(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄細胞の移植を促進するための、ドナー由来の細胞組成物を調製する方法であって、
ヒト、マウスまたはラット由来の造血細胞混合物からB220-、Mac-I-、CD45+、CD45R+、CD3+、CD8+、CD4-、αβTCR-およびγδTCR-からなる群より選択される少なくとも１つの表現型の細胞画分を選別すること、
ヒト、マウスまたはラット由来の別の造血細胞混合物からＴ細胞を除去すること、及び
選別した前記細胞画分を、前記のＴ細胞を除去したヒト、マウスまたはラット由来の造血細胞混合物に加えて細胞組成物を調製すること、
を特徴とする、前記方法。
【請求項２】
細胞画分の選別が、ヒト、マウスまたはラット由来の造血細胞混合物からαβTCR-の表現型の細胞画分を選別することである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞画分の選別が、マウス由来の造血細胞混合物を細胞選別法に供して、B220-、Mac-I-、CD45+、CD45R+、B220-/CD45R+、CD8+/CD45R+、CD8+/CD45R-、CD4-/CD45R+、CD4-/CD8+、CD8+/CD45R+/αβTCR-、CD8+/CD3+、CD3+、CD8+、CD4-、αβTCR-またはγδTCR-の表現型の細胞画分を得ることである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒト、マウスまたはラット由来の造血細胞混合物を、細胞表面マーカーαβTCRまたはγδTCRに対する抗体を用いた陰性選択に供して、細胞画分を調製することを特徴とする、骨髄細胞の移植を促進するためのドナー由来の細胞組成物を調製する方法。
【請求項５】
ヒト、マウスまたはラット由来の造血細胞混合物を、細胞表面マーカーαβTCRに対する抗体を用いた陰性選択に供して、細胞画分を得ることを特徴とする、骨髄細胞の移植を促進するためのドナー由来の細胞組成物を調製する方法。
【請求項６】
前記抗体が磁気ビーズに結合されている、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記造血細胞混合物を最初に密度勾配遠心分離によって分離させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記造血細胞混合物が、骨髄、胸腺、末梢血、胎児肝臓または胚卵黄嚢に由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞組成物が、Ｂ細胞および／またはＮＫ細胞が除去されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって調製される細胞組成物。
【請求項１１】
マウス由来の造血促進細胞混合物から細胞選別によって得られたB220-、Mac-I-、CD45+、CD45R+、B220-/CD45R+、CD8+/CD45R+、CD8+/CD45R-、CD4-/CD45R+、CD4-/CD8+、CD8+/CD45R+/αβTCR-、CD8+/CD3+、CD8+、CD4-またはαβTCR-の表現型の細胞画分と、Ｔ細胞除去を行った造血細胞混合物とを含有する、骨髄細胞の移植を促進するためのドナー由来の細胞組成物。
【請求項１２】
請求項10または11に記載の細胞組成物を含有する、レピシエントにおける造血幹細胞の移植を促進するための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項10または11に記載の細胞組成物を含有する、骨髄移植用の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項10または11に記載の細胞組成物を含有する、哺乳動物のリンパ造血系を部分的にまたは完全に再構成するための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項10または11に記載の細胞組成物を含有する、ドナーの細胞、組織または臓器の長期移植を促進する目的で哺乳動物においてドナー特異的免疫寛容を引き起こすための医薬組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物が、前記細胞組成物の由来するヒト、マウスまたはラットに対して異種である、請求項14または15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、前記細胞組成物の由来するヒト、マウスまたはラットに対して同種異系である、請求項14または15に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は、哺乳動物の造血促進細胞（facilitatory cells、ＦＣ）に関するものである。特に、本発明は、ＦＣの単離、特徴づけ、及び使用に関するものである。本発明のＦＣは、他のあらゆる既知の骨髄細胞から、それらの形態、細胞表面の表現型、及びイン・ビボでの機能によって区別することができる。今日では、精製した造血幹細胞単独、又はＦＣを除去した骨髄細胞では、レシピエントには容易に移植されないことがわかっている。ＦＣを、他の骨髄細胞、特に、造血幹細胞とともにレシピエントに同時投与すると、ＦＣは、不利な生物学的活性を呈することなく、これらの細胞の移植を促進する。実際、移植細胞対宿主病を生じることなくリンパ造血のキメリズムを確立する際、ＦＣが骨髄細胞の移植を促進する能力によって、ドナー特異的寛容性を誘導し、ドナーの細胞、組織及び器官の永久的な受容を可能にする。したがって、ＦＣは、癌、貧血、自己免疫疾患、免疫不全、ウイルス感染、および代謝異常の治療に際して、骨髄移植によって造血機能を再構成したり、固形の器官、組織、および細胞の移植を容易にすることを含むがこれに限定されない多岐にわたる用途を有しうるものである。
２．発明の背景
固形器官の移植における主たる目標の一つは、他の外来抗原に対するレシピエントの免疫応答能は保全しつつ、レシピエントが移植片拒絶免疫応答を生じることなくドナーの器官を移植することである。典型的には、非特異的免疫抑制剤、たとえばシクロスポリン、メトトレキセート、ステロイド、ＦＫ５０６を使用して宿主の拒絶応答を防ぐ。これらの免疫抑制剤は、連日にわたって投与する必要があり、通常、投与を中止すると、移植片拒絶反応が生じてしまう。しかし、免疫応答のあらゆる側面を抑制することによって機能する非特異的免疫抑制剤は、レシピエントの感染症及び癌を含む疾患に対するレシピエントの感受性を大きく増加させてしまう。更に、免疫抑制剤の使用にもかかわらず、移植片拒絶は、依然として、ヒトの器官移植において病的状態や死亡の主因である。移植された心臓で５年間生着しているのは５０％に過ぎず、移植された腎臓で１０年間生着しているのは２０％に過ぎない。（Powles, 1980, Lancet, p. 327; Ramsay, 1982, New England J. Med., p. 392を参照のこと）。ヒトの移植片のほとんどは、永久的に受容されることなく、１０年以内に機能しなくなる。したがって、レシピエントの寛容を誘導することができれば、重要な進歩となるであろう。
完全な全身的ドナー特異的移植寛容が生じる唯一既知の臨床状態は、骨髄移植によってキメラ状態が創出された場合である。（Qin et al., 1989, J. Exp. Med. 169: 779; Sykes et al., 1988, Immunol. Today 9: 23; Sharabi et al., 1989, J. Exp. Med. 169: 493を参照のこと）。これは、出生直後及び成熟した動物モデル、ならびにヒトにおいて、レシピエントの全リンパ球放射線照射に続いて、ドナーの細胞を骨髄移植することによって達成されてきた。骨髄移植の成功率は、部分的には、ドナーの細胞と、レシピエントの細胞との主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）を、密接に一致させることができるかに依存している。ＭＨＣは、ドナー及び宿主両者の細胞表面に発現される膨大な数の個々人に特有の糖タンパク質をコードする遺伝子複合体であり、移植拒絶免疫応答の主要な標的となる。ヒトにおいては、ＭＨＣはＨＬＡとして称される。患者と家族、たとえば兄弟を適合させて、ＨＬＡを同一とすることができた場合には、移植細胞対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性が完全になくなるわけではないものの、成功する確立は比較的高い。しかし、同一種のＭＨＣ非適合の２個体間で同種異系骨髄移植を行った場合には、通常、生着不良、免疫応答不良、及び高率のＧＶＨＤが併発する。
ＧＶＨＤは、骨髄移植において死に至る可能性のある合併症で、未処理のＨＬＡ−同一の骨髄の移植を受けたレシピエントの約３５−５０％（Martin et al., 1985, Blood 66: 664）、及びＨＬＡ−非同一の骨髄の移植を受けたレシピエントの８０％以下で発症する。残念ながら、適切に適合したＨＬＡ−同一の家族をドナーとして有する患者は、一般に３０％に過ぎず、したがって、ほとんどの患者は、骨髄移植の考慮対象外とされるか、移植を行うにしても、高率のＧＶＨＤの危険性を覚悟しなければならない。ＧＶＨＤは、ドナーの移植物中に含まれる免疫応答能のある成熟した免疫細胞（主にＴ細胞であるが、一部のＢ細胞及びナチュラルキラー細胞）が宿主の組織の抗原を異物として認識し、不利な免疫応答を誘発する能力を有している結果、生じるものである。ドナー及びレシピエントの骨髄の混合物を移植する混合同種異系再構成を行うと、免疫応答性が改善され、ＧＶＨＤに対する抵抗性が増大するものの、依然として、うまく生着するとは限らず、ＧＶＨＤもしばしば発症する。
骨髄移植についての最近の研究では、ＧＶＨＤの主因がＴ細胞であり、ドナーの細胞調製物からＴ細胞を除去すると、ＧＶＨＤの発症率が低減することを示唆する（Vallera et al., 1989, Transplant, 47: 751; Rayfield, 1984, Eur. J. Immunol., p. 308; Vallera, 1982, J. Immunol., 128: 871; Martin and Korngold, 1978, J. Exp. Med., p. 1687; Prentice, 1984, Lancet, p. 472）。動物モデルで、ＧＶＨＤの主なメディエーターがＴ細胞であると考えられるようになってから、ヒトドナーの骨髄からのＴ細胞除去（ＴＣＤ）を行うための積極的なプロトコールが計画された。ＧＶＨＤの発症率は劇的に減少したものの、ＴＣＤに伴って移植不良が有意に増加し、Ｔ細胞が骨髄の移植に際して実際の役割も果たしている可能性を示唆している。（Soderling, J. Immunol., 1985, 135: 941; Vallera, 1982, Transplant, 33: 243; Pierce, 1989, Transplant, p. 289）。ヒトレシピエントにおける移植不良の増加は、患者全体の約５−７０％の範囲にわたり、ドナーとレシピエントとの間でＭＨＣの差異の程度に相関した（Blazar, 1987, UCLA Symp., p. 382; Filipovich, 1987, Transplant, p. 62; Martin et al., 1985, Blood, 66: 664; Martin et al., 1988, Adv. Immnol. 40: 379）。移植不良を生じた患者は、たとえ二度目の骨髄移植を行っても、大抵、死亡する。その結果、米国の移植施設の大半は、ドナーの骨髄のＴＣＤを中止し、したがって、重篤な疾病状態及び死亡に至るＧＶＨＤが高率で発生する事態を受け入れざるを得なくなった。その結果、治療の一形態としての骨髄移植の適用は、潜在的な利益が、ＧＶＨＤの可能性よりも明らかに優れる場合のみに制限されている。
Ｔ細胞が、有害なＧＶＨＤの反応と、有用な移植の促進の双方に関係しているという考え方は、科学的共同体において長年存在してきた謎であった。研究者たちは、骨髄の移植を促進しうるものの、ＴＣＤの間に除去されてしまう骨髄の成分が存在する可能性について探求を開始した。この促進成分の特定及び精製は、移植をプロトコールを計画し、移植を高め得る細胞を保全しながら選択的にＧＶＨＤを防止することを可能にする。
ほとんどの研究者は、この促進成分が造血幹細胞と区別される造血細胞であると推測したが、本発明より先に、かかる成分が同定され又は特徴づけられることはなかった。実際、あらゆる証拠が、いくつかの形態のＴ細胞への関与を指摘していた。ＧＶＨＤを生じることなく、レシピエントの造血幹細胞の移植を促進しうるこの成分を同定する正確な知識は、強く必要とされ続けていた。
３．発明の要約
本発明は、上記の長年切望されてきた必要性を満足するものである。本発明は、哺乳動物の造血ＦＣ、該細胞の単離方法、ならびに損傷若しくは破壊された自己、同種同系、同種異系、又は異種の造血機能の幹細胞による再構成を促進し、及び、ドナー細胞、組織および固形器官の移植についてドナー特異的寛容を誘導するための該細胞を使用する方法に関する。
