(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
0003875024.tif 000015
（式中、R１は下記一般式（II）又は（III）：
【化２】
0003875024.tif 000016
（式中、R２はメチル基又はエチル基）
【化３】
0003875024.tif 000017
で表される基を示す。）
で表わされる化合物、その塩又はその水和物。
【請求項２】
ストレプトミセス・エスピー・エムイーアール・2487(Streptomyces sp. Mer-2487, FERM BP-6762) 菌を栄養培地中で培養し、その培養液から請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物を採取する事を特徴とする、請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物を有効成分とする医薬。
【請求項４】
請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物を有効成分とするヒト免疫不全ウイルス(HIV) の増殖阻害剤。
【請求項５】
請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物を有効量と薬理上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項１記載の化合物、その塩又はその水和物の、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) の増殖阻害剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）Ｔａｔ分子の活性を阻害し、ＨＩＶ増殖を抑制するＨＩＶ感染症治療に有効な新規生理活性物質に関する。
従来技術
ＡＩＤＳはレトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２により引き起こされる免疫系の病気であり、ほとんど患者の致死をもたらす。ＡＩＤＳの予防および症状の軽減のために、ウイルスの増殖を抑制する組成物の探索に興味がもたれている。
ＨＩＶは細胞に感染後、遺伝子ＲＮＡがウイルス粒子中に含まれる逆転写酵素によりＤＮＡに逆転写されＨＩＶインテグラーゼにより宿主細胞のＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＨＩＶ遺伝子の５’端にあるＬＴＲ中のプロモーターからＨＩＶ  ＲＮＡが転写され遺伝子ＲＮＡとなると同時に、そのＲＮＡを鋳型としてウイルス蛋白質が合成される。合成されたウイルス蛋白質のいくつかはＨＩＶプロテアーゼにより切断されて成熟蛋白となり次世代のウイルス粒子を形成する。以上のウイルス生活環より、逆転写酵素阻害・インテグラーゼ阻害・ＨＩＶ  ＬＴＲからの転写阻害・プロテアーゼ阻害などがＨＩＶ感染症治療薬の作用点として挙げられる。
これまでにＨＩＶ感染症治療薬としてヌクレオシド系および非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤が実用化され治療に効果を上げている。しかし、既にこれらの抗ＨＩＶ剤に対する耐性株の出現が報告されており（Ｇｕｎｔｈａｒｄ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．７２（３）：２４２２（１９９８））、新たな抗ＨＩＶ剤の開発が望まれている。特に、作用点の異なる抗ＨＩＶ剤は耐性化変異が交叉しないことから、既存の薬剤に耐性を獲得してしまったＨＩＶ感染の治療を可能にし、また既存の薬剤と併用することで耐性の出現を遅らせることが期待される。
ＨＩＶ  Ｔａｔ分子はＨＩＶ  ＲＮＡ５’端のＴＡＲ領域に結合して、ＨＩＶ  ＬＴＲからの転写を促進する活性（Ｔａｔ活性）を持つことが知られている（Ｌａｓｐｉａ  Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：２８３（１９８９））。Ｔａｔを欠失したＨＩＶが増殖できない（Ｐｏｐｉｋ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．６７（２）：１０９４（１９９３））ことから、Ｔａｔ活性を阻害する薬剤（Ｔａｔ阻害剤）はＨＩＶ増殖を抑制し、新規メカニズムのＨＩＶ感染症治療薬となることが期待される。
これまでＲｏ  ５−３３３５およびラットでの腎毒性を軽減したＲｏ  ２４−７４２９がＴａｔ活性を阻害しＨＩＶ増殖を抑制する化合物として報告されているが、Ｒｏ  ５−３３３５は標準的な抗ＨＩＶ活性の評価系であるＭＴ−４急性感染系で効果を示さない（Ｗｉｔｖｒｏｕｗ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：２６２８（１９９２））など抗ＨＩＶ活性が充分でなく、また、臨床導入したＲｏ  ２４−７４２９は効果が得られなかった（Ｈａｕｂｒｉｃｈ  Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １７２：１２４６（１９９５））。
また、ＴａｔのＴＡＲ領域と結合するドメインのアナログであるＡＬＸ４０−４Ｃも、細胞系でＴａｔ活性を阻害しているとの報告はなく、また報告されている抗ＨＩＶ活性も吸着阻害に基づくことを示唆している（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ，．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．７０（５）：２８２５（１９９６））。
発明の開示
本発明はＴａｔ活性を阻害し、ＨＩＶ増殖を抑制する新規物質を単離し、ＨＩＶ感染症の治療剤を提供することにある。
