(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌとからなることを特徴とする、牛腎上皮細胞用の動物由来成分無添加培養液。
【請求項２】
牛腎上皮細胞を、基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis（2-hydroxyetyl）-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌと、動物由来成分とを含有し、かつ、血清を含有しない無血清培養液に順化させた後、さらに無血清培養液中の動物由来成分の含有量を順次下げて培養を行い、最終的に請求項１に記載の培養液を用いて培養することを特徴とする、請求項１に記載の培養液で増殖可能であり、かつ、病原体の迷入がない細胞系の作出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の作出方法により得られた細胞系を用いて、疾病の診断用抗原、ワクチン又は医薬品を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物由来成分無添加培養液、およびそれを用いる細胞系の作出方法に関し、詳しくは、動物由来成分が含まれない哺乳類由来細胞用の動物由来成分無添加培養液、当該動物由来成分無添加培養液を用いて動物由来成分無添加で増殖可能な細胞系を作出する方法、当該細胞系を用いて疾病の診断用抗原、ワクチンおよび医薬品を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスの培養や検査の際には、動物から採取抽出された成分、即ち動物由来成分が多用されている。例えば、疾病用の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造用材料の一つとして、動物由来の初代培養細胞や株化細胞が必要であり、さらに、当該細胞を調製するために、血清を添加した培養液が必須とされ、さらに、この培養液にはTryptose Phosphate Brothなどの添加も行われていた。
しかしながら、これら動物の組織細胞、血清、Tryptose Phosphate Broth等の動物由来成分には、既知あるいは未知の病原体の迷入の危険や抗体の存在がある。例えば、腎臓由来細胞では、ペスチウイルスやマイコプラズマ等の迷入が考えられる（非特許文献１参照）。
そのため、ウイルスの培養や検査の際、診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤を製造する際には、病原体の迷入の危険を回避すべく使用前に十分な検査が必要とされている。
【０００３】
また、培養液に使用する血清、Tryptose Phosphate Broth等の動物由来成分についても、特に牛血清などの反芻動物に由来する動物由来成分については、近年の牛海綿状脳症（ＢＳＥ）問題の影響を受けている。すなわち、牛血清などの反芻動物に由来する動物由来成分をワクチンの製造に使用する場合は、病原体の迷入の危険がなく安全なことが証明されたものを入手する必要があり、多大な労力を強いられている。
従来より、多くの生物学的研究の目的に応じて、牛血清の代わりに種々の増殖因子などが添加された無血清培養液が市販されている。このような無血清培養液であれば、牛血清に由来する病原体の迷入の危険は回避されるが、販売価格が高いため、大量のワクチンや診断用抗原の製造には実用的ではない。
【０００４】
一方、豚腎尿細管上皮由来株化細胞系等の培養細胞は、既知の無血清培養液で増殖可能であるが、上述のように、このような既知の無血清培養液には、Tryptose Phosphate Brothなどの動物由来成分が添加されているため、病原体の迷入の危険性は完全に否定できない。
【０００５】
牛腎上皮由来株化細胞（ＭＤＢＫ細胞）は、非特許文献２に記載されているように、プラスチック培養瓶において細胞単層を形成し、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の迷入が否定されているという特徴を有する既知の細胞である。ＭＤＢＫ細胞は、扱いやすい確立された培養細胞であり、また、多くのウイルスに感受性を示すため、従来、疾病の診断や、ワクチンをはじめとする生物学的製剤の製造に利用されてきた。
このＭＤＢＫ細胞を親細胞として継代培養する場合、従来は基礎培養液としてのEagle MEMに、Tryptose Phosphate Brothを加え、さらに牛血清を添加したものを使用していたため、レトロウイルス、ペスチウイルス、マイコプラズマ等の病原体の迷入の危険性が完全に否定できないという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】
原澤亮、水澤博、竹内昌男：「動物細胞培養における“コンタミ”の簡易検出」、蛋白質・核酸・酵素、Vol.40 No.15、p2361-2368（1995）
【非特許文献２】
Madin, S.H. and Darby, N.B. 1958. Established kidney cell lines of normal adult bovine. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 98, p574
