(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］で表される化合物である２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンを有効成分として含有することを特徴とする抗ＭＲＳＡ薬剤。
【化１】
0003979843.tif 000006
【請求項２】
式［Ｉ］で表される化合物が、ワタヨモギ（Artemisia gilvescens）から抽出された化合物であることを特徴とする請求項１記載の抗ＭＲＳＡ薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ＭＲＳＡ薬剤に関し、特に、ワタヨモギ（Artemisia gilvescens）に由来し、副作用が少ない抗ＭＲＳＡ薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＲＳＡ（methicilin-resistant Staphylococcus aureus）は、ペニシリン耐性黄色ブドウ球菌に効力を有する抗菌薬として最初に開発された合成ペニシリンであるメチシリンに耐性を有する黄色ブドウ球菌である。ＭＲＳＡの病原性は一般の黄色ブドウ球菌とほぼ同等と考えられ、ヒトへの定着性が強く、コアグラーゼ、エンテロトキシン、ロイコシジン、ＴＳＳＴ−１（トキシックショックシンドロームトキシン）、エクソフォリアチン（表皮剥脱毒）、溶血毒等の種々の毒素や菌体外酵素（細胞外酵素）を産生することが知られている。このＭＲＳＡはメチシリンのみならず、β−ラクタム系抗生物質、すなわち、耐性ブドウ球菌用ペニシリンを始めとして総てのペニシリン系、第１、第２、第３世代と呼ばれる総てのセフェム系、モノバクタム系、カルバペネム系抗生物質等、現在市販されている殆ど総てのβ−ラクタム系抗生物質に耐性を示すばかりでなく、アミノグリコシド系、マクロライド系抗生物質等の多くの抗生物質に対し耐性を示し、最近開発されたニューキノロン系抗生物質にも耐性を示すなど、ＭＲＳＡ感染症は極めて難治性の疾患として現在大きな問題となっている。例えば、ＭＲＳＡ感染症は、現医療において血管や気道の確保のために用いられるカテーテル等の医療器具がＭＲＳＡに汚染されている場合に容易に発症すると共に院内感染が生じやすく、中でも、免疫不全状態になっている患者、長期抗菌薬投与患者、抵抗力が弱い寝たきり老人・未熟児等に特に発症しやすく、最近特に、院内感染対策としての抗ＭＲＳＡ薬剤の早急な開発が望まれている。
【０００３】
ＭＲＳＡに抗菌活性を有する薬剤として、特開平９−２７８７７９号公報には、新規セフェム化合物及びその薬理学上許容される塩並びに生理的に加水分解可能なカルボン酸エステルが開示されている。また、特開平１１−２２８４０７号公報には、フラボン誘導体を有効成分として含有する抗ＭＲＳＡ活性医薬組成物が記載されている。しかしながら、これら合成薬剤においては強い副作用、毒性等の問題があることが多く、免疫力の低下した患者に施用する場合など制約が多く、ＭＲＳＡ感染症の治療は一般には極めて困難であって、副作用の少ない抗ＭＲＳＡ薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
一方、キク科（Compositae）植物は広く世界に分布しており、約１０００属、２００００種が知られている。この科に属するヨモギ属（Artemisia）植物は、北半球に広く分布している植物であって約２５０種を数え、日本だけでも特産種を含めて３０種あり、薬用植物として使われているものも多く、成分研究も数多くなされている。例えば、シナヨモギ（A.cina）は回虫駆除作用のあるα−santoninの原料植物として用いられ、カワラヨモギ（A.cappillaris Tunb．）は胆汁分泌促進作用のあるcapillartemisin A,B、capillarisin等を含み、黄疸、肝炎、胆嚢炎等の薬効を有するものとして漢方薬に用いられている。また、抗マラリア薬剤として使用されるartemisininは黄花蒿（A.annua L．）から単離されている。しかしながら、ヨモギ属に属するワタヨモギ（A.gilvescens Miq．）は中国の一部（Anhui, Hunan, Hubei, Jiangxi, Shaanxi, Sichuan）と、日本では徳島県鳴門市にしか生育が確認されていない希少植物であって、薬用としては使用されたことはなく、徳島、沖縄で強い繁殖力のある栽培品として栽培されているに留まっている。
【０００５】
