(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マグネタイト粒子と、当該マグネタイト粒子を被覆するアミロース層とを備え、飽和磁化が２０Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ２／ｋｇであり、保磁力が１５．９３ｋＡ／ｍ以下であり、平均粒子サイズが０．０５μｍ〜２０μｍの球状、楕円体状または粒状の形状を有する、タンパク質結合用磁性担体。
【請求項２】
ｐＨ７．５のリン酸カリウムバッファー中で３０日間４℃で保存した場合、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上を保つ、請求項１記載のタンパク質結合用磁性担体。
【請求項３】
アミロースに特異的に結合し得るタンパク質そのものよりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質との融合タンパク質に対して相対的に高い親和性を有する、請求項１または２記載のタンパク質結合用磁性担体。
【請求項４】
担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出がなされる、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質結合用磁性担体。
【請求項５】
マグネタイト粒子を分散させた分散液にアミロースを添加後加熱し、更に冷却することでマグネタイト粒子を被覆するアミロース層を形成することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質結合用磁性担体の製造方法。
【請求項６】
アミロースに特異的に結合し得るタンパク質を含有する生物試料から、当該タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）上記タンパク質を請求項１記載のタンパク質結合用磁性担体に結合させる工程と、
（ｂ）タンパク質結合用磁性担体に結合させたタンパク質を、生物試料から単離させる工程と、
（ｃ）生物試料から単離された上記タンパク質をタンパク質結合用磁性担体から分離させる工程とを含有することを含む、方法。
【請求項７】
上記タンパク質結合用磁性担体が、ｐＨ７．５のバッファー中で３０日間４℃で保存した場合、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上を保つものである、請求項６記載のタンパク質の精製方法。
【請求項８】
上記タンパク質結合用磁性担体が、アミロースに特異的に結合し得るタンパク質そのものよりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質の融合タンパク質に対して相対的に高い親和性を有する、請求項６または７記載のタンパク質の精製方法。
【請求項９】
上記タンパク質結合用磁性担体が、担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出がなされるものである、請求項６〜８のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質結合用磁性担体を含有するタンパク質抽出用液と、タンパク質を溶離し得る溶出用液とを備えるタンパク質精製用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的タンパク質を含有する生物試料から当該タンパク質を精製するために好適に使用され得る磁性担体およびその製造方法、ならびに当該磁性担体を利用したタンパク質の精製方法、タンパク質精製用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、例えば細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、動物組織、植物組織（これらから得られる破砕液、抽出液なども含む）、無細胞タンパク質合成液などの試料（以下、これらを総称して「生物試料」と呼ぶ）中の特定の目的タンパク質を、他の成分から抽出・精製するための多種多様な方法、物質およびアプローチが存在する。
【０００３】
一般的なアプローチの一例として、担体に対するタンパク質の非特異的親和性を利用するものが挙げられる。このようなアプローチによるものとして、例えば、タンパク質分子の電荷に基づくイオン交換クロマトグラフィーが知られている。イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質と反対の電荷を有するクロマトグラフィーマトリックスにタンパク質混合物を添加し、可逆的な静電気的相互作用により様々なタンパク質をマトリックスに結合させる。マトリックスに結合したタンパク質は、イオン強度を高めることにより、もしくは溶出バッファーのｐＨを変化させることによって、結合の弱いものから強いものの順に溶出させることができる。
【０００４】
また一般的なアプローチの他の例として、分離手段としてタンパク質の物理的特性を利用するものが挙げられる。このようなアプローチによるものとして、例えば、タンパク質の大きさに基づくゲル濾過が知られている。ゲル濾過では、所定の大きさの孔を有するクロマトグラフィーのマトリックスを詰めたゲル濾過カラムに、タンパク質混合物を添加する。その後、溶出用液（通常、バッファー）を用いて溶出させ、個々のクロマトグラフィーフラクションとして収集して分析に供することができる。
【０００５】
一般的なアプローチのさらに他の例として、精製用試薬に対するタンパク質の特異的親和性を利用するものが挙げられる。このようなアプローチによるものとして、例えば、目的タンパク質に対して特異的に吸着し得る抗体を利用した、あるいは目的タンパク質が抗体である場合には該抗体に特異的に吸着し得る抗原を利用した、アフィニティークロマトグラフィーが知られている。アフィニティークロマトグラフィーでは、通常、抗体または抗原はカラム基材に結合され、当該抗体または抗原に特異的に吸着し得る抗原または抗体を含む溶液をカラムに添加し、カラム基材上で免疫複合体（抗原抗体複合体）を形成させる。続いて、例えば非常にイオン強度が高いバッファー、または非常にｐＨが高いかもしくは低いバッファーに上記免疫複合体をさらすことにより、免疫複合体を不安定化させて、溶出させる。このようにアフィニティークロマトグラフィーは、目的とするタンパク質と固相に固定化されたリガンドとの間の特異的な相互作用を利用する、非常に効果的なタンパク質の精製方法である。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、通常、固相リガンドはいくつかの固有の科学的特性を有し、当該特性により目的タンパク質を選択的に吸着する。また混入タンパク質（contaminant protein）は、固相リガンドに結合しないか、もしくは適切な溶液で固相リガンドを洗浄することで除去することができる。
【０００６】
近年の遺伝子技術による混成遺伝子の調製の可能性は、新たな道を開いた。すなわち、所望のタンパク質をコードする遺伝子配列とリガンドに対して高い親和性を有するタンパク質フラグメント（親和性ペプチド）をコードする遺伝子配列とを結合することにより、上記分離に適した親和性ペプチドを有する組換えタンパク質を発現させることが可能となり、当該親和性ペプチドを使用する精製の一工程において、所望の組換えタンパク質を融合タンパク質の形態にて精製が行えるようになった。また部位を制限した変異により、親和性ペプチドと所望の組換えタンパク質との結合点に特定の化学的または酵素的な開裂部位を導入することも可能であり、融合タンパク質を適当な親和性樹脂により精製した後に、化学的または酵素的に親和性ペプチドを開裂させて、所望の組換えタンパク質を回収することができる。かかる精製方法は、例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４ならびに、特許文献１、特許文献２により知られている。
