(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状成長媒体を該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ複数のバイオフィルム付着部位を横断して流しながら該複数のバイオフィルム付着部位上でバイオフィルム形成微生物を培養することによって該複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルムを作製する工程からなるバイオフィルム成長方法。
【請求項２】
該複数のバイオフィルム付着部位に位置するバイオフィルムを検定してバイオフィルムの特徴を分析する工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項３】
バイオフィルムの特徴が、抗菌試薬に対するバイオフィルムの感度であり、かつバイオフィルムを検定する前に抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程をさらに含む請求項２の方法。
【請求項４】
抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理した後で検定を行う前にバイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外す工程をさらに含む請求項３の方法。
【請求項５】
バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外した後に、バイオフィルムを培養する工程をさらに含む請求項４の方法。
【請求項６】
バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外す工程は、各バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外してウエル板の個々のウエルに置く請求項４の方法。
【請求項７】
バイオフィルム付着部位が複数列設けられる場合には、抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程は各列のバイオフィルム付着部位を異なった抗菌試薬で処理することを含む請求項３の方法。
【請求項８】
一列の各バイオフィルム付着部位を異なった濃度の抗菌試薬で処理することをさらに含む請求項７の方法。
【請求項９】
液状成長媒体の流れ方向を繰り返し反転させる請求項３、７または８の方法。
【請求項１０】
液状成長媒体が容器の複数の流路中を流れ、容器を揺動することによって液状成長媒体の流れ方向を反転させる請求項９の方法。
【請求項１１】
バイオフィルム付着部位が蓋の複数の突起であり、バイオフィルムの培養工程が流路中の液状成長媒体に突起を吊り下げるとともに、容器を揺動させてバイオフィルムの成長中にバイオフィルムに剪断力を付与する請求項１０の方法。
【請求項１２】
各バイオフィルム付着部位を異なった濃度の抗菌試薬によってさらに処理する請求項２の方法。
【請求項１３】
複数のバイオフィルム付着部位上にバイオフィルム形成微生物を培養する前に、さらに複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルム抵抗被覆を施す請求項１２の方法。
【請求項１４】
さらに異なったバイオフィルム付着部位に異なった被覆を施す請求項１３の方法。
【請求項１５】
さらに液状成長媒体中のホスト物質の存在下にバイオフィルム形成微生物を培養する請求項１の方法。
【請求項１６】
バイオフィルムを作製するために、複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルム形成微生物を最初に培養した後、続いて複数の別々の複数のマイクロ反応器でバイオフィルム形成微生物を培養する工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項１７】
異なったバイオフィルム付着部位を異なった複数の抗菌試薬で処理する請求項３の方法。
【請求項１８】
液状成長媒体を流すための少なくとも一つの流路を有する容器と、流路内に複数のバイオフィルム付着部位を支持するための支持部を有する複数のバイオフィルム付着部位と、液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ複数のバイオフィルム付着部位を横切って異なる方向に各流路に沿って液状成長媒体を流す手段とを有するバイオフィルム分析装置。
【請求項１９】
複数のバイオフィルム付着部位が複数の列で形成され、各列には少なくとも２以上のバイオフィルム付着部位が設けられ、容器には略同一形状の複数の流路が設けられている請求項１８の装置。
【請求項２０】
バイオフィルム付着部位が略同一の形状を有する請求項１９の装置。
【請求項２１】
複数のバイオフィルム付着部位の支持部が容器の蓋を形成している請求項２０の装置。
【請求項２２】
複数のバイオフィルム付着部位を横切って液状成長媒体を流す手段が傾斜したテーブルである請求項１８，１９あるいは２０の装置。
【請求項２３】
液体の流れ方向を繰り返し変更ながら複数のバイオフィルム付着部位の各々を横切って液状成長媒体を流しつつ、バイオフィルム形成微生物を培養し、各列に複数のバイオフィルム付着部位が設けられた複数の列に配置した複数のバイオフィルム付着部位上でバイオフィルムを形成し、それによって複数のバイオフィルム付着部位の各々の付着部位でバイオフィルムを作製するバイオフィルム成長方法。
【請求項２４】
複数のバイオフィルム付着部位に位置するバイオフィルムを検定してバイオフィルムの特徴を分析する工程をさらに含む請求項２３の方法。
