(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-グルコース、D-ガラクトース、マルトース、セロビオース、およびラクトースを基質とし、コンドラス・クリスプス（Chondrus crispus）のヘキソースオキシダーゼ（HOX）活性を有するポリペプチドをコードする単離DNA断片またはcDNAであり、以下の（i）〜（iii）より選択されるDNA断片またはcDNA。
（i）配列番号：30に記載の核酸配列のヘキソースオキシダーゼコード領域を含むDNA断片またはcDNA
（ii）配列番号：30記載の核酸配列を含むDNA断片またはcDNA
（iii）配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNA断片またはcDNA
【請求項２】
請求項1記載のDNA断片またはcDNAを含む組換えDNA分子。
【請求項３】
DNA断片またはcDNAが、該DNA断片またはcDNAに本来は連結していない発現シグナルに機能的に結合している、請求項2記載の組換えDNA分子。
【請求項４】
請求項1記載のDNA断片若しくはcDNA、または請求項2〜3記載の組換えDNA分子を含む、宿主細胞。
【請求項５】
細菌細胞、菌類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される微生物細胞である、請求項4記載の細胞。
【請求項６】
大腸菌細胞、乳酸菌細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞からなる群より選択される、請求項5記載の細胞。
【請求項７】
発現シグナルに機能的に結合されたDNA断片を含む請求項4記載の宿主細胞を、培養培地中で培養し、該細胞および／または該培養培地からヘキソースオキシダーゼを回収することを含む、コンドラス・クリスプス（Chondrus crispus）ヘキソースオキシダーゼ（HOX）ポリペプチドの活性を有するポリペプチドを作製する方法。
【請求項８】
宿主細胞が、細菌種、菌種、および酵母種からなる群より選択される微生物である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が、大腸菌細胞、乳酸菌細胞、S．セレビシエ（cerevisiae）細胞、およびP．パストリス（pastoris）細胞からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが実質的に純粋な形状である調製物を得るために、培養培地および／または宿主細胞から最初に回収されたポリペプチド調製物を精製する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドが融合産物である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
D-グルコース、D-ガラクトース、マルトース、セロビオース、およびラクトースを基質とし、ヘキソースオキシダーゼ活性を有する請求項7〜11のいずれかに記載の方法により調製されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドを添加することを特徴とする、食品の製造方法。
【請求項１４】
食品が、酪農食品、デンプン含有食品、および非酪農飲料からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが抗微生物剤または抗酸化剤として機能する、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが食品梱包における酸素除去剤として機能する、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドを添加することを特徴とする、動物飼料の製造方法。
【請求項１８】
動物飼料がサイレージである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
食品中に当初存在する糖の少なくとも一部を除去するのに十分な量の、請求項4記載の宿主細胞、請求項12記載のポリペプチドを、該食品に添加することを含む、食品の糖含有量を低下させる方法。
【請求項２０】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドを添加することを特徴とする、医薬品、化粧品および歯科保護製品からなる群より選択される製品の製造方法。
【請求項２１】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドを練り粉に添加することを含む、練り粉から焼固製品を調製する方法。
【請求項２２】
練り粉中でポリペプチドを発現することのできる請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドと、少なくとも一つの通常の練り粉成分とを含む、練り粉改善用組成物。
【請求項２３】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペントサナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも一つの酵素をさらに含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドが分析用試薬として使用される、試料中の糖含有量を分析する方法。
【請求項２５】
請求項4記載の宿主細胞、または請求項12記載のポリペプチドを用いるラクトンの製造方法であって、該ポリペプチドにより酸化されうる炭水化物を含むリアクターに、該宿主細胞および／または該ポリペプチドを適用すること、ならびに炭水化物がラクトンに酸化される条件下でリアクターを作動させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
発明の領域
本発明は、組み換えDNA技術によりヘキソースオキシダーゼを産生する方法、本発明により産生される該酵素、および食品工業およびその他の領域におけるその利用を提供する。
技術的背景および従来技術
ヘキソースオキシダーゼ（D-ヘキソース：O2酸化還元酵素、EC 1.1.3.5）は、酸素の存在下Dグルコース、ならびにマルトース、ラクトース、およびセルビオースを含むいくつかの他の還元糖を、対応するラクトンへと酸化し、さらに対応するアルドビオン酸へと加水分解する能力のある酵素である。従って、ヘキソースオキシダーゼは、D-グルコースのみを転化できる別の酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼとは、より広範囲の糖基質を利用できるという点で異なっている。ヘキソースオキシダーゼによって触媒される酸化反応は、例えば次のように図示される。
D-グルコース + O2 ---> δ-D-グルコノラクトン + H2O2または
D-ガラクトース + O2 ---> γ-D-ガラクトノラクトン + H2O2
現在までのところ、ヘキソースオキシダーゼ（以下、HOXと呼ぶこともある）は、イリドフィカス・フラシダム（Irydophycus flaccidum）（BeanおよびHassid、1956）およびコンドラス・クリスパス（Condrus crispus）（Sullivanら、1973）のようないくつかの紅藻種からこの酵素を単離することにより産生されてきた。さらに、藻種であるユーソラ・クリスタータ（Euthora cristata）がヘキソースオキシダーゼを産生することが示されている。
これらの天然の起源から単離されたヘキソースオキシダーゼを、ある食品の製造に使用できる可能性が報告されている。このように、イリドフィカス・フラシダムから単離されたヘキソースオキシダーゼは、乳中のラクトースを転化し、対応するアルドビオン酸を産生しうることが示されてきており、乳における酸性化剤として、例えばこの目的で酸性化微生物培養物の代用物となりうるなどの、興味の対象となりうることが示されている（Rand、1972）。この点においてヘキソースオキシダーゼはグルコースオキシダーゼよりも興味深い酵素であると指摘されてきた。なぜなら、グルコースオキシダーゼは、グルコースを含まないか低含量のグルコースしか含まない乳または食品では、グルコースを添加するか、またはラクトースをグルコースおよびガラクトースヘと分解するラクトース分解酵素であるラクターゼを添加した場合にしか酵素的に有効となり得ないためである。このようにしてグルコースがグルコースオキシダーゼのための基質として利用されうるようになったとしても、ラクターゼの最終産物のわずか５０％のみがグルコースオキシダーゼによる基質として利用されるに過ぎず、従ってグルコースオキシダーゼは天然の乳または酪農製品の効率の良い酸性化剤ではないのである。
JP-B-73/016612に開示されているように、ヘキソースオキシダーゼの過酸化水素を生成する能力を含む、酸素酸化還元酵素の能力には、抗菌効果があるため、チーズ、バターおよび果汁を含むある種の食品の保存安定性を改善するために用いられてきた。酸化還元酵素は、食品において酸素除去剤または抗酸化剤としても有用となりうることも示されている。
