(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡであって、ベクターｐ( ｐＡＩＩ１７) ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７５９０９をＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで消化することにより得られ、９００ｂｐ長であることを特徴とする、前記単離ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の単離ＤＮＡが挿入されたベクターから成る組換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡであって、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列がベクターｐ( ｐＡＩＩ１７) ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７５９０９をＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで消化することにより得られるＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列に対応し、９００ｂｐ長であり、ここでＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、メチラーゼは配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記単離ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。
【請求項５】
クローニングベクターがｐ( ｐＡＩＩ１７) ＳｓｐＲ７. ２−Ｂ１  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７５９０９から成ることを特徴とする請求項４に記載のクローニングベクター。
【請求項６】
請求項２、４または５に記載のクローニングベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項２、４または５に記載のクローニングベクターによって形質転換された宿主細胞をエンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に培養することを包含するＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからこれらの酵素を産生する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に自然に存在する酵素の１つのクラスである。このクラスの酵素を他の夾雑細菌成分から分離して精製できれば、ＤＮＡ分子を正確なフラグメントに切断するために実験室で制限エンドヌクレアーゼを使用することが可能である。この酵素の特性は、ＤＮＡ分子を特異的に同定し、夫々の成分遺伝子に分画し得ることである。制限エンドヌクレアーゼが現代遺伝学研究に不可欠なツールであることは証明済みである。これらは、遺伝子を操作及び分析するための生化学的「鋏」の役割を果たし得る。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し該配列に結合することによって作用する。即ち、エンドヌクレアーゼは該配列に結合し、分子を該配列の内部またはその一方側で開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有している。今日までの研究では数百種類の細菌種から百種類以上の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】
細菌は通常、その種ごとに極めて少数の制限エンドヌクレアーゼを有している。エンドヌクレアーゼはそれらが由来する細菌に従って命名されている。例えば、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種（ＡＴＣＣ１３９２５）はＳｓｐＩと呼ばれる制限エンドヌクレアーゼを合成する。この酵素は配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し開裂する。
【０００５】
理論に拘束されるつもりはないが、制限エンドヌクレアーゼは本来は、細菌細胞の自己防御的役割を果たすと考えられている。該酵素はウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子感染に対する耐性を細菌に与える。このような耐性がなければ、外来ＤＮＡ分子が細菌を破壊したり細菌に寄生したりするであろう。耐性を与えるために該酵素は、認識配列が発生する度毎に感染ＤＮＡ分子に結合し該分子を開裂する。その結果として分子が分解され、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮＡはエキソヌクレアーゼによっていっそう分解され易くなる。
【０００６】
細菌防御系の第２の成分は修飾メチラーゼである。該酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し該ＤＮＡを感染外来ＤＮＡから識別できるようにするための手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識してこれに結合するが、ＤＮＡを破壊するのでなく、配列内部の１つまたは別のヌクレオチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メチル化された認識配列は制限エンドヌクレアーゼによる結合及び開裂の対象外となる。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼ活性によって常に完全に修飾されており、従って内在する制限エンドヌクレアーゼに対して完全に不感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及び攻撃に感受性を示すのは、非修飾であり従って外来であると同定されるＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴って現在では、遺伝子のクローニングが可能であり、また、遺伝子がコードしているタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得られたよりも大量に産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための重要な要件は、所望のクローンが１０−３〜１０−４という低頻度で発生するときに、複合「ライブラリー」、即ち「ショットガン」タイプのクローニング手順で得られたクローン集団の内部から、所望のクローンを同定し得る簡単で確実な方法を開発することである。必要な少数のクローンを生存させながら不要な多数のクローンを破壊する選択的な方法が好ましい。
【０００８】
タイプＩＩの制限修飾系は漸増頻度でクローニングされている。最初にクローニングされた系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染を使用した（ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ３：９７−１１２，（１９７８）；ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  １７８：７１７−７１９，（１９８０）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５０３−１５０７，（１９８１）。細菌中の制限−修飾系の存在は細菌にバクテリオファージ感染に対する耐性を与えるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保有する細胞は原則として、ファージに接触したライブラリーから生存細胞として選択的に単離され得る。しかしながら、この方法は高い評価を得ることはできなかった。特に、クローニングされた制限−修飾遺伝子が選択的生存を維持するに充分な耐性を必ずしも示さないことが知見された。
【０００９】
別のクローニング方法では、先ずプラスミド由来（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として特徴付けられる系を大腸菌クローニングプラスミドに移入する（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ  ＆  Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ  １９：３５５−３５９，（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９，（１９８５））。
【００１０】
より多数の系をクローニングするために使用されている第３のクローニング方法では、活性メチラーゼ遺伝子の選択を用いている（１９８６年９月３日公開のＥＰＯ公開Ｎｏ，１９３，４１３及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５））。制限遺伝子と修飾遺伝子とは緊密な連関を有しているので、しばしば１つの遺伝子だけを選択することによって双方の遺伝子を含むクローンを単離し得る。しかしながらメチル化活性に基づく選択によって完全な制限−修飾系が必ずしも得られることはなく、ときどきはメチラーゼ遺伝子だけが得られる（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ  １０：２１９−２２５，（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ  ２０：１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ  ＆  Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ  ２１：１１１−１１９，（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４２，（１９８３）。制限−修飾系のクローニングの概要に関しては、例えばＬｕｎｎｅｎら，Ｇｅｎｅ  ７４：２５−３２（１９８８）及びＷｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｇｅｎｅ，７４：２８１−２８５（１９８８）を参照するとよい。
【００１１】
メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼの遺伝子をクローニングするための別の方法は、ＤＮＡ損傷の比色アッセイに基づく。メチラーゼをスクリーニングするためには、プラスミドライブラリーで宿主大腸菌ＡＰ１−２００株を形質転換させる。メチラーゼの発現は、ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋またはＭｒｒ＋である大腸菌の菌株中でＳＯＳ応答反応を誘発する。ＡＰ１−２００菌株はＭｃｒ系及びＭｒｒ系に対して温度感受性であり、大腸菌の損傷誘発性ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレアーゼの遺伝子をコードしている組換えプラスミドは、限定温度におけるｌａｃＺ遺伝子の誘発に基づいて検出される。メチラーゼ遺伝子をコードしている形質転換体は、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレート上で青色コロニーとして検出される。（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１８３１−１８３５，（１９９１）及びＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：１５０−１５５（１９９１））。同様に、大腸菌ＥＲ１９９２株は、ｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒが欠失している。（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ”法と呼ばれる）この系においては、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡに損傷を与えるときにＳＯＳ応答を誘発する同系メチラーゼの非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子が検出され得る。ＳＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレート上で深青色コロニーを形成する。（Ｘｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３９９−２４０３（１９９４））。
