(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を有するインスリン誘導体：
【化１】
0003917333.tif 000047
（式中、
Ｂ１にあるXaaはPheであるか、又は欠失しており；
Ｂ30にあるXaaは欠失しており、そしてLysB29のε−アミノ基は少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基を有する）；
ただし亜鉛と複合していない、前記インスリン誘導体。
【請求項２】
LysB29のε−アミノ基に結合している親油性置換基が少なくとも６個の炭素原子を有するカルボン酸に由来するアシル基である、請求項１記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
枝分れしていることのある前記アシル基が８〜24原子長の炭素原子主鎖を含んで成る、請求項２記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記アシル基が少なくとも６個の炭素原子を有する脂肪酸のアシル基である、請求項２記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記アシル基が６〜24個の炭素原子を有する直鎖状の飽和カルボン酸のアシル基である、請求項２記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記アシル基がドデカノン酸、トリデカノン酸及びテトラデカノン酸を含んで成る群から選ばれる、請求項２記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
Ｂ１位にあるXaaが欠失している、請求項１記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
ＮεB29−（リトコロイル−グルタミル）デス（Ｂ３０）ヒトインスリンである、請求項１記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
糖尿病の処置を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物であって、治療的に有効な量の請求項１〜８のいずれか１項記載のインスリン誘導体を薬理学的に許容される担体と一緒に含んで成る薬理組成物。
【請求項１０】
糖尿病の処置を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物であって、治療的に有効な量の請求項１〜８のいずれか１項記載のインスリン誘導体を、即効性を有するインスリン又はインスリン類似体との混合において、薬理学的に許容される担体と一緒に含んで成る、薬理組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性であり、且つ遅延型の活性プロフィールを有する新規のヒトインスリン誘導体、かかる誘導体の提供方法、それらを含む薬理組成物、及び糖尿病の処置におけるかかるインスリンの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの糖尿病患者は、食事に関係する必要条件をカバーするため、即効性インスリンのボーラス注射により補給される基底Ｘ要条件をカバーする遅延型インスリンの１又は２回の日常注射を含んで成る療法での複数回の日常のインスリン注射で処置される。
遅延型インスリン組成物は当業界において公知である。即ち、遅延型インスリン組成物の一の主要タイプは結晶インスリン又はアモルファスインスリンの注射用水性懸濁物を含んで成る。これらの組成物において、利用されるインスリン化合物は一般にプロタミンインスリン、亜鉛インスリン又はプロタミン亜鉛インスリンである。
【０００３】
インスリン懸濁物の利用には所定の欠点がある。即ち、正確な投与量を保障するため、所定容量のこの懸濁物をバイアルから抜き取る又はカートリッジから押し出す前にインスリン粒子をゆっくりと振盪させることによって均質に懸濁しておかねばならない。また、インスリン懸濁物の保存のためには、凝塊の形成又は凝集を避けるため、インスリン溶液よりも幅の狭い域値内に温度を保たねばならない。
【０００４】
プロタミンは当初は非免疫原であると信じられていたが、しかし現在ではプロタミンはヒトにおいて免疫原でありうる、また医療目的のためのその用途は抗体の形成を招きうるものと明らかとなった（Samuelら、Studies on the immunogenecity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation tesr, Clin. Exp. lmmunol. 33 , pp252-260 (1988)) 。
【０００５】
また、プロタミン−インスリン複合体はそれ自体免疫原であることがわかった(Kurtzら、Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins, Diabetologica25, pp322-324 (1983)) 。従って、一部の患者については、プロタミン含有インスリン組成物の使用は避けねばならない。別のタイプの遅延型インスリン組成物は生理学的pHより低いpH値を有する溶液であり、その溶液を注射したときのpH値の上昇を理由に、インスリンはその溶液から沈殿し出す。このような溶液の欠点は、注射により組織の中で形成される沈殿物の粒度分布、そしてそれ故薬物治療のタイミングが、注射部位の血流及びその他のやや予測できない状況のパラメーターに依存する点にある。更なる欠点は、インスリンの固体粒子が注射部位において組織炎症を引き起こす局所刺激物として作用しうることにある。
【０００６】
WO 91／12817 (Novo Nordisk  A／S)はコバルト（III ）のインスリン複合体を含んで成る遅延型可溶性インスリン組成物を開示する。これらの複合体の遅延性はほんの中間的であり、そしてその生物学的利用能は低い。
【０００７】
ヒトインスリンは３個の第一アミノ基を有する：Ａ−鎖及びＢ−鎖のＮ−末端基並びに LysB29 のε−アミノ基。これらの一又は複数の基において置換されているいくつかのインスリン誘導体が従来技術において知られている。即ち、米国特許第 3,528,960号(Eli Lilly）はＮ−カルボキシアロイルインスリンであって、そのインスリン分子の１，２又は３個の第一アミノ基がカルボキシアロイル基を有するインスリンに関する。具体的なＮεB29 置換化インスリンは開示されていない。
【０００８】
GB特許第 1,492,997号(Nat．Res. Dev. Corp.)によれば、ＮεB29 においてカルバミル置換を有するインスリンは向上した低血糖作用プロフィールを有する。
【０００９】
日本特許公開公報第１−254699の（Kodama Co., Ltd.）は、脂肪酸が PheB1のアミノ基に、もしくは LysB29 のε−アミノ基に、又はその両者に結合しているインスリンを開示する。その誘導化の記述の目的は、薬理学的に許容される安定なインスリン製剤の獲得にある。
【００１０】
Ｂ30において、ヌクレオチドトリプレットにより必ずしもコードされない少なくとも５個の炭素原子を有するアミノ酸を有するインスリンが日本国特許公開公報第57− 067,548号（Shionogi）に記載されている。そのインスリン類似体は真性糖尿病、特にウシ又はブタインスリン抗体の発生によりインスリン耐性となっている患者の真性糖尿病の処置において有用であると主張されている。
【００１１】
本明細書で用いている「インスリン誘導体」とは、ヒトインスリンの分子構造と類似のそれを有し、 CysA7と CysB7との間及び CysA20 と CysB19 との間にジスルフィド架橋を、そして CysA6と CysA11 との間に内部ジスルフィド架橋を有し、更にインスリン活性を有する化合物を意味する。
【００１２】
ところで、可溶性であり、且つ注射を経た後に溶液のままであり、そして最少限の炎症及び免疫原特性をもつインスリンを含む遅延型注射用インスリン組成物についての要望がまだある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一の目的は、遅延型の活性プロフィールをもち、生理学的pH値において可溶性であるヒトインスリン誘導体を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、本発明に係るヒトインスリン誘導体を含んで成る薬理組成物の提供にある。
本発明の更なる目的は、本発明のヒトインスリン誘導体を作るための方法の提供にある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、 LysB29 のε−アミノ基が親油性置換基を有している一定のヒトインスリン誘導体は遅延型の活性プロフィールを有し、且つ生理学的pH値において可溶性であることが明らかにされた。
【００１６】
従って、最も広い観点において、本発明は以下の配列を有するインスリン誘導体：
【化２】
0003917333.tif 000002
（式中、
Ａ21及びＢ３位にある Xaaは独立して、Lys, Arg及び Cysを除く、遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり；Ｂ３位にある Xaaは Pheにあるか又は欠失しており；Ｂ１位にある Xaaは（ａ）10〜24個の炭素原子を有するコードされ得ない親油性アミノ酸、この場合５個までの炭素原子を有するカルボン酸のアシル基が LysB29 のε−アミノ基に結合している、（ｂ）Lys, Arg及び Cysを除く、遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基、この場合、 LysB29 のε−アミノ基は親油性置換基を有する、又は（ｃ）欠失している、この場合、 LysB29 のε−アミノ基は親油性置換基を有する）及びその任意のZn2+複合体に関し、ただしＢ30位にある Xaaが Thr又はAla,Ａ21及びＢ３位にある Xaaが共に Asn、そしてＢ１位にある Xaaが Pheであるとき、このインスリン誘導体はZn2+複合体となっている。
【００１７】
一の好適な態様において、本発明は、Ｂ30アミノ酸残基が欠失しているか、又はLys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによってコードされうる任意のアミノ酸残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立して、Lys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり； PheB1が欠失していてよく； LysB29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基を有し；そして２〜４個のZn2+イオンが各インスリンヘキサマーに結合していることのあるヒトインスリン誘導体に関連し、ただし B30が Thr又は Alaであり、そしてＡ21及びＢ３が共に Asnであり、そして PheB1が欠失していないとき、２〜４個のZn2+イオンがこのインスリン誘導体の各ヘキサマーに結合している。
【００１８】
別の好適な態様において、本発明は、Ｂ30アミノ酸残基が欠失しているか又はLys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立してLys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり、ただしＢ30アミノ酸残基が Ala又は Thrなら、残基Ａ21及びＢ３の少なくとも一方が Asn以外のものであり； PheB1が欠失していてよく；そして LysB29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基であるヒトインスリン誘導体に関する。
【００１９】
別の好適な態様において、本発明は、Ｂ30アミノ酸残基が欠失しているか又はLys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立してLys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり； PheB1が欠失してよく； LysB29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基であり；そして２〜４個のZn2+イオンが各インスリン亢量体に結合している、ヒトインスリン誘導体に関する。
【００２０】
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が欠失しているヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が Aspであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が Gluであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が Thrであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が少なくとも10個の炭素原子を有する親油性アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
