組み込まれる。この発明のプローブには、記載された核酸配列のあらゆる断片が含まれ、例えば少なくとも45個のヌクレオチド、例えば60、80または100個以上のヌクレオチドの長さを有し得る。好ましいプローブは、ｕｒｅ  Ａ、ｕｒｅ  Ｂ、ｕｒｅ  Ｉ、ＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂ遺伝子に由来するものである。
この発明のプローブは、任意の遺伝子増幅反応後の、生物学的試料におけるヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出に用いることができる。最も好ましくは、これらのプローブは、ヘリコバクター・フェリスもしくはヘリコバクター・ピロリ、またはその両者の検出に用いられる。いずれに用いられるかは、プローブとして選択される配列が一方もしくは他方のいずれに特異的であるか、あるいは両者にハイブリダイズすることができるのかによる。一般に、そのような検出を行なうにあたっては、ハイブリダイゼーション条件は過酷である。
この発明はまた、ヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出のためのキットであって：
−上に定義される、この発明によるヌクレオチドプローブ；
−ヘリコバクターの核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応を行なうための適切な培地；
を包含することを特徴とするキットにも関する。
この発明のヌクレオチド配列は、核酸増幅反応において、プライマーとしても機能し得る。このプライマーは、通常、上述の配列の少なくとも10個、好ましくは少なくとも18個の保全ヌクレオチドを含む。典型的な長さは、連続したヌクレオチド25ないし30個であり、100個以上もの長さであることもある。このようなプライマーは一対で用いられ、増幅される断片の５’および３’末端とハイブリダイズするように選択される。この増幅反応は、例えばＰＣＲ法を用いて行なうことができる（欧州特許出願EP 200363，201184および229701）。Ｑ−β−複製法（Biothechnology，vol.6，Oct.1988）もまた、増幅反応において用いることができる。
この発明はまた、この発明の核酸配列のいずれかを含むことを特徴とする発現ベクターにも関する。特に好ましい発現ベクターは、プラスミドｐＩＬＬ689およびｐＩＬＬ205（それぞれ、ＣＮＣＭ  Ｉ−1356およびＣＮＣＭ  Ｉ−1355）である。この発現ベクターは、通常、適切なプロモーター、ターミネーターおよびマーカー遺伝子、並びに十分な発現に必要な他の調節信号を含む。
この発明はさらに、この発明の核酸配列によって安定に形質転換されている原核もしくは真核宿主細胞に関する。宿主の例として、ＣＨＯ細胞および細胞系のような高度な真核生物；酵母、大腸菌、例えば大腸菌ＨＢ101のようなバクテリアを含む原核生物；結核菌［Mycobacterium tuberculosum］；バキュロウイルスおよびワクチニアを含むウイルスに言及することができる。通常、宿主細胞はベクターによって形質転換される。しかしながら、この発明においては、常法を用いて、相同組換えにより核酸配列を挿入することもできる。
この発明の安定に形質転換された宿主を培養することにより、ヘリコバクターウレアーゼポリペプチドおよび、適用可能である場合には、ＨＳＰ物質を、組換え手段により生成させることができる。次いで、この蛋白質様物質を収集し、精製する。この組換え物質を適切な賦形剤、アジュバントおよび、任意に、安定化剤のような他の添加剤と組合せることにより、医薬組成物が調製される。
この発明はまた、下記実施例に記載される通りに構築された（1993年7月20日に、Ｉ−1337の受付番号でＣＮＣＭに寄託されている）プラスミドｐＩＬＬ920およびｐＩＬＬ927（ＣＮＣＭ  Ｉ−1340、1993年7月20日に寄託）にも関する。
この発明の異なる側面が図中に示される：
図１：
ｐＩＬＬ205のトランスポゾン変異誘発および配列決定。組換えコスミドｐＩＬＬ199および組換えプラスミドｐＩＬＬ205の線形制限地図（並びに相対スケールマーカー）が示される。括弧内の数字は、クローニングベクターの１つ（それぞれ、ｐＩＬＬ575およびｐＩＬＬ570）に挿入されたＨ．フェリスＤＮＡ断片のサイズを示す。円内の“プラス”および“マイナス”記号は、ｐＩＬＬ205におけるミニＴｎ3-Ｋｍ［MiniTn3-Km］トランスポゾンの挿入部位に相当する。“プラス”記号は、トランスポゾンがウレアーゼの発現を不活性化しなかったことを示す。これに対して、マイナス記号はウレアーゼ発現が無効となったことを示す。文字は、定量的なウレアーゼ活性およびウレアーゼ遺伝子産物の合成についてさらに特徴付けられた変異体クローンを示す。ｐＩＬＬ205上の構造ウレアーゼ遺伝子（ｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ）の位置がボックスで示されており、その長さは各々のオープンリーディングフレームのサイズに比例している。矢印は転写の方向を示す。図の底部のスケールはＨｉｎｄIIIおよびＰｓｔＩ制限断片の（キロ塩基での）サイズを示している。制限部位は以下のように表わされている：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｐｖ、ＰｖｕII；Ｂｇ、ＢｇｌII；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄIII；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｐｓ、ＰｓｔＩ。括弧内の文字は、クローニングベクター起源の部位を示す。
図２：
Ｈ．フェリスバクテリアに対して生成したウサギポリクローナル抗血清（1：1に希釈、1000）と反応した、組換えプラスミドを有する大腸菌ＨＢ101細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット解析。Ａ）抽出物は：プラスミドベクターｐＩＬＬ570（レーン１）；組換えプラスミドｐＩＬＬ205（レーン２）；および遺伝子座“ａ”、“ｂ”、“ｃ”、“ｄ”および“ｅ”（レーン３−７）で分断されたｐＩＬＬ205誘導プラスミドを有する大腸菌細胞の抽出物。Ｂ）抽出物は：Ｈ．ピロリｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＩＬＬ753（Labigne et al.，1991）（レーン１）；および遺伝子座“ｆ”、“ｇ”、“ｈ”および“ｉ”（レーン２−５）で分断されたｐＩＬＬ205誘導プラスミドを有する大腸菌細胞の抽出物。小さな矢の頭は、Ｈ．フェリスの推定ｕｒｅ  Ａおよびｕｒｅ  Ｂ遺伝子産生物を表わす約30および66キロダルトンのポリペプチドを示す。パネルＢにおける大きな矢の頭は、抗−Ｈ．フェリス血清と交叉反応するＨ．ピロリの対応遺伝子産物を示す。数字は、蛋白標準の分子量（1000を単位として）を示す。
図３：
Ｈ．フェリス構造ウレアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。配列の上の数字は、２つのＵｒｅ  ＡおよびＵｒｅ  Ｂポリペプチドの各々において、アミノ酸位置の他にヌクレオチド位置を示す。Ｕｒｅ  Ａ（ｂｐ43ないし753）およびＵｒｅ  Ｂ（766ないし2616）の予想されるアミノ酸配列が配列の下に示される。推定リボソーム結合部位（シャイン−ダルガーノ配列、ＳＤ）には下線が付されている。
図４：
Ｈ．フェリスの構造ウレアーゼ遺伝子の配列と：ａ）Ｈ．ピロリウレアーゼの２つのサブユニット配列（Labigne et al.，1991）；ｂ）プロテウス・ミラビリス［Proteus mirabilis］の３つのサブユニットの配列（Jones and Mobley，1989）；ｃ）タチナタマメウレアーゼの単一サブユニットの配列との比較。最良の配列（アラインメント）を確実にするために（ダッシュで示される）ギャップが導入されている。★、Ｈ．フェリス配列のアミノ酸と同一のアミノ酸；＝、種々のウレアーゼによって共有されるアミノ酸；・、ヘリコバクターウレアーゼに独特のアミノ酸。パーセンテージは、Ｈ．フェリスウレアーゼサブユニットのアミノ酸と同一のアミノ酸の数に関連する。Ｈ．ｆ．、ヘリコバクター・フェリス；Ｈ．ｐ．、ヘリコバクター・ピロリ；Ｐ．ｍ．、プロテウス・ミラビリス；Ｊ．ｂ．、タチナタマメ。
図５：
組換えプラスミドｐＩＬＬ689、ｐＩＬＬ685、およびｐＩＬＬ691の制限地図。これらのプラスミドの構築は、表１に詳細に記載されている。三角内のＫｍは、プラスミドｐＩＬＬ687、ｐＩＬＬ688およびｐＩＬＬ696の構築につながるカナマイシンカセットの挿入部位を表わす（表２）。地図の下のボックスは、核酸配列から推測された３つの遺伝要素、すなわちＩＳ5、ＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂの位置を示す。
図６：
ヘリコバクター・ピロリ熱ショック蛋白質遺伝子クラスターのヌクレオチド配列。配列の上の最初の数字はヌクレオチド位置を示し、二番目の数字は、ＨＳＰ  ＡおよびＨＳＰ  Ｂ蛋白質の各々について、アミノ酸残基位置に数字を振ったものである。推定リボソーム結合配列（シャイン−ダルガーノ［ＳＤ］部位）には下線が付されている。
図７：
ヘリコバクター・ピロリ Ｈｓｐ  Ａ（Ａ）またはＨｓｐ  Ｂ（Ｂ）の推定アミノ酸配列と他のＧｒｏＥＬ様（Ａ）またはＧｒｏＥＳ様（Ｂ）蛋白質の推定アミノ酸配列との比較。アスタリスク印がついたアミノ酸は、ヘリコバクター・ピロリ Ｈｓｐ  ＡまたはＨｓｐ  Ｂ配列のアミノ酸と同一である。
図８：
大腸菌ミニ細胞におけるヘリコバクター・ピロリ Ｈｓｐ  Ａ熱ショック蛋白質の発現。ヘリコバクター・ピロリ Ｈｓｐ  ＡおよびＨｓｐ  Ｂ熱ショック蛋白質に相当する、58および13ｋＤＡの明らかな分子塊を伴う蛋白質バンドが、プラスミドｐＩＬＬ689およびｐＩＬＬ692に相当するレーンに明瞭に視認され、対照ベクター（各々、ｐＩＬＬ570およびｐＡＣＹＣ177）には見られない。
図９：
ヘリコバクター・フェリス ｕｒｅ  Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
図10：
ヘリコバクター・フェリスおよびヘリコバクター・ピロリの、ｕｒｅ  Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるｕｒｅ  Ｉ蛋白質のアミノ酸配列の比較。
図11：
遺伝暗号。鎖終結、もしくは“ノンセンス”コドン。イニシエーター・ホルミル−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡMetFの特定にも用いられる。このように、ＶａｌのトリプレットであるＧＵＧは“多義的”であり、バリンおよびメチオニンの両者をコードする。
図12：
一文字および三文字アミノ酸略語の意味。
図13：
ｐＭＡＬ発現ベクター系を用いる、Ｈ．ピロリ  ＵｒｅＡ−ＭＢＰ組換え蛋白質の精製。蛋白精製の種々の段階からの抽出物を、10％解像ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル［10%resolving SDS-polyacrylamide gel］上で移動させた。電気泳動に続いて、ゲルをクーマシーブルーで染色した。抽出物は：１）非誘導細胞；２）ＩＰＴＧ誘導細胞；誘導細胞抽出物のフレンチプレス［French press］溶解物；５）アミロース樹脂カラムからの溶出物；６）陽イオン交換カラムからの溶出物（第１溶出［first passage］）；７）陽イオン交換カラムからの溶出物（第２溶出）；８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準マーカー蛋白質、であった。
図14：
ポリクローナルウサギ抗−ヘリコバクター血清によるＵｒｅＡ組換え融合蛋白質の認識。マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ、レーン１）、Ｈ．フェリスＵｒｅＡ−ＭＢＰ（レーン２）、およびＨ．ピロリＵｒｅＡ−ＭＢＰ（レーン３）の蛋白抽出物を、Ｈ．ピロリおよびＨ．フェリスの全細胞抽出物に対して生じたウサギポリクローナル抗血清（1：5000に希釈）を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。精製された融合蛋白質は、矢印によって示されている。この蛋白質の推定分解生成物が、アスタリスクで示されている。
図15：
相同および非相同ＵｒｅＢ蛋白質に対して生じたウサギ抗血清によるＵｒｅＢ組換え融合蛋白質の認識。以下の抽出物をニトロセルロースメンブランにブロッティングした：１）標準蛋白質マーカー；２）Ｈ．フェリスＵｒｅＡ−ＭＢＰ；３）ＭＢＰ；４）Ｈ．ピロリＵｒｅＡ−ＭＢＰ。これらのメンブランを、それぞれＭＢＰ−融合Ｈ．ピロリおよびＨ．フェリスＵｒｅ  Ｂサブユニットに対して生じたポリクローナルウサギ抗血清（１:5000に希釈）と反応させた。標準蛋白質の分子量をブロットの左手側に示す。
図16：
精製されたＵｒｅＢ  ＭＢＰ融合組換え蛋白質に対して生じた抗血清を用いる、Ｈ．ピロリおよびＨ．フェリス全細胞抽出物のウェスタンブロット解析。Ｈ．フェリス（レーン１）およびＨ．ピロリ（レーン２）細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ全抽出物を、精製されたＨ．ピロリＵｒｅＢおよびＨ．フェリスＵｒｅＢ  ＭＢＰ融合蛋白質に対して生じたポリクローナルウサギ抗血清（1：5000に希釈された血清）と反応させた。Ｈ．フェリスおよびＨ．ピロリの各非組換えＵｒｅＢサブユニットのゲル移動度に相違を見出すことができる。左側の数字は標準マーカー蛋白質の分子量を表わす。
図17：