パン製造および製粉工業では、小麦粉の焼固性を高めるため、伸縮性を改善し望ましい強度および安定性を有する練り粉をつくるために、例えばヨウ素酸塩、過酸化物、アスコルビン酸、臭素酸カリウム塩、またはアゾジカルボンアミドのような酸化剤を使用することが知られている。酸化剤のこの効果の背景にある機構としては、例えば小麦粉の中のグルテンのような穀粉蛋白質は、チオール基を含んでおり、酸化されるとジスルフィド結合を形成してそれによりこの蛋白質がより安定な形を形成して、練り粉の品質、ならびに焼固製品の容量および芯構造に改善をもたらすのである。
しかしながら、現在利用可能な酸化剤のいくつかのこうした使用については、消費者からの反対を受けているか、または規制団体により認可されておらず、従って、こうした従来の穀粉および練り粉の添加剤の代替物を探す努力がなされており、上記の目的のためにグルコースオキシダーゼの使用が従来技術において提案されている。従って、US2,783,150では、練り粉の流動学的特徴を改善するために穀粉にグルコースオキシダーゼを添加することが開示されている。CA2,012,723では、セルロース分解酵素およびグルコースオキシダーゼを含む、パンを改善する薬剤が開示されており、JP-A-084848では、グルコースオキシダーゼおよびリパーゼを含むパンを改善する組成物の使用が示唆されている。
しかしながら、練り粉およびパンを改善する添加物としてグルコースオキシダーゼを使用することについては、練り粉の系において有効となるためには基質としてグルコースが存在することが必要であり、そして一般的に穀物粉のグルコース含有量が低い、という制限がある。例えば、小麦粉中のグルコースの存在量は0〜0.4％（重量/重量）の範囲であり、すなわち、小麦粉にはグルコースは全く含まれていないのと同等である。それゆえ、練り粉の中にグルコースが存在しないかまたは低い含有量であるということは、練り粉の改善剤としてのグルコースオキシダーゼの使用に対して、制限因子となると考えられる。対照的に、新鮮に調製された練り粉におけるマルトース含有量はすでにかなり高く、穀粉の中に天然に存在するか、または添加されたβ-アミラーゼの活性により、さらにマルトースは形成されていく。
現在利用されているヘキソースオキシダーゼの起源は、上記の天然に存在する海藻種からの抽出により単離された、粗精製または部分精製された酵素調製物である。しかしながら、藻中のヘキソースオキシダーゼの量は低いため、この方法での酵素の製造は大変に面倒で経費がかかり、これら自然起源から酵素を費用に関して効率的に工業生産することは明らかに難しい。さらに、効率的なコスト水準で、十分に純粋な酵素産物を準備することは、この手法では容易には達成されない。
それゆえ、天然起源に依存することなく、この工業的に価値のある酵素のより安価な別の起源を提供すること、また、精製された形で、すなわち混在する酵素活性、または好ましくないその他の混入物質、例えば好ましくない藻色素およびヘキソースオキシダーゼ産生藻種が生育する海領域に存在しうる環境汚染物を含まない形で、本酵素を提供することは、工業的に非常に必要とされていることである。
さらに、十分な量で、そしてコストに関して効率的な価格で、食品水準のヘキソースオキシダーゼを工業的に利用することが可能となれば、食品工業ばかりではなく、以下のようなその他の工業分野においても、このような酵素を用いる新たな応用が確実に開かると考えられる。組換えヘキソースオキシダーゼの食品工業におけるこのような新規の応用の一例としては、本酵素の練り粉の改善剤としての利用があり、もう一つの例としては、ラクトンの生産における、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチド、または該ポリペプチドを産生する組換え生物の使用が挙げられる。
発明の概要
本発明により、組み換えDNA技術を用いることにより、食品および医薬品の生産を含む関連のあるいかなる工業目的に対しても極めて適当な品質および精製度のヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドを、工業的に適当な量で、提供することが初めて可能となった。
従って、第一の面として、本発明は、ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法に関する。本方法は、ポリペプチドをコードするDNA断片を単離または合成し、該DNA断片にとって適当な発現シグナルと結合されるような条件で該DNA断片を適当な宿主生物に導入し、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドが発現しうる条件下で宿主生物を培養し、培養液または宿主生物からポリペプチドを回収することを含む。
もう一つの面において、本発明は、以下の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、ヘキソースオキシダーゼ活性を有する単離された形態のポリペプチドに関する。
（i）Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro（配列番号：１）
（ii）Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser（配列番号：２）
（iii）Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe（配列番号：３）
（iv）Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr（配列番号：４）
（v）Tyr-Tyr-Phe-Lys（配列番号：５）
（vi）Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp（配列番号：６）
（vii）Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp（配列番号：７）
（viii）X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met（配列番号：８）
ここで、XはAla、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValからなる群より選択されるアミノ酸、ならびにそれらの変異体および異形体を表す。
さらなる面において、本発明は、ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA断片を含む組換えDNA分子に関し、そして該DNA分子を含む微生物細胞に関する。
他の面において、本発明は、食品または動物飼料の製造、および医薬品、化粧品、または歯科保護製品の製造において、上記ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチド、または該ポリペプチドを発現する微生物細胞を使用することに関する。
別の有用な面において、食品に当初から存在する糖の少なくとも一部を除去するのに十分な量の、本明細書に開示されているポリペプチドまたは微生物細胞を食品に添加することを含む、食品の糖含有量を減少させる方法、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する微生物細胞を練り粉に添加することを含む、練り粉から焼固製品を調製する方法、および本発明によるポリペプチドまたは微生物細胞と、少なくとも一つの通常の練り粉成分とを含む練り粉改善用組成物、が提供される。
別の面において、本発明は、糖含有量を測定するための分析用試薬として、本発明のポリペプチドまたは微生物細胞を利用することに関する。
重要な面において、本発明はまた、該ポリペプチドにより酸化されうる炭水化物を含む反応装置に、ポリペプチドおよび／または微生物細胞を適用し、そして該炭水化物が酸化される条件下で反応装置を作動させることを含む、ラクトンの製造における本発明のポリペプチドまたは微生物細胞の利用を提供する。
発明の詳細な開示
ヘキソースオキシダーゼは、いくつかの海藻種によって天然に産生される。このような種は、スギノリ（Gigartinales）目に属するスギノリ（Gigartinaceae）科に見られる。スギノリ科に属するヘキソースオキシダーゼ産生藻種の例には、コンドラス・クリスパスおよびイリドフィカス・フラシダムがある。ユーソラ・クリスタータ種を含むカクレイト（Cryptomeniales）目の藻種もまた、本発明のヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドの起源となりうる。したがって、このような藻種は、ヘキソースオキシダーゼ、およびヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNAの起源として有用となりうる。本明細書において使用されるように「ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチド」とは、少なくともD-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、マルトース、ラクトース、およびセロビオースを酸化する酵素をさす。
