(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類自己免疫疾患患者において自己免疫疾患の症状を軽減するための自己ワクチンであって、該ワクチンは該患者から採取した血液を変性させた血液アリコートからなり、該変性血液アリコートは、酸化剤および紫外線照射により体外処理されたものであって、等量の該患者の未処理の血液と比較して以下の識別特徴を有する：
（ａ）細胞内液胞化が進み細胞表層の形態が異常に滑らかである白血球の数の増加、
（ｂ）ＭＨＣクラスII白血球細胞表層特異的タンパクＨＬＡ−ＤＲを発現している白血球の数の低下、
（ｃ）ＣＤ−１１ｂを含む少なくとも１つの細胞表層マーカーの白血球上での発現のアップレギュレーション。
【請求項２】
ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の数が８−１２％である、請求項１記載の自己ワクチン。
【請求項３】
該変性血液アリコートが、等量の該患者の未処理の血液と比較して、リンパ球が外部刺激に対して反応して増殖する能力の低下を示す、請求項１または２記載の自己ワクチン。
【請求項４】
該変性血液アリコートが、等量の該患者の未処理の血液と比較して、好中球が貪食して酸化的バースト反応をする能力の低下を示す、請求項１〜３のいずれか記載の自己ワクチン。
【請求項５】
貪食できる好中球の割合が６０％までであり、酸化的バースト反応をすることができる好中球の割合が４０％までである、請求項４記載の自己ワクチン。
【請求項６】
該酸化剤がオゾンである、請求項１〜５のいずれか記載の自己ワクチン。
【請求項７】
自己免疫疾患患者からとった血液アリコートをオゾンと酸素のガス混合物でバブリングすると同時に紫外線照射することにより体外処理して製造されたものである、請求項１〜６のいずれか記載の自己ワクチン。
【請求項８】
紫外線照射とオゾン−酸素混合気体によるバブリングが、３７−４３℃の温度で行うことにより製造される、請求項７記載の自己ワクチン。
【請求項９】
下記の工程：
患者から採取した血液アリコートを免疫システム改変に効果のある量のオゾンガスと紫外線にさらすことにより体外で変性させて、該血液アリコートが、該患者の未処理の血液の等量のアリコートと比較して以下の識別特徴：
（ａ）細胞内液胞化が進み細胞表層の形態が異常に滑らかである白血球の数の増加、
（ｂ）ＭＨＣクラスII白血球細胞表層特異的タンパクＨＬＡ−ＤＲを発現している白血球の数の低下、
（ｃ）ＣＤ−１１ｂ、Ｂ−７．２、およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表層マーカーの白血球上での発現のアップレギュレーション、
を有するようにする工程；
によりワクチンが作られることを特徴とする、哺乳類の自己免疫疾患患者に投与して患者の自己免疫疾患の症状を軽減するための自己ワクチンの製造方法。
【請求項１０】
アリコートの量が０．０１−４００ｍｌである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アリコートの量が１−５０ｍｌである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
オゾンガスと紫外線が３７−５５℃の温度で血液アリコートに同時に加えられる、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
オゾンが、医薬等級の酸素との混合気流として加えられ、気流中のオゾン含量は１．０−１００μｇ／ｍｌであり、速度は１分当たり０．０１−２．０リットルで（ＳＴＰ）、期間は０．５−６０分である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
紫外線が、Ｃ帯波長の紫外線を出す少なくとも１個のＵＶランプから供給されるものである、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
紫外線が、波長が２５３．７ｎｍの紫外線を少なくとも９０％出す複数のＵＶランプから供給されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
血液アリコートが３７−４３℃の温度でオゾンと紫外線により処理され、その期間が２−５分間であり、オゾン／酸素混合物は１分当たり０．１−１．０リットルで供給され、オゾンの含量は５−５０μｇ／ｍｌである、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
患者が関節炎を患っている、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
