(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトG-CSFレセプターに特異的に結合し又はこれと相互作用し、細胞の増殖及び分化を刺激するアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
ヒトG-CSFレセプターに特異的に結合し又はこれと相互作用し、該レセプターを二量化し又は該レセプターと関連するキナーゼのリン酸化を活性化して細胞増殖及び分化を刺激するアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
好中球又はその前駆細胞の増殖及び分化を刺激する請求項１又は２記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
ヒトG-CSFレセプターの細胞外部分と相互作用する請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記ヒトG-CSFレセプターがネイティブヒトG-CSFレセプターである請求項１ないし４のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項６】
G-CSFレセプターのアミノ酸残基1-603（配列番号２７）の間の領域と相互作用する請求項１ないし５のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体又はF(ab)'2、Fab若しくはscFvである抗原結合性断片である請求項１又は２記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項８】
mAb163-93又はmAb174-74-11であるアゴニスト抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体mAb163-93又はmAb174-24-11のいずれかと同じエピトープに結合する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体。
【請求項１０】
Ｈ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、
CDR1: Asn Tyr Gly Met Asn  （配列番号１５）
CDR2: Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys Gly  （配列番号１６）
CDR3: Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr  （配列番号１７）
又はＬ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、
CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu  （配列番号１８）
CDR2:  Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser （配列番号１９）
CDR3:  Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr  （配列番号２０）
を包含する請求項７記載のアゴニスト抗体。
【請求項１１】
Ｈ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、
CDR1: Ser Tyr Ala Met Ser（配列番号２１）
CDR2: Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys（配列番号２２）
CDR3: Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr（配列番号２３）
又はＬ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、
CDR1:  Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His（配列番号２４）
CDR2:  Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser（配列番号２５）
CDR3:  Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr（配列番号２６）
を包含する請求項７記載のアゴニスト抗体。
【請求項１２】
生体外増殖アッセイにより測定されるヒトG-CSFレセプターを発現するヒト又はマウス細胞の増殖を刺激することができる請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を産生するセルライン。
【請求項１４】
ハイブリドーマセルライン163-93又は174-74-11である請求項１３記載のハイブリドーマセルライン。
【請求項１５】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡであって、配列番号１５ないし２０又は配列番号２１ないし２６から選ばれるアミノ酸配列を有する少なくとも１個のCDR配列をコードするDNA。
【請求項１６】
請求項１５記載のＤＮＡを含む遺伝子デリバリーシステム。
【請求項１７】
前記システムは、ウイルスベクター、プラスミド又は非ベクターデリバリーシステムを包含する請求項１６記載の遺伝子デリバリーシステム。
【請求項１８】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する好中球減少症の治療薬。
【請求項１９】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の少なくとも１種のアゴニスト抗体又はその抗原結合性断片及び薬理学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む組成物。
【請求項２０】
ヒトG-CSF-応答性プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を発現することができるヒトG-CSF応答性セルラインを構築し、被検抗体で刺激した後の細胞中の酵素活性又は蛍光強度を測定することを含む、ヒトG-CSFアゴニスト活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
前記G-CSF応答性セルラインがNFS60である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質又はジヒドロ葉酸リダクターゼである請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
ヒトG-CSFレセプターを発現するヒトG-CSFレセプター応答性セルラインを構築し、被検抗体で刺激した後の細胞の増殖を測定することを含む、ヒトG-CSFアゴニスト活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２４】
アッセイ方法が、G-CSFレセプターを発現する細胞を用いた比色アッセイ又は取り込みアッセイである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記比色アッセイ系が3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド(MTT)の還元を測定することを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒトG-CSF応答性セルラインがヒトG-CSFレセプターの細胞外領域の配列を含む請求項２０ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体によるヒトG-CSFレセプターを免疫学的に検出する方法。
【請求項２８】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体による、細胞表面上にヒトG-CSFレセプターを発現する細胞の免疫学的検出方法。
【請求項２９】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体により、可溶性ヒトG-CSFレセプターを免疫学的に検出及び測定する方法。
【請求項３０】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項１９記載の組成物を有効成分として含有する、細胞増殖及び分化を刺激するための刺激剤。
【請求項３１】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項１９記載の組成物を有効成分として含有する、ヒトG-CSFレセプターを二量化し、該レセプターと関連するキナーゼのリン酸化を活性化して細胞増殖及び分化を刺激するための刺激剤。
【請求項３２】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項１９記載の組成物を有効成分として含有する、好中球の増殖及び分化を刺激するための刺激剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
この出願は、１９９８年４月３０日に出願された米国仮出願第60/083,575号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
骨髄において血球細胞が生育し、分裂し及び分化する過程は、造血と呼ばれている(Dexter, T.M.及びSpooner, E., annu. Rev. Cell Biol.,3:423,1987)。異なる細胞系列に属する多くの異なる型の血球細胞が知られている。種々の血球細胞の型のそれぞれは、自己更新することができ又は異なる成熟細胞型の全てを生み出すことができる前駆細胞を与えることができる多分化能性幹細胞から生じる。生体内では３つの群の細胞、すなわち、赤血球、血小板及び白血球が生産され、後者の大部分は宿主免疫防御に関与している。
