(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化哺乳動物細胞株であって、単一の不死化遺伝子に隣接する、少なくとも第一及び第二レコンビナーゼ標的部位を有する外来核酸を前記細胞のゲノム中に含有し、前記標的部位が、レコンビナーゼと接触した時に、前記不死化遺伝子の切出しを媒介できることを特徴とする細胞株。
【請求項２】
前記外来核酸が更に選択マーカー遺伝子を有する請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
前記選択マーカー遺伝子が、負の選択マーカー遺伝子である請求項２に記載の細胞株。
【請求項４】
前記核酸が、更に、停止部位を有する請求項２に記載の細胞株。
【請求項５】
前記外来核酸が、更に、第一選択マーカー遺伝子と、第二選択マーカー遺伝子とを含有する請求項１に記載の細胞株。
【請求項６】
前記第二選択マーカー遺伝子が、第一及び第二レコンビナーゼ標的部位の間にない請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
不死化細胞のゲノムにおいて、単一の不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ標的部位を含有する不死化細胞を形成する方法であって、
前記方法が、細胞を、
(a)第一レコンビナーゼ部位、
(b)単一の不死化遺伝子、及び
(c)第二レコンビナーゼ部位、
を含有する外来核酸で形質転換して、レコンビナーゼの不存在下において、前記外来核酸を前記細胞のゲノム中に挿入することを特徴とする方法。
【請求項８】
前記核酸が、更に、少なくとも一種の選択マーカー遺伝子を含有する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択マーカー遺伝子が、負の選択マーカー遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
不死化細胞のゲノム中に単一の不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ標的部位を含有する外来核酸を含有する不死化細胞を非不死化する方法であって、
前記方法が、前記レコンビナーゼ標的部位を、該レコンビナーゼ標的部位を認識できるレコンビナーゼと接触させ、もって、前記不死化遺伝子を切り出すことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記不死化細胞を前記レコンビナーゼをコードするレコンビナーゼ核酸で形質転換し、該形質転換細胞を、前記レコンビナーゼが発現し、前記不死化遺伝子が切出される条件下において維持することによって、前記接触を行う請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
不死化細胞の非不死化方法であって、
(a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、
(ii)単一の不死化遺伝子、
(iii)負の選択マーカー遺伝子、及び
(iv)第二レコンビナーゼ標的部位、
を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記レコンビナーゼ標的部位間の配列の切出しによって、不死化遺伝子及び負の選択マーカーを切出すような配向で単一の切出し得る不死化遺伝子を含有する不死化細胞を製造し、そして
(b)前記レコンビナーゼ標的部位を、該レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼと接触して、前記不死化遺伝子及び負の選択マーカー遺伝子を切出す、
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転換することによって前記接触を行う請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記外来核酸が、更に、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼの遺伝子を含有し、前記レコンビナーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結され、前記不死化細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件下で成長させることによって前記接触を行う請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、更に、負の選択マーカー剤の存在下に非不死化細胞を選択する工程を含有する請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記外来核酸が、更に正の選択マーカー遺伝子を含有する請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記外来核酸が、更に、付加的な外来遺伝子を含有する請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
不死化細胞の非不死化方法であって、
(a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、
(ii)単一の不死化遺伝子、
(iii)選択マーカー遺伝子、及び
(iv)第二レコンビナーゼ標的部位、
を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記レコンビナーゼ標的部位間の配列の切出しによって、不死化遺伝子を切出し、その結果、選択マーカー遺伝子を発現する配向で単一の切出し得る不死化遺伝子を含有する不死化細胞を製造し、そして
(b)前記レコンビナーゼ標的部位を、該レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼと接触して、前記不死化遺伝子を切出す、
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記核酸が、更に、停止部位を含有する請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転換することによって前記接触を行う請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記外来核酸が、更に、誘導性プロモーターと作動可能に連結された前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼの遺伝子を含有し、前記不死化細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件下で成長させることによって前記接触を行う請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、更に、前記選択マーカー遺伝子を発現する非不死化細胞を選択する工程を含有する請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
不死化細胞の非不死化方法であって、
(a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、
(ii)単一の不死化遺伝子、
(iii)第一選択マーカー遺伝子、
(iv)第二レコンビナーゼ標的部位、及び
(iv)第二選択マーカー遺伝子、
を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記不死化遺伝子が発現される場合に、第一の選択マーカー遺伝子も発現され、前記第二選択マーカー遺伝子は発現されず、前記不死化遺伝子が切出される場合には、前記第二選択マーカー遺伝子が発現されるような配向で、単一の切出し得る不死化遺伝子を含有する不死化細胞を製造し、そして
(b)前記レコンビナーゼ標的部位を、該レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼと接触して、前記不死化遺伝子及び前記第一の選択マーカー遺伝子を切出す、
