(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プセウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）種の微生物でシス−ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を処理することを含むシス−ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を分割する方法。
【請求項２】
シス−ジヒドロキシジヒドロインデンの混合物が式（１）
0003917653.tif 000004
（式中、ＲおよびＲ4はそれぞれ独立して−Ｈ、ハロゲン、−Ｎ3、−ＯＨ，−ＣＮ，アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ3、−ＯＲ1、−ＳＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＰＲ1Ｒ2、−ＣＯＲ1、または−ＣＯ2Ｒ1であり、式中、Ｘはハロゲンであり、並びにＲ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキル、アリール、アルケニルまたはアルアルキルである）の化合物を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（１）の化合物が式（２）
0003917653.tif 000005
（式中、ＲおよびＲ4は請求項２に記載のとおりである）である請求項２記載の方法。
【請求項４】
プセウドモナス・プチダ種がＮＣＩＭＢ８８５９およびＮＣＩＭＢ１１７６７から選択される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
シス−ジヒドロキシジヒドロインデンがシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンであり、プセウドモナス・プチダ種がプセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ８８５９である請求項１記載の方法。
【請求項６】
シス−ジヒドロキシジヒドロインデンがシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンであり、プセウドモナス・プチダ種がプセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ１１７６７である請求項１記載の方法。
【請求項７】
ｐＨが４から９の範囲内に調整された水性の緩衝媒質の中で実施される請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
温度が０℃から１００℃までの間である請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はラセミ体のジオール（ｄｉｏｌ）類の分割方法、特にラセミ体のシス−ジオール（ｃｉｓ−ｄｉｏｌ）類の分割方法，より詳しくはラセミ体の芳香族シス−ジオール類、ラセミ体の脂環式シス−ジオール類およびラセミ体の複素環式シス−ジオール類、具体的にはジヒドロキシジヒドロインデン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｅｎｅ）類、より具体的にはビシナル（ｖｉｃｉｎａｌ）−シス−ジヒドロキシジヒドロインデン類の分割方法に関する。
分割したジヒドロキシジヒドロインデン類は医薬や農薬のような生物学的に活性な化合物を合成するための有用な中間体である。
分割したジオール類、具体的にはジヒドロキシジヒドロインデン類、更に具体的にはビシナル−シス−ジヒドロキシジヒドロインデン類を、適当な微生物を用いる生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって高度のエナンチオマー過剰率（ｅｎａｍｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ：ｅ．ｅ．）でかつ良好な総括収率で都合よく製造できることが今回見いだされた。
本発明はプセウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）種の微生物を用いてジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）類の混合物を処理することを含むジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体類の混合物の分割方法を提供する。
ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体類の混合物は、好ましくは、一般式（１）の化合物を含む。
0003917653.tif 000002
式中、ＲおよびＲ4はそれぞれ独立してＨ，ハロゲン、−Ｎ3、−ＯＨ，−ＣＮ，アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ3、−ＯＲ1、−ＳＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＰＲ1Ｒ2、−ＣＯＲ1、−ＣＯ2Ｒ1、その内、Ｘはハロゲン、並びにＲ1およびＲ2はそれぞれ独立してアルキル、アリール、アルケニルまたはアルアルキル（aralkyl）である。
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2およびＲ4であらわしたアルキル基、アルケニル基、アリール基およびアルアルキル基はそれぞれ−ＮＯ2、−ＣＮ，−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｃ1-6−アルキル、−Ｃ1-6−アルコキシ、−ＣＦ3、−ＯＨ，−ＯＲ3から選択し、置換されてもよく、その場合Ｒ3はアルキル、アリール、アルケニルまたはアルアルキル基である。
Ｒ，Ｒ1，Ｒ2、Ｒ3またはＲ4の１つがアルキルの時、好ましくはＣ1-10−アルキル、より好ましくはＣ1-6−アルキル、特にＣ1-4−アルキルである。
Ｒ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3またはＲ4の１つがアルケニルである時、好ましくはＣ2-10アルケニル、より好ましくはＣ2-6−アルケニルである。Ｒ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3またはＲ4の１つがアリールの時、フエニル基であるのが好ましい。
Ｒ1，Ｒ2またはＲ3の１つがアルアルキルである時、好ましくはＣ1-6−アルキルフエニル、より好ましくはベンジル基である。
ＲおよびＲ4はそれぞれ独立して好ましくは−Ｈ，−Ｆ，−Ｃｌ，Ｂｒ，−Ｉ，−Ｎ3、−ＯＨ，−ＣＮ，アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ3、−ＯＲ1、ＳＲ1または−ＣＯＲ1であり、式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ1はアルキル、アリール、アルケニルまたはアルアルキルであって、より好ましくは，−Ｈ，−Ｆ，Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｎ3、−ＯＨ，−ＣＮ，−Ｃ1-6−アルキル、Ｃ2-6−アルケニル、フエニル、−ＣＦ3、−ＣＣｌ3、−ＯＣ1-6−アルキル、−ＳＣ1-6−アルキルまたはーＣＯＣ1-6−アルキルであり；並びに特に−Ｈ，−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｎ3、−ＯＨ，−ＣＮ，−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3または−ＣＯＣＨ3である。