cDNAの構築において利用されるmRNA源として、合成DNAオリゴヌクレオチドのプライマーの構築において出発点として使用しうる藻材料を同定する目的で、天然のヘキソースオキシダーゼの単離にこのような天然の起源を使用する場合、従来技術および本発明においてなされているように、典型的には水性の抽出溶媒を用いた抽出によって藻の出発材料から本酵素が単離される。
このような抽出のための出発材料として、藻は生育する海域から採取された新鮮な状態で用いられてもよいし、例えば常温での空気乾燥、または循環温風または凍結乾燥法による乾燥などの適当な工業的乾燥法によって、葉状体を乾燥させた後使用されてもよい。その後の抽出段階を容易にするため、新鮮な、または乾燥された出発材料は、例えば破砕または混合によって粉末にされてもよい。
水性の抽出溶媒としては、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、20mMトリエチルアミン緩衝液、または20mMトリス塩酸緩衝液のような、pHが６〜８の範囲にある衝溶液が適当である。ヘキソースオキシダーゼは、典型的には緩衝液に出発材料を懸濁し、好ましくは撹拌下、０〜２０℃の温度範囲内、例えば約５℃で、１〜１０日間懸濁物を放置することによって、藻材料から抽出される。
懸濁された藻材料はその後、濾過、篩過、または遠心分離のような適当な分離方法によって水性の溶媒から分離され、その後ヘキソースオキシダーゼが濾過物または上清から回収される。選択的には、分離された藻材料は、一つまたは複数のさらなる抽出段階にかけられる。
いくつかの海藻には、フィコシアニンのような色素が含まれるため、色素を除去するためのさらなる精製段階を濾過物または上清に対して行うことが必要な場合もある。例えば、色素を溶解することができる有機溶媒で濾過物または上清を処理し、その後水性溶媒から溶解した色素を含む溶媒を分離することによって、色素を除去することができる。
水性抽出溶媒からのヘキソースオキシダーゼの回収は、水性溶媒から蛋白質を回収しうるいかなる従来の方法により行ってもよい。このような方法としては、イオン交換クロマトグラフィーなどを行い、選択的にはさらに限外濾過のような濃縮段階を行う方法などが含まれる。それらの方法のいくつかが、以下に詳細に説明される。蛋白質を沈殿させる、例えば硫酸アンモニウムのような物質を添加し、その後沈殿を分離し、そして選択的にはこの蛋白質が溶解するような条件におくことによっても、この酵素を回収することが可能である。
本発明の目的のためには、例えば他の蛋白質または非蛋白質の夾雑物を本質的に含まない調製物のような、実質的に純粋な形態で本酵素を提供することが望ましく、上記抽出および単離段階から生じる比較的純粋でない酵素調製物に対しては、以下の実施例で説明するように、クロマトグラフィー段階、ゲル濾過、またはクロマトフォーカシング（chromatofocusing）といったさらなる精製段階を行うことが好ましい。
上述のように、本発明にかかるヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドは、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子を含む適当な宿主生物細胞を培養培地で培養し、該細胞および／または培養液から酵素を回収することにより製造することができるような、組み換えDNA技術的手法によって提供される。
本明細書で提供されるヘキソースオキシダーゼを製造する方法は、第一段階として、ヘキソースオキシダーゼをコードするDNA断片の単離または構築を含む。このようなDNA断片を調製するにはいくつかの手法が利用可能である。すなわち、DNA断片は本来ヘキソースオキシダーゼを産生する生物由来のものとして単離されうる。コードDNA断片の位置を同定するためには、検索しているDNA断片にハイブリダイズするようなRNAまたはDNAプローブ配列を適当な条件下で配置し、続いてコード配列を含むDNA断片を単離し、適当なクローニングベクターにこれをクローン化することが必要とされる。
別の適当な手法としては、以下の実施例に詳細が開示されているように、ヘキソースオキシダーゼを産生する生物からmRNAを単離し、このmRNAをcDNAライブラリーを構築するための出発点として利用し、このライブラリーをヘキソースオキシダーゼのアミノ酸配列に基づき合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを基礎としたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でのDNA合成のために用いる。この様な手法はヘキソースオキシダーゼをコードするDNA断片を産生するために適当であることが見出された。例として、以下に詳細に説明される手法を総括的に説明する。
合成オリゴヌクレオチドは、本明細書に以下に説明されているようにコンドラス・クリスパスから抽出されたヘキソースオキシダーゼの40kDポリペプチドをendoLys-C消化して調製した、HOX-2およびHOX-3のペプチド配列を基礎として調製された。鋳型として第１鎖cDNAを用い、センス鎖のHOX-2プライマー、およびアンチセンス鎖のHOX-3プライマーを用いたPCRにより、407bpのDNA断片が産生された。この断片は、大腸菌ベクターであるpT7 Blueに挿入され、引き続き塩基配列が決定された。この407bpの断片には、HOX-2およびHOX-3のペプチドのための配列に加え、上記40ｋＤコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ断片のHOX-4およびHOX-5ペプチドを含むオープンリーディングフレームが含まれいることが判明した。この単離については以下においてもまた記載されている。
センス鎖およびアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドが、407bpの断片を基礎として合成され、その後それぞれ800bpおよび1400bpの二つの断片が、鋳型としてcDNAを用いたPCRによって単離された。これら二つの断片がpT7 Blueベクターにクローン化され、引き続き塩基配列が決定された。5'断片のDNA配列には、HOX-6ペプチドを含むオープンリーディングフレームが見られた。それは、上記の40ｋＤのコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ断片からも単離された。同様に、3'断片には、HOX-1、HOX-7およびHOX-8を含むリーディングフレームが見られた。HOX-1の単離は以下に記載する。HOX-7およびHOX-8はいずれも、以下に記載するようにして、endoLys-C消化により得られた29kDのコンドラス・クリスパス由来ヘキソースオキシダーゼポリペプチドから単離されたものである。
上記のような組み合わされたDNA配列を基礎として、推定hox遺伝子の5'端に相当するオリゴヌクレオチドと、該遺伝子の3'端に相当するオリゴヌクレオチドとが合成された。これら２つのオリゴヌクレオチドは、鋳型として第一鎖cDNAを用いたPCRで用いられ、その結果約1.8kbのDNA断片が得られた。この断片は、上記の大腸菌ベクターにクローン化され、塩基配列が決定された。このDNA塩基配列は上記の5'端配列、407bp配列、および3'端配列が結合した配列と同一であり、この約1.8kDのDNA配列は、40kDおよび29kDのコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ断片の両方をコードすると結論付けられた。
当業者にとっては自明であるように、ヘキソースオキシダーゼの単離および特徴付けを含め、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片を単離するための上記の手法は、他の植物または微生物由来などの、上述の海藻種を含むコンドラス・クリスパス以外の他の天然起源に由来するヘキソースオキシダーゼをコードする断片などの作製に対しても使用されうる。
または、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片のDNA配列は、例えばビューケージ（Beaucage）およびカルサーズ（Caruthers）（1981）により説明されているホスホアミダイト法、またはマッテス（Matthes）ら（1984）により説明されている方法のような確立した標準的な手法によって合成的に構築することも可能である。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成装置により合成され、精製され、アニール化され、連結され、適当なベクターにクローン化される。
さらに、DNA断片は、全体のDNA断片の様々な部分に相当する、合成DNA、ゲノムDNA、またはcDNAの副断片を、標準的な手法に従い適当に連結することによって調製された、ゲノムDNAと合成DNAとの混合物、合成DNAとcDNAとの混合物、またはゲノムDNAとcDNAとの混合物であってもよい。