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転換することによって前記接触を行う請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記外来核酸が、更に、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼの遺伝子を含有し、前記レコンビナーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結され、前記不死化細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件の下で成長させることにより前記接触を行う請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、更に、付加的な外来遺伝子を含有する請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記外来核酸が、更に、停止部位を含有する請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記レコンビナーゼが、Creレコンビナーゼである請求項１に記載の不死化哺乳動物細胞株。
【請求項２９】
前記レコンビナーゼが、FLPレコンビナーゼである請求項１に記載の不死化哺乳動物細胞株。
【請求項３０】
前記レコンビナーゼが、Creレコンビナーゼである請求項７、１０、１２、１８又は２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記レコンビナーゼが、FLPレコンビナーゼである請求項７、１０、１２、１８又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、細胞の不死化及び脱不死化方法及び組成物に関し、特に、遺伝子治療に応用される方法に関する。
背景
遺伝子の欠失を修正するために又は疾病を治療するために外来核酸を細胞に加える遺伝子治療は、急速に発展している分野である。よく行われる遺伝子治療は、外来核酸のベクターとして患者の細胞を使用する。即ち、細胞を患者から取出し、遺伝子操作し、患者へ再び導入するものである。例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい。
この方法についての問題点は、取出した細胞がたいてい培養内で有限寿命がありそれ以後の遺伝子操作ができないことである。従って、取出された細胞系はしばしばがん遺伝子のような不死化遺伝子でトランスフォームされる。これにより細胞の無限の発育及び増殖が可能である。しかしながら、がん遺伝子を患者に導入することが望ましくないために、がん遺伝子を含む不死化細胞は移植候補として不適切である。
従って、本発明の目的は、生体外で発育及び不滅化され、次に、脱不死化するように誘導され、即ち、がん遺伝子を除去するように誘導され、その後、患者や動物に導入される不死化細胞系の生成方法及び組成物を提供することである。
発明の要約
上記の目的によれば、本発明は、細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ標的部位を含む単離した不死化細胞を提供する。その標的部位は、レコンビナーゼと接触する場合に不死化遺伝子の切除を仲介することができる。
態様においては、不死化細胞は正又は負の選択マーカー遺伝子とすることができる選択マーカー遺伝子を含む外来核酸を更に含んでいる。細胞は、ＳＴＯＰ（又は停止）部位、及び追加の選択マーカー遺伝子を含むこともできる。
他の態様においては、前記不死化細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ標的部位を含む不死化細胞の生成方法が提供される。その方法は、ａ）第一レコンビナーゼ標的部位；ｂ）不死化遺伝子；及びｃ）第二レコンビナーゼ標的部位を含む外来核酸で細胞をトランスフォームし、レコンビナーゼの存在しないときには前記外来核酸が前記細胞ゲノムに取込まれている工程を含む。外来核酸は、選択マーカー遺伝子を少なくとも１種含むことができる。
更に、前記不死化細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ標的部位を含む外来核酸を含有する不死化細胞を脱不死化する方法が提供される。その方法は、前記レコンビナーゼ標的部位と、前記レコンビナーゼ標的部位を認識することができるレコンビナーゼとを接触させる工程を含んでいる。
本発明の別の態様は、不死化細胞を脱不死化する方法が提供される。その方法は、第一レコンビナーゼ標的部位；不死化遺伝子；負の選択マーカー遺伝子；及び第二レコンビナーゼ標的部位を含む外来核酸を取込む工程を含んでいる。外来核酸は、レコンビナーゼ標的部位間の配列の切除が不死化遺伝子と負の選択マーカーを切除するような向きに切除可能不死化遺伝子を含む不死化細胞を生じるように細胞ゲノムに取込まれる。その方法は、更に、レコンビナーゼ標的部位と、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼとを接触させて前記不死化遺伝子と前記負の選択マーカー遺伝子が切除される工程を含んでいる。適切な負の選択薬剤の存在下に細胞を培養することにより、切除した不死化遺伝子と負の選択遺伝子をもたない細胞が選択される。
更に、不死化細胞を脱不死化する方法が提供される。その方法は、第一レコンビナーゼ標的部位；不死化遺伝子；正の選択マーカー遺伝子；及び第二レコンビナーゼ標的部位を含む外来核酸を取込む工程を含んでいる。核酸は、レコンビナーゼ標的部位間の配列の切除が不死化遺伝子を切除して選択マーカーの発現をもたらすような向きに切除可能不死化遺伝子を含む不死化細胞を生じるように細胞ゲノムに取込まれる。その方法は、更に、前記レコンビナーゼ標的部位と、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼとを接触させて前記不死化遺伝子を切除する工程を提供する。次に、正の選択薬剤を用いて細胞を単離する。選択マーカーを発現しない細胞は選択されない。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、条件不死化のための４種のベクターを示す設計図である。ＲＴＳはレコンビナーゼ標的部位である。ＭＰＣＳは多重ポリリンカークローニング部位であり、不死化遺伝子が挿入される。ＳＴＯＰは翻訳又は転写停止配列である。ＬＴＲはウイルス長末端反復である。ＳＶ４０はＳＶ４０由来のプロモーターである。
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅは、好適実施態様を示す図である。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は同じ基本的ベクターの２つの代替的設計である。両ベクターにおいては、ＲＴＳ、即ち、ｌｏｘＰ部位又はＦＲＴ部位が隣接した多重ポリリンカークローニング部位（ＭＰＣＳ）に不死化遺伝子（例えば、ｖ−ｍｙｃ）が挿入される。ＭＰＣＳの下流に、下流選択マーカー（アルカリホスファターゼ、薬剤選択マーカー、細胞表面タンパク質、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ等）の翻訳を防止するように設計されたTGACTGACCTGAのような“ＳＴＯＰ”配列がある。また、細胞の初期不死化を選択する異種薬剤選択マーカー、例えば、ヒスチジノール、ネオマイシン、ヒゴマイシン等がある。薬剤選択マーカーは、ウイルスＬＴＲ及びＳＶエンハンサーのような内部プロモーター−エンハンサーによるがん遺伝子経由して（２Ａ）又はその逆に（２Ｂ）進められる。図２Ｃは、実施例に用いられるｒｅｔｍｙｃｇａｌベクターであり；使用した不死化遺伝子はｖ−ｍｙｃとし、第二選択可能マーカーはｌａｃＺとし、第一選択可能マーカーはヒスチノールとした。図２Ｄはｒｅｔｔｋｎｅｗ．ａｐベクターであり、不死化遺伝子はｖ−ｍｙｃとし、内部プロモーターはｔｋとし、第一選択マーカーはｎｅｏとし、第二選択マーカーはアルカリホスファターゼとした。図２Ｅはｒｅｔ．ＩＮＳ．ａｐベクターであり、不死化遺伝子はｖ−ｍｙｃとし、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位であり、第一選択マーカーはｎｅｏとし、第二選択マーカーはアルカリホスファターゼとした。