アミロースカラム（レーン２および３）から溶出された物質、または緩衝液Ｅ（ｐＨ4.5）、レーン４および５；もしくは緩衝液Ｃ（ｐＨ6.3）、レーン６および７、でＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出された物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ＭＣ1061（ＰＩＬＬ933）の溶解物から溶出された物質（レーン２、３、５および７）並びにＭＣ1061（ＰＭＡＬ−ｃ2）の溶解物から溶出された物質（レーン４および６）。レーン３には、それが緩衝液Ｅに懸濁されていたことを除いて、レーン２と同じ物質が含まれている。したがって、レーン３および５に見られるように、緩衝液ＥはＭＢＰ−ＨｓｐＡサブユニットのダイマー形成に応答し得ることが示されている。
図18：
血清ＩｇＧは、28名のＨ．ピロリ感染患者（四角、左）および12名の非感染患者（円、右）のＭＢＰ（底部）、ＭＢＰ−ＨｓｐＡ（頂部）およびＭＢＰ−ＨｓｐＢ（中間部）に応答する。実験手順に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおける各血清の光学密度は、30分間のインキュベーションの後に492ｎｍで読取った。表象の大きさは、同じ光学密度値を示す血清の数に比例している。
実施例
Ｉ−Ｈ．フェリス  ウレアーゼ遺伝子のクローニング、発現および配列決定：
パートＩの実験手順：
細菌株および培養条件：
Ｈ．フェリス（ＡＴＣＣ 49179）を、5％溶血ウマ血液（バイオメリュークス）並びに10ｎｇ  ｍｌ-1のバンコマイシン（レダリー研究室）、2.5μｇ  ｍｌ-1のポリミキシンＢ（ファイザー）、5μｇ  ｍｌ-1のトリメトプリン（シグマ化学株式会社）および2.5μｇ  ｍｌ-1のアンホテリシンＢ（Ｅ．Ｒ  スキーブ  アンド  サンズ株式会社）からなる抗生補足物質で補足された血液寒天培地no.2（オキソイド）で成育させた。バクテリアを要時調製した寒天プレートで培養し、一番上に蓋を置いて、好気状態下、37℃で2−3日間インキュベートした。クローニング実験において用いられる大腸菌株ＨＢ101（ボイヤーおよびルーランド−ダソイックス）およびＭＣ1061（マニアティスら、1983）は、グルコース無添加ルリアブロス［Luria broth］中あるいはルリア寒天培地上において、37℃で、所定の通りに成育した。窒素−制限条件下で成育したバクテリアを、0.4％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースおよび10ｍＭ  Ｌ−アルギニンを補足したアンモニア無添加Ｍ９最小培地（ｐＨ7.4）からなる窒素−制限固形培地上で継代した（キュサックら、1992）。
ＤＮＡ操作：
全ての標準ＤＮＡおよび分析は、他に記載された以外は、マニアティスらによって記述された方法に従って行われた（1983）。
Ｈ．フェリスＤＮＡの単離：
全てのゲノムＤＮＡはザルコシル−プロテイナーゼＫ溶解法（ラビニュー−ラッセルら、1988）によって抽出した。Ｈ．フェリスを接種した12枚の血液寒天プレートを、触媒無添加の嫌気性ガスパック（ＢＢＬ70304）を用いた嫌気ジャー（ＢＢＬ）中で、３７℃にて1−2日保温した。プレートを15％（Ｖ／Ｖ）グリセロール−  9％（Ｗ／Ｖ）ショ糖溶液50ｍｌに集め、（ソルバール［Sorvall］遠心機で）5,000ｒｐｍ、4℃にて30分間遠心した。ペレットを5ｍｇ  ｍｌ-1リゾチームを含む25ｍＭトリス−10ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）中に50ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む溶液0.2ｍｌに再懸濁し、ＶＴｉ65ポリアロマークイックシールチューブに移した。この懸濁液に、20ｍｇ  ml-1プロテイナーゼＫの溶液0.2ｍｌ及び5Ｍ過塩素酸ナトリウム0.02ｍｌを添加した。0.5Ｍ  ＥＤＴＡ−10％（Ｗ／Ｖ）ザルコシル0.65ｍｌを添加することによって細胞を溶解し、懸濁液が透明になるまで65℃にてインキュベートした（約5分間）。チューブの容量は126ｇ塩化セシウム、1ｍｌアプロチニン、99ｍｌＴＥＳバッファー（30ｍＭトリス、5ｍＭ  ＥＤＴＡ、50ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ7.5）からなる（１00ｍｌ当り）塩化セシウム溶液で満たした。溶解液を18℃で15−18時間、45000ｒｐｍで遠心した。全ＤＮＡを収集し、ＴＥバッファー（10ｍＭトリス、1ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して4℃で透析した。
コスミド  クローニング：
Ｈ．フェリスに由来する染色体ＤＮＡを、既に記述されているように（ラビニら、1991）、コスミドベクターｐＩＬＬ575にクローニングした。Ｓａｕ 3Ａでの部分的切断により生じたＤＮＡ断片を、（10から40％）ショ糖密度勾配で分画し、ＢａｍＨＩで切断して、脱リン酸化されたｐＩＬＬ575ＤＮＡ調製物に連結させた。コスミドをファージラムダ粒子（アマシャム、イン・ビトロ・パッケージングキット）に組込み、大腸菌ＨＢ101に感染させるために用いた。ウレアーゼ発現をスクリーニングするために、カナマイシン−耐性形質導入株を、マイクロタイタープレート（ベクトン・ディキンソン）の個々のウェルに分配されている、（20μｇ  ｍｌ-1）カナマイシンを含む窒素−制限［mimiting］固体培地（上記参照）上にレプリカプレートした［replica-plated］。各々のウェルにウレアーゼ試薬（ハゼールら、1987）0.1ｍｌを添加する前に、マイクロタイタープレートを2日間37℃で有酸素的にインキュベートした。尿素分解は、試薬の色調変化によって37℃で5−6時間以内に検出された。幾つかのウレアーゼ陽性反応コスミドクローンの制限地図が作成され、そのうちの一つがサブクローニングのために選択された。
Ｈ．フェリスＤＮＡのサブクローニング：
コスミドＤＮＡの大規模な塩化セシウムプラスミド調製物を、部分的にＳａｕ 3Ａで切断した。ＤＮＡ断片（7−11ｋｂ）をアガロースゲルから電気溶出し、フェノール−クロロホルム抽出を用いて精製した。冷却エタノールで沈殿させた後、この断片をＢｇ／III−切断プラスミドｐＩＬＬ570に連結し（ラビーニら、1991）、その組換えプラスミドを十分な資格を有する大腸菌ＭＣ1061細胞の形質転換に用いた。スペクチノマイシン−耐性形質転換体を、窒素−過多（ルリア寒天）および窒素−制限条件下でウレアーゼ発現について選択し、かつスクリーニングした。
定量性ウレアーゼ活性：
37℃で2.5日間好気的に成育した培養体を集め、0.85％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムで2回洗浄した。ペレットをＰＥＢバッファー（0.01Ｍ  ＥＤＴＡ含有0.1Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ7.4））に再懸濁し、次いで30Ｗ、50％サイクルにセットしたブランソン  ソニファイヤー  モデル450［Brnaon Sonifier model］を用いて30秒間の破砕を4回行なうことにより超音波処理した。細胞片は遠心によって破砕物から除いた。破砕物のウレアーゼ活性を、バースロット反応の変法（クーザックら、1992）により、ＰＥＢで調製された0.05Ｍウレアーゼ溶液中において測定した。ウレアーゼ活性は、μｍｏｌ  尿素  ｍｉｎ-1ｍｇ-1バクテリア蛋白として表現した。
蛋白質測定：
蛋白質濃度は、ブラッドフォードアッセイの市販品（シグマ化学）で推定した。
トランスポゾン突然変異：
ＭｉｎｉＴｎ3−Ｋｍデリバリー系（ラビーニら、1992）によってクローン化されたＨ．フェリス中に、無作為挿入突然変異が生じた。簡単に説明すると、トランスポザーゼをコードするプラスミドｐＴＣＡを含む大腸菌ＨＢ101細胞を、クローン化Ｈ．フェリスＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬＬ570形質転換した。ｐＩＬＬ570誘導体プラスミドへのＭｉｎｉＴｎ3−Ｋｍエレメントの移動は接合によって行なわれた。その後、得られた共組込み体［cointefrates］を、高濃度のカナマイシン（500ｍｇｌ-1）およびスペクチノマイシン（300ｍｇｌ-1）の存在下で、解析された構造に対して選択した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング：
可溶化された細胞抽出物を、4.5％アクリルアミドスタッキングゲルおよび12.5％解析ゲルを含むスラブゲルで、レムリーの方法（レムリー、1970）に従って分析した。電気泳動は、ミニ−スラブゲル装置（バイオ−ラド）で200Ｖにて行なった。
100Ｖに設定されたミニ・トランス−ブロット・トランスファー・セル［Mini Trans-Blot transfer cell］（バイオ−ラド）セットにおいて、1時間（冷却しながら）、蛋白質をニトロセルロース紙に転写した（トービンら、1979）。ニトロセルロースメンブランをリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ7.4）に溶解した5％（Ｗ／Ｖ）精製カゼイン（ＢＤＨ）で、室温にて2時間ブロックした（フェレロら、1992）。メンブランを、ＰＢＳで調製された1％（Ｗ／Ｖ）カゼインで希釈された抗血清で、４℃にて一晩反応させた。その後、免疫反応体を、アビジン−ペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）と組み合わされたビオチニル化２次抗体（キルケガードおよびペリー研究室）を用いて検出した。反応生成物を可視化するために、0.3％（Ｗ／Ｖ）4-クロロ-1-ナフトール（バイオ−ラド）からなる基質溶液を用いた。
ＤＮＡ配列決定：
配列決定しようとするＤＮＡ断片を、Ｍ13ｍｐ18およびＭ13ｍｐ19バクテリオファージベクター（ファルマシア）中にクローニングした（メイシングおよびビーラ、1982）。組換えファージＤＮＡを十分な資格を有する大腸菌ＪＭ101細胞に感染させ、Ｘ−ガル［X-gal］（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む培地上にプレートした。組換えファージＤＮＡで感染されたバクテリアから生じたプラークを、ポリエチレングリコール処理による一本鎖ＤＮＡテンプレートの調製（ザンガーら、1977）のために選択した。シークエナーゼキット［Sequenase kit］（ユナイテッド・ステイト・バイオケミカル社）を用いたジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネイション法に従って、一本鎖ＤＮＡの配列を決定した。
ヌクレオチド配列受託番号：
ヌクレオチド受託番号［accession number］は、Ｘ69080（ＥＭＢデータライブラリー）である。
パートＩ実験の結果：
Ｈ．フェリス・コスミド・クローンによるウレアーゼ活性の発現：
コスミドベクターｐＩＬＬ575中にＨ．フェリス染色体ＤＮＡの部分的に切断された断片（大きさが30から45ｋｂ）をクローニングした結果、約700のコスミドクローンが単離された。ウレアーゼ発現を誘発させるために、窒素−制限培地でクローンをサブカルチャーした（クザックら、1992）。これらのうちの6株については、5−6時間のインキュベーションの後（実験手順の項に記載したように）ウレアーゼ−陽性になることが同定された。さらに一晩インキュベーションを行なったものの、他にウレアーゼ−陽性コスミドクローンは同定されなかった。ウレアーゼをコードするコスミドを持つ３つのクローンの制限酵素の分析により、共通の28ｋｄＤＮＡ断片が示された。両末端に共通の断片のＤＮＡ領域を有するコスミド（消化されたｐＩＬＬ199）を、サブクローニングのために選択した。
大腸菌細胞中へのクローニングの際に、ウレアーゼ発現に必要とされるＨ．フェリス遺伝子の同定：
大腸菌細胞において、ウレアーゼ発現に対して必要な最小ＤＮＡ領域を明らかにするために、ウレアーゼをコードするコスミドｐＩＬＬ199をＳａｕ 3Ａで部分的に切断し、その断片をプラスミドｐＩＬＬ570にサブクローニングした。この形質転換株を窒素−過多および窒素−制限培地でサブカルチャーし、ウレアーゼ陽性表現型についてスクリーニングを行なった。窒素−制限状態下で成育した場合には、5つの形質転換導入株がウレアーゼ活性を発現した。一方、窒素−過多培地での成育の後には活性は検出されなかった。制限マッピング分析により、ウレアーゼをコードするプラスミドは7ないし11ｋｂのインサートを含んでいることが示された。ｐＩＬＬ205と呼ばれるプラスミドが、さらなる実験のために選ばれた。
大腸菌におけるウレアーゼ発現に対して必須である推定領域を調べるるために、かつウレアーゼ構造遺伝子を含むクローン化ＤＮＡ領域を局在化するために、クローン化Ｈ．フェリスＤＮＡの無作為突然変異を行なった。このため、ＭｉｎｉＴｎ3−Ｋｍエレメント（ラビニら、1992）を用いて、プロトタイププラスミドｐＩＬＬ205の無作為挿入突然変異を発生させた。ｐＩＬＬ205の各々の突然変異コピーについて挿入の部位をマップし、これらのプラスミドを持つ細胞をウレアーゼ活性に対して定性的に分析した（図１）。（“ａ”ないし“ｉ”と呼ばれる）ｐＩＬＬ205の突然変異誘導体を持つ大腸菌ＨＢ101細胞の選択は、ウエスタンブロッティングによる推定ウレアーゼサブユニットの検出の他に、定量的なウレアーゼ活性の決定にも用いられた。
