(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは天然又は合成ヌクレオチドを示し、
Ｂは２個の結合可能中心を有する架橋メンバーを示し、
Ｃは式
【化１】
0003887786.tif 000021
のクマリン残基を示し、
ここで
Ｒ1は水素又はシアノを示し、
Ｒ2はスルホベンゾチアゾリルを示し、
Ｒ3はＨを示すか、又はＣ1-4−アルキルを示し、ここでＣ1-4−アルキルは非置換であるか又はヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4−アルコキシカルボニルもしくはスルホにより置換されており、あるいは非置換であるか又は塩素、臭素、Ｃ1-4−アルキルもしくはスルホにより１回もしくは１回より多く置換されているフェニルスルホニルを示し、
Ｒ4はＢへの結合を示す］
の蛍光ヌクレオチド。
【請求項２】
ＡがＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ、及び対応するデオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドよりなる群から選ばれる天然又は合成ヌクレオチドを示し、
Ｂが鎖長が最高５０原子であり、該原子がＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ又はＳよりなる群から選ばれる、直鎖状もしくは分枝鎖状の２官能基性架橋メンバーを示し、
Ｒ2がスルホベンゾチアゾリルを示し、
Ｒ3は水素、メチル、エチル、−（ＣＨ2）1-4−ＯＨ、−（ＣＨ2）1-4−ＮＨ2、−（ＣＨ2）1-4−ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ2）1-4−ＳＯ3Ｈを示し、
Ｒ4は結合を示す、
請求項１に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項３】
ＢがＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ及びＳよりなる群から選ばれる２〜２０個の原子の鎖長を有する直鎖状もしくは分枝鎖状の２官能性架橋メンバーを示し、
Ｒ2がスルホベンゾチアゾリルを示す、
請求項２に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項４】
Ｂがペプチド、炭化水素、ポリアルコール、ポリアルコキシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミン及び炭水化物２官能性架橋メンバーよりなる群から選ばれる２官能性架橋メンバーを示す、
請求項３に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項５】
Ｂがアルキレン、アルケニレン、アルキニレン及びアリーレンよりなる群から選ばれる、
請求項３に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項６】
Ｂが−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2ＮＨ−、−グリシル−グリシル−グリシル−、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−、スペルミン、スペルミジン、−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3−よりなる群から選ばれる２官能性架橋メンバーを示す、
請求項３に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項７】
式
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
ＡはＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ  ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ、及び対応するデオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドよりなる群から選ばれる天然又は合成ヌクレオチドを示し、
Ｂはアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2ＮＨ−、−グリシル−グリシル−グリシル−、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−、スペルミン、スペルミジン、−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3−よりなる群から選ばれる２官能基性架橋メンバーを示し、
Ｃは式
【化２】
0003887786.tif 000022
のクマリン残基であり、
ここで
Ｒ1は水素またはシアノを示し、
Ｒ2はスルホベンゾチアゾリルを示し、
Ｒ3はＨを示すか、又はＣ1-4−アルキルを示し、ここでＣ1-4−アルキルは非置換であるか又はヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4−アルコキシカルボニルもしくはスルホにより置換されており、あるいは非置換であるか又は塩素、臭素、Ｃ1-4−アルキル又はスルホにより１回もしくは１回より多く置換されているフェニルスルホニルを示す］
の蛍光ヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載の蛍光ヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はターミナルトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素を用いて、核酸中に酵素的に導入することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の蛍光ヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はターミナルトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素を用いて、核酸中に酵素的に導入することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の蛍光ヌクレオチドを含有する遺伝子プローブ。
【請求項１１】
請求項７に記載の蛍光ヌクレオチドを含有する核酸の検出試薬。
【請求項１２】
請求項１に記載の蛍光ヌクレオチドを含有する遺伝子プローブ。
【請求項１３】
請求項１に記載の少なくとも１種のヌクレオチドを含有する核酸の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は蛍光クマリン残基を有する置換基としてのヌクレオチドの製造、これらのヌクレオチドの核酸への酵素的導入、及び相補的なクマリン−標識核酸（遺伝子プローブ）とのハイブリッド形成(hybridization)による特定された配列の核酸の検出に関する。
【０００２】
相同核酸配列の検出のために最も多く用いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成である。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識し、ハイブリッド形成条件下で調べるべき核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させる。プローブとして用いられた核酸と検出されるべき核酸の間に相同が存在する場合、それぞれの相補的核酸１本鎖がハイブリッド形成し、ハイブリッド２本鎖を形成する。その後ハイブリッドが検出される。
【０００３】
過去において、プローブとして用いられた核酸はほとんど、放射性誘導リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩の挿入により標識され、ハイブリッドはオートラジオグラフィーにより検出された。
