(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の体液サンプル中で、フルクトサミン濃度を電気化学的に測定する方法であって、以下の工程：
ａ．該体液サンプルを、緩衝剤およびバイオセンサと接触させる工程であって、該バイオセンサが、アノードとカソードとを含む、工程と；
ｂ．該アノードに、電圧を印加する工程と；
ｃ．該アノードと該カソードとの間を通過する電流を測定する工程と；
ｄ．測定した電流を、該体液について測定したフルクトサミン濃度に対する電流の標準曲線と比較する工程と、を包含し、
該緩衝剤が、該体液サンプルのｐＨを１０〜１２．５の間に調節し、そして、該緩衝剤が、該バイオセンサ上に存在し得るか、さもなくば該電流が測定される前に該サンプルに添加され得る、方法。
【請求項２】
前記アノードが、遷移金属または炭素形成物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アノードが、ガラス状カーボン、白金、または金である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオセンサに接触されるアノード液のｐＨが、１０．５〜１１．５のｐＨに調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
参照電極を前記体液サンプルに同時に接触させる工程、ならびに該参照電極と前記アノードとの間の電圧を測定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記参照電極が、銀／塩化銀電極である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
ａ．前記体液サンプルを第２のバイオセンサと接触させる工程であって、該第２のバイオセンサが、前記バイオセンサと同様の緩衝剤、アノードおよびカソードを使用する、工程と；
ｂ．該体液サンプルを、フルクトサミン結合剤と接触させる工程と；
ｃ．該第２のアノードに対して同一の電圧を印加する工程と；
ｄ．該第２のバイオセンサの該アノードと該カソードとの間の電流を、さらに測定する工程と；
ｅ．該第２のバイオセンサにより測定された電流を、他方のバイオセンサについて測定された電流から減算する工程と；
ｆ．減算して得られた値を前記標準曲線と比較する工程と、をさらに包含し、
該フルクトサミン結合剤が、該バイオセンサ上に存在し得るか、さもなくば該電流が測定される前に該サンプルに添加され得る、方法。
【請求項８】
前記フルクトサミン結合剤が、ホウ酸、１つ以上のボロン酸誘導体、または１つ以上の抗フルクトサミン抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者の体液サンプル中で、フルクトサミン濃度を電気化学的に決定する方法であって、以下の工程：
ａ．該体液サンプルを、１つ以上のメディエータ、緩衝剤、およびバイオセンサと接触させる工程であって、該バイオセンサが、アノードとカソードから構成される工程；
ｂ．該アノードに、電圧を印加する工程と；
ｃ．該アノードとカソードとの間を通過する電流を測定する工程と；
ｄ．測定した電流を、該体液について測定したフルクトサミン濃度に対する電流の標準曲線と比較する工程と、を包含し、
該緩衝剤および該メディエータが、該バイオセンサ上に存在するか、さもなくば該電流が測定される前に該サンプルに添加され、そして、該緩衝剤が、該体液サンプルのｐＨを４〜１２．５の間に調節する、方法。
【請求項１０】
前記メディエータが、フェロセン、ニトロブルーテトラゾリウム塩、トリス［ビピリジル］ルテニウム錯体、またはトリス［ビピリジル］オスミウム錯体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アノードが、遷移金属または炭素形成物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アノードが、ガラス状カーボン、白金、または金である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液サンプルのｐＨが、１０．５〜１１．５のｐＨに調節される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液サンプルを参照電極に接触させる工程、ならびに該参照電極と前記アノードとの間の電圧を測定する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記参照電極が、銀／塩化銀電極である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記メディエータが、ニトロブルーテトラゾリウム塩であり、前記ｐＨが１０．３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記メディエータが、フェロセンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
請求項９に記載の方法であって、以下の工程：
ａ．前記体液サンプルを第２のバイオセンサと接触させる工程であって、該第２のバイオセンサが、前記バイオセンサと同様の緩衝剤、アノードおよびカソードを使用する、工程と；
ｂ．該体液サンプルを、フルクトサミン結合剤と接触させる工程と；
ｃ．該第２のアノードに対して同一の電極を印加する工程と；
ｄ．該第２のバイオセンサの該アノードと該カソードとの間の電流を、さらに測定する工程と；
ｅ．該第２のバイオセンサにより測定された電流を、他方のバイオセンサについて測定された電流から減算する工程と；
ｆ．減算して得られた値を前記標準曲線と比較する工程と、をさらに包含し、
該フルクトサミン結合剤が、該バイオセンサ上に存在し得るか、さもなくば該電流が測定される前に該サンプルに添加され得る、方法。
【請求項１９】
前記フルクトサミン結合剤が、ホウ酸、１つ以上のボロン酸誘導体、または１つ以上の抗フルクトサミン抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者の体液サンプル中で、フルクトサミン濃度を電気化学的に決定する方法であって、以下の工程：