患者が慢性関節リウマチを患っている、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
患者が強皮症に患っている、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫疾患患者に投与して症状を軽減するためのワクチンの製造における、その患者から採取し請求項９〜１９のいずれかに記載の方法により変性させた血液アリコートの使用。
【請求項２１】
患者が関節炎の患者である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
患者が慢性関節リウマチの患者である、請求項２０記載の使用。
【請求項２３】
患者が強皮症の患者である、請求項２０記載の使用。
【請求項２４】
患者が乾癬の患者である、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
患者が炎症性大腸炎の患者である、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
患者が乾癬の患者である、請求項２０記載の使用。
【請求項２７】
患者が炎症性大腸炎の患者である、請求項２０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ワクチン、その調製及び医療における使用に関する。具体的には、本発明は自己免疫疾患とその症状を軽減すること、その際に有用なワクチン、そのようなワクチンを調製し使用するプロセスに関する。
発明の背景
自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性硬化症、糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬などがある。移植器官の拒絶もまた、病理学的に自己免疫疾患に似ているプロセスである。自己免疫疾患は２つに大別できる。結合組織自己免疫疾患（関節炎、狼創、強皮症がその例である）と特定器官の不全（多発性硬化症、糖尿病がその例である）である。
一般には、正常に機能している免疫システムは外から侵入してきた生物（非自己）と自分自身の体内の組織（自己）とを見分けて、外来生物に対する防御を行う。したがって、免疫システムが適正に機能するためには、システムが自己と非自己を識別する能力がその中心となる。患者の免疫システムが自己と非自己を識別できず自己抗原に対して反応し始めると、自己免疫疾患が起こる。患者の免疫システムが自己に対して応答する原因は完全には分かっておらず、いくつかの異なる説が出されている。ある抗原に対する免疫応答は、あるリンパ球上のあらかじめ決められた特異性を有するレセプターとその抗原が相互作用することが引き金となる。免疫システムの発生の初期段階で自己抗原を認識するレセプターを持つリンパ球は、認識され、体内のシステムから削除することにより排除されると考えられている。あるいは、又はさらに加えて、このような自己反応性リンパ球はその活性がサプレッションによりコントロールされている。
健常人の免疫システムは、自然において高度に保存されている（すべての生物にわたって似たような構造を有する）一群のタンパク質を認識しそれに反応することができる。このタンパク質のファミリーはストレスタンパクあるいは熱ショックタンパク（ＨＳＰ）と呼ばれ、おおよその分子量によってグループ分けされている。ＨＳＰファミリーのメンバーには、ＨＳＰ６０群や、数ある中でも分子量が５０から１００キロダルトンの範囲にあるタンパク質が含まれる。ＨＳＰの生産の増加ははじめは熱ストレスに対する応答として同定されたが、現在はこれは種々の細胞ストレスに対する一般的応答の一部であるとみられている。ＨＳＰは通常は細胞内に存在し、その機能は、ストレスを受けた細胞のいろいろなタンパク質の構造を安定化して細胞を種々のストレッサーのタンパク質変性効果から保護することにあると考えられている。しかし、ＨＳＰはそのほかにも今のところはよくわかっていない機能を多く持っているらしい。熱ショックタンパク、即ちＨＳＰについては、サイエンティフィックアメリカン誌１９９３年５月号５６ページにWilliam J. Welchがやや詳しく論じている。
ＨＳＰファミリーのグルーブの１つであるＨＳＰ６０群には細菌細胞とヒト細胞の間で５０％の相同性を示すタンパク質が含まれている。ＨＳＰ６５を持っている細菌が感染すると、健常なヒトではその細菌性ＨＳＰ６５に対する免疫応答が起こることが、抗ＨＳＰ６５抗体がつくられることから立証される。したがって健常免疫システムは自己類似抗原を認識し、それに反応できるようである。