【請求項２５】
液状成長媒体を流す工程が、容器の複数の均一な流路に沿って前後に液状成長媒体を流して各バイオフィルム付着部位において均一なバイオフィルムを形成する請求項２４の方法。
【請求項２６】
バイオフィルムの特徴が、抗菌試薬に対するバイオフィルムの感度であり、かつバイオフィルムを検定する前に抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程をさらに含む請求項２４の方法。
【請求項２７】
バイオフィルム付着部位を抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理した後で検定を行う前にバイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外す工程をさらに含む請求項２６の方法。
【請求項２８】
バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外した後に、さらにバイオフィルムを培養する工程をさらに含む請求項２７の方法。
【請求項２９】
バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外す工程は、各バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外してウエル板の個々のウエルに置く請求項２７の方法。
【請求項３０】
抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程は各列の複数のバイオフィルム付着部位を異なった抗菌試薬で処理することを含む請求項２９の方法。
【請求項３１】
一列の各バイオフィルム付着部位を異なった濃度の抗菌試薬で処理することをさらに含む請求項３０の方法。
【請求項３２】
バイオフィルム付着部位が蓋の複数の突起であり、バイオフィルムの培養工程が流路中の液状成長媒体に突起を吊り下げながら、容器を揺動させてバイオフィルムの成長中にバイオフィルムに均一の剪断力を付与する請求項２３の方法。
【請求項３３】
バイオフィルムを検定する工程が、バイオフィルムに活性染料を塗布して染色されたバイオフィルムによって発生した光の強度を自動的に測定することを含む請求項２４の方法。
【請求項３４】
バイオフィルムを作製するために、複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルム形成微生物を最初に培養した後、続いて複数の分離マイクロ反応器でバイオフィルム形成微生物を培養する工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項３５】
複数のバイオフィルム付着部位上にバイオフィルム形成微生物を培養する前に、さらに複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルム抵抗被覆を施す請求項２３の方法。
【請求項３６】
さらに異なったバイオフィルム付着部位に異なった被覆を施す請求項３５の方法。
【請求項３７】
さらに液状成長媒体中のホスト物質の存在下にバイオフィルム形成微生物を培養する請求項２３の方法。
【請求項３８】
異なったバイオフィルム付着部位を異なった複数の抗菌試薬で処理する請求項２６の方法。
【請求項３９】
液状成長媒体を流すための少なくとも複数の流路を有する容器と、複数の列に配列され流路中に複数のバイオフィルム付着部位を支持する支持部を備えた複数のバイオフィルム付着部位と、培養中に容器の内部が汚染されるのを防止する手段と、該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ流路内に支持されている複数のバイオフィルム付着部位を横切って液状成長媒体を流す手段とを有するバイオフィルム成長装置。
【請求項４０】
各流路が略同一の形状を有する請求項３９の装置。
【請求項４１】
各バイオフィルム付着部位が略同一の形状を有する請求項４０の装置。
【請求項４２】
複数のバイオフィルム付着部位が容器の蓋を形成している請求項４１の装置。
【請求項４３】
複数のバイオフィルム付着部位が蓋から出た突起である請求項４２の装置。
【請求項４４】
複数のバイオフィルム付着部位を横切って液状成長媒体を流す手段が傾斜したテーブルである請求項４１の装置。
【請求項４５】
液状成長媒体は、複数の溝部を流れる請求項１の方法。
【請求項４６】
各バイオフィルムは等価である請求項１の方法。
【請求項４７】
１あるいはそれ以上のバイオフィルムのバクテリアが残りのバイオフィルムのバクテリアと異なる請求項１の方法。
【請求項４８】
各バイオフィルム付着部位上のバイオフィルムのバクテリアが異なる請求項４７の方法。
【請求項４９】
バイオフィルム付着部位は複数の溝部に延びる突出部である請求項４５の方法。
【請求項５０】
液状成長媒体を収納する複数の溝部を有する容器と、容器のカバーを形成しかつ複数の溝部内に収納されるように配置されるバイオフィルム付着部位を形成する複数の突出部とを有するプレートと、該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ流路内に支持されている複数のバイオフィルム付着部位を横切って液状成長媒体を流す手段からなるバイオフィルム製造装置。
【請求項５１】
さらに、液状成長媒体を溝部内に流す容器用可動支持部材を有する請求項５０に記載のバイオフィルム製造装置。
【請求項５２】
複数の溝部が、複数のチャネルである請求項５０のバイオフィルム製造装置。
【請求項５３】
