(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）であって、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｐａｒｉｓ， ＦｒａｎｃｅのＣＮＣＭに受託番号第Ｉ−１６１４号の下に寄託されたＮＤＶ Ｃ２株のウイルス。
【請求項２】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｐａｒｉｓ， ＦｒａｎｃｅのＣＮＣＭに受託番号第Ｉ−１６１４号の下に寄託されたＮＤＶ Ｃ２株のウイルスと、
医薬的に許容可能なキャリヤまたは稀釈剤とを含有する、家禽をニューカッスル病（ＮＤ）から防御するのに用いるワクチン。
【請求項３】
ウイルスが生きた状態で用いられることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
動物１匹当たり１０3.0〜１０8.0 ＥＩＤ50を含むことを特徴とする請求項２または３に記載のワクチン。
【請求項５】
家禽に感染する１種以上の他の病原体に由来するワクチンをも含有することを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載のワクチン
【請求項６】
他の病原体が伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス及びレオウイルスからなる群の中から選択されることを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載のウイルスを調製する方法であって、ａ．請求項１に記載のウイルスであるＮＤＶ Ｃ２株を、前記ＮＤＶの複製を支持することができる細胞又は孵化鶏卵に接種するステップ、ｂ．前記ＮＤＶを増殖させるステップ、及びｃ．前記ＮＤＶを回収するステップを含む方法。
【請求項８】
ＮＤに対する家禽の防御に用いるワクチンを製造する方法であって、
請求項７に記載の方法によって得られる回収されたＮＤＶを医薬的に許容可能なキャリヤまたは稀釈剤と組み合わせることを含む方法。
【請求項９】
家禽のＮＤを防除する方法であって、請求項２から６のいずれか１項に記載のワクチンを鳥に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、弱毒性（ｍｉｌｄ）ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株、及び該ＮＤＶ株を含有する、家禽をニューカッスル病から防御するのに用いるワクチンに係わる。
【０００２】
【従来の技術、及び発明が解決しようとする課題】
ニューカッスル病は広範な地理的分布を示す家禽のウイルス感染症であり、家禽産業に多大の経済的損失を招く。この疾患の病因物質はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）で、該ウイルスはパラミクソウイルス属のプロトタイプウイルスである。ニューカッスル病は、上記ウイルスの分離株及び株が異なるとそれによって疾患の重篤度が甚だしく変化するという複雑さを有する。通常、ニワトリが若いほど疾患は急性でかつ重篤である。感染は吸入または摂食によって生起し得、感染形態のウイルスは鳥から鳥へと伝播する。
【０００３】
上記ＮＤＶは幾つかの病原型、即ち強毒ＮＤＶ、中間毒ＮＤＶ及び弱毒ＮＤＶが同定されている。弱毒、中間毒及び強毒という術語はｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏとの両方で行なわれた実験室試験から派生したが、今ではニワトリに対する毒力が弱いウイルス、中位のウイルス、及び強いウイルスを指すのに普通に用いられている。神経向性強毒形態の疾患はＮＤＶの病原性の高い株によって誘発され、突然重篤な呼吸性徴候が現われた後神経性徴候が現われるという特徴を有する。ほとんどの場合、感染動物は助からない。内臓向性強毒ＮＤＶ株は病原性が高く、高い死亡率と胃腸管の重篤な病変とをもたらす。ＮＤＶの中間毒株は普通、十分に感受性である鳥では重篤な呼吸性疾患を誘発し、かつ成鳥において甚だしい産卵低下を招く。ＮＤウイルスの弱毒株は通常、特に十分に感受性である若齢鳥において呼吸性徴候を特徴とする軽度疾患を誘発する。
【０００４】
