(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性３-キヌクリジノールの製造方法であって、
以下の式：
【化１】
0003891522.tif 000006
で表される３-キヌクリジノンと、３-キヌクリジノンを立体選択的に還元し得る生物学的触媒とを反応させる工程を包含し、
ここで該工程では、
前記生物学的触媒がロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がキャンディダ（Candida）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｓ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がスポリディオボルス（Sporidiobolus）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がロドスポリディウム（Rhodosporidium）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がトリコスポロン（Trichosporon）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がゴルドナ（Gordona）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するか；
前記生物学的触媒がピキア（Pichia）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｓ）−３−キヌクリジノールを製造するか；または
前記生物学的触媒がノカルディア（Nocardia）属に属する微生物由来であり、かつ（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造することを特徴とする、方法。
【請求項２】
生成した光学活性３-キヌクリジノールを３-キヌクリジノンと分離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光学活性３-キヌクリジノールが(R)-(-)-３-キヌクリジノールである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的触媒が、微生物菌体、微生物培養液、微生物菌体の処理物、および精製酵素からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的触媒が微生物菌体のアセトン処理物である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula  glutinis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula  graminis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula  minuta）、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida  parapsilosis）、キャンディダ・インターメディア（Candida  intermedia）、キャンディダ・アンタルクティカ（Candida  antarctica）、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium  toruloides）、シゾサッカロマイセス・オクトスポルス（Schizosaccharomyces  octosporus）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus  laurentii）、クリプトコッカス・テレウス（Cryptococcus  terreus）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon  cutaneum）、ゴルドナ・テラエ（Gordona  terrae）、ピキア・アノマラ（Pichia  anomala）、およびノカルディア・アステロイデス（Nocardia  asteroides）からなる群から選択される微生物である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬に利用される光学活性な生理活性化合物および液晶材料の合成中間体として有用である光学活性３-キヌクリジノールの製造に関する。より詳細には、本発明は、生物学的触媒である微生物または微生物に由来する酵素を用いて、３-キヌクリジノンを立体選択的に還元して、光学活性３-キヌクリジノール、特に(R)-(-)-３-キヌクリジノールを生成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生理活性を有する多くの化合物は、その光学異性体の混合物として使用されている。しかし、望ましい活性は、一方の光学異性体のみに存在する場合が多い。さらに、所望の活性を有しない他方の光学異性体が、生体に対して毒性を有する場合があることも知られている。従って、有効かつ安全な医薬または生理活性化合物を提供するためには、その原料または合成中間体として用いられる光学純度の高い光学活性物質の製造方法を開発することが強く要望されている。
【０００３】
３-キヌクリジノンの還元生成物である３-キヌクリジノールは、スクアレンシンターゼ阻害作用を有する動脈硬化の治療剤、またはムスカリン受容体拮抗作用を有する気管支拡張剤、および胃腸運動抑制剤などの合成中間体として知られる化合物である（特開平８−１３４０６７号、ＥＰ−４０４７３７Ａ２、ＥＰ−４２４０２１Ａ１、ＷＯ９２／０４３４６、およびＷＯ９３／０６０９８を参照）。