【０００７】
融合タンパク質の親和性ペプチドは、生化学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質に直接的または間接的に結合され得る。単一の親和性ペプチドを用いる場合には、当該親和性ペプチドは、生化学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質のアミノ末端アミノ酸またはカルボキシル末端アミノ酸に結合され得る。二個の親和性ペプチドを用いる場合には、いずれか一方の親和性ペプチドが生化学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質のアミノ末端アミノ酸に結合され得、残る他方の親和性ペプチドが生化学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質のカルボキシル末端アミノ酸に結合され得る。
【０００８】
間接的結合の場合、親和性ペプチドは適当な選択的開裂部位を含み、当該選択的開裂部位を介し、それらは生化学的に活性な所望のポリペプチドまたはタンパク質に結合され得る。好適な選択的開裂部位としては、好ましくはアミノ酸配列−（Ａｓｐ）n−Ｌｙｓ−（式中、ｎは２，３または４を示す）または−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−が知られている。これら選択的開裂部位は、それぞれプロテアーゼであるエンテロキナーゼおよび凝集ＦａｃｔｏｒＸａにより特異的に認識され得る。このような親和性ペプチドは、自体公知の方法によって、上記選択的開裂部位にて酵素的に開裂させることができる。
【０００９】
また直接的結合の場合、親和性ペプチドは、生化学的に活性な所望のポリペプチドまたはタンパク質に結合して残る。すなわち、親和性ペプチドは、化学的または酵素的に開裂可能な選択的開裂部位を有しない。直接的結合は、所望のポリペプチドまたはタンパク質の活性が親和性ペプチドの存在により不利な影響を受けない場合には有利である。
【００１０】
特許文献２には、特定の糖質に特異的な親和性を示す親和性ペプチドを有する結合タンパク質、換言すれば、糖結合タンパク質を用いた融合タンパク質の製造方法と、それを用いた簡便な精製方法が開示されている。上記糖結合タンパク質としては、例えば、モノ、ジまたは多糖結合タンパク質、更に具体的には、マルトース結合タンパク質やアラビノース結合タンパク質などが挙げられる。特に、大腸菌のｍａｌＥ遺伝子産物であるマルトース結合タンパク質は、浸透圧による影響を受け得るペリプラズムタンパク質であり、マルトースおよびマルトデキストリンに特異的な親和性を示す。このマルトース結合タンパク質やそのフラグメント、あるいはその目的タンパク質との融合タンパク質は、アミロースレジンを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製することが可能である。マルトース結合タンパク質を融合タンパク質の親和性ペプチドとして利用することにより、目的タンパク質が難溶性である場合や不溶化しやすい場合においても、可溶化した状態で精製できる可能性が高いことが当業者により知られている。
【００１１】
【非特許文献１】
Itakuraら、Science 198, 1056-1063 (1977)
【非特許文献２】
Germinoら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 6848-6852 (1983)
【非特許文献３】
Nilssonら、Nucleic Acids Res. 13, 1151-1162 (1985)
【非特許文献４】
Smithら、Gene 32, 321-327 (1984)
【特許文献１】
特許第２６８６０９０号公報
【特許文献２】
特許第２７０３７７０号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上のようにタンパク質の精製方法は種々存在し、特に融合タンパク質を利用したアフィニティーカラムクロマトグラフィーは非常に優れた精製方法であるが、これらの方法は高価な担体等を使用するため材料の再生と再利用を行うのが一般的であり、未だ簡便であるというには難点がある。また従来のカラムクロマトグラフィーを中心とした精製方法では、カラム中に試料を順次通していくため多大な時間を要し、自動化やハイスループット化を困難なものとしている。
本発明の目的は、上記課題を解決するためになされたものであって、従来と比較して格段に簡便であり、自動化およびハイスループット化可能なタンパク質の精製方法、およびそのための材料を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、簡便で自動化およびハイスループット化が可能なタンパク質の精製方法を開発するために鋭意検討した結果、アミロースとマルトース結合タンパク質とが特異的に結合しやすいことに着目し、糖質の代表としてアミロースで表面処理した強磁性酸化物粒子にマルトース結合タンパク質を結合させ、このタンパク質の生物試料からの精製を試みた結果、タンパク質を効率良く単離できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）マグネタイト粒子と、当該マグネタイト粒子を被覆するアミロース層とを備え、飽和磁化が２０Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ２／ｋｇであり、保磁力が１５．９３ｋＡ／ｍ以下であり、平均粒子サイズが０．０５μｍ〜２０μｍの球状、楕円体状または粒状の形状を有する、タンパク質結合用磁性担体。
（２）ｐＨ７．５のバッファー中で３０日間４℃で保存した場合、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上を保つ、（１）に記載のタンパク質結合用磁性担体。
（３）アミロースに特異的に結合し得るタンパク質そのものよりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質の融合タンパク質に対して相対的に高い親和性を有する、（１）または（２）記載のタンパク質結合用磁性担体。
（４）担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出がなされる、（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質結合用磁性担体。
（５）マグネタイト粒子を分散させた分散液にアミロースを添加後加熱し、更に冷却することでマグネタイト粒子を被覆するアミロース層を形成することを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質結合用磁性担体の製造方法。
（６）アミロースに特異的に結合し得るタンパク質を含有する生物試料から、当該タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）上記タンパク質を（１）記載のタンパク質結合用磁性担体に結合させる工程と、
（ｂ）タンパク質結合用磁性担体に結合させたタンパク質を、生物試料から単離させる工程と、
（ｃ）生物試料から単離された上記タンパク質をタンパク質結合用磁性担体から分離させる工程とを含有することを含む、方法。
（７）上記タンパク質結合用磁性担体が、ｐＨ７．５のバッファー中で３０日間４℃で保存した場合、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上を保つものである、（６）記載のタンパク質の精製方法。
（８）上記タンパク質結合用磁性担体が、アミロースに特異的に結合し得るタンパク質そのものよりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質の融合タンパク質に対して相対的に高い親和性を有する、（６）または（７）記載のタンパク質の精製方法。
