(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、培養物から下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼを採取することを特徴とするアルカリペクチン酸リアーゼの製造法。
（１）作用
ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性
プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応pH
pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH
pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中６０分間処理）
（５）分子量
約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ）
【請求項２】
アルカリペクチン酸リアーゼが下記の酵素学的性質を有する、請求項１記載の製造法。
（１）作用
ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性
プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応pH
pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH
pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中６０分間処理）
（５）最適反応温度
５０〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性
約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液中、３０分間処理）
（７）分子量
約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ）
（８）等電点
pH１０．３付近（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤
エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される。
（１０）金属イオン
反応にＣａ2+を必要とする。
【請求項３】
アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌が、バチルス属に属するものである請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌が、バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８７）である請求項３記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等植物の細胞は、細胞壁に囲まれており、それぞれの細胞は中葉を介して相互に接着し組織を形成している。細胞壁の主体はセルロースであるが、一次壁にはヘミセルロースやペクチン質が存在している。また中葉の主成分はペクチン質であり、細胞壁間の接着剤の役目を果たしている。植物組織の崩壊という観点からみると、例えば果実の成熟は自身の酵素により細胞壁や中葉の水不溶性のペクチン質が分解され、水溶性のペクチン質へと変化し、軟化して行くという過程をたどる。そのために果実の破砕物や搾汁の中には多量のペクチン質が含まれ、食品工業においては、以前から果汁の清澄化にペクチン質分解酵素を用いている。そればかりでなくペクチン質分解酵素は、搾汁率の向上、柑橘ジュースパルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食品の製造、みかん内果皮の剥皮、コーヒー豆の外皮を除去した後に残るペクチンを主成分とする粘質物の除去等に広く用いられている。また、セルラーゼ、ヘミセルラーゼと併用することで大豆外種皮の剥皮、澱粉製造の収率向上、茶成分の抽出、粉末化などにも効果を認められている。
【０００３】
ペクチナーゼを工業的に利用しようという試みは、洗剤工業界においても考えられており、例えば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９０等が開示されている。前者においては、セルラーゼは繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で泥汚れ洗浄力に対する効果について述べられているが、完全に精製された酵素を用いていないためにその効果に関しては明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとして洗浄剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が開示されているが、これはリゾップス属のセルラーゼ及びペクチナーゼを併用することで洗浄力を発揮するというものであるが、いずれも中酸性領域に至適pHを有する酵素である。また、コンタクトレンズ用洗浄剤（特開昭６２−９１３号公報）、イオン交換膜洗浄剤（特開平１−３０４００７号公報）等にペクチナーゼを使用することも開示されている。また、植物性繊維の精練においてペクチナーゼは古くから用いられている。
【０００４】
ペクチン質分解酵素の基質はプロトペクチン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸などに分けられるが、いずれもＤ−ガラクツロン酸がα−１，４結合したポリガラツクロン酸を基本骨格としている。プロトペクチンは水不溶性の重合度１，０００〜２，０００のポリガラクツロン酸単位からなり、５０〜８０％のメトキシル基を有している。一方、ペクチンとペクチニン酸は水溶性で、ポリガラクツロン酸がメトキシル化されたものであり、後者の場合、そのメトキシル基が少量のものを言う。ペクチン酸はメトキシル基を含まないポリガラクツロン酸そのものである。
【０００５】
これらの基質に対して作用する酵素は大きく分類すると、４種類存在する。すなわち（１）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、（２）ペクチンとペクチン酸のα−１，４結合を加水分解するエンド型とエキソ型のポリガラクツロナーゼ、（３）ペクチンとペクチン酸に対しβ−脱離反応でα−１，４結合を切断し、基質の非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成するエンド型とエキソ型のペクチンリアーゼとペクチン酸リアーゼ、そして（４）オリゴガラクツロン酸を主な基質とするオリゴガラクツロナーゼである（伊崎，バイオサイエンスとインダストリー，50, 315-321, 1992）。この他、プロトペクチンに対して作用するプロトペクチナーゼも知られるようになってきている（Sakai, T. & Okushima, M., Agric. Biol. Chem.,42, 2427-2429, 1978;Sakai, T. & Okushima, M., Agric. Biol. Chem., 46, 667-676, 1982;Sakai, T. & Sakamoto, T., Agric. Biol. Chem., 54, 879-889, 1990）。この酵素はポリガラクツロナーゼあるいはペクチン酸リアーゼ活性を有するＡ−タイプと、セルロースとペクチン質を結び付けている介在多糖のアラビナンのα−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水分解するＢ−タイプのプロトペクチナーゼに分類されるという（坂井と阪本，繊維工学，45, 19-32, 1992）。
