(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気穿孔用パルス波形を生成するための装置であって、前記装置は、
第１の出力電圧を提供する第１の電力供給部と、
第２の出力電圧を提供する第２の電力供給部とを含み、前記第１および第２の電力供給部は別々の電気エネルギ源であり、さらに、
電磁気的に結合された一次巻線および二次巻線を有する変圧器とを含み、前記二次巻線は１対の出力端子間に配置され、さらに、
前記第１の電力供給部および前記一次巻線に結合されて、第１のゲーティング信号に応答して前記第１の電力供給部から前記一次巻線に前記第１の出力電圧を印加する第１のスイッチと、
前記第２の電力供給部および前記二次巻線に結合されて、第２のゲーティング信号に応答して前記第２の電力供給部から前記二次巻線に前記第２の出力電圧を印加する第２のスイッチと、
ユーザ特定の出力パルス波形を受取って前記出力端子に前記特定された出力パルス波形を生成するよう前記第１および第２のゲーティング信号を提供するコントローラとを含む、装置。
【請求項２】
前記第１の電力供給部は第１の供給信号に比例する大きさを有する第１の出力電圧を提供し、
前記第２の電力供給部は第２の供給信号に比例する大きさを有する第２の出力電圧を提供し、
前記コントローラは前記第１および第２の供給信号を提供して前記出力端子において前記特定された出力パルス波形を生成する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１および第２の電力供給部の各々は、エネルギ蓄積リザーバならびに前記第１および第２のスイッチに選択的に結合される電力源である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
各エネルギ蓄積リザーバはキャパシタを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記第１および第２のスイッチは各々、トランジスタを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記第１および第２のスイッチは各々、絶縁ゲートバイポーラ接合トランジスタを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項７】
前記変圧器は１０マイクロヘンリーより低い漏れインダクタンスを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記コントローラはマイクロプロセッサを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記コントローラに結合されたユーザインターフェイスをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
各々が前記出力端子のうち異なる一つに電気的に接続される１対の電極をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記出力端子のうち一つと前記二次巻線との間に電気的に挿入されるダイオードをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記第２のスイッチと前記第２の電力供給部とは直列に結合され、前記直列結合は前記二次巻線と電気的に並列に取付けられる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記第２のスイッチおよび前記第２の電力供給部と直列に結合されたダイオードをさらに含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１のスイッチおよび前記第１の電力供給部は直列に結合され、前記直列結合は前記一次巻線と電気的に並列に取付けられる、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記電極は板電極を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
前記電極は針電極を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記電極間の距離を感知しかつそれを表わす電子的ギャップ距離出力信号を提供するギャップセンサをさらに含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
電気穿孔用パルスを発生する装置であって、
一次巻線および二次巻線を含む変圧器と、
前記一次巻線に結合され、ゲーティング信号の受信に応答して前記一次巻線にわたって第１の予め定められた電圧を印加する第１の電気エネルギ源と、
前記二次巻線に結合され、ゲーティング信号の受信に応答して前記二次巻線にわたって第２の予め定められた電圧を印加する第２の電気エネルギ源とを含み、前記第１および第２の電気エネルギ源は別々の電気エネルギ源であり、さらに、
コントローラを含み、前記コントローラは、
１または複数の出力パルスの出力パルスパターンを特定するユーザ入力を受取るステップを含み、前記ユーザ入力は各パルスの持続時間を特定しかつ第１の予め定められた出力レベルまたは第２の予め定められた出力レベルのいずれかを特定し、さらに、
前記第２の予め定められた出力レベルの各パルスについて、前記特定された持続時間の間、ゲーティング信号を前記電気エネルギ源のうち一方に印加するステップと、
前記第１の予め定められた出力レベルの各パルスについて、前記特定の持続時間の間、前記第２の電気エネルギ源にゲーティング信号を同時に印加しながら、前記第１の電気エネルギ源にゲーティング信号を印加するステップとを含むステップを行なうことによって、電気穿孔用パルスパターンを生成するようプログラミングされる、装置。
【請求項１９】
電気穿孔用パルスを発生する装置であって、
一次巻線および二次巻線を含む変圧器と、