（９）上記タンパク質結合用磁性担体が、担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出がなされるものである、（６）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
（１０）（１）に記載のタンパク質結合用磁性担体を含有するタンパク質抽出用液と、タンパク質を溶離し得る溶出用液とを備えるタンパク質精製用試薬キット。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の磁性担体は、強磁性酸化物粒子と、当該強磁性酸化物粒子を被覆する糖質層とを、基本的に備え、タンパク質と結合し得るものである。
【００１５】
本発明における強磁性酸化物粒子は、金属製の粒子を酸化反応させて得られた、磁気応答性（磁界に対する感応性）を有する粒状物を指す。ここで「磁気応答性を有する」とは、磁石等による外部磁界が存在するとき、磁界により磁化する、あるいは磁石に吸着するなど、磁界に対して感応性を示すことを指す。強磁性酸化物としては特に制限はなく、鉄、コバルト、ニッケルなど、公知の金属の酸化物が挙げられるが、特に磁界に対する感応性に優れることから、強磁性酸化鉄であるのが好ましい。このように強磁性酸化鉄が特に好ましいが、超常磁性を有するものであっても磁界に対して感応するものであれば、使用することが可能である。強磁性酸化鉄としては、従来公知の種々の強磁性酸化鉄を使用することができるが、中でも化学的安定性に優れることからマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マンガン亜鉛フェライト（Ｍｎ1-XＺｎＸＦｅ2Ｏ4）などのフェライトから選ばれる少なくとも一種であるのが好ましく、中でも大きな磁化量を有しているため磁界に対する感応性に優れるマグネタイトが特に好ましい。
【００１６】
強磁性酸化鉄粒子は、例えば水中でＦｅ（ＯＨ）2等の粒子を酸化反応させる従来公知の方法にて作製することができる。後述する実施例には、一例として、マグネタイト粒子の作製例を記載している。
【００１７】
本発明に使用する強磁性酸化物粒子は、その形状に特に制限はなく、球状、楕円体状、粒状、板状、針状、立方体状などの多面体状などが挙げられるが、後述の磁性担体とした時点で好適な形状に実現され易い点から、球状、楕円体状または粒状が好ましい。
【００１８】
また本発明に使用する強磁性酸化物粒子の大きさにも特に制限はないが、通常、１個〜１００個の粒子が集結した塊状物を糖質層にて被覆することで１個の磁性担体が形成され、このように形成された磁性担体として後述のように０．０５μｍ〜２０μｍという好適な大きさの磁性担体を形成し易いことから、０．０５μｍ〜０．５μｍの平均粒子サイズを有することが好ましい。なお、この強磁性酸化物粒子の「粒子サイズ」とは、当該粒子のあらゆる方向に関する長さのうち最大となる長さをいい、上記強磁性酸化物粒子の平均粒子サイズは、例えば、透過型電子顕微鏡写真上で各粒子３００個の粒子サイズを測定し、その数平均として算出する。
【００１９】
本発明における糖質層を形成する糖質としては、特に制限はなく、モノ、ジ、または多糖およびこれらの混合物などが使用でき、目的とするタンパク質に応じ当該タンパク質と親和性を充分に有するものを適宜選択して使用すればよい。このような糖質としては、例えば、グルコース、ガラクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、マルトデキストリン、アミロース、デキストリン、可溶性デンプンなどが例示されるが、価格が安価で入手が容易であることから、グルコースを主単位とするオリゴ糖または多糖が好ましく、アミロースがより好ましい。特に、マルトース結合タンパク質の一部または全部を含む融合タンパク質を目的タンパク質とする場合、アミロースを糖質として用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の磁性担体は、上述した強磁性酸化物粒子を糖質層にて被覆してなるものである。ここで「被覆」とは、強磁性酸化物粒子の外側を覆って、磁性担体の最外に糖質層が形成されてなることを指す。当該糖質層は、強磁性酸化物粒子を完全に覆うように形成されていてもよく、また、目的タンパク質と糖質との親和的結合を阻害しない範囲であれば強磁性酸化物粒子の一部が露出してなるように形成されていてもよい。
【００２１】
また糖質層は、磁性担体の最外に形成されていればよく、強磁性酸化物粒子により付与される磁性担体の磁気応答性が失われないならば、強磁性酸化物粒子と糖質層との間に中間の層が形成されていてもよい。具体的には、強磁性酸化物粒子をシリカ被膜で覆った磁性シリカビーズや、強磁性酸化物粒子をシリカ中に分散させるなどの加工を施した粒子に糖質層を形成してなる磁性担体が例示される（これらの場合において、シリカにて中間の層を形成）。このように強磁性酸化物粒子と糖質層との間に、シリカにて形成された中間の層を有すると、粒子形状が真球状に近いものが得られるというような利点を有する磁性担体を実現することができる。なおシリカにて中間層を形成する場合、核酸のコンタミネーションを防ぐため、中間層を完全に覆うように糖質層を形成するのが好ましい。
【００２２】
本発明の磁性担体において、強磁性酸化物粒子を被覆する糖質の量（糖質層の被着量）は、強磁性酸化物粒子に対して１重量％〜３０重量％であるのが好ましく、５重量％〜２０重量％であるのがより好ましい。上記糖質の量が強磁性酸化物粒子に対して１重量％未満であると、磁性担体のタンパク質への結合性が低くなってしまう傾向にあるためであり、また上記糖質の量が強磁性酸化物粒子に対して３０重量％を超えると、磁性担体の磁気特性に悪影響を及ぼし、後述の磁界を利用したタンパク質の抽出・精製の効率が低下する傾向にあるためである。
【００２３】
なお本発明の磁性担体は、１個の強磁性酸化物粒子を糖質層にて被覆して１個の磁性担体として形成されてもよく、また複数個の強磁性酸化物粒子を糖質層にて被覆して１個の磁性担体として形成されていてもよいが、通常は、１個〜１００個の強磁性酸化物粒子を糖質層にて被覆した形態で１個の磁性担体として供される。
【００２４】
本発明の磁性担体は、その形状に特に制限はなく、針状、球状、板状など各種の形状であってよいが、後述の磁界を用いた磁性担体の捕集や磁性担体に結合したタンパク質の生物試料からの単離の際に、磁性担体としての捕集性と分散性とのバランスがよく、操作性に優れる点から、球状、楕円体状または粒状の形状で実現されるのが好ましい。ここで、「球状」とは、アスペクト比（あらゆる方向で測定した場合の最大長さと最小長さとの比）が１．０〜１．２（１．０以上１．２以下）の範囲内である形状を指し、「楕円体状」とは、アスペクト比が１．２を超えて１．５以下の範囲内である形状を指す。また「粒状」とは、球状のように粒子の長さが全方向で揃っているものや、楕円体状のように一方向の長さのみ大きいもの以外の方向による長さの差異はあるが、全体として形状に特に異方性がない形状を指す。
【００２５】
磁性担体の大きさも特に制限はないが、上記の形状と同様に操作性が良好である点から、平均粒子サイズが０．０５μｍ〜２０μｍであるのが好ましく、０．１μｍ〜１０μｍであるのがより好ましい。磁性担体の平均粒子サイズが０．０５μｍ未満であると、磁性担体の比表面積が大きくなるため目的タンパク質との結合量は大きくなる反面、磁性担体の捕集が困難となってしまう傾向にある。また磁性担体の平均粒子サイズが２０μｍを超えると、磁性担体の比表面積が小さくなり、かつ沈降し易くなるため、目的タンパク質との結合量が低下してしまう傾向にある。
【００２６】
なお磁性担体の「粒子サイズ」は、上述した強磁性酸化物粒子の粒子サイズと同義であり、磁性担体の平均粒子サイズも上述した強磁性酸化物粒子の平均粒子サイズと同様にして算出すればよい。
【００２７】
また後述のように、磁界を利用して本発明の磁性担体を用いたタンパク質の精製を行う場合には、磁性担体の磁気特性が重要である。このような磁気特性として、タンパク質の結合した磁性担体の捕集に主として関与する飽和磁化と、磁性担体とタンパク質との分離（タンパク質の溶離）に主として関与する保磁力とが挙げられる。