【００２１】
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸が10〜24個の炭素原子を有する親油性α−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
【００２２】
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸が10〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和・脂肪族α−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がＤ−又はＬ−Ｎε−ドデカノイルリジンであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノウンデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノドデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノトリデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノテトラデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノペンタデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノヘキサデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
【００２３】
別の好適な態様において、本発明はＡ21アミノ酸が Alaであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＡ21アミノ酸が Glnであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＡ21アミノ酸が Glyであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＡ21アミノ酸が Serであるヒトインスリン誘導体に関する。
【００２４】
別の好適な態様において、本発明はＢ３アミノ酸が Aspであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ３アミノ酸が Glnであるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ３アミノ酸が Thrであるヒトインスリン誘導体に関する。
【００２５】
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を有するカルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
【００２６】
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が８〜12原子長の炭素鎖を有するカルボン酸に対応する枝分れした又は枝分れしていないアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
【００２７】
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を有する脂肪酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が６〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が８〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が10〜16個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
【００２８】
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が10個まで、好ましくは５個までのオキシエチレン単位を含んで成るオリゴオキシエチレン基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は LysB29 のε−アミノ基が10個まで、好ましくは５個までのオキシプロピレン単位を含んで成るオリゴオキシプロピレン基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。
【００２９】
別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキサマーが２個のZn2+イオンと結合しているヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキサマーが３個のZn2+イオンと結合しているヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキサマーが４個のZn2+イオンと結合しているヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明は糖尿病を処置するための医薬品の調製のための本発明に係るヒトインスリン誘導体の利用に関する。
【００３０】
別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を薬理学的に許容される担体と共に含んで成る糖尿病の処置を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物に関する。
【００３１】
別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を、即効性を有するインスリン又はインスリン類似体と混合されて、薬理学的に許容される担体と共に含んで成る糖尿病の処置を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物に関する。
【００３２】
別の好適な態様において、本発明は、生理学的pH値において可溶性である本発明に係るヒトインスリン誘導体を含んで成る薬理組成物に関する。
【００３３】
別の好適な態様において、本発明は約 6.5〜約 8.5の間隔の中のpH値において可溶性である本発明に係るヒトインスリン誘導体を含んで成る組成物に関する。別の好適な態様において、本発明は、本発明に係るヒトインスリン誘導体を含んで成る遅延型薬理組成物に関する。
【００３４】
別の好適な態様において、本発明は、約 120nmol／ml〜約1200nmol／ml、好ましくは約 600nmol／mlの本発明に係るヒトインスリン誘導体を含む溶液である薬理組成物に関する。
【００３５】
別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明に係るインスリン誘導体を薬理学的に許容される担体と共に糖尿病の処置を必要とする患者に投与することを含んで成る、かかる処置を必要とする患者の糖尿病の処置のための方法に関する。
【００３６】
別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明に係るインスリン誘導体を、即効性を有するインスリン又はインスリン類似体と混合して、薬理学的に許容される担体と共に、糖尿病の処置を必要とする患者に投与することを含んで成る、かかる処置を必要とする患者の糖尿病の処置のための方法に関する。
【００３７】
Zn2+イオンが結合していない本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体の例は以下の通りである：
ＮεB29 −トリデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
【００３８】
ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、
ＮεB29 −デカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン、及び
ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン。
【００３９】
２個のZn2+イオンが一のインスリンヘキサマー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体の例は以下の通りである：
（ＮεB29 −トリデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,2Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,2Zn2+ 、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
【００４０】
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
【００４１】
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル  ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル  ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6,2Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
【００４２】
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
【００４３】
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn
2+及び
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 2Zn2+。
【００４４】
３個のZn2+イオンが一のインスリンヘキサマー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体の例は以下の通りである：
（ＮεB29 −トリデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,3Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル  デス（Ｂ30) ヒトインスリン)6,3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,3Zn2+ 、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
【００４５】
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
【００４６】
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル  ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル  ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6,3Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
【００４７】
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
【００４８】
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
【００４９】
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+及び
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 3Zn2+。
【００５０】
４個のZn2+イオンがこのインスリンヘキサマー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体の例は以下の通りである：
（ＮεB29 −トリデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,4Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6,4Zn2+ 、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
【００５１】
