(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
防御抗原を含み、皮膚表皮角質層を物理的または化学的に破壊することにより活性化された表皮ランゲルハンス細胞表面に適用するための該抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項２】
支持体の片面に、防御抗原を放出可能な状態で含む該粘着層が積層されてなる粘着テープ製剤の形態であることを特徴とする請求項１記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項３】
粘着層表面が２種の領域に分かれるように該粘着層が区分され、そのいずれか一方が防御抗原を含むことを特徴とする請求項２記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項４】
支持体の両面に粘着層が積層され、片面の粘着層が防御抗原を放出可能な状態で含む粘着テープ製剤の形態であることを特徴とする請求項１記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項５】
防御抗原が、病原性微生物、その感染防御抗原となるペプチドおよび癌細胞特異的変異ペプチドからなる群より選択される１以上のものである請求項１〜４のいずれかに記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項６】
微生物感染症または癌の予防治療剤である請求項５記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤。
【請求項７】
皮膚表皮角質層を破壊することにより、表皮ランゲルハンス細胞表面にＭＨＣクラスＩ分子を発現させた後、該表皮に防御抗原を経皮接種することにより該ランゲルハンス細胞を該抗原特異的に活性化してリンパ節に移動させ、リンパ節内で前駆キラーＴ細胞を該抗原提示ランゲルハンス細胞と作用させることを特徴とする非ヒト哺乳動物の該抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項８】
請求項１または２記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤を、角質層を破壊した表皮に投与することにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする請求項７記載の非ヒト哺乳動物の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項９】
粘着テープの粘着層表面を、皮膚表皮角質層面に接着した後剥離する操作を１回以上行うことにより該角質層を破壊することを特徴とする請求項７記載の非ヒト哺乳動物の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項１０】
請求項３記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤の、防御抗原を含まない粘着層領域を用いて皮膚表皮角質層を破壊し、該抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤の、防御抗原を含む粘着層領域表面を該表皮に接着させることにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする請求項９記載の非ヒト哺乳動物の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項１１】
請求項４記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤の、防御抗原を含まない片面の粘着層を用いて皮膚表皮角質層を破壊し、該抗原特異的キラーＴ細胞賦活剤の、防御抗原を含む片面の粘着層表面を該表皮に接着させることにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする請求項９記載の非ヒト哺乳動物の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項１２】
防御抗原が、病原性微生物、その感染防御抗原となるペプチドおよび癌細胞特異的変異ペプチドからなる群より選択される１以上のものである請求項７〜１１のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【請求項１３】
非ヒト哺乳動物の微生物感染症または癌の予防および治療方法である請求項１２記載の抗原特異的キラーＴ細胞賦活方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、防御抗原を含有する該抗原特異的キラーＴ細胞賦活用、並びに微生物感染症および癌予防治療用製剤、特に粘着テープ製剤に関する。さらに、本発明は、該免疫賦活剤を用いた哺乳動物のキラーＴ細胞賦活方法、並びに微生物感染症および癌の予防治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、Ｂ型およびＣ型肝炎等のウイルス感染症や癌のような重篤な症状に至る難治療性の疾患に対して、ウイルス感染細胞や癌細胞のみを選択的に攻撃除去する薬や治療法は現在のところ無く、生体に副作用や危害を与えない有効な治療法の開発が待たれるところである。
