(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明部材の内部に分離流路が形成された電気泳動部材と、
前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、
前記分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、
前記分離流路内で分離された各成分による前記光の吸収又は発光を所定の範囲にわたって検出する光検出手段と、
前記光検出手段の検出信号を前記分離流路の各位置に対応させて記憶する検出信号記憶部と、
複数種類の等電点既知のマーカサンプルを両性電解質混合物を充填した前記分離流路に導入して分離する第一の分析を行ない、前記マーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点からｐＨと検出位置ｘとの関係を示すｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を算出するｐＨ勾配関数演算部と、
前記ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を記憶するｐＨ勾配関数記憶部と、
試料とともに複数種類のマーカサンプルを前記両性電解質混合物と同じ両性電解質混合物を充填した前記分離流路に導入して分離する第二の分析を行ない、検出した前記マーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点に基づいて前記ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を校正してｐＨと検出位置ｘとの関係を示すｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を得るｐＨ勾配関数校正部と、
校正された前記ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）に基づいて、分離した試料成分のｐＨを決定する試料成分同定部と、を備えたことを特徴とするマイクロチップ電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド、タンパク質等の両性電解質をその等電点で分離し分析する電気泳動装置に関し、さらに詳しくは分離流路の所定の範囲にわたって分離した試料成分を検出できる電気泳動装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ペプチドやタンパク質等を分離し分析する技術として、キャピラリ等電点電気泳動というものがある。図１は、従来のキャピラリ等電点電気泳動装置を表す概略図である。
【０００３】
内面処理を施して電気浸透流が生じないようにしたキャピラリ１内に種々の電離度をもつ多数の両性電解質混合物（ポリアミノポリカルボン酸混合物やポリアミノポリスルホン酸混合物など：ポリバッファという）を溶かした水溶液３を充填し、キャピラリ１の一端を水溶液３に含まれる電解質の中で最も酸性の強いものよりも低いｐＨを与える酸性の溶液（リン酸水溶液など）５に浸し、他端を水溶液３に含まれる電解質の中で最も塩基性の強いものよりも高いｐＨを与えるアルカリ性の溶液（水酸化ナトリウム水溶液など）７に浸す。溶液５及び溶液７には電極が浸されており、溶液５は陽極液、溶液７は陰極液となっている。また、図示は省略されているが、キャピラリ１の検出点の位置に、紫外線吸収検出や電気伝導率検出等による検出器が備えられている。
【０００４】
溶液５及び溶液７に電圧をかけると、それぞれの両性電解質が等電点の位置まで移動したのち停止し、キャピラリ内にｐＨ勾配が形成される。この時、溶液３にタンパク質などの両性電解質試料を加えておくと、その成分はｐＨ勾配上の等電点の位置で細いゾーンに濃縮される。
定常状態に達したのち、ゾーンを検出点まで移動させるためにキャピラリ内の液を種々の方法で移動させ、各成分のゾーンを検出する。ゾーンを移動させる方法として、電極液を変えて電圧印加を続ける方法と、圧力差で押し出す方法がある。
【０００５】
図１に示した従来技術では、電圧を印加しながら両性電解質成分を等電点に濃縮する過程と、濃縮された成分のゾーンを検出点まで移動させる過程の２つの過程があり、ゾーンを移動させるために、電極液を変えて電圧印加を続けるか、又は圧力差で押し出す必要がある。ゾーンを移動させるこれらの方法は、どちらも時間がかかる上に、ｐＨ勾配上に正しく濃縮されたゾーンを検出点まで移動させることによりゾーンを乱れさせることは避けられない。
【０００６】
このような不具合を解決するために、ゾーンを移動させることなく検出する方法が提案されている。その方法は、分離が定常状態に達した後、分離流路の所定の範囲にわたって光を照射し、各位置における光の吸収又は発光を所定に範囲にわたって検出する。光検出手段としては、分離流路に沿って配列されたアレイ状の受光素子を有する検出器などが用いられる。この方法では試料分離後にゾーンを移動させることがないので、分離状態を乱さずに、高速で測定を行なうことができる。