上記現状に鑑み、本発明者らは微生物培養液を原料として、Ｔａｔ阻害剤の探索スクリーニングを行った。その結果、ストレプトミセス属に属する微生物の培養液中にＴａｔ阻害剤が産生されることを見出し、この活性物質を単離・構造決定したところ新規活性物質であることが判明した。そしてこの活性物質は、Ｒｏ  ５−３３３５が活性を示さないＭＴ−４急性感染系を含む各種の急性ＨＩＶ感染系においてＨＩＶ増殖を抑制することが示された。また、ＲＮＡへの転写過程を抑制するという作用機序から予想されるとおり、持続感染系においてもＨＩＶ増殖を抑制し、逆転写酵素阻害剤が無効なＨＩＶ遺伝子が宿主細胞のＤＮＡに組み込まれた後でも効果を発揮できる治療薬と成りうることが示された。
すなわち本発明は、下記一般式（Ｉ）：
0003875024.tif 000002
（式中、Ｒ１は高級アルキル基を示す。ここで高級アルキルとはＣ１２からＣ１８のアルキル基で分岐をしているものを含む。）
で表わされる化合物、その塩又はその水和物、及びその製造方法、並びにそれを有効成分とする医薬に関する。
より具体的には、一般式（Ｉ）において、Ｒ１が下記一般式（ＩＩ）：
0003875024.tif 000003
（式中、Ｒ２はメチル基又はエチル基）
で表される基である化合物、その塩又はその水和物、
一般式（Ｉ）において、Ｒ１が下記式（ＩＩＩ）：
0003875024.tif 000004
で表される基である化合物、その塩又はその水和物である。
ストレプトミセス・エスピー・エムイーアール・２４８７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｍｅｒ−２４８７，ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１８）菌を栄養培地中で培養し、その培養液から一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物を採取する事を特徴とする、一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物の製造方法を提供する。
一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物を有効成分とするヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖阻害剤に関する。
式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物を有効量と薬理上許容される担体とを含む医薬組成物、式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物をヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖阻害剤の製造に用いること、式（Ｉ）で表される化合物、その塩又はその水和物の有効量を人に投与してヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖を阻害する方法を提供する。よって、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖による病気を予防・治療する。
本明細書においては、一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１が一般式（ＩＩ）で表される基であり、一般式（ＩＩ）中のＲ２がメチル基である化合物をＥＭ  ２４８７Ａ、Ｒ２がエチル基である化合物をＥＭ  ２４８７Ｂ、一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１が式（ＩＩＩ）で表される基である化合物をＥＭ  ２４８７Ｃと称する。
発明の詳細な説明
産生株の菌学的性状
本発明化合物の代表的な産生菌株として、長野県志賀高原林地の土壌より分離された放線菌で、本発明者らが、エムイーアール・２４８７（Ｍｅｒ−２４８７）菌株と番号を付した菌株が挙げられる。このＭｅｒ−２４８７菌株の菌学的性状は次の通りである。
（１）形態
基生菌糸より直鎖状（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜５０個の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子のうは認められない。胞子の大きさは０．６〜０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ程度であり、胞子の表面は平滑状（ｓｍｏｏｔｈ）を示し、鞭毛は認められない。
（２）各種培地における生育状態
培養は全て２８℃で行った。色調の記載はコンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡｍｅｒｉｃａのＣｏｌｏｒ  Ｈａｒｍｏｎｙ  Ｍａｎｕａｌ）の（）内に示す符号で表示する。
１）イースト・麦芽寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を着生し、赤色系（５ｃａ〜６ｅｃ）の胞子が見られる。培養裏面は深緑色〜焦げ茶である。茶色の溶解性色素を僅かに産生する。
２）オートミール寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、赤色系（５ｄｃ）の胞子が見られる。培養裏面は焦げ茶である。茶色の溶解性色素を僅かに産生する。
３）スターチ・無機塩寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を豊富に着生し、赤色系（５ｃａ〜６ｅｃ）の胞子が見られる。培養裏面は深緑色〜青紫色である。溶解性色素は産生しない。
