(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子を製造する方法であって、アルファウイルスは、ベネズエラ馬脳脊髄炎（Venezuelan Equine Encephalitis virus；ＶＥＥ）ウイルス、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、セムリキ森林ウイルス（Semliki Forest virus）、又は南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６（Ｓ．Ａ．ＡＲ８６）であり、
（ａ）アルファウイルス許容細胞を複製能欠損レプリコンＲＮＡによりトランスフェクトするステップと、ここで、前記レプリコンＲＮＡはアルファウイルスのパッケージングセグメントと挿入された異種ＲＮＡとを含有し、前記レプリコンＲＮＡはアルファウイルスの構造タンパク質をコードする配列を欠失しており、前記アルファウイルス許容細胞は、
（１）前記レプリコンＲＮＡとは別個の第一のヘルパーＲＮＡと、ここで、前記第一のヘルパーＲＮＡは（ｉ）少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、（ｉｉ）少なくとも一の他のアルファウイルス構造タンパク質はコードしていない、
（２）前記レプリコンＲＮＡとは別個であり、第一のヘルパーＲＮＡとも別個である第二のヘルパーＲＮＡと、ここで、第二のヘルパーＲＮＡは（ｉ）前記第一のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしていないが、（ｉｉ）前記第一のヘルパーＲＮＡによりコードされない前記少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードする
を含み、
ここで、前記アルファウイルスのパッケージングセグメントは、前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡから欠失されており、
前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記アルファウイルス構造タンパク質の全ては、一緒になって会合して、前記レプリコンＲＮＡを含むアルファウイルス粒子となる、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞中に前記アルファウイルス粒子を作成するステップと、
（ｃ）前記トランスフェクトされた細胞から前記アルファウイルス粒子を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも一の前記レプリコンＲＮＡ、前記第一のヘルパーＲＮＡ、及び前記第二のヘルパーＲＮＡが、一以上の弱毒化突然変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レプリコンＲＮＡを前記アルファウイルス許容細胞にトランスフェクトする前記ステップが、エレクトロポレーションである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘルパーＲＮＡが、前記アルファウイルス許容細胞にトランスフェクトされる請求項１〜３の方法。
【請求項５】
前記ヘルパーＲＮＡが、エレクトロポレーションにより前記アルファウイルス許容細胞にトランスフェクトされる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子の調製物であって、アルファウイルスは、ベネズエラ馬脳脊髄炎（Venezuelan Equine Encephalitis virus；ＶＥＥ）ウイルス、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、セムリキ森林ウイルス（Semliki Forest virus）、又は南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６（Ｓ．Ａ．ＡＲ８６）であり、
（ａ）アルファウイルス許容細胞を複製能欠損レプリコンＲＮＡによりトランスフェクトするステップと、ここで、前記レプリコンＲＮＡはアルファウイルスのパッケージングセグメントと挿入された異種ＲＮＡとを含有し、前記レプリコンＲＮＡはアルファウイルスの構造タンパク質をコードする配列を欠失しており、前記アルファウイルス許容細胞は、
（１）前記レプリコンＲＮＡとは別個の第一のヘルパーＲＮＡと、ここで、前記第一のヘルパーＲＮＡは（ｉ）少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、（ｉｉ）少なくとも一の他のアルファウイルス構造タンパク質はコードしていない、
（２）前記レプリコンＲＮＡとは別個であり、第一のヘルパーＲＮＡとも別個である第二のヘルパーＲＮＡと、ここで、第二のヘルパーＲＮＡは（ｉ）前記第一のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしていないが、（ｉｉ）前記第一のヘルパーＲＮＡによりコードされない前記少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードする
を含み、
ここで、前記アルファウイルスのパッケージングセグメントは、前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡから欠失されており、
前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記アルファウイルス構造タンパク質の全ては、一緒になって会合して、前記レプリコンＲＮＡを含むアルファウイルス粒子となる、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞中に前記アルファウイルス粒子を作成するステップと
を含む方法により製造される前記トランスフェクトされた細胞から得られる細胞培養物に由来する調製物。
【請求項７】
アルファウイルスがＶＥＥである請求項６に記載の調製物。
【請求項８】
アルファウイルスの構造タンパク質の少なくとも一が、Ｅ２アミノ酸の７６位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸１２０位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸２０９位の弱毒化突然変異、Ｅ１アミノ酸２７２位の弱毒化突然変異、Ｅ１アミノ酸８１位の弱毒化突然変異、Ｅ１アミノ酸２５３位の弱毒化突然変異、及びＥ１アミノ酸２５３位の弱毒化突然変異とＥ３アミノ酸５６〜５９位の欠失の組み合わせを含む弱毒化突然変異からなる群から選択される弱毒化突然変異を含むＶＥＥの構造タンパク質である請求項６又は７に記載の調製物。
【請求項９】
弱毒化突然変異が、
（ａ）Ｅ１アミノ酸８１位の弱毒化突然変異
（ｂ）Ｅ１アミノ酸２５３位の弱毒化突然変異、及び
（ｃ）Ｅ１アミノ酸の８１位の弱毒化突然変異とＥ１アミノ酸２５３位の弱毒化突然変異
からなる群から選択される請求項８の調製物。
【請求項１０】
アルファウイルスがＳ．Ａ．ＡＲ８６である請求項６に記載の調製物。
【請求項１１】
レプリコンＲＮＡ又はアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも一が、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６に由来し、ｎｓＰ１アミノ酸５３８位の弱毒化突然変異、ｎｓＰ２アミノ酸９６位の弱毒化突然変異、ｎｓＰ２アミノ酸３７２位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸３０４位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸３１４位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸３７２位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸３７６位の弱毒化突然変異、Ｅ２アミノ酸３７８位の弱毒化突然変異からなる群から選択される弱毒化突然変異を含む、請求項６又は１０に記載の調製物。
【請求項１２】
異種ＲＮＡ配列が、免疫原性タンパク質若しくはペプチド又は治療に有効なタンパク質若しくはペプチドをコードする請求項６〜１１のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１３】
レプリコンＲＮＡが、２つの異なる異種ＲＮＡ配列を含む請求項６〜１２のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１４】
レプリコンＲＮＡが、第一の異種ＲＮＡ配列の発現を指示するプロモーター配列と、第二の異種ＲＮＡ配列の上流に位置するＩＲＥＳ配列とを含む請求項６〜１３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１５】
レプリコンＲＮＡが、２つの別個のプロモーター配列を含み、それぞれのプロモーター配列が異なる異種ＲＮＡ配列の発現を指示する請求項６〜１３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１６】
２つの別個のプロモーター配列がアルファウイルス２６Ｓプロモーター配列である請求項１５に記載の調製物。
【請求項１７】
異種ＲＮＡ配列が、ラッサ熱ウイルス免疫原、ヒト免疫不全ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス免疫原、ワクシニアウイルス免疫原、エボラウイルス免疫原、マールブルグウイルス免疫原、インフルエンザウイルス免疫原、リフトバレー熱ウイルス免疫原、クリミアコンゴ出血熱ウイルス免疫原、シシリアサンドフライ（Sandfly）ウイルス免疫原性タンパク質、ヒトコロナウイルス免疫原、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、プラスモディウムＣＳ１免疫原、及びボツリヌス菌毒素Ｃ断片免疫原からなる群から選択される免疫原性タンパク質又はペプチドをコードする請求項６〜１６のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１８】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載の調製物を含む組成物。