【００１２】
制限−修飾遺伝子のクローニングに関して考えられる障害は、修飾によって保護されていない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子が導入され易いことにある。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを単一クローンとして一緒に導入するとき、エンドヌクレアーゼによる宿主ＤＮＡの開裂が生じる前にメチラーゼによる修飾が生じて宿主ＤＮＡが保護される必要がある。従って場合によっては、最初にメチラーゼ、次いでエンドヌクレアーゼの順で遺伝子を順次にクローニングするしかない。制限−修飾系のクローニングに関する別の障害は、大腸菌のある種の菌株はシトシンまたはアデニンの修飾に対して不利な反応を示すことにある。これらの菌株は、メチル化シトシンを含有するＤＮＡを破壊する系（Ｒａｌｅｉｇｈ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３：９０７０−９０７４（１９８６））またはメチル化アデニンを含有するＤＮＡを破壊する系（Ｈｅｉｔｍａｎ  ＆  Ｍｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１６９：３２４３−３２５０，（１９８７）；Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ  ＆  Ｒｅｖｅｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：２７９−２９６（１９８９），Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ，Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍｏｒａｎ．Ｓｌａｔｋｏ，Ｈｏｒｎｓｔｒａ  ＆  Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：５２０７−５２１９（１９９１））を有している。シトシン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ還伝子は、単独の場合にも対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒の場合にも、これらの菌株に容易にクローニングできない。この問題を回避するためには、これらの系が欠失した大腸菌の突然変異株（ＭｃｒＡ−及びＭｃｒＢ−またはＭｒｒ−）を使用することが必要である。
【００１３】
精製された制限エンドヌクレアーゼは実験室内でＤＮＡの特性決定及び再配列を行うための有用なツールであり、また修飾メチラーゼも多少程度は少ないが同様の有用ツールである。組換えＤＮＡ技術によってこれらの酵素を多量に合成する細菌株を得ることが産業上重要な理由はここにある。このような細菌株は、精製作業を容易にする、商業的に有用な量を産生する手段を提供する、などの理由によって有用であろう。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から指定番号＃１３９２５で得られるＮＥＢ菌株＃３１５）に由来のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮＡからこれらの酵素を産生する方法に関する。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩ、即ちＤＮＡ配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し矢印で示す第１の５′Ｔと第３の５′Ａとの間を開裂する酵素、を発現する形質転換宿主に関する。
【００１５】
ＳｓｐＩの好ましいクローニング方法は、ライブラリーＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ちその非メチル化認識配列を開裂する酵素、と共にインキュベートすることによって、対応するメチラーゼ遺伝子を発現するＤＮＡを含む十分な数のライブラリーを形成し、制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートしたときに開裂されなかった組換えＤＮＡによって宿主を再度形質転換し、得られた形質転換体の生存物から陽性クローンをスクリーニングする段階を含む。
【００１６】
しかしながら、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種ＤＮＡの複数のライブラリーを構築した後で、メチラーゼ遺伝子またはメチラーゼ遺伝子の部分及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の部分を得ることは可能であったが、完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることはできなかった。従って、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするための代替的な戦略が必要になった。この戦略では、宿主細胞中にメチラーゼを存在させないでベクターｐＡＩＩ１７中でＴ７プロモーター系の調節下にエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びに、かかる組換えＤＮＡから産生される酵素に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
ＳｓｐＩの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニングし発現させるために好ましい本発明の方法は、図１、６及び７に示されており、以下の段階を含んでいる。
Ｉ．ＳｓｐＩメチラーゼのクローニング
Ａ．ライブラリーの調製
Ａ−１．実施例に詳細に記載されているようにＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種の標準増殖プロトコルに従ってＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種を増殖させる。細胞を溶解させ、ゲノムＤＮＡを、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９７（１９８９）に記載の技術によって精製する。
Ａ−２．ゲノムＤＮＡを以下の制限エンドヌクレアーゼ：ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩで完全に消化する。
Ａ−３．これらの制限酵素フラグメントをクローニングベクターの対応するクローニング部位に結合する（例えば、ＢｇｌＩＩ生成フラグメントはＢｇｌＩＩクローニング部位に結合し、他も同様である）。理想的には、クローニングベクターはｐＢＩＩｓｐＩ．２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４のように１つまたは２つのＳｓｐＩ部位と前記クローニング部位とを含むベクターであり、Ｍｒｒ−である大腸菌ＲＲ１細胞またはＭｒｒ−及び／またはＭｃｒＡ−である任意の他の大腸菌株のような適当な宿主細胞を形質転換させるために混合物が使用される。
Ａ−４．形質転換細胞をアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールなどの抗生物質を含む形質転換細胞の選択培地で平板培養する。インキュベーション後、形質転換コロニーを単一培養物として一緒に収集して細胞ライブラリーを作製する。
Ａ−５．細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全に（ｉｎ  ｔｏｔｏ）精製してプラスミドライブラリーを作製する。
Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング
Ｂ−１．Ｗａｔｓｏｎら、前出、に記載の方法と同様の方法を用い、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種から調製したＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼによってプラスミドライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全消化する。メチラーゼ非含有の未修飾クローンがＳｓｐＩ消化によって特異的に破壊され、ＳｓｐＩメチラーゼクローンの相対頻度が増加する。
Ｂ−２．選択されたＤＮＡを大腸菌ＲＲ１のような適当な宿主に戻して形質転換させ、形質転換体を選択培地で平板培養することによって回収する。コロニーを採取し、それらのＤＮＡ中のＳｓｐＩ修飾遺伝子の存在を分析する。該遺伝子を含むプラスミドを精製し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして消化に耐性か否かを判定する。全細胞性ＤＮＡ（染色体及びプラスミド）も精製し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする。ＳｓｐＩ修飾遺伝子を保有するクローンのＤＮＡは完全に修飾されており、プラスミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの双方が実質的に消化耐性である。
Ｂ−３．作製したＤＮＡライブラリーを、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩなどでサザンブロッティング用に調製し、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６のようなクローン化したメチラーゼ遺伝子でプローブする。
Ｃ．修飾メチラーゼ遣伝子のマッピング及び欠失サブクローンの調製
Ｃ−１．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を多数の異なる制限酵素でマッピングした。制限地図を図２に示す。
Ｃ−２．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を以下の制限酵素：ＰｓｔＩ、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって消化し、再結合した。これらの欠失サブクローンをＳｓｐＩで消化し生存物をスクリーニングすることによってそのメチラーゼ活性を検定した。これらの欠失サブクローンのいくつかはメチラーゼ活性を有しており、残りはメチラーゼ活性を有していなかった。これは、推定メチラーゼ遺伝子に相当する長さ約１．２キロ塩基の領域を示した（図２参照）。この領域はＸｈｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間に存在した。ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩによって消化した。このフラグメントをｐＵＣ１８上のＳａｌＩからＢａｍＨＩ部位まで及びｐＵＣ１９中にサブクローニングした。
Ｃ−３．最も小さいメチラーゼサブクローン、１．２ＫｂのＢｇｌＩＩからＸｈｏＩまでのフラグメント、のＤＮＡ配列を決定した。この領域のＤＮＡ配列を図３に示す。
Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及び、エンドヌクレアーゼ位置のマッピング
Ｄ−１．ＳｓｐＩ制限遺伝子及び修飾遺伝子を保有するＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種の細胞からＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼを産生させる。細胞を発酵槽中の富裕培地で増殖させる。細胞を遠心によって採集する。ｇａｕｌｉｎミルによって細胞を破壊し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を産生させる。ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を標準イオン交換法及びアフィニティクロマトグラフィー法によって精製する。図４はＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生スキームを示す。
【００１９】
