(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式
【化１】
0003886598.tif 000006
で表されるＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジン又はその生理学的に許容し得る塩からなる発癌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発癌抑制剤に関する。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】
癌の治療法に関しては、これまでに様々な研究がなされている。特に、治療薬については、数多くの研究および開発が行われ、実際に医療現場で使用されている薬剤もある。しかしながら、未だに癌を根治する特効薬はなく、現在使用されている抗癌剤あるいは免疫療法剤などの癌治療薬では、その治療効果の弱さと副作用の強さとが問題となっている。
【０００３】
このような癌発生後の治療薬の問題点は、薬剤を正常細胞に影響を与えることなく癌細胞のみに特異的に作用させることの困難性、および化学合成物質の薬剤が本来的に有する安全性の問題に起因する。
【０００４】
最近、癌発生後の治療薬とは別に、癌の発生を抑制するという観点で、癌抑制物質の探索が特に重要視されている。有効な癌抑制物質を抽出あるいは合成し薬剤として、発癌の防止に用いることができれば、特に遺伝性癌あるいは職業癌の予防が可能となる。このような薬剤は、今後の新しい医療および日常生活における健康維持に大きく寄与すると考えられる。
【０００５】
このような発癌抑制剤は、日常生活で手軽に摂取し得ることが好ましい。さらに、経口投与でも効果を示し、副作用のないことが必要条件である。しかしながら、これまでのところ、安全性に問題がない特定の発癌抑制物質を発癌予防あるいは治療用の薬剤として用いている例はない。
【０００６】
本発明の目的は、遺伝性癌あるいは職業癌の予防、または癌治療後の再発防止等に有効な発癌抑制剤を得ることにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、発癌抑制の機能を有する食品を得ることにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、発癌抑制作用を示しかつ人体に悪影響を及ぼさない安全な化合物を広く探索し、鋭意検討を重ねた結果、植物由来の化合物の中に発癌抑制作用を有するものを見いだし、本発明に至ったのである。
【０００９】
本発明に係る発癌抑制剤の要旨とするところは、化学式
【００１０】
【化３】
0003886598.tif 000002
【００１１】
で表されるＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジン又はその生理学的に許容し得る塩を有効成分とすることにある。
【００１２】
本発明に係る食品の要旨とするところは、化学式
【００１３】
【化４】
0003886598.tif 000003
【００１４】
で表されるＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジン又はその生理学的に許容し得る塩を発癌抑制剤として含むことにある。
【００１５】
本発明の用語「発癌抑制」とは、癌細胞の発生を抑制することおよび一旦発生した癌細胞の増殖を抑制することを意味する。
【００１６】
本発明の用語「生理学的に許容し得る塩」は、投与しても安全性に問題のないすべての塩を指し、例えば、無機酸である塩酸、リン酸、硝酸などの塩、あるいは有機酸である酢酸、クエン酸、マレイン酸、酒石酸などの塩をいう。
【００１７】
本発明の用語「食品」とは、飲料あるいは固形の食品をいい、好ましくは、特定の保健効果が認められる食品、あるいは生体調整成分の機能を生かして作られる、機能性食品を意味する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に係るＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンは、天然物中に見いだされ、特に好ましくは、コショウから分離採取することができる。あるいは、コショウの果実の乾燥粉砕物から有機溶剤などで抽出されるコショウオレオレジンから分離採取することができる。
【００１９】
具体的には、本発明に係るＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンは、コショウあるいはコショウオレオレジンから種々の方法で得ることができる。その方法は、特に限定されないが、例えば、コショウの果実の乾燥粉砕物あるいはコショウオレオレジンを有機溶剤で処理し、不溶性成分を分離した有機溶剤相を取る。この処理に利用する有機溶剤の例としては、例えば、ｎ−ヘキサン、塩化メチレン、エチレンジクロライドなどが挙げられる。
【００２０】
次いで、この有機溶剤相を、例えば重炭酸塩水溶液で処理し、さらに得られる有機溶剤相をアルカリ水溶液で処理し、このアルカリ水溶液相のｐＨを中性から酸性に調整する。この処理に利用する重炭酸塩の例としては、例えば炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムあるいはこれらの組み合わせが挙げられる。アルカリの例としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２１】
次いで調整した液を有機溶剤で抽出することにより、フェノ−ル性アミド化合物の複数種を含む分離物を取得することができる。得られたフェノ−ル性アミド化合物を、例えば、シリカゲルカラムを用いて、メチレンクロライドとメタノ−ルとの混合溶剤で溶出して、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを単離し得る。
