(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６３、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６４、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０３８、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０７８及びビフィドバクテリウム・アドレスセンティスＹＩＴ４０４５から選ばれる一種又は二種以上のビフィドバクテリウム属微生物を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を含有するコレステロールの腸管からの吸収抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム属微生物を用いた発酵豆乳を含有するコレステロールの腸管からの吸収抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
豆乳には、大豆蛋白質、リン脂質、イソフラボンが含まれており、脂質代謝に有効であることが期待されている。しかしながら、豆乳には特有の不快臭や不快味があるため多くの消費者から敬遠されているのが現状である。
そこで、豆乳特有の不快臭を軽減するために、乳酸菌やビィフィズス菌で豆乳を発酵させることなども試みられているが、発酵豆乳に優れた脂質代謝改善効果があることは未だ報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
動脈硬化症の予防・改善には、血中コレステロール量を低下させることが一般的であり、高コレステロール血症、特に高ＬＤＬ(低比重リポタンパク質）コレステロール血症の改善が効果的である（馬淵  宏ら(1987)Coronary vol4,281）。
また、動脈硬化の発生は、ＬＤＬの酸化変性が発端となって起こることが報告されており（Steinberg,D.ら(1989)New Engl J.Med.,321,1196-1197)、ＬＤＬに対し抗酸化活性を有する物質が注目されている。
【０００４】
従って、本発明の目的は、動脈硬化症の予防・改善に効果的な優れた脂質代謝改善剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる実情に鑑み、本発明者らは、豆乳の持つ有効成分に着目し鋭意研究を行った結果、豆乳にビフィドバクテリウム属微生物、特にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６３、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６４、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０３８、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０７８、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスＹＩＴ４０４５を作用させて得られた発酵豆乳が、優れた脂質の腸管からの吸収抑制作用を有し、脂質代謝改善剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６３、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６４、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０３８、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０７８及びビフィドバクテリウム・アドレスセンティスＹＩＴ４０４５から選ばれる一種又は二種以上のビフィドバクテリウム属微生物を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を含有するコレステロールの腸管からの吸収抑制剤を提供することにある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において原料となる豆乳は、油脂を含有した丸大豆、脱皮大豆、又はフレーク大豆等を原料としたものが好ましいが、脱脂大豆を原料としたものであってもよい。
【０００８】
豆乳は原料を水につけた後、熱水又は０．５〜１．０重量％（以下、単に％で示す）の炭酸ナトリウムを含む熱水を添加して磨砕後、おからを取り除き、更に加熱殺菌して製造することができるが、本発明で用いる豆乳はいかなる方法で製造されたものであってもよい。
【０００９】
豆乳には、後の微生物処理のために、ショ糖、ブドウ糖、果糖、転化糖等の食品に用いられる糖；肉エキス、ペプトン、酵母エキス、ペプチド等の微生物の増殖に必要な栄養素を添加してもよい。また、微生物の至適ｐＨに調整するために豆乳にクエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸等の食品に用いられる酸を添加してもよい。
【００１０】
本発明のコレステロールの腸管からの吸収抑制剤は、豆乳にビフィドバクテリウム属微生物を作用させて得られた発酵豆乳を主成分とする。豆乳に作用させるビフィドバクテリウム属微生物はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６３、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６４、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０３８、ビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０７８及びビフィドバクテリウム・アドレスセンティスＹＩＴ４０４５から選ばれる一種又は二種以上である。
