(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物と、セラミドと、イソマルトオリゴ糖と、脂溶性ビタミンと、からなる組成物を有効成分とする創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤。
【請求項２】
コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物と、セラミドと、イソマルトオリゴ糖と、脂溶性ビタミンと、からなる組成物を有効成分とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤に関し、詳細には、コラーゲンを主成分とする創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
超高度高齢化社会を迎えつつある今日、加齢変化に伴って生じ易くなる生活習慣病等の様々な疾患は医療費を増大させ、また今後の介護に与える影響も大きく重大な問題であり、また、若年層の日常の不規則な食生活から生じる免疫機能低下症、若年性痴呆症やアレルギー性疾患などの発症率の上昇も同様に重大な問題である。このようなことから、医療技術の更なる向上と共に、食生活（介護食を含む）の見直しと改善が早急に要求されている。
【０００３】
ところで、加齢変化とは、時間の経過と共に身体に起こるすべての形態的・生理的変化をいい、年齢と共に生体恒常性の低下、特に新陳代謝機能や免疫機能が低下し、その結果、すべての器官と組織中の細胞の萎縮・消失の増大、脂肪酸酸化の亢進、感染症の発症率の上昇などを招き、各種の疾患に罹り易くなると共に、これら疾患からの回復が遅れ、例えば免疫能の低下によりメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に感染する場合のように死へ転帰することもある。また、高齢化で寝たきり患者の増加も予想され、新陳代謝機能の低下に伴う皮膚繊維芽細胞を遊走・増殖させる機能の低下による予後の悪化した褥瘡（床ずれ）の治療が医療上の問題となる可能性がある。
【０００４】
そのため、従来よりこれら加齢変化に伴う各種疾患に対し、諸種の植物や動物に由来する乾燥粉末・抽出物、ホルモン剤、抗酸化剤、ＤＨＡ等の高級不飽和脂肪酸などに関する研究開発が盛んに行われてきている。一方、ヒトの総蛋白質の約３０％を占めるコラーゲンは、近年の結合組織に関する生化学的研究の著しい進歩によって、単に生体組織の骨格構造の形成のみでなく、細胞の接着、細胞の増殖や分化などに特異的な作用を示す重要な機能因子であることも解明されてきており、さらに加齢と共に新陳代謝機能が低下していくのは、コラーゲン蛋白の新陳代謝機能の低下が引き金となるとの報告もある。このように、コラーゲンは量的にも質的にも生体にとって重要な成分であるにも拘わらず、これまでのコラーゲンの使用法は皮膚への塗布、すなわち化粧品や軟膏剤への使用が大半であり、経口摂取用では健康食品として僅かに使用されるのみで、中高年者の生体内コラーゲン合成系を高めるためにコラーゲンを経口摂取させ高濃度のコラーゲンを生体内で維持させるという発想は極めて少なく２、３の報告がされているにすぎない。例えば特開平７−２７８０１２号公報には、コラーゲン蛋白もしくはその加水分解物を必須成分とした新陳代謝促進剤及びこれに杜中葉等の抽出物等を配合した食品が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記植物由来や動物由来の乾燥粉末・抽出物やホルモン剤等からは、加齢変化に対し十分な効果が得られていない。また、特開平７−２７８０１２号公報の発明のコラーゲンでは、摂取されたコラーゲンが生体内でコラーゲン本来の機能発現と共に生体内のコラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼによるコラーゲン分解機構が作動することへの防御・制御が加味された成分が添加されていないため、摂取されたコラーゲンの酵素的分解による消失分を大量摂取で補わなければならないという問題点があった。さらに、コラーゲンに杜中葉等の抽出物等を配合した食品においても、コラーゲンの大量摂取を前提とするものであり、また抽出物等とコラーゲンとの相乗作用や増強作用のメカニズムについて生化学的、生理学的あるいは免疫学的根拠に基づく解明が何らなされていない。
【０００６】
