(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ粗酵素。
（１）作用：ペプチド鎖中に存在する塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側でペプチド結合を切断する。
（２）基質特異性：大豆β−コングリシニンのαサブユニット及びα′サブユニットにおいて、塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側のペプチド結合を選択特異的に加水分解する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは８〜９であり、ｐＨ５〜１０の範囲内で安定である。
（４）作用適温の範囲：５〜５０℃の範囲内で作用し、至適温度は３０℃付近である。
（５）阻害、活性化及び安定化
アンチパイン二塩酸塩、（４−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド、アプロチニン、ロイペプチンにより阻害を受ける。
（６）採取方法
大豆品種「毛振」の種子からｐＨ６．５〜９において豆乳を調製し、該豆乳から１１Ｓグロブリン画分を採取し、該画分を硫安５０％飽和で沈殿させることにより得られる。
【請求項２】
大豆品種「毛振」の種子からｐＨ６．５〜９において豆乳を調製し、該豆乳から１１Ｓグロブリン画分を採取することを含む、請求項１記載のプロテアーゼ粗酵素の製造方法。
【請求項３】
大豆種子又は大豆種子から調製した豆乳を請求項１記載のプロテアーゼ粗酵素で処理した後、大豆β−コングリシニンの限定加水分解物を採取することを特徴とするタンパク質の限定加水分解物の製造方法。
【請求項４】
大豆種子から調製した豆乳が使用され、
上記豆乳を上記粗酵素で処理する工程が、ｐＨ６．５〜９において行われ、且つ
大豆β−コングリシニンの限定加水分解物を採取する工程が、上記の処理工程を経た豆乳から７Ｓグロブリン画分を採取する工程を含む、
ことを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、大豆β−コングリシニン分子を構成するサブユニット中に存在する塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側でペプチド結合を加水分解により切断する新規プロテアーゼ、その製造方法及びタンパク質の限定加水分解物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質をプロテアーゼで加水分解する際、反応を途中で止めることにより分解途上の加水分解物を入手することができる。このような限定加水分解物の産業上の有用性は一般に広く知られており、その製造方法も、例えば特開昭64-14274号、特開平1-252245号及び特開平1-281043号等に開示されているように、いくつかの限定加水分解法が提案されている。
【０００３】
これに類似した研究の例としては、オバルブミンのペプシンによるｐＨ４での分解 (J. Agric. Food Chem. 1988, 36, 417-420) 、大豆７Ｓ、11ＳグロブリンにトリプシンをｐＨ８で作用させた分解 (Agric. Biol. Chem., 46, 11, 2829-2834, 1982 / Agric. Biol. Chem., 42, 11, 2103-2109, 1978)  等がある。
しかし、このような方法で限定加水分解物を調製すると、限定加水分解物もできるが、それと同時に限定加水分解物が更に分解されることにより、低分子画分も生成されていた。また、限定加水分解物を得る反応そのものに厳密な反応の制御が必要であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、疾病に与える影響について優れた特性を有するタンパク質源となり得、またタンパク質の物性（例えば粘性、ゲル形成能）が制御された限定加水分解物、及び該限定加水分解物を生産し得る新規プロテアーゼを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明のプロテアーゼの理化学的性質は下記の通りである。
（１）作用：ペプチド鎖中に存在する塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側でペプチド結合を切断する。
