(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質の精製方法であって、該方法が、
（a）下記構造式を有するカルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスを供給するステップ、
0003946772.tif 000003
ここで、
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3はＨ；
Ｍは配位数６を持つ２+酸化状態の遷移金属イオン；
Ｒ4はＣＭ−Ａspのカルボキシルメチル基のメチレン基の炭素原子をＲ5と連結させる結合アーム；
Ｒ5はＣＭ−Ａspと結合したアームＲ4をＲ6に連結させる機能的結合基；及び
Ｒ6はポリマーマトリックスであり、
（b）ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質を含むサンプルを前記マトリックスと接触させて、前記タンパク質を前記マトリックスに結合させるステップ、及び
（c）前記ポリヒスチジンタグを有するタンパク質を前記マトリックスから溶離して、精製ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質を得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
遷移金属イオンが、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+およびＺｎ2+からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
結合アームが−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−及び−（ＣＨ2）4ＮＨ−からなる群から選択される請求項１の精製方法。
【請求項４】
機能的結合基がＯ、Ｓ、ＮＨ及びＣＯで構成される群より選択される請求項１の方法。
【請求項５】
ポリマーマトリックスがアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーでの使用に適したマトリックスである請求項１の方法。
【請求項６】
ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファロース及びナイロンから構成される群から選択される請求項１の方法。
【請求項７】
ＭがＦｅ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+あるいはＺｎ2+；
Ｒ4が−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−あるいは−（ＣＨ2）4ＮＨ−；
Ｒ5がＯ、Ｓ、ＮＨあるいはＣＯ；及び
Ｒ6がアガロースあるいはポリスチレン
である請求項１の方法。
【請求項８】
ＭがＣｏ2+；
Ｒ4が−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−あるいは−（ＣＨ2）4ＮＨ−；
Ｒ5がＯあるいはＣＯ；及び
Ｒ6がアガロース、クロスリンクアガロースあるいはポリスチレン
である請求項１の方法。
【請求項９】
下記の構造式を有する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー錯体であって、
0003946772.tif 000004
ここで、
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3がＨ；
Ｍは配位数６を持つ２+酸化状態の遷移金属イオン；
Ｒ4はＣＭ−Ａspのカルボキシルメチル基のメチレン基の炭素原子をＲ5と連結させる結合アーム；
Ｒ5はＣＭ−Ａspと結合したアームＲ4をＲ6に連結させる機能的結合基；及び
Ｒ6はポリマーマトリックス
である錯体。
【請求項１０】
遷移金属イオンがＦｅ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+及びＺｎ2+から構成される群から選択される請求項９の錯体。
【請求項１１】
結合アームが、−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−及び−（ＣＨ2）4ＮＨ−からなる群から選択される請求項９の錯体。
【請求項１２】
機能結合基が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＣＯからなる群から選択される請求項９の錯体。
【請求項１３】
ポリマーマトリックスがアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーの使用に適するマトリックスからなる請求項９の錯体。
【請求項１４】
ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファロース及びナイロンから構成される群から選択される請求項９の錯体。
【請求項１５】
ＭがＦｅ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+あるいはＺｎ2+；
Ｒ4が−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−あるいは−（ＣＨ2）4ＮＨ−；
Ｒ5がＯ、Ｓ、ＮＨあるいはＣＯ；及び
Ｒ6がアガロースあるいはポリスチレン
である請求項９の錯体。
【請求項１６】
ＭがＣｏ2+；
Ｒ4が−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−あるいは−（ＣＨ2）4ＮＨ−；
Ｒ5がＯあるいはＣＯ；及び
Ｒ6がアガロース、クロスリンクアガロースあるいはポリスチレン
である請求項９の錯体。
【請求項１７】
カルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスの合成方法であって、該方法が、
（a）ωモノプロテクテッドα，ω−ジアミノ酸とマレイン酸とを反応させて、ミカエル付加生成物を形成し、
（b）ミカエル付加生成物のω−アミノ機能基を脱保護し、
