(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVポリペプチドのコア領域に含まれるC−1、CI及びCIIの３個のポリペプチド領域、NS3領域に含まれるNS3−1及びNS3−2の２個のアミノ酸領域、並びにNS4領域に含まれるNS4−I1、NS4−I2、NS4−II1及びNS4−II2の４個のアミノ酸領域を含み、これらの領域が、Ｎ−末端からＣ−末端に向けてNS3−1、NS3−2、NS4−Ｉ1、CＩ、NS4−Ｉ2、NS4−II1、CII、NS4−II2及びC-1の順で、エピトープ活性を有しないリンカーペプチドにより連結されていてもよい単一ポリペプチドから成るキメラ抗原ペプチドであって、
C−1が、HCVポリペプチドのアミノ酸配列１−40、
CIが、Ｉ型HCVポリペプチドのアミノ酸配列66−80、
CIIが、II型HCVポリペプチドのアミノ酸配列66−80、
NS3−1がHCVポリペプチドのアミノ酸配列1238−1311、
NS3−2がHCVポリペプチドのアミノ酸配列1366−1460、
NS4−I1がＩ型HCVポリペプチドのアミノ酸配列1712−1750、
NS4−I2がI型HCVポリペプチドのアミノ酸配列1678−1705、
NS4−II1がII型HCVポリペプチドのアミノ酸配列1716−1750
NS4−II2がII型HCVポリペプチドのアミノ酸配列1690−1713
であるキメラ抗原ペプチド。
【請求項２】
遺伝子型グループ１に属するHCVポリペプチドの第1238位〜第1311位または第1238位〜第1313位のペプチド領域（NS3−1）、第1363位〜第1460位のペプチド領域（NS3−2）、第1712位〜第1751位のペプチド領域（NS4−Ｉ1）、第66位〜第80位のペプチド領域（CＩ）および第1686位〜第1704位のペプチド領域（NS4−Ｉ2）；
遺伝子型グループ２に属するHCVポリペプチドの第1716位〜第1751位のペプチド領域（NS4−II1）、第66位〜第80位のペプチド領域（CII）及び第1690位〜第1714位のペプチド領域（NS4−II2）；並びに
遺伝子型グループ１または２に属するHCVポリペプチドの第１位〜第43位または第１位〜第42位のペプチド領域（C−1）；
を含み、これらの領域が、Ｎ−末端からＣ−末端に向けてNS3−1、NS3−2、NS4−Ｉ1、CＩ、NS4−Ｉ2、NS4−II1、CII、NS4−II2及びC-1の順で、エピトープ活性を有しないリンカーペプチドにより連結されていてもよい単一ポリペプチドから成るHCVキメラ抗原ペプチド。
【請求項３】
配列番号：１に示すアミノ酸配列中、18位のアミノ酸Thr以後のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＨＣＶキメラ抗原ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ抗原ペプチドをコードするDNA。
【請求項５】
請求項４に記載のDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換させる宿主を培養し、該培養物からキメラ抗原ペプチドを採取することを特徴とする、キメラ抗原ペプチドの製造方法。
【請求項６】
HCV感染の検出方法であって、被検体を請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ抗原ペプチドと接触せしめ、抗原−抗体反応が生じたか否かを判定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、広範囲のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の感染を検出することができる抗原ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎でありウィルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非Ｂ型肝炎は、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっていた。
１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウィルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と命名された（1989年、Choo Q.-L.等、Science 、 244巻、p359-362）。ほぼ同時期に本出願人を含む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単離され、その構造上の特徴が明らかとなった。
【０００３】
推定されるＨＣＶ遺伝子は約９３００〜９５００塩基からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、約３，０００アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードしている。予想されるアミノ酸配列はフラビウィルスあるいはペスチウィルスと相同性を持ち、これらのウィルスに近縁のウィルスであろうと考えられている。これらのウィルス構造との比較から、ＨＣＶゲノムによってコードされるポリペプチドは、１本のポリペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ１）、ＮＳ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋白質であるＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４，ＮＳ５に切断され、それぞれの機能を果たすと考えられている（1991年、Houghton, M.等、Hepatology、14巻、p381-391）。
【０００４】
ＨＣＶの感染を調べるためには、ＨＣＶゲノムによってコードされているこれらのポリペプチドによって、患者体内に誘発された抗体を検出する方法が一般に用いられている。特にコア及びＮＳ３，ＮＳ４に対する抗体は、ＨＣＶ患者の多数に検出されることから（1991年、Houghton, M.等、Hepatology、14巻、p381-391）、これらのポリペプチドの一部を遺伝子工学的な手法を用いて生産したものを抗原とした抗原抗体反応を検出する試薬が作られ、ＨＣＶの感染の有無の判別に役立って来た。
しかしながら、広範囲のＣ型肝炎の感染をエピトープペプチドのみを組合わせた単一のポリペプチドで、高感度に検出できる抗原は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、広範囲のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の感染を高感度に検出することができる抗原ペプチド、その製造方法、及びこの抗原ペプチドを用いたＨＣＶ感染の検出方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するため、本発明は、ＨＣＶポリペプチドのコア領域、ＮＳ３領域及びＮＳ４領域のそれぞれからの２以上のペプチド領域を連結したポリペプチドから成るＨＣＶ抗体に対するキメラ抗原ペプチドを提供する。
従って本発明は、ＨＣＶポリペプチドのコア領域の少なくとも２個のエピトープ性ペプチド領域、ＮＳ３領域の２個のエピトープ性ペプチド領域及びＮＳ４領域の少なくとも２個のエピトープ性ペプチド領域を含んで成るＨＣＶキメラ抗原ペプチドを提供する。なお、本発明のＨＣＶキメラ抗原ペプチドは、ＨＣＶに感染したヒトが産生する抗体と特異的に結合するものである。
【０００７】
さらに具体的には、本発明は、ＨＣＶポリペプチドのコア領域に含まれる３個のポリペプチド領域（Ｃ−１，ＣＩ及びＣII）、ＮＳ３領域に含まれる２個のアミノ酸領域（ＮＳ３−１及びＮＳ３−２）並びにＮＳ４領域に含まれる４個のアミノ酸領域（ＮＳ４−Ｉ１，ＮＳ４−Ｉ２，ＮＳ４−II１及びＮＳ４−II２）を含んで成る（但し、ＣＩ，ＮＳ４−Ｉ１及びＮＳ４−Ｉ２はＩ型ＨＣＶに由来し、そしてＣII，ＮＳ４−II１及びＮＳ４−II２はII型ＨＣＶに由来する）、キメラ抗原ペプチドを提供する。本発明はさらに、このアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するキメラ抗原ペプチドを提供する。
【０００８】
本発明は、好ましくは、Ｃ−１がＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１−４３（配列番号：３６）から成り、ＣＩがＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列６６−８０（配列番号３７）から成り、ＣIIがII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列６６−８０（配列番号：３８）から成り、ＮＳ３−１がＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１２３８−１３１３（配列番号：３９）から成り、ＮＳ３−２がＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１３６３−１４６０（配列番号：４０）から成り、ＮＳ４−Ｉ１がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１７１２−１７５０（配列番号：４１）から成り、ＮＳ４−Ｉ２がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６７８−１７０５（配列番号：４２）から成り、ＮＳ４−II１がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１７１６−１７５０（配列番号：４３）から成り、そしてＮＳ４−II２がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６９０−１７１３（配列番号：４４）から成るキメラ抗原ペプチドを提供する。本発明はまた、このアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するキメラ抗原ペプチドを提供する。
【０００９】
本発明はさらに具体的には、遺伝子型グループ１に属するＨＶＣポリペプチドの第１２３８位〜第１３１１位または第１２３８位〜第１３１３位のペプチド領域、第１３６３位〜第１４６０位のペプチド領域、第１７１２位〜１７５１位のペプチド領域、第６６位〜第８０位のペプチド領域および第１６８６位〜第１７０４位のペプチド領域；遺伝子型グループ２に属するＨＣＶポリペプチドの第１７１６位〜第１７５１位のペプチド領域、第６６位〜第８０位のペプチド領域及び第１６９０位〜第１７１４位のペプチド領域；並びに遺伝子型グループ１または２に属するＨＣＶポリペプチドの第１位〜第４３位または第１位〜第４２位のペプチド領域を含んで成り、これらがエピトープ活性を有しないリンカーペプチドにより連結されていてもよい単一ポリペプチド、あるいは上記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する単一ポリペプチドから成るＨＣＶキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた、上記キメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクターを提供する。
本発明はまた、上記発現ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらに、上記宿主を培養し、培養物からキメラ抗原ペプチドを採取することを特徴とするキメラ抗原ペプチドの製造方法を提供する。
本発明はまた、ＨＣＶ感染の検出方法であって、被検体を上記キメラ抗原ペプチドと接触せしめ、抗原−抗体反応が生じたか否かを判定することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
本発明によって例示される手法に従えば、抗原抗体反応を利用した方法に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、抗原抗体間の特異反応の反応性向上を達成することが出来、抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するためのペプチド抗原の機能向上を達成出来る。
また本発明によって例示されるポリペプチドを用いることにより、ＨＣＶ感染患者血清中のＨＣＶに対する抗体を検出することが可能であり、ＨＣＶ感染の正しい判別に有用である。
本発明によれば、従来法では複数の抗原を生産しなければ達成できなかった性能が１抗原で達成できる。その結果として従来法よりも、例えば生産回数の軽減、生産方法の簡便化、品質管理など生産に関わる諸検査数の軽減と簡便化などの生産面での効率化を図ることが可能となった。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ＨＣＶの感染診断は、ＨＣＶそのものが発見される前に、ＨＣＶが増殖するために必要な情報をコードする遺伝子断片の一部が単離されたため、それを遺伝子組換え技術により酵母を宿主として発現させたものを用いた診断方法が用いられることとなった。このいわゆる第一世代試薬と呼ばれるＣ１００−３抗原を用いた試薬（1989年、Kuo, G. 等、Science, 244, p362-364）により、ＨＣＶ感染患者の約７割が検出できるようになったことが報告されている。
