(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0003879088.tif 000006
（式中、Ｒ1 はハロゲン原子を表し、Ｒ2 は水素原子または水酸基の保護基を表す。）で表されるスピロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なスピロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体に関する。本化合物は静脈内皮細胞の静脈細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）産生を阻害する作用を示し、癌転移抑制剤、抗炎症剤の他、動脈硬化、移植拒絶反応、慢性関節リュウマチ、サルコイドーシス等の治療薬としての利用が期待される。
【０００２】
【従来の技術】
ＶＣＡＭ−１は静脈細胞接着分子（ＶＣＡＭ）の１つで、１９８９年に新たに見出された分子量９万の糖蛋白である（Osborn, L., et al, Cell 59, 1203, 1989）。ＶＣＡＭ−１は血管内皮細胞をＴＮＦ（腫瘍壊死因子）やＩＬ−１（インターロイキン−１）等の炎症性サイトカインで刺激することによって発現が誘導され、血管内皮細胞とＶＣＡＭ−１のリガンドであるＶＬＡ−４を発現する細胞（リンパ球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、メラノーマ等）との接着に関与する。また最近、濾胞樹状細胞等での発現も確認されている。
【０００３】
炎症反応においてはＶＣＡＭ−１の他にＰ−セレクチン、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１等の接着分子が関与するが、この内ＶＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−１を介する接着は特に強固で、実際の疾患においてはこれらの働きが重要な役割を果たしているとされる。動脈硬化、同種移植片拒絶症、メラノーマ等の癌転移、気管支喘息、及び種々の急性、慢性炎症性疾患等、広い範囲の病変局所の血管内皮細胞でＶＣＡＭ−１の発現亢進が報告されている。従って、この静脈内皮細胞のＶＣＡＭ−１産生を抑制する作用を持つ物質は、これらの疾患の治療薬として有効であると考えられる。本発明者らは、そのような作用を示す物質を既にいくつか報告した（文部省がん重点研究総括班、ワークショップ”癌化学療法の分子標的”039, 1994 ）が、より優れた物質の発見が望まれている。
【０００４】
一方医療の場では、炎症性疾患は直接生命に関わるものではないものの、様々な原因による症状に悩む患者は数多く、より有効で副作用の少ない治療薬が常に求められている。また癌の転移は癌による死亡の主因であるにも関わらず、その予防法、治療法は未だに殆ど確立されていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、新規な構造を有するＶＣＡＭ−１の産生阻害物質を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、海洋生物の抽出液に含まれる成分を探索した結果、ハリコンドリア属に属する海綿抽出液から分離されるスピロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体が静脈内皮細胞によるＶＣＡＭ−１の産生を阻害する作用を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記一般式（１）
【０００８】
【化２】
0003879088.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1 はハロゲン原子を表し、Ｒ2 は水素原子または水酸基の保護基を表す。）で表されるスピロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
前記一般式（１）において、水酸基の保護基としては、置換もしくは無置換の低級アルキル基、トリ低級アルキルシリル基、又はアシル基を例示することができる。低級アルキル基とは、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基を意味し、その具体例としてメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。低級アルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基、フェニル基、ｐ−トリル基、フリル基等のアリール基等を挙げることができる。
【００１１】
本発明の前記一般式（１）で表されるシクロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体のうち、下記式（１ａ）で表される化合物は、ハリコンドリア属に属する海綿類である例えばクロイソカイメン（Halicondria okadai）を有機溶媒中で粉砕、抽出し、更にクロマトグラフィにより分離することにより通常の方法で得られる。
【００１２】
【化３】
0003879088.tif 000003
【００１３】
粉砕、抽出に用いられる溶媒としてはメタノール、エタノール、アセトン等が挙げられ、クロマトグラフィはカラム及び薄層クロマトグラフィが用いられ、カラムクロマトグラフィとしてはシリカゲルの他、ＴＳＫ  Ｇ３０００Ｓ、セファデックスＬＨ−２０、逆相系のＲＰ−１８が用いられ、薄層クロマトグラフィとしては、シリカゲルの他、ＲＰ−１８が用いられる。
【００１４】
