(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型コートタンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の単離された小RNAウイルスであり、ここで上記Ig様ドメインはホスト細胞親和性のため改変または置換されている単離されたウイルス。
【請求項２】
Ig様ドメインが、ウイルスがその通常のホスト細胞型（類）以外のものである所定の細胞型に選択的に結合または感染するように改変されている請求項１の単離されたウイルス。
【請求項３】
所定の細胞型が、ウイルスの通常のホスト種範囲の外側の昆虫種に属している細胞タイプである請求項２の単離されたウイルス。
【請求項４】
ウイルスが、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、及びテトラウイルス科（Tetraviridae）から選択される請求項１から３のいずれか一項の単離されたウイルス。
【請求項５】
ウイルスが、ヌダウレリア（Nudaurelia）β様ウイルス科またはヌダウレリア（Nudaure1ia）ω様ウイルス科のメンバーである請求項４の単離されたウイルス。
【請求項６】
ウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）萎縮病ウイルス（HaSV）、ヌダウレリア（Nudaurelia）ωウイルス（NωV）及びヌダウレリア（Nudaurelia）βウイルス（NβV）から選択される請求項５の単離されたウイルス。
【請求項７】
上記Ig様ドメインが、外来性タンパク質由来のIg様ドメインの全てまたは機能的な部分（類）によって改変または置換されている請求項１から６のいずれか一項の単離されたウイルス。
【請求項８】
外来性タンパク質から由来するIg様ドメインが、抗体の可変ドメイン（V）または定常ドメイン（C）、及び細胞接着タンパク質及び受容体のIg様ドメインから選択される請求項７の単離されたウイルス。
【請求項９】
Ig様ドメインが、非Ig様四次構造を含むことによって改変または置換される請求項１から６のいずれか一項の単離されたウイルス。
【請求項１０】
非Ig様四次構造が、ペプチドループ、＜30kDaのタンパク質及びレクチンから選択される請求項９の単離されたウイルス。
【請求項１１】
非Ig様四次構造が抗原性である請求項９または１０の単離されたウイルス。
【請求項１２】
ペスト昆虫の増殖をコントロールするための方法であり、該方法は上記ペスト昆虫によって感染された領域に、請求項１から１０のいずれか一項の小RNAウイルス、場合により農業的に許容可能なキャリアーと混合して適用することを含む方法。
【請求項１３】
野生型タンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の小RNAウイルスから由来するコートタンパク質遺伝子（類）の発現から調製されるウイルス様粒子（VLP）であり、上記遺伝子（類）が、発現されたコートタンパク質のIg様ドメインがホスト細胞親和性を修飾するために改変または置換されているVLP。
【請求項１４】
Ig様ドメインが、VLPがIg様ドメインの改変または置換の不存在下で結合及び感染するであろうホスト細胞型（類）以外のものである所定の細胞型に、ウイルスが選択的に結合及び感染するように改変されている請求項１３のVLP。
【請求項１５】
所定の細胞型が昆虫種に属する細胞型である請求項１４のVLP。
【請求項１６】
コートタンパク質遺伝子（類）が、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、及びテトラウイルス科（Tetraviridae）から選択されるウイルスから由来する請求項１３から１５のいずれか一項のVLP。
【請求項１７】
ウイルスが、ヌダウレリア（Nudaurelia）β様ウイルス科またはヌダウレリア（Nudaurelia）ω様ウイルス科のメンバーである請求項１６のVLP。
【請求項１８】
ウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）萎縮病ウイルス（HaSV）、ヌダウレリア（Nudaurelia）ωウイルス（NωV）及びヌダウレリア（Nudaurelia）βウイルス（NβV）から選択される請求項１７のVLP。
【請求項１９】
上記Ig様ドメインが、外来性タンパク質由来のIg様ドメインの全てまたは機能的な部分（類）によって改変または置換されている請求項１３から１８のいずれか一項のVLP。
【請求項２０】
外来性タンパク質から由来するIg様ドメインが、抗体の可変ドメイン（V）または定常ドメイン（C）、及び細胞接着タンパク質及び受容体のIg様ドメインから選択される請求項１９のVLP。
【請求項２１】
Ig様ドメインが、非Ig様四次構造を含むことによって改変または置換される請求項１３から１８のいずれか一項のVLP。
【請求項２２】
非Ig様四次構造が、ペプチドループ、＜30kDaのタンパク質及びレクチンから選択される請求項２１のVLP。
【請求項２３】
非Ig様四次構造が抗原性である請求項２１または２２のVLP。
【請求項２４】
VLPが、上記ホスト細胞に結合及び感染した場合に発現される外来性核酸分子をキャプシド化する請求項１３から２２のいずれか一項のVLP。
【請求項２５】
外来性核酸分子が、殺虫剤性である、または殺虫剤性毒素をコードする請求項２４のVLP。
【請求項２６】
外来性核酸分子か細胞毒素をコードする請求項２４のVLP。
【請求項２７】
野生型コートタンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の小RNAウイルスから由来するコートタンパク質遺伝子（類）の発現から調製されるウイルス様粒子（VLP）を含むワクチンであり、上記遺伝子（類）が、発現されたコートタンパク質のIg様ドメインが、VLPがホスト生物における免疫応答を引き出すように表面に位置した抗原を提示するために改変または置換されているワクチン。
【請求項２８】
コートタンパク質遺伝子（類）が、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、及びテトラウイルス科（Tetraviridae）から選択されるウイルスから由来する請求項２７のワクチン。
【請求項２９】
ウイルスが、ヌダウレリア（Nudaurelia）β様ウイルス科またはヌダウレリア（Nudaurelia）ω様ウイルス科のメンバーである請求項２８のワクチン。
【請求項３０】
ウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）萎縮病ウイルス（HaSV）、ヌダウレリア（Nudaurelia）ωウイルス（NωV）及びヌダウレリア（Nudaurelia）βウイルス（NβV）から選択される請求項２９のワクチン。
【請求項３１】
Ig様ドメインが、非Ig様四次構造を含むことによって改変または置換される請求項２７から３０のいずれか一項のワクチン。
【請求項３２】
非Ig様四次構造が、ペプチドループ、＜30kDaのタンパク質及びレクチンから選択される請求項３１のワクチン。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ホスト細胞親和性、または言い換えるとホスト細胞結合及び感染の特異性を修飾するために、改変されたまたは置換されたIg様ドメインを持つ小RNAウイルス及びウイルス様粒子（VLP）に関する。本発明はまた、殺虫剤及び医療の応用における上記小RNAウイルス及びVLPの使用に関する。
発明の背景