前記突出部が、複数の列及び複数の線上に配置されている請求項５０のバイオフィルム製造装置。
【請求項５４】
複数の溝部が、略同一の形状を有する請求項５０のバイオフィルム製造装置。
【請求項５５】
プレートが、汚染物質を透過させない請求項５０のバイオフィルム製造装置。
【請求項５６】
プレートが、プレートから除去する前及び後において突出部が汚染物質を透過させない請求項５５のバイオフィルム製造装置。
【請求項５７】
さらに、複数のピンに被膜を有する請求項５０のバイオフィルム製造装置。
【請求項５８】
被膜によってバイオフィルムの成長を阻止あるいは促進する請求項５７に記載のバイオフイルム製造装置。
【請求項５９】
複数の溝部を有する容器と複数の突出するバイオフィルム付着部位を有する容器用カバーを用意し、容器の溝部に流動液状成長媒体を入れ、液状成長媒体を該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつバイオフィルム接着部材を横切って流しつつバクテリアをバイオフィルム付着部位上で培養して、各バイオフィルム付着部位上にバイオフィルムを形成する複数のバイオフィルムを製造する方法。
【請求項６０】
容器を可動支持面に置くことによって液状成長媒体を流す請求項５９に記載のバイオフィルム製造方法。
【請求項６１】
さらに、バイオフィルム付着部位からバイオフィルムをはがす工程を含む請求項５９のバイオフィルム製造方法。
【請求項６２】
突出バイオフィム付着部位が、溝部中の液状成長媒体に懸濁させたピンである請求項５９のバイオフィルム製造方法。
【請求項６３】
液状成長媒体を該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ複数のバイオフィルム付着部位を横断して流しながら該複数のバイオフィルム付着部位に複数のバイオフィルムを形成し、複数のバイオフィルムを少なくとも一つの抗バクテリア剤と接触させ、該抗バクテリア剤に対するバイオフィルムの反応性を検定する抗バクテリア剤のスクリーニング方法。
【請求項６４】
複数の突出するバイオフィルム付着部位を有するカバーを有する容器を用意する工程と、容器の溝部に流動液状成長媒体を入れる工程と、液状成長媒体をバイオフィルム接着部材を横切って流しつつバクテリアをバイオフィルム付着部位上で培養する工程とを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
さらに、検定する前にバイオフィルム付着部位からバイオフィルムをはがす工程を含む請求項６３の方法。
【請求項６６】
検定工程をバイオフィルム付着部位上のバイオフィルムに対して行う請求項６３の方法。
【請求項６７】
複数の同一のバイオフィルムが形成され、少なくとも一つの該バイオフィルムをその他のバイオフィルムの場合と異なった抗微生物剤あるいは異なった濃度の抗微生物剤と接触させる請求項６３の方法。
【請求項６８】
各該バイオフィルムを異なった抗微生物剤あるいは異なった濃度の抗微生物剤と接触させる請求項６７の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、バイオフィルムを培養・分析し、また抗菌試薬に対するバイオフィルムの感度を分析するための方法及び装置に関する。
発明の背景
近年バクテリアの成長特性が広範に研究され、バクテリアは表面に付着する複合層を形成することが分かった。これらの複合形態のバクテリアは、バイオフィルムあるいは定着バクテリアとして知られている。バイオフィルムは、人体及び動物の体、食物処理、健康管理施設、金属加工ショップ、酪農及び他の産業等を含めて種々の領域において問題を起こす可能性がある。
バイオフィルム形態でのバクテリアは、浮遊状態のバクテリアよりも抗菌試薬に対して抵抗力があることが広く知られている。バクテリアが存在するかどうかの試験及びバクテリアに対する抗生物質の効能についての試験には、伝統的に浮遊状態のバクテリアの試験も含まれていた。従って、抗菌試薬のバクテリア阻止濃度が低く見積もり、バクテリアを処理するために間違った抗菌試薬あるいは誤った両で抗菌試薬を用いることを阻止することも可能である。
バイオフィルムの蓄積をモニターする装置の一つの形式が、カナダ・ジャーナル・オブ・マイクロバオロジー（１９８１）２７巻９１０−９１７頁に記載されている。同文献においてマッコイ等（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ）はリサイクル回路中の水が流れることが可能なチューブを備えたいわゆるロビンス装置を用いることを記載している。該チューブは、その壁に複数のポートを有し、各ポートには生物学的汚染可能な表面を有しかつチューブに対し固定した状態でポート中に保持可能となっている突起を備えており、該生物学的汚損可能な表面がチューブの内表面の一部を形成している。突起は所望時間が経過後にポートから取り外され微生物の成長について表面を顕微鏡検査することによって分析することができ、あるいは微生物を表面から取り除き、その後成長度合いを評価することによって試験表面を分析することもできる。例えば、物理的あるいは化学的手段、例えばバクテリア性ＡＴＰを検出することによって、あるいはさらに微生物を培養して生成物を分析することによって微生物の数を評価することもできる。
米国特許Ｎｏ．５，３４９，８７４に記載されている別の装置では、通路中あるいは第一の通路と平行となっている第二の通路中に複数の除去可能な突起を設けることにより水通路中でバイオフィルムが成長しているかどうかを決定している。スタッド上のバイオフィルムを分析するためにスタッドを取り除くことが可能となっている。ロビンス装置のような装置や単一の通路に除去可能なスタッドを用いている他の装置も比較的長い処理時間となり、いくつかの異なった抗菌試薬を試験する場合に速いリスポンス時間を与えるものではない。