【００２８】
一般に、飽和磁化が高ければ高いほど磁界への感応性は大きく、したがって飽和磁化の高い磁性担体は磁界を利用したタンパク質の精製においてタンパク質を結合した状態での磁性担体の捕集性は向上されるが、余りに高いと磁気的に凝集してしまう。
【００２９】
本発明の磁性担体は、その飽和磁化が好ましくは２０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）であり、より好ましくは３０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜８０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）である。磁性担体の飽和磁化が２０Ａ・ｍ2／ｋｇ未満であると、磁性担体の磁界に対する感応性が低くなり、捕集性が低下してしまう傾向にある。また磁性担体の飽和磁化が１００Ａ・ｍ2／ｋｇを超えると、磁性担体が磁気的に凝集し易くなってタンパク質精製の系中での分散性が低下する傾向にある。当該磁性担体の飽和磁化は、例えば振動試料型磁力計（東英工業（株）製）を用いて、７９６．５ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加したときの磁化量を測定することにより求めることができる。
【００３０】
また磁性担体は、捕集するときに印加された磁界によってある程度磁化されるが、保磁力が大きくなるほど磁性担体間の凝集力が大きくなり、磁性担体からタンパク質を溶離するときの磁性担体の分散性が低下する。その結果、結合したタンパク質の溶液中での溶離性が低くなり、抽出効率が低下する傾向にある。この保磁力の値は、小さい分には特に問題とはならないが、小さい保磁力を得るためには使用する強磁性酸化鉄粒子の種類や、さらには磁性担体の合成方法までも制約を受けることになる。
【００３１】
本発明の磁性担体は、その保磁力が好ましくは１５．９３ｋＡ／ｍ（２００エルステッド）以下であり、より好ましくは２．３９ｋＡ／ｍ〜１１．９４ｋＡ／ｍ（３０エルステッド〜１５０エルステッド）である。当該磁性担体の保磁力は、例えば振動試料型磁力計（東英工業（株）製）を用いて、７９６．５ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加して飽和磁化した後、磁界をゼロに戻し、さらに逆方向に磁界を徐々に増加させながら印加して、磁化の値がゼロになる印加磁界の強さから求めることができる。
【００３２】
本発明の磁性担体は、後述する磁界を利用したタンパク質の精製方法における磁性担体の捕集性と分散性とのバランスを良好にする観点から、その飽和磁化が２０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）であって、かつその保磁力が１５．９３ｋＡ・ｍ（２００エルステッド）以下であるように実現されてなるのが好ましい。
【００３３】
特に好ましい本発明の磁性担体としては、強磁性酸化物粒子と、当該強磁性酸化物粒子を被覆する糖質層とを備え、１５．９３ｋＡ／ｍ（２００エルステッド）以下の保磁力と、２０Ａ・ｍ2／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇの飽和磁化を有し、かつ平均粒子サイズが０．０５μｍ〜２０μｍの球状、楕円体状または粒状の形状を有するように実現される態様が挙げられる。中でもこのような態様において、強磁性酸化物粒子がマグネタイト粒子であり、かつ糖質がアミロースである磁性担体で実現されることが好ましい。
【００３４】
本発明の磁性担体を用いて精製し得る（本発明の磁性担体が結合し得る）タンパク質（目的タンパク質）としては、糖質に特異的に結合し得るタンパク質であれば特に限定されない。ここで本明細書中における「タンパク質」は、従来公知の各種の糖結合タンパク質は勿論のこと、糖に対し特異的に結合し得るフラグメントを有する融合タンパク質（例えば、特許文献２に開示されたような融合タンパク質）も包含し、さらに糖に対し特異的に結合し得る限り、これらのフラグメントなどの、いわゆるペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドも包含するものとする。具体的には、マルトース結合タンパク質、アラビノース結合タンパク質、グルコース結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、レクチンなどの糖結合タンパク質や、これらの一部または全部を含んでなり糖への親和性を有する融合タンパク質〔例えば、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質の融合タンパク質（後記β−ガラクトシダーゼα鎖のアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＬａｃＺα、後記大腸菌トランスポザーゼのアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１、緑色蛍光タンパク質のアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＧＦＰ１など）〕が例示される。中でも特に、浸透圧による影響を受けるペリプラズムタンパク質であり、マルトースおよびマルトデキストリンに特異的に結合し得ることから、大腸菌のｍａｌＥ遺伝子産物であるマルトース結合タンパク質が好ましい。
【００３５】
本発明の磁性担体を製造する方法に特に制限はないが、糖質による強磁性酸化物粒子の被覆（糖質層の形成）は、例えば、強磁性酸化物粒子を適宜の分散媒中に分散させた分散液に糖質を添加した後、加熱し、さらに冷却する方法にて行うことができる。このような本発明の磁性担体の製造方法は、温度による糖質の溶解度の差異を利用して強磁性酸化物粒子を糖質で被着処理して、糖質層を形成する方法である。
【００３６】
本発明の製造方法における各条件は、用いる強磁性酸化物粒子や糖質によって適宜選択でき、特に限定されるものではない。以下、強磁性酸化物粒子としてマグネタイト粒子を用い、糖質としてアミロースを用いる場合を例に挙げて、具体的に説明する。
【００３７】
まず、常温（２０℃）でマグネタイト粒子を分散媒中に分散させる。分散媒としては特に制限はなく、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコールなどが挙げられるが、製造コストを低くできるとの理由により水を用いるのが好ましい。分散媒に添加するマグネタイト粒子の量にも特に制限はないが、均一な分散液が得られやすいことから、１重量％〜５０重量％の濃度となるよう添加することが好ましい。
【００３８】
次に、常温で攪拌しながら分散液にさらにアミロースを添加した後、９０℃程度まで加熱する。アミロースのマグネタイト粒子に対する添加量は、０．１重量％〜３０重量％とすることが好ましいが、アミロースの水に対する溶解量が通常、数％程度（２％〜６％）であるため、この濃度以下となるようにマグネタイト粒子を分散させる水の量を選択することが好ましい。例えば、マグネタイト粒子１０ｇを水５０ｇに分散させ、０．１ｇ〜３ｇ程度のアミロースを添加すればよい。なおアミロースの添加後、１０分間〜１時間程度常温で攪拌した後に上記温度に加熱し、さらに加熱した状態で１０分間〜１時間攪拌を行うと、アミロースも均一に分散され、均一な糖質層を形成し易くなる上で好ましい。
【００３９】
続いて、アミロース溶解分散液を攪拌しながら常温まで冷却する。これにより、溶解していたアミロースが徐々に析出してきて、マグネタイト粒子の表面に被着する。
【００４０】
このようにすれば、マグネタイト粒子と、当該マグネタイト粒子を被覆するアミロースにて形成された糖質層とを備える態様の本発明の磁性担体を製造できる。なお、上記飽和磁化および保磁力を兼ね備える磁性担体は、上記の磁性担体の製造方法の過程において、例えば、１個の磁性担体あたり強磁性酸化物粒子の数が１個〜１００個となるように糖質層で被覆し、かつ強磁性酸化物粒子に対して糖質の割合が０．１重量％〜３０重量％となるようにすればよい。
