(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程Ａ〜Ｃを含むことを特徴とする、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法。
Ａ．式（１）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程
Ｂ．上記工程Ａにおいて算出された値が、ＤＮＡ分析の対象となるＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程
Ｃ．上記工程Ｂにおいて選択された１以上のプライマーを用い、ＲＡＰＤ法によりＸ個の個体についてＤＮＡ分析を行う工程
式（１）
Ｐ＝[f1/n、（n-f1）/n]max×[f2/n、（n-f2）/n]max×…×[fm/n、（n-fm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、f1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１フラグメントの増幅が観察された個体の数、f2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２フラグメントの増幅が観察された個体の数、fmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍフラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、本法によりＤＮＡを分析しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【請求項２】
次の工程Ａ〜Ｃを含むことを特徴とする、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法。
Ａ．式（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程
Ｂ．上記工程Ｂにおいて算出された値が、ＤＮＡ分析の対象となるＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程
Ｃ．上記工程Ｂにおいて選択された１以上のプライマーを用い、ＲＡＰＤ法によりＸ個の個体についてＤＮＡ分析を行う工程
式（２）
Ｐ＝[fp1/n、（n-fp1）/n]max×[fp2/n、（n-fp2）/n]max×…×[fpm/n、（n-fpm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、fp1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fp2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fpmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍ多型フラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、本法によりＤＮＡを分析しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【請求項３】
ｎが５以上である、請求項１又は２に記載のＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法。
【請求項４】
次の工程Ａ〜Ｃを含むことを特徴とする、個体間の識別方法。
Ａ．式（１）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程
Ｂ．上記工程Ａにおいて算出された値が、識別しようとするＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程
Ｃ．上記工程Ｂにおいて選択された、１以上のプライマーを用いてＸ個の個体から抽出されたゲノムＤＮＡにつきＲＡＰＤ法を行い、増幅されたＤＮＡの電気泳動パターンを比較する工程
式（１）
Ｐ＝[f1/n、（n-f1）/n]max×[f2/n、（n-f2）/n]max×…×[fm/n、（n-fm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、f1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１フラグメントの増幅が観察された個体の数、f2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２フラグメントの増幅が観察された個体の数、fmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍフラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、識別しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【請求項５】
次の工程Ａ〜Ｃを含むことを特徴とする、個体間の識別方法。
Ａ．式（２）より計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程
Ｂ．上記工程Ａにおいて算出された値が、識別しようとするＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程
Ｃ．上記工程Ｃにおいて選択された、１以上のプライマーを用いてＸ個の個体から抽出されたＤＮＡにつきＲＡＰＤ法を行い、増幅されたＤＮＡの電気泳動パターンを比較する工程
式（２）
Ｐ＝[fp1/n、（n-fp1）/n]max×[fp2/n、（n-fp2）/n]max×…×[fpm/n、（n-fpm）/n]max
