(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の定性的または定量的検出方法であり、この抗体をそれに対する抗原と免疫複合体が形成できるように接触させ、反応混合物を結合活性の低い抗体を含有する免疫複合体を不安定化するが、一方、結合活性の高い抗体を含有する免疫複合体は実質的に維持するタンパク質変性剤と接触させ、抗体の抗原への結合の程度を熟練した研究者には周知の方法により測定する方法において、タンパク質変性剤は尿素−過酸化水素とする方法。
【請求項２】
抗体の結合活性を測定する方法であり、抗体を互いに独立にそれに対する抗原との第一および第二の混合物において免疫複合体が形成できるように接触させ、２つの混合物の一方は結合活性の低い抗体を含有する免疫複合体を不安定化するが、一方結合活性の高い抗体を含有する免疫複合体は実質的に維持するタンパク質変性剤と接触させ、両サンプルにおける抗体の抗原への結合の程度を熟練した研究者には周知の方法により互いに独立に測定し、抗体の結合活性を第一および第二の混合物中における抗原-抗体結合の程度の比によって明らかにする方法において、タンパク質変性剤は尿素−過酸化水素とする方法。
【請求項３】
抗原は固相に結合した形態で抗体と接触させ、ついで尿素−過酸化水素を含有する緩衝溶液で洗浄する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光アッセイによって行われる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
診断に関連のある体液中の抗体の検出に用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
診断に関連のある抗体はウイルス、細菌または寄生虫に向けられた抗体である請求項５記載の方法。
【請求項７】
診断に関連のある抗体はＥＢＶ、ルベラウイルス、ＣＭＶ、ハンタウイルス、パルボウイルスＢ19、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２またはトキソプラズマ・ゴンディに向けられた抗体である請求項５たは６記載の方法。
【請求項８】
尿素−過酸化水素は２.５〜６.５Ｍの濃度で用いられる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法によって抗体の結合活性を測定することにより初期感染と古い感染を識別する方法。
【請求項１０】
急性ルベラウイルス感染もしくはその経過を最近完了した感染、最初のＣＭＶ感染、最初のＥＢＶ感染、最初のＨＳＶ感染またはトキソプラズマ・ゴンディ感染を検出する方法。
【請求項１１】
尿素−過酸化水素からなるイムノアッセイ用の洗浄溶液。
【請求項１２】
尿素−過酸化水素からなるイムノアッセイ用のサンプル希釈緩衝液。
【請求項１３】
尿素−過酸化水素は２.５〜６.５mol／Ｌの濃度で存在する請求項１１または１２記載の洗浄溶液またはサンプル希釈緩衝液。
【請求項１４】
尿素−過酸化水素は４.５〜６.０mol／Ｌの濃度で存在する請求項１３記載の洗浄溶液またはサンプル希釈緩衝液。
【請求項１５】
尿素−過酸化水素は約５.３mol／Ｌの濃度で存在する請求項１３記載の洗浄溶液またはサンプル希釈緩衝液。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実施する診断補助剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体の定性的または定量的検出のためおよびそれらの結合活性の測定のための方法および診断補助剤に関する。これは、ウイルス、細菌または寄生虫の感染の初期相の診断を可能にする。本発明の診断補助剤は大規模な分析臨床検査室における自動化過程にとくに適している。
【０００２】
【従来の技術】
イムノアッセイは、医学的診断の目的での血清および血漿サンプル中の免疫グロブリンの検出のために、それらのとくに優れた特異性および感度により頻繁に使用されている。さらに、イムノアッセイは使用が簡便であることによって傑出している。
【０００３】
急性の感染の場合、診断は、主としてＩｇＭ抗体の検出に基づいて行われる。しかしながら、新鮮な初感染とその経過は完了したかまたは再活性化された感染の信頼できる識別が、付加的な検討なしには可能でないケースが臨床検査の実務においては頻繁に認められる。しかしながら、たとえば、特定のウイルス、細菌または寄生虫に特異的なＩｇＧ抗体の結合活性の付加的な測定は、感染時期についてその付加的測定なしには全く不可能であるかもしくは不十分な正確さでしか提示できない血清学的状態の評価を可能にすることが知られている。
【０００４】
免疫グロブリンの結合活性の測定は、様々なアッセイで、たとえばタンパク質変性イムノアッセイにより行われる。このアッセイは熟練した研究者に、とくに以下の文献に開示されている。すなわち、J. Schubertら (1996), J. Lab. Med. 20(12): 713-717; J.J. Gray (1995), J. Virol. Methods 52: 95-104; J. Polanecら (1994), J. Clin. Lab. Analysis 8: 16-21; H.O. Kangroら (1991), J. Med. Virol. 33: 100-105 に記載されている。共通して使用されている変性物質の例は尿素、ジエチルアミン、グアニジン、チオシアナートである。
