(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼの断片ペプチドであって、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドを、哺乳動物に免疫することにより得られるリンパ球と、ミエローマ細胞とを融合して、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ａに対するモノクローナル抗体であって、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ、前立腺由来、赤血球由来、血小板由来及びポテト由来の酸性ホスファターゼのいずれとも交差反応性を持たないかあるいは交差反応性が１０％以下のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、該ハイブリドーマが産生する該モノクローナル抗体を回収することを特徴とする、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ａに対するモノクローナル抗体であって、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ、前立腺由来、赤血球由来、血小板由来及びポテト由来の酸性ホスファターゼのいずれとも交差反応性を持たないかあるいは交差反応性が１０％以下のモノクローナル抗体の製造法。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、タイプＩｇＭ、軽鎖κ、分子量約９５万ダルトンである請求項１記載のモノクローナル抗体の製造法。
【請求項３】
ハイブリドーマが工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９２７として寄託されているハイブリドーマＴｒｋ７３である請求項１又は２記載のモノクローナル抗体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いた検体中の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aの測定方法、更には該ハイブリドーマを作製するための免疫原としてのペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト酸性ホスファターゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって少なくともバンド０〜５の６個のバンドに分けられることが知られている。この中でバンド５に相当するタイプ５のアイソザイムは、酒石酸による抑制に対して耐性を示すことからヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼと呼ばれている。従って、本明細書においては、酒石酸耐性酸性ホスファターゼとは、酸性ホスファターゼのバンド５に相当する酵素をいうものとする。
ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼは、 骨代謝異常やHairy cell leukemia、Paget病、Gaucher病などの患者において、その血中濃度が優位に上昇すると考えられている。従って、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼの血中濃度の測定は、これらの疾患の診断に適用できることから、これまで幾つかの測定法が提案されているが、いずれの測定法も、他の酸性ホスファターゼのアイソザイムをともに測定してしまうため特異的かつ精密な測定法がなかった。また、このヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼは血中存在量が少ないこと、不安定であること、抗原性が低いことなどが原因で、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼに対する抗体を作成するための免疫用抗原として大量に精製し、利用することが難しかった。従って、ペプチド抗原を利用してヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体を作成する方法（Hybridoma.14,91-94.1995）が試みられたこともあるがこれまで成功していない。
【０００３】
また、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼは、高精度の電気泳動により、更に二つのバンドに分けられ、それらはヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５a及びヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５bと呼ばれている。ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aと５bは、それらの蛋白のアミノ酸配列は同一であるが、糖鎖が異なり、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５bは、その糖鎖においてシアリル酸残基が欠失しており、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質とした場合の至適ｐＨ値が約５．７と約６．０の間にあり、他方、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aは、その糖鎖においてシアリル酸残基が欠失しておらず、ｐＮＰＰを基質とした場合の至適pH値が約４．９であることが知られている(Clin. Chem. 24(7): 1105-1108, 1978; Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aと５bは、それぞれに臨床的意義があるといわれているが、これまで精密測定系がないため測定が難しかった。即ち、例えば、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに特異的に結合するモノクローナル抗体として、組換えヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼを抗原として作成したモノクローナル抗体４E６が報告されている(Clin. Chem. 41(10): 1495-149、 1995)が、その後の研究により、このモノクローナル抗体４E６は、ポテト酸性ホスファターゼとも高い結合性を有することが明らかにされており(Immuno. Lett. 70(1999), 143-149)、 選択性が十分とは言えないものである。