【請求項１９】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載の調製物又は製薬的に許容可能な担体中の請求項１８に記載の組成物を含む医薬製剤。
【請求項２０】
異種ＲＮＡ配列が効果免疫量存在する免疫原性タンパク質又はペプチドをコードする請求項１９の医薬製剤。
【請求項２１】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載の調製物、請求項１８に記載の組成物、又は医薬として使用するための請求項１９又は２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載の調製物の製造のためのヘルパー細胞であって、アルファウイルス許容細胞中に、
（ａ）アルファウイルスレプリコンＲＮＡと、ここで、レプリコンＲＮＡはアルファウイルスのパッケージングセグメントと挿入された異種ＲＮＡを含有し、レプリコンＲＮＡはアルファウイルスの構造タンパク質をコードし、前記ヘルパー細胞はレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされている、
（ｂ）前記レプリコンＲＮＡとは別個の第一のヘルパーＲＮＡと、ここで、前記第一のヘルパーＲＮＡが（ｉ）少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、（ｉｉ）少なくとも一の他のアルファウイルス構造タンパク質をコードしない、
（ｃ）前記レプリコンＲＮＡと別個であり、前記第一のヘルパーＲＮＡとも別個である第二のヘルパーＲＮＡと、ここで、前記第二のヘルパーＲＮＡは（ｉ）前記第一のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしていないが、（ｉｉ）前記第のヘルパーＲＮＡによりコードされない少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードする、
を含み、
前記アルファウイルスのパッケージングセグメントは前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡから欠失されており、
前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡによりコードされる前記アルファウイルス構造タンパク質の全ては、一緒になって会合して、前記レプリコンＲＮＡを含有するアルファウイルス粒子となる、ヘルパー細胞。
【請求項２３】
少なくとも一の前記レプリコンＲＮＡ、前記第一のヘルパーＲＮＡ、前記第二のヘルパーＲＮＡが、一以上の弱毒化突然変異を含む請求項２２のヘルパー細胞。
【請求項２４】
前記レプリコンＲＮＡが、エレクトロポレーションにより前記ヘルパー細胞にトランスフェクトされる請求項２２又は２３に記載のヘルパー細胞。
【請求項２５】
前記第一及び第二のヘルパーＲＮＡが、トランスフェクションにより前記ヘルパー細胞に導入される請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のヘルパー細胞。
【請求項２６】
前記ヘルパーＲＮＡが、エレクトロポレーションにより前記ヘルパー細胞にトランスフェクトされる請求項２５に記載のヘルパー細胞。
【請求項２７】
ヘルパー細胞が、
（ａ）ヘルパーＲＮＡの少なくとも一が、アルファウイルスのキャプシドタンパク質とアルファウイルスのＥ１糖タンパク質とをコードするが、アルファウイルスのＥ２糖タンパク質をコードしないヘルパー細胞、
（ｂ）ヘルパーＲＮＡの少なくとも一が、アルファウイルスのキャプシドタンパク質とアルファウイルスのＥ２糖タンパク質とをコードするが、アルファウイルスのＥ１糖タンパク質をコードしないヘルパー細胞、及び
（ｃ）ヘルパーＲＮＡの少なくとも一が、アルファウイルスのＥ１糖タンパク質とアルファウイルスのＥ２糖タンパク質とをコードするが、アルファウイルスのキャプシドタンパク質をコードしないヘルパー細胞
からなる群から選択される請求項２２〜２６に記載のヘルパー細胞。
【請求項２８】
ヘルパー細胞が、
（ａ）第一のヘルパーＲＮＡがアルファウイルスのキャプシドタンパク質をコードするが、アルファウイルスのＥ１糖タンパク質とアルファウイルスのＥ２糖タンパク質とをコードせず、第二のヘルパーＲＮＡがアルファウイルスのＥ１糖タンパク質とアルファウイルスのＥ２糖タンパク質とをコードするヘルパー細胞、
（ｂ）第一のヘルパーＲＮＡがアルファウイルスのキャプシドタンパク質とアルファウイルスのＥ１糖タンパク質をコードするが、アルファウイルスのＥ２糖タンパク質をコードせず、第二のヘルパーＲＮＡがアルファウイルスのＥ２糖タンパク質をコードするヘルパー細胞、及び
（ｃ）第一のヘルパーウイルスが、アルファウイルスのキャプシドタンパク質とアルファウイルスのＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルスのＥ１糖タンパク質をコードせず、第二のヘルパーウイルスがアルファウイルスのＥ１糖タンパク質をコードするヘルパー細胞
からなる群から選択される請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のヘルパー細胞。
【請求項２９】
Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、及びニワトリ胚線維芽細胞からなる群から選択される請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のヘルパー細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術、特に真核細胞への外来遺伝子の導入および発現に関する。
発明の背景
アルファウイルス属には、様々なウイルスが含まれ、そのすべてがトガウイルス（Togaviridae）科の一員である。アルファウイルスには、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスEastern Equine Encephalitis virus（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスVenezuelan Equine Encephalitis virus（ＶＥＥ）、エヴァグレーズウイルスEverglades virus、ムカンボウイルスMucambo virus、ピクシュナウイルスPixuna virus、西部ウマ脳脊髄炎ウイルスWestern Equine Encephalitis virus（ＷＥＥ）、シンドビスウイルスSindbis virus、セムリキ森林ウイルスSemliki Forest virus、ミデルブルグウイルスMiddelburg virus、チクングンヤ熱ウイルスChikungunya virus、オニョンニョン熱ウイルスO'nyung-nyong virus、ロス川ウイルスRoss River virus、バーマー森林ウイルスBarmah Forest virus、ゲタウイルスGetah virus、サギヤマウイルスSagiyama virus、ベバルウイルスBebaru virus、マヤロウイルスMayaro virus、ウナウイルスUna virus、アウラウイルスAura virus、ワタロアウイルスWhataroa virus、ババンキウイルスBabanki virus、キジラガウイルスKyzylagach virus、ハイランドＪウイルスHighlands J virus、森林モーガンウイルスFort Morgan virus、Ndumu virus、およびバギークリークウイルスBuggy Creek virusなど、様々な種のアルファウイルスが含まれる。ウイルスのゲノムは、５’末端がメチル化されたキャップで修飾され、３’末端が可変長ポリ（Ａ）トラクトで修飾された１本鎖メッセンジャーセンスＲＮＡである。単一のウイルスタンパク質であるＣを含む構造サブユニットは、正十二面体ヌクレオキャプシド内のＲＮＡゲノムと会合している。ビリオンの場合、キャプシドは、膜貫通タンパク質スパイクの規則正しい配列で覆われた液体エンベロープで囲まれており、その各々は、２種の糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２のヘテロダイマー複合体で構成されている。Pedersen et al.J. Virol. 14:40（1974）を参照されたい。シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスは、原型のアルファウイルスと考えられ、広範に研究がおこなわれてきた。Schlesinger, The Togaviridae and Flaviviridae、Plenum Publishing Corp., New York（1986）を参照されたい。本発明者は、ＶＥＥウイルスを研究してきた。Davis et al.に付与された米国特許第５，１８５，４４０号を参照されたい。
上述のウイルスに関する研究により、アルファウイルス病や、外来ＤＮＡを導入するためにアルファウイルスベクターを使用することによって、他の疾患に備えてワクチン接種を行う有益な技術が開発された。Davis et alに付与された米国特許第５，１８５，４４０号、およびＰＣＴ公開ＷＯ９２／１０５７８号を参照されたい。真核細胞への外来ＤＮＡ導入は、次第に高まる関心の的となった。弱毒化ウイルス生ワクチンは、ウイルス性疾患を管理する上で、最も効を奏する手段の１つであることは周知である。しかし、一部のウイルス病原体では、生きたウイルス株で免疫することは実用的でなかったり、危険であったりする可能性がある。１つの代替方法は、このような病原体の免疫感作抗原をコードしている配列を別のウイルスのワクチン株に挿入する方法である。このような、生きたＶＥＥベクターを使用する１つの系は、１９９４年５月２７日に提出された、筆者らの同時係属特許出願番号第０８／２５０，４４５号に記載されている。また別のこのような系は、Hahn et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2679（1992）に記載されており、その中には、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質の切断短縮型（truncated form）を発現するシンドビスウイルス構造物が記載されている。運悪く、現在利用できるこのような系は比較的少数である。