【０００４】
遺伝子プローブを標識するこの方法は特に感度の高い方法であることが証明されたが、放射性材料の取り扱いの故にやっかいでもある。従って実験室の安全性及び放射性化合物の廃棄に特別の要求がなされる。
【０００５】
さらにその半減期のために、放射性材料は限られた期間しか用いることができない。
【０００６】
この理由で、いくつかの非−放射性標識法が過去においてすでに開発された。これらの場合、遺伝子プローブはビオチン分子（欧州特許第０  ０６３  ８７９号明細書）又はジゴキシゲニン分子（欧州特許第０  ３２４  ４７４  Ａ１号明細書）を用いて標識され、例えばこれらの検出分子の核酸プローブへの挿入は化学的、光化学的又は酵素的経路で行われる。核酸プローブの誘導の後、検出されるべき核酸配列とのハイブリッド形成を行う。ハイブリッドはビオチンへの（ストレプト）アビジン−マーカー酵素複合体の結合、又はジゴキシゲニンへの抗−ジゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体の結合により検出される。
【０００７】
これらの方法の欠点は、核酸プローブに結合したマーカー分子を直接検出できず、従って定量できない事実に伴うものである。代わりにこれらのビオチン又はジゴキシゲニンなどのマーカー分子は、マーカー分子と特異的に相互作用する分子と結合させることにより検出しなければならない。例えばビオチンの検出の場合のストレプタビジンなどのこれらの分子はそれとして直接検出できず、代わりに適した方法でマーカー物質を備えていなければならない。これは、例えば蛍光染料であることができ、その濃度は蛍光測定により決定することができる。しかしこれらのマーカー物質は、加えられた基質を定量的に評価できる形態に変換する酵素であることが非常に多い。そのような基質は例えば染料、蛍光染料又は化学発光化合物の前駆体であることができる。
【０００８】
このことから、標識遺伝子プローブを用いてハイブリッドを検出するためにさらに処置段階が必要であることになる。追加の処置段階はそれぞれ誤差又は不正確さの危険を伴う。例えばビオチン又はジゴキシゲニンへの結合に必要な化合物は、ストレプタビジン又は抗体などの生物分子であり、その製造は大変である。その後これらの生物分子をさらに別のマーカー酵素とカップリングさせなければならない。免疫反応及び酵素反応には多くの処置段階が含まれ、ハイブリッド形成反応の評価を非常に複雑なものとする。
【０００９】
この理由で、容易に入手でき、核酸に容易に結合することができ、直接的な方法で検出することができる、核酸プローブのハイブリッド形成のための物質がまだ必要とされている。
【００１０】
本発明の目的は、これらの必要条件を満たす核酸のための標識物質を開発することであった。
【００１１】
式
Ａ−Ｂ−Ｃ
（Ｉ）
［式中、
Ａは天然又は合成ヌクレオチド又はその誘導体を示し、
Ｂは２個の結合可能中心を有する架橋メンバーを示し、
Ｃは式
【００１２】
【化２】
0003887786.tif 000002
【００１３】
のクマリン残基を示し、
ここで
Ｒ1は水素又はシアノであり、
Ｒ2は２、４又は５位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここで両残基はＳＯ3Ｈ基を有し、さらに置換されていることができ、
Ｒ3はＨ、Ｃ1-4−アルキル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル−Ｃ1-4−アルキル又はフェニルスルホニルであり、ここでＣ1-4−アルキルは非置換であるか、又はヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4−アルコキシカルボニル又はスルホにより置換されていることができ、フェニルスルホニルは非置換であるか、又は塩素、臭素、Ｃ1-4−アルキル又はスルホにより１回又は１回より多く置換されていることができ、
Ｒ2又はＲ3は第１又は第２アミノ基、ヒドロキシル、カルボキシル又はＣ1-4−アルコキシカルボニルにより置換されていることができるか、又はそれ自身がそのような置換基を示すか、あるいはＲ2又はＲ3は加水分解によりそのような基に変換されることができ、
Ｒ4が置換基であって結合でない場合、ＢへのＣの結合は残基Ｒ2上の別の置換基、例えばアミノ又はカルボキシルにより成される］
の蛍光ヌクレオチドを酵素的経路により核酸に導入することができ、強くて検出の容易な標識を与えることができることを見いだした。
【００１４】
式中、
ＡがＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ  ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰから成る天然又は合成ヌクレオチドの群、及びこれらの系からのデオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチド、ならびにこれらからさらに誘導された誘導体から選ばれる残基を示し、
Ｂが鎖長が最高５０原子であり、該原子がＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ又はＳであることができ、直鎖状もしくは分枝鎖状であることができる２官能基性架橋メンバーであり、Ｃが式
【００１５】
【化３】
0003887786.tif 000003
【００１６】
のクマリン残基を示し、
ここで
Ｒ1が上記の意味を有し、
Ｒ2が２、４又は５位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここでフェニルはスルホ基により置換され、さらにカルボキシル、Ｃ1-4−アルキルカルボニルオキシ、アミノ、−ＮＨ−Ｃ1-4−アルキル、−（ＣＨ2）1-4−ＮＨ2、Ｃ1-4−アルキル、シアノ、フッ素、塩素、臭素又はスルホにより置換され、チアゾリル残基はスルホにより置換され、場合によりさらに置換基を有することができるか、
又はチアゾリル残基は、スルホ基により置換され、さらに置換されていることができるベンゼン環が４及び５位で縮合しており、
Ｒ3が水素、メチル、エチル、−（ＣＨ2）1-4−ＯＨ、−（ＣＨ2）1-4−ＮＨ2、又は−（ＣＨ2）1-4−ＣＯＯＨあるいは（ＣＨ2）1-4−ＳＯ3Ｈ
である式（Ｉ）の化合物が好ましい。
【００１７】
式中、
Ａが上記の意味を有し、
ＢがＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ及びＳから成る群より選ばれる２−２０個の原子を有し、ペプチド誘導体、炭化水素、例えばアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン又はそれらの置換誘導体、ポリアルコール、ポリアルコキシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミン、炭水化物、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2ＮＨ−、−グリシル−グリシル−グリシル−、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−、スペルミン又はスペルミジン、−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3−であることができる２官能基性架橋メンバーであり、
Ｃが上記の式を有するクマリン残基であり、ここで
Ｒ1が上記の意味を有し、
Ｒ2が２位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここでフェニルはスルホによる置換され、さらにパラ−カルボキシル、パラ−アミノ、パラ−ＮＨ−Ｃ1-4−アルキル、パラ−ＣＨ2−ＮＨ2、シアノ、メチル又はエチルにより置換され、チアゾリルはスルホによる置換され、さらにクロロ、シアノ又はカルボキシルにより置換されているか、あるいはチアゾリル残基は、スルホにより置換され、さらに置換基としてカルボキシル又はアミノを含むことができるベンゼン環が４及び５位で縮合しており、