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血清やTryptose Phosphate Brothをはじめとする動物由来補助成分等の動物由来成分が添加されておらず、かつ、廉価な動物由来成分無添加培養液を提供し、当該動物由来成分無添加培養液を用いて哺乳類由来細胞を分化させ、病原体の迷入がない細胞系を作出する方法を確立することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべく検討を重ねた。すなわち、既知の無血清培養液成分から、病原体の迷入の原因となりうる血清やTryptose Phosphate Broth等の動物由来成分を削除するとともに、それらの削除によって生じる培養液および培養細胞に対する悪影響を解決するための緩衝剤の添加を検討した。その結果、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-PeptoneおよびＢＥＳとを、それぞれ所定量含有する動物由来成分無添加培養液は、病原体の迷入の危険がなく、従来動物由来成分を要求するとされていた細胞系の作出に利用できることを見出した。
また、この動物由来成分無添加培養液により、病原体の迷入がない細胞系を作出できることを見出した。
更に、この病原体の迷入がない細胞系は、上記の動物由来成分が削除された動物由来成分無添加培養液で生育可能なので、ウイルスの培養や検査のほか、疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に用いることができることを見出した。
【０００９】
また、本発明者らは、ＭＤＢＫ細胞を材料として、上述の動物由来成分無添加培養液で増殖可能な細胞の作出に成功した。作出されたＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同様の性質を示すことはもちろん、ＢＶＤＶの他、レトロウイルス、ペスチウイルス、マイコプラズマ等の各種病原体の迷入が否定されているので、ウイルスの培養や検査のほか、疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に好適に用いることができることをも見出した。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
請求項１記載の本発明は、基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌとからなることを特徴とする、牛腎上皮細胞用の動物由来成分無添加培養液である。
請求項２記載の本発明は、牛腎上皮細胞を、基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis（2-hydroxyetyl）-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌと、動物由来成分とを含有し、かつ、血清を含有しない無血清培養液に順化させた後、さらに無血清培養液中の動物由来成分の含有量を順次下げて培養を行い、最終的に請求項１に記載の培養液を用いて培養することを特徴とする、請求項１に記載の培養液で増殖可能であり、かつ、病原体の迷入がない細胞系の作出方法である。
【００１１】
請求項３記載の本発明は、請求項２に記載の作出方法により得られた細胞系を用いて、
疾病の診断用抗原、ワクチン又は医薬品を製造する方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
請求項１に係る本発明の牛腎上皮細胞用の動物由来成分無添加培養液は、基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌとからなることを特徴とするものである。
【００１３】
すなわちまず、請求項１に係る本発明の培養液は、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-PeptoneおよびＢＥＳとを、それぞれ所定量含有することを第一の特徴とするものである。
ここで、基礎培養液としてのEagle MEMとは、Eagle MEMおよびその改変培養液のことを言う。改変培養液としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／ハムのＦ−１２培地、ハムのＦ−１２培地、ハムのＦ−１０培地などを挙げることができる。Eagle MEMは、所定の成分を所定の分量混合して作製することもできるが、各種市販品（例えば、日水製薬製）を用いることが簡便である。
【００１４】
請求項１に係る本発明の培養液においては、このようなEagle MEMを含有することが必要である。Eagle MEMの含有量については、哺乳類由来細胞の生育状況に合わせて適宜調整することができるが、通常、５．００〜１５．００ｇ／Ｌ、好ましくは７．００〜１３．００ｇ／Ｌ、より好ましくは９．００〜１０．００ｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００１５】
また、請求項１に係る本発明の培養液においては、Bacto-Peptoneを３．００〜１２．００ｇ／Ｌ、好ましくは５．００〜１０．００ｇ／Ｌ含有してなることが必要である。３．００ｇ／Ｌ未満または１２．００ｇ／Ｌを超える場合には、哺乳類由来細胞が生育できず、本発明の目的を達成できないので好ましくない。
【００１６】
