(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体が入る隙間がないよう密着させて第一部材と係合した導波管と、該導波管は光を受けるためのレンズ末端部を有する前部傾斜部、導波管の外へ光を伝搬するためのレンズを有する後部傾斜部、及び、前記前部傾斜部にレンズにおいて受け取られる光を前記後部傾斜部にレンズを通して伝搬するために、前記前部傾斜部から前記後部傾斜部へ光を伝搬するための互いに平行な第一平面および第二平面を有する平面部を備えることと、
導波管と結合し、導波管と共に生物学的液体を入れるための少なくとも１つのリザーバの壁面を区画し、同時に前記導波管の第一表面が前記少なくとも１つのリザーバの床板を区画し、前記床板が一部分で捕捉分子と結合している第一部材とを含み、生物学的液体を分析するための装置中で使用する改良されたバイオセンサであって、不活性かつ不透明な材料から形成されている少なくとも１つのリザーバ壁面を含む改良されたバイオセンサ。
【請求項２】
前記不活性かつ不透明な材料が金属であるものとする請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項３】
前記第一部材全体が金属で形成されているものとする請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項４】
前記第一部材がリザーバに液体を振動ポンプを用いて出し入れするための出入口を有するものとする請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項５】
前記バイオセンサが導波管への第一部材の装着を緩衝するために配置されたガスケットを含むものとする請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項６】
前記ガスケットが薄層の可塑性材料および合成樹脂ポリマー材料であるものとする請求項５に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項７】
前記導波管がプラスチック、石英およびガラスから成る光学材料の部類の中から選択した一つの光学材料から形成されるものとする請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項８】
前記導波管が平坦かつ結合効率とビームの特性を監視するために前記導波管を通過する光を測定するための後部レンズと結合しているものとする請求項８に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項９】
前記バイオセンサが第二部材を含むことと、前記導波管が前記第一部材と前記第二部材との間に挟まれることからなる請求項１に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項１０】
前記バイオセンサが支持板を含むものとする請求項９に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項１１】
前記バイオセンサが第三部材を含むことと、前記第三部材が前記バイオセンサと測定装置とを結合するための手段を有していることをからなる測定装置に配置された請求項１０に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項１２】
前記導波管が平坦かつ前記導波管に光を結合するための回折格子と結合しているものとする請求項７に記載の改良されたバイオセンサ。
【請求項１３】
光を受けるためのレンズ末端部を有する前部傾斜部と、
導波管の外へ光を伝搬するためのレンズを有する後部傾斜部と、
前記前部傾斜部にレンズにおいて受け取られる光を前記後部傾斜部にレンズを通して伝搬するために、前記前部傾斜部から前記後部傾斜部へ光を伝搬するための互いに平行な第一平面および第二平面を有する平面部とから成る導波管。
【請求項１４】
捕捉分子が前記平面部の前記第一平面に結合するものとする請求項１３に記載の導波管。
【請求項１５】
前記導波管が光学プラスチックから形成されることと、前部傾斜部が約１５度から３２度の平均角で平面部の平面から反対に折れ曲がることからなる請求項１３に記載の導波管。
【請求項１６】
光を受けるためのレンズ末端部を有する前部傾斜部と、導波管の外へ光を伝搬するためのレンズを有する後部傾斜部と、前記前部傾斜部にレンズにおいて受け取られる光を前記後部傾斜部にレンズを通して伝搬するために、前記前部傾斜部から前記後部傾斜部へ光を伝搬するための互いに平行な第一平面および第二平面を有する平面部とを備える導波管と、前記後部傾斜部のレンズは前記導波管を通過する光を測定すべく方向付けられていることによって、カプリング効率とビーム特性を監視することと、前記導波管は液体が入る隙間がないよう密着させて第一部材と結合されていることと、
導波管と結合し、導波管と共に生物学的液体を入れるための複数個のリザーバの壁面を区画し、同時に導波管の表面が前記複数個のリザーバの非金属床板を区画し、前記床板が一部分で捕捉分子と結合している第一部材と、
前記第一部材の導波管への接着を保護するよう配置されたガスケットと、
第一部材と第二部材の間に導波管が挟まれるような第二部材とから成る、生物学的液体を分析するための装置中で使用するバイオセンサ。
【請求項１７】
前記第一部材がリザーバに液体を注入または排出するための出入口を有するものとする請求項１６に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
光を受けるためのレンズ末端部を有する前部傾斜部と、導波管の外へ光を伝搬するためのレンズを有する後部傾斜部と、前記前部傾斜部にレンズにおいて受け取られる光を前記後部傾斜部にレンズを通して伝搬するために、前記前部傾斜部から前記後部傾斜部へ光を伝搬するための互いに平行な第一平面および第二平面を有する平面部とを備える導波管と、前記後部傾斜部のレンズは導波管を通過する光を測定すべく方向付けられていることによって、カプリング効率とビーム特性を監視することと、前記導波管は液体が入る隙間がないよう密着させて第一部材と結合されていることと、
導波管と結合し、導波管と共に生物学的液体を入れるための一つ以上のリザーバを区画し、同時に導波管の表面が前記リザーバの床板または天井板を区画し、前記床板が一部分で捕捉分子と結合している第一部材と、
生物学的液体を前記捕捉分子と接触させるために前記生物学的液体を前記リザーバに注入および排出するための前記リザーバと互いに流体の移動が可能であるように連通した出入口とから成る、生物学的液体を分析するための装置中で使用する改良された装置。
【請求項１９】
液体が入る隙間がないよう密着させて第一部材と係合した導波管と、該導波管は光を受けるためのレンズ末端部を有する前部傾斜部、導波管の外へ光を伝搬するためのレンズを有する後部傾斜部、及び前記前部傾斜部にレンズにおいて受け取られる光を前記後部傾斜部にレンズを通して伝搬するために、前記前部傾斜部から前記後部傾斜部へ光を伝搬するための互いに平行な第一平面および第二平面を有する平面部を備えることと、
導波管と結合し、導波管と共に生物学的液体を入れるための一つ以上のリザーバを区画し、前記導波管の第一平面が一部分で捕捉分子と結合している第一部材と、
生物学的液体を前記捕捉分子と接触させるために前記生物学的液体を前記リザーバに注入および排出するための前記リザーバと互いに流体の移動が可能であるように連通した出入口と、前記平面を通して放射する光を検出するための光検出器とから成るバイオセンサと、
光源とを有する改良された装置であって、
表面が一般的に水平で、装置が置かれているその表面の水準にあって、平面が前記リザーバの天井板を形成するような方法で前記バイオセンサの向きを合わせて置くことから成る、生物学的液体を分析するための改良された装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は診断用装置の構成部分に関し、より詳しくはレンズ（導波管）および連結したフローセルを有する改良型バイオセンサに関する。
発明の背景
ユタ州立大学研究財団による国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／９４／０５５６７（国際公開特許第９４／２７１３７号公報、公開日１９９４年１１月２４日）は多数の被検体に対する均一蛍光免疫測定法用の装置を開示している。一実施形態において、当該出願は連結したガスケットと共に二枚のプレートに挟まれた平面導波管を有するバイオセンサを使用する装置を開示している（国際公開特許第９４/２７１３７号の図３Ａから３Ｃ）。ガスケットの内部エッジは反応リザーバまたはウェルに対する壁面の役割をする。