Ｒ3が上記の意味を有する
式（Ｉ）の化合物が特に好ましい。
【００１８】
蛍光染料としてのクマリンの利用は、例えばクマリンが特に高い安定性及び光に対する堅牢性において顕著であるのでフルオレセインの利用と比較して有利である。
【００１９】
本発明の物質は原則的に、クマリン染料成分とヌクレオチド成分を結合させることにより製造される。両成分は反応性中心を含み、それらは化学的に誘導することができ、互いに結合することができる。そのような中心は多くの場合２成分の側鎖に位置する。側鎖中のこれらの反応性中心を介して２成分が結合すると、本発明の化合物が得られ、ヌクレオチド部分及びクマリン部分の結合した側鎖は式（Ｉ）の架橋メンバーＢを形成する。
【００２０】
例えばヒドロキシル、アミノ又はカルボキシル基を反応性及び誘導可能中心として用いることができる。例えばメタンスルホニルクロリド、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いることにより、ヒドロキシル及びカルボキシル基は変換され、反応性エステルを形成し、それはＯ−求核試薬又はＮ−求核試薬に結合してカルボン酸エステル又はカルボキシアミドを形成する。
【００２１】
反応性側鎖により修飾されたヌクレオチドは、文献に記載の方法により得られる；例えばＤ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ  １９９２，１７９を参照。特に詳細に記載されている化合物は、５位にアリルアミン側鎖を有する（Ｐ．Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６３３（１９８１））、又はプロパルギルアミン側鎖を有する（Ｆ．Ｗ．Ｈｏｂｂｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３４２０（１９８９））ウリジン５’−三リン酸塩及びデオキシウリジン５’−三リン酸塩の誘導体、ならびに６及び８位にヘキサメチレンジアミン側鎖を有するアデノシン５−三リン酸誘導体［Ｖ．Ｆｏｌｓｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２，３０９（１９８９）；Ｃ．−Ｙ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７８，８（１９７７）］である。
【００２２】
これらの化合物のいくつかは現在も商業的に入手可能である。クマリン染料も同様に文献から、例えば欧州特許第９０  １２  １３４８号明細書から既知である。側鎖を有し、その上に修飾ヌクレオチドの側鎖に結合することができる反応性中心が位置する製品が得られる。かくしてカルボキシル置換基を有するクマリン染料は、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いて反応性カルボン酸エステルに変換することができ、その後それを上記の修飾ヌクレオチドの１つのアミノ基と反応させ、カルボキシアミドを形成する。
【００２３】
これらの結合反応に伴う問題は、ヌクレオチド及びクマリン成分の溶解度の差である。ヌクレオチドはほとんど排他的に水溶性であるが、クマリンは通常Ｈ2Ｏに不溶性であるか、又はほんのわずかしか溶解しない。クマリンは同様に多くの有機溶媒への溶解度も低い。
【００２４】
それほど溶解度の異なる２つの化合物の場合、上記の結合反応は困難を伴ってしか行うことができない。溶媒混合物（水及び有機溶媒）が必要であり、両反応物を適した量で溶液中に保ち、かくして満足できる収量の反応生成物を得るために、その混合比は正確に決定しなければならない。
【００２５】
本発明の式（Ｉ）のクマリン−置換ヌクレオチドは、少なくとも１個のスルホン酸基を有するクマリン染料を含む。従って、スルホン酸基がクマリン分子を適当に水溶性にするので、ヌクレオチド及びクマリン成分は水溶液中で結合することができる。この方法で本発明の式（Ｉ）の生成物は、スルホン酸基を含まない同等生成物よりずっと簡単に得ることができる。スルホン化クマリンは、合成の間にスルホ基により置換された適した原料を用いることにより合成することができる。
【００２６】
しかしスルホン化クマリンは合成の後に、適したスルホン化法を用いてクマリンを誘導することにより製造するのが好ましい。スルホン化剤として用いるのに適した試薬は、硫酸含有率が７０％かそれ以上の濃硫酸、１００％硫酸、クロロスルホン酸及び濃度が最高６５％の発煙硫酸である。
【００２７】
クマリンは、好ましくは０℃−５０℃で上記のスルホン化剤の１つに染料を導入し、同様に好ましくは０℃−５０℃で出発材料が完全に反応するまで撹拌することによりスルホン化誘導体に変換する。生成物は既知の方法で単離及び精製することができる。
【００２８】
本発明はさらに、スルホクマリンにより置換された式（Ｉ）のヌクレオチドの、限定された配列の核酸を検出するための利用に関する。この目的のために、クマリンにより置換されたヌクレオチドの酵素的挿入により核酸を誘導する。得られる蛍光核酸は、ハイブリッド形成による相同核酸配列の検出のための遺伝子プローブとして用いることができる。形成される蛍光ハイブリッドは困難なく検出するこができる。
【００２９】
さらに選ぶことができる本発明の式（Ｉ）の蛍光ヌクレオチドの利用が、酵素増幅過程の間に核酸中にこれらの分子を挿入する可能性から生ずる。分析するべき核酸を本発明の蛍光ヌクレオチドの存在下で特異的に増幅した結果として生ずる核酸フラグメントも、天然のヌクレオチドの代わりにこれらの式（Ｉ）の蛍光ヌクレオチドを含む。この方法で、増幅により製造された核酸フラグメントは蛍光性となり、その形成を簡単に直接検出することができる。得られた蛍光核酸フラグメントもハイブリッド形成実験のための標識遺伝子プローブとして用いることができる。
【００３０】
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、種々の酵素的方法により蛍光ヌクレオチドで誘導することができる。“ランダム−プライム”法（“ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ”ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６（１９８３））はＤＮＡを誘導するための方法であり、すべての可能なヘキサヌクレオチド配列の混合物と修飾するべきＤＮＡのハイブリッド形成に基づいている。これらのヘキサヌクレオチドの３’−ＯＨ末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をクレノウ酵素などのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを用いて合成する。ＤＮＡポリメラーゼの基質として与えられた４個のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくとも１個がクマリン−置換ヌクレオチドにより置換されると、蛍光染料で標識された相補的ＤＮＡが得られる。
【００３１】
可能な限り最も多様な配列を有する短いオリゴデオキシリボヌクレオチドの混合物の代わりに、特異的配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド（“特異的プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）”）も用いることができる。これらの“特異的プライマー”は１本鎖ＤＮＡの相補的セグメントのみに一定の様式で結合し、相補的ＤＮＡの合成はこれらの特異的プライマーの３’−ＯＨ末端からのみ開始される。“ランダム−プライム”法の場合と同様に相補的ＤＮＡの標識は、この場合もクマリン染料を含む少なくとも１個のヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼに与えることにより成される。