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
【００５２】
（ＮεB29 −トリデカノイル  ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル  ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル  ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル  ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6,4Zn2+ 、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
【００５３】
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル GlyA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
【００５４】
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −ドデカノイル AlaA21  GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −トリデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4  Zn2+、
（ＮεB29 −テトラデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+、
（ＮεB29 −デカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+及び
（ＮεB29 −ドデカノイル GlnB3 GluB30 ヒトインスリン）6, 4Zn2+。
【００５５】
用語
本明細書において用いているアミノ酸残基についての３文字コード及び１文字コードはJ. Biol. Chem. 243, p.3558 (1968) に記載されているものである。
この DNA配列において、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンである。
【００５６】
以下の頭文字語を使用した：
ジメチルスルホキシドについてはDMSO、ジメチルホルムアミドについては DMF, tert・ブトキシカルボニルについては Boc、逆相高性能液体クロマトグラフィーについてはRP-HPLC, X-OSuはＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル、Ｘはアシル基、そしてトリフルオ酢酸については TFA。
【００５７】
【発明の実施の形態】
親油性インスリン誘導体の調製
本発明に係るインスリン誘導体はとりわけ以下に記載の通りにして調製できる：
１．  Ｂ30位における遺伝子コードによりコードされうるアミノ酸残基、例えばスレオニン（ヒトインスリン）又はアラニン（ブタインスリン）を特徴とするインスリン誘導体
１．１  ヒトインスリンからの出発
ヒトインスリンを Boc−試薬（例えばジ−tert−ブチルジカルボネート）で処理して（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリン、即ち、両鎖のＮ−末端が Boc基によって保護されているヒトインスリンを生成する。HPLC等による任意的な精製後、その生成物をＸが導入すべきアシル基である式 X-OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルと反応させることによりアシル基を LysB29 のε−アミノ基の中に導入する。最終段階において、 TFAを Boc基を除去するために使用し、次いで生成物ＮεB29 −Ｘヒトインスリンを単離する。
【００５８】
１．２  一本鎖インスリン前駆体からの出発
Ｂ１位においてアルギニン残基を介してそのＢ１に接続されている伸長部(Exp）で伸長され、且つＢ30とＡ１との架橋がアルギニン残基である一本鎖インスリン前駆体、即ち、一般式Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) の化合物を出発材料として用いてよい。Ｘがアシル基である一般式 X-OSuのＮ−ヒドロキシススクシニミドエステルによるこの出発材料のアシル化は、 LysB29 のε−アミノ基の中及び前駆体のＮ−末端アミノ基の中にアシル基Ｘを導入する。一般式（ＮεB29 −Ｘ）のこのアシル化前駆体、即ちX-Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) を、水と適当な水混和性有機溶媒、例えば DMF, DMSO又は低級アルコールとの混合物の中でトリプシンにより処理することで、式（ＮεB29 −Ｘ）の中間体 ArgB31 インスリンが得られる。この中間体をカルボキシペプチダーゼＢで処理すると所望の生成物（ＮεB29 −Ｘ）インスリンが得られる。
【００５９】
２．  Ｂ30位においてアミノ酸残基を有さないインスリン誘導体、即ちデス（Ｂ30）インスリン
２．１  ヒトインスリン又はブタインスリンからの出発
アンモニアバッファー中でのカルボキシペプチダーゼＡによる処理により、ヒトインスリン及びブタインスリンは共にデス（Ｂ30）インスリンとなる。任意的な精製の後、デス（Ｂ30）インスリンを Boc試薬（例えばジ−tert−ブチルジカルボネート）で処理して（Ａ１，Ｂ１）−ジ Boc  デス（Ｂ30）インスリン、即ち、両鎖のＮ−末端が Boc−基により保護されているインスリンを生成する。HPLCの如くによる任意的な精製の後、その生成物をＸが導入すべきアシル基である式 X-OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルと反応させることにより LysB29 のε−アミノ基の中にアシル基を導入する。最終工程において、 Boc基を除去するのに TFAを使用し、そして生成物（ＮεB29 −Ｘ）デス（Ｂ30）インスリンを単離する。
【００６０】
２．２  一本鎖ヒトインスリン前駆体からの出発
Ｂ１位においてアルギニン残基を介してそのＢ１位に接続されている伸長部(Exp）で伸長され、且つＢ30とＡ１とに架橋を有する一本鎖インスリン前駆体が有用な出発材料となりうる。好ましくは、この架橋は式Yn-Argのペプチドであり、ここでＹはリジン及びアルギニンを除くコード可能なアミノ酸であり、そしてｎは０又は１〜35の整数である。ｎ＞１のとき、Ｙは辺々のアミノ酸を表示しうる。Ｂ30とＡ１との架橋の好適な例はAlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg及び Arg（ヨーロッパ特許第163529号）である。一般式Ext-Arg-B(1-30)-Yn-Arg-A(1-21)のかかる前駆体のリシルエンドペプチダーゼ、例えばアクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus ）プロテアーゼによる処理はExt-Arg-B(1-29)-Thr-Yn-Arg-A(1-21)デス（Ｂ30）インスリンをもたらした。この中間体の、一般式 X-OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ここでＸはアシル基である）によるアシル化は、アシル基Ｘを LysB29 のε−アミノ基の中に並び並びにＡ−鎖及びＢ−鎖の中にＮ−末端アミノ基を導入し、（ＮεB29 −Ｘ）X-Ext-Arg-B(1-29)X-Thr-Yn-Arg-A(1-21) デス（Ｂ30）インスリンをもたらす。この中間体は、水と適当な有機溶媒、例えば DMF, DMSO又は低級アルコールとの混合物の中での処理により、所望の誘導体（ＮεB29 −Ｘ）デス（Ｂ30）ヒトインスリンをもたらす。
【００６１】
ＮεB29 修飾インスリンのデーター
ＮεB29 修飾インスリンの一定の実験データーを表１に示す。
【００６２】
インスリン誘導体の、ヒトインスリンに対する親油性 k'relを、LiChrosorb RP18 （５μｍ， 250×４mm）HPLCカラムで、（Ａ）10％のアセトニトリルを含む 0.1Ｍのリン酸ナトリウムバッファー pH7.3及び（Ｂ）50％アセトニトリル水溶液の混合物を溶出液として用いて40℃でのイソクラチック溶出により測定した。この溶出は溶出液のUV吸収を 214nmで追跡することによりモニターした。ボイド時間toは、 0.1mMの硝酸ナトリウムの注入により確認した。ヒトインスリンについての保持時間ｔhuman は、ＡとＢ溶液との比を変えることによって少なくとも２toとなるように調整した。
k'rel＝（ｔderivative−to）／（ｔhuman −to）
【００６３】
血流グルコース低下作用の延長の度合いをウサギで試験した。各インスリン誘導体は一日遅延試験で６羽づつのウサギに12nmolのそれを皮下注射することによって試験した。グルコース分析用の血液採取は注射の前、並びに注射して１，２，４及び６時間後に行った。実験グルコース値は初期値の％として表わす。血液グルコース値より計算した遅延指数は等級付け遅延（延長）指数である。Markussen ら、Protein Engineering Ｉ(1987) 205-213におけるp211を参照のこと。その方式は、ウシ・ウルトラレンテ・インスリンについて 100の値、そしてActrapid（商標）（Novo Nordisk A／S, 2880 Bagsraerd, Denmark）について０の値とするように等級付している。
【００６４】
表１に挙げているインスリン誘導体は、Znを含まないと特定されているものを除き、インスリンヘキサマー当り３個のZn2+を含む溶液として投与した。
【００６５】
非常に遅延型の類似体にとってはウサギのモデルは不適当であり、なぜなら初期値からの血液グルコースの低下は遅延指数を評価するには小さすぎるからである。かかる類似体の延長はブタでの消失率による方がより良く特性決定される。Ｔ50％は、外部γ−カウンターで測定したときに、注射部位からＡ14 Tyr (125I) 類似体の50％が消失した時間とする（Ribel, Uら、The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. serrano-Rios and P. J. Lefebre（編）： Diabetes 1985; Proceeding of the 12th Congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96) 。
【００６６】
表２には一連の非常に延長型のインスリン類似体のＴ50％値を示す。これらの類似体はヘキサマー当り３個のZn2+を含む溶液として投与した。
【００６７】
【表１】
0003917333.tif 000003
【００６８】
【表２】
0003917333.tif 000004
【００６９】
溶解度
インスリンヘキサマー当り３個のZn2+イオンを含む表１に挙げるＮεB29 修飾インスリン全ての溶解度が、防腐剤としての 0.3％のフェノール及び等張性を達しめるための 1.6％のグリセロールを更に含んで成る中性(pH7.5）で水性の薬理製剤の中で 600nmol／mlを超えていた。 600nmol／mlは、臨床において通常採用される100 IU／mlの組成物で認められるヒトインスリンの濃度である。
【００７０】
ε−Ｂ29アミノ基は、アミド結合、スルホンアミド結合、カルバミド、チオカルバミド又はカルバメートの成分でありうる。ε−Ｂ29アミノ基により担持される親油基はアルキル基でもありうる。
【００７１】
本発明に係るヒトインスリン誘導体を含む、薬理組成物はかかる処置を必要とする患者に非経口投与してよい。非経口投与はシリンジ、任意的にはペン型シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射によって実施されうる。他方、非経口投与は点滴ポンプによって行ってよい。更なる任意は、鼻スプレー式でヒトインスリン誘導体を投与するための粉末又は液体でありうる。
【００７２】
本発明の注射用ヒトインスリン組成物は薬品産業の慣用の技術を利用して調製してよく、それは成分を適宜溶解及び混合して所望の最終製品にすることを含む。
【００７３】
即ち、一手順に従うと、このヒトインスリン誘導体を、調製すべき組成物の最終容量より若干少ない量の水に溶かす。等張剤、防腐剤及びバッファーを適宜加え、次いで溶液のpHを必要ならば例えば塩酸、又は塩基、例えば水性水酸化ナトリウムを用いて必要に応じて調整する。最後に、溶液の容量を水で調整して所望の成分濃度にする。
【００７４】
等張剤の例は、塩化ナトリウム、マンニトール及びグリセロールである。
【００７５】
防腐剤の例は、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート及びベンジルアルコールである。
【００７６】
適当なバッファーの例は酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムである。
