(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするシクロスポリンおよびＦＫ５０６から選択される免疫抑制剤による副作用の軽減剤。
【請求項２】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするシクロスポリンによる副作用の軽減剤。
【請求項３】
副作用が多臓器的又は全身的であることを特徴とする請求項１又は２に記載の副作用の軽減剤。
【請求項４】
副作用が胃腸障害又は神経障害であることを特徴とする請求項１又は２に記載の副作用の軽減剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、免疫抑制剤による副作用の軽減剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）を有効成分とし、免疫抑制剤による副作用を緩和し得る副作用の軽減剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、自己免疫疾患や悪性腫瘍の治療、臓器移植における移植片拒絶反応の抑制などに免疫抑制剤が使用されている。免疫抑制剤は、過剰に起こっている免疫応答を抑制する薬剤であり、その免疫抑制の特異性により、非特異的免疫抑制剤と特異的免疫抑制剤に大別される。
非特異的免疫抑制剤としては、例えば、副腎皮質ホルモン（例えば、コルチゾン、デキサメタゾン等）、代謝拮抗剤（例えば、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート等）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ブスルファン等）、アルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン等）、抗生物質（例えば、シクロスポリンＡ及びＧ、ＦＫ５０６、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン等）などが挙げられる。また、特異的免疫抑制剤としては、例えば、抗リンパ球グロブリン、リンパ球表面に発現されている各種抗原に対するモノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体等）などが挙げられる。
上記の免疫抑制剤において、シクロスポリン及びＦＫ５０６は強い免疫抑制作用を有し、腎臓、肝臓、心臓、膵臓などの臓器移植における移植片拒絶反応の抑制にすばらしい成績を収めており、注目されている薬剤である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、多くの免疫抑制剤が使用されているが、何れの薬剤も副作用を有しており、例えば、骨髄抑制、白血球減少、血小板減少、重症感染症、肝障害、腎障害、神経障害、肺障害、胃腸障害、食欲不振、悪心、嘔吐、下痢、貧血、口内炎、脱毛、起毛、皮膚色素沈着、血圧低下、不整脈、発熱、痙攣、不妊症、無精子症、倦怠感など、多臓器的又は全身的な副作用が報告されている。このように、現在用いられている免疫抑制剤は副作用が強く、その投与量に制約があるとともに使用に際しては細心の注意を払う必要があるという問題がある。
より具体的には、骨髄抑制の強い免疫抑制剤は、白血球減少症を起し、重症感染症を発症し易く、その投与量を制限せざるを得ない。そのため、臓器移植においては急性拒絶反応が発症し易く、機能不全に陥ることが多かった。臓器移植後の急性拒絶反応の発症率を著しく低減できることから、臓器移植の際に汎用されるシクロスポリンは、骨髄抑制の出現頻度が少ないため、白血球減少症に伴う重篤な感染症の発症を防止でき、臓器移植後の管理が容易になるという利点を有し、この効果からも臓器移植の成績を著しく向上させることが可能になった。
【０００４】
しかし、シクロスポリンにおいても副作用は認められ、例えば、腎毒性、肝毒性、神経障害、高血圧、大腿骨頭壊死、白内障、糖尿病、急性膵炎、サイトメガロウイルス感染症などが報告されており、その投与量が制約される。特に、腎移植において、腎毒性に基づく腎障害は、移植腎の予後に重大な影響を及ぼすのみならず、移植後早期においては、移植後の急性拒絶反応に起因する腎機能不全との識別が困難であることが問題となる。そのため、血中シクロスポリン濃度を常にモニタリングし、投与量を注意深くコントロールすることが不可欠であり、シクロスポリンの副作用が認められたら投与量を減少するか投与を中止せねばならず、副作用に対する移植後管理が必要がある。
なお、カルシウム-チャンネル ブロッカーやプロスタグランジンが、シクロスポリンに起因する腎毒性を防止する上で有用であるとの報告もされている(Transplantation 51, 293-295, 1991; Clin. Nephrol 25 [suppl.1], S89-S94, 1986)。しかし、これらの薬剤は効果が十分でなく、更に多臓器的又は全身的な副作用を抑制することはできない。
【０００５】
上述のように、現在用いられている免疫抑制剤は重篤な多臓器的又は全身的副作用を有しており、そのため用法及び用量に多くの制限があり、免疫抑制剤の多臓器的又は全身的副作用を著しく低減し得る薬剤が強く求められている。
本発明者は、上記の問題を解決するため、免疫抑制剤の副作用を軽減し得る薬剤について鋭意検討した結果、ＨＧＦが免疫抑制剤の多臓器的又は全身的副作用を著しく低減し得ることを見出した。
より詳細には、ＨＧＦは、本発明者らが再生肝ラット血清中から成熟肝実質細胞をin vitroで増殖させる因子として見出した蛋白質である（Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450, 1984）。本発明者らは更に、ＨＧＦをラット血小板より単離することに成功し（Proc. Natl. Acad. Sci, 83, 6489, 1986, FEBS Letters, 22, 311, 1987）、そのアミノ酸配列を一部決定した。さらに、本発明者らは解明されたＨＧＦアミノ酸配列をもとにヒト及びラット由来のＨＧＦｃＤＮＡクローニングを行い、このｃＤＮＡを動物細胞に組換え技術により導入してＨＧＦを蛋白質として得ることに成功した（ヒトＨＧＦ：Nature, 342, 440, 1989；ラットＨＧＦ：Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 3200, 1990）。