ところで、２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンは、深海の海洋生物から単離された化合物として明らかにされ（Tetrahedron Letters, Vol.25, No.20, 2109−2110, 1984, Printed in Great Britain等）、更に、化学変換や結晶構造が報告されていた（Zeitschrift fur Kristallographie, 177, 287−290, 1986等）が、この化合物が抗ＭＲＳＡ活性を有することは報告されていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、副作用、毒性の少ない抗ＭＲＳＡ薬剤であって、院内感染が問題となる免疫力が低下した患者に対し、安全に使用することができる天然物由来の抗ＭＲＳＡ活性を有する抗ＭＲＳＡ薬剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、薬用植物として用いられていない植物の評価を実施すべく、対象植物として徳島県に生育するワタヨモギ（A.gilvescens Miq．）を選択した。２０００年に徳島大学薬用植物園で栽培したワタヨモギを採取し、その地上部３．３ｋｇを乾燥後粉砕し、ソックスレー抽出器で順次ヘキサン、酢酸エチル、メタノールで抽出処理した。まず、ヘキサン抽出残渣の酢酸エチル抽出物５８ｇを表１に示すように各種クロマトグラフィーにより分離精製し、化合物I〜IXで表されるセスキテルペン９種を単離し、構造を決定した。そして、その一部については、ヒト大腸癌由来細胞株ＨＣＴ１１６を用いて細胞毒性を調べ、また、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ（methicilin-sensitive Staphylococcus aureus）に対する抗菌活性を調べた。その結果、化合物１で表されるセスキテルペン ケトラクトン（sesquiterpene ketolactone）に抗ＭＲＳＡ活性が見い出された。
【０００８】
【表１】
0003979843.tif 000002
【０００９】
化合物１で表されるセスキテルペン ケトラクトン（sesquiterpene ketolactone）は黄色結晶として得られ、ＩＲスペクトルによりラクトン（１７５８ｃｍ-1）、カルボニル基（１６８６ｃｍ-1）の存在が示唆された。表２に示すように、1ＨＮＭＲスペクトルデータにおいては、６本のシングレットからなる非常にシンプルなシグナルを示し、３個のメチル基[δH２．１２（ｓ）、２．３２（ｓ）、２．７１（ｓ）]、低磁場側に二重結合性メチン３個[δH６．２４（ｓ）、６．５４（ｓ）、６．８６（ｓ）]の存在が確認され、13ＣＮＭＲスペクトルデータにおいては、１５本のシグナルが確認された。また、ＨＲＥＩＭＳスペクトルが、ｍ／ｚ ２４０．０８１６，[Ｍ]+ｃａｌｃｄ．２４０．０７８６であるところから、分子式はＣ15Ｈ12Ｏ3であることが判明した。
【００１０】
【表２】
0003979843.tif 000003
【００１１】
ＨＭＢＣスペクトルデータでは、メチル基δH２．３２（ｓ、Ｈ−１３）からδC１３２．７（Ｃ−３）のメチン炭素、δC１４６．０（Ｃ−４）、１６０．８（Ｃ−５）の四級炭素に、δH６．２４（ｓ、Ｈ−３）からδC１９５．２（Ｃ−２）のカルボニル炭素、δC１２７．１（Ｃ−１）、１４６．０（Ｃ−４）の四級炭素、δC１４．３（Ｃ−１３）のメチル炭素に相関がみられ、図１に示す部分構造が考えられた。また、ラクトン部分のカルボニル炭素と考えられるδC１６９．２（Ｃ−１２）には、メチル基δH２．１２（Ｈ−１５）からのみ相関がみられ、さらにこのメチル基δH２．１２（Ｈ−１５）からδC１１６．９（Ｃ−１１）、１５６．１（Ｃ−７）、１４４．７（Ｃ−８）の四級炭素に相関がみられることから、図２に示す部分構造が考えられた。
【００１２】
これらのデータから、マラフィリディン（malaphyllidin）（図３）やリンデルアズレン（linderazulene）（図４）の構造が考えられたが、ＨＭＢＣ、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹスペクトルデータから、セスキテルペン ケトラクトン（sesquiterpene ketolactone）と推定した。
【００１３】
このセスキテルペンケトラクトンは、以前に海綿gorgonianのparamuricea chamaleonから単離されたリンデルアズレンのphoto artifactとして初めて構造決定された（Tetrahedron Letters, Vol.25, No.20, pp2109-2110, 1984）が、その後、同じ海綿のPlacogorgia sp．から天然物質として単離された（Zeitschrift  fur Kristallographie 177, 287-290, 1986）。また、最近、キク科タンポポ属のTaraxacum wallichiiから単離され、13ＣＮＭＲが測定され帰属されている。しかし、これらの文献に報告された1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲスペクトルデータの帰属が一部誤っていることがわかった。このようにして、ワタヨモギから抽出された上記セスキテルペン ケトラクトンが、２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンであることを確認した。
