(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において異種遺伝子を強力に発現させるためのプロモーター活性を有する核酸分子であって：
ｉ）配列番号１で示される配列、またはその一部を有する配列であって、配列番号１の配列と同等のプロモーター活性を有する、核酸分子、あるいは
ｉｉ）該配列番号１で示される配列、またはその一部を有する配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２】
前記プロモーターが、前記異種遺伝子の発現を、植物の生長分裂組織において特異的に促進する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子、および該核酸分子と発現可能に接続された異種遺伝子を含む、発現ベクター。
【請求項４】
前記異種遺伝子が、２β水酸化酵素をコードする遺伝子である、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の発現ベクターにより形質転換された植物細胞。
【請求項６】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項７】
前記植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項８】
請求項５に記載の植物細胞により再生された植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の植物体の子孫。
【請求項１０】
請求項８に記載の植物体の花粉。
【請求項１１】
請求項９に記載の子孫により得られる種子。
【請求項１２】
植物の栄養生長組織における特異的な発現が所望される異種遺伝子を植物に導入する方法であって：
請求項３に記載の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程；および
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記異種遺伝子が、茎および／または葉の伸長を抑制する機能を持つ、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、植物遺伝子のプロモーターを用いる、有用植物の育種に関する。さらに詳しくは、イネの３β水酸化酵素２遺伝子（以下、ＯｓＧＡ３ｏｘ２という）のプロモーター遺伝子を用いる有用植物の育種に関する。
背景技術
草型の人為的改変、特に、伸長生長の抑制によって引き起こされる矮性は、作物育種において極めて重要な目標とされている。矮性は、正常な伸長生長の調節に関わる遺伝子に突然変異が生じた結果もたらされる生長異常である。植物の伸長生長は、細胞分裂と細胞伸長の積み重ねによってもたらされるが、それらは、温度、光などの外的環境要因、および植物ホルモンなどの内的環境要因のような様々な因子による複合的な影響によって調節されている。したがって、矮性に関わる遺伝子には、植物ホルモンの合成やその受容に直接関わるもの、それらの発現調節に関わるものなど様々な種類があることが予測される。なかでも、ジベレリンの生合成経路における異常が、矮性化の原因の１つとしてよく知られている。
高等植物におけるジベレリン生合成は３つの段階に分けられ、それぞれプラスチド、小胞体膜、細胞質に存在する酵素により触媒される。ＧＡ１２アルデヒド以降の第三段階では、早期１３位水酸化酵素と非水酸化酵素の２つの経路が存在する。両経路とも、ジベレリンは３位の炭素が３β水酸化酵素により水酸化されることによって生理的に活性化し、引き続き２位の炭素が２β水酸化酵素により水酸化されることによって不活性化される。
イネにおいて、３β水酸化酵素遺伝子は、少なくとも２種類（ＯｓＧＡ３ｏｘ１およびＯｓＧＡ３ｏｘ２）存在することが明らかになっている。そのうちの１つであるＯｓＧＡ３ｏｘ２は、イネ矮性遺伝子として古くから知られるＤ１８（ｄｙ）遺伝子座に対応することが示されている。他方、イネの２β水酸化酵素遺伝子ＯｓＧＡ２ｏｘ１は、２−オキソグルタル酸依存性酵素遺伝子群に属する新規遺伝子として単離された。ジベレリンの活性型と不活性型との変換に直接的に関わるこれらの酵素の発現を調節することにより、植物の伸長生長を抑制する試みがなされてきた（化学と生物、第３８巻、２０００年、１３１〜１３９頁）。この試みの１つにおいて、形質転換植物体内で２β水酸化酵素遺伝子の発現量を調節することにより、内生の活性型ジベレリン含量を変え、その結果として、所望の草丈の形質転換植物を得ようとする試みがなされた。しかし、従来の構成性プロモーターであるアクチンプロモーターを使用してＯｓＧＡ２ｏｘ１を植物体全体に強制発現させる場合、茎および葉に加えて、生殖器官においてジベレリンが常に代謝されてしまうため、極矮性を示すほどに内生ジベレリン含量が激減した形質転換体では、多量のジベレリンを必要とする生殖器官の正常な発育も妨げられてしまう。従って、２β水酸化酵素遺伝子の過剰発現により矮性形質転換植物を開発する場合、栄養生長組織において特異的に働くプロモーターを利用して、生殖器官への影響を抑えることが必要である。
タバコにおいて、３β水酸化酵素をコードする遺伝子（Ｎｔｙ遺伝子）について、植物における発現組織の局在が調べられた（Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９９）２０（１），１５−２４）を参照のこと）。この研究では、Ｎｔｙ遺伝子のプロモーター領域をＧＵＳ遺伝子に連結させ、植物体中の種々の組織における発現の様子を観察した。この結果、Ｎｔｙ遺伝子のプロモーター領域に連結されたＧＵＳ遺伝子は、栄養生長組織を含む、ジベレリン作用が生じている部位に制限されていた。本研究は、３β水酸化酵素をコードする遺伝子の発現とジベレリン作用との関連を見出したに過ぎない。よって、実用的に用いられ得る栄養組織特異的プロモーターは、未だ見出されていない。
従って、イネの遺伝子から、活性が高く、実用的にも使用され得る栄養生長組織発現のためのプロモーターが取得できれば、イネ等の作物を含む有用植物の品種改良に大いに貢献できる。
発明の開示
本願発明は、遺伝子工学的手法による植物の育種に関し、その目的は、栄養生長組織（特に茎および／または葉）で高い活性を有する植物遺伝子プロモーター、およびそれを含有する発現ベクター、ならびにその利用方法を提供することにある。
本願発明者らは、イネの３β水酸化酵素２（ＯｓＧＡ３ｏｘ２）遺伝子が栄養生長組織（特に、茎および／または葉）で高いプロモーター活性を示すことを見いだし、この知見に基づいて本願発明を完成したものである。
本願発明は、植物の栄養生長組織において異種遺伝子を特異的に発現させるためのプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１（図２Ａ〜Ｃ）で示される配列、またはその一部を有する配列であって、配列番号１の配列と同等のプロモーター活性を有する、ＤＮＡである。ここで、配列番号１で示される配列は、イネＯｓＧＡ３ｏｘ２構造遺伝子の５’上流域、第１エキソン、第１イントロン、および第２エキソンの一部を含む配列である。本願発明の１つの実施態様において、このＤＮＡは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載の配列またはその一部を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズする。