本発明は、部分的には、ＴＨＹ１+、ＭＨＣのクラスＩＩ+（僅少ないし中程度の発現にとどまる）、ＣＤ４５+、ＣＤ４５Ｒ+、ＣＤ８+、ＣＤ３+、及びαβＴＣＲ-の表現型を示し、同種異系ドナーの骨髄細胞のレシピエントへの生着を促進しうる細胞集団が、マウスの骨髄に含まれているという出願人の発見に基づくものである。これらの細胞の除去を行うことを含む消極的選別方法及び高度に又は部分的に精製した形態でこれらの細胞を加えることを含む積極的選別方法のいずれも、それらは移植促進活性を有しており、かつ、ＧＶＨＤの原因となるＴ細胞と区別可能であることを確かにする。精製ＦＣは、形態学的には、リンパ球を含む他の全ての造血細胞の型と区別される。さらに、これらの細胞は、骨髄細胞のＭＨＣハプロタイプがＦＣと同一であれば、骨髄細胞の最適な移植が達成される点でＭＨＣ特異的様式で作用する。本発明のＦＣはまた、混合リンパ球造血キメリズムを確立するに際して、種の障壁を越えた異種骨髄移植を媒介することもできる。
本発明を、実施例によって説明し、マウス、ラット、ヒヒ、及びヒトのＦＣを単離し、ならびにその細胞表面の表現型を特徴づける。ＧＶＨＤを発症することなく、ドナーの骨髄細胞の移植を首尾よく確立させるために単離したＦＣを使用する。また、ＧＶＨＤを生じる細胞、特にＴ細胞を除去し、ＦＣを残存させたドナーの骨髄細胞は、生着及び混合キメリズムをもたらし、レシピエントをドナーに対する免疫寛容にする。ここに記載する本発明によってなされる多岐にわたるＦＣの使用は、移植、ならびに、癌、代謝異常、免疫不全、自己免疫疾患、糖尿病、ヘモグロビン異常症、肝炎、エイズ、および老化の治療を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明は骨髄または造血細胞の他の生理学的材料からFCを精製する方法を提供する。このFCは特定のマーカーが存在する、または存在しないことに基づく分離により精製される。
骨髄または精製幹細胞の移植化を容易にしてキメラ造血免疫系を確立するFCの能力を利用することにより、本発明はドナー特異的移植寛容を賦与し且つ非特異的な免疫抑制剤に対する必要性を省く移植方法を提供する。
本発明の目的は、精製または部分精製の造血FCを含む細胞性組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、精製または部分精製の造血FCおよび（MHCが該FCに特異的である）精製または部分精製の造血幹細胞を含む細胞性組成物を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、精製または部分精製の造血FC、MHCが該FCに特異的な造血幹細胞、およびMHCが該FCに特異的な１種類以上の他の造血細胞成分を含む細胞性組成物を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、GVHDに係わるT細胞のみが特異的かつ選択的に除去された造血幹細胞と造血FCを含む細胞性組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、造血細胞の生理学的材料から造血FCの精製方法を提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は、混合同種、混合異種、完全同種および完全異種キメラ免疫系をレシピエント中に確立する方法を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、ドナー特異的移植寛容を可能とする、ドナーの生理学的成分をレシピエント中に移植する方法を提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は、多様な疾患および不全を、FCをともなう骨髄移植により治療する方法を提供することにある。
３.１．定義
ここで用いる「レシピエント」はヒトを含めたすべての哺乳類を意味する。
ここで用いる「ドナー」はヒトを含めたすべての哺乳類を意味する。
これまで理解されてきた意味だけが示される場合を除いて、ここで用いる「MHCが特異的である」細胞は、細胞主要組織適合複合体（MHC）が実際に促進細胞（facilitatory cell）と同一であるかないかにかかわらず、または普遍的な促進細胞の場合ではMHCが単に移植に対する障壁ではあるかないかにかかわらず、主要組織適合複合体が促進細胞の移植化の促進を妨げない細胞を意味する。
ここで用いる「精製の」は、特定された細胞を自然の状態から濃縮するかまたはその濃度を高めること（これら細胞の単離を含む）を意味する。
ここで用いる「実質的に破壊する」は、レシピエントの全てまたはほとんど全ての免疫系を破壊することを意味する。
ここで用いる「致死放射する」は、レシピエントの免疫系を放射線により実質的に破壊することを意味する。
ここで用いる「免疫抑制する」は、異物認識細胞を攻撃する傾向（すなわち移植片の拒絶）の抑制等のレシピエントの免疫系の機能を抑制することを意味する。
ここで用いる「細胞減少させる」は、投与を受ける免疫細胞ために物理的空間を作るようにレシピエントの免疫系の細胞の一部を破壊することを意味する。
ここで用いる「ドナー生理学的成分」は、器官、組織および細胞等のドナーの体の一部またはいくつかの部分の組合せを意味する。
ここで用いる「キメラ」は、レシピエントの細胞と少なくとも１ドナーの細胞を有するレシピエントを意味する。
ここで用いる「同系」はドナーに由来するものであることを意味し、このドナーはレシピエントと遺伝学的に同一である。
ここで用いる「同種」はドナーに由来するものであることを意味し、このドナーはレシピエントとは同じ種のものである。
ここで用いる「異種」はドナーに由来するものであることを意味し、このドナーはレシピエントとは異なる種のものである。
ここで用いる「混合キメラ免疫系」は、0.5％〜99％の同種または異種細胞と残りのパーセントの同系細胞からなるレシピエント免疫系を意味する。
ここで用いる「完全同種細胞キメラ免疫系」はある種のレシピエント免疫系を意味し、この免疫系は同種および同系の両方の細胞の投与により作られたものであって、事実上100％の同種細胞（しかし、限定された数の免疫細胞系統を提供するために残っている同系細胞が一部存在してもよい）からなるものである。
ここで用いる「完全異種キメラ免疫系」はある種のレシピエント免疫系を意味し、この免疫系は同系および異種の両方の細胞の投与により作られたものであって、事実上100％の異種細胞（しかし、限定された数の免疫細胞系統を提供するために残っている同系細胞が一部存在してもよい）からなるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は精製FCの透過型電子顕微鏡写真を示す。
５．発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類の造血FC、そのFCを単離し特性付ける方法、およびそれを用いる方法に関する。
初期の陰性選択（negative selection）研究では、造血促進細胞はCD8-であるという見方を導いたが、ここに記載するその後の研究では、FCの適当な表現型としてCD8+があるという結論が得られた。陽性選択（positive selection）研究によりこの促進細胞は現在はCD8+であると結論的に示されたので（以下のセクション７を参照されたい）、CD8-に関する初期の前記結論を導いたここに記載の実験データは資料という趣旨のためのみに示したものである（以下のセクション６を参照されたい）。これらの一見して矛盾する結果は、セクション６に用いられた陰性選択方法において抗体と補体で処理されたときにCD8を低濃度で発現する細胞の不完全な除去によるものかもしれない。陽性選択のために抗CD8モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリー研究において、促進活性を示す小集団のCD8+細胞が同定されている。同様な観察がFCマーカーとしてのCD3について得られた。陰性選択アプローチによるCD3+細胞の除去はFCを排除しなかったが、FCは細胞選別実験とアドバック（add-back）実験によりCD3+であることが示されている。セルソーターはさらに高い感度と正確性で細胞表面上の低密度の抗原の同定を行なう。
さらに、促進細胞集団はクラスII鮮明であるとも元来考えられた。この決定は抗クラスII抗体減少研究に基づく推定によりなされた。それに続く陽性選択とアドバック実験において、促進細胞はクラスII鮮明フラクションにあるのではなく、弱い〜中程度染色レベルの範囲のクラスII分子を発現していることが示された。これは、他の細胞タイプをコントロールとして比較することにより３レベルの染色の強さを区別するフローメトリーと抗体染色により決定された。例えば、クラスII-細胞はバックグランドとして用いられ、B細胞や樹枝状細胞等の細胞を示して明るく染色するクラスII+抗原はクラスII鮮明とみなされた。さらに、電子顕微鏡法を用いるここに記載の同時形態学的研究（以下のセクション７）により、クラスII鮮明はリンパ球として同定された。したがって、B細胞に比較すると、FCはクラスII陽性であるが、クラスII鮮明ではない。
本発明は以下のサブセクションでさらに詳しく説明するが、これは単に説明を目的するものであって、限定を目的とするものではない。説明の明確化のために、ここに記載の具体的な操作と方法はマウスモデルを用いて例示するが、これらは本発明の実施の例証のためだけに記載するものである。類似の操作と技術はすべての哺乳類種に等しく適用することができ、これにはヒトを対象として包含するものであるが、これはドナーとして用いられるFCおよびそうした細胞を移植により受けるヒトレシピエントを用いるという点からである。したがって、同様な表現型と機能を有するヒトFCはここに記載の条件下で用いることができる。さらに、非ヒトの動物FCはヒト患者で異種細胞の移植化を増進させるために用いることもできる。
５.１．促進細胞の特性付け
全身の致死量放射後に同系（ホスト）と同種または異種（ドナー）骨髄がともに投与された混合キメリズムのモデルにより、促進細胞の同定が可能となった。多様な細胞サブセットを除去するか選択し、次にこれをRAMB、THY1または（多様なCDマーカーに対する）モノクローナル抗体を用いてT細胞を激減させた骨髄に戻すためのドナー骨髄接種材料の処理は、同種骨髄の移植化と混合同種キメリズムの全体的なレベルに劇的な影響を示した。この混合骨髄接種材料の同系と同種の両成分のTCDを実施すると、混合多系統リンパ造血キメリズム（mixed multilineage lymphohematopoietic chimerism）が生じる。ホストとドナーの赤血球細胞、血小板、T細胞、B細胞、骨髄系統細胞およびNK細胞の混合物は検出することができるので、同系および同種の両方の幹細胞はともに接合（co-engraft）するという証拠がある。リンパキメリズムのレベルは他系統のものとは同じではないために、各系統は独立して調節される。しかし、各系統の同種キメリズムのパーセントは、約12カ月以内において、レシピエントの生存のためにほとんど変動がなく、依然として著しく安定的である。
THY1を発現する細胞から骨髄接種材料の同種成分を減少させると、混合キメリズムが観察される。これとは著しく対照的に、未処理の同種骨髄が投与されると、同種幹細胞移植化の促進が起こり、100％の同種キメリズムが生じる。この効果は非常に効能があるが、これは投与量滴定研究によれば、TCD同種骨髄細胞が移植に失敗した場合にグラフと促進効果が確実に得られ、その結果として同系の再集団のみがもたらされるためである。同種幹細胞の移植化の同様な促進は、CD4+、NK細胞、成熟単球およびマクロファージ、またはB細胞が除去される場合に生じる。したがって、混合キメリズムモデルは移植化促進活性が可能な細胞の同定および特性付けのためにインビボのモデルを提供する。
ここに記載の研究は、促進細胞は幹細胞ではないことを示すものであって、その理由は（１）抗RAMBによる処理は、移植化がヒトよりも容易に起こる齧歯類において、同種骨髄移植化に対する促進効果を消失させるが、（100％の同種移植化とは対照的に）混合キメリズムが生じ、（２）同種マウス骨髄細胞のTHY1.2細胞減少も促進効果を消失させるが、混合キメリズムの形における同系：同種移植のバランスはRAMB処理後のよりもわずかに高いからである。RAMBのいくつかのバッチは骨髄幹細胞を除去するとよく特性付けられているが、この効果は他の実験においてそれらの使用の前に同系（A〜A）再構成研究で除かれており、これは骨髄からすべての幹細胞の除去の結果として移植化の失敗から死がもたらされるためである。
一つの可能な説明は、骨髄からのTHY1.2減少またはRAMBの減少は、骨髄始原細胞の選択的減少を導くというものである。しかし、未処理同系骨髄細胞に対して段階別の数のTCDが致死照射マウスに投与されると、生存曲線は両グループについて類似しており、両方の骨髄調製物は類似の再構成能力を有していることを示している。この同系再構成の場合、比較的に放射線抵抗性の「促進細胞」はレシピエントマウス個体に内生的に存在している。したがって、抗体処理後の幹細胞減少は、未処理の同種骨髄に対するTCDのレシピエントに見られる減少レベルのキメリズムを説明しそうにもない。
