(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の目標微生物有機体検体を含有すると推測される物質の試料中の該検体を生体のまま視覚的に又は光分析によって検出するのに使用される組立て品（assembly）であって、
（ａ）試料容器；
（ｂ）該試料容器に入っている増殖支持性培地(growth supporting medium)であって、該培地は、該検体が該培地中で目標検体コロニーを形成することができるように該検体の代謝増殖を支持するように作動し、且つ、該培地は、該培地中に形成する該目標検体コロニーの培地内移動を制限する培地である；及び
（ｃ）該培地の全体に渡って均一に分散した１種以上の標識目標検体−特異物質（ＬＡＳＭ（ｓ））であって、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、目標検体コロニーに示差的にハイライトを与えるように、該培地内で、該培地の中又はその上に形成する該目標検体コロニーの方向に移動することができ、且つ、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、該検体の中又はその上の結合部位に特異的である結合要素を含む；
を含む、組立て品。
【請求項２】
該培地は、その中又はその表面上で、目標微生物有機体検体のコロニー形成を促進するが、非目標微生物有機体検体の代謝的コロニー形成は阻害する培地である、請求項１記載の組立て品。
【請求項３】
該検体が大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７を含み；該ＬＡＳＭ（ｓ）が、検出可能な標識と結合した、大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７−特異抗体を含み；該培地が、ミュラー・ヒントン寒天カービー・バウエル培地、及びマッコンキーのソルビタール培地から成る群から選ばれる増殖支持性培地である、請求項１記載の組立て品。
【請求項４】
該標識が、発蛍光団、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、及びＣｙ−７から成る群から選ばれる標識である、請求項３記載の組立て品。
【請求項５】
該標識がスルホローダミン(sulforhodamine)である、請求項４記載の組立て品。
【請求項６】
該標識がフルオレセインである、請求項４記載の組立て品。
【請求項７】
該検体がリステリア菌を含み；該ＬＡＳＭ（ｓ）が、検出可能な標識と結合したリステリア菌−特異抗体を含み；且つ、該培地が、エスクリンを主成分とするグラム陽性選択寒天培地である、請求項１記載の組立て品。
【請求項８】
該標識が発蛍光団である、請求項７記載の組立て品。
【請求項９】
該発蛍光団がスルホローダミンである、請求項８記載の組立て品。
【請求項１０】
該発蛍光団がフルオレセインである、請求項８記載の組立て品。
【請求項１１】
該検体がチフス菌を含み；該ＬＡＳＭ（ｓ）が、検出可能な標識と結合した、チフス菌−特異抗体を含み；且つ、該培地が、ビスマスサルファイト寒天培地、及びヘクトエンエンテリック寒天培地から成る群から選ばれる寒天培地である、請求項１記載の組立て品。
【請求項１２】
該標識が発蛍光団である、請求項１１記載の組立て品。
【請求項１３】
該発蛍光団がスルホローダミンである、請求項１２記載の組立て品。
【請求項１４】
該発蛍光団がフルオレセインである、請求項１２記載の組立て品。
【請求項１５】
該検体がカンジダ・アルビカンスを含み；該ＬＡＳＭ（ｓ）が、検出可能な標識と結合したカンジダ・アルビカンス−特異抗体又はレクチンを含み；且つ、該培地が、ミュラー・ヒントン寒天カービー・バウエル培地である、請求項１記載の組立て品。
【請求項１６】
該標識が発蛍光団である、請求項１５記載の組立て品。
【請求項１７】
該発蛍光団がスルホローダミンである、請求項１６記載の組立て品。
【請求項１８】
該発蛍光団がフルオレセインである、請求項１６記載の組立て品。
【請求項１９】
１種以上の目標微生物有機体検体を含有すると推測される物質の試料中の該検体を生体のまま光分析によって検出するのに使用される組立て品（assembly）であって、
（ａ）試料容器；
（ｂ）該試料容器に入っている増殖支持性培地(growth supporting medium)であって、該培地は、該検体が該培地中で目標検体コロニーを形成することができるように該検体の代謝増殖を支持するように作動し、且つ、該培地は、該培地中に形成する該目標検体コロニーの培地内移動を制限する培地である；及び