【０００３】
造血前駆細胞の増殖及び分化は、コロニー刺激因子(CSFs)及びインターロイキンを包含する一群のサイトカインにより制御される(Arai, K-I., et al., Annu. Rev. Biochem. 1990, 59:783-836)。好中球及びマクロファージの生産には、少なくとも４種類のサイトカイン、すなわち、インターロイキン-3(IL-3)、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及びマクロファージ刺激因子(M-CSF)が関与している。これらのうち、G-CSFは、好中球性顆粒球系列の細胞にのみ特異的に作用する(Demetri, G.D.及びGriffin, J.D., Blood, 1991, 78:2791-2808)。生体内でのG-CSFの主な生物学的効果は、単分化能前駆細胞からの好中球の増殖及び分化を増大させることである(Cohen, A.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:2484-2488)。G-CSFはまた、好中球の移動、生存、並びに貪食作用及び殺菌を包含する機能を増強する(Crawford, J., et al., N. Engl. J. Med., 1991, 325:164-170, Moore, M.A.S., Annu. Rev. Immunol. 1991, 9:159)。この生理的過程は、重要な宿主防御システムの基礎として働き、生体内において大規模に起きている。
【０００４】
市販の組換えヒトG-CSF(Neupogen（登録商標）、Amgen,Inc.)の生体内における半減期は僅か3.5時間であり、好中球の生成を刺激するために必要なG-CSFの閾濃度を維持するために毎日投与しなければならない。(Physician's Desk Reference, 53rd, 1999, 532-537)。高投与量における、組換えヒトG-CSF(「rhG-CSF」)治療の主な副作用は骨の痛みであり、これはおそらく注射直後にrhG-CSFが一時的に高濃度になることに起因するものと考えられる。もっとも、これは、投与量の少ない患者では頻度がより低い。
【０００５】
rhG-CSFの生体内における半減期を長くするための種々の手段が研究されており、このような手段として、ポリエチレングルコール(PEG)と結合させることが含まれる。しかしながら、最近の報告により、PEG結合体は、非修飾タンパク質よりも活性がかなり低く、タンパク質に結合されたPEG部分の分子量と生体外での活性とが反比例関係にあることが示された。Bowen S.,et al., Exp. Hemat., 1999, 27: 425-432.さらに、動物実験により、PEGに結合されたrhG-CSFはその半減期が１〜３日に延長されるが、それよりは長くはならないことが示された。
【０００６】
PEG結合rhG-CSFとは対照的に、モノクローナル抗体(「mAb」)の生体内における半減期は、抗体のアイソタイプに依存して約２〜３週間である。ヒトG-CSFレセプターに対するアゴニスト抗体の１回の注射により、G-CSF−様活性が数週間に亘って得られるであろう。従って、化学療法を受けている重度慢性好中球減少症患者は、アゴニストmAbの延長された生物学的活性の故に病院を訪れる頻度を減らすことができるという利益を潜在的に受ける。さらに、血流中に維持されるアゴニスト抗体の濃度により、好中球前駆細胞の増殖及び分化が継続的に刺激され、従って、より高い効果が得られ、これによってNeupogen（登録商標）や他のrhG-CSF誘導体よりも低い投与量でおそらく副作用も低くなるであろう。
【０００７】
G-CSFの種々の作用は、２つの異なる結合部位を通じて、そのレセプターと結合し、1:2リガンド／レセプター複合体を形成することにより開始される。好中球性顆粒球の前駆細胞及び成熟委任細胞上に発現されるG-CSFレセプターは、サイトカイン／造血レセプターのスーパーファミリーに属する。インターロイキン-2(IL-2)ないしIL-7及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)のレセプターを包含する、このファミリーのメンバーの大部分は、α、β、及び時々γサブユニットさえ含むヘテロメリック複合体の形成を通じて活性化されるが、単一のポリペプチド鎖から成るG-CSFは、リガンドが結合するとホモ二量体を形成すると信じられる(Fukunaga, R., et al., J. Biol. Chem., 1990, 265:24008)。
【０００８】
G-CSFのホモ二量化は、信号伝達に必須であることが示されている(Wells, J.A.,及びVos, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1996, 65:609)。G-CSFレセプターは、生来のタンパク質キナーゼ領域を含まないが、チロシンキナーゼ活性はG-CSF信号の伝達に必須的であると思われる。G-CSFに誘導されるレセプターホモ二量化を通じたG-CSFレセプター活性化の信号は、例えばJAK1及びJAK2のような種々のチロシンキナーゼの非共有結合的結合 (Barge, R.M.Y.,et al, Blood, 1996, 87:2148-2153)、及び、次いで、Stat3及びStat5のような転写因子Statのリン酸化 (Tian, S-S., et al., Blood, 1994, 84:1760-1764; Watowich, S.S., et al., Annu. Rev Cell Dev. biol., 1996, 12:91; Dong F., et al., J. Immunol., 1998, 161: 6503-6509) により媒介される。これらのチロシンキナーゼは、G-CSFに応答するG-CSFレセプターリン酸化及びStat活性化において必須的な役割を果たす(Tian S-S. et al., blood, 1996, 88:4435-4444; Shimoda, K., et al., Blood, 1997, 90:597-604)。
【０００９】
G-CSFレセプター以外にも、エリスロポイエチン(「EPO」)、成長ホルモン(「GH」）、プロラクチンレセプター（「PRL」）及びトロンボポイエチン（「TPO」）のレセプターの機能もまた、リガンドにより誘起されるレセプターの二量化により開始され、特定のキナーゼの組がリン酸化されるものと考えられる(Youssoufian, H., et al., Blood, 1993, 81:2223; Alexander, W.S., et al., EMBO, 1995, 14:5569; Heldin C.H., Cell, 1995, 83:213)。従って、ホモ二量化及びレセプター担持細胞の増殖に対する信号伝達を引き起こす能力に基づく、本発明において開示されるG-CSFレセプターアゴニストのスクリーニング方法は、これらの他のレセプターに対するアゴニストのスクリーニングにも用いることができる。
【００１０】
発明の概要
本発明は、G-CSFレセプター及び他のホモ二量体サイトカインレセプターに対する相互作用的アゴニスト抗体であって、これらのレセプターと結合しまたはこれらと相互作用することにより、リガンドと同じ生物学的役割を演じるものに関する。本発明は、２つのサイトカインレセプタータンパク質、好ましくは、例えば２つのG-CSFレセプタータンパク質のような２つの同一のサイトカインレセプタータンパク質に結合し、又は相互作用することができるアゴニスト抗体を包含する。これらのアゴニスト抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の全抗体分子、並びに、Fab、scFv及び２価F(ab')2のような免疫グロブリン断片を包含する。アゴニスト抗体及び断片は、動物由来、ヒト−マウスキメラ性、ヒト化、DeImmunised（登録商標）、又は完全にヒト由来のものであってよい。
【００１１】
好ましい具体例では、G-CSFレセプターアゴニストは、G-CSFレセプターを発現する細胞の増殖及び／又は分化を刺激する。これは、G-CSFレセプターの細胞外領域に結合し、G-CSFレセプターを二量化し、及び／又はG-CSFレセプターに付随するキナーゼのリン酸化を活性化することにより達成することができる。G-CSFレセプターを発現する細胞は一般的に原始的幹／前駆造血細胞を含み、従って、アゴニストは、原始的造血細胞の分化及び／又は増殖を促進して好中球的顆粒球系列細胞の再増殖をもたらすであろう。
【００１２】
本発明の他の局面は、生体外での細胞に基づくアッセイシステムを用いた、例えばG-CSFレセプターアゴニスト抗体のような、ホモ二量化サイトカインレセプターのアゴニストをスクリーニングするための方法に関する。後述のように、細胞は、G-CSFレセプター又はアゴニストの結合により活性化されるG-CSFレセプターの部分でトランスフェクトすることができ、そして、アゴニスト分子の存在下で細胞の増殖をモニターすることができる。
【００１３】
本発明はまた、診断目的及び治療用途の両者のために、アゴニスト抗体を包含するこれらのアゴニストを使用することを包含する。mAb163-93及びmAb174-24-11と命名された、例示的なアゴニスト抗体を産生するハイブリドーマが、それぞれ、＿＿＿及び＿＿＿の受託番号で、バージニア州20110-2209、マナサス、ユニバーシティ  ブルバード  10801のアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託されている。G-CSFレセプターアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインが、HB-12524の受託番号でＡＴＣＣに寄託されている。