Ｄ−２．このように精製されたエンドヌクレアーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で均質であり、タンパク質は見掛け平均分子量３２，０００ダルトンを有し、ラムダＤＮＡ上で測定した比活性はタンパク質１ｍｇあたり約１４０，０００単位（またはそれ以上）である。
Ｄ−３．エンドヌクレアーゼのアミノ末端配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａタンパク質シークエンサー（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９７，（１９８９））を用いて得られる。また、タンパク質配列に基づいてＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを作製する。
Ｄ−４．プローブを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム中のメチラーゼクローンに対するエンドヌクレアーゼの相対位置をマッピングする。図５はＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム中のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を示す。
ＩＩ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
Ａ．ＭｃｒＡ−プレ保護宿主中の新しいライブラリーの構築
Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＳｓｐＩメチラーゼ遣伝子を特異的にクローニングするためのプライマーを設計し得る。２つのＰＣＲプライマーを設計した。ＳｓｐＩメチラーゼをｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６から増幅し、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９のポリリンカーに、ｐＵＣ１８構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５）中ではメチラーゼ遺伝子の方向がｌａｃプロモーターと同方向になり、ｐＵＣ１９構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ａ８）中ではｌａｃプロモーターと逆方向になるようにサブクローニングしした。
Ａ−２．ｐＡＣＹＣ１８４中で新しいＳｐｈＩ及びＸｈｏＩライブラリーを作製した。これらのライブラリーで、過発現メチラーゼ構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５またはｐＳｓｐＭ−Ａ８で予め保護したＭｃｒＡ−宿主（ＥＲ１７９７）を形質転換させた。これらのライブラリーをサザンブロッティング用に調製し、エンドヌクレアーゼ遺伝子に特異的なオリゴマーによってプローブした。これらのライブラリーのいずれにも検出可能なＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は存在しなかった。
Ｂ．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡの逆方向（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ
Ｂ−１．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡをＳａｃＩＩで限定消化することによってＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の逆方向ＰＣＲ用鋳型を調製した。標的ＳａｃＩＩフラグメントは長さ約４ｋｂであり、メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼの完全遺伝子をコードしていなければならない。消化後、ＤＮＡを希釈し再結合させて環状鋳型を形成した。
Ｂ−２．メチラーゼ遺伝子のＡｓｅＩ部位に結合（ｆｌａｎｋ）するＰＣＲプライマーを設計した。増幅を行って、予想された４Ｋｂの産物を同定した。図６はゲノム鋳型に対して逆方向ＰＣＲを行うためのスキームを示す。
Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物をランダムプライムし、これを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。エンドヌクレアーゼの位置までのＰＣＲ産物をマッピングした。
Ｂ−４．ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５メチラーゼ構築物によって予め保護されたコンピテントＥＲ２２５２細胞に逆方向ＰＣＲ産物をクローニングする試験は失敗に終わった。
Ｂ−５．逆方向ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断してエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単離した。この産物をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩからＳａｌＩまでの部位にクローニングした。
Ｂ−６．ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによって逆方向ＰＣＲ産物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをマッピングし、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遣伝子のＮ−末端半鎖の正しい構造であることを確認した。このエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端部分を、既にクローニングされていたＣ−末端部分に付加すると、完全機能性エンドヌクレアーゼが得られた。
Ｃ．ＰＣＲの使用による制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅
Ｃ−１．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端及びＣ−末端に適したＰＣＲプライマーを設計した。Ｎ−末端用の縮重プライマーは、遣伝子操作により作製されたＮｄｅＩ部位を含むＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのタンパク質配列に基づく。Ｃ−末端のプライマーは遺伝子操作により作製されたＢａｍＨＩ部位を含む修飾メチラーゼのＤＮＡ配列に基づく。図７は、エンドヌクレアーゼ増幅用プライマーが由来した場所を示す。
Ｃ−２．ｄＮＴＰ及びＭｇＳＯ４の存在下にＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、段階Ｃ−１で得られたプライマーによってＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム鋳型を増幅させた。
Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中へのＰＣＲ産物のクローニング
Ｄ−１．９００塩基対のＰＣＲ産物をベクターｐＡＩＩ１７のＮｄｅＩからＢａｍＨＩまでの部位にクローニングした。プラスミドｐＡＩＩ１７はｐＥＴ１１ｃに基づくＴ７ベクターである（Ｋｏｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８：１９６５−１９７５，（１９９３））。結合産物で大腸菌ＲＲ１及びＥＲ２１６９の双方を形質転換させた。双方の細胞株がＳｓｐＩメチラーゼによって予め保護されていなかった。
Ｄ−２．ＥＲ２１６９形質転換体の９６個のコロニーを採取し、アンピシリン含有Ｌ−寒天プレート及び１０ｍＭのＩＰＴＧを加えたアンピシリン含有Ｌ−寒天プレートで再度平板培養した。ＩＰＴＧの存在下に増殖しなかったコロニーに対応するコロニーを個別に増殖させ、１０ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。ラムダＤＮＡに対する粗細胞抽出物のＳｓｐＩ活性を検定した。図８は、ラムダＤＮＡに対して検定した粗細胞抽出物中のＳｓｐＩ活性の写真である。
【００２０】
上記に概説した各段階は本発明の好ましい実施モードを示しているが、上記方法を当業界で公知の技術に従って変更し得ることは当業者に明らかであろう。
【００２１】
以下の実施例は現状で実施されるのが好ましい本発明の実施態様を示している。実施例は単なる例示であり、実施例によって本発明の範囲が特許請求の範囲以外の制限を受けてはならないことは理解されよう。
【００２２】
【実施例】
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
Ｉ．ＳｓｐＩメチラーゼのクローニング
Ａ．ライブラリーの調製
Ａ−１．ゲノムＤＮＡの精製：約５ｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種の細胞（ＡＴＣＣ＃１３９２５）を解凍し、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プラスチック管（５０ｍｌ）中で０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１及び０．１ＭのＥＤＴＡ（２５ｍｌ）に再懸濁させた。３５ｍｌの上記バッファ中に６０ｍｇのリゾチームを含む溶液を２つの５０ｍｌプラスチック管に分割し、各々に等しい分量（１５ｍｌ）の細胞懸濁液を添加した。溶液を３７℃で１５分間インキュベートした。２０％ストック溶液からＳＤＳを添加してＳＤＳの最終濃度を１％に調整した。２００μｌのプロテイナーゼＫ（ストック１ｍｌあたり２０ｍｇ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。この時点で粘性の拡散溶液が得られたが、溶液は透明ではなかった。２ｍｌの１０％ＳＤＳ／８％サルコシルを管に添加し（各１ｍｌ）、５５℃で２時間加熱した。サンプルは粘性に維持されたが、完全に透明ではなかった。サンプルをＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１、１ｍＭのＥＤＴＡ）（２リットル）に一回交換して合計１６時間透析した。透析後、溶液（９８ｍ１）を等容量のＴＥ，ｐＨ８．０で希釈し、２つに分割し、各々に９８．０ｇのＣｓＣｌと１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エチジチウムとを添加することによって、ＣｓＣｌ勾配溶液を調製した。２０個の管をＴｉ７０ロータに入れ４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心した。バンドを取り出し、ＣｓＣｌ−水−飽和イソプロパノールで抽出した。溶液を上記と同じバッファに透析し、次いで、フェノール及びクロロホルムで抽出した（各々で１回ずつ）。この溶液を再度透析してフェノールを除去し、次いで電気泳動にかけた。
Ａ−２．限定消化：精製したＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断し、以下の手順で完全消化した。５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７，５と１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１００ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＤＴＴとから成るバッファ中に１００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む３００μｌの溶液を調製し、この溶液を３つの管に分割した。５０単位の適当な制限酵素を管に添加した。管を３７℃で１時間インキュベートし、次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを３００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再溶解し、各１０μｌをアガロースゲル電気泳動によって分析した。