ｐＩＬＬ205を有する大腸菌ＨＢ101細胞のウレアーゼ活性は、1.2±0.5μｍｏｌ尿素ｍｉｎ-1ｍｇ-1バクテリア蛋白であった（表１）。これはクローニングに用いられた親Ｈ．フェリス株の活性の約５分の１である。“ａ”、“ｃ”、“ｄ”、“ｆ”および“ｇ”の位置へのトランスポゾンの挿入は陰性の表現型となり、一方“ｂ”、“ｅ”、“ｈ”および“ｉ”の位置での突然変異は、これらの突然変異したｐＩＬＬ205のコピーを有するクローンのウレアーゼ活性には重大な影響は与えなかった。このように、ＭｉｎｉＴｎ3−ＫｍエレメントによるｐＩＬＬ205の突然変異により、大腸菌細胞におけるＨ．フェリスウレアーゼ遺伝子発現に必要な3つのドメインが同定された。
Ｈ．フェリスウレアーゼ構造遺伝子の局在：
ｐＩＬＬ205を有する大腸菌細胞の抽出物のウエスタンブロット分析により、ポリクローナルＨ．フェリスウサギ抗体と交叉反応する約30および66ｋＤａの２つのポリペプチドの存在が示された（図２Ａ）。これらの蛋白質は、ベクター（ｐＩＬＬ570）を有する細菌によっては生産されなかった。本来のＨ．フェリスウレアーゼは、算出分子量30および69ｋＤａの繰り返しモノマーサブユニットからなることが報告されている（ターベットら、1992）。このため、30および66ｋＤａ蛋白は、各々ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物に対応するものと思われた。興味深いことに、ヘリコバクター・ピロリ ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＩＬＬ763を有する大腸菌細胞の抽出物（クザックら、1992）は、抗-Ｈ．フェリス抗体と交叉反応する約30および62ｋＤａの分子サイズを有する２つのポリペプチドを発現した（図２Ｂ）。
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ｐＩＬＬ205の突然変異誘導株を持つクローンは、１株の例外を除いて全てが、ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物を発現した（図２Ａ，Ｂ）。幾つかの変異株（すなわち“ｃ”、“ｄ”、“ｆ”および“ｇ”変異株）ではウレアーゼサブユニットは合成されるものの、活性酵素は産生されなかったことから、ウレアーゼ活性発現に必須の補助機能がトランスポゾン挿入により破壊されていた可能性が推測できる。対照的に、ｐＩＬＬ205::ａと呼ばれる変異体は、ｕｒｅＢ産生物を産生せず、ウレアーゼ陰性であった。したがって、トランスポゾン挿入部位はｕｒｅＢ遺伝子に局在しているものと推定された。Ｈ．フェリスウレアーゼの構造ポリペプチドをコードする潜在的なオープンリーディングフレームを明らかにするために、挿入部位“ａ”に対応するＤＮＡ領域の配列決定分析を行なった。
Ｈ．フェリス構造ウレアーゼ遺伝子の配列決定分析：
トランスポゾン挿入部位“ａ”に隣接したＨ．フェリスＤＮＡの2.4ｋｂ領域の配列決定分析により、同じ方向に転写されるｕｒｅＡおよびｕｒｅＢと呼ばれる２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された（図３）。トランスポゾンはｕｒｅＢの末端から240ｂｐ上流に局在していることが確かめられた。両方のＯＲＦはＡＴＧ開始コドンで始まり、大腸菌コンセンサス・リボゾーム結合配列に類似する部位が先行する（シャインおよびダルガーノ、1974）。これらのＨ．フェリス構造遺伝子間に介在する遺伝子［intergenic space］は３つのコドンからなっており、それらは隣接するオープンリーディングフレームと同位相である。すでにヘリコバクター・ピロリに対するｃａｓ（ラビニーら、1991）において観察されているように、これはｕｒｅＡ遺伝子の停止コドンにおける単一突然変異により、理論的には融合した単一ポリペプチドが生じるであろうということを示唆している。
Ｈ．フェリス ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子は各々26074ｋＡおよび61663Ｄａの算出分子量を有するポリペプチドをコードしており、Ｈ．ピロリのｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産物とアミノ酸配列レベルで高い類似性を示している。２つのヘリコバクターｓｐｐ．の対応するｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産物間の同一性の程度は、各々73.5％および88.2％であると計算された。アミノ酸配列情報によると、Ｈ．フェリスおよびＨ．ピロリのｕｒｅＡおよびｕｒｅＢポリペプチド（ラビニーら、1991）の推定分子量は、非常に類似している。それにもかかわらず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった場合には、Ｈ．フェリスのｕｒｅＢ産生物はヘリコバクター・ピロリの対応する遺伝子産物よりも移動度が低かった（図２Ｂ）。
II−Ｈ．ピロリとＨ．フェリスの組換えウレアーゼサブユニット蛋白質の発現：これらの蛋白質のマウスモデルでの粘膜免疫原としての可能性の評価：
この研究の目的はＨ．ピロリとＨ．フェリスのウレアーゼサブユニットに由来する組換え抗原の開発と、Ｈ．フェリス／マウスモデルでのこれらの抗原の免疫防御効果の評価である。Ｈ．ピロリとＨ．フェリスのウレアーゼサブユニットをコードしているそれぞれの構造遺伝子を、Escherichia coli（大腸菌）に別個にクローニングし、過剰発現［over-expressed］させた。その結果得られた組換えウレアーゼ抗原（大腸菌の42ｋＤａマルトース結合蛋白質と融合している）を大腸菌培養物から大量に精製した。これらは免疫原性ではあったが酵素的には不活性だった。この発見はＨ．ピロリの感染に対する組換えワクチンを開発することが可能であることを示した。
パートIIの実験手順
バクテリア株、プラスミドと成育条件：
Ｈ．フェリス（ＡＴＣＣ49179）を、10％の分解したウマ血液（BioMerieux）を加えた血液寒天ベースno.2（Oxood）を含み、バンコマイシン（10μｇ／ｍＬ）、ポリミキシンＢ（25ｎｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（5μｇ／ｍＬ）と、アンホテリシンＢ（2.5μｇ／ｍＬ）の抗生物質を補足した血液寒天培地で培養した。バクテリアを微好気条件で37℃で2日、前述したように培養した。大腸菌株ＭＣ1061とＪＭ101は、クローニングと発現の実験で使ったが、37℃で寒天を加え、または加えないルリア培地で機械的に培養した。抗生物質のカルベニシリン（100μｇ／ｍＬ）とスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を必要量加えた。
ＤＮＡ操作と分析：
全てのＤＮＡ操作と分析は、他の方法に言及しない限り標準的な方法で行った。制限酵素と修飾酵素はアマシャム（フランス）から購入した。クローニングするＤＮＡ断片は、アガロースゲルから電気抽出し、エルチップ［Elutip］ミニカラム（Schleicher and Schull、ドイツ）で精製した。単鎖ＤＮＡの配列決定は、Ｍ13ｍｐ18とＭ13ｍｐ19バクテリオファージベクター（ファルマシア、フランス）を使って行なった。単鎖ＤＮＡのテンプレートは、組換えファージＤＮＡをポリエチレングリコール処理して調製した。テンプレートの配列決定は、ジデオキシ鎖終結法によってシークエンスキット（米国バイオケミカル社、U.S.A.）を使って行なった。
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いたクローニングのための挿入断片の調製
Ｈ．ピロリとＨ．フェリスのｕｒｅＡ遺伝子をクローニングするために、変性した36マー［36-mer］のプライマーを、公表されたウレアーゼ配列（Labigne et al., 1991：Ferrero and Labigne, 1993）から推測した。（プライマーセット＃１；表２参照）。プラスミドｐＩＬＬ763とｐＩＬＬ203（表３）を有する大腸菌クローンから得た精製ＤＮＡは、Ｈ．ピロリとＨ．フェリスのウレアーゼの構造遺伝子をコードしており、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。反応試料に含まれていたのは、10-50ｎｇの変性ＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液（10ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ［ｐＨ8.3］中に50ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（それぞれ最終濃度が1.25ｍｍｏｌ／Ｌ）、2.5ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2、それぞれのプライマーが25ｐｍｏｌ、および0.5μＬ  Ｔａｑポリメラーゼである。試料は次のプログラムを30回行なった。94℃で2分間、40℃で1分間。
増幅生産物は、ｐＡＭＰベクター（図１）の接着末端に、製造者（“CloneAmp System”、ギブコ  ＢＲＬ;Cergy Pontoise、フランス）の記述したプロトコルに従ってクローニングした。簡単に説明すると、60ｎｇの増幅生成物を直接、緩衝液（50ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、1.5ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2、0.1％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチンを含む10ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.3）に、50ｎｇのｐＡＭＰと１つのベクターＤＮＡと1ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼと共に混入した。結合は37℃で30分間行なった。受容細胞（200μＬ）である大腸菌ＭＣ1061を、20μＬの結合混合物で形質転換した。続いてｐＡＭＰベクターのポリリンカーからＢａｍＨ1とＰｓｔＩを用いて挿入断片を二重に加水分解して切り出し、配列決定のためのＭ13ｍｐバクテリオファージと同様に、組換え抗原の生産のために選ばれた発現ベクターｐＭＡＬ（New England Biolabs., Beverly, USA）に、サブクローニングした。
Ｈ．ピロリのｕｒｅＢ遺伝子を含む生成物の増幅は、ＰＣＲ反応で35マーのプライマー（セット＃２、表２）を幾つか用いて行った。ＰＣＲ反応混合物は、初めに94℃で3分間変性してから、次のプログラムを30回行なった。94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間。精製した増幅生成物（1850塩基対）をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで分解し、ｐＭＡＬにクローニングした（ｐＩＬＬ927、図２）。大腸菌MC1061のコンピテント細胞を結合反応で形質転換した。
Ｈ．フェリス ｕｒｅＢは２段階の方法でクローニングしたが、これは完全なｕｒｅＢサブユニットと不完全なものの両者を生成した。プラスミドｐＩＬＬ213（表３）をｕｒｅＢサブユニットのアミノ酸残基の219番に相当するＤｒａＩ酵素とＨｉｎｄIIIで分解した。その結果得られた1350塩基対の断片を精製して、ＸｍｎＩとＨｉｎｄIIIで分解したＰＭＡＬにクローニングした（ｐＩＬＬ219、図２）。完全なｕｒｅＢ蛋白質を合成できるクローンを生産するために、ｕｒｅＢ遺伝子のＮ末端部分から685塩基対の断片（ＡＴＧコドンを除く）を増幅するＰＣＲプライマーを開発したが、これはプラスミドｐＩＬＬ219内の挿入断片の始めの部分とも重なり合っている。ＰＣＲの増幅材料を精製し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで分解し、ｐＭＡＬ（ｐＩＬＬ221、図14）にクローニングした。ｕｒｅＢ遺伝子生産物の残りの部分をコードしている1350塩基対のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＩＬＬ219から切り出して、線状にしたｐＩＬＬ221調製物（ｐＩＬＬ222、図14）にクローニングした。
ベクターｐＭＡＬにおける組換えウレアーゼポリペプチドの発現：
発現ベクターｐＭＡＬは、誘導性プロモーター（Ｐlac）の制御下にあり、ＭａｌＥ（マルトース結合蛋白質）の生産をコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。後者のＯＲＦとクローニングした配列によって、ＭＢＰ融合蛋白質が合成された。これはアミロースレジンで容易に精製された。商業的に有用なｐＭＡＬの２つのバージョンのうち、シグナル配列（すなわちｐＭＡＬ−ｃ２）をコードしていないバージョンが組換え蛋白質をより多く合成したので終始使用した。
大規模な精製実験に先立って、組換えプラスミドを持つ大腸菌クローンを融合蛋白質の産生についてスクリーニングした。
組換えウレアーゼペプチドの精製：