そこで、本発明は従来の加齢変化に特徴的な新陳代謝機能の低下や免疫機能の低下に対する対応策の問題点を解決するためになされたものであり、コラーゲンを大量に摂取しなくとも生体内で高濃度に維持でき、コラーゲンとの相乗作用による、創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、（１）経口的に摂取されたコラーゲンに対する酵素学的分解抑制方法の検討（２）新生細胞群に対する活性酸素による破壊阻止方法の検討（３）免疫担当細胞群の標的部位への遊走を促進させることによる新生細胞群に対する不測の感染防御方法の検討などを主眼として、鋭意これらを十分に満足させる天然成分の探索を進めた。
【０００８】
すなわち、本発明者らは、コラーゲン分解酵素のコラゲナーゼ、繊維質エラスチンの分解酵素のエラスターゼあるいは中性脂肪分解酵素のリパーゼなどの酵素作用を阻止することが報告されている（Ｌａｔｉ，Ｅ．ＦｒａｇｒａｎｃｅＪ；２３；８１−８９，１９９５）セラミドに着目した。セラミドは、六単糖（特にガラクトース）とスフィンゴシンがエーテル結合し、さらに数種の脂肪酸とアミド結合した糖脂質を約５０％含有する脂質で小麦や米ぬかなどに含まれている。フランスを中心とした近郊欧州諸国では小麦由来のセラミドが化粧品や健康食品の素材として用いられているが、日本国内では化学的合成セラミドが主に化粧品の材料として用いられているにすぎず、天然セラミドを食品素材として経口摂取する利用法は殆ど行われていないのが現状であり、また経口摂取されたコラーゲンとの併用についての相互作用は十分に解明されていない。なお、セラミドのその他の生理作用としては、主に血圧上昇抑制剤（特開昭６０−１８３９５５号公報参照）、免疫機能活性化剤（特開平３−２１８４６６号公報参照）、癌細胞増殖抑制剤（特開平７−２５８１００号公報参照）等が挙げられる。
【０００９】
また、本発明者らは生体が感染した場合に特異性免疫系が作動するまでの繋ぎの生体防御機構として非特異性免疫系が作動するに際し多糖体が関与しているとのこれまでの報告に基づき、イソマルトオリゴ糖に着目した。イソマルトオリゴ糖はα−１，４を有するマルトースやマルトースオリゴマーとは異なるα−１，６からなる分子構造を有しており、糖分解酵素群（α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ等）の作用を受けない非発酵性である点に特徴があり、イソマルトース、パノース、イソマルトトリ・テトラオースなどを約４０％含有する熱安定性で吸収性に優れたイソオリゴ糖である。なお、イソマルトオリゴ糖は甘味性が砂糖（スクロース）の約５０％で、保湿性や吸湿性に優れているため食品の食感、品質面での食材として幅広く利用されている。
【００１０】
さらに、抗酸化作用を有するビタミンに着目し、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖の他脂溶性ビタミンを添加することを検討した。脂溶性ビタミンは、生体の成長と正常な機能維持に不可欠なビタミンで、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋがあり、さらにビタミンＤにはＤ２とＤ３がある。
【００１１】
本発明者らは、以上説明したセラミド、イソマルトオリゴ糖及び脂溶性ビタミンを組み合わせてコラーゲンに添加することによる効果を生化学的、生理学的及び免疫学的な見地から研究を重ねた結果、創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進効果、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の感染に対する抗菌効果を相乗的に発揮することに想到し本発明を完成した。  すなわち、本発明は、コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物、セラミド、イソマルトオリゴ糖及び脂溶性ビタミンからなる組成物を有効成分とする創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
コラーゲンは、種々の動物の皮膚、骨、血管、靱帯、腱等の種々の組織から得られるが、本発明では由来動物の種類の如何を問わず、また取得された組織の如何を問わず広く用いることができる。また、コラーゲンをアルカリ、酸、加圧により、あるいは酵素により加水分解することで得られるコラーゲンの加水分解物を用いることもでき、コラーゲンと併用することもできる。さらに、コラーゲンの熱変性物であるゼラチンを用いることもできる。
【００１３】
セラミドは、小麦、米ぬか、麹などに多量に含まれ、また動物細胞にも含まれている。  また、セラミドは化学的合成によっても製造される。本発明では天然物由来のセラミドを好適に用いることができ、天然物に由来する限りいずれに由来するセラミドをも用いることができる。なお、天然物由来セラミドは市販品を容易に入手することができる。
