(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠攣縮性狭心症に付随する血管内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-786番目のチミン（T）からシトシン（C）への変化またはその相補鎖における対応する変化の有無を判定する、冠攣縮性狭心症患者由来の試料の選別方法。
【請求項２】
eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-786番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅し、その増幅フラグメントを制限酵素Msp Ｉにより処理し、次いで酵素処理したフラグメントを電気泳動にかけることにより、変化の有無を判定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-786番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチド、および制限酵素MspＩを含む、冠攣縮性狭心症を診断するためのキット。
【請求項４】
eNOSをコードするcDNA上、エクソン７に相当する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチド、および制限酵素Ban IIおよび／またはMbo Ｉをさらに含む、請求項３記載のキット。
【請求項５】
eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-1468番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチド、および制限酵素Mbo Ｉをさらに含む、請求項３記載のキット。
【請求項６】
eNOS遺伝子のヌクレオチドの変化であってそのcDNAとして894番目のグアニン（G）からチミン（T）への変化ならびにeNOS遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-922番目のアデニン（A）からグアニン（G）への変化および-1468番目のチミン（T）からアデニン（A）への変化、あるいはそれらの相補鎖における対応する変化、の中から選ばれるいずれか１つの変化の有無をさらに判定する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
eNOSをコードするcDNA上、エクソン７に相当する部分をＰＣＲにより増幅し、その増幅フラグメントを制限酵素Ban IIおよび／またはMbo Ｉにより処理し、次いで酵素処理したフラグメントを電気泳動にかけることにより、変化の有無を判定する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-1468番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅し、その増幅フラグメントを制限酵素Mbo Ｉにより処理し、次いで酵素処理したフラグメントを電気泳動にかけることにより、変化の有無を判定する、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は特定疾患の診断に応用できる技術、詳細には冠攣縮関連疾患遺伝子のスクリーニング方法に関する。
背景技術
生体内一酸化窒素（生体内NO）は最近生体内にて同定された物質であり、血管拡張物質（18-25）や神経伝達物質として（11,12）、また免疫反応物質（13-17）として働くことが示されている。生体内NOはL-アルギニンから合成され、その合成には少なくとも３つの一酸化窒素合成酵素（nitric oxide synthase：NOS）、即ち神経型NOS、血管内皮型NOSおよびマクロファージ型NOSが一つのファミリーとして関与している。神経型NOSと血管内皮型NOSはそれぞれ構成型であり、細胞内のカルシウム濃度に依存してその活性は増大する。一方、マクロファージ型NOSはカルシウム非依存性であり、炎症に応じて活性化する。最近いくつかのグループから血管内皮型NOS（endothelial cell nitric oxide synthase：eNOS）の遺伝子構造が示され、そのeNOS遺伝子は第７染色体の7q35-36に存在し、26のエクソンからなり、そして21kbの長さを有することが報告された（18-25）。
発明の開示
冠動脈の攣縮（冠攣縮）は冠攣縮性狭心症または異型狭心症を生起させるが、冠攣縮はその他にも広く虚血性心疾患においてその発症要因の大きな因子と考えられている（1-6）。しかしながら冠攣縮のメカニズムはまだほとんど解明されていない。
そこで、冠攣縮のメカニズムが解明されれば、冠攣縮が関連していると思われる虚血性疾患を早期に診断し処置できると考え、鋭意研究を重ねた。なお、これまでの報告では、冠攣縮の発症メカニズムとして、血管内皮の障害というよりは平滑筋の過収縮性（hyper-contractility）が問題であるという指摘が多い（35）。
アセチルコリンは平滑筋に作用しそれを収縮させるが、内皮が正常である場合は、内皮から一酸化窒素（NO）を分泌させ、分泌されたNOが血管平滑筋に働き、結果として血管を拡張させる。しかし、冠攣縮性狭心症の症例にアセチルコリン冠動脈内投与を行うと、血管は拡張せずに冠攣縮が誘発される（7,8）。本発明者らはこの事実に着目し、冠攣縮性狭心症の症例では、アセチルコリン誘発のNOの基礎分泌が低下していることを既に示している（10）。
さらに、ニトログリセリンや亜硝酸剤は生体内にてNOとなり血管を拡張させるが、予めNO合成を抑制しておいた血管に対する亜硝酸剤の反応は過敏であること（9）、および冠攣縮性狭心症の冠動脈がニトログリセリンに対して過敏に反応すること（6）から考えても、冠攣縮性狭心症の冠動脈では、NOの基礎分泌が低下していることが考えられる。以上のような結果から冠攣縮とNO、詳細には冠攣縮とNOを分泌する内皮との間には強い関連があると思われた。これまで、NOの基礎分泌の低下という事実のみから、冠攣縮とNOの内皮との関連に目を付けた報告はない。