さらに、ここに記載の造血幹細胞とFCは細胞表面マーカー発現の異なる特徴を有している。骨髄幹細胞はほとんどの部分でCD34+、CD3-、CD7-、CD8-、CD10-、CD14-、CD15-、CD19-、CD20-、CD33-およびTHY1+であるものとして特徴付けられることを米国特許第5,061,620号は主張している。さらに、真の造血幹細胞はクラスII-であると信じられている。THY1マーカーはクラスT細胞、NK細胞およびいくつかの骨髄細胞上に存在しているが、ラップとヒトの成熟T細胞上には存在していない。精製された細胞は遺伝的に同一であるレシピエントに移植されると、通常は移植化が起こる。しかし、これらの高く精製された細胞は、遺伝的に異なる同種または異種のレシピエントには移植化しない。
ここに記載する研究は多分化能骨髄幹細胞はクラスII陽性ではないことを示してる。クラスII陽性細胞を除去するための二つの異なるアプローチ（陰性選択を用いかつ抗体と補体処理によるフローサイトメトリー）を用いて、同種幹細胞移植化に関する促進効果は除去され、多系統混合キメリズムに導びかれる完全な同種移植化を排除する。幹細胞がこれらの減少により除去された場合、同系のみの再集団が生じたであろう。
米国特許第5,061,620号に記載された骨髄幹細胞フラクションもTHY1陽性であるが、THY1の低い陽性とTHY1の明るい陽性との区別は重要である。この差異を参照として幹細胞を富ますアプローチが可能となるが、その理由は幹細胞上のTHY1抗原発現レベルは最近まで当業者に正しく評価されず（Spangrude et al., 1988, Science 241:58）、係わった（さらに成熟した）幹細胞後代を分化の少ない細胞に対して分離させる際の重要なファクターであったためである（Spangrude, 1989, Immunology Today 10:344も参照されたい）。さらに、最近の報告はTHY1.2対立形質を有するマウスの幹細胞上にTHY1の発現がないことを示している（Spangrude and Brooks, 1992, Blood 80:1957）。
著しい対照として、促進細胞の精製はクラスII陽性細胞フラクションの増加に頼っている。さらに、幹細胞がないときにこれらの細胞のみが致死照射同系（A〜A）受容体を再構成しない一方で、50〜100同系幹細胞のみがマウスにおける致死照射からの救助に十分である。
同じ操作にしたがうヒト骨髄の詳細な分析は、フローサイトメトリー上の同様な前方および側面の散乱により（CD34-である）クラスII+細胞集団を明らかとする。これはヒト促進細胞集団を示すものと信じられている。齧歯動物の対応する細胞のように、ヒト細胞はB細胞（CD19、CD20）、単球／マクロファージ（CD14）およびT細胞（CD4、αβ-TCR、CD3）マーカーに関して陰性である。抗CD34に等しいモノクローナル抗体は齧歯幹細胞では存在していないために、推定促進細胞集団に対するCD34染色との比較は実施することができない。
FCは新規な細胞集団であるので、FCが、いまだに同定されたことのない他のマーカーを発現することがありうる。そのような場合、これらの独自の分子を同定する以前の失敗は、他の造血細胞タイプ中での発現の低下または欠如によるものかもしれない。したがって、そのような未知のマーカーを同定し特性付けるために、FCを用いて細胞表面抗原に対する抗体を産生することができる。さらに、そのような抗体はこれら細胞の特性付けおよび精製に有用であろう。
特にヒトおよび齧歯類由来のFCにより発現された新規な抗原性マーカーを認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体産生も本発明の範囲の一部である。知られている多様な方法を用いて、これらの細胞に対する抗体をそれらの単離後に産生することができる。抗体の産生のために、精製または部分精製の生存可能なFC固定細胞または膜調製物（ウサギ、ハムスター、マウス、ラット等のものが挙げられるが、これらに限定されない）を用いた注射により多様なホスト動物に免疫性を与えることができる。ホスト種に基づいて多様なアジュバントが免疫学的応答を向上させるために用いることができ、アジュバントとして（完全または不完全）フロイント、無機ゲル例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳濁液、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（無菌化ウシ型結核菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
FC上の新規な抗原に対するモノクローナル抗体は、培養での連続細胞系による抗体分子の産生を提供する技術を用いることにより調製することができる。これら技術として、KohlerとMilsteinにより最初に記載されたハイブリドーマ技術（1975, Nature 256, 495-497）、さらに最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）およびEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
同系、同種、および異種ホストは、生存可能な形または固定された形で、または抽出された膜フラグメントとして調製することのできるFCにより免疫性を与えてもよい。モノクローナル抗体は、FCに対しては選択的に結合するが、成熟マクロファージ、顆粒球、樹枝状細胞、T細胞、B細胞および幹細胞には結合しないことにより区別させて選抜することができる。
分子の結合部位を有する抗体フラグメントは公知の技術により作ることができる。例えば、そうしたフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により作ることのできるF（ab'）2フラグメントおよびF（ab'）2フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作ることのできるFabフラグメントがあるが、これらに限定されるものではない。
ドナー細胞移植化を増強する際のFCの活性は、細胞間相互作用および／またはサイトカイン産生に関与する機構を示唆するものでもある。FCにより作られる潜在的な新しいサイトカインを同定するために、長期のFC培養を確立してもよいし、または連続細胞系をウイルスか薬品を用いてFCで腫瘍細胞を形質転換することにより作ってもよい。培養上清は、バイオアッセイで特定のサイトカインに応答することが知られているインディケーターとして用いられる多様な細胞タイプにそれら上清を適用することにより直接に分析することができる。細胞は代謝を通じて標識することができ、それらの上清を生化学的な分析に供してもよい。SDS-PAGEおよび／または生物活性により主要タンパク質を同定したら、そのタンパク質を調製用SDSゲル、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動ゲルにより精製することができる。タンパク質の純度はSDS-PAGEにより確かめられ、タンパク質アッセイで定量され、それらの活性はバイオアッセイで確認されポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生用の免疫原として用いられる。
さらに、これら精製タンパク質は、多様な組織タイプの広い範囲のインディケーター細胞系の増殖および／または分化の促進および／または抑制するためにバイオアッセイで調べることができる。放射能標識タンパク質は、アフィニティー標識等の方法によりそれらの細胞表面レセプターの同定に用いてもよい。サイトカインに対する特定の抗体を用いて、膜形および分泌形のサイトカインを同定・定量し、それらの生合成経路を研究し、該タンパク質を親和性に基づいて精製し、そしてコード配列の分子クローニングのために発現ライブラリーを免疫的にスクリーニングしてもよい。
５.２．促進細胞の単離
本発明は、骨髄、または造血細胞の他の生理学的材料からFCを富ませるおよび／または精製する方法を提供する。FCの活性は、その原料から濃縮されると、比較的小量でそれらを使用することができ、絶対的な純度は必要ではない。FCはそれが存在する組織から多様な分離方法を用いて単離することができる。以下のセクション７はそうした方法の変法を骨髄からFCを分離するために示す。本発明のこの特徴にしたがえば、FCは特定のマーカーの存在または非存在に基づく分離により単離することができる。
骨髄が好ましいが、造血細胞の他の生理学的材料（例えば、脾臓、胸腺、血液、胚芽卵黄嚢または胎児肝臓）を利用してもよい。骨髄は大腿骨または脛骨から分離するのが好ましいが、脊椎または他の骨腔から分離してもよい。骨髄は当業者によく知られている多様な方法（生理学的媒体、平衡塩溶液、生理学的緩衝液および他の天然因子の混合物を骨にざっと流す等）により骨腔から分離してもよい。骨髄を濾過し、遠心し、再び懸濁するのが典型的である。
造血細胞材料がいったん得られたら、造血FCは特定の抗体を利用する多様な方法により得ることができ、そうした抗体としては多様なマーカーを有するかまたは欠いている細胞を選択するために特定のマーカーに結合するものが好ましい。これらの技術は、例えば、蛍光活性化セルソーター（FACS）と特異的蛍光色素を用いるフローサイトメトリー、アフィニティーカラムマトリックスまたはプラスチック表面などの固体支持体に結合させた細胞表面マーカー特異的抗体およびアビジンまたはストレプトアビジンに複合させたビオチンを用いるビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジン分離、抗体被覆の磁気ビーズを用いる磁気的な分離、抗体および補体または細胞毒か放射活性同位体に結合させた抗体などの破壊分離を挙げることができる。
抗体による特定マーカーのための分離は、陰性または陽性分離方法によってもよい。陰性分離において、所望としない細胞上に存在するマーカーに特異的な抗体を用いる。抗体が結合した細胞を分離または溶解させて、残った所望の混合物はもとのままに保たれる。陽性分離において、所望の細胞上に存在するマーカーに特異的な抗体を用いる。抗体が結合した細胞は分離されてもとのままに保たれる。陽性および陰性分離は実質的に同時にまたは順次に用いてもよいことが理解されるであろう。本発明は、ここに記載のように、FCの特徴的表現型に基づいて細胞を単離することのできる分離技術も包含するものであることも理解されるであろう。
現在までのところ、抗体に基づく分離に最も共通した技術はフローサイトメトリーの利用、例えばFACSによるものであった。典型的には、フローサイトメトリーによる分離は以下のとおり行なわれる。造血細胞の懸濁混合物を遠心し、これを媒質中に再び懸濁する。蛍光色素に複合させた抗体を添加して、この抗体を特定の細胞表面マーカーに結合させる。次に、この細胞混合物を１回以上の濾過・再懸濁ステップにより洗浄する。この混合物は異なる蛍光特性に基づく細胞を分離するFACSを通過させる。FACSシステムは、多色分析等の性能と能力の異なるレベルに利用することができる。促進細胞はサイズと粒度により、ならびにある種の細胞表面マーカーの陽性および／または陰性発現により影響を受ける前方および側面の散乱の特徴的プロフィールにより同定することができる。
フローサイトメトリー以外の他の分離技術はより速い分離を提供できる。このような方法の１つはアフィニティークロマトグラフィーによるビオチン-アビジンに基づく分離である。典型的には、このような技術は洗浄骨髄を特異的なマーカーに対するビオチン-結合抗体とインキュベートし、その後アビジンカラムを通過させて実施する。ビオチン-抗体-細胞複合体はビオチン-アビジン相互作用を介してカラムに結合していて、他の細胞はカラムを通過する。最後にカラム-結合細胞を摂動または他の方法で放出できる。ビオチン-アビジン系が特異的であるので迅速な陽性分離に適している。
フローサイトメトリーおよびビオチン-アビジン技術は高度に特異的な細胞分離法を提供する。所望により分離を、特異性は低いが、大量の″非促進″細胞を造血細胞源から除去できる技術で開始できる。例えば、磁気ビード分離法を使用して、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞およびマクロファージ（MAC）を含む″非促進″分化造血細胞群、並びに巨核球、マスト細胞、好酸球および好塩基球を含む微量細胞群を最初に除去できる。存在する総造血細胞の望ましくは少なくとも約70%、そして通常少なくとも約80%が除去できる。
好ましい最初の分離技術は密度勾配分離である。ここで、骨髄または他の造血細胞混合調製物を遠心分離し、そして上澄みを除去する。細胞を、例えば、10%FCS添加RPMI 1640培地（ギブコ社）に再懸濁し、例えば、フィコールまたはパーコールまたはユーロコリン（Eurocollin）培地を用いて調製した密度勾配にかける。その後、分離を遠心分離により実施するか、または例えばコベルおよび細胞分離器′2991（Cobel&Cell Separator）（コベブ（Cobev）、コロラド州、レイクウッド）を用いて自動的に実施できる。造血細胞混合物源とその濃度によっては別の分離手順が望ましいであろう。例えば、血液を造血細胞源として使用する場合は、いずれの画分の分離よりも前に赤血球を溶解することが望ましいであろう。さらに、懸濁分離法も、単独でまたは本文中に記載されている他の精製手順の全てと組み合わせて使用できる。（Noga et al., 1990, Prog. Clin. Biol. Res. 333:345; Noga et al., 1992, Prog. Clin. Biol. Res. 377:411）。