本願発明はまた、栄養生長組織（特に、茎および／または葉）において異種遺伝子を特異的に発現させるための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、配列番号１で示される配列、またはその一部を有する配列であって配列番号１の配列と同等のプロモーター活性を有する、イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターを含み、さらに、このプロモーターと発現可能に接続された異種遺伝子を含む。１つの実施態様では、上記異種遺伝子は、茎および／または葉の伸長を抑制する機能を持つ遺伝子であり得る。さらに１つの実施態様では、上記異種遺伝子は、２β水酸化酵素をコードする遺伝子である。本願発明はさらに、上記発現ベクターで形質転換された植物細胞（単子葉植物細胞または双子葉植物細胞であり得る）、この植物細胞により再生された植物体、この植物体の子孫および伝播体、およびこの子孫により得られる種子も提供する。
本願発明はさらに、植物の栄養生長組織における特異的な発現が所望される異種遺伝子を植物に導入する方法を提供する。この方法は、上記の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程；およびこの形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程を包含する。
上記の異種遺伝子は、茎および／または葉の伸長を抑制する機能を持つ遺伝子であり得る。このような遺伝子を上記方法において使用することにより、矮性植物を作製し得る。また、上記方法において、植物細胞は、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞のいずれかであり得る。
発明を実施するための最良の形態
本願発明について、以下に、より詳細に説明する。
（イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターの単離）
イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターは、イネのゲノミックライブラリーからスクリーニングされ得る。米国クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が市販しているイネのゲノミックＤＮＡライブラリー（Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ）が用いられ得る。
スクリーニング用のプローブとしては、本願発明者らが単離したイネＯｓＧＡ３ｏｘ２  ｃＤＮＡが用いられ得る。
まず、ファージλを用いて作製されたイネゲノミック遺伝子ライブラリーを大腸菌に感染させてプラークを形成させる。このプラークを常法に従って、ニトロセルロース等のメンブレンに移し、標識したスクリーニング用プローブでハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ終了後、洗浄し、オートラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイズすることが確認されたファージからＤＮＡを調製する。
調製したファージＤＮＡを、適当な制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離する。分離したＤＮＡ断片をナイロンメンブレンに移して、上記のスクリーニング用プローブをハイブリダイズさせ、シグナルの強さとバンドパターンの相違に基づいて、スクリーニングする。
最もシグナルの強いクローンはＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子を含み、弱いシグナルのクローンはＯｓＧＡ３ｏｘ２に類似しているがＯｓＧＡ３ｏｘ２ではない遺伝子を含んでいると考えられる。また、バンドパターンの比較により、遺伝子の一部を欠損したクローンを識別できる。さらに、バンドパターンに基づく各クローンの物理地図を作製することにより、プロモーターを構成すると推定される、構造遺伝子の５’上流域の長さが約１．６Ｋｂｐ程度あるクローンを特定できる。
以上の様にして、完全なＯｓＧＡ３ｏｘ２ゲノミック遺伝子が、単離され得る。
ＯｓＧＡ３ｏｘ２ゲノミック遺伝子の塩基配列をＯｓＧＡ３ｏｘ２  ｃＤＮＡの塩基配列と比較することにより、プロモーター領域が特定され得る。プロモーター配列としては、ゲノミック遺伝子がイントロンを有する場合は、構造遺伝子の５’上流域だけではなく、第１イントロン等の領域をも含み得る。本プロモーター配列は、好ましくは、配列番号１に示される配列である（図２Ａ〜Ｃもまた参照のこと）。配列番号に示される配列は、イネＯｓＧＡ３ｏｘ２構造遺伝子の５’上流域、第１エキソン、第１イントロン、および第２エキソンの一部を含む。
（ＧＵＳ活性の測定によるプロモーター活性部分の特定）
ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域が特定されると、その配列を切り出して、植物発現用ベクターにつなぎ込み得る。つなぎ込まれたプロモーターの活性を評価するために、そのプロモーターの下流にレポーター遺伝子、例えば、適当な酵素をコードする遺伝子を連結したプラスミドを作製し得る。このプラスミドを植物細胞中に導入し、遺伝子の発現を、例えば、酵素活性を測定して、観察する。植物を宿主とする場合には、例えば、ｐＢＩ２２１等のようなプラスミドを用いて、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を指標として測定するのが一般的であり、本願明細書においても、ＧＵＳの発現で測定する方法が適用され得る。
ＧＵＳ活性は、例えば、植物細胞工学、第４巻、第４号、２８１〜２８６頁（１９９２）、同第５巻、第５号、４０７〜４１３頁（１９９２）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ５（４）３８７−４０５（１９８７）に記載の手順を用いて測定され得るが、測定方法はこれに限定されない。簡単には、植物体の各組織または切片を、１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、７％（ｖ／ｖ）メタノール、および５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する組織化学基質溶液中に浸漬し、そして反応が進行するのに適当な温度および時間（例えば、ＣａＭＶプロモーターなどとＧＵＳの融合遺伝子を導入した場合、３７℃で３０分〜４時間）、インキュベートする。褐変およびＧＵＳ不活性化を防止するために、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤が添加され得る。例えば、２ｍＭ  ＤＴＴが、切りとってすぐ；（切片を作製する場合）寒天包埋の段階；切削の過程；または切片の減圧脱気時に添加され得る。また５ｍＭの濃度のＤＴＴが、３７℃におけるＧＵＳ反応時に添加され得る。次いで、エタノールを添加して反応を停止させ、脱色させ、そして組織または切片を顕微鏡または実体顕微鏡下で観察する。
ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域の様々な欠失体、例えば、５’上流側から様々な長さに欠損させたＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域をＧＵＳ遺伝子と融合させたプラスミドを用いてプロモーター活性を測定し、その活性に必須な部分等を特定し得る。このような活性部分の特定のための手法は、当業者には公知である。従って、例えば、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域に不要な配列を除去して得られる、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーターと同等の活性を有する配列も本願発明の範囲内にある。
いったんＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域およびその活性部分が特定されると、さらにその配列を改変して、プロモーター活性を高めたり、発現する組織について特異性を変更させることも可能である。例えば、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域またはその活性部分を一部改変して得られる、改変前と同等の活性を有する配列も本願発明の範囲内にある。
配列番号１（図２Ａ〜Ｃ）の配列を有するプロモーター領域は、栄養生長組織において特異的にその活性を発現する。従って、本願明細書において、プロモーター活性について「同等」であるとは、活性の強度が、少なくとも、基準となるプロモーター領域の活性の強度と同程度であると共に、活性の特異性も、少なくとも、基準となるプロモーター領域の活性の特異性と同程度であることをいう。用語「同等」は、活性の強度および活性の特異性が、基準となるプロモーター領域と比較して、明らかに高い場合を除外する意図ではないことに留意すべきである。「配列番号１の配列と同等のプロモーター活性を有する」とは、例えば、本願明細書の下記実施例と同様の条件でプロトプラストにおいてＧＵＳ遺伝子を発現させたとき、そのＧＵＳ活性が、配列番号１の配列についてのＧＵＳ活性の約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上であり、かつ、栄養生長組織において特異的にその活性を発現することをいう。
本願発明の範囲内に含まれる配列は、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域またはその活性部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み得る。本明細書中で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェンシー」は、標的に対する正確なほとんど正確な相補性を有する標的配列およびプローブの融解温度（Ｔｍ）未満の約５℃〜約２０℃または２５℃の範囲の条件をいう。本明細書中で使用するように融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算する方法は当該分野において周知である（例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１５２：ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびＳａｍｂｒｏｏｋｓら、（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，第１−３巻  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）（共に本明細書中で参考として援用される）。標準的な文献によって示されるように、Ｔｍ値の簡単な見積もりは、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる。（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（１９８５）を参照のこと）。他の文献は、Ｔｍの計算に構造ならびに配列特徴を考慮するより精巧な計算を含む。ハイブリッドの融解温度（従ってストリンジェントなハイブリダイゼーションについての条件）は、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）および標的の性質（溶液中に存在するまたは固定化されるＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在および非存在）のような種々の因子によって影響される。これらの因子の影響は周知であり、当該分野における標準的な文献で考察されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前掲）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７））を参照のこと。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ｐＨ７．０〜８．３の約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン塩濃度、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオンの塩濃度、ならびに短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃の温度、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）については少なくとも約６０℃の温度である。前記したように、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成することもでき、この場合、より低い温度が使用され得る。例えば、２つのポリヌクレオチドは、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互に特異的にハイブリダイズし得る場合、実質的配列同一性を有するとして同定される。本明細書中で使用する用語「実質的な同一性」、「実質的な配列同一性」または「実質的な類似性」は、核酸の情況においては、２つのポリヌクレオチドの間の配列類似性の尺度をいう。あるいは、実質的な配列同一性は、２つのヌクレオチド（またはポリペプチド）配列の間のパーセント同一性として記載できる。２つの配列は、それらが少なくとも約６０％同一である場合、好ましくは少なくとも約７０％同一である場合、または少なくとも約８０％同一である場合、または少なくとも約９０％同一である場合、または少なくとも約９５％もしくは９８％〜１００％同一である場合、実質的に同一であると考えられる。配列同一性の他の程度（例えば、「実質的」未満）は、異なるストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションによって特徴付けることができる。