４）グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を着生しない。培養裏面はクリーム色で、溶解性色素は産生しない。
５）チロシン寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を着生しない。培地中にメラニン色素を産生しない。培養裏面は深緑色である。
（３）各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え生育を見た。
１）Ｌ−アラビノース      −
２）Ｄ−キシロース        ＋
３）Ｄ−グルコース        ＋
４）Ｄ−フルクトース      ±
５）シュークロース        ＋
６）イノシトール          −
７）Ｌ−ラムノース        −
８）Ｄ−マンニトール      −
９）ラフィノース          −
＋は同化する、±は多少同化する、−は同化しない
（４）細胞壁成分の性状
細胞を加水分解したものをセルロースの薄層クロマトグラフィーによって分析したところ、本菌の細胞壁成分のジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｉｍｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）の異性体型はＬＬ型であった。
以上の菌学的性質から本菌はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌であると思われる。
本発明者は本菌をストレプトミセス・エスピー・エムイーアール２４８７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｍｅｒ−２４８７）として工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１８の番号で１９９８年３月１９日に寄託している。また、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１８は、１９９９年６月１８日に国際寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６２へ移管した。
（培養条件）
本発明の生理活性物質ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃは、上記菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。生理活性物質ＥＭ２４８７の生産菌としては、ストレプトミセス属に属しＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃを生産する能力を有するものであれば、上記菌株に限らず全て本発明に利用できる。
上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養に用いられる培地としては、ストレプトミセス属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜等を単独又は組み合わせて用いることができる。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源を単独又は組み合わせて用いることができる。その他例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属塩類、ビタミンＢ及びビオチン等のビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。消泡剤の添加にあたっては、目的物質の生産に悪影響を与えない濃度とする必要があり、例えば使用濃度としては０．０５％以下が望ましい。
培養条件は、該菌株が良好に生育して上記物質を生産し得る範囲内で適宜選択し得る。例えば培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２８〜３５℃に保つのがよい。培養日数は２〜８日程度で、通常３〜５日である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。培養液中に蓄積された本発明の生理活性物質ＥＭ２４８７は、濾過、遠心分離等の既知の通常の固液分離手段によって菌体を分離し、その菌体からの抽出により回収可能である。
分離・精製
生理活性物質ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃの分離・精製は既知の種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、メタノール、酢酸エチル、アセトン、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出、活性炭、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等への吸着と含水アルコール、含水アセトン等による溶出、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲル濾過、シリカゲル、アルミナ等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を、単独あるいは適宜組み合わせ、場合により反復使用することで分離、精製する事ができる。