前記一次巻線に結合され、第１のゲーティング信号に応答して前記一次巻線にわたって第１の予め定められた電圧を印加する第１の電気エネルギ源と、
前記二次巻線に結合され、第２のゲーティング信号に応答して前記二次巻線にわたって第２の予め定められた電圧を印加する第２の電気エネルギ源とを含み、前記第１および第２の電気エネルギ源は別々の電気エネルギ源であり、さらに、
前記第１および第２のエネルギ源に電気的に結合されたコントローラを含み、
前記コントローラは、
（ａ）前記変圧器の前記二次巻線の端子に第１の電圧を印加することによって前記二次巻線の端子に第１の電圧を生成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の開始後予め定められた遅延の後に、前記二次巻線の端子への前記第１の電圧の印加を維持しながら同時に前記一次巻線の端子に第２の電圧を印加するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の開始後予め定められた遅延の後に、前記一次巻線の端子への前記第２の電圧の印加を終了する一方で、予め定められた時間期間、前記二次巻線の端子への前記第１の電圧の印加を維持するステップとを含む方法ステップを実行するようプログラミングされる、装置。
【請求項２０】
前記コントーラはさらに、前記ステップ（ａ）に先立って、
所望の電界を特定する入力を受信するステップと、
電極のギャップ距離を特定する入力を受信するステップと、
前記特定された電極ギャップ距離にわたって前記特定された電界を提供するための前記第１の電圧を計算するステップとを含む方法ステップを実行するようプログラミングされる、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記変圧器の予め定められた接触子に電気的に結合された１対の電極と、
前記電極間の電極ギャップ距離を感知してそれを表わす電極ギャップ距離出力信号を提供するギャップセンサとをさらに含み、
前記コントローラはさらに、
所望の電界の入力を受信するステップと、
前記電極ギャップ距離出力信号を受信するステップと、
前記電極にわたって前記入力された所望の電界を提供する前記第１の電圧を計算するステップとを含むステップを実行するようプログラミングされる、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
一次巻線および二次巻線を含む変圧器を含む電気穿孔用パルス装置において電気穿孔用パルスパターンを生成するための方法ステップを実行するためのデジタル処理装置によって実行可能な、機械可読命令のプログラムを具体的に実装する、データ記憶媒体を含む製造部品であって、前記方法ステップは、
１または複数の出力パルスの出力パルスパターンを特定するユーザ入力を受信するステップを含み、前記ユーザ入力は、各パルスの持続時間、および、第１の予め定められた出力レベルまたは第２の予め定められた出力レベルのいずれかを特定し、さらに、
前記第１の予め定められた出力レベルの各パルスに対して、前記特定された持続時間の間、前記変圧器の前記二次巻線の端子に第１の予め定められた電圧を印加するステップと、
前記第２の予め定められた出力レベルの各パルスに対して、前記変圧器の前記二次巻線の端子に前記第１の予め定められた電圧を印加する一方で同時に、前記特定された持続時間の間、前記変圧器の前記一次巻線の端子に、前記第１の予め定められた電圧とは実質的に異なる第２の予め定められた電圧を印加するステップとを含む、製造部品。
【請求項２３】
変圧器の二次巻線の端子において段階式の電気穿孔用パルスパターンを生成するための方法ステップを実行するデジタル処理装置によって実行可能な、機械可読命令のプログラムを具体的に実装する、データ記憶媒体を含む製造部品であって、前記変圧器はまた、前記二次巻線に電磁気的に結合されかつ１対の一次巻線の端子を有する一次巻線を含み、前記方法ステップは、
（ａ）前記二次巻線の端子に第１の電圧を印加することによって前記二次巻線の端子において第１の電圧を生成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の開始後予め定められた遅延の後に、前記二次巻線の端子への前記第１の電圧の印加を維持しながら、同時に、前記一次巻線の端子に前記第１の電圧とは実質的に異なる第２の電圧を印加するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の開始後予め定められた遅延の後に、前記一次巻線の端子への前記第２の電圧の印加を終了し、かつ、予め定められた時間期間の間、前記二次巻線の端子への前記第１の電圧の印加を維するステップとを含む、製造部品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は一般に、電気による細胞操作に関する。より特定的には本発明は、細胞内に分子をより効率的に導入しかつ細胞組織への損傷を最小にするための、ユーザが選択したパルス方式に従って電界を生成しかつ印加する、電気穿孔装置および方法に関する。
背景技術
細胞は、細胞の細胞質内にその膜を通過して分子が入り込むことに対して生来の抵抗力を有する。科学者達は１９７０年代に初めて「電気穿孔法」を発見した。これは、電界を使用して細胞に、永続的な損傷を与えることなく孔を開ける方法である。この電気穿孔法はさらに、細胞に一時的に孔を開けて細胞内に分子がそれらを通じて入り込むことができるようにすることによって、種々の分子を細胞の細胞質内に挿入するのに役立つよう、開発されてきた。
電気穿孔法は、多種多様の細胞内に物質を移植するのに使用されてきている。このような細胞にはたとえば、卵、血小板、ヒト細胞、赤血球、哺乳類細胞、植物プロトプラスト、植物花粉、リポソーム、細菌、菌類、酵母、および精子などが含まれる。さらに、電気穿孔法は、ここでは「移植物質」、「移植分子」、「移植薬剤」と称される、種々の物質を移植するのに使用されてきている。すなわち、これらの物質には、ＤＮＡ、遺伝子、およびさまざまな化学薬剤が含まれる。