配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）のパーセント同一性は、典型的には、２つの配列の間の最適アライメントを決定し、そして２つの配列を比較することによって算定される。例えば、タンパク質発現で用いる外因性転写物は、参照配列（例えば、対応する内因性配列）と比較した同一性または類似性の特定のパーセントを有するとして記載され得る。配列の最適アライメントがＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検分によって、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムを用いて行われ得る。種々の方法によって得られた最良のアライメント（すなわち、最高パーセントの同一が得られること）を選択する。典型的には、これらのアルゴリズムは「比較ウィンドウ」（通常は少なくとも１８ヌクレオチドの長さ）にわたって２つの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較し、従って、小さい付加または欠失（すなわち、ギャップ）を可能にする。付加および欠失は、典型的には、付加または欠失を含まない参照配列に対して配列の２０パーセント以下の長さである。特定の長さまたは領域を参照して、２つの配列の間の配列同一性を記載することが時々望ましい（例えば、２つの配列は、少なくとも５００塩基対の長さにわたって少なくとも９５％の同一性を有するとして記載され得る）。通常、長さは少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、または５００塩基対、アミノ酸、または他の残基である。配列同一性のパーセントは、比較の領域にわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較する工程、��一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵ）が両配列に生じる位置の数を決定して適合された位置の数が得られ、そして参照配列または比較領域における塩基の総数と比較して適合した位置の数（またはパーセント）を決定する工程によって計算される。配列類似性を測定するのに適したさらなるアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；およびＳｈｐａｅｒ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８：１７９−１９１に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同一長さのワードとアラインされる場合に、いくつかの陽性評価された閾値スコアＴに適合するかまたはそれを満足するかのいずれかである問題の配列中に長さＷの短いワードを同定することによって、最初に高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接するワードスコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見い出すためのサーチを開始するための核として作用する。ワードのヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向におけるワードヒットの拡張は：累積アライメントスコアがその最大達成値から未知数Ｘだけ遠ざかる場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のために０以下になる場合；またはいずれかの配列の端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォールトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。用語ＢＬＡＳＴは、２つの配列の間の類似性の統計的解析を行うＢＬＡＳＴアルゴリズムをいう。Ｋａｒｌｉｎ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の適合性が偶然に起こる確率の指標を提供する。あるいは、２つの核酸配列が類似するという別の指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。
本願明細書において、栄養生長組織において「特異的に」発現するとは、目的とする遺伝子産物を栄養生長組織において、同じ植物体の他の組織または器官の少なくとも１種におけるよりも多く発現することをいう。「栄養生長組織」とは、植物において、有性生殖に直接関係しない組織を意味し、これには、根、茎、および葉のような栄養器官を構成する全組織が含まれる。栄養生長組織において「特異的に」発現するとは、例えば、遺伝子産物を、茎および葉の少なくとも一方において、同じ植物体の任意の部位の花器器官におけるよりも多く発現することをいう。このような発現の特異性は、本願明細書の下記実施例と同様の条件で形質転換植物を作製することにより評価し得る。
（発現カセットおよび組換えプラスミドの構築およびその利用）
活性が確認されたＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーター領域またはその活性部分を有する配列は、適当な植物発現ベクターに組み込まれ得る。この植物発現用ベクターに組み込まれた配列の３’末端側に、適当なリンカー配列、例えばマルチプルクローニングサイトを有するリンカーを導入して、植物宿主に適した発現カセットが作製され得る。従って、本願明細書において「異種遺伝子を挿入するための部位」とは、リンカーまたはリンカーと同様に作用する配列に含まれる部位をいう。この発現カセットには、所望により他の調節エレメントが含まれ得る。例えば、発現効率を向上させるため等の目的で、ターミネーター配列が含まれ得る。このターミネーター配列は、上記マルチプルクローニングサイトを有するリンカー配列を介して、プロモーター配列と結合され得る。この発現カセットは、使用される特定の宿主生物について適切な選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。
上記植物発現用カセットのプロモーターの３’下流、例えばマルチプルクローニングサイトに、発現が意図される異種遺伝子が発現可能に接続されて、組換えプラスミドを生じる。本願明細書において「異種遺伝子」とは、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子以外のイネまたは他の植物において内因性の遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子であって、その遺伝子産物の発現が栄養生長組織（特に、茎および／または葉）において所望される任意の遺伝子をいう。
