(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（１）：
【化１】
0003955345.tif 000005
[式中、二つのカルボキシル基の一方または両方が、炭素数１〜５の直鎖または分岐の低級アルキル基とのエステルを形成していてもよい]
で示される新規アミノ酸ダイジハーベイン、またはその塩。
【請求項２】
次の化学式（１ａ）：
【化２】
0003955345.tif 000006
[式中、二つのカルボキシル基の一方または両方が、炭素数１〜５の直鎖または分岐の低級アルキル基とのエステルを形成していてもよい]
で示される請求項１の化合物、またはその塩。
【請求項３】
請求項１または２記載の化合物を有効成分としてなる、非ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なグルタミン酸受容体アゴニストに関し、さらに詳細には、非ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストである、新規アミノ酸ダイジハーベインおよびその塩ならびに生物学的前駆体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸は哺乳動物の中枢神経系における興奮性神経刺激の伝達物質として、また、神経細胞を破壊し種々の脳・神経疾患を惹起する神経興奮毒として、さらに記憶や学習の形成に重要に係わる物質として注目を集めている。
Ｌ−グルタミン酸受容体は、このような多様な生理機能と連結しており、イオンチャンネル型受容体（ｉＧｌｕＲ）と代謝調節型受容体（ｍＧｌｕＲ）の２種類に分類される。イオンチャンネル型受容体はさらに外因性のアゴニスト群の導入により、次の３種類のサブタイプ、すなわち、
【０００３】
（ａ）ＮＭＤＡタイプ
（ｂ）ＫＡタイプ
（ｃ）ＡＭＰＡタイプ
（但し、ＮＭＤＡ＝Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸，ＫＡ＝カイニン酸，ＡＭＰＡ＝α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾルプロピオン酸を意味する。以下、この略号を使用することがある。）に分類されている。また、ＫＡタイプとＡＭＰＡタイプをまとめて非ＮＭＤＡ型と称することもある。
【０００４】
従来、非ＮＭＤＡ型受容体のうち、ＫＡタイプ受容体は、カイニン酸自体がラットにおいて癲癇様の病変を引き起こすこと、および神経細胞の細胞体脱落作用を示すことが見いだされており、このＫＡタイプ受容体は、神経細胞死と関連していると考えられる。一方、ＡＭＰＡ受容体は中枢神経系における通常の早い伝達に関与しており、ＡＭＰＡ受容体の活性化が引き金となってＮＭＤＡ型受容体の活性化が起こるとされている。さらに、近年、分子生物学的研究から、イオンチャンネル型Ｌ−グルタミン酸受容体の１〜４型（ｉＧｌｕＲ１〜４）がＡＭＰＡ型受容体に、５〜７型（ｉＧｌｕＲ５〜７）ならびにＫＡ１，２型がＫＡタイプ受容体に対応することが見いだされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のとおり、Ｌ−グルタミン酸によるグルタミン酸受容体の刺激は、神経細胞死や中枢神経系の伝達を始めとして生体における重要な機能を果たしている。そのため、グルタミン酸受容体のアゴニストは、神経系の機能を解明するための研究材料として欠かすことができないものである。しかし、非ＮＭＤＡ型（特にＫＡタイプ）受容体のアゴニストとしては、天然物由来のドーモイ酸やアクロメイン酸のようなカイノイド（分子中にカイニン酸骨格をもつ化合物の総称）が知られているのみで、受容体の機能を研究する上で新たな骨格を有するアゴニスト／アンタゴニストの開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは毒として知られている海洋天然物の数々が、細胞内／細胞間での情報伝達に係わる機構に微量かつ特異的に作用していることに注目し、特異な生理活性を有する新規化合物の単離を目指してきた。その結果、ミクロネシア産海綿の一種（Ｄｙｓｉｄａｅ  ｈｅｒｂａｃｅａ）の水抽出物が、マウスに対し発作的な痙攣など特徴的な症状を惹起することを見だした。
【０００７】
本発明者らはこの知見をもとに、この症状を惹起する活性本体を単離・精製すべく鋭意研究した結果、マウスに対する毒性を指標に、Ｄ．ｈｅｒｂａｃｅａの水抽出物から、液体クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を組み合わせて、次の化学式（１）
【０００８】
【化３】
0003955345.tif 000002
【０００９】
で表される、新規アミノ酸を単離・構造決定し、この化合物がグルタミン酸非ＮＭＤＡ型受容体のアゴニストであることを見いだし、ダイジハーベインと命名した。
