(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、２０モル％以上４０モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、３モル％以上４０モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１５モル％以上２５モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１モル％以上２５モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項６】
基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【請求項７】
請求項６に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、２０モル％以上４０モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項８】
請求項６に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、３モル％以上４０モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項９】
請求項６に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１５モル％以上２５モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１０】
請求項６に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１モル％以上２５モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１１】
基板の表面に、
アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
ホスホリルコリン基を含む第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
が、
前記基板、前記第一の層、および前記第二の層の順で積層されていることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１２】
請求項１１に記載のバイオチップ用基板において、
前記第一の層の前記アミノ基と、前記第二の層の前記活性エステル基とが反応してアミド結合が形成されたことを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１３】
請求項１１に記載のバイオチップ用基板において、前記第一の層が前記アミノ基を有するシランカップリング剤を含むことを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１４】
請求項１、６および１１のいずれかに記載のバイオチップ用基板において、
ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１５】
請求項１または１１に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質は、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１６】
基板上に第一の層が形成され、
さらに第一の層上に第二の層が形成され、
前記第一の層は、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも一つの基を有する化合物から形成され、
前記第二の層は、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する単量体と、の共重合体から形成されていることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１７】
基板と、
前記基板上に設けられ、オルガノシロキサンからなる第一の層と、
第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する単量体との共重合体からなる第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１８】
請求項１６に記載のバイオチップ用基板において、
前記化合物の、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基が、前記第二の層の前記共重合体と共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項１９】
請求項１６に記載のバイオチップ用基板において、
前記第一の層が、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有するシランカップリング剤により形成されたことを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２０】
請求項１９に記載のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体が、メタクリル基またはアクリル基を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２１】
請求項１９に記載のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２２】
請求項１６に記載のバイオチップ用基板において、活性エステル基を有する前記単量体が、メタクリル基またはアクリル基を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２３】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板において、前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を含むことを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２４】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板において、前記基板の材料がプラスチックであることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２５】
請求項２４に記載のバイオチップ用基板において、前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンであることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２６】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板において、前記基板の材料がガラスであることを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２７】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（１）に示される一価の基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【化１】
0003887647.tif 000027
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項２８】
請求項２７に記載のバイオチップ用基板において、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【化２】
0003887647.tif 000028
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項２９】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項３０】
基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（１）で示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【化３】
0003887647.tif 000029
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項３１】
請求項３０に記載のバイオチップ用基板において、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【化４】
0003887647.tif 000030
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項３２】
基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【請求項３３】
基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（１）で示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【化５】
0003887647.tif 000031
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項３４】
請求項３３に記載のバイオチップ用基板において、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【化６】
0003887647.tif 000032
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項３５】
基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項３６】
基板と、
前記基板上に設けられ、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物から形成された第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、下記式（１）で示される一価の基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【化７】
0003887647.tif 000033
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項３７】
請求項３６に記載のバイオチップ用基板において、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ用基板。
【化８】
0003887647.tif 000034
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項３８】
基板と、
前記基板上に設けられ、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物から形成された第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、カルボン酸誘導基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項３９】
請求項１または６に記載のバイオチップ用基板の前記基板の表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質を固定化し、蛍光色素を用いて前記生理活性物質を検出するためのマイクロアレイ用基板であって、
前記基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む前記高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ用基板。
【請求項４０】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項４１】
ホスホリルコリン基を含む第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４２】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記活性エステル基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４３】
請求項４２に記載のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーがアミノ基を有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項４４】
請求項４２に記載のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドまたは複数種類の前記ポリアルキレンオキシドを構造中に含むことを特徴とするバイオチップ。
【請求項４５】
請求項４１または４２に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料がプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のバイオチップにおいて、前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンであることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４７】
基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４８】
請求項４７に記載のバイオチップにおいて、
複数の前記活性エステル基を有し、
前記複数の活性エステル基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４９】
請求項４７に記載のバイオチップにおいて、前記流路を覆う保護部材を有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項５０】
請求項４９に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料と前記保護部材の材料のうち、少なくとも一方がプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５１】
請求項４７に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料が、検出光に対して透明なプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５２】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、さらに前記捕捉物質に前記生理活性物質が捕捉されたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項５３】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項５４】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項５５】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、前記高分子物質は、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項５６】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料がガラスであることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５７】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、前記捕捉物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５８】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が、中性またはアルカリ性の条件で前記基板の表面に固定化されてなることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５９】
請求項４１、４２および４７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６０】
ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（１）に示される一価の基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記式（１）に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【化９】
0003887647.tif 000035
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項６１】
請求項６０に記載のバイオチップにおいて、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ。
【化１０】
0003887647.tif 000036
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項６２】
ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６３】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、下記式（１）で示される一価の基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記式（１）で示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記式（１）で示される一価の基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【化１１】
0003887647.tif 000037
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項６４】
請求項６３に記載のバイオチップにおいて、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ。
【化１２】
0003887647.tif 000038
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項６５】
基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位を複数とを含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記カルボン酸誘導基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６６】
基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（１）に示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【化１３】
0003887647.tif 000039
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【請求項６７】
請求項６６に記載のバイオチップにおいて、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ。
【化１４】
0003887647.tif 000040
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【請求項６８】
基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６９】
請求項３９に記載のマイクロアレイ用基板に、
核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の前記捕捉物質が固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項７０】
請求項１１に記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、
（１）前記基板の前記表面とアミノ基を有する前記化合物との接触工程、および
（２）前記アミノ基を有する化合物と前記高分子物質との接触工程、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項７１】
請求項１６に記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、
前記基板上に、前記第一の層を形成した後、
前記第一の層上で、ホスホリルコリン基を有する前記単量体と活性エステル基を有する前記単量体とを共重合することにより前記第二の層を形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項７２】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板の使用方法であって、
（１）生理活性物質を捕捉する捕捉物質を中性またはアルカリ性の条件で前記基板上に固定化するステップ、および
（２）前記マイクロチップ用基板の表面に、検出される生理活性物質を含む前記条件以下のｐＨの液体を接触させて、前記捕捉物質に前記生理活性物質を捕捉させるステップ、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載のバイオチップ用基板の使用方法において、
前記捕捉物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法。
【請求項７４】
請求項７２に記載のバイオチップ用基板の使用方法において、
検出される前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップの使用方法。
【請求項７５】
請求項１、６、１１、１６および１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板を用いたバイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板は、複数の前記活性エステル基を有し、
一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、
捕捉物質を固定化する工程の後、残りの前記活性エステル基を不活性化する工程と、
を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステル基を不活性化する前記工程を、アルカリ化合物を用いて行うことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項７７】
