(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯槽骨の骨欠損部に用いるための骨再生シートであって、間葉系幹細胞をシート状に培養した単層の培養細胞シートと、生分解性物質をシート状に形成した単層の生分解性シートとを積層してなる骨再生シート。
【請求項２】
培養細胞シートが、その少なくとも一面に細胞外マトリックスを備え、該細胞外マトリックスにより生分解性シートに接着されている請求項１に記載の骨再生シート。
【請求項３】
培養細胞シートが、その一面に細胞外マトリックスを備え、他の面に生分解性シートが接着されている請求項１に記載の骨再生シート。
【請求項４】
培養細胞シートと生分解性シートとが、生分解性接着剤により接着されている請求項１または請求項３に記載の骨再生シート。
【請求項５】
生分解性シートが、コラーゲンまたはポリ乳酸からなる請求項１から請求項４のいずれかに記載の骨再生シート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、骨の欠損部を再生する際に使用する骨再生シートに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、再生工学の進歩により、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
体内の空間において骨の形成作用を促進する技術として、体内空間に配置した骨補填材を骨膜によって覆う技術がある。骨膜は、骨補填材を体内空間の所定位置に保持することができるとともに、リモデリングにおいて重要となる細胞形成の働きを有するために、骨補填材と骨細胞との接触部位からのみならず、骨補填材と骨膜との接触部位からも骨の細胞形成が開始され、骨の形成作用を促進することができる。
【０００４】
しかしながら、骨膜は、骨を覆う膜であるため、患者本人から入手する場合には外科手術を伴うことになり、またその量も限られている。また、第三者や動物からの入手も困難な場合が多いという問題がある。
【０００５】
一方、人体から採取した幹細胞を培養皿において適当な培地で培養し、得られたシート状の培養細胞を外傷等による皮膚等の欠損部に配置して、その細胞形成作用を利用することにより、欠損部を修復する技術がある。この技術を利用すれば、培養細胞シートを工業的に製造することができるので、例えば、火傷患者に対し、欠損部の皮膚を修復するために、その患者の体の他の部位から皮膚を切り取るような手術を行う必要がなく、患者にかかる負担が少なくて済むという利点がある。
したがって、このような培養細胞シートを、骨膜に代えて、体内空間における骨欠損の修復に用いることができれば便利である。
【０００６】
また、歯科の分野では、歯周疾患等による歯槽骨の骨欠損を修復する技術として、以下の技術が提案されている。
すなわち、骨欠損部における歯周組織の新付着を得るために、歯根面上に歯根膜由来の細胞を増殖させる必要があるが、歯肉組織の細胞が先に歯根面上に到達すると歯根膜由来の細胞の増殖が妨げられることが知られており、これを防止するために、バリヤーメンブレンを使用する。
【０００７】
バリヤーメンブレンには、例えば、GORE社製のゴアテックスメンブレン、シージー社製のシージーメンブレン等がある。図４に示されるように、これらのバリヤーメンブレン２３は、歯根面２０と歯肉組織２１との間に配置され、歯根面２０上に歯根膜由来の細胞を増殖させるための空間２２を確保するようになっている。この場合に、バリヤーメンブレン２３が口腔内に露出していると細菌に汚染されやすくなるので、バリヤーメンブレン２３の表面を歯肉弁で覆っておく必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このようなバリヤーメンブレン２３には骨形成作用がないので、骨欠損部における歯根膜由来の細胞の増殖は、歯根面２０のみから行われる。したがって、骨欠損部を迅速に修復することができないという問題がある。
一方、バリヤーメンブレン２３に代えて培養細胞シートを使用し、培養細胞シートの骨形成作用により、骨欠損部の修復速度を向上させることが考えられる。しかしながら、この場合には、培養細胞シートを歯肉組織２１によって覆う必要があるため、培養細胞シートに接触する歯肉組織２１の細胞が増殖することになり、歯根膜由来の細胞の増殖が妨げられるという問題がある。
【０００９】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、他の組織細胞の接触を遮断して骨形成作用を促進し、骨欠損部の修復速度を向上することができる骨再生シートを提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、歯槽骨の骨欠損部に用いるための骨再生シートであって、間葉系幹細胞をシート状に培養した単層の培養細胞シートと、生分解性物質をシート状に形成した単層の生分解性シートとを積層してなる骨再生シートを提供する。