さらに、請求項１に係る本発明の培養液においては、このようなＢＥＳ[N,N-Bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoethanesulfonic acid]を１．００〜５．００ｇ／Ｌ、好ましくは１．５０〜４．００ｇ／Ｌ、特に好ましくは２．００〜３．００ｇ／Ｌ含有してなることが必要である。１．００ｇ／Ｌ未満または５．００ｇ／Ｌを超える場合には、哺乳類由来細胞が生育できず、本発明の目的を達成できないので好ましくない。
【００１７】
請求項１に係る本発明の培養液は、動物由来成分を含有しないことを第二の特徴とするものである。
ここで、動物由来成分とは、動物から採取・抽出された成分・抽出液のことであり、例えば、牛血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）などの血清、血漿、組織抽出液、ウシ羊水、ウシ胎児抽出液（Bovine Embryo Extract：ＢＥＥ）、ニワトリ胎児抽出液（Chicken Embryo Extract：ＣＥＥ）等の羊水、腹水等の生物学的溶液、Tryptose Phosphate Broth（例えば、DIFCO社製）、乳糖などがある。生物学的溶液の場合、本発明においては、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）問題への懸念を払拭するという本発明の目的を達成できる点で、反芻動物由来のものを含有しないことが好ましい。
請求項１に係る本発明の培養液は、上述のようなEagle MEM、Bacto-PeptoneおよびＢＥＳをそれぞれ所定量含有し、かつ、動物由来成分を含有しないものであれば、他の成分、例えば通常培養液に添加する成分である抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン等）、抗真菌剤（アンホテリシンＢ等）等を含有するものであっても良い。
【００１８】
請求項１に係る本発明の培養液は、牛腎上皮細胞の培養に用いられる。
このような牛腎上皮細胞としては、実施例で用いたＭＤＢＫ細胞などの確立された株化細胞を挙げることができる。
【００１９】
これらの株化細胞のうちＭＤＢＫ細胞は、米国のAmerican Type Culture Collection にATCC No. CCL-22として保管されており、申請により入手できる。
【００２０】
請求項１に係る本発明の培養液は、動物由来成分を含まないため病原体の迷入の危険がなく、従って病原体の迷入がない細胞系の作出に用いることができる。このような病原体の迷入がない細胞系の作出方法を提供するのが、請求項２に係る本発明である。
即ち、請求項２に係る本発明は、牛腎上皮細胞を、基礎培養液としてのEagle’s Minimum Essential Medium［Eagle MEM］と、Bacto-Peptone  ３．００〜１２．００ｇ／ＬおよびN,N-Bis（2-hydroxyetyl）-2-aminoethanesulfonic acid［ＢＥＳ］１．００〜５．００ｇ／Ｌと、動物由来成分とを含有し、かつ、血清を含有しない無血清培養液に順化させた後、さらに無血清培養液中の動物由来成分の含有量を順次下げて培養を行い、最終的に請求項１に記載の培養液を用いて培養することを特徴とする、請求項１に記載の培養液で増殖可能であり、かつ、病原体の迷入がない細胞系の作出方法を提供するものである。
【００２１】
請求項２に係る本発明の作出方法は、牛腎上皮細胞を、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-Peptoneと、ＢＥＳと、動物由来成分とを、それぞれ所定量含有するが血清を含有しない無血清培養液に順化させた後、さらに無血清培養液中の動物由来成分の含有量を順次下げて培養を行い、最終的に請求項１に記載の培養液を用いて培養することを特徴とする。
【００２２】
請求項２に係る本発明の作出方法においてはまず、牛腎上皮細胞を、所定の無血清培養液に順化させる。ここで、無血清培養液とは、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-Peptoneと、ＢＥＳと、動物由来成分とを、それぞれ所定量含有するが血清を含有しない培養液を言う。
即ち、無血清培養液は、請求項１に係る本発明の動物由来成分無添加培養液と比較して、動物由来成分を含有する点で相違する。動物由来成分の含有量は、牛腎上皮細胞の生育状況に合わせて適宜調製できる。例えば、Tryptose Phosphate Brothの場合、１．００〜５．００ｇ／Ｌ、好ましくは２．００〜４．００ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５０〜３．５０ｇ／Ｌとすることができる。
【００２３】
尚、動物由来成分の定義や、Eagle MEM、Bacto-Peptone、およびＢＥＳの含有量は、請求項１に係る本発明の説明において詳述した通りである。
無血清培養液は、血清を含有しないものであるから、動物由来成分のうち牛血清（ＦＢＳ）などの血清は含有しない。尚、無血清培養液は、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-Peptoneと、ＢＥＳと、動物由来成分とを、それぞれ所定量含有するが血清を含有しないものであれば、先述したような抗生物質、抗真菌剤等の他の成分を含有するものであっても良い。
このような無血清培養液としては、材料となる牛腎上皮細胞に合うような組成のものを適宜調製して用いることができるし、市販品を用いることもできるが、動物由来成分を含有する他は後で用いる請求項１に記載の培養液と同様とすることが、細胞増殖性および経済性の観点から好ましい。