【００２２】
さらに、本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンは、合成して得ることもできる。合成は、例えば、文献（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４、２８３１（１９８０））に記載のようにして行われ得るが、この方法に限定はされない。
【００２３】
具体的には、例えば、約０℃にて無水ベンゼン中に溶解したブロモクロトン酸を無水ベンゼン中の臭化チオニルに加え、溶媒を留去し、得られた４−ブロモクロトン酸臭化物を無水ベンゼンに溶解し、約０℃でピペリジンと反応させる。反応溶液を室温まで昇温したのち、更に適当な時間冷却水に注いで、ベンゼンで抽出する。有機溶剤層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および水で洗う。乾燥し濃縮してシロップを得る。このシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で精製し、アミドを得る。
【００２４】
精製したアミドを、例えば１００℃〜１１０℃でトリエチルフォスファイトに加える。反応温度を上げて、適当な時間保持する。過剰のトリエチルフォスファイトを減圧下で留去し、残渣を無水ＤＭＦに溶かし、ｐ−ベンジルオキシベンズアルデヒドの無水ＤＭＦ溶液と混合する。この混合液をＮａＯＥｔ溶液で処理し、室温で攪拌する。混合液を水で希釈し、塩化メチレンで抽出する。乾燥した抽出物をベンゼンで再結晶化し、白色針状結晶を得る。
【００２５】
上述のようにして得られるベンジルアミドの酢酸溶液に濃塩酸を加え、混合液を約１００℃で処理し、室温に適当な時間放置する。真空下にて混合液を濃縮した後、水を加え、塩化メチレンで抽出する。有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で洗い、酢酸を除去する。その後、水酸化ナトリウム溶液で抽出し、そのアルカリ抽出液を希塩酸で酸性化し、水溶液を塩化メチレンで抽出する。濃縮した産物をアセトンから再結晶化し、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの針状の結晶を得ることができる。
【００２６】
本発明においては、一般的には発癌抑制剤として、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを単独で経口剤として投与するか、または賦形剤あるいは担体と混合して経口剤として投与することが好ましい。非経口剤として投与しても良い。
【００２７】
例えば、経口剤として投与する場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤などに製剤し得る。これらは糖衣を施しても施していなくてもよい。経口投与用の製剤には、ゼラチン、デンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロ−ス、コ−ンスタ−チ、無機塩類等の賦形剤が用いられ得る。さらに、コ−ンスタ−チ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖、サッカリンのような甘味剤あるいはペパ−ミント、アカモノ油などの香味剤を適宜用いて、製剤することも可能である。
【００２８】
非経口剤として投与する場合、例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との溶液の状態、または、分散剤、懸濁剤、安定剤などを添加した状態で、注射剤、坐剤などに調製し得る。非経口投与用の注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖あるいはその他の補助薬を含む等張液などが挙げられる。適宜、アルコ−ルあるいは非イオン性界面活性剤などを用いることもできる。油性液としては注射用植物油、トウモロコシ油、大豆油などを用いることができ、適宜、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコ−ルなどの溶解補助剤を用い得る。
【００２９】
本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを有効成分とする発癌抑制剤は、上述のように、薬学的に許容されるものであれば、その種類および組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更した態様で提供される。
【００３０】
本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンは、飲料に添加物として直接添加するか、あるいはビスケットのような固形の食品に添加して、癌予防の食品、健康食品あるいは機能性食品等として提供することもできる。
【００３１】
本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを、例えば、油脂、エタノ−ル、プロピレングリコ−ル、グリセリンあるいはこれらの混合物に溶解して、液状として、飲料に添加するか固形食品に添加することが可能である。あるいはＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンと必要に応じて、アラビアガム、デキストリン等のバインダ−と混合して、粉末状あるいは顆粒状にし、飲料に添加するか固形食品に添加することも可能である。その他にも、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを食品に添加する方法は様々な態様で可能である。
【００３２】