一方、冠攣縮は欧米人より日本人に多い疾患であり（26,27）、そのことから、その発症因子に遺伝的背景があるのではないかと考えた。
以上の知見に基づき、本発明者らは、生体内NOを合成するためのNOSのうち血管内皮型一酸化窒素合成酵素（endothelial cell nitric oxide synthase：eNOS）の遺伝子に着目し、それが冠攣縮の発症に関与しているか否かを検討した結果、本発明を完成した。
発明の概要
即ち、本発明は、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）遺伝子のヌクレオチドの変化であってそのcDNAとして８９４番目のグアニン（G）からチミン（T）への変化および774番目のシトシン（C）からチミン（T）への変化、ならびにeNOS遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-786番目のチミン（T）からシトシン（C）への変化、−９２２番目のアデニン（A）からグアニン（G）への変化および-1468番目のチミン（T）からアデニン（A）への変化、あるいはそれらの相補鎖における対応する変化、の中から選ばれるいずれか１つまたは２以上の変化の有無を判定することを特徴とする、冠攣縮関連疾患遺伝子のスクリーニング方法、に関する。好ましくはeNOS遺伝子内の変化のいずれか１つ、およびその５’フランキング領域内の変化の少なくとも１つ、の２以上の変化の有無を判定する方法、特に好ましくは冠攣縮関連疾患が狭心症である方法、さらに好ましくは冠攣縮関連疾患が冠攣縮性狭心症である方法である。
別の態様として、本発明は、上記の変化を制限酵素による切断の有無によってスクリーニングするRFLPを利用する方法に関する。具体的には、eNOSをコードするcDNA上、エクソン７に相当する部分をＰＣＲにより増幅し、その増幅フラグメントを制限酵素Ban IIおよび／またはMbo Ｉにより処理し、次いで酵素処理したフラグメントを電気泳動にかけることにより、変化の有無を判定する方法、ならびに同様にeNOSをコードするcDNA上、エクソン６に存在する変化を制限酵素FoK Ｉにより、eNOS遺伝子の５’フランキング領域中-786番目の変化を制限酵素Msp Ｉにより、eNOS遺伝子の５’フランキング領域中-1468番目の変化を制限酵素Mbo Ｉにより処理し、変化の有無を判定する方法に関する。
さらに、本発明は本発明方法を実施するためのキット、即ちeNOSをコードするcDNA上、エクソン７に相当する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチドおよび制限酵素Ban IIおよび／またはMbo Ｉを含む、冠攣縮関連疾患を診断するためのキット；eNOSをコードするcDNA上、エクソン６に相当する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチドおよび制限酵素FoK Ｉを含む、冠攣縮関連疾患を診断するためのキット；eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-786番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチドおよび制限酵素Msp Ｉを含む、冠攣縮関連疾患を診断するためのキット；eNOS遺伝子の５’フランキング領域中、-1468番目を包含する部分をＰＣＲにより増幅するための増幅用オリゴヌクレオチドおよび制限酵素Mbo Ｉを含む、冠攣縮関連疾患を診断するためのキットに関する。なお、本発明キットに含まれる増幅用オリゴヌクレオチドは以下に示す表１に記載しているもの以外のオリゴヌクレオチドでもよく、それはeNOSのゲノムＤＮＡの配列を参照していずれも使用することができる。
さらに、本発明は冠攣縮関連疾患に付随するeNOS遺伝子の上記ヌクレオチドの変化の中から選ばれるいずれか１つまたは２以上の変化の有無を判定することを特徴とする、冠攣縮関連疾患の診断方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、eNOS遺伝子のエクソン７を含むDNAフラグメントをPCR-SSCP解析にかけた電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。矢印はバンド上のシフトを示している。
図２は、eNOS遺伝子のエクソン７を含むDNAフラグメントのPCR-SSCPにて変異のあった症例（変異型）と変異のない症例（正常型）とを直接シークエンシングした結果を示すグラフである。変異型ではヘテロ接合体の結果を示している。
図３は、eNOS遺伝子のエクソン７を含むDNAフラグメントをPCR-RFLPによりスクリーニングした結果を示している。制限酵素はBan IIおよび／またはMbo Ｉを用いている。図３Ａはその制限酵素地図である。図３Ｂは実際の電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
図４は、eNOS遺伝子のエクソン６を含むDNAフラグメントをPCR-RFLPによりスクリーニングした結果を示す電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。制限酵素はFoK Ｉを用いている。
図５は、eNOS遺伝子の５’フランキング領域中-786番目および-1468番目を含むDNAフラグメントをそれぞれPCR-RFLPによりスクリーニングした結果を示す電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。制限酵素は-786番目の変化ではMsp Ｉを、-1468番目の変化ではMbo Ｉを用いている。
発明の開示
上記のように、本発明者らは、eNOS遺伝子に着目し、それが冠攣縮の発症に関与しているか否かを検討した結果、次の事実を見出した。
Ａ）eNOS遺伝子のエクソン内の変異
１）エクソン７における変異：eNOSをコードするcDNA上、894番目におけるグアニン（G）がチミン（T）に変異