ウイルス感染細胞や癌細胞を選択的に殺傷する１つの有効な方法として、生体が生来有している免疫系を賦活する方法が以前から注目されている。哺乳動物が持つ免疫系を誘導賦活する方法としてワクチン法が知られている。ワクチンは、生弱毒性微生物を含む生ワクチンと、不活化微生物またはその感染防御抗原を含む不活化ワクチンに分けられる。不活化ワクチンに属するコンポーネントワクチンは、微生物抗原蛋白や癌細胞表面蛋白あるいはそれらのペプチド断片などを抗原として使用するものであり、安全に免疫系を賦活する有効な手段として従来よりよく用いられてきた。しかしながら、従来のワクチン法は体液性免疫を賦活する、すなわち抗原特異的な抗体の産生を高めるものであり、細胞外に放出されたウイルス粒子等の除去には有効であるが、ウイルス感染の主体となる感染細胞や癌細胞の除去に対しては効力が無い。
【０００３】
ウイルス感染細胞や癌細胞の特異的な除去にあたっては、生体の免疫系の中でも、特にＣＤ８分子陽性のキラーＴ細胞（以下、ＣＴＬという場合もある）が重要な役割を果たす。ウイルス感染細胞はウイルス蛋白を、また癌細胞は変異蛋白をそれぞれ細胞質内でペプチド断片化し、それを主要組織適合複合体（以下、ＭＨＣという）クラスＩ分子と呼ばれる器に乗せ細胞表面に発現し、異常の起きた細胞であることを生体免疫系にアピールする。ＣＴＬは該ウイルスペプチドまたは変異ペプチド（癌抗原ペプチド）／ＭＨＣクラスＩ分子複合体を認識し、それを発現した細胞を殺傷する。
【０００４】
近年、ウイルス感染細胞や癌細胞を特異的に認識して殺傷するＣＴＬの活性化、増幅を目的としたワクチン法の研究が活発に行われるようになった。中でも、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）への抗原提示能が知られていた樹状細胞が、ＣＴＬに対してもＭＨＣクラスＩ分子を介して高い抗原提示能を有することが明らかとなり、これを用いたワクチン法の開発が最も注目を浴びている（J. I. Mayordomo et al. Nature Med. 1 (12), 1279-1302 (1995))。しかし、この方法は、末梢血中にわずかに存在する未分化樹状細胞を分離し、これを試験管内で長期間培養して増幅させ、得られる活性化樹状細胞にウイルスペプチドまたは癌抗原ペプチドを感作して細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子上に該抗原ペプチドを提示した樹状細胞を誘導し、これを生体内に移入するというものであり、未分化樹状細胞の分離や長期間培養等の煩雑な操作を伴うので、臨床応用の実現性は乏しい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ウイルス感染症や癌の有効な予防治療法を確立するための、ウイルス感染細胞または癌細胞を特異的に殺傷するＣＴＬを効率的に活性化する医薬製剤の提供である。また、本発明の別の目的は、該製剤を用いたＣＴＬの賦活方法およびウイルス感染症や癌の予防治療法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、皮膚表皮に多数常在する樹状細胞であるランゲルハルス細胞が、生体の外的刺激に対する初期バリアである表皮角質層を物理的または化学的に破壊するだけで活性化され、ＣＴＬへの抗原提示能が急激に高まること、並びに活性化された表皮ランゲルハンス細胞は、ＣＴＬへの抗原提示に重要なＭＨＣクラスＩ分子の他、ＣＴＬへの確実な接着に必要なＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０等の発現が増大させ、ＣＴＬ前駆細胞が多数存在するリンパ節内へと移動することを見出した。また、本発明者らは、角質層バリアを破壊した皮膚表皮に、バリア破壊後約２４時間以内にウイルスペプチドまたは癌抗原ペプチドを塗布するか、あるいは該抗原ペプチドを粘着層に放出可能な状態で含有する粘着テープを貼付することによって該抗原ペプチドを経皮接種すれば、表皮ランゲルハンス細胞は、その細胞表面で発現が高まったＭＨＣクラスＩ分子上に該抗原を提示しながらリンパ節へ移動し、そこでＣＴＬ前駆細胞と接着することによりＣＴＬ前駆細胞を活性化して増幅させ、効率よく該抗原特異的な成熟ＣＴＬへと分化させ得ることを見出した。さらに、本発明者らは、上記の方法で抗原ペプチドを経皮接種した哺乳動物から採取したリンパ球が、該抗原で感作した細胞のみを特異的に傷害することを確認して本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）防御抗原を含み、皮膚表皮角質層を物理的または化学的に破壊することにより活性化された表皮ランゲルハンス細胞表面に適用するための該抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（２）支持体の片面に、防御抗原を放出可能な状態で含む該粘着層が積層されてなる粘着テープ製剤の形態であることを特徴とする上記（１）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（３）粘着層表面が２種の領域に分かれるように該粘着層が区分され、そのいずれか一方が防御抗原を含むことを特徴とする上記（２）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（４）支持体の両面に粘着層が積層され、片面の粘着層が防御抗原を放出可能な状態で含む粘着テープ製剤の形態であることを特徴とする上記（１）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（５）防御抗原が、病原性微生物、その感染防御抗原となるペプチドおよび癌細胞特異的変異ペプチドからなる群より選択される１以上のものである上記（１）〜（４）のいずれかの抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（６）微生物感染症または癌の予防治療剤である上記（５）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤。