（c）ポリマーマトリックスにミカエル付加生成物を付着させる
段階を含む方法。
【請求項１８】
プロテクテッドアミノ基の保護基がベンジルオキシカルボニル基である請求項１７の方法。
【請求項１９】
ポリマーマトリックスが、アフィニティー又はゲルクロマトグラフィーの使用に適するマトリックスである請求項１７の方法。
【請求項２０】
ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファローズ及びナイロンから構成される群から選択される請求項１７の方法。
【請求項２１】
ω−モノプロテクテッドα，ω−ジアミノ酸が、Ｎ6−カルボベンジルオキシ−Ｌ−リシンである請求項１７の方法。
【請求項２２】
ミクロチッタープレートあるいはフィルターでのタンパク質機能のスクリーニングにおいて、
（a）請求項９の錯体のプレートあるいはフィルターへの固定
（b）前記固定化された錯体のスクリーニングされる機能を持つタンパク質への結合
（c）結合タンパク質に対するタンパク質機能に対する検査の実行
の段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
参照関連明細書
本明細書は1996年８月16日出願、審査中明細書シリアルナンバー08/698,747の続編部である。
発明の背景
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、金属キレートクロマトグラフィーなる用語を使用してPorathより初めておこなわれ（Porath, J., J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage（1975）Nature  258：598−599）、これまでいくつか総説が発表されている（Porath, J.（1992）Protein Purification andExpression  ３：263−281；及び本文中で引用されている論文）。ＩＭＡＣ精製過程はＣｕ2+及びＮｉ2+のような軟金属負荷キレートマトリックスの使用が基礎となっている。タンパク質表面の電子供与基、特にヒスチジンのイミダゾール側鎖は負荷金属の無配位部位と結合することができる。金属と電子供与基との間の相互作用はpHの低下あるいはイミダゾールの置換により可逆化することができる。したがって、ヒスチジンのような電子供与基を持つタンパク質は可逆的な金属錯体／タンパク質相互作用により精製することができる。
数種の異なった金属キレートリガンドがタンパク質精製のためのＩＭＡＣに使用されてきた。イミノジ酢酸（ＩＤＡ）リガンドは３座配位であり、この３つの配位部位のみで金属と固着する（Porath, J., B. Olim（1983）Biocheistry  22：1621−1630）。金属の弱い固着力のため、金属の漏出が生じることが知られている。トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）リガンドは５座配位であり、非常に強力な金属−キレート錯体を形成する。この欠点はタンパク質との相互作用が１価のみで行われるために、タンパク質が非常に弱い結合力でしか結合しないことである。ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）は金属ーイオンタンパク質相互作用特性による金属固着力の均衡を起こす４座配位リガンドである（Hochuli, E., H. Dobeli, A. Schacher（1987）J. Chromatography 411：177−184）。その他のキレートリガンドもこれまで名前や性質が報告されている。例えば、上記Porath（1992）を参照せよ。しかしながら、これらのリガンドは結合能の減少、特異性の減少及び金属漏出の増加が含まれる欠点をも持つ。
1991年に、Fordらはヒスチジン残基を含むテイルを持つ組み換えタンパク質（ポリヒスチジン組み換えタンパク質）にＩＭＡＣ技術（Ｎｉ−ＮＴＡリガンド）を応用したタンパク質精製法を応用したものを報告した（Ford, C., I. Suominen, C. Glatz（1991）Protein Expression and Purification  ２：95−107）。この方法は２残基以上のヒスチジン残基が非常に強力な金属イオン錯体の形成に関与できるという利点がある。アガロース上に固定化され、Ｎｉ2+で負荷されたＮＴＡキレートリガンドはこの方法（上記、Hochuli et al.；U. S. Patent No.5,047,513）に有効である。これはQiagen,Inc.（Chatsworth, CA）を通じて市販品として入手できる。しかしながら、この樹脂は金属イオンとポリ−ヒスチジン組み換えタンパク質との間の交換が最高条件では無いという欠点を持っていいる。金属漏出が起こる可能性があり、バックグラウンドタンパク質が時として組み換えタンパク質の精製に混入することがある。
金属キレートゲル、すなわちカルシウムと錯体を形成したカルボキシルメチル化アスパラギン酸（ＣＭ−Ａsp）アガロースは天然カルシウム結合タンパク質の精製に使用されてきた（Mantovaara, T., H., Pertoft, J. Porath（1989）Biotechnology and Applied Biochemistry  11：564−570；Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath（1991）Biotechnology and Applied Biochemistry  13：315−322；Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath（1991）Biotechnology and Applied Biochemistry  13：120−126）。しかしながら、Mantovaaraらが記載したＣａ1+−ＣＭ−Ａsp錯体はヒスチジン標識組み換えタンパク質に対し強くは結合しないという自身の欠点を抱えている。この弱い結合特性に加えて、これがヒスチジン標識に対し非選択的であることが別の欠点として存在する。