【００７７】
本発明に係るインスリン誘導体の鼻投与用組成物は、例えば、ヨーロッパ特許第 272,097号（Novo Nordisk A／S)に記載の通りにして調製できうる。
【００７８】
本発明のインスリン組成物は糖尿病の処置に利用できうる。任意の患者のための最適投与レベルは様々な要因、例えば採用する特定のヒトインスリン誘導体の薬効、患者の年齢、肉体的活動力及び食事、他の薬剤との可能な組合せ、並びに糖尿病の症度に応じるであろう。本発明のヒトインスリン誘導体の日常の投与量は公知のインスリン組成物についてと似たようにして当業者により各個別の患者について決定されることが推奨される。
【００７９】
好都合なら、本発明のヒトインスリン誘導体はその他のタイプのインスリン、例えばヒトインスリンもしくはブタインスリン、又はより即効性を有するインスリン類似体と混合して利用してよい。かかるインスリン類似体の例は例えばヨーロッパ特許出願、公開番号EP 214,826 (Novo Nordisk A／S), EP375,437 (Novo Nordisk A ／S)及びEP383,472 (Eli Lilly & Co.) に記載されている。
【００８０】
本発明を以下の実施例で更に説明するが、しかしながらそれらを保護範囲を狭めるものではない。以上の説明及び以下の実施例に開示の特徴は、それぞれ独立して、又は組合されて、本発明を様々な形態で実施するための資料となりうる。
【００８１】
【実施例】
プラスミド及び DNA材料
発現プラスミドは全てcPOTタイプである。かかるプラスミドはEP特許出願第 171,142号に記載され、そしてプラスミドの選別及び安定化の目的でシゾサッカロマイセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe ）トリオースミリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT）を含むことを特徴とする。 POT−遺伝子を含むプラスミドは寄託されているＥ．コリ（E.coli）株（ATCC 39685）より入手できる。このプラスミドは更にＳ．セレビジエ（S.cerevisiae）トリオースミリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーター(PTP1 及び TTP1)を含む。これらはpMT742 (Egel-Mitani,Ｍら、Gene 73 (1988) 113-120)（図１参照のこと）と、シグナル／リーダー／生成物についてのコード領域を含むEcoRＩ-XbaＩ制限部位によって規定される領域を除き、同一である。
【００８２】
合成 DNAフラグメントを自動 DNA合成装置（Applied Biosystemsモデル380A）で、ホスホラミジット薬品及び市販の試薬を用いて合成した（Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters  22 (1981) 1859-1869)。
【００８３】
利用したその他の方法及び材料は全て当業界公知一般事項である（例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 を参照のこと）。
【００８４】
分析
調製したインスリンの分子量はMS（マススペクトル）によって、Bio-Ion 20装置 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden）を利用するPDMS（プラズマ脱離マススペクトル）、又はAPI III  Biomolecular Mass Analyzer (Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, (Canada)を用いるESMS）エレクトロスプレー・マススペクトル）のいづれかにより得た。
【００８５】
実施例１
LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA002からの AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化３】
0003917333.tif 000005
【００８６】
以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）をGene Amp PCR試薬キット（Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA)を用い、製造者の仕様書に従って行った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100μｌのミネラル油（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）をかぶせた。
2.5 μｌのオリゴヌクレオチド#98 (2.5pmol)
2.5 μｌのオリゴヌクレオチド#128 (2.5pmol)
10μｌの10Ｘ  PCR バッファ
16μｌのdNTP混合物
0.5 μｌの Taq酵素
58.5μｌの水
１サイクルを行った：94℃で 45sec, 49℃で１min , 72℃で２min 。
【００８７】
次に、５μｌのオリゴヌクレオチド #16及び#126を加え、そして15サイクルを行った：94℃で 45sec, 45℃で１min , 72℃で1.5min。 PCR混合物を 2.5％のアガロースゲルに載せ、そして電気泳動に標準の技術を利用してかけた（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Pres, 1989) 。得られる DNAフラグメントをアガロースゲルから切り取り、そしてGene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA）を用いてその製造者の仕様書に従って単離した。精製した PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼの中に溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩにより標準の技術に従って切り、 2.5％のアガロースゲルで泳動させ、そしてGene Clean Kitを用いて記載の通りに精製した。
【００８８】
プラスミドpAK188は、ベクター（ファージミド）pBLUESCRIPT IIsk( ＋／−）(Stratagene, USA）のEcoRＩ／ XbaＩフラグメントの中に挿入されている合成酵母シグナル／リーダー遺伝子LaC212 spx３(WO 89／02463 のExample ３記載）をコードするEcoRＩ／Nco Ｉフラグメントより成る 412bpの DNA配列、それに続くＢ29とＡ１のアミノ酸残基をつなぐSer Asp Asp Ala Lys 架橋を有するインスリン前駆体Ｍ15をコードする合成 NcoＩ／ XbaＩより成る。このプラスミドpAK188を図１に示す。
【００８９】
プラスミドpAK188を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして3139bpのベクターフラグメントを単離した。２本の DNAフラグメントをＴ４ DNAリガーゼ及び標準の条件を利用して互いとライゲーションさせた（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Habour Laboratory Press, 1989）。そのライゲーション混合物をコンビテントＥ．コリ株（Ｒ- ，Ｍ+ ）の中に形質転換し、次いでアンピシリン耐性について選別した。プラスミドを、得られるＥ．コリ  コロニーから、標準の DNAミニプレップ技術（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)で単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ちEcoRＩ， XbaＩ, Nco Ｉ及び HpaＩでチェックした。選別したプラスミドは DNA配列決定分析（Sequenase, U.S. Biochemical(orp.）により、 AlaA21, AspB3ヒトインスリン前駆体についての適正な配列を含むことが示され、pEA5.3と命名した。
【００９０】
プラスミドpKFN1627はＥ．コリーＳ．セレビジエシャトルベクターであり、EP特許第 375,718号に記載のプラスミドpKFN1003とは、固有 XbaＩ部位の上流の短い DNA配列を除き同じである。pKFN1003において、この配列は酵母接合因子アルファー１シグナル−リーダー配列とインフレームで融合した合成アプロチニン遺伝子をコードする 178bpのフラグメントである。pKFN1627において、対応の 184bpの配列は接合因子アルファー１配列とインフレームで融合したインスリン前駆体MI５(GluB1，Glu B28)（即ち、B(1-29), GluB1,  CluB28)-Ser Asp Asp Ala Lys-A(1-21)をコードする（ SEQ 1D No.17,18及び19を参照のこと）。ベクターpKFN1627を図１に示す。
【００９１】
pEA5.3を制限エンドヌクレアーゼEcoRＩ及び XbaＩで切り、そして得られる 412bpの DNAフラグメントを単離した。酵母発現ベクターpKFN1627を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩ、並びに NcoＩ及びEcoRＩで切り、9273bpの DNAフラグメントが１回目の消化より単離され、そして1644pbの DNAフラグメントが２回より単離された。次に 412bpのEcoRＩ／ XbaＩフラグメントを他の２つのフラグメント、即ち、9273bpの NcoＩ／ XbaＩフラグメント及び1644bpの NcoＩ／EcoRＩフラグメントに標準の技術を利用してライゲーションさせた。
【００９２】
そのライゲーション混合物を上記の廻りにしてＥ．コリの中に形質転換せしめた。得られるＥ．コリ由来のプラスミドを標準の技術を利用してチェックし、単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoRＩ， XbaＩ， NcoＩ， HpaＩでチェックした。選別したプラスミドは DNA配列分析により(Sequenase kitを用い、その製造者U.S. Biochemicalにより述べられている通りにして）、 AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体 DNAの適正な配列を含み、且つ LaC212 spx ３シグナル／リーダー DNAをコードする DNAの後に挿入されていることを示した。このプラスミドをpEA5.3.2と命名し、そして図１に示す。LaC212spx ３シグナル／リーダー／ AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.20，21及び22に示す。プラスミドpEA5.3.2をヨーロッパ特許出願公開番号 214,826に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形質転換し、そして得られる株をyEA002と命名した。
【００９３】
実施例２
LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA005からの AlaA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化４】
0003917333.tif 000006
【００９４】
AlaA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAは、実施例１の AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じようにして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／ AlaA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.23, 24及び25に示す。プラスミドpEA8.1.1は所望の配列を含むことが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA005と命名した。
【００９５】
実施例３
LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA007からの GlyA21  AspB3ヒトインスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化５】
0003917333.tif 000007
【００９６】