商業的家禽産業ではＮＤに起因する経済的損失を低減するべく、ニワトリにＮＤに対する予防接種を行なっている。弱毒株及び中間毒株に由来する生ワクチンが定常的に適用されており、その際中間毒ワクチンは二次接種にのみ適する。しかし、弱毒グループ内でも毒力はきわめて様々である。生ワクチンとして用いられるＮＤＶ株には、Ｖ４、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１、Ｆ、Ｌａ  Ｓｏｔａ（弱毒）、並びに株Ｈ、Ｍｕｋｔｅｓｗａｒ、Ｋｏｍａｒｏｖ及びＲｏａｋｉｎ（中間毒）が含まれる。生ＮＤワクチンの主な利点は、噴霧及び飲料水適用などの安価な大量適用技術で投与できることである。しかし、生ワクチンは、特に噴霧接種後に気道内で重大な予防接種反応（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を惹起しかねない。そのため、予防接種、特に一次接種にはきわめて弱毒性のウイルスを用いることが重要であるが、その結果として普通ワクチンの反復適用が必要となる。
【０００５】
不活化ワクチンは、通常比較的老いた鳥に注射によって投与する。大抵の場合、不活化ワクチンは水酸化アルミニウムなどのアジュバントキャリヤまたは油中水型エマルションと混合された死亡ウイルスを含有する。油性エマルションワクチンの製造に用いられるウイルスには、Ｕｌｓｔｅｒ  ２Ｃ、ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１、Ｌａ  Ｓｏｔａ、Ｒｏａｋｉｎ、及び様々な有毒ウイルスが含まれる（Ｄ．  Ｊ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ，  Ｃａｌｎｅｋ等編，  ９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ．４９６−５１９，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｍｅｓ，  Ｉｏｗａ，  １９９１）。
【０００６】
通常用いられる生きたＮＤＶ株のＨｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１及びＬａ  Ｓｏｔａは、穏やかなものではあるが呼吸性予防接種反応をなお惹起するので、接種動物において（呼吸性）予防接種反応を惹起せず、しかもニューカッスル病に対する強固な免疫を誘起する、更に弱毒性であるＮＤＶワクチン株が必要とされる。このような株は幾つか従来技術に開示されている。米国特許第５，２５０，２９８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｌａｗａｒｅ）にはＨｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１親株の、低温に適応する生きた温度感受性突然変異体が開示されており、この突然変異体はＣａＴｓと呼称される。米国特許第５，１４９，５３０号（Ｄｕｐｈａｒ  Ｉｎｔ．  Ｒｅｓ．  Ｂ．Ｖ．）には、Ｕｌｓｔｅｒ  ２Ｃ株に由来する株ＮＤＷが開示されている。更に米国特許第５，１８８，５０２号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）には、呼吸性疾患の徴候を示していないシチメンチョウの腸管から単離した、自然に弱毒化したＮＤＶ株が開示されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明はその一構成において、Ｃ２と呼称される新規なＮＤＶ株を提供し、この株は１９９５年７月２６日付でＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  ２５Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，  Ｐａｒｉｓ，  ＦｒａｎｃｅのＣＮＣＭに受託番号第Ｉ−１６１４号の下に寄託してある。本発明によるウイルス株は、既存のＮＤＶ（ワクチン）株とは異なり気道内でも、またその他の器官においても予防接種反応を惹起せず、しかも強固な免疫応答を誘起し得る。
【０００８】
実施例１に述べた実験によって、特許請求したＮＤＶ株と既存のＮＤＶワクチン株との相違点を、特許請求したＮＤＶ株の好ましい予防接種特性と共に詳述する。
【０００９】