これに対して、本発明は幾何八面体構造（配位数６）をとって遷移金属と錯体を形成するＣＭ−Ａspキレートリガンドを含んでいる。この独特の形状により、ポリヒスチジンを融合した組み換えタンパク質の精製に有効的に使用することができる。これはＣＭ−Ａspリガンドの新使用法であり、ここにおいて記載された発明の主題の一部である。
発明の概要
本発明はポリヒスチジン標識を融合した組み換えタンパク質の精製を特異的に意図する固定化カルボキシルメチル化アスパラギン酸（ＣＭ−Ａsp）リガンドを使用する新たなＩＭＡＣ精製法に関する。新精製法は次の構造を持つＣＭ−Ａspキレートマトリックスが基礎となっている。
0003946772.tif 000002
マトリクッスの一般式が本発明で使用され、上記で示される。
Ｒ4−Ｒ5−Ｒ6がＨの場合；
Ｍは配位数６を持つ２＋酸化状態の遷移金属；
Ｒ1はＣＭ−Ａspの窒素原子をＲ2と連結させる結合アーム；
Ｒ2はＣＭ−Ａspと結合したアームＲ1をＲ2に連結させる機能的結合基；
Ｒ3はポリマーマトリックス、例えばアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーで一般的に使用されるポリマーマトリックス。
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3がＨの場合；
Ｒ4はＣＭ−Ａspのカルボキシルメチル基の炭素原子をＲ5と連結させる結合アーム；
Ｒ5はＣＭ−Ａspと結合したアームＲ4をＲ6に連結させる機能的結合基；
Ｒ6はポリマーマトリックス、例えばアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーで典型的使用されるポリマーマトリックス。
好ましい具体例は；
ＭはＦｅ2+，Ｃｏ2+，Ｎｉ2+，Ｃｕ2+あるいはＺｎ2+；
Ｒ1は−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−，−ＣＨ2（ＯＨ）ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−，−（ＣＨ2）4ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−，及び−（ＣＨ2）2ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−；
Ｒ2はＯ，ＳあるいはＮＨ；及び
Ｒ3はアガロース。
特に好ましい具体例は；
ＭがＣｏ2+；
Ｒ1がＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2；
Ｒ2がＯ；及び
Ｒ3がクロスリンクアガロース。
樹脂に６ＸＨis組み換えタンパク質を載せる前に、組み換え細胞は溶解及び音波処理することができる。リゼイトはそれ自身金属とキレートを形成しない水性バファー（pH８）で平衡化することができる。記載される工程のこの段階で使用することができる水溶液の例は50mMリン酸ナトリウム（pH8.0）/10mM Ｔris−ＨＣｌ（pH8.0）/100mM ＮａＣｌ、あるいはその類似物である。平衡バッファーには変性剤あるいは界面活性剤、例えば10％トリトンＸ−100、６ＭグアニジウムＨＣｌ、あるいはその類似物を含むことができる。調製された６ＸＨis組み換えタンパク質を金属ＣＭ−Ａspキレート樹脂（「ＣＭ−Ａsp樹脂錯体」）に結合させる前に、タンパク質結合樹脂はpH7.0あるいは8.0の水で洗浄される。タンパク質の溶離は一定のpHであるいはpH勾配の減少により行うことができる。好ましい具体例は、タンパク質の溶離が約6.0から6.3までのpHで行うことである。代わりに、ＣＭ−Ａspキレート樹脂に結合した６ＸＨis組み換えタンパク質は低濃度（100mM以下）のイミダゾールpH8.0で洗浄することができ、その後、濃度を40−100mMに増加させたイミダゾールで溶離させることができる。
本発明の一つの側面としてＣＭ−Ａsp誘導アガロースキレート樹脂の大規模合成が含まれる。これは先に報告された小規模調製の改良法である（Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath（1991）Biotechnology and Applied Biochemistry  13：315−322）。この改良にはオキシレン−アガロース形成のための特殊な条件、オキシラン−アガロースに対するアスパラギン酸の共役を調節する温度、及び外部結合金属除去のための高イオン強度洗浄が含まれる。これらの条件、温度、及びイオン濃度はここで詳細に記載されている。
本発明に付随する応用にはマイクロチッタープレートあるいはフィルター上のタンパク質分画のスクリーニングが含まれる。本発明の付随する応用には、抗原及び抗体の精製だけではなくタンパク質−タンパク質相互作用研究も含まれる。例えば、96穴プレートにＣＭ−ＡspによりＣｏ2+の半分を固定化することにより、これらのプレートは６ＸＨis標識タンパク質の計量、タンパク質−タンパク質相互作用研究、診断上の疾病のスクリーニング、薬品の拮抗物質及びアゴニストスクリーニング、及びレポーター遺伝子検定に使用することができる。Ｃｏ2+はまたナイロン膜のような膜上にＣＭ−Ａspにより固定化することができ、細胞由来のタンパク質ライブラリー作成のために発現ライブラリーからのタンパク質を得るために使用できる。この膜はまた工業用酵素のスクリーニングに使用することができる。本発明の応用には相互作用分子、例えば核酸あるいは微小コファクターの精製にまで拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はＣＭ−Ａspキレート樹脂を使用した組み換え６ＸＨisタンパク質の精製の工程を示す図である。
図２Ａ−２ＢはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によるpH勾配を使用した変性条件下で６ＸＨisプレプロ−α−因子の精製について、Ｎｉ−ＮＴＡと比較して示すゲルである。
