(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域を含む抗体。
【請求項２】
配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項３】
それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項４】
以下の（１）〜（７）の抗体：
（１）  配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）  配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）  配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）  配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）  配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）  配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；および
（７）  配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
からなる群より選択される抗体。
【請求項５】
グリピカン３のアミノ酸残基５４２〜５５１、５４４〜５５３または５４６〜５５５のいずれかの配列からなるペプチドに結合する抗体。
【請求項６】
グリピカン３のアミノ酸残基５４６〜５５１の配列からなるペプチドに結合する抗体。
【請求項７】
第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体は、それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体。
【請求項８】
以下の（１）−（１５）のいずれか：
（１）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７４，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７５，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７６，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７７，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７８，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７９，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８０，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８１，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８２，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８４，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）  それぞれ配列番号１２３，１２４，および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８５，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域，を含む抗体；
（１３）  それぞれ配列番号１２３，１２４，および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８６，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８７，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；および
（１５）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８８，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体，
からなる群より選択される抗体。
【請求項９】
以下の（１）〜（１５）からなる群より選択される軽鎖可変領域：
（１）  配列番号１９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（２）  配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（３）  配列番号１９３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（４）  配列番号１９４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（５）  配列番号１９５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（６）  配列番号１９６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（７）  配列番号１９７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（８）  配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（９）  配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１０）  配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１１）  配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１２）  配列番号２０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１３）  配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１４）  配列番号２０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（１５）  配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
および、以下の（１）〜（７）からなる群より選択される重鎖可変領域：
（１）  配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（２）  配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（３）  配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（４）  配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（５）  配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（６）  配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（７）  配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
を有する抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である請求項１−９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１−４または７−１０のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号５７、６７、７７〜８３および９１のいずれかに記載の塩基配列を有する、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞を培養し、抗体を単離、精製することによる抗体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１−１０のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
請求項１−１０のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１８】
肝細胞癌を治療するための請求項１７記載の抗癌剤。
【請求項１９】
グリピカン３のアミノ酸残基５４２〜５５１、５４４〜５５３または５４６〜５５５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２０】
グリピカン３のアミノ酸残基５４６〜５５１のアミノ酸配列からなるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗グリピカン３抗体、ならびにかかる抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。
【背景技術】  グリピカン３（ＧＰＣ３）は、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの１つであり、発生における細胞分裂や、癌細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。
ＧＰＣ３に結合するある種の抗体が、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）活性およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害）活性により細胞増殖抑制作用を有することが見いだされている（ＷＯ２００３／０００８８３）。また、ＧＰＣ３が生体内で切断されて分泌型ＧＰＣ３として血中に分泌され、これを検出しうる抗体を用いて癌の診断が可能であることが示唆されている（ＷＯ２００４／０２２７３９、ＷＯ０３／１００４２９、ＷＯ２００４０１８６６７）。
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、用いられる抗体は高いＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を有していることが好ましい為、ＧＰＣ３を認識する抗体として高い細胞傷害活性を有する抗ＧＰＣ３抗体が望まれていた。
本発明は、従来の抗体と比較して高いＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有する抗ＧＰＣ３抗体を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは従来の抗グリピカン３抗体と比較して高い細胞傷害活性を有する抗体の取得に成功した。さらに、それらの抗体のエピトープを解析することにより、高い細胞傷害活性を発揮する抗体が認識するＧＰＣ３上の部位を見出すことに成功した。
本発明は、以下の（１）−（１２）のいずれか；
（１）  配列番号１２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）  配列番号１０９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１１０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）  配列番号１０６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１０７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１０８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）  配列番号１３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１３４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）  配列番号１０６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１３５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１３６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）  配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１２７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）  配列番号１２９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１３１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）  配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１０４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１０５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（９）  配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１０）  配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１１６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１１）  配列番号１１２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（１２）  配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１１９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および１２０配列番号に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
別の観点においては、本発明は、以下の（１）−（１３）のいずれか：
（１）  配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）  配列番号１４３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１４５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）  配列番号１４０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１４２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）  配列番号１６７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１６８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１６９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）  配列番号１７０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１７１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）  配列番号１５９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１６０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１６１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）  配列番号１６２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）  配列番号１６４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１６５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１６６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（９）  配列番号１３７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１３９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１０）  配列番号１５５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１５６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１１）  配列番号１４９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１５０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１２）  配列番号１４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１４８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（１３）  配列番号１５２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１５３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
好ましくは、本発明の抗体は、以下の（１）−（１３）：
（１）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）  それぞれ配列番号１０９，１１０および１１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４３，１４４および１４５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）  それぞれ配列番号１０６，１０７および１０８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４０，１４１および１４２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）  それぞれ配列番号１３２，１３３および１３４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１６７，１６８および１６９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）  それぞれ配列番号１０６，１３５および１３６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７０，１４４および１７１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）  それぞれ配列番号１２６，１２７および１２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１５９，１６０および１６１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）  それぞれ配列番号１２９，１３０および１３１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１６２，１４７および１６３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）  それぞれ配列番号１２９，１３０および１３１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１６４，１６５および１６６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）  それぞれ配列番号１０３，１０４および１０５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１３７，１３８および１３９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）  それぞれ配列番号１１８，１２１および１２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１５５，１５６および１５７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）  それぞれ配列番号１１５，１１６および１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４９，１５０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域，を含む抗体；