【００１１】
この発明によれば、間葉系幹細胞等の間葉系細胞により形成された培養細胞シートに骨芽細胞への分化誘導因子を接触させることにより、骨芽細胞を増殖させて歯槽骨の骨欠損部の修復を促進するとともに、該培養細胞シートに積層された生分解性シートによって、他の細胞が培養細胞シートに接触するのを防止することが可能となる。
その結果、他の細胞によって骨形成作用を妨げられることなく、歯槽骨の骨欠損部を迅速に修復することができる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の骨再生シートにおいて、培養細胞シートが、その少なくとも一面に細胞外マトリックスを備え、該細胞外マトリックスにより生分解性シートに接着されている骨再生シートを提供する。
この発明によれば、培養した培養細胞シートを生分解性シートに重ねておくだけで、細胞外マトリックスの接着作用によって培養細胞シートを生分解性シートに接着することができるので、極めて簡易に骨再生シートを製造することができる。
【００１３】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の骨再生シートにおいて、培養細胞シートが、その一面に細胞外マトリックスを備え、他の面に生分解性シートが接着されている骨再生シートを提供する。
この発明によれば、培養細胞シートの表面に備えられた細胞外マトリックスを露出させた骨再生シートが製造される。したがって、骨欠損部に骨再生シートを配置するときには、その細胞外マトリックスの接着作用を利用して骨再生シートの固定を容易にすることができるとともに、該細胞外マトリックスに書き込まれている情報を骨欠損部に配されている他の細胞の受容体に引き渡し、骨形成を促進することが可能となる。
【００１４】
請求項４に係る発明は、請求項１または請求項３に記載の骨再生シートにおいて、培養細胞シートと生分解性シートとが、生分解性接着剤により接着されている骨再生シートを提供する。
この発明によれば、積層された培養細胞シートと生分解性シートとが生分解性接着剤により接着されることにより一体化された骨再生シートを製造することができる。
【００１５】
請求項５に係る発明は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の骨再生シートにおいて、生分解性シートが、コラーゲンまたはポリ乳酸からなる骨再生シートを提供する。
この発明によれば、生分解性シートを生体適合性に優れたコラーゲンまたはポリ乳酸により製造することにより、培養細胞を保護しながら、他の細胞の培養細胞への接触を防止することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この発明の第１の実施形態に係る骨再生シートについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る骨再生シート１は、図１に示されるように、間葉系幹細胞を培養することによりシート状に形成した培養細胞シート２と、生分解性物質をシート状に形成した生分解性シート３とを積層して、相互に接着させたものである。
【００１８】
培養細胞シート２は、単層のものであって、例えば、厚み約５〜５０μｍ程度である。また、生分解性シート３は、例えば、コラーゲンからなるシートであって、厚み約１０〜３００μｍ程度である。
これら培養細胞シート２と生分解性シート３とは、フィブリン糊４によって相互に接着され、一体的に保持されている。
培養細胞シート２の表面には、細胞外マトリックス５が接着状態に配置されている。細胞外マトリックス５は、例えば、培養の間に合成されたものであって、細胞膜表面に発現した受容体を介して細胞に接着状態に配されている。
【００１９】
このように構成された本実施形態の骨再生シート１の作用について、以下に説明する。本実施形態に係る骨再生シート１は、培養細胞シート２を一面側に備え、生分解性シート３を他面側に備えているので、培養細胞シート２の表面を修復したい骨欠損部に面する方向に向けて配置することにより、骨欠損部に存在する分化誘導因子によって、培養細胞を分化させ、骨欠損部に新しい細胞を増殖させることが可能となる。
【００２０】
この場合において、培養細胞シート２の表面には、細胞外マトリックス５が形成されているので、培養細胞シート２を骨欠損部に向けて配置すると、該細胞外マトリックス５の接着作用により、骨欠損部に配されている骨補填材等に容易に固定することができる。また、細胞外マトリックス５を介して接触している骨補填材に含まれている分化誘導因子の情報が培養細胞シート２に伝達され、培養細胞の分化、増殖が開始されることになる。