FCは一般にαβ-TCR-、γδ-TCR-、CD4-、CD5-、CD16-、CD19-、CD20-、CD56-、成熟骨髄系列（CD14-）、クラス（Class）II+、CD45+、CD45R+、THY1+、CD8+およびCD3+により特性決定される。高濃度のFCは、造血細胞の混合物をクラスII+およびTHY1+である画分を含む促進細胞に陽性分離をすることにより得られる。クラスII+画分は染色強度に基づきさらに分離でき、クラスII鮮明群は除去できる。
高濃度のFCは造血細胞混合物をクラスII+およびCD45R+である画分を含む促進細胞に陽性分離をすることにより得られる。さらに高濃度のFCは造血細胞混合物をクラスII+、CD45R+およびTHY1+である画分に分離することにより得られる。
上記のように、細胞を分離するために使用する特異的なマーカーは造血細胞混合物の起源に依存する。骨髄の約1-8%がクラスII陽性である。骨髄細胞の少なくとも80%は、本文中に記載の、促進細胞が保有していないマーカーを使用する陰性選択により除去される。造血細胞源が骨髄の場合は、高濃度のFCは多数の異なる陰性選択を連続することにより得られる。さらに高濃度のFCが、骨髄をクラスII+である画分に正の分離をすることにより得られる。さらに高濃度が、このクラスII+画分をCD19-である画分にさらに分離することにより得られる。
特異的なマーカーに基づく分離法が開示されているが、本発明は、分離が陰性分離、陽性分離、あるいは陰性および陽性分離の組み合わせであろうとも、そして分離が細胞選別または例えば、抗体に加えて補体処理、カラム分離、パンニング（panning）、ビオチン-アビジン技術、密度勾配遠心のような他の技術または当分野で習熟している者には既知の他の技術を使用していようとも、高濃度のFCから成る細胞組成物を生じる、本文中に開示されているFCの特性決定に基づく全ての分離を意図することが理解されよう。本発明は制限するものではないがヒト、霊長類、ヒヒ、ラット、マウスおよび他の齧歯類を含むいずれの哺乳類についても使用されるこれらの分離法を意図することが理解されよう。
造血細胞混合物の起源により、十分量のFCの試料を得るために必要な混合物の量が決定される。造血細胞混合物の起源により十分量の試料を得るのに必要な時間もまた決定される。例えば、血液中のFCの濃度は比較的低く、純粋なFCの画分を血液から分離するには、例えば、造血細胞混合物源として骨髄を使用する場合と比較して多量の血液と比較的長時間を必要とする。
FCは生理的な造血細胞源中に見いだされる細胞の約0.5%と8%の間で存在する。本文中に開示されたような分離法により、生理的な造血細胞源に天然に見いだされるより実質的に多量のFCから成る細胞組成物を生成できる。例えば、少なくとも細胞の約30%が前記のように特性決定された造血FCである細胞組成物が提供され、そして少なくとも細胞の約95%が前記のように特性決定された造血FCである細胞組成物もまた提供される。マーカーを適切に選択することにより、in vivoで使用するための実質的に純粋なFC群が提供できる。
５.３．促進細胞の使用
同種または異種のレシピエントでの骨髄供与細胞の移植を促進するFCの能力により、それらは移植手順を含む種々の治療プロトコールを促進するのに有用であることが示唆される。高濃度の造血FCから成る細胞組成物の処方は、GVHDの代わりの問題および移植の失敗に解決策を提供する。これとは別に、FCを保持しているT細胞除去供与骨髄もまた移植に使用できる。本発明は、混合同種または混合異種キメラ免疫系、完全同種または完全異種キメラ造血系の設立におけるFCの使用を提供する。一般に本発明法は、MHC-特異性供与幹細胞および目的とするいずれかの別の供与骨髄成分と共に、精製供与FCから成る細胞組成物の受容体への投与に関し、T細胞は好ましくは含まない。混合または完全同種または異種キメリズム（chimerism）が目的の場合は、FCおよび幹細胞から成る同系または自己細胞組成物を供与細胞組成物と共に投与する。しかしながら、FCを、宿主にとって自己または同系の他の供与細胞と共に使用する必要はない。同種または異種FCをMHC適合骨髄細胞と共に使用して、自己または同系供与細胞の同時投与をしないでレシピエントを再構築できる。
本発明のFCがT細胞ではなく、そして移植を促進できることを証明するように企画された研究を、同種および異種のセッティングの両方で実施した（上記実施例6-10を参照されたい）。異なる系のマウス間のようなある動物モデルでは、同種の骨髄移植が最も簡単に見えることは注目に値する。それ故、RAMBまたは抗-Thyで処理したマウス供与骨髄細胞は、FCを保持しつつ再構築を実施する場合より低レベルの移植ではあるが、同種の宿主で、あるレベルのキメリズムをなお通常生じることができる。しかしながら、マウスへのラット供与細胞の異種骨髄移植は、移植の失敗の結果としてレシピエントの死によって示されるように、TCD後の供与細胞を用いて達成することは一般にさらに困難である。異種骨髄移植での結論は、移植の失敗のために同種供与骨髄細胞のTCDが高死亡率を引き起こす点で、ヒト同種骨髄移植で観察される結果とさらに密接に類似している。それ故、動物モデルで異種移植および異種キメリズムを促進するFCの能力により、これらの細胞がヒト同種骨髄移植においてうまく使用できることが示される。理由は分からないが、イヌとブタでの同種骨髄移植は達成するのが最も困難なようだ。
FCは、FCに対してMHC-特異性の幹細胞と他の骨髄成分の移植を促進できる。特定の種または特定の種のある系は、伝統的に理解されているように、促進細胞に対して非MHC-特異性の幹細胞および他の骨髄成分の移植も促進できるFCを有することが可能である。便宜上、これらのFCを普遍的FCと呼ぶことにする。このような細胞から成る細胞組成物もまた本発明は意図する。さらに、FCおよび幹細胞はそのMHCと完全に適合する必要はないことが可能である。MHCのクラスIおよびクラスIIの両方の遺伝子内にサブ領域が存在する。それ故、これらの領域のただ１つで適合すれば、FCが幹細胞移植を促進するのに十分であり得る。このように重要なMHCサブ領域を規定するのを目的とする研究は種々の市販のMHC組換え近交系マウスを利用して、マウスで実施するのが最善である。
一般に、精製されたまたは一部精製されたFCは、キメラ免疫系の優位な生存を提供するために、FCに対してMHC-特異性である幹細胞の移植を促進する。幹細胞およびFCは共通の供与体または遺伝学的に同一の供与体からのものが好ましい。しかしながら、供与体が普遍的な促進細胞を有する種または種の系である場合は、幹細胞は促進細胞に対してMHC-特異性である必要はない。陽性選択、陰性選択、または陽性および陰性選択の組み合わせのいずれかにより、FCを個別に精製し、そしてその後、それらをMHC-特異性幹細胞および目的のいずれかの別の供与体骨髄成分と共に受容体に投与することにより、GVHDにより生じるT細胞が移植の失敗の恐れ無しで除去できる。結果として、混合または完全または完全に同種のまたは異種の再集団（repopulationn）が達成できる。
同種又は異種のキメラ免疫系の確立方法の一実施態様は、レシピエントの免疫系をほぼ破壊することを含んでいる。これは、当業者に周知の技術によって行なうことができる。これらの技術は、レシピエントの骨髄幹細胞のほぼ全面的な除去に帰着する。しかしながら、生き残って特異的免疫細胞の産生を続ける幾分か抵抗性のあるレシピエント幹細胞が存在することがある。これらの技術には、例えば、選択したレベルの放射線でレシピエントを致死的に照射すること、特定の毒素をレシピエントに投与すること、毒素又は放射性同位元素に付着させた特定のモノクローナル抗体を投与すること、又はこれらの技術の組み合わせがある。
骨髄は、ドナーの長骨から収集される。同種キメリズムに関しては、ドナーとレシピエントとは同種であり、異種キメリズムに関しては、ドナーとレシピエントとは異種である。高濃度のFCを含む細胞組成物が、他のドナーの骨髄細胞から、前掲の節5.2において開示された方法によって分離される。高濃度の造血始原幹細胞を含む別の細胞組成物が、残りのドナーの骨髄から分離される。高濃度の幹細胞を含む細胞組成物の分離は、FCを精製するのに用いるような技術によって行なうことができるが、異なる標識に基づくものである。最も注目に値するCD34幹細胞分離技術には、米国特許第5,061,620号に開示された方法、及びワシントン州、Bothellの法人、CellProによって製造された独立のLC Laboratory Cell Separation System, CD34キットがある。次いで、精製したドナーの促進細胞組成物と精製したドナーの幹細胞組成物とを、任意の割合で混合するのが好ましい。しかしながら、必ずしも、これらの細胞組成物を混合する必要はない。
促進細胞上では発現されない本明細書に開示された標識の何れか又は全てを用いた陰性選択によって促進細胞を精製すると、得られる細胞組成物は、FC及び他の未成熟な始原細胞だけでなく、幹細胞を含んでいる。殆ど精製の必要なしに造血促進及び幹細胞を保持しながらGVHD産生細胞を特異的に排除するのに、抗CD3及び抗TCR αβのようなＴ細胞特異標識に対する抗体を用いることができる。斯かる場合には、この一つの細胞組成物が、精製したFC及び精製した幹細胞を含む本明細書で先に言及した二つの細胞組成物の代りになる。
次いで、精製したドナーのFC及び精製したドナーの幹細胞を、レシピエントに投与する。これらの細胞組成物が別個の組成物である場合には、それらを同時に投与するのが好ましいが、比較的短い時間内に別々に投与してもよい。投与の態様は、静脈注射が好ましいが、これに限定されない。
投与されると、それらの細胞は、レシピエントの身体内の骨腔（bone cavity）、脾臓、胎児又は成体の肝臓、及び胸腺を含む種々の造血細胞部位へ向かうと考えられている。これらの細胞は、適当な部位に播種されることになる。これらの細胞は移植されてキメラ免疫系を形成し始める。非不遍（non-universal）のFCは、それらが移植を促進する幹細胞に関して伝統的に理解されていたように、MHC特異性のはずであるため、幹細胞及びFC双方が互いに結合して適当な部位に移植のための播種をすることが可能である。
同種移植又は異種移植の程度は、同系細胞と同種又は異種細胞との相対数と、レシピエントの条件付けの種類及び程度とに依存する滴定することのできる結果である。同系成分のFCを、TCD処理又は他の技術によって枯渇させた場合には、完全に同種異系又は異種のキメリズムが生ずるが、但し、閾値の同種異系又は異種のFCが投与されることが条件である。同系と同種異系又は異種とのほぼ同程度の移植が求められている。投与すべき種々の細胞の量が、特定の種のレシピエントに関して算出されている。例えば、ラットでは、Ｔ細胞を除去させた骨髄成分は、レシピエントあたり約１×107の細胞〜５×107の細胞が投与されるのが典型的である。マウスでは、Ｔ細胞を除去させた骨髄成分は、レシピエントあたり約１×106の細胞〜５×106の細胞が投与されるのが典型的である。人間では、Ｔ細胞を除去させた骨髄成分は、レシピエントの体重のキログラムあたり約１×108の細胞〜３×108の細胞が投与されるのが典型的である。異種間（cross-species）移植に関しては、より多数の細胞が必要である。
マウスでは、投与する精製したFCの数は、レシピエントあたり約１×104〜４×105のFCであるのが好ましい。ラットでは、投与する精製したFCの数は、レシピエントあたり約１×106〜30×106のFCであるのが好ましい。人間では、投与する精製したFCの数は、レシピエントのキログラムあたり約１×106〜10×106のFCであるのが好ましい。
マウスでは、投与する幹細胞の数は、レシピエントあたり約100〜300の幹細胞であるのが好ましい。ラットでは、投与する幹細胞の数は、レシピエントあたり約600〜1200の幹細胞であるのが好ましい。人間では、投与する幹細胞の数は、レシピエントあたり約１×105〜１×106の幹細胞であるのが好ましい。用いる特定の細胞の量は、レシピエントの健康状態を含む多くの要因に依存する。加えて、細胞を種々のサイトカインと一緒に投与すると、移植を更に促進することができる。
全身照射に加え、例えば、照射、毒素、毒素又は放射性同位元素と結合した抗体、又はこれらの技術の幾つかの組み合わせを含むレシピエントの免疫系をほぼ破壊するのに用いるのと同様の技術による免疫抑制及び細胞減少（cytoreduction）によって、レシピエントを条件付けすることができる。しかしながら、用いる作用因子のレベル又は量は、免疫抑制及び細胞減少の場合のほうが、免疫系をほぼ破壊する場合よりもかなり低い（少ない）。例えば、レシピエントの残りの免疫系をほぼ破壊するには、950ラド（R）の全身照射（TBI）でレシピエントを致死的に照射することが必要なことがしばしばである。この放射線のレベルは、レシピエントの種が何であれ、かなり一定したものである。一貫した異種（ラット→マウス）キメリズムが、750ラドのTBIで、一貫した同種（マウス）キメリズムが、600ラドのTBIで達成されてきた。キメリズムは、混合リンパ球反応（MLR）及び細胞障害リンパ球（CTL）応答によって確認されるPBL型別及び寛容性により立証されたものである。
