(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−メルカプトインドールからなる新規なインドール配糖体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エビネラン（Ｃａｌａｎｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ  Ｌｉｎｄｌ．）から単離した新規なインドール配糖体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
エビネランのアルコール溶液抽出物が、発毛・育毛剤として著効を示すことは知られている（特開平５−２９４８１３号公報）。しかしながら、エビネラン抽出液含有成分は、まだ十分に分析されてなく、有効成分の特定にいたっていない現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エビネランアルコール抽出液の分画成分を精査し、生理的に有用な活性をもつ新規なインドール配糖体を単離することに成功し、本発明にいたった。
【０００４】
すなわち、本発明は、エビネランから単離した血流促進作用を有する新規なインドール配糖体を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成した本発明の新規なインドールな配糖体は、化１で示す２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−メルカプトインドール（２−Ｓ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−３−ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−２−ｍｅｒｃａｐｔｏ  ｉｎｄｏｌ）（以下「カラントサイドＢ／ｃａｌａｎｔｏｓｉｄｅ  Ｂ」という）からなることを特徴としている。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のカラントサイドＢは、次のようにして製造できる。エビネランの根茎を細切りした後、例えばメタノールで熱時抽出し、メタノール抽出エキスを得る。得られたメタノール抽出エキスを酢酸エチルと水（１：１）で分配抽出する。次いで水移行部を逆相シリカゲルカラムクロマトガラフィーに付し、水、メタノールで順次溶出し、メタノール溶出部を得る。メタノール溶出部を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、さらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び逆相高速液相クロマトグラフィーを用いて分離することにより、カラントサイドＢが単離される。
【０００８】
カラントサイドＢは、化学構造からみて染料として知られる既知物質インジルビン同様の染色性が推定され、加えて血流促進増加作用を有し、育毛剤などの用途が期待できる。
【０００９】
【実施例】
宮崎産エビネ新鮮根茎（１０ｋｇ）を細切りした後、ＭｅＯＨ（１８リットル）で熱時抽出を計３回おこなった。ＭｅＯＨ抽出液３回分をあわせて減圧下溶媒留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（３６０ｇ，３．６％）を得た。エビネＭｅＯＨ抽出エキス（３６０ｇ）をＡｃＯＥｔ−Ｈ２Ｏ（１：１）で分配し、ＡｃＯＥｔ移行部（１１０ｇ，１．１％）、Ｈ２Ｏ移行部（２５０ｇ，２．５％）を得た。得られたＨ２Ｏ移行部エキスを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．０ｋｇ，Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ］で糖除去し、ＭｅＯＨ流出部エキス（１５ｇ，０．１５％）を得た。ＭｅＯＨ流出部エキス（１５ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（５０：５０→８０：２０，ｖ／ｖ）］で分画し、Ｆｒ．１（１．５ｇ，０．０１５％）、Ｆｒ．２（３．０ｇ，０．０３０％）、Ｆｒ．３（３．４ｇ，０．０３４％）、Ｆｒ．４（０．５ｇ，０．００５％）、Ｆｒ．５（０．７ｇ，０．００７％）、Ｆｒ．６（３．１ｇ，０．０３１％）、Ｆｒ．７（３．４ｇ，０．０３４％）を得た。Ｆｒ．１（１．５ｇ）をさらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７：３：１（下層）→６５：３５：１０（下層）→６：４：１］で分画し、Ｆｒ．１−１〜Ｆｒ１−８を得た。Ｆｒ．１−５（２１０ｍｇ，０．００２２％）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（４０：６０，ｖ／ｖ）］、逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ（２５：７５，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］で分離精製し、カラントサイドＢ（化１，１５ｍｇ，０．０００１５％）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎ）（化２，８．８ｍｇ，０．００００９％）を得た。
【００１０】
【化２】
【００１１】
【分析例】
カラントサイドＢは負の旋光性を示す淡黄色粉末で、分析結果は下記のとおりである。
カラントサイドＢ：非品粉末
旋光性：［α］Ｄ２５−１２．０゜（ｃ＝０．２，ＭｅＯＨ）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）
次式計算値  Ｃ２０Ｈ２８ＮＯ１１Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋：４９０．１３０１