【００１４】
イソマルトオリゴ糖は、イモ、米、麦芽などのデンプンに特殊な糖転移酵素を作用させて製造され、市販品を容易に入手できる。
【００１５】
脂溶性ビタミンは、ビタミンＡ、Ｄ３及びＥを併用することが好ましく、ビタミンＡ、Ｄ３、Ｅは各々の単品を用いてもよいが、以下に述べるビタミンＭＶを用いることがさらに好ましい。すなわち、ビタミンＭＶとは３種の脂溶性ビタミンＡ、Ｄ３、Ｅを含む複合ビタミンで、特殊な可溶化液で粒子内に封入（粒径：平均０．０１μｍ）し、水に容易に溶解でき（可溶化油溶性ビタミン）、しかもドライ脂溶性ビタミン類よりも自然酸化に対する安定性に優れ、加熱滅菌や長期保存でもビタミン残有率に優れている。また、ビタミンＭＶはビタミンＡ、Ｄ３、Ｅを各々３０００ＩＵ／ｇ、２５０ＩＵ／ｇ、１３．５ｍｇ／ｇ含み、例えば、１日当たり０．６ｇのビタミンＭＶを摂取すれば、第５次日本人の栄養所要量（ビタミンＡ：１８００ＩＵ／日、ビタミンＤ３：１５０ＩＵ／日、ビタミンＥ：８ｍｇ／日）に十分に達することになる。そこで、以下の説明における脂溶性ビタミンはビタミンＭＶにより行うこととする。
【００１６】
コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及び脂溶性ビタミンを組み合わせた組成物を有効成分とする本発明の創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤の投与形態は、経口投与が一般的であるがこれに限定されない。また、剤型も用途に応じて適宜選択でき、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤、軟膏基剤などを用いて散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤、軟膏剤などの剤型とできる。さらに、本発明の創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤はそれらの薬効を失わない限り他の薬効を有する製剤（動植物由来を含む）を配合して医療用製剤として供することができる。例えば、本発明の創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤に他の抗菌剤、制癌剤あるいはサイトカイン類を配合したり、また、本発明の創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤に動物由来コンドロイチンを添加して皮膚のシミ・シワ形成予防・消去促進軟膏剤や化粧品として供することができる。また、植物性抗菌成分や抗生剤を添加した軟膏剤や湿布剤を床ずれ、皮膚炎、外傷治療剤として供することもできる。
【００１７】
本発明のコラーゲン、セラミド、イソマルトオリゴ糖及び脂溶性ビタミンからなる組成物における各成分の配合割合は、コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物１００重量部に対し、セラミド０．２〜０．６重量部、イソマルトオリゴ糖２０〜６０重量部、脂溶性ビタミン２〜６重量部が好ましく、コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物１００重量部に対し、セラミド０．３〜０．５重量部、イソマルトオリゴ糖３０〜５０重量部、ビタミンＭＶ３〜５重量部がさらに好ましい。各成分が下限を下回ればコラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物との十分な相乗性が得られないことがあり、また上限を上回れば抗原が飽和状態になりマクロファージが十分に機能しなくなる虞があるからである。コラーゲンは必須アミノ酸のトリプトファンを殆ど含んでいないため、過剰に摂取すると必須アミノ酸のバランスを崩す虞がある。そこで、このことを勘案した上、本発明が創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤として所期の効果を十分に発揮し得るためには、コラーゲン及び／又はコラーゲンの加水分解物の摂取量は１日当たり５〜１０ｇが好ましいが、もちろん適用される患者の病状や剤型などに応じ適宜増減でき、例えば熱傷患者であれば大用量を摂取させることができる。
【００１８】
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
参考例１（熱傷マウス創傷部位の作製法と熱傷創傷面積の測定法）