ある病状−例えば慢性関節リウマチや強皮症のような多くの自己免疫疾患−では、患者にはＨＳＰ６５にたいする抗体が存在する。過去には、このことから自己免疫疾患が細菌の感染に起因するという結論が導かれた。現在では、自己免疫疾患は−少なくともいくつかの場合においては−自己免疫応答の不適切なコントロールに関係しているようである。言い換えると、自己の体内のＨＳＰに対してひき起こされて適切にコントロールされていない自己免疫応答から、ＨＳＰ６５に対する抗体ができることもあり得るのである。したがってそのような場合、特定かつ特異的ワクチン投与を用い、身体に生来備わった免疫コントロール機構を刺激することにより、不適切な自己免疫応答をコントロールすることができるだろう。
身体の免疫応答を刺激するためには、宿主身体に注射すると宿主の免疫システムがワクチンに含まれる抗原を免疫システムの細胞に提示できるようなワクチンが必要である。抗原提示は抗原提示細胞により行われる。
自己免疫疾患を治療するためのワクチンは、身体の免疫コントロール機構を活性化する抗原又はその断片（ペプチド）を含んでいなければならない。加えて、その抗原（ペプチド）は、ワクチンか宿主に導入されたときに宿主の免疫システムによって認識される形態で存在しなければならない。抗原のあるものは無傷細胞上に存在するだろう。そのようなワクチン投与は調節性の免疫経路、特に自己免疫応答をコントロールしているものを活性化して、自己免疫応答をダウンレギュレーションするためのものである。
哺乳類の自己免疫システムのコントロール機構を活性化する特定の抗原については完全には理解されていないが、それらにリンパ球レセプターに由来する抗原が含まれるだろうことはわかる。これらの抗原はコントロール機構を刺激するように働いて、患者の病的自己免疫応答を引き起こすリンパ球を抑制するのであろう。ＨＳＰ６０タンパクなどのＨＳＰ群や、ＭＨＣクラス１及びクラス２分子を含む主要組織適応遺伝子複合体（ＭＨＣ）のような白血球表面分子もまたこれに含まれる。ＭＨＣクラス２分子の生理的機能は、免疫応答の一部として抗原提示細胞に対してペプチドを提示することである。
ある自己免疫病の患者にワクチンとして投与するためのリンパ球レセプターやその他の細胞に由来する分子はその患者自身の細胞に由来するものであることが重要である。なぜならばこのシステムは適切な調節性免疫応答を刺激するのに必要な自己免疫特異性を有するからである。血液中の他の白血球のレセプターも、代わりにあるいは付加的に、ここに提起されたワクチン投与プロセスにおいて重要であろう。このようなシステムをワクチンの基礎として使用することは、ある特定のウイルス抗原をそのウイルスにより引き起こされる病気を治療し予防するためのワクチンとして使用することと類似していると考えられるだろう。
であるから、ある自己免疫疾患を治療するためのワクチンは患者自身の血液標品から調製されるべきである。このようなワクチンは自己ワクチンということができる。
抗原が免疫システムを刺激（あるいは抑制）するのに効果的であるためには、抗原は体にもともと存在する抗原提示細胞により宿主のシステムに提示されなければならない。抗原提示細胞の多くは貪食細胞であって、これらは抗原にとりついて貪食作用により抗原を飲み込み、抗原を分解あるいは加工する。このような自己ワクチンを調製するには、ワクチン中の抗原の源であるリンパ球や他の白血球が患者に再度注入されたときに抗原提示貪食細胞により貪食され易いような形態になるようなプロセスが含まれる必要がある。そのことにより抗原又はその有効な残基が抗原提示細胞の表面に提示される。それから抗原は免疫システムのコントロール機構を刺激又は抑制することができる。
哺乳動物の正常な生育期間中、細胞の領域が除去されて組織が作りなおされていく。これは細胞がプログラムされた細胞死あるいはアポトーシスと呼ばれる過程を経ることにより遂行される。アポトーシス細胞は崩壊し、その内容物を放出せずに貪食される。
米国特許第４，９６８，４８３号（Mueller et al.）は、患者の血液の一部を体外で、温度を制御しながら酸素／オゾンの混合物と紫外線により処理することにより血液を酸素化する装置を記載している。この装置は血液学的酸化治療に使用することが提案されている。
米国特許第５，０５２，３８２号（Wainwright）は、オゾンを制御下に発生させ投与するための装置を開示している。この装置はオゾン発生用のジェネレーター、オゾン生成を監視するためのモニター、決められた量の投与オゾンを供給するための投薬装置、装置の運転を制御するためのコンピューター制御装置とからなる。この特許はさらに、外傷を治療するためにもウイルスあるいは細菌感染の治療のためにもオゾンを患者に投与することが知られていることを開示している。
発明の概要
本発明の目的の１つは、少なくとも１種の自己免疫疾患の症候を軽減するのに有用な、新規な自己ワクチンを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、そのような自己ワクチンを製造するための新規なプロセスを提供することである。