【００１３】
しかし、その後の検討により、Ｃ１００−３抗体は疑陽性が高く、現在ではＣ１００−３抗原を除くことにより感染の判別がより確かなものになることが報告されるに至った（1994年、Zaaijer, H.L. 等、Vox Sang., 66, p150 ）。
一般に特異／非特異反応比を向上させる方法として、特異反応を生じさせるエピトープの数を多くし、相対的に特異／非特異反応比を上昇させる方法がとられている。この方法はＨＣＶ診断薬開発においても用いられており、例えばいわゆる第一世代試薬から第二世代試薬に移行した際には、Ｃ１００−３にコア領域、ＮＳ３領域の組換え抗原を加えることにより、Ｃ１００−３のみでは検出できなかった患者中の抗体を検出できるようになった。
【００１４】
またその際にＣ１００−３の感度が減少し、結果的に非特異的な反応が減少した（1992年、飯野四郎と日野邦彦、代謝、29, p503-511；1993年、林紀夫等、日本臨床、51巻、p329-333）。この際にはＣ１００−３の疑陽性反応を生じさせる非特異反応が軽減したのではなく、特異反応を生じさせる領域（コア領域、ＮＳ３領域）を加えることにより、相対的にＣ１００−３の反応性が低下し、結果として特異／非特異反応比が上昇し、判別結果をより信頼できるものとなった。しかしながらこのようにして改良が加えられた検出試薬を用いても数多くの問題点が報告されている。
【００１５】
例えばもっとも新しい第３世代と呼ばれる試薬を用いてもＨＣＶが感染している患者の一部について陽性判定をしない（1994年、B.C.Dow 等、Vox Sang., 67 巻、p236-237）、第３世代試薬の判定保留サンプルにもＰＣＲによってＨＣＶの感染が裏づけられるものが多く見いだされる（1994年、L.Dussaix 等、J.Clin.Microbiol., 32 巻、p2071-2075）などの報告があり更なる改良が望まれている。
本発明はこれらの一般的な手法とは異なる手法により特異／非特異反応比を上昇させ、判別結果の信頼性を向上させるものである。
【００１６】
つまり、本発明は、ある抗原が患者血清と反応した場合に、特異的な、診断に重要な抗体結合配列（エピトープ）により反応しているのか、非特異反応により結合しているのかを調べ、診断に重要な特異的反応を生じさせる配列のみを選択し、一方解析より明らかになった非特異反応を呼ぶ配列を除いた人工的な遺伝子配列からなる抗原を構築することにより本発明は成立する。
【００１７】
本発明を達成するにあたり、ＨＣＶポリペプチドのうち抗ＨＣＶ抗体を検出するに必要十分な配列を検討した。検討するためにコア領域（Ｃ１１抗原：1992年、M.Saito 等、Clin.Chem., 38巻、p2434-2439）、ＮＳ３領域（Ｃ７抗原：1992年、M.Saito 等、Clin.Chem., 38巻、p2434-2439）及びＮＳ４抗原（Ｃ１４−１，Ｃ１４−２：1994年、T.Tanaka等、Hepatol., 19巻、p1347-1353）を用いた。ＮＳ５領域については、「ＮＳ５領域と反応する患者血清は少なく、ＮＳ５抗原とのみ反応する血清はほとんどなく、またこれらはＨＣＶの存在を示すＰＣＲでは陰性であることから疑陽性と考えられる」との報告が多数あり（1994年、Lancet、 343巻、p853-854；1994年、S.Uyttendaele 等、Vox Sang., 66 巻、p122-129）検討に値しないものと判断した。
【００１８】
本発明を達成するために、必要十分である領域から、さらに必要な配列、非特異反応を引き起こす不必要な配列を最初に分類した。ポリペプチドからなる抗原に存在するエピトープは、比較的短い連続したアミノ酸で構成されるものと、一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組むことによって生じるものがある（免疫学辞典：東京化学同人、１９９３年）。
【００１９】
エピトープを決定する代表的な方法として、Geysen等の開発したＰＥＰＳＣＡＮ法（1987年、Geysen等、J.Immunol.Meth., 102巻、p259-274）があるが、この方法では、比較的短鎖のペプチドを固相上にて合成させたものと抗体とを反応させることから、比較的短い（６〜８アミノ酸長）連続したアミノ酸で構成されるエピトープを決定するのに適している。しかし同方法では、一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組んだエピトープは検出されにくい。そこでエピトープ解析は化学的に合成した、または遺伝子工学的に合成した比較的長鎖、アミノ酸長として２０〜６０のポリペプチドを用いて行う方が望ましい。
【００２０】
コア領域のエピトープ解析
ＨＣＶポリペプチドの１から１６０番目のアミノ酸に対して、１から２０、１１から３０、２１から４０のように１０アミノ酸からなり、それぞれが２０アミノ酸長のペプチドを化学合成した。これらと患者血清との反応性を検討したところ、患者血清と強く反応したペプチドは１から４０に属するものがほとんどであり、これらは強い抗原性を示すエピトープであることが分かった。
一方既に本出願人等によって明らかにされているように、ＨＣＶポリペプチドのコア領域にグループ１，２のＨＣＶ感染により反応性の異なる領域が存在する（特願平６−２３２０７３）。その領域とは６１から８０にあたる領域である。この領域についてグループＩとIIを比較した例を下に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
上記の領域に於てグループ間でアミノ酸配列は保存されているのに対し、グループ間でアミノ酸配列が異なっていることは明白である。この領域の配列が抗原性を持ち、グループ判別の抗原として用いることが可能か否かは、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチドを作成し、それらが患者血清と反応するか否かを調べることにより明らかとなる。
【００２３】
実施例１に検討した結果を記載した。血清との反応性はＮＳ４領域を用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数は少ないことから、グループ判別のための主要なエピトープを提供しているとは考えられない。しかしながらＨＣＶグループ特異的に反応していることは、ＰＣＲ及びＮＳ４領域を用いた判別方法により明らかとなった。さらに詳細に検討すると、ＮＳ４領域には反応せず、この領域にのみグループ特異的に反応する患者血清が、グループＩの血清に於て少数ながら存在することが明らかになった。
【００２４】
実施例１で示したものと同様の結果は、町田等によって〔Machida et al., Hepatology, (1992) 16 : 886-891 〕、６５から８１の領域の配列を持つペプチドを用いて示されている。
故にコア領域からはＨＣＶ診断に必要なエピトープ配列は１から４０番目の配列と、グループ１  ＨＣＶの６５から８０、グループ２  ＨＣＶの６５から８０番目の配列であることが判明した。
【００２５】
ＮＳ３領域のエピトープ解析
ＮＳ３領域の一部、ＨＣＶポリペプチドの１２２１から１４７３までからなるポリペプチドに結合する抗体は、多くの患者血清中に認められ、強い抗原性が認められる（特願平２−３３９５８９）。この領域のうち特異的反応に重要な領域を限定するため、ＨＣＶポリペプチドの１２２１から１２８１（Ｃ７−１）、１２６５から１３３０（Ｃ７−２）、１３０８から１３７１（Ｃ７−３）、１３４０から１４０９（Ｃ７−４）、１３８８から１４４３（Ｃ７−５）、１４０９から１４７３（Ｃ７−６）の配列を持つペプチドを遺伝子工学的に作成し、患者血清中の抗体との反応性を検討した。
【００２６】
その結果Ｃ７−２，Ｃ７−５及びＣ７−６が患者血清の比較的多くと反応した。しかしながら、全体（１２２１から１４７３）と反応する血清のうち、Ｃ７−１からＣ７−６までの何れかに反応する血清の割合は約６０％しかなく、用いた組換え抗原が比較的長鎖にも関わらず、反応性が消失してしまうエピトープ、つまり一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組んだ強い構造エピトープが存在していることを示す。一方Ｃ７−３は患者血清ともよく反応したが、健常人血清の多くとも反応し、この領域には非特異反応を生じせしめる配列が存在することが分かった。
【００２７】
次にこのような高次構造依存的なエピトープを生じさせる領域が何れに存在するのかを調べた。ＨＣＶポリペプチドの１３４０から１４７３からなる比較的長鎖のポリペプチド、Ｃ７−４６、を作成し患者血清との反応性を検討した。この比較的長鎖のペプチドは患者血清の多くと反応し、その反応する血清は、Ｃ７−４，Ｃ７−５，Ｃ７−６の何れかに反応する血清と、これらには反応しないが、長鎖のＣ７−４６には反応する血清から成り立っていた。
【００２８】
このことから、Ｃ７−４６という長鎖にすることにより、高次構造依存的なエピトープが構成され、反応性が向上したことが示された。Ｃ７−４６の反応性はさらに短くしたＣ７−Ｎａｔｉｖｅでも保持されていた。
これらの結果から、ＮＳ３領域のエピトープ領域としては、Ｃ７−２を含む１２３８から１３１１番目の配列と、Ｃ７−４６の一部、つまり１３６６から１４６０番目の配列が抗ＨＣＶ抗体検出に必要十分であることが判明した。
【００２９】
ＮＳ４領域ペプチドのエピトープ解析
ＮＳ４領域の一部をコードするＣ１４−１−２抗原、Ｃ１４−２−２抗原は、それぞれＨＣＶのグループ１、グループ２に感染した患者の血清中の抗体と反応する（特願平５−１９４１８５）。従来ＨＣＶ感染判別に用いているＮＳ４領域からなるＣ１００−３抗原、およびＣ１００−３抗原の一部からなる５−１−１抗原はＣ１４−１−２抗原と似た反応性を呈する。すなわち従来用いられているＣ１００−３抗原、およびＣ１００−３抗原の一部からなる５−１−１抗原はグループ１に感染した患者の血清とはよく反応するものの、グループ２に感染した患者血清との反応性が低い。
【００３０】
そのため、ＮＳ４領域を用いてＨＣＶ感染の有無を検出するためにはグループ１，２の何れのＨＣＶに感染していても反応する抗原でなければならない。そこで本発明者等はＣ１４−１−２，Ｃ１４−２−２抗原のエピトープを組み合わせることにより、既に用いられている抗原の機能を増強させることに成功し、この組み合わせた抗原ポリペプチドを最適なＨＣＶ抗体検出のための抗原の一部として用いることにした。
【００３１】
これらのポリペプチドに存在するエピトープは、ペプチドを用いた阻害実験により決定した。実施例２に具体的な方法を記載したが、Ｃ１４−１−２抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１−Ｗ，１−Ｘ，１−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに１−Ｗで阻害が認められたものについては、１−Ｗの配列を分断化した配列を持つ１−Ｗａを加えると反応の阻害が認められた。
一方Ｃ１４−２−２抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド２−Ｗ，２−Ｘ，２−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害が認められたものについては、２−Ｗの配列を分断化した配列を持つ２−Ｗａを加えると反応の阻害が認められた。
【００３２】
これらの結果からグループ１  ＨＣＶ感染患者血清中に有る抗体のエピトープは、グループ１  ＨＣＶのポリペプチド配列の１７１２から１７５０番目と１６７８から１７０５番目の配列にあり、グループ２  ＨＣＶ感染患者血清中に有る抗体のエピトープはグループ２  ＨＣＶのポリペプチド配列の１７１６から１７５０番目と１６９０から１７１３番目にあることが判明した。
【００３３】
エピトープキメラ抗原の設計
本発明によって可能となったエピトープキメラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結合させることでは不十分である。単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エピトープの結合によって生じる配列が、新たなエピトープとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。
またペプチドが短鎖の場合には、ＮＳ３領域のエピトープ解析で示したように、エピトープとして機能しないことがある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることにより、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働きをする可能性がある。
【００３４】
本発明は、このような問題点を解決する方法をも示すものである。
エピトープキメラ抗原は以下の手順に従うことにより効率的に設計することが出来る。始めにエピトープペプチドの性質を調べることが重要である。即ちエピトープはそれに結合する抗体の結合部位（パラトープ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立するためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取ることが必要である。