（但し、fp1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fp2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fpmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍ多型フラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、識別しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【請求項６】
ｎが５以上である、請求項４又は５に記載のＲＡＰＤ法により行う個体間の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＡＰＤ法を用いたＤＮＡの分析方法、更に個体間の識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある形質を有する動植物等を育種しようとする場合、まず、当該形質に優れた個体を特定の母集団から選抜（一次選抜）することが行われる。しかし、形質の発現には、通常、遺伝的要因と環境的要因とが関与するので、育種のためには、これらの要因のうち環境的要因を排除し、当該形質に関して純粋に遺伝的に優れた個体を選抜しなければならない。従って、上記のようにして一次選抜された個体群に属する個体を相互に交配して有性的に、あるいは、これらの個体それぞれから無性的に次世代の個体を得、この次世代の個体を種々の環境条件で育て、再度、同じ形質で選抜（二次選抜）する過程が必要とされる。この結果、異なる環境条件の中で、当該形質に関し優れた成績を示す個体同士が共通の親に由来するものであれば、その個体及び親は、遺伝的にその形質に優れた個体と言うことができる。
【０００３】
育種の対象が木本植物である場合、このことは、ある個体の形質が遺伝的に優れたものか否かを確認するために、多大な時間を要することを意味する。木本植物は生長が極めて遅いため、一次選抜された個体群から次世代の個体を得、この個体について目的とする形質が評価できるようになるまでには、相当の期間が必要とされるからである。例えば、林木育種において重要な形質である生長量の最終的な評価は、その個体の伐採時においてなされなくてはならないが、林地への苗の植栽から伐採まで、スギやヒノキは数１０年から１００年、亜熱帯性のマホガニーでも数１０年、早生樹として知られるアカシアやユーカリでさえ１０年程度の期間が必要とされる。しかも、こうした次世代個体の検定のため、その植栽から評価に至るまでの間、複数の林地を人手をかけて整備し、維持しておかなければならない。
【０００４】
一方、ＲＡＰＤ法は、任意の塩基配列を有する１０塩基程度のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、検体ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：以下、単にＰＣＲ法という。）で増幅し、増幅されたＤＮＡの電気泳動パターンを解析して行うＤＮＡの分析方法である。この方法を用いると、個々の生物のＤＮＡ変異を比較的容易に検出できるため、遺伝的類似度を指標とした親子鑑定等の目的に利用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本願発明者らは、一次選抜された個体の示す優れた形質と、ＲＡＰＤ法により明らかにされる個体間の遺伝的類似度とを関連付けることで、二次選抜をすることなく、当該形質に関して純粋に遺伝的に優れた個体を選抜できると考え、動植物、特に木本植物の育種へのＲＡＰＤ法の応用について検討を行った。
【０００６】
しかし、そのためにはまず、遺伝的類似度を調べようとする全ての個体を、ＲＡＰＤ法により完全に識別できなくてはならない。
【０００７】
従って、本願発明は、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析精度の向上を目的として、より具体的には、分析の対象となる全ての個体を完全に識別できるＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法の提供を目的として、なされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは鋭意検討の結果、個々のプライマーの個体識別能の算出方法を見出すと共に、ＲＡＰＤ法による個体の完全識別が、このプライマーの個体識別能を知ることで可能となることを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
即ち本願発明は、以下の式（１）又は（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程、算出された値が、ＤＮＡ分析の対象となるＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程、及び、こうして選択された１以上のプライマーを用い、ＲＡＰＤ法によりＸ個の個体についてＤＮＡ分析を行う工程、を含むことを特徴とする、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法に関する。また、本願発明は、以下の式（１）又は（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積を算出する工程、算出された値が、ＤＮＡ分析の対象となるＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択する工程、及び、こうして選択された１以上のプライマーを用いてＸ個の個体から抽出されたＤＮＡにつきＲＡＰＤ法を行い、増幅されたＤＮＡの電気泳動パターンを比較する工程を含むことを特徴とする、個体間の識別方法にも関する。
【００１０】
式（１）
