(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−ミオ−イノシトールを１−エピ化によりＤ−キロ−イノシトールに変換する酵素活性とＤ−キロ−イノシトールを６−エピ化によりＤ−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性とを有するＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉ）と、前記Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号３に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉｉ）とから成るＤＮＡ。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載される配列表の配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉ）は、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列であり、また請求の範囲第１項に記載される配列表の配列番号３のアミノ酸配列をコードＤＮＡ領域（ｉｉ）は、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載されるＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼは、産業技術総合研究所にブダペスト条約によりＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９の受託番号で寄託されたアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株の細菌に由来するＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼである、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載のＤＮＡを内部ＤＮＡ領域として含有するＤＮＡ断片であって、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇに至る１９３１  ｂｐのサイズの塩基配列を有することを特徴とする、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットのタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼαユニットのタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列表の配列番号２に示される３３６個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列と、配列番号３に示される２６１個のアミノ酸によりなるアミノ酸配列とを含有する、請求の範囲第７項に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８ｂｐのサイズのＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３ｂｐのサイズのＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼαユニットの活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡにおける１個もしくは数個の塩基が欠失、置換および（または）付加されることで形成された改変ＤＮＡであって、前記の１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡに対してストリジェントな条件でハイブリダイズすることができ且つＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性をもつタンパク質をコードする改変ＤＮＡ。
【請求項１２】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡにおける６９２番目の塩基Ｇが塩基Ａにより置換されることにより形成された改変ＤＮＡである、請求の範囲第１１項に記載の改変ＤＮＡ。
【請求項１３】
配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡによりコードされるところの、配列番号１に記載の合計５９７個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列における３６番目のアミノ酸、バリンがイソロイシンにより置換されることにより形成された組換タンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性をもつ組換タンパク質をコードする、請求の範囲第１２項に記載の改変ＤＮＡ。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡの一部からなるＤＮＡを、ＰＣＲ法のためのプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのクローニング方法。
【請求項１５】
制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のＤＮＡの切断断片に対して、配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列のうちの４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇに至る請求の範囲第４項に記載の１９３１ｂｐのサイズの塩基配列を有して且つＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片を連結してなるプラスミドが、導入されることにより形質転換された宿主微生物を作成し、この形質転換した宿主微生物を培養して宿主菌体内に導入した遺伝子を発現させ、このように導入遺伝子を発現させた形質転換宿主微生物の菌体を、緩衝液または培地中でＤ−ミオ−イノシトールに作用させてＤ−キロ−イノシトールを生成することから成る、Ｄ−キロ−イノシトールの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットのタンパク質をコードする新規なＤＮＡならびに該ＤＮＡでコードされるタンパク質に関し、また前記の新規ＤＮＡを内部ＤＮＡ領域として含有する新規なＤＮＡ断片にも関する。さらに、本発明は、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質をコードする新規なＤＮＡとβユニットタンパク質をコードする新規なＤＮＡ、ならびにこれら新規なＤＮＡによりコードされるタンパク質にも関する。
さらに、本発明は、上記の本発明ＤＮＡを外来遺伝子として導入された宿主微生物を利用して、その菌体をＤ−ミオ−イノシトールに作用することによってＤ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを製造する方法も包含する。さらにまた、本発明は、前記の本発明ＤＮＡとストリジェントな条件でハイブリダイズする改変ＤＮＡを包含する。また本発明は前記の新規なＤＮＡ、またはその一部からなるＤＮＡをＰＣＲ法のためのプローブまたはプライマーとして用いる、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのクローニング方法を包含する。
背景技術
Ｄ−キロ−イノシトールは、経口投与可能な化合物で、細胞内情報伝達を活性化するイノシトール脂質系に作用して、ＩＩ型糖尿病の治療（特表平４−５０５２１８号）、および、多嚢胞性卵巣症候群の治療（ＵＳＰ５９０６９７９号；Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊ．Ｅ．Ｎｅｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年、３４０巻、１３１４頁）に医療効果をもたらすことが提唱されている治療剤である。Ｄ−キロ−イノシトールは、機能的には広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
Ｄ−キロ−イノシトールは、９種類あるイノシトール立体異性体の一つであり、その製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンを加水分解し、製造する方法（ＵＳＰ５０９１５９６号、ＵＳＰ５４６３１４２号、ＵＳＰ５７１４６４３号）、またマメ科植物に含有されるＤ−ピニトールを加水分解し、製造する方法（ＵＳＰ５８２７８９６号）、さらに有機合成により製造する方法（ＵＳＰ５４０６００５号、ＷＯ９６／２５３８１号）、その他が知られる。
しかしながら、カスガマイシンやＤ−ビニトールを出発原料とする場合、これらの物質が高価であり、また、有機合成により製造する場合も収率および光学純度が低く、最終産物であるＤ−キロ−イノシトールは高価なものになる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネスまたはアグロバクテリウム・ルビの細菌をミオ−イノシトールに作用させて、これから、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシトールの混合物を製造する方法も知られる（特開平９−１４０３８８号）。この方法では、４種のイノシトール立体異性体の混合物が生成するため、そして特にＤ体とＬ体との分離が困難であるので精製操作が煩雑であり、単離されたＤ−キロ−イノシトールの最終的な収率は１％以下の低収率である。
ミオ−イノシトールは、次式
0003887600.tif 000002
で示される化学構造を有する。なお、式（Ａ）ではＤ−ミオ−イノシトールとして炭素番号を付けてある。Ｄ−キロ−イノシトールは次式（Ｂ）
0003887600.tif 000003
で示される化学構造を有する。Ｄ−ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとは、エピマーの関係にある。
先に、ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９として寄託中）の菌体またはその菌体破砕物を作用させて、ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換させることを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提案された（日本特願平１１−１７９７９６号、１９９９年６月２５日出願）。しかし、この方法では、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換率が良くなく、また所望のＤ−キロ−イノシトールの精製品の収率も満足できないという不都合がある。
発明の開示
本発明者らは、Ｄ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールの製造に１−エピメラーゼ酵素を直接に用いる反応により、より効率的であり且つ副生物のないＤ−キロ−イノシトールの製造が可能であると考えた。そこで、１−エピメラーゼ酵素を用いてＤ−キロ−イノシトールを製造する方法を検討した。このような作用の１−エピメラーゼ酵素を有する微生物として、土壌より単離した前記のアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株が、Ｄ−ミオ−イノシトールを基質として利用してＤ−キロ−イノシトールを生成する酵素活性を有するＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを産生することが見出された。また、本菌株からＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを単離する研究を行った。
前記のアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から新規酵素としてＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを得ることに成功した（後記の実施例１参照）。この酵素は、Ｄ−ミオ−イノシトールを１−エピ化によりＤ−キロ−イノシトールに変換する酵素活性と、Ｄ−キロ−イノシトールを６−エピ化によりＤ−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性を有することが見出された。しかも、本発明者らにより、この酵素、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼは、次の諸性質を有すると認められた。
（１）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールの異性化（エピ化）を触媒する酵素活性または作用を有する
（２）補酵素特異性：酵素活性の発現に補酵素としてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を要求する
（３）Ｋｍ値：Ｄ−キロ−イノシトールでは５６ｍＭ、ミオ−イノシトールでは１７ｍＭである
（４）分子構造と分子量：本酵素は、補酵素を結合するβユニットと、補酵素を結合しないαユニットとが１：１に結合するサブユニット構造を持ち、前記の両ユニットの共存下に酵素活性を有する。補酵素を結合するβユニットの分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で３５，０００〜３７，０００ダルトンであり、補酵素を結合しないαユニットの分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で２７，０００〜２９，０００ダルトンである
（５）至適ｐＨ：２５℃で、ｐＨ８．５から９．０の範囲にある
（６）温度安定性：ｐＨ７．０で１０分間保持したとき、補酵素を結合するβユニットは約４０℃までの温度で安定である。補酵素を結合しないαユニットは約３０℃までの温度で安定である
（７）金属塩の影響：Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋の存在下に酵素活性は増強される。Ｃｕ２＋またはＮｉ２＋の存在下では酵素活性は阻害される。
この新規酵素は、上記のようにＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼと命名されたが、Ｄ−ミオ−イノシトールを１−エピ化する酵素活性より強い、Ｄ−キロ−イノシトールを６−エピ化する活性を有することから、Ｄ−キロ−イノシトール  ６−エピメラーゼと称することもできる。
本発明の第１の目的は、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株の菌体から前記のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを酵素工学的手法により単離、精製し、精製されたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素学的性質を明らかにさせ、しかもまた前記のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードする遺伝子を遺伝子工学的な手法で収得し、そしてこの遺伝子のＤＮＡ配列を解明することにある。
本発明の第２の目的は、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードし得る新規なＤＮＡまたはこれの改変ＤＮＡを提供し、またその新規なＤＮＡを内部ＤＮＡ領域として含有して、前記の１−エピメラーゼをコードすることのできる新規なＤＮＡ断片を提供することにある。本発明の別の目的は、本発明で得られた新規なＤＮＡを利用して、Ｄ−ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換する方法を提供することにある。本発明のその他の目的は、次の記載から明らかとなるものである。
本発明者らは、上記の課題を解決するために一連の研究を行った。先ず、前記のＡＢ１０１２１株からＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを酵素工学的方法により単離して精製する研究を行い、本酵素の単離、精製に成功した。さらに該ＡＢ１０１２１株の菌体の染色体ＤＮＡから、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを分離する研究を行った。その研究の一つの過程において、後記に詳しく説明される遺伝子工学的方法に従って、ＡＢ１０１２１株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用い且つ適当に設計されたプライマーＤＮＡとして後記のプライマーＡｅｐｉ−１ＦおよびＡｉｎ−２Ｒを用いるＰＣＲ法を採用すると、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的ＤＮＡ配列を含有する約７００  ｂｐのＤＮＡ断片−Ａが得られることを見出し、またこのことに成功した。また、適当に設計されたプライマーＤＮＡとして後記のプライマーＢｅｐｉ−１ＦおよびＢｉｎ−２Ｒを用いるＰＣＲ法を採用すると、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的ＤＮＡ配列を含有する８２２  ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂが得られることを見出し、またこのことに成功した。
前記のＤＮＡ断片−ＡとＤＮＡ断片−Ｂとの塩基配列を解析して決定することによって、前記のαユニット遺伝子の部分的ＤＮＡ配列の塩基配列と、前記のβユニット遺伝子の部分的ＤＮＡ配列の塩基配列とが解明された。
αユニット遺伝子の解明された部分的ＤＮＡ配列の塩基配列を参考にして工夫、設計された後記の２種のプライマーＡｅｐｉ−４ＦおよびＡｅｐｉ−３Ｒを作製した。これら２種のプライマーを用いて且つ前記のＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、リバースＰＣＲ法（細胞工学、１４巻、ｐ５９１−５９３、１９９５年、参照）を行った。このことによって、約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ断片−Ｃを得ることに成功した。このＤＮＡ断片−Ｃの塩基配列を解析し、ＤＮＡ断片−ＣとＤＮＡ断片−Ａの塩基配列のデータと組合せることにより、配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列には、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット遺伝子とαユニット遺伝子が含まれていると判明した。
他方、前述したβユニット遺伝子の解明された部分的ＤＮＡ配列の塩基配列を参考にして工夫、設計された後記の２種のプライマーＢｅｐｉ−４ＦおよびＢｅｐｉ−３Ｒを作製した。これら２種のプライマーを用いて且つ前記のＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、リバースＰＣＲ法を行った。このことによって、約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ断片−Ｄを得ることに成功した。
このＤＮＡ断片−Ｄの塩基配列を解析し、ＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列を組合せることにより、前記のＤＮＡ断片−ＣとＤＮＡ断片−Ａを組合せた場合と全く同じ塩基配列を有することが認めらた。
配列表の配列番号１のコード領域を、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの化学分析で解明された部分的なアミノ酸配列と比較して研究した。その結果、配列表の配列番号１の塩基配列の内部には、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットをコードする２つの遺伝子の全塩基配列が含有されると判明した。
更に、配列表の配列番号１の塩基配列中のコードＤＮＡ領域を参考にして後記の２種のプライマーＢｅｐｉ−８ＦおよびＡｅｐｉ−６Ｒを作製した。これら２種のプライマーを用いて且つ前記ＡＢ１０１２１株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ法を行った。これによって、１９３２  ｂｐの塩基配列より成るＤＮＡ断片−Ｅを得ることに成功した。
配列表の配列番号１の塩基配列を調べると、この塩基配列には、２つのコード領域が含まれていることが認められ、その５’側にある上流の第１のコード領域は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードしていること、および第１のコード領域の３’側に続く数個の塩基（ＧＧＴＣＴＴＴＣ）よりなるＤＮＡ配列を介して、下流にある第２のコード領域は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードしていることが判明した。
さらに、上記の第１のコード領域でコードされるアミノ酸配列（配列番号２）をもつポリペプチドは、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットのタンパク質であること、また上記の第２のコード領域でコードされるアミノ酸配列（配列番号３）をもつポリペプチドは、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼαユニットのタンパク質であることが本発明者によって決定された。
さらに前記の１９３２  ｂｐのサイズを有するＤＮＡ断片−Ｅは、これの塩基配列を解析すると、前記の２５８１  ｂｐのサイズの配列番号１の塩基配列の４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇに至る１９３１  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列と５’側末端の塩基１個とを含有することが認められ、従って、１９３２  ｂｐのＤＮＡ断片−Ｅは、前記の２５８１  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片と共通して、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をコードする第１のコードする領域と、それに続くＤＮＡ配列と、これに続く第２のコード領域、すなわち配列番号３のアミノ酸配列をコードする第２のコード領域とを含有することが解明された。
上記の１９３２  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−Ｅをプラスミドベクターに連結し、この連結されたＤＮＡとしてのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた大腸菌形質転換株の菌体を外来遺伝子の発現の誘導のための処理にかけた。そのように処理された大腸菌形質転換株の菌体を培養すると、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼに相当するタンパク質を産生できることが確認できた。さらに、そのように処理された大腸菌形質転換株の菌体をＤ−ミオ−イノシトールに作用させると、Ｄ−キロ−イノシトールを生成できること、またＤ−キロ−イノシトールに作用させると、Ｄ−ミオ−イノシトールを生成できることが確認された。