化学式（１）の化合物は、塩の形、あるいは例えば二つのカルボキシル基の一方または両方が低級アルキルエステルを形成した生物学的前駆体の形でも、生体内でダイジハーベインに変化して、その生物学的活性を示すと考えられる。
したがって、本発明は、新規アミノ酸ダイジハーベインおよびその塩ならびに生物学的前駆体を、グルタミン酸非ＮＭＤＡ型受容体のアゴニストとして提供する。
【００１０】
本発明の化合物の低級アルキルエステルの例としては、メチルエステル，エチルエステル，ｎ−およびｉｓｏ−プロピルエステル，ｎ−，ｓｅｃ−およびｔｅｒｔ−ブチルエステル，ｎ−，ｓｅｃ−およびｔｅｒｔ−プロピルエステル等、炭素数が１〜５の直鎖または分岐の低級アルキル基とのエステルがあり、これらのエステルはダイジハーベインを通常のエステル化法によって処理することにより得られる。
【００１１】
本発明の化合物の塩の例としては、ダイジハーベインから通常の方法によって得られる酸付加塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等の塩があり、医薬または生化学試薬等として用いる場合は、生理学上に許容できる塩であることが望ましい。このような酸付加塩には、乳酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、桂皮酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、あるいはリン酸塩、リン酸水素塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩および硫酸水素塩等が挙げられる。また、このようなアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が、アルカリ土類金属塩としてはカルシウム塩が例示される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物（１）は、本化合物を含む海綿、例えば、Ｄ．ｈｅｒｂａｃｅａを水抽出して得られる抽出物を、マウスに対する毒性を指標に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０等を用いる液体クロマトグラフィーおよびＣ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で、２１０ｎｍの紫外吸収モニターがシングルピークを示すまで精製することにより得られる。
【００１３】
【作用】
本発明の化合物（１）は、マウスに腹腔内投与することにより、低用量（２０μｇ／ｋｇ）では脇腹をむやみに掻く行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ）を、中用量（１．３ｍｇ／ｋｇ）では癲癇様の痙攣を生じ、さらに投与量を上げると（６．５ｍｇ／ｋｇ）激しい発作の後死亡をひきおこす。
【００１４】
また、本発明の化合物（１）は、ラット脳より調製されたシナプス膜標品に対する〔3Ｈ〕カイニン酸および〔3Ｈ〕ＡＭＰＡの結合を阻害するが、ＮＭＤＡアンタゴニストである〔3Ｈ〕ＣＧＳ−１９７５５（シス−４−ホスホノメチル−２−ピペリジンカルボン酸）の結合は阻害しない。
さらに、化合物（１）は、ラット初代培養大脳皮質神経細胞においてカイニン酸よりも強い内向き電流を惹起する。この惹起電流応答は非ＮＭＡＤＡアンタゴニストのＣＮＱＸ（６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン）で阻害されるが、ＮＭＡＤＡアンタゴニストのＭＫ８０１（（５Ｒ，１０Ｓ）−（＋）５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ〔ａ，ｄ〕シクロヘプテン−５，１０−イミン）では阻害されない。このことから、化合物（１）は、ＫＡおよびＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体に作用する非ＮＭＤＡ型グルタミン酸アゴニストである。
【００１５】
本発明の化合物（１）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは既知のＫＡアゴニストであるドーモイ酸よりも強い活性を示しており、非カイノイド性の非ＮＭＤＡ型グルタミン酸アゴニストとして、神経科学の分野で、カイニン酸およびドーモイ酸と同様に有用な試薬として用いることができる他、病変モデルの作成などを初めとするグルタミン酸受容体研究につながり、グルタミン酸遮断薬開発への糸口を提供するものである。
【００１６】
【実施例】
次いで、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明のこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１．化合物（１）の単離
ステップ１．海綿からの粗抽出物の作成
