(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロシスティンを産生する水圏プランクトン・微生物に温度５０〜７０℃で２０〜６０分間の加熱処理を施して前記ミクロシスティンを抽出する毒素抽出工程；
前記ミクロシスティンとプロテインホスファターゼを反応させたのち、その反応系にｐ−ニトロフェニルリン酸塩を添加してｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素反応工程；および、
前記反応系の吸光度を測定し、その測定値に基づき、前記ミクロシスティンの濃度を検量線から読み取る工程；を備えていることを特徴とする水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析方法。
【請求項２】
前記毒素抽出工程と前記酵素反応工程との間に、抽出した前記ミクロシスティンを選択的に濃縮する毒素濃縮工程が介在している請求項１の水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析方法。
【請求項３】
ミクロシスティンを産生する水圏プランクトン・微生物に温度５０〜７０℃で２０〜６０分間の加熱処理を施して、前記ミクロシスティンを抽出する毒素抽出手段；
前記毒素抽出手段に接続され、前記ミクロシスティンとプロテインホスファターゼとｐ−ニトロフェニルリン酸塩とを接触させてｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素反応手段；および、
前記酵素反応手段からの流出物の吸光度を測定する吸光光度計；とを備えていることを特徴とする水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置。
【請求項４】
前記酵素反応手段が、プロテインフォスタファーゼが担持されている担体を充填した酵素カラムと、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩の貯留槽と、前記ミクロシスティンの貯留槽とから成り、それぞれは三方コックを介して接続されている請求項３の水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置。
【請求項５】
前記毒素抽出手段と前記酵素反応手段との間には、前記ミクロシスティンを選択的に濃縮する毒素濃縮手段が介装されている請求項３の水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置。
【請求項６】
前記毒素濃縮手段が、限外濾過膜装置を備えている請求項５の水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析方法および分析装置に関し、更に詳しくは、ミクロキスティス，ノジュラリア，クロイソカイメンや、湖沼水，河川水，海水などに含有されているプロテインホスファターゼ活性阻害毒素の濃度を簡便・迅速に分析する方法と分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
富栄養化の進んだ湖沼や海面では藍藻類やクロイソカイメンが多量に発生している。これらの水圏プランクトンや微生物の中には、動物組織中に存在してリン酸化タンパク質から脱リン酸反応を行う酵素であるプロテインホスファターゼ（Protein Phosphatase）の触媒活性を阻害する毒素を産生するものがある。代表的なものとしては、ミクロキスティスの産生毒素であり、肝臓毒として知られているミクロシスティン（microcystin）をあげることができる。
【０００３】
湖沼水は、上水，家畜の飲み水，養魚用として利用され、また海水は養魚用，養貝用として利用されていることを考えれば、これら湖沼水や海水中における産生毒素の動態濃度を把握して、その水質管理を行うことは重要な問題である。
このようなことから、藍藻類や水に存在するプロテインホスファターゼ活性阻害毒素の濃度分析が、最近行われ始めている。
【０００４】
その場合の分析手順としては、まず、水圏プランクトンや微生物の細胞内に産生している毒素を抽出し、ついでその抽出毒素を定量分析するというステップが含まれている。
毒素抽出に関しては、例えば試料に超音波振動を印加して細胞膜を破壊することにより毒素を抽出するという方法や、試料に対する凍結−融解を反復して抽出する方法などが一般的に行われている。