７週齢の正常ｄｄＹ系雌マウス（平均体重：３０ｇ）の腹腔内に、チオペンタールナトリウム麻酔剤（ラボナール、万有製薬社製）の０．１ｍｌ（２４ｍｇ／ｍｌ）を投与した後、電気バリカンにて背部の毛を剃り、電気ゴテ（２ｃｍ×３ｃｍ、１００Ｖ／１００Ｗ）を除毛表皮面に３秒間当て、熱傷創傷部位（６ｃｍ２、１０％／体表面積）を作製した。この熱創傷はヒトでの生存限界である３度熱傷に相当する。熱傷直後及び熱傷後７日毎、２８日間に亘り、麻酔下のマウス背部創傷面にセロファン紙を当てて、セロファン紙上に創傷面をマーカーでトレースした後、画像解析装置（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＯＰ−ＡＭ０３、コントロン社製、ドイツ）にて創傷面積を計測した。
【００２０】
実施例１（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡ菌）の熱傷創傷面における生菌数の推移と感染抵抗性増強作用）
ＭＲＳＡ菌感染実験系は、（１）非摂取対照群（純水摂取群）（２）コラーゲン（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｆａｂｒｉｋｅｎ社製）（以下、ＣＰＨと略すこと有り）単独摂取群（３）ＣＰＨ＋セラミド（日本油脂社製）（以下、ＳＧＬと略すこと有り）摂取群（４）ＣＰＨ＋イソマルトオリゴ糖（三重化糧社製）（以下、ＩＭＯと略すこと有り）摂取群（５）ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ビタミンＭＶ（日本油脂社製）（以下、ＦＳＭＶと略すこと有り）摂取群の計５群（各群３匹宛）を準備し、以下の実験的ＭＲＳＡ菌の感染実験を行った。マウスに摂取させる摂取量は、マウスにヒトでの熱傷生存限界度数である３度に相当する熱傷を付加させたことを考慮し、ヒトの体重当たりの摂取量の１０倍量にてＣＰＨ（３０ｍｇ／マウス／日）、ＳＧＬ（１０８μｇ／マウス／日）、ＩＭＯ（１０．８ｍｇ／マウス／日）及びＦＳＭＶ（１．０８ｍｇ／マウス／日）の各々を調合することとし、熱傷１日前から熱傷後２１日間（計２２日間）に亘って吸水瓶からの吸水（１０〜１５ｍｌ／マウス／日）により摂取させた。なお、この摂取量は以下の各実施例においても同様である。
【００２１】
熱傷２４時間後に熱傷創傷壊死表皮部分を剥離し、剥離した創傷面にＭＲＳＡ菌液０．１ｍｌ（１０８生菌単位＝ＣＦＵ／ｍｌ）を滅菌綿棒で塗布感染させた後、感染直後、７、１４、２１及び２８日目に滅菌生理食塩水を浸した綿棒にて感染創傷面を拭き取り、綿棒を０．５ｍｌの滅菌生理食塩水加試験管に移し、創傷面積当たりの還元生菌数（ＣＦＵ／ｃｍ２）をスタフィロコッカスＮｏ．１１０寒天培地にて定量した。
【００２２】
その結果、図１に示すように、ＣＰＨ単独摂取群におけるＭＲＳＡ菌感染創傷面からの還元生菌数（ＣＦＵ／ｃｍ２）の減少を非摂取対照群のそれと比較した場合、感染後７〜２８日間に亘って有意差（検定法：Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔ法）は全く認められなかった。これに対して、ＣＰＨ＋ＳＧＬあるいはＣＰＨ＋ＩＭＯの摂取群でのＭＲＳＡ菌の還元生菌数の減少推移は、非摂取対照群よりも良好であり、感染１４日目以降では有意差のある減少推移が認められた。また、１４日目におけるＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群の非摂取対照群に対する有意差（危険率１％以下）は、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群の有意差（危険率５％以下）よりも顕著であった。一方、ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群と非摂取対照群間におけるＭＲＳＡ菌の還元生菌数の有意差は、感染後７日目からみられ（危険率５％以下）、感染後２１日目における両者間の有意差は、極めて顕著であった（危険率０．１％以下）。以上の結果より、創傷面からのＭＲＳＡ菌排除促進効果を示さなかったコラーゲンに、セラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶを組み合わせて添加することにより、免疫強化によって熱傷皮下組織のＭＲＳＡ菌排除促進効果が促進され、特にコラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶの３種を添加する組成物では極めて顕著な相乗的作用を示すことが明らかとなった。
【００２３】