ミクロネシア連邦ヤップ島の浅瀬（水深３−５ｍ）で１９９５年７月に採集した海綿、Ｄ．ｈｅｒｂａｃｅａ（２００ｇ）を精製水（２０ｍｌ）と共にホモジナイズした後、４℃，１０，０００ｒｐｍで遠心分離して抽出液を得た。これに２−プロパノール（１００ｍｌ）を加えて高分子化合物を沈殿として除去し、遠心分離で得られた上清を集め、減圧留去、凍結乾燥し、粗抽出物を得た。
【００１８】
ステップ２．化合物（１）の精製
得られた粗抽出物を精製水（５０ｍｌ）に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（ファルマシア製，３．５×１００ｃｍ）のカラムクロマトグラフィーに付し、精製水で溶出した。マウス腹腔内投与にて毒素活性を示した画分を集め、ＯＤＳ中圧カラム（和光純薬製，ＷＡＫＯ  ６０）を用いる逆相カラムクロマトグラフィーに付し水で溶出した。活性画分を集め、再びＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（ファルマシア製，３．５×１００ｃｍ）のカラムクロマトグラフィーで分離した。次いで、活性画分をＲＰ１８（バイオ・ラッド製，１×２５ｃｍ）を用いるＨＰＬＣに付し、精製水を展開溶媒として、流速１ｍｌ／ｍｉｎで展開し、２１０ｎｍの紫外吸収でモニターしながら、保持時間１４．６分のピークを分取して、化合物（１）を無色のアモルファスとして７ｍｇ得た。化合物（１）は、上記ＨＰＬＣで保持時間１４．６分の箇所に、シングルピークを与え、ダイジハーベインと命名された。
【００１９】
機器分析値：
ＴＬＣ（シリカゲル）：Ｒｆ＝０．７（Ｈ2Ｏ），Ｒｆ＝０．４（メタノール／０．５Ｍ−ＮａＣｌ＝５：１）．
〔α〕D＝−３．５°（ｃ０．４，Ｈ2Ｏ，２６℃）．
ＣＤ（Ｈ2Ｏ）：λｅｘｔ  ２２３ｎｍ，Δε−１．４；λｅｘｔ  ２０３ｎｍ，Δε１１．６．
ＰＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ，δｐｐｍ）：１．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５，１５．０Ｈｚ），２．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，１４．０Ｈｚ），２．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．５，１４．０Ｈｚ），２．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，１５．０Ｈｚ），２．７５（ｓ，１Ｈ），３．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，１１．５Ｈｚ），３．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０，１３．０Ｈｚ），３．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，３．５Ｈｚ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，１３．０Ｈｚ），４．１５（ｂｒｓ，１Ｈ），４．３０（ｂｒｓ，１Ｈ）．
ＥＳＩＭＳ：ｍ／Ｚ  ３０５（Ｍ＋Ｈ），３２７（Ｍ＋Ｎａ）．
ＨＲＦＡＢＳＭＳ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ12Ｈ21Ｎ2Ｏ7 ３０５．１３４９，
ｆｏｕｎｄ  ３０５．１３４８．
【００２０】
これらのデータから、ダイジハーベインは前記化学式（１）で表されることが判明し、その立体構造は化学式（１ａ）と推定された。
【００２１】
【化４】
0003955345.tif 000003
【００２２】
実施例２．ダイジハーベイン  ジメチルエステルの合成
実施例１で得られたダイジハーベイン（２．２ｍｇ）のメタノール溶液（０．９ｍｌ）に氷冷した１０％塩化チオニル／メタノール溶液（１００μｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。メタノールを留去し、残渣を水（１ｍｌ）に溶解した後凍結乾燥し、標記化合物を定量的に得た。
【００２３】
機器分析値：
ＴＬＣ（シリカゲル）：Ｒｆ＝０．７（メタノール／０．５Ｍ−ＮａＣｌ＝５：１）．
ＰＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δｐｐｍ）：２．２５−２．３５（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ），
２．８２（ｍ，１Ｈ），２．８７（ｓ，１Ｈ），３．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３Ｈｚ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．８５−３．８８（ｍ，６Ｈ），３．８９（ｂｒｓ，１Ｈ），３．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５，１３Ｈｚ），４．０７（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｂｒｓ，１Ｈ），４．５５（ｍ，１Ｈ）
