(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のドメイン：細胞質ドメイン（ドメインＩ）、トランスメンブランドメイン（ドメインＩＩ）、近位細胞外ドメイン（ドメインＩＩＩ）および遠位細胞外ドメイン（ドメインＩＶ）の順にコードするヌクレオチド配列からなり、
該ドメインの少なくとも１つはマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、それ以外のドメインはヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来することを特徴とする、キメラＣＤ４０リガンド遺伝子。
【請求項２】
以下のドメイン：細胞質ドメイン（ドメインＩ）、トランスメンブランドメイン（ドメインＩＩ）、近位細胞外ドメイン（ドメインＩＩＩ）および遠位細胞外ドメイン（ドメインＩＶ）の順にコードするヌクレオチド配列からなり、
ａ）ドメインＩＩＩおよびＩＶがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩＩおよびＩがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する；または
ｂ）ドメインＩＩＩおよびＩＶがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩＩおよびＩがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する；または
ｃ）ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する；または
ｄ）ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する；または
ｅ）ドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩＩがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する；または
ｆ）ドメインＩＩＩがマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来し、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＶがヒトＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する
ことを特徴とする、キメラＣＤ４０リガンド遺伝子。
【請求項３】
ドメインＩＩＩのヌクレオチド配列のプロテアーゼ開裂部位が除去されている、請求項１または２記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子が、作動可能なようにプロモーター領域およびポリアデニル化シグナルに連結している、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
発現ベクターである請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列またはベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
真核細胞である請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
新生物細胞である請求項７または８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
抗原提示細胞である請求項７〜９のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子またはベクターを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかに記載の宿主細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
さらに免疫原性抗原を含有する請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記免疫原性抗原がベクターによってコードされる、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ワクチンとして有用な請求項１１〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
新生物の処置のための医薬の製造のための請求項１〜６のいずれかに記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子またはベクターの使用。
【請求項１７】
新生物が、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌および卵巣癌からなる群から選択される請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄単球性白血病（ＡＭＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列またはベクターによってコードされるポリペプチド。
【請求項２０】
試験管内でヒト細胞の免疫反応性を改変する方法であって、該ヒト細胞内に請求項１〜６のいずれかに記載のキメラＣＤ４０リガンド遺伝子またはベクターを導入し、該キメラＣＤ４０リガンドを該細胞の表面に発現させることを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、キップス等、「補助分子リガンド遺伝子を含む新規な発現ベクター、ならびに免疫調節のためのおよび悪性腫瘍の処置のためのそれらの用途」（１９９６年１２月９日出願の米国仮出願第６０／１３２１４５号）に対する優先権を主張するものであり、これを図面を含めて引用して本明細書の一部とする。
発明の技術分野
本発明は、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を含む新規な発現ベクター、ならびに、免疫調節、改良されたワクチン接種プロトコルならびに悪性腫瘍および自己免疫疾患の処置のためのそれらの用途に関するものである。より詳細には、本発明は、種々の新生物細胞または悪性細胞を処置するための発現ベクターおよび方法、ならびに自己免疫疾患を処置するための発現ベクターおよび方法を提供するものである。さらに本発明は、高い安定性および増強された機能を有する補助分子リガンドの生成および発現を企図するものである。
発明の背景
白血病、リンパ腫、癌腫およびその他の悪性腫瘍は良く知られており、例えば「ハリソンの内科学の原理」、ウィルソン等編、マクグロウ−ヒル、ニューヨーク、1599-1612頁に記載されている。これらの悪性腫瘍は、迅速且つ連続的に増殖する細胞を排除する免疫系の監視機構を、どういう訳か免れてきたように見受けられる。これらの悪性腫瘍が免疫系の監視を免れる正確な仕組みはわかっていない。
これら悪性の免疫系細胞の幾つかは、免疫カスケード内で適切に機能しない悪性抗原提示細胞である。例えば、新生物的Ｂ細胞は、インビトロで、弱い同種内のまたはオートロガスの混合リンパ球反応さえも誘発することができない。悪性腫瘍が免疫監視機構の機能不全のせいで生き残るさらなる証拠は、同種移植レシピエントおよび長期免疫抑制療法を受けている対象といったような免疫妥協した個体では、係る悪性腫瘍の頻度が上がるということを包含する。さらに、これらの悪性腫瘍の頻度は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の患者および原発性免疫不全症候群、例えばＸ連鎖リンパ増殖性症候群またはウィスコット−アルドリッヒ症候群の患者において上昇する（トマス等、Adv.Cancer Res.、57:329、1991）。
免疫系は通常、悪性細胞を外来細胞として認識し、それらの細胞を身体から一掃することにより、悪性細胞を排除するよう機能する。免疫反応は、患者内部の免疫系の抗体反応および細胞免疫反応の両者に依存している。より詳細には、悪性細胞を外来のものとして認識するよう働く細胞性免疫反応は、幾つかの異なった免疫系の細胞と、それらの細胞間の相互作用とを必要とする。免疫反応は、その細胞表面にＴ細胞レセプターを有するＴリンパ球（Ｔ細胞）で始まる。Ｔ細胞はまた、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）上の補助分子と相互作用する種々の補助分子をその表面に発現する能力をも有する。Ｔ細胞のＴ細胞レセプターが悪性細胞のような外来抗原と特異結合すると、これは活性化し、その細胞表面に補助分子リガンドＣＤ４０リガンドを発現する。補助細胞分子リガンドは、活性化したＴ細胞上に短時間存在するにすぎず、その細胞表面から速やかに除去される。補助細胞分子リガンドが活性Ｔ細胞の表面から除去された後は、補助分子リガンドを介してＢ細胞に結合する能力は失われる。
活性Ｔ細胞の表面に存在する時、補助細胞リガンドは、Ｂ細胞に存在する補助細胞分子と特異結合することができる。この特異的なＴ−Ｂ細胞相互作用は、ＢおよびＴ細胞に共同刺激表面補助分子およびサイトカインを発現させ、これらが、悪性細胞を特異的に殺し身体から除去する細胞溶解Ｔ細胞を導く免疫活性化を引き起こす。
活性Ｔ細胞との相互作用はＢ細胞のみに限定されている訳ではなく、Ｔ細胞に抗原を提示できる任意の細胞（抗原提示細胞）によって行われ得る。これらの細胞は、Ｂリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、単球、ランゲルハンス細胞、交互嵌入細胞、濾胞樹状細胞またはクッパー細胞を包含する。これらの細胞は全て、それらを免疫系の他の細胞と相互作用させることを可能にする様々な補助分子を細胞表面に持っていることが知られている。例えば、これらの抗原提示細胞は全てその細胞表面に補助分子ＣＤ４０を持っている。これら補助分子の存在により、抗原提示細胞が相補的補助分子リガンドに特異結合でき、したがって他の免疫細胞と直接相互作用できるのである。
多数の補助分子リガンドが腫瘍壊死因子スーパーファミリーの成員である（ファンスロウ等、Sem.Immun.、6:267-268(1994)）。これらの補助分子リガンドのうち幾つかのものの遺伝子がクローニングされ同定されている。これらの補助分子リガンド遺伝子は、補助分子をコードしており、それらは全てII型膜タンパクの立体配置を有し、他の補助分子リガンド遺伝子と様々な程度の相同性を表している。例えば、マウスＣＤ４０リガンドおよびヒトＣＤ４０リガンドの両者をコードしている補助分子リガンド遺伝子が分離されている。アーミティッジ等、Nature、357:80-82(1992)およびホーレンボウ等、EMBO J.11:4313-4321(1992)を参照されたい。
ＣＤ４０およびそのリガンドＣＤ４０リガンドは、正常な免疫反応の重要な構成因子である。ＣＤ４０により仲介されるシグナルは、免疫リンパ球を増殖および分化させ、有効な抗原提示細胞にさせる。悪性または新生物的Ｂ細胞は、能力の低い抗原提示細胞であり、活発な同種混合リンパ球反応を刺激することができない。免疫細胞上のＣＤ４０分子がうまく架橋すると、強い免疫反応を触発する強い同種混合リンパ球反応が導かれる。ＣＤ４０を強力に架橋させるために、様々な可溶性ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０に特異的な抗体が使用されてきた。これらの可溶性ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０に特異的な抗体は、抗原提示細胞上のＣＤ４０分子の架橋にとって最適ではなく、また、抗原提示細胞の強い刺激を引き起こすために細胞膜上に発現されるＣＤ４０リガンドほど有効に働く訳ではない。これらの方法はまた、大量のＣＤ４０リガンド構築物または抗体を分離せねばならず、それが困難なそして時間のかかる仕事であるため、実行が難しい。培養細胞を産生し次いでそれを抗原提示に使用する、ＣＤ４０リガンドを有する線維芽細胞の形質転換を含む、溶液状態または膜結合分子としてのＣＤ４０リガンドを利用する別の方法は、インビボのヒト臨床プロトコルには従わない。
ＣＤ９５（Fas）とそのリガンド（Fas-リガンド、またはFasL）との相互作用は、免疫反応の持続および／または活性リンパ球の寿命を制限するよう機能する。Fas-FasL結合により誘発されるアポトーシスは、活性化した自己反応性リンパ球を一掃する働きを有する。この経路を変えることにより惹起される問題は、Fas-Fasリガンド相互作用に欠陥を有する動物で立証されている。ＣＤ９５またはFasLを不活性化する突然変異を有するマウスは、慢性関節リウマチ（RA）または全身性狼瘡の患者に見られるものと類似する自己免疫疾患を包含する数多くの疾患を発生させる。ザング等、J.Clin.Invest.100:1051-1957(1997)は、コラーゲン誘発関節炎のマウスの関節にFasLを発現するウイルスを注射すると、滑液細胞のアポトーシスおよび関節炎症状の緩解が導かれることを示している。Fasリガンドの発現は、自己免疫疾患の病因に或る役割を果たしている活性化された細胞の一掃を可能にする。故に、慢性関節リウマチ患者の関節にFasLを導入する遺伝子治療方法は、浸潤している単核細胞の破壊を導くことにより疾病の病理を改善するよう機能し得る。
可溶性補助分子および補助分子リガンドの投与は、望ましくない生理的効果を伴うまたはその引き金となることが示されている。例えば、野生型ＣＤ４０レセプター発現を行うマウスを可溶性ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ８融合タンパクで処置すると、肺の炎症反応を引き起こした。これは、ＣＤ４０レセプターの遺伝子がノックアウトされているマウスでは観察されなかった。J.A.ウィレイ等、Journal of Immunology、158:2932-2938(1997)に記載されるこれらの実験は、ＣＤ４０のライゲーションが炎症反応を引き起こし得ることを示唆するインビトロデータを支持するものである。
K.J.トレーシーおよびA.セラミ、Annu.Rev.Med.45:491-503(1994)に記載されるように、精製された組換え可溶性腫瘍壊死因子（αまたはβのいずれか）の直接投与は、ショックおよび組織損傷をもたらす。ＴＮＦを静脈内または動脈内に急激に投与した後、数分以内に、ショック、組織損傷、毛管漏洩症候群、低酸素症、肺浮腫、および高死亡率を伴う多臓器不全の症状が起こる。長期にわたるＴＮＦの低用量投与は、食思不振、体重減少、脱水および全身のタンパクおよび脂肪の涸渇を招く。
可溶性Fasリガンドおよびレセプターはまた、組織損傷およびその他の望ましくない作用を伴うことが示されている。FasレセプターＣＤ９５はアポトーシスの仲介物質である。FasリガンドはFasレセプターに結合することによりアポトーシスを誘発する。P.R.ガレ等、J.Exp.Med.182:1223-1230(1995)が示すように、拮抗関係にある抗Fas抗体の投与はマウスに肝障害をもたらした。拮抗する抗体を腹腔内注射されたマウスは数時間以内に死に、分析により、アポトーシスによる重篤な肝障害が死をもたらした可能性が最も高いことが判明した。
劇症リンパ腫の際の全身的な組織損傷の病因論における可溶性Fasリガンド（FasL）の役割が、K.サトー等、British Journal of Haematology、94:379-382(1996)に記載されている。この報告に提示されている発見は、可溶性FasLが肝損傷および汎血球減少症の病因と直接関係していることを示している。
補助分子リガンドＣＤ７０のレセプターＣＤ２７は、ヴァン・オース等、Blood、82:3430-3436(1993)に書かれた報告で、Ｂ細胞の悪性腫瘍に関係することが示された。
これらの発見は全て可溶性補助分子リガンドの投与を禁忌とし、その可溶性型の上昇をもたらすことなくこれらの分子のレベルを増大させる治療法の必要性を強調するものである。
補助分子リガンド遺伝子および様々な免疫細胞表面でのそれらの発現に関する情報が豊富であるにも関わらず、この補助分子リガンド遺伝子が抗原提示細胞上で調節される正確な機構は未だ知られていない。これら抗原提示細胞上での補助分子リガンド遺伝子の発現調節に関する特別の知識無しには、補助分子リガンド遺伝子の発現を変化させることにより免疫反応を変えることは、現在の所不可能である。或る抗原提示細胞上で補助分子リガンド遺伝子の発現を如何に調節するかという特別な知識無しには、悪性細胞に対する免疫反応を変えることは不可能である。したがって、抗原提示細胞を包含する正常のおよび悪性の細胞上での補助分子リガンド遺伝子の発現を増大させる方法に対する必要性がある。
さらに、補助分子リガンドの発現を調節する能力無しには、これらの細胞の免疫的掃討を変えることは不可能である。
発明の要約
本発明は、補助分子リガンド遺伝子を含む新規な発現ベクター、およびそれらの遺伝子を正常なおよび悪性の抗原提示細胞中に導入しそれにより免疫反応を変化させる方法、自己免疫疾患の処置、ならびに様々な新生物形成の処置を提供することによって、これらの必要性を満たすものである。本発明は、補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを包含するベクターを提供する。これらのベクターはまた、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル（３’末端）といったようなさらなる遺伝的要素を含み、それらは、ベクターを当該細胞内にうまく位置させ、そして細胞内での補助分子リガンド遺伝子の発現を指令することを可能にする。このような遺伝子治療ベクターは、動物細胞を直接形質転換させることができ、それにより、補助分子リガンド遺伝子をその動物の細胞中に、補助分子リガンドをその細胞内部で産生するために利用され得るような形で導入することができる。
本発明の別の態様においては、細胞表面での補助分子リガンドの半減期を変えることにより、または細胞表面での該分子の発現レベルを変化させることにより、補助分子リガンドの機能を改変する。好ましい態様において、本発明は、細胞表面での係る補助分子リガンドの安定性が改善するよう改変した補助分子リガンドを提供する。このような安定性の増大は、キメラ分子および少なくとも一つの位置に突然変異が導入された分子を包含する、本出願に記載した分子に関わる開示された方法のいずれかを用いて達成することができる。本発明はまた、係る分子の発現の増大をも企図している。
本発明はさらに、遺伝子の複数部分が、異なる種由来のまたは異なる種由来でない二つの別個の補助分子リガンドから誘導されるキメラである、補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを提供する。本発明に係る補助分子リガンド遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの分子をコードしている遺伝子を包含する。ＴＮＦファミリーを形作っている分子は、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０リガンド、Fasリガンド、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、４１ＢＢリガンド（4-1BBL）、神経成長因子およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）を包含する。本発明の幾つかの態様においては、本発明に係るキメラ補助分子リガンド遺伝子は、少なくとも一部分のマウス補助分子リガンド遺伝子を、マウス、ヒトまたはその他の種のいずれかから誘導される補助分子リガンド遺伝子の複数部分と共に含んでいる。本発明の好ましい幾つかの態様は、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子、ならびに、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の少なくとも１セグメントをヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の少なくとも１セグメントと共に含むキメラＣＤ４０リガンド遺伝子を利用するものである。本発明は、一つの種の補助分子リガンド遺伝子由来の複数セグメントが、所望により異なる種由来のものであってもよい、第二の補助分子リガンド遺伝子由来の複数セグメントに交換されたキメラ補助分子リガンド遺伝子を企図するものである。例えば、一つの好ましい態様において、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子のトランスメンブランおよび細胞質ドメインを、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞外ドメインに結合させた。
本発明は、ヒト、哺乳動物、昆虫、またはその他の細胞に直接感染することのできる遺伝子治療ベクターを企図する。このような遺伝子治療ベクターの使用は、それらの細胞内への補助分子リガンド遺伝子の挿入を極めて簡単にする。企図される遺伝子治療ベクターは、インビボまたはインビトロで使用して所望細胞に感染させることができ、悪性細胞に感染させて生理的リガンドを持続的に高レベルで発現させるのに特に有用である。
本発明はまた、補助分子リガンド遺伝子および当該細胞内部で当該補助分子リガンドを発現させるに充分な遺伝的情報を含んでいる、遺伝子治療ベクターを含む動物、哺乳動物、およびヒトの細胞を企図している。好ましい態様において、本発明はさらに、本発明に係る遺伝子治療ベクターを含む、または補助分子リガンド遺伝子をプロモーターおよび３’末端領域と共に含む、ヒト新生物的抗原提示細胞をも企図するものである。
本発明はさらに、キメラ補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを含んでいるヒト細胞およびヒト新生物細胞を企図している。本発明はさらに、補助分子リガンド遺伝子、キメラ補助分子リガンド遺伝子、マウス補助分子リガンド遺伝子、ヒト補助分子リガンド遺伝子、本発明に係る遺伝子治療ベクター、本発明に係るベクター、ならびに、ヘテロローガスなプロモーター、エンハンサーまたはポリアデニル化配列と共にキメラ補助分子リガンド遺伝子を含んでいる細菌細胞または動物細胞を企図している。
本発明はさらに、補助分子リガンドがヒトの細胞表面で発現されるよう、補助分子リガンド遺伝子をコードしている遺伝子をヒトの細胞中に導入することにより、患者内部の免疫反応またはヒト細胞の免疫活性をインビボで変える方法を企図している。この方法は、補助分子リガンド遺伝子を遺伝子治療ベクターの一部として、またはヘテロローガスなもしくは天然のプロモーター、エンハンサーもしくはポリアデニル化シグナルと共に導入することを含む。本発明に係る幾つかの好ましい態様は、免疫活性を変えるためにヒトの細胞中に、ＣＤ４０について上に企図されたように組み立てられたFasリガンド遺伝子およびキメラFasリガンド遺伝子を導入することを利用している。本発明はまた、係る補助分子リガンド遺伝子を、補助分子を有する細胞内に挿入し、この補助分子に、細胞表面で、該補助分子リガンドが結合するような方法を包含するものである。
免疫活性を変える本発明方法は、ヒト新生物細胞、例えばヒトリンパ腫、白血病およびその他の悪性腫瘍を包含する、ヒト、動物、およびマウスの細胞の全ての型に適用可能である。好ましい態様において、この方法は、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を、患者の、抗原提示細胞となり得る細胞、または、バイスタンダー抗原提示細胞を刺激することのできる細胞中に導入するために使用される。このような抗原提示細胞は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、交互嵌入細胞、濾胞樹状細胞、クッパー細胞等を包含する。様々な抗原提示細胞が、白血病、リンパ腫、急性単球性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性骨髄単球性白血病（AMML）、慢性骨髄性または慢性骨髄単球性白血病（CMML）といったようなヒト患者の既知の悪性腫瘍の一部として存在し得、したがって、ヒトまたは動物の免疫系に抗原を提示することのできる、またはバイスタンダー抗原提示細胞を刺激することのできる、任意の細胞の全腫瘍を包含するであろう。本発明はまた、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子をコードしている遺伝子を、患者に見出される、筋肉細胞、皮膚細胞、間質細胞、結合組織細胞、線維芽細胞等を包含する、かなり多数の異なる細胞の内部に導入することにより、免疫系を調節することを企図するものである。
本発明はさらに、ヒトの患者または動物の患者のいずれかにおいて新生物形成を処置する方法を企図している。一つの好ましい態様において、この方法は、新生物細胞をヒトまたは動物の患者から分離し、その分離した細胞内に、キメラ補助分子リガンドまたは補助分子リガンドをコードしている遺伝子を挿入し、その結果、当該分子がその新生物細胞またはその他の体細胞表面で発現されるようにすることを含む。次いでこの新生物細胞は、そのヒトまたは動物患者の中に注入して戻すと、亢進した免疫反応に参加できるのである。
本発明はまた、補助分子リガンド遺伝子を、腫瘍または癌腫特異抗原をコードしている遺伝子と共に同時感染または同時導入させることを企図するものである。次いでこの分子の組み合わせは新生物細胞の表面で発現され、そして、それらの細胞を患者に導入すると、それらの細胞の破壊をもたらす迅速な免疫反応が導かれる。
本発明はさらに、遺伝子治療ベクターを直接、または補助分子リガンド遺伝子を持つその他のベクターを直接、患者の腫瘍または腫瘍床中に導入することを包含する。患者の腫瘍床に入ると、遺伝子治療ベクターまたは他のベクターは、腫瘍または腫瘍床に存在する細胞に侵入し、次いでそれらの細胞表面で補助分子リガンドを発現する。次いでこれらの細胞は、ヒトまたは動物の免疫反応に充分に参加することができる。
本発明はまた、ワクチンに対する免疫反応を増大させる方法をも企図している。動物に、補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝的ベクターを有するワクチンを投与することによる、予め定められた生物または抗原に対して動物をワクチン接種する、本発明方法。本発明方法の別の態様は、二つの別個の遺伝的ベクター（一方は、免疫が望まれる生物由来の抗原を含んでいる）を投与することにより動物にワクチン接種することを含むものであって、これは、標的動物の細胞を分離し、予め定められた生物由来の少なくとも一つの抗原をコードしているベクターをそれらの細胞に接触させ、その結果、該抗原がその細胞により発現されるようにし、そしてさらに、それらの細胞を、その動物の抗原提示細胞の表面に補助分子リガンド遺伝子を発現する、異なったベクターと接触させることによるものである。これら二つの別個のベクターが協力して、抗原単独によるワクチン接種よりずっと強力で且つ長く持続するワクチン接種が生み出される。
本ワクチン接種方法は、ウイルス、細胞、細菌、任意のタンパクまたは真菌類に対する免疫の創出のために設計されるワクチン接種に適用し得る。本方法はまた、種々の癌腫および新生物に対する免疫化に適用し得る。これらの態様において、免疫が望まれる腫瘍抗原は、補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝的ベクターと共に動物体内に導入する。
本発明はさらに、補助分子リガンドをコードしている遺伝子治療ベクターを利用する、関節炎の処置方法をも企図する。関節炎での使用のために特に興味深いのは、Fasリガンド活性の発現が関節において増大した、そして／または関節内部の細胞上でのFasリガンド活性の安定性が向上している、Fasリガンド分子である。別の態様において、本発明は、キメラ補助分子リガンドおよびキメラ補助分子リガンド遺伝子を利用する関節炎の処置方法を企図した。本発明はさらに、本発明に係る発現ベクターを、Fasリガンドおよびキメラ分子を包含するFasリガンドの改変型と共に利用する、関節炎のエクスビボ治療法およびインビボ治療法をも企図するものである。