請求項７５に記載のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステル基を不活性化する前記工程を、１級のアミノ基を有する化合物を用いて行うことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載のバイオチップの製造方法において、１級のアミノ基を有する前記化合物が、アミノエタノールまたはグリシンであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項７９】
請求項７５に記載のバイオチップの製造方法において、前記捕捉物質が、
核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項８０】
請求項４１に記載のバイオチップの製造方法であって、前記捕捉物質を含む酸性または中性の液体を前記基板の前記表面に接触させる工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項８１】
請求項４２に記載のバイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板の一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、共有結合を形成させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、
捕捉物質を固定化する前記工程の後、残りの前記活性エステル基と前記親水性ポリマーとを反応させて、共有結合させる工程と、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の生理活性物質の検出または分析に用いられるバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高いタンパク質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、タンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板）表面に固定化したものを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板上にタンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
プロテインチップのシグナル検出において、プロテインチップ基板への検出対象物質の非特異的な吸着は信号対雑音比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００６】
このため、通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定化した後に二次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化したタンパク質の上にコーティングされてしまい、二次抗体と反応できないという問題があった。このため、一次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。非特異的吸着の原因としては種々あるが基材とタンパクとの疎水性相互作用、水素結合などが考えられている。そのため、バイオチップ基板の表面は親水性であり、かつ水素結合基を持たないことが求められている。
【０００７】
また、プロテインチップ基板への検出対象物質の非特異的吸着を除去するために界面活性剤による洗浄過程が多数組み込まれているが、界面活性剤によりコーティング膜がはがれてしまうという問題もあり、界面活性剤による洗浄でもコーティング膜が剥がれないプロテインチップが求められている。
【０００８】
また、マイクロアレイ状のチップを用いて試料検体の情報を得る技術は、生物学、医学において欠くことのできない技術になりつつある。たとえば、ＤＮＡマイクロアレイでは、複雑な生物系においてもゲノム全体の発現パターンの研究が可能となり、遺伝子情報量の爆発的な増加がもたらされている。
【０００９】
マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ用基板のバックグランドはＳ／Ｎ比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（たとえば、非特許文献１など）。Ｓ／Ｎ比とは、ラベル化された試料検体から得られたシグナル量（シグナル）をラベル化された試料検体から得られたシグナル物質以外の部位から発生したシグナル量（ノイズ）で除した値のことをいい、Ｓ／Ｎ比が高いと検出感度が高くなる。
【００１０】
マイクロアレイ上の物質を検出する手段として蛍光物質を用いる場合、マイクロアレイ基板の自己蛍光量がバックグランドとなり、基板の自己蛍光が高いと、Ｓ／Ｎ比が低下する問題がある。また、蛍光物質の基板への付着によりバックグランドにムラが生じた場合、その基板から得られたデータの再現性または信頼性に支障をきたす原因となりうる。
【００１１】
マイクロアレイ用基板として用いられる素材は、ガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、生理活性物質を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。ガラスやプラスチックなどの不活性な表面に様々な官能基を直接導入することは困難であるため、まずアミノ基を導入しておき、そのアミノ基を介して官能基を導入する方法が一般的である。
【００１２】
基板表面へのアミノ基の導入方法として、アミノアルキルシランによる処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性、再現性の観点から、アミノアルキルシランによる処理が多用されている。一般的に用いられているアミノアルキルシランとしては、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルメチルジメトキシシランなどの１級アミノ基を有するアミノアルキルシランが挙げられる。
【００１３】
アミノ基を介して官能基を導入する方法として、たとえば、２官能性アルデヒドを有するグルタルアルデヒドで処理することにより、基板にアルデヒド基を導入することが知られている（特許文献２、特許文献３、特許文献４）。マレイミド基を導入する場合は、一端にマレイミド基、一端に活性エステルを有する架橋剤であるＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドなどで処理することができる（特許文献５）。また、同様にＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを導入する場合には、両端に活性エステル基を有するEthyleneglycol−O,O−bis (succinimidylsuccinate)などを用いる。
【００１４】
ところが、基板に上記のような表面処理を施した場合、基板の自己蛍光量が増大し、この基板の自己蛍光の上昇がＳ／Ｎ比の低下の原因となっていた。また、蛍光物質の基板への付着が起こることによりバックグランドが高くなり、Ｓ／Ｎ比の低下の原因となる問題もあった。そのため、表面処理により自己蛍光量が増大せず、かつ蛍光物質の付着のないマイクロアレイ用基板が求められていた。
【００１５】
また、マイクロアレイ研究の一方で、反応の高効率化および微少サンプル化を目指し、マイクロフルイディクスと呼ばれる、微細流路を用いる技術が開発されている。たとえば、微細流路内で抗原抗体反応を起こさせる免疫分析などが挙げられる（特許文献６）。ＤＮＡ分析においてもマイクロ流路を用いた手法が検討されている（特許文献７）。
【００１６】
ところが、微細流路を用いた生理的活性物の従来の分析においては、流路へ生理活性物質が付着してしまい、検出感度の低下をまねくことがあった。このため、流路への生理活性物質の付着を防止する技術が求められている。また、ＤＮＡのハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等においては、より短時間かつ少量で反応が起こる系が切望されている。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【特許文献２】特開２００２−１７６９９１号公報
【特許文献３】特開２００２−１８１８１７号公報
【特許文献４】特表２００２−５３２６９９号公報
【特許文献５】特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献６】特開２００１−００４６２８号公報
【特許文献７】特開２００４−０５３４１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合が抑制され、検出感度に優れたバイオチップを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００１９】
本発明のバイオチップ用基板は、ホスホリルコリン基を有するため、基板上への生理活性物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、活性エステル基を有するため、生理活性物質を捕捉する捕捉物質を高分子物質中に安定的に導入することができる。このため、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度を向上させることができる。本発明のバイオチップ用基板は、たとえば基板の表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されるバイオチップに用いる基板とすることができる。
【００２０】
本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、３モル％以上４０モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、２０モル％以上４０モル％未満であってもよい。
【００２１】
本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１モル％以上２５モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタクリレート基を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１５モル％以上２５モル％未満であってもよい。
【００２２】
本発明によれば、基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【００２３】
本発明のバイオチップ用基板は、上記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有するため、基板上への生理活性物質の非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる。なお、（ａ）成分の第一単位と（ｂ）成分の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、（ａ）成分と（ｂ）成分とが混合されていてもよい。
【００２４】
本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、３モル％以上４０モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、２０モル％以上４０モル％未満であってもよい。なお、本明細書において、高分子物質が上記（ａ）、（ｂ）成分を含む構成では、ホスホリルコリン基の割合は、（ａ）成分と（ｂ）成分に含まれるホスホリルコリン基の合計を指す。
【００２５】
本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１モル％以上２５モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタクリレート基との合計に対する割合が、１５モル％以上２５モル％未満であってもよい。
【００２６】
本発明によれば、基板の表面に、
アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
ホスホリルコリン基を含む第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
が、
前記基板、前記第一の層、および前記第二の層の順で積層されていることを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００２７】
本発明においては、基板、第一の層および第二の層がこの順で積層されているため、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度を向上させることができる。また、界面活性剤等による洗浄による層の剥離を抑制することができる。なお、第一の層または第二の層は、膜状に形成することができる。
【００２８】
本発明のバイオチップ用基板において、
前記第一の層の前記アミノ基と、前記第二の層の前記活性エステル基とが反応して共有結合、具体的にはアミド結合が形成された構成とすることができる。
【００２９】
本発明のバイオチップ用基板において、前記第一の層が前記アミノ基を有するシランカップリング剤を含んでもよい。アミノ基を有するシランカップリング剤は、ポリオルガノシロキサン等のオルガノシロキサンの形態で存在していてもよい。
【００３０】
本発明のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する構成とすることができる。
【００３１】
本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質は、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する構成とすることができる。また、本発明において、前記高分子物質は共重合体とすることができる。この構成において、前記高分子物質は、前記ホスホリルコリン基を有する単量体と、前記活性エステル基を有する単量体と、前記ブチルメタクリレート基を有する単量体と、の共重合体とすることができる。
【００３２】
本発明によれば、基板上に第一の層が形成され、
さらに第一の層上に第二の層が形成され、
前記第一の層は、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも一つの基を有する化合物から形成され、
前記第二の層は、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する単量体と、の共重合体から形成されていることを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００３３】
また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、オルガノシロキサンからなる第一の層と、
第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する単量体との共重合体からなる第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００３４】
この構成によれば、基板上にホスホリルコリン基と活性エステル基とを含む共重合体から形成された層を有するため、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度を向上させることができる。また、かつ界面活性剤等による洗浄による層の剥離を抑制することができる。この構成において、前記基板の表面に前記第一の層が設けられ、前記第一の層の表面に前記第二の層が設けられた構成とすることができる。
【００３５】
また、前記オルガノシロキサンは、重合性二重結合を含む基を有する化合物とすることができる。重合性二重結合を有する基がアルケニル基を構成していてもよい。また、重合性二重結合を有する基の少なくとも一部がアクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を構成していてもよい。
【００３６】
本発明のバイオチップ用基板において、前記化合物の、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基が、前記第二の層の前記共重合体と共有結合を形成していてもよい。
【００３７】
本発明のバイオチップ用基板において、前記第一の層が、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有するシランカップリング剤により形成されていてもよい。また、シランカップリング剤は、オルガノシロキサンを形成していてもよい。
【００３８】
本発明のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体が、メタクリル基またはアクリル基を有する構成とすることができる。また、本発明のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであってもよい。
【００３９】
本発明のバイオチップ用基板において、活性エステル基を有する前記単量体が、メタクリル基またはアクリル基を有する構成とすることができる。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を含むことができる。
【００４０】
本発明のバイオチップ用基板において、前記基板の材料がプラスチックであってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンであってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記基板の材料がガラスであってもよい。
【００４１】
本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（１）に示される一価の基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００４２】
【化１】
0003887647.tif 000002
【００４３】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【００４４】
また、本発明によれば、基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（１）で示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【００４５】
また、本発明によれば、
基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（１）で示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００４６】
また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物から形成された第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、上記式（１）で示される一価の基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００４７】
こうした構成によれば、上記式（１）に示したように、第二単位にカルボニル基を介して脱離基Aが存在するため、高分子物質中に生理活性物質を捕捉する捕捉物質をさらに確実に化学的に導入することができる。
【００４８】
本発明のバイオチップ用基板において、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であってもよい。こうすることにより、脱離基Ａをさらに確実に活性化し、反応性をさらに向上させることができる。なお、下記式（ｐ）または式（ｑ）は、それぞれ、Ｎを含む環状化合物のＮからＨが抜けた構成やＣを含む環状化合物のＣからＨが抜けた構成とすることもできる。
【００４９】
【化２】
0003887647.tif 000003
【００５０】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００５１】
本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００５２】
また、本発明によれば、基板の表面に、下記（ａ）、（ｂ）成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
（ａ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子
（ｂ）ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタクリレート基を有する第三単位とを含む高分子
【００５３】
また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００５４】
また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、およびアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物から形成された第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、カルボン酸誘導基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
【００５５】
本発明によれば、前記バイオチップ用基板の前記基板の表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質を固定化し、蛍光色素を用いて前記生理活性物質を検出するためのマイクロアレイ用基板であって、前記基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む前記高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ用基板が提供される。本発明のマイクロアレイ用基板は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制しつつ、捕捉物質と活性エステル基とを反応させて共有結合を形成させることができるため、生理活性物質の検出を確実に行うことができる。
【００５６】
本発明によれば、前記バイオチップ用基板に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されたことを特徴とするバイオチップが提供される。なお、捕捉物質は生理活性を有することができる。また、生理活性物質を有する分子とすることができる。この分子は単独で生理活性物質を捕捉することもできるし、複数の分子で生理活性物質を捕捉することもできる。また、本発明において、捕捉物質が高分子物質に共有結合している構成とすることができる。
【００５７】
本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００５８】