菌の培養液からの本発明化合物の精製は以下のようにして精製することができる。ストレプトミセス属の微生物を通常の適切な培養条件にて培養後、培養液を清澄濾過したのちブタノール又はメチルイソブチルケトンなどの有機溶媒を加え抽出し、有機溶媒層を減圧下濃縮する。次いでメタノールにて抽出し、石油エーテル（ｌｉｇｈｔ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）などで処理し粗抽出物を得る。次いでシリカゲルなどを用いる吸着クロマトグラフィー、ＬＨ  ２０ゲルクロマトグラフィ、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィーなどを適宜利用して分画し、活性スクリーニングにより活性画分を確認する。上記手法を適宜組み合わせることにより活性物質を単離することができる。吸着クロマトグラフィーに使用する溶媒としては、クロロホルム、メタノール、アセトン、ヘキサン、トルエンなど通常使用される有機溶媒を用い、適宜濃度を選択、組み合わせて使用することができる。結晶化の溶媒としてはクロロホルムとヘキサン、又はクロロホルムと四塩化炭素などを用いることができる。一つの手法としてＭ．Ｌｕｍｂらの方法がある（Ｎａｔｕｒｅ．２０６，２６３，１９６５）。
単離した化合物の構造解析は、元素分析、ＧＣ−ＭＳ、ＮＭＲ、融点など常法の手法によって行うことができる。
医薬への応用
単離した新規物質はＴａｔ活性を阻害し、急性感染系および持続感染系においてＨＩＶ増殖を抑制して、ＨＩＶ感染症治療で引き起こされるエイズの治療に有用である。また、ヌクレオシド系及び非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤と併用してその治療効果を高めるため、あるいは耐性ウイルスの出現を遅らせるために使用しても良い。
特にヌクレオシド系及び非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤に対して耐性を獲得してしまったＨＩＶに感染している患者に有用である。
該化合物を各種疾患治療・予防剤として投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約１ｍｇ〜１０００ｍｇを１日１〜数回にわけて投与する。
製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する場合は、生薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し支えない。
注射剤を調製する場合には、生薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。実施例において、パーセント（％）は特記しない限り、重量／容量パーセントを示す。
実施例１  ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃの分離精製
Ｍｅｒ−２４８７株の斜面培地（ＩＳＰ−２）から１白金耳を５０ｍｌの種母培地（グリセリン２％、グルコース２％、大豆粉（エスサンミート：味の素（株）製）２％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．２５％、炭酸カルシウム０．３２％、硫酸銅０．０００５％、塩化マンガン０．０００５％、硫酸亜鉛０．０００５％、ｐＨ７．４）を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で２日間回転振とう機上で培養して種培養液を得た。この種培養液それぞれ１５０ｍｌを本培養培地（デキストリン３％、グルコース０．５％、大豆粉（エスサンミート：味の素（株）製）１．５％、コーン・スティープ・リカー０．５％、炭酸カルシウム０．５％、消泡剤０．０５％、ｐＨ７．２）１５Ｌを含む３０Ｌ容ジャーファーメンター２基に接種して、２８℃で７０時間通気撹拌培養（通気量７．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌１００〜２５０ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。培養終了後、得られた培養液２４Ｌを連続遠心分離器にかけ、上清と菌体とに分離した。また、菌体を２０Ｌのメタノールで抽出し、得られたメタノール抽出物を、減圧下で濃縮し、メタノールを留去し、上清と混合した。
混合液に水で膨張したダイヤイオンＨＰ−２０  ２．４Ｌを加え、撹拌した後、樹脂をろ取してカラムに充填し、２０％メタノール６Ｌで洗浄した。続いて、８０％アセトン４１Ｌで溶出し、溶出液を減圧下で濃縮し、アセトンを留去した。残った水溶液を減圧下濃縮乾固して粗抽出物を得た。
このものを少量のジメチルスルホキシドに溶解し、アセトニトリル−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝２：８の混合溶液で予め平衝化しておいたＹＭＣ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＭ  １２０−Ｓ５０（ワイエムシィ社製）のカラム（内径６０ｍｍ、長さ９５０ｍｍ）に二度に分けて付した。同じ組成の混合溶媒で洗浄し、続いて、３５：６５の組成の混合溶媒で溶出した。
溶出液は高速液体クロマトグラフで分析し、ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃ（カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０、内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍ、ワイエムシイ社製、移動層：アセトニトリルー２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝３５：６５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２６０ｎｍにおける紫外吸収、保持時間；Ａ：２．５ｍｉｎ、Ｂ：６．１ｍｉｎ、Ｃ：６．３ｍｉｎ）を含む溶出液を集め、ＥＭ  ２４８７  Ａ，Ｂ，Ｃを含むフラクションを得た。アセトニトリルを減圧下留去した後、水で膨張したダイヤイオンＨＰ−２０を加え、撹拌した後、樹脂をカラムに充填し、２０％メタノールで洗浄した。続いて、８０％アセトンで溶出し、溶出液を減圧下で濃縮し、アセトンを留去した。残った水溶液を減圧下濃縮乾固して粗抽出物を得た。