実施例２（ＭＲＳＡ菌感染創傷面の真皮層・皮下組織層内の浸潤細胞数と細胞分類）
実施例１に記載した感染実験系５群（非摂取対照群及び摂取４群）の感染７日目における創傷面の真皮層と皮下組織層間に１０％胎児牛血清添加イーグルＭＥＭ培養液（ヘパリン：４単位／ｍｌ）５ｍｌを注入し、背部を十分に揉みほぐした後、注入培養液を注射器で回収し、その１ｍｌをプラスチックマイクロプレート（６ウエル：直径３０ｍｍ）に移した。マイクロプレートを２時間保温後（３７℃、５％ＣＯ２下）、培養液を静かに除去し、メタノール固定、ギムザ染色後マイクロプレートのウエル上の浸潤細胞分類を顕微鏡下で算定した。
【００２４】
表１に示すように、非摂取対照群の浸潤総細胞数に比べて、摂取４群の浸潤総細胞数はいずれも高い有意性が観察され、中でもＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群と共に、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群における有意性（危険率０．１％以下）が極めて著しかったことから、イソマルトオリゴ糖による結合組織の再生への寄与が示唆された。なお、非摂取対照群に対するＣＰＨ単独摂取群の危険率は５％以下で、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群の危険率は１％以下であった。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
また、これら浸潤細胞の細胞分類を行ったところ、表２に示すように非摂取対照群ではリンパ系細胞の比率が最も高く（平均９０．５％）、マクロファージ等の網内系細胞は６．１％、上皮性及び繊維芽細胞群は３．４％にすぎなかった。これに対して、ＣＰＨ単独摂取群では網内系細胞（マクロファージ様）が約１０％に増加していたものの、全般的に非摂取対照群の細胞分類と大差がなかった。他方、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群における網内系細胞とリンパ系細胞の比率は、それぞれ約４６％、４９％を示し、これら細胞の著しい上昇がみられた。特に、マクロファージ様網内系細胞の増加は、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群のそれ（約２５％）よりも極めて顕著であった。これらの結果は、実施例１で得られたＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群の１４日目以降にみられた有意性のあるＭＲＳＡ菌排除促進作用の結果とよく一致していたことから、イソマルトオリゴ糖には免疫担当細胞群（マクロファージ等の網内系、リンパ球、ＮＫ細胞等のリンパ系、好中球等の顆粒球系細胞）の損傷部位や患部への遊走促進作用、ひいてはこれら細胞群に対する機能増強能（免疫強化能）を有することが示唆された。他方、ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群で観察されたこれら細胞の分類比率は、正常皮膚組織の有する自然的再生機構の第一次機転システムにみられる浸潤細胞群の比率に極めて近い値であったことから、熱傷によって損傷を受けた皮下組織の再生準備機構はコラーゲンの投与によって促進されると共に、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶを組み合わせて添加することにより、再生準備機構は相乗的に亢進されることが細胞学的実験結果から確認された。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例３（熱傷創傷面治癒実験系における熱傷創傷面積の縮小推移及び創傷面の治癒経過）
熱傷マウスにおける熱傷創傷面治癒実験系は、実施例１に記載したのと同様の５群のマウス（各群：１０匹）を準備し、熱傷直後、熱傷後７、１４、２１、及び２８日目の創傷面積を参考例１の方法で計測した。その結果、表３に示すように、熱傷直後の創傷面積は６．２３±０．３６ｃｍ２で電気ゴテの面積（６ｃｍ２）に近い創傷面が得られた。ＣＰＨ単独摂取群における７、１４、２１及び２８日目の創傷面積は各々平均５．９８、４．９３、２．５３及び０．７７ｃｍ２であり、日数と共に縮小し、非摂取対照群の７〜２８日目の平均創傷面積よりも低い値を示したものの、有意性は実験期間中全く認められなかった。これに対して、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群では熱傷後７日目（５．６１±０．