(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  油中に界面活性剤を溶解して逆ミセルを得；
（ｉｉ）  前記逆ミセルに、単量体、または単量体と予め形成された重合体の混合物の水溶液を加え；
（ｉｉｉ）  前記混合物を重合工程に付し；
（ｉｖ）  溶媒を除去して重合反応生成物を乾燥して乾燥ナノ粒子および界面活性剤を含んでなる乾燥集合体を得；
（ｖ）  水性緩衝液に前記乾燥集合体を分散させ；そして
（ｖｉ）  そこから界面活性剤および他の毒性物質を分離する、
ことを特徴とする、高い単分散性とともに１００ｎｍまでの寸法を有する、高度に単分散された重合体親水性ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）において、架橋剤、開始剤および薬剤または標的物質を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）  油中に界面活性剤を溶解して逆ミセルを得；
（ｉｉ）  前記逆ミセルに、予め形成された重合体の水溶液及び架橋剤を加え；
（ｉｉｉ）  前記混合物を架橋工程に付し；
（ｉｖ）  溶媒を除去して架橋反応生成物を乾燥して乾燥ナノ粒子および界面活性剤を含んでなる乾燥集合体を得；
（ｖ）  水性緩衝液に前記乾燥集合体を分散させ；そして
（ｖｉ）  そこから界面活性剤および他の毒性物質を分離する、
ことを特徴とする、高い単分散性とともに１００ｎｍまでの寸法を有する、高度に単分散された重合体親水性ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記工程（ｉｉ）において、開始剤および薬剤または標的物質を加える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ粒子が１０ｎｍ〜１００ｎｍの寸法を有する、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記単量体および（または）予め形成された重合体が生体適合性であり、非抗原性である、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記単量体および（または）予め形成された重合体がビニルピロリドン、ビニルピロリドンとポリエチレングリコールフマレートとの混合物、ポリビニルピロリドンまたはポリビニルピロリドンとポリエチレングリコールフマレートとの共重合体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記重合体が生体適合性であり、抗原性である、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記重合体がウシ血清アルブミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋剤がＮ，Ｎ−メチレン−ビスアクリルアミド（ＭＢＡ）またはグルタルアルデヒドである、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記開始剤が水溶性ペルジサルフェート塩であり、活性剤がテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）である、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記開始剤がアンモニウムペルジサルフェートである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
重合体物質の重量により１％〜１０％の標的物質が前記ナノ粒子中にカプセル化される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
界面活性剤の０．０１Ｍ〜０．１Ｍが逆ミセルの製造のために使用される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
界面活性剤がビスエチルヘキシルスルホ琥珀酸ナトリウムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記油がアルカンである、請求項１または請求項３に記載の方法
【請求項１７】
前記アルカンがｎ−ヘキサンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
