(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識した核酸プローブ分子を標的核酸分子とハイブリダイズさせることにより、該核酸プローブ分子に含まれる配列に対して相補的な所望のヌクレオチド配列を有する標的核酸分子を検出する方法であって、
自己相補的なステム・ループ構造を有する第一のヌクレオチド部分と、該第一のヌクレオチド部分の一端から延出した一本鎖構造を有する第二のヌクレオチド部分とを具備したヘアピン型構造の核酸プローブ分子であって、前記第二のヌクレオチド部分は検出すべき所望のヌクレオチド配列に対して相補的であり、前記核酸プローブ分子は更に標識を有している、ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子であって、下記の第二ステップにおいて標的ＤＮＡと組み換え中間体を形成したときに、前記第一のヌクレオチドが、標的二重鎖ＤＮＡのうちの該プローブとハイブリダイズしている方の鎖の5’末端のヌクレオチドに隣接し、その間にギャップが生じないように構成されている核酸プローブ分子を準備すると共に、前記核酸プローブ分子にＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブ・ＲｅｃＡ複合体を形成させる第一ステップと、
標的核酸分子を該複合体に接触させて、該核酸プローブ分子と該標的核酸分子との間の全ての相補的塩基間でハイブリッドを形成させる第二ステップと、
ハイブリッドを形成している該標的核酸分子鎖の末端と、該核酸プローブ分子の第一ヌクレオチド部分の末端との間でリガーゼを作用させることにより、該プローブと該標的核酸分子とを連結させる第三ステップと、
該ハイブリッドから前記ＲｅｃＡタンパク質分子および前記リガーゼを除去する第四ステップと、
ハイブリッドを形成しなかった未反応核酸プローブ分子を、該ハイブリッドから分離する第五ステップとを具備し、
該ハイブリッドに含まれる前記核酸プローブ分子中の前記標識を検出することにより、該核酸プローブ分子と相補的な配列を有する核酸を検出する方法。
【請求項２】
上記の標的核酸分子が二重鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記のリガーゼがNAD要求性リガーゼであることを特徴とする、請求項1または2の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
上記のリガーゼを使った反応を、３７〜６５℃の溶液中で行うことを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の核酸検出技術は、病気の診断、動植物の品種や親子の鑑定、ＤＮＡのクローニング等に応用されている。従来の核酸を検出する方法としては、サザンハイブリダイゼーション等の、標識したプローブを用いた検出方法がある。これらの方法に関して、これまでに種々の改良がなされてきた。
【０００３】
その中の一つとしては、ＲｅｃＡタンパク質を使った酵素反応により、標的二重鎖ＤＮＡと、オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて組み換え中間体を形成させることを特徴とする、標的ＤＮＡ検出方法がある（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-15117, 1988 ）。ハイブリダイゼーションにより形成された中間体は、オリゴヌクレオチドプローブの標的ＤＮＡへの結合に関して、特に除タンパク質操作の後に不安定であるため、上記の引例においては、光架橋を行って安定な組み換え中間体を形成させている。しかし、光架橋により標的ＤＮＡへのプローブの非特異的な結合が起きることや、光架橋時の紫外線照射により標的ＤＮＡが損傷を受けてしまうという不具合があった。
【０００４】
一方、別の改良方法としては、南京錠型オリゴヌクレオチドをプローブとして、その両末端を、標的ＤＮＡで隣り合った配列へハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション後に該プローブの両末端を連結し、より安定なハイブリッドを形成させ、上記の別法の不具合の一部を改善した方法がある（Nilsson et al., Science, 265, 2085, 1994）。しかしながらこの方法では、標的核酸分子は一本鎖でなくてはならず、ゲノムＤＮＡなどの二重鎖の解析ができないという難点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記した従来の改良方法では、標的核酸分子への損傷により、後の解析時の障害となったり、一本鎖のみしか検出できないといった、難点または不具合があった。本発明の目的は、下記のハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法を提供することにある：
１）標的核酸の二重鎖のままでの検出を可能にする方法；