このようにして生じた組換えプラスミドを用いて、植物細胞が形質転換され得る。植物細胞の形質転換は、アグロバクテリウムを用いる方法、プロトプラストへのエレクトロポレーションによる方法など、当業者に公知の任意の方法によって行い得る。例えば、植物細胞のプロトプラストの作製は、Ｋｙｏｚｕｋａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：４０８−４１３（１９８７）に記載の方法に従って行い得る。単子葉植物において好ましい、アグロバクテリウムを用いる形質転換方法としては、本発明者らにより開発された、ＰＣＴ／ＪＰ／０３９２０に記載の方法が挙げられる。この方法によって単子葉植物においても、より迅速で、かつ効率の良い形質転換体植物が得られるが、植物の形質転換に用いる方法はこれに限定されない。
形質転換された植物細胞を常法により再分化させて、形質転換された植物組織とし、さらに植物体とすることができる。形質転換のための組換えプラスミドの作製にあたって、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターは、例えば、細菌と植物の両宿主で発現可能なバイナリーベクターに組み込むことが可能である。このようなバイナリーベクターは当業者に周知である。例えば、アグロバクテリウムの発現系を含む、ｐＢＩ系などのベクターを用いると、微生物による植物への感染のシステムを利用し得る。適切な組換えプラスミドを用いることにより、イネ等の単子葉植物およびタバコ等の双子葉植物を含む任意の形質転換可能な植物に目的の異種遺伝子を導入し得る。
植物細胞とは、任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。
本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
本発明のプロモーターが作用し得る「植物」は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物の両方を包含する。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含まれる。好ましくは、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、アスパラガス、ジャガイモ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ナタネ、ホウレンソウ、トマト、ペチュニアなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法が適用される最も好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネである。
上述のように、ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターは、栄養生長組織（特に、茎および／または葉）において特異的に発現し得る。従って、異種遺伝子として、茎および／または葉の伸長を抑制する機能を持つ遺伝子を利用することにより、矮性植物を作製することができる。本願明細書において「茎および／または葉の伸長を阻害する機能を持つ遺伝子」とは、その遺伝子産物が茎および／または葉の伸長を抑制し得るもの（例えば、ジベレリン分解系に関与する酵素（特に、２β水酸化酵素（この酵素は、活性型ジベレリン（ＧＡ１およびＧＡ４）（３β水酸化酵素によって、ジベレリン基本骨格の３位の炭素が活性化されている）を、不活性型ジベレリン（ＧＡ８およびＧＡ３４）に、ジベレリン基本骨格の２位の炭素を水酸化することによって変換する）、細胞壁の拡大伸長に関与する酵素（例えば、種々の細胞壁多糖類合成酵素（例えば、グルカナーゼ、セルラーゼ、およびヘミセルラナーゼ）等をコードする遺伝子）と、その遺伝子自体が茎および／または葉の伸長を抑制する機能を示すもの（例えば、栄養生長組織（特に、茎および／または葉）の伸長時に発現する内因性遺伝子（例えば、ジベレリンの合成系に関与する遺伝子（例えば、シロイヌナズナＧＡ４遺伝子）およびジベレリンの合成系に関与する酵素（例えば、２０酸化酵素、３β水酸化酵素）をコードする遺伝子）のアンチセンスＲＮＡ、およびそのような内因性遺伝子を分解し得るリボザイム）とを含んでいう。矮性植物の選抜およびそれを用いる植物の品種改良のための手法は、当業者に周知である。植物の矮化には、上記ジベレリンのシグナル伝達系に関与する遺伝子、ならびにブラシノライド合成系およびシグナル伝達系に関与する遺伝子などもまた関与し得る。
上記の形質転換植物の作製はまた、矮性以外の形質を植物に付与するためにも利用し得る。例えば、毒性タンパク質をコードする異種遺伝子を用いることにより、茎葉を摂食する害虫などの制御を図ることができる。栄養生長組織（特に、茎および／または葉）での特異的な遺伝子発現を利用する、任意の有用植物の作製が、本願発明の範囲内にある。本発明のプロモーターによって発現される遺伝子には、化学物質を分解するタンパク質をコードする遺伝子もまた含まれる。このようなタンパク質として、除草剤分解タンパク質が挙げられる。除草剤分解タンパク質をコードする異種遺伝子を用いることにより、除草剤適用による所望の植物の選抜を図ることができる。
本発明のプロモーターの作用は、形質転換植物当代に加え、その後代植物にも遺伝し得る。形質転換当代植物および次世代植物、その伝播体（例えば、花粉）、およびその伝播体から生成された種子においても、本発明のプロモーターの作用は発揮し得る。後代への導入プロモーターの遺伝は、本プロモーターの配列をプローブとしたサザン分析によって確認され得る。
本願発明により、イネの遺伝子から、栄養生長組織（特に、茎および／または葉）で活性が高い、実用的なプロモーターの使用が提供される。従って、本願発明は、イネの品種改良のみならず、他の種々の植物の品種改良に利用され得る。
（実施例）
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。この実施例は、本発明を限定するものではない。実施例で使用した、材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
（実施例１：イネＯｓＧＡ３ｏｘ２プロモーターによるＧＵＳ遺伝子の発現）
１．イネＯｓＧＡ３ｏｘ２ゲノミック遺伝子の単離：ゲノミックライブラリーからのスクリーニング
（植物材料）
イネ種子（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ジャポニカ品種：「日本晴」、「どんとこい」「コシヒカリ」など）を１％次亜塩素酸ナトリウム中で１時間入れて滅菌し、そして滅菌蒸留水で完全にリンスした。土壌上で発芽させ、そして温室内で生長させた。
（手順）