本発明のもう１つのそしてより特定された目的は、少なくとも１種の自己免疫疾患の症状をその病気に苦しむヒトの患者において軽減するための、新規な治療法を提供することである。
したがって、本発明は第１の態様からは、ほ乳動物患者における自己免疫疾患を治療するための、自己免疫疾患患者自身の血液の一部に由来する自己ワクチンを提供する。自己ワクチンの特徴は、自己免疫疾患患者の非処理の循環血液と比較して、そのなかに以下の特徴の少なくとも１つが存在することである。
・電子顕微鏡下で観察されるアポトーシス特有の（apopincreased）凝縮細胞内液胞と、走査電子顕微鏡で観察される異常に滑らかな表層トポグラフィとを示すリンパ球の数の増加；
・血液白血球の細胞表面からＭＨＣクラスII分子のＨＬＡ−ＤＲをはじめとする特定のタンパク質が放出されて、結果としてそのような表層タンパク質を発現している細胞の数が減少する；
・ある種の細胞表層マーカー、例えば細胞接着分子ＩＣＡＭ−１のリガンドの成分であるＣＤ−１１ｂ、の発現のアップレギュレーション；
・白血球、特にリンパ球中に存在する熱ショックタンパクのＨＳＰ−６０の量の減少と血漿中のＨＳＰ−６０の増加；
・リンパ球中のＨＳＰ−７０の減少；
・リンパ球が外部刺激に応答して増殖する能力の低下；
・好中球が貪食し、酸化的バースト反応を行う能力の低下。
本発明の自己ワクチン中では、形態が変化したリンパ球と他の白血球の数が増加している。これらの細胞は宿主の体内に再注入されると優先的に貪食されるようになるのだろう。
哺乳類の体内には、種々の抗原提示細胞と好中球を含む多数の異なるタイプの貪食細胞が存在する。抗原提示細胞による貪食を他の貪食細胞による貪食よりも助長するために、本発明の自己ワクチン中に存在するリンパ球と他の白血球を処理してこれらの細胞が抗原提示貪食細胞と優先的に相互作用できるようにする。細胞は細胞接着分子の発現をはじめとする多くのメカニズムにより、互いに接着する。あるタイプの細胞上に存在する細胞接着分子は、接着するタイプの細胞上に存在するその接着分子に特異的なリガンドと相互作用する。本願発明では、宿主の体内の抗原提示細胞上に見出される接着分子に対するリガンドの自己ワクチン中の細胞の表面上での発現をアップレギュレーションし、その結果、自己ワクチン中の細胞が宿主の体内の抗原提示細胞と優先的に相互作用することになるだろう。抗原提示細胞は数多くの細胞接着分子を発現している。細胞接着分子の１つにＩＣＡＭ−１があり、これに対するリガンドの１つがＣＤ−１１ｂである。本発明のプロセスが、形態が変化した細胞の優先的な貪食を変化させる方法の１つはＣＤ−１１ｂを含む接着分子のアップレギュレーションである。
本発明による自己ワクチンの調製は、自己免疫疾患の患者から、０．０１ｍｌから４００ｍｌの量でその血液を採り、採った血液を体外で免疫システムにたいする刺激効果のある量のオゾンガス及び紫外線にさらすものである。患者から採取した血液は１つ又はそれ以上の特徴を有し、その特徴によりそれが自己免疫状態にある患者の血液であると特徴づけられ、健常個体の血液や、他の異常や病的状態の患者の血液と区別できる。その特徴としては、赤血球沈降速度の増大、リウマチ因子レベルの上昇、Ｃ反応性タンパクのレベルの上昇、ＨＳＰ６５に対する抗体の存在、およびこれらの要素の２つ以上の組合せがある。これ以外にも、特定の自己免疫病に特徴的で、したがってその病気の患者の血液中に存在する因子が知られており、その病気を診断するための標準的血液検査の基礎をなしている。
本発明の、少なくとも１種の自己免疫疾患の患者の症状を軽減するための治療法は、患者から０．０１ｍｌから４００ｍｌの量でその血液を採り、採った血液を体外で免疫システムにたいする刺激効果のある量のオゾンガス及び紫外線にさらし、ついで処理した血液を患者に投与することからなる。
図面への簡単な言及
図１は後で述べる実施例２の結果をグラフで示すものである。
好ましい実施態様の説明
本発明の自己ワクチンを自己免疫患者に注射すると、以下に述べる本発明の具体的な実施態様に示すように、その患者の自己免疫の病状が顕著に軽減されることがわかる。この再注射の後ワクチンが正確にどのように働くのかは完全にはわかっていない。以下の仮説は本発明をよりよくより完全に説明するためであって、拘束したり制限したりするものではない。
