(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  前記アミノ酸配列（ａ）において１〜２４個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に示される塩基配列からなる、請求項３または４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３に示される塩基配列からなる、請求項３または４に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡを含んでなる、組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターによって形質転換されてなる、形質転換細胞。
【請求項９】
真核細胞である、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項９に記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物から、目的タンパク質を採取することを含んでなる、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、カイコの中部絹糸腺由来の新規なタンパク質、および該タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
背景技術
従来より、動物、植物、微生物などの多くの生物から数多くのプロテアーゼが単離されている。これらは、食品加工、食肉の軟化、皮革加工、光学分割、洗剤添加用、タンパク質やペプチドの低分子化もしくは限定分解、各種ペプチドもしくはタンパクの分析、同定、分解もしくは合成、さらには、病気の検査試薬や医薬品など、多岐の分野にわたって利用されている。
【０００３】
このようなプロテアーゼの産業上の利用分野の拡大とともに、より安定性に優れ、基質特異性等に関して応用価値の高いプロテアーゼが望まれている。このため、いわゆるタンパク質工学によるプロテアーゼ改良や、自然界からの新規プロテアーゼの更なる探索などが行われている。
【０００４】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、産業上重要な昆虫であるカイコ細胞、特にカイコの絹糸腺から、そこに特異的に存在するプロテアーゼ活性を有する特定のタンパク質を見出した。そして、本発明者らは、今般、カイコ中部絹糸腺に優位に発現しているこの新規なプロテアーゼをコードするＤＮＡをクローニングし、このＤＮＡの塩基配列および、それから予想されるアミノ酸配列を決定し、さらにこのＤＮＡを宿主中で発現生産させることに成功した。得られた発現産物は、プロテアーゼ活性を有するものであった。なお、この発現産物をＢｍ−ＳＧＳＰ（「カイコ中部絹糸腺セリンプロテアーゼ（Bombyx mori silk gland-derived serine protease）」とも称する）と命名した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００５】
従って、本発明は、カイコの中部絹糸腺由来の新規なタンパク質、および該タンパク質をコードするＤＮＡの提供を目的としている。
【０００６】
そして、本発明によるタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）からなるものである。
（ａ）  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  前記アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【０００７】
ここで、配列番号１のアミノ酸配列とは、下記の配列のことをいう。
（配列番号１）：
MetCysLeuGluLeuValLeuValValLeuAlaLeuAsnGlyValLeuSerGlnSerProGlyCysAspPheAlaGlnAsnIleAlaValGlyThrThrValAspIleSerSerProGlyTyrProGlyAsnTyr(Arg/Ser)ProGlyIleGlnCysArgTrpIleAlaThrCys(Pro/Leu)ValGlyTyrAsnCysGlnIleAspCysProIleIleSerIleProGlnSerSerSerCysIleAspArgLeuLeuLeuSerArgThrGlyAspProGlnLeuSerGlyAlaGluValTyrCysGlyArgGlyThrLeuSerAlaThrSerValGlyGlnArgLeuSerLeuGlyLeuIleSerSerAsnSerSerProGlyGlyTyrPheArgCysArgValTyrAlaValAlaSerAlaProSerProAlaProCysArgCysGlyGluArgLysGlnThrArgIleValGlyGlyGluGluAlaLysIleAsnGluPheArgMetMetValGlyLeuValAspIleSerIleArgGlnIleLysCysGlyGlyAlaLeuIleSerAsnArgHisValLeuThrAlaAlaHisCysIleAlaAsnGlnArgThrAspAsnIleGlyValIleValGlyGluHisAspValSerSerGlyThrGluSerAlaAlaGlnGlyTyrValValGlnArgPheIleIleHisProLeuPheThrAlaSerAsnTyrAspTyrAspValAlaIleValGluThrThrLysGluIleThrPheSerAspIleValGlyProAlaCysLeuProPheLysPheValAsnThrAsnPheThrGlyLeuLysValThrIleLeuGlyTrpGlyThrLeuPheProGlyGlyProThrSerAsnValLeuArgLysValAspLeuAsp(Val/Ile)IleSerGlnSerThrCysArgSerTyrGluSerThrLeuThrAspArgGlnMetCysThrPheThrProGlyLysAspAlaCysGlnAspAspSerGlyGlyProLeuLeuTyrThrAspProSerThrGlyLeuPhePheAsnLeuGlyIleValSerTyrGlyArgPheCysAlaSerAsnSerProGlyIleAsnMetArgValThrAlaValLeuAspTrpIleValSerSerThrGlnTyrAsnPheCysArgLys
［前記配列中、括弧内はその内のいずれかひとつのアミノ酸残基を示す。］
【０００８】
また本発明によれば、前記したタンパク質（ａ）または（ｂ）をコードするＤＮＡも提供される。
【０００９】