（１２）  それぞれ配列番号１１２，１１３および１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４６，１４７および１４８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；および
（１３）  それぞれ配列番号１１８，１１９および１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１５２，１５３および１５４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群より選択される。
さらに別の観点においては、本発明は、以下の（１）〜（７）のいずれかに記載の重鎖可変領域：
（１）  配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（２）  配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（３）  配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（４）  配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（５）  配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（６）  配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（７）  配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
を有する抗体を提供する。
また別の観点においては、本発明は、配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
好ましくは、本発明の抗体は、以下の（１）〜（７）の抗体：
（１）  配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）  配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）  配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）  配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）  配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）  配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；および
（７）  配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
からなる群より選択される。
さらに別の観点においては、本発明は以下の（１）−（１５）のいずれか：
（１）  配列番号１７４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）  配列番号１７５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）  配列番号１７６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）  配列番号１７７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）  配列番号１７８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）  配列番号１７９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）  配列番号１８０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）  配列番号１８１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（９）  配列番号１８２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１０）  配列番号１８３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１１）  配列番号１８４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１２）  配列番号１８５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１３）  配列番号１８６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１４）  配列番号１８７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（１５）  配列番号１８８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号１４４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は以下の（１）−（１５）：
（１）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７４，１４４および１５８，に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７５，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７６，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７７，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７８，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１７９，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８０，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８１，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８２，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８４，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）  それぞれ配列番号１２３，１２４，および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８５，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域，を含む抗体；
（１３）  それぞれ配列番号１２３，１２４，および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８６，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８７，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；および
（１５）  それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１８８，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体，
からなる群より選択される抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は以下の（１）〜（１５）：
（１）  配列番号１９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（２）  配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（３）  配列番号１９３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（４）  配列番号１９４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（５）  配列番号１９５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（６）  配列番号１９６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（７）  配列番号１９７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（８）  配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（９）  配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１０）  配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１１）  配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１２）  配列番号２０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１３）  配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１４）  配列番号２０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（１５）  配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
からなる群より選択される軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、以下の（１）〜（１５）からなる群より選択される軽鎖可変領域：
（１）  配列番号１９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（２）  配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（３）  配列番号１９３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（４）  配列番号１９４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（５）  配列番号１９５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（６）  配列番号１９６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（７）  配列番号１９７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（８）  配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（９）  配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１０）  配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１１）  配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１２）  配列番号２０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１３）  配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１４）  配列番号２０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（１５）  配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
および、以下の（１）〜（７）からなる群より選択される重鎖可変領域：
（１）  配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（２）  配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（３）  配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（４）  配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（５）  配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（６）  配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（７）  配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
を有する抗体を提供する。
本発明の好ましい抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびにこれらのＣＤＲ１，２および３のアミノ酸配列と、配列番号との対応を以下の一覧表に示す。
0004011100.tif 000002
0004011100.tif 000003
0004011100.tif 000004
また、上述のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつその抗体と同等の活性を有する抗体も本発明の範囲内である。好ましくは、本発明の抗体はヒト化抗体である。すなわち、別の観点においては、本発明はグリピカン３に結合するヒト化抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、グリピカン３のアミノ酸残基５２４〜５６３の配列を有するペプチドに結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン３のアミノ酸残基５３７〜５６３の配列を有するペプチドに結合する。また好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン３のアミノ酸残基５５０〜５６３の配列からなるペプチドに結合しないことを特徴とする。好ましくは、本発明の抗体は、グリピカン３のアミノ酸残基５４４〜５５３の配列を有するペプチドに結合し、また好ましくは、グリピカン３のアミノ酸残基５４６〜５５１の配列を有するペプチドに結合する。
また別の観点においては、本発明は、それぞれ配列番号１２３，１２４および１２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号１４３，１４４および１５８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２および３を有する軽鎖可変領域を含む抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体、すなわち、抗原との結合において競合する抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、グリピカン３に結合し、かつグリピカン３を発現する細胞に対して高いＣＤＣ活性を有する抗体、ならびに、グリピカン３に結合し、かつグリピカン３を発現する細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明のいずれかの抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１１−２１、３３−４３、５５−５９、６５−７０、７７−８３のいずれかに記載の塩基配列を有する。
別の観点においては、本発明は、上述の本発明の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供する。好ましくは、本発明の抗癌剤は、肝細胞癌を治療するために用いられる。
さらに別の観点においては、グリピカン３のアミノ酸残基５２４〜５６３のアミノ酸配列からなるペプチド、グリピカン３のアミノ酸残基５３７〜５６３のアミノ酸配列からなるペプチド、グリピカン３のアミノ酸残基５４４〜５５３のアミノ酸配列からなるペプチド、又はグリピカン３のアミノ酸残基５４６〜５５１のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＣＨＯ細胞、全長ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７に対する抗ＧＰＣ３抗体の結合活性をフローサイトメトリーにより評価した図である。Ｍ１Ｅ７（実線）、Ｍ１１Ｆ１（破線）はそれぞれ５μｇ／ｍＬ濃度で使用した。
図２は、競合ＥＬＩＳＡによるエピトープ分類の結果を示した表である。ビオチン化した抗ＧＰＣ３抗体の結合に対する競合的な阻害の程度を％表示し、競合的阻害のパターンに従いａからｅまでの５つのグループに分類された。
図３は、抗ＧＰＣ３抗体が可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質の４０ｋＤａのＮ端断片に結合するか、３０ｋＤａのＣ端断片に結合するかウエスタンブロッティングにより評価した結果である。Ｌ９Ｇ１１はＮ端断片に結合し、Ｍ３Ｃ１１はＣ端断片に結合する事が判明した。
図４は、ＨｅｐＧ２の培養上清中に分泌型ＧＰＣ３が存在する事をサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した結果である。Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ１９Ｂ１１等のＮ端断片に結合する抗体の組み合わせで高度に検出され、Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ３Ｂ８等のＣ端断片に結合する抗体では強くは検出されなかった。
図５は、抗ＧＰＣ３抗体を用いてＨｅｐＧ２の培養上清の免疫沈降を行い、分泌型ＧＰＣ３を検出した結果である。コントロールとして培地（レーン１、３）若しくはＨｅｐＧ２の培養上清（レーン２，４）をＭ１Ｅ７（レーン１，２）、Ｍ１０Ｄ２（レーン３、４）を用いて免疫沈降を行った。Ｎ端断片に結合するＭ１０Ｄ２により分泌型ＧＰＣ３が検出された。
図６は、ＧＰＣ３Ｃ末端ペプチドとＧＳＴの融合タンパク質を利用して、ＧＰＣ３Ｃ末端断片に結合する抗体のエピトープをウエスタンブロッティングにより分析した結果である。可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質（レーン１）、ＧＳＴ（レーン２）、ＧＣ−１（レーン３）、ＧＣ−２（レーン４）、ＧＣ−３（レーン５）、ＧＣ−４（レーン６）、ＧＣ−５（レーン７）を還元条件下にてＳＤＳ電気泳動後、Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１１Ｆ１を用いてウエスタンブロッティングにより検出した。
