(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源から出力されたコヒーレント光を標本面上に走査したときの前記標本からの透過光、反射光又は前記標本に発生する蛍光を検出するレーザ走査顕微鏡において、
前記レーザ光源から出力された第１のコヒーレント光の光路に設けられた第１走査光学系と、
前記レーザ光源から出力された第２のコヒーレント光の光路に設けられた第２走査光学系と、
を具備し、
前記第１のコヒーレント光を前記１走査光学系によって、前記第２のコヒーレント光を前記２走査光学系によって個別に走査することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記第１のコヒーレント光は、標本観察用の光であり、前記第２のコヒーレント光は、前記標本に対して反応を起こさせる光であり、
前記第１走査光学系によって前記第１のコヒーレント光を前記標本上で走査して得られる前記標本からの反射光又は蛍光を検出して前記標本の画像を生成し、前記第２走査光学系によって前記第２のコヒーレント光を前記標本の所望の位置に照射することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項３】
前記第１のコヒーレント光を前記標本に集光する対物レンズと、前記第２のコヒーレント光を前記標本に集光する対物レンズと、が前記標本を挟んで対向して配置され、前記第１のコヒーレント光と、前記第２のコヒーレント光を前記標本に対して互いに対向する側から照射することを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】
前記第１のコヒーレント光を前記標本に集光する対物レンズと、前記第２のコヒーレント光を前記標本に集光する対物レンズと、が１つの対物レンズで共用され、
前記第１のコヒーレント光の光路と、前記第２のコヒーレント光の光路とを一致させる光路結合手段を備え、
前記第１走査光学系と前記１つの対物レンズの間、且つ前記第２走査光学系と前記１つの対物レンズの間に前記光路結合手段を配置したことを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項５】
前記光路結合手段は、ダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項６】
前記第２のコヒーレント光を、前記第２走査光学系により前記標本上にスポット的に照射することを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項７】
前記第２のコヒーレント光を、前記第２走査光学系により前記標本上の所望の範囲に走査して照射することを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項８】
前記第２のコヒーレント光の集光位置を光軸方向にシフトさせる光学調整機構を前記第２のコヒーレント光の光路に設け、前記第１走査光学系による観察断面と光軸方向に異なる断面に前記第２走査光学系による前記第２のコヒーレント光の照射を行うようにしたことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項９】
前記光学調整機構は、前記第２のコヒーレント光を出力するレーザ光源と、前記第２走査光学系の間に配置されている請求項８のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１０】
前記第１走査光学系及び前記第２走査光学系を走査制御する１つの制御手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１１】
前記第１のコヒーレント光を照射したときの前記標本からの反射光又は蛍光を検出する第１の検出光学系と、
前記第２のコヒーレント光を照射したときの前記標本からの反射光又は蛍光を検出する第２の検出光学系と、
を備え、
前記第１の検出光学系及び前記第２の検出光学系で検出されたそれぞれの検出結果に基づいて生成される第１の標本画像及び第２の標本画像を同時に表示することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１２】
前記標本に照射される前記第２のコヒーレント光の集光位置に一致させて位置確認用の光を前記標本に照射する位置確認用光学系を備えることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１３】
前記第１のコヒーレント光を出射するレーザ光源と、前記第２のコヒーレント光を出射するレーザ光源が互いに異なることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１４】
前記第１のコヒーレント光を出射するレーザ光源と、前記第２のコヒーレント光を出射するレーザ光源と、が同一であり、前記同一のレーザ光源から出射される光を前記第１のコヒーレント光の光路と前記第２のコヒーレント光の光路とに分割する光路分割手段と、を備えることを特徴とする請求項１、２又は４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１５】
前記第１のコヒーレント光及び前記第２のコヒーレント光は、多光子吸収を起こさせるＩＲパルスレーザであることを特徴とする請求項１４に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１６】
前記第１のコヒーレント光は、可視連続レーザ光またはＩＲパルスレーザ光であり、前記第２のコヒーレント光は、ＩＲパルスレーザ光であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１つに記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１７】
前記標本は被加工物であり、前記第１のコヒーレント光は、前記被加工物の観察用の光であり、前記第２のコヒーレント光は、前記被加工物を加工するための光であり、前記第１走査光学系によって前記第１のコヒーレント光を前記被加工物上で走査して得られる前記被加工物からの反射光、又は蛍光を検出して前記被加工物の画像を生成し、前記第２走査光学系によって前記第２のコヒーレント光を前記被加工物の所望の位置に照射して加工する請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１８】
前記第１のコヒーレント光を前記被加工物に集光する対物レンズと前記第２のコヒーレント光を前記被加工物に集光する対物レンズが１つの対物レンズで共用され、
前記第１のコヒーレント光の光路と前記第２のコヒーレント光の光路とを一致させる光路結合手段を備え、
前記第１走査光学系と前記１つの対物レンズの間、且つ前記第２走査光学系と前記１つの対物レンズの間に前記光路結合手段を配置したことを特徴とする請求項１７に記載のレーザ走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光源から出力されたコヒーレント光で標本面上を走査したときの標本からの透過光や反射光又は標本に発生する蛍光を検出するレーザ走査顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
図１６は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
この走査型レーザ顕微鏡は、コヒーレント光を発するレーザ光源１００と、このレーザ光源１００からの光束を対物レンズ１０７の像面に走査させる走査光学ユニット１０２と、前記光束を像面に集光させる対物レンズ１０７とを有している。
【０００３】
すなわち、レーザ光源１００から発せられたコヒーレント光（レーザ光）は、ダイクロイックミラー１０１を透過して走査光学ユニット１０２に入射する。
この走査光学ユニット１０２は、互いに直交方向に走査する各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂを有するもので、これら走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによってコヒーレント光を偏向する。
【０００４】
この偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイクロイックミラー１０５を透過し、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【０００５】
すなわち、結像レンズ１０６を透過した光は、ダイクロイックミラー１０８、対物レンズ１０７に至り、さらに対物レンズ１０７を透過した光は、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【０００６】