図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、全細胞が脱不死化したことを確かめるために負の選択マーカーを用いた不死化／脱不死化構築物を示す図である。図３Ａは、トランスフォ−メーションの選択マーカーとして不死化遺伝子を用いる。また、負の選択薬剤へ曝露することを用いるクローン分析もトランスフォーメーションのマーカーとして役立つものである。図３Ｂは、トランスフォーメーションのマーカーとして正の選択マーカーを用いる。正及び負の選択マーカー遺伝子は、どの順序に位置してもよい。図３Ｃは、誘導プロモーターの制御下でレコンビナーゼを加える。正の選択遺伝子を加えることもできる。また、これらの遺伝子はどの順序に位置してもよい。レコンビナーゼ以外の遺伝子の転写用プロモーターは、様々な位置に置かれるので示されていない。
図４及び図４Ｂは、２種類の異なるレコンビナーゼ及びＴＲＳの使用を示す図である。図４Ａは、不死化遺伝子及び第一選択マーカー遺伝子の発現を可能にし、第二選択マーカー遺伝子は２つのＲＴＳ１間の切除まで発現されない。ＲＴＳ１切除時に第二選択マーカー遺伝子が発現され、脱不死化細胞の選択を可能にする。移植前に、ＲＴＳ２を認識するレコンビナーゼに曝露すると第二選択マーカーが切除され、外来核酸を最少にする。図４Ｂは、外来遺伝子が含まれ、例えば、治療剤をコード化している以外は同じ図である。従って、細胞が移植されて外来遺伝子が発現され、少し後で細胞を第二レコンビナーゼに曝露して外来遺伝子を除去する。
図５は、選択マーカー遺伝子のまん中にＲＴＳを入れることによりＳＴＯＰ部位の使用を避ける条件不死化構築物を示す図である。ＲＴＳは、切除時にＲＴＳの１つがゲノムに残るようにエキソンに含まれなければならない。その構築物で細胞をトランスフォームすると不死化遺伝子と第一選択マーカー遺伝子が第二プロモーターを用いて転写される。次に、第一選択マーカーに基づいて不死化細胞が選択される。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子と第一選択マーカーがＲＴＳ部位の１つと共に切除される。第二選択マーカーが転写され、宿主細胞の細胞組織によって認識されるＲＮＡスプライスシグナルの結果として第二ＲＴＳが除去される。これにより、第二選択マーカー遺伝子を転写させることができる。
図６Ａ及び図６Ｂは、誘導プロモーターとレコンビナーゼ遺伝子の使用を示す図である。図６Ａ及び図６Ｂは、誘導プロモーターの制御下のレコンビナーゼ遺伝子を含む以外は図１Ｃに示される構築物に対応する。図６Ａは、切除後のゲノムにレコンビナーゼ遺伝子が残る構築物を示し、図６Ｂは、レコンビナーゼ遺伝子を消失する構築物を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞の条件不死化方法及び組成物に関する。本明細書における“条件不死化”とは、細胞を不死化し、少し後で脱不死化することができる過程を意味する。従って、ある条件下では細胞が不死化され、下記の異なる条件下では細胞はもはや不死化されず、正常な老化パターンに戻り、もはや細胞培養内で無限に発育及び増殖しない。
当業者に理解される本明細書における“不死化”とは、細胞が不死化遺伝子でトランスフォームされて不死化遺伝子の発現が培養内でかなり無限に発育及び増殖する能力を与えることを意味する。
本明細書における“不死化遺伝子”とは、細胞の老化機構を克服して細胞がかなり無限に継代培養することができる遺伝子を意味する。不死化遺伝子は当該技術において周知である。不死化遺伝子は、通常は、使用される細胞に対して外来であり、細胞ゲノムに組込まれる。不死化する遺伝子の例としては、（１）ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、Ｔ抗原及びユーイング肉腫がん遺伝子のような核がん遺伝子（Fredericksenら,(1988) Neuron 1:439-448; Bartlett, P.ら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3255-3259, Snyder, E.Y.ら(1992) Cell 68:33-51）、（２）ｂｃｒ−ａｂｌ及びニューロフィブロミンのような細胞質がん遺伝子(Solomon, E.ら(1991) Science 254:1153-1160)、（３）ｎｅｕ及びｒｅｔのような膜がん遺伝子(Aaronson, A.S.A (1991) Science 254:1153-1161、（４）変異体ｐ５３及び変異体Ｒｂ（網膜芽腫）のような腫瘍サプレッサー遺伝子の優性突然変異（Weinberg, R.A. (1991) Science 254:1138-1146）、及び（５）負のNotch優性遺伝子のような他の不死化遺伝子(Coffman, C.R.ら,(1993) Cell 23:659-671);（５）成長因子；（６）成長因子レセプター；及び（７）Ｂｃｌ２のような抗細胞死遺伝子が挙げられる。特に好ましいがん遺伝子としてはｖ−ｍｙｃ及びＳＶ４０Ｔ抗原が挙げられる。
本明細書における“脱不死化”とは、不死化細胞の不死化遺伝子の全部又は一部が細胞のゲノムから物理的に切除され、細胞が正常な老化サイクルに戻ることができ、もはや培養内で無限に発育及び増殖しない過程を意味する。脱不死化細胞は、条件不死化構築物の全部又は一部が切除されたものである。従って、本明細書における開示と共に当業者に理解される様々な条件不死化構築物が作成され、種々の量の外来核酸が細胞ゲノム内に残ることになる。好適実施態様においては、不死化遺伝子の全部が脱不死化細胞から除去される。
本発明の条件不死化及び脱不死化方法は、部位特異的レコンビナーゼ系を用いて達成される。数種の系が既知であり、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅレコンビナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のＦＬＰ（“ｆｌｉｐ”）レコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅ系はＣｒｅレコンビナーゼを用い、これは３８ｋＤａタンパク質、とｌｏｘＰと呼ばれる２つの３４塩基対レコンビナーゼ標的部位（ＲＴＳ）である。組換えは、同じ分子上の直接反復ｌｏｘＰ部位間で起こり介在ＤＮＡセグメントを切除することができる。Sauerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5166 (1988); Sauerら，Nuc. Acids Res. 17:147 (1989); Laksoら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232; Hoessら，J. Mol. Biol. 181:351-362 (1985); Abremskiら，Cell 32:1301 (1983); Sternbergら，J. Mol. Biol. 150:467-486 (1981); Orbanら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6861 (1992)を参照されたい。ＦＬＰ系は、ＦＬＰタンパク質と２つのＦＬＰ組換え標的部位（当該技術においてＦＲＴと呼ばれ、本明細書においてはＲＴＳと示される）を用い、これは２つの１３逆方向塩基対反復と８塩基対スペーサーからなるものである（例えば、O'Gorman, Science 251:1351 (1991); Jayaram, PNAS USA 82:5875-5879 (1985); Senecofら，PNAS USA 82:7270 (1985); Gronostajskiら，J. Biol. Chem. 260:12320 (1985)参照）。これらの全ての文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