（ｃ）該培地の全体に渡って均一に分散した１種以上の標識目標検体−特異物質（ＬＡＳＭ（ｓ））であって、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、目標検体コロニーに示差的にハイライトを与えるように、該培地内で、該培地の中又はその上に形成する該検体コロニーの方向に移動することができ、且つ、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、該検体の中又はその上の結合部位に特異的である結合要素を含む；
を含む、組立て品。
【請求項２０】
該培地は、その中又はその表面上で、目標微生物有機体検体のコロニー形成を促進するが、非目標微生物有機体検体の代謝的コロニー形成は阻害する培地である、請求項１９記載の組立て品。
【請求項２１】
該ＬＡＳＭ（ｓ）が、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、及びＣｙ−７から成る群から選ばれる、光分析によって検出可能な標識を含む、請求項１９記載の組立て品。
【請求項２２】
１種以上の目標微生物有機体検体を含有すると推測される物質の試料中の該検体を生体のまま光分析によって検出するための方法であって、
（ａ）試料容器を与える段階と；
（ｂ）該試料容器に入っている増殖支持性培地(growth supporting medium)を与える段階であって、該培地は、該検体が該培地中で目標検体コロニーを形成することができるように該検体の代謝増殖を支持するように作動し、且つ、該培地は、該培地中に形成する該目標検体コロニーの培地内移動を制限する培地である；
（ｃ）該培地の全体に渡って均一に分散した１種以上の標識検体−特異物質（ＬＡＳＭ（ｓ））を与える段階であって、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、光分析によって検出可能であり、及び、該培地内で、該培地の中又はその上に形成する該検体コロニーの方向に移動することができ、且つ、該ＬＡＳＭ（ｓ）は、該検体の中又はその上の結合部位に特異的である結合要素を含む；
（ｄ）分析されている物質を、該培地の上又はその中に接種する段階と、
（ｅ）該接種済み培地を光分析によって走査して、明るく標識された目標検体コロニーが存在するか否かを調べる段階と；
を含む、方法。
【請求項２３】
該培地は、その中又はその表面上で、目標微生物有機体検体のコロニー形成を促進するが、非目標微生物有機体検体のコロニー形成は阻害する培地である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該ＬＡＳＭ（ｓ）が、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、及びＣｙ−７から成る群から選ばれる、光分析によって検出可能な標識を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
該明るく標識された目標検体コロニーが、該培地中で、かすかに標識された光輪によって囲まれている、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
該培地の同一面積から逐次読取りを行って、局部ＬＡＳＭ濃度であって、その変化が目標検体の増殖に関連する該濃度の変化を検出する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質試料中に１種以上の微生物目標検体が存在するか否かを、視覚的に又は光分析によって検出し；次いで、物質試料中に存在することが分かったとき、該１種以上の目標検体を数え上げるための方法及び装置に関する。分析される物質は、生体物質；環境物質(environmental material)；食料品物質；又は１種以上の目標検体の住み処となり得る他の物質；である場合がある。（単数又は複数の）目標検体は、検査される物質中に見出されるかも知れない、微生物、バクテリア、菌類、マイコプラズマ、原生動物等の１種以上の特殊な生体である。１種以上の目標検体が存在するか否かは、適切な増殖培地中に１種以上の目標検体の代謝生殖(metabolic reproduction)を生じさせることによって決定される。それら分析は、ゲル又は半固体の増殖物質であって、１種以上の目標検体の選択増殖(selective growth)を助けるが、試料中に存在するかも知れない他の生存可能有機体の増殖を制限する上記増殖物質の中で行うことができる。このようなやり方で、増殖培地中に、検出可能な目標検体のコロニー(colonies; 細胞集落)が形成される。それらコロニーは、１種以上の目標検体のある部分と選択的に結合し、視覚的に又は光分析により検出可能な物質を伴う種々の技術によって検出し、数え上げることができる。