本発明によれば、活性エステル基の作用により捕捉物質が高分子物質に化学的に固定化されているとともに、基板上への生理活性物質の非特異的吸着がホスホリルコリン基の作用により抑制されるので、生理活性物質の分析を確実に行うことができる。なお、捕捉物質とが反応して、共有結合を形成している構成として、捕捉物質と活性エステル基のある所定の部位とが反応して共有結合している場合も含まれる。また、本発明において、前記基板の表面に前記高分子物質が層状に形成されていてもよい。また、前記基板の表面を前記高分子物質が被覆していてもよい。こうすれば、さらに確実に非特異的吸着を抑制することができる。また、固定化に用いる活性エステル基を基板表面にさらに確実に導入できる。
【００５９】
本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記活性エステル基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００６０】
本発明においては、高分子物質中に、たとえば一種類の活性エステル基が２個以上含まれ、補足物質と共有結合を形成した活性エステル基以外の、残りの活性エステル基と親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成している。このため、生理活性物質と活性エステル基との反応が抑制され、また、高分子物質が親水化されている。よって、生理活性物質の非特異的吸着がより一層抑制された構成となっている。
【００６１】
本発明のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーがアミノ基を有する構成とすることができる。こうすれば、親水性ポリマーを活性エステルとさらに確実に反応させて、アミド結合を形成させることができる。
【００６２】
本発明のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドまたは複数種類の前記ポリアルキレンオキシドを構造中に含むことができる。また、前記親水性ポリマーが、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、これらの共重合体、およびこれらの少なくとも一つと他のポリアルキレンオキシドとの共重合体のいずれかを構造中に含むことができる。
【００６３】
本発明のバイオチップにおいて、前記基板の材料がプラスチックであってもよい。また、本発明のバイオチップにおいて、前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンであってもよい。
【００６４】
本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、アルキルエステルよりも高い活性を有する活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００６５】
本発明のバイオチップにおいては、基板に流路が設けられているため、捕捉物質がさらに充分に固定化された構成となっている。また、生理活性物質をさらに確実に捕捉物質と相互作用させることができる構成となっている。このため、流路中に試験液を流動させて、捕捉物質に捕捉された試験液中の生理活性物質の検出または定量に好適に用いることができる。また、試験液中に含まれる成分の特定に用いることもできる。なお、この構成において、流路が基板の表面に溝状に設けられていてもよい。
【００６６】
本発明のバイオチップにおいて、複数の前記活性エステル基を有し、前記複数の活性エステル基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されていてもよい。なお、活性エステル基が不活性化されているとは、活性エステル基を構成する一部の基（脱離基）が他の基に置換されて、高い反応活性を喪失していることをいう。
【００６７】
本発明のバイオチップにおいて、前記流路を覆う保護部材を有していてもよい。また、保護部材が板状部材であってもよい。このとき、基板と板状の保護部材とが接合され、接合面に流路が形成された構成とすることもできる。
【００６８】
本発明のバイオチップにおいて、前記基板または保護部材の材料がプラスチックであってもよい。また、本発明のバイオチップにおいて、前記基板の材料が、検出光に対して透明なプラスチックであってもよい。また、本発明において、前記基板と前記保護部材の少なくとも一方の材料が、検出光に対して透明なプラスチックであってもよい。
【００６９】
本発明のバイオチップにおいて、さらに前記捕捉物質に前記生理活性物質が捕捉された構成とすることができる。
【００７０】
本発明のバイオチップにおいて、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することができる。
【００７１】
本発明のバイオチップにおいて、前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することができる。
【００７２】
本発明のバイオチップにおいて、前記高分子物質は、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することができる。この構成において、前記高分子物質は、前記ホスホリルコリン基を有する単量体と、前記活性エステル基を有する単量体と、前記ブチルメタクリレート基を有する単量体と、の共重合体とすることができる。
【００７３】
本発明のバイオチップにおいて、前記基板の材料がガラスであってもよい。
【００７４】
本発明のバイオチップにおいて、前記捕捉物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であってもよい。また、本発明のバイオチップにおいて、前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であってもよい。
【００７５】
本発明のバイオチップにおいて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が、中性またはアルカリ性の条件で前記基板の表面に固定化されてなる構成とすることができる。前記中性またはアルカリ性の条件は、ｐＨ７．６以上の条件とすることができる。
【００７６】
本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（１）に示される一価の基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記下記式（１）に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００７７】
【化３】
0003887647.tif 000004
【００７８】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
【００７９】
また、本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、上記式（１）で示される一価の基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記式（１）で示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記式（１）で示される一価の基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００８０】
また、本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（１）に示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００８１】
本発明のバイオチップにおいて、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であってもよい。
【００８２】
【化４】
0003887647.tif 000005
【００８３】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００８４】
本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００８５】
また、本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位を複数とを含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、
残りの前記カルボン酸誘導基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００８６】
また、本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
【００８７】
本発明によれば、前記マイクロアレイ用基板に、
核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の前記捕捉物質が固定化されたことを特徴とするマイクロアレイが提供される。
【００８８】
本発明によれば、マイクロアレイ用基板の自己蛍光を低減し、かつ蛍光物質の吸着を低減することにより、マイクロアレイの検体のシグナルを精密に検出することができる。
【００８９】
本発明によれば、前記バイオチップ用基板の製造方法であって、
（１）前記基板の前記表面とアミノ基を有する前記化合物との接触工程、および
（２）前記アミノ基を有する化合物と前記高分子物質との接触工程、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法が提供される。
【００９０】
また、本発明によれば、前記バイオチップ用基板の製造方法であって、
前記基板上に、前記第一の層を形成した後、
前記第一の層上で、ホスホリルコリン基を有する前記単量体と活性エステル基を有する前記単量体とを共重合することにより前記第二の層を形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法が提供される。
【００９１】
本発明によれば、前記バイオチップ用基板の使用方法であって、
（１）生理活性物質を捕捉する捕捉物質を中性またはアルカリ性の条件で前記基板上に固定化するステップ、および
（２）前記マイクロチップ用基板の表面に、検出される生理活性物質を含む前記条件以下のｐHの液体を接触させて、前記捕捉物質に前記生理活性物質を捕捉させるステップ、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法が提供される。
【００９２】
本発明のバイオチップ用基板の使用方法によれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の溶液のｐＨを制御することにより、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度の高いマイクロチップを得ることができる。この構成において、液体は、生理活性物質を含む溶液とすることができる。また、上記（１）における条件は、たとえばｐＨ７．６とすることができる。
【００９３】
本発明のバイオチップ用基板の使用方法において、前記捕捉物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であってもよい。
【００９４】
また、本発明のバイオチップ用基板の使用方法において、検出される前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であってもよい。
【００９５】
本発明によれば、前記バイオチップ用基板を用いたバイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板は、複数の前記活性エステル基を有し、
一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、
捕捉物質を固定化する工程の後、残りの前記活性エステル基を不活性化する工程と、
を有することを特徴とするバイオチップの製造方法が提供される。
【００９６】
本発明のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステル基を不活性化する前記工程を、アルカリ化合物を用いて行うことができる。
【００９７】
また、本発明のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステル基を不活性化する前記工程を、１級のアミノ基を有する化合物を用いて行うことができる。また、本発明のバイオチップの製造方法において、１級のアミノ基を有する前記化合物が、アミノエタノールまたはグリシンであってもよい。
【００９８】
本発明のバイオチップの製造方法において、前記捕捉物質が、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であってもよい。また、この構成において、捕捉物質を固定化する前記工程は、前記生理活性物質を含むｐＨ７．６以下の溶液を前記基板の前記表面に接触させる工程を含んでもよい。
【００９９】
本発明によれば、本発明のバイオチップの製造方法であって、前記捕捉物質を含む酸性または中性の液体を前記基板の前記表面に接触させる工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法が提供される。本発明において、酸性または中性の前記液体のｐＨが７．６以下あってもよい。
【０１００】
本発明によれば、前記バイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板の一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、共有結合を形成させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、
捕捉物質を固定化する前記工程の後、残りの前記活性エステル基と前記親水性ポリマーとを反応させて、共有結合させる工程と、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法が提供される。
【０１０１】
本発明によれば、前記バイオチップの製造方法により製造されたことを特徴とするバイオチップが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０２】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
【０１０３】
（第１の実施形態）
本実施形態は、基板（固相基板）上に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されバイオチップ用基板に関する。このバイオチップ用基板は、基板の表面に高分子物質を有する。高分子物質は、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する。以下、バイオチップ用基板の構成部材について説明する。
【０１０４】
（高分子物質）
ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。第一単位に含まれるホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基は捕捉分子を化学的に固定化する役割を果たす。
【０１０５】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【０１０６】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【０１０７】
活性化されたカルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、たとえば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【０１０８】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【０１０９】
【化５】
0003887647.tif 000006
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【０１１０】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【０１１１】
【化６】
0003887647.tif 000007
【０１１２】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【０１１３】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【０１１４】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【０１１５】
【化７】
0003887647.tif 000008
【０１１６】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【０１１７】
なお、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【０１１８】
本実施形態および以下の実施形態では、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【０１１９】
基板の表面に捕捉物質が固定化されるバイオチップ用基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【０１２０】
また、本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【０１２１】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【０１２２】
【化８】
0003887647.tif 000009
【０１２３】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【０１２４】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、非特異吸着を抑制する性質と、捕捉物質固定化する性質とのバランスにより一層優れた構成である。このため、これを用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質が設けられた基板上への非特異的吸着を抑制しつつ、捕捉物質をさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
【０１２５】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【０１２６】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【０１２７】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【０１２８】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【０１２９】
（基板の素材）
本実施形態において、バイオチップ用基板として使用される基板の素材は、たとえばガラス、プラスチック、金属その他とすることができる。このうち、表面処理の容易性および量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【０１３０】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、生理活性物質の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【０１３１】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【０１３２】
本実施形態に係るバイオチップ用基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【０１３３】
なお、本実施形態および以下の実施形態において、基板の形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【０１３４】
得られたバイオチップ用基板を用いてバイオチップを作製することができる。以下、バイオチップ用基板を用いたバイオチップについて説明する。
【０１３５】
バイオチップは、たとえば、バイオチップ用基板の表面に、高分子物質を介して生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化された構成とすることができる。こうすれば、生理活性物質の検出にさらに好適に用いることができる。
【０１３６】
なお、本実施形態および以降の実施形態において、バイオチップは、単独で用いられてもよいし、他の分析装置中に組み込まれた状態で用いられてもよい。たとえば、バイオチップが分析装置の試料台を兼ねる構成とすることもできる。
【０１３７】
本実施形態および以下の実施形態において、生理活性物質を捕捉する捕捉物質は、生理活性物質に特異的に相互作用する物質とすることができる。特異的な相互作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。また、捕捉物質は生理活性を有することができる。生理活性を有する捕捉物質としては、たとえば、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、または糖タンパク質とすることができる。
【０１３８】
また、本実施形態および以下の実施形態において、生理活性物質は、たとえば、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、または糖タンパク質とすることができる。
【０１３９】
次に、バイオチップの製造方法を説明する。本実施形態のバイオチップは、バイオチップ用基板に捕捉物質を固定化することにより得られる。
【０１４０】
（生理活性物質を捕捉する捕捉物質の固定化）
バイオチップの製造工程は、たとえば、
（ｉ）バイオチップ用基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基と捕捉物質とを反応させて共有結合を形成させることにより、バイオチップ用基板の捕捉物質を固定化する工程、
（ｉｉ）捕捉物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する工程、すなわち残りの活性エステル基を不活性化する工程、
を有することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【０１４１】
上記（ｉ）において、生理活性物質を捕捉する捕捉物質をバイオチップ用基板上に固定化する際には、捕捉物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部が捕捉物質と反応して、捕捉物質と共有結合が形成される。
【０１４２】
捕捉物質を溶解または分散した液体のｐＨは、たとえば酸性から中性とすることができる。
【０１４３】
また、点着後、固定化されなかった生理活性物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することができる。
【０１４４】
また、上記（ｉｉ）に示したように、洗浄後は生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【０１４５】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【０１４６】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【０１４７】