蛍光を放射したトレーサー分子は導波管の表面に結合し、導波管の中を伝搬する光ビームから隣接した溶液中を通るエバネッセンス場（evanescent field）によって励起される。また、その光ビームは例えば導波管の前端で導入されている。反応リザーバには、液体（例えば血清や血液）を入れ、導波管の表面に結合した捕捉分子と混合する（前記国際公開特許の３２ページから３３ページに開示したように「コーティング化学」による）。放射された蛍光はエバネッセント光透過領域から直接集められる。一実施形態において、バイオセンサはリザーバを区画する壁面が透明になっている（例えば国際公開特許第９４／２７１３７号の図１１Ａから１１Ｃを参照されたい）。本特許は完全型すなわち一体型のバイオセンサについても開示する（国際公開特許第９４／２７１３７号の図１２Ａ、１２Ｂ、１３）。
完全型すなわち一体型のバイオセンサの導波管部分は組立に変形が起こったり、保管中にまたは温度変化によって歪むことがある。
そのうえ、ガスケットが確実には密封されていなかったり、必ずしも反応物に対して充分に不活性ではなかったりして、望ましい分析の妨げとなる可能性がある。不活性な壁面を有するリザーバを備えたバイオセンサを持つことが望ましく、その壁面は導波管を別の導波管と容易に交換できるよう、容易に導波管と分離できるのがよい。
発明の開示
本発明は一つあるいは複数のリザーバを有するバイオセンサを含み、本バイオセンサはプレートのような複数の部材の間に配置された（例えば「間に挟んだ」）導波管と、分析する反応が起こる一つ以上のリザーバの壁面となるように形成された少なくとも一つ以上の部材とを含む。リザーバ壁面は不動態化した金属（例えば黒色陽極処理アルミニウム）のような不活性で不透明な材料が望ましい。バイオセンサにはガスケットを含むこともあるが、ガスケットはリザーバ壁面のいかなる重要な部分も形成しないような方法で（例えばガスケットを金属板中に形成した溝に設置することによって）複数の部材および導波管と係合されている。様々な組成（例えばプラスチック、石英、ガラス、あるいはオキシ窒化ケイ素）の導波管は部材と連結してバイオセンサを形成する。一つまたは複数のレンズが導波管と一体化している。バイオセンサの金属板には反応リザーバで分析すべき液体を注入、排出、および振動するための出入口がある。
導波管を部材の間に挟むするため、平面導波管は一体型に形成された導波管よりも一般に歪みが少ない。リザーバの構成を区画するために不透明かつ不活性な金属を使用することにより、分析すべき反応は干渉されない。
バイオセンサの設計は平面導波管と相互に作用するのに有利なように形成されているが、この導波管は後部導波管を通過する光（蛍光やエバネッセント光ではなくコアレーザービーム光）を測定するために設計された後部一体型レンズを有しており、結合効率とビームの特性を監視する。したがって本発明では導波管（およびこのようなレンズを用いたバイオセンサ）の外で光を収束するための後部レンズと連結した平面導波管をも含み、当該導波管はクオリティコントロール測定の役割をし、ゆえにバイオセンサが適切に配置され光が作用していることを保証する。
本発明は驚くべきことに全血を迅速に分析できる程度にまでバイオセンサの性能を増大させる光測定装置およびレーザーに対して特定の位置にバイオセンサを向けることも含む。
【図面の簡単な説明】
本図面では、本発明の目下好適な実施形態を示しており、違う図でも同じ参照符号は同じ部分を指す。
図１は、本発明で用いられるフローセル上部の拡大底面図を示す。
図２は、図１を２-２におけるフローセル上部の拡大断面図を示す。
図３は、３-３線における図１のフローセル上部の拡大断面図を示す。
図４は、本発明によるバイオセンサの拡大分解斜視図を示す。
図５は、図１のフローセル上部と接触する薄層状ガスケットの拡大側面図を示す。
図６は、一体化した入出力複合レンズを有するプラスチック製平面導波管を示す。
図７は、図６の導波管の拡大側面図である。
図８は、本発明を実施するために有効な蛍光測定法の装置の略図であり、地面に関して特に有効な方位にした図４のフローセルのアセンブリを示す。
図９は、導波管の一部および本発明による競合的免疫蛍光測定法の生化学的成分の拡大側面図である。
図１０は、本発明によるバイオセンサのフローセル部分の拡大分解斜視図を示す。
図１１は、本発明に関して使用されているガスケットの斜視図を示す。
図１２は、図１から３のフローセル上部と結合する第二フレーム部材（フローセル底部）の拡大平面図を示す。
図１３は、図１２に示した第二フレーム部材の拡大側面図を示す。
図１４は、図４のフローセルアセンブリの一部を形成する支持板の拡大斜視図を示す。
図１５は、図４フローセルアセンブリのステージ部材の拡大平面図を示す。
図１６は、図１５に示したステージ部材の拡大側面図を示す。
図１７は、図１５と図１６との拡大図を示す。
図１８は、本発明によるバイオセンサの拡大分解斜視図を示す。
図１９は、光回折格子連結器を有するプラスチック薄膜導波管の一部の拡大定型化側面図を示す。
図２０は、単独の光回折格子カプラを有するプラスチック薄膜導波管の一部の拡大定型化側面図を示す。
図２１は、本発明のエバネッセントアッセイ（CK-MB）と公知の装置とを比較した相関分析の結果を示したグラフである。
図２２は、相関を示す図２１のデータを両対数プロットで表示したグラフである。
図２３は、本発明による装置を使用した場合に、撹拌（振動）が全血および５０％全血および５０％血漿についてのCK-MBアッセイに及ぼす影響を示したグラフである（旧型のCPDA抗凝固性溶液に希釈）。
図２４は、同一溶液中に存在する異なる対象分析物を検出するために異なる捕捉分子とトレーサー分子とを用いて、平面導波管センサから放射された蛍光を波長および空間より分析する検出法の拡大模式図である。
発明を実施するための最良の形態
Ａ．フローセル
符号１００で表し、図１から図３で示したフローセル上部は光吸収材料から形成されることが望ましい（例えば黒色陽極処理表面のような不動態化表面を有するアルミニウムのような金属など）。このフローセル上部１００は一般にプレートのようになっており、複数のウェルすなわちリザーバ１０２、１０４、１０６（例えば２から１０のリザーバ）を含むように形成されている。
少なくとも別個の二つのリザーバを有する装置はリザーバが一つの実施例よりも大きな利点があり、例えば同じ導波管で、測定用試料の蛍光と「コントロール」領域からの蛍光とを同時に測定するのが望ましい時などがある。例えば、導波管への非特異的結合（または非特異的蛍光）水準を測定用試料から引き算できる。同様に、励起した光の強度が変動したために生じる測定変化も補正することができる。置換分析では、「コントロール」領域は検体を含まない試料または既知量の検体で予め装填した導波管である。三つまたはそれ以上のウェルがある記載された実施形態に関しては、「未知の」試料すなわち測定用試料に加えて、検体を含まないコントロールと少なくとも一つの既知の較正試料とのどちらについても蛍光を測定することができる。しかしながら、リザーバが一つであっても、本発明は一試料中に存在する多数の検体を分析することができる（例えば多数の実験で一つの導波管を使用することによって）。
記載された実施形態においては、リザーバ１０２〜１０６はそれぞれ出入口１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８を有しており、これらの出入口はリザーバ１０２〜１０６に分析すべき液体を注入したり液体を回収したりするためにフローセル上部１００を貫通している。いくつかの場合で、ポンプを用いてこの液体をリザーバの中および外へと振動させるが、これにより検体と反応物（例えば図２３を参照）とが多く混合される。振動させると、アッセイの効率（例えば速度）が増加する。記載された実施形態において、出入口１０８〜１１８は、フローセル上部１００中に符号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０で示された落ちくぼんだ凹部の各々と連結している。
個々のリザーバに関連する凹部の間には、フローセル上部において、側部または縦に溝が形成されていることもあり、リザーバの中にある液体を混合するのに役立つ（図示しない）。
リザーバ１０２〜１０６の外側表面はそれぞれ壁面１３２、１３４、１３６により区画される。壁面１３２、１３４、１３６をフローセル上部とは別の要素として構成することも可能であるが、フローセル上部１００の残りの部分と一体に形成されることが望ましい。壁面１３２〜１３６の内側の周囲１３８、１４０、１４２は、不活性で不伝導性のプラスチックのような不活性かつ不伝導性の材料や、不動態化した陽極処理アルミニウム、銅、ステンレス鋼、および同様な合金のような金属から製造されている。記載された実施例において、フローセル上部１００全体は金属で作られているが、別の実施形態（図示しない）では、フローセル上部はリザーバに据えた（図示しない）非金属材料、黒色材料、または金属スリーブでもよい。液体に接する材料はタンパク質を吸収する性質が低くなくてはならない。したがって、金属、親水性の非金属材料、親水性材料の薄膜で覆われた疎水性の非金属材料（例えばPEG，PLURONICSや他のヒドロゲル）が使用できる。