こうして、本発明者らによって今回、得られた前記の２５８１  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−ＣとＤＮＡ断片−Ａを組合せた塩基配列および１９３２  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−Ｅは、ともに、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードする遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有することが確認された。前記に示したように本発明者により見出された諸知見に基づいて、本発明は完成された。
従って、第１の本発明においては、Ｄ−ミオ−イノシトールを１−エピ化によりＤ−キロ−イノシトールに変換する酵素活性とＤ−キロ−イノシトールを６−エピ化によりＤ−ミオ−イノシトールに変換する酵素活性とを有するＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉ）と、前記Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質を構成するところの配列表の配列番号３に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉｉ）とから成るＤＮＡが提供される。
第１の本発明によるＤＮＡは、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉ）としての、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列と、配列表の配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域（ｉｉ）としての、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列とを含有することを特徴とする、ＤＮＡであることができる。
第２の本発明においては、第１の本発明のＤＮＡを内部ＤＮＡ領域として含有するＤＮＡ断片であって、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇに至る１９３２  ｂｐのサイズの塩基配列を有することを特徴とする、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの各遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片が提供される。
第３の本発明においては配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットのタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
第４の本発明においては、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼαユニットのタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
第５の本発明においては、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質が提供される。
第５の本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に示される３３６個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列と、配列番号３に示される２６１個のアミノ酸によりなるアミノ酸配列とを含有する、タンパク質であることができる。
第６の本発明においては、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８  ｂｐのサイズのＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの活性を有するタンパク質が提供される。
また、第７の本発明においては、配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３ｂｐのサイズのＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼαユニットの活性を有するタンパク質が提供される。
さらに、第１の本発明のＤＮＡを得るためにＰＣＲ法でテンプレートとして使用されるＤＮＡ染色体を有して、しかもＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ産生能を有する微生物の具体例は、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９の受託番号で寄託中）である。本菌株の菌学的性質は次の通りである。
尚、本菌株の同定の当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１（１９８４）を参考にして同定した。
（ＡＢ１０１２１株の菌学的性質）
（ａ）形態的特徴
（１）細胞形態：桿菌で大きさは０．５〜０．７×０．９〜２．８μｍ。多形性は無い。
（２）運動性：懸滴法及びＳＩＭ培地での観察の結果、運動性は認められなかった。
（３）普通寒天培地上での生育状態：生育は中程度。コロニー形態は円形、平滑で光沢を帯びる。
（ｂ）生理生化学的性状
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以上の通り、ＡＢ１０１２１株の主性状は、グラム陰性の桿菌で、大きさは０．５〜０．７×０．９〜２．８μｍである。グルコースを好気的に分解し、酸を生成する。カタラーゼ、オキシダーゼ、３−ケトラクトン酸テストに陽性であった。これらの菌学的性質を総合して検索した結果、本菌株はアグロバクテリウム属に属する菌株であると判断した。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１（１９８４）２４４頁−２５４頁によると、アグロバクテリウム属細菌は４種に分類されているが、ＡＢ１０１２１株はいずれの種とも、その菌学的性質において完全には合致しなかった。従って、本菌株を公知のものと区別するため、アグロバクテリウム・エスピー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＢ１０１２１と命名し、１９９９年５月７日に工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７３８３として寄託された。工業技術院生命工学工業技術研究所は２００１年に独立行政法人産業技術総合研究所に編入されたので、該ＡＢ１０１２１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に在る独立行政法人  産業技術総合研究所にブダペスト条約の規約下に２００１年７月３０日に移管寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９の受託番号で同研究所に寄託されている。
第１の本発明のＤＮＡはＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードする遺伝子であり、第１の本発明のＤＮＡは、その遺伝子の由来に関わらずＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードでき、好適には、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来の遺伝子であるＤＮＡであることができる。第１の本発明のＤＮＡの使用形態は、このＤＮＡを組み込んだ微生物を構築し、そのＤＮＡを発現させて、そのコードするＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを生成、機能させることである。
第１の本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡを導入された宿主の菌のプラスミドおよび染色体上のいずれに存在していてもかまわない。第１の本発明のＤＮＡでコードされるタンパク質を発現させるための宿主・ベクター系は、この遺伝子が安定に維持され発現される宿主・ベクター系であればいずれの宿主・ベクター系でもかまわないが、好適には宿主として大腸菌ＪＭ１０９株、またベクター系としてはｐＵＣ１８を挙げることができる。
さらに第１の本発明のＤＮＡには、前記ＤＮＡだけでなく、それらの改変ＤＮＡ体であって、前記ＤＮＡに対して、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、６０℃で２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）中、好ましくは６０℃で０．５×ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２×ＳＳＣ中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする改変ＤＮＡ体も包含される。このような改変ＤＮＡ体のより具体的なものとして、以下のようなものが挙げられる。
前記のエピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの改変体は、配列表の配列番号１における５８７番目の塩基から２３８８番目の塩基にいたる塩基配列に対して少なくとも５５％、好ましくは７０％、さらに好ましくは９５％の相同性を示すものである。このようなＤＮＡ改変体は、前記塩基配列の、それぞれ、５′末端もしくは３′末端においてまたはその途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものを含む。この塩基の一部が他の塩基により置換されているＤＮＡ改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、前記ＤＮＡと異なる塩基配列を有するものも含まれる。
遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、それぞれ、前記各ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列を参照し、各アミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、タンパク質全体として類似の形状を有するように行うのがよい。前記のＤＮＡ改変体は、第１の本発明の前記ＤＮＡと同等の機能をもつＤＮＡ、すなわちＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードしているものが、相当高い確率で得られると推定される。
このような本発明のＤＮＡ改変体は、前記各ＤＮＡの塩基配列またはそれらによりコードされる推定アミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。
従って第８の本発明においては、配列表の配列番号１に記載される２５８１ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡにおける１個もしくは数個の塩基が欠失、置換および（または）付加されることで形成された改変ＤＮＡであって、前記の１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡに対してストリジェントな条件でハイブリダイズすることができ且つＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性をもつタンパク質をコードする改変ＤＮＡが提供される。
第８の本発明の改変ＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡにおける６９２番目の塩基Ｇが塩基Ａにより置換されることにより形成された改変ＤＮＡである改変ＤＮＡであることができる。
また、第８の本発明の改変ＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載される２５８１  ｂｐのサイズの塩基配列の５８７番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る１８０２  ｂｐのサイズの塩基配列をもつＤＮＡによりコードされるところの、配列番号１に記載の合計５９７個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列における３６番目のアミノ酸、バリンがイソロイシンにより置換されることにより形成された組換タンパク質であって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性をもつ組換タンパク質をコードする改変ＤＮＡであることもできる。
さらに第９の本発明では、第１の本発明のＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡの一部からなるＤＮＡを、ＰＣＲ法のためのプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのクローニング方法が提供される。
さらに、第１０の本発明によると、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のＤＮＡの切断断片に対して第２の本発明による１９３２  ｂｐのサイズの塩基配列（すなわち配列番号１の塩基配列の４６４番目のＡから２３９４番目のＧに至るＤＮＡ領域）を有して且つＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのα、βユニットの遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片を連結してなるプラスミドを導入することにより形質転換された宿主微生物を作成し、この形質転換した宿主微生物を培養して宿主菌体内に導入した遺伝子を発現させ、このように遺伝子を発現させた形質転換宿主微生物の菌体を、緩衝液または培地中でＤ−ミオ−イノシトールに作用させてＤ−キロ−イノシトールを生成することから成る、Ｄ−キロ−イノシトールの製造法が提供される。ここで用いられる宿主微生物は、導入された外来遺伝子を発現できる能力を持つ微生物であり、例えば細菌、特に大腸菌であることができる。
第１０の本発明方法において、配列表の配列番号１の塩基配列の４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇに至る１９３１  ｂｐのサイズの塩基配列を有する第２の本発明のＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化断片に連結してなるプラスミドが使用される。このプラスミドの導入により形質転換される宿主微生物は大腸菌例えば大腸菌ＪＭ１０９株であるのが好ましい。
次に、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９として前記の産業技術総合研究所に寄託中）の菌体からＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質をそれぞれ単離して精製する方法、ならびに前記のαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質の部分アミノ酸配列を決定する方法、さらには該Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質を各々コードするαユニット遺伝子およびβユニット遺伝子を内部に含有する２５８１  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を収得する方法の概要を説明する。これらの方法の各段階の詳細は後記の実施例１〜３に記載される。
（１）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からのＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの単離と精製
前記ＡＢ１０１２１株からＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの単離と精製のためには、常法に従って、ＡＢ１０１２１株の菌を適当な条件下で液体培養し、その培養液を遠心分離、またはろ過などの手段によって、固液分離し、上清濾液ならびに湿菌体を採取する。分離した菌体は、超音波破砕、フレンチプレス、ダイノミールなどの種々の破砕手段を用いて破砕するか、あるいは、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて細胞抽出液の形にして酵素液とする。このようにして採取される上清濾液あるいは酵素含有溶液は、次に、通常用いられている酵素の精製手段によって精製される。例えば、塩析、除核酸、イオン交換クロマトグラフィー、疎水結合クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティーカラムクロマトグラフィーなどにかけることによって、酵素の精製を行うことができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一なバンドを示す精製Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを得ることができる。
（２）酵素活性の測定方法
本酵素を単離して精製する方法において、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの酵素活性を測定するためには、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．１３ｍｌ、Ｄ−キロ−イノシトール  １８ｍｇ、ＮＡＤ＋  ０．７５ｍｇ、８ｍｇ／ｍｌ  ＤＣＩＰ（２，４−ジクロロインドフェノール）０．３ｍｌ、２５０単位／ｍｌジアホラーゼ（オリエンタル酵母社製、ＥＣ１．６．９９．２）６μｌにＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ酵素の溶液を加えて全容を１．０ｍｌとする。得られた混合液を、２５℃に保って、１６時間反応させた後、反応液に強塩基性イオン交換樹脂と強酸性イオン交換樹脂を各２００ｍｇ加え、３０分間静置する。その後に、１５，０００×ｇで遠心し、上清をＨＰＬＣにより分析する。ＨＰＬＣは、Ｗａｋｏｓｉｌ  ５ＮＨ２カラム（ＩＤ４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を用いて、４０℃で、移動相として８０％アセトニトリルを流速２ｍｌ／ｍｉｎで流して行い、ＲＩ検出器で溶出液中のイノシトール含量を検出する。このＨＰＬＣ条件において、１６時間で７０ｎモルのＤ−キロ−イノシトールを異性化して、Ｄ−ミオ−イノシトールを生成する酵素量を、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの１単位とした。
（３）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの部分アミノ酸配列の決定
前記のとおり精製品として得られたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを用いると、エドマン分解法によりＮ末端アミノ酸配列を決定することができる。また、内部アミノ酸配列の決定は、本精製酵素をペプシンにより加水分解し、ＨＰＬＣでペプチドフラグメントを単離し、このペプチドフラグメントを用いて、エドマン分解法による内部アミノ酸配列を決定することができる。この方法の各段階の詳細は後記の実施例１に記載される。
（４）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡの調製
培地でＡＢ１０１２１株を培養する。得られた培養液を遠心して菌体を集める。その菌体からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製する。
すなわち、ＡＢ１０１２１株菌体をＢ１緩衝液に懸濁し、リゾチーム、ＲＮａｓｅＡ、プロテイナーゼＫのそれぞれの酵素を添加し、保温して溶菌する。得られた反応混合物にＢ２緩衝液（３Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２０％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５）を添加し保温しタンパク質を変性させる。得られた変性反応溶液をフェノール抽出し、このフェノール抽出を数回行う。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてからエタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿させる。沈澱させたＤＮＡを乾燥後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して保存する。この染色体ＤＮＡは次のＰＣＲでテンプレートとして用いる。
（５）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
（ｉ）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来Ｄ−ミオ−イノシトール１−エピメラーゼαユニットタンパク質の遺伝子の一部をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）にて部分的にクローニングするための操作を次のように行う。
前述のαユニットのタンパク質の化学分析で判明したＮ末端アミノ酸８残基の配列Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅと、ペプシン分解内部ペプチドのアミノ酸８残基の配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒに対応する以下のようなプライマーを設計し作製する。
0003887600.tif 000007
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために以下に示す混合塩基あるいはイノシンを使用する。
0003887600.tif 000008
プライマーＡｅｐｉ−１Ｆの塩基配列は後記の配列表の配列番号４に下記のとおり示され、また、プライマーＡｅｐｉ−２Ｒの塩基配列は配列表の配列番号５に下記のとおり示される。
0003887600.tif 000009
Ａｅｐｉ−１Ｆはαユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸８残基を順方向にコドンに変換したものであり、Ａｉｎ−２Ｒはペプシン分解物である内部ペプチドのＮ末端アミノ酸８残基のコドンの相補鎖を逆向きに並べたものである。この２種類のプライマーおよびテンプレートとしての染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行うと、両端にこれらの配列を持つＤＮＡ断片が特異的に増幅される。