本明細書における“レコンビナーゼ標的部位”（ＲＴＳ）は、介在配列を切除するためにレコンビナーゼによって認識される核酸配列を意味する。２つのＲＴＳが切除に必要であることは理解されるべきである。従って、ｃｒｅレコンビナーゼが用いられる場合、各ＲＴＳはｌｏｘＰ部位を含み、ｌｏｘＰ部位が用いられる場合、対応するレコンビナーゼはｃｒｅレコンビナーゼである。即ち、レコンビナーゼはＲＴＳに対応するか又はこれを認識しなければならない。ＦＬＰレコンビナーゼが用いられる場合、各ＲＴＳはＦＬＰ組換え標的部位（ＦＲＴ）を含み、ＦＲＴ部位が用いられる場合、対応するレコンビナーゼはＦＬＰレコンビナーゼである。
これらのレコンビナーゼ系を用いて、適切なレコンビナーゼに曝露すると宿主細胞に挿入された不死化遺伝子が切除される。従って、条件不死化構築物は、不死化遺伝子の発現をもたらす向きに細胞に挿入される。全ての実施態様について、宿主細胞は核酸を発現してはならず、好ましくは、本発明の外来核酸を加える前に適切なレコンビナーゼをコード化する核酸を含まない。少し後で、介在不死化遺伝子を切除するためにレコンビナーゼが発現し、レコンビナーゼ標的部位に接触する。
好ましくは、成功した不死化及び脱不死化を検出又は選択するために選択マーカー遺伝子が用いられる。例えば、第一選択マーカーの発現は成功した不死化の検出を可能にする。即ち、不死化遺伝子が細胞ゲノムに組込まれた場合にマーカー遺伝子が発現する。第一選択マーカー遺伝子と好ましくは異なる第二選択マーカーの発現は、下記に詳細に記載されるように不死化遺伝子の切除を意味する。これらの選択マーカーは、正或いは負の選択マーカーとすることができる。当該技術において既知の“選択マーカー遺伝子”又は等価物は遺伝子を含む細胞の選択又は検出を可能にする遺伝子を意味する。“正の選択”は、正の選択マーカーを含む細胞のみが正の選択薬剤に曝露すると生存するか又は標識又は検出される過程を意味する。例えば、薬剤耐性は正の共通選択マーカーであり、薬剤耐性遺伝子を含む細胞は薬剤を含む培地上で発育し、耐性遺伝子を含まない細胞は死滅する。適切な薬剤耐性遺伝子は、特に、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ネオマイシン耐性、ヒグロマイシン耐性及びピューロマイシン耐性である。他の正の選択マーカー遺伝子としては、細胞の選別又はふるい分けを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は、特に、アルカリホスファターゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質の遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、及びＣＤ８のような表面マーカーが挙げられる。実施態様においては、下記に記載されるように、不死化遺伝子自体が正の選択マーカーとして働くことができる。
他の実施態様においては、負の選択マーカーが用いられる。“負の選択”は、負の選択マーカーでトランスフェクトした細胞が負の選択マーカーを含む細胞を死滅する適切な負の選択薬剤に曝露されると死滅する過程を意味する。例えば、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含む細胞はガンシクロビル（ＧＡＮＣs）に感受性がある。同様に、Ｇｐｔ遺伝子を含む細胞は６−チオキサンチンに感受性がある。負の選択マーカー遺伝子が条件不死化構築物に適切に配置された場合には脱不死化された細胞を単離するために用いられる。即ち、負の選択マーカーは、不死化遺伝子で発現し、不死化遺伝子がなお存在する場合には細胞は死滅する。
一般に、条件不死化−脱不死化ベクターと技術は次のように進行する。不死化に用いられる遺伝子構築は、外来核酸でまずトランスフォームすることにより不死化が得られるようにつくられる。細胞が発育及び増殖され、上記のように他の遺伝子が加えられる。細胞が幹細胞である場合には、所望されるならば不死化細胞が分化される。次に、移植前に又は少し後で細胞を操作して不死化遺伝子を切除する。即ち、細胞を脱不死化する。
好適実施態様においては、不死化遺伝子を細胞に導入するクローニングベクターは、不死化遺伝子、選択マーカー、プロモーター及びＲＴＳがゲノムに同時に組込まれるように構築される。即ち、ＤＮＡのゲノムへの組込みは脱不死化を促進しないことを必要とする。また、不死化遺伝子は、相同組換えベクターの構築が更に必要とした配列を導入させることを可能にするフランキング配列が十分なゲノムに導入される。
好適実施態様においては、脱不死化は、下記のようにレコンビナーゼをコード化する外来核酸を細胞に導入するする結果として起こる。
実施態様においては、本発明は、条件的に不死化した細胞系を提供する。その細胞系は、下記の様々な異なった条件不死化構築物を含む核酸を含有する。その不死化細胞系は、少なくとも１種の細胞を本発明の構築物を含む核酸でトランスフォームすることによりつくられる。
その条件的に不死化した細胞系は、下記の種々の脱不死化方法に用いられる。
他の実施態様においては、細胞系は、細胞系の細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子を隣接するレコンビナーゼ標的部位を含む核酸を含んでいる。その標的部位は、ＲＴＳがレコンビナーゼと接触する場合にＲＴＳが不死化遺伝子の切除を仲介することができるような向きでなければならない。即ち、ＲＴＳを認識するレコンビナーゼが存在しないときには不死化遺伝子は細胞ゲノムに取込まれ発現して不死化細胞系を生成する。ＲＴＳを対応するレコンビナーゼに曝露する場合にはＲＴＳ間の配列の切除が起こる。その配列は不死化遺伝子を含むので、切除により遺伝子の消失、即ち脱不死化が得られる。
別の実施態様においては、図３Ａに概略されるように、本発明は、第一レコンビナーゼ標的部位、不死化遺伝子、負の選択マーカー遺伝子、及び第二レコンビナーゼ標的部位を含む核酸を含有する不死化細胞系を提供する。上記のように、ＲＴＳを認識するレコンビナーゼの存在しないときには不死化遺伝子は細胞のゲノムに取込まれ発現して不死化細胞系を生成する。ＲＴＳをレコンビナーゼと接触させる場合にはＲＴＳは不死化遺伝子の切除を仲介することができる。好適実施態様においては、不死化遺伝子及び負の選択マーカー遺伝子はＲＴＳが隣接しする。従って、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子及び負の選択マーカーが発現し、不死化又は負の選択マーカーの発現に基づいてトランスフォームした細胞が選択される。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露又は接触すると不死化遺伝子及び負の選択マーカーが切除され、負の選択薬剤に曝露することにより脱不死化細胞が選択される。即ち、脱不死化細胞が生存し、不死化遺伝子及び負の選択マーカー遺伝子を含む細胞が死滅する。
他の実施態様においては、本発明は、第一レコンビナーゼ標的部位、不死化遺伝子、選択マーカー遺伝子、及び第二レコンビナーゼ標的部位を含む核酸を含有する不死化細胞系を提供する。上記のように、ＲＴＳを認識するレコンビナーゼの存在しないときには不死化遺伝子が細胞ゲノムに取込まれ発現して不死化細胞系を生成する。ＲＴＳがレコンビナーゼと接触する場合にはＲＴＳは不死化遺伝子の切除を仲介することができる。実施態様においては、レコンビナーゼの存在しないときには不死化遺伝子は発現するが選択マーカー遺伝子は発現しないような構築物の向きが好ましい。これは、図１及び図４に示されるようにＳＴＯＰ部位を構築物に加えることにより行われることが好ましいが、図５に示されるようにイントロン内の選択マーカーのまん中にＲＴＳの１つを含むことにより達成される。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露すると介在配列が切除され、不死化遺伝子及び選択マーカー遺伝子の発現の消失が生じ、脱不死化細胞の選択を可能にする。また、構築物の向きは、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子及び選択遺伝子が発現するようにし、不死化の選択を可能にする。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及び選択遺伝子が切除され、得られた細胞は選択遺伝子の消失により脱不死化が選択される。