【図面の簡単な説明】
第１図：第１図は、幾つかの補助分子リガンド遺伝子と、配列データから推測したこれら遺伝子のドメインＩ−IVを示す図である。
第２図：第２図は、キメラ補助分子リガンド遺伝子の例を示す図である。マウスの補助モジュールから誘導したドメインを陰を付して示す。
第３図：第３図は、これらの分子をコードしている遺伝子を含む遺伝子治療ベクターに感染させたHelaまたはＣＬＬ細胞の表面に見出されたマウスまたはヒトＣＤ４０リガンドの量を示している。第３Ａ図は、非感染Hela細胞（陰付き）およびマウスＣＤ４０リガンドをコードしている遺伝子治療ベクターに感染したHela細胞を示している。第３Ｂ図は、非感染Hela細胞（陰付き）およびヒトＣＤ４０リガンドをコードしている遺伝子治療ベクターに感染したHela細胞を示している。第３Ｃ図は、非感染ＣＬＬ細胞（陰付き）およびマウスＣＤ４０リガンドをコードしている遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞を示している。第３Ｄ図は、非感染ＣＬＬ細胞（陰付き）およびヒトＣＤ４０リガンドをコードしている遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞を示している。
第４図：第４図は、補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド遺伝子）を含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＬＬ細胞上での、ＣＤ５４（第４Ｂ図）およびＣＤ８０（第４Ｄ図）の発現の増強のヒストグラムを示している。陰付きのグラフは、ＦＡＣＳ分析における対照染色を示し、白抜きのグラフは、ＣＤ５４（第４Ａ図および第４Ｂ図）またはＣＤ８０（第４Ｃ図および第４Ｄ図）のいずれかに対して免疫特異的なモノクローナル抗体での染色を示す。
第５図：第５図は、様々な刺激方法に応答した同種Ｔ細胞の、3Ｈ−ＴｄＲ取り込みにより測定した細胞増殖を示している。補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド遺伝子）を発現する遺伝子治療ベクターを含むＣＬＬ細胞を導入し、同種Ｔ細胞を刺激して増殖させた。
第６図：第６図は、補助分子リガンド遺伝子を含むＣＬＬ細胞で刺激された同種Ｔ細胞によるガンマインターフェロン（IFNg）の産生を示している。
第７図：第７図は、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを使用した、動物の新生物形成の処置を示している。白抜きの正方形は、本発明に係る補助分子リガンドを発現しない新生物細胞で免疫したマウスを示している。本発明に係る補助分子リガンドを発現する新生物細胞で免疫したマウスは、この図の最上部に水平線で示されており、罹患を示さない。
第８図：第８図は、ＣＬＬ（上のグラフ）および正常な血液単核細胞（下のグラフ）における、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０リガンド転写物の産生レベルおよび安定性を示している。
第９図：第９図は、補助分子リガンド（ＣＤ４０リガンド）に感染したＣＬＬＢ細胞における導入遺伝子発現の時間経過を示している。ＰＥ標識したＣＤ４０リガンドで染色したＣＤ１９+ＣＬＬ細胞の蛍光強度と、ＰＥ標識したイソタイプ対照ｍＡｂで染色したＣＤ１９+ＣＬＬ細胞の蛍光強度とを、各時点で比較した、ＭＦＩＲ（平均蛍光強度比）を、左側の縦座標に示した目盛りに従って、実線でつないだ黒丸で表す。
第１０図：第１０図は、補助分子リガンドＣＤ４０リガンドを含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ Ｂ細胞の表面抗原表現型の変化を示している。陰付きのヒストグラムは、非特異的対照抗体で染色した非感染ＣＬＬ細胞の染色（細い線）を表し、細い線で描かれた白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ−コンジュゲートした特異的ｍＡｂで染色した非感染ＣＬＬ細胞を表し、そして太い線で描かれた白抜きのヒストグラム（標識されたＣＤ１５４−ＣＬＬ）は、補助分子リガンド遺伝子治療ベクターに感染し、ＦＩＴＣ−コンジュゲートされた特異的ｍＡｂで染色したＣＬＬ細胞を表す。
第１１図：第１１図は、補助分子リガンドを含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞で産生されたＣＤ２７のレベルを示している。第１１Ａ図は、ＣＤ４０Ｌ感染ＣＬＬ（ＣＤ１５４−ＣＬＬ）細胞が、低下したレベルの表面ＣＤ２７を発現することを示している。白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたａＣＤ２７ ｍＡｂを用いた、非感染ＣＬＬ細胞（細い線）または感染ＣＬＬ（太い線）の染色をそれぞれ表している。第１１Ｂ図は、ＣＬＬ Ｂ細胞によるＣＤ２７の可溶性型の産生を示す。
第１２図：第１２図は、補助分子リガンド（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１５４とも呼ばれる）を含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞により誘発される同種Ｔ細胞の反応を示している。第１２Ａ図は、補助分子リガンドを含むＣＬＬ細胞で同種Ｔ細胞を刺激した後の上清中のＩＦＮｇの濃度を示す。第１２Ｂ図は、3Ｈ−チミジンの取り込みにより評価した、細胞増殖を示す。第１２Ｃ図および第１２Ｄ図は、補助分子リガンドを含むＣＬＬにより誘発される二次同種Ｔ細胞反応を示す。
第１３図：第１３図は、補助分子リガンドＣｄ４０リガンドまたはＣＤ１５４、および対照を含むＣＬＬ Ｂ細胞により誘発されたオートロガスなＴ細胞の反応を示している。第１３Ａ図は、ＣＬＬ細胞と同時培養したオートロガスＴ細胞による3Ｈ−チミジンの取り込みを示す。第１３Ｂ図は、ＣＬＬ細胞と同時培養したオートロガスＴ細胞により産生されたヒトＩＦＮｇのレベルを示す。第１３Ｃ図では、補助分子リガンドを含むＣＬＬ Ｂ細胞により誘発されたオートロガスＴ細胞のＣＴＬ活性をグラフ化してある。
第１４図：第１４図は、オートロガスＣＬＬ Ｂ細胞に対するＣＴＬの特異性を示している。ＩＦＮｇ濃度は４８時間培養後の上清で評価し（第１４Ａ図）、細胞溶解活性は３時間培養の時点で評価した（第１４Ｂ図）。第１４Ｃ図では、ＣＴＬ検定に先立ち、オートロガス白血病標的細胞にｍＡｂを添加した。
第１５図：第１５図は、補助分子リガンドを発現するＣＬＬ細胞で観察される表現型の変化の創出において、細胞間の刺激が或る役割を果たしていることを示している。第１５Ａ図では、補助分子リガンド（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１５４）を含む遺伝子治療ベクターに感染した後に誘導されたＣＤ５４およびＣＤ８０の発現に及ぼす培養密度の影響を示している。陰付きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたイソタイプ対照ｍＡｂによる白血病Ｂ細胞の染色を表す。白抜きのヒストグラムは、高密度または低密度（矢印で示す）で培養し、ＣＤ５４またはＣＤ８０に特異的なＦＩＴＣ−コンジュゲートしたｍＡｂで染色したＣＤ１５４−ＣＬＬ Ｂ細胞を表す。第１５Ｂ図は、抗ＣＤ１５４ ｍＡｂによるＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞の活性化の阻害を示す。第１５Ｃ図および１５Ｄは、補助分子リガンドを発現するＣＬＬ細胞により誘導される、バイスタンダー非感染ＣＬＬ Ｂ細胞上での免疫補助分子の発現を示す。陰付きのヒストグラムは、ＰＥ−コンジュゲートさせたイソタイプ対照ｍＡｂによる染色を表す。
第１６図：第１６図は、補助分子リガンドをコードしているベクターが、マウスにおいてβ−ｇａｌに対する免疫化を増強することを示している。第１６Ａ図は、ｐＣＤ４０Ｌベクターの筋肉内注射を受けたマウスは、非修飾ｐｃＤＮＡ３ベクターまたはｐＣＤ４０Ｌのいずれかを注射したマウスより、有意に大量のβ−ｇａｌに対する抗体を産生したことを示している。ｄ２８において集めた血清の連続希釈のＥＬＩＳＡ分析である第１６Ｂ図は、ｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌを同時注射したマウスは、ｐｌａｃＺ＋ｐｃＤＮＡ３で処置したマウスの８倍高い抗β−ｇａｌ抗体の平均力価をｄ２８において持っていたことを示す。
第１７図：第１７図は、補助分子リガンドをコードしているベクターｐＣＤ４０Ｌ有りまたは無しでの筋肉内プラスミドＤＮＡ免疫化に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ免疫反応の分析を示している。ｐｌａｃＺおよびｐｃＤＮＡ３またはｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌのいずれかを注射したマウスの血清中で、ＩｇＧ２ａ抗β−ｇａｌ抗体は、ＩｇＧ１サブクラス抗体に優っていた。対照的に、β−ｇａｌタンパクを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスは、専らＩｇＧ１抗β−ｇａｌ抗体を産生し、検出し得るＩｇＧ２ａ抗β−ｇａｌ抗体を産生しなかった。
第１８図：第１８図は、補助分子リガンドをコードしているベクターｐＣＤ４０Ｌを、ｐｌａｃＺと同じ部位および異なる部位に注射した比較を示している。ｐＣＤ４０Ｌのアジュバント効果は、同じ部位にｐｌａｃＺと同時注射することを必要とする。
第１９図：第１９図は、補助分子リガンドをコードしているベクターｐＣＤ４０Ｌを真皮内にｐｌａｃＺと同時注射すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ抗β−ｇａｌ反応を増強することを示している。
第２０図：第２０図は、補助分子リガンドをコードしているベクターｐＣＤ４０Ｌは、ｐｌａｃＺが、同系βｇａｌ発現標的細胞に特異的なＣＴＬを誘導する能力を増強することを示している。ｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌの注射を受けたマウスから取った脾臓細胞エフェクター細胞は、対照注射を受けたマウス由来の脾臓細胞より有意に多数の細胞を特異的に溶解した。
第２１図：第２１図は、ＣＤ４０を発現する肺腫瘍セルラインにおける、マウスＣＤ４０ＬではなくヒトＣＤ４０Ｌのダウンモデュレーションを示すものである。
第２２図：第２２Ａ図は、ＣＤ４０の結合が、肺腫瘍セルラインにおいて腫瘍細胞表面マーカーＣＤ９５（Fas）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、およびＭＨＣ−Ｉの発現の増強を誘導することを示している。第２２Ｂ図は、ＣＤ４０陽性腫瘍細胞によるヒトＣＤ４０Ｌのダウンモデュレーションを示している。
第２３図：第２３図は、ＲＡ滑液の存在下での、リンパ球によるFasリガンド発現の阻害を示している。
第２４図：第２４図は、Ｂ細胞ＣＬＬのための、補助分子リガンド（ＣＤ４０Ｌ）遺伝子治療処置の臨床試験の概要を示している。
第２５図：第２５図は、ヒトＦａｓリガンドと、ドメインIIIがマウスFasリガンドのドメインIIIに置き換えられたヒトFasリガンドとの配列の並置を示している。上段のタンパク配列は天然ヒトFasリガンドである。ドメインIIIは点線による下線を付してある。二重下線は、予想されるＭＭＰ開裂部位を示す。下段のタンパク配列はキメラヒト−マウスFasリガンドのものである。マウスFasリガンドのドメインIII（点線による下線を付した）をヒトFasリガンドのドメインIIIの代わりに用いる。番号は、ポリペプチド配列の始点を１としたアミノ酸配列番号に対応する。アミノ酸をコードしているコドンに対する最初のヌクレオチド塩基の番号は、１＋３ｘ（ｎ−１）［ここでｎはアミノ酸配列番号である］である。
第２６図：第２６図は、ヒトＦａｓリガンドと、ドメインIIIがヒトＣＤ７０のドメインIIIに置き換えられたヒトFasリガンドとの配列の並置を示している。上段のタンパク配列は天然ヒトFasリガンドであり、下段の配列は、FasドメインIIIがヒトＣＤ７０のドメインIIIに置換されている、キメラFasリガンドの配列である。その他の記号は第２５図と同様に使用する。
第２７図：第２７図は、ヒトＦａｓリガンドと、ドメインＩがヒトＣＤ７０のドメインIIIに置き換えられたヒトFasリガンドとの配列の並置を示している。上段のタンパクは天然ヒトFasリガンドであり、下段のタンパク配列は、ドメインIIIがヒトＣＤ７０のドメインＩに置換されている、キメラFasリガンドの配列である。その他の記号は第２５図と同様に使用する。
第２８図：第２８図は、M.M.スミス等、Journal of Biol.Chem.、270:6440-6449(95)およびH.ナガセおよびG.B.フィールズ、Biopolymers(Peptide Science)、40:399-416(96)に記載されている、既知のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）開裂部位およびその周辺のアミノ酸を示している。開裂部位は矢印で示す。
発明の詳細な説明
本明細書中に引用した参考文献は全て、引用することによりその全体を本明細書の一部とする。
Ｉ．定義
＋  「補助分子リガンド遺伝子」とは、補助分子リガンドの全体または一部をコードしている遺伝子である。この遺伝子は、少なくとも、補助分子リガンドの機能的部分をコードするに要するヌクレオチド配列を含んでいる。この遺伝子は所望により、プロモーター、エンハンサーおよび３’末端といったような遺伝的要素を含んでいてよい。補助分子リガンド遺伝子は、ＣＤ４０リガンド、Fasリガンド、ＣＤ７０、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド（4-1BBL）、神経成長因子およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）を包含する、腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーの一員であるリガンドから誘導される。本明細書中使用される「補助分子リガンド遺伝子」という語は、下に定義するキメラ補助分子リガンド遺伝子を包含する。
本明細書中使用する「悪性細胞または新生物細胞」という語は、ヒトの患者または動物に見出される悪性のまたは癌の細胞を意味するとして定義する。悪性または新生物細胞の好ましい型は、任意の悪性抗原提示細胞を包含する。幾つかの好ましい態様においては、これらの悪性抗原提示細胞は、細胞表面に存在する少なくとも低レベルのＣＤ４０を有する。
本明細書中使用する「新生物的ヒト細胞」という語は、抗原提示細胞を包含するがこれに限定されない、新生物的であるヒト細胞、抗原提示細胞として機能し得る、または抗原提示を促進するよう機能し得る、任意の新生物細胞、新生物的単球、新生物的マクロファージ、新生物的Ｂ細胞、新生物的樹状細胞、新生物的ランゲルハンス細胞、新生物的交互嵌入細胞、新生物的濾胞樹状細胞、または新生物的クッパー細胞等を意味するとして定義する。新生物的ヒト細胞の定義は、ヒト患者の腫瘍床において新生物細胞と共に存在する細胞を包含する。典型的には、新生物的ヒト細胞は、白血病、リンパ腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＡＭＭＬ、ＣＭＬ、ＣＭＭＬ、ＣＬＬ、その他の腫瘍の抗原提示細胞または胸部、卵巣もしくは肺新生物細胞のいずれかである。本発明に係る補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子はさらに、体細胞中に挿入できるということも企図されている。これらの体細胞は、それらの細胞が免疫系に抗原を提示できるようにさせる分子をコードしている遺伝子を、それらの細胞内に導入する、遺伝子工学によって作り出すことができる。
本明細書中使用する「キメラ遺伝子」という語は、その遺伝子の一部が第二の異なる遺伝子から誘導されて第一の遺伝子と合し、その結果、得られるキメラ遺伝子に、少なくとも各遺伝子の一部が存在するような遺伝子を意味するとして定義する。得られるタンパクをコードしている配列のどこか一部分が、第二のそして異なる遺伝子から誘導されているならば、その遺伝子はキメラであり得る。典型的なキメラ遺伝子は、一つの遺伝子由来の特定の機能的ドメインが第二の遺伝子に移され、そして第二の遺伝子の類似ドメインに取って代わっている遺伝子を包含する。例えば、得られたキメラ遺伝子は、マウス遺伝子から誘導された一つのドメインと、ヒト遺伝子から誘導された幾つかのドメインを持っているかも知れない。これらのドメインは、５個のアミノ酸ないし数百個のアミノ酸の大きさの範囲であり得る。キメラ補助分子リガンド遺伝子の別の例は、天然に存在するいかなる補助分子リガンド遺伝子にも見いだせないアミノ酸をコードしているヌクレオチドを含む遺伝子を包含する。キメラ遺伝子および可能な種々のドメインの組み合わせの例は多数有り、当業者は、それをキメラとするために第二の遺伝子に存在しなければならない或る遺伝子の量には制限の無いことが理解できるであろう。
本明細書中使用する「マウスＣＤ４０リガンド遺伝子」という語は、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子から誘導される補助分子リガンド遺伝子を意味するものとして定義する。係るマウスＣＤ４０リガンド遺伝子の例は、アーミティッジ等、Nature、357:80-82(1992)により分離された遺伝子、および、低緊縮ハイブリダイゼーション条件下でアーミティッジ等により記載された遺伝子とハイブリダイズする、マウス起源から誘導されたその他の遺伝子を包含する。
本明細書中使用する「ベクターまたは遺伝的ベクター」という語は、細菌または動物細胞のような生物の内部で自己を複製できる核酸を意味するとして定義する。典型的な遺伝的ベクターは、組換えＤＮＡ技術で一般的に使用されるプラスミド、および、細菌または動物細胞内部で複製できる種々のウイルスを包含する。好ましい型の遺伝的ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルス等を包含する。
本明細書中使用する「遺伝子治療ベクター」という語は、動物、例えばヒトの患者の内部の細胞に直接感染することのできる遺伝的ベクターを意味するとして定義する。幾つかの遺伝子治療ベクターが文献に記載されており、「慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞のアデノウイルスベクター感染」と題されたキャントウェル等、Blood（印刷中(1996)）に記載された遺伝子治療ベクターが包含される。このようなベクターは、例えば、P.J.ウォルおよびI.R.ハート、Ann.Oncol.6追補1:73(1995)；K.T.スミス、A.J.シェパード、J.E.ボイドおよびG.M.リース、Gene Ther.3:190(1996)；M.J.クーパー、Semin.Oncol.23:172(1996)；E.ショーネシー、D.ルー、S.チャタージー、およびK.K.ウォング、Semin.Oncol.23:159(1996)；J.C.グロリオーソ、N.A.デルーカ、およびD.J.フィンク、Annu.Rev.Microbiol.49:675(1995)；T.R.フロッテおよびB.J.カーター、Gene Ther.2:357(1995)；V.ランドリアナリソン−ジュートゥコフおよびM.ペリコーデット、Biological.23:145(1995)；D.B.コーン、Curr.Opin.Pediatr.7；56(1995)；R.G.ヴァイルおよびS.J.ラッセル、Br.Med.Bull.51:12(1995)；S.J.ラッセル、Semin.Cancer Biol.5:437(1994)；ならびにM.アリ、N.R.レモイン、およびC.J.リング、Gene Ther.1:367(1994)に記載されている。ここに記載した全ての参考文献は、引用して本明細書の一部とする。
II．補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝的ベクターおよび構築物
Ａ．補助分子リガンド遺伝子
本発明の一つの態様において、好ましい遺伝子治療ベクターは補助分子リガンド遺伝子を含む。この補助分子リガンド遺伝子は、いかなる供給源から誘導してもよく、ヒトの作成したもので天然に現れない分子を包含することができる。本発明は、マウスＣＤ４０リガンド、ヒトＣＤ４０リガンド、Fasリガンド、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、神経成長因子、ＣＤ７０、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）およびキメラ補助分子リガンドをコードしている遺伝子を包含する、腫瘍壊死ファミリー（TNF）内の分子をコードしている遺伝子から誘導される補助分子リガンド遺伝子を企図している。一つの補助分子リガンドのヌクレオチド配列、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の少なくとも一つの型の配列を決定し、配列番号１として掲載した。本発明は、配列番号１に存在する配列とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、本発明において有用な、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、様々な異なる系統のマウスから分離できることが理解できるであろう。
ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、配列番号２として示す。本発明は、配列番号２とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、本発明において有用な、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個体に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。本発明は、キメラ補助分子リガンドまたはキメラ補助分子リガンド遺伝子の一部としての、ヒトＣＤ４０リガンドおよび／またはヒトＣＤ４０リガンド遺伝子のドメイン、サブドメイン、アミノ酸またはヌクレオチド配列の用途を企図している。
ウシＣＤ４０リガンド遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、配列番号８として示す。本発明は、配列番号８とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ウシＣＤ４０リガンド遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された動物に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
ヒトＴＮＦαおよびヒトＴＮＦβのヌクレオチド配列を決定し、各々配列番号９および１０として示す。本発明は、ヒトＴＮＦαまたはヒトＴＮＦβ（各々配列番号９および１０）のいずれかとホモローガスであって、故にこれらの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。本発明において有用な、ヒトＴＮＦαおよびヒトＴＮＦβ遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子は、その遺伝子が分離された個々の個体に応じて異なるかも知れず、このような変異は、ユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得る。
ブタＴＮＦαおよびＴＮＦβのヌクレオチド配列を決定し、配列番号１１として示す。本発明は、配列番号１１とホモローガスであって、故にこれらの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ブタＴＮＦαおよびＴＮＦβ遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個々の動物に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
マウスＴＮＦα遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、配列番号１２として示す。本発明は、配列番号１２とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、マウスＴＮＦα遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個体に応じて異なるかも知れず、これらの変異がユニークな補助分子遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
ヒトFasリガンドおよびマウス(C57BL/6)Fasリガンドのヌクレオチド配列を決定し、それぞれ配列番号１３および１４として示す。マウスBalb/cFasリガンドのヌクレオチド配列は配列番号３１として示す。本発明は、配列番号１３、１４、および３１のいずれかとホモローガスであって、故にこれらの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ヒトFasリガンドまたはマウスFasリガンド遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個々のヒトまたは動物に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
ヒトＣＤ７０遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、配列番号１５として示す。マウスＣＤ７０遺伝子配列もまた決定し、配列番号３６として示したが、これはテッセラー等、J.Immunol.159:4959-65(1997)に記載された。本発明は、配列番号１５または３６とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ヒトＣＤ７０遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個体に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
ヒトＣＤ３０リガンド遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、配列番号１６として示す。本発明は、配列番号１６とホモローガスであって、故にこの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ヒトＣＤ３０リガンド遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個体に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
本発明はさらに、メッセンジャーＲＮＡの選択的スプライシングによって起こる、本明細書で提供される補助分子リガンド遺伝子のヌクレオチド配列の変異および変異体をも企図している。この、メッセンジャーＲＮＡの選択的スプライシングは、１またはそれ以上の所望によるアミノ酸セグメントをコードしているかも知れないさらなるヌクレオチド配列を挿入し、次いでこれは、コードされている補助分子リガンドがさらなる性質または機能を持つようにさせる。
