(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003917372.tif 000018
（式中、
Ｒ1は、アリールボロン酸エステル残基であり；
Ｙは、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは１〜５の整数である）よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｚは、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｘは、メチレン基および炭素−酸素単結合よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ2は、水素、トリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ3は、水素および活性化リン残基よりなる群から選択されるメンバーである）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ1は、フェニルボロン酸エステル残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記フェニルボロン酸エステル残基は、
【化２】
0003917372.tif 000019
（式中、
Ｒ4とＲ5は、水素、メチルおよびフェニルよりなる群から独立に選択されるメンバーであり；
Ｑは、メチレン基および炭素−炭素単結合よりなる群から選択されるメンバーである）
よりなる群から選択されるメンバーである請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙは炭素−炭素単結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＹはＯ（ＣＨ2）mであり、ｍは１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＹはＳ（ＣＨ2）mであり、ｍは１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＺはＣ1−Ｃ5アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘはメチレン基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘは炭素−酸素単結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ2はジメトキシトリチルであり、
Ｒ3はホスホラミダイトである、請求項３に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｑはメチレン基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項１３】
ホスホラミダイトは、β−シアノエチル−Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式：
【化３】
0003917372.tif 000020
（式中、
Ｒは、アリールボロン酸残基であり；
Ｙは、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは１〜５の整数である）よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｚは、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｘは、メチレン基および炭素−酸素単結合よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ6は、水素およびヒドロキシルよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ7は、ヒドロキシルおよびモノリン酸エステルよりなる群から選択されるメンバーであり；
ｎは、０〜１０の整数であり；
ｎ’は、１０〜１０００の整数であり；そして
Ｎｕ’とＮｕ''は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヌクレオチド類似体よりなる群から独立に選択されるメンバーであり；
ここで、
Ｒ、Ｙ、およびＸは、ｎのいずれか所定のモノマー値に対して同じかまたは異なってもよく；Ｒ6とＮｕ’は、ｎ’のいずれか所定のモノマー値に対して同じかまたは異なってもよい）
の化合物。
【請求項１６】
Ｒはフェニルボロン酸残基である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記フェニルボロン酸残基は、
【化４】
0003917372.tif 000021
よりなる群から選択されるメンバーである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
ＺはＣ1−Ｃ5アルキレンである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘはメチレン基である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ6は水素である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘは炭素−酸素単結合である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２３】
ｎ’は１０〜８００の整数である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２４】
ｎ’は１０〜４００の整数である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
ｎ’は１０〜１００の整数である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
式：
【化５】
0003917372.tif 000022
（式中、
Ｒは、アリールボロン酸残基であり；
Ｙは、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは１〜５の整数である）よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｚは、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｘは、メチレンおよび炭素−酸素単結合よりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ6は、水素およびヒドロキシルよりなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ7は、ヒドロキシルおよびモノリン酸エステルよりなる群から選択されるメンバーであり；
ｎは、０〜１０の整数であり；
ｎ’は、１０〜１０００の整数であり；そして
Ｎｕ’とＮｕ''は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヌクレオチド類似体よりなる群から独立に選択されるメンバーであり；
ここで、
Ｒ、Ｙ、およびＸは、ｎのいずれか所定のモノマー値に対して同じかまたは異なってもよく；Ｒ6とＮｕ’は、ｎ’のいずれか所定のモノマー値に対して同じかまたは異なってもよい）
の化合物。
【請求項２７】
Ｒはフェニルボロン酸残基である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記フェニルボロン酸残基は、
【化６】
0003917372.tif 000023
よりなる群から選択されるメンバーである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
ＺはＣ1−Ｃ5アルキレンである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｘはメチレン基である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ6は水素である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｘは炭素−酸素単結合である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３４】
ｎ’は１０〜８００の整数である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３５】
ｎ’は１０〜４００の整数である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
ｎ’は１０〜１００の整数である、請求項３５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、現在米国特許第６，０３１，１１７号となっている米国特許出願第０９／２７２，９７８号（１９９９年３月１９日出願）、および現在米国特許第６，０１３，７８３号となっている米国特許出願第０９／２７２，８３４号（１９９９年３月１９日出願）の優先権を主張する（これらはその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
発明の分野
本発明は、核酸固定化、精製および検出の分野、さらに詳しくは修飾オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへのボロン酸（boronic acid）の導入のための試薬に関する。
発明の背景
アリールボロン酸（例えば、フェニルボロン酸）は、ある必要な官能基を有する広範な極性分子と相互作用することが知られている。安定性の異なる複合体（１，２−ジオール、１，３−ジオール、１，２−ヒドロキシ酸、１，３−ヒドロキシ酸、１，２−ヒドロキシルアミン、１，３−ヒドロキシルアミン、１，２−ジケトンおよび１，３−ジケトン）が、中性のフェニルボロン酸またはフェニルボロネート陰イオンとの間で存在することが知られている。固定化されたフェニルボロン酸は、多様な生物学的試料から、必要な官能基を有する分子種を選択的に保持するためのクロマトグラフィー支持体として使用されている。特に限定されないが、炭水化物、カテコールアミン、プロスタグランジン、リボヌクレオチド、およびステムを含む多くの重要な生物学的分子は、必要な官能基を含有し、この方法で解析または精製されている。生物学的分子の単離と分離のためのフェニルボロン酸クロマトグラフィー媒体の使用は、いくつかの総説に記載されている（Singhal, R.P.とDeSilva, S.S.M. (1992) Adv. Chromatog., 31:293-335; Mazzeo, J.R.とKrull, I.S. (1989) BioChromatog., 4, 124-130;およびBergold, A.とScouten, W.H. (1983)、Solid Phase Biochemistry (Scouten, W.H.編）pp. 149-187, ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）、ニューヨークを参照）。
【０００２】
ｃｉｓまたはコアクシャル１，２−ジオールおよび１，３−ジオール官能基を有する分子種（そして特に炭水化物）は、フェニルボロネート陰イオンを有する固定化化合物と複合体を形成して、アルカリ性水溶液条件下で環状エステルを形成することが知られている（例えば、Lorand, J.P.とEdwards, J.O. (1959) J. Org. Chem., 24, 769を参照）。さらにアリールボロン酸残基に結合する炭水化物は、アリールボロン酸とアリールボロン酸内に含有されるアミン官能基との電子的相互作用を増強して、蛍光性変化を誘導することが知られている（T.D. Jamesら、(1994) J. Chem. Soc. Chem. Comm., 477-478を参照）。
【０００３】
生物学的分子（例えば生物学的巨大分子）と複合体を形成する能力を考慮すると、アリールボロン酸から得られる試薬は、固定化、精製および検出を含む多様な生物結合への応用に有用である。生物結合とは、化学的または生物学的手段により２つまたはそれ超の異なる分子種（そのうち少なくとも１つは、生物学的巨大分子である）の結合のための説明用語である。生物結合には、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、多糖、ホルモン、核酸、リポソームおよび細胞の、互いの結合または任意の他の分子種との結合があり、これは有用な性質を付与する。生物学的巨大分子の固定化はまた、生物結合の場合の特殊なケースと考えられ、ここで巨大分子は、可逆的または不可逆的に不溶性支持体に結合している。生物結合は、生化学的、免疫化学的および分子生物学的研究に広く使用されている。生物結合の主要な応用には、特に限定されないが、遺伝子プローブの検出、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、モノクローナル抗体薬剤ターゲティングおよび医用イメージングがある。
【０００４】
多くの例において、生物結合は、２つの結合パートナーの間の結合対を形成する既知の反応に基づく。生物結合反応の１つの例は、第１の結合パートナー（例えば、オルト置換アセトアミドフェニルボロン酸）と第２の結合パートナー（例えば、糖タンパク質に結合した炭水化物残基の隣接ジオール残基）が関与する（Cai, S.X.とKeana, J.F.W. (1991) Bioconjugate Chem. 2, 317-322を参照）。
【０００５】
さらに、３−イソチオシアネートフェニルボロン酸由来のフェニルボロニック酸生物接合体は、医用イメージングで使用するために、放射性テクネチウムジオキシム複合体をモノクローナル抗体に付加するのにうまく使用されている（Linder, K.E., Wen, M.D., Novotnik, D.P., Malley, M.F., Gougoutas, J.Z., Nunn, A.D.とEckelman, W.C. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 160-170; Linder, K.E., Wen, M.D., Novotnik, D.P., Ramalingam, K., Sharkey, R.M., Yost, F., Narra, R.K.とEckelman, W.C. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 407-414を参照）。
【０００６】
さらにボロン酸試薬は、サリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）および２，６−ジヒドロキシベンゾヒドロキサム酸（ＤＨＢＨＡ）から得られる、新に開発されたボロン酸複合体形成試薬とともに使用する時、生物結合試薬として広い有用性を示している。ボロン酸試薬、ボロン酸複合体形成試薬、これらの接合体と生物接合体、ならびにその調製法と使用は、米国特許第５，５９４，１１１号、５，６２３，０５５号、５，６６８，２５８号、５，６４８，４７０号、５，５９４，１５１号、５，６６８，２５７号、５，６７７，４３１号、５，６８８，９２８号、５，７４４，６２７号、５，７７７，１４８号、５，８３１，０４５号および５，８３１，０４６号に開示されている。
【０００７】
生物結合反応におけるアリールボロン酸の有用性を考慮すると、当該分野で必要なものは、例えば自動固相合成中に合成オリゴヌクレオチドに取り込みやすいボロン酸化合物である。こうして産生されるボロン酸修飾オリゴヌクレオチドは、生物結合反応（例えば巨大分子の固定化、精製および検出）に有用であろう。本発明は、これらおよび他のニーズを満足する。
発明の要約
アリールボロン酸から得られる試薬は、生物学的巨大分子と複合体を形成する能力の結果として、種々の生物結合反応への応用に有用である。本発明は、入手できるボロン酸試薬を包含し、ボロン酸修飾合成オリゴヌクレオチドの調製に有用である。従って１つの態様において本発明は、式Ｉの一般的構造を有する化合物に関する。
【０００８】
【化７】
0003917372.tif 000002
【０００９】