別の実施態様においては、本発明は、第一レコンビナーゼ標的部位、不死化遺伝子、第一選択マーカー遺伝子、第二レコンビナーゼ標的部位、及び第二選択マーカー遺伝子を含む核酸を含有する不死化細胞系を提供する。その実施態様においては、構築物の向きは、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子及び第一選択マーカー遺伝子が発現しかつ第二選択マーカー遺伝子が発現しないようにする。これは、ＳＴＯＰ部位を構築物に加えることにより達成されることが好ましいが上記のように別の方法でも行われる。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露又は接触すると不死化遺伝子及び第一選択マーカー遺伝子が切除され、第二選択マーカーが発現する。これにより、第二選択マーカー遺伝子に基づいて脱不死化細胞の選択が可能である。
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ或いはＦＬＰ／ＦＲＴレコンビナーゼ系を含む好ましいレトロウイルスクローニングベクターを用いる数種の特定の実施態様が図面に示される。種々の構築により不死化細胞が生成され、引き続き脱不死化されるが、その数種だけが図面に示されていることを当業者は認識するであろう。
好適実施態様においては、条件不死化構築物は図１及び図２に示される通りである。まず、第一プロモーターと第一選択マーカー；第二プロモーター；レコンビナーゼ標的部位（ＲＴＳ）が隣接した多重ポリリンカークローニング部位（ＭＰＣＳ）；及び第二選択マーカーを含むクローニングベクターが構築される。不死化遺伝子、通常はがん遺伝子は、第二選択マーカーの発現を防止する任意のＳＴＯＰ配列と共にＭＰＣＳに挿入される。TGACTGACCTGAのようなＳＴＯＰ配列が当該技術において既知である。従って、レコンビナーゼの存在しないときは第二プロモーターを用いて不死化遺伝子が発現し、第一プロモーターを用いて第一選択マーカーが発現する。これにより、トランスフォームした不死化細胞の選択が可能であるがＳＴＯＰ配列が第二マーカーの発現を防止する。従って、不死化細胞がクローン化及び発育し、所望されれば追加の遺伝子が加えられる。脱不死化については、当該技術において周知の技術を用いて適切なレコンビナーゼの発現（好ましくは一時的）が達成される。これにより、レコンビナーゼ標的部位、不死化遺伝子を含むＭＰＣＳ、及びＳＴＯＰ配列の切除が得られる。従って、第二選択マーカー遺伝子がそこで発現し、そのマーカー遺伝子に基づいて脱不死化細胞が選択される。
図１Ａでは、第一選択マーカーが第一プロモーターによって（又はＬＴＲの内部プロモーターから）翻訳され、第二プロモーターを経由してＭＰＣＳに挿入された不死化遺伝子に至る。レコンビナーゼの存在しないときはＳＴＯＰ配列が第二選択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及びＳＴＯＰ配列が切除され、第二選択マーカーが第二プロモーターから進むことを可能にする。図１Ｂでは、不死化遺伝子の翻訳は内部ＬＴＲプロモーターを経由して進み、第一選択マーカーはＳＶ４０プロモーター又は等価物によって翻訳されるが、ＳＴＯＰ配列が第二選択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及びＳＴＯＰ配列が切除され、第二選択マーカーの翻訳を可能にする。図１Ｃでは、第一選択マーカー及び不死化遺伝子は第一プロモーター或いはＬＴＲプロモーターによって翻訳されるが、ＳＴＯＰ配列が第二選択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及びＳＴＯＰ配列が切除され、プロモーター又はＬＴＲによって第二選択マーカーの翻訳を可能にする。図１Ｄでは、緑色蛍光タンパク質及び不死化遺伝子の翻訳がＬＴＲプロモーター（又は他のプロモーター）によって起こる。緑色蛍光タンパク質は選択マーカーとして働く。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及び緑色蛍光タンパク質コード配列が切除される。従って、細胞はまず緑色蛍光タンパク質の存在によって選択され、次に、不在によって選択される。
ＲＴＳは、多くの方法でレコンビナーゼに曝露又は接触する。本明細書において“ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露する”又は“接触する”とは、ＲＴＳ間の配列の切除を可能にする方法でレコンビナーゼタンパク質がＲＴＳと相互作用しなければならないことを意味する。一般に、ＲＴＳを含む細胞内にレコンビナーゼタンパク質が存在することが必要とされることの全てである。これは、下記のように条件不死化構築物を含む細胞においてレコンビナーゼコード化遺伝子を発現することにより行われる。
好適実施態様においては、たいてい部位特異的組換えが迅速で効率がよいのでレコンビナーゼの発現は一時的である。一時的発現は、当該技術において周知の様々な方法で達成され、リン酸カルシウム沈降によるプラスミドＤＮＡのトランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクション又は他の物理化学的方法、レトロウイルスベクターを用いる導入、又はアデノウイルスのような他の組換えウイルスベクターからの発現が含まれるがこれらに限定されない。高発現効率が共通であるのでアデノウイルスが特に好ましい。
他の実施態様においては、レコンビナーゼをコード化する遺伝子は、誘導プロモーターの制御下に配列され、不死化／脱不死化構築物の一部である。通常は、図面に示された実施態様のいずれかにおいてレコンビナーゼ遺伝子に作用可能に結合された誘導プロモーターが含まれる。そのタイプの構築物は、図６及び図３Ｃに概略される。図６Ａは図１Ｃに対応し、ゲノムに残る誘導プロモーター／レコンビナーゼ遺伝子が加えらる。図６Ｂは、レコンビナーゼが切除される場合の図１Ｃに対応する。ＲＴＳ間の配列の切除を引き起こすのに少量のレコンビナーゼだけが必要であるので、未成熟組換えを避けるために堅く調節されたプロモーターを使用することが望ましい。レコンビナーゼを隣接する転写停止シグナルも望ましい。不死化遺伝子、好ましくはレコンビナーゼ遺伝子の組換え及び切除は、適切な誘導条件が与えられると起こる。
好適実施態様においては、負の選択マーカー、又は正と負の選択マーカーの組合わせが用いられる。負の選択マーカーは、不死化細胞が移植されないように防止するために特に有効である。例えば、負の選択マーカーは、不死化遺伝子と共に発現される。脱不死化後、細胞は、不死化遺伝子に密接に結合されるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をなお含有する細胞を死滅するＧＡＮＣのような負の選択薬剤に曝露される。個々の例は図３に示される。図３Ａでは、ＲＴＳは不死化遺伝子と負の選択遺伝子を隣接する。上記のように、不死化遺伝子は第一選択マーカーとして働く。また、負の選択遺伝子を含むクローナルコロニーは、負の選択マーカーを用いることにより同定される。即ち、クローナルコロニーは負の選択遺伝子を含む親コロニーを同定するために用いられる。不死化遺伝子と負の選択遺伝子の発現を進めるために用いられるプロモーターは、第１ＲＴＳの両側に配置される。レコンビナーゼと接触する場合、不死化遺伝子と負の選択遺伝子が切除され、細胞が脱不死化する。残存する不死化細胞は、推定上の脱不死化細胞を負の選択薬剤に曝露することにより死滅させることができる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の場合には、細胞はＧＡＮＣに曝露される。これにより、残存する不死化細胞が減少しかつ潜在的に消失し、細胞が移植に用いられる場合に望ましい。細胞ゲノム内に外来核酸が残っているとしても非常に少ないのでその構築物は特に好ましく、移植に望ましい。図３Ｂでは、不死化細胞を選択するために正の選択遺伝子が構築物に含まれる。図３Ｃでは、誘導プロモーターの制御下にレコンビナーゼが含まれ遺伝子操作の必要がない以外は図３Ａと同じ系である。