【００４１】
なお、本発明の磁性担体は、上述した本発明の製造方法で得られたものに制限されるものではなく、同様の構成を有するならば上記以外の製造方法で得られたものであってもよい。
【００４２】
本発明の磁性担体は、保存安定性に優れているので、タンパク質の精製方法に好適に使用することができる。好ましい本発明の磁性担体は、分散液中で３０日間２〜１０℃（特に４℃）で保存した場合でも、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上（好ましくは９０％以上）を保つ。ここでいう「分散液」としては、バッファーが挙げられ、具体的にはリン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸塩バッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ホウ酸バッファー、酢酸バッファー、ＭＥＳバッファーなどが挙げられ、中でも２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０〜８．０）が好ましい。また、ここでいう「タンパク質結合能力」は、粒子１ｇで精製できるタンパク質量である。なお、タンパク質量は、下記ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と称する）による定量法および吸光度（２８０ｎｍ）測定により求めることができる。
【００４３】
〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質定量法〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質量の定量は、つぎのようにして行う。まず、濃度既知の標準タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）および対象タンパク質の希釈系列（例えば、２倍、４倍、８倍など）をそれぞれ作製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。ついで、標準タンパク質の希釈系列からＳＤＳ−ＰＡＧＥの最低検出可能な濃度（Ａ）を求め、一方、対象タンパク質の希釈系列から対象タンパク質が検出可能な希釈倍率を求めて、そのときのタンパク質濃度を上記（Ａ）とみなし、希釈倍率を乗ずることにより対象タンパク質の濃度を決定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、例えば、電気泳動実験法（日本電気泳動学会編、１９９９年発行）に記載の方法など、公知の方法を用いて行う。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の定量は、２８０ｎｍの吸光度を測定することによっても行うことができる。
【００４４】
また、本発明の磁性担体は、好ましくは、上述した糖質に特異的に結合し得るタンパク質そのものよりも、該タンパク質の一部または全部を含んでなり糖への親和性を有する融合タンパク質に対して相対的に高い親和性を有する。このような性質を有する本発明の磁性担体は、後述するように糖質に特異的に結合し得るタンパク質の一部または全部を含んでなり糖への親和性を有する融合タンパク質を含有する生物試料より当該融合タンパク質を精製するのに好適に用いることができる。好ましくは、糖質に特異的に結合し得るタンパク質と、該タンパク質の一部または全部を含んでなり糖への親和性を有する融合タンパク質を発現した組換体の破砕液に対して精製操作した場合（具体的には、実験例４および実験例５の方法に従って精製操作した場合）、融合タンパク質と実質的に１００％結合する磁性担体が挙げられる。ここでいう「融合タンパク質と実質的に１００％結合する」とは、糖質に特異的に結合し得るタンパク質を含む融合タンパク質以外のタンパク質の磁性担体への結合量が検出限界未満であることをいう。また、タンパク質の磁性担体への結合量は、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量法および吸光度（２８０ｎｍ）測定により求めることができる。すなわち、「融合タンパク質と実質的に１００％結合する」とは、これらのタンパク質定量法では検出できない程度にしか融合タンパク質以外のタンパク質が結合していないことをいう。
【００４５】
さらに、本発明の磁性担体は、好ましくは、担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出がなされるという特性を有する。溶出が特定のバッファー種に特異性を示すということは、使用バッファーで溶出の有無をコントロールできることを示しており、とりわけ本発明の担体を固定化酵素用担体として利用する際に、固定化酵素の寿命が向上するという点で大きな効果が期待できる。好ましくは、担体に結合したタンパク質の回収率が、リン酸バッファーによる場合６０％以上（好ましくは８０％以上）であり、他のバッファーによる場合２０％以下（好ましくは１０％以下）である。ここでいうリン酸バッファーとしては、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファーなどが挙げられ、中でも２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０〜８．０）が好ましく、特に５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）が好ましい。また、ここでいう他のバッファーとしては、２０ｍＭ〜１００ｍＭのトリス塩酸バッファー、トリス硫酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ホウ酸バッファーなどが挙げられ、特に５０ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、トリス硫酸バッファー（ｐＨ８．０）、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．７）、ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）、ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、ホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）が挙げられる。なお、ここでいうタンパク質の溶出は、例えば、目的タンパク質がマルトース結合タンパク質である場合には、１ｍＭ〜１００ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）のマルトースを含むバッファーにより行う。また、ここでいう「タンパク質の回収率」は、精製したタンパク質をサンプルとして磁性担体を用いた精製操作を行い、得られた（回収された）タンパク質の量と（元の）サンプルとしたタンパク質の量の比である。なお、タンパク質量は、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量法および吸光度（２８０ｎｍ）測定により求めることができる。
【００４６】
本発明はまた、上述してきた磁性担体を用いて、上記糖質に特異的に結合し得るタンパク質を含有する生物試料から当該タンパク質を精製する方法を提供する。本発明のタンパク質の精製方法は、［１］上記タンパク質を磁性担体に結合させる工程と、［２］磁性担体に結合させたタンパク質を、生物試料から単離させる工程と、［３］生物試料から単離された磁性担体に結合したタンパク質を、磁性担体から分離させる工程とを経て、タンパク質を精製することを特徴とする。
【００４７】