式（１）の化合物は好ましくは式（２）の化合物である。
0003917653.tif 000003
式中、ＲおよびＲ4は前に定義した通りである。
式（１）と式（２）の特に好ましい化合物は、Ｒが前に定義した通りであり、Ｒ4がＨか、アルキルまたはアルコキシである化合物である。
Ｒが−Ｈ以外の置換基である場合、Ｒが結合している炭素原子はキラル中心である。本発明は５員環の１位、２位および３位に３個のキラル中心を持ち、それ故に、本発明の更に別の特徴を成すジヒドロキシジヒトロインデン類を分割する方法を提供する。
Ｒ、Ｒ4またはＸの１つがハロゲンである場合、好ましくは、−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒまたは−Ｉ，より好ましくは−Ｆ，−Ｃｌまたは−Ｂｒである。
本願方法は好ましくは水性の媒質中で、より好ましくは緩衝化された水性の媒質中で実施する。適当な緩衝剤は無機物であっても有機物であってもよく、好ましくは媒質のｐＨを４から９の範囲に、より好ましくは６から８の範囲に、特にｐＨ７に調整する緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは無機物、より好ましくはアルカリ金属のリン酸塩、特にリン酸カリウムである。特に適当な水性の媒質は０．１Ｍリン酸カリウムである。
もしそう望むならば、ＮＡＤＨ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）再循環を提供する補基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を必要に応じて水性の媒質に加えてもよい。好ましい補基質はピルビン酸ナトリウムのようなα−ケト酸、およびエタノール、イソプロパノールまたはグルコースのようなアルコールである。
本発明の方法は好ましくは０℃から１００℃の温度、より好ましくは２０℃から４５℃，特に２８℃から３２℃の温度で実施することが好ましい。
反応が２、３時間から数多くの日数までのうち適当な期間続行した後に、例えば、遠心分離法で微生物を除却すること、および／またはその反応物を５℃未満まで冷却すること、などの適当な手段によって反応を終結することが可能である。
生成物は、酢酸エチルのようなエステルを用いて溶媒抽出により反応混合物から単離してもよい。生成物は、カラムクロマトーグラフィーのような任意の好適な手段、例えば、溶離液としてメタノールまたはメタノールとジクロロメタンとの混合物を用いるシリカゲル若しくはキーゼルゲル（Kieselgel）Ｃ６０からの溶離によって、または酢酸エチル／ヘキサンのようなエステル／アルカンの混合物を用いる再結晶法によって精製してもよい。
ジヒドロキシジヒドロインデン混合物は、好ましくは、シス−ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物、並びに更に好ましくは、シス−ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体のラセミ体混合物である。好ましいジヒドロキシジヒドロインデン混合物は、一般式（１）また（２）においてＲおよびＲ4が両方ともＨであるジヒドロキシジヒドロインデン混合物である。プセウドモナス・プチダ種の選択は、鏡像異性体の一方不斉分解（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を可能にする。それ故、本発明の最初の好ましい具体例は、シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン類の混合物をプセウドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ８８５９で処理してシス−［１Ｓ：２Ｒ］−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンを生成することである。
本発明の第２の好ましい具体例は、シス−１，２−ジヒドロキシジヒドロインデン類の混合物をプセウドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ１１７６７またはＮＣＩＭＢ１２１９０で処理してシス−［１Ｒ：２Ｒ］−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンを生成することである。
以下の実施例によって、本発明を更にくわしく説明する。
実施例１
プセウドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ８８６９を用いる生物変換
１．微生物源（Source of microorganism）
プセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ８８５９（以後、ＮＣＩＭＢ８８５９と記す）をザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド、エイビー２  １アールワイ、スコットランド、アバディーン、セント  マシャール  ドライブ  ２３（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23, St Machar Drive, Aberdeen, Scotland,AB2 1RY）から凍結乾燥培養物として得た。
２．ＮＣＩＭＢ８８５９菌株の増殖
ＮＣＩＭＢ８８５９を、固体のナフタレンを炭素源として加えた定められた最少培地上で増殖させた。最少培地は下記のものを含んでいた：
ＫＨ2ＰＯ4                            ０．９６ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                            １．２３ｇ／ｌ
ＮＨ4Ｃｌ                             ３．００ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                    ０．４０ｇ／ｌ
微量元素溶液                          １．９ｍｌ／ｌ
微量元素溶液は下記のものをを含んでいた：
Ｎａ2ＥＤＴＡ                       ５０．００ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                    ２．２０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2                             ５．５４ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                    ５．０６ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                    ５．００ｇ／ｌ
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ          １．１０ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ                    １．５７ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                    １．６１ｇ．ｌ
構成成分は上記の順番で溶解して溶液とした。ｐＨは上記ＥＤＴＡ塩を加えた後、並びに最後の成分を加えた後に２Ｍ  ＫＯＨを加えてｐＨ６．０になるように調整した。