【０００７】
分離流路に形成されるｐＨ勾配の位置精度及び再現性は、両性電解質の組成、注入状況などによって変化するため、ｐＨを分離位置だけで正確に決定することは不可能である。これを解決するため、ｐＨが既知のマーカサンプルを試料とともに分離流路に注入し、そのマーカサンプルをｐＨ軸の基準点として、分離した試料成分のｐＨの決定を行なっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
通常は、手作業で、マーカサンプルの分離位置関係から、分離した試料成分のｐＨを決定しているので、ｐＨ軸による試料成分の自動同定は困難であった。
また、ｐＨ勾配を詳細に把握するために多数のマーカサンプルを注入すると、試料とマーカサンプルとの区別がつきにくいという問題もあった。
そこで本発明は、試料分離後にゾーンを移動させずに試料の同定を行なう等電点電気泳動装置において、試料成分のｐＨを正確に自動で同定することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
図２は本発明を表すブロック図である。
所定の範囲にわたって分離流路からの光を検出する光検出手段２は、検出信号を分離流路の検出位置に対応して記憶する検出信号記憶部４に接続されている。検出信号記憶部４は、ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を算出するｐＨ勾配関数演算部６、ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を校正してｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を得るｐＨ勾配関数校正部８、及び分離した試料成分をｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）に基づいて同定する試料成分同定部１０に接続されている。ｐＨ勾配関数演算部６で算出されたｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）はｐＨ勾配関数記憶部１２に記憶された後、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）算出時にｐＨ勾配関数校正部８に送られる。
ここで、ｐＨ勾配関数とは、多数の両性電解質混合物を分離流路に充填して電圧を印加したときに形成されるｐＨ勾配を表すものであり、検出位置（分離位置）ｘに対するｐＨの関数である。
【００１０】
本発明による等電点電気泳動装置は、透明部材の内部に分離流路が形成された電気泳動部材と、分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、分離流路内で分離された各成分による光の吸収又は発光を所定の範囲にわたって検出する光検出手段と、その光検出手段の検出信号を分離流路の各位置に対応させて記憶する検出信号記憶部と、複数種類の等電点既知のマーカサンプルをポリバッファを充填した分離流路に導入して分離する第一の分析を行ない、マーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点からｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を算出するｐＨ勾配関数演算部と、ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を記憶するｐＨ勾配関数記憶部と、複数種類のマーカサンプルとともに試料を上記ポリバッファと同じポリバッファを充填した分離流路に導入して分離する第二の分析を行ない、検出したマーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点に基づいてｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を校正してｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を得るｐＨ勾配関数校正部と、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）に基づいて、分離した試料成分のｐＨを決定する試料成分同定部とを備えるものである。
【００１１】