本発明は別の構成において、上記新規なＮＤＶ  Ｃ２株のウイルスを医薬に許容可能なキャリヤまたは稀釈剤と共に含有する、家禽をＮＤから防御するのに用いるワクチンも提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ＮＤＶ  Ｃ２株のウイルスは生きたウイルスとして、または不活化したウイルスとしてワクチンに含有させ得る。
【００１１】
ＮＤＶ  Ｃ２株のウイルスは、寄託ウイルスに由来するウイルス、及び例えば孵化卵や細胞培養における連続継代（ｓｅｒｉａｌ  ｐａｓｓａｇｉｎｇ）により寄託ＮＤＶ  Ｃ２株から派生させた子孫ウイルスを含む。
【００１２】
本発明によるワクチンに含有させるべきＣ２株のＮＤＶウイルスは通常の方法で取得可能である。手短に言えば、感受性基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にＮＤＶＣ２ウイルスを接種し、これを前記ウイルスが所望の力価に複製されるまで増殖させ、その後ＮＤＶ含有物質を回収する。
【００１３】
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）やニワトリ腎細胞（ＣＫ）といった一次（鳥類）細胞培養、またはＶＥＲＯ細胞系や幼体ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞系といった哺乳動物細胞系を含めた、ＮＤウイルスの複製を支持し得るあらゆる基質が本発明に使用可能である。
【００１４】
好ましくは、ＮＤＶ  Ｃ２ウイルスは孵化鶏卵において増殖させる。
【００１５】
上記のようなＮＤウイルスをその上で増殖させる基質は特にＳＰＦ孵化卵である。孵化卵には、例えば少なくとも１０2.0  ＥＩＤ50を含むＮＤＶ含有尿膜腔液（ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｆｌｕｉｄ）を卵１個につき０．２ｍｌ接種し得る。
好ましくは、９〜１２日齢の孵化卵に約１０5.0  ＥＩＤ50を接種し、その後３７℃で２〜４日間インキュベートする。２〜４日後、ＮＤウイルス生成物を好ましくは尿膜腔液の収集によって回収する。その後、収集した液を２５００×ｇで１０分間遠心し、続いて上清をフィルター（１００μｍ）で濾過し得る。
【００１６】
生きたウイルスを含有する本発明によるワクチンは、懸濁液の形態でかまたは凍結乾燥状態で製造及び販売可能であり、該ワクチンのような組成物に通常用いられる、医薬に許容可能なキャリヤまたは稀釈剤をも含有する。キャリヤには、安定剤、防腐剤及び緩衝剤が含まれる。適当な安定剤は、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、デキストラン、グルタメートまたはグルコースなど）、タンパク質（粉乳血清、アルブミンまたはカゼインなど）、またはこれらの分解生成物である。適当な緩衝剤は、例えばアルカリ金属リン酸塩である。適当な防腐剤はチメロサール、メルチオラート及びゲンタマイシンである。稀釈剤には水、水性緩衝液（緩衝食塩水など）及びポリオール（グリセロールなど）が含まれる。
【００１７】
所望であれば、本発明による生ワクチンにアジュバントを含有させることも可能である。
【００１８】
本発明による生ワクチンは注射可能であるが、好ましくはＮＤ予防接種に通常用いられる安価な大量適用技術によって投与する。前記技術には飲料水接種及び噴霧接種が含まれる。本発明のワクチンウイルスはきわめて弱毒性であるので、ワクチンを噴霧投与することが特に推奨される。
【００１９】
飲料水経由の投与では通常動物に、ワクチン含有水を与える約２〜４時間前から水を与えずにおく。この投与法では、給水器に総ての鳥が平等に水を飲める十分なスペースが有ることが重要である。ワクチンは新鮮な飲料水中に、個々の鳥に十分な量を投与するべく算出した濃度で適用する。
【００２０】
飲料水中に少量の塩素、鉄、亜鉛または銅イオンが存在することによって生存ワクチンウイルスが激減するのを防止するべく、好ましくはワクチン含有水に脱脂乳（粉末）などの保護剤を添加する。
【００２１】
粗噴霧投与及びエアゾル投与を含む噴霧法では、生ＮＤウイルスワクチンを液体小粒子に封入して投与する。粗噴霧法の粒子は普通１０〜１００μｍの初期液滴寸法を有し、エアゾル投与法の液滴は普通１μｍ未満から５０μｍである。
【００２２】
（水道）水粒子の乾燥（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ）の結果として溶解塩の濃度が上昇することによる生きたワクチンウイルスの不活化を防止するべく、水性相に少量の脱脂乳、脱脂粉乳またはゼラチンといったタンパク質保護剤を添加し得る。