図７は、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の、ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞に対するＣＤＣ活性を評価した結果である。
図８は、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の、ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞、およびＨｅｐＧ２に対するＡＤＣＣ活性を評価した結果である。
図９は、マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いて、ＧＣ３３のヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７に対するＡＤＣＣ活性を評価した結果である。
図１０は、ＧＣ３３抗体のヒト肝癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍活性を評価した結果である。
図１１は、ＧＣ３３のマウス−ヒトキメラ抗体の、ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞に対するＣＤＣ活性を評価した結果である。
図１２は、ＧＣ３３のマウス−ヒトキメラ抗体の、ＨｅｐＧ２に対するＡＤＣＣ活性を評価した結果である。
図１３は、ＧＣ３３のエピトープ解析用に作製したＧＳＴ融合タンパク質（ＧＣ−４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４）に含まれるＧＰＣ３由来配列を示した図である。
図１４は、ＧＳＴ、ＧＣ−７、８、９、１１、１２、１３、１４を還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ＧＣ３３を用いてウエスタンブロッティングを行った結果である。
図１５は、ヒト化ＧＣ３３のＧＰＣ３に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより評価した結果である。
図１６は、可溶型ＧＰＣ３免疫マウス由来クローンについて、アイソタイプ、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ、エピトープ解析、免疫沈降実験の結果をまとめた抗体パネルである。
図１７は、ＧＣ−３免疫マウス由来クローンについて、アイソタイプ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、エピトープ解析の結果をまとめた抗体パネルである。
図１８は、ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１に位置するＧｌｙ３４をＣｙｓ、Ｍｅｔを除く他の１７アミノ酸に置換した改変型抗体の、可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより評価した結果である。
図１９は、ＧＣ３３、Ｍ３Ｃ１１、およびＭ１Ｅ７マウス−ヒトキメラ抗体の、全長ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞に対するＣＤＣ活性を評価した結果である。
図２０は、ＧＣ３３、Ｍ３Ｃ１１、およびＭ１Ｅ７マウス−ヒトキメラ抗体の、全長ＧＰＣ３発現ヒト肝癌細胞株ＳＫ−０３に対するＡＤＣＣ活性を評価した結果である。
［発明の詳細な説明］
抗体
本発明は、下記の（Ｉ）〜（ＸＩ）に記載の抗体を提供する。
（Ｉ）以下の（１）〜（１２）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域を含む抗体：
（１）配列番号１２３、１２４、１２５（ＧＣ３３）
（２）配列番号１０９、１１０、１１１（Ｍ１１Ｆ１）
（３）配列番号１０６、１０７、１０８（Ｍ３Ｂ８）
（４）配列番号１３２、１３３、１３４（ＧＣ１９９）
（５）配列番号１０６、１３５、１３６（ＧＣ２０２）
（６）配列番号１２６、１２７、１２８（ＧＣ１７９）
（７）配列番号１２９、１３０、１３１（ＧＣ１９４）
（８）配列番号１０３、１０４、１０５（Ｍ１３Ｂ３）
（９）配列番号１１８、１２１、１２２（Ｌ９Ｇ１１）
（１０）配列番号１１５、１１６、１１７（Ｍ６Ｂ１）
（１１）配列番号１１２、１１３、１１４（Ｍ５Ｂ９）
（１２）配列番号１１８、１１９、１２０（Ｍ１０Ｄ２）。
上記（１）〜（１２）の抗体の中で好ましいものは（１）〜（８）の抗体であり、さらに好ましいものは（１）〜（５）の抗体であり、特に好ましい抗体は（１）の抗体である。上記（１）〜（８）の抗体はグリピカン３のＣ末端側ペプチド（グリピカン３の３７４番目のアミノ酸から５８０番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記（９）〜（１２）の抗体はグリピカン３のＮ末端側ペプチド（グリピカン３の１番目のアミノ酸から３７３番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、診断用抗体として有用である。
（ＩＩ）以下の（１）〜（１３）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体：
（１）配列番号１４３、１４４、１５８（ＧＣ３３）
（２）配列番号１４３、１４４、１４５（Ｍ１１Ｆ１）
（３）配列番号１４０、１４１、１４２（Ｍ３Ｂ８）
（４）配列番号１６７、１６８、１６９（ＧＣ１９９）
（５）配列番号１７０、１４４、１７１（ＧＣ２０２）
（６）配列番号１５９、１６０、１６１（ＧＣ１７９）
（７）配列番号１６２、１４７、１６３（ＧＣ１９４（１））
（８）配列番号１６４、１６５、１６６（ＧＣ１９４（２））
（９）配列番号１３７、１３８、１３９（Ｍ１３Ｂ３）
（１０）配列番号１５５、１５６、１５７（Ｌ９Ｇ１１）
（１１）配列番号１４９、１５０、１５１（Ｍ６Ｂ１）
（１２）配列番号１４６、１４７、１４８（Ｍ５Ｂ９）
（１３）配列番号１５２、１５３、１５４（Ｍ１０Ｄ２）。
上記（１）〜（１３）の抗体の中で好ましいものは（１）〜（８）の抗体であり、さらに好ましいものは（１）〜（５）の抗体であり、特に好ましい抗体は（１）の抗体である。上記（１）〜（８）の抗体はグリピカン３のＣ末端側ペプチド（グリピカン３の３７４番目のアミノ酸から５８０番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記（９）〜（１３）の抗体はグリピカン３のＮ末端側ペプチド（グリピカン３の１番目のアミノ酸から３７３番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、診断用抗体として有用である。
（ＩＩＩ）以下の（１）〜（１３）の抗体：
（１）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１４３、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ３３）
（２）配列番号１０９、１１０、１１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１４３、１４４、１４５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ１１Ｆ１）
（３）配列番号１０６、１０７、１０８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１４０、１４１、１４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ３Ｂ８）
（４）配列番号１３２、１３３、１３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１６７、１６８、１６９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ１９９）
（５）配列番号１０６、１３５、１３６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７０、１４４、１７１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ２０２）
（６）配列番号１２６、１２７、１２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１５９、１６０、１６１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ１７９）
（７）配列番号１２９、１３０、１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１６２、１４７、１６３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ１９４（１））
（８）配列番号１２９、１３０、１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１６４、１６５、１６６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（ＧＣ１９４（２））
（９）配列番号１０３、１０４、１０５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１３７、１３８、１３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ１３Ｂ３）
（１０）配列番号１１８、１２１、１２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１５５、１５６、１５７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｌ９Ｇ１１）
（１１）配列番号１１５、１１６、１１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１４９、１５０、１５１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ６Ｂ１）
（１２）配列番号１１２、１１３、１１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１４６、１４７、１４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ５Ｂ９）
（１３）配列番号１１８、１１９、１２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１５２、１５３、１５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体（Ｍ１０Ｄ２）からなる群より選択される抗体。
上記（１）〜（１３）の抗体の中で好ましいものは（１）〜（８）の抗体であり、さらに好ましいものは（１）〜（５）の抗体であり、特に好ましい抗体は（１）の抗体である。上記（１）〜（８）の抗体はグリピカン３のＣ末端側ペプチド（グリピカン３の３７４番目のアミノ酸から５８０番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、治療用抗体として有用である。また、上記（９）〜（１３）の抗体はグリピカン３のＮ末端側ペプチド（グリピカン３の１番目のアミノ酸から３７３番目のアミノ酸までのペプチド）を認識し、診断用抗体として有用である。
（ＩＶ）以下の（１）〜（７）のいずれかに記載の重鎖可変領域：
（１）配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ａ）；
（２）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｃ）；
（３）配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｆ）；
（４）配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｈ）；
（５）配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｉ）；
（６）配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｊ）；
（７）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｋ）；
を有する抗体。
上記（１）〜（７）の抗体の中で特に好ましい抗体は（２）〜（７）の抗体である。
（Ｖ）配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体。
（ＶＩ）以下の（１）〜（７）の抗体：
（１）配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ａ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体；
（２）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｃ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体；
（３）配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｆ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体；
（４）配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｈ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体；
（５）配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｉ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を有する抗体；
（６）配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｊ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を含む抗体；
（７）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｋ）および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）を含む抗体；
からなる群より選択される抗体。
上記（１）〜（７）の抗体の中で特に好ましい抗体は（２）〜（７）の抗体である。
（ＶＩＩ）以下の（１）〜（１５）のいずれかの抗体：
（１）配列番号１７４、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号１７５、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）配列番号１７６、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）配列番号１７７、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）配列番号１７８、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）配列番号１７９、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）配列番号１８０、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）配列番号１８１、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）配列番号１８２、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）配列番号１８３、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）配列番号１８４、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）配列番号１８５、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）配列番号１８６、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）配列番号１８７、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１５）配列番号１８８、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
上記（１）〜（１５）の抗体の中で好ましい抗体は（１５）の抗体である。
（ＶＩＩＩ）以下の（１）〜（１５）いずれかの抗体：
（１）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７４、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７５、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７６、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７７、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７８、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１７９、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８０、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８１、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８２、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８３、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８４、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８５、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８６、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８７、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１５）配列番号１２３、１２４、１２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号１８８、１４４、１５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
上記（１）〜（１５）の抗体の中で好ましい抗体は（１５）の抗体である。
（ＩＸ）以下の（１）〜（１５）のいずれかに記載の抗体：
（１）配列番号１９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（２）配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（３）配列番号１９３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（４）配列番号１９４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（５）配列番号１９５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（６）配列番号１９６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（７）配列番号１９７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（８）配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（９）配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１０）配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１１）配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１２）配列番号２０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１３）配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１４）配列番号２０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