明白に認識された小RNAウイルスには、Picornaviradae、Nodaviradae及びTetraviradaeのメンバーが含まれる。しかしながら、このカテゴリーに含まれる多くの認識されていない昆虫ウイルスが存在する。Tetraviradaeは、直径が35-41nmの非エンベロープ、正二十面体キャプシド及び単一鎖ポジティブセンスRNA（ss+RNA）ゲノムを持つ小等軸昆虫ウイルスのファミリーである。それらはウイルス学者からは広い注意を向けられていない。それらの周知のホスト範囲は、単一の昆虫目、Lepidoptera（ガ、チョウ）の数ファミリーのガでのみ確認されており、そのことが該ウイルスを、昆虫ホストに制限された単なる小RNAウイルスファミリーにしている。それらは、重要な昆虫ペストであるそのホストのいくつかをコントロールすることにおいて有効であるように思われる一方で、それらはこの点ではほとんど用いられていない。細胞カルチャー系が欠如していたこと、または最近まで実験室で培養された昆虫からウイルスを得るための信頼できる手段が欠如していたことは、不特定の質のまばらに入手可能な屋外採取生物に頼る必要性を要した。上記のような困難性のため、最近やっとテトラウイルスの2の群、およそ6kbの単一部分ゲノムを持つNudaurelia β様ウイルス、及び5.3と2.5kbのssRNAを含む二部分ゲノムを持つNudaurelia ω様ウイルスが現実に存在することが明らかとなった。わずかに2の周知のNudaurelia ω様ウイルスが存在する。一つのメンバー（Helicoverpa armigera萎縮病ウイルス−HaSV）の完全なゲノムが、本発明者らによって以前に配列決定されている。他のメンバーは、部分的にシークエンスされているNudaurelia ωウイルス（NωV）である。
テトラウイルスによる感染の最も興味ある面の一つは、それらが単一の組織型にのみ感染するようであることであり、HaSVの場合には、その部位は中腸である。HaSVの特異性を強調する決定的な実験において本発明者らは、ウイルスが幼虫の血体腔内に注射され、それによってHaSVに対して通常さらされないホストの非中腸細胞型にさらされた場合でさえ、その中腸特異性が支配することを示した。ウイルスの存在は、3の群の幼虫、一つはHaSVを注射されたもの、一つはHaSVを食べたもの、及び非感染コントロール由来の中腸及び死骸の残部から抽出されたRNAのノーザンブロット上でのクローン化cDNAプローブを用いることによって調べられた。彼らはHaSVを用いて処理された両群の幼虫の中腸RNAにのみポジティブシグナルを観察した。
特定の細胞型に対するHaSV粒子の特異的結合に対するさらなる証拠は、HaSVを用いて感染されたH.armigeraの幼虫の厳密な試験から由来する。銀で強調したイムノゴールド染色の感受性イムノ組織化学法を、感染幼虫の一連の横方向及び縦方向の切片で用いた。この一連の切片をまた、電子顕微鏡を用いて調べた。前腸、脂肪、体、唾液腺及び脳由来の組織に相当の注意を払ったにもかかわらず、中腸細胞にのみに染色が現れた。中腸の分化した細胞の両型、円柱細胞及び胚細胞に感染が見出され、同様に基底膜でのずっと小さい非分化再生細胞でも感染が見出された。全てのこれらの中腸細胞型で感染が見出されたが、ワックスに埋め込まれた中腸の切片における細胞に対するウイルス結合の分析により、胚細胞がHaSV結合の一時的なターゲットであり、円柱細胞はそうではないことが示された。
2の周知のω様ウイルスは、高程度の配列同一性を示す。つまり、2のω様ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列は全体で67%の同一性（76%の相同性）を示す。この比較により、高ホモロジー（およそ80%同一で、95%にわたって同一の過度に伸張した配列を含む）の2の領域を持つ、コート（キャプシド）タンパク質における4のドメインが定義された（Hanzlik等,1995）。49残基アミノ末端ドメインは比較的低ホモロジーを示し、同様に該配列の中部に位置する165残基配列は33%の同一性を示す。驚くべきことに、高い全体にわたる配列同一性は、検出可能な血清学的関係に置いて反映されず、それは低配列ホモロジーの中央ドメインが、完全なビリオンの唯一の免疫原性部分としてキャプシド表面にさらされていることを示唆する。Hanzlik等（1995）によって最初に示唆されたように、この領域は2のウイルスの異なるホスト特異性に関与している。
本発明者らは、HaSVの中央ドメイン（残基287から416に相当する）がイムノグロブリン（Ig）スーパーファミリーに属する構造を形成するという驚くべき発見をなした。その構造がIg様ホールドを示す他のタンパク質ドメインには、抗体で見出される可変ドメイン（V）及び定常ドメイン（C）が含まれる（例えばHIV gp 120によって認識されるCD4受容体）。これらのタンパク質による他の細胞または細胞外マトリックスに対する細胞接着の仲介は、成長、分化、免疫応答及び組織構造と治癒において中心的な役割を果たす。これらのタンパク質の多くはまた、ウイルスによる受容体として用いられる（Lentz（1990））。
細胞接着アッセイ及びプレートに付着した人工脂質二重層の分析に基づく最近の研究により、表面タンパク質の結合によって促進される細胞接着の原理が解明されている。これらの研究は、MHCクラスII及びCD4タンパク質の間の結合に基づく作用によって例示され、それらは免疫応答に置いて抗原提示細胞（APC）とCD4+T細胞の接着を介在する。可溶性（モノマー）CD4（sCD4）は、100μMの濃度でさえ、細胞接着アッセイにおいてT細胞クローンのMHCクラスII特異的増殖応答（Hussey等,1998）及びCD4トランスフェクトCOS-7細胞に対するMHCクラスII+B細胞の結合（Sakihama等,1995a）を阻害しない。このことは、MHCクラスにタンパク質に対するモノマーsCD4のアフィニティーが、＞10-4Mであることを意味する。CD4+細胞の表面でのCD4分子のオリゴマー化には、これらの細胞接着タンパク質分子の間の相互作用の親和性を増大することによる、MHCクラスIIタンパク質に対する安定な結合が必要とされる（Sakihama等,1995a,b）。このオリゴマー化は、1または2のCD4分子とMHCクラスIIダイマーの間の最初の相互作用に引き続く。キメラCD4分子の特性指摘は、膜基底ドメイン3及び／または4がオリゴマー化に関与するようであることを示す。
本発明者らは、HaSVのIg様ドメインとNωVの相当するドメインの間の配列同一性の欠如は、テトラウイルス粒子を改変されたIg様ドメインまたは置換された四次構造を持つことが可能な二十面体プラットフォームとして用い得ることを許容し、それによって修飾されたホスト細胞結合特異性を示すであろう。
Ig様ドメインは、テトラウイルスキャプシドの表面で類似の3倍のまたは二十面体の3倍の関連するサブユニットのいずれかと相互作用する著しい突起部を形成する。それ故二十面体粒子は、CD4とMHCクラスIIオリゴマーの間の結合と類似した、細胞表面受容体に対する完全なキャプシドの安定な結合を許容すると思われるIg様ドメインの決まったオリゴマー形態で存在する。この概念に対する支持は、Weber及びKarjalainen（1993）の発見から由来し、彼らはマウスCD4とヒトCμの可溶性ペンタマーイムノ融合構築物が、ポリマー結合マウスsCD4とB細胞の間の相互作用を阻害し、一方でマウスCD4とマウスCκの可溶性モノマーイムノ融合構築物は阻害しないことを報告した。
発明の開示
それ故、第一の面として、本発明は野生型コートタンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の単離された小RNAウイルスを提供し、個々で上記Ig様ドメインはホスト細胞親和性を修飾するために改変または置換されている。