記載された実施例において、フローセル上部１００（図４）と連結した液体出入口１５６、１５８を受取るため、個々のリザーバ１０２〜１０６に結合している出入口１０８〜１１８は、リザーバの凹部１２０〜１３０とそれぞれ一対の容器１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４（図１に作図線で図示）とを互いに流体の移動が可能であるように連通する。液体出入口１５６、１５８は一つのリザーバについてしか記載されていないが、本発明の記載は同様にフローセル（もしあるとすれば）の他のリザーバにも当てはまることはいうまでもない。
図４に示すように、液体出入口１５６、１５８はフローセル上部１００に穴を開けてくりぬいたねじ切り部材（ねじ山は図示しない）と接触する雄ねじ刻設された管継手である。管継手の解放端では例えばシリンジポンプ（図示しない）と液体とが連通している（例えば管材や導管による。図８に示す）。測定液が出入口１０８から１１８と連通するかぎり、出入口とフローセル上部の間に液体を結ぶ他の装置も使うことができる。このように、分析すべき液体（例えば全血、血漿、希釈液、またはこれらの混合物）は例えば振動ポンプ（図示しない）を用いてリザーバ１０２〜１０６から出し入れされる。
さらに図１と図４に示すように、壁面１３２〜１３６の外側表面の一部分はフローセル上部を形成する凹部１６０を規定している。凹部１６０はガスケット１６２を受け入れるように作られており（図４、５、１１）、ガスケット１６２については以下にさらに詳細に述べる。ガスケット１６２はフローセル上部１００の上に導波管を配置する際の緩衝材となり、フローセル上部と連結して導波管のすべりを妨げる。ここでより詳しく述べるように、ガスケットはリザーバ１０２〜１０６中の液体を入れている壁面１３２〜１３６のどの部分の役割も果たさないことが望ましい。フローセルは石英導波管か、より好ましくは以下に述べるプラスチック成形導波管１６４とともに使用する。
Ｂ．導波管
図４、６、７に示すように、入力レンズ１６６と出力レンズ１６８とが結合して備わっている好適な導波管１６４は、プラスチック成形導波管（例えば光学プラスチックで成形されている）である。このような導波管１６４は、ソリ形をしており、平行な第一平面１７２と第二平面１７４平面を有する平面部１７０（光学基板）およびこの二平面の間の厚さが１７６であるエッジを有することが好ましい（図９）。導波管表面のうち少なくとも一方の平面１７２には多数の捕捉分子２４０が結合している（例えば図９に示したように平面上に固定化する。ただし、捕捉分子を表面に十分密着して結合される他の方法（導波管表面にストリップ免疫測定法を設置したり、捕捉分子を繊維に接着する繊維状の「マット」を使用したりする）を使用する場合もある）。平面１７２、１７４は可能な限り光学的に平滑であるのが良い。例えば、表面のうねりや粗さの間隔は約６５ナノメートルから１９５マイクロメートルの範囲外でなければならず、同時に６５０ナノメートル付近の間隔も避けるべきである（波長６３２．８ナノメートルの光線が使用されている場合）。表面の粗さ振幅（roughness amplitude）すなわちＲａ（平均ピークまたは谷に対する理論上の平面）は０．００６５マイクロメートル（０．２６マイクロインチ）より小さくなければならない。しかしこの二倍の長さであってもよい。前記厚さは一般的には０．２０から１ミリメートル（mm）の間で、より好ましくは約０．５mmである
平面部のエッジには内部に伝搬した光を受け取るための領域（例えばレンズ１６６）が存在する。図６および図７で示した実施形態においては、入力すなわち光を受け取るレンズ１６６は、導波管前部における光を受け取る領域に隣接した導波管に一体型に構成されている。レンズと平面部とを光学的に結合させる別の方法も使用することができる。このようなレンズ表面の仕様は、導波管の平面部あるいは「プレート」部分と同様である。最大粗さ振幅は０．００１３マイクロメートルから０．０２５マイクロメートル（０．５マイクロインチから１マイクロインチ）が好ましい。加工線は導波管の長軸に対して平行（レンズを見ると垂直）とするのが望ましい。レンズの側部とレンズの傾斜部領域の表面仕様は平面構造の上部および底部の表面ほど厳密ではない。
別の実施形態（図示しない）において、一枚のレンズ（あるいは複数のレンズ）は導波管と一体型に結合していないが、導波管（あるいは複数の導波管）と光学的に相互作用するように構成されている。
ところで、光を導波管へ収束するためにレンズを使うよりも、回折格子を使うことがある。種々の回折格子およびこれらを導波管に組み込む方法について知られている。例えばヘミング（Heming）等による米国特許第５，４８０，６８７号（１９９６年１月２日）の第４欄１〜１０行目および第６欄２０行目から第７欄５５行目まで、フラナガン（Flanagan）等による米国特許第５，０８１，０１２号（１９９２年１月１４日）、ファッティンガー（Fattinger）による米国特許第５，４５５，１７８号（１９９５年１０月３日）、クンツ（Kunz）による米国特許第５，４４２，１６９号（１９９５年８月１５日）バージェス・ジュニア（Burgess, Jr.）等による米国特許第５，０８２，６２９号（１９９２年１月２１日）を参照されたい。回折格子は多くの手段により作られる。浮き出し、成形、写真平板、直接エッチングする電子ビームリソグラフィー、干渉リソグラフィー、位相リソグラフィーなどを含むが、これらの手段に限定されるわけではない。浮き出した回折格子は機械的に刻印するか、熱により表面上に刻印し、基板に貼り付ける。
平板印刷の回折格子は化学現像と、適当な光源により照明を覆った後のフォトレジストと基板のエッチングにより形成される。干渉平板リトグラフィーと位相リトグラフィーとは類似の技術であり、従来の平板印刷よりもエッチングした構造部分の解像度がすぐれている。イオンあるいは粒子ビームによる方法では、イオンまたは分子の流れを用いて回折格子の基板に直接エッチングすなわち「書く」ことにより、正確な回折格子を形成することができる。
回折格子自体は導波管の平面部あるいは傾斜部の前部の上を覆う金属フィルムが規則正しい特徴をしたエッチングの型から成っている。分光計で「レプリカ」回折格子として使われるような、標準の回折格子が使用される。このように回折格子のカプラを利用することは、光を受け取るレンズやプラズマでエッチングした回折格子の利用に伴う製作の複雑さを回避するのに役立つ。このようなカプラを利用する手順は現在プラスチック製のクレジットカード上にホログラムを浮き出すために使われており、このような方法を以て、カプラは比較的低価格で大量生産される。
図１９で示した別の実施形態のように、回折格子３１４（深さまたは厚みが５ナノメートル以下）を有する波形の導波管が、屈折率の低い基板３１８がついたプラスチック製の薄膜導波管３１６（または成形された薄いプラスチック製の平面導波管）の光の受け取り領域と結合して（例えば成形する、接着する、熱して押しつける、あるいは浮き出しにするなど）いる。ここで記載された実施例では、回折格子３１４は薄膜と屈折率の低い基板の間に配置されているが、薄膜導波管の表面１７２に回折格子をつけるような他の位置も使用することができる。また他に、光を異なる方向から導波管へ向けることもできる。とにかく、回折格子は内部に伝搬する光２１８を受ける。このような場合、導波管部分は一般に透明な光学プラスチックから形成されており、厚さは約１０マイクロメートルから約２００マイクロメートル、より好ましくは約１２５マイクロメートルである。極端に導波管の膜が薄い場合（例えば約１０マイクロメートルから２５マイクロメートル）、結果としてその薄膜は堅い開放支持体３１７に接着することが望ましい。また、結果としてその薄膜は薄膜よりも屈折率の低い支持基板に取り付けるとよい（図１９）。
効率の測定から、組み立てられた光学導波管蛍光免疫測定法において最も効率的なエッチングの深さは回折格子間隔の約１．５倍であることが決定される。回折格子で回折が起こるためには、間隔ｄは波長（λ）と同じオーダーでなければならない。二つの隣り合う回折要素（スリット、接点（rigids）、およびこれに類するもの）から出る光線の光路差をδと仮定すると、δが波長のｍ倍（ｍは整数）である場合、回折格子を通る光によって強め合う干渉模様が形成される。
δ＝ｄ（ｎtsinθt・-ｎisinθi）＝λ（ｍ）
ここでｄは回折格子間隔、θtとθiは回折格子の境界面での透過角および入射角（表面平均値に関して測定）を指す。ｎtとｎiは透過する媒質と入射する媒質（例えば導波管と基板）の屈折率をそれぞれ示す。本式を使用すると、回折間隔が０．７マイクロメートルのとき、結合した６３２．８ナノメートルの光の入射角は３８．０３度と決定される。