好適実施態様においては、種々の構築物について上記で概略されたように脱不死化前に選択マーカーの翻訳を防止するためにＳＴＯＰ部位が用いられる。また、図５に示されるように、選択マーカー遺伝子のまん中にＲＴＳを入れることにより機能性選択マーカーの発現を防止することが可能である。その方法は、残存するヌクレオチドがたぶんフレームシフト突然変異を引き起して非機能性選択マーカーを生じるのでレコンビナーゼによってＲＴＳの一方及びｍＲＮＡプロセシングによってもう一方を正確に切除することによるものである。
他の実施態様においては、１セットを超えるＲＴＳが用いられる。これは、同じレコンビナーゼによって認識される追加のＲＴＳセットを用いて又は異なるレコンビナーゼによって認識されるＲＴＳを用いて行われる。
同じレコンビナーゼのＲＴＳセットを用いる場合、２つのＲＴＳ間の切除が所望の又は測定可能な結果を得るような構築を設計するのに注意しなければならない。即ち、２つのＲＴＳ間に切除が起こるので、外来核酸が隣接している１つのＲＴＳがゲノム内に残ることが可能である。
好適実施態様においては、異なるレコンビナーゼのＲＴＳセットが用いられる。これは、外来遺伝子がゲノム内に含まれる場合に特に有用である。例えば、図４Ａに示された構築物を用いると不死化細胞が第一選択マーカーを用いて選択される。脱不死化については、ＲＴＳ１部位を認識するレコンビナーゼが用いられ、脱不死化細胞が第二選択マーカーを用いて選択される。第二選択遺伝子は、脱不死化時にのみ用いられる第一プロモーター、又は不死化及び脱不死化状態での転写を可能にするそれ自体のプロモーターを用いて転写される。外来タンパク質を発現する脱不死化細胞が移植される。少し後で、外来遺伝子産物がもはや必要としないときに第二レコンビナーゼに曝露することにより第二選択マーカーと外来遺伝子の切除が得られる。また、外来遺伝子は生体外でのみ必要とされ、その場合には移植前に第二レコンビナーゼが用いられる。本明細書に記載される他の構築物についてのように、当業者は本明細書での教示を用いて機能的に類似した種々の構築物を構築することができる。
付加的な態様においては、２種類のレコンビナーゼを使用して、移植則に外来核酸の実質的に全てを除去する。例えば、図４Ｂに示される構造物を使用して、不死化細胞を、第一選択マーカーによって選択する。非不死化に対しては、RTS1に対応するレコンビナーゼをその構造物に接触させ、第一プロモーターから転写された第二選択マーカーに基づいて細胞を選択する。細胞は、次いで、移植前に、RTS2部位を認識する第二のレコンビナーゼと接触して、単一ＲＴＳ部位を除く全てを除去する。切出し（excision）は非常に効率的であり、クローンコロニーを使用する選択マーカーの喪失を、選択に使用することができる。
一つの態様においては、組換えによって、第一の選択し得るマーカーを切出す。この方法は、非不死化細胞を移植する場合に好ましく、外来遺伝子を患者に導入するのを最小化するのに望ましい。
好ましい態様においては、第一の選択マーカーは、薬剤抵抗遺伝子、特に、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ネオマイシン抵抗、ハイグロマイシン抵抗、及びピューロマイシン抵抗の薬剤抵抗遺伝子である。この態様においては、第二の選択マーカーは、細胞を分類又はスクリーニングできる遺伝子であり、アルカリホスファターゼ遺伝子、緑蛍光タンパク質の遺伝子、lacZ遺伝子、CD8のような表面マーカー、第一選択マーカーとして説明した遺伝子の何れかを、第一及び第二選択マーカーが何れかの単一細胞における異なる遺伝子である限り、含むことができる。ある態様においては、形質転換の頻度は、非常に高く、第一又は第二選択マーカーを除去することができるかもしれない。ただし、非不死化細胞を移植することを目的とする場合には、発癌遺伝子を含有する細胞が動物中に移植されないことを確保することが望まれるので、一般には、少なくとも第二選択マーカーを保持することが好ましい。一つの態様においては、単一の選択マーカー、例えば、細胞分類(cell sorting)ができる緑蛍光タンパク質のような選択マーカーを使用する。この態様においては、マーカーは、不死化遺伝子が導入され、形質転換細胞が細胞分類によって非形質転換細胞から分離される場合に発現される。非不死化に際しては、マーカー遺伝子を除去して、細胞を再分類する。非不死化細胞は、マーカー欠失している。
更なる態様においては、不死化細胞は、表現型によって選択される。例えば、不死化遺伝子は、かかる遺伝子を含有しない細胞は培地で無限に成長しないので、第一の選択マーカーとして機能することができ、この基礎に基づけば、かかる細胞を除去できる。別に、マーカーは、クローン分析を使用して検出することができる。例えば、HSV-TK遺伝子を使用する場合には、クローンは、ＴＫ活性について分析できる。
ここで使用する用語「遺伝子工学処理細胞(genetically-engineered cell)」又は「組換え細胞」は、外来（即ち、天然に存在しない）核酸、例えば、ＤＮＡを導入した細胞を意味する。ここでの「異質」又は「非相同的な」又は「外来」核酸は、細胞のゲノム中には通常見出されない核酸若しくはそのようなゲノム中に通常見られない形態の核酸を意味する。従って、発癌遺伝子やレコンビナーゼ標的部位のような不死化遺伝子は、宿主のゲノム中には通常見られ得ないものであり、従って、これらの配列を含有する不死化細胞は、遺伝子工学処理されたものである。ある態様においては、条件(conditionally)不死化細胞を操作して、１種以上の付加的な外来遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ゲノム中に通常含有され、即ち、相同的であるが認知できる程度には発現されないか、若しくは非相同的であり、即ち、ゲノムに通常見出されない。例えば、相同的な成長因子遺伝子は、ゲノム内に通常見られない形態で細胞中に導入することができる。即ち、細胞中で通常見られないレベルで成長因子を発現できるようにするプロモーター等の制御配列とともに、又は成長因子を通常発現しない細胞タイプ内に導入することができる。また、非相同的な遺伝子を導入することができる。従って、本発明の条件不死化細胞は、遺伝子工学処理して、１より多くの外来核酸配列を含むことができる。
本発明の条件不死化構造体又は方法は、また、治療的に有利な付加的な外来遺伝子を含有してもよい。例えば、成長因子をコードする遺伝子を導入して、移植細胞の生存を容易としたり、患者の治療を容易化することができる。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）や、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）及び脳由来ニューロトロフィン因子（ＢＤＮＦ）などのニューロトロフィンは有用かもしれない。神経細胞以外の細胞を使用する場合、適切な外来遺伝子には、例えば、ヒト成長因子や、上皮性成長因子、神経成長因子等の成長因子；サイトカイン；酵素及び酵素阻害剤；α、β又はγインターフェロン等のインターフェロン；凝固因子（因子VIII）；ＡＤＡ；抗細胞死遺伝子；その他のタンパク質などをコードするものが挙げられる。
従って、例えば、治療剤をコードする異質ＤＮＡの導入等の生体外操作のために不死化し、次いで非不死化して、治療剤を発現する遺伝子工学処理細胞を患者に導入することができる。また、細胞自身が治療剤であり、移植されて、例えば、パーキンソン病におけるような病気の又は死にかけた細胞を置換する。
一つの態様においては、細胞を、遺伝的に欠陥のある患者から取り出し、本発明の技術を使用して細胞を再導入する前に、工学処理して、少なくとも訂正された遺伝子の一つのコピーを含有させる。このように処理できる遺伝的な病気はこの技術分野において公知である。
不死化遺伝子に加えて、本発明の細胞は、以下で更に詳細に記載するように、付加的な外来核酸を有する。この外来核酸には、少なくとも2種類のレコンビナーゼ標的部位、好ましくは、選択（マーカー）遺伝子、転写終結部位、リンカー、及び他の上記のような興味のある遺伝子が含まれる。
異質核酸又は外来核酸は、例えば、カルシウムホスフェート媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、レトロウィルス形質転換、アデノウィルス形質転換、ヘルペスウィルス形質転換、プロトプラスト融合及びリポフェクションを含みかつこれに限定されない、当該技術分野において公知の各種技術によって導入することができる。