このものを少量のジメチルスルホキシドに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ワイエムシイ社製、移動層：アセトニトリル−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝３５：６５、流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２６０ｎｍにおける紫外吸収、保持時間；Ａ：１２．０ｍｉｎ、Ｂ：２２．０ｍｉｎ、Ｃ：２６．０ｍｉｎ）に付した。この分取をくりかえし、ＥＭ  ２４８７  Ａ，Ｂ，Ｃのピークを示す溶出液をそれぞれ併せ、アセトニトリルを減圧下留去した後、水で膨張したダイヤイオンＨＰ−２０を加え、撹拌した後、樹脂をカラムに充填し、２０％メタノールで洗浄した。続いて、８０％アセトンで溶出し、溶出液を減圧下で濃縮し、アセトンを留去した。残った水溶液を減圧下濃縮乾固してＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃの純粋な白色粉末をそれぞれ４３２ｍｇ，４４．８ｍｇ，２２．４ｍｇ得た。
ＥＭ  ２４８７Ａ精製および構造解析データ
１．色および性状：白色粉末
２．分子式：Ｃ３２Ｈ５７Ｎ５Ｏ１６Ｐ２
３．マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  ８２８（Ｍ−Ｈ）−
４．比旋光度：［α］Ｄ２２  −７．９（ｃ  １．３、ＭｅＯＨ）
５．紫外部吸収スペクトル：
中性メタノール中：λｍａｘ  ｎｍ（ε）：２６２（３４２００）
酸性メタノール中：λｍａｘ  ｎｍ（ε）：２６２（３６１００）
塩基性メタノール中：λｍａｘ  ｎｍ（ε）：２６０（２７１００）
６．赤外部吸収スペクトル：
ＫＢｒ粉末中で測定した。主な吸収を示す。（波数、ｃｍ−１）
２９２０，２８５０，１６８０，１４７０，１２４０，１０７０，８８０，７２０，５５０
７．１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルおよびＨＭＢＣ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ
重メタノール溶液中で測定した結果を表１に示す。表には、化合物の炭素の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）、その分析データすなわちＥＭ  ２４８７Ａの化学シフト表（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ２４８７Ａ）、炭素間の相関（ＨＭＢＣ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）を参照値（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とともに示した。
0003875024.tif 000005
0003875024.tif 000006
８．溶解性：
可溶：中性の水、メタノール、ジメチルスルホキシド
不溶：ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム
９．高速液体クロマトグラフィー：
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０、内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍ（ワイエムシイ社製）
溶媒：アセトニトリル−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝３５：６５
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍにおける紫外吸収
保持時間：２．５ｍｉｎ
ＥＭ  ２４８７Ｂ精製および構造解析データ
１．色および性状：白色粉末
２．分子式：Ｃ３３Ｈ５８Ｎ５Ｏ１６Ｐ２
３．マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  ８４２（Ｍ−Ｈ）−
４．１Ｈ  ＮＭＲスペクトル
重メタノール溶液中で測定した結果を表２に示す。
0003875024.tif 000007
５．溶解性：
可溶：中性の水、メタノール、ジメチルスルホキシド
不溶：ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム
６．高速液体クロマトグラフィー：
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０、内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍ（ワイエムシイ社製）
溶媒：アセトニトリルー２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝３５：６５
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍにおける紫外吸収
保持時間：６．１ｍｉｎ
ＥＭ  ２４８７Ｃ精製および構造解析データ
１．色および性状：白色粉末
２．分子式：Ｃ３３Ｈ５８Ｎ５Ｏ１６Ｐ２
３．マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  ８４２（Ｍ−Ｈ）−
