(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管作動性腸管ペプチド−グリシン−システイン−NOという構造の化合物。
【請求項２】
血管系平滑筋、無血管系平滑筋、気道平滑筋、胃腸平滑筋、および海綿体平滑筋を弛緩させるために使用される、請求項1に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
血管系平滑筋、無血管系平滑筋、気道平滑筋、胃腸平滑筋、および海綿体平滑筋を望ましくない収縮の弛緩に応答する疾病状態を治療するために使用される、請求項1に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
気腫、喘息、気管支炎、線維症、過剰粘液分泌、気流閉塞症および術後合併症から成る群より選択される閉塞性肺疾患を治療するために使用される、請求項1に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
内視鏡処置に関連する胃腸平滑筋収縮もしくは痙攣を治療するために使用される、請求項1に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ヒト男性不能症を治療するために使用される、請求項1に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は対応する活性を持つ神経ペプチドの付加物および断片、突然変異体およびそれらの誘導体、とりわけ血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）の分野に関し、また血管平滑筋（例えば大動脈）および気管、オッディ括約筋、胃腸平滑筋、海綿体平滑筋を含むいくつかの組織の無血管平滑筋の弛緩を含むそれらの用途、および男性不能症を含む関連疾患の診断および治療用途に関する。
各種の神経ペプチドが効力ある平滑筋弛緩活性について記述されてきた。これらはペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩＳ）およびペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、サブスタンスＰ、およびタキキニンと呼ばれる哺乳類種から誘導される一連の関連天然発生ペプチドなどのペプチドを含む。これらはニューロキニンＡ、ブラジキニン、ニューロキニンＢ、およびその他を含む。ペプチドカルシトニン遺伝子関連性ペプチド（ＣＧＲＰ）もまた海綿体平滑筋を含むある種の組織で平滑筋弛緩活性を有する。
ＶＩＰは２８アミノ酸ポリペプチドホルモンである（サイード他、生化学ヨーロピアンジャーナル、２８巻、１９９ぺージ、１９７２年）。それは１９６９年に正常なブタ肺から初めて分離され、その時点で徐々にしかし延ばされた未梢血管拡張を起こすものと示された。このポリペプチドが血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）と名付けられたのは１９７０年で、その時それはブタの腸から分離された（サイード他、サイエンス、１６９巻、１２１７ページ、１９７０年）。その時以来、それは分離され、そのアミノ酸配列がその他の種の中でもラット、ブタ、ウシ、テンジクネズミ（モルモット）およびヒトで決定された。すべての源から分離されたＶＩＰのアミノ酸配列はテンジクネズミを除き同一であり、テンジクネズミの場合はそれは４個の非極性アミノ酸置換により異なっている。ヒトＶＩＰのアミノ酸配列は公開された（バーネット他、臨床内分泌学および代謝、５９巻、１１３３−１１３７ページ、１９８４年）。
ＶＩＰ免疫反応ニューロンおよび神経繊維は中枢神経系を通じて発見されており、多くの器官系例えば尿生殖器系、胃腸系、呼吸器系および心血管系に広く分布されている（カリル他、胃腸内分泌学における血管作動性腸管ペプチド、２６０−２７２ページ、ジェイ．シー．トンプソン編、マグローヒル、ニューヨーク、１９８７年）。胃腸運動性は胃腸管の分離性解剖学的部分を通じる分泌および栄養分の整然とした動きに原因がある。広範な神経系およびホルモン系がこの複雑な混合および推進活性を規制する。血液循環およびクローム親和性細胞で見出される胃腸ニューロンおよびホルモンにより放出される神経伝達物質は胃腸機能を調整する原因となる化学的メッセンジャーである。
これらのメッセンジャーの標的細胞に対する作用は矛盾する。腸神経系の回路は作用薬が標的細胞を刺激し同時に標的細胞を阻害するも一つの作用薬の放出を刺激するようなものである。かくして作用薬の無傷のシステムに対する作用は個別の細胞に対する作用により予言することはできない。異なった作用薬に露出された分離筋細片を使用する各種の試験管内研究からのデータが臨床内視鏡セッティングで見られる結果と比較される時にこれがとりわけ真実であることが発見された。
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は選択された組織層で効力ある平滑筋弛緩剤である。陰茎海綿体において、小柱平滑筋（勃起性組織）の弛緩はこのペプチドにより容易に行われる（ヘルンド他、スカンジナビア生理学公式記録、１２４巻、４１３−４１９ページ、１９８５年；ラーセン他、泌尿器学研究、１９巻、２１１−２１３ページ、１９８１年）。ＶＩＰの作用の機構は古典的には細胞内サイクリックＡＭＰ（アデノシン一リン酸）の増加を通じてである。最近のデータ（イグナッロ他、生化学生物物理学研究通信、８４３−８５０ページ、１９９０年、およびキム他、臨床研究ジャーナル、８８巻、１１２−１１８ページ、１９９１年）は酸化窒素（ＮＯ）が組織サイクリックＧＭＰ（グアノシン５′一リン酸）の増加を通じて海綿体平滑筋の非アドレナリン作用性非コリン作用性弛緩ならびに内皮依存性弛緩を調停することを示唆している。酸化窒素の制約はその非常に長続きしない半減期である。酸化窒素のニトロソチオール付加物は運搬機構として有用であることが示されてきたが、それは付加物が生物活性形態で酸化窒素を安定させるためである。ＶＩＰおよび酸化窒素シンターゼ（酸化窒素を合成する酵素）は海綿体内の神経で共存することが発見された（ジューンマン他、泌尿器学ジャーナル、１４９巻、２４５Ａ（アブストラクト１２７）、１９９３年）が、これはそれらが共神経伝達物質であるらしいことを示していた。
この発明は、酸化窒素および、平滑筋弛緩活性を有する神経ペプチド、とりわけＶＩＰの結合された血管平滑筋弛緩作用ならびに多重経路を経由するその調停がもし唯一の伝達物質あるいは機構が存在した場合より弛緩不全が少ないという利点を提供するという発明者の発見に基づくものである。この原理および神経ペプチドとＮＯの作用を結合するという目標に関して、ＶＩＰ−ＮＯドナーがこの発明の一部として開発されてきた。ＶＩＰはニトロシル化を受け易い遊離チオールを持たないために、ＶＩＰ類似体（ＶＩＰ−グリシン−システイン−ＮＨ2）がシステインの付加で遊離チオール官能基を提供するように調製された。ここで報告され実験はＶＩＰ−Ｇ−ＣがＶＩＰの生物活性を維持しまたシステインの遊離チオールがＳ−ニトロソ−ＶＩＰをＮＯドナーにするようにニトロシル化できることを示している。
この発明は血管あるいは無血管平滑筋弛緩活性を持ち、それに対して少なくとも１個のＮＯあるいはＮＯ2基が直接あるいは間接的に結合されている神経ペプチドあるいは類似体、断片あるいはそれらの誘導体よりなる化合物、薬理許容担体あるいは賦形剤にある化合物の組成物、およびその化合物および組成物の用途を提供する。
一つの実施例において、神経ペプチドはペプチドヒスチジンイソロイシン、ペプチドヒスチジンメチオニン、サブスタンスＰ、カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびタキキニンよりなるグループから選択される。
望ましい実施例において、神経ペプチドは血管あるいは無血管平滑筋弛緩活性を持つ血管腸ペプチドあるいは類似体、断片あるいはそれらの誘導体である。この見地のとりわけ望ましい実施例は酸化窒素あるい酸化窒素放出成分と接合した血管作動性腸管ペプチドである。
このように、この発明はとりわけ少なくとも１個のＮＯあるいはＮＯ2基と直接あるいは間接的に結合されている対応する活性を持つ血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）および断片、突然変異体およびそれらの誘導体に関し、また血管平滑筋（例えば大動脈）および気管、オッディ括約筋、胃腸平滑筋、海綿体平滑筋を含む無血管平滑筋を含むいくつかの組織にある平滑筋の弛緩を含むそれらの用途、および男性不能を含む関連疾患の診断および治療用途に関する。
一つの見地において、この発明は少なくとも１個のＮＯあるいはＮＯ2基に直接あるいは間接的に結合されている対応活性を持つ血管作動性腸管ペプチドおよび断片、突然変異体およびそれらの誘導体を提供する。この発明は更に少なくとも１個のＮＯあるいはＮＯ2基に直接あるいは間接的に結合されている対応活性を持つ血管作動性腸管ペプチドあるいは断片、突然変異体あるいはそれらの誘導体の治療有効量および薬理許容担体あるいは賦形剤よりなる薬理組成物を提供する。
も一つの見地において、この発明は、この発明の化合物あるいは組成物の血管平滑筋弛緩量に前記血管平滑筋を接触させることよりなる血管平滑筋を弛緩させる方法を提供する。
も一つの見地において、この発明は血管平滑筋の望ましくない収縮の予防あるいは弛緩に応答する疾病状態の治療のための方法を提供し、それはそれを必要とする個体に対しこの発明の化合物あるいは組成物の血管平滑筋弛緩量を投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明の無血管平滑筋を弛緩させる方法を提供し、それはこの発明の化合物あるいは組成物の無血管平滑筋弛緩量に前記無血管平滑筋を接触させることよりなる。
も一つの見地において、この発明は無血管平滑筋の望ましくない収縮の予防あるいは弛緩に応答する疾病状態の治療のための方法を提供し、それはそれを必要とする個体に対しこの発明の化合物あるいは組成物の無血管平滑筋弛緩量を投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明の気道平滑筋を弛緩させる方法を提供し、それはこの発明の化合物あるいは組成物の気道平滑筋弛緩有効量に前記気道平滑筋を接触させることよりなる。
も一つの見地において、この発明は気道平滑筋の望ましくない収縮の予防あるいは弛緩に応答する疾病状態の治療のための方法を提供し、それはそれを必要とする個体に対しこの発明の化合物あるいは組成物の気道平滑筋弛緩量を投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明は気腫、ぜん息、気管支炎、線維症、過剰粘液分泌、気流閉塞症および術後合併症よりなるグループから選択される閉塞性肺疾患を予防し治療する方法を提供し、それは薬理許容担体内でこの発明に従って化合物の気腫、ぜん息、気管支炎、線維症、過剰粘液分泌、気流閉塞症および術後合併症よりなるグループから選択される閉塞性肺疾患を予防し治療するための有効な量をそれを必要とする個体に対し投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明は胃腸平滑筋を弛緩させる方法を提供し、それはこの発明の化合物あるいは組成物の胃腸平滑筋弛緩量に前記胃腸平滑筋を接触させることよりなる。
も一つの見地において、この発明は胃腸平滑筋の望ましくない収縮の予防あるいは弛緩に応答する疾病状態の治療のための方法を提供し、それはそれを必要とする個体に対しこの発明の化合物あるいは組成物の胃腸平滑筋弛緩量を投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明は内視鏡処置に関連する胃腸平滑筋収縮あるいは痙攣を予防しあるいは治療する方法を提供し、それは薬理許容担体内でこの発明に従って内視鏡処置に関連する胃腸平滑筋収縮あるいは痙攣を予防しあるいは治療するための化合物の有効量をそれを必要とする個体に投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明は海綿体を弛緩させる方法を提供し、それはこの発明の化合物あるいは組成物の海綿体平滑筋弛緩量に前記海綿体を接触させることよりなる。
も一つの見地において、この発明は海綿体平滑筋の望ましくない収縮の予防あるいは弛緩に応答する疾病状態の治療のための方法を提供し、それはそれを必要とする個体に対しこの発明の化合物あるいは組成物の海綿体平滑筋弛緩量を投与することよりなる。
も一つの見地において、この発明はヒト男性不能症を予防しあるいは治療する方法を提供し、それは薬理許容担体でこの発明に従って化合物のヒト男性不能症を予防しあるいは治療するのに有効な量をそれを必要とするヒト男性に投与することよりなる。
以下は図面の簡単な説明であり、それはこの発明を更に図解する目的のためだけに提示されたものであり同じことを制約する目的のためのものではない。
図１は日光の存在および不在の下でＶＩＰＧＣ−ＮＯの光分解の比率を図解する。
図２はラビットの大動脈輪の緊張に対するＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣおよびＧＳＮＯの作用の比較を示す。
図３Ａは時間にわたってラビット大動脈輪の弛緩に対するＶＩＰＧＣ−ＮＯの作用を示し、図３Ｂは同じ条件の下でのＶＩＰの作用を示す。
図４はテンジクネズミの気管輪の緊張に対するイソプロテレノール、ＶＩＰ、ＶＩＰ−ＧＣおよびＶＩＰＧＣ−ＮＯの作用の比較を示す。
図５はラビットオッディ括約筋の収縮頻度に対するＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＶＩＰ、ＶＩＰ−ＧＣおよびＧＳＮＯの作用を示す。
図６はラビットオッディ括約筋の収縮の大きさに対するＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣおよびＧＳＮＯの作用を示す。
図７ＡおよびＢはラビットオッディ括約筋の自発収縮に対するＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰによる阻害の比較を示す。
図８はラット胃底細片の収縮の大きさに対するイソプロテレノール、ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＧＳ−ＮＯの比較阻害作用を示す。
図９はラビット大動脈輪のサイクリックＧＭＰおよびサイクリックＡＭＰに関するＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびその類似体の作用を示す。
図１０はテンジクネズミ気管輪のサイクリックＧＭＰおよびサイクリックＡＭＰ量に対するＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびその類似体の作用を示す。
図１１はＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯ（ＳＮＯ−ＶＩＰ）およびＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（ＶＩＰ−ＧＣ）に対するラビット海綿体組織の応答の比較を示す。