空気から導波管を形成する最下層へ伝わる光の入射角および導波管フィルムの溝の密度は上記方程式を用いて算出される。６３２．８マイクロメートルの入射光を用いると、密度２４００ｇ／mm、１８００ｇ／mm、１２００ｇ／mmのポリエチレンに対する入射角はそれぞれ４．６度、２７．４度、５７．２度となる。
更なる別の実施形態では、レーザー光は一体型光学導波管上（integrated optic waveguide、IOW）でプリズムにより合成（prism-coupled）したり（図示しない）、端をぶつけて合成（end-fire coupled）したり（導波管中へ直接光の焦点を合わせる）、導波管へ先細りに合成したり（taper-coupled）（例えば、厚さまたは屈折率が漸減した（tapered）薄膜を利用する。ただし回折格子カプラと関連することが好ましい）することができる。
光をフローセルで先細りに合成させるために、ゆるやかに漸減した部分（例えば曲線か直線）を利用して、光を薄い平面導波管の端に「一カ所にまとめる」ことができる。よく視準を合わせた入射ビーム（レーザーなど）は、「明るさの法則」による制約のため、多様な様式の導波管（例えば厚さ約５０マイクロメートル）に収束する（すなわち、ビームの大きさの積と、開口数はこの先細り形（taper）を通して一定である）。この先細り形はレンズとも繋がる。
図６、図７に示した導波管は棚板（shelf）すなわちリッジ（ridge）１７６を有する。このリッジ１７６は導波管１６４がフローセルと連結して機能している場合、フローセル上部の端に接触している（図４）。図１に示したように、フローセル上部１００には二つの出入口１７８と１８０があり、これらは導波管を定位置に固定する（挟み込む）ためフローセル上部１００および導波管１６４と接触するように構成した第二フレーム部材１８６（フローセル下部）の支持部材（支持柱）１８２および１８４と接触する。
レーザー光は受け取りレンズ１６６に平均角θで入射するのが好ましい（図８）。平均角θは一般に、導波管を形成するために使用される材料の種類と導波管の両面の向かい側にある媒体の光学的性質とに依存的して変化する。導波管あるいは導波管の層がポリスチレン（例えばNOVOCOR）で形成されている場合、平均角は一般に３２度より小さくなり、例えば１５度〜２５度となる。一般的なビーム幅は０．５ミリメートルから２．０ミリメートルの間で変化する。
導波管の反対側では、外部結合装置１８８が後部すなわち出カレンズ１６８と接触しており、光が検出されることを確実にする（図８）。外部結合装置１８８は単一光検出器でも、多数光検出器でも、標準CCD（荷電結合素子）でも、同様な装置でもよい。導波管１６４を通り抜け外部結合装置１８８により受け取られた光線は特性または／および強度について分析される。ブロック等（Block）による米国特許第４，５８２，８０９号（１９８６年４月１５日）に述べられている光の末端収集法（end collection）と異なり、本発明では、二つの理由から光は導波管の末端部で検出される。一番目の理由は、特性のコントロール測定としてである。導波管を通過する光は、バイオセンサが装置に適切に配置されており、かつ光源が依然として機能していることが装置を使用する者にわかるように測定される。また、装置が作動される前に予め決定した光の強度が後部レンズ１６８で最初に検出できるように装置は形成されており、ここでもフローセルアセンブリ（「バイオセンサ」）、一般的に１９０が、適切に配置されていることを保証している。検出が末端部である二番目の理由は、導波管を通過する光の量が均一であることを確実にし、かりに均一でないとすれば誤差を補正するという、装置の較正に関連している。導波管に結合するレンズ１６８から外部で収束する光は、十分な光がレンズを通過して検出可能な蛍光が創出されていることを保証するために、レンズ幅全体に渡って測定されることが望ましい。
また、図６および図７で示したようなプラスチック製導波管はポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル（「ＰＭＭA」）、ポリカーボネート、あるいはこれらと等価な材料のような光学プラスチックより成形（例えば射出成形）されており、かつ１．３３より大きい屈折率（水の屈折率は１．３３である）を有することが望ましい。導波管の大きさは望まれる用途に左右される。
前部レンズ傾斜部１９２と後部レンズ傾斜部１９４は互いと平面部１７０とに関して「凹状の」すなわち弧状の位置にあることが示されている（図７）が、これらの傾斜部は共通の中心に対して折れ曲がっている必要はなく、レンズ傾斜部のうち一方は平面部の面から反対方向に折れ曲がっていてもよく、傾斜部は概ね平行な平面に傾斜する（図示しない）。
別の実施形態（図示しない）では、ユタ州立研究財団による国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／９６／０２６６２（国際公開特許第９６／２６４３２号公報、開示日１９９６年８月２９日）で開示されている層のように、導波管が薄層状の層を含んでおり、そのうち一層は構造の支持層の役目を果たし、他層（薄層例えばＳｉＯＮ）は光を透過する役割をしている。このような実施形態において、構造の支持層はポリスチレン、ＰＭＭＡ、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリイミド、ポリエステル、ポリウレタン、有機的に修飾したセラミック、ジエチレングリコールビスアリルカーボネートのポリマー、アリルジグリコールカーボネート、ポリカーボネート、または等価な材料のようなプラスチックから形成される。導波管の層はＴｉＯ2、ＴｉＯ2とＳｉＯ2の混合物、ＳｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ5、Ｓｉ3Ｎ4、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2、またはＺｒＯ2のような他のふさわしい材料からも形成され得るが、ポリスチレンのような光学プラスチックであることが好ましい。ＴｉＯ2やＳｉＯ2やＳｉ3Ｎ4のような導波管層は、プラズマ化学蒸着法（ＰＶＣＤ）、プラズマ衝撃化学蒸着法（ＰＩＣＶＤ）、または同様な方法により析出される。
Ｃ．ガスケット
ガスケット１６２は導波管１６４とフローセル上部１００との間に設置されることが望ましい（図４、図５、図１１）。一体型レンズを有する導波管１６４と一緒に使用するのに好適なガスケット１６２は、フローセル上部の凹部に適合するように形成されたシリコンゴムガスケット１９８に接着した（適切な糊や両面テープを使用する。例えばアメリカオハイオ州ストウにあるモーガン・アドヒーシブ・コーポレーション（Morgan Adhesive Co.）より入手できるMANTAC No.SB 1154など）透き通ったテフロン（TEFLON）層１９６を含む。また、合成樹脂ポリマー（例：テフロンのような材料）も使用される。記載したガスケット１６２はリザーバ１０２〜１０６を囲みはするが影響はしない三つの内部開口部を持つように形成されている。
バイオセンサのアセンブリに関して、リザーバ１０２〜１０６においては、導波管１６４の第一平面１７２は、個々のリザーバの床板あるいは天井板となっており（図８）、他方フローセル上部１００はその天井板または床板および前記壁面の構成要素となるように形成されている。図８に示した方向では、平面１７２が天井板の役割をしておりかつ地球との位置関係がとりわけ便利な水準になっているが、特に振動させると、より短い時間（例えば５分から１０分）に全血の中からでも標的分子の存在を装置が検出する能力を高める。しかしながら、当然いうまでもなく、フローセルアセンブリ１９０はいかなる位置にも（例えば垂直やいかなる角にも）向けることができる。フローセルアセンブリ１９０をある方向に向けると、望ましい場合、導波管１６４から気泡や重い原料を取り除く手助けとなる。他にも、干渉信号を吸収するための染料を試料液に混合することができる。リザーバはここでは一般に矩形で示されているが、他の形のもの使用できる。
ガスケット１６２は励起した光の波長域において、導波管材料の屈折率よりも小さい屈折率を有するやや堅い材料から形成されていることが好ましい。結果を最良にするためには、ガスケット材料の屈折率は導波管の屈折率と比較してできるだけ低くするべきと考えられている。石英またはガラスから形成された導波管では、屈折率は一般に約１．４６から１．５２となり、高鉛ガラスに対してより高くなっている。屈折率が１．３５から１．４３の透明な（無着色の）シリコンゴム（シロキサンポリマー）はガスケット１６２に使用する材料として現在好まれている。PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）やFEP（フッ化エチレンプロピレン）のようなテフロンまたはテフロン型の材料も約１．３４から１．３５の屈折率を有しており、層１９６として使用するのに適している。