［１］の工程ではまず、目的タンパク質を含有する生物試料と、磁性担体とを混合し、目的タンパク質と磁性担体とを結合させる。当該目的タンパク質と磁性担体の結合の方法は、適宜のバッファー中でこれらが互いに接触し得る程度に混合させるならば、特に制限はない。この混合は、例えばチューブを軽く転倒攪拌あるいは振盪することによる程度で充分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて行うことができる。
【００４８】
当該［１］の工程を行うに際して、磁性担体は、適宜の分散媒中に分散されて、タンパク質抽出用液として予め調製されているのが好ましい。磁性担体を分散させる分散媒としては、特に制限はないが、タンパク質の精製に一般的に用いられているバッファーであることから、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸バッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ホウ酸バッファーなどが好ましく、中でも２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０〜８．０）を使用するのが好ましい。
【００４９】
タンパク質抽出用液の調製に際し、磁性担体は、分散液の濃度が０．１ｇ／ｍＬ〜１．０ｇ／ｍＬとなるように添加されるのが好ましい。０．１ｇ／ｍＬ未満であると、タンパク質を多く保持させることができず、集磁性も悪くなる傾向にあるためであり、また１．０ｇ／ｍＬを超えると、分散液の分散性も保存安定性も悪くなる傾向にあるためである。
【００５０】
タンパク質抽出用液と生物試料との混合の割合は目的タンパク質の分子量に応じて左右されるが、磁性担体と生物試料中に含有される目的タンパク質との重量比が、１：０．００１〜１：０．１となるような割合であるのが好ましい。
【００５１】
続く［２］の工程では、上記［１］の工程で磁性担体と結合させた目的タンパク質を、磁性担体ごと生物試料中から単離する。当該単離は、遠心分離やフィルター分離によって行ってよいが、操作が容易であり短時間で特異的な単離が可能であることから、精製装置全体の小型化や連続的な処理、自動化処理を容易にし得る観点より、磁場、すなわち磁石を使用して行うのが好ましい。使用する磁石としては、例えば、磁束密度が０．０３Ｔ（３００ガウス）程度の磁石が好適に使用され得る。具体的には、上記［１］の工程を適宜のチューブ中で行い、磁性担体と目的タンパク質との結合後、チューブの側壁に磁石を近づけて目的タンパク質が結合した磁性担体をチューブ側壁近傍に集めた状態で、チューブ内から残りの液を排出することによって、単離すればよい。
【００５２】
［３］の工程では、上述のようにして生物試料より単離した目的タンパク質を、磁性担体より分離させる。この工程では、例えば、タンパク質を溶離させ得る溶出用液を、［２］の工程後のチューブ内に注入し、タンパク質を磁性担体より溶離させる。その後、磁性担体を再び磁石で捕集して、チューブ内から除去することにより、目的タンパク質が磁性担体より分離される。
【００５３】
上記タンパク質を溶離させ得る溶出用液としては、該タンパク質に親和性をもつ糖質を含有する溶液が好適に使用される。例えば、目的タンパク質がマルトース結合タンパク質である場合には、１ｍＭ〜１００ｍＭのマルトースを含むバッファーが例示される。バッファーとしては、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸塩バッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ホウ酸バッファーなどが挙げられ、中でも２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０〜８．０）が好ましい。
【００５４】
上記のような［１］〜［３］の工程を基本的に含有する精製方法を経て、生物試料中から目的とするタンパク質を精製することができる。このような本発明の精製方法は、従来と比較して利便性が飛躍的に向上された方法であり、自動化およびハイスループット化が可能である。
【００５５】
さらに、本発明は、上述してきた磁性担体を用いて、糖質に特異的に結合し得るタンパク質と、該タンパク質の一部または全部を含んでなり糖への親和性を有する融合タンパク質融合タンパク質を含有する生物試料から当該融合タンパク質を精製する方法を提供する。当該本発明の融合タンパク質の精製方法は、［１］上記融合タンパク質を磁性担体に結合させる工程と、［２］磁性担体に結合させた融合タンパク質を、生物試料から単離させる工程と、［３］生物試料から単離された磁性担体に結合した融合タンパク質を、磁性担体から分離させる工程とを経て、融合タンパク質を精製することを特徴とする。また、［１］〜［３］の各工程は、上記糖質に特異的に結合し得るタンパク質の精製方法に準じて行えばよい。このような［１］〜［３］の工程を基本的に含有する精製方法を経て、糖質に特異的に結合し得るタンパク質と、当該タンパク質を含んでなる融合タンパク質を含有する生物試料中から目的とする融合タンパク質を精製することができる。このような本発明の精製方法は、従来と比較して利便性が飛躍的に向上された方法であり、自動化およびハイスループット化が可能である。
【００５６】
なお本発明の磁性担体は、当該磁性担体と、当該磁性担体を分散させて上記タンパク質抽出用液を調製するための分散媒と、上述したタンパク質を溶離可能な溶出用液とを、あるいは、当該磁性担体を含有する上記タンパク質抽出用液と、上述したタンパク質を溶離可能な溶出用液とを、それぞれ別のチューブ等に収容したタンパク質精製用の試薬キットとして供されてもよい。このような本発明の試薬キットは、タンパク質を精製する際に、様々な試薬等を各々準備、調製する手間を省き、迅速に、必要な量だけ用いて本発明の方法を実施することができる。
【００５７】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を記載して、より具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００５８】
実施例１
＜マグネタイト粒子の合成＞
アミロースで被着処理を行うマグネタイト粒子を、以下の方法により合成した。１００ｇの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を１０００ｃｃの純水に溶解した。この硫酸第一鉄と等倍モルになるように、２８．８ｇの水酸化ナトリウムを５００ｃｃの純水に溶解した。次に硫酸第一鉄水溶液を攪拌しながら、１時間かけて水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、水酸化第一鉄の沈殿物を生成させた。滴下終了後、攪拌しながら、水酸化第一鉄の沈殿物を含む懸濁液の温度を８５℃まで昇温した。懸濁液の温度が８５℃に達した後、２００Ｌ／ｈｒの速度で、エアーポンプを使用して空気を吹き込みながら、８時間酸化して、マグネタイト粒子を生成させた。このマグネタイト粒子は、ほぼ球形で、平均粒子サイズは、０．２８μｍであった。
なおマグネタイト粒子の平均粒子サイズは、透過型電子顕微鏡写真上、３００個の粒子サイズを測定し、その数平均として求めた。
【００５９】
＜アミロースの被着処理＞
上述のようにして合成したマグネタイト粒子１０ｇを、５０ｃｃの純水中に分散させた。この分散液中に、常温（２０℃）でアミロースを１ｇ添加して３０分間攪拌した後、攪拌しながら９０℃まで加熱した。さらに９０℃で１時間攪拌した後、攪拌を続けながら室温まで徐冷した。アミロースは、加熱すると溶解しやすくなり、冷却すると溶解しにくくなるため、この冷却過程において、アミロースがマグネタイト粒子の表面に析出する。このようにしてマグネタイト粒子がアミロースで形成された糖質層にて被覆されてなる磁性担体（アミロース被覆マグネタイト粒子）を作製した。