【００２３】
小粒子の発生には、市販の背負い噴霧機、孵化場噴霧機及びアトミスト（ａｔｏｍｉｓｔ）噴霧機などの通常の噴霧装置及びエアゾル発生機を用い得る。飲料水接種も通常の装置を用いて可能である。通常の噴霧／エアゾル接種及び飲料水接種についての詳細は、Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｓｔ  ｖｏｏｒ  Ｐｌｕｉｍｖｅｅ，  Ｄｏｏｒｎ，  オランダによって発行されたｖａｎ  Ｅｃｋ等の“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，”  ＶＩ−ＶＩＩ，  １９８８に見出され得る。
【００２４】
生ワクチンを投与する他の方法に、点眼投与及びくちばし浸漬（ｂｅａｋ  ｄｉｐｐｉｎｇ）投与などが有る。
【００２５】
本発明は更に別の構成において、Ｃ２株のＮＤウイルスを不活化形態で含有するワクチンも提供する。不活化ワクチンの主な利点は、長期間持続する感染防御抗体をきわめて高レベルに生成させ得ることである。
【００２６】
増殖ステップ後に回収したＮＤウイルスを不活化する目的は、ウイルスの再生産を排除することである。この目的は通常、化学的または物理的手段で達成可能である。化学的不活化は、ウイルスを例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミン、またはこれらの誘導体で処理することによって行ない得る。必要であれば、不活化化合物はあとで中和する。例えば、ホルムアルデヒドで不活化した物質はチオスルフェートまたはメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し得る。物理的不活化は好ましくは、ウイルスを紫外線、Ｘ線またはγ線といった高エネルギー放射線に曝露することによって実施可能である。所望であれば、ｐＨは処理後に約７の値に戻し得る。
【００２７】
不活化ＮＤウイルスを含有するワクチンは、例えば先に述べた医薬に許容可能なキャリヤまたは稀釈剤のうちで不活化ワクチンの製造に適するものを１種以上含有し得る。
【００２８】
好ましくは、本発明による不活化ワクチンはアジュバント活性を有する化合物を１種以上含有する。本発明による不活化ワクチンに含有させるのに適した化合物または組成物には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）やＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標）といった鉱油またはビタミンＥ酢酸エステルなどの植物油を主材とする水中油型または油中水型エマルション、及びサポニン類が含まれる。
【００２９】
本発明によるワクチンは活性成分として有効量のＮＤＶ  Ｃ２ウイルス、即ち予防接種を受けた鳥において有毒なＮＤウイルスの攻撃に対する免疫を誘起する量の免疫ＮＤＶ物質を含有する。本明細書中で「免疫」とは、予防接種を受けた鳥の集団において予防接種を受けていない鳥のグループよりはるかに高レベルの防御を誘起することと定義する。
【００３０】
典型的には、本発明による生ワクチンは動物１匹当たり１０3.0〜１０8.0  ５０％胚感染量、好ましくは１０5.0〜１０7.0  ＥＩＤ50の量で投与し得る。
【００３１】
不活化ワクチンは動物１匹当たり１０4.0〜１０9.0  ＥＩＤ50、好ましくは１０6.0〜１０8.0  ＥＩＤ50の抗原同等物を含有し得る。
【００３２】
不活化ワクチンは非経口的に、例えば筋肉内または皮下投与する。
【００３３】
本発明によるワクチンはニワトリに有効に用い得るが、シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びウズラ（ｐａｒｔｒｉｄｇｅｓ）など、他の家禽を本発明のワクチンで有効に予防接種することも可能である。ニワトリにはブロイラー、繁殖鶏及び産卵鶏が含まれる。
【００３４】
