(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子及びジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンを含有し、母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入するための遺伝子物質含有組成物。
【請求項２】
Ｃ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１記載の遺伝子物質含有組成物。
【請求項３】
遺伝子欠損児出生予防、胎児の遺伝子欠損症予防及び治療、動物の品種改良用である請求項１又は２記載の遺伝子物質含有組成物。
【請求項４】
遺伝子含有溶液とジオクタデシルアミドグリシルスペルミン含有溶液を混和し、機械的振動を与えて調製した溶液である請求項２又は３記載の遺伝子物質含有組成物。
【請求項５】
先天性遺伝子疾患において欠損する遺伝子及びジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンを含有し、母体に投与して胎児に遺伝子を導入することを特徴とする胎児の遺伝子欠損症予防及び治療剤。
【請求項６】
遺伝子及びジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンを含有する遺伝子物質含有組成物をヒト以外の哺乳類の母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は遺伝子物質含有組成物に関し、更に詳細には妊娠母体中の胎児に遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現させるための遺伝子物質含有組成物並びに実験動物、家畜及び産業用動物も含めた胎児への遺伝子の導入方法に関する。
背景技術
近年、ヒトを含む動物個体へ直接外来遺伝子を導入するための種々の方法が開発され、遺伝子異常に起因する疾患に対する遺伝子治療等への応用が期待されている。
一方、先天性遺伝子欠損症等の先天性遺伝子異常に基づく疾患は、出生前に治療されることが望ましい。ところで、出生前の個体に対する遺伝子導入法については、動物実験において受精卵へのマイクロインジェクション〔Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．＆  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０，４６５−４９９（１９８６）〕が知られているだけである。
この受精卵へのマイクロインジェクション法は、初期胚における遺伝子導入を可能にしたものの、より発生の進んだ段階における胎児への外来遺伝子の導入手段は存在せず、また、ヒトにおける妊娠の場合の胎児への遺伝子治療には適用できない。
従って、本発明の目的は、発生のより進んだ段階で胎児に外来遺伝子を導入する方法の開発と、それを可能にする遺伝子物質含有組成物を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は目的の遺伝子を母体を介して胎児に投与する手段について種々検討してきたところ、遺伝子を特定のトランスポーターとともに母体に投与すれば、胎盤における母体と胎児の血液関門である基底膜を通過し、遺伝子が胎児細胞内に導入でき、当該遺伝子が胎児細胞内で発現することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は遺伝子及びジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンを含有し、母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入するための遺伝子物質含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、先天性遺伝子疾患において欠損する遺伝子及びジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンを含有し、母体に投与して胎児に遺伝子を導入することを特徴とする胎児の遺伝子欠損症予防及び治療剤を提供するものである。
また、本発明はこの遺伝子物質含有組成物をヒト以外の哺乳類の母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入する方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明組成物を投与した場合における母体肝臓及び胎児のゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの結果を示す図である。