本発明の癌抑制剤中のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの濃度は、一般的には、経口剤として投与する粉剤あるいは錠剤等の場合、１〜１００重量％が好ましく、非経口剤として投与する注射剤あるいは坐薬の場合、０．１〜５０重量％が好ましいが、これらの濃度は適宜変更することができる。食品に添加する場合、通常の食品添加物と同様の濃度あるいはそれより多い濃度で、例えば、０．０１〜３０重量％程度の適当量を加える。食品に添加する場合、好ましくは、０．１〜３０重量％程度を加える。
【００３３】
本発明の発癌抑制剤の投与量は、投与を受ける者の年齢、体重、症状あるいは投与の目的により決定される。一般的には、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの量として、成人の体重１ｋｇに対し、1 日あたり経口投与では０．０１〜３ｇ、特に０．０２〜１ｇが好ましく、非経口投与では１〜２００ｍｇが好ましい。
【００３４】
本発明の癌抑制剤により抑制される癌の種類は、限定されない。すなわち、例えば、体内の各種臓器である、胃、腸、肺、肝臓、膵臓、胆嚢、子宮、卵巣、あるいは脳に発生する固形癌、神経系腫瘍、骨肉腫、血液性癌、あるいは悪性リンパ腫等の癌であり得る。
【００３５】
本発明の発癌抑制剤を投与する場合あるいは発癌抑制作用を有する食品を摂取する場合の例としては、遺伝性癌の予防、環境あるいは生活習慣に起因する癌の予防、あるいは腫瘍摘出手術後の癌転移の予防、あるいは癌治療の１つとしての投与が挙げられる。より具体的には、遺伝子診断等により、将来発癌する可能性が高いと認められる者が、発症前に本発明の癌抑制剤を予防的に摂取する場合、喫煙習慣のある者や放射性物質に曝される職業に従事する者が予防的に摂取する場合、または化学的療法としての抗癌剤投与に代わってあるいはそれと並行して投与する場合等がある。
【００３６】
次に本発明の癌抑制剤の製造およびそれを用いた癌抑制効果を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明はここに示した実施例にのみ限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを、合成法により調製した。
【００３８】
０℃にて無水ベンゼン（１８０ｍｌ）中に溶解したブロモクロトン酸（７４．３ｇ、０．０３Ｍ）を無水ベンゼン（４５ｍｌ）中の臭化チオニル（３４．８ｍｌ，０．０１Ｍ）に加え、溶媒を留去し、得られた４−ブロモクロトン酸臭化物を無水ベンゼン（７５ｍｌ）に溶解し、０℃でピペリジン（８９ｍｌ，０．０８Ｍ）と反応させた。反応溶液を室温まで昇温したのち、更に１時間冷却水に注いで、ベンゼンで抽出した。有機溶剤層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および水で洗った。乾燥し濃縮して、３２．４ｇのシロップを得た。このシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で精製し、アミドを得た。
【００３９】
精製したアミドを、１０５℃でトリエチルフォスファイト（９．６ｇ）に加えた。反応温度を１５０℃に上げて、１時間保持した。過剰のトリエチルフォスファイトを減圧下で留去し、残渣を無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶かし、１２．２ｇのｐ−ベンジルオキシベンズアルデヒドを含む無水ＤＭＦ溶液（４５ｍｌ）と混合した。この混合液をＮａＯＥｔ溶液で処理し、室温で攪拌した。混合液を水で希釈し、塩化メチレンで抽出した。乾燥した抽出物（１９．２ｇ）をベンゼンで再結晶化し、白色針状結晶を得た。
【００４０】
上述のようにして得られたベンジルアミド（６ｇ）の酢酸溶液（３００ｍｌ）に濃塩酸（１５０ｍｌ）を加え、混合液を１００℃で２時間処理し、室温で一晩放置する。真空下にて混合液を濃縮した後、水を加え、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で洗い、酢酸を除去した。その後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で抽出し、そのアルカリ抽出液を希塩酸で酸性化し、水溶液を塩化メチレンで抽出した。濃縮した産物（３ｇ）をアセトンから再結晶化し、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの針状の結晶（２．１ｇ）を得ることができた。
【００４１】
実施例２
異なる２つの条件下でラットを飼育し、その肝臓を採取した。
【００４２】
８週齢の雄性Ｆ３４４ラット３０匹を使用し基礎飼料であるＭＦ粉末（オリエンタル酵母工業株式会社製）を用いて飼育した。ラットは、２群に分け（１５匹／群）、試験開始時（第０日）に各群のラットに発癌剤ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）を２０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で腹腔内投与した。
【００４３】
第１群のラットに対しては、−２０℃にて冷凍保存しておいた実施例１で得たＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを常温に戻し、５０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようエタノ−ルに溶解し、ＤＥＮ投与の３日前より１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で１日１回計５日間連続強制経口投与した。第２群のラットに対しては、溶媒のエタノ−ルのみを２ｍｌ／ｋｇ体重の割合で計５日間同様に投与した。
【００４４】