【００３５】
すなわちエピトープとして機能する配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するためには、パラトープに結合出来る立体構造を取ることが必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長さが変わる、ペプチドにアミノ酸が付加されることにより変化することから、エピトープキメラ抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープキメラ抗原を設計する際にはエピトープキメラ抗原にエピトープペプチドを導入することにより抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との反応性を向上させるための工夫をする必要がある。そのため組み合わせるエピトープペプチドの本来の構造についての情報が必要である。
【００３６】
エピトープペプチドの構造を知るためには、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により構造が分析出来ているものであれば、それを用いれば良いが、一般にはこのような例は少ないことから、アミノ酸配列からその２次構造予測を行う方法、例えばChouとFasman等によって開発された計算式〔Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13：211-222 ; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13：222-245 ; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1978) Ann.Rev.Biochem. 47：251-276 〕やRobson等によって開発された計算式〔Robson B. & Suzuki E. (1976) J.Mol.Biol. 107：327-356 ; Garnier, J., Osguthorpe D.J. & Robson B. (1978) J.Mol.Biol. 120 : 97-120〕などを利用し解析を行う。
【００３７】
さらにHoppとWoods 〔Hopp T.P. & Woods K.R. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78：3824-3828 〕やKyteとDoolittle 〔Kyte J. & Doolittle R.F. (1982) J.Mol.Biol. 157 : 105-132 〕等によって開発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを行いエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf〔Jameson B.A. & Wolf H. (1988) Comput.Applic. in Biosciences 4 : 181-186 〕によって提唱されている計算式に従い、目的とするペプチドの抗原性に関しての予測した性質も知っておくことは好ましいことである。
【００３８】
さらにJanin 等やEmini 等によって提唱されている表面部位の予測法〔Jamin J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J.Mol.Biol. 125 : 357-386 ; Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., & Boger J. (1965) J.Biol. 55 : 836-839〕、Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測法〔Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 72 : 212-213 〕で得られる情報も抗原性を予想する際に役立つ。
【００３９】
エピトープキメラ抗原の設計においては、上記の予測方法を参考に、組み合わせるエピトープペプチドの導入により抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との反応性を向上させるように、さらに組み合わせることにより健常者血清と反応しないようなリンカーペプチドを結合するように注意を払う必要がある。
本発明のエピトープキメラ抗原を完成させるためには、上記のような予測法に基づき遺伝子設計を行なうのみでは不十分であり、さらにそれを発現させ、抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との反応性を確認し、さらに多数の健常者血清を用い、非特異的な反応を生じていないことを確認することが必要である。
【００４０】
上記の設計方針に基づき設計を行ない、大腸菌を用いて発現精製した異なる並びの抗原の機能を、上記の機能確認方法により確かめることにより、配列番号１に示したアミノ酸配列中、第１８位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸配列からなるエピトープキメラ抗原を完成するに至った。
この抗原においてエピトープ断片は（１２３８−１３１３；グループ１）−（１３６３−１４６０；グループ１）−（１７１２−１７５０；グループ１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１７０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グループ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ２）−（１−４３）の並びで結合されている。この配列が好ましい抗原配列の様態の一つであるが、上記の設計方針と機能確認方法に従えば他の並びも可能である。
【００４１】
例えば、（１２３８−１３１３；グループ１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−（１７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８０；グループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ１様）−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片からなる抗原は、好ましい配列の様態の一つとして例示される。ここで、「グループ１様」とは、対応する領域のグループ１のアミノ酸配列に対して相同性の高いアミノ酸配列を意味する。
【００４２】
上記の方針に基づいて設計されたキメラ抗原ペプチドの全アミノ酸配列の例を配列番号：４７に示す。この配列中、３位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸配列がキメラ抗原ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号：４７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドはいずれも、本願発明の抗原性を有することが確認されており、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と配列番号：４７に示すアミノ酸配列とは約８０％の相同性を有する。従って、天然配列に基づく、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つＨＣＶに感染したヒトが産生する抗体と特異的に結合する抗原ペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
エピトープキメラ抗原の作成
前述の方法で設計したエピトープキメラ抗原は、種々の原理に基づく化学合成法により作成することが可能であるが、遺伝子工学的な手法を用いて作成することも可能である。
遺伝子工学的な手法とは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中、少なくとも１８位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：４７に示すアミノ酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列あるいはその部分配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶゲノムＲＮＡやそれのｃＤＮＡから業界で一般的に用いられている方法により単離する過程、もしくは化学的に合成する過程、及びこれらの技術を組み合わせて得る工程を含む。
【００４４】
また上記ペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む複製可能な発現ベクターを構築する過程、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得る過程、さらに前記形質転換体を培養し発現産物を発現させる工程、及び発現したペプチドを回収する工程を含む。
例えば配列番号１に示すアミノ酸配列中第１８位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：４７に示すアミノ酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ断片は実施例４又は７に示すように作成することが可能である。さらに実施例５又は７に示す様に形質転換体を取得し、実施例５及び８に示すようにして形質転換体を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能である。
【００４５】
遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発現ベクターとしては、実施例に開示されている大腸菌を宿主とし、大腸菌トリプトファンオペロンの制御下に発現させるベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌トリプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、λプロモーター等を利用したベクターを用いることが可能である。
【００４６】
また大腸菌以外にも酵母を宿主とし、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ，II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主としバキュロウィルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞例えばＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ細胞Ｈｅｌａ細胞等を宿主とし、慣用に用いられる組み込み型発現ベクターやワクチニアウィルスをベクターとした発現系、アデノウィルスや慣用に用いられるウィルスをベクターとした発現系を利用しても発現可能である。
【００４７】
さらに遺伝子工学的手法を用いる場合には、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質として発現させることも慣用に用いられる手段である。
かのごとく作成したキメラ抗原は実施例６及び９に示すようにＨＣＶ患者血清中の抗ＨＣＶ抗体を検出することが可能である。
【００４８】
【実施例】
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものでは無いことは、上述のごとく明らかである。
実施例１．コア領域のエピトープの解析
配列番号２及び３の配列を持つペプチドをアプライドバイオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３０Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により確認した。
【００４９】
このペプチドを２．５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり１００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり１００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置し抗原をプレートに固定した。
【００５０】
各ウェルに検体希釈液〔０．５％カゼイン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕によって１１倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清１００μｌを加え４５分静置した。ウェルを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、４５分静置した。ウェルを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表２にまとめて示す。