【０００４】
不斉炭素原子を有する３-キヌクリジノールには、光学異性体が存在する。従って、合成中間体として有用な光学活性３-キヌクリジノールを分離する必要があり、現在までにいくつかの試みがなされている。
【０００５】
光学活性３-キヌクリジノールの製法として、これまでに、例えば、１-ベンジル-３-ヒドロキシキヌクリジウムクロライドをD-酒石酸誘導体で光学分割し、(S)-(+)-３-キヌクリジノールを生産する方法（Israel Journal of Chemistry, 9, 267-268(1971)）、およびD-グルコースからの(S)-(+)-３-キヌクリジノールの合成方法（Tetrahedron Letters, 27, 3057-3058(1986)）が報告されている。
【０００６】
微生物や酵素を利用する方法として、例えば、(R,S)-キヌクリジニルブチレートに、馬血清ブチルコリンエステラーゼを作用させ、光学活性(S)-(+)-３-キヌクリジニルブチレートを残存させる方法（Life Science, 21, 1293-1302 (1977)）、およびBacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを作用させ、高い光学純度の光学活性(R)-(-)-３-キヌクリジノールを製造する方法（US 5215918A）が知られている。
【０００７】
しかし、これらの方法は、低い光学純度、または合成工程の煩雑さから大量生産が容易でないなどの問題を含む。また、いずれの方法も、ラセミ体の３-キヌクリジノールを光学分割して目的の光学異性体を得る手法であるため、目的としない他方の光学異性体が残存する。そのため、これらの方法では、目的としない光学異性体に関して、その不斉炭素の立体配置を反転させて目的の光学異性体へ変換させる工程、あるいは目的としない光学異性体をラセミ化して、再度の光学分割による目的の光学異性体を得る工程を必要とし、生産コストが高くなる問題点がある。
【０００８】
一方、３-キヌクリジノンのルイス酸付加物をロジウム錯化合物を触媒として不斉水素化して、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法（特開平９−１９４４８０）が報告されているが、光学純度が低く、工業的な製造方法ではない。
【０００９】
このような観点から、光学活性３-キヌクリジノール、特に合成中間体として有用な(R)-(-)-３-キヌクリジノールを極めて高い光学純度で効率よく、３-キヌクリジノンから直接製造する方法が強く要望されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、立体選択性の高い生物学的触媒を利用し、高い光学純度を有する光学活性３-キヌクリジノールを効率良く製造する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法であって、
以下の式：
【００１２】
【化２】
0003891522.tif 000002
【００１３】
で表される３-キヌクリジノンと、３-キヌクリジノンを立体選択的に還元し得る生物学的触媒とを反応させる工程
を包含する。
【００１４】
好ましい実施態様においては、前記方法は、生成した光学活性３-キヌクリジノールを３-キヌクリジノンと分離する工程をさらに包含する。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記生物学的触媒は、ロドトルラ（Rhodotorula）属、キャンディダ（Candida）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属、およびノカルディア（Nocardia）属に属する微生物からなる群から選択される微生物に由来する。
【００１６】
好ましい実施態様においては、前記光学活性３-キヌクリジノールは(R)-(-)-３-キヌクリジノールである。
【００１７】
好ましい実施態様においては、前記生物学的触媒は、微生物菌体、微生物培養液、微生物菌体の処理物、および精製酵素からなる群から選択される。より好ましい実施態様においては、前記生物学的触媒は微生物菌体のアセトン処理物である。
【００１８】
好ましい実施態様において、前記微生物は、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula  glutinis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula  graminis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula  minuta）、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida  parapsilosis）、キャンディダ・インターメディア（Candida  intermedia）、キャンディダ・アンタルクティカ（Candida  antarctica）、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium  toruloides）、シゾサッカロマイセス・オクトスポルス（Schizosaccharomyces  octosporus）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus  laurentii）、クリプトコッカス・テレウス（Cryptococcus  terreus）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon  cutaneum）、ゴルドナ・テラエ（Gordona  terrae）、ピキア・アノマラ（Pichia  anomala）、およびノカルディア・アステロイデス（Nocardia  asteroides）からなる群から選択される微生物である。