式Ｉにおいて、Ｒ1は、特に限定されないが、アリールボロン酸エステル残基（例えば、フェニルボロン酸エステル）を含む官能基である。式Ｉ中のＹは、特に限定されないが、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは約１〜約５の範囲の値を有する整数である）を含む官能基である。ある態様において、ＹはＯ（ＣＨ2）m（ここで、ｍは１である）又はＳ（ＣＨ2）m（ここで、ｍは１である）。本明細書において、Ｙが炭素−炭素単結合である時、Ｒ1は、カルボニル基に直接結合している。式Ｉ中のＺは、特に限定されないが、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドを含む官能基である。１つの態様において、ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである。式Ｉ中のＸは、特に限定されないが、メチレン基と炭素−酸素単結合を含む官能基である。Ｘが炭素−酸素単結合である時、式Ｉ中のメチン炭素は、ＯＲ3に直接結合している。式Ｉ中のＲ2は、特に限定されないが、水素、トリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルを含む官能基である。式Ｉ中のＲ3は、特に限定されないが、水素または活性化リン残基を含む官能基である。
【００１０】
式Ｉのアリールボロン酸化合物は、自動固相合成中のオリゴヌクレオチドの合成に有用である。こうして生成したオリゴヌクレオチドは、種々の生物結合反応（例えば、核酸の固定化、精製、および検出）に有用である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’末端または５’末端に付加した式Ｉの化合物を用いて合成することができる。
【００１１】
従って他の態様において本発明は、修飾５’を有しかつ以下の一般式を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
【化８】
0003917372.tif 000003
【００１３】
式IIにおいてＲは、特に限定されないが、アリールボロン酸残基（例えば、フェニルボロン酸）を含む官能基である。式II中のＹは、特に限定されないが、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは約１〜約５の範囲の値を有する整数である）を含む官能基である。式II中のＺは、特に限定されないが、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドを含む官能基である。１つの態様において、ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである。式II中のＸは、特に限定されないが、メチレン基と炭素−酸素単結合を含む官能基である。式II中のＲ6は、特に限定されないが、水素およびヒドロキシルを含む官能基である。式II中のＲ7は、特に限定されないが、ヒドロキシルとモノリン酸エステルを含む官能基である。式II中の指数ｎは、約０〜約１０の範囲の整数である。式II中の指数ｎ’は、約１０〜約１００００の範囲の整数である。式II中のＮｕ’とＮｕ''は、特に限定されないが、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヌクレオチド類似体を含む独立に選択されるヌクレオチド塩基である。変数Ｒ、ＹおよびＸは、ｎのあるモノマー値について同じかまたは異なっていてもよい。変数Ｒ6とＮｕ’は、ｎ5のあるモノマー値について同じかまたは異なっていてもよい。ある態様において、式II中のｎ’は約１０〜８００の整数であり、好ましくはｎ’は約１０〜４００の整数であり、そして最も好ましくはｎ’は約１０〜１００の整数である。
【００１４】
さらに別の態様において本発明は、修飾３’と以下の一般式を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
【化９】
0003917372.tif 000004
【００１６】
式IIIにおいてＲは、特に限定されないが、アリールボロン酸残基（例えば、フェニルボロン酸）を含む官能基である。式III中のＹは、特に限定されないが、Ｏ（ＣＨ2）m、Ｓ（ＣＨ2）m、および炭素−炭素単結合（ここで、ｍは約１〜約５の範囲の値を有する整数である）を含む官能基である。式III中のＺは、特に限定されないが、１〜１６個の炭素原子を有するアルキレン、アルキレンアミド、アルキレンアミドアルキレンおよびアルキレンアミドアルキレンアミドを含む官能基である。１つの態様において、ＺはＣ1−Ｃ2アルキレンアミドである。式III中のＸは、特に限定されないが、メチレン基と炭素−酸素単結合を含む官能基である。式III中のＲ6は、特に限定されないが、水素とヒドロキシルを含む官能基である。式III中のＲ7は、特に限定されないが、ヒドロキシルとモノリン酸エステルを含む官能基である。式III中の指数ｎは、約０〜約１０の範囲の値を有する整数である。式III中の指数ｎ’は、約１０〜約１００００の範囲の値を有する整数である。ある態様において、式III中のｎ’は約１０〜８００の整数であり、好ましくはｎ’は約１０〜４００の整数であり、そして最も好ましくはｎ’は約１０〜１００の整数である。式III中のＮｕ’とＮｕ''は、特に限定されないが、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヌクレオチド類似体を含む独立に選択されるヌクレオチド塩基である。変数Ｒ、ＹおよびＸは、ｎのあるモノマー値について同じかまたは異なっていてもよい。変数Ｒ6とＮｕ’は、ｎ’のあるモノマー値について同じかまたは異なっていてもよい。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、以後の詳細な説明を読むと、より容易に明らかになるであろう。
発明の詳細な記載及び好適な実施態様
Ｉ．用語解説
本明細書において「アルキル」という用語は、分岐または非分岐炭化水素鎖（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、オクタ−デシルおよび２−メチルフェニル）を意味する。これらの基は、そのようなアルキル基に一般的に結合する１つまたはそれ超の官能基（例えば、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、アルキルチオ、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミドなど）で随時置換されて、トリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピル、２−フルオロエチル、カルボキシメチル、シアノブチルなどのアルキル基を形成する。
【００１８】
「アルキレン」という用語は、１〜２０個の炭素原子および好ましくは約１〜１６個の炭素原子を有する、上記の２価アルキル基、例えばメチレン（−ＣＨ2−）、プロピレン（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）、クロロエチレン（−ＣＨＣｌＣＨ2−）、２−チオブテン−ＣＨ2ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ2ＣＨ2、１−ブロモ−３−ヒドロキシル−４−メチルペンテン（−ＣＨＢｒＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−）を意味する。
【００１９】
「アルキレンアミド」という用語は、−（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）または−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎ基（ここで、ｎは、約１〜約２０、好ましくは約１〜１６である）を意味する。
【００２０】
「アルキレンアミドアルキレン」という用語は、−（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nまたは−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ2）n基（ここで、ｎは、約１〜約２０、好ましくは約１〜１６である）を意味する。
【００２１】
「アルキレンアミドアルキレンアミド」という用語は、−（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）または−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎまたは（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎまたは−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ2）nＮＣ（Ｏ）（ここで、ｎは、約１〜約２０、好ましくは約１〜１６である）を意味する。
【００２２】
「アリール」という用語は、好ましくは約６〜１４個の炭素原子を有する少なくとも１つの芳香環（例えば、フェニル、ナフチル）を形成するか、またはそのようなアリール基に一般的に結合する１つまたはそれ超の官能基（例えば、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミドなど）で、随時置換されて、ビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニルなどのアリール基を形成する、炭素原子の鎖を意味する。
【００２３】
「アシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を意味し、ここでＲは、上記で定義したアルキルまたはアリール（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、またはブチリル）である。
【００２４】
「アルコキシ」という用語は、−ＯＲを意味し、ここでＲはアルキルである。
【００２５】
「アミド」という用語は、アミド結合を−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−を意味し、ここでＲは水素またはアルキルである。
【００２６】
「アミノ」という用語は、アミン結合−ＮＲ−を意味し、ここでＲは水素またはアルキルである。
【００２７】
本明細書において「ヌクレオチドモノマー」という用語は、「標準的」ヌクレオチド、すなわちアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウラシル、およびこれらのヌクレオチドの誘導体を意味する。そのような誘導体には、特に限定されないが、イノシン、５−ブロモデオキシシチジン、５−ブロモ−デオキシウリジン、Ｎ６−メチル−デオキシアデノシン、５−メチル−デオキシシチジンなどがある。
【００２８】
本明細書において「保護基」という用語は、分子上の反応性基（例えば、ヒドロキシルまたはアミン）が結合されているかまたは置換されている基を意味する。保護基は、１つまたはそれ超の化学反応工程中に、特定の基の反応を防止するように選択される。一般に具体的な保護基は、分子中に存在する他の反応性基を変化させることなく反応性基を回復できるように、後で除去できるように選択される。保護基の選択は、保護すべき特定の基の官能基と、それと接触する化合物である。保護基の選択は、当業者に公知である。例えば、Greeneら、Protective Groups in Organic Synthesis、第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley and Sons, Inc.）（Somerset, N.J.）（1991）を参照されたい。
II．化合物
ある態様において本発明は、生物結合反応で有用なポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドの合成の試薬として有用な、新規なアリールボロン酸誘導体を提供する。オリゴヌクレオチドへのこれらのアリールボロン酸試薬の取り込みは、オリゴヌクレオチドが生物結合反応（これは、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、多糖、ホルモン、核酸、リポソームおよび細胞のような生物学的分子の結合を含む）に参加することを可能にする。
【００２９】
従って１つの態様において本発明は、式Ｉ：
【００３０】
【化１０】
0003917372.tif 000005
【００３１】
（式中、Ｒ1、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｒ2およびＲ3は、上記で定義した）の一般的構造を有する化合物に関する。
【００３２】
式Ｉの化合物は、例えば高い繰り返し効率で自動固相オリゴヌクレオチド合成をするのに有用である。ある好適な実施態様において、反応性の高い活性化リン残基および容易に除去可能な保護基が使用される。ある好適な実施態様においてＲ1は、フェニルボロン酸エステルである。いくつかの好適なフェニルボロニック酸エステル残基には、特に限定されないが、以下の残基がある：
【００３３】
【化１１】
0003917372.tif 000006
【００３４】
式中、Ｒ4とＲ5は、特に限定されないが、水素、メチルおよびフェニルを含む官能基である。Ｑは、特に限定されないが、メチレン基および炭素−炭素単結合を含む官能基である。本明細書において、Ｑが炭素−炭素単結合である時、Ｑの両端の炭素原子は、直接結合される。
【００３５】
Ｒ3は、特に限定されないが、水素と活性化リン残基（特に限定されないが、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固相支持体に共有結合したヘミスクシネート、シクロヘキシルカルボジイミド、および固相支持体に共有結合したシクロヘキシルカルボジイミド）を含む官能基である。好ましくはＲ3は、ホスホラミダイトである。
【００３６】
Ｚは、随時アミド基で中断される約１〜約１６個の炭素原子を有するスペーサー基である。さらにＺは、アミド基で始まりかつ終わることができる。好ましくはＺは、Ｃ1−Ｃ5アルキレン基またはＣ1−Ｃ5アルキレンアミド基である。
【００３７】
ある好適な実施態様において、Ｘはメチレン基であり、Ｒ2はジメトキシトリチル基、例えばＯ−（４，４’−ジメトキシトリチル）である。Ｒ3は、好ましくはホスホラミダイト基、例えばＯ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイト基である。式Ｉの好適な化合物は、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトである。別の態様において、Ｒ2はジメトキシトリチルであり、そしてＲ3はホスホラミダイトである。
【００３８】
本発明の化合物は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド合成の両方で、合成オリゴヌクレオチドの任意の位置に、アリールボロン酸残基（例えばフェニルボロン酸またはフェニルジボロン酸残基）を導入するのに有用である。好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５’末端または３’末端が修飾される。好適な実施態様において式Ｉの化合物は、合成オリゴヌクレオチドの５’末端にフェニルボロン酸またはフェニルジボロン酸残基を導入するのに使用される。
【００３９】
従って、他の実施態様において本発明は、式IIの一般的構造を有する化合物に関する：
【００４０】
【化１２】
0003917372.tif 000007
【００４１】
式中、Ｒ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｒ6、Ｒ7、ｎ、ｎ’、Ｎｕ’およびＮｕ''は、上記で定義した。さらに変数Ｒ、ＹおよびＸは、ｎのあるモノマー値に対して同じかまたは異なってよい。さらに変数Ｒ6とＮｕ’は、ｎ’のあるモノマー値に対して同じかまたは異なってよい。
【００４２】
ある好適な実施態様において式IIのＲは、フェニルボロン酸残基である。適当なフェニルボロン酸残基には、特に限定されないが、以下がある：
【００４３】
【化１３】
0003917372.tif 000008
【００４４】
いくつかの他の態様において式Ｉの化合物は、合成オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’末端にアリールボロン酸（例えば、フェニルボロニック酸またはフェニルジボロン酸残基）を導入するのに使用される。従って他の実施態様において本発明は、式IIIの一般的構造を有する化合物に関する：
【００４５】
【化１４】
0003917372.tif 000009
【００４６】
式中、Ｒ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｒ6、Ｒ7、ｎ、ｎ’、Ｎｕ’およびＮｕ''は、上記で定義した。さらに変数Ｒ、ＹおよびＸは、ｎのあるモノマー値に対して同じかまたは異なってよい。さらに変数Ｒ6とＮｕ’は、ｎ’のあるモノマー値に対して同じかまたは異なってよい。式IIIのＲは、好ましくはフェニルボロン酸残基である。好適なフェニルボロン酸残基は、式IIについて上記したものである。
III．合成