【００２４】
請求項２に係る本発明においては、牛腎上皮細胞を、上述のような無血清培養液に順化させる。順化させるとは、上述のような無血清培養液を用いて、細胞増殖性の程度をみて無血清培養液の交換および継代を維持し、完全無血清培養液に順化させる（血清を完全に要求しなくなる）ことを言う。牛腎上皮細胞の定義については、請求項１に係る本発明の説明において詳述した通りである。
無血清培養液の順化は、細胞増殖性の程度をみながら行えば良く、材料となる哺乳類由来細胞や無血清培養液の組成によって異なるので、一概に定義することは困難であるが、例えばＭＤＢＫ細胞を順化させる場合、通常、３〜１０日間隔、好ましくは４〜７日間隔で無血清培養液を新鮮な無血清培養液に交換する。また、細胞の継代間隔についても同様に定義することは困難であるが、例えばＭＤＢＫ細胞の場合、１８〜３０日、好ましくは、２１〜２８日である。
請求項２に係る本発明の作出方法においては、さらに無血清培養液中の動物由来成分の含有量を順次下げて培養を行い、最終的に請求項１に記載の培養液を用いて培養することを特徴とする。
即ち、前記無血清培養液中の動物由来成分の含有量を下げた培養液に順次交換して継代を維持し、最終的に動物由来成分を全く含まない請求項１に記載の培養液で培養することである。動物由来成分については、請求項１に係る本発明の説明において詳述した通りである。
例えば、ＭＤＢＫ細胞を用いる場合、動物由来成分の含有量を１／２量程度ずつ下げた培養液を、４〜７日サイクルで３〜４回交換し、最終的に０とする。
【００２５】
請求項２に係る本発明の作出方法によれば、動物由来成分無添加培養液で生育可能な、病原体の迷入がない細胞系を作出することが可能である。
例えば、牛腎上皮細胞としてＭＤＢＫ細胞を用いた場合は、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞を作出することが可能である。ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、理化学研究所セルバンクに寄託されている。ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、アルカリ性フォスファターゼ活性、上皮系細胞骨格であるサイトケラチンおよびγ−グルタミルトランスペプチターゼ活性についてＭＤＢＫ細胞と同様の活性を有し、レトロウイルス、ペスチウイルス、マイコプラズマ等病原体の迷入がなく、しかも、ウイルスに対する感受性が親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同様である。
【００２６】
請求項２に記載の作出方法により得られた細胞系は、病原体の迷入がなく、しかも請求項１に記載の動物由来成分無添加培養液で生育できるため、ウイルスの培養や検査に用いることができる。特に、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、例えば、ウイルス検査法や抗体検査法の際に利用すると、請求項１に記載の動物由来成分無添加培養液を用いて実施できるため、通常高頻度に検出されるＢＶＤＶの抗体やその他の牛に感染する各種ウイルスに対する抗体を事前に検査する必要がないといったメリットを有するので、好ましい。
【００２７】
また、請求項２に記載の作出方法により得られた細胞系は、病原体の迷入がなく、しかも請求項１に記載の動物由来成分無添加培養液で生育できるため、疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に用いることができる。特に、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、ウシおよびブタの疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に用いることができる。このような製造方法を提供するのが請求項３に係る本発明である。
【００２８】
すなわち、請求項３記載の本発明は、請求項２に記載の作出方法により得られた細胞系を用いて、疾病の診断用抗原、ワクチン又は医薬品を製造する方法である。
【００２９】
請求項３記載の本発明の方法により製造される診断用抗原、ワクチンおよび医薬品の対象となる疾病としては、ヒトをはじめとする哺乳類の疾病全般が挙げられる。
請求項３記載の本発明の方法において、細胞系としてＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞を用いた場合に製造される診断用抗原、ワクチンおよび医薬品の対象となる疾病としては、牛ウイルス性下痢・粘膜病、牛伝染性鼻気管炎、牛パラインフルエンザ、牛ＲＳウイルス感染症等が挙げられ、ブタの疾病としては、オーエスキー病等が挙げられる。
また、請求項３記載の本発明の方法により製造される医薬品としては、通常のいわゆる製剤化してなる医薬品の他、組換え体等を用いた生理活性物質（インターフェロン等）も含む。
このような診断用抗原、ワクチンおよび医薬品の製造には、公知の方法を適用すれば良く、例えばローラーボトルを用いた細胞培養法や浮遊細胞培養法等を用いてウイルスを増殖させ、ウイルス原液を製造する方法を適用することが可能である。
【００３０】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１（動物由来成分無添加培養液への順化によるＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の作出）