【００１４】
そこで、上記化合物２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンのＭＲＳＡ、ＭＳＳＡに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値を微量液体希釈法により測定した。また、イソキサゾリル系合成ペニシリンであるオキサシリン（ＭＰＩＰＣ）をポジティブコントロールとして用いた。その結果、２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンは、ＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ６５３８）や臨床分離株であるＭＲＳＡ（ｎｏ．４）に対しては抗菌活性を示さなかったが、臨床分離株であるＭＲＳＡ（ｎｏ．５）に対しては強い抗菌活性を示し、特定のＭＲＳＡ（ｎｏ．５）に対してはオキサシリンよりも優れた抗菌活性を示すことがわかった。
本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１５】
すなわち本発明は、式［Ｉ］で表される化合物である２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンを有効成分として含有することを特徴とする抗ＭＲＳＡ薬剤（請求項１）や、
【化２】
0003979843.tif 000004
式［Ｉ］で表される化合物が、ワタヨモギ（Artemisia gilvescens）から抽出された化合物であることを特徴とする請求項１記載の抗ＭＲＳＡ薬剤（請求項２）に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
式［Ｉ］で表される化合物は、公知の反応を利用して化学合成することもできるが、ワタヨモギから簡便に抽出・単離することもできる。ワタヨモギからの上記化合物の単離は、例えば、乾燥地上部のヘキサン抽出残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出エキスをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝１：１）で分画し、高抗ＭＲＳＡ活性の画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝１０：１）で分画し、高抗ＭＲＳＡ活性の画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝１：１）とゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により行うことができる。
【００２０】
本発明のセスキテルペンケトラクトンである化合物は、特定のＭＲＳＡに対して、強い抗菌活性を有する。式［Ｉ］で表される化合物のＭＲＳＡに対する抗菌活性は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定により確認することができ、ＭＩＣ測定は、例えば、文献（Japan Society for Antimicrobial Chemotherapy 29,76-79, 1981）記載の抗菌感受性測定方法などにより実施することができる。例えば、ミューラーヒントン培地を基礎とした半合成培地を用いた寒天平板希釈法を用いた場合、一定時間、例えば、２４時間培養後のコロニー数が数個（５個以内）であれば、発育が阻害されたと判断することができる。また、ミューラーヒントンブロスを用いて、ＭＲＳＡ等の供試菌の菌数を約１０６／ｍＬに調整した接種菌液を用いる液体希釈法においては、一定時間、例えば、２４時間培養後の波長５７０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が０．０５以下となるとき、発育が阻害されたと判断することができる。
【００２１】
上記式［Ｉ］で表される化合物は、予防若しくは治療用の抗ＭＲＳＡ薬剤とすることができる。医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：ワタヨモギ含有物の抽出
２０００年に徳島大学薬用植物園で栽培したワタヨモギ（A gilvescens）の乾燥地上部２９３ｇを粉砕してソックスレー抽出器を用いて、ヘキサン抽出残渣を酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽出液を濃縮器で溶媒を留去して、酢酸エチル抽出エキス８．６ｇを得た。
【００２３】
実施例２：抗ＭＲＳＡ活性物質の特定