複数種類のマーカサンプルを分離流路に注入し分離して第一の分析を行ない、その分離状態を光検出手段２により検出して検出信号記憶部４に記憶し、各マーカサンプルの検出位置及び既知の等電点に基づいて分離流路におけるｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）をｐＨ勾配関数演算部６により算出する。注入するマーカサンプルの種類は確実に分離できる範囲で多い方が好ましく、より高精度なｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を算出することができる。
そのｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）をｐＨ勾配関数記憶部１２に記憶する。
【００１２】
次に、試料とともに複数種類のマーカサンプルを分離流路に注入し分離して第二の分析を行ない、その分離状態を光検出手段２により検出して検出信号記憶部４に記憶する。ｐＨ勾配関数校正部８により、ｐＨ勾配関数記憶部１２から読み出したｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を第二の分析におけるマーカサンプルの検出位置及び既知の等電点に基づいて、必要に応じて平行移動、伸縮などの校正を行ない、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を得る。注入するマーカサンプルは２、３種類といった少数でよい。マーカサンプル数が少なければ、試料ピークとマーカサンプルピークの区別がしやすくなる。
【００１３】
ここで、本発明では第一の分析及び第二の分析に同じポリバッファを用いている。第二の分析における試料の混入によるマーカの等電点への影響は弱いので、第一の分析及び第二の分析におけるｐＨ勾配関数ｆ（ｘ），ｇ（ｘ）の基本的な形はあまり変わらず、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）はｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）と比較して平行移動や伸縮変形のみを受けていると仮定することができる。
試料成分同定部１０により、校正されたｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）に基づいて、検出信号記憶部４に記憶された第二の分析のデータからそれぞれ分離した試料成分のｐＨを決定する。
【００１４】
【実施例】
図３は一実施例を表す概略構成図である。この実施例では本発明を、透明板状部材の内部に分離流路が形成されたマイクロチップを用いたマイクロチップ電気泳動装置に適用した。測定にはアレイ型光センサを用い、流路に沿ってライン状に光照射するか、又は流路に沿って光学的にスキャンすることにより光照射を行なう。検出方法としては、紫外線吸収による吸光度を求める方法やレーザ蛍光法など、濃度情報が得られる方法であればいずれも利用できる。この実施例では吸光度法を用い、検出器としてフォトダイオードを分離流路に沿って配列したアレイ型光検出器を用いている。
【００１５】
ガラス基板内部に分離流路１４と試料導入流路１６が交差して形成されたマイクロチップ１８が備えられている。マイクロチップ１８の一表面には、分離流路１４の両端及び試料導入流路１６の両端に対応する位置に、分離流路１４又は試料導入流路１６に達する穴がそれぞれ形成されている。分離流路１４の両端及び試料導入流路１６の両端に泳動電圧を印加する泳動電源装置２０が備えられている。
【００１６】
光源２２と分光器２４により構成され、分離流路１４の所定の範囲にわたって光を照射する光照射手段２６が備えられている。マイクロチップ１８の照射手段２６とは反対側に、分離流路１４からの光をそれぞれの位置で検出する光受光素子が分離流路１４に沿って並べられたアレイ型光検出器２８が備えられている。アレイ型光検出器２８は、検出信号を増幅する増幅回路３０及びアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器３２を介して、ＣＰＵ３４に接続されている。図２で示した検出信号記憶部４、ｐＨ勾配関数演算部６、ｐＨ勾配関数校正部８、試料成分同定部１０及びｐＨ勾配関数記憶部１２は、ＣＰＵ３４により構成される。
【００１７】
マーカサンプルや試料、ポリバッファがそれぞれ入れられた容器３６が設置されている。マイクロチップ１８、容器３６間を移動し、マーカサンプルや試料、ポリバッファを分離流路１４又は試料導入流路１６の一端に注入するニードル３８が備えられている。ニードル３８の動作はモータ４０により駆動される。ニードル３８には、設定された量のマーカサンプル、試料又はポリバッファを吸引／吐出するシリンジ４２が接続されている。シリンジ４２の動作はモータ４４により駆動される。モータ４０，４４は、モータ制御回路４４を介して、ＣＰＵ３４に接続され、ＣＰＵ３４により制御される。
【００１８】
マイクロチップ１８の材質が石英やホウ珪酸ガラス等の場合は、分離流路１４及び試料導入流路１６の内壁表面は、電気浸透流が発生しないように、リニアアクリルアミドやポリビニルアルコール等により予め処理してシラノール基を化学修飾しておくことが好ましい。