親細胞であるＭＤＢＫ細胞（ATCC No. CCL-22）の継代培養にあたり、培養液を下記の組成からなる無血清培養液に変更したところ、細胞数は減少し、細胞増殖が著しく低下した。
【００３１】
0003994159.tif 000002
【００３２】
そこで、約３０代継代目までは、その増殖が不安定であることを考慮して、４〜７日間隔で無血清培養液を新鮮な無血清培養液に交換し、細胞の継代間隔は、その増殖性の相違によって２１〜２８日とした。
その結果、良好な増殖を示す細胞が得られ、さらに約５０代継代を重ねたのち、安定した増殖を示すようになり、約１１０代継代を経過したのちも安定かつ良好な増殖性を示し、完全無血清培養液に順化した細胞を得た。
【００３３】
次に、上記の組成からなる無血清培養液において、Tryptose Phosphate Brothの添加量を順次減量した他は同様にして調製した培養液を用いて、同様に継代培養を行った。その結果、Tryptose Phosphate Brothの添加量を約０．１８ｇ／Ｌまで減少させても、ＭＤＢＫ細胞の増殖性を維持することができたが、Tryptose Phosphate Brothを全く添加しない場合は、細胞の増殖は甚だ減弱した。
【００３４】
そこで、上記の組成からなる無血清培養液において、Tryptose Phosphate Brothを段階的に減少させ、約１２０代継代目からは下記の組成からなる完全動物由来成分無添加培養液に移行して継代培養を続けた。継代４日目に培養液を新鮮な培養液に交換し、細胞の継代間隔は、その増殖性の相違をみて７〜１０日とした。
【００３５】
0003994159.tif 000003
【００３６】
その結果、安定した増殖を示す細胞が得られた。さらに、約１５代継代を経過したものも安定かつ良好な増殖性を示していた。そこで、この細胞を動物由来成分無添加培養液順化細胞株として、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞と命名した。
【００３７】
実施例２（ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の増殖性および増殖形態）
実施例１で得たＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の前記動物由来成分無添加培養液における増殖性を調べた。すなわち、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞のまきこみ数を約２００万個／２５ｃｍ２ボトルとして上記の組成からなる完全動物由来成分無添加培養液で７日間培養した。その結果得られた動物由来成分無添加培養液におけるＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の増殖曲線を、図１に示す。尚、図１中の▲は、培養液を７日間通して用いた場合の結果を、●は培養液を４日目に更新した場合の結果を示す。
図１から明らかなとおり、培養液を７日間通して用いた場合、３日後には細胞数は約６００万個／２５ｃｍ２ボトルに増加したが、細胞の増殖は５日目から減少する傾向にあった。しかしながら、一方、培養液を３〜４日後に交換した場合、細胞の増殖は経時的に増加し、７日後には約８００万個／２５ｃｍ２ボトルに達した。
この結果から、完全動物由来成分無添加培養液を用いてＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞を培養するにあたり、培養液を３〜４日後に更新することにより、細胞の増殖性が良好となることが明らかとなった。
さらに、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の増殖形態の経時的な変化を観察したところ、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は約４日目に単層を形成した。約５〜６日後に細胞室内に小空胞が観察されたが、４日目の培養液の更新により、小空胞の出現は消失した。
【００３８】
実施例３（ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の性質）
（１）ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の染色体数
ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の染色体数の分布率を調べた。結果を図２に示す。
図２から明らかなとおり、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の染色体数は、４３（２ｎ）を中心に分布していることが解明された。牛の正常染色体数は６０（２ｎ）、親細胞であるＭＤＢＫ細胞のそれは５１（２ｎ）であることから、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞においては、多数の染色体の脱落が生じているものと考えられる。
【００３９】
（２）ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の酵素活性等
また、組織化学的検査によって、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の酵素活性等について調べた。
【００４０】
▲１▼  アルカリ性フォスファターゼ活性（Burston法）