Ｐ＝[f1/n、（n-f1）/n]max×[f2/n、（n-f2）/n]max×…×[fm/n、（n-fm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、f1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１フラグメントの増幅が観察された個体の数、f2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２フラグメントの増幅が観察された個体の数、fmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍフラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、本法によりＤＮＡを分析しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【００１１】
式（２）
Ｐ＝[fp1/n、（n-fp1）/n]max×[fp2/n、（n-fp2）/n]max×…×[fpm/n、（n-fpm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、fp1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fp2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fpmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍ多型フラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、本法によりＤＮＡを分析しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１３】
本願発明において、プライマーの個体識別能を算出するために行われ、また、この個体識別能に基づき選択されたプライマーを用いて行われるＲＡＰＤ法は、分析の対象となる個体から抽出されたＤＮＡ（検体ＤＮＡともいう。）をＰＣＲにより増幅し、次いでその増幅産物を電気泳動により分離して、分離パターン（単に、電気泳動パターンともいう。）を解析するというステップからなる。
【００１４】
分析対象からのＤＮＡの抽出は、それぞれによく知られた定法に従い行えばよい。例えば、植物からのＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法やＳＤＳ法等又はこれらの変法により行うことができる。ちなみに、ＣＴＡＢ法を用いてユーカリ属樹木から全ＤＮＡを抽出する場合には、生重にして約１００ｍｇ以上の組織が試料としてあれば、ＲＡＰＤ法による分析を行うだけのＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
ＰＣＲは、こうして得られたＤＮＡを、ＰＣＲ反応用緩衝液中で、プライマー、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの総称。）及びＤＮＡポリメラーゼと混合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応させることにより行う。例えば、植物から抽出したＤＮＡをＲＡＰＤ法により分析しようとする場合には、ＰＣＲは、検体ＤＮＡ２５〜５０ｎｇ、プライマー０．２〜１μＭ、ｄＮＴＰ２０〜２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ１．２５〜２．５Ｕを混合した１×ＰＣＲ反応用緩衝液（全量２５〜５０μｌ）を、次に示す温度サイクルで反応させるのが好ましい。ＰＣＲ反応用緩衝液、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼについては市販されているので、これを用いることができる。
【００１６】
植物ＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ温度条件
ステップ１：
９４〜９６℃  約５〜７分→３５〜３６℃  約０．５〜１分→７０〜７４℃  約１〜２分
１サイクル
ステップ２：
９４〜９６℃  約１〜１．５分→３５〜３６℃  約０．５〜１分→７０〜７４℃約１〜２分
３８〜４３サイクル
ステップ３：
９４〜９６℃  約１〜１．５分→３５〜３６℃  約０．５〜１分→７０〜７４℃約５〜１０分
１サイクル
【００１７】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ後の反応液について電気泳動を行うことにより分離する。電気泳動法としては、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等、各種の電気泳動法を使用することができる。例えば、ゲル電気泳動法を本願発明に適用する場合には、担体としてゲル濃度０．５〜１．５ｗ／ｖ％のアガロースゲル又はゲル濃度３．５〜５ｗ／ｖ％のポリアクリルアミドゲル、緩衝液としてＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Tris-borate、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用い、室温の下、アガロースゲルを用いた場合には電圧７０〜１５０Ｖ、ポリアクリルアミドゲルを用いた場合には電圧１００〜２００Ｖで泳動を行えばよい。
【００１８】
もっとも、ＲＡＰＤ法の諸条件の設定に当たってはあくまでも、最終的に、各検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物についてクリアな電気泳動パターンが得られるか否かが基準となる。従って、本願発明においても、かかる基準を満たすように、より具体的には、各検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物が最も明確、かつよく分離した電気泳動パターンを示すように、上記したＤＮＡの抽出や、ＰＣＲ及び電気泳動のための諸条件を自由に改変することができる。