ＰＣＲを、報告されたＧＡ３β水酸化酵素配列間の保存領域から設計した鋳型および縮重プライマー（５’プライマー：５’−ＧＴＮＧＴＮＡＡＲＧＴＮＧＧＮＧＡＲＲＴ−３’（配列番号２）；３’プライマー：５’−ＡＹＹＴＡＲＴＣＲＴＴＧＧＡＮＧＴＮＡＣ−３’（配列番号３））としてイネゲノムＤＮＡを用いて実施した。これらの産物の１つの推定されたアミノ酸配列プライマーは、報告されたＧＡ３β水酸化酵素の対応する領域に類似であった。報告されたＧＡ３β水酸化酵素配列から予期されたサイズに対応する２１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。このＰＣＲ産物をイネゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。いくつかのクローンを単離し、そして各ゲノムクローンの制限地図に基づいて２つのグループに分けた。最後に、各グループの１つを配列決定し、そして各クローンをＯｓＧＡ３ｏｘ１およびＯｓＧＡ３ｏｘ２と称した（ＯｓＧＡ３ｏｘ１およびＯｓＧＡ３ｏｘ２はそれぞれ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＧＡ３β水酸化酵素−１およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＧＡ３β水酸化酵素−２をいう）。これは、ＧＡ３β水酸化酵素遺伝子全体を含んだクローンＯｓＧＡ３ｏｘ１およびＯｓＧＡ３ｏｘ２の単離を生じた。ＯｓＧＡ３ｏｘ１は、本発明者がプローブとして使用したフラグメントと配列を共有したが、ＯｓＧＡ３ｏｘ２は、フラグメントから対応する領域で異なる配列を含んだ。ＧＡ３β水酸化酵素をコードする全長ｃＤＮＡクローンを、特異的プライマーを用いてイネ茎頂および開花していない花器から単離された全ＲＮＡを使用して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得た。ＲＮＡゲルブロット分析およびＤＮＡゲルブロット分析のために、遺伝子特異的プローブであるＯｓＧＡ３ｏｘ２全ｃＤＮＡ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＰｖｕＩＩ（５１９ｂｐ）フラグメントおよびＯｓＧＡ３ｏｘ１由来のＫｐｎＩ−ＰｖｕＩＩ（３１０ｂｐ）フラグメントを使用した。各特異的プローブをプローブとしてゲノムサザンハイブリダイゼーションのために使用したとき、交差ハイブリダイゼーションは検出されなかった（データは示さず）。各ｃＤＮＡ（ＯｓＧＡ３ｏｘ１またはＯｓＧＡ３ｏｘ２）はそれぞれ、３７９アミノ酸または３７０アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有した（データは示さず）。ゲノムＯｓＧＡ３ｏｘ２は、短いサイズ（１１０ｂｐ）を有する１つのイントロンを含んだ。このイントロンは、双子葉植物において以前に報告されたＧＡ３β水酸化酵素と同じ位置に位置した。他のクローンＯｓＧＡ３ｏｘ１は、２つのイントロンを含んだ。一方は、ＯｓＧＡ３ｏｘ２の場合と同じ位置に位置した。それはほとんど同等のサイズであった（１１０ｂｐ）。他方は、補因子の結合の位置に位置した。補因子２−オキソグルタル酸（４００ｂｐ）の結合の位置に位置した（データは示さず）。両クローンの推定アミノ酸配列は、他のＧＡ３β水酸化酵素に対する高度の類似性を共有したが、それらは互いに対して最も高い類似性を示した（５６．６％同一度および８８．２％類似性）。
２．ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターを有する組換えプラスミドの作製
イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターを有するベクターの作製を図１に示す。
イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子の５’非翻訳領域を含み得る断片を得るために、１．により得られたクローンをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロース電気泳動により約２．５Ｋｂｐの断片を回収した。ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のプロモーターの機能を確認するために、植物細胞用発現ベクターｐＢＩ１０１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。本ベクターは、順に、ノパリン合成酵素プロモーター（ＮＯＳ−Ｐｒｏ）、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩコーディング領域（ＮＰＴＩＩ（ＫＯＮ  Ｒ））、ノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ−Ｔ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コーディング領域およびノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ−Ｔ）を有している。このｐＢＩ１０１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化した。この発現ベクターに挿入するために、上記ＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子断片をさらにＳｍａＩで消化した。得られた断片は、クローン挿入配列の１番目から２，４０６番目までの配列を有し、そして５’非翻訳配列、第１エキソン、第１イントロン、および第２エキソンの一部を含んだ（図２Ａ〜Ｃ）。断片の５’末端側は、ＢａｍＨＩ部位であり、３’末端はＳｍａＩ部位である。この断片を、上記の制限消化した発現ベクターに連結し、ＧＵＳレポーター遺伝子との融合を含むｐＢＩ１０１−Ｈｍ３を作製した。本発現ベクターには、ハイグロマイシン耐性を付与するために、ＧＵＳコーディング領域の下流に、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（３５Ｓ）とノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）との間に位置する）もまた挿入した。
３．イネ種子への形質転換とＧＵＳ遺伝子の発現
イネの代表的品種である日本晴の種子を、籾殻の除去後、無傷の状態で、７０％エタノール中に１０秒間置いた後、水洗し、その後０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および２．５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣ１０）の水溶液中に３０分置くことにより殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。
（前培養）
種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した。
（植物発現用ベクター）
上記で生成したｐＢＩ１０１−Ｈｍ３で、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１を形質転換した（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１（１９８６））。ＥＨＡ１０１は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来の菌である。アグロバクテリウムを、ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＡＢ培地（グルコース（５ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１．３ｇ／Ｌ）、ＮＨ４ＣＩ（１ｇ／Ｌ）、ＫＣＩ（１５０ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ／Ｌ）、Ｆ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．５ｍｇ／Ｌ）、ｐＨ７．２、ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（１．５％）（３ｇ／２００ｍｌ）、１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１２０μｌ／１００ｍｌ））中に、２〜３日間、２５℃で暗所で培養した。