式Ｉの種々の化合物の合成に関する詳細は、図１〜７に示し、さらに後述の実施例１〜３に詳述する。一般的合成方策は以下の通りである。図１〜２または３〜５において、脂肪族アミノ基を含有する保護１，２−または１，３−ジオールは、それぞれ保護アリールボロン酸（例えば、フェニルボロン酸）のカルボン酸誘導体の活性化型（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルまたはイミダゾリド）と反応させられる。１，２−または１，３−アミン含有ジオールは、１−ヒドロキシルで酸不安定性残基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル）で保護される。フェニルボロン酸は、別の１，２−または１，３−ジオール（例えば、１，３−プロパンジオール、ピナコール、またはベンゾピナコール）を使用して保護されて、環状ジエチルを生成する。生じる生成物を、次に活性化ホスフィン（例えば、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン）と反応させて、オリゴヌクレオチド合成に有用な最終活性化物質を生成する。
【００４７】
式Ｉの化合物の調製のための合成中間体として有用なアリールボロン酸（例えばフェニルボロン酸）は通常、ハロゲン化アリールからアリールマグネシウムまたはアリールリチウムを生成し、次にトリアルコキシボレートでトランスメタレーションすることにより、in situで合成される（Todd, M.H.ら、(1997) Tetrahedron Lett., 38, 6781-6784; Crisofoli, W.A.ら、(1991) Tetrahedron Lett., 32, 5881-5884; Sharp, M.J.ら、(1987) Tetrahedron Lett., 28, 5093-5096;およびLarson, R.D.ら、(1994) J. Org. Chem., 59, 6391-6394を参照）。
【００４８】
さらに、ハロゲン化アリールとアルコキシジボロン（Ishiyama, T.ら、(1995) Org. Chem., 60, 7508-7510; Giroux, A.ら、(1997) Tetrahedron Lett., 38, 3841-3844を参照）またはジアルコキシヒドロボラン（Murata, M.ら、J. Org. Chem. 1997, 62, 6458-6459を参照）から、触媒としてＰｄＣｌ2（ｄｐｐｆ）を使用して、フェニルボロン酸を生成するために、遷移金属触媒交差結合反応が開発されている。式Ｉの化合物の調製のための合成中間体として有用なフェニルボロン酸は、同時係属出願第０９／１３８，１０５号（１９９８年８月２１日出願）の主題である。
【００４９】
いったん産生されると式Ｉの化合物は、式IIおよび式IIIの化合物を生成するために使用することができ、これらは、当業者に公知の自動固相合成法を使用して調製することができる。例えば自動固相オリゴヌクレオチド合成（式Ｉの化合物により提供されたような、１つまたはそれ超の非天然の修飾を含有するオリゴヌクレオチドを含む）の化学は、以下の総説論文や参考書に記載されている：Crockett, G.C. (1983) "The Chemical Synthesis of DNA", Aldrichimica Acta 16(3), 47-55; Engels, J.W.およびUhlmann, E. (1989) "Gene Synthesis", Angew Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716-734; Goodchild, J. (1990) "Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of Their Synthesis and Properties", Bioconjugate Chem. 1(3), 165-187; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (1984) M.J. Gait編(IRL Press Limited: Oxford, England), 217 pp。
【００５０】
固相状態合成では、式Ｉの化合物を供給するタイミングとその濃度は、市販のＤＮＡ合成機で使用される非修飾の市販のホスホラミダイトに典型的なプロトコールと差は無い。市販の合成機（例えば、モデル３９４、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリホルニア州、アメリカ合衆国）上の余分のホスホラミダイト用に設けられたポート上の容器に、式Ｉの化合物を含有する溶液を加えればよいだけである。しかし式Ｉの特定化合物の結合効率が他のホスホラミダイトより実質的に低い場合、式Ｉの化合物の供給のタイミングまたはその濃度を変更して合成を最適化することが必要かも知れない。低い結合効率を補正するためのオリゴヌクレオチド合成プロトコールの最適化手段は、当業者に公知である。一般的には、供給する試薬の濃度または量を上げて、高結合効率を達成するだけである。結合効率を測定する手段もまた、公知である。例えばＲ2がジメトキシトリチル（ＤＭＴ）の場合、結合効率は、酸工程（これはＤＭＴ基を除去する）中のＤＭＴ陽イオン濃度を測定することにより決定することができる。ＤＭＴ陽イオン濃度は、通常酸洗浄液を分光光度計でモニターして測定される。酸／ＤＭＴ溶液は、明るい橙色である。あるいは、結合が失敗した場合、キャッピングはオリゴヌクレオチドのさらなる伸長を防止するため、例えば毛細管電気泳動またはＨＰＬＣを使用して、末端切断型と完全長オリゴヌクレオチドの比率を比較することにより、結合効率を推定することができる。
【００５１】
固相オリゴヌクレオチド合成は、多くの固層支持体を使用して実施することができる。好適な支持体は、合成されたオリゴヌクレオチド中で３’末端塩基となる保護されたモノマーが結合するための官能基を提供するものである。この支持体は、特定の合成化学で使用される試薬に対して不活性でなければならない。適切な支持体は、当業者に公知である。固層支持体材料には、特に限定されないが、ポリアクロイルモルホリド、シリカ、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、およびカルボキシル修飾テフロンがある。好適な支持体は、アミノ官能基化制御多孔性ガラスとカルボキシル官能基化テフロンである。
【００５２】
固相オリゴヌクレオチド合成は、出発点として、固層支持体に結合した完全に保護されたモノマー（例えば、保護されたヌクレオチド）を必要とする。この結合は典型的には、リンカーに共有結合した３’−ヒドロキシル（結合している時はオキソ）を介し、これは次に、固層支持体に共有結合する。次に最初の合成サイクルは、その３’−ホスフェートを介して、縮合反応により結合ヌクレオチドの５’−ヒドロキシルにヌクレオチドモノマーを結合させ、これは３’−５’ホスホジエステル結合を形成する。次の合成サイクルでは、最後に結合したヌクレオチドの５’−ヒドロキシルにヌクレオチドモノマーを付加する。こうしてオリゴヌクレオチドが３’から５’方向に合成され、その３’が固層支持体に結合した「増殖する」オリゴヌクレオチドが生成される。
【００５３】
当業者は、ヌクレオシドモノマーを固層支持体に結合させる無数の手段を知っているが、スクシネートまたはヘミスクシネートを介して制御多孔性ガラスに共有結合したモノマーが一般的に好ましい。制御多孔性ガラスにヘミスクシネートを介して結合した従来の保護されたヌクレオチドは、多くの異なる供給源（例えば、Glen Research, スターリング、バーモント州、アメリカ合衆国）；アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリホルニア州、アメリカ合衆国；ファルマシアエルケービー（Pharmacia LKB）、 ピスカタウェイ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）から市販されている。
【００５４】
オリゴヌクレオチドの３’末端に式Ｉの化合物を配置することは、固層支持体に結合した式Ｉの完全にブロックされた化合物を用いて、オリゴヌクレオチド合成を開始する必要がある。多くの異なる反応性基で官能基化した制御多孔性ガラスは、市販されている（例えば、シグマケミカル（Sigma Chemical）、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）。結合スキームは、Atkinsonら、第３章、Gait編、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, アイアールエルプレス（IRL Press）、ワシントン・ディー・シー（１９８４）に記載されている。塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル、イミダゾリド、トリアゾリド、またはテトラゾリドはまた、縮合剤として使用することができる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と構造類似体はまた、適当なリンカーである。他のリンカーと適当な縮合基は、当業者に公知である。
【００５５】
完全長オリゴヌクレオチドがいったん合成されると、保護基が除去され（オリゴヌクレオチドが脱保護される）、次にオリゴヌクレオチドは、使用前に固層支持体から切断される。切断と脱保護は、同時にまたは順に起きても良い。２つの操作は、互いに割り込んで、一部の基がオリゴヌクレオチドから除去されてから固層支持体から切断され、他の基は溶液中の切断されたオリゴヌクレオチドから脱保護されてよい。このイベントの順序は、存在する特定のブロッキング基、固層支持体への具体的な結合、および合成を行う個人の好みに依存する。脱保護が切断に先行する場合、保護基は、オリゴヌクレオチドから洗浄除去され、オリゴヌクレオチドは固層支持体に結合して残る。逆に脱保護が切断の後の場合、除去された保護基はオリゴヌクレオチドとともに溶液中に残るであろう。オリゴヌクレオチドは、使用前にこれらの保護基から単離する必要がしばしばある。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、短い１本鎖配列に限定されない。当業者は、オリゴヌクレオチド合成は典型的には、約１，０００塩基、好ましくは約１００塩基の上限があり、多くのオリゴヌクレオチドは一緒に結合して、長い配列を生成することは理解されるであろう。さらに、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドは、一緒にハイブリダイズされて２本鎖分子を形成する。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズまたは連結させてより長い２本鎖分子を形成する方法は、当業者に公知である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ニューヨーク、１９８５年）。
IV．生物接合体
上記したように式Ｉのアリールボロン酸は、自動固相合成法を使用して合成オリゴヌクレオチド中に取り込み、式IIと式IIIの化合物を生成しやすい。こうして生成した修飾オリゴヌクレオチドは、特に限定されないが、巨大分子（例えば、核酸）の固定化、精製、および検出を含む生物結合反応に有用である。
【００５７】
２つまたはそれ超の分子種を化学的または生物学的手段で結合させると、生物結合が起きる。多くの例において、生物結合は、２つの結合パートナーの間の結合対を形成する既知の反応に基づく。例えば生物結合反応は、抗原と結合タンパク質（例えば抗体）との間で起きる。生物結合反応には、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、多糖、ホルモン、核酸、リポソーム、および細胞、または他の生物学的分子の、互いの結合または任意の他の分子種との結合があり、これは有用な性質を付与する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、第１の結合パートナーとして特に有用であり、第２のパートナーとしての核酸の固定化、精製、および検出に関して生物結合を生成する。
【００５８】
速記法を使用して生物結合を例示するために、第１の結合パートナーは式IIまたはIIIの化合物であり、これは以下の図で示される：
【００５９】
【化１５】
0003917372.tif 000010
【００６０】
この図では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約１０〜約１０，０００塩基であり、３’末端または５’末端のいずれかに約１〜約１０個のアリールボロン酸残基を有する（ここでＢ’は、ＨまたはＢ（ＯＨ）2基である）式IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドを示す。
【００６１】
この例では、第２の結合パートナーは、そこに接合体が結合した２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸（サリチルヒドロキサム酸）から得られる分子である。適当な接合体には、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、多糖、ホルモン、核酸、リポソーム、細胞、および蛍光性標識物がある。第２の結合パートナーは、以下で示される：
【００６２】
【化１６】
0003917372.tif 000011
【００６３】
式IVにおいて、Ｘは、特に限定されないが、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＲ’、ＮＨＯＨ、およびＮＨＯＲ’があり、Ｒ’は特に限定されないが、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨ2ＣＯＮＨ2、およびＣＨ2ＯＣＨ3を含む基である。Ｙは特に限定されないが、Ｏ、ＳおよびＮＨを含む基であり、好ましくはＯである。
【００６４】
式IVの化合物およびその調製法は、米国特許第５，５９４，１１１号、５，５９４，１５１号、５，６２３，０５５号、５，６４８，４７０号、５，６６８，２５７号、５，６６８，２５８号、５，６７７，４３１号、５，６８８，９２８号、５，７４４，６２７号、ならびに同時係属出願：米国特許出願第０８／４８８，１９３号（１９９５年６月７日）；米国特許出願第０８／５７７，０６８号（１９９５年６月２２日出願）；米国特許出願第０８／６８９，３４１号（１９９７年８月７日出願）；米国特許出願第０８／９５６，１９５号（１９９７年１０月２２日出願）；および米国特許出願第０８／９５６，２０４号（１９９７年１０月２２日出願）に開示されている。
【００６５】
本発明のある実施態様において、第１の結合パートナーとしての式IIまたは式IIIのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２の結合パートナーとしての式IVの接合体との生物結合は、以下の式Ｖの生物接合体を生成する：
【００６６】
【化１７】
0003917372.tif 000012
【００６７】
式中、Ｘ2は、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＲ’、ＮＯＨ、およびＮＯＲ’であり、Ｒ’は上記で定義したものである。
【００６８】
第１の結合パートナーとしての式IIまたはIIIの化合物と第２の結合パートナーとしての式VIの化合物を使用する生物接合体を作成することもできる。
【００６９】
【化１８】
0003917372.tif 000013
【００７０】
式VIの化合物とその調製は、米国特許第５，７７７，１４８号と５，８３７，８７８号、ならびに同時係属出願：米国特許出願第０８／９５６，１９４号（１９９７年１０月２２日出願）；米国特許出願第０８／９５６，１９６号（１９９７年１０月２２日出願）（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。こうして生成した生物接合体は、以下の式VIIで示される：
【００７１】
【化１９】
0003917372.tif 000014
【００７２】
式VIとVIIの生物接合体は、緩衝化水溶液または有機溶液中で調製される。生物接合体は、数分以内に約４℃〜約７０℃の温度範囲で生成される。あるｐＨの水溶液中の生物接合体の安定性は、基Ｘ2とＹにより大きな影響を受ける。例えば、式VIの生物接合体（ここでＸはＮＯＨであり、ＹはＯである）は、ｐＨが４．５より大きく１２．５未満の水溶液中で安定である。しかし式VIIの生物接合体（ここでＸはＮＯＨであり、ＹはＯである）は、ほぼｐＨが２．５より大きく１２．５未満の水溶液中で安定である。従って、低ｐＨの緩衝化水溶液中で作業する時は、式VIIの生物接合体が好ましい。
【００７３】
各結合パートナー間の生物結合反応（ボロン酸複合体形成）は、イオン強度の大きな変化、有機溶媒の存在、界面活性剤の存在、カオトロピック剤（タンパク質変性剤）の存在に対して非感受性であり、これらは先行技術の間接的標識系に適合せず、生物学的巨大分子の構造は、必要な結合性を保存するように維持しなければならない。多くの例において、本明細書に記載の系により、生物接合体の形成を支配する制約は、生物活性分子種の活性（未変性のコンフォメーション）を維持するのに必要な条件により付加されるものに限定される。