【００１９】
なお、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析方法に係る本願発明においては、プライマーとして、１０塩基程度のオリゴヌクレオチドを用いる。かかるプライマーはＤＮＡシンセサイザーを用いて容易に合成することができるが、例えば、オペロン社よりＯＰＥＲＯＮ  １０ＭＥＲ  ＫＩＴＳとして、種々の配列のものが市販されているので、これを用いるのが便利である。
【００２０】
各プライマーの個体識別能は、式（１）を用いて算出する。
【００２１】
式（１）
Ｐ＝[f1/n、（n-f1）/n]max×[f2/n、（n-f2）/n]max×…×[fm/n、（n-fm）/n]max
（但し、Ｐはプライマーの個体識別能、f1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１フラグメントの増幅が観察された個体の数、f2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２フラグメントの増幅が観察された個体の数、fmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍフラグメントの増幅が観察された個体の数であり、[]maxとは、[]内の二つの数式を計算した結果の大小を比較し、大きな方の数値を採用することを意味する。また、ここでｎ個の個体は、本法によりＤＮＡを分析しようとするＸ個の個体を全て含む集団から、任意に選抜される。）
【００２２】
即ち、まず、ＤＮＡを分析しようとする個体を全て含む集団より任意に選抜されたｎ個の個体からゲノムＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＲＡＰＤ法により分析する。このとき、同じ個体から抽出された同じＤＮＡについて分析する場合でも、最終的に得られる電気泳動パターンは、用いるプライマーによって異なったものとなる。図１〜７は、仮に、異なるプライマー１〜７を用い、ａ、ｂ、ｃ、ｄの４個体に対してＲＡＰＤ法によりそのゲノムＤＮＡを分析したとした場合に、最終的に得られる電気泳動パターンとして考えられる主なケースをモデル的に示した図である（電気泳動法としてゲル電気泳動法を用いた場合を想定。）。
【００２３】
図１は、プライマー１を用いた場合である。この図は、プライマー１を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、ａ〜ｄいずれの個体においても、電気泳動にてＰＣＲ増幅産物は全く検出されなかったことを示している。つまり、このプライマー１を用いてＲＡＰＤ法を行っても、個体ａ〜ｄを識別することはできない。このとき、プライマー１の個体識別能はＰ＝[0/4、（4-0）/4]max＝[0、1]max＝1と算出される。
【００２４】
図２は、プライマー２を用いた場合である。この図は、プライマー２を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、ａ〜ｄいずれの個体においても、電気泳動にて同じ移動度を示すＰＣＲ増幅産物が１種、つまり式（１）でいう第１フラグメントの増幅のみが共通して検出されたことを示している。従って、このプライマー２を用いてＲＡＰＤ法を行っても、個体ａ〜ｄを識別することはできない。このときも、プライマー２の個体識別能はＰ＝[4/4、（4-4）/4]max＝[1、0]max＝1であり、プライマー１の場合と同じとなる。
【００２５】
図３は、プライマー３を用いた場合である。この図は、プライマー３を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、ａ〜ｄいずれの個体においても、電気泳動にて同じ移動度を示すＰＣＲ増幅産物がそれぞれ３種、つまり式（１）でいう第１フラグメント、第２フラグメント及び第３フラグメントの増幅が共通して検出されたことを示している。電気泳動にて検出されるフラグメントの数はプライマー１や２を用いたときよりも多いが、やはり、これでは個体ａ〜ｄを識別することができない。このときも、プライマー３の個体識別能はＰ＝[4/4、（4-4）/4]max×[4/4、（4-4）/4]max×[4/4、（4-4）/4]max＝[1、0]max×[1、0]max×[1、0]max＝1×1×1＝1であり、プライマー１及び２の場合と同じとなる。
【００２６】
図４は、プライマー４を用いた場合である。この図は、プライマー４を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、個体ａ、ｂ、ｄにおいては、電気泳動にて同じ移動度を示すＰＣＲ増幅産物が１種、つまり式（１）でいう第１フラグメントの増幅が共通して検出されたが、個体ｃにおいては、この第１フラグメント及び他のＰＣＲ増幅産物が全く検出されなかったことを示している。従って、このプライマー４を用いてＲＡＰＤ法を行えば、個体ａ、ｂ、ｄ間の識別はできないものの、個体ａ、ｂ、ｄよりなるグループと個体ｃとの識別は可能となる。このときのプライマー４の個体識別能はＰ＝[3/4、（4-3）/4]max＝[0.75、0.25]max＝0.75と算出される。
【００２７】