溶媒除去後に、乾燥ナノ粒子および界面活性剤を緩衝溶液に分散し次に塩化カルシウムで処理してナノ粒子から付着している界面活性剤を定量的に除去する、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
水性緩衝液中に分散されたナノ粒子が、緩衝液から未反応物質を除去するために透析される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
透析後分散されたナノ粒子が凍結乾燥され且つ保存される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、封じこめられた（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）標的分子を有するかまたはそれを有しない、１００ｎｍまでの寸法および高い単分散性を有する高度に単分散された重合体親水性ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体系において薬剤の投与後、活性物質はその生理化学的性質および分子構造の機能として体中に分布される。その標的部位に到達する薬剤の最終の量は投与された量のほんのごく少量である可能性がある。非標的部位での薬剤の蓄積は有害な作用および望ましくない副反応を導く可能性がある。それ故に、体の特定部位への薬剤の標的化が必要である。
【０００３】
体中の薬剤の生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を修正する一つの方法は、超微細な薬剤担体中にこれらを取り込むことである。これらの担体としてはリポソーム、ナノ粒子および薬物体（ファーマコソーム：ｐｈａｒｍａｃｏｓｏｍｅ）が広く研究されてきた。薬剤標的化用剤としてリポソームは、主として低い取り込み効率、薬剤不安定性、急速な薬剤漏れおよび貧弱な貯蔵安定性を原因としてその使用が制限されていることが分かっている。これらの問題を克服することを目的として、重合体ナノ粒子の製造が最近２０年間以来検討されてきた。ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの寸法範囲の固体コロイド粒子として定義される。
【０００４】
ナノ粒子カプセル化薬剤に関しての薬剤標的化可能性および持続放出（徐放）作用における最近の進歩について多数の研究が報告されてきた。細網内皮細胞系（ＲＥＳ）に特に注目してインビボ研究がまた報告された。経口および眼経路によるナノ粒子投与に関するインビボ研究の幾つかが、生体内利用可能性がある改良に関して文献にまた報告された。これらの重合体ナノ粒子は非抗原性、生体適合性および生分解性であるべきである。
【０００５】
体の特定部位での標的化のために用いられる粒子の重要な特性は、２つの要因：即ち、（ｉ）ナノ粒子の寸法および（ｉｉ）ナノ粒子の表面特性、により主として影響されることが分かった。
【０００６】
７μｍより小さい粒子および特にナノ粒子は肺中で濾過されずそれらの生体内分布は、細網内皮細胞系（ＲＥＳ）との相互作用により左右される。生分解性ナノ粒子は肝臓中のクッパー細胞により主として吸収され、一方これらの粒子の少量は脾臓および骨髄中のマクロファージにまで進行する。骨髄吸収および他の部位での標的化は粒子寸法を減少させることにより劇的に修正することが出来る。２００ｎｍおよびそれ以上の直径のナノ粒子はＲＥＳとの相互作用に依存しての生体内分布を有する。しかしながら、もし粒子寸法がずっと小さくされ（即ち１００ｎｍ以下）、そして粒子表面が親水性にされるならば、その分布は逆転される可能性がある。例として、これらの粒子を３つの寸法範囲、−６０ｎｍ、１５０ｎｍおよび２５０ｎｍに分離し、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）タイプの界面活性剤を吸着させて表面を親水性にすると、最大表面親水性を有する小さい寸法の粒子はクッパー細胞以外の細胞によって添付図面の図１に示されるようにほとんど吸収される。特に図１は骨髄による、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）界面活性剤で被覆されていないおよびそれで被覆された、ナノ粒子の寸法依存性吸収を示す。血液血清中のこれらの小さな粒子はオプソニン作用による血清蛋白質を吸着せず結果として、血液中のそれらの循環時間はかなり増大される。疎水性粒子はオプソニン作用に起因して非常に迅速に循環から除去される。親水性表面を有するナノメーター寸法の粒子は長時間血液中に残り、その結果特定部位での標的化が容易にされる。