図２は、外来遺伝子のみを投与した場合における母体肝臓及び胎児のゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの結果を示す図である。
図３は、本発明組成物を妊娠３、６、９、１２、１５日目に投与した場合における胎児のゲノムＤＮＡのサザンブロッティング結果を示す図である。
図４は、妊娠９日目の母体に本発明組成物を投与した時の胎児、新生児及び生後１ケ月の子マウスより採取したゲノムＤＮＡのサザンブロッティング結果を示す図である。
図５は、図４で示した生後１ケ月の子マウスの各臓器から採取したゲノムＤＮＡのスロットブロッティング結果を示す図である。
図６は、妊娠９日目の母体に本発明組成物を投与した時の胎児及び新生児マウスより採取したＲＮＡのノザンブロッティング結果を示す図である。
図７は、ＳＶ４０−ＣＡＴ遺伝子が導入された胎児及び新生児マウスより採取した蛋白質のＣＡＴ活性を示す図である。
図８は、妊娠８．５日目の母体に本発明組成物を投与し、胎児に導入されたβ−アクチン−ｌａｃＺの発現をＸ−ｇａｌを用いた染色により示す図である。
図９は、導入されたβ−アクチン−ｌａｃＺが発現している胎児マウスの組織切片を示す図である。
図１０は、ＳＲ−α−ｈｓｔ−１遺伝子が導入された生後２週児マウス及びその母マウスの血小板数を示す図である（心臓より採血した）。
図１１は、ＳＲ−α−ｈｓｔ−１遺伝子が導入された生後３週児マウス及びその母マウスの血小板数を示す図である（眼窩静脈より採血した）。
図１２は、ＳＲ−α−ｈｓｔ−１遺伝子が導入された生後３週児マウス及びその母マウスの血清中ｈｓｔ−１タンパク質濃度を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、トランスポーターとは、遺伝子が目的とする細胞に移入するのを補助する物質をいう。本発明で使用されるトランスポーターは、母体から胎児細胞へ遺伝子を導入し得るものであり、より詳細には妊娠母体に投与することにより胎児細胞中へ遺伝子を導入し得るものである。かかるトランスポーターとしては、カチオン化リポポリアミンが挙げられるが、このうちジＣ10−Ｃ20アルキルアミドグリシルスペルミンが好ましく、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンが特に好ましい。
本発明に用いられる遺伝子は、胎児の時期に治療又は予防するのが望ましい疾患のための遺伝子、又は実験動物、家畜を含む産業用動物及び愛玩用動物等の品種改良において動物個体への遺伝子導入に用いられる全ての遺伝子であれば特に制限されない。
例えば、胎児が欠損していることが判明している遺伝子、家族歴よりその胎児が欠損していることが明らかな遺伝子、胎児が羅っている先天性疾患の治療のための遺伝子等が挙げられる。
かかる先天性遺伝子疾患と欠損遺伝子産物との関係を次表に示す。
0003887017.tif 000002
また、自然発生の遺伝子疾患動物や人工的に作成された遺伝子機能不全動物（ノックアウトアニマル）に対する遺伝子導入モデルに利用できる他、ウイルス肝炎又は小児悪性腫瘍の治療に、ウイルス肝炎（Ａ，Ｂ，Ｃ）に感染した際のウイルス遺伝子産物を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはウィルムス腫瘍、神経芽腫等の小児悪性腫瘍を起こすがん遺伝子、又はその他の疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドも利用できる。
また、動物個体への遺伝子導入に用いられる遺伝子としては、（１）動物体内で医薬品等を生産させるための遺伝子、（２）動物の肉質、体質、毛皮、乳汁等の改善のための遺伝子、（３）胎生動物において、ある遺伝子を欠損又は導入することにより当該遺伝子の働きを検討するための遺伝子材料、（４）子宮内胎児死亡をおこす遺伝子欠損動物への遺伝子発現回復のための遺伝子材料等が挙げられる。
なお、胎児には、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、チンパンジー、ネコ、ブタ、マウス及びラット等のヒト以外の哺乳類並びにヒトが含まれる。
用いる遺伝子の形態は特に制限されないが、導入、発現のさせやすさを考慮すれば、当該遺伝子が発現し得るように構築されたプラスミドが特に好ましい。また、遺伝子に強いプロモーター及び／又はエンハンサーを連結して用いた場合には、当該プロモーター及び／又はエンハンサーにより発現が増大するためより好ましい。更に、このプロモーターとして、臓器選択性の高いプロモーターを用いた場合には、遺伝子を特定の臓器において発現させる、いわゆる臓器ターゲティングも可能である。