（１５）配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体。
上記（１）〜（１５）の抗体の中で好ましい抗体は（１５）の抗体である。
（Ｘ）以下の（１）〜（１５）からなる群より選択される軽鎖可変領域：
（１）配列番号１９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号１９２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（３）配列番号１９３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（４）配列番号１９４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（５）配列番号１９５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（６）配列番号１９６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（７）配列番号１９７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（８）配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（９）配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１０）配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１１）配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１２）配列番号２０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１３）配列番号２０３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１４）配列番号２０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（１５）配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
および、以下の（１）〜（７）からなる群より選択される重鎖可変領域：
（１）配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（２）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（３）配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（４）配列番号８７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（５）配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（６）配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（７）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
を有する抗体。
上記の抗体の中で好ましい抗体は、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体である。
（ＸＩ）上記の（Ｉ）〜（Ｘ）のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ（Ｉ）〜（Ｘ）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
本発明において、（Ｉ）〜（Ｘ）のいずれかに記載の抗体と同等の活性とは、ヒトグリピカン３抗体への結合活性、またはヒトグリピカン３を発現する細胞（例えば、ＨｅｐＧ２またはヒトグリピカン３発現組換えＣＨＯ細胞、など）への細胞傷害活性が同等であることをいう。
ヒト化抗体
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、グリピカン３に結合するヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化抗体は既知の方法を用いて製造することができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、例えばＣＤＲがマウス抗体由来である場合には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはＩｇＧを用いることが好ましく、さらにＩｇＧ１又はＩｇＧ３が好ましく、特にＩｇＧ１が好ましい。ＩｇＧ１は高い細胞傷害活性を有している点で抗体を抗癌剤として利用する場合に有効である（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５：８８（１９９７））。
なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
ヒト化抗体におけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能であるが、好ましくはマウス抗体のＣＤＲ配列である。
抗体のヒト化において、通常、由来となった抗体のアゴニスト活性を維持したままヒト化を行うことは困難であるが、本発明においては、由来となったマウス抗体と同等のアゴニスト活性を有するヒト化抗体の取得に成功した。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。
本発明においてヒト化抗グリピカン３抗体の好ましい例としては、例えば、配列番号８４（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ａ）、配列番号８５（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｃ）、配列番号８６（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｆ）、配列番号８７（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｈ）、配列番号８８（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｉ）、配列番号８９（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｊ）または配列番号９０（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｋ）に記載の重鎖可変領域を有する抗体、または配列番号９２（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）に記載の軽鎖可変領域を有する抗体を挙げることができる。特に好ましい例としては、配列番号８４（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ａ）、配列番号８５（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｃ）、配列番号８６（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｆ）、配列番号８７（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｈ）、配列番号８８（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｉ）、配列番号８９（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｊ）または配列番号９０（ＧＣ３３  ＶＨ  ｖｅｒ．ｋ）に記載の重鎖可変領域と、配列番号９２（ＧＣ３３  ＶＬ  ｖｅｒ．ａ）に記載の軽鎖可変領域とを有する抗体を挙げることができる。
さらに、本発明のヒト化抗グリピカン３抗体の好ましい例としては、配列番号９０に記載の重鎖可変領域と配列番号２０５に記載の軽鎖可変領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、以下の（１）〜（８）のいずれかに記載の抗体：
（１）配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（ＧＣ３３）；
（２）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（（Ｍ１１Ｆ１）；
（３）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（（Ｍ３Ｂ８）；
（４）配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（（ＧＣ１９９）；
（５）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＧＣ２０２）；
（６）配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＧＣ１７９）；
（７）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＧＣ１９４（１））；
（８）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＧＣ１９４（２））；
が結合するエピトープに結合する抗体を挙げることができる。さらに好ましくは（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体であり、特に好ましくは（１）に記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体である。
上記いずれかの抗体が結合するエピトープに結合する抗体は、特に高い細胞傷害活性を有する点で有用である。
上記（１）〜（７）いずれかに記載の抗体はヒトグリピカン３の５２４番目のアミノ酸から５８０番目のアミノ酸までの領域に結合し、特に５２４番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域に結合する。上記（１）〜（５）いずれかに記載の抗体はヒトグリピカン３の５３７番目のアミノ酸から５６３番目の領域に結合する。上記（１）に記載の抗体は、５４４番目のアミノ酸から５５３番目のアミノ酸の領域に結合し、特に５４６番目のアミノ酸から５５１番目の領域に結合する。
上記エピトープを認識する抗体は、高い細胞傷害活性を有するので癌などの疾患の治療用として有用である。特に、５４６番目のアミノ酸から５５１番目の領域に結合する抗体は特に細胞傷害活性が高いので有用である。
従って、本発明は、ヒトグリピカン３の５２４番目のアミノ酸から５８０番目のアミノ酸までの領域、好ましくは５２４番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは５３７番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは５４４番目のアミノ酸から５５３番目のアミノ酸までの領域、特に好ましくは５４６番目のアミノ酸から５５１番目のアミノ酸までの領域をエピトープとして、それらの領域に結合する抗体を含む。
本発明において好ましい他の態様としては、ヒトグリピカン３の５２４番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域を認識し、かつ、５３７番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域を認識しない抗体を挙げることができる。
さらに、本発明において好ましい他の態様としては、ヒトグリピカン３の５３７番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域を認識し、かつ、５５０番目のアミノ酸から５６３番目のアミノ酸までの領域を認識しない抗体を挙げることができる。
抗体が認識するエピトープの解析は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば実施例記載のウェスタンブロッティング法などにより行うことが可能である。
上記の領域をエピトープとして認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能であり、例えば、ヒトグリピカン３のアミノ酸配列を基に目的の領域のアミノ酸配列を含むペプチドを作製し、該ペプチドを免疫原として抗体を作製することにより、または、通常の方法で抗体を作製した後、得られた抗体が認識するエピトープを決定し、目的のエピトープを認識する抗体を選択することにより得ることが可能である。
本発明の抗グリピカン３抗体の好ましい例としては、グリピカン３を発現する細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を有する抗体または高いＣＤＣ活性を有する抗体を挙げることができる。
本発明において高いＡＤＣＣ活性または高いＣＤＣ活性とは、公知の抗グリピカン３抗体よりも高いＡＤＣＣ活性または高いＣＤＣ活性を有することをいう。公知のグリピカン３抗体としては、ＷＯ２００４／２２７３９に記載されているＭ３Ｃ１１またはＭ１Ｅ０７を挙げることができる。
ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の測定方法は、当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、クロム遊離試験により行うことが可能である。ＡＤＣＣ活性を測定する際のクロム遊離試験の具体的な条件としては、特に限定されないが、例えば、実施例記載の条件を用いて測定することができる。
グリピカン３を発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２などの肝癌細胞、グリピカン３をコードする遺伝子を組み込まれたＣＨＯ細胞などを挙げることができる。ＡＤＣＣ活性を測定する場合にはＨｅｐＧ２細胞を用いることが好ましく、ＣＤＣ活性を測定する場合にはＧＰＣ３発現組換えＣＨＯ細胞を用いることが好ましい。ＧＰＣ３発現組換えＣＨＯ細胞は如何なる方法により作製されてもよいが、例えば実施例に記載の方法により作製することが可能である。
抗グリピカン３抗体を抗癌剤として用いる場合には、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（ＧＣ３３）と同程度のＡＤＣＣ活性を有していることが好ましい。抗グリピカン３抗体を抗癌剤として用いる場合には、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（ＧＣ３３）と同程度のＣＤＣ活性を有していることが好ましい。
さらに本発明はグリピカン３への結合活性が高い抗体を含む。
本発明において、グリピカン３への結合活性は、当業者に公知の手段を使用して測定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。すなわちセンサーチップ上にグリピカン３タンパク質を固定して抗体と反応させ、測定値から抗体とグリピカン３の相互作用を反応速度定数として算出することができる。また、結合活性の評価には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、被験抗体が結合する抗原をコーティングしたプレートに、被験抗体を含む試料、例えば、被験抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。結合活性の上限は特に限定されないが、例えば、当業者が技術的に作製可能な範囲の上限を設定することができる。しかしながら、技術的に作製可能な範囲は、技術の進歩により拡大されることが理解されるであろう。
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。脱アミド化されるアミノ酸としてはアスパラギン、グルタミンを挙げることができるが、好ましくはアスパラギンである。アスパラギンに隣接するアミノ酸としては、特に限定されずどのようなアミノ酸でもよいが、アスパラギン−グリシン配列は特に脱アミド化されやすいことが知られているので、アスパラギンに隣接するアミノ酸としてはグリシンが好ましい。置換後のアミノ酸としては、アスパラギンおよびグルタミン以外であれば特に限定されず、如何なるアミノ酸でもよいが、好ましくはバリン、プロリン以外のアミノ酸であることが好ましい。従って、本発明においては、抗体の脱アミド化を目的とする場合には、アスパラギン、グルタミン、バリン、プロリン以外のアミノ酸に置換することが好ましい。アミノ酸置換による脱アミド化の抑制については、例えばＷＯ０３／０５７８８１を参考に行うことが可能である。脱アミド化抑制を目的にアミノ酸置換を行う場合には、置換前の抗原結合活性を維持していることが好ましい。
さらに、抗体安定化の他の態様として、グルタミン酸の他のアミノ酸への置換を挙げることができる。また、本発明では、抗体重鎖の６番目がグルタミン酸である場合、該グルタミン酸をグルタミンに置換することにより、顕著に抗体を安定化できることを見いだした。したがって、本発明は、抗体重鎖の６番目のグルタミン酸をグルタミンに置換することにより抗体を安定化する方法に関する。抗体中のアミノ酸番号は当業者に公知である（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  １９８３）。
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
又、本発明に使用する抗体は二種特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）でもよい（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１５２，５３６８−５３７４、など）。二種特異性抗体は一方がグリピカン３を認識し、他方が他の抗原を認識してもよいし、グリピカン３分子上の異なるエピトープを認識してもよい。
また本発明の抗体は、そのＮ末端あるいはＣ末端に他のタンパク質を融合してもよい（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１０，１２７４−１２８１）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。
さらに、本発明の抗体は細胞障害活性が増強された抗体でもよい。細胞障害活性が増強された抗体としては、例えば、フコースが欠損した抗体、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付加した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸を置換することによりＦｃγ受容体との結合活性を変化させた抗体などを挙げることができる。これら細胞障害活性が増強された抗体は当業者に公知の方法で作製することができる。
抗体の作成方法