生きた細胞内に異質物質を導入するのに、電気穿孔法はインヴィトロおよびインヴィヴォの双方で使用されてきている。インヴィトロの応用においては、生きた細胞のサンプルをまず移植薬剤と混合して、平行板等の電極間に配置する。その後、その細胞と移植片との混合物に対して電極が電界を印加する。インヴィトロの電気穿孔法を行なうシステムは、例として、Electro Cell Manipulator ECM 600の製品およびElectro Square Porator T820を含み、これらはいずれもBTX Division of Genetronics,Inc.によって製造されたものである。
電気穿孔法のインヴィヴォでの応用においては、電極は、治療の対象となる細胞の領域を覆う表皮をつかむカリパス内に設けられる。より深く位置する細胞に到達するためには、代替的に、患者に針状の電極を挿入してもよい。いずれの場合にも、治療領域に移植薬剤を注入した後に、電極によってその領域に電界を印加する。インヴィヴォの電気穿孔法を行なうシステムの例として、Electro Cell Manipulator ECM 600の製品およびElectro Square Porator T820があり、これらはいずれもBTX Division of Genetronics,Inc.によって製造されたものである。
インヴィヴォの電気穿孔法の応用において研究中のものに、電気化学療法がある。これは、電気穿孔法を使用して、腫瘍細胞内に直接、化学療法用薬剤を入れるものである。この治療は、腫瘍内に直接、抗がん剤を注入して、１対の電極間で腫瘍に対して電界を印加することによって行なわれる。薬剤の分子は、腫瘍細胞の間、腫瘍細胞の内部およびその周辺における間質液内に懸濁される。腫瘍細胞に電気穿孔を行なうことにより、それらの細胞の多くに隣接する薬剤の分子が細胞内に入り込み、その結果として癌性の腫瘍細胞を死滅させる。
この応用において電気穿孔法が特に有利であるのは、電気穿孔法によって使用される移植薬剤の量が減じられることである。このような薬剤はしばしば、正常な細胞には有害である。特に、電気穿孔法によれば移植薬剤が実際に細胞内に入る量が増すため、腫瘍領域内に導入する移植薬剤の量を低減することが可能となる。電気穿孔法は化学療法としても有益である。なぜなら、ブレオマイシン等の非常に効果が期待される抗がん剤のいくつかは、ある種の癌細胞の膜を通常では通過できないためである。しかし、電気穿孔法における最近の実験では、ブレオマイシンを細胞内に直接挿入することが可能であることがわかった。
（インヴィトロおよびインヴィヴォのいずれの場合も）公知の電気穿孔技術は、治療領域のまわりに位置付けられた電極に対して、短い高電圧のパルスを印加して行なう。電極間に生成された電界が、細胞膜を一時的に有孔とする。そこで、移植薬剤の分子が細胞に入ることができるようになるのである。公知の電気穿孔法の応用例においては、この電界は約１００μｓの持続時間を有する１０００Ｖ／ｃｍ程度の、単一の方形波パルスを含む。このようなパルスは、たとえば、
BTX Division of Genetronics,Inc.によって製造されたElectro Square Porator T820の公知の応用において生成され得る。
ある種の応用には公知の電気穿孔法が好適ではあるが、場合によっては、電界が実際に電気穿孔された細胞に対して損傷を与えるおそれがある。たとえば、過剰に印加された電界は、細胞壁に永続的な孔を開けて細胞に損傷を与えるおそれがある。極端な例では、電界が完全に細胞を破壊しかねない。
このような望ましくない影響を取除く試みとして、少なくとも１つの応用において、複数パルスの使用が提案されている。一応用例においては、たとえば、電気機械リレーを使用して、連続的な第１および第２のパルスを提供する方法が提案されている（S.I.Sukharev et al.,Biophys.J.Vol.63,November 1992,pp.1320-1327）。より特定的には、Sukharevは、図１に示す電界パルス１００を使用する。このパルス１００は、（１）第１の、持続時間の短い高電圧パルス１０２、（２）Δｔの遅延１０３、この間パルスは生成されない、および、（３）第２の、持続時間の長い低電圧パルス１０４を含む。第１のパルス１０２は膜に孔を開けるためのものであり、これに対し、第２のパルス１０４は、ＤＮＡを細胞の細胞質ゾル内へと電気泳動にかけるためのものである。Sukharevは、この遅延１０３が長すぎてはならないと認識している。
Sukharevのシステムはある応用においては満足な結果が得られるものであるが、用途によっては十分であるとは言えない。たとえば、Sukharevの電気穿孔法では移植薬剤内の十分な量の分子を対象となる細胞内に有効に移動させることができないことを発見した利用者もいるであろう。これは、Sukharevで使用された第１のパルス１０２と第２のパルス１０４との間の遅延１０３が長すぎたことに起因すると本願の発明者は認識している。電気穿孔法によって開けられた細胞の孔は、その細胞の温度に概して依存する一定時間期間、開いた状態を保つ。したがって、第１のパルスの影響が、第１のパルスと第２のパルスとの間の遅延の間に、大幅に減少し始めることがある（それにより、細胞の孔が閉鎖される）。ある応用においては、これによって第１のパルスの細胞に対する影響が、第２のパルスが発生するまでに完全に打ち消される場合がある。結果として、Sukharevの電気穿孔法の効力は、場合によっては不十分であるおそれがある。さらに、第１のパルスが有効でなければ、Sukharevのシステムにおける第２のパルスを、それが細胞を完全に破壊してしまう程度にまで上昇させる必要も出てくる。
上述の遅延は、電気機械リレーを使用するSukharevのシステムには固有のものである。Sukharevは個別のパルス発生器を使用し、それらの出力が選択的にリレーによって電極の出力に結合される。しかしながら、当該技術分野において公知なように、電気機械のリレーの切換は一般に、かなりの時間を要し、時には５０〜１００ｍｓに及ぶ場合もある。したがって、Sukharevによって達成される移植薬剤の効力は、応用によっては低すぎる場合がある。