【０００２】
【従来の技術】
滅菌した増殖培地に試料を置いて、目標バクテリアと、菌類、原生動物等の他の生存可能有機体とが存在するか否かを調べるために試料を分析することは、周知である。種々のバクテリアは通常、それらの外観によって；増殖培地或いは他の培地とそれらバクテリアの化学反応によって；又は酵素反応物若しくは免疫反応物を適用することによって；識別される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
異種のバクテリアコロニーは同じように見えるので、正しい同定を確立することができる前には、通常、多数のコロニーについて多数の試験を行う必要がある。このことは、バクテリアの亜種(sub-species)を同定する必要がある場合、例えば、外見上同じであるが他種の大腸菌コロニーとの混合物の中に、大腸菌抗原型Ｏ−１５７：Ｈ７のコロニーの位置を見出す必要がある場合、特に問題となる。そのような諸有機体の位置を迅速に視覚的に決定するのに役立つ特殊な諸特性を有する増殖培地が存在するものの、目標有機体がそのバックグラウンド(background)に一層深く関与すればするほど、化学的試験のみでそれら目標有機体を同定することは一層困難である。そのようなコロニーの位置を迅速に且つ特異的に決定することができれば、とりわけ、いかなる追加の操作も技術者に必要でないならば、それは非常に望ましいことである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料中に１種以上の目標微生物検体が存在するか否かを検出するための方法及び装置に関する。目標検体の検出は、栄養培地中に目標検体を増殖させてその培地中に目標検体のコロニーを形成し、次いで、結果としての、その培地中に形成し得るあらゆる目標検体のコロニーを検出し、次いで、数え上げることによって行う。
【０００５】
１種以上の標識検体−特異物質（ＬＡＳＭ（ｓ））を含有するか又はＬＡＳＭ（ｓ）と結合する培地で分析を行う。ＬＡＳＭ（ｓ）は、培地全体に渡って均一に分布している。ＬＡＳＭ（ｓ）には、結合性要素が含まれている。結合性要素は、目標検体の中若しくはその上で結合部位に特異であるヌクレオチド配列、タンパク質、又はレクチンであることがある。標識は、結合性要素に付着する、コロイド若しくは粒子を含有する色素又は発蛍光団であることがある。培地中のＬＡＳＭ（ｓ）は、拡散し、その培地を通って目標検体コロニーまで移動することが可能であり、そして、諸コロニー中の個々の有機体(organisms)に結合し、それによって、培地の残部に対応し、それら諸コロニーに示差的にハイライトを与える。ＬＡＳＭ（ｓ）は、そのように結合しているＬＡＳＭが、容易に感知できる程にはそのサイトから移動し離れない限り、有機体の表面か又は有機体の生成物［例えば、有機体のカプセル材、又は分子内構造］に直接結合する。ＬＡＳＭ（ｓ）の結合によって、諸目標検体コロニーにより占められる培地領域中のＬＡＳＭ濃度(concentration)は使い果たされるので、一層低いＬＡＳＭ濃度の「光輪(halo)」が、各目標検体コロニーの周りに形成され、そして、標識コロニーに対応する高強度のピークが、各光輪の中央に存在する。培地中に存在する非目標有機体はいかなるものであってもＬＡＳＭ（ｓ）と結合せず、この特性を示す。
【０００６】
