(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒霊芝の溶媒抽出物を含有したマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とし、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患であるガンの転移の予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品または医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤に関し、詳しくは、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に効果が期待でき、かつ安全性の高いＭＭＰ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンは、ほとんどの先進諸国における主要死亡原因の１つであり、我国では、およそ３割の人がガンで亡くなってい状況である。近年の外科療法、放射線療法の発達により、ガンの原発巣自体はほぼ取り除けるようになったが、それでも尚死亡率が高いのは、ガンが転移を起こす性質を有しているためと考えられており、転移が多発するようになったガンを治療することは現状では非常に困難であると言わざるをえない。従って、従来の原発巣の治療法に加えて、転移を抑制する方法を確立することが、ガン治療の大きな目的の１つであると考えられる。このような現況の中、徐々にではあるが転移のメカニズムが分子レベルで明らかになりつつあり、最近では、その転移プロセスの１つとして細胞外基質の分解系が注目されている。
【０００３】
ガンの転移とは、原発部位から離脱したガン細胞が血流に乗って全身に散布され、他の臓器に生着し、その組織で再び増殖をはじめることである。一般に、腫瘍組織は、密な細胞外基質に囲まれているため、ガン細胞が原発部位からの移動を行うためには細胞外基質の酵素分解を必要とする。細胞外基質はコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等の多様な高分子によって構成されており、これら細胞外基質の分解に関わる主要な酵素群が、ＭＭＰである。ＭＭＰは、ガン組織中で血管が新生される際あるいはガンが転移する際に、発現量が上昇したり酵素の活性化が起こることが、例えば下記非特許文献１に記載されている。従って、これらの酵素の発現量の低下や活性阻害は、ガン細胞の浸潤性を抑制し、転移を抑えることに繋がると考えられる。
【０００４】
【非特許文献１】
「腫よう湿潤およびマトリックスメタロプロティナーゼ合成のレチノイド仲介阻害」（Ｓｃｈｏｅｎｅｒｍａｒｋ  Ｍ  Ｐ等、『Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』、Ｖｏｌ．８７８、第４６６−４８６頁、１９９９年）
【０００５】
ガン細胞による高分子群の浸潤過程において、とりわけコラーゲンの分解は重要なステップである。例えば、ガン細胞が血管内へ侵入、および血管外へ脱出するためには、血管の基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンを分解する必要があるが、Ｌｉｏｔｔａらはガン細胞が分泌するＩＶ型コラーゲン分解酵素の作用がガンの転移能を決定する重要な因子であることを、下記非特許文献２において示している。ＭＭＰに属するゼラチナーゼは、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、エラスチン等の基質を分解する。従って、例えばゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。
【０００６】
【非特許文献２】
「転移可能性と基底膜コラーゲン酵素分解との相関」（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ等、『Ｎａｔｕｒｅ』、Ｖｏｌ．２８４、第６７−６８頁、１９８０年）
【０００７】
ＭＭＰはガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に中心的な役割を果たすことが、以下の非特許文献３に報告されている。さらに皮膚においては、紫外線等の外部刺激によって活性の亢進したＭＭＰが皮膚の構造維持に重要な成分を分解することから、紫外線によって活性化する老化促進因子として最近特に注目されている。
【０００８】
【非特許文献３】
「組織破壊性プロテアーゼとしてのマトリックスメタロプロテアーゼ」（中田光俊、岡田保典  『呼吸』、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．４、第３６５−３７１頁、１９９９年）
【０００９】
それゆえＭＭＰの阻害剤は、ＭＭＰの亢進が原因で起こる上記疾患の治療及び改善に有用であると考えられることから、各方面で盛んにスクリーニングが行われてきた。こうした阻害剤については、下記の文献に記載されている。
【００１０】
【特許文献１】
特開平９−４０５５２号公報
【特許文献２】
特開平１１−１４７８３３号公報
【特許文献３】
特開２０００−２２６３１１号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明においては、高転移性悪性腫瘍細胞株により産生されるＭＭＰに対して阻害活性を有し、ガンの転移等、ＭＭＰの亢進が原因として起こる疾患を予防及び改善しうるＭＭＰ阻害剤を得ることを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安全性の高い植物抽出物に素材を求め、ＭＭＰ阻害活性のスクリーニングを行った。その結果、マンネンタケの溶媒抽出物が優れたＭＭＰ阻害効果を有し、また実験的肺転移モデルを用いた動物実験においても、高いガン転移抑制効果を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、上述の課題の少なくとも一つは、マンネンタケの溶媒抽出物を有効成分とすることを特徴とするＭＭＰ阻害剤によって達成される。
【００１３】
また、本発明は、マンネンタケの溶媒抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ亢進性疾患の予防、抑制、または症状の改善などを目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品または食品としても把握することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。本発明に用いられるマンネンタケは、生薬「霊芝」に用いられる担子菌であり、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属し、霊芝（赤芝）、黒霊芝（黒芝）、紫芝等が含まれる。その学名は、文献［Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ、１９（３）、２６５−２７９、１９７９］によると、霊芝（赤芝）（学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、黒霊芝（学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｕｍ）、紫芝（学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｅ）に分類されているが、それに限定されるものではない。本発明に用いられるマンネンタケは、広く中国や日本市場で流通されているものを用いることができる。また、マンネンタケの中でも、霊芝（赤芝）及び黒霊芝が好ましく、黒霊芝が最も好ましい。