【００３２】
“ニックトランスレーション”の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７（１９７７））は、少量の酵素ＤＮアーゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用に基づいている。ＤＮアーゼＩは２本鎖ＤＮＡ中に１本鎖切断を与える。同時にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ及びこの酵素の基質として働く４個のデオキシリボヌクレオチドが反応混合物中に存在する。Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩは１本鎖切断にて５’−末端デオキシリボヌクレオシドを切断し、同時に基質として与えられたデオキシリボヌクレオチドの１個を遊離の３’−ＯＨ末端に隣接して挿入する。この過程を繰り返すことにより１本鎖切断が３’末端に移動する。基質として与えられる４個のヌクレオチドの少なくとも１個がクマリン−置換ヌクレオチドにより置換されると、この“ニックトランスレーション法”を用いて蛍光ＤＮＡが得られる。
【００３３】
２本鎖又は１本鎖ＤＮＡの３’末端−標識の場合、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを３’−ＯＨ末端に結合する酵素、ターミナルトランスフェラーゼが用いられる。この酵素は少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とする。天然のヌクレオチドの代わりにクマリンで置換されたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドも酵素基質として用いることができる。かくして３’−ＯＨ末端で伸長された核酸は、これらの化合物を含み、結局蛍光性となる。
【００３４】
“逆転写”の方法は１本鎖リボ核酸を、又は２本鎖リボ核酸を１本鎖への変換の後に対応するＤＮＡに変換する。この目的のために、プライマーとしてオリゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分にアニーリングする。逆転写酵素を用い、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプライマーの３’−ＯＨ末端から出発して合成される。このＤＮＡ合成において、４種のデオキシリボヌクレオチドが酵素基質として与えられ、少なくとも１種はクマリン−置換誘導体である。逆転写酵素はこの材料も新しく形成されたＤＮＡ鎖に挿入し、その結果後者は蛍光染料により標識される。
【００３５】
さらに選択することができる本発明のクマリン−置換ヌクレオチドを含む核酸の製造法は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを製造する酵素の利用から生ずる。そのような酵素は、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼである。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又はＴ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡ、ならびにＲＮＡ合成のための基質としての４個のリボヌクレオチドを必要とする（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，４７７（１９８３））。
【００３６】
プロモーター領域は例えば転写ベクター中に挿入することができ、他の可能性は、ヘアピンを形成してその結果ＲＮＡポリメラーゼが必要としている２本鎖プロモーター領域を含むことになるような方法で構築された短い１本鎖核酸の利用である（欧州特許第４２７  ０７３号及び欧州特許第４２７  ０７４号明細書）。蛍光標識を有するＲＮＡ分子は、クマリン染料により置換されたリボヌクレオチドを基質として用いることにより得られる。
【００３７】
これらの方法で製造された蛍光核酸は、限定された配列の核酸をハイブリッド形成により検出するための遺伝子プローブとして用いることができる。蛍光染料で標識された遺伝子プローブはすべての既知のハイブリッド形成検定で用いることができる。そのような方法は多数の出版物を例とする文献から周知である。蛍光ハイブリッドは蛍光スペクトル分析又は蛍光顕微鏡により直接検出することができる。
【００３８】
本発明の方法は固定全細胞、固定組織スメア又は単離染色体を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、ならびに血液、血清又は他の体液におけるウィルス及びバクテリア感染の検出に特に有利に適用することができる。
【００３９】
本発明はさらに本発明のクマリン−置換ヌクレオチドの、増幅法の間の酵素基質としての利用に関する。ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅法の両方を用いることができる。
【００４０】
最も良く知られている増幅法は“ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）”の名前で知られている（欧州特許第２００  ３６２号明細書）。この方法の場合、生物試料中の検出されるべき核酸は１本鎖に変換され、２個のオリゴヌクレオチド（プライマー）とハイブリッド形成する。２個のオリゴヌクレオチドは検出されるべき核酸２本鎖の異なる成分領域に相補的であり、それぞれ１個のオリゴヌクレオチドが２個の分離した１本鎖の１個にハイブリッド形成する。ハイブリッド形成の後、ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び酵素基質としてのデオキシリボヌクレオチドで処理する。プライマーの３’−ＯＨ末端から出発して相補的ＤＮＡが１度合成されると、すべての核酸２本鎖がもう一度１本鎖に変換され、核酸へのプライマーのハイブリッド形成及びその後の重合を含む過程が繰り返される。この過程を多数回繰り返すことにより、試料中に含まれる検出されるべきＤＮＡを最高１０9倍に増幅することができる。
【００４１】
重合過程の間にクマリン置換基を含む少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識を有する増幅核酸が得られる。この蛍光は核酸の検出に参画することができる。これは、例えばＥｔＯＨを用いてこのＤＮＡを沈澱させるなどにより、蛍光ＤＮＡを適当に単離した後に行うことができる。さらにこの仕上げは、相補的ＤＮＡ、好ましくは固相上に固定されたＤＮＡ上に蛍光ＤＮＡを単離することにより行うことができる。
【００４２】
本発明のクマリン−置換ヌクレオチドを利用することができ、蛍光増幅生成物の製造に導くＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の他の方法は、例えばＬＣＲ法（欧州特許第３２０  ３０８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（欧州特許第３２９  ８２２号明細書）、ＱＢ法（ＰＣＴ  ８７／０６２７０）又はＨＡＳ法（欧州特許第４２７  ０７４号明細書）である。
【００４３】
以下の実施例は記載されている本発明を例示するものであるが、いかようにも本発明を制限すると理解するべきではない。
【００４４】
【実施例】
実施例１
４．０ｇの染料７−（Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシ−トリメチレンアミノ）−３−（４’，５’−ベンゾ−チアゾ−２’−イル）クマリンを４０ｍｌの発煙硫酸（２０％）中にゆっくり導入し、混合物を室温で２時間撹拌する。その後それを１００ｇの氷に加え、濃水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に調節する。回転蒸発器で水を大部分蒸留し、残留物を４００ｍｌの１０％塩酸と共に３時間加熱還流する。濃水酸化ナトリウム溶液で中和した後、混合物をもう一度蒸発乾固し、固体残留物を５００ｍｌのＤＭＦと共に撹拌する。混合物を濾過して不溶性塩を除去し、ＤＭＦを回転蒸発器で除去する。１０−２０ｍｌのジエチルエーテルを用いて撹拌抽出した後、２．２ｇ（４７％）の式