PCR-SSCP（polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism）と直接シークエンス法を用い、冠攣縮性狭心症患者から得たeNOS遺伝子のエクソン７に点変異を認めた。その変異は、GAGからGATへの変化であり、アミノ酸ではグルタミン酸からアスパラギン酸へ変化させる変異（Glu298Asp）であった。この変異について９６人の冠攣縮性狭心症と８６人のコントロール症例をスクリーニングし、冠攣縮性狭心症群では２２人、コントロール群では７人に変異が認められた。
２）エクソン６における変異：eNOS遺伝子のcDNA上、774番目におけるシトシン（C）がチミン（T）に変異
PCR-SSCP法を用い、冠攣縮性狭心症患者１０人中４人にこの塩基置換を見出した。他方、コントロール群の９人にはこの塩基置換が認められなかった（P=0.03）。なお、この置換はアミノ酸変化をもたらすものではない。
Ｂ）eNOS遺伝子の５’フランキング領域における変異
eNOS遺伝子の５’フランキング領域にいくつかの変異を見出し、それらの変異と冠攣縮疾患との相関性を評価して以下の結果を得た。
１）５’フランキング領域（-786）のチミン（T）がシトシン（C）に変異
PCR-SSCP法を用い、冠攣縮性狭心症患者１２３人中３４人（２７．６％）にこの塩基置換を見出した。他方、コントロール群では、８６人中４人（４．７％）にしかこの塩基置換が認められなかった。（P<0.0001）
２）５’フランキング領域（-922）のアデニン（A）がグアニン（G）に変異
PCR-SSCP法を用い、冠攣縮性狭心症患者１０４人中３１人（２９．１％）にこの塩基置換を見出した。他方、コントロール群では、８３人中３人（３．６％）にしかこの塩基置換が認められなかった。（P<0.0001）
３）５’フランキング領域（-1468）のチミン（T）がアデニン（A）に変異
PCR-SSCP法を用い、冠攣縮性狭心症患者９８人中２６人（２６．５％）にこの塩基置換を見出した。他方、コントロール群２６人にはこの塩基置換が認められなかった（０％）。（P<0.0006）
先に見出されたeNOS遺伝子の変異は冠攣縮関連疾患の診断に有用である。
「冠攣縮関連疾患」とは本明細書では、狭心症、特に冠攣縮性狭心症、異型狭心症、不安定狭心症、労作性狭心症、安静狭心症、急性心筋硬塞、または微小血管疾患（microvasculor disease）等を意味する。
本発明により証明された冠攣縮とeNOS遺伝子の変異との関連性により、冠攣縮関連疾患が疑われる患者から入手したeNOS遺伝子およびその５’フランキング領域における上記の変異を確認すれば、その患者は冠攣縮関連疾患の大きな危険因子を持っていると推定できる。これらの変異は、いずれか１つでも冠攣縮関連疾患の指標とすることができるが、２つ以上の変異が見出されれば、より確かな指標とすることができる。また、eNOS遺伝子領域およびその５’フランキング領域ともに変異が認められれば、重篤な冠攣縮関連疾患を呈することも見出されている。
このように、本発明は、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）遺伝子のヌクレオチドの変化であってそのcDNAとして８９４番目のグアニン（G）からチミン（T）への変化および774番目のシトシン（C）からチミン（T）への変化、ならびにeNOS遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-786番目のチミン（T）からシトシン（C）への変化、−９２２番目のアデニン（A）からグアニン（G）への変化および-1468番目のチミン（T）からアデニン（A）への変化、あるいはそれらの相補鎖における対応する変化、の中から選ばれるいずれか１つまたは２以上の変化の有無を判定することを特徴とする、冠攣縮関連疾患遺伝子のスクリーニング方法に関する。
「それらの相補鎖における対応する変化」とは、例えばeNOS遺伝子のヌクレオチドの変化であるそのcDNAとして８９４番目のグアニン（G）からチミン（T）への変化の場合は、８９４番目のグアニンの相補鎖におけるシトシン（C）がアデニン（A）に変異している変化を意味する。
まず、患者からeNOSの遺伝子およびその５’フランキング配列を入手する方法を概略説明する。
遺伝子を取り出す試料としてはあらゆる生検試料を使用することができるが、典型的には白血球であり、肝組織バイオプシーも使用できる。得られた試料をプロテイナーゼＫ−ＳＤＳによりタンパク質分解・変性後、フェノール／クロロホルム抽出によりゲノムＤＮＡ（＋ＲＮＡ）が得られる。所望により、ＲＮＡはＲＮアーゼにより除去することができる。
次いで、得られたゲノムＤＮＡを、以下に記載のプライマーのいずれかを用いてＰＣＲにより増幅させる。次いで、以下に記載する核酸変異検出手法により変異の有無を確認する。
１）ＲＦＬＰ法（制限断片長多型）
２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
３）ＡＳＯハイブリダイゼーション法（allele specific oligonucleotide hybridization）
ＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、検索する変異部位に対応した塩基配列をもつ、１８ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドプローブ（シグナルを得るにはラジオアイソトープあるいはビオチン標識が必要）とのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値に準じたポスト洗浄により、１塩基ミスマッチの検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）が可能となる。これは、ＰＣＲを用いた特定の塩基置換の検出法としては最も典型的な方法である。
４）シークエンス法
５）サザンブロッティング法
ＤＮＡを制限酵素処理し、電気泳動で展開し、プローブとハイブリダイゼーションをする一般的方法である。ゲノミックサザン法、ＰＣＲサザン法のいずれも使用できる。後者ならば、上記（３）と原理は同じであるが、移動度の情報が得られる点で、精度上の利点を有している。