【００２１】
すなわち、骨欠損部において、骨面からの骨形成作用に加えて、培養細胞シート２からの骨形成作用が生ずるので、骨欠損部の修復をより迅速に行うことができる。また、この場合において、培養細胞シート２の裏面には生分解性シート３が接着されているので、培養細胞シート２の裏面に他の細胞が接触することはない。したがって、生分解性シート３により、他の細胞の影響が培養細胞シート２に及ぶことを阻止することができる。
【００２２】
上述した本実施形態に係る骨再生シート１の作用について、骨再生シート１を歯周疾患等による歯槽骨の骨欠損の修復に使用する場合を例に挙げて、図２を参照して説明する。
図２の（ａ）は歯周疾患等により生じた歯槽骨６の骨欠損部７の断面図であり、上皮組織である歯肉組織８が骨欠損部７を覆っている状態を示している。
【００２３】
本実施形態に係る骨再生シート１を使用するには、まず、図２の（ｂ）に示されるように、骨欠損部７を覆っている歯肉組織８を切開して骨欠損部７を露出させ、そこに、骨補填材９を補填する。骨補填材９は、例えば、β−ＴＣＰに適当な分化誘導因子を添加したものにより構成する。次に、図２の（ｂ）に示されるように、骨欠損部７に補填された骨補填材９を覆うように本実施形態に係る骨再生シート１を固定する。図中、符号１０は、骨再生シート１を歯槽骨６に固定する生分解性物質からなるステープルである。
【００２４】
この場合において、骨再生シート１は、一面に配されている培養細胞シート２を骨補填材９の方向に向けて、骨補填材９に接触するように配置されるとともに、他面に配されている生分解性シート３を外側に向けて配置される。そして、口腔内において生分解性シート３が細菌により汚染されることを防止するために、骨再生シート１を被覆するように切開した歯肉組織８を引っ張って縫合する。これにより、図２の（ｃ）に示される状態となる。
【００２５】
このように構成された骨再生シート１によれば、歯槽骨６側からの通常の骨形成作用に加えて、培養細胞シート２側からの骨形成作用が生じ、骨欠損部７が高い速度で修復されることになる。また、この場合のように、上皮組織である歯肉組織８が骨欠損部７に存在する場合であっても、生分解性シート３によって、当該歯肉組織８の培養細胞シート２への接触を遮断することができる。したがって、培養細胞シート２は、歯肉組織８によって歯根膜由来の細胞の増殖を阻害されず、歯槽骨６の骨欠損部７を効果的に修復することができる。
【００２６】
そして、このように構成された骨再生シート１を使用することにより、骨欠損部７に配置された培養細胞シート２および骨補填材９が経時的に自家骨化されるとともに、生分解性シート３は分解されて吸収され、図２の（ｄ）に示される状態となる。
【００２７】
本実施形態に係る骨再生シート１は、別々に構成した培養細胞シート２と生分解性シート３とを接着した構造を有しているので、適用箇所に応じて、任意の剛性を有するものを選択することができる。例えば、本実施形態では、培養細胞シート２を単層の細胞からなるものとし、５０μｍ程度の生分解性シート３を採用したので、比較的柔軟な骨再生シート１が構成されている。したがって、比較的自由に形状を変更することができ、任意の形状に適合させることが可能である。
【００２８】
さらに剛性が必要とされる箇所に適用する場合には、生分解性シート３の厚みが厚いものを選択することにより対応することができる。
【００２９】
なお、上記実施形態においては、培養細胞シート２と生分解性シート３とをフィブリン糊４で接着することにしたが、この発明はこれに限定されるものではなく、他の任意の生分解性接着剤を採用することにしてもよい。また、接着剤を使用することなく、間葉系幹細胞の培養時に細胞に接着状態に形成される細胞外マトリックス５の接着作用を利用して、培養細胞シート２と生分解性シート３とを積層状態に接着させることにしてもよい。
【００３０】
次に、本実施形態に係る骨再生シート１の製造方法について、図３を参照して説明する。
本実施形態に係る骨再生シート１の製造方法は、間葉系幹細胞を所定の培養温度下において培養皿１１上で培養する培養ステップと、培養皿１１の温度を前記培養温度より低い所定の剥離温度まで低下させ、培養皿１１から培養細胞シート２を回収する剥離ステップと、得られた培養細胞シート２を生分解性シート３に積層して接着する接着ステップとを備えている。
【００３１】