また、本発明遺伝子物質含有組成物においては、遺伝子とトランスポーターは単に混合物として存在していてもよいし、ミセルを形成したトランスポーターと遺伝子が混合された形態でもよいし、さらにリポソームを形成したトランスポーターと遺伝子が混合された形態でもよい。トランスポーターがリポソームを形成している場合、遺伝子は当該リポソームの中、膜中及び／又は膜の表面に存在していることが好ましい。リポソームの形成法としては、機械的振動（Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）法、超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）法、逆相蒸発（Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｈａｓｅ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）法、凍結乾燥法、加温法、多価アルコール法、メカノケミカル法、脂質溶解法及び噴霧乾燥法等が挙げられる。リポソームを調製するにあたっては、更に膜構成成分として、ジミリホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール並びにホスファチジン酸等のリン脂質、コレステロール、α−トコフェロール、ジセチルホスフェート及びステアリルアミン等を添加することができる。
遺伝子とトランスポーターの配合比は、その種類により異なるが通常ＤＮＡ１μｇに対し１〜１００nmol、特に５〜１０nmolトランスポーターを配合するのが好ましい。
本発明組成物の投与方法は、妊娠中の母体に注射、特に動脈又は静脈注射する方法が好ましい。更に母体血管内にカテーテルを用いて投与する方法も挙げられる。また、投与時期は、妊娠中であれば特に制限されないが、器官形成期が特に好ましい。
本発明組成物は、母体に投与された後胎盤の基底膜を通過し、臍帯を経て胎児細胞中に遺伝子を導入する。この導入された遺伝子は、出産後の子の細胞中にも存在し、発現していることが確認されている。
従って、本発明の組成物は、胎児への遺伝子導入実験、及び遺伝子欠損児出生予防又は胎児の遺伝子欠損症予防及び治療に有用である。また、産業用動物、愛玩用動物（ペット）などの動物の品種改良にも有用である。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
実施例１
（１）導入用プラスミド
ＳＶ４０−クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）プラスミド〔４７５２ｂｐ，プロメガ社〕を使用した。
（２）トランスポーター
ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）ｐ．６９８３〕（トランスフェクタム，Ｂｉｏｓｅｐｒａ  Ｉｎｃ．）を使用した。
（３）本発明組成物の調製
ＳＶ４０−ＣＡＴ  プラスミド１３３μｇに０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液２５０μｌを加え、プラスミド溶液を調製した。また、ＤＯＧＳ５００μｇに９６％エタノール２０μｌを加え、室温で５分間インキュベートし、更に精製水１８０μｌを加え、ＤＯＧＳ溶液を調製した。ＤＯＧＳ溶液２００μｌに精製水２５０μｌを加えた溶液に、先に調製したプラスミド溶液を加え、ボルテックスミキサーにて直ちに機械的振動を与えて本発明組成物を調製した。
（４）遺伝子の導入
ｉ）上記の組成物を、交尾後９．５日目の妊娠雌性マウス（体重約３０ｇ，チャールスリバー社）の尾静脈に注射した。７日後（妊娠１６．５日）に母体の肝臓を採取し、更に胎児を帝王切開にて摘出した。肝臓及び胎児からゲノムＤＮＡを採取し、サザンブロッティングによりＣＡＴ遺伝子の存在の有無をチェックした。ゲノム  ＤＮＡの採取はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，４９９３−４９９７（１９８６）に従って行った。ＤＮＡは制限酵素ＳａｌＩで完全消化したものと、未消化のものを１％アガロースゲル上で電気泳動にて分離し、ハイボンド−Ｎ＋ナイロン膜（アマシャム社）に転写した。ブロットは32ＰラベルしたＳＶ４０−ＣＡＴフラグメント（１９０８ｂｐ，ＨｉｎｄIIIフラグメント）をプローブとしてハイブリダイズさせ、オートラジオグラムにより特異バンドの検出を行った。
その結果、図１に示すように胎児細胞のゲノムＤＮＡ中に外来遺伝子であるＳＶ４０−ＣＡＴプラスミドが導入されていることが判明した。
図１中レーン１及び２はコントロールのＳＶ４０−ＣＡＴプラスミド（３３ｐｇ）、レーン３及び４は未処置母体肝臓、レーン５及び６は未処置胎児、レーン７及び８は本発明組成物を投与された母体の肝臓、レーン９及び１０はその胎児より採取されたゲノムＤＮＡである。