ＮＤＶ  Ｃ２ウイルスが弱毒性であるために、本発明によるワクチンは孵化直後、即ち１日齢から鳥に投与可能である。本発明のワクチンは一次予防接種用ワクチンとして用い得、所望であればその後同じかまたは異なるＮＤＶワクチンで１回以上の二次予防接種（ブースター予防接種）を行なう。重大な予防接種反応を惹起することなく所望レベルの防御を達成するためには本発明によるワクチンを、Ｃｌｏｎｅ  ３０（登録商標）、Ｌａ  Ｓｏｔａ、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１というように逐次より有毒なウイルスを段階的に用いることを含む予防接種プログラムにか、または弱毒性生ウイルスワクチンの投与に始まり、その後不活化ワクチンの投与を行なうプログラムに組み込むことが特に適当である。
【００３５】
一例として、ブロイラーは１日齢で予防接種し、その後１４〜２１日齢で二次免疫し得る。産卵鶏または繁殖鶏は１〜１０日齢で予防接種し、その後２６〜３８日齢及び１０〜１２週齢でブースター予防接種し得る。
【００３６】
本発明は、ＮＤＶ  Ｃ２株のウイルスに加えて、家禽に感染する他の病原体に由来する１種以上の免疫原を含有するワクチンも含有する複合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）も包含する。
【００３７】
好ましくは、上記複合ワクチンは伝染性気管支炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；  ＩＢＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ貧血物質（ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｅｍｉａａｇｅｎｔ；  ＣＡＡ）またはレオウイルスのワクチン株１種以上を付加的に含有する。
【００３８】
ＮＤ予防接種及びワクチン製造についてはあらゆる点に関する包括的な説明が、Ａｌｌａｎ等，  ＦＡＯ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．１０，  ＦＡＯ，  Ｒｏｍｅ，  １９７８；Ｇ．  Ｍ．  Ｃｒｏｓｓ，  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｄ．  Ｊ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ｅｄ．），  ｐｐ．３３３−３４６，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ．，  Ｂｏｓｔｏｎ，  １９８８；  及びＭｅｕｌｅｍａｎｓ，  上掲書，  Ｄ．  Ｊ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ｅｄ．），  ｐｐ．３１８−３３２，  １９８８に開示されている。
【００３９】
【実施例】
実施例１
ＮＤＶ  Ｃ２ワクチンの安全性
１．１．  弱毒ＮＤＶ株のＨｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１及びＣ２に対する呼吸性反応に関する比較を標準化した条件（Ｊ．  Ｈ．  Ｈ．  ｖａｎ  Ｅｃｋ等，  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０，  ｐｐ．４９７−５０７，  １９９１）下に、ワクチンをエアゾル適用し、その後有毒大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｂａｃｉｌｌｉ  （５０６株；  Ｏ７８０Ｋ８０）を気管内接種した後の体重増加、死亡率、及び大腸菌病（ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）に対する感受性に基づいて行なった。
【００４０】
実験方法
ＳＰＦ−ＷＬ雌鳥のＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１株に対する呼吸性反応をＮＤＶ  Ｃ２株に対する呼吸性反応と比較した。：
０日目：  雛の孵化：  ＳＰＦ−ＷＬ雛（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，  Ｂｏｘｍｅｅｒ）。実験では雌鳥のみを用いた。；
１日目：  鳥を個別に計量した。平均体重にさほど差の無い三つのグループを形成した。各グループは３０〜３４羽のニワトリから成った。非特異的死亡率に関して補正したグループの大きさを表１に示す。二つのニワトリグループを各一方のＮＤＶ株の標準化エアゾルに曝露し、一方第三のグループにはペプトンのエアゾルを与えた（プラシーボグループ）。エアゾルへの曝露の直後、３グループを類似の負圧アイソレーターに別々に収容した。；