【００１４】
配列表の概要
配列番号１〜６は、G-CSFレセプターのクローニングに用いた種々のプライマーを示す。
配列番号７〜１４は、本発明の２つのアゴニスト抗体の可変領域のクローニングに用いた種々のプライマーを示す。
配列番号１５〜２６は、本発明の２つのアゴニスト抗体のCDR（Ｌ鎖及びＨ鎖の両方）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
発明の製造及び使用
１．  本発明のアゴニストの製造
ここに記載したG-CSFレセプターアゴニストは、好ましくはG-CSFレセプターの細胞外領域中のエピトープを標的とする。アゴニストの例として、ハイブリドーマセルライン163-93及び174-74-11により生産されるものを挙げることができる。
【００１６】
本発明のモノクローナルアゴニスト抗体は、免疫化及び融合（下記実施例４参照）によって、又は単離されたリンパ球からEBVトランスフォーメーションを用いて、又はヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされた昆虫若しくは哺乳動物細胞から生産することができる。臨床使用のために、アゴニスト抗体は、好ましくは、キメラ性、DeImmunized（登録商標）、ヒト化又はヒト抗体である。このような抗体は、免疫原性を低減させることができ、ひいてはヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が避けられる。抗体は、抗体依存性細胞性細胞障害(S.M. Canfield及びS.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991:173: 1483-1492)及び補体媒介細胞溶解(Y. Xu et al., J. Biol. Chem., 1994:269:3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol. 1996; 156:2840-2850)を補強しないIgG4、IgG2又は他の遺伝的に変異されたＩｇＧ若しくはＩｇＭであることが好ましい。
【００１７】
キメラ性抗体は、周知の組換えＤＮＡ技術により生産され、動物の可変領域とヒト定常領域とを有する。ヒト化抗体は、キメラ性抗体よりもヒトペプチド配列の割合が高い。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性を司る相補性決定領域(CDR)のみが動物由来で動物抗体に対応するアミノ酸配列を有しており、分子の残りの実質的に全ての部分（ある場合には、可変領域内のフレームワーク領域の小さな部分を除く）がヒト由来で、アミノ酸配列においてヒト抗体に対応する。L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, 米国特許第5,225,539; C. Queen et al.,米国特許第5,530,101参照。
【００１８】
DeImmunised（登録商標）抗体は、国際出願PCT/GB98/01473に記載されているように、潜在的Ｔ及びＢ細胞エピトープが排除されている抗体である。従って、ヒトにおけるそれらの免疫原性は、それらが生体内で適用された場合、実質的に減少されていると予想される。
【００１９】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(Stratagene Corp.,カリフォルニア州ラ  ジョラ）を用いてヒト抗体の断片(VH, VL, Fv, Fd, Fab又は(Fab')2)を生産し、キメラ性抗体を製造するのに用いられる技術と同様な技術を使用し、これらの断片を用いて全ヒト抗体を構築することを含む、数種類の異なる方法により生産することができる。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウス中で生産することもできる。このようなマウスは、カリフォルニア州フレモントのAbgenix, Inc.及びニュー  ジャージー州アナンデールのMedarex Inc.から市販されている。
【００２０】
全体的又は部分的なヒト抗体は、全体的なマウスmAbよりも免疫原性が低い。本発明にとってまた適当な、２価断片もまた、より免疫原性が低い。従って、これらの型の抗体の全ては、ヒトにおいて免疫応答をより引き起こしにくい。従って、本発明のアゴニスト抗体に対して予言されているように、それらは、全体的な動物抗体よりもヒトに投与することにより適している。特に、抗体を繰り返しまたは長期間に亘って投与しなければならない場合にそうである。
【００２１】
患者に抗体を投与することの１つの代替手段は、遺伝子治療技術によりアゴニスト抗体を内発的に生成させることである。アデノウイルス、AAV及びレトロウイスルを包含する標準的なベクターを用い、又は非ベクターデリバリーシステムにより、アゴニスト抗体又はその断片、誘導体若しくは類似体をコードするＤＮＡ配列を生体内で分配することができる。アゴニスト抗体又はその断片、誘導体若しくは類似体が持続的に発現されることは、慢性的好中球減少症の臨床治療にとってさらなる優位性を有するかもしれない。
【００２２】
ここに記載するアゴニスト分子はまた、G-CSFレセプターに特異的に結合しまたはこれと相互作用し、その二量化及び活性化をもたらす、ペプチド及び有機化合物のような小さな分子をも包含する。このような小さな分子は、また、低減された免疫原性を示すかもしれない。
【００２３】
ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域（本発明において、ヒトG-CSFレセプターに対する抗体の生成に用いられる）は、この分野において周知の分子組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。細胞外領域は、成熟ヒトG-CSFレセプターの、N-末端から1-603アミノ酸残基に亘って延びている（配列番号２７）。例えば米国特許第5,589,456号、第5,422,248号及び第5,574,136号参照）。しかしながら、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域の一部は、精製された又は部分精製された形態で、免疫原として用いることができる。
【００２４】
ヒトG-CSFレセプターのこの細胞外領域は、例えばマウスの様な動物を免疫する免疫原としてそのまま用いることができるし、あるいは、免疫化の前に、これを先ず、担体分子と結合させてその免疫原性を増大させることができる。適当な担体分子は、例えばTag, Flag、ロイシン−ジップのようなペプチド、又は、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)、アリカリフォスファターゼ(AP)、インテイン又は免疫グロブリンの定常領域（後述するようにアゴニスト抗体の作製に用いられた）のようなタンパク質を包含する。担体分子は、組換えＤＮＡ技術によってG-CSFに結合することができる。免疫原性を増大させることに加え、G-CSFレセプターの細胞外領域を含む、このようなキメラ性融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーを用いた抗原の精製を容易にすることができる。G-CSFレセプターの細胞外領域を含む抗原をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに入れ、これを次いで大腸菌、酵母、昆虫細胞並びにサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。この方法により生産した抗原は、周知の技術により精製することができる。
【００２５】
適当な免疫原は、ネイティブ又は野生型G-CSFレセプター細胞外領域に人工的又は自然に生成された、置換、欠失又は挿入を有する突然変異体を包含する。G-CSFレセプター又はその類似体を発現する細胞もまた免疫原として用いることができる。このような細胞は、一次ヒト細胞、AML-193のようなセルライン、G-CSFレセプターの全長若しくは一部又はG-CSFレセプターの細胞外領域を含むキメラ性タンパク質(Takahashi, T., et al., J. Biol. Chem. 1996, 271: 17555-17560)でトランスフェクトされたヒト若しくはマウス細胞（あるいは、任意的に、発現ベクターとしてバキュロウイルスを用いた昆虫細胞）を包含する。
【００２６】
G-CSFレセプターに対するアゴニスト抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）を生成させるために、ここに記載した免疫原を用いて、周知の方法により、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット）又はウサギ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、又はヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス、又はヒトＢ細胞若しくはヒト骨髄細胞を移植された、重症複合免疫不全(SCID)マウスを免疫することができる。ハイブリドーマは、免疫された動物からのＢ細胞と、ミエローマ細胞（例えばSp2/0及びNS0)を、G. KohlerとC. Milstein (Nature, 1975, 256:495-497)によって記載された常法により融合することによって生成させることができる。G-CSFレセプターに対する抗体はまた、ファージディスプレイシステム(Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 1991, 227:381; Marks et al. J. Mol. Biol., 1991,222:581)におけるヒトＢリンパ又はヒト骨髄からの組換え単鎖Fv又はFabライブラリーをスクリーニングすることによって生成させることもできる。