カルベニシリン［carbenicillin］（100μｇ／ｍＬ）と2％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含む新鮮な500ｍＬのルリアブロスに、一晩培養した大腸菌クローンの培養物（5ｍＬ）を接種した。Ａ600＝0.5になるまで、培地を37℃ででインキュベートし250ｒｐｍで振盪した。1ｍｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に加える前に、1.0ｍＬのサンプルをとった（非誘導細胞）。培養株は、さらに4時間インキュベートし、別に1.0ｍＬのサンプル（誘導細胞）をとった。この非誘導細胞と誘導細胞を、後でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ＩＰＴＧで誘導した培養菌は7000ｒｐｍで20分間、4℃で遠心分離して上清を除去した。沈殿物を、次にあげるプロテアーゼ阻害剤（ベーリンガー、マンハイム、ドイツより供給）を含む50ｍＬのカラム緩衝液（200ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、1ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む10ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス  ＨＣｌ、ｐＨ7.4）に懸濁した。それらは、2μｍｏｌ／Ｌ  ロイペプシン、2μｍｏｌ／Ｌ  ペプスタチンと1ｍｍｏｌ／Ｌ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。そのままの細胞を、フレンチ・プレッシャー・セル［French Pressure Cell］（16 000  ｌｂ／ｉｎ2）を通して溶解した。アミロースレジン（ニューイングランド、バイオラブス）の2.6ｃｍ×20ｃｍカラムのクロマトグラフィーにかける前に、細胞破片を遠心分離で除去し、その溶解物をカラム緩衝液で希釈して最終濃度2.5ｍｇ蛋白／ｍＬにした。レジンは、Ａ280がレベルに戻るまで、カラム緩衝液で0.5ｍＬ／分で洗浄した。ＭＢＰ融合組換え蛋白質は、カラムから10ｍｍｏｌ／Ｌ  1-マルトースを含むカラム緩衝液で洗浄することによって溶出した。
組換え蛋白質を含む画分を集めて、数回4℃で低塩緩衝液（20ｍｍｏｌ／Ｌ  トリスＨＣｌ、ｐＨ8.0中、25ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む）で透析した。その後、集めた画分を、0.5ｍＬ／分の流量で、高負荷クロマトグラフィーシステム（ファルマシア）に接続した1.6×10ｃｍの陰イオン交換カラム（ＨＰ−セファロース、ファルマシア、スウェーデン）にのせた。蛋白質は塩勾配（25ｍｍｏｌ／Ｌから500ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）でカラムから溶出した。Ａ280で高い吸光度を示した画分を蒸留水で4℃にて徹底的に透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ウサギ抗血清：
Ｈ．ピロリ85Ｐ株（Labigne et al., 1991）とＨ．フェリス（ＡＴＣＣ49179）の全細胞抽出物に対するポリクローナルなウサギ抗血清を調製した。Ｈ．ピロリとＨ．フェリスのウレアーゼサブユニットの組換え蛋白調製物に対するポリクローナルウサギ抗血清は、フロイント完全アジュバント（シグマ）中の100μｇの精製組換え蛋白質でウサギに免疫することによって生産した。4週間後、ウサギをフロイント不完全アジュバント中、100μｇの蛋白質で追加免疫した。６週間目に、最終的にこの動物から血を取り、血清を-20℃で保存した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによる蛋白質分析：
Laemmliの方法に従って、可溶化した細胞抽出物を4.5％アクリルアミド・スタッキング・ゲルと10％の解像ゲル［resolving gel］からなるスラブゲルで分析した。ミニスラブゲル装置（バイオラッド、USA）で200Ｖで電気泳動を行った。
蛋白質を、ミニ・トランス−ブロット・トランスファー・セル（バイオラッド）セットのニトロセルロース紙に100Ｖで1時間、冷やしながら転写した。ニトロセルロースメンブランをリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ7.4）中、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のカゼイン（ＢＤＨ、英国）で、室温で2時間静かに振盪してブロックした。メンブランを、4℃で一晩、ＰＢＳで調製した1％カゼインで希釈した抗血清と反応させた。免疫反応は、特異的なビオチン結合二次抗体とストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Kirkegaard and Parry Lab., Gaithersburg, USA）を用いて検出した。反応生成物はオートラジオグラフフィルム（ハイパーフィルム、アマシャム、フランス）で、化学発光法（ＥＣＬシステム、アマシャム）を用いて視覚化した。
蛋白質濃度はブラッドフォード分析（シグマ化学社、セントルイス、USA）で測定した。
動物実験：
6週令のメスのスイス特定病原体フリー（ＳＰＦ）マウスを得て（Centre d′Elevage R. Janvier, Le-Genest-St-Isle，フランス）、市販の固形飼料と水で任意に飼育した。この動物の腸でヘリコバクター・ムリダルム［Helicobacter muridarum］がいないものを選んだ。全ての胃への投薬は、1.0ｍＬのポリエチレンカテーテル（Biotrol、パリ、フランス）のついた使い捨ての注射器を使って100μＬをマウスに与えた。
Ｈ．フェリス培養物からの音波処理した抽出物および接種物の調製：
Ｈ．フェリスバクテリアをＰＢＳに回収し、5000ｒｐｍで10分間、4℃でソーバルＲＣ-5遠心分離機（Sorvall、USA）で遠心分離した。沈殿物を2回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。バクテリア懸濁液を前述したように音波処理し、少なくとも一回凍結融解した。蛋白質の同定を音波処理物について行った。
防御の研究のためのＨ．フェリスの有毒株を確保するために、Ｈ．フェリスバクテリアをイン・ビボで、必要になるまで培養した。簡単にいえば、マウスに3回（1010バクテリア／ｍＬを）、5日間にわたって接種した。バクテリアは、胃の生体組織検査から血液寒天培地に再び単離した（37℃で4-7日間、微好気中で培養した）。血液寒天プレートで2日間培養したバクテリアをペプトン水（ディフコ、USA）に直接回収した。バクテリアの生存度と運動性を、動物に投与する前に、位相差顕微鏡で評価した。
マウス防御研究：
50μｇの組換え抗原と10μｇのコレラ全毒素（シグマ化学社）をＨＣＯ3に再懸濁し、0、1、2、3週にマウスの胃に投与した。音波処理したＨ．フェリス抽出物（全蛋白質を400-800μｇ含む）で免疫したマウスに10μｇのコレラ毒も投与した。5週目に、それぞれのグループの半分のマウスに、有毒なＨ．フェリスの接種物を抗原投与した。残りのマウスには15週にさらなる“追加”免疫をした。17週に、後者にＨ．フェリスの培養株を抗原投与した。
マウスでのＨ．フェリスコロニー形成の評価：
免疫用量を受けてから2週間後（つまり、それぞれ7週目と19週目）、脊椎脱臼で死亡させた。胃を殺菌した0.8％ＮａＣｌで洗浄し、それぞれの胃から胃腔の一部を、尿素指示培地（2％尿素、120ｍｇＮａ2ＨＰＯ4、80ｍｇ  ＫＨ2ＰＯ4、1.2ｍｇフェノールレッド、1.5ｇ寒天を1000ｍＬに調製）を含む12ｃｍ×12ｃｍの寒天プレートの表面に置いた。それぞれの胃の残りはホルマリン−生理食塩水に入れ、組織学用に処理するまで保存した。胃の縦の切片（4μｍ）を切り取り、ギムザ法で機械的に染色した。必要なときは、切片を更に、ヘマトキシリン−エオシンおよびウォーシン−スターリー銀染色法で染色した。
マウスの胃の粘膜でのＨ．フェリスバクテリアの存在は、観察者の先入観を排除するために、コード化したギムザ染色した胃の切片のスクリーニングと同様に、指示培地でのウレアーゼ活性（24時間まで）の検出で評価した。胃の切片のバクテリアの数は半定量的に、次の方法に従って記録した：0、切片全体にバクテリアが見られない；1、全体にわずかな（＜20）バクテリアが見られる；2、少数（＜20）のバクテリアが存在する幾つかの高勢力［high power］（Ｈ．Ｐ．）域がある；3、少数から普通の数（＜50）のバクテリアが存在する幾つかのＨ．Ｐ．域がある；および4、多数のバクテリア（＞50）が存在する多くの（＞5）Ｈ．Ｐ．域がある。単核細胞の浸潤は次のように記録した：0、明らかな浸潤がない；1、粘膜下組織と粘膜筋板に限って少数の単核細胞の浸潤が見られる；2、粘膜下組織と粘膜筋板に並みの数の単核細胞の浸潤が見られ、時には緩やかな凝集が見られる；および3、多数の単核細胞の浸潤があり、細胞の結節性の凝集を特徴とする
パートII実験の結果：
大腸菌におけるヘリコバクターウレアーゼポリペプチドの発現：
Ｈ．フェリスとＨ．ピロリのそれぞれのｕｒｅＡ遺伝子生産物をコードしている配列を含む断片をＰＣＲで増幅し、発現ベクターｐＭＡＬ上に存在する、42ｋＤａのＭＢＰをコードしているＯＲＦとクローニングした。ＰＣＲ生成物の配列決定により、わずかなヌクレオチドの変化が明らかになったが、それぞれの遺伝子生成物の推定アミノ酸配列を変えるものではなかった。これらの組換えプラスミド（それぞれｐＩＬＬ919とｐＩＬＬ920）で形質転換した大腸菌ＭＣ1061細胞は、およそ69ｋＤａの予想分子量の融合蛋白質を発現した。続くアフィニティクロマトグラフィー（アミロースレジン）と陰イオン交換ゲルメディア（Ｑ−セファロース）のクロマトグラフィーにより、これらの蛋白質は高純度に精製された（図１）。組換え大腸菌細胞の2-Ｌ培養物からの収量は精製抗原がおよそ４０ｍｇだった。
同様に、Ｈ．ピロリとＨ．フェリスウレアーゼの大きなｕｒｅＢサブユニットは大腸菌（それぞれ、プラスミドｐＩＬＬ927とｐＩＬＬ222）で発現し、予想分子量103ｋＤａの融合蛋白質を生成した。これらの場合の収量は、ｕｒｅＡ調製物の場合より幾分少なかった（バクテリア培養物2-Ｌからおよそ20ｍｇが回収された）。さらに、融合蛋白質のＭＢＰ部分からのｕｒｅＢポリペプチドの開裂に関連する問題が生じた。これらの難題は、組換えｕｒｅＢポリペプチドが大きいことが原因である。
組換えウレアーゼポリペプチドの分析：
Ｈ．ピロリおよびＨ．フェリスの全抽出物に対して生じたウサギポリクローナル抗血清を用いた抗原調製物のウェスタンブロット分析は、抗原が、非相同な抗血清と同様に相同な抗血清に対しても免疫原性を保持していることを示した（図14および15）。抗血清はＭＢＰ成分だけを認識したのではなかった。Ｈ．ピロリとＨ．フェリスのウレアーゼポリペプチド間の交叉反応性は、これらの蛋白質のアミノ酸配列の同一性が高いことと一致している。
Ｈ．ピロリとＨ．フェリスから調製された精製組換えｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ蛋白質に対して生じたウサギポリクローナル抗血清は、バクテリアの全細胞抽出物に存在するウレアーゼポリペプチドに強く反応した（図16）。我々が既に観察しているように、Ｈ．フェリスウレアーゼのｕｒｅＢサブユニットはＨ．ピロリのそれよりＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でわずかに移動度が高い（図１６）。
免疫防御研究に用いられるＨ．フェリス接種物の調製：
Ｈ．フェリスバクテリアの接種物の有毒性を確かめるために、Ｈ．フェリスに感染したマウスの胃からバクテリアを再び単離した（材料と方法参照）。バクテリアはイン・ビトロで、最小の回数継代した。これらのバクテリアから調製して-80℃で保存した手持ちの培養株を、他のマウスの防御研究のための新鮮な接種物を調製するために用いた。この方法によって、連続した実験で使った接種物は再生産できることが確かめられた。
Ｈ．フェリスの胃への感染に対するマウスの免疫化：
所定の抗原調製物で3週間免疫したマウスを２つのロットに分け、2週間の後、これらの一方に107バクテリア／ｍＬを含むＨ．フェリスの接種物を抗原投与した。組換えＨ．フェリスｕｒｅＡで免疫した動物の一つのグループにも、接種物を抗原投与したが、他の動物とは異なり、19週まで殺さなかった。
ａ）5週目の防御
音波処理したＨ．フェリス調製物で免疫化したマウスのコントロールグループから取った胃の生体組織検査試料の85％はウレアーゼ陰性であり、したがってＨ．フェリス感染を防御したようだった（表４）。これは、ＭＢＰだけ投与した動物の他のコントロールグループからのそれが20％であることと比較された。組換えウレアーゼサブユニットが投与されたマウスのグループのウレアーゼ陰性の胃の割合は、70％（Ｈ．ピロリｕｒｅＢ）から20％（Ｈ．ピロリｕｒｅＡ）まで変化した。Ｈ．フェリスによる細菌性コロニー形成のレベルも、胃の組織から作った組織切片から評価した。Ｈ．フェリスバクテリアは、目立つらせん状の形態をしているので、胃の窪み部分と腺部分の両方の粘膜表面にあるこの生物体を簡単に見ることができた。組織学的な証拠からマウスでの防御のレベルは生体組織検査のウレアーゼテストで観察されたものより低いことがわかった。すなわち、Ｈ．フェリスの音波処理した調製物とＨ．ピロリｕｒｅＢで免疫したマウスのそれぞれ25％および20％の胃の組織が、Ｈ．フェリスバクテリアに感染していなかった。
これらのマウスのグループの中で、細菌性コロニー形成の組織学的スコアが低いこと（未公開データ）の他に、生態組織検査でウレアーゼ陰性が多いことは、この動物で免疫防御的な応答が誘起されていることを示している。しかし、この応答は、抗原投与法で投与された接種物を防御するには不十分であったかもしれない。
ｂ）17週目での防御：
それぞれの動物グループの残りのマウスに、15週目に追加免疫した。これらのマウスに、17週目に、以前使ったもののおよそ100分の1以下のバクテリアを含むＨ．フェリス接種物を抗原投与した。2週間後、ＭＢＰで免疫した全てのマウスの胃の生態組織検査の結果はウレアーゼ陰性であった（表４）。対照的に、組換えウレアーゼサブユニットで免疫したマウスの胃の生態組織検査のウレアーゼ活性は、Ｈ．ピロリｕｒｅＡの50％からＨ．フェリスｕｒｅＢの100％と様々であった。後者はＨ．フェリスの音波処理した抽出物で免疫した動物グループで観察された防御に匹敵した。組織学的な証拠から、Ｈ．フェリスとＨ．ピロリのｕｒｅＢサブユニットは、それぞれ免疫した動物の60％と20％を防御した。これを、Ｈ．フェリスの音波処理した抽出物で免疫したマウスの防御のレベルが85％であったことと比較した。組換えＨ．ピロリｕｒｅＡによるマウスの免疫は、この動物を防御しなかった。同様に、全てのＨ．フェリスｕｒｅＡで免疫したマウスの胃には、5週目に抗原投与したものの、19週目にはＨ．フェリスバクテリアがかなりコロニーを形成していた（表４）。
