(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有するメタノール酵母由来の蛋白質、又は該アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列からなり、且つプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列で表される請求項２記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含んで成るベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
前記宿主がメタノール酵母である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記メタノール酵母がキャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）である請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体からプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項４に記載のベクターと異種構造遺伝子を含むベクターとを用いて宿主を共形質転換し、得られる形質転換体を培養し、該培養物から該異種構造遺伝子の発現生産物であるペプチド又は蛋白質を採取することを特徴とする該異種構造遺伝子によりコードされるペプチド又は蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質中のジスルフィド結合の形成を触媒することにより、タンパク質の高次構造形成を促進する酵素であるプロテインジスルフィドイソメラーゼおよびその遺伝子に関する。とりわけ、プロテインジスルフィドイソメラーゼの中でも、異種遺伝子の分泌発現の効率が高く有用タンパク質の工業的生産に好適な微生物であるメタノール酵母由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼおよびその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；Protein Disulfide Isomerase ）は小胞体（以下ＥＲと記載する）内腔の主要タンパク質であり、還元したＲＮａｓｅを酸化的にリフォルディングする活性として最初に見いだされた（Goldberger, R.F. et al. (1963 ）J. Biol. Chem. 238, 628-635 ）。ＰＤＩは分泌タンパク質のジスルフィド結合を組み換えることにより安定な高次構造の形成を触媒している酵素であると考えられている。
【０００３】
異種タンパク質、とりわけジスルフィド結合を持つことの多い分泌タンパク質の場合、ＰＤＩによるジスルフィド結合の組み換えが、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（ＰＰＩ；Peptidyl-Prolyl-cis-trans Isomerase ）によるタンパク質のフォルディングと共に、タンパク質の分泌過程における律速段階であることが指摘されている（Gething, M.J. and Sambrook, J. (1992) Nature 355, 33-45 ）。また、in vitroにおいてもＰＤＩが、ＲＮａｓｅなどの単一ドメインからなるタンパク質のフォルディングを促進することが示されている（Jaenicke, R. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3,104-102 ）。
【０００４】
一方、メタノール酵母はメタノールを唯一炭素源として生育し、菌体収率も高いことから、ホルムアルデヒドなどのアルデヒド類、エポキサイド、メチルケトン、ギ酸などの合成化学工業原料の製造に用いられてきた。また、菌体そのものをタンパク質源として利用することや、菌体成分であるアミノ酸、ビタミン等の生産に利用することも研究され、実用化されているものもある。また、最近になってメタノール酵母を宿主とした異種遺伝子の発現系が開発され、サッカロマイセス（Saccharomyces ）酵母よりも高い生産性を有することが示されている（特開平５−３４４８９５）。
【０００５】
特に分泌タンパク質の場合にはその生産性は高く、例えばリゾプス属糸状菌由来のグルコアミラーゼの場合、３．４ｇ／ｌとサッカロマイセス酵母に比較して約１０倍の生産性を示した（Sakai, Y., et al. (1996 ）Biochim. Biophys. Acta  1308,81-87）。なお、メタノール酵母としては、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等が知られている。
