(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から誘導され且つＤ−ソルビトールのＬ−ソルボースへの酸化を触媒するＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼであって、以下の理化学的性質：
ａ）分子量：８００，０００±５０，０００Ｄａ
ｂ）分子構造：各々７９，０００±５，０００Ｄａの分子量を有する１０個の同族（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）サブニットからなる
ｃ）基質特異性：ポリオール類に対して活性
ｄ）至適ｐＨ：６．０〜７．０
ｅ）ｐＨ安定性：７．０〜９．０
ｆ）至適温度：約２０〜４０℃
ｇ）阻害：Ｃｕ２＋及びＦｅ３＋による
を有することを特徴とする精製された形態のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
微生物がグルコノバクテル・アルビズス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５１、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）  ＩＦＯ  ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６３、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６４、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６５、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６７、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２７０、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス  ＩＦＯ  ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３１７１、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８５、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８６、グルコノバクテル・インズスツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６０、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２９２、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９３、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９４、グルコノバクテル・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１８９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  １２４６７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）  ＩＦＯ  ３９９０、グルコノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）  ＩＦＯ  ３２４４、グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１３０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３１７２、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５４、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５６、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５７、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５８、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２８９、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９１、アセトバクテル・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ）  ＩＦＯ  ３２８１、アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅａｎｓｉｓ）  ＩＦＯ  ３２５９、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ）  ＩＦＯ  ３２８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム  ＩＦＯ  １３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）  ＩＦＯ  １２３８８からなる群より選ばれる請求項１に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
細胞中でＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを生産することができるグルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、該Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを細胞から単離することを特徴とする請求項１又は２に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の存在下に、水性媒体中で好気的条件下においてＤ−ソルビトールを酸化することを特徴とするＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規なＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造法、及び該酵素を用いたケトース類、特にＬ−ソルボースの製造法に関する。
【０００２】
上記の通り、本発明により提供される新規なＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（後文ではＳＬＤＨと呼ぶ）はＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する。Ｌ−ソルボースはビタミンＣの製造における重要な中間体である。
【０００３】
Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する酵素は既知である。Ｊ．Ｔ．Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｔ．Ｅ．Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．Ｈ．Ｃｈｅｌｄｅｌｉｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，３２３−３２９，１９５７）は、アセトバクテル・スボキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）（グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）と同義）の無細胞抽出物がＤ−ソルビトール酸化の経路に関与する３つの酵素を含むことを報告した。Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒するこれらの酵素の２つが精製された。１つはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（後文ではＮＡＤＰと呼ぶ）−依存性Ｌ−ソルボースレダクターゼとして、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）ＩＦＯ  ３２９３の可溶性画分から、Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｔ．Ｈｏｓｈｉｎｏ  ａｎｄ  Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａにより単離され（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，２０４３−２０４９，１９９１）、他は膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼとして、グルコノバクテル・スボキシダンス変異株α  ＩＦＯ  ３２５４から、Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｏ．Ａｄａｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ａｍｅｙａｍａにより単離された（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３５−１４１，１９８２）。
【０００４】
しかし、本発明により提供されるＳＬＤＨは、酵素のサブユニットの構造、分子量、基質特異性及び至適ｐＨにおいて、上記の２つの酵素と明白に異なる。ＮＡＤＰ−依存性Ｌ−ソルボースレダクターゼの分子量は６０，０００であるが、本発明により提供されるＳＬＤＨの分子量は、７９，０００±５，０００の分子量を有する同族（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）サブユニットから成り、反応を触媒するためにＮＡＤＰを必要としない。他方、Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．により単離された膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼは、分子量が６３，０００、５１，０００及び１７，０００の３種のサブユニットから成り、Ｄ−ソルビトールを特異的に酸化し、及びＤ−ソルビトールの場合の５％の反応速度でＤ−マンニトールも酸化するが、Ｄ−アラビトール又はエリトリトールを酸化しなかった。さらに彼らは酵素の至適ｐＨが４．５であり、酵素活性がｐＨ５．０において安定であり、ｐＨ７．０において活性の９２％が失われることを示した。しかし、本発明のＳＬＤＨはＤ−ソルビトール及びＤ−マンニトールのみでなくＤ−アラビトール及びエリトリトールも酸化し、至適ｐＨは６．０であり、ｐＨ８．０においてさえ活性は安定である。
【０００５】
本発明の目的は、Ｄ−ソルビトールに作用してＬ−ソルボースを製造し（すなわちＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する）且つ以下の理化学的性質：
ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有する同族サブニットから成る、
ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性
ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０
を有する精製された形態の新規な酵素ＳＬＤＨを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、グルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、あるいは細胞中でＳＬＤＨを生産することができるその突然変異体を培養し、細胞を破壊し、それを破壊細胞の無細胞画分から、好ましくは微生物の膜画分から単離及び精製することにより新規な酵素ＳＬＤＨを製造する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、該酵素ＳＬＤＨを用いてＬ−ソルボースを製造する方法を提供することである。
【０００７】
後述の実施例に従って製造される新規なＳＬＤＨの精製試料の理化学的性質は以下の通りである：
１）酵素活性
本発明の新規なＳＬＤＨは、以下の反応式に従い、電子受容体の存在下におけるＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する：
Ｄ−ソルビトール＋電子受容体→Ｌ−ソルボース＋還元電子受容体
酵素は電子受容体として酸素を用いない。これは、可能な電子受容体として酸素を用いたＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの変換を酵素が触媒する活性がないことにより確認された。さらに、溶解酸素プローブにより検出すると、反応混合物において酸素の消費が検出されなかった。しかし電子受容体として作用する能力を有するいずれの従来の化合物も、本発明の酵素と組み合わせて用いることができる。電子受容体として、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（後文ではＤＣＩＰと呼ぶ）、フェナジンメトサルフェート（後文ではＰＭＳと呼ぶ）、フェリシアニド又はシトクロムｃを用いることができる。
【０００８】
酵素アッセイは以下の通りに行った。Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性のアッセイのための基本的反応混合物は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．２５ｍＭのＤＣＩＰ及び０．３２５ｍＭのＰＭＳから成り、それはアッセイの直前に調製した。１ｃｍの光路を有するキュベットは０．４ｍｌの基本的反応混合物、０．１ｍｌの０．４Ｍ  Ｄ−ソルビトール及び酵素溶液を０．５１ｍｌの合計体積で含んだ。参照キュベットは基質以外のすべての成分を含んだ。反応はＤ−ソルビトールを用いて２５℃において開始し、６００ｎｍにおいてＤＣＩＰの初期還元速度として酵素活性を測定した。１酵素単位は、１分当たりに１μモルのＤＣＩＰの還元を触媒する酵素の量として定義する。ｐＨ６．０におけるＤＣＩＰの吸光係数は１０．８ｍＭ-1であった。
【０００９】
２）基質特異性
酵素の基質特異性は、Ｄ−ソルビトールの代わりに種々の基質溶液（１００ｍＭ）を用いた以外は１）における上記と同じ酵素アッセイ法を用いて決定した。測定の結果を表１に示す。調べた基質の中で、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−アラビトール、エリトリトール及びグリセロールは高度に酸化され、Ｄ−マンニトール及びＤ−アドニトールもＤ−ソルビトールの反応速度の４９．９及び６６．６％において酸化された。
【００１０】
【表１】
0003874032.tif 000002
【００１１】
ａ）相対的活性は、基質Ｄ−ソルビトールの場合に得られる反応速度のパーセントとして表す。
【００１２】
３）至適ｐＨ
ＳＬＤＨの反応速度とｐＨの間の関連性を、種々のｐＨ及び緩衝液を用いる以外は１）における上記と同じ酵素アッセイ法を用いて決定した。結果を表２に示す。酵素は６．０〜７．０の至適ｐＨ値を示し、ｐＨ６．０において最高活性を示した。
【００１３】
【表２】
0003874032.tif 000003
【００１４】
ａ）データはｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液における活性のパーセンテージとして表す。
【００１５】
４）ｐＨ安定性