２）標的核酸と安定なハイブリッドを形成することが可能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子；
３）標的核酸に損傷を与えずに、上記のヘアピン型核酸プローブ分子を標的核酸にハイブリダイズさせて、形成されたハイブリッドを検出することにより、該核酸プローブに含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出する方法。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決し、目的を達成するために、本発明のヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法は、以下のごとく構成されている。
（１）本発明の核酸プローブ分子は、
自己相補的なステム・ループ構造を有する第一のヌクレオチド部分と、該第一のヌクレオチド部分の一端から延出した一本鎖構造を有する第二のヌクレオチド部分とを具備したヘアピン型構造の核酸プローブ分子であって、前記第二のヌクレオチド部分は検出すべき所望のヌクレオチド配列に対して相補的である、ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子である。
【０００７】
なお、上記の第二のヌクレオチド部分は、少なくとも１５塩基のヌクレオチドであることが好ましく、また第一のヌクレオチド部分の長さは、少なくとも１３塩基のヌクレオチドであることが好ましい。前記の核酸プローブは更に標識を付していることが好ましい。
（２）本発明の、上記核酸プローブを利用した核酸検出方法は、
標識した核酸プローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせることにより、該プローブに含まれる配列に対して相補的な所望の配列を有する標的核酸分子を検出する方法であって、標識を付した上記の核酸プローブ分子にＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブ・ＲｅｃＡ複合体を形成させる第一ステップと、標的核酸を該複合体に接触させて、該プローブと該標的核酸分子との間の一部、又は全ての相補的塩基間でハイブリッドを形成させる第二ステップと、ハイブリッドを形成している該標的核酸鎖の末端と、該プローブの第一ヌクレオチド部分の末端との間でリガーゼを作用させることにより、該プローブと該標的核酸分子とを連結させる第三ステップと、該ハイブリッドからタンパク質を除去する第四ステップと、ハイブリッドを形成しなかった未反応プローブを、該ハイブリッドから分離する第五ステップとを具備し、該ハイブリッドに含まれる核酸プローブ中の標識を検出することにより、該プローブと相補的な配列を有する核酸を検出する方法である。
【０００８】
なお、前記の標的核酸分子は二重鎖ＤＮＡであることが好ましく、更に上記のリガーゼはNAD 要求性リガーゼであることが好ましい。また上記のリガーゼを使った反応は、３７〜７５℃の溶液中で行うことが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下において本願発明の実施の形態を示すが、これはあくまで本願発明を例示するにとどまり、本願発明を限定するものではないことは、当業者には自明である。
【００１０】
図１は本発明に係るヘアピン型ＤＮＡプローブ分子を利用して、二重鎖ＤＮＡの検出を行う方法を示す概略図である。本発明の技術的思想を最もよく表すヘアピン型ＤＮＡプローブ分子、及び該ＤＮＡプローブ分子を利用した標的二重鎖ＤＮＡ分子の検出方法について、図１を参照して順次説明する。
〈ヘアピン型核酸プローブ分子〉
図１において１１は、標的ＤＮＡ分子１６の末端の配列を認識して検出するための、ヘアピン型ＤＮＡプローブ分子である。該プローブ１１はその５’末端に、当該技術分野で広く知られた方法において、３２P により標識１２を入れたものである。該プローブ１１の５’側には、標的ＤＮＡ１６の末端の配列に相補的な部分があり（標識１２からステム・ループ構造部分１３までの間）、その３’側には自己相補的でステム・ループ構造をとる配列１３がある。標的ＤＮＡ１６の末端配列に相補的な部分は、鎖交換反応時、及びそれに続くライゲーション反応時にプローブと標的ＤＮＡとの間の安定な中間体形成を可能にする長さを有し、この長さは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであることが好ましい。しかし該中間体を、該鎖交換反応時、及びライゲーション反応時に安定に存在させるために必要なプローブの長さは、ＧＣ含有量といった、標的ＤＮＡの配列の特徴、並びに反応温度及び反応液中の塩濃度などの反応条件により影響されるものであるが、このことは当業者らには自明であり、当業者らは、標的ＤＮＡの末端配列の特徴、及び反応条件に応じてプローブの長さを調節するであろうことは自明である。よって該プローブの、標的ＤＮＡの末端配列に相補的な部分は、鎖交換反応時に安定な組み換え中間体を形成し、ライゲーション反応時にも該中間体が安定であることを保証するものであることを具備している。