図２Ａ−２Ｂの凡例のそれぞれは、レーン１：未精製リゼイト、レーン２：通過流出物、レーン３：６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH8.0による洗浄物、レーン４：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウムによる洗浄物、レーン５：８Ｍ尿素、0.１Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH8.0による洗浄物、レーン６：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン７：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン８：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン９：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH5.9による溶出物、レーン１０：８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、pH4.5による溶出物；レーン１１：６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.2Ｍ酢酸による溶出物；レーンＭ：分子量マーカーの泳動結果を示す。
図３は未変性条件でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂による６ＸＨis標識ＤＨＦＲ精製を示すゲルである。凡例：レーン１：未精製リゼイト、レーン２：通過流出物、レーン３：１回目の洗浄物、レーン４：３回目の洗浄物、レーン５：最終溶出ＤＨＦＲの泳動結果を示す。
図４は変性条件でのＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂による６ＸＨis標識ＤＨＦＲ精製を示すゲルである。凡例：レーン１：未精製リゼイト、レーン２：通過流出物、レーン３：１回目のpH7.0での洗浄物、レーン４：２回目のpH7.0での洗浄物、レーン５：１回目のpH6.0での溶出ＤＨＦＲ；レーン６：２回目のpH6.0での溶出ＤＨＦＲの泳動結果を示す。
図５はβ−メルカプトエタノールの濃度を増加させた未変成条件でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂による６ＸＨis標識ＤＨＦＲ精製を示すゲルである。凡例：レーン１：20μl細胞リゼイト；レーン２，４，６，８：20μl通過流出物；レーン３，５，７，９：５μl溶出物の泳動結果を示す。
図６はＮｉ−ＮＴＡと比較したＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によるβ−メルカプトエタノール存在下での細胞リゼイトから精製された６ＸＨis ＤＨＦＲ生産量を示すグラフである。タンパク質濃度はブラッドフォード検定により決定された。生産量は細胞リゼイト中の総タンパク質に対するパーセントで表示される。
図７Ａ−７Ｂは未変成条件でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂による６ＸＨis ＧＦＰの精製を示すゲルである。ＧＰＦバンドはClontech製chemiluminescence Western Exposure Kitを使用しＸ線フィルムに一晩感光させて検出した。
凡例：レーン１：リゼイト上清、レーン２：通過流出物、レーン３：１回目の洗浄物、レーン４：１回目の溶出物、レーン５：２回目の溶出物、レーン６：３回目の溶出物、レーン７：４回目の溶出物の泳動結果を示す。
図８はＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂により精製した６ＸＨis ＧＦＰの生物的活性を示す。凡例はチューブ１：細胞リゼイト、チューブ２：通過流出物、チューブ３：洗浄物、チューブ４：１回目の溶出物、チューブ５：２回目の溶出物、チューブ６：３回目の溶物の泳動結果を示す。
発明の詳細な説明
ＣＭ−Ａsp金属キレート錯体を使用する本発明は、ポリヒスチジンテイルあるいは「標識」を持つ組み換えタンパク質の精製に有効に使用することができる。
本発明の実施態様に従うと、樹脂リガンド、例えばＣＭ−ＡspはＣａ2+以外の金属と結合し、ＣＭ−Ａsp−金属錯体を形成する。好ましくは、本発明で使用されるＣＭ−Ａspリガンドは例えばＦｅ2+，Ｃｏ2+，Ｎｉ2+，Ｃｕ2+あるいはＺｎ2+のような遷移金属（サードブロック遷移金属として知られる）の一つと、幾何八面体構造をとって錯体を形成する。他のポリマーマトリックス、例えばポリスチレン（マイクロチッタープレートに対しての）、ナイロン（ナイロンフィルターに対しての）、セファローズ（Pharmacial, Uppeala, Sweden）あるいはその類似物が本発明で使用することが可能であり、この技術の一般的技能を持つ人にはすぐに認知できると思われる。ポリヒスチジン標識は組み換えタンパク質をこれら遷移金属に非常に強力な金属イオン錯体を形成するために協同的な方法で有効に結合させることができる「隣接」ヒスチジン残基を所有している。この協同結合とはこの技術において一般に「隣接ヒスチジン効果」として知られていることを言う。本発明の目的のため、及びこの技術の一般的技能を持つ人に理解されるように、「強力」あるいは「非常に強力な」金属イオン錯体とは金属イオンとキレートリガンドとの間の結合力について言う。例えば、強力あるいは非常に強力な金属イオン錯体は、錯体から金属漏出がほとんど、あるいは本質的に全く起こらないため、例えばポリヒスチジン標識を持つ組み換えタンパク質のような精製タンパク質が別起源あるいは精製される混合物からの「バックグラウンド」タンパク質に汚染されない。
ＣＭ−Ａsp金属錯体は組み換えタンパク質の表面の２つの近接ヒスチジン残基と強力で可逆的な金属錯体を形成することができる２価の有効原子価を供給する。ＣＭ−Ａspリガンドを使用する別の利点は強力に金属イオンを固着し、そこでは金属イオンの漏出が別の錯体結合剤、例えばＮｉ−ＮＴＡで観測される金属漏出に比較して、事実上無いとすることができるところである。特に好ましい具体例では、Ｃｏ2+がＣＭ−Ａspにおける遷移金属として使用される。Ｃｏ2+−ＣＭ−Ａspはβ−メルカプトエタノールのような還元剤に対しての感受性を低下させることができる。30mMまでのβ−メルカプトエタノールの存在下で、金属イオン漏出は無視できる程度の低い値を示している。