したがって、外来抗原のワクチンとして使用することが可能な、ウイルスのワクチン株に安全に組込むべき外来抗原をコードしている核酸配列が、依然として技術上必要性である。
発明の概要
第１の態様として、本発明は、感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子をアルファウイルス許容細胞で発現するためのヘルパー細胞を提供する。ヘルパー細胞は、細胞内アルファウイルス構造タンパク質が集まってアルファウイルス粒子を構成するように、（ａ）（ｉ）少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、且つ（ii）少なくとも一の他のアルファウイルス構造タンパク質をコードしていない第１ヘルパーＲＮＡと、（ｂ）第１ヘルパーＲＮＡとは別個の第２ヘルパーＲＮＡであって、（ｉ）第１ヘルパーＲＮＡにコードされる少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードせず、且つ（ii）第１ヘルパーＲＮＡにコードされない少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしている第２ヘルパーＲＮＡとを含む。好ましくは、アルファウイルスパッケージングセグメントは、少なくとも第１ヘルパーＲＮＡから欠失しており、さらに好ましくは、第１ヘルパーＲＮＡからも第２ヘルパーＲＮＡからも欠失している。
好ましい実施態様では、アルファウイルスパッケージングセグメントおよび挿入された異種ＲＮＡをコードするレプリコンＲＮＡにより、ヘルパー細胞が共トランスフェクトされる。ヘルパー細胞がレプリコンＲＮＡも含む実施態様では、アルファウイルスパッケージングセグメントは、第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡの両者から欠失していてもよく、また欠失していることが好ましい。たとえば、ヘルパー細胞がアルファウイルスパッケージングセグメントおよび挿入された異種ＲＮＡをコードしているレプリコンＲＮＡを含む実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡはアルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードし、第２ヘルパーＲＮＡはアルファウイルスキャプシドタンパク質をコードする。レプリコンＲＮＡ、第１ヘルパーＲＮＡ、および第２ヘルパーＲＮＡは、すべて別個の分子上にあり、宿主細胞に共トランスフェクトされる。
他の実施態様では、ヘルパー細胞はアルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしている第１ヘルパーＲＮＡを含み、且つアルファウイルスパッケージングセグメント、挿入された異種ＲＮＡ、および第１ヘルパーＲＮＡにコードされない残りのアルファウイルス構造タンパク質をコードしているレプリコンＲＮＡで共トランスフェクトされる。それゆえ、レプリコンＲＮＡおよび第１ヘルパーＲＮＡは別個の分子上にあり、レプリコンＲＮＡと第１ヘルパーＲＮＡにコードされない構造タンパク質をコードしているＲＮＡは１つの分子上にある。異種ＲＮＡは、ヘルパー細胞で発現が望まれるタンパク質またはペプチドをコードする外来ＲＮＡを含む。
構造タンパク質をコードしているＲＮＡ、すなわち、第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡは、１つ以上の転写弱毒化突然変異を含むことが好適である。好ましい実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡのうち少なくとも１つは、弱毒化突然変異を少なくとも１つ含む。細胞内のＲＮＡ組換えの場合、弱毒化突然変異により、構造遺伝子と非構造遺伝子が結合すると毒性の低減したウイルスがつくられるという利点が得られる。
第２の態様として、本発明は感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子を製造する方法を提供する。この方法には、上述のヘルパー細胞をレプリコンＲＮＡを共トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞中でアルファウイルス粒子を生成するステップと、細胞からアルファウイルス粒子を収集するステップとが含まれる。レプリコンＲＮＡは、アルファウイルスパッケージングセグメント、非構造タンパク質および異種ＲＮＡをコードする。レプリコンＲＮＡによりコードされる非構造タンパク質は、複製および転写に必要なタンパク質であってもよい。トランスフェクトされた細胞は、上述の第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡをさらに含む。
第３の態様として、本発明は、感染性の複製能欠損アルファウイルスを発現するための一組のＲＮＡを提供する。この一組のＲＮＡは、（ａ）少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているＲＮＡがレプリコンＲＮＡから欠失していることを特徴とする、プロモーター配列および挿入された異種ＲＮＡをコードしているレプリコンＲＮＡと、（ｂ）第１ヘルパーＲＮＡは、レプリコンＲＮＡから欠失している構造タンパク質、およびプロモーター配列をトランス型でコードすることを特徴とする、レプリコンＲＮＡとは別個の第１ヘルパーＲＮＡとの組み合わせを含む。この実施態様では、少なくとも一の構造タンパク質をコードしているＲＮＡセグメントは、第１ヘルパーＲＮＡ以外のＲＮＡ上に位置することが好ましい。それゆえ、たとえば、この一組のＲＮＡは、アルファウイルスパッケージング配列をコードするＲＮＡ、挿入された異種ＲＮＡおよびアルファウイルスキャプシドタンパク質を含むが、アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質は欠失しているレプリコンＲＮＡを含んでもよく、第１ヘルパーＲＮＡはアルファウイルスＥ１糖タンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質の両者をコードしているＲＮＡを含むことが好ましい。
別の実施態様では、この一組のＲＮＡは、レプリコンＲＮＡおよび第１ヘルパーＲＮＡとは別個の第２ヘルパーＲＮＡも含む。この実施態様では、第２ヘルパーＲＮＡは、レプリコンＲＮＡおよび第１ヘルパーＲＮＡによりコードされる構造タンパク質とは異なる、少なくとも一の構造タンパク質をトランス型でコードする。それゆえ、たとえば、この一組のＲＮＡは、アルファウイルスパッケージング配列および挿入された異種ＲＮＡをコードするＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡ、プロモーター配列をコードするＲＮＡおよびアルファウイルスＥ１糖タンパク質とアルファＥ２糖タンパク質の両者をコードしているＲＮＡを含む第１ヘルパーＲＮＡ、およびプロモーター配列およびアルファウイルスキャプシドタンパク質をコードするＲＮＡを含む第２ヘルパーＲＮＡを含むことが可能であり、レプリコンＲＮＡ、第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡは、別個の分子上で、互いにトランス型である。
第４の態様として、本発明は、プロモーター配列、および挿入された異種ＲＮＡをコードしており、且つ、感染性ウイルス粒子が複製能欠損であるように、少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているＲＮＡがそのＲＮＡから欠失していることを特徴とするＲＮＡを含む感染性ＶＥＥレプリコン分子を提供する。
第５の態様として、本発明は、薬理学上許容できる担体中の、有効な免疫原性量の上述の感染性アルファウイルス粒子を含む医薬製剤を提供する。
前述の態様および本発明の他の態様を、下記の詳細な説明で、詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ｐＶ４０３１クローンの図示と、ｐＶＲ２クローンの製造である。
第２図は、本発明による二重ヘルパーＲＮＡ系プラスミドの構造物を示す図である。Ｐ２１−１およびＰ２４−３と表示される図面で、破線は、プラスミドで欠失している構造タンパク質またはその一部を示す。第２図は、単一ヘルパーＲＮＡ系プラスミド、および異種遺伝子を含む組換えＶＥＥクローンの構造物も示す。
第３図は、異なる２種の投与単位における、単一ヘルパーＲＮＡ系でつくられたＶＥＥレプリコン／ラッサ（Lassa）Ｎ感染性粒子接種マウスで得られた結果を示すグラフ図である。上のグラフは、感染性粒子の低用量接種で得られた結果を示す。下のグラフは、感染性粒子の高用量接種で得られた結果を示す。
発明の詳細な説明