さらに本発明の一つの好ましい態様によれば、配列番号２に示される塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなり、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００１０】
ここで、配列番号２の塩基配列とは、下記の配列のことをいう。
（配列番号２）：
ATGTGCCTTGAACTTGTATTGGTTGT(A/G)CTGGCCTTGAA(T/C)GGCGTGTTATCACAGAGCCCGGGATGCGACTT(T/C)GCGCAAAATATTGCCGTCGGAACTACGGTGGATATAAGCAGTCCGGGTTACCCCGGCAACTAC(C/A)GTCCCGGTATTCAATGTAGATGGATAGCGACATGTC(C/T)CGTTGGATACAATTGTCAAATAGATTGCCCCATAAT(C/A)TCCATACCCCAAAGTTCTTCTTGCATAGATCGACTATTGCTCTC(A/G)AGGACGGGTGACCCCCAATTGAGTGGAGCCGAAGTCTACTGCGGGAGAGGAACTTTATCTGCAACTTCTGTTGGCCAGAGACTTAGTTTGGGGTTGATATCTTCAAACTCAAGTCCCGGTGGATACTTCAGGTGTCGCGTATACGCGGTGGCATCAGCTCCTAGTCCAGCACCTTGCAGATGCGGGGAAAGGAAACAGACCCGCATTGTGGGGGGTGAAGA(G/A)GC(G/T)AAAATCAATGAATTCCGAATGATGGTCGGGTTAGTTGATATCAGCATCAGGCAAATCAAATGCGGAGGCGCCTTGATCTCTAATAG(A/G)CATGTACTGAC(C/T)GCAGCCCATTGTATTGCCAACCAAAGAACGGATAACATAGGAGTTATAGTTGGAGAACACGATGTTTCCAGCGGCACAGAATCGGCAGCTCAGGGTTACGTAGTACAAAGGTTTATTATACATCCATTATTTACTGCTTCCAATTATGACTACGACGTGGC(G/C)ATAGTGGAAACAACAAAGGAAATAACATTCAGCGATATAGTTGGACCGGCTTGTCTACCGTTCAAGTTCGTCAATACCAATTTCACTGGCTTAAAAGTTACCATTCTTGGTTGGGGAACGTTATTCCCGGGAGGTCCAACGTCTAATGTTCTCCGTAAGGTAGACCTGGACGTCATCAGCCAGAGCACCTGTAGGAGTTACGAGTCGACACTGACGGACAGACAGATGTGCACATTCACTCCTGGGAAGGACGCGTGTCAAGACGACTCCGGTGGCCCTCTGCTCTATACAGACCCGAGTACCGGATTGTTCTTCAACCTGGGCATCGTGAGTTACGGTCGTTTCTGCGCATCAAACAGTCCGGGCATCAACATGAGAGTCACCGCAGTACTGGACTGGATCGTCTCGTCCACGCAATATAACTTCTGCAGGAAATAA
［前記配列中、括弧内はその内のいずれかひとつの塩基を示す。］
【００１１】
本発明によれば、カイコの絹糸腺において優位に発現しているセリンプロテアーゼ、特にＢｍ−ＳＧＳＰをコードするＤＮＡをクローニングすることができ、さらにこのＤＮＡがコードするタンパク質を単離・精製することができる。本発明によるタンパク質は、基質特異性を利用した特定アミノ酸配列の切断による、タンパク質の構造解析や、その機能改変、または、特定のタンパク質の分解を目的とする医療品、あるいは、食品軟化や風味の改良などの食品加工等の各種の分野において極めて有用である。
【００１２】
【発明の具体的説明】
本発明によるタンパク質
本発明によるタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）からなるものである。
（ａ）  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  前記アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数個（好ましくは１〜２４個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【００１３】
本発明において、プロテアーゼ活性を有するタンパク質とは、当業者によりプロテアーゼ活性が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例の操作９と同様の条件において測定した場合にプロテアーゼ活性が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００１４】
本発明において、タンパク質が有するプロテアーゼ活性は、好ましくはセリンプロテアーゼ活性である。すなわち、本発明によるタンパク質は好ましくは、カイコ絹糸腺セリンプロテアーゼ（Ｂｍ−ＳＧＳＰ）である。
【００１５】
またここで、本発明によるタンパク質というときには、タンパク質の誘導体も包含する意味で用いられる。ここでタンパク質の誘導体とは、前記したプロテアーゼ活性を有するものであって、かつ、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各種アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を受けたものをいう。このような適当な他の置換基による修飾は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を目的として行われることがある。
【００１６】
本発明において、アミノ酸とは、光学異性体、すなわちＤ体およびＬ体のいずれをも包含する。また、ここでいうアミノ酸には、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のみならず、それら以外のα−アミノ酸、ならびにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等が包含されてもよい。
【００１７】
本発明の一つのより好ましい態様においては、前記（ｂ）のタンパク質は、前記アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質である。
【００１８】
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合、ある芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、下記の６群が挙げられる。これらは各郡内において互いに保存的置換を行うことができる。
（ｉ）  アラニン（Ala）、セリン（Ser）、およびトレオニン（Thr）、