ii）また、ＳＶ４０−ＣＡＴプラスミドをトランスポーターと混合せず、そのまま妊娠マウスにｉ）と同様に投与して実験を行った結果を図２に示す。図２から明らかに、ＳＶ４０−ＣＡＴプラスミドは、トランスポーターが存在しなければ胎児細胞中に効率良く導入されないことがわかる。なお、図２中、レーン１及び２はコントロールのＳＶ４０−ＣＡＴプラスミド（３３ｐｇ）、レーン３及び４はプラスミドのみを投与した母体の肝臓、レーン５及び６はその胎児より採取されたゲノムＤＮＡである。
iii）また、ｉ）と同様の実験を投与時期を変化させて行った結果を図３に示す。図３から妊娠３日及び６日までの投与ではほとんど遺伝子が導入されず、妊娠９日目頃以降から遺伝子が導入され、妊娠９日目付近が最も導入効率が高いことが判明した。なお、図３中、レーン１及び２はコントロールのＳＶ４０−ＣＡＴプラスミド（３３ｐｇ）、レーン３及び４は妊娠３日、レーン５及び６は妊娠６日、レーン７及び８は妊娠９日、レーン９及び１０は妊娠１２日、レーン１１及び１２は妊娠１５日目に遺伝子を導入された胎児のゲノムＤＮＡを示す。
実施例２
実施例１と同様に妊娠９日目に実施例１（３）で得た本発明組成物を投与し、妊娠１６．５日目の胎児、新生児マウス及び生後１ケ月後の子マウスからゲノムＤＮＡを採取し、サザンブロッティングを行った。
その結果、図４に示すように、いずれの場合にも導入遺伝子が存在していることが確認された。図４中、レーン１及び２はコントロールのＳＶ４０−ＣＡＴプラスミド（３３ｐｇ）、レーン３及び４は妊娠１６．５日胎児、レーン５及び６は新生児マウス、レーン７及び８は生後１ケ月の子マウスのゲノムＤＮＡを示す。更に、生後１ケ月後の子マウスについて各臓器からゲノムＤＮＡを採取し、スロットブロッティングを行った結果、図５に示すように広範囲の臓器に遺伝子が導入されていることが判明した。図５中、レーン１は脳、レーン２は甲状腺、レーン３は胸腺、レーン４は心臓、レーン５は肺、レーン６は肝臓、レーン７は脾臓、レーン８は膵臓、レーン９は腎臓、レーン１０は小腸、レーン１１は子宮、レーン１２は筋から採取されたゲノムＤＮＡをそれぞれ示す。
実施例３
実施例１．ｉ）のようにして導入された遺伝子ＳＶ４０−ＣＡＴの発現をノザンブロッティングにより確認した。
すなわち、実施例１．ｉ）と同様にして遺伝子導入された胎児又は新生児マウスの全身よりイソゲン（ニッポンジーン社）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（２０μｇ）を１％アガロースゲルで電気泳動にて分離し、ニトロセルロース膜（ニトロプラスセルロース膜，ミクロンセパレーションズ  インク．）に転写し、実施例１と同様にして32ＰラベルしたＳＶ４０−ＣＡＴフラグメントをプローブとしてハイブリダイズさせ、オートラジオグラムにより特異バンドの検出を行った。その結果、図６に示すように、胎児及び新生児のマウスのいずれにおいても導入遺伝子からＲＮＡへの転写が行われていることが判明した。図６中、レーン１は未処置胎児、レーン２は遺伝子が導入された胎児、レーン３は遺伝子が導入された新生児マウスを示す。
また、実施例１．ｉ）と同様にして遺伝子を導入された胎児又は新生児マウスの全身より蛋白質を採取し、外来遺伝子の発現、すなわちＣＡＴの酵素活性をアッセイした。すなわち、各サンプルの蛋白質を等しくし、６０℃で５分間加熱処理することによりＣＡＴの内因性阻害因子を不活化し、公知の手段（Ｚｈｕ，Ｎ．，Ｌｉｇｇｉｔｔ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｙ．＆  Ｄｅｂｓ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，２０９−２１１（１９９３）及びＧｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．＆  Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１０４４−１０５１（１９８２））によりＣＡＴ活性をアッセイした。なお、酵素活性測定は、０．１μＣｉの14Ｃでラベルしたクロラムフェニコール（５５ｍＣｉ／mmol）を最終量１５０μｌに対し２００nmolのアセチルコエンザイムＡを添加して行った。
その結果、図７に示すように胎児及び新生児のマウスのいずれにおいても導入された遺伝子が発現し、ＣＡＴ蛋白質が産生していることが判明した。図７中、レーン１は未処置胎児、レーン２は外来遺伝子を投与された胎児、レーン３は外来遺伝子を投与された新生児マウス、レーン４は０．２μＵのコントロールＣＡＴを示す。
実施例４