４．１Ｈ  ＮＭＲスペクトル
重メタノール溶液中で測定した結果を表３に示す。
0003875024.tif 000008
0003875024.tif 000009
５．溶解性：
可溶：中性の水、メタノール、ジメチルスルホキシド
不溶：ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム
６．高速液体クロマトグラフィー：
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０、内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍ（ワイエムシイ社製）
溶媒：アセトニトリルー２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝３５：６５
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍにおける紫外吸収
保持時間：６．３ｍｉｎ
実施例２  Ｔａｔ阻害活性
（１）レポーター遺伝子の構築
Ｔａｔ活性を阻害する化合物をスクリーニングするために、ＴＡＲ領域を含むＨＩＶ  ＬＴＲからの転写が測定できるレポーター遺伝子を構築した。後藤らが報告したＴＮＦ−αプロモーターの後に分泌型アルカリフォスファターゼＰＬＡＰ、続いてＮｅｏ耐性遺伝子を含むＴＮＦ−αレポータープラスミドＴＮＦ−ａ−ＰＬＡＰ−ＰＧＫ−ｎｅｏ（Ｇｏｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：８６０（１９９６））のＴＮＦ−αプロモーターを含むＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより入手したｐＵＣ−ＢＥＮＮ−ＣＡＴのＨＩＶ  ＬＴＲおよび感染細胞由来配列を含むＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入してレポーター遺伝子ｐＰＧＫＦを構築した。
（２）Ｔａｔ発現遺伝子の構築
Ｔａｔの２ｎｄ．エクソンが細胞の染色体に組み込まれたＨＩＶ  ＬＴＲからの転写活性化に必要であるとの報告（Ｊｅａｎｇ  Ｋ．Ｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３３）：２４９４０（１９９３））があることから、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより入手したＴａｔ発現ベクターｐＳＶ２  Ｔａｔに２ｎｄ．エクソンの配列（Ｃｏｌｌｍａｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．６６（１２）：７５１７（１９９２））を付加した。配列番号１と配列番号２の合成オリゴヌクレオチドをアニール後、Ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社製）により伸長反応を行いＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ消化して、ｐＳＶ２  ＴａｔのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入しｐＳＶ２  Ｔａｔ−ｌｏｎｇを構築した。
（３）エレクトロポレーション法による遺伝子の導入
導入したい遺伝子配列を含む１０から４０μｇのＤＮＡを、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地中に懸濁した３×１０６から１×１０７のヒト白血病細胞ＣＥＭと混合し、４℃で１０分間放置した後、ジーンパルサー（バイオラッド社製）にて３００Ｖ，１０００μＦの条件で通電した。その細胞懸濁液を直ちに１０％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地（１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地）に希釈し、ＣＯ２インキュベータ中で培養した。
（４）アルカリフォスファターゼ活性の測定
被験溶液中のＦＣＳに含まれるアルカリフォスファターゼを失活させるために６５℃で２０〜３０分処理した。化学発光測定用の９６穴プレートに、被験溶液１０μｌ、炭酸バッファー（０．２８Ｍ  Ｍａ２ＣＯ３ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ１０．０，８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）５０μｌおよびルミステイン（住友金属社製）５０μｌを加え１時間室温で放置後、マイクロプレートルミノメーター  ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にて化学発光を測定した。
（５）レポーター細胞株の樹立
Ｔａｔ活性を阻害する化合物をスクリーニングするために、レポーター遺伝子を発現するレポーター細胞株を樹立した。レポーター遺伝子ｐＰＧＫＦをエレクトロポレーション法によりヒト白血病細胞ＣＥＭ細胞に導入した。ＣＯ２インキュベータ中で一晩培養した後、０．８ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地に懸濁し２４穴プレートで培養した。２週間後、細胞が増殖してきたウエルの培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性を測定し、活性のあるウエルからＰＬＡＰ産生細胞を限外希釈法にてクローニングした。
クローニングした細胞を増殖させた後、Ｔａｔ発現遺伝子の導入、およびＴＮＦによりＰＬＡＰ産生の高まるクローンを選択した。選択したレポーター細胞は継代培養してＴａｔ阻害活性の測定に使用した。