【００１１】
次にヘアピン型ＤＮＡプローブ１１のステム・ループ構造１３は、一本鎖の当該プローブを安定化して、更に標的ＤＮＡのうちのハイブリダイズする側の鎖の５’末端へ、該プローブの３’末端を近付けるために、このようなステム・ループ構造をとっている。該ステム・ループのステム部分は１２〜３０ヌクレオチドで、ループ部分は、１〜１０ヌクレオチドで、全体では１３〜４０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。そして該プローブは、標的ＤＮＡと組み換え中間体を形成したときに、そのステム・ループ構造の３’末端のヌクレオチドが、標的二重鎖ＤＮＡのうちの該プローブとハイブリダイズしている方の鎖の５’末端のヌクレオチドに隣接し、その間にギャップが生じないように構成されている。また、このステム・ループ構造１３の長さは、該プローブ分子１１と標的分子１６との間のハイブリッド形成条件下で、自己相補的塩基間で結合することを保証する長さであることが好ましい。
〈ヘアピン型ＤＮＡプローブを利用した二重鎖ＤＮＡの検出方法〉
図１においてまず、ヘアピン型ＤＮＡプローブ１１とＲｅｃＡタンパク質１４とを接触させて、ＲｅｃＡ・プローブ複合体１５を形成させる。ＲｅｃＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＤＮＡの相同組み換えに関与している酵素タンパク質であり、ＡＴＰの存在下で一本鎖ポリヌクレオチドと結合することによりその酵素活性が活性化される。ＲｅｃＡは更に、ＡＴＰアーゼ活性を有し、二重鎖ＤＮＡを部分的に巻き戻して、これと部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡを結合させることにより、ＤＮＡの組み換えを行う酵素である。次に、この中間体１５に標的ＤＮＡ１６を接触させる。このときに、ＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳ（アデノシン5 ’- Ｏ- （３- チオ三リン酸））などのＡＴＰ類縁体を使用すると、鎖交換反応においてプローブ・標的ＤＮＡ中間体１７が形成されたところで反応が停止する。もしＡＴＰ類縁体の代わりにＡＴＰを使用すると、溶液中のＲｅｃＡのＡＴＰアーゼ活性により反応液中のＡＤＰ濃度が上昇する。このＡＤＰ濃度の上昇は、ＲｅｃＡ・プローブ・標的核酸の反応中間体１７からのＲｅｃＡの解離を引き起こしてしまい、ハイブリッド核酸が解消してしまうおそれがある。この反応中間体１７に対してリガーゼ１８を効かせることにより、該プローブの３’末端と、標的二重鎖ＤＮＡのうち該プローブとハイブリダイズしている側の鎖の５’末端との間の連結を行う。上記のとおり、この反応系にはＡＴＰを用いることが好ましくないので、ここで使用するリガーゼはＮＡＤをエネルギーとして要求するタイプのものであることが好ましい。ＮＡＤ要求性リガーゼとしては、例えば高熱細菌から抽出される耐熱性リガーゼがある。ライゲーション反応の温度は、３７〜７５℃であることが好ましいが、この温度範囲は、プローブと標的核酸末端との間の安定なハイブリッド形成、及び効率のよい連結反応を保証するためのものである。反応温度が３７℃未満の場合は、リガーゼの反応速度が低下し、一方、７５℃を越える場合には、プローブと標的核酸との間でアニーリングが起きにくくなり、ともにハイブリッド形成を阻害すると考えられるためである。ライゲーション反応終了後に除タンパクを行い、次いでハイブリダイズしなかったプローブと、ハイブリッドとを分離する。以上の工程により、標的ＤＮＡの末端部分に、標識の入ったプローブを安定に連結して、この標識を検出することにより該標的ＤＮＡを検出することが可能となる。
〈変形例〉
上記の実施形態に示されたヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該プローブ分子を利用した標的核酸分子検出方法は下記の変形例を含んでいる：
・当該技術分野で広く知られる方法により、５’末端以外を標識したヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該プローブ分子を利用した標的核酸分子検出方法；
・分子の５’側にステム・ループ構造を有し、その３’側に、標的核酸の末端配列と相補的な配列を有するヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該プローブ分子を利用した標的核酸分子検出方法；
・一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを標的核酸分子とする、ヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子を利用した該標的核酸検出方法。
【００１２】
【実施例】