酵素を１℃において種々のｐＨの緩衝液中で１６時間放置し、次いで残留活性を１）における上記と同じ酵素アッセイ法を用いて測定した。測定の結果を表３に示す。活性の６０％以上が７．０〜９．０のｐＨにおいて残った。
【００１６】
【表３】
0003874032.tif 000004
【００１７】
ａ）データはｐＨ８．０のＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液における活性のパーセンテージとして表す。
【００１８】
５）熱安定性
酵素を０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で種々の温度において５分間インキュベートすることにより、熱安定性を調べた。１）における上記と同じ酵素アッセイ法を用いて残留活性を測定し、その直後に処理酵素を氷水中で冷却した。結果を表４に示す。酵素は３５℃まで安定であり、４０、５０及び６０℃でインキュベートされた後にそれぞれその活性の約２０、７０及び９０％を失った。
【００１９】
【表４】
0003874032.tif 000005
【００２０】
ａ）データは２０℃における活性のパーセンテージとして表す。
【００２１】
６）至適温度
１）における上記と同じアッセイ法で、２０〜６０℃の温度において酵素活性を測定した。結果を表５に示す。酵素は２０〜４０℃において至適温度を示し、３０℃において最高活性を示した。４５及び５０℃においてその活性のそれぞれ６０及び７０％の低下が観察され、６０℃では活性が検出されなかった。
【００２２】
【表５】
0003874032.tif 000006
【００２３】
ａ）データは３０℃における活性のパーセンテージとして示す。
【００２４】
７）金属イオン類及び阻害剤の影響
ＳＬＤＨへの金属イオン類及び阻害剤の影響を、１）における上記の同じアッセイ法を用いて活性を測定することにより調べた。基本的反応混合物に酵素溶液を加えた後、各金属溶液を撹拌しながら入れ、Ｄ−ソルビトールを加えて反応を開始した。表６に示される通り、０．９１及び１．７９ｍＭのＣｏ2+の添加により８〜１７％の活性が刺激された。しかし０．９１ｍＭのＣｕ2+及びＦｅ3+の添加はそれぞれの場合に強い阻害性であり、Ｚｎ2+の添加は４４〜６８％の阻害率であった。活性への種々の阻害剤の影響を調べた。表７に示される通り、キニンヒドロクロリド及びモノヨードアセテートはそれぞれ２５％及び７５％の阻害率であった。
【００２５】
【表６】
0003874032.tif 000007
【００２６】
相対的活性は、表に示されている金属化合物を含まずに得られる反応速度のパーセンテージとして表す。
【００２７】
【表７】
0003874032.tif 000008
【００２８】
相対的活性は、表に示されている阻害剤を含まずに得られる反応速度のパーセンテージとして表す。
【００２９】
８）反応速度への基質濃度の影響
Ｄ−ソルビトールの濃度を０．５〜８０ｍＭに変化させた場合の酸化反応の速度を測定し、Ｄ−ソルビトールに関するＫｍ値を決定した。反応のための電子受容体としてＤＣＩＰを用い、見掛けのＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数は１８ｍＭと算出された。
【００３０】
９）分子量
寸法排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ゲルカラムを用いたＨＰＬＣにより、２８０ｎｍにおいて、及び１分当たり１．０ｍｌの流量において本来のＳＬＤＨの分子量を決定した。精製ＳＬＤＨは、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）の存在下で７９，０００±５，０００の分子量を有する同族サブユニットから成った。
【００３１】
１０）精製法
ＳＬＤＨの精製は、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル−濾過クロマドラフィー、ゲル−電気泳動、塩析及び透析などの既知の方法の組み合わせにより行われる。
【００３２】
本発明により提供されるＳＬＤＨは、適した微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊細胞の無細胞抽出物から、好ましくは微生物の膜成分からそれを単離精製することにより調製することができる。
【００３３】
本発明のために用いられる微生物はグルコノバクテル及びアセトバクテル属に属する微生物である。該微生物の突然変異体及び変異株も本発明で用いることができる。
【００３４】
本発明において用いるのが最も好ましい株の例は、グルコノバクテル・アルビズス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５１、グルコノバクテル・アルビズスＩＦＯ  ３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）  ＩＦＯ  ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６３、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６４、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６５、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６７、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２７０、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス  ＩＦＯ  ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３１７１、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８５、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８６、グルコノバクテル・インズスツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ）ＩＦＯ  ３２６０、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２９２、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９３、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９４、グルコノバクテル・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１８９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  １２４６７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）  ＩＦＯ  ３９９０、グルコノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）  ＩＦＯ  ３２４４、グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１３０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３１７２、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５４、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５６、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５７、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５８、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２８９、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９１、アセトバクテル・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ）  ＩＦＯ  ３２８１、アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅａｎｓｉｓ）  ＩＦＯ  ３２５９、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ）  ＩＦＯ  ３２８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム  ＩＦＯ  １３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）  ＩＦＯ  １２３８８である。