ウレアーゼの胃の生体組織検査では、胃の組織切片の組織学的な分析に比べて、感受性と特異性の値はそれぞれ63％および95％であった。したがって、組織学で、マウスでのＨ．フェリス感染をより正確に予測できることが分かった。
免疫した胃の細胞性免疫応答：
Ｈ．フェリスのコロニー形成の組織学的な評価に加えて、マウスの胃組織を単核細胞応答の存在についても評価した（0から3）。ＭＢＰだけで免疫したマウスでは、穏やかな慢性の胃炎が、筋粘膜と胃上皮粘膜下組織だけに少数の単核細胞と共に見られた。対照的に、組換えウレアーゼポリペプチドや、Ｈ．フェリスの音波処理した調製物で免疫した動物の胃の粘膜には、多くの単核細胞が存在した。炎症性の細胞は合体して、組織の粘膜下組織でゆるい凝集体を作るか、結節性の構造を作り胃上皮の粘膜領域に広がった。Ｈ．フェリスｕｒｅＡで免疫したマウスの胃粘膜は、Ｈ．フェリスバクテリアがかなりコロニーを形成していたが、単核細胞を僅かか、もしくは全く含まなかったので、単核細胞の応答はバクテリアの存在とは関係がないようだった。
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III−ヘリコバクター・ピロリｈｓｐＡ−Ｂ熱ショック遺伝子クラスター：ヌクレオチド配列、発現及び機能：
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ（ニッケル金属酵素）と密接な関連があると報告されたＧｒｏＥＬクラスの熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の相同体が、最近になってDunnらとEvansらによりＨ．ピロリの細胞から精製された（それぞれInfect. Immun., 60:1946, 1992, 1946及び2125参照）。この免疫学的に優勢な［immunodominant］蛋白質の報告されたＮ末端のアミノ酸配列に基づき、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中のＧｒｏＥＬ様蛋白質をコードする遺伝子（ｈｓｐＢ）を標的とするために、変性オリゴヌクレオチドが合成された。遺伝子増幅の後、ＨｓｐＢ蛋白質の初めの36アミノ酸をコードする108塩基対断片が精製され、Ｈ．ピロリ・ゲノミックバンク［genomic bank］中でＨｓｐＢをコードしている全遺伝子をもつ組換えコスミドを同定するためのプローブとして用いられた。ｈｓｐＢ遺伝子はｐＩＬＬ684コスミドのＢｇｌII制限酵素切断断片の3.15キロベース（Kb）に存在した。ｐＩＬＬ570プラスミドベクターにサブクローニングされたその断片（ｐＩＬＬ689）の塩基配列により、ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢと命名された２つのオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）の存在が明らかにされ、その構成は他の細菌種におけるｇｒｏＥＳＬバイシストロン性オペロン［bicistronic operons］と非常に類似したものであった。ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢはそれぞれ118及び545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、それぞれ13.0キロダルトン（ｋＤａ）及び58.2ｋＤａの分子量に相当する。アミノ酸配列の比較研究により以下のことが明らかとなった。i)Ｈ．ピーロリのＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質はそれらの細菌の相同物に非常に類似していた；ii)Ｈ．ピロリのＨｓｐＡ蛋白質は他の細菌のＧｒｏＥｓ相同物にはないカルボキシル基末端での顕著なモチーフを特徴とする；この独特なモチーフは、ニッケル結合のような金属結合ドメインに似た、一連の8個のヒスチジン残基からなる。驚くべきことに、遺伝子クラスターのすぐ上流にＩＳ5挿入エレメントが見いだされた。それはＨ．ピロリのゲノムには存在せず、コスミドクローニングの過程で積極的に選択されたものであった。そのＩＳ5はｐＩＬＬ689内でｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子の発現に関連していることが見いだされた。ｐＩＬＬ689プラスミドでのＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質の発現は、ミニ細胞生産株にて分析された。２つのポリペプチドは大腸菌細胞内で構成的に発現されることが示された。ｐＩＬＬ689組換え体プラスミドがＨ．ピロリウレアーゼ遺伝子クラスターとともに大腸菌宿主株に導入されると、ウレアーゼ活性の増加が観察された。そのことは熱ショック蛋白質とウレアーゼ酵素との間の密な相互作用を示唆する。ＨｓｐＡシャペロンに関する特異的な機能の概念を支えているのは、ｈｓｐＢのコピーがＨ．ピロリゲノム内では１つだけ見いだされる一方で、ｈｓｐＡのコピーはゲノム内に２つ見いだされ、その内の１つはｈｓｐＢ遺伝子にリンクし、もう１つはｈｓｐＢ遺伝子にリンクしていないという事実である。Ｈ．ピロリと同遺伝子型のｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子における変異株を構築する試みは不成功に終わり、このことはこれらの遺伝子が細菌の生存に関して必須であることを示唆する。
パートIIIの実験手順：
細菌の株、プラスミド、及び培養条件：
クローニング実験はＨ．ピロリ85Ｐ株から調製されたゲノムＤＮＡにより行われた。Ｈ．ピロリＮ6株は、それらが好都合な形質転換能をもつという理由からエレクトロポーレーション実験の受容株として用いられた。大腸菌ＨＢ101株もしくは大腸菌ＭＣ1061株はそれぞれコスミドクローニング及びサブクローニングの実験用宿主として用いられた。大腸菌Ｐ678-54株はミニ細胞の調製用に用いられた。本研究に用いられたベクター及び組換えプラスミドを表１に示した。Ｈ．ピロリ株は、バンコマイシン（10ｍｇ／ｌ）、ポリミキシンＢ（2,500Ｕ／Ｉ）、トリメトプリム（5ｍｇ／ｌ）、及びアンファテリシンＢ（4ｍｇ／ｌ）を添加したウマ血液寒天培地上で生育された。プレートはＣＯ2発生器［carbon dioxide generator envelope］（ＢＢＬ70304）を備えた嫌気性ジャー内で微好気性条件下、37℃にてインキュベートした。大腸菌株はグルコース無添加のＬ-ブロース中（1Ｌ中に10ｇのトリプトン、5ｇの酵母抽出物及び5ｇの塩化ナトリウム；ｐＨ7.0）、もしくはＬ-寒天培地（1.5％寒天）上で37℃にて生育された。ウレアーゼ活性測定のために用いられた窒素制限培地は、炭素源として0.4％Ｄ-グルコースを含み、新しく調製された濾過滅菌したＬ-アルギニンが最終濃度10ｍＭになるように加えられた、アンモニウムフリーのＭ9最小寒天培地（ｐＨ7.4）よりなる。組換え体クローンの選択のための抗生物質の濃度は以下のとおりである（1Ｌ中のミリグラム）：カナマイシン、20；スペクチノマイシン、100；カーベニシリン、100。
ＤＮＡの調製：
Ｈ．ピロリ由来のゲノムＤＮＡは、従来記述されているようにして調製した。コスミドＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法により調製し、引き続いて従来記述されているセシウムクロライド−臭化エチジウム勾配により精製した。
コスミドクローニング：
Ｈ．ピロリｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子クラスターのクローニングに用いられた、大腸菌ＨＢ101内でのＨ．ピロリ85Ｐのコスミド遺伝子バンクの構築は以前に示された通りである。
ＤＮＡ分析及びクローニング手法：
制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ4ＤＮＡライゲース、ＤＮＡポリメラーゼＩ  大（クレノウ）フラグメント及びＴａｑポリメラーゼはアマシャム［Amersham］社から購入し、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼはバイオラブ［Biolabs］から、及びコウシ腸ホスファターゼ［calf intestinal phosphatase」ファルマシア［pharmacia］から購入した。全ての酵素は製品の使用説明書に従って用いた。ＤＮＡ断片はトリス酢酸緩衝液の存在下で泳動させるアガロースゲル上で単離した。ベテスダ研究所［Bethesda Research Laboratories］からの1ｋｂのラダーを断片サイズ標準として用いた。必要な場合には、ＤＮＡ断片は、従来記載されるようにアガロースゲル上から電気溶出により単離し、イルティップデー・ミニカラム［Elutip-d minicolum］（Schleicher and Schuell, Dassel，ドイツ）により移動緩衝液［migration buffer］から回収した。基本的なＤＮＡ操作はSambrookらにより示された実験手順に従い行なわれた。
ハイブリダイゼーション：
Ｈ．ピロリ・コスミド・バンクのスクリーニング及びサブクローン同定用のコロニーブロットは、Sambrookら（43）の実験手順に従い、ニトロセルロースメンブラン（Schlecher and Schuell, Dassel，ドイツ）上で調製した。ＰＣＲ産物の放射活性標識は、ファルマシア社のランダムヘキサマーをプライマーとして用い、ランダムプライミング［random priming］により行なった。コロニーハイブリダイゼーションは非常に厳しい条件下で行なった（5×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、50％ホルムアミド、42℃）（1×ＳＳＣ；150ｍＭ塩化ナトリウム、15ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0）。サザンブロットハイブリダイゼーションのために、ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロースシートへ転写し（0.45μｍポアサイズ；Schleicher & Schuell, Inc.）、そしてあまり厳しくない条件下（5×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、30％もしくは40％ホルムアミド、42℃で32Ｐ標識されたデオキシリボヌクレオチドプローブ添加）でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはアマシャム・ハイパーフィルム−ＭＰ（Amersham Hyperfilm-MP）を用い、オートラジオグラィーにより示された。
ＤＮＡ配列決定：
プラスミドＤＮＡの適当な断片をＭ13ｍｐ18/19ベクターにサブクローニングした。１本鎖のＤＮＡを大腸菌ＪＭ101株のファージ感染により調製した。配列決定は、アメリカ合衆国バイオケミカルシークエナーゼキット［United States Biochemicals Sequenase kit］を用い、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により行なった。Ｍ13ユニヴァーサルプライマー［M13 universal primer］と補助的な特異的プライマーの両方（図１）を、コーディングおよびノンコーディングＤＮＡ鎖の双方の配列決定に用いた。２本鎖ＤＮＡの配列決定は従来記述される通りに行なった。ＰＣＲ産物の直接配列決定［direct sequencing］を、増幅し、電気溶出したＰＣＲ産物をイルティップデー・ミニカラム（Schleicher and Schuell）に通して精製した後に行なった：シークエナーゼ・キットを用いた配列決定に関する標準的な手順は以下の改良を加えてから用いられた：ＰＣＲ産物は、プライマーとして200ピコモルのオリゴヌクレオチドを含み、最終濃度を1％とするＤＭＳＯを含むアニーリング混合物を3分間煮沸することにより変性した；その混合物はすぐに氷上で冷却した；標識段階はマンガンイオン（ｍＭ）の存在下で行なった。
Ｈ．ピロリのエレクトロポーレーション：
Ｈ．ピロリ変異株構築のための試みにおいて、カナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ3′-III）を含むカセットで分断された標的遺伝子を持つ適当なプラスミド構造物で、従来記載されているエレクトロポーレーション手法により、Ｈ．ピロリＮ6株を形質転換した。カナマイシンで分断されたｆｌａＡ遺伝子をもつプラスミドｐＳＵＳ10をエレクトロポーレーションのポジティブコントロールとして用いた。エレクトロポーレーションの後、抗生物質耐性を発現させるためバクテリアを非選択培地にて48時間生育し、その後カナマイシン含有培地へ移した。選択培地では6日目まで培養した。
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）：