【００２７】
G-CSFレセプターに特異的な抗体の選択は、プレート上に抗原、すなわち好ましくはG-CSFレセプター/IgG4(Fc)キメラ性タンパク質が直接的又は間接的にコーティングされる、従来の酵素免疫分析(ELISA)法により行うことができる。ＥＬＩＳＡにより検出される、キメラ性タンパク質への抗体mAb163-93のこのような結合は、図３に示されている。エピトープがリガンドのエピトープと近い又は重なる抗体を同定するために競合的ＥＬＩＳＡを用いることもできる(Current protocols in molecular biology, Ausubel, F.M. et al.編、Wiley Intersccience発行、1996)。
【００２８】
G-CSFレセプター/IgG4(Fc)キメラ性タンパク質を直接的又は間接的にコーティングした後、rhG-CSF(R&D Biosystems, ミネソタ州ミネアポリス）を競合的ＥＬＩＳＡに用いることができる。G-CSFレセプターへの抗体の結合は、ヤギ抗マウス抗体のような、第二抗マウス抗体の添加により測定することができる。第二抗体には、セイヨウワサビペルオキシダーゼを包含する、種々の化合物及びタンパク質を検出のために結合することができる。
【００２９】
後述するトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４のような、細胞の表面上に発現されるヒトG-CSFレセプターに対する抗体の結合特異性は、FACS分析（実施例６）により測定することができる。図4Aに示されるように、マウスモノクローナル抗体mAb163-93は、ヒトG-CSFレセプターを発現するマウストランスフェクタント細胞Ｄ４にに特異的に結合するが、コントロールmAbは結合しなかった。さらに、mAb163-93は、ヒトG-CSFレセプターを発現するＤ４細胞には特異的に結合するが、その親細胞である32D-c123には結合しなかった（図４Ｂ）。
【００３０】
生体外での細胞系生物学的機能分析によりG-CSFレセプターアゴニストをスクリーニングする方法もまた本発明に包含される。アゴニストの大規模なスクリーニングのために、このような方法の１つは、G-CSF−応答性遺伝子のプロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を発現するためのカセットの構築物を導入した、NFS60のようなG-CSF応答性セルライン(Schindler, C及びDarnell, J.E., Annu. Rev. Biochem., 1995, 64:621)を構築することを包含する。ここで用いられるレポーターは、ルシフェラーゼ、−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質又はジヒドロ葉酸リダクターゼ(Pelletier, J.N., et al., Proc. Natl.Adad. Sci. USA, 1998,95:5290)であり得る。刺激後、細胞内の酵素活性又は蛍光密度を測定することにより、高効率スクリーニングによりG-CSFレポーターに対するアゴニストをスクリーニングすることができる。
【００３１】
アゴニスト抗体を含むアゴニストのための生体外細胞系生物学的機能分析はまた、生体外細胞増殖試験を包含する。本発明の好ましい具体例として、ヒトG-CSFレセプターの全長を発現するマウスセルラインＤ４を構築し、MTT-系比色分析と組み合わせて大規模にアゴニスト抗体をスクリーニングするために用いた。MTTを用いた比色分析システムは、放射性同位体を用いることなく、サイトカイン及びそれらのアゴニストに応答した細胞増殖を分光光度的に定量するように設計される。BaF3及びFDC-P1、又は好ましくは本発明の実施例７の32D-C123のような親マウスセルラインは、mIL-3依存的で、ヒトG-CSFレセプターの全長を発現するための宿主細胞として適当である(Hapel, A.J. et al., Blood, 1984, 64: 786-790)。構成性hCMVプロモーターの制御下においてヒトG-CSFレセプターの全長を発現するベクターでトランスフェクトし、次いで選択すると、下記実施例７及び図１に示されるように、MTT分析及び3Ｈ−チミジン取り込み分析によって示されるように、Ｄ４のようなトランスフェクタントもまたG-CSFに反応するようになる。
【００３２】
マウストランスフェクタントセルラインＤ４中でのチロシンキナーゼJAK1のリン酸化は、内発性ヒトG-CSFレセプターを発現するヒトセルラインAML-193と同様に、rhG-CSF(R&D Biosystems)により誘起される（図２）。実施例７に記載されるように、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウスセルラインＤ４をMTTアッセイと組み合わせて用いることにより、アゴニスト、特にアゴニスト抗体のスクリーニングが大幅に容易になる。このスクリーニング法はまた、AML-193のようなネイティブのG-CSF−依存性ヒトセルライン、ヒトG-CSFレセプター突然変異体を発現するマウスセルライン、又は、エリスロポイエチンレセプター(Goldsmith, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 7006-7011)若しくはFasレセプター(Takahashi, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271: 17555-17560)のような他のサイトカインレセプターの細胞内領域と融合させたヒトG-CSFの細胞外領域を包含するキメラ性タンパク質を採用することもできる。
【００３３】
ヒト骨髄を用いた顆粒球コロニー形成アッセイも又、本発明のアゴニスト抗体のスクリーニングに用いることができる。さらに、このアッセイはまた、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球の増殖及び分化を刺激するアゴニスト抗体の能力、効率及び特性の決定、並びに非ヒト霊長類との種特異性の決定に用いることができる。このアッセイの結果は、本発明のアゴニスト抗体が、組換えヒトG-CSFと同様に作用し、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球の分化及び増殖を、濃度依存的に特異的に刺激することを示している。更に、アゴニスト抗体mAb163-93は、このアッセイにおいて、rhG-CSFと本質的に同じ効率を示した（図７）。さらに、アゴニストmAbで刺激された、ヒト骨髄からのコロニーから採取された細胞は、典型的な好中球の形態を示す（図８Ｄ）。rhG-CSFは、注射後、主として腎臓の働きにより、生体内では循環から迅速に排除され、このため、その薬理効果の持続時間は短いことを理解すべきである(Tanaka, H., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989,251:1198-1203; Layton, J.E., et al., blood, 1989, 74: 1303-1307)。一方、本発明で記載する顆粒球コロニー形成アッセイでは、このような排除機能が存在しないので、生体内に比べ、rhG-CSFは、ヒト骨髄からの好中球の増殖及び分化を刺激する活性を持続的に示す。長半減期のPEG化(Pegylated)ヒト成長ホルモンとヒト成長ホルモンの比較(Clark, R.,et al., J. Bio. Chem., 1996, 271:21969-21977)から示唆されるように、アゴニスト抗体mAb163-93の能力は、その長い生体内での半減期の故に、rhG-CSFと同等かそれよりも高いであろう。
【００３４】
上記スクリーニング技術を用い、mAb163-93及びmAb174-74-11を包含する、モノクローナルアゴニスト抗体のパネルがヒトG-CSFレセプターに対して生成された。組換えヒトG-CSFとして作用するアゴニスト抗体mAb163-93は、G-CSFレセプターを活性化し、JAKキナーゼのチロシンリン酸化を誘起し(図6A,左側のパネル。リン酸化が抗pTyr抗体により検出されている）、転写因子のリン酸化を誘起する（図６Ｂ、左側のパネル。リン酸化が抗pTyr抗体により検出されている）。本発明において生成された抗体のパネル中の数種類のアゴニスト抗体は、生体外においてG-CSF応答性細胞の増殖を刺激することが示された（図5A-C)。mAb163-93は、細胞表面上のG-CSFレセプターに特異的に結合することが示された（図4A及び4B)。さらに、これらのヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体は、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を特異的に刺激する（図7A,7B及び8A-C)。これは、生体内での有効性をさらに示すものである。これは、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を刺激するモノクローナル抗体の最初の例である。
【００３５】
ヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体の種交差反応性もまた、顆粒球コロニー形成アッセイを用いて測定された。mAb163-93のような、これらのヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体は、種々の非ヒト霊長類の骨髄からの好中球性顆粒球の増殖及び分化を、種々の程度で特異的に刺激することが示された（下記表１）。アゴニスト抗体mAb163-93によって刺激された、チンパンジー骨髄からの顆粒球のコロニー形成数は、濃度依存的に増加した（図９）。細胞染色の結果は、チンパンジー骨髄からの好中球の増殖及び分化を刺激するこのアゴニストmAbの特異性を示していいる（図１０）。このタイプの種交差反応性アッセイは、前臨床試験のための適当な動物モデルの選択に用いることができる。