グリピカン３に結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、グリピカン３タンパク質またはグリピカン３発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって哺乳動物を免疫する。得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞を選択することができる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、配列番号３および４に示されるグリピカン３遺伝子／アミノ酸配列にしたがってグリピカン３タンパク質を取得し、これを抗体取得の感作抗原として使用する。すなわち、グリピカン３をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトグリピカン３タンパク質を公知の方法で精製する。
次に、この精製グリピカン３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、グリピカン３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトグリピカン３のアミノ酸配列にしたがって化学合成により得ることも可能である。
本発明の抗グリピカン３抗体の認識するグリピカン３分子上のエピトープは特定のものに限定されず、グリピカン３分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗グリピカン３抗体を作製するための抗原は、グリピカン３分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合すべき親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５８）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫してハイブリドーマを得る方法の他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリピカン３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、グリピカン３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに別の方法では、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるグリピカン３を投与して抗グリピカン３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させ、その細胞からグリピカン３に対するヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗グリピカン３抗体を産生するハイブリドーマから、抗グリピカン３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗グリピカン３抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗グリピカン３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、Ｈ鎖またはＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。
ポリヌクレオチド
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１１−２１、３３−４３、５５−５９、６５−７０、７７−８３のいずれかに記載の塩基配列を有する。また、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等のヌクレオチドからなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により製造するために使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングするために、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このようなベクターは、本発明の抗体を製造するために用いることができる。本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させることができる。また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換することができる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明の抗体を製造するためには、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が挙げられる。本発明においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫ細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系を使用することができる。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等、および枯草菌が挙げられる。
組換え抗体の製造
本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養することにより製造することができる。目的とするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、ＦＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物または植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物としてトランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
以上のようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
なお、抗体の精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
診断方法
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体を用いて被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出し、癌などの疾患の診断を行う方法を提供する。
検出とは、定量的または非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＧＰＣ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、ＧＰＣ３タンパク質の濃度の測定、ＧＰＣ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料とは、ＧＰＣ３タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、などを挙げることができるが、好ましいものは血液、血清、血漿である。また、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、特に制限されず、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができるが、好ましいものは肝癌である。検出するＧＰＣ３は、特に限定されず、全長ＧＰＣ３でも、その断片でもよい。ＧＰＣ３断片を検出する場合には、Ｎ端断片でもＣ端断片でもよいが、好ましくはＮ端断片である。また、ヘパラン硫酸などが付加されたＧＰＣ３タンパク質でも、ＧＰＣ３コアタンパク質でもよい。
被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＧＰＣ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいものは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗ＧＰＣ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＧＰＣ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＧＰＣ３抗体とＧＰＣ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＧＰＣ３抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
抗ＧＰＣ３抗体とＧＰＣ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＧＰＣ３タンパク質と抗ＧＰＣ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法においては、ＧＰＣ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出することが可能である。また、コントロール試料および被検試料の検出結果を数値として得、それらの数値を比較することにより、被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
抗ＧＰＣ３抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＧＰＣ３抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に結合する標識抗体を用いてＧＰＣ３を検出することができる。
抗ＧＰＣ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。
具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＧＰＣ３抗体を検出する。タンパク質の検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＧＰＣ３抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＧＰＣ３タンパク質を検出する。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の他の態様として、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に結合する一次抗体、および該一次抗体を特異的に結合する二次抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＧＰＣ３タンパク質を、一次抗ＧＰＣ３抗体および該一次抗体を特異的に結合する二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、一次抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に結合する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、プレートに残った二次抗体を検出する。二次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体を含有する医薬組成物は癌などの細胞増殖に関連する疾患の治療および／または予防に有用であり、特に肝癌の治療および／または予防に有用である。本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量を投与しうるよう選択する。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の処方は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−２０３６３７号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】実施例１
ヒトグリピカン３（ＧＰＣ３）のｃＤＮＡクローニング
ヒトＧＰＣ３をコードする全長ｃＤＮＡは、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２より常法により調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。
すなわち、２μｌのＣａｃｏ２由来ｃＤＮＡ、１μｌのセンスプライマー（ＧＡＴＡＴＣ−ＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＣＧＴ：配列番号１）、１μｌのアンチセンスプライマー（ＧＣＴＡＧＣ−ＴＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣ：配列番号２）、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２  １０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１．２５ｍＭ）、１．０μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを含む５０μｌの反応液を、９４℃で１分、６３℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応による増幅産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入した。ＡＢＩ３１００  ＤＮＡシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトＧＰＣ３の全長をコードするｃＤＮＡを単離した。配列番号３で表される配列はヒトＧＰＣ３遺伝子の塩基配列を、配列番号４で表される配列はヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
実施例２
可溶型ＧＰＣ３の作製
抗ＧＰＣ３抗体作製のための免疫タンパク質として、Ｃ末端側の疎水性領域（５６４−５８０アミノ酸）を欠損させた可溶型ＧＰＣ３タンパク質を作製した。
完全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを鋳型としてアンチセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  Ｃ：配列番号５）とＥｃｏＲＩ認識配列、Ｋｏｚａｋ配列を加えたセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ：配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片（１７１１ｂｐ）をｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇにクローニングした。ｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇは、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８；１９３−１９９）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩ（Ｈｉｒａｔａら、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ  １９９４；３５６；２４４−２４８）のＤＨＦＲ遺伝子発現領域を挿入し、また、マルチクローニングサイトの下流にＦｌａｇタグ配列を付加し、Ｆｌａｇタグ付加タンパクとして発現されるよう設計した。作製された発現プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株を得た。１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファにより溶出した。次に、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドにより行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）による濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によるゲルろ過を行いＦＬＡＧペプチドを除去した。最後にＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いて濃縮し、同時にＴｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で溶出を行うことによりバッファ置換を行った。
実施例３
可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質の作製
ＧＰＣ３はヘパラン硫酸による修飾を受け巨大分子となる。抗ＧＰＣ３抗体のスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除する為、ヘパラン硫酸付加部位に点変異を導入した可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を作製し、スクリーニングに用いた。
上記可溶型ＧＰＣ３（１−５６３）を鋳型とし、アッセンブリーＰＣＲ法によって４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させたｃＤＮＡを作製した。この際、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたｃＤＮＡをｐＣＸＮＤ３ベクターにクローニングした。ｐＣＸＮＤ３は、ｐＣＸＮ２のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入して作製した。作製された発現プラスミドＤＮＡをＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファにより溶出した。次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてアフィニティー精製を行った。１０〜１５０ｍＭのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて濃縮し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファにより溶出した。
還元条件下にてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａの３つのバンドが得られた。ＡＢＩ４９２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてアミノ酸シークエンスを行った結果、３０ｋＤａのバンドはＧＰＣ３の３５９番目以降、もしくは３７５番目以降のアミノ酸配列と一致し、ＧＰＣ３はＡｒｇ３５８とＳｅｒ３５９の間、若しくはＬｙｓ３７４とＶａｌ３７５の間で切断を受け、４０ｋＤａのＮ末端断片と３０ｋＤａのＣ末端側断片に分割していることが判明した。
実施例４
全長ヒトＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞株の作製
フローサイトメトリを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長ＧＰＣ３を発現するＣＨＯ細胞株の樹立を行った。
１０μｇの全長ヒトＧＰＣ３遺伝子発現ベクターと６０μＬのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を混合し、複合体を形成させた後に、ＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株に添加することにより、遺伝子導入を行った。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養後、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎおよび１０％  ＦＢＳを含むαＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いて、選抜を開始した。得られたＧｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンを可溶化し、抗ＧＰＣ３抗体を用いたウエスタンプロットにより全長ヒトＧＰＣ３の発現を確認し、安定発現細胞株を取得した。
実施例５
ＥＬＩＳＡによる結合活性の評価