本明細書で先に述べたように、上記に開示された方法は、同種キメリズム及び異種キメリズムの何れを確立させるのにも用いることができる。異種キメリズムは、先に詳述したように、ドナーとレシピエントとが異なる種である場合に確立する。ラットとマウスとの間、ハムスターとマウスとの間、及びチンパンジーとヒヒとの間の異種キメリズムが確立されている。人間と他の霊長類との間の異種キメリズムも可能である。人間と他の哺乳動物との間のキメリズムも同様に実行可能である。
上記に開示された方法は、一レシピエント及び一ドナーを用いているが、本発明は、開示された方法において二体のドナーからの幹細胞及び精製したFCが単一のレシピエントに移植されるような方法を包含するものであることが認められよう。
本発明は、レシピエントの免疫系をほぼ破壊し又はレシピエントの免疫系を免疫抑制し細胞減少させ、次いで、同系又は自己の精製したFC及びこのFCとMHCが同一な幹細胞を含む同系又は自己の細胞組成物を、レシピエントに投与することによって、レシピエントの造血系を再形成する方法も提供することが認められよう。
好結果の同種由来又は異種キメリズムを確立させる能力は、移植体の生き残りを非常に向上させることができる。本発明は、ドナーの生理的構成要素、例えば、器官、組織、又は細胞を移植する方法を提供する。これらの方法を用いるラット及びマウスにおける並びにラット及びマウス間の好結果の移植体の例には、例えば、膵島細胞、皮膚、心臓、肝臓、甲状腺、上皮小体、副腎皮質、副腎髄質、及び胸腺がある。レシピエントのキメラ免疫系は、ドナーの器官、組織、又は細胞に完全に寛容であるが、第三者の移植片を徹底的に拒絶する。骨髄移植も、前以て移植された骨髄と遺伝子的に等しい又は非常に似通った器官、組織、又は細胞移植片に、後発許容性を付与する。
移植されたドナーの器官、組織、又は細胞は、レシピエント内で、応答能を以てそれらの機能を充分に果たす。例えば、移植した膵島細胞は、応答能を以て充分に機能し、それにより、糖尿病の有効な治療をもたらすものである。加えて、本発明の方法を用いた骨髄の移植は、インシュリン依存が生じる前に、自己免疫糖尿病形質を排除する。造血FCを用いる本発明の方法を使用して、人間と動物との間の確固とした（solid）器官移植を成功裏に行なうことができる。例えば、病気であると診断された後又はインシュリン依存の発症後、他の種からの膵島細胞を人間に移植して、そのレシピエントの糖尿病を治療することができる。主要な動物ドナー、例えば、豚、牛又は魚からの容器は、現在のドナー不足の問題を解決することができる。例えば、心臓移植体が必要な患者の50％が、ドナーが得られる前に亡くなっている。内分泌組織移植体（甲状腺、上皮小体、副腎皮質、副腎髄質、島）の永久受容が、異種キメラにおいて、遺伝子的に同一のドナーからの骨髄移植の後に起きることが証明されている。そのため、例えば、糖尿病のような自己免疫の他に内分泌疾患を治療するため、本発明の方法によって達成された混合異種キメリズム又は完全異種キメリズムを用いることができる。
本発明の方法は、当業者に公知の方法によりドナーの特定の生理的構成要素を移植すること、及びこれと関連して、移植体ドナーを、精製したドナーの促進細胞組成物及びドナーの幹細胞組成物のドナーとして用い、レシピエントにキメラ免疫系を形成することことを含むものである。混合キメラ免疫系が、好ましい。混合キメラ免疫系を形成する方法は、移植の前、間、又は後に行なうことができるが、特に、本明細書で開示したようなキメラ化法では、免疫抑制及び細胞減少或いは免疫系破壊が必要なので、移植の前に行なうことが好ましい。開示された方法は、同種移植及び異種移植の何れをも可能にするものである。本明細書で開示された方法は、ドナー特異の免疫許容性をもたらすので、ドナーの器官、組織、又は細胞の拒絶に対抗するために以前は必要であった多くの処置が不要である。例えば、生きた骨及び軟骨を、本明細書に開示の方法によって移植することができる。
細胞育成技術が、FC、幹細胞及び遺伝子的に適合したドナーの生理的構成要素の容易に入手可能な供給をもたらす。例えば、促進細胞富化骨髄細胞を、試験官内の培養で増殖させること及び／又は将来の移植のために貯蔵することができる。同じドナーからの細胞材料を、移植片として将来用いるため、同様に貯蔵することができる。
移植以外にも、好適な同種又は異種キメラ造血系を形成する能力、或いは同系又は自己の造血系を再形成する能力は、GHVDに関連する罹病率及び死亡率のために骨髄移植によって現在治療できない種々の他の疾病又は疾患の療法を提供することができる。自己免疫疾患は、自身の免疫系による器官又は組織の攻撃を伴うものである。この疾患においては、免疫系が、器官又は組織を外来異物として認識する。しかしながら、キメラ免疫系が確立されると、身体は、何が外来異物で何が自己であるのかを再学習する。開示したようなキメラ免疫系を形成することで、斯かる病状を引き起こす自己免疫による攻撃を簡単に停止させることができる。更に、自己免疫による攻撃は、本明細書で先に説明したように、免疫抑制及び細胞減少の後或いは免疫系破壊の後に、同系又は自己の細胞組成物を用いて患者の免疫系を再形成することにより停止させることができる。この方法によって治療することのできる自己免疫疾患には、例えば、Ｉ型糖尿病、全身性紅班性狼瘡、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬、大腸炎、更にはアルツハイマー病までもがある。FCに加えて幹細胞を用いることで、骨髄移植を用いて治療することのできる疾病の範囲を大きく広げることができる。
キメラ免疫系はドナーの免疫系由来の造血細胞を含むので、レシピエント免疫系の欠陥は、欠陥のないドナー免疫系によって軽減され得る。鎌状赤血球貧血症、球状赤血球症またはサラセミアなどのヘモグロビン異常症、ハンター病、ハーラー病などの代謝障害、および酵素欠損（これらすべては患者の造血系における欠陥に起因するものである）は、正常なドナー由来の精製されたドナー造血ＦＣおよびドナー幹細胞を用いて患者のうちにキメラ免疫系を確立することによって治癒し得る。このキメラ免疫系は、好ましくは少なくとも１０％ドナー起源（同種または異種）のものでなければならない。
成功する異種キメリズムを確立する能力は、病原体に仲介される病気状態（種特異的耐性が役割を果たすウイルス性疾患を含む）を治療または予防する方法を提供できる。例えば、エイズはレトロウイルス（ＨＩＶ）によるリンパ造血系の感染によって引き起こされる。このウイルスは第一に、骨髄幹細胞によって作られる細胞を表すＣＤ４+Ｔ細胞および抗原に感染する。いくつかの動物、例えばヒヒなどは、エイズに対し生得の免疫または耐性を有する。ヒヒまたはその他のエイズ耐性および／または免疫性動物をドナーとして用いてヒトレシピエントに異種免疫系を確立することによって、ヒトレシピエントの造血系はドナー動物のエイズ耐性および／または免疫性を獲得することができる。他の病原体に仲介される病気状態も、その病気を引き起こす特定の病原体に対する動物の免疫または耐性を用いるこのような方法によって、治癒または予防し得る。例としてはＡ、Ｂ、Ｃ型肝炎、および非Ａ，Ｂ、Ｃ型肝炎が含まれる。促進細胞は異種間の幹細胞移植を可能とする上で主要な役割を果たすため、このアプローチは骨髄接種物中の促進細胞の存在に頼ることになろう。
促進細胞の除去は、異種間の移植を実質的に損なうことが示されている。しかし、好ましいアプローチではないが、未処理の異種骨髄は十分な細胞が投与されればうまく移植されるであろう。この場合、促進細胞の富化有りまたは無しで、エイズの治療または予防に骨髄由来細胞を使用することができよう。これまでの研究は、ＧＶＨＤが種の障壁を越えて起こり得ることを実証した。それゆえ好ましいアプローチは、ここに開示する方法により精製されたドナーＦＣを含有する細胞組成物、またはＴ細胞を除去した組成物を用いて、異種キメラ免疫系を確立することであろう。
さらに、いくつかの動物、例えばヒヒおよび他の非ヒト霊長目は、肝炎に対する生得的な免疫性または耐性を有する。ヒヒまたは他の肝炎耐性動物由来の肝臓を、本発明の方法（そこでは精製されたドナーＦＣおよび幹細胞を用いて、異種キメラ免疫系が患者のうちに確立される）を使用して肝炎患者に移植することによって、ドナーの肝臓は肝炎の危険にさらされず、またレシピエントはその移植に耐性となるであろう。それによって非特異的免疫抑制剤の必要はなくなろう。未変更の骨髄または精製幹細胞は、肝臓が造血組織として働くことができるようにように、それで十分であり、また同一ドナー由来の幹細胞の移植を促進するＦＣを含有する可能性がある。
また、混合キメラ免疫系の確立は、ガンに対する保護となることが判明した（Sykeksら、1990 Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,87:5633-5637）。そのメカニズムは不明であるが、ドナーとレシピエントの免疫系細胞の組み合わせによる免疫細胞腫瘍特異性の多様化によるものかもしれない。
通常、混合キメリズムが好ましい。しかし、ある場合には完全な同種キメリズムまたは完全な異種キメリズムが好ましくなろう。例えば、本発明は白血病または他のリンパ造血系の悪性腫瘍を治療する方法を提供する。この方法は、患者の免疫系を実質的に破壊し、ここに記述する方法によって完全に同種のキメラ免疫系を確立することからなる。患者自身の免疫系はガンにかかっているので、同系の細胞をガンにかかっていないドナーの同種細胞で完全に置換することが好ましい。この場合、ドナー調製物中のすべてのガン細胞を排除するために、自己の精製幹細胞およびＦＣを用いることができる。特に、体内のＦＣを除去するために高用量の化学療法または照射が用いられている場合はそうである。
本発明はまた老化は生理的影響に抵抗する方法を提供する。現在の研究が、老化は例えば、成長ホルモンの低下等のホルモン変化に関連していることを示している。これらの変化は、生理的および／または生理化学的保護、例えば遊離基からの保護などの低下をもたらしうる。本発明の方法を用いた、下垂体、下垂体および視床下部、または他の内分泌組織の移植は、回復したホルモンレベルを提供することができる。
本発明はまた遺伝子治療の実施方法を提供する。最近、時には遺伝子的に変更を加えた自己細胞でさえレシピエントに拒絶される可能性のあることが示された。本発明の方法を利用して、レシピエントにキメラ免疫系を確立することが可能である。これには、移植される他の細胞の遺伝子変更と同一の方法で遺伝子変更を行なった造血細胞を用いる。これはレシピエントに、自原であれ、同系であれ、同種であれ、または異種であれ、遺伝子変更された細胞への耐性を与えるであろう。
本発明は、ＦＣと幹細胞を保持しつつＴ細胞を除去した精製ＦＣ細胞組成物を含有する細胞組成物、ＦＣの精製方法、全くの、完全な、または混合された同種または異種キメラ免疫系の確立方法、同系免疫系の再確立方法、ならびにＦＣ組成物を特異的疾病、病状または障害の治療もしくは予防に利用する方法を開示することが理解されるであろう。また、本発明は、促進細胞について精製していない異種細胞を投与することによって、ある種の病原体によって仲介される病気を治療または予防する方法を開示することも、理解されるであろう。本発明の特定の態様は説明のため本明細書中先に記述されているが、当業者には細部の無数の変形が、添付の請求の範囲に明示されている本発明から逸脱することなく成し得ることが明らかであろう。
６．実施例：促進細胞の除去は、同種骨髄移植の成功を減少させる
６．１．材料および方法
６．１．１．混合同種キメラの調製
混合キメラの調製のため、同系マウスおよび同種マウスの長骨由来の骨髄を集めた。マウスを７０％アルコールを用いて調製したＣＯ2麻酔で安楽死させ、下肢長骨（大腿骨および脛骨）を摘出した。骨髄を、５０μｌ／ｍｌのゲンタマイシンを補充した媒体１９９（Gibco Laboratories Life Technology Inc., Grand Island, New York）を用い、また２２−ゲージ針を用いて、骨から洗い流した。媒体混合物（ＭＥＭ）を用いて、１８−ゲージ針を介しての穏やかな吸引によって骨髄を機械的に再懸濁し、懸濁物を無菌ナイロンメッシュガーゼで瀘過した。次に細胞を１０００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、ＭＥＭに再度懸濁し、数を数えた。標準的同種再構成においては、Ｔ細胞除去にＲＡＭＢを使用した（１：４０または適切な希釈で１０8細胞／ｍｌで４℃３０分間）。次に細胞をＭＥＭで洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、モルモット補体中に３７℃で３０分間再懸濁した（Gibco Laboratories Life Technology Inc., Grand Island, New York）。細胞を２回洗浄し、数を数え、動物１匹あたり全量１ｍｌの注射を可能とする適切な濃度でＭＥＭに再懸濁した。レシピエント動物の照射後４〜６時間以内に、２７−ゲージ針を使用して外側尾静脈から細胞を注射した。
６．１．２．動物
６〜８週令の雄C57BL/10SnJ（B10）,B10.BR/SgSn（B10.BR）,BALB/cマウスをJackson Laboratory（Bar Harbor, Maine）より購入した。４〜８週令の雄Fischer 344（F344）、ACIおよびWistar Furth（WF）雄ラットをHarlan Sprague Dawley, Inc.（Indianapolis, Indiana）より購入した。動物はピッツバーグ大学Biomedical Science Towerの、特定病原体の存在しない設備に収容された。