（ii）  アスパラギン酸（Asp）、およびグルタミン酸（Glu）、
（iii）  アスパラギン（Asn）、およびグルタミン（Gln）、
（iv）  アルギニン（Arg）、および、リジン（Lys）、
（ｖ）  イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、およびバリン（Val）、
（vi）  フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、およびトリプトファン（Trp）。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が５５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質が提供される。前記の相同性は、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であることが好ましい。
【００２０】
なお、ここでいう「相同性」（または「同一性」）の程度は、配列番号１に示されるアミノ酸配列との比較において、例えば、ホモロジー検索プログラムＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)（NCBI(National Center for Biotechnology Information)により開発され、インターネット上で入手可能）や、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ソフトウェア開発株式会社）により求めることができる。
【００２１】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質は、以下の（ａ’）または（ｂ’）からなるものである。
（ａ’）  配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ’）  そのアミノ酸配列において、１もしくは複数個（好ましくは１〜２４個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【００２２】
本発明によるＤＮＡ
本発明によるＤＮＡは、前記したタンパク質をコードするものである。したがって、本発明によるＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  前記アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【００２３】
一般的に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に決定することができる。よって、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することができる。従って、本発明において、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号２に示される塩基配列を有するものに加えて、該配列番号１と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつ、縮重関係にあるコドンを塩基配列として有するものも包含する。
【００２４】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明のＤＮＡは、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相同性が６０％以上の塩基配列からなり、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。前記の相同性は、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上であることが好ましい。
【００２５】
本発明において、ＤＮＡの変異体は、当該分野において既知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、挿入、転座、遺伝コードの縮重によりアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更などの方法によって、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡから調製することができる。
【００２６】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明のＤＮＡは、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のＤＮＡは、配列番号２に示される塩基配列からなるものであり、さらにより好ましくは、配列番号３に示される塩基配列からなるものである。
【００２８】
タンパク質の製造
本発明によるタンパク質は、慣用の各種合成法を利用することによって製造したものであっても、天然起源のものであってもよい。本発明によるこのタンパク質は、そのアミノ酸配列が決定されていることから、その配列全てを合成することによって得てもよく、また、天然起源のものを一部利用してそれを基にさらに合成を行って得たものであってもよい。本発明の一つの態様によれば、本発明によるタンパク質は、天然のカイコ中部絹糸腺由来のものであることができる。
【００２９】
また、本発明によるタンパク質は、それをコードするＤＮＡを入手もしくは製造することができる場合には、そのＤＮＡによって宿主細胞を形質転換させた形質転換細胞において、製造することができる。より具体的には、本発明によるタンパク質は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同ＤＮＡ断片を発現可能な状態で含むＤＮＡ、特に組換えベクター、の形態とし、それを用いて宿主細胞の形質転換を行い、得られた形質転換体を培養することによって製造することができる。すなわち、本発明においては、該タンパク質の製造に際し、所謂宿主−ベクター系を使用することができる。なお、本発明においては、このような宿主−ベクター系を適用するにあたっては、当該技術分野において慣用されている各種の発現ベクター（組換えベクター）作成法および形質転換法を使用することができる。
【００３０】
従って、本発明の別の態様によれば、前記したような形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物から目的タンパク質を採取することを含んでなる、本発明によるタンパク質の製造方法が提供される。そして、本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質は、前記した製造方法により製造されたものである。
【００３１】
組換えベクター