本発明の方法において用いることができるこれらの微生物は、要求に応じて誰にでも分譲するための公共の寄託機関（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、例えばＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ（ＩＦＯ）に保存されているものも含む。これらの中で、特定の、及び好ましい微生物であるグルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５は、ブタペスト条約の下に、１９９５年２月１２日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された。割り当てられた寄託番号はＤＳＭ  ９７１５である。
【００３５】
微生物は適した栄養を補足された水性培地中において好気的条件下で培養することができる。培養は３．５〜８．０、好ましくは５．０〜７．５のｐＨにおいて行うことができる。培養期間は微生物及び、用いられる栄養培地に依存して変わり、約６〜１００時間が好ましい。培養を行う好ましい温度範囲は約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃である。
【００３６】
培地は通常：同化可能な炭素源類、例えばグリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリトリトール、リビトール、キシリトール、イノシトール、ズルチトール（ｄｕｌｃｉｔｏｌ）、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース及びスクロース、好ましくはＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール又はグリセロール；消化可能な窒素源類、例えばペプトン、酵母抽出物、パン酵母及びコーン浸漬液（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）を例とする有機物質、ならびに硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び亜硝酸カリウムなどの無機物質；ビタミン類；ならびに微量元素などの栄養を含むことが必要である。
【００３７】
以下において、培養の後の微生物からのＳＬＤＨの単離及び精製に関する実施態様を簡単に説明する。
【００３８】
（１）液体培養ブロスから遠心又は濾過により細胞を収穫する。
【００３９】
（２）収穫された細胞を水、生理食塩水又は適したｐＨを有する緩衝溶液を用いて洗浄する。
【００４０】
（３）洗浄された細胞を緩衝溶液に懸濁させ、ホモジナイザー、ソニケーター、フレンチプレス又はリゾチームによる処理などを用いて破壊し、破壊細胞の溶液を得る。
【００４１】
（４）破壊細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物の膜画分からＳＬＤＨを単離及び精製する。
【００４２】
本発明により提供されるＳＬＤＨはＤ−ソルビトールからのＬ−ソルボースの製造のための触媒として有用である。反応は約５．５〜約８．０、好ましくは６．０〜７．０のｐＨ値において、電子受容体、例えばＤＣＩＰ、ＰＭＳ、フェリシアニド、シトクロムｃなどの存在下で、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸塩緩衝液などの溶媒中で行われなければならない。反応を行うための好ましい温度範囲は約２０℃〜約５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃である。ｐＨ及び温度がそれぞれ約６．５〜７．５及び３０℃に設定された場合に、反応は通常特に良い結果を与える。酵素、Ｄ−ソルビトール、電子受容体の量、ｐＨ、温度又はエアレーション速度などの他の反応条件に依存して、Ｄ−ソルビトールは約２〜２４時間以内、好ましくは約１２時間以内にＬ−ソルボースに完全に変換される。溶媒中のＤ−ソルビトールの濃度は反応条件に依存して変わるが、一般に約１０〜約３００ｇ／Ｌが適しており、約１０〜約２００ｇ／Ｌが最も好ましい。
【００４３】
上記に加え、培養された細胞もポリオール類からのケトース類の製造、特にＤ−ソルビトールからのＬ−ソルボースの製造に有用である。溶媒中でＤ−ソルビトールから製造されるＬ−ソルボースは、遠心及び濃縮などの従来の方法の組み合わせにより単離される。しかしＬ−ソルボースを含む溶媒を単離段階を含まずに、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法によるビタミンＣの工業的製造における出発材料として用いることもできる。
【００４４】
反応において、酵素を適した担体を用いた固定化状態で用いることもできる。当該技術分野で一般に既知の酵素の固定化のためのいずれの手段も用いることができる。例えば酵素を、官能基を有する樹脂の膜、顆粒などに直接結合することができ、あるいはそれを二官能基を有する架橋化合物、例えばグルタルアルデヒドを介して樹脂に結合することができる。
【００４５】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００４６】
【実施例】
実施例１
Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造
（１）グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５の培養
グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ（ＩＦＯ）により供給され、本研究を通じて用いた。培地は１リットルの脱イオン水中に２０ｇのＤ−ソルビトール、３ｇの酵母抽出物、３ｇのビーフ抽出物、３ｇのコーン浸漬液、１０ｇのポリペプトン、１ｇのウレア、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び１ｇのＣａＣＯ3を含んだ。ＣａＣＯ3を加える前に水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調節した。フラスコにおける培養を、回転震盪を用いて好気的に１日行うか、あるいは３０リットルの発酵容器における培養を３０℃で、５００ｒｐｍの撹拌及び１５Ｌ／分のエアレーションにおいて２１．５時間行った。ブロスを４００ｘｇにおいて１０分間遠心して炭酸カルシウムを除去し、次いで１０，０００ｘｇにおいて遠心して細胞をペレット化した。細胞塊（ｃｅｌｌ  ｃａｋｅ）を生理食塩水で１回洗浄した。かくして無損傷の細胞（湿潤重量２００ｇ）が２０リットルの培養から得られた。細胞は使用まで−２０℃において凍結した。
【００４７】
（２）膜画分の調製
細胞（湿潤重量１００ｇ）を２００ｍｌの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁させ、フレンチプレスに２０，０００ｐｓｉにおいて通過させた。無損傷の細胞の除去のための遠心の後、上澄み液（無細胞抽出物）を８０，０００ｘｇで１時間遠心し、この沈澱を膜画分と称する（湿潤重量２．２８ｇ）。