【０００７】
現在、薬剤カプセル化のためのナノ粒子は、所望の薬剤の存在下に、分散された単量体の重合かまたはエマルジョン中に予め形成された重合体の分散のいずれかを包含する方法により調製される。ナノ粒子を調製するための当業界において既知の方法は（ｉ）分散重合方法、（ｉｉ）乳化重合方法、（ｉｉｉ）エマルジョン中の合成重合体ナノ球（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）の分散および（ｉｖ）界面重合技術である。すべてのこれらの方法において水中油型のエマルジョンが使用され、重合体は油相中に形成されるかまたは溶解される。
【０００８】
【発明が解決しょうとする課題】
結果として、重合体物質はそれらが油中に可溶性であるべきなので常に疎水性であり、エマルジョン液滴の平均寸法は殆ど１００ｎｍまたはそれ以上の直径であるので、形成される粒子は大きな寸法（即ち１００ｎｍ以上）のナノ粒子である。さらに、エマルジョン液滴が高度に多分散されるので、形成されるナノ粒子は広い多様な寸法範囲を有し、これらはまた高度に多分散される。したがってこのような公知の方法においては、（ｉ）コロイド寸法以下の寸法のナノ粒子を造ることが出来ない（ｉｉ）エマルジョン媒体は重合体材料が疎水性であるべきことを要求する。したがって、コロイド寸法以下の小さな寸法のナノ粒子であってしかも親水性であり、高度に単分散されたナノ粒子の製造方法の開発が望まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明の目的：  この発明の目的は標的化された物質を有するかまたは標的化された物質を有しない、高い単分散性とともに１００ｎｍまでの寸法を有する高度に単分散された重合体ナノ粒子の新規な製造方法を提供することである。
【００１０】
この発明の別の目的は必要とする寸法に調節することが出来る前記重合体ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【００１１】
この発明の他の目的は標的化された物質を有するかまたは標的化された物質を有しない、コロイド以下の寸法の前記高度に単分散された重合体ナノ粒子の製造方法を提供することである。
この発明のなお他の目的は前記親水性重合体ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【００１２】
この発明の別の目的は、水性緩衝液中に分散され、何ら毒性物質を含有しない前記高度に単分散された薬剤を仕込んだ重合体ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【００１３】
この発明のなお別の目的は、先行技術の粒子に伴う不利な点を防ぐ親水性の種類の高度に単分散された薬剤を仕込んだ重合体ナノ粒子の製造方法を提案することである。
【００１４】
この発明のなお他の目的は、標的薬剤／標的物質が細胞内の標的部位で曝されるまで、インビボでまたは細胞培養インビトロで外部からの干渉（ｏｕｔｅｒｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）から、前記標的薬剤／標的物質を安全に保つために、標的薬剤／標的物質をナノ粒子中に挿入しそして仕込むための方法を提案することである。
【００１５】
発明の記載：  この発明に従えば、工程において：
（ｉ）界面活性剤を油中に溶解して逆ミセルを得、
（ｉｉ）前記逆ミセルに単量体または予め形成された重合体の水溶液を加え、そして必要に応じて、架橋剤、開始剤および薬剤または標的物質を加え、
（ｉｉｉ）前記混合物を重合工程に付し、
（ｉｖ）溶媒を除去して重合化反応生成物を乾燥して乾燥ナノ粒子および界面活性剤を含んでなる乾燥集合体を得、
（ｖ）水性緩衝液中に前記乾燥集合体を分散させ、そして
（ｖｉ）そこから界面活性剤および他の毒性物質を分離する、
ことを特徴とする高い単分散性と共に１００ｎｍまでの寸法を有する、標的化物質を有するかまたは標的化物質を有しない高度に単分散された重合体親水性ナノ粒子の製造方法が提供される。
【００１６】