ａ．該体液サンプルを、オキシドレダクターゼ酵素、緩衝剤、およびバイオセンサと接触させる工程であって、該バイオセンサが、アノードとカソードから構成される工程；
ｂ．該アノードに、電圧を印加する工程と；
ｃ．該アノードとカソードとの間を通過する電流を測定する工程と；
ｄ．測定した電流を、該体液について測定したフルクトサミン濃度に対する電流の標準曲線と比較する工程と、を包含し、
該緩衝剤および該酵素が、該バイオセンサ上に存在するか、さもなくば該電流が測定される前に該サンプルに添加され、そして、該緩衝剤が、該体液サンプルのｐＨを４〜１０の間に調節する、方法。
【請求項２１】
前記体液サンプルを１つ以上のメディエータまたは補因子と接触させる工程をさらに含み、該メディエータが、最初に該バイオセンサ上に存在するか、または前記電流が測定される前に該サンプルに添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素が、フルクトシルＮ−アルキルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルアミンオキシダーゼである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のメディエータが、フェロセン、ニトロブルーテトラゾリウム、トリス［ビピリジル］ルテニウム錯体、またはトリス［ビピリジル］オスミウム錯体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記補因子が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはフラビンアデニンジヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アノードが、遷移金属または炭素形成物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記アノードが、ガラス状カーボン、白金、または金である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液サンプルを参照電極に同時に接触させる工程、ならびに該参照電極と前記アノードとの間の電圧を測定する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記参照電極が、銀／塩化銀電極である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の血糖状態を測定するためのアッセイシステムに関する。より詳細には、本発明は、患者の体液サンプル中のフルクトサミン濃度を電気化学的に測定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病に罹患した個体は、一般に、異常に高い血糖値を有する。なぜなら、膵臓が、炭化水素の代謝を調節するために十分な量の活性ホルモン（インスリン）を血流中に分泌しないからである。高血糖状態として知られる、異常に高い血糖値が長期間にわたり続く場合には、個体は、糖尿病の慢性合併症（網膜疾患、腎疾患、神経疾患、および心血管疾患を包含する）に罹患する。ほぼ正常な血糖の制御を維持できる糖尿病の患者では、これらの恐ろしい合併症を起こす可能性が大きく低減することは、複数の研究から明らかである。従って、血糖状態を測定およびモニタリングするために、いくつかの試験が開発されてきた。
【０００３】
血糖状態をモニタリングするための１つの一般的な医学的試験は、糖尿病による血液グルコースレベルを直接測定することである。血液グルコースレベルは、個々の症例の種類および重篤度に依存して、食事、活動（ａｃｔｉｖｉｔｙ）、および治療法により影響を受け、所定の日を通して顕著に変動するために、幾人かの患者については、血液グルコースレベルを１日あたり７回まで測定する。測定したグルコースレベルにおいて観察されたパターンに基づき、患者および医師は共に、この疾患をよりよく管理するために、食事、運動、およびインスリン摂取の調整を行う。この情報は明らかに、すぐに患者に入手可能であるべきである。
【０００４】
しかし、所定の日におけるグルコースレベルの頻繁な変動のために、患者の食事、活動、および／または治療法に依存せずかつ血液グルコースレベルの指示をより長い期間提供する試験もまた開発されてきた。これらの試験は、タンパク質に結合するグルコースの測定を包含する。
【０００５】
全血、血清、および他の生物学的流体中に存在するようなタンパク質は、非酵素的条件下でグルコースと反応して、フルクトサミンとしても知られるグリケート化（ｇｌｙｃａｔｅｄ）タンパク質を生成する。この反応の程度は、血中のグルコース濃度に直接依存する。結果として、健康な個体と比較して、通常、糖尿病患者（ｄｉａｂｅｔｉｃｓ）は高いフルクトサミン濃度を有する。従って、グリケート化血清タンパク質の濃度は、高血糖状態の指示薬として用いられる。特に、フルクトサミンレベルの測定は、糖尿病の制御をモニタリングするのに有用である。なぜなら、フルクトサミン濃度は、一定の期間（約半月の期間）にわたる血清グルコースレベルの平均値を反映するからである。
【０００６】
フルクトサミンは、以下のように形成される。血清アルブミンのような血液タンパク質は、グルコースと血液タンパク質の有用なアミノ基（主に、リジン残基のε−アミノ基およびタンパク質末端アミノ酸のα-アミノ基）との非酵素的縮合反応により、インビボでグリケート化される。グルコースは、このタンパク質のアミノ基に結合してＳｃｈｉｆｆ塩基（すなわち、グリコシルアミンまたはアルジミン）を形成する。グリコシルアミンは、分子転位（特に、Ａｍａｄｏｒｉ転位）を受けて、「フルクトサミン」と呼ばれる安定なケトアミンを形成する。この反応シーケンスを、図１ａに図示する。安定なケトアミン構造は、いったん形成されると、その存続期間（ｌｉｆｅｓｐａｎ）を通して、このタンパク質と共に残留する。
【０００７】