【０００６】
遺伝子組換え技術によって異種タンパク質の分泌生産を行う場合、タンパク質のフォルディングの速度を速めることにより、分泌効率が向上すると考えられる。このような考えを基に、ヒトＰＤＩの遺伝子をサッカロマイセス酵母中で目的遺伝子と共に共発現させることにより、ヒト血清アルブミンの分泌量を平均で６０％増加させた例が開示されている（特開平６−３８７７１）。
【０００７】
タンパク質の適切なフォルディングのために必要とされるジスルフィド結合の形成や交換には適切な環境が必要で、そのために真核生物細胞ではＥＲやゴルジ装置などの細胞内コンパートメントを持っており、分泌タンパク質はこのような細胞内オルガネラの中を移行しながら、適切なフォルディングや糖鎖付加を受けて、エキソサイトーシスによって細胞外に分泌される。真核生物の分泌タンパク質は分子内ジスルフィド結合を持ったものが多く、ＥＲ中で起こるジスルフィド結合の形成や交換反応は、そのタンパク質の高次構造形成や分泌に必須である。
【０００８】
従って、ジスルフィド結合の形成や交換反応を触媒するＰＤＩは、ＥＲ内に局在化あるいは残留することが必要で、このために小胞体保持シグナルとよばれる特有のアミノ酸配列をＣ末端に持っている。小胞体保持シグナルの配列としては、動物ではLys-Asp-Glu-Leu （配列番号：２）、サッカロマイセス酵母ではHis-Asp-Glu-Leu （配列番号：３）が知られている。上記記載のヒトＰＤＩ遺伝子をサッカロマイセス酵母で発現させた場合、ヒトＰＤＩのＥＲ保持シグナルがサッカロマイセス酵母で十分機能せず、ＰＤＩのＥＲ内局在化が十分果たせなかったと考えられる。このためにＰＤＩ遺伝子を高発現させても、それに見合ったＥＲ内のＰＤＩ活性の上昇が起こらず、共発現させた分泌タンパク質の分泌量の増大が６０％という値に留まったと考えられる。
【０００９】
メタノール酵母で発現させたＰＤＩが十分機能を発揮するためには、メタノール酵母由来のＰＤＩを利用するのが望ましい。また、メタノール酵母が前述の如くタンパク質分泌能が高いのは、タンパク質分泌過程の律速段階であるＰＤＩによるジスルフィド結合の組み換えが効率よく行われているためと考えられ、メタノール酵母由来のＰＤＩは他起源のＰＤＩに比較して比活性が高いか、ＥＲ内の活性が高いと考えられる。しかしながらメタノール酵母のＰＤＩおよびその遺伝子については未だ知られていない。従ってそれを利用したメタノール酵母分泌発現系における生産性の向上についても、何ら検討されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、メタノール酵母が持つＰＤＩ遺伝子をクローニングし、その塩基配列を明らかにして、メタノール酵母のＰＤＩの特徴を解明すべく鋭意研究を行った。すなわち、本発明の目的は、メタノール酵母における異種タンパク質の分泌生産をより効率的に行うために、メタノール酵母由来のＰＤＩ遺伝子を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために、ＰＤＩの活性部位にある保存領域のアミノ酸配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲにより増幅ＤＮＡ断片を得た。この増幅ＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法によって、メタノール酵母キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）のＰＤＩ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子の塩基配列および当該ＰＤＩのアミノ酸配列を明らかにした。さらに、当該ＰＤＩ遺伝子で形質転換したメタノール酵母中で、糸状菌由来のペルオキシダーゼ遺伝子を共発現させることにより当該ペルオキシダーゼの分泌発現量を約１０倍増加させ、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有するメタノール酵母由来の蛋白質、又は該アミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有するメタノール酵母由来の蛋白質を提供する。