Ａ−３．結合：フラグメント化したＤＮＡをｐＢＩＩＳｐ１．２（ＸｃａＩで切断したｐＢＩＩ０１（ＡＴＣＣ＃６７９０１）とＳｓｐＩ部位が挿入されたリンカー）に以下のごとく結合した。ＢｇｌＩＩで消化した１０．０μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のＤＮＡ（１００μｌ）を、２．０μｇのＢｇｌＩＩ開裂し脱リン酸化したｐＢＩＩＳｐ１．２（２０．０μｌ）と混合し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡを１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心し、１００μｌの７０％エタノールで１回洗浄した。ＤＮＡを９９μｌの１×結合バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）に再懸濁させ、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。３μｌのアリコートを使用して大腸菌ＲＲ１株を以下のごとく形質転換させた。各アリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント大腸菌ＲＲ１細胞と混合し、３０分間氷上に維持した。４２℃で２分間熱衝撃した後、細胞を１ｍｌのルリアブイヨン（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で希釈し、３７℃で１時間増殖させた。
Ａ−４．一次細胞ライブラリー：形質転換した細胞培養物を遠心し、２５０μｌの容量に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアー寒天（Ｌ−寒天）プレートで平板培養した。３７℃で一夜インキュベーション後、プレートを取り出し、約１１４，０００コロニーを掻き取り、抗生物質を含む２５ｍｌのＬＢ培地に導入した。これらの細胞から以下の手順でプラスミドＤＮＡを調製した。細胞を遠心によってペレット化し、３ｇの細胞ペーストを１４ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０及び５０ｍＭのグルコースに再懸濁させた。懸濁液をリゾチーム中で４．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５℃で５分間インキュベートした。１％のドデシル硫酸ナトリウムと０．２ＮのＮａＯＨとの２７ｍｌのアリコートを添加し、次いで溶液を撹拌し、０℃で５分間インキュベートした。氷冷した２０ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム，ｐＨ４．８を添加してゲノムＤＮＡを沈殿させ、１０秒間穏やかに撹拌し、氷上に５分間静置し、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。１０，０００×ｇで５分間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、等容量のクロロホルムで抽出した。１０，０００×ｇで５分間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、２倍容のエタノールを添加することによって核酸を沈殿させた。１２，０００×ｇで２０分間遠心することによって沈殿物を収集した。７０％のエタノールでペレットを１回洗浄し、上記同様に再ペレット化した。ペレットを真空下に乾燥し、８ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。８ｇの塩化セシウムと０．５ｍｌの臭化エチジウム溶液（５ｍｇ／ｍｌ）とを添加することによって塩化セシウムー臭化エチジウム平衡密度遠心のためのＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得られたプラスミドＤＮＡのバンドを注射器及び１８ｇ針で取り出した。等容量のＣｓＣｌ−水−飽和イソプロパノールで抽出することによって臭化エチジウムを除去した。塩化セシウムを透析によって除去した。ＤＮＡを等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）によって抽出し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に一夜透析した。
Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング
Ｂ−１．一次選択及び選択されたライブラリー：１μｇ（１２．０μｌ）のＢｇｌＩＩプラスミドライブラリーを、２７μｌの制限エンドヌクレアーゼ消化バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００μｇのウシ血清アルブミン）に希釈した。１００単位（１μｌ）のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼを添加し、管を３７℃で２時間インキュベートした。この時点で７単位（１μｌ）の仔ウシ腸ホスファターゼを添加し、反応混合物を更に３０分間インキュベートした。一次ライブラリーの場合と同様に、この反応混合物の５μｌのアリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント大腸菌ＲＲ１細胞と混合して形質転換させ、平板培養し、一夜増殖させた。
Ｂ−２．個別コロニーの分析：上記の形質転換によって得られたコロニーを採取し、アンピシリン含有のＬＢ寒天培地で平板培養した。１８個のコロニーを１０ｍｌの培養物に増殖させ、それらに含まれるプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ  ＆  Ｄｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９）を応用した以下のミニ調製物（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製手順によって調製した。
【００２３】
ミニ調製物精製手順：各培養物を以下のごとく処理した。１．５ｍｌの一夜培養物を６，０００×ｇで５分間遠心してペレット化した。上清を傾瀉し、細胞ペレットを２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有の１５０μｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのグルコース，ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で５分間維持後、２００μｌの０．２ＭのＮａＯＨ、１％のＳＤＳを添加し、管を振盪して細胞を溶解し、次いで氷に載せた。５分後、１５０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８を添加し、振盪し、氷に載せ、更に５分間維持した。形成された沈殿物を４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心した。上清を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）によって抽出した。１０，０００×ｇで５分間遠心することによって層を分離した。８８０μｌのエタノールを収容した遠心管に上清を注入し、混合した。室温で１０分間維持した後、管を１２，０００×ｇで１０分間遠心し、沈殿した核酸をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの７０％エタノールー水で再度洗浄し、再度ペレット化し、真空下に室温で３０分間乾燥した。いったん乾燥したペレットを、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ含有の５０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再懸濁させ、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。
【００２４】
引き続いて、プラスミドのミニ調製物をＳｓｐＩ及びＢｇｌＩＩで消化することによって分析した。
Ｂ−３．メチラーゼ遺伝子クローン：分析したプラスミドの１１％がＳｓｐＩに耐性であり長さ約９．６ＫｂのＢｇｌＩＩフラグメントを保有することが判明した。これらのプラスミドは機能性ＳｓｐＩ修飾メチラーゼ遺伝子だけをコードしており制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードしていないことが後で判明した。観察した他の８９％のプラスミドはＳｓｐＩに耐性でなく、不要な（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）フラグメントを含むかまたはベクターに再結合していた。ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩから成る他の４つのライブラリー中では、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼによる開裂に対して耐性のクローンは全く検出されなかった。これらの４つのライブラリーを以下の手順でサザンブロッティング用に調製した。１μｇのライブラリーＤＮＡをＳｓｐＩまたはクローニング酵素（即ちＰｓｔＩライブラリー用にはＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩライブラリー用にはＥｃｏＲＩ、など）によって消化した。未切断のライブラリーＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを０．７％のアガロースゲル上でクローニング酵素によって一夜消化した。ゲルに対して、０．２５ＭのＨＣｌによる１５分間の洗浄を２回繰り返し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌによる１５分間の洗浄を２回繰り返し、最後に１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨによる３０分間の洗浄を２回繰り返した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移させるために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロースシートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで湿潤させ、ゲルと同寸法の切片をゲルの片面に配置した。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体に上に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの積層体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載せ、一番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを転移させた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキングした。メチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６のニックトランスレーションを以下のごとく行って３２Ｐ標識プローブを調製した。１μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１Ｍのβ−メルカプトエタノール及び０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに再懸濁させた。４μｌの各０．１ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを１０μｌの６５０Ｃｉ／ｍｍｏｌのα３２−ＰのｄＡＴＰと共に添加した。４ピコグラムのＤＮＡアーゼＩを１０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと共に添加した。この混合物を１６℃で３時間インキュベートした。
【００２５】
ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（５００ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳＡ）、２０×ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、１０％のＳＤＳ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリダイズした。室温で１時間プレハイブリダイズした後、標識プローブを添加し、ハイブリダイゼーション段階を６８℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわたって６８℃の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを加えた２×ＳＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに４及び１８時間露光した。