従って、本発明の目的は、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aと特異的に反応し、他の酸性ホスファターゼのアイソザイムとは交差反応性を示さない、あるいは示しても極めて低い交差反応性しか示さないモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、それを利用したヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aの測定法、更には該ハイブリドーマを作製するための免疫原としてのペプチドを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、組換えヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼなどの複雑な蛋白作製を伴わないペプチドによる、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに特異的なモノクローナル抗体の作製を目的として鋭意研究した結果、抗原ペプチドとして特定のペプチドを選択することにより、ヒト酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに特異的なモノクローナル抗体が得られることを見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
従って、本発明は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに対するモノクローナル抗体であって、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５b、前立腺由来、赤血球由来、血小板由来及びポテト由来の酸性ホスファターゼのいずれとも交差反応性を持たないかあるいは交差反応性が１０％以下のモノクローナル抗体に関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
更に本発明は、上記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする検体中の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aの測定方法に関する。
更に本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドと実質的に同様の免疫原性を有するペプチドに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書においては、酸性ホスファターゼ、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５a及び酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５bを、それぞれACP、 TrACP５a及びTrACP５bと略記する。
上記モノクローナル抗体は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドと実質的に同様の免疫原性を有するペプチドを免疫原として利用することにより得ることができる。配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列は、ヒトＴｒＡＣＰのアミノ酸番号１４３〜１６０の領域に相当する(Gene, 13(1993), 201-207)。配列番号１のアミノ酸配列からなるぺプチドは、天然型のヒトTrACPに近い抗原性を有しているものと考えられるので、このペプチドを免疫原として用いることにより、ヒトTrACP５aに特異性を持つモノクローナル抗体を得ることができる。
免疫原として用いるペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様の免疫原性を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって実質的に同様の免疫原性を有するペプチドが挙げられる。また、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、連続した３個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは１２個以上のアミノ酸残基からなる実質的に同様の免疫原性を有するペプチドであってもよい。また、更には、このようなペプチドを含むペプチドであって実質的に同様の免疫原性を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、アミノ酸残基５０個までからなるペプチドが挙げられる。
免疫原として用いる上記したペプチドは化学合成によって得る事ができる。あるいは、ヒトTrACP遺伝子のクローニングにより明らかにされた塩基配列（Gene.130,201-207.1993）を参考にして、ペプチドをコードする遺伝子をPCR法によって増幅し、発現ベクターに導入して適当な宿主細胞に形質転換し、形質転換細胞を培養してペプチドをコードする遺伝子を発現させることによって作製することもできる。また、ペプチドを融合蛋白として発現させてもよい。
免疫原として用いるペプチドは、 必ずしも高純度に精製したものでなくともよく、粗精製品であってもよい。また、 ペプチドは、通常ハプテンとなるキャリアープロテインに化学結合して、抗原として用いられる。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、上記ペプチドを免疫原として動物を免疫し、その抗ペプチド抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
このハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、上記したようにして得たペプチドを、必要に応じてハプテンに結合し、これをフロイントの完全、不完全アジュバント、またはPBSなどの緩衝液とともに数回に分けてマウス等の動物に２〜３週間おきに腹腔内または尾静脈投与することによって免疫する。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。融合法としては、ケーラーとミルスタインの方法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコール（PEG）を用いることにより融合できる。またセンダイウィルスによっても融合を行うことができる。