【００５１】
【表２】
0003891629.tif 000003
【００５２】
この結果、配列番号：２及び３に示すアミノ酸配列がそれぞれＩ型ＨＣＶポリペプチド及びII型ＨＣＶポリペプチドに対応していることが確認された。
実施例２．ＮＳ３領域のエピトープ解析
ＮＳ３領域の部分配列を持つ断片を得るため、表３に示す配列を持つ１２種類のプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成機（ABI 社、Ｍｏｄｅｌ  ３９４ＡまたはMilligen／Biosearch 社、Ｍｏｄｅｌ  ８７００）を用いて合成した。
【００５３】
【表３】
0003891629.tif 000004
【００５４】
ＮＳ３領域を含むDNA p3N2（特開平５−８４，０８５）１ngを鋳型とし、１Ｆと１Ｒ、２Ｆと２Ｒ、３Ｆと３Ｒ、４Ｆと４Ｒ、５Ｆと５Ｒ、または６Ｆと６Ｒの組み合わせでプライマーをそれぞれ１００pmol用いＰＣＲ（polymerase chain reaction ）を行ない、１Ｆと１ＲではＨＣＶポリペプチド１２２１から１２８１に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−１断片）、２Ｆと２Ｒでは１２６５から１３３０に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−２断片）、３Ｆと３Ｒでは１３０８から１３７１に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−３断片）、４Ｆと４Ｒでは１３４０から１４０９に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−４断片）、５Ｆと５Ｒでは１３８８から１４４３に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−５断片）、または６Ｆと６Ｒでは１４０９から１４７３に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−６断片）、さらに４Ｆと６Ｒにより１３４０から１４７３に相当する断片Ｃ７−４６を得た。
【００５５】
増幅されたＤＮＡ断片は２％アガロース電気泳動により分離し、Mermaid Kit （Bio101社）を用いアガロース断片から回収した。回収した断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）を用いてクローニングし、Dye terminator cyclesequencing kit (ABI)を用いDNA sequencer (ABI：Model 373A）により分析することにより塩基配列を決定し、目的の断片がクローニング出来ていることを確認した。
【００５６】
断片がクローニングされたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで切断し、２％アガロース電気泳動により分離し、Mermaid Kit （Bio101社）を用いＣ７−１からＣ７−６断片をそれぞれ回収した。回収した断片をtrc promoterによりＴｒｐＥとの融合蛋白質として発現させるためのベクターｐｔｒｃＴｒｐＥにクローニングすることによりｐＣ７−１，ｐＣ７−２，ｐＣ７−３，ｐＣ７−４，ｐＣ７−５，ｐＣ７−６を得た。またＣ７−４６については、Mermaid Kit （Bio101社）を用い回収した断片をｐＡＴ−ＴｒｐＥにクローニングすることによりｐＣ７−４６を得た。これらのプラスミドによる大腸菌ＴＯＰ−１０株（Invitrogen社）の形質転換体を用い、組換え抗原を発現させた。
【００５７】
組換え抗原の発現は、Ｃ７−１からＣ７−６に関しては、形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で振蕩培養し、ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside ）を終濃度０．４mMとなるよう加えた後さらに３７℃で４時間振蕩培養することにより行なった。
抗原は、誘導発現させた菌体を集め、１ｇ菌体あたり５mlの細胞溶解液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ml lysozyme 〕に懸濁し、３７℃に保温することにより細胞壁を溶解した後、超音波処理により破砕することによって得られる不溶性分画から精製した。各抗原はＣ７−６を除き４Ｍまたは６Ｍの尿素を加えた緩衝液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕により抽出させることが出来、Ｃ７−６については４Ｍ塩酸グアニジンを加えた緩衝液により抽出した。
【００５８】
Ｃ７−１は抽出液から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、Ｃ７−２の場合には陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及び逆相カラムクロマトグラフィーにより、Ｃ７−３は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることにより、Ｃ７−４は逆相カラムクロマトグラフィーにより、Ｃ７−５とＣ７−６は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより抽出液から精製した。
【００５９】
Ｃ７Ｎは以下のように構築した。オリゴヌクレオチドプライマーはフォスファアミダイト法によりCyclone Plus DNA合成機(MILLIPORE社) を用いメーカーの合成用プロトコールに従い合成した。合成したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。
Ｃ７Ｓ２：５′−GGAATTCGAGGAGGTGGCCCTGTCTAACACT −３′（配列番号：４５）、
Ｃ７ＡＳ２：５′−GGGATCCTTACTGGGTGACGCATGTGTTACAGTC−３′（配列番号：４６）。
【００６０】
上記のプライマーを用いＣ７Ｎの発現用のフラグメントをＰＣＲによって得、ベクターへクローニング後、配列を確認した。
まずプラスミドＣ１１−７（特開平５−８４，０８５）１μｌ（１ng）、１０×反応緩衝液＃１  １０μｌ、20mM  ｄＮＴＰ’ｓ  １０μｌ、プライマーＣ７Ｓ２及びＣ７ＡＳ２をそれぞれ１μｌ（各２０pmol）、並びにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（STRATAGENE社：２．５Ｕ）を加え、９５℃５分、５０℃５分及び７２℃３分反応させた。その後、９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分のサイクルで３０回反応させ、最後に７２℃で５分間加温した。
このＰＣＲ反応液を３％ NuSieve３：１アガロース(FMC Bioproducts社）で電気泳動したところ、約３５０bpのＰＣＲ産物が得られた。
【００６１】
ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、 Gene Clean IIキット(Bio 101社）を用いて精製し、１０μｌのＴＥ溶液（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM  ＥＤＴＡ）に回収した。回収したＤＮＡ  ５μｌにｐＧＥＭ−Ｔベクター(Promega社）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ(Promega社：１ Weissユニット／μｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で３時間反応させた。
【００６２】
この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１blueを井上らの方法 (Inoue et al, Gene, 96 (1990) 23-28) に従って形質転換させＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色のコロニーをアンピシリン５０mg／mlを添加したＬＢ培地３mlで一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｃＩで切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドＤＮＡを選択した。
【００６３】
得られたプラスミドＤＮＡはWizerdTM Minipreps DNA Purification System(Promega社) を用い、メーカーのプロトコールに従い精製した。精製したＤＮＡを PRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminator cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社) を用いＴ７プライマー（Applied Biosystems社) でメーカーの推奨する方法に従って反応させた。この反応産物を３７０ＤＮＡシーケンサー (Applied Biosystems社) で解析し、塩基配列を決定した。正しい配列のクローンをｐＧＥＭ−Ｃ７Ｎと命名した。
【００６４】
次にｐＧＥＭ−Ｃ７ＮのＤＮＡフラグメントをＴｒｐＥプロモーターを持つ発現用ベクターｐＡＴ−Ｔｒｐに組み込んだ。
ｐＧＥＭ−Ｃ７Ｎ  １μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、３％ NuSieve３：１アガロース(FMC Bioproducts社) で電気泳動し、約３５０bpのＤＮＡフラグメントが得られた。このＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、 Gene Clean IIキットを用いて精製し、１０μｌのＴＥ溶液に回収した。このＤＮＡフラグメント５μｌに制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで切断したＴｒｐプロモーターを持つ発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ（特開平５−８４，０８５）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１ Weissユニット／μｌ）及び滅菌蒸留水２μｌを加え、１６℃で３時間反応させた。
【００６５】
この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１blueを井上らの方法に従って形質転換させた。このコロニーをアンピシリン５０μｇ／mlを添加したＬＢ培地３mlで一晩培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドを選択した。
目的のプラスミドを含んだ大腸菌を１００μｇ／mlのアンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地で一晩培養し、大腸菌を回収し、菌体蛋白質を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色し、目的とする１４Ｋの分子量の蛋白質を確認した。
【００６６】
発現が確認された大腸菌を 100μｇ／mlのアンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地３Ｌで一晩培養し、大腸菌を遠心分離で回収した。大腸菌１ｇにつき５mlの溶解緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．０／３０mM  ＮａＣｌ／５mM  ＥＤＴＡ）に懸濁し、リゾチーム１mgを加えて３７℃で１時間震盪した。これを１５０Ｗ、９０秒の条件で２回ソニケーションし細胞を破砕した。これを１５Ｋ、３０分間４℃で遠心分離して得られた沈殿に緩衝液Ａ（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．０）を加えて懸濁後、１５００rpm 、５ストロークの条件でホモジェナイズした。
【００６７】
これを１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離して得られた沈殿を緩衝液Ａで洗浄、再び遠心分離を行った。得られた沈殿に２Ｍ尿素を含んだ緩衝液Ａを加えて懸濁し、１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離して上清と沈殿を得た。沈殿に対して同様の操作を４Ｍ，６Ｍ尿素についても行った。尿素抽出後、それぞれの操作で得られた抽出物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行うことによって目的の蛋白がどの画分に来たかを確かめた。目的の蛋白質は夾雑物とともに４Ｍ尿素抽出液中に存在した。
【００６８】
４Ｍ尿素抽出液をＱ sepharose（１６／１０）にかけ、０．４ml／分の流速で１５分間、０−０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