本発明にかかる方法の次の段階としては、単離または合成されたヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片が、DNA断片にとって適当な発現シグナルと機能的に結合されるような条件で、適当な宿主生物に導入される。このような導入は、当業者に周知の方法により行われうるが、このような方法には挿入断片を有するベクターを構築し、このベクターで宿主生物を形質転換することが含まれる。適当なベクターとしては、選択された宿主生物内で複製を行うことのできるプラスミドが含まれる。例えば、トランスポゾンのような転移因子に断片を挿入し、選択された宿主生物およびトランスポゾンの混合物に、トランスポゾンが宿主生物の染色体に組み込まれ、適当な発現シグナルと結合しうるような条件を与えることによる方法などにより、DNA断片を宿主生物の染色体へと組み込むことも本発明に含まれる。
本発明により、上記のような方法または当業者に既知の別の方法により産生される、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドの遺伝子を含む、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片は、発現ベクターを用いて酵素学的に活性のある形態で発現されうる。通常、発現ベクターは、典型的なクローニングベクターの構成成分、すなわち選択された宿主生物におけるベクターの自律的複製を可能とする因子を含み、選別のための一つまたは複数の表現形質マーカーを含む。発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および選択的に、リプレッサー遺伝子または一つまたは複数のアクティベーター遺伝子をコードする、調節配列を含んでいる。発現したポリペプチドを分泌されるようにするためには、シグナル配列がこの遺伝子のコード配列の上流に挿入される。本明細書において、用語「発現シグナル」には、上記の調節配列、リプレッサー配列、アクティベーター配列、およびシグナル配列のいずれもが含まれる。調節配列の調節下で発現するためには、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子は、発現のための適当な様式で調節配列に機能的に結合される。プラスミドベクターに組み込むことができ、ヘキソースオキシダーゼ遺伝子の転写を補助できるプロモーター配列には、tacプロモーターや、PLプロモーターおよびPRプロモーターを含むファージラムダ由来のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のDNA断片を運ぶ発現ベクターは、選択された宿主生物においてヘキソースオキシダーゼ遺伝子の発現を可能とするベクターであればいかなるものであってもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することになると考えられる。すなわち、ベクターは、例えばプラスミド、バクテリオファージ、または染色体外要素、ミニ染色体、または人工的染色体などのように、自立的に複製するベクター、すなわち染色体外の因子として存在し染色体の複製とは独立に複製を行うベクターであってもよい。または、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、染色体とともに複製がおこるものであってもよい。
このベクターにおいて、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片は、適当なプロモーター配列と機能的に結合している必要がある。プロモーターは、選択された宿主生物に対して転写活性を与えるものであればいかなるDNA配列であってもよく、宿主生物に対して同種または異種のいずれの蛋白質をコードする遺伝子由来であってもよい。細菌宿主において本発明のDNA断片の転写を可能にする適当なプロモーターの例としては、大腸菌のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリコロー（Streptomyces）のアガラーゼ遺伝子のdagAプロモーター、バチルス・リシェニフォーミス（Bacillus licheniformis）のα-アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のマルトース生成に関与するアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefacience）のα-アミラーゼ遺伝子（amyQ）のプロモーター、枯草菌（Bacillus subtilis）のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーターがある。
菌類種での転写に対しては、有用なプロモーターの例としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のアルコール酸化酵素、コウジカビ（Aspergillus oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテアーゼ、クロカビ（Aspergillus niger）の中性α-アミラーゼ、クロカビの酸耐性α-アミラーゼ、クロカビのグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼ、コウジカビのアルカリ性プロテアーゼ、コウジカビのトリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターがある。酵母種での発現のために適当なプロモーターの例としては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）のGal 1プロモーターおよびGal 10プロモーターが挙げられる。大腸菌のような細菌種で発現される場合には、適当なプロモーターとして、T7プロモーターまたはラムダバクテリオファージプロモーターなどのバクテリオファージプロモーターから選択してもよい。
ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片を含むベクターにはまた、例えばその産物が栄養要求性の表現型を与える変異のような宿主生物での欠損を補償する遺伝子であるような、選択可能なマーカーが含まれ、またはこのマーカーは抗生物質耐性または重金属イオン耐性を与えるようなものであってもよい。
上述のようなDNA構築物または発現ベクターのいずれかを含む本発明の宿主生物は、本発明にかかるポリペプチドの組み換え生産において宿主として有利に使用される。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含むDNA構築物によって細胞を形質転換してもよいし、都合よく、宿主の染色体にDNA構築物を導入してもよい。このような導入は、DNA断片が細胞内でより安定に維持されやすいので、一般的には有利であると考えられる。DNA構築物の宿主染色体への挿入は、例えば相同的組み換え、非相同的組み換え、または転移因子を用いた従来の方法に従って行なってもよい。または、宿主生物は、上記のような発現ベクターで形質転換されてもよい。
本発明に従って、宿主生物は哺乳類、鳥類、または昆虫の細胞などの動物細胞、または植物細胞のような高等生物の細胞であってもよい。しかしながら、好ましい態様において、宿主生物は、微生物細胞、例えば細菌の細胞または酵母細胞のような菌類の細胞である。
適当な細菌の宿主生物の例としては枯草菌、バチルス・リシェニフォーミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンツス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアローモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウツス（Bacillus lantus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）およびバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のようなバチルス科、ストレプトミセス・ミュリヌス（Streptomyces murinus）のようなストレプトミセス種、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のようなラクトコッカス種、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）を含むラクトバチルス種、リューコノストック種、およびストレプトコッカス種などが含まれる乳酸細菌種といった、グラム陽性細菌種がある。または、大腸菌を含む腸内細菌科またはシュードモナス科に属する種のようなグラム陰性細菌種株もまた、宿主生物として選択されうる。