【０００６】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）は、１９６１年、バチルス  ポリミキサ（Bacillus polymyxa）の培養液に初めて見い出されたもので、ペクチン酸に対しβ−脱離反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であり、反応にカルシウムイオンを必要としている（Nagel, C. W. & Vaughn, R. H., Arch. Biochem. Biophys., 94, 328-332, 1961）。
【０００７】
一般に、細菌由来（Pseudomonas属、Erwinia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知られている（Rombouts, F. M. & Pilnik, W., Economic Microbiol., 5, 227-282, 1980）。さらに、真菌、細菌由来のいくつかのペクチン酸リアーゼは、その最適反応pHをpH１０〜１０．５付近に有すると報告されている。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. ciceri株の生産する２種のアルカリペクチン酸リアーゼ（Artes, E. P. & Tana, M., Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 107-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14株（Han, H.-J. et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20, 655-662, 1992）などはいずれもpH７〜８付近にも活性のピークが存在し、二つのピークを有するpH−活性曲線を示している。すなわち、単純なpH−活性曲線を示す酵素ではない。また、分子量も前者は、３７ｋＤａ（ゲル濾過法）、後者は４３ｋＤａ（ゲル濾過法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であり、２０ｋＤａより遙かに大きい。また、その最適反応pHをpH１０付近に有すると報告されているFusarium solani f. sp. pisi株の生産するＰｅｌＢは、分子量が２９ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）である（Guo, W. et al., J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995）。同様に生産されるＰｅｌＤは、分子量が２３ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）である（Guo, W. et al., Arch., Biochem. Biophys., 332, 305-312, 1996）。さらに、最適反応pHをpH１０．２５に有すると報告されているAmycolata sp.の生産するペクチン酸リアーゼは、その分子量が３１ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）である（Bruhlmom, F., Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）。一方、特公昭５８−２６７３には好アルカリ性バチルス属の菌株をペクチン質を唯一の炭素源としてペクチン酸リアーゼを生産する方法が開示されているが、ここでは誘導酵素の製造法を述べているにすぎず、また生産される酵素の最適反応pHは、pH９付近である。
【０００８】
前述のように、植物性繊維の精練に関しては古くよりペクチナーゼを利用するという試みがなされており、特に麻繊維の精練に広く使用されてきた。このような状況の中で例えば、特開昭５１−１４９９７６号、特公昭５７−３９６３６号、特開平６−２２０７７２号公報等に開示されているようにペクチナーゼ（ペクチン酸リアーゼを含む）を植物性繊維の精練、非木材繊維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用することができる。繊維の精練においてはアルカリ性領域で処理することで精練度合を高めることができるとされている。また、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高アルカリ性（pH１０〜１１）にすることによってその洗浄力を高めることができる。一方、植物性繊維上のプロトペクチンに付着した汚れを除去するには、Ａ−タイプに属し高アルカリ性領域で作用するペクチン酸リアーゼが有効であると考えられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は高アルカリ領域において充分作用するＡ−タイプのアルカリペクチン酸リアーゼを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
以上のような状況を鑑みて、本発明者らは新たなペクチン酸リアーゼを探索すべく日本国内の土壌よりスクリーニングしたところ、微生物が産生するアルカリ領域に最適反応pHを有する新規なアルカリペクチン酸リアーゼを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼの製造法を提供するものである。
【００１２】
0003917258.tif 000002
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明アルカリペクチン酸リアーゼは、さらに詳細には、以下の酵素学的性質を有する酵素である。
【００１４】
0003917258.tif 000003
【００１５】
本発明ペクチン酸リアーゼは、例えばアルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造される。かかるアルカリペクチン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ１５株が挙げられる。
【００１６】
Ａ  形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ        桿菌  ０．３〜０．５×１．６〜２．１μｍ
（ｂ）多形性                    無し
（ｃ）運動性                    有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）
０．６〜０．７×１．２〜１．４μｍ，中央、準端，膨潤有り
（ｅ）グラム染色                陽性
（ｆ）抗酸性                    陰性
（ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育（培地１）
黄白色、点状、隆起状、全縁のコロニーを形成
（ｈ）リトマスミルク（培地２）  僅かに赤色を呈するが凝固はしない
【００１７】
Ｂ  生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地３）    陽性
（ｂ）脱窒反応  （培地３）      陰性
（ｃ）ＭＲテスト（培地４）      陽性（pH５．５）
（ｄ）ＶＰテスト（培地４）      陽性
（ｅ）インドール生成（培地５）  陰性
（ｆ）硫化水素生成（培地６）    陰性
（ｇ）デンプン加水分解（培地７）陽性
（ｈ）クエン酸の利用（培地８）  陽性
（ｉ）無機窒素の利用（培地９）  硝酸塩、アンモニウム塩を利用しない。
（ｊ）色素の生成（培地１０）    無し
（ｋ）ウレアーゼ（培地１１）    陰性
（ｌ）オキシダーゼ（培地１２）  陽性
（ｍ）生育の温度範囲（培地１３）２０℃〜４５℃
（ｎ）生育のpH範囲（培地１４）  pH７〜１０