【００１１】
これらビフィドバクテリウム属微生物を豆乳に作用させる方法は特に限定されず、例えば、培養したビフィドバクテリウム属微生物の菌液を上記豆乳に接種した後、その微生物に適した温度、時間、嫌気性菌なら嫌気性等の条件を適宜決定して発酵を行えばよい。なお、発酵は、菌株を複数種組み合わせた混合発酵であってもよいし、菌株を複数種組み合わせた連続発酵であってもよい。
また、ビフィドバクテリウム属微生物及びそれ以外の微生物を用いた上記混合発酵あるいは連続発酵でもよい。
【００１２】
豆乳にビフィドバクテリウム属微生物を作用させて得られた発酵豆乳は、そのまま本発明の脂質代謝改善剤とすることができるが、食品や経口医薬品に通常使用されている添加物を加えてもよい。ここで用いる添加物としては、糖類、蛋白質、脂質、ビタミン類、植物抽出物、動物抽出物、ゲル化剤、香料、着色剤等が挙げられる。なお、本発明において発酵豆乳は、殺菌してから用いることもできる。
【００１３】
本発明の脂質代謝改善剤及びＬＤＬ抗酸化剤を医薬として使用する場合の投与量は、投与法、患者の年齢、体重、容態によって異なるが、経口投与の場合、成人患者に対して１日あたり１００〜５００mlとすることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の脂質代謝改善剤は、任意の範囲で食品に添加して用いることができ、脂質代謝改善食品とすることができる。食品としては、乳酸菌飲料、発酵乳、豆乳、牛乳、チーズ、プリン等に１０〜８０％、好ましくは４０〜７０％程度含有させればよく、その他ビスケット、パン等に含有させることもできる。
【００１５】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
素豆乳（四国化工機製、固形分12.0％、粗脂肪2.48％、粗タンパク4.71％）を100 ℃で90分蒸気滅菌後、Bifidobacterium breve YIT4065(FERM P-15488)（豆乳培地）を接種し、３０時間培養した。培養終了後の菌液のｐＨは4.82、滴定酸度は8.25であった。これを凍結乾燥した発酵豆乳凍結乾燥物の組成は、素豆乳の組成とほぼ一致していた。また、対照として発酵豆乳のタンパクをカゼインに、脂質をコーン油に、残りをシュクロースで置換した対照混合物を調製した。これらの発酵豆乳、豆乳及び対照混合物を使用し、表１に示すコレステロール無添加食餌及び表２に示すコレステロール添加食餌をそれぞれ調製した。なお、表１及び表２において、ビタミン混合、塩類混合はAIN-76に準じたものである。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【００１９】
５週齢のシリアンハムスター（ＳＬＣ）雄36匹を使用し、３日間ＭＦ（オリエンタル酵母工業（株）製）固形食、４日間ＭＦ粉末食にて予備飼育後、平均体重に差がでないように６群に分けて（１群６匹）、室温24±1℃、湿度55±5％の環境下、個別ブラケットケージで上記食餌にて飼育した。なお、食餌及び水は自由摂取とした。
２〜３日おきに摂取量を測定し、試験開始７日後、４時間絶食後、ネンブタール麻酔下で解剖し、腹大動脈より採血し血漿を分離して脂質を分析した。
【００２０】
分析は、血漿脂質は総コレステロール、HDL（高比重リポタンパク質）-コレステロール、トリグリセライドについて臨床検査キット（デタミナTC555／協和メディクス（株）製、HDL-コレステロールテストワコー／和光純薬（株）製、トリグリセライドＧテストワコー／和光純薬（株）製）にて測定することにより行った。
統計処理は、分散分析（等分散性が認められなかった場合はlog 変換後分散分析）の後Tukeyの検定にて多重比較した。結果を表３〜表６に示す。値は平均値と標準偏差で表した（ｎ＝６）。有意水準は0.05とした。
同じアルファベットが付されている値は有意差がないことを示す。表３及び表５において終体重は絶食前の体重を示す。動脈硬化指数は計算式（１）により算出した。
【００２１】
【数１】
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【００２２】
【表３】
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【００２３】
【表４】
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【００２４】
【表５】
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【００２５】
【表６】
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【００２６】
コレステロール無添加食において、終体重、体重増加量、飼料効率への豆乳及び発酵豆乳の影響は認められなかった。摂食量において豆乳と発酵豆乳で対照に比べて多い傾向にあるが多重比較すると差が検出されなかった。豆乳と発酵豆乳の血漿トリグリセライドの値は対照と比べて半減した。
総コレステロールに３群間の差はなかったが、HDL-コレステロールは発酵豆乳群で対照群に比べ増加し、（VLDL（超低比重リポタンパク質）＋LDL）-コレステロール値は減少した。
動脈硬化指数も発酵豆乳群で対照群と比べて低下した。豆乳群ではHDL-コレステロール、（VLDL＋LDL）-コレステロール、動脈硬化指数いずれも対照とも発酵豆乳とも差は認められなかった。
【００２７】