（７）皮膚表皮角質層を破壊することにより、表皮ランゲルハンス細胞表面にＭＨＣクラスＩ分子を発現させた後、該表皮に防御抗原を経皮接種することにより該ランゲルハンス細胞を該抗原特異的に活性化してリンパ節に移動させ、リンパ節内でＣＴＬ前駆細胞を該抗原提示ランゲルハンス細胞と作用させることを特徴とする哺乳動物の該抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（８）上記（１）または（２）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤を、角質層を破壊した表皮に投与することにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする上記（７）の哺乳動物の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（９）粘着テープの粘着層表面を、皮膚表皮角質層面に接着した後剥離する操作を１回以上行うことにより該角質層を破壊することを特徴とする上記（７）の哺乳動物の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（１０）上記（３）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤の、防御抗原を含まない粘着層領域を用いて皮膚表皮角質層を破壊し、該抗原特異的ＣＴＬ賦活剤の、防御抗原を含む粘着層領域表面を該表皮に接着させることにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする上記（９）の哺乳動物の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（１１）上記（４）の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤の、防御抗原を含まない片面の粘着層を用いて皮膚表皮角質層を破壊し、該抗原特異的ＣＴＬ賦活剤の、防御抗原を含む片面の粘着層表面を該表皮に接着させることにより防御抗原を経皮接種することを特徴とする上記（９）の哺乳動物の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（１２）防御抗原が、病原性微生物、その感染防御抗原となるペプチドおよび癌細胞特異的変異ペプチドからなる群より選択される１以上のものである上記（７）〜（１１）のいずれかの哺乳動物の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
（１３）哺乳動物の微生物感染症または癌の予防および治療方法である上記（１２）の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活方法の特徴は、皮膚表皮角質層を物理的または化学的に破壊することにより表皮ランゲルハンス細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子の発現が増大するとともに、活性化された表皮ランゲルハンス細胞がリンパ節に移動するという現象を利用する点にある。ＭＨＣクラスＩ分子の発現が増大した後、該表皮ランゲルハンス細胞がリンパ節へ移動するまでの間に、該表皮に防御抗原を経皮接種すれば、該ＭＨＣクラスＩ分子内自己ペプチドは該防御抗原のペプチドで置換される。
【０００９】
本発明において、防御抗原とは、病原微生物（細菌、真菌、ウイルス等）の感染防御抗原となる該微生物由来蛋白、癌細胞特異的に発現する変異蛋白、あるいは免疫原性を保持したそれらのペプチド断片等の他、従来生ワクチンまたは不活化ワクチンとして使用される生弱毒性微生物またはその死菌などもすべて包含する。微生物由来蛋白としては、例えばＨＩＶ由来蛋白、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスの表面抗原、インフルエンザウイルスの表面抗原等が、また、癌細胞特異的変異蛋白としては、癌化細胞分化抗原蛋白等が挙げられる。該防御抗原は１種のみでも、複数の防御抗原を混合して使用してもよい。
【００１０】
活性化された表皮ランゲルハンス細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子／防御抗原ペプチド複合体で抗原提示しながらリンパ節内へと移動し、リンパ節内で該防御抗原を特異的に認識するＭＨＣ拘束性Ｔ細胞レセプターを有するＣＴＬ前駆細胞と密接に結合する。両細胞の結合には、抗原−レセプター間結合の他、ＭＨＣクラスＩ分子−ＣＤ８間、ＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１間、ＬＦＡ−３−ＣＤ２間結合が寄与する。該結合によりＣＴＬ前駆細胞は活性化されて増幅し、該抗原特異的な成熟ＣＴＬへと分化する。この成熟し増幅した抗原特異的ＣＴＬはリンパ液の循環に乗って全身をパトロールし、該抗原を提示する標的細胞（例えば、ウイルス感染細胞や癌細胞等）のみを識別して結合し、パーフォリンやグランザイムといった細胞傷害物質を放出して標的細胞を殺傷する。
【００１１】
角質層を破壊する方法は特に制限されないが、例えばアセトンなどの有機溶剤により角質間層を形成する皮脂を除く方法、あるいは機械的に角質層を破壊する方法などが挙げられる。後者の好ましい一態様として、粘着テープを表皮角質層面に接着させた後剥離する操作（以下、粘着テープストリッピングと称する）を１回ないし数回繰り返す方法が例示される（白井文哉ら、日東技報、31 (2)、76 (1993) ）。
【００１２】