上記のプライマー２種（Ａｅｐｉ−１ＦおよびＡｉｎ−２Ｒ）と前項（４）で得たアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行なう。上記のＰＣＲ反応によって、約７００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａと称する）が増幅される。このＤＮＡ断片−Ａはαユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。ＰＣＲ増幅した反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画する。この約７００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ａ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱して回収する。乾燥させたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させて保存する。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片−ＡをＰＣＲ産物のクローニングベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングする。プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）によりＤＮＡ断片−Ａを連結し、得られた連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片−Ａの溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ａとの連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡの溶液と、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、ＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。この培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地に塗布する。さらに３７℃、１６時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして、前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択する。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養する。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行う。こうして得られたプラスミドＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配列は、目的とするエピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列を有する約７００ｂｐのＤＮＡ断片−Ａであることが後記の塩基配列解析から確認された。
（６）クローニングされたＤＮＡ断片−Ａの塩基配列解析
前項（５）（ｉｉ）でクローニングされたプラスミド中のＤＮＡ挿入断片の全遺伝子配列を解析する。アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定されるＤＮＡ配列の塩基配列を決定した。
塩基配列解析の結果、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−Ａは電気泳動で約７００  ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には６９３  ｂｐであることが明らかとなった。６９３  ｂｐの塩基配列のコード領域をコドンとしてアミノ酸に置換したところ１種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。
ＤＮＡ断片−Ａとしてクローニングした６９３  ｂｐのＤＮＡ配列をアミノ酸へ置換したところ、Ｎ末端アミノ酸配列の９番目から１５番目の配列はＴｈｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕであることが判った。これはアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から分離および精製したＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析から得られた結果と一致しており、従って、クローニングした６９３  ｂｐのＤＮＡ配列はアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニット蛋白質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
（７）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
（ｉ）前項（５）（ｉ）で示したαユニット遺伝子の一部分のクローニングと同じ手法を用いて、β遺伝子の部分的配列をクローニングするためにアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から直接に分離および精製されているＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸８残基Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙとペプシン分解内部ペプチドのアミノ酸７残基Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅから以下のようなプライマーＢｅｐｉ−１ＦおよびＢｉｎ−２Ｒを設計し作製する。
0003887600.tif 000010
コドンの揺らぎは混合塩基あるいはイノシンを使用した。
0003887600.tif 000011
プライマーＢｅｐｉ−１Ｆの塩基配列は後記の配列表の配列番号６に下記のとおり示され、また、プライマーＢｅｐｉ−２Ｒの塩基配列は配列表の配番号７に下記のとおり示される。
0003887600.tif 000012
Ｂｅｐｉ−１Ｆはβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸８残基を順方向にコドンに変換したものであり、Ｂｉｎ−２Ｒはペプシン分解物である内部ペプチドのＮ末端アミノ酸８残基のコドンの相補鎖を逆向きに並べたものである。この２種類のプライマーでＰＣＲを行うと、両端にこれらの配列を持つＤＮＡ断片が特異的に増幅してくる。
上記のプライマー２種（Ｂｅｐｉ−１ＦおよびＢｉｎ−２Ｒ）と前記の（４）項で得たアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行なう。
上記のＰＣＲ反応によって約８００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｂと称す）が増幅するが、このＤＮＡ断片−Ｂはβユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画する。その後、上記の約８００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱させる。精製したＤＮＡ断片−ＢをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して保存する。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−ＢをＰＣＲ産物クローニング用のプラスミドベクターｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングする。すなわちプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒにＤＮＡ断片−ＢをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ（ＤＮＡ断片−Ｂ）溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｂとの連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡの溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合してプラスミドを大腸菌に導入させる。
その後、ＳＯＣ培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。この培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、培養する。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドの導入で形質転換した大腸菌が得られるから、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養する。増殖した形質転換大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡを分離および精製する。こうして得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ配列は、目的とするエピメラーゼβユニット遺伝子の部分的配列を含有するＤＮＡ断片−Ｂであり、ＰＣＲ反応で増幅された約８００  ｂｐのＤＮＡ断片と考えられた。
（８）クローニングされたＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列解析
前項（７）（ｉｉ）でクローニングされたプラスミドＤＮＡの中の挿入ＤＮＡ断片の全塩基配列を解析した。これにより、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定できるＤＮＡ配列の塩基配列を決定した。
この塩基配列解析の結果、クローニングされた８２２  ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列が明らかとなった。この８２２  ｂｐのＤＮＡ配列のコード領域をアミノ酸に置換したところ１種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の８２２  ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲの時に使用した２種類のプライマーの配列が見い出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ｂがこの２種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
クローニングした８２２  ｂｐのＤＮＡ配列をアミノ酸へ置換したところ、Ｎ末端アミノ酸配列の９番目から１５番目の配列はＴｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｓｐであり、これはアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から分離、精製したＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸解析から得られた結果と一致しており、ＤＮＡ断片−ＢとしてクローニングしたＤＮＡ配列はアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  βユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
（９）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの両方をコードする遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片のクローニングと、それの全ＤＮＡの塩基配列解析
前記のようにして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列およびβユニット遺伝子の部分的配列が決定されたので、インバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、Ｐ．５９１−５９３、１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がるαユニットあるいはβユニットの全ＤＮＡ塩基配列を増幅、クローニング、配列解析する。すなわち、すでに前述のクローニングしたＤＮＡ断片−Ａまたは−Ｂを切断しないような制限酵素を選択して用いて染色体ＤＮＡを切断し、その切断断片の両端を連結して環状化する。次に、クローニングしたＤＮＡ断片の両端方向（外側）に向かってプライマーをそれぞれ設計してＰＣＲ反応にかけると、クローニングされていない上流、下流に連続して存在する未知領域が、テンプレートが環状化しているために増幅される。すなわち、たとえばアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡのαユニットタンパク質の部分的ＤＮＡ配列をもとにして、その上流、下流領域の配列を決定することができる。
（ｉ）具体的には、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡ（前記の（４）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化する。得られたＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡ断片をフェノール抽出、クロロホルム抽出を行いＤＮＡを精製し、エタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液にＤＮＡを溶解する。このＤＮＡ溶液をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉと等量ずつ混合し、保温してＤＮＡ断片を自己環状化させる。フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い精製する。エタノール沈澱で再びＤＮＡを回収後、ＴＥ緩衝液に溶解し、これをテンプレートとして次のＰＣＲ反応に用いる。
（ｉｉ）他方、αユニット遺伝子の部分配列から、以下のようなプライマーＡｅｐｉ−４ＦおよびＡｅｐｉ−３Ｒを設計し作製する。
0003887600.tif 000013
プライマーＡｅｐｉ−４Ｆの塩基配列は後記の配列表の配列番号８に示され、また、プライマーＡｅｐｉ−３Ｒの塩基配列は配列表の配列番号９に示される。
（ｉｉｉ）次に、上記のプライマー２種すなわちＡｅｐｉ−４ＦおよびＡｅｐｉ−３Ｒを用いて、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後に自己環状化したＤＮＡ自己環状化物をテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行なう。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株の染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化、自己環状化物をテンプレートとしてで約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｃと称す）が得られる。
上記のＰＣＲ反応によって約２．５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ）が増幅したが、これは、αユニット遺伝子のＤＮＡ配列およびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画する。約２．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱する。得られた精製品のＤＮＡ断片−ＣをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して保存する。
（ｉｖ）このＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片−ＣをＰＣＲ産物用のクローニングベクターであるｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングする。プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ断片−ＣをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結する。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片−Ｃの溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｃとの連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置する。その後、ＳＯＣ培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡを精製する。
（ｖ）ＤＮＡ断片−Ｃ（約２．５  ｋｂのサイズ）の塩基配列の解析
前項（ｉｖ）でクローニングにより得られたプラスミドの中の挿入ＤＮＡの塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置により解析した。これによって、前述のプラスミドＤＮＡの全塩基配列を決定することができた。前記の約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ断片−ＣとＤＮＡ断片−Ａの塩基配列を組合せることにより、後記の配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列には、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット遺伝子とαユニット遺伝子が含まれていることが判明した。
（ｖｉ）前項（ｉ）に示したと同様にしてアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化する。得られたＥｃｏＲＩ切断断片をＤＮＡリガーゼによって自己環状化させ、これをテンプレートとして用いる。別途、βユニット遺伝子の部分配列を参考として、以下のような２方向に外向きのプライマーＢｅｐｉ−４ＦおよびＢｅｐｉ−３Ｒを設計、作製する。
0003887600.tif 000014
プライマーＢｅｐｉ−４Ｆの塩基配列は後記の配列表の配列番号１０に示され、また、プライマーＢｅｐｉ−３Ｒの塩基配列は配列表の配列番号１１に示される。
（ｖｉｉ）これらプライマー２種と前記で得られたアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後に自己環状化したＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行なう。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化、自己環状化物をテンプレートとしたＰＣＲ法により、約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片（ＤＮＡ断片−Ｄと称す）が得られる。
上記のＰＣＲ反応によって約２．５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ）が増幅するが、これは、βユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列の未決定のＤＮＡ領域およびその周辺領域を含むＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画する。約２．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱する。得られた精製品のＤＮＡ断片−ＤをＴＥ緩衝液に溶解して保存する。
（ｖｉｉｉ）このＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−Ｄの塩基配列を解析するために、まずＤＮＡ断片−Ｄのクローニングを行う。すなわち、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）によりＤＮＡ断片−Ｄを連結する。すなわち、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片−Ｄの精製品の溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｄとの連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置する。その後、ＳＯＣ培地を加えて、大腸菌を振とう培養する。
前記のプラスミドの導入により形質転換された大腸菌を含む培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離する。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドのＤＮＡを分離および精製する。
（ｉｘ）ＤＮＡ断片−Ｄ（約２．５  ｋｂｐサイズ）の塩基配列の解析
前項（ｖｉｉｉ）でクローニングにより得られたところの、上記のインバースＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片−Ｄの塩基配列を含有するプラスミドＤＮＡの全塩基配列を解析する。
これによって、前述のプラスミドＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ配列の全塩基配列を決定することができる。前記の約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ断片−ＤとＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列を組合せると、後記の配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列と一致した。
（１０）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαおよびβユニットタンパク質をコードする遺伝子の判定
配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列から、それのコード領域によってコードされるアミノ酸配列を判定すると、配列番号１のＤＮＡ配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇまでの１００８  ｂｐのＤＮＡ配列によってコードされる３３６個のアミノ酸の配列−βと、配列番号１のＤＮＡ配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａまでの７８３ｂｐのＤＮＡ配列によってコードされる２６１個のアミノ酸の配列−αとがあることが判明した。
アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から直接に分離されたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の化学分析の結果を参照すると、上記の３３６個のアミノ酸の配列−βは、βユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであり、かつ、上記の２６１個のアミノ酸の配列−αはαユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであると判断できた。
以上のようにして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットをコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびβユニットをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、それぞれに、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのＤＮＡ配列の内部に含有されており、そしてそれぞれが、配列番号１のＤＮＡ配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列と、５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列であると決定された。