用語「アルファウイルス」は、技術上定型的な意味を有し、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスEastern Equine Encephalitis virus（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスVenezuelan Equine Encephalitis virus（ＶＥＥ）、エヴァグレーズウイルスEverglades virus、ムカンボウイルスMucambo virus、ピクシュナウイルスPixuna virus、西部ウマ脳脊髄炎ウイルスWestern Equine Encephalitis virus（ＷＥＥ）、シンドビスウイルスSindbis virus、セムリキ森林ウイルスSemliki Forest virus、ミデルブルグウイルスMiddelburg virus、チクングンヤ熱ウイルスChikungunya virus、オニョンニョン熱ウイルスO'nyung-nyong virus、ロス川ウイルスRoss River virus、バーマー森林ウイルスBarmah Forest virus、ゲタウイルスGetah virus、サギヤマウイルスSagiyama virus、ベバルウイルスBebaru virus、マヤロウイルスMayaro virus、ウナウイルスUna virus、アウラウイルスAura virus、ワタロアウイルスWhataroa virus、ババンキウイルスBabanki virus、キジラガウイルスKyzylagach virus、ハイランドＪウイルスHighlands J virus、森林モーガンウイルスFort Morgan virus、Ndumu virus、およびバギークリークウイルスBuggy Creek virus、およびウイルスの分類に関する国際委員会（International Committee on Taxonomy of Viruse；ICTV）によってアルファウイルスと同定される他のウイルスなど、様々な種のアルファウイルスが含まれる。本発明に使用するのに好ましいアルファウイルスＲＮＡ転写産物としては、ＶＥＥ、シンドビスウイルス、およびセムリキ森林ウイルスなどがある。
本発明の方法に使用されるアルファウイルス許容細胞は、ウイルスＲＮＡ転写産物でトランスフェクトする際に、ウイルイス粒子をすることができる細胞である。アルファウイルスは、広い宿主範囲を有する。適当な宿主細胞の例としてはベロ細胞、幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、およびニワトリ胚線維芽細胞などがあるが、これらに限定されない。
本願明細書で使用される語「構造タンパク質」または「アルファウイルス構造タンパク質」は、ＲＮＡレプリコンの包膜（たとえば、パッケージング）に必要なコードされたタンパク質を指し、キャプシドタンパク質、Ｅ１糖タンパク質およびＥ２糖タンパク質を含む。上述の通り、アルファウイルスの構造タンパク質は、一以上のヘルパーＲＮＡ（すなわち、第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡ）に分布している。さらに、結果として生じたアルファウイルス粒子が複製能欠損であるように、少なくとも一の構造タンパク質がレプリコンＲＮＡタンパク質から欠失しているという条件で、一以上の構造タンパク質がレプリコンＲＮＡと同じＲＮＡ分子上にあってもよい。本願明細書で使用される用語「欠失した」または「欠失」は、特定のセグメントの完全欠失、または標準用法により、特定のセグメントを無効または無機能にさせることができるほど、そのセグメントの十分な部分の欠失のいずれかを意味する。たとえば、Temin et al.に付与された米国特許第４，６５０，７６４号を参照されたい。本願明細書で使用される用語「複製能欠損」は、ヘルパーＲＮＡが存在しない条件下で、宿主細胞でレプリコンＲＮＡを包膜できないことを意味する。このレプリコンＲＮＡは、包膜に必要なアルファウイルス構造タンパク質のすべてを含まず、パッケージされたレプリコンＲＮＡはウイルスゲノム全体を複製することができないように、必要な構造タンパク質のうち少なくとも一がレプリコンＲＮＡから欠失しているため、結果として生じるアルファウイルス粒子は複製能欠損である。
感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子を発現させるためのヘルパー細胞は、上述の通り、一組のＲＮＡを含む。この一組のＲＮＡは、主として第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡを含む。第１ヘルパーＲＮＡは、少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているが、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードしてはいないＲＮＡを含む。換言すれば、第１ヘルパーＲＮＡは、少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードせず、それゆえ、少なくとも一のコードされていないアルファウイルス構造タンパク質が第１ヘルパーＲＮＡから欠失している。１つの実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードしているＲＮＡを含み、アルファウイルスキャプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質は第１ヘルパーＲＮＡから欠失している。別の実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡはアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしているＲＮＡを含み、アルファウイルスキャプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１糖タンパク質は第１ヘルパーＲＮＡから欠失している。第３の実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡはアルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしているＲＮＡを含み、アルファウイルスキャプシドタンパク質は第１ヘルパーＲＮＡから欠失している。
第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡによりコードされる少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質と異なる少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているＲＮＡを含む。したがって、第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡによりコードされない少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードする。第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡによりコードされる少なくとも一の構造タンパク質をコードせず、それゆえ、第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡは、構造タンパク質を二重にはコードしない。第１ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをコードしているＲＮＡを含む実施態様では、第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスキャプシドタンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうち一または両者をコードしているＲＮＡを含んでもよい。第１ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをコードしているＲＮＡを含む実施態様では、第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスキャプシドタンパク質とアルファウイルスＥ１糖タンパク質のうち一または両者をコードしているＲＮＡを含んでもよい。第１ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質の両者をコードしているＲＮＡを含む実施態様では、第２ヘルパーＲＮＡは、第１ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスキャプシドタンパク質をコードしているＲＮＡを含むことが可能である。
１つの実施態様では、パッケージングセグメント（包膜またはパッケージングシグナルを含むＲＮＡ）が少なくとも第１ヘルパーＲＮＡから欠失している。好ましい実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡの両者からパッキングセグメントが欠失している。
第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡの両者からパッケージングセグメントが欠失している好ましい実施態様では、第１ヘルパーＲＮＡと第２ヘルパーＲＮＡに加えて、レプリコンＲＮＡでヘルパー細胞が共トランスフェクトされる。レプリコンＲＮＡは、パッケージングセグメントおよび挿入された異種ＲＮＡをコードする。挿入された異種ＲＮＡは、タンパク質またはペプチドをコードしているＲＮＡであってもよい。一般に、挿入された異種ＲＮＡは、宿主アルファウイルス許容細胞により発現されるのが望ましいタンパク質またはペプチドをコードし、且つ同細胞でタンパク質またはペプチドを発現するのに必要なプロモーターおよび調節セグメントを含む。挿入された異種ＲＮＡは、宿主細胞により生成が望まれる任意のタンパク質またはペプチドをコードしてもよい。適当な異種ＲＮＡは、原核起源（たとえば、ボツリヌス毒素Ｃ（Botulinus toxin C）をコードしているＲＮＡ）であってもよく、または真核起源（たとえば、グリーン蛍光タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＰ）をコードしているAqueoria victoriaクラゲのＲＮＡ、マラリアPlasmodiumタンパク質cslをコードしているＲＮＡ）であってもよい。
