(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造［Ｉ］を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
−（ＣＨ2 ）ｎ−Ｙ                      ［Ｉ］
（ｎは、１以上、２０以下の整数、Ｙは、１級、２級、３級あるいは４級のアミノ基を示す。）
【請求項２】
該ポリマが、下記一般式［III］で示されるポリマである請求項１記載のスーパー抗原吸着材料。
【化１】
0003890625.tif 000006
【請求項３】
請求項１または２記載のスーパー抗原吸着材料を用いた体液浄化カラム。
【請求項４】
請求項１または２記載のスーパー抗原吸着材料を用いた創傷被覆材。
【請求項５】
下記構造［II］を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
−Ｒ−（ＣＨ2 ） ｎ−Ｒ’−Ｙ          ［II］
（ｎは０または１、Ｒ，Ｒ’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる１種，Ｙは１級、２級あるいは３級のアミノ基を示す。）
【請求項６】
該ポリマが、下記一般式［IV］で示されるポリマである請求項５記載のスーパー抗原吸着材料。
【化２】
0003890625.tif 000007
【請求項７】
請求項５または６記載のスーパー抗原吸着材料を用いた体液浄化カラム。
【請求項８】
請求項５または６記載のスーパー抗原吸着材料を用いた創傷被覆材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、黄色ブドウ球菌毒素や連鎖球菌毒素等のスーパー抗原を、選択的に吸着するスーパー抗原吸着材料、およびその材料を用いた体液浄化や感染症の治療に用いるカラムあるいは創傷被覆材料に関する。特にヒト血液中等の高蛋白濃度溶液から選択的にスーパー抗原を吸着除去するのに好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
スーパー抗原とは、従来の抗原と異なり、抗原提示細胞内におけるプロセッシング過程を経ることなく、抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原クラスII蛋白（以下、「ＭＨＣクラスII」と言うことがある）に結合し、さらにはこのＭＨＣクラスIIとの複合体を形成することにより特定のＶ領域を有するＴ細胞を刺激し、免疫系を異常に活性化させる化合物であり、敗血症時の発熱、発疹、血圧低下や食中毒時の嘔吐あるいは自己免疫疾患の誘発等を引き起こすとされている。スーパー抗原としては、黄色ブドウ球菌外毒素や連鎖球菌外毒素、あるいはある種のウイルス蛋白やヒートショック蛋白が確認されているが、今後も特定化されていく可能性がある。
【０００３】
もし、スーパー抗原を選択的に吸着することができる材料が存在すれば、これを用いて血液、尿等の体液や食料品、飲料物中からスーパー抗原を除去することが可能となり、食中毒、敗血症や自己免疫疾患の治療や発症を予防することが可能になる。
【０００４】
これまで、これら毒素を選択的に血液中や培養液上清から吸着するための結合物質には、毒素に対する抗体や、黄色ブドウ球菌外毒素に対する主要組織適合性抗原クラスII蛋白質等の高親和性ポリペプチドが固定されたカラム材料が用いられてきた。
【０００５】
しかし、これらの結合物質はペプチドあるいは蛋白質であることが多く、その結果、高価である，滅菌により失活しやすい等の欠点を有していた。
【０００６】
また、毒素蛋白質を精製するために培養上清よりイオン交換樹脂を用いて毒素を吸着してくる方法も知られているが、この方法では、溶液のｐＨの影響を受けやすく、血液や食料品等でｐＨを中性に保つ必要性のある場合には特異性が低く、血液中等の高蛋白質溶液から微量の毒素を溶液組成を変化することなく吸着するには不適当である。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明はこれら従来技術の欠点を解消しようとするものであり、選択性に優れ、滅菌による失活がなく、かつ安価であるスーパー抗原の吸着材料を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は、該材料を用いたスーパー抗原除去用の体液浄化モジュールおよびスーパー抗原吸着性の創傷被覆材料を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌外毒素等のスーパー抗原が疎水性相互作用を強く有する官能基に対して選択的に吸着する性質を見出し、種々の官能基を検討した。その結果、上記目的を達成するために、本発明は下記の構成を有する。
【０００９】
「(1) 下記構造を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
【００１０】
−（ＣＨ2 ）ｎ−Ｙ                      ［Ｉ］
（ｎは、１以上、２０以下の整数、Ｙは、１級、２級、３級あるいは４級のアミノ基を示す。）
(2) 下記構造を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