フルクトサミンの特に有用な特性は、塩基性条件下で、そのエネアミノール互変異性体（フルクトサミンエネアミノール互変異性体ともいう）と平衡であることである。この平衡転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を、図１ｂに示す。このエネアミノール互変異性体は、還元剤である。例えば、Ｂｕｒｄら、米国特許出願第０８／２６９，３５１号、およびＩｓｍａｉｌ、米国特許第４，９５６，３０１号（１９９０年９月１１日）を参照のこと（その両方は、本明細書中で参考として援用される）。フルクトサミンおよびその互変異性体の還元特性は、本発明の１つの局面を提供し、そしてフルクトサミンの電気化学的測定を可能にする。図１ｃにさらに示すように、このエネアミノール互変異性体の酸化は、グルコソンおよび脱グリケート化（ｄｅｇｌｙｃａｔｅｄ）タンパク質を生じる。
【０００８】
電気化学的測定以外の手段による、フルクトサミンを測定するためのいくつかの方法は、すでに公知である。例えば、Ｂａｋｅｒは、米国特許第４，６４２，２９５号および４，６４５，７４２号において、溶液アッセイ中でフルクトサミンレベルを測定する方法を開示している。これらのタイプのアッセイは、溶液アッセイに付随した不便さおよび比較的大容量の液体サンプルを必要とすることなどのいくつかの実施上の制限を有する。このような方法は、乾燥相化学（ｄｒｙ−ｐｈａｓｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（例えば、Ｉｓｍａｉｌにより米国特許第４，９５６，３０１号に開示される）に適用されている。しかし、Ｉｓｍａｉｌの乾燥相アッセイは、試験ストリップデバイスであり、これは、反応促進化合物の使用を必要とする。開示された促進化合物は、フルクトサミンアッセイに特に有用な特定の試薬（すなわち、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）およびカーボネート緩衝液）と共には機能できない。フルクトサミン濃度を測定するための多層試験デバイスもまた、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｋａｍｏｔｏは、公開された欧州特許出願公報第０  ４７３  １８９号において、フルクトサミンをアッセイするための多層分析要素を記載する。Ｓｔａｎｉｆｏｒｄらは、欧州特許出願公報第５２６，１５０号において、フルクトサミン含有サンプルをプロテアーゼで前処理する工程、次いでこのサンプルをケトアミンオキシダーゼと反応させる工程、そして生成物（ｒｅｓｕｌｔｓ）を測色で測定する工程を包含する、酵素的方法を論じている。Ｍｏｄｒｏｖｉｃｈらは、欧州特許出願第５７３，９４２号において、サンプルをホウ酸で処理してフルクトサミンの酸化を防ぐ追加反応を利用する減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）法を用いて、フルクトサミンをテトラゾリウム塩を用いて測色的に検出している。
【０００９】
１つの報告は、グルコースオキシダーゼおよびメタロセンボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃａｃｉｄ）をメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として用いる、フルクトサミン様化合物であるグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）の電気化学的測定を記載する。ＨｂＡｌｃが存在する場合、これはメタロセンボロン酸と反応して、このメタロセンメディエータと還元されたグルコースオキシダーゼとの反応を防ぐ。Ｉｓｈｉｋａｗａらの米国特許第５，３８７，１０９号は、酵素フルクトシルアミンデグリカーゼを用いる、フルクトサミンの測色的測定を主に記載する。Ｉｓｈｉｋａｗａらは、特定のＨ２Ｏ２電極およびＯ２電極とのそれぞれの酵素触媒反応におけるＨ２Ｏ２／Ｏ２反応生成物を検出することを簡潔に述べているが、このような電極は、フルクトサミン、酵素、およびメディエータを検出する本発明のバイオセンサよりもずっと使用が不便である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記で議論した方法のほとんどは、測色検出法を用いる。測色測定に関して、サンプルの天然色または沈殿物からの頻繁な干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）が存在する。例えば、患者血液サンプル由来の赤血球は、測色測定を干渉し得る。さらに、正確な測定のために、上記のアッセイに頻繁に必要とされるサンプルの容積は、代表的にはかなりの量である。色または沈殿物からの干渉がなく、かつ比較的少ないサンプル容積で用いられ得るフルクトサミンアッセイが必要とされている。さらに、多くのタイプの体液サンプルにおいてフルクトサミンを測定するための迅速かつ簡便なアッセイが必要とされている。最後に、比較的に単純な器具を含み、好ましくは小規模化できるアッセイを得ることは望ましい。本発明は、これらの必要性を満足し、かつ、関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、患者の体液サンプル中でフルクトサミン濃度を電気化学的に測定するための方法に関する。このことは、該体液サンプルを、緩衝剤およびバイオセンサと接触させることにより確認され、このバイオセンサは、アノードとカソードとから構成される。アノードに電圧を印加し、アノードとカソードとの間を通過する電流を測定する。測定した電流量を、該体液について測定したフルクトサミンの濃度に対する電流の標準曲線と比較する。この緩衝剤は、この体液サンプルのｐＨを約１０〜約１２．５の間に調節する。この緩衝剤は、バイオセンサ上に存在し得るか、さもなくば電流が測定される前にこのサンプルに添加され得る。
【００１２】