さらに、本発明の実行に適した挿入された異種ＲＮＡとしては、アレナウイルス（Arenavirus）（たとえば、ラッサ熱ウイルス）、レンチウイルス（Lentivirus）（たとえば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ウマ感染性貧血ウイルス）、ポックスウイルス（Poxvirus）（たとえば、ワクシニア）、フィロウイルス（Filovirus）（たとえば、エボラウイルス、マールブルクウイルス）、オルソミクソウイルス（Orthomyxovirus）（たとえば、インフルエンザウイルス）、ブンヤウイルス（Bunyavirus）（たとえば、ＲＶＦＶウイルス、ＣＣＨＦウイルス、およびＳＦＳウイルス）、およびコロナウイルス（Coronavirus）を含め、広く様々なウイルスのウイルスＲＮＡを含む。挿入された異種ＲＮＡを提供するのに使用することができる適当なウイルスＲＮＡ遺伝子の例としては、ラッサ熱ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、レッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子、インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、インフルエンザ核タンパク質遺伝子、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子、ＨＩＶエンベロープＧＰ１６０遺伝子、およびＨＩＶマトリックス／キャプシド遺伝子などがあるが、これらに限定されない。レプリコンＲＮＡは、複製および転写に必要なシス作用配列を含む、アルファウイルス非構造タンパク質もコードする。
好ましい実施態様では、第１分子、すなわち、レプリコンＲＮＡは、パッケージングセグメントおよび挿入された異種ＲＮＡをコードしているＲＮＡを含み、第２分子、すなわち、第１ヘルパーＲＮＡは、必要な少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているが、すべてをコードしてはいないＲＮＡを含み、第３分子、すなわち第２ヘルパーＲＮＡは、必要な少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているが、すべてをコードしてはいないＲＮＡを含むというように、レプリコンＲＮＡ、第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡは、別々の分子上で提供される。たとえば、本発明の１つの好ましい実施態様では、ヘルパー細胞は、アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質およびキャプシドタンパク質が、宿主細胞内で集まってアルファウイルス粒子を構成するように、（ａ）アルファウイルスパッケージング配列および挿入された異種ＲＮＡをコードしているＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡと、（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしているＲＮＡを含む第１ヘルパーＲＮＡと、（ｃ）アルファウイルスキャプシドタンパク質をコードしているＲＮＡを含む第２ヘルパーＲＮＡを含む一組のＲＮＡを含む。
別の実施態様では、第１分子、すなわち、第１ヘルパーＲＮＡは、必要な少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているが、すべてをコードしているのではないＲＮＡを含み、第２分子、すなわち、レプリコンＲＮＡはパッケージングセグメント、挿入された異種ＲＮＡ、および第１ヘルパーＲＮＡにコードされない残りの構造タンパク質をコードしているＲＮＡを含むように、レプリコンＲＮＡと第１ヘルパーＲＮＡは別個の分子上にあり、レプリコンＲＮＡと、第１ヘルパーＲＮＡにコードされない構造遺伝子をコードしているＲＮＡが、また別の１つの分子上に一緒に存在する。たとえば、本発明の１つの好ましい実施態様では、アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質、およびキャプシドタンパク質は、宿主細胞内で集まってアルファウイルス粒子を構成し、レプリコンＲＮＡはその中に納められるように、ヘルパー細胞は、（ａ）アルファウイルスパッケージング配列、挿入された異種ＲＮＡ、およびアルファウイルスキャプシドタンパク質をコードしているＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡと、（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしているＲＮＡを含む第１ヘルパーＲＮＡとを含む一組のＲＮＡを含んでなる。
本発明の１つの好ましい実施態様で、アルファウイルス構造タンパク質、すなわち、キャプシド、Ｅ１糖タンパク質およびＥ２糖タンパク質をコードしているＲＮＡは、少なくとも１つの弱毒化突然変異を含む。本願明細書で使用される語もである「弱毒化突然変異」および「弱毒化アミノ酸」は、従来技術の標準用語に従って、突然変異を含むヌクレオチド配列、または突然変異を含むヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸を意味し、その突然変異はその宿主で疾患を引き起こす確率の低減（すなわち、毒性の喪失）を招く。突然変異が置換突然変異であれフレーム内欠失突然変異であれ、たとえば、B. Davis, et a1., Microbiology 132（第３版、1980）を参照されたい。ウイルスに対して致命的な突然変異または突然変異の組み合せは、「弱毒化突然変異」なる語から除外される。それゆえ、この実施態様によれば、第１ヘルパーRNAと第２ヘルパーRNAのうち少なくとも１つは、弱毒化突然変異を少なくとも１つ含む。さらに好ましい実施態様では、第１ヘルパーRNAと第２ヘルパーRNAのうち少なくとも１つは、少なくとも２個、すなわち複数の弱毒化突然変異を含む。複数の弱毒化突然変異は、第１ヘルパーRNAまたは第２ヘルパーRNAのいずれにあってもよく、あるいはランダムに分布して、１つ以上の弱毒化突然変異が第１ヘルパーRNAにあり、１つ以上の弱毒化突然変異が第２ヘルパーRNAにあってもよい。あるいは、レプリコンＲＮＡおよび第１ヘルパーＲＮＡにコードされない構造タンパク質をコードしているＲＮＡが同一の分子上にあるとき、弱毒化突然変異は、第１ヘルパーＲＮＡによりコードされない構造タンパク質をコードするＲＮＡに位置してもよい。弱毒化突然変異は、非構造タンパク質（たとえば、レプリコンＲＮＡ）をコードしているＲＮＡ内にあってもよい。
適切な弱毒化突然変異は使用するアルファウイルスによって異なる。たとえば、アルファウイルスがＶＥＥの場合、適当な弱毒化突然変異は、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、あるいはヒスチジンをＥ２アミノ酸７６位として特定するＥ２アミノ酸７６位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸１２０位として特定するＥ２アミノ酸１２０位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、あるいはヒスチジンをＥ２アミノ酸２０９位として特定するＥ２アミノ酸２０９位のコドン、弱毒化突然変異、好ましくはトレオニンまたはセリンをＥ１アミノ酸２７２位として特定するＥ１アミノ酸２７２位のコドン、弱毒化突然変異、好ましくはイソロイシンまたはロイシンをＥ１アミノ酸８１位として特定するＥ１アミノ酸８１位のコドン、弱毒化突然変異、好ましくはセリンまたはトレオニンをＥ１アミノ酸２５３位として特定するＥ１アミノ酸２５３位のコドン、およびＥ３コドン５６〜５９位の欠失と上述のような弱毒化突然変異を特定するＥ１アミノ酸２５３位のコドンの組み合わせ突然変異から成る群から選択することが可能である。ＶＥＥゲノム内の他の適当な弱毒化突然変異は、当業者に周知である。
アルファウイルスが南アフリカアルボウイルスSouth Africa Arbovirus No.86（S. A. AR86）である、他の実施態様で、適当な弱毒化突然変異は、非構造タンパク質と構造タンパク質の両者をコードしているＲＮＡ分子上にあり、弱毒化アミノ酸、好ましくはイソロイシンをｎｓＰ１アミノ酸５３８位として特定するｎｓＰ１アミノ酸５３８位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはトレオニンをＥ２アミノ酸３０４位として特定するＥ２アミノ酸３０４位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸３１４位として特定するＥ２アミノ酸３１４位のコドン、Ｅ２アミノ酸残基３７２位の弱毒化アミノ酸、好ましくはバリンを特定するＥ２アミノ酸３７２位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはアラニンをＥ２アミノ酸３７６位として特定するＥ２アミノ酸３７６位のコドン、Ｅ２アミノ酸残基３０４位、３１４位、３７２位および３７６位の弱毒化アミノ酸を特定するＥ２アミノ酸残基３０４位、３１４位、３７２位および３７６位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはロイシンをＥ２アミノ酸３７８位として特定するＥ２アミノ酸３７８位のコドン、弱毒化アミノ酸、好ましくはグリシンをｎｓＰ２アミノ酸９６位として特定するｎｓＰ２アミノ酸９６位のコドン、および弱毒化アミノ酸、好ましくはバリンをｎｓＰ２アミノ酸３７２位として特定するｎｓＰ２アミノ酸３７２位のコドン、組み合わせで、ｎｓＰ２アミノ酸残基９６位および３７２位の置換突然変異を弱毒化化するｎｓＰ２アミノ酸残基９６位および３７２位のコドン、ｎｓＰ２アミノ酸残基５２９位の弱毒化アミノ酸、好ましくはロイシンを特定するｎｓＰ２アミノ酸残基５２９位のコドン、ｎｓＰ２アミノ酸残基５７１位の弱毒化アミノ酸、好ましくはアスパラギンを特定するｎｓＰ２アミノ酸残基５７１位のコドン、ｎｓＰ２アミノ酸残基６８２位の弱毒化アミノ酸、好ましくはアルギニンを特定するｎｓＰ２アミノ酸残基６８２位のコドン、ｎｓＰ２アミノ酸残基８０４位の弱毒化アミノ酸、好ましくはアルギニンを特定するするｎｓＰ２アミノ酸残基８０４位のコドン、ｎｓＰ３アミノ酸残基２２位の弱毒化アミノ酸、好ましくはアルギニンを特定するｎｓＰ３アミノ酸残基２２位のコドン、および組み合わせで、ｎｓＰ２アミノ酸残基５２９位、５７１位、６８２位、および８０４位、およびｎｓＰ３アミノ酸残基２２位の弱毒化アミノ酸を特定するｎｓＰ２アミノ酸残基５２９、５７１、６８２、および８０４、およびｎｓＰ３アミノ酸残基２２位のコドンから成る群から選択することが可能である。他のアルファウイルスを使用する実施態様に有用な適当な弱毒化突然変異は、当業者に周知である。既知の手順に従って、ＲＮＡをコードするｃＤＮＡに部位指向性突然変異誘発を実施することにより、弱毒化突然変異をＲＮＡに導入することが可能である。たとえば、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488（1985）を参照されたい。この文献の開示内容は、引用することにより本願明細書に完全に組込まれる。あるいは、既知の手順に従って、ＲＮＡをコードするｃＤＮの同種制限フラグメントを置換することにより、ＲＮＡに突然変異を導入することも可能である。