粘着テープストリッピングに用いる粘着テープは、その接着力がベークライト板に対し８０ｇ／１２ｍｍ幅以上の剥離粘着力を有するものであることが好ましく、また、必要以上に角質を剥離しても効果は変わらないことを考慮すれば、１６００ｇ／１２ｍｍ幅以下の剥離粘着力であることが好ましい。粘着剤の材質としてはアクリル系ポリマー粘着剤、ゴム系ポリマー粘着剤などいずれの粘着剤であってもよい。
【００１３】
防御抗原の経皮接種は、角質層を破壊すると同時もしくは破壊後約２４時間以内に、好ましくは破壊後約１２時間以内に粘着テープストリッピングした同じ表皮表面に本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤を投与することにより行うことができる。本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤は、外用剤の形態をとるものであれば特に制限はなく、通常防御抗原と適当な外用剤用の基剤を含むものである。具体的には、例えば、防御抗原を、適当な軟膏基剤と混和して調製される軟膏剤や、あるいは粘着層を基剤として、防御抗原を該粘着層に植種する形に存在させるかもしくは該粘着層に埋め込む形で存在させて徐放放出が可能となるように設計された粘着テープ製剤（以下、抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤と称する）が挙げられる。
【００１４】
軟膏剤の場合、軟膏基剤としてワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコン、植物油、ロウ等の油脂系基剤、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、オイセリン等の乳剤性基剤、マクロゴール類等の水溶性基剤などが例示される。また、必要に応じてパラオキシ安息香酸エステル類等の保存剤を添加してもよい。
【００１５】
防御抗原の経皮接種は、該軟膏剤を角質層を破壊した皮膚表皮に塗布することにより行うことができる。軟膏剤中の防御抗原含有量は、該軟膏剤を通常量塗布した際の投与量が、１種の抗原について０．１μｍｏｌ／ｃｍ2 〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ2 の範囲となるように調整されるのが好ましい。
【００１６】
防御抗原の経皮接種の特に好ましい態様は、本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤であり、これは角質層を破壊した皮膚表皮に貼付するものである。本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤は、防御抗原が適度に徐放されるように設計されていると同時に、粘着層表面に植種されるかもしくは粘着層中に埋め込まれた該防御抗原が、少なくとも本来の防御抗原としての機能を保持する程度に安定に存在することが必要である。また、この抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤の粘着力は、表皮に十分接着するほどに強く設計されていることも重要である。使用される粘着剤は、防御抗原の抗原性を低下または変化させないことが必須であるが、上記の条件を充足する粘着剤であれば、アクリル系ポリマー粘着剤であっても、ゴム系ポリマー粘着剤であってもよい。特に、好適に用いられる粘着剤としては親水性ポリマーからなる粘着剤が挙げられる。
【００１７】
親水性ポリマーとしては、アラビアゴム，カルボキシメチルセルロースなどの水溶性天然高分子など、またビニルピロリドン、ビニルアルコール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、アクリル酸などの水溶性モノマーを重合してなるポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメトキシエチルアクリレート、ポリアクリル酸など、さらにこれら水溶性モノマーの２種以上の共重合体が例示される。また本発明で求められる親水性を損なわない範囲内で、アクリル酸ブチルやアクリル酸−２−エキシヘキシルなどの疎水性モノマーが重合された粘着性高分子であってもよい。
【００１８】
より好ましい親水性ポリマーとして、アルコキシアルキルアクリレートおよびＮ−ビニルラクタムからなるアクリル系共重合体が挙げられる。アクリル系共重合体のモノマー成分であるアルコキシアルキルアクリレートとしては、炭素数１〜４のアルコキシ基と炭素数２〜４のアルキル基あるいはアルキレングリコール基とをもつアクリレートが好ましい。具体的には、例えば２−メトキシエチルアクリレート、２−エトキシエチルアクリレート、２−ブトキシエチルアクリレート、３−メトキシプロピルアクリレート、３−エトキシプロピルアクリレートさらにメトキシトリエチレングリコールアクリレート、メトキシジプロピレングリコールアクリレートなどのアルコキシアルキレングリコールアクリレートが挙げられ、親水性が高いなどの点から、２−メトキシエチルアクリレート、２−エトキシエチルアクリレートが好ましい。
【００１９】
もう一方のモノマー成分であるＮ−ビニルラクタムとしては、５〜７員環のＮ−ビニルラクタムが使用される。例えば、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−ビニル−２−ピペリドン、Ｎ−ビニル−２−カプロラクタムなどが挙げられるが、安全性や凡用性の面からＮ−ビニルピロリドンが好ましい。
【００２０】
アルコキシアルキルアクリレートの配合割合は特に限定されないが、好ましくはアクリル系共重合体全体の６０〜８０重量％であり、さらに好ましくは６５〜７５重量％である。また、Ｎ−ビニルラクタムの配合割合も特に制限はないが、好ましくはアクリル系共重合体全体の２０〜４０重量％であり、さらに好ましくは２５〜３５重量％である。