さらに、患者の体液サンプル中でフルクトサミン濃度を電気化学的に測定するための方法は、この体液サンプルを、１つ以上のメディエータ、緩衝剤、およびバイオセンサと接触させることにより確認され、このバイオセンサは、アノードとカソードから構成される。アノードとカソードとの間に電圧を印加し、アノードとカソードとの間を通過する電流を測定する。測定した電流量を、体液について測定したフルクトサミンの濃度に対する電流の標準曲線と比較する。この緩衝剤およびメディエータは、このバイオセンサ上に存在するか、さもなくば電流が測定される前にこのサンプルに添加される。この緩衝剤は、この体液サンプルのｐＨを４〜約１２．５の間に調節する。
【００１３】
さらに、患者の体液サンプル中でフルクトサミン濃度を電気化学的に測定するための方法は、体液サンプルを、オキシドレダクターゼ酵素、緩衝剤およびバイオセンサと接触させることにより確認され得、このバイオセンサは、アノードとカソードから構成される。アノードとカソードとの間に、電圧を印加し、そして、アノードとカソードとの間を通過する電流を測定する。測定した電流量を、体液について測定したフルクトサミンの濃度に対する電流の標準曲線と比較する。
【００１４】
この緩衝剤および酵素は、このバイオセンサ上に存在するか、さもなくば該電流が測定される前にサンプルに添加される。この緩衝剤は、この体液サンプルのｐＨを４〜約１０の間に調節する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、患者のサンプル中に存在するフルクトサミン（「ケトアミン」ともいう）（図１ａ）またはその高度にアルカリ性である互変異性体（「エネアミノール」ともいう）（図１ｂ）の量を電気化学的に測定することにより、哺乳動物の血液中のグルコースレベルを測定する工程を包含する。本発明は、１つの局面において、アルカリｐＨにて、存在するエネアミノールの濃度を直接測定することの簡便性を提供し、そして他の局面において、広いｐＨ範囲にわたって、この測定と組み合わせてメディエータを使用することにより付加された感度を提供する。
【００１６】
あるいは、このような感度および簡便性は、約４〜約１０のｐＨ範囲においてオキシドレダクターゼおよび必要に応じてメディエータまたは補因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）を用いて達成され得る。
【００１７】
より詳細には、この生物分析学的発明において用いられる電気化学的技術は、アンペロメトリーとして公知である。この技術は、固定電圧において通過した電流を測定することを包含する。電圧は、この場合には、フルクトサミンおよびそのエネアミノール互変異性体（これらは、強い還元試薬である）の酸化電圧により固定されるか、あるいはフルクトサミンまたはその互変異性体もしくは酸化する酵素のいずれかからの電子を受容するメディエータか、フルクトサミンまたはその互変異性体の酸化を補助するメディエータにより、固定される。ここで、上記酵素は、必要に応じて、メディエータまたは補因子の存在下で使用される。
【００１８】
本発明の１つの局面は、フルクトサミンの直接的な電気化学的検出を包含し、そしてより詳細には、そのアルカリ性エネアミノール互変異性体の形態（図２）の直接的な電気化学的検出を包含する。従って、この体液サンプルは、得られる溶液のｐＨを約１０〜約１２．５、好ましくは約１０．３〜約１１．５の間にするため、固体緩衝剤（バイオセンサの表面上）または緩衝溶液（体液サンプルに添加される）と接触させられる。使用される緩衝剤は、酸化可能な基を含んではならない。適切な緩衝剤には、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミン）−１−プロパン硫酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）；リン酸水素ナトリウム／水酸化ナトリウム；グアナジニウムカーボネートおよびグアナジニウムホスフェートのようなグアナジニウム塩；塩化カリウム／水酸化ナトリウム；リン酸水素カリウム；メタノール性水酸化ナトリウム；水酸化テトラメチルアンモニウム；炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム；特定のアミノ酸；および当該分野で周知の他の適切な緩衝剤；あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。緩衝剤は、接触している体液サンプル中に溶解され得るように、アノードを取り囲む多孔性メッシュ（および他方の電極を取り囲む任意のメッシュ）上で乾燥され得る。
【００１９】
フルクトサミンの直接の検出の改変は、以下に述べるように、ホウ酸または１つ以上のボロン酸誘導体を用いて、体液サンプル中のフルクトサミンの電気反応性（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）がブロックされる場合に、コントロールセルを作動させることを伴う。
【００２０】
体液は、フルクトサミンのｐＨおよび電圧と類似するｐＨおよび電圧において酸化され得る物質をしばしば含む。このような物質には、尿酸およびアスコルビン酸が挙げられる。このような干渉が起こる状況下において、フルクトサミンの酸化をブロックすることが当該分野で公知であるフルクトサミン結合剤を用いて、この体液サンプルの一部でさらなる酸化が起こり得る。例えば、バイオセンサ上での多孔性メッシュの使用と組み合わせて、このサンプル自身の一部にホウ酸が添加され得る。同一のアノードハーフセル（ｈａｌｆ−ｃｅｌｌ）において、通過した電流を、未処理のアノード液（ａｎｏｌｙｔｅ）またはサンプルと同様の様式で測定する。処理されたアノード液またはサンプルからの電流の値を、未処理のアノード液またはサンプルからの電流の値から減算して、フルクトサミンの濃度を測定する。この方法の精度は、全血および関連する体液中に存在するフルクトサミンが、任意のボロン酸またはホウ酸結合化合物（１０〜１２．５のｐＨにおける還元を受ける）の最大濃度で通常存在することから、保証されている。非電気化学的分析におけるホウ酸の使用は、Ｉ．Ｅ．Ｍｏｄｒｏｖｉｃｈの欧州特許出願公報第５７３，９４２号（１９９３年１２月１５日公開）（本明細書中で参考として援用する）に記載される。あるいは、Ｈｉｌｌら、米国特許第４，８２０，６３６号（１９８９年４月１１日発行）（本明細書中で参考として援用する）で議論される、メタロセンボロン酸または他のボロン酸誘導体は、適切な制御方法を提供するために、ホウ酸と同様の様式であり得る。