ガスケットの他の部分１９８は、不透明な（例えば赤や黒）ネオプレンまたはシリコンゴムで形成することができるが、これらの材料は壁面が金属であるため、必要不可欠というわけではないが、生物学的に不活性であることが好ましい。
Ｄ．フローセルアセンブリ
図１８に示すように、本発明による好適なフローセルアセンブリ１９０は、一般的にフローセル部分（一般に２００、図１０参照）、ガスケット１６２、および導波管１６４を含んでいる。図１０に示すように、フローセル部分はフローセル上部１００、フローセル下部１８６、およびフローセルステージ（または「フローセル台」）２０２を含んでいる。図８に示すようにここでより詳細に記述すると、バイオセンサ１９０のこれら三つの構成要素は、励起した光が導波管１６４の前部レンズ１６６に入射し、前部レンズ傾斜部１９２と平面部１７０を透過し、後部レンズ傾斜部１９４と後部レンズ１６８から外部結合装置１８８へと出て行くような方法で、互いに統合される。フローセルアセンブリはフローセル上部１００とフローセル下部１８６とを結合し、従ってガスケット１６２と導波管１６４とをその間に挟む手段をも含んでいる。そのようにするための記載された手段は、フローセル下部１８６のねじ穴２０８、２１０と互いに接触するねじ締めボルト２０４、２０６である。しかし当然ながら、ねじ、ナット、ボルト、留め金、スナップフィット、および同様の等価な手段も代わりに使用することができる。
導波管支持板２１２はフローセル下部１８６と係合して示されている(図４)。導波管は支持板と位置を調整して並んでいる場合、フローセル下部とフローセル上部の間に配置された状態で再現される。光ビームを受けるための開口を三つ有する三経路ビームマスク２１４(3-channel beam mask)についても示している。
Ｅ．装置
フローセル２００に関すると、ガスケット１６２と特定の導波管１６４が互いに連結しその結果形成されたバイオセンサ１９０は、蛍光免疫測定法のような免疫測定法を行うための装置の中で使用される。図８に示すように、このような装置は光源２１６を含んでおり、この光源は反射鏡２２０、２２２、２２４によって光学バイオセンサ１９０に向けられる光ビーム２１８を含む。光源２１６はそれぞれ中心波長４８８〜５１４．５ｎｍと６００〜約９００ｎｍ（例えば６３３ｎｍ）とで放射するアルゴンレーザーまたはレーザーダイオードである。
図８の実施形態にはさらに、望ましい場合、特定のバイオセンサ１９０の入力レンズ１６６上にビーム２１８を集束させるのを助長するように配置されている４５度角の反射鏡２２６がある。バイオセンサ１９０にはビーム２１８からの光を受けるよう配置された一端１６６を有する光学基板が存在する。一体化されていない石英セルの場合、ビーム２１８からの光をバイオセンサの端部で集束するために、焦点レンズ２２８は測度反射鏡（angle mirror）２２６とバイオセンサ１９０の間に配置されるのが望ましい。焦点レンズ２２８は着脱可能で、焦点を最良に合わせるため配置を調整できるようにＸ−Ｙ変換装置を装備して図示されている。
さらに、変換装置は組成の異なる導波管の角θを調整するために移動させることもできる。光学基板１６４の重要な部分（石英導波管の場合、全部）は図９に示すように幅１７６の間隔を空けた二つの平面を有する平坦な形が一般的であり、ここでより詳細に記述する。
光検出手段、一般に２３０は、バイオセンサ１９０から放射する蛍光を探知するように配置されている。図９に関連してここでより詳細に述べると、放射された光は試料中に存在する選択された検体の濃度を反映している。図８に示した光検出手段２３０には集束レンズ２３２があり、このレンズは光学基板１６４を通過した光２１８が伝搬する方向と実質的に直交する方向から放射する蛍光を集束するように配置されている。
集束レンズ２３２と光学基板１６４との間の距離２３４は当業者に知られているように、エバネッセント光の透過領域から放射する光の収集を最大にするように、かつ同時にこの光を光検知器の面に結像するように選択される。集束レンズ２３２によって収集された光は検出手段２３０に送られ、収集した蛍光レベルを反映した出力信号により応答する。
検出手段２３０は、従来技術において周知のように、放射した蛍光の波長域に及ぶ波長領域の光を検知するために役立つ光検知器であれば、どのようなタイプのものでもよい。ただし、同時に多数の検体を分析評価するための好適な実施例においては、検出手段２３０はエバネッセント帯域２３６で生じた各々の蛍光信号を直接結像できる結像型の検出器とする。図８の装置において、検出手段２３０は信号を生じるCCD検出器である。このように映像信号を収集することより、各ウェルやパッチ（patch）を測定するのに別々の光学要素が必要なシステムよりもずっと簡単な方法で多数の試料を同時に測定できる。また、本映像検出システムにより、導波管への蛍光のエバネッセント透過を経由するよりもむしろエバネッセント領域２３６から直接的に、放射した蛍光を収集できる（Fig.9）。
また、検出手段２３０は、光電子増倍管、半導体光ダイオード、またはこのような検出器の列でもよい。CCD以外の実施形態では、列は一般に目的に応じて単一検出器であることが望ましい。小型の検出器の列があると、使用者は最大量の蛍光が検出されており、収集や検出光学レンズの調整間違いにより不注意に失われないことを確認できる。光学的に、回折格子を備えた分光写真器は、検出された光のスペクトル解析を行うためのCCDや他の検出手段と結合される。この場合、手段は試料から収集した全蛍光を決定するためにおのおののピーク周辺の信号関数を積分するのに提供される。また、検査機関での使用に対する実施例においては、定量に関するすべてのパラメータは標準化されているが、分光器はトレーサーの蛍光領域の波長のみを通過するフィルタに置き換えることができる。
図９にはアッセイが行われる際の状態が一般的に示されている。光学基板１６４は第二平面１７４から幅１７６だけ離間した少なくとも一つの平面１７２を有する。少なくとも表面１７４は試料溶液２３８に対して接触するように配置されている。導波管表面１７２上には捕捉分子２４０が固定されている。試料溶液２３８は、特定の検体中にある多数の検体分子２４２と多数のトレーサー分子２４４とを含む。トレーサー分子は、例えば検体に混合する前に試料溶液と混合したり、導波管表面１７２に実際には化学結合しないで導波管表面上でトレーサー分子を乾燥させたりして、試料溶液に混ぜることができる（あるいはトレーサー分子が水溶性成分（捕捉分子とトレーサー分子間の特定の相互作用を干渉しない水溶性の等質など）を利用して表面に結合している場合のように、少なくとも永続的に結合しているわけではない）。捕捉分子を選び、検体分子２４２の各々に存在する結合部分と結合するように形成される。トレーサー分子は捕捉分子と相補的（結合という意味において）であるように選ばれ、適切な波長の光刺激に対応して蛍光を発するように（例えば捕捉分子に蛍光標識を付けることにより）形成される。トレーサー分子２４４により放射される蛍光のレベルにより捕捉分子と結合した検体の量を測定でき、ゆえに溶液中の検体２４２の濃度を反映する。
光が導波管１６４内を伝搬し、表面１７２、１７４において内部反射される場合、エバネッセント光場が形成される。このエバネッセント光場の強度曲線２３０は、距離軸２３２と水平軸２３４を図のようにとった場合、平面１７２からの距離に伴って減少する（図の縮尺は合っていない）。エバネッセントの光の強さは距離と同一線上に、軸２３２に沿って変化する。励起領域２３６は、トレーサー分子２４４の充分な量すなわち検出可能な量を励起するうえでエバネセント光の強度が充分である唯一の領域である（図の縮尺は合っていない）。励起領域２３６の外側のトレーサー分子２４４は誘導蛍光をほとんどあるいは全く引き起こさない。励起領域２３６は通常約１０００〜２０００オングストロームの深度範囲である。
捕捉分子２４０は検体分子２４２に対して反応性を有するものであればよく、全ての抗体、Fabフラグメント、ペプチド、エピトープ、膜受容体、全ての抗原性分子（ハプテン）または抗原性フラグメント、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、ミメトープ、核酸あるいはこれらの混合物を用いることが可能である。また捕捉分子２４０として、細胞または細胞器官の膜に通常見られ、検体に対して特異性を有する受容体分子や、こうした受容体の、検体に対して特異的結合性を有する部分を用いることを可能である。
捕捉分子２４０は従来技術において公知である任意の方法により表面１７２上に固定することが可能である。しかし、好ましい実施例においては、捕捉分子は部位特異的に固定されている。この応用例において用いられる「部位特異的」とは、捕捉分子の特異的部位が、一般的な先行技術に基づく方法におけるようにランダムな部位ではなく、捕捉分子上にある特異的部位を意味する。先に参照した国際公開特許公報第９４／２７１３７号に、光学基体上に抗蛋白質コーティング（protein-resistant coating）を施すことにより基体の表面上に捕捉分子を部位特異的に固定する方法の詳細が示されている。