【００２１】
親水性高分子の製造は、それぞれ自体既知の方法で行うことができる。例えばアクリル系共重合体は、溶液重合、乳化重合、懸濁重合、塊状重合、光重合などのいずれの共重合方法で製造してもよい。
【００２２】
粘着層には、さらに適度な粘着性を付与するために、親水性または水溶性の低分子物質を添加してもよい。親水性または水溶性の低分子物質としては、沸点が１００〜４００℃の高沸点液状化合物が挙げられる。その具体例として多価アルコール、糖アルコールなどが挙げられるが、この時タンパク質と反応して褐変反応（メイラード反応）など起こさない還元糖が好ましく用いられる。多価アルコールとしてはエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、液状ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，１，１−トリヒドロキシプロパン、グリセリンなど還元糖としては、ソルビトール、ソルビタン、エリスリトール、キシリトール、トレハロースなどが挙げられる。
【００２３】
またグリセリンとエチレングリコールやプロピレングリコールとのエーテル型付加体であるポリオキシエチレングリセルエーテルやポリオキシプロピレンソルビトールエーテルやポリオキシエチレンソルビタンエーテルでもよい。これらの親水性又は水溶性低分子物質の使用量は、粘着層を形成する粘着剤の５〜９０重量％範囲で添加される。
【００２４】
上記の親水性粘着層は、粘着層全体が架橋されていて、該粘着層を構成する成分のうち５〜７５％が水によって溶解溶出されないゲル状不溶体を構成してもよい。この場合の粘着層の架橋方法としては、架橋剤の添加による方法が挙げられる。架橋剤としては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、トリグリシジルイソシアヌレートなどの多価エポキシ化合物、コロネートＬやコロネートＨＬ（日本ポリウレタン社製）などのイソシアネート化合物が用いられる。これらの架橋剤の添加量は、粘着層を構成する粘着剤１００重量部に対して通常０．０１〜５重量部の範囲で選ばれる。
【００２５】
また、別の粘着層の架橋方法としては、例えば電子線またはγ線などの放射線照射架橋による不溶化が挙げられる。この場合の放射線の照射線量は、例えばアクリル系共重合体であれば、１ＫＧｙ以上、特に２５ＫＧｙ以上５０ＫＧｙ以下とすることが好ましい。
【００２６】
粘着層は、生体の表皮に貼布するに十分な粘着力を有するように設計されていれば特に制限はないが、例えば、ベークライト板に対して３０ｇ／１２ｍｍ幅以上、好ましくは８０ｇ／１２ｍｍ幅以上の剥離粘着力を有するものが挙げられる。必要以上に生体皮膚に粘着すると皮膚組織を傷めてしまう場合があるので、６００ｇ／１２ｍｍ幅以下の剥離粘着力を有するように設計するのがより好ましい。粘着層の厚さは、所要の剥離粘着力が得られ、且つ剥離する際に粘着層が凝集破壊することがないように設計されていればよく、通常１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜８０μｍの範囲が用いられる。
【００２７】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤は、少なくとも粘着層の一部に防御抗原を放出可能な状態で含有するものであれば、使用に応じて種々の剤型を選択することができる。該粘着テープ製剤を防御抗原の経皮接種のみに使用する場合、支持体の片面に粘着層が積層され、該粘着層全体に、好ましくは均一になるように防御抗原が含まれるものが例示される。一方、角質層を破壊するための粘着テープストリッピングと防御抗原の経皮接種の両方に該粘着テープ製剤を使用する場合、支持体の片面に粘着層が積層され、該粘着層の表面が２種の領域に分かれるように粘着層が区分され、そのいずれか一方の粘着層領域に防御抗原が含まれるもの、あるいは支持体の両面に粘着層が積層され、片面の粘着層にのみ防御抗原が含まれるものが例示される。どちらの剤型においても、防御抗原を含まない粘着層領域が粘着テープストリッピングに、防御抗原を含む粘着層領域が防御抗原の経皮接種のためにそれぞれ使用される。両粘着層領域は、粘着テープストリッピングおよび防御抗原の経皮接種にそれぞれ要求される上記の条件を充足する限り、同一の粘着層であっても異なる粘着層であってもよい。
【００２８】
本発明で用いる柔軟なシート状の支持体は、取扱時破壊しない程度に十分な強度があれば特に材質は限定されないが、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどからなるプラスチックフィルムが好適に用いられる。
【００２９】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤は、例えば、上記の粘着性親水性高分子と親水性低分子物質を含有する水溶液または水／アルコール混合溶液に、防御抗原を必要な濃度で含むように調整された水分散液または水／アルコール混合分散液を加えてよく混合分散させた後、柔軟なシート上の支持体上に一定の厚さで塗布し、１０〜２００℃の範囲の適当な温度で乾燥することによって製造される。この時乾燥温度は、塗布した粘稠な分散液中の内容物の変質を防ぐためにはできるだけ低い温度が好ましく、通常３０〜１００℃の温度の範囲が用いられる。この方法で製造される粘着テープ製剤の粘着層は必要な濃度で、且つ均一に防御抗原を含有することになる。また、防御抗原の全体もしくは一部が、形成された粘着層に埋め込まれている形で存在しており、結果的に該防御抗原が適度に徐放されるように設計されることになる。