実測値                                        ：４９０．１３４２
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：
３４５３，１６２０，１５６０，１４４８，１０４３
ＵＶ（ｃ＝０．０００６，ＭｅＯＨ，ｎｍ，ｌｏｇε）：
２８９（４．０），２２１（４．４）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ）：
４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１’−Ｈ），
４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１”−Ｈ）
７．００（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．２，７．９，７．９Ｈｚ，５−Ｈ），
７．１３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．２，７．９，７．９Ｈｚ，６−Ｈ）
７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，７．９Ｈｚ，７−Ｈ），
７．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，７．９Ｈｚ，４−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ，δｃ）：
Ｃ−１                ，    Ｃ−２      １１３．３，
Ｃ−３      １４２．０，    Ｃ−４      １１９．５，
Ｃ−５      １２０．３，    Ｃ−６      １２４．２，
Ｃ−７      １１２．２，    Ｃ−８      １３６．３，
Ｃ−９      １２１．５，    Ｃ−１０              ，
Ｃ−１’      ８９．４      Ｃ−２’      ７３．７，
Ｃ−３’      ７８．０      Ｃ−４        ７１．２，
Ｃ−５’      ８１．９      Ｃ−６’      ６２．７，
Ｃ−１”    １１２．２      Ｃ−２”      ７５．４，
Ｃ−３”      ７７．８      Ｃ−４”      ７１．２，
Ｃ−５”      ７９．１      Ｃ−６”      ６２．４，
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ  ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
５１２（Ｍ＋Ｎａ）＋
【００１２】
カラントサイド  Ｂ  オクタアセテイト（化６）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ）：
１．９８，２．０３，２．０３，２．０４，２．０８，２．１５，
２．１５，２，２０（３Ｈ，ｓ）（Ｏ−Ａｃｘ８）
７．０９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，８．２，８．２Ｈｚ，５−Ｈ），
７．２４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，８．２，８．２Ｈｚ，６−Ｈ）
７．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．９，８．２Ｈｚ，７−Ｈ），
７．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．９，８．２Ｈｚ，４−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ，δｃ）：
２０．５，２０．６，２０．６，２０．７，２０．８，２０．９，
２１．０，２１．０，６１．６，６２．２，６７．６，６８．６，
７０．０，７１．３，７１．８，７４．１，７６．５，８３．７，
１０２．７，１１０．８（Ｃ−２），１１１．１（Ｃ−７），
１１９．０（Ｃ−４），１１９．９（Ｃ−５），１２０．８（Ｃ−９）
１２３．８（Ｃ−６），１３５．１（Ｃ−７），１４１．０（Ｃ−３）
【００１３】
【分析例２】
（糖の同定）
カラントサイドＢ（３ｍｇ）の５％Ｈ２ＳＯ４−ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）（１：１，ｖ／ｖ，１．０ｍｌ）溶液を窒素気流下、加熱還流し、２時間攪拌した。反応液を陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４００（ＯＨ−ｆｏｒｍ）で中和し、樹脂を濾別後、溶媒を減圧留去し、粗生成物（２．８ｍｇ）を得た。粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．２ｇ，Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ）で分離精製し、溶媒を減圧留去し、粗生成物（１．０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物のピリジン溶液に、Ｌ−システィンメチルエステルヒドロクロライド（０．３ｍｇ）を加え６０℃で１時間攪拌し、つづいてＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（０．３ｍｌ）を加え６０℃で１時間攪拌し、濾別後、ＧＣ用サンプルとして以下に示す条件でＧＣ分析を行った。
ＣＧ条件
カラム：Ｓｕｐｅｌｕｃｏ  ＳＴＢＴＭ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
Ｉｎｊｅｃｔｏｒ  ｔｅｍｐ：２３０℃
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｔｅｍｐ：２３０℃