本発明はさらに、Cys-Gly-His-Cys （配列番号：４）を含む活性中心の保存領域とArg-Asp-Glu-Leu （配列番号：９）からなる小胞体保持シグナル配列を有し、且つプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有するメタノール酵母由来の蛋白質を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＰＤＩをコードする遺伝子、該遺伝子を含んで成るベクター、該ベクターにより形質転換された宿主、および該形質転換宿主を用いてＰＤＩを製造する方法、並びに前記ベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターとで共形質転換された宿主、および該共形質転換宿主酵母において目的分泌タンパク質遺伝子を共発現させることにより目的タンパク質を著量分泌する方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、ジスルフィド結合交換反応の活性中心として各種起源のＰＤＩで保存されている配列、Cys-Gly-His-Cys をサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＰＤＩアミノ酸配列中に２カ所見いだした。この配列を含むS. cerevisiae のＰＤＩアミノ酸配列をもとに、メタノール酵母のコドン使用頻度を参考にして各種のＰＣＲ用プライマーを設計した。これらのプライマーを用いてメタノール酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応生成物の塩基配列から推定されるアミノ酸配列が、S. cerevisiae のＰＤＩアミノ酸配列と類似性を持っていることを確認した。
【００１５】
メタノール酵母のゲノムＤＮＡを各種制限酵素で完全分解し、アガロース電気泳動により分画する。上記記載のＰＣＲ産物をプローブにしてサザンハイブリダイゼーションを行い、ＰＤＩ遺伝子の全領域を含み、最小のＤＮＡ断片を生じる制限酵素を知る。その制限酵素で完全分解したメタノール酵母のゲノムＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを作成し、上記記載のＰＣＲ産物をプローブにしたコロニーハイブリダイゼーションによってＰＤＩ遺伝子を持ったクローンを選択する。
【００１６】
選択したクローンからプラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーション解析によって  上記記載のＰＣＲ産物の配列を含んでいることを確認する。さらに、このプラスミドの挿入断片の制限酵素地図を作成し、これを基にサブクローニングを行いＰＤＩ遺伝子を含む最小のＤＮＡ断片を取得する。取得したＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、メタノール酵母由来ＰＤＩのアミノ酸配列を解析する。
【００１７】
このようにして得られたメタノール酵母由来ＰＤＩ遺伝子をメタノール酵母で高発現させ、ＰＤＩを製造することができる。ＰＤＩ遺伝子の発現ベクターとしては公知のものが使用できるが、メタノール酵母キャンディダ・ボイディニの発現ベクターとしては特開平５−３４４８９５に記載のpNOTe1やpTRex が利用できる。メタノール酵母の形質転換法および外来遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換体の取得法は、公知の方法（Sakai, Y. et al.  (1991) J. Bacteriol., 173, 7458 〜7463）が利用できる。また、メタノール酵母由来ＰＤＩ遺伝子を、目的分泌タンパク質遺伝子と共にメタノール酵母細胞内で共発現させることにより、目的分泌タンパク質の分泌量を増大させることができる。
【００１８】
メタノール酵母C. boidinii 由来のＰＤＩは、Arg-Asp-Glu-Leu （配列番号：９）というサッカロマイセス酵母のHis-Asp-Glu-Leu （配列番号：３）とは異なる小胞体保持シグナルを持っていたが、自分自身のものである以上C. boidinii の細胞に認識されて、ＰＤＩがＥＲに保持されてその機能を十分発揮することは間違いない。ＰＤＩの発現に用いる発現ベクターは、上記記載のpNOTe1やpTRex の栄養用要求性マーカーを、目的タンパク質の発現ベクターに用いたものとは異なる遺伝子に変えたものを用いることができる。また、宿主メタノール酵母に２つの発現ベクターのマーカーに対応した栄養要求性を付与することにより、上記記載の方法で形質転換が可能である。また、メタノール酵母へ栄養要求性を付加する方法については、公知の方法（Sakai, Y. et al.  (1991) J. Bacteriol., 173, 7458 〜7463）が利用できる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．
キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）Ｓ２株（Tani, Y., et al., (1985) Agric. Biol. Chem., 49, 2699 〜2706）より、ＰＤＩ遺伝子の取得、およびその塩基配列の決定を行った。なお、当該株はCandida boidinii SAM1958と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微工研条寄第3766号（FERM BP-3766）として1992年2 月25日に寄託されている。
【００２０】
（１）ＰＣＲによる増幅
ジスルフィド結合交換反応の活性中心として各種起源のＰＤＩで保存されている配列、Cys-Gly-His-Cys （配列番号：４）に関するS. cerevisiae のＰＤＩ中のアミノ酸配列として以下の２つの配列に注目した。
Pro-Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lys （配列番号：５）（サッカロマイセス酵母のＰＤＩにおけるアミノ酸配列番号59〜65番目のアミノ酸)
Tyr-Ala-Pro-Trp-Cys-Gly-His （配列番号：６）（サッカロマイセス酵母のＰＤＩにおけるアミノ酸配列番号402 〜408 番目のアミノ酸)
C. boidinii コドン使用頻度を参考にして、このアミノ酸配列に対応する以下のような塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２１】
すなわち、センスプライマーとして、
5'-CCGGAATTC CCT(A) TGG TGT(C) GGT(A) CAT(C) TGT(C) AA-3' （配列番号：７）
アンチセンスプライマーとして、
5'-CGCGGATCC TG A(T)CC A(G)CA CCA A(T)GG A(G/T)GC A(G)T-3'（配列番号：８）
を合成した。これらのオリゴヌクレオチドの５’末端にはEcoRI およびBamHI の認識する配列がそれぞれあり、この２つのプライマーで増幅されたＤＮＡ断片の５’末端にはEcoRI サイトが、３’末端にはBamHI サイトが形成されるようになっている。
【００２２】
C. boidinii のゲノムＤＮＡを鋳型にして、上記記載の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ、約１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が認められた。この増幅断片を回収し、制限酵素EcoRI 消化によって得られた約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を、EcoRI 消化したpBluescript II SK+に挿入した。挿入断片の塩基配列を解析したところ、S. cerevisiae ＰＤＩのアミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列が認められたので、このＤＮＡ断片をC. boidinii のＰＤＩ遺伝子の一部であると断定した。
【００２３】
（２）ゲノムＤＮＡのサザーンハイブリダイゼーション解析
キャンディダ・ボイディニＳ２株の菌体よりゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡの単離法としては、例えばクリエールらの方法（Cryer, D.R. et al., (1975) Meth. Cell. Biol., 12, 39〜44）が挙げられる。キャンディダ・ボイディニＳ２株のゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、0.7 ％アガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡをゲルからナイロンメンブレン（アマシャム社製）に転移、固定した。上記記載のＰＤＩ遺伝子を含む２５０ｂｐＤＮＡ断片をランダムプライマー・キット（アマシャム社製）を用いて、３２Ｐで標識した。
【００２４】
標識したＤＮＡ断片を、5 xSSC-1%SDS-1xDenhardt 溶液に加えハイブリダイゼーション溶液を作成した。ＤＮＡを固定したナイロンメンブレンにこのハイブリダイゼーション溶液を加え、プラスチックバッグに封入した。封入したナイロンメンブレンを６５℃、１６時間インキュベートした後、ナイロンメンブレンをプラスチックバッグから取り出して、 2xSSC-0.1％SDS 溶液にて室温で洗った。次にナイロンメンブレンを0.2xSSC- 0.1%SDS溶液中で６５℃、３０分間インキュベートした後、溶液を新しいものに変え、６５℃、３０分間のインキュベーションを繰り返した。メンブレンを2xSSC で洗った後、風乾してオートラディオグラフィーを行った。上記記載の２５０ｂｐのプローブとハイブリダイズする最小のＤＮＡ断片として、図２に示すように約６．２ｋｂのXbaI断片が見いだされた。