【００４５】
【化４】
0003887786.tif 000004
【００４６】
の生成物が得られる。（ＭＳ−ＦＡＢに従いスルホン酸のＮａ塩；物質は１モルのＤＭＦを用いて結晶化）融点：＞２５０℃
実施例２
同様の方法で７−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシ−エチルアミノ）−３−（４’，５’−ベンゾチアゾール−２’−イル）クマリンから式
【００４７】
【化５】
0003887786.tif 000005
【００４８】
の生成物が５０％の収率で得られる。融点：２７０℃（Ｎａ塩）
実施例３
式
【００４９】
【化６】
0003887786.tif 000006
【００５０】
の製造
３．０ｇ（６．１ミリモル）の式
【００５１】
【化７】
0003887786.tif 000007
【００５２】
の化合物（１）を９０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解する。溶液を５０℃に加熱する。１．５ｍｌのピリジン（１．４７ｇ、１８．５ミリモル）及び５．７ｇのジコハク酸イミジルカーボネート（２２．１ミリモル）をこの温度で加える。５０−６０℃で３時間撹拌した後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルへの変換が完了する。真空中で蒸留することによりジメチルホルムアミドを除去した後、残りの残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離剤トルエン／エタノール  １：２）により精製する。１．８ｇの式（３）の黄色固体（５０％）が得られる。
【００５３】
実施例４
【００５４】
【化８】
0003887786.tif 000008
【００５５】
Ｎａ4塩
の製造
９ｍｇの５−アリルアミノ−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ、１．６ｘ１０-5モル）を５ｍｌのＨ2Ｏに溶解する。０．２モルのＮａ2ＣＯ3を用いて溶液をｐＨ９．５に調節し、その後２２ｍｇの式（３）の活性化カルボン酸エステル（３．８ｘ１０-5モル）を固体の形態で加える。室温における反応の間、０．２モルのＮａ2ＣＯ3を加えることによりｐＨを８．５−９．５に保つ。室温で終夜撹拌した後、さらに２０ｍｇ（３．４ｘ１０-5モル）の式（３）の染料を２時間の間で加え、室温で撹拌を続ける。合計４５時間の運転時間の後、５−アリルアミノ−ｄＵＴＰは薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、エタノール／Ｈ2Ｏ  ５：２）によりもはや検出されない。反応混合物を真空中で蒸発乾固する。得られた反応生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ  １０（溶離剤Ｈ2Ｏ）上で３回クロマトグラフィーにかけることにより精製する。３．８ｍｇの式（４）のクマリン−置換デオキシリボヌクレオチドが得られる。
【００５６】
実施例５
【００５７】
【化９】
0003887786.tif 000009
【００５８】
Ｎａ4塩
の製造
１４ｍｇの８−（６−アミノヘキシル）アミノ−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、２．２６ｘ１０-5モル）を１０ｍｌのＨ2Ｏに溶解する。０．１モルのＮａ2ＣＯ3を用いて得られた溶液をｐＨ９．５に調節する。その後３２ｍｇの式（３）のクマリン誘導体（５．５ｘ１０-5モル）を室温で加え、混合物を室温で２０時間撹拌する。０．１モルのＮａ2ＣＯ3を加えることによりｐＨを８．５−９．５の範囲内に保つ。反応の完了後、８−（６−アミノヘキシル）アミノ−ＡＴＰは薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ  ５：２）によりもはや検出されない。反応混合物を真空中で蒸発乾固する。得られた反応生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ  １０（溶離剤Ｈ2Ｏ）上で３回クロマトグラフィーにかけることにより精製する。ＲＮアーゼによる汚染を避けるためにクロマトグラフィーに用いる装置はすべて使用前に滅菌する。８．９ｍｇの式（５）の蛍光ヌクレオチドが得られる。
【００５９】
実施例６
【００６０】
【化１０】
0003887786.tif 000010
【００６１】
Ｎａ4塩
の製造
１０ｍｇの５−アリルアミノ−ＵＴＰ（１．６ｘ１０-5モル）を５ｍｌのＨ2Ｏに溶解する。０．２モルのＮａ2ＣＯ3溶液を用いて溶液をｐＨ９．５に調節し、その後２０ｍｇ（３．４ｘ１０-5モル）の式（３）のクマリンを室温で加える。０．２モルのＮａ2ＣＯ3溶液を加えることによりｐＨを８．５−９．５の値に保ちながら室温で８時間混合物を撹拌する。反応混合物を真空中で蒸発乾固する。得られた反応生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ  １０（溶離剤Ｈ2Ｏ）上で３回クロマトグラフィーにかけることにより精製する。ＲＮアーゼによる汚染を避けるためにクロマトグラフィーに用いた装置はすべて使用前に滅菌する。５．５ｍｇの式（６）の蛍光ヌクレオチドが得られる。
【００６２】
実施例７
【００６３】
【化１１】
0003887786.tif 000011
【００６４】
の製造
２００ｍｇの６−アミノカプロン酸（１．５ｘ１０-3モル）を５ｍｌの水に溶解する。０．１モルのＮａ2ＣＯ3溶液を用いて溶液のｐＨを９．５に調節する。１．０ｇの式（３）のカルボン酸エステル（１．７ｘ１０-3モル）を室温で加え、その後室温で撹拌を続ける。０．１モルのＮａ2ＣＯ3溶液を加えることによりｐＨを９−９．５の値に保つ。２０時間撹拌した後、新規生成物（７）が少量の残留出発材料（３）と共に薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／エタノール  １：５）により検出される。反応混合物を真空中で濃縮乾固し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／エタノール  １：５、及びその後エタノール／Ｈ2Ｏ  １５０：１）により分別する。
【００６５】
生成物−含有留分を真空中で濃縮乾固し、残留生成物を５０−１００ｍｌのジエチルエーテルを用いて撹拌抽出する。３９８ｍｇ（３９％）の構造（７）の物質が得られる（融点２５０℃）。
【００６６】
実施例８
【００６７】
【化１２】
0003887786.tif 000012
【００６８】
の製造
０．３５ｇの化合物（７）（５．８ｘ１０-4モル）及び０．４６ｇのＮ，Ｎ’−ジコハク酸イミジルカーボネート（１．８ｘ１０-3モル）を３．５ｍｌのＤＭＦに溶解する。反応混合物を５０−６０℃に３時間加熱する。溶液を真空中で濃縮乾固し、得られた生成物（８）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／エタノール  １：２）で単離する。生成物−含有留分を真空中で濃縮乾固し、得られた生成物を５０ｍｌのジエチルエーテルを用いて撹拌抽出する。２４８ｍｇ（６１％）の式（８）の化合物が得られる［融点８０℃（分解）］。
【００６９】
実施例９
５−アリルアミノ−ｄＵＴＰを化合物（８）と反応させ、その後の手順を化合物（３）との反応の場合の実施例４における記載と同様に行うと、式
【００７０】
【化１３】
0003887786.tif 000013
【００７１】
Ｎａ4塩
の蛍光ヌクレオチド（９）が得られる。
【００７２】
実施例１０