上記融合した細胞からヒトＴｒＡＣＰ５ａを認識する抗体を産生するハイブリドーマの選択は、以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地及びHT培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。このコロニー培養上清中にヒトＴｒＡＣＰ５aに対する抗体が含まれている場合には、免疫原として用いたペプチドをそのプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等、２次標識抗体を反応させるＥＩＡ法により、ヒトTrACP５aに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、通常細胞培養に用いられる培地において培養し、その培養上清より目的とするモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物をあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。即ち、例えばクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【０００９】
上記した方法により、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに対するモノクローナル抗体であって、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５b、前立腺由来、赤血球由来、血小板由来及びポテト由来の酸性ホスファターゼのいずれとも交差反応性を持たないかあるいは交差反応性が１０％以下のモノクローナル抗体が得られた。このモノクローナル抗体は、タイプＩｇＭ、軽鎖κ、分子量 約９５万ダルトンの特性を有していた。また、このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしてTrK７３が確立された。このハイブリドーマは、 工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１２年６月２８日に寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ  Ｐ−１７９２７が付与されている。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体を用いた測定法によって検体中のヒトＴｒＡＣＰ５ａ濃度を知ることができる。このような測定法としては、酵素免疫測定法(EIA)、酵素固定化免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫測定法(ＲＩＡ)などが挙げられる。このような測定法には、通常用いられる固相、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、グラスフィルターなどが用いられる。標識としては、例えば、ホースラデシュパーオキシダーゼ、ワサビペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらの試薬を用いた免疫測定法それ自体は当業者に既に周知であり、周知の方法により本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法を容易に実施できる。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製と免疫
既に発表されているヒトTrACPの遺伝子の塩基配列（Gene.130,201-207.1993）を基にしてアミノ酸配列１４３〜１６０番目に相当する領域を選び、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドを化学的に全合成した後、これをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）と結合させて抗原とした。これをフロイント完全アジュバントで乳化させて感作抗原とし、Balb/c ６週齢雌性マウスに５０μgを腹腔内投与した。２回目以降はフロイント不完全アジュバントを用い２週間おきに３回免疫を行い、最終回はPBS溶液にて尾静脈投与した。
【００１２】
（２） 細胞融合とスクリーニング
最終ブーストの３日後に外科的に脾臓を摘出し、細胞融合に用いた。融合はケーラーとミルスタインの方法（Nature.256,495.1975）に従い、ポリエチレングリコールを用いて脾細胞とP3-X63-Ag8-U1（P3U1）を融合した。融合細胞はＨＡＴ培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレートに分注して３７℃、５％CO2条件にて培養した。約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの方法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて作製した合成ペプチドをＰＢＳ中に溶解し、０．５μg/１００μl/wellとなるように９６穴ウエルに分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．００５% Tween ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％BSA溶液を２００μl分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．００５% Tween ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後に培養上清１００μlを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるホースラデシュパーオキシダーゼ(ＨＲＰ)標識抗マウスイムノグロブリン抗体を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質であるＯＰＤを加えて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チエックした。
（３）抗体の確認
得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキットにて検定した結果、以下のような結果であった。
クラス  ＩｇＭ
軽鎖    κ
また、分子量は、約９５万ダルトンであった。
（４）腹水採取と抗体精製
上記（２）で得られたハイブリドーマ、Ｔｒｋ７３の１×１０7細胞個をプリスタン０．５ml投与後２週間のBalb/c１０週齢雌性マウスに腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水を外科的に採取した。スクリーニングで行ったＥＩＡ法によって腹水をサンプルとして確認すると高濃度の本発明のモノクローナル抗体（以下、このモノクローナル抗体をモノクローナル抗体Ｔｒｋ７３と記載することもある）が含まれていた。この腹水を硫安５０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、Ｓ−３００カラムによりＩｇＭフラクションを精製した。