【００２６】
ＥｃｏＲＩライブラリーだけがプローブにハイブリダイズするメチラーゼクローンを含むことが判明した。
Ｃ．ＳｓｐＩメチラーゼクローンのマッピング及び欠失サブクローンの調製
Ｃ−１．５μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼによって以下のごとく消化した。５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中に１００μｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡを含む５０μｌの溶液を試験管に導入した。この管に、１００単位のＰｓｔＩエンドヌクレアーゼを添加し、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。消化物全部を０．７％アガロース分取ゲル上で泳動した。全メチラーゼ遺伝子を含有すると判定された約７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントから成る選択フラグメントをゲルから切り出した。ゲルフラグメントを２１ゲージの針から交互に押し出して凍結させた。この処理を３回繰り返した。得られた混合物を４℃、１００，０００×ｇで１時間遠心してアガロースをペレット化した。残りの水溶液をＮａＣｌ濃度０．４Ｍにし、２倍容のイソプロパノールで沈殿させた。１２，０００×ｇで２０分間遠心することによってＤＮＡをペレット化し、低温の７０％エタノールで１回洗浄した。ＤＮＡペレットを２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に再懸濁させ、等容量のフェノールによって抽出した。１０，０００×ｇで１０分間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、１０，０００×ｇで１０分間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、等容量のクロロホルムで抽出し、１０，０００×ｇで遠心することによって層を分離した。水相を除去し、１／１０容量（０．２ｍｌ）の２．７５Ｍの酢酸ナトリウムと２倍容の冷エタノールとを添加することによってＤＮＡを沈殿させた。
１２，０００×ｇで２０分間遠心してＤＮＡをペレット化し、冷７０％エタノールで１回洗浄した。ＤＮＡを０．５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に再懸濁させた。
Ｃ−２．ゲル調製したＤＮＡフラグメントを以下の手順で再結合した。５μｌの１０×結合バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）をゲル調製した４５μｌの限定消化フラグメントに添加し、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。１、２及び３μｌのアリコートを使用して段階Ｉ（Ａ−３）に記載のように大腸菌ＲＲ１株を形質転換させた。形質転換した細胞培養物を遠心し、２５０μｌ容量に再懸濁させ、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有のＬ−寒天で平板培養した。得られた平板培養物を３７℃で一夜インキュベートした。
Ｃ−３．段階Ｉ（Ｂ−３）に記載の手順で複数のコロニーをミニ調製すると、正しいサイズのフラグメントが含まれることが知見された。ＰｓｔＩ欠失クローンはＳｓｐＩ消化に耐性であり、従って完全メチラーゼ遺伝子を含んでいることが判明した。
【００２７】
また、段階Ｉ（Ｃ−１）の記載と同様にして、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中でｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＡｓｅＩで消化し、５Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性でないことが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＢａｍＨＩで消化し、７Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＥｃｏＲＶで消化し、１３Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＸｈｏＩで消化し、次いで６．８Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＣｌａＩ及びＢｓｔＢＩで二重消化した。まず、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩，ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム及び１ｍＭのＤＴＴ中のＣｌａＩで３７℃で消化した。次いで、５，０００単位のＢｓｔＢＩを添加し、混合物を６５℃で１時間インキュベートした。１１．４Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性でないことが判明した。ＳｓｐＩメチラーゼの欠失クローンを図２にまとめる。
【００２８】
これらの欠失クローンの全部において、メチラーゼ含有ＤＮＡの最小領域はＢｇｌＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に存在していた。従って、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中の５μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を、４０単位のＢｇｌＩＩ及び４０単位のＸｈｏＩによって１時間消化した。消化産物を０．７％の低融点アガロースゲル上で泳動した。１．２ＫｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをゲルから切り出した。β−アガロースを用いて以下の手順でゲルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）と１ｍＭのＥＤＴＡ中に導入した。６単位のβ−アガロースを添加し、アガロースを４２℃で１時間消化した。４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心することによって未消化の糖質をペレット化した。ＤＮＡ含有上清に０．５ＭのＮａＣｌを加え、２倍容のイソプロパノールを添加した。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却した後、１５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを７０％のイソプロパノールで洗浄して乾燥した。ＤＮＡを２０μｌのＴＥに再懸濁させた。１０μｌのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメチラーゼフラグメントを夫々ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に結合した。これらの２つのメチラーゼサブクローンのＤＮＡ配列を決定した。得られたＤＮＡ配列を図３に示す。
Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及び、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼの位置のマッピング
Ｄ−１．ＮＥＢ＃３１５と命名されたＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、３７℃の発酵槽中で、１０．０ｇ／リットルのトリプトンと、５．０ｇ／リットルの酵母エキスと、２．０ｇ／リットルのＮａＣｌと、４．４ｇ／リットルのＫ２ＨＰＯ４と、２．０ｇ／リットルのグルコースと、１０ｍｇ／リットルのウシヘミンと、２．０ｍｇ／リットルのＮＡＤ；ＤＰＮとから成るＴＲＹ−ＹＥブイヨン培地中で増殖させた。細胞を遠心によって収集し、細胞ペーストを新鮮なうちに使用するかまたは−７０℃で保存した。以後の段階はすべて４℃で行う。
Ｄ−２．細胞ペースト（２５３ｇ）を解凍し、細胞を５００ｍｌの音波処理バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させる。
Ｄ−３．細胞をｇａｕｌｉｎミルによって破壊して懸濁細胞１ｍｌあたり約３５ｍｇの可溶性タンパク質を遊離させる。
Ｄ−４．１５，０００×ｇで４０分間遠心することによって不溶性細胞破片を除去する。
Ｄ−５．上清に５０ｇの細胞破片除去剤（Ｗｈａｔｍａｎ）を添加し、１０，０００×ｇで１０分間遠心する。
Ｄ−６．２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ６．９、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴで平衡させたホスホセルロースカラム（５×３５ｃｍ）（ＷｈａｔｍａｎＰ−１１）に上清流体を加える。カラムの２倍容の上記バッファでカラムを洗浄する。カラムを素通りした流体を単一フラスコに収集する。ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼはカラムに保持され、０．３〜０．６ＭのＮａＣｌに溶出する。最も活性の画分をプールし、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに対して一夜透析する。
Ｄ−７．ホスホセルロースカラムから得られたプールを、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴで平衡させたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２．５×２５ｃｍ）に導入し、カラムの２倍容の同じバッファで洗浄する。０．０５Ｍから０．８ＭまでのＮａＣｌの直線勾配（総容量５００ｍｌ）を展開させ、カラムに導入する。３ｍｌの画分が収集される。ラムダＤＮＡに対する画分中のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの存在を検定する。活性画分をプールし、１００倍容の２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに透析する。
Ｄ−８．透析したＳｓｐＩ活性のプール（２５ｍｌ）を１ｍｌのＭｏｎｏ  ＳＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入し、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴで洗浄し、同じバッファ中で５０ｍＭのＫＣｌから１．０ＭのＫＣｌまでの４０ｍｌの直線勾配を展開させ、カラムに導入する。１ｍｌの画分を収集し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在を検定する。最も活性の４つの画分は均質であり、タンパク質１ｍｇあたり比活性約１４０，０００単位を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分子量３２，０００ダルトンを有することが判明した。
Ｄ−９．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９７，（１９８９））を用い、４μｇの均質なＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのアミノ末端タンパク質の配列を決定した。最初の３０個の残基は分解していた。得られた最初の２５個の残基の配列は以下の通りであった：ＳＫＡＡＹＱＤＦＴＫＸＳＬＬＩＫＫＸＸＮＬＩＴＭ（配列番号１）（タンパク質配列の１文字コードの説明に関しては表１を参照されたい）。
Ｄ−１０．タンパク質配列に基づいて、以下の配列をもつ２個の１７ｍｅｒを作製した：５′ＧＣＮＧＣＮＴＡＹＣＡＲＧＡＣＴＴ３’（配列番号２）及び５′ＧＣＮＧＣＮＴＡＹＣＡＲＧＡＴＴＴ３’（配列番号３）（Ｙ＝ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）。これらの１７ｍｅｒを使用して、ＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕＳゲノムＤＮＡ上のエンドヌクレアーゼのアミノ末端の位置をマッピングした。