図１２はＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯ（ＳＮＯ−ＶＩＰ）およびＶＩＰに対するラビット海綿体組織の応答の比較を示す。
図１３はＶＩＰあるいはパパベリンのいずれかの注射に続き麻酔されたイヌにおける生体内勃起性応答の比較を示す。
図１４はＶＩＰＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰのいずれかの海綿体内投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起性応答の比較を示す。
図１５はＶＩＰ−ＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰのいずれかの海綿体内投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起性応答の比較を示す。
図１６はＶＩＰ、ＳＮＯ−ＶＩＰあるいはパパベリンのいずれかの投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起性応答の比較を示す。
ここで使用されるように、「ＶＩＰ」という用語はその配列がバーネット他、前掲同書で公開されるカルボキシルアミド化タンパク質を引用するだけでなく、そのタンパク質の機能活性類似体、断片および誘導体（とりわけアミノ末端アセチル化誘導体）も引用する。ＶＩＰ種の類似体および誘導体もしくは断片のすべては薬理的治療あるいは診断用途の同じ配列を持たない。かくして平滑筋弛緩作用により特定の疾患の治療のために開示された主要なＶＩＰの実施例の類似体、断片およびその他の包含がこの疾患にとりわけ関係する活性の存在について断定される。
ＶＩＰ類似体あるいは誘導体が機能活性であると言われるのは患者への投与に際し、非ニトロシル化ポリペプチドのＳ−ニトロシル化形態に事実上機能的に等しい範囲で処置される病気で生じる原因となる作用を減少することができる場合である。そのような類似体、断片および誘導体はアミノ末端あるいはカルボキシル末端のいずれかから１個、２個、３個あるいはそれ以上のアミノ酸を含有あるいは欠いているＶＩＰの種を含む。従来知られているように、アミノ酸は適切なアミノあるいはカルボキシル保護基を用いて保護あるいは非保護の形態で存在する。ＶＩＰは遊離アミンあるいはそのアミノ末端を持ち、あるいはそれは酸添加塩もしくはアセチル化誘導体として調製することができる。
機能活性ＶＩＰ類似体および機能活性誘導体、およびそれらの調製方法は合衆国特許番号４，６０５，６４１号、４，７３４，４００号、４，８２２，７４４号、４，８３５，２５２号、４，９３９，２２４号、および５，０５５，３０２号に開示され、すべてがここで引用例として組み込まれている。
他の適用できる類似体はＶＩＰのペプチド断片１−６、１８−２８、１５−２８、１４−１８、および７−２８を含むものを特異的に含む。これらは合衆国特許番号３，８６２，９２７号で確認できる。
他の特に適切な候補者は、アミノ酸１１がスレオニンよりむしろセリンであり、アミノ酸１３がロイシンよりもむしろフェニルアラニンであり、アミノ酸２６がイソロイシンよりもむしろバリンであり、またアミノ酸２８がアスパラギンよりもむしろスレオニンであるものである。これらの類似体は合衆国特許番号４，２３７，０４６号で報告されている。
更に適用できるものはＶＩＰのアミノ酸１１−２３からのアミノ酸残基断片、とりわけ残基１５−２０およびその既知の類似体を含むものである。これらは合衆国特許番号４，７３７，４８７号で報告されている。
活性の他の候補者は、カルボキシルあるいはカルボキシアルキルもしくはアリル基で保護され、シクロアルキルおよびアラルキル成分を含むハロニトロ下級アルキルあるいは下級アルコキシ成分で随意に置換されているアミノ酸を持つＶＩＰ種である。これらはアルカリル、ビニル、イソニコチニルあるいはアダマンチルもしくはフタロイル、トシルあるいはホルミル成分を含む複合アルキル成分であることができる。アルキル成分あるいは各種アミノ酸延長断片の形態での各種遮断剤あるいは増量剤（extenders）がＶＩＰ配列のカルボキシルおよびアミノ末端に付加することができ、また活性の確認に際して勃起性機能不全の治療への適用に適切であると考えられる。
一般に、ポリニトロソ化ペプチドおよびタンパク質の合成はいくつかの方法で達成できる。１）モノＳ−ニトロシル化は、ペプチドおよびタンパク質を酸性化ニトライトの等モル濃度（最終濃度０．５Ｎ塩酸）で脱イオン化水で１−３０分の間保温することにより最良に達成される。保温時間はニトロソ化の効率およびタンパク質の耐性に依存する。ニトロソ化は更にＳ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソグルタチオンおよび関連するアルキルニトレートなどの化合物を含む各種の他のニトロソ化剤を用いて達成される。これらの化合物はペプチドあるいはタンパク質が過酷な酸性条件に耐えられない場合に使用されるものとなる。
ポリＳ−ニトロソ化を達成するには二つの方法がある。まず最初に、ペプチドあるいはタンパク質は３０−６０分で１００−１０００モル過剰ジチオスレイトールに還元される。これは分子内チオールを露出する。ペプチドあるいはタンパク質はゲル濾過（Ｇ−２５）によりジチオスレイトールから分離される。タンパク質は次いでタンパク質に相対的に過剰に酸性化ニトライト（０．５Ｎ塩酸）の濃度を増加させながら露出される。サビルの補完測定法はＳ−ニトロソ化がいつ完成されるかを示す。例えばアルブミンを用いて、この方法は約２０個の分子内Ｓ−ＮＯ誘導体に導く。
選択肢として、タンパク質はチオール化剤、例えばホモシステインチオラクトンで処理することができる。これはホモシステイン基をタンパク質内の露出されたアミン残基に加える傾向がある。誘導体化されたタンパク質は次いで酸性化ニトライトに露出することでＳ−ニトロソ化することができる。サビルの補完測定法で増加するニトライト濃度への露出はＳ−ニトロソ化がいつ最大になるかを確認することができる。選択肢として、チオール基は標準の手順を用いてタンパク質上で定量化することができ、次いで酸化ニトライト（０．５Ｎ塩酸）の化学量論濃度で処理されたタンパク質上で定量化できる。
求核官能基（チオール以外のもの）のポリニトロソ化はタンパク質が過剰の酸性化ニトライトで保温される時に達成することができる。タンパク質反応性の順序はチロシン続いてトリプトファンなどの残基上のアミンである。アミド結合は多分反応性が低い。従って多くのＮＯ基が高過剰の酸性化ニトライトでタンパク質を単に保温することでタンパク質に付加することができる。例えば、アルブミンを１０００倍過剰のニトライトに露出すると、ＮＯ／モルタンパク質の約２００モルに導かれる。これらの実験は約１時間の保温で０．５規定塩酸内で行われた。15Ｎ  ＮＭＲが、ＮＯによる追加（あるいは置換）がどこで生じるかを決定するために使用できる。
更にニトロソ化は嫌気性条件下で真正酸化窒素ガスへの露出により行うことができる。ニトロソ化を成功させるために、タンパク質は少なくともＮＯガス５気圧で数時間保温されねばならない。保温時間はタンパク質で特異的である。これは各種タンパク質塩基へのＮＯ付着に導くことができる。もっともよく特徴付けられた反応は第一アミンを含む。この機構は脱アミノ化なしでＮ−ニトロソ化を支持する経路を提供する。特異的に、酸性化ニトライトへの露出はいずれにせよ第一アミンの脱アミノ化に導き、一方この方法は有力な生物活性を持つＮ−ヒドロキシニトロソアミンの形成に導く。他の塩基センターでの類似の置換も生じる。