酵母の宿主生物は、パン酵母を含むサッカロミセス種またはシゾサッカロミセスに属する種から有利に選択されうる。糸状菌の中で適当な宿主生物には、例えばコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス、またはクロカビのようなアスペルギルス種が含まれる。または、例えばフサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）のようなフサリウム種またはリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のようなリゾムコル種の株も宿主生物として使用されうる。一つの好ましい態様としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）種の株が宿主生物として使用される。
菌類種またはグラム陽性細菌種のような上記の有用な宿主生物のいくつかは、それ自体既知の方法で、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む方法によって形質転換されうる。
ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドの産生のために、上記のような組換え宿主生物の細胞は、回収可能な形態でポリペプチドが発現されるような条件下で培養される。細胞を培養するために用いられる培養液は、問題となっている宿主細胞を培養し、ポリペプチドを発現させるのに適当な、いかなる従来の培地であってもよい。適当な培地は、商業的な供給源から入手可能であり、また開示されている方法に従って調製されてもよい。
結果として得られるポリペプチドは、典型的には従来の手法によって培養液から回収される。こうした手法には、必要に応じて細胞を破砕した後に、遠心分離または濾過によって培養液から細胞を分離し、その後、例えば硫酸アンモニウムのような塩を添加することによって上清または濾過物の蛋白質成分を沈殿させ、次に精製段階を行うことが含まれる。
食品または飼料製品の製造で用いられる細菌培養物などの微生物培養物を、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主生物として利用することができる点は、本発明の産業上便利な面である。すなわち、酪農製品、または食肉製品もしくはワインのようなその他の食品の製造に使用される、例えば上記の乳酸細菌種のいずれかから選択された一つまたは複数の乳酸細菌株を含む乳酸細菌初期培養物は、初期培養物が添加された食品中に直接的にヘキソースオキシダーゼを産生する宿主生物として使用することが可能である。
同様に、牧草またはトウモロコシのような飼い葉作物、または動物飼料用のサイレージの産生のための魚・畜殺場の廃棄物のような動物由来の蛋白質性廃棄物に、接種物として添加される乳酸細菌初期培養物の中に、本発明にかかるヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子を導入してもよい。この目的では、サイレージ接種物によるヘキソースオキシダーゼの発現は、サイロに貯蔵されている飼い葉作物または廃棄物の中に本来存在する酸素が枯渇し、それによって無気的状況が確立され、グラム陰性細菌および酵母のような好気的腐敗生物の増殖が抑制されるということを意味する。
パン酵母のようなパン酵母培養物、またはワインおよびビールを含むアルコール性飲料の製造に使用される酵母培養物も、本発明のヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードする遺伝子に対する宿主生物として使用されうる。このような組換えパン酵母株の場合では、産生されるヘキソースオキシダーゼは、以下に説明されているように、練り粉を改善する効果を有するであろう。
上記のことから、ヘキソースオキシダーゼ活性が必要な食品または他の製品に、本発明にかかるヘキソースオキシダーゼを発現する組換え微生物培養物を直接的に添加すれば、単離された酵素の添加に代わるものとして使用されうることは明かである。
さらに工業的に重要な態様では、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドを発現する組換え微生物培養物は、この酵素の産生、またはヘキソースオキシダーゼ活性酵素により酸化されうる上記の炭水化物のいずれかからのラクトン産生のために、バイオリアクター内で使用される。この後者の応用では、微生物培養物の細胞は、好ましくは細胞を結合するための広い表面を提供する小粒子の形態にある、ポリマー材料のような固相支持体上に有用に固定化される。または、単離された酵素を、上記の目的のために用いることもでき、また好ましくは固相支持物質に結合させることもできる。この点について、細胞または酵素の結合はこの目的のための従来のどのような方法によって提供されてもよい。
本発明の別の有用な態様では、ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドは、融合産物、すなわちヘキソースオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列に加えてその他の有用な活性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。すなわち、ヘキソースオキシダーゼ活性に加えて一つまたは複数の酵素活性を有する融合ポリペプチドが考えられる。このような追加される酵素活性としては、ラクターゼ、グルコアミラーゼを含むアミラーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ラクターゼのような炭水化物を分解する酵素、またはグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼもしくはピラノースオキシダーゼのような他の酸化還元酵素から選択されてもよいし、また、プロテアーゼおよびペプチダーゼ、リパーゼ、またはヌクレアーゼの中から選択されてもよい。本発明にかかるヘキソースオキシダーゼポリペプチドに挿入されるために選択される追加の酵素配列は、酵素学的に活性のある融合産物を意図される、その産物に依存している。すなわち、例えば、酪農製品を製造する際に使用されるヘキソースオキシダーゼ活性を有する融合ポリペプチドは、有利に、ラクターゼ、プロテアーゼ、またはペプチダーゼを含みうるし、練り粉の改善のための融合ポリペプチドは、融合パートナーとして上記の炭水化物分解酵素のいずれかを含みうる。追加の酵素活性を有するヘキソースオキシダーゼ活性を有する融合ポリペプチドを発現する、上記のような本発明にかかる微生物細胞は、上記のような方法で、その他の食品および動物飼料の接種のために使用することが可能であることもまた明かである。
適当な融合パートナーは、ヘキソースオキシダーゼに、改変した溶解性などの性質を与える配列、またはヘキソースオキシダーゼに、ヘキソースオキシダーゼポリペプチドの精製もしくは固定化の目的のため、より強固により選択的に特定の固体物質に結合する能力を与えるような「標識」グループとして機能しうる配列であってもよい。
さらに、異なる起源に由来するヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドの部分配列を含み、そしてこれら異なる起源由来のヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドのDNA配列を、キメラポリペプチド全長をコードするDNA断片に結合させることにより構築されるDNA断片によりコードされるような、キメラ産物としてポリペプチドを提供することは、本発明の範囲内である。
一つの有用な態様において、本発明による方法は、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片が、以下の配列からなる群より選択されたアミノ酸配列をコードする、少なくとも一つのDNA配列を含むような方法である。
（i）Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro（配列番号：１）
（ii）Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser（配列番号：２）
（iii）Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe（配列番号：３）
（iv）Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr（配列番号：４）
（v）Tyr-Tyrr-Phe-Lys（配列番号：５）
（vi）Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp（配列番号：６）
（vii）Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp（配列番号：７）
（viii）X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met（配列番号：８）
ここで、Xは、Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValからなる群より選択されるアミノ酸、ならびにこれらの変異体および異形体を表す。