好ましくは、第１ヘルパーＲＮＡおよび第２ヘルパーＲＮＡはプロモーターも含む。レプリコンＲＮＡがプロモーターも含むことも好ましい。第１ヘルパーＲＮＡ、第２ヘルパーＲＮＡおよびレプリコンＲＮＡに包含するのに適したプロモーターは、技術上周知である。１つの好ましいプロモーターは、アルファウイルスがＶＥＥのときに使用するＶＥＥの２６Ｓプロモーターである。ＶＥＥ２６Ｓよりすぐれたさらなるプロモーターとしては、シンドビス２６Ｓプロモーター、セムリキ森林２６Ｓプロモーター、およびアルファウイルスポリメラーゼにより認識される他のプロモーター配列などがある。（野生型の活性レベルと比較して）プロモーターの活性レベルを変える突然変異を含むアルファウイルスプロモーター配列も、本発明の実行に適当である。Raju and Huang, J. Virol.65, 2501-2510（1991）にはこのような突然変異体配プロモーター配列が記載されている。この文献の開示内容は引用することにより本願明細書に組込まれる。第１ヘルパーＲＮＡ、第２ヘルパーＲＮＡ、およびレプリコンＲＮＡがすべて別個の分子上にある系で、３種のＲＮＡすべてに同じプロモーターが使用される場合、プロモーターは、３つの分子間に同種配列を提供する。選択されたプロモーターが、レプリコンＲＮＡ分子によりコードされる非構造タンパク質と機能的に作用することが好ましい。
２種の免疫原をワクチン接種すると、単一の免疫原をワクチン接種するときと比較して病気に対して改善された防御が得られる場合、二重プロモーターレプリコンにより、同じ細胞で両免疫原が確実に生産されるようになる。このようなレプリコンは、２種の異なる異種タンパク質の挿入および発現を可能にするために、２６ＳのＲＮＡプロモーターを２コピー含み、各々の後に異なるマルチクローニング部位が続くことを除外すれば、上述のものと同じと考えられる。別の有用な戦術は、ピコルナウイルスであるＥＭＣウイルスのＩＲＥＳ配列を、上述のレプリコンの単一２６Ｓプロモーターから下流の２種の異種遺伝子の間に挿入し、このようにして、単一レプリコン転写産物由来の２種の免疫原を同じ細胞で発現させる方法である。
感染性複製能欠損アルファウイルス粒子は、本願明細書に開示されている方法に従って、当業者に周知の技術を組み合せて作成することができる。この方法には、アルファウイルスパッケージングセグメントおよび挿入された異種ＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡと、少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているＲＮＡを含む第１ヘルパーＲＮＡと、および第１ヘルパーＲＮＡによりコードされるものとは異なる少なくとも一のアルファウイルス構造タンパク質をコードしているＲＮＡを含む第２ヘルパーＲＮＡとをアルファウイルス許容細胞にトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞内にアルファウイルス粒子を生成するステップと、細胞からアルファウイルス粒子を収集するステップとを含む。アルファウイルス許容細胞にトランスフェクトするステップは、当業者に周知の適当な任意の手段に従って実施することができる。たとえば、ＲＮＡの細胞内への取り込みは、たとえば、細胞をＤＥＡＥ-デキストランで処理するか、細胞に加える前にＲＮＡを「LIPOFECTINTM」で処理するか、あるいはエレクトロポレーションによるなど、任意の適当な手段で行うことができるが、エレクトロポレーションは、現在、アルファウイルス許容細胞へのＲＮＡ取り込みの実行に好まれる方法である。上述の技術は従来技術で周知である。たとえば、Davis et al.に付与された米国特許第５，１８５，４４０号、およびBioption ABに対するＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１０５７８号を参照されたい。これらの文献は、引用することにより、その開示内容が本願明細書に完全に組込まれる。
細胞内で感染性ウイルス粒子の産生を促進するステップも、従来の技術を使用して実行することができる。たとえば、Davis et al.に付与された米国特許第５，１８５，４４０号、Bioption ABに対するＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１０５７８号、およびTemin et al.に付与された米国特許第４，６５０，７６４号を参照されたい（Teminらは、アルファウイルスよりもむしろレトロウイルスに関連している文献であるが）。感染性ウイルス粒子は、標準細胞培養増殖技術で産生することも可能である。
感染性アルファウイルス粒子を収集する工程も、従来技術を使用して実施することが可能である。たとえば、技術上周知の細胞溶解や、細胞培養の上清の収集によって、感染性粒子を収集することが可能である。たとえば、Davis et al.に付与された米国特許第５，１８５，４４０号、Bioption ABに対するＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１０５７８号、およびTemin et al.に付与された米国特許第４，６５０，７６４号を参照されたい。他の適当な技術は当業者に周知であろう。場合によっては、収集された感染性アルファウイルス粒子は、要望に応じて精製してもよい。適当な精製技術は、当業者に周知である。
ワクチンなど、本発明の医薬製剤は、本願明細書に開示されている感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子の免疫原量を、薬理学上許容できる担体と組み合せて含む。「免疫原量」は、医薬製剤が投与される被験対象に免疫応答を引き起こすことができるほど十分な感染性アルファウイルス粒子の量である。治療を受ける被験対象の年齢および種、および免疫応答が望まれる免疫原によって、１回量当たり約１０3〜約１０7の量のレプリコン含有粒子、好ましくは約１０4〜１０6のレプリコン含有粒子が適当と考えられる。薬理学上許容できる担体の例としては、無発熱物質滅菌水および無発熱物質生理食塩水であるが、これらに限定されない。本発明の感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子の免疫原量が投与される被験者には、ヒトや動物（たとえば、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ロバ、マウス、ハムスター、サル）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の医薬製剤は、非経口（たとえば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、および関節内）投与に適するものを含む。代わりに、本発明の医薬製剤は、被験者の粘膜に投与するのに適していてもよい（たとえば、鼻腔内投与）。製剤は、便宜上、単位剤形で産生することも可能であり、技術上周知の方法のいずれで産生してもよい。
本発明のヘルパー細胞、ＲＮＡおよび方法は、レプリコンＲＮＡ上にある挿入島された異種ＲＮＡが、in vitroで望ましく合成されるタンパク質またはペプチドをコードするin vitro発現系に有用である。さらに、本発明のヘルパー細胞、ＲＮＡ、方法および医薬製剤は、治療方法またはそれ以外の方法として、所望のタンパク質またはペプチドを必要とする被験者にタンパク質またはペプチドを投与する方法に有用である。本発明のこの実施態様で、本発明のレプリコンＲＮＡ上にある異種ＲＮＡは所望のタンパク質またはペプチドをコードし、ヘルパー細胞または本発明のヘルパー細胞を含有する医薬製剤は、所望のタンパク質またはペプチドを必要とする被験者に投与される。この方式で、タンパク質またはペプチドは、in vivoで被験者内で産生することが可能である。被験者にはタンパク質またはペプチドの欠乏が認められるか、被験者におけるタンパク質またはペプチドの生産は、治療またはそれ以外の方法として、若干の治療効果を与えるため、被験者はタンパク質またはペプチドを必要としていると思われる。
次の実施例は、本発明を例示することを目的としたものであり、限定することを目的としたものではない。これらの実施例で、nmはナノメーターを意味し、ｍLはミリリットルを意味し、IUは感染の単位を示し、pfu/mLはプラーク形成単位／ミリリットルを意味し，ＶＥＥはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスを意味し、ＥＭＣは、脳心筋炎ウイルスを意味し，ＢＨＫは仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を意味し、ＨＡは赤血球凝集素遺伝子を意味し、ＧＦＰはグリーン蛍光タンパク質遺伝子を意味し、Ｎはヌクレオキャプシドを意味し、ＦＡＣＳは蛍光活性化細胞ソーターを意味し、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位を意味する。「Ｅ２アミノ酸（たとえば、lys、thr）数」という表現は、Ｅ２タンパク質の指定残基の指定アミノ酸を示す。この慣習は、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質の特定の残基のアミノ酸を指すのにも使用される。