（２）基質特異性：大豆β−コングリシニンのαサブユニット及びα′サブユニットにおいて、塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側のペプチド結合を選択特異的に加水分解する。特に、大豆β−コングリシニンのαサブユニット及びα′サブユニットにおいてＡｒｇ−Ａｒｇ間に特異的に作用する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは８〜９であり、ｐＨ５〜10の範囲内で安定である。
（４）作用適温の範囲：５〜50℃の範囲内で作用し、至適温度は30℃付近である。
（５）阻害、活性化及び安定化
アンチパイン二塩酸塩、（４−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド、アプロチニン、ロイペプチン等のセリンプロテアーゼ阻害剤により阻害を受ける。
（６）力価の測定法
本発明のプロテアーゼの活性は、大豆β−コングリシニン（αサブユニット）を基質として用いる。 0.1μmol の基質を含有するｐＨ８の30mMトリス塩酸緩衝液１mlに酵素溶液20μl を加え、30℃にて２時間反応せしめ、 100℃にて10分加熱することにより反応を停止せしめる。この間に分解した基質（αサブユニット）の量を測定する。１分間に１nmole のαサブユニットを分解する酵素の量を１単位とする。
（７）精製方法
大豆11Ｓグロブリン画分を硫安50％飽和で沈殿する画分をイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
【０００６】
本発明のプロテアーゼは、例えば、α′サブユニットを欠失した大豆種子、例えば「毛振」からｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ８において豆乳を調製し、該豆乳から前記プロテアーゼを採取することにより製造することができる。
ここで用いる豆乳は、例えば、前記種子を粉砕後、場合によりヘキサン等の適当な有機溶媒により脱脂した後、トリス塩酸緩衝液等のｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ８の緩衝液で抽出することにより得ることができる。
【０００７】
本発明のプロテアーゼの前記豆乳からの採取は、好ましくは、前記豆乳をｐＨ６．４に調整した後、遠心し、沈殿した画分（所謂大豆11Ｓグロブリン画分）をｐＨ７．６の緩衝液に溶解し、これに硫安を50％飽和になるまで添加することにより沈殿した画分を遠心し、次いで、イオン交換クロマトグラフィー等によって精製することにより行うことができる。
【０００８】
また、前記豆乳から７Ｓグロブリン画分を採取し、次いで、塩析により大豆β−コングリシニンの限定加水分解物を採取することにより、外部からプロテアーゼを添加したり、その反応を制御する必要なく、完熟種子中に存在するプロテアーゼの作用によって限定加水分解物を調製することができる。
即ち、豆乳調製中に、ｐＨ以外何ら反応を制御することなく、限定加水分解物を調製することができる。これは、プロテアーゼの基質特異性にも関係するが、それだけではなく、基質であるβ−コングリシニン分子の立体構造にも関連していると考えられる。即ち、このβ−コングリシニン分子の溶液中での立体構造とプロテアーゼの基質及び反応特異性との組み合わせによって、非常に簡便に限定加水分解物が得られると考えられる。
【０００９】
前記７Ｓグロブリン画分の採取は、常法により行うことができ、例えば、脱脂大豆を例えばトリス塩酸緩衝液で抽出後、ｐＨ６．４の沈殿画分を除去した後、ｐＨ４．８の沈殿画分を採取し、ｐＨ７．６の水溶液で７Ｓグロブリン画分を溶解する Thannらの方法(J. Agric. Food Chem., 24 (6), P1119) 、脱脂大豆を希カルシウム塩溶液で抽出して分画する方法（特開昭48-56843号公報）、米国特許第3953611 号明細書記載の one convenient method "7S SOYBEAN PROTEIN ISOLATE" 、特公昭60-3812 号公報記載の大豆蛋白の分画法、特公平3-65138 号公報記載の大豆蛋白の製造法、特開昭61-236795 号公報記載の蛋白の分画法により行うことができる。
【００１０】
更に、大豆種子又はその処理物、例えば豆乳等の大豆β−コングリシニン含有物を前記プロテアーゼ又はその粗酵素で処理した後、大豆β−コングリシニンの限定加水分解物を採取することによっても限定加水分解物を調製することができる。ここで用いる前記粗酵素としては、例えばα′サブユニットを欠失した大豆種子からｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ８において調製した豆乳から採取されたプロテアーゼ含有物が挙げられる。
【００１１】