バイオチップ用基板に固定化する捕捉物質は、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を有することが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基を有する捕捉物質を用いることにより、効率よくかつ強固にバイオチップ基板上に捕捉物質を固定化することができる。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。
【０１４８】
たとえば、本実施形態および以下の実施形態に記載のバイオチップ用基板上に固定化する捕捉物質として核酸、アプタマーを用いる場合、活性エステル基との反応性を高めるために、アミノ基を導入することが好ましい。ＤＮＡやアプタマー等の核酸鎖の場合、分子鎖中にアミノ基を有しているが、さらに、分子鎖末端にアミノ基を導入してもよい。こうすることにより、末端のアミノ基を活性エステル基と反応させて、高分子物質とさらに確実に共有結合を形成させることができる。また、末端のアミノ基を固定化に用いることにより、ＤＮＡ相補鎖とのハイブリダイゼーションやタンパクとの相互の反応をより一層効率よく行うことができる。
【０１４９】
また、捕捉物質として、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質を用いる場合にも、必要に応じてアミノ基を導入することが好ましい。
【０１５０】
以上により、基板上に捕捉物質が固定化されたバイオチップが得られる。このバイオチップは、生理活性物質の検出、定量等に用いることができる。また、試験液中に含まれる生理活性物質の特定にも利用可能である。以下、バイオチップを用いた生理活性物質の検出について説明する。
【０１５１】
（生理活性物質の検出）
バイオチップを用いた生理活性物質の検出方法に特に制限はないが、たとえば蛍光物質を用いて行うことができる。こうすることにより、検出感度を向上させることができる。
【０１５２】
また、バイオチップ上に活性エステル基を不活性化しないで用いる場合や、活性エステル基が基板上に残存している可能性が有る場合には、検出対象の生理活性物質を溶解または分散した液体が中性から酸性とすることができる。こうすることにより、高分子物質と生理活性物質との非特異的な反応や吸着をより一層確実に抑制することができる。
【０１５３】
このような条件として、具体的には、液体のｐＨは８．０以下、好ましくは７．６以下とすることができる。また、さらに具体的には、たとえばｐＨ７．０とすることができる。ｐＨが高すぎると、活性エステル基と生理活性物質のアミノ基とが反応を起こし、捕捉分子を点着した以外の部分に、検出する生理活性物質が共有結合により固定化されやすくなる。
【０１５４】
本実施形態によれば、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコーティングすることなく検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制するとともに、生理活性物質を捕捉する捕捉分子を共有結合により確実に固定化することができるため、検出感度や検出精度を向上させることができる。
【０１５５】
本実施形態のバイオチップは、たとえば生体試料中の多数のタンパク質、核酸等の並列検出および分析に用いられる。より詳細には、たとえばプロテオミクスや遺伝子活性の細胞内タンパク質レベルでの測定等に用いられる。
【０１５６】
なお、本実施形態で用いた各部材は、以下の実施形態においても用いることができる。
【０１５７】
以下の実施形態においては、第１の実施形態と異なる部分を中心に説明する。
【０１５８】
（第２の実施形態）
本実施形態では、第１の実施形態において、バイオチップ用基板への捕捉物質の固定化および生理活性物質の検出を、以下の条件で行う。
【０１５９】
（捕捉物質の固定化）
本実施形態においても、第１の実施形態の場合と同様に、捕捉物質をバイオチップ基板上に固定化する際に、捕捉物質を溶解または分散させた液体を点着する方法を用いることができる。
【０１６０】
また、本実施形態においては、捕捉物質の固定化反応を中性またはアルカリ性の条件で行う。たとえば、点着に用いる捕捉物質を溶解または分散した液体を中性またはアルカリ性とする。こうすることにより、捕捉物質と高分子物質の第二単位中の活性エステル基とをさらに確実に反応させ、共有結合を形成させることができる。こうした条件として、たとえばｐＨ７．０以上、好ましくはｐＨ７．６以上とすることができる。さらに具体的には、ｐＨを８．０とすることができる。ｐＨが低すぎる条件では、活性エステル基と捕捉物質とが反応を起こしにくく、捕捉物質を固定化することが困難となる懸念がある。
【０１６１】
また、捕捉物質を含む液体のｐＨの下限は、捕捉物質の種類や高分子物質の材料に応じて適宜選択されるが、たとえばｐＨ１０以下とすることができる。
【０１６２】
なお、本実施形態においても、点着後、固定化されなかった生理活性物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ましい。
【０１６３】
また、本実施形態においては、捕捉物質の固定化後、生理活性物質を捕捉させる際に、生理活性物質を含む酸性または中性の液体、たとえば溶液を基板上の高分子物質に接触させることもできる。生理活性物質を含む液体は、中性または酸性、具体的には第１の実施形態にて前述したｐＨ条件とすることができる。こうすることにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制しつつ、捕捉物質にさらに安定的に相互作用させることができる。
【０１６４】
なお、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０１６５】
たとえば、本実施形態のバイオチップの構成は、下記（ｉ）から（ｘ）に示す構成とすることができる。
（ｉ）ホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子層を表面に有する基板に、該活性エステル基を介して、生理活性物質を捕捉する分子が基板表面に固定化される構成、
（ｉｉ）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基中に含まれる構成、
（ｉｉｉ）活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成、
（ｉｖ）高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である構成、
（ｖ）基板がプラスチック製である構成、
（ｖｉ）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンある構成、
（ｖｉｉ）基板がガラス製である構成。
（ｖｉｉｉ）捕捉物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである構成、
（ｉｘ）バイオチップにさらに生理活性物質が捕捉された構成、
（ｘ）生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである構成。
【０１６６】
本実施形態によれば、タンパク質、核酸等の検出および分析に用いられる際に、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合が抑制され、検出精度や検出感度が高いバイオチップが得られる。
【０１６７】
（第３の実施形態）
本実施形態においては、第１の実施形態に記載のバイオチップ用基板を用いて、第２の実施形態に記載の条件で捕捉物質の固定化を行う。捕捉物質の固定化の条件は、第２の実施形態に記載の条件とすることができる。
【０１６８】
また、本実施形態では、捕捉物質の固定化後、基板上の高分子物質に、検出対象の生理活性物質を含む液体を接触させ、捕捉物質に生理活性物質を捕捉させる。このとき、生理活性物質を含む液体のｐＨを、捕捉物質を含む液体のｐＨ以下のｐＨ、好ましくは捕捉物質を含む液体のｐＨより低いｐＨとする。
【０１６９】
このようにすれば、生理活性物質と活性エステル基との反応をさらに確実に抑制することができる。
【０１７０】
具体的には、バイオチップ用基板への捕捉物質の固定化および生理活性物質の検出を、下記（１）（２）の手順で行うことができる。
（１）ｐＨ７．６以上で捕捉物質を固定するステップ、および
（２）検出する生理活性物質を含むｐＨ７．６以下の溶液を基板表面に接触させ、捕捉物質に生理活性物質を捕捉させるステップ。
【０１７１】
本実施形態によれば、生理活性物質を含む液体のｐＨを制御することにより、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出精度や検出感度の高いバイオチップを得ることができる。また、マイクロチップ用基板としてマイクロアレイ用基板を用いれば、検出感度に優れたマイクロアレイが得られる。
【０１７２】
なお、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０１７３】
（第４の実施形態）
本実施形態のバイオチップ用基板は、基板表面に、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導体とを含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、を有する。基板、第一の層および第二の層がこの順に積層されている。
【０１７４】
基板としては、たとえば第１の実施形態に記載の材料または形状のものを用いることができる。たとえば、飽和環状ポリオレフィン等のプラスチック製の基板やガラス製の基板とすることができる。
【０１７５】
第一の層は、アミノ基を有する化合物を含む。第一の層は、第二の層を基板上に固定化し、その剥離を抑制する接着層として機能する。第一の層は、たとえば、アミノ基を有するシランカップリング剤等のアミノシランを含むことができる。こうすれば、基板表面に第一の層をさらに安定的に設け、基板表面を第一の層でさらに確実に被覆することができる。なお、アミノ基を有するシランカップリング剤は、オルガノシロキサンやポリオルガノシロキサン等の形態で存在していてもよい。
【０１７６】
第一の層の厚さは、たとえば１Å（０．１ｎｍ）以上とすることができる。こうすることにより、基板表面を確実に被覆し、第二の層の基板表面からの剥離をさらに確実に抑制することができる。また、第一の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば１００Å（１０ｎｍ）以下とすることができる。
【０１７７】
第二の層は、基板上を被覆して生理活性物質の検出等に適した表面状態を提供する機能を有する。第二の層を構成する高分子物質は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。高分子物質中のホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。また、高分子物質中のカルボン酸誘導基は、第一の層中の化合物のアミノ基と反応する役割および捕捉物質を固定化する役割を果たす。
【０１７８】
高分子物質として、たとえば第１の実施形態に記載の構成を適用することができる。また、高分子物質中のホスホリルコリン基を含む基およびカルボン酸誘導基は、たとえば第１の実施形態に例示した基とすることができる。たとえば、高分子物質の第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する構成とすることができる。また、高分子物質の第二単位がｐ−ニトロフェニル基を有する構成とすることができる。さらに、第１の実施形態と同様に、本実施形態においても、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有していてもよい。以下、活性化されたカルボン酸誘導体が活性エステル基である場合を例に説明する。
【０１７９】
第二の層の厚さは、たとえば５ｎｍ以上とすることができる。こうすることにより、第一の層の設けられた基板表面を確実に被覆し、生理活性物質等の非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる。また、第二の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば１００ｎｍ以下とすることができる。
【０１８０】
なお、基板と第一の層との間および第一の層と第二の層との間には、介在層が存在していてもしていなくてもよい。第一の層が基板に接して設けられ、第二の層が第一の層に接して設けられた構成とし、実質的に介在層が存在しない積層形態とすることにより、バイオチップの製造過程または使用過程における基板からの高分子物質の剥離より一層確実に抑制することができる。
【０１８１】
また、第一の層のアミノ基と、第二の層中の一部の活性エステル基とが反応して共有結合、具体的にはアミド結合が形成された構成とすることができる。こうすることにより、基板上に第二の層をより一層確実に固定し、その剥離を抑制することができる。また、残りの活性エステル基を用いて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質をバイオチップ用基板上に化学的に固定化し、バイオチップを得ることができる。
【０１８２】
次に、本実施形態に係るバイオチップ用基板の製造方法を説明する。本実施形態のバイオチップ用基板の製造方法は、基板上に第一の層を設ける工程と、第一の層上に第二の層を設ける工程とを含むことができる。基板に接して第一の層が設けられ、第一の層に接して第二の層が設けられる構成の場合、バイオチップ用基板の製造工程は、たとえば下記（１）および（２）の工程を含むことができる。
（１）基板の表面とアミノ基を有する化合物との接触工程、および
（２）アミノ基を有する化合物と高分子物質との接触工程。
【０１８３】
まず、上記（１）の工程について説明する。（１）の工程により、基板上に第一の層が形成される。
【０１８４】
基板表面へのアミノ基を有する化合物を含む第一の層の導入には、アミノアルキルシラン処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどの方法を用いることができる。このうち、アミノアルキルシラン処理は、簡便性および均一性の観点から好ましく用いられる。
【０１８５】
アミノアルキルシラン処理は、たとえばアミノアルキルシラン（カップリング剤）溶液への基板の浸漬および熱処理によることができる。アミノアルキルシラン溶液の濃度は、たとえば、０．１重量％以上１０重量％以下、好ましくは、０．１重量％以上５重量％以下、さらに好ましくは１重量％以上５重量％以下とすることができる。アミノアルキルシラン濃度を０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上とすることにより、基板の表面により一層確実にアミノ基を有する化合物を層状に形成することができる。また、アミノアルキルシラン濃度を１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、さらに好ましくは１重量％以下とすることにより、アミノアルキルシラン化合物を基板状に一様に分散させることができる。このため、第一の層の膜厚のばらつきを抑制することができる。
【０１８６】
次に、上記（２）の工程について説明する。（２）の工程により、第一の層上に第二の層が形成される。
【０１８７】
第一の層の上部に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層を形成する際には、たとえばホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬する方法を用いることができる。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の濃度はたとえば０．０５重量％以上５．０重量％以下、好ましくは０．１重量％以上１．０重量％以下とすることができる。
【０１８８】
高分子物質の濃度を０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることにより、第一の層を被覆する第二の層を確実に設けることができる。また、高分子物質の濃度を５．０重量％以下、好ましくは１．０重量％以下とすることにより、第一の層上に一様に第二の層を形成し、第二の層の膜厚のばらつきを抑制することができる。
【０１８９】
本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、かつ界面活性剤による洗浄によっても膜剥がれしない検出精度または検出感度の高いバイオチップ用基板が得られる。
【０１９０】
本実施形態のバイオチップ用基板を使用して各種の捕捉物質を固定化し、バイオチップを得ることができる。また、バイオチップを用いて生理活性物質の検出等を行うことができる。
【０１９１】
なお、本実施形態においても、捕捉物質および生理活性物質としては、たとえば第１の実施形態に記載の物質を用いることができる。また、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０１９２】
（第５の実施形態）
本実施形態では、以上の実施形態に記載の記載のバイオチップ用基板を用いたバイオチップに関する。本実施形態のバイオチップは、基板の表面にホスホリルコリン基と複数のカルボン酸誘導基とを有する高分子物質を有するバイオチップ用基板の、一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有結合を形成しており、残りの前記カルボン酸誘導基と親水性基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成している構成である。共有結合による高分子物質への親水性ポリマーの導入により、バイオチップ表面の高分子物質へのタンパク質の非特異的吸着をさらに低減できる。
【０１９３】
バイオチップ用基板としては、本明細書の他の実施形態に記載のバイオチップ用基板のいずれかの構成を用いることができる。以下、第１の実施形態に記載のバイオチップ用基板を用いる場合を例に説明する。バイオチップ用基板の高分子物質は、たとえば、第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を含み、第二単位が活性化カルボン酸誘導基の一態様である活性エステル基としてｐ−ニトロフェニル基を有する構成とすることができる。また、上記一般式（２）に示した高分子物質を用いてもよい。
【０１９４】
また、本実施形態のバイオチップは、バイオチップ用基板の高分子物質中に含まれる複数の活性エステル基のうち、一部の活性エステル基を捕捉物質と反応させて、捕捉物質と共有結合を形成させる捕捉物質の固定化工程と、捕捉物質の固定化工程の後、残りの活性エステル基を親水性ポリマーと反応させて、親水性ポリマーと共有結合させる工程を含むことができる。
【０１９５】
（捕捉物質の固定化）
バイオチップ基板への捕捉物質の固定化は、以上の実施形態に記載の方法により、たとえば第２の実施形態に記載の方法により、行うことができる。具体的には、本実施形態においても、上述した実施形態と同様に、捕捉物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解または分散した液体を点着する方法を用いることができる。捕捉物質を溶解または分散した液体のｐＨは、中性またはアルカリ性、好ましくは7.6以上とすることができる。また、点着後、固定化されなかった捕捉物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することができる。
【０１９６】
本実施形態では、捕捉物質の固定化後および洗浄後、さらに、捕捉物質を点着した以外の基板表面部分、つまり基板上に残存している活性エステル基を親水性ポリマー化する。以下、高分子物質への親水性ポリマーの導入について説明する。
【０１９７】
（親水性基を有するポリマーの導入）
本発明では、さらに生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基とを親水性ポリマーとを反応させて、高分子物質を親水性ポリマー化する。
【０１９８】
親水性ポリマーは、親水基を有するポリマーであり、たとえばポリアルキレンオキシドまたは複数種類のポリアルキレンオキシドを構造中に含むことができる。ポリアルキレンオキシドとして、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これらの共重合体、およびこれらの少なくとも一つと他のポリアルキレンオキシドとの共重合体のいずれかを構造中に含むことができる。
【０１９９】
また、親水性ポリマーは、活性エステル基との反応性を高めるために末端がアミノ化されていることが好ましい。末端にアミノ基が導入された親水性ポリマーとしては、具体的にはサン  テクノケミカル株式会社製のジェファーミンMシリーズ（ＸＴＪ−５０５、ＸＴＪ−６５０６、ＸＴＪ−５０７、Ｍ−２０７０、ＸＴＪ−２３４）等が挙げられる。
【０２００】
活性エステル基への親水性ポリマーの導入には、親水性ポリマーの溶液等の液体に生理活性物質が固定化された基板を浸漬する方法が好ましい。親水性ポリマーを含む液体中の親水性ポリマーの濃度は、たとえば０．１重量％以上とすることができる。こうすることにより、高分子物質に確実に親水性ポリマーを導入することができる。また、親水性ポリマーの濃度は、たとえば１００重量％以下とすることができる。溶液の粘度が高いポリマーを使用する場合は希釈して使用することが好ましい。こうすることにより、高分子物質に安定的に親水性ポリマーを導入することができる。
【０２０１】
本実施形態に係るバイオチップは、親水性ポリマーの導入により残存する活性エステル基が脱離した構成であるため、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度をより一層確実に向上させることができる。
【０２０２】
なお、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０２０３】
（第６の実施形態）
第１の実施形態に記載のバイオチップ用基板および以上の他の実施形態に記載のバイオチップ用基板において、高分子物質の第二単位に含まれるカルボン酸誘導基を活性エステル基とする場合、活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基であってもよい。
【０２０４】
たとえば、バイオチップ用基板に一次抗体等の生理活性を有する捕捉物質が固定化されたバイオチップとして、捕捉物質の固定化法においては、物理的吸着による固定化法、化学反応による固定化法などが用いられる。
【０２０５】
化学的固定化法においては、活性エステルを用いて生理活性物質のアミノ基と反応させることにより固定化する方法が知られている。しかしながら活性エステル基はそのエステルの種類によりアミノ基との反応性が大きく変化する。
【０２０６】