GlyA21  AspB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAは、実施例１の AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じようにして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／ GlyA21  AspB3ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.26, 27及び28に示す。プラスミドpEA1.5.6は所望の配列を含むことが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA007と命名した。
【００９７】
実施例４
LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA006からの GlyA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化６】
0003917333.tif 000008
【００９８】
GlyA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAは、実施例１の AlaA21  AspB3ヒトインスリン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じようにして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／ GlyA21  ThrB3ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.29, 30及び31に示す。プラスミド pEA4.4.11は所望の配列を含むことが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA006と命名した。
【００９９】
実施例５
アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA113からのＮ−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg)を有する ArgB-1  ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体の合成
Ａ）
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化７】
0003917333.tif 000009
【０１００】
以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）を、Gene Amp PCR試薬キット(Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA）を用い、その製造者の仕様書に従って行った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100μｌのミネラル油(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA）をかぶせた。プラスミドpAK220（これはpAK188と同一である）は、ベクター( ファージミド) pBLUESCRIPT IIsk( ＋／−）(Stratagene, USA）の中に挿入された、合成酵母シグナル／リーダーLaC212 spx３(WO 89／02463 のExample ３に記載）をコードする 412bpの DNA配列、それに続くインスリン前駆体MI５(SEQ ID No.14,15及び16参照のこと) より成る。
【０１０１】
５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmol)
５μｌのオリゴヌクレオチド#263 (100pmol)
10μｌの10ＸのPCR バッファー
16μｌのdNTP混合物
0.5 μｌの Taq酵素
0.5 μｌのpAK220プラスミド（pAK188と同じ）を鋳型として（0.2 μｇの DNA）
63μｌの水
【０１０２】
全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、40℃で１分及び72℃で２分より成る。 PCR混合物を２％のアガロースゲルに載せ、そして標準の技術を利用して電気泳動にかけた。得られる DNAフラグメントをアガロースゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA）を用い、その製造者の仕様書に従って単離した。精製した PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼバッファーに溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼHindIII 及び XbaＩで標準の技術を用いて切った。このHindIII ／ XbaＩ DNAフラグメントをGene Clean Kitを用い、上記の通りに精製した。
【０１０３】
プラスミドpAK406は、酵母アルファー因子リーダーをコードするpMT636(WO 90／10075 に記載）由来のEcoRＩ／HindIII フラグメントを含んで成る 520bpの DNA配列とベクターcPOTの中に挿入されたインスリン前駆体MI５の残りをコードするpAK188由来のHindIII ／ XbaＩフラグメント(SEQ ID No.32,33及び34参照のこと) にライゲーションされたインスリン前駆体の一部より成る。ベクターpAK406を図２に示す。
【０１０４】
プラスミドpAK233は、合成酵母シグナル／リーダーLaC212 spx３(WO 89／02463 のExample ３記載）をコードする 412bpの DNA配列、それに続くベクターcPOTの中に挿入されたインスリン前駆体B(1-29)-GluLysArg-A(1-21) (A21-Gly) (SEQ ID No.35, 36 及び37参照のこと）についての遺伝子より成る。プラスミドpAK233を図２に示す。
【０１０５】
プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして9237bpのベクターフラグメントが単離された。このプラスミドpAK406を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及びHindIII で切り、そして2012bpのベクターフラグメントが単離された。これら２本の DNAフラグメントを一緒にHindIII ／Xba Ｉ PCRフラグメントにＴ４ DNAリガーゼ及び標準の条件を用いてライゲーションさせた。このライゲーション混合物を次にコンビテントＥ．コリ株（Ｒ- ，Ｍ+ ）に形質転換し、続いてアンピシリン耐性について選別した。プラスミドを、得られるＥ．コリ  コロニーから標準のミニプレップ技術を用いて単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoRＩ,XbaＩ, Nco Ｉ, HindIII でチェックした。選別したプラスミドは DNA配列決定により、 ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体 DNAについての適正な配列を含み、且つＳ．セレビジエアルファー因子 DNAをコードする DNAの後に挿入されていることを示した。このプラスミドをpEA108と命名し、そして図２に示す。アルファー因子リーダー／ ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA及びそのアミノ酸配列はSEQ ID No.38, 39及び40である。プラスミドpEA108を実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663の中に形質転換させ、そして得られる株をyEA108と命名した。
【０１０６】
Ｂ）
以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）を、Gene Amp PCR試薬キット(Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA）を用い、その製造者の仕様書に従って行った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100μｌのミネラル油(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA）をかぶせた。
５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmol)
５μｌのオリゴヌクレオチド#307 (100pmol)
10μｌの10Ｘの PCRバッファー
16μｌのdNTP混合物
0.5 μｌの Taq酵素
0.5 μｌのpEA108プラスミドを鋳型として（0.1 μｇの DNA）
63μｌの水
【０１０７】
全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、40℃で１分及び72℃で２分より成る。 PCR混合物を２％のアガロースゲルに載せ、そして標準の技術を利用して電気泳動にかけた。得られる DNAフラグメントをアガロースゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA）を用い、その製造者の仕様書に従って単離した。精製した PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼバッファーに溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで標準の技術を用いて切った。この NcoＩ／ XbaＩ DNAフラグメントをGene Clean Kitを用い、上記の通りに精製した。
【０１０８】
プラスミドpAK401は、アルファー因子リーダーをコードするpMT636(WO 90／10075 に記載）（部位特異的突然変異誘発によりアルファーリーダーの３′末端の中に Nco部位を導入して構築）由来のEcoRＩ／ NcoＩフラグメントを含んで成る 523bpの DNA配列ベクター（ファージミド）pBLVESCRIPT(＋／−）(Stratagene, USA）の中に挿入されたインスリン前駆体MI５をコードするpAK188由来の NcoＩ／ XbaＩフラグメント(SEQ ID No.41,42及び43参照のこと) より成る。ベクターpAK401を図３に示す。
【０１０９】
プラスミドpAK401を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして3254bpのベクターフラグメントが単離され、そして NcoＩ／ XbaＩ PCRフラグメントで一緒にライゲーションさせた。このライゲーション混合物をコンビテントＥ．コリ株の中に形質転換し、そして得られるＥ．コリ  コロニーから標準の DNAミニプレップ技術を利用してプラスミドを単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoRＩ,XbaＩ, Nco Ｉでチェックした。選別したプラスミドを p113Aと命名し（図３に示す）、EcoRＩ及び XbaＩで切り、そして 535bpのフラグメントが単離された。
【０１１０】
プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして9237bp及び1644bpのフラグメントが単離された。これら２本の DNAフラグメントを一緒にEcoRＩ／Xba Ｉ PCRフラグメントにＴ４ DNAリガーゼ及び標準の条件を用いてライゲーションさせた。このライゲーション混合物を次にコンビテントＥ．コリ株（Ｒ- ，Ｍ+ ）に形質転換し、続いてアンピシリン耐性について選別した。プラスミドを、得られるＥ．コリ  コロニーから標準のミニプレップ技術を用いて単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoRＩ,XbaＩ, Nco Ｉ, HindIII でチェックした。選別したプラスミドは DNA配列決定により、Ｎ末端伸長部 Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Argを有する ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体 DNAについての適正な配列を含み、且つＳ．セレビジエアルファー因子 DNAをコードする DNAの後に挿入されていることを示した。このプラスミドをpEA113と命名し、そして図３に示す。Ｎ末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg）アルファー因子リーダー／ ArgB-1  ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体複合体をコードする DNA及びそのアミノ酸配列はSEQ ID No.44, 45及び46である。プラスミドpEA113を実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663の中に形質転換させ、そして得られる株をyEA113と命名した。