この発明に従えば、逆ミセル液滴の水性コアはナノ粒子の製造のためのナノリアクター（ｎａｎｏｒｅａｃｔｏｒ）として用いられる。そのような液滴の水性コアの寸法は１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲である。これらの液滴の内側に主として形成される粒子の寸法は液滴の水性コアの寸法より大きい。さらに重合は水性媒体中で起こるので、表面親水性の性質を有する重合体がこの発明により得られる。それ故に、本発明の逆ミセル法を用いて、親水性表面を有する非常に小さな寸法のナノ粒子を造ることが可能であり、その結果、それらのオプソニン作用ならびにＲＥＳによる吸収が実質的に最小にされる。重合反応が行われる逆ミセル液滴が高度に単分散性であるので、本粒子の高い単分散性が可能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
水性相は、光学的に透明なミクロエマルジョン相中に全体の混合物を維持するような方法で調節される。単量体、界面活性剤、あるいは油の極性のような要因により左右されるので、水性相の範囲を規定することはできず、ただ系が光学的に透明なミクロエマルジョン相中にあることがファクターとなる。
本発明に従えば、ナノ粒子は１００ｎｍまでの寸法範囲、好ましくは１０ｎｍ〜１００ｎｍまでの寸法を有する。
【００１８】
本発明に従えば、逆ミセル液滴の水性コアは超微細なナノ粒子を造るための、そして１００〜２００ｋダルトン蛋白質の寸法までの最大寸法の薬剤（通常は水溶性化学物質）をカプセル化するための、ナノリアクター（ｎａｎｏｒｅａｃｔｏｒ）として有効に使用される。本発明の方法により、非常に均一性のそして約１０ｎｍまでにもなる直径の極度に小さな粒子が達成された。
【００１９】
界面活性剤、ビスエチルヘキシルスルホ琥珀酸ナトリウムまたはエーロゾルＯＴ（Ａｅｒｏｓｏｌ  ＯＴ）（即ち、ＡＯＴ）をｎ−ヘキサン中に溶解して、逆ミセルを造る。ヘキサン中のＡＯＴ溶液（通常ヘキサン中０．０３Ｍ〜０．１ＭのＡＯＴ）に、単量体または予め形成された重合体、架橋剤、開始剤および薬剤の水溶液を加え、そして窒素ガスの存在下に重合を行う。より大きな寸法のナノ粒子を得るために追加の量の水が加えられてよい。逆ミセル中に溶解することが出来る薬剤の最大量は薬剤ごとに変わりその量は透明なミクロエマルジョンが半透明な溶液に変換されるまで薬剤の量を徐々に増大させることにより決定されなければならない。すべての原液は燐酸塩緩衝液中で調製され、そしてその内容物は溶液の透明性を確実するために激しく攪拌される。反応混合物は窒素ガスでパージされる。重合は窒素雰囲気下に行われる。次に低圧力下、例えば３５℃の温度で回転蒸発器を用いて溶媒ｎ−ヘキサンを蒸発させて、透明な乾燥集合体が得られる。乾燥集合体を水中に分散しジエチルヘキシルスルホ琥珀酸のカルシウム塩（ＡＯＴからのＣａ（ＤＥＨＳＳ）2 ）のすべてが沈殿するまで、ＣａＣｌ2 の溶液を滴下する。次にその混合物を例えば１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離に付す。カプセル化された薬剤を含有するナノ粒子を含有する上澄み液を傾瀉する。若干のナノ粒子が沈殿物のケーキに吸収されて残る。沈殿したカルシウム（ＤＥＨＳＳ）2 からのナノ粒子の完全な回収のために、前者をｎ−ヘキサン中に溶解しそして水を用いてナノ粒子を抽出する。水性分散液は、例えば１２，０００カットオフ透析膜を通過させて約１時間、直ちに透析しそして液体を凍結乾燥して乾燥粉末にしさらに使用に供するまで低い温度で貯蔵する。
【００２０】
ミクロエマルジョンを用いるナノ粒子の製造のための流れ図を例示する添付図面の図２を参照する。工程Ａは油中に界面活性剤を溶解することにより造られた逆ミセル液滴Ａ１を示す。油中に界面活性剤が溶解されるとき、疎水性成分のテール（ｔａｉｌｓ）Ａ２は油と接触したまま残りそして内部コアＡ３は親水性成分からなるだろう。水が逆ミセルＡ１含有溶液に加えられるとき、親水成分は水に可溶性であるので、水は親水性領域またはコアＡ３にひきよせられる。単量体、架橋剤、所望の薬剤および開始剤は逆ミセルＡ１に加えられる。上記成分は種類において親水性であるので、そのような成分はコアＡ３に進行する。窒素雰囲気下に重合が行われて、工程Ｂにおいて示されるように重合体Ｂ１およびカプセル化薬剤を形成する。工程Ｂにおいて、溶媒の除去のために低圧下蒸発が行われる。工程Ｃはナノ粒子Ｃ１および界面活性剤Ｃ２から構成される乾燥集合体を例示する。乾燥集合体は燐酸塩緩衝液に溶解され次に工程Ｄで３０％ＣａＣｌ2 を加えてジエチルヘキシルスルホ琥珀酸（ＤＥＨＳＳ）カルシウムとして界面活性剤を沈殿させる。工程Ｄはナノ粒子Ｃ１およびカルシウムＤＥＨＳＳを例示する。工程Ｄの溶液を工程Ｅで遠心分離して緩衝液中に分散された透明なナノ粒子およびＣａ（ＤＥＨＳＳ）2 の沈殿物を得る。
【００２１】