本明細書において、用語「異形体」は、ヘキソースオキシダーゼ活性を完全に失うことのないようなヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチド配列に対するあらゆる改変を呼ぶために使用される。このような改変には天然の起源に由来するポリペプチド、またはすでに改変の加えられたポリペプチド配列に存在するアミノ酸残基に対し欠損および置換を行うことを含みうるし、このような改変はそうしたポリペプチドにアミノ酸残基を付加するような挿入を含みうる。一つまたは複数のアミノ酸残基の置換は、例えば特に部位特異的変異導入のようなそれ自体公知の方法を用いて変異導入法により、置換にとって適当な一つまたは複数のアミノ酸をコードする一つまたは複数のコドンを改変または置換することにより行われうる。同様に、一つまたは複数のアミノ酸残基の欠損は、本発明によるポリペプチドをコードするようなDNA断片中の対応する一つまたは複数のコドンを欠損させることにより作製されうる。
上述のように、本発明による方法は、さらなる段階として、培養液および／または微生物から最初に回収されたポリペプチド調製物を精製することを含みうる。このさらなる段階の目的は、ヘキソースオキシダーゼポリペプチドが実質的に純粋な形態で含まれる酵素調製物を得ることである。用語「実質的に純粋な形態」とは、培養液、産生宿主生物の細胞、または培養中の細胞によって産生される物質に由来するいかなる望ましくない混入物質も、この調製物には含まれていない、ということを意味する。すなわち、精製段階から得たポリペプチド調製物には非ヘキソースオキシダーゼ酵素活性が実質的に存在しないということが、多くの応用に対して重要なのである。精製法は、目的の精製の程度によるが、以下の実施例に説明されている方法のように、脱塩、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィー法、およびゲル濾過法のような、従来の蛋白質精製法から典型的には選択されることになろう。
上述のように、本発明は、さらなる面において、上記アミノ酸配列、または上記のような変異体および異形体の少なくとも一つを含む、ヘキソースオキシダーゼ活性を有する単離形態でのポリペプチドに関する。好ましくはポリペプチドは上記のような方法に従って産生される。
産生の方法、特に問題となっている宿主生物に依存して、本発明によるポリペプチドは様々な程度までグリコシル化されていてもよいし、ある目的に対しては実質的に非グリコシル化された形態で発現されたほうが有利な場合もある。
本発明の好ましい態様では、ポリペプチドは、機能的特徴の点で、従来技術において説明されているような藻種コンドラス・クリスパスに天然に存在するヘキソースオキシダーゼのポリペプチドに同一であるか、部分的に同一なものである。本明細書に説明されているようなSDS-PAGEにかけられたとき、藻の起源から抽出されたこのようなヘキソースオキシダーゼは、29、40および／または60kDの独立した蛋白質のバンドを示しうることが見いだされた。
ポリペプチドを一般的に費用に関して効率的に使用するために、酵素は広いpH範囲にわたり高い酵素活性を有することが好ましい。すなわち、本発明によるヘキソースオキシダーゼは、少なくともpHが1〜9の範囲、例えば2〜9の範囲、例えば5〜9の範囲で酵素活性を示すことが好ましい。この点に関して、天然に由来するヘキソースオキシダーゼの活性のあるpH範囲または至適pHは、上記のように酵素を改変することにより、またはヘキソースオキシダーゼをコードしているDNAを含むレプリコンもしくは宿主生物のランダム変異導入を行い、次に目的の変化したpH特質を有する変異株を選択することによって、望ましい方向へ、望ましい程度に修飾することが可能である。または、本酵素のこのような改変は、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドの活性に対する温度耐性および至適温度を改変すること、または酵素の等電点を変化させることを目的としてもよい。
さらに、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、10〜90℃の範囲、例えば15〜80℃の範囲、例えば20〜60℃の範囲内のような広い温度範囲で酵素学的に活性を有する。特に、ある特別な目的では、例えば、その後の焼固段階の少なくとも一部においてヘキソースオキシダーゼ活性を有することが有用でありうるような、練り粉に対してこの酵素が使用される場合には、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドは、70℃またはそれ以上の高い温度で顕著な残存酵素活性を維持することが好ましい。
ヘキソースオキシダーゼの応用の範囲は、基質として使用することのできる炭水化物の範囲に依存している。ヘキソースオキシダーゼはグルコース、ガラクトース、およびマンノースのようなヘキソースに対して最も高い基質特異性を有することが明かとなっているにもかかわらず、本発明によるポリペプチドに対する基質として使用されうる炭水化物の範囲はヘキソースに限定されないことも見出された。すなわち、好ましいポリペプチドは、ヘキソースに対する高い特異性に加えて、ラクトース、マルトースおよび／またはセルビオースのような二糖類を含む他の炭水化物に対しても高い特異性を有しており、例えばキシロースを含むペントース、またはデオキシペントース、またはラムノースもしくはフコースのようなデオキシヘキソースに対してさえも実質的な特異性を有している。ヘキソースおよび他の単糖類に対する高い特異性に加え、ヘキソースオキシダーゼはまた二糖類、特に乳中に存在するラクトース、ならびに穀粉および練り粉に存在するマルトースに対しても相当な特異性を有していることは、実用性が非常に高いことを示す。
従って、別の好ましい態様では、本発明によるポリペプチドは、D-グルコースに加え、D-ガラクトース、マルトース、セロビオース、ラクトース、D-マンノース、D-フコースおよびD-キシロースからなる群より選択される少なくとも一つの糖を酸化するものである。
なお別の好ましい態様では、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドは4〜5の範囲の等電点を有する。具体的には、ポリペプチドは、好ましくは等電点4.3±0.1または等電点4.5±0.1を有する。
一般的に、本発明によるポリペプチドは、典型的には100〜150kDの範囲にあるようなセファクリルS-200スーパーファイン（Sephacryl S-200 Superfine）（ファルマシア（Pharmacia））を用いたゲル濾過法により決定される分子量を有する。本方法、もしくは等価な方法によって決定される分子量はまた、見かけの分子量とも呼ばれる。具体的には、ポリペプチドは、110kD±10kDの見かけの分子量を有しうる。
さらに別の面として、本発明はヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドをコードするDNA断片を含む、組み換えDNA分子を提供する。上述のように、このようなDNA断片は天然の起源から単離してもよいし、例えば、以下の実施例に詳細に説明されているようにして構築してもよい。さらに、コード断片は、天然に存在するヘキソースオキシダーゼのアミノ酸配列に基づき合成することも可能である。組換え分子は、上記のような発現ベクター型のいずれから選択してもよい。好ましい態様においては、組換えDNA分子は、上記のアミノ酸配列（i）から（viii）、または該ポリペプチドの変異体もしくは誘導体の少なくとも一つを含むヘキソースオキシダーゼポリペプチドをコードするDNA断片を含む。一つの特定の態様において、組換えDNA分子は、以下のDNA配列（配列番号：３０）を含む。
0003917183.tif 000002
0003917183.tif 000003
さらに、本発明はもう一つの面において、上記組み換えDNA分子を含む微生物細胞を提供する。本発明によるポリペプチドをコードするDNA断片を含む宿主生物の上記の一般的な説明は、このような微生物細胞を包含しており、したがって、該細胞は上記の微生物群、科、属、および種のいずれかから選択されうる。すなわち、微生物細胞は、例えば、大腸菌細胞、乳酸細菌細胞、パン酵母細胞、およびピキア・パストリス細胞のような、細菌細胞、菌類細胞、および酵母細胞から選択されうる。
本発明による微生物細胞は、例えば製造過程中などにヘキソースオキシダーゼ活性を有することが望ましい製品に直接添加する場合、微生物培養物の形態で、好ましくは濃縮された形態で供給されてもよい。すなわち、このような培養物は、好ましくは、培養物の1gあたり105から1012の範囲の濃度で、本発明による微生物細胞を含みうる。培養物は、新鮮な培養物、すなわち液体培地の細胞の非凍結懸濁液であってもよく、または凍結または乾燥した形態、例えば凍結乾燥培養物であってもよい。微生物細胞はまた、特定の目的のために、固体基質に固定化されてもよい。
上記のように、さらにもう一つの面において、本発明は、食品の製造において、本発明によるヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチド、または該ポリペプチドを発現する微生物細胞の使用に関する。本明細書において、用語「製造」とは、その後の処理工程の前、間、後、包装中、最終産物の保存中それが消費されるまで、ヘキソースオキシダーゼまたは微生物細胞を問題となっている食品のための成分に添加することを含むような、最も広い意味で理解されるべきである。そのような利用に利点がある食品は、ヘキソースオキシダーゼの最終産物が食品に有利な効果を与えるならばいかなる製品であってもよい。