【０１１１】
実施例６
アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA136からのＮ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg）を有する ArgB-1  ArgB1一本鎖ヒトインスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【化８】
0003917333.tif 000010
【０１１２】
以下の PCRをGene Amp PCR試薬キットを用いて実施した。
５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmol)
５μｌのオリゴヌクレオチド#389 (100pmol)
10μｌの10Ｘの PCRバッファー
16μｌのdNTP混合物
0.5 μｌの Taq酵素
２μｌのpEA113プラスミドを鋳型として（0.5 μｇの DNA）
63μｌの水
【０１１３】
全部で12サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、37℃で１分、及び72℃で２分より成る。
【０１１４】
Ｎ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg）を有するアルファー因子リーダー／ ArgB-1  ArgB1一本鎖ヒトインスリン前駆体をコードする DNAを、実施例５のＮ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg）を有するアルファー因子リーダー／ ArgB-1  ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体をコードする DNAに記載と同じようにして構築した。Ｎ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg）を有するアルファー因子リーダー／ ArgB-1  ArgB31 一本鎖ヒトインスリン前駆体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配列はSEQ ID No.47, 48及び49である。このプラスミドを実施例１記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形質転換し、そして得られる株をyEA136と命名した。
【０１１５】
実施例７
（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンの合成
５ｇの亜鉛非含有インスリンを41.3mlのDMSOに溶かした。この溶液に 3,090mlの酢酸を加えた。反応を室温で行い、そして 5,650mlのDMSOに溶かした 565mgのジーtert−ブチルピロ炭酸塩の添加により開始させた。反応を５ 1／2 時間進行させ、そして 250μｌのエタノールアミノの添加により停止させた。生成物を1500mlのアセトンの添加により沈殿させた。その沈渣を遠心により単離し、そして真空乾燥して、6.85ｇの収量の物質が得られた。
【０１１６】
（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocインスリンを以下のようにして逆相HPLCにより精製した。粗生成物を 100mlの25％のエタノール水溶液に溶かし、pHを HClで 3.0に合わせ、そしてオクタデシルジメチルシリル−置換化シリカ粒子（平均粒子サイズ15μｍ、孔サイズ 100Å）の充填したカラム（直径５cm、高さ30cm）に載せ、そして溶出バッファーで平衡にした。溶出はエタノールと１mMの水性HCl, 0.3Ｍの kclの混合物を用いて２ｌ／ｈの流速で行った。インスリンはエタノール含有量を30％から45％に上昇させることにより溶出した。適切な画区を20％のエタノールで希釈し、そして pH4.8で沈殿させた。沈殿した物質を遠心により単離し、そして真空乾燥した。これにより、 1.701ｇの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンが94.5％の純度で得られた。
実施例８
（ＮεB29 −ベンゾイルヒトインスリン）6, 3Zn2+の合成
400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２mlのDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOとの（１：９，Ｖ／Ｖ）混合物 748μｌを加えた。反応は15℃で行い、そして 132μｌの  DMF に溶かした14.6mgの安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により開始させた。反応は２時間後に 100mlのアセトンを添加することにより停止させた。沈殿した物質を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 343mgの物質が回収できた。
【０１１７】
Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去した。溶解物質を30分インキュベートし、そして50mlのアセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単離し、そして真空乾燥した。
ＮεB29 −ベンゾイルヒトインスリンを実施例７に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。 230mgの収量が得られた。６mMのZn2+及び50mMのクエン酸を含む pH5.5の15％の水性エタノールからの再結晶化は、表題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心により単離し、そして真空乾燥した。収量は 190mgであった。
MSによる分子量は5911；理論値は5911である。
【０１１８】
実施例９
（ＮεB29 −リトコロイルヒトインスリン）6, 3Zn2+の合成
400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２mlのDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOとの（１：９，ｖ／ｖ）混合物 748μｌを加えた。反応は15℃で行い、そして 300μｌの  DMF に溶かした 31.94mgのリトコリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により開始させた。反応は２時間後に 100mlのアセトンを添加することにより停止させた。沈殿した物質を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 331mgの物質が回収できた。
【０１１９】
Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去した。溶解物質を30分インキュベートし、そして50mlのアセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単離し、そして真空乾燥した。収量は 376mgであった。
【０１２０】
Ｂ29−リトコロイルインスリンを実施例７に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。67mgの最終収量が94％の純度で得られた。６mMのZn2+及び50mMのクエン酸を含む pH5.5の15％の水性エタノールからの再結晶化は、表題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心により単離し、そして真空乾燥した。収量は49mgであった。
MSによる分子量は6160；理論値は6166である。
【０１２１】
実施例10
（ＮεB29 −ベンゾイルヒトインスリン）6, 3Zn2+の合成
400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２mlのDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOとの（１：９，ｖ／ｖ）混合物 748μｌを加えた。反応は15℃で行い、そして 132μｌの  DMF に溶かした18.0mgのデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により開始させた。反応は60分後に 100mlのアセトンを添加することにより停止させた。沈殿した物質を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 420mgの中間生成物が回収できた。
【０１２２】
Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去した。溶解物質を30分インキュベートし、そして生成物を50mlのアセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単離し、そして真空乾燥した。粗生成物の収量は 420mgであった。
【０１２３】
その粗生成物を実施例７に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。表題の生成物の 254mgの最終収量が得られた。６mMのZn2+及び50mMのクエン酸を含む pH5.5の15％の水性エタノールからの再結晶化は、表題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心により単離し、そして真空乾燥した。収量は 217mgであった。
MSによる分子量は5962；理論値は5962である。
【０１２４】
実施例11
デス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
デス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成はMarkussen (Methods in diabetes research. Vol. I, Laboratory methods, part B, 404-410. Ed: J. Larner and S. Phol., John Wiley & Sons, 1984)に記載の通りにして実施した。５ｇのヒトインスリンを 500mlの水に溶かし、その間溶液のpH値は 0.5Ｍの硫酸の添加により 2.6に保っておいた。次に、インスリンを 100ｇの硫酸アンモニウムの添加により塩析し、そして沈渣を遠心により単離した。そのペレットを 800mlの 0.1Ｍの炭酸水素アンモニウムの中に溶かし、そしてその溶液のpH値を１Ｍのアンモニアで 8.4に調整した。
【０１２５】
50mgのウシカルボキシペプチダーゼＡを25mlの水に懸濁し、そして遠心により単離した。その結晶を25mlの水に懸濁し、そして透明な溶液が得られる最終pH10となるまで 0.1Ｍのアンモニアを加えた。このカルボキシペプチダーゼ溶液をインスリン溶液に加え、そしてその反応を24時間進行させた。数滴のトルエンを反応中の防腐剤として働くように加えた。
【０１２６】
24時間後、デス（Ｂ30）ヒトインスリンを、その溶液を撹拌しながら80ｇの塩化ナトリウムを逐次添加することによって結晶化させた。次いでpH値を 8.3に調整し、そして結晶化をゆっくり撹拌しながら20時間進行させた。結晶を 1.2μｍのフィルター上で単離し、 250mlの氷冷２−プロパノールで洗い、そして最後に真空乾燥した。
【０１２７】
実施例12
（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
表題の化合物を実施例７に記載と類似の方法で、出発物質としてデス（Ｂ30）ブタインスリンを用いて合成した。その粗生成物をアセトンにより沈殿させ、そして真空乾燥した。（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒトインスリンを実施例７記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。
【０１２８】
実施例13
ＮεB29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒトインスリンを、実施例10記載の手順に従うＮεB29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成のための出発物質として用いた。その粗生成物をアセトンにより沈殿させ、真空乾燥し、 TFAを用いて脱保護した。得られる生成物をアセトンにより沈殿させ、そして真空乾燥した。次いでＮεB29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンを実施例10に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。