【００７４】
本発明を具体例により詳細に説明する。以下の例は例示目的であり、決して本発明を限定するものではない。当業者は、同じ結果を得るために種々の重要ではないパラメータを変化させ修飾することができることを、容易に理解するであろう。
Ｖ．実施例
実施例１
本例は、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）］アミノ−１，３−オクタンジオール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの調製を例示する。
【００７５】
【化２０】
0003917372.tif 000015
【００７６】
Ａ．４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸の合成  ４−カルボキシフェニルボロン酸（１０．０ｇ、６０．２mmol）を熱無水１，４−ジオキサン（１５０ml）に溶解し、少量の活性炭で処理し、まだ熱いうちに０．５μｍガラスフィルターでろ過した。ろ液を加熱還流し、ベンゾピナコール（２２．１ｇ、６０．３mmol）を加えた。溶液を１時間還流し、室温まで冷却した。次にロータリーエバポレーターで溶媒を除去して白色の固体を得て、これを−２０℃で酢酸エチル／ヘキサンから一晩結晶化した。固体をろ過し、真空下で乾燥して２３．３ｇ（収率７８％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈと13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルおよび高速液体クロマトグラフィーで確認した。
【００７７】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 13.23（ブロードシングレット、1Ｈ, ＣO2H)、8.19（ダブレット、2H, ArH [安息香酸]), 8.13 (ダブレット、2H, ArH), 7.10 (マルチプレット、20H, ArH [ベンゾピナコール])。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6);δ 167.4, 141.9, 135.4, 129.2, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.3。
【００７８】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１４．９±０．１分。
Ｂ．４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸ＮＨＳエステルの合成
４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸（１７．４ｇ、３５．０mmol）を、無水テトラヒドロフラン（１００ml）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（４．０ｇ、３４．８mmol）を加え、次に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．２ｇ、３４．６mmol）を加えた。反応物を室温で一晩攪拌し、この間１，３−ジシクロヘキシル尿素の白色の沈殿物が生成した。固体をろ過して除去し、少量のテトラヒドロフランで洗浄した。一緒にしたろ液を、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固してオフホワイトの固体を得た。この固体をテトラヒドロフラン（１００ml）に溶解し、溶液をろ過し、ヘキサン（３００ml）を加えた。−２０℃で一晩結晶化させた。固体をろ過し、真空下で乾燥して１８．４ｇ（収率８９％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲで確認した。
【００７９】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.31（ダブレット、2H, ArH [安息香酸]), 8.25 (ダブレット、2H, ArH [安息香酸]), 7.15 (マルチプレット、20H, ArH [ベンゾピナコール]), 2.91 (シングレット、4H, ＣＨ2)。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6);δ 170.4, 161.9, 141.7, 136.0, 129.7, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.5, 25.5。
Ｃ．８−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−３−オキソオクタン酸メチルの合成
６−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］安息香酸（２５．０ｇ、９４．０mmol）と２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（１３．６ｇ、９４．０mmol）を無水ジクロロメタン（５００ml）に溶解した。トリエチルアミン（３５ml、２５５mmol）を加え、反応混合物を乾燥窒素下で室温で攪拌した。ジエチルシアノホスホネート（１５．４ml、９４．０mmol）を加えると、溶液は急速に黄色になる。一晩攪拌後、溶液を注意深く１Ｍ塩酸（２００ml、２回）、水（２００ml、３回）、および塩化ナトリウム飽和水溶液（２００ml、１回）で洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粘性の橙色のシロップを得た。この物質を無水メタノール（５００ml）に溶解し、乾燥窒素下で４時間還流した。溶液を冷却し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残渣を酢酸エチル：ヘキサン（１：１、v/v、５０ml）に溶解し、１０mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分とした。以下のステップ勾配を使用した：５０：５０（v/v）酢酸エチル：ヘキサンで２２分、次に１００％酢酸エチルで１８分、次に１００％メタノールで２０分。溶出液を、２７０nmの吸収でモニターした；生成物は最初の大きなピークに溶出する。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な淡黄色のシロップを得て、これは４℃に保存すると固化して、２７．７ｇ（収率９２％）の生成物を与える。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００８０】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.33 (マルチプレット、5H, ArH), 7.23 (トリプレット、 1Ｈ, NH), 5.00 (シングレット、2H, ArＣＨ2O), 3.60 (シングレット、3Ｈ, OＣＨ3), 3.58 (シングレット、2H, [C=O]CH2[C=O]), 2.97 (カルテット、2Ｈ, NHＣＨ2ＣＨ2), 2.49 (トリプレット、2H, ＣＨ2ＣＨ2[C=O]), 1.40 (マルチプレット、4H, NHＣＨ2ＣＨ2およびCＨ2ＣＨ2[C=O]), 1.20 (マルチプレット、2H, ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2). 13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ203.6, 168.0, 156.3, 137.5, 128.4, 127.8, 65.2, 51.7, 48.5, 42.1, 40.1, 29.2, 25.6, 22.5。ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１３．０±０．１分。
Ｃ．８−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−１，３−オクタンジオールの合成
８−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−３−オキソオクタン酸メチル（２６．０ｇ、８０．９mmol）を無水テトラヒドロフラン（１２５ml）に溶解した。この溶液を、乾燥窒素下で無水テトラヒドロフラン（２５０ml）中の水素化ホウ素リチウム（６．１ｇ、２７９．８mmol）の冷却（氷浴）溶液にゆっくり滴下して加えた。添加が完了後、反応混合物を室温まで暖め、一晩攪拌した。次に混合物を氷浴で冷却し、１Ｍの塩酸（３００ml）を静かに滴下して加えた。添加が完了後そして発泡が停止後、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して、ほとんどのテトラヒドロフランを除去した。残渣（水＋生成物）にクロロホルム（２５０ml）を加え、混合物をよく振盪し、層を分離した。水層を追加のクロロホルム（２５０ml）で抽出した。クロロホルム抽出物を塩化ナトリウム飽和水溶液（１００ml、１回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を蒸発乾固して、粘性の清澄な無色のシロップを得た。このシロップをメタノール（１００ml、５回）で同時蒸発させ、残渣をエチルエーテルとヘキサンから−２０℃で一晩結晶化した。白色の固体をろ過し、真空下で乾燥して２３．５ｇ（収率９８％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.33 (マルチプレット、5H, ArH), 7.22 (トリプレット、1Ｈ, NH), 5.00 (シングレット、2H, ArＣＨ2O), 4.33 (トリプレット、1Ｈ, ＣＨ2OH), 4.29 (ダブレット、1Ｈ, ＣHOH), 3.50 (マルチプレット、3H, CH[OH]ＣＨ2ＣＨ2OH), 2.98 (トリプレットのダブレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 1.52-1.23 (マルチプレット、10H, NHＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2ＣＨ2OH). 13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ156.4, 137.6, 128.5, 127.9, 67.4, 65.2, 58.4, 40.4, 40.2, 37.5, 29.5, 26.4, 25.0。ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１１．０±０．１分。
Ｄ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−１，３−オクタンジオールの合成
メチル８−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−１，３−オクタンジオール（８．３ｇ、２８．０mmol）を無水ピリジン（５０ml、１回）で同時蒸発させた。得られたシロップを無水ピリジン（５０ml）に溶解し、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（１０．０ｇ、２９．５mmol）を加えた。橙色の溶液を水分の無いところで室温で一晩攪拌した。次にメタノール（１０ml）を加え、溶液を室温でさらに１時間攪拌した。ｔ−ブチルメチルエーテル（２００ml）を加え、混合物をよく攪拌し、懸濁液を−２０℃で２時間放置した。混合物をろ過し、固体をｔ−ブチルメチルエーテル（１００ml）で洗浄し、一緒にしたろ液をロータリーエバポレーターで濃縮して粘性の黄色のシロップを得た。シロップを酢酸エチル（２０ml）とヘキサン（２０ml）＋トリエチルアミン（１ml）に溶解し、この溶液の５mlのアリコートを、分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分の３９：６０：１（v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンであった。溶出液を、２８０nmの吸収でモニターした。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な淡黄色のシロップを得た。このシロップを真空下で水酸化カリウムペレット上で乾燥して１２．９ｇ（収率７７％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。1Ｈ NMR (300 MHz, アセトニトリル-d3):δ7.45-7.27 (マルチプレット、14H, ArH [DMT, Cbz]), 7.22 (トリプレット、1Ｈ, NH), 6.86 (ダブレット、4H, ArH [DMT]), 5.62 (ブロードシングレット、1Ｈ, ＣHOH), 5.04 (シングレット、2H, ArＣＨ2O), 3.75 (シングレット、6H, Ar-OＣＨ3), 3.63 (ダブレット、1Ｈ, ＣHOH), 3.20-3.00 (マルチプレット、4H, NHＣＨ2ＣＨ2およびＣＨ2ＣＨ2O-DMT), 1.72-1.23 (マルチプレット、10H, NHＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-ＣＨ2ＣＨ2CH[OH]-ＣＨ2ＣＨ2O-DMT)。13Ｃ NMR (75 MHz, クロロホルム-d):δ 158.9, 156.8, 145.1, 137.0, 136.3, 130.3, 128.8, 128.3, 128.2, 127.1, 113.5, 87.0, 71.5, 66.7, 62.7, 55.4, 41.2, 37.4, 36.9, 30.1, 26.8, 25.3。 ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１７．２±０．１分。
Ｅ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−アミノ−１，３−オクタンジオールの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−１，３−オクタンジオール（１２．９ｇ、２１．６mmol）をメタノール（２５０ml）に溶解した。この溶液を１リットルのParr水素化容器に入れ、容器に窒素を５分間パージした。酢酸エチル（２０ml）でスラリーにしたパラジウム担持活性炭触媒（１．０ｇ、１０％Ｐｄ／Ｃ）を加え、溶液をParrシェーカーに固定した。容器を再度窒素でパージし、排気して、３５psiの圧力で水素を導入した。容器を室温で６時間攪拌し、次に真空にし、窒素を充填し、シェーカーから取り出した。内容物を０．５μｍのガラスファイバーでろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。シロップをさらに水酸化カリウムで真空下で乾燥して、１０．１ｇ（収率１００％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ7.38-7.16 (マルチプレット、9H, ArH), 6.86 (ダブレット、4H, ArH), 3.71 (シングレット、6H, Ar-OＣＨ3), 3.63 (マルチプレット、4H, CHOHとＣＨ2ＮＨ2), 3.04 (トリプレット、2H, ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2), 2.53 (トリプレット、2H, ＣＨ2ＣＨ2O-DMT), 1.61-1.17 (マルチプレット、10H, ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2ＣＨ2O-DMT)。13Ｃ NMR (75 MHz, クロロホルム-d6):δ 158.2, 145.6, 136.4, 128.9, 129.1, 127.9, 126.7, 113.2, 85.4, 67.3, 60.7, 55.0, 41.1, 37.5, 32.3, 26.5, 25.1。 ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１２．７±０．１分。