ヒトおよびマウス４−１ＢＢＬのヌクレオチド配列を決定し、それぞれ配列番号１７および１８として示す。本発明は、配列番号１７または１８のいずれかとホモローガスであって、故にこれらの配列と低緊縮条件下でハイブリダイズする任意の補助分子リガンド遺伝子の用途を企図する。当業者には、ヒト４−１ＢＢＬ遺伝子を包含する補助分子リガンド遺伝子が、その遺伝子が分離された個体に応じて異なるかも知れず、このような変異がユニークな補助分子リガンド遺伝子の生成に有用であると立証し得ることが理解できるであろう。
本発明はさらに、以下の遺伝子：ウシＴＮＦ−α（配列番号２１）、マウスＣＤ４０リガンド（配列番号２２）、ヒト神経成長因子β（配列番号２３）、マウス神経成長因子（配列番号２４）、ラットFasリガンド（配列番号２５）、ヒトＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）（配列番号４１、ジェンバンク受理番号Ｕ３７５１８）、マウスＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）（配列番号４２、ジェンバンク受理番号Ｕ３７５２２）、マウスＣＤ３０リガンド（配列番号４３）、ヒト４−１ＢＢＬ（配列番号１７）、およびマウス４−１ＢＢＬ（配列番号４４および１８）、によりコードされている任意のドメイン、サブドメイン部分、またはアミノ酸配列を含むキメラ補助分子をも企図している。本発明はまた、これらの配列とホモローガスなアミノ酸配列をコードしている遺伝子を利用するキメラ補助分子をも企図する。
本発明は、或る補助分子リガンド遺伝子またはその他の遺伝子から誘導されたヌクレオチド配列と機能的に結合した、これとは異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導されたヌクレオチドセグメントを含む、キメラ補助分子リガンド遺伝子を企図する。
例えば、異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導された少なくとも１個のさらなる別の遺伝子セグメントと機能的に結合した、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の１セグメントを含む、キメラ補助分子リガンド遺伝子が企図される。異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導された特定のセグメントの大きさは、数個のアミノ酸をコードしているヌクレオチド配列から、補助分子リガンドのサブドメイン、補助分子リガンドのドメイン、または補助分子リガンドの１ドメイン以上まで異なっていてよい。本発明に係るその他のキメラ補助分子は、天然に存在する補助分子リガンドの一部として見出されないアミノ酸セグメントをコードしているヌクレオチドが挿入されている、補助分子リガンド遺伝子を含む。このアミノ酸セグメントは、人工的に作り出すことができ、または天然に見出されるタンパクから誘導することができる。このキメラ補助分子リガンド遺伝子はキメラアミノ酸配列をコードしており、よって、コードされているキメラ補助分子リガンドは、その異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導された個々のセグメントに見出される性質に加えてユニークな性質を持つことができる。キメラ補助分子リガンド遺伝子は、このキメラ遺伝子の組み立てに使用された補助分子リガンドから誘導された性質を有する補助分子リガンドをコードしているかも知れない。
腫瘍壊死因子ファミリーの一員である補助分子リガンド遺伝子の各々は、幾つかのドメインから成る類似の二次構造を持っている。このドメイン構造は、補助分子リガンド遺伝子の５’領域によりコードされている第一ドメインを含んでいる。第二ドメイン（ドメインII）は、細胞膜にまたがっているアミノ酸を含み、故にトランスメンブランドメインと呼ばれる。第三ドメイン（ドメインIII）は、近位細胞外ドメインであり、これらのアミノ酸は細胞膜の近位に発見されたアミノ酸である。第四ドメイン（ドメインIV）は、補助分子リガンド遺伝子の３’末端によりコードされており、遠位細胞外ドメインと呼ばれている。この遠位細胞外ドメイン（ドメインIV）は一般に腫瘍壊死因子ファミリー分子の可溶性型を形作っている。ヒトＴＮＦのＸ線結晶構造に基づき、この補助分子ＣＤ４０リガンドの予想される二次構造が、M.ペイトゥシュおよびC.ヨンゲニール、International Immunology、5:233-238(1993)によってこれらの分子のドメイン構造と共に推測された。腫瘍壊死因子ファミリーのその他の成員の二次構造を、ヒトＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドドメイン構造の比較と共に、コンピューター解析を用いて推測した。第１表に、幾つかの補助分子リガンド遺伝子のドメイン境界を示す。これら補助細胞分子リガンドの幾つかについてのドメインの模式図を第１図に示す。ドメインの境界の割当てはおよそのものであり、当業者には、これらの境界が異なっているかも知れないが、それでも尚有用なドメインの同定を提供することが理解できるであろう。
0004015201.tif 000002
当業者には、典型的なキメラ補助分子遺伝子は、例えばマウスＣＤ４０リガンド遺伝子およびヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の間のドメインまたはサブドメインセグメントを交換することによって生成される遺伝子を包含することが理解できるであろう。例えば、キメラ補助分子遺伝子は、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子のドメインＩをマウスＣＤ４０リガンド遺伝子のドメインII−IVと機能的に結合させることによって組み立てることができる。当業者には、第Ｉ表に規定されている補助分子を用いて作り得た様々なキメラ補助分子リガンド遺伝子が理解できるであろう。本発明はまた、第Ｉ表には示されていないが類似のドメイン構造を有することが示されているキメラ補助分子をも企図している。例えばマウスＣＤ４０リガンド遺伝子およびヒトＣＤ４０リガンド遺伝子または第二のマウスＣＤ４０リガンド遺伝子の間で、より小さなセグメント（サブドメインセグメント）が交換されている、その他のキメラ遺伝子もまた企図されている。当業者には、補助分子をコードしている遺伝子は、少なくとも、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子（配列番号１）によりコードされているマウスＣＤ４０リガンドのような補助分子リガンドの様々な機能的セグメントに対応する遺伝子セグメントを持っていることが理解できるであろう。第Ｉ表で規定したヌクレオチド境界はマウスＣＤ４０リガンド遺伝子（配列番号１）について規定したものとはかなり相違しているかも知れないが、それでも尚、本発明において有用なドメインを定義している。
一つの好ましい態様において、キメラ補助分子リガンド遺伝子は、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子のトランスメンブラン（ドメインII）をコードしているヌクレオチドおよび細胞質ドメイン（ドメインＩ）をコードしているヌクレオチドに機能的に結合した、ヒトＣＤ４０リガンドの細胞外ドメイン（ドメインIIIおよびIV）をコードしているヌクレオチドを含む。このような好ましいキメラ補助分子の例を第２図に示す。このような遺伝子のためのヌクレオチド配列の例は配列番号７である。本発明に係るその他のキメラ補助分子リガンド遺伝子では、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞外ドメイン（ドメインIIIおよびIV）をコードしているヌクレオチドが、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子のトランスメンブラン（ドメインII）および細胞質ドメイン（ドメインＩ）をコードしているヌクレオチドに機能的に結合していてよい。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号３である。本発明に係るその他の好ましいキメラ補助分子リガンド遺伝子では、ヒトＣＤ４０リガンドの細胞外ドメイン（ドメインIIIおよびIV）およびトランスメンブランドメイン（ドメインII）をコードしているヌクレオチドが、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞質ドメイン（ドメインＩ）をコードしているヌクレオチドと結合している。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号６である。本発明の企図するその他のキメラ補助分子遺伝子は、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞質ドメインをコードしているヌクレオチドに機能的に結合した、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞外ドメイン（ドメインIIIおよびIV）およびトランスメンブランドメイン（ドメインＩＩ）をコードしているヌクレオチドを含む。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号５である。本発明によってその他のキメラ補助分子リガンド遺伝子が企図されるが、その遺伝子においては、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞外ドメイン（ドメインIIIおよびIV）が、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の細胞質ドメイン（ドメインＩ）に機能的に結合しているマウスＣＤ４０リガンド遺伝子のトランスメンブランドメイン（ドメインＩＩ）に機能的に結合している。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号４である。
当業者には、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子およびマウスＣＤ４０リガンド遺伝子を包含する任意の補助分子リガンド遺伝子の、ドメインまたはその他の選択されたセグメントを利用する、より多くの組み合わせが可能であることが理解できるであろう。このようなさらなるキメラ補助分子遺伝子は、以下の遺伝子：ドメインＩをコードしているヌクレオチドが特定の補助分子リガンド遺伝子から選択され、そして直接またはさらなるヌクレオチド配列によって、特定の補助分子リガンド遺伝子由来のドメインIIをコードしているヌクレオチドに機能的に結合している、キメラ補助分子遺伝子、を包含する。次いでこれらのドメインは、直接またはさらなるヌクレオチド配列により、特定の補助分子リガンド遺伝子由来のドメインIIIをコードしているヌクレオチドに機能的に結合するであろう。次にこの分子は、直接またはさらなるヌクレオチド配列により、特定の補助分子リガンド遺伝子のドメインIVをコードしているヌクレオチドに、機能的に結合するであろう。この方法で組み立てられたキメラ補助分子リガンド遺伝子は、これらの位置に異なったアミノ酸を提供するのに役立つさらなるヌクレオチドを、いずれかの末端またはドメインの間に有するかも知れない。当業者には、これら特定の組み合わせは例示に過ぎず、或る補助分子のドメイン全体より小さい部分をコードしているヌクレオチドを含む遺伝子セグメントが、異なった補助分子間で交換されている、他の多数の組み合わせが考えられるということが理解できるであろう。
本発明はさらに、Fasリガンド、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、神経成長因子またはＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）から誘導される遺伝子セグメントと組み合わせた、マウスまたはヒトＣＤ４０リガンドの遺伝子セグメントを含む、キメラ補助分子リガンド遺伝子をも企図する。特に有用なキメラ補助分子リガンド遺伝子は、異なった補助分子リガンド遺伝子から誘導された遺伝子セグメント（群）と共に、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子から誘導された少なくとも１個の遺伝子セグメントを含む。
本発明はさらに、作られた補助分子が、特定の細胞上での該補助分子または補助分子タンパクの発現レベルを調節するための翻訳後機構により、使用されるキメラ補助分子内部のアミノ酸を取り除くよう修飾されているようなキメラ補助分子リガンド遺伝子を企図する。キメラ補助分子またはキメラ分子から除去される部位は、メタロチオネインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼおよび特異的または非特異的にアミノ酸配列を認識するその他のプロテアーゼを包含する、プロテアーゼ開裂部位を作り上げるアミノ酸または部位を包含し得る。特に好ましい態様では、翻訳後調節機構に用いられる、可能性あるまたは実際の認識部位を作り上げているドメインIIIのアミノ酸が修飾されまたは除去される。
本発明はまた、ドメイン、サブドメインフラグメントまたはその他のアミノ酸残基が或る補助分子リガンド遺伝子から取り去られ、同じ種由来の第二の補助分子リガンド遺伝子へと動かされた、キメラ補助分子リガンド遺伝子をも企図している。例えば、この特別の態様では、ＣＤ４０リガンド分子由来のヒトドメインII、およびヒトドメインIが、例えば、ＣＤ４０リガンド分子のヒトドメインIVと機能的に結合した、ＣＤ７０分子由来のヒトドメインIIIをコードしているヌクレオチドに機能的に結合しているかも知れない。故にこのキメラ補助分子は、ヒトＣＤ４０ＬドメインＩ、IIおよびIVならびにヒトＣＤ７０ドメインIIIを含んでいる。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号１９である。当業者には、異なった補助分子リガンド遺伝子からの同じ種由来のドメインを用いたこのような幾つかの組み合わせが、全て特定の活性および性質を持っているであろう幾つかのキメラ補助分子遺伝子を作り出すことができるということが理解できるであろう。
本発明は、特定の補助分子リガンド遺伝子のドメインIIIが異なる補助分子リガンド遺伝子由来のドメインIIIに置き換えられたキメラ補助分子リガンド遺伝子を企図している。一つの特に好ましい態様では、マウスドメインIIIを用いてＣＤ４０リガンド分子中のヒトドメインIIIを置き換えた。故にこのキメラ補助分子は、ヒトＣＤ４０ＬドメインＩ、ヒトＣＤ４０ＬドメインII、マウスＣＤ４０ＬドメインIII、およびヒトＣＤ４０ＬドメインIVを含む。このような遺伝子のヌクレオチド配列の例は配列番号２０である。
本発明はさらに、補助分子遺伝子のドメインまたは他のアミノ酸配列の一部の内部にまたはその代わりに挿入した、人造のアミノ酸配列を含む、キメラ補助分子の用途をも企図する。これら人造のアミノ酸セグメントは、その補助分子に特定の機能を与える、または望ましくない機能を除去するために用いられる、任意のアミノ酸配列を選択することにより、作り出すことができる。これら人造のアミノ酸セグメントは、それらの特定の人造アミノ酸セグメントのコード化に必要なヌクレオチド配列を、所望の位置で、補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子中に挿入することによって作成する。さらに、このキメラ補助分子リガンド遺伝子は、他の分子のサブドメインセグメントまたはアミノ酸が所望の目的のために変えられている小セグメントを含むヌクレオチドセグメントを含むことができる。サブドメインヌクレオチドセグメントの使用は、本発明に係るキメラ補助分子の中に、他の分子から誘導された短いアミノ酸配列を導入することを可能にする。補助分子リガンドへのこのような短いサブドメインセグメントの組み込みまたはアミノ酸変化は、その分子への望ましい特徴の導入または望ましくない特徴の除去を可能にする。
補助細胞分子内のドメイン構造の同定は当分野で良く知られており、一般に、その補助分子内部のシステイン残基の同定、および、これに続く様々なシステイン残基間のジスルフィド結合のマッピングを必要とする。補助分子の様々なサブドメインセグメントのマッピングは当分野で良く知られており、その補助分子のアミノ酸配列の分析を含み、また一般に、予想されるアルゴリズムを使用した組織壊死因子の結晶構造の比較と、それによるキメラ補助分子または補助分子の推定構造の創出を含む。次にこの、これらの分子の推定構造を使用して、さらなるキメラ補助分子の組み立てに使用する分子の様々なサブドメイン部分を選択することができる。このようなマッピング研究の例は、M.ピトゥシュおよびC.V.ヨンゲニール、International Immunology、5:233-238(1993)による研究ならびに第１図に示す分析を包含する。
本発明はさらに、末端切除されて天然の補助分子リガンドに見出されるアミノ酸配列の全長より短い部分をコードしている補助分子リガンド遺伝子およびキメラ補助分子リガンド遺伝子をも企図する。これらの末端切除は補助分子リガンド遺伝子の性質を改変するかも知れないが、幾つかの同定されている活性は温存される。このような末端切除は補助分子から遺伝子セグメントまたは遺伝子セグメント群を除去することによってなされ、典型的には補助分子リガンドとその補助分子との結合に直接関与しないドメインをコードしているヌクレオチドを除去することによって実施されるであろう。これら末端切除された補助分子リガンド遺伝子またはキメラ末端切除補助分子リガンド遺伝子は、その末端切除補助分子遺伝子から取り除かれたドメインに取って代わるアミノ酸セグメントまたはドメインをコードしているさらなる遺伝子セグメントを含むかも知れない。しかし、末端切除により除去された補助分子の一部分のこのような置換は必須ではない。
本発明に係るキメラ補助分子遺伝子は、或る補助分子リガンド遺伝子由来の特定のヌクレオチド配列を、同じまたは異なった補助分子リガンド遺伝子から誘導された相異なるヌクレオチド配列に機能的に結合させるための、標準的遺伝子工学方法を用いて組み立てることができる。さらに、標準的遺伝子工学法を使用して、人造のヌクレオチド配列またはサブドメインヌクレオチド配列を、キメラ補助分子リガンド遺伝子中に挿入することができる。当業者には、このようなキメラ補助分子遺伝子を作成するために様々な方法が利用できることが理解できるであろう。例えば、「ＳＯＥＮ」として知られる遺伝子変換法を使用して、異なるキメラ補助分子から誘導されたヌクレオチドセグメントを含むキメラ補助分子遺伝子を作成することができる。この遺伝子変換法を使用する方法は当分野で良く知られており、例えばR.M.ホートン、Mol.Biotechnol.3:93(1995)；S.A.アリおよびA.シュタインカセラー、Biotechniques、18:746(1995)；J.P.ヴィラーダガ、E.ディ・パオロ、およびA.ボレン、Biotechniques、18:604(1995)；K.マジャムダー、F.A.ファター、A.セルヴァパンディヤン、およびR.K.バトナガー、PCR Met hods Appl.4:212(1995)；E.ボールズおよびT.ミオスガ、Curr.Genet.28:197(1995)；A.N.ヴァレージョ、R.J.ポグリス、およびL.R.ピース、PCR Methods Appl.4:S123(1994)；T.ヘンケルおよびP.A.バウエル、Anal.Biochem.214:351(1993)；D.C.テシアーおよびD.Y.トマス、Biotechniques、15:498(1993)；H.G.モリソンおよびR.C.デスロシアース、Biotechniques、14:454(1993)；R.C.カドウェルおよびG.F.ジョイス、PCR Methods Appl.2:28(1992)；ならびにJ.スタッパート、J.ウィルシング、およびR.ケムラー、Nucleic Acids Res.20:624(1992)に記載されている。これとは別に、当業者には、部位特異的突然変異誘発を使用して、特定のヌクレオチド配列中に変化を導入し、本発明に係るキメラ補助分子遺伝子を直接作成または間接的に使用して作成できることが理解できるであろう。例えば、バイオラド・ラボラトリーズの提供する突然変異原キットをこのキットの中に記載された方法およびプロトコルと共に使用して、ヌクレオチド配列に所望の変化を作り出すことができる。これらの方法は、クンケル、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:488-492(1985)およびクンケル等、Meth.Enzol.Mol.154:367-382(1987)により最初に記載された。本明細書に記載され且つ当分野で知られている、部位特異的突然変異誘発プロトコルを使用することにより、熟練した研究者は、変化したアミノ酸配列をもたらす、またはアミノ酸配列は温存されるが遺伝子内に所望の制限酵素認識配列を導入する、個別的なヌクレオチド変化を誘導することができる。次いでこの新しい制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いてその遺伝子をその特定の位置で切り取り、それを、もう一つの補助分子リガンド遺伝子の遺伝子またはセグメントに使用する。これらの方法に加えて、当業者には、キメラ補助分子リガンド遺伝子の全体を、当分野で既知の合成法を用いて合成することができる。この方法は、その当業者がキメラ補助分子リガンド遺伝子のヌクレオチド配列を作成し、その配列を、そのような遺伝子を合成することのできる仲間に提供しさえずればよい。
Ｂ．遺伝子構築物
本発明は、様々な型の遺伝的ベクターに存在する補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子の使用を企図している。遺伝的ベクターとは、もう一つのＤＮＡセグメントを挿入して、このさらなるＤＮＡセグメントが複製するようにさせる、細胞内で自立的複製のできるＤＮＡ分子を指す。そのベクターに入っている遺伝子を発現することのできるベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。したがって、本発明に係る遺伝的ベクターおよび発現ベクターは、天然では通常一緒に見出されない少なくとも二つのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子である。
本発明において有用な遺伝的ベクターは、所望により、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列と機能的に結合した補助分子リガンドをコードしている補助分子リガンド遺伝子を含む。このような調節配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
特に有用な調節配列は、種々の哺乳動物、ウイルス、微生物、および昆虫遺伝子由来のプロモーター領域を包含する。このプロモーター領域は、その遺伝子の転写の開始を指令し、そして補助分子リガンド遺伝子を含むＤＮＡの全ての転写をもたらす。有用なプロモーター領域は、ラウス肉腫ウイルス（RSV）−長い末端反復配列（LTR）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）エンハンサー／プロモーター領域ｌａｃプロモーター、およびアデノウイルスから分離したプロモーターを包含し、当業者の知悉する他のいかなるプロモーターも、真核生物、原核生物、ウイルス、または微生物細胞での遺伝子発現に役立つものと理解されるであろう。真核生物細胞内で遺伝子およびタンパクを発現するのにとりわけ役立つその他のプロモーターは、哺乳動物細胞プロモーター配列およびエンハンサー配列、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、サルウイルス４０(SV40)、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導されるものを包含する。典型的にはＳＶ４０のようなウイルスのウイルス複製起点に隣接して見出される、ウイルスの初期および後期プロモーターが、特に有用である。発現ベクターに使用される種々のプロモーターの例は、オキアマおよびベルグ（Mol.Cell.Biol.3:280、1983）により記載されており、ｐＭＬＳＶＮ ＳＶ４０はコスマン等、Nature、312:768(1984)に記載されている。当業者には、特定の有用なプロモーターの選択は、そのセルライン、および、特定のセルライン内部で補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子を発現させるために使用する遺伝子構築物についての、他の様々なパラメータに依存することが理解できるであろう。さらに、当業者は、本発明において有用となるに充分高いレベルで標的細胞中で遺伝子を発現させることが知られているプロモーターを選択するであろう。
本発明に係る遺伝的ベクターおよび発現ベクターは、所望により、発現ベクターから生成されるメッセンジャーＲＮＡの、タンパクへの効率的な翻訳を可能にするリボゾーム結合部位、補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子に機能的に結合していてよい種々のシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列、を包含する、種々のさらなる調節配列を含むことができる。シグナルペプチドは、もし存在するならば、翻訳融合ポリペプチドの細胞外分泌の改善を可能にする前駆体アミノ酸として発現される。
故に本発明の企図する遺伝子構築物は、プロモーター配列またはプロモーターおよびエンハンサー配列のいずれかと機能的に結合し、さらにメッセンジャーＲＮＡの終止およびポリアデニル化を指令するポリアデニル化配列に機能的に結合した、上記補助分子リガンド遺伝子の様々な型を包含する。本発明に係る遺伝子構築物は、所望の細胞内部でのその構築物の効率的な複製および発現を可能にするその他の遺伝子配列を含むであろう事が企図される。このような配列は、天然補助分子リガンド遺伝子から誘導される、または例えばウイルス遺伝子から誘導される、イントロンを包含し得る。
本発明はさらに、直接哺乳動物細胞に感染して所望の補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子をその細胞内に導入することのできる、遺伝子治療ベクターをも企図する。これらの遺伝子治療ベクターは、動物または患者から分離した細胞を直接感染させるのに役立ち、または、動物または患者の内部に直接導入し、それによりその動物または患者内部の所望細胞を直接感染させることができる。
遺伝子をうまく移動させて所望の外来ＤＮＡ配列の発現をもたらすことのできる数多くの型の遺伝子治療ベクターが開発され、文献に記載されてきた。例えば、Current Comm.Mol.Biol.、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1987)の「哺乳動物細胞のための遺伝子移動ベクター」と題された論文。さらに、燐酸カルシウムトランスフェクション（ベルマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:7176(1984)）、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合（ディーンズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:1292(1984））、電気穿孔、リポソーム融合、ポリブレントランスフェクションおよび細胞膜のレーザー微穿孔による遺伝子の直接移動を包含する、多数の技術を用いるトランスベクションによって、裸のＤＮＡを、ヒトの細胞を包含する真核生物細胞中に物理的に導入することができる。さらに、当業者には、ＤＮＡを、それが細胞のゲノムに統合され、所望遺伝子の発現を可能にするように細胞内にうまく導入することのできるいかなる技術も、本発明に役立つであろう事が理解できるであろう。