アミノ酸およびポリペプチドのニトロシル化技術についての詳細な背景はＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９３／０９８０６で得ることができ、その全体がここで引用例として組み込まれている。
ここで開示したニトロシル化「ＶＩＰ」類似体およびここで特異的に開示された数多くの他の典型的な化合物を知って貰えたので、日常的な選抜方法がこの発明に従って各種の平滑筋の弛緩に特異的に関連する活性を持つ他の類似体、断片その他を提供するであろう。
この発明は何らかの理論あるいは特定の作用機構により制約されるものではないが、発明者は単一クラスの新規な化合物、ＶＩＰのニトロシル化類似体および断片ならびに誘導体でサイクリックＧＭＰ依存型キナーゼ活性およびサイクリックＡＭＰ依存型キナーゼ活性（血管拡張）を結合する新しい概念に到達した。かくして単一の治療化合物で血管および無血管平滑筋を含む平滑筋弛緩の二つの機構についての利点が得られた。これらの化合物およびその用途がこの発明の主要な見地である。
「不能症」という用語は勃起を得あるいは維持することができないことで特徴付けられる男性性的機能障害の状態を引用する。平滑筋は勃起機能で重大な役割を果す。ＶＩＰの酸化窒素付加物は海綿体平滑筋を弛緩させる。
「海綿体」という用語は陰茎の遠位２／３で連通し、尿道をとり巻く海綿体と一緒に勃起組織を構成する２個の隣接する円柱状構造を引用する。この勃起組織は動脈および静脈の間に点在する血管空間の不規則海綿状システムよりなる。勃起は海綿体平滑筋の弛緩が動脈抵抗の低下を生じその結果動脈血流の陰茎への増加を生じる時に起こる。陰茎動脈は膨張し、血流および海綿体圧力を増加し、また小柱平滑筋は弛緩し、血液を海綿体内に閉じ込める。
勃起不能症の器官的原因は、内分泌性，薬剤誘導、局所障害、神経系、および血管系を含む。とりわけ不能症は、抗ヒスタミン薬、降圧薬、心因性薬、および抗コリン作用薬により生じる神経系遮断から生じることがある。不能症は更に内部側頭葉損傷、脊髄疾患、および糖尿病ニューロパシーから生じる知覚投入不全などから生じる神経系疾患から生じることがある。一般に、癌のための骨盤手術は骨盤神経叢を分裂させ陰茎を神経支配する。追加のまたもっとも一般的な不能症の原因は内因性欠損あるいは陰茎外傷から生じる欠陥網への不十分な血流である。
現在利用できる不能症の治療方法は主として外科手術および薬剤の海綿体注射よりなる。一つの外科手術は小さいシリコーン杆体を体内に挿入することによる陰茎人工器官の移植を含む。しかし陰茎は絶えず勃起状態に留まる。選択肢として、膨張性人工器官装置が腹膜後空間に置かれた物質の連結貯蔵器官と共に各体に移植することができる。勃起は陰嚢内に位置するポンプの使用で行われる。複雑さの度合はシリコーン杆体より高い。
平滑筋弛緩剤パパベリンの海綿体内注射は勃起を誘導するのに使用されてきた。しかしこの治療方法の著しい欠点は数多い副作用および合併症がパパベリンなどの薬剤の絶え間ない使用から生じることである。高頻度の線維症（パパベリン）、陰茎強直症および苦痛（ＰＧＥ1）がパパベリンおよびＰＧＥ1などの薬剤の使用で観察されてきた。このような薬剤使用で高い失敗率もあり、従って代替的な薬剤治療の必要性も存在する。
この発明の化合物はいくつかのユニークな利点を提供する。これらは運搬のための生物活性形態で酸化窒素を安定させる。これらはサイクリックＡＭＰ弛緩応答およびサイクリックＧＭＰ依存性弛緩応答を含む作用のユニークな機構でユニークな化合物を提供する。またこれらは小さく従って海綿体への注射により、尿道内あるいは局所投与により容易に運搬することができる。陰茎勃起の推定上の内因性モジュレーターの生物活性、ＶＩＰおよびＮＯ、ならびに化合物を用いる勃起機能不全に対する治療を有するために、これらの化合物はサイクリックＡＭＰおよびサイクリックＧＭＰ双方の増加で生じる作用のユニークな機構を持つものと考えられ、従って勃起機能不全の治療にユニークな治療アプローチを提供する。
ＶＩＰおよびその各種類似体に対するニトロシル化の作用は器官室で試験管内でテストすることができる。ラビット海綿体あるいはヒト海綿体は等張を測定するために器官室内で懸濁される。組織はアルファアドレナリン受容体作用薬（ノルエピネフリン、フェニレフリン）を用いて収縮され、一度安定した収縮に到達すると、各種ＶＩＰ／ＶＩＰ類似体（ニトロシル化されたものあるいはそうでないもの）の弛緩作用が器官室への各分子の累積的追加により比較される。多重室が同時に設定され（８から１６）、これは同一条件の下で多重類似体の生物活性の比較を可能にさせる。この手法は閾値濃度、および各分子の海綿体平滑筋弛緩のＥＣ５０およびＥＣ最大値の測定を可能にする。
類似体を選別する他の手法は、ＶＩＰの受容体を持ちまた測定できる物質の放出を通じてＶＩＰあるいはその類似体の露出に応答する細胞系（例えばＶＩＰに応答してＧＨおよびもしくはプロラクチンを放出する細胞系）の使用を含む。この手法は多重類似体、例えば１０ないし４０個の同時選抜を可能とする。
この発明は更に薬理許容担体と共にこの発明の化合物を含有する薬理組成物に関する。
単一用量形態を産出する担体物質と組合される活性成分の量は治療される宿主および投与の特定の方式により変化するであろう。
この発明の化合物およびもしくは組成物を用いて疾病状態を治療する用量養生は患者の型、年齢、体重、性、食事および医療条件、疾病の発病度、投与の経路、使用される特定の化合物の活性、効力、薬理動力学および毒物学プロファイル、薬剤運搬システムが利用されるかまたは化合物が薬剤組合せの一部として投与されるかなどを含む各種の因子に従って選択される。かくして使用される用量養生は前に設定された望ましい用量養生から逸脱することもある。
望ましい実施例において、組成物は海綿体への注射によりあるいは尿道内もしくは局所投与によりヒトに投与するのに適した薬剤組成物として日常の手順に従って処方される。
注射可能製剤、例えば無菌注射可能水性あるいは油性懸濁液は適切な分散剤あるいは湿潤剤および懸濁剤を用いて従来の技術に従って処方される。無菌注射可能製剤は更に無毒非経口許容希釈剤あるいは溶媒、例えば１，３ブタンジオールとしての無菌注射可能溶液あるいは懸濁液である。採用される許容担体および溶媒は、水、リンゲル液、および等張食塩溶液である。加えて無菌の不揮発性油が溶媒あるいは懸濁媒体として従来採用されている。この目的ために、オレイン酸などの不揮発性油に加えて合成モノあるいはジグリセリドを含むいずれかの刺激のない不揮発性油が注射可能物の製剤に用途を見出している。
典型的には注射投与のための組成物は無菌等張水性緩衝液の溶液、懸濁液あるいは乳化液である。適切な注射担体は必ずしもそれに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびそれらの組合せである。処方は投与の方式に合致するものでなければならない。もし望ましければ、組成物は更に少量の湿潤剤あるいは乳化剤、もしくはｐＨ緩衝剤を含むことも可能である。必要とあれば、組成物は注射の部位で生じる苦痛を和らげるために加溶化剤および局所麻酔薬を含むこともある。
一般に成分は個別にあるいは一緒に混合された単一用量形態として、例えば活性剤の量を示すアンプルあるいは小容器として気密封入コンテナ内で減圧凍結乾燥粉あるいは無水濃縮物として供給される。組成物が注射で投与される場合には、注射用の無菌水あるいは食塩水のアンプルが用意され成分は投与の前に混合することができる。
この発明の治療に役立つものは中性あるいは塩の形態で処方される。薬理許容塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるもののような遊離アミノ基を用いて形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されたもののような遊離カルボキシル基を用いて形成されるものを含む。