Ｏ．Ｄ．２８０nmの吸収ピークを示した溶出画分をゲル濾過カラムHiload Superdex ７５pg（２６／６０×２）にかけ、緩衝液Ｂ（５０mM酢酸ナトリウムpH５．５／４Ｍ尿素／０．２Ｍ  ＮａＣｌ／５mM  ＤＴＴ）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離確認したところほぼ単一の蛋白質として分離できた。目的蛋白質の存在する画分を５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．０／０．４Ｍ尿素に透析し、ＤＴＴを除いた。
【００６９】
精製した抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を検定した。
精製した抗原を２．５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置した。
【００７０】
このように抗原をプレートに固定した。検体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。
【００７１】
陽性陰性の判定は、第２世代ＨＣＶ検出試薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国際試薬株式会社）を用いて判定が陰性になった血清からなる群（５６例）の分布からそれぞれの抗原を用いた場合の陽性判定値を求めて判断した。
陽性陰性の判定を行った血清は、第２世代ＨＣＶ検出試薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国際試薬株式会社）を用いて判定が陽性になった血清からなる群（４２例）を用いた。これらの血清はいずれもＣ７抗原に対する反応性は陽性を示す。各種抗原の陽性率（カット中）は、Ｃ７−１（９．５％）、Ｃ７−２（２８．６％）、Ｃ７−３（０％）、Ｃ７−４（０％）、Ｃ７−５（３１．０％）、Ｃ７−６（１１．９％）、Ｃ７−４６（１００％）、Ｃ７−Native（１００％）であった。
【００７２】
実施例３．Ｃ１４−１−２抗原のエピトープ解析
精製したＣ１４−１−２ペプチドを２．５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置した。このように抗原をプレートに固定した。
【００７３】
検体２０μｌと化学合成したペプチド（０．１mg／ml）２０μｌを等量混和し、室温１時間静置した。これに検体希釈液を２００μｌ加えた後にペプチドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
0003891629.tif 000005
【００７５】
表４に示した検体は全てＨＣＶグループＩに属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（特願平５−１９４１８５号）との反応性より明らかであり、グループＩの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らかである。これらの結果からＣ１４−１−２抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペプチドにエピトープが存在していることが明らかになった。
【００７６】
実施例４．エピトープキメラ抗原ペプチドをコードする遺伝子の作成
表５に示すＤＮＡをＤＮＡ合成機（ABI : Model 394AまたはMillipore : Model 8700）を用いて合成した。
【００７７】
【表５】
0003891629.tif 000006
【００７８】
ＥＰ１及びＥＰ２Ｒはグループ１のＨＣＶ  ｃＤＮＡから１７１２−１７５０番目のペプチドをコードする配列を取り出すためのプライマーである。ＥＰ５とＥＰ６はグループ１のＨＣＶ  ｃＤＮＡからペプチド１６７８−１７０５番目のペプチドをコードする配列を取り出すためのプライマーである。またＣ７ＥＰ１ＦとＣ７ＥＰ１Ｒは１２３８−１３１３番目のペプチドをコードする配列を、Ｃ７ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒは１３６３−１４６０番目のペプチドをコードする配列を、ｃｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲは１−４３番目のペプチドをコードする配列を取り出すためのプライマーである。
【００７９】
またＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰＩＲはグループ２  ＨＣＶの１７１６−１７５０番目のペプチドをコードする配列を、ＣＯＲＥＧＲ２ＳとＣＯＲＥＧＲ２ＡＳはグループ２  ＨＣＶの６６−８０番目をコードする断片を、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒはグループ２  ＨＣＶの１６９０−１７１３番目のペプチドをコードする配列を作り出すためのプライマーである。
【００８０】
これらのプライマーを用いてＰＣＲにより配列を取り出した。以下順次各断片の構築を記載する。１ngのＨＣＶ  ｃＤＮＡ（Ｃ６−７９）（特開平６−２２５，７７０）、１００pmolプライマー（ＥＰ１とＥＰ２ＲまたはＥＰ５とＥＰ６）を加え、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチン、０．２mM  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Taq DNA Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整しミネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、２分の条件で２５サイクル反応を行わせた。
【００８１】
またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチン、０．２mM  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Taq DNA Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整しミネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行わせた。反応液の一部をアガロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組合せでは約１４０bpの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組合せでは約１５０bpの、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せでは約５０bpの断片、ＥＰ５とＥＰ６の組合せでは約１００bpの断片を分離した。
【００８２】
分離したＤＮＡ断片をアガロース切片からMermaid kit （Bio101社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を２５ngのｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターと共に２０μｌの反応液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１０mM  ＭｇＣｌ2 、１mM  ＡＴＰ、１０mM  ＤＴＴ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ〕中で１６℃１時間反応させた。反応液の一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社）をHanahan の方法〔DNA cloning : A practical approach (ed. D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC press, (1885)〕に従って形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。
【００８３】
ＥＰ１とＥＰ２Ｒとを用いて生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行うことにより約１４０bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せで生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行うことにより約６０bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。
【００８４】
回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴ７Ｔ３１９Ｕ（ファルマシア社）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＳＵＲＥ（Stratagene社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。
【００８５】
得られたプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行うことにより１００bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した断片と、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。
【００８６】
このようにしてＧｒ１ＥＰＶ５遺伝子断片を持つプラスミドを構築した。このプラスミド１０ngを用い各々３０pmolのＧｒ１ＥＰＶ５ＦとＧｒ１ＥＰＶ５Ｒプライマーを用いＰＣＲを行い、（１７１２−１７５０；グループ１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１７０５；グループ１）番目のアミノ酸をコードする配列を増幅させ、QIAquick PCR purification kit （QIAGEN社）を用い増幅断片を回収した。回収した断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニングした。このようにしてＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切り出すことの出来る約２５０bpの断片を持つｐＧＲ１ＥＰＮを得た。
【００８７】
ＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒまたは、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１ngのＳ１４株ＨＣＶ  ｃＤＮＡ（本出願人等による特願平４−２０７３９１）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒでは約１２０bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒでは約８０bpの断片を増幅させ得た。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチン、０．２mM  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Taq DNA Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整しミネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行わせることにより約５０bpの断片を得た。
【００８８】
これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニングした。ＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒから得た断片を持つプラスミドをＸｈｏＩとＣｌａＩで、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒから得た断片を持つプラスミドをＳａｃＩとＣｌａＩで切断しアガロース電気泳動により小断片を分離した。Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した小断片と、ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することによりＸｈｏＩ，ＳａｃＩで切り出される約１９０bpの断片を持つプラスミドを得た。
【００８９】
このプラスミドをＣｌａＩにより切断し、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒから得られた断片を持つプラスミドをＡｃｃＩとＣｌａＩによって切断することにより得られる断片を結合させることにより（１７１６−１７５０；グループ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ２）をコードする断片を持つプラスミド、ｐＧＲ２ＥＰＮを得た。
【００９０】