例１
ｐＶＲ２クローンの構築
２種の弱毒化突然変異（Ｅ２ lys ２０９、Ｅ１ thr ２７２）、および１９９４年５月２７日に提出された同時係属特許出願番号第０８／２５０，４４５号に記載のマルチクローニング部位が後続するＥ１糖タンパク質遺伝子の３’末端からすぐ下流の２６ＳサブゲノムＲＮＡプロモーター配列の重複を含むｃＤＮＡクローン（ｐＶ４０３１）から、ＶＥＥ構造タンパク質遺伝子（C-PE2-6K-E1）を取り出した。ＶＥＥゲノム配列をヌクレオチド７５０５位（遺伝子配列の５’末端から番号をつけた）で切断するＡｐａＩ制限酵素で、ｐＶ４０３１プラスミドＤＮＡを完全に消化した。この酵素の第２認識部は、重複２６Ｓサブゲノムプロモーターに認められる。したがって、ｐＶ４０３１をＡｐａＩで消化すると、ＤＮＡフラグメント２個が生じ、そのうち一つはＶＥＥ非構造遺伝子および複数のクローニング部位が後続する２６ＳサブゲノムＲＮＡプロモーターを１コピー含み、もう一つの小さい方のフラグメントは、ＶＥＥ構造遺伝子が後続する２６ＳサブゲノムＲＮＡプロモーターを含有する。大きいほうのフラグメントを単離し、再連結して、クローンｐＶＲ２を産生した。第１図は、ｐＶ４０３１クローンおよびｐＶＲ２クローンを図示するものである。
例２
単一ＲＮＡヘルパープラスミドの構築
ヘルパープラスミドの出発材料は４種の全長ｃＤＮＡクローン、すなわち、ＶＥＥの毒性トリニダードロバ（Trinidad donkey）株であるｐＶ３０００、およびトリニダードロバ株ＶＥＥの遺伝的バックグラウンドで、弱毒化突然変異ｐＶ３０１４（E2 lys 209, E1 thr 272）、ｐＶ３５１９（E2 lys 76, E2 lys209, E1 thr 272）およびｐＶ３５２６（E3 56〜59の欠失、E1 ser 253）を含む３種のクローンである。全長ｃＤＮＡクローンの独特の制限部位および希少制限部位を使用して非構造タンパク質領域の一部を欠失させることにより、幾つかの異なるヘルパープラスミドが産生されている。全長クローンを１種または２種の制限酵素で消化し、より大きいＤＮＡフラグメントを分離し、再連結して機能的プラスミドを形成する。組織培養細胞のトランスフェクションに際して、このようなプラスミド由来のin vitroＲＮＡ転写産物は、機能的ＲＮＡ複製複合体をコードせず、包膜シグナルも含まないと考えられる。ヘルパー構造物は、非構造遺伝子欠失のサイズが異なる。ヘルパー構築物は、その構築に使用される弱毒化突然変異クローン、および欠失した非構造領域のパーセンテージによって表示される。
V3014Δ520-7505(93%)    V3519Δ520-7507(93%)    V3526Δ520-7507(93%)
V3014Δ520-6965(87%)    V3519Δ1687-7507(78%)    V3526Δ520-7505(93%)
V3014Δ2311-7505(70%)    V3519Δ3958-7507(47%)
V3014Δ3958-7505(47%)    V3519Δ1955-3359(19%)    V3000Δ1955-3359(19%)
V3014Δ520-3954(19%)
V3014Δ1955-3359(19%)
V3014Δ1951-3359(19%)
V3014Δ2311-3055(10%)
V3014Δ2307-3055(10%)
例３
二重ＲＮＡヘルパープラスミドの構築
第２図に示す、二重ヘルパー系をコードしているプラスミドも構築した。V3014Δ520-7505（９３％）単一ヘルパークローンを使用して、ＨｐａＩ制限酵素で消化し、続いて連結することによりＥ２糖タンパク質遺伝子およびＥ１糖タンパク質遺伝子の追加欠失を構築すると、結果としてヌクレオチド８４９４位（Ｅ３遺伝子）からヌクレオチド１１，２３０（Ｅ１遺伝子の３’末端付近）までの間の配列が欠失した。ＢＨＫ細胞にレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションするとき、このプラスミドのin vitroＲＮＡ転写産物（第２図のＰ２１−１に示す）は、複製および転写が行われて、ＶＥＥのＣタンパク質のみをコードしているｍＲＮＡが生じる。
二部に分かれたヘルパーの第２メンバーをコードしているプラスミド（第２図Ｐ２４−３に示す）は、Tth111I制限酵素（ヌクレオチド7544位で）およびSpeI制限酵素で（ヌクレオチド8389位で）切断し、Tth111I末端およびSpeI末端を含む合成二重オリゴヌクレオチドを挿入することにより同一起源のクローンから構築する。挿入された配列は、２６Ｓプロモーターの下流部分、およびＥ３の第１アミノ酸残基であるSerコドンが後続するＡＴＧ開始コドンを復帰させる。このプラスミドのin vitroＲＮＡ転写産物は、レプリコンＲＮＡと共に細胞にトランスフェクトすると、ＶＥＥ糖タンパク質が生じる。これらのヘルパーＲＮＡをレプリコンＲＮＡと共に細胞にトランスフェクトすると、レプリコンＲＮＡのみを含む、感染性ではあるが複製能が欠損した粒子が生じる。このヘルパーＲＮＡの５’末端、３’末端および２６Ｓプロモーター（４０ヌクレオチド）を除外すれば、キャプシドヘルパーＲＮＡと糖タンパク質ヘルパーＲＮＡとの間で共通の唯一の配列は、８３８９位から８４９４位までの配列（１０５ヌクレオチド）である。
例４
異種遺伝子を含有する組換えＶＥＥレプリコン
インフルエンザＨＡ遺伝子、ラッサ熱ウイルスＮタンパク質遺伝子およびラッサ熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子をｐＶＲ２クローンに個別に挿入すると、培養ＢＨＫ細胞で首尾よく発現した。このような構築物を、第２図の３番目の部分に示す。下表１に示す通り、細菌、原生動物および無脊椎動物を含め、広範囲の生物に起源のある他の幾つかの遺伝子（たとえば、ボツリヌス毒素Ｃフラグメント遺伝子、マラリアプラスモジウムＣＳ１遺伝子、Chalfieら，science 263:802（1994）によりAquoria victoriaクラゲＤＮＡからクローニングしたＧＦＰ遺伝子）も、ＶＥＥクローンに首尾よく挿入され、発現されている。表１で、空白は、個々の遺伝子について個々の機能が試験されていないことを示すものであって、その遺伝子でのその機能の試験が不成功であったことを示すものではない。
0003946768.tif 000002
例５
異種タンパク質発現の検出および感染性レプリコン粒子のパッケージング
組換えＶＥＥレプリコン系におけるタンパク質発現の検出は、３４０〜４９０nmの範囲の光に曝露したとき、自己蛍光を発光するＧＦＰの場合を除き、特異的蛍光抗体結合によって行われる。ＧＦＰ−レプリコンＲＮＡのみをＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションし、発現を蛍光で分析するとき、９５％を超える細胞が活性ＧＦＰを含有する。ＢＨＫ細胞におけるラッサ熱Ｎタンパク質の発現レベルは、トランスフェクトされた細胞溶解物のポリアミドゲル電気泳動法およびNIH Image Version 1.52でクマシー染色ゲルを用いた画像分析により測定する。レベルは、総細胞タンパク質の１５〜１９％の範囲である。
ＧＦＰレプリコンＲＮＡとV3014Δ520-7505（９３％）ヘルパーＲＮＡの共エレクトロポレーションにより、ＧＦＰを感染能欠損粒子にパッケージし、ＢＨＫ細胞の感染、４００nm光での定量的検鏡、ならびにＦＡＣＳ分析で力価を決定する。レプリコン粒子の収量は、上述の条件で２〜６×１０7／mLである。ラッサ熱レプリコンＲＮＡをパッケージするために、様々な単一ヘルパー構築物を使用した収量は、１×１０4IU/mLから８×１０7IU/mLの範囲であった。
例６
単一ＲＮＡヘルパー系でパッケージされたレプリコンに対する免疫応答
ラッサ熱Ｎ遺伝子を含むパッケージされたレプリコンをマウスに接種し、Ｎに特異的な血清抗体の誘導に使用した。結果を第３図に報告する。低用量接種を使用すると、ＶＥＥに特異的な血清抗体は全く検出されなかった。しかし、高用量接種マウスの血清中にＶＥＥ特異的抗体が認められ、これは製剤中の複製成分組換え型のためと考えられる（プラークアッセイで、レプリコン粒子の力価より１０4少ないと推定される）。両タイプのマウスが同用量の第２回Ｎレプリコンを受けると、両者とも抗Ｎ力価の有意な上昇を示した。第３図を参照されたい。
例７
単一ＲＮＡヘルパー系における組換えＶＥＥレプリコンのワクチン接種
インフルエンザウイルスＨＡまたはラッサウイルスNを発現する組換えＶＥＥレプリコンを構築した（それぞれ、HA-Rep、N-Rep）。これらのレプリコンをＶＥＥ単一ＲＮＡヘルパー系でパッケージすると、ＨＡ構築物およびＮ構築物では、それぞれ３×１０7感染性粒子／mL（ＨＡ-RepV）および４×１０7感染性粒子／ｍL（N-RepV）という収量が得られた。上述のパッケージされたレプリコンを様々な用量でマウスに接種し、得られた免疫応答を免疫ブロット（immunoblot；ＩＢ）および酵素連結イムノアッセイ（enzyme-linked immunoassay；ＥＩＡ）でモニタリングした。このマウスにインフルエンザウイルスを投与し、病気および死亡をモニタリングした。この実験結果を以下に示す。
１回免疫感作後、３×１０7のHA-RepVまたは４×１０7のN-RepVを受けたすべてのマウスでセロコンバージョンが認められた。さらに、ブースター免疫感作後、幾何平均ＥＩＡ力価が有意に上昇した。３×１０5のHA-RepVおよび４×１０5のN-RepVを受けたすべてのマウスは、２種の免疫感作後、セロコンバージョンを示した。３×１０3のHA-RepVを２回受けたマウスはセロコンバージョンを示さなかった。３×１０7のHA-RepVまたは３×１０5のHA-RepVを２回受けたすべてのマウスが、重度のインフルエンザウイルス投与から保護された。低用量を受けたマウスまたは生理食塩水を受けたコントロールマウスは保護されなかった。