【００４８】
（３）可溶化
ＳＬＤＨをグルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）の膜画分から単離した。最初にＥ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｏ．Ａｄａｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ａｍｅｙａｍａ，（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３５−１４１，１９８２）により報告された方法を用いてＳＬＤＨを可溶化した。可溶化は膜を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ＭのＫＣｌ、０．１ＭのＤ−ソルビトール及び約１０ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質を含む０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて５℃において２時間処理することにより行った。しかしＳＬＤＨ活性は膜画分から回収されず、可溶化上澄み液及び残留膜画分の両方における全活性が上記の条件で失われた。
【００４９】
従ってｐＨ値、緩衝液、界面活性剤及びＫＣｌの濃度などの可溶化条件の、ＳＬＤＨ活性への影響を研究した。表８に示す通り、膜画分を１％のＴｒｉｒｏｎＸ−１００及び０．０４ＭのＤ−ソルビトールを含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と５℃において２時間混合した時に、膜画分から可溶化上澄み液中へのＳＬＤＨ活性の回収は７４％であった。酵素はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを用いて可溶化されず、０．０１ＭのＫＣｌの添加により活性は失われた。
【００５０】
【表８】
0003874032.tif 000009
【００５１】
グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）の膜画分から単離段階｛実施例１−（４）｝のためのＳＬＤＨの活性画分を得るために、凍結膜を解凍し、緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を得、次いで１％のＴｒｉｒｏｎＸ−１００及び０．１ＭのＤ−ソルビトールを加えた。懸濁液を１８０ｒｐｍにおいて２時間震盪し、次いで８０，０００ｘｇにおいて６０分間遠心し、沈澱を除去した。ＳＬＤＨ活性は可溶化上澄み液に回収された（２００ｍｌ）。
【００５２】
（４）ジエチルアミノエチル（後文ではＤＥＡＥと呼ぶ）−セルロースカラムクロマトグラフィー
実施例１−（３）で得られた可溶化上澄み液（２００ｍｌ）を、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化され、洗浄されたＤＥＡＥ−セルロースのカラム（２．５ｘ３０ｃｍ）上に置いた。酵素の溶離は、同じ緩衝液中の０．１ＭのＮａＣｌを用いて行った。酵素活性を有する画分を集めた。
【００５３】
（５）ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー
前段階からプールされた酵素画分（１２５ｍｌ）を、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１リットルの緩衝液の２バッチに対して透析し、同じ緩衝液を用いて平衡化され、洗浄されたＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５ｘ５０ｃｍ）上に置き、ＮａＣｌの直線勾配（０〜０．２Ｍ）を用いてＳＬＤＨ活性を溶離した。主酵素活性は０．１６〜０．１８Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度において溶離した。
【００５４】
６）ヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー
前段階からプールされた活性画分（４０ｍｌ）を、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５００ｍｌの緩衝液の２バッチに対して透析した。酵素の一部（５ｍｌ）を平衡化されたヒドロキシルアパタイトカラム（２．５ｘ２０ｃｍ）上に置いた。酵素活性はカラムの洗浄の間に溶離した。同じ調製を繰り返した後、酵素活性を有する画分を集めた。活性画分を緩衝液に対して透析した後、合計体積は５２ｍｌであった。次いで画分を限外濾過（ＰＭ１０、Ａｍｉｃｏｎ）により１０ｍｌに濃縮した。
【００５５】
（７）セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ３００カラムクロマトグラフィー
前段階からの酵素画分の一部（２ｍｌ）を、０．０５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化されたセファクリルＨＲ３００カラム（１ｘ１２０ｃｍ）上に置き、展開した。この分別段階を繰り返し、活性画分を合わせた。緩衝液に対して透析された活性画分（１３ｍｌ）をプールし、−８０℃において保存した。
【００５６】
酵素の精製段階のまとめを表９に示す。
【００５７】
【表９】
0003874032.tif 000010
【００５８】
（８）単離酵素の純度
タンパク質の１ｍｇ当たり４５．４３単位の比活性を有する精製酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）を以下の分析に用いた。
【００５９】
本来のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの分子量を、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化された寸法排除ゲルカラム（ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷXLカラム、７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＨＰＬＣ（検出、２５４μｍ；流量、１ｍｌ／分）により決定した。分子量標準シアノコバラミン（１．３５Ｋ）、ミオグロビン（１７Ｋ）、オボアルブミン（４４Ｋ）、γ−グロブリン（１５８Ｋ）及びチログロブリン（６７０Ｋ）を用いた。精製酵素は単一のピークを示し、分子量は約８００，０００±５０，０００であると決定された。
【００６０】
ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）の存在下で、酵素は約７９，０００±５，０００の分子量の単一のバンドを示した。これらの結果から、精製ＳＬＤＨは１０個の同族サブユニットから成る。
【００６１】
（９）反応生成物の同定
各基質から変換された生成物の同定のために、０．０４ＭのそれぞれＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−アラビトール、エリトリトール、Ｄ−アドニトール及びグリセロール、ならびに８ｍＭのＰＭＳを含む反応混合物を、２．０単位の精製酵素と共に０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０℃において４時間インキュベートした。反応混合物をＨＰＬＣ及び薄層クロマトグラフィーにより分析した。Ｌ−ソルボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシルロース、エリトルロース、Ｄ−リブロース及びジヒドロキシアセトンがそれぞれＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−アラビトール、エリトリトール、Ｄ−アドニトール及びグリセロールから生成された。