特に、遺伝子のデリバリーのための組換え感染性ウイルス粒子を利用する遺伝子治療ベクターが広く記載されてきた。例えば、S.L.ブロディーおよびR.G.クリスタル、Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90(1994)；A.スリヴァスタヴァ、Blood.Cells、20:531(1994)；D.ジョリー、Cancer Gene Ther.1:51(1994)；S.J.ラッセル、Eur.J.Cancer、30A:1165(1994)；J.K.イー、T.フリードマン、およびJ.C.バーンズ、Methods Cell Biol.43PtA:99(1994)；K.A.ボリス-ローリーおよびH.M.テミン、Curr.Opin.Genet.Dev.3:102(1993)；P.トルストシェヴ、Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.33:573(1993)；およびB.J.カーター、Curr.Opin.Biotechnol.3:533(1992)を参照されたい。本発明は、補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することにより本発明の所望の方法を実施するための遺伝子治療ベクターの用途を企図している。多くのウイルスベクターが定義されて遺伝子治療ベクターとして使用され、それらには、サルウイルス４０(SV40)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスから誘導されるウイルスベクターが包含される。当業者には、有用な遺伝子治療ベクターは、補助分子リガンドをコードしているＤＮＡを標的細胞中に直接導入し、そのＤＮＡを細胞に存続させて補助分子リガンドをその細胞内で所望のやり方で発現させるようにできるベクターであることが理解できるであろう。
本発明に係る遺伝子治療ベクターは、補助分子リガンド遺伝子を、ヒトの細胞を包含する様々な哺乳動物細胞内部に導入するのに役立つ。遺伝子治療ベクターに感染する個々の細胞は、ベクターの様々な特性に依存し、係るベクターを用いて本発明に係る補助分子リガンド遺伝子を、造血またはリンパ系幹細胞、抗原提示細胞、胚幹細胞、および、ＣＤ４０をその表面に有する細胞を包含する、免疫系の中で抗原提示可能なその他の細胞の中に導入することができる。さらに、このような遺伝子治療ベクターは、補助分子リガンド遺伝子をコードしている遺伝子を、ヒト新生物細胞、例えばリンパ腫、白血病、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＭＬ、ＣＭＭＬ、乳癌、肺癌、卵巣癌または、抗原提示細胞としてまたはバイスタンダーである抗原提示細胞を刺激することのできる細胞として働くことのできる任意の腫瘍の中に導入することができる。さらに、企図される遺伝子治療ベクターを使用して、免疫系に抗原を提示できるよう作り替えた細胞の中に、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子を導入することができる。
III．補助分子リガンドまたはキメラ補助分子リガンドをコードしている遺伝子構築物を含む細胞
本発明はまた、本発明に係る遺伝子構築物を含む様々な細胞を企図している。これらの細胞は補助分子リガンド遺伝子をコードしている構築物を含んでおり、よって、上記II.B.項に記載の様々な遺伝的要素を含んでいる。これらの細胞は、微生物細胞、真核生物細胞、昆虫細胞、およびヒト細胞を包含する種々の哺乳動物細胞であってよい。本発明の好ましい態様では、これらの細胞は、ヒトの新生物細胞を包含する様々な新生物細胞を包含する。これらの新生物細胞はいかなる細胞型であってもよく、免疫系の細胞、およびその他の血液細胞を包含する。免疫系の中で抗原提示細胞として機能できる新生物細胞、または本発明に係るトランスジェニック補助細胞分子の発現によってバイスタンダーの抗原提示細胞を刺激することのできる新生物細胞が特に好ましい。典型的には、免疫系に抗原を提示するよう機能できるこれらの新生物は、補助分子、例えばＣＤ４０分子を細胞表面に持っている、または持っていた。一般に、これらの細胞は、本来免疫系に抗原提示することができるが、本発明は、本来免疫系に抗原を提示できるのではなく、その細胞が免疫系に抗原を提示できるよう遺伝的に作り替えた細胞の中に、補助分子リガンド遺伝子を導入することをも企図している。典型的には、これらの細胞は、新生物的となった、様々な既知の細胞型、例えば単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、交互嵌入細胞、濾胞樹状細胞またはクッパー細胞等を包含する。さらに、本発明はまた、本明細書に記載した遺伝子構築物を含む、種々の癌腫、胸部、卵巣および肺癌由来の細胞を企図するものである。別の好ましい態様では、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子を細胞の中に入れ、これを、腫瘍床または関節のような処置部位に注射することができる。例えば、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子を線維芽細胞中に挿入し、その細胞表面でこの補助分子リガンドを発現させることができる。次いでこの線維芽細胞を処置部位に注射して、それらの細胞表面に補助分子リガンドが存在することに起因する所望の免疫効果を惹起する。これらの細胞は、その処置部位に存在する別の免疫細胞（バイスタンダー細胞）を刺激する。このようにしてこの工程は免疫系に所望の効果を生む。
IV．補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝的ベクターおよび構築物を利用する方法
本発明は、補助分子リガンド遺伝子をコードしている遺伝子をヒトの細胞中に導入し、その結果、当該遺伝子によりコードされている補助分子リガンドがそれらの細胞表面で発現されるようにすることを含む方法を使用する、ヒト細胞の免疫反応姓を変える方法を企図する。本発明は、免疫系の標的として、または外来標的に応答する免疫系の一部として、免疫反応に参加する、任意のヒト細胞にとって有用である。最終結果が、補助分子リガンド遺伝子が所望細胞内に導入されるということである、極めて様々な方法が企図される。これらの方法はエクスビボ法、インビボ法、および、ＤＮＡ、遺伝的ベクターまたは遺伝子治療ベクターを動物またはヒトに注射すること（任意の動物またはヒトに存在する腫瘍床の中への直接注入を包含する）を含む様々な他の方法を包含する。
補助分子リガンド遺伝子が導入されるべき細胞を動物または患者から分離し、次いでその遺伝子を、適当な方法を用いてそれら分離された細胞内に導入する、エクスビボ法が企図される。有用なエクスビボ法の例は、例えばS.E.レイパー、M.グロスマン、D.J.レイダー、J.G.トーエン、B.J.クラーク、D.M.コランスキー、D.W.ミュラー、およびJ.M.ウィルソン、Ann.Surg.223:116(1996)；Lルー、R.N.シェン、およびH.E.ブロクスメイアー、Crit.Rev.Oncol.Hematol.22:61(1996)；O.N.コック、J.A.アレイ、K.リー、B.M.デイヴィス、J.S.リース、およびS.L.ガーソン、Semin.Oncol.23:46(1996)；L.J.フィッシャーおよびJ.レイ、Curr.Opin.Neurobiol.4:735(1994)；ならびにB.R.ゴールドシュピール、L.グリーンおよびK.A.カリス、Clin.Pharm.12:488(1993)に記載されている。Ｄ．ディロー等はBlood 90:1927-1933(1997)に、Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（ALL）を処置するためにＣＤ４０Ｌ活性化細胞を使用する方法を記載している。彼等は、ＣＤ４０Ｌをコードしているレトロウイルスベクターに感染した線維芽細胞と共に白血病細胞を培養し、次いでこの細胞混合物をマウスに注射した。このようなアプローチは、ヒトに実施した場合、補助分子リガンドを発現する別のセルラインにより治療細胞をインビトロで刺激するという点で、本明細書に企図される方法とは相違するであろう。J.L.シュルツ等はBlood、89:3806-3816(1997)で、前もってＣＤ４０Ｌ発現線維芽細胞と共に培養しておいたＦＬ Ｂ細胞にインビトロでＴ−ＴＩＬを暴露させることにより、濾胞性リンパ腫(FL)細胞に対し細胞毒性であるＴ−ＴＩＬ（腫瘍浸潤Ｔ細胞）を刺激する方法を記載している。彼等は、この方法で刺激されたＴ−ＴＩＬＳを患者に輸注する、養子免疫療法を提唱している。さらにこの方法は、補助分子を発現する別のセルラインで、輸注されるべき細胞をインビトロ刺激する必要がある。
補助分子リガンド遺伝子がそれら分離された細胞内にうまく導入されることが確実となるような任意選択の工程があればそれも含めて該遺伝子の導入が終わった後、この分離された細胞を、特定の部位にまたは患者の循環内に直接導入する。本発明の好ましい態様では、腫瘍マーカーまたは抗原がその細胞を同定するような分子を包含する細胞表面マーカーを使用して、これらの分子を特異的に患者から分離する。当業者には、このような分離法は良く知られており、且つ、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、篩い分け、カラムおよびその他の類似方法を包含する様々な形式を含む免疫選択といった方法を包含することが理解できるであろう。
本発明はさらに、最初に所望細胞を患者から分離することなく、補助分子リガンド遺伝子を動物またはヒト患者の体内で所望細胞中に導入することを企図する。遺伝子を、インビボまたは患者の体内で特定の細胞内に導入する方法は良く知られており、遺伝子治療ベクターの使用および動物または患者への様々な遺伝子構築物の直接注射を包含する。有用な方法の例は、I.ダンコおよびJ.A.ウォルフ、Vaccine、12:1499(1994)；E.ラズ、A.ワタナベ、S.M.バイアード、R.A.アイゼンバーグ、T.B.パー、M.ロッツ、T.J.キップス、およびD.A.カーソン、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4523(1993)；H.L.デイヴィス、R.G.ファーレン、およびB.A.デメネイクス、Hum.Gene Ther.4:151(1993)；S.スガヤ、K.フジタ、A.キクチ、H.ウエダ、K.タカクワ、S.コダマ、およびK.タナカ、Hum.Gene Ther.7:223(1996)；H.プレンティス、R.A.クロナー、Y.リー、L.ニューマン、およびL.キーデス、J.Mol.Cell Cardiol.28:133(1996)；C.スーブレイン、R.モウアワッド、O.リキセ、V.カルヴェス、A.グマーリ、O.ヴェローナ、M.ウェイル、およびD.カヤット、Eur.J.Cancer、32A:691(1996)；A.カス−アイスラー、K.リー、およびL.A.レインワンド、Ann.N.Y.Acad.Sci.772:232(1995)；R.P.デマッテオ、S.E.レイパー、M.アーン、K.J.フィッシャー、C.バーク、A.ラドゥ、G.ウィデラ、B.R.クレイター、C.F.バーカー、およびJ.F.マークマン、Ann.Surg.222:229(1995)；C.L.アディソン、Ｔ．ブラシアク、Ｒ．ラルストン、W.J.ミュラー、J.ゴルディー、およびF.L.グラハム、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:8522(1995)；U.R.ヘンジ、P.S.ウォーカー、およびJ.C.ヴォーゲル、J.Clin.Invest.97:2911(1996)；P.L.フェルグナー、Y.J.ツァイ、L.スーク、C.J.フィーラー、M.マンソープ、J.マーシャル、およびS.H.チェング、Ann.N.Y.Acad.Sci.772:126(1995)；ならびにP.A.ファース、A.シャメイ、およびL.ヘニゴーセン、Hybridoma、14:149(1995)に記載されている。典型的な適用においては、補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを患者の循環内に、または限局した部位に導入し、その遺伝子治療ベクターが所望の細胞に特異的に感染することを可能にさせる。別の好ましい態様では、遺伝子治療ベクターを、補助分子リガンド遺伝子が導入されるべき少なくとも幾つかの細胞を含んでいる、動物の腫瘍床に直接注射する。
本発明はさらに、プロモーターおよび補助分子リガンド遺伝子とこれに続くポリアデニル化配列を持っている遺伝子構築物由来のＤＮＡを、患者または動物に直接注射する事をも企図する。このような有用な方法の例は、R.G.ヴァイルおよびI.R.ハート、Ann.Oncol.5追補4:59(1994)に記載されている。この遺伝子構築物のＤＮＡは、動物または患者の筋肉またはその他の部位に直接注射し、または動物または患者の腫瘍床に直接注射する。別法として、少なくとも補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子構築物由来のＤＮＡを使用し、動物に直接注射する。
本発明の好ましい態様では、補助分子リガンド遺伝子を、細胞表面に補助分子を有しているヒト細胞を包含する細胞内に導入することによって、ヒト患者または動物の免疫反応または応答を変える。このような細胞には、ヒトの細胞、ヒト抗原提示細胞が包含され、所望によりこれらの細胞は、刺激することのできる細胞または細胞群の表面に補助分子を発現する能力を持つ新生物的抗原提示細胞であってよい。幾つかの態様において、補助分子リガンド遺伝子が導入されるべき細胞の表面に存在する補助分子の量は、極めて少なく、このように補助分子が少量であるのは、係る細胞表面の補助分子のダウンレギュレーションに起因する。幾つかの態様においては、補助分子リガンド遺伝子が導入される細胞は、少なくとも低レベルのＣＤ４０分子が細胞表面に存在するか、または、細胞表面にＣＤ４０リガンド分子を発現していたが、その発現が低下しまたは無くなってしまった細胞に由来している。
特定の細胞の免疫活性を変える好ましい方法は、ヒト細胞を包含する哺乳動物細胞に適用可能である。これらのヒト細胞は、ヒト新生物細胞、例えばヒトリンパ腫、白血病、ならびに胸部、肺および卵巣癌を包含するその他の悪性腫瘍を包含することができる。幾つかの好ましい態様では、この細胞は、ヒト患者の正常な抗原提示細胞、例えば単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、交互嵌入細胞、濾胞樹状細胞、クッパー細胞、およびその他の類似細胞である。好ましい態様において、そのような細胞は、本発明に係る補助分子が細胞内に導入される時に免疫活性の変化を獲得するリンパ球である。別の好ましい態様においては、細胞は、本発明に係る補助分子リガンド遺伝子が細胞内に導入される時にバイスタンダー抗原提示細胞を刺激することのできる、新生物または正常細胞であってよい。本発明はまた、本来免疫系に抗原を提示できない細胞を、補助分子をコードしている遺伝子を包含する、抗原提示に必要な分子をコードしている遺伝子を導入するよう遺伝的に作り替え、それによりこれらの細胞が人工的な抗原提示細胞として振る舞うようにできるということをも企図している。次いで補助分子リガンド遺伝子をこれら人工の抗原提示細胞中に導入することができる。例えば細胞増殖またはリンホカインの産生といった、特定の細胞が抗原提示細胞として機能できるか否かを決定するための様々な試験が文献で知られており、故に本発明においてこの点は容易に決定できる。
上記の正常なヒト細胞に加え、本発明はまた、所望により抗原提示細胞であってもよい様々な新生物または悪性細胞中に、補助分子リガンド遺伝子を導入することをも企図している。企図されるこのようなヒト新生物細胞は、白血病、リンパ腫、ＡＭＬ、ＡＭＭＬ、またはＣＭＭＬ、ＣＭＬ、ＣＬＬ、および、補助分子リガンドがその細胞内に導入される時にバイスタンダー抗原提示細胞を刺激することのできる任意の新生物細胞を包含する。さらに、抗原提示細胞として挙動できる、または挙動するよう作り替えられた、胸部、卵巣または肺癌細胞のような新生物細胞もまた企図される。しかしながら本発明に係る免疫調節は、個別に特定していないその他の悪性腫瘍にも適用可能であり、したがって、動物またはヒトの免疫系の中で抗原を提示できる任意の細胞の任意の腫瘍、または、補助分子リガンド遺伝子がそれらの細胞中に導入された後に抗原提示細胞として挙動できる、またはバイスタンダー抗原提示細胞を刺激できる任意の細胞を包含するであろう。一般にこれらの抗原提示細胞はその細胞表面に補助分子を持っている。
ヒトまたは動物細胞の免疫活性を変える本方法は、免疫活性の変化が望まれる細胞の中に補助分子リガンド遺伝子を導入することを企図している。本発明に役立つ遺伝子は、上記に特定した広範囲の補助分子リガンド遺伝子およびキメラ補助分子リガンド遺伝子を包含し、好ましい態様において、少なくともマウスＣＤ４０リガンド遺伝子の一部を包含する。特に好ましい態様では、本発明方法を用いて細胞内に導入される補助分子リガンド遺伝子は、免疫活性の変化が望まれる細胞の表面に存在する補助分子に対応するよう選択する。本発明の或る特定の適用において、細胞表面にＣＤ４０分子を発現する細胞の免疫活性は、ＣＤ４０リガンド分子、より好ましくはマウスＣＤ４０リガンド分子をコードしている遺伝子を導入することにより、達成する。
本発明はさらに、キメラ補助分子リガンド遺伝子である補助分子リガンド遺伝子を細胞内に導入することにより、ヒトまたは動物細胞の免疫活性を変化させることをも企図している。種々の有用なキメラ補助分子リガンド遺伝子が上記で同定され、且つ多岐にわたる分子を包含しており、それらのキメラ補助分子リガンド遺伝子の特異な性質を利用して標的細胞の免疫活性を変化させることができる。好ましい態様において、有用なキメラ補助分子リガンド遺伝子は、免疫活性の変化が望まれる細胞の表面に存在する補助分子に結合できる補助分子リガンドの少なくとも一部をコードしている遺伝子である。
免疫活性を変えるための本発明方法は、補助分子リガンドをコードし、故に補助分子リガンド遺伝子を含んでいる遺伝子治療ベクターを包含する、遺伝的ベクターおよび遺伝子構築物の使用を企図する。典型的には、本発明に係る遺伝子治療ベクターを包含する遺伝的ベクターおよび遺伝子構築物は、補助分子リガンド遺伝子と機能的に結合したプロモーターと、これに続くポリアデニル化配列を持っている。別の態様においては、唯一の必要条件は、本発明に係る遺伝的ベクター、遺伝子構築物、および遺伝子治療ベクターが、補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子を含んでいることである。
Ｖ．新生物を処置する方法
本発明はさらに、ヒトの新生物細胞中に、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を挿入し、その結果、該補助分子リガンドがその新生物細胞の表面で発現されるようにすることを含む、ヒトの新生物を処置する方法をも企図する。本発明は、インビボ、エクスビボの両方で、そして補助分子リガンドをコードしている遺伝子を含む様々なＤＮＡ分子を患者内部に直接注射することによって、ヒトの新生物を処置することを企図する。しかし、最低限、ヒトの新生物を処置するための本発明方法は、それら新生物細胞が細胞表面に補助分子リガンドを発現するようなやり方で、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を新生物細胞中に挿入することを含む。これらの新生物細胞における補助分子リガンド遺伝子の発現は、免疫系を調節し、その新生物の縮小または排除をもたらす。
ヒトの新生物を処置する好ましい方法において、この方法はさらに、まずヒトの患者からヒト新生物細胞を取得し、次に、補助分子リガンドが新生物細胞の表面で発現されるよう、この分離したヒト新生物細胞中に、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を挿入する工程を含む。次に、その細胞表面に補助分子リガンドを持っているヒト新生物細胞を、その患者に輸注して戻す。当業者には、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を含む、変化したヒト新生物細胞を患者に輸注して戻すために、数多くの方法が適用可能であること、そしてこれらの方法は当分野で良く知られていることが理解できるであろう。
ヒト新生物を処置する、企図される方法は、リンパ腫、白血病、およびその他の悪性腫瘍を包含する多岐にわたるヒトの新生物に適用できる。好ましい態様において、ヒト新生物は、ヒト免疫系の抗原提示細胞を含む新生物であって、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、交互嵌入細胞、濾胞樹状細胞、クッパー細胞等を包含する。別の好ましい態様では、ヒト新生物は、白血病、リンパ腫、ＡＭＬ、ＡＭＭＬ、ＣＭＭＬ、ＣＭＬまたはＣＬＬ、肺癌、乳癌、卵巣癌およびその他の類似の新生物である。
本発明に係るヒト新生物を処置する方法で有用な遺伝的ベクター、遺伝子構築物および遺伝子治療ベクターは上に開示してあり、それらは、プロモーターが補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子と機能的に結合し、次にこれがポリアデニル化配列と機能的に結合している構築物を包含する。ヒト新生物を処置する方法は、本明細書に記載の遺伝子構築物、遺伝的ベクターおよび遺伝子治療ベクターの使用を企図する。さらに本発明は、補助分子リガンド遺伝子をコードしている少なくとも１個の遺伝子を含むＤＮＡの使用を企図する。この遺伝子はプロモーターおよびその他の調節配列を含んでいても含んでいなくてもよい。
本発明の好ましい態様では、ヒト新生物を含む細胞は、ヒト患者内部の腫瘍床と呼ばれる少なくとも一つの限定された部位に位置する。この腫瘍床は典型的には、腫瘍または新生物細胞を、腫瘍または新生物細胞に付随する幾つかの他の細胞と共に含んでいる。本発明は、補助分子リガンドが腫瘍細胞表面で発現され、それにより該細胞が免疫反応に参加するようにするため、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を患者の腫瘍床内部に注射することにより、腫瘍床に存在するこのようなヒト新生物を処置する方法を企図するものである。補助分子リガンドをコードしている遺伝子は、遺伝子治療ベクター、遺伝子構築物または遺伝的ベクターの一部として存在し得る。
好ましい態様において、補助分子リガンド遺伝子は、マウスＣＤ４０リガンド遺伝子の少なくとも一部を持っているキメラ補助分子リガンド遺伝子である。別の好ましい態様では、コードされている補助分子リガンドは、処置されるべきヒト新生物上に存在する補助分子に結合することができる。
本発明に係る処置方法で使用する種々の遺伝子治療ベクターは、ヒトの細胞に直接感染できるベクターを包含する。このようなベクターは文献に記載されており、本発明に記載した方法に容易に適用できる。
本発明は、S.E.レイパー等、Ann.Surg.223:116(1996)；L.ルー等、Crit.Rev.Oncol.Hematol.22:61(1996)；O.N.コック等、Semin.Oncol.23:46(1996)；L.J.フィッシャー等、Curr.Opin.Neurobiol.4:735(1994)；B.R.ゴールドシュピール等、Clin.Pharm.12:488(1993)；I.ダンコ等、Vaccine、12:1499(1994)；E.ラズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4523(1993)；H.L.デイヴィス等、Hum.Gene Ther.4:151(1993)；S.スガヤ等、Hum.Gene Ther.7:223(1996)；H.プレンティス等、J.Mol.Cell Cardiol.28:133(1996)；C.スーブレイン等、Eur.J.Cancer、32A:691(1996)；A.カス−アイスラー等、Ann.N.Y.Acad.Sci.772:232(1995)；R.P.デマッテオ等、Ann.Surg.222:229(1995)；C.L.アディソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:8522(1995)；U.R.ヘンジ等、J.Clin.Invest.97:2911(1996)；P.L.フェルグナー等、Ann.N.Y.Acad.Sci.772:126(1995)；P.A.ファース、Hybridoma、14:149(1995)；J.ヨヴァンディッヒ等、Hum.Gene Ther.6:603(1995)；C.H.エヴァンズ等、Hum.Gene Ther.7:1261の方法を包含する任意の型の遺伝子治療の使用を企図している。
VI．ワクチン接種の方法
本発明は、予め定められた生物に対して動物にワクチン接種する方法であって、所望の生物に対する免疫反応をその動物に惹起することのできる免疫原性動物抗原を含有するワクチンを、補助分子リガンドをコードしている遺伝子を含むベクターと共に動物に投与することを含む、方法を企図するものである。本発明はまた、所望の免疫反応を惹起することのできる、または特定の抗原に対する免疫反応を変えることのできる、免疫原性抗原をコードしている遺伝子を、補助分子リガンド遺伝子を包含する遺伝子を含んでいるベクターと共に、投与することを含む、動物にワクチン接種する方法をも企図する。この特別の態様においては、導入するベクターまたはベクター群は、所望の免疫原性抗原および所望の補助分子リガンドをコードしている。本発明はさらに、この免疫原性ペプチドまたはペプチド群をコードしている遺伝子（群）は、補助分子リガンドをコードしている遺伝子または遺伝子群と同じベクター上に存在していてよいということを企図する。
本発明に係るワクチン接種法は、例えばウイルス、細菌、真菌またはその他の生物といった、予め定められた任意の生物に対するワクチン接種を導くために使用できるという点で、普遍的なものである。さらに、本ワクチン接種法を使用して、新生物細胞に対する免疫反応を創出することができる。
別の好ましい態様では、本発明に係るワクチン接種法は、キメラ補助分子リガンド遺伝子である補助分子リガンド遺伝子を含む、遺伝的ベクター、遺伝子構築物または遺伝子治療ベクターを利用する。このキメラ補助分子リガンド遺伝子は、好ましくはマウスＣＤ４０リガンド遺伝子の少なくとも一部を含んでいる。別の好ましい態様においては、このワクチン接種法は、最低限補助分子リガンド遺伝子またはキメラ補助分子リガンド遺伝子をコードしているＤＮＡ分子を利用する。この特別のＤＮＡは、補助分子リガンド遺伝子の発現を指令するプロモーター配列を含んでいてもいなくてもよい。
本発明はさらに、このワクチン接種法が、特定の細胞または生物の中で補助分子リガンドを発現できる遺伝的ベクターを、アンドウイルス由来の少なくとも一つのポリペプチドを発現できるベクターと共に利用できることを企図している。このアンドウイルスポリペプチドは、その細胞において補助分子リガンドを発現する、同じまたは異なるベクターから発現され得る。この特別の態様では、アンドウイルスポリペプチドは、その生物内の少なくとも一つの細胞型で発現され、このワクチン接種プロトコルに応答して見出された免疫反応を調節する役割を担う。
本発明はさらに、慢性関節リウマチの患者の関節に存在する細胞中に補助分子リガンド遺伝子を導入することをも企図している。好ましい態様において、導入される補助分子リガンド遺伝子は、Fasリガンド遺伝子の少なくとも一部を含み、補助リガンドの発現時に、細胞表面にFasを発現している細胞の細胞死を誘発する。この工程は、破壊的炎症プロセスの縮小につながる。