三宅等の「付着性バクテリアを殺すために必要とされる抗生物質の濃度を測定する簡便な方法」、化学治療１９９２年３８巻２８６−２９０頁に記載されている別の装置では、９６個のウエルのプラスチック製細胞培養プレートの底に付着させた黄色ブドウ球菌細胞を順次希釈した得た抗生物質溶液で処理した後、さらに２４時間培養させた後に細胞の活性をブドウ球菌細胞の成長によって評価した。この方法では、定着性バクテリア転移増殖が不均一でかつ浮遊状態のバクテリアが沈着するという欠点がある。
本特許明細書に記載の装置によって、効率的かつ自動的にバイオフィルムを殺して検定することが可能となり、この検定は多くの診断検定システムに共通の９６個ウエル型プラットフォームとの特定の用途を有する。
発明の概要
従って、本発明の第一の視点によれば、液状成長媒体を該液体の流れ方向を繰り返し変更しつつ複数のバイオフィルム付着部位を横断して流しながら該複数のバイオフィルム付着部位上でバイオフィルム形成微生物を培養することによって該複数のバイオフィルム付着部位にバイオフィルムを作製するためのバイオフィルムの成長方法を提供するものである。
本発明の別の視点では、複数のバイオフィルム付着部位の各々を横切って液状成長媒体を流しつつ、バイオフィルム形成微生物を培養し各列に複数のバイオフィルム付着部位が設けられた複数の列に配置した複数のバイオフィルム付着部位上でバイオフィルムを形成する。
本発明のさらに別の視点では、得られたバイオフィルムの特徴を検定する。
本発明のさらに別の視点では、バイオフィルムの該特徴が、抗菌試薬に対するバイオフィルムの感度であり、かつ該方法はバイオフィルムを検定する前に抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程をさらに含む。
本発明のさらに別の視点では、バイオフィルム付着部位を抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理した後でバイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外した後さらにバイオフィルムを培養する工程も含む。バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外す工程は、各バイオフィルム付着部位からバイオフィルムを取り外してウエル板の分離ウエルに置くようにすることもできる。
バイオフィルム付着部位が複数列で設けられている場合には、抗菌試薬によってバイオフィルム付着部位を処理する工程は各列のバイオフィルム付着部位を異なった抗菌試薬で処理し、かつ一列の各バイオフィルム付着部位を異なった濃度の抗菌試薬で処理することもできる。
本発明の方法のさらに別の視点では、単一の抗菌試薬の種々の変性の効能を試験する場合に用いられるような複数の抗菌試薬を異なって組み合わせたもの等の複数の異なった抗菌試薬によって異なるバイオフィルム付着部位を処理する。
液状成長媒体の流れ方向を繰り返し反転させることが好ましい。本発明のこの視点では、液状成長媒体を容器の複数の流路に流すことができ、容器を揺動させることによって液状成長媒体の流れ方向を反転させる。
本発明の別の視点では、バイオフィルム付着部位は蓋から突出した複数の突起とし、バイオフィルムの培養工程が複数の流路中の液状成長媒体に突起を吊り下げると共に、バイオフィルムの成長中に容器を揺動させてバイオフィルムに剪断力を付与することを含む。
本発明の別の視点では、液状成長媒体を流すための少なくとも一つの流路を有する容器を有するバイオフィルム分析装置が提供される。複数のバイオフィルム付着部位が少なくとも一列に配置され、該付着部位は流路内に複数のバイオフィルム付着部位を支持するための支持部を備えている。
本発明の装置の別の視点では、複数のバイオフィルム付着部位を横切って、好ましくは異なる方向に、各流路に沿って液状成長媒体を流す手段が設けられている。
本発明の装置のさらに別の視点では、容器内部の汚染を防止する手段が設けられている。
複数のバイオフィルム付着部位が複数の列に形成され、各列には複数のバイオフィルム付着部位があり、容器には複数の流路が設けられ、各流路は各列の複数のバイオフィルム付着部位に対して設けられていることが好ましい。
本発明のさらに別の視点では、複数のバイオフィルム付着部位の支持部が容器の蓋を形成している。
本発明のさらに別の視点では、複数のバイオフィルム付着部位を横切って液体成長媒体を流す手段が傾斜したテーブルである。
本発明のこれらの視点及び別の視点は、以下の記載及び請求の範囲の記載において明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
ここに、例として図面を参照して本発明の好ましい実施態様を記述するが、同様の番号は同様の部材を表す。
図１は、容器の蓋にもうけた複数のバイオフィルム付着部位の底面図である。
図２は、図１の複数のバイオフィルム付着部位を収納する容器の上面図である。
図３は図１と図２の蓋と容器の一部切断除去した側面図である。
図４は、傾斜テーブル上の図３に示すような蓋と容器との組み合わせを図示する側面図である。
図５は、本発明で用いる９６個のウエルを有するプレートの上面図である。
図６は、中空突起を如何にして封止することができるかを示す本発明に用いる中空突起の側面図である。
好ましい実施態様／本発明を実施するための最善の態様の説明
