(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
0003890537.tif 000007
〔式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子またはＳＯ3Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３である。〕で表されるＮ−アセチルノイラミン酸又はそのホモポリマーの硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項２】
有効成分が下記式（Ｉ）
【化２】
0003890537.tif 000008
〔式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子またはＳＯ3Ｈを示し、ｎは４〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３である。〕で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩である請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
下記式（Ｉ）
【化３】
0003890537.tif 000009
〔式中、Ｒは前記に同じ。ｎは４〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３である。〕で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするセレクチン阻害剤。
【請求項４】
下記式（Ｉ）
【化４】
0003890537.tif 000010
〔式中、Ｒは前記に同じ。ｎは４〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３である。〕で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＰ−セレクチン阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗炎症剤、セレクチン阻害剤、癌転移抑制剤及び虚血−再潅流障害治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セレクチンファミリー（Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン）は、脈管系において糖鎖をリガンドとする細胞接着受容体分子であり、炎症、癌転移（sialyl Lewisx抗原と反応するため） と密接な関係がある。
【０００３】
セレクチンファミリーに対するリガンドとしては、スルファチド及びその硫酸基の位置置換異性体が知られている（脂質生化学研究、第３７巻、１９９５年；International Immunology, Vol.7, No.7, pp1107-1113, 1995）。しかしながら、スルファチド及びその異性体は、入手が非常に困難な物質であるという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なセレクチン阻害剤、抗炎症剤、癌転移抑制剤及び虚血−再潅流障害治療剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸、コロミン酸等のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル及びコロミン酸が、いずれもセレクチン阻害剤として有用であり、癌転移抑制剤及び虚血−再潅流障害治療剤としての薬効が期待できること、さらに前記硫酸エステルが抗炎症剤として有用であることを見出した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下のセレクチン阻害剤及び抗炎症剤を提供するものである。本発明のセレクチン阻害剤は、Ｐ−セレクチン及びＬ−セレクチンの白血球、腎の遠位尿細管上皮細胞等の各種セレクチン結合細胞に対する結合阻害活性を有し、セレクチンの作用を阻害する。
【０００７】
本発明のセレクチン阻害剤及び抗炎症剤は、ヒト及び哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等に有用である。
【０００８】
項１．  下記式（Ｉ）
【０００９】
【化４】
0003890537.tif 000002
【００１０】
〔式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子またはＳＯ3Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３である。〕
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸又はそのホモポリマーの硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。
【００１１】
項２．  下記式（Ｉ）
【００１２】
【化５】
0003890537.tif 000003
【００１３】
〔式中、Ｒ、前記に同じ。ｎは３〜１０００の整数を示す。但し、ｎが３〜１１の場合にはＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３であり、ｎが１２以上の場合には、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０〜３である。〕
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーまたはその硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするセレクチン阻害剤。
【００１４】
項３．  下記式（Ｉ）
【００１５】
【化６】
0003890537.tif 000004
【００１６】
〔式中、Ｒ、前記に同じ。ｎは３〜１０００の整数を示す。但し、ｎが３〜１１の場合にはＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３であり、ｎが１２以上の場合には、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０〜３である。〕
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーまたはその硫酸エステル又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＰ−セレクチン阻害剤。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物を有効成分とする抗炎症剤において、ｎは１〜１０００、好ましくは１〜５００、より好ましくは１〜３００、特に４〜２００が挙げられる。