導波管は同一試料について多数の（例えば四つの）異なる検体を調べることができるよう設計されている。これは、導波管の異なる部分に異なるタイプの捕捉抗体を固定化させることによって行われ、その方法は模式として言及されている。三つの異なる模式がポリスチレンセンサに抗体を固定化するために適していると思われる。つまり、ガスケットを施した多数ウェル被覆トレイ（gasketed multi-well coating tray）、液体インクジェット印刷および写真平板である。前者では、インクジェット印刷機と同様な機械が導波管の特定部分に試薬を噴霧するために使用される。後者では、光化学的に選別域に抗体をつなぐため、紫外線が使用される。
ある固定化化学は導波管への抗体の物理的吸収を基づいている。方法の一つに、固定化の少し前に酸性条件に短時間暴露するというのがある。この酸による前処理の操作により、固定化抗体の抗原結合能（AgBC）が数例で三倍にまで改善することが示されている。この固定化化学は比較的簡単で、ガスケットを施した多数ウェル被覆トレイあるいは液体インクジェット印刷技術と併用できるが、数例において他の方法よりも非特異的結合の程度が高いことが示されている。
他の二つの固定化化学はPEO−PEO−PEOという形状のトリブロックポリマー（tri-block polymers）のファミリーに基づいている。ここでPEOはポリ（エチレンオキシド）を、PPOはポリ（プロピレンオキシド）を表す。これらの表面活性剤は商品名プルロニクス（PLURONICS）で市販されており、PEOとPPOとのブロック用に様々な鎖の長さがある。PPOブロックはPEOブロックよりもかなり疎水性が高く、PEOブロックを大量の溶液に暴露したままで、ポリスチレンのような無極性の表面に容易に吸着する。PEO鎖の自由末端は移動性が高く、事実上タンパク質を表面から一掃する。
二番目および三番目のどちらの固定化化学でも、抗体を接着する前に導波管の表面をプルロニクスで被覆するが、これら二つの化学では、抗体の接着の仕方が異なっている。二番目の化学では抗原結合断片（Ｆａｂ'）とPEOブロックとを共役させるために光化学的架橋試薬を用いており、この方法は写真平板による様式に適している。三番目の化学では、化学的架橋試薬を用いてＦａｂ'断片をプルロニクスに接着させるが、この方法はガスケットを施した多数ウェル被覆トレイあるいは液体インクジェットと併用できるようになっている。光化学的架橋法は二つの異なるプルロニクス（F108とP105）および二つの異なる光化学的架橋剤（BPMとBPIA）に関して評価された。二つ一組にしてできる組み合わせの四通りすべてから許容できるレベルの全抗原結合量が得られるが、一方ではBPIA架橋剤を用いて抗体をF108に固定化すると、許容できないレベルの非特異的結合が得られる。その他の三つの二つ一組にした組み合わせについては、非特異的結合のレベル（全結合量の約１．５％）が非常に低い。さらには、P105とBPMの組み合わせは特に優れており、検出不可能なレベルの非特異的結合しか生じない。
図９では、競合測定法の図解を示す（置換測定法とも呼ばれる）。しかしながら、当業者には明白なように、本装置に関してサンドイッチアッセイのような別の検定法を計画することも可能である。例えば、ハイブリテック・インコーポレイティッド（Hybritech, Inc.）に付与された米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
図９の実施形態において、この競合免疫測定法では捕捉分子２４０が検体２４２の代わりにトレーサー分子２４４とも結合するように作製されたトレーサー分子２４４が存在する。検体分子２４２の濃度がより高くなると、トレーサー分子２４４の大部分が捕捉分子２４０から周囲の溶液へと置き換わるため、基板１６４の励起帯域２３６の中に存在するトレーサー分子の数が減少する。トレーサー分子の結合がこのように減少すると、次には蛍光の量も又減少する。対照的に、検体分子２４２の濃度が低くなると、トレーサー分子２４４が捕捉分子２４０に結合できるようになり、従って励起帯域２３６の範囲内に保持される。
注意点の心血管マーカーCK-MB（急性心筋梗塞に関連する）を使用して血漿と全血の両方について行った試験では、結果は比較可能であった（拡散および粘性の違いを考慮に入れた場合）。
図８の装置の実施例では、蛍光の測定は分光器により行われる。蛍光の検出はモノクロメーター（スペックスインダストリーインコーポレイティッド（SPEX Industries, Inc.）、１６８０Ｃ型）およびCCD（フォトメトリックスリミテッド（Photometrics Ltd.）、シリーズ２００またはＣＨ−２５０）により行われる。ところで光源２１６は、選択された蛍光染料の励起に望ましい波長で放射する光源ならばどんなものでもよい。また、一旦検査法の手順が有効になり標準化されれば、蛍光スペクトルや空間分布を測定する必要がなくなることもある。検出手段は測定の最低限の必要条件に従って簡略化することができる。
別の代わりの実施形態では、光源２１６は市販されている６００〜７００ｎｍの赤色波長領域で放射するレーザーダイオードとなっている。レーザーダイオードは電力約１２ミリワットで波長約６３５ｎｍの放射ピークを供給する。６３３ｎｍで放射するレーザーダイオードも入手可能で、使用することができる。この領域の波長を用いる実施形態のために、シアニン染料のような染料を使うことが必要である。シアニン染料の蛍光は赤色スペクトル領域の波長に関して励起する。このような染料の一例が蛍光染料CY5で、バイオロジカルディテクションシステムインコーポレイティッド（Biological Detection System, Inc.）やピッツバーグピーエー（Pittsburgｈ PA）(カタログ番号A25000)から入手できる。CY5染料は製品の使用説明書および／またはBDSから入手できるキットにより、望ましいトレーサー分子と共役させることができる。二番目の染料であるCY7も適切であろう。染料と共役法についても、「Cyanine Dye Labelling Reagents-Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Ester」（Cytometry 11: 418-430(1990)）という表題のサウスウィックピーエル（Southwick, P.L.）らの論文に特性を記述している。光源としてレーザーダイオードを使用すると、バイオセンサおよび導波管をプラスチックで形成することができ、これにより製造費用がかなり減り、導波管とリザーバについて半円筒状のレンズを一体型に成形することが容易になる。
望ましい場合、種々の波長で光を放射する、種々の標識を用いてもよい。このような状況では、導波管は検出すべき一個以上の分子の検出に使用するために、様々なタイプの捕捉分子（例えば様々な抗原と反応する抗体）を表面に固定化することができる。このような場合、導波管からの信号を多重送信することによって多数の波長を検出することができる。
図２４は試料溶液２３８中に存在する関心の対象となっている種々の検体（Analytel, Analyte2, Analyte3, …Analytex）を検出するために、種々の捕捉分子（Capture Ab1, Capture Ab2, Capture Ab3, …Capture Abx）、トレーサー分子（Tracer Ab1, Tracer Ab2, Tracer Ab3,…Tracer Abx）、および標識（F1, F2, F3, …Fx）を使用した導波管センサから放射される、同時に波長および空間的に解像した蛍光の検出について模式的に例証している。記載された実施形態では、他の方法でここに記述するように装置が働くが、おのおののトレーサー分子（Tracer Ab1, Tracer Ab2, Tracer Ab3,…Tracer Abx）は異なる色の蛍光物質（F1, F2, F3, …Fx）で標識されている。
導波管は、導波管のエバネッセント領域の内側に存在する蛍光物質をすべて励起させるのにふさわしい一つまたはそれ以上の様々な波長の光２１８に照射される。ある配置では、領域通過フィルタを用いると、種々の蛍光物質からの放射を区別できる。光線２４８、２４９、２５０はトレーサー分子上のそれぞれの標識から放射されている。この光線はその後レンズ２５２を通過し、特定のトレーサー分子の標識、記載した事例ではTracer Ab1、によって放射された波長に選択的な領域フィルタ２５４の上で放射した光が平行になる。車輪２５６のようなフィルタ切り替え部は、例えば異なる蛍光標識のおのおのに選択的な三つの異なる領域フィルタを内蔵している。このように、Tracer Ab1によって放射された光線２４８のみがフィルタを通過する。波長の選別に加えて空間的な解像も望まれる場合、フィルタ２５４を通過した光線２４８は二番目のレンズ２５８を通過する。レンズ２５８はCCDやダイオード列（diode array）のような空間的に解像した光検出器２６０の上に光２４８の像を形成する。波長の解像だけが望ましい場合は、光検出器２６０は単一の空間的に統合された装置でよく、レンズ２５８も任意に省略することができる。