【００３６】
【表１】
表１  非ヒト霊長類の骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成
0003979008.tif 000002
【００３７】
上記のことは、２価アゴニスト抗体がG-CSFレセプターを活性化することができること、すなわち、それらはG-CSFの能力を真似るようにG-CSFレセプターを架橋して複合体を形成しレセプターを活性化することができることを示している。さらに、Fv及びFabのような、１つのレセプター分子にのみ結合する、抗体の１価部分は、以下にその適用を記載するように、G-CSFと競合するアンタゴニストとして用いることができる。
【００３８】
２．  本発明のアゴニストの使用
組換えヒトG-CSFは、組換えＤＮＡ技術によって生産され、治療への適用が成功した最初のサイトカインの１つである。このサイトカインは、種々の類似遺伝性(congenic)及び医原性好中球減少症に付随する感染症の発病率を減少させるために広く用いられている。現在までに、米国FDAによって、rhG-CSF治療は、以下の５つの疾病への適用が認可されている。(1)骨髄抑制性化学療法を受けている癌患者、(2)急性骨髄性白血病誘導及び強化化学療法を受けている癌患者、(3)骨髄移植を受けた癌患者、(4)末梢血前駆細胞回収及び治療を受けている癌患者及び(5)重度慢性好中球減少症の患者(Physician's Desk Reference, 第５３版、1999, 532-537)。好中球顆粒球系列の増殖及び分化に対するユニークな機能的特異性は、HIV患者、全身性炎症反応症候群(SIRS)及び敗血症患者、並びに糖尿病性足感染(diabetic foot infection)及び他の感染症患者を包含する他の疾病にも有用である(Miles, S.A., et al., Blood 1990, 75; 2137-2142; Kuritzkes, D.R. et al., AIDS 1998, 12:65-74; Weiss, M. et al., Bloob 1999, 93: 425-439; Lancet 1997, 350: 855-859; Deresinski, S.C., et al, Infect. Med. 1998, 15:856-70)。
【００３９】
ここで開示した、rhG-CSFとして作用するヒトG-CSFレセプターアゴニスト及び抗体は、細胞表面上のG-CSFレセプターに特異的に結合し、JAKキナーゼ及び転写因子のチロシンリン酸化を誘起するメカニズムにより、G-CSFレセプターを活性化し、G-CSF応答性細胞の増殖を刺激する。さらに、ヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体は、rhG-CSFと同様、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を特異的に刺激する。従って、ここに開示したヒトG-CSFレセプターアゴニスト及び抗体は、rhG-CSFと全ての同じ治療用途に有用であると一般的に予測される。さらに、アゴニスト抗体の長い半減期及び生体内での安定性の故に、治療的処置においてrhG-CSFよりも有意に潜在的に有利である。
【００４０】
本発明のアゴニスト及びアゴニスト抗体は、適切な医薬製剤の形態で、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射を包含するがこれらに限定されない種々の経路により投与することができる。用量は、動物モデルからの外挿及び臨床試験におけるルーチンな実験により決定することができる。
【００４１】
これらの本発明のアゴニスト及び抗体はまた、組換え細胞培養物または天然源からのG-CSFレセプターのアフィニティ精製に有用である。一般的なアフィニティ精製技術はこの分野において周知であり、これらのいずれをもこの目的のために用いることができる。
【００４２】
本発明の抗体は、G-CSFレセプターの可溶性細胞外領域及びG-CSFレセプターをその表面上に発現している細胞と免疫学的に反応する。従って、本発明はまた、この分野において周知の免疫学的方法を用いて、可溶性の形態にあるG-CSFレセプターの存在及び／又は細胞表面上に存在するG-CSFレセプターの存在を検出及び測定する方法をも提供する。さらに、Fab及びscFvのようなアゴニスト抗体の１価断片及びそれらの誘導体は、G-CSFがG-CSFレセプターと相互作用することを競合により防止するアンタゴニストとして作用し得、従って、G-CSFの生物学的機能を阻害し得る。これは、ある種の腫瘍及び癌の治療において有用であり得る。ここに開示した抗体を用いた免疫反応試験により、レセプター構造又はレセプター発現が正常か、異常か又は突然変異したものかもまた決定することができる。これらの結果は、診断及び治療目的に有用であり得る。
【００４３】
【実施例】
実施例１    ヒトG-CSFレセプタータンパク質の細胞外部分のクローニング
G-CSFレセプタータンパク質のクローニングは次のようにして行った。１ｎｇのヒト骨髄ｃＤＮＡ（Clontech,カリフォルニア州パロ  アルト）をＰＣＲにおける鋳型として用いた。プライマーとしてAAG TGG TGC TAT GGC AAG GCT G（配列番号１）及びCAC TCC AGC TGT GCC CAG GTC TT（配列番号２）を500 nMの最終濃度で含む１００μｌの反応混合物にこれを加えた。これらのプライマーは、ヒトG-CSFレセプターの細胞外部分をコードするｃＤＮＡの５‘及び３’末端に相同的であることが知られている。反応条件は次の通りであった。９４℃、１分間；６２℃、３０秒間；７２℃、３分間；４０サイクル繰り返し。
【００４４】
ＰＣＲからのＤＮＡ断片（約1.6 kb)を、BIO Inc.（カリフォルニア州ビスタ）からのプロトコールに従ってアガロースゲルから単離し、次いでTAクローニングベクター(Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド)に挿入し、組換えプラスミドpT1-11を生成した。この挿入物のＤＮＡ配列は、United States Biochemical（オハイオ州クリーブランド）からのＤＮＡ配列決定キットを用いて、両ストランドとも配列決定することにより決定した。ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域をコードする、pT1-11中のＤＮＡ断片（Fukunaga, R. et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA, 1990, 87:8702)によって規定された配列を用いて）をEcoR1で消化し、末端をKlenow断片で平滑化した。これを次いで、IgG4(Fc)をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドpFc1に挿入し、これをXba1で消化した。末端をKlenow断片で平滑化し、プラスミドpFT1-9を生成した。ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域及びIgG4(Fc)をコードするpFT1-9中のＤＮＡ断片をAseI及びHincIIで消化し、Klenow断片で平滑化し、次いで哺乳動物発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)中に挿入した。このベクターをEcoRV及びHincIIで消化し、次いでKlenow断片で平滑化してプラスミドpCGC23を生成した。このプラスミドにおいて、ヒトG-CSFRの細胞外領域／IgG4(Fc)の発現は、hCMVプロモーターの制御下にある。
【００４５】
実施例２  動物細胞中でのhG-CSFRの細胞外領域／IgG4(Fc)の発現
以下のようにして、線状化したpCGC23でNSO細胞をトランスフェクトした。4 x 107個の対数期のNSO細胞を回収し、2% FBS添加IMDM培地0.8 ml中に再懸濁した。１０μｇの線状化プラスミドＤＮＡと１０分間氷上でインキュベートした後、BioRad装置を用いて、細胞混合物を、２００ボルト、９６０μＦでエレクトロポレーションにかけた。氷上で２０分間後、１００μｌの希釈細胞浮遊液を約２０枚の９６−ウェルプレートの各ウェルに加えた。２日後、G418(Gibco BRL,メリーランド州ガイサースバーグ）を含む１００μＬの同じIMDM培地を各ウェルに加えてG418の濃度を0.8 mg/mlとした。１０日後、次のようにしてＥＬＩＳＡによりヒトG-CSFレセプターの細胞外領域／IgG4(Fc)融合タンパク質の発現をスクリーニングするために培養上清を吸引した。
【００４６】
Immulon 2プレート（Dynatech Laboratories, バージニア州チャンティリー）のウェルを濃度１μｇ／ｍｌの、５０μＬの抗ヒトIgG(Fc)抗体でコーティングし、室温で一夜インキュベートした。プレートを軽くたたいてコーティング溶液を除去した後、２００μＬのBLOTTO(5%脱脂乾燥牛乳含有PBS)を室温で各ウェルに加えて非特異的結合をブロックした。１時間後、ウェルをPBSTバッファ(0.05% Tween 20含有PBS)で洗浄した。トランスフェクションプレート中の各ウェルからの培養上清の５０μｌを回収し、５０μｌのBLOTTOと混合し、マイクロプレートの個々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウェルをPBSTで洗浄した。結合したヒトG-CSFレセプターの細胞外領域／ＩｇＧ４（Ｆｃ）融合タンパク質を、1:2000にBLOTTOで希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ(H+L)結合セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, ペンシルベニア州ウェスト  グローブ）との反応により検出した。0.1% 3,3',5,5'テトラメチルベンジジンを含むペルオキシダーゼ基質溶液(Sigma,ミズーリー州セント  ルイス）及び0.0003%過酸化水素(Sigma)を発色のために各ウェルに加え、３０分間放置した。反応は、５０μｌの0.2M H2SO4を各ウェルに加えることによって終了した。BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, バーモント州ウィノースキー）を用いて、反応混合物のOD450-570を測定した。