Ｆ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル］アミノ−１，３−オクタンジオールの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−アミノ−１，３−オクタンジオール（１０．０ｇ、２１．６mmol）を無水テトラヒドロフラン（１００ml）に溶解し、４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（１２．８ｇ、２１．６mmol）を加えた。清澄な溶液を、室温で乾燥窒素下で一晩攪拌した。次に反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して粘性のシロップとした。残渣を、トリエチルアミン（１０ml）を含有する酢酸エチル（１００ml）に溶解し、溶液を４℃で数時間冷却した。冷混合物をろ過して、一部の沈殿固体を除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮して粘性のシロップとした。残渣を酢酸エチル（２５ml）とトリエチルアミン（１ml）を含有するヘキサン（２５ml）に溶解し、この溶液の５mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分の３９：６０：１（v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンであった。溶出液を、２８０nmの吸収でモニターした。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な淡褐色のシロップをを得た。このシロップをさらに、水酸化カリウムペレットで真空下で乾燥して１４．９ｇ（収率７３％）の淡い茶色のガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびに勾配および定組成ＨＰＬＣで確認した。1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ8.61 (トリプレット、1Ｈ, NH), 8.14 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 8.00 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.39-7.09 (マルチプレット、30H, ArH [DMT, ベンゾピナコール]), 6.86 (ダブレット、4H, ArH [DMT]), 4.27 (ダブレット、1Ｈ, ＣHOH), 3.70 (シングレット、6H, Ar-OＣＨ3), 3.57 (ブロードシングレット、1Ｈ, ＣHOH), 3.29 (トリプレットのダブレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 3.07 (トリプレット、2H, ＣＨ2ＣＨ2O-DMT), 1.70-1.23 (マルチプレット、10H, NHＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2CH-[OH]ＣＨ2ＣＨ2O-DMT)。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 166.0, 158.1, 145.4, 141.9, 138.4, 136.3, 135.1, 129.7, 128.1, 127.8, 127.5, 127.2, 127.0, 126.5, 113.1, 96.1, 85.3, 67.2, 60.5, 55.9, 38.1, 37.4, 29.1, 26.6, 24.9。ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１９．４±０．１分。ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝６．２±０．１分。
Ｇ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル］−アミノ−１，３−オクタンジオール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル］−アミノ−１，３−オクタンジオール（３．５ｇ、３．７mmol）を、無水ジクロロメタン（５０ml、塩基性アルミナでろ過した）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．６ml、１４．９mmol）を加え、溶液を乾燥窒素下で室温で攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノクロロホスフィン（１．２ml、５．４mmol）を滴下して加え、溶液を１時間攪拌した。次に反応混合物をロータリーエバポレーターで約２０mlに濃縮し、酢酸エチル（１５０ml、１００mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液であらかじめ洗浄した）を加えた。有機溶媒を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄（５０ml、１回）し、次に塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄（５０ml、１回）し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、淡黄色のシロップを得た。この物質を、酢酸エチル（２５ml）とトリエチルアミン（１ml）を含有するヘキサン（２５ml）に溶解した。この溶液の５mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣによりPorasilシリカ（４０mm×１００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分の１９：８０：１（v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンであった。溶出液を、２７０nmの吸収でモニターした：生成物は大きなピーク中であった。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のガラス様泡状物を得て、これをさらに無水炭酸カリウムで真空下で乾燥して２．７ｇ（収率７８％）の生成物を得た。生成物の純度を、1ＨとＨＰＬＣで確認した。1Ｈ NMR (300 MHz, アセトニトリル−ｄ3）:δ 8.14 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.89 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.43-7.08 (マルチプレット、31Ｈ, ArH [DMT, ベンゾピナコール] およびNH), 6.86-6.82（２つのダブレット、4H, ArH [DMT]), 3.95 (マルチプレット、1Ｈ, ＣHO-P), 3.74-3.734 (２つのシングレット、6H, Ar-OＣＨ3）、3.50 (マルチプレット、4H, OＣＨ2ＣＨ2CNとNCH(ＣＨ3)2）、3.34 (マルチプレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 3.12 (マルチプレット、2H, ＣＨ2ＣＨ2O-DMT), 2.58-2.46 (トリプレットのダブレット、2H, OＣＨ2ＣＨ2CN), 1.80-1.30 (マルチプレット、10H, NHＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2ＣＨ2O-DMT), 1.12-1.01 (ダブレットの２つのダブレット、12H, NCH(ＣＨ3)2)。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、部分的に分離したジアステレオ異性体の存在のために複雑であったことに注意されたい。ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝１１．７と１２．８±０．１分（ジアステレオ異性体）。
実施例２
本例は、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］アミノ−１，２−プロパンジオール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの調製を例示する。
【００８１】
【化２１】
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【００８２】
Ａ．４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸の合成  図４と５に関して、４−カルボキシフェニルボロン酸（１０．０ｇ、６０．２mmol）を熱無水１，４−ジオキサン（１５０ml）に溶解し、少量の活性炭で処理し、まだ熱いうちに０．５μｍガラスフィルターでろ過した。ろ液を加熱還流し、ベンゾピナコール（２２．１ｇ、６０．３mmol）を加えた。溶液を１時間還流し、室温まで冷却した。次に溶媒を、ロータリーエバポレーターで除去して、白色の固体を得て、これを−２０℃でエチルエーテル／ヘキサンから一晩結晶化した。固体をろ過し、真空下で乾燥して２３．３ｇ（収率７８％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈと13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００８３】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 13.23（ブロードシングレット、1Ｈ, ＣO2H)、8.19（ダブレット、2H, ArH [安息香酸]), 8.13 (ダブレット、2H, ArH), 7.10 (マルチプレット、20H, ArH [ベンゾピナコール])。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6);δ 167.4, 141.9, 135.4, 129.2, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.3。
【００８４】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１４．９±０．１分。
Ｂ．４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸ＮＨＳエステルの合成
４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸（１７．４ｇ、３５．０mmol）を、無水テトラヒドロフラン（１００ml）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（４．０ｇ、３４．８mmol）を加え、次に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．２ｇ、３４．６mmol）を加えた。反応物を室温で一晩攪拌し、この間１，３−ジシクロヘキシル尿素の白色の沈殿物が生成した。固体をろ過して除去し、少量のテトラヒドロフランで洗浄した。一緒にしたろ液を、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固してオフホワイトの固体を得た。この固体をテトラヒドロフラン（１００ml）に溶解し、溶液をろ過し、ヘキサン（３００ml）を加えた。−２０℃で一晩結晶化させた。固体をろ過し、真空下で乾燥して１８．４ｇ（収率８９％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲで確認した。
【００８５】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.31（ダブレット、ArH [安息香酸]), 8.25 (ダブレット、2H, ArH [安息香酸]), 7.15 (マルチプレット、20H, ArH [ベンゾピナコール]), 2.91 (シングレット、4H, ＣＨ2)。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6);δ 170.4, 161.9, 141.7, 136.0, 129.7, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.5, 25.5。
Ｃ．３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオールの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（１６．０ｇ、５０．０mmol）を５０mlの２−プロパノールに溶解（静かに加熱しながら）し、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（４．６ｇ、５０．４mmol）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。白色の沈殿物が生成した。次にロータリーエバポレーターで溶媒を除去して、白色の固体を得て、これを水（２００ml）に溶解した。陰イオン交換樹脂（ＡＧ１−Ｘ８［ＯＨ-型］、５０ｇ湿重量；バイオラッド（Bio-Rad））を加え、スラリーを１時間攪拌した。樹脂をろ過して除去し、水（１００ml、１回）とメタノール（１００ml、２回）で洗浄した。一緒にしたろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して白色の固体を得た。この固体をトルエン（１００ml、１回）と同時蒸発させ、次に真空下で充分乾燥して１４．１ｇ（収率９６％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００８６】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.85（トリプレット、1Ｈ, NH [アミノプロパンジオール), 7.37-7.26 (マルチプレット、5H, ArH), 7.21 (トリプレット、1Ｈ, NH [β−アラニン]), 4.99 (シングレット、2H, ArＣＨ2O), 4.64 (ブロードシングレット、2H, OH), 3.48 (ペンテット、1Ｈ, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2OH), 3.27 (ダブレットのダブレット, 2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2OH), 3.18 (カルテット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 3.08 (マルチプレットのダブレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2OH), 2.28 (トリプレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2)。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6);δ 171.0, 156.3, 137.4, 128.5, 127.9, 70.5, 65.3, 63.8, 42.2, 37.2, 35.7。
【００８７】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝９．４±０．１分。
Ｄ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオールの合成
３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオール（５．０ｇ、１６．９mmol）を、無水ピリジン（５０ml）に溶解し、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（５．７ｇ、１６．９mmol）を加えた。黄色の溶液を、乾燥窒素下で室温で一晩攪拌した。次にメタノール（１０ml）を加え、溶液をさらに１時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで＜４０℃の浴温度で除去して、粘性の黄色のシロップを得た。シロップを酢酸エチル（２００ml）と５％（w/v）炭酸ナトリウム水溶液（１００ml）とで分配した。層を分離し、酢酸エチル層を塩化ナトリウム飽和水溶液（１５０ml、１回）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して黄色のガムを得た。ガムを、酢酸エチル：トリエチルアミン（１ml）を含有するヘキサン（１：１ v/v、３０ml）で溶解し、ろ過し、この溶液の５mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分とした。以下のステップ勾配を使用した：７４：２５：１（v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンで１０分溶出して、いくつかの小さな混入物質を溶出しし、次に９４：５：１（v/v/v）酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンで２０分溶出して、所望の生成物を溶出した。溶出液を、２７０nmの吸収でモニターした。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な淡黄色のシロップを得た。シロップを真空下で水酸化カリウムペレットでさらに乾燥して、５．４ｇ（収率５４％）のパリパリのガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００８８】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.80 (トリプレット、1H, NH[アミノプロパンジオール]), 7.41-7.18 (マルチプレット、15Ｈ, ArH [DMT, Cbz]およびNH[β−アラニン]), 6.88 (ダブレット、4H, ArH [DMT]), 5.00 (シングレット、2H, ArCH2O), 4.97 (ダブレット、1H, CH[OH]), 3.72 (シングレット、6H, ArOCH3), 3.68 (マルチプレット、1H, CH2CH[OH]CH2O-DMT), 3.19 (カルテット、2H, NHCH2CH2), 3.14 (マルチプレットのダブレット、2H, CH2CH[OH]CH2O-DMT), 2.85 (マルチプレット、2H, CH2CH[OH]CH2O-DMT), 2.24 (トリプレット、2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 170.5, 158.1, 156.0, 145.0, 137.2, 135.9, 129.7, 128.2, 127.8, 127.6, 127.5, 126.5, 113.1, 85.2, 68.7, 65.7, 65.1, 54.9, 42.6, 37.1, 35.5。