図５は、プライマー５を用いた場合である。この図は、プライマー５を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、個体ａ、ｂにおいては、電気泳動にて同じ移動度を示すＰＣＲ増幅産物が１種、つまり式（１）でいう第１フラグメントの増幅が共通して検出されたが、個体ｃ、ｄにおいては、この第１フラグメント及び他のＰＣＲ増幅産物が全く検出されなかったことを示している。従って、このプライマー５を用いてＲＡＰＤ法を行えば、個体ａ、ｂ間、個体ｃ、ｄ間の識別はできないものの、個体ａ、ｂよりなるグループと個体ｃ、ｄよりなるグループとの識別は可能となる。このときのプライマー５の個体識別能はＰ＝[2/4、（4-2）/4]max＝[0.50、0.50]max＝0.50と算出される。
【００２８】
図６は、プライマー６を用いた場合である。この図は、プライマー６を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、個体ａ、ｃにおいては、電気泳動にて同じ移動度を示すＰＣＲ増幅産物が１種、つまり式（１）でいう第１フラグメントの増幅のみが共通して検出され、一方、個体ｂ、ｄにおいては、この第１フラグメントとは異なる移動度を示すＰＣＲ増幅産物がやはり１種、つまり式（１）でいう第２フラグメントの増幅のみが共通して検出されたことを示している。従って、このプライマー６を用いてＲＡＰＤ法を行えば、個体ａ、ｃ間、個体ｂ、ｄ間の識別はできないものの、個体ａ、ｃよりなるグループと個体ｂ、ｄよりなるグループとの識別は可能となる。このときのプライマー６の個体識別能はＰ＝[2/4、（4-2）/4]max×[2/4、（4-2）/4]max＝[0.50、0.50]max×[0.50、0.50]max＝0.50×0.50＝0.25と算出される。
【００２９】
図７は、プライマー７を用いた場合である。この図は、プライマー７を用いてＲＡＰＤ法により分析を行った場合、個体ａ〜ｄのそれぞれにおいて、全く異なった電気泳動パターンが検出されたことを示している。即ちこの場合は、個体ａにおいては、式（１）でいう第１フラグメント、第２フラグメント及び第５フラグメントの増幅が、個体ｂにおいては、式（１）でいう第１フラグメント、第４フラグメント及び第５フラグメントの増幅が、個体ｃにおいては、式（１）でいう第２フラグメント、第３フラグメント、第４フラグメント及び第５フラグメントの増幅が、個体ｄにおいては、式（１）でいう第２フラグメント及び第５フラグメントの増幅が、電気泳動にて検出された。従って、このプライマー７を用いてＲＡＰＤ法を行えば、個体ａ、ｂ、ｃ、ｄを完全に識別することができる。このときのプライマー７の個体識別能はＰ＝[2/4、（4-2）/4]max×[3/4、（4-3）/4]max×[1/4、（4-1）/4]max×[2/4、（4-2）/4]max×[4/4、（4-4）/4]max＝[0.50、0.50]max×[0.75、0.25]max×[0.25、0.75]max×[0.50、0.50]max×[1、0]max＝0.50×0.75×0.75×0.50×1＝0.14と算出される。
【００３０】
なお、上記のモデルケースからも理解できるように、式（１）によれば、あるプライマーを用い、ｎ個の個体に対してＲＡＰＤ法による分析を行った場合に、電気泳動において、例えば第ｍフラグメントの増幅がｎ個の個体全てに共通して検出されるとき（又は共通して検出されないとき）は、その第ｍフラグメントの[fm/n、（n-fm）/n]maxの値が１となるため、当該プライマーの個体識別能Ｐの値に何の影響も及ぼさない。従って、式（１）を、かかるフラグメント以外のフラグメント、換言すれば多型性を示すフラグメントのみに着目して変形することもできる。こうして式（１）を変形したものが、以下に示す式（２）である。
【００３１】
式（２）
Ｐ＝[fp1/n、（n-fp1）/n]max×[fp2/n、（n-fp2）/n]max×…×[fpm/n、（n-fpm）/n]max
（但し、fp1は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第１多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fp2は当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第２多型フラグメントの増幅が観察された個体の数、fpmは当該プライマーを用いてｎ個の個体のゲノムＤＮＡに対してＲＡＰＤ法を行った場合に、第ｍ多型フラグメントの増幅が観察された個体の数であり、他の記号の意味は、式（１）の場合と同様である。）
【００３２】
図７に示すケースにおいて、プライマー７の個体識別能Ｐをこの式（２）に基づき算出すると、この場合は、第１フラグメントが式（２）にいう第１多型フラグメント、第２フラグメントが式（２）にいう第２多型フラグメント、第３フラグメントが式（２）にいう第３多型フラグメント、第４フラグメントが式（２）にいう第４多型フラグメントに該当するので、Ｐ＝[2/4、（4-2）/4]max×[3/4、（4-3）/4]max×[1/4、（4-1）/4]max×[2/4、（4-2）/4]max×＝[0.50、0.50]max×[0.75、0.25]max×[0.25、0.75]max×[0.50、0.50]max＝0.50×0.75×0.75×0.50＝0.14となり、式（１）に基づいて算出した値と同じ値が得られる。
【００３３】
また、式（１）及び式（２）において、ｎは５以上であることが望ましい。本願発明においては、ＤＮＡを分析しようとする個体を全て含む集団（母集団）から任意に選抜されたｎ個の個体が、当該母集団の遺伝的性質を反映していると仮定して、これらｎ個の個体を対象として行ったＲＡＰＤ法の結果に基づき、式（１）又は式（２）より、あるプライマーの当該母集団に対する個体識別能を算出する。従って、ｎの数は多ければ多い程、当該母集団の遺伝的性質がより確実に反映され、正確な個体識別能が算出されるとも考えられるが、通常、ｎが５以上になると、算出される個体識別能の値はほぼ一定に収束するので、実際にはｎをそれほど大きくする必要はない。
【００３４】