【００２９】
オリゴマープローブを以下の手順でγ−３２−Ｐによって末端標識した。５μｌのオリゴマープローブ（２５０ｎｇ）を、２０μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴに再懸濁させる。５μｌのγ−３２−Ｐを添加し、次いで１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加する。これを３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３０】
サザンブロットを以下のごとく調製した。１μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡをＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｖｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩによって消化した。消化物を０．７％のアガロースゲル上で一夜泳動した。ゲルを０．２５ＭのＨＣｌで１５分間ずつ２回洗浄し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌで夫々１５分間ずつ２回洗浄し、最後に１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで３０分間ずつ２回洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移させるために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロースシートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで湿潤させ、ゲルと同寸法の１つの切片をゲルの片面に配置した。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体に上に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの積層体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載せ、一番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを転移させた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキングした。
【００３１】
ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５０×デンハルト溶液（５００ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフィコール、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳＡ）、２０×ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、１０％のＳＤＳ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリダイズした。室温で１時間プレハイブリダイズした後、標識プローブを添加し、ハイブリダイゼーション段階を３７℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわたって３７℃の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを加えた２×ＳＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに４日間及び７日間露光した。
【００３２】
このブロットから、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６クローンの地図、制限エンドヌクレアーゼの領域のゲノム地図を作製した。図５は、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノム中のＳｓｐＩ制限／修飾系の領域の制限部位の地図である。
ＩＩ．ＳｓｐＩ制限系のクローニング
Ａ．ＭｃｒＡ−宿主中の新しいライブラリーの調製
Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計した。Ｎ−末端用プライマーは以下の配列：５’ＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡ３’（配列番号４）を有していた。Ｃ−末端プライマーは以下の配列：５’ＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡ３’（配列番号５）を有していた。ＳｓｐＩメチラーゼをｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６から以下のごとく増幅した。２ｎｇの鋳型ＤＮＡを、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００μＭのｄＮＴＰ、プライマーに希釈し、１単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。９５℃で１分間変性し、７２℃で１分間アニーリングし、７５℃で２分間伸長させるサイクルをサーマルサイクラー中で３５サイクル繰り返した。１．１ＫｂのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をＴＥに対して１時間微量透析し、次いで１０μｌをＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで以下のごとく消化した。１０μｌのＰＣＲ産物に、２μｌの５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ７．９、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴと、４μｌのＨ２Ｏと、２４単位のＢｇｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩとを添加し、３７℃で一夜インキュベートした。
【００３３】
ベクターを以下のごとく調製した。５μｇのｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を、２０μｌ中の１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中でインキュベートし、２０単位のＢａｍＨＩと６０単位のＳａｌＩとを添加した。消化物を３７℃で１時間インキュベートした。次にＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌのＴＥに再懸濁させた。
【００３４】
プラスミドとＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ切断ＰＣＲ産物とを１６℃で一夜結合させた。増幅したメチラーゼ構築物で大腸菌ＥＲ２２５２株を形質転換させ、コンピテント細胞を調製した。（ｌａｃプロモーターの反対方向に伸びる）ｐＵＣ１９中のメチラーゼは構築物ｐＳｓｐＭ−Ａ８である。（ｌａｃプロモーターと同方向に伸びる）ｐＵＣ１８中のメチラーゼは構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５である。
Ａ−２．段階Ｉ（Ｄ−１０）で得られたデータに基づいて、（段階Ｉ（Ａ−１）に記載のごとく調製された）精製Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩを用いて以下の手順で限定消化した。１０μｇのゲノムＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに希釈し、５０単位のＳｐｈＩまたはＸｈｏＩと共に適当な管に導入した。管を３７℃で１時間インキュベートし、次いでフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを５０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再溶解させ、各１μｌの溶解物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００３５】
ｐＡＣＹＣ１８４ベクターを以下の手順で調製した。１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４を２００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。４０単位のＳｐｈＩまたはＳａｌＩを添加し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベートし、ここで４単位のｃｉｐを添加し、インキュベーションをさらに３０分間継続した。消化物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを１００μｌのＴＥに再懸濁させた。
【００３６】
結合を以下の手順で行った。ＳｐｈＩ切断した１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳｐｈＩ切断した１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）中で混合し、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６℃で一夜インキュベートした。ＸｈｏＩ切断した１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳａｌＩ切断し脱リン酸化した１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合バッファ中で混合した。１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で一夜インキュベートした。
Ａ−３．ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５によって予め保護されたＥＲ２２５２細胞を形質転換させる以外は段階Ｉ（Ａ−４）の手順を用いて一次細胞ライブラリーを調製した。一次細胞ライブラリーから得られたＤＮＡを以下の制限酵素：ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｖｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩによって消化した。消化物を０．７％のアガロースゲル上で一夜泳動した。段階Ｉ（Ｂ−３）と同様にサザンブロッティング用ゲルを調製した。サザンブロットを、段階Ｉ（Ｄ−１０）で使用したＳｓｐエンドヌクレアーゼのＮ−末端用の２つの縮重オリゴによってプローブした。サザンブロットからエンドヌクレアーゼ含有クローンは全く同定されなかった。
Ｂ．Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡの逆方向ＰＣＲ
Ｂ−１．ＰＣＲ用鋳型となるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のＤＮＡを段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして調製した。次いで、ＤＮＡをＳａｃＩＩによって以下の手順で消化した。５μｇのゲノムＤＮＡを９５μｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、５μｌ（１００単位）のＳａｃＩＩを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。消化物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡペレットを５００μｌの１×リガーゼバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に再懸濁させ、次いで１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。結合を１６℃で一夜進行させた。リガーゼを６５℃で１５分間熱失活させた。
Ｂ−２．逆方向ＰＣＲに使用したプライマーはメチラーゼ遣伝子内部のＤＮＡ配列に由来した。右回りの３０ｍｅｒは以下の配列を有している：ＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号６）。左回りのプライマーの配列はＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＣＧ（配列番号７）である。