６．１．３．細胞サブセットの骨髄からの除去
細胞サブセットの除去を実施する際、骨髄を同様な方法で集めた。処置は、抗ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４、ＩｇＧ２ｂ、ＡＴＣＣまたはＲＬ１／７２、ＩｇＭ）、抗ＣＤ８（ＬＹＴ２、ＩｇＭ、ＡＴＣＣ）、抗Ｔｈｙ１．２（２０−２０−５  ＩｇＭ；ＡＴＣＣ）、抗−Ｍａｃ−１（ＩｇＧ２ｂ；ＡＴＣＣ）、または抗−クラスＩＩ  ＩＡk（ＩｇＭ；ＡＴＣＣ）、およびニュージーランド・ホワイト・リタイアード・ブリーダー・ラビット（retired breeder rabbit）より調製したウサギ補体（Ｃ′）で、前もって研究室でスクリーニングしておいたものを用いて実施した。インキュベーションは３７℃で４５分間、抗体処理のために行ない、その後洗浄して、３７℃で３０分間Ｃ′と共に処理と行ない、２回洗浄した。残っている細胞は、しばしば使用前に抗体と補体を用いて２巡目の間に除去された。
抗ＮＫ１．１抗体はＣ′を固定しなかったので、ＮＫ細胞の除去はフローサイトメトリーによる陰性選択を用いて実施した。骨髄は通常の無菌的方法で集め、モノクローナル抗体抗ＮＫ１．１を用いた染色を、２％ＦＣＳおよびゲンタマイシンを加えたハンクスの平衡塩類溶液中で実施した。ＮＫ１．１抗体で染まらない細胞画分を集め、ＮＫ陰性細胞集団として使用した。
ウサギ−抗−マウス−脳（ＲＡＭＢ）は、ウサギをホモジナイズしたマウスの脳で免疫にして調製した、ポリクローナル抗血清であった。ＲＡＭＢは過去２、３０年にわたってＴ細胞を除去するための作用剤としてしばしば使用されてきた。
６．１．４．フローサイトメトリーによるキメラの特徴づけ
レシピエントは、同系、異種、同種、同系および異種、または同系および同種ドナーのリンパ系エレメントを用いた移植について、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２ｂまたはＨ−２ｋ）およびクラスＩ［ＲｔＩ］ラット抗Ｆ３４４［ＲｔＩＡ］1］、ＷＦ［ＲｔＩＡu］、またはＡＣＩ［ＲｔＩＡ2］表面マーカーを持つ末梢血白血球（ＰＢＬ）の百分率を測定するフローサイトメトリーにより、特徴づけられた。簡単に述べると、末梢血をヘパリンを加えたプラスチック製血清バイアルに集めた。良く混合した後、懸濁物を１．５ｍｌの室温リンパ球分離媒体（ＬＳＭ）（Organon Technical, Kensington, Maryland）上に層状に重ね、２０℃１７００ｒｐｍで３０分間遠心にかけた。リンパ球の層を生理食塩水−ＬＳＭ界面から吸引し、媒体で洗浄した。赤血球をＡＣＫで溶解し（塩化アンモニウム／炭酸カリウム溶解緩衝液）、残っている細胞は適切なモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）で３０分間４℃で染色し、必要な場合はサンドイッチ法で対比染色した。
脾臓および胸腺リンパ系細胞の分析は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）（FACS II Becton Dickinson and Company, Mountain View, California）を用いて実施した。モノクローナル抗体抗ＷＦおよび抗Ｆ３４４−ビオチンは、ラット由来のもので、ラット細胞のクラスＩ染色に使用した。抗Ｈ２bｍＡｂ（２８−８−６Ｓ（ＩｇＧ２ａ；ＨＢ３１；American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）はクラスＩ染色に使用した。抗ＣＤ４−ＰＥマウス、抗ＴＨＹ１．２ＰＥ、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣマウス（Becton Dickinson and Company）、抗ＴＣＲ−αβ−ＦＩＴＣ、抗ＴＣＲ−γδ、抗Ｂ２２０（抗Ｂ細胞）および抗クラスＩＩ（ＩＡkまたはＩＥk）（Pharmangen, San Diego, California）は、細胞サブセット染色に使用した。
データは細胞頻度ヒストグラムとして示された。そこでは対数蛍光強度は横軸に表され、相対的細胞数は縦軸に表された。当該ｍＡｂによる染色の後、陽性と考えられた細胞の百分率を、陰性および陽性対照集団（Ｂ１０マウスおよびＦ３４４ラット）の対照蛍光プロフィールから陽性と決定されたカットオフ（cut-off）を用いて計算した。さらに、細胞の相対的サイズおよび顆粒性を、前方散乱および側面散乱を用いたフローサイトメトリーにより測定した。リンパ球およびサイズが小さく顆粒性の低い他の細胞は１つの特徴的領域に存在し、他方、より大きくまたより顆粒性の細胞（マクロファージおよび顆粒球など）は別の領域に存在した。
６．２．結論
以下のセクションに記述する実験は、混合キメラモデルを使用した。それらの実験では、レシピエント動物は致死量の照射を受け、同種ドナー細胞を同系細胞の共投与有りまたは無しで様々な用量およびサブセットで移植された。同種または異種キメリズムの百分率、つまり混合キメリズムのレベルは、ドナー細胞の移植効率の読み出された情報（read-out）として使われた。
注目すべきことに、異なる系統のマウス間における同種骨髄の移植成功は、一般に比較的高頻度で起こる。つまり、ＴＣＤは移植を完全に阻害するわけではない。しかし、異種移植の達成ははるかに困難である。すなわち、異種ドナー細胞のＴＣＤは通常、移植の失敗によりレシピエントの死を引き起こす。実際、動物モデルで実施した異種移植における発見は、ヒト同種骨髄細胞のＴＣＤが通常高い死亡率をもたらすヒト同種骨髄移植の結果により多く、密接に似ていた。このように、同種骨髄細胞が移植されたこのセクション、および以下に述べる実施例７ならびに８に提示するデータは、第一にＦＣの活性を実証するために使用された。これらのデータは、ＴＣＤドナー細胞によって達成されるより低いレベルのキメリズムに対するキメリズムの増加を測定することによって得た。しかし、後に述べる実施例９は、移植がＴＣＤ異種ドナー細胞を受けたレシピエントの死と関連して評価される、異種移植の結果を提示する。致死量を照射されたレシピエントの，ＴＣＤ同系（宿主型）およびＴＣＤ同種（ドナー型）骨髄（Ａ＋Ｂ→Ａ）による再構成は、混合多血統リンパ造血キメリズムをもたらした（表１、グループＡ参照）。骨髄接種物の同系成分のみがＲＡＭＢで処理されたＴＣＤであった場合、完全な同種移植がもたらされた（表１；グループＢ参照）。よって、同系骨髄幹細胞はＴＣＤによって排除されなかった。しかし、その移植を促進する細胞は排除された。
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ＴＣＤはほぼ確実に幹細胞除去の結果ではない。なぜなら、同系再構成研究において、移植を達成する細胞数の滴定は、未処理の骨髄が投与されようが、またはＴＣＤ骨髄が投与されようが同様の生存曲線を示したからである。同様の発見が、ＲＡＭＢで処理した骨髄を投与した時、または抗ＴＨＹ−１モノクローナル抗体およびＣ′処理を活用した時に得られた。混合同種キメラモデルを用いた更なる研究において、モノクローナル抗体およびＣ′を用いたＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ４+およびＣＤ８+、ならびにＭＡＣ−１+細胞の除去は、同種移植の成功を排除しないことが実証された。すなわち、１００％同種キメリズムがもたらされた（表１；グループＣからＦ参照）。この発見はとりわけ臨床上重要である。なぜなら、これらのマーカーを発現している細胞は、ヒト、マウス、およびラットにおいてＧＶＨＤを生ずると思われるからである。ＣＤ４+細胞、ＣＤ８+細胞、Ｂ細胞、及びより低い程度であるがＮＫ細胞は、致死的および非致死的ＧＶＨＤと関係があるとされてきた。これらサブセットの除去はそれゆえＧＶＨＤを排除するであろうが、促進細胞は排除しないであろう。
表１の混合同種キメラモデルにおける除去の妥当性は、非交差反応性モノクローナル抗体または飽和サンドイッチ抗体法（同一抗原に対する非ブロック性第２抗体が得られない場合）を用いたフローサイトメトリーにより確認された。レシピエント動物は、抗クラスＩ（Ｈ−２kおよびＨ−２b）モノクローナル抗体およびＰＢＬを用いて、再構成後６週間目に同種および同系キメリズムのレベルに関して分類した。数匹の動物は２、４および６か月目に再分類し、キメリズムの速度論を追跡した。
ＴＨＹ１．２+細胞を除去するための同種骨髄接種物の抗ＴＨＹ１．２およびＣ′による処理は、完全同種に代わって混合同種移植によって表される、促進効果の減少をもたらした。抗ＴＨＹ１．２による効果は、ＲＡＭＢによる効果ほど劇的でなかったが、これは抗ＴＨＹ１．２にすべてのＴＨＹ１．２+細胞を完全に除去する能力がないことの結果かもしれない。この処理は同種幹細胞を除去しなかった。なぜなら、何らかの同種移植の成功が観察されたからである。したがって、この処理は、未処理骨髄を投与したときに起こった促進効果を排除してしまったに違いない（表２参照）。
各実験について補体対照が実施され、結果は未処理骨髄に関する結果と同様であった。
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この促進効果の潜在力を特徴付け、またその効果を得るために必要な細胞数を推定するための更なる研究において、ドナー細胞の滴定を実施して、混合キメリズムまたは同系再集団形成（repopulation）によって証拠付けられる、促進効果が消失する用量を決定した（表３Ａ参照）。５ｘ１０6ＲＡＭＢ処理同種骨髄細胞を投与した時（表３Ａ；グループ１〜４参照）は、同種骨髄細胞移植の成功は全く起こらなかったが、５ｘ１０6未処理（表３Ａ；グループ１５および１６参照）またはＣＤ４除去（表３Ａ；グループ６〜８参照）またはＣＤ８除去（表３Ａ；グループ９〜１１参照）またはＣＤ４およびＣＤ８除去（表３Ａ；グループ１２〜１４参照）同種骨髄細胞を投与した時は、動物の１００％が完全にキメラとなった。同様の結果が、ＭＡＣ−１+細胞（表３Ａ；グループ１７参照）またはＢ２２０+細胞（表３Ａ；グループ１９参照）を除去した際に起こった。表３Ｂは、表３Ａに示されたデータに積み上げる追加データを示す。これらのデータは、促進細胞は多能性造血幹細胞とは別の細胞である、という結論をさらに支持する。なぜならＣＤ４+およびＣＤ８+細胞の除去は幹細胞を富化し、かつ完全な同種キメリズムが＜５ｘ１０6同種細胞を投与すると消え始めたからである。
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１．抗Ｈ−２bおよび抗Ｈ−２k  ｍＡｂを用いた、ＰＢＬ（広いリンパ系ゲート）に関するフローサイトメトリー分析によって、再構成後６週目に分類を実施した。数匹の動物については、４ケ月までの後の時点で第２および第３回の分類を行なった。我々の以前の経験におけるのと同様、同種キメリズムの百分率は個々の動物について安定していた。
２．すべてのマウスは、５ｘ１０6ＲＡＭＢ処理同系Ｂ１０細胞および１５ｘ１０6個の種々に処理された同種骨髄細胞の混合物（５ｘ１０6ＲＡＭＢ  Ｂ１０＋１５ｘ１０6処理済Ｂ１０．ＢＲ→Ｂ１０）を、先に記述した全身照射（９．５Ｇｙ）による条件づけの後に受けた。モノクローナル抗体およびウサギ補体（２サイクル）処理を用いて実施された陰性選択研究の代表的概要。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、同種骨髄移植片の移植（engraftment）に影響を及ぼすことが報告されている。これらの細胞は、マウスにＴＨＹ１及びＮＫ１．１マーカーを、マウス及びラットの両方にＮＫＲＰ１を、そしてヒトにＣＤ１６及びＣＤ５６を発現する。抗−ＮＫ１．１抗体は補体を結合しないので、フローサイトメトリーを用いてＮＫ１．１+細胞を陰性選択し、残存するＮＫ１．１-同種骨髄接種物を混合同種キメラの製造にドナー細胞として使用した。混合された５×１０6のＲＡＭＢ処理Ｂ１０及び５×１０6のＮＫ１．１+除去Ｂ１０．ＢＲ骨髄を受けた、４つの試験レシピエントのうちの４つにおいて、完全な同種再構成が見られ（１００％Ｂ１０．ＢＲ）、このことは促進細胞がＮＫ細胞ではないことを示した。
同様の抗体＋Ｃ’除去を、抗−クラスＩＩ（Ｉ−Ａk）モノクローナル抗体＋補体処理を用いて実施した。しかしながら、このアプローチによるクラスＩＩ致死が、抗−クラスＩ又はサブセットダイレクト抗体介在細胞毒性ほど有効ではないことは良く知られている。表４は、実施された３つの実験の一つの結果を示す。これらのデータは、ｍＡｂ＋Ｃ’を用いたクラスＩＩ除去が、ＲＡＭＢと同様の方法で、同種促進効果を除去したことを示す。しかしながら、この場合、ｍＡｂ及びＣ’処理は最適のアプローチではないので、フローサイトメトリー及び陽性細胞の選別のための直接標識したモノクローナル抗体を用いて、陰性選択実験を下記のセクション７に論じたように行った。
低い濃度で細胞表面マーカーを発現する細胞は、このマーカーに対する抗体により、例えば補体媒介溶解により除去されないようである。これは、ＦＣにおけるクラスＩＩ分子の発現に関するデータ、並びに抗体を用いた細胞選別による陽性選択に対する、抗体＋補体により試験した場合のＣＤ８及びＣＤ３のＦＣ発現における不均衡を説明しうる。細胞選別は、非常に正確な技術であり、低レベルの特定の表面マーカーを発現する少量の細胞の同定をも可能にする。殆どのＦＣがＣＤ８、ＣＤ３、及びクラスＩＩを非常に低いレベルで発現する可能性が高い。