【００２４】
評価例１．マウスへの腹腔内投与：
化合物（１）を精製水で希釈し、ＤＤＹマウス（オス、１５ｇ）の腹腔内に注入した。低用量（２０μｇ／ｋｇ）では脇腹をむやみに掻く行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ）を繰り返すようになり、この行動は１０−２０分継続した。中用量（１．３ｍｇ／ｋｇ）では癲癇様の痙攣を示し、この症状は翌日には回復した。しかし、さらに投与量を上げると（６．５ｍｇ／ｋｇ）、激しい発作の後約４０分で死亡した。
【００２５】
評価例２．ラット脳シナプス膜標品でのラジオバインディングアッセイ
ラット脳シナプス膜標品は文献記載の方法で調製した（London, E. D., Coyle, J. T., Mol. Pharmacol. 1979, 15, 492; Murphy, D. E., Snowhill, E. W.;Williams, M., Neurochem. Res. 1987, 12, 775 およびMurphy, D. E., Hutchison, A. J., Hurt, S. D., Williams, M., Sills, M. A., Br. J. Pharmacol. 1988, 95, 932）。使用したラジオリガンドとバインディングアッセイの培養条件と実験結果は以下の通りである。
【００２６】
ＫＡ受容体
〔条件〕：リガンド〔3Ｈ〕カイニン酸  １ｎＭ，培養液  １００ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．１），培養条件  ４℃  １時間
〔結果〕：化合物（１）は濃度依存的に〔3Ｈ〕カイニン酸の受容体への結合を阻害した。化合物（１）ならびにグルタミン酸、カイニン酸のＩＣ50値を以下に示す。
化合物（１）  ５９±７．８ｎＭ
グルタミン酸  １１０±１８ｎＭ
カイニン酸    ４．３±０．５ｎＭ
【００２７】
ＡＭＰＡ受容体
〔条件〕：リガンド〔3Ｈ〕ＡＭＰＡ  ５ｎＭ，培養液  １００ｍＭ  ＫＳＣＮ／５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４），培養条件  ４℃  １時間
〔結果〕：同様に化合物（１）は濃度依存的に〔3Ｈ〕ＡＭＰＡの受容体への結合を阻害した。化合物（１）ならびにグルタミン酸、ＡＭＰＡのＩＣ50値を以下に示す。
化合物（１）  ２２４±２２ｎＭ
グルタミン酸  １２４±４１ｎＭ
ＡＭＰＡ      ５．６±１．１ｎＭ
【００２８】
ＮＭＤＡ受容体
〔条件〕：リガンド〔3Ｈ〕ＣＧＳ−１９７５５  １０ｎＭ，培養液  ５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０），培養条件  ４℃  １時間
〔結果〕：化合物（１）はこの条件で〔3Ｈ〕ＣＧＳ−１９７５５の受容体への結合を阻害しなかった。
【００２９】
評価例３．ラット初代培養大脳皮質神経細胞における電気生理学評価
１０〜２１日培養したラット初代培養大脳皮質神経細胞において発現しているグルタミン酸受容体について、アゴニストに対する受容体応答を電気生理学的手法（パッチクランプホールセル記録法）で観察した（Murase, K., Randic. M.,Shirasaki, T., Nakagawa, T., Akaike, N., Brain Res. 1990, 525, 84）。化合物（１）は容量依存的に強い内向き電流を惹起した。
化合物（１）ならびにカイニン酸、ＡＭＰＡのＥＣ50値を以下に示す。
0003955345.tif 000004
また、化合物（１）により惹起される電流は、ＣＮＱＸで著しく阻害されるが、ＭＫ８０１では阻害されなかった。
【００３０】
以上の評価例から、化合物（１）は非ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体アゴニストであることが判明した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、非ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体アゴニストである新規アミノ酸ダイジハーベインおよびその低級アルキルエステルならびに塩が提供される。この化合物は病変モデルの作成などを初めとするグルタミン酸受容体の研究につながり、グルタミン酸受容体遮断薬開発への糸口を提供するものである。
【００３２】
さらに本発明の化合物は、非ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストの研究を通じて、グルタミン酸受容体遮断薬開発への糸口を提供するものであり、癲癇、ハンチントン氏病、パーキンソン氏病等の神経障害、神経変異症等の治療への展開が期待できる。