天然には、ヘキソースオキシダーゼの望ましい活性は、この酵素に対する基質が十分量存在するときにのみ得られる。基質炭水化物は、本明細書のための食品または成分中に本来存在するものであってもよいし、または製造工程中に添加されるか作出されてもよい。製造過程で作出される基質の例としては、二糖類、オリゴ糖類、多糖類を、食品に本来存在するかまたは製造中に添加される酵素の酵素学的活性の結果として生じるヘキソースオキシダーゼにより分解可能な低分子糖物質へと酵素的に分解されるものである。さらに、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドに対する基質は、上記の融合パートナーの酵素学的活性の結果としても作出される。
ヘキソースオキシダーゼ活性の望ましい効果は、この酵素に対する基質を含む製品における、糖基質からのラクトン生成およびその後の対応する酸への添加、過酸化水素形成、ならびに、酸素の消費が含まれる。
ヘキソースオキシダーゼ活性が有利となる食品の典型的な例としては、例えば酪農製品、デンプン含有食品、および非酪農飲料が含まれる。ここで、酪農製品の範囲の製造においては、pHを下げることが望ましい。それは、通常、牛乳に乳酸産生初期培養物を接種することにより行われる。上記のように、ヘキソースオキシダーゼまたは該酵素を発現する生物は、牛乳を酸性化する別の手段として使用されうる。乳酸微生物初期培養物の添加によって現在酸性化されているある食肉製品または野菜製品のような、製造過程で酸性化される他の食品においても、同様な効果が望ましいと考えられる。
ヘキソースオキシダーゼ活性から生じる酸素の消費は、食品および医薬品の製造に関して、いくつかの有利な点を含む。酸化腐敗過程を受けやすい脂質を含む食品および医薬品の製造において酸素を枯渇または除去することにより、ヘキソースオキシダーゼは抗酸化剤として機能しうるし、さらに、酸素含有量の減少によって、生育が酸素の存在に依存している腐敗微生物が阻止されるため、ヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドは抗微生物剤としても機能しうる。
この後者の効果は、包装された食品の保存期間を延長させるためにも使用されうる。この場合、食品そのものへ、またはヘキソースオキシダーゼとその適当な基質を包装物の中に混合して、しかし食品の内容物とは分離して、本発明によるヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドを付与することにより、腐敗が防止されうる。典型的な例としては、このような混合物は例えば缶またはビンのような食品保存容器の内側に付着させられる。このように、本発明によるヘキソースオキシダーゼは、食品梱包における酸素除去剤として使用されうる。
食品の製造における本発明によるポリペプチドの上記の効果は、明らかに、動物飼料製品の製造にもまた応用可能である。特に、牧草またはトウモロコシのような飼い葉作物、または畜殺場もしくは魚処理プラントからの蛋白質性の動物廃棄製品からサイレージを作るときに、こうした効果が望ましい。このような飼料製品は、現在、酸または乳酸細菌接種物のような酸産生細菌を添加することによりサイレージ化されている。酸性化細菌の増殖を促進し、グラム陰性細菌および酵母のような好気性腐敗生物の増殖を抑制するためには、サイレージ中の酸素含有量が低いことが必須である。それ故、飼料をサイレージ化するときに、選択的には乳酸細菌接種物または低分子糖物質を産生する酵素のような従来の新鮮保存物への添加物を一つまたは複数さらに含むような組成物の形態で、酸素除去剤および酸性化剤として、本発明によるヘキソースオキシダーゼは有用である。
本発明によるヘキソースオキシダーゼポリペプチドのさらに別の有用な応用は、食品に当初存在する糖の少なくとも一部を除去するのに十分な量のポリペプチドまたはポリペプチドを産生する微生物細胞を製品に添加することを含む、食品の糖含有量を低下させるための本酵素の利用である。このような応用は、例えば、低糖含有量が望ましい糖尿病患者食の作製、および低アルコール含有量のワイン作製において有用である。後者の応用においては、好ましくは、酵母の接種に先立ち発酵前果汁にヘキソースオキシダーゼが添加される。
さらに有用な面において、本発明は、医薬品、化粧品、もしくは歯磨剤または歯科製品のような歯科保護製品の製造における、本発明によるヘキソースオキシダーゼ活性ポリペプチドまたは本酵素を産生する微生物細胞の使用に関する。このような製品におけるヘキソースオキシダーゼの望ましい効果は、本質的には食品および動物飼料に関して上述したものと同様である。
本発明によるヘキソースオキシダーゼの特に重要な用途は、練り粉改善剤としての使用である。練り粉にヘキソースオキシダーゼを添加することにより、練り粉が引き延ばされたときの切断に対する抵抗性が増加することが見いだされている。すなわち、この酵素は、練り粉に、機械的な変形を受けにくくなるような伸張性の増大を与える。この点に関して、グルコースオキシダーゼで知られている効果に基づくと、本発明によるヘキソースオキシダーゼの練り粉への添加の効果は、練り粉中の酵素によって生成される過酸化水素がそれにより酸化されるチオール基と反応した場合に起こる、粉蛋白質における硫黄含有アミノ酸でのチオール基間の架橋形成の結果であると考えられる。
したがって、本発明は、本発明によるポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現しうる微生物を有効量練り粉に添加することを含む、練り粉から焼固製品の調製方法を提供し、練り粉中で本発明によるポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現しうる微生物と、少なくとも一つの従来の練り粉成分とを含む、練り粉改善用組成物もまた提供する。有用な態様において、このような組成物は、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびプロテアーゼから選択される練り粉または焼固製品改善酵素の少なくとも一つをさらに含んでいてもよい。
さらに別の本発明の面として、ヘキソースオキシダーゼは生物学的試料、およびその他の試料における、本酵素により転化されうる糖の濃度を決定する方法における分析用試薬として使用される。典型的には、糖含有量は、測定すべき試料に存在する基質糖の酵素的転化により生じる、最終産物の量を決定することにより測定される。これに関して、ヘキソースオキシダーゼは、インビトロでの分析アッセイでの試薬として直接的に使用されうるし、またはセンサーに本酵素が取り込まれることも考えられる。
本発明は、以下の実施例および添付の図による例示により説明される。
図１はヘキソースオキシダーゼ（HOX）の精製の概略、およびアミノ酸配列情報を得るために用いられた二つの手法を示している。
図２は異なる精製段階におけるヘキソースオキシダーゼの生成物の、非変性の、非乖離ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非変性PAGE）を示している。試料は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび濃縮の後に得られた酵素調製物（レーン１）、ゲル濾過後の酵素調製物（レーン２）、および、陽イオン交換クロマトグラフィー（レーン３）またはクロマトフォーカシング（レーン４）の後に得られた酵素調製物を示す。ファストゲル（Phast gel）（ファルマシア、8〜25％勾配ゲル）は銀染色された。標準蛋白質の分子量（x 10-3）が左に示されている。ヘキソースオキシダーゼに相当するバンドは、矢印で示されているが、平行して行われたもう一枚のゲルの酵素染色により同定された。４つのレーンは独立したゲルで泳動された。
図３は本文に説明されているようなヘキソースオキシダーゼのファクリルS-200HRでのゲル濾過による精製で得られた紫外線プロファイルを示す。ヘキソースオキシダーゼ（HOX）活性を含む画分がぬりつぶされた領域で示されている。
図４はコンドラス・クリスパスから、DEAE-セファロースファーストフロー（Fast Flow）での陰イオン交換クロマトグラフィー、セファクリルS-200でのゲル濾過、続いてS-セファロースファーストフローでの陽イオン交換クロマトグラフィー（レーン１）またはモノP（Mono P）カラムでのクロマトフォーカシング（レーン２）によって精製されたヘキソースオキシダーゼのSDS-PAGEを示している。標準蛋白質の分子量（x 10-3）が左に示されている。60kD、40kDおよび29kDのポリペプチドが矢印で示されている。還元された試料は、12％ポリアクリルアミドゲルで泳動され、クーマシーブリリアントブルーR-250で染色された。二つのレーンは独立したゲルで泳動された。