可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を１μｇ／ｍＬとなるようにコーティングバッファ（０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものをイムノプレートに加え、４℃にて一晩放置しコーティングした。希釈バッファ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）にてブロッキング処理を行った後、抗ＧＰＣ３抗体を加え、室温で１時間放置した。リンスバッファ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）にて洗浄後、アルカリホスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を加え、室温で１時間放置した。リンスバッファにて洗浄後、ＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ社）を１ｍｇ／ｍＬとなるように基質バッファ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．８），１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）に希釈したものを添加し、室温で１時間発色させた後、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて吸光度（４０５ｎｍ，参照波長６５５ｎｍ）を測定した。
実施例６
可溶型ＧＰＣ３の免疫およびハイブリドーマの選抜
ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３のホモロジーはアミノ酸レベルで９４％の高い相同性を示すため、通常のマウスに免疫しても抗ＧＰＣ３抗体を得難い可能性を考え、自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールズ・リバーより購入）を免疫動物として用いた。７週齢、もしくは８週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型ＧＰＣ３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、ベクトンディッキンソン社）を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ、ベクトンディッキンソン社）でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。その内２匹に対し、最終免疫として５０μｇ／ｈｅａｄとなるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。最終免疫の４日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）と２：１になるように混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を加えＰＥＧ１５００を希釈し、遠心操作によりＰＥＧ１５００を除去した後、１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０にて懸濁したものを１００μＬ／ウエルとなるように９６穴培養プレートに播種した。翌日、１００μＬ／ウエルとなるように１０％ＦＢＳ、１  ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ社）、０．５  ｘ  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を含むＲＰＭＩ１６４０（以降、ＨＡＴ培地）を添加した。２，３，５日後に培養液の半分をＨＡＴ培地に置き換え、７日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を１１クローン（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ１Ｅ７、Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１、Ｌ９Ｇ１１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ５Ｂ９、Ｍ１０Ｄ２）取得した。
実施例７
抗ＧＰＣ３抗体のアイソタイプの決定、および精製
アイソタイプは、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いた抗原依存的ＥＬＩＳＡにより決定した。抗体の精製は、ＦＢＳ（Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を添加したＨＡＴ培地にて培養したハイブリドーマの培養上清を、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に吸着させた後、結合バッファ（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファ（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出液は直ちに中和バッファ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で中和した。ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファ置換した。
実施例８
ＥＬＩＳＡによる結合活性の評価
取得された抗ＧＰＣ３抗体の結合活性を簡便に評価する為、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートに対する抗体濃度依存的な結合を検出した。精製抗体を１０μｇ／ｍＬから３倍ずつ１２段階に希釈したものを加え、２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、ＳＩＧＭＡ１０４による発色を行った。発色の程度は発色時間により変化するので、データは正確に１時間後に測定したものを解析した。各抗体は全て濃度依存的な発色を示した。抗体濃度と発色の程度との相関をプロットし、解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて近似曲線を作成し、そのＥＣ５０値を結合活性の指標として決定した。図１６に全クローンのＥＣ５０値を示した。
実施例９
フローサイトメトリによる結合活性の評価
１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（ＧＩＢＣＯ社）／ＰＢＳにて細胞を剥離し、１ｘ１０６細胞／ｍＬになるようにＦＡＣＳバッファ（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬウエルとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ社）に分注し、遠心操作にて上清を除去した。適当な濃度に希釈した抗ＧＰＣ３抗体を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファにて１回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、氷上にて３０分間反応させた。反応後、５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除き、ＦＡＣＳバッファ４００μＬに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。フローサイトメーターはＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）および側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。図１に示すように抗ＧＰＣ３抗体（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１１Ｆ１）はＧＰＣ３を発現させたＣＨＯ細胞に強く結合し、親株であるＣＨＯ細胞には結合しない事から、細胞膜上に提示されたＧＰＣ３に特異的に結合する事が判明した。また、肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣより購入）、ＨｕＨ−７（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）に対して結合を示したことから、肝細胞癌を特異的に認識する可能性が示された。可溶型ＧＰＣ３免疫マウス由来クローンのフローサイトメトリによる結合活性については抗体濃度５μｇ／ｍＬにおけるヒストグラムのＸ−ｍｏｄｅ値を図１６に示す。
実施例１０
競合ＥＬＩＳＡによるエピトープ分類
得られた抗体についてエピトープによる分類を行う為、競合ＥＬＩＳＡを実施した。抗体のビオチン化はＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を１μｇ／ｍＬとなるようにコーティングバッファで希釈したものを１００μＬ／ウエルとなるように加え、一晩４℃で保管しコーティングした。翌日２００μＬの基質バッファを加えブロッキングを行った。４℃で一晩以上放置したプレートへ抗ＧＰＣ３抗体を１００μＬ／ウエルとなるように加え、室温で１時間反応させた。その後プレートの洗浄なしに１０μｇ／ｍＬのビオチン標識した抗ＧＰＣ３抗体１０μＬを加えさらに１時間反応させた。３００μＬ／ウエルのリンスバッファで３回洗浄し、希釈バッファで１０００倍に希釈したＡＰ−ストレプトアビジンコンジュゲート（ＺＹＭＥＤ社）を１００μＬ／ウエルとなるように加え、室温で１時間反応させた。３００μＬ／ウエルのリンスバッファで５回洗浄し、ＳＩＧＭＡ１０４を１ｍｇ／ｍＬとなるように基質バッファで希釈したものを１００μＬ／ウエルとなるように加えた。１時間室温でインキュベートした後、吸光度（４０５ｎｍ，参照波長６５５ｎｍ）を測定した。
図２に競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。ビオチン化抗体の結合を５０％以上競合的に阻害した抗体については、エピトープが立体的に近傍であると判断した。８種類のビオチン化抗体の結合に対する競合的な発色の阻害のパターンによりグループ分けした結果、可溶型ＧＰＣ３免疫マウス由来の１１クローンは５つのグループ（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）に分類された（図１６）。
実施例１１
ウエスタンブロッティングによるエピトープ分類
可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を還元条件下にて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（ＴＥＦＣＯ社）にチャージし電気泳動後、Ｔｈａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ移した。膜をＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ＴＢＳ）で軽く洗った後、５％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで約１０分間振とうした後、１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行い、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて検出した。
図３に示すように、Ｌ９Ｇ１１は４０ｋＤａ付近のバンドに結合することからＮ端側結合抗体であると判断された。Ｍ３Ｃ１１は３０ｋＤａ付近のバンドに結合することからＣ端側に結合する抗体と判断した。競合ＥＬＩＳＡでｃ，ｄ，ｅに属する抗体は全てＮ末端に結合し、ａ、ｂは全てＣ末端に結合した（図１６）。Ｌ９Ｇ１１は他のＮ端側結合抗体と比較してウエスタンブロッティングの検出感度が高く、Ｎ端側断片をウエスタンブロッティングにより検出するにあたって有用な抗体であると考えられた。
実施例１２
分泌型ＧＰＣ３の検出
ＧＰＣ３が３５８番目のアミノ酸部位、若しくは３７４番目のアミノ酸部位で切断される事実を見出し、分泌型ＧＰＣ３が肝癌患者の血中に分泌されるという仮説を立てた。そこで分泌型ＧＰＣ３を検出する為、ＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。
イムノプレートに１０μｇ／ｍＬとなるように抗ＧＰＣ３抗体をコートし、基質バッファを用いてブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、ＨｅｐＧ２の培養上清を加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのリンスバッファで３回洗浄後、１０μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識した抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのリンスバッファで３回洗浄後、ＡＰ−ストレプトアビジンを加え、１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウエルのリンスバッファで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＡＭＰＡＫ（ＤＡＫＯ社）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。Ｎ端断片に結合する抗体（Ｍ６Ｂ１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ１８Ｄ４）とＣ端断片に結合する抗体（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ３Ｂ８）を組み合わせ５種類のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。いずれの組み合わせも分泌型ＧＰＣ３を用いたスタンダード曲線では同等の感度を示した。ＨｅｐＧ２の培養上清を用いて評価した結果、Ｎ端断片に結合する抗体の組み合わせで１μｇ／ｍＬ程度と高濃度で分泌型ＧＰＣ３が検出された（図４）。Ｃ端に結合する抗体の組み合わせでは検出濃度が低かった事から、分泌型ＧＰＣ３ではＮ端断片が優位に存在すると考えられた。
次に、抗ＧＰＣ３抗体を用いてＨｅｐＧ２の培養上清の免疫沈降を行い、分泌型ＧＰＣ３の検出を行った。Ｎ端断片に結合するＭ１０Ｄ２を用いた場合、４０ｋＤａの分泌型ＧＰＣ３が検出された（図５）。それに対しＣ端断片に結合するＭ１Ｅ７を用いた場合、分泌型ＧＰＣ３は検出されなかった。取得した全ＧＰＣ３抗体について免疫沈降実験を行った結果、Ｎ端断片に結合する全ての抗体は分泌型ＧＰＣ３を強く検出し、Ｃ端断片に結合する抗体では検出されないか、弱く検出された（図１６）。免疫沈降により分泌型ＧＰＣ３を検出し得る抗体は肝細胞癌の診断用抗体として有用であると考えられる。また、分泌型ＧＰＣ３を検出しにくい抗体は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有する治療用抗体として開発する上で、血液中の分泌型ＧＰＣ３にトラップされずに肝細胞癌へ移行し得る点で有用であると考えられた。
実施例１３
抗ＧＰＣ３抗体可変領域のクローニング
抗ＧＰＣ３抗体産生ハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、抗ＧＰＣ３抗体可変領域をＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて１×１０７細胞のハイブリドーマより抽出した。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、以下の合成オリゴヌクレオチド：マウスＩｇＧ１定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１ＧＧＧ  ＣＣＡＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡＣＡＧ  ＡＴＧ（配列番号７）マウスＩｇＧ２ａ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ａＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  ＡＴＧ（配列番号８）マウスＩｇＧ２ｂ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＴＧ（配列番号９）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＧ（配列番号１０）を用い、５’末端側遺伝子断片を増幅した。
逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応した。ＰＣＲ溶液５０μＬは、５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（以上、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、２．５μＬの逆転写反応産物、１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１、ＭＨＣ−ＩｇＧ２ａ、ＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂまたはｋａｐｐａを含有した。ＰＣＲは、９４℃の初期温度にて３０秒間そして９４℃にて５秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、さらに９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを２５回反復した。最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングし、塩基配列を決定した。
Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ１Ｅ７、Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ５Ｂ９、Ｍ１０Ｄ２、Ｌ９Ｇ１１のＨ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２に、Ｌ鎖可変領域の塩基配列を配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４に示す。
実施例１４
ＧＳＴ融合蛋白を用いたエピトープ分類
Ｃ端断片に結合する抗体についてはエピトープの詳細な解析を行う為、段階的に短くしたＧＰＣ３Ｃ端断片ペプチドとＧＳＴの融合タンパク質ＧＣ−１（Ｓｅｒ４９５からＬｙｓ５６３）、ＧＣ−２（Ｇｌｙ５１０からＬｙｓ５６３）、ＧＣ−３（Ａｌａ５２４からＬｙｓ５６３）ＧＣ−４（Ｇｌｙ５３７からＬｙｓ５６３）、ＧＣ−５（Ｓｅｒ５５０からＬｙｓ５６３）を作製した。ＧＰＣ３  Ｃ末端領域をｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へクローニングしＧＳＴのＣ末端側にＧＰＣ３  Ｃ末端領域を連結したプラスミドＤＮＡを構築した。プラスミドＤＮＡをＤＨ５αへ導入し形質転換体を得、対数増殖期にある形質転換体の培養物に１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えることによりＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導し、２時間培養後に菌体を回収した。超音波処理により破砕後、ＸＬ−８０超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ，ロータ７０．１Ｔｉ）を用い３５，０００ｒｐｍで３０分遠心後の培養上清を回収し、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて精製した。このようにして精製したＧＳＴ融合タンパク質を還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、抗ＧＰＣ３抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った（図６）。Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１Ｅ７はＧＣ−１、２を検出し、ＧＣ−３、４、５を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、ＧＣ−２の領域に含まれており、ＧＣ−３の領域では不十分な領域であるといえる。Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１はＧＣ−１、２、３、４を検出し、ＧＣ−５を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、ＧＣ−４の領域に含まれており、ＧＣ−５の領域では不十分な領域であるといえる。各抗体の結合し得るＧＳＴ融合蛋白の最小領域について図１６のウエスタンブロッティングの項に記載した。