このように標本１１０に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。例えば、蛍光指示薬にカルシウンイオン指示薬のfluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍの光を発する。
【０００７】
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７、ダイクロイックミラー１０８、結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０５、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー１０１に到達し、このダイクロイックミラー１０１で反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【０００８】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５によって計測される。
【０００９】
ここで、上記ダイクロイックミラー１０１の特性は、標本１１０を染色する蛍光色素の励起波長（レーザ波長）及び蛍光波長によって決定される。例えば、上記の通り蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬のfluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍの光を発するので、ダイクロイックミラー１０１は例えば波長５０５ｎｍ以上の光を反射する特性となる。
【００１０】
このような標本１１０の観察において、コヒーレント光が走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂで偏向し、対物レンズ１０７を通過し、照明することによって標本１１０の断面１１１上の結像位置の蛍光を逐次測定でき、走査範囲内の標本像を構築できる。
【００１１】
又、ステージ１０９又は対物レンズ１０７を昇降させることによって、標本１１０の断面１１１とは異なる断面像を取得できるので、標本像の３次元構築も可能である。
【００１２】
一方、レーザ光源１００をＵＶ（紫外線）パルスレーザとし、かつ走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂを任意の向きで停止させると、標本１１０の所望の位置にＵＶパルスレーザを照射することができる。
【００１３】
例えば、ケージド試薬を用いる場合、ＵＶパルスレーザを照射することによってケージド基に囲われている物質が放出され、細胞のある特定部位に特異現象を引き起こさせることができる。
【００１４】
標本１１０の全体照明は、光源１１６、レンズ１１７、励起フィルタ１１８及びダイクロイックミラー１０８を有する照明光学系によって行われ、標本１１０から発せられる蛍光は、ダイクロイックミラー１０５で反射し、測光フィルタ１１９で蛍光波長が選択され、蛍光像としてＣＣＤカメラ等の撮像素子１２０により取得される。
【００１５】
以上のように、標本１１０の所望の位置にレーザ光を瞬間的に照射して（ＵＶパルスレーザを照射して）、この影響によって起こる標本１１０の動的特性を調査する場合、標本像の時系列的記録が必要になる。このような場合に一般的によく使われるのがＣＣＤカメラを用いて画像を取得する方法である。
【００１６】
しかしながら、ＣＣＤカメラによる画像取得の方法では、コンフォーカルでの画像ではないので、コンフォーカル画像と比較して焦点深度の深い画像となり、このためにケージド基を解除したことによる特異反応が標本１１０のどのくらいの深さのところで起こっているのか分からない。
【００１７】
従って、標本像もコンフォーカルレーザ顕微鏡として標本画像を観察・記録しながら、標本１１０の所望の位置にレーザ光を瞬間的に照射して、標本１１０の動的特性を調査することが望ましい。
【００１８】
又、研究用途によっては、標本１１０にレーザ光を照射する部位と観察したい断面とが同一平面上にあるとは限らず、ある断層の一部にレーザ光を照射し、それとは異なる断層の画像を取得したい場合がある。例えば、動脈において、その外郭の交感神経に刺激を与えたとき、その内側の平滑筋や内皮細胞にどのような反応が生じるかを調査する場合などである。従って、このような場合、レーザ光を照射する部位と、画像を取得する断面とが標本１１０内で選択できることが望ましい。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、標本画像を観察・記録しながら標本の所望の位置にレーザ光を照射し、標本の動的特性などを調査できるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。
又、本発明は、レーザ光を照射する部位と画像を取得する断面とが標本内で選択できるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
請求項１によれば、レーザ光源から出力されたコヒーレント光を標本面上に走査したときの標本からの透過光、反射光又は標本に発生する蛍光を検出するレーザ走査顕微鏡において、レーザ光源から出力された第１のコヒーレント光の光路に設けられた第１走査光学系と、レーザ光源から出力された第２のコヒーレント光の光路に設けられた第２走査光学系と、を具備し、第１のコヒーレント光を１走査光学系によって、第２のコヒーレント光を２走査光学系によって個別に走査することを特徴とするレーザ走査顕微鏡である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
(1) 次に本発明の第１の実施の形態について説明する。なお、図１６と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
図１は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
【００２６】
このレーザ走査顕微鏡は、第１のレーザ光源１００から出力されたコヒーレント光で標本１１０面上を走査する観察用の第１の走査光学系１と、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光を標本１１０の任意の位置に照射してケージドを解除させる（標本１１０に化学反応を起こさせる）ための第２の走査光学系３とを備えている。
【００２７】
このうち観察用の第１の走査光学系１は、ダイクロイックミラー１０１、走査光学ユニット１０２、リレーレンズ１０３、ミラー１０４、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７が配置されている。
【００２８】
第２の走査光学系３は、第２のレーザ光源２から出力されるコヒーレント光の光路上に、互いに直交方向に走査する各走査ミラー４ａ、４ｂを備えた走査光学ユニット４、リレーレンズ５、ミラー６、結像レンズ７、対物レンズ８を配置した構成となっている。
【００２９】
又、第１の走査光学系１におけるダイクロイックミラー１０１の分岐光路上には、検出光学系９が配置されている。この検出光学系９は、第１の走査光学系１によりコヒーレント光で標本１１０面上を走査したときの標本１１０に発生する蛍光を検出する機能と、第２の走査光学系３によりコヒーレント光で標本１１０面上を走査したときの標本１１０からの透過光を検出する機能を有している。
【００３０】
この検出光学系９は、ダイクロイックミラー１０１の分岐光路上に、測光フィルタ１１２、レンズ１１３、ピンホール１１４及び光電変換素子１１５を配置した構成となっている。
【００３１】
上記ダイクロイックミラー１０１の特性は、標本１１０を染色する蛍光色素の励起波長（レーザ波長）及び蛍光波長によって決定される。例えば、上記の通り蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬のfluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍの光を発するので、ダイクロイックミラー１０１は、例えば波長５０５ｎｍ以上の光を反射する特性となる。
【００３２】
なお、第１のレーザ光源１００にＩＲパルスレーザを用いて２光子吸収による画像を取得することができる。このとき、２光子吸収現象は結像位置でのみ発生するので、ピンホール１１４は理論的には不要となる。又、ダイクロイックミラー１０１は、ＩＲレーザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１１５に導くための短波長反射の特性を持つものとなる。
【００３３】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
この例で第２の走査光学系３は、標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射するために用いられる。
【００３４】
すなわち、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、走査光学ユニット４に入射する。この走査光学ユニット４は、各走査ミラー４ａ、４ｂによってコヒーレント光を任意に偏向する。