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる組換えベクターが提供される。
【００３２】
このようなベクターは、慣用のベクター系に、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明においては、このベクターは、前記ＤＮＡ断片を少なくとも２回以上の反復した形式で含んでいてもよい。
【００３３】
本発明において使用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、宿主−ベクター系の確立されている慣用のベクター系、例えば、プラスミド、ウイルス、人工的な染色体、ファージ、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。より具体的には、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合にはｐＢＲ系、ｐＵＣ系やｐＱＥ系のプラスミド、λファージ系のバクテリオファージ、枯草菌の場合にはｐＵＢ系のプラスミド、ならびに、酵母の場合にはＹＥｐ系やＹＣｐ系のベクター、脊椎動物細胞の場合には、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するpSV2dhfr［Subramani,S. et al. (1981). Mol. Cell. Biol. 1:854-864参照］等を例示できる。また、植物の場合には、例えばカリフラワーモザイクウイルスの初期プロモーターである３５ｓプロモーターと根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン合成遺伝子ポリアデニル化配列を有し、さらに、根頭癌腫病菌による遺伝子導入配列を有したｐＢＩ１２１［Jefferson, R.A. et al. (1987) EMBO J. 6:3901-3907参照］等が挙げられる。本発明において使用されるベクターは、プラスミドであるのが好ましい。
【００３４】
本発明においてベクターは、本発明によるＤＮＡがトランスフェクションまたは形質転換された形質転換細胞を選択できるような一以上の選択マーカーを含むものであることができる。このような選択マーカーとしては、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン等の抗生物質、栄養要求性および細胞死関連遺伝子による制御などが挙げられる。
【００３５】
さらに、本発明による組換えベクターは、前記したタンパク質の発現に必要なＤＮＡ、例えばプロモーター、または他の制御配列（例えば、細菌発現用のリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写開始信号、転写終止配列、翻訳停止シグナル、上流制御領域、エンハンサー、オペレーターやシグナル配列等）が本発明のＤＮＡに連結されるものであることが好ましい。
【００３６】
この際、プロモーターまたは他の制御配列は、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に制限されず、当該技術分野において公知のものであればいずれのものであっても使用可能である。このようなものとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、レトロウィルスＬＴＲ、ＥＦプロモーター等、およびこれらのプロモーターの一部などが挙げられる。組換えベクターは、上記制御配列に加えて、タンパク質の発現を調節できる調節配列を含むものであってもよい。
【００３７】
形質転換細胞
本発明によれば、前記組換えベクターをトランスフェクションするか、または前記組換えベクターによって宿主細胞を形質転換されてなる、形質転換細胞が提供される。
【００３８】
本発明において使用可能な宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば何れのものも使用可能である。このような宿主細胞としては、原核細胞、または真核細胞のいずれであってもよい。
【００３９】
本発明において、宿主細胞として使用可能な原核細胞としては、例えば大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）等が挙げられる。目的のＤＮＡをこれらの宿主細胞内で形質発現させるには、宿主と適合し得る複製起点およびプロモーター配列を含むプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換すれば良い。
【００４０】
例えば大腸菌としては、E. coli K12 株由来のＪＭ１０９株等がよく用いられ、この場合の組換えベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドがよく用いられるが、本発明においてはこれらに限定されずに、公知の各種の菌株およびベクターはいずれのものも使用可能である。プロモーターとしては、大腸菌においては、例えば、ラクトースプロモーター（ｌａｃ）やトリプトファン・ラクトースプロモーター（ｔｒｃ）等が挙げられる。
【００４１】
本発明において、宿主細胞として使用可能な真核細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母、カビ、および植物等の細胞が含まれる。
【００４２】
脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞［Gluzman,Y.（1981）. Cell 23:175-182.参照］、ヒト腎胚細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。
【００４３】
昆虫細胞としては、夜盗蛾科の毛虫（Spodoptera frugiperda）由来細胞［Smith,G.E. et al. （1983）. Mol.Cell.Biol. 3:2156-2165. 参照］、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞が挙げられる。また、カイコ等の個体を用いてもよい。
【００４４】
酵母としては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）が挙げられる。
【００４５】
また、植物細胞としてはタバコ（Nicotiana tabacum）やイネ（Oryza sativa）が挙げられる。
【００４６】
本発明においては、宿主細胞として使用される細胞としては、真核細胞が好ましい。好ましい真核細胞としては、例えば、ハムスター由来のＣＨＯ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞が挙げられる。
【００４７】