リンパ球の一種であって免疫システムの制御に重要な役割を果たしているＴ細胞には、ＣＤ−８細胞（さらにサブレッサー細胞と細胞障害性細胞とに分けられる）と、ＣＤ−４細胞（これはヘルバーＴ細胞としても知られ、さらにＴＨ１とＴＨ２細胞とに分けられる）とがある。ＴＨ１細胞はインターフェロンγのような炎症性サイトカインを分泌する。ＴＨ２細胞は調節性細胞と考えられ、インターロイキン４のような調節性サイトカインを分泌する。健常個体においては、ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞の比はおおよそ３：１である。自己免疫状態では、通常ＴＨ細胞タイプの平衡が狂い、ＴＨ２細胞に比べてＴＨ１細胞が増加することが多い。即ち、これら２種のＴ細胞の比率が変化して、その結果自己免疫疾患ではよく見られる炎症状態が発現するのである。リンパ球から出て血漿へ移行するＨＳＰ６０、白血球の表面から放出されるＨＬＡ−ＤＲ及び／または他のＭＨＣ抗原も含め、本発明の自己ワクチンの多数の成分は、そしておそらくは細胞表面マーカーＢ７．２の発現の増大も、患者の血液中のＴＨ２細胞のアップレギュレーション、あるいはＴＨ１細胞の減少をもたらすのであろう。このことは平衡を調節するサイトカインが増加するような方向、及び／またはサプレッサー細胞をアップレギュレートする方向へと変化させ、自己免疫疾患を抑制する経路を刺激し、自己免疫応答経路を解消あるいは遮断する。
多くの人々がおびただしい数の自己反応性Ｔ細胞を持っていると思われるのに、自己免疫疾患の患者においてはこのことがこれらの自己反応性細胞のコントロールにおける特徴であり、これが自己免疫疾患の原因の一部であることは、一般に受け入れられている。自己免疫疾患に苦しむ人たちのこれらの自己反応性Ｔ細胞を調節する能力がダメになっているのである。本発明の自己ワクチンは正常な免疫状態へシステムを回復するのである。
自己ワクチンは血液の一部を少なくとも１つのストレッサーの調節量にさらして製造される。ストレッサーは、オゾンのような酸化剤、紫外線、高温、これらストレッサーの２つ以上の組合せのなかから選択する。このような処理をしてできた血液は、自己ワクチンとして働き、自己免疫患者に再注射することができる。このような処理を１クール行った後、慢性関節リウマチ、強皮症などの患者の自己免疫疾患の徴候や症状は顕著に軽減される。慢性関節リウマチの症状の主観的軽減報告は、米国リウマチ学協会（American College of Rheumatology）により慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の進行を測定するのに意味があると認められた客観テストである、相対的赤血球沈降速度の客観的測定と一致する。
患者から採られかつ患者の自己免疫状態に派生する特徴を有する血液を変性させて本発明による自己ワクチンを調製する際、血液細胞はストレスを受ける。これは細胞に含まれる熱ショックタンパク質ＨＳＰに影響を及ぼす。ＨＳＰ−６０のレベルは単核球では減少し、血漿中では上昇する。さらに、単核球中のＨＳＰ−７２のレベルは減少する。また本発明のプロセスの結果、リンパ球のある種の表面（膜）タンパク質、たとえばＨＬＡ−ＤＲ、は減少するが、いっぽうＣＤ−３のような他の表面タンパク質は変化せず、好中球のＣＤ−１１ｂのような表面タンパク質はアップレギュレートされる。したがって、起こっているのが、非特異的な膜の変化でもなければ細胞破壊でもないことは明らかである。これは複雑で能動的なプロセスである。
本発明の自己ワクチンを電子顕微鏡で見ると細胞の表面の形態が変わり、細胞内液胞が増加していることがわかる。このことは自己ワクチン中には、再注入されたときに優先的に貪食されて自己免疫疾患の抗原が適切に提示されることになるだろう、形態が変化した細胞の数が増えていることを示唆する。
本発明による好ましい自己ワクチン中には、同じ患者の未処理の末梢血と比べてＨＳＰ−６０の存在を示す単核球あるいは白血球の数が減少し、また各細胞内のＨＳＰ−６０のレベルも減少している。通常患者はＨＳＰ−６０の存在を示す単核球を（全血細胞間フローサイトメトリーで測定して）典型的な例では約３０％有するのに対し、この自己ワクチンは１２−２０％しか持たない。実験によれば、この数値は６試験の平均で２９．３％から１５．５％に低下した。また好ましくはＨＳＰ−７２の存在を示す白血球の数は、同じ患者の未処理血液中では約５０％であるのに対し、本発明の自己ワクチン中では２５−３５％に減少している。実験研究では、ＨＳＰ−７２に関するこの数値（同様に測定した６試験の平均）は非処理血液で４９．４％であるのに自己ワクチン中では３０．２％に低下した。
本発明の好ましい自己ワクチン中では、細胞表面特異的タンパク質ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の数はおそらく細胞表層からこのタンパクが放出される結果患者の未処理血液に比べ低下している。一般に、ＨＬＡ−ＤＲを発現している細胞の数は、全血フローサイトメトリーで測定して、約２３％から約８−１２％に低下する。実験によれば、５試験の平均でこの数値は２３．３％から１０．３％に低下した。