【００３５】
この任意に偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ５を透過した後、ミラー６によって光路の向きを変え、結像レンズ７を透過し、対物レンズ８に導かれる。
【００３６】
この対物レンズ８を透過した光は、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、４ｂによってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポット的に照射させてもよい。さらに、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。
【００３７】
一方、第１のレーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過して走査光学ユニット１０２に入射する。
この走査光学ユニット１０２は、各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによってコヒーレント光を偏向する。
【００３８】
この偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【００３９】
そして、結像レンズ１０６を透過した光は、対物レンズ１０７に至り、さらにこの対物レンズ１０７を透過した光は、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【００４０】
このように標本１１０に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。例えば、蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬のfluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍの光を発する。
【００４１】
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー１０１に到達し、このダイクロイックミラー１０１で反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【００４２】
このダイクロイックミラー１０１は、上記透過率波長特性で説明したように、標本１１０を染色する蛍光色素の励起波長及び蛍光波長とレーザ波長に依存している。
【００４３】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５によって計測される。
【００４４】
このように上記第１の実施の形態においては、第１の走査光学系１とは別に、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光を第２の走査光学系３により標本１１０上の任意の位置に照射し、かつ第１のレーザ光源１００から出力されたコヒーレント光で第１の走査光学系１により標本１１０上を走査し、その蛍光を光電変換素子１１５によって計測するようにしたので、例えば第１の走査光学系により標本画像を観察・記録している途中に、第２の走査光学系３によりコヒーレント光を標本１１０に照射すれば、第２の走査光学系３によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１１０の動的特性（化学反応）などを調査できる。
(2) 次に本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００４５】
図２は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
このレーザ走査顕微鏡は、観察用の第１の走査光学系１の光路と第２の走査光学系３の光路とを途中で一致させ、これら第１及び第２の走査光学系１、３を１つの対物レンズ１０７で共用する構成となっている。
【００４６】
第２の走査光学系３は、上記第１の実施の形態と同様に、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光を標本１１０の任意の位置に照射する機能を有している。
【００４７】
第１と第２の走査光学系１、３の各光路を一致させる構成を説明すると、第１の走査光学系１におけるリレーレンズ１０３の焦点位置には、ダイクロイックミラー１０が配置されている。又、このダイクロイックミラー１０の配置位置は、第２の走査光学系３におけるリレーレンズ５の焦点位置に一致している。
【００４８】
このダイクロイックミラー１０は、第１及び第２のレーザ光源１００，２の出力波長により次のような特性を有している。
通常、ケージド試薬の解除には、ＵＶ光が使用される。そこで以下の組み合わせを考える。
(a) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）の組み合わせが考えられる。
(b) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連続レーザ光（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせが考えられる。
(c) 観察用としては、第１のレーザ光源１００にＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせが考えられる。
【００４９】
なお、ＩＲパルスレーザは、２光子励起現象を引き起こすことのできるレーザとする。
図３はかかる条件に適用する各ダイクロイックミラー１０の透過率波長特性を示す。
【００５０】
同図(a) は上記組み合わせ(a) の場合のダイクロイックミラー１０の特性を示し、このダイクロイックミラー１０は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を反射する特性を有している。
【００５１】
同図(b) は上記組み合わせ(b) の場合のダイクロイックミラー１０の特性を示し、上記同様に、ダイクロイックミラー１０は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。
【００５２】
同図(c) は上記組み合わせ(c) の場合のダイクロイックミラー１０の特性を示し、このダイクロイックミラー１０は、ＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）及び波長５３０ｎｍの蛍光を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。
【００５３】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
第２の走査光学系３は、標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射するために用いる。
【００５４】
すなわち、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー１０に入射し、ここで光路が変更され、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【００５５】
この結像レンズ１０６を透過した光は、対物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【００５６】
なお、上記同様に用途に応じて、各走査ミラー４ａ、４ｂによってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポット的に照射させてもよい。さらに、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。
【００５７】
一方、レーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによって偏向される。
【００５８】
この偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイクロイックミラー１０を透過し、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【００５９】
この結像レンズ１０６を透過した光は、対物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【００６０】
このように標本１１０に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー１０１に到達し、このダイクロイックミラー１０１で反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【００６１】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５によって計測される。
【００６２】
