(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有することを特徴とする、低血糖症およびグリコーゲン病から選ばれる疾患の予防および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はインスリン様作用に起因する疾患の予防および／または治療剤に関し、詳細には肝実質細胞増殖因子（以下、これを「ＨＧＦ」と略称することがある）を有効成分とする低血糖症、グリコーゲン病等のインスリン様作用に起因する疾患の予防および／または治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
血糖に影響を与えるホルモンとしては種々のものが知られているが、そのうち最も重要なものはインスリンである。インスリンは、ブドウ糖の取り込み促進、グリコーゲン合成酵素の活性化、解糖系律速酵素の誘導および活性化などを通して血糖を低下させ、グリコーゲン蓄積の方向に働く。この作用を利用して、インスリンはＩ型糖尿病患者の治療に使用されているが、インスリン治療中の糖尿病患者では過剰注射や食事摂取不十分などによりしばしば低血糖が発現することが知られている。
【０００３】
このような低血糖症に対しては、通常ブドウ糖投与により低血糖症状が回復することが知られているが、経口血糖降下薬により惹起された低血糖症の場合は、血糖値の回復や症状の回復が困難な場合がある。このような場合はグルカゴンの投与が行われているが、グルカゴンを膵臓からの抽出によって得る場合は、得られるグルカゴンに限りがあり、化学合成によって得る場合は、グルカゴンはアミノ酸２９個からなる長いペプチドであり合成する時間、費用等がかかり経済的ではない。また、インスリノーマや下垂体機能低下症などではその原因に対する根本的な治療が必要となり、あらたな薬剤が望まれていた。
【０００４】
一方、ＨＧＦは、初代培養肝実質細胞の増殖を促進させうるヒト由来の蛋白性因子として、劇症肝炎患者血漿より見い出された（特開昭63-22526号公報；以下、ヒト由来の肝実質細胞増殖因子を「ｈＨＧＦ」と略称することがある）。その後、ｈＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコ−ドする遺伝子（ｃＤＮＡ）（特開平3-72883 号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いた組換えｈＨＧＦ蛋白質（以下、「ｒｈＨＧＦ」と略称することがある）の生産方法および形質転換体（特開平3-285693号公報）が報告されている。
【０００５】
ｒｈＨＧＦ蛋白質は、生体外（J. Clin. Invest.，87，1853-1857 (1991)）、また生体内（Jpn. J. Pharmacol.，59(suppl. 1)，137 (1992)）において肝実質細胞の増殖及び機能を促進する働きが認められた。さらに、ＨＧＦの標的細胞、組織が広く検索され、肝細胞以外の種々の上皮細胞（尿細管上皮、肺上皮、胆管上皮、胃上皮）や線維芽細胞、リンパ球系細胞がＨＧＦに反応してその増殖や運動性を変化させることが判明した（Mitsubishi Kasei R & D Review，7，16-24 (1993)）。また、これらＨＧＦ標的細胞上のレセプター分子として、癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物が機能していることが明らかとなった（Science, 251, 802-804 (1991)）。しかし、これまでＨＧＦと低血糖等のインスリン様作用に起因する疾患との関連性について、本発明者らの知る限り、報告された例はない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＨＧＦの糖・グリコーゲン代謝との関連性について探索、検討を進めてきた結果、ＨＧＦが、インスリンによるグリコーゲン合成の阻害作用を有しており、インスリン様作用に起因する疾患に対する優れた予防および／または治療剤になり得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成分として含有することを特徴とするインスリン作用に起因する疾患の予防および／または治療剤である。
【０００８】
更に、本発明の好ましい態様によれば、肝実質細胞増殖因子が以下の理化学的性質
1)  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンである、
2)  肝実質細胞を増殖させる活性を有する、
3)  ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、
4)  トリプシンによる消化処理またはキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、および
5)  ヘパリンに対して強い親和性を有する
を有する蛋白性因子である上記予防および／または治療剤；肝実質細胞増殖因子がヒト由来の肝実質細胞増殖因子である上記予防および／または治療剤；肝実質細胞増殖因子がｃＤＮＡを用いた組換え肝実質細胞増殖因子である上記予防および／または治療剤；組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列で表される肝実質細胞増殖因子である上記予防および／または治療剤；組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細胞増殖因子である上記予防および／または治療剤；組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細胞増殖因子である上記予防および／または治療剤；インスリン様作用に起因する疾患が低血糖症およびグリコーゲン病から選ばれる疾患である上記予防および／または治療剤；インスリン様作用が、グリコーゲン合成作用である上記予防および／または治療剤が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明の予防および／または治療剤は、ＨＧＦを有効成分として含有する。かかるＨＧＦは、ＨＧＦを含有することの知られているヒトやラット等のほ乳動物由来の体液や組織、または自発的にＨＧＦを産生する細胞から天然のＨＧＦを単離してもよいし、あるいは遺伝子組換え法により該増殖因子ｃＤＮＡを細胞に導入して得られる組換えＨＧＦを用いてもよい。組換えＨＧＦを産生させる宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
【００１０】
具体例には、上記ほ乳動物由来の胎盤、肝障害患者肝組織及び血液、MRC-5 細胞、IMR-9 細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平3-285693号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株などから得られたものが該当する。また、これらＨＧＦにおいては、その前駆体蛋白質や、肝実質細胞を増殖させるという活性を損なわない範囲において一部のアミノ酸を置換、欠失、挿入、修飾するなどの改変を行ったものを用いてもよい。かかる改変体としては、特開平2-288899号公報、WO90/10651号公報、特開平3-130091号公報、同3-255096号公報、同4-30000号公報、Nature, 342, 440-443(1989)等に記載のものが挙げられる。
【００１１】
本発明においては、ＨＧＦが、特開昭63-22526号公報および米国特許第5,004,805号公報に記載されている、以下の理化学的性質を有する蛋白性因子であることが好ましい。
1)  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンである、
2)  肝実質細胞を増殖させる活性を有する、
