(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシの未分化細胞をドナー細胞とし、同細胞を同一のミトコンドリアＤＮＡを持つレシピエント卵子へ核移植することにより作成した８細胞以上に分割したクローン胚であって胞胚腔を形成する前のものを集合培養し、単一のウシ胚として発育させることを特徴とするクローンウシの生産方法。
【請求項２】
ウシの分化細胞をドナー細胞とし、同細胞を同一のミトコンドリアＤＮＡを持つレシピエント卵子へ核移植することにより作成した８細胞以上に分割したクローン胚であって胞胚腔を形成する前のものを集合培養し、単一のウシ胚として発育させることを特徴とするクローンウシの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核移植技術と細胞集合（アグリゲーション）法を併用したクローンウシの生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、胚操作技術は非常にめざましい発展をとげている。中でも核移植技術は、経済的価値の高い同一の遺伝形質を有する個体を多数生産できる、クローン生産技術として、国内外で広く研究が進められ、めざましい発展をとげている。
【０００３】
すなわち、まず、家畜での最初の核移植は、Ｗｉｌｌａｄｓｅｎによりドナー細胞にヒツジの受精卵を用いて行われた（Ｎａｔｕｒｅ，３２０，６３−６５，１９８６）。ついで、英国ロスリンのグループは、ヒツジ胚由来の培養細胞からクローン羊を作出し、（Ｎａｔｕｒｅ，３８０，６４−６６，１９９６）、さらにヒツジの乳腺細胞を用いて、クローン羊を作出（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０−８１３，１９９７）することにより、ドナー細胞の未分化性は必須でないことを明らかにした。
【０００４】
そして、１９９８年には、ウシ、マウスでのクローン作出が報告され、哺乳動物において核移植技術を用いれば、生体の体細胞を用いて個体を発生させることができるという種を越えた普遍的事実が確定され、今日に至っている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の核移植技術にあっては、未分化及び分化細胞からのクローンウシを生産することは可能であるが、作成された核移植胚からのクローン産子の作出効率が極めて低いという問題がある。
【０００６】
これは、生体由来胚に比較して受胎率が低く、流産の発生率が高いことが主な原因である。特に、受胎率が低いのは、従来の核移植技術により作成された胚の細胞数が、同齢の生体由来胚に比較して少ないためである。このように胚の細胞数が少ないのは、レシピエント卵子の除核時に、核のみならずその周囲の細胞質を同時に除去し、また胚の再構築後も比較的長時間にわたり体外培養を行うためと考えられる。
【０００７】
本発明は、このような従来の問題を解決するためになされたもので、一胚あたりの胚細胞数を増加させて、受胎率ひいてはクローンウシの生産数増加につながる実用的なクローンウシの生産方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明が提供するクローンウシの生産方法は、次の（１）及び（２）に記載の方法である。
【０００９】
（１）ウシの未分化細胞をドナー細胞とし、同細胞を同一のミトコンドリアＤＮＡを持つレシピエント卵子へ核移植することにより作成した８細胞以上に分割したクローン胚であって胞胚腔を形成する前のものを集合培養し、単一のウシ胚として発育させることを特徴とするクローンウシの生産方法。
【００１０】
（２）ウシの分化細胞をドナー細胞とし、同細胞を同一のミトコンドリアＤＮＡを持つレシピエント卵子へ核移植することにより作成した８細胞以上に分割したクローン胚であって胞胚腔を形成する前のものを集合培養し、単一のウシ胚として発育させることを特徴とするクローンウシの生産方法。
【００１１】
本発明が提供するクローンウシの生産方法は、従来のキメラを作出する手法である細胞集合（アグリゲーション）法を応用することで、生体由来胚とほぼ同数の細胞数を持つ胚（核移植集合胚）を作出することを可能としたものである。
【００１２】
この生産方法によれば、図１に示すように、核移植技術により作成された胚を複数個集合し、１つの胚として発育させることでクローン胚を再構築し、体外で移植可能胚に発育させた後、仮親の子宮内に移植しクローンウシを作出することができる。
【００１３】
ここにいう細胞集合（アグリゲーション）法は、細胞質同士を密着させるだけであり、比較的容易に操作を行うことが可能であり、マニュピレーション装置等は必要としない。
【００１４】
この手法により作成された核移植集合胚によれば、実施例で明らかにしたように、高い受胎率を得ることができる。また、生産された個体の遺伝形質は、キメラではなく、クローンであることも実証できた。