なお、第１のレーザ光源１００にＩＲパルスレーザを用いると、２光子吸収により蛍光画像を取得することができ、このとき２光子吸収現象は結像位置でのみ発生するので、ピンホール１１４は理論的には不要となる。又、ダイクロイックミラー１０１は、ＩＲレーザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１１５に導くための短波長反射の特性を持つものとなる。
【００６３】
このように上記第２の実施の形態においては、第１の走査光学系１に対して第２の走査光学系３をダイクロイックミラー１０によって結合し、これら第１及び第２の走査光学系１、３を１つの対物レンズ１０７により共用する構成としても、上記第１の実施の形態と同様の効果を奏することは言うまでもない。
(3) 次に本発明の第３の実施の形態について説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００６４】
図４は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
このレーザ走査顕微鏡は、第２の走査光学系３にも観察用の検出光学系１１を設け、かつ第１及び第２の走査光学系１、３を１つのコントロールユニット１２により走査制御する構成となっている。
【００６５】
このうち観察用の検出光学系１１は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光で標本１１０面上を走査したときの標本１１０に発生する蛍光、又は標本１１０からの反射光を検出する機能を有している。
【００６６】
この検出光学系１１は、第２のレーザ光源２と走査光学ユニット４との間の光路上に、ダイクロイックミラー１３を配置し、このダイクロイックミラー１３の反射光路上に、標本１１０からの蛍光波長のみを選択する測光フィルタ１４、レンズ１５、ピンホール１６及び光電変換素子１７を配置した構成となっている。
【００６７】
一方、コントロールユニット１２は、第１及び第２の走査光学系１、３の各走査光学ユニット１０２、４の走査動作を制御するとともに各光電変換素子１１５、１７の動作を制御し、これら光電変換素子１１５、１７からそれぞれ出力される各電気信号を取り込み、コンピュータ１８に対して例えば画像の重ね合わせ処理や画像を並べたりする処理等の画像処理の指令を発する機能を有している。
【００６８】
コンピュータ１８は、画像処理した結果をモニタテレビジョン１９に映し出す機能を有している。
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
【００６９】
第１のレーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによって偏向され、リレーレンズ１０３を通過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイクロイックミラー１０、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光される。
【００７０】
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、走査光学ユニット１０２を通ってダイクロイックミラー１０１に到達し、ここで反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【００７１】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、ピンホール１１４を貫けて光電変換素子１１５によって計測される。
一方、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー１０で反射され、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光される。
【００７２】
この標本１１０の反射光又は蛍光は、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０、リレーレンズ５、走査光学ユニット４を通ってダイクロイックミラー１３に到達する。なお、ダイクロイックミラー１３は、標本１１０からの反射光を検出するときハーフミラーに代える。
【００７３】
そして、測光フィルタ１４を取り外すことにより標本１１０からの反射光、又は測光フィルタ１４を透過させて蛍光波長のみを選択した蛍光は、その光をレンズ１５によってピンホール１６面に結像する。光電変換素子１７は、このピンホール１６を貫けた蛍光を計測する。
【００７４】
一方、コントロールユニット１２は、各光電変換素子１１５、１７からそれぞれ出力される各電気信号を取り込み、コンピュータ１８に対して例えば画像の重ね合わせ処理や画像を並べたりする処理等の画像処理の指令を発する。
【００７５】
このコンピュータ１８は、各光電変換素子１１５、１７からそれぞれ出力される各電気信号に基づいてそれぞれ画像を求め、これら画像の重ね合わせ処理や画像を並べたりする処理等の画像処理を実行し、その画像処理結果をモニタテレビジョン１９に映し出す。
【００７６】
このように上記第３の実施の形態においては、上記第２の実施の形態と同様な効果を奏することができるとともに、１つのコントロールユニット１２によって第１及び第２の走査光学ユニット１０２、４を走査制御するので、第１の走査光学ユニット１０２の光電変換素子１１５及び第２の走査光学ユニット４の光電変換素子１７からそれぞれ得られる各画像を重ね合わせたり、並べたりしてモニタテレビジョン１９上に表示できる。
【００７７】
又、第１及び第２の走査光学ユニット１０２、４により走査したときの２つの画像を同時にモニタテレビジョン１９上に表示でき、例えば第１の走査光学ユニット１０２の走査により得られる画像内で、第２の走査光学ユニット４の走査による画像を得ることもできる。
【００７８】
なお、第１のレーザ光源１００と第２のレーザ光源２との各出力波長が同一であれば、ダイクロイックミラー１０は、ハーフミラーに代えてもよい。
(4) 次に本発明の第４の実施の形態について説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００７９】
図５は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
第２のレーザ光源２と走査光学ユニット４との間の光路上には、標本１１０に照射されるコヒーレント光の集光位置を、このコヒーレント光の光軸方向にシフトさせる光学調整機構２０が配置されている。
【００８０】
具体的に光学調整機構２０は、第１のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の出射角度を持つように変換出力するもので、固定レンズ２１と光軸方向に移動自在な可動レンズ２２とから構成されている。
【００８１】
すなわち、固定レンズ２１により集光された光を、例えば位置２３ｂに配置された可動レンズ２２に入射することによって、この可動レンズ２２から出射される光に任意の出射角度が持たれるようになる。例えば、可動レンズ２２が位置２３ｂに配置された場合、可動レンズ２２から出射される光が平行光になるように設定されている。
【００８２】
このように光学調整機構２０から出射されるコヒーレント光の光束が任意の出射角度を持つように変換すると、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置がその光軸方向にシフトするものとなっている。
【００８３】
例えば、図６に示すように可動レンズ２２を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は図７に示すように標本断面２４ａ側にシフトし、反対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｃ側にシフトする。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｂ近傍にシフトするものとなっている。
【００８４】
なお、光学調整機構２０における可動レンズ２２が位置２３ｂに配置されたとき、２つのレーザ光源２、１００の各集光位置が例えば同一断面２４ｂになるように、光学素子すなわちリレーレンズ５とリレーレンズ１０３とは同一のものを使用し、結像レンズ１０６とリレーレンズ５及びリレーレンズ１０３との距離を等しくする。
【００８５】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
レーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによって偏向され、リレーレンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイクロイックミラー１０、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面２４に集光される。
【００８６】