【００１８】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物を有効成分とする（Ｐ−）セレクチン阻害剤において、ｎは３〜１０００、好ましくは３〜５００、より好ましくは３〜３００、特に４〜２００が挙げられる。
【００１９】
本発明の（Ｐ−）セレクチン阻害剤は、ｎが１２以上、好ましくは５０以上の場合、硫酸エステルとなっていなくても阻害剤として働くが、硫酸エステルの方が阻害活性が高まるため好ましい。
【００２０】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物において、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子当たりのＳＯ3Ｈ残基の数は０．１〜３、好ましくは０．３〜２、より好ましくは０．３〜１．５、特に０．５〜１．５である。
【００２１】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルを有効成分とする抗炎症剤は、ｎが１種のみの単一化合物であってもよく、また、１〜１０００の範囲内でｎの値が異なる複数のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物であってもよい。
【００２２】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルを有効成分とする（Ｐ−）セレクチン阻害剤は、ｎが１種のみの単一化合物であってもよく、また、３〜１０００の範囲内でｎの値が異なる複数のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル、ｎが１２以上のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は公知であり、例えば国際公開ＷＯ９４／１７１２３号公報に記載の方法に従い、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー１重量部に対し、溶媒（ＤＭＦ，ＤＭＳＯ等）の存在下又は不存在下に触媒（ピリジン、トリエチルアミン等）０．５〜２００重量部、硫酸化剤（サルファトリオキシド・ピリジン、サルファトリオキシド・トリメチルアミン、クロロスルホン酸、ピペリジン硫酸等）０．２〜３０重量部と、０〜９０℃で０．２〜１００時間程度反応させることにより、目的とするＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルが得られる。硫酸化反応後は、公知の精製方法（濃縮、ゲル濾過、イオン交換等の各種クロマトグラフィー、再沈殿、透析等の精製方法に従い精製することができる。
【００２４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーは、重合度（ｎ）が一定数のホモポリマーを用いてもよく、コロミン酸のような天然のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物を用いても良い。
【００２５】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【００２６】
本発明の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル又はその塩並びに薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、抗炎症剤、セレクチン阻害剤、癌転移抑制剤、虚血−再潅流障害治療剤として有用である。該医薬組成物は、特に限定されるものではないが、例えば注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤等の種々の形態で用いることができる。
【００２７】
抗炎症作用としては、具体的には、肺炎、潰瘍、静脈炎、動脈炎、慢性関節リウマチ、成人性呼吸切迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性脳・心臓疾患、アトピー性皮膚炎、臓器移植後の浸潤などの炎症に対する作用が挙げられる。
【００２８】
癌転移に関しては、sialyl Lewisx抗原に関与する癌、例えば肺の小細胞癌、神経芽細胞腫の癌の転移抑制に効果が期待できる。
【００２９】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルを有効成分とする医薬組成物を注射剤として調製する場合、添加剤としては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などが挙げられ、これらを適当に配合することにより、注射剤用製剤とすることができる。該製剤は、静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内に投与される。
【００３０】
本発明の医薬組成物を経口剤として調製する場合の添加剤としては、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤等が挙げられる。
【００３１】
本発明の医薬組成物を坐剤として調製する場合の添加剤としては、基剤、界面活性剤などが挙げられる。
【００３２】
本発明の医薬組成物を軟膏剤として調製する場合の添加剤としては、基剤、界面活性剤等が挙げられる。
【００３３】
上記の各種製剤中に配合される有効成分である本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルの量は、投与すべき患者の年齢、性別、体重、症状などにより変動するが、一般的には、ヒト成人に対する１投与単位当たり、経口剤では１〜１００ｍｇ程度、注射剤では０．１〜２０ｍｇ程度、坐剤では１〜５０ｍｇ程度であるのが好ましく、ヒト成人１日当たりの投与量としては、剤型によって異なるが、１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜２００ｍｇ程度である。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルは、優れたセレクチン阻害剤作用、抗炎症作用及び癌転移抑制作用であり、かつ、細胞毒性も低いため、セレクチン阻害剤、抗炎症剤として有用である。また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルは、癌転移抑制剤としても有用である。さらに、長期投与にも使用し得るものである。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
【００３６】
参考例１
Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルの製造