Ｃ７ＥＰ１ＦとＣ７ＥＰ１Ｒ、またはＣ７ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１ngのＨＣＶ  ｃＤＮＡ（Ｃ１１−７）（特願平２−１８０８８９）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒでは約２２０bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒでは約３００bpの断片を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニングした。Ｃ７ＥＰ１ＦとＣ７ＥＰ１Ｒによって得られた断片をＥｃｏＲＩとＢｓｐＥ１で、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒにより得られた断片をＢｓｐＥ１とＨｉｎｄIII で切断しアガロース電気泳動により小断片を分離した。
【００９１】
Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した小断片と、ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断したｐＵＣ１１９をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することによりＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切り出される、（１２３８−１３１３）−（１３６３−１４６０）をコードする約５００bpの断片を持つプラスミドｐＣ７ＥＰＮを得た。
ｃｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲを用いＰＣＲにより１ngのＨＣＶ  ｃＤＮＡ（Ｃ１１−２１）（特願平２−４１３８４４）から約１２０bpの断片を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニングすることにより、１−４３をコードするＳａｃＩ，ＢａｍＨＩで切り出される約１２０bpの断片を持つプラスミド、ｐＣＯＲＥを得た。
【００９２】
上記遺伝子断片を組み合わせ結合させ、ｐＡＴ−ＴｒｐベクターのＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩサイトに挿入することにより（１２３８−１３１３）−（１３６３−１４６０）−（１７１２−１７５０；グループ１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１７０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グループ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ２）−（１−４３）の並びからなるキメラ抗原遺伝子を発現させるベクターｐＣ５０Ｎを得た。なお、このプラスミドを含有する大腸菌ｐＣ５０Ｎ／ＸＬ１−blueは工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３８０として平成７年１２月２７日に寄託された。
【００９３】
実施例５．エピトープキメラ抗原の発現と精製
ｐＣ５０Ｎで形質転換された大腸菌を１００μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（１０mg／ml Lysozyme ）を加え、３７℃において１時間処理した。この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ、９０秒で２回）にかけることにより細胞を破壊した。
【００９４】
１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlのＮＰ４０を１％含むＡ溶液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）〕に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの２Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し可溶性分画を回収した。
６Ｍ尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法によりエピトープキメラ抗原を精製した。
【００９５】
実施例６．エピトープキメラ抗原と患者血清との反応
エピトープキメラ抗原を精製した抗原を３μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置した。
【００９６】
このように抗原をプレートに固定した。検体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。
【００９７】
複数抗原を用いている第２世代ＨＣＶ抗体検出試薬としてはイムチェックＨＣＶコクサイ（国際試薬株式会社）とＲＩＢＡ−２（オルソ社）を用い、判定はそれぞれの試薬に添付されている基準に従った。結果をまとめて示す。
血清番号１０のように第２世代試薬間で判定が一致しない疑陽性サンプルは、本発明のＣ５０Ｎ抗原では陰性に、また第２世代確定診断試薬で判定保留であった１４番の血清は、Ｃ５０Ｎ抗原では陽性に判定された。
このように本発明のＣ５０Ｎ抗原は複数抗原を組み合わせたＨＣＶ抗体検出試薬の性能を１本の抗原で発揮していることは明らかである。結果を表６及び表７に示す。
【００９８】
実施例７．人工配列を持つ抗原遺伝子の構築と発現
下記の配列を持つＤＮＡ断片をＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム394A）を用い、メーカーの推奨する方法に従い合成した。合成したＤＮＡ断片はＯＰＣカラム（アプライドバイオシステム）を用いメーカーの推奨する方法に従い精製した。
【００９９】
ＥＰ−１０：AGCCGTGACC CAGAATTCAC CAAAGTGCCG GTTGCTTATG CGGCCAAAGG TTATAAGGTC CTGGTTCTGG ACCCGAGC （配列番号：４８）
ＥＰ−１１：ACCATGGGCC TTGCTCAGAT ACGCGCCGAA ACCCAGGGTG CTGGCAACGC TCGGGTCCAG AACCAG（配列番号：４９）
ＥＰ−１２：GCCCATGGTG TGAACCCGAA CATCCGCACG GGCATCCGTA CCGTTACCAC CGGTGCTCCG GTGACCTAT （配列番号：５０）
ＥＰ−１３：ATCGTACGCA CCGCCGGCGC AACCGCCGTC CGCCAGGTAT TTACCGTAGG TGGAATAGGT CACCGGAGCA CC （配列番号：５１）
ＥＰ−１４：GGTGCGTACG ATGTGATCTA TGGCCGCGCG  ATCCCGATCG AAGCGATCAA AGGCGGTCGC CATCTGGTT（配列番号：５２）
ＥＰ−１５：CAATCCGGAC AGCGCGCTCG CCAGTTCATC GCATTTCTCC TTGCTATGGC AGAAAACCAG ATGGCGACCG CC （配列番号：５３）
【０１００】
ＥＰ−１６：CTGTCCGGAT TGGGTCTGAA CGCTGTGGCA TTCTATCGCG GTCTGGACGT GAGCATTATC CCGACCCAGG GC （配列番号：５４）
ＥＰ−１７：CGCGAAGCTT ACCAGACCGG TCATCAGCGC ATCGGTGCTA ACGATAACCA CATCGCCCTG GGTCGGGATA AT （配列番号：５５）
ＥＰ−１８：GTAAGCTTCG CGAGCCATGT GCCGTACATC GAGCAGGGTA TGCAACTGAG CGAACAATTT AAGCAGAAG （配列番号：５６）
ＥＰ−１９：CGGGGCGGCC GCCTCCGCCT GTTTGGTCGC GGTCTGCAGC AGACCCAGGC TCTTCTGCTT AAATTGTTCG CT （配列番号：５７）
ＥＰ−２０：GAGGCGGCCG CCCCGGTGGT TGGCACCCCG AAAAGCCGCC GTCCG （配列番号：５８）
ＥＰ−２１：GATGGTACCC GGTTGCGCCC AGGCACGACC TTCCGGACGG CGGCTTTTC （配列番号：５９）
ＣＥＰ（１３）：CAGGGTACCA TCATCCTGAG CGGTCGTCCG GCGGTTGTAC CGGAT （配列番号：６０）
【０１０１】
ＣＥＰ（１４）：CTCGAGAAAT TCTTGATACA GCACTTCACG ATCCGGTACA ACCGC （配列番号：６１）
ＥＰ１０１：GAGCTCGCCA TGGGCACCAA CCCGAAACCG GAGCGTAAAA GCAAGCGTAA CACCAACCGT AAACCGCAGG ATATTAAA （配列番号：６２）
ＥＰ１０２：GCGGATCCTT ACGGACCACG ACGCGGCACC AGGTACACAC CACCCACCAC CTGACCACTA CCCGGGAATT TAATATCCT GCGGTTTACG （配列番号：６３）
４２−１：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGCCGC GCGATCCCGA T（配列番号：６４）
４２−２：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGCCGC GCGATCCCGA T（配列番号：６５）
４２−３：GTTACAGTCG ACCACTGAGT CAAAATCGCC GGTAAAACCG GTCATCAGCG CATCGG （配列番号：６６）
４２−４：CGAAGCTTAC CAGTCCAGAT CCCTGGGTGA TGCATGTGTT ACAGTCGACC ACTGAGT（配列番号：６７）
【０１０２】
Ｃ７領域エピトープ遺伝子断片は、ＥＰ−１０とＥＰ−１１，ＥＰ−１２とＥＰ−１３，ＥＰ−１４とＥＰ−１５，ＥＰ−１６とＥＰ−１７の組み合わせで、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することにより各断片をクローニングした。
【０１０３】
Automated DNA sequencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確認した後、ＥＰ−１０とＥＰ−１１の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩで切断することにより得られる断片、ＥＰ−１２とＥＰ−１３の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＮｃｏＩ−ＢｓｉｗＩで切断することにより得られる断片、ＥＰ−１４とＥＰ−１５の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＢｓｉｗＩ−ＢｓｐＥＩで切断することにより得られる断片、ＥＰ−１６とＥＰ−１７の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＢｓｐＥＩ−ＨｉｎｄIII で切断することにより得られる断片を調製し、これらを組み合わせてＮＳ３領域エピトープをコードするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片を構築した。
【０１０４】
ＨＣＶグループ１のＮＳ４領域エピトープとＨＣＶグループ１コア領域エピトープをコードする断片はＥＰ−１８とＥＰ−１９，ＥＰ−２０とＥＰ−２１を組み合わせ、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することにより各断片をクローニングした。
【０１０５】
Automated DNA sequencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確認した後、ＥＰ−１８とＥＰ−１９の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＨｉｎｄIII −ＮｏｔＩで切断することにより得られる断片、ＥＰ−２０とＥＰ−２１の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドからはＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片を調製し、これらを結合することによりＨｉｎｄIII −ＫｐｎＩ断片を調製した。一方ＣＥＰ（１３）とＣＥＰ（１４）の精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。
【０１０６】
３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することにより各断片をクローニングした。Automated DNA sequencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確認した後、ＣＥＰ（１３）とＣＥＰ（１４）の組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラスミドから得たＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片と、上記のＨｉｎｄIII −ＫｐｎＩ断片を結合させ、グループ１エピトープキメラペプチドをコードするＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片を得た。