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、走査光学ユニット１０２を通ってダイクロイックミラー１０１に到達し、ここで反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【００８７】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、ピンホール１１４を貫けて光電変換素子１１５によって計測される。
一方、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、光学調整機構２０に入射する。
【００８８】
この光学調整機構２０は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を、固定レンズ２１及び可動レンズ２２の配置位置２３ａ〜２３ｃに応じて任意の出射角度を持つように変換出力する。
【００８９】
この光学調整機構２０から任意の出射角度で変換出力されたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー１０で反射され、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光される。
【００９０】
なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、４ｂによって標本１１０上のある範囲を走査してもよいし、静止させてスポット的に照射させてもよい。さらに、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させることもできる。
【００９１】
ここで、上記光学調整機構２０における可動レンズ２２が各位置２３ａ〜２３ｃの範囲で可動することで、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置は、その光軸方向にシフトする。
【００９２】
例えば、図６に示すように可動レンズ２２を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は図７に示すように標本断面２４ａ側にシフトし、反対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｃ側にシフトする。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｂ近傍にシフトする。
【００９３】
このように上記第４の実施の形態においては、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の出射角度を持つように変換出力し、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置をその光軸方向にシフトさせる光学調整機構２０を設けたので、標本１１０にレーザ光を照射する部位と観察したい断面とが同一平面上にあるとは限らない場合、すなわち断層の一部にレーザ光を照射し、それとは異なる断層の画像を取得したい場合、例えば動脈において、その外郭の交感神経に刺激を与えたとき、その内側の平滑筋や内皮細胞にどのような反応が生じるかを調査する場合などがあるが、このような場合でも光学調整機構２０の可動レンズ２２を移動させることにより、観察したい断面とレーザ光を照射する断層とが同一平面上になくても対応でき、上記第１の実施の形態の効果の如く、第１の走査光学系により標本画像を観察・記録している途中に、第２の走査光学系によりコヒーレント光を標本１１０に照射すれば、第２の走査光学系によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１１０の動的特性（化学反応）等を調査できる。
【００９４】
なお、可動レンズ２２の移動量に対して集光位置２４ａ〜２４ｃの位置関係を予め調査しておけば、ステージ１０９の移動量に対して可動レンズ２２の移動量を相関付けることができ、ステージ１０９が昇降しても、可動レンズ２２を調整することで標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射できる。すなわち、第１の走査光学系１によって標本１１０の任意の平面の断層像の取得を行いながら、第２の走査光学系３によって任意の部位にコヒーレント光を照射できる。
(5) 次に本発明の第５の実施の形態について説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００９５】
図８は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射する第２の走査光学系３の光路上には、ダイクロイックミラー２５を介して位置確認用のポインタレーザ光源２６が設けられている。
【００９６】
このポインタレーザ光源２６は、標本１１０に照射したときに標本１１０に変化を与えない波長、例えば波長６５０ｎｍのポインタ用のレーザ光を出力する機能を有している。
【００９７】
このポインタレーザ光源２６を用いたときに、標本１１０からの反射光により位置確認する場合の各ダイクロイックミラー２７、２８の各特性は次の通りとなる。
【００９８】
上記第２の実施の形態で説明したように、ケージド試薬の解除には、通常、ＵＶ光が使用される。そこで以下の組み合わせを考える。(a) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）の組み合わせが考えられる。(b) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連続レーザ光（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせが考えられる。(c) 観察用としては、第１のレーザ光源１００にＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）、第２のレーザ光源２としてＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせが考えられる。
【００９９】
なお、ＩＲパルスレーザは、２光子励起現象を引き起こすことのできるレーザとする。
図９はかかる条件に適用する各ダイクロイックミラー２７、２８の透過率波長特性を示す。
【０１００】
同図(a) は上記組み合わせ(a) の場合のダイクロイックミラー２８の特性を示し、このダイクロイックミラー２８は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を反射する特性を有している。そして、ダイクロイックミラー２８は、波長６５０ｎｍに対して透過率５０％程度に設定されている。
【０１０１】
同図(b) は上記組み合わせ(b) の場合のダイクロイックミラー２８の特性を示し、上記同様に、ダイクロイックミラー２８は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。
【０１０２】
同図(c) は上記組み合わせ(c) の場合のダイクロイックミラー２８の特性を示し、このダイクロイックミラー２８は、ＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎｍ）及び波長５３０ｎｍの蛍光を透過し、ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。そして、ダイクロイックミラー２７は、波長６５０ｎｍに対して透過率が極力小さく設定されている。
【０１０３】
なお、レーザ光源２が本来の目的以外の波長、例えばポインタレーザ光源２６と同じ波長のレーザ光を出力できるような多波長出射のものであれば、レーザ光源２の出射端に励起フィルタを設けることによって、ポインタレーザ光源２６及びダイクロイックミラー２５は不要となり、それでも同一の効果は得られる。
【０１０４】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
先ず、第１の走査光学系１により標本１１０の画像が取られる。
すなわち、第１のレーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー２７を透過し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによって偏向される。
【０１０５】
この偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイクロイックミラー２８を透過し、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【０１０６】
この結像レンズ１０６を透過した光は、対物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【０１０７】
このように標本１１０に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。