【００２５】
（３）コロニーハイブリダイゼーションによるＰＤＩ遺伝子のクローニング
キャンディダ・ボイディニＳ２株のゲノムＤＮＡを制限酵素XbaIで完全消化し、0.7 ％アガロースゲル電気泳動で分画した。６．２ｋｂ付近のアガロースを切り出し、ＤＮＡセル（第一化学社製）を用いてＤＮＡ断片を回収した。XbaIで消化したpBluescript II SK+にこの回収したＤＮＡを挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換してキャンディダ・ボイディニＳ２株のゲノムライブラリーを作成した。
【００２６】
このライブラリーを、上記２５０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法によってスクリーニングし、陽性のクローンを得た。ハイブリダイゼーションの条件は、上記のサザーンハイブリダイゼーションの条件と全く同一である。陽性のクローンからプラスミドを回収し、挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図１に示す。この制限酵素地図をもとにサブクローニングを行い、ＰＤＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片をXbaIからSalIまでの約２ｋｂ（図１中で左側）に限定した。
【００２７】
（４）塩基配列の決定
上記記載のXbaIからSalIまでの約２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このＤＮＡ断片をファージM13 に両方向にクローニングし、２本鎖ＤＮＡ（ＲＦ）を各々調製した。これらの二本鎖ＤＮＡを大腸菌エキソヌクレアーゼIII と反応させ、一方向に欠失が導入された二本鎖ＤＮＡを調製した。エキソヌクレアーゼIII を利用した一方向欠失挿入プラスミドの作成法に関しては、「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法II」の289-305 頁に詳しく記載されている。
【００２８】
前記の方法により得られた一方向に欠失が挿入された各二本鎖ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換して、一方向に欠失が挿入されたファージクローンを作成した。各ファージクローンから二本鎖ＤＮＡを調製して、制限酵素による切断パターンから欠失の程度を調べ、適当なクローンから一本鎖ファージＤＮＡを調製した。これら一本鎖ファージＤＮＡを鋳型として、ジデオキシ法（Sanger, F.,et al.,  (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 ）によって塩基配列を決定した。各クローンの塩基配列をつなぎ合わせることにより、図１中XbaIサイトからSalIサイトの手前までの２．０ｋｂの塩基配列を決定した。
【００２９】
配列番号１に塩基配列と、塩基配列から導かれるＰＤＩのアミノ酸配列を示した。C. boidinii のＰＤＩは、配列番号１の塩基配列番号３６７から１９５９番目までの塩基配列によってコードされた５３１アミノ酸からなることがわかり、ＰＤＩ１遺伝子と名付けた。ＰＤＩ１のアミノ酸配列は、S. cerevisiae 由来のＰＤＩと４５％、ヒトＰＤＩと２２％の同一性を示した。類似のアミノ酸を含めると、S. cerevisiae のＰＤＩと６４％、ヒトＰＤＩと４９％の類似性を示した。
【００３０】
ＰＤＩのジスルフィド結合交換反応の活性中心として各種起源のＰＤＩで保存されている配列、即ちCys-Gly-His-Cys （配列番号：４）が配列番号１の６１から６４番目のアミノ酸配列、および４０８から４１１番目のアミノ酸配列の２カ所に見いだされた。また、Ｃ末端に存在する小胞体保持シグナル配列は、Arg-Asp-Glu-Leu （配列番号：９）であり、S. cerevisieのＰＤＩのHis-Asp-Glu-Leu （配列番号：３）や哺乳類のＰＤＩに広く認められるLys-Asp-Glu-Leu （配列番号：２）とも異なる配列であった。
【００３１】
なお、プロテインジスルフィドイソメラーゼ活性の測定は、還元・変性・再酸化による方法で作成したスクランブルドリポヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）の再構成への促進効果を見ることによって行うことができる。リボヌクレアーゼＡの再構成の程度は、その酵素活性の回復の程度を指標として定量化する（特開平６−３８７７１）。