その結果、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子のＤＮＡの全塩基配列が決定された。αユニット遺伝子は、ＡＴＧを開始コドンとして有する７８３  ｂｐの塩基からなり、２６１個のアミノ酸残基（分子量２７７００）からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。
βユニット遺伝子は、ＡＴＧを開始コドンとして有する１００８  ｂｐの塩基からなり、３３６個のアミノ酸残基（分子量３６１５０）からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
さらに、αユニット遺伝子とβユニット遺伝子は相互に近接してアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体上に存在する。βユニット遺伝子がαユニット遺伝子の上流に正方向に位置し、その下流にαユニット遺伝子が同じ方向にあり、両遺伝子間のＤＮＡ配列はＧＧＴＣＴＴＴＣの８塩基だけから成るものであることが判明した。
配列番号１および３に示されたαユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、相同性のあるタンパク質は見い出されなかった。
また、配列番号１および２に示されたβユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、バチラス  サチラス由来のＤ−ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼと５４％の高い相同性が認められた。
次に、本発明により得られたところの、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子とβユニットの両方を含有する１９３２  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−Ｅの作製と、このＤＮＡ断片を導入されて有するプラスミドｐＢＡ１９を構築する方法を説明する。この方法の詳細は後記の実施例４に記載される。
（１）前記に記したアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子の両方を内部に含有する塩基配列（配列番号１の２５８１  ｂｐのＤＮＡ配列）を参考として用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方を含有するＤＮＡ断片をサブクローニングする操作を次に行う。このために、以下のような５’末端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅあるいはＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを付加したプライマー（Ｂｅｐｉ−８Ｆ／Ａｅｐｉ−６Ｒ）を作製する。
0003887600.tif 000015
プライマーＢｅｐｉ−８Ｆの塩基配列は後記の配列表の配列番号１２に示され、また、プライマーＡｅｐｉ−６Ｒの塩基配列は配列表の配列番号１３に示される。
このプライマー２種すなわちＢｅｐｉ−８ＦおよびＡｅｐｉ−６Ｒを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡ（前記の（１）参照）をテンプレートとして用いてＰＣＲを行なう。
上記のＰＣＲ反応によって約２．０  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅する。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画する。
上記の約２．０  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱する。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して保存する。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡをＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｅと称する）を得る。このＤＮＡ断片−Ｅは、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの遺伝子（すなわちβユニット遺伝子）とαユニットの遺伝子（すなわちαユニット遺伝子）との両方を内部に含有するＤＮＡである。それの塩基配列を解析すると、ＤＮＡ断片−Ｅは１９３２  ｂｐの塩基配列から成り、後記の配列表の配列番号１の４６４番目の塩基Ａから２３９４番目の塩基Ｇまでの塩基配列を内部に含むものであると判明した。
（２）βおよびα遺伝子を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製する。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片−Ｅを連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のＤＮＡ断片−ＥとＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結する。これによって、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅと、ベクターｐＵＣ１８との連結体である４５９７  ｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＢＡ１９と称する）が構築される。
（３）このプラスミドｐＢＡ１９を、前記に記載したと同じ要領で大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に導入する。プラスミドｐＢＡ１９の導入により形質転換された大腸菌を、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株と称する。この大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株をＬＢ液体培地中で培養する。培養した大腸菌菌体からプラスミドｐＢＡ１９を抽出する。こうしてβユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方の遺伝子を含有するＤＮＡ断片−Ｅを内部に有するプラスミドｐＢＡ１９がサブクローニングできる。
したがって、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの上記のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子が大腸菌内でクローニングする事が可能になる。
次に、前記で得られたところの、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するＤＮＡ配列（前記のＤＮＡ断片−Ｅに相当する）を含有するプラスミドＤＮＡｐＢＡ１９の導入により形質転換された大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株が、上記の両遺伝子の発現によって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質を産生できるかを下記のとおり試験する。
そのためには、下記のとおり、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を、培地中で遺伝子産物の誘導物質としてのＩＰＴＧ（すなわちイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の存在下または非存在下で培養し、αおよびβ遺伝子を発現できるかをみる。その産物であるタンパク質の発現はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認する。これらの方法の概要を以下に説明するが、その詳細は実施例５に記載される。
（１）βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するプラスミドＤＮＡ  ｐＢＡ１９の導入により得られた前記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株をＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有）で前培養する。新しいＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に、その前培養した菌体を含む培養液を添加して培養する。次いで、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を培地に添加後、さらに２４時間培養して遺伝子発現を誘導する。得られた培養液を遠心分離にて菌体を集め、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に菌体を懸濁して、菌懸濁液を振とうさせ溶菌させる。得られた溶菌液をを遠心すると上清である菌体の可溶性画分を得る。得られた可溶性画分（上清）を１０〜２０％のグラジエントゲル（マルチゲル、第一化学薬品（株））を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。
（２）βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を導入された形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の培養をＩＰＴＧの添加、存在下で行った場合には、その得られた培養菌体の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量約４万と３万の位置にタンパク質の顕著なバンドが検出される。
従って、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体のＩＰＴＧの存在下における培養により産生された分子量４万のタンパク質と分子量３万のタンパク質は、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の発現によって特異的に誘導されたタンパク質であることが判った。アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質は、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列中にあるその遺伝子の大きさから、それぞれ３６１００、２７７００と推定される。前記のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された大きい方（４万）の蛋白質はＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット、小さい方（３万）はαユニットに相当すると思われた。このことから、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体中に本発明により導入されたところのアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αおよびβユニットの各遺伝子は大腸菌内でそのコードするタンパク質を発現することが認められる。
さらに、前記で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体に本発明により導入されているＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子が大腸菌内で実際にＤ−キロ−イノシトールを異性化するエピメラーゼ活性を発現することを確認する実験を行う。これらの実験は、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体を、基質としてＤ−キロ−イノシトールを含んだ緩衝液中で反応させる緩衝液中の変換反応法（イ）と、基質を含む培地中でＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を培養しながら菌体を基質に反応させる培地中の変換反応法（ロ）の２通りを行う。これらの実験の詳細は後記の実施例６が参照される。
次に、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの遺伝子にＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ法を用いてランダムに変異を導入して遺伝子改変を行う方法の概要を説明する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例７に記載される。
（１）Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ法によるＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子の改変
（ｉ）エピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ  ｐＢＡ１９をテンプレートとして、βユニット遺伝子とαユニット遣伝子をＰＣＲで増幅する。この際、鋳型となるＤＮＡに対して間違った塩基がＤＮＡ１分子当たり１−数カ所ランダムに入るような条件でＰＣＲを行なう。このために、以下のような５’末端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅあるいはＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを付加したプライマー（Ｂｅｐｉ−８Ｆ／Ａｅｐｉ−９Ｒ）を設計し作製する。
0003887600.tif 000016
次に、このプライマー２種すなわちＢｅｐｉ−８ＦおよびＡｅｐｉ−９Ｒを用いてかつエピメラーゼβユニット遺伝子及びα遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡ：ｐＢＡ１９をテンプレートとして用いてＰＣＲを行なう。
この時、通常の反応液組成の中にＭｎＣｌ２を添加し、さらに４種のｄＮＴＰの割合を変えたものを用いることにより鋳型となるＤＮＡに対して間違った塩基が取り込まれるようにする。
上記のＰＣＲ反応によって約２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅される。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画する。上記の約２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解させる。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片を得られる。
このＤＮＡ断片は、Ｄ−ミオ−イノシトール１−エピメラーゼβユニットの遺伝子（すなわちβユニット遺伝子）とαユニットの遺伝子（すなわちαユニット遺伝子）との両方を内部に含有するＤＮＡであり、その分子中にはランダムに１−数カ所の塩基置換が生じた集合体である。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を大腸菌のクローニングベクターｐＵＣ１８にクローニングする。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結する。こうして得られた連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。すなわち、ＰＣＲ増幅断片の溶液とｐＵＣ１８ベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡの溶液と、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、ＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃、１６時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子及びαユニット遺伝子のいろいろな箇所の塩基が置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
（ｉｉｉ）上記で得られた、βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子内にランダムに塩基置換が生じた形質転換大腸菌ライブラリーを基質ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加されたＬＢ液体培地で培養する。３７℃、３日間培養した後に培養液をシリカゲルＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社、Ａｒｔ５７１５）にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で展開する。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させる。コントロールとして変異の入っていないエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を含有するプラスミドｐＢＡ１９の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９の培養液を用いる。
ＴＬＣ上でコントロールより生成物であるＤ−キロ−イノシトールの発色スポットが大きくなったものを選別し、さらにＨＰＬＣで分析する。統計的に有為に変換率が高まったものをさらに選別し、これらのクローンについてはエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析して、変異箇所を同定する。
上記のようにＤ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換が増大したクローンのスクリーニングによって、変換率がコントロールと比較して１．３−１．５倍程度統計的に有為に増大しているものとして、Ｙ５７−１１Ｅ株が選別された。Ｙ５７−１１Ｅ株の保有するプラスミドＤＮＡを抽出してそのエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析したところ、βユニット遺伝子の１０６番目の塩基がＧからＡに置換し、アミノ酸としては３６番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変わっていた。Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ法によるランダムな変異の導入によってエピメラーゼ遺伝子を改変し、活性の増大した株を作製する事が出来た。
次に、このβユニット遺伝子の３６番目のアミノ酸をバリンやイソロイシン以外の１８種類のアミノ酸に置換させて変換活性がどのように変化するか検討する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例８に記載される。
（２）部位特異的総変異によるＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子３６番目アミノ酸の置換
（ｉ）でランダムに変異を導入することにより変換活性の増大したクローンが得られた。そのうちβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が置換することによって変換活性が増大したことに着目して、３６番目のアミノ酸を他のすべてのアミノ酸に置き換えて活性との相関を検討する。
エピメラーゼβユニット遺伝子３６番目のアミノ酸だけを特異的に変えるために以下のような操作を実施する。エピメラーゼβユニット遺伝子の上流から３６番目アミノ酸のコドンを混合塩基のＮＮＮとして３９番目アミノ酸までの上流領域断片を以下に示したＢｅｐｉ−１６Ｆ／Ｂｅｐｉ−１４Ｒプライマーで増幅し、３６番目アミノ酸のコドンを混合塩基のＮＮＮとして３３番目アミノ酸からαユニット遺伝子の最後までの下流領域断片をＢｅｐｉ−１７Ｆ／Ａｅｐｉ−１０Ｒプライマーで増幅する。
0003887600.tif 000017
増幅したＤＮＡ断片は、そのβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸に相当する配列がいろいろなアミノ酸をコードする配列を有する集合体である。得られた上流領域断片と下流領域断片はβユニット遺伝子内の３３番目アミノ酸から３９番目アミノ酸までが重複しているのでこれらの断片をアニールさせたものをテンプレートとして、βユニット遺伝子の上流配列のプライマーＢｅｐｉ−１６Ｆとαユニット遺伝子の下流配列のプライマーＡｅｐｉ−１０ＲでＰＣＲを行い、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の全長を得ることができる。
上記のＰＣＲ反応によって約２  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅される。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画する。上記の約２  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解させる。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片を得られる。
このＤＮＡ断片は、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの遺伝子（すなわちβユニット遺伝子）とαユニットの遺伝子（すなわちαユニット遺伝子）との両方を内部に含有するＤＮＡであり、そのβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が種々のアミノ酸に置き換わったものである。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を大腸菌のクローニングベクターｐＵＣ１８にサブクローニングする。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結する。こうして得られた連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。すなわち、ＰＣＲ増幅断片の溶液とｐＵＣ１８ベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡの溶液と、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、ＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃、１６時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。
得られた形質転換体は、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が２０種類のアミノ酸に置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
ライブラリーから白色コロニーを選別してβユニット遺伝子の塩基配列を解析して、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸がどのようなアミノ酸に置換されたか確認する。この結果、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸をコードする３塩基の並びが３４種類の変異体が得られ、その結果、グルタミン、メチオニンを除く１８種類のアミノ酸に置き換えることができた。