【００１１】
−Ｒ−（ＣＨ2 ） ｎ−Ｒ’−Ｙ      ［II］
（ｎは０または１、Ｒ，Ｒ’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる１種，Ｙは１級、２級あるいは３級のアミノ基を示す。）」
本発明においてポリマ成分としては特に限定なく、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子材料や、セルロース、コラーゲン、キトサン及びその誘導体を含む天然高分子材料等が好ましく用いられ、これらポリマは、単独重合あるいは共重合、また、ブレンドしても用いることができる。さらに、本発明の材料においては、後述の式［Ｉ］あるいは［II] で示される側鎖を有するが、かかる側鎖の導入のし易さを考慮すると、前記ポリマとして、アミノ基やカルボキシル基を有する高分子材料が特に好ましい。また、本発明においては、これらアミノ基やカルボキシル基を有しない材料の表面を、アミノ基やカルボキシル基を有する材料で被覆して用いることも好ましい。
【００１２】
また、本発明の材料は、体液浄化カラム、創傷被覆材、免疫学的な測定材料などとして好ましく用いられる。その形状としては特に限定はないが、カラムとして用いる場合にはビーズ、繊維、中空繊維、織物等が好ましく、また、免疫学的な測定に用いる場合には、ビーズ、プレート、チューブ等の形状が好ましく、創傷被覆材料の場合は、織物あるいはフィルム等の形状が好ましい。さらに、本発明の材料には、例えば、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料などに、前記ポリマを被覆した材料も含まれる。
【００１３】
本発明においては、スーパー抗原を吸着するために、上記ポリマの側鎖に、
−（ＣＨ2 ） ｎ−Ｙ                      ［Ｉ］
（ｎは、１以上、２０以下の整数、Ｙは、１級、２級、３級あるいは４級のアミノ基を示す。）、
あるいは
−Ｒ−（ＣＨ2 ） ｎ−Ｒ’−Ｙ            ［II］
（ｎは０または１、Ｒ，Ｒ’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる１種，Ｙは１級、２級あるいは３級のアミノ基を示す。）
を有する。
【００１４】
これら［Ｉ］あるいは［II］で示される官能基として、［Ｉ］としては、アミノヘキシル基、モノメチルアミノヘキシル基、ジメチルアミノヘキシル基、アミノオクチル基、アミノドデシル基などが挙げられる。また、［II］としては、ｐ−（β−ｐ−アミノフェニルエチル）フェニル基、ｐ−（ｐ−アミノフェニルメチル）フェニル基、４−（４アミノシクロヘキシルメチル）シクロヘキシル基、ｐ−（β−ｐ−モノメチルアミノフェニルエチル）フェニル基等が挙げられる。
リガンドの結合法としては、一般に公知の方法が用いられる。例えば、１級アミノ基を有する材料に、１級アミノ基に対して過剰量、つまりはアミノ基１モルに対して２モル以上、好ましくは５モル以上のヘキサメチレンジイソシアネートや４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート，ナフタレンジイソシアネート、１，４ジシクロヘキシルジイソシアネート等の有機ジイソシアネートを反応させた後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性水溶液あるいは熱水で処理し末端の未反応イソシアネート基を加水分解し１級アミノ基を得る方法が挙げられる。
【００１５】
あるいは、イソシアネート基あるいはカルボキシル基あるいはスクシンイミド等のカルボン酸の活性エステル基を有する材料にヘキサメチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、４，４’ジフェニルメタンジアミン等のジアミン類をイソシアネート基あるいはカルボキシル基あるいはスクシンイミド等のカルボン酸の活性エステル基に対して過剰量、つまりはアミノ基１モルに対して２モル以上好ましくは５モル以上反応させることも挙げられる。
【００１６】
溶媒としては、上記の有機ジイソシアネートや有機ジアミン類が溶解する極性溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎブタノール等のアルコール類やアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類が使用できる。
【００１７】
有機ジイソシアネートおよび有機ジアミンの反応時間及び温度に関しては限定はないが、用いた極性溶媒の沸点以下の温度において３０分から２４時間の温度が好ましい。また、アミノ基の２級、３級および４級化としては、ヨウ化メチルなどのハロゲン化アルキルやジメチル硫酸を反応させることにより容易に行える。
【００１８】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
疎水性基を付加したキトサンビーズによるスーパー抗原のバッチ法のよる吸着試験を以下の通り行った。
【００２０】
粒径０．１mmのキトサンビーズ（富士紡（株）製、“キトパール”ＡＬ−０１）１２ｍｌ（沈降時体積、乾燥時重量は１．０ｇ）をジメチルホルムアミド中で撹拌する。この操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【００２１】