「Ig様ドメイン」なる語によって、我々は「容器様」形態を形成する7から9のアンチパラレルのβストランドを用いているが、しかしながら、水素結合が該容器構造の周りに広がっていないため、基本的には2の別個のβ−プリーツシートが存在し、物理的に折り畳まれてβ−サンドイッチを形成しているコア構造を持つ別個の構造的ドメインをいう。該定義内のあるIg様ドメイン（テトラウイルスIg様ドメインのような）もまたコア構造の外側にさらなるβ−ストランドを持つ。
「ホスト細胞親和性」なる語によって、我々は生物内での細胞の特異的な集団において結合し、侵入しそして感染を開始するウイルス（及び以下に記載されるウイルス様粒子（VLP））の能力をいう。
好ましくは、Ig様ドメインは、ウイルスの通常のホスト細胞型（類）以外の所定の細胞型に、該ウイルスが選択的に結合及び感染するように改変されている。上記「ターゲッティング」とは、例えば通常のホスト種の範囲の外側にペスト昆虫のコントロールに置いて小RNAウイルスの殺虫剤的性質の利用が可能であることをいう。以上より本発明に記載の小RNAウイルスは、殺虫剤的試薬として有意な能力を提供する。
本発明は特にTetraviradaeに関して記載される一方で、Ig様ドメインはまた他の小RNAウイルスにも存在することが予期される。したがって、第一の面の小RNAウイルスは、Picornaviradae、Nodaviradae及びTetraviradaeのメンバーから選択される。好ましくは、小RNAウイルスは、Nudaurelia β様ウイルス（特にNβV）のようなTetraviradae科のメンバーである。さらに好ましくは、該小RNAウイルスは、Nudaurelia ω様ウイルスの属のメンバーである。最も好ましくは、小RNAウイルスは、Helicoverpa armigera萎縮病ウイルス（HaSV）及びNudaurelia ωウイルス（NωV）から選択される。
HaSV野生型コートタンパク質（p71）のIg様ドメインは、図１に示されたアミノ酸配列の残基281から414に位置する。NβV野生型コートタンパク質のIg様ドメインは、図２に示された634のアミノ酸配列の残基285から433内に位置する。NωV野生型コートタンパク質のIg様ドメインは、Agrawal及びJohnson,1995によって報告された配列の残基280から413に位置する。
Ig様ドメインの改変または置換は、野生型コートタンパク質遺伝子（類）を、上記記載された様な他のタンパク質由来のIg様ドメインの全てまたは機能的部分（類）をコードする核酸配列を含むキメラ遺伝子（類）で置換することによって成し遂げられる。この文脈における機能的部分（類）とは、小RNAウイルスが一つ以上の細胞型に特異的に結合及び感染することを未だ許容するIg様ドメインの部分（類）をいう。
通常のホスト種範囲の外側のペスト昆虫の細胞タイプに対する小RNAウイルスのターゲット化のために、キメラ遺伝子（類）には、ターゲットペスト昆虫に属する腸細胞タイプに対して特異的な抗体の可変ドメイン（V）または定常ドメイン（C）の全てまたは機能的部分（類）をコードするか核酸配列が含まれる。代わりに該キメラ遺伝子（類）は、細胞接着に関与するタンパク質、または細胞表面エピトープに対して特異的なモノクローナル抗体由来のIg様ドメインの全てまたは機能的部分（類）をコードする核酸配列を含む。
他のタンパク質由来のIg様ドメインまたはその機能的部分（類）をコードする核酸配列を用いてIg様ドメインを改変または置換することが好ましい一方で、本発明は、ホスト細胞親和性の好ましい修飾を成し遂げるために非Ig様四次構造をコードする核酸配列を用いたIg様ドメインの改変及び置換を企図する。例えば、Ig様ドメインを、ペプチドループ（例えばノダウイルス（nodaviruses）のコートタンパク質に存在するもののような）、小タンパク質及びレクチンの包含によって改変する、またはそれらを用いて置換する。
Ig様ドメインの適切な改変はまた、野生型コートタンパク質遺伝子（類）のサイトディレクトミュータジェネシスのような方法によっても成し遂げられる。
第二の面として、本発明は、ペスト昆虫の増殖をコントロールするための方法を提供し、該方法は第一の面に記載の小RNAウイルスを、場合により農業的に許容されるキャリアーを混合して、上記ペスト昆虫に感染された領域に適用することを含む。
NωV及びHaSVの両者由来のコートタンパク質は、バキュウロウイルス発現系において発現された場合、ウイルス様粒子（VLP）を形成する能力を持つ。それ故本発明者らの発見は、例えば核酸分子といった特異的輸送試薬として用いるためのVLPを生産する可能性を提供する。それ故、これらのVLPは、殺虫剤的試薬として、または例えば遺伝子治療のための特異的遺伝子輸送の手段としての使用において有用である。小RNAウイルスからのVLPの生産は、国際特許出願No.PCT/AU93/00411において議論され、その前開示が参考としてここで併合されるものとして考えられる。
HaSV VLPは、HaSVビリオンのものと非常に相同な性質を持つ。これらには、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性、CsCl溶液における浮遊性、形態と大きさ、分解からキャプシド化されたRNAを保護する能力、及びHaSVにとってのH.armigera腸細胞に対するアフィニティーが含まれる。後者の性質は、VLPが幼虫のワックス横断切片におけるH.armigera腸細胞上の受容体に同様な方式で結合するという観察によって示された。これは、VLPが細胞内に侵入し、その中でRNAを発現することが可能であることを示す。
それ故、第三の面として、本発明は、野生型コートタンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の小RNAウイルス由来のコートタンパク質（類）の発現から調製されるウイルス様粒子（VLP）を提供し、上記遺伝子（類）は、発現されるコートタンパク質のIg様ドメインがホスト細胞親和性を修飾するために改変または置換されるように改変されている。
好ましくは、VLPはコートタンパク質遺伝子（類）の発現から調製され、該遺伝子（類）は該VLPが所定の細胞型（類）に選択的に結合及び感染するように、発現されたコートタンパク質のIg様ドメインを改変または置換するような改変を受けており、該所定の細胞型（類）は、コートタンパク質（類）のIg様ドメインの改変または置換が存在しないVLPで結合及び感染するホスト細胞型（類）以外のものである。
好ましくは、コートタンパク質遺伝子（類）は、Picornaviradae、Nodaviradae及びTetraviradaeのメンバーから選択される。しかしながら好ましくは、該遺伝子（類）は、Nudaurelia β様ウイルス（特にNβV）のようなTetraviradae科のメンバーから由来する。さらに好ましくは、該遺伝子（類）は、Nudaurelia ω様ウイルスの属のメンバーから由来する。最も好ましくは、該遺伝子（類）は、Helicoverpa armigera萎縮病ウイルス（HaSV）及びNudaurelia ωウイルス（NωV）から由来する。
VLPを発現するために用いられるコートタンパク質遺伝子（類）は、野生型コートタンパク質遺伝子（類）を、第一の面に関して上記記載されたようなキメラ遺伝子（類）で置換することによって生産される。
本発明の第三の面に記載のVLPは、所定の細胞型（類）に核酸分子を特異的に輸送するための有意な可能性を提供する。殺虫剤的試薬としての使用のためには、該核酸は例えば、リシン、神経毒、ゲロニン（gelonin）及びジフテリア毒素のような毒素をコードする。医療的応用においては、該核酸分子は例えば、細胞毒素（例えばガンの治療のため）、または必要とされるような（例えば遺伝子治療のため）他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