本発明の好ましい自己ワクチン中の表面マーカーＣＤ−１１ｂのアップレギュレーションは、自己ワクチン中のＣＤ−１１ｂテスト陽性の好中球の割合が同じ患者のもとの血液と比較して増加することで表される。通常、この好中球は約１０％からおよその範囲７０−９５％にまで増加する。実験によれば、６試験の平均で、１０．３％から８４％へと増加した。
本発明の重要な特徴は、自己免疫疾患を患う患者のための自己ワクチンがその患者自身の血液から作られるということである。その患者の血液は自己免疫疾患に派生する特性を有する。自己ワクチンの基礎となる抗原は患者自身の血液中にその起源がある。外部抗原は全く加えない。有効な抗原は患者の血液中に存在する、及び／または患者自身の血液を用いて自己ワクチンを作るプロセスにより放出されるか修飾される。さらに、多くの場合に、患者が苦しんでいる自己免疫疾患が正確に何であるかはどうでもよいようである。その病気のための自己ワクチンのための抗原は、患者自身の血液中に存在するかその血液を処理することにより出現してくる。
好ましくは、抜き取った血液中の白血球に加えるストレッサーは温度ストレス（体温より高い血液温度）、酸化的環境（たとえば血液中をオゾンと酸素の混合ガスをブクブク通す）、および紫外線であり、同時あるいは順番に加えるが好ましくは同時に加える。
本発明はヒトにおける自己免疫疾患の症状を軽減する方法を提供する。その方法は：
（ａ）約０．０１ｍｌから４００ｍｌの血液を、免疫システムを改変するに足る量のオゾンガスと紫外線にさらし、
（ｂ）工程（ａ）で処理した血液をヒトに投与する、
ことからなる。
一般に、本発明のよれば約０．０１ｍｌから約４００ｍｌまでの血液を処理することができる。、好ましい量は約０．１ｍｌから２００ｍｌの範囲にある。より適しているのは処理する量は約０．１−１００ｍｌ、さらに好ましいのは１−５０ｍｌ、最も好ましいのは５−１５ｍｌである。本方法では最も好ましくは約１０ｍｌの血液をオゾンガスと紫外線で処理し、ついで処理血液を患者に筋肉内注射する。
すでに述べたように、本発明によれば、処理する血液に上に述べた３つのストレッサーを同時にかけることが好ましい。白血球細胞の細胞膜が破壊されるような過剰レベルのストレッサーを用いないように注意する。
温度ストレッサーは血液標品を液相、即ち約０℃から約５６℃に保たなければならない。約５５℃を超えて加熱してはならない。業界で知られるふさわしい熱源ならどれでも血液を加熱するのに使用できるが、好ましいのは１つ又はそれ以上の赤外線ランプである。好ましくは温度ストレッサーは処理する血液を正常体温より高い温度に温める。即ち３７−５５℃で、最も好ましいのは約３７−４３℃で例えば約４２．５℃である。好ましくはＵＶ／オゾン処理の間血液の温度をこの高くした温度に保っておく。
あるいは、血液標品はＵＶ照射を行っている間に血液があらかじめ決めた温度（好ましくは約４２．５℃）に達するまで加熱し、この時点で血液にオゾンの気泡を通すことを開始する。それからＵＶ／オゾン同時処理を決められた時間、好ましくは３分間、続ける。
もう１つの好ましい方法は、血液を血液を所定の温度、好ましくは４２．５℃にまで加熱している間に、血液をＵＶ／オゾン処理し、所定の温度に達したら処理を終わらせるか、あるいはＵＶ／オゾン処理をさらにある時間、最も好ましくは約３分間、続ける。
酸化的ストレッサーをかけるには、好ましくは血液を医療等級の酸素とオゾンの混合ガスにさらすが、最も好ましいのは、微量成分としてオゾンを含む医療グレードの酸素ガスの気流を泡として上述の温度範囲で血液中に通すことである。オゾンガスは当業界で知られている従来の供給源から入手できる。気流はオゾンを約１．０−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは３−７０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５−５０μｇ／ｍｌを含むのが適当である。ガス気流は血液標品に約０．０１−２．０リットル／分、好ましくは約０．１−１．０リットル／分、最も好ましくは約０．１８リットル／分の速度で供給する（STP）。
紫外線ストレッサーをかけるのは、処理する血液が上述の温度に保たれ、酸素／オゾンガス混合物で曝気される間に、血液を適当な紫外線の線源から照射するのが適当である。紫外線は当業界で従来知られているどのような線源からも供給できる。たとえば複数の低圧ＵＶランプでる。本発明の方法は好ましくは標準型ＵＶランプ、即ちＣ帯波長（２８０ｎｍより短い波長）を出すＵＶランプ、を使用する。標準ＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂ線源に対応する紫外線も使うことができる。好ましく使用するのは低圧紫外線ランプで少なくとも９０％の紫外線が約２５３．７ｎｍの波長を有するラインスペクトルを生じるものである。上述の温度と酸化的環境のストレッサーと同時にかけるに適当なそのような紫外線の用量を得るには、各ランプが１メートルの距離で約４５−６５ｍＷ／平方ｃｍの強度を与える、選んだ波長の出力が約１５−２５ワットのランプを複数、血液を入れたサンプル容器を囲むように配置する。２５３．７ｎｍでの合わせた出力が１５−２５ワットであるこのようなランプ数個でサンプル瓶を囲み、最大強度で用いるのがいいだろう。血液の入射面で供給されるＵＶエネルギーは平方センチメートル当たり０．２−０．２５ジュールである。このような処理は、患者に再注射できる状態の上にのべた自己ワクチンを作り出すために本発明にしたがい適当に改変された血液を供給する。