【００１９】
次に、この実施例の動作を説明する。
（ｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）の決定（第一の分析））
ＣＰＵ３４により、モータ制御回路４４を介してモータ４０を駆動させ、ニードル３８をポリバッファの入った容器３６に移動させる。モータ４４を駆動させて、シリンジ４２により、所定量のポリバッファを吸引する。ニードル３８をマイクロチップ１８の分離流路１４の一端の穴に移動させ、シリンジ４２を動作させて、分離流路１４及び試料導入流路１６にポリバッファを充填する。
ニードル３８をマイクロチップ１８上から退けた後、光照射手段２６により、分離流路１４の所定の範囲に光を照射する。分離流路１４からの光をアレイ型光検出器２８により検出し、増幅回路３０、Ａ／Ｄ変換器３２を介して、ＣＰＵ３４の検出信号記憶部４にバックグラウンドとして記憶する。
【００２０】
次に、例えば等電点の異なる４種類のマーカサンプルを含む溶液（マーカサンプル溶液）の入った容器３６にニードル３８を移動させ、シリンジ４２により、所定量のマーカサンプル溶液を吸引する。ニードル３８をマイクロチップ１８の試料導入流路１６の一端の穴に移動させ、シリンジ４２を動作させて、試料導入流路１６にマーカサンプル溶液を注入する。
ニードル３８をマイクロチップ１８上から退けた後、泳動電源装置２０により分離流路１４及び試料導入流路１６より所定の電圧を所定の時間だけ印加し、マーカサンプルを分離流路１４と試料導入流路１６の交点に移動させる。さらに、所定の電圧を所定の時間だけ印加し、分離流路１４のｐＨ勾配に従って４種類のマーカサンプルを分離する。マーカサンプルはそれぞれの等電点位置に濃縮される。
【００２１】
分離完了後、光照射手段２６により、分離流路１４の所定の範囲に光を照射する。分離流路１４からの光をアレイ型光検出器２８により検出し、その検出信号を増幅回路３０、Ａ／Ｄ変換器３２を介して、ＣＰＵ３４の検出信号記憶部４に送る。
ＣＰＵ３０の検出信号記憶部４に、増幅及びＡ／Ｄ変換された検出信号を、検出位置に対応してバックグラウンドを差し引いて記憶する。
【００２２】
図４（ａ）は、第一の分析のマーカサンプルの分離を表すデータである。縦軸は検出強度、横軸は検出位置（ｘ）を表す。検出位置（ｘ）は、アレイ型光検出器２８の分離流路に沿って並べられた検出素子の、分離流路１４と試料導入流路１６の交点側から数えた順番である。
等電点がそれぞれｐＨ１，ｐＨ２，ｐＨ３，ｐＨ４のマーカサンプルが検出位置ｘ１，ｘ２，ｘ３，ｘ４でそれぞれ検出されている。分離順序から各マーカサンプルを同定することができる。導電点の大小関係は、ｐＨ１＜ｐＨ２＜ｐＨ３＜ｐＨ４である。
【００２３】
図４（ｂ）は、第一の分析のｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を表すグラフである。縦軸はｐＨ、横軸は検出位置（ｘ）を表す。
ｐＨ勾配関数演算部６により、検出信号記憶部４に記憶された第一の分析データからそれぞれのマーカサンプルにおいて検出位置ｘに対するｐＨをプロットし、最小二乗法による多項式近似やスプライン補間などを用いてｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を推定する。
そのｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）をｐＨ勾配関数記憶部１２に記憶する。
【００２４】
（実試料の測定（第二の分析））
第一の分析と同様にして、分離流路１４及び試料導入流路１６に第一の分析と同じポリバッファを注入し、分離流路１４の所定の範囲に光を照射し、分離流路１４からの光をアレイ型光検出器２８により検出し、増幅回路３０、Ａ／Ｄ変換器３２を介して、ＣＰＵ３４の検出信号記憶部４にバックグラウンドとして記憶する。
試料と、試料とは区別できる等電点の異なる２種類のマーカサンプルとを含む溶液（試料溶液）の入った容器３６にニードル３８を移動させ、シリンジ４２により、所定量の試料溶液を吸引する。ニードル３８をマイクロチップ１８の試料導入流路１６の一端の穴に移動させ、シリンジ４２を動作させて、試料導入流路１６に試料溶液を注入する。
【００２５】
ニードル３８をマイクロチップ１８上から退けた後、泳動電源装置２０により分離流路１４及び試料導入流路１６より所定の電圧を所定の時間だけ印加し、マーカサンプル及び試料を分離流路１４と試料導入流路１６の交点に移動させる。さらに、所定の電圧を所定の時間だけ印加し、分離流路１４のｐＨ勾配に従ってマーカサンプル及び試料を分離する。マーカサンプル及び試料成分はそれぞれの等電点位置に濃縮される。
分離完了後、第一の分析と同様にして、分離状態を検出し、その検出信号を検出信号記憶部４にバックグラウンドを差し引いて記憶する。