本発明の前記一般式（１）で表される他の化合物は、例えば、前記式（１ａ）で表されるシクロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体を常法に従って、ヨウ化メチル、臭化ベンジル等のアルキル化剤によるアルキル化、トリメチルシリルクロリド等のシリル化剤によるシリル化、アセチルクロリド等によるアシル化を行うことによって得ることができる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例により詳細に説明する。
【００１６】
実施例１．クロイソカイメンの抽出、分配
クロイソカイメン（２００ｋｇ）を約２１６Ｌのエタノールと混合して、ブレンダで粉砕した。１０日後、濾過して得られた抽出液を減圧下濃縮し、暗褐色の含水油状物を得た。これを等容の酢酸エチルで３回抽出し、併せて減圧下濃縮乾固し粗抽出物を得た。この抽出物を７０％メタノール−水とヘキサンで分配し、７０％メタノール層を減圧下濃縮し、メタノールを留去した。
【００１７】
実施例２．シクロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体の分離精製
内径７ｃｍのガラスカラムにエタノールに懸濁させたＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓを高さ１０ｃｍに充填し、溶媒を水に置換した後、上記の濃縮した水層を通過させた。このカラムに２０％エタノール−水、４０％エタノール−水、６０％エタノール−水、７５％エタノール−水、及び９９％エタノールを順次流し、４０％エタノール−水溶出部を集めて濃縮し、黒褐色油状物を５０ｍＬ得た。
【００１８】
内径３．５ｃｍのガラスカラムにメタノールに懸濁させたＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱを高さ２０ｃｍに充填し、溶媒を水に置換し、上記溶出物を少量の水に懸濁させてカラム上に載せた。このカラムに水、２５％メタノール−水、５０％メタノール−水、７５％メタノール及びメタノールを順次流し、２５％メタノール−水溶出部を集めて濃縮し、黒褐色油状物７．６ｇを得た。
【００１９】
内径３．５ｃｍのガラスカラムにベンゼンで懸濁させたシリカゲル（１００ｇ）を充填し、少量のベンゼンに溶かした上記油状物を吸着させた。このカラムに順次、ベンゼン５０ｍＬ、クロロホルム、１％メタノール−クロロホルム、５％メタノール−クロロホルム、１０％メタノール−クロロホルム、２５％メタノール−クロロホルム及びメタノール各１００ｍＬを流し、５％メタノール−クロロホルムで溶出される画分を集め、濃縮して黒色油状物７５０ｍｇを得た。
【００２０】
上記の内の１００ｍｇを分取用薄層板（厚さ０．５ｍｍ、２０×２０ｃｍ）１枚に吸着させ、１０％メタノール−クロロホルムで展開し、Ｒｆ値が０．６２から０．５３の部分をかきとり、メタノールで溶出、濃縮して低純度シクロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体２０ｍｇを黄色油状物として得た。これを分取用薄層板に乗せ、５０％酢酸エチル−ヘキサンで展開し、Ｒｆ値が０．５４から０．４５の部分をかきとり、処理してシクロ［１−アザビシクロ［４．４．０］デカ−３−エン−９，１’−シクロペンタン］誘導体４．０ｍｇを白色粉末として得た。
【００２１】
分子式：C23H32O3NCl
1H-NMR(CD3OD) :δ1.01(3H,d,J=7.0Hz,H-22), 1.13(1H,dddd,J=13.0,5.0,4.5,2.0Hz,H-6), 1.29(1H,ddd,J=11.0,5.0,2.0Hz,H-8), 1.43(1H,ddd,J=12.0,10.0,3.0Hz,H-10), 1.50(1H,dddd,J=13.0,13.0,13.0,4.5Hz,H-6), 1.64(1H,ddd,J=11.0,7.0,4.0Hz,H-8), 1.66(1H,m,H-11), 1.68(1H,m,H-11), 1.71(1H,dddd,J=9.5,7.0,5.0,4.5Hz,H-7), 1.73(1H,br.s,H-13), 1.74(1H,m,H-12), 1.75(1H,m,H-12), 1.78(1H,dddd,J=13.0,9.5,4.0,2.0Hz,H-7), 1.98(1H,ddddd,J=19.5,5.3,3.5,1.5,0.5Hz,H-4), 2.18(1H,ddd,J=12.0,7.0,4.0Hz,H-10), 2.56(1H,dddd,J=14.5,3.0,2.5,1.1Hz,H-20), 2.64(1H,ddddd,J=19.5,6.5,4.0,2.5,2.0Hz,H-4), 2.73(1H,qdd,J=8.5,7.0,1.0Hz,H-14), 2.87(1H,ddd,J=14.5,12.5,4.5Hz,H-20), 3.18(1H,dddd,J=13.0,6.5,2.0,1.5Hz,H-5), 3.21(1H,dddd,J=17.5,2.0,1.5,0.5Hz,H-23), 3.45(1H,dddd,J=17.5,4.0,3.5,2.0Hz,H-23), 3.98(1H,ddd,J=11.5,4.5,2.5Hz,H-21), 4.62(1H,ddd,J=12.5,11.5,3.0Hz,H-21), 5.03(1H,ddd,J=7.8,4.5,1.5Hz,H-17), 5.35(1H,ddd,J=15.5,4.5,1.0Hz,H-16), 5.57(1H,ddd,J=7.8,1.1Hz,H-18), 5.76(1H,ddd,J=15.5,8.5,1.5Hz,H-15), 7.03(1H,dddd,J=5.3,2.6,2.0,1.5Hz,H-3).