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これらのデータは、促進細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、タンデムＣＤ４及びＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｍａｃ−１又はＢ２２０に対する抗体により溶解されないことを示す。従って、これらのマーカーを有する細胞の陰性選択は、ＧＶＨＤ産生細胞を除去し、ＦＣの濃度を高めるであろう。この操作の後、全細胞の少なくとも８０％が除去されるであろう。これらのマーカーを有する細胞の陰性選択は、ＦＣを保存して高濃度化し、ＧＶＨＤ−産生細胞を除去するための臨床的に有効なアプローチであろう。陽性選択を用いる次の研究は、ＦＣがＣＤ８+であることを示した（下記のセクション７参照）。これらの表面的には矛盾する結果は、おそらく、陰性選択方法におけるＣＤ８+細胞の不完全な排除による、即ち、抗体及び補体で処理した場合の細胞毒性効果のために十分なＣＤ８分子がＦＣ表面上に存在しないことによるであろう。従って、ＦＣを保存する試みにおいて、ＧＶＨＤ産生細胞を除去するために、抗−ＣＤ８抗体を使用するのは、まず抗体をその活性についてスクリーニングしない限り、理想的なアプローチではないかもしれない。さらに、マウスのＦＣは抗−ＣＤ３除去によっては除去されなかったが、陽性細胞選択によりＣＤ３+であることが示された。ラットのＦＣは、ラット−マウス骨髄移植において抗−ＣＤ３＋Ｃ’処理によっては除去されなかった。従って、ここに開示した実験データは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に特異的な抗体、ＣＤ８及びＣＤ３が補体溶解によってはＦＣを完全には除去しないかもしれないが、細胞選別及びアッドバック研究を行った場合に、そのようなマーカーがＦＣ表面に実際に存在することを示している。
この見解は、ＦＣによるＣＤ３の発現に関して特に重要である。ＣＤ３は、第一のＧＶＨＤ産生細胞であるＴ細胞により高レベルで発現するマーカーであるので、Ｔ細胞を選択的に除去させるために抗−ＣＤ３抗体を使用することが可能であり、これは、ＣＤ３を低レベルで発現するＦＣを保存する。しかしながら、この方法で抗−ＣＤ３を用いるためには、その使用の前に、その選択活性をin vitro及びin vivoでプレスクリーニングしなければならない。
７．実施例：促進細胞の添加が同種骨髄移植を強化する
７．１．材料及び方法
７．１．１．ＦＣの陽性選択
骨髄はＢ１０マウスドナー及びＢ１０．ＢＲドナーから、前記実施例６において既に記載した方法で採取した。Ｂ１０骨髄のＴ細胞をＲＡＭＢ及びモルモットの補体を用いて、既に記載したように除去した。Ｂ１０．ＢＲ骨髄を、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に、５００ｍｌ当たり５ｍｌ（１モル）のＨＥＰＥＳを用いて７０×１０6細胞／ｍｌ再懸濁し、そこに２％のＦＣＳを加えた。細胞を遠心分離にかけ、続いて、５０×１０6細胞／ｍｌを処理するために、フルオレセイン結合（ＦＩＴＣ）抗−クラスＩＩモノクローナル抗体を、ＭＥＭ＋ＦＣＳ中、１：１０の希釈率で添加した。この細胞を４℃で４５分間インキュベートし、その後、選択培地としてのＨＢＳＳ＋２％ＦＣＳ混合物中、１０００ｒｐｍ、５分間で２回洗浄した。その後、この細胞を培地に再懸濁し、ナイロンメッシュで濾過し、蛍光自動細胞分離分析装置（ＦＡＣＳ）で分析した。デュアルレーザーシステム（the  dual laser system）により、分析する各細胞について４つの蛍光パラメーターと二つの散乱光パラメーターを記録することが可能であった。残存する赤血球及びデュアル（dual）細胞及びデブリスを、光散乱及びヨウ化プロピジウム染色により除去した。フルオレセインとフィコエリスリン、並びにフルオレセインとヨウ化プロピジウムの立体オーバーラップのための補正を調整した。
細胞選択のために、染色したサンプルを選別操作を通して４℃に維持した。選別した水滴を１０％ＦＣＳを用いてＭＥＭに集めた。細胞集団をＦＡＣＳにより単離した後、サンプルをＭＥＭ中に１：１で希釈し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上澄みをデカントし、細胞ペレットを０．５ｍｌのＭＥＭに再懸濁した。懸濁液を計測し、致死的に照射されたレシピエントに静脈内投与するために濃度を調整した。これらの研究において、照射したＢ１０マウスは、５×１０6のＲＡＭＢ−処理Ｂ１０骨髄細胞＋５×１０6のＲＡＭＢ−処理Ｂ１０．ＢＲ骨髄細胞＋陽性又は陰性選別されたＢ１０．ＢＲサブセットを受けた。レシピエントの過半数が同系又は同種が１０％未満となるよう集合した同種骨髄細胞に対する同系骨髄細胞の割合を調べるために、滴定を行った。ＲＡＭＢ−処理同系：ＲＡＭＢ−処理同種骨髄細胞の割合が、１：１（５×１０6ＲＡＭＢ−処理Ｂ１０＋５×１０6ＲＡＭＢ−処理Ｂ１０．ＢＲ−Ｂ．１０）のとき、レシピエントの５７％が同系として再集合し、同種ＰＢＬキメラの全平均は１７％であった。
７．２．結果
前記のセクション６に記載した陰性選択実験より、（１）クラスＩＩ+集団を同種骨髄接種物から除去すると、促進効果が失われること、及び（２）クラスＩＩ+集団を単独で投与しても同種骨髄の移植の生着の結果とはならないことが証明され、これにより、幹細胞がクラスＩＩ+ではないことが示された。促進細胞＋幹細胞フラクションの純度が最高でも７０−８０％しか得られない、望ましくない細胞タイプの抗体＋補体除去とは対照的に、この細胞選別を用いると、約９６−９９％の純度で、細胞生存率＞９５％のフラクションを選択することができた。陽性選択及びアッドバック研究からのデータは、促進細胞が、クラスＩＩ+ではあるが、クラスＩＩ鮮明ではないことを示した。同時に電子顕微鏡による形態学的研究により、リンパ球としての、そしておそらく成熟Ｂ細胞としての、クラスＩＩ鮮明細胞が確認された。一方ＦＣは、独特の非リンパ系の形態を示した（図１参照）。従って、クラスＩＩ鮮明であることは、別の陰性選択マーカーとしての使用し得る。
同種幹細胞移植の促進は、中間前方散乱及び下方散乱（“リンパ球系”）ゲートからの、クラスＩＩ弱い／中程度、ＣＤ４５+、ＣＤ４５Ｒ+、又はＣＤ８+ドナー特異的選別細胞がレシピエントに投与された場合に、確実に、再現可能に起こる（表５）。しかしながら、骨髄ゲートを特徴づける前方及び側方光散乱プロフィールからのドナー特異的クラスＩＩ弱い／中程度細胞は、移植を促進せず、陰性と推定されるフラクションも促進しない。さらに、同じ推定マーカーのために選別されたＭＨＣ−異種ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）サードパーティ（third party）細胞は、４回の実験のうち４回とも同種幹細胞移植を促進しなかった。他方、Ｈ−２kｘＨ−２dＦ１マウスから単離されたＣＤ８+／ＣＤ４５Ｒ+／ＴＣＲαβ-ＦＣは、Ｂ１０マウスにおいてＲＡＭＢ−除去Ｂ１０（Ｈ−２b）及びＢ１０．ＢＲ（Ｈ−２k）骨髄の移植を強化することができ、１００％Ｈ−２k同種キメリズムの結果となり、これは、ハプロアイデンティカル、即ち半分適当したＦＣが、骨髄幹細胞の移植の促進に十分であることを示す。従って、ＦＣはドナー細胞に遺伝的に適合していなければならないが、部分的に適合していれば良い。
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これらのデータは、“リンパ球ゲート”の大きさ及び顆粒特性を有するＣＤ８+、ＣＤ４５+、ＣＤ４５Ｒ+、クラスＩＩ弱い／中程度（ただしクラスＩＩ鮮明は除く）の同種骨髄細胞集団が、同種幹細胞の移植を促進する原因となることを示す。これは、単細胞型又は小さいが多細胞の集団を表し得る。促進効果は抗体及び補体を用いるＣＤ８陽性細胞の除去によっては除去されないが、細胞選別のための同じｍＡｂ及びアッドバック実験により、その細胞集団が実際にＣＤ８を発現するが、抗体＋補体処理によって溶解されないらしいことが明らかにされた。細胞の抗体除去のためには、高濃度の対応する抗原が細胞表面上に存在する必要があり、従って、低レベルの抗原しか発現しない細胞は抗体によって有効には除去されず、同じ抗体を同じ細胞集団を結合し陽性選択を行うために使用することがはるかに容易であることは、当該分野において良く知られている。
促進細胞集団のさらに高い純度を得るために、二色細胞選別（two color cell sorting）及びアッドバック実験を、上記の推定されている細胞表面マーカーを種々の組み合わせで結合して行った。陰性選択及びアッドバック実験におけるように、５×１０6のＲＡＭＢ  Ｂ１０＋５×１０6のＲＡＭＢ  Ｂ１０．ＢＲ骨髄細胞を、陽性又は陰性と推定されて選択された細胞集団と融合した（表６）。対応する数のＲＡＭＢ処理Ｂ１０．ＢＲ骨髄細胞を受けた追加の調整対照は、確実且つ再現可能な促進効果を有しなかった（ｎ＝１９６）。このアプローチを用いて、８７乃至９９％の範囲の純度の細胞フラクションが得られた。促進細胞フラクションは、“リンパ球”ゲートのＣＤ４５Ｒ+、ＣＤ８+、クラスＩＩ+、ＣＤ４５+、ＣＤ８+、ＣＤ３+フラクションに存在した。表６の（Ｅ）において、細胞は、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ８−ＦＩＴＣにより染色された。従って、結果は、ＣＤ４+ＣＤ８-、ＣＤ４+ＣＤ８+及びＣＤ４-ＣＤ８+細胞を含んでいた。いくつかの三色（three color）選別研究においては、促進細胞がＣＤ８+、ＣＤ４５Ｒ+及びαβＴＣＲ-であることが示された。促進効果を媒介するには、１０，０００−１５，０００程度の選別細胞で十分であった。さらに、この表現型の精製したフラクションは、トランスミッション電子顕微鏡及び免疫細胞化学分析によると、形態学的にクラスＩＩ弱い／中程度のフラクションと類似していた。これらの細胞は、特有の外観を有し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−３及びＩＬ−４を満たした顆粒を大量に含有する。
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促進細胞及び樹状細胞は、いくつかの表現型マーカーを共有するが、他のものは異なっている。促進細胞上のクラスＩＩ及びＣＤ４５Ｒの共発現（coexpression）は、これらの細胞が樹状型の系列の細胞のサブセットを表しうることを示唆する。しかしながら、樹状細胞は、延長した指間突起という古典的な組織学的形態、及びここに記載したＦＣとは明らかに異なる細胞表面表現型を示す。さらに、成熟樹脂状細胞は、クラスＩＩ鮮明及びＣＤ８-である点でＦＣとは区別される。最も重要なことは、強力な抗原提示細胞である樹脂状細胞は幹細胞の移植を促進できないことである。慣用的な方法（Steinman, 1991, Ann, Rev, Immunol. 9:271）による成熟骨髄誘導樹脂状細胞の増殖は、５×１０5又は１×１０6の樹脂状細胞を用いた混合同系／同種モデルにおいては、骨髄幹細胞の移植を促進しなかった。
陽性選別を行ったクラスＩＩ弱い／中程度細胞集団を、トランスミッション電子顕微鏡を用いて形態学的に分析した（図１）。直系約８−１０ミクロンの非常に均一な細胞集団が存在した。この細胞は、比較的顆粒のない周細胞原形質縁及びより中央に位置し密に詰められた大量の顆粒を含んでいた。これらの顆粒の大部分は、血小板α粒の高密度コアレミニセント（dense core reminiscent）を有していた。葉状の核は、骨髄系を示唆するが、顆粒は、好中球の均一な密度の顆粒や、好酸球の特徴である不完全結晶体とは異なっている。大量の高密度顆粒及び馬蹄形の核は、この細胞がＴ細胞又はＢ細胞集団であることを大きく否定する。何故なら、リンパ系細胞は、丸い核と顆粒が乏しい細胞質と、高い核：細胞質比を有するからである。さらに、促進細胞は、骨髄又は樹脂状細胞からの樹脂状細胞前駆体とは似ていなかった。選別されたクラスＩＩ鮮明集団は、ＦＣとは明確に区別される成熟Ｔ／Ｂリンパ球細胞集団の古典的な形態を示した。マウスＴ細胞は、クラスＩＩ鮮明を発現しないので、クラスＩＩ集団は成熟Ｂリンパ球を表す可能性が高い。
本発明のＦＣが造血細胞を増やすことのできる幹細胞ではないこと、及び幹細胞移植にＦＣの存在が必要であることを示すために、精製した幹細胞及びＦＣを同種再構成に使用した。この実験において、Ｓｃａ１+及びＬＩＮ-の表現型（Ｂ２２０-、αβＴＣＲ-、ＧＲ−１-、ＭＡＣ−１-及びＣＤ８-）を有するＢ１０．ＢＲ幹細胞を単離して、細胞選別により９５％より高い純度とした。これらの細胞は、生物学的機能がＣＤ３４+ヒト幹細胞に等しいと信じられている。５０，０００のＳｃａ  １+、Ｌｉｎ-幹細胞を、そのＣＤ８及びＣＤ４５Ｒの二発現（αβ−ＴＣＲ-）について陽性選別を行った５０，０００のＲ１０．ＢＲ  ＦＣを伴う又は伴わない照射した同種Ｂ１０マウスに注射した。表７は、幹細胞又はＦＣ単独では、レシピエントのマウスを再構成しないが、ＦＣ及び幹細胞の組み合わせでは同種のキメリズムを導くことを示す。幹細胞単独では内因性ＦＣの存在により同系レシピエントにおいて移植生着されたが、ＦＣ単独では移植生着されなかったことは、さらにＦＣが幹細胞でないことを確証する。