６）ＡＲＭＳ（amplification refracting mutation system）
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’から３’に相補鎖ＤＮＡが合成されるが、プライマーの３’末塩基にミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下する、即ち電気泳動的に観察不可能になることを利用するものであり、プライマーの３’末塩基が検出したい変異塩基に相補的なものを用いてＰＣＲを行ない、増幅産物の有無を検出できる。
７）ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）
ＰＣＲ産物中のミスマッチを持つヘテロデュプレックスがホモデュプレックスよりもその解離が容易であることを利用した方法であり、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動の移動度が落ちるので、展開するポリアクリルアミドゲルに尿素およびホルムアミドの密度勾配をつけることによりそれがさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、即ち変異の存在が検出される。
８）ＲＮａｓｅＡ切断法
ＲＮａｓｅＡ（ＲＮＡ分解酵素）は２本鎖のＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。従って、例えば32Ｐにより標識したＲＮＡプローブを１本鎖変性したサンプルＤＮＡとハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理後、電気泳動により展開すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるので、２本のバンドとして検出できる。
９）化学切断（chemical cleavage）法
２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾した後、ピペリジン処理をすると糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、本処理後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなれば変異が検出されたことになる。Glu298Aspの検出の場合、プローブを正常型の逆鎖の配列とすれば、ミスマッチはＣ−Ｔなので、いずれの修飾も使用することができる。
１０）リガーゼ法
２つのオリゴヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで連結するとき、結合位置に鋳型ＤＮＡとの間にミスマッチがあると、結合できないことが原理である。
ｉ）ＬＭＧＤ（ligase-mediated gene detection）法
一方のオリゴＤＮＡは例えば32Ｐ標識、他方はビオチン標識し、ライゲーション後、ストレプトアビジン吸着による回収を行なう。これらが連結する（即ち、ミスマッチしない）ならば、32Ｐの放射線量が高値を示すので、検出することができる。
ii）ＬＣＲ（ligase chain reaction）
上記のライゲーション反応を、耐熱性のリガーゼを用いて繰り返し行なうことで、ＰＣＲと同様に生じたＤＮＡ鎖に対してもオリゴＤＮＡがアニールするので、高感度に変異の検出が可能となる。
発明の好ましい実施の態様
１．エクソン７上の変異
エクソン７における変異、即ちeNOSをコードするcDNA上、894番目におけるグアニン（G）からチミン（T）への変異は、GAGからGATへの変化であり、それぞれ異なる制限酵素部位を形成するものである。従って、制限酵素を用いても変異の有無を知ることができる。具体的には、得られた増幅産物を制限酵素BanII、MboIのいずれか１つを用いて消化することで、上記変異の有無を知ることができる。詳細には、制限酵素BanIIによって切断されれば、変異は存在しないことが分かり、またMboIによって切断されれば、変異が存在することが分かる。
あるいは、eNOSのcDNA上、894番目のグアニン（G）からチミン（T）への変異はアミノ酸ではグルタミン酸からアスパラギン酸へ変化させる変異（Glu298Asp）である。従って、eNOSのアミノ酸配列の変化、即ちeNOSアミノ酸配列上、２９８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に変化していることを指標にすることもできる。
２．エクソン６上の変異
エクソン６における変異、即ちeNOSをコードするcDNA上、774番目のシトシン（C）からチミン（T）への変化もそれぞれ異なる制限酵素部位を形成する。従って、制限酵素を用いて変異の有無を知ることができる。具体的には、得られた増幅断片を制限酵素Fok Ｉにより消化することで、上記変異の有無を知ることができる。詳細には、Fok Ｉにより消化されれば、変異が存在することが分かり、消化されなければ、変異が存在しないことが分かる。
３．５’フランキング領域の-786番目の変異
eNOS遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-786番目のチミン（T）からシトシン（C）への変化も異なる制限酵素部位を形成する。従って、制限酵素を用いても変異の有無を知ることができる。具体的には、得られた増幅産物を制限酵素Msp Ｉを用いて消化することで、上記変異の有無を知ることができる。詳細には、制限酵素Msp Ｉによって１ヶ所が切断されれば、変異は存在しないことが分かり、またMsp Ｉによって２ヶ所が切断されれば、変異が存在することが分かる。
４．５’フランキング領域の-1468番目の変異