【０００５】
また、抽出毒素の分析方法としては、次のような方法が一般に行われている。例えば、抽出毒素とプロテインホスファターゼを反応させたのち、その反応系に放射性同位元素Ｐ32で標識した基質を反応させ、そのときの放射線量を計測し、その計測値に基づき、予め作成しておいた検量線から当該反応系における抽出毒素の検出と濃度分析が行われる。
【０００６】
また、ミクロシスティン類のような特定の毒素に対しては、液体クロマトグラフィーで単離して分析する方法や、特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）で分析する方法が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来の毒素抽出法の場合、例えば特殊な超音波発振器が必要であり、また、凍結−融解による毒素抽出には多大の時間を必要とするという問題がある。
また、従来の分析方法に関しては、例えばＰ32を使用する場合、その放射線被曝防止の観点から、特殊な分析環境の整備が必要となる。そして、液体クロマトグラフィーやＥＬＩＳＡ法を適用する場合には、特定の毒素しか分析することができず、また分析には多大の時間を必要とするなどの問題がある。
【０００８】
本発明は、従来の毒素抽出およびその定量分析における上記した問題を解決し、水圏プランクトンや微生物からその産生毒素を極めて簡単に抽出することができ、また抽出毒素の濃度を正確かつ迅速に分析することができる新規な水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析方法および分析装置の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、水圏プランクトンや微生物を単に加熱するだけで内部の産生毒素を容易に抽出することができるとの新たな知見を得るに至った。
そしてまた、次のような知見も得るに至った。
【００１０】
すなわち、抽出毒素をプロテインホスファターゼと反応させると、抽出毒素とプロテインホスファターゼとの量関係にもよるが、プロテインホスファターゼに対する抽出毒素の被毒量が少ない場合には、当該抽出毒素によってプロテインホスファターゼの一部はその脱リン酸化活性を阻害されるが、その反応系に、プロテインホスファターゼを基質とする所定濃度のｐ−ニトロフェニルリン酸塩（透明無色）を添加すると、残余のプロテインホスファターゼの酵素作用により、当該ｐ−ニトロフェニルリン酸塩はリン酸とｐ−ニトロフェノールとに分解するという事実である。そしてこのときの反応系はこの生成したｐ−ニトロフェノールによって黄色を呈するので、その吸光度を測定することにより、ｐ−ニトロフェノールの存在量、逆にいえば、抽出毒素で被毒されずに触媒活性を保持しているプロテインホスファターゼの量、更にいえば、抽出毒素の被毒量すなわち抽出毒素の濃度を検出することができるという知見を得るに至った。
【００１１】
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明の分析方法と分析装置を開発するに至ったのである。
すなわち、本発明の水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析方法は、ミクロシスティンを産生する水圏プランクトン・微生物に温度５０〜７０℃で２０〜６０分間の加熱処理を施して前記ミクロシスティンを抽出する毒素抽出工程；
前記ミクロシスティンとプロテインホスファターゼを反応させたのち、その反応系にｐ−ニトロフェニルリン酸塩を添加してｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素反応工程；および、
前記反応系の吸光度を測定し、その測定値に基づき、前記ミクロシスティンの濃度を検量線から読み取る工程；を備えていることを特徴とし、好適には、前記毒素抽出工程と前記酵素反応工程との間に、抽出した前記ミクロシスティンを選択的に濃縮する毒素濃縮工程が介在している分析方法である。
【００１２】
また、本発明においては、ミクロシスティンを産生する水圏プランクトン・微生物に温度５０〜７０℃で２０〜６０分間の加熱処理を施して、前記ミクロシスティンを抽出する毒素抽出手段；