図１，図２あるいは図３に最も特定して示されるように、バイオフィルム検定装置はＥＬＩＳＡ等級プラスチック材料あるいは他の適当な材料（例えば、ステンレス・スチール、チタン）からなるバイオフィルム蓋１０と、蓋１０から出た突起１２とからなる。突起１２は、少なくとも８つの列１４とし各列は少なくとも１２個の突起に形成するのが好ましい。他の数の列あるいは一列当たり他の個数の突起を用いることもできるが、上記のものは生物医薬的装置で通常用いられている９６個のウエル型プレートと合致するので便利な個数である。図示するようなさらに多い突起を用いて培養後の当初のバイオフィルムの濃度を決定することもできる。例示する突起１２は、約１．５ｃｍの長さで２ｍｍ幅である。
さらに、バイオフィルム検定装置は、成形凸部２６によって複数の流路（溝部）２４に分割した液体保持溜め部２２を備えた容器２０を有する。流路２４は突起１２を収納するのに十分な幅となっている。いずれの列１４の各突起１２に対して一つの流路２４が存在させるべきである。蓋１０は、流路２４内にバイオフィルム付着部位を支持するための突起支持部を形成している。蓋１０は容器の周辺壁２９上に緊密に嵌合する周辺口部１６を備えており、培養中に容器の内部が汚染されるのを防止している。
既存の装置を用いて本発明を実施する場合には、本発明に用いるために該装置に変更を加えるべきである。突起を取り外可能な細片に取り付けるファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）システムの場合には、細片は、例えば、細片上に配置したプラスチックシートを用いて封止すべきである。ファルコンシステムの場合、全体の容器を横切って延びる溝状バリアーもある。これによって一つの流路が分離される。ファルコン装置が用いられる場合には、一つの凸部２６のように除去するか変更して終了させるべきである。
中空の突起を用いるＮＵＮＣシステムを用いる場合には、例えば図６に示すように、同様にシートを用いて突起を被覆すべきである。即ち、図６に示すように、突起１２ａをシート１３で被覆し、容器内部の汚染を防止している。また、ＮＵＮＣ装置では、例えば、内部のバリアーを上昇さセル個とによって蓋を封止することにより、蓋を容器に連結する方法に変更を加えて容器内部の汚染を防止することが必要となる。
バイオフィルム培養容器２０は、バイオフィルム成長に対して二つの重要な機能を有する。第一に、バイオフィルム蓋１０の突起１２にバイオフィルムを形成する微生物を含有する液状成長媒体のための溜め部として機能する。第二の機能は、複数の突起に渡って剪断力を発生し、それによって突起上に最適なバイオフィルムが生成するのを可能とする。バイオフィルム形成微生物は、例えば、バクテリア、イースト、糸状菌類等の菌類とすることができる。
図４に示すように、蓋１０をした容器２０を傾斜テーブル３０上で揺動させることによって突起１２上に剪断力を発生させる。突起は、吊り下げられた状態で流路２４中に着座しているので、突起１２の先端は流路２４内を流れる液状成長媒体に浸漬させることができる。凸部２６は、突起１２を横切り通過させて流路２４に沿って液状成長媒体を流す。容器１０を揺動させることによって流れ方向を繰り返し変更させる。本例の場合には、突起１０を横切って液状成長媒体の流れを繰り返し反転させ、それによって蓋１０の各々の突起１２上にバイオフィルムを等しい割合で確実に形成するのを助ける。液状成長媒体を一方向のみに流すことによってバイオフィルムを成長させることも可能である一方、いくつかの流路に吊り下げた複数の突起１２のアレイを用いることは配置・組立上は困難となる。その理由は、その場合には、方法によっては、各流路の一端部から他端部へ流体を還流することが必要となる場合があるからである。容器を揺動して液体を流路に沿って前方・後方に流すことにより、乱流が自然に生ずる状況と同様に良好なバイオフィルム成長環境が得られる。
各突起１２及び各流路２４は略同一の形状（製造許容誤差内）を有するべきであり、それによってバイオフィルム形成中に突起を横切る剪断流れを確実に均一とすることができる。さらに、均一な流路２４を全て連結して同一の栄養素及び混合物を分配する溜め部２２を充填する。同一バイオフィルム形成液の分配及び流路の形状を各流路に対して同一とすることによって、抗菌試薬を試験する目的上で同等な複数のバイオフィルムを各突起に生成させる。このようにして、突起の位置の違いを考慮することなく、異なった抗生物質を異なった濃度で互いに比較することが可能となる。このようにして製造したバイオフィルムは、均一であると考えられる。プレート上の任意の突起に関してＰ＜０．０５の範囲で結果が得られた。
バイオフィルム付着部位を抗菌試薬によって処理することにより、本特許明細書で集合的に「抗菌試薬」として言及する抗生物質あるいは殺菌剤に対するバイオフィルムの感度を測定し、バイオフィルムを検定する。これは、培養容器１２内にバクテリア性バイオフィルムを転移増殖させた蓋１０を図５に図示するような従来の９６個のウエル型のプレート４０に設置することによって達成することができる。抗生物質あるいは殺菌剤希釈液を含む成長媒体を懸濁させたウエル４２の数は突起１２の数によって決定される。蓋１０とプレート４０とを嵌合させて、プレート外部からのバクテリアによる汚染を防止することができる。容器の同一の流路２４で培養した突起１２はそれぞれ異なった抗菌試薬で処理すべきである。このようにして、いずれの流路の成長状況も流路全体に沿って、従って該流路に吊り下げられた各突起１２に対して非常に類似したものとなるであろうから、一致した結果が得られるであろう。これによって、異なった抗菌試薬によって異なった突起１２を処理する場合の信頼性が改良されるに役立つ。