本発明の精製工程の一つの具体例は以下の通りである
1.  本技術で詳しく知られている通常手順と技法に従って行う組み換え６ＸＨisタンパク質を含むリゼイト／音波処理物の調製。
2.  弱アルカリpH、例えば約pH8.0での金属負荷ＣＭ−Ａspキレート樹脂への６ＸＨisタンパク質の結合。
3.  同じ弱アルカリpH（約pH8.0）でのタンパク質／樹脂錯体の洗浄。約7.0のpHあるいはイミダゾールを添加したものでの任意の洗浄も可能である。
4.  pHが約6.0−6.3溶離バッファー、あるいはイミタゾールを約40から100mM加えたpHが約8.0の溶離バッファーによる純粋な組み換え６ＸＨisタンパク質の溶出。
本発明の精製工程の好ましい具体的例を図１に表す。本工程はバッチワイズ、スピンカラム、及び大規模連続フローカラムで使用することができる。
上記工程で使用されるバッファーは同様な工程で通常使用される標準バッファーで、本技術において知られているように適切に調節及び修正が行わてれる。例えば、50mMリン酸/10mM Ｔris/100mM ＮａＣｌなどの高イオン強度バッファーの場合は必要とされるpHの調節を行ってから使用することができる。リン酸塩成分は10−100mM、Ｔrisは５−25mM、ＮａＣｌは50−200mMの範囲で存在することができる。
任意の溶離条件は不純物の種類、精製されるタンパク質の量、及びタンパク質の特有の性質に依存し、この技術の一般的技能を持つ人にすぐに理解されるようにケースバイケースの基準で決定される。
本発明には
（ａ）  マレイン酸に対する単一保護α，ω−ジアミノ酸のα−アミノ機能のミカエル付加。
（ｂ）  ω−アミノ機能性の脱保護。及び
（ｃ）  固体マトリックスへの１次アミノ分子キレート剤の付着
を含むカルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスの合成方法も付随する。
以下は発明の実行の工程を示す実施例である。すべてのパーセントは重量パーセントであり、すべての溶媒混合比率は特に記載のない限り容積比率である。
実施例１−ＣＭ−Ａspキレート樹脂の大規模調製
セファローズＣＬ−６ＢあるいはＣＬ−６Ｂ（Phamacia, 8.0L）はddＨ2Ｏで洗浄し、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22Ｌ丸底フラスコに移された。エピクロロヒドリン（約2.0Ｌ）が加えられ、セファローズ樹脂で混合した高濃度懸濁液は約20分間、室温で放置される。水酸化ナトリウム（約560ｇ）及びボロハイドライドナトリウム（約48ｇ）を含むほぼ6400ml ddＨ2Ｏの水溶液が加えられ、常温で一晩撹拌混合される。濾過により収集されたオキシレン派生樹脂はddＨ2Ｏ（１回約10Ｌ）で10回、10％炭酸ナトリウム（約10Ｌ）で１回洗浄され、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22Ｌ丸底フラスコに移された。1.3Ｍチオ硫酸ナトリウムで処理されたオキシラン派生樹脂の標本はオキシラン濃度（好ましくは、＞700μmol/ｇ）を決定するためにほぼpH7.0まで滴定される。
約7.6Ｌ ddＨ2Ｏに水酸化ナトリウム（ほぼ268ｇ）を加えた水溶液にＬ−アスパラギン酸（約575ｇ）及び炭酸ナトリウム（約1700ｇ）を加えて、約25℃以下の温度に保っておく。pHをほぼ11.0に調節し、樹脂に溶液を加える。撹拌装置及び温熱マントルを使用して約80℃で４時間加熱し、その後、一晩室温まで冷却される。樹脂は濾過により収集され、ddＨ2Ｏ（１回約10Ｌ）で10回、10％炭酸ナトリウム（約10Ｌ）で１回洗浄され、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22Ｌ丸底フラスコに移された。
氷温冷却した12Ｌ ddＨ2Ｏ中の水酸化ナトリウム（約900ｇ）溶液にブロモ酢酸（約3000ｇ）をほぼ750ｇ増加するように、温度を約30℃以下に保ったまま加えた。炭酸ナトリウム（約660ｇ）が加えられ、pHを約10に調節する。樹脂を溶液と常温で一晩反応させる。樹脂は濾過により収集され、ddＨ2Ｏ（１回約10Ｌ）で６回、10％酢酸で６回、さらにddＨ2Ｏで10回洗浄する。洗浄はリトマス試験紙によってpHが約6.0を示すまでddＨ2Ｏで連続して洗浄する。ＣＭ−Ａspキレート樹脂は金属負荷に対する準備として吸引乾燥された。
実施例２−Ｃ−結合ＣＭ−Ａspキレート樹脂
Ｎ6−カルボベンジルオキシ−Ｌ−リジン（6.15ｇ）及び過剰のマレイン酸（17.6ｇ）を２Ｍ ＮａＯＨ（35mL）に溶解させた。溶液は24時間還流させ、その後常温まで冷却された。溶液は６Ｍ ＨＣｌでpHを３に調節させて冷蔵された。混合液は水（15mL）で洗浄された未反応マレイン酸を除去するために濾過された。濾液及び洗浄液を混合し、その後蒸発乾燥させた。残滓を４％ギ酸アルミニウム（120mL）に溶解し、短時間脱気した。10％Pb/Ｃ（600mg）を加え、混合液をアルゴン雰囲気中で５時間撹拌しながら還流した。混合物はセライトを通し濾過し、濾液を蒸発乾燥させた。残滓は水酸化ナトリウム（1.3ｇ）及び炭酸ナトリウム（8.7ｇ）を含むddＨ2Ｏ（40mL）させた。最終的なpHをＨに調整した。実施例１の記載法で調整した（ベット容量40mL）オキシラン派生樹脂にこの溶液を加えた。混合液は60℃で機械的に４時間撹拌した後、16時間室温で放置した。樹脂は濾過により収集され、ddＨ2Ｏ（６×100mL）、10％ＨＯＡｃ（６×100mL）およびddＨ2Ｏ（６×100mL）で、あるいはリトマス試験紙によってpHが約6.0を示すまで洗浄された。Ｃ−結合ＣＭ−Ａspキレート樹脂は金属負荷に対する準備として吸引乾燥された。
実施例３−ＣＭ−Ａspキレート樹脂の金属負荷