前記毒素抽出手段に接続され、前記ミクロシスティンとプロテインホスファターゼとｐ−ニトロフェニルリン酸塩とを接触させてｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素反応手段；および、
前記酵素反応手段からの流出物の吸光度を測定する吸光光度計；とを備えていることを特徴とする水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置が提供される。
【００１３】
好適には、前記酵素反応手段が、プロテインフォスタファーゼが担持されている担体を充填した酵素カラムと、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩の貯留槽と、前記ミクロシスティンの貯留槽とから成り、それぞれは三方コックを介して接続されており、また、前記毒素抽出手段と前記酵素反応手段との間には、前記ミクロシスティンを選択的に濃縮する毒素濃縮手段が介装されている水圏プランクトン・微生物産生毒素の分析装置が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の分析方法について詳細に説明する。
本発明の分析方法においては、水圏プランクトンや微生物に加熱処理を施してそれらの産生毒素であるミクロシスティンを抽出する毒素抽出工程を必須として備えていることを最大の特徴とする。
【００１５】
具体的には、ミクロキスティスのような藍藻類が含まれている水を加熱するだけで、ミクロシスティンを抽出するのである。
このときに適用する温度は５０〜７０℃である。
例えば、ミクロキスティスを加熱すると、温度４０℃近辺からその産生毒素であるミクロシスティンの抽出量は急激に増加し、温度６０℃近辺でその抽出量は飽和傾向を示す。このようなことから、効果的なミクロシスティンの抽出を実現することを考えて、加熱温度は上記範囲に設定される。
【００１６】
また、そのときの加熱時間は２０〜６０分である。
例えば、温度５０℃でミクロシスティンの抽出を行った場合、加熱時間が長くなるほど抽出量は増加していくが、加熱時間を２０分以上にしてもその抽出量は飽和傾向を示すのであまり長時間加熱しても無駄である。このようなことから、加熱時間は上記した範囲に設定される。
【００１７】
なお、この毒素抽出工程において、この反応系に加水分解酵素を添加すると、ミクロシスティン抽出が促進されるので好適である。用いる加水分解酵素としては、例えば、α−アミラーゼやリゾチームなどを好適なものとしてあげることができる。しかし、これらに限定されるものではなく、対象のプランクトンや微生物の細胞膜を分解できる酵素であれば何であってもよい。また添加量は格別限定されるものではない。
【００１８】
このようにして得られた抽出毒素は、次に酵素反応工程に移送され、プロテインホスファターゼとの反応に供せられる。
用いるプロテインホスファターゼとしては格別限定されるものではないが、例えば、プロテインホスファターゼtype−２Ａを好適例とする。また、プロテインホスファターゼを含有する生体抽出物質も全て使用可能である。
【００１９】
この反応系におけるプロテインホスファターゼの濃度は格別限定されるものではない。
この反応系においては、プロテインホスファターゼの一部はミクロシスティンの被毒作用によって脱リン酸化活性が失活する。しかし、他の部分は失活していない。この反応系の条件は、温度３７℃前後、反応時間１５〜３０分程度に設定することが好ましい。後述する吸光度測定時における感度が良好になるからである。
【００２０】
ついで、この反応系にｐ−ニトロフェニルリン酸塩が添加される。このとき、被毒されていないプロテインホスファターゼの酵素作用により、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩はリン酸とｐ−ニトロフェノールに分解する。
反応系におけるミクロシスティンの濃度が高い場合には、プロテインホスファターゼの被毒量（触媒活性の失活度合）は多くなっているので、添加したｐ−ニトロフェニルリン酸塩の分解量は少なく、その結果、ｐ−ニトロフェノールの生成量は減少する。また、逆に反応系におけるミクロシスティンの濃度が低い場合は、プロテインホスファターゼの被毒量は少ないので、添加したｐ−ニトロフェニルリン酸塩の分解量は多く、その結果、ｐ−ニトロフェノールの生成量は多くなる。すなわち、反応系におけるミクロシスティンの濃度に対応して、添加したｐ−ニトロフェニルリン酸塩の減少量とｐ−ニトロフェノールの生産量が変化する。