本発明の一つのより好ましい態様においては、宿主細胞は昆虫細胞である。昆虫細胞は、操作が容易で、当該分野において良く知られており、目的とするＤＮＡやタンパク質の大量生産のための大量培養が容易であり、さらに、目的タンパク質のフォールディングが正常に行われるため、本発明において有利に使用することができる。
【００４８】
このような昆虫細胞としては、例えば、バキュウロウイルス発現系が知られている、夜盗蛾科の昆虫細胞が挙げられる。夜盗蛾科の昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾科のSpodoptera frugiperdaの卵母細胞から樹立された細胞株のＳｆ９細胞（Invitrogen社）が挙げられる。
【００４９】
タンパク質の精製
前記した方法により得られる本発明によるタンパク質は、その化学的性質もしくは物理的性質を利用して、慣用の各種分離操作を必要に応じて適用することにより分離精製することができる。例えば、タンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、および透析法等の手段、またはこれら手段の組み合わせを実施することにより、本発明によるタンパク質を分離精製することができる。
【００５０】
【実施例】
下記は、本発明の例を示して本発明を具体的に説明するものである。本発明は、これらに限定されるものではない。
【００５１】
操作１：  カイコ中部絹糸腺からのトータルＲＮＡの調製
脱皮から４日目のカイコ終令幼虫の中部絹糸腺を摘出し、TRIZOL 試薬（ライフテック・オリエンタル株式会社）によりトータルＲＮＡを調製した。
なお、ここで用いたカイコは、一般的に入手可能な家蚕(Bombyx mori)である。
【００５２】
操作２：  ｃＤＮＡ合成用プライマーの設計と合成
各種セリンプロテアーゼには特徴的な保存配列が存在する。この配列をもとに、３種のdegenerate ＰＣＲプライマー、すなわち下記のprimer（プライマー）１、primer２、およびprimer３を設計し、これらを、ＤＮＡ合成装置を使用して、フォスフォアミダイト法により化学合成した。
セリンプロテアーゼの保存配列と、プライマーの部位を図１に示す。
【００５３】
(合成プライマー)
primer1：5'- GTNBTNWCNGCNGCNCAYTG -3'    （配列番号４）
primer2：5'- AVNGGNCCNCCNGARTCNCC -3'    （配列番号５）
primer3：5'- CCNGARTCNCCNTKRCANG -3'     （配列番号６）
ここで、
Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを示し、
Ｂは、Ｃ、ＧまたはＴを示し、
Ｖは、Ａ、ＣまたはＧを示し、
Ｗは、ＡまたはＴを示し、
Ｙは、ＣまたはＴを示し、
Ｒは、ＡまたはＧを示し、
Ｋは、ＧまたはＴを示す。
【００５４】
操作３：  ＲＴ−ＰＣＲ(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)法によるｃＤＮＡの調製
操作２で合成したprimer２とスーパースクリプトII(Super ScriptTMII)RNアーゼＨ−逆転写酵素（ライフテック・オリエンタル株式会社）を用いて、操作１で調製したカイコ中部絹糸腺のトータルＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。
この際の反応条件は、トータルＲＮＡとプライマーとを含む反応液を、７０℃１０分間インキュベートした後、３７℃で２分間インキュベートし、次いでここにスーパースクリプトII RNアーゼＨ− 逆転写酵素を加えて、３７℃で１時間逆転写反応を行った。
【００５５】
操作４：  セリンプロテアーゼの部分タンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
操作３より得られたｃＤＮＡを鋳型とし、上記操作２で合成したprimer1とprimer2とを用いて１回目のＰＣＲを実行した。
この時の反応条件は、９４℃で２分間インキュベートした後、ＤＮＡ増幅サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、ついで７２℃で１分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００５６】
次いで、一回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、上記操作２で合成したprimer１とprimer３とを用いて２回目のＰＣＲを実行した。
【００５７】
この時の反応条件は、９４℃で２分間インキュベートした後、ＤＮＡ増幅サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、ついで７２℃で１分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００５８】
以上のＰＣＲによって得られたサンプルに、当量のＴＥ飽和フェノールを加えて十分混合した後、遠心分離（１２，０００ｇ×５分）を行った（フェノール処理）。次いでこの上清を回収し、クロロホルム処理を行ってフェノールを除去した。さらに、サンプルの１／１０倍量の５Ｍ酢酸アンモニウムと２．５倍量のエタノールとをそこに添加して、遠心（１２，０００ｇ×３０分）した後、ＤＮＡを回収した（エタノール沈殿操作）。
以上のようにして得られたＰＣＲ産物は、ＴＥバッファーに溶解させた。
【００５９】
操作５：  ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約０．４７ｋｂｐのＤＮＡのバンドを切り出して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング法を用いてｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（プロメガ社製）にサブクローニングし、組換えベクターを得た。
【００６０】
得られた組換えベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。次に、得られた大腸菌をアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌のコロニーを選択し、常法によって大腸菌形質転換体からプラスミドを調製した。
【００６１】
次に、得られたプラスミドについて、インサートＤＮＡの塩基配列を決定した。以下に示す２種のシークエンスプライマー（T7 PrimerおよびSP6 Primer）ならびに、ThermoSequenaseTM ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット, v2.0（アマシャム社製）を用いて、シークエンス反応を行なった。この際の反応条件は、９６℃で１分間インキュベートした後、反応サイクル（９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、ついで６０℃で４分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を２５回行うことであった。