以下の実施例は本発明の様々な側面を例示するために供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
VII．関節炎を処置する方法
本発明はまた、補助分子、例えばFasリガンドで形質転換した細胞を関節中に挿入することを含む、関節炎の処置方法をも企図している。好ましい態様では、その補助分子リガンドの発現または細胞表面での該分子の安定性が変えられる。これら好ましい態様において、補助分子リガンドは増強して機能し、関節内の関節炎の処置の助けとなる。本発明は、インビボ、エクスビボの両方で、そして有用な補助分子リガンドをコードしている遺伝子を含む様々なＤＮＡ分子を患者内部に直接注射することによって、ヒトの関節炎を処置することを企図する。慢性関節リウマチに対し、下記の実施例の項に記載するものを包含する様々な有用なプロトコルを設計することができる。
本発明は、二つの異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導される遺伝子の一部分を含むキメラ補助分子リガンド遺伝子であってよい、補助分子リガンド遺伝子を利用する、関節炎の処置を企図している。別の態様では、このキメラ補助分子リガンドは、同じ補助分子リガンド遺伝子由来のドメインを利用して作成できる。得られるキメラ補助分子リガンドは、それらが発現される際、細胞表面での安定性が変化している。この安定性の変化が、これらのキメラ補助分子リガンドの発現する細胞周辺の局所環境において免疫系の機能を調節する。例えば、或る好ましい態様では、Fasリガンドの安定性が、関節炎に罹患している患者の関節内部の細胞表面で変化を受ける。この安定性の変化が免疫系を調節し、その細胞をアポトーシスに向かわせ、こうして炎症のある関節内部の免疫反応が低下する。別の態様においては、本明細書に記載の補助分子リガンド遺伝子を、得られる補助分子リガンドが、変化した安定性を持ち、関節炎の処置に有用となり得る免疫調節効果を惹起するように変化させる。
本発明は、好ましい態様において、キメラ補助分子リガンド遺伝子が関節炎の処置に利用されることを企図する。これらのキメラ補助分子リガンド遺伝子は、好ましくは、Fasリガンドに対する影響または機能を有するFasリガンド遺伝子ドメインIVの少なくとも一部を含んでいる。好ましい態様では、そのドメインの少なくとも一部が存在し、これによってFasリガンドがその生物学的効力を持つことが可能となる。そのドメインの少なくとも一部が存在する。別の好ましいキメラ補助分子リガンドでは、それらのリガンドは、本発明に係る別の補助分子リガンド遺伝子由来の、または同じ補助分子リガンドの異なるドメイン由来のドメインを含んでいる。マウスFasリガンドのドメインIIIと機能的に結合したヒトFasリガンドのドメインIVで構成されるFasキメラ補助分子リガンド遺伝子は特に好ましい。この特別の組み合わせは、より安定なFasリガンドを産み、故に、ヒトFasリガンドのドメインIIIをマウスリガンドのドメインIIIに置き換えることにより、このヒトFasリガンド遺伝子の活性が変わる。
これに代わり、別の好ましい態様では、細胞表面のマウスFasリガンドをコードさせるために、ヒトFasリガンドの代わりにマウスFasリガンド遺伝子を使用する。マウスFasリガンドはヒトFasリガンドより安定であり、よって関節でのFasリガンド活性が変わる。得られる変化したFasリガンド活性は、慢性関節リウマチの処置に有用である。
さらなる好ましい態様は、ヒトFasリガンドのドメインIVに存在する効力または機能を他の補助分子リガンド由来の他のドメインと結びつける態様を含む。例えば、ＣＤ７０ドメインIIIはヒトFasリガンドのドメインIIIより安定であり、したがってヒトＣＤ７０由来のドメインIIIおよびFasリガンドのドメインIVならびにその他の支持ドメインより成るキメラ補助分子リガンドは、より安定であろう。安定性の増大はFasリガンド活性の増大につながる。別の好ましい態様では、FasリガンドのドメインIIIを、多コピーのドメインまたはドメイン群に置き換える。このような多コピーのドメインは、ＣＤ７０分子のドメインIIIまたはＩといったような、２またはそれ以上のコピーの他のドメインで構成されるドメインを包含する。
別の好ましい態様において、本発明は、マトリックス−メタロプロテイナーゼ（MMP）のための開裂部位がその補助分子リガンドから除去されてしまったFasリガンド遺伝子のような補助分子リガンド遺伝子を企図する。第２８図に図示したＭＭＰ開裂および認識部位は、M.M.スミス等、Journal of Biol.Chem.270:6440-6449(95)およびH.ナガセおよびG.B.フィールズ、Biopolymers(Peptide Science)40:399-416(96)に議論されている。好ましい態様では、少なくとも１個のＭＭＰ部位がFasリガンド遺伝子の少なくともドメインIIIから取り除かれた。Fasリガンド遺伝子からのＭＭＰ部位の除去はFasリガンドをより安定とし、よって関節炎の処置において、より有効となる。
別の好ましい態様において、キメラ補助分子リガンド遺伝子は、ヒトFasリガンド遺伝子の一部と、他のヒト補助分子リガンド由来の他のドメインまたは他の種から誘導された補助分子由来のドメインを含んでいる。例えば、本発明は、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ７０リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ＴＮＦ−αならびにヒトFasリガンドおよびマウスFasリガンドの突然変異体由来のドメインの使用を企図している。このようなキメラ補助分子リガンドの生成は、キメラでありしたがって少なくとも二つの異なる補助分子リガンド遺伝子から誘導される部分を有する、補助分子リガンド遺伝子を操作および作成することにより、容易に達成できる。
実施例
１．ヒトのＣＬＬ細胞におけるヒトおよびマウスの補助分子リガンドの発現
ａ．ヒトおよびマウスの補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子構築物および遺伝子治療ベクターの構築
ヒトの補助分子リガンド遺伝子（ヒトのＣＤ４０リガンド）またはマウスの補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）のいずれかをヒトおよびマウスそれぞれの遺伝子を用いて構築した。これらの遺伝子を各々次の様式でクローニングした。
ｉ．マウスＣＤ４０−Ｌのクローニング
１×１０7個のマウス脾細胞Ｂ６から全ＲＮＡをＲＮＡ・ＳＴＡＴ−６０キット（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ”Ｂ”社、フレンズウッド、ＴＸ製品）を使用して分離して、これをあらかじめ固定化ＣＤ３−特異的ｍＡｂで８時間活性化した。次に、オリゴ−ｄＴプライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ・ｃＤＮＡ合成キット（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社、グランドアイランド、ＮＹ製品）でｃＤＮＡを合成した。次にこのｃＤＮＡから次のｍＣＤ４０−Ｌ特異的プライマーを使用するＰＣＲによってマウスのＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ４０−Ｌ）遺伝子を増幅した。５’−ＧＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＡＧＡＡ（配列番号２６）および５’−ＧＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣ（配列番号２７）。増幅したｍＣＤ４０−ＬのＰＣＲ産物を真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジェゴ、ＣＡ製品）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌ部位にサブクローニングした。このプラスミド構築物からＢｇ１ＩＩ酵素およびＸｈｏＩ酵素で制限消化をした後、ＣＭＶプロモーター、ｍＣＤ４０−Ｌ遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを包含するＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ断片を次にシャトルプラスミドＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２（Ｓｐｅｓｓｏｔ・Ｒ．著、１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６８巻：３７８頁）にサブクローニングして、ｍＣＤ４０−Ｌ・ｐＸＣＸ２と命名した。以下のように、このプラスミドを使用してアデノウイルスを産生した。
ｉｉ．ヒトＣＤ４０−Ｌのクローニング
ヒトのＣＤ４０−Ｌ遺伝子を含むプラスミドを使用して本明細書で使用するヒトのＣＤ４０−Ｌを作製した。この遺伝子の配列は知られており、この遺伝子は好都合に使用した。ＧｅｎＢａｎｋ、受理番号Ｘ６７８７８参照。このプラスミドを使用してヒトのＣＤ４０−Ｌ遺伝子をセンスプライマー：５’−ＣＣＡＡＧＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡ−３’（配列番号２８）およびアンチセンスプライマー：５’−ＣＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２９）の特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
これらのプライマーには真核生物発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）にサブクローニングするためのフランキング制限酵素部位を含む。このＰＣＲで増幅したＣＤ４０−Ｌ断片をｐＲｃ／ＣＭＶのＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｈＣＤ４０−Ｌ・ｐＲｃ／ＣＭＶと命名した。ＣＭＶプロモーター、ｈＣＤ４０−Ｌ遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ断片を次にこのプラスミドから分離し、前記のようにシャトルプラスミドＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２にサブクローニングした。このプラスミドをｈＣＤ４０−Ｌ・ｐＸＣＸ２と命名した。以下のように、このプラスミドを使用してアデノウイルスを産生した。
ｉｉｉ．アデノウイルスの合成
ｍＣＤ４０−Ｌ・ｐＸＣＸ２またはｈＣＤ４０−Ｌ・ｐＸＣＸ２プラスミドのいずれかを燐酸カルシウム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ著、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、実験室便覧）」、第２版、１６章：３３〜３４頁）を用いてｐＪＭ１７（ＧｒａｈａｍとＰｒｅｖｅｃ著、１９９１年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における方法論）」、第７巻）とともに２９３細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、ＭＤ）に共遺伝子移入した。分離したアデノウイルスのプラークを釣上げ、２９３細胞に再感染させて増殖した。次の修正点を除いて記載（ＧｒａｈａｍとＰｒｅｖｅｃ著、１９９１年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における方法論）」、第７巻）の通りに高力価アデノウイルス製品を製造した。ウイルス粒子の濃縮に使用した塩化セシウム勾配は密度１．４５ｇ／ｃｍ3および１．２ｇ／ｃｍ3の二段階勾配であった。ＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社、ブリー、ＣＡ製品）を使用して２５０００ｒｐｍでこの試料を４℃で遠心分離した。このウイルスバンドをＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ２５ＤＮＡ級カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ＮＪ製品）を使用して脱塩した。分離したウイルスを１０％グリセリン添加燐酸緩衝食塩水中に７０℃で保存した。ウイルスタイターは精製アデノウイルスの順次希釈で２９３細胞を感染させ、形成されたプラーク数を計測することによって決定した。ウイルスタイターは典型的には１０10から１０12プラーク形成単位／ｍＬ（ＰＦＵ／ｍＬ）の範囲であった。
ｂ．マウスおよびヒトの補助分子リガンド遺伝子のＣＬＬ細胞およびＨｅＬａ細胞への導入
アデノウイルス感染には新規に解凍して洗浄したＣＬＬ細胞またはＨｅｌａ細胞を培養培地０．５〜１ｍＬ中に懸濁し、５％ＣＯ２−空気インキュベータ中、３７℃で培養した。この細胞に感染多重度（ＭＯＩ）を変えてアデノウイルスを添加し、感染した細胞を特段の記載がない限り４８時間培養した後にトランスジーンの発現を分析した。
ｃ．ＣＬＬ細胞およびＨｅｌａ細胞中での補助分子リガンド遺伝子の発現
実施例１ｂで製造したマウスまたはヒトのいずれかのＣＤ４０リガンド遺伝子を含有するアデノウイルスベクターに感染したＣＬＬ細胞およびＨｅｌａ細胞を、次にヒトまたはマウスのＣＤ４０リガンドに対して免疫特異的な商業的に購入したモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンジェゴ、ＣＡ製品）を製造社の指示書に従って使用して染色した。このＣＬＬ細胞およびＨｅｌａ細胞をヨウ化プロピジウム添加ＲＰＭＩ−１６４０、３％ウシ胎児血清、および０．０５％ナトリウムアジドからなる染色培地（ＳＭ）で洗浄し、次にＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、サンノゼ、ＣＡ製品）で分析した。死細胞および破砕物は分析から特異的な正方向および側方向光散乱プロファイルおよびヨウ化プロピジウム染色によって排除した。表面抗原の発現は平均螢光強度比（ＭＦＩＲ）として測定した。ＭＦＩＲは特異的なＦＩＴＣ複合ＭｏＡｂで染色された細胞の螢光強度平均値（ＭＦＩ）を対照ＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色された細胞のＭＦＩで割った商に等しい。この方法は大きく活性化された活性の強い細胞で見られる自己螢光の非特異的な増大を制御する。
ヒトのＣＤ４０リガンド遺伝子またはマウスのＣＤ４０リガンド遺伝子のいずれかの遺伝子ベクターを含むＣＬＬ細胞およびＨｅｌａ細胞および適当な対照とから作製されたヒストグラムを第３Ａ図〜第３Ｄ図に示す。マウスおよびヒトの補助分子リガンド遺伝子（ＣＤ４０リガンド）双方のＨｅｌａ細胞での発現を各々第３Ａ図および第３Ｂ図に示す。マウスおよびヒトの補助分子リガンドのＣＬＬ細胞での発現を第３Ｃ図および第３Ｄ図に示す。ＣＬＬ細胞での補助分子リガンド遺伝子の発現およびＣＬＬ細胞表面でのマウスＣＤ４０リガンドの発現を第３Ｃ図に示す。ヒト補助分子リガンドがＣＬＬ細胞表面に発現されないことは、第３Ｄ図に示す。
第８図はＣＤ４+・Ｔ細胞を持つＣＬＬ患者が、ＣＤ３ライゲーション後に補助分子リガンドｍＲＮＡの発現を誘導できるかどうかを検査するために行った実験から得たデータを示す。ＥＬＩＳＡによる定量的競合ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＤ４０リガンド転写水準を測定した。この実験では、ＣＤ４０リガンドおよびＣＬＬ細胞中のＣＤ４０リガンド遺伝子から転写されたＲＮＡと、ＣＤ３のライゲーションによって誘導した後に正常なドナー細胞中のＣＤ４０リガンドおよびＲＮＡのレベルとを、比較する。ＣＤ３活性化にはプレートをＣＤ３・ｍＡｂで被覆し、塗布したＣＬＬまたは正常ドナー単核細胞を指定時間インキュベーションの後に、細胞を表面抗原の発現またはＣＤ１５４・ＲＮＡメッセージの水準について分析した。ＣＬＬまたは正常ドナー血清を活性化検定実験の初期に細胞に添加してＣＤ４０リガンドの表面発現について試験した。
定量的なＣＤ１５４・ＲＴ−ＰＣＲ・ＥＬＩＳＡには全ＲＮＡを抽出し、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）ｃＤＮＡを含む挿入物から競合ＲＮＡを作製した。分離したＲＮＡの入った個々のウェルに競合ＲＮＡを量を変えて添加してウェルのＲＮＡを分離し、続いてｃＤＮＡに変換した。Ｃａｎｔｗｅｌｌ，Ｍ．ほか著、Ｎａｔｕｒｅ・Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻：９８４〜９８９頁、（１９９７年）に記載のようにして、ＣＤ３活性化、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ反応を行った。ビオチン化ＰＣＲ産物をストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ社製品）で被覆したマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、オクスナルド、ＣＡ製品）上で捕捉し、インキュベーションした。プレートをＮａＯＨで処理してセンス鎖を除去した後、洗浄した。次にＤＮＡを野生型遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドまたは競合体−特異的オリゴヌクレオチドのいずれかとハイブリッドを形成させた。末端トランスフェラーゼを使用して、各プローブをジゴキシゲニン−１１−ジデオキシＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製品）分子で標識した。プレートをインキュベーションし、ＨＹＢＥ緩衝液および遮断緩衝液で洗浄し、次にペルオキシダーゼ−複合抗−ジゴキシゲニン抗体（１５０Ｕ／ｍＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製品）の遮断緩衝液溶液を添加した。ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）およびペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ・ａｎｄ・Ｐｅｒｒｙ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ガイザースバーグ、ＭＤ製品）を添加して発色させて吸光度を４５０ｎｍで測定し、Ｄｅｌｔａｓｏｆｔ・ＩＩ（Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ社、プリンストン、ＮＪ製品）を使用してデータを分析した。
標準的ｃＤＮＡ反応について、ＲＮＡ産物のモル数を吸光度に対してプロットした標準曲線を作製した。次にこれらの標準曲線を示す等式を用い、ＥＬＩＳＡ測定値から得られた吸光度を基にして、未知のＰＣＲ反応液中に存在する野生型または競合ＤＮＡのモル数を算出した。次に野生型ＤＮＡの量と競合ＤＮＡの量との比を最初の試料に添加した競合ＲＮＡの既知量に対してプロットした。試料中の標的ＲＮＡの未知モル数の量の外挿には比率１を取った（比率１は標的ＲＮＡの量に対して競合ＲＮＡの量が等しいことを意味する）。次式に基づいてＣＤ４細胞に対する標的ＲＮＡの分子を算出した：
［（標的ＣＤ１５４ＲＮＡモル数）×（６×１０23分子／モル）×（被験ＲＮＡの希釈率）］／（全細胞集団中のＣＤ４・Ｔ細胞％）
第８図の上側グラフはＣＬＬ患者のＴ細胞はＣＤ３ライゲーション後に検出可能なＣＤ４０リガンドを発現しないことを示す。ＣＤ４０リガンドのＲＮＡは産生されるが、安定ではない。正常なドナーＴ細胞ではＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０リガンドＲＮＡは発現される（下側グラフ）が、蛋白質濃度もＲＮＡ濃度もいずれも安定的に持続されない。
第９図はＣＤ４０リガンドの表面発現の時間的経過を示す。発現は感染後４８時間で最高レベルに達し、その後少なくとも６日間高レベルに維持された。この実験で、ＣＬＬ・Ｂ細胞をゼロ時間に１０００のＭＯＩで補助分子リガンドを含む遺伝子治療ベクターで感染させた。次にその後の様々な時間にフローサイトメトリーで評価した。横座標に示す各時点で検出可能なＣＤ１５４を発現する活性ＣＣＬ・Ｂ細胞の比率を右側縦座標に記す百分率目盛に対応する縦の棒グラフで示す。
ｄ．ヒトおよびマウスの補助分子リガンドの機能
ｉ．補助分子をコードする遺伝子治療ベクターを含む細胞上でのＣＤ８０およびＣＤ５４の誘導
実施例１ｂで製造したマウス補助分子リガンド遺伝子に感染したＣＬＬ細胞を組織培養プレートで培養した。多重パラメータＦＡＣＳ分析機を使用し、フルオレッセインイソチオシアネートと各表面抗原に免疫特異的なモノクローナル抗体との複合体を使用してＣＬＬ細胞を分析して、ＣＤ８０およびＣＤ５４の発現を検出した。対照としては非感染ＣＬＬ細胞を使用した。細胞を適当なＦＡＣＳ分析に付してヒストグラムを作製した。ＣＤ８０ｍＡｂはＥｄｗａｒｄ・Ｃｌａｒｋ博士から恵与され、ＣＤ５４ｍＡｂはＣＡＬＴＡＧ社から商業的に購入した。ＣＤ８０をＫｉｐｐｓ、ほか著、「Ｌａｂｏｒａｔｒｙ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・ＩＩ（実験免疫学ＩＩ）」、１２巻：２３７〜２７５頁（１９９２年）に記載されている標準的方法を使用して複合した。
この分析の結果を第４Ａ図〜第４Ｄ図に示す。第４Ａ図〜第４Ｂ図は非遺伝子移入ＣＣＬ細胞（第４Ａ図）またはマウスのＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＣＬ細胞中（第４Ｂ図）のＣＤ５４発現量を比較する。影付グラフはＦＡＣＳ染色に対するアイソタイプの対照を示し、白色グラフは抗−ＣＤ５４抗体で染色された細胞を示す。これらの結果はＣＤ５４の発現レベルがマウスのＣＤ４０リガンドを含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＬＬ細胞中では増加することを示す。
第４Ｃ図および第４Ｄ図では非感染ＣＣＬ細胞中（第４Ｃ図）またはマウスのＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＣＬ細胞中（第４Ｄ図）のＣＤ８０発現量を比較する。影付グラフはＦＡＣＳ染色に対するアイソタイプ対照を示し、白色グラフは抗−ＣＤ８０抗体で染色された細胞を示す。これらの結果はＣＤ８０の発現レベルがマウスＣＤ４０リガンドを含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＬＬ細胞中では増加することを示す。
別の実験の一つでは、マウス補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＣＬ細胞をＣＤ５４およびＣＤ８０のみでなく、ＣＤ８６、ＣＤ５８、ＣＤ７０およびＣＤ９５も誘導発現についてフローサイトメトリーで評価した。フルオレッセインに複合したヒトのＣＤ５４およびＣＤ７０に特異的なｍＡｂはＣＡＬＴＡＧ社から購入した。ヒトＣＤ２７、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＣＤ９５特異的フルオレッセイン複合ｍＡｂおよびヒトまたはマウスのＣＤ４０リガンドに特異的なフィコエリスリン複合ｍＡｂはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から入手した。黒色ヒストグラムはＦＩＴＣ−複合アイソタイプ非特異的ｍＡｂを有するＣＬＬ・Ｂ細胞の染色を示す。非感染ＣＬＬ細胞（第１０図、細線ヒストグラム）またはＡｄ−ｌａｃＺ−感染ＣＬＬ細胞（非感染細胞で得たものと同様なデータであるが記載していない）とは対照的に、ＣＤ４０リガンドをコードするアデノウイルスベクター（ＣＤ１５４）に感染したＣＬＬ細胞は高いレベルのＣＤ５４（第１０図、上左）、ＣＤ８０（第１０図、上中）、ＣＤ８６（第１０図、上右）、ＣＤ５８（第１０図、下左）、ＣＤ７０（第１０図、下中）およびＣＤ９５（第１０図、下右）を発現した。他方、非感染ＣＬＬ細胞（１１Ａ、細線ヒストグラム）（Ｐ＜０．０１、ボンフェロニのｔ検定）またはＡｄ−ｌａｃＺ−感染ＣＬＬ細胞（非感染細胞で得たものと同様なデータであるが記載していない）よりもＣＤ４０リガンド−ＣＣＬ（ＣＤ１５４・ＣＬＬ）は明らかに低いレベルの表面膜ＣＤ２７（第１１Ａ図、太線ヒストグラム）および可溶性ＣＤ２７（第１１Ｂ図）を発現した。第１１Ａ図に示す実験では、感染後３日目のＣＬＬ・Ｂ細胞をＣＤ２７の発現についてフローサイトメトリーで検討した。黒色ヒストグラムはＦＩＴＣ複合アイソタイプ対照ｍＡｂを有するＣＬＬ・Ｂ細胞の染色を示す。第１１Ｂ図では、感染後または刺激後７２時間目のＣＬＬ・Ｂ細胞の細胞不含上清液を集めてヒトＣＤ２７濃度をＥＬＩＳＡで試験した。ＣＤ２７発現の減少（第１１Ｂ図）はＲａｓｓｅｎｔｉ，Ｌ．Ｚ．とＴ．Ｊ．Ｋｉｐｐｓ著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５巻：１４３５〜１４４５頁に記載されたＣＤ３２発現Ｌ細胞が提示するｍＡｂ・Ｇ２８−５と交差結合したＣＤ４０で刺激された白血病Ｂ細胞で認められたものと類似していた。
ｉｉ．マウスＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを導入したＣＬＬ細胞に対する同種異系Ｔ細胞の応答
マウスＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞が同種異系（すなわち他の個体から得た）Ｔ細胞を刺激する性能を細胞増殖検定法を使用して分析した。略述すれば、被験細胞をｌａｃ−Ｚ遺伝子またはマウスＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターとＩＬ−４濃度１０ｎｇ／ｍＬとの存在下に感染多重度１０００で共培養した。他の試料では、ＣＬＬ細胞をＭＯＰＣ２１（対照ＩｇＧ）またはＧ２８−５（抗ＣＤ４０モノクローナル抗体）で刺激するか、またはＣＤ３２−Ｌ細胞にプレインキュベーションし、同時にＩＬ−４で処理した。ＩＬ−４処理と一緒のＣＤ３２−Ｌ細胞とのプレインキュベーションは直接的遺伝子遺伝子移入以外のＣＤ４０分子の交差結合の効果的な型の一つであることを示した。
３７℃で３日間の培養後、細胞をマイトマイシンＣで処理して増殖を防止し、次に同種異系Ｔ細胞を刺激するために使用した。この共培養の前に、適当な様々な量のＣＬＬ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で処理したか、またはｌａｃ−Ｚ遺伝子またはマウスＣＤ４０リガンド遺伝子を刺激因子比１：１０で含む遺伝子治療ベクターで感染させた。３７℃で２日間培養後、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生をＥＬＩＳＡ検定法で測定した。３７℃で５日間共培養後、複合細胞への3Ｈ−チミジンの導入を８時間の間隔レベルの後に測定した。この検定結果を下記の表ＩＩおよび第５図に示す。