８−（６−アミノヘキシル）アミノ−ＡＴＰを化合物（８）と反応させ、その後の手順を化合物（３）との反応の場合の実施例５における記載と同様に行うと、式
【００７３】
【化１４】
0003887786.tif 000014
【００７４】
Ｎａ4塩
の蛍光ヌクレオチド（１０）が得られる。
【００７５】
実施例１１
５−アリルアミノ−ＵＴＰを化合物（８）と反応させ、その後の手順を化合物（３）との反応の場合の実施例６における記載と同様に行うと、式
【００７６】
【化１５】
0003887786.tif 000015
【００７７】
Ｎａ4塩
の蛍光ヌクレオチド（１１）が得られる。
【００７８】
実施例１２
化合物（４）−（１１）と全く同様の方法で核酸の酵素的標識に用いることができる蛍光ヌクレオチドが、同様の方法でＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールなどの適した助剤を用い、アミノ−置換ヌクレオチドを化合物（２）と結合させることにより得られる。
【００７９】
実施例１３
蛍光ヌクレオチドを用いたポリヌクレオチドの３’末端−標識
式（４）のクマリン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ヒドロキシ−クマリン−ｄＵＴＰ及びレゾルフィン−ｄＵＴＰを用い、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからの末端−標識キットを用いて１．７ｋｂ長のポリヌクレオチドプローブを３’末端で標識した。１０μｌの反応緩衝液（カコジル酸カリウム、１モル／ｌ；トリス／ＨＣｌ、１２５ミリモル／ｌ；ウシ血清アルブミン、１．２５ｍｇ／ｍｌ；ｐＨ６．６；２５℃）、１−２μｇのオリゴヌクレオチド、２５単位のターミナルトランスフェラーゼ、ＣｏＣｌ2、２．５ミリモル／ｌ及び０．０２５ミリモルの蛍光ｄＵＴＰを含む５０μｌの混合物中の３７℃にて６０分後、約５０％の３’末端−標識が達成される。
【００８０】
標識ポリヌクレオチドを、適した沈澱法又はカラムクロマトグラフィー法により遊離のＮＴＰから分離し、スロット−ブロットハイブリッド形成(slot-blot hybridization)又は液中ハイブリッド形成(liquid hybridization)（実施例１８及び１９）における遺伝子プローブとして用いた。
【００８１】
標識ＤＮＡの蛍光を特定のクマリン染料に対応する励起及び発光波長にて蛍光光度計で測定した。式（４）のクマリン−ｄＵＴＰを用いて標識したＤＮＡの蛍光が、フルオレセイン、ヒドロキシクマリン又はレゾルフィンを用いて標識したＤＮＡより１００倍高いことが観察された。
【００８２】
実施例１４
クレノウ酵素を用いたランダム−プライム標識によるＤＮＡの蛍光−標識
ランダム−プライムＤＮＡ標識の方法は、標識されるべきＤＮＡへのすべての可能な塩基配列のヘキサヌクレオチドの混合物のハイブリッド形成に基づいている。その後クレノウ酵素を用いてランダムプライマーの３’末端から相補鎖を合成する。この方法では、基質として与えられ、本実施例のようにクマリン染料で標識された修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩が新しく合成される相補鎖に挿入される。プライマーとして働くヘキサヌクレオチド混合物中には実際にすべての配列の組み合わせが存在し、用いられたＤＮＡにこれらのヘキサヌクレオチドが統計的分布に基づいて結合し、全ＤＮＡが同じ割合で標識されることが保証される。反応はＤＮＡの長さに依存しない。２００ｂｐ長のフラグメントを５ｋｂの長さのポリヌクレオチドと全く同様に用いることができる。
【００８３】
式（４）の化合物はＤＮＡ中に非常に良く挿入され、フルオレセイン−ｄＵＴＰと比較して最高１００倍大きい蛍光信号を与える。
【００８４】
ランダム−プライムＤＮＡ標識法を用いると、特に高度の特異的標識を有するＤＮＡが得られる。従って最少量も標識することができる。この方法で標識したＤＮＡは、例えば実施例１８及び１９に記載するような多様なハイブリッド形成法で用いることができる。
【００８５】
実施例１５
ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの蛍光−標識
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は欧州特許第２００  ３６２号及び欧州特許第２０１  １８４号明細書に記載されている。この熱サイクル増幅法は、出発オリゴヌクレオチドを用いることによる限定された大きさのＤＮＡフラグメントの増幅に基づいており、熱安定性Ｔａｇポリメラーゼを用い、それぞれの場合に出発オリゴヌクレオチドの配列によって与えられる配列領域を出発鎖に相補的に５’末端から合成する。２本鎖の変性、出発オリゴヌクレオチド（プライマー）のアニーリング、及びＴａｇポリメラーゼを用いた新しいＤＮＡ配列の伸長により、これらのサイクルを多数回繰り返して出発ＤＮＡフラグメントの１００万倍の増幅が達成される。
【００８６】
増幅の間に、蛍光ＮＴＰも遊離のヌクレオチド三リン酸塩に加えて挿入することができ、このようにして蛍光分子を増幅ＤＮＡ中に挿入することができる。その後蛍光−標識ＤＮＡをハイブリッド形成実験に直接導入することができ、このようにして感度の高い遺伝子プローブ試験を行うことができる。
【００８７】
ＰＣＲ反応には以下を含んだ：合計１００μｌのＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．０１％のゼラチン）中にニトロソモナス  エウロピアエ（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐｅａｅ）からの２μｇのゲノムＤＮＡ、２μモルのプライマー１  （５’ｄＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣ）及びプライマー２  （５’ｄＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧ）、２．５単位のＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＴａｇポリメラーゼ、及び２００μモルの各ｄＮＴＰ。それぞれの場合に蛍光ヌクレオチドとして、１６０μｌのｄＴＴＰを補った４０μｌの式（４）の蛍光ｄＵＴＰを用いた。増幅はＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＣＲプロセッサーで行った。
【００８８】
試料を用い、最初にＤＮＡの初期熔融を９４℃で２分３０秒間行い、その後各サイクルにてＤＮＡを９４℃で１分間変性し、プライマーアニーリングを４０−４５℃で２分間行い、プライマー伸長を７２℃で３分間行った。３５サイクルの後、７２℃で２０分間最終的伸長を行い、その後試料を４℃で冷却した。化合物（４）で標識された増幅ＤＮＡは、フルオレセイン−ｄＵＴＰで標識した増幅ＤＮＡより最高で１００倍強い蛍光信号を与える。
【００８９】
実施例１６
蛍光リボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼを用いた試験管内転写によるＲＮＡ標識
Ｔ７又はＴ３プロモーターを含む直鎖状にされた鋳型ＤＮＡを、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、ならびに対応する蛍光ＮＴＰを用い、ＲＮＡポリメラーゼにより試験管内でＲＮＡ中に転写する。この方法で標識したＲＮＡはハイブリッド形成及びＲＮＡ−増幅試験、ならびにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成において用いることができる。標識ＲＮＡの蛍光を測定することにより直接評価する。
【００９０】
Ｔ７プロモーター及び１．７ｋｂのＤＮＡ挿入片を含むｐＳＫ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物をＲＮＡ転写及び蛍光測定に用いた。以下の組成を有する転写混合物を作成した：