【００６２】
(プライマー)
T7 Primer：5'- TAATACGACTCACTATAGGGCGA -3'      （配列番号７）
SP6 Primer：5'- ATTTAGGTGACACTATAGAATAC -3'     （配列番号８）
得られたＰＣＲ産物についてＤＮＡオートシークエンサー（ＡＢＩ社製ＰＲＩＳＭＴＭ３７７型）でシークエンシングを行ったところ、新規のセリンプロテアーゼをコードしていると考えられるｃＤＮＡ配列が確認された。
【００６３】
操作６：  ５' ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA Ends)法によるカイコセリンプロテアーゼの５'末端ｃＤＮＡのクローニング
用いた５種のプライマーの配列を下記に示す。
（プライマー配列）
GSP1-L Primer：5'- CCACGTCGTAGTCATAATTG -3'         （配列番号９）
GSP2-L Primer：5'- TAACCCTGAGCTGCCGATGCTGT -3'      （配列番号１０）
GSP3-L Primer：5'- GCTGGAAACATCGTGTTCTCCAA -3'      （配列番号１１）
Abridge Universal Amplification Primer (AUAP)：
5'- GGCCACGCGTCGACTAGTAC -3'                      （配列番号１２）
Abridged Anchor Primer：
5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG -3'      （配列番号１３）
【００６４】
操作１と同様にしてカイコ中部絹糸腺から調製されたトータルRNAについて、上記のプライマーGSP1-Lを使用して操作３と同様に逆転写反応を行って、ｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
次に、5' RACE システム（5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0）（ライフテック・オリエンタル株式会社）を用いて、５'末端ｃＤＮＡをクローニングした。
【００６６】
１回目のＰＣＲに用いたプライマーは、Abridged Anchor プライマー、およびGSP2-Lであった。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５分間インキュベートした後、DNA増幅サイクル（９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、ついで７２℃で３分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００６７】
１回目のＰＣＲで得られた産物を鋳型として、プライマーＡＵＡＰ、およびＧＳＰ３−Ｌを使用して２回目のＰＣＲを行った。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５分間インキュベートした後、ＤＮＡ増幅サイクル（９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、ついて７２℃で３分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００６８】
以上のようにして得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により確認したところ、約０．７５ｋｂｐをメインにする複数のバンドの増幅が確認された。
【００６９】
約０．７５ｋｂｐのＤＮＡ断片を操作４と同様にして回収し、さらに、回収されたＰＣＲ産物について、操作５と同様にして、pBluescript II SK-プラスミドへ挿入後、形質転換およびＤＮＡオートシークエンシングを行なった。
【００７０】
操作７：  ３' ＲＡＣＥ法によるカイコセリンプロテアーゼの３'末端ｃＤＮＡのクローニング
使用した４種のプライマーの配列を下記に示す。
（プライマー配列）
GSP1-U Primer：5'- TTCTTGGTTGGGGAACGTTATTC -3'      （配列番号１４）
GSP2-U Primer：5'- ACGTCTAATGTTCTCCGTAAGGT -3'      （配列番号１５）
AUAP：5'- GGCCACGCGTCGACTAGTAC -3'                  （配列番号１６）
3' RACE Adapter Primer：
5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT -3'       （配列番号１７）
【００７１】
操作１と同様にしてカイコ中部絹糸腺から調製されたトータルRNAについて、上記の3' RACEアダプタープライマー(Adapter Primer)を使用して操作３と同様に逆転写反応を行って、ｃＤＮＡを合成した。
【００７２】
次に、上記操作で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーはＧＳＰ１−Ｕ、およびＡＵＡＰを使用して、１回目のＰＣＲを行った。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５分間インキュベートした後、サイクル（９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、ついて７２℃で３分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００７３】
１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーGSP2-U、およびAUAPを使用して２回目のＰＣＲを行った。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５分間インキュベートした後、ＤＮＡ増幅サイクル（９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、ついで７２℃で３分間のインキュベートを行うプロセスを１サイクルとする）を３０回行うことであった。
【００７４】
以上のようにして得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により確認したところ、約０．４５ｋｂｐをメインにする複数のバンドの増幅が確認された。