【００６２】
実施例２
精製ＳＬＤＨによるＬ−ソルボース製造
０．２ｍｌの精製ＳＬＤＨ（０．０４ｍｇタンパク質）、０．０４ｍｇの０．２Ｍ  ＰＭＳ、０．１ｍｌの０．４Ｍ  Ｄ−ソルビトール、０．４ｍｌの０．５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．３ｍｌの水を含む反応混合物（合計体積１．０４ｍｌ）を穏やかに震盪させながら３０℃でインキュベートした。その結果、Ｌ−ソルボースが約１．３ｍｇ／時の速度で生成された。
【００６３】
実施例３
膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの分布
種々の酢酸バクテリアにおける膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの分布を、本発明により提供されるＳＬＤＨに対する抗体を用いたイムノブロッティングアッセイにより探査した。種々の酢酸バクテリアの各細胞ホモジネートをＳＤＳで処理し、３〜５μｇのタンパク質を含む各２０μｌの溶液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に置き、次いで電気泳動を行った。ゲルにおいて展開されたタンパク質のバンドをニトロセルロース膜に電気泳動により移し、抗体と反応させた。ニトロセルロース膜をヒツジ抗−ウサギのためのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットを用いることにより処理し、どの微生物が分子量（ＭＷ）７９，０００±１，０００の位置において陽性のバンドを示すかについてそれを調べた。表１０に示される通り、調べられたグルコノバクテル株のすべて、ならびにアセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス  ＩＦＯ  ３２５９、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム  ＩＦＯ  ３２８８及びアセトバクテル・アセチ  キシリヌム  ＩＦＯ  １３７７２は陽性のバンドを示した。アセトバクテル・アセチ亜種アセチ  ＩＦＯ  ３２８１及びアセトバクテル・リクエファシエンス  ＩＦＯ  １２３８８の細胞ホモジネートは、ＭＷ７９，０００±１，０００の位置において弱い陽性のバンドを示した。
【００６４】
【表１０】
0003874032.tif 000011
【００６５】
本発明の主たる特徴及び態様は以下の通りである。
【００６６】
１．Ｄ−ソルビトールのＬ−ソルボースへの酸化を触媒し且つ以下の理化学的性質：
ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有する同族サブニットから成る
ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性
ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０
を有する精製された形態のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【００６７】
２．以下の理化学的性質：
ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有する同族サブニットから成る
ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性
ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０
ｄ）ｐＨ安定性：７．０〜９．０
ｅ）至適温度：約２０〜４０℃
ｆ）阻害：Ｃｕ2+及びＦｅ3+による
を有する上記１項に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【００６８】
３．グルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物又はその突然変異体から誘導される上記１又は２項に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【００６９】
４．微生物がグルコノバクテル・アルビズス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５１、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）  ＩＦＯ  ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６３、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６４、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６５、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６７、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２７０、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス  ＩＦＯ  ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３１７１、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８５、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８６、グルコノバクテル・インズスツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６０、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２９２、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９３、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９４、グルコノバクテル・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１８９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  １２４６７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）  ＩＦＯ  ３９９０、グルコノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）  ＩＦＯ  ３２４４、グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１３０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３１７２、グルコノバクテル・スボキシダンスＩＦＯ  ３２５４、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５６、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５７、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５８、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ３２８９、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９１、アセトバクテル・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ）  ＩＦＯ  ３２８１、アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅａｎｓｉｓ）  ＩＦＯ  ３２５９、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ）  ＩＦＯ  ３２８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム  ＩＦＯ  １３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス（Ａｃｅ���ｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）  ＩＦＯ  １２３８８から成る群より選ばれる上記３項に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【００７０】