【００２１】
あるいは、フルクトサミン結合剤は、フルクトサミンのエピトープに対する抗体であり得、これは、本発明の精度を増加させ得る。このような抗体は、Ｍｅｚｅｒの米国特許第４，４７８，７４４号、Ｗａｇｎｅｒらの米国特許第４，８０６，４６８号、Ｃｏｈｅｎらの米国特許第５，１８３，７３９号、およびＺｅｕｔｈｅｎらの米国特許第５，２０６，１４４号に例示され、それらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００２２】
フルクトサミンまたはそのエネアミノール互変異性体の濃度は間接的に、すなわち、フルクトサミンまたはエネアミノールからの電子を受容する物質（これらは次いでアノードで酸化される）の濃度を測定することにより、測定され得る。
【００２３】
これらの物質は、他の利点の中でも、このアッセイの電圧またはｐＨを低減することをもたらし得る。
【００２４】
間接的測定の１つの方法には、メディエータ（図３）と呼ばれる有機分子または有機金属分子を使用することが挙げられる。以下に記載する酵素と共に使用しない場合、これらのメディエータは、エネアミノール互変異性体の酸化の測定を促進するのに用いられる。メディエータは、フルクトサミンの酸化を実行するのに必要とされるセルの電圧を低下させる、電気的に活性な（ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ）化合物である。このような化合物は、電極上に直接コーティングされ得るか、体液サンプルを含むアノード液に添加され得るか、あるいは電極を取り囲む任意の多孔性メッシュ上で乾燥され得る。これらの化合物の例は、当該分野で周知であり、フェナジンエトスルフェート、フェナジンメトスルフェート、フェニレンジアミン、１−メトキシフェナジンメトスルフェート、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、クロラニル、フルオラニル、ブロマニル、テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）、テトラシアノキノドメタン（ＴＣＮＱ）、ポリビオロゲン（ｐｏｌｙｖｉｏｌｏｇｅｎ）、フェロセン、置換フェロセン（例えば、１，１’−フェロセンジカルボン酸、１，１’−ジメチルフェロセン、ビニルフェロセン、２−ヒドロキシエチルフェロセン、クロロメチルトリメチルアミノフェロセン、１，１−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン、チトクロムＣ３、ベンゾキノン、フェニレンジアミン）、ルテニウムまたはオスミウムの（ビピリジル）錯体、（１，１０−フェナントロリル）錯体、または（ターピリジル）錯体のような可溶性遷移金属有機錯体（例えば、［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３Ｃｌ２］）が挙げられる。このようなメディエータの議論は、例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓらの米国特許第４，５４５，３８２号（１９８５年１０月８日発行）（本明細書中で参考として援用する）において見出される。さらに、この電極を、導電性ポリマー材料（例えば、ポリ（アニリン）、ポリ（ピロール）、またはポリ（チオフェン））のようなポリマー性材料でコーティングし得る。
【００２５】
テトラゾリウム化合物もまた、メディエータとして使用し得る。理想的には、テトラゾリウム化合物を、約１０〜１０．８の間のｐＨで、好ましくは１０．３付近のｐＨで、体液サンプルに添加する。（体液サンプル／アノード液のｐＨを１２より低く維持することにより、テトラゾリウム化合物が、このサンプル中に存在するグルコースと反応することを防止する。）テトラゾリウム化合物は、このサンプル中に存在するフルクトサミンにより還元されて、ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を与える。次いで、ホルマザンの酸化を、アノードにおいて測定する。
【００２６】
本発明における使用に適切なテトラゾリウム化合物は、フルクトサミンと反応することが知られているものである。このような化合物には、ネオテトラゾリウムクロリド（ＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＴＮＢＴ）、ブルーテトラゾリウムクロリド（ＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロリド、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、テトラゾリウムバイオレット、２，３，５−トリフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＴＣＮＢＴ）、テトラゾリウムＸＴＴ（ＸＴＴ）、２−２’−ベンゾチアゾリル−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムクロリド（ＢＳＰＴ）、およびジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＤＳＮＢＴ）が挙げられる。好ましい化合物は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）である。
【００２７】
テトラゾリウム化合物は、バイオセンサと接触させられるアノード液中または体液サンプル中で、約１ミリモル〜約３０ミリモルの濃度で有用であるべきである。
【００２８】
フルクトサミンの測色測定のためのテトラゾリウム化合物の使用条件のさらなる議論（本発明の電気化学的測定に対立するものとして）は、Ｄ．Ａ．Ａｒｍｂｕｓｔｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３３／１２、２１５３−２１６３頁（１９８７））中、および本明細書中で列挙された参考文献中に見出され得る。