得られたアミロース被覆マグネタイト粒子は、平均粒子サイズが０．６μｍの球状あるいは粒状形状であり、振動試料型磁力計（東英工業（株）製）を用いて、７９６．５ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加して測定された飽和磁化が７５．１Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）、保磁力が７．１７ｋＡ／ｍ（９０エルステッド）であった。
【００６０】
実施例２
水酸化第一鉄の沈殿物を含む懸濁液の温度を８５℃から６０℃に変更してマグネタイト粒子を合成した以外は実施例１と同様にして、磁性担体（アミロース被覆マグネタイト粒子）を作製した。
合成されたマグネタイト粒子は平均粒子サイズが０．１３μｍの球状形状であり、また得られたアミロース被覆マグネタイト粒子は、平均粒子サイズが０．４μｍの球状あるいは粒状形状であり、実施例１と同様の方法にて測定された飽和磁化が７３．８Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）、保磁力が８．３６ｋＡ／ｍ（１０５エルステッド）であった。
【００６１】
実施例３
アミロースの添加量を１ｇから２ｇに変更してアミロースの被着処理を行った以外は実施例１と同様にして、磁性担体（アミロース被覆マグネタイト粒子）を作製した。
得られたアミロース被覆マグネタイト粒子は、平均粒子サイズが０．８μｍの球状あるいは粒状形状であり、実施例１と同様の方法にて測定された飽和磁化が６９．７Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）、保磁力が７．５７ｋＡ／ｍ（９５エルステッド）であった。
【００６２】
実験例１〜３
実施例１〜３でそれぞれ作製したアミロース被覆マグネタイト粒子を用いて、以下の手順にて、生物試料中から目的タンパク質を抽出・精製した。
タンパク質を単離するための生物試料としては、プラスミドｐＭＡＬｃ２Ｅ（β−ガラクトシダーゼα鎖のアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＬａｃＺαを発現するプラスミド（New England Biolab社より販売されている））を保持する大腸菌（Escherichia coli JM109（東洋紡績より販売されている））を５０ｍＬ  ＴＢ培地／５００ｍＬフラスコにて３７℃、２０時間培養した菌体を用いた。菌体を菌体濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が２０となる様５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波にて９分間間欠破砕後、上清を遠心分離して調製し、これをタンパク質精製用の生物試料として用いた。
まず、上記各アミロース被覆マグネタイト粒子を０．２ｇ／ｍＬになるように５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中に分散させた。各アミロース被覆マグネタイト粒子分散液を１００μＬ、生物試料１ｍＬにそれぞれ混合して混合液とした。固液分離後洗浄液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５）にて洗浄し、アミロース被覆マグネタイト粒子に結合したタンパク質を回収するための溶出用液として１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を使用した。
【００６３】
具体的な操作としては、以下のとおりである。
（１）各混合液の菌体濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定し、遠心チューブにて菌体を遠心分離した。次に菌体を菌体濁度が２０となる様５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波にて９分間間欠破砕後上清を遠心分離して調製した。
（２）上清１ｍＬを１．５ｃｃ用エッペンドルフチューブに移して生物試料とし、これにアミロース被覆マグネタイト粒子分散液１００μＬを加えて約５分間混合した。
（３）１．５ｃｃ用エッペンドルフチューブの形状に合った磁石スタンドに、上記チューブを設置することにより、アミロース被覆マグネタイト粒子を磁石側に集めた。
（４）フィルターチップで溶液を吸引し、排出した。
（５）チューブを磁石スタンドより取りはずし、洗浄液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５）を１ｃｃ注入した。
（６）アミロース被覆マグネタイト粒子と十分混合した後、再度磁石スタンドに設置し、上記と同様にして溶液を廃棄した。
【００６４】
上記の方法でタンパク質を結合させたアミロース被覆マグネタイト粒子に、５０μＬの１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加え、約５分間混合した。次に、磁石スタンドに設置し、回収する溶液をフィルターチップで吸引し、別の新しいチューブに移した。回収量は、４０μＬとした。回収したタンパク質について、吸光度計により吸光度（ＯＤ：２８０ｎｍ）を測定して、濃度を求めた。タンパク質の回収量は、上記タンパク質濃度に回収容積を掛けて算出した。
【００６５】
結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
0003979949.tif 000002
【００６７】
また図１は、精製前の種々のタンパク質の混合液である生物試料（図１（ａ））と、本方法にて精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＬａｃＺα（図１（ｂ））とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す図である。図１から明らかなように、本方法にて、極めて簡便な操作で高純度のタンパク質が得られることが判る。
【００６８】
実験例４
実施例２で作製したアミロース被覆マグネタイト粒子を用いて、以下の手順にて、生物試料中から目的タンパク質を抽出・精製し、該マグネタイト粒子の分散液中での安定性を調べた。
タンパク質を単離するための生物試料としては、プラスミドｐＭＡＬ  ｃ２Ｅを改変して大腸菌トランスポザーゼのアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を発現するようにしたプラスミド（ｐＭＡＬ−ＴＮＰ１）を保持する大腸菌（Escherichia coli JM109（東洋紡績より販売されている））を５０ｍＬ  ＴＢ培地／５００ｍＬフラスコにて３７℃、２０時間培養した菌体を用いた。菌体を菌体濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が２０となる様５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波にて９分間間欠破砕後、上清を遠心分離して調製し、これをタンパク質精製用の生物試料として用いた。
まず、上記アミロース被覆マグネタイト粒子を０．２ｇ／ｍＬになるように５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中に分散させた。該分散液、および該分散液を３０日間冷蔵（４℃）保存した分散液を用いて、実験例１〜３に示した方法にて上記生物試料より融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を精製した。
【００６９】
図２は、分散直後のアミロース被覆マグネタイト粒子と、分散後３０日間冷蔵（４℃）保存したアミロース被覆マグネタイト粒子にて、それぞれ精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す図である。また、分散直後および分散後３０日間冷蔵（４℃）保存したアミロース被覆マグネタイト粒子のタンパク質結合能力を０．２ｇのアミロース被覆マグネタイト粒子で精製できる融合タンパク質の量を吸光度（２８０ｎｍ）測定によるタンパク質定量法により定量して求めたところ、それぞれ５００μｇ／ｇ−粒子および４５０μｇ／ｇ−粒子であった。すなわち、本発明のアミロース被覆マグネタイト粒子は、分散液中での３０日間の冷蔵（４℃）保存によっても、保存前のタンパク質結合能力の８０％以上を保つことが判る。