【００４７】
OD450-570が高かったトランスフェクタントをピックアップし、限界希釈法により単一細胞クローニングを行った。上の段落に記載したのと同じＥＬＩＳＡ及び検出を行って、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域及びＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質を含む融合タンパク質を高発現しているセルラインを同定した。
【００４８】
実施例３    ヒトG-CSFRの細胞外部分／ＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質の精製
ヒトG-CSFRの細胞外部分／ＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質を発現しているトランスフェクタント細胞からの培養上清１リットルを回収し、製造者の指示書(Biopresessing Inc.,ニュージャージー州プリンストン）に従い、Prosep-Aアフィニティクロマトグラフィーによってキメラ性タンパク質を精製した。このタンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）アフィニティカラム上でさらに精製した。このキメラ性タンパク質の純度をSDS-PAGE及び免疫ブロットの両方により測定した。
【００４９】
実施例４  ハイブリドーマ生成
精製された５０μｇのヒトG-CSFレセプターの細胞外領域及びＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質を、フロインドの完全アジュバント（Difico Laboratories,ミシシッピー州デトロイト）及び２００μｌのリン酸緩衝塩溶液(PBS, pH7.4)中に含むものをBALB/cマウス(Harlan,テキサス州ヒューストン）に皮下注射した。２週間及び４週間後に、フロインドの不完全アジュバント中に含まれた同じ量の融合タンパク質でマウスをブースターした。２週間後、かつ、屠殺の３日前に、マウスに最後のブースターを腹腔内投与した。それらの脾細胞をSp2/0ミエローマ細胞と融合させた。５０％ポリエチレングリコール(MW 1450)(Kodak,ニューヨーク州ロチェスター）及び５％ジメチルスルホキシド(Sigma,ミズーリー州セント  ルイス）を含む培地中で5 x 108個のSp2/0と5 x 108個の脾細胞を融合させた。5% FBS、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、0.1 mMヒポキサンチン、0.4μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを添加したIscove培地(Gibco BRL,メリーランド州ガイサースバーグ）２００μｌ当たり脾細胞が5 x 104個になるように細胞濃度を調整した。１００枚のマイクロプレートの各ウェルに２００μｌの細胞浮遊液を加えた。１０日後、実施例７に記載された生体外細胞増殖アッセイを用いたスクリーニングのために培養上清を吸引した。
【００５０】
実施例５  ヒトG-CSFレセプターの全長をコードするｃＤＮＡのクローニング
Ultraspec-3  ＲＮＡ単離キットを用い、製造者の方法(Biotex Laboratories Inc.,テキサス州ヒューストン）を用い、ヒトセルラインAML-193(ATCCカタログNo. CRL-9589)から全ＲＮＡを調製した。AML-193セルラインからの全ＲＮＡ１０μｇを、製造者のプロトコール(Gibco BRL、メリーランド州ガイサースバーグ）に従う逆転写反応における第一鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型として用いた。ヒトG-CSFレセプターのＣ末端側半分をコードするｃＤＮＡを増幅するために、得られた第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、２つのプライマー、NheI: CCC CCC CAG CGC TAG CAA TAG CAA CAA GAC CTG GAG G（配列番号３）及びR10: GGA ATT CCT AGA AGC TCC CCA GCG CCT CC（配列番号４）を含む５０μｌの反応混合物中でＰＣＲを行った。反応条件は次の通りであった。９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、３分間で４０サイクル。ＰＣＲ産物を、SmaIで消化したクローニングベクターpUC19にクローニングし、プラスミドpC3を精製した。ヒトG-CSFレセプターのＮ−末端側半分をコードするｃＤＮＡ断片の末端に新たな制限酵素部位Nhe1を生成するために、ＰＣＲにおいて、２つのプライマーを用い、プラスミドpCGC23ＤＮＡを鋳型として用いた。これらのプライマーは、T7P: AAT ACG ACT CAC TAT AG（配列番号５）及びNhe2: AGG TCT TGT TGC TAT TGC TAG CGC TGG GGG GGC CCA GG（配列番号６）であった。このＰＣＲ反応からの、ヒトG-CSFレセプターのＮ−末端側半分をコードするＤＮＡ断片を、ベクターpCR-Blunt(Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングしてプラスミドpB12を生成した。ヒトG-CSFレセプターの全長を組み立てるために、プラスミドpB12からのG-CSFレセプターＮ−末端側半分のＤＮＡ断片を、Nhe1及びHincIIで消化したプラスミドpC3に挿入し、プラスミドpCB1を生成した。ヒトG-CSFレセプターの全長をコードするｃＤＮＡ断片を、哺乳動物発現プラスミドpcDNA3（Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド）に挿入し、プラスミドpCGF4を生成した。
【００５１】
実施例６    G-CSF−依存性マウス及びヒトセルラインの確立及び特徴付け
ヒト全長G-CSFレセプターを発現するプラスミドpCGF4をBspC1消化により線状化した後、実施例２において上記したエレクトロポレーションにより、マウスセルライン32D-c123又はヒトセルラインTF-1(ATCC,バージニア州）にトランスフェクトした。10% FBS, 0.8 mg/mlのG418、及び1 ng/mlのmIL-3又は1 ng/mlのヒトGM-CSF（R&D Systems, ミネソタ州ミネアポリス）を添加したRPMI 1640中での増殖によってトランスフェクタントを選択し、さらに、10% FBS, 0.6 mg/mlのG418及び1 ng/mlのrhG-CSF(R&D Systems)を含むRPMI培地を用いた、実施例７に記載するMTTアッセイによってさらに選択した。ヒトG-CSFによって増殖が刺激されたトランスフェクタントは、限界希釈法により単一細胞クローニングした。
【００５２】
完全長ヒトG-CSFレセプター発現プラスミドを含むヒト及びマウストランスフェクタントのG-CSFに対する増殖依存性は、実施例７に記載するように、これらのトランスフェクタントをヒトG-CSF、ヒトGM-CSF又はIL-3の存在下及び非存在下で増殖させることにより測定した。これらのサイトカインによる、トランスフェクタントの増殖依存性は、実施例７に記載するようにMTTアッセイ及び3H-チミジン取り込みアッセイを用いて監視した。
【００５３】
細胞膜表面上にヒトG-CSFRを発現するトランスフェクタントは、FACS分析により確認した。1% BSA含有PBSで洗浄した後、50  lの精製モノクローナル抗体を、終濃度５μｇ／ｍｌでトランスフェクタント細胞に加えた。細胞混合物を氷上で３０分間インキュベートし、１５分毎に振盪した。冷PBSで３回洗浄後、FITC結合ヤギ抗マウスIgG[F(ab')2]を、1:50希釈でトランスフェクタント細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。冷PBSで３回洗浄した後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで一夜固定した。これらのmAbが結合するトランスフェクタント細胞の細胞結合パーセンテージは、FACS分析によって分析した。
【００５４】
実施例７    生体外細胞増殖アッセイ
MTT-系比色アッセイ(te Boekhorst P.A., et al., Leukemia 1993, 7:1637-44)を用いて、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス又はヒトセルラインの増殖を刺激する、アゴニスト抗体の能力をスクリーニング及び測定した。10% FBS及び1 ng/mlのmIL-3を含むRPMI培地中で前培養されたトランスフェクタント細胞を、10% FBS含有RPMIで３回洗ってmIL-3を除去し、10% FBS含有RPMI中で2.5 x 104個／ウェルの密度でプレートした。ハイブリドーマプレートからの上清又は精製抗体を各ウェルに添加した。３日間インキュベートした後、１０μｌのMTT(ＰＢＳ中2.5 mg/ml、Boehringer-Maimheim Biochemical)を各ウェルに添加した。６時間インキュベーション後、10% SDS及び0.01 N HClを含む１００μｌの溶解溶液を添加して細胞を溶解し、プレートを一夜インキュベートした。アゴニスト抗体によって刺激されたこれらのG-CSF−依存性細胞の増殖は、OD540-690を読むことによって監視することができる。精製抗体のアゴニスト活性を測定するMTTアッセイでは、rhG-CSF及び抗体は、２倍低減希釈で２系列又は３系列で希釈を行った。