８日目：  生存している鳥を個別に計量した。その後、総てのニワトリに有毒大腸菌を気管内接種した。；
１５日目：  再び全グループの生存雛を個別に計量し、剖検し、大腸菌病病変を配点評価した。
【００４１】
ニワトリを毎日検査し、死んだ雛は総て肉眼的に調べた。気道及び大腸菌病病変には特に注意した。大腸菌病病変は胸気嚢、心膜及び肝臓において評価した。
鳥１羽当たりの最高点は１２とした。１グループ当たりの平均病変点を計算した。
【００４２】
ワクチン接種反応指数（ｖａｃｃｉｎａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ；ＶＲＩ）は、予防接種に起因する体重損失に基づく。ＶＲＩは０〜１０である。１日目から８日目までをカバーするＶＲＩ（ＶＲＩ１）及び１日目から１５日目までをカバーするＶＲＩ（ＶＲＩ２）を計算した。ＶＲＩ１はワクチンの成長抑制及び死亡誘発潜在能（ｐｏｔｅｎｃｙ）を表わし、ＶＲＩ２はそのうえ大腸菌病に対する感受性を増大させる潜在能をも表わす。
【００４３】
結果
臨床検査
実験の最初の８日間、ペプトングループのニワトリは疾患の臨床徴候を示さず、ＮＤＶ  Ｃ２で予防接種したグループの鳥もまたそうであった。ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１ワクチンに曝露した鳥では、曝露から２〜３日間きわめて重大な呼吸性反応が観察された。総ての鳥が口を開いて呼吸し、その様子は首を伸ばしての喘ぎ（ｓｎａｐｐｉｎｇ  ａｔ  ｂｒｅａｔｈ）に変わった。
【００４４】
大腸菌接種から２日後、ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１で予防接種した生存鳥ではポンピング呼吸（ｐｕｍｐｉｎｇ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）が観察された。
ＮＤＶ  Ｃ２株に曝露したグループでは大腸菌接種後数羽の鳥のみが軽微な呼吸性徴候を示した。
【００４５】
死亡率、体重及び病変評点
特異的死亡率、体重及び病変評点を表１に示す。Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１株で予防接種したグループでは６３％の鳥がエアゾルへの曝露後最初の８日の間に死亡し、かつ残りの鳥の９１％が大腸菌の気管内接種後に死亡したが、ＮＤＶ  Ｃ２株接種グループ及びペプトングループに死亡した鳥はいなかった。
【００４６】
ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１ワクチン株で予防接種したグループでは、８日齢と１５日齢との両方における体重、並びに平均病変評点、及び大腸菌病病変を有するニワトリのパーセンテージに対する負の影響が観察されたが、ただし１５日齢において測定できたのは１羽の生存ニワトリの値のみであった。
【００４７】
ＮＤＶ  Ｃ２予防接種は、８日齢または１５日齢での体重増加にも、大腸菌病病変の出現率及び重篤度にも全く／ほとんど影響しなかった。
【００４８】
ワクチン接種反応指数
ＶＲ指数を表２に示す。ＮＤＶ  Ｃ２で予防接種したグループでは、ＶＲＩ１もＶＲＩ２も非常に小さかった。
【００４９】
他方、ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１株で予防接種したグループのＶＲＩ１及びＶＲＩ２はきわめて大きかった。
【００５０】
ＮＤＶ  Ｃ２株は呼吸性反応に関して安全である。ＮＤＶ  ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株によって重篤な呼吸困難と、大腸菌病に対する高い感受性とを誘発されたニワトリにおいてさえ、ＮＤＶ  Ｃ２株は有害な反応をほとんど惹起しなかった。
【００５１】
【表１】
0003945842.tif 000002
【００５２】
【表２】
0003945842.tif 000003
【００５３】
実施例２
ウイルス同定
２．１．：  溶離時間