【００８９】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１５．３±０．１分。
Ｅ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオールの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオール（５．４ｇ、９．０mmol）を無水メタノール（１５０ml）に溶解した。この溶液を１リットルのParr水素化容器に入れ、容器に窒素を５分間パージした。酢酸エチル（２０ml）でスラリーにしたパラジウム担持活性炭触媒（１．０ｇ、１０％Ｐｄ／Ｃ）を加え、溶液をParrシェーカーに固定した。容器を再度窒素でパージし、排気して、３５psiの圧力で水素を導入した。容器を室温で６時間攪拌し、次に真空にし、窒素を充填し、シェーカーから取り出した。内容物を０．５μｍのガラスファイバーでろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。シロップをさらに水酸化カリウムペレットで真空下で乾燥して、４．０ｇ（収率９６％）のパリパリのガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００９０】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.86 (トリプレット、1H, NH[アミノプロパンジオール]), 7.40-7.18 (マルチプレット、9Ｈ, ArH), 6.87 (ダブレット、4H, ArH), 3.72 (シングレット、6H, ArOＣＨ3), 3.68 (マルチプレット、1Ｈ, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 3.21 (マルチプレットのダブレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 3.10 (ブロードシングレット、3H, ＮＨ2およびOH), 2.90 (マルチプレット、ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 2.68 (トリプレット、2H, ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2), 2.24 (トリプレット、2H, ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 171.7, 158.1, 145.1, 136.0, 129.7, 127.8, 127.7, 126.5, 113.1, 85.2, 68.7, 65.7, 54.9, 42.5, 38.7, 38.1。
【００９１】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１１．９±０．１分。
Ｆ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］アミノ−１，２−プロパンジオールの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオール（４．０ｇ、８．６mmol）を無水ジクロロメタン（１００ml）に乾燥窒素下で溶解した。４−ジヒドロキシボリル−（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（８．５ｇ、１４．４mmol）を加えると、溶液は淡黄色になった。反応混合物を室温で６時間攪拌し、次に重炭酸ナトリウム飽和水溶液（１００ml、１回）次に塩化ナトリウム飽和水溶液（１００ml、１回）で洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去して黄色のシロップを得た。シロップを、トリエチルアミン（１ml）を含有する酢酸エチル（２５ml）に溶解し、この溶液の５mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分とした。以下のステップ勾配を使用した：９９：１（v/v/v）酢酸エチル：トリエチルアミンで１０分溶出して、いくつかの小さい混入物質を溶出し、次に７９：２０：１（v/v/v）酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンで２０分溶出して所望の生成物を溶出した。溶出液を、２７０nmの吸収でモニターした。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な淡黄色のシロップを得た。シロップを真空下で水酸化カリウムペレットでさらに乾燥して、３．９ｇ（収率４８％）のパリパリのガラス様の泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびに勾配および定組成ＨＰＬＣで確認した。
【００９２】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.64 (トリプレット、1Ｈ, NH [β−アラニン］), 8.11 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.97 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.86 (トリプレット、1Ｈ, NH[アミノプロパンジオール]), 7.41-7.08 (マルチプレット、30H, ArH [DMT, ベンゾピナコール]), 6.86 (ダブレット、4H, ArH [DMT]), 4.97 (ダブレット、1Ｈ, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 3.72 (シングレット、6H, ArOＣＨ3), 3.70 (マルチプレット、1Ｈ, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 3.46 (カルテット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 3.16 (マルチプレットのダブレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 2.89 (マルチプレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 2.38 (トリプレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2)。13Ｃ NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 170.8, 166.2, 158.3, 145.2, 142.0, 138.3, 136.1, 135.1, 129.9, 128.2, 128.0, 127.8, 127.5, 127.3, 127.1, 126.7, 113.3, 96.3, 85.4, 68.9, 65.9, 55.1, 42.9, 36.3, 35.3。
【００９３】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１８．７±０．１分。
【００９４】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝２．５±０．１分。
Ｇ．１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］アミノ−１，２−プロパンジオール２−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの合成
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−［（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］アミノ−１，２−プロパンジオール（３．９ｇ、４．１mmol）を、無水ジクロロメタン（１００ml、塩基性アルミナでろ過した）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．６ml、２０．７mmol）を加え、溶液を乾燥窒素下で室温で攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（１．１ml、５．０mmol）を滴下して加え、溶液を１時間攪拌した。次に反応混合物をジクロロメタン（１００ml）で希釈し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（５０ml、１回）、次に塩化ナトリウム飽和水溶液（５０ml、１回）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、淡黄色のガラス様泡状物を得た。この物質を酢酸エチル（１５ml）とトリエチルアミン（１ml）を含有するヘキサン（１０ml）に溶解した。この溶液の５mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４０mm×１００mm；Waters）のカラムで精製した。流速は５０ml/分とした。以下のステップ勾配を使用した：５０：４９：１（v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンで１０分溶出して、次に９９：１  酢酸エチル：トリエチルアミンで５分溶出し、次に４９：５０：１の酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンで５分溶出した。溶出液を、２７０nmの吸収でモニターした；生成物は９９：１（v/v）酢酸エチル：トリエチルアミンで溶出する。生成物の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。シロップを真空下で水酸化カリウムペレットでさらに乾燥して、３．６ｇ（収率７６％）のパリパリのガラス様の泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣで確認した。
【００９５】
1Ｈ NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.65 (トリプレットのダブレット、1Ｈ, NH [β−アラニン］), 8.15 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.99 (ダブレット、2H, ArH [PBA]), 7.84 (トリプレットのダブレット、1Ｈ, NH[アミノプロパンジオール]), 7.43-7.10 (マルチプレット、30H, ArH [DMT, ベンゾピナコール]), 6.87 (ダブレットのダブレット、4H, ArH [DMT]), 4.06 (マルチプレット、1Ｈ, ＣH), 3.71 (シングレット、6H, Ar-OＣＨ3), 3.80-3.35 (マルチプレット、8H, OＣＨ2ＣＨ2CＮ, NCH(ＣＨ3)2, CHＣＨ2OおよびNHＣＨ2ＣＨ2), 3.18 (マルチプレットのダブレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 3.03 (マルチプレットのダブレット、2H, ＣＨ2CH[OH]ＣＨ2O-DMT), 2.69 (トリプレットのダブレット、2H, ＯＣＨ2ＣＨ2CN), 2.40 (マルチプレット、2H, NHＣＨ2ＣＨ2), 1.02 (ダブレットのダブレット、12H, NCH(ＣＨ3)2)。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、部分的に分離したジアステレオ異性体の存在のために複雑であったことに注意されたい。31P NMR (121 MHz, DMSO-d6):δ 149.1, 148.4 (ジアステレオ異性体)。
【００９６】
ＨＰＬＣ（逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝４．１と４．８±０．１分（ジアステレオ異性体）。
実施例３
本例は、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ− [（４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの合成を例示する。
【００９７】
【化２２】
0003917372.tif 000017
【００９８】
Ａ．４−ジヒドロキシボリル（ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸の合成  図６と７を参照して、４−カルボキシフェニルボロン酸（１０．０ｇ、６０．２mmol）を熱無水１，４−ジオキサン（１５０ml）に溶解し、少量の活性炭で処理して、熱いうちに０．５μmガラスファイバーフィルターでろ過した。ろ液を加熱還流して、ベンゾピナコール（２２．１ｇ、６０．３mmol）を加えた。この溶液を１時間還流し、次に室温まで冷却した。次に溶媒をロータリーエバポレーターで除去して白色の固体を得て、これをエチルエーテル／ヘキサンから−２０℃で一晩結晶化した。固体をろ過して、真空下で乾燥して、２３．３ｇ（収率７８％）の生成物を得た。この生成物の純度を、1Ｈ  ＮＭＲおよびＨＰＬＣにより確認した。
【００９９】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 13.23 (ブロードシングレット, 1H, CO2H), 8.19 (ダブレット, 2H, ArH [安息香酸]), 8.13 (ダブレット, 2H, ArH), 7.10 (マルチプレット, 2OH, ArH [ベンゾピナコール])。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 167.4, 141.9, 135.4, 129.2, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.3。
【０１００】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１４．９±０．１分。
Ｂ．４−ジヒドロキシボリル (ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸ＮＨＳエステルの合成
４−ジヒドロキシボリル (ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸 (１７．４ｇ、３５．０mmol）を無水テトラヒドロフラン (１００ml）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド (４．０ｇ、３４．８mmol）を加え、続いて１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド (７．２ｇ、３４．６mmol）を加えた。反応物を一晩室温で撹拌すると、１，３−ジシクロヘキシル尿素の白色の沈殿物が生成した。この固体をろ過して除去し、少量のテトラヒドロフランで洗浄した。一緒にしたろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、オフホワイト色の固体を得た。固体をテトラヒドロフラン (１００ml）に溶解し、この溶液をろ過し、ヘキサン (３００ml）を加えた。−２０℃で一晩結晶化させた。固体をろ過して、真空下で乾燥して、１８．４ｇ (収率８９％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲにより確認した。