さらに、抗菌試薬による処理後にバイオフィルムを培養する工程では、培養中に９６個ウエル型のプレート４０が汚染されるのを防止しかつカバーしたプレートが標準のＥＬＩＳＡプレート・リーダで利用できるようにするために、９６個ウエル型プレート４０を非常に高さの低い形状とするために標準の９６個のウエル型のプレート４０と同じプラスチックで形成した従来のカバー（図示せず）が必要となる。各検定について、伝統的な最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小バイオフィルム除去濃度（ＭＢＥＣ）を得るために２個の９６ウエル型プレート４０とプレートカバーが必要となるであろう。
手  順
各生物について、バイオフィルム成長カーブを決定して抗生物質／殺菌剤に対する感度を確認すべきである。
一日目−選択したバクテリアを適当な成長媒体中で培養し最適な酸素圧力の下で適当な培養温度で一晩攪拌する。成長媒体はトリプシン消化性の大豆肉汁（ＴＳＢ）とすることができる。温度は、本特許明細書で記載する各培養においては３７℃とすることができる。
二日目−バイオフィルム検定装置システムの容器２０を新しい成長媒体（例えばＴＳＢ）に懸濁した２％一夜培地２０ｍｌで充填して、突起で覆った蓋１０でカバーし、の培養器中でセット３ｄ揺動プラットフォーム（ベルコ揺動プラットフォーム）上で培養する。成長カーブの時間２で開始して７時間継続し１時間当たり二個の突起を無菌的に除去する。各突起を無菌燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に軽く浸漬して洗浄し、その後１ｍｌの無菌燐酸塩緩衝食塩水１ｍｌ中に配置し２１ｋｃでドアール（ＤｏＡＬＬ）超音波クリーナを用いて５分間音波処理をしてバイオフィルムを取り外す。音波処理物を燐酸塩緩衝食塩水で順次希釈し（１０-1から１０-６）、バイオフィルム数値を決定するため滴板した。
三日目−プレートを数えて転移増殖率を決定し、一突起当たりの〜１０5集落形成単位（ｃｆｕ）のバイオフィルムを得るのに必要な培養時間を計算する。該バイオフィルムは、抗生物質／殺菌剤による殺戮を測定するための最適バイオフィルムの厚さである。
ＭＢＥＣ検定
一日目−バクテリアを成長媒体（例えばＴＳＢ）で培養し、例えば３７℃で震動させながら一夜成長させる。
二日目−（１）新しい成長媒体（例えばＴＳＢ）で希釈した２％一夜培地２０ｍｌをバイオフィルム検定装置システムの容器２０中に入れ、バイオフィルム１０でカバーし、例えば３７℃で〜１０5ｃｆｕ／突起１２に達するに必要な時間揺動プラットフォーム３０上で培養する。傾斜テーブル３０を揺動することによって液状成長媒体の流れ方向を変化させ、それによってバイオフィルムの成長が増長する。
（２）バイオフィルムを培養する一方、無菌フードで製造者の指示に従って無菌二回蒸留水（ｄｄｗ）で５ｍｇ／ｍｌの抗生物質ストック溶液あるいは抗菌剤を準備し、９６個のウエル型プレート中で成長媒体による抗生物質／殺菌剤希釈液を準備する。各抗菌試薬に対して、一列（Ａ−Ｈ）を用いて８種類迄の異なった抗生物質あるいは殺菌剤を試験することができる。プレートは、以下のように用意する。
列Ａ−Ｈは、各々特定の抗生物質／殺菌剤を含む。各列のウエルは以下の異なった濃度の抗菌試薬によってセットする。
ウエル＃１  ＴＳＢ、抗生物質無し
ウエル＃２  ＴＳＢプラス１ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃３  ＴＳＢプラス２-2ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃４  ＴＳＢプラス２-3ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃５  ＴＳＢプラス２-4ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃６  ＴＳＢプラス２-5ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃７  ＴＳＢプラス２-6ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃８  ＴＳＢプラス２-7ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃９  ＴＳＢプラス２-8ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃１０ＴＳＢプラス２-9ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃１１  ＴＳＢプラス２-10ｍｇ／ｍｌ抗生物質
ウエル＃１２  ＴＳＢプラス２-11ｍｇ／ｍｌ抗生物質
（３）培養期間後、（抗生物質検定で使用されない蓋１０の領域、即ち、使用しない列から）二個の突起１２を折り取り、ＰＢＳで洗浄し、超音波処理をし、希釈しプレート上でスポット化し、当初のバイオフィルムの濃度を決定する（成長曲線上で行うように正確に）。溝付容器２０を用いてＰＢＳ中で残余の突起を洗浄し、移植増殖した突起を９６個のウエル型の抗生物質プレートに設置して３７℃で一夜培養する。
三日目−培養・処理したバイオフィルムを検定するために使用する技術によっては、バイオフィルムを取り外すことなくその場所で検定することもできる。あるいは突起から取り外して検定することもでき、あるいは取り外して、さらに培養しその後で検定することもできる。以下の工程は、バイオフィルムを取り外して、培養し、検定する例を示す。