分析すべき物質の試料を培地の中に接種するか、又は培地の上に分配する。もし、定量分析が望まれる場合は、試料の接種材料の量の容積を測定する。それら諸有機体が増殖するにつれて、コロニーが形成し、次いで、培地の中又はその上の固定位置に残存する。培地内のＬＡＳＭ（ｓ）は、培地の中に又は培地を通過して移動し得るように、所定の大きさに造る。従って、目標検体コロニーの領域内にあるＬＡＳＭ（ｓ）は、培地を通過して自由に移動し、コロニー中の目標有機体、又はそれら目標有機体の生成物に結合する。これによって、目標有機体コロニーは、培地中の周囲領域よりも一層大きい標識信号を示す。これの理由は、それら目標有機体コロニーがＬＡＳＭに富むこととなり、周囲領域のＬＡＳＭが使い果たされることになることである。目標有機体コロニーに隣接する、培地に密着した周囲領域は、弱標識信号を発する傾向にある。最終的には、培地中で、「薄暗い(dim; かすかな)」光輪によって囲まれた「明るい(bright)」地点が形成される結果となる。試料中に目標検体が全く存在しない場合、培地は、比較的均一なレベルで標識信号を発し続けて、均一に「着色されている(colored)」ように見える。
【０００７】
分析は、１９９９年２月２３日に出願された共同係属出願ＵＳＳＮ０９／２５５，６７３号明細書に記述されるような、高感度オプトメカニカル読取り装置(sensitive opto-mechanical photometric reader)を使用する場合、培地に試料を接種した後、１〜２時間以内で完了させることができ；或いは、目視検査を採用する場合、約１８時間以内で完了させることができる。培地の中に接種した、又は培地の上に広げた試料の容積が分かるので、培地中でハイライトされたコロニーの数を数え上げることによって、検体試料の単位容積当りの、目標検体の量を定量することができる。これによって、本発明を使用して、目標検体を定量分析することが可能となる。ＬＡＳＭを含有する培地の一部に試料接種を行わないで、培地のこの部分を負の対照(negative control)として使うのが望ましい。
【０００８】
幾つかの試料［とりわけ、環境試料(environmental samples)；多量の他の物質を含有する試料；等の「汚染された(dirty; 汚い)」源からの試料］は、非常に様々な粒子；又は、幾らかのレベルの非特異信号を有することもある他の物質；を有することがあり、これら非特異信号が諸目標検体からの信号と混同されることもある。しかし、この問題は、培地における同一の諸領域から逐次的な画像であって、適切な期間により互いに分離されている該画像を目視的に又は光分析によって捉えることによって克服することができる。目標有機体から形成されるそれらのコロニーのみが、連続して増殖するために、信号強度が増加する。連続的画像の比較は、デジタル画像処理を使用することによって行うのが好ましいが、強度が増大しているこれら領域を周囲培地から分けることができる。この動態解析(kinetic analysis)方法は、適切な光度測定読取り装置が利用できるあらゆる環境において好ましい方法である。なぜなら、この技術によって、動態解析を達成するための最大の速度と、最大の感度と、最善の選択性とが与えられるからである。
【０００９】
最大の信号対雑音比を与えるために、培地はなるべく薄い方［即ち、約１ｍｍ以下、好ましくは約０．５０ｍｍ以下］が好ましい。標識の濃度は、その標識からの信号が、培地の非接種領域から実際に検出することのできるようなものであるべきである。目視試験のために有用な信号は、適当な照明条件下、肉眼でわずかに見ることのできる信号である。自動化した試験のためには、標識濃度は、その定量を可能とする、「暗い(dark)」バックグラウンド全体に渡る十分な信号対雑音比を有する強度を与えなければならない。使用する計器の光度測定特性に基づいて、精確な量を決定しなければならない。フルオレセイン、スルホローダミン等の発蛍光団、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５及びＣｙ−７は、光分析のプロトコルの標識として使用することができる。各目標のためのＬＡＳＭｓの諸標識を、例えば、色、及び／又はＬＡＳＭｓからの光波放出によって同定することが可能であれば、上記方法を用いて２種以上の目標有機体を検出することができる。
【００１０】
従って、本発明の目的は、目標検体が存在するか否かを調べるための検体試料を分析するのに使用することができる方法及び装置を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、記述された特性を持つ方法及び装置であって、培地内を移動することのできる、目標検体−特異標識物質と結合した該培地の上に試料が置かれている上記方法及び装置を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、記述された特性を持つ方法及び装置であって、目標検体が生物である上記方法及び装置を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、記述された特性を持つ方法及び装置であって、同一培地の上で２種以上の目標検体を検出し得る上記方法及び装置を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、記述された特性を持つ方法及び装置であって、培地中に目標検体のコロニーを増殖させることによって目標検体を検出する上記方法及び装置を提供することである。