【００７５】
増幅した約０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を操作４と同様にして、さらに、回収されたＰＣＲ産物について、操作５と同様にして、pBluescript II SK−プラスミドへ挿入後、形質転換およびＤＮＡオートシークエンシングを行なった。
【００７６】
シークエンシングの結果、上記操作５で得られたｃＤＮＡクローンと重なりあう複数の５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥクローンが得られた。そのＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列から、カイコ絹糸腺由来の新規セリンプロテアーゼは、開始コドンから終止コドンまで全長１，１７９ｂｐで、３９２アミノ酸から成るタンパク質であることが判明した。
【００７７】
操作８：  カイコ絹糸腺セリンプロテアーゼの全長ｃＤＮＡクローンの取得
５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥの結果得られたｃＤＮＡ断片から、以下のようにして完全長のカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼを取得した。
【００７８】
全長ｃＤＮＡクローンの取得操作の概要を図２に示した。
完全長のカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するため、操作６および操作７より明らかになった開始コドンと終止コドンの部分をもとに、特異的なＰＣＲプライマー（SGSP-5-RsrおよびSGSP-3-Hind）を設計して、これらを常法に従って化学合成した。プライマー配列を以下に示す。
【００７９】
（プライマー配列）
SGSP-5-Rsr Primer： 5'-TCTCGGTCCGTCAGAAATGTGCCTTGAACTTGTA -3'
（配列番号１８）
SGSP-3-Hind Primer： 5'-CCAAGCTTATTTCCTGCAGAAGTTATATTGCG -3'
（配列番号１９）
【００８０】
次に、操作３と同様にして、調製された鋳型ＤＮＡとしてのカイコ中部絹糸腺由来ｃＤＮＡについて、上記のプライマー（SGSP-5-RsrおよびSGSP-3-Hind）を使用してＰＣＲを行った。
【００８１】
得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により確認したところ、約１．２ｋｂｐのバンドの増幅が確認された。
【００８２】
増幅した約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を上記操作４と同様にして回収した。
【００８３】
上記操作で得られたＰＣＲ産物を、バキュロウィルス用トランスファーベクターＨＴ−ＣＨの制限酵素サイト（ＲｓｒIIおよびＨｉｎｄIII）にサブクローニングした。この結果得られた、Ｂｍ−ＳＧＳＰ遺伝子を連結したバキュロウィルス用トランスファープラスミドを、ここではｐＢｍ−ＳＧＳＰと呼称する。
【００８４】
ＤＮＡオートシークエンシングを行ない、ｐＢｍ−ＳＧＳＰが完全長のカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼのｃＤＮＡを有することを確認した。
【００８５】
クローニングした全長ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を図３に示した。
【００８６】
全長クローンは、１，１７９ｂｐ、３９２アミノ酸残基から成るタンパク質をコードし、活性中心であるＨｉｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ残基などセリンプロテアーゼの特徴を備えていた。また、そのＮ末端側にはシグナルペプチドと考えられる疎水性に富む配列が存在していた。
【００８７】
操作９：  ＲＴ−ＰＣＲ法によるカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼの絹糸腺各部における発現確認
次に、絹糸腺各部におけるカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。脱皮後４日目のカイコ終令幼虫の前部絹糸腺、中部絹糸腺（前部、中部、後部）、および後部絹糸腺の各部から、操作１と同様にしてトータルＲＮＡを調製した。
絹糸腺各部を図４に示した。
【００８８】
次に、調製した絹糸腺各部のトータルＲＮＡと前記のプライマー（３’RACE Adapter Primer）とを使用して、操作３と同様な方法で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。続いて、このｃＤＮＡサンプル４μｌと操作８で合成したプライマー（SGSP-5-RsrおよびSGSP-3-Hind各２００ｐｍｏｌ）を使用して、ＰＣＲを行った。この際の、ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、ついで７２℃で２分間のインキュベートを１サイクルとして、３０サイクル行うものであった。得られたサンプルについて、アガロースゲル電気泳動を行い増幅を確認した。
【００８９】
結果は図５に示されるとおりであった。
図５より、Ｂｍ−ＳＧＳＰはカイコの中部絹糸腺で優位に発現することが示された。
【００９０】
操作１０：  昆虫細胞（Ｓｆ９）を用いたＢｍ−ＳＧＳＰの分泌生産
昆虫細胞でのタンパク質生産にはバキュロウィルス（ライフテック・オリエンタル株式会社製）を用いた。
【００９１】
上記操作８で構築したＢｍ−ＳＧＳＰ遺伝子を含むバキュロウィルス用トランスファーベクター（ｐＢｍ−ＳＧＳＰ）で、あらかじめＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡを菌体内に有する大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃを、常法にしたがって形質転換した。
【００９２】
形質転換された大腸菌の菌体内では相同組み換えが起こり、ＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡにＢｍ−ＳＧＳＰ遺伝子が組み込まれる。ＤＨ１０Ｂａｃ内のＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡにはｌａｃＺ遺伝子が入っており、相同組換えを起こしていない菌体は、Ｘ−ｇａｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地上で青いコロニーを形成するが、相同組換えを起こして、ｌａｃＺ遺伝子が破壊されると、白いコロニーを形成する。
