(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてウルソデオキシコール酸、またはその薬剤学的に許容される塩、またはエステルを含む、環境ホルモン毒性の低減または除去用製剤。
【請求項２】
環境ホルモンが、ポリ塩素化ベンゼン化合物およびダイオキシンからなる群から選ばれるハロゲン化芳香族炭化水素、またはＤＤＴ、フタレート、アルキルフェノールおよびビスフェノールＡからなる群から選ばれる内分泌撹乱物質である、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
環境ホルモンが、ダイオキシンまたはビスフェノールＡである、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
体重減少、成長抑制、血糖調節能低下、免疫機能低下または生殖機能低下の予防または治療のための請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項５】
さらに薬剤学的に許容される担体を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項６】
経口投与用または注射用製剤である、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
注射用製剤が筋肉または静脈注射用製剤である、請求項６記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、無害化処理剤としてウルソデオキシコール酸(３α,７β−ジヒドロキシ−５β−コール酸；以下、'ＵＤＣＡ'と称する)、またはその薬剤学的に許容される塩またはエステルを含む環境ホルモン毒性の低減または除去用製剤に関する。
【０００２】
背景技術
ＵＤＣＡ(分子量：３９２.５８；分子式：Ｃ２４Ｈ４０Ｏ４)は、生体内において多様な薬理活性を持っている。例えば、毛細胆管を清掃し、毛細胆管内の老廃物と毒性胆汁酸を排出させ、肝細胞膜の安定化と肝細胞を保護する作用がある。また、肝血流量を増加させ、コレステロールの吸収と生合成の抑制し、胆石を溶解してその生成を抑制し、免疫活性を正常化する薬理活性をもっている。従って、現在は胆石症、膽道系疾患、慢性肝炎疾患、肝不全、小腸切除術後の消化不良、脂肪肝などの疾患の臨床治療のために用いられている。ＵＤＣＡは動物の膽汁成分中の一つであるが、人の膽汁には極めて少量存在する。代わりに、ＵＤＣＡの立体異性体であるＣＤＣＡ(ケノデオキシコール酸)が主にグリシンまたはタウリンと共に抱合した形態で人の胆汁に存在する。
【０００３】
環境ホルモンは内分泌系の正常な機能を妨害する化学物質である。これらホルモンは、環境中に排出され体内に吸収されて生体内で、まるでホルモンのように作用するので、しばしば内分泌撹乱化学物質として呼ばれている。環境ホルモンと称される物質は、現在世界自然保護基金(ＷＷＦ、World Wildlife Fund)目録に６７種の化学物質が登録されており、日本の厚生省には産業用化学物質、医薬品、食品添加物などの１４２種の物質が登録されている実情である。ＷＷＦで分類された内分泌撹乱化学物質は、ダイオキシン類が含まれる有機塩素物質６種、ＤＤＴが含まれる農薬類４４種、ブチルベンジルフタレートが含まれたフタレート類８種、カドミウムを含む重金属３種、ビスフェノールＡおよびベンゾピレンに分類される。
【０００４】
このような環境ホルモンは、例えば、生物の女性化だけでなく男性化、行動の妨害、発癌促進など生体に多様な影響を及ぼしている。最近、多数の研究者らによって野生生態系に重大な影響を及ぼし、人にも同様の影響を及ぼしていることが明らかにされた。このような内分泌撹乱化学物質の大部分はそれらのエストロゲン類似活性のために生体内で極めて微量でも毒性が現れるので、環境中の外因性エストロゲンとして呼ばれている。
【０００５】
韓国を含む世界各国で環境ホルモンの多様な種類がプラスチック、アルミニウム缶の内部コーティング物質、インスタントラーメンの容器、洗剤の分解物、焼却炉の排気ガス、農薬などから広範囲に検出されている。これらの環境中への排気量は極微量であるが、環境中での高脂溶性および高持続性のために媒体間の移動および食物連鎖を通じて生物学的濃縮を起こしていることが明らかになっており、生態系に深刻な副作用を惹き起こしている。
【０００６】
内分泌撹乱化学物質の中で、ＤＤＴとビスフェノールＡは生体内でエストロゲン様活性を有する代表的な物質である。ビスフェノールＡはプラスチック製造過程での主成分として用いられるポリ塩化ビニールの可溶化剤として使用され、また、家庭で広範囲に使用するプラスチック製品に大量に含まれているので、人と接触する危険が特に高い。ＤＤＴとビスフェノールＡは、子宮肥大のような女性生殖器に影響を及ぼす物質として知られている。このような女性生殖器の肥大化は動物試験で子宮重量の増加を誘導する。それらの分子生物学的メカニズムは、これら物質がエストロゲン受容体と結合してエストロゲン様活性を有することによるものと知られている。従って、ＤＤＴとビスフェノールＡは卵巣を結紮した試験動物の子宮の重量と形態でエストロゲンと同じ効果を示す。特に、環境ホルモンの中で、最も注目すべきポリ塩素化ベンゼン化合物類およびダイオキシン系のハロゲン化芳香族炭化水素化合物は、一般的な反応メカニズムによって類似の毒性を示すものとして知られている。
【０００７】
ポリ塩素化ジベンゾダイオキシンとポリ塩素化ジベンゾフランを含むハロゲン化芳香族炭化水素類は、化石燃料の燃焼、医療ゴミの焼却、または製紙の漂白工程から排出される最も代表的な環境汚染物質である。化学名が２,３,７,８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであるダイオキシンは、一般的な反応メカニズムによって毒性を発揮するポリ塩素化芳香族炭化水素類で最も強力な毒性を持つ化合物である。人は一般的に食物、飲料水、土壌、ホコリ、煙または空気に組み込まれているこの種の化合物にさらされる。特に、このような物質の生産、利用および廃棄に従事する労働者らは持続的または間歇的に比較的高濃度のポリハロゲン化芳香族炭化水素類にさらされる危険性が高く、健康上の大きな脅威となっている。生計または趣味でつりをする釣り人はこれらの物質が魚類に生物濃縮するので経口的に危険にさらされる可能性がある。焼却場周辺の農夫らもまた経口的に危険にさらされる可能性がある。また、産業事故と産業廃棄物の不適切な廃棄によって高濃度で放出される。焼却場で燃焼時に放出される灰に含まれている揮発性のダイオキシンは肺内吸収の対象となっている。ダイオキシンは極めて低い濃度で土壌、空気と堆積物に存在しているが、これらの持続的な安定性と脂溶性ために食物連鎖を通じて生物学的に濃縮されることがある。一般に、人は食材を通じてダイオキシンにさらされている。食材を通じて人がさらされるダイオキシンの濃度は、約０.１〜０.３pg／ｋg／日と推定されている。