実施例１のＣＭ−Ａspキレート樹脂（吸引乾燥されたベッド体積が約１Ｌ）は遷移金属イオン溶液、例えばヘキサハイドレイト塩化コバルト、ヘキサハイドレイト硫酸ニッケル、ペンタハイドレイト硫酸銅、あるいは塩化亜鉛の溶液で金属イオン価に従って処理される。樹脂は200mM金属溶液と室温でほぼ72時間反応させ、その後濾過によって収集された。金属を負荷したＣＭ−Ａspキレート樹脂はddＨ2Ｏ（１回約１Ｌ）で５回、100mM ＮａＣｌ（１回約１Ｌ）で２回、ddＨ2Ｏ（１回約１Ｌ）で６回、20％エタノール水（１回約１Ｌ）で１回洗浄する。樹脂は20％エタノール水中で保存する。
実施例４−pH勾配を使用した変性条件下で組み換え６ＸＨisプレプロ−α−因子の精製のＮｉ2+−ＮＴＡとＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂との比較
変性条件下でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂とＮｉ−ＮＴＡの精製の定性比較のために、S. cerevisiaeのＣ末端６ＸＨis標識プレプロ−α−因子をE. coliで発現させた。１グラムの沈殿させた細菌細胞は６Ｍグアニジウム塩酸（Ｇｕ−ＨＣｌ）、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム液、pH8.0中で破壊される。３ミリリットルのリゼイト上清をＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂重力流出カラムに載せた。樹脂−タンパク質混合物は８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム液、pH8.0で洗浄され、6.3，5.9及び4.5の３つの異なるpHの８Ｍ尿素、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム液で溶出された。最後に、すべての結合タンパク質は６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ、0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.1Ｍ酢酸液で溶出された。それぞれの段階のサンプルは12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルに載せられ、電気泳動の後、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。６ＸＨis標識プレプロ−α−因子はpH6.3でゲル上では一本の主要なバンドとして確認されるものとして溶出された。
同じ方法で、３ミリリットルのリゼイト上清をＮｉ−ＮＴＡ重力流出カラムに載せた。樹脂−タンパク質混合物は上記と同じ方法で洗浄及び溶出された。それぞれの段階のサンプルは12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルに載せられ、電気泳動の後、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。pH6.3の溶出液には10本以上のタンパク質バンドが存在した。６ＸＨis標識プレプロ−α−因子のバンドはそれらの中では弱いバンドであった。タンパク質の主要部は他の混入タンパク質が存在しないpH4.5で溶出された。このことは高度に精製された６ＸＨis標識プレプロ−α−因子は、Ｎｉ−ＮＴＡでは混入物も放出する条件（pH6.3）でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂から溶出されることを示す。Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂の６ＸＨis標識プレプロ−α−因子に対する親和性はＮｉ−ＮＴＡのタンパク質に対するものに比較してより選択性があった。
この結果は高度に精製された６ＸＨis標識プレプロ−α−因子は、Ｎｉ−ＮＴＡでは混入物も放出する条件でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂から溶離されることを示す。図２Ａ−２Ｂを参照。図２ＡはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂からの１mlを使用した結果である。図２Ｂはニッケル−ＮＴＡからの１mlを使用した結果である。
実施例５−未変性条件でのＣＭ−Ａspキレート樹脂による組み換え６ＸＨis ＤＨＦＲ精製
Ｎ末端６ＸＨis標識マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、分子量20.3kDa）をE. coli細胞で発現させた。細胞はその後0.75mg/mlリソチームで調製され、溶解バッファー（100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Ｔris−ＨＣｌ、pH8.0）で機械的に撹拌しながら破壊させ、800μlのリゼイト上清をの溶解バッファーで前平衡した100μlのＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂を使い作業実施し、溶解バッファーで３回洗浄した。すべての結合タンパク質は300μlの100mM ＥＤＴＡ、pH8.0で溶解させた。20ミリリットルのリゼイト及び溶離液のそれぞれの40μlの続分画を12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルで泳動した。ゲルはクーマーシーブルーで染色された。分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。この結果は未変性精製条件で６ＸＨis標識ＤＨＦＲに対してＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂が選択的結合親和性をもつことを示した。宿主タンパク質の識別できる結合は起こらなかった。
この結果はＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂が６Ｘヒスジンに対して選択的結合親和性もつことを示した。宿主タンパク質の識別できる結合は起こらなかった。図３参照。
実施例６−変性条件でのＣＭ−Ａsp樹脂による組み換え６ＸＨis ＤＨＦＲ精製