【０００６】
肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見されたＨＧＦは、本発明者をはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で種々の生理活性を示し、種々の臓器・組織の傷害治癒に働いている因子であることが明らかとなり、研究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。
このようなＨＧＦの作用からして、本発明者はＨＧＦが免疫抑制剤による副作用の軽減に有用であろうと思料し、免疫抑制剤の副作用に対するＨＧＦの効果を検討したところ、ＨＧＦは免疫抑制剤による多臓器的又は全身的な副作用を著しく軽減し得ることが判明した。免疫抑制剤による副作用の軽減にＨＧＦが有効であることは新たな知見であり、従来知られていなかったＨＧＦの作用である。
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は免疫抑制剤による副作用を緩和し得る副作用の軽減剤（以下、便宜上、副作用軽減剤という）を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の副作用軽減剤は、ＨＧＦを有効成分として含有することからなり、特に抗生物質系免疫抑制剤による副作用の軽減に顕著な効果を奏する。
上記の構成からなる本発明の有効成分であるＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られており、例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞など）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００８】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００９】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００１０】
上記のＨＧＦは、後記実施例に示されるように、免疫抑制剤による多臓器的又は全身的な種々の副作用を軽減することができ、より具体的には、腎毒性、肝毒性、胃腸疾患（例えば、食欲不振、下痢等）、神経障害（例えば、脱力状態、イライラ、痙攣等）及び臓器の傷害を防止でき、また臓器の修復を促進し、更に副作用による死亡率を低減することができる。
ＨＧＦの作用する細胞は、例えば、肝細胞、腎尿細管上皮細胞、肺胞上皮、胃粘膜上皮、血管上皮、皮膚ケラチノサイトなど、極めて広範囲の臓器・組織に及んでいる。従って、ＨＧＦは、免疫抑制剤による多臓器的又は全身的な副作用を効果的に軽減することができる。
更に、ＨＧＦの医薬品としての実用性を考える上でさらに重要な点は、ＨＧＦは動物に長期間投与しても殆ど副作用が認められないことである。また、ＨＧＦがＧ１期、すなわち増殖期に入った細胞のみを増殖促進し、Ｇ０期、すなわち静止期にある細胞には作用しないことも大きな特長である。このことは、傷害のある組織の増殖再生は促進するが、傷害を受けていない組織に対しては全く作用を及ぼさないことを意味する。従って、過剰にＨＧＦを投与しても、あるいは血液などを介して非患部にＨＧＦが到達しても、正常組織にガン化を誘導したり過剰な増殖を起こすことがないと考えられる。
【００１１】
本発明の副作用軽減剤は、ヒトをはじめとする哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）における、前述の非特異的免疫抑制剤及び特異的免疫抑制剤による副作用の軽減に適用され、特にシクロスポリン、ＦＫ５０６、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン等の抗生物質系免疫抑制剤による副作用の軽減に顕著な効果を示す。また、上述のように、ＨＧＦの作用は広範囲の臓器・組織に及ぶので、局所的な副作用軽減を超えた多臓器的又は全身的な副作用軽減を図ることができる。
【００１２】
本発明の副作用軽減剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体と共に経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１３】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１４】
本発明の副作用軽減剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の副作用軽減剤の有効成分であるＨＧＦは、免疫抑制剤による副作用を著しく軽減することができる。特に、ＨＧＦの作用は広範囲の臓器・組織に及ぶので、局所的な副作用軽減を超えた多臓器的又は全身的な副作用軽減を図ることができる。従って、本発明によれば、副作用に起因する免疫抑制剤の用法・用量の制約が少なくなり、免疫抑制剤が用いられる各種疾患の治癒率及び臓器移植の成功率を向上させることができると共に患者の負担を著しく軽減することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、試験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
なお、試験例で使用したヒト組換体ＨＧＦ（以下、ｈｒ−ＨＧＦという）は、ヒト組換体ＨＧＦ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清から精製したものを用いた(Nakamura et al., Nature 342, 440-443, 1989; Seki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172, 321-327, 1990)。