好ましい態様においては、外来ＤＮＡは、レトロウィルストランスフェクションの技術を使用して、細胞に導入する。組換えレトロウィルスを使用して、不死化遺伝子、選択又はマーカー遺伝子、レコンビナーゼ標的部位及びレコンビナーゼを導入する。組換えレトロウィルスを細胞株を梱包するのに使用して、高力価のウィルス粒子（一般に、105〜106pfu/ml）の培養上清を製造する。組換えウィルス粒子を使用して、当該技術分野で公知のようにウィルス粒子を含有する培地で細胞培養体を培養することによって細胞培養体マーカー又はその子孫を感染する。レトロウィルス感染に続いて、細胞を洗浄し、次いで、標準培地で培養する。感染細胞は、次いで、異質ＤＮＡの取り込み及び発現について分析する。細胞は、選択マーカー遺伝子を取り込みかつ発現する細胞について選択する選択条件に暴露してもよい。
好ましい態様において、クローニングベクターは、レトロウィルスベクターであり、図面に記載されるような、長い末端繰り返し（ＬＴＲ）を利用する。別の態様では、伝統的な発現プラスミド、ヘルペスウィルスをベースとするベクター、並びに当該技術分野の当業者に周知の等価物を利用する。
更に別の態様では、当該技術分野で公知のカルシウムホスフェート媒介トランスフェクションの技術を使用して、異質ＤＮＡを導入する。例えば、本発明の条件不死化細胞構造物を含有するカルシウムホスフェート沈殿を、WiglerらのProc. Natl. Acad. USA 76:1373-1376 (1979)の技術を使用して調製する。細胞培養体を、組織培地皿に確立する。細胞のプレーティング後２４時間後に、約20μg/mlの異質ＤＮＡを含有するカルシウムホスフェート沈殿を添加する。細胞は20分間室温で培養する。30μＭのクロロキンを含有する組織カルチャー培地を添加し、細胞を37℃で一夜培養する。トランスフェクションの後、細胞を選択マーカー遺伝子を取り込みかつ発現する細胞について選択する選択条件に暴露してもよい。
上記技術は、特定の細胞について一度より多くの回数実施することができる。例えば、これらの技術を使用して、レコンビナーゼ部位を有する不死化遺伝子を導入し、次いで、更に、不死化細胞に外来核酸、例えば、レコンビナーゼをコードする発現プラスミドを導入する。
当該技術分野の当業者によって理解されるように、非常に広範な適当なプロモーターを本発明で使用することができる。特に有用なプロモーターには、レトロウィルスのＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、及び組織又は細胞特異的プロモーター、特に、条件不死化する細胞型に特異的なプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の条件不死化方法を実施するのに使用できる適当な細胞には、本発明の構造物に使用されるレコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼを産生しない何れの細胞型が含まれる。好ましくは、細胞は、それらがレトロウィルスベクターによって感染され得るように分裂する。好適な細胞は、脊椎動物細胞、好ましくは、霊長類、ヒツジ、ブタ、牛、犬、猫及びウマのような哺乳動物、更に好ましくは、ヒト細胞である。特に好ましい細胞は、神経幹細胞、造血性幹細胞、膵臓幹細胞、肝臓幹細胞、上皮幹細胞、腸幹細胞、骨形成幹細胞及び嗅覚幹細胞等のあらゆるタイプの幹細胞が挙げられ、特に好ましい幹細胞は、神経クレスト幹細胞及び造血幹細胞である。好適な非幹細胞には、膵臓島細胞、線維芽細胞、破骨細胞、骨芽細胞、上皮又は真皮性細胞、内皮細胞、肝細胞、赤芽球、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、メラノサイト、リンパ球（Ｂ、Ｔ）、骨髄性細胞及びグリア細胞等を含む。
好ましい態様において、非不死化細胞の表現型、成長及び寿命は、遺伝子操作の内同一の細胞型と同一である。即ち、非不死化細胞は、不死化前の出発細胞と同一である。別の態様では、細胞は変更した特性を有してもよい。
ある場合には、出発細胞が、in vivoで延長した寿命を有することを認識すべきである。即ち、それらの細胞は、宿主細胞中に存在するかもしれないが、生体外では無限に成長することはできない。従って、例えば、島細胞は、ヒトにおいて、生存期間生きつづけるものと考えられる。更に、島細胞は、生体外での細胞カルチャーにおける成長及び増殖にとって依然として不死化が必要であるかもしれない。同様に、神経幹細胞のような幹細胞は、延長した期間持続するかも知れず、また、in vivoで限定された自己更新を行うことができるが、細胞カルチャーにおいて無限成長及び無限増殖にとって、不死化遺伝子により不死化されなければならない。不死化細胞の無限拡大によって、複数の患者の治療に対する「普遍的ドナー細胞株」が形成できる。
新しい培地条件に暴露されない限り、不死化細胞株の分裂によって、実質的に同一の娘細胞が形成されることは理解されるべきである。即ち、定義上、不死化細胞は、無限再生ができる。例えば、神経クレスト幹細胞のような不死化幹細胞の細胞分裂によって、２つの神経クレスト幹細胞が形成され、両方とも、同等に非分化である。ある実験又は生理学的条件に曝されると、これらの幹細胞は、部分的又は完全な分化を生じる。
当該技術分野の当業者によって理解されるように、不死化細胞株に適当な培地条件は、細胞型によって変動する。
本発明の条件不死化方法には、当該技術分野の当業者にによって理解されるように、多くの用途がある。
一つの態様において、条件不死化細胞は、幹細胞であり、好ましい態様では、細胞は、WO94/02593に記載されるような神経クレスト幹細胞及び多分化能神経幹細胞である。ここで、この文献を参考として明示的に導入する。当該技術分野の当業者に理解されるように、神経幹細胞は、中枢神経及び末梢神経系のグリア及びニューロンを形成するものであり、移植又は体内埋植されて、新規なニューロン及びグリアを形成する。例えば、急性外傷性自動車障害に対する、脊髄中の運動ニューロン及びその関連するグリア細胞の置換又はパーキンソン病の治療のための、中脳における死滅しつつあるドーパミン作動性ニューロンの置換は、予備診断研究において追求されている活動的な領域である。遺伝子工学処理された不死化細胞の移植の第2の用途は、遺伝子治療である。細胞は、移植前に、喪失した遺伝子産物を発現するように遺伝子的に修正され、次いで、これらの細胞を特定の脳の領域に移植することによって、必要とする身体の領域に遺伝子産物を送達する。かかる遺伝子治療方法の原理の証明は、試験系として、遺伝性ムコ多糖症を使用する動物モデルにおいて既になされている。
別の態様において、幹細胞以外の細胞を、生体外成長のために不死化し、次いで、生体中に再導入する前に、非不死化することができる。例えば、米国特許第5,387,237号明細書は、ブタ膵臓島細胞で充填されたプラスチックシリンダーを含有するバイオ人工的な膵臓を開示している。これらのブタ膵島細胞を生体外成長及び増殖のために不死化して、長期にわたって均一化させ、次いで、生体への導入前に不死化することができる。
例えば、これらの方法は、例えば、米国特許第5,299,346号明細書に一般的に記載されているように、生体外遺伝子治療技術に使用することができる。従って、患者に移植される細胞は、ヒトか動物からに係わらず、条件不死化処理することができ、次いで、移植前に非不死化することができる。一つの態様において、細胞を、移植使用とする患者から、又は他の態様において、他の患者又は動物から取り出す。例えば、米国特許第5,387,237号明細書に記載されるように、ブタ膵島細胞を条件不死化し、ヒトへの移植前に、非不死化することができる。
従って、宿主ヒト又は哺乳動物への、幹細胞のような不死化細胞を導入又は移植する方法が提供される。移植技術は、当該技術分野において周知であり、非不死化細胞で実施することができる。従って、例えば、非不死化細胞を、宿主に移植して、細胞の治療的可能性を評価したり、神経系の神経性の病気を治療することができる。好ましい態様では、細胞は、幹細胞であり、病気は、末梢神経系の神経性の病気である。
更に、不死化細胞株を、その細胞の発達、分化及び／又は機能を発揮できる薬剤をスクリーニングするために使用することができる。これらの薬剤には、小分子有機薬剤及び成長因子が含まれる。