４２ｃｍ２）に有意差（危険率５％以下）が認められ、ＣＰＨ ＋ＩＭＯ摂取群においても熱傷後１４日目（４．６９±０．６４ｃｍ２）に有意差（危険率５％以下）が認められた。一方、ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群における創傷面積の縮小推移は、他の摂取群よりも著しく、熱傷後７日目での創傷面積は５．０１±０．４５ｃｍ２（危険率１％以下）であり、１４日目ですでに高い有意性（危険率０．１％以下）のある創傷面の縮小（２．４３±０．８４ｃｍ２）がみられた。なお、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群の上記以外の有意差における危険率は、１４日で１％以下、２１日で０．１％以下であり、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群では、２１日で５％以下、２８日で１％以下であった。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
これらの結果から、コラーゲンにコラゲナーゼやエラスターゼ等の酵素活性阻止作用を有するセラミドを添加したことによって、生体内に摂取されたコラーゲンの酵素的分解が抑制され、さらには免疫担当細胞群の熱傷創傷面皮下組織への浸潤を促進させたイソマルトオリゴ糖の添加、あるいは活性酸素消去作用を有するビタミンＭＶの添加により熱傷創傷面の治癒促進が極めて効率良く、かつ速やかに行われたものと考えられる。
【００３１】
実施例４（創傷皮下組織の病理組織学的検討）
上記実施例３で述べた推論を立証するために、以下の検討を行った。実施例３に記載した５群の実験中、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群を除く４群の１４日目における平均創傷面積値に最も近いマウス創傷面の皮膚組織を切除し、常法に準じて処理した。すなわち、脱水（アルコールシリーズ）、固定（１％グルタルアルデヒド、１％パラホルムアルデヒド）、パラフィン包理した後、組織切片を作製した。さらに、スライドグラスに標簿切片を付着・固定させた後、結合組織繊維を特異的に染め分けられるエラスチカ  ファンギーソン染色液にて染色し、皮下組織内の結合組織（膠原繊維、弾力繊維、その他エラスチン等の繊維質）の再生・形成の程度を顕微鏡下で観察した。
【００３２】
その結果は図２に示す通りで、熱傷直後の皮下組織切片を結合組織の状態、存在部位及び質量についての顕微鏡的観察が可能なエラスチカ  ファンギーソン染色液で染色したところ、桃紅色に染色されている層は全くみられず、組織そのもが壊死状態に陥っており、ヒトの３度の熱傷に相当する熱傷の影響が真皮層のみならず皮下組織層にまで達していた。これに対して、熱傷１４日目における非摂取対照群の皮下組織切片像では、繊維芽細胞や上皮性（円形）細胞の真皮層内への浸潤が著しく、桃紅色に染まった膠原繊維、弾力繊維も僅かではあるが認められたが、表皮層再生の進展は殆どみられなかった。熱傷１４日目のＣＰＨ単独摂取群では、皮下組織層の桃紅色に染色された結合組織繊維分は極めて少量であるものの、非摂取対照群の皮下組織層の染色性よりも僅かながら優れており、表皮層の再生も順調であるものの、なお繊維芽細胞や上皮性細胞の浸潤は皮下組織全体に認められ、皮下組織再生の初期段階であることが観察された。これに対して、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群での皮下組織切片を観察したところ、表皮層の再生はほぼ完了しており、鮮やかな桃紅色に染色された染色部位は表皮層から皮下組織層に全体的にみられ、繊維芽細胞や上皮性細胞も僅かであったが、染色された皮下組織層は網目状が目立っており、皮下組織の完全な再生には至っていなかった。一方、ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群での皮下組織像を観察したところ、真皮層と皮下組織層の前面が濃桃紅色に染色されており、しかも染色された膠原繊維の緻密性は、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群のそれよりも顕著であった。以上のことから、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶを組み合わせて添加することにより結合組織の再生、ひいては生体組織の新陳代謝が相乗的に促進されることが病理組織学的にも明らかになった。
【００３３】
実施例５（熱傷創傷面の完全治癒マウス百分率の推移）