【００２６】
図５（ａ）は、第二の分析のマーカサンプルの分離を表すデータである。縦軸は検出強度、横軸は検出位置（ｘ）を表す。
等電点がそれぞれｐＨ０，ｐＨ００のマーカサンプルが検出位置ｘ０，ｘ００でそれぞれ検出され、その間の検出位置に分離した試料成分が検出されている。導電点の大小関係は、ｐＨ０＜ｐＨ００である。
【００２７】
図５（ｂ）は、第一の分析のｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を実線で表し、第二の分析のｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を一点鎖線で表すグラフである。縦軸はｐＨ、横軸は検出位置（ｘ）を表す。
ｐＨ勾配関数校正部８により、検出信号記憶部４に記憶された第二の分析のデータからマーカサンプルのデータのみを取り出し、検出位置ｘに対するｐＨをプロットする。ｐＨ勾配関数記憶部１２からｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を読み出し、第二の分析のｐＨプロットに基づいてｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を必要に応じて平行移動又は線形伸縮による校正を行ない、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を決定する。
試料成分同定部１０により、そのｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）と検出信号記憶部４に記憶された第二の分析のデータを用いて、各試料成分のｐＨを求める。
【００２８】
この実施例では、第一の分析時に等電点の異なる４種類のマーカサンプルを用いたが、これに限定されるものではなく、３種類以上のマーカサンプルを用いればｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）が求まる。第二の分析時にマーカサンプルが３種類以上ある場合は、ｐＨ軸は単純な比例伸縮ではなく、スプライン曲線などを用いた高次の関数フィットをすることによりｐＨ精度をさらに向上させることができる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明は、試料分離後にゾーンを移動させずに試料の同定を行なう等電点電気泳動装置において、複数種類のマーカサンプルをポリバッファを充填した分離流路に導入し、マーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点からｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を算出する第一の分析と、複数種類のマーカサンプルとともに試料を上記ポリバッファと同じポリバッファを充填した分離流路に導入し、検出したマーカサンプルの検出ピーク位置及び等電点に基づいてｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を平行移動や伸縮させて校正を行なってｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を求め、ｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）に基づいて、分離した試料成分のｐＨを決定する第二の分析を行ない、試料成分のｐＨを自動的に決定するようにしたので、分析作業の効率化を図ることができ、さらに信頼性の高いデータが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来のキャピラリ等電点電気泳動装置を表す概略図である。
【図２】  本発明を表すブロック図である。
【図３】  一実施例を表す概略構成図である。
【図４】  （ａ）は、第一の分析のマーカサンプルの分離を表すデータであり、（ｂ）は、第一の分析のｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を表すグラフである。
【図５】  （ａ）は、第二の分析のマーカサンプルの分離を表すデータであり、（ｂ）は、第一の分析のｐＨ勾配関数ｆ（ｘ）を実線で表し、第二の分析のｐＨ勾配関数ｇ（ｘ）を一点鎖線で表すグラフである。
【符号の説明】
２      光検出手段
４      検出信号記憶部
６      ｐＨ勾配関数演算部
８      ｐＨ勾配関数校正部
１０      試料成分同定部
１２      ｐＨ勾配関数記憶部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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