本発明のこれら及び他の諸目的並びに諸利点は、添付の諸図面と関連させれば、次に記述する本発明の詳細な記述から、容易に明らかになるであろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（発明を実施するための詳細な諸例）
次に、図１に言及すると、数字「２」によって広く表示される、長方形断面の培地の平面図を示す。この培地は、本発明の方法を実施するのに適合する。図１に示す培地領域は、均一に分配された標識信号の放出を示すために、均一な陰影を付けている。標識信号の放出は、培地に試料を接種する前か、若しくは、試料中に目標検体が全く存在しないときは、試料を接種し培養した後に、ヒトの目で検出するか又は走査用計器で検出する。培地２の中の領域３は、分析中の試料を接種しない領域であるが、試料中に使用した試薬の全てを含有する。従って、領域３は、負の対照領域(negative control area)として役立つ。図２及び図３は、試料中に目標検体が存在する場合、培地２における標識放出パターンの、結果として生じる変化を例証する。図２は、試料中の目標検体のレベルが比較的低いときの結果を示す。それによると、培地２において、一層低いレベルの標識の光輪６によって囲まれた、一層大きく標識された多数のコロニー４が生じる。図３は、試料中の目標検体のレベルが比較的高いときの結果を示す。図２及び図３から、諸コロニー４は数え上げることが可能であり；また、試料の接種材料の容積及び培地２の領域の大きさは知ることができるので、本発明の方法に従って、試料の単位容積当りの検体の濃度を得ることができる；ことが分かるであろう。図４は、培地の線走査(linear scan)を行う自動分析計器によって検出される、標識からの放出強度のピクトグラフである。トレース(trace)８は、培地中の標識からの放出レベルを示し；一時的低下(dips)１０は、「薄暗い」光輪６から発せられる低レベルの標識信号の放出を示し；また、ピーク１２は、「明るい」コロニー４から発せられる高レベルの標識信号の放出を示す。
【００１４】
【実施例】
次は、本発明の技術を利用して検出し得る諸目標検体の諸例である。
例１
食物又は環境源からの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を検出する場合、ＬＡＳＭは、フルオレセイン、テキサスレッド(Texas Red)等の発蛍光団を、Ｏ１５７：Ｈ７有機体に特異な抗体に共有(covalently)結合させることによって造られる。そのＬＡＳＭは、ミュラー・ヒントン(Muller-Hinton)寒天培地、マッコンキーのソルビタール(MacConkey’s Sorbital)培地等の増殖培地と混合し、結果的に、適当な波長の光を当てたとき、はっきりと目視することができるのに十分なＬＡＳＭ濃度；又は、描画装置(imaging system)によって容易に測定するのに十分なＬＡＳＭ濃度；が結果的に得られるようにする。目視検査の場合、フルオレセインは好ましい標識である。光度測定分析のプロトコルが使用されるとき、標識は、スルホローダミン標識、Ｃｙ３、Ｃｙ５、又はＣｙ７の標識である場合があり、Ｃｙ標識の後者は、赤外波長又は近赤外波長の信号を放出し、ヒトの目では検出し得ないが、光分析により検出し得る。
【００１５】
プレート(plate)は、計器による検出のフォーマット(format)で使用するためには、培地／ＬＡＳＭの混合物を好ましくは０．５ｍｍの厚さで注ぎ込み、目視による検出のフォーマットで使用するためには、その混合物を約１．０ｍｍの厚さの層で注ぎ込む。試料が臨床源からのものであれば、培地の上に直接平板培養してもよい。試料が食物源からのものであれば、食物源は、無菌液に分散させ、次いで、濾過して、目に見える粒子材料をその試料から除去することが好ましい。環境源からの試料は、食物源の場合と同じやり方で処理することができる。試料を約３５oＣの温度で培養した後、平板培養した試料は、上述の通り、周期的に検査する。少しの有機体しか含有していないと推測される試料は、例えば、多量の検査すべき物質を濾過し、次いで、フィルタを培地の上に置くことによって、濃縮することができる。フィルタが本質的に透過性である限り、ＬＡＳＭｓはそのフィルタを通過し、次いで、あたかもそれら有機体が培地それ自体の表面で増殖しているかのように、培地上で増殖している諸有機体に付着する。