（１）無菌フードで、バイオフィルムの蓋１０を９６個のウエル型の抗生物質プレートから取り外し（プレートを捨てるべからず）、無菌ＰＢＳを含む９６個のウエルプレート中で突起を洗浄し、蓋１０を新鮮なＴＳＢ（０．２５ｍｌ／ウエル）含む新しい９６個のウエル型のプレートに配置してバイオフィルムの蓋１０全体を超音波処理し、生存するバイオフィルムバクテリアを除去し、各突起からのバイオフィルムを９６個ウエル型のプレートの個々のウエルに移す。さらに、フード中でバイオフィルムの蓋１０を取り外し平らなカバーで置きかえる。
（２）浮遊状態の残存物を表示すべく４９０ｎｍでの抗生物質プレートを読むか、あるいは当該技術で知られている浮遊状態の残存性を検定するための他の方法を用いる。
（３）新たに超音波処理したプレートの各ウエルから０．０２ｍｌの媒体を取り出し、きれいに滴板し、各ウエルから０．０２５ｍｌ取り出して連続した希釈液（１０-1から１０-6）を用意し、０．０２ｍｌ滴板する（マイクロプレートで希釈を行うことができる。各抗生物質に対して一つの希釈液）。残余の媒体及びバクテリアを含むプレートを設置して一夜３７℃で培養する。
四日目−例えば４９０ｎｍで一晩培養したプレートを読み取ることによって、あるいはプレート上の集落を数えて残存するバクテリアの実際の数を決定することによって、あるいは当該技術で知られている他の方法を用いることによって定着残存物を検定する。
バクテリアを計数するためにいくつかの異なった従来の方法を用いることができる。超音波処理したバクテリアを培養し、順次希釈液を取り実際に集落形成ユニットを計数することによって行うこともできる。あるいは例えば光学的密度を決定するために光学リーダを用いる自動化した方法を採用することもできる。しかしながら、濁度の光学リーダは実用上不正確過ぎるので、バイオフィルムを活性化染料で処理し染色されたバイオフィルムから放たれる光の強度を測定することを通して活性化染料技術を適用し生存能の測定を自動化することが好ましい。活性化染料技術を使用する場合には、バイオフィルムをさらに培養する必要はない。さらに別の実施態様では、細胞が溶解してＡＴＰを放つまで細胞に対し超音波処理をしルシフェラーゼを加えて機械的に読み取り可能な光の出力を得ることによって検定を行うこともできる。さらに別の実施態様では、自動化することは困難であると考えられるが、共焦点の顕微鏡を用いて突起状のバイオフィルムに対し直接検定を行うこともできる。以下の実施例では、順次希釈した後人力で計数して結果を得ている。実施例は、同一の成長状況に対して浮遊状態のバクテリアの計数と定着性バクテリアの計数との間を比較するものである。
実施例１
表１は、容器２０を揺動させながら（表皮ブドウ球菌バイオフィルムを流路２４中で突起１２上に培養し、その後二倍希釈で抗生物質Ａ（アンセフ、セファゾリン）、Ｂ（オルベニン（Ｏｒｂｅｎｉｎ）−２０００、クロキサシリン）、Ｃ（プリマクシン、イミペネム及びシラスタティン（ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ）、Ｄ（バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、Ｅ（ダラシン（Ｄａｌａｃｉｎ）、クリンダマイシン及びＦ（タザジン（Ｔａｚａｄｉｎｅ）、セフタジジン（Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ））で処理した結果を示す。抗生物質を以下のように９６個のウエル型のプレートの列Ａ−Ｆのウエル２−１２に適用した。ウエル２：抗生物質なし、ウエル３：１０００μｇ／ｍＬ，ウエル４：５００μｇ／ｍＬ、・・・ウエル１２：２μｇ／ｍＬ。結果を人力で読み取りによってｃｆｕ／突起の項目で結果を表示してある。
0003886152.tif 000002
表２は、表１のサンプルと同様の処理によって同一の表皮ブドウ球菌のバイオフィルムの光学密度の読みを与えるもので、人力で計数したｃｆｕと自動化した読みとの間の比較を示す。
0003886152.tif 000003
表３は、表１に示す結果に対すると同一の条件で培養し抗菌試薬によって処理をした場合の表皮ブドウ球菌の浮遊状態のバクテリアの濁度の光学的密度の読みを示す。この表は、同一の条件で培養・処理を行った定着バクテリアを検定した場合に比較して浮遊状態のバクテリアを検定する場合には多くの場合にいかにより低い計数を与えるのかを明瞭に示す。
0003886152.tif 000004
実施例２
表３は、容器２０を揺動させながら黄色ブドウ球菌バイオフィルムを流路２４中で突起１２上で培養し、その後二倍希釈で抗生物質Ａ（アンセフ、セファゾリン）、Ｂ（オルベニン（Ｏｒｂｅｎｉｎ）−２０００、クロキサシリン）、Ｃ（プリマクシン、イミペネム）及びシラスタティン（ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ）、Ｄ（バンコミシン）、Ｅ（ダラシン（Ｄａｌａｃｉｎ）、クリンダマイシン）及びＦ（タザジン（Ｔａｚａｄｉｎｅ）、セファタジン（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ））で処理した結果を示す。抗生物質を以下のように９６個のウエル型のプレートの列Ａ−Ｆのウエル２−１２に適用した。ウエル２：抗生物質なし、ウエル３：１０００μｇ／ｍＬ，ウエル４：５００μｇ／ｍＬ、・・・ウエル１２：２μｇ／ｍＬ。
0003886152.tif 000005
表５は、表４のサンプルと同様の処理によって同一の黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの光学密度の読みを与えるもので、人力で計数したｃｆｕと自動化した読みとの間の比較を示す。
0003886152.tif 000006