（ｏ）生育における酸素の影響  （培地１５）    嫌気条件下で生育する。
（ｐ）ＯＦテスト  （培地１６）  生育するが色調の変化は認められない
（ｑ）グルコースからのガス産生（培地１７）    無し
（ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１８）  ３％塩化ナトリウム含有培地上で生育できない。
（ｓ）糖からの酸生成（培地１９）  下表に結果を示す。
【００１８】
【表１】
0003917258.tif 000004
【００１９】
培地１  ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量
培地２  バクトリトマスミルク  （Ｄｉｆｃｏ社製）、１０．５重量％
培地３  ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．８重量％；硝酸カリウム、０．１重量％
培地４  ＶＰ−ＭＲ  ブロス（ＢＢＬ社製）、指示量
培地５  ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；インドール試験紙( 日水製薬社製）
培地６  ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製）、指示量
培地７  ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；可溶性デンプン、１．０重量％
培地８  クリステンセン培地（栄研化学社製）、指示量
培地９  酵母エキス、０．０５重量％；硫酸ナトリウム、０．１重量％；リン酸１カリウム、０．１重量％，；グルコース、０．１重量％；硝酸ナトリウム、又は亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、０．０２５重量％
培地１０  キングＡ培地、キングＢ培地（栄研化学社製）、指示量
培地１１  バクトペプトン、０．１重量％；塩化ナトリウム、０．３重量％；リン酸１カリウム、０．２重量％；酵母エキス、０．０５重量％；グルコース、０.1重量％；フェノールレッド、０．００１重量％；尿素、２．０重量％
培地１２  チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬社製）
培地１３  ＳＣＤ培地（日本製薬社製）
培地１４  ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、pHを調整した。
培地１５  アナエロビック  アガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量
培地１６  ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；グルコース、１．０重量％
培地１７  ＳＣＤ培地（日本製薬社製）、指示量；グルコース、０．５重量％
培地１８  ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；塩化ナトリウム、３．０〜１０．０重量％
培地１９  リン酸二アンモニウム、０．１；塩化カリウム、０．０２重量％；硫酸マグネシウム、０．０２重量％；酵母エキス、０．０２重量％；寒天、１．５重量％；ブロムクレゾールパープル、０．０００６重量％；糖類（別滅菌）、０．５重量％
【００２０】
以上の菌学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株はバチルス  サーキュランス（Bacillus circulans）に属させることが妥当である。しかし、バチルス  サーキュランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本菌株の諸性質は既知のバチルス  サーキュランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８７）として寄託した。
【００２１】
ＫＳＭ−Ｐ１５株等のアルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リアーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。炭素源、窒素源は特に制限はなく、資化しうる炭素源、例えばペクチン質、ガラクトース、グルコース、蔗糖、でんぷん、クエン酸、酢酸等があげられる。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆粉、綿実油粕、酵母エキス、尿素等が利用できる。その他、リン酸塩、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、  Ｎａ+ 、Ｋ+ 等の金属塩など有機、無機微量栄養源を培地中に適宜添加できる。培地のpHの調整には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を用い、本酵素の最適生産pHに調整することが望ましい。
【００２２】
かくして得られた培養液中からのアルカリペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うことができる。即ち、培養液から遠心分離又はろ過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿法、等電点沈殿法によってタンパク質を沈殿させたり、限外ろ過により濃縮させて目的酵素を得る。塩析法の例として硫安（３０〜９０％飽和画分）、溶媒沈殿法の例としてエタノール（５０％以上）中で酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理し、凍結乾燥粉末を得ることができる。ここで脱塩方法としては、透析あるいはセファデックスＧ−１０等を用いるゲルろ過の方法が用いられる。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるがさらに公知の方法により精製、結晶化することもできる。
【００２３】
かくして得られる本発明のアルカリペクチン酸リアーゼの一例であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｐ１５株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活性の測定は次の如くして行った。
【００２４】
（１）標準酵素活性測定法
試験管に０．３mlの０．５M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM  塩化カルシウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温した。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ  １４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、３mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa, S. & Nagel, C. W., J. Food Sci. 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とした。
【００２５】
（２）最適反応pH
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、又は５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．０）を用いて最適反応pHを調べたところ、本酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０．３〜１０．７の範囲内において最高活性の９０％以上の活性を示した。さらにpH１０．０〜１１．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した（図１）。