ＰＣＲは、パーキンエルマー・シータス・サーマルサイクラー［Perkin-Elmer Cetus thermal cycler］を使用したジーンアンプキット［GeneAmp kit］（Perkin-Elmer cetus）を用いて行なった。標準的な増幅反応は、50ピコモルの各プライマーと少なくとも5ピコモルの標的ＤＮＡを必要とする。標的ＤＮＡは増幅反応に加えられる前に熱変性させた。反応は以下に示す３つの段階の25サイクルから構成された：変性（94℃、1分間）、アニーリング（算出されたプライマーの融解温度［melting temperatures］により、42℃から55℃の範囲の温度で、2分間）、伸長（72℃、2分間）。変性されたオリゴヌクレオチドを厳しくない条件下で用いた場合には、それぞれのオリゴヌクレオチドは1000ピコモルまで加え、50サイクル実行し、アニーリングは42℃で行なった。
ミニ細胞）内で発現した蛋白質の分析：
適当なハイブリッドプラスミドを有するミニ細胞を単離し、［35Ｓ］メチオニン（50μＣｉ／ｍｌ）で標識した。アセトン沈殿性物質約100,000ｃｐｍを12.5％のゲルでドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。94,000から14,000までの範囲の分子量をもつ標準蛋白質（Bio-Rad Laboratories社の低<分子量キット［low<molecular-weights kit］）を並行に流した。ゲルを染色し、En3Hance（New England Nuclear）を用いて蛍光間接撮影法により検査した。
ウレアーゼ活性：
ウレアーゼ活性は従来記載されている手法に修正を加え、ベルテロット［Berthelot］反応により定量した。ウレアーゼ活性は細菌の蛋白質のミリグラム当り、1分間に加水分解される尿素のマイクロモルとして示した。
パートIII実験の結果：
ヘリコバクター・ピロリのＧｒｏＥＬ様熱ショック蛋白質をコードする遺伝子を持つ組換え体コスミドの同定：
Ｈ．ピロリの精製熱ショック蛋白質の公表されたＮ末端のアミノ酸配列を基に、２つの変性されたオリゴヌクレオチドを、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中の目的の遺伝子を標的とするために合成した。初めの１つは5′-GCNAARGARATHAA RTTYTCNG-3′である。ここでＮは４つのヌクレオチドを表し、ＲはＡとＧを、ＹはＴとＣを、ＨはＴ、Ｃ及びＡを表す。このオリゴヌクレオチドは蛋白質（AKEIKFSD）の初めの８アミノ酸に由来する；２番目は5′CRTTNCKNCCNCKNGGNCCCAT-3′である。ここでＫはＧとＴを表し、それは29番目から36番目のアミノ酸を指定する相補的なコドン（MGPRGRNV，参照）に相当する。ＰＣＲ産物について期待される大きさは108塩基対（ｂｐ）であった。増幅反応は、“材料と方法”の項で示された、あまり厳しくない条件下で行なわれ、400ｂｐから100ｂｐまでの範囲の大きさを持つ６つの断片が合成された。３つの最も小さな断片をアクリルアミドゲルから電気溶出し、精製した。ＰＣＲ産物の直接配列決定により、公知の配列に相当するアミノ酸をコードするＤＮＡ断片の同定が可能となった。そこで、この断片を標識し、Ｈ．ピロリのＧｒｏＥＬ様蛋白質をコードする遺伝子の５´部分と相同性を示す組換え体コスミドを同定するために、コロニーハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた；さらにこの遺伝子はｈｓｐＢと名付けられた。遺伝子バンクは、組換え体コスミドを持つ400個の独立したカナマイシン耐性大腸菌形質導入体からなる。それらのうち、１つの単一コロニーがプローブとハイブリダイズした。それはｐＩＬＬ684と命名された組換えプラスミドを持ち、その大きさは46ｋｂであった。ｈｓｐＢ遺伝子を検出する際に見られた低い頻度（400分の1）は、幾つかのクローン化された遺伝子が5から7個の組換え体コスミドで確実に検出されるのと比較すると異常なものであった。ｈｓｐＢ遺伝子を同定するために、3ｋｂから4ｋｂまでの大きさを持つ断片をエンドヌクレアーゼＳａｕ3ＡによるｐＩＬＬ684コスミドＤＮＡの部分制限により生成させ、精製し、プラスミドベクターｐＩＬＬ570のＢｇｌII部位に連結した。100個のサブクローンのうち、ｘがポジティブクローンであった。このうち１つをさらに研究した（ｐＩＬＬ689）；それは２つのＢｇｌll制限酵素サイトにより広げられた3.15ｋｂのインサートを持ち、その部分は詳細にマップされた（図５参照）。ＰＣＲ32Ｐ標識されたプローブを用いることにより、ｈｓｐＢ遺伝子の５´末端がｐＩＬＬ689の632ｂｐのＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ中央の制限酵素断片に存在することが見い出された。これは、ｐＩＬＬ689組換え体プラスミド中にｈｓｐＢの全遺伝子が存在することを期待できることを示している。
Ｈ．ピロリのｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子群のＤＮＡ配列及びそれにより推定されたアミノ酸配列：
図５で示された3200ｂｐのｐＩＬＬ689は、非対称的な制限酵素断片であるＢｇｌII−ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIをＭ13ｍｐ18及びＭ13ｍｐ19にクローニングすることにより配列決定した：それぞれのクローン化された断片は二本鎖のそれぞれで別々に配列決定した。16個のオリゴヌクレオチドプライマー（図１）を、解読の確認をするため、及び／または別々に配列決定された断片をオーバーラップする配列を作製するために合成した；これらは２本鎖ＤＮＡの配列決定分析におけるプライマーとして用いた。
配列の分析により、２つの明確な遺伝子的な因子が明らかにされた。第１は、図５で示された同じ方向に転写される２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在である。それらはｈｓｐＡ及びｈｓｐＢと命名された；この２つのＯＲＦのヌクレオチド配列とそれにより予測されるアミノ酸配列を図６に示した。ｈｓｐＡの第一番目のコドンはｐＩＬＬ689のＨｉｎｄIIIの左方向323ｂｐ上流で始まる（図５）。そしてそれはシャイン−ダルガーノ・リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）（GGAGAA）により先導されている。ｈｓｐＡ  ＯＲＦは118アミノ酸のポリペプチドをコードしている。ｈｓｐＢ  ＯＲＦの初めのコドンはｈｓｐＡ終始コドンの25塩基下流で始まる；それはＲＢＳ部位（AAGGA）により先導されている。ｈｓｐＢ  ＯＲＦは545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、ｒｈｏ−独立［rho-independent］転写ターミネーター（自由エネルギー、△Ｇ＝−19.8Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に類似したパリンドローム配列に引き続くＴＡＡコドンにより終了する（図６）。予測されるＨｓｐＢ蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列は、既に公知である精製されたＨ．ピロリの熱ショック蛋白質のＮ末端配列と、Ｎ末端のメチオニンを除いては同一であった。そのメチオニンは精製された蛋白質には欠けており、転写後に除去されるのかもしれず、その結果成熟蛋白質は544個のアミノ酸よりなるかもしれない。Ｈ．ピロリＨｓｐＡ及びＨｓｐＢの推定されるアミノ酸配列をＧｒｏＥＳやＧｒｏＥＬクラスのＨｓｐの幾つかのアミノ酸配列と比較した（図７）。ＨｓｐＢはアミノ酸レベルでレジオネラ・ニュウモフィラ［Legionella pneumophila］ＨｔｐＢ蛋白質（82.9％の類似性）、大腸菌ＧｒｏＥＬ蛋白質（81.0％の類似性）、クラミジア・プシタッキ［Chlamydia psittaci］もしくはクラミジア・トラコマティス［C. trachomatis］のＨｙｐＢ蛋白質（79.4％の類似性）、及びクロストリジウム・パーフリンゲンス［Clostridiumperfringens］のＨｓｐ60蛋白質（80.7％の類似性）との間で高い相同性を示し、マイコバクテリウムのＧｒｏＥＬ様蛋白質に対しては低い類似性を示した。しかしながら、ほとんど全てのＧｒｏＥＬ相同体と同様に、Ｈ．ピロリＨｓｐＢは、最近になって大腸菌ＧｒｏＥＬシャペロニン内で必須ではないことが示された、カルボキシル基末端のグリシン−メチオニンモチーフ（MGGMGGMGGMGGMM）を保存していることが証明された。Ｈ．ピロリＨｓｐＡ蛋白質と他のＧｒｏＥＳ様蛋白質との間の、アミノ酸レベルでの相同性の程度を図７に示した。示された配列は、Ｈ．ピロリＨｓｐＡ蛋白質のカルボキシルキ末端では他の細菌のＧｒｏＥＳ相同体には欠如している顕著なモチーフが特徴的であることを示している。この独自に高度に保存されたモチーフは、２つのシステイン残基間の２箇所でループを形成することができる、27個の付加的なアミノ酸より構成される；27個のアミノ酸のうち、8個はヒスチジン残基であり、それらは金属結合ドメインを強く示唆する。
配列決定分析により明らかにされた第２の遺伝子的な因子は、ｈｓｐＡ遺伝子の84ｂｐ上流での挿入配列（ＩＳ5）の存在であった。このエレメントの塩基配列は、ＩＳ5のそばに位置する２つの逆方向反復配列のうちの１つに相当する16個の塩基配列（CTTGTTCGCACCTTCC）が存在する点において、大腸菌内のＩＳ5に関して従来記載されているものと完全に一致していた。ＤＮＡレベルで完全に一致したことから、我々はこのＩＳ5はＨ．ピロリ染色体に初めから存在していたものでなく、むしろクローニング過程でｈｓｐＡ−ＨｓｐＢ遺伝子クラスターの上流に挿入されたという仮説を推測した。ただし、この仮説はさらなる分析により確かめられる必要がある。
Ｈ．ピロリ染色体中のｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子クラスターの上流配列の同定：
i）Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中、ii）初めのコスミドｐＩＬＬ684中、及びiii）ｐＩＬＬ684組換え体コスミドのＳａｕ3Ａ部分的制限酵素分解の結果生じた100個のサブクローン中の推定配列を標的とするために、２つのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子増幅によりＩＳ5の存在を検査した。その２つのオリゴヌクレオチドの１つはＩＳ5エレメントの内部に存在するもので、もう１つはＩＳ5エレメントの下流に存在するものである（オリゴ＃1及び＃2、図６）。ＩＳ5はＨ．ピロリの染色体には存在せず、コスミドｐＩＬＬ684を有する大腸菌株のごく初期のサブカルチャー中に存在していた。ＩＳ5配列の全部もしくは一部を含んでいると推定される100個のｐＩＬＬ684サブクローン誘導体において、我々はＩＳ5の左末端に加えて、元来のｈｓｐＡ−ｈｓｐＢ遺伝子クラスターの上流配列を探した。このスクリーニングは、異なったＳａｕ3Ａで部分的に生成されたサブクローンの制限酵素分析をすることにより行なった。これらの基準を満たしているプラスミドの１つ（ｐＩＬＬ694）の制限酵素地図を図５に示す。ＩＳ5の左末端側のヌクレオチド配列が決定された；ＩＳ5エレメントの16ｂｐの逆方向反復配列の両端における4ｂｐの重複CTAAの存在（図６）により、我々は、ＩＳ5エレメントは転移により最近取り込まれたことを確信することができた。その後、ＩＳ5エレメントのすぐ上流に位置する245個のヌクレオチド配列を決定した（図６に示す）。この配列は非コード領域からなり、その中には推定される共通の熱ショックプロモーター配列［heat shock promoter sequence］の存在が検出された；そこには完全に保存された-35領域（TAACTCGCTTGAA）と、一致の程度が低い-10領域（CTCAATTA）が存在した。組換え体コスミド中に存在するＩＳ5エレメントの両端に位置する配列に対応する２つのオリゴヌクレオチド（図２に示される＃3と＃4）を合成した；これらの２つのオリゴヌクレオチドはＩＳ5配列が存在する場合にはXXXXｂｐの断片を増幅させるはずであり、ＩＳ5が存在しない場合にはある断片を増幅させるはずである。標的ＤＮＡとしてｐＩＬＬ684コスミド、ｐＩＬＬ694プラスミド、及びＨ．ピロリ85Ｐ株染色体を用いたＰＣＲ反応の結果は予測に適合した（結果は記載せず）。さらにＨ．ピロリ染色体から得られたＰＣＲ産物の直接配列決定を行ない、図６（Ｂ）に示される再構築されたｈｓｐＡ−ｈｓｐＢ上流配列が確認された。配列決定された全ての領域の遺伝子構成をさらに確認にするために、オリゴヌクレオチドの＃5及び＃6、並びに＃7及び＃8（図６）を用い、プラスミドｐＩＬＬ689の遺伝子を増幅することにより２つのプローブを調製した；それらを、Ｈ．ピロリ85Ｐ株染色体のＨｉｎｄIII制限酵素消化物に対するあまり厳しくない条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、プローブとして用いた。その結果、クローニング過程において検出可能な転位は他には存在しないことが明らかとなった（データは記載せず）。これらの実験により、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中にｈｓｐＢ遺伝子コピーは１つしか存在しないのに対して、サザンハイブリダゼーションによりｈｓｐＡ遺伝子の２つのコピーが検出されることを我々は示し得た。
ミニ細胞中で発現するポリペプチドの分析：