５．グルコノバクテル又はアセトバクテル属に属する微生物、あるいは細胞中でＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを生産することができるその突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異株（ｖａｒｉａｎｔ）を培養し、該Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを細胞から単離することを含む上記１、２、３及び４項のいずれか１つに定義されているＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造法。
【００７１】
６．微生物がグルコノバクテル・アルビズス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５１、グルコノバクテル・アルビズス  ＩＦＯ  ３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）  ＩＦＯ  ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６３、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６４、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６５、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２６７、グルコノバクテル・セリヌス  ＩＦＯ  ３２７０、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス  ＩＦＯ  ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３１７１、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８５、グルコノバクテル・グルコニクス  ＩＦＯ  ３２８６、グルコノバクテル・インズスツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ）  ＩＦＯ  ３２６０、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）  ＩＦＯ  ３２９２、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９３、グルコノバクテル・メラノゲヌス  ＩＦＯ  ３２９４、グルコノバクテル・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  ３２７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１８９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  １２４６７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）  ＩＦＯ  ３９９０、グルコノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）  ＩＦＯ  ３２４４、グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）  ＩＦＯ  ３１３０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３１７２、グルコノバクテル・スボキシダンスＩＦＯ  ３２５４、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５５（ＤＳＭ  ９７１５）、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５６、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５７、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２５８、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ３２８９、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９０、グルコノバクテル・スボキシダンス  ＩＦＯ  ３２９１、アセトバクテル・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ）  ＩＦＯ  ３２８１、アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅａｎｓｉｓ）  ＩＦＯ  ３２５９、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ）  ＩＦＯ  ３２８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム  ＩＦＯ  １３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス（Ａｃｅ���ｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）  ＩＦＯ  １２３８８から成る群より選ばれる上記５項に記載の方法。
【００７２】
７．微生物を培養し、その後細胞を破壊し、破壊細胞の無細胞抽出物からＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを単離及び精製することを含む上記５又は６項に記載の方法。
【００７３】
８．適した栄養分を含む水性培地中で好気的条件下に、３．５〜８．０、好ましくは５．０〜７．５のｐＨで、及び約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃の温度範囲内において微生物の培養を行うことを含む上記５〜７項のいずれか１つに記載の方法。
【００７４】
９．上記１、２、３及び４項のいずれか１つで定義されているＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の存在下に、水性媒体中で好気的条件下においてＤ−ソルビトールを酸化することを含む、Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する方法。
【００７５】
１０．酸化を約５．５〜約８．０、好ましくは６．０〜７．０のｐＨ値において、及び約２０〜約５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度範囲内で行う上記９項に記載のＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する方法。