第１群および第２群のいずれのラットに対しても、試験開始より第２週と第３週の２週間、発癌促進剤である２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）を０．０１％の濃度で基礎粉末飼料に混合して与えた。第３週の第１日目に各群のラットに対して、２／３部分肝切除術を施行し、肝臓の病変を増幅させた。この肝切除術の影響により第２群で３例が死亡したため試験から除外した。
【００４５】
第５週の第１日目にすべてのラットを屠殺し、肝臓を摘出した。それぞれのラットの肝臓の組織標本を作った。
【００４６】
実施例３
実施例２で得られたラット肝臓の組織標本を用いて、肝臓の前癌病変の指標である胎盤型グルタチオンＳ−トランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ−Ｐ）の有無を、アビジン−ビオチン複合体法による免疫組織染色で調べた。
【００４７】
まず、試料の肝臓組織を１００％キシレンに５分間ずつ３回浸漬してパラフィンを除去し、次に、１００％エタノ−ル、９０％エタノ−ル、８０％エタノ−ル、および７０％エタノ−ルにそれぞれ５分間ずつ浸漬した。次に、この試料を、５分間流水で、次に５分間０．０５Ｍリン酸緩衝食塩水で洗浄した。
【００４８】
洗浄後、試料を３％過酸化水素水溶液で５分間処理し、肝臓組織に存在する内因性ペルオキシダ−ゼ活性の染色に及ぼす影響を抑えた。次に、０．０５Ｍリン酸緩衝食塩水で５分間ずつ３回洗浄し、試料を正常ヤギ血清（べクタステイン社製）で室温にて１５分間処理した。リン酸緩衝食塩水で軽くすすいだ後、試料にウサギ抗ＧＳＴ−Ｐ抗体（ＭＢＬ社製、ウサギポリクロ−ナル抗体）を３７℃にて１２０分間反応させた。再度リン酸緩衝食塩水で５分間ずつ３回洗浄し、未結合の抗体を取り除いた。
【００４９】
次に、ウサギ抗ＧＳＴ−Ｐ抗体が結合した試料に、ビオチン修飾したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ベクタステイン社製）を３０分間結合させ、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。この抗体を結合した試料に、アビジンを結合したペルオキシダ−ゼ（ベクステイン社製）を３０分間反応させ、標識を行った。その後、基質のジアミノベンチジンを１０分間反応させ、リン酸緩衝食塩水で反応を停止させた後、ヘマトキシリン染色液で対比染色を行った。試料をエタノ−ル系列で脱水後、１００％キシレンで５分間ずつ３回処理し、エンテラン封入を行った。
【００５０】
染色した組織をイメ−ジアナライザ−（ＩＰＡＰ：Ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，住友化学製）で解析した。ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の数およびその平均面積を、第一群および第二群のラットの肝臓について比較し、本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの癌抑制効果を評価した。その結果を表１および表２に示す。
【００５１】
【表１】
0003886598.tif 000004
【００５２】
【表２】
0003886598.tif 000005
【００５３】
ラットの最終体重および全体重に対する肝臓の重量は、両群において特に差異は認められず、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンによる毒性は認められなかった。
【００５４】
表１に示した発癌促進物質である２−ＡＡＦの総摂取量は、基礎試料に加えた量からえさの食べ残しに含まれる量を差し引いて算出した。第１群のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジン投与群では、第２群のエタノ−ル投与した対照のラットに比較して明らかに多かった。それにも関わらず、表２に示すように、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の検索結果においては、第２群の方が第１群より数が多く、面積も大きかった。従って、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンは明らかに癌を抑制する効果があることがわかった。特に数においては有意差検定の結果、有意差が認められ（Ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、本試験の結果が確実であることが確認された。
【００５５】
実施例４
本発明のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの毒性試験を試みた。
Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンをラットに、３０００ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与したところ死亡例は全く認められず、特に毒性症状も観察されなかった。従って、Ｎ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンの毒性は全くないかあるいは極めて低いことが確認された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、天然物由来のＮ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−２Ｅ，４Ｅ−ペンタジエノイルピペリジンを有効成分とする、安全性の高い発癌抑制剤が提供される。この発癌抑制剤は、発癌予防、癌の再発防止、あるいは抗癌剤として用いることができる。さらに、本発明により、癌予防のための健康食品あるいは機能性食品が得られる。