【００１５】
本発明が対象とする動物はヒト以外の哺乳動物のうちのウシである。
【００１６】
ドナー細胞は、初期胚由来もしくは初期胚より樹立された胚性幹細胞など未分化細胞、胎仔由来もしくは生体から得られる分化細胞のいずれでもよく、特定の種類には限定されない。
【００１７】
ドナー細胞の培養は、それぞれの細胞に適合した公知の手法で行うことができる。
【００１８】
レシピエント卵子も通常の核移植手法に使用されるものでよい。しかし、生産されるクローンウシのミトコンドリアＤＮＡがキメラを示すことは避けたほうがよい。できるだけ同一個体の卵巣からのみ採取した卵子を利用するのが望ましい。
【００１９】
また、レシピエント卵子には、除核操作後確実に除核が確認されたもののみを用いる。ドナー細胞のレシピエント卵子への核移植は、公知の手法で行う。すなわち、細胞融合もしくは核の挿入により核の置換を行った後、活性化処理を施し胚の再構築を行う。
【００２０】
作成されたクローン胚（核移植胚）は、桑実胚までに透明帯を除去し、裸化した複数個の胚の細胞同士を集合し密着させる。このとき、集合に用いる胚は、適切な発育ステージにある、なるべく変性細胞の少ない形態的に良質な胚のみを選び出して利用する。
【００２１】
集合した胚は、１つの胚として胚盤胞期胚にまで発育することを確認し、仮親たる受胚動物に移植を行い、クローンウシを誕生させる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
【００２３】
【実施例】
以下に実施例のクローンウシの生産方法を工程順に説明する。
【００２４】
（１）と殺後の雌ウシから卵巣を速やかに摘出し、これを２５〜３０℃に保温したリンゲル液に入れて実験室へ持ち帰り、１９Ｇ注射針を用いて直径８ｍｍ以下の小卵胞から吸引法により未受精卵母細胞を採取した。
【００２５】
（２）採取した未受精卵母細胞の中から、実体顕微鏡による形態観察で卵丘細胞が緊密に付着したもののみを選抜し、これを２０％非働化子牛血清（ＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）添加Ｄ−ＰＢＳ（ＣＳＰＢＳ）で２回洗浄した後、５％非働化子牛血清添加ＴＣＭ１９９（ＣＳ１９９）に移して３回洗浄し、その後、６００μｌ当たり約８０個の割合で３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に移し、ＣＯ2インキュベーター内（３％ＣＯ2、９７％空気、３８．５℃）で、約２０〜２２時間の成熟培養を行った。
【００２６】
（３）成熟培養後の卵子をヒアルロニダーゼ（３３０ＩＵ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）で処理し、その中からパスツールピペットで卵丘細胞を除去し、第一極体の放出が確認できた卵細胞質の均一な卵子を選抜し、これをレシピエント卵子とした。
【００２７】
（４）ドナー細胞には、卵管由来の細胞を用いた。その細胞は、細胞数が３×１０6個／ｍｌとなるように、２０％非働化胎仔血清（ＦＢＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）添加ＤＭＥＭにて調整して３５ｍｍシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、ＣＯ2インキュベーター内（３％ＣＯ2、９７％空気、３９．５℃）で培養した。
【００２８】
（５）細胞がシャーレにてコンフルエントの状態まで発育したら、トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｇｉｂｃｏ）を用いてシャーレ表面から単離し、再び細胞数が３×１０6個／ｍｌとなるように、２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭにて調整し、同様に培養を行った。
【００２９】
この操作を４回から６回繰り返した後、細胞がコンフルエントの状態まで発育したら、０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭにて５日間の血清飢餓培養を行い、これを核移植に用いた。
【００３０】
（６）核移植操作は、まず、倒立顕微鏡下でマイクロマニュピレーターに取り付けたホールディングピペットとカッティングニードルを操作し、成熟培養を行ったレシピエント卵子の第一極体付近の透明帯を切開した。
【００３１】
（７）次に、切開済みの卵子を、ＣＳＰＢＳを媒液にして作成したサイトカラシンＢ（５μｇ／ｍｌ，ｓｉｇｍａ）に移し、極体とともにその近くの細胞質を透明帯外に押し出して除核処理を行った。
【００３２】
（８）押し出された細胞質は、ヘキスト３３３４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）にて染色し、ＵＶ励起により染色体の有無を確認した。このようにして除核が確認された卵子のみをその後の操作に供した。