細菌（ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔｉｏｎ）後、２ｇ／ｌのナフタレンを唯一の炭素源として最少培地に加えた。培養物にＮＣＩＭＢ８８５９株の寒天平板からの単一のコロニー、または、ＮＣＩＭＢ８８５９株菌のナフタレン増殖液体培養物のいずれかで接触した。
オービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）（３００ｒｐｍ）にのせた４００ｍｌの最少培地を含む複数の２リットルのシェイクフラスコ（ｓｈａｋｅｆｌａｓｋ）中で３０℃でバッチ培養によりＮＣＩＭＢ８８５９を増殖させた。生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）に利用する前に、後期指数的生長相（ｌａｔｅ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ）においてＮＣＩＭＢ８８５９混合物を採取し、この混合物を初めにグラスウールを通してろ過し、余分のナフタレンを取り除いた。
３．（１Ｒ：２Ｓ／１Ｓ：２Ｒ）−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンのラセミ体の製造
水（２．５ｃｍ3）、アセトン（５ｃｍ3）およびｔｅｒｔ−ブタノール（１．５ｃｍ3）の混合体中にあるインデン（０．５ｇ，４．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、４−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（０．６ｇ，５．９ｍｍｏｌ）および四酸化オスミウムの四塩化炭素溶液（０．００５ｇ／０．５ｃｍ3）を加えた。反応混合物を室温で３日間撹拌した後で、メタ重亜硫酸ナトリウムの飽和水溶液（０．５ｃｍ3）を加え、撹拌をもう一時間継続した。反応混合物を水（５０ｃｍ3）で薄め、酢酸エチル（２ｘ５０ｃｍ3）で抽出し、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で乾燥した。有機相の抽出物から溶剤を減圧蒸留すると、粗製の（１Ｒ：２Ｓ／１Ｓ：２Ｒ）１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンの灰色がかった白色のふわふわした結晶（０．６３ｇ，９７％）が得られた（融点：９８−１００℃）．
４．シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンのラセミ体の生物変換
上記の工程２の後で得られたＮＣＩＭＢ８８５９混合物を遠心分離機にかけて（８ｋ  ｒｐｍ，１５分，２５℃）細胞ペレットを得た。次いでこの細菌細胞を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再度懸濁させて、６００ｎｍで３．０８の最終光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を得た。それから、（既に緩衝液に溶解した）ラセミ体のシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン基質を反応混合物に加えて０．４２ｇ／ｌの最終濃度を得た。
ピルビン酸ナトリウムを補基質として加えた。３８０ｃｍ3の反応容量に対して、１５．２ｃｍ3の１０％ピルビン酸ナトリウム溶液を加え３５ｍＭの最終濃度を得た。
生物変換混合物（３９５．２ｃｍ3）をオービタルシェイカー（３００ｒｐｍ）にのせた２リットルのシェイクフラスコ中において３０℃で２４時間インキュベートした。この時間の終わりに、遠心分離によって（８ｋ  ｒｐｍ，１５分，４℃）反応を停止させ、生成物を精製する前に上澄み液を４℃で保存した。
５．生成物の精製
上記の工程４で得た上澄み液を減圧下でその重量の１／５まで濃縮し、その濃縮液を塩化ナトリウムで飽和させた。この飽和溶液を酢酸エチルで２回（２ｘ８０ｃｍ3）で抽出し、抽出液を一緒にして無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで蒸発乾固した。粗生成物を酢酸エチル／ヘキサンで再結晶し、シス−［１Ｓ：２Ｒ］−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン（３５％，＞９８％ｅ．ｅ．）を得た（このｅ．ｅ．値はジメチルテルフタル酸エステル誘導体類の1Ｈ−ＮＭＲ分析およびキラル固定相高速液体クロマトグラフイー（ｃｈｉｒａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）によって得た）。
６．ラセミ体の３−置換シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン類の生物変換
複数のラセミ体の基質（ｒａｃｅｍｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、すなわち、［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｓ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン，または［１Ｓ：２Ｒ：３Ｓ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｒ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン（対応するアルケンである１−メチルインデンのＯｓＯ4酸化によって得られた）の個々の部分動力学的分割（ｐａｒｔｉａｌ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を、プセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ８８５９を用いて、上記工程４において記載した条件と同様の条件下で、但しより短い生物変換時間（１６時間）にわたって実施した。回収した複数の基質は、各々の場合において、１種の鏡像異性体、すなわち、（−）−［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ］（５０％ｅ．ｅ）および（＋）−［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ］（４８％ｅ．ｅ）の含有量が高められ、キラル固定相ＨＰＬＣ分析によればそれぞれ３０％および５４％の収率であることが分かった。ラセミ体のシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンに関する酵素を触媒とする動力学的分割方法の時間−進行（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ）研究によって、十分な時間と十分に高い細胞密度（ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が与えられれば、全分割（ｔｏｔａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を達成することが可能であることが示された。ラセミ体基質である［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｓ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンおよび［１Ｓ：２Ｒ：３Ｓ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｒ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンの動力学的分割を最適化する同様な試みはいずれについてもなされていないが、全分割は後者のタイプの最適化を必要とするであろう。