Ｃａ（ＤＥＨＳＳ）2 のケーキは若干の吸収されたナノ粒子を含有する可能性があり、これはヘキサン中にケーキを溶解しそして２、３回緩衝液によりナノ粒子を浸出することにより回収されることが出来る。侵出用溶液は溶液Ｅと一緒に集められる。ナノ粒子を含有するそのような緩衝溶液は依然として或る種の未反応物質または毒性物質を含有する可能性があり、これらは２時間その溶液を透析することにより除去され次に凍結乾燥される。
【００２２】
通常、ｎ−ヘキサン中に０．０１〜０．１ＭのＡＯＴを使用する。ビニルピロリドン（ＶＰ）またはビニルピロリドンとポリエチレングリコールフマレート（ＰＥＧＦ）との混合物は、それらが重合の際水溶性ヒドロゲルを形成し高度に生体適合性であるので単量体として使用される。使用される他の適当であるが、しかし抗原性の重合体はウシ血清アルブミンである。他の適当な水溶性ヒドロゲルおよび生体適合性物質がナノ粒子の形成のために使用されることが出来る。ヒドロゲルの場合は、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）を用いて架橋が行われ、アルブミンはグルタルアルデヒドにより架橋される。ＭＢＡで架橋されたポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の場合において、使用される単量体の量は、例えばＡＯＴの約５０重量％であり使用される架橋剤（ＭＢＡ）の量は重合体の１．２％ｗ／ｗである。そのような組成物は最大の貯蔵寿命を有しこの組成物のナノ粒子による薬剤の保持はまた最大である。薬剤の仕込みはミセルシステム中の薬剤の溶解度にしたがって重合体の１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗであるべきであるが逆ミセル中の薬剤の溶解度が高ければ、それはまた増大させることが出来る。
【００２３】
【実施例】
以下の実施例は本発明の例示のために提供され本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【００２４】
実施例  １：抗原仕込みポリビニルピロリドンナノ粒子の製造
アスペルギルス  フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）からの抗原をカプセル化のための薬剤として用いた。ヘキサン中の０．０３Ｍ  ＡＯＴ溶液の４０ｍｌ中に、新しく蒸留した純粋なビニルピロリドンの１４０μｌ、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドの３５μｌ（０．４９ｍｇ／ｍｌ）、１％アンモニウム硫酸第一鉄溶液の２０μｌ、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）の１１．２％水溶液の４０μｌ、開始剤としての５％過硫酸カリウムの１０μｌおよび抗原の１８０μｌ（抗原＝１６ｍｇ／ｍｌ）を加えた。逆ミセル中に加えられるべき過剰の緩衝液の量は、調製されるべきナノ粒子の所望の寸法により決定された。過剰の緩衝液の容量は、ゼロから、ミクロエマルジョン形成が可能であり且つ相分離が起こらない最大量まで変化させることが出来る。溶液は均質であり且つ光学的に透明であった。連続的にかき混ぜながら、恒温浴中で３０℃で８時間Ｎ2 ガスの存在下に重合反応を行った。カプセル化された薬剤を含有するポリビニルピロリドンのナノ粒子が形成された。回転真空蒸発器中で溶媒を蒸発させ乾燥集合体を５ｍｌの水中に再懸濁させた。計算量の３０％ＣａＣｌ2 の溶液を滴下して加えてビスエチルヘキシルスルホ琥珀酸カルシウム塩としてＡＯＴを沈殿させた。遠心分離した水溶液は均質で且つほとんど透明であるナノ粒子を含有する。遠心分離後のカルシウムＤＥＨＳＳのケーキはそれに吸収された若干量のナノ粒子を含有する。それを１０ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解し各回に１ｍｌの水を用いてヘキサン溶液を２〜３回洗浄した。相分離した透明な水性相を排出させて且つもとの濾液とともに集めた。次に、ナノ粒子の合計水性分散液を水に対して約２時間透析（１２，０００カットオフ膜）し透析された溶液を直ちに凍結乾燥して次の使用のための乾燥粉末にした。サンプルはＡＯＴ、単量体、架橋剤およびペルジサルフェートを含有すべきでない。微量の未反応物質および界面活性剤はＨＰＬＣにより検出することが出来た。ペルジサルフェートは澱粉沃素溶液を用いて化学的に検出されＡＯＴの存在は次のとおりに試験された。
【００２５】
乾燥粉末の１ｍｇ／ｍｌの溶液にメチレンブルー染料の１滴を加えた。次に溶液を１ｍｌのｎ−ヘキサンと完全に混合し相分離させた。次にヘキサン層を染料の存在下に５８０ｎｍで分光測光的に試験した。