【０１０１】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.31 (ダブレット, 2H, ArH [安息香酸]), 8.25 (ダブレット, 2H, ArH [安息香酸]), 7.15 (マルチプレット, 2OH, ArH [ベンゾピナコール]), 2.91 (シングレット, 4H, CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 170.4, 161.9, 141.7, 136.0, 129.7, 128.2, 127.6, 127.4, 126.2, 96.5, 25.5。
Ｃ．ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリンメチルエステルの合成  Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル (１４．１ｇ、４４．０mmol；バッケム (Bachem））を１００mlの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して、セリンメチルエステル塩酸塩 (５．２ｇ、４３．６mmol）を加えた。混合物を室温で撹拌し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン (１０ml、５７．４mmol）を加えた。反応物を一晩撹拌した。次に溶媒をロータリーエバポレーターで除去して、清澄な無色のシロップを得た。この物質を酢酸エチル (２５０ml）と水 (２５０ml）とに分配した。層を分離し、酢酸エチル層を、順に重硫酸カリウム半飽和水溶液 (２００ml、１回）、重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (２００ml、２回）および塩化ナトリウム飽和水溶液 (２００ml、１回）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去して、清澄な無色のシロップを得た。このシロップを真空で十分に乾燥して、１０．４ｇ (収率７４％）の無定形の白色の固体を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣにより確認した。
【０１０２】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.21 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.33 (マルチプレット, 5H, ArH), 7.18 (トリプレット, 1H, NH [β−アラニン]), 5.00 (トリプレット, 1H, OH), 4.99 (シングレット, 2H, Ar-CH2O), 4.32 (マルチプレット, 1H, CH), 3.62 (マルチプレット, 2H, CH2OH), 3.60 (シングレット, 3H, CH3), 3.18 (カルテット, 2H, NHCH2CH2), 2.33 (トリプレット, 2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 171.0, 170.5, 155.9, 137.2, 128.2, 127.6, 127.5, 65.1, 61.1, 54.5, 51.5, 36.9, 35.2。
【０１０３】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝９．９±０．１分。
Ｄ．３−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリンメチルエステルの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリンメチルエステル (１０．０ｇ、３０．８mmol）を無水ピリジン (１００ml）に溶解して、塩化４，４’−ジメトキシトリチル (１１．０ｇ、３２．５mmol）を加えた。この黄色の溶液を乾燥窒素下で室温で一晩撹拌した。次にメタノール (１０ml）を加えて、この溶液をさらに１時間撹拌した。溶媒を＜４０℃の浴温でロータリーエバポレーターで除去して、粘性の黄色のシロップを得た。このシロップを酢酸エチル (３００ml）と重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (１５０ml）とに分配した。層を分離して、酢酸エチル層を順に重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (１５０ml、１回）および塩化ナトリウム飽和水溶液 (１５０ml、１回）で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、ロータリーエバポレーターで濃縮して、黄色のシロップを得た。このシロップを酢酸エチル (１００ml）に溶解して室温で撹拌した。ヘキサン (２００ml）をゆっくり滴下して加えると、ほぼ白色の固体が沈殿した。固体を−２０℃で一晩回収し、ろ過し、酢酸エチルとヘキサンとの混合物 (１：１、v/v） (１００ml）で洗浄し、真空下で乾燥して、１７．０ｇ (収率８８％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣにより確認した。
【０１０４】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.51 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.39-7.21 (マルチプレット, 15H, ArH [DMT, Cbz]およびNH [β−アラニン]), 6.90 (ダブレット, 4H, ArH [DMT]), 5.02 (シングレット, 2H, Ar-CH2O), 4.60 (マルチプレット, 1H, CH), 3.73 (シングレット, 6H, Ar-OCH3), 3.64 (シングレット, 3H, CO2CH3), 3.23 (マルチプレット, 4H, NHCH2CH2およびCHCH2O), 2.43 (トリプレット, 2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 171.0, 170.7, 158.4, 156.2, 144.8, 137.3, 135.5, 135.4, 129.9, 128.5, 127.9, 127.8, 126.9, 113.2, 85.5, 65.3, 63.0, 55.0, 52.3, 51.9, 37.0, 35.2。
【０１０５】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１５．９±０．１分。
Ｅ．１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリノールの合成
３−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリンメチルエステル (１０．０ｇ、１６．０mmol）を無水テトラヒドロフラン (１００ml）に溶解した。この溶液を乾燥窒素下で、無水テトラヒドロフラン (１００ml）中の水素化ホウ素リチウム (１．０ｇ、４５．９mmol）の撹拌溶液に滴下して加えた。この清澄な無色の溶液を室温で乾燥窒素下で６時間撹拌した。次に水 (５０ml）を加えて、混合物をさらに４時間撹拌した。テトラヒドロフラン (２００ml）を加えると、白色の固体が沈殿した。混合物をろ過し、固体を少量のテトラヒドロフランで洗浄して、ろ液をロータリーエバポレーターで約５０mlに濃縮した。酢酸エチル (２５０ml）を加えて、層を分離した。酢酸エチル溶液を、順に重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (１００ml、１回）および塩化ナトリウム飽和水溶液 (１００ml、１回）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して、ろ過した。ろ液からロータリーエバポレーターで溶媒を留去して、清澄なシロップを得て、これをさらに真空で水酸化カリウムペレットで乾燥して、９．３ｇ (収率９７％）のパリパリのガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣにより確認した。
【０１０６】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.80 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.40-7.19 (マルチプレット, 15H, ArH [DMT, Cbz]およびNH [β−アラニン]), 6.88 (ダブレット, 4H, ArH [DMT]), 5.00 (シングレット, 2H, Ar-CH2O), 4.63 (トリプレット, 1H, CH2OH), 4.01 (マルチプレット, 1H, CH), 3.72 (シングレット, 6H, Ar-OCH3), 3.45 (トリプレット, 2H, CHCH2OH), 3.20 (カルテット, 2H, NHCH2CH2), 2.98 (マルチプレットのダブレット, 2H, CHCH2O-DMT), 2.32 (トリプレット, 2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 170.2, 158.2, 156.2, 145.3, 137.3, 136.0, 129.9, 129.1, 128.5, 127.9, 127.6, 126.7, 113.2, 85.2, 65.2, 62.6, 60.8, 55.0, 50.9, 37.2, 35.8。
【０１０７】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１４．８±０．１分。
Ｆ．１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−β−アラニルセリノールの合成
１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルセリノール (９．３ｇ、１５．５mmol）を無水メタノール (２００ml）に溶解した。この溶液を１リットルのParr水素化容器に入れて、この溶液を窒素で５分間パージした。酢酸エチル (２０ml）でスラリー化したパラジウム担持活性炭触媒 (１．０ｇ、１０％  Ｐｄ／Ｃ）を加えて、この容器をParrのシェーカーに装着した。容器を再度窒素でパージし、排気して、水素を３５psiの圧力まで導入した。容器を室温で６時間振盪し、次に排気し、窒素を充填してシェーカーから取りだした。内容物を０．５μmガラスファイバーフィルターでろ過して、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。このシロップをさらに真空で水酸化カリウムペレットで乾燥して、７．１ｇ (収率９３％）のパリパリのガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣにより確認した。
【０１０８】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 7.87 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.38-7.20 (マルチプレット, 9H, ArH), 6.88 (ダブレット, 4H, ArH), 3.97 (マルチプレット, 1H, CH), 3.72 (シングレット, 6H, Ar-OCH3), 3.45 (ダブレット, 2H, CHCH2OH), 3.26 (ブロードシングレット, 3H, NH2およびOH), 2.95 (マルチプレットのダブレット, 2H, CHCH2O-DMT), 2.73 (トリプレットのダブレット, 2H, NH2CH2CH2), 2.19 (トリプレット, 2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 171.3, 158.3, 145.4, 136.1, 130.0, 128.0, 127.9, 126.7, 113.3, 85.3, 62.7, 60.9, 55.0, 51.0, 37.8, 37.7。
【０１０９】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１１．０±０．１分。
Ｇ．１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ− [ (４−ジヒドロキシボリル− (ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノールの合成
１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−β−アラニルセリノール (７．１ｇ、１４．４mmol）を無水テトラヒドロフラン (１００ml）に乾燥窒素下で溶解した。トリエチルアミン (２．０ml、１４．４mmol）を加え、続いて４−ジヒドロキシボリル (ベンゾピナコール環状エステル）安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル (８．５ｇ、１４．４mmol）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、ろ過して、ろ液をロータリーエバポレーターで粘性のシロップ状になるまで濃縮した。このシロップを酢酸エチル (２５０ml）に溶解して、溶液を、順に重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (２００ml、２回）、次いで塩化ナトリウム飽和水溶液 (２００ml、１回）で洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去して、黄色のシロップを得た。シロップを、トリエチルアミン (１ml）を含有する酢酸エチル (６０ml）に溶解して、この溶液の１０mlのアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４７mm×３００mm；Waters）のカラムにより精製した。流速は５０ml/分とした。以下のステップ勾配を使用した：６６：３３：１ (v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンで１０分間いくつかの少数混入物質を溶出し、次に９８：１：１ (v/v/v）酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンで２０分間所望の生成物を溶出した。溶出液は、２７０nmの吸光度によりモニターした。生成物画分をプールして、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。このシロップをさらに真空で水酸化カリウムペレットで乾燥して、７．１ｇ (収率９３％）のパリパリのガラス様泡状物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲにより、さらには勾配および定組成ＨＰＬＣで確認した。
【０１１０】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.64 (トリプレット, 1H, NH [β−アラニン]), 8.09 (ダブレット, 2H, ArH [PBA]), 7.95 (ダブレット, 2H, ArH [PBA]), 7.83 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.38-7.09 (マルチプレット, 3OH, Ar [DMT, ベンゾピナコール]), 6.85 (ダブレット, 4H, ArH [DMT]), 4.68 (トリプレット, 1H, CHCH2OH), 4.05 (マルチプレット, 1H, CH), 3.70 (シングレット, 6H, Ar-OCH3), 3.49 (ダブレット, 4H, CHCH2OHおよびNHCH2CH2), 2.98 (マルチプレットのダブレット, 2H, CHCH2O-DMT), 2.46 (トリプレット, 2H, NHCH2CH2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 166.3, 158.2, 145.3, 142.0, 141.9, 138.1, 136.0, 135.2, 129.9, 128.2, 127.9, 127.6, 127.4, 127.1, 126.7, 113.2, 96.3, 85.2, 62.6, 60.9, 55.1, 50.9, 36.3, 35.4。