【０００８】
ダイオキシンとその関連物質などの脂溶性は母乳での濃縮と授乳期の乳房で脂肪組織からの排出を促進する。従って、母乳育ちの新生児は正常濃度の約１０〜２０倍以上高濃度のダイオキシンに毎日曝露されている。ダイオキシンに対する防御および解毒物質に対する従来の研究によると、ダイオキシンは芳香族炭化水素受容体と結合して免疫抑制、内分泌障害、発癌および虚血性心疾患を惹き起こすことが明らかにされている。
【０００９】
Casper R.F.らが報告しているように(Mol. Phar. Macol. 1999 Oct.; 56(4): 784-790)、赤ワインから抽出されたレスベラトロール(Resveratrol)は、ダイオキシン物質が結合する芳香族炭化水素受容体に結合することによって、これらが現わす毒性を予防する効果があると報告された。現在までの研究で明らかにされたように、レスベラトロールは好適な薬効を有し、さらに毒性のない物質であるため、今後多くの臨床試験を経てダイオキシンの毒性を予防する医薬品として開発されることになるだろう。しかし、この物質は体内に既に吸収されたダイオキシンに対する競合的阻害活性はあるが、ダイオキシン自体の継続的な吸収抑制や排出促進はできない。従って、既に吸収されたダイオキシンは組織中、特に、肝臓や脂肪組織に蓄積されており、従ってダイオキシンの毒性を完全に抑制することはできない。
【００１０】
また、ダイオキシンの吸着排泄活性の可能性がある物質として知られているオレストラ(olestra)(Lancet, 1999, Oct. 9; 354(9186)：1266-1267)は、蔗糖(sucrose)に多くの脂肪酸が結合しており膵酵素によって分解できないポリ脂肪酸エステル物質である。この物質はダイオキシンに強く吸着する作用を持っているため、胃腸循環を経て再吸収されるダイオキシンを效果的に排出し、再吸収自体を妨害する作用によって、臨床的な効用が高い物質である。しかし、オレストラはビタミンＡ,Ｄ,Ｅ,Ｋおよびカロテノイド類などの脂溶性ビタミンに対して吸着活性を持っているので、これらの必須ビタミンの吸収を妨げるという欠点がある。
【００１１】
さらに、活性炭をダイオキシンの吸着剤として用いてもよいが、オレストラと同様に、吸着作用の選択性が低いので商品化に困難な問題を持っている。
【００１２】
エストロゲンまたはこれと類似活性を持つ物質に対する抑制剤として知られたタモキシフェン(tamoxifen)とファスロデックス(Faslodex, ICI 182, 780, AstraZeneca)は、乳癌の治療剤として開発され、現在、臨床試験が行なわれている。これらは、ダイオキシンの解毒のために臨床的に応用できる可能性がある。しかし、現在、乳癌治療剤として使用されているタモキシフェンは、却って子宮肥大活性のような副作用を持っているため、人における環境ホルモンの危険性を除去するための目的として用いることには制限がある。今までの研究の結果から見て、ファスロデックスは乳癌治療剤としてタモキシフェンの副作用を改善した優れた臨床作用を持っているが、その効能は抗癌効果に制限され、事実上、その抗エストロゲン活性はエストロゲン受容体に対する競合的阻害効果のみに制限される。従って、体内でエストロゲンとエストロゲン活性を持つ類似物質の負荷を除去する作用を持っているＵＤＣＡとはっきりと区別できる。
【００１３】
発明の開示
本発明者らは、ＵＤＣＡを使用する場合、膽汁の流量を増加させ、毒性物質を容易に排泄できることを見出し、本発明の完成に至った。従って、本発明の目的は、環境ホルモンによって惹き起こされる可能性のある体重減少、成長抑制、血糖調節能の低下、癌、免疫調節機能の低下、生殖毒性および免疫毒性などを予防または改善するための製剤を提供することである。
【００１４】
本発明は、有効性分としてＵＤＣＡ、または薬剤学的に許容されるその塩またはエステルを含む環境ホルモン毒性の低減および除去用製剤に関するものである。
【００１５】
ＵＤＣＡは膽汁流量を増加させ、毒性物質の排泄を容易にする。また、他の臓器より肝臓に蓄積されやすいダイオキシンを效果的に除去して正常肝細胞を保護すると同時に、必須の脂溶性物質の吸収を阻害しないので、なんら副作用なく非常に効果的に解毒することができる。
【００１６】
本発明によると、ＵＤＣＡまたはその同属体(equivalent)を使用することによって、種々の環境ホルモンへの曝露によって生じる毒性を改善または除去することができる。本発明ではＵＤＣＡの同属体は、当分野でＵＤＣＡと同等の薬理学的作用を持つものとして知られたその薬剤学的に許容される塩またはエステルを含む。この代表的な例は、ＵＤＣＡのナトリウム塩とＵＤＣＡのタウリン抱合体である。
【００１７】
本発明でいう「環境ホルモン」とは、ＰＣＢ類とダイオキシン化合物のハロゲン化芳香族炭化水素類、および、ＤＤＴ、フタレート類化合物(phthalates)、アルキルフェノール、ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質を含む。
【００１８】
本発明によると、ダイオキシンに人為的に曝露された試験動物にＵＤＣＡを投与することによって、ダイオキシンにより生成する多種の毒性症状、例えば、死亡、体重減少、成長抑制、血糖調節能の喪失、睾丸重量などを抑制または正常化することができることを立証した。また、ＵＤＣＡを使用することによって、エストロゲン様活性を持つ物質に対する子宮肥大作用を效果的に抑制できることを明らかにした。これにより、ＵＤＣＡが生体内で抗エストロゲン効果を持っていることが確認された。
【００１９】
本発明では、薬理学的有効量のＵＤＣＡを投与したマウス(mice)にＴＣＤＤを皮下注射して所定時間後に生じる死亡率の変化、血液検査、器官摘出および免疫染色法の測定によってＴＣＤＤに対する解毒効果を立証し、体内での吸収を阻害して、腸肝循環によって持続的に現れるＴＣＤＤ毒性を遮断し、除去することが知られている活性炭と比較してその効果を立証した。