ところで、波長の選択性は、フィルタ車輪以外のいくつかある手段のうちの一つによって成し遂げられる。それらは回折格子、プリズム、あるいは音響光学変調機のようなもので、異なる放射光の波長を角で選別し、それらの波長が個々の光検出器の要素に分離し、その要素の出力が各波長領域内の信号の強さを表すように使用する。回転フィルタ車輪の使用を避ける別の配置では静止ビームスプリッタ（stationary beam splitters）を使用するが、これは個々の光検出器の要素の前に配置した静止フィルタを通じて入る、放射した光の直接の部分に使用される。
また、異なる蛍光物質の励起した波長が測定できるほどに重複しないで十分分離された場合、光源は励起した各波長を通過して調子を合わせて配列している。いかなる時間に放射された光も、特定の時間に励起した波長を選んだ蛍光物質のセットの信号の強さと関連しており、フィルタのような、これ以上の波長を選別するための装置は必要ない。
本発明を以下の実施例により、さらに説明する。
実施例
実施例１
一体型レンズを有する導波管は図６および７に示したように、清潔な環境で透明な一般用途用ポリエチレンから射出成形された。本導波管は長さ３８ｍｍ、幅２５ｍｍであった。平面１７０の厚さ１７６は一貫して０．５ｍｍであった。リッジすなわち「棚板（shelf）」は高さ１．３ｍｍであった。前部レンズおよび後部レンズはそれぞれの曲率中心が同一平面上にある底部エッジを有していた。前部レンズの水平角２６２は約１５度であった。後部レンズの水平角２６４は約１９度であった。前部レンズおよび後部レンズの曲率半径はそれぞれ約３．２ｍｍと約１．６ｍｍであった。前部レンズの平均角θは２１度であった。後部レンズの平均角は約２４度であった。
実施例２
フローセル上部は、図１〜３および８に示したように硬質な黒色陽極処理６０６１−Ｔ６アルミニウムで形成された。フリーセル上部は、厚さ０．２５ｍｍ（０．０１０ｉｎ．）の壁面を各周囲に有する三つのリザーバと、中央に平面と、片側の端から幅１．６ｍｍ（１／１６ｉｎ．）のところに二つの半カプセル型をした凹部と、各凹部の中心に達する直径１．６ｍｍ（１／１６ｉｎ．）の出入口とを含んだ。この出入口はフローセルの反対側に突出する深さ５．１ｍｍ（０．２００ｉｎ．）の＃１０〜３２の連結器（標準ねじ、ＮＰＴではない）へと開口した。９０度のさら穴２６６（図２）を出入口連結器の表面に設けた（プラスチック製のかかりのある管材料連結器を出入口連結器にねじ込み、さら穴上で固く結合している）。リザーバの配列の両側にランド（ｌａｎｄｓ）２６８、２７０と呼ばれる二つの（溝と溝との）山の部分が存在した。おのおののランドにはその部分の厚みを貫通する三つの穴があった。四つの＃３１のねじ穴２７２、２７４、２７６、２７８が形成された（例えばドリルで穴を開けた）。二つの出入口１７８および１８０は、第二フレーム部材１８６に適合するように押し込んだ２．４ｍｍ（３／３２ｉｎ．）の公称四つ角ピン１８２および１８４と滑らせてぴったり適合するように、穴を開けて広げた。
実施例３
ガスケット１６２は、図４、５、１１に示したように、１．６ｍｍ（１／１６ｉｎ．）のシリコンゴム板と０．０７６ｍｍ（０．００３ｉｎ．）の自動接着性ＦＥＰフィルム（全体厚さ１．６７６ｍｍ（０．０６６ｉｎ．））とを薄層状にした複合構造として形成された。その外側の寸法は幅が約２５ｍｍ（１ｉｎ．）で長さが２５．４０ｍｍ（１．０００ｉｎ）であり、ガスケットはフローセルのリザーバに符合する三つの内部開口部を有していた。ガスケットは水噴射式カッターを用いて作製され、ＦＥＰ層がフローセル表面から向きが逸れるようにフローセル上に取付けた。
実施例４
第二フレーム部材１８６は、図４、１０、１２、１３、１８に示したように、黒色陽極処理６０６１−Ｔ６アルミニウムから形成された。これはフローセル１００の三つのリザーバ１０２、１０４、１０６に（わずかに大きかったが）符合する三つの内部開口部２８０、２８２、２８４を含んでいた。内部開口部は浅い凹部２８６（深さ０．４６ｍｍ（０．０１８ｉｎ．））に配置しているが、その凹部に導波管をはめ、導波管表面のトレーサー分子の反応より放射されるエバネッセント光を検出手段２３０によって検出した。フローセル１０２に関して、ランド２８８、２９０は内部開口部の両側に存在し、おのおののランドには三つの穴があった。四つのねじ穴（例えば２０８や２１０）は蝶ねじを受けるために穴を開け＃４〜４０にねじ切った。二つの出入口は、穴にぴったり圧入できる３．２ｍｍ（１／８ｉｎ．）の公称だぼを受け入れるために穴を開けた。そのだぼはステンレス鋼で、第二部材の上部表面から約７ｍｍ（０．２８０ｉｎ．）、下部表面から６．６ｍｍ（０．２６０ｉｎ．）突出した。露出しただぼは公称直径２．４ｍｍ（３／３２ｉｎ．）に規格化し、四角に切って位置決めピン１８２、１８４の摩擦を低くするようにした。第二部材底面は機械にかけて、導波管から放射された蛍光用の単独の大きな窓２９２を備えた。第二部材の前部表面には二つの据え付け穴２９４、２９６が含まれ、この穴にはフローセルを支持板２１２に固定するために＃２〜５６で深さ約４ｍｍ（０．１５ｉｎ．）に穴を開けねじ切った。支持板は図１４に示したように、１．６ｍｍ（１／１６ｉｎ．）の公称６０６１−Ｔ６アルミニウム板から製造された単純なＵ型ブラケットである。これには第二部材の前部に存在する穴と符合する二つの＃４２の穴が含まれる。支持板の目的はフローセルに押しつけている間、導波管を側部で固く止めておくことであった。この部分の直立腕は入力結合レンズの外端部で導波管と接触し、他方入力レーザービームとの結合は妨害を受けない。
実施例５
ステージ２０２は、図１５〜１７に最もよく示されているように、硬質の黒色陽極処理６０６１−Ｔ６アルミニウムから形成された板状の構造をしている。この部品の受け取り部位２９８は一段下がっており、矩形の内部開口部を含む。＃２〜５６に穴を開けてねじ切った三つの穴３００、３０２、３０４は本部品の前部に配置しており、これらはレーザービームマスクを固定するために用いた。＃１０〜３２の二つの穴３０６、３０８はステージを試験装置に乗せるため右側に深さ１９ｍｍ（０．７５ｉｎ．）の穴を開けた。内部開口部には傾斜した前部側面３１０と後部側面３１２があった。窓のどちらの側にも二つの２．４ｍｍ（３／３２ｉｎ．）の出入口（フローセルの出入口と類似）が配置され、これらにより、締め付けたフローセルと第二部材とをステージ２０２に乗せることができた。
実施例６
実施例１の導波管と一体型レンズ、実施例２のフローセル上部、実施例３のガスケット、実施例４の第二部材および支持板、実施例５のステージを図４のように連結した。硬質の黒色陽極処理皮膜を公称増強の０．００２５ｍｍ（０．００１ｉｎ．）部品に施したが、アセンブリ１９０は適正なはめ具合の確率を最大にするために、陽極酸化の前にできるだけ多く点検した。
ガスケットフローセル上部１００の三つのリザーバ１０２〜１０６の外側寸法と一致させるため切断した。アセンブリを締め金で留めた場合、シリコンゴム表面はフローセルと接触し、ＦＥＰ表面は導波管と接触した。ガスケット上に存在し、取付け作業のじゃまになったり壁面の上部を越えたりするせきは、レーザーナイフで注意深く切り取った（せきの上部は導波管の表面に曝されるが、接触してはいなかった。ガスケット由来のせきは正しく締め付ける妨げとなる）。
導波管１６４は第二部材１８６中の浅い凹部にはめ込んだ。導波管は側方に最小限しか移動させることができないが、圧迫されていたりはさみつぶされたりしてはいなかった。少しだけ（０．１ｍｍ（０．００３ｉｎ．））側方へ移動させることが可能であった。圧迫が起こるような場合は、適切に配置するために凹部の壁面を追加的に削り取る必要があった。
導波管１６４がフローセルの下に模式的に直接配置していることを保証するため、導波管１６４を第二部材１８６に設置した後、支持板２１４に寄り掛けた。支持板２１４と接触するのは前部レンズの最も外部の角においてのみであり、前部レンズの下側の射出成形突出部との接触は起こらなかった（射出成形は結果として形成される突出部を別の場所に設置するために設計される）。第二部材前部は支持板と接触した場合、フローセルの直下に導波管が存在することを確実にするため、刻みを入れる必要があった。ガスケットをフローセル中にはめて、第二部材上に導波管に配置した後、フローセルの出入口に位置決めピンを埋め込むことにより、フローセルと第二部材とを結合させた。完全にかみ合わせると、他に余分な締め付けの力をかけていなければ（例えばガスケットを加圧しない）、フローセルのランドと第二部材のランドの間に０．１５ｍｍ（０．００６ｉｎ．）の隙間ができる。ランド同士が接触するように四つの蝶ねじで完全に締め付けると、ガスケットは０．１５ｍｍ（０．００６ｉｎ．）圧縮された。フローセルと第二部材はで手動で容易に分解でき、貼り付くこともないが、必要に応じてピンに薄い潤滑油の被膜を使用するとよい。第二部材の圧入孔および／またはフローセルの出入口は、二つの部品の連結を損なう可能性のあるバリや隆起を避けるため、わずかに円錐形に広げるのが望ましい。