Ｎ末端６ＸＨis標識マウスＤＨＦＲを25mlの培養E. coli細胞で発現させた。細胞を沈殿させ、溶解バッファー（100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Ｔris−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、pH8.0）に再懸濁させ、そして渦動により破壊した。600μlのリゼイト上清を0.5mlのＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂−ＮＸ金属親和性樹脂を含むＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂で作業を実施し、2,000×ｇで２分間遠心分離した。カラムは１mlの洗浄バッファー（100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM ＰＩＰＥＳ、pH7.0）で２回洗浄し、結合タンパク質は600μl溶離バファー（20mM ＰＩＰＥＳ、100mM ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、pH6.0）で溶出した。20ミリリットルのリゼイト及び40μlの溶出液のそれぞれの続分画を12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルで泳動した。ゲルはクーマーシーブルーで染色された。分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。この結果は変性条件下で６ＸＨis標識ＤＨＦＲに対してＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂が選択的結合親和性をもつことを示した。６Ｘヒスチジンに対してのＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂の結合特性により完全なタンパク質状態を保つ中性pH条件（pH6.0）でタンパク質を溶出させることができる。
この結果は結合タンパク質が中性pH（pH6.0）で溶出させることができることを示す。このことはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂の結合特性により完全なタンパク質状態を保つ中性pH条件でタンパク質を溶出させることができることを示す。図４を参照。
実施例７−未変性条件でベータメルカプトエタノールの濃度を増加によるＣＭ−Ａsp樹脂を使用したよる組み換え６ＸＨis ＤＨＦＲ精製
Ｎ末端６ＸＨis標識マウスＤＨＦＲをE. coli細胞で発現させた。25mlの培養細胞は２mlの音波処理バッファー（100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Ｔris−ＨＣｌ、100mM ＮａＣｌ、pH8.0）中で凍結融解により破壊した。その後、2.66mlのリゼイト上清を２００μlの音波処理バッファーで前平衡化したＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂重力流出カラムを使い作業を実施分離した。タンパク質／樹脂混合物は音波処理バッファー、pH8.0で３回洗浄した。すべての結合タンパク質は600μlの100mM ＥＤＴＡ、pH8.0で溶出した。未変性条件下でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂精製のβ−メルカプトエタノールの効果を検査するため、ここで使用されるすべてのバッファーには０，10，20あるいは30mMのいずれかの濃度のβ−メルカプトエタノールを含んでいた。それぞれの溶出液のサンプルは12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルで電気泳動し、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。すべての溶出液で分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。β−メルカプトエタノールの存在はＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂により行われる６ＸＨis標識ＤＨＦＲの精製に影響を与えることはない。30mMまでのβ−メルカプトエタノールを含むすべての精製バッファーでは、通過流出物の20.3kDaの位置の顕著なバンドは無く、β−メルカプトエタノール存在下でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂を使用したタンパク質精製の工程中金属の損失が起こらないことを示している。
この結果は30mMまでのβ−メルカプトエタノールを含む精製バッファーの場合、通過流出物に20.3kDaの顕著なバンドは無く、β−メルカプトエタノール存在下でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂を使用したタンパク質精製の工程中金属の損失が起こらないことを示している。図５参照。
実施倒８−Ｎｉ−ＮＴＡと比較したＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によるベータ−メルカプトエタノール存在下での細胞リゼイトから精製された６ＸＨis ＤＨＦＲ生産量