不死化細胞は、不死化発癌遺伝子が生体への導入に先立って除去され、不死化遺伝子による腫瘍の潜在的な形成が排除されているので、特に、移植又は体内埋植に有用である。本発明の方法は、ヒトの治療及び動物用途の両方、例えば、非ヒト細胞のヒトの使用に適用可能である。従って、本発明の方法及び構造物は、ヒトや、ブタ、霊長類、マウス又はラット等のげっし類動物、犬、牛及び羊からの細胞で使用することができる。
以下は、例示として提示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして構成するものではない。更に、ここで言及する全ての文献は、参考として明示的に導入する。
実施例
この実施例では、標準的なモロニーマウス白血病ウィルスレトロウィルスベクターを使用し、修正した。v-myc発癌遺伝子を有する標準組換え複製無能力レトロウィルスベクターを、v-mycコード配列をフランキングするloxP部位を配置し、かつloxP-v-myc-loxP配列の下流（3'）側にβ-ガラクトシダーゼコード配列を配置するように、修正した。更に、実験には、アルカリホスファターゼ、ネオマイシン抵抗及び緑蛍光タンパク質(GFP）及びGFPの「ヒト化」物（蛍光活性化細胞分類の使用が可能な、GFPよりも10倍感度の高い緑ランタンタンパク質(GLP）と呼ばれる）の両者を含む付加的な選択マーカーを使用した。これらの修正は、当該技術分野の当業者にとってよく知られ、制限酵素、消化、連結、PCR増幅、細菌形質転換、プラスミド単離及び更なる特性確認を含む標準的な分子生物学的手法及び配列決定によって実施した。
この修正した組換えレトロウィルス構造物が実際に組換え感染性ウィルス粒子を産生することができることを確認するために、以下の実験をまず実施した。感染性複製無能力ウィルス粒子を調製するために、構造物を梱包株BOSC 23中にトランスフェクトした。BOSC 23細胞の過渡的トランスフェクションに続いて、レトロウィルス粒子を含有する、これらの３日後のトランスフェクション細胞の上清を集めた。これらの上清中の感染性ウィルスの力価は、105〜106pfu/mlであった。これらの感染性上清を使用して、NIH 3T3細胞を感染した。感染後数日のこれらの細胞を、鳥v-mycに対する抗体で染色することにより、これらの細胞の多くが、v-myc発癌遺伝子を発現したことを確認した。姉妹カルチャーをXgal剤で固定しかつ染色することによって、ベクターの設計から予測されるように、感染細胞のいずれも、β-ガラクトシダーゼを発現しなかったことが確認された。従って、この実験から、(1)構造物が、感染性レトロウィルス中に梱包され得ること、及び(2)そのベクター中に含まれるv-myc発癌遺伝子コード配列が転写され、感染細胞においてタンパク質に翻訳され得ることの２つの重要な事柄が見出された。
cre酵素をレトロウィルス感染細胞にトランスフェクションすると、v-mycコード配列が切出され、β-ガラクトシダーゼ酵素活性が付随的に活性化された。このことは、レトロウィルス感染細胞を、creレコンビナーゼがサイトメガロウィルスCMVエンハンサーの制御下にある発現構造物によってトランスフェクトすることによって行った。そのトランスフェクションから24〜48時間後に、細胞は、Xgal染色のために、固定し、加工した。この染色により、レトロウィルス感染細胞が、その核内に青色反応生成物によって示されるβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を示すことが分かった。creコード配列を欠失した同一の発現ベクターでトランスフェクトしたコントールカルチャーには、β-ガラクトシダーゼ活性は見出されなかった。creトランスフェクト細胞を、v-myc発癌遺伝子に対する抗体で染色することによって、これらのトランスフェクト細胞が、もはや、creレコンビナーゼによるプロウィルスからの切出しに基づいて予想されるように、v-myc発癌遺伝子を発現しないことが確認された。
従って、これらの実験によって、creレコンビナーゼが、哺乳動物細胞ゲノム中の一体化されたプロウィルスからv-myc発癌遺伝子配列を切出し得ること、また、この発癌遺伝子の切出しによって、このベクターの設計に基づいて予想されるように、下流側のリポーター遺伝子、この場合、β-ガラクトシダーゼの付随的な活性化が生じることが示された。
このレトロウィルス構造物からのv-myc発癌遺伝子の発現によって、一次細胞型を不死化できる機能的v-myc配列が産生された。このことは、マウス胚線維芽細胞を使用して行った。線維芽細胞を、標準的操作によって単離し、培養し、次いで、loxP胚によてフランキングされた修正v-myc発癌遺伝子をコードし、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を下流側に含むレトロウィルスベクターで感染させた。このベクターを、retmycgalと命名し、図２Ｃに示す。この感染細胞を、６mMヒスチジンの存在下で培養することにより、選択下に置いた。レトロウィルスベクターは、また、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。従って、組み込まれたプロウィルスを発現する細胞は、６mMヒスチジンの存在の下で生存するが、非感染細胞は死滅する。非感染細胞のコントールプレートは、６mMヒスチジンの不存在下において、非感染及び感染細胞の間の成長速度を比較した。約６継代を含有するカルチャーでの４〜５週間の成長の後、ヒスチジン抵抗性myc感染細胞と、非感染細胞との間には、明らかな相違が視認された。この時までに、非感染コントール線維芽細胞は、老化に到達し、平坦化し、分裂を停止した。これとは対照的に、retmycgalレトロウィルス構造物で感染した細胞は、培地中において、力強い増殖を示し続けた。これらの細胞のいくつかを、v-mycに対する抗体で固定化し、染色すると、これらの感染線維芽細胞の核に、鳥v-myc発癌遺伝子の豊富な発現が示され、その不死化状態がv-myc発癌遺伝子の発現によることを確認した。予想されるように、これらの細胞には、β-ガラクトシダーゼ活性は検出されなかった。
これらの実験は、その系が非常に敏感なので、ネオマイシン薬剤抵抗を第一選択マーカーとして使用して、行った。
このmycコード配列は、確立された感染細胞のゲノムから、その細胞へのcre発現構造物のトランスフェクションによって切出すことができた。一過性感染細胞の場合に以前に示されたように、mycの切出しによって、付随的に、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の活性化が生じた。CMV cre構造物のこれらの細胞へのトランスフェクションに続いて、Xgal染色によって、多くの青色細胞を検出することができた。従って、これらのデータから、少なくとも６回継代した安定な感染一次細胞においても、creレコンビナーゼが、v-mycコード配列を切出し、下流のマーカー、β-ガラクトシダーゼの発現を活性化できることが分かった。更に重要なことは、これらのデータによって、組み込まれたプロウィルスからのv-mycコード配列の発現が、実際に、予想されるように、これらの一次マウス線維芽細胞を機能的に不死化できることを示す。
更に、レコンビナーゼの導入に対する従来の方法（即ち、ＤＮＡ媒介遺伝子転移）によって、５〜10％の細胞が非不死化したのに対して、creレコンビナーゼをコードするアデノウィルスベクターの使用によって、ほぼ、５０％の細胞が非不死化する。
また、WO/94/02593に従う神経クレスト幹細胞は、neoを第一選択マーカーとして、かつアルカリホスファターゼ遺伝子を第二選択マーカーとして使用して、同様に不死化する。
要約すると、この実施例によって、retmycgalレトロウィルスベクター及び他のベクターで感染して不死化できる一次マウス胚線維芽細胞を使用して、これらの不死化細胞を少なくとも６世代にわたって安定に継代し、次いで、これらの細胞をcre発現構造物によってトランスフェクションすることによってそのゲノムから発癌遺伝子myc配列を切出すことによって、その細胞を非不死化できることが証明された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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