ｐＩＬＬ689組換えプラスミドとｐＩＬＬ692組換えプラスミド及びそれぞれのクローニングベクターｐＩＬＬ570とｐＡＣＹＣ177が、ミニ細胞生産株である大腸菌ｐ678-54への形質転換により導入された。ｐＩＬＬ689とｐＩＬＬ692プラスミド（図５）は、２つのベクターにクローン化された、同じ3.15ｋｂのインサートを有する。ｐＩＬＬ570はポリクローニングサイトの上流に転写及び翻訳の終結点をもつ；ｐＩＬＬ689内でのインサートの向きは、転写の終結点がＩＳ5断片の上流に位置し、従ってｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子の上流に位置するような方法で作製された。見かけ上の分子量が60ｋＤａと14ｋＤａであるポリペプチドと同様に泳動した２つのポリペプチドがミニ細胞実験においてｐＩＬＬ689及びｐＩＬＬ692から明らかに検出されたが（結果は示さず）、一方それらは当該のベクターからは検出されなかった；これらの結果により、ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子はＩＳ5エレメント内に位置するプロモーターから構造的に発現していることが示された。さらに、ＳＤＳゲル上で視認されたポリペプチドの量はそれぞれのベクターのコピー数に十分に一致していたが、一方で、２つのポリペプチドのバンドの強度は２つの遺伝子のポリシストロン性転写［polycistronic transcription］を示唆していた。
ＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質の役割を理解するための試み：
大腸菌内のプラスミドｐＩＬＬ686及びプラスミドｐＩＬＬ691のｈｓｐＡ遺伝子もしくはｈｓｐＢ遺伝子内に、従来記述されているＫｍカセットを挿入することにより、遺伝子を２箇所で分断した。これは、エレクトロポーレーションによりＨ．ピロリ内で分断された遺伝子を元に戻すため、そして対立遺伝子の置換に関して選択するために行なった。結果として生じたｐＩＬＬ696プラスミドは、Ｃ末端のアミノ酸配列の欠失に相当する、一部が欠けた形態のＨｓｐＡ蛋白質をコードしていた；そのプラスミドにおいて、Ｋｍカセットは、Ｋｍ遺伝子のプロモーターがｈｓｐＢの下流遺伝子のプロモーターとして働くような方法で挿入された。ｐＩＬＬ687プラスミドとｐＩＬＬ688プラスミドは、ｈｓｐＢ遺伝子内でＫｍカセットをいずれかの向きで挿入することにより生じた。精製されたｐＩＬＬ687プラスミド、ｐＩＬＬ688プラスミド及びｐＩＬＬ696プラスミド（表２、図５）をエレクトロポーレーション実験に用いた際には、これらのどの構築物からも、Ｈ．ピロリＮ6株のカナマイシン形質転換株を単離することはできなかった。一方ポジティブコントロールとして用いられたｐＳＵＳ10プラスミドでは常に単離することができた。これらの結果により、Ｈ．ピロリのＨｓｂＡ及びＨｓｐＢ蛋白質はＨ．ピロリの生存に必須な蛋白質であることが示唆された。
i）文献におけるＨｓｐＢ蛋白質とウレアーゼサブユニットとの密接な関連性についての一定の記述；ii）ニッケル結合ドメインを連想させるＣ末端配列を有するＨｓｐＡ蛋白質の独特な構造；及びiii）Ｈ．ピロリの生育可能なｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ変異株が存在しないことのため、我々は大腸菌内で機能相補実験により、Ｈ．ピロリのウレアーゼとの関係におけるＨ．ピロリのＨｓｐ蛋白質の役割を示すことを試みた。ウレアーゼ遺伝子クラスターをコードしているプラスミドｐＩＬＬ763もしくはプラスミドｐＩＬＬ753（両方ともｐＩＬＬ570の誘導体、表５）を、ミニ細胞内で視認されるように構造的にＨｓｐＡ及びＨｓｐＢポリペプチドを発現する共存可能なｐＩＬＬ692プラスミド（ｐＡＣＹＣ177誘導体）と共に導入した。どちらの相補実験においても、同じ大腸菌内でＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質が発現することにより、制限された窒素源として10ｍＭ  L-アルギニンが添加された最小培地で、ウレアーゼ遺伝子の誘導に引き続いてウレアーゼ活性が３倍以上増加することが観察された。
0003955317.tif 000007
IV−Ｈ．ピロリＨＳＰＡ及びＨＳＰＢの発現、精製及び免疫原性
パートIVの実験手順：
組換え融合蛋白質の発現と精製：
“結果”の項で示したようにｐＭＡＬ-ｃ2ベクター内への２つの遺伝子のクローニングに引き続いて、以下に示すプライマーを用いてＭａｌＥ−ＨｓｐＡ及びＭａｌＥ−ＨｓｐＢ融合蛋白質を発現させた。
0003955317.tif 000008
グルコース（30％）とアンプシリン（100μｇ／ｍｌ）を含む２Ｌのルリア培地に、融合プラスミドを含む一晩培養したＭＣ1061株20ｍｌを接種し、37℃で震盪培養した。培養液のＯＤ600が0.5に達した時、ＩＰＴＧ（最終濃度で10ｍＭ）を添加し、細胞をさらに4時間インキュベートした。細胞を遠心分離（5000ｒｐｍ、30分間、4℃）により集め、プロテアーゼ阻害剤［ロイペプチン（2μＭ）-ペプスタチン（2μｍ）-ＰＭＳＦ（1ｍＭ）-アプロチニン（1：1000希釈）］が添加された、10ｍＭトリス−ＨＣｌ、200ｍＭ  ＮａＣｌ、1ｍＭ  ＥＤＴＡから成る100ｍｌのカラム緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスに通した。遠心分離（10,000ｒｍｐ、20分間、4℃）後、上澄み液を回収し、カラム緩衝液で希釈した（2倍）。予め平衡に達したアミロース樹脂（22×2.5ｃｍ）にのせる前に、溶解物を0.2μｍのニトロセルロースフィルターに通した。カラム緩衝液にて調製された10ｍＭマルトースを用いて融合蛋白質を溶出して、融合蛋白質を含む画分を貯留し、蒸留水で透析し、凍結乾燥した。融合蛋白質をｍｌ当り凍結乾燥物2ｍｇの最終濃度で蒸留水に再懸濁させ、-20℃で保存した。調製物の濃度と純度は、ブラッドフォルド蛋白質分析［Bradford protein assay］（sigma Chemicals）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御した。
組換え蛋白質のニッケル結合の特性：
ｐＭＡＬ−ｃ2ベクターもしくは誘導組換えプラスミドのいずれかを含んでいる大腸菌ＭＣ1061細胞を、カーベニシリン存在下（100μｇ／ｍｌ）、100ｍｌのルリアブロス中で生育した。遺伝子の発現はＩＰＴＧを用いて4時間誘導した。細胞を遠心分離し、そのペレットを2ｍｌの緩衝液Ａ（6Ｍ塩酸グアニジン、0.1Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、0.01トリス、ｐＨ8.0）に再懸濁した。室温で1時間穏やかに撹拌した後、この懸濁液を10,000ｇ、15分間、4℃で遠心分離した。予め緩衝液Ａで平衡に達しているニッケル-ニトリロ三酢酸樹脂（Nickel-NTA, QIA express）のアリコート1.6ｍｌを上清に加え、この混合物をカラムにのせる前に室温で1時間撹拌した。カラムは20ｍｌの緩衝液Ａ、次いで30ｍｌの緩衝液Ｂ（8Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸ナトリウム、0.01Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0）で洗浄した。蛋白質は、ｐＨ6.3（緩衝液Ｃ）、ｐＨ5.9（緩衝液Ｄ）及びｐＨ4.5（緩衝液Ｅ）に調整された緩衝液Ｂと同等の緩衝液、並びに緩衝液Ｆ（6Ｍ塩酸グアニジン、0.2Ｍ酢酸）で連続的に溶出した。それぞれの画分の15μｌを50μｌのＳＤＳ緩衝液と混合し、ＳＤＳゲル上にのせた。
ヒト血清：
血清サンプルは40個体から得られた。そのうち28サンプルは、Ｈ．ピロリの培養で陽性であることと生検の組織学的な考察によりＨ．ピロリ感染患者であることが確認され、12サンプルは未感染患者であった。この血清は、R. J. Adamek（Bochum大学、ドイツ）の好意により提供を受けた。
イムノブロッティング：
ミニ・プロテインII・エレクトロフォレシス・セル［Mini PROTEAN II electrophoresis cell］中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥが終了した時点で、1時間、100Ｖに調節されたミニ・トランスブロット・トランスファー・セル［Mini Trans-Blottransfer cell］（Bio-Rad）で蛋白質をニトロセルロース紙に（冷却しながら）転写した。免疫学的染色［immunostaining］を、反応産生物を視認するためにＥＣＬウェスタン・ブロッティング検出システム（Amersham）を用いたことを除いて、従来記述されているように（Ferreroら，1992）行なった。Ｈ．ピロリ85Ｐ株の全細胞抽出液に対して生じたヒト血清とウサギ抗血清を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ7.4）中に調製された１％（ｗ／ｖ）カゼインで1：1000及び1：5000にそれぞれ希釈した。
血清学的方法［固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）］：
以下の量の抗原を96穴プレート（Falcon 3072）に吸収させた：2.5μｇの蛋白質ＭａｌＥ、5μｇのＭａｌＥ−ＨｓｐＡ、もしくは2.5μｇのＭａｌＥ−ＨｓｐＢ。プレートを一晩、4℃にて放置し、その後ＥＬＩＳＡ洗浄溶液（ＥＷＳ）［0.05％（ｖ／ｖ）のトゥィーン20［Tween 20］を含む1％のＰＢＳ］で3回洗浄した。プレートを、1％の粉末ミルクを添加されたＥＷＳ中において、37℃で、90分間インキュベーションすることにより飽和させた。ウェルを再びＥＷＳで3回洗浄し、その後振とう条件下において、ヒト血清（0.5％粉末ミルクを含むＥＷＳで1：500希釈）の存在下で37℃、90分間穏やかに撹拌した。結合した免疫グロブリンは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（1：500）（Kirkegaard and Perry Lab.）と組み合わせたビオチニル化２次抗体（0.5％の粉末ミルクを添加したＥＷＳ中に希釈（1：1000）されたヤギの抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＭ）と共に37℃で、90分間インキュベートすることにより検出した。結合したペルオキシダーゼは、基質であるクエン酸塩と過酸化水素との反応により検出した。プレートを暗条件下で室温にてインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートレーダーで5分、15分、30分間隔で492ｎｍでの吸光度を読み取った。30分後、最終濃度0.5Ｍになるまで塩酸を添加することにより反応を停止させた。
パートIV実験の結果：
誘導しうるＭａｌＥ−ＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ融合蛋白質を生産する組換えプラスミドの構築：
ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢの全遺伝子をＰＣＲにより増幅するために、オリゴヌクレオチド＃1と＃2（ｈｓｐＡ）及び＃3と＃4（ｈｓｐＢ）をそれぞれ用いた。ＰＣＲ産物を電気溶出し、精製し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した。切断により生じた断片（それぞれ大きさとして360ｂｐ及び1600ｂｐ）を、次にそれぞれｐＩＬＬ933とｐＩＬＬ934と命名されたプラスミドを生じさせるために、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩにより切断されたｐＭＡＬ−ｃ2ベクターに連結させた。ＩＰＴＧによる誘導とアミロースカラム上での可溶性蛋白質の精製の後、予測された大きさの融合蛋白質（ｐＩＬＬ933に関しては55ｋＤａ［図17］、及びｐＩＬＬ934に関しては100ｋＤａ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で視覚化された。これらの各々は、ＭａｌＥ蛋白質とＨｓｐポリペプチドのそれぞれの2番目のアミノ酸との融合に相当する。融合蛋白質の発現収量は、2リットルのブロス培養液から調製された場合、ＭａｌＥ−ＨｓｐＡについては100ｍｇであり、ＭａｌＥ−ＨｓｐＢについては20ｍｇであった。
ＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ融合蛋白質の抗原性、並びにＨ．ピロリに感染した患者におけるＨｓｐＡ及びＨｓｐＢの免疫原性の研究：
この融合蛋白質が依然として抗原性を有するか否かを決定するために、ＭａｌＥ蛋白質とＨ．ピロリ85Ｐ株の全細胞の抽出液に対して生じたウサギ抗血清を用いたウェスタンブロットによりそれぞれを分析した。どちらの融合蛋白質も、ＭａｌＥに対する抗体（結果は示さず）、及び抗-Ｈ．ピロリ抗血清に対して免疫反応があった。抗-Ｈ．ピロリ抗血清は精製されたＭａｌＥ蛋白質を認識しなかった（図18）。これらの結果により、融合蛋白質はそれらの抗原性を維持していることが示された；さらに、ＨｓｐＢ蛋白質が免疫原性であることは知られているものの、ＨｓｐＡそれ自体がウサギにおいて免疫原性であるというこの事実はここで初めて示された。
同様の方法で、ＨｓｐＡ及びＨｓｐＢポリペプチドがヒトにおいて免疫原性であるか否かを決定するために、ウェスタン・イムノブロッティング・アッセイと固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＨ．ピロリに感染した患者におけるＨｓｐＡ及び／またはＨｓｐＢに対する体液性免疫応答を分析し、感染していない患者のそれと比較した。Ｈ．ピロリ−陰性のヒトの12の血清のうち、ＭａｌＥ、ＭａｌＥ−ＨｓｐＡ、もしくはＭａｌＥ−ＨｓｐＢ蛋白質で陽性免疫ブロットシグナルを示したものはなかった。対照的に、Ｈ．ピロリ−陽性患者の28の血清のうち、12（42.8％）がＨｓｐＡ蛋白質と反応し、20（71.4％）がＨｓｐＢ蛋白質を認識した。ＨｓｐＡを認識した血清の全てがＨｓｐＢとも反応した。免疫応答とＨ．ピロリ感染についての臨床上の兆候との間には何の関連性も示されなかった。但し、分析された株の数が少ないので、このような結論は時期尚早であるかもしれない。