上記方法によりＰＤＩ活性を測定したところ、上記ＤＮＡ断片を含有するメタノール酵母形質転換体が、表１に示すように対照とした形質転換していないメタノール酵母よりも高いプロテインジスルフィドイソメラーゼ活性を有することが確認された。
【００３２】
実施例２．異種の目的タンパク質の分泌
メタノール酵母C. boidinii 由来のＰＤＩ１遺伝子と、糸状菌Arthromyces ramosus 由来のペルオキシダーゼ（ARP ）遺伝子とを共発現することにより、ARP の分泌量が増加することを確認した。なお、発現ベクターとして用いたpNOTe1およびARP 発現ベクターpNOTe1ARP については特開平5-344895に開示されている。
【００３３】
pNOTe1の栄養要求性マーカー（URA3）を、C. boidinii 由来のLEU2遺伝子と交換することにより、pNOTe1とは異なる栄養要求性マーカーを持った発現ベクターを作ることが出来る。また、宿主メタノール酵母にこの２つの発現ベクターのマーカーに対応した栄養要求性を付与することにより、上記記載の２種の発現ベクターによる形質転換が可能である。メタノール酵母へ栄養要求性を付加する方法については、公知の方法（Sakai, Y. et al.  (1991) J. Bacteriol., 173, 7458 〜7463）が利用できる。
【００３４】
（１）発現ベクターの構築
ARP 遺伝子を含む1.1 kbのEcoRI DNA 断片をプラスミドpNOTe1ARP から切り出し、pNOTe1のNot I サイトに挿入して、図３(a) に示したプラスミドpNPO3 を作成した。
【００３５】
PDI1遺伝子の発現のために、栄養要求性マーカーとしてLEU2遺伝子をもち、相同組み換え部位としてC.boidiniiのリボソ─ムDNA(rDNA) をもつ発現ベクターを図４に示した手順で作成した。まず、pNOTe1をEcoR IとHind IIIで切断して、C. boidinii のアルコールオキシダーゼ遺伝子（AOD1）のプロモーター・ターミネーターを含む2.0 kbのDNA 断片を切り出し、pUC19 のEcoR I-Hind III サイトに挿入して、プラスミドpNOT46を作成した。
【００３６】
C. boidinii 由来のrDNAを含むDNA 断片をＰＣＲにより得、pNOT46のHindIII サイトに挿入して、pNOT46R を作成した。C. boidinii のLEU2遺伝子を含むプラスミドpCLEU321（Sakai, Y. and Tani, Y. (1992) J. Bacteriol., 174, 5988-5993 ）を、EcoRI で消化して3.2 kb  のLEU2遺伝子を含むDNA 断片を切り出して平滑末端にした。この平滑末端化した3.2 kb  のDNA 断片を、NdeI消化後やはり平滑末端化したpNOT46R に挿入して、pNL1を作成した。上記発現ベクターに組み込むために、PDI1遺伝子の両端にNotIサイトをPCR 法によって作成した。
【００３７】
センスプライマーとして、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAAAATGAAGTTAACTAATTTCAAA-3'（配列番号：10）
アンチセンスプライマーとして、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTATAATTCATCACGAACATCA-3'（配列番号：11）
を合成した。この２つのオリゴヌクレオチドの5 ’末端側にはNotIが認識する配列があり、これらのプライマーを用いて増幅されたDNA 断片には、PDI1遺伝子の開始コドンの直前と終止コドンの直後にNotIサイトが形成されるようになっている。C. boidinii のゲノムDNA を鋳型にして、上記記載の２つのプライマーを用いてPCR 反応を行い、増幅された1.6 kbのDNA 断片をNotI消化後、プラスミドpBluescript SK+ のNotIサイトに挿入して、pSKPD を作成した。pSKPD をNotI消化して得られる1.6 kbのDNA 断片を、上記記載のpNL1のNotIサイトに挿入して、図３(b) に示すpNRPD を作成した。
【００３８】
（２）形質転換酵母の作成