【００３３】
（９）除核がなされたレシピエント卵子は、ＣＳ１９９に移し、その囲卵腔内にホールディングピペットとインジェクションピペットを用いてドナー細胞を挿入した。
【００３４】
（１０）成熟培養開始から約２４時間目に卵子とドナー細胞の融合操作を行った。融合液には修正ＺＦＭ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）を用い、ニードル型電極でレシピエント卵子とドナー細胞を挟み込み、融合機（ＥＣＭ２０００；ＢＴＸ）にて２３〜２４Ｖ−１７μｓｅｃ×２回／１５０μｍの条件で直流パルスを通電し、胚の再構築を行った。
【００３５】
（１１）融合処理が終了した融合卵子は、１０μＭＣａイオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳにて５分間、ＣＳ１９９を媒液にして作成したシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）にて６時間培養し、複合活性化処理を行った。
【００３６】
（１２）処理後、融合及び変性の有無を確認し、融合成功胚の発生培養を行った。発生培養は、５％非働化子牛血清添加ＣＲ１ａａ（ＣＳＣＲ１）により、５％ＣＯ２、９５％空気、３８．５℃の条件下で行った。発生培養開始後４８時間目に分割検査を行い、分割を行ったもののみの培養を継続した。
【００３７】
表１に核移植の成績を電気融合率及び分割率で示す。
【００３８】
【表１】
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（１３）融合後７２〜９６時間後に８細胞以上に分割した胚を選び、これをＤ−ＰＢＳを媒液にして作成したアクチナーゼＥ（５ｍｇ／ｍｌ，科研製薬）に約３０秒間浸漬し、膨化した透明帯を除去することで割球を裸化した。
【００３９】
（１４）裸化した割球を、細く引いたパスツールピペットで３胚同時に軽くピペッティングすることにより、割球同士を密着させた。
【００４０】
（１５）密着した胚は、オイルにてカバーした２０μｌのＣＳＣＲ１に移し、融合から７日間培養を継続した。
【００４１】
（１６）７日目に胞胚腔を確認した胚のみ発生胚とし、２０％ＦＢＳ及び１００μＭβメルカプトエタノール添加ＴＣＭ１９９（βＭＥ１９９）に移し、２４時間の培養を続けた。
【００４２】
表２に集合の有無を基準とする胚の発生率を示す。
【００４３】
【表２】
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表２は、分割した核移植胚を集合させれば、確実に移植可能な胞胚腔を形成する胚を得ることができることを示している。
【００４４】
（１７）培養後、２重染色により、内部細胞塊及び栄養膜細胞の細胞数を測定した。
【００４５】
表３にその細胞数を示す。比較のために、生体由来胚、体外受精胚、核移植胚についても示した。
【００４６】
【表３】
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表３から明らかなように、集合により作成された胚は、従来の核移植胚に比較し細胞数が増加し、生体由来胚と比較し遜色がないことが判る。
【００４７】
図２は、実施例の方法により作成された核移植集合胚と従来の方法により作成された核移植胚を示す。同図から明らかなように、実施例の方法により作成された胚は、形態的に細胞数が多く内部細胞塊が明瞭であり、良質な胚であると判断できる。
【００４８】
（１８）形態の良好な胚は、発情から８日目に同調した受卵牛へ移植を行った。
【００４９】
表４にその移植成績を示す。表４から明らかなように受胎率の向上に伴い、生存個体生産率も向上していることが分る。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、本来キメラを作出することを目的とする細胞集合（アグリゲーション）法を核移植技術と併用することによって、核移植により作成された胚を複数個集合培養するようにしたので、一胚あたりの胚細胞数を増加させて、受胎率の向上を図ることができ、したがって、クローンウシの生産数の増加を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係るクローンウシの生産方法を示す工程図
【図２】  実施例のクローンウシの生産方法によって作成された核移植集合胚を示す顕微鏡写真
【図３】  従来のクローンウシの生産方法によって作成された核移植胚の顕微鏡写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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