【００１５】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級１価アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、上記低級アルコール類及びケトン類等の極性溶媒が良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。また、内服に用いる場合は、この中から内服に適した溶媒を選択できる。
【００１６】
マンネンタケの溶媒抽出物の配合量は特に限定されないが、ＭＭＰ亢進性疾患の予防改善医薬品、医薬部外品、化粧品または食品の全量中、乾燥物として０．０００５〜１０．０重量％、好ましくは０．００５〜５．０重量％である。０．０００５重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくく、１０．０重量％以上配合しても効果の増強はみられにくく不経済である。
【００１７】
マンネンタケの溶媒抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて濃縮、希釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００１８】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ亢進性疾患の予防、抑制あるいは症状の改善を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品または食品には、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品に用いられる成分である賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、油脂類、ロウ類等の成分を配合することもできる。
【００１９】
本発明の剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、座剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、錠菓、飲料等が挙げられる。
【００２０】
次に本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を示す。
【００２１】
製造例１  黒霊芝の熱水抽出物
黒霊芝の乾燥物２０ｇに４００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の熱水抽出物を１．４ｇ得た。
【００２２】
製造例２  黒霊芝の５０％エタノール抽出物
黒霊芝の乾燥物１００ｇに９００ｍＬの５０％エタノールを加えて、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝の５０％エタノール抽出物を１．９ｇ得た。
【００２３】
製造例３  黒霊芝のエタノール抽出物
黒霊芝の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加えて、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を１．５ｇ得た。
【００２４】
製造例４  霊芝（赤芝）の熱水抽出物
霊芝（赤芝）の乾燥物２０ｇに４００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して霊芝（赤芝）の熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００２５】
製造例５  霊芝（赤芝）の５０％エタノール抽出物
霊芝（赤芝）の乾燥物１００ｇに９００ｍＬの５０％エタノールを加えて、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝（赤芝）の５０％エタノール抽出物を３．１ｇ得た。
【００２６】
製造例６  霊芝（赤芝）のエタノール抽出物
霊芝（赤芝）の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加えて、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝（赤芝）のエタノール抽出物を２．５ｇ得た。
【００２７】
実施例１  散剤１
処方                                                            配合量
１．黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）                            ２．０部
２．乾燥コーンスターチ                                      ３８．０
３．微結晶セルロース                                        ６０．０
［製法］成分１〜３を混合し、散剤１とする。
【００２８】
実施例２  散剤２
実施例１において、黒霊芝の熱水抽出物を黒霊芝の５０％エタノール抽出物（製造例２）に置き換えたものを散剤２とする。
【００２９】
実施例３  散剤３
実施例１において、黒霊芝の熱水抽出物を霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）に置き換えたものを散剤３とする。
【００３０】
実施例４  散剤４
実施例１において、黒霊芝の熱水抽出物を黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）と霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）の等量混合物に置き換えたものを散剤４とする。
【００３１】
比較例１  散剤Ａ（マンネンタケの溶媒抽出物未配合の散剤）
実施例１において、黒霊芝の熱水抽出物を乾燥コーンスターチに置き換えたものを散剤Ａとする。
【００３２】
実施例５  錠剤
処方                                                            配合量
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例３）                      ５．０部
２．乾燥コーンスターチ                                      ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム                    ２０．０
４．微結晶セルロース                                        ４０．０
５．ポリビニルピロリドン                                      ７．０
６．タルク                                                    ３．０
［製法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００３３】
実施例６  錠菓
処方                                                            配合量
１．霊芝（赤芝）の５０％エタノール抽出物（製造例５）          ２．０部
２．乾燥コーンスターチ                                      ５０．０
３．エリスリトール                                          ４０．０
４．クエン酸                                                  ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル                                      ３．０
６．香料                                                        適量
７．水                                                          適量