発明者らは時々、HaSVコートタンパク質由来のVLPがウイルス配列を持たない低分子量RNAをキャプシド化するであろうことを観察しているが、もし第三の面のVLPがターゲット細胞に対して望ましい遺伝子を輸送することに有用であるのであれば、ウイルスRNA上にキャプシド化（及び複製）シグナル配列を用いることがおそらく必要である。つまり、キャプシド化（及び複製）シグナルが外来起源の発現可能RNAを特異的にキャプシド化及び輸送するVLPの生産を許容するために用いられることがおそらく必要であり、それによって、ターゲット細胞に対する望ましい活性の輸送が可能になる。これは、ターゲット細胞において翻訳された場合に機能的タンパク質を生産するためのmRNAの形態、または該産物が結局は発現されるであろうターゲット細胞のゲノム内に取り込まれるレトロウイルス状またはレトロトランスポゾン状RNAの形態であろう。
小RNAウイルスコートタンパク質のIg様ドメインを改変または置換する可能性はまた、抗原性四次構造を持つVLPの形成を提供する。上記VLPはワクチン試薬として重要な有望性を提供するであろう。
それ故、第四の面として、本発明は、野生型コートタンパク質（類）内にIg様ドメインを含む種類の小RNAウイルス由来のコートタンパク質遺伝子（類）の発現から調製されたウイルス様粒子（VLP）を含むワクチンを提供し、上記遺伝子（類）は、VLPがホスト生物における免疫応答を引き出す目的で表面に位置する抗原を提示するように、発現されたコートタンパク質のIg様ドメインが改変または置換されている状態に改変されている。
該抗原は、例えばウイルス（例えばHIV、HCV、CMV）または細菌（例えばMycobacteria、Streptococcus、Haemophilias）由来のタンパク質の全部分または抗原部分である。
テトラウイルスコートタンパク質及びVLPで実施された研究から、本発明者らは、本発明によって企図される特異的RNA輸送VLPの生産を可能にする独自の群の6の性質または特性を同定した。これらの特性は以下のように要約される：
１．外来性発現系から発現された場合に、容易にVLPを生産するテトラウイルスコートタンパク質の能力。
２．ウイルスキャプシド化シグナル配列を含み、異なる活性のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコードする外来性mRNAを容易にキャプシド化するテトラウイルスVLPの能力。
３．コードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳が、VLPが結合及び感染する細胞において特異的に生ずるような方法で、外来性mRNAを輸送可能なテトラウイルスVLPの能力。
４．ホスト細胞親和性に関与するIg様ドメインを形成する異なる領域のテトラウイルスコートタンパク質内の規定。
５．テトラウイルスコートタンパク質状のIg様ドメインを、外来起源の他のIg様ドメイン及び構造で修飾または置換する可能性。
６．脊椎動物免疫応答に対する低反応性を示すテトラウイルスVLPを生産する可能性。
これらの性質及び特異的RNA輸送VLPを生産する実現可能性は、以下の非制限的な実施例及び添付された図面を参考として、以下に詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
図１はHaSVゲノムのRNA2をコードするcDNAの核酸配列を提供する（RNA1をコードするcDNAの核酸配列は上記記載の特許出願No.PCT/AU93/00411に提供されている）。コートタンパク質p71及びp17の推定のアミノ酸配列もまた示されている。p71は残基G281からE414でIg様ドメインを含む。
図２はNβV RNAゲノムをコードするcDNAの核酸配列を提供する。コードされるタンパク質の推定のアミノ酸配列もまた提供される。コートタンパク質（p70）は、634残基配列の残基P285からK433でIg様ドメインを含む。
実施例１
外来性発現系からのVLP生産：
テトラウイルスコートタンパク質は、外来性発現系によって発現された後VLPを容易に生産し、重要なことにそれらはin vitro条件の下でRNA含有VLP内にアセンブルされる。in vitroアセンブリーは、様々な望ましいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするmRNAを持ち、ホストに対する毒性のためin vivoの生産を妨げるために発現されるであろう細胞毒素を含むVLPの低価格で、ラージスケールの生産を容易にする。VLPのin vitro生産はまた、混入した生物／因子の除去に対する厳密な必要性に容易に適合することが可能であるために、医療の応用においても重要である。
バキュウロウイルス、酵母及び植物細胞のような真核生物発現系でのテトラウイルスVLPのin vivoの生産は、上記記載の国際特許出願No.PCT/AU/93/00411及びHanzlikとGordon,1997に記載されている。略記すると、これらの系におけるテトラウイルスVLPの生産は、強力なプロモーターを用いたコートタンパク質前駆体遺伝子（例えばHaSVに対しては；RNA2のp71）の発現、それからHaSVビリオンに対するものとしてのまたはAgrawalとJohnson（1995）の方法によるVLPの精製を含む。in vitro条件の下でテトラウイルスVLPを生産するために、Yusibov等,（1996）によって記載された方法は、大腸菌のような原核生物ホストにおけるコートタンパク質前駆体の発現の後に用いられる。
実施例２
HaSV VLPキャプシド化外来性RNAの生産：
テトラウイルスコートタンパク質から生産されたVLPは、特定のウイルスキャプシド化シグナル配列を持つ外来性mRNAを容易に取り込む。上記mRNAは、様々な望ましいペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコードする。これはHaSV VLP内に非ウイルス遺伝子、大腸菌β−グルクロニダーゼ（GUS）を置く以下の実験によって示されうる。
その中に翻訳可能なGUS mRNAを持つHaSV VLPを、2の組換えバキュウロウイルスを用いてSf9細胞を共感染することによって作製しうる。商業的に入手可能なバキュウロウイルスベクター、Bac-to-Bac Expression System（Gibco-BRL）のpFastBacを用いる。Baculovirus 1をポリヘドリンプロモーターの後部にp71コートタンパク質オープンリーディングフレーム（ORF）を置くことによって構築した（図1参照）。Baculovirus 1がそれ自体でSf9細胞に感染する場合、コートタンパク質ORFの転写されたmRNAを選択的にキャプシド化するVLPが形成される。これは、キャプシド化シグナル配列がコートタンパク質ORF内に存在することを示す。この情報をGUS活性を発現するキャップシドか可能RNAを生産するBaculovirus 2を構築するために用いた。
Baculovirus 2またはpFBGUSp71ウイルスを、開始AUGコドンがコートタンパク質ORFの代わりにGUS ORFの翻訳を開始するように、コートタンパク質ORFとポリヘドリンプロモーターの間にGUS ORF（β−グルクロニダーゼ、Jefferson等,1986）を置くことによって構築した。それ故、転写がバキュウロウイルス感染の間に生じた場合、GUSとして発現されるmRNAが生産される。このmRNAはまた、GUS ORFの抗部に置かれたHaSV p71コートタンパク質ORFによって所有されるキャプシド化シグナルを所有する。その結果、Baculovirus 1及び2が同じ細胞に感染した場合、Baculovirus 1から作製されたVLPが選択的にコートタンパク質ORFのみと共にRNAをキャプシド化し、同様にコートタンパク質ORFによって引き続くGUS ORFと共にRNAをキャプシド化する。