【００２１】
そして、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩の溶液は無色透明であり、ｐ−ニトロフェノールは波長４０５〜４１０nmを吸収波長とする。すなわち、前記したｐ−ニトロフェニルリン酸塩の減少、それと対をなすｐ−ニトロフェノールの生成は、その反応系の色彩変化として把握することができる。換言すれば、反応系の吸光度を測定することにより、上記したミクロシスティンの濃度分析は可能となる。
【００２２】
この反応系におけるｐ−ニトロフェニルリン酸塩の濃度は格別限定されるものではない。また、上記したｐ−ニトロフェニルリン酸塩の酵素分解を円滑に進めるためには、当該反応系の温度を３７℃前後に設定し、反応時間を３０〜４５分に設定することが好ましい。
このようにして酵素反応工程で調製され、ｐ−ニトロフェノールが生成している流出物は次に吸光光度計に移送され、そこで吸光度が測定される。このときの測定波長は、高感度を得るために、４０５nmに設定することが好ましい。
【００２３】
一方、分析対象のミクロシスティンに関しては、上記した反応系において、既知濃度のミクロシスティンを用いてそれと吸光度との関係を測定し、両者の検量線を予め作成しておく。
そして、その検量線を用いて実測値から反応系におけるミクロシスティンの濃度が読み取られる。
【００２４】
本発明においては、以上の工程を経ても充分にその目的を達成することができるが、更に、次のような工程を前記毒素抽出工程と前記酵素反応工程の途中に介在させると、測定感度をより一層高めることができるので好適である。すなわち、ミクロシスティンを選別的に濃縮する工程である。
前記した毒素抽出工程では、ミクロシスティンだけではなく例えば細胞膜などの細胞残渣のような夾雑物も副生する。そして、この夾雑物が共存する状態で前記した吸光度測定を行うと、光散乱などによりその測定感度は大幅に低下する。したがって、高感度の測定を行うためには、毒素抽出工程後に、これら夾雑物を除去し、同時にミクロシスティンを濃縮することが好ましい。
【００２５】
そのために、本発明においては、毒素抽出工程からの抽出物を、例えば限外濾過膜を用いてミクロシスティンと夾雑物を分離し、限外濾過膜を通過したミクロシスティンのみを選択的に採集し、それを用いて前記した酵素反応工程、および吸光度測定が行われる。
次に、本発明の分析装置を図面に則して説明する。
【００２６】
図１は、前記したミクロシスティンの選択的な濃縮を実施できる本発明装置の好適例を示す基本構成図である。
この装置は、まず、毒素抽出手段Ａ，酵素反応手段Ｃ，吸光光度計Ｄを備え、毒素抽出手段Ａと酵素反応手段Ｃの間に毒素濃縮手段Ｂが介装された構造になっている。
【００２７】
毒素抽出手段Ａは、図示しない加熱手段を付設する加熱槽１を備えており、この加熱槽１は三方コック２１を介して試料を導入するための経路Ｗ１と接続されている。そして、加熱槽１には、当該加熱槽１からの抽出物を導出するための経路Ｗ２が配設され、それは、ポンプＰ１を介して後述する毒素濃縮手段Ｂの膜分離装置３１に接続されている。また、前記膜分離装置３１と前記した三方コック２１の間は経路Ｗ３で接続されている。更に、加熱槽１には、槽内試料を排出するための経路Ｗ４が配設され、バルブＶ１，Ｖ２を介して装置全体のドレイン経路Ｗ１３と接続されている。
【００２８】
ここで、膜分離装置３１としては、ミクロシスティン（分子量約１０００）は通過できるが、それよりも分子量が大きい他の夾雑物は通過できない限外濾過膜装置を用いることが好ましい。
この毒素抽出手段Ａにおいては、バルブＶ１を閉にした状態で加熱槽１に採取された試料は温度５０〜７０℃で２０〜６０分間加熱されてそのミクロシスティンが抽出される。そして、三方コック２１を作動して、経路Ｗ２および経路Ｗ３の間で閉回路を形成したのち、ポンプＰ１を作動することにより、加熱槽１内の抽出物を前記閉回路に循環させる。
【００２９】
経路Ｗ２から膜分離装置３１に導入された抽出物のうち、ミクロシスティンは膜を通過して経路Ｗ４に流出していく。しかし、抽出物のうちの夾雑物は経路Ｗ３を経由し三方コック２１から加熱槽１に還流する。すなわち、抽出物のうち、目的とするミクロシスティンは選択的に分離され、経路Ｗ４から後述する酵素反応手段Ｃの抽出毒素貯留槽４に貯留される。
【００３０】