１０μｌの直鎖状ＤＮＡ構築物（０．５μｇ）、
４μｌの転写緩衝液（４０ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．９；６ｍＭのＭｇＣｌ2；１０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのスペルミジン）、
２μｌの１００ｍＭ  ジチオエリトリトール
１μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ＣＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ＧＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ＵＴＰ
０．５μｌのＴ７ポリメラーゼ（１０単位）。
【００９１】
ＲＮＡを蛍光ヌクレオチドで標識するために、１０ｍＭの式（５）の化合物をＵＴＰの代わりに用いた。
【００９２】
混合物を３７℃で２時間インキュベートする。その後エタノール沈澱を行い、沈澱をエタノールで５回洗浄し、ＲＮＡをＴＥ緩衝液に再溶解する。蛍光は蛍光光度計で測定した。
【００９３】
実施例１７
Ｔ７／Ｔ３ヘアピン増幅を用いたＲＮＡの蛍光標識
ヘアピン増幅は欧州特許第４２７  ０７４号明細書に記載されているＲＮＡの増幅法である。対応するＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡの転写のためにＴ７又はＴ３プロモーターを形成するヘアピンオリゴヌクレオチドを用いると、ＲＮＡの標識に蛍光ＲＴＰを用いてそれを何百倍に増幅することを選択できる。蛍光標識を用いることにより、蛍光信号を用い、光度計で増幅を直接評価することができ、やっかいなＥＬＩＳＡ法が不必要となる。
【００９４】
転写混合物は実施例１６に示した通りに作成した。式（６）の化合物を蛍光ヌクレオチドとして用いた。標識オリゴヌクレオチド転写物の蛍光をポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。
【００９５】
実施例１８
蛍光−標識ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドプローブを用いたスロット−ブロットハイブリッド形成
通常の方法に従い、４０−６８℃のインキュベーション温度でハイブリッド形成を行った。それぞれの場合に用いたハイブリッド形成温度に依存して異なる物質を加えた。ハイブリッド形成の速度及び程度を増すためにデキストランサルフェート又は他のポリマーを用いた。膜へのＤＮＡの非特異的結合を抑制するために乾燥乳、デンハート溶液、ヘパリン又はＳＤＳなどの洗剤及び遮蔽剤を用いた。ハイブリッドの融点を下げ、より低いハイブリッド形成温度を用いることができるようにするために、ウレア又はホルムアミドなどの変性剤を使用することができる。これとは別に、ブロット上の非−相同ＤＮＡへの遺伝子プローブの非特異的結合は、異種ＤＮＡを加えることにより減少させることができる。
【００９６】
ハイブリッド形成の準備のために、５０−５００ｎｇのニトロソモナス  エウロピアエからの非標識ゲノムＤＮＡを最初に１００℃で５分間変性させ、その後０℃に冷却する。その後ＤＮＡを予備処理したニトロセルロース又はナイロン膜に、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  ＳｃｈｕｅｌｌからのＭｉｎｉｆｏｌｄＩＩ濾過装置を用いて移し、８０℃で２時間固定した。
【００９７】
フィルターを、フィルター１００ｃｍ2当たり少なくとも２０ｍｌのハイブリッド形成溶液を含む密閉プラスチックフィルムバッグ又はプラスチックボックス中の６８℃で少なくとも１時間ハイブリッド形成させた。
【００９８】
溶液を、１００ｎｇの蛍光遺伝子プローブを加えてある２．５ｍｌ／１００ｃｍ2フィルターのハイブリッド形成溶液と置換した。フィルターを６８℃で穏やかに振りながら少なくとも６時間インキュベートした。
【００９９】
その後フィルターを、各回フィルター１００ｃｍ2当たり少なくとも５０ｍｌの２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ用いて５分間室温で２回、及び各回０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを用いて１５分間６８℃で２回洗浄した。
【０１００】
その後フィルターをハイブリッド形成ＤＮＡの検出に直接用いた。
【０１０１】
溶液：
２０ｘＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０
ハイブリッド形成溶液：５ｘＳＳＣ；０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎａ塩、０．０２％  ＳＤＳ；０．５％遮蔽剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）溶液、５０−７０℃で作成。
【０１０２】
スロット−ブロットハイブリッド形成に同様に用いることができる他のハイブリッド形成溶液は、例えば：
ハイブリッド形成混合液２：５０％  ホルムアミド；７ｘＳＳＣ；２ｘデンハート溶液（１００ｘデンハート溶液：２％  Ｆｉｃｏｌｌ、２％  ポリビニルピロリドン、２％  ウシ血清アルブミン）；３００μｇ／ｍｌ  コウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合液３：６ｘＳＳＣ；１０ｘデンハート溶液；５０μｇのニシン精子ＤＮＡ；ウシ血清アルブミン、０．１％
ハイブリッド形成混合液４：５ｘＳＳＣ；５％  ＰＥＧ；５％  乾燥乳粉末；０．０１Ｍ  ピロリン酸ナトリウム
である。
【０１０３】
読み取りは試料中で結合した蛍光クマリン染料を用いて行った。フィルター上の蛍光スロットブロットはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＣＳ  ９３０スキャナーで定量的に評価した。
【０１０４】
実施例１９
蛍光−標識オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブを用いた液中ハイブリッド形成
ハイブリッド形成複合体の分離にＤｙｎａｌからのストレプタビジン−塗布磁気粒子を用い、サンドイッチハイブリッド形成として液中ハイブリッド形成を行った。
【０１０５】
液中ハイブリッド形成試験は、５’ｄＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＴのヌクレオチド配列を有する１００ｎｇの５’−ビオチン化捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）オリゴヌクレオチドプローブ、５’ｄＡＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＴＡＡＣのヌクレオチド配列を有する１００ｎｇの蛍光−標識オリゴヌクレオチドプローブ（検出遺伝子プローブ）、及び濃度の異なる（５０ｎｇ−１０００ｎｇ）５０μｌの体積のニトロソモナス標的ＤＮＡを用いてサンドイッチ試験として行った。
【０１０６】
１００℃に１０分間加熱し、その後０℃に冷却した後、５０μｌの２ｘＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒハイブリッド形成混合液を加え、６８℃で１時間ハイブリッド形成を行った。磁気ビーズを１ｘＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ混合液で予備処理し、磁石で液から分離し、それをピペットで除去し、その後ビーズをハイブリッド形成混合液に加え、それを穏やかに動かしながら室温で１／２時間インキュベートした。カップリングしたハイブリッド形成複合体をビーズと共に残留液から分離し、それをピペットで除去し、ビーズを緩衝液Ａ（２ｘＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳ）で１回、その後緩衝液Ｂ（０．１ＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳ）で２回洗浄した。磁気粒子を２００μｌのＳａｕＩＩＩａ制限酵素緩衝液中に取り上げ、２単位のＳａｕＩＩＩａ制限酵素を加えた後、蛍光−標識ＤＮＡを３７℃で１時間、ビーズから分裂させた。