実施例１５
抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の作製
抗ＧＰＣ３抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１およびκ鎖定常領域配列に連結した。各抗体のＨ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＮｈｅＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトＩｇＧ１定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｋｓ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＨベクターにクローニングした。ＮｈｅＩ部位により、マウスＨ鎖可変領域とヒトＨ鎖（γ１鎖）定常領域が連結している。作製されたＨ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングした。また、各抗体のＬ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＢｓｉＷＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトｋａｐｐａ鎖定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＬベクターにクローニングした。ＢｓｉＷＩ部位により、ヒトＬ鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたＬ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＵＣＡＧクローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。
抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、Ｌ鎖遺伝子断片が挿入されたｐＵＣＡＧベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社）で消化して得られる遺伝子断片をＨ鎖遺伝子が挿入されたｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
抗体を安定に発現するＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により細胞に遺伝子を導入した。２５μｇの各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターとＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中を取り出し、ＩｇＧ量について以下に示す濃度定量法で測定した。高産生細胞株を順次拡大培養し、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、大量培養を行い、培養上清を得た。各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の精製は、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行った。
実施例１６
補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）の測定１６．１  ヒトアルブミン・ベロナール・バッファ（ＨＡＶＢ）の作製
ＮａＣｌ（特級、和光純薬工業株式会社）１２．７５ｇ、Ｎａ−バルビタール（特級、和光純薬工業株式会社）０．５６２５ｇ、バルビタール（特級、和光純薬工業株式会社）０．８６２５ｇをミリＱ水に溶解し２００ｍＬとした後、オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ処理した１００ｍＬの温ミリＱ水を加え、ｐＨ７．４３を確認した（推奨ｐＨ７．５）。これを５×ベロナールバッファとした。ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）０．２２０５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．０３ｍｏｌ／Ｌとし、ＣａＣｌ２溶液とした。ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）１．０１６５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．１ｍｏｌ／Ｌとし、ＭｇＣｌ２溶液とした。５×ベロナールバッファ１００ｍＬ、ヒト血清アルブミン（ブミネート（登録商標）２５％、ヒト血清アルブミン濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、バクスター株式会社）４ｍＬ、ＣａＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＭｇＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＫＣｌ（特級、純正化学株式会社）０．１ｇ、グルコース（Ｄ（＋）−グルコース、ブドウ糖無水、特級、和光純薬工業株式会社）０．５ｇをミリＱ水に溶解し５００ｍＬとした。これをＨＡＶＢとした。ろ過滅菌後、設定温度５℃にて保存した。
１６．２  標的細胞の調製
実施例４で作製された全長ヒトＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳと０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を添加したα−ＭＥＭ核酸（＋）培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し、細胞剥離緩衝液（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離して、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、３日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのクロム−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養し、この細胞をＨＡＶＢで２回洗浄し、５０μＬのＨＡＶＢを加え標的細胞とした。
１６．３  クロム遊離試験（ＣＤＣ活性）
各キメラ抗体をＨＡＶＢで希釈して４０μｇ／ｍＬの抗体溶液とした。標的細胞に抗体溶液を５０μＬずつ添加し、氷上にて１５分間静置した。続いて、各ウェルにＨＡＶＢにて希釈した、健常者ボランティア末梢血由来ヒト血清を終濃度２５％になるよう１００μＬずつ添加し（抗体の終濃度１０μｇ／ｍＬ）、５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で９０分間静置した。プレートを遠心分離後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、ガンマカウンターにて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、ＨＡＶＢを５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞にＨＡＶＢを１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＣＤＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図７に示した。９種類の抗ＧＰＣ３キメラ抗体のうち、Ｃ末端認識抗体であるＭ３Ｂ８とＭ１１Ｆ１がＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞に対し強いＣＤＣ活性を示したのに対し、その他の抗体ではＣＤＣ活性が認められなかった。Ｍ３Ｂ８とＭ１１Ｆ１はＣｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡにおいて「ｂ」と呼ばれるグループに属しており、強いＣＤＣ活性を示すのに重要なエピトープを見出す事ができた。
実施例１７
ヒト末梢血由来ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性の測定１７．１  ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＴＭ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
１７．２  標的細胞の調製
１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨｅｐＧ２細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、２日間培養した。実施例４で作製された全長ヒトＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳと０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を添加したα−ＭＥＭ  核酸（＋）培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し、細胞剥離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離して、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、３日間培養した。両細胞は培養後、それぞれ５．５５ＭＢｑのクロム−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で１時間培養し、この細胞を培地で１回洗浄し、５０μＬの１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０培地を加え標的細胞とした。
１７．３  クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１５分反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。その結果を図８に示した。９種類の抗ＧＰＣ３キメラ抗体のうち、Ｃ末端認識抗体が強いＡＤＣＣ活性を示す傾向が認められた。
実施例１８
ＧＯ−３の免疫およびハイブリドーマの選抜
得られた抗ＧＰＣ３抗体のうち、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のみが強いＣＤＣ活性を示したことから、ＣＤＣ活性にはエピトープ依存性があることが判明した。ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を併せもつ抗体の取得を目的とし、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のエピトープを含むＧＳＴ融合タンパク質であるＧＣ−３を用いて免疫を行った。ＧＣ−３は上記方法により大量に精製し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてゲルろ過を行い、バッファをＰＢＳに置換したものを免疫蛋白として使用した。Ｂａｌｂ／ｃ（日本チャールズリバーより購入）３匹、ＭＲＬ／ｌｐｒ  ３匹を、上記方法に従いＧＣ−３で免疫した。初回免疫にはＧＣ−３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、ＦＣＡを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをＦＩＡでエマルジョン化したものを皮下に投与した。５回免疫の後、全マウスに対し最終免疫（５０μｇ／ｈｅａｄ）を尾静脈内に行った。細胞融合を行い、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を５クローン（ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４）取得した。
ハイブリドーマの培養上清よりＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰを用いて抗体を精製し、上記方法に従い解析を行った。可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＥＣ５０値を算出し、フローサイトメトリにより５μｇ／ｍＬでのヒストグラムのＸ−ｍｏｄｅ値を測定した（図１７）。競合ＥＬＩＳＡによるエピトープ分類の結果、ｂに属するもの（ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３）と新しいエピトープグループｆ（ＧＣ１７９、ＧＣ１９４）に分類された。ＧＳＴ融合タンパク質を用いたエピトープ分類の結果、ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３はＧＣ−１、２、３、４を検出し、ＧＣ−５を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のエピトープと同様に、ＧＣ−４の領域に含まれており、ＧＣ−５の領域では不十分な領域であるといえる。一方、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４はＧＣ−１、２、３を検出し、ＧＣ−４、５を検出しなかった。これら抗体のエピトープは、ＧＣ−３の領域に含まれており、ＧＣ−４の領域では不十分な領域であるといえる。各抗体の結合し得るＧＳＴ融合蛋白の最小領域について図１７のウエスタンブロッティングの項に記載した。
ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４について上記方法に従いＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域をクローニングし、配列を決定した。ＧＣ１９４のＬ鎖については２種類の配列がクローニングされた。ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４のＨ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号５５、５６、５７、５８、５９に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４に示す。ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４（１）、ＧＣ１９４（２）のＬ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６に示す。
さらに、これらのアミノ酸配列を既知の抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較して相同性を調べることにより、ＣＤＲ領域を以下のとおり決定した。
0004011100.tif 000005
0004011100.tif 000006
実施例１９
マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いたＡＤＣＣ活性の測定１９．１  マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液の調製
ＳＣＩＤマウス（日本クレア・オス・１０週齢）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０培地中５×１０５個／ｍＬとなるよう懸濁し、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で５日培養した。培養後スクレーパーではがして培地で１回洗浄し、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０培地中５×１０６／ｍＬとなるよう懸濁し、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液とした。
１９．２  標的細胞の調製
ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７は１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社製）を含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）にて維持継代し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、１日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのクロム−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で１時間培養し、この細胞を培地で１回洗浄し、５０μＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加え標的細胞とした。
１９．３  クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１５分反応させた後に、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図９に示した。ＧＣ３３抗体は０．１μｇ／ｍＬ以上の抗体濃度においてＡＤＣＣ活性を示し、ＧＣ１９９抗体と比較して強い活性を示すことが明らかとなった。
実施例２０
ＧＣ３３抗体のヒト肝癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍活性２０．１  ヒト肝癌移植マウスモデルの作製
ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７は、ＤＭＥＭ培地とＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１：１で含む溶液にて５×１０７個／ｍＬになるように調製した。前日に抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製、１バイアルを１ｍＬの注射用蒸留水で溶解後４ｍＬの生理的食塩水を添加）１００μＬを腹腔内へ投与したＳＣＩＤマウス（オス、５週齢）（日本クレア）の腹部皮下へ上記細胞懸濁液１００μＬ（５×１０６個／マウス）を移植した。
２０．２  抗体調製および投与
ヒト肝癌移植マウスモデルに対し、投与当日にＰＢＳ（−）で０．５ｍｇ／ｍＬ（５ｍｇ／ｋｇ投与群）および０．１ｍｇ／ｍＬ（１ｍｇ／ｋｇ投与群）になるように調製した抗体溶液を、細胞移植後２０日目より、週に１回、３週間、１０ｍＬ／ｋｇにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、ＰＢＳ（−）（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を同様に週に１回、３週間、１０ｍＬ／ｋｇにて、尾静脈より投与した。いずれの群も、１群６匹で行った。
２０．３  抗腫瘍効果の評価