上述のレプリコンは単一ＲＮＡヘルパーでパッケージされているため、HA-RepV製剤中にもN-RepV製剤中にも、ＶＥＥ約１０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／mLが生じた。その結果、ワクチン接種を受けたマウスのほとんどに、ＶＥＥに対するセロコンバージョンが認められた。しかし、ヘルパーＲＮＡは弱毒化突然変異を含んでいたため（3014遺伝的バックグラウンド）、再生したＶＥＥウイルスは弱毒化しており、上記動物に病気を惹起しなかった。
先の１つのRepV免疫感作が後続の異種RepV免疫感作を妨害するかどうかを決定するために、単ＲＮＡ系を使用して、マウスに先ずN-RepVで免疫感作し、続いてHA-RepVで免疫感作した。３×１０6のN-RepVか３×１０4のN-RepVを２回接種後、２×１０5のHA-RepVを２回接種すると、すべての動物がＨＡに対するセロコンバージョンを示した。先行のN-RepV免疫感作による有意な妨害は明白ではなかった。続いて上記動物に毒性インフルエンザウイルスを投与すると、すべての動物が防護免疫を示した。
N-RepVを単一ＲＮＡヘルパーでパッケージすると、レプリコンＲＮＡとヘルパーＲＮＡとの間で組換えが可能になり、ＶＥＥウイルスが再生した。しかし、N-RepV製剤中のＶＥＥウイルスが複製能を有する結果としてＶＥＥタンパク質に対する抗体反応が動物に発生したにもかかわらず、ＨＡに対する免疫応答が誘導された。
例８
二重ＲＮＡヘルパー系でパッケージされた組換えＶＥＥレプリコンのワクチン接種
上述の通り、構造タンパク質を提供するために単一ヘルパーＲＮＡを使用して組換えレプリコンをパッケージすると、共トランスフェクション中のＲＮＡ組換えにより、弱毒化されているが完全に感染性の複製有能ＶＥＥウイルスが再生する可能性がある。これを防止するために、１つのヘルパーＲＮＡ上にヌクレオキャプシド遺伝子が提供され、糖タンパク質遺伝子が第２ヘルパーＲＮＡに提供される二重ヘルパーＲＮＡ系を構築する。（上述の例３を参照されたい）。二重ヘルパー系および上述のN-RepおよびHA-Repを用いて、共トランスフェクトを実行した。パッケージされたレプリコン、N-RepVおよびHA-RepVの収量を、免疫蛍光法でモニタリングした。同様に、免疫蛍光法およびプラークアッセイ（ＰＦＵ）で複製有能ＶＥＥウイルスの有無をモニタリングした。共トランスフェクションの培地も他のＢＨＫ細胞培養に入れて、存在する感染性ＶＥＥウイルスを増幅した後、フラスコの培地をプラークアッセイで分析した。結果を表２に示す。
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表２のデータは、二重ヘルパーＲＮＡ系およびN-Repを用いて４種のトランスフェクションが行われ、このヘルパー系およびHA-Repを用いて３種のトランスフェクションが行われたことを示す。パッケージされたレプリコンの力価は３×１０5〜１×１０8の範囲であった。上述の収量は、単一ヘルパー系で得られたものと同等以上であった。
免疫蛍光法または直接プラークアッセイで複製有能ＶＥＥウイルス粒子が検出された例は皆無であった。これは、単一系で得られた結果と著しく異なる。複製有能ＶＥＥウイルスは、１つの感染単位を理論的に検出することができる手順である新鮮培養でのＢＨＫ細胞のブラインド継代（増幅）後でも検出されなかった。
通常、新生マウスの大脳内（ic）接種は、細胞培養の接種よりも敏感な感染性ウイルスのアッセイ法である。したがって、単一ＲＮＡ系または二重ＲＮＡ系のいずれかを用いてパッケージしたHA-RepVを、哺乳マウスに高用量で接種した（表３）。単一ヘルパー系と二重ヘルパー系の両者の構築に使用されたＶＥＥ糖タンパク質遺伝子は、3014ＶＥＥ構築物から得られた。これを皮下接種すると成体マウスで弱毒化されるが、脳内接種した哺乳マウスでは弱毒化されない。哺乳マウスにおける3014のLD50は１．６PFUである。
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上述のデータから、二重ヘルパーＲＮＡ系でパッケージされたHA-RepVでのプラークアッセイで、レプリコン有能ＶＥＥウイルスは全く検出されなかったが、単一ヘルパー系でパッケージされたHA-RepVでは比較的高い力価が確認されたことがわかる。二重ヘルパー系でパッケージされた用量５×１０5および５×１０7のHA-RepVでは哺乳マウスすべてが生存したが、単一ヘルパー系でパッケージされた高用量HA-RepVでは全く生存せず、低用量では１／１０が生存したにすぎない。
二重ヘルパー系でパッケージされた用量５×１０7のHA-RepVは、皮下接種した成体マウスでの免疫応答を実現するのに必要な量よりも約１００倍多いことが以下からわかる。したがって、より高用量のパッケージされたHA-RePV/二重ＲＮＡヘルパーでも、既知の最も敏感な系（哺乳マウス）で無害であるということから、二重ＲＮＡヘルパー系の高い安全域がわかる。
例９
二重ヘルパー系でパッケージされたＨＡレプリコンによるマウスの免疫感作
二重ＲＮＡヘルパー系で生成されたN-RepVおよびHA-RepVを成体Balb/cマウスに接種し、ラッサN、インフルエンザHA、およびＶＥＥに対する免疫応答を酵素連結イムノアッセイ（ＥＩＡ）で測定した。その後、マウスに毒性インフルエンザウイルスを投与した。
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表４の結果からわかるように、N-RepＶ製剤またはHA-RepＶ製剤のいずれでも、プラークアッセイで複製有能ＶＥＥウイルスは全く検出されなかった。第０日のN-RepV接種後、有意な力価がマウスに現われ、これは第３２日のブースター免疫感作後、劇的に増大した。ＶＥＥ特異的抗体は全く検出されなかった。
第８４日に、同じマウスに後続のHA-RepVを接種し、第９８日に測定したとき、有意な抗ＨＡ力価を示して応答した。上記の幾何平均力価は、後続のHA-RepV接種後、２０，７２２に上昇した。抗ＨＡ力価から、先の異種レプリコン免疫感作による妨害はないことがわかる。
二重ヘルパー系から産生したレプリコン４種を接種後、マウスには、ＶＥＥに対する検出可能なＥＩＡ力価がなかった。第１３４日に試験したとき、マウスは毒性インフルエンザウイルスの投与から完全に防護されていた。このインフルエンザウイルスは、以前に、未ワクチン接種マウスで５０％死亡率および１００％罹病率を引き起こした。
例１０
キャプシド遺伝子の突然変異誘発
通常、ＶＥＥゲノムのアルファウイルスヌクレオキャプシド遺伝子および糖タンパク質遺伝子は、単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされる。このＯＲＦの翻訳中に、オートプロテアーゼ活性によってヌクレオキャプシドは成長しつつあるポリプロテインを切断する。このプロテアーゼ活性は、キモトリプシンと類似した活性セリンモチーフに基づくものであり、３種の異なるアミノ酸残基（セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジン）との相互作用を必要とする。ＶＥＥヌクレオキャプシド遺伝子の場合、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基は、それぞれアミノ酸２２６、１７４および１５２に位置する。これらの残基の突然変異誘発は、ヌクレオキャプシドのプロテアーゼ活性を傷つけ、他のアルファウイルスについて示してきたように、生育不能ウイルスが生じる。しかし、ヌクレオキャプシド遺伝子が別々のｍＲＮＡ上に提供される二重ヘルパー系では、オートプロテアーゼ活性の要件は皆無である。
上記残基の突然変異誘発が二重ヘルパーＲＮＡ系のパッケージングに悪影響を及ぼすかどうかを決定するために実験を行った。下表５および６に示すように、部位指向的突然変異誘発手順を使用して、上述の座の３つのアミノ酸を変えた。この突然変異は、ヌクレオキャプシド遺伝子および補足（Ｅ３）配列をコードする単一のＲＮＡに発生した。修飾された各構築物が、レプリコンと共に、共トランスフェクトされ、ヌクレオキャプシドタンパク質のサイズをポリアミドゲルで検定し、タンパク質自己切断の程度を求めた。
続いて、突然変異の個々の組み合わせを試験して、レプリコンパッケージングの程度を求めた（感染性レプリコン単位の放出によってモニタリングした）。これらの研究で、翻訳終始シグナル（停止コドン）をキャプシド遺伝子の末端に挿入した。
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表５のデータは、ヌクレオキャプシドタンパク質自己切断を防止する３つの座の各々の特異的突然変異が同定されたことを示す。１５２座または２２６座で試験したすべてのアミノ酸置換は切断を阻害した。しかし、１７４座での幾つかの異なる変化は、切断を継続することが可能であった。
表６のデータから、パッケージングは、若干の突然変異では検出することができなかったことがわかる。しかし、他の場合、野生型ＶＥＥヌクレオキャプシドヘルパーと比較して、効率のよいパッケージングが確認された。それゆえ、レプリコンと二重ＲＮＡ系ＲＮＡの各々で生じる複数の組換えが起こりそうもない場合には、このような修飾されたヌクレオキャプシド構築物を使用すると、組換え体が機能的ヌクレオキャプシドを有することを妨げることができた。本願明細書に記載の修飾されたヌクレオキャプシド遺伝子は、二重ヘルパー系でのみ機能的である。
上述のように変化したヌクレオキャプシドタンパク質により、複製有能ウイルスが生じる組換えが起こらないというさらなる保証が得られる。粒子集合（particle assembly）で機能するが自己タンパク質分解（autoproteolysis）の過程では機能しない変化したキャプシドタンパク質遺伝子は、レプリコン粒子を産生するためのヘルパー機能を提供するものの、生育可能な組換え体を生じる公算は非常に低い。
前述した事柄は、本発明の例示であって、本発明を限定すると考えてはならい。本発明は以下の請求項および請求項に含まれるべき請求項の同等物により、明確に規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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