別の実験では、ＣＤ４０リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ・Ｂ細胞が同種異系混合リンパ球Ｔ細胞反応（ＭＬＴＲ）で刺激因子細胞として作用する性能について評価した。これに並行して対照ｌａｃ−Ｚベクター感染ＣＬＬ細胞およびＣＤ３２−Ｌ細胞および抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｇ２８−５）またはアイソタイプ対照Ｉｇと共に培養したＣＬＬ・Ｂ細胞の刺激因子性能もＲａｎｈｅｉｍ，Ｅ．Ａ．とＴ．Ｊ．Ｋｉｐｐｓ著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：９２５〜９３５頁（１９９３年）；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．とＪ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：４４９４−４４９８頁（１９８６年）、およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ほか著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：７０〜７２頁（１９９１年）に記載のようにして試験した。別の非関連ドナーから得たエフェクターＴ細胞をエフェクター対標的比４：１でＣＣＬ刺激因子細胞と共培養した。３７℃で１８時間培養後にはＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞とともに培養すると同種異系ＣＤ３+細胞の３０％は活性化に関連する抗原ＣＤ６９を発現した（データ未提示）。対照的に、非感染ＣＬＬ細胞またはＡｄ−ｌａｃＺ感染ＣＬＬ細胞と共培養した時には４％に満たないＴ細胞がＣＤ６９を発現した（データ未提示）。
ＭＬＴＲ開始から２日後、培養上清液中のＩＦＮγ濃度をＥＬＩＳＡで検定した。補助分子リガンドＣＤ４０Ｌに感染したＣＬＬ細胞で刺激されたＭＬＴＲの上清液（第１２Ａ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）は抗−ＣＤ４０ｍＡｂで刺激したＭＬＴＲ培養物のもの（第１２Ａ図、ａＣＤ４０−ＣＬＬ）（２３±３ｎｇ／ｍＬ）よりも有意に（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）高い濃度のＩＦＮγ（３０６±５ｎｇ／ｍＬ、ｍ±ＳＥ、ｎ＝３）を含有していた。後者と対照Ａｄ−ｌａｃＺ感染ＣＬＬ細胞で刺激したＭＬＴＲ培養物（第１２Ａ図、ｌａｃＺ−ＣＬＬ）（４３±１０ｎｇ／ｍＬ）との間には、有意差がなかった（Ｐ＞０．１、ボンフェロニのｔ検定）。エフェクター細胞単独の上清液または非感染ＣＬＬ細胞刺激ＭＬＴＲ培養物の上清液（第１２Ａ図、ＣＬＬ）、または対照Ｉｇ処理ＣＬＬ細胞（第１２Ａ図、ＭＯＰＣ−ＣＬＬ）は検出可能量のＩＦＮγを含有していなかった（＜２ｎｇ／ｍＬ）。同様に、エフェクターＴ細胞を加えないで単独で培養した白血病Ｂ細胞集団はいずれも検出可能量のＩＦＮγを産生しなかった（データ未提示）。
５日後、3Ｈ−チミジン取り込みで細胞の増殖を評価した。アイソタイプ対照ＩｇＧ処理刺激因子細胞（第１２Ｂ図、ＭＯＰＣ−ＣＬＬ）または非感染刺激因子細胞（第１２Ｂ図、ＣＬＬ）の培養物は3Ｈ−チミジンを白血病−刺激因子細胞不含培養物（第１２Ｂ図、Ｎｏｎｅ）よりも多く取込むことはできなかった。Ａｄ−ｌａｃＺ感染ＣＬＬ・Ｂ細胞（第１２Ｂ図、ｌａｃＺ−ＣＬＬ）も同種異系Ｔ細胞を刺激して3Ｈ−チミジンを対照培養物よりもはるかに多く取込むことはなかった。対照的に、抗−ＣＤ４０刺激白血病細胞またはＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞は各々有意（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）なエフェクター細胞増殖を誘導した（第１２Ｂ図、ａＣＤ４０−ＣＬＬまたはＣＤ１５４−ＣＬＬ）。さらに、ＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞で刺激された培養物に取込まれた3Ｈ−チミジンの量（４１００４±７６１ｃｐｍ（ｍ±ＳＥ）、ｎ＝３）は同数のａＣＤ４０−ＣＬＬ細胞で刺激された培養で取込まれた3Ｈ−チミジンの量（２２９３５±１８９２ｃｐｍ、ｎ＝３）よりも有意（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）に大きかった。しかしながら、これらマイトマイシンＣ処理白血病細胞集団はいずれもエフェクターＴ細胞不含で培養した時には3Ｈ−チミジンを取込まなかった（データ未提示）。また、同種異系Ｔ細胞とＣＤ４０刺激ＣＬＬ細胞との間のＭＬＴＲについて記載したように｛６５４９、７１６７、７１６８｝、ＣＤ１５４−ＣＬＬに応答する同種異系Ｔ細胞の増殖をＭＬＴＲの初期に添加した時にはＣＴＬＡ−４−ＩｇまたはＣＤ１１ａ・ｍＡｂで阻害できたので、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との間またはＣＤ５４とＣＤ１１ａ／ＣＤ１８との間の各々の相互作用が本実験の同種異系Ｔ細胞反応に寄与することを示す（データ未提示）。
0004015201.tif 000003
ｉｉｉ．補助分子リガンド遺伝子を含むＣＬＬによるガンマ−インターフェロンの刺激
補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）を含むＣＬＬ細胞がＴリンパ球を活性化する性能を決定することによって、これらのＣＬＬ細胞の機能を分析した。操作は以下の通りに行った：健康ドナー（ＣＤ３+９０％以上）から得た同種異系Ｔリンパ球を磁気ビーズとＣＤ１４およびＣＤ１９抗原に特異的なモノクローナル抗体を使用して精製した。次にこれらの同種異系Ｔリンパ球を補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）またはｌａｃ−Ｚ遺伝子に感染したＭＭＣ処理ＣＬＬ細胞とともに培養した。この共培養は１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で行った。２４時間培養後に、細胞を収集し、標準的ＦＡＣＳ分類プロトコルを使用してＴリンパ球上の抗原ＣＤ６９の発現を測定して分析した。培養２日後に細胞培養上清液を集め、ＥＬＩＳＡ検定法を使用してヒトのインターフェロン−γの濃度を測定した。補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）を含むＣＬＬ細胞の一部およびｌａｃ−Ｚを発現するアデノウイルスを含む細胞の一部をヒトのインターロイキン４、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍＬ）、の存在下に培養した。この量のヒトのインターロイキン４の存在下での同種異系Ｔリンパ球によるインターフェロンγの産生も分析した。これらの分析の結果を第６図に示す。
記載の通り、補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）を含むヒトのＣＬＬ細胞はｌａｃ−Ｚ遺伝子を含むＣＬＬ細胞と比較すると実質的に高濃度のインターフェロンγを細胞培養上清液中に産生した。補助分子リガンド遺伝子を含むＣＬＬ細胞と接触したＴリンパ球によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生の増大は、補助分子リガンド遺伝子を含むこれらのＣＬＬ細胞が免疫反応を強化するために有効であることを指摘する。
ｉｖ．補助分子リガンド遺伝子を含む非修正ＣＬＬ・Ｂ細胞と前接触した同種異系Ｔ細胞の刺激
以前の研究で、たとえばＣＤ２８のような共刺激分子に由来するシグナルの不在下にＴ細胞への抗原提示が特定のＴ細胞クローンのアネルギーを起こすことができると報告された。この理由から、以前にＣＤ８０およびその他の免疫補助分子の発現を欠失する非修正ＣＬＬ・Ｂ細胞とともに培養された同種異系Ｔ細胞をＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＣＬＬ細胞に応答する性能について、試験した。同種異系エフェクター細胞は単独で培養した時（第１２Ｃ図、Ｎｏｎｅ）よりも、非修正ＣＬＬ細胞（第１２Ｃ図、ＣＬＬ）に反応して、またはＡｄ−ｌａｃ−Ｚに感染した対照ＣＬＬ細胞（第１２Ｃ図、ｌａｃ−Ｚ−ＣＬＬ）に反応して、より多量の3Ｈ−チミジンを取込むことはなかった。対照的に、非修正ＣＬＬ・Ｂ細胞と前共培養した後にさえ、同種異系エフェクター細胞はなお補助分子リガンドを発現する細胞に応答する増殖（第１２Ｃ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）またはＩＦＮγの産生（第１２Ｄ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）を誘導できた。Ａｄ−ｌａｃ−Ｚに感染した白血病細胞を刺激因子に使用した時には、ＩＦＮγの中庸な量が二次的培養物の上清液中に検出された（第１２Ｄ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）けれども、この濃度はＡｄ−ＣＤ４０−リガンドに感染したＣＬＬ細胞との二次的培養物に認められるもの（第１２Ｄ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）よりも有意（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）に低かった。同様に、非感染ＣＬＬ細胞で刺激されたＭＬＴＲ培養物（第１２Ｄ図、ＣＬＬ）の白血病細胞単独（データ未提示）、およびエフェクター細胞単独（第１２Ｄ図、Ｎｏｎｅ）の上清液ではＩＦＮγ（＜２ｎｇ／ｍＬ）含有量は認識不能であった。これらの結果は、非修正ＣＬＬ・Ｂ細胞と共に培養した同種異系エフェクター細胞が補助分子リガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ・Ｂ細胞への反応からは排除されないことを示す。
ｖ．マウス補助分子リガンド遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを導入したＣＬＬ細胞への自己Ｔ細胞の反応
ＣＬＬ患者の血液から分離したＴ細胞をそれがマウス補助分子ＣＤ４０リガンドをコードする遺伝子治療ベクターを含む自己のＣＬＬ・Ｂ細胞に対して試験管内で反応する性能について試験した。Ｔ細胞を＞９５％の純度まで分離した。次にマイトマイシンＣ処理自己白血病細胞とともに２５Ｕ／ｍＬの外因性インターロイキン−２添加血清不含ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。刺激細胞無添加の部分的な二次的外因性ＩＬ−２（第１３Ａ図、およびデータ未提示）培養物に中庸量の3Ｈ−チミジン取込（＜＝１００００ｃｐｍ）が検出された。しかしながら、Ｔ細胞増殖のレベルは非感染ＣＬＬ細胞（第１３Ａ図、ＣＬＬ）またはＡｄ−ｌａｃ−Ｚに感染した対照ＣＬＬ細胞（第１３Ａ図、ｌａｃ−Ｚ−ＣＬＬ）に応答して増大することはなかった。対照的に、補助分子リガンドを含む遺伝子治療ベクターに感染したＣＬＬ細胞は（第１３Ａ図、ＣＤ１５４−ＣＬＬ）は自己のＴ細胞に対照培養物のいずれよりも有意に多量（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）の3Ｈ−チミジンの取り込み（１７，３６８±１，０９３ｃｐｍ、ｎ＝３）を誘導した。さらに、補助分子ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードするベクターに感染したＣＬＬ細胞で刺激されたＭＬＴＲはまたその他の培養物のいずれよりも（第１３Ｂ図）有意に多量（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）のＩＦＮγ（１６５±３ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝３）を作製した。
自己ＭＬＴＲから５日後にＴ細胞を収集し、自己ＣＬＬ・Ｂ細胞に対するＣＴＬ活性について評価した。自己ＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬ細胞と共培養したＴ細胞は非修正ＣＬＬ・Ｂ細胞に対するＣＴＬ活性を発現して、Ｅ：Ｔ比２：１で４０．１％のライシスを起した（±２．３％）（第１３Ｃ図、ＣＤ１５４）。しかしながら、非感染ＣＬＬ細胞またはＡｄ−ｌａｃ−Ｚ感染ＣＬＬ細胞と共培養した時に、Ｔ細胞はこの対照反応では同じ標的細胞に対して検出可能なＣＴＬ活性を起こさなかった（第１３Ｃ図）。
ｖｉ．同種異系ＣＬＬ・Ｂ細胞に対する自己ＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬ・Ｂ細胞によって刺激されたＣＴＬの特異性
自己ＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬで刺激されたエフェクター細胞を同種異系のＣＬＬ・Ｂ細胞に対してＣＴＬ活性を示す性能またはＩＦＮγを分泌する性能について評価した（第１４図）。ＣＤ１５４−ＣＬＬまたはｌａｃ−Ｚ−ＣＬＬでの自己ＭＬＴＲから５日後にＴ細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって分離し、良く洗浄し、次に培地中で２４時間培養した。洗浄したＴ細胞を自己の標的ＣＬＬ・Ｂ細胞（「Ａｕｔｏ・ＣＬＬ」、黒棒）または同種異系標的ＣＬＬ・Ｂ細胞（「Ａｌｌｏ−１・ＣＬＬ」または「Ａｌｌｏ−２・ＣＬＬ」、影付棒またはハッチ棒）と混合した。ｌａｃ−Ｚ−ＣＬＬ細胞ではなく、ＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬ細胞での自己ＭＬＴＲにより刺激されたＴ細胞は非修正自己ＣＬＬ・Ｂ細胞との二次的培養に応答して、同種異系ＣＬＬ・Ｂ細胞とのＭＬＴＲよりも有意に多量のＩＦＮγを産生した（第１４Ａ図）（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）。さらに、ｌａｃ−Ｚ−ＣＬＬ細胞でなく、ＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬで刺激されたＴ細胞は自己ＣＬＬ細胞に対して細胞傷害性であったが、同種異系ＣＬＬ細胞には細胞傷害性はなかった（第１４Ｂ図）。同様な結果は自己ＭＬＴＲで活性化された同種異系ドナーのＴ細胞についても得られ、ここでも自己のＣＬＬ・Ｂ細胞に対して特異的な細胞傷害性を示した。最後に、クラスＩの主要組織適合性複合体（ＮＨＣＩ）抗原に対するｍＡｂであるＷ６／３２は自己ＣＬＬ・Ｂ細胞に対してＣＤ４０−リガンド−ＣＬＬ細胞で刺激されたＴ細胞の細胞傷害性を有意に阻害できた（第１４Ｃ図、αＨＬＡ−クラスＩ）（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定）。この阻害はＭＨＣクラスＩＩ抗原特異的なｍＡｂ（第１４Ｃ図、αＨＬＡ−ＤＰ）、Ｆａｓ−リガンドに特異的なｍＡｂ（第１４Ｃ図、αＦａｓＬ）または無関係な特異性を持つアイソタイプ対照ｍＡｂ（第１４Ｃ図、ＭＯＰＣ−２１）では観察されなかった。総合すると、これらの研究ではＡｄ−ＣＤ４０−リガンド−感染ＣＬＬ細胞が試験管内で自己の抗白血病細胞性免疫反応を誘導でき、自己の非修正白血病Ｂ細胞に対して特異的なＭＨＣ−クラスＩ−限定ＣＴＬの作製に到ることを示す。
ｅ．Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ・ＣＬＬ細胞による巻込非感染白血病Ｂ細胞のトランス活性化
腫瘍マーカー発現での変化（１（２）節に前記）が細胞内、細胞間のどちらに由来するかを解明するために、補助分子リガンド（ＣＤ４０４０Ｌ、またはＣＤ１５４）をコードするアデノウイルス遺伝子治療ベクターの感染後に誘導されるＣＤ５４およびＣＤ８０の発現に及ぼす培養密度の効果を検討した。感染後、ＣＣＬ細胞を標準的な高密度（たとえば、１×１０6細胞／ｍＬ）または標準的な低密度（たとえば、２×１０5細胞／ｍＬ）で３７℃で３日間培養した。高密度で塗布した細胞はホモタイプの凝集体を含有したが、低密度で塗布した細胞では均等な分散を維持して実質的な細胞−細胞間接触はなかった（データ未提示）。類似レベルの異種ＣＤ１５４を発現したけれども、高密度で培養したＣＤ１５４−ＣＬＬ・Ｂ細胞は、低密度で培養したＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞よりも、高いレベルのＣＤ５４およびＣＤ８０の発現を誘導した（第１５Ａ図）。高密度で達成された刺激はＣＤ４０＜−＞ＣＤ１５４相互作用を遮断することのできるハムスターの抗マウスＣＤ１５４ｍＡｂとともに細胞を培養することによって阻害できた（第１５Ｂ図、ａＣＤ１５４・Ａｂ）。総合すると、この研究はＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞はトランス状態で相互に活性化できることおよびＣＤ１５４の表面発現は最適白血病細胞刺激に必要であることを示す。
これに加えて、Ａｄ−ＣＤ１５４感染、非感染、Ａｄ−ｌａｃ−Ｚ感染、またはＧ２８−５−刺激ＣＬＬ細胞を緑色螢光色素で標識し、ＣＤ１５４−ＣＬＬ細胞が非感染巻込み白血病細胞を刺激できるかどうかを検討した。色素標識細胞を同数の非標識同種同系のＣＬＬ・Ｂ細胞に対する刺激因子細胞として使用した。２日間の培養後、培養刺激因子細胞はそれ自体が緑色螢光色素を保持し、フローサイトメトリーでその細胞を非標識ＣＬＬ・Ｂ細胞から区別できた。Ａｄ−ＣＤ１５４感染白血病Ｂ細胞と共培養した時には巻込（緑色螢光陰性）ＣＤ１９+ＣＬＬ・Ｂ細胞は誘導されてＣＤ５４（第１５Ｃ図、右側ヒストグラム）またはＣＤ８６（第１５Ｄ図、右側ヒストグラム）を発現したが、模倣感染ＣＬＬ細胞（第１５Ｃ図および第１５Ｄ図、左側ヒストグラム）、Ｇ２８−５−刺激ＣＬＬ細胞、またはＡｄ−ｌａｃ−Ｚ感染ＣＬＬ細胞との共培養では発現しなかった（データ未提示）。予期された通り、これらの巻込（緑色螢光陰性）ＣＬＬ細胞はまた異種ＣＤ１５４に対しても陰性であった。
ｆ．補助分子リガンドをコードする遺伝子治療ベクターでの白血病の処置
第２４図は修正ＣＤ４０リガンドをコードするアデノウイルス遺伝子治療ベクターを有するＢ細胞ＣＬＬの処置を検討する臨床試験を略記する。フェレーシスによって収集した白血病細胞を修正ＣＤ４０リガンドをコードする複製欠失ベクターに感染させる。この蛋白質の発現に続いて宿主の抗白血病細胞免疫反応を刺激する目的で細胞を患者に戻す。この方策では白血病細胞表面にあるただ１個の免疫刺激分子の発現に影響を及ぼす遺伝子治療法よりも遥かに優れている。事実、この方策は一連の免疫刺激補助分子およびサイトカインを発現する白血病細胞をもたらし、ならびに患者の一度も収集したことのない白血病細胞に同じ変化を起こすことのできる分子をもたらす。
２．キメラ補助分子リガンド遺伝子の発現
本明細書に記載する標準的技術を使用して下記のキメラ補助分子リガンド遺伝子を製造する。
ａ．異なる２種の補助分子遺伝子を利用するキメラ補助分子リガンド遺伝子の製造
ヒトのＣＤ４０リガンド遺伝子を抗−ＣＤ３モノクローナル抗体で活性化したＴ細胞から製造したＲＮＡから５’−プライマーおよび３’−プライマーを良く知られているＰＣＲ法とともに使用して分離した。ヒトＣＤ４０リガンドとマウスＣＤ４０リガンドとのキメラ補助分子遺伝子は本明細書に記載する配列番号２のマウスＣＤ４０遺伝子および新たにクローニングしたヒトＣＤ４０リガンド遺伝子から構築する。ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとをマウスＣＤ４０リガンド遺伝子のものと交換し、Ｈ（Ｅｘ）−Ｍ（Ｔｍ−Ｃｙ）ＣＤ４０リガンドと命名する。これらキメラ補助分子リガンド遺伝子を以前にＨｏｒｔｏｎ著、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３巻：９３頁（１９９５年）にＳＯＥＮとして記載された遺伝子変換技術を使用して産生させる。産生されたキメラ補助分子リガンド遺伝子を描いた図式を第４図に示す。これら各々のキメラ補助分子リガンド遺伝子のヌクレオチド配列を次表に配列番号３〜配列番号７として示す。
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第２図に示すキメラ補助分子分子の各々をコードするアデノウイルスベクターは実施例１に記載の方法を使用して構築する。次にこれらの各構築物を実施例１の方法に従ってＨｅｌａ細胞またはＣＬＬ細胞に遺伝子移入する。
ｂ．ＣＬＬ細胞およびＨｅｌａ細胞上でのキメラ補助分子リガンドの発現
前記で構築した各キメラ補助分子リガンド遺伝子の発現を実施例１に指定したＦＡＣＳ分析を使用して分析する。ヒトまたはマウスのＣＤ４０リガンドの外部ドメインに免疫特異的な適当なモノクローナル抗体を選択して、これらの細胞表面上にあるキメラ補助分子発現のレベルを測定するために使用する。適当な分析および適当なヒストグラムの作成後、少なくともマウスＣＤ４０リガンド遺伝子の一部を含むキメラ補助分子の発現を確認する。
ｃ．キメラ補助分子リガンドの機能
ＣＬＬ細胞をＭＯＩを変えてｍＣＤ４０Ｌアデノウイルスに感染させ、次に４８ウェルまたは２４ウェル組織培養プレートで培養時間を変えて（４８、７２、および９６時間）培養する。次にＣＤ１９+細胞を多重バラメータＦＡＣＳ分析によってＣＤ８０およびＣＤ５４の発現誘導についてフルオレッセインイソチオシアネートを複合した実施例１に記載する各表面抗原について特異的なｍＡｂを使用して分析する。増加したＣＤ５４およびＣＤ８０の量はマウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来するドメイン単数または複数を含むキメラ補助分子を有する細胞上に認められる。
キメラ補助分子遺伝子を含む細胞をさらに実施例１（ｄ）に従って分析する。マウスＣＤ４０リガンド遺伝子に由来するドメインを含むキメラ補助分子遺伝子を含む細胞はガンマインターフェロンの産生およびＴ細胞の増殖を刺激することができる。
ｄ．同種から得た異なる補助分子２種からの近位細胞外ドメインを含むキメラ補助分子遺伝子の発現
ヒトのＣＤ７０遺伝子（ドメインＩＩＩ）からの近位細胞外ドメインを含み、それ以外のドメインはヒトのＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する、キメラ補助分子リガンド遺伝子を製造する。この遺伝子は本明細書に前記したような標準的生物学的技術を使用して製造する。このキメラ補助分子リガンド遺伝子は配列番号１９として示すＤＮＡ配列を有する。別のキメラ補助分子リガンド遺伝子はマウスのＣＤ４０リガンド遺伝子から得た近位細胞外ドメインを含み、残りのドメインはヒトのＣＤ４０リガンド遺伝子から誘導するように製造する。この遺伝子は本明細書に前記した標準的技術を使用して製造する。このキメラ補助分子リガンド遺伝子は配列番号２０で示されるＤＮＡ配列を有する。配列番号１９および２０で示されるキメラ補助分子遺伝子を実施例１に記載する適当なベクターに挿入し、ヒトの新生物細胞に導入する。このキメラ補助分子遺伝子の細胞内発現を実施例１に記載のようにして測定する。
これら各キメラ補助分子遺伝子がコードするキメラ補助分子は実施例１に記載のＦＡＣＳ分析を使用すればヒト新生物細胞上に見出される。ＣＤ５４およびＣＤ８０量の増加量は実施例１に記載の技術を使用すればキメラ補助分子遺伝子を含む細胞上に見出される。キメラ補助分子遺伝子を含む細胞は実施例１の記載に従って検定すればガンマインターフェロンの産生およびＴ細胞増殖を刺激することができる。
３．補助分子をコードするベクターを使用する予防接種効果の増強
以下の操作法を使用する補助分子をコードする遺伝子治療ベクターを使用する予防接種のプロトコルを例証する。
ａ．補助分子遺伝子治療ベクターとｐｌａｃＺとを共注射したマウスにおける抗体反応の増強
本明細書に記載のものを含めた標準的技術を使用して３種の異なる遺伝子治療構築物を製造した。第一は対照遺伝子治療ベクターｐｃＤＮＡ３であって、どの遺伝子も含まない。第二はｐｌａｃＺであってＬａｃ−Ｚ遺伝子を含み、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を含む。第三はｐ−ｍＣＤ４０Ｌであって実施例１に記載したマウスＣＤ４０リガンド遺伝子を含む。
免疫の前に、血清を６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃ−マウスから採取してβ−ガラクトシダーゼに対する抗体の初期量を求めた。各動物にプラスミドＤＮＡを一回当り１００μｇ筋肉注射した。１週間の間隔で４回の注射を行った。
第三回の注射の前に、動物から採血してβ−ｇａｌに対する早期の抗体反応を観察した。プラスミドＤＮＡの最終回注射の１週後に、採血してβ−ガラクトシダーゼに対する後期の抗体反応を観察した。検定の感受性を検査するため、抗−β−ｇａｌ抗血清から分離した既知量の抗−β−ｇａｌ抗体で並行実験した。
抗−β−ｇａｌ抗体のＥＬＩＳＡで血清希釈率１：４０、１：２００、または１：１０００を試験した。これにはポリスチレン製ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをβ−ｇａｌ・１０μｇ／ｍＬ燐酸緩衝食塩水で被覆した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％トゥイーン２０ホウ酸緩衝食塩水（ＢＢＳ）（０．１Ｍ−ホウ酸塩、０．２Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）を含む遮断緩衝液でプレートを３回洗浄した。希釈血清５０μＬを各ウェルに加えた。室温で少なくとも１時間後、プレートを遮断緩衝液で３回洗浄し、次にアルカリ性ホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。１時間後、プレートを遮断緩衝液で４回洗浄して、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ・＆・Ｐｅｒｒｙ社、ゲイザースバーグ、ＭＤ製）２５ｍＬとともにインキュベーションした。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ｄｅｖｉｃｅｓ社、メンロパーク、ＣＡ製）を使用して各ウェルの４０５ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度が高いほど、試料には特異的抗体の量が多い。
これらの実験２種のデータを表ＩＶおよび表Ｖに示す。結果を表ＶＩおよび表ＶＩＩにまとめ、実験２種からのデータも揃えて提供する。要約頁ではｎは各４群の動物数を示す。Ｓ．Ｄ．は標準偏差、およびＡｖｇ．は特定群内の全動物に対する平均吸光度である。
群４の結果は、補助分子リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする遺伝子治療ベクターの使用が遺伝的または遺伝子治療ベクターをコードするβ−ｇａｌに対する免疫を強化することを証明する。この群の動物から得た血清の１：４０希釈の平均吸光度は群１、群２、および群３の平均吸光度よりも（Ｐ＜０．０５、ボンフェロニのｔ検定、表ＶＩＩ参照）有意に高かった。
別の実験から得たデータは、さらに補助分子リガンドをコードする遺伝子治療ベクターがβ−ｇａｌに対する免疫を強化するとの知見を補強する（第１６図）。ここではｐＣＤ４０ＬおよびｐｌａｃＺを骨格筋に共注射して大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードするｐｃＤＮＡ３に基づくベクターであるｐｌａｃＺに対する免疫反応の強化を試験した。相対的な抗−β−ｇａｌ・Ａｂ活性をＥＬＩＳＡで測定した。予想通り、非修正ｐｃＤＮＡ３ベクターまたはｐＣＤ４０Ｌ単独またはを注射したマウスは検出可能な量のβ−ｇａｌに対する抗体を産生しなかった（第１６Ａ図）。マウスに１００μｇのｐｃＤＮＡ３（チェッカー模様棒）、５０μｇのｐｃＤＮＡ３＋５０μｇのｐＣＤ４０Ｌ（ライン棒）、５０μｇのｐｃＤＮＡ３＋５０μｇのｐｌａｃＺ（ストライプ棒）または５０μｇのｐＣＤ４０Ｌ＋５０μｇのｐｌａｃＺ（黒色棒）のいずれかを注射した。一方で、ｐｌａｃＺおよびｐｃＤＮＡ３を注射したマウスは第４回の最終注射後１週間目の２８日には抗−β−ｇａｌ抗体を発現した。ｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌを注射したマウスはｐｌａｃＺおよびｐｃＤＮＡ３を注射したマウスよりも高いタイターの抗−β−ｇａｌ抗体を発現した。第１６Ｂ図の２８日に採取した血清の順次希釈のＥＬＩＳＡ分析はｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌを共注射したマウスではｐｌａｃＺ＋ｐｃＤＮＡ３で処理したマウスよりも２８日には８倍も高い平均タイターの抗−β−ｇａｌ抗体を有したことを示す。