導入用プラスミドとして、ニワトリのβ−アクチンプロモーターを含むｌａｃＺプラスミド（Ｓａｋｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６，５７５８−５７６２（１９８９））を用いた。ｌａｃＺプラスミド１３３μｇ及びＤＯＧＳ４００nmolを用いて、実施例１（３）と同様にして本発明組成物を調製した。
得られた組成物を、交尾後８．５日目に妊娠雌性マウスの尾静脈に注射して遺伝子導入した。妊娠１０．５日目の胎児を摘出し、チエンらの方法（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｅｒｌｉｅ，Ｊ．Ｐ．＆  Ｏｌｓｏｗ，Ｅ．Ｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，２１５−２１８（１９９３））に従ってβ−アクチン−ｌａｃＺ活性をＸ−ｇａｌを用いて染色して検出した。凍結切片は、染色した胎児を４℃の２０％シュクロース及び０．２％デキストロースを含むリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬した後作成した。また、連続切片は、３０μｍの厚さに切断し、適当な切片を核ファスト赤で対染色して観察した。
得られた遺伝子導入マウスの全身染色の結果を図８に、切片の染色の結果を図９に示す。その結果、β−アクチン−ｌａｃＺ活性が胎児の広範囲の臓器中で発現していることが判明した。図８中、ａ〜ｅは遺伝子が導入された胎児であり、ｆは未処置のコントロール胎児である。図９中、ｇは胎児全身の縦方向（矢状断）切片、ｈは胎児全身の心臓を通る前額断切片、ｉは右眼胞の切片（拡大）、ｊは膵臓芽の切片（拡大）、ｋは左前肢芽の切片（拡大）であり、ＦＢは前脳、Ｈは心臓、ＭＴは中腎管、ＮＣは脊索、ＩＲＳは網膜内空間、ＰＢは膵臓芽、Ｄは背側部、Ｖは腹側部を示す。
実施例５
導入用遺伝子としてｈｓｔ−１遺伝子を用い、プロモーターとしてＳＲ−αプロモーターを連結した遺伝子を妊娠母体に投与し、生後の仔マウスでｈｓｔ−１遺伝子が発現するか否か検討した。ｈｓｔ−１遺伝子の産物は血小板を増加することが知られているので、発現の有無は血小板数を測定することにより判断した。
（１）導入用遺伝子
ＳＲ−αプロモーターに連結したｈｓｔ−１遺伝子を含む発現プラスミドを用いた。
（２）本発明組成物の調製
ＳＲ−α−ｈｓｔ−１遺伝子１３３μｇを用いる以外は実施例１（３）と同様にして調製した。
（３）遺伝子の導入
得られた組成物を、交尾１０．５日目の妊娠雌性マウスの尾静脈に注射して遺伝子導入した。生後２週及び３週に仔マウスの血小板数を測定した。また、同時に母マウスの血小板数も測定した。結果を図１０及び図１１に示す。なお、図１０は心臓より採血し、図１１は眼窩静脈より採血した。
その結果、ｈｓｔ−１遺伝子を導入された仔マウスの血小板数は、コントロールマウスのそれに比べて高値を示しており、仔マウスにｈｓｔ−１遺伝子が導入され、その遺伝子が仔マウスの体内で発現したことがわかる。
また、生後３週の仔マウスの血清中のｈｓｔ−１タンパク質をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。すなわち、生後３週の仔マウスから採取した血清５０μｌを用いて公知の手段（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１２３６８−１２３７２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９４）に従ってＥＬＩＳＡ法によりｈｓｔ−１タンパク質を測定した。その結果を図１２に示す。その結果、ｈｓｔ−１遺伝子を導入した母体から得られた仔マウスの血中にｈｓｔ−１タンパクが検出された。
産業上の利用可能性
本発明組成物を用いれば、それを母体に投与することにより遺伝子欠損症児の出生を防止でき、また妊娠中に遺伝子欠損症の治療ができる。また動物実験において、未知の遺伝子を胎生期に導入することにより、発生における当該遺伝子の機能を解明できる。また、動物体内で医薬品等の生理活性物質を生産させたり、その生産量を増大させることもでき、更に動物の体質、肉質、乳汁及び毛皮の改善などの動物の品種改良にも応用できる。
【図１】
0003887017.tif 000003
【図２】
0003887017.tif 000004
【図３】
0003887017.tif 000005
【図４】
0003887017.tif 000006
【図５】
0003887017.tif 000007
【図６】
0003887017.tif 000008
【図７】
0003887017.tif 000009
【図８】
0003887017.tif 000010
【図９】
0003887017.tif 000011
【図１０】
0003887017.tif 000012
【図１１】
0003887017.tif 000013
【図１２】
0003887017.tif 000014