【００２６】
（３）pH安定性
４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH３〜１２）、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）又は５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９〜１０．５）中に１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、カルシウムの存在の有無に拘らずpH５〜１１．５の範囲で極めて安定であった（図２）。
【００２７】
（４）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５０〜５５℃であった（図３）。
【００２８】
（５）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mMの塩化カルシウムを添加した系及び無添加系を用意し、酵素を加えて１０℃〜７０℃の各温度で３０分間放置した。その後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、５０℃まで極めて安定であった。また、カルシウムイオンによる安定化効果は高温側で若干認められた（図４）。
【００２９】
（６）分子量
ａ．平衡沈降法による本酵素の分子量は次のように求めた。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ−７０Ｈ型、  ＲＡＰ６０型ローター）を用いダブルセクターセルの一方に酵素サンプル（０．２，０．３，０．４及び０．６mg／ml）を０．１ml、もう一方に０．１mlの脱イオン水を注入し、２０℃、２００００rp    m で２０−２４時間回転させ平衡状態に達した後、ＵＶスキャナ（日立製作所製  ＡＢＳ−７型）を用いて酵素の分布状態を測定し、データ解析装置（日立製作所製  ＤＡ−７型）により分子量を求めた。部分比容値は、０．７４を用い、タンパク質濃度を０に外挿し分子量を求めた結果、本酵素の分子
量は、２０．３±１．０ｋＤａであった。
【００３０】
ｂ．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）により、本酵素の分子量は約２６ｋＤａと見積られた。尚、標準タンパク質としてバイオラッド社製の分子量マーカー（ホスフォリラーゼｂ，９７．４ｋＤａ；牛血清アルブミン，６６．２ｋＤａ；オボアルブミン，４５ｋＤａ；カルボニックアンヒドラーゼ，３１ｋＤａ；トリプシンインヒビター，２１．５ｋＤａ；α−ラクトアルブミン，１４．４ｋＤａ）を用いた。
【００３１】
（７）等電点
pH８−１０．５のアンフォライン（ファルマライト，ファルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法により、本酵素の等電点はpH１０．３付近であった。
【００３２】
（８）アミノ末端配列
本酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫであった。
【００３３】
（９）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチンを基質とた場合の反応速度を標準酵素活性測定法を用いて調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Ｌｏｔ  １４４８２）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Ｌｏｔ  １２２Ｈ３７８０）を用いた時の約２倍の反応速度であった。エステル化度が高くなるにつれて反応速度は減少していくが、９３％のエステル化度を有するペクチンに対しても弱いながらも作用した（図５）。なお、ペクチン酸（ＩＣＮ社製）に対するｋｍ値は、０．０８％であった。次に基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm四方）した木綿繊維片１０mg（１％ｗ／ｖ）を０．６mM塩化カルシウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、酵素を添加した後、３０℃、６０分間、１２０rpm で反応させた。反応液を遠心分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸法により定量した（Sakai, T., Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）。その結果、０．１U の酵素を用いた場合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸として２０〜５０μｇのペクチン遊離量が認められた。このことは、本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに対して作用していることを示唆し、さらに上澄液中の２３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、本酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが判った。さらにＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙの方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、ペクチン酸に対する反応速度と同程度の反応速度で分解した。
【００３４】
（１０）基質の分解様式
オストワルド粘度計（イワキガラス社製、Ｎｏ．１）に終濃度が５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．６mM塩化カルシウム、０．７５％ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ  １４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）となるように調製した反応液を加えて、３０℃で恒温した。これに酵素を０．１U添加し、３０℃で１時間反応させた。一定時間ごとに粘度を測定しながら、反応液を１mlずつ採取し、０．５Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を０．０４ml加えた後、２３５nmにおける吸光度を測定した。その結果、反応時間に伴い粘度は低下し、初期粘度を１００％とした場合、３０分後には６０％、６０分後には４０％まで減少した。この時の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和物生成量は、基質の構成ガラクツロン酸量を１００％とした場合、６０分後で２％程度であったことから、本酵素はエンド型のペクチン酸リアーゼであることが判った（図６）。
【００３５】
（１１）金属イオンの影響
本酵素は、反応にカルシウムイオンを必要とし、そのＫｍ値は０．１４mMであった。１mMのＥＤＴＡにより処理をした酵素（脱イオン水に対して透析したもの）についてカルシウムイオン以外の金属イオンの影響を調べた結果、マンガン、ストロンチウム、コバルトの各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であった。次に１mMのＥＤＴＡ  を含む１０mM  ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を最終濃度が５０mM  ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃で３０分間放置した。処理した酵素液を２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法により残存活性を測定した。本酵素は、上記の処理において各種金属イオンに対し極めて安定であったが、水銀イオン及び亜鉛イオンにより若干阻害された（表２）。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