eNOS遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチドの変化であって-1468番目のチミン（T）からアデニン（A）への変化も異なる制限酵素部位を形成する。従って、制限酵素を用いても変異の有無を知ることができる。具体的には、得られた増幅産物を制限酵素Mbo Ｉを用いて消化することで、上記変異の有無を知ることができる。詳細には、制限酵素Msp Ｉによって１ヶ所が切断されれば、変異は存在しないことが分かり、またMsp Ｉによって２ヶ所が切断されれば、変異が存在することが分かる。
実施例
実施例１
eNOS遺伝子のエクソン７における変異の検出
試験対象は96人の冠攣縮性狭心症例と86人のコントロール症例である。冠攣縮性狭心症群の症例は全て安静時の自然発作の経験を有している（男性53人、女性43人、平均61歳、33歳〜86歳）。全ての症例において心臓カテーテル検査を実施し、冠動脈造影上、アセチルコリンやエルゴノビン誘発による冠攣縮を認め、同時に心電図上、有意のST-T変化を認めた（7,8）。またこれらの症例に有意の冠動脈狭窄所見（>75%）は認められなかった。
86人のコントロール症例の中で、61人は胸痛症候群であり、12人は心電図異常であり、また13人は軽い弁膜症例であった（男性35人、女性51人、平均年齢61歳、13歳〜83歳）。コントロール症例も全てにおいて冠動脈造影を施行しており、その結果、冠動脈には有意狭窄は認められなかった。コントロール症例群の内、61人の胸痛症候群と12人の心電図異常例にはアセチルコリンまたはエルゴノビン冠動脈内投与による冠攣縮の誘発試験を行い、いずれも陰性であった。また、コントロール症例からは心筋梗塞、シンドロームＸ、心筋症、心不全症例を除外した。
（１）PCR-SSCPによるeNOS遺伝子変異の検索
i）ＤＮＡの単離
典型的な冠攣縮性狭心症例１０人およびコントロール症例９人から末梢静脈採血し、白血球よりDNAを抽出した（28）。ＤＮＡの抽出にはＤＮＡ抽出薬キットドナクイック［大日本製薬］を使用した。
ii）ＰＣＲ工程
既に報告されているeNOS遺伝子の構造を参考にして（18-25）、PCR-SSCP法を施行した（29）。PCR-SSCP法はeNOS遺伝子のすべてのエクソンに渡り施行した。
すべてのプライマーはそれぞれのエクソンを挟む形でイントロンの中に作成した。用いた全てのプライマーを以下の表１に示す。
0003928140.tif 000002
50mmol/L KCL、20mmol/Lトリス-塩酸（pH 8.4）、O.75mmol/L MgCl2、0.1mmol/L dNTPs、α-[32P]dCTP（O.2ml）、各プライマー（5pmo1）および0.01U Taqポリメラーゼ（GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD USA）を含有する溶液5μｌを、各チューブ当りに作成し、次いで、患者由来のDNA 30ngを加える。
PCR操作は次の通りである。まず、９４℃にて２分間１サイクルを行ない、次ぎに９４℃にて３０秒、５５〜５８℃にて３０秒および７２℃にて１分のサイクルを３０サイクル行ない、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃にて保存した。エクソン７の増幅は５７℃にて行なった。
iii）ＳＳＣＰ工程
電気泳動は、室温における5%グリセロールゲルの条件と、4℃における5%および10%グリセロールゲルの条件の３つの条件で行った。
グリセロールゲルは次のようにして作成した。
1）アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを４９：１に混和した溶液５％：
2）０．５×ＴＢＥ（１０×ＴＢＥ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１０８ｇ＋ホウ酸５５ｇ＋０．５Ｍ ＥＤＴＡ４０ｍｌ＋水（全量５００ｍｌとなる量）を２０倍に希釈）：
3）５％あるいは１０％グリセロールに調製した溶液６０ｍｌに１０％ＡＰＳ（ペルオキソ二硫酸アンモニウム）１６０μｌとＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン）６０μｌを加え、ゲルを作製する。
iv）結果
エクソン７を増幅させた結果を図１に示す。これにより、エクソン７を含むフラグメントにおいて、冠攣縮性狭心症群の１０人中、３人にバンドシフトを認めた。一方、コントロール群には全くシフトを認めなかった。
（２）直接シークエンス法による変異遺伝子の検討
工程（１）のPCR-SSCPにて変異が認められた症例と健常パターンを生じた症例のDNAを再び工程（１）の（ii）の条件下で増幅し、Wizard PCR Preps DNA精製システム（Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega, USA）にて精製した。ABI製（USA）のオートシークエンサーにて直接シークエンス法にて塩基配列を決定した。
変異のあるDNAと正常例のDNAとを直接シークエンス法にて解析した結果、エクソン７に、eNOS、cDNAの８９４番目が、グアニン（G）からチミン（T）に変化している点変異を見いだした。これは変異のあった３例すべてで確認された。この点変異はeNOSアミノ酸の配列上、グルタミン酸からアスパラギン酸へと変化を引き起こすミスセンス変異であった（Glu298Asp）。図２に直接シークエンスの結果を示す。ここでは変異のない正常型とヘテロ接合体を示した。
（３）PCR-RFLPによるGからTへの変異のスクリーニング
工程（２）に示しているように、eNOS遺伝子のエクソン７にGlu298Asp変異を起こすミスセンス変異が見い出されたので、そのスクリーニングをすべての冠攣縮性狭心症例とコントロール症例、即ち冠攣縮性狭心症例９６人とコントロール症例８６人に対して行った。このスクリーニングにはPCR-RFLP（polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism）法を用いた。制限酵素の不完全切断の誤認を防ぐ目的で、Ban IIとMbo Ｉの２つの制限酵素を使用した[共に宝酒造より入手]。