「高電圧の生体高分子融合システム（″High-Voltage Biological Macromolecule Fusion System″）」と題された米国特許第４，６６３，２９２号は特定された電圧の大きさの出力放電パルスのパルス持続時間の制御のために出力高電圧変圧器を使用する、電気穿孔装置を教示している。
「生体細胞を浸透可能にするための方法および装置（″Method and Device for Making Living Cells Permeable″）」と題されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／１８１０３号は、電気穿孔において生体細胞に単一の短い高電界パルスを印加することによって放電パルスを制御して、これらの細胞を細胞に導入されるべき分子構造の薬剤物質に対して浸透可能とする、電気穿孔装置を教示している。この装置は、その後、少なくとも１つの、電界の大きさがより小さい、より長い電気パルス放電を生成する。
このように、本願の発明者によって認識されるように、既存の電気穿孔システムは、電界を過剰に生成するため、または隣接するパルス間に存在する遅延のために、ある種の応用においては好適でない場合がある。さらに、既存の電気穿孔システムの多くは、パルスの振幅、持続時間、数等の、電界パルスのパラメータに対して十分に制御が効かない。
発明の開示
概して、本発明は、ユーザが特定したパルス方式に従って電界を生成しかつ印加する、電気穿孔方法および装置に関する。このようなパルス方式の一例は、第１の持続時間を有する低電圧パルスと、そのすぐ後に続く第２の持続時間を有する高電圧パルスと、その後すぐに続く第３の持続時間を有する低電圧パルスとを含む。本発明は、細胞の表面に分子を蓄積するために低電圧の電界を提供し、細胞に開口部を設けるために適切な高電圧電界を提供し、最後に、細胞内へと分子を移動させるために低電圧電界を提供する。
分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの一部、化学薬剤または他の分子等の、遺伝子または薬剤であり得る。分子は、細胞を取囲む間質細胞内、または、細胞を含む液状媒体内のいずれかにおいて、細胞に密接して配置される。
したがって、本発明の一局面は、細胞内に分子をより効率的に導入しかつ細胞組織への損傷を最小に抑えるための、ユーザの選択したパルス方式に従って電界を生成しかつ印加する方法に関する。
本発明の別の局面は、そのパルス方式を生成しかつ印加するための、電気パルス発生器を含む装置に関する。このような装置の一実施例は、以下の構成要素を利用する。すなわち、第１および第２の電力供給部が第１および第２の出力電圧をそれぞれ提供する。一次巻線および二次巻線を有する変圧器は、二次巻線に結合された１対の出力端子を有する。第１のスイッチは、第１のゲーティング信号に応答して、一次巻線に対して第１の出力電圧を印加する。第２のスイッチは、第２のゲーティング信号に応答して、第２の電圧を直接、出力端子に印加する。コントローラは、ユーザ仕様の入力パルスパターンを受信し、第１および第２のゲーティング信号を提供して、出力端子において特定された出力パルスパターンを生成する。
本発明は、多数の顕著な利点を提供する。概して、本発明は、移植薬剤の分子を非常に有効に細胞内に導入するのに有益である。治療薬剤としては、たとえば、癌、カポジ肉腫、および他の多数の病状および症状を治療するための薬剤を含み得る。
一定レベルの電界を使用する先行技術による構成とは違って、本発明の段階的なパルスは、細胞の穿孔の前後に低電圧の電界を使用することによって、細胞の損傷を最小に留める。本発明はしたがって、高電圧の電界に対する細胞の露出を最小に留めて、細胞への損傷を防止する。さらに、本発明の段階的なパルスは、第１および第３のパルスが先行技術による構成よりも低い電圧を使用するため、エネルギの節約に繋がる。
さらに、移植薬剤の分子を受取るように細胞に孔を開けるのに電気穿孔法を使用することによって、本発明は薬剤の効力を高める。結果として、必要とされる移植薬剤の量が減じられ、それによって、移植薬剤の副作用も減じられる。
本発明の別の利点は、変圧器の一次巻線に電圧が印加される時間期間にかかわらず、結果として得られる変圧器の飽和現象が、その変圧器の二次巻線に対応する出力信号が与えられる持続時間を制限することである。これにより、変圧器の一次巻線への電圧の長引く印加にさもなければ起因したであろう、治療される細胞への損傷が防止される。本発明の別の利点は、変圧器の出力がフローティング状態であるため、患者が別の接地電位に接続されていれば実質的な電流の流れが防止される点である。
本発明はまた、以下に詳細に述べる他のさまざまな利点を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
本発明の目的、利点および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面を参照して読まれることにより、より容易に理解されるであろう。図中：
図１は、先行技術に従った電気穿孔法の波形を示す図である。
図２は、本発明の一局面に関連する、パルス発生器のハードウェアコンポーネントおよび相互接続を示す図である。
図３は、本発明の一局面に従った、データ記憶媒体を含む製造部品の一例を示す図である。
図４は、本発明の一局面に従った、方法ステップのシーケンスの一例を示すフローチャートである。
図５から図９は、本発明に関連の、電気穿孔パルス方式を示す図である。
図１０は、本発明の一例に従った、方法ステップのシーケンスの一例を示すフローチャートである。
発明を実施するためのベストモード
ハードウェアコンポーネントおよび相互接続
上述のように、本発明の一局面は、細胞内に分子をより効率的に導入しかつ細胞組織への損傷を最小に抑えるための、ユーザが選択したパルス方式に従って電界を生成しかつ印加することが可能な、改善された電気パルス発生器に関する。図２は、一例としてのパルス発生器２００を示す。パルス発生器２００は、以下のような、多種多様な構成要素を含む。