【００２６】
実施例  ２：ポリエチレングリコールフマレートからナノ粒子を次のとおりにして調製した：
温度計、還流コンデンサーおよび窒素入口を備えた１００ｍｌの３つ首フラスコ中でポリエチレングリコール６００の５ｇ、フマル酸の０．９ｇおよびヒドロキノンの１．２２ｍｇを一緒に混合し７〜８時間１９０℃で加熱した。生成物は室温で緑色がかった黄色の粘稠な液体であった。
【００２７】
０．０６ｍ  ＡＯＴ  ｎ−ヘキサンの４０ｍｌ中に以下の成分を加えた。ポリエチレングリコールフマレートの１００μｌ（０．１８６ｇ／ｍｌ）、新しく蒸留されたビニルピロリドンの１０μｌ、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドの１０μｌ（０．０４９ｇ／ｍｌ）、０．５％アンモニウム硫酸第一鉄の１０μｌ、１１．２％ＴＭＥＤの２０μｌそして場合により、モル重量１６ＫＤ（１６０ｍｇ／ｍｌ）の蛍光イソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）の１０μｌまたは２０μｌ。液滴の寸法に依存して緩衝液の０〜２００μｌが加えられた。
【００２８】
上記溶液中にＮ2 ガスを３０分間通過させ次に激しく攪拌しながら、５％カリウムペルジサルフェートの１０μｌを開始剤として加えた。その後に窒素ガスを３０℃でもう６時間溶液中に通過させた。
【００２９】
ポリビニルピロリドン粒子の場合において前記と同じ方法に従って、水溶液からナノ粒子を回収した。
【００３０】
実施例  ３：  ウシ血清アルブミン−グルタルアルデヒドナノ粒子の製造：
ｎ−ヘキサン中の０．０６ｍ  ＡＯＴの４０ｍｌ中にウシ血清アルブミンの２００μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびミセル液滴の所望の寸法に依存して、０〜６００μｌの水を加えた。透明なミクロエマルジョンが形成されるまで混合物を室温で完全に攪拌した。十分に攪拌した溶液に、５％グルタルアルデヒドの２０μｌを加えナノ粒子形成後さらに３０分間攪拌した。上記ポリビニルピロリドンの場合に記載されたとおりの方法に従って、ＡＯＴ溶液からナノ粒子の水溶液を調製した。
【００３１】
ナノ粒子は以下のとおりに特徴づけられた：
ポリビニルピロリドンナノ粒子中のＦＩＴＣ−デキストラン染料の取り込み効率を、次のとおりにして測定した。繰り返された洗浄物を含む水性抽出液を集めそして１０ｍｌの容量までにした。１００ＫＤ膜フィルターを通過させて５００μｌの溶液を濾過し２μｄの燐酸緩衝液を加えた。溶液の吸光度を、４９３ｎｍで測定した。燐酸塩緩衝液中の遊離のＦＩＴＣの同じ濃度の吸光度を測定した。吸光度における差から取り込み効率が計算され表に示されるとおり、その値はナノ粒子の寸法とは無関係に３９〜４４％範囲にあることが見出された。
【表１】
0003887454.tif 000002
【００３２】
ナノ粒子の寸法はレーザー光散乱測定により測定された。
ナノ粒子の寸法を測定するための動的レーザー光散乱測定はＢＩ２００ＳＭ角度計（ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ）を有するブルックヘブン９０００機を用いて行った。アルゴンイオン空気冷却レーザーを光源として４８８ｎｍで操作した。散乱された強度の強度自己相関関数の時間依存性を１２８チャネルデジタルコリレーター（ｃｏｒｒｅｌａｔｏｒ）を用いることにより誘導した。強度相関データーは累積率の方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｃｕｍｕｌａｎｔｓ）を用いて処理した。水性緩衝液中に分散された粒子の並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）拡散係数（σＴ）は崩壊方程式（ｄｅｃａｙ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いる相関曲線の非線形最小自乗フィット（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｆｉｔ）から得た。並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）拡散係数の値から散乱粒子の流体力学直径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）Ｄｈの平均がストークス−アインシュタィン関係により計算された。