より好ましい実施態様において、前記微生物は、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）JCM3782、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra） JCM3785、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）JCM8113、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra） JCM8117、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula  glutinis）IFO389、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula  graminis） IFO0190、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula  minuta）IFO0879、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans） JCM1542、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans）JCM2909、キャンディダ・パラプシロシス（Candida  parapsilosis） JCM1618、キャンディダ・パラプシロシス（Candidaparapsilosis） JCM1785、キャンディダ・インターメディア（Candida  intermedia） IFO0761、キャンディダ・アンタルクティカ（Candida  antarctica）JCM3941、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor） IFO1035、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor）IFO1845、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium  toruloides） IFO8766、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus  laurentii）IFO0609、クリプトコッカス・テレウス（Cryptococcus  terreus） IFO0727、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporoncutaneum） IFO1198、ゴルドナ・テラエ（Gordona  terrae） JCM3206、ピキア・アノマラ（Pichia  anomala） IFO10213、およびノカルディア・アステロイデス（Nocardia  asteroides）IFO3384からなる群から選択される微生物である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２０】
本発明の方法は、３-キヌクリジノンに生物学的触媒を作用させて、３-キヌクリジノンを立体選択的に還元することにより、光学活性３-キヌクリジノールに変換する。
【００２１】
本発明の方法に用いられる生物学的触媒の基質は、式：
【００２２】
【化３】
0003891522.tif 000003
【００２３】
により示される３-キヌクリジノンである。本発明の方法に用いられる基質は、塩酸塩などの無機酸塩、および酢酸塩などの有機酸塩を含む。
【００２４】
本発明に用いられ得る生物学的触媒は、３-キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元し得る。詳細には、本発明に用いられ得る生物学的触媒は、３-キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元して、光学活性３-キヌクリジノールに変換するカルボニル還元酵素を含有（産生）する任意の微生物（例えば、酵母、糸状菌および細菌）に由来する。このような酵素を含有（産生）する微生物は、例えば、実施例１に記載の方法を用いて、３-キヌクリジノンから生成される(R)-(-)-３-キヌクリジノールまたはその光学異性体である(S)-(+)-３-キヌクリジノールについて分析することによりスクリーニングされ得る。
【００２５】
前記の酵素活性を有する酵素を含有（または産生）する微生物として、好ましくは、ロドトルラ（Rhodotorula）属、キャンディダ（Candida）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属、およびノカルディア（Nocardia）属に属する微生物が挙げられる。