融合ＭａｌＥ−ＨｓｐＡ蛋白質のニッケル結合特性：
ＩＰＴＧでの誘導に引き続いて発現したＭＢＰ−ＨｓｐＡ組換え蛋白質を、ニッケル親和性カラムでの一段階精製により細胞全体の抽出液から精製した。これに対して、ＭＢＰ単独及びＭＢＰ−ＨｓｐＢはこの特性を示さなかった。図18は、ｐＨ6.3でモノマーとして、またｐＨ4.5でモノマーとして溶出されたＭＢＰ−ＨｓｐＡ蛋白質の一段階精製を示す。パネル7で見られる独特のバンドとパネル5で見られる２つのバンドは、ともに抗ＨｓｐＡウサギ血清により特異的に認識された。これは、融合ＭＢＰ−ＨｓｐＡ蛋白質のニッケル結合特性が、ヒスチジンとシステイン残基が豊富であるＨｓｐＡのＣ末端の配列に起因するかもしれないことを示唆した。
参考文献
0003955317.tif 000009
0003955317.tif 000010
0003955317.tif 000011
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0003955317.tif 000014
0003955317.tif 000015
配  列  表
（1）一般情報
（i）出願人：
（A）名称：パスツール研究所
（B）通り：25-28 rue du Dr Roux
（C）都市：パリ  セデックス  15
（E）国  ：フランス
（F）郵便コード（ZIP）：75724
（G）電話：45.68.80.94
（H）テレファックス：40.61.30.17
（A）名称：国立保健医療リサーチ研究所［INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE］
（B）通り：101 rue de Tolbiac
（C）都市：パリ  セデックス  13
（E）国  ：フランス
（F）郵便コード（ZIP）：75654
（G）電話：44.23.60.00
（H）テレファックス：45.85.07.66
（ii）ヘリコバクター感染に対する免疫性組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
（iii）配列の数：8
（iv）コンピューター読取可能形式：
（A）メディアタイプ：フロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：Patentln Release #1.0, Version #1.25（EPO）
（v）現在の出願データ
（A）出願番号：EP 93401309.5
（2）配列番号1の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：2619塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：misc feature
（B）存在位置：31..36
（D）他の情報：／標準名＝“シャイン−ダルガーノ配列”
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：misc feature
（B）存在位置：756..759
（D）他の情報：／標準名＝“シャイン−ダルガーノ配列”
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：43..753
（D）他の情報：／標準名＝“URE A”
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：766..2475
（D）他の情報：／標準名＝“URE B”
（xi）配列
0003955317.tif 000016
0003955317.tif 000017
0003955317.tif 000018
0003955317.tif 000019
0003955317.tif 000020
（2）配列番号2の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：237アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（vi）起源：
（A）生物名：ヘリコバクター・フェリス
（xi）配列
0003955317.tif 000021
（2）配列番号3の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：569アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（vi）起源
（A）生物名：ヘリコバクター・フェリス
（xi）配列
0003955317.tif 000022
0003955317.tif 000023
0003955317.tif 000024
（2）配列番号4の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：2284塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：124..477
（D）他の情報：／標準名＝“H.pylori - Hsp A”
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：506..2143
（D）他の情報：／標準名＝“H.pylori - Hsp B”
（xi）配列
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0003955317.tif 000026
0003955317.tif 000027
0003955317.tif 000028
（2）配列番号5の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：545アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（vi）起源：
（A）生物名：Ｈ．ピロリ
（xi）配列
0003955317.tif 000029
0003955317.tif 000030
（2）配列番号6の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：118アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（vi）起源
（A）生物名：Ｈ．ピロリ
（xi）配列
0003955317.tif 000031
（2）配列番号7の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：591塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（vi）起源：
（A）生物名：Ｈ．フェリス
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..591
（D）他の情報：／標準名＝″URE I″
（xi）配列
0003955317.tif 000032
（2）配列番号8の情報
（i）配列の特性
（A）配列の長さ：199アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（vi）起源：
（A）生物名：Ｈ．フェリス
（xi）配列
0003955317.tif 000033
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３（ｉ）】
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【図３（ｉｉ）】
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【図３（ｉｉｉ）】
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【図３（ｉｖ）】
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【図３（ｖ）】
0003955317.tif 000042
【図３（ｖｉ）】
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【図４（ｉ）】
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【図４（ｉｉ）】
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【図４（ｉｉｉ）】
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【図４（ｉｖ）】
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【図４（ｖ）】
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【図４（ｖｉ）】
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【図４（ｖｉｉ）】
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【図４（ｖｉｉｉ）】
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【図４（ｉｘ）】
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【図４（ｘ）】
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【図５】
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【図６（ｉ）】
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【図６（ｉｉ）】
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【図６（ｉｉｉ）】
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【図６（ｉｖ）】
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【図６（ｖ）】
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【図７Ａ（ｉ）】
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【図７Ａ（ｉｉ）】
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【図７Ａ（ｉｉｉ）】
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【図７Ａ（ｉｖ）】
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【図７Ａ（ｖ）】
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【図７Ａ（ｖｉ）】
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【図７Ａ（ｖｉｉ）】
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【図７Ｂ（ｉ）】
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【図７Ｂ（ｉｉ）】
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【図８】
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【図９（ｉ）】
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【図９（ｉｉ）】
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【図９（ｉｉｉ）】
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【図９（ｉｖ）】
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【図９（ｖ）】
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【図９（ｖｉ）】
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【図９（ｖｉｉ）】
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【図９（ｖｉｉｉ）】
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【図９（ｉｘ）】
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【図９（ｘ）】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７（ｉ）】
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【図１７（ｉｉ）】
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【図１７（ｉｉｉ）】
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【図１８】
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