GUS mRNAのキャップシド化は、両バキュロウイルスを用いて共感染されたSf9細胞から生産された精製VLPから抽出されたRNAのノーザンブロッティングによっって確認される。VLPを精製するために、Sf9細胞を2のウイルスを用いて感染し、４日後該細胞を凍結／溶解及び0.2% Ninidet P40界面活性剤を用いたTrisバッファー（50mM Tris pH7.4）においてボルテックスして溶解する。10,000×gで10分の浄化の後、ホモジェネートの上清を100,000×gで3時間で10%スクロースクッションを通してペレット化する。オーバーナイトのインキュベーションによって再懸濁した該ペレットを、Trisバッファーにおいて等容量の30%及び60%のCsClを持つ遠心分離チューブ状で直接層状にし、それからそれを200,000×gで12時間回転させる。それから乳白光を発するバンドを、100,000×gで３時間でペレット化し、そしてTrisバッファーに再懸濁する。抽出されたRNAを放射性活性ラベル化GUSのみのプローブを用いてつりだした場合、VLP由来のRNAは4.6kbバンドに強力にハイブリダイズし、それはpFBGUSp71ウイルスから転写された抽出されたmRNAのサイズである。VLPを含むこれらのGUS RNAはまた、HaSVビリオンと高く同様の方式でH.armigera中腸細胞に結合する。これは、該粒子をH.armigera中腸のワックス横断切片を用いてインキュベートし、Bravo等,（1992）の方法に従って免疫学的に検出した場合、見られる。Baculovirus 2の代わりの構築物は、GUS ORFの後部に置かれたHaSV RNA2（図1）の全て、またはp17またはp71ORFのそれぞれの開始AUGコドンの部位に位置する開始AUGコドンを用いて、RNA2内に置かれたGUS ORFを含むであろう。
ほとんどのいかなるmRNAを含むVLPも、T7ポリメラーゼを用いてin vitroのキャップ化RNAを最初に転写し、それからYusibov（1996）によって記載された精製コートタンパク質を用いて該転写産物をアセンブルすることによってin vitroで作製し得る。
実施例３
HaSV VLPにおいてキャプシド化された外来性RNAの輸送：
テトラウイルスVLPは、それらが結合し感染する細胞に特異的に翻訳のためにキャプシド化mRNAを輸送することが可能である。この現象は、H.armigeraの新生児幼虫に対して、HaSV p71由来の実施例２にしたがって作製されたVLPを含むGUS mRNAを与えることによって観察されている。
100μg/ml（mRNA）濃度のGUS VLPを用いた10%スクロース溶液を、滴下食餌法（Hughes及びWood,1981）を用いて新生児幼虫に与え、それから室温で３時間後犠牲にした。11のGUS VLPを与えた幼虫を集め、1mM X-Glucと共にGUS抽出バッファー（Jefferson等,1986）（20mM NaHPO4,pH7.0,5mMジチオスレイトール,1mM Na2EDTA,0.1%トリトンX-100）において別々にホモジェネートした。GUSの存在を示す著しい青色が該抽出物においてオーバーナイトで形成され、一方でGUS mRNAを含まないVLPを与えられたコントロール幼虫（11）から得られた同様な抽出物は、無色のままであった。該結果は、VLPを含むGUS mRNAを与えられた新生児幼虫の中腸を切開し、それらをX-Glucアッセイバッファー（2mM X-Gluc,50mM NaHPO4,pH7.0,0.1%トリトンX-100）内に置くことによって確認された。オーバーナイトでのインキュベーション後、GUS活性を示す青色のスポットが、ストロマディールバルブ（stromadeal valve）の後部に直接生じた。コントロールはいかなる青色も示さなかった。
実施例４
HaSV及びNωV VLPのIg様ドメインの置換：
テトラウイルスコートタンパク質は、ホスト細胞親和性に関与するVLPの表面上のドメインを形成するアミノ酸配列内の区別される領域を持つ。Ｘ線結晶解析研究により、このドメインはイムノグロブリン様（Igよう）四次構造を持つことが示される（Munshi等,1996）。ホスト細胞親和性におけるIg様ドメインの重要性は、HaSV Ig様ドメインが中腸胚細胞腔における因子と高く特異的に結合することを示す以下の実験による明らかにされる。
H.armigera中腸を切開し、ワックスに埋め込み、それから標準的な方法で切片化した。それから実施例２にしたがって生産されたHaSVビリオンとGUS VLPを、30分切片と共にインキュベートし、洗浄し、それからBravo等,（1992）の方法に従ってHaSVビリオンまたはVLPの存在に対して組織化学的に試験した。得られた結果は、HaSV VLPの特異的な結合は胚細胞因子でのみ生じることを示した。他の組織または培養細胞では結合は生じなかった。加えて、Nudaurelia cyntheriaまたはGalleria melonellaのような他の鱗翅類の中腸では、HaSV VLPの結合は生じなかった。
実験はまた、該結合は飽和可能であることを示した。これは、提供者の説明書にしたがってフォト−ビオチン（bresatec）を用いてラベルし、標準的な方法に従ってアビジン試薬を用いて検出したHaSVビリオン及びGUS VLPを用いた二重ラベル実験によって観察された。中腸ワックス切片と共にインキュベートされたビオチンラベル化粒子は、非ラベル化HaSV VLPを用いた30分のプレインキュベーションの不存在下でのみ検出された。
上記記載のワックス切片結合アッセイに関与するさらなる実験において、HaSV Ig様ドメインは結合活性に関与することが示された。これは、HaSVのIg様ドメインを持つハイブリッドNudaurelia ωウイルス（NωV）VLPを生産することによって成し遂げられ、それによってNωV VLPがHaSVビリオン及びVLPのものと同様なH.armigera中腸胚細胞に対する同一の特異的結合活性を持つことが確認された。さらにハイブリッド粒子は、GUS ORFに対する転写産物3'上にNωV RNA2配列を持つGUS mRNAを輸送可能であった（Agrawa1及びJohnson,1992）。これはまた、NωVのIg様ドメインを持つHaSVハイブリッド粒子が、HaSV VLPによって示されないNudaurelia中腸に対する特異的結合を示す、相補的実験においても示された。
HaSV Ig様ドメインを持つNωVハイブリッド粒子を、pFBWCAPを生産するためにバキュロウイルス発現ベクター、pFastBac（Gibco-BRL）内にNωVコートタンパク質ORF（Agrawal及びJohnson,1995）を置き、Padgett及びSorge（1996）によって記載された継ぎ目のないクローニング法を実施することによって作製した。プライマーOmega 1(ATGACTCTTCTCTGTGTGGTGGCGATCGGAGTAAG)及びプライマーOmega 2(AGTACTCTTCAACTACCGCTGCTTCTAATCGCAG)をpFBWCAP由来でIg様ドメインの前後にコートタンパク質ORFのN末端及びC末端（残基M1-Q274及びT415-ストップ445由来）を含むベクターを有するの6.4kb PCR断片を生産するために用いた。同様に、HaSVコートタンパク質の残基Q277-T420を有する428bp断片を、プライマーStuntIgN(AGTACTCTTCGCAGTACGACGTCAGCGAGGCCGAC)及びプライマーStuntIgC(ATGACTCTTCGAGTCTCTAAGAGCGTGTTCCTAAA)からPfuポリメラーゼを用いたPCRによって生産した。両断片は、Eam 1104 Ｉを用いて切断され、プラスミドpFBWIgを形成するためにライゲートされた。それからこのプラスミドをBac-to-Bacバキュロウイルス発現系の提供者（Gibco-BRL）にしたがって組換えバキュロウイルスを生産するために用いた。結果として生じたハイブリッドVLPを、実施例２におけるHaSV VLPを調製するために用いた方法によって、組換えバキュロウイルスを用いて感染されたSf9細胞から調製した。