コロミン酸（購入先：ナカライテスク株式会社）９０ｍｇをジメチルホルムアミド２０ｍｌに入れ、ここに４７７ｍｇのサルファトリオキシド・ピリジン錯体及び３７ｍｇのジメチルアミノピリジンを加え、３０℃にて２４時間撹拌した。その後、氷冷し、これを１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍｌに滴下した。濾過により固形物を分離し、透析チューブ（ＶＩＳＫＡＳＥ  ＳＡＬＥＳ  ＣＯＲＰ．製、孔の直径：２４オングストローム）を用いて透析を行った。透析後、ナトリウムイオン型のイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、オルガノ株式会社製）カラムに通した。カラム流出液を減圧下で５ｍｌにまで濃縮した。濃縮液を凍結乾燥させ、１２６ｍｇの目的物を得た。得られたコロミン硫酸エステルは、ｎ（平均値）＝５０（ＨＰＬＣを用いたゲル濾過により測定された平均分子量から求めた）であった。
【００３７】
また、ロジゾン酸法(rhodizonic acid method)〔アナリティカル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.), 41, 47 (1971)〕で測定した結果、該コロミン酸硫酸エステルのＮ−アセチルノイラミン酸１分子当たりの硫酸エステル基の数は、１．１であった。
【００３８】
参考例２
コロミン酸（購入先：ナカライテスク株式会社）９０ｍｇに対し７１５ｍｇのサルファトリオキシド・ピリジン錯体及び５６ｍｇのジメチルアミノピリジンを加え、３０℃にて４８時間撹拌した以外は、参考例１と同様にして、ｎ（平均値）＝５０（ＨＰＬＣを用いたゲル濾過により測定された平均分子量から求めた）、Ｎ−アセチルノイラミン酸１分子当たりの硫酸エステル基の数＝１．６のコロミン酸硫酸エステルを得た。
【００３９】
参考例３〜８
原料のコロミン酸に代えて、Ｎ−アセチルノイラミン酸の１〜６量体を用いた他は、参考例１と同様にして、表１及び表２に示す各々の硫酸エステルを得た。
【００４０】
実施例１
(1)  コブラ毒素(CVF)投与ラットにおける肺炎モデルに対する治療作用
特定の病原体に感染していないロング−エバンス(Long-Evans)ラット（雄性、250-300g）を使用した。コブラ毒（ＣＶＦ）はコブラ(Naja naja)粗製毒からTillら、J. Clin. Invest., 69, 1126-1135 (1982)の記載に従って調製した。体重１kg当たり２０ＵのＣＶＦを125Ｉ−ＢＳＡ（０．５μＣｉ）の一定量と共にラットの静脈内に注射した。
【００４１】
ＣＶＦ注入３０分後にラットを塩酸ケタミン（１００mg/kg）（Paeke Davis and Co.)で麻酔し、背部大動脈から採血した。ネガティブ・コントロールは、ラットにＣＶＦに代えてリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を使用する以外は上記と同様に処理して作成した。３０分ごとに肺の血管系をＰＢＳ１０mlを用い、右心室を介して潅流した。次に、肺を摘出し、滅菌生理食塩水１０ｍｌで上記血管系を潅流し、次いで組織内に残存する放射線量をガンマシンチレーションカウンターで測定した。なお、ポジティブ・コントロールは、被検物質を投与しなかった場合の測定値である。
【００４２】
肺の損傷を、肺血管透過性の増大（死亡時に得た静脈の血液１ｍｌ中に存在する放射能量に対する肺組織内に存在する125Ｉ−ＢＳＡ放射能量の比）を求めることによって特定した。肺損傷の防護は下記式により算出した。
【００４３】
防護率（％）＝１００×〔被検物質値−ネガティブコントロール(PBS)値〕／〔ポジティブコンントロール−ネガティブコントロール(PBS)値〕
（２）組織ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性
好中球浸潤の指標として、組織のＭＰＯ活性を測定した。グリコゲン刺激ラットの一定数の腹腔内好中球を正常なラットの肺に加え、組織をホモジナイズし、次いで抽出した後、標準曲線を作成した(Warrenら、J. Clin Invest., 84, 1873-1882 (1989))。
【００４４】
肺サンプルを、緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．０）６ｍｌを用い、ホモジナイザー（Polytron: Tekmer Co.）を４に設定し、４×１０秒ホモジナイズし、次いで４℃で遠心（３０００ｇ、３０分）した。上澄液中のＭＰＯ活性を、ｏ−ジアニシジンの存在下でＨ2Ｏ2の消費からもたらされる吸収度（４６０ｎｍ）の変化を測定することによって評価した。各種の被検物質を上記（１）のＣＶＦを投与する直前に各々１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した場合の結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0003890537.tif 000005
【００４６】
”硫酸化度”は、Ｎ−アセチルノイラミン酸１分子当たりの硫酸基の数を示す。
【００４７】
(2)  Ｐ−セレクチン−Ｉｇ結合の阻害(IC50)作用
Ｐ−セレクチン（ヒト由来）は、Watanabe T., Song Y., Hirayama, Y., Tamatani T., Kuida K., Miyasaka M., Biochem. Biophys. Acta, 1131, 321-324 (1992) に記載の方法に従い調製した、遺伝子工学的に調製したセレクチン細胞外ドメインとヒトＩｇＧとのキメラ蛋白質（以下、"P-セレクチン-IgG"と略す）を用いた。
【００４８】
一定量のP-セレクチン-IgGの存在下に、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はそのホモポリマーの硫酸エステルの濃度を増加させて、該硫酸エステルによるP-セレクチン-IgGと白血球の結合阻害作用を観察した。P-セレクチン-IgGの白血球に対する結合は、フィコエリトリンをヒトＩｇＧのＦｃ領域に複合体化させた抗体を用い、フローサイトメトリック分析(flow cytometric analysis)により測定した。前記硫酸エステルとして、参考例６で得たＮ−アセチルノイラミン酸四量体の硫酸エステル（硫酸化度＝１．１）を用いた結果を図１に示す。また、参考例１〜５、７、８の硫酸エステルについての結果を表２に示す。なお、ＩＣ50は、白血球に対する結合を５０％阻害するP-セレクチン-IgGの濃度である。
【００４９】
【表２】
0003890537.tif 000006
【００５０】
表１の結果から、各種重合度及び硫酸化度のＮ−アセチルノイラミン酸の硫酸エステルは、抗炎症作用（CVD肺炎モデルの炎症抑制）及びＰ−セレクチン阻害剤としての作用に優れており、セレクチン阻害剤、Ｐ−セレクチン阻害剤、抗炎症剤として有用であることが明らかになった。また、癌転移、虚血−再潅流障害は、セレクチンと密接に関連することが明らかになっていることから、セレクチンと選択的に結合する本発明のセレクチン阻害剤は、癌転移抑制剤及び虚血−再潅流障害治療剤としても有用であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ−アセチルノイラミン酸四量体の硫酸エステルのＰ−セレクチンに対する阻害率を示す。
【図１】
0003890537.tif 000011