（アグロバクテリウム感染）
アセトシリンゴン２μｇ／ｍｌを添加したＡＡＭ培地（ＡＡ−１（×１０００）１ｍｌ（ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ（１０００ｍｇ／１００ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（３００ｍｇ／１００ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ／１００ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（２５ｍｇ／１００ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．５ｍｇ／１００ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２．５ｍｇ／１００ｍｌ）、ＫＩ（７５ｍｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−２（×１０００）１ｍｌ（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１５．０ｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−３（×１０００）１ｍｌ（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２５ｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−４（×１０００）１ｍｌ（Ｆｅ−ＥＤＴＡ（４．０ｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−５（×１０００）１ｍｌ（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１５．０ｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−６（×２００）５ｍｌ（ニコチン酸（２０ｍｇ／１００ｍｌ）、チアミンＨＣｌ（２００ｍｇ／１００ｍｌ）、プリドキシンＨＣｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）、ミオイノシトール（２０００ｍｇ／１００ｍｌ））、ＡＡ−Ｓｏｌ（×１００）１０ｍｌ（Ｌ−アルギニン（５３００ｍｇ／３００ｍｌ）、グリシン（２２５ｍｇ／３００ｍｌ））、ＡＡ−ＫＣｌ（×５０）２０ｍｌ（ＫＣｌ（３ｇ／２０ｍｌ））、カザミノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６８．５ｇ／Ｌ）、グルコース（３６ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（９００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸（３００ｍｇ／Ｌ）、ｐＨ５．２）中に形質転換されたアグロバクテリウムを懸濁させた。この懸濁液に、前培養した上記種子を９０秒間浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２５℃で保温して共存培養した。
（除菌および選抜）
共存培養の完了後、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行った。
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充した、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、７日間、３０℃で保温した。
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置き、さらに７日間、３０℃で保温した。
（再分化）
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカサミノ酸、２ｍｇ／ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を置き、２週間、３０℃で保温した。第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、３０℃で保温した。
（鉢上げ）
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。
４．ＧＵＳ染色の組織特異的発現
植物組織における上記プロモーターによる遺伝子発現を検討するために、ＧＵＳ活性の組織化学的分析を行った。このような組織化学的分析は、植物細胞工学、第４巻、第４号、２８１〜２８６頁に記載の手順を用いて実施した。本方法は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：３９０１−３９０７（１９８７））に準拠し、Ｋｏｓｕｇｉらの改良を伴う（Ｋｏｓｕｇｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７０：１３３−１４０（１９９０））。簡単には、切除した切片を、５％（ｗ／ｗ）寒天中に包埋し、そして寒天ブロックをマイクロスライサーを用いて薄く切った。厚さ１００〜１３０μｍの組織切片を、１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、７％（ｖ／ｖ）メタノール、および５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する組織化学基質溶液中に浸漬し、そして３７℃で４時間インキュベートした。２ｍＭ  ＤＴＴを、切りとってすぐ；寒天包埋の段階；切削の過程；または切片の減圧脱気時に添加した。また５ｍＭの濃度のＤＴＴを、３７℃におけるＧＵＳ反応時に添加した。エタノールを添加して反応を停止させ、脱色させ、そして切片を顕微鏡下で観察した。この結果、イネの茎において高いＧＵＳ活性がみられた。茎を顕微鏡で観察したところ、茎壁がＧＵＳ活性によって青く染色されていた（図３）。
（実施例２：イネＯｓＧＡ３ｏｘ２プロモーターによる２β水酸化酵素遺伝子の発現）
実施例１の第２節において、イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーター領域として、イネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のＢａｍＨＩ部位からＳｍａＩ部位までの領域の代わりにイネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のＸｂａＩ部位からＳｍａＩ部位までの領域（図２Ａ〜Ｃを参照のこと）を、ＧＵＳコーディング領域の代わりに２β水酸化酵素をコードする遺伝子（ＯｓＧＡ２ｏｘ１）のコーディング領域を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、イネ種子を形質転換および再生させて、トランスジェニック植物を作製した。