分取血液は数秒から約６０分までの時間でストレッサーにさらすことができる。通常は０．５分から６０分の間である。これはＵＶ照射の強度、温度、酸化剤の濃度と酸化剤が分取血液に供給されると速度によってある程度変わる。分取血液に加えられるストレッサーが強烈であるほど適用時間は一般に短くなる。他のストレッサーのレベルを設定してから、最適時間を決めるための実験を実施者が行う必要があるだろう。おおからのストレッサー条件下では、好ましい時間は約０．５−１０分の範囲にあり、最も好ましくは２−５分、通常は３分前後である。開始時の血液の温度、および予定の温度まで温めたり冷やしたりする速度は患者ごとに異なる傾向がある。
本発明の好ましいプロセスを行うにあたって、血液アリコート（あるいは分離された血液細胞画分または分離された細胞（血小板も含め）の混合物、全血とともにこれらのいろいろな白血球を含有する組合せも集合的に”アリコート”とよぶ）は、米国特許第４，９６８，４８３号（Mueller）に記載されたタイプの装置を使用してストレッサーで処理することができる。アリコートは適当な、無菌の、紫外線透過性の容器に入れる。この容器を次いで機械に装着する。アリコートの温度を、赤外線ランプのような適当な熱源を用いて予定の値、例えば４２．５℃、に調節し、血液に酸化ストレスを与えるためのガスを流す前にＵＶランプを決められた時間点灯してＵＶランプの出力を安定させる。ついで、組成のわかった酸素／オゾンガス混合物を流量の制御しながらアリコートに加えるがその時間はあらかじめ決められた０．５−６０分、好ましくは２−５分、最も好ましくは上に述べたように約３分間である。その結果アリコートは３種のストレッサーを同時に受け取る。
このようにして望む効果を十分発揮できる本発明の自己ワクチンを作るのに適したように血液アリコートは変えられる。
以下に述べる実施例４は、本発明にしたがって血液を処理する方法が免疫改変効果を有するという知見を裏付けるものである。具体的には、血液をＵＶ／オゾンで処理するとリンパ球と単球の表面上の活性化マーカーの発現が増加することが見出された（実施例４参照）。
そこで、ある人から採取した約０．０１ｍｌから約４００ｍｌの血液を免疫システム改変に効果のある量のオゾンガスと紫外線にさらし、処理した血液をヒトに投与することにより、その人の免疫システムを改変する方法も本発明は提供するものである。同様に本発明は、ヒトから採取した約０．０１ｍｌから約４００ｍｌの血液を免疫システム改変に効果のある量のオゾンガスと紫外線にさらし、処理した血液をヒトに投与することにより、ヒトの免疫システム失調を治療する方法も考慮している。
この方法により治療できるであろう具体的な免疫システム障害には、慢性関節リウマチ、強皮症、移植片−宿主病、真性糖尿病、臓器拒絶、流産、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、その他の炎症性疾患がある。本発明の発見は、子宮内膜症を含む不妊を特徴とする自己免疫疾患を治療にも適用できるであろう。
本発明の臨床使用、及びそのような臨床使用から得られた客観的及び主観的結果を示す具体的な実施例を参照してさらに説明する。
実施例  １
進行中の慢性関節リウマチを有する３０人の患者（２１人が女性、９人が男性）を、本発明の好ましい方法で処理した。研究開始時における患者の年齢幅は２６〜７２歳であり、平均年齢は５２．２歳であった。６２週（平均２０．６週）の期間にわたり、各患者を３０〜６０回処置した（平均４８．３回処置）。各回の処置は、血液の１０ｍｌアリコートを採取し、その血液アリコートを、温度を上げた状態で、前記したＭｕｅｌｌｅｒ等の米国特許第４，９６８，４８３号に一般的に記載されているような装置を使用して気体の酸素／オゾン混合物及び紫外線で同時に処理を行った。
気体混合物の構成は１４〜１５ｃｍｇ／ｍＬのオゾン／医薬等級の酸素であった。その気体混合物を３分間にわたり、約２００ｍＬ／分の速度で血液アリコートに供給した。アリコートの温度は４２．５℃で一定に保った。紫外線の波長は２５３．７ｎｍであった。