工程（１）の（ii）に記載の手法により、すべての症例のeNOS遺伝子のエクソン７を増幅させた。エクソン７を含むPCR増幅フラグメントは２４８bpである。次いで、得られた増幅フラグメントを製造元の教示に従ってBan IIおよびMbo Ｉのいずれかで消化した。得られた消化物を４％Ｎ u Ｓ ieve ＧＴＧアガロースゲルの電気泳動に供し、バンドを認めた。
その結果は図３に示すように３つのパターンに類別された。なお、図３Ａは制限酵素地図であり、図３Ｂは実際の電気泳動の写真である。
図３Ｂに示されているように、変異のない野生型では、Ban IIにより163bpと85bpの長さの２つのフラグメントが形成され、Mbo Ｉでは、切断されていない248bpのバンドが認められた。これにより、変異のない野生型にはBan II部位が一つであり、Mbo Ｉ部位は存在しないことが証明された。
eNOSのcDNAの８９４番目がT/Tであるホモ接合体の症例はBan IIにより切断されることなく（248bp）、Mbo Ｉでは158bpと90bpの長さの２つのフラグメントが形成された。これにより、ホモ接合体の症例ではBan II部位はなく、Mbo Ｉ部位が一つ存在することが証明された。
Ban IIにより248bp、163bpおよび85bpの３つのバンドが形成され、Mbo Ｉでは248bp 158bpおよび90bpの３つのバンドが認められる症例が存在した。これはBan IIおよびMbo Ｉのいずれかで消化すると、それぞれ一方のバンドにのみ１つの切断部位が存在することから、ヘテロ接合体（G/T）である。
上記の３つのパターンをもとに、冠攣縮性狭心症群とコントロール群におけるeNOS遺伝子Glu298Asp変異の頻度についての検討をすべての症例において行なった。各症例について上記２つの酵素での消化をそれぞれ行なった。その結果、これら２つの酵素で行った結果は全症例で一致した。
Glu298Asp変異は96人の冠攣縮性狭心症例のうち22人で認められ（23%）、このうちホモ接合体が１人であり、ヘテロ接合体が21人であった。一方、86例のコントロール群においては、７人が変異を有し（8%）、これらは全てヘテロ接合体であった。
（４）統計解析：冠攣縮とGlu298Asp変異および他の危険因子との関係
Fisher's exact probabilityによるカイ二乗検定およびunpaired-t検定にて、工程（３）にて得られた変異の頻度、並びに年齢、性、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、肥満度および煙草の冠危険因子の頻度を、冠攣縮性狭心症例群とコントロール症例群間で比較した。また、多変量解析（ロジステック重回帰分析）にてどの因子が最も冠攣縮に関与しているかを検討した。解析はSPSS Advanced Statistics 6.1 for the Macintosh（SPSS Japan Inc., Japan）にて施行した。独立変数は次のようにすべてダミー変数を用いた。全て数値は、平均±SDにて表している。
性別；０：男性,１：女性
年齢；０：60未満，１：60以上
肥満度（body mass indeｘ）；０：26未満，１：26以上，
コレステロール血症；０：正常，１：高コレステロール血症（閾値,260mg/dl）
煙草；０：非喫煙者，１：喫煙者
高血圧；０：正常血圧，１：高血圧（閾値，160/95mmHg）
糖尿病；０：糖尿病なし，１：糖尿病あり（閾値，空腹時血糖140mg/dlまたはOGTTにて200mg/dl）
カイ二、乗検定の結果を以下の表２に、forward stepwise selection（Wald）を用いた検定を以下の表３に示す。全ての統計上、p=0.05を有意としている。
統計解析の結果
Glu298Asp変異および他の危険因子：年齢、性別、血圧、糖尿病、高コレステロール血症、肥満度、喫煙と冠攣縮との関係において、性別（p=.035）、喫煙（p=.00001）およびGlu298Asp変異（p=.005）が以下の表２に示すように有意差を示した。
0003928140.tif 000003
多変量解析（ロジステック重回帰分析）の結果を以下の表３に示す。最も冠攣縮に寄与する因子は喫煙であり（p=.0005）、次がGlu298Asp変異であった（p=.0272）。ロジステック重回帰分析では性別と冠攣縮との関係は認められなかった。
0003928140.tif 000004
実施例２
eNOS遺伝子のエクソン６における変異の検出
実施例１に記載のようにして、冠攣縮性狭心症例１０人およびコントロール症例９人からゲノムDNAを単離し、表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＳＳＣＰ工程に付し、エクソン６に変異を認めた。次いで、エクソン６の直接シークエンシングを行い、eNOS遺伝子のcDNA上、774番目におけるシトシン（C）がチミン（T）に塩基置換していることを見出した。
この塩基置換は、冠攣縮性狭心症患者１０人中４人に認められたが、コントロール症例の９人にはこの塩基置換は認められなかった（P=0.03）。なお、この置換はアミノ酸変化をもたらすものではなかった。
実施例３
eNOS遺伝子の５’フランキング領域における変異の検出（１）
プライマーとして次のものを使用する以外は、実施例１に記載の手法に実質的に従って、５’フランキング領域（-786）のチミン（T）におけるシトシン（C）への塩基置換を見出した:
PCR-SSCP（-585〜-820bp；236bp）
プライマー5'側：5'-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3'
プライマー3'側：5'-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3'
この塩基置換は、冠攣縮性狭心症患者１２３人中３４人（２７．６％）に認められたが、コントロール症例では、８６人中４人（４．７％）にしかこの置換は認められなかった。（P<0.0001）
実施例４
eNOS遺伝子の５’フランキング領域における変異の検出（２）
プライマーとして次のものを使用する以外は、実施例１に記載の手法に実質的に従って、５’フランキング領域（-922）のアデニン（A）におけるグアニン（G）への塩基置換を見出した：