より好ましくは、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）JCM3782、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra） JCM3785、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra）JCM8113、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula  rubra） JCM8117、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula  glutinis） IFO389、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula  graminis）IFO0190、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula  minuta） IFO0879、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans）JCM1542、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans） JCM2909、キャンディダ・パラプシロシス（Candida  parapsilosis）JCM1618、キャンディダ・パラプシロシス（Candida  parapsilosis） JCM1785、キャンディダ・インターメディア（Candida  intermedia）IFO0761、キャンディダ・インターメディア（Candida  intermedia） AKU4429、キャンディダ・アンタルクティカ（Candida  antarctica）JCM3941、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor） IFO1035、スポリディオボルス・サルモニカラー（Sporidiobolus  salmonicolor）IFO1845、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium  toruloides） IFO8766、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus  laurentii）IFO0609、クリプトコッカス・テレウス（Cryptococcus  terreus） IFO0727、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon  cutaneum）IFO1198、ゴルドナ・テラエ（Gordona  terrae） JCM3206、ピキア・アノマラ（Pichia  anomala） IFO10213、およびノカルディア・アステロイデス（Nocardia  asteroides）IFO3384などである。これらの微生物株は、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）、（財）発酵研究所（ＩＦＯ）、または京都大学農学部（ＡＫＵ）などの微生物保存機関から入手できる。
【００２６】
本発明の方法において、生物学的触媒として用いられる微生物は、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導される）、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの操作された微生物は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual第２版（Sambrook, J.ら編、Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。
【００２７】
上記微生物の培養は、日常的に用いられる、当業者に周知な固体培地または液体培地のどちらを用いてもよい。好ましくは、上記微生物の培養は液体培地を用いて行われる。微生物の培養に使用される培地の成分は、炭素源および窒素源として、培養される微生物が利用できる任意の炭素源および窒素源を用いることができる。このような炭素源として、好ましくは、デンプン、スクロースまたはグルコースなどの糖、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）である。窒素源として、好ましくは、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源および硫安、塩安、尿素等の無機窒素化合物を用いることができる。炭素源の濃度は１〜２０％、好ましくは１〜５％の範囲である。窒素源の濃度は１〜２０％、好ましくは１〜５％の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる限り、任意の温度が可能であるが、好ましくは２０〜３０℃である。培養時間は、上記の酵素が十分に産生される限り、任意の時間であるが、好ましくは１６〜４８時間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうを用いて行うことができる。
【００２８】
本発明の方法で用いられる生物学的触媒は、上記の微生物培養から得られる任意の調製物を包含し得る。このような調製物として、例えば、上記の微生物培養から得られる微生物菌体、微生物培養液、微生物菌体の処理物、および種々の程度に精製された酵素などを含む。微生物培養液は、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。微生物菌体の処理物として、例えば、アセトン処理物、超音波処理などによる細胞破砕物、固定化菌体などが含まれる。これらは、当業者に周知の方法により調製され得る。例えば、アセトン処理物は、培養により得られた微生物菌体またはその懸濁液を、冷却した（例えば、−２０℃）アセトン中に攪拌し、その後例えば濾過により得られる、上記の酵素活性を保持した粉体状の菌体処理物である。微生物菌体の固定化は、例えば、微生物菌体の存在下で、カラギーナンまたはアクリルアミドなどのゲル化剤をゲル化することによって行われる。酵素の精製は、例えば、アセトン処理物および細胞破砕物を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われ、種々の精製度の酵素（ほぼ均一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
【００２９】