【０１０７】
グループ２エピトープキメラペプチドをコードする断片はｐＣ５０ＮをＸｈｏＩ−ＳａｃＩで切断することによって得られる断片を用いた。
これらのコアエピトープペプチドをコードする断片は、精製したＥＰ１０１，ＥＰ１０２断片それぞれを１μｇ含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回収した。
【０１０８】
回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することにより各断片をクローニングした。Automated DNA sequencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確認することによりコアエピトープペプチドをコードする断片ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
上記の各エピトープ断片を順次連結結合させていくことにより、エピトープキメラペプチドＣＥＰ−ＡをコードするＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩを得た。この断片をｐＡＴ−ＴｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによりＣＥＰ−Ａ抗原発現ベクター、ｐＣＥＰ−Ａを構築した。
【０１０９】
ＣＥＰ−Ａ抗原の発現プラスミドのＮＳ３領域の変更を以下のように行った。
ｐＣＥＰ−Ａ  １ng（１０μｌ）に１０ｘＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，２mM  ｄＮＴＰ  ５μｌ、プライマー４２−２及び４２−３，１００pmol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKaRa LA Taq （宝酒造、５単位／μｌ）０．５μｌを加え、滅菌蒸留水で５０μｌにした。ミネラルオイル（シグマ社）を１滴重層し、攪拌後軽く遠心した。これをパーキンエルマーシータス社のDNA Thermal cycler PJ2000 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリング５０℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を３０サイクル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持し、４℃に冷却した。
【０１１０】
得られたＰＣＲ反応液２．５μｌに１０ｘＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，２mM  ｄＮＴＰ  ５μｌ、プライマー４２−１及び４２−４，１００pmol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKaRa LA Taq （宝酒造、５単位／μｌ）０．５μｌを加え、滅菌蒸留水で５０μｌにする。これをパーキンエルマー社のDNA Thermal cycler PJ2000 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリング５０℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を３０サイクル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持し、４℃に冷却した。このＰＣＲ反応液を3% NuSieve agarose (FMC Bioproducts 社) で電気泳動したところ、約３５０bpのＰＣＲ産物が得られた。
【０１１１】
この約３５０bpのＰＣＲ産物をアガロースから切り出し、ＴＥ（１０mM  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ (pH７．５），１mM  ＥＤＴＡ）を２００μｌ加え、６８℃に加温する。ＴＥ飽和フェノールでフェノール抽出を２回、ＴＥ飽和クロロフォルムでクロロフォルム抽出を１回行い、水層を分離する。エタノール沈殿を行い、７５％エタノールで１回リンスし、乾燥させ、ＴＥ１０μｌに溶解した。回収したＤＮＡ  ５μｌにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega 社）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ，Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌ（Promega 社：1 Weiss units ／μｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で１時間反応させた。
【０１１２】
この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１  ｂｕｌｅを井上らの方法〔Inoue et al, Gene, 96 (1990) 23-28〕に従って形質転換させＸ−ｇａｌ，ＩＰＴＧを含むＬＢ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色のコロニーをアンピシリン１００μｇ／mlを添加したＬＢ培地３mlで一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置（KURABO：PI-100）でプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｌＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドＤＮＡを選択した。
【０１１３】
得られたプラスミドＤＡＮはWizerdTM Minipreps DNA Purification System（Promega 社）を用い、メーカーのプロトコールに従い精製した。精製したＤＮＡをPRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminator cycle Sequencing Kit (Applied Biosysytems社）を用いＴ７プライマー及びＳＰ６プライマー（Applied Biosysytems 社）でメーカーの推奨する方法に従って反応させた。この反応産物を370 DNA sequencer (Applied Biosysytems社）で解析し、核酸配列を決定した。正しい配列のクローンをｐＧＥＭ−Ｃ７Ｍと命名した。
【０１１４】
ｐＧＥＭ−Ｃ７ＭをＳｐ１ＩとＨｉｎｄIII によって切断し、アガロース電気泳動により３４０bpの断片を分離した。分離した断片はMermaid DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、ＴＥバッファー中に回収した。一方ｐＣＥＰ−ＡをＳｐ１ＩとＨｉｎｄIII によって切断し、アガロース電気泳動により約４kbp の断片を分離した。分離した断片はGene Clean II キット（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、ＴＥバッファー中に回収した。上記の回収した両断片をＴ４  ＤＮＡ  リガーゼにより連結結合させ、反応液を用い大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、目的の断片が挿入されているクローンを選択した。
【０１１５】
この結果、（１２３８−１３１３；グループ１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−（１７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８０；グループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ１様）−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片からなる抗原、ＣＥＰＭを発現する発現ベクターｐＣＥＰＭによって形質転換された大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ／ＨＢ１０１株を得た。
【０１１６】
実施例８．エピトープキメラ抗原の発現と精製
大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ／ＨＢ１０１株を１００μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５），３０mMＮａＣｌ，５mM  ＥＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（10mg／ml  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を加え、37℃において１時間処理した。この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ, ９０秒で２回）にかけることにより細胞を破壊した。１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。
【０１１７】
不溶性分画を５０mlのＮＰ４０を１％含むＡ溶液〔５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）〕に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。
懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの２Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し可溶性分画を回収した。
６Ｍ尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法により本発明のエピトープキメラ抗原を精製した。
【０１１８】
実施例９．エピトープキメラ抗原と患者血清との反応
上記のようにして得た本発明のエピトープキメラ抗原ＣＥＰＭを５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２．５mM  ＥＤＴＡ，０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置した。このように抗原をプレートに固定した。検体２０μｌに検体希釈液２００μｌ加えた後に抗原を固定したプレートに加えた。
【０１１９】
３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。
結果を表６及び表７に示す。
【０１２０】
【表６】
0003891629.tif 000007
【０１２１】
【表７】
0003891629.tif 000008
【０１２２】
【配列表】
0003891629.tif 000009
0003891629.tif 000010
0003891629.tif 000011
0003891629.tif 000012
【０１２３】
0003891629.tif 000013
【０１２４】
0003891629.tif 000014
【０１２５】
0003891629.tif 000015
【０１２６】
0003891629.tif 000016
【０１２７】
0003891629.tif 000017
【０１２８】
0003891629.tif 000018
【０１２９】
0003891629.tif 000019
【０１３０】
0003891629.tif 000020
【０１３１】
0003891629.tif 000021
【０１３２】
0003891629.tif 000022
【０１３３】
0003891629.tif 000023
【０１３４】
0003891629.tif 000024
【０１３５】
0003891629.tif 000025
【０１３６】
0003891629.tif 000026
【０１３７】
0003891629.tif 000027
【０１３８】
0003891629.tif 000028
【０１３９】
0003891629.tif 000029
【０１４０】
0003891629.tif 000030
【０１４１】
0003891629.tif 000031
【０１４２】
0003891629.tif 000032
【０１４３】
0003891629.tif 000033
【０１４４】
0003891629.tif 000034
【０１４５】
0003891629.tif 000035
【０１４６】
0003891629.tif 000036
【０１４７】
0003891629.tif 000037
【０１４８】
0003891629.tif 000038
【０１４９】
0003891629.tif 000039
【０１５０】
0003891629.tif 000040
【０１５１】
0003891629.tif 000041
【０１５２】
0003891629.tif 000042