植物発現用ベクターの作製について、以下に説明する。
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｅ  Ｌ．、品種：日本晴）由来のゲノムＤＮＡを増幅するために、推定Ａｌａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＧＡ  ２β−ヒドロキシラーゼ遺伝子、ジオキシゲナーゼのＭａｒａｈ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ  ｍＲＮＡ（受入番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｙ０９１１３；ＭａｃＭｉｌｌａｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３，１３６９−１３７７（１９９７））、イネＧＡ２０酸化酵素遺伝子（受入番号Ｕ５０３３３；Ｔｏｙｏｍａｓｕら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．９９，１１１−１１８（１９９７））、イネＧＡ３β水酸化酵素遺伝子および他の２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素の保存領域から設計した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作製した（順方向プライマー、５’−ＧＧＮＴＴＹＧＧＮＧＡＲＣＡＹＷＣＮＧＡＹＣＣ−３’（配列番号４）；および逆方向プライマー５’−ＧＧＩＳＨＩＳＣＲＡＡＲＴＡＤＡＴＩＲＴＩＳＷＩＡ−３’（配列番号５））。増幅フラグメント（約８０ｂｐ）をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、そしてそれらの配列を確認した。６４の独立したクローンの１つが、新規な２−オキソグルタル酸依存性様アミノ酸を含み、そして、これは、イネＧＡ２β水酸化酵素遺伝子をコードすると推定された。この部分アミノ酸配列を使用して、ＤＤＢＪ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅを検索し、１つのイネＥＳＴクローン（受入番号Ｃ７２６１８）を得た。このＥＳＴクローンの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマー（順方向プライマー、５’−ＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧ−３’（配列番号６）；および逆方向プライマー５’−ＣＴＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴ−３’（配列番号７））を設計し、そしてＰＣＲにおいてイネゲノムＤＮＡの鋳型として使用した。増幅されたフラグメントを、ｐＣＲ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、そしてそれらの配列を確認した。この２３０ｂｐフラグメントをｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンについてスクリーニングするためのプローブとして使用した。
イネ未熟種子から構築したｃＤＮＡライブラリーおよびＳａｕ３ＡＩで部分消化したイネゲノムＤＮＡから構築したゲノムライブラリーを、上述のように調製したプローブを用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、６５℃で１４時間、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）、５×デンハート溶液（１×デンハート溶液は、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、０．０２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）である）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および２０ｍｇ／ｌサケ精子ＤＮＡ中で行い、そしてフィルターを、室温で２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で洗浄した。スクリーニングにより得られたｃＤＮＡをＯｓＧＡ２ｏｘ１と称し、これは、３８２アミノ酸配列を含む１，１４６ｂｐのオープンリーディングフレームを含んだ（データは示さず）。ＯｓＧＡ２ｏｘ１のｃＤＮＡを、その５’側を制限酵素ＥｃｏＲＩで、そしてその３’側を制限酵素ＥｃｏＲＶで切り出し、ｐＢＩ１０１ベクターにインフレームに連結されるように平滑化し、次いで、このベクターのＳｍａＩ部位に連結した。実施例１の２．節で得たイネＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、さらにＸｂａＩおよびＳｍａＩで消化した。上記ｐＢＩ１０１ベクターにおいて、ＯｓＧＡ２ｏｘ１の上流のＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位にこのＯｓＧＡ３ｏｘ２断片を連結した。
成長した植物を図４に示す。図４の右側が、形質転換種子から得られた植物体を示し、左側は未処理のコントロール植物を示す（日本晴）。形質転換植物は、コントロール植物に比較して、明らかに背丈が低く、矮化していた。これは、本発明のプロモーターによって、茎において２β水酸化酵素が発現されたことを示す。
産業上の利用可能性
本願発明におけるＯｓＧＡ３ｏｘ２遺伝子プロモーターは、茎葉で非常に高い活性を有している。従って、本願発明は、栄養生長組織の遺伝子操作による、イネ等の植物の品種改良のために有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本実施例で使用した発現ベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ３の作製を示す模式図である。
図２Ａ〜Ｃは、ＯｓＧＡ３ｏｘ２の５’非翻訳配列、第１エキソン、第１イントロン、および第２エキソンの一部を含む領域の配列を示す図である。図中、大文字の塩基は、エキソン部位を示し（１５６７位〜２０３９位および２１５１位〜２４０６位）、下方にコードされたアミノ酸の配列を示す。図２Ａ〜Ｃにおいて、制限酵素認識部位もまた示す。
図３は、茎のＧＵＳ組織染色の結果を示す写真である。
図４は、本プロモーターが連結されたＯｓＧＡ２ｏｘ１遺伝子により形質転換された矮性植物を示す写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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