毒素濃縮手段Ｂは、前記した膜分離装置３１の外に、もう１つの膜分離装置３２を備えており、この膜分離装置３２と前記した抽出毒素貯留槽４とは経路Ｗ５で接続されている。そして、膜分離装置３２は、ポンプＰ２と三方コック２２を介して経路Ｗ６で前記毒素貯留槽４と接続され、更には、経路Ｗ７を介して経路Ｗ４と接続して全体のドレイン経路Ｗ１３と接続している。また、三方コック２２は経路Ｗ８を介して全体のドレイン経路Ｗ１３と接続されている。
【００３１】
ここで、別の膜分離装置３２は、前記した膜分離装置３１の場合とは逆に、ミクロシスティンは通過できないが、それよりも分子量が小さい他の夾雑物は通過できる限外濾過膜装置を用いることが好ましい。
この毒素濃縮手段Ｂにおいては、経路Ｗ４からのミクロシスティンが貯留槽４に一定量貯留した時点で、バルブＶ１を閉，バルブＶ２を開にし、また三方コック２２で経路Ｗ８を遮断し、更には、後述する酵素反応手段Ｃの三方コック２３を閉にして経路Ｗ５−貯留槽４−経路Ｗ６−膜分離装置３２の閉回路を形成する。そして、ポンプＰ２を作動することにより、貯留槽４のミクロシスティンを循環させる。
【００３２】
貯留槽４から膜分離装置３２に流入したミクロシスティンからは、いまだ残存していた夾雑物が除去され、より濃縮された状態でミクロシスティンは経路Ｗ５を通って貯留槽に還流する。そして、分離除去された夾雑物は経路Ｗ７を通って全体のドレイン経路Ｗ１３から排出される。
かくして、貯留槽４には、ミクロシスティンが濃縮した状態で貯留される。
【００３３】
なお、この毒素濃縮手段Ｂでは、ミクロシスティンと夾雑物との分離に限外濾過膜装置を用いる例を示したが、分離に用いる装置はこれに限定されるものではなく、例えば、ゲル濾過装置のようにミクロシスティンと夾雑物を分離できるものであれば何であってもよい。
上記毒素濃縮手段Ｂで得られたミクロシスティンは、次に酵素反応手段Ｃに移送される。
【００３４】
酵素反応手段Ｃは、前記した抽出毒素貯留槽４とｐ−ニトロフェニルリン酸塩の貯留槽５と酵素カラム６とで構成されている。そして、貯留槽４からの経路Ｗ９と貯留槽５からの経路Ｗ１０は三方コック２３で合流して経路Ｗ１１となり、ポンプＰ３を介して酵素カラム６に接続されている。そして、酵素カラム６は経路Ｗ１２を介して吸光光度計Ｄに接続されている。
【００３５】
貯留槽５には、所定濃度のｐ−ニトロフェニルリン酸塩と緩衝液とが貯留されている。緩衝液としては、４３mM  ＭｇＣｌ２，４mM  ＥＤＴＡおよび４mM  ＤＴＴを含む４０mM  Tris−ＨＣｌ緩衝液などが好適である。また、ｐＨ８.９〜９.０に調整して用いることが好ましい。
一方、酵素セル６は、例えばアルミナのような担体にプロテインホスファターゼを担持させたものが用いられる。例えば、シリカゲルにプロテインホスファターゼType−２Ａを担持させたものが好適である。
【００３６】
この酵素反応手段Ｃにおいては、三方コック２３とポンプＰ３を作動することにより、貯留槽４のミクロシスティンと貯留槽５のｐ−ニトロフェニルリン酸塩の緩衝液との所定量をそれぞれの経路Ｗ９，Ｗ１０から経路Ｗ１１に流入して混合せしめ、酵素セル６に注入する。
酵素セル６に注入された上記混合物は当該酵素セル６を流下し、その過程で、プロテインホスファターゼによるｐ−ニトロフェニルリン酸塩の分解が進んでｐ−ニトロフェノールを生成する。
【００３７】
この反応系は温度３７℃前後で効果的に進行するので、当該酵素セル６の周囲に加熱手段を設けて、担持されているプロテインホスファターゼの温度が上記した温度に保持されるように運転される。また、上記温度における反応時間は、吸光度測定時の感度の点でいうと１５〜３０分であることが好ましいので、前記混合物が注入してから流出するまでに要する時間が上記した時間となるように、酵素カラムへの担体の充填密度が調整される。
【００３８】
この酵素セル６から流出した流出物は、次に、吸光光度計Ｄに移送され、そこで、吸光度が測定される。
そして、予め作成しておいて検量線を用いることにより、その測定値からミクロシスティンの濃度が定量される。
【００３９】
【実施例】
（１）検量線の作成
以下のようにして検量線を作成した。
まず、公知の９６穴マイクロプレートの各穴に、４０mM塩化ニッケル溶液５μＬ，５mg／Ｌ牛血清アルブミン溶液５μＬ，０.２ユニットのプロテインホスファターゼType−２Ａ溶液５μＬ、および、ｐＨ７.０の０.１mMトリス塩酸緩衝液に塩化カルシウムを濃度０.１mMになるように溶解して成る溶液７５μＬを注入した。