特定の疾患あるいは病気の治療に有効なこの発明の治療組成物の量は、明らかな発病度あるいは疾患の範囲の度合に依存するであろう。海綿体内投与の適切な用量範囲は薬物適用量一回分注射でＶＩＰ約１乃至３μｇである。有効用量は試験管内あるいは動物モデル試験システムから誘導される用量応答曲線から外挿され得る。
この発明の化合物は単独の活性薬剤として投与できるが、それは更に治療の標的とされる特異的な疾病状態に対し有効であることが知られている１個もしくはそれ以上の化合物を併用することができる。
この発明は更に、この発明の薬理組成物の成分の１個もしくはそれ以上を含む充填された１個もしくはそれ以上のコンテナよりなる薬用パックあるいはキットを提供する。このようなコンテナに関連するものは薬剤あるいは生物学的産品の製造、使用あるいは販売を規制する政府当局の指示した形態による注意書であり得るし、その注意書はヒト投与に関する製造、使用あるいは販売に関し当局による承認を反映する。
実施例１
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（Ａｃｍ）−ＮＨ2からのＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯの合成
この実施例はＳ−ニトロソペプチドＶＩＰ類似体の合成を報告し、ここで天然ペプチドはシステイン残基を用いて提供される。
ペプチドのＶＩＰおよびＶＩＰ科は遊離システイン残基を持たない。これを考慮に入れて、Ｓ−ニトロシル化されるためには修飾がなされなければならない。Ｓ−ニトロシル化誘導体はチオールの付加を必要とする二つの方法により合成することができる。これはａ）天然ペプチドのチオール化、および、ｂ）付加システイン残基を用いる新規ペプチドの合成、により達成できる。後者の方法は改良された効力を試験できるアミノ酸の付加組合せの機会を用意するという利点を提供する。チオールを持つ新規なペプチド産物は例えば以下のようにＳ−ニトロシル化される。
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2ペプチド
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（分子量３４８６）はα−アミノ成分がＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基で保護されたα−アミノ酸を用いてる固相ペプチド合成法により合成された。連続アミノ酸は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いる活性化により発生期ペプチドに連結された。アミノ酸側鎖は下記の通り保護された。
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−［ＮＨ］
ここでｔＢｕ＝第三ブチル、ＯｔＢｕ＝第三ブチルエステル、
Ｔｒｔ＝トリチル、Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、およびＢｏｃ＝第三ブチルオキシカルボニル。
完成されたペプチドは固定サポートから切断され、９５％トリフルオロ酢酸、フェノール、エタンジチオールおよびチオアニソールを用いる処理で保護解除され、続けて氷冷ジエチルエーテルにより沈殿された。それは１％酢酸内に再溶解され逆相ＨＰＬＣにより精製され０．１％三フッ化酢酸から凍結乾燥された。アミノ酸組成物およびペプチド容量がアミノ酸分析で測定された。
このペプチドは次の通りＳ−ニトロソ化された。凍結乾燥ペプチドは１Ｍ塩酸に溶解された。チオール容量はエルマン試薬で測定された。ＮａＮｏ2の当量がペプチド溶液に加えられ５分室温で反応させられた。Ｓ−ＮＯの形成はサビル検定で測定され、ここでＨｇ2+によりチオール基から置換されたＮＯはスルファニルイミドのジアゾ化により検定され、次いで発色団Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンを用いて結合された（サビル、アナリスト（ロンドン），８３巻，６７０−６７２ページ（１９５８年））。ペプチド溶液のｐＨはＮａＯＨを用いて約３に調節され、ＳＮＯ−ペプチドは逆相ＨＰＬＣカラムを通過され凍結乾燥された。
実施例２
ニトロシル化ＶＩＰ類似体を用いる試験管内組織弛緩ラビット大動脈輪の調製および張力記録
ラビット大動脈輪の調製は前に記載されたものと同じであった（ジアおよびファーチゴット、１９９３年）。要約すると、１．５乃至２．０ｋｇのオスのニュージーランドラビットが末梢耳静脈へのペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射により麻酔された。下行性胸大動脈が素早く除去され下記の組成物（ｍＭ）を含む氷冷クレブス溶液内に置かれた。ＮａＣｌ、１１８；ＫＣｌ、４．８；ＭｇＳＯ4、１．２；ＣａＣｌ2、２．５；ＫＨ2ＰＯ4、１．２；ＮａＨＣＯ3、２５；グルコース、１１；Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．０３。胸大動脈はまず大抵の脂肪および結合組織を取り除かれた。それは次いでプラスチックホルダー内で２．５ｍｍ間隔で配設された５個の平行かみそり刃を横切り直角に置き、次いでその上を大型ポリプロピレンピペットチップを回転させ（同時に等しいサイズの４個の輸を生産して）横断輪に切断した。この研究で使用された大動脈輪および他の組織（以下を参照）はＬ型フックで対に配設され、他に説明のない限り２０ｍｌの器官室でクレブス溶液（９５％酸素、５％炭酸ガス、３７℃でガス処理したもの）に懸濁された。
張力はグラスＦＴ０３Ｃトランスデューサーを用いて等尺で測定され、モデル７グラスポリグラフ（グラス・インスツルメンツ、クインシー、マサチューセッツ）に展示された。この研究で使用された輪および他の組織（以下を参照）は他の説明のない限り実験が開始される前に少なくとも９０分４回のすすぎ洗いで平衡状態に置かれた。基本張力は約２ｇで維持された。大抵の実験は同一大動脈からの４個の輪の組で実施された。弛緩の研究を行うために、各輪は浴液に２００ｎＭのＰＥを付加することにより（最大緊張３０−７０％）最大下に予備収縮された。結果はフェニレフリン誘導緊張の弛緩のパーセンテージで表現される。
気道の調製
オスのハートレーテンジクネズミ（３００−４００ｇ）が深い水準の麻酔を達成するためにペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の使用で麻酔された。気管が切開され、冷却クレブス液に移された。気管はついで切開で周辺の脂肪および結合組織を取り除かれ、軟骨の環節の間を横断して切断され約２ｍｍ厚の気管輪を得た。輪は３７℃で前記のクレブス液を含む２０ｍｌの器官浴にステンレススチール製フックの間で懸濁された。フックはＦＴＯ３Ｃトランスデューサーに連結された。輪は前に記載された基本張力１ｇで平衡状態に置かれ、次いでメタコリン（１００ｎＭ）で２回特発された。輪は各特発露出の後完全にすすぎ洗いされた。気管輪はもしそれが１００ｎＭのメタコリンに露出された時に少なくとも１ｇの張力を支えられなかった場合には使用されなかった。器官浴の表面は汚染を最小にするために１Ｎ塩酸で処理され、クレブス液が加えられる前に室内空気で乾燥された。弛緩研究のためにメタコリン（１００ｎＭ）が気管輪を収縮するために使用され、その結果はメタコリン誘導緊張の弛緩のパーセンテージで表現される。
ラビットオッディ括約筋の調製