【００１７】
試験例１
シクロスポリンの副作用に対するＨＧＦの軽減作用を下記の方法で試験した。
１．方法
まず、本試験の実験計画を図１に示した。急性臓器不全は、ＩＣＲマウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ（以下、ＣｓＡという）を毎日腹腔内投与することにより作成した。ｈｒ−ＨＧＦ（１回１匹当り５μｇ）又はコントロールとしての生理食塩水（０．１ｍｌ）は、最初のＣｓＡ投与の３０分前及びその後は１２時間おきに尾静脈より投与した。図１において、上記薬剤の投与時は黒三角印（ＣｓＡ）及び白三角印（ｈｒ−ＨＧＦ／生理食塩水）で示した。
また、マウスは、最初のＣｓＡ投与後６０時間及び１０８時間後に犠牲死させ、血液検査、病理組織検査及び臓器修復検査に供した。図１において、犠牲死は星印で示した。
【００１８】
２．結果
▲１▼生存率
試験マウスの生存率を図１の下図に示した。コントロール群では、３日間生存したマウスは８３．３％であり、５日間生存したマウスは５０％であった。それに対して、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では全例生存した。この２群間の生存率には、logrank testにおいて５％の危険率で有意差があった。
このように、ｈｒ−ＨＧＦの投与は、ＣｓＡにより急性臓器不全を起したマウスの生存を著しく延長することが判明した。
【００１９】
▲２▼徴候及び症状
ｈｒ−ＨＧＦ投与群及びコントロール群のマウスの徴候及び症状の概要を表１に示した。コントロール群においては、ＣｓＡ投与１日目より全例に、中程度から重症な下痢が認められた。また、起毛、運動機能減少及び脱力状態は、一時的な過剰運動に引き続き殆どのマウスで同時に認められた。その後、摂餌しなくなり、何匹かのマウスは強度の痙攣を伴い死亡した。
一方、ｈｒ−ＨＧＦ処理群において、下痢はコントロール群に比べて軽症であった。また、脱力状態、起毛及び痙攣は認められず、摂餌も良好であり、活発な状態が維持された。
なお、体重変動については、コントロール群では５日間で初期体重の９３．６±９．６％に減少したが、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では１０２．５±３．０％に増加し、unpaired Wilcoxon testにて５％の危険率で有意差があった。
このように、ｈｒ−ＨＧＦの投与は、ＣｓＡによる副作用の徴候及び症状を緩和し得ることが判明した。
【００２０】
【表１】
0003962097.tif 000002
【００２１】
▲３▼血液検査
コントロール群においては、ＧＰＴ(Glutamate pyruvate transaminase)値及び総ビリルビン値の僅かな上昇が認められ、若干の肝障害を起していた。血中尿素窒素値及び血中クレアチニン値についは、コントロール群とｈｒ−ＨＧＦ処理群との間には統計的に有意な差は認められなかった。
【００２２】
▲４▼病理組織学的所見
上記のように、血中尿素窒素値及び血中クレアチニン値についは、コントロール群とｈｒ−ＨＧＦ処理群との間には統計的に有意な差は認められなかったが、組織学的には差異が認められた。コントロール群においては、全マウスについて３日目に、近位尿細管における広範囲な弱から中程度の空胞化が認められ、この変化は５日目まで生存した３匹のマウスにおいても認められた。
一方、ｈｒ−ＨＧＦ処理群においては、弱い空胞化が３日目には５匹の内の４匹に認められたが、５日目になると組織学的には局所性のわずかな尿細管壊死が２匹のマウスに認められた以外は、腎臓は正常であった。
また、中程度から重症の空胞形成及び巣状細胞の変化については表２に示す。
上記及び表２の結果に示されるように、ｈｒ−ＨＧＦの投与は、ＣｓＡによる臓器不全を防止し得ることが判明した。
【００２３】
【表２】
0003962097.tif 000003
【００２４】
▲５▼臓器修復検査（ＤＮＡ合成）
ＨＧＦが腎臓及び肝臓の修復を促進しているかを検討するため、ＢｒｄＵ(5-bromo-2'-deoxyuridine)をマウスに取り込ませ、続いてＢｒｄＵ特異的な免疫組織染色法で腎臓及び肝臓を染色することにより、腎臓及び肝臓におけるＤＮＡ合成を測定した。その結果を表３に示す。
ＤＮＡ合成期の細胞の割合(ラベリング インデックス:labeling index)は、腎臓に関し、０．１４％から３日目のコントロール群では０．４％に上昇し、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では０．８８％にまで上昇した。
また、肝臓に関して、コントロール群のラベリング インデックスは３日目において０．１％以下であり、この値は正常マウスの値と略同じであった。一方、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では０．５５％にまで上昇した。これはunpaired Wilcoxon testにて５％の危険率で有意差があった。
このように、ｈｒ−ＨＧＦ処理群ではラベリング インデックスの上昇が認められ、ＤＮＡ合成が活発に行われており、腎臓及び肝臓の修復が促進されていることが明らかとなった。
なお、ラベリング インデックスの測定は、Ishikiらの方法(Hepatology 16, 1227-1235, 1992)により行った。
【００２５】
【表３】
0003962097.tif 000004
【００２６】
実施例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００２７】
実施例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００２８】
実施例３
注射用蒸留水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、ソルビトール２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１における実験計画及びマウスの生存率（％）を示す図である。
【図１】
0003962097.tif 000005