電力供給部
電力供給部２０２は、パルス発生器２００で使用するための所望の電圧レベルの信頼できる電源を提供する。電力供給部２０２は、電源２０３から、１１０Ｖまたは２２０ＶＡＣ等の入力電圧を受ける。分圧器２０４は、入力した電圧を複数の基準電圧に変換する。ここで説明する実施例においては、分圧器出力線２０４ａ、２０４ｂ上には５００Ｖ（直流）の基準電圧が存在する。
これらの電圧は、第１および第２のそれぞれのトランジスタ２０６、２０７のコレクタ２０６ｂ、２０７ｂに提供される。トランジスタ２０６、２０７は、選択的にゲート制御されて、それら入力電圧がステップ電圧ノード２０８、２０９に印加される。トランジスタ２０６、２０７のこの選択的なゲート処理は、比較器２１２、２１３のそれぞれによって実行される。比較器２１２、２１３は、ステップ電圧ノード２０８、２０９における電圧がステップ電圧入力線２１６、２１７上に構築された電圧を下回ったときに、トランジスタ２０６、２０７のゲート２０６ａ、２０７ａをトリガする。たとえば、比較器２１２が、ステップ電圧ノード２０８上の電圧が予め設定された入力線２１６上の電圧よりも低いと判定したときに、比較器２１２はトランジスタ２０６のゲート２０６ａを活性化し、これにより、トランジスタ２０６が分圧器２０４の入力電圧をステップ電圧ノード２０８に直接結合する。したがって、トランジスタ２０６は、ステップ電圧入力線２１６、２１７に従って、それぞれのステップ電圧ノード２０８、２０９において、実質的に一定の電圧を維持する。
エネルギリザーバ
パルス発生器２００はまた、ステップ電圧ノード２０８、２０９にそれぞれ結合されたエネルギリザーバ２２０、２２１を含む。エネルギリザーバ２２０、２２１は一例として、３２００μＦ、５００Ｖの電解キャパシタ等の、キャパシタを含んでもよい。これらのキャパシタは、５００Ｖ（直流）の最大ステップ電圧２０８、２０９に適切である。
変圧器
パルス発生器２００はさらに、変圧器２２４を含む。変圧器２２４は、一次巻線２２４ａおよび二次巻線２２４ｂを含む。変圧器２２４は、数マイクロ秒程度の高速のパルス立上がり時間を有利に提供できるように、低い漏れインダクタンスを示すことが好ましい。変圧器２２４は好ましくは、数μＨ程度の低インダクタンスを示す。このような特徴は、１２本の別個のより導線からなる単一のケーブルで変圧器２２４を巻くことによって提供され得る。この場合、１２本のより導線のうち６本が一次導線として並列に接続され、６本が二次導線として直列に接続される。これによって、１：６の昇圧比が提供される。さらに、変圧器の鉄心のフルフラックス振動を用いるために、鉄心のまわりに別個の低電圧の直流バイアス巻線を使用することも可能である。一例として、変圧器は積層鉄心を利用してもよい。
変圧器２２４は、パルス長が予め定められた最大値を超過すると飽和するように有利に構築することが可能であり、これにより、患者を過剰な電気エネルギから保護することができる。好ましくは、変圧器２２４は飽和までに０．３Ｖ−秒（３０００Ｖ×１００μ秒）を搬送することが可能である。変圧器２２４の別の利点は、その出力がフローティング状態であることであって、したがって、患者が別の接地電位に接続されていれば、実質的な電流が流れることはない。
二次巻線２２４ｂは出力ノード２３０、２３１に結合される。出力ノード２３０、２３１はここに説明する応用においては、電極によって実装されている。電極（図示せず）は、平行板電極、針電極、カリパス電極、または別の電極構成を含んでもよい。カリパス電極の詳細な説明は、（１）１９９５年９月２９日に出願された、「薬剤および遺伝子の電気穿孔法による供給を利用する治療方法（″Method of Treatment Using Electroporation Mediated Delivery of Drugs and Genes″）」と題された、米国特許出願連続番号第０８／５３７，２６５号、および、（２）Dev等による、「電気化学療法−癌治療の新しい方法（″Electrochemotherapy-a novel method of cancer treatment″）」、Cancer Treatment Reviews（1994）20,105-115に記載されている。針電極の有益な例は、１９９５年６月６日に出願された、「薬剤および遺伝子の電気穿孔法による供給のための針電極（″Needle Electrodes For Electroporation Mediated Delivery Of Drugs and Genes″）」と題された、米国特許番号第５，７０２，３５９号に記載されている。
電極２３０、２３１の間の負荷は抵抗器２３４として表わされる。ここに説明する実施例においては、負荷２３４は多数の細胞を含み、これは、インヴィトロまたはインヴィヴォで、卵、血小板、ヒト細胞、赤血球、哺乳類細胞、植物プロトプラスト、植物花粉、リポソーム、細菌、菌類、酵母、精子、または他の細胞のサンプルを含み得る。
エネルギリザーバ２２０および電力供給部２０２を保護するために、ダイオード２３６がエネルギリザーバ２２０と電極２３０との間に配置されてもよい。同様に、エネルギリザーバ２２１および電力供給部２２０を保護するために、二次巻線２２４ｂと電極２３０の間にダイオード２３７が配置されてもよい。
スイッチ
パルス発生器２００はさらに、一次巻線２２４ａ、二次巻線２２４ｂをそれぞれ通って電流が選択的に流れるようにする、スイッチ２２６、２２７を含む。その構造の一例として、各スイッチ２２６、２２７は、Fuji Electric brand IMBI400F-060 model IGBT等の、絶縁ゲートバイポーラトランジスタ（″IGBT″）を含み得る。