【０１１１】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）中のアセトニトリルの線形勾配、１５分で０〜１００％アセトニトリル、２６０nmの吸光度を検出器でモニター）：保持時間＝１８．６±０．１分。
【０１１２】
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝２．４±０．１分。
Ｈ．１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ− [ (４−ジヒドロキシボリル− (ベンゾピナコール環状エステル）−ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール３−Ｏ− (２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトの合成
１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ− [ (４−ジヒドロキシボリル (ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール (７．２ｇ、７．６mmol）を無水ジクロロメタン (２５０ml、塩基性アルミナでろ過）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン (５．５ml、３１．６mmol）を加えて、溶液を乾燥窒素下で室温で撹拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノクロロホスフィン (２．５ml、１０．５mmol）を滴下して加え、溶液を１時間撹拌した。次に反応混合物をロータリーエバポレーターで約５０mlまで濃縮し、酢酸エチル (３００ml、１００mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で前もって洗浄した）を加えた。この有機溶液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液 (１００ml、１回）および次に塩化ナトリウム飽和水溶液 (１００ml、１回）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、淡黄色のガラス様泡状物を得た。この物質を酢酸エチル (２５ml）およびトリエチルアミン (１ml）を含むヘキサン (１５ml）に溶解した。この溶液の５mlアリコートを分取用ＨＰＬＣ（Waters PrepLC 2000システム）によりPorasilシリカ（４０mm×１００mm；Waters）のカラムにより精製した。流速は５０ml/分とした。以下の多相線形勾配を使用した：５０：４９：１ (v/v/v）〜７９：２０：１ (v/v/v）酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンで１０分間、９９：１ (v/v）酢酸エチル：トリエチルアミンで５分間、７９：２０：１酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンで２分間、そしてこの組成で３分間保持。溶出液は、２６０nmの吸光度でモニターした；生成物は最初の大きなピークで溶出した。生成物画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固して、清澄な無色のシロップを得た。このシロップを酢酸エチル (３０ml）＋トリエチルアミン (２ml）に溶解して、この溶液を、急速撹拌氷冷ヘキサン (３００ml）に滴下して加えることによって、白色の沈殿物が生成した。沈殿物を−２０℃で一晩回収し、ろ過し、冷ヘキサンで十分に洗浄し、真空下で無水炭酸カリウムで乾燥して、７．９ｇ (収率９１％）の生成物を得た。生成物の純度を、1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲならびにＨＰＬＣにより確認した。
【０１１３】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ 8.64 (トリプレットのダブレット, 1H, NH [β−アラニン]), 8.11 (ダブレット, 2H, ArH [PBA]), 7.97 (ダブレット, 2H, ArH [PBA]), 7.95 (ダブレット, 1H, NH [セリン]), 7.38-7.09 (マルチプレット, 3OH, Ar [DMT, ベンゾピナコール]), 6.85 (ダブレット, 4H, ArH [DMT]), 4.22 (マルチプレット, 1H, CH), 3.70 (シングレット, 6H, Ar-OCH3), 3.70-3.40 (マルチプレット, 8H, OCH2CH2CN, NCH (CH3)2, CHCH2OPおよびNHCH2CH2), 3.02 (マルチプレット, 2H, CHCH2O-DMT), 2.68 (トリプレットのダブレット, 2H, OCH2CH2CN), 2.48 (マルチプレット, 2H, NHCH2CH2), 1.02 (ダブレットのダブレット, 12H, NCH (CH3)2)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6):δ 170.5, 166.2, 158.3, 145.2, 142.1, 142.0, 138.1, 135.9, 135.2, 129.9, 128.2, 127.9, 127.6, 127.4, 127.1, 126.8, 119.0, 113.3, 96.3, 85.4, 62.3 (ブロード), 58.5, 58.4, 58.3, 58.2, 42.6, 42.4, 36.3, 35.4, 31.0, 24.4, 24.3, 22.1, 19.9, 19.8。 31P NMR (121 MHz, DMSO-d6):δ 147.4, 147.1 (ジアステレオマー異性体).
ＨＰＬＣ (逆相、４．６×１００mm  Ｃ４カラム、流速１．０ml/分、７％  ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．５）：９３％アセトニトリルを使用する定組成溶離）：保持時間＝４．４±０．１分。
実施例４
本例は、ボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドの自動固相合成を例示する。
【０１１４】
オリゴデオキシリボヌクレオチドＰＸ００１ (配列：5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3'）を、標準的自動ホスホラミダイト化学 (モデル３９４自動ＤＮＡ合成機、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ (Perkin Elmer/Applied Biosystems） [フォスターシティー、カリホルニア州］製、および添付されるウルトラファスト (UltraFast）ＤＮＡ合成試薬、グレン・リサーチ (Glen Research） [スターリング、バージニア州］製）をトリチルＯＮ (Trityl ON）モードで用いて１μmolスケールで合成した。完成したオリゴデオキシリボヌクレオチドは、支持体に保持した。適切な量の所望のフェニルボロン酸 (ＰＢＡ）含有ホスホラミダイトを、無水アセトニトリル (１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ− [４−ジヒドロキシボリル− (ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）］アミノ−１，３−オクタンジオール３−Ｏ− (２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスホラミダイトおよび１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ− [ (４−ジヒドロキシボリル (ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル）］アミノ−１，２−プロパンジオール３−Ｏ− (２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスホラミダイト）、または７５：２５ (v/v）無水アセトニトリル：無水テトラヒドロフラン (１−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ− [ (４−ジヒドロキシボリル− (ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル）］セリノール３−Ｏ− (２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイト）のいずれかに溶解して、０．１Ｍの最終濃度を得た。この溶液をＤＮＡ合成機に、特別のホスホラミダイトの瓶の位置の１つに入れた。次に１つ以上のＰＢＡ残基をオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に、結合反応の「待ち時間」を１５分に延長した、標準的結合サイクルの変法を用いて付加した。再び、合成は、トリチルＯＮモードで行った。オリゴデオキシリボヌクレオチドへのＰＢＡアミジトの付加の結合収率は、各サイクルの回収トリチル溶液およびこれに続く分析ＨＰＬＣから＞９５％であると推定された。
【０１１５】
完成したトリチル化ＰＢＡ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドは、次に製造業者のプロトコールにしたがって、装置上の濃水酸化アンモニウムにより支持体から切断した。ヌクレオ塩基上の保護基とボロン酸は、加熱ブロック中の水酸化アンモニウム溶液を６０℃で１時間加熱することにより、同時に除去した。次にこの溶液を冷蔵庫で４℃に冷却して、スピードバック (SpeedVac）真空濃縮器 (サヴァント・インスツルメンツ (Savant Instruments） [ファーミングデール (Farmingdale）、ニューヨーク州］）で約１mlまで濃縮した。粗ＰＢＡ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドを含む溶液を４℃で貯蔵して、後に高速液体クロマトグラフィーにより精製できた。
実施例５
本実施例は、ボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドの精製を例示する。
【０１１６】
粗トリチル化ボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドを、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを精製するのに一般的に利用される方法の変法を用いて、逆相ＨＰＬＣにより精製した。しかしトリチル化未修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドおよび標識オリゴデオキシリボヌクレオチドを精製するために一般に使用されるＣ１８およびＣ８相は、トリチル化ボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドには不十分にしか機能しなかった。所望の生成物に関連するピークは、非常にブロードであり、テーリングがひどく、不純物からの分離が不十分であった。Ｃ４相がよく機能し、満足な結果を与えることが見い出された。
【０１１７】
粗トリチル化ボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドの上記溶液のアリコート (１０〜１００μl）を、ヒューレット・パッカード・シリーズ (Hewlett Packard Series）１０５０液体クロマトグラフィーに結合した４．６mm×１５０mm  Ｃ４カラム (イナートシル (Inertsil）５μm、メタケム・テクノロジーズ (MetaChem Technologies） [トーランス、カリホルニア州］）に注入した。０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．５ (成分Ａ）中のアセトニトリル (成分Ｂ）の二相性線形勾配を使用して、クロマトグラムを展開した。勾配は以下のとおりとした：９５：５ (v/v）Ａ：Ｂ〜６５：３５ (v/v）Ａ：Ｂを２１分間で、次に１０：９０ (v/v）Ａ：Ｂを３分間で。流速は１．０ml/分とし、２８０nmのＵＶ検出を用いて分離を観測した。生成物のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、１８〜２２分でカラムから溶出したが、ＰＢＡ残基の数が多いほど対応して保持時間が長い。生成物を回収して、スピードバックで蒸発乾固して、油状ペレットを得た。このペレットを１mlの８０：２０ (v/v）氷酢酸：水に溶解して、室温で１時間放置することによりトリチル基を除去した。再び溶液をスピードバックで蒸発乾固して、油状ペレットを得た。ペレットを０．５mlの水に溶解して凍結保存した。１０μlのアリコートを、上記カラムおよび勾配を用いてＨＰＬＣにより分析した。この手順により得られたボロン酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドの純度は、一般に＞９０％であった (下記図８を参照）。
【０１１８】
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、参照することにより、全ての目的のためにその全体を本明細書の一部とした。本発明は、好ましい実施態様およびその実施例を参照して説明したが、本発明の範囲は、これらの記述される実施態様だけに限定されるものではない。当業者には明らかであるように、添付される請求の範囲により定義および限局される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、上述の発明には修飾および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（β−アラニル）アミノ−１，２−プロパンジオールを調製するための合成法を要約する。
【図２】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−［（４−ジヒドロキシ−ボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル］アミノ−１，２−プロパンジオール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトを調製するための合成法を要約する。
【図３】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−アラニルセリノールを調製するための合成法を要約する。
【図４】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−［（４−ジヒドロキシ−ボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル］セリノール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトを調製するための合成法を要約する。
【図５】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−［（３，５−ビス−ジ−ヒドロキシボリル（ピナコール環状エステル）ベンゾイル）−β−アラニル］セリノール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピルアミノホスホラミダイトを調製するための合成法を要約する。
【図６】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−アミノ−１，３−オクタン−ジオールを調製するための合成法を要約する。
【図７】  本発明の化合物である１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−８−Ｎ−［（４−ジヒドロキシ−ボリル（ベンゾピナコール環状エステル）ベンゾイル］アミノ−１，３−オクタンジオール３−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピルアミノホスホラミダイトを調製するための合成法を要約する。
【図８】  ５’末端に１、２、３および４つのアリールボロン酸残基を有する、自動合成により調製される４つのボロン酸修飾オリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフィー精製を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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