実施例５
HaSV VLPのIg様ドメインの修飾：
テトラウイルスIg様ドメインを、粒子形成を妨げることなく他の構造体で置換しうる。
（i）ループ構造を用いた置換
この実験の目的は、粒子形成及びRNAキャプシド化に影響することなく、テトラウイルスコートタンパク質のIg様ドメインをコートする領域を、最小のループ構造と交換し得ることを示すことである。上記ループは、VLPのホスト細胞親和性を修飾するために用い得る。
HaSV p71コートタンパク質ORFを、残基Q276-T416の間のIg様ドメインを除去し、５のSGSGS残基のリンカーを挿入することによって修飾する。これはプライマーHR2noIgL(CTGCGGTAGGCTAGTCGGGGT)及びHR2Loop(AGTGGAAGTGGCACTACTCGACCCTCCTCTCGTAGG)を用いてImai等,（1991）の方法によってなされ、後者はSGSGSリンカーをコードするアンカー配列を有する。キナーゼ処理されたプライマーを用いたPCRを、p71 0RFを含むプラスミドpFBp71で実施し、結果として生じた6.8kb断片の末端をライゲートし、大腸菌内にトランスフォームし、スクリーニングした。結果として生じたプラスミドpFBHloopを、Bac-to-Bac系（Gibco-BRL）を用いて組換えバキュロウイルスを生産するために用いた。粒子をHaSVビリオンに対するものとして精製し、それは32-34nMの直径の期待された面及び形態、並びに被修飾VLPより小さい外観を示した。修飾p71を用いた粒子はまた、粒子からのRNA抽出の後ホルムアルデヒドRNAゲル上でRNAの存在によってみられるように、RNAをキャプシド化した。
Hloop構造はまた、テトラウイルスコートタンパク質の代わりの部位でSGSGSループドメインを挿入することによって作製されうる。例えば、SGSGSループは、G281とE414の間で、上記HR2loopに対して同様の方法を用いて置換しうる。または代わりに、外来性Ig様ドメイン自体のループの一つ；例えばD353及びE358を加えうる。
ループ構造がテトラウイルスの所定のホスト細胞親和性を与えるようであるということは、ノダウイルスとテトラウイルスコートタンパク質の結晶構造の比較により明らかである（Munshi等,1996）。つまり、テトラウイルスコートタンパク質のIg様ドメインの類似領域で、ノダウイルスコートタンパク質は、可変的な配列を持つ５のペプチドのループを有する（Dasgupta及びSgro,1989）。そのため、フロックハウスウイルスの５のペプチドループ、ATTFAを用いたテトラウイルスIg様ドメインの置換（Wery等,1994）は、結果として生じたVLPにFHVと同様なDrosophila細胞に対する結合及び完全なアフィニティーを与えるであろう。テトラウイルスVLPのホスト細胞親和性を修飾するもう一つの手段は、コートタンパク質上のアセンブル場において３のペプチド配列、RGDを置くことである。これは結果として生じたVLPに、多くのヒト細胞上に位置するインテグリンファミリーのタンパク質のRGD受容体に対する結合アフィニティーを与えるであろう（Pierschbacher及びRuoslahti,1984）。これは、ノダウイルス様ループ構造を用いて、または外来性テトラウイルスIg様ドメインを置換することによってのいずれかでなされる得る。
特定の細胞表面エピトープを持つ細胞に対する結合アフィニティーを持ったループ構造は、確率的な方法を用いて容易に得られるはずである。一つの上記方法は、ファージミドディスプレー系を用いた望ましい結合アフィニティーを有する6-8残基のループを提供するpSKAN法（MoBiTec）に基づくであろう（Rottgen及びCollins,1995）。第二の方法は、可変的ループ領域を持つVLPを形成するためにテトラウイルスコートタンパク質自体の使用に基づくものであり、それからそれを望ましい結合アフィニティーに対して選択する。この第二の方法から生産される望ましい結合アフィニティーを持つVLPの回収は、VLPが望ましいループ領域をコードするmRNAをキャプシド化しているであろうという事実によって容易である。この方法を繰り返すことにより、望ましいアフィニティーを持つVLPが豊富になろう。これはpSKAN法と同様な方法によって成し遂げられるが、VLPの非複製性質を説明するために適宜修飾される。
詳細には、HaSV p71の改変されたループバージョン、pFBHLoopは、ループ領域におけるループプライマーから由来する超可変領域を置くために用いられる。それからプライマーHR2noIgL(CTGCGGTAGGCTAGTCGGGGT)を、pFBp71由来の6.8kb断片をPCRするために、HR2LoopVar(NNNNNNNNNNNNNNNACTCGACCCTCCTCTCGTAGG)と接合して用い得、それからポリヘドリンプロモーターの後部に異なるループ領域を有するp71を用いて一連のプラスミドを生産するためにそれ自体をライゲートする。それからこれらのプラスミドを、Bac-to-Bac系を用いて生産される組換えバキュロウイルスを持つコロニーのプールを生産するために用いる。それから組換えバキュロウイルスを、プールから調製し、トランスフェクトSf9細胞に対して用いる。６日後、Sf9細胞を凍結−溶解及びソニケーション（Trisバッファー,pH8.0において0.1% Triton X-100）を用いて溶解し、該粒子を4℃で１週間インキュベートすることによって成熟させる。それから該溶解物を、製造者（Dynal）にしたがってマグネチックビーズに対して結合した望ましいリガンドまたは表面エピトープタンパク質を用いてインキュベートしうる。結合粒子を十分だが穏やかに洗浄し、溶出することなくRNAを直接抽出するであろう。それから該RNAを、EcoRI及びNotI酵素を用いて切断し、同じ2の酵素の切断から由来しHaSV p71 ORFの残りの部分を有するpFBp71のより大きい断片にライゲートされうる1.7kb断片を生産するために、プライマーHR236F5(AGAAGAAACCAACGGCGT)及びHR2R2140(AGGACGTTGCCTCCGACTTC)を用いてRT-PCRを実施するために用い得る。それから結果として生じたプラスミドを、組換えバキュロウイルス生産／トランスフェクション／粒子結合／RT-PCR／プラスミド調製、の繰り返される第二の周を開始するために用いる。
組換えバキュロウイルス生産／トランスフェクション／粒子結合／RT-PCR／プラスミド調製、の少なくとも３周が、望ましい表面エピトープに対するアフィニティーを有するループを持つ粒子に到達するために必要とされるであろう。
（ii）小タンパク質を用いた置換