MSにより認められる分子量5856；理論値5861。
【０１２９】
実施例14
ＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
ａ．Ａ．リティカスプロテアーゼの固定化
５mlの水性の 0.2ＭのNaHCO3バッファー pH9.4に溶解した13mgのＡ．リティカスプロテアーゼを、同じバッファーで洗っておいた４mlの沈降させたMiniLeak（商標）メディウムゲルと混合した（MiniLeakは、Kem En Tec, Copenhagenより入手したジビニルスルホン活性化 Sepharose CL 6Bである）。このゲルを室温で24時間ゆっくり撹拌することにより懸濁を保った。次に、このゲルを濾過により単離し、水で洗い、そして20mlの１Ｍのエタノールアミン pH9.4に懸濁し、そして室温で24時間懸濁に保った。最後に、このゲルを水、次いで 0.1Ｍの酢酸で洗い、そして４℃で保存した。濾液の酵素活性は当初の溶液の13％であり、約87％の固定化反応が得られたことを示唆する。
【０１３０】
ｂ．ブタトリプシンの固定化
ブタトリプシンをMiniLeak（商標）Low に、Ａ．リティカスの固定化について上記した条件を利用し、１mlのゲル当り１mgの置換度となるように固定化した。
【０１３１】
ｃ．固定化Ａ．リティカスプロテアーゼを用いるGlu(GluAla)3Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21) インスリンの合成
20mlの 0.1ＭのNaHCO3バッファー pH9.0に溶かした 200mgのGlu(GluAla)3Arg-B(1-29)-ThrArg-A(1-21)一本鎖ヒトインスリン前駆体に固定化Ａ．リティカスプロテアーゼを担持するゲル４mlを加えた。そのゲルを室温で６時間反応混合物の中で懸濁に保った後、加水分解は完了し、Glu(GluAla)3-Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21)ヒトインスリンが得られる（反応は逆相HPLCにより追跡）。加水分解後、ゲルを濾過により除去した。その濾液に５mlのエタノール及び15μｌの１Ｍの ZnCl2を加え、そしてpHを HClを用いて 5.0に合わせた。生成物の沈殿は４℃で一夜ゆっくり撹拌しながら放置することで完了した。その生成物を遠心により単離した。１mlの氷冷20％エタノールで１回洗い、そして真空乾燥した後、収量は 190mgであった。
【０１３２】
ｄ．ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いるＮ A1,Ｎ B1,ＮεB29 −トリドデカノイルGlu(GluAla)3Arg-B(1-29), Thr-Arg-A(1-21)ヒトインスリンの合成
190mg（30μmol)のGlu(GluAla)3Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21) インスリンを１mlのDMSO及び1.05mlの 0.572ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの DMF溶液に溶かした。この溶液を15℃に冷やし、そして 0.6mlのDMSOに溶解した36mg(120μmol)のドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを加えた。反応は24時間以内に完了した。親油性の表題の化合物は単離しなかった。
【０１３３】
ｅ．ＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）インスリンの合成
約2.65mlのDMSO／ DMF／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの中に含まれている先の工程ｄ由来の生成物を20％のエタノールを含んで成る10.6mlの50mMのグリシンバッファーで希釈し、そしてpHをNaOHで10に調整した。室温で１時間放置後、１mgの固定化トリプシンを１mlのゲル当り担持している１mlのMiniLeakゲルを加えた。その反応混合物を室温で48時間ゆっくり撹拌した。所望の生成物を単離するため、反応混合物を、オクタデシルジメチルシリル−置換化シリカ粒子（平均粒子サイズ15μｍ、孔サイズ 100Å）で充填した逆相HPLCカラム（直径５cm、高さ30cm）に載せた。溶出のためには、 pH7.7に調整され、エタノール濃度が40％から44％（ｖ／ｖ）に上昇する20mMのトリス／HCl バッファーを2000ml／ｈの流速で用いた。約43〜44％のエタノールで溶出する主要ピークが表題の化合物を含んでいた。主要ピークを含む画分をプール、エタノール濃度を20％（ｖ／ｖ）に下げるように水を加え、そしてpHを 5.5に調整した。その溶液を−20℃で一夜放置し、これにより生成物を沈殿させた。その沈渣を−８℃での遠心により単離し、そして真空乾燥した。表題の化合物の収量は90mgであった。MSにより認められる分子量は5892；理論値は5890。
【０１３４】
実施例15
ＮεB29 −（Ｎ−ミリストイル−α−グルタミル）ヒトインスリンの合成
500mg の（Ａ１，Ｂ１）−ジBoc ヒトインスリンを 2.5mlのDMSOに溶かし、そして 2.5mlの１／１のDMSO／DMF(ｖ／ｖ）に希釈しておいた 428μｌのエチルジイソプロピルアミドを加えた。その温度を15℃にし、そして 2.5mlの１／１のDMSO／DMF(ｖ／ｖ）に溶解した85mgのＮ−ミリストイル−Glu (OBut)Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを加えた。30分後、その反応混合物を60mlの水に注ぎ、pHを５にし、そしてその沈渣を遠心により単離した、その沈渣を真空乾燥した。乾燥反応混合物を25mlの TFAに溶かし、そしてその溶液を室温で30分放置した。 TFAを真空でエバポレーションした。ゼラチン状の残渣を60mlに水に溶かし、そしてpHを濃アンモニアを用いて11.2にした。表題の化合物は６Ｎの HClを用いてpHを 8.5にすることによってこの溶液から結晶化した。その生成物を遠心により単離し、10mlの水で洗い、そして真空乾燥した。収量 356mg・HPLCにより純度94％。
【０１３５】
本例の生成物は、 LysB29 のε−アミノ基が以下の構造を有する置換基を有するヒトインスリンである：
CH3(CH2)12CONHCH(CH2CH2COOH)CO-
MSにより認められた分子量6146：理論値6148。
【０１３６】
実施例16
ＮεB29 −ウンデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
表題の化合物は実施例14に記載のＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにウンデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用することにより合成した。
MSにより認められたこの生成物の分子量5876：理論値5876。
【０１３７】
実施例17
ＮεB29 −トリデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
表題の化合物は実施例14に記載のＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにトリデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用することにより合成した。
MSにより認められたこの生成物の分子量5899：理論値5904。
【０１３８】
実施例18
ＮεB29 −ミリストイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
表題の化合物は実施例14に記載のＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにミリスチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用することにより合成した。
MSにより認められたこの生成物の分子量5923：理論値5918。
【０１３９】
実施例19
ＮεB29 −パルミトイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
表題の化合物は実施例14に記載のＮεB29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用することにより合成した。
MSにより認められたこの生成物の分子量5944：理論値5946。
【０１４０】
実施例20
ＮεB29 −スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリン
ａ．Ｎ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンの調製
ジスクシニミジルスベレート(1.0ｇ，Pierce) を DMF (50ml) に溶かし、そしてＤ−チロキシン(2.0ｇ，Aldrich)を20℃で撹拌しながら加えた。チロキシンをゆっくり溶かし、そして20時間後、溶媒を真空エバポレーションにより除去した。油状の残渣を２−プロパノールから結晶化させ、 0.6ｇのＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンを得た。m.p. 128−133 ℃。
【０１４１】
ｂ．（Ａ１，Ａ２）−ジ BocヒトインスリンとＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンとの反応
（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリン(200mg）をドライ DMF（10ml）の中に、室温でトリエチルアミン（20μｌ）の添加により溶かした。次にＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシン（80mg）を加えた。この反応を逆相HPLCによりモニターし、そして反応が約90％完了したら、溶媒を真空除去した。このエバポレーション残渣に無水トリフルオロ酢酸（５ml）を加え、そしてこの溶液を室温に１時間保った。真空でトリフルオロ酢酸を除去した後、その残渣を１Ｍの酢酸（５ml）とアセトニトリル(1.5ml）との混合物に溶かし、調製逆相HPLCにより精製し、そしてPD−10カラムで脱塩した。ＮεB29 −スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリンの収量は50mgであった。
【０１４２】
本例の生成物は LysB29 のε−アミノ基が以下の構造の置換基を有するヒトインスリンである：Thyrox-CO(CH2)6CO （ここでThyroxは、α−アミノ基に対するアミド結合を介してオクタンジオン酸成分に結合しているチロキシンである）。
MSにより認められたこの生成物の分子量は6724：理論値6723。
【０１４３】
実施例21
ＮεB29 −（２−スクシニルアミド）ミリスチン酸ヒトインスリンの合成
ａ．α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HCl の調製
−10℃においてメタノール（５ml，Merck)に塩化チオニル(0.2ml, Aldrich)を強力に撹拌しながら滴下した。次にα−アミノミリスチン酸(0.7ｇ；α−ブロモ酸からアンモニアとの反応により調製）を加えた。その反応混合物を室温で一夜撹拌し、次いで乾くまでエバポレートした。粗生成物(0.7ｇ）を工程ｂに直接用いた。
【０１４４】
ｂ．Ｎ−スクシノイル−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの調製
α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HCl (0.7ｇ）をクロロホルム（25ml，Merck)に溶かした。トリエチルアミン（0.35ml，Fluka)を、次いで無水コハク酸(0.3ｇ，Fluka)を加えた。その反応混合物を室温で２時間撹拌し、乾くまで濃縮し、そしてその残渣を酢酸エチル／石油エーテル（１／１）から再結晶化させた。収量： 0.8ｇ。
【０１４５】
ｃ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの調製