実施例１：ヘアピン型ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとの中間体形成における配列特異性の確認
〈実験材料及び実験方法〉
３２P で５’末端を標識した６３量体のヘアピン型ＤＮＡプローブ分子を利用した、ScaIで切断した直鎖状プラスミドＤＮＡ、ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）の検出
配列番号１及び図２に示した６３量体のヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＴＲＩ−２０−６３）は、当該技術分野で広く行なわれている化学合成方法により作成し、ＨＰＬＣにより精製したものを使用した。このプローブの5 ’末端４０ヌクレオチド部分は、プラスミドＤＮＡ、p BluescriptSK(-) をScaIで切断したときのその末端の配列と相補的な配列からなる。ＲｅｃＡタンパク質は市販のものを使用した（Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。まず、以下の組成の反応液Ａ及び反応液Ｂを調整した。
反応液Ａ：
１０Ｘ緩衝液Ａ                            ０．５μｌ
４８ｍＭ  ＡＴＰγＳ                      ０．５μｌ
ヘアピン型プローブ（ＴＲＩ−２０−６３）  ５ｎｇ
ＲｅｃＡ                                  ０．４８μｇ
これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。
反応液Ｂ：
１０Ｘ緩衝液Ｂ                            ０．５μｌ
４８ｍＭ  ＡＴＰγＳ                      ０．５μｌ
標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ                    １００ｎｇ
これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。
なお、上記の１０Ｘの緩衝液の詳細は次のとおりである。
１０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭ  トリス・酢酸塩（ｐＨ７．２）／２５ｍＭ  （ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ
１０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭ  トリス・酢酸塩（ｐＨ７．２）／２２５ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ
標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ：制限酵素ＳｃａＩ、またはＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）    （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手）
上記の反応液Ａ及び反応液Ｂを３７℃で１５分間反応させた後に混合して、３７℃で３０分間反応させた。次に、以下の組成のライゲ−ション反応液１０μl を加えて、４５℃で一晩反応させた。
ライゲーション反応液
１０X アンプリガーゼ  ＤＮＡ  リガーゼ  ＲＸＤ  緩衝液
（エピセンターテクノロジー社）                            ２μl
アンプリゲース（エピセンターテクノロジー社）
（100 ユニット/ μl ）                                    ２０ユニット
これに二回蒸留水を加えて１０μl とした。
【００１３】
反応停止液（０．２２Ｍ  ＥＤＴＡ／５．６％  ＳＤＳ）を１．８μｌ加えて、反応を停止させた。次いで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテネースＫを１μｌ加え、そのまま４５℃で１５分間反応させて、タンパク質を分解させた。反応終了後にＢＰＢ色素液２μｌを加え、０．８％アガロースゲル電気泳動に試料をかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色して写真を撮り、次いでゲルドライヤーでゲルを乾燥させた。この乾燥させたゲルをオートラジオグラフィーにかけて（−８０℃、一晩）、Ｘ線フィルムを現像した。臭化エチジウム染色の泳動像と、オートラジオグラフィー像とを比較した。
〈結果〉