培養細胞をアセトン固定した後に、Vectore Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I（VECTORE LABORATORIES）を用いて検出した。
その結果、アルカリ性フォスファターゼ活性が検出され、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞と同様であった。
【００４１】
▲２▼  上皮系細胞骨格であるサイトケラチン
培養細胞をアセトン固定した後に、マウスモノクローナル抗体：Mab to Cytokeratin 5/8 Pan Epitherial Cytokeratin（Progen）を一次抗体とし、ヒストファインSAB-PO（M）キット（ニチレイ）を用いたSAB法で検出した。
その結果、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞にはサイトケラチンが検出され、親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同様であった。
【００４２】
▲３▼  γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）活性
培養細胞をアセトン固定した後に、N-γ-Glutamyl-α-NaphtylamideとFastgarnet GBC塩を含有する基質液に浸漬し、０．１Ｍ  ＣｕＳＯ４液で処理して検出した。
その結果、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞には、γ−グルタミルトランスペプチターゼ活性が検出されず、親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同様であった。
【００４３】
（３）ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の病原体による汚染の有無
さらに、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の病原体の汚染について調べた。
▲１▼  ペスチウイルスの汚染
ペスチウイルスは、牛由来培養細胞に高頻度に迷入している。そこで、ペスチウイルスの遺伝子を増幅する逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法およびウイルス非構造蛋白質ＮＳ３を検出する間接蛍光抗体法を行ってペスチウイルスの汚染を調べた。
【００４４】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法は、Vileekら（Vileek，S.，Herring，A．J.，Herring，J．A.，Nettleton，P．F.，Lowings，J．P.，Paton，D．J.，1994．Pestiviruses isolated from pigs，cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis．Arch．Virol．136，309-323）のプライマーを用い、寶酒造のRNA PCR Kit（AMV）Ver．2.1を使用して実施した。
ウイルス非構造蛋白質ＮＳ３を検出する間接蛍光抗体法は、アセトン固定した培養細胞に、ペスチウイルスのＮＳ３に対するモノクローナル抗体JCU/BVD/CF10（JCU TropBio）を一次抗体として反応させ、ついで、FITC標識抗マウスIgG抗体を二次抗体として反応させ、蛍光顕微鏡で観察し、特異蛍光を示す細胞をペスチウイルス感染細胞と認定した。
その結果、ペスチウイルスの汚染は否定された。
【００４５】
▲２▼  マイコプラズマの汚染
Kojimaらの報告（Akemi Kojima，Toshio Takahashi，Mayumi Kijima，Yasuaki Ogikubo，Makoto Nishimura，Shinzo Nishimura，Ryo Harasawa and Yutaka Tamura，1997，Detection of Mycoplasma in Avian Live Virus Vaccines by Polymerase Chain Reaction．Biologicals 25，365-371）に従い、マイコプラズマの遺伝子を増幅するポリメラーゼ連鎖反応法を行った。尚、ポリメラーゼ連鎖反応法には、タカラ酒造のＤＮＡポリメラーゼEx Taqを用いた。
その結果マイコプラズマの汚染は否定された。
【００４６】
▲３▼  レトロウイルスの汚染
レトロウイルスは、培養細胞に高頻度に迷入している。そこで、実施例１と同様に、完全動物由来成分無添加培養液を用いてＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞を培養し、培養２日目および９日目の培養細胞上清を高速遠心法により濃縮した試料について、「逆転写酵素活性−非放射性」（ロシュ）のキットを用いて、レトロウイルスが有する逆転写酵素活性について調べた。
また、レトロウイルスが迷入している豚由来ＰＫ−１５細胞を陽性対照試料、逆転写酵素０．０６２５ｎｇを陽性対照、逆転写酵素０ｇを陰性対照として、同様に逆転写酵素活性の有無について調べた。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の試料に、いずれも逆転写酵素活性が認められない。このことから、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞には、レトロウイルスの迷入がないことが明らかである。