ｉ．補助分子ベクター共注射に刺激された免疫グロブリンサブクラスの産生
抗−β−ｇａｌ抗体反応の力価は強化されるが、ｐｌａｃＺの注射で誘導される抗−β−ｇａｌのＩｇＧのサブクラスはｐＣＤ４０Ｌの共注射では変化しなかった。ｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３またはｐｌａｃＺとｐＣＤ４０Ｌのいずれかを注射したマウスの血清ではＩｇＧ２ａ抗−β−ｇａｌ抗体はＩｇＧ１サブクラス抗体に優越していた（１７図）。また、横座標に示す注射をした各群のマウスで２８日採取の免疫前血清（ストライプ棒）または免疫後血清（黒色棒）に存在する抗−β−ｇａｌ・ＩｇＧ１および抗−β−ｇａｌ・ＩｇＧ２ａのＥＬＩＳＡ吸光度の測定も描写する。対照的に、β−ｇａｌ蛋白質を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスは主としてＩｇＧ１β−ｇａｌ抗体を発現したが、検出可能量のＩｇＧ２ａ抗−β−ｇａｌ抗体は発現しなかった。
ｉｉ．補助分子ベクターによる予防接種効果の増強には同部位へのｐｌａｃＺの共注射が必要である
ｐＣＤ４０Ｌプラスミドが抗−β−ｇａｌ抗体に及ぼすアジュバント効果は、ｐｌａｃＺを同部位に注射した時にのみ認められる（第１８図）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の群にｐｌａｃＺおよびｐＣＤ４０Ｌを共に同部位に筋肉内注射するか、または末端部位（右および左後肢四頭筋）に同時に別々に注射した。対照群にはｐｌａｃＺおよびｐｃＤＮＡ３を同部位に筋肉内注射した。動物を２８日に採血して、血清を抗−β−ｇａｌ抗体について横座標に示す希釈率で試験した。このグラフは各群の試料について希釈率１：４、１：２００または１：１０００の複数ウェルの４０５ｎｍでの平均吸光度を示す代表的な実験を例示する。ｐｌａｃＺとｐＣＤ４０Ｌとを、同時ではあるが、別の部位に注射した動物は２８日目までには検出可能な抗−β−ｇａｌ抗体を発現しなかった。さらに、この動物から２８日目に採取した血清の抗−β−ｇａｌ抗体のタイターはｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３との注射を受けたマウスのものと類似して、ｐｌａｃＺとｐＣＤ４０Ｌとの注射を同部位に受けたマウスの値よりも有意に低い値を示した。
ｉｉｉ．補助分子ベクターおよびｐｌａｃＺとを皮膚に共注射した時の補助分子ベクターによる予防接種効果の増強
ｐＣＤ４０Ｌプラスミドはまた皮膚に注射した時もｐｌａｃＺに対する抗−β−ｇａｌ抗体の応答を強化する。第１９図に示す実験では、マウス尾の基部近くに５０μｇのｐｃＤＮＡ３（チェッカー模様棒）、２５μｇのｐｃＤＮＡ３＋２５μｇのｐＣＤ４０Ｌ（輪郭棒）、２５μｇのｐｃＤＮＡ３＋２５μｇのｐｌａｃＺ（縞模様棒）、または２５μｇのｐＣＤ４０Ｌ＋２５μｇｐｌａｃＺ（黒色模様棒）を皮内注射した。注射、採血およびＥＬＩＳＡ分析を第１６Ａ図に示す通りに行った。チェッカー棒グラフおよび輪郭棒グラフの群は各々マウス８匹を含むが、縞の棒グラフおよび黒色棒グラフはおのおの１２匹のマウスを含んでいた。各棒グラフの高さは各群の１：４０希釈血清の吸光度平均値±標準偏差を示す。データの統計学的分析は縞模様の棒グラフおよび黒色棒グラフの群は独立であることを示す（Ｐ＜０．０５）。筋肉内注射で観察されるように、ｐｌａｃ−ＺとｐＣＤ４０Ｌとを共注射したマウスは第二注射１週後（１４日）および２週間前にｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３を注射したマウスよりも検出可能な血清抗−β−ｇａｌ抗体を発現した。さらに、これらの動物はまたｐｌａｃＺ注射群の２８日目のマウスよりも８倍も高い抗−β−ｇａｌ抗体タイターを有していた。非修正ｐｃＤＮＡ３ベクターまたはｐＣＤ４０Ｌ単独のいずれかを注射したマウスは検出可能な対β−ｇａｌ抗体を産生しなかった。
ｂ．補助分子遺伝子治療ベクターとｐｌａｃＺとを共注射したマウスにおけるＣＴＬ反応の増強
ＣＴＬ特異的または同系のβ−ｇａｌ発現標的細胞のｐｌａｃＺによる誘導を強化するｐＣＤ４０Ｌの性能を検査した。ｐＣＤ４０ＬとｐｌａｃＺとを骨格筋（第２０Ａ図）または皮膚（第２０Ｂ図）に共注射したＢＡＬＢ／ｃマウスはｐｌａｃＺ遺伝子移入Ｐ８１５細胞系統、Ｐ１３．２に対して特異的なｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３とを共注射したマウスよりも大きな数のＣＴＬを発生させた。５：１エフェクター：標的比率で、ｐｌａｃＺとｐＣＤ４０Ｌとを筋肉内注射したマウスから得た脾細胞のエフェクター細胞は２０％を越えるＰ１３．２の特異的溶解を達成した。対照的に、ｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３で対照注射した時はこのレベルの特異的溶解に達するためにはマウスの脾細胞はエフェクター対標的細胞の比率９倍以上が必要であった。同様にして、ｐｌａｃＺとｐＣＤ４０Ｌとを皮内注射したマウスからの脾細胞エフェクター細胞はエフェクター対標的細胞の比率４：１ではＰ１３．２細胞の５０％以上を殺した。ｐｌａｃＺとｐｃＤＮＡ３とを皮内注射したマウスから得た脾細胞を使用してこれに対応するレベルの特異的溶解に達するためには８倍も高いエフェクター：標的比率が必要であった。けれども、ｐＣＤ４０ＬとｐｌａｃＺとを共注射したマウスの脾細胞はｐｌａｃ−ＺをｐｃＤＮＡ３と共に注射したマウスのものよりも大きなＰ８１５に対する非特異的ＣＴＬ活性を持っていなかった（第２０図）。期待通りに、ｐｃＤＮＡ３単独またはｐｃＤＮＡ３およびｐＣＤ４０Ｌとを注射したマウスから得た脾細胞はＰ１３．２またはＰ８１５細胞の特異的溶解を媒介しなかった。
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４．補助分子遺伝子またはキメラ補助分子遺伝子を含む遺伝子治療ベクターを使用する新生物病の処置
ａ．マウスにおける新生物病の処置
本発明の補助分子リガンドをコードする遺伝子を使用するマウスモデル系における新生物処置法を証明する。補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０リガンド）を含む遺伝子治療ベクターは前記の実施例に記載したようにして製造した。この遺伝子治療ベクターを使用してその補助分子リガンド遺伝子をＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する腫瘍から得られた新生物細胞Ｌｉｎｅ１細胞に導入した。この補助分子は前記実施例に従ってこの新生物細胞に導入した。この新生物細胞表面での補助分子リガンドの発現は前記実施例に記載したようなフローサイトメトリーを使用して確認した。
新生物を処置する補助分子リガンド遺伝子の効果は次のようにして証明した：雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に照射したＬｉｎｅ１新生物細胞１．０×１０5個を腹腔内注射した。このＬｉｎｅ１新生物細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスの特発性肺アデノカルシノマに由来する。この新生物細胞はＢｌｉｅｄｅｎ、ほか著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ・Ｓｕｐｐ．、６巻：８２頁（１９９１年）に記載されている。他の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに前記の補助分子リガンド遺伝子（マウスＣＤ４０）をコードする遺伝子治療ベクターを導入しておいたＬｉｎｅ１腫瘍細胞を照射して、その１．０×１０5個を腹腔内注射した。
各群のマウスを１０日間おいて免疫反応を発現させた。１０日後に各マウスに１０×１０4個の非照射生Ｌｉｎｅ１新生物細胞をチャレンジした。このマウスを次に腫瘍の形成を観察し、死亡率の理由から腫瘍が２．０ｃｍに増殖した時に屠殺した。観察結果を第７図に示す。第７図に見られるように、その細胞表面に本発明の補助分子リガンドを発現する新生物細胞で免疫したマウスは実験期間を通じて腫瘍を発生しなかった。本発明の補助分子リガンド遺伝子を持たない新生物細胞で免疫したマウスは新生物細胞でチャレンジの５０日後には腫瘍が発生した。
第２１図はマウスのＣＤ４０Ｌではなく、ＣＤ４０を発現する肺腫瘍細胞系統でのヒトＣＤ４０Ｌの下方変調を証明する。ヒトの細胞系統Ｈｅｌａ（ＣＤ４０陰性の頚部癌、第２１Ａ図）、Ａ４２７（ＣＤ４０陰性の肺癌、第２１Ｂ図）、ＮＣＩ４６０（ＣＤ４０弱陽性の肺大細胞癌、第２１Ｃ図）およびＳＫ−Ｍｅｓ−１（ＣＤ４０強陽性の肺扁平上皮腫瘍、第２１Ｄ図）をｌａｃ−Ｚ（Ａｄ−ＬａｃＺ）、マウスＣＤ４０Ｌ（Ａｄ−ｍＣＤ４０Ｌ）、およびヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｄ−ｈＣＤ４０Ｌ）をコードするアデノウイルスに０（空試験）、１および１０のＭＯＩで感染させた。感染の４８時間後、マウスＣＤ４０ＬおよびヒトＣＤ４０Ｌの表面発現を測定した。リガンドを発現する細胞の百分率をＹ軸にプロットする。ヒトおよびマウスのＣＤ４０ＬはＣＤ４０陰性細胞系統では等レベルで発現する。しかしながら、ＣＤ４０を発現する細胞系統ではマウスＣＤ４０Ｌの発現のみが安定である。ｍＣＤ４０Ｌとは対照的に、ヒトのＣＤ４０ＬはＣＤ４０陽性腫瘍では下方変調される。
第２２Ａ図のグラフに示すデータは、ＣＤ４０結合は腫瘍表面マーカーの発現を誘導することを示す。αＣＤ４０・ｍＡｂを持ち、ＣＤ４０を発現する肺癌細胞系統を処置するとＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）およびクラスＩ主要組織適合性抗原（ＭＨＣ−Ｉ）の各腫瘍細胞表面マーカーの発現が強化される。ＣＤ４０弱陽性肺大細胞癌ＮＣＩ４６０をＣＤ４０特異的モノクローナル抗体（太線）またはアイソタイプ対照ｍＡｂであるＭＯＰＣ２１（細線）とともにＣＤ３２を発現するマウス繊維芽細胞上でインキュベーションした。４８時間インキュベーションした後に、肺腫瘍細胞をＣＤ９５、ＣＤ５４およびＭＨＣ−Ｉの発現についてＦＡＣＳで分析した。
第２２Ｂ図は再びＣＤ４０陽性腫瘍細胞によるヒトＣＤ４０Ｌの下方への変調を示す。Ｈｅｌａ（ＣＤ４０陰性）、ＣＬＬ（ＣＤ４０陽性）およびＳＫ−ＭＥＳ−１（ＣＤ４０陽性）腫瘍細胞をＣＤ３活性化正常ドナーＴ細胞とともに２４時間共培養した。腫瘍細胞：Ｔ細胞比は２．５：１とした。共培養後、ＣＤ２を発現するＴ細胞をＣＤ４０Ｌ表面発現についてＦＡＣＳによって分析した。細線はＦＩＴＣ標識したアイソタイプの対照抗体で染色されたＴ細胞（ＭＯＰＣ２１）および太線はＦＩＴＣ標識したαＣＤ４０Ｌ抗体で染色された活性化Ｔ細胞（αＣＤ１５４抗体）を示す。ＣＤ４０陽性腫瘍細胞系統であるＳＫ−ＭＥＳ−１およびＣＬＬはその表面にはＣＤ４０リガンドを発現しない。
５．ヒトの血液リンパ球でのヒトおよびマウス補助分子リガンド、Ｆａｓリガンドの発現
ａ．ヒトおよびマウスのＦａｓリガンド遺伝子を含む遺伝子治療ベクターおよび遺伝子構築物の構築
ヒトの補助分子リガンド遺伝子（ヒトＦａｓリガンド）またはマウスの補助分子リガンド遺伝子（マウスＦａｓリガンド）のどちらかを、ヒトおよびマウスの各々の遺伝子を利用して構築した。推測上のＭＭＰ切断部位を除去した改変された補助分子を作成し、ΔＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３と命名した。ΔＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３のヌクレオチド配列を配列番号４０に示す。ヒトＦａｓリガンドのヌクレオチド３２５から３４２まではアミノ酸６個をコードするが、これはΔＦａｓＬには存在しない。ΔＦａｓＬの設計はドメインＩＩＩがＭＭＰに最も近づきやすい部位を含み、細胞表面から分子を切断する標的であろうとの理由に基づく。ヒトのＦａｓリガンド遺伝子の配列は決定されており、配列１３および配列３０（Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号Ｕ１１８２１）に列挙してある。マウスのＦａｓリガンド遺伝子は決定されており、配列番号１４（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号Ｕ１０９８４）および配列番号３１（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号Ｕ５８９９５）に列挙してある。ラットのＦａｓリガンド遺伝子は決定されており、配列番号２５（Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号Ｕ０３４７０）に示してある。キメラ構築物をＣＤ４０リガンドキメラ構築物について実施例２に記載のようにして製造したが、これではヒトのＦａｓリガンドのドメインＩＩＩが他の蛋白質、特にＴＮＦ属の蛋白質で置き換えてある。キメラ構築物には、これらに限定するものではないが、マウスＦａｓリガンドのドメインＩＩＩに置換された（キメラ配列配列番号３７、第３７図に示す配列群）またはヒトのＣＤ７０のドメインＩＩＩで置換された（配列番号３８として示されるキメラ配列、第３８図に示す配列群）、またはヒトのＣＤ７０のドメインＩで置換された（配列番号３９として示されるキメラ配列、第３９図に示す配列群）、ドメインＩＩＩを持つヒトのＦａｓリガンドを包含する。多重のドメイン、例えばドメインＩＩＩの場所にヒトＣＤ７０ドメインＩＩＩが２コピーが挿入されたヒトのＦａｓリガンドなど、が挿入されたキメラ構築物も実施例Ｉに記載の方法を使用して製造される。ヒトのＦａｓリガンドのドメインＩＩＩに置換するために合成的配列が使用されたキメラ構築物も製造される。
ｉ．ヒトＦａｓリガンドのクローニング
ヒトのＦａｓリガンドをコードするｃＤＮＡを真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３にサブクローニングした。正常なドナー血液リンパ球を１ｎｇ／ｍＬＰＭＡプラス０．５μＭ−イオノマイシンで４時間活性化した。全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ・Ｒｎｅａｓｙキットで分離した。次にｃＤＮＡをポリ−Ａ・ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーでＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ・ｃＤＮＡ合成キットを使用して合成した。ヒトのＦａｓリガンドをコードする遺伝子を次にＦａｓリガンド特異的プライマー（センスプライマー：配列番号３２、アンチセンスプライマー：配列番号３３）でＰＣＲ増幅した。ＦａｓリガンドＰＣＲ産物を次に標準的な分子生物学技術を使用してｐｃＤＮＡ３にサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３にサブクローニングしたＲＴ−ＰＣＲ産物をｈＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３と命名する。
ｉｉ．マウスＦａｓリガンドのクローニング
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６株マウスから得たマウスのＦａｓリガンド遺伝子Ｓも前記のようにＰＭＡ＋イオノマイシンでマウス脾細胞を活性化し、続いて前記のようなポリ−Ａ合成したｃＤＮＡから増幅した（センスプライマー：配列番号３４、アンチセンスプライマー：配列番号３５）。これらの遺伝子をｐＴＡＲＧＥＴ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ製）にサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３にサブクローニングしたＲＴ−ＰＣＲ産物をｍＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３と命名する。
ｉｉｉ．アデノウイルスベクターの構築
ヒトのＦａｓリガンド、マウスＦａｓリガンド、またはΔＦａｓリガンドをコードするアデノウイルスベクターを構築するためにはクローニングしたｃＤＮＡ挿入物をプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジェゴ、ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ部位にサブクローニングした。ＲＳＶプロモーター−エンハンサーを有し、ウシ成長ホルモンのポリＡシグナル配列を有するＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏ１断片をプラスミドＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ１部位にサブクローニングした。このプラスミドＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２はプラスミドｐＸＣＸ２をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー配列をＥ１領域にクローニングして修正したものである。次に得られたプラスミドを燐酸カルシウム法を使用してｐＪＭ１７とともに２９３細胞に共遺伝子移入した。分離したアデノウイルスベクターのプラークを釣り上げて２９３細胞を感染させて増幅した。前記のように、ウイルス粒子の濃縮に塩化セシウムの段階的勾配、１．４５ｇ／ｃｍ3および１．２０ｇ／ｃｍ3の濃度勾配を使用し、試料をＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ブリー、ＣＡ製）で２時間遠心分離するとタイターの高いアデノウイルス製品が得られた。このウイルスバンドをＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５・ＤＮＡ級カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェー、ＮＪ）を用いて脱塩し、分離したウイルスを１０％グリセリン添加燐酸塩緩衝食塩水中に−７０℃で保存した。このウイルスのタイターは許容２９３細胞に希釈率を変えて感染させ、プラーク数を計数して求めた。タイターは典型的には１０10から１０12プラーク形成単位／ｍＬの範囲であった。このアデノウイルス構築物をＡｄ−ｈＦａｓＬ、Ａｄ−ｍＦａｓＬおよびＡｄ−ΔＦａｓＬと命名する。
ｂ．マウスおよびヒトのＦａｓリガンド遺伝子のヒト細胞への導入
ｈＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３、ｍＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３およびΔＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３の各構築物を電気穿孔法で２９３に遺伝子移入する。遺伝子移入した細胞をＧ４１８を含む培地中で選択する。Ｆａｓリガンド遺伝子移入体を抗−Ｆａｓ−リガンド抗体とフローサイトメトリーとを使用してトランスジーンの発現についてスクリーニングする。使用する方法はＣＤ４０ＬをＣＬＬ細胞に遺伝子移入する時に記載したものと同様である。
ＦａｓＬ−アデノウイルス感染には、１０6の新たに解凍し、洗浄したＣＬＬ細胞またはＨｅｌａ細胞を０．５ｍＬから１ｍＬの培養培地中に３７℃の５％ＣＯ2空気インキュベータ中で懸濁する。感染多重度（ＭＯＩ）を変えて細胞にアデノウイルスを添加し、感染した細胞を特段の記載がない限り４８時間培養した後、トランスジーン発現について分析する。
ｃ．ヒト細胞中でのＦａｓリガンド遺伝子の発現
リンパ滲出性疾患または一般的リンパ滲出性疾患のマウスは胸腺から活性化された自己反応性細胞を排除できない。これはこれらのマウスではＦａｓ受容体と補助分子リガンドであるＦａｓリガンドとの間の相互作用に欠陥があるという事実に関連する。これらの動物はリンパ腺症、巨脾症、腎炎および全身性紅斑性狼瘡またはリューマチ性関節炎（ＲＡ）の患者に見られるものに類似する全身性自己免疫疾患を含む多数の疾患を発病する。活性化リンパ球が関節から排除する役目をするＦａｓ受容体と補助分子リガンドとの間の正常な相互作用がＲＡ患者では障害されているであろうことが認識されている。
ＲＡの滑液リンパ球はマッチした正常ドナー血液リンパ球に対するマッチしたＲＡ血液リンパ球のものよりも高い比率でＦａｓ受容体を発現している。一方、ＲＡ滑液リンパ球は補助分子リガンドを殆どまたは全く発現しない。ＲＡ滑液リンパ球はＦａｓ誘導アポトーシスに感受性なので、ＲＡ関節内Ｆａｓリガンドの局所的発現が潜在的にＲＡ自己免疫疾患を媒介する滑液の単核球を排除しているかもしれない可能性がある。
第２３図はリンパ球でのＦａｓリガンド発現はＲＡ関節液への接触で阻害されることを示す。正常なドナー血液のＴ細胞は１ｎｇ／ｍＬのＰＭＡプラス０．５ｍＭ−イオノマイシンで５時間に活性化された。細胞をリューマチ性関節炎の血液プラズマ（白丸）、ＲＡ関節液（菱型）またはいずれもなし（四角）の存在下にインキュベーションした。これに加えて濃度を変えたＭＭＰ阻害剤ＢＢ９４とともに細胞をインキュベーションした。活性化の後、細胞をＦａｓリガンド表面発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｆａｓリガンドを発現する細胞の百分率を第２３図にプロットする。この実験でＲＡ関節液および血清中にＦａｓリガンドの表面発現を防止する因子が存在することが証明される。
ｄ．ヒト、マウスおよびキメラの補助分子リガンド、Ｆａｓリガンドの機能
ΔＦａｓＬ構築物の能力を測定するために、前記遺伝子移入細胞をＦａｓリガンド感受性ヒトＴ細胞系統ＪＵＲＫＡＴと混合する。共培養４時間の後、非接着性ＪＵＲＫＡＴ細胞を集めてアポトーシスに着いて評価する。螢光性化合物である３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン・ヨウ化物（ＤｉＯＣ６）を使用して前記プロトコルの修正を使用してアポトーシスを評価する。このためには、細胞を室温で燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で洗浄する。細胞を９６ウェルＵ字底プラスチック製マイクロタイタープレートの別々のウェルに全量５０ｍＬ容で１０5〜５×１０5細胞／ウェルで入れる。指定があれば飽和量のＰＥ−複合抗体を添加し、続いてＤｉＯＣ６およびプロピジウム・ヨーディド（ＰＩ）を添加する。ＤｉＯＣ６およびＰＩは各々４０ｎＭおよび最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで使用する。次に細胞を３７℃で１５分間５％ＣＯ２組織培養インキュベータ中でインキュベーションする。染色された細胞を次に氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、最後に２００ｍＬのＳＭに懸濁してＦＡＣＳで分析する。特徴的な正方向および光散乱特性を持つ死菌および破砕物およびＰＩ染色物を分析系から排除する。
ＣＤ９５を発現する細胞のＦａｓ媒介アポトーシスを指向するΔＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３を発現する細胞の性能をＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３を発現する細胞の性能と比較する。ΔＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３またはＦａｓＬ−ｐｃＤＮＡ３がコードする蛋白質産物の相対的安定性は金属プロテイナーゼ阻害剤の存在または不在下のおよびＲＡ関節液との前−および後−培養でのいずれかのリガンドを発現する細胞のフローサイトメトリーによって評価する。
６．補助分子リガンド、Ｆａｓリガンドをコードする遺伝子治療ベクターでの関節炎の治療
前記の通りに製造した最高な発現安定性を示し、Ｆａｓ誘導アポトーシスの媒介に最大な能力を有する異種Ｆａｓリガンド構築物をＲＡの遺伝子治療に使用する。可能性のある治療用構築物を詳しく特徴付けられた関節炎のマウスモデルで効果および生体内での機能について試験する。
ａ．マウスにおける関節炎の遺伝子治療
ｉ．関節炎についてのマウスモデル
マウス関節炎のモデルの一つはコラーゲン誘導関節炎である。これはＤＢＡ／１マウスにタイプＩＩコラーゲンの完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）液を注射することによって滑膜炎およびびらんを伴う組織学的にＲＡに類似の関節炎を起こすものとして知られている。われわれの研究には雄性ＤＢＡ／ＩマウスをウシのタイプＩＩコラーゲンの完全フロインドアジュバントで０日目に免疫し、２１日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）に追加免疫する。２８日目に動物にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および／または同型のコラーゲンをｉ．ｐ．注射するかまたは酢酸単独に注射をする。典型的にはコラーゲンで免疫した動物の前または後足首の腫張および／または発赤を２回目の注射後、第三または第四週に検出する。この脊椎動物はまれにしか罹患しない。最初から数週後に末梢関節が腫張する。罹患した関節は初期関節浮腫の組織学的変化を示し、続いて滑膜増殖を示す。
別の動物モデルは最近Ｋｏｕｓｋｏｆｆ，Ｖ．ほか著、Ｃｅｌｌ、８７巻：８１１〜８２２頁（１９９７年）に報告された。これは偶然に作製されたもので、Ｔ細胞受容体（ＣＲ）トランスジェニックマウス系統と非肥満糖尿病（ＮＯＤ）株とを交配してＲＡのＫＲＮ×ＮＯＤマウスモデルが作製された。この交配の子孫は一般的にＲＡ患者のものと高度に類似する関節疾患を発病する。その上、この動物の疾患は早期な時間的に再現性のある発病および高度に再現性のある経過を辿る。この関節炎は明らかにトランスジェニックＴＣＲによるＮＯＤ由来主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の認識を誘導して一般的自己寛容および全身性自己反応性機構の衰弱に到る。
ｉｉ．補助分子リガンドをコードする遺伝子治療ベクターで処理したマウスにおける関節炎症状の沈静
われわれは最初にＳａｗｃｈｕｋとその協力者が報告したプロトコルをマウスの関節にアデノウイルスベクターを微量注射するように適応させて、修正した。この操作法を使用して我々は再現性良く５μＬ容をマウスの膝の関節腔に注射できる。この操作では、マウスをメトファンで麻酔する。＃１１メスで膝後面上の皮膚に約２〜３ｍｍの切開部を作って膝蓋骨−脛骨じん帯部を可視化する。われわれはマイクロ−１００μＬ−Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび３０ゲージの針を使用して５μＬまでの液を注射できる。注射後、膝切開部をＮｏｘａｂｏｎｄ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ・Ｐｒｏｄｕｃｔｓ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）で塞ぐ。われわれのアデノウイルスのタイターは典型的にはｍＬ当り１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）を超えるので、前記の通り、５ｍＬで少なくとも５×１０8ｐｆｕのウイルスを膝関節に送達することができる。対照の動物には対照Ａｄ−ｌａｃＺベクター、トランスジーンを欠失する複製欠損アデノウイルスベクターを、またはウイルスを懸濁するために使用する緩衝液（１０ｍＭ−トリス、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１０％グリセリン）を注射する。