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐ    ：２３０℃
Ｈｅ流速                  ：１５ｍｌ／ｍｉｎ
保持時間（ｔｒ）
Ｄ−グルコース：２４．１５
Ｌ−グルコース：２５．４６
【００１４】
前記分析結果から、カラントサイドＢは、ＩＲスペクトルにおいて、水酸基（３４５３ｃｍ−１）及びピロール環（１５６０ｃｍ−１）の存在が示唆された。またカラントサイドＢは、ポジティーブモードＦＡＢ−ＭＳにおいて、疑似分子イオンピークがｍ／ｚ５１２（Ｍ＋Ｎａ）＋に観測され、高分解能ＦＡＢ−ＭＳから分子式Ｃ２０Ｈ２７ＮＯ１１Ｓを有する化合物であることが判明した。そして、カラントサイドＢを、Ｈ２ＳＯ４−ジオキサンで酸加水分解すると、Ｄ−グルコースが得られた。グルコースの結合様式は、アノメリック水素のカップリング定数及びアノメリック炭素の化学シフト［δ４．４３（ｄ，Ｊ＝９．２），δｃ８９．４］、［δ４．９２（ｄ，Ｊ＝７．３），δｃ１０６．５］から２個のグルコースを有し、いずれもβ結合していることが明らかとなった。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲデータを新規カラントサイドＡ（化３）と比較すると、糖鎖構造は異なるが、インドール環部は類似しており、カラントサイドＢは、インドール配糖体であることが推定された。さらに、各種２次元ＮＭＲ（１Ｈ−１Ｈ、１３Ｃ−１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ）スペクトルの詳細な解析により、グルコースが２分子結合していることが判明するとともに、インドール環部の２位炭素にチオエーテル基を有することが明らかとなった。
【００１５】
【化３】
【００１６】
また糖部については、１Ｈ−１Ｈ，１３Ｃ−１ＨＯＨＡＨＡスペクトルの解析の結果、糖部のシグナルが完全に帰属され、グルコースの結合位置については、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、１個のグルコースのアノメリック水素［δ４．９２，（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３）］から、インドール環の３位炭素（δｃ１４２．０）間に相関が観測され、またもう１個のグルコースのアノメリック水素［δ４．４３，（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２）］から、インドール間の２位炭素（δｃ１１３．０）の間に相関が認められた。その結果、２個のグルコースは、インドール環の２，３位に結合していると決定した。
【００１７】
さらに、既知Ｓ配糖体であるボレアバンＡ（ｖｏｒｅａｖａｎＡ，化４）とＮ配糖体であるＤＦ−Ｐ（化５）の１３Ｃ−ＮＭＲデータをカラントサイドＢと比較すると、カラントサイドＢは、１位炭素が［δｃ８９．４（Ｃ−１）］と高磁場へ、５位炭素が［δｃ８１．９（Ｃ−５）］と低磁場へシフトしており、Ｓ配糖のボレアバンＡ（化４）と比較的類似していることなどから、グルコースの結合位置は、インドール環部の２位にグルコースが結合していることが示唆された。またカラントサイドＢを、無水酢酸−ピリジンでアセチル化すると、オクタアセチル体（化６）が得られ、オクタアセチル体の各種２次元ＮＭＲを測定したところ、同様の相関が認められたことからも、カラントサイドＢの構造が確認され、カラントサイドＢを、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−メルカプトインドール（化１）と決定した。
【００１８】
【化４】
【００１９】
【化５】
【００２０】
【化６】
【００２１】
【試験例】
（ラット皮膚血流促進作用）
実験動物として、ＳＬｃ：ウィスター系雄性ラット（体重１８０〜２００ｇ）を用いた。皮膚血流量は、レーザードップラー血流計（Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ  ＰＦ２Ｂ，Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて測定した。ラットの背部を剪毛し、翌日にウレタン（１ｇ／ｋｇ）麻酔下でラットの皮膚血流量を測定し、前値とした。前値測定直後に被験液２５μｌ（５０％エタノール溶液）を前値測定部位に塗布し、その２０分後に塗布部位の皮膚血流量を再度測定し、前値に対する増加率を算出した。なお、対照群には５０％エタノール溶液を塗布した。被験液には、実施例で得られた本発明のカラントサイドＢ（ＣＤＨ３）（０．２％）、参考例の既知物質インジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ，化７）（０．２％）を用いた。結果を図１に示す。
【００２２】
【化７】
【００２３】
図１に示すように、本発明のカラントサイドＢは、２０分で皮膚血流量を有意に増加させた。インジルビンにも同様の促進作用は認められるが、有意ではなかった。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なカラントサイドＢは皮膚血流促進作用を有し、育毛剤等の有用な用途が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エビネランから単離されたカラントサイドＢとインジルビンのラット皮膚血流促進効果を示すグラフである。
【化１】0003890545.tif 000002
【化２】0003890545.tif 000003
【化３】0003890545.tif 000004
【化４】0003890545.tif 000005
【化５】0003890545.tif 000006
【化６】0003890545.tif 000007
【化７】0003890545.tif 000008
【図１】
0003890545.tif 000009