【０００５】
結合活性の測定は既に、ウイルス性および非ウイルス性原因の感染、たとえばエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ルベラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ハンタウイルス、パルボウイルスＢ19、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-6）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１もしくは２型（ＨＳＶ-１/-２）およびトキソプラズマ・ゴンディ感染の診断に有効に用いられてきた。しかしながら、この方法はとくに技術的な問題により、分析臨床検査室で広く用いられるには至ってはいない。これには主に３つの理由が原因となっている。
【０００６】
１．主として用いられる物質、尿素は著者らによって推薦されている濃度が結晶化点であり、イムノアッセイの自動化または部分自動化操作用の装置（イムノアッセイプロセッサー）のすべてのピペットの先端やチューブをしばしば詰まらせる。
２．低モル濃度（たとえば５〜６Ｍ）の尿素溶液を使用すると、方法の有効性がかなり低下する。
３．文献中にその方法の評価は限界または不能である旨述べられた範囲が広すぎる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、抗体の結合活性を測定する既知の方法は、改良する必要がある。とくに、自動化イムノアッセイ過程への適用性に改良を必要としていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、上述の問題がこれまでタンパク質変性イムノアッセイに用いられたことのない物質である尿素−過酸化水素（たとえば、Carl Roth GmbH＋Co Karlsruhe から入手できる：商品番号 7641.1）をタンパク質変性剤として使用することによる本発明の範囲内において解決できることが見出されたのである。この物質は驚くべきことに、低モル濃度（約２.５〜６.５Ｍ）でも、尿素の高モル濃度（約６〜８Ｍ）溶液と同様にタンパク質変性イムノアッセイに有効な性質をもっている。したがって、本発明は抗体の定性的または定量的検出方法であり、この抗体をそれに対する抗原と免疫複合体が形成できるように接触させ、反応混合物を結合活性の低い抗体を含有する免疫複合体を不安定化するが、一方、結合活性の高い抗体を含有する免疫複合体は実質的に維持するタンパク質変性剤と接触させ、抗体の抗原への結合の程度を熟練した研究者には周知の方法により測定する方法において、タンパク質変性剤は尿素−過酸化水素とする方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、抗体の結合活性を測定する方法であり、抗体を互いに独立にそれに対する抗原との第一および第二の混合物において免疫複合体が形成できるように接触させ、２つの混合物の一方は結合活性の低い抗体を含有する免疫複合体を不安定化するが、一方、結合活性の高い抗体を含有する免疫複合体は実質的に維持するタンパク質変性剤と接触させ、両サンプルにおける抗体の抗原への結合の程度を熟練した研究者には周知の方法により互いに独立に測定し、抗体の結合活性を第一および第二の混合物中における抗原-抗体結合の程度の比によって明らかにする方法において、タンパク質変性剤は尿素−過酸化水素とする方法に関する。
【００１０】
このタイプの好ましい方法は、抗原を固相に結合した形態で抗体と接触させ、ついで尿素−過酸化水素を含有する緩衝溶液で洗浄する方法である。このタイプの好ましい方法の例には、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光アッセイが包含される。しかしながら、熟練した研究者によれば、本発明の記載に従い尿素−過酸化水素を用いて本発明をそのまま実施できる他のイムノアッセイシステムは明瞭であろう。
【００１１】
上述の方法は、体液中の診断に関連のある抗体を検出する本発明の方法にとくに適している。このタイプの抗体は、ウイルス、細菌もしくは寄生虫たとえば、ＥＢＶ、ルベラウイルス、ＣＭＶ、ハンタウイルス、パルボウイルスＢ19、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２またはトキソプラズマ・ゴンディ向けられた抗体である。
【００１２】
結合活性の測定は、部分的にまたは完全に自動化された市販品を入手できるイムノアッセイ（たとえばＥＬＩＳＡ）を用いて有利に実施できる。本発明の他の利点は結果の良好な解析対応性である。
【００１３】