この方法は、好ましくは、α′サブユニットを欠失した大豆種子からｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ８において調製した豆乳から採取されたプロテアーゼ含有物で大豆種子から調製した豆乳をｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ８において処理した後、該豆乳から前述した常法に従い７Ｓグロブリン画分を採取することにより行うことができる。
【００１２】
以上のようにして得られたαサブユニットの限定加水分解物は、αサブユニットのアミノ末端から127 番目から543 番目までの領域であり、一次構造がｃＤＮＡから推定されて明らかになっている。この配列からアミノ酸組成を求めると、Ｔｒｐ、Ｃｙｓは１残基も含まず、またＭｅｔも１残基しか含んでいない。このため、例えばタンパク質の粘性及びゲル形成能が低下した限定加水分解物とすることができ、更に、Ｔｒｐは脳の代謝において、その誘導物質がある種の疾病に悪い影響を及ぼすため、これを含まないタンパク質は、それらの疾病の患者に対してタンパク質の供給源として重要な役割を果たしうる。また、悪性腫瘍の進行をＭｅｔ欠乏タンパク質が遅らせるという報告があるが、このような患者に対しても、有力なタンパク質源となりうると考えられる。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕  プロテアーゼの製造
α′欠失系統の大豆種子（例えば毛振品種）100 ｇを粉砕後、ヘキサンにより脱脂し、10倍量のトリス塩酸緩衝液（30mM、ｐＨ８）で約１時間抽出することによって豆乳を調製した（オカラ成分を遠心で除いた）。この豆乳を氷冷しながら、ｐＨ６．４に調整し、一晩静置した。約10,000ｇで遠心し、沈殿した画分（所謂大豆11Ｓグロブリン画分）を標準緩衝液（35mMリン酸緩衝液、ｐＨ７．６、０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む）約150ml に溶解し、これに硫安を50％飽和になるまで添加することにより沈殿した画分を遠心することにより得た。
【００１４】
この沈殿画分が、求める粗酵素含有画分である（約１Ｕ／mg）。
〔実施例２〕  限定加水分解物の調製
実施例１で調製した豆乳より、ｐＨ６．４で沈殿しなかった画分をｐＨ４．８に調整し、この条件で沈殿した画分（所謂７Ｓ画分）を同じく標準緩衝液に溶解し、硫安50％飽和で沈殿する画分を遠心操作により除き、硫安90％飽和にした。
【００１５】
この沈殿画分を硫安65％飽和溶液で抽出した画分が限定加水分解物を主として含有する画分である。
この操作で、純度90％の限定加水分解物が約１ｇ得られる。
〔実施例３〕  限定加水分解物を主成分として含む７Ｓグロブリン画分の調製
実施例１でα′欠失系統の大豆種子（例えば毛振品種）100 ｇから調製した粗酵素含有画分を、普通品種の大豆100 ｇより調製した豆乳（ｐＨ８）に添加し、約１時間攪拌した。この豆乳をｐＨ６．４に調整し、沈殿しなかった画分をｐＨ４．８に調整し、沈殿させることによって限定加水分解物を含む７Ｓグロブリン画分を約20ｇ得た。
【００１６】
〔試験例１〕  限定加水分解物の非ゲル化特性
実施例２で調製した限定加水分解物の加熱によるゲル化特性を動的粘弾性測定装置を用いて、次の条件で測定した。
0003890611.tif 000002
測定結果を図１に示す。この図から、実施例２で調製したβ−コングリシニンの限定加水分解物は、10％という高濃度において加熱してもゲルを形成せず、従って粘度（Ｇ′：貯蔵弾性率）が上昇しないことがわかる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、疾病に与える影響について優れた特性を有するタンパク質源となり得、しかもタンパク質の限定加水分解の程度が容易に制御された限定加水分解物、及び該限定加水分解物を生産し得る新規プロテアーゼを提供することができる。これまでは、完熟種子中に存在するプロテアーゼで、β−コングリシニンを限定加水分解するプロテアーゼは見つかっていなかった。また、本発明のプロテアーゼのように基質特異性が高く、しかも切断箇所が明らかなプロテアーゼに関する知見は初めてであり、酵素活性の高いプロテアーゼも初めてである。
【図面の簡単な説明】
【図１】動的粘弾性の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
●  大豆β−コングリシニン
▲  大豆β−コングリシニンの限定加水分解物
【図１】
0003890611.tif 000003