上記（１）に記載の発現ベクター２種を用いて、メタノール酵母C. boidinii の形質転換体を作成した。宿主に用いた菌株は、特開平5-344895において開示されているC. boidinii  TK62 （ura3）株の、LEU2遺伝子を破壊したC. boidinii  BUL（ura3, leu2）である。C. boidinii のLEU2遺伝子については、Sakai らによって開示されている（Sakai, Y. and Tani, Y. (1992) J. Bacteriol., 174, 5988-5993 ）。C. boidinii の形質転換法の方法については、特開平5-344895において開示されている。
【００３９】
まず、ARP 遺伝子の形質転換体を作成した。上記記載のARP 発現ベクターpNPO3 をBam HI消化して直鎖状にした後、C. boidinii  BUL（ura3, leu2）株を形質転換して、Ura3+ で形質転換体を選択した。選抜された形質転換体の一つであるBPO17 株においては、図５、A)、B)に示すように、宿主酵母BUL 株の染色体DNA 上の ura3 部位と発現ベクターpNPO3 中の URA3 部位との相同組み換えにより、ARP 遺伝子を含むpNPO3 の全領域が ura3 部位に組み込まれれている。このことは、図５、C)に示すように、宿主BUL 株および形質転換体BPO17 株のゲノムDNA をBglII で消化した後、 URA3 遺伝子の全領域を含む3.3 kbのBamHI-SalI DNA断片をプローブとして行ったサザーンハイブリダイゼーションにおいて、BUL 株には5.5 kbの、BPO17 株には14.4 kb のハイブリダイズするバンドが認められることから確認された。
【００４０】
次に、上記記載のARP 遺伝子で形質転換したC. boidinii BPO17 （ leu2 ）株を宿主として、PDI1遺伝子の形質転換体を作成した。PDI1発現ベクターpNRPD をApaI消化により直鎖分子にした後、BPO17 （ leu2 ）株を形質転換して、Leu+で選択することによりBPP1  株を取得した。BPP1  株においては、図６、A)、B)に示すように、宿主酵母BPO17 株の染色体DNA 上のrDNA部位と発現ベクターpNPO3 中ののrDNA部位との相同組み換えにより、PDI1遺伝子を含むpNRPD の全領域がrDNA部位に組み込まれれている。
【００４１】
図６、C)に示すように、BUL 株、宿主BPO17 株および形質転換体BPP1株のゲノムDNA をHindIII で消化した後、pSKPD をNotI消化して得られるPDI1遺伝子を含む1.6 kbのDNA 断片をプローブとして行ったサザーンハイブリダイゼーションにおいて、BUL 株およびBPO17 株からは12.6 kb の内在性のPDI1遺伝子を含む領域に由来するバンドが、BPP1株からは上記12.6 kb のバンド以外に発現ベクターpNRPD に由来する6.1 kbのバンドが認められることから、染色体DNA へのPDI1遺伝子の組み込みが確認された。
【００４２】
（３）形質転換体の解析
ARP 遺伝子で形質転換したBPO17 株、ARP 遺伝子とPDI1遺伝子の両方で形質転換したBPP1株、および宿主として用いたBUL 株から mRNA を抽出し、ノーザンハイブリダイゼーションによってPDI1遺伝子の発現量を調べた。メタノールを唯一炭素源とするＹＭ培地（ Sakai, Y., et al., (1981) J. Gen. Microbiol., 123, 365 〜396 ）で、30℃、48時間培養した上記３菌株の菌体から、ISOGEN（日本ジーン社製）によって全RNA を抽出し、BIOMAG mRNA 精製キット（パーセプティブ社（PerSeptive Diagnostics）製）によって精製した。
【００４３】
精製したmRNAを1.1 ％アガロースゲル（20 mM MOPS緩衝液、1 mM EDTA 、2.2 M ホルムアミドを含む）で電気泳動後、ナイロン膜にブロッティングした。実施例１に記載のサザーンハイブリダイゼーションと全く同一の条件でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに用いたプローブは、上記記載のpSKPD 由来の1.6 kbのNotI DNA断片を用いた。
図７に示すように、PDI1遺伝子の強い発現がPDI1遺伝子で形質転換したBPP1株に認められ、内在性のPDI1遺伝子によると思われる弱い発現がBUL 株およびBPO17 株に認められた。
【００４４】
上記３種の菌株をメタノールを唯一炭素源とするＹＭ培地で30℃、48時間培養した後、菌体中のPDI 活性を測定した。集菌した菌体を50 mM リン酸カリ緩衝液（pH 7.5）に懸濁し、2 mlのエッペンドルフチューブに移して、等量のジルコニウム・ビーズ（直径 0.5 mm ）を加えた。チューブをビーズ・ビーダー（モデル 3110BX 、バイオスペック社（Biospec Products））で30秒激しく撹拌後、30秒間氷冷するという操作を６回繰り返した。菌体破砕液を４℃、16,000 x g、５分間遠心し、上清の酵素活性を測定した。