［製法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成形する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００３４】
実施例７  飲料
処方                                                            配合量
１．霊芝（赤芝）のエタノール抽出物（製造例６）                １．０部
２．ステビア                                                  ０．０５
３．リンゴ酸                                                  ５．０
４．香料                                                      ０．１
５．水にて全量を１００とする
［製法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。
【００３５】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【００３６】
実験例−１  ＭＭＰ阻害試験
ゼラチンザイモグラフィーを用いて、マンネンタケの溶媒抽出物のゼラチナーゼ活性に対する阻害試験を行った。すなわち、０．６ｍｇ／ｍＬのゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１ｍｍ厚）を作製し、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の培養上清０．０１４ｍＬを非還元条件下で電気泳動した。その後ゲルを２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＳＩＧＭＡ社製）の溶液にて室温で３０分間２回洗浄してＳＤＳを除去し、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％ｂｒｉｊ−３５（ＳＩＧＭＡ社製）を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にて３７℃で２４時間インキュベートした。この際、黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）、霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）または黒霊芝の熱水抽出物と霊芝（赤芝）の熱水抽出物の等量混合物をゲルを浸した緩衝液中に添加した。反応終了後ゲルを０．２％クマシーブリリアントブルーＲ（マクシー社製）の溶液にて染色し、５％メタノール−７．５％酢酸溶液にて脱色した。青色のゲル上で染色されないバンドとして検出されるゼラチナーゼ活性をデンシトメーター（アトー社製、アトーデンシトグラフ、ＡＥ−６９０５）にて定量化し、阻害率を算出した。阻害率（単位は％）の計算は、この例では、用いたデシントメータの数値を利用して、次式（１）により計算した。その結果、表１に示すように、マンネンタケの溶媒抽出物はＢ１６マウスメラノーマ細胞の産生するゼラチナーゼを濃度依存的に阻害した。
【００３７】
阻害率＝｛１−（Ａ／Ｂ）｝×１００      …（１）
Ａ：マンネンタケの溶媒抽出液を添加した場合のデシントメータの数値
Ｂ：マンネンタケの溶媒抽出液を添加しない場合のデシントメータの数値
【００３８】
【表１】
0003984522.tif 000002
【００３９】
実験例−２  ＭＭＰ阻害試験
また、同様の阻害試験を、霊芝（赤芝）の５０％エタノール抽出物（製造例５）、霊芝（赤芝）のエタノール抽出物（製造例６）、黒霊芝の５０％エタノール抽出物（製造例２）、黒霊芝のエタノール抽出物（製造例３）を用いて行なった。この結果を、表２に示した。なお、この４つの例では反応中の終濃度は、いずれも０．０３％と、極めて低濃度であった。にもかかわらず、エタノールを用いて抽出したマンネンタケの抽出物は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の産生するゼラチナーゼを、熱水抽出物より低濃度で効果的に阻害した。
【００４０】
【表２】
0003984522.tif 000003
【００４１】
実験例−２  ガン転移抑制試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）、霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）または黒霊芝の熱水抽出物と霊芝（赤芝）の熱水抽出物の等量混合物を１日１回、１００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔経路にて１週間連続投与を行った。対照群には生理食塩水を腹腔内投与した。動物の例数は一群８匹とした。次いで、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞をマウス１匹あたり１ｘ１０5 個となるように尾静脈より注入した。その後も試料の投与は継続し、ガン細胞の接種から３週間後に肺を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で固定した。ホルマリン固定した肺を５葉に分割し、表面に形成された転移巣の数をカウントした。その結果、表３に示すように、マンネンタケの溶媒抽出物の投与により転移巣の形成は対照群と比較して有意に抑制され、十分な抗転移効果を有することがわかった。
【００４２】
【表３】
0003984522.tif 000004
【００４３】
以上より、黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）、霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）及び黒霊芝の熱水抽出物と霊芝（赤芝）の熱水抽出物の等量混合物は、ＭＭＰ阻害作用とガン転移抑制効果に優れていた。また、黒霊芝と霊芝（赤芝）の５０％エタノール抽出物及びエタノール抽出物（製造例２，３，５及び６）についても試験を行ったところ、同様にＭＭＰ阻害作用とガン転移抑制効果に優れていた。
【００４４】
実験例−３  ガン転移抑制試験
市販の飼料（オリエンタル酵母工業製：マウス・ラット飼育用−ＭＦ）に、黒霊芝の熱水抽出物（製造例１）、黒霊芝の５０％エタノール抽出物（製造例２）、霊芝（赤芝）の熱水抽出物（製造例４）または黒霊芝の熱水抽出物と霊芝（赤芝）の熱水抽出物の等量混合物をそれぞれ配合した本発明の散剤１〜４（実施例１〜４）をそれぞれ５．０％添加した飼料を調製し、自由に摂取させた。同様に、マンネンタケの抽出物未配合の散剤Ａ（比較例１）を５．０％添加した飼料を調製し、自由に摂取させた（対照群）。動物の例数は一群８匹とした。散剤添加飼料による飼育開始から２週間後、実験例２の場合と同様にガン細胞の移植を行い、３週間後に転移巣の数をカウントした。その結果、表４に示すように、飼料にマンネンタケの溶媒抽出物を含む散剤を混合することにより、転移巣の形成は対照群（比較例）と比較して有意に抑制され、ガン転移の抑制に効果的であることが示された。
【００４５】
【表４】
0003984522.tif 000005
【００４６】
実施例５の錠剤及び実施例６の錠菓については、乳鉢で粉末化した試料を用いて散剤と同様の試験を行った。また、実施例７の飲料については、試料０．３ｍＬを胃ゾンデを用いて１日１回経口投与し、同様にガン転移に対する効果を調べた。その結果、実施例５〜７についても同様のガン転移抑制効果が認められた。
【００４７】
【発明の効果】
以上より、マンネンタケの溶媒抽出物はガン細胞の産生するＭＭＰに対する阻害効果を有し、ＭＭＰが関与して起こるガンの転移に対しても抑制効果を示した。本発明のＭＭＰ阻害剤は、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制、症状の改善に有用である。