【００５５】
hG-CSFレセプターでトランスフェクトされた細胞を刺激する、これらのアゴニスト抗体の能力は又、3H-チミジン取り込みアッセイを用いて測定することもできる。10% FBSを含み、サイトカインを含まない培地で３回洗浄した後、1-2 x 104トランスフェクタント細胞（５０μｌ／ウェル）を、RPMI 1640及び10% 透析FBSとを含む９６−ウェルプレート中で、種々の濃度のmIL-3, rhG-CSF(R&D Biosystems)、ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体と混合した。４８時間インキュベーション後、細胞を細胞を細胞回収機(Skatron, バージニア州）で回収し、3H-チミジンの取り込みを、液体シンチレーション分析器で各３回測定した。
【００５６】
実施例８  ヒトG-CSFレセプターアゴニストモノクローナル抗体の精製
ハイブリドーマから生成された抗体を、Prosep-Aアフィニティクロマトグラフィーにより、製造者の指示書(Bioprocessing Inc.,ニュージャージー州プリンストン）に従って精製した。ヒトG-CSFアゴニスト抗体の純度を、SDS-PAGE及びウェスタンブロットを用いてチェックした。モノクローナル抗体のうちの２つをmAb163-93及びmAb174-24-11と命名した。
【００５７】
実施例９  骨髄コロニー形成アッセイ
健康なボランティアから約１０ｍｌのヒト骨髄細胞を採取し、常法によりFicoll-Paque分離を行った。界面の細胞を注意深くパスツールピペットで回収し、３倍体積のIMDM+2% FBSに懸濁し、次いで400 gで５分間遠心した。この方法により、原始細胞が２〜４倍に濃縮された最終の骨髄細胞浮遊液が得られた。なぜなら、より成熟し、より密度の大きな骨髄細胞は、赤血球と共に除去されるからである。これらのヒトG-CSFRアゴニスト抗体の特異性を測定するために、製造者によって提供されたプロトコール(StemCell Technologies Inc.,カナダ国バンクーバー）に従って顆粒球コロニー形成アッセイを行う。ヒト又はチンパンジー骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を刺激する、アゴニスト抗体の能力及び効率を定量的に測定するために、異なる濃度の系列のアゴニスト抗体又はrhG-CSFを２つずつこのアッセイに適用した。図７及び図９に示されるように、アゴニスト抗体mAb163-93は、rhG-CSF (R&D Biosystems)と同様に、ヒト又はチンパンジー骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を濃度依存的に刺激する。細胞染色の結果は、このアゴニストmAbが、どのようにヒト及びチンパンジー骨髄からの好中球の増殖及び分化を刺激するのかを示している。
【００５８】
実施例１０  チロシンリン酸化アッセイ
サイトカイン及びアゴニスト抗体により誘起されるチロシンリン酸化を以下のようにして分析した。対数期の約2 x 107個の細胞を回収し、無血清培地で３回洗浄した後、無血清RPMI培地中で４時間培養して飢えさせた。飢えた細胞を、終濃度2.6 nMのmIL-3、rhG-CSF(R&D Biosystems)又はアゴニストmAbで刺激し、次いで、遠心で回収した。細胞を、1 mMのNa3VO4、1μＭのペプスタチン、５０μＭ の3,4-ジクロロイソクプマリン(dichloroisocpumarin)、1 mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1 mMの1,10-フェナンスロリン、ロイペプチン(10μg/ml)及びアプロトニン(10 μg/ml)を添加した0.5 mlの溶解バッファ(50 mN Tris.HCl, pH7.5/150 mM NaCl/1%(vol/vol)Triton X-100/1 mM EDTAで溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、溶解物を14,000 rpmで１５分間遠心することによって清澄化した。免疫沈降のために、JAK1、JAK2又はStat3(Upstate Biotechnology, ニューヨーク州レイクプラシッド）に対するウサギポリクローナル抗体を清澄化された溶解物に添加し、４℃で２時間インキュベートした。次いで５０μｌのプロテインＡビーズ(Gibco BRL)を各溶解物に加え、インキュベーションを４℃で２時間継続した。インキュベーション後、ビーズを溶解バッファで３回洗浄し、３５μｌのレムリの試料バッファ(62.5 mM Tris:pH7.6, 2% SDS, 10%グリセロール及び5% 2-メルカプトエタノール）中に懸濁した。懸濁液を９５℃で５分間加熱し、4%-7.5% SDS-PAGE上で電気泳動した。ブロッティング後、ブロックされたフィルターを、製造者のプロトコールに従って、HRP-結合マウスモノクローナル抗フォスフォチロシン抗体4G10(Upstate Biotechnology)と共にインキュベートした。ＰＢＳ及び0.05% Tween 20含有ＰＢＳで洗浄した後、フィルターを、製造者の指示書に従ってSuperSignal Substrate kit (Pierce、イリノイ州ロックフォード）で検出した。該ニトロセルロースフィルターを、抗体及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合第二抗体で上記と同様に再プローブした。
【００５９】
実施例１１  ハイブリドーマ細胞からのアゴニスト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ断片の分析
アゴニスト抗体を産生するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、実施例１に記載したように、RT-PCR反応の鋳型として用いた。これらのＰＣＲ反応に用いたプライマーは、下記配列番号７〜１４に示されている。ＰＣＲ反応により生成されたＤＮＡ断片は、クローニングベクターpCR-Blunt (Invitrogen)にクローニングし、製造者の指示書に従って、自動ＤＮＡシーケンサーGenetic Analyzer 310(PE Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて分析した。２つの別々のRT-PCR反応からの個々の組換えプラスミドを分析し、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のＤＮＡ配列がアゴニスト抗体由来であることを確認した。
【００６０】
可変領域のクローニングのために用いたプライマーのＤＮＡ配列
mAb163-93可変領域のクローニングのためのプライマー
0003979008.tif 000003
【００６１】
mAb174-74-11クローニング用プライマー
0003979008.tif 000004
【００６２】
これらの抗体の可変領域の相補性決定領域は、以下の配列を有することが示された。
mAb163-93(IgG1サブクラス）、Ｈ鎖可変領域CDR配列：
CDR1: Asn Tyr Gly Met Asn（配列番号１５）
CDR2: Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys Gly（配列番号１６）
CDR3: Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr（配列番号１７）
【００６３】
mAb163-93(IgG1サブクラス）、Ｌ鎖可変領域CDR配列：
CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala（配列番号１８）
CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser（配列番号１９）
CDR3: Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr（配列番号２０）
【００６４】
mAb174-74-11(IgG2aサブクラス）、Ｈ鎖可変領域CDR配列：
CDR1: Ser Tyr Ala Met Ser（配列番号２１）
CDR2: Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys Gly（配列番号２２）
CDR3: Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr（配列番号２３）
【００６５】
0003979008.tif 000005
【００６６】
上記した用語、表現、実施例及び具体例は、例示のためだけのもので非限定的なものであり、本発明の範囲は以下の請求の範囲に規定され、請求の範囲に記載された発明の全ての均等物を包含する。
【００６７】
0003979008.tif 000006
【００６８】
0003979008.tif 000007
【００６９】
0003979008.tif 000008
【００７０】
0003979008.tif 000009
【００７１】
0003979008.tif 000010
【００７２】
0003979008.tif 000011