それぞれの変異株を基質Ｄ−ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加したＬＢ液体培地で３７℃、４日間培養し、その培養上清を遠心回収して培養液中の基質Ｄ−ミオ−イノシトールの変換物をＨＰＬＣにて分析する。
コントロールとしてｐＢＡ１９プラスミドを保持する大腸菌株ｐＢＡ１９−ＪＭ１０９を同時に培養して変換率の相対値をもとめたところ、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸がイソロイシンに置換した時に最も変換活性が増大していることが判明した。
次に、自然界の土壌に生息する菌からＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子を得る方法を検討する。以下にその方法の概要を説明する。その方法の各段階の詳細は後記の実施例９に記載される。
（１）集積培養菌からの１−エピメラーゼ相同遺伝子の単離
（ｉ）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子の配列を指標にして自然界の土壌に生息する菌からエピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子が得られるか検討する。
土壌サンプルは、各地から採取して、約３００ｍｇを１ｍｌの滅菌水に懸濁する。ボルテックスミキサーでよく混合して、室温で１時間静置してその上清１０μｌを、Ｄ−ミオ−イノシトールあるいはＤ−キロ−イノシトールを唯一の炭素源とする集積培地に添加する。
これを２８℃で４−７日間振とう培養し、新しい集積培地に培養液を植え継ぐ操作を繰り返し、炭素源としてミオ−イノシトールを含む培地の方がＤ−キロ−イノシトールを含む培地よりよく増殖しているもの、あるいはＤ−ミオ−イノシトールを含む培地にのみ菌が増殖しているものを選別する。
上で選別した菌の培養液を遠心して培養菌体を回収し、菌体から染色体ＤＮＡを宝酒造（株）製の’Ｇｅｎとるくん’を使用して抽出、精製する。フェノール抽出を２回行い、クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてから約２．５倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。、沈澱させたＤＮＡを乾燥後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解し保存する。
この染色体ＤＮＡをテンプレートとして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットあるいはαユニット遺伝子に相同な配列が得られるかどうか以下に示すような操作を行うことにより検討する。
アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株ではエピメラーゼβユニット遺伝子とαユニット遺伝子がタンデムに近接して存在しているので、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子を連結した状態で増幅できるか検討する。このために、以下に示すようなβユニット遺伝子の開始コドンから２１塩基の配列にクローニング部位としてＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅをつなげたプライマーＢｅｐｉ−１０Ｆ，およびαユニット遺伝子のＣ末端配列１８塩基と終止コドンにクローニング部位としてＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅをつなげたプライマーＡｅｐｉ−９Ｒを設計し作製する。
0003887600.tif 000018
上記のプライマー２種（Ｂｅｐｉ−１０ＦおよびＡｅｐｉ−９Ｒ）と前項で得た集積培養菌からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行う。
独立して採取した土壌由来の菌すべてにβおよびαユニット遺伝子の大きさの約２ｋｂに相当するＤＮＡが増幅された。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画する。上記の約２．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱して回収する。得られたＤＮＡ乾燥させたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解する。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片を得る。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を大腸菌のクローニングベクターｐＵＣ１８にサブクローニングする。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得る。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結する。こうして得られた連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。すなわち、ＰＣＲ増幅断片の溶液とｐＵＣ１８ベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、連結反応を行う。こうして得られた連結ＤＮＡの溶液と、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、大腸菌にプラスミドを導入させる。
その後、ＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ），ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃、１６時間培養する。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択する。
得られた形質転換体を基質ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加したＬＢ液体培地で３７℃、４日間培養する。その培養上清を遠心回収して培養液中の基質ミオ−イノシトールの変換物をＨＰＬＣにて分析する。コントロールとしてアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌株ｐＢＡ１９−ＪＭ１０９を同時に培養する。
土壌菌から得たエピメラーゼに相同な配列を有する大腸菌株においても、基質Ｄ−ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する活性を有することが判明した。その変換活性は、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からクローニングしたエピメラーゼ活性とほぼ同等であった。土壌菌由来のエピメラーゼ活性を発現しうるＤＮＡの塩基配列を解析し、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のエピメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較したところ、βユニット遺伝子９９番目の塩基ＧがＴに置換しているだけで（アミノ酸としては、ロイシンのまま）他の領域の塩基配列は一致していた。
以上のように、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株よりクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同なＤＮＡ配列は、自然界に広く存在し、エピメラーゼ活性を発現させることが可能である。
さらに、基質としてＤ−ミオ−イノシトールを含む培地中で、前記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの存在下あるいは非存在下で、培養しながら菌体をＤ−ミオ−イノシトールに作用させ、Ｄ−キロ−イノシトールを生成させ、次いでこれを含む反応溶液からＤ−キロ−イノシトールを単離することができ、このための実験を行った。この実験の詳細は後記の実施例１０、１１が参照される。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例について具体的に説明する。
実施例１
（１）ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットとβユニットの採取と精製
ミオ−イノシトール４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ディフコ社製）１ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム４ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム７ｇ／Ｌ、５リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水塩０．０２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩０．００５ｇ／Ｌ、塩化ニッケル０．００２５ｇ／Ｌおよび水からなる液体培地（ｐＨ６．８）を５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに１００ｍｌ入れ、滅菌（１２０℃、２０分間）した後冷却し、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９）を接種し、２７℃で２４０時間培養した。培養後、５０本５リットル分の培養液を遠心分離して菌体を集めた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の１００ｍｌを菌体に加えて、懸濁させ、ロッドタイプの超音波破砕装置で菌体を破砕した後、遠心分離によって、上清の粗酵素液１００ｍｌを得た。この粗酵素液の全Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ活性は７８，８４７単位であった。
この粗酵素液に、終末濃度４５％になるように硫安を加え、沈殿物を遠心して集め、硫安分画を行った。沈殿画分を透析し、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（ベッドボリューム２００ｍｌ：東ソー社製）に吸着させ、吸着物を０Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配でクロマトグラフィー法によって、荷電の違いにより、精製を行った。活性画分を再度透析し、再度２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに吸着させ、吸着物を０Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配でクロマトグラフィーによって、酵素の精製を行った。
次に不要なＮＡＤ＋依存酸化酵素を除く目的で、溶出された活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブルートヨパール（ベッドボリューム２０ｍｌ：東ソー社製）を通過させた。次に、その通過した活性画分に３ｍＭになるようにＭｇＳＯ４を加えて、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む溶液で平衡化したブルートヨパール（ベッドボリューム２０ｍｌ：東ソー社製）に吸着させ、吸着物を０Ｍ〜１．０ＭのＫＣｌの濃度勾配でクロマトグラフィー法によって、親和力の違いにより、酵素の精製を行った。通過画分には、補酵素を結合しないαユニットが含まれた。また、カラムからＫＣｌ濃度勾配によって脱着した画分には、補酵素を結合するβユニットが含まれた。
それぞれの酵素ユニットを含有する溶液を回収し、限外ろ過（分子量３，０００カットオフ）により濃縮し、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＩＤ７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍ：東ソー社製）によって、分子量の違いにより分取精製し、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットのそれぞれの精製酵素標品を得た。
（２）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの部分アミノ酸配列の決定
上記（１）で精製されたαユニットとβユニットの各々のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、それぞれ、エドマン分解法による気相アミノ酸シーケンサー（東ソー社製のＰＩ−２０２０気相プロテインシーケンサー）により決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列１５残基は、以下の通りであった。
0003887600.tif 000019
また、内部アミノ酸配列は、精製されたαユニットとβユニットの各タンパク質を、それぞれ、タンパク濃度換算で１／５０量のペプシンと共に、ｐＨ２．０塩酸溶液中にて、３６℃、１０時間処理を行い、限定加水分解を行った。その後、得られたペプチドをあらかじめ０．１％のトリフルオロ酢酸含む１０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＯＤＳカラム（直径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ：資生堂社）に吸着させ、吸着物を１０％〜５０％のアセトニトリルの濃度勾配でクロマトグラフィーによって、疎水親和力の違いにより、ペプチドの分離を行った。
このようにして、αユニットとβユニットのペプチドフラグメントは、それぞれ、調製され、ＨＰＬＣによって分取され精製されたペプチドフラグメントの１つをエドマン分解法による前記の気相アミノ酸シーケンサーにより決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列は、以下の通りであった。
0003887600.tif 000020
以上のように分析されたαユニットとβユニットの各タンパク質の部分アミノ酸配列の情報を基にして、後記の実施例２においてプライマーを設計し作製した。
実施例２
（１）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体のＤＮＡの調製
ＬＢフラスコ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）にスラント培地（２％ミオ−イノシトール、０．２％酵母エキス、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で培養したＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７９）を一白金耳接種し、２８℃、１６時間培養した。得られた培養液を６０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を集めた。その菌体から以下のようにしてＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、ＡＢ１０１２１株菌体をＢ１緩衝液（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８）に懸濁し、２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、８７．５５μｇ／ｍｌ  ＲｎａｓｅＡ、４５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫとなるようにそれぞれの酵素を添加し、３７℃、１時間保温した。得られた反応混合物にＢ２緩衝液（３Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２０％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５）を添加し５０℃、３０分保温しタンパク質を変性させた。得られた変性反応溶液をフェノール抽出し、このフェノール抽出を５回行った。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてから約２．５倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈澱させたＤＮＡを乾燥後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。この染色体ＤＮＡは次のＰＣＲでテンプレートとして用いる。
（２）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
（ｉ）アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質の遺伝子の一部をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）にて部分的にクローニングするための操作を次のように行った。
前述のαユニットのタンパク質のＮ末端アミノ酸８残基の配列Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅと、ペプシン分解で得た内部ペプチドのアミノ酸８残基の配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒに対応する以下のようなプライマー（Ａｅｐｉ−１ＦおよびＡｉｎ−２Ｒ）を設計し作製した（配列表の配列番号４および５参照）。
0003887600.tif 000021
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、以下に示した混合塩基あるいはイノシンを使用した。
0003887600.tif 000022
次に、このプライマー２種（Ａｅｐｉ−１ＦおよびＡｉｎ−２Ｒ）と前項（１）で得たアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合液（各０．４ｍＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットからなるものとした。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、初めに変性を９５℃、３分、さらに変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、１分間行う３段階の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃で伸長反応を１分間行うことにより実施した。上記のＰＣＲ反応によって、約７００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が（以下、ＤＮＡ断片−Ａと称する）増幅した。このＤＮＡ断片−Ａはαユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。
ＰＣＲ増幅した反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。この約７００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ａ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱して回収した。乾燥させたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させた。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片−ＡをＰＣＲ産物のクローニングベクターであるｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。すなわち、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ断片−Ａを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、得られた連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片−Ａの溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ａとの連結反応を行った。こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。
その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。この培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布した。さらに３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とするエピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列を有する約７００  ｂｐのＤＮＡ断片−Ａであることが確認された。
（３）クローニングされたＤＮＡ断片−Ａの塩基配列解析
前項（２）（ｉｉ）でクローニングされたプラスミド中のＤＮＡ挿入断片の全遺伝子配列を解析した。アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定されるＤＮＡ配列の塩基配列を決定した。この塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。
塩基配列解析の結果、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−Ａは電気泳動で約７００  ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には６９３  ｂｐであることが明らかとなった。６９３  ｂｐの塩基配列をコドンとしてアミノ酸に置換したところ１種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の６９３  ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前期のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーのＤＮＡ配列が見い出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａがこの２種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
ＤＮＡ断片−Ａとしてクローニングした６９３  ｂｐのＤＮＡ配列をアミノ酸へ置換したところ、Ｎ末端アミノ酸配列の９番目から１５番目の配列はＴｈｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕであることが判った。これはアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から分離および精製したＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析から得られた結果と一致しており、従って、クローニングした６９３  ｂｐのＤＮＡ配列はアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
（４）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニット遺伝子の部分的配列のクローニング