培養皿１１は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で表面に固定化した温度応答性培養皿である。この培養皿１１の表面は、３２℃を境にして、それ以上では市販の細胞溶媒用皿と同等の弱い疎水性を示し、種々の細胞を培養できる一方、３２℃以下では急激に親水化する性質を有している。
【００３２】
したがって、培養ステップは、３２℃より高い温度、例えば、人間の体温に近い、３７℃程度の培養温度に維持して行われる。具体的には、培養皿１１の上に骨髄細胞を載せて３７℃程度の培養温度に維持することにより、骨髄細胞内の間葉系幹細胞１２を培養皿１１の表面に沈着させる。３７℃では、培養皿１１の表面は弱い疎水性を示しているので、増殖した間葉系幹細胞１２は培養皿１１の表面に貼り付いた状態となる。
このとき、間葉系幹細胞１２は、培養の間に、細胞外マトリックス５を合成・分泌・沈着し、細胞外マトリックス５は、培養皿１１表面と間葉系幹細胞１２の層との間に配置される（図３（ａ）参照）。
【００３３】
また、剥離ステップは、３２℃より低い温度、例えば、３０℃に冷却する。３２℃以下では培養皿１１の表面は高い親水性を示すので、細胞外マトリックス５を介して培養皿１１表面に貼り付いていた間葉系幹細胞１２は、単層の培養細胞シート２として容易に剥離されることになる。
このとき、単層の間葉系幹細胞１２を備えた培養細胞シート２の培養皿１１に面していた表面には、上述したように細胞外マトリックス５が接着した状態に配されており、該細胞外マトリックス５も間葉系幹細胞１２とともに培養皿１１から剥離されて回収される。
【００３４】
そして、接着ステップは、上記剥離ステップにおいて回収された培養細胞シート２を、公知の方法で製造したコラーゲンからなる生分解性シート３の表面に積層し、両者を接着させることにより行われる。培養細胞シート２と生分解性シート３との接着は、例えば、両者間にフィブリン糊４を塗布することにより行う。
このとき、培養細胞シート２の表面の内、上述した細胞外マトリックス５が接着状態に配されている面とは反対側の面に生分解性シート３を接着する。これにより、一面に細胞外マトリックス５が露出し、他面を生分解性シート３によって被覆された骨再生シート１が製造される。
【００３５】
このように本実施形態に係る骨再生シート１の製造方法によれば、温度応答性培養皿を使用することにより、培養皿１１表面に付着した培養細胞１２を剥離させるために、トリプシンなどの蛋白質分解酵素による処理を行うことなく、重層化していない単層の間葉系幹細胞１２や、その表面に形成されている細胞外マトリックス５をも非侵襲的に回収することができ、簡易に骨再生シート１を製造することができる。
【００３６】
なお、上記製造方法において言及した培養温度および剥離温度は、例として示したものであり、培養可能な温度範囲および培養皿１１の表面が疎水性から親水性に変化する温度に応じて、適宜設定してよい。
また、上記実施形態では、剥離ステップの後に接着ステップを行うこととしたが、これに代えて、接着ステップの後に剥離ステップを行うことにしてもよい。
【００３７】
また、フィブリン糊４を用いて接着することに代えて、培養細胞シート２の表面に生成された細胞外マトリックス５を接着剤として利用して、培養細胞シート２と生分解性シート３とを接着することにしてもよい。さらに、生分解性シート３としてコラーゲンシートを採用したが、これに代えて、ポリ乳酸からなるシート等、他の任意の生分解性シートを採用することにしてもよい。
【００３８】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る骨再生シートによれば、培養細胞シートに接着された生分解性シートによって、他の細胞が骨欠損部へ侵入することを防止して、骨面からの通常の骨形成作用が妨げられないように保持することができるとともに、培養細胞シートの骨形成作用が他の細胞によって妨げられることをも防止するので、骨欠損部を迅速に修復することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】   この発明の一実施形態に係る骨再生シートの縦断面図である。
【図２】   図１の骨再生シートを歯槽骨の骨欠損部の修復に適用する場合を説明するための断面図である。
【図３】   図１の骨再生シートを温度応答性培養皿から剥離する状態を説明する断面図である。
【図４】   従来の歯槽骨の骨欠損部の修復方法を説明するための断面図である。
【符号の説明】
１  骨再生シート  ２  培養細胞シート  ３  生分解性シート  ４  フィブリン糊（生分解性接着剤）  ５  細胞外マトリックス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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