本発明の方法では、前記生物学的触媒を含有する適切な反応液中で、例えば、３-キヌクリジノンを立体選択的に還元し、生成物として光学活性３-キヌクリジノール、特に(R)-(-)-３-キヌクリジノールを得る。
【００３０】
本発明の方法の１つの実施態様において、光学活性３-キヌクリジノール、例えば(R)-(-)-３-キヌクリジノールは、３-キヌクリジノンの存在下、前記の微生物を培養することによって得ることができる。培養液に添加する３-キヌクリジノンの量は、０.１〜１０wt/vol％、好ましくは０.１〜５wt/vol％である。添加された３-キヌクリジノンは必ずしも完全に溶解しなくてもよい。添加された３-キヌクリジノンが完全に溶解しない場合、例えば、塩（例えば、塩酸塩）として溶解性を向上させても良く、あるいはエタノールのような有機溶媒を、還元反応を実質的に阻害しない程度（例えば、５％）に添加してもよい。
【００３１】
本発明の方法の別の実施態様において、光学活性３-キヌクリジノール、例えば(R)-(-)-３-キヌクリジノールは、適切な反応液（水または緩衝液）中で、培養された微生物の菌体またはその処理物（例えば、アセトン処理物）を３-キヌクリジノンと接触させ、反応することにより得ることができる。反応液に添加する３-キヌクリジノンの量は、０.１〜２０wt/vol％、好ましくは０.１〜１０wt/vol％である。添加された３-キヌクリジノンは必ずしも完全に溶解しなくてもよい。添加された３-キヌクリジノンが完全に溶解しない場合、例えば、塩（例えば、塩酸塩）として溶解性を向上させても良く、あるいはエタノールのような溶媒を、生物学的触媒による還元反応を実質的に阻害しない濃度（例えば、５％まで）に添加してもよい。特に菌体処理物を使用する場合、上記のカルボニル還元酵素の補酵素のＮＡＤＰＨを添加することが好ましい。その添加量は、２〜４００g/l、より好ましくは２〜２００g/lである。
【００３２】
本発明の方法のさらに別の実施態様において、反応に用いる生物学的触媒を適切に選択することにより、上記と同じ反応条件下で、立体配置が(S)配置の光学活性３-キヌクリジノールを得ることができる。
【００３３】
反応は、制御されたｐＨのもとで行われ得る。反応のための至適なｐＨを保持するために、例えばリン酸緩衝液などの緩衝液が使用される。反応液のｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８である。あるいは、反応の進行に伴って変化するｐＨをモニターしながら、酸（例えば、硫酸）およびアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）を添加することによって反応液のｐＨを至適なｐＨに維持および調節し得る。
【００３４】
本発明の方法で用いられる生物学触媒の量は、特に限定されないが、その基質である３-キヌクリジノンに対して、約０.１〜１０ｇ／基質mol、好ましくは約１〜５ｇ／基質molである。
【００３５】
反応温度は１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３５℃である。反応時間は、用いる生物学的触媒の量、反応温度、反応ｐＨなどに依存して変動するが、通常１〜７２時間程度である。
【００３６】
本発明の方法では、生成した光学活性３-キヌクリジノールは、必要に応じて、基質の３-キヌクリジノンおよび生成した光学活性３-キヌクリジノールの化学的特性または物理的特性の差異を利用して分離され得る。本発明の方法では、表１に示すように、適切な生物学的触媒を選択することによって、光学純度が１００％の光学活性３-キヌクリジノール、すなわち(R)-(-)-３-キヌクリジノールまたは(S)-(+)-３-キヌクリジノールが生成するため、光学活性３-キヌクリジノールの一方の光学異性体のみを得ることができる。
【００３７】
生成した光学活性３-キヌクリジノールは、反応終了後、その性質（例えば、溶解度、疎水性）に依存して、例えば、溶媒抽出法、結晶析出法、カラムクロマトグラフ法などの当該分野で通常用いられる分離操作を用いて、未反応の３-キヌクリジノンと分離される。例えば、溶媒抽出法では、塩基性条件下、トルエンで反応液から未反応の３-キヌクリジノンを抽出した後、クロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒を用い、生成した光学活性３-キヌクリジノールを回収することができる。
【００３８】
得られた生成物は、必要に応じて、上記の手段を用いて、さらに精製され得る。この場合、第２の手段は、第１の手段と異なる方が好ましい（例えば、第１の手段として溶媒抽出を用いた場合、第２の手段として、例えばカラムクロマトグラフィが挙げられる）。
【００３９】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
生成した３-キヌクリジノンの定量ならびに光学純度の測定は、以下の分析条件を用いて、ガスクロマトグラフィーにより行った。
【００４１】
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：alpa-DEX120（長さ：３０m、内径：０.２５mmID；スペルコ社製）
カラム初期温度：１４０℃（１０分）
インジェクター温度：２２０℃
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム（２００kPa）
検出器：ＦＩＤ
＜実施例１＞
５００ml容三角フラスコに、１００mlのＹＭ培地（ポリペプトン（日本製薬製）５g/l、酵母エキス（日本製薬製）３g/l、麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）３g/l、グルコース１０g/l、ｐＨ５.５）を入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、あらかじめ同培地で前培養しておいたロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）JCM3782の培養液を接種し、２５℃で２日間、ロータリーシェーカーで回転培養（１６０rpm）を行った。