【００４７】
実施例４（ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞におけるＢＶＤＶの増殖性）
ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞における牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＮｏｓｅ株の増殖性を調べた。
すなわち、培養フラスコに培養したＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞に、ＢＶＤＶのＮｏｓｅ株をＭＯＩ（multiplicity of infection）＝０．０１で接種した。ウイルスを細胞に１時間吸着させた後に、ウイルス液を取り除き、新鮮な動物由来成分無添加培養液を添加して３７℃に静置した。ウイルスを接種してから経時的に培養上清液および細胞を改修し、それらに含まれるウイルス量をウシ精巣細胞を用いて測定した。尚、ウイルス量の測定には、一般的な１０倍階段希釈法を用い、細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す細胞をＢＶＤＶのＮｏｓｅ株が感染したとみなして、Kerburの算出法に従ってウイルス量を算出した。
【００４８】
その結果、ウイルスを接種した後５〜７日で、培養上清に放出される感染ウイルスが１０３〜１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、培養細胞内に存在する感染ウイルスが１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌのレベルで増殖することが解明された。なお、培養液に牛血清を５％の割合で添加すると、ウイルスを接種した後５日で、培養上清に放出される感染ウイルスは、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌレベルに達することが明らかとなった。
【００４９】
実施例５（ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞におけるＢＶＤＶの感受性）
ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞における各種ウイルスの感受性を調べた。即ち、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞とＭＤＢＫ細胞でウイルス液の感染価をそれぞれ測定し、その差を見ることによりウイルスの細胞への感染性の程度を評価した。
【００５０】
▲１▼ＢＶＤＶの感受性
各ＢＶＤＶウイルス液を１０倍階段希釈し、各希釈培養液に浮遊させたＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞およびＭＤＢＫ細胞のそれぞれを培養プレートに同時に入れて、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で７日間静置培養した。細胞病原性ＢＶＤＶ（Ｎｏｓｅ株、Ｏｓｌｏｓｓ株、ＫＺ９１株、Ｓｉｎｇｅｒ株および５９１２株）については、ＣＰＥをＢＶＤＶ陽性の指標とし、非細胞病原性ＢＶＤＶ（Ｎｏ．１２−４２株、関東東山株、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−１株、Ｉｎｄｉａｎａ−４６株およびＧＢＫ株）については、抗ＮＳ３モノクローナル抗体を用いたPeroxidase Linked Assay法を用い、Kaerberの算出法に従ってウイルス感染価を評価した。
結果を図４に示す。尚、図４中、黒色部はＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞における感受性を、白色部はＭＤＢＫ細胞における感受性を示す。
【００５１】
図４から明らかなとおり、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、細胞病原性株および非細胞病原性株のいずれにおいても、ウイルスに対する感受性が高く、親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同等の感受性を示すことが確認された。
【００５２】
▲２▼ウシ伝染性鼻気管炎、ウシパラインフルエンザ、ウシＲＳウイルス感染症およびオーエスキー病のワクチン株または病原性株の感受性
ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）、ウシパラインフルエンザウイルス（ＰＩ３Ｖ）、ウシＲＳウイルス感染症ウイルス（ＢＲＳＶ）およびオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）の各ウイルス液を１０倍階段希釈し、各希釈培養液に浮遊させたＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞およびＭＤＢＫ細胞のそれぞれを同時に培養プレートもしくは培養チューブに同時に入れて、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で７日間静置培養した。なお、ウシＲＳウイルス感染症ウイルス（ＢＲＳＶ）については、３４℃で１４日間回転培養した。培養後にＣＰＥをウイルス陽性の指標とし、Kaerberの算出法に従ってウイルス感染価を評価した。