【００１６】
例２
リステリア菌［例えば、チーズの試料からのリステリア菌］を検出する場合、分析は、リステリア有機体に特異な抗体に発蛍光団又は他の色素を共有結合により結合させることによってＬＡＳＭを造ることを除き、上述の例１に従って実施するのが好ましい。そのＬＡＳＭは、エスクリンを主成分とするグラム陽性選択寒天培地等の増殖培地と混合する。分析中の試料を培地の上に接種した後、プレートは３５oＣで定温放置する。次いで、プレートは、上述の通りに、定期的に目視検査又は光分析を行う。
【００１７】
例３
チフス菌［例えば、食物、水、又は臨床源からのチフス菌］を検出する場合、分析は、チフス菌有機体に特異な抗体に発蛍光団又は他の色素を共有結合させることによってＬＡＳＭを造ることを除き、上述の例１に従って実施するのが好ましい。そのＬＡＳＭは、ビスマスサルファイト寒天培地、ヘクトエンエンテリック寒天培地等の増殖培地と混合する。分析中の試料を培地の上に又はその中に接種した後、プレートは３５oＣで定温放置する。次いで、プレートは、上述の通り、定期的に目視検査又は光分析を行う。
【００１８】
例４
臨床試料からの酵母カンジダ・アルビカンスを検出する場合、分析は、カンジダ・アルビカンス有機体に特異な抗体又はレクチンに、発蛍光団又は他の色素を共有結合により結合させることによってＬＡＳＭを造ることを除き、上述の例１に従って実施するのが好ましい。そのＬＡＳＭは、サブローブドウ糖寒天培地等の増殖培地と混合する。分析中の試料を培地の上に接種した後、プレートは３５oＣで定温放置する。次いで、プレートは、上述の通り、定期的に目視検査又は光分析を行う。
【００１９】
【発明の効果】
分析中の試料の中に存在するかも知れない種々の微生物が存在するか否かを検出するために、上述の方法及び装置を利用することができることは、容易に理解されるであろう。増殖培地の中に形成し得る明るく標識された目標微生物コロニーを取り囲む、局在化し薄暗く標識された諸光輪の発生によって、目視による検出又は光分析による検出が可能となり、増殖培地の中に形成されるあらゆる目標微生物コロニーを数え上げることができる。増殖培地の選択的特性を利用すれば、それによって、目標微生物コロニーの増殖が高められ、非目標微生物コロニーの増殖が抑制される。この技術は、単に、形成したコロニーを数え上げ、且つ、増殖培地の上か又はその中に接種した試料の容積を記録することによって、試料中の目標微生物の濃度を評価するのに使用することができる。培地の同一領域から一連の読取りを行い、局所的ＬＡＳＭ濃度の諸変化を検出することができる。これらの変化は、目標検体の増殖に関連している。
【００２０】
本発明に関し開示した態様の多くの変化及び変形を、本発明の概念から逸脱しないで行うことができるのであるから、特許請求の範囲によって請求されることを除き、本発明は制限されるように意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従って形成された、標識目標検体−特異物質と、目標検体増殖培地との混合物の平面図である。
【図２】図１に類似の平面図であるが、分析中の試料中に目標検体が存在するために、前記混合物中に局在化し強く標識された領域が、異なる程度で形成されることを示す。
【図３】図１に類似の平面図であるが、分析中の試料中に目標検体が存在するために、前記混合物中に局在化し強く標識された領域が、異なる程度で形成されることを示す。
【図４】試料を光分析の光放出信号検出器によって走査するとき、試料から発せられる信号強度レベル；又は目視により観察された信号強度レベル；のピクトグラフのトレースである。
【符号の説明】
２  長方形断面の培地
３  分析中の試料を接種しない領域
４  一層大きく標識されたコロニー
６  一層低いレベルの標識の光輪
８  トレース
１０  一時的低下
１２  ピーク
【図１】
0003984035.tif 000002
【図２】
0003984035.tif 000003
【図３】
0003984035.tif 000004
【図４】
0003984035.tif 000005