この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー２８、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー２７に到達し、このダイクロイックミラー２７で反射して測光フィルタ１１２に入射する。
【０１０８】
この測光フィルタ１１２に入射した光は、標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５によって計測される。
【０１０９】
この光電変換素子１１５から出力される電気信号は、例えば画像処理装置に送られ、ここで画像処理されて標本１１０の画像としてモニタテレビジョンに映し出される。
【０１１０】
次に第２のレーザ光源２をオフした状態で、ポインタレーザ光源２６からコヒーレント光を出力させる。
このポインタレーザ光源２６から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー２５により第２の走査光学系３の光軸と同軸に入り、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー２８に入射して光路の向きを変え、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光される。
【０１１１】
この標本１１０の反射光又は蛍光は、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー２８、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、走査ユニット１０２を通ってダイクロイックミラー２７に到達する。
【０１１２】
そして、測光フィルタ１１２を取り外すことにより標本１１０からの反射光、又は測光フィルタ１１２を透過させて蛍光波長のみを選択した蛍光は、レンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５によって取得される。
【０１１３】
この光電変換素子１１５から出力される電気信号は、上記同様に画像処理装置に送られ、ここで画像処理されて標本１１０の画像としてモニタテレビジョンに映し出される。
【０１１４】
従って、位置確認用のコヒーレント光の集光された画像は、モニタテレビジョンの画面上に第１の走査光学系１によって得られた標本１１０の画像の上に重ねて映し出される。
【０１１５】
ここで、レーザ光源１００とポインタレーザ光源２６とが同一波長であれば、パルス光照射位置のみ輝度が高くなって画像として現れる。又、これらレーザ光源１００、２６が異なる波長であれば、レーザ光源１００から出力されるコヒーレント光によって得られる蛍光標本全体画像と異なる波長で検出できるようにダイクロイックミラー２７と測光フィルタ１１２との間にさらにダイクロイックミラー、測光フィルタ、レンズ、ピンホール、光電変換素子を設け、ポインタレーザ光源２６から出力されるコヒーレント光によって得られる像だけを検出できるようにポインタレーザ光源２６、ダイクロイックミラー、測光フィルタの波長を選択すればよい。
【０１１６】
この位置確認用のコヒーレント光の集光位置は、第２のレーザ光源２を動作させたときの集光位置と同一になっている。
従って、モニタテレビジョンに映し出される画面を観察しながら第２の走査光学系３を移動させ、位置確認用のコヒーレント光の集光位置が標本１１０に例えば化学反応を起こさせたい部位に一致するように移動させる。
【０１１７】
そうして、位置確認用のコヒーレント光の集光位置が標本１１０に化学反応を起こさせたい部位に一致した後、第２のレーザ光源２からコヒーレント光が出力される。
【０１１８】
この第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー２８で反射され、結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するものとなる。
【０１１９】
この結像レンズ１０６を透過した光は、対物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光される。
【０１２０】
このとき、第１の走査光学系１は、上記同様に標本１１０の断面１１１の画像を検出し、モニタテレビジョンに映し出すので、第２の走査光学系３により標本１１０にコヒーレント光を照射したときの動的特性が観察できる。
【０１２１】
このように上記第５の実施の形態においては、標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射する第２の走査光学系３の光路上に、ダイクロイックミラー２５を介してポインタレーザ光源２６を設けたので、標本１１０にコヒーレント光を照射して例えば化学反応を起こさせる前に、コヒーレント光を照射する部位を標本１１０の全体像の中から位置合わせの確認ができる。
【０１２２】
なお、ポインタレーザ光源２６は、上記第５の実施の形態に限らず、上記第１〜４の実施の形態における第２の走査光学系３に設け、標本１１０にコヒーレント光を照射して例えば化学反応を起こさせる部位の確認ができる。
【０１２３】
又、図１０は工業用のレーザ加工に適用した場合のレーザ走査顕微鏡の構成図である。
第２のレーザ光源２ａは、例えばＣＯ2 などのガスレーザ発振装置が用いられ、標本に代わって被加工物１１ａがステージ１０９上に載置されている。
【０１２４】
この場合、ダイクロイックミラー２５や走査光学ユニット４、リレーレンズ５、ダイクロイックミラー２８、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７は、レーザ光源２ａのレーザ出力に耐えられるものが用いられる。
【０１２５】
このような構成であれば、被加工物にコヒーレント光を照射してレーザ加工する前に、このレーザ加工する部分を被加工物の全体像の中から位置合わせ確認できる。
(6) 次に本発明の第６の実施の形態について説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【０１２６】
図１１は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
第２のレーザ光源２と第２の走査光学ユニット４との間の光路上には、標本１１０に照射されるコヒーレント光の集光位置をこのコヒーレント光の光軸方向にシフトさせる光学調整機構２０が配置されている。
【０１２７】
この光学調整機構２０は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の出射角度を持つように変換出力するもので、例えば、可動レンズ２２を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ａ側にシフトし、反対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ｃ側にシフトする。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ｂ近傍にシフトするものとなっている。
【０１２８】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。なお、第１の走査光学系１の作用は上記第１の実施の形態と同様なのでその説明は省略し、光学調整機構２０の作用について説明する。
【０１２９】
第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレント光は、光学調整機構２０に入射する。この光学調整機構２０は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を、固定レンズ２１及び可動レンズ２２の配置位置２３ａ〜２３ｃに応じて任意の出射角度を持つように変換出力する。
【０１３０】
この光学調整機構２０から任意の出射角度で変換出力されたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５からミラー６で光路の向きを変え、結像レンズ７、対物レンズ８を透過し、標本１１０の断面２９ａ〜２９ｃに集光される。
【０１３１】
なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、４ｂによって標本１１０上のある範囲を走査してもよいし、静止させてスポット的に照射させてもよい。さらに、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させることもできる。
【０１３２】
ここで、上記光学調整機構２０における可動レンズ２２が各位置２３ａ〜２３ｃの範囲で可動することで、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置は、その光軸方向にシフトする。
【０１３３】