例えばｐ−ニトロフェニルエステルなどは比較的高いｐＨ側での反応性に優れる。このため、生理活性を有する捕捉物質の種類によっては、高いｐＨによる捕捉物質の変性、分解などが原因となり充分なシグナル強度が得られない懸念があった。
【０２０７】
このような場合、活性エステル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とすることにより、より低いｐＨ、たとえばｐＨ７．４以上９．０以下にて捕捉物質を固定化することができる。このため、高ｐＨにおける安定性の低い捕捉物質の場合においても、生理活性を保持した状態で高分子物質に安定的に固定化することができる。
【０２０８】
なお、本実施形態のバイオチップ用基板の基本構成は、高分子物質中の第二単位がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することを除くほか、第１の実施形態に記載のバイオチップ用基板と同様とすることができる。
【０２０９】
たとえば、基板の表面に高分子物質を有するバイオチップ用基板において、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である構成とすることができる。
【０２１０】
本実施形態によれば、基板上に吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制することができるので、シグナル強度を向上させることができる。
【０２１１】
なお、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０２１２】
（第７の実施形態）
以上の実施形態に記載のバイオチップ用基板において、高分子物質中の第一単位にホスホリルコリン基の割合、または高分子物質の第二単位に含まれる活性化カルボン酸誘導基の割合を、以下のようにすることもできる。以下、活性化カルボン酸誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。
【０２１３】
本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成部材としては、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載のものを用いることができる。
【０２１４】
本実施形態において、基板上の高分子物質が、下記（ａ）成分からなる構成とすることができる。
（ａ）ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを必須成分とし、ブチルメタクリレート基を有する第三単位を任意成分とする高分子
【０２１５】
この場合、高分子物質中に含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタクリレート基との合計に対する割合を、たとえば３モル％以上、好ましくは２５％以上とすることができる。ホスホリルコリン基の割合が小さすぎると、チップとして用いたときに、生理活性物質の非特異的吸着を起こすようになり、バックグランドが高くなる懸念がある。
【０２１６】
また、基板上の高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタクリレート基との合計に対する割合を、たとえば４０モル％以下、好ましくは４０モル％未満、さらに好ましくは３５モル％以下、さらにまた好ましくは３５モル％未満とすることができる。ホスホリルコリン基の割合が大きすぎると、混合ポリマーの水溶性が高くなるため表面層が剥離してしまう懸念がある。
【０２１７】
また、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、たとえば１モル％以上２５モル％以下とすることができる。活性エステル基の割合が小さすぎると、生理活性物質の固定化量が低下し充分なシグナルが得られない懸念がある。また、活性エステル基の割合が大きすぎると、最表面に存在する活性エステル基量が飽和してしまいシグナル強度が向上しない懸念がある。
【０２１８】
さらに具体的には、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、たとえば１５モル％以上２５モル％未満とすることができる。また、生理活性物質の検出反応におけるバックグランドをより一層確実に低下させる観点では、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、１モル％以上８％以下とすることがさらに好ましい。１モル％以上８％以下とすることにより、検出感度をさらに向上させることができる。
【０２１９】
また、高分子物質が上記（ａ）成分および下記（ｂ）成分からなる以下の構成とすることもできる。
（ｂ）ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する高分子
【０２２０】
なお、上記（ａ）の第一単位と上記（ｂ）の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記（ａ）がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、（ａ）の第三単位と上記（ｂ）の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【０２２１】
（ｂ）成分は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【０２２２】
なお、高分子物質が上記（ａ）、（ｂ）成分からなる場合、（ａ）、（ｂ）成分が混合されている構成とすることができる。上記（ａ）成分および（ｂ）成分のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【０２２３】
上記（ａ）、（ｂ）成分からなる混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタクリレート基との合計に対する割合は、たとえば３モル％以上、好ましくは２５モル％以上とすることができる。混合ポリマーにおいても、ホスホリルコリン基の割合が小さすぎると、生理活性物質の非特異的吸着を起こすようになり、バックグランドが高くなる懸念がある。
【０２２４】
また、上記（ａ）、（ｂ）成分からなる混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタクリレート基との合計に対する割合は、たとえば、４０モル％以下、好ましくは４０モル％未満、さらに好ましくは３５モル％以下、さらにまた好ましくは３５モル％未満とすることができる。混合ポリマーにおいても、ホスホリルコリン基の割合が大きすぎると、混合ポリマーの水溶性が高くなるため表面層が剥離してしまう懸念がある。
【０２２５】
また、上記（ａ）、（ｂ）成分からなる混合ポリマ−に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタクリレート基との合計に対する割合を、たとえば１モル％以上２５モル％以下することができる。混合ポリマーの場合にも、活性エステル基の割合が小さすぎると、生理活性物質の固定化量が低下し十分なシグナルが得られない懸念がある。また、活性エステル基の割合が大きすぎると、最表面に存在する活性エステル基量が飽和してしまいシグナル強度が向上しない懸念がある。
【０２２６】
さらに具体的には、（ａ）、（ｂ）成分からなる混合ポリマ−に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、たとえば１５モル％以上２５モル％未満とすることができる。また、生理活性物質の検出反応におけるバックグランドをより一層確実に低下させる観点では、（ａ）、（ｂ）成分からなる混合ポリマ−に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、１モル％以上８％以下とすることがさらに好ましい。１モル％以上８％以下とすることにより、検出感度をさらに向上させることができる。
【０２２７】
なお、本実施形態においても、活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等を用いることができる。
【０２２８】
本実施形態のバイオチップ用基板に捕捉物質を用いると、検出感度に優れたバイオチップを得ることができる。バイオチップ用基板を用いたバイオチップの作製には、以上の実施形態に記載の方法を用いることができる。
【０２２９】
たとえば、本実施形態においても、捕捉物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解または分散した液体を点着する方法を用いることができる。また、捕捉物質を溶解または分散した液体のｐＨは７．６以上とすることができる。また、点着後、固定化されなかった物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することができる。また、洗浄後は生理活性物質を点着した以外の部分を親水性ポリマー化してもよい。
【０２３０】
本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合が抑制され、検出精度または検出感度の高いバイオチップを得ることができる。
【０２３１】
（第８の実施形態）
本実施形態は、以上の実施形態に記載のバイオチップ用基板を有するマイクロアレイ用基板に関する。このマイクロアレイ用基板は、基板表面にホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を有する。
【０２３２】
本実施形態において、マイクロアレイ用基板の構成部材、材料、および製造方法としては、以上の実施形態に記載のものを用いることができる。
【０２３３】
本実施形態のマイクロアレイ用基板は、自己蛍光を低減化、蛍光色素の吸着を低減した構成である。このため、検体の情報シグナルを蛍光としてさらに高感度で検出することができる。このマイクロアレイ用基板は、基板の表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質を固定化し、蛍光色素を用いて生理活性物質を検出するためのマイクロアレイ用基板として好適に用いられる。
【０２３４】
また、本実施形態のマイクロアレイ用基板を用いると、たとえば蛍光色素を用いて生理活性物質を検出するマイクロアレイに好適に用いられるマイクロアレイが得られる。たとえば、マイクロアレイ用基板に、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質のうち、少なくとも一つの捕捉物質を固定化することにより、マイクロアレイが得られる。なお、本明細書において、マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイには限られず、基板上に生理活性を有する所定の捕捉物質を集積化した（チップ化した）素子のことをいう。
【０２３５】
なお、本実施形態において、マイクロアレイ用基板およびマイクロアレイの構成に、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載のマイクロチップ用基板およびマイクロチップの構成を適用することができる。
【０２３６】
たとえば、本実施形態のバイオチップの構成は、下記（ｉ）から（ｖｉ）に示す構成とすることができる。
（ｉ）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基であるマイクロアレイ用基板、
（ｉｉ）活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基であるマイクロアレイ用基板、
（ｉｉｉ）高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であるマイクロアレイ用基板。
（ｉｖ）基板がプラスチック製であるマイクロアレイ用基板、
（ｖ）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンであるマイクロアレイ用基板、
（ｖｉ）基板がガラス製であるマイクロアレイ用基板。
【０２３７】
（第９の実施形態）
本実施形態は、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質が基板上に設けられたマイクロチップ用基板の別の構成に関する。本実施形態のマイクロチップ用基板は、基板と、基板上に設けられ、オルガノシロキサンを含む第一の層と、第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体とカルボン酸誘導基を有する単量体との共重合体を含む第二の層と、を有する。基板、第一の層および第二の層がこの順に積層された層が設けられている。以下、カルボン酸誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。
【０２３８】
この構成において、第一の層を構成するオルガノシロキサンは、重合性二重結合を有する基を有する化合物とすることができる。重合性二重結合を有する基がアルケニル基（オレフィン基）を構成していてもよい。また、重合性二重結合を有する基の少なくとも一部がアクリレート基、メタクリレート基、またはビニル基を構成していてもよい。第一の層は、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、または他のアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物を有することができる。
【０２３９】
基板の構成としては、以上の実施形態に記載の基板を用いることができる。
【０２４０】
第一の層は、重層される第二の層が単量体のラジカル重合、光重合、またはラジカルイオン重合等の重合により形成される際に、第二の層中の単量体と反応し、共有結合により第二の層を基板上に固定化する層である。
【０２４１】
第一の層の厚さは、たとえば１Å（０．１ｎｍ）以上とすることができる。こうすることにより、基板表面を確実に被覆し、第二の層の基板表面からの剥離をさらに確実に抑制することができる。また、第一の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば１００Å（１０ｎｍ）以下とすることができる。
【０２４２】
第二の層は、基板上を被覆して生理活性物質の検出等に適した表面状態を提供する機能を有する。第二の層は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と捕捉物質を固定化する性質とを併せ持つ。第二の層中の共重合体中のホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、共重合体中の活性エステル基は生理活性物質を固定化する役割を果たす。
【０２４３】
第二の層の厚さは、たとえば５ｎｍ以上とすることができる。こうすることにより、第一の層の設けられた基板表面を確実に被覆し、生理活性物質等の非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる。また、第二の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば１００ｎｍ以下とすることができる。
【０２４４】
なお、基板と第一の層との間および第一の層と第二の層との間には、介在層が存在していてもしていなくてもよい。第一の層が基板に接して設けられ、第二の層が第一の層に接して設けられた構成とし、実質的に介在層が存在しない積層形態とすることにより、バイオチップの製造過程または使用過程における基板からの高分子物質の剥離より一層確実に抑制することができる。また、このとき、第一の層中のオルガノシロキサンが重合性二重結合を有する基を有し、重合性二重結合を有する基と前記共重合体とが反応して、共有結合が形成された構成とすることができる。
【０２４５】
また、本実施形態において、第一の層が、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、または他のアルケニル基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物のみから形成され、第二の層が共重合体のみから形成されていてもよい。また、基板の表面に第一の層が設けられ、第一の層の表面に第二の層が設けられた構成としてもよい。
【０２４６】
次に、本実施形態のバイオチップ用基板の製造方法を説明する。このバイオチップ用基板は、基板表面に、第一の層を形成した後、第一の層上でホスホリルコリン基を有する単量体と活性エステル基を有する単量体とを共重合することにより第二の層を形成することにより得られる。
【０２４７】
基板表面の第一の層の形成に使用するオルガノシロキサンとしては、重合性二重結合を有するシランカップリング剤を用いることができる。なお、シランカップリング剤は、基板上にオルガノシロキサンの状態で存在していてもよい。また、オルガノシロキサンは、アクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、またはその他のオレフィン基から選ばれる少なくとも１つの基を有するシランカップリング剤であることが好ましい。
【０２４８】
これらのシランカップリング剤としては、（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、N-(3-アクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル)−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、N-(3-メタクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル)−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、メタクリルオキシメチルトリエトキシシラン、メタクリルオキシメチルトリメトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）メチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリルオキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリルオキシプロピルジメチルメトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）−プロピルトリメトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリイソプロペンオキシシラン、ビニルトリイソプロポキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、ビニルトリス（メチルエチルケトキシイミノ）シラン、アリルオキシウンデシルトリメトキシシラン、アリルトリエトキシシラン、ノルボルネニルトリエトキシシラン、３−ブテニルトリエトキシシラン、２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシラン、（２−（３−シクロヘキセニル）エチル）トリエトキシシラン、（２−（３−シクロヘキセニル）エチル）トリメトキシシラン、（３−シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン、ドコセニルトリエトキシシラン、７−オクテニルトリメトキシシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、ビニルトリ−ｔ−ブトキシシラン、ビニルトリス、（メトキシプロポキシ）シラン、ビニルメチルジエトキシシラン、ビニルメチルジメトキシシラン、１，３−ジビニルテトラアメチルジシラザン、ビニルジメチルエトキシシラン、トリビニルメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリル）エチレン、ビス（トリメトキシシリルメチル）エチレン、トリエトキシシリル修飾ポリ１，２−ブタンジエンなどが挙げられる。
【０２４９】
シランカップリング剤による第一の層の形成は、たとえばシランカップリング剤溶液を基板に浸漬し熱処理することにより行うことができる。シランカップリング剤溶液の濃度は、０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上とすることができる。こうすることにより、第一の層をさらに確実に形成することができる。また、シランカップリング剤溶液の濃度は、たとえば１０重量％以下、好ましくは５重量％とすることができる。こうすることにより、第一の層を基板上により一層安定的に形成することができる。
【０２５０】
第一の層の上部に、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体、および活性エステル基を有する単量体の重合体を含む第二の層を導入するには、たとえば、ホスホリルコリン基を有する単量体、および活性エステル基を有する単量体の溶液に第一の層が形成された基板を浸漬し、各単量体を重合することができる。重合は、ラジカル重合、ラジカルイオン重合、光重合などで行われる。ホスホリルコリン基を有する単量体、および活性エステル基を有する単量体の溶液には重合開始剤を添加しておくことができる。
【０２５１】
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、たとえば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン 、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【０２５２】
活性エステル基を有する単量体は、活性エステル基としてたとえば第１の実施形態に記載の活性エステル基、さらに具体的には、ｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等を有する単量体が好ましく、さらにメタクリル基またはアクリル基を有するものが好ましい。特にp−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【０２５３】
以上により得られるバイオチップ用基板は、タンパク質、核酸等の検出および分析に用いられる際に、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、かつ界面活性剤による膜剥がれすることがなく、検出精度や検出感度に優れる。また、得られたバイオチップ用基板に各種の捕捉物質を固定化し、生理活性物質の検出等が可能なバイオチップを得ることができる。
【０２５４】
なお、本実施形態において、捕捉物質および生理活性物質は、たとえば以上の実施形態に記載の物質とすることができる。また、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０２５５】
（第１０の実施形態）
本実施形態は、以上の実施形態に記載のバイオチップ用基板を用いたバイオチップに関する。また、本実施形態は、生体試料中のタンパク質、核酸等の分析を、微細流路を用いて行うバイオチップに関する。
【０２５６】