また、本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤の別の製造方法としては、上記の粘着性親水性高分子と親水性低分子物質を含む水溶液または水／アルコール混合溶液をそのまま柔軟なシート状の支持体上に一定の厚さで塗布し、１０〜２００℃の範囲の適当な温度で乾燥させることによって、また必要に応じて架橋処理することによって、まず防御抗原を含有しない粘着テープを製造した後、防御抗原を必要な量で含むように調整された水分散液または水／アルコール混合分散液を、該粘着テープの粘着層表面に必要な防御抗原植種量になるように塗布し、水またはアルコールを蒸散乾燥させる方法が挙げられる。防御抗原を含む粘着層領域と、防御抗原を含まない粘着層領域を有する剤型の粘着テープ製剤は、上記２通りの製造方法を適当に組み合わせることにより製造することができる。
【００３０】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活用粘着テープ製剤は、通常、防御抗原量が、１種の抗原について０．１μｍｏｌ／ｃｍ2 〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ2 の範囲で含まれるように設計調整されるのが好ましい。
【００３１】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤は、上記の角質層破壊とそれに続く防御抗原の経皮接種により該抗原特異的ＣＴＬを感作、増幅させるものである。結果として生じる抗原特異的ＣＴＬはリンパ系を循環しながら、該防御抗原を提示する細胞（例えば、ウイルス感染細胞、癌細胞など）を特異的に識別して結合し、これを殺傷する。したがって、該抗原特異的ＣＴＬ賦活剤は、ウイルス等の微生物感染症や癌の予防および治療用に使用することができる。
【００３２】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤は、一般にＴ細胞依存性の細胞性免疫系を有する動物に対して適用できるが、好ましくは、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物に用いられる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明する。
【００３４】
実施例１
（１）粘着テープストリッピングによる皮膚角質層バリア破壊後の表皮ランゲルハンス細胞数の変化測定
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス耳翼の一方の角質層を市販のセロファンテープでストリッピング操作を１０回繰り返すことによって破壊し、１２、２４、４８時間後の一定面積に切除した耳翼表皮シートをトリプシン処理することによって表皮細胞浮遊液を得た。これをＭＨＣクラスII抗原の一つであるＩ−Ａb 抗原に特異的な抗体で染色し、Ｉ−Ａb 抗原強陽性のランゲルハンス細胞をフローサイトメトリーによりカウントした。コントロールには、同一マウス個体の角質層を破壊していないもう一方の耳翼表皮を用いた。結果を図１に示す。
【００３５】
粘着テープストリッピングしていないマウス耳翼表皮にはランゲルハンス細胞が定常量で存在しているが、ストリッピング処理した方の耳翼表皮のランゲルハンス細胞数はテープストリッピング後１２時間でほぼ半減し、表皮を離れて他組織へ移動していることが明らかとなった。ランゲルハンス細胞の移動はテープストリッピング後約１２〜２４時間で最大となり、その後表皮ランゲルハンス細胞数は徐々に増加して定常量まで回復した。
（２）角質層バリア破壊後の表皮ランゲルハンス細胞の活性化アクセサリー分子の発現
Ｂ６マウスの一方の耳翼角質層を実施例１−（１）で用いたのと同じ粘着テープを用いてストリッピング操作を１０回繰り返すことによって破壊し、０、１２、２４、４８時間後にそれぞれ切除した耳翼の表皮シートをトリプシン処理し、表皮細胞浮遊液を得た。これをＩ−Ａb ，ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１），ＣＤ８６（Ｂ７−２）およびαβＴＣＲにそれぞれ特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。コントロールとしては、同一マウス個体の角質層を破壊していないもう一方の耳翼表皮を用いた。結果を図２に示す。
【００３６】
粘着テープストリッピングした耳翼表皮ランゲルハンス細胞は、１２、２４時間後に活性化し、ＣＴＬに抗原提示する際のＣＴＬとの結合などに重要なＩＣＡＭ−１，Ｂ７−２，ＣＤ４０分子の発現を増大させることが判った。また、抗体のコントロールとして行ったαβＴＣＲ抗体を用いた染色ではバリア破壊後当然発現及び発現増強は観察されなかった。さらに、ＩＣＡＭ−１，Ｂ７−２，ＣＤ４０分子の発現増強は、バリア破壊後１２〜２４時間前後でピークに達し、４８時間後には活性化前のレベルに戻ることが判明した。粘着テープストリッピングしていないマウス耳翼表皮では、ランゲルハンス細胞のＩＣＡＭ−１，Ｂ７−２，ＣＤ４０分子の発現レベルに変化は見られなかった。
（３）角質層バリア破壊後の表皮ランゲルハンス細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子の発現
実施例１−（２）と同じ方法で、ＭＨＣクラスＩ分子の一つであるＨ−２Ｋb 分子の発現について検討した。結果を図３に示す。粘着テープストリッピングしたマウス耳翼の表皮ランゲルハンス細胞は、破壊１２、２４時間後に明らかにＣＴＬへの抗原提示の際重要なＨ−２Ｋb 分子の発現を増大させることが判った。一方、角質層を破壊していない耳翼表皮のランゲルハンス細胞では、該分子の発現増強は観察されなかった。