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要約すれば、陽性選択とアドバック実験を用いることにより、FCはTHY1+、CD45+、CD45R+、CD3+クラスII弱い/中程度およびCD8+であることによって特徴付けられた。これらの細胞は幹細胞を同種および異種レシピエントに移植するために必要とされる。形態学的には、これら細胞はリンパ球にもまたこれまでに記載された他のどの細胞タイプにも類似するものではない。したがって、FCは白血球マーカーの独自の組合せを発現する異なる細胞集団である。MHC特異的：リガンド相互作用は同種移植の成功に寄与すると思われる。対照的に、B細胞、マクロファージ／単球、NK細胞、CD4+およびクラスII鮮明細胞は促進活性を示さない。
８．実施例：特定のT細胞サブセットドナー骨髄の減少は同種細胞の移植達成を減じない
８.１．結果
上記の実施例６と実施例７に記載の研究から得られた結果は、本発明のFCがT細胞とは異なる細胞タイプであることを明確に示すものであるが、Thy-1、CD3およびCD8等のある種のマーカーは両細胞集団により共通して発現される。T細胞は、FCではなくT細胞により発現されるマーカーのみに対する抗体により選択的および特異的に減少させることができるという認識は、ドナー骨髄細胞のTCDは、適当なT細胞特異性試薬がTCDに用いられると、骨髄移植でドナー細胞移植を危険にさらさずにGVHD産生細胞を除去するために用いることができることを示している。実際、本発明の観点から、RAMBまたは抗Thy-1抗体を用いるTCDの結果としてドナー細胞移植化の低減化を示す本技術における発見は、その時点で用いられた試薬はT細胞とFCの両方を減少させることを意味するものとここでは解釈することができる。
ラットで行なった同種骨髄移植の結果を表８に示す。未修飾同種ラット骨髄細胞は同種ラット骨髄に移植されて、適合的に移された場合TCD同系ラット骨髄細胞とともに混合キメリズムを作ることが示されている。このアプローチはドナー細胞移植を確立することが可能であったが、それはGVHDの高い危険性のために臨床的に適用できる方法ではなかった。一方、RARBを有するラットドナー骨髄細胞のTCDは同種受容固体の移植化を誘導することはなかったが、これはFCとGVHD仲介T細胞の同時的な除去によるものと思われる。しかし、最も重要なことは、抗CD3または抗αβ-TCR抗体などのT細胞特異的試薬でドナー細胞が減少した場合に、ドナー細胞の移植化が達成されたことである。FCはCD3+であるかもしれない一方で、ある種の抗CD3抗体はFCを顕著に排除せずにT細胞を選択的に除去可能であろうことに注意されたい。
さらに、リンパ造血キメリズムは、通常はレシピエントのドナー特異的寛容に関連性のあることがよく知られている。αCD3で減少させた同種細胞で再構成されたラットにドナーラット系の心臓移植物を移植した場合に、それらは３カ月以上にわたって移植物を保持することが知られている。一方、関連性のない第三のラット系の心臓移植物は約10日以内でレシピエントにより拒絶された。同様な結果が皮膚移植片に関しても観察され、ここではドナー特異的移植片は受容され、遺伝的に異なる第三の移植片は拒絶された。
これらの結果を一緒にすると、ドナー骨髄細胞をT細胞特異的試薬で処理すると、T細胞のみが減少して、骨髄移植に使用するFCは保持されることが示される。このアプローチは、造血幹細胞がレシピエントに移植化する能力を減少させずに、GVHDに係わるほとんどの細胞を除去する。GVHD産生細胞は、細胞調製物をB細胞とNK細胞に特異的な抗体で処理することによりさらに除去することができる。さらに、ドナー骨髄細胞の移植はレシピエントのキメリズムを確立して、ドナーの細胞、組織または器官の移植が長期または永久的な移植を確立させるように、レシピエント中でドナー特異的寛容の状態を誘導する。したがって、骨髄移植用のドナー細胞調製物中のFCの存在は、固体器官移植を容易にするために、GVHDの危険性のない寛容試薬として用いることができる。誘導された寛容はドナー特異的であるために、他の抗原に対する免疫応答を受けるレシピエントの能力を免疫的に損なわないことには注意すべきである。
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９．実施例：促進細胞は異種骨髄移植化を高める
９.１．材料と方法
９.１.１．異種的に再構成された動物（A+B→A）
マウス＋ラット→マウスキメラにおいて、特に断らないかぎり、マウスに５×106個のT細胞減少マウス骨髄細胞と４×107未処理ラット骨髄細胞を投与した。抗TCR αβ抗体と補体を用いるか、または抗体に結合させた免疫磁気ビーズにより実施したTCDは同様な結果を達成した。マウス→ラットキメラにおいて、ラットに250×106の未処理または処理マウス骨髄細胞を投与した。これらの条件下で、T細胞の成熟化は胸腺中で発達的に調節を受けて進んだために、マウス＋ラット→マウスキメラの大部分のラットTリンパ球はラット骨髄幹細胞前駆体に由来し、骨髄接種材料中のTリンパ球とは夾雑しなかった。さらに、マウス＋ラット→マウスキメラのほとんどのT細胞がマウス由来のものであった。照射コントロールを調製して照射が十分であることを確かめた。
９.１.２．ヒト骨髄の採取
ヒト骨髄は死体ドナーの脊椎体から得られた。この脊椎体は、500,000単位のポリミキシン、500,000単位のバシトラシンおよび10％のヒト血清アルブミンで補った栄養に富む培地（Ex-Vivo; Whitacker Company）に移した。この脊椎体はそれぞれ４片に分割した。すべての操作は室温で行なった。網状組織の軟骨を骨鉗子を用いて削り取り、骨髄細胞を合計90分間静かに撹拌させることにより除去した。30分間隔で、上清を二重層メッシュ篩（細孔サイズ420ミクロン；180ミクロン）でこして、500mlの新しい媒質を加えた。すべてのフラクションを一緒にして、1000rpmで10分間遠心し、カウントし、20×106細胞／mlの濃度に再度懸濁した。この技術を用いて、５脊椎体につき40×109〜60×109細胞が得られた。次に、サイトメトリー分析を上記の実施例６に記載のように行なってそれらの表現型を決定した。
９.２．結果
促進細胞は種間障壁（例えば、ラット→マウス、マウス→ラット）を越えた骨髄移植に同様の効果を及ぼす。４×１０6個のラット骨髄細胞および同系マウス細胞を、ウサギ抗ラット脳（ＲＡＲＢ）または抗Ｔｈｙを用いてＴＣＤ後にマウスに移植したとき、致死的に照射したレシピエントは再構成に失敗した（表９）。さらに、ラット骨髄細胞を、ドナー細胞としての同系マウス細胞の不在下にＲＡＲＢまたは抗Ｔｈｙ１．１を用いてＴＣＤ後に致死照射マウスに移植した場合には、照射からの救済の失敗（形成不全を引き起こした）と移植の失敗のためにレシピエントの死亡率が１００％となった（表１０）。この結果は、ドナー細胞のＴＣＤが一般に移植を生起させないために高い死亡率（最高７０％）をもたらすヒトの同種異系間骨髄移植の結果によく似ている。一方、未処置のラット骨髄、またはＣＤ４+＋ＣＤ８+細胞またはＣＤ３+細胞またはαβ−ＴＣＲ+細胞またはαβ−ＴＣＲ+細胞＋Ｂ細胞またはαβ−ＴＣＲ+細胞＋ＮＫ細胞を枯渇させたラット骨髄を投与した場合には、移植が達成されて９０％以上のレシピエントが１８０日間を越えて生存していた。ラットＦＣはＣＤ８+であって、対応するマウス細胞の表現型に似ていることに注意すべきである。従って、抗ＣＤ８を用いた陰性選択の際に観察された結果は、この場合も、それらの不完全な分離によるものと思われる。異種移植用のＦＣはαβ−ＴＣＲ-、ＣＤ３-およびＣＤ４-であった。というのは、免疫磁性ビーズまたは補体媒介細胞障害を用いてこれらの細胞を枯渇させることにより、促進効果がなくならなかったからである。またしても、ラットＦＣはＣＤ３+であるかもしれないが、それらは抗体によって完全には除去されなかった。
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また、異種間キメリズムを示す動物は、混合白血球反応での反応性の欠如ならびに心臓、皮膚および膵島移植片の許容度により測定したところ、ドナー細胞に対して寛容性であることが観察された。かくして、ドナー細胞集団中のＦＣの保持は異種間骨髄移植を高めるばかりか、ドナー特異的寛容性の状態をも引き出し、後続のまたは同時の異種間細胞／臓器移植を可能にするものである。これらの組織が異種環境において適切に機能するという点に留意することは重要である。
ヒト椎体から大量の骨髄細胞を単離する技術がすでに開発されている。骨髄のモノクローナル抗体染色を、げっ歯類のそれに類似した技術を用いて、対応する細胞集団を同定するために行った。ＦＡＣＳによるヒト骨髄の前方散乱および側方散乱プロフィールの分析により、げっ歯類の骨髄中のＦＣに表現型の点で似ている細胞が同定された。
類似の細胞集団がクラスII鮮明であるか、クラスII中程度および弱いか、Ｂ細胞系列（ＬＥＵ１２）陰性であるか、種々のＣＤ４５イソフォームおよびＴ細胞マーカー陰性であるかを調べるために、２つの染色を行った。これらの実験の一つでは、染色に先立って骨髄の密度勾配分離を利用して、異なる密度の細胞集団について富化した。ヒトの骨髄はげっ歯類の骨髄ＦＣに似ているクラスII陽性、Ｂ細胞系列マーカー陰性細胞の集団を含んでいることが証明された。さらに、クラスII鮮明な、Ｂ細胞集団も見られた。
げっ歯類のＦＣと細胞表面マーカーの類似性を共有するヒト骨髄中に存在する細胞画分がヒト骨髄幹細胞の移植を高めることができるか否かを調べるために、混合異種キメラのモデル（マウス＋ヒト→マウス）を採用した。キメラを調製し、その際ＴＣＤ同系（Ｂ１０マウス）＋未処置ヒト（８０×１０6細胞）を９５０ラッドの全身照射を受けたレシピエントに投与した。再構成後１週間で、２匹の動物を犠牲にし、それらの骨髄、脾臓および胸腺組織に細胞表面マーカーＨＬＡ−ＤＲ（クラスII）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ１４をもつヒト細胞が存在するかどうか分析した。骨髄には混合ヒトキメリズムの証拠（＜１０％）が存在し、また脾臓には＜５％のキメリズムが存在していた。４ヵ月間にわたって追跡した動物は、低レベルであるものの検出可能なレベルのヒト細胞を骨髄中にもち続けた。観察されたキメリズムの低レベルおよびマウスにおける成熟ヒト血液細胞の不在は、ヒト血液細胞がマウス宿主内でマウスサイトカイン類に応答する能力をもたないためかもしれない。従って、インターロイキン−１および３、種々のコロニー刺激因子、幹細胞因子、エリトロポエチンといった特定の成長因子の同時投与がマウスでのヒト細胞の増殖および成熟化を助長できるかもしれない。また、系統発生的にげっ歯類よりもヒトに似ているヒヒのような他の動物宿主を使って、推定ＦＣの存在下でヒト骨髄細胞の異種移植における促進作用を調べた。２２００ラッドの放射線で処置したヒヒに未処置のヒト骨髄細胞（６×１０8細胞／ｋｇ）を移植する実験は、低いけれども検出可能なレベルの混合系統のヒト細胞のヒヒへの移植を示した。
10．実施例：混合異種キメリズムは自己免疫糖尿病を予防し、インスリン炎を逆転させる
10.１．材料および方法
10.１.１．マウス自己免疫モデル
Taconic Laboratoriesから非肥満糖尿病（ＮＯＤ）のマウスを入手し、ピッツバーグ癌研究所で病原体フリーの施設に収容した。動物施設では、ＮＯＤ雌マウスが６ヵ月齢までに６５％の割合で、８ヵ月齢までに８０％の割合で自然発生的に急性糖尿病を発症した。検査した全ての動物が６週齢までにインスリン炎を患っていた。混合同種異系キメリズムを確立するために、致死照射ＮＯＤマウスに、同系骨髄細胞＋Ｂ１０．ＢＲまたはＡＫＲマウス由来の同種異系骨髄細胞を移植した。再構成後の特定の時期に、これらの動物の免疫組織化学的分析を行った。
10.２．結果
ここに記載した混合同種異系キメリズムモデルを用いて、ＮＯＤマウスの糖尿病の発症を予防した。このようなマウスに同種異系骨髄細胞を移植すると、７ヵ月までに混合同種異系キメリズムを示し、試験した全動物において糖尿病の発生が予防できた。再構成後５ヵ月でのマウスの免疫組織化学的分析は、膵島がインスリン炎にかかっていないことを示した。これに対して、同系骨髄細胞だけで再構成された１３匹のマウスのうち４匹は急性糖尿病を発症し、全動物がインスリン炎にかかっていた。これらの結果は、ＧＶＨＤに関与するＴ細胞を選択的に排除し、かつ同種異系骨髄移植を促進するＦＣを保存することができれば、ＧＶＨＤのためにこの療法を現在受けられない様々な病状に骨髄移植を広めることができることを示唆する。造血ＦＣと幹細胞の同時投与もレシピエントの細胞減少をそれほど攻撃的でないものにして、移植を可能にするかもしれない。この療法により治療しうる疾患には自己免疫疾患、エイズのような免疫不全およびウイルス感染症が含まれるが、これらに限らない。
本発明は例示した実施態様によってその範囲が限定されるものではなく、かかる実施態様は本発明のさまざまな側面の例示として解釈されるべきである。実際、ここに示しかつ記載したもののほかに、本発明の種々の変更が当業者には前記の説明および添付図面から明らかになるだろう。このような変更も添付の請求の範囲に含まれるものとする。
本明細書中で引用した全ての刊行物は参考としてその全体をここに組み入れる。
【図１】
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