表５は、表４に示す結果に対すると同一の条件で培養し抗菌試薬によって処理をした黄色ブドウ球菌の浮遊状態のバクテリアの濁度の光学的密度の読みを示す。この表は、同一の条件で培養・処理を行った定着バクテリアを検定した場合に比較して浮遊状態のバクテリアを検定する場合には多くの場合にいかにより低い計数を与えるのかを明瞭に示す。
0003886152.tif 000007
実施例３
表７は、容器２０を揺動させながら大腸菌のバイオフィルムを流路２４中で突起１２上で培養し、その後二倍希釈で抗生物質Ａ（チカルシリン  シグマ  Ｔ−５６３９、）、Ｂ（カルベニシリン  シグマ  Ｃ−１３８９）、Ｃ（トブラマイシン  シグマ  Ｔ−４０１４）、Ｄ（ゲンタマイシン硫酸塩、シグマ  Ｇ−３６３２）、Ｅ（アンピシリン  シグマ  Ａ−９５１８）、Ｆ（タザジン（Ｔａｚａｄｉｎｅ）、セファタジン（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ））、Ｇ（プリマクシン、イミペネム）及びシァスタティン（ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ））及びＨ（シプロフロキサシン）で処理した結果を示す。大腸菌は、２％の摂取物において培養を開始し新鮮なＴＳＢ中一晩生育した。２０ｍｌを容器２０の主要な溜め部（流路２−１２）に入れて、１．５ｍｌを流路１にいれ第一列の突起上に最初の移植増殖のサンプル化を図った。最初のバイオフィルムは４時間転移増殖した。抗生物質を以下のように９６個のウエル型のプレートの列Ａ−Ｆのウエル２−１２に適用した。ウエル２：抗生物質なし、ウエル３：１０００μｇ／ｍＬ，ウエル４：５００μｇ／ｍＬ、・・・ウエル１２：２μｇ／ｍＬ。２５０μＬ体積の最終の希釈抗生物質をウエルに適用した。
0003886152.tif 000008
表８は、表７のサンプルと同様の処理によって同一の大腸菌のバイオフィルムの光学密度の読みを与えるもので、人力で計数したｃｆｕと自動化した読みとの間の比較を示す。
0003886152.tif 000009
表９は、表７に示す結果に対すると同一の条件で培養し抗菌試薬によって処理をした大腸菌の浮遊状態のバクテリアの濁度の光学的密度の読みを示す。この表は、同一の条件で培養・処理を行った定着バクテリアを検定した場合に比較して浮遊状態のバクテリアを検定する場合には多くの場合にいかにより低い計数を与えるのかを明瞭に示す。
0003886152.tif 000010
バクテリアの生存がゼロとなる抗菌試薬の濃度（ＭＢＥＣ）は上記検定から用意に評価できる。同様に、ＭＩＣも上記検定から決定できる。
本発明者は、ある場合にバイオフィルムにホスト成分を加えない場合にはバイオフィルムが形成されないことを発見した。従って、バイオフィルムを形成するためにバクテリアあるいはバイオフィルム形成生物の培養中に容器の中の成長媒体にホスト成分を加えることができる。加えることのできるホスト成分にはホスト生物からの血清たんぱく質あるいは細胞が含まれる。異なったホスト細胞及び成分の効果を試験するために、流路２４の端部２５を壁で封止して一つの流路の成長媒体が他の流路に流れるのを防止することもでき、それによって各流路におけるバイオフィルムの成長を他の流路との成長とから分離することができる。
また、上述した装置は、バイオフィルムの成長を阻止するために用いる皮膜を試験するために用いることもできるし、またバイオフィルムの形成を昂進することが可能な皮膜をテストすることにも用いることができる。最初の工程で、突起１２を試験する被膜で被覆して、その後で突起上にバイオオフィルムを成長させることもできる。その後、バイオフィルムを検定し、あるいは抗菌試薬で処理した後検定することもできる。検定はその場所で行っても良いし、あるいはバイオフィルムを取り外して行うこともできる。異なった被膜を突起の異なった列について試験することもできる。異なった部位で成長条件を変更してバイオ発酵するために大量の活性バイオフィルムを作製するためにバイオフィルムの形成を昂進する方法を用いることもできる。この場合には、所望により、発酵生成物を検定する場合を除いて、検定工程は必要ではなく、例えばマイクロ反応容器としての９６個のウエル型のプレートのウエルにバイオフィルムを培養する。一般に、複数の部位で迅速かつ均一にバイオフィルムを成長することを希望するのであればいつでも、開示したバイオフィルム培養システムを用いることができる。
好ましい方法は液状成長媒体の流れを反転することであるが、各流路の一端部から同一の流路の他端部に流体を還流することによって液体を一方向に流すことも可能である。
本発明の方法は、効能について効果のありそうな抗菌剤候補を篩い分けることにも用いることができる。バイオフィルムの培養後に各バイオフィルム付着部位を異なった抗菌試薬で処理してもよく、あるいは複数の抗菌試薬を組み合わせた試薬で処理してもよい。例えば、異なった複数の試薬としては、抗生物質を組替え開発中に製造されるような単一の試薬の複数の変種の組み合わせとすることもできる。３４０個のピンを有するプレートでは、抗生物質の３４０種類の異なった組み合わせを試験することができる。
当業者であれば以下の請求の範囲で包含されるべく意図している本発明の本質から逸脱することなく本特許明細書に記載されている発明に実質的でない変更を加えることができるであろう。
【図１】
0003886152.tif 000011
【図２】
0003886152.tif 000012
【図３】
0003886152.tif 000013
【図４】
0003886152.tif 000014
【図５】
0003886152.tif 000015
【図６】
0003886152.tif 000016