【００３７】
参考例１  抗原ペプチドの合成
公知文献に基づいて、ＭＨＣクラスＩ分子の一つであるＨ−２Ｋb 分子上に提示され、Ｂ６マウスにおいてＣＴＬを誘導活性化し得る単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）および水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来抗原ペプチド、並びに卵白アルブミン（ＯＶＡ）由来ペプチド３種を合成した。
ＨＳＶ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ４９８−５０５
（文献：Bonneau et al., Virology 195; 62-70 (1993))
配列：Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu （配列表配列番号１）
ＶＳＶ  ＮＰ  ５３−５９
（文献：Van Bleek and Nathenson, Nature 348; 213-215 (1990))
配列：Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu （配列表配列番号２）
Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ２５７−２６４
（文献：Falo et al., Nature Med. 1; 649-653 (1995))
配列：Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu （配列表配列番号３）
【００３８】
参考例２  Ｈ−２Ｋb 分子を強制発現させたＬ細胞遺伝子導入株の作製
角質層を破壊した皮膚に抗原ペプチドを塗布した際、マウス体内で誘導活性化されるＣＴＬが抗原ペプチドを提示したＨ−２Ｋb 分子に特異的なＣＴＬであるかどうかを試験管内で確かめるために、Ｈ−２Ｋb 分子を全く持たないＬ細胞にＨ−２Ｋb 分子を強制的に発現させた細胞株を作製した。
（ｉ）Ｈ−２Ｋb 分子遺伝子導入株の作製
強制発現プロモーター遺伝子の下流にＨ−２Ｋb 遺伝子を組み込み、且つチミジンキナーゼ遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを作製し、これを塩化カルシウム法によりＬtk- 細胞に導入した。遺伝子導入された細胞をチミジンキナーゼ活性を指標として選抜してＬkb遺伝子導入株を得た。
（ii）Ｌkb細胞におけるＨ−２Ｋb 分子の発現の証明
作製したＬkb細胞をＨ−２Ｋb 特異的抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。細胞のコントロールとしては遺伝子導入前のＬtk- 細胞を用い、また抗体のコントロールとしてはＨ−２Ｋb 特異的抗体と抗体のクラスだけが一致する別の抗体を用いた。その結果、Ｌkb細胞では確実にＨ−２Ｋb 分子の発現が観察された（図４）。
【００３９】
実施例２  角質層バリア破壊皮膚への抗原ペプチド塗布による抗原特異的ＣＴＬの感作及び誘導
角質層バリアを破壊した皮膚で活性化した表皮ランゲルハンス細胞が、抗原ペプチドパルスにより生体内で抗原特異的ＣＴＬを感作および誘導活性化することを以下の手順で確認した。
Ｂ６マウス耳翼の角質層を実施例１−（１）で用いたものと同じ粘着テープを用い、ストリッピング操作を１０回繰り返すことにより破壊し、ストリッピングから１２、２４、４８時間後に、参考例１で合成した抗原ペプチドを塗布する。該抗原ペプチドは７０％エタノールに溶解し、耳翼片面当たり１０μｍ塗布した。ペプチド塗布から１週間後に頚部リンパ節を切除し、リンパ球を試験管内でＩＬ−２を微量（５Ｕ／ｍｌ）に含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２日間培養した。51ＣｒでラベルしたＬkb細胞（コントロールとしてＬtk- 細胞を用いる）を抗原ペプチド５μｍｏｌでパルスした。培養したリンパ球をエフェクター細胞として、51Ｃｒラベルおよび抗原ペプチドパルスしたＬkb細胞またはＬtk- 細胞を標的細胞として細胞傷害アッセイを行った。
【００４０】
頚部リンパ節におけるＣＴＬの存在比の変化：
表１に頚部リンパ節におけるリンパ球総数及びＣＤ８陽性細胞数の変化を、各抗原ペプチド塗布毎に計測した結果を示した。抗原ペプチドは参考例１で示した３種を用いた。テープストリッピングにより活性化された抗原ペプチドパルス表皮ランゲルハンス細胞はリンパ節において抗原提示し、免疫系細胞を感作増幅してその数を増加させることが示された。特に、ＣＴＬのマーカーであるＣＤ８分子を持つリンパ球数の増加が観察された。このＣＤ８陽性リンパ球数の増加は、テープストリッピング１２〜２４時間後に最大となり、表皮におけるランゲルハンス細胞数の変化とよく対応した。したがって、活性化された表皮ランゲルハンス細胞はリンパ節に移動してリンパ節内でＣＴＬを活性化することが強く示唆された。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
ペプチド抗原特異的ＣＴＬの感作誘導：
テープストリッピング１２時間後にＨＳＶ  ｇｐ  Ｂ，ＶＳＶ  ＮＰ，ＯＶＡの３種の抗原ペプチドを、それぞれ単独に塗布した群から得た頚部リンパ球由来のエフェクター細胞についての細胞傷害アッセイの結果を図５に示す。例えば、ＨＳＶ  ｇｐ  Ｂペプチドを抗原ペプチドとして塗布した群から得た頚部リンパ節のＣＴＬは、ＨＳＶ  ｇｐ  Ｂ特異的に感作増幅しており、Ｈ−２Ｋb とＨＳＶ  ｇｐ  Ｂペプチド複合体を表現している細胞のみを認識し確実にその細胞を傷害した。ＶＳＶ  ＮＰペプチドやＯＶＡペプチドを塗布した群についても、頚部リンパ節由来のＣＴＬはそれぞれの接種された抗原ペプチドを提示する細胞のみを特異的に傷害した。なお、当然のことながら、エフェクター細胞／標的細胞の比が大きいほど確実に標的細胞を傷害した。