このようにして算出された、あるプライマーのある集団に対する個体識別能は、ＲＡＰＤ法により当該集団に含まれる個体を完全に識別するための指標として用いられる。具体的には、式（１）又は式（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積が、ＤＮＡ分析の対象となるＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択してＲＡＰＤ法によりＤＮＡを分析することで、更に詳しくは、式（１）又は式（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積が、識別しようとするＸ個の個体に対して１／Ｘ未満となるように選択された、１以上のプライマーを用いてＸ個の個体から抽出されたゲノムＤＮＡにつきＲＡＰＤ法を行い、増幅されたＤＮＡの電気泳動パターンを比較することで、Ｘ個の個体の完全識別が可能となる。従って、１００個の個体をＲＡＰＤ法により完全に識別するためには、式（１）又は式（２）により計算されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積が、１／１００＝０．０１未満となるようプライマーを選択しなければならない。
【００３５】
ＲＡＰＤ法により得られたＤＮＡの電気泳動パターンを比較して個体を識別するには、電気泳動にて第１〜第ｍフラグメントとして検出されるＰＣＲ増幅産物の有無を、用いたプライマー毎に識別しようとする個体間で比較する。このとき、以下の式（３）を用いることで、この比較を数値化して行うことができる。
【００３６】
式（３）
Ｄ＝１−２×[xyf/(xf＋yf＋xyf)]
（但し、Ｄは個体ｘとｙの遺伝距離、xyfは、個体ｘとｙについて１以上のプライマーを用いて行ったＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析により、電気泳動にて個体ｘとｙに共通して増幅が検出されたフラグメントの数、xfは、個体ｘとｙについて１以上のプライマーを用いて行ったＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析により、電気泳動にて個体ｘにおいてのみ増幅が検出されたフラグメントの数、yfは、個体ｘとｙについて１以上のプライマーを用いて行ったＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析により、電気泳動にて個体ｙにおいてのみ増幅が検出されたフラグメントの数である。なお、個体ｘとｙについてのＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析は、同じプライマーを用い、その他の条件も同じくして行った。）
【００３７】
式（３）は、各個体が遺伝的にどの程度隔たっているかを数値化するものでもある。そして、式（３）により算出される遺伝距離を知ることで、動植物等の育種において、二次選抜をすることなく、目的とする形質に関して純粋に遺伝的に優れた個体を選抜することも可能となる。ある優れた形質に基づいて一次選抜された集合を対象として、その集合に含まれる個体間の遺伝距離を調べ、その結果、相互の遺伝距離が小さく、遺伝的に類縁関係にあると考えられる個体群が明らかになれば、その群に属する個体が共有する当該優れた形質は遺伝的なものと考えられるからである。なお、かかる目的で遺伝距離を算出する場合には、本願発明のＲＡＰＤ法によるＤＮＡの分析は、１０以上のプライマーを用いて行うことが望ましい。１０以上のプライマーを用いれば、正確な遺伝距離を算出するために、十分な数のフラグメント、つまり式（３）におけるxyf、xf、yfを確保することができる。
【００３８】
【作用】
本願発明は、ＲＡＰＤ法に用いるプライマーに着目し、このプライマーの個体識別能を明らかにすることで、ＲＡＰＤ法による個体の完全識別という目的を達成した。
【００３９】
本願発明においては、あるプライマーを用いて、ある集団に属する異なる個体のゲノムＤＮＡをＲＡＰＤ法により分析した場合に、最終的に得られる電気泳動パターンが同一となる確率、換言すれば、電気泳動にて検出される第１〜第ｍフラグメントの有無が全て共通する確率を、そのプライマーの当該集団に対する個体識別能と考え、式（１）又は式（２）により算出する。そして、こうして算出されるプライマーの個体識別能又は各プライマーの個体識別能の積が、１／Ｘ未満となるように１以上のプライマーを選択して、同じ集団に属するＸ個の個体についてＲＡＰＤ法によりＤＮＡ分析を行うことで、分析の対象となったＸ個の個体を完全に識別することが可能となるのである。
【００４０】
即ち、式（１）又は式（２）により算出された、ある集団に対する一のプライマーの個体識別能を０．００３とすると、分析の対象となる個体が１００個であれば、ＲＡＰＤ法により、このプライマーを用いてこれら１００個の個体を完全に識別することができる。しかし、分析の対象となる個体が１０００個になると、このプライマーではこれら１０００個の個体を完全に識別することはできない。このプライマーを用いて、当該集団に属する個体のゲノムＤＮＡをＲＡＰＤ法により分析した場合、１０００個体中３個体が同一の電気泳動パターンを示す筈だからである。この場合には、このプライマーを、他のプライマーと併せて用いればよい。２以上のプライマーを併用してＲＡＰＤ法を行った場合、最終的に得られる電気泳動パターンが同一となる確率は、各プライマーの個体識別能の積となる。従って、個体識別能０．００３のプライマーでも、他のプライマーと併せて用い、これらのプライマーの個体識別能の積が０．００１未満となるならば、１０００個の個体を完全に識別できることとなる。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００４２】
［実施例１］
木本植物ユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus  以下、Ｅ．グロブルスと略称する。）１６３個体について、本願発明の方法を適用して各個体を識別し、遺伝距離を算出して遺伝的類縁関係を示す系統樹を作成した。