【００７０】
実験例５
実施例２で作製したアミロース被覆マグネタイト粒子、および市販のアミロース被覆レジン（New England Biolab社より販売されている）を用いて、以下の手順にて、実験例４に示した生物試料中から目的タンパク質を抽出・精製した。
アミロース被覆マグネタイト粒子を用いてタンパク質を精製する方法は、実験例４に準じた。市販のアミロース被覆レジンについては、まず、該レジンを０．２ｇ／ｍｌになるように５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中に分散させた。アミロース被覆レジン分散液を１００μＬ、生物試料１ｍＬにそれぞれ混合して混合液とした。固液分離後洗浄液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５）にて洗浄し、アミロース被覆レジンに結合したタンパク質を回収するための溶出用液として１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を使用した。
【００７１】
具体的な操作としては、以下のとおりである。
（１）各混合液の菌体濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定し、遠心チューブにて菌体を遠心分離した。次に菌体を菌体濁度が２０となるように５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波にて９分間間欠破砕後上清を遠心分離して調製した。
（２）上清１ｍＬを１．５ｃｃ用エッペンドルフチューブに移して生物試料とし、これにアミロース被覆レジン分散液１００μＬを加えて約５分間混合した。
（３）約３ｃｃの容量を持つフィルター装置（ミリポア社より販売されている）を使用し、上記のアミロース被覆レジンと生物試料との混合液を濾過した。
（４）アミロース被覆レジンが残されたフィルター装置に洗浄液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５）を１ｃｃ注入し、十分混合した後、溶液を濾過した。
【００７２】
上記の方法でタンパク質を結合させたアミロース被覆レジンに、５０μＬの１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加え、約５分間混合した。次に、上記フィルター装置に付属の回収装置を使用し、溶液を回収した。
【００７３】
図３は、アミロース被覆マグネタイト粒子と、市販のアミロース被覆レジンにて、それぞれ精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す図である。図３から明らかなように、本発明のアミロース被覆マグネタイト粒子が、糖結合性タンパク質そのもの（非融合タンパク質）よりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質との融合タンパク質（目的融合タンパク質）に対して高い親和性を有することが判る。
【００７４】
更に、精製タンパク質量の分析結果と上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質定量法の結果を基に、融合タンパク質と非融合タンパク質の精製量を測定した。その結果、市販のアミロース被覆レジンを用いた場合では、融合タンパク質が平均０．８μｇ（繰り返し数３）に対し非融合タンパク質が平均０．１４μｇ混入してしまう。これに対し、本発明のアミロース被覆マグネタイト粒子を用いた場合では、融合タンパク質が平均４．３μｇ（繰り返し数３）に対し非融合タンパク質が平均０μｇ、つまり混入が検出されなかった。すなわち、本発明のアミロース被覆マグネタイト粒子が、糖結合性タンパク質そのもの（非融合タンパク質）よりも、糖結合タンパク質と糖結合性を実質的に示さないタンパク質との融合タンパク質（目的融合タンパク質）に対して高い親和性を有することが数値的に実証された。
【００７５】
実験例６
実施例２で作製したアミロース被覆マグネタイト粒子を用いて、以下の手順にて、実験例４に示した生物試料中から目的タンパク質を抽出・精製した。
アミロース被覆マグネタイト粒子を用いてタンパク質を精製する方法は、アミロース被覆マグネタイト粒子に結合したタンパク質を回収するための溶出用液の組成を除き、実験例４に準じた。本実験例では、該溶出用液として、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を使用した方法を比較した。
【００７６】
図４は、アミロース被覆マグネタイト粒子に結合したタンパク質を回収するための溶出用液として、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を使用し、それぞれ精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す図である。図４から明らかなように、本発明のアミロース被覆マグネタイト粒子が、担体に結合したタンパク質の溶出に際し、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出が為される性質を有することが判る。
【００７７】
また、実際に、種々の溶出バッファーによるタンパク質の回収率を、タンパク質のＡ２８０を測定することにより求めた。すなわち、精製した融合タンパク質をサンプルとして精製操作を行い、得られた融合タンパク質の量と（元の）サンプルとした融合タンパク質の量の比により回収率を求めた。その結果、回収率は以下の表２の通りとなり、溶出液にリン酸バッファーを用いることで他のバッファーを用いる条件よりも効率的に溶出が為される性質を有することが数値的に実証された。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
【発明の効果】
本発明により、簡便で自動化およびハイスループット化が可能なタンパク質の精製方法およびそのための材料を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製前の試料と本方法にて精製したβ−ガラクトシダーゼα鎖のアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＬａｃＺαをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す。
【図２】分散直後のアミロース被覆マグネタイト粒子と、分散後３０日間冷蔵（４℃）保存したアミロース被覆マグネタイト粒子にて、それぞれ精製した大腸菌トランスポザーゼのアミノ末端にマルトース結合タンパク質が結合している融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す。
【図３】アミロース被覆マグネタイト粒子と、市販のアミロース被覆レジンにて、それぞれ精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す。
【図４】アミロース被覆マグネタイト粒子に結合したタンパク質を回収するための溶出用液として、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、１０ｍＭマルトースを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を使用し、それぞれ精製した融合タンパク質ＭＢＰ−ＴＮＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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