例えば、可動レンズ２２を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ａ側にシフトし、反対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ｃ側にシフトする。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９ｂ近傍にシフトする。
【０１３４】
このように上記第６の実施の形態においては、レーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の出射角度を持つように変換出力し、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置をその光軸方向にシフトさせる光学調整機構２０を設けたので、上記第４の実施の形態と同様に、標本１１０にレーザ光を照射する部位と観察したい断面とが同一平面上にあるとは限らない場合、すなわち、ある断層の一部にレーザ光を照射し、それとは異なる断層の画像を取得したい場合、例えば動脈において、その外郭の交感神経に刺激を与えたとき、その内側の平滑筋や内皮細胞にどのような反応が生じるかを調査する場合などがあるが、このような場合でも光学調整機構２０の可動レンズ２２を移動させることにより、観察したい断面とレーザ光を照射する断層とが同一平面上になくても対応でき、上記第１の実施の形態の効果の如く、第１の走査光学系により標本画像を観察・記録している途中に、第２の走査光学系によりコヒーレント光を標本１１０に照射すれば、第２の走査光学系によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１１０の動的特性（化学反応）等を調査できる。
【０１３５】
なお、上記第１乃至第６の実施の形態は、次の通り変形してもよい。
例えば、上記図５に示す第４の実施の形態に対し、上記第５の実施の形態のポインタレーザ光源２６を付加してもよい。
【０１３６】
この場合のレーザ照射位置確認方法は、可動レンズ２２を位置２３ｂに配置し、レーザ光を照射したい断層像と観察したい断層像とを記録する。ここで、２つの断層の距離を計測する。
【０１３７】
可動レンズ２２の移動量と対物レンズ１０７出射後の結像位置が予め相関づけられていると、可動レンズ２２の移動量が決まる。
例えば、図７に示す断層２４ｃにレーザ光を照射し、断層２４ｂの画像を取得しようとする場合、可動レンズ２２は位置２３ｃにあればよい。このとき断層２４ｃにレーザ光が結像するかどうか確認するためには、ステージ１０９を断層２４ｂと２４ｃの差分だけ上方向に移動させれば、ポインタレーザ光源２６から出力されたコヒーレント光による標本１１０の蛍光又は反射光が光電変換素子１１５により確認できる。この確認後は、ステージ１０９を元の位置に戻して測定を開始すればよい。
【０１３８】
又、レーザ光源及びその走査光学系は、２系統に限らず、複数系統備えるようにしてもよい。これにより、例えば標本１１０の任意の位置の観察・記録と、標本１１０の任意の位置における動的特性などを調査とが複数箇所で行うことができる。
(7) 次に本発明の第７の実施の形態について説明する。
【０１３９】
図１２は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構成図である。
同図において、３０は近赤外域の波長のサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザ光源、３１は光束をコリメートする光束変換光学系、３２は対物レンズ系、３３は標本面である。
【０１４０】
又、３４は近赤外の波長域でも比較的短波長（例えば７００ｍｍ辺り）を反射し、比較的長波長（例えば８５０ｍｍ辺り）を透過するダイクロイックミラー、３５は直進する光束、３６は直角に曲げられた光束、３７は近赤外を透過し可視光を反射するダイクロイックミラー、３８及び３９は一対のガルバノミラー、４０は瞳投影レンズ、４１は対物レンズ系３２の像位置、４２は結像レンズ、４３は対物レンズ、４４は検出光学系、４５は検出光学系４４の検出器、４６は近赤外の波長域でも比較的長波長（例えば８５０ｍｍ辺り）と可視光を反射し，近赤外の波長域中比較的短波長（例えば７００ｍｍ辺り）を透過するダイクロイックミラー、４７は検出光学系４４のピンホール、４８はコンデンサーレンズ、４９は近赤外カットフィルタである。
【０１４１】
図１３(a)(b)は、それぞれ図１２の領域Ａ、Ｂ及びＣにおける置き換え可能な他の光学系を示す部分構成図である。
同図(a) において５５は瞳リレー光学系であり、同図(b) において３６は第２の近赤外レーザ光をコリメートした光束である。
【０１４２】
又、５０、５１は光束を偏向するための近接配置された２枚のガルバノミラー、５２は瞳投影レンズ、５３は対物レンズ系３２の像位置、５４は検出器である。
【０１４３】
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。
近赤外域の波長のサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザ光源３０からの光束は、光束変換光学系３１に導入され、所望の大きさのコリメート光に変換される。
【０１４４】
そのコリメート光は、近赤外の波長域でも比較的短波長（例えば７００ｎｍ辺り）を反射し比較的長波長（例えば８５０ｎｍ辺り）を透過するダイクロイックミラー３４により直進する光束３５と直角に曲げられた光束３６の２光束に分けられる。
【０１４５】
直進する光束３５は近赤外光を透過し可視光を反射するダイクロイックミラー３７を透過し、近接して配置された２枚のガルバノミラー３８、３９により偏向させられた光束は瞳投影レンズ４０によって、結像レンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系３２の像位置４１に集光される。
【０１４６】
この時、瞳投影レンズ４０により、近接して配置された２枚のガルバノミラー３８、３９の中間点が対物レンズ系３２の瞳位置近傍に投影されていることは云うまでもない。
【０１４７】
対物レンズ系３２の像位置４１に集光され、ラスタースキャンされたスポットは対物レンズ系３２により標本面３３に投影され、標本面上を微小スポットとなりラスタースキャンする。
【０１４８】
標本面３３で２光子（或いはそれ以上の多光子）吸収により励起され発生した蛍光が、光路を逆進し、ダイクロイックミラー３７で反射され検出光学系４４に導入される。
【０１４９】
この時、検出光学系４４の集光位置にピンホール４７を配し、所謂共焦点系とすることにより、更に光軸方向の分解能を向上させることができ、また光学系等からフレアなどの余分な光を除去できるため、コントラストも向上する。ピンホール４７は常に光路中にあっても構わないし、光路中に出し入れ自由でも構わない。また、その径は、対物レンズや使用波長に応じて可変にすることが望ましい。
【０１５０】
また、標本面３３から発した蛍光は、標本面を挟んで対物レンズと逆側に配置されたコンデンサレンズ４８と近赤外カットフィルタ４９を介し、検出器５４で検出しても良い。検出された蛍光信号は検出器５４により電気信号に変換され、図示しない信号処理系を経てモニタ上に画像として表示される。
【０１５１】
一方、ダイクロイックミラー３４により直角に曲げられた光束３６は近接して配置された２枚のガルバノミラー５０、５１により互いに直交する方向に偏向される。これらのガルバノミラー５０、５１により偏向させられた光束は瞳投影レンズ５２によって、結像レンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系３２の像位置５３に集光される。
【０１５２】
この時、瞳投影レンズ５２により、近接して配置された２枚のガルバノミラー５０、５１の中間点が対物レンズ系３２の瞳位置近傍に投影されていることは云うまでもない。
【０１５３】
２枚のガルバノミラー５０、５１により対物レンズ系３２の像位置５３の任意の位置に集光されたスポットは像位置５３と結像レンズ４２の間に配された近赤外の波長域でも比較的長波長（例えば８５０ｎｍ辺り）と可視光を反射し、近赤外の波長域中比較的短波長（例えば７００ｎｍ辺り）を透過するダイクロイックミラー４６で対物レンズ系３２に導入され、標本面３３上の任意の位置に微小スポットとして投影され、２光子（或いはそれ以上の多光子）吸収による化学反応を起こす。
【０１５４】
上記構成のように、近接して配置された２枚のガルバノミラー（スキャナ）５０、５１で走査する場合は、瞳位置はそれらの中央付近が望ましいが、どちらかのスキャナ上にあっても良い。又、領域Ａを図１３(a) に示すようなスキャナー間にリレー光学系５５を配置したものに置き換えた走査光学系であっても良い。
【０１５５】
又、領域Ｂを図１３(b) に示すように先にダイクロイックミラー３４で分割し、それらを別々の光束変換光学系３１で所望の大きさのコリメート光３５、３６にするような構成に置き換えても構わない。
【０１５６】
なお、図１４(a)(b)及び(c) は、図１２に示されているダイクロイックミラー３４、３７及び４６の分光特性の一例を示す波長と透過率の関係図である。