（ｉ）前項（２）（ｉ）で示したαユニット遺伝子の一部分のクローニングと同じ手法を用いて、β遺伝子の部分的配列をクローニングするためにアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から直接に分離および精製されているＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸８残基の配列Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙとβ−ユニットタンパク質のペプシン分解物の内部ペプチドのアミノ酸７残基の配列Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅから以下のようなプライマーＢｅｐｉ−１ＦおよびＢｉｎ−２Ｒを設計し作製した（配列番号６および７参照）。
0003887600.tif 000023
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために混合塩基あるいはイノシンを使用した。
0003887600.tif 000024
次に、このプライマー２種すなわちＢｅｐｉ−１ＦおよびＢｉｎ−２Ｒを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡ（前記の（１）項で得たもの）をテンプレートとして用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合液（各０．４ｍＭ），ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットからなるものとした。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、初めに変性を９５℃、３分、さらに変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、１分間行う３段階の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃で伸長反応を１分間行うことにより実施した。
上記のＰＣＲ反応によって約８００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ断片−Ｂと称す）が増幅したが、このＤＮＡ断片−Ｂはβユニット遺伝子の一部分である可能性が高い。このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画した。その後、上記の約８００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノール沈澱させた。精製したＤＮＡ断片−ＢをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
（ｉｉ）このＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−ＢをＰＣＲ産物のクローニング用のベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒに、次のように連結した。すなわち、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒにＤＮＡ断片−ＢをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ（ＤＮＡ断片−Ｂ）溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｂとの連結反応を行った。こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。
その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。この培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換した大腸菌が得られるから、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡを分離および精製した。こうして得られたプラスミドは、目的とするエピメラーゼβユニット遺伝子の部分的配列を含有するＤＮＡ断片−Ｂをその中に挿入されてあり、このＤＮＡ断片−ＢはＰＣＲ反応で増幅された約８００  ｂｐのＤＮＡ断片と考えられた。
（５）クローニングされたＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列の解析
前項（４）（ｉｉ）でクローニングされたプラスミドＤＮＡの挿入ＤＮＡ断片の全塩基配列を解析した。これにより、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質遺伝子の部分配列に該当すると判定できる挿入ＤＮＡ配列の塩基配列を決定した。この塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。
塩基配列解析の結果、クローニングされた８２２  ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列が明らかとなった。この８２２  ｂｐのＤＮＡ配列をアミノ酸に置換したところ１種のオープンリーディングフレームに翻訳することができた。クローニングされた前記の８２２  ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲの時に使用した２種類のプライマーの配列が見い出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ｂがこの２種類のプライマー特異的に増幅したことが明らかとなった。
クローニングした８２２  ｂｐのＤＮＡ配列をアミノ酸へ置換したところ、Ｎ末端アミノ酸配列の９番目から１５番目の配列はＴｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｓｐであり、これはアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から分離精製したＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸解析から得られた結果と一致している。ＤＮＡ断片−Ｂとして、クローニングしたＤＮＡ配列はアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  βユニットタンパク質をコードする遺伝子の一部分であることが明らかとなった。
実施例３
本例では、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットおよびβユニットの両方をコードする遺伝子の全ＤＮＡの塩基配列解析を行った。
前記の実施例１のようにして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子の部分的配列およびβユニット遺伝子の部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３、１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がるαユニットあるいはβユニットの全ＤＮＡ塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、すでに前述のクローニングしたＤＮＡ断片を切断しないような制限酵素を選択してこれを用いて、染色体ＤＮＡを切断し、その切断断片の両端を連結して自己環状化する。次に、クローニングしたＤＮＡ断片の両端方向（外側）に向かってプライマーをそれぞれ設計してＰＣＲ反応にかけると、クローニングされていない上流、下流に連続して存在する未知領域がテンプレートが環状化しているために増幅される。すなわち、たとえばアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡのαユニット蛋白質タンパク質の部分的ＤＮＡ配列をもとにしてその上流、下流領域の配列を決定することができる。
（１）具体的には、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡ（実施例２の（１）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化した。得られたＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡ断片をフェノール抽出、クロロホルム抽出を行いＤＮＡを精製し、エタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液にＤＮＡを溶解した。このＤＮＡ溶液をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉと等量ずつ混合し１６℃、１６時間保温してＤＮＡ断片を自己環状化させた。フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い精製した。エタノール沈澱で再びＤＮＡを回収後、ＴＥ緩衝液に溶解し、これをテンプレートとして次のＰＣＲ反応に用いた。
（２）他方、αユニット遺伝子の部分配列から、以下のようなプライマーＡｅｐｉ−４ＦおよびＡｅｐｉ−３Ｒを設計し作製した（配列番号８および９参照）。
0003887600.tif 000025
次に、上記のプライマー２種すなわちＡｅｐｉ−４ＦおよびＡｅｐｉ−３Ｒを用いてアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後に自己環状化したＤＮＡ自己環状化物をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行なった。
ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合液（各０．４ｍＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットからなるものとした。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、初めに変性を９５℃、３分行い、その後変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３０回繰り返すことにより実施した。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株の染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化、自己環状化物をテンプレートとしてで約２．５  ｋｂのＤＮＡ増幅断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｃと称す）が得られた。
上記のＰＣＲ反応によって約２．５  ｋｂの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ）が増幅したが、これは、αユニット遺伝子のＤＮＡ配列およびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。約２．５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱した。得られた精製品のＤＮＡ断片−ＣをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
（３）このＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片−ＣをＰＣＲ産物のクローニング用ベクターであるｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ｖｅｃｔｏｒでクローニングした。すなわち、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ断片−ＣをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片−Ｃの溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｃとの連結反応を行った。
こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡを精製した。
（４）ＤＮＡ断片−Ｃ（約２．５  ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（３）でクローニングにより得られたプラスミドの挿入ＤＮＡの全領域の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置により解析した。これによって、前述のプラスミドの中の挿入ＤＮＡの全塩基配列を決定することができた。その結果、前記の約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ断片−ＣとＤＮＡ断片−Ａの塩基配列を組合せることにより後記の配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列が得られた。
（５）前項（１）に示したと同様にしてアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化した。得られたＥｃｏＲＩ切断断片をＤＮＡリガーゼによって自己環状化させ、これをテンプレートとして用いた。
別途、βユニット遺伝子の部分配列を参考として、以下のようなプライマーＢｅｐｉ−４ＦおよびＢｅｐｉ−３Ｒを設計した（配列番号１０および１１参照）。
0003887600.tif 000026
次に、これらプライマー２種と前記で得られたアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後に自己環状化したＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合液（各０．４ｍＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットよりなるものとした。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、初めに変性を９５℃、３分、さらに変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３０回繰り返すことにより実施した。
この結果、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化、自己環状化物をテンプレートとしたＰＣＲ法により、約２．５  ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片（ＤＮＡ断片−Ｄと称す）が得られた。
上記のＰＣＲ反応によって約２．５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ）が増幅したが、これは、βユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列の未決定のＤＮＡ領域およびその周辺領域を含むＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動法により分画した。約２．５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ）をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈澱した。得られた精製品のＤＮＡ断片−ＤをＴＥ緩衝液に溶解した。
（６）このＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片−Ｄを、ＰＣＲ産物のクローニング用ベクターであるｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ｖｅｃｔｏｒでクローニングした。すなわち、プラスミドベクターｐＴ７ＢｌｕｅＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）によりＤＮＡ断片−Ｄを連結した。得られた連結ＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片−Ｄの精製品の溶液とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター溶液を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片−Ｄとの連結反応を行った。こうして得られた連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
前記のプラスミドの導入により形質転換された大腸菌を含む培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られたので、これを選択して分離した。
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養して増殖した大腸菌菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドのＤＮＡを分離および精製した。
（７）ＤＮＡ断片−Ｄ（約２．５  ｋｂｐサイズ）の塩基配列の解析
前項（６）でクローニングにより得られたところの、上記のインバースＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片−Ｄの塩基配列を含有するプラスミドの中の挿入ＤＮＡの全塩基配列を解析した。塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。
これによって、前述のプラスミドＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ配列の全塩基の全遺伝子配列を決定することができた。前記の約２．５  ｋｂのＤＮＡ断片−ＤとＤＮＡ断片−Ｂの塩基配列を組合せると、後記の配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列と一致することが判明した。
（８）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質をコードする遺伝子の判定
配列表の配列番号１に示された２５８１  ｂｐの塩基配列から、それのコードする領域によってコードされるアミノ酸配列を判定すると、配列番号１のＤＮＡ配列の５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇまでの１００８  ｂｐのＤＮＡ配列によってコードされる３３６個のアミノ酸の配列−βと、配列番号１の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａまでの７８３  ｂｐのＤＮＡ配列によってコードされる２６１個のアミノ酸の配列−αとがあることが判明した。
アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株から直接に分離されたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質およびβユニットタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の化学分析の結果を参照すると、上記の３３６個のアミノ酸の配列−βは、βユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであり、かつ、上記の２６１個のアミノ酸の配列−αはαユニットタンパク質のアミノ酸配列に相当するものであると判断できた。
以上のようにして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニットタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびβユニットタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、それぞれに、配列表の配列番号１に示される２５８１  ｂｐのＤＮＡ配列の内部に含有されており、そしてそれぞれが、配列番号１のＤＮＡ配列の１６０６番目の塩基Ａから２３８８番目の塩基Ａに至る７８３  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列と、５８７番目の塩基Ａから１５９４番目の塩基Ｇに至る１００８  ｂｐのサイズのＤＮＡ配列であると決定された。
その結果、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子のＤＮＡの全塩基配列が決定された。
αユニット遺伝子は、ＡＴＧを開始コドンとして有する７８３  ｂｐの塩基からなり、２６１個のアミノ酸残基（分子量２７７００）からなるタンパク質をコードしている（配列番号３参照）。
βユニット遺伝子は、ＡＴＧを開始コドンとして有する１００８ｂｐの塩基からなり、３３６個のアミノ酸残基（分子量３６１５０）からなるタンパク質をコードしている（配列番号２参照）。
さらに、αユニット遺伝子とβユニット遺伝子は相互に近接してアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体上に存在する。βユニット遺伝子がαユニット遺伝子の上流に正方向に位置し、その下流にαユニット遺伝子が同じ方向にあり、両遺伝子間のＤＮＡ配列はＧＧＴＣＴＴＴＣの８塩基だけから成るものであることが判明した。
配列番号１および３に示されたαユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、相同性のあるタンパク質は見い出されなかった。
また、配列番号１および２に示されたβユニット遺伝子のアミノ酸配列について、相同性のあるタンパク質を検索したところ、バチラス  サチラス由来のＤ−ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼと５４％の高い相同性が認められた。
実施例４
本例は、本発明により得られたところの、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのαユニット遺伝子とβユニットの両方を含有するＤＮＡ断片を導入されて有するプラスミドｐＢＡ１９を構築する方法を例示する。
（ｉ）実施例３に記したアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子の両方を内部に含有するＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１の２５８１  ｂｐのＤＮＡ配列）を参考として用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方を含有するＤＮＡ断片をサブクローニングする操作を次に行う。このために、以下のような５’末端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅあるいはＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを付加したプライマー（Ｂｅｐｉ−８Ｆ／Ａｅｐｉ−６Ｒ）を設計し作製した（配列番号１２および１３参照）。
0003887600.tif 000027
次に、このプライマー２種すなわちＢｅｐｉ−８ＦおよびＡｅｐｉ−６Ｒを用いてかつアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体ＤＮＡ（実施例２の（１）参照）をテンプレートとして用いてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合液（各０．４ｍＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットから成るものとした。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、初めに変性を９５℃、３分、さらに変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、伸長を６８℃、２分間行う３段階の反応を３０回繰り返し、最後に７２℃で伸長反応を２分間行うことにより実施した。