Ｎ−スクシノイル−α−アミノミリスチン酸メチルエステル(0.8ｇ）をドライDMF (10ml, Merck, ４Åモレキュラーシーブで乾燥）に溶かした。ドライピリジン（80μｌ，Merck)及びジ（Ｎ−スクシニミジル）炭酸塩(1.8ｇ，Fluka)を加え、そしてその反応混合物を室温で一夜撹拌した。そのエバポレーション残渣をシリカゲル60（Meck）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、そして２−プロパノール／石油エーテル（１／１）から再結晶化させた。Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの収量：0.13ｇ，m.p.64−66℃。
【０１４６】
ｄ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ BocヒトインスリンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステルとの反応
反応は実施例20ｂに記載の通りに実施したが、ただしＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンの代わりにＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステル（16mg）を使用した。真空でトリフルオロ酢酸を除去後、そのエバポレーション残渣を 0.1Ｍの水酸化ナトリウムにより０℃で処理してメチルエステルをけん化した。けん化が逆相HPLCによって完了していると判定できたら、溶液中のpH値を３にし、そして溶液を凍結乾燥した。調製逆相HPLCによる精製及びPD−10カラムでの脱塩の後、ＮεB29 −（２−スクシニルアミド）ミリスチン酸ヒトインスリンの収量は39mgであった。
【０１４７】
本例の生成物は、 LysB29 のε−アミノ基が次の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：CH3(CH2)11CH(COOH)NHCOCH2CH2CO- 。
MSにより認められた分子量は6130：理論値6133。
【０１４８】
実施例22
ＮεB29 −オクチルオキシカルボニルヒトインスリンの合成
この合成は実施例20ｂに記載の通りに実施したが、ただしＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンの代わりに、ｎ−オクチルオキシカルボニルＮ−ヒドロキシスクシニミド（９mg；ｎ−オクチルクロロホルメート（Aldrich)及びＮ−ヒドロキシスクシニミドより調製）を用いた。ＮεB29 −オクチルオキシカルボニルヒトインスリンの収量は86mgであった。
【０１４９】
本例の生成物は、 LysB29 のε−アミノ基が次の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：CH3(CH2)7OCO- 。
MSにより認められた分子量は5960：理論値5964。
【０１５０】
実施例23
ＮεB29 −（２−スクシニルアミド）パルミチン酸ヒトインスリン
ａ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸メチルエステルの調製
本化合物は実施例21ａ．〜ｃ．に記載の通りにして、α−アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノパルミチン酸を用いて調製した。
【０１５１】
ｂ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ BocヒトインスリンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸メチルエステルとの反応
この反応は実施例21ｄに記載の通りに実施したが、ただしＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸を用い、ＮεB29 −（２−スクシニルアミド）パルミチン酸ヒトインスリンを得た。
本例の生成物は LysB29 のε−アミノ基が以下の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：CH3(CH2)13CH(COOH)NHCOCH2CH2CO- 。
【０１５２】
実施例24
ＮεB29 −（２−スクシニルアミドエチルオキシ）パルミチン酸ヒトインスリン
ａ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−２−アミノエチルオキシパルミチン酸メチルエステルの調製
本化合物は実施例21ａ．〜ｃ．に記載の通りにして、α−アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノエチルオキシパルミチン酸(R. TenBrink, J. Org. Chem. 52 (1987) 418-422 記載の一般手順により合成）を用いて調製した。
【０１５３】
ｂ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ BocヒトインスリンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノエチルオキシパルミチン酸メチルエステルとの反応
この反応は実施例21ｄに記載の通りに実施したが、ただしＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノエチルオキシパルミチン酸を用い、ＮεB29 −（２−スクシニルアミドエチルオキシ）パルミチン酸ヒトインスリンを得た。
【０１５４】
本例の生成物は LysB29 のε−アミノ基が以下の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：CH3(CH2)13CH(COOH)NHCH2CH2OCOCH2CH2CO-。
【０１５５】
実施例25
ＮεB29 −リトコロイル−α−グルタミルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成
この合成は、実施例13に記載の通りにして、デカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに、Ｎ−リトコロイル−Ｌ−グルタミン酸α−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、γ−tert−ブチルエステルを用いて実施した。
【０１５６】
本例の生成物は LysB24 のε−アミノ基が以下の構造式の置換基を有するデス（Ｂ30) ヒトインスリンである：リトコロイル−NHCH(CH2CH2COOH)CO- 。
MSにより認められたこの生成物の分子量は6194：理論値6193。
【０１５７】
実施例26
ＮεB29 −３，３′，５，５′−テトラヨードチロアセチルヒトインスリンの合成
この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに３，３′，５，５′−テトラヨードチロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて実施した。
MSにより認められたこの生成物の分子量は6536：理論値6538。
【０１５８】
実施例27
ＮεB29 −Ｌ−チロキシルヒトインスリンの合成
この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに Boc−Ｌ−チロキシンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて実施した。
MSにより認められたこの生成物の分子量は6572：理論値6567。
【０１５９】
実施例28
溶液において 600nmol／mlのＮεB29 −デカノイルデスＢ（30）ヒトインスリン・１／３ Zn2+ を含んで成る薬理組成物
ＮεB29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン(1.2μmol)を水 (0.8ml)に溶かし、そしてpH値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムの添加により 7.5にした。0.01Ｍの酢酸亜鉛（60μｌ）と、0.75％のフェノール及び４％のグリセロールを含む溶液 (0.8ml)とを加えた。この溶液のpH値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムを用いて 7.5にし、そしてこの溶液の容量を水で２mlにした。
【０１６０】
得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態でカートリッジ又はバイアルに移し入れた。
【０１６１】
実施例29
溶液において 600nmol／mlのＮεB29 −デカノイルデスＢ（30）
ヒトインスリン・１／２ Zn2+ を含んで成る薬理組成物
表題の化合物 1.2μmol を水 (0.8ml)に溶かし、そしてpH値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムの添加により 7.5にした。0.75％のフェノール及び1.75％の塩化ナトリウムを含む溶液 (0.8ml)とを加えた。この溶液のpH値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムを用いて 7.5にし、そしてこの溶液の容量を水で２mlにした。
得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態でカートリッジ又はバイアルに移し入れた。
【０１６２】
実施例30
溶液において 600nmol／mlのＮεB29 −リトコロイルヒトインスリンを含んで成る薬理組成物
表題の化合物 1.2μmol を水 (0.8ml)に溶かし、そして 0.2Ｍの水酸化ナトリウムを用いて溶液のpH値を 8.5にすることによって溶解させた。その溶液に0.75％のクレゾール及び４％のグリセロールを含むストック水溶液 0.8mlを加えた。最後に、そのpHを再び 8.5にし、そして溶液の容量を水で２mlにした。
得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態でカートリッジ又はバイアルに移し入れた。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpEA5.3.2の構築を示す。
【図２】プラスミドpEA108の構築を示す。
【図３】プラスミドpEA113の構築を示す。
【配列表】
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【化９】0003917333.tif 000012
【化１０】0003917333.tif 000013
【化１１】0003917333.tif 000014
【化１２】0003917333.tif 000015
【化１３】0003917333.tif 000016
【化１４】0003917333.tif 000017
【化１５】0003917333.tif 000018
【化１６】0003917333.tif 000019
【化１７】0003917333.tif 000020
【化１８】0003917333.tif 000021
【化１９】0003917333.tif 000022
【化２０】0003917333.tif 000023
【化２１】0003917333.tif 000024
【化２２】0003917333.tif 000025
【化２３】0003917333.tif 000026
【化２４】0003917333.tif 000027
【化２５】0003917333.tif 000028
【化２６】0003917333.tif 000029
【化２７】0003917333.tif 000030
【化２８】0003917333.tif 000031
【化２９】0003917333.tif 000032
【化３０】0003917333.tif 000033
【化３１】0003917333.tif 000034
【化３２】0003917333.tif 000035
【化３３】0003917333.tif 000036
【化３４】0003917333.tif 000037
【化３５】0003917333.tif 000038
【化３６】0003917333.tif 000039
【化３７】0003917333.tif 000040
【化３８】0003917333.tif 000041
【化３９】0003917333.tif 000042
【化４０】0003917333.tif 000043
【化４１】0003917333.tif 000044
【化４２】0003917333.tif 000045
【化４３】0003917333.tif 000046
【図１】
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【図２】
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【図３】
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