ラビットオッディ括約筋（ＳＯ）の調製はこれまでに記載されたもの（スリブカ他、１９９４年）を一部修正したものと類似していた。簡単に言うと、ラビット腹部は正中線で開かれた。胆嚢、胆管、胃幽門洞、および隣接十二指腸は分離され、一括して除去され、ｐＨ７．４の氷冷クレブス溶液に移された。十二指腸は隣接する幽門および胃幽門洞があった対腸間膜に沿って開かれた。管腔表面から、ファーター膨大部が確認され、ＳＯは鋭い切開で照明付き拡大レンズの下で氷上に分離された。
ＳＯは対のフックに配設されクレブス液を含む器官室に３７℃で懸濁された。静止張力は１ｇに調節され、円形収縮はＦＴＯ３Ｃフォーストランスデューサーでモニターされ、モデル７グラスポリグラフで記録された。ＳＯは前記記載された通り平衡状態に置かれた。ＳＯ収縮頻度および大きさに対するＶＩＰおよびそのＳ−ニトロシル化類似体ＶＩＰＧＣ−ＮＯの直接の作用を調べるために、２種の化合物ならびにＶＩＰＧＣおよびＧＳＮＯの異なった濃度のものが器官浴に付加された。いくつかの実験はＳＯの収縮性を強化するためにＡＣｈを用いて行われ、次いでＳＯの収縮性に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＶＩＰＧＣおよびＧＳＮＯの作用が試験された。各実験的観察が完了した後、ＳＯは新鮮なクレブス液で少なくとも３回洗浄された。
ラット胃底の調製
２００−３００ｇのオスおよびメスのスプレーグ・ドーレーラットが腹腔内に与えられたペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇを用いて麻酔された。深い麻酔が得られた後、瀉血が頸静脈および総頸動脈両方を切断することで達成された。腹部は正中線で開かれ、胃が除去され、ｐＨ７．４の氷冷酸素添加クレブス液に移された。胃は切開され、ピンクの幽門末端が灰色底部末端から切り離された。底部末端はシート状を形成するように切開され、内容物は洗い流された。胃底の縦方向筋細片（３×２０ｍｍ）がベーン（ベーン、薬理化学治療ブリティッシュ・ジャーナル、１２巻、３４４ページ、１９５７年）に記載の通り調製された。細片はガス処理クレブス液２０ｍｌを含む器官浴内に置かれた２個の平行プラチナ電極の間で１ｇの静止張力の下で配設された。クレブス溶液は、平滑筋の緊張を高めるため壁内神経および５−ヒドロキシトリプトアミン（５−ＨＴ、５−１０μＭ）の野刺激に応答するコリン作用およびアドレナリン作用関連性を遮断するためにアトロピン（１μＭ）およびグアネチジン（４μＭ）を更に含んでいた。ある実験では、内因性プロスタグランジンの影響を避けるために、インドメタシン（１０μＭ）がクレブス液に存在していた。組織はクレブス液を１０分毎に交換し１時間平衡状態に置かされた。
平衡器官の後、平滑筋の弛緩はＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯ、イソプロテレノールおよびＧＳＮＯにより引き出された。ある実験では、細片はＮG−モノメチルＬ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）で１０分保温された。
サイクリックヌクレオチドの測定
ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびその類似体により誘導される弛緩の機能を評価するために、最高の弛緩の期間（血管の弛緩には１０分必要とされ、ＩｓｏおよびＶＩＰＧＣ−ＮＯならびにその類似体により誘導される気管の弛緩にはそれぞれ５分および２０分必要とされた）これらの化合物に露出された組織は液体窒素で直ちに凍結された。凍結組織は氷冷６％のトリクロール酢酸で均質化され約１０％（ｗ／ｖ）のホモジネートを得た。ホモジネートは２，０００ｇで１５分４℃で遠心分離された。上澄み画分はペレットからデカントされ５容積の水飽和エチルエーテルで４回洗浄され、残存水性抽出物は酵素免疫検定キット（エイマシャム・ライフ・サイエンス・インコーポレイテッド、アーリントンハイツ、イリノイ）で使用するためにサイクリックＧＭＰおよびＡＭＰの検定のためにとっておかれた。
ＶＩＰＧＣ−ＮＯの安定性
ＶＩＰＧＣは０．５Ｎ塩酸に溶解され、次いで等モルのＮａＮＯ2と反応させられた。混合物内でのＶＩＰＧＣ−ＮＯの形成はサビルの比色分析検定を用いて直接測定されるか、あるいは１．０Ｎ苛性ソーダを伴うｐＨ７．０で混合物を滴定した直後に検出された。ＶＩＰＧＣ−ＮＯ安定性についての光作用を研究するために、試料はエッペンドルフ試験管に封入され、管は均一な期間窓越しに日光に露出された。日光に露出された試料のＶＩＰＧＣ−ＮＯは試料のｐＨ値がどのようなものであるにもかかわらず暗所に貯蔵されたＶＩＰＧＣ−ＮＯ試料よりも速やかに衰えた（図１）。
ラビット大動脈輪に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＧＳＮＯの作用
フェニレフリン（１００μＭ）で予備収縮された無傷大動脈輪で、ＶＩＰＧＣ−ＮＯの付加は用量依存性方法で弛緩を産出し、それは１０ｎＭから１μＭの用量範囲でＧＳＮＯに露出された輪でも観察された。しかし同じラビットからの時間調和大動脈輪では、ＶＩＰおよびＶＩＰＧＣの連続累積付加は１μＭのみである程度の弛緩を産出した（図２）。
ラビットのフェニレフリン予備収縮大動脈輪において、ＶＩＰＧＣ−ＮＯの単一用量（１μＭ）は完全な血管弛緩を導入し、それは急速な開始と支持された持続を示していた（図３）。ＶＩＰＧＣ−ＮＯと比較すると、ＶＩＰの同一用量は１９±４％（ｎ＝３）の弛緩を産出したに過ぎなかった。
テンジクネズミ気管に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯの作用
ＶＩＰ状免疫反応性がテンジクネズミ気道ニューロンで発見された。気道を弛緩するＶＩＰおよびそのニトロシル化類似体ＶＩＰＧＣ−ＮＯの効力を比較するために、１０μＭメタコリンで、予備収縮された分離テンジクネズミ気道におけるＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣの用量応答曲線が初めて作られた（図４）。ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣは気管輪にそれぞれＩＣ50の７４±５ｎＭ、３２±６ｎＭおよび５９±９ｎＭ（すべてｎ＝４）で弛緩を産出した。対照的にイソプレテノールはＩＣ50の７４±３ｎＭで気管輪の弛緩を生じた。ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣ（すべて１００ｎＭ）によるテンジクネズミ気管の弛緩は約２０分で安定期に達した。対照的に１００ｎＭのイソプレテレノールは約５分で気道弛緩の安定期に達した。１００ｎＭプロパノールでの気道輪の予備処理は用量範囲１０−３２０ｎＭでのイソプロテレノールの累積付加により誘導された気道弛緩を遮断するだけであった。しかし、プロパノールは同じ用量範囲でＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、およびＶＩＰＧＣ−ＮＯにより誘導された弛緩に対抗しなかった。
オッディ括約筋に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＧＳＮＯの作用