第二部材底面の位置決めピンはステージ上の出入口に配置しやすく、容易に適合した。組み合わせたとき、部品の間に気付かれるほどのゆとりは存在しなかった。フローセルと第二部材との取り付けに関して、第二部材とステージは適度の手の力で容易に分解することができた。
実施例７
図２０に示すように、一枚のホログラフィー用の回折格子３１４（Edmund Scientific #43226, 2400ｇ／ｍｍ，ＡＩ／Ｎ9Ｆ2でコートした）を、トルエンに溶解した１０％ポリスチレン製チップから形成されたセメント３２０を用いてポリスチレン製薄板導波管３１６に（Scenic Materials，厚さ１２５μｍ，ｎ＝１．６０）接着した。結果として生じる導波管への内部結合は約５度角でヘリウム・ネオンレーザーを使用して成し遂げられた。結果として生じる連結構造は成形レンズ入力カプラよりも薄かった。
実施例８
Ａ．導波管の作製
ウォーカー（Walker et al.）等が「Corning 7059, silicon oxynitride, and silicon dioxide thin-film integrated optical waveguides:In search of low-low, non-fluorescent reusable glass waveguides」（Appl. Spectrosc, 46:1437-1441(1992)）に述べたような方法で、ＳｉＯＮ層を有する溝を備えた薄層導波管は回折格子をエッチングした石英ウェーハ上で形成した。一時的に、ウェーハを３００度、５０ワット、１．２５トルで作動するプラズマ衝撃化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）の室（Texas Instruments）へ入れた。使用するガスはＳｉＨ4、シラン、窒素、アンモニア、および一酸化二窒素であった。ＳｉＯＮ層は一分間あたり５９０オングストロームの付着率で２５．４２分間生産され、層の厚さは１．５μｍとなった。プラウマン（Plowman et al.）等の「Femtomolar sensitivity using a channel-etched thin film waveguide fluoroimmunosensor」（Biosensor & Bioelectronics, 11:149-160(1996)）で述べられているように、フォトレジストを持つ付加的な層からＳｉＯＮにエッチングされる場合、九つの平行な１ｍｍ×６５ｍｍの溝が形成される。結果として生じる導波管のウェーハは約２．５ｍｍ×７．８ｍｍでそれぞれ三つの導波管の溝を有する、三つの矩形片に切断した（ただしこの実施例では、溝のない格子導波管を使用している）。
Ｂ．回折格子の作製
平面長さ１００ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの石英ウェーハ基板（Hoya, Woodcliff Lake, NJ, QZ 4W55-325-UP）を室温、６％過酸化水素硫酸溶液で洗浄した。次いでＨＭＤＳ真空蒸発プライム（prime）を受けたウェーハを、１分間で４２００回転の割合で回転しながらフォトレジスト（Shipley SNR 200, MA, USA）で被覆すると厚さ約０．７ｍｍの薄層が生じ、それから１００度で１分間穏やかにベーキングした。負のレジストが曝されると、線量２０ｍＪ／ｃｍ2のクロムー石英マスク（DuPont, Kokomo, IN, USA）に対して紫外線（２４８ｎｍ,ＫｒＦ  excimer laser, Laser Stepper GCA-ALS, Tukesbury, MA, USA）を使用すると、０．７μの周期的な溝の様式が明らかになった。ウェーハを１３０度で９０秒間前処理としてベーキングする。フォトレジストを規定度（normalization）０．１７にてShipley MF 312(MA USA)溶液中で展開し、回転嵌挿させる。１００度で６０秒間展開後のベーキングを行った。結果として生じるフォトレジストの様式は、エッチング速度４５０オングストローム／分でＯ2やＣＨＦ3との反応性に富むイオンによりエッチングされたものである（8110 Reactive Ion Etcher, AME, Santa Clara, CA, USA）。回折格子のエッチング深さを０．６μ、０．８μ、１．０μとするために、１３．３３分、１７．７７分、２２．２２分のエッチング時間を要し、縦横比はそれぞれ０．８、１．０、１．４となった。残りのフォトレジストはＯ2プラズマにより除去した。
Ｃ．試験
光カプラとして薄層一体型光学導波管（ＩＯＷｓ）に使用すると、収束レーザー光（光源は２ｍＷヘリウムーネオンレーザー、６３２．８ｎｍ、最大１０ｍＷ、Melles-Groit, Uniphase, Manteca, CA, USA）において、回折格子はプリズムのおおよそ半分の効率となった。どちらの取り組み方（例えばプリズムおよび回折格子）でもバックグラウンドより大きいフェムトモル濃度の試料を検出した。
実施例９
本発明のエバネッセント波測定装置を標準ABBOTT STAT  CK-MB  IMxシステムと比較した。
Ａ．  臨床試料
６３件の臨床試料を入手し（病院でのCK-MB試験用に内科医から寄与された）、ABBOTT STAT IMxシステムを使用してCK-MBに対する検査を行った。おのおのの臨床試料に対して得られた値を記録した。各試料は０．５５ｍｌの大きさに等分し、ロット番号を割り当て、−２０度で保存した。
Ｂ．器具設置/測定の標準化
次に、本発明のバイオセンサ１９０を用いて試料をCK-MBシステムで測定した。CK-MBの特異性は１０００ng/mlCK-MBとCK-BBとに関してCK-MBを除去した血漿（固相吸収）に加えることによって決定した。CK-MMの交差反応は０．１％より小さかった。標準試料は既知の大量の組み替えCK-MB（Genzyme）を加えることにより調製した。
Ｃ．  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体についてはJ.LandensonらClinical Chemistry, vo132, pp.657-63(1986)に記載されている。捕捉抗体は０．１マイクロモラー濃度（PBSA緩衝液で希釈）で室温で２時間インキュベートして導波管の表面にコートした。インキュベーション後、各導波管をPBSAで一度洗浄し、１mlのコート後溶液（０．５％ウシ血漿アルブミン（BSA）/０．１％トレハロース/PBSA）を加えて室温で１時間インキュベートした。コート後溶液を捨て、導波管を真空デシケータ中で一時間乾燥させた。
Ｅ．特異的パフォーマンス
本発明にアコーディングする装置とCK-MBアッセイ用のABBOTT STAT IMxとの相関関係を図２１、２２に図示した。この結果、相関関係０．９８で比較できる二つ一組の値、５０ng/ml以下の高い割合のサンプルを含む試料分布と、臨床の試験所の環境で臨床上の評価に決定的なポイントとなる確立された範囲とが示された。図２１では本発明(ｙ軸ngCK-MB/ml)について得られた値をｘ軸ABBOTT STAT IMMx（mg CK-MB/ml）に対してプロットした。図２２では図２１のデータを両対数で示した（同様に本発明の値をｙ軸、ABBOTT STAT IMMxの値をｘ軸とした）。
実施例１０
システムの利用法をさらに確立するために、先の実施例について続けた。既知の干渉物質（例えばヘモグロビンやビリルビン）についてもより広く研究に組み込むするために、免疫蛍光測定法を干渉することで知られているヘモグロビン（濃度１５mg/ml）およびビリルビン（濃度１mg/ml）を加えて既知のCK-MB濃度（２０ng/mlCK-MB、ヒト血漿に溶解）を分析した。このシステムでは１００％のCK-MBを検出することができた。記述および図示した実施例の特徴は例を上げて説明する目的のために意図したものであり、限定的あるいは制限的に解釈されるべきではない。次のクレームで定義した本発明の意図や範囲から離れずに、ここで説明した実施例については当業者が様々な応用および変形を行うことが可能であることは言うまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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