【００２０】
本発明によると、ＵＤＣＡはＤＤＴ、フタレート類、アルキルフェノール、ビスフェノールＡなどのように高脂溶性物質として持続的な蓄積によって生体内で毒性を発現する物質を膽汁内で可溶化させて効果的に排出し、無毒化する。ＵＤＣＡはこれら物質による生体内作用を最小限にすることができる。
【００２１】
本発明でハロゲン化芳香族炭化水素の代表的な物質であるＴＣＤＤ、およびビスフェノールＡを使用して実験を行ったが、環境ホルモンは同様の作用メカニズムによって類似の毒性を惹き起こすことが知られているから、本発明の範囲はこれら特定物質に限定されるものではない。従って、ＵＤＣＡを用いるその臨床的応用は他の環境ホルモン毒性の解毒、および抑制および予防にも有効である。従って、本発明によると、環境ホルモンの毒性はその種類や量に関係なく効果的に予防または治療することができる。
【００２２】
本発明の製剤は、当分野で通常用いられる薬剤学的に許容され得る担体を含み、また、薬剤学的に許容され得る担体と混合して錠剤、散剤、粒剤、液剤、シロップ剤、カプセル剤などに製造できる。さらに、これらの製剤は筋肉または静脈注射によって投与できるように注射剤に製造することもできる。ＵＤＣＡは薬剤学的に投与可能なあらゆる投与手段によって投与することができる。
【００２３】
本発明によると、ＵＤＣＡを環境ホルモンによる毒性を抑制する効果的な量、好ましくは、１０mg〜２０００mgの量を一日に数回に分けて投与する。
【００２４】
本発明の実施するための最良の形態
本発明は、下記の実施例からさらによく理解できるが、当業者は記載された具体的な物質および結果は単に例示を目的とするものであって、下記に添付する請求範囲でより十分記載された発明を制限する意図もなく制限されるべきでもないことは容易に理解できるであろう。
【００２５】
実施例１：ダイオキシンに対するＵＤＣＡの解毒効果
１.試験動物
この実施例で使用された試験動物は、ＣＲＪ(Charles River in Japan)で飼育された平均体重１８〜２２gを有する５週齢の雄性Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ系マウスを購入して、一定の温度２４±１℃、湿度６０±１０％、明暗周期１２時間の飼育環境条件下で１週間馴化させた後、実験に用いた。
【００２６】
試験動物にはピューリナ粉末飼料(Hae Eun Trade. Coから購入)を与え、水は自由に摂取させた。全試験動物の体重を試験期間中、週に２回ずつ測定した。
【００２７】
２.試験物質の調剤および投与
Chem. Services Inc.(米国)製造のトルエンに溶解されている２,３,７,８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン(ＴＣＤＤ)(ガスクロマトグラフィー分析結果、純度９５％以上)を、窒素で揮発させて粉末を得た。アセトンとトウモロコシ油を１：６の容積比で混合した混合溶媒に前記粉末を溶かして、ＴＣＤＤ  １１０μg/kg、２７.５μg/kgおよび６.９μg/kgの投与量でマウスの１体重当たり５mLの容積でマウスに皮下注射した。試験物質として用いたＵＤＣＡは０.５、０.２５、０.１２５重量％となるようにそれぞれ粉末飼料に混入し、ＴＣＤＤ投与１０日前(前−投与)からＴＣＤＤ投与後(後−投与)にも６０日間飼料に混入させて与えた。
【００２８】
３.検体採取および検査
６０日間の試験終了後、２４時間試験動物を絶食させた後、エーテルで麻酔した。腹部を切開して腹部大静脈から血液を採取した後、放血致死させ、肝臓、腎臓、精巣および副睾丸を摘出し、摘出した全臓器の重量を測定した。精巣のみを別に保管し、光学顕微鏡検査と電子顕微鏡検査を行なった。血液は血液生化学検査のために遠心分離機で血清を分離した後、自動血液生化学分析器であるDimension(Dupont、米国)を利用して分析した。血球分析は別途の採血瓶に血液を分注した後、自動血球分析器であるCelldyn(Abbott、米国)を利用して分析した。
【００２９】
４.精巣の光学顕微鏡的検査
摘出した精巣は１０％中性ホルマリン緩衝液に２４時間固定した後、流水で洗浄した。その後、エタノールで脱水し、キシレンで透明にした後、パラフィンで包埋した後、ミクロトーム(microm HM 440E)で厚さ２〜３μmの切片を調製した後、ヘマトキシリン(Hematoxylin)とエオシン(Eosin)で二重染色して光学顕微鏡で観察した。
【００３０】
５.精巣の電子顕微鏡的検査
摘出した精巣はpＨ７.３に調整したリン酸緩衝液を用いて調製した前固定液(２.５％  グルタルアルデヒド)に浸し、１mm3の大きさに細切した。前固定液で４℃、４時間前固定した後、同じ緩衝液で水洗した。次いで、１％四酸化オスミウム(osmium tetroxide, pＨ７.３)で２時間固定した後、同じ緩衝液で水洗した後、エタノールで脱水し、酸化プロピレンで置換して、epon混合液に包埋した。包埋された組織は超ミクロトーム(Reicher-Jung, Ultracut E)を使用して厚さ60〜70nmの超薄切片を調製した後、酢酸ウラニル(uranyl acetate)とクエン酸鉛(lead citrate)で二重染色して透過型電子顕微鏡(H-600, Hitachi, 日本)で観察した。
【００３１】
６.ジョンセンスコアー(Johnsen's score)の測定
精子形成の程度を測定するための方法として、ジョンセンスコアー測定を行い、精子形成の成熟の程度に従って配列された主細胞の存在または不存在に基づいて１０から１まで測定した。精巣組織のジョンセンスコアーの基準は次の通りである。
【００３２】
１０：多数の精子、一定の厚さの胚上皮細胞組織、および開口した細胞内腔を有する完全な精子形成状態、
９：多数の精子はあるが、胚上皮細胞の基底膜からの顕著な分離および胚上皮細胞の崩壊、または胚上皮細胞の細胞内腔の喪失
８：断面内に５〜１０個未満の精子の存在
７：精子不存在の多数の精子細胞
６：精子不存在の５〜１０個未満の精子細胞
５：精子および精子細胞不存在、数個または多数の精母細胞
４：精子および精子細胞不存在、５個未満の精母細胞
３：生殖細胞として精原細胞のみが存在
２：生殖細胞がなく、セルトリ細胞のみ存在
１：細精管断面に細胞無し