結果を図５に示す。尚、図５中、黒色部はＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞における感受性を、白色部はＭＤＢＫ細胞における感受性を示す。
【００５３】
図５から明らかな通り、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、いずれのウイルスに対しても親細胞であるＭＤＢＫ細胞と同等の感受性を示すことが確認された。
このことから、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞がワクチンおよび診断抗原製造用の細胞として有用であること考えられる。さらに、当該細胞に感受性のあるウイルスによる疾病のワクチンの製造用細胞としても有用と考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
上記の課題を解決すべく検討を重ねた。すなわち、既知の無血清培養液成分から、病原体の迷入の原因となりうる血清やTryptose Phosphate Broth等の動物由来成分を削除し、緩衝剤の添加を検討した。その結果、基礎培養液としてのEagle MEMと、Bacto-PeptoneおよびＢＥＳとを、それぞれ所定量含有する動物由来成分無添加培養液は、病原体の迷入の危険がなく、従来動物由来成分を要求するとされていた細胞系の作出に利用できることを見出した。
また、この動物由来成分無添加培養液により、病原体の迷入がない細胞系を作出できることを見出した。
更に、この病原体の迷入がない細胞系は、上記の動物由来成分が削除された動物由来成分無添加培養液で生育可能なので、疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に用いることができることを見出した。
本発明の動物由来成分無添加培養液は、病原体の迷入の原因となりうる動物由来成分を含まない上に、従来動物由来成分を要求するとされていた細胞系の作出に利用できる。
また、本発明の動物由来成分無添加培養液によれば、哺乳類由来細胞から既知の病原体の迷入の恐れのない清浄な細胞系を作出することが可能となり、その利用性を広げることができる。
また、本発明の作出方法によれば、病原体の迷入がない細胞系を効率よく得ることができる。特に、反芻動物由来の細胞を対象とした場合には、近年のＢＳＥ問題への懸念も回避できる。
更に、本発明の作出方法により得られる病原体の迷入がない細胞系は、上記の動物由来成分が削除された動物由来成分無添加培養液で生育可能なので、疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品等の生物学的製剤の製造に用いることにより、ウイルス検査は勿論のこと、抗体検査の技術的改善、生物学的製剤の製造の均一化、安全性の確保、省力化、大量生産による低コスト化等に飛躍的な技術を提供することができる。
【００５５】
特に、本発明の作出方法により得られるＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞は、レトロウイルス、ペスチウイルス、マイコプラズマ等の病原体の迷入がなく、しかも、上記の動物由来成分が削除された動物由来成分無添加培養液で生育可能である。従って、例えば、ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞を用いたウイルス検査法や抗体検査法は、動物由来成分無添加培養液を用いて実施できるため、高頻度に検出される牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）に対する抗体やその他の牛に感染する各種ウイルスに対する抗体を事前に検査する必要がないといったメリットを有する。
また、牛ウイルス性下痢・粘膜病、牛伝染性鼻気管炎、牛パラインフルエンザ、牛ＲＳウイルス感染症等のウシの疾病や、オーエスキー病等のウシ以外の動物の疾病の診断用抗原、ワクチン、医薬品など生物学的製剤の製造に使用することにより、製品の均一化、安全性の確保、省力化、大量生産による製造コストの低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  動物由来成分無添加培養液におけるＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の増殖曲線である。
【符号の説明】
図１中の▲は、培養液を７日間通して用いた場合の結果を、●は培養液を４日目に更新した場合の結果を示す。
【図２】  ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の染色体数の分布率を示す図である。
【図３】  ＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞の培養上清の逆転写酵素活性を示す図である。
【図４】  ＢＶＤＶの感受性を示す図である。
【図５】  ＢＶＤＶ以外の各種ウイルスの感受性を示す図である。
【符号の説明】
図４および図５中、黒色部はＭＤＢＫ−ＮＳＴ細胞における感受性を、白色部はＭＤＢＫ細胞における感受性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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