Ｎ末端６ＸＨis標識ＤＨＦＲを発現させ、実施例７で記載された未変性条件下でＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂により精製した。タンパク質濃度はブラッドフォード検定により決定された。生産量は細胞リゼイト中の総タンパク質に対するパーセントで表示された。精製された６ＸＨis標識ＤＨＦＲの生産量は、精製バッファー中に含まれるβ−メルカプトエタノールの濃度が０，10，20，30mMのそれぞれに対して、14％，28％，34％，35％であった。同じ未変性条件下でＮｉ−ＮＴＡで精製されたタンパク質では、精製された６ＸＨis標識ＤＨＦＲの生産量は、精製バッファー中に含まれるβ−メルカプトエタノールの濃度が０，10，20，30mMのそれぞれに対して、４％，8.8％，3.4％，４％であった。β−メルカプトエタノールが存在する未変性条件下では精製６ＸＨis標識ＤＨＦＲの生産量は、Ｎｉ−ＮＴＡに比較してＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂を使用する場合には、有意に高くなる。このことは、Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂上の金属イオンは八面体金属結合に最善であるＣＭ−Ａsp金属キレートによりセファローズビーズに強力に固着することを示す。結果はβ−メルカプトエタノールの濃度が０，10，20，30mMでＮｉ−ＮＴＡ使用に比較してＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂を使用する場合には、精製された６ＸＨis標識ＤＨＦＲの生産量は有意に高くなる。このことは、Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂上の金属イオンは八面体構造金属結合に有効であるＣＭ−Ａsp金属キレートによりセファローズビーズに強力に固着することを示す。図６を参照。
実施例９−未変成条件でＣｏ2+−ＣＭ−Ａspによる６ＸＨis ＧＦＰの精製
Ｎ末端６ＸＨis標識グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をE. Coli細胞で発現させた。細胞を沈殿させ、音波処理バッファー（100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Ｔris−ＨＣｌ、100mM ＮａＣｌ、pH8.0）に再懸濁させ、凍結融解を３回行うことで破壊した。２mlのリゼイト上清を音波処理バッファーで前平衡化した400μlのＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂で作業を実施し、２mlの音波処理バッファー、pH8.0で３回洗浄した。６ＸＨis標識ＧＦＰは20mMＴris−ＨＣｌ、100mM ＮａＣｌを含む400μlの75mMイミダゾールバッファー、pH8.0で溶出した。それぞれの精製段階のサンプルは12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルで電気泳動し、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。75mMイミダゾールバッファーの溶出液には分子量27.8kDaの位置に一本のバンドが検出された。このことは、６ＸＨis標識ＧＦＰはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂に選択的に結合し、未変性精製条件で低濃度のイミダゾールで溶出できることを示した。
それぞれの精製段階のサンプルまたは12％ポリアクリルアミド/ＳＤＳゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。ブロット上のタンパク質はアンチＧＦＰモノクローナル抗体をプローブに調べられた。一本のＧＦＰバンドは細胞リゼイト及び溶離液のサンプルで明確に検出された。通過流出物にはＧＦＰバンドは検出されず、細胞リゼイト中に出現したすべてのＧＦＰはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂結合したことを示した。
この結果は75mMイミダゾール溶出液ではクーマーシーブルーで染色でゲルには一本のバンドが現れる（図７Ａ）。このことは、６ＸＨis標識ＧＦＰはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂に選択的に結合することを示す。ウエスタン分析のデータは通過流出物にはＧＤＦが含まれず、Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂と６Ｘヒスチジンの間に高い親和性があることを示した（図７Ｂ）。
実施例１０−Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspより精製した６ＸＨis ＧＦＰの生物学的活性
Ｎ末端６ＸＨis標識ＧＦＰをE. Coliで発現させた。細胞リゼイトは実施例７で記載のとおり調製された。細胞リゼイトは２ml Ｃｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂ディスポーザブルグラビティーカラムに載せられ、実施例９で記載の方法でバッチ／グラビティーフローカラムを使用して精製した。カラムは音波処理バッファーで３回洗浄し、100mM ＥＤＴＡ，pH8.0で溶出した。それぞれの精製段階から微小遠心管にサンプルが集められた。収集されたすべてのサンプルの蛍光はUltraLum Electronic U. V. Transilluminatorによって検出した。この実験では６ＸＨis標識ＧＦＰがＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によって未変性条件で生物学的活性を保ったまま等質的に精製することができることを示した。
それぞれの精製段階でのサンプルの写真はＧＦＤはＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によって未変性条件で等質的に精製することができ、蛍光はＣｏ2+ＣＭ−Ａspキレート樹脂によって精製されたＧＦＰが生物学的活性をなお保っている事を示す。
ここにおいて記載される実施例と具体例は説明する目的のためものであり、またこの点でこの技術の技能を有する人に暗示されうる様々な修正あるいは変更は、この明細書の精神および範囲及び添付された請求項の分野の内部に含まれるべきことを理解しなければならない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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