別の方法では形質導入細胞の養子免疫細胞移入を意図する宿主動物に同系なマウスから脾細胞を収集する。細胞の増殖を外因性ＩＬ−１２（１００単位／ｍＬ）で４８時間誘導する。細胞を計数し、次にウェル当り１ｍＬの完全培養培地を入れた１２ウェル皿に５×１０5個または１×１０6細胞／ｍＬの密度で再塗布する。ウイルスとＣｏｎＡとを共に再塗布の時間にポリブレン（８μｇ／ｍＬ）の存在下に添加する。培地を感染の２４時間後に１００単位組換えＩＬ−２／ｍＬ添加完全培地と交換する。感染後４８時間にフローサイトメトリーでＦａｓリガンド発現について、適当量の形質導入細胞を試験する。
各動物に標準化された数のサイトカイン産生細胞または対照模倣遺伝子移入細胞を腹腔内注射する。前記４Ａ節に記載したようにして濃厚細胞懸濁液を直接マウスの関節腔に注射する。並行して適量の遺伝子移入した細胞集団を外因性ＩＬ−２添加組織培養液中に維持する。
マウスを関節炎の兆候について盲検方式で観察する。疾患発症日付を記録し、各関節または関節群（足指、足首、くるぶし、手首、膝）の臨床的重症度を次のように級分けする：０（正常）、１（紅斑）、２（腫れ）、３（変形）、４（壊死）。各スコアを集めて関節炎スコアとする。関節炎の重症度を所与の日に観察された平均スコアおよび各マウスが臨床的疾患の経過の間に到達した最大関節炎スコアの平均の両方で表す。死亡時に後足を解剖して組織学的検査またはＲＴ−ＰＣＲを行う。関節炎の組織学的重症度は関節液増殖および炎症細胞滲出について０〜３の尺度で記録する：各スコアは０＝正常および３＝重症である。
被験アデノウイルスベクターの対照を関節内注射したマウスについては、対側性部位間に観察される関節炎のレベルを比較する。それに加えて、全関節スコアから全動物について注射した関節のスコアを差し引いた値を対照または被験アデノウイルスベクターを注射した関節に観察される値と比較する。
Ｆａｓリガンド・アデノウイルス発現ベクターの局所的投与は定量的ＲＴ−ＰＣＲでＣＤ８０ｍＲＮＡの相対的レベルを測定することによって評価すると活性化された細胞のクリアランスを起こす。この処置はまた強化されたレベルに到る。また、罹患マウスの関節組織に確認されるレベルのアポトーシスがＴＵＮＥＬ検定（「Ｔｅｒｍｉｎａｌ・ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ・ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ・（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ・ｄＵＴＰ・Ｎｉｃｋ・Ｅｎｄ・Ｌａｂｅｌｉｎｇ」）によって評価する。ＴＵＮＥＬはＴｄＴ緩衝液（３０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１４０ｎＭ−ナトリウムカコジレート、１ｍＭ−塩化コバルト）に切片を浸漬し、次にＴｄＴ（ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ社、グランドアイランド、ＮＹ）およびビオチン化ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナポリス、ＩＮ）を添加して実行する。この反応は切片をＴＢ緩衝液（３００ｍＭ−塩化ナトリウム、３０ｍＭ−クエン酸ナトリウム）に浸漬して停止させる。続いて試料をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで処理し、次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ・ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンガム、ＣＡ）を使用して可視化する。免疫組織化学には、切片を室温３０分間４％スキムミルクでブロックし、次にマウスＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ８０またはＣＤ９５（Ｆａｓ）に特異的なビオチン化ｍＡｂとインキュベーションする。これらの抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入できる（サンジェゴ、ＣＡ）。
ｂ．補助分子リガンド、Ｆａｓリガンドをコードする遺伝子治療ベクターでのリューマチ性関節炎の治療
治療効果をもつものと確認されたＦａｓリガンド構築物の候補をヒトでのＲＡを処置するプロトコルに使用した。ヒトでのプロトコルはＦａｓリガンド構築物を放出する生体内または生体外のいずれかでの方法を含む。さらに、このＦａｓリガンド構築物は潜在的にウイルス性または非ウイルス性に放出される。治療の戦略の概要を次に記載する。
生体外治療法はインターロイキン−１受容体拮抗剤を合成するようにレトロウイルス的に形質導入された自己由来滑液細胞の関節内移植について報告されているプロトコルと類似している（Ｅｖａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ、ほか著、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ・Ｔｒｉａｌ・ｔｏ・Ａｓｓｅｓｓ・ｔｈｅ・Ｓａｆｅｔｙ，Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ・Ｅｆｆｉｃａｃｙ・ｏｆ・Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ・ａ・Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ・Ａｎｔｉ−Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ・Ｃｙｔｏｋｉｎｅ・Ｇｅｎｅ・ｔｏ・Ｈｕｍａｎ・Ｊｏｉｎｔｓ・ｗｉｔｈ・Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ・ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｈｕｍａｎ・Ｇｅｎｅ・Ｔｈｅｒａｐｙ（関節炎を治療できると思われるサイトカインの遺伝子をヒトの関節に移植する方法の安全性、可能性および有効性を評価するための臨床試験、ヒトの遺伝子療法）」、７巻：１２６１〜１２８０頁）。この操作ではＲＡの臨床的診断後、全関節置換の間に滑液膜を収集する。滑液細胞を再分離して増殖し、次に、外因性Ｆａｓリガンドを滑液細胞に形質導入または遺伝子移入（レトロウイルス、アデノウイルス、裸のＤＮＡ、など）する。遺伝子修正滑液細胞を次に患者に再注射し、患者をＲＡに関連する症状の緩和および修正滑液細胞に入れたＦａｓリガンドの発現および機能について監視し、試験する。
別の生体外プロトコルでは、異種Ｆａｓリガンドを安定に発現する同種異系の不死化細胞系統をＲＡ患者に投与する。このプロトコルではＦａｓリガンドを安定に発現する安定な不死化細胞系統を構築する（たとえば電子穿孔法のような非ウイルス法で細胞に遺伝子を遺伝子移入して導入したもの、または細胞にその遺伝子をウイルス法で形質導入したもの）。この修正細胞系統を患者に注射し、ＲＡに関連する症状の緩和および修正滑液細胞に入れたｈＦａｓリガンドの発現および機能について監視し、試験する。
生体内による治療法はＺｈａｎｇ、ほか著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００巻：１９５１〜１９５７頁（１９９７年）に記載されているマウスのＦａｓリガンドアデノウイルス遺伝子治療ベクターを使用してコラーゲン誘導関節炎を緩和する考え方と類似している。このような手法でも、ＲＡ患者の関節へのｈＦａｓリガンド構築物またはキメラΔＦａｓＬの直接的送達はウイルス的または非ウイルス的方法で行う。この操作では、Ｆａｓリガンド構築物（たとえばｈＦａｓリガンドアデノウイルス）を滑液膜に直接的に注射する。患者をＲＡに関連する症状の緩和について監視し、試験する。ならびに修正滑液細胞の中のｈＦａｓリガンドの発現および機能について生物学的に試験する。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）  特許出願人：  キップス，トーマス・ジェイ
シャーマ，サンジャイ
キャントウェル，マーク
（ii）  発明の名称：  補助分子リガンド遺伝子を含む新規な発現ベクター、
ならびに免疫調節のためのならびに悪性腫瘍および自己免疫疾患の処置のためのその用途
（iii）  配列の数：３５
（iv）  連絡先：
（Ａ）名宛人：ライオン・アンド・ライオン
（Ｂ）通り：スイート４７００，ウエスト・フィフス・ストリート６３３
（Ｃ）市：ロス・アンジェルス
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９００７１−２０６６
（ｖ）  コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：３．５インチディスケット１．４４Ｍｂ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパティブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＩＢＭ Ｐ．Ｃ．ＤＯＳ ５．０
（Ｄ）ソフトウェア：FastSeq Version 2.0
（vi）  本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：To be assaigned
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）  優先権出願データ：
（Ａ）出願番号：６０／１３２１４５
（Ｂ）出願日：１９９６年９月１２日
（viii）  弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ガイゼ、ジェフリー・ダブリュー
（Ｂ）登録番号：３４，６１３
（Ｃ）参照／整理番号：２３１／００３
（ix）  電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：（２１３）４８９−１６００
（Ｂ）ファックス番号：（２１３）９５５−０４４０
（Ｃ）テレックス：６７−３５１０
（２）  配列番号1の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：786塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号1:
0004015201.tif 000009
（２）  配列番号2の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：783塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号2:
0004015201.tif 000010
（２）  配列番号3の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：783塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号3:
0004015201.tif 000011
（２）  配列番号4の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：786塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号4:
0004015201.tif 000012
（２）  配列番号5の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：783塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号5:
0004015201.tif 000013
（２）  配列番号6の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：786塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号6:
0004015201.tif 000014
（２）  配列番号7の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：786塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号7:
0004015201.tif 000015
（２）  配列番号8の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：864塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号8:
0004015201.tif 000016
（２）  配列番号9の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：3634塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号9:
0004015201.tif 000017
0004015201.tif 000018
0004015201.tif 000019
（２）  配列番号10の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1997塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号10:
0004015201.tif 000020
0004015201.tif 000021
（２）  配列番号11の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：10240塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号11:
0004015201.tif 000022
0004015201.tif 000023
0004015201.tif 000024
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0004015201.tif 000028
（２）  配列番号12の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1644塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号12:
0004015201.tif 000029
0004015201.tif 000030
（２）  配列番号13の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1890塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号13:
0004015201.tif 000031
（２）  配列番号14の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1541塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号14:
0004015201.tif 000032
（２）  配列番号15の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：888塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号15:
0004015201.tif 000033
（２）  配列番号16の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1906塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号16:
0004015201.tif 000034
0004015201.tif 000035
（２）  配列番号17の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1619塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号17:
0004015201.tif 000036
（２）  配列番号18の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1239塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号18:
0004015201.tif 000037
（２）  配列番号19の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：606塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号19:
0004015201.tif 000038
（２）  配列番号20の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：783塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号20:
0004015201.tif 000039
（２）  配列番号21の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：558塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号21:
0004015201.tif 000040
（２）  配列番号22の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1783塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号22:
0004015201.tif 000041
0004015201.tif 000042
（２）  配列番号23の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1047塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号23:
0004015201.tif 000043
（２）  配列番号24の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1176塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号24:
0004015201.tif 000044
（２）  配列番号25の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：1623塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号25:
0004015201.tif 000045
（２）  配列番号26の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：28塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号26:
0004015201.tif 000046
（２）  配列番号27の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：27塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号27:
0004015201.tif 000047
（２）  配列番号28の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：30塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号28:
0004015201.tif 000048
（２）  配列番号29の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：30塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号29:
0004015201.tif 000049
（２）  配列番号30の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：972塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号30:
0004015201.tif 000050
（２）  配列番号31の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：885塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号31:
0004015201.tif 000051
（２）  配列番号32の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：29塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号32:
0004015201.tif 000052
（２）  配列番号33の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：30塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号33:
0004015201.tif 000053
（２）  配列番号34の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：27塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号34:
0004015201.tif 000054
（２）  配列番号35の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：27塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号35:
0004015201.tif 000055
（２）  配列番号36の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：680塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号36:
0004015201.tif 000056
（２）  配列番号37の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：846塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号37:
0004015201.tif 000057
（２）  配列番号38の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：786塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号38:
0004015201.tif 000058
（２）  配列番号39の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：864塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号39:
0004015201.tif 000059
（２）  配列番号40の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：828塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号40:
0004015201.tif 000060
（２）  配列番号41の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：846塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号41:
0004015201.tif 000061
（２）  配列番号42の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：876塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号42:
0004015201.tif 000062
（２）  配列番号43の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：720塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号43:
0004015201.tif 000063
（２）  配列番号44の情報：
(i)  配列の特徴
(A)  長さ：930塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号44:
0004015201.tif 000064
【図１】
0004015201.tif 000065
【図２】
0004015201.tif 000066
【図３】
0004015201.tif 000067
【図４】
0004015201.tif 000068
【図５】
0004015201.tif 000069
【図６】
0004015201.tif 000070
【図７】
0004015201.tif 000071
【図８】
0004015201.tif 000072
【図９】
0004015201.tif 000073
【図１０】
0004015201.tif 000074
【図１１】
0004015201.tif 000075
【図１２】
0004015201.tif 000076
【図１３】
0004015201.tif 000077
【図１４】
0004015201.tif 000078
【図１５】
0004015201.tif 000079
【図１６】
0004015201.tif 000080
【図１７】
0004015201.tif 000081
【図１８】
0004015201.tif 000082
【図１９】
0004015201.tif 000083
【図２０】
0004015201.tif 000084
0004015201.tif 000085
【図２２】
0004015201.tif 000086
【図２３】
0004015201.tif 000087
【図２４】
0004015201.tif 000088
【図２５】
0004015201.tif 000089
【図２６】
0004015201.tif 000090
【図２７】
0004015201.tif 000091
【図２８Ａ】
0004015201.tif 000092
【図２８Ｂ】
0004015201.tif 000093
【図２８Ｃ】
0004015201.tif 000094