PCR-SSCP（-801〜-1008bp；208bp）
プライマー5'側：5'-TCAGTCTCTGAGGTCTCGAA-3'
プライマー3'側：5'-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3'
この塩基置換は、冠攣縮性狭心症患者１０４人中３１人（２９．１％）に認められたが、コントロール症例では、８３人中３人（３．６％）にしかこの置換は認められなかった。（P<0.0001）
実施例５
eNOS遺伝子の５’フランキング領域における変異の検出（３）
プライマーとして次のものを使用する以外は、実施例１に記載の手法に実質的に従って、５’フランキング領域（-1468）のチミン（T）におけるアデニン（A）への塩基置換を見出した：
PCR-SSCP（-1214〜-1490bp；221bp）
プライマー5'側：5'-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3'
プライマー3'側：5'-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3'
この塩基置換は、冠攣縮性狭心症患者９８人中２６人（２６.５％）に認められたが、コントロール症例２６人にはこの置換は認められなかった（０％）。（P<0.0006）
実施例６
変異のスクリーニング
上記にて得られた５つの変異は例えば、ＡＳＯハイブリダイゼーション法（Hybridization with Allelic-Specific Oligonucleotides）により大規模にスクリーニングすることができる。大規模スクリーニング用のこのＡＳＯハイブリダイゼーション法を以下に例示する：
１）ＳＳＣＰと同様にＰＣＲをかける。この場合、最終的に２０μｌとなるようにする。反応液の組成およびサイクル条件は実施例１のエクソン７の場合と同じである。
２）ＰＣＲ反応液１０μｌをとり、０．５Ｍ ＮａＯＨ（１．５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ）２００μｌのうち、１００μｌを野生型用ナイロン膜に定着させ、残り１００μｌを変異型用ナイロン膜に定着させる。
３）定着させたナイロン膜をそれぞれ別のハイブリバッグに入れ、プレハイブリダイゼーション液（３×ＳＳＰＥ、５×Denhart's試薬、０．５％ＳＤＳ、１μｇ／μｌニシン精子ＤＮＡ）を加え、６５℃にて２時間インキュベートする。
４）32Ｐ標識正常型プローブ（５×１０6dpm/ml）および５倍量の非標識異常型プローブを入れ、また一方のバッグには32Ｐ標識異常型プローブ（５×１０6dpm/ml）および５倍量の非標識正常型プローブを入れる。
５）それぞれバッグを６０℃、３０分間インキュベートし、さらに温度を６０℃からＸ℃（実施例３では５３℃、実施例４では５０℃、実施例５では４６℃）に低下させながら１時間インキュベートする。
６）バッグからナイロン膜を取り出し、２×ＳＳＰＥ（０．１％ＳＤＳ）にて１０分間２回室温にてインキュベートし、次いで５×ＳＳＰＥ（０．１％ＳＤＳ）にて１０分間１回Ｘ℃でインキュベートする。
７）ナイロン膜をサランラップに包んでＸ線フィルムに重ね、現像する（オートラジオグラフィー）。
実施例７
eNOS遺伝子のエクソン６および５’フランキング領域における変異のスクリーニング
実施例２、３および５に示した直接シークエンス法により、eNOS遺伝子のcDNA上、エクソン６の774番目がシトシン（C）からチミン（T）に、またその５’フランキング領域の-786番目がチミン（T）からシトシン（C）に、同じく５’フランキング領域の-1468番目がチミン（T）からアデニン（A）に塩基置換していることを見出した。これらの変異のスクリーニングをPCR-RFLP法により以下のようにして行った。なお、PCRに用いたオリゴヌクレオチドおよび増幅条件をそれぞれ以下の表４および表５に示す：
0003928140.tif 000005
0003928140.tif 000006
（１）エクソン６上の変異
実施例１の工程（２）に記載の方法に実質的に従い、表４に記載のプライマーおよび表５に記載の増幅条件を用い、試料のeNOS遺伝子のエクソン６を増幅させた。得られた増幅断片（232bp）を製造元の教示に従ってFok Ｉにより消化した後、これを10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、バンドを確認した。変異型遺伝子のみがFok Ｉにより消化されるため、C/Cのホモ接合体は232bpバンドが、C/Tのヘテロ接合体では232bp、133bp、99bpのバンドが、T/Tであるホモ接合体では133bp、99bpのバンドがそれぞれ確認された。得られたPCR-RFLPによるスクリーニングの結果を図４に示す。
（２）５’フランキング領域の-786番目の変異
実施例１の工程（２）に記載の方法に実質的に従い、表４に記載のプライマーおよび表５に記載の増幅条件を用い、試料における５’フランキング領域の-786番目の変異を含む部分を増幅させた。得られた増幅断片（354bp）を製造元の教示に従ってMsp Ｉにより消化した後、これを10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、バンドを確認した。正常型遺伝子（T）のホモ接合体ではMsp Ｉにより１ヶ所が消化され、196bpおよび158bpの２つのバンドを与える。一方、変異型遺伝子（G）のホモ接合体はMsp Ｉにより２ヶ所が消化されるため、158bp、154bp、44bpの３つのバンドを与える。得られたPCR-RFLPによるスクリーニングの結果を図５に示す。
（３）５’フランキング領域の-1468番目の変異