上記のＰＣＲ反応によって約２．０  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画した。
上記の約２．０  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥバッファー緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡをＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つ１９３２  ｂｐのサイズのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｅと称する）を得た。
このＤＮＡ断片−Ｅは、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの遺伝子（すなわちβユニット遺伝子）とαユニットの遺伝子（すなわちαユニット遺伝子）との両方を内部に含有するＤＮＡである。ＤＮＡ断片−Ｅは１９３２  ｂｐの塩基配列から成り、それの塩基配列を解析すると、前記したとおり、配列表の配列番号１に示される塩基配列の部分配列であると判明した。
アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株染色体からクローニングしたエピメラーゼβユニットおよびαユニットの遺伝子の全長は１９３１ｂｐであるが、これを大腸菌内で発現させるためにベクタープラスミドへ挿入させる過程で「のりしろ」となる制限酵素切断部位を付加させた遺伝子をＰＣＲ法で作製した。そのために５’末端に１塩基付加され１９３２ｂｐとなった。
（ｉｉ）一方、βおよびα遺伝子を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片−Ｅを連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のＤＮＡ断片−ＥとＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結した。これによって、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅと、ベクターｐＵＣ１８との連結体である４５９７  ｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＢＡ１９と称する）が構築された。このプラスミドｐＢＡ１９の図を添付図面の図１に示す。
（ｉｉｉ）このプラスミドｐＢＡ１９を、実施例３の（３）に記載したと同じ要領で大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に導入した。プラスミドｐＢＡ１９の導入により形質転換された大腸菌を、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株と称する。
この大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株をＬＢ液体培地中で培養した。培養した大腸菌菌体からプラスミドｐＢＡ１９を抽出した。こうしてβユニット遺伝子とαユニット遺伝子との両方の遺伝子を含有するＤＮＡ断片−Ｅを内部に有するプラスミドｐＢＡ１９がサブクローニングできた。
したがって、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼの上記のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子が大腸菌内でクローニングする事が可能になった。
実施例５
本例においては、実施例４で得られたところの、βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するＤＮＡ配列（前記のＤＮＡ断片−Ｅに相当する）を含有するプラスミドＤＮＡｐＢＡ１９の導入により形質転換された大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株が、上記の両遺伝子の発現によって、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質を産生できるかを試験した。
すなわち、本例では、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を、培地中で遺伝子産物の誘導物質としてのＩＰＴＧ（すなわちイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の存在下または非存在下で培養し、αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子を発現できるかをみた。その産物であるタンパク質の発現はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。具体的には、次の方法を行った。
（１）βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を内部に含有するプラスミドＤＮＡ  ｐＢＡ１９の導入により得られた前記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を、ＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有）で３７℃、１６時間、前培養した。新しいＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に、その前培養した菌体を含む培養液を培地量の１／２００量で添加して菌体数が吸光度でＡ６００＝１．０になるまで培養した。次いで、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を培地に添加後、さらに２４時間培養して遺伝子発現を誘導した。また、ＩＰＴＧを添加しなかった比較実験も行った。得られた培養液を遠心分離（６０００回転、１０分間）にて菌体を集め、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に菌体を懸濁して、菌懸濁液を室温でゆっくりと振とうさせ溶菌させた。得られた溶菌液を遠心（１５０００回転、２０分間）すると、上清である菌体の可溶性画分を得た。得られた可溶性画分（上清）を１０〜２０％のグラジエントゲル（マルチゲル、第一化学薬品（株））を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
コントロールとして、ベクタープラスミドｐＵＣ１８だけを導入されて保持する大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を用いて、同様の実験を行った。
（２）βユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を導入された形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の培養をＩＰＴＧの添加、存在下で行った場合には、その得られた培養菌体の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量約４万と３万の位置にタンパク質の顕著なバンドが検出された。
他方、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の培養をＩＰＴＧの無添加で行った比較実験の場合には、得られた培養菌体の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量約４万と分子量３万の位置にタンパク質の弱いバンドしか検出できなかった。さらに、コントロールとして、ベクタープラスミドｐＵＣ１８だけの導入を受けた大腸菌ＪＭ１０９株の前記の形質転換体を、ＩＰＴＧの存在下で培養した場合には、得られた培養菌体中には、前記の分子量４万と分子量３万のタンパク質の産生を検出できなかった。
従って、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体のＩＰＴＧの存在下における培養により産生された分子量４万のタンパク質と分子量３万のタンパク質は、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株のβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の発現によって特異的に誘導されたタンパク質であることが判る。
アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼのβユニットタンパク質およびαユニットタンパク質は、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列中にあるその遺伝子の大きさから、それぞれ３６１００、２７７００と推定される。前記のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された大きい方（４万）の蛋白質は１−エピメラーゼのβユニット、小さい方（３万）はαユニットに相当すると思われた。上記の実験から、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体中に本発明により導入されたところのアグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  αユニット遺伝子およびβユニット遺伝子は大腸菌内でそのコードするタンパク質を発現することが認められた。
実施例６
本例では、実施例４で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体に本発明により導入されているＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子が大腸菌内で実際にＤ−キロ−イノシトールを異性化するエピメラーゼ活性を有する１位エピメラーゼを発現することを確認する実験が行れたものである。実験は、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体を、基質としてＤ−キロ−イノシトールを含んだ緩衝液中で反応させる緩衝液中の変換反応法（イ）と、基質を含む培地中でＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を培養しながら菌体を基質に反応させる培地中の変換反応法（ロ）の２通りを行った。
（イ）緩衝液中の変換反応法（その１）
（ｉ）実施例４で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体をＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有）で菌体量が吸光度Ａ  ６００＝１．０になるまで培養した。その後に、培地にＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加した。さらに２４時間培養して遺伝子発現を誘導した。得られた培養液を遠心分離（６０００回転、１０分間）にて菌体を集め、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）で洗浄して、洗浄菌体を得た。
（ｉｉ）こうして得られた大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の洗浄菌体を、変換反応用の緩衝液（５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．５；１０ｍｇ／ｍｌのＤ−キロ−イノシトールおよび４ｍｇ／ｍｌのＮＡＤを含有）に懸濁した。この懸濁液中で菌体を基質に３７℃、２４時間反応させた。反応液を遠心分離（１６０００回転、５分間）して上清を得た。この上清中の生産物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社  Ａｒｔ５７１５、以下、ＴＬＣ）にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で展開した。薄層に過マンガン酸カリウム水溶液を噴霧させてスポットを発色させた。
添加されたＩＰＴＧの存在下に培養されて遺伝子の発現を誘導された大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体から洗浄により得た洗浄菌体を、上記の緩衝液中で基質Ｄ−キロ−イノシトールに反応させた場合、得られた反応液をＴＬＣにかけたシリカゲル薄層上では、Ｄ−キロ−イノシトールのスポットがほとんど消失しており、またＤ−キロ−イノシトールから変換されたＤ−ミオ−イノシトールに相当するスポットが認められた。
他方、ＩＰＴＧを添加しないで培養されて、遺伝子の発現を誘導されなかった大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の洗浄菌体を、上記の緩衝液中で基質Ｄ−キロ−イノシトールに作用させた場合には、その反応液を上記のＴＬＣにかけて調べると、シリカゲル薄層上で基質Ｄ−キロ−イノシトールのスポットが多く残っており、Ｄ−ミオ−イノシトールのスポットは小さかった。
上記の観察事実は、前記の実施例５の（２）で調べたところの、形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の培養をＩＰＴＧの存在下で行い、遺伝子の発現を誘導し、そして菌体の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質のバンドを検出した時のタンパク質発現の結果と一致していた。大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株でのαユニットおよびβユニットのタンパク質の発現量の増大にともなって緩衝液中での基質の変換反応も進んだことを示している。
このことは、本発明によりクローニングしたエピメラーゼのαおよびβ遺伝子はこれら遺伝子の導入された形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の菌体内で発現してエピメラーゼ活性を発現できることを示している。
（ロ）培地中での変換反応法
実施例４で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を基質Ｄ−キロ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）およびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加されたＬＢ液体培地で培養した。菌体量が吸光度Ａ  ６００＝１．０になるまで培養した後に、培地にＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加した。その後、３７℃で培養を続けた。培養液を経時的にサンプリングし、培養液サンプルを遠心（１６０００回転、５分間）して上清を得た。この上清中の生産物をシリカゲルＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社、Ａｒｔ５７１５）にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で展開した。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させた。
培養開始から２４時間、あるいは４８時間後の培養液から取られたサンプルの上清中には基質Ｄ−キロ−イノシトールがほとんど未反応で残存した。しかし、培養７２時間後の培養液中では、基質の約３０％がＤ−ミオ−イノシトールに変換されたことが認められた。
なお、緩衝液中の変換反応（その２）を次の通り行った。すなわち、本例の前項（イ）の緩衝液変換反応法の（ｉｉ）で用いた変換反応用の緩衝液に基質として添加された１０ｍｇ／ｍｌのＤ−キロ−イノシトールに代えて、１０ｍｇ／ｍｌのＤ−ミオ−イノシトールを基質として添加した。前項（イ）（ｉｉ）と同じ要領で、大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株の洗浄菌体の１０ｍｇを変換反応用の緩衝液の０．５ｍｌに懸濁して、３７℃、２４時間にわたってＤ−ミオ−イノシトールに菌体を作用させた。
反応液を遠心分離して上清を得た。上清を薄層シリカゲルクロマトグラフィーにかけて、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で展開し、さらに過マンガン酸カリウム水溶液で発色させた。基質のＤ−ミオ−イノシトールのスポットと、Ｄ−キロ−イノシトールのスポットが認められた。
実施例７
Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ法によるＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ遺伝子の改変
（１）Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ  ｐＢＡ１９をテンプレートとして用いて、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子をＰＣＲで増幅した。この際、鋳型となるＤＮＡに対して間違った塩基がＤＮＡ１分子当たり１〜数カ所ランダムに入るような条件でＰＣＲを行った。このために、以下のような５’末端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅあるいはＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを付加したプライマー（Ｂｅｐｉ−８Ｆ／Ａｅｐｉ−９Ｒ）を設計し作製した。
0003887600.tif 000028
次に、このプライマー２種すなわちＢｅｐｉ−８ＦおよびＡｅｐｉ−９Ｒを用いてかつ前記エピメラーゼβユニット遺伝子及びα遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡ−：ｐＢＡ１９をテンプレートとして用いてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ用の反応液組成は、通常の反応液組成の中にＭｎＣｌ２を添加し、さらに４種のｄＮＴＰの割合を変えたものを用いた。すなわち、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１〜０．３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットから成るものとした。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、１分間、伸長を６８℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返し、最後に７２℃で伸長反応を２分間行うことにより実施した。
上記のＰＣＲ反応によって約２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画した。上記の約２  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを、Ｋ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片は、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットの遺伝子（すなわちβユニット遺伝子）とαユニットの遺伝子（すなわちαユニット遺伝子）との両方を内部に含有するＤＮＡであり、その分子中にはランダムに１〜数カ所の塩基置換が生じた集合体である。
（２）一方、上で作製したβ遺伝子およびα遺伝子内に変異が生じたＤＮＡ断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の溶液とプラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化物を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片との連結反応を行った。これによって、その分子内に塩基置換が生じたβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するＤＮＡ断片と、ベクターｐＵＣ１８との連結体であるプラスミドが構築された。
このランダムに塩基置換が生じたβユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子を含有するプラスミドの集合体を、大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に導入した。連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース，１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドＤＮＡで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子及びαユニット遺伝子のいろいろな箇所の塩基が置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
（３）上記で得られた、βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子内にランダムに塩基置換が生じた形質転換大腸菌ライブラリーを、基質Ｄ−ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加されたＬＢ液体培地で培養した。３７℃、３日間培養した後に培養液をシリカゲルＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社、Ａｒｔ５７１５）にかけ、展開溶媒クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で展開した。シリカゲル薄層に過マンガン酸カリウム溶液を噴霧させてスポットを発色させた。コントロールとして変異の入っていないエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子を含有するプラスミドｐＢＡ１９の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９の培養液を用いた。
ＴＬＣ上でコントロールより生成物であるＤ−キロ−イノシトールの発色スポットが大きくなったものを選別した。選別したクローンについて、再度培養を行い活性の再現性を確認し、再現性が得られたものについて培養液上清をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析にてＤ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換率がコントロールと比較して１．２倍以上あったものについて複数本培養を行い、統計的に有為に変換率が高まったものをさらに選別した。これらのクローンについてはエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析して、変異箇所を同定した。塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。