この実験の目的は、30kDaより小さい分子量を有する小タンパク質を、VLPが作製された場合に、小タンパク質が該粒子の外側に展示されるようにテトラウイルスコートタンパク質のIg様ドメイン内に挿入しうることを示すことである。これは、ホスト細胞親和性を修飾するために、またはタンパク質に対するワクチンを生産するためにのいずれかで用いられ得る。例えば、27kDaの緑色蛍光タンパク質（GFP）（Prasher等,1992）が、NωV VLPの外側に展示されうることが示されている。これは、NωVコートタンパク質内にHaSV Ig様ドメインを挿入するために、実施例４に記載されたものと同様な方法によって成し遂げられた。該方法は、Eam １１０４位を用いて切断した場合、pFBWCAP由来のω1及びω2を用いて生産されたEam 1104I切断6.4kb PCR断片に対して相補的な末端を有する750bp断片を生産するために、gfp10 cDNA（Prasher等,1992）でPCRを実施するために、プライマーWGFPN(AGTACTCTTCGCAGAGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTT)及びWGFPC(ATGACTCTTCGAGTACTGCCACTTCCACTTTTGTATAGTTCATCCATGCC)を利用した。pFBWGFP内に共にライゲートされた場合、一次構造：（NωV M1-Q280）-（GFP）-（リンカーペプチドSGSGS）-（NωV415-ストップ445）を有するハイブリッドNωVコートタンパク質が形成された。このプラスミドを、Bac-to-Bac系にしたがって組換えバキュロウイルスを生産するために用いた。
ハイブリッドタンパク質を、pFBWCAPと同様な方式で発現させ、蛍光細胞は、UV光で照射された場合明らかであった。粒子は精製された場合に不安定であることが明らかであるが、透過型電子顕微鏡（TEM）で調べられた場合、該粒子が細胞内部に存在するのは明らかであった。しかしながら、粒子が、3:1の割合のpFBWループウイルス及びpFBWGFPウイルスから調製されたタンパク質の組み合わせを用いて形成された場合、精製可能な安定なVLPが形成された。ウイルスpFBWループは、ループ構造を有し、同じ方法によって作成され、NωV Ig様ドメインの代わりに残基、SGSGSを挿入しているHloopの類似性NωV VLPバージョンである。該粒子はより大きい直径、45nmを有し、形態は精製粒子の外側上でより大きい突起部を示した。該粒子はRNAをキャプシド化することが示された。
ハイブリッドテトラウイルス/GFP粒子の成功した証明により、30kDaより小さいタンパク質が、テトラウイルス粒子の外側上に展示されうることが示された。もし上記タンパク質が、細胞表面タンパク質に対する結合アフィニティーを所有するのであれば、そこでVLPの親和性は決定されるであろう。
イムノグロブリンドメインまたはレクチンは、テトラウイルスコートタンパク質のIg様ドメインとして特異的である領域内に挿入されうる様なタンパク質の優れた例である。しかしながら、特定の修飾が、テトラウイルスコートタンパク質ORFに対するその挿入の前に該タンパク質に対して必要である。これは、該タンパク質の四次構造に隣接するN末端及びC末端に対する必要性のためであり、この構造がテトラウイルスIg様ドメインの四次構造で明らかであるからである。Ig様ドメインを、テトラウイルスコートタンパク質の構造に対して有害であろう伸張した構造のおそらく存在しない他のタンパク質をもって交換させるのが、この構造である。N及びC末端を隣接させるように修飾するためのタンパク質の例は、イムノグロブリンスーパーファミリーのV及びC型ドメイン、及び抗体由来のIg様ドメインであり、ここでN末端はほぼ該タンパク質の長さによってC末端から分離される（Bork等,1994,Williams及びBarclay,1988）。テトラウイルスコートタンパク質内への挿入に対する候補のタンパク質の三次元構造の調査が、もし修飾が必要であるならば示すであろう。テトラウイルスコートタンパク質内への挿入に対するIg様ドメインを用いたタンパク質を修飾する方法の例は、以下に提供される。
（iii）外来性Ig様ドメインを用いた置換
イムノグロブリンスーパーファミリーのタンパク質メンバーの使用は、これらのタンパク質は細胞表面認識（Williams及びBarclay,1988）、及び抗体とその関連する抗原の間のもののような結合事象（Rees等,1994）に関与することが周知であるため、テトラウイルスVLPに対する親和性を決定するために特に望ましい。これは、テトラウイルスVLPの外側表面上での上記タンパク質の存在が、VLPに、該タンパク質によって通常結合される同じ細胞に対する結合を引き起こすであろうことを予測させる。
しかしながら、ほとんどの上記Ig様タンパク質は、該タンパク質の三次元構造の反対の末端でN及びC末端を持ち、それ故Ig様タンパク質の修飾は以前のセクションで議論されたようにテトラウイルスコートタンパク質内への挿入の前に必要とされる。修飾は、テトラウイルスIg様ドメインの流域内の挿入される候補のIg様ドメインのN末端にテトラウイルスIg様ドメインの開始の前に最後のテトラウイルスコートタンパク質残基を連結する、15-20残基のペプチドリンカーを加えることによって成し遂げられる。上記方法において、Ig様ドメインの非基部の末端で通常存在するであろうN末端を、テトラウイルスキャプシドの表面に連結する。それから候補のIg様ドメインのC末端を、より短い3-5残基のペプチドリンカーによってテトラウイルスIg様ドメインを末端に有する残基に連結する。リンカーの長さは、VLPの表面上でIg様ドメインの最適な構造のために経験的に決定される必要がある。ペプチドリンカーの構成は、Bird等,（1988）に記載されているように必要とされる長さに対してSer-Gly残基を改変しているであろう。
代わりのリンカー構成は、（Gly 4Ser）4のようなある場合でより最適である（Somia等,1995）。例えば、NωVコートタンパク質を用いる一つの上記ハイブリッドテトラウイルスコートタンパク質の構築は、（NωV M1-Q280）-（リンカーペプチド[SerGly]8）-（N末端-V型Igドメイン-C末端）-（リンカーペプチドSerGlySer）-（NωV T415-ストップ445）である。
V型Igを、低密度リポタンパク質受容体を有するヒト細胞に対するVLPの親和性を修飾するためにテトラウイルスコートタンパク質内に置く方法の例は、Somia等,（1995）の研究に基づく。C7ハイブリドーマのガンマIg領域を含む400bpの断片を、プライマーGlySer(GGCGGTGGCGGATCGGGCGGT)及びGammaCGCCTTTAATTAATGAGGAGAC)を用いてSomia等,（1995）のpBS（Gly 4Ser）4由来のPCRを用いて生産し、プライマーHR2noIgL(CTGCGGTAGGCTAGTCGGGGT)及びHR2LoopIg(AGTGGCACTACTCGACCCTCCTCTCGTAGG)を用いてpFBp71由来の6.8kb PCR断片に対してブラントしクローン化した。後者はSGSリンカーをコードするアンカー配列を有する。結果として生じたプラスミドは、Bac-to-Bac系を用いて組換えバキュロウイルスを生産するために用いた場合、一次構造（HaSV p71 M1-Q276）-（Gly 4Ser）4-（ガンマV型Igドメイン）-（SerGlySer）-（HaSV p71 T421-N446）を有するタンパク質を生産する。RNAをキャプシド化しQT6細胞に結合可能な安定なVLPが、このタンパク質を発現した場合に生産されるはずである（Somia等,1995）。望ましい細胞型に対する結合特異性を有する適したIg様ドメインはまた、ファージディスプレー法を用いて確率的に由来し得る（Clackson等,1991）。
実施例６
脊椎動物免疫系に対して低反応性を有するHaSV VLPの生産：
テトラウイルスコートタンパク質から生産されるVLPは、脊椎動物免疫系に対する低反応性を有するように作製されうる。