【００２９】
好ましいメディエータには、フェロセン、ニトロブルーテトラゾリウム塩、トリス［ビピリジル］ルテニウム錯体、またはトリス［ビピリジル］オスミウム錯体からなる群から選択されるものが挙げられる。さらに好ましいメディエータは、フェロセンおよびニトロブルーテトラゾリウムである。
【００３０】
フルクトサミンまたはそのエネアミノール互変異性体を測定する間接的方法の別の局面は、上記のメディエータ（図４）の存在下または非存在下で、オキシドレダクターゼ酵素を用いることである。従って、酵素が単独で用いられる場合、酵素に依存して、還元された酵素の濃度、酵素触媒反応の反応生成物、または酵素触媒反応のために必要とされる任意の共酵素（ｃｏ−ｅｎｚｙｍｅ）が測定され得る。
【００３１】
このコンセプトを例示するものは、プロテイナーゼを用いる前処理と、その後のケトアミンオキシダーゼとの反応の組み合わせを用いるシステムであり、これは、Ｊ．Ｍ．Ｓｔａｎｉｆｏｒｄらの欧州特許出願第５２６，１５０号（１９９３年２月３日公開）（本明細書中で参考として援用される）に記載される。ケトアミンオキシダーゼは、フルクトシル結合をタンパク質窒素（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に選択的に切断して、グルコソン；（未グリケート化）タンパク質および過酸化水素を生じる。従って、グルコソン、還元されたケトアミンオキシダーゼ酵素、または過酸化水素の濃度を電気化学的に測定することができ、過酸化水素の濃度は、当該分野で公知の過酸化水素電極を用いて測定できる。他の例は、フルクトサミンデヒドロゲナーゼの使用である。このデヒドロゲナーゼ反応において、ＮＡＤは、酵素により酸化されたフルクトサミンから電子を受容する。従って、還元された酵素および酸化されたフルクトサミン分子（グルコソン）に加えて、共酵素ＮＡＤＨの濃度もまた、アノードにおいて電気化学的に測定され得る。ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）は、この間接的方法とともに用いられ得る別の共酵素である。
【００３２】
グルコソンもまた、アルカリ性ｐＨにおいて、銅（ＩＩ）イオンのような遷移金属イオンの存在により生成する。従って、当業者は、上記の間接的手順およびこのように生成したグルコソンの濃度を電気化学的に測定することにおいて、オキシドレダクターゼ酵素を銅（ＩＩ）イオンに置き換えることができる。
【００３３】
当業者が理解するように、この間接的方法のために他の酵素を使用し得る。このような酵素には、日本国特許第３０１５５７８０号；日本国特許第６１−２６８−１７８号；Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．１００５」、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５５（２）：３３３−３３８（１９９１）；Ｃ．Ｇｅｒｈａｒｄｉｎｇｅｒら、「Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｒｅｅ  Ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｂｙ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｏｉｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：２１８−２２４（１９９５）；およびＭ．Ｏｉｍｏｍｉら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−ｋｅｔｏａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ」、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４５：４６３−４６６（１９８９）に記載されるものが挙げられる。特に好ましいのは、フルクトシルオキシダーゼおよびフルクトシルＮ−アルキルアミノ酸オキシダーゼである。
【００３４】
当業者が理解するように、酵素を用いる間接的方法のｐＨは、直接的方法またはメディエータを単独で用いる方法のいずれかと比べてより低い範囲内にある。
【００３５】
従って、この酵素補助反応は、好ましくは約６〜約９の間のｐＨで行われる。上記で議論したような他の条件の全てが適用可能である。従って、例えば、酵素は、この電気化学的セルのアノード液に、バイオセンサとともに用いられるべき体液サンプルに、あるいは電極上または電極を取り囲むメッシュ上に形成される乾燥形成物中に添加され得る。このような酵素の必要とされる濃度は、当該分野で見出されている。最終的に、この間接的方法において、メディエータを酵素と組み合わせ得る。
【００３６】
このような組み合わせは、還元酵素（例えば、フルクトサミンオキシドレダクターゼ）または不安定な反応生成物（例えば、過酸化水素）の濃度を測定するのに必要な場合に最も有利である。なぜなら、この両方のタイプの物質は、一般に、測定するのが難しいからである。従って、例えば、フェロセンをアノードにおいてフェロシニウムイオンに酸化し、次いでこれをフルクトサミンオキシドレダクターゼの還元形態により還元する。後者は予め酸化したフルクトサミンを有する。上記に列挙したメディエータの全ては、フェロセンと類似の様式で機能するテトラゾリウム化合物を節約する。グルコースを測定するためのメディエータと酵素との組み合わせの例は、Ｈｉｇｇｉｎｓらの米国特許第４，７１１，２４５号中に見出され得る。
【００３７】