【００３３】
７.統計処理
試験結果は平均±標準偏差値として表わした。急性毒性試験での体重変化、飼料および水の摂取量、生化学的検査および臓器重量に対する統計学的な分析は、等分散の時には一元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)検定を実施した。一元配置分散分析検定で有意性が認められた場合、ｐ＜０.０５およびｐ＜０.０１水準でｔ−検定を実施した。
【００３４】
８.試験結果
(１)死亡動物と死亡時間に及ぼす影響
表１
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの致死率に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000002
【００３５】
−  ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡの曝露に関係なく死亡動物はなかった。
−  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡに曝露しなかった群で３０％の致死率を表し、死亡時間は５５±５日で、ほぼ試験終了期に試験動物が死亡した。それに対して、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％を曝露させた群では、投与量に関係なく動物の死亡はなかった。
−  ＴＣＤＤ  １１０μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群は全動物が３５±７日に死亡した。ＵＤＣＡ  ０.１２５重量％に曝露した群は、全動物が３３±４日に死亡した。ＵＤＣＡ  ０.２５重量％に曝露した群は、９０％の動物が３４±５日に死亡した。ＵＤＣＡ  ０.５重量％に曝露した群は、４０％の動物が５１±８日に死亡した。これと対照的に活性炭  ０.５重量％に曝露した群では、７０％の動物が３５±６日に死亡した。
【００３６】
(２)体重変化に及ぼす変化
表２.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、体重変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000003
0003883506.tif 000004
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
#；ｐ＜０.０５でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
−；全試験動物の死亡
【００３７】
−ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群と溶媒対照群の間では統計的に有意な差はなかったが、体重はＴＣＤＤの投与後５９日目で顕著に減少した。それに対して、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群ではこのような統計的に有意な体重減少が抑制された。
−ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群は、ＴＣＤＤ投与後１２日目から溶媒対照群と比べて体重が有意的に持続的に減少した。しかし、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群では、このような統計的に有意な体重減少が抑制されて溶媒対照群のように殆ど同じ水準で体重が維持された。
−ＴＣＤＤ  １１０μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群は、ＴＣＤＤ投与後１２日目から溶媒対照群と比べて体重が有意に持続的に減少した。さらに、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群は、ＵＤＣＡ曝露のない群と同じく体重が持続的に減少した。
【００３８】
(３)飼料および水の摂取量
表３.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、飼料消費量に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000005
0003883506.tif 000006
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
−；全試験動物の死亡
【００３９】
前記表３に示すように、飼料摂取量はＴＣＤＤの曝露濃度が増加するにつれて顕著に減少した。
−ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡに曝露した群と曝露のない群の間では統計的に有意な差は観測されなかった。
−ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群：ＴＣＤＤ投与後３０日目から、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群とＵＤＣＡ曝露のない群の間では、統計的に有意な差が観測された。すなわち、ＴＣＤＤ投与によって飼料摂取量の減少が抑制された。
−ＴＣＤＤ  １１０μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群と曝露のある群の間では、飼料摂取量は統計的に有意な差は示さなかった。
【００４０】
表４.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、水分摂取量に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000007
0003883506.tif 000008
*；ｐ＜０.５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
−；全試験動物の死亡
【００４１】
表４に示すように、水摂取量はＴＣＤＤの曝露濃度が増加するにつれて顕著に減した。
−ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群と曝露のある群の間では、統計的に有意な差が観測されなかった。
−ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群；ＴＣＤＤ投与後３０日目から、ＵＤＣＡを  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群とＵＤＣＡ曝露のない群の間では、統計的に有意な差が観測された。すなわち、ＴＣＤＤ投与によって水摂取量の減少が抑制された。
−ＴＣＤＤ  １１０μg/kgの投与量群；ＵＤＣＡ曝露のない群と曝露のある群の間では、飼料摂取量は統計的に有意な差を示さなかった。
【００４２】
(４)生化学的検査
血液生化学的検査は血糖(ＧＬＵ)、ＧＯＴ、ＧＰＴ、トリグリセリド(ＴＧ)、高密度脂質蛋白(ＨＤＬ−Ｃ)、低密度脂質蛋白(ＬＤＬ−Ｃ)およびアルカリ・ホスファタ−ゼ(ＡＬＰ)の濃度を測定し、その結果を下記に示した。
【００４３】
表５.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの血液生化学的変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000009
*；ｐ＜０.０５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
#；ｐ＜０.０５でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００４４】
ＧＬＵはＴＣＤＤの投与量に比例して統計的に有意に減少した。それぞれのＴＣＤＤの投与量で、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した場合、血糖減少に対する顕著な抑制効果が現われた。ＧＯＴはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意に増加し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した場合、このような増加が顕著に抑制された。しかし、ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群は溶媒対照群と比べて有意に増加しなかった。ＧＰＴはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意に増加し、ＵＤＣＡ  ０.２５および０.５重量％の曝露によってこのような増加が顕著に抑制された。ＨＤＬ−ＣはＴＣＤＤの投与量に比例して有意に減少し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した場合、このような減少は顕著に抑制された。ＬＤＬ−ＣはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意に減少しなかったが、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％に曝露した群と有意な差を示す結果となった。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群は、溶媒対照群と比べて有意に減少し、ＵＤＣＡ  ０.１２５重量％の曝露によって有意な差を示す結果となった。ＴＧおよびＡＬＰは統計的に有意な変化がなかった。
【００４５】
(５)血液学的検査
血液学的検査は白血球数(ＷＢＣ)、好中球数(ＮＥＵ)、リンパ球数(ＬＹＭ)、単核球数(ＭＯＮＯ)、好酸球数(ＥＯＳ)、好塩基球数(ＢＡＳＯ)、赤血球数(ＲＢＣ)、ヘモグロビン濃度(ＨＧＢ)、ヘマトクリット値(ＨＣＴ)、平均赤血球容積率(ＭＣＶ)、平均赤血球ヘモグロビン量(ＭＣＨ)、平均赤血球ヘモグロビン濃度(ＭＣＨＣ)、赤血球分布幅(ＲＤＷ)および血小板値(ＰＬＴ)を測定し、その結果を下記に示す。
【００４６】
表６.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの血液学的変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000010
0003883506.tif 000011
*；ｐ＜０.０５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００４７】
ＷＢＣ、ＭＯＮＯ、ＥＯＳ、ＢＡＳＯ、ＲＢＣおよびＲＤＷには、ＴＣＤＤ投与による有意な変化がなかった。ＮＥＵはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な増加を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によってその増加に対する顕著な抑制効果を示した。ＬＹＭはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な減少を示し、ＵＤＣＡ  ０.２５および０.５重量％の曝露によってその減少に対する顕著な抑制効果を示した。ＨＧＢはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な減少を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によってその減少に対する顕著な抑制効果を示した。ＨＣＴはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な減少を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によりその減少に対する顕著な抑制効果を示した。ＭＣＶはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な減少を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によってその減少に対する顕著な抑制効果を示した。ＭＣＨはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な減少を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によってその減少に対する顕著な抑制効果を示した。ＭＣＨＣは溶媒対照群と比べて統計的に有意な増加を示し、ＵＤＣＡの曝露によってその増加に対する抑制効果が現われなかった。ＰＬＴはＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な増加を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によってその増加に対する顕著な抑制効果を示した。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群は溶媒対照群と比べて有意な変化効果を示さなかった。