ＮＤＶの赤血球（ＲＢＣ）凝集能はＨＮタンパク質の、ＲＢＣの表面に存在する受容体への結合に依拠する。酵素ノイラミニダーゼはＨＮ分子の一部でもあり、パラミクソウイルス属を構成する全ウイルスに存在する。前記酵素の保有がもたらす明らかな結果の一つに、凝集したＲＢＣが徐々に溶離されること（ｇｒａｄｕａｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ）が有る。ＮＤＶによって凝集したニワトリＲＢＣの溶離速度は、溶離を急速に生起させるか緩慢に生起させるかでＮＤＶ分離株を大まかにグループ分けするのに用いられている（Ｊ．  Ｓｐａｌａｔｉｎ等，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １４，  ｐｐ．５４２−５４９，  １９７０）。
【００５４】
ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１株、ＮＤＶ  Ｃ２株、ＮＤＷ株またはＣａＴｓ株によって凝集したニワトリＲＢＣの溶離速度を測定した。次の結果が得られた。
【００５５】
【表３】
0003945842.tif 000004
【００５６】
２．２．：  モノクローナル抗体ＡＶＳ−１との反応
モノクローナル抗体は抗原の、（エピトープと呼ばれる）普通非常に小さい領域に対するものであり、即ちきわめて特異的である。この特異性を用いて各ウイルス間の類似性または相違性を、当該ウイルスが有する、上記のような抗体と反応する能力に基づいて示すことができる。
【００５７】
十分に特性解明されたＮＤＶモノクローナル抗体の一つであるＡＶＳ−１と幾つかのＮＤＶ株との反応性を、血球凝集抑制（ＨＩ）試験を用いて評価した。
【００５８】
ＨＩ試験は標準的な操作に従い、マイクロタイトレーションプレートにおいて１ウェル当たり８ＨＡＵを用いて行なった。
【００５９】
モノクローナル抗体ＡＶＳ−１は、ＨＩ試験において市販のＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１及びＬａ  Ｓｏｔａ株ワクチンと特異的に、かつ大規模に反応することが過去にＳｒｉｎｉｖａｓａｐｐａ等によってＡｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０，  ｐｐ．５６２−５６７，  １９８６に示された。
【００６０】
【表４】
0003945842.tif 000005
【００６１】
表３及び表４の結果から、ＮＤＶ  Ｃ２株はＣａＴｓ、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１及びＮＤＷとは異なる特性を有するという結論を導くことができる。
【００６２】
実施例３
ＮＤＶ  Ｃ２ワクチンの効力
ＮＤＶ  Ｃ２ウイルスを、稀釈液０．１ｍｌ中に約３〜４ｌｏｇｓ  ＥＩＤ50のウイルスが存在するように稀釈し、これを２００個の１０〜１２日齢ＳＰＦ胚に接種した。胚を３７℃で放置した。接種から４日後、胚を明かりに透かして検査し（ｃａｎｄｌｅｄ）、生きている胚を総て４℃で２時間放置した。その後、尿膜腔液を回収した。総量１３４０ｍｌの尿膜腔液を６６０ｍｌの安定剤と混合した。これを１５分間混合し、その後１０ｍｌ容のガラス製バイアルに、バイアル１個に２ｍｌずつ入れた。次に、バイアルを凍結乾燥した。
【００６３】
ワクチンの免疫原性を確認するために、１日齢ＳＰＦニワトリを用いて点眼免疫（Ａ）及び噴霧免疫（Ｂ）を行なった。予防接種及び攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）のプロトコルについては表５及び７を参照されたい。予防接種の２８日後に行なった攻撃には有毒ＮＤＶ株Ｔｅｘａｓ−ＧＢを用いた。攻撃後の１４日間、総てのニワトリにおいてＮＤＶ感染の徴候が観察された。前記徴候には神経性振戦（ｎｅｒｖｏｕｓ  ｔｒｅｍｏｒｓ）、麻痺または死亡が含まれた。これらの徴候を一つ以上示したニワトリは総て、防御されていないと看做した。
【００６４】
Ａ．点眼予防接種の効力
【００６５】
【表５】
0003945842.tif 000006
【００６６】
【表６】
0003945842.tif 000007
【００６７】
Ｂ．噴霧予防接種の効力
【００６８】
【表７】
0003945842.tif 000008
【００６９】
【表８】
0003945842.tif 000009
【００７０】
ＮＤＶ  Ｃ２で予防接種したニワトリでＴｅｘａｓ−ＧＢ感染の徴候を示したものは全く無い（点眼予防接種）か、または３２羽中１羽のみ（噴霧予防接種）であった。予防接種しなかった対照ニワトリは総てＴｅｘａｓ−ＧＢ感染の徴候を示した。