処置後の測定は、各患者の最終処置の１日〜９ヶ月（平均１２．４週）後に行った。血液サンプルを採取し、標準試験方法を使用して、白血球、赤血球沈降速度、リウマチ因子、及びＣ−反応性蛋白を分析した。慢性関節リウマチを含むほとんどの炎症状態においては、赤血球沈降速度及びＣ−反応性蛋白は高くなっており、リウマチ因子は、ほとんどの慢性関節リウマチのケースと、いくつかの他の自己免疫疾患のケースにおいて高くなっている。白血球細胞数、赤血球沈降速度、リウマチ因子及びＣ−反応性蛋白は、全て処置クール後に有為に減少した。特に注目すべきことは、American College of Rheumatologyで認められている慢性関節リウマチの改善指標である、赤血球沈降速度が有意に減少したことである。
さらに、処置クール前後に、慢性関節リウマチ症状の見た目の重症度について、医療従事者により主観的な評価を行い、５（非常に悪い）から１（極めて良好）のスケールで患者を評価した。ここでも、各ケースでの著しい改善が報告された。
個々の処置前後のレベルの平均値及びそれらの比較した対応のあるｔ−検定の値を以下の表に示す。
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実施例  ２
適当に制御及び管理された条件下での、ロンドンのSt Bartholomew病院で行った公開臨床試験において、第一期レイノー病を有する４人の患者に本発明に係る治療を施した。
それら患者における疾患の自己免疫成分の研究は、一人の患者においてＨＳＰ−６０及びＨＳＰ−６５に特異的な抗体が高いレベルであることを示した。その患者におけるそれら抗体のレベルを添付図面に示す。その図面から、治療後にそのレベルが著しく減少したことを理解できる。図面の「１」で示された処置の第１クールは、１４日間に９回の処置からなっている。さらに、それらの自己抗体レベルは、数週間後に再び増加しはじめ、そして治療の第２クールで再び低下した。図面の「２」で示された処置の第２クールは、１０日間に５回行った処置からなっている。これらのデータは、本発明により処理した血液を使用する治療、すなわちここに記載した自己ワクチンが、処理した患者においてＨＳＰ抗体が減少したことで証明されたように、自己免疫応答を減少させることを示唆している。
実施例  ３
１３人の正常対照ボランティア及び自己免疫疾患強皮症に悩む２人の患者においてヘルパーＴ−リンパ球サブセットＴＨ１及びＴＨ２を測定した。細胞内サイトカインフローサイトメトリーにより測定した、対照群のＴＨ１：ＴＨ２の比は、３．０２９±０．６３９（平均±標準偏差）であった。強皮症の患者群は、それぞれ５．０及び４．５８のＴＨ１：ＴＨ２の比を有し、たぶんＴＨ２数に対してＴＨ１数が増加していることを示すと思われる。多くの自己免疫疾患のような炎症病変においては、ＴＨ１細胞が相対的に増加しており、従って、健康な対照群の個体よりもそれら患者においてはその比がより高くなるであろうことが予想された。
本発明に従い処理した血液（すなわち、ここに記載した自己ワクチン）を使用する治療の後で、それらの患者におけるＴＨ１：ＴＨ２比は、それぞれ３．２９及び３．１３であり、すなわちその比は正常値に近づいていた。これらのデータは、本発明に従い処理した血液を使用する治療が、ＴＨ２細胞の相対的な増加により証明されたように、自己免疫応答を減少させることを示唆している。
実施例  ４活性化マーカーの染色
本実施例は、本発明に従いＵＶ／オゾンを使用する血液処理が、処置した単核細胞の表面にある活性化マーカーの増加により証明されるように、ヒト血液に関する免疫促進作用を有することを示す実験アプローチを説明するものである。
末梢血液のサンプル（２０ｍｌ）を個体群から採取した。各サンプルを２つのアリコートに分けた。第１のアリコートを以下に示すように、本発明に従い処理した：
１０ｍｌのアリコートを、４２．５℃の温度で、オゾンガス（オゾン濃度は５〜５０μｇ／ｍｌで変わりうる）及び紫外線（２５３．７ｎｍ）により、in vivoで３分間処理した。米国特許第４，９６８，４８３号に記載されたものと類似の装置でその血液サンプルの処理を行った。
各サンプルからの１０ｍｌの第２の血液アリコートは未処理コントロールとした。
常用のモノクローナル抗体技術を使用して、各血液サンプルを、Ｔ−リンパ球及び単球の活性化マーカーについて染色した。個々のマーカーに対し正に染色した全細胞数を顕微鏡で定量した。その結果を以下に示す：
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上記の本実施例のデータは全て二連の平均値であり、本発明に従ってＵＶ／オゾンを使用した処理の結果、Ｔ−リンパ球及び単核球が活性化されたことを示す。
【図１】
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