【０１０７】
その後４００μｌの２重蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ）を加え、ＤＮＡの蛍光を蛍光光度計で測定した。
【０１０８】
実施例２０
増幅された蛍光−標識標的ＤＮＡを用いた液中ハイブリッド形成
液中ハイブリッド形成を逆相試験として行った。この目的のために、１．７ｋｂのニトロソモナス−特異的遺伝子プローブをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒからの３’末端−標識キットを用いて３’末端にてビオチン化し、その後ニトロソモナスからの蛍光−標識された増幅ゲノムＤＮＡを用い、実施例１９と同様にしてハイブリッド形成した。蛍光ハイブリッド形成複合体を、ストレプタビジン−塗布磁気粒子上でビオチン化遺伝子プローブを用いて混合物全体から分離し、適した洗浄段階の後、実施例１９と同様にしてＳａｕＩＩＩａ制限酵素を用いて蛍光ＤＮＡを磁気粒子から分裂させ、蛍光光度計で測定した。
【０１０９】
本発明の主たる特徴及び態様は以下の通りである。
【０１１０】
１．式
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは天然又は合成ヌクレオチド又はその誘導体を示し、
Ｂは２個の結合可能中心を有する架橋メンバーを示し、
Ｃは式
【０１１１】
【化１６】
0003887786.tif 000016
【０１１２】
のクマリン残基を示し、
ここで
Ｒ1は水素又はシアノであり、
Ｒ2は２、４又は５位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここで両残基はＳＯ3Ｈ基を有し、さらに置換されていることができ、
Ｒ3はＨ、Ｃ1-4−アルキル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル−Ｃ1-4−アルキル又はフェニルスルホニルであり、ここでＣ1-4−アルキルは非置換であるか、又はヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4−アルコキシカルボニル又はスルホにより置換されていることができ、フェニルスルホニルは非置換であるか、又は塩素、臭素、Ｃ1-4−アルキル又はスルホにより１回又は１回より多く置換されていることができ、
Ｒ2又はＲ3は第１又は第２アミノ基、ヒドロキシル、カルボキシル又はＣ1-4−アルコキシカルボニルにより置換されていることができるか、又はそれ自身がそのような置換基を示すか、あるいはＲ2又はＲ3は加水分解によりそのような基に変換されることができ、
Ｒ4が置換基であって結合でない場合、ＢへのＣの結合は残基Ｒ2上の別の置換基、例えばアミノ又はカルボキシルにより成される］
の蛍光ヌクレオチド。
【０１１３】
２．式
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
ＡはＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ  ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰから成る天然又は合成ヌクレオチドの群、及びこれらの系からのデオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチド、ならびにこれらからさらに誘導された誘導体から選ばれる残基を示し、
Ｂは鎖長が最高５０原子であり、該原子がＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ又はＳであることができ、直鎖状もしくは分枝鎖状であることができる２官能基性架橋メンバーであり、Ｃは式
【０１１４】
【化１７】
0003887786.tif 000017
【０１１５】
のクマリン残基を示し、
ここで
Ｒ1は上記の意味を有し、
Ｒ2は２、４又は５位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここでフェニルはスルホ基により置換され、さらにカルボキシル、Ｃ1-4−アルキルカルボニルオキシ、アミノ、−ＮＨ−Ｃ1-4−アルキル、−（ＣＨ2）1-4−ＮＨ2、Ｃ1-4−アルキル、シアノ、フッ素、塩素、臭素又はスルホにより置換され、チアゾリル残基はスルホにより置換され、場合によりさらに置換基を有することができるか、
又はチアゾリル残基は、スルホ基により置換され、さらに置換されていることができるベンゼン環が４及び５位で縮合しており、
Ｒ3は水素、メチル、エチル、−（ＣＨ2）1-4−ＯＨ、−（ＣＨ2）1-4−ＮＨ2、又は−（ＣＨ2）1-4−ＣＯＯＨあるいは（ＣＨ2）1-4−ＳＯ3Ｈである］
の蛍光ヌクレオチド。
【０１１６】
３．式
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは上記１及び２項の意味を有し、
ＢはＣ、Ｈ、Ｏ、Ｎ及びＳから成る群より選ばれる２−２０個の原子を有し、ペプチド誘導体、炭化水素、例えばアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン又はそれらの置換誘導体、ポリアルコール、ポリアルコキシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミン、炭水化物、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2ＮＨ−、−グリシル−グリシル−グリシル−、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−、スペルミン又はスペルミジン、−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3−であることができる２官能基性架橋メンバーであり、
Ｃは式
【０１１７】
【化１８】
0003887786.tif 000018
【０１１８】
のクマリン残基であり、
ここで
Ｒ1は上記１及び２項記載の意味を有し、
Ｒ2は２位に結合したフェニル又はチアゾリルであり、ここでフェニルはスルホによる置換され、さらにパラ−カルボキシル、パラ−アミノ、パラ−ＮＨ−Ｃ1-4−アルキル、パラ−ＣＨ2−ＮＨ2、シアノ、メチル又はエチルにより置換され、チアゾリルはスルホによる置換され、さらにクロロ、シアノ又はカルボキシルにより置換されているか、あるいはチアゾリル残基は、スルホにより置換され、さらに置換基としてカルボキシル又はアミノを含むことができるベンゼン環が４及び５位で縮合しており、
Ｒ3は上記１及び２項記載の意味を有する］
の蛍光ヌクレオチド。
【０１１９】
４．ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はターミナルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる酵素を用いた、核酸中への酵素的導入のための上記１−３項のいずれか１つに記載の化合物の利用。
【０１２０】
５．核酸検出のための増幅法における上記１−３項のいずれか１つに記載のヌクレオチドの利用。
【０１２１】
６．上記１−３項のいずれか１つに記載のヌクレオチドの１種又はそれ以上を含む遺伝子プローブ。
【０１２２】
７．上記１−３項のいずれか１つに記載のヌクレオチドの１種又はそれ以上を含む核酸検出のための試薬。
【０１２３】
【表１】
0003887786.tif 000019
【０１２４】
【表２】
0003887786.tif 000020