抗体の結合活性の測定のためのこの新規な方法は、新鮮な（すなわちごく最近の発生）感染を古い（すなわちそれほど最近の発生ではない）感染と識別するのにとくに適している。とくに本発明は、急性のルベラウイルス感染、または最近その経過を完了した感染、最初のＣＭＶ感染、最初のＥＢＶ感染、最初のＨＳＶ感染もしくはトキソプラズマ・ゴンディ感染を検出する方法に関する。
【００１４】
本発明はさらに、上述の新規な方法の適用のために適当な診断補助剤（診断試薬、アッセイキット）に関する。これらのタイプの診断補助剤は、熟練した研究者にはそれ自体既知の様式で、本発明の説明に基づいて製造される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
新規な尿素−過酸化水素溶液の調製
市販品を入手できるＥＬＩＳＡキットからの洗浄溶液は、タンパク質変性剤の希釈溶液としてしばしば使用される。以下の実施例においては、いわゆるＰＯＤ洗浄溶液（注文番号：OSEW，Behring Diagnostics GmbH, Marburg, Germany）を例として用いた。しかしながら、ＥＬＩＳＡの洗浄に原理的に適当な任意の他の洗浄溶液の使用が可能であった。尿素−過酸化水素は、２.５mol／Ｌ〜６.５mol／Ｌの範囲、好ましくは４.５mol／Ｌ〜６.０mol／Ｌの範囲で使用される。至適濃度は５.３mol／Ｌである。尿素−過酸化水素はイムノアッセイを実施するために用いられる他の溶液、たとえばサンプル希釈緩衝液中での使用も意図される。
【００１６】
イムノアッセイ操作
上述の新規な尿素−過酸化水素溶液は、イムノアッセイたとえばＥＬＩＳＡを慣用方法で実施する際に用いられる。
既知の方法と比較して新規な方法における改良点は、サンプルのインキュベーションに続いて、尿素−過酸化水素を含有する洗浄溶液のその方法に適当な容量（たとえばマイクロタイタープレートに基づくＥＬＩＳＡでは約０.３ml）で２回洗浄し、ついでたとえば各回同じ容量の洗浄溶液で２回洗浄する点である。自動化装置の製造業者によって提供された洗浄溶液の留置時間は必ずしも変更する必要はない。
自動化操作が要求される場合には、アッセイはＥＬＩＳＡプロセッサー上で実施する（たとえば Behring Diagnostics GmbH から入手可能）。
【００１７】
以下の実施例では Behring Diagnostics GmbH のＥＬＩＳＡを使用して改良した。洗浄溶液としてはＰＯＤ洗浄溶液を用いた。これらの実施例は本発明をさらに例示するためのものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例１：
結合活性のＥＬＩＳＡ測定を至適化するため、最初に、様々なモル濃度の試薬を用いて新鮮なおよび古いルベラ感染についてそれぞれの血清で、尿素洗浄工程と尿素−過酸化水素洗浄工程を比較した。
結果：
図１は、濃度範囲２.５mol／Ｌ〜６.５mol／Ｌで新規な尿素−過酸化水素溶液が、上記２つのグループの血清の間の最良の分離を達成することを示している。
【００１９】
実施例２：
尿素−過酸化水素による新規な方法の有効性を、ルベラ血清変換により、従来技術の慣用方法と比較して調べた。
結果：
表１参照。結合活性のＥＬＩＳＡ測定は、新規方法によって以下のように評価した：１５％以下＝急性感染、１５〜２０％＝急性感染の耐性範囲、２０％以上＝最近のものではない感染。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
実施例３：
方法の識別は、確認されたルベラＩｇＭ陽性血清グループと比較して、確認されたルベラＩｇＭ陰性血清グループに示すことである。
結果：
表２参照。ルベラ感染の初期相からの血清の大部分は約５％未満の結合活性指数を有し、一方、感染の後期に由来するルベラ血清の大部分は約５０％の平均結合活性指数を有する。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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【００２４】
実施例４：
ルベラ系に対して実施例３をチェックするためには方法の識別を単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の例を用いて再び示すことである。確認されたＨＳＶ ＩｇＭ陽性血清のグループを確認されたＨＳＶ ＩｇＭ陰性血清グループと比較する。
結果：
表３参照。単純ヘルペスウイルス感染の初期相からの血清の大部分は約５％未満の結合活性指数に達するが、感染の後期からの単純ヘルペスウイルス血清は約50％より大きい平均結合活性指数を有する。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Enzygnost（登録商標）抗−ルベラウイルスＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイにおけるタンパク質変性物質、尿素および尿素−過酸化水素のモル濃度至適化試験結果を示すグラフであり、Ａはルベラ感染の初期相（血清AB 05：ルベラ接種後４週に採取）、Ｂはルベラ感染の後期相（血清 281：ルベラウイルスとの接触数年後）である。
【図１】
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