実施例１の工程（２）に記載の方法に実質的に従い、表４に記載のプライマーおよび表５に記載の増幅条件を用い、試料における５’フランキング領域の-1468番目の変異を含む部分を増幅させた。得られた増幅断片（627bp）を製造元の教示に従ってMbo Ｉにより消化した後、これを10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、バンドを確認した。正常型遺伝子（T）のホモ接合体ではMbo Ｉにより１ヶ所が消化され、515bpおよび112bpの２つのバンドを与える。一方、変異型遺伝子（A）のホモ接合体はMbo Ｉにより２ヶ所が消化されるため、515bp、61bp、41bpの３つのバンドを与える。得られたPCR-RFLPによるスクリーニングの結果を図５に示す。
（４）５’フランキング領域の-922番目の変異
この変異の検出はPCR-SSP（Sequence-Specific Primer）法により行った。-922番目のAまたはGが3'方向伸長側の起点となるように、上、下流方向の各々にプライマーを２種類（計４種類）設定する。このプライマーは表４記載の（b）および（c）記載のものと同一である。これらのプライマーとペアとなるセンスあるいはアンチセンスプライマー（２種）はそれぞれ-1468番目、-786番目の変異箇所を増幅領域内に含むように設定する。これらのPCRを行ったところ、-922番目がA/Aのホモ接合体の場合には3'側の起点がAかT（相補配列）のプライマーのみで増幅し、A/Gのヘテロ接合体はすべてのプライマーで増幅し、G/Gのホモ接合体の場合は3'方向の起点がGかC（相補配列）のプライマーのみで増幅した。
得られた増幅断片は上記（２）および上記（３）で得られた増幅断片と同一である。得られた増幅断片を検討したところ、ある種の検体では、-922番目がA（正常型）であるアレルに由来する上記（２）の増幅断片（354bp）は-786番目の塩基がTであり正常型のみを与え、他方、-922番目がG（異常型）であるアレルに由来する上記（２）の増幅断片（354bp）は-786番目の塩基がGであり異常型のみを与えることが判明した。同様に、-922番目がA（正常型）であるアレルに由来する上記（３）の増幅断片（627bp）は-1468番目の塩基がTであり正常型のみを与え、他方、-922番目がG（異常型）であるアレルに由来する上記（３）の増幅断片（627bp）は-1468番目の塩基がAであり異常型のみを与えることが判明した。このことから、ある種の態様では、５’フランキング領域内の上記の変異は全て同一アレル上に連鎖していることが確認され、３ヶ所のうちいずれか１つの変異を検出すれば、他の２ヶ所の有無も予測可能であることが示された。
考察
上記のように、本発明者らはeNOS遺伝子に変異があり、NOSの活性を下げ、これが冠攣縮に関与しているのではないかとの仮説を立て、実験を行なった。もしこれが正しければ、冠攣縮が一枝のみよりは、多枝に渡ることが多い事実にも合致する（8）。なお、実施例１にて見出されたGlu298Asp変異はMarsdenらにより報告されているが（24）、その意義については全く調べられていない。
実施例１では、Glu298Asp変異は冠攣縮性狭心症群２３％、一方コントロール群８％に認められ、冠攣縮性狭心症群はコントロール群に比較してその頻度が有意に高いことが示された。また多変量解析の結果でも冠攣縮とGlu298Asp変異の間で有意の相関があることが示された。
但し、この変異の率は冠攣縮症例の２３％程度であったことから、冠攣縮症例の残り７７％については、他の因子がその成因にかかわっている可能性がある。実施例１ではeNOSのエクソン７中の変異を指標としたが、この変異とは別に、eNOSの他の領域（プロモーター領域やイントロン領域など）にも変異があるのではないかとの仮説の下、実験を繰り返し、その事実を突き止めた（実施例２〜５）。従って、これらの変異の相関性を詳細に調べれば、いっそう確かな冠攣縮関連疾患の診断が可能となる。
あるいはまた、eNOS遺伝子のみでなく、他の遺伝子が冠攣縮の成因になっている可能性もある。さらには遺伝的要因の他に、環境因子が冠攣縮の病態にかかわっていることも考慮に入れるべきである。というのは、家族発症型の冠攣縮症例が比較的少ないからである。実施例１でも、喫煙が冠攣縮の危険因子であることが示された。この結論は他の報告と一致している（30,31）。今回、ロジスティック重回帰分析の結果、変異を含めた全ての危険因子の中で、喫煙が冠攣縮の最も強い因子であることが示され、環境因子が冠攣縮の成因の上で極めて重要であることが示唆された。喫煙が内皮障害を引き起こすことは、他の研究者も指摘している（32,33）。
Glu298Asp変異はコントロール群でも８％認められた（786人、実施例１）。この理由について詳細は不明だが、変異の見られた７人のうち６人は非喫煙者であり、よってこの症例には喫煙と言う強い影響をもたらす危険因子がないことになる。もう一つの理由として、冠攣縮の診断の困難さがあると思われる。つまりいくつかの理由から冠攣縮を見逃して、冠攣縮症例をコントロール症例群に入れている可能性がある。その理由とは、
１）発作はよく深夜から早朝にかけておこることが多く、一般に日中にはあまり起こらないので見逃しやすいこと、
２）アセチルコリンを冠動脈内に投与しても、常に冠攣縮が誘発できるとは限らず、アセチルコリン誘発の冠攣縮は冠攣縮性狭心症の"diseaseactivity"（病気の活動性）に依存することが多いこと、
３）３分の２以上の冠攣縮の発作は、サイレント（症状なし）であること、
４）検査の結果、冠攣縮性狭心症ではないと判断されても、将来は冠攣縮が出現するかもしれないことである。逆に冠攣縮性狭心症群の診断は冠動脈造影をして確実に冠攣縮を確認しており確定診断に至っている症例である。
本発明は環境因子のみならず遺伝的要因も冠攣縮の病因にかかわっていることを示した最初のものであり、より優れた冠攣縮関連疾患の診断を提供するものである。
以下に本明細書中に引用した文献名を列記する。
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【図１】
0003928140.tif 000007
【図２】
0003928140.tif 000008
0003928140.tif 000009
【図４】
0003928140.tif 000010
【図５】
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