【００４３】
角質層バリア破壊後の皮膚への経時的な抗原ペプチド塗布によるＣＴＬの感作誘導に与える影響：
テープストリッピング１２、２４、４８時間後に抗原ペプチドを塗布したそれぞれの群から得られる頚部リンパ球由来のエフェクター細胞についての細胞傷害アッセイの結果を図６に示す。いずれの群においても、テープストリッピングにより活性化したペプチドパルス表皮ランゲルハンス細胞は、リンパ節において抗原特異的にＣＴＬを感作誘導し、それぞれの抗原ペプチドを提示する細胞のみを特異的に傷害した。テープストリッピング１２〜２４時間後に抗原ペプチドを塗布した時に、最も強く抗原特異的ＣＴＬがリンパ節内で感作誘導され、増幅していることが判った。
【００４４】
実施例３  抗原ペプチドを含有する粘着テープ製剤の製造
攪拌器付密閉型反応器に２−メトキシエチルアクリレート７０重量部、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン３０重量部、重合開始剤としてアゾイソブチロニトリル０．１７重量部及び蒸留水：メタノール：イソプロパノール混合溶剤（重量比１６：２３：１）２５０重量部を仕込み、反応容器を窒素置換した後、反応器内の温度を６０〜６２℃に維持しながら１．５時間攪拌した。続いて７５℃で２時間攪拌することにより反応を完結させた後、室温まで冷却して粘稠なアクリル系強重合体溶液を得た。この重合体溶液にポリオキシプロピレングリセリルエーテル（平均分子量４００）１０重量部、トレハロース（林原商事社品：商品名トレハオース）１０重量部を添加して完全に溶解させた。このアクリル系共重合体を含む溶液を厚さ６μｍの柔軟な薄葉ポリエステルフィルム上に塗布した後、１３０℃で１０分間乾燥させて、粘着層の厚さが５０μｍの粘着テープを得た。別に参考例１で得られる抗原ペプチドＨＳＶ  ｇｐ  Ｂを７０％エタノールに溶解した後、該粘着テープの粘着層表面に１ｃｍ2 当たり５０μｍｏｌの塗布量になるように塗布した後、エタノールを蒸散乾燥させ、ＨＳＶ  ｇｐ  Ｂペプチドを植種した粘着テープ製剤を得た。この粘着テープ製剤は、使用するまでその粘着層表面を保護する目的で離型紙を貼り付けた。
【００４５】
実施例４  角質層バリア破壊皮膚への抗原ペプチド含有粘着テープ製剤の貼付による抗原特異的ＣＴＬの感作増幅
実施例２において、抗原ペプチドを塗布する代わりに角質層破壊テープストリッピング直後に、実施例３で得られたＨＳＶ  ｇｐ  Ｂ抗原ペプチドを植種した粘着テープ製剤を貼付する以外は、実施例２と全く同様の操作を行って、角質層バリア破壊により該抗原ペプチド特異的に活性化した表皮ランゲルハンス細胞がリンパ節に移動して該抗原ペプチド特異的ＣＴＬを感作誘導することを確認した。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
テープストリッピング後、表皮ランゲルハンス細胞の活性化に必要なリードタイムの経過の後は連続的に表皮ランゲルハンス細胞の活性化が発現しているはずである。したがって、抗原ペプチド粘着テープをテープストリッピングした皮膚表面に貼り付けることにより、連続的に抗原ペプチドが接種されることとなり、結果として連続的に抗原ペプチドパルス表皮ランゲルハンス細胞がリンパ節へ移動する。その結果、連続的に抗原ペプチド特異的ＣＴＬが感作誘導されることとなる。また、結果的に実施例２の接種法に比べ抗原ペプチド特異的ＣＴＬが時間的にも早く増幅活性化され、ストリッピング時を０時間として、抗原ペプチド含有粘着テープ製剤を貼り付けてから一定時間経過後までに増幅される抗原ペプチド特異的ＣＴＬの総量も増加することがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ賦活剤は、皮膚表皮角質層の破壊とそれに続く該抗原特異的ＣＴＬ賦活剤による防御抗原の経皮接種という非常に簡便な方法により、該抗原を提示する細胞のみを特異的に識別してこれを殺傷し得るＣＴＬを効率よく感作増幅することができるので、一般に難治療性のウイルス感染症や癌の予防および治療剤として極めて有用であり、ヒトを含む哺乳動物のウイルス感染症および癌に対して副作用の少ない画期的な予防治療法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】テープストリッピングによる角質層破壊後のマウス耳翼表皮ランゲルハンス細胞の経時変化を示す図である。
【図２】テープストリッピングによる角質層破壊後のマウス耳翼表皮ランゲルハンス細胞における活性化アクセサリー分子の発現の変化を示す図である。
【図３】テープストリッピングによる角質層破壊後のマウス耳翼表皮ランゲルハンス細胞表面のＨ−２Ｋｂ分子の発現の変化を示す図である。
【図４】Ｌｋｂ細胞におけるＨ−２Ｋｂ分子の発現を示す図である。
【図５】テープストリッピングによる耳翼表皮角質層破壊１２時間後に３種の抗原ペプチドをそれぞれ単独に塗布したマウス群から得られた頚部リンパ球由来のエフェクター細胞の細胞傷害活性を示す図である。
【図６】テープストリッピングによる耳翼表皮角質層破壊１２、２４、４８時間後に、３種の抗原ペプチドをそれぞれ単独に塗布したマウス群から得られた頚部リンパ球由来のエフェクター細胞の細胞傷害活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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