実施例３に記載した５群の熱傷後２１及び２８日目におけるマウスの創傷面が完全に治癒した匹数から、完全治癒マウス百分率の推移を調べた。その結果、表４に示すように、ＣＰＨ単独摂取群での熱傷創傷面の完全治癒は熱傷後（摂取後）２８日目にみられたものの、僅かに１０％にすぎなかった。これに対して、ＣＰＨ＋ＩＭＯ摂取群、ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群及びＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群の２１日目における創傷面完全治癒率は、各々２０％、４０％及び６０％であり、実施例３と実施例４の実験結果と極めて一致した傾向がみられた。また、２８日目のＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群あるいはＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群における完全治癒率は、５０％及び７０％にまで達した。この実験系からも、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶを組み合わせて添加することにより結合組織の再生が確実かつ迅速に行われ、生体組織の新陳代謝が相乗的に促進されることが明らかとなった。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
実施例６（ヒト由来正常皮膚上皮細胞・皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用）
表皮層、真皮層及び皮下組織内の主要細胞である上皮性細胞や繊維芽細胞の分裂と増殖を亢進させることは、シミ、シワあるいは老化細胞等に対する皮膚・皮下組織の新陳代謝の促進や細胞の再生・新生の亢進につながることは容易に考えられる。そこで、以下の実験系によりヒト由来正常皮膚上皮細胞・皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用について検討した。
【００３６】
１０％胎児牛血清（以下、ＦＢＳと略すこと有り）添加イーグルＭＥＭ培養液にヒト由来正常皮膚上皮細胞（ＮＣＴＣ２５４４株）及びヒト由来正常皮膚繊維芽細胞（ＣＲＬ−２０９０株）の１×１０４コ／ｍｌを浮遊させ、これら細胞浮遊液の各２ｍｌをプラスチックマイクロプレート（６ウエル：３０ｍｍ）に移した後、２時間保温（３７℃、５％ＣＯ２下）した。保温後、ウエル内をリン酸生食緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ミリポアーフイルターにより滅菌済の（１）ＣＰＨ（２５０μｇ／ｍｌ）単独添加（ＦＢＳ無添加）イーグルＭＥＭ液（２）ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ（ＣＰＨ：２５０μｇ／ｍｌ、ＳＧＬ：０．９μｇ／ｍｌ、ＩＭＯ：９０μｇ／ｍｌ、ＦＳＭＶ：９μｇ／ｍｌ）添加イーグルＭＥＭ液（ＦＢＳ無添加）（３）５％ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭ液（実験対照群）の各４ｍｌを各々ウエルに加え、３７℃（５％ＣＯ２下）で１４日間培養した。培養直後、培養後３、７、１０及び１４日目に（１）、（２）の実験群及び（３）の実験対照群のウエル上の培養細胞を０．２％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム液で剥離し、ウエル当たりの細胞数を顕微鏡下で計測した。また、ウエル上の７日間培養細胞をメタノール固定、ギムザ染色した後、培養細胞の増殖状態と細胞形態を顕微鏡下で観察した。
【００３７】
その結果、図３に示すように実験対照群における上皮細胞及び繊維芽細胞の増殖推移は、いずれも培養後３日目からみられ、培養後７日目にほぼ最高閾値に達した。これに対して、ＣＰＨ単独添加イーグルＭＥＭ液での上皮細胞の増殖は、培養１４日間を通して殆どみられず、繊維芽細胞で培養７〜１０日目に僅かな増殖がみられたにすぎなかった。一方、ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ添加イーグルＭＥＭ液での上皮細胞と繊維芽細胞の増殖の程度は実験対象群でのそれよりも多少とも劣るものの、細胞増殖の推移パターンは殆ど同様であった。このように、コラーゲンのみを水溶性ビタミン類、アミノ酸類、ブドウ糖及び数種のトリカルボン酸を含むイーグルＥＭＥ液に加えた場合には、上皮細胞や繊維芽細胞の崩壊や壊死こそみられなかったものの、これら細胞の分裂・増殖過程にまで至らすことは不可能であった。この結果から、コラーゲンそのものは複数の増殖因子を多量に含有している胎児牛血清の代用にはならないこと、そしてコラーゲンはこれら細胞に対して、単なる蛋白源あるいは細胞形態維持等の機能のみ有することが示された。これに対して、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶをイーグルＭＥＭ液に添加することによって、培養細胞の増殖は胎児牛血清添加イーグルＭＥＭ液での増殖とほぼ同様の結果が得られたことから、