（６）ＭＴＴ法による生細胞の測定
９６穴プレートに培養した細胞に、７．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液２０μｌを加えＣＯ２インキュベータ中で２時間培養した。細胞を吸い込まないように１５０μｌの上清を除き、１００μｌの１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むイソプロパノールを加えてＭＴＴが還元されてできた色素（ホルマザン）を可溶化した。各ウエルの５４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（バイオラッドＭｏｄｅｌ  ３５５０）を用いて測定し、生細胞の指標とした。
（７）細胞内で発現させたＴａｔに対するＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃ阻害活性
レポーター細胞にエレクトロポレーション法によりＴａｔ発現遺伝子ｐＳＶ２  Ｔａｔ−ｌｏｎｇ遺伝子を導入後、ＣＯ２インキュベータ中で培養した。また、Ｔａｔ発現遺伝子を導入しない細胞も同様に培養した。翌日、培養した細胞を１０００ｒｐｍ５分間の遠心で集め、１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地中に１．２５×１０５／ｍｌの濃度に調整して、細胞懸濁液とした。
被験検体はＤＭＳＯに溶解し、１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩで１００倍に希釈して検体希釈液を調整した。
９６穴プレートに、検体希釈液２０μｌ、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを含むあるいは含まない１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地２０μｌ、細胞懸濁液１６０μｌを加え、ＣＯ２インキュベータ中で２日間培養した。培養上清１０μｌを採取しアルカリフォスファターゼ活性を測定した。また、ＭＴＴ法にて検体の細胞毒性を測定した。
表４に培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性およびＭＴＴ法の吸光度を示した（括弧内は薬剤無添加のコントロールを１００％としたパーセント）。ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃは１０μｇ／ｍｌの濃度でＴａｔ発現遺伝子を導入しない細胞のアルカリフォスファターゼの産生には影響を与えず、細胞毒性も示さなかった。Ｔａｔ発現遺伝子の導入によりアルカリフォスファターゼの産生量は約２０倍に促進されたが、ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，ＣはＴａｔにより促進されたアルカリフォスファターゼの産生のみを抑制した。
また、ＴＮＦの存在下ではＴａｔ発現遺伝子導入および非導入細胞のアルカリフォスファターゼ産生は更に約３倍促進された。この場合においても、ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，ＣはＴａｔ発現遺伝子を導入しない細胞のアルカリフォスファターゼの産生には影響を与えず、Ｔａｔ発現遺伝子の導入により促進されたアルカリフォスファターゼの産生のみを抑制した。
（８）細胞外から供給したＴａｔに対するＥＭ  ２４８７Ａの阻害活性
レポーター細胞に無血清培地中２μｇ／ｍｌのＴａｔ（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製），１ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｔｏｌ，１００μＭ  Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎの存在下で２時間培養し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心後１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベータ中で培養した。また、Ｔａｔ非存在下で同様に処理した細胞も培養した。翌日、培養した細胞を１０００ｒｐｍ  ５分間の遠心で集め、１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地中に１．２５×１０５／ｍｌの濃度に調整して、細胞懸濁液とした。
９６穴プレートに、検体希釈液２０μｌ、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを含むあるいは含まない１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地２０μｌ、細胞懸濁液１６０μｌを加え、ＣＯ２インキュベータ中で２日間培養した。培養上清１０μｌを採取しアルカリフォスファターゼ活性を測定した。また、ＭＴＴ法にて検体の細胞毒性を測定した。
細胞外からＴａｔを供給することによりアルカリフォスファターゼの産生量は約３０倍に促進された。また、ＴＮＦ存在下ではアルカリフォスファターゼ産生は更に約３倍に促進された。表４に培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性およびＭＴＴ法の吸光度を示した（括弧内は薬剤無添加のコントロールを１００％としたパーセント）。ＴＮＦの存在非存在にかかわらず、ＥＭ  ２４８７Ａは１０μｇ／ｍｌの濃度でＴａｔを供給しない細胞のアルカリフォスファターゼの産生には影響を与えず、Ｔａｔ発現遺伝子の導入により促進されたアルカリフォスファターゼの産生のみを抑制した。無処置（Ｎｏｎｅ  Ｔｒｅａｔ）とともに表４に結果を示した。