【００４２】
この培養液に、３-キヌクリジノン塩酸塩８０８mg（５０mM）を添加し、さらに５日間回転培養を続けた。培養終了後、培養液に１００gの炭酸カリウムを加え塩基性条件下にした後、未反応の３-キヌクリジノンを５０mlのトルエンで２回抽出除去した。その後、生成物を反応液から、５０mlのクロロホルムで２回抽出した。
【００４３】
抽出液をガスクロマトグラフィーで分析した結果、２１０mg（収率３３％）の(R)-(-)-３-キヌクリジノールが、光学純度１００％e.e.（エナンチオマー過剰率）で得られた。
【００４４】
＜実施例２＞
種々の微生物を用いて、実施例１に記載のように、反応を行い、そして生成物を抽出した。抽出液の分析結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0003891522.tif 000004
【００４６】
表１は、多くの微生物で、光学純度が１００％e.e.で光学活性３-キヌクリジノール（すなわち、一方の光学異性体のみ）が得られたことを示す。
【００４７】
＜実施例３＞
３Ｌ容ジャーファーメンターに、実施例１に記載のＹＭ培地２Ｌを入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、あらかじめ同培地で前培養しておいたロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）JCM3782の培養液を接種し、２５℃で２日間、通気攪拌培養（通気量：１vvm、攪拌速度：５００rpm）を行った。得られた培養液を遠心分離（１８０００rpm、２０分）し、６１ｇのロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）JCM3782の湿菌体を得た。
【００４８】
４００mlの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に、得られた菌体６１ｇを懸濁した後、３-キヌクリジノン塩酸塩１２.９ｇ（２００mM）とスクロース４０ｇを添加し、２５℃で、４日間攪拌した。反応終了後、４００ｇの炭酸カリウムを加え塩基性条件下にした後、未反応の３-キヌクリジノンを２００mlのトルエンで２回抽出除去した。その後、生成物を２００mlのクロロホルムで２回抽出した。
【００４９】
抽出液をガスクロマトグラフィーで分析した結果、(R)-(-)-３-キヌクリジノールが６.６ｇ（収率６５％）で得られ、その光学純度は１００％e.e.（エナンチオマー過剰率）であった。
【００５０】
＜実施例４＞
４００mlの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に、実施例３に記載されるように培養を行って得られた菌体６１ｇを懸濁した後、３-キヌクリジノン塩酸塩６.５ｇ（１００mM）とスクロース４０ｇを添加し、２５℃で、４日間攪拌した。反応終了後、４００ｇの炭酸カリウムを加え塩基性条件下にした後、生成物を２００mlのクロロホルムで２回抽出した。
【００５１】
抽出液をガスクロマトグラフィーで分析した結果、(R)-(-)-３-キヌクリジノールが５.０ｇ（収率９９％）で得られ、その光学純度は１００％e.e.（エナンチオマー過剰率）であった。
【００５２】
＜実施例５＞
実施例３と同様にして得られたロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）JCM3782の菌体１２ｇを２００mlの冷アセトン（−２０℃）に分散し、約５分攪拌した後、ろ過により菌体を回収した。同様の処理をさらに３回行った後、真空乾燥によりアセトンを除去し、粉末状のアセトン処理菌体２.４ｇを得た。
【００５３】
２０mlの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に、得られたアセトン処理菌体２.４ｇを分散した後、３-キヌクリジノン塩酸塩６４８mg（２００mM）とＮＡＤＰＨ １.８ｇとを添加し、２５℃で、４８時間攪拌した。反応終了後、２０ｇの炭酸カリウムを加え塩基性条件下にした後、未反応の３-キヌクリジノンを１０mlのトルエンで２回抽出除去した。その後、生成物を１０mlのクロロホルムで２回抽出した。
【００５４】
抽出液をガスクロマトグラフィーで分析した結果、３６４mg（収率７１％）の(R)-(-)-３-キヌクリジノールが光学純度１００％e.e.（エナンチオマー過剰率）で得られた。
【００５５】
＜実施例６＞
種々の微生物を用いて、実施例５に記載のように、培養菌体をアセトン処理し、反応を行い、そして生成物を抽出した。抽出液の分析結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
0003891522.tif 000005
【００５７】
表２は、アセトン処理菌体を用いても、高い光学純度で生成物が得られることを示す。さらに、培養菌体をアセトン処理することにより、収率が増大していることを示す。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、光学活性３-キヌクリジノール、特に(R)-(-)-３-キヌクリジノールを高い光学純度で効率よく製造することができる。微生物菌体のアセトン処理物は、培養菌体よりも高い収率で(R)-(-)-３-キヌクリジノールを生成し得る。得られる光学活性３-キヌクリジノールは、動脈硬化、気管支喘息、または胃腸運動抑制などの治療剤を製造するための合成中間体として有用である。