ヒト免疫系は、核酸を含む粒子に基づく治療に対してより大きな障害の一つである。これは、粒子が細胞に侵入する前の免疫応答が該粒子を中和する以前に、いくつかの場合でのみその使用を制限する。しかしながら、ハイブリッドテトラウイルスVLPは、免疫系に対して「非顕視的」であることによってこの現象に遭遇する手段を有する。以下に記載される実験は、ウサギ及びマウス免疫系に対するVLPの免疫原性の>98%が、テトラウイルスIg様ドメインに残存していること、及びVLPの連続的な表面（即ち、テトラウイルスコートタンパク質のループ型構築物によって作製される表面）が、場合により、表面上のIg様形態の存在においてほとんど免疫原性を示さないことを示す。これは、ヒトソース由来のIg様ドメインの置換が、上記タンパク質の存在に対する条件下のヒト免疫系を誘導しないであろうことを示唆する（即ち、ヒトIg様ドメインを有する異なるヒト抗体を用いる血液輸血と同様に）。
粒子の免疫原性に関与するテトラウイルスコートタンパク質の領域を決定するために、以下の実験を実施した。プラスミドpT7T2p69を、プラスミドpT7T2p71からHanzlik等,（1995）に記載された方法で構築した。しかしながら、pT7T2p71の場合には細菌内でHaSV P71を発現する代わりに、プラスミドpT7T2p69は、付加的なCが挿入された核酸C589no後にフレームシフトミューテーションのために、HaSV p71の一部（Hanzlik等,1995）とp71コートタンパク質の融合物を発現した。それ故、生産された融合タンパク質は、p17のM1-P96及びp71のN70-N646を取り込んだ。p71のIg様ドメインをコードする領域を、pFBp71及びプライマーHR2noIgRとHR2noIgL（配列については上記参照）によりImai等,（1991）の方法を用いて欠失した。これにより、Bac-to-Bac系を用いたプラスミドから生産される組換えバキュロウイルスによって発現される結果として生じるタンパク質からQ280-T415が除去された。2の異なる膜でウエスタンブロットをし、抗p17または抗p71抗血清（Hanzlik等,1995）を用いて別々にプローブし、そしてフィルム上にルミネッセンスを誘導するアルカリホスファターゼを用いて検出した場合、抗p71を用いてプローブされた検出タンパク質由来のシグナルは、非検出タンパク質のものより２％より少なく小さかった。膜状の異なる量の抗原を説明する抗p17シグナルの標準化は、欠失により影響を受けないp17由来のシグナルを用いて成し遂げられた。免疫原性の>98%を説明するIg様ドメインの現象は、2の異なるウサギ、及び3の異なるマウスポリクローナル抗血清に対して確かであった。この観察は、NωV及びHaSVに対する抗血清は、<35%同一を有するIg様ドメイン以外のコートタンパク質の領域で>80%同一を除いて交差反応しないことに気がついたHanzlik等,（1995）のものによって支持される。
多くの変異型及び／または修飾が、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特異的な実施態様に示される本発明に対してなされることは、当業者に明らかであろう。それ故、本実施態様は、全て説明のために記載され、制限するためのものではないと考えられる。
参考文献
Agrawal,D.K.and Johnson,J.E.(1992).Virology 190,89-97
Agrawal,D.K.and Johnson,J.E.(1995).Virology 207,89-97.
Bird,R.E.and Walker,B.W.(1988)TibTech 9,132-137.
Bork,P.,Holm,L.,and Sander,C.(1994)J.Mol.Biol.242,309-320
Bravo,A.,Hendrick,K.Jansens,S.and Peferaen,M.(1992).J.of Invert.Pathol.60,247-253.
Clackson,T.,Hoogenboom,H.R.,Griffiths,A.D.and Winter,G.(1991)Nature 352,624-628
Dasgupta,R.and Sgro,J-Y.(1989)Nuc.Acids Res.17,7525-7526.
Hanzlik and Gordon,(1997)Advances in Virus Research(in press)
Hanzlik,T.N.,Dorrian,S.J.,Gordon,K.H.J.and Christian,P.D.(1993).J.Gen.Virol.74,1105-1110.
Hanzlik,T.N.,Dorrian,S.J.,Johnson,K.N.,Brooks,E.M.and Gordon,K.H.J.(1995).J.Gen.Virol.76,799-811.
Hughes,P.R.and Wood,H.A.(1981)J.Invert.Pathol.37,154-159.
Hussey,R.E.,Richardson,N.E.,Kowalski,M.,Brown,N.R.,Chang,H.-C.,Siliciano,R.F.,Dorfman,T.,Walker,B.,Sodroski,J.& Reinherz,E.L.(1988).Nature 331,78-81.
Imai,Y.,Matsushima,Y.Sugimura,T.,and Terada,M.(1991)Nuc.Acids Res.19,2785.
Jefferson,R.A.,Burgess,S.M.and Hirsh,D.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86,8447-8451.
Lentz(1990)J.Gen.Virol.71,751-766.
Munshi,S.,Liljas,L.,Cavarelli,J.,Bomu,W.,McKinney,B.,Reddy,V.and Johnson,J.E.(1996).J.Mol.Biol.261,1-10.
Padgett,K.A.and Sorge,J.A.(1996)Gene 168,31-35.
Prasher,D.C.,Eckenrode,V.K.Ward,W.W.,Prendergast,F.G.and Cormier,M.J.(1992)Gene 141,229-233
Pierschbacher,M.D.and Ruoslahti,E.(1984)Nature 309,30-33.
Rees,A.R,.Staunton,D.,Webster,D.M.,Searle,S.J.,Henry,A.H.,Pedersen,J.T.(1994)TibTech 12,199-206.
Rottgen,P.,and Collins,J.(1995)Gene 164,243-250.
Sakihama,T.,Smolyar,A.& Reinherz,E.L.(1995a).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6444-6448.
Sakihama,T.,Smolyar,A.& Reinherz,E.L.(1995b).Immunology Today 16,581-587.
Somia,N.V.,Zoppe,M.,Verma,I.M.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,7570-7574
Weber,S.& Karjalainen,K.(1993).Int.Immunol.5,695-698.
Williams,A.F.and Barclay,A.N.(1988)Ann.Rev.Immunol.6,381-405
Yusibov,V.Kumar,A.North,A.Johnson,J.E.and Loesch-Fries,S.(1996)J.Gen Virol.77,567-573.
【図１】
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【図２】
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