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実施例３  Ｍｏｌｔ−４急性感染系におけるＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃの抗ＨＩＶ活性
ヒト白血病細胞Ｍｏｌｔ−４にＨＩＶ−１  ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株を感染させた。ＨＩＶ感染細胞および非感染細胞１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを種々の濃度の薬剤とともに３７℃にて培養し、４日後に同じ濃度の薬剤を含む培養液にて１：５に希釈した。培養開始から７日目にＭＴＴ法にて生細胞数を測定し、ＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，Ｃの細胞傷害抑制活性（抗ＨＩＶ活性）と細胞毒性の判定を行った。
薬剤無添加のＨＩＶ非感染細胞の生細胞数を１００％とし、薬剤無添加のＨＩＶ感染細胞の生細胞数を０％として、ＨＩＶ感染細胞に対して５０％の細胞傷害抑制活性を示す薬剤濃度ＥＣ５０を求めた。
薬剤無添加の非感染細胞培養中の生細胞数を１００％とし、培地のみの中の生細胞数を０％として、非感染細胞に対して５０％の細胞傷害活性を示す薬剤濃度ＣＣ５０を求めた。
表５に示すようにＥＭ  ２４８７Ａ，Ｂ，ＣはＭｏｌｔ−４急性感染系において、ＨＩＶ増殖において抗ＨＩＶ活性を示した。表には、５０％細胞傷害抑制濃度（ＥＣ５０（μＭ））、５０％細胞傷害濃度（ＣＣ５０（μＭ））、選択係数（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を示した。
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実施例４  ＭＴ−４急性感染系におけるＥＭ  ２４８７Ａの抗ＨＩＶ活性
ヒト白血病細胞ＭＴ−４にＨＩＶ−１  ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株を感染させた。ＨＩＶ感染細胞および非感染細胞１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを種々の濃度の薬剤とともに３７℃にて培養した。培養開始から４日目にＭＴＴ法にて生細胞を測定し、薬剤添加による細胞傷害抑制活性（抗ＨＩＶ活性）と細胞毒性の判定を行った。
表６に示すようにＲｏ  ２４−７４２９はＭＴ−４急性感染系において効果を示さなかったが、ＥＭ  ２４８７Ａには抗ＨＩＶ活性が認められた。
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実施例５  ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）急性感染系におけるＥＭ  ２４８７Ａの抗ＨＩＶ活性
ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ  １×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにＨＩＶ−１  ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株を感染させ、種々の濃度の薬剤とともに３７℃にて培養した。培養開始から６日目にＥＬＩＳＡによりｐ２４抗原を測定してＨＩＶ量を定量するとともに、ＭＴＴ法にて生細胞を測定し、薬剤添加によるＨＩＶ産生抑制活性（抗ＨＩＶ活性）と細胞毒性の判定を行った。
薬剤無添加のｐ２４抗原量を１００％とし、５０％のＨＩＶ増殖抑制活性を示す薬剤濃度ＥＣ５０を求めた。
表７に示すようにＥＭ  ２４８７ＡはＰＢＭＣ急性感染系において抗ＨＩＶ活性が認められた。
実施例６  ＯＭ１０．１持続感染系における抗ＨＩＶ活性
ＨＩＶ−１が感染した前骨髄球ＯＭ１０．１細胞  １×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを種々の濃度の薬剤にて２時間前処理し、その後１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αにて刺激、さらに薬剤存在下にて培養を続けた。培養開始から３日目にＥＬＩＳＡによりｐ２４抗原を測定してＨＩＶ量を定量するとともに、ＭＴＴ法にて生細胞を測定し、薬剤添加によるＨＩＶ産生抑制活性（抗ＨＩＶ活性）と細胞毒性の判定を行った。
表７に示すようにＥＭ  ２４８７ＡはＯＭ１０．１持続感染系において抗ＨＩＶ活性が認められた。
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本発明により、これまで実用化されているヌクレオシドおよび非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤・プロテアーゼ阻害剤に加え、ＡＩＤＳ治療の第三の手段を提供することが可能となる。
逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤と併用することで、ＨＩＶ増殖を更に抑制することが期待されることから、耐性ウイルスの出現を遅らせるために使用することができる。特に、作用点が異なり耐性が交叉しないことから、ヌクレオシド系及び非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤に対して耐性を獲得してしまったＨＩＶに感染している患者に有用である。
【配列表】
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