【数１】
0003887454.tif 000003
（但しｋはボルツメン定数であり、ηは絶対温度Ｔでの溶媒の粘度である）。
【００３３】
ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールフマレートおよびウシ血清アルブミンの薬剤仕込みナノ粒子の寸法を測定した。各々のタイプについての代表的なスペクトルを図３に示す。図３（ｉ〜ｉｉｉ）は下記のナノ粒子について示す：
（ｉ）ＦＩＴＣ−デキストランを含有するポリエチレングリコールフマレートから造られたナノ粒子、
（ｉｉ）ＦＩＴＣ−デキストランを含有するポリビニルピロリドンから造られたナノ粒子、
（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドで架橋されたウシ血清アルブミンから造られたナノ粒子。
【００３４】
ミクロエマルジョン液滴の寸法の変化と粒子寸法の変化については、興味あることには、ポリビニルピロリドンナノ粒子の寸法は液滴寸法の増大とともに指数的に（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ）増大するが、ウシ血清アルブミン−グルタルアルデヒドの場合において、ナノ粒子の寸法はおおよそ一定のままである。
【００３５】
インビトロ放出運動（ｋｉｎｅｔｉｃ）研究：
ＦＩＴＣ−デキストランをカプセル化している凍結乾燥ナノ粒子の既知の量を５０ｍｌのポリプロピレンチューブ中で燐酸塩緩衝液塩水の１０ｍｌ中に懸濁させた。チューブを３７℃に維持された水浴中に置いた。予め定められた間隔で、各々のチューブから取り出した５００μｌの容量を１００ＫＤフィルター（ミリポアＵＦＰ２ＴＨＫ２４）中に通過させた。フィルターはナノ粒子を保持し遊離の染料は濾液中に現れた。濾液中の染料濃度を分光測光的に測定した。
【００３６】
図４は異なる種々の仕込みのポリエチレングリコールフマレート粒子からＦＩＴＣ−デキストラン染料の放出を例示する。図４において、曲線Ｘ１は染料の６．４％仕込みを示しＸ２は染料の３．２％仕込みを示す。
【００３７】
抗原カプセル化ナノ粒子を注射することによるマウスにおけるインビボ抗体応答：
ＰＶＰナノ粒子中に取り込まれたアスペルギルス  フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）抗原の３００μｇを含有し、正塩水の１００μｌ中に懸濁されたＰＶＰナノ粒子を７日の間隔で３回マウスに皮下注射した。各々のグループは５匹の動物を有し、そのうちの３匹はナノ粒子に取り込まれた抗原を受容し、１匹は遊離の抗原（３００μｇ）を受容しそして対照は正塩水に懸濁された空のナノ粒子を受容した。予め定められた間隔でマウスを出血させ、そしてマウス血清中のアスペルギルス  フミガーツス特異抗体の量を間接ＥＬＩＳＡ検定を用いて検定した。特異抗体応答を例示する図５において結果を示す。
【００３８】
異なる種々の量の架橋剤を用いてのポリビニルピロリドンナノ粒子中に取り込まれたアスペルギルス  フミガーツスの抗原の特異抗体応答は、０％、０．３％、０．６％および１．２％それぞれの架橋剤を有する、それぞれ曲線Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６で示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】骨髄による、ポロキサマー界面活性剤で被覆されたまたはそれで被覆されていないナノ粒子の寸法依存性吸収を示す棒グラフである。
【図２】本発明のナノ粒子の製造法を示す流れ図である。
【図３】各タイプについてのナノ粒子の代表的なスペクトルを示す棒グラフである。
（ｉ）はＦＩＴＣ−デキストランを含有するポリエチレングリコールフマレートから造られたナノ粒子についてであり、
（ｉｉ）はＦＩＴＣ−デキストランを含有するポリビニルピロリドンから造られたナノ粒子についてであり、そして
（ｉｉｉ）はグルタルールデヒドで架橋されたウシ血清アルブミンから造られたナノ粒子についてである。
【図４】異なる種々の仕込みのポリエチレングリコールフマレート粒子からのＦＩＴＣ−デキストラン染料の放出を示す線グラフである。
【図５】特異抗体応答を示す線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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