ＧＣ３３抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については腫瘍体積の経時変化および最終投与日より一週間後の腫瘍重量で評価した。腫瘍体積は以下の式にて算出した。
腫瘍体積＝長径×短径×短径／２その結果、図１０に示すとおり、ＧＣ３３抗体投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して有意な腫瘍増殖の抑制が認められた。
以上より、ＧＣ３３抗体がヒト肝癌移植マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。
実施例２１
ＧＣ３３マウス−ヒトキメラ抗体の作製
ＧＣ３３のＨ鎖、Ｌ鎖は、５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する合成オリゴヌクレオチド、および３’末端側塩基配列に相補的でＢａｍＨＩ部位を有する合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ消化後、ヒトＩｇＧ１定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇγ１、およびヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇκへクローニングした（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３７１−３８１）。上記方法に従いＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）へ導入し安定発現細胞株を樹立した。培養上清よりＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて抗体を精製した。培養上清中のＩｇＧ濃度の測定は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）とヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を用いたヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、市販の精製ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）との比較により定量した。
実施例２２
ＧＣ３３マウス−ヒトキメラ抗体を用いたＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性の測定
実施例１６および１７に記載した方法に従ってＧＣ３３、Ｍ３Ｃ１１、およびＭ１Ｅ７マウス−ヒトキメラ抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性測定を行った。標的細胞として、ＣＤＣ活性は全長ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞を、ＡＤＣＣ活性はＨｅｐＧ２をそれぞれ用いた。それぞれの結果を図１１、図１２に示す。いずれの実験系においてもＧＣ３３は他２抗体と比較して強いＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった。
実施例２３
ＧＣ３３のエピトープ解析
ＧＣ３３についてはエピトープを詳細に決定するため、さらに短いＧＰＣ３Ｃ末端ペプチドとＧＳＴの融合タンパク質を作製し、ウエスタンブロッティングにより解析した。作製したＧＳＴ融合タンパク質に含まれるＧＰＣ３由来ペプチド配列を図１３に示す。ＧＣ３３はＧＣ−４（ａａ  ５３７−５６３）に結合し、ＧＣ−５（ａａ  ５５０−５６３）に結合できない事から、エピトープがａａ  ５３７−５５０の領域を少なくとも一部含む領域であると考えられた。始めにＧＣ−６（ＧＮＳＱＱＡＴＰＫＤＮＥＩＳ（配列番号９３））、ＧＣ−７（ＧＮＳＱＱＡＴＰ（配列番号９４））、ＧＣ−８（ＱＱＡＴＰＫＤＮ（配列番号９５））、ＧＣ−９（ＴＰＫＤＮＥＩＳ（配列番号９６））を作製した。５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＳａｌＩ認識配列の切断端が付加されるように設計したフォワードオリゴＤＮＡとリバースオリゴＤＮＡを作製した。オリゴＤＮＡはエスペックオリゴ株式会社に合成を委託し、Ｃ−１８カートリッジ精製され、５’末端リン酸化したものを使用した。１０μＭのフォワードオリゴＤＮＡ２５μＬと１０μＭのリバースオリゴＤＮＡ２５μＬを混合し、９４°Ｃで５分間の後、３７°Ｃで１０分間、室温で１５分間反応させた後、４°Ｃで１０分放置し、フォワードオリゴＤＮＡとリバースオリゴＤＮＡをアニールさせた。吸光度測定により濃度を決定した後、インサート：ベクターのモル比が３：１となるように、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ消化したｐＧＥＸ４Ｔ−３にクローニングした。塩基配列を確認した後、上記方法に従いＧＳＴ融合タンパク質を調製し、Ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いて精製した。これを還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＧＣ３３を用いるウエスタンブロッティングにより解析した。いずれのＧＳＴ融合タンパク質も強くは検出できず、ＧＣ３３による結合はさらにＣ末端側の配列が必要である事が予想された（図１４）。そこで、ＧＣ−１１（ＡＴＰＫＤＮＥＩＳＴ（配列番号９７））、ＧＣ−１２（ＰＫＤＮＥＩＳＴＦＨ（配列番号９８））、ＧＣ−１３（ＤＮＥＩＳＴＦＨＮＬ（配列番号９９））、ＧＣ−１４（ＥＩＳＴＦＨＮＬＧＮ（配列番号１００））を作製し同様に評価した結果、ＧＣ−１１、ＧＣ−１２、ＧＣ−１３がＧＣ３３により強く結合された。この結果より、ＧＣ３３はＧＰＣ３のＣ末端５４４番目から５５３番目の配列（ＰＫＤＮＥＩＳＴＦＨ）内にそのエピトープが存在すると考えられる。
実施例２４
ＧＣ３３のヒト化
公開されているＫａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｋａｂａｔ／）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）より抗体の配列データを入手し、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、Ｈ鎖可変領域はＤＮ１３（Ｓｍｉｔｈｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；３６：１１３−１２４）と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖可変領域はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０６４１０５のｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＫ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＶＬＪ  ｒｅｇｉｏｎ，ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ，  ｃｌｏｎｅ：Ｋ６４と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖のシグナル配列についてはＡＢ０６４１０５と相同性の高いＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｓ４０３５７のシグナル配列を利用した。これらのヒト抗体のフレームワーク領域（以下、ＦＲ）にＧＣ３３の相補性抗原決定領域（以下、ＣＤＲ）を移植して、ヒト化抗体を作製した。
具体的には、５０ｂａｓｅ程度の合成オリゴＤＮＡを約２０ｂａｓｅ程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴＤＮＡをＰＣＲ法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。５’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＨｉｎｄＩＩＩ部位、および３’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＢａｍＨＩ部位で切断し、ヒトＩｇＧ１定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇγ１、ヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇκへクローニングした（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３７１−３８１）。このようにして作製したヒト化ＧＣ３３はＨ鎖、Ｌ鎖それぞれｖｅｒ．ａと命名した。Ｈ鎖、Ｌ鎖ともにｖｅｒ．ａのヒト化ＧＣ３３（ｖｅｒ．ａ／ｖｅｒ．ａ）はマウスＧＣ３３可変領域の抗体（ｍｏｕｓｅ／ｍｏｕｓｅ）と比較して結合活性が低くかった（図１５）。Ｈ鎖とＬ鎖についてマウスＧＣ３３配列とｖｅｒ．ａ配列をキメラに組み合わせた抗体（ｍｏｕｓｅ／ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅ）を作製し結合活性を評価した結果、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅで結合活性の低下が認められ、アミノ酸置換による結合活性の低下はＨ鎖に起因する事が判明した。そこで、Ｈ鎖の改変体ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋを作製した。これらの全てのヒト化ＧＣ３３はマウスＧＣ３３可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した（図１５）。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋの塩基配列を配列番号７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３に、アミノ酸配列を配列番号８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０に示す。ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖可変領域ｖｅｒ．ａの塩基配列を配列番号９１に、アミノ酸配列を配列番号９２に示す。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋでは、６番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されているが、これらの抗体は熱安定性が顕著に増加していた。
実施例２５
ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖の改変
蛋白質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が知られており、Ａｓｎ−Ｇｌｙが特に脱アミド化し易い配列として知られている（Ｒｏｃｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１；９８；９４４−９４９．）。配列番号９１に示されるヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａ可変領域のＣＤＲ１内にあるＡｓｎ３３については、一次配列がＡｓｎ−Ｇｌｙであることから、脱アミド化が容易に起きやすい配列である事が予想された。
Ａｓｎ３３の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、Ａｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。すなわち、１２５ｎｇのセンスプライマー（ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴＧＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ：配列番号１７２）、１２５ｎｇのアンチセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ：配列番号１７３）、５μＬの１０ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１０ｎｇのヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａがクローニングされたＨＥＦｇκ、１μＬのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０ｕＬの反応液を用い、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で９分からなるサイクルを１２回のＰＣＲを行った。その後制限酵素ＤｐｎＩを加え３７℃で２時間消化したものをキットに添付のＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に導入し形質転換体を得た。正しく変異の導入されたクローンについて、可変領域を切り出し、再度ＨＥＦｇκへクローニングし直した。これをヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖ｖｅｒ．ｋがクローニングされたＨＥＦｇγ１と共にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＣＯＳ７細胞へ導入し、一過性に発現させた抗体を培養上清から回収した。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより抗体濃度を定量し、可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより改変抗体の結合活性を評価した。図１８に示すようにＡｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体（Ｎ３３Ｄ）では結合活性が消失しており、Ａｓｎ３３で脱アミド化が起きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。
Ａｓｎ３３の脱アミド化を抑制する方法として、Ｇｌｙ３４を他のアミノ酸に改変する方法が報告されている（ＷＯ０３０５７８８１Ａ１）。上記方法に従い、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、Ｇｌｙ３４をＣｙｓ、Ｍｅｔを除く他の１７アミノ酸に置換して、一連の改変抗体Ｇ３４Ａ、Ｇ３４Ｄ、Ｇ３４Ｅ、Ｇ３４Ｆ、Ｇ３４Ｈ、Ｇ３４Ｎ、Ｇ３４Ｐ、Ｇ３４Ｑ、Ｇ３４Ｉ、Ｇ３４Ｋ、Ｇ３４Ｌ、Ｇ３４Ｖ、Ｇ３４Ｗ、Ｇ３４Ｙ、Ｇ３４Ｒ、Ｇ３４Ｓ、Ｇ３４Ｔを作製した。これをＣＯＳ７細胞で一過性に発現させ、その培養上清を用いて結合活性の評価を行った。その結果、Ｐｒｏ（Ｇ３４Ｐ）、Ｖａｌ（Ｇ３４Ｖ）以外ではＧ３４を他のアミノ酸に置換しても結合活性が維持されている事が判明した。
上述の改変抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７４（Ｇ３４Ａ）、配列番号１７５（Ｇ３４Ｄ）、配列番号１７６（Ｇ３４Ｅ）、配列番号１７７（Ｇ３４Ｆ）、配列番号１７８（Ｇ３４Ｈ）、配列番号１７９（Ｇ３４Ｎ）、配列番号１８０（Ｇ３４Ｔ）、配列番号１８１（Ｇ３４Ｑ）、配列番号１８２（Ｇ３４Ｉ）、配列番号１８３（Ｇ３４Ｋ）、配列番号１８４（Ｇ３４Ｌ）、配列番号１８５（Ｇ３４Ｓ）、配列番号１８６（Ｇ３４Ｗ）、配列番号１８７（Ｇ３４Ｙ）、配列番号１８８（Ｇ３４Ｒ）、配列番号１８９（Ｇ３４Ｖ）、配列番号１９０（Ｇ３４Ｐ）に記載する。また、上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１９１（Ｇ３４Ａ）、配列番号１９２（Ｇ３４Ｄ）、配列番号１９３（Ｇ３４Ｅ）、配列番号１９４（Ｇ３４Ｆ）、配列番号１９５（Ｇ３４Ｈ）、配列番号１９６（Ｇ３４Ｎ）、配列番号１９７（Ｇ３４Ｔ）、配列番号１９８（Ｇ３４Ｑ）、配列番号１９９（Ｇ３４Ｉ）、配列番号２００（Ｇ３４Ｋ）、配列番号２０１（Ｇ３４Ｌ）、配列番号２０２（Ｇ３４Ｓ）、配列番号２０３（Ｇ３４Ｗ）、配列番号２０４（Ｇ３４Ｙ）、配列番号２０５（Ｇ３４Ｒ）、配列番号２０６（Ｇ３４Ｖ）、配列番号２０７（Ｇ３４Ｐ）に記載する。
実施例２６
全長ヒトＧＰＣ３発現ヒト肝癌細胞株（ＳＫ−０３）の作製
抗ＧＰＣ３抗体の生物活性評価用の細胞株を得るために、全長ＧＰＣ３を発現するヒト肝癌細胞株の樹立を行った。
ＰｖｕＩで処理した１μｇの全長ヒトＧＰＣ３遺伝子発現ベクターを、２μＬのＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社）と混合し、複合体を形成させた後に、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞（ＡＴＣＣより購入）に添加することにより、遺伝子導入を行った。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養後、終濃度１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎおよび１０％  ＦＢＳを含むダルベッコＭＥＭ（Ｄ−ＭＥＭ，ＳＩＧＭＡ社）を用いて、ＧＰＣ３発現株を選抜した。得られたＧｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンのヒトＧＰＣ３の発現はキメラＧＣ３３抗体とＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＩＣＮ社）を用いたフローサイトメトリにより確認し、安定発現細胞株ＳＫ−０３を取得した。
実施例２７
マウス−ヒトキメラ抗体を用いたＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性の比較
実施例２２で示したＧＣ３３、Ｍ３Ｃ１１、およびＭ１Ｅ７マウス−ヒトキメラ抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を直接比較する目的で、３抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の測定を同一実験系で実施例１６および１７に記載した方法に従って行った。標的細胞として、ＣＤＣ活性は全長ＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞を、ＡＤＣＣ活性はＳＫ−０３をそれぞれ用いた。それぞれの結果を図１９、図２０に示す。いずれの実験系においてもＧＣ３３は他２抗体と比較して強いＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明の抗体は、細胞増殖抑制剤として、抗癌剤として、および癌の診断薬として用いることができる。
【図１】
0004011100.tif 000007
【図２】
0004011100.tif 000008
【図３】
0004011100.tif 000009
【図４】
0004011100.tif 000010
【図５】
0004011100.tif 000011
【図６】
0004011100.tif 000012
【図７】
0004011100.tif 000013
【図８】
0004011100.tif 000014
【図９】
0004011100.tif 000015
【図１０】
0004011100.tif 000016
【図１１】
0004011100.tif 000017
【図１２】
0004011100.tif 000018
【図１３】
0004011100.tif 000019
【図１４】
0004011100.tif 000020
【図１５】
0004011100.tif 000021
【図１６】
0004011100.tif 000022
【図１７】
0004011100.tif 000023
【図１８】
0004011100.tif 000024
【図１９】
0004011100.tif 000025
【図２０】
0004011100.tif 000026
【配列表】
0004011100000001.xml