コレステロール添加食においては、豆乳及び発酵豆乳群の体重増加量と摂食量及び飼料効率は対照群と比較してそれぞれ増加した。血漿トリグリセライド値は豆乳と発酵豆乳群で対照群の約１／４に減少した。
また、総コレステロールについても豆乳群、発酵豆乳群は対照群と比べて、１５％程度減少した。豆乳、発酵豆乳群はHDL-コレステロールの上昇、（VLDL＋LDL）-コレステロールの減少が認められ、動脈硬化指数が約半分に減少し、コレステロール無添加の対照群の値に近くなった。
【００２８】
以上の結果により、発酵豆乳は、コレステロール添加、無添加にかかわらず、対照に比べ明らかにHDL-コレステロールの上昇と（VLDL＋LDL）-コレステロールの減少が認められ、脂質代謝改善効果が確認された。
更に発酵豆乳は、コレステロール無添加において、豆乳に比べ明らかに優れた脂質代謝改善効果を有することが確認された。
【００２９】
実施例２
嫌気ＧＡＭ培地にて前培養したヒト由来ビフィドバクテリウム属微生物（１０株）を素豆乳（100℃90分滅菌）に１％接種し、37℃、48時間培養した。
培養液１mlに３mlのメタノールを加えて攪拌、４℃で一晩放置したのち、遠心分離（3000rpm、10分間）して上清（４倍希釈液）を得た。これを更にメタノールで希釈し、40倍希釈サンプルを調製した。
【００３０】
シリアンハムスター（雄、６週齢）をＭＦ飼料で１週間予備飼育したのち、0.5％コレステロール、及び5％ラードを添加したＭＦ飼料で２週間飼育した。解剖前日に24時間絶食させ、腹部大動脈から採血を行い、EDTA法により血漿を調製した。この血漿から超遠心法によりLDL 画分を採取し、生理的リン酸緩衝液で24時間透析したのち、適当な濃度に希釈して酸化反応用LDL とした。
【００３１】
ＬＤＬ（終濃度250μg/ml protein）はサンプル添加後、5μM  ＣｕＳＯ4存在下で37℃、4時間インキュベートして酸化させ、EDTA添加ののち冷却して反応を止め、反応液中のThiobarbituric acid reactive substance（以下、TBARSで示す）を比色法による吸光度測定から求めた。サンプルのかわりにメタノールを添加したものをコントロールとし、計算式（２）にてＬＤＬ脂質酸化抑制率（％）を求めた。結果を表７に示す。なお、抗酸化性は、滅菌済素豆乳の値を100としたときの比抑制率として表した。
【００３２】
【数２】
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【００３３】
【表７】
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【００３４】
以上の結果により、ビフィドバクテリウム属微生物による発酵豆乳は、ＬＤＬ抗酸化活性を有し、豆乳と比較しても優れたＬＤＬ抗酸化活性が認められた。
【００３５】
実施例３
嫌気ＧＡＭ培地にて前培養したビフィドバクテリウム属微生物（２４株）を素豆乳（四国加工機製、100 ℃90分滅菌）に１％接種し、所定時間37℃で好気培養した後、測定まで−20℃で保存した。
上記のとおり調製した発酵豆乳200mgに、後述する方法で調製した人工脂質ミセルを200μlを加えて、37℃で１時間放置後、遠心分離（1000rpm,15分）し、上清のコレステロール濃度をデタミナTC555（協和メディックス）を用いて測定した。コントロールとしては素豆乳を用い、各発酵豆乳の沈殿に移行したコレステロール量をコレステロール不溶化率とした。結果を表８に示す。
【００３６】
〔人工脂質ミセルの調製〕
リン酸バッファー（150mM,pH7.0)75mlに、oxgall(DIFCO)2g、コレステロール（和光純薬工業（株）製) 921mg 、リゾフォスファチジルコリン（SIGMA)135mgの順で加えて溶解し、次いでモノオレイン酸（東京化成工業（株）製）90.2mg、オイレン酸(和光純薬工業（株）製) 702.2mg を加え混合し、リン酸バッファーを加えて全量を100mlとした。
溶液を攪拌しながら、室温での超音波処理(SONIFR,スモールチップ）を行った。このエマルジョン及びミセル溶液をしばらく攪拌後100,000×ｇ(RP50-2,40,000rpm)、25℃にて超遠心分離を16〜18時間行った。超遠心分離後、透明なミセル層のみを回収し、人工脂質ミセルを調製した。
【００３７】
【表８】
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【００３８】
以上の結果により、ビフィドバクテリウム属微生物による発酵豆乳はいずれも豆乳に比べミセル不溶化作用が強かった。コレステロールが小腸粘膜から吸収されるにはミセルに溶解していることが必須である。よって発酵豆乳は豆乳よりもコレステロールの吸収を抑制することが示唆された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の脂質代謝改善剤は、HDL-コレステロールを増加させる一方、（VLDL＋LDL）-コレステロールを減少させるので、動脈硬化症の予防・改善効果が期待できる。特に、コレステロール無添加の条件下では、対照混合物と豆乳には差が認められないのに対し、本発明の脂質代謝改善剤は、有意に（VLDL＋LDL）-コレステロールを減少させる効果が認められ、常人においても動脈硬化症の効果的な予防が期待できる。
また、本発明の脂質代謝改善剤は、ＬＤＬに対する優れた抗酸化活性を有するので、動脈硬化の発端とされるＬＤＬの酸化変性を効果的に防止することができる。更に、本発明の脂質代謝改善剤は、豆乳にビフィドバクテリウム属微生物を作用させて得られた発酵豆乳からなるので、安全性にも全く問題のない官能的にも優れた脂質代謝改善剤であり、動脈硬化の予防及び治療に有用である。