【００３７】
ＳａｃＩＩ切断し再結合した１μｇのゲノム鋳型（段階ＩＩ（Ｂ−１）に記載のごとく調製）を、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００μＭのｄＮＴＰ、プライマーと混合し、１単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。９５℃で１分間変性し、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で４分間伸長させるサイクルをサーマルサイクラー内で３０サイクル繰り返した。４ＫｂのＰＣＲ産物が観察された。
Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物を０．７％の低融点アガロースゲル上で泳動した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、ＮＥＢｌｏｔキットを用いて以下のごとくランダムプライムした。ゲル切片は６５℃で溶解し、その測定容量は７０μｌであった。１０μｌの１０×ランダムプライミングバッファを添加し、２５０μモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰを添加した。１μｌのＤＮＡ−ポリメラーゼＩ−クレノウフラグメントと５μｌの３２Ｐ−７−ｄＣＴＰとを添加した。ランダムプライミング反応を３７℃で６時間継続させた。ランダムプライムしたＰＣＲ産物を使用して、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｖｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩによって消化したＳｓｐゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。ハイブリダイゼーションを６８℃で一夜行った。プロットを２×ＳＳＣで５回洗浄した。プロットをＸ線フィルムに４時間露光し、次いで現像した。ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼの位置に対する逆方向ＰＣＲ産物をマッピングした。
Ｂ−４．逆方向ＰＣＲ産物を以下の手順でｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。最初に、ベクターをＥｃｏＲＶによって切断し、脱リン酸化した。８μｇのｐＡＣＹＣ１８４を１００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、６単位のＥｃｏＲＶを添加し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベートした。１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼを添加し、反応をさらに３０分間進行させた。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。逆方向ＰＣＲによって得られたＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、１００μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、６６μＭのｄＡＴＰ中で１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってキナーゼ処理した。キナーゼ処理した逆方向ＰＣＲ産物を次に、ＥｃｏＲＶ切断し脱リン酸化したｐＡＣＹＣ１８４に以下の手順で結合した。ＥｃｏＲＶ切断し脱リン酸化した１μｇのｐＡＣＹＣ１８４を、１×リガーゼバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に懸濁させた。キナーゼ処理した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を、８００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼと共に添加した。結合反応を室温で１時間進行させ、次いで５μｌを用いて、ｐＳｓｐＭ−Ａ８及びｐＳｓｐＭ−Ｂ５で予め保護したＥＲ２２５２細胞を形質転換させた（段階ＩＩ（Ａ−１）と同様にして調製）。
【００３８】
細胞をプレートから掻き取り、一次細胞ライブラリーの場合と同様にしてＤＮＡを調製した（段階Ｉ（Ａ−４））。ＤＮＡを以下の酵素：ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩで消化し、次いで０．７％のアガロースゲル上で泳動し、サザンブロットした。サザンブロットを、配列ＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧ（配列番号８）をもつＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＣ−末端に特異的なキナーゼ処理した３０ｍｅｒ（段階Ｉ（Ｄ−１０）に記載のごとくキナーゼ処理）でプローブした。エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡは検出されなかった。
Ｂ−５．エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単離するために、逆方向ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩによって切断した。１０μｌの逆方向ＰＣＲをＴＥに対して１時間微量透析した。次に、逆方向ＰＣＲ産物を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに導入し、８単位のＢｇｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩを添加した。これを３７℃で１時間インキュベートした。６５℃で２０分間インキュベートすることによって制限酵素を熱失活させた。これをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断しておいたｐＵＣ１９に結合した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ切断した１００ｎｇのｐＵＣ１９をリガーゼバッファに再懸濁させた。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ切断した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を添加し、４００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。結合を１６℃で一夜進行させた。２０μｌの結合産物でＥＲ２２６７を形質転換し、８０ｎｇのＸ−ｇａｌ及び１０ｍＭのＩＰＴＧと共に５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有培地で平板培養した。
【００３９】
いくつかの白色ヒロニーを採取し、１０ｍｌの一夜培養物として増殖させた。これらの細胞をミニ調製すると５０％がインサートを含むことが判明した。
Ｂ−６．インサートＤＮＡを含むと判断されたミニ調製物（段階１１（Ｂ−５）で得られたもの）をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩでマッピングして、インサートがＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端半鎖として正しい制限地図を有するか否かを判定した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化物を得るためには、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させてミニ調製した１μｇのＤＮＡを２０単位のＢａｍＨＩまたは２０単位のＳａｌＩによって消化した。ＥｃｏＲＩ消化物を得るためには、５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０２５％のトリトンＸ−１００中で２０単位のＥｃｏＲＩによって消化した。ＳａｃＩＩ消化物を得るためには、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７．９）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム及び１ｍＭのＤＴＴ中で２０単位のＳａｃＩＩによって消化した。上記反応の各々ではミニ調製した１μｇのＤＮＡを３７℃で１．５時間消化した。マッピングしたインサートＤＮＡの半鎖はＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端半鎖の正しい構造を有していた。
Ｃ．ＰＣＲを用いた制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅
Ｃ−１．ゲノムＤＮＡからＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接増幅するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。遺伝子のＮ−末端用プライマーは、段階Ｉ（Ｄ−９）で得られたような、遺伝子操作によって作製されたＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位を含む縮重アミノ酸配列に基づいていた。Ｎ−末端オリゴの配列は、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＶＡＡＡＧＣＭＧＣＭＴＡＹＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡ（配列番号９）（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｙ＝ＣまたはＴ）である。Ｃ−末端用オリゴは、ＣＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴ  ＧＧＴＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧ（配列番号１０）であった。
Ｃ−２．段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして、ＰＣＲ鋳型となるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを調製した。鋳型となる１μｇのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００μＭのｄＮＴＰ及び１単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ中に再懸濁させた。９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング及び７３℃で２分間の伸長から成るサイクルをサーマルサイクラー内で３０サイクル行った。完全ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子に間違いないと考えられる９００塩基対のＰＣＲ産物が主要産物として同定された。
【００４０】
９００ｂｐのＰＣＲ産物をＴＥに対して１時間微量透析し、次いで、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩでマッピングすることによって特性決定した。次にＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによって以下のごとく消化した。７０μｌのＰＣＲ産物を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに導入し、４０単位のＢａｍＨＩと４０単位のＮｄｅＩとを添加した。消化物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで１％の低融点アガロースゲル上で泳動した。バンドを切り出し、β−アガロースを用いて以下の手順でゲルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１ｍＭのＥＤＴＡに導入した。６単位のβ−アガラーゼを添加し、アガロースを４２℃で１時間消化した。未消化の糖質を４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心することによってペレット化した。ＤＮＡ含有上清を０．５ＭのＮａＣｌに導入し、２倍容のイソプロパノールを添加した。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却し、その後、１５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを７０％イソプロパノールで洗浄し、乾燥した。ＤＮＡを２０μｌのＴＥに再懸濁させた。
Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中でのＰＣＲ産物のクローニング
Ｄ−１．５μｇのベクターｐＡＩＩ１７（ｐＥＴ１１ｃに由来のＴ７発現ベクター；Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３））を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。６０単位のＮｄｅＩ及び８０単位のＢａｍＨＩを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。消化物を０．７％の低融点アガロースゲル上で泳動し、６．２Ｋｂのバンドをゲルから切り出した。ゲルから得られたバンドを融解させ、段階ＩＩ（Ｃ−２）と同様にβ−アガラーゼによってＤＮＡを回収した。ＤＮＡペレットを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させた。
【００４１】
段階ＩＩ（Ｃ−２）で得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ切断したｐＡＩＩ１７に以下のごとく結合した。ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断した１μｇのＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断した１μｇのｐＡＩＩ１７とを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡに再懸濁させた、４００単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。結合を１６℃で一夜進行させた。
【００４２】
２μｌの結合産物を非プレ保護ＳｓｐＩメチラーゼと共に用いてＲＲ１を形質転換させ、また、同じく２μｌを用いて同系メチラーゼの欠失したＥＲ２１６９を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有培地で平板培養した。１８時間後、各プレートから９６個のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有のマスタープレートで複製した。ＥＲ２１６９形質転換体も１ｍＭのＩＰＴＧとアンピシリンとを含有するプレート上で複製した。１８時間後、ＩＰＴＧ上で増殖させたＥＲ２１６９から複数のコロニーが溶解したことが観察された。
Ｄ−２．ＥＲ２１６９プレートから採取した最初の１８個のコロニーを１０ｍｌの一夜培養物として増殖させた。ＩＰＴＧの存在下でコロニーが溶解することが観察されると、対応する１０ｍｌ培養物の１ｍｌを１０倍に希釈し、対数増殖期の中期に１０ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。細胞培養物をＩＰＴＧの存在下で３時間増殖させた。１．５ｍｌの培養物を微量遠心管で遠心した。細胞ペレットを４００μｌの２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。細胞を１０秒間音波処理して破壊した。細胞破片を１５，０００×ｇで５分間遠心した。ラムダＤＮＡに対する上清のＳｓｐＩ活性を検定した。
【００４３】
ＳｓｐＩ活性のアッセイは以下の順で行った。１μｇのラムダＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに総量２０μｌに希釈した。音波処理細胞から得られた１μｌの上清を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。消化物を０．７％アガロースゲル上で泳動した。７つの粗細胞抽出物のうち６つでＳｓｐＩ活性が検出された。図８はＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。ＳｓｐＩ活性を有するプラスミドを増殖させ、ＣｓＣｌ調製し、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ３、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ９、ｐ（ｐＡＩＩ１７）−ＳｓｐＲ７．２−Ａ１０、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ１２、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１及びｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ６と命名する。
【００４４】
プラスミドｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１はブダペスト条約の規約に従って１９９４年１０月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．７５９０９で受託された。
【００４５】
表１はアミノ酸配列の１文字コードの説明である。
【００４６】
【表１】
0003963971.tif 000002
【００４７】
【配列表】
0003963971.tif 000003
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【００４８】
【化１】
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【００４９】
【化２】
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【００５０】
【化３】
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【００５１】
【化４】
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【００５２】
【化５】
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【００５３】
【化６】
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【００５４】
【化７】
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【００５５】
【化８】
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【００５６】
【化９】
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【００５７】
【化１０】
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【００５８】
【化１１】
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【００５９】
【化１２】
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【００６０】
【化１３】
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【００６１】
【化１４】
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【００６２】
【化１５】
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【００６３】
【化１６】
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【００６４】
【化１７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｓｐＩ制限メチラーゼのクローニングスキームの概略図である。
【図２】ＢｇｌＩＩクローンの欠失を伴うＳｓｐＩメチラーゼをコードする９．６ＫｂのＢｇｌＩＩフラグメントの制限地図である。
【図３Ａ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するアミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメチラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【図３Ｂ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するアミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメチラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）である（図３Ａの配列の続き）。
【図３Ｃ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するアミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメチラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）である（図３Ｂの配列の続き）。
【図３Ｄ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するアミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメチラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）である（図３Ｃの配列の続き）。
【図４】ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生スキームを示す。
【図５】Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡのメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の領域のマップである。
【図６】ＳａｃＩＩ切断し再結合したゲノムＤＮＡに対する逆方向ＰＣＲのスキームである。
【図７】エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接増幅するために使用されたＰＣＲプライマーが由来した場所を示す地図である。
【図８】プラスミドｐＡＩＩ１７中のエンドヌクレアーゼ遺伝子を保有する大腸菌ＥＲ２１６９の細胞抽出物中のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図９】調製された種々のライブラリーの一覧表である。
【図１０Ａ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクローンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２２）である。
【図１０Ｂ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクローンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２２）である（図１０Ａの配列の続き）。
【図１０Ｃ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクローンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２２）である（図１０Ｂの配列の続き）。
【図１０Ｄ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクローンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２２）である（図１０Ｃの配列の続き）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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