上記のようにＤ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換が増大したクローンのスクリーニングによって、変換率がコントロールと比較して１．３〜１．５倍程度統計的に有為に増大しているものとして、Ｙ５７−１１Ｅ株が選別された。Ｙ５７−１１Ｅ株の保有するプラスミドＤＮＡを抽出してそのエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の塩基配列を解析したところ、βユニット遺伝子の１０６番目の塩基がＧからＡに置換し、アミノ酸としては３６番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変わっていた。Ｙ５７−１１Ｅ株からプラスミドを抽出して大腸菌ＪＭ１０９へ再度形質転換させたものでも、Ｄ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換活性は同程度に増大していた。すなわち、変換活性の増大は、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸がバリンからイソロイシンに変わったことに由来していることが確認された。そこで、このβユニット遺伝子の３６番目のアミノ酸をバリンやイソロイシン以外の１８種類のアミノ酸に置換させて変換活性がどのように変化するか検討することとした。
実施例８
部位特異的総変異によるＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子３６番目アミノ酸の置換
（１）実施例７でランダムに変異を導入することにより変換活性の増大したクローンが得られた。そのうちβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が置換することによって変換活性が増大したことに着目して、３６番目のアミノ酸を他のすべてのアミノ酸に置き換えて活性との相関を検討した。
前記エピメラーゼβユニット遺伝子３６番目のアミノ酸だけを特異的に変えるために以下のような手法を用いて実施した。エピメラーゼβユニット遺伝子の上流から３６番目アミノ酸のコドンを混合塩基のＮＮＮとして３９番目アミノ酸までの上流領域断片を以下に示したＢｅｐｉ−１６Ｆ／Ｂｅｐｉ−１４Ｒプライマーで増幅し、３６番目アミノ酸のコドンを混合塩基のＮＮＮとして３３番目アミノ酸からαユニット遺伝子の最後までの下流領域断片をＢｅｐｉ−１７Ｆ／Ａｅｐｉ−１０Ｒプライマーで増幅した。
増幅したＤＮＡ断片は、そのβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸に相当する配列がいろいろなアミノ酸をコードする配列を有する集合体である。得られた上流領域断片と下流領域断片はβユニット遺伝子内の３３番目アミノ酸から３９番目アミノ酸までが重複しているのでこれらの断片をアニールさせたものをテンプレートとして、βユニット遺伝子の上流配列のプライマーＢｅｐｉ−１６Ｆとαユニット遺伝子の下流配列のプライマーＡｅｐｉ−１０ＲでＰＣＲを行い、エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の全長を得ることができた。
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（２）一方、上で作製したβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が置き換わったＤＮＡ断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の溶液とプラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化物を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片との連結反応を行った。これによって、３６番目のアミノ酸が２０種類のアミノ酸に置き換わったβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の両方を内部に含有するＤＮＡ断片と、ベクターｐＵＣ１８との連結体であるプラスミドが構築された。
このランダムに塩基置換が生じたβユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子を含有するプラスミドの集合体を、大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に導入した。連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体は、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸が２０種類のアミノ酸に置換されたプラスミドを有しているライブラリーである。
前記ライブラリーから白色コロニーを選別して、βユニット遺伝子の塩基配列を解析して、βユニット遺伝子の３６番目アミノ酸がどのようなアミノ酸に置換されたか確認した。塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。下記の第１表に示すようにβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸をコードする３塩基の並びが３４種類の変異体が得られ、その結果、グルタミン、メチオニンを除く１８種類のアミノ酸に置き換えることができた。
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それぞれの変異株を基質Ｄ−ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加したＬＢ液体培地で３７℃、４日間培養し、その培養上清を遠心回収して培養液中の基質Ｄ−ミオ−イノシトールの変換物をＨＰＬＣにて分析した。
コントロールとして、テンプレートとして用いたｐＢＡ１９プラスミドを保持する大腸菌株ｐＢＡ１９−ＪＭ１０９とβユニット遺伝子の３６番目アミノ酸がイソロイシンに置換したＹ５７−１１Ｅ株を培養して用いた。コントロールｐＢＡ１９−ＪＭ１０９株のＤ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換率を１．０とした時の変異株の変換率の相対値をもとめ添付の表に記した。その結果、３６番目アミノ酸をイソロイシンに置き換えたものが最も変換活性が増大していた。
実施例９
集積培養菌からのエピメラーゼ相同遺伝子の単離
（１）アグロバクテリウム・エスピー１０１２１株からクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ  βユニット遺伝子あるいはαユニット遺伝子の配列を指標にして自然界の土壌に生息する菌からエピメラーゼ遺伝子に相同性のある遺伝子が得られるかを試行した。
土壌サンプルは、各地から採取して、約３００ｍｇを１ｍｌの滅菌水に懸濁した。ボルテックスミキサーでよく混合して、室温で１時間静置してその上清１０μｌを以下に示す集積培地に添加した。集積培地はＤ−ミオ−イノシトールあるいはＤ−キロ−イノシトールを唯一の炭素源とする培地で、その組成は１リットル当たりの量として下記の通りである。
Ｋ２ＨＰＯ４                ２．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                １．２ｇ
ＮａＣｌ                    １．０ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４          ３．０ｇ
ＭＩ／ＤＣＩ                １．０ｇあるいは１０．０ｇ
水道水（ｐＨ７．０）
この集積培地２ｍｌを遠沈管に入れ、上に記した土壌サンプル懸濁液を添加し、２８℃で４〜７日間振とう培養し、新しい集積培地に培養液を植え継ぐ操作を繰り返した。
基質であるＤ−ミオ−イノシトールの方がＤ−キロ−イノシトールよりよく増殖しているもの、あるいはＤ−ミオ−イノシトールにのみ菌が増殖しているものを選別した。
（２）上で選別した菌の培養液を遠心して培養菌体を回収した。菌体からの染色体ＤＮＡの抽出は宝酒造（株）製の“Ｇｅｎとるくん”を使用してその使用説明書に従い、以下のように抽出、精製した。すなわち、培養液から得た菌体をＧｅｎＴＬＥ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ  １８０μｌに懸濁した。ＧｅｎＴＬＥ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを２０μｌ加えｖｏｒｔｅｘによりよく撹拌し、７０℃で１０分間加熱した。ＧｅｎＴＬＥ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを１００μｌ加え、穏やかに混合する。マイクロチューブを氷中に置き、１分ごとに転倒混和しながら５分間冷却した。１２０００  ｒｐｍで遠心し、上清を新しいチューブに移してフェノール抽出を２回行った。クロロホルムで抽出後に、クロロホルム抽出液に、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてから約２．５倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈澱させたＤＮＡを乾燥後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。この染色体ＤＮＡは次のＰＣＲでテンプレートとして用いる。
炭素源としてＤ−ミオ−イノシトールを資化できる土壌由来の菌から染色体ＤＮＡを抽出したので、これをテンプレートとして用いてアグロバクテリウム・エスピー１０１２１株からクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニットあるいはαユニット遺伝子に相同なＤＮＡ配列が得られるかどうかを、ＰＣＲ法にて次のように試みた。
アグロバクテリウム・エスピー１０１２１株ではエピメラーゼβユニット遺伝子とαユニット遺伝子がタンデムに近接して存在していたので、βユニット遺伝子とαユニット遺伝子を連結した状態で増幅できるか検討した。このために、βユニット遺伝子の開始コドンから２１塩基のＤＮＡ配列にクローニング部位としてＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅをつなげた下記のプライマーＢｅｐｉ−１０Ｆ、およびαユニット遺伝子のＣ末端配列１８塩基と終止コドンにクローニング部位としてＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅをつなげた下記のプライマーＡｅｐｉ−９Ｒを設計した。
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ＰＣＲ用の反応液組成は、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応用緩衝液（宝酒造）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ混合溶液（各０．４ｍＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットから成るものとした。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９５℃、３分間、さらに、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを４２℃、１分間、伸長を６８℃、２分間行う３段階の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃で伸長反応を２分間行うことにより実施した。
上記のＰＣＲ反応によって、独立して採取した土壌由来の菌すべてにβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子の大きさの約２ｋｂに相当するＤＮＡが増幅した。このＰＣＲ増幅反応液を、次にアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ増幅生成物を分画した。上記の約２．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ  ０１（宝酒造）によって回収し、フェノール抽出、クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈澱した。得られたＤＮＡ断片の精製品をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。
さらに、このＰＣＲ増幅ＤＮＡをＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡ断片を得た。
（３）一方、土壌菌由来のエピメラーゼβユニット遺伝子及びαユニット遺伝子に相同なＤＮＡ断片を大腸菌で発現させるためのプラスミドを次のように作製した。すなわち、プラスミドベクターｐＵＣ１８に前記のＤＮＡ断片を連結させる。このために、先ずベクターｐＵＣ１８をＫ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ベクター消化物を得た。
前記のＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１８のベクター消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造）により連結した。すなわち、精製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の溶液とプラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化物を混合し、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃、一晩保温して、ベクターＤＮＡとＤＮＡ断片との連結反応を行った。これによって、土壌菌由来のエピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同な配列を保有するプラスミドが構築された。
上記で作製したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に導入した。連結ＤＮＡ溶液と大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）とを混合し、氷中で３０分間、４２℃で４０秒間、さらに氷中で２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
この形質転換された大腸菌を含む培養液を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；１００μＭ）含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布し、３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記の組換えプラスミドで形質転換した大腸菌が得られるので、これを選択して分離した。得られた形質転換体を基質Ｄ−ミオ−イノシトール（８ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ  １ｍＭを添加したＬＢ液体培地で３７℃、４日間培養した。その培養上清を遠心回収して培養液中の基質Ｄ−ミオ−イノシトールの変換物をＨＰＬＣにて分析した。
コントロールとして、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のエピメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌株ｐＢＡ１９−ＪＭ１０９を同時に培養した。土壌菌から得たエピメラーゼに相同なＤＮＡ配列を含有する大腸菌株においても、基質Ｄ−ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する活性を有していた。その変換活性は、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株からクローニングしたエピメラーゼ活性と同等であった。土壌菌由来のエピメラーゼ活性を発現しうるＤＮＡの塩基配列を解析し、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株由来のエピメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較した。塩基配列解析は、ＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター  サイクル  シークエンス法で行った。その結果、βユニット遺伝子９９番目の塩基ＧがＴに置換しているだけで（アミノ酸としては、ロイシンのまま）他の領域の塩基配列は一致していた。
以上のように、アグロバクテリウム・エスピーＡＢ１０１２１株よりクローニングしたＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼβユニット遺伝子およびαユニット遺伝子に相同なＤＮＡ配列は、自然界に広く存在し、Ｄ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼ活性を発現させることが可能である。
実施例１０
本例では、前記の実施例６（ロ）と同様にして、培地中で前記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を培養しながら菌体を基質Ｄ−ミオ−イノシトールに作用させる変換反応を用いて、Ｄ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを生成、単離する方法を行った。
すなわち、前記の実施例４で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ添加したＬＢ液体培地で、菌体量が吸光度Ａ６００＝１．０になるまで前培養し、植菌用菌体溶液を調製した。本培養は、Ｄ−ミオ−イノシトール１００ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ  ２０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５０ｇおよび酢酸アンモニウム５０ｇ、ＭｎＣｌ２  １０ｇを１０Ｌの蒸留水に加えて、ｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブにより滅菌し、冷却後、３２℃に保温した培養液に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを１ｍＭになるように加えた。これに上記の植菌用菌体溶液を１００ｍｌ加えて培養した。
培養はジャーファメンターにて、通気、攪拌し、３２℃で２日間培養を行った。培養２日後、基質として加えられたＤ−ミオ−イノシトールの内、１５．５％がＤ−キロ−イノシトールに変換された。
培養液は連続遠心装置で、菌体と培養ろ液に分離し、培養ろ液を陽イオン交換樹脂（ＤｕｏｌｉｔｅＣ２０−Ｈｔｙｐｅ：２００ｍｌ）カラムと陰イオン交換樹脂（ＤｕｏｌｉｔｅＡ１１６−ＯＨｔｙｐｅ：２００ｍｌ）カラムを通過させて脱塩し、さらに活性炭カラムを通過させて脱色した。このように調製した溶液を濃縮し、白色粉末９５ｇを得た。これに１２５ｍｌの蒸留水を加えて加熱溶解させた後、４℃まで冷却し、Ｄ−ミオ−イノシトールを結晶として析出させた。結晶はろ過により除去された。
得られたろ液をさらに４０ｍｌまで濃縮し、室温で析出するＤ−ミオ−イノシトールをさらにろ過により除去した。このろ液を陰イオン交換樹脂（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＣＧ４００−ＯＨｔｙｐｅ：３０００ｍｌ）カラムに供し、蒸留水で溶出した。溶出液を分画し、Ｄ−ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを分離し、Ｄ−キロ−イノシトール含む画分を集めて濃縮し、Ｄ−キロ−イノシトールの白色粉末１０．９ｇを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α］Ｄ２５が＋６５°（ｃ＝１．０，Ｈ２Ｏ）であり、光学純度９９％以上、融点２３８℃であった。
実施例１１
本例では、実施例６（ロ）と同様に、培地中で形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を培養しながら菌体を基質Ｄ−ミオ−イノシトールに作用させる変換反応を用いて、Ｄ−ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを生成、単離する方法を行った。
すなわち、実施例４で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ添加したＬＢ液体培地で、菌体量が吸光度Ａ６００＝１．０になるまで前培養し、植菌用菌体溶液を調製した。本培養は、基質としてＤ−ミオ−イノシトール１００ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ  ２０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５０ｇおよび酢酸アンモニウム５０ｇ、ＭｎＣｌ２  １０ｇを１０Ｌの蒸留水に加えて、ｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブにより滅菌し、冷却後、３２℃に保温した培養液に、上記の植菌用菌体溶液を１００ｍｌ加えて培養した。培養はジャーファメンターにて、通気、攪拌し、３２℃で３日間培養を行った。培養３日後、基質として加えられたＤ−ミオ−イノシトールの内、１５％がＤ−キロ−イノシトールに変換された。
培養液は連続遠心装置で、菌体と培養ろ液に分離し、培養ろ液を陽イオン交換樹脂（ＤｕｏｌｉｔｅＣ２０−Ｈｔｙｐｅ：２００ｍｌ）カラムと陰イオン交換樹脂（ＤｕｏｌｉｔｅＡ１１６−ＯＨｔｙｐｅ：２００ｍｌ）カラムを通過させて脱塩し、さらに活性炭カラムを通過させて脱色した。このように調製した溶液を濃縮し、白色粉末９６ｇを得た。これに１２５ｍｌの蒸留水を加えて加熱溶解させた後、４℃まで冷却し、Ｄ−ミオ−イノシトールを結晶として析出させた。結晶はろ過により除去された。
得られたろ液をさらに４０ｍｌまで濃縮し、室温で析出するＤ−ミオ−イノシトールをさらにろ過により除去した。このろ液を陰イオン交換樹脂（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＣＧ４００−ＯＨｔｙｐｅ：３０００ｍｌ）カラムに供し、蒸留水で溶出した。溶出液を分画し、Ｄ−ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを分離し、Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を集めて濃縮し、Ｄ−キロ−イノシトールの白色粉末１０．７ｇを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α］Ｄ２５が＋６５°（ｃ＝１．０，Ｈ２Ｏ）であり、光学純度９９％以上、融点２３８℃であった。
産業上の利用可能性
本発明に従えば、特定のＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼをコードするＤＮＡ、その改変ＤＮＡが提供され、またそれらのＤＮＡを利用したＤ−キロ−イノシトールの効率のよい製造方法が提供される。Ｄ−キロ−イノシトールは、ＩＩ型糖尿病あるいは多嚢胞性卵巣症候群の治療剤として利用が期待される物質である。したがって、本発明は、例えば、医薬の製造において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、第１０の本発明方法で用いる大腸菌の形質転換株に利用できるプラスミドｐＢＡ１９の構造図を示す。
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