スイッチ２２６とエネルギリザーバ２２１とは直列に結合される。この直列結合は、一次巻線２２４ａと並列に取付けられる。電圧がスイッチ２２６のゲート２２６ａに印加されると、コレクタ２２６ｂおよびエミッタ２２６ｃが電気的に接続される。したがって、エネルギリザーバ２２１が一次巻線２２４ａと並列に、有効に配置される。これにより、エネルギリザーバ１２１からの電流が一次巻線２２４ａを通じて流れるようになる。
同様に、スイッチ２２７とエネルギリザーバ２２０とは直列に結合され、この直列結合が二次巻線２２４ｂと並列に取付けられる。電圧がスイッチ２２７のゲート２２７ａに印加されると、コレクタ２２７ｂとエミッタ２２７ｃとが電気的に接続される。これにより、エネルギリザーバ２２０は二次巻線２２４ｂと並列に、有効に配置される。これによって、エネルギリザーバ２２０からの電流が負荷２３４を通じて流れるようになる。
有利な構成として、エネルギリザーバ２２０、２２１も、スイッチ２２６、２２７も、巻線２２４ａ、２２４ｂを接地することはない。巻線２２４ａ、２２４ｂはしたがって、電気的にフローティング状態にある。その結果、別の接地電位に接続された患者または他の負荷２３４を通じて実質的な電流が流れることはない。
コントローラ
パルス発生器２００の別の構成要素は、コントローラ２４０である。これは、スイッチ２２６、２２７の動作を管理する。概して、コントローラ２４０は、特定のスケジュールに従ってスイッチ２２６、２２７のオンおよびオフの時間を制御して、電極２３０、２３１において予め定められたパルス方式を生成する。コントローラ２４０がスイッチ２２７をトリガすると、エネルギリザーバ２２０の電圧が電極２３０、２３１に印加される。コントローラ２４０がスイッチ２２６をトリガすると、エネルギリザーバ２２０の電圧が変圧器２２４に印加され、そこで、電圧は、６倍に倍増されて電極２３０、２３１に印加される。コントローラ２２０は、スイッチ２２６、２２７の双方をトリガする場合もあり、この場合、ステップ電圧２０８、２０９の合計からなる付加的な電圧が電極２３０、２３１に印加される。
コントローラ２４０は、コンピュータ、デジタルまたはアナログ処理装置、プログラマブルロジックアレイ、ハードワイヤード論理回路、応用指向集積回路（“ＡＳＩＣ”）、または別の好適な装置を含み得る。例示的な実施例においては、コントローラ２４０は、必要に応じて適切なＲＡＭおよびＲＯＭモジュールを伴う、PIL 16C64 Microchipマイクロプロセッサを含み得る。
好ましくは、コントローラ２４０は、ユーザとデータを交換するためにユーザインターフェイス２４２に結合される。ここに説明する例においては、ユーザはユーザインターフェイス２４２を操作して、電極２３０、２３１に印加される所望のパルスパターンを入力することが可能である。
一例として、ユーザインターフェイス２４２は、英数キーパッド、タッチスクリーン、コンピュータマウス、プッシュボタンおよび／またはトグルスイッチ、または、ユーザから入力を受けるのに好適な別の構成要素を含み得る。ユーザインターフェイス２４２はまた、ＣＲＴスクリーン、ＬＥＤスクリーン、ＬＣＤスクリーン、液晶ディスプレイ、プリンタ、ディスプレイパネル、オーディオスピーカ、または、ユーザにデータを伝達するのに好適な別の構成要素もまた含み得る。
好ましい設計パラメータ
電気的な要件は、腫瘍細胞と薬剤とのインヴィトロでの実験において効能があると判定された、典型的には１２００〜１３００Ｖ／ｃｍの電界強度、および、約１００μ秒のパルス長から導出することが可能である。パルス発生器の最大電圧は、治療が望まれる腫瘍の最大サイズから導出される。直径が最大２ｃｍの腫瘍を１３００Ｖ／ｃｍの電界強度のカリパス電極（平行板）で治療するには、１３００×２＝２６００Ｖの動作電圧が必要とされる。このパルス発生器は、さらに余分なマージを提供すべく、最大で３０００Ｖを生成するよう設計された。
細胞／腫瘍に特有の抵抗率は、１００オーム×ｃｍの低さと仮定された。電極の面積が３ｃｍ×３ｃｍ＝９ｃｍ2である場合、抵抗は２２オームである。発生器の内部インピーダンスは、充電と放電との間で実質的な電圧降下が起こらないように、少なくとも２２オームの１０分の１の低さであらねばならない。最大電圧が３０００Ｖであり負荷インピーダンスが２２オームである場合、キャパシタの部分放電から方形パルスを生成するための切換要件は、非常に大きな４００ｋＷとなる。
望まれる最大浸透パルス長は１００μ秒であり、これは、１パルスにつき４０Ｊのエネルギとなる。分子収集および電気泳動のためのパルスパラメータとしては、５００Ｖの最大電圧および２００ｍ秒の最大パルス長が使用され得る。
最大負荷電流はおよそ１３６Ａであり、これは６・１３６＝８１６Ａの一次電流に変換される。これがスイッチが搬送しかつオンおよびオフすべき電流となる。スイッチ２２６、２２７は好ましくは、１ｍ秒につき直流８００Ａを維持することが可能である。最大電圧は６００Ｖである。過渡スパイクは、１０％の安全マージのために最大５５０Ｖに制限される。ここで、過渡を減じかつできるかぎりＩＧＢＴの最大電圧限度に安全に適合可能となるようにするために、低インダクタンスの機械アセンブリを慎重に提供する必要があった。
２２オームの負荷インピーダンスは、一次側に変換されて、２２／６×６−０．６１オームとなる。合計０．０５５オームの内部インピーダンスが、変圧器の一次側で達成された。これは、二次側において１．９８オームの等価インピーダンスに変換される。このような低インピーダンスは、アークまたは短絡の場合に過剰な電流を生じさせることとなり、高価なスイッチングＩＧＢＴを破壊しかねない。ＩＧＢＴは電流を制限する特徴を含んで構成することが可能であり、これにより、アークまたは短絡の場合のような過剰な負荷電流が生じた場合に数μ秒以内にスイッチをオフとすることが可能となる。実験においては、二次側でアークを誘導することにより、二次側の１５０Ａに対応して一次側で電流が約９００Ａを超過するや否や、５μ秒以内にＩＧＢＴが遮断されるという、良好な結果が得られた。