具体的には、近赤外レーザ光の波長を７００ｎｍに設定し、標本面上の任意の位置で２光子吸収によるケージド試薬の解除を行わせ、次に近赤外レーザの波長を８５０ｎｍに設定し２光子吸収による蛍光イメージングを行う。
(8) 次に本発明の第８の実施の形態について説明する。
【０１５７】
図１５は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の部分構成図である。なお、全体的な構成は上記第７の実施の形態等と同じであり、走査光学系のみが異なるため、その部分のみ図示する。
【０１５８】
５６は瞳リレー光学系であり、５７は共振ガルバノミラーである。
以下、作用について説明する。
ダイクロイックミラー３７を透過した近赤外光束は、共振ガルバノミラー５７によりＸ方向（モニタ上で横方向）に高速に偏向される。
【０１５９】
偏向された光束は、瞳リレー光学系５６によりリレーされ、近接して配置された２枚のガルバノミラー３８、３９によりＸ、Ｙ両方に偏向される。Ｘ、Ｙ両方に偏向された光束は、瞳投影レンズ４０によって、結像レンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系３２の像位置４１に集光される。
【０１６０】
この時、共振ガルバノミラー５７の位置は瞳リレー光学系５６により近接して配置された２枚のガルバノミラー３８、３９の中間点に投影され、更にこの位置が瞳投影レンズ４０により、対物レンズ系３２の瞳位置近傍に投影されていることは云うまでもない。
【０１６１】
ここで、２光子（或いはそれ以上の多光子）吸収により励起され発生した蛍光を画像として高速に捉える時は、共振ガルバノミラー５７とＹ方向のガルバノミラー３９を用いて走査し、Ｘ方向のガルバノミラー３８は固定しておく。これにより、遅くともビデオレート以上の速さで画像を得ることができる。
【０１６２】
他方、画像が暗く低速で走査したい場合、或いは標本面上の任意の位置で２光子（或いはそれ以上の多光子）吸収による化学反応を起こさせたい場合は、共振ガルバノミラー５７は固定し、Ｘ、Ｙ両方向のガルバノミラー３８、３９で走査する。
【０１６３】
本実施の形態では高速スキャナとして共振ガルバノミラーを挙げているが、音響光学素子（ＡＯＤ）やポリゴンミラーを用いても良い。但し、これらの高速スキャナのうち、音響光学素子は波長依存性があるため試料に照射された光の波長と、蛍光のように試料から発する光の波長とが異なるような場合には波長依存性に起因する問題を考慮しなければならない。また、ポリゴンミラーは走査方向において、走査幅や走査中心を制御できないためランダム走査の用途には使用できない。何れの場合もこれらの高速スキャナは任意の偏向方向にスキャナを制御することが不可能であるため、ランダムスキャンの用途には使えない。
【０１６４】
本実施の形態の構成を採れば、用いるスキャナを切り換えるだけで、高速のイメージングと低速のイメージング或いはランダムアクセスを行うことができる。尚、３次元像の構築や３次元内でのランダムアクセスにはステージ上下或いは対物レンズ上下による光軸方向の走査（Ｚ走査）を併用することは云うまでもない。また、低速イメージングやランダムアクセスには、既知の手法であるが、光束スキャンによる走査ではなく、ステージ或いは対物レンズのスキャンによる走査という手法もあることを付記しておく。
【０１６５】
上記何れの実施の形態も、これらの構成に限定されるものではなく、複数のレーザと走査光学系等の様々な組み合わせで構成できることは云うまでもない。また、一般のレーザ走査顕微鏡と同様、複数の検出器で検出された信号を画像処理し、特殊な効果を得ることができることも云うまでもない。
【０１６６】
【発明の効果】
本発明の請求項１〜５によれば、標本画像を観察・記録しながら標本の所望の位置にレーザ光を照射し、標本の動的特性などを調査できるレーザ走査顕微鏡を提供できる。
【０１６７】
又、本発明の請求項４、５によれば、レーザ光を照射する部位と画像を取得する断面とが標本内で選択できるレーザ走査顕微鏡を提供できる。
又、本発明の請求項６によれば、複数のレーザや走査光学系等を組み合わせることにより、実用上有効なシステムを構築することが可能で、又高速イメージグと３次元ランダムアクセスも簡単な切り換えで可能となり、かつ検出器のレイアウトの自由度の大きな多光子吸収レーザ走査顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図３】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラーの透過率波長特性を示す図。
【図４】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【図５】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第４の実施の形態を示す構成図。
【図６】同顕微鏡に用いられる光学調整機構の具体的な構成図。
【図７】同光学調整機構による結像面のシフトを示す模式図。
【図８】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第５の実施の形態を示す構成図。
【図９】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラーの透過率波長特性を示す図。
【図１０】同顕微鏡をレーザ加工に適用した場合の構成図。
【図１１】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第６の実施の形態を示す構成図。
【図１２】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第７の実施の形態を示す構成図。
【図１３】同顕微鏡における各領域に置き換え可能な光学系を示す図。
【図１４】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラーの透過率波長特性を示す図。
【図１５】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第８の実施の形態を示す構成図。
【図１６】従来のレーザ走査顕微鏡の構成図。
【符号の説明】
１…第１の走査光学系、
２，２ａ…第２のレーザ光源、
３…第２の走査光学系、
４…走査光学ユニット、
５…リレーレンズ、
６…ミラー、
７…結像レンズ、
８…対物レンズ、
９…検出光学系、
１０…ダイクロイックミラー、
１１…検出光学系、
１２…コントロールユニット、
１３…ダイクロイックミラー、
１４…測光フィルタ、
１５…レンズ、
１６…ピンホール、
１７…光電変換素子、
１８…コンピュータ、
１９…モニタテレビジョン、
２０…光学調整機構、
２１…固定レンズ、
２２…可動レンズ、
２５…ダイクロイックミラー、
２６…ポインタレーザ光源、
２７，２８…ダイクロイックミラー、
３０…レーザ光源、
３１…光束変換光学系、
３２…対物レンズ系、
３３…標本面、
３４，３７…ダイクロイックミラー、
３８，３９…ガルバノミラー、
４０…瞳投影レンズ、
４２…結像レンズ、
４３…対物レンズ、
４４…検出光学系、
４５…検出器、
４６…ダイクロイックミラー、
４７…ピンホール、
４８…コンデンサレンズ、
４９…赤外カットフィルタ、
５０，５１…ガルバノミラー、
５２…瞳投影レンズ、
５４…検出器、
５５…リレー光学系、
５６…瞳リレー光学系、
５７…共振ガルバノミラー、
１００…第１のレーザ光源、
１１０…標本、
１０１…ダイクロイックミラー、
１０２…走査光学ユニット、
１０２ａ，１０２ｂ…走査ミラー、
１０３…リレーレンズ、
１０４…ミラー、
１０５…ダイクロイックミラー、
１０６…結像レンズ、
１０７…対物レンズ、
１０８…ダイクロイックミラー、
１０９…ステージ、
１１０…標本、
１１３…レンズ、
１１４…ピンホール、
１１２…測光フィルタ、
１１５…光電変換素子。
【図１】
0003917731.tif 000002
【図２】
0003917731.tif 000003
【図３】
0003917731.tif 000004
【図４】
0003917731.tif 000005
【図５】
0003917731.tif 000006
【図６】
0003917731.tif 000007
【図７】
0003917731.tif 000008
【図８】
0003917731.tif 000009
【図９】
0003917731.tif 000010
【図１０】
0003917731.tif 000011
【図１１】
0003917731.tif 000012
【図１２】
0003917731.tif 000013
【図１３】
0003917731.tif 000014
【図１４】
0003917731.tif 000015
【図１５】
0003917731.tif 000016
【図１６】
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