【００９３】
したがって、白いコロニーを選択して、常法を適用することによって、組換えウィルスＤＮＡを調製した。
【００９４】
次に、調製したウィルスＤＮＡを、昆虫細胞Ｓｆ９（夜盗蛾科Spodoptera frugiperda由来の細胞であり、Invitrogen社から入手可能）にトランスフェクションした。
【００９５】
Ｓｆ９００ＩＩ−ＳＦＭ（＋１０％ＦＣＳ）培地を用いて、シャーレでＳｆ９細胞（２×１０６cells／ml）を培養し、４日後のその培養上清を回収して、これをウィルス液とした。１×１０９ｆｐｕ／ｍｌの該ウィルス液を用いて、さらにＳｆ９細胞にＢｍ−ＳＧＳＰ遺伝子が組み込まれたバキュロウィルスを感染させ、２７℃で４日間培養した後、３０ｍｌの培養上清を得た。
【００９６】
操作１１：  昆虫細胞で発現させた組換えＢｍ−ＳＧＳＰタンパク質の精製
培養上清を透析バッファー（２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ２）に対して一晩透析した。
【００９７】
本実験において、培養上清中に分泌されたＢｍ−ＳＧＳＰは、そのＣ末端側に６個のヒスチジンから成るＨｉｓ−ｔａｇを有している。このため、透析後の培養上清からのＢｍ−ＳＧＳＰの精製は、Ｈｉｓ−ｔａｇと高い親和性を有するＮｉ−ＮＴＡカラム（Ni-NTA タンパク質精製システム (Qiagen社製)）を用いて行った。Ｎｉ−ＮＴＡ（ニッケル-ニトリロトリ酢酸）に吸着させたＢｍ−ＳＧＳＰタンパク質は、１００ｍＭイミダゾール溶液で溶出させた。溶出した精製後のタンパク１μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、精製タンパクの確認を行った。
【００９８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は、図６に示されるとおりであった。
【００９９】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルを銀染色することによって、タンパク質の純度測定を行った。図６より、Ｂｍ−ＳＧＳＰ細胞の培養上清から、分子量約４２ｋＤａのＢｍ−ＳＧＳＰタンパクの完全精製が確認された。
【０１００】
昆虫細胞培養液３０ｍｌから２８．０μｇの精製Ｂｍ−ＳＧＳＰタンパク質が得られた。
【０１０１】
操作１２：  カイコ由来新規セリンプロテアーゼＢｍ−ＳＧＳＰのプロテアーゼ活性の測定
プロテアーゼ活性測定は、トリプシン型セリンプロテアーゼが特異的に切断する合成基質である、Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Lys-p-ニトロアニリド (または「Suc-AAPK-pNA」と示す) を用いて行った。
【０１０２】
Ｂｍ−ＳＧＳＰを生産するＳｆ９細胞の培養液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分）して細胞画分を得た。続いて、該細胞を１０ｍＭトリスバッファー(ｐＨ７．５)に懸濁し、超音波処理により細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分）し、得られた上清を酵素液とした。
【０１０３】
対照実験として、Ｂｍ−ＳＧＳＰを生産しないＳｆ９細胞（HT-CH）に関しても同様な操作を行った。
【０１０４】
基質（Suc-AAPK-pNA）１０ｍＭ  ５μｌと、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ３４５μｌと、バッファー (５０ｍＭ ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸), ２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）３７５μｌとを混合して、３７℃で１５分間プレインキュベートした。次に、上記操作で調製したＢｍ−ＳＧＳＰ酵素液２５μｌをそこに添加して、３７℃で１５０分間反応させた。反応終了後、常法に従って吸光度（４１０ｎｍ）を測定し、酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を求めた。
【０１０５】
結果は図７に示されるとおりであった。
なお、１Ｕは１分間に１ｎｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを放出するのに必要な酵素量である。また、ｐ−ニトロアニリンの４１０ｎｍにおけるモル吸光係数は８９００（Ｍ−１ｃｍ−１）で与えられる。よって酵素活性は以下の式により求められる：
Ｕ／ｍｇ  ＝  ΔＡ４１０÷（８．９×Ｘ×Ｙ×Ｚ）×１０６
［ここで、Ｕ／ｍｇはタンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）、ΔＡ４１０は波長４１０ｎｍにおける吸光度変化、Ｘは酵素液量（μｌ）、Ｙは反応時間（分）、および、Ｚはタンパク濃度（ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ表す］。
【０１０６】
図７に示されるように、得られた本発明のカイコ絹糸腺由来のＢｍ−ＳＧＳＰは、トリプシン型セリンプロテアーゼが特異的に切断する基質Ｓｕｃ−ＡＡＰＫ−ｐＮＡを切断したことから、セリンプロテアーゼ活性が確認された。なお、ＨＴ−ＣＨはネガティブコントロールである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、セリンプロテアーゼの保存配列とプライマー設定配列の関係を示す。
【図２】  図２は、完全長のカイコ絹糸腺セリンプロテアーゼ遺伝子を有するプラスミドを構築する過程を示したものである。
【図３】  図３ａおよび図３ｂは、Ｂｍ−ＳＧＳＰの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】  図４は、カイコ絹糸腺部を示す。
【図５】  図５は、Ｂｍ−ＳＧＳＰ部位特異的発現を確認した際（実施例の操作９）の電気泳動の結果を写真で示す。
【図６】  図６は、昆虫細胞によるＢｍ−ＳＧＳＰの生産を確認した際（実施例の操作１１）の電気泳動の結果を写真で示す。
【図７】  図７は、Ｂｍ−ＳＧＳＰのプロテアーゼ活性を測定した結果を示す。
【図１】
0003883961.tif 000002
【図２】
0003883961.tif 000003
【図３ａ】
0003883961.tif 000004
【図３ｂ】
0003883961.tif 000005
【図４】
0003883961.tif 000006
【図５】
0003883961.tif 000007
【図６】
0003883961.tif 000008
【図７】
0003883961.tif 000009