【００４８】
(６)臓器重量測定
臓器重量測定検査は肝臓、腎臓、精巣および副精巣を測定し、その結果は下記の通りである。
【００４９】
表７.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、体重、肝臓重量および比体重変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000012
*；ｐ＜０.０５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００５０】
肝臓はＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて統計的に有意な重量減少と比体重増加を示し、ＵＤＣＡ  ０.１２５、０.２５および０.５重量％の曝露によって重量減少に対する顕著な抑制効果を示し、比体重に対する増加は示さなかった。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群では、比体重のみが溶媒対照群と比べて有意な増加を示し、ＵＤＣＡ曝露による抑制効果は現われなかった。
【００５１】
表８.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの腎臓比体重および体重変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000013
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００５２】
腎臓はＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて有意な重量減少および比体重増加を示した。このような変化はＵＤＣＡ曝露によって抑制された。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群では溶媒対照群と比べて有意な変化は現われなかった。
【００５３】
表９.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの精巣体重および比体重変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000014
*；ｐ＜０.０５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
#；ｐ＜０.０５でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００５４】
ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて精巣の重量が有意に減少し、その比重量も有意に増加した。ＵＤＣＡ曝露によるこのような現状の抑制効果がＵＤＣＡの各濃度によって相違に現われた。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kg投与量群では、体重のみが対照群と比べて有意な減少を示した。このような減少はＵＤＣＡ  ０.１２５および０.５重量％曝露によって抑制された。
【００５５】
表１０.
ＴＣＤＤの単一回皮下注射後、マウスの副精巣体重および比体重に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000015
*；ｐ＜０.０５で溶媒対照群と有意な差
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
#；ｐ＜０.０５でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００５６】
副精巣はＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの投与量群で、溶媒対照群と比べて有意な重量減少および比体重増加を示し、ＵＤＣＡ曝露によるこのような現状の抑制効果がＵＤＣＡの各濃度によって相違に現われた。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgの投与量群では左部重量のみが対照群と比べて有意な減少を示した。このような減少はＵＤＣＡ曝露によって抑制された。比体重においてはＴＣＤＤ単独群と比べて有意な比体重増加を示した。
【００５７】
(７)光学顕微鏡上の病理組織学的所見
ＴＣＤＤを単独投与した群で、精原細胞(spermatogonia)を含む大部分の生殖細胞で分化の減少を示し、生殖上皮細胞の溶解度に起因する基底膜付近の精原細胞の脱落と、これによる隣接細胞の間の間隔の拡張が観察され、基底区画と内腔部(インナ−スペ−ス隣接区画)間の間隔が拡張される所見を示し、精母細胞と精子細胞の発育停止状態が観察された。一部の群では壊死性病巣部位とセルトリ細胞のみが存在する細精管が観察された。従って、ＴＣＤＤは非常に激しい変化の原因となることを示した。しかし、ＵＤＣＡに曝露した群では溶媒対照群と類似な形態の細精管の維持が見られ、一部個体では精子形成の程度が逆に増加する所見を示した。(図１、２、３参照)。
【００５８】
(８)電子顕微鏡上の細胞微細構造の変化
ＴＣＤＤ単独投与群ではライディッヒ細胞の細胞質内空胞の形成、ミトコンドリアの膨脹および変性、滑面小胞体の減少と変形が観察された。ファゴリソソ−ムと脂肪顆粒の増加、そして核濃縮の現状が観察された。細精管では基底膜と生殖細胞間が分離する特徴的な所見があり、生殖細胞核の不規則な形態とクロマチンの凝縮が観察された。また、細胞質内の小器官の破壊と消失が観察された。しかし、ＵＤＣＡを投与した群は大部分の個体で溶媒対照群と類似の細胞形態と微細構造を保持し、一部の個体では細胞の微細構造が非常によく発達していることが観察された(図４〜１０参照)。
【００５９】
(９)組織病理学的所見の定量化のためのJohnsen's scoreの結果
表１１.