（１２）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。まず、標準酵素活性測定法に各種化合物を添加して酵素反応を行ったところ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、０．０１％ニトリロ三酢酸、０．１％トリポリリン酸ナトリウムによって完全に阻害された。これは、本酵素がカルシウムイオンを反応に必要とするためにキレーターである上記化合物によってカルシウムイオンが捕捉されることで起きたと考えられた。次に所定濃度の各種化合物を５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中に添加し、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後に残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、界面活性剤、キレート剤、他の化合物により阻害されることはなかった（表３）。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
このように本発明のアルカリペクチン酸リアーゼは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡ−タイプの酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHはpH１０．３〜１０．７にあり、分子量は約２０〜２１ｋＤａ（平衡沈降法）である。これらの性質を有する本発明酵素は、以上の点で従来のFusarium oxysporum f. sp. ciceri株、Bacillus sp. YA-14株、Frsarium solani f. sp. pisi株及びAmycolata sp.の生産するアルカリペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
【００４０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
【００４１】
実施例１：ペクチン酸リアーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王（株）の微生物保存室に保有の菌株を下記の組成を有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込み１０分間靜置した。ポリガラクツロン酸の分解に起因してコロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、ペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス
エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株を得た。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
実施例２：ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養
上述のスクリーニングにより得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００４４】
実施例３：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来アルカリペクチン酸リアーゼの精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養液を遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）し、その上澄液（１２５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）を行い沈殿物を回収した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（９００ml）のうち１００mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた（１１００ml）。次にＢｉｏ  Ｃａｄ  ６０  ＨＰＬＣシステム（日本パーセプティブ社製）を用いて０．２mM塩化カルシウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化しておいたスルホプロピルカラムへ上記の非吸着画分を２００mlずつ添着した。０から０．２M の塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法により、タンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼ活性は０．１M 付近の塩化ナトリウム濃度で単一ピークとして溶出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法においても均一なタンパク質として検出された。上記の操作を繰り返し、精製酵素を得た。活性収率は約６０％であり、精製倍率は５０倍であった。得られた精製酵素は前記の酵素学的性質を有していた。
【００４５】
実施例４：プロトペクチンに対する作用（市販木綿糸からのペクチン遊離量）
市販木綿糸４０mg（カネボウ社製カタン糸３０番手）に１．９mlの５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加え、精製アルカリペクチン酸リアーゼ（実施例３）を０．１ml（０．２４U）添加し、３０℃、１時間反応させた。反応後、糸を取去り氷冷した後、遠心分離（３０００rpm、５分間）を行った。得られた上清液中に含まれる遊離のペクチン量をカルバゾール硫酸法（Sakai, T., Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）にて定量した。ブランクは、酵素液の代わりに酵素希釈用緩衝液（１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５）を０．１ml加えたものを用意し、上記と同様の操作を行ったものとした。その結果、本酵素は、木綿糸１ｇ当り約０．７８mgのペクチンを遊離した。
【００４６】
【発明の効果】
本発明ペクチン酸リアーゼは、アルカリ条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの反応に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図３】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの反応に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図５】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの基質特異性を示す図である。
【図６】本発明アルカリペクチン酸リアーゼのポリガラクツロン酸に対する分解様式を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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