酢酸エチル抽出エキスをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル８００ｇ、展開溶媒クロロホルム−メタノール＝１０：１）により、画分１〜画分１８の計１８画分に分画した。これら１８画分についてディスク拡散法によりＭＳＳＡ及びＭＲＳＡに対する抗菌活性スクリーニング試験を行なった。その結果、画分４（３００ｍｇ）はＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ６５３８）に対しては抗菌活性を示さなかったが、ＭＲＳＡ（臨床分離株）に対しては強い抗菌活性を示した。そこで、この画分４をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、展開溶媒ヘキサン−酢酸エチル＝１：１）で画分４−１〜４−８の計８画分に分画し、これら８画分について、抗ＭＲＳＡ活性試験を行なった。画分４−４〜４−５（１７ｍｇ）に強い抗ＭＲＳＡ活性が認められたことから、この分画からさらに高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＧＰＣ、移動相：クロロホルム）で合計５種の単一化合物を単離した。更に、抗ＭＲＳＡ活性試験を行なったところ、ａｔｓ１２０５と仮称した化合物（２．５ｍｇ）に強い抗ＭＲＳＡ活性が認められた。
【００２４】
ａｔｓ１２０５についてＮＭＲのデータは以下のとおりであった。
尚、1ＨＮＭＲスペクトルは、BRUKER ARX-400 NMR spectrometer(400MHz)、BRUKER ARX-300 NMR spectrometer(300MHz)、13ＣＮＭＲスペクトルはBRUKER ARX-400 NMR spectrometer(100.5 MHz)で測定した。カラムクロマトグラフィーはsilica gel 60 N（63-210 mesh：関東化学（株）社製）を用い、ＨＰＬＣのカラムはMightysil Si 60 250-20（５μｍ：関東化学（株）社製）、ＧＰＣのカラムはshodex GPCH 2001,2002（ＣＨＣｌ3）を用いた。
PMR（chloroform−d1、TMS＝０ppm）：6.86ppm（1H、s）、6.54（1H、s）、6.24ppm（1H、s）、2.69ppm（3H、s）、2.32ppm（3H、s）、2.12ppm（3H、s）
CMR（chloroform−d1、TMS＝０ppm）：195.2、169.2、160.8、156.1、146.0、144.7、143.4、135.0、132.7、127.1、116.9、114.7、22.3、14.3、8.5
【００２５】
実施例３：２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンのＭＲＳＡ増殖阻害スクリーニング試験
文献（Japanese Society for Antimicrobial Chemotherapy 29, 76-79, 1981）記載の方法によりスクリーニング試験を行なった。即ち、ミューラーヒントン・ブロース（ＢＢＬ社製）で臨床分離株であるＭＲＳＡ（ｎｏ．５）を３７℃で２０時間培養し、菌数を１０6／ｍＬに調整した時点で、表４に示す量の２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオン、又はポジティブコントロールとしてオキサシリン（ＭＰＩＰＣ）をそれぞれ添加し、添加後１８時間、２４時間、４８時間経過時における濁度（ＯＤ；波長５７０ｎｍ）をそれぞれ測定した。結果を表３に示す。通常、ＯＤが０．０５以下であれば、菌が増殖していないと判断されることから、１８時間後、２４時間後、４８時間後のＭＩＣ値は、２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンの場合、それぞれ０．９８μｇ／ｍＬ、１．９５μｇ／ｍＬ、３．９１μｇ／ｍＬであり、ＭＰＩＰＣの場合は、それぞれ１６μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬであり、２，７−ジヒドロ−３，５，８−トリメチルアズレノ[６，５−ｂ]フラン−２，７−ジオンは特定のＭＲＳＡに対する抗菌活性が非常に優れていることがわかった。
【００２６】
【表３】
0003979843.tif 000005
【００２７】
【発明の効果】
本発明の抗ＭＲＳＡ薬剤は、優れた抗ＭＲＳＡ活性を有し、ワタヨモギから抽出された天然物であり、副作用が少なく、毒性の少ない抗ＭＲＳＡ薬剤であって、院内感染が問題となる免疫力が低い患者に対し、安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の式[Ｉ]で表される化合物の一部分の構成を表す図である。
【図２】本発明の式[Ｉ]で表される化合物の一部分の構成を表す図である。
【図３】マラフィリデイン（malaphyllidin）の構造式を表す図である。
【図４】リンデルアズレン（linderazulene）の構造式を表す図である。
【図１】
0003979843.tif 000007
【図２】
0003979843.tif 000008
【図３】
0003979843.tif 000009
【図４】
0003979843.tif 000010