【００４３】
Ｉ．プライマーの選択
【００４４】
Ｉ−１．ゲノムＤＮＡの抽出
天然林由来の種子（オーストラリア  Commonwealth Scientific and Industrial Research Organizationより入手。）から得られたＥ．グロブルス実生苗１００個体より無作為に１０個体を選び、この１０個体のゲノムＤＮＡを改良ＣＴＡＢ法にて抽出した。
【００４５】
即ち、これら１０個体の実生苗のそれぞれから約１５０ｍｇの葉を採取し、これを液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕して、２％（W/V）ＣＴＡＢ、１００ｍＭ  Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％（V/V）メルカプトエタノールからなるＤＮＡ抽出溶液２．０ｍｌに移し、この混合液を１０分ごとに混合しつつ６０分間、６５℃にて加温した。加温後、室温に戻したこの混合液に４％（V/V）イソアミルアルコールを含むクロロホルム８００μｌを加えて、ローテーターにて２０分間混合し、次いで、１５０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離を行って、上澄みを回収した。回収した上澄みは、再度等量のクロロホルム（含４％（V/V）イソアミルアルコール）を加え、同様の操作を行って精製した。精製したこの上澄みに、予め４℃に冷却しておいた１．５倍量のイソプロパノールを加え、よく混合してから、室温で２０分間、更に−２０℃で１２時間放置してＤＮＡを析出させた。析出したＤＮＡは、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間）を行って回収し、７０％エタノール１ｍｌを加えて洗浄、そして再び遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０℃で５分間）を行って回収し、減圧して乾燥させた後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１３０μｌに溶解した。
【００４６】
Ｉ−２．ＲＡＰＤ法による分析
Ｉ−１において、Ｅ．グロブルス１０個体からそれぞれ抽出された各ゲノムＤＮＡに対し、プライマーとして、オペロン社よりＯＰＥＲＯＮ  １０ＭＥＲ  ＫＩＴＳ  ＯＰＡ〜ＯＰＰ及びＯＰＳシリーズとして販売されているＲＡＰＤ−ＰＣＲ用プライマー３４０種を用い、ＰＣＲを行った。
【００４７】
ＰＣＲは、上記ゲノムＤＮＡを２５ｎｇ／２５μｌ、プライマーを１μＭ、ｄＮＴＰ（宝酒造（株）製）を各２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製『TaKaRa EX taq』）を１．２５units／２５μｌ、電気泳動用色素タートラジンを１ｍＭ及び電気泳動用比重調整剤フィコール（シグマ社製『Ficol-1400』）を２％となるように、１×ＰＣＲ反応用緩衝液（宝酒造（株）製『TaKaRa EX taq専用バッファー』）に混合した混合物、全量２５μｌを次に示す温度サイクルで反応させることにより行った。なお、このときプライマーは、上記３４０種のプライマーを１種づつ、一反応毎に順次変更して用いてＰＣＲを行った。
【００４８】
ステップ１：
９４℃７分→３６℃１分→７２℃  ２分      １サイクル
ステップ２：
９４℃１分→３６℃１分→７２℃  ２分    ４３サイクル
ステップ３：
９４℃１分→３６℃１分→７２℃１０分      １サイクル
【００４９】
次いで、ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ後の反応液について、担体としてゲル濃度１ｗ／ｖ％、厚さ０．７ｃｍ、泳動方向長さ２０ｃｍのアガロースゲル、緩衝液として０．５×ＴＢＥ緩衝液（同前）を用い、室温の下、定電圧１３０Ｖで約４〜５時間ゲル電気泳動を行うことにより、分離した。また、分離されたＤＮＡフラグメントの検出は、電気泳動後、担体として用いたゲルを、エチジウムブロマイド０．５〜２μｇ／ｍｌを含む０．５×ＴＢＥ緩衝液（同前）に１０〜２０分間浸漬してから、これに３０２ｎｍ付近の紫外線を照射することにより行った。
【００５０】
Ｉ−３．個体識別能の算出
Ｉ−２で行った、ＲＡＰＤ法によるＥ．グロブルスのゲノムＤＮＡ分析結果に基づき、このＲＡＰＤ法に用いた各プライマーのＥ．グロブルスに対する個体識別能を、式（２）に基づいて算出した。
【００５１】
その結果、個体識別能の高いもの（式（１）又は式（２）で算出される数値としては、小さいもの）から順に１０種のプライマーを選択し、以下の実験を行った。ここで選択したプライマーと、そのＥ．グロブルスに対する個体識別能を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0003979024.tif 000002
【００５３】
ＩＩ．Ｅ．グロブルスの個体識別
チリ国第８州カニェテ付近の標高１００〜５００ｍにある林地より、材積の優劣を基準として一次選抜されたＥ．グロブルス（以下、単に一次選抜木ともいう。）４９個体、及び、同じ林地より無作為に選抜されたＥ．グロブルス１１４個体から、Ｉ−１と同様にしてＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを検体として、Ｉで選択された１０種のプライマーを用い、Ｉ−２と同様にしてＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析を行った。
【００５４】