【０１５３】
0003891629.tif 000043
【０１５４】
0003891629.tif 000044
【０１５５】
0003891629.tif 000045
【０１５６】
0003891629.tif 000046
【０１５７】
0003891629.tif 000047
【０１５８】
0003891629.tif 000048
【０１５９】
0003891629.tif 000049
【０１６０】
0003891629.tif 000050
【０１６１】
0003891629.tif 000051
【０１６２】
0003891629.tif 000052
【０１６３】
0003891629.tif 000053
【０１６４】
0003891629.tif 000054
【０１６５】
0003891629.tif 000055
【０１６６】
0003891629.tif 000056
【０１６７】
0003891629.tif 000057
【０１６８】
配列番号：４７
配列の長さ：１１９７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Synthetic DNA
配列
GAA TTC ACC AAA GTG CCG GTT GCT TAT GCG GCC AAA GGT TAT AAG GTC     48
Glu Phe Thr Lys Val Pro Val Ala Tyr Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val
5                   10                  15
CTG GTT CTG GAC CCG AGC GTT GCC AGC ACC CTG GGT TTC GGC GCG TAT     96
Leu Val Leu Asp Pro Ser Val Ala Ser Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr
20                  25                  30
CTG AGC AAG GCC CAT GGT GTG AAC CCG AAC ATC CGC ACG GGC ATC CGT    144
Leu Ser Lys Ala His Gly Val Asn Pro Asn Ile Arg Thr Gly Ile Arg
35                  40                  45
ACC GTT ACC ACC GGT GCT CCG GTG ACC TAT TCC ACC TAC GGT AAA TAC    192
Thr Val Thr Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Tyr
50                  55                  60
CTG GCG GAC GGC GGT TGC GCC GGC GGT GCG TAC GAT GTG ATC GGA TCT    240
Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Tyr Asp Val Ile Gly Ser
65                  70                  75                  80
GGA GAG GAG GTG GCC CTG TCT AAC ACT GGA GAG GTC CCC TTC TAT GGC    288
Gly Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Val Pro Phe Tyr Gly
85                  90                  95
CGC GCG ATC CCG ATC GAA GCG ATC AAA GGC GGT CGC CAT CTG GTT TTC    336
Arg Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Val Phe
100                 105                 110
TGC CAT AGC AAG GAG AAA TGC GAT GAA CTG GCG AGC GCG CTG TCC GGA    384
Cys His Ser Lys Glu Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ser Ala Leu Ser Gly
115                 120                 125
TTG GGT CTG AAC GCT GTG GCA TTC TAT CGC GGT CTG GAC GTG AGC ATT    432
Leu Gly Leu Asn Ala Val Ala Phe Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Ile
130                 135                 140
ATC CCG ACC CAG GGC GAT GTG GTT ATC GTT AGC ACC GAT GCG CTG ATG    480
Ile Pro Thr Gln Gly Asp Val Val Ile Val Ser Thr Asp Ala Leu Met
145                 150                 155                 160
ACC GGT TTT ACC GGC GAT TTT GAC TCA GTG GTC GAC TGT AAC ACA TGC    528
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Val Asp Cys Asn Thr Cys
165                 170                 175
ATC ACC CAG GGA TCT GGA CTG GTA AGC TTC GCG AGC CAT GTG CCG TAC    576
Ile Thr Gln Gly Ser Gly Leu Val Ser Phe Ala Ser His Val Pro Tyr
180                 185                 190
ATC GAG CAG GGT ATG CAA CTG AGC GAA CAA TTT AAG CAG AAG AGC CTG    624
Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ser Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ser Leu
195                 200                 205
GGT CTG CTG CAG ACC GCG ACC AAA CAG GCG GAG GCG GCC GCC CCG GTG    672
Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val
210                 215                 220
GTT GGC ACC CCG AAA AGC CGC CGT CCG GAA GGT CGT GCC TGG GCG CAA    720
Val Gly Thr Pro Lys Ser Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln
225                 230                 235                 240
CCG GGT ACC ATC ATC CTG AGC GGT CGT CCG GCG GTT GTA CCG GAT CGT    768
Pro Gly Thr Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val Pro Asp Arg
245                 250                 255
GAA GTG CTG TAT CAA GAA TTT CTC GAG GCC TCT AGA GCG GCT CTC ATT    816
Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Leu Glu Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile
260                 265                 270
GAA GAG GGG CAA CGG ATA GCC GAG ATG CTG AAG TCC AAG ATC CAG GGC    864
Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly
275                 280                 285
TTA CTG CAG CAA GCC TCC AAG CAG GCC CAA GAC ATA AAA ATC GAC GGT    912
Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala Gln Asp Ile Lys Ile Asp Gly
290                 295                 300
ACC CTG ATT ATT CCG AAA GAT CGT CGC AGC ACC GGT AAA AGC TGG GGT    960
Thr Leu Ile Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly
305                 310                 315                 320
AAA CCG GGC TTC CTC ATC GAT AGC TTG CAT ATC AAC CAG CGA GCC GTC   1008
Lys Pro Gly Phe Leu Ile Asp Ser Leu His Ile Asn Gln Arg Ala Val
325                 330                 335
GTT GCA CCG GAC AAG GAG GTC CTT TAT GAG GCT TTT GAT GAG ATG GAG   1056
Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu
340                 345                 350
CTC GCC ATG GGC ACC AAC CCG AAA CCG GAG CGT AAA AGC AAG CGT AAC   1104
Leu Ala Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Glu Arg Lys Ser Lys Arg Asn
355                 360                 365
ACC AAC CGT AAA CCG CAG GAT ATT AAA TTC CCG GGT AGT GGT CAG GTG   1152
Thr Asn Arg Lys Pro Gln Asp Ile Lys Phe Pro Gly Ser Gly Gln Val
370                 375                 380
GTG GGT GGT GTG TAC CTG GTG CCG CGT CGT GGT CCG TAAGGATCC         1197
Val Gly Gly Val Tyr Leu Val Pro Arg Arg Gly Pro
385                 390                 395
【０１６９】
0003891629.tif 000058
【０１７０】
0003891629.tif 000059
【０１７１】
0003891629.tif 000060
【０１７２】
0003891629.tif 000061
【０１７３】
0003891629.tif 000062
【０１７４】
0003891629.tif 000063
【０１７５】
0003891629.tif 000064
【０１７６】
0003891629.tif 000065
【０１７７】
0003891629.tif 000066
【０１７８】
0003891629.tif 000067
【０１７９】
0003891629.tif 000068
【０１８０】
0003891629.tif 000069
【０１８１】
0003891629.tif 000070
【０１８２】
0003891629.tif 000071
【０１８３】
0003891629.tif 000072
【０１８４】
0003891629.tif 000073
【０１８５】
0003891629.tif 000074
【０１８６】
0003891629.tif 000075
【０１８７】
0003891629.tif 000076
【０１８８】
0003891629.tif 000077