精巣組織のJohnsen's score
0003883506.tif 000016
**；ｐ＜０.０１で溶媒対照群と有意な差
##；ｐ＜０.０１でＴＣＤＤ単独投与群と有意な差
【００６０】
前記表１１に示すように、ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgと２７.５μg/kgを単独投与した各群で、溶媒対照群と統計的に有意な差(ｐ＜０.０１)を示した。ＴＣＤＤ  ６.９μg/kgを単独投与した群とＵＤＣＡをそれぞれ０.１２５、０.２５、０.５重量％濃度でＴＣＤＤと併用曝露させた群の間でもいずれも統計的に有意な差(ｐ＜０.０１)を示し、ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgを単独投与した群とＵＤＣＡをそれぞれ０.１２５、０.２５、０.５％濃度でＴＣＤＤと併用曝露させた群の間でもやはり統計的に有意な差(ｐ＜０.０１)を示した。ＴＣＤＤ毒性にＵＤＣＡによる防御効果が観察された。また、このような効果はＴＣＤＤ  ６.９μg/kg群と２７.５μg/kg群の全てで容量依存的に増加した。
【００６１】
実施例２：ビスフェノ−ルＡの子宮増殖に及ぼす影響
１.試験動物と投与計画
卵巣切除された雌性Ｂ６Ｃ３Ｆ１系マウスは、ＣＲＪから飼育された５週齢で平均体重１８〜２２gを購入して一定の温度２４±１℃、湿度６０±１０％、明暗周期１２時間の一定の飼育環境条件下で一週間馴化させた後、試験に用いた。試験動物にはピュ−リナ固形飼料を与え、水は自由に摂取させた。馴化させた後、試験物質はトウモロコシ油に溶解し、一日に一回ずつ、４日間皮下注射した。この時、用いられた試験物質であるビスフェノ−ルＡとＵＤＣＡの濃縮原液はエタノ−ルを用いて調製し使用した。ビスフェノ−ルＡは、一日に一回ずつ、２mg容量を０.２mLのトウモロコシ油に溶解して単独あるいはＵＤＣＡと同時投与した。ＵＤＣＡの投与量は０.２あるいは２.０mgであり、トウモロコシ油は溶媒対照群に投与した。
【００６２】
２.子宮重量の測定
試験動物の臨床的な毒性発現の観察は一日に一回ずつ行い、試験終了日に子宮を摘出して重量を測定した。
【００６３】
３.統計分析
結果は平均±標準偏差で表わした。投与群の平均分散を評価するために一元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)を行なった。一元配置分散分析検定で有意性が認められた場合にはｐ＜０.０５、ｐ＜０.０１水準でｔ−検定を実施した。
【００６４】
４.結果
表１２.