3)  ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、
4)  トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、および
5)  ヘパリンに対して強い親和性を有する
また、かかるＨＧＦはヒト由来のものであることが好ましく、特に好ましいものとしては、特開平3-72883号公報、特開平4-89499号公報およびヨーロッパ公開特許第0412557号公報に記載の、後記配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列で表されるもの、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表されるもの、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されるものを挙げることができる。
【００１２】
本発明において、上記ＨＧＦは、下記実施例で示すように、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、成長ホルモン等によるグリコーゲン合成を阻害する。従って、前述の低血糖症の他、生体組織にグリコーゲンの異常蓄積を招く疾患であるグリコーゲン病等の予防および／または治療剤として有効である。
【００１３】
本発明の予防および／または治療剤は、前記ＨＧＦを単独もしくは適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤形態（剤型）に調合され、使用される。剤型としては、一般に非経口的投与に適する剤型が、好ましくは、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤（バイアル）が使用に供される。各種剤型への調製は、この技術分野で慣用される通常の手法を用いて行われる。製剤化に使用される製剤担体としては、各種剤型への調製に慣用される希釈剤や添加剤などが用いられる。
【００１４】
例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記ＨＧＦの有効量を、例えば蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどの賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミンなどの安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノールなどの保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤などを加え、常法に従い凍結乾燥することにより調製される。また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦの有効量を、例えば蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マンニトールなどの溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリンなどの緩衝剤、ブドウ糖、添加糖などの等張化剤、上記安定化剤、上記保存剤、上記無痛化剤、上記ｐＨ調節剤などの添加剤を加え、これを通常の加熱滅菌、無菌濾過などにより無菌化して調製される。上記添加剤の配合量は、各種の製剤形態に応じて適宜決定される。
【００１５】
また、本発明の予防および／または治療剤は、特開平5-301824号公報に記載のように、ＨＧＦをヘパリン、デキストラン硫酸等の硫酸化多糖類もしくはその誘導体と併用することにより、その活性を増強することができ、また安定化することができる。
【００１６】
本発明の薬剤は、これを必要とする患者に対して非経口的に、一般には皮下、筋肉または静脈内注射により、その所定量を単回、もしくは複数回に分けて投与するか、または連続的に投与する。かかる投与量は、患者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整されるが、有効ＨＧＦ量として、１日当たり１μg/kg〜10 mg/kg、より好ましくは10〜1000μg/kgの範囲で投与される。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の予防および／または治療剤は、低血糖症、グリコーゲン病等のインスリン様作用に起因する疾患に対する予防および／または治療剤として有用である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なおＨＧＦは、特開平3-285693号公報に記載されているBD-24株等を用いて、該公報に記載されている方法に従って製造された組換えｈＨＧＦを使用した。
【００１９】
実施例１
ウィスター系雄性ラット（体重220-250g）を用い、セグレンらの方法（P.O. Seglen, Methods in Cell Biology 13, 29(1976)）により、肝細胞を単離し、ウイリアムメディウムに５．５ｘ１０-6個／ｍｌの濃度で４８時間培養したものに、ＨＧＦを添加し、時間経過による肝細胞数当たりのグリコーゲン量を測定した。グリコーゲンの定量は、アンスロン法を用いて行った。
【００２０】
その結果、コントロール群（１０-8Ｍインスリン＋１６ｍＭグルコース）では、時間の経過とともにグリコーゲン量が増加し、８〜１２時間後には開始時の約１．５〜２倍となった。ＨＧＦ投与群（ＨＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ＋１０-8Ｍインスリン＋１６ｍＭグルコース）では、全経過を通じてグリコーゲンの増加は強く阻害された（図１参照）。
【００２１】
また、ＨＧＦ投与群では、ＨＧＦの濃度を０．２ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの種々の濃度で添加し８時間培養した時点でのグリコーゲン量に及ぼすＨＧＦの効果を調べたところ、ＨＧＦは濃度依存性にグリコーゲン蓄積を阻害し、２０〜３０ｎｇ／ｍｌで最大効果を示した（図２及び図３参照）。
【００２２】
なお、培地中よりインスリンを除去した系で上記と同様の実験を行ったところ、コントロール群のグリコーゲン量は時間とともに徐々に減少を示し、ＨＧＦ投与群ではこのコントロール群の作用と何等の差も認められなかった。コントロール群（１６ｍＭグルコース）では、１２時間後、グリコーゲン量が１９７．３２±１４．０３μｇグルコース／１０6個細胞となり、ＨＧＦ投与群（ＨＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ＋１６ｍＭグルコース）では、１２時間後、１９５．７０±６．０５μｇグルコース／１０6個細胞となり、コントロール群とＨＧＦ投与群でグリコーゲン量はほぼ同等であった。
【００２３】
上記の結果より、ＨＧＦはインスリンによるグリコーゲン合成の阻害作用を有しており、低血糖症、グリコーゲン病等のインスリン様作用に起因する疾患に対する予防および／または治療剤になり得るといえる。
【００２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】肝細胞のグリコーゲン蓄積に及ぼすＨＧＦの効果を示す図である。縦軸は肝細胞１０6個当たりのグリコーゲン量を示し、横軸は時間を示す。
【図２】肝細胞のグリコーゲン蓄積に及ぼすＨＧＦの効果を示す図である。縦軸は肝細胞１０6個当たりのグリコーゲン量を示す。
【図３】肝細胞のグリコーゲン蓄積に及ぼすＨＧＦの効果を示す図である。縦軸は肝細胞１０6個当たりのグリコーゲン量を示し、横軸はＨＧＦ濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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