本実施形態のバイオチップは、基板および基板に設けられた流路を有する。流路は、たとえば基板の表面に溝状に設けられていてもよい。このバイオチップは、流路の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を有する。また、活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成している。
【０２５７】
また、バイオチップが、流路を覆う保護部材を有してもよい。こうすれば、流路の内容物の乾燥や流路外への漏出を抑制することができる。このため、バイオチップを用いた分析をさらに安定的に行うことができる。保護部材の形状に特に制限はないが、たとえば板状、シート状、またはフィルム状とすることができる。以下、板状の基板と板状の保護部材を有する構成を例に、本実施形態のバイオチップについてさらに詳細に説明する。
【０２５８】
図１は、本実施形態に係るバイオチップの構成を示す平面図である。図１に示したバイオチップは、流路基板および蓋基板の二つの板状部材が接合されてなる基板１０３と、基板１０３の接合面に設けられた溝１０２と、溝１０２の両端に設けられ、溝１０２に連通する貫通孔１０１とを有する。図１では、基板１０３を構成する流路基板の表面に３つの溝１０２が互いに平行に設けられている。
【０２５９】
溝１０２は、液体を流通可能な微細流路として機能する。また、貫通孔１０１は、溝１０２中への試験液等の液体の導入部として機能する。また、貫通孔１０１は外気に接続しているため、溝１０２中の液体を流動させる導気孔としても機能する。
【０２６０】
基板１０３は、溝１０２の表面すなわち微細流路表面の一部または全体に、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を有する。基板１０３上の高分子物質に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されている。カルボン酸誘導基と捕捉物質とが反応して、共有結合を形成している。これにより、たとえば、ＤＮＡやタンパク質などの生理活性を有する捕捉物質が基板上に固定化されている。
【０２６１】
高分子物質は、複数のカルボン酸誘導基を有し、複数のカルボン酸誘導基は、捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されている。ここで、カルボン酸誘導基が不活性化されているとは、カルボン酸誘導基を構成する一部の基（脱離基）が他の基に置換されて、活性を喪失していることをいう。
【０２６２】
高分子物質は、以上の実施形態に記載の物質とすることができる。高分子物質の第二単位に含まれるカルボン酸誘導基は、たとえば第１の実施形態に記載の基とすることができる。たとえば、カルボン酸誘導基を活性エステル基とすることができる。以下、カルボン酸誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。また、活性エステル基は、固定化の対象となる捕捉物質によって使い分けることができるが、たとえば、第１の実施形態に記載の基、さらに具体的には、ｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とすることができる。
【０２６３】
高分子物質は、溝１０２の表面に層状に形成されていてもよい。こうすれば、溝１０２の表面への非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる。高分子物質からなる層の厚さに特に制限はないが、たとえば５ｎｍ以上とすることができる。また、溝１０２の表面に膜状の高分子物質が設けられていてもよい。こうすれば、溝１０２の表面をさらに安定的に高分子物質の膜で被覆することができる。また、高分子物質は、溝１０２の表面全面に設けられていてもよい。こうすれば、溝１０２の表面への非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【０２６４】
基板１０３の素材は、たとえば、以上の実施形態で用いられる基板の素材とすることができる。具体的には、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性および量産性から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【０２６５】
また、基板１０３を構成する流路基板および蓋基板のうち、少なくとも片方を検出光に対して透明な樹脂とすることができる。透明な樹脂の材料は、生理活性物質の検出反応に用いられる検出光の波長に応じて適宜選択されるが、たとえば、飽和環状ポリオレフィン、ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ポリカーボネイトなどが挙げられる。流路基板および蓋基板のうちの少なくとも一方を透明とすることにより、送液の状態を容易に確認することができる。また、流路基板および蓋基板のうちの少なくとも一方について適当な着色を施すこともできる。こうすることにより、光学的に流路内の反応を観察する際に、感度を上げる作用も期待できる。
【０２６６】
図１に示したバイオチップは、流路中に試験液を流動させて、捕捉物質に捕捉された試験液中の生理活性物質の検出または定量に用いられる構成とすることができる。また、試験液中に含まれる成分の特定も可能である。
【０２６７】
貫通孔１０１の径は、蓋基板の厚さや流路の幅等に応じて適宜設計される。また、流路となる溝１０２については、以下の構成とすることができる。バイオチップ用基板に捕捉物質が固定化されたバイオチップの流路中で生理活性物質の検出反応を効率よく行うためには、ある程度の流速が必要である。また、反応に寄与するのは捕捉物質が固定化されている流路表面部分である。これらのことから、少ない量のサンプル液で効率よく反応させるには、流路の断面積が小さい方が好ましい。
【０２６８】
流路の延在方向に垂直な断面の幅および深さは、たとえば２０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上とすることができる。こうすることにより、流路へのサンプル液の流通を充分に確保することができる。また、サンプル液の流通を制御しやすい構成とすることができる。また、流路の幅および深さは、たとえば５００μｍ以下、好ましくは２００μｍ以下とすることができる。こうすることにより、ハイブリダイゼーションなどの生理活性物の捕捉の状況を蛍光スキャナーなどで行う場合にも、認識のしやすさを充分に確保することができる。また、流路の長さは検出物質の種類や試験液の量などに応じて適宜設計することができる。
【０２６９】
次に、図１に示したバイオチップの製造方法について説明する。
まず、微細流路が彫刻された流路基板と蓋となる蓋基板を準備する。流路基板と蓋基板は、それぞれ、上述した基板および保護部材に対応する。流路基板には、前述した溝１０２および溝１０２に連通し流路基板を貫通する貫通孔１０１を設けておく。
【０２７０】
次に、両基板の接合面、すなわち流路を形成する側の面を、ホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質でコートする。高分子物質のコートは、たとえば以上の実施形態において、マイクロチップ用基板の作製時に基板上に高分子物質を付着させる方法により行うことができる。
【０２７１】
そして、流路基板の流路内または蓋基板の流路形成部内もしくはその近傍の所定の位置に、捕捉物質を溶解または分散させた液体を滴下してある一定時間放置し、捕捉物質を固定化する。捕捉物質を含む液体を高分子物質上に滴下する方法として、たとえば、ピンスポッターによる点着や、インクジェット方式のスポットが挙げられる。また、捕捉物質を含む液体のｐＨは、たとえば２以上１１以下とすることができる。捕捉物質を含む液体のｐＨが大きすぎたり小さすぎたりする場合、強酸側または強アルカリ側となるため、生理活性物質の変性が起こる可能性がある。たとえば、捕捉物質がタンパク質である場合、捕捉物質を含む液体のｐＨを中性付近とすることができる。
【０２７２】
捕捉物質の固定の後、洗浄を行い、固定化されなかった余剰の捕捉物質を除去する。洗浄の後、活性エステル基を不活性化する。不活化処理は、たとえば第１の実施形態に記載の条件で行うことができる。具体的には、アルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物を用いて不活性化を行うことができる。
【０２７３】
不活性化の後、流路基板と蓋基板を貼り合わせ、液体が流通できる流路を形成する。二枚の基板の貼り合わせは、接着剤の塗布による接着や熱溶着により行うことができる。また、生理活性を有する捕捉物質は一般的に熱に弱いため、熱に弱い捕捉物質が固定化されている場合、基板の材料として熱可塑性の樹脂を用いることができる。熱可塑性の樹脂を用いることにより、比較的低温での熱溶着が可能である。
【０２７４】
本実施形態では、ホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質に捕捉物質を固定化するため、固定化後、生理活性物質の耐熱性を向上させることができる。このため、熱可塑性樹脂を用いれば、熱溶着を行っても、固定化した捕捉物質の活性を保持することができる。
【０２７５】
なお、捕捉物質および生理活性物質としては、以上の実施形態に記載の物質が挙げられる。また、本実施形態においても、捕捉物質の構造に応じて、捕捉物質にアミノ基を導入してもよい。また、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として、第１の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
【０２７６】
次に、本実施形態のバイオチップの使用方法を、捕捉物質として一次抗体がチップ上に固定化されている場合を例に説明する。
【０２７７】
バイオチップを使用する際には、まず、マイクロポンプやマイクロシリンジ等の送液手段を用いて、一定量のサンプル液を送液する。この工程で抗体に検出目的のタンパクが捕捉される。サンプル液の送液の後、洗浄液を一定量送液し洗浄を行う。
【０２７８】
次に、分析目的のタンパク質に対する抗体に蛍光物質等の標識を施した二次抗体を一定量送液し、洗浄を行う。サンプル液中に分析目的のタンパクが存在すれば、蛍光スキャナーにより蛍光スポットとして認識できる。
【０２７９】
以上により、抗原抗体反応の効率が高く、少ない送液量で充分なタンパクを捕捉することができる。また、ブロッキングを施さずともタンパクの吸着が起こらず、少ない洗浄液の送液量での洗浄が可能で、検出時のバックグランドを充分に低下させることができる。
【０２８０】
本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、試験液中の成分、ここでは検出対象の生理活性物質を含む成分の流路上への非特異的吸着を抑制することができる。このため、検出感度を上げることができる。また、検出部を流路状とすることにより、捕捉物質と生理活性物質との特異的な相互作用の効率をより向上させることができる。
【０２８１】
以上、本発明を実施形態に基づいて説明した。この実施形態はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０２８２】
（実験例）
（実験例Ａ１、実験例Ａ２）
実験例Ａ１および実験例Ａ２では、第１の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０２８３】
（実験例Ａ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow index）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０２８４】
次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより、表１に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。
【０２８５】
その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表１に示す。
【０２８６】
（実験例Ａ２）
実験例Ａ１と同様の基板の表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２重量％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
【０２８７】
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表１に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、非特異吸着防止の為に５重量％スキムミルクを懸濁させた９．６ｇ／リットルのＰＢＳ（phosphate buffered saline）緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表１に示す.
【０２８８】
実験例Ａ１および実験例Ａ２における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０２８９】
実験例Ａ１は、いずれの希釈倍率においても、実験例Ａ２よりもスポットシグナル値が強く、バックグランド値が低く、S/N比が大きい結果になった。
【０２９０】
【表１】
0003887647.tif 000010
【０２９１】
（実験例Ｂ１、実験例Ｂ２）
実験例Ｂ１および実験例Ｂ２では、第２の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０２９２】
（実験例Ｂ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０２９３】
次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表２に示した希釈倍率でｐＨが８．０に調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、ｐＨ７．０に調製された、抗原であるマウスIgG2aの溶液を基板表面に塗布し、抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表２に示す。
【０２９４】
（実験例Ｂ２）
ｐＨが７．０に調製された一次抗体である抗マウスIgG2aとｐＨが８．０に調製された抗原であるマウスIgG2aの溶液を用いた以外はすべて実験例Ｂ１と同様の操作を行った。
【０２９５】
実験例Ｂ１および実験例Ｂ２における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０２９６】
実験例Ｂ１は、いずれの希釈倍率においても、実験例Ｂ２よりもスポットシグナル値が強く、バックグランド値が低く、S/N比が大きい結果になった。
【０２９７】
【表２】
0003887647.tif 000011
【０２９８】
（実験例Ｃ１、実験例Ｃ２）
実験例Ｃ１および実験例Ｃ２では、第３の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０２９９】
（実験例Ｃ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３００】
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表３に示した希釈倍率でｐＨが8.0に調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、ｐＨ7.0に調製した抗原であるマウスIgG2aの溶液を基板表面に塗布し、抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表３に示す。
【０３０１】
（実験例Ｃ２）
ｐＨが７．０に調製された一次抗体である抗マウスIgG2aとｐＨが８．０に調製された抗原であるマウスIgG2aの溶液を用いた以外はすべて実験例Ｃ１と同様の操作を行った。
【０３０２】
実験例Ｃ１および実験例Ｃ２における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３０３】
表３より、実験例Ｃ１は、いずれの希釈倍率においても、実験例Ｃ２よりもスポットシグナル値が強く、バックグランド値が低く、S/N比が大きい結果になった。
【０３０４】
【表３】
0003887647.tif 000012
【０３０５】
（実験例Ｄ１、実験例Ｄ２）
実験例Ｄ１および実験例Ｄ２では、第４の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０３０６】
（実験例Ｄ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を、１重量％のKBM903（信越化学社製、アミノシラン）水溶液に浸漬することにより第一の層を形成した。さらにこの基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する第二の層を形成した。
【０３０７】
（実験例Ｄ２）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を形成した。
【０３０８】
（評価実験）
次に、得られたそれぞれの基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表４に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。その後１．０重量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液に１時間浸漬した。
【０３０９】
その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表４に示す。
【０３１０】
実験例Ｄ１および実験例Ｄ２における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３１１】
表４に示したように、実験例Ｄ１では、高いスポットシグナル値、低いバックグランド値が観測されたが、実験例Ｄ２では、層が剥がれてしまい、低いスポットシグナル値を示した。また層剥がれにより基板に非特異的吸着を起こしたためバックグランド値も高くなった。
【０３１２】
【表４】
0003887647.tif 000013
【０３１３】
（実験例Ｅ１、実験例Ｅ２）
実験例Ｅ１および実験例Ｅ２では、第５の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０３１４】
（実験例Ｅ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３１５】
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表５に示した希釈倍率で調製された一次抗体、抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、親水性ポリマーとして、ＸＴＪ−５０６（サン  テクノケミカル株式会社製、末端アミノ化エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体）の４０重量％水溶液に浸漬することにより活性エステル基を親水性ポリマー化した。
【０３１６】
（実験例Ｅ２）
ＸＴＪ−５０６の４０重量％水溶液の代わりに０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液を用いたこと以外は実験例Ｅ１と同様の操作を行った。
【０３１７】
（評価実験）
実験例Ｅ１および実験例Ｅ２のバイチップのそれぞれについて、さらに抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表５に示す。
【０３１８】
蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３１９】
実験例Ｅ１は、いずれの希釈倍率においても、実験例Ｅ２よりもバックグランド値が低く、S/N比が大きい結果になった。
【０３２０】
【表５】
0003887647.tif 000014
【０３２１】
（実験例Ｆ１〜実験例Ｆ３）
実験例Ｆ１〜実験例Ｆ３では、第６の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０３２２】
（実験例Ｆ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３２３】
次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表６に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、０．１規定の炭酸水素ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。
【０３２４】
その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表６に示す。
【０３２５】
（実験例Ｆ２）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液を用いた以外は実験例Ｆ１と同様に操作した。
【０３２６】
（実験例Ｆ３）
実験例Ｆ１と同様にして基板の表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２重量％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
【０３２７】
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表６に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、非特異吸着防止の為に５重量％スキムミルクを懸濁させた９．６ｇ／リットルのＰＢＳ緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表６に示す。
【０３２８】
実験例Ｆ１〜Ｆ３における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３２９】
実験例Ｆ１は、いずれの希釈倍率においても、実験例Ｆ２および実験例Ｆ３よりもスポットシグナル値が強く、バックグランド値が低く、S/N比が大きい結果になった。
【０３３０】
【表６】
0003887647.tif 000015
【０３３１】
（実験例Ｇ１〜実験例Ｇ９）
実験例Ｇ１〜実験例Ｇ９では、第７の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０３３２】
（実験例Ｇ１〜Ｇ７、実験例Ｇ１０、実験例Ｇ１１）単独ポリマー
表７の割合よりなるホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質を飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））のスライド基板に導入した。溶液はエタノール基板で０．５重量％とした。
【０３３３】
【表７】
0003887647.tif 000016
【０３３４】
（実験例Ｇ８、実験例Ｇ９、実験例Ｇ１２〜Ｇ１４）
実験例Ｇ６または実験例Ｇ７で用いたポリマーの０．５重量％エタノール溶液を、それぞれＭＰＣポリマー（ホスホリルコリン基３０モル％、ブチルメタクリレート基７０モル％）の０．５重量％エタノール溶液と混合することにより各基の割合を調整した。配合割合と最終組成を表８に示す。