ビスフェノ−ルＡの子宮重量変化に及ぼすＵＤＣＡの効果
0003883506.tif 000017
**；ｐ＜０.０１で対照群(トウモロコシ油)投与と有意な差
##；ｐ＜０.０１でビスフェノ−ルＡ  ２mg／日投与群と有意な差
【００６５】
表１２に示すように、一日一回ずつ、２mgのビスフェノ−ルＡの投与によって約２倍の子宮重量が増加し、ＵＤＣＡ  ０.２mgの同時投与によっては統計的に有意な変化はなかったが、２.０mgの同時投与によってはビスフェノ−ルＡ投与によって増加した子宮重量を、トウモロコシ油を投与した溶媒対照群水準に減少させた。
【００６６】
結論的に外因性エストロゲンであるビスフェノ−ルＡは、エストロゲンと同様の生理活性を示し、その代表的な例として子宮増殖を誘発し、子宮重量の増加を示した。ＵＤＣＡはその効果に拮抗する作用を示した。
【００６７】
製剤例１：顆粒剤
ＵＤＣＡ                                  １０重量％
ラクト−ス                                ６５重量％
澱粉                                      １９重量％
ヒドロキシプロピルセルロ−ス                ５重量％
ステアリン酸マグネシウム                    １重量％
【００６８】
前記成分を混合して全体混合物の約３０重量％に該当するエタノ−ルを結合剤として使用して練り合わせた後、常法により顆粒化し、乾燥した顆粒を１gずつパックに入れ、乾燥したＵＤＣＡ  １００mgを含有する顆粒剤を製造した。
【００６９】
製造例２：錠剤
前記製剤例１で製造された顆粒を１錠当たり５００mgずつ圧縮成形し、ＵＤＣＡ  ５０mgを含有する錠剤を常法により製造した。
【００７０】
製剤例３：シロップ剤
ＵＤＣＡ                                  ０.６重量％
スクロ−ス                              ５０重量％
カルボキシメチルセルロ−スナトリウム      ０.０５重量％
メチルパラベン                            ０.０８重量％
香料                                      ０.１重量％
精製水                                    適量
【００７１】
４９.１７重量部の精製水にカルボキシメチルセルロ−スナトリウムを加えて膨潤させた。得られた混合物にスクロ−スおよびメチルパラベンを加えて加温溶解させた。得られた溶液にＵＤＣＡを加えて攪拌し、均質な溶液にした後、香料を加えて混合する。得られた溶液を最終容量１００mLとし、濾過した。濾液を３３mLずつ、瓶に充填して滅菌し、１瓶当たりＵＤＣＡ  ２００mgを含有するシロップ剤を製造した。
【００７２】
製剤例４：注射剤
ＵＤＣＡ                                    ２重量％
エチルアルコ−ル                            ２重量％
ポリエチレングリコ−ル                      ０.５重量％
塩化ナトリウム                              適量
【００７３】
前記成分を、２M水酸化ナトリウム溶液を加えてpＨ６.５に調節した後、注射用蒸留水を加えて総量１００mLとした。
【００７４】
産業上の利用可能性
本発明により、ＵＤＣＡは環境ホルモンによって誘発される毒性効果を抑制する優れた効果を有し、体重減少、成長抑制、低血糖、免疫機能低下、生殖毒性および免疫毒性など環境ホルモン曝露によって誘発され得るあらゆる健康危害を予防または治療する効果を有する。
【００７５】
また、ＵＤＣＡは人体でエストロゲン様活性を示す内分泌撹乱化学物質に拮抗する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  溶媒投与対照群の細精管を光学顕微鏡で観察した写真である(×２００)。
【図２】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの単独投与群の光学顕微鏡写真である(×２００)。図に示すように、非常に減少した精子形成が観察された。細胞質の崩壊のために、大部分の細胞の形状が不明瞭である。基底部の生殖内皮細胞はかなり融解し、精巣の細精管で基底部からの精原細胞の脱落が見られ、基底部と内腔部との間隔もかなり大きい。細精管内の正常な精子派生段階はほとんど観察されず、生殖細胞がほとんど無くセルトリ細胞のみが存在する細精管が観察される。
【図３】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgとＵＤＣＡ０.５重量％の併用投与群の精巣の細精管を光学顕微鏡で観察した写真である(×２００)。図に示すように、大体において正常な細精管が観察され、一部損傷した細精管と細精管中心で未成熟精子細胞が観察された。
【図４】  溶媒投与対照群のセルトリ細胞と生殖細胞を電子顕微鏡で観察した写真である(×３,０００)。セルトリ細胞と生殖細胞の間が緊密接触し、堅い結合が観察された。
【図５】  ライディッヒ細胞(Leydig's cells)と細胞小器官を電子顕微鏡で観察した写真である(×２,５００)。正常ライディッヒ細胞形状と細胞小器官がよく保持されていた。
【図６】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの単独投与群のライディッヒ細胞を観察した電子顕微鏡写真である(×４,０００)。ライディッヒ細胞の細胞質内にファゴリソソ−ムが観察された。
【図７】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの単独投与群のセルトリ細胞を観察した電子顕微鏡写真である(×４,０００)。セルトリ細胞の細胞質内に大きな脂肪滴が観察され、細胞質内空胞とファゴリソソ−ムが観察された。
【図８】  溶媒投与対照群で精子頭部を観察した電子顕微鏡写真である(×２５,０００)。正常に発達している精子頭部が観察された。
【図９】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgの単独投与群の精子頭部を観察した電子顕微鏡写真である(×１０,０００)。精子頭部がセルトリ細胞の細胞質の空胞の中で頻繁に観察された。
【図１０】  ＴＣＤＤ  ２７.５μg/kgとＵＤＣＡ  ０.５重量％の併用投与群の精子頭部を観察した電子顕微鏡写真である(×８,０００)。正常な形状の精子頭が保持されていた。
【図１】
0003883506.tif 000018
【図２】
0003883506.tif 000019
【図３】
0003883506.tif 000020
【図４】
0003883506.tif 000021
【図５】
0003883506.tif 000022
【図６】
0003883506.tif 000023
【図７】
0003883506.tif 000024
【図８】
0003883506.tif 000025
【図９】
0003883506.tif 000026
【図１０】
0003883506.tif 000027