（ａ）セラミドは全ての生体細胞の細胞膜上に存在する増殖因子受容体（成分：ホスファチジルイノシトールリン脂質）に何らかの作用、例えば拮抗的受容体成分として作用し、コラーゲンの細胞への働きを何らかの形で促進させる、
（ｂ）細胞増殖因子の多くは糖蛋白であることから、イソマルトオリゴ糖とコラーゲン間で増殖因子的構造成分として細胞膜受容体に作用する、
（ｃ）脂溶性ビタミン類が含まれていないイーグルＭＥＭ液にビタミンＭＶを加えることにより、細胞増殖機構に何らかの影響を及ぼす、
ことが推測された。
【００３８】
実施例７（毒性試験・抗原性試験）
ｄｄＹ系雌及び雄マウス（５週齢）を１群５匹宛準備し、コラーゲンにセラミド、イソマルトオリゴ糖及びビタミンＭＶを添加した製剤（２倍段階希釈）の経口投与、皮下投与及び腹腔内投与によりマウスの死亡数を５日間に亘り記録し、これら投与法における製剤のＬＤ５０値をベーレンス・カーバー法に従って求めた。経口投与及び皮下投与によるＬＤ５０値は雌雄共に同じ値を示し、４２００ｍｇ／ｋｇ以上及び６７００ｍｇ／ｋｇ以上であった。一方、腹腔内投与によるＬＤ５０値は、経口投与あるいは皮下投与のそれらよりも４〜６倍も低い値を示し、雌に対しては１１８０ｍｇ／ｋｇ、雄に対しては１０４２ｍｇ／ｋｇであった。
【００３９】
ｄｄＹ系雌マウス（５週齢）を１群３匹宛準備し、マウス１匹当たり、上記製剤１００ｍｇ／マウス（約３３３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に１回接種した後、１４日目に血液を眼球摘出によって採取分離し、血清中の製剤（抗原）に対する抗体産生の有無について、沈降凝集包（抗原抗体反応）にて調べた結果、沈降線と抗原抗体反応凝集像は、寒天ゲル、ゼラチンゲル層のいずれにおいても認められず、抗体の産生は陰性であった。
【００４０】
実施例９（軟膏剤）
コラーゲン                １２ｇ
セラミド                  ６０ｍｇ
イソマルトオリゴ糖      ４．５ｇ
ビタミンＭＶ            ５００ｍｇ
に適量の白色ワセリンを加えて全量１００ｇの創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進軟膏剤を製した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の創傷の皮膚繊維芽細胞遊走・増殖促進剤によれば、摂取されたコラーゲンは生体内で高濃度を維持すると共に、コラーゲン、セラミド、イソマルトオリゴ糖及び脂溶性ビタミンが相乗的に作用して、創傷の皮膚繊維芽細胞の遊走・増殖を促進できるので、創傷の早期で確実な治癒が可能となる。また、本発明のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に作用する抗菌剤によれば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の感染に対する抗菌効果があるので、抗生物質による治療の補助療法としての有用性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の熱傷創傷面における生菌数の推移及び感染抵抗性増強作用を示すグラフである。
●印実験系の危険率（７日目：５％以下、１４日目：１％以下、２１日、２８日：０．１％以下の有意差あり）
△印実験系の危険率（１４日、２１日目：５％以下、２８日目１％以下の有意差あり）
▲印実験系の危険率（１４日、２１日目：１％以下、２８日目：０．１％以下の有意差あり）
◆印実験系の危険率（７〜２８日目：有意差なし）
【図２】創傷皮下組織の切片像を示す。
１：非摂取対照群
２：ＣＰＨ単独摂取群
３：ＣＰＨ＋ＳＧＬ摂取群
４：ＣＰＨ＋ＳＧＬ＋ＩＭＯ＋ＦＳＭＶ摂取群
【図３】ヒト由来正常皮膚上皮細胞及び皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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