酸素処理クレブスで３７℃で約３０分平衡状態に置かれた後すべての分離ラビットＳＯは内在するリズミカルな収縮性を回復する。平均の収縮頻度および大きさはそれぞれ８．０±０．６／分および５４０±６０ｍｇ（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２０）であった。用量範囲１ｎＭ−１μＭでのＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣの累積付加は基本収縮頻度および大きさを用量依存的に阻害した（図５、６）。これらの化合物の作用はそれの器官室への付加２分後に観察され少なくとも９０分継続した。１μＭ水準で、ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣは収縮頻度を９４±１６％（ｎ＝６）、９１±１０％（ｎ＝７）および８８±１２％（ｎ＝４）それぞれ阻害したが、一方ＧＳＮＯは効力が著しく低いことが観察された。１００μＭでＧＳＮＯはオッディ括約筋の基本収縮性を９１±９％（ｎ＝３）阻害した。
アセチルコリン（ＡＣｈ）の付加は基本圧で用量依存型増加を産出した。ＡＣｈ（１０μＭ）の最終濃度は相の収縮で６９±１５％の加速および緊張圧（ｎ＝１２）で７３±１２％の上昇をもたらした。ＡＣｈ前処理（１０％）のラビットオッディ括約筋については、ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＶＩＰＧＣ（１ｎＭ−１μＭ）およびＧＳＮＯ（０．１μＭ−１００μＭ）の累積的付加はオッディ括約筋のＡＣｈ誘導収縮を徐々に減衰した。ＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＶＩＰＧＣ（１μＭ）およびＧＳＮＯ（１００μＭ）はオッディ括約筋のＡＣｈ増強（１０μＭ）相収縮をそれぞれ９３±７％、９０±３％、７２±２２％および８９±５％阻害した。
オッディ括約筋の相収縮に関しＶＩＰとＶＩＰＧＣ−ＮＯによる阻害効力を比較するために、組織はＶＩＰあるいはＶＩＰＧＣ−ＮＯの単一用量（０．１μＭ）で３０分保温された（図７）。保温の期間中に、オッディ括約筋の不規則かつ不完全な収縮が０．１μＭ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯの存在下（２６±１３、ｎ＝５、Ｐ＜．０５）よりも０．１μＭＶＩＰ存在下（４０±１１（ｎ＝５））でより頻繁に見られた。
胃底細片に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＧＳＮＯの作用
酸素処理クレブスで３７℃で保温した時、ラットの胃底細片は３０分以内に内在するリズミカルな収縮性を展開した。５ＨＴ（１０μＭ）の付加は細片の収縮に著しい増加を産み出した。細片の平均収縮の大きさおよび頻度は１．１±０．２ｇおよび２４±２／１０分（ｎ＝１７）であった。再びＶＩＰＧＣはＶＩＰＧＣ−ＮＯより効力が少ないように見えた。しかし天然ＶＩＰの作用の効力は観察されなかった。イソプロテレノールおよびＧＳＮＯはもっとも効力の少ない２個の阻害剤であった（図８）。
大動脈輪および気道輪のｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ容量に対するＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびＧＳＮＯの作用
ラビット大動脈輸のＶＩＰＧＣ−ＮＯ、ＧＳＮＯでの前処理は、これらの輪が最大の弛緩に達した時にｃＧＭＰ濃度に著しい増加をもたらした（いずれもＰ＜０．０１）。同じラビットからの時間調和大動脈輪において、ＶＩＰおよびＶＩＰＧＣを用いる大動脈輸の保温は同じくｃＧＭＰの水準の増加をもたらした。しかしＶＩＰあるいはＶＩＰＧＣにより導入されたｃＧＭＰ量の増加はＶＩＰＧＣ−ＮＯあるいはＧＳＮＯのそれよりも小さかった（図９）。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの同時測定がＶＩＰ、ＶＩＰＧＣ、ＶＩＰＧＣ−ＮＯあるいはＧＳＮＯ（すべて１μＭ、図９）で前処理された同じ組織で行われた時にはｃＡＭＰ容量に著しい増加はなかった。
テンジクネズミの気管輪がＶＩＰＧＣ−ＮＯ．ＶＩＰおよびＶＩＰＧＣ（すべて１００ｎＭ，ｎ＝４）で導入された弛緩の安定期に到達すると、ｃＧＭＰ容量の著しい増加が観察された。しかしＶＩＰＧＣ−ＮＯおよびその類似体で前処理されたこれらの組織のｃＡＭＰ水準には付随する増加は存在しなかった（図１０）。イソプロテノール（１００ｎＭ）は時間調和対照と比較してｃＡＭＰ水準では著しい増加を示した（Ｐ＜０．０５，ｎ＝４）がｃＧＭＰでは何らの変化もなかった。
実施例３
海綿体反応性の器官室研究
オスのニュージーランド白ラビット（３．０−３．５Ｋｇ）がペントバルビュール（５０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内用量で犠牲とされ、解体された。ラビットの陰茎は、外科手術で一括して除去され、白膜が無傷で保たれるように十分な注意が払われた。海綿体および尿道は切除された。海綿体組織は周辺の白膜から離れるように十分注意して切開された。
約３ｍｍ×３ｍｍ×１０ｍｍの海綿体組織が水ジャケットをつけた器官室（２５ｍｌ）内で生理食塩水（１１８．３ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫ2ＰＯ4、２．５ｍＭのＣａＣｌ2、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、０．０２６ｍＭのＣａＮａ  ＥＤＴＡ、および１１．１ｍＭのグルコース）に浸された。細片は一端でフォーストランスデューサーに結合されたワイヤにシルクタイで付され、他端で金属サポートにシルクタイで固着された。溶液は大気９５％およびＣＯ2５％でガス処理され、これは約１５０ｍｍＨｇおよびｐＨ７．３−７．５の溶液でＰＯ2で確実にした。温度は水ジャケット室を通じる暖かい蒸留水の循環により３７℃に維持された。海綿体は次いで漸増して延伸され、各細片で最適の等張収縮張力が達成されるまで行われた。３回の各延伸（１−１．５グラム張力／延伸）の後、組織はフェニレフリン（１．０μＭ）で収縮された。フェニレフリンに対する安定した最大収縮が一度達成されると、この応答がこれまでのものと比較された。収縮の大きさがこれまでの収縮の１０％以内であると、張力は収縮の最適休止等張張力であると見做された。ラビット海綿体組織の収縮のための最適等張張力は約４グラムであった。
各実験において、ラビット海綿体組織の３個の異なった細片が５×１０-7から７×１０-7Ｍのフェニレフリンで収縮された。一度安定した収縮が達成されると、細片はＶＩＰ、ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯ、あるいはＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2に露出された。これらの分子は蒸留水の溶液に入れられ、器官室濃度が１０-9Ｍで始まり１０-5Ｍの濃度にまで対する累積半対数増分で器官室に加えられた。
用量応答曲線内での弛緩は、ＶＩＰあるいはその類似体への露出の前（弛緩０％）に組織がフェニレフリンで達成した安定した緊張の量を示す一般参考線から測定された。この参考線といずれか一定の用量でのトレーシングの最大下方偏りとの間の直立垂直距離がこの用量での応答として記録された。すべての応答は実験の最後で０．１ｍＭのパパベリンの付加により誘導された最大弛緩のパーセンテージとしての表現された。データはｎ個の異なった動物に対する平均値±ＳＥとして表現される。
図１１はＶＩＰ−Ｇｌｙ−ＮＯ（ＳＮＯ−ＶＩＰ）およびＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（ＶＩＰＧＣ）に対するラビット海綿体の応答の比較を示す。フェニレフリン（５×１０-7Ｍから７×１０-7Ｍ）で収縮されたラビット海綿体細片は累積濃度でのＶＩＧＣＮＯあるいはＶＩＰＧＣのいずれかに露出された。この実験はＧｌｙ−ＣｙｓのＶＩＰへの付加が新しい分子の生物活性を維持することを示している。更に試験された両方の化合物に対する最大の有効濃度（３×１０-6Ｍ）で、ＶＩＰＧＣＮＯはＶＩＰＧＣより有力な弛緩剤である。この差異はＶＩＰＧＣには存在しないＶＩＰＧＣＮＯのＮＣドナー性能に帰因する。