【０３３５】
【表８】
0003887647.tif 000017
【０３３６】
（評価実験）
次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表９に示した希釈倍率で調製された一次抗体、抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウムの水溶液に浸漬することにより活性エステル基を処理した。
【０３３７】
実験例Ｇ１〜Ｇ１４のバイチップについて、さらに抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表９に示す。
【０３３８】
蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４５％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３３９】
表９より、実験例Ｇ４、実験例Ｇ１０〜Ｇ１４は、バックグランド値が特に低く、S/N比が大きい結果になった。
【０３４０】
【表９】
0003887647.tif 000018
【０３４１】
（実験例Ｈ１、実験例Ｈ２）
実験例Ｈ１および実験例Ｈ２では、第８の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、ＤＮＡのハイブリダイゼゼーションを行った。
【０３４２】
（実験例Ｈ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３４３】
（実験例Ｈ２）
実験例Ｈ１に使用したのと同様の基板を２体積％の３−アミノプロピル−トリメトキシシランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導入した。アミノ基を導入した基板を１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。
【０３４４】
（ＤＮＡ溶液の調製）
ＤＮＡ溶液１およびＤＮＡ溶液２として、以下の溶液を調製した。
ＤＮＡ溶液１：５'末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号１）（シグマジェノシス社製）を０．１μｇ／μｌの濃度になるように所定の緩衝液で溶解した。
ＤＮＡ溶液２；５'末端にＣｙ３標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）（シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ/μｌの濃度になるように３×ＳＳＣ（standard saline citrate）、０．２重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の溶液に溶解した。
【０３４５】
（スポットおよびハイブリダイゼーション）
実験例Ｈ１では、ＤＮＡ溶液１を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上にスポットした。スポット終了後、８０℃のオーブン中に静置した。
【０３４６】
その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に５分間浸漬することによって、活性エステル基を不活性化することにより、ブロッキング処理を行った。次に、この基板上に、ＤＮＡ溶液２を展開し、カバーグラスで覆い、６５℃の多湿容器内で３時間放置することで、固定化されたオリゴＤＮＡとＣｙ３標識オリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行った。その後、２×ＳＳＣ、０．５重量％ＳＤＳ中で洗浄し、次に純水洗浄することによりＤＮＡハイブリダイゼーション後の基板を作製した。
【０３４７】
実験例Ｈ２では、実験例Ｈ１と同様にして、ＤＮＡ溶液１を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上にスポットした。スポット終了後、８０℃のオーブン中に静置した。
【０３４８】
その後、０．５重量％水素化ホウ素ナトリウムＰＢＳ溶液に５分間浸漬することによって、余分なアルデヒド基をブロッキングした。この基板上に、ＤＮＡ溶液２を展開し、カバーグラスで覆い、６５℃の多湿容器内で３時間放置することで、固定化されたオリゴＤＮＡとＣｙ３標識オリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行った。その後、２×ＳＳＣ、０．５重量％ＳＤＳ中で洗浄し、次に純水洗浄することによりＤＮＡハイブリダイゼーション後の基板を作製した。
【０３４９】
（評価実験）
実験例Ｈ１および実験例Ｈ２における自己蛍光量の測定には、マイクロアレイ用蛍光スキャナー「ScanArray」（Packard BioChip Technologies社製）を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍであった。ＳｃａｎＡｒｒａｙを用いて得られたスキャンイメージから、スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いて基板の蛍光量を数値化した結果を表１０に示す。
【０３５０】
ＤＮＡハイブリダイゼーション後の蛍光カウント値、バックグランド値の測定にはマイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４５％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍであった。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した結果を表１０に示す。
【０３５１】
実験例Ｈ１では、実験例Ｈ２と比較して、自己蛍光が低い結果となった。また、ＤＮＡハイブリダイゼーション後の蛍光カウント値についても実験例Ｈ１が優れていた。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。
【０３５２】
【表１０】
0003887647.tif 000019
【０３５３】
（実験例Ｉ１〜実験例Ｉ５）
実験例Ｉ１〜実験例Ｉ５では、第９の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
【０３５４】
（実験例Ｉ１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃））をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を、１重量％の（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシランのエタノール／水混合溶液に浸漬することにより第一の層を形成した。さらにこの基板を２−メタクリルオキシエチルホスホリルコリン（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、ラジカル開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）のエタノール溶液に浸漬し６５℃にて４時間加熱することにより基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
【０３５５】
（実験例Ｉ２）
第一の層の形成に（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシランの代わりにメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランを用いた以外は実験例Ｉ１と同様に操作して基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
【０３５６】
（実験例Ｉ３）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を、１重量％のビニルトリエトキシシランのエタノール／水混合溶液に浸漬することにより第一の層を形成した。さらにこの基板を２−メタクリルオキシエチルホスホリルコリン（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、光開始剤である１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）のエタノール溶液に浸漬し２５０ｎｍ−４００ｎｍの紫外線を２時間照射することにより基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
【０３５７】
（実験例Ｉ４）
第一の層の形成にアリルトリエトキシシランを用いた以外はすべて実験例Ｉ３と同様に操作して基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
【０３５８】
（実験例Ｉ５）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して基板を作製した。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を形成した。
【０３５９】
（評価実験）
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表１１に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステル基を失活させた。その後１．０重量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液に1時間浸漬した。
【０３６０】
その後、抗原であるマウスIgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスIgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表１１に示す。
【０３６１】
実験例Ｉ１〜実験例Ｉ５における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【０３６２】
実験例Ｉ１〜実験例Ｉ４では、高いスポットシグナル値、低いバックグランド値が観測されたが、実験例Ｉ５では、層が剥がれてしまい、低いスポットシグナル値を示した。また層剥がれにより基板に非特異的吸着を起こしたためバックグランド値も高くなった。
【０３６３】
【表１１】
0003887647.tif 000020
【０３６４】
（実験例Ｊ１〜Ｊ６）
本実験例では、第１０の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップを作製し、ＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび抗体の検出を行った。
【０３６５】
（溶液類の調製）
本実験例において、ＤＮＡ溶液１、２、抗体溶液、抗原溶液、およびブロッキング溶液１〜３として、以下の溶液を調製した。
【０３６６】
DNA溶液１：５'末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号１）（シグマジェノシス社製）を０．１μｇ／μｌの濃度になるように所定の緩衝液に溶解し調製した。
ＤＮＡ溶液２：５'末端にＣｙ３標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）（シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ／μｌの濃度になるように３×ＳＳＣ、０．２重量％ＳＤＳの溶液に溶解した。
【０３６７】
抗体溶液：抗マウスIgG2a抗体（ウサギ由来）をＰＢＳ中に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の濃度で溶解し調製した。
抗原溶液：ＦＢＳ中にマウスIgG2a抗体を１μｇ／ｍｌ濃度で溶解し、ｐＨ９．５の炭酸バッファー１ｍｌ中に、上記マウスIgG2a抗体を含むＦＢＳを１００μｌを加え、さらに１ｍｇ／ｍｌ濃度でＮＨＳ化Ｃｙ３を超純水に溶解させた溶液を１０μｌ添加し、２５℃で２時間放置し、ゲルろ過カラムにより未反応のＮＨＳ化Ｃｙ３を除き、ＰＢＳ中にＣｙ３標識されたマウスIgG2aおよびＦＢＳ由来タンパク質を含む溶液を調製した。
【０３６８】
ブロッキング溶液１：０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を調製した。
ブロッキング溶液２：水素化ホウ素ナトリウムを０．５重量％の濃度でＰＢＳ中に溶解し調製した。
ブロッキング溶液３：ＢＳＡを１重量％濃度でＰＢＳ中に溶解させ調製した。
【０３６９】
（実験例Ｊ１）
射出成形により、幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝と、溝の末端に設けられた直径１ｍｍの貫通孔と、を有するポリスチレン樹脂基板を成形した。また、この基板と同じ大きさのポリスチレン樹脂の平板基板を成形した。
【０３７０】
溝を形成させた基板の溝を有する面と平板基板の片面とを２−メタクリロイルオキシエチルホシホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液を塗布乾燥することにより、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３７１】
直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、ＤＮＡ溶液１を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝を有する基板の溝が形成された面を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液１を注入し、流路内に満たした後、１０分間放置し、流路内の活性エステル基を不活化し、ＤＮＡハイブリダイゼーションによる評価に供した。
【０３７２】
（実験例Ｊ２）
射出成形により、ポリスチレン樹脂基板に、幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝および溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板を成形した。また、この基板と同じ大きさの平板基板を成形した。
【０３７３】
溝を形成させた基板の溝を有する面と平板基板の片面を２−メタクリロイルオキシエチルホシホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液を塗布乾燥することにより、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【０３７４】
直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液１を注入し、流路内に満たした後、１０分間放置し、流路内の活性エステル基を不活化し、抗原抗体反応による評価に供した。
【０３７５】
（実験例Ｊ３）
射出成形によりポリスチレン樹脂基板に幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝および溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン２重量％溶液中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、ＤＮＡ溶液１を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液２を注入し、流路内に満たした後、１０分間放置し流路内のアルデヒド基を不活化し、ＤＮＡハイブリダイゼーションによる評価に供した。
【０３７６】
（実験例Ｊ４）
射出成形によりポリスチレン樹脂基板に幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝および溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン２重量％溶液中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
【０３７７】
直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液２を２μｌ／分のスピードで１０分間送液した後、ブロッキング溶液３を２μｌ／分のスピードで１０分間送液し、最後にＰＢＳを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
【０３７８】
（実験例Ｊ５）
射出成形によりポリスチレン樹脂基板に幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝および溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン２重量％溶液中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
【０３７９】
直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液２を２μｌ／分のスピードで１０分間送液し、最後にＰＢＳを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
【０３８０】
（実験例Ｊ６）
射出成形によりポリスチレン樹脂基板に幅１５０μｍ深さ１００μｍの溝および溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成形した。両基板の表面に親水化処理を施した。
【０３８１】
直径１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の樹脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔からブロッキング溶液３を２μｌ／分のスピードで１０分間送液し、最後にＰＢＳを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
【０３８２】
（ＤＮＡハイブリダイゼーションによる評価実験）
実験例Ｊ１および実験例Ｊ３を用いて評価を行った。注入孔からＤＮＡ溶液２を２μｌ／分のスピードで１分間、３分間、５分間、および１０分間送液した後、ＰＢＳ（−）を５μｌ／分のスピードで１０分間送液し洗浄を行い、超純水を送液した後、流路中のＤＮＡスポット部およびスポット部以外の蛍光（Ｃｙ３）をマイクロアレイ用スキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いて測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４５％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍであった。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した結果を表１２および表１３に示す。
【０３８３】
（抗原抗体反応による評価実験）
実験例Ｊ２、実験例Ｊ４、実験例Ｊ５および実験例Ｊ６を用いて評価を行った。注入孔から抗原溶液を２μｌ／分のスピードで１分間、３分間、５分間、および１０分間送液した後、ＰＢＳ（−）を５μｌ／分のスピードで１０分間送液し洗浄を行い、超純水を送液した後、流路中のＤＮＡスポット部およびスポット部以外の蛍光（Ｃｙ３）をマイクロアレイ用スキャナーで測定した。結果を表１４および表１５に示す。
【０３８４】
なお、以上の実験例においては、基板の材料をプラスチックとした実験例を示したが、基板の材料をガラスとした場合にも、基板表面にホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質を用いることにより、検出感度の向上が可能であった。
【０３８５】
【表１２】
0003887647.tif 000021
【０３８６】
【表１３】
0003887647.tif 000022
【０３８７】
【表１４】
0003887647.tif 000023
【０３８８】
【表１５】
0003887647.tif 000024
【０３８９】
以下、本発明の実施態様を列挙する。
（１−１）固相基板の表面の生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（１−２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである（１−１）記載のバイオチップ用基板。
（１−３）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（１−１）又は（１−２）記載のバイオチップ用基板。
（１−４）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（１−１）〜（１−３）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（１−５）固相基板がプラスチック製であることを特徴とする（１−１）〜（１−４）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（１−６）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（１−５）記載のバイオチップ用基板。
（１−７）固相基板がガラス製である（１−１）〜（１−４）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（１−８）（１−１）〜（１−７）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化する工程、及び生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
（１−９）活性エステル基の不活性化をアルカリ化合物を用いて行う（１−８）記載のバイオチップの製造方法。
（１−１０）活性エステル基の不活性化を1級のアミノ基を有する化合物を用いて行う（１−８）記載のバイオチップの製造方法。
（１−１１）1級のアミノ基を有する化合物がアミノエタノール、又はグリシンである（１−１０）記載のバイオチップの製造方法。
（１−１２）生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（１−８）〜（１−１１）いずれかに記載のバイオチップの製造方法。
（１−１３）（１−８）〜（１−１２）いずれか記載のバイオチップの製造方法により製造されたバイオチップ。
【０３９０】
（２−１）ホスホコリン基及び活性エステル基を有する高分子層を表面に有する基板に、該活性エステル基を介して、生理活性物質を捕捉する分子が基板表面に固定化されているバイオチップ。
（２−２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（２−１）記載のバイオチップ。
（２−３）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（２−１）又は（２−２）記載のバイオチップ。