【００２２】
13C-NMR(CD3OD):δ18.1(C-22), 22.1(C-7), 22.4(C-11), 24.6(C-12), 24.9(C-6), 27.1(C-8), 32.1(C-10), 33.5(C-4), 33.7(C-14), 38.7(C-20), 41.9(C-23), 51.8(C-5), 51.9(C-13), 62.3(C-21), 69.6(C-17), 70.8(C-9), 128.3(C-16), 128.4(C-2), 129.7(C-19), 133.0(C-18), 139.0(C-15), 139.2(C-3), 167.6(C-1).
【００２３】
HR-EIMS(m/Z): 405.2018 (Δ-5.3mmu)(M+).
【００２４】
EI-MS(m/Z): 405, 407.
【００２５】
［α］D25: +240.7°(c 0.54, MeOH)
【００２６】
融点:183.2-185.5℃
【００２７】
IR(cm-1): 3580, 2800-2950, 1710, 1658.
【００２８】
試験例１．ヒトＶＣＡＭ−１産生阻害試験
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＣＳ−ＶＥ）を、ヒトリコンビナント塩基性ＦＧＦ１０ｎｇ／ｍＬを添加した１０％牛胎児血清含有ＣＨＬ−ＭＣＢＤ１３１培地に加え、１×１０4 個／ｍＬに調製してコラーゲンＩ処理した９６穴プレートに０．１５ｍＬづつ分注し、ＣＯ2 培養器（ＣＯ2 ５％、湿度１００％、３７℃）でコンフルエントに達するまで培養した。ヒトリコンビナントＴＮＦ−αを２５Ｕ／ｍＬ添加した１０％牛胎児血清含有ＣＨＬ−ＭＣＢＤ１３１培地１００μＬに交換し、続いて試験化合物を所定の濃度になるように添加した培地１００μＬを加え、ＣＯ2 培養器（ＣＯ2 ５％、湿度１００％、３７℃）で１８時間培養した。培地を除去後、０．３％過酸化水素含有冷却メタノール１００μＬを加え、室温で３０分間静置して細胞を固定し、抗ヒトＶＣＡＭ−１抗体、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ１抗体及び基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いる２抗体法でＶＣＡＭ−１を定量した。測定したＶＣＡＭ−１量の対照群のそれに対する百分率から５０％産生阻害濃度（ＩＣ50）を求めた。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
0003879088.tif 000004
【００３０】
なお、上記化合物について、以下の方法により細胞毒性試験を行い、上記濃度において毒性が認められないことを確認した。
即ち、試験例１と同条件で試料を添加して培養した９６穴プレートに１．１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ水溶液を０．０５ｍＬ分注しＭＴＴ法で生存細胞を計測した。測定値の対照群に対する百分率から５０％増殖阻害濃度（ＩＣ50）を求めた。
結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
0003879088.tif 000005
【００３２】
【発明の効果】
本発明の化合物は細胞毒性を示さない範囲で、ヒト静脈内皮細胞による細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）の産生を阻害し、例えば癌転移抑制剤、抗炎症剤の他、気管支喘息、動脈硬化、移植拒絶反応、慢性関節リュウマチ、サルコイドーシス等の治療薬としての用途を有する。