【００４０】
ここに、既知量の標準ミクロシスティンを水に溶解してミクロシスティン濃度を変化させた試料溶液５μＬを添加し、マイクロミキサで１分間撹拌し、更に、温度３７℃の恒温槽中で３０分間反応させた。
一方、ｐＨ７.０の０.１mMトリス塩酸緩衝液にｐ−ニトロフェニルリン酸塩を濃度１.５mg／Ｌとなるように溶解して成る溶液を調製した。
【００４１】
そして、この溶液１２０μＬを前記した反応系に添加し、全体を温度３７℃の恒温槽中で４５分間加熱して反応を進めた。
ついで、ここに、１３％リン酸水素ニカリウム溶液２０μＬを添加して反応を停止せしめ、得られた溶液の吸光度をマイクロプレートリーダを用い、波長４０５nmで測定した。
【００４２】
その吸光度をミクロシスティン濃度に対してプロットした。その結果を図２に示した。
図２から明らかなように、測定した吸光度はミクロシスティン濃度に対して直線的に変化している。すなわち、この直線は、充分に検量線として機能し得るものである。
【００４３】
（２）本発明の分析方法とＥＬＩＳＡ法との対比
本発明の分析方法による測定結果の信頼性を確認するために、同一濃度のミクロシスティン試料に対して、前記した分析手順に沿う本発明の分析を行い、また、従来からの、ＥＬＩＳＡ法により分析を行った。
それぞれの方法から分析されたミクロシスティン濃度の関係を図３に示した。
【００４４】
図３から明らかなように、本発明の分析方法の場合の方がミクロシスティン濃度は若干高い値で検知されているが、ＥＬＩＳＡ法との間では良好な直線関係を示している。
すなわち、本発明の分析方法は、従来のＥＬＩＳＡ法に代わるミクロシスティン濃度の定量法として採用することができる。
【００４５】
（３）実測
容積５mLのプラスチック製遠心沈殿管に、ミクロキスティスの含有量が異なる試水１mLを採取し、全体を温度５０℃で２０分間加熱した。ついで、平均孔径０.２μｍの限外濾過膜で濾過した。得られた溶液を分析用試料とした。
この分析用試料を用いて、以後は、(1)で述べた分析手順に従って吸光度を測定した。その結果を図４に示した。
【００４６】
図４中の直線は、図２で示した検量線である。この図４から明らかなように、試水中のミクロキスティスから本発明の抽出法で抽出されたミクロシスティンの濃度の定量が可能になっている。
【００４７】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、水圏プランクトンや微生物を加熱するだけでその産生毒素を抽出することができ、そしてその定量分析が可能である。
したがって、本発明は、藍藻類や水に存在するミクロシスティンのようなプロテインホスファターゼ活性阻害毒素を迅速かつ簡便に分析する方法および装置としてその工業的価値は大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の好適な分析装置例を示す基本構成図である。
【図２】本発明の分析方法における検量線である。
【図３】本発明の分析方法による結果とＥＬＩＳＡ法による結果との対比を示すグラフである。
【図４】ミクロキスティスに対する本発明の分析方法における実測結果を示すグラフである。
【符号の説明】
Ａ                毒素抽出手段
Ｂ                毒素濃縮手段
Ｃ                酵素反応手段
Ｄ                吸光光度計
１                加熱槽
４                抽出毒素の貯留槽
５                ｐ−ニトロフェニルリン酸塩緩衝液の貯留槽
６                酵素カラム
２１，２２，２３  三方コック
３１，３２        膜分離装置
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３  ポンプ
Ｗ１〜Ｗ１２      経路
Ｗ１３            全体のドレイン経路
Ｖ１，Ｖ２        バルブ
【図１】
0003994353.tif 000002
【図２】
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【図３】
0003994353.tif 000004
【図４】
0003994353.tif 000005