【００４５】
PDI 活性の測定はヒルソンらの方法（Hillson, D.A. et al. (1984) Methods Enzymol., 107, 281-294) に従った。すなわち、最終1 mlの反応液中に、50 mM のリン酸カリ緩衝液（pH 7.5）、500 μg のスクランブルドRNase 、0.01 mM のディチオスライトールを含む。反応液を10分間インキュベートした後、10  μl を抜き取り3 mlの0.25 mg の酵母RNA を含むTKM 緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 、25 mM KCl 、5 mM MgCl ）を加え、30℃で２分間、260 nmでの吸収を紫外キュベット中で測定することにより、RNase 活性を測定した。１ユニットのPDI 活性を、１分間に１ユニットのRNase 再活性化を触媒する酵素活性とした。ここで、１ユニットのRNase 活性は、１分間に260 nmの吸収を１増大させる酵素量と定義した。
【００４６】
表１に示すように、菌体内のPDI 活性は、PDI 遺伝子で形質転換したBPP1株において、ARP 遺伝子のみで形質転換したBPO17 株や宿主に用いたBUL 株よりも、９倍以上高かった。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
（３）ARP の分泌発現
ARP 遺伝子で形質転換したBPO17 株、ARP 遺伝子とPDI1遺伝子の両方で形質転換したBPP1株、および宿主として用いたBUL 株を、メタノールを唯一炭素源とするYM培地で培養し、培養液中のARP 活性を比較した。図８に示したように、ARP 遺伝子とPDI1遺伝子を共発現させたBPP1株において、培養液中のARP 活性は培養84時間目に最高値0.024 U/mlに達した。ARP 遺伝子だけを発現させたBPO17 株では、培養液中のARP 活性は培養48時間目に最高値0.002 U/mlに達したが、宿主に用いたBUL 株の培養液中にはARP 活性は全く検出されなかった。この結果から、PDI1遺伝子とARP 遺伝子を共発現させることにより、ARP の分泌発現量が約10倍増大したことがわかった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、メタノール酵母のＰＤＩ遺伝子が取得され、本遺伝子をメタノール酵母で大量発現させてＰＤＩ酵素を取得することが可能になった。また、本遺伝子を目的分泌タンパク質遺伝子とメタノール酵母内で共発現させることにより、目的タンパク質の分泌効率、すなわち目的タンパク質の生産量を飛躍的に向上させることが可能になった。
【００５０】
【配列表】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はキャンディダ・ボイディニのＰＤＩ１遺伝子を含む６．２ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図、塩基配列を決定した部分、およびＰＤＩ１遺伝子の位置と方向を示す図である。
【図２】図２はC. boidinii におけるPDI 遺伝子の存在を示すサザーンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図３】図３(a) はARP 遺伝子の発現ベクターpNPO3 、および(b) はPDI1遺伝子の発現ベクターpNRPD の構成を示す図である。
【図４】図４はPDI1遺伝子の発現ベクターpNRPD の作成の手順を示す図である。
【図５】図５はBPO17 株のゲノムDNA にARP 遺伝子が組み込まれた状態を示す模式図、およびそれを確認したサザーンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図６】図６はBPP1株のゲノムDNA にPDI1遺伝子が組み込まれた状態を示す模式図、およびそれを確認したサザーンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図７】図７はPDI1遺伝子の発現量を解析したノザーン分析の結果を示す図である。
【図８】図８はBPO17 株、BPP1株、BUL 株を培養したときの培養液中のARP 活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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