【００７３】
0003979008.tif 000012
【００７４】
0003979008.tif 000013
【００７５】
0003979008.tif 000014
【００７６】
0003979008.tif 000015
【００７７】
0003979008.tif 000016
【００７８】
0003979008.tif 000017
【００７９】
0003979008.tif 000018
【００８０】
0003979008.tif 000019
【００８１】
0003979008.tif 000020
【００８２】
0003979008.tif 000021
【００８３】
0003979008.tif 000022
【００８４】
0003979008.tif 000023
【００８５】
0003979008.tif 000024
【００８６】
0003979008.tif 000025
【００８７】
0003979008.tif 000026
【００８８】
0003979008.tif 000027
【００８９】
0003979008.tif 000028
【００９０】
0003979008.tif 000029
【００９１】
0003979008.tif 000030
【００９２】
0003979008.tif 000031
【００９３】
0003979008.tif 000032
【００９４】
0003979008.tif 000033
0003979008.tif 000034
0003979008.tif 000035
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、MTTアッセイにより測定すると、マウス細胞32D-c123の増殖は、rmIL-3によってのみ刺激され、rhG-CSFによっては刺激されないことを示す。
【図２】  図１Ｂは、32D-c123をヒトG-CSFレセプターの全長でトランスフェクトした後では、MTTアッセイで測定すると、トランスフェクタントＤ４細胞の増殖は、rmIL-3及びrhG-CSFにより別々に刺激することができることを示している。
【図３】  図１Ｃは、トランスフェクタントＤ４による3H-チミジン取り込みは、mIL-3又はrhG-CSFを含有する培地で増殖させた場合には濃度依存的に増加するが、コントロールmAbを含有する培地で増殖させた場合には増加しないことを示す。
【図４】  図２は、rhG-CSFにより誘起された、ヒトG-CSFレセプターの全長でトランスフェクトされたＤ４細胞中でのJAK1キナーゼのチロシンリン酸化を示す。同じJAK1キナーゼのチロシンリン酸化は、rhG-CSF(R&D Biosystems)の存在下においてさえ、親細胞32D-c123中では検出されなかった。ポジティブコントロールとしての、内発性ヒトG-CSFレセプターを発現するヒトG-CSF−応答性細胞AML-193(ATCC No. CRL-9589)ではまた、rhG-CSFの刺激によってJAK1キナーゼのチロシンリン酸化が示された。IP:図に示す抗体での免疫沈降。ブロット：示されるように、HRP-結合抗体による検出。Anti-pTy: 抗フォスフォチロシン抗体4G10(Upstate Biotechnology,ニューヨーク州レイクプラシッド）。
【図５】  図３は、mAb163-93がG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc)キメラ性タンパク質に結合することをＥＬＩＳＡにより示している。ヒトG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc)は、Immulon 2プレート上にコートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ(Fc)抗体によって捕捉される。 マウス抗体mAb163-93のヒトG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc)キメラ性タンパク質への結合は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ(Fc)の結合により検出された。
【図６】  図４Ａは、FACS分析により測定すると、全長ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４への結合パーセンテージは、mAb163-93では濃度依存的に増加するが、同じアイソタイプのコントロールmAbG3-519では増加しないことを示す。
【図７】  図４Ｂは、結合細胞パーセンテージにより示すと、mAb163-93は、全長ヒトG-CSFレセプターを発現するマウス細胞Ｄ４に特異的に結合するが、その親細胞32D-c123には結合しないことを示す。
【図８】  図５Ａ及び図５Ｂは、MTTアッセイで測定した、mAb163-93及びmAb174-74-11を包含する種々のマウスモノクローナルアゴニスト抗体によって刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を示す。同じアイソトープの、HIV-gpt120に対するmAb G3-519及びrhG-CSF(R&D Biosystems)をネガティブ及びポジティブコントロールとして設定した。
【図９】  図５Ａ及び図５Ｂは、MTTアッセイで測定した、mAb163-93及びmAb174-74-11を包含する種々のマウスモノクローナルアゴニスト抗体によって刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を示す。同じアイソトープの、HIV-gpt120に対するmAb G3-519及びrhG-CSF(R&D Biosystems)をネガティブ及びポジティブコントロールとして設定した。
【図１０】  図５Ｃは、3H-チミジンの取り込みによって示されるように、mAb163-93及びmAb174-74-11を包含するモノクローナル抗体のパネルは、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を刺激することができることを示す。
【図１１】  図６Ａ及び６Ｂは、サイトカインrmIL-3、rhG-CSF、及びアゴニスト抗体mAb163-93により刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４中のキナーゼJAK2（図６Ａ）及び転写因子Stat3（図６Ｂ）のチロシンリン酸化を示す。
【図１２】  図６Ａ及び６Ｂは、サイトカインrmIL-3、rhG-CSF、及びアゴニスト抗体mAb163-93により刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４中のキナーゼJAK2（図６Ａ）及び転写因子Stat3（図６Ｂ）のチロシンリン酸化を示す。
【図１３】  図７Ａ及び図７Ｂは、ヒト骨髄からの顆粒球のコロニー形成の刺激の定量アッセイを示す。図７Ａ：rhG-CSF及びマウスmAb163-93（コントロールmAb G3-519は、mAb163-93とアイソタイプが同じである）並びに図７Ｂ：他のマウスアゴニストmAb。
【図１４】  図７Ａ及び図７Ｂは、ヒト骨髄からの顆粒球のコロニー形成の刺激の定量アッセイを示す。図７Ａ：rhG-CSF及びマウスmAb163-93（コントロールmAb G3-519は、mAb163-93とアイソタイプが同じである）並びに図７Ｂ：他のマウスアゴニストmAb。
【図１５】  図８は、8A:アイソタイプが同じコントロールmAb G3-519; 8B: rhG-CSF(R&D Biosystems)； 8C: モノクローナルアゴニスト抗体mAb163-93により刺激されたヒト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を示し、8Dは、8Cのコロニーからピックアップされた細胞の細胞染色後の形態を示す。
【図１６】  図９は、mAb163-93が、チンパンジー骨髄からの顆粒球のコロニー形成を濃度依存的に刺激することができることを示す。
【図１７】  図１０は、10A: 濃度50 nMの同じアイソタイプのモノクローナル抗体G3-519; 10B: 濃度0.5 nMのrhG-CSF(R&D Biosystems); 10C: 濃度5 nMのモノクローナルアゴニスト抗体mAb163-93により刺激された、チンパンジー骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を示し、10Dは、Cのコロニーからピックアップされた細胞の細胞染色後の形態を示す。
【図１８】  図１１は、ヒトG-CSFレセプターに対するアゴニストmAb163-93が、内発性マウスG-CSFレセプターを発現するマウス細胞NFS60の増殖を刺激することを示す。
【図１】
0003979008.tif 000036
【図２】
0003979008.tif 000037
【図３】
0003979008.tif 000038
【図４】
0003979008.tif 000039
【図５】
0003979008.tif 000040
【図６】
0003979008.tif 000041
【図７】
0003979008.tif 000042
【図８】
0003979008.tif 000043
【図９】
0003979008.tif 000044
【図１０】
0003979008.tif 000045
【図１１】
0003979008.tif 000046
【図１２】
0003979008.tif 000047
【図１３】
0003979008.tif 000048
【図１４】
0003979008.tif 000049
【図１５】
0003979008.tif 000050
【図１６】
0003979008.tif 000051
【図１７】
0003979008.tif 000052
【図１８】
0003979008.tif 000053