その結果、これら１６３個体は、そのＤＮＡのＰＣＲ増幅産物が電気泳動にて全て異なる分離パターンを示し、この電気泳動パターンの相違により各個体を完全に識別することができた。そこで、これら１６３個体について式（３）により遺伝距離を算出し、この遺伝距離を基に、系統樹作成ソフトLane Multiscreener（ＡＴＴＯ社製）を利用して、１６３個体全ての遺伝的類縁関係を示す系統樹を作成した。なお、この系統樹作成ソフトは、平均距離法に基づき、ある個体群について、遺伝距離が表す各個体相互の類縁関係の遠近を総合し、その個体群全体の遺伝的類縁関係を系統樹という形に変換して示すものである。
【００５５】
作成した系統樹を図８〜１０に、また、Ｅ．グロブルス一次選抜木４９個体相互について算出した遺伝距離を表２〜７に示す。なお、系統樹の右端には、一次選抜木についてのみ、その個体名を示した。
【００５６】
【表２】
0003979024.tif 000003
【００５７】
【表３】
0003979024.tif 000004
【００５８】
【表４】
0003979024.tif 000005
【００５９】
【表５】
0003979024.tif 000006
【００６０】
【表６】
0003979024.tif 000007
【００６１】
【表７】
0003979024.tif 000008
【００６２】
［実施例２］
実施例１で明らかにしたＥ．グロブルスの類縁関係の、育種への応用について検討した。
【００６３】
実施例１で用いたＥ．グロブルス一次選抜木４９個体中３８個体より種子を採取し、この３８系統の種子から実生苗を得て、この実生苗について二次選抜を行った。即ち、環境的要因を排除し、材積という形質に関して純粋に遺伝的に優れた個体を選抜すべく、この実生苗を、チリ第８州アラウコ付近の林地３箇所、同州ロス・サウセス付近の林地１個所、同州プレコルディジェラ付近の林地１箇所、同州カゥクェネス付近の林地１箇所の計６箇所の林地に、各系統あたり２０個体づつ植栽して育成し、５年後、これらの材積を調査して材積の大きい順に１〜３８位までランク付けを行った。
【００６４】
この結果を、図８〜１０の系統樹と共に示す。図８〜１０の系統樹において、一次選抜木の個体名の傍らに付された符号が、上記ランク付けの結果であり、１〜１０位にランクされた個体には＋＋の符号が、１１〜２０位にランクされた個体には＋の符号が、２１〜３０位にランクされた個体には−の符号が、そして３１位以下にランクされた個体には−−の符号が付されている。
【００６５】
図８〜１０より明らかなように、一次選抜木にも、他の複数の一次選抜木と相互に遺伝的類縁関係のある個体群を形成するものと、他の一次選抜木とあまり遺伝的類縁関係がなく、かかる個体群を形成しないものとが存在する。しかし、個体群を形成するもののうち、一次選抜木ＭＩＮ５３、ＴＧ１４、ＴＧ２４、ＭＩＮ１４、ＴＧ１３、ＭＩＮ０２よりなる群、及び、ＶＴ３９、ＶＴ１２、ＶＴ２３、ＶＴ１７、ＴＧ２７、ＶＴ１１、ＦＡ４４よりなる群においては、これらの一次選抜木中、二次選抜の結果２０位以上の上位にランクされた個体がいずれも５０％を超え、これらの一次選抜木で観察された優れた形質（この場合は、材積の大きさ。）が、遺伝的なものである可能性を示唆している。また、材積に関して優れたある個体について本願発明のＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析を行った結果、当該個体が遺伝的にこれらの個体群に属することが明らかとなれば、当該個体は、材積という形質について純粋に遺伝的に優れている可能性が高い。従って、本願発明の方法を育種に応用することで、一次選抜に係る形質が遺伝的なものであるか否かを、二次選抜を行うことなく、ある程度の確率で知ることができると考えられる。
【００６６】
【発明の効果】
本願発明の方法によれば、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡ分析により、その分析の対象となる個体を完全に識別することが可能となる。
【００６７】
従って、本願発明の方法によれば、容易・迅速・確実に個体を識別し、また、個体間の遺伝距離を知ることが可能となる。
【００６８】
更に、本願発明の方法を育種に応用することにより、目的とする形質について純粋に遺伝的に優れている個体を、二次選抜を行うことなくある程度の確率で知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図２】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図３】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図４】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図５】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図６】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図７】ＲＡＰＤ法の結果として得られる電気泳動パターンを、モデル的に示した説明図である。
【図８】Ｅ．グロブルス１６３個体の遺伝的類縁関係を示す系統樹の１部である。
【図９】Ｅ．グロブルス１６３個体の遺伝的類縁関係を示す系統樹の１部である。
【図１０】Ｅ．グロブルス１６３個体の遺伝的類縁関係を示す系統樹の１部である。
【図１】
0003979024.tif 000009
【図２】
0003979024.tif 000010
【図３】
0003979024.tif 000011
【図４】
0003979024.tif 000012
【図５】
0003979024.tif 000013
【図６】
0003979024.tif 000014
【図７】
0003979024.tif 000015
【図８】
0003979024.tif 000016
【図９】
0003979024.tif 000017
【図１０】
0003979024.tif 000018