【００１３】
（５） ウエスタン・ブロッティング
ウエスタン・ブロッティング用サンプルとして既に公知の方法(Clin.Chem.24:7,1105-1108.1978)によりヒトCord  plasmaよりTrACPを精製した。このヒトＴｒＡＣＰを更に分離精製しヒトＴｒＡＣＰ５ａ及びヒトＴｒＡＣＰ５ｂの２種類の酵素を得た。精製したヒトＴｒＡＣＰ５ａ及びヒトＴｒＡＣＰ５ｂは、ディスク電気泳動法(Clin.Chem.24:2,309-312.1978)及びフッ素阻害による活性測定法(Clin.Chem.46:4,469-473.2000)により、いずれも単一であることを確認した。これらのヒトＴｒＡＣＰ５ａとヒトＴｒＡＣＰ５ｂの２種の酵素をそれぞれ２μg取り、非還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタン・ブロッティング法により反応性を確認した。その結果、ヒトＴｒＡＣＰ５ａでは約３３Ｋダルトン（非分解物）及び約２３Kダルトン付近にバンドが認められた。ヒトＴｒＡＣＰ５ｂでは、約３３Ｋダルトン及び約２３Ｋダルトンのいずれにもバンドが認められなかった。
この結果は、モノクローナル抗体Trk７３がヒトＴｒＡＣＰ５ａと反応性を持つこと、また公知の報告(Arch.Biochem.Biophys.345,230-236.1997)で現れると考えられる２３Ｋダルトンの分解ラージフラグメントと反応することを示している。他方、モノクローナル抗体Ｔｒｋ７３は、ヒトＴｒＡＣＰ５ｂと反応性を持たないことを示している。
（６）特異性検定
モノクローナル抗体Ｔｒｋ７３の特異性を調べるため、上記のヒトＴｒＡＣＰ５ａ及びヒトＴｒＡＣＰ５ｂの他に、赤血球由来ＡＣＰ、血小板由来ＡＣＰ、前立腺由来ＡＣＰ及びポテト由来ＡＣＰを９６穴マイクロタイタープレートに０．５μｇ／１００μl ＰＢＳ／ｗｅｌｌとなるように分注した。その後上記（２）と同様にブロッキングを行いプレートの作成をした。別にＢＳＡ、カゼインのみ(ブロッキング剤のみ)のプレートをコントロールとして同時に作成した。結果のブランク吸光度の２倍値までをマイナス(-)、３倍値までをプラス・マイナス(±)、３倍以上５倍以下をプラス(+)、５倍以上をストロング・ポジティブ(++)と判断した。得られた結果を表１に示した。
【００１４】
【表１】
0003994369.tif 000002
表１から明らかなように、ＴｒＡＣＰ５ａだけがストロング・ポジティブであり、他はすべてマイナスであった。また、モノクローナル抗体Ｔｒｋ７３は、ＴｒＡＣＰ５ｂ、赤血球由来ＡＣＰ、血小板由来ＡＣＰ、前立腺由来ＡＣＰ及びポテト由来ＡＣＰのいずれとも１０％以下の交差反応性しか持たないことが判った。
【００１５】
実施例２
モノクローナル抗体を利用したEIAによるヒトTrACP５aの測定
実施例１の（６）と同様の方法で精製したTrACP５aをマイクロタイタープレートに結合させ、プレートを作製した。ＴｒＡＣＰ５ａは、それぞれ３０００ｎｇからの１０倍希釈であり、３０００ｎｇ、３００ｎｇ、３０ｎｇ、３ｎｇ、０．３ｎｇ、０．００３ｎｇの６段階の濃度を調整した。１次抗体としてモノクローナル抗体Ｔｒｋ７３を１００μl／ｗｅｌｌで分注し、実施例１の（２）と同様に抗マウスイムノグロブリン‐ＨＲＰ標識２次抗体を反応させる方法で検定した。得られた感度検定結果を図１に示した。図１から明らかなように０．３ngまでの濃度のＴｒＡＣＰ５ａが検出可能であることが判った。
【００１６】
実施例３
モノクローナル抗体を利用したEIAによるヒトＴｒＡＣＰ５ａの測定
まず、一次抗体を調製するために組換えヒトＴｒＡＣＰ（ｒＴｒＡＣＰ）をハイマンらの方法(J.Biol.Chem.269,1294-1300.1994)により作製した。このｒＴｒＡＣＰを、実施例１の（１）でマウスに行ったのと同様の方法にてＷｉｓｔｅｒ系６週齢雌性ラットに感作した。最終感作３日後に頸静脈より全採血し、血清を得た。さらに血清をプロテインAカラム処理してＩｇＧ分画を作成した。このポリクローナルなＩｇＧ分画を５μg/１００μｌ ＰＢＳ／ｗｅｌｌとなるようにマイクロタイタープレートに分注し、実施例１の（６）と同様の方法にてブロッキングを行って固相プレートを作成した。別に精製したモノクローナル抗体Ｔｒｋ７３を４ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ１ｍｇを過ヨウ素酸法にて結合させ、二次標識抗体を作成した。このプレートと標識抗体を用いて、精製したヒトＴｒＡＣＰ５ａを検体としてＥＩＡ測定系を作ったところ、図２のような検量線を得た。
上記方法において、精製したＴｒＡＣＰ５ａの代わりに、実際の検体として６例のヒト血清を使用して、血清中のＴｒＡＣＰ５ａを測定したところ表２に示した結果を得た。これらの結果から、ヒト血清中のＴｒＡＣＰ５ａの濃度の平均値は２．５８ ｎｇ／ｍｌであった。
【００１７】
【表２】
0003994369.tif 000003
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、酒石酸耐性酸性ホスファターゼの１４３〜１６０番目に相当するアミノ酸配列領域からなるペプチドあるいはそれと同様の免疫原性を有するペプチドを抗原として用いて、モノクローナル抗体を作製することにより、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５aに特異的なモノクローナル抗体であって、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５b、前立腺由来、赤血球由来、血小板由来及びポテト由来の酸性ホスファターゼのいずれとも交差反応性を持たないかあるいは交差反応性が１０％以下のモノクローナル抗体が得られ、このモノクローナル抗体は血中の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ａを高精度に測定することができる。
【００１９】
【配列表】
0003994369.tif 000004
【００２０】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト酒石酸耐性酸性フォスファターゼの１４３〜１６０番目のアミノ酸配列に相当するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体を利用したEIAによるヒトＴｒＡＣＰ５ａの感度検定結果を示す。
【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体を利用したＥＩＡによるヒトＴｒＡＣＰ５ａの測定の検量線を示す。
【図１】
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【図２】
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