図１２はＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯ（ＳＮＯ−ＶＩＰ）およびＶＩＰに対するラビット海綿体組織の応答の比較を示す。フェニレフリン（５×１０-7Ｍから７×１０-7Ｍ）で収縮されたラビット海綿体細片は累積的濃度でＶＩＰＧＣＮＯあるいはＶＩＰのいずれかに露出された。この実験は試験された両方の化合物に対し最大有効濃度（３×１０-6Ｍ）で、ＶＩＰＧＣＮＯがＶＩＰよりもにより有力な弛緩剤であることを示している。
実施例４
イヌ動物モデルにおける生体内研究
オスの雑種イヌ（２０−３０Ｋｇ）が動物モデルとして使用された。ペントバルビタール麻酔（３０ｍｇ／Ｋｇ）および機械的呼吸の下で、２０ゲージアングロカテーテルが全身血圧測定のために頸動脈に挿入された。腹部切開が陰茎で行われ海綿体は露出された。イヌでは右体および左体は連通していない。
１９ゲージのミニカテーテルが、圧測定およびＶＩＰ・ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＯ、ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ2あるいはパパベリンのいずれかの運搬のために各体で海綿組織に挿入された。体は連通していないために、ＶＩＰの２個の類似体が同一動物で比較された場合にはいつでも１個の体が１個の類似体を試験するために使用され、他の体は他のものを試験するために使用された。薬剤は０．５ｍｌ量の溶液で変化する注射濃度の下でまず１０-7Ｍで始まり徐々に用量を高めてある場合には１０-4Ｍにまで上げて海綿体内に運搬された。大抵の実験では最後にパパベリン８０ｍＭがＶＩＰあるいはその類似体により引き出されるものへのこの応答を比較するために海綿体内に投与された。すべての時点で全身血圧が海綿体内圧比較のためにモニターされた。
図１３は１０-5Ｍ、ＶＩＰあるいはパパベリン（８×１０-2Ｍ）の注射に続く麻酔されたイヌにおける生体内勃起応答を示している。縦座標は海綿内圧（ｍｍＨｇ）であり、横座標は時間（１００秒増分での勃起応答の持続）である。パパベリンあるいはＶＩＰ投与直前および直後の心臓拡張期血圧（ＤＢＰ）は１１０→５５ｍｍＨｇであった。この実験は海綿体ＶＩＰがこのモデルで持続陰茎勃起を誘導できるということを示している。両方の場合において処置の海綿体投与に続き血圧の著しい低下が存在した。
図１４はＶＩＰＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰいずれかの海綿内投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起応答の比較を示す。縦座標は海綿内圧（ｍｍＨｇ）であり、横座標は時間（１００秒増分での勃起応答の持続）である。ＶＩＰ−ＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰ投与直前および直後の心臓拡張期血圧（ＤＢＰ）は以下の通りであった。１×１０-4Ｍ、ＶＩＰ−ＧＣ（１００ｍｍＨｇ、不安定）：１×１０-4Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１００→９０ｍｍＨｇ）；３×１０-5Ｍ、ＶＩＰ−ＧＣ（１１５→１００ｍｍＨｇ）；３×１０-5Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１１５→６５ｍｍＨｇ）；１×１０-5Ｍ、ＶＩＰ−ＧＣ（１２０→９５ｍｍＨｇ）；１×１０-5Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１１５→１００ｍｍＨｇ）；１×１０-6Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１２０ｍｍＨｇ）；１×１０-7Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１１５ｍｍＨｇ）。ＶＩＰ−ＧＣは一つの海綿体に、またＳＮＯ−ＶＩＰが他の方に注射された、ＳＮＯ−ＶＩＰの３×１０-7および１０-6（いずれの場合も０．５ｍｌ）の用量は部分勃起応答を生じ、一方ＶＩＰＧＣの３×１０-7および１０-6Ｍは何らの作用も与えなかった（図示されてはいない）。ＳＮＯＳ−ＶＩＰあるいはＶＩＰ−ＧＣの３×１０-6Ｍでは何の応答もなかった（ＤＢＰ＝１２０ｍｍＨｇ）。試験された最大濃度（１０-4Ｍ）で、ＶＩＰ−ＧＣおよびＳＮＯ−ＶＩＰは類似の大きさで海綿内圧を起こし増加させたが、応答の持続はＳＮＯ−ＶＩＰの方が長かった。注釈に示されているように、１０-5Ｍ以下の濃度では処置は心臓拡張期血圧に何らの作用も与えなかった。より高い濃度は一過性高血圧を生じた。
図１５はＶＩＰ−ＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰのいずれかの海綿内投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起応答の比較を示す。縦座標は海綿内圧（ｍｍＨｇ）であり、横座標は時間（１００秒増分での勃起応答持続）である。ＶＩＰ−ＧＣあるいはＳＮＯ−ＶＩＰ投与直前あるいは直後の心臓拡張期血圧（ＤＢＰ）は以下の通りであった：１×１０-5Ｍ、ＶＩＰ−ＧＣ（１００→４０ｍｍＨｇ）；１×１０-5Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１１０ｍｍＨｇ）；３×１０-6Ｍ、ＶＩＰ−ＧＣ（１２０→１１０Ｈｇ）：３×１０-6Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１２０ｍｍＨｇ）；１×１０-6Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１１５ｍｍＨｇ）。ＶＩＰ−ＧＣは一つの海綿体に、またＳＮＯ−ＶＩＰは他の方に注射された。示されているように、ＳＮＯ−ＶＩＰ（１０-6Ｍ）は部分勃起応答を誘導し、一方同じ濃度のＶＩＰ−ＧＣは何らの作用ももたらさなかった（図示されてはいない）。試験された最高の濃度（１０-5Ｍ）で、ＳＮＯ−ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＧＣは比較できる勃起応答を生じ、もっともＳＮＯ−ＶＩＰが僅かではあるがより効力（より高い海綿内圧およびより早い開始）があった。
図１６はＶＩＰ、ＳＮＯ−ＶＩＰあるいはパパベリンのいずれかの投与に際し麻酔イヌにおける生体内勃起応答の比較を示す。縦座標は海綿内圧（ｍｍＨｇ）である。横座標は時間（１００秒増分での勃起応答持続）である。ＶＩＰ、ＳＮＯ−ＶＩＰあるいはパパベリンの投与直前あるいは直後の心臓拡張期血圧（ＤＢＰ）は以下の通りであった。８０ｍＭ、パパベリン＋ＳＮＯ−ＶＩＰ（１００→８５ｍｍＨｇ）；８０ｍＭパパベリン＋ＶＩＰ（１００→８５ｍｍＨｇ）；３×１０-5Ｍ（９５→５０ｍｍＨｇ）；１×１０-5Ｍ、ＶＩＰ（６０→５ｍｍＨｇ）；１×１０-5Ｍ、ＳＮＯ−ＶＩＰ（８０ｍｍＨｇ）。示されているようにＶＩＰ（１０-5Ｍ）は部分的および短時間の勃起応答を生じ、一方同じ濃度のＳＮＯ−ＶＩＰはより大きくより長い持続時間の勃起を生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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