（２−４）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（２−１）〜（２−３）いずれか記載のバイオチップ。
（２−５）固相基板がプラスチック製である（２−１）〜（２−４）いずれか記載のバイオチップ。
（２−６）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（２−５）記載のバイオチップ。
（２−７）固相基板がガラス製である（２−１）〜（２−４）いずれか記載のバイオチップ。
（２−８）生理活性物質を捕捉する分子が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（２−１）〜（２−７）いずれか記載のバイオチップ。
（２−９）生理活性物質を捕捉する分子の固定化が、ｐＨ７．６以上で行なわれる、（２−１）〜（２−８）いずれか記載のバイオチップ。
（２−１０）（２−１）〜（２−９）いずれか記載のバイオチップに更に生理活性物質が捕捉されたバイオチップ。
（２−１１）生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（２−１０）記載のバイオチップ。
（２−１２）（２−１０）又は（２−１１）のバイオチップの製造方法であって、生理活性物質を含むｐＨ７．６以下の溶液を基板表面に接触させる工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【０３９１】
（３−１）基板の表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する
高分子物質を有するバイオチップ用基板の使用方法であって、（１）ｐＨ７．６以上で生理活性物質を捕捉する分子である捕捉分子を固定する工程、及び（２）検出する生理活性物質を含むｐＨ７．６以下の溶液を基板表面に接触させ、該捕捉分子に生理活性物質を捕捉させる工程、を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法。
（３−２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（３−１）記載のバイオチップ用基板の使用方法。
（３−３）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（３−１）又は（３−２）記載のバイオチップ用基板の使用方法。
（３−４）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（３−１）〜（３−３）いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。
（３−５）捕捉分子が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（３−１）〜（３−４）いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。
（３−６）検出する生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（３−１）〜（３−５）いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。
【０３９２】
（４−１）固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にアミノ基を有する化合物を含む層Aとホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層Bとが基板、層A、層Bの順で重層されていることを特徴とするバイオチップ用基板。
（４−２）層Aのアミノ基の一部又は全てが層Bの活性エステル基と反応して共有結合を形成している（４−１）記載のバイオチップ用基板。
（４−３）層Bの活性エステル基の一部が層Aのアミノ基と反応して共有結合を形成している（４−１）又は（４−２）記載のバイオチップ用基板。
（４−４）層Aがアミノシランを含む（４−１）〜（４−３）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−５）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（４−１）〜（４−４）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−６）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（４−１）〜（４−５）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−７）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（４−１）〜（４−６）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−８）固相基板がプラスチック製である（４−１）〜（４−７）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−９）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（４−８）記載のバイオチップ用基板。
（４−１０）固相基板がガラス製である（４−１）〜（４−７）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（４−１１）（４−１）〜（４−１０）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、（１）基板表面とアミノ基を有する化合物との接触工程、及び（２）ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質との接触工程、を含むバイオチップ用基板の製造方法。
【０３９３】
（５−１）基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有するバイオチップ用基板に活性エステル基と反応して生理活性物質が固定化され、前記生理活性物質が固定化されている以外の基板表面の活性エステル基部に親水性基を有するポリマーが導入されていることを特徴とするバイオチップ。
（５−２）親水性ポリマーが、アミノ基を有する親水性ポリマーである（５−１）記載のバイオチップ。
（５−３）親水性ポリマーがポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものである（５−１）又は（５−２）記載のバイオチップ。
（５−４）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（５−１）〜（５−３）いずれか記載のバイオチップ。
（５−５）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（５−１）〜（５−４）いずれか記載のバイオチップ。
（５−６）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（５−１）〜（５−５）いずれか記載のバイオチップ。
（５−７）固相基板がプラスチック製である（５−１）〜（５−６）いずれか記載のバイオチップ。
（５−８）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（５−７）記載のバイオチップ。
（５−９）固相基板がガラス製である（５−１）〜（５−６）いずれか記載のバイオチップ。
（５−１０）生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（５−１）〜（５−９）いずれかに記載のバイオチップ。
（５−１１）（５−１）〜（５−１０）いずれか記載のバイオチップの製造方法であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有するバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化する工程、及び生理活性物質が固定化されている以外の基板表面の活性エステル基部に親水性基を有するポリマーを導入する工程、を含むことを特徴とするのバイオチップの製造方法。
【０３９４】
（６−１）固相基板の表面の生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（６−２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである（６−１）記載のバイオチップ用基板。
（６−３）前記高分子物質がブチルメタクリレート基、を含む共重合体である（６−１）又は（６−２）記載のバイオチップ用基板。
（６−４）固相基板がプラスチック製であることを特徴とする（６−１）〜（６−３）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（６−５）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（６−４）記載のバイオチップ用基板。
（６−６）固相基板がガラス製である（６−１）〜（６−３）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（６−７）（６−１）〜（６−６）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化する工程、及び生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
（６−８）活性エステル基の不活性化をアルカリ化合物を用いて行う（６−７）記載のバイオチップの製造方法。
（６−９）活性エステル基の不活性化を1級のアミノ基を有する化合物を用いて行う（６−７）記載のバイオチップの製造方法。
（６−１０）１級のアミノ基を有する化合物がアミノエタノール、又はグリシンである（６−９）記載のバイオチップの製造方法。
（６−１１）生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（６−７）〜（６−１０）いずれかに記載のバイオチップの製造方法。
（６−１２）（６−７）〜（６−１１）いずれか記載のバイオチップの製造方法により製造されたバイオチップ。
【０３９５】
（７−１）  ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質、あるいは前記高分子物質とホスホリルコリン基及びブチルメタクリレート基からなるポリマーとの混合ポリマーを基板の表面に有することを特徴とするバイオチップ。
（７−２）  高分子物質、あるいは混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の割合が２０モル％以上４０モル％未満である（７−１）記載のバイオチップ。
（７−３）  高分子物質、あるいは混合ポリマーに含まれる活性エステル基の割合が１５モル％以上２５モル％未満である（７−１）又は（７−２）記載のバイオチップ。
（７−４）  ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（７−１）〜（７−３）いずれか記載のバイオチップ。
（７−５）  活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（７−１）〜（７−４）いずれか記載のバイオチップ。
（７−６）  前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（７−１）〜（７−５）いずれか記載のバイオチップ。
（７−７）  固相基板がプラスチック製である（７−１）〜（７−６）いずれか記載のバイオチップ。
（７−８）  プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（７−７）記載のバイオチップ。
（７−９）  固相基板がガラス製である（７−１）〜（７−６）いずれか記載のバイオチップ。
（７−１０）（７−１）〜（７−９）いずれか記載のバイオチップの製造方法であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質、あるいは前記高分子物質とホスホリルコリン基及びブチルメタクリレート基からなるポリマーとの混合ポリマーを有するバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化する工程、及び前記生理活性物質が固定化されている以外の基板表面の活性エステル基部に親水性基を有するポリマーを導入する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
（７−１１）生理活性物質が核酸、アプタアマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なくとも一つである（７−１０）に記載のバイオチップの製造方法。
【０３９６】
（８−１）固相基板の表面に生理活性物質を固定化し蛍光色素を用いて検出するためのマイクロアレイ用基板であって、固相基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ用基板。
（８−２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（８−１）記載のマイクロアレイ用基板。
（８−３）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である（８−１）又は（８−２）記載のマイクロアレイ用基板。
（８−４）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（８−１）〜（８−３）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８−５）固相基板がプラスチック製である（８−１）〜（８−４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８−６）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（８−５）記載のマイクロアレイ用基板。
（８−７）固相基板がガラス製である請求項（８−１）〜（８−４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８−８）（８−１）〜（８−７）いずれか記載のマイクロアレイ用基板に核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖タンパク質の内、少なくとも一つの生理活性物質を固定化したマイクロアレイ。
【０３９７】
（９−１）固相基板の表面に生理活性物質を固定化するためのバイオチップ用基板であって、固相基板表面上に層Ａが形成され、更に層Ａ上に層Ｂが形成され、層Ａはアクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、及びオレフィン基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物Ａから形成され、層Ｂはホスホリルコリン基を有する単量体の重合体、及び活性エステル基を有する単量体の重合体から形成されていることを特徴とするバイオチップ用基板。
（９−２）化合物Ａのアクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、及びオレフィン基から選ばれる少なくとも１つの基の一部又は全てが、層Ｂのホスホリルコリン基を有する単量体、及び活性エステル基を有する単量体の共重合体と共有結合を形成している（９−１）記載のバイオチップ用基板。
（９−３）化合物Ａがアクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、及びオレフィン基から選ばれる少なくとも１つの基を有するシランカップリング剤である（９−１）又は（９−２）記載のバイオチップ用基板。
（９−４）ホスホリルコリン基を有する単量体が、更にメタクリ基又はアクリル基を有するものである（９−１）〜（９−３）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（９−５）ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである（９−４）記載のバイオチップ用基板。
（９−６）活性エステル基を有する単量体が、更にメタクリ基又はアクリル基を有するものである（９−１）〜（９−５）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（９−７）活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシイミドエステル基である（９−１）〜（９−６）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（９−８）固相基板がプラスチック製である（９−１）〜（９−７）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（９−９）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（９−８）記載のバイオチップ用基板。
（９−１０）固相基板がガラス製である（９−１）〜（９−７）いずれか記載のバイオチップ用基板。
（９−１１）（９−１）〜（９−１０）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、固相基板表面にアクリレート基、メタクリレート基、ビニル基、及びオレフィン基から選ばれる少なくとも１つの基を有する化合物Ａを有する層Ａを形成した後、層Ａ上でホスホリルコリン基を有する単量体、及び活性エステル基を有する単量体を共重合することにより層Ｂを形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
（９−１２）（９−１）〜（９−１０）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。
【０３９８】
（１０−１）基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、前記流路上に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
（１０−２）（１０−１）に記載のバイオチップにおいて、複数の前記カルボン酸誘導基を有し、前記複数のカルボン酸誘導基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されていることを特徴とするバイオチップ。
（１０−３）（１０−１）または（１０−２）に記載のバイオチップにおいて、前記カルボン酸誘導基が活性エステル基であることを特徴とするバイオチップ。
（１０−４）（１０−３）に記載のバイオチップにおいて、前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することを特徴とするバイオチップ。
（１０−５）基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（１）に示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、前記式（１）に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
【０３９９】
【化９】
0003887647.tif 000025
【０４００】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く一価の脱離基である。）
（１０−６）（１０−５）に記載のバイオチップにおいて、前記式（１）に示される一価の基が、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基であることを特徴とするバイオチップ。
【０４０１】
【化１０】
0003887647.tif 000026
【０４０２】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
（１０−７）（１０−１）乃至（１０−６）いずれかに記載のバイオチップにおいて、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することを特徴とするバイオチップ。
（１０−８）（１０−１）乃至（１０−７）いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記高分子物質は、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするバイオチップ。
（１０−９）（１０−１）乃至（１０−８）に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料がプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
（１０−１０）（１０−１）乃至（１０−９）いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記流路を覆う保護部材を有することを特徴とするバイオチップ。
（１０−１１）（１０−１０）に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料と、前記保護部材の材料のうち、少なくとも一方が検出光に対して透明なプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
（１０−１２）（１０−１）乃至（１０−１１）に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料がガラスであることを特徴とするバイオチップ。
（１０−１３）（１０−１）乃至（１０−１２）いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記捕捉物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップ。
（１０−１４）（１０−１）乃至（１０−１３）いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオチップ。
【産業上の利用可能性】
【０４０３】
本発明のバイオチップは、タンパク質をはじめとする生理活性物質の非特異的吸着が少ないため検体中の標的となる生理活性物質のロスが抑制されており、効率よく抗原抗体反応等の特異的相互作用が生じるため、短時間で高感度な生理活性物質の検出が可能である。また、基板の自己蛍光が低減化し、蛍光色素の吸着を低減された構成であるため、Ｓ／Ｎ比を高め、検体のシグナルを精密に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０４０４】
【図１】実施の形態に係るバイオチップの構成を示す平面図である。
【符号の説明】
【０４０５】
１０１  貫通孔
１０２  溝
１０３  基板
【図１】
0003887647.tif 000041
【配列表】
0003887647000001.app