本発明に用いられる装置は、一般に「バイオセンサ」と呼ばれる、従来の電気化学的セルまたはより小さい形態の電気化学的セルであり得る。用語「バイオセンサ」は、当該分野で用いられる用語と同様であり、言い換えれば、１滴と同じ程度に少量の患者のサンプル（すなわち、約１０マイクロリットル以下）がアノードおよびカソードの両方と接触するように、少なくとも１つのアノードおよび１つのカソードが絶縁支持体上に含まれる。バイオセンサと従来の電気化学的セルとの間の差異には、主に、アノードおよびカソードの物理的サイズ、あるいはアノード液またはカソード液のそれぞれの量または全く存在しないこと、そして測定されるべき流体サンプルの量がある。用いられる装置のタイプにかかわらず、電極は、電極間に印加される電圧およびアノードにおけるフルクトサミンならびにその互変異性体の酸化から生じる電流の量を測定するための電力供給源と装置との両方に接続されなければならない。直接的にまたは間接的に測定されるのは、フルクトサミンまたはその互変異性体の酸化であるので、本発明の作動電極はアノードである。参照電極とも呼ばれる第３の電極を必要に応じて用いて、アノードにおける別の反応の進行をモニターすることを補助してもよい。
【００３８】
最終的に、さらなるオプションは、第４のまたは補助電極（これは、第２のアノードであり、作動電極と異なる（通常、作動電極より低い）電圧に設定される）を用いることである。補助電極を用いて、干渉物質（例えば、尿酸）を酸化し得る。
【００３９】
本発明は、電気化学的セルおよびバイオセンサにより実施でき、ここで、電極の組成および形状、ならびに適用可能ならば、電解質セルディバイダ（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｄｅｒ）および電極を取り囲む多孔性メッシュは、電気化学および生物分析学の分野で公知である。特に有用なテキストブックには、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍ．Ｍ．Ｂａｉｚｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｌｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７３）ならびにＢｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｋａｒｕｂｅ、およびＷｉｌｓｏｎ編、ＯＵＰ（１９８７）が挙げられ、その両方は参考として援用される。さらに、本発明に適切なセルおよびバイオセンサについてのさらなる教示は、ＭｃＡｌｅｅｒら、米国特許第５，２６４，１０６号（１９９３年１１月２３日発行）；Ｇｒｅｅｎら、米国特許第４，８７６，２０５号（１９８９年１０月２４日発行）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、米国特許第４，５４５，３８２号（１９８５年１０月８日発行）；Ｆｏｕｌｄｓら、米国特許第５，１２４，２５３号（１９９２年６月２３日発行）；Ｈｉｌｌら、米国特許第４，８２０，６３６号（１９８９年４月１１日）；Ｋｕｈｎら、米国特許第５，３８５，８４６号（１９９５年１月３１日）；およびＮ．Ｇ．Ｃａｒｔｅｒら、欧州特許出願第５９３，０９６号（１９９４年４月２０日発行）中に見出され得、その全ては、本明細書中で参考として援用される。
【００４０】
本発明に用いるためのアノードは、例えば、ガラス状カーボン、カーボンペースト、カーボンフェルト、グラファイト、グラファイトフェルト、熱分解性（ｐｙｒｏｌｙｔｉｃ）グラファイト、水銀、銅、鉛、亜鉛、白金、銀、金、チタン、またはカドミウム、あるいは遷移金属の触媒層でコーティングされた炭質（ｃａｒｂｏｎａｃｅｏｕｓ）材料である。好ましくは、アノードは、遷移金属または炭素形成物から作製され、より好ましくは、金、白金、またはガラス状カーボンから作製される。このアノード材料は、幾分高度に精製されるべきであり、このことは当該分野で一般的である。
【００４１】
カソードは、フルクトサミン酸化の還元的サイドにより攻撃されない、任意の精製された材料から作製され得る。本発明のためのカソードは、通常、貴金属（特に白金）または他の一般的に用いられる電極材料（例えば、炭素）から作製される。白金電極は、好ましいカソードである。
【００４２】
参照電極は、使用される場合、通常は公知の標準的電圧のものである。このような電極は、水銀／塩化水銀電極（飽和カロメルまたはＳＣＥ）または銀／塩化銀電極であり、後者が好ましい。
【００４３】
本発明で用いられる電極の形態は重要ではない；それらは同じまたは異なり得、そして固体シート、棒、フィルム、ガーゼ（ｇａｕｚｅ）、または布、不透過または多孔質のミクロ粒子、あるいは粒子の流動床（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ  ｂｅｄ）であり得、これらは同様に良好な結果をもたらす。
【００４４】
アノードとカソードとの間および他の電極（もしあれば）との間の距離を、各電極で起こる半反応が他の電極での対応する半反応を妨害することなしに、可能な限り小さくして電極を配列することは、非常に効果的である。バイオセンサの形状において、体液サンプル（例えば、血液、血漿、血清、唾液、または尿）の１滴または２滴のみの使用を必要とするように、アノードとカソードとの間をさらなる流体を用いることなくつなぐ（ｓｐａｎ）ことが望ましい。一般に、電流（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｌｏｗ）を最小化しそして電流に対する体液サンプルへの抵抗によって引き起こされる温度の上昇を最小化するためには、物理的に近接していることが望ましい。
【００４５】
カソードとアノードとの間の電圧を、種々の方法で制御し得る。電圧を制御するための最も効果的かつ正確な方法は、参照電極を用いることによる方法である。このプロセスのための望ましい電圧は、このシステムのボルタモグラムを試験することにより決定され、そして、カソードとアノードとの間の電圧を調節して、参照電極とカソードとの間に所望の一定電圧を与える。この制御方法は、カソードとアノードとの間の全電圧による制御よりもずっと効果的である。なぜなら、このような電圧は、分割膜（ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の状態、カソード液の濃度、および検出されるべきフルクトサミン化合物の濃度に依存するからである。次いで、この電流の変化を、固定電圧において、好ましくはカソード電極に対する適切な電圧における電流時間（Ｉ−ｔ）過渡（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）を測定することにより、モニターし得る。適切な電圧範囲は、以下に記載する直接的方法のための銀／塩化銀参照カソードに対して約２００ミリボルト〜約１１００ミリボルトであり、１０００ミリボルト〜１１００ミリボルトが好ましく、そして補助方法（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）については、約１００ｍＶ〜１０００ｍＶである。