このビーズを１０ｇのヘキサメチレンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、撹拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行い、この洗浄操作を３回繰り返し未反応ヘキサメチレンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と撹拌しながら室温で２０分間反応させイソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、次の構造式を有するキトサンビーズを得た。
【００２２】
【化３】
0003890625.tif 000002
この修飾キトサンビーズおよびコントロールとしての未修飾キトサンビーズを用いて、ウサギ血漿中の３種のスーパー抗原、黄色ブドウ球菌外毒素Ｂ（ＳＥＢ）及び外毒素Ｃ（ＳＥＣ）及びトキシックショックシンドロームトキシン１（ＴＳＳＴ１）の吸着除去を行った。スーパー抗原の初期濃度は１ｎｇ／ｍｌとし、血漿量１０ｍｌに対して上記のキトサンビーズ１ｍｌを添加し、３７℃において６０分間振盪し、反応前後のウサギ血漿中の３種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した。６０分後のウサギ血漿中のスーパー抗原濃度を表１に示す。この結果が示すように、化学修飾によりキトサンビーズにスーパー抗原吸着能が付加されることが示された。
【００２３】
【表１】
0003890625.tif 000003
実施例２
疎水性基を付加したキトサンビーズによるスーパー抗原の循環法による吸着試験について以下のとおり行なった。
【００２４】
粒径０．１mmの実施例１と同様のキトサンビーズ１２ｍｌ（沈降時体積、乾燥時重量は１．０ｇ）をジメチルホルムアミド中で撹拌する。この操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【００２５】
このビーズを１５ｇの４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、撹拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行い、この洗浄操作を３回繰り返し未反応４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と撹拌しながら室温で２０分間反応させイソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、次の構造式を有するキトサンビーズを得た。
【００２６】
【化４】
0003890625.tif 000004
この修飾キトサンビーズおよびコントロールとしての未修飾キトサンビーズを用いて、実施例１同様にウサギ血漿中のスーパー抗原（ＴＳＳＴ１）の循環方法による吸着除去を行った。スーパー抗原の初期濃度は１ｎｇ／ｍｌとし、血漿量１０ｍｌに対して上記のキトサンビーズ１ｍｌを添加し、３７℃において６０分間反応させ、５分，１５分，３０分，４５分，６０分後のウサギ血漿中の３種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した（図１）。このように、化学修飾によりキトサンビーズに体外循環のような流動条件下におけるスーパー抗原吸着能が示された。
【００２７】
比較例１
３種の疎水性ビーズによるスーパー抗原吸着試験につき、以下の通り行った。
実施例１で作製した疎水性キトサンビーズ及び市販の疎水クロマトグラフィー用ビーズであるブチルトヨパール（東ソー（株））及びフェニルセファロース（ファルマシア  バイオテク（株））を用いて３種のスーパー抗原、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＴＳＳＴ−１の吸着試験を行った。スーパー抗原の初期濃度は１ｎｇ／ｍｌとし、血漿量１０ｍｌに対して上記のビーズ１ｍｌを添加し、３７℃において６０分間振盪し、反応前後のウサギ血漿中の３種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
0003890625.tif 000005
このように、他の疎水性のビーズに比較しても本発明のリガンドを有するビーズはスーパー抗原に対して高い結合活性があることが示された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、選択性に優れ、滅菌による失活がなく、かつ安価であるスーパー抗原の吸着材料が提供された。本発明の吸着材料を用いて、各種スーパー抗原を選択的に効率よく除去できるので、血液、尿等の体液や食料品、飲料物中よりスーパー抗原を除去するために用いることができ、これにより、除去カラムや創傷被覆材料を構成することで食中毒、敗血症や自己免疫疾患の治療や発症を予防することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】循環法によるスーパー抗原吸着試験の結果を示す。
【図１】
0003890625.tif 000008