図３は、上記の実施例に示された実験の結果をまとめたものである。図３（Ａ）は、オートラジオグラフィーの結果を、図３（Ｂ）は、同じゲルの臭化エチジウムの染色結果を示すものである。（Ａ）のゲルのレーン１〜３を比較して、レーン１に特異的に検出されているバンド（レーン１）が、ＳｃａＩで切断した直鎖状のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）にヘアピン型ＤＮＡプローブがハイブリダイズして検出されたものである。レーン２にはレーン１と同じ長さで同じ量のＤＮＡがあるが（Ｂを参照）、標的ＤＮＡの末端配列がレーン１のものとは異なるために、ヘアピン型ＤＮＡプローブとハイブリダイズできず、よって標的ＤＮＡが検出されていない。レーン１及び２において、同じ長さで同じ量のＤＮＡが存在することは、（Ｂ）のゲルで示されている。レーン３ではプローブが認識しないＤＮＡを使って行った、ネガティブの対照実験である。
【００１４】
実施例２：ヘアピン型ＤＮＡプローブによる標的二重鎖ＤＮＡ検出における、ＲｅｃＡ及びリガーゼ依存性の確認
（実験材料及び実験方法）
実験は、実施例１に記載のものと本質的に同様にして行った。鎖交換反応及びそれに続くライゲーション反応の条件を以下の組み合わせにより行った。
0003891620.tif 000002
〈実験結果〉
図４に実施例２の結果を示した。（Ａ）のゲルはオートラジオグラフィーの結果を、（Ｂ）のゲルは臭化エチジウム染色の結果を表している。レーン１〜４を比較すると、ＲｅｃＡ及びリガーゼをともに作用させた実験のみにおいて、ヘアピン型プローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイズして検出されている。この実験は、ＲｅｃＡ及びリガーゼのどちらか一方でも欠く場合には、プローブと標的ＤＮＡとの安定なハイブリッドは形成されないため、ハイブリッドが検出されなかったことを示している。（Ｂ）のゲルにおいては、レーン１〜４において全て、同じ長さで同じ量のＤＮＡが各レーンにあったことを示している。実施例１の結果と合わせると、標的核酸分子の末端配列に相補的な配列を有するヘアピン型プローブとＲｅｃＡとの組み合わせにより、安定な組み換え中間体が形成されて検出されることが示された。
【００１５】
【発明の効果】
本発明に係るヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブを用いて、本発明に係る核酸検出方法を実施すると、以下のような効果が生ずる：
・標的核酸を完全に変性することなく、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを行うことができるので、二重鎖ゲノムのような長い核酸の検出を比較的簡単な操作で行うことができ、更に、標的核酸自体の情報が得られる；
・本発明の方法には、サザンハイブリッド法で使用されるような固相支持体を要せず、チューブ内において行うことが可能であるため、一度に多数の試料を扱うことや、異なる種類のプローブを使って核酸についての異なる情報を同時に得ることが、比較的短い時間に行える；
・反応に関する成分が全て反応溶液中に存在するために、プローブ濃度を上げて反応速度を上げることが可能である；
・固相支持体を使わずに全ての反応を液中で行うために、バックグラウンドを低くすることが可能である；
・強い紫外線を標的核酸に照射する必要がないので、標的核酸に障害を与えない。
【００１６】
よって本発明によれば、標的核酸と安定なハイブリッドを形成することが可能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子、並びに標的核酸に損傷を与えずに、上記のヘアピン型核酸プローブ分子を標的核酸にハイブリダイズさせて、形成されたハイブリッドを検出することにより、該核酸プローブに含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出する方法が提供される。
【００１７】
【配列表】
0003891620.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヘアピン型核酸プローブを用いた、核酸検出方法の概略を示す図。
【図２】本発明の実施例で使用したヘアピン型一本鎖ＤＮＡプローブの構造を示す図。
【図３】本発明の方法により形成させた組み換え中間体の検出を示す、オートラジオグラフィー、及びゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色像の写真。
【図４】本発明の方法により形成する組み替え中間体の検出が、ＲｅｃＡ及びリガーゼに依存することを示す、オートラジオグラフィー、及びゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色像の写真。
【符号の説明】
１１・・・ヘアピン型一本鎖核酸プローブ
１２・・・標識
１３・・・ステム・ループ構造
１４・・・ＲｅｃＡ
１５・・・ＲｅｃＡ・プローブ複合体
１６・・・標的核酸
１７・・・組み換え中間体
１８・・・リガーゼ
１９・・・プロテネースＫ
【図１】
0003891620.tif 000004
【図２】
0003891620.tif 000005
【図３】
0003891620.tif 000006
【図４】
0003891620.tif 000007