必要なキャパシタのサイズは、５％の負荷にわたる最大許容可能な電圧降下から推定することが可能である。一次パルスにおいて導通される電荷は、１００μｓ×８１０Ａ−０．０８Ｃｂである。もしこれがキャパシタのバンクの５％であれば、バンクは２０×０．０８＝１．６Ｃｂを保持せねばならない。最大５００Ｖにおいて、必要な容量は、Ｃ＝Ｑ／Ｖ＝１．６／５００＝０．００３２Ｆまたは３２００μＦである。これらのキャパシタ内に蓄積されるエネルギは４００ジュールである。
収集および電気泳動のためのパルスに関しては、第２のキャパシタ放電回路はパルス変圧器がなければより長いパルス長（数１００ｍ秒）および低電圧（５００Ｖ）を搬送する。低電圧回路および高電圧回路は、ダイオード２３７および２３６のまとまりによって互いから離される。
動作
上述の種々のハードウェアの実施例に加えて、本発明の別の局面は概して、改善された電気穿孔法を達成するための、ユーザが特定する電界パルスパターンを生成するための方法に関する。
データ記憶媒体
この方法は、たとえば、コントローラ２４０を操作して機械可読命令のシーケンスを実行することによって実現することが可能である。これらの命令は、種々のデータ記憶媒体内に常駐し得る。これに関し、本発明の一局面は、改善された電気穿孔法を達成すべくユーザが特定する電界パルスパターンを生成するための方法ステップを行なうデジタルデータプロセッサによって実行が可能な、機械可読命令のプログラムを具体的に実装する、データ記憶媒体を含む、製造部品に関する。
このデータ記憶媒体は、たとえば、コントローラ２４０内に包含されるＲＡＭを含んでもよい。代替的に、これら命令は、磁気データ記憶ディスケット３００（図３）等の、別のデータ記憶媒体内に包含されてもよい。コントローラ２４０内に包含されている場合にもまた別の場所に包含されている場合にも、これら命令はこれらに代えて、別の種類のデータ記憶媒体、たとえばＤＡＳＤ記憶装置（たとえば、従来技術による「ハードドライブ」またはＲＡＩＤアレイ）、磁気テープ、電子的読出専用メモリ（たとえばＲＯＭ）、光学的記憶装置（たとえばＷＯＲＭ）、紙製の「パンチ」カード、または他のデータ記憶媒体上に記憶されてもよい。本発明のここに説明する実施例においては、機械可読命令は、コンパイルされたPIL 16C64 Microchip機械コードのラインを含み得る。
動作ステップ
上述のように、本発明の一局面は概して、改善された電気穿孔法を達成するための、ユーザが特定する電界パルスパターンを生成するための方法に関する。図４は、本発明のこの局面の一例を説明するための、方法ステップのシーケンス４００を示す。説明を簡潔にするために、図４のシーケンスは上に記載したパルス発生器２００の特定の文脈で記載されているが、これによって限定を加えることを意図しているものではない。
ステップ４００がタスク４０２において開始された後に、タスク４０４においてコントローラ２４０は１または複数の出力パルスの出力パルスパターンを特定するユーザ入力を受取る。一例として、このユーザ入力はユーザインターフェイス２４２から受取られてもよい。代替例として、ユーザ入力は別の電子装置から受取られてもよく、または、予め記憶された記録であってもよい。
好ましくは、ユーザ入力は各パルスの持続時間を特定し、かつ、「高」出力電圧または「低」出力電圧のいずれかを特定する。次に、予め定められた低電圧の各パルスに対して、タスク４０４においてパルス発生器が、特定された持続時間の間、出力端子２３０および２３１において予め定められた「低」電圧を生成する。より特定的には、コントローラ２４０がスイッチ２２７をゲート制御することによって低電圧パルスを生成し、それにより、エネルギリザーバ２２０が負荷２３４を通じて放電するようにされ得る。
やはりタスク４０４において、特定された時間期間の間、変圧器の一次巻線端子に別の電圧を平行して印加することによって、二次巻線端子において高電圧パルスが生成される。より特定的には、この高電圧パルスは、上述のように電圧を生成するステップを含むが、それと同時に、スイッチ２２６をトリガしてエネルギリザーバ２２１が一次巻線２２４を通じて放電するようにする。リザーバ２２１の電圧が変圧器２２４によって増大されることにより、高電圧が電極２３０、２３１で生成される。この電圧は、エネルギリザーバ２２０、２２１内に蓄積された電圧の付加合計である。代替的に、より低めの「高」電圧出力が、スイッチ２２７を用いることなくスイッチ２２６をトリガすることのみによって生成されてもよい。
上に述べたパルスのうち１または複数のパルスはしたがって、ユーザが特定するパルスパターンを生成するようタスク４０４において生成される。ユーザが特定するパルスパターンがタスク４０４を完了することによって作成された後に、ルーチン４００はタスク４０６において終了する。
好ましいパルスパターンを用いた動作
上述のように、パルス発生器２００は「高」および／または「低」出力電圧の１または複数のパルスを含む、ユーザが特定するパルスパターンを提供する。図５から図９は、種々のパルス波形の例を図示する。これらはユーザが特定するパルス方式を構成するよう、単独でまたは組合せて使用され得る。
図５から図９に示すパルスパターンの各々は種々の応用において別個の利点を提供するが、以下の説明においては、パターン７００（図７）の特徴および動作に重点をおいて、電気的にはパルス発生器２００内の動作について、また、生理学的には細胞サンプル内の動作について、本発明の動作を説明する。
パターン７００は、「段階式パターン」を含み、ここで、第１、第２および第３の電圧レベル７０２〜７０４を提供する。これらの電圧の１、２、またはすべての電圧が、必要に応じて等しくされてもよい。パルスは第１、第２、および第３の持続時間７０６〜７０８を有する。この例においては、第１および第３の電圧７０６、７０８は５００Ｖ（直流）を提供し、これに対し、第２の電圧７０７は３０００Ｖ（直流）を提供する。
図１０は、この段階式パターン７００を生成しかつ印加するのに用いられるシーケンス１０００、およびパターン７００の印加によって引起こされる生理学的な効果を示す。このシーケンスがタスク１００２で開始された後に、ユーザインターフェイス２４２はタスク１００４においてユーザ入力を受取る。ここで説明する実施例においては、このユーザ入力は、パターンの各部分に対する持続時間および電圧レベルを含む、所望の電気穿孔用パルスパターンのユーザ仕様を含む。