【００４６】
本発明における使用のための電気化学的センサは、アンペロメトリー検出を包含するものであり得るか、ストリップ要素（特に、使い捨てドライストリップ）を利用するものであり得る。従って、センサ電極は、例えばスクリーン印刷、噴霧、または他の適切な蒸着（ｄｅｐｏｓｉｔ  ｉｎ）技術により形成された電極領域を包含し得る。
【００４７】
ドライストリップセンサは、１対の長手方向の実質的に平行な導電性トラック（ｔｒａｃｋ）をその上に有する細長い電気絶縁基板を含み得、各トラックには、読み出し手段と電気的に連絡する手段が同一の端部に設けられ、そして本明細書中で議論したように、アノードおよびカソードが設けられ、また追加電極が存在していてもよい。
【００４８】
より詳細には、このようなセンサは、絶縁性材料（例えば、ｐｖｃなどの合成ポリマー）の支持ストリップの形状で適切に配置され、これは、その末端間の位置において、導電性のプリントトラック上で支持される２つの電極を有する。例えば、電極は、ストリップ上に並んだ２つの長方形の領域の形態をとり得る。このような領域は、フルクトサミン濃度を試験するために、体液サンプルの１滴によりカバーされるべき標的領域として形成され得る。所望ならば、非長方形電極領域（例えば、菱形、半円、または三角形の領域）を用いて、液体サンプルとの最適化された接触のための標的領域を提供し得る。
【００４９】
さらに、アノード電極に類似する第３の電極が、この支持ストリップ上に存在し得る。このような補助電極は、より低い電圧が補助電極に印加される場合、後者の電極とカソードとの間を通過する電流を、アノードを通過する電流から減算し得、そして、得られる電流がフルクトサミンの酸化によるものであるという点で、より信頼し得る結果をもたらし得る。
【００５０】
バイオセンサの代表的な製造手順において、接着剤が、スクリーン印刷され得るか、さもなくば各ストリップバイオセンサのサンプル標的領域の周囲に塗布され得、続いて、メディエータ、補因子および／または酵素（もし存在するならば）でコーティングされた紙が、この領域に配置されそして接着される。緩衝液でコーティングされた保護多孔性メッシュを、サンプル標的層上に配置し、そしてサンプル標的領域と読みとり装置に挿入されるべき末端との両方を未コーティングのまま残すために、この試験要素に一般に付与される絶縁プリントにより、所定の位置に保持する。このメッシュは、例えばナイロンまたはポリエステルなどのポリマーであり得る。このメッシュの上に含浸される緩衝液は、上記で議論されている。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、例示することを意図しているが、本発明を制限するものではない。
【００５２】
実施例Ｉ
フルクトサミンの直接的測定  グリケート化ヒト血清アルブミン（ｇＨＳＡ）を１Ｍグアニジウムカーボネート（ｐＨ  １１．５）に溶解させて、０．５ｍＭ、１．０ｍＭおよび１．５ｍＭの溶液を得た。これらの溶液の電圧を、−１００ｍＶ〜＋１２００ｍＶで直線的に走査し、方向が逆になった点で、−１００ｍＶまで逆に走査した。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金補助電極と共に、３ｍｍのガラス状カーボン作動電極を用いた。ｇＨＳＡの酸化は、＋１０４０ｍＶで起こり、そして対応する電流を、図５中の用量応答曲線により表されるように測定した。
【００５３】
本発明を、開示された実施態様を参照して記載してきたが、当業者は、詳細に記載された特定の実施例が本発明の例示にすぎないことを容易に理解する。種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲のみによって限定される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１ａは、グリコシルアミンを形成するためのタンパク質とグルコースとの縮合、およびそれに続くフルクトサミンへのＡｍａｄｏｒｉ転位を図示する。図１ｂは、フルクトサミンとそのエネアミノール互変異性体との間のアルカリ平衡を図示する。図１ｃは、グルコソンおよび遊離のタンパク質を生じる、フルクトサミンまたはエネアミノールの酸化反応の１つのタイプを図示する。
【図２】アノード（影をつけた領域）におけるフルクトサミン（「Ｆ」）またはエネアミノール互変異性体の酸化を概略的に示す。
【図３】アノード（影をつけた領域）においてメディエータ化合物（「Ｍ」）を用いる、フルクトサミン（「Ｆ」）またはエネアミノール互変異性体の酸化を概略的に示す。
【図４】アノード（影をつけた領域）において、オキシドレダクターゼ酵素（「ＦＯＸ」）およびフェロセン（Ｆｃ）の両方と、メディエータ化合物とを用いる、フルクトサミン（「Ｆ」）の酸化を概略的に示す。
【図５】以下の実施例Ｉにおいて得られた結果を図示する。このグラフの横座標上にある３つのデータ点は、グリケート化されたヒト血清アルブミン（「フルクトサミン」と呼ばれる）の０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、および１．５ｍＭ溶液についての点である。
【図１ａ】
0003965212.tif 000002
【図１ｂ】
0003965212.tif 000003
【図１ｃ】
0003965212.tif 000004
【図２】
0003965212.tif 000005
【図３】
0003965212.tif 000006
【図４】
0003965212.tif 000007
【図５】
0003965212.tif 000008