代替的な実施例においては、ユーザは変圧器２２４によって印加される電界の所望の大きさ、および、電極２３０、２３１の間のギャップの測定値を特定してもよい。この場合、コントローラ２４０が、たとえば電界をそのギャップで乗じることによって、所望の電界を印加するために変圧器２２４が生成すべき適切な電圧を算出することも可能である。一実施例においては、このギャップの測定値がユーザによって手動で入力され得る。代替的に、このギャップは、機械的に測定されかつ自動化された手段によってコントローラ２４０に電子的に提供され得る。この自動化された手段はたとえば、米国特許番号第５，４３９，４４０号に示されている。
タスク１００４と平行して、電力供給部２０２は出力ノード２０８、２０９に基準電圧を生成する。この例においては、５００Ｖ（直流）の基準電圧２０８、２０９が使用される。タスク１００８における基準電圧の生成により、タスク１００８においてエネルギリザーバが充電される。
タスク１００８の後、タスク１０１０においてオペレータが治療部位に移植薬剤の分子を供給する。この移植薬剤は、１または複数の種類のＤＮＡ、遺伝子、および／または種々の化学薬剤を含み得る。電気化学療法の場合には、有益な移植薬剤の一例はブレオマイシンである。
生きた患者の場合、その治療部位は生きた細胞の１領域を含み、オペレータは好ましくは、液状の移植薬剤を皮下注射針を用いて注入する、看護婦または医師である。
しかし、インヴィトロにおける移植薬剤の注入の場合、治療部位は適切なコンテナ内に配置された細胞の標本からなり得る。この例の場合、操作するのは液状の移植薬剤を細胞の標本内に注入、点眼、または他の方法で導入する、実験技師であり得る。
ステップ１０１０においては、インヴィヴォの場合にもインヴィトロの場合にも、治療部位における細胞の間隙に移植薬剤が配置される。次に、タスク１０１２において、オペレータは電極を治療部位に設ける。生きた患者の場合、これは、カリパスで真皮を通じて細胞の領域を掴むステップ、患者の組織内に針のアレイを挿入するステップ、または別の手順を含み得る。インヴィトロの治療部位については、タスク１０１２は、細胞の標本をこの目的のために設けられた１対の板状の電極の間に配置するステップを含む。一例として、板状の電極としては、ＢＴＸブランドのキュベット、部品番号６４０が用いられ得る。
タスク１０１２の後に、タスク１０１４においてコントローラ２４０はスイッチ２２７をゲート制御して、エネルギリザーバ２２０を放電し、それにより、「低」電圧を電極２３０、２３１に印加する。このステップにおいて、移植薬剤の分子が細胞標本内の細胞膜の付近に集められる。本願の発明者によって発見されたように、このステップは、電圧を低下しても十分に行なうことが可能である。したがって、エネルギリザーバ２２０のこの「低」電圧がこの目的を達成することが可能であり、やはり、標本内の細胞への損傷を防止しかつ電気エネルギの節約に役立つ。
図７は、タスク１０１４を電圧パルス７０２として図示している。示されるように、このパルスは好ましくは約１０〜２００ｍ秒の持続時間７０６および約５００Ｖ（直流）の電圧を有する方形波を含む。しかし、応用によっては、異なるパラメータがパルス７０２を規定するのに置き換えられてもよい。
タスク１０１４の後に、タスク１０１６においてコントローラ２４０はスイッチ２２６のゲート制御を行なう（この間にもスイッチ２２７のゲート制御は続行している）。これにより、基準電圧２０８、２０９の合計に対応して、電極２３０、２３１上に「高」電圧が生成される。この高電圧は、組織標本の細胞内に小さな孔を安全に開けるのに十分である。本発明者は、この効果が、電気穿孔法によるもの、移植薬剤の充電された分子上のクーロン力の作用によるものであると信ずる。
図７は、このステップを電圧パルス７０３として示す。示されるように、このパルスは好ましくは、約１００μ秒の持続時間７０７および約１２００Ｖ／ｃｍの大きさの電界を有する方形波を含む。しかし、応用によっては、パルス７０２を規定するのに異なるパラメータが置き換えられてもよい。
有利な構成として、パルス発生器２００は自動的に、このステップ中の組織標本の細胞への損傷を制限する。具体的には、一次巻線２２４ａからの電圧が二次巻線２２４ｂを飽和すると、二次巻線２２４ｂ上に現れた電圧が、変圧器の動作の公知の原理に従って、減退し始める。したがって、一次巻線２２４ａに印加される電圧が過剰な時間期間印加されたとしても、二次巻線２２４ｂが自動的に、この高電圧パルスに対する組織標本の露出を制限する。
次に、タスク１０１８において、コントローラ２４０はスイッチ２２６のゲート制御を終了する。ここではまだ、スイッチ２２７のゲート制御は続行されている。このステップによって、移植薬剤の分子が細胞の浸透可能な膜を通過して細胞の細胞質に入ることが可能となる。
図７は、このステップを電圧パルス７０４として図示している。示されるように、このパルスは好ましくは、約１〜２００ｍ秒の持続時間７０８および、約５００Ｖ（直流）の電圧を有する方形波を含む。しかし、応用によっては、パルス７０４を規定するのに異なるパラメータが置き換えられてもよい。
タスク１０１８の後に、コントローラ２４０はスイッチ２２７のゲート制御を終わり、パルス７００を終了する。その後、オペレータはタスク１０２２において細胞標本から電極を外し、タスク１０２２においてこのシーケンス１０００を終了する。
他の実施例
本発明の現時点において好ましいと考えられる実施例を以上に説明したが、添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲から離れることなく、種々の変更例および修正例が可能であることは、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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