図５はヘキソースオキシダーゼの等電点フォーカシング（IEF）を示している。ゲルはクーマシーブリリアントブルーR-250で（レーン１）、または本文に説明されているように酵素活性に対して（レーン２）染色された。平行して泳動された等電点マーカーの位置は左に示されている。二つのレーンは独立したゲルで泳動された。
図６は40kDのHOXポリペプチドのエンドプロテアーゼLys-C消化により生成したペプチドの逆相HPLC分離を示している。1、2、3、4、5と表示されたピークはアミノ酸配列分析にかけられた。
図７は29kDのHOXポリペプチドのエンドプロテアーゼLys-C消化により生成したペプチドの逆相HPLC分離を示している。1、2と表示されたピークはアミノ酸配列分析にかけられた。
図８はコンドラス・クリスパスから抽出されたRNAのノーザンブロット解析を示している。変性アガロースゲルに対して全RNAがそれぞれ30μg（レーン１）、3μg（レーン２）かけられた。左の矢印はヘキソースオキシダーゼ特異的転写物を示している。分子量マーカーの位置はkbで右に示されている。
図９はピキア・パストリスにおける組換えヘキソースオキシダーゼの発現を仲介するプラスミドpUPO153の構築を示す。小さい矢印はPCRプライマーを示している。灰色の枠はヘキソースオキシダーゼ遺伝子を示している。
図１０はハイトラップ-Q（HiTrap-Q）カラムでの陰イオン交換クロマトグラフィー（第一段階）によるピキア・パストリスからの組換えヘキソースオキシダーゼの精製を示す。収集画分中のアルコールオキシダーゼ（AOX）活性（●）およびヘキソースオキシダーゼ（HOX）活性（○）は本文に説明されているようにアッセイされた。
図１１はセファクリルS-200HRでのゲル濾過（第二段階）による、ピキア・パストリスからの組換えヘキソースオキシダーゼの精製を示す。収集画分中のアルコールオキシダーゼ（AOX）活性（●）およびヘキソースオキシダーゼ（HOX）活性（○）は本文に説明されているようにアッセイされた。
図１２は大腸菌における組換えヘキソースオキシダーゼの発現を仲介するプラスミドpUPO181の構築を示す。小さい矢印はPCRプライマーを示している（灰色の枠はヘキソースオキシダーゼ遺伝子を示している）。
図１３は大腸菌で産生された組み換えヘキソースオキシダーゼのSDS-PAGEを示す。溶解された細胞からの粗精製抽出物は14％変性ゲルで解析された。標準蛋白質の分子量（x 10-3）が左に示されている。ゲルはクーマシーブリリアントブルーR-250で染色された。レーン１はpUPO181を有する大腸菌からの抽出物を示す。レーン２はプラスミドを有しない対照を示す。矢印はヘキソースオキシダーゼのバンドを示す。
図１４はパン酵母における組換えヘキソースオキシダーゼの発現を仲介するプラスミドpUPO155の構築を示す。小さい矢印はPCRプライマーを示している。灰色の枠はヘキソースオキシダーゼ遺伝子を示している。
実施例１
コンドラス・クリスパスからのヘキソースオキシダーゼの精製
本酵素の精製の概略、およびアミノ酸配列情報を得るために用いられた二つの手法は、図１に示されている。
1.1  コンドラス・クリスパスの採取、乾燥、および粉砕
紅海藻であるコンドラス・クリスパスはデンマーク、ジュットランド（Jutland）のグレナ（Grena）の近くの海岸深さ２〜５メートルのところで、４月から９月にかけて採取された。新鮮に採取された藻葉は冷水で洗浄され、研究室への運搬中は氷中で保存された（２４時間以内）。海藻はその後直ちに乾燥されるかまたはその後の処理を行うまで凍結状態で保存された。酵素精製のため、材料は-18℃で保存され、一方mRNAが回収される予定の材料は液体窒素中に保存された。
コンドラス・クリスパスの葉は４℃で解凍され、２〜３日室温（２０〜２５℃）で風乾された。乾燥材料はワーリング・コマーシャル・ブレンダー（Waring Commercial Blendor）（34BL97モデル、Waring社、米国コネティカット州ニューハーフォード）で細かく粉砕された。
1.2  酵素の抽出
約500gのコンドラス・クリスパス粉末が2.5lの20mMトリス塩酸（pH7.0）と混合された。抽出および精製過程では、すべて、ミリ-Q UFプラス（Milli-Q UF Plus）実験室純水精製システム（ミリポア（Millipore））から得られた水が使用された。緩衝液は４℃に予冷された。混合液は４℃で６〜８日放置された。抽出物は数層のガーゼを通して濾過により回収された。
海藻材料は上記の最初の方法と同様の反復抽出にかけられた。材料は、通常、残存活性がほとんど無視できるレベルまで低下する５〜８回の抽出後、廃棄された。
濾過物は、ソーバル（Sorvall）GSAローター（Sorvall Instruments）中10,000Xgで遠心分離することにより透明にされた。上清はワットマン（Whatman）クロマトグラフィーペーパー（chr 1）を通して濾過され、水で伝導度が７〜８mS/cmになるまで希釈された。抽出物はこうして以下に説明するような陰イオン交換クロマトグラフィー用に調製された。
1.3  ヘキソースオキシダーゼのアッセイ
使用された手法は、本質的にはサリバン（Sullivan）およびイカワ（Ikawa）（1973）に説明されているものであった。このアッセイは過酸化物の存在下で糖の酸化で形成される過酸化水素がo-ジアニシジンという発色物質と反応して、402nmでの吸光度を有する色素を形成するという原理に基づいている。
アッセイ混合物は1〜40μlの酵素試料と、370μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0；462μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.1M D-グルコース；9μlの水中0.1mg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma Chemicals、カタログ番号P6782またはBoehringer Mannheimカタログ番号814 393）；および9μlの水中3.0mg/mlのo-ジアニシジン二塩酸塩（3,3'-ジメトキシベンジジン、Sigma CHemicals）からなるアッセイ溶液850μlとからなっている。室温で15または30分インキュベートした後、アッセイは一滴の37％塩酸（メルク（Merck）、p.a.）の添加により停止された。100μlの試料がアッセイチューブからマイクロタイタープレート（NUNC、デンマーク）のウェルへと移され、410nmでの吸光度がタイターテック・マルチスキャンIIプラス（Titertek Multiskan II PLUS）プレートリーダー（Labsystems/Flow Laboratories、フィンランド）で読みとられた。観測された活性が、グルコースオキシダーゼではなくヘキソースオキシダーゼに依るものであることを確実にするため、D-グルコースのかわりに基質としてD-ガラクトースを用いたアッセイも行った。
1.4  陰イオン交換クロマトグラフィー
この段階は、スーパー・ラック（Super Rac）フラクションコレクター（LKB-Produkter AB、スウェーデン）に接続された、バイオパイロット（BioPilot）クロマトグラフィーシステム（ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）、スウェーデン）で行われた。
精製におけるこの段階、および次の段階は、室温（２０〜２５℃）で行われたが、フラクションコレクターは冷蔵庫に置き、収集画分を酵素アッセイまで４℃で保存できるようにした。280nmでの吸光度および伝導度が記録された。DEAE-セファロースファーストフロー（ファルマシア）を充填し、緩衝液A：20mMトリス塩酸、pH7.5で平衡化した500mlのカラム容量のXK50/30カラム（ファルマシア、5.0×25cm）に抽出物がのせられた。流速は試料をのせる間は5ml/分であり、その後のクロマトグラフィー工程中は10ml/分であった。2800mlの0％から100％の緩衝液B:20mMトリス塩酸、500mM NaCl、pH7.5の濃度勾配で吸着蛋白質は溶出された。15mlの画分が濃度勾配溶出の間に回収された。
各クロマトグラフィーを行ったあとで、カラムは500mlの0.5M NaOHで再生され、500mlの1.0Mトリス塩酸pH7.5で中性化され、最終的に1200mlの緩衝液Aで平衡化された。収集画分に対し、上記のように、ヘキソースオキシダーゼ活性アッセイが行われた（試料40μl、インキュベーション時間30分）。ヘキソースオキシダーゼ活性の画分が集められ、４℃で保存された。
1.5  ヘキソースオキシダーゼ活性を含む画分の濃縮
DEAEセファロースクロマトグラフィーからの画分をいくつかのプールにまとめ、ミリポア・ラブ（Millipore Lab）限外濾過カセットシステム（製品番号XX420LCS0）で濃縮された。このシステムは名目分子量限界（NMWL）30,000のメンブレンセル（カタログ番号PTTKOLCP2）を装着しており、ペリスタポンプによって運転される。室温で約50mlまで濃縮されたのち、酵素調製物はさらにセントリプレップ（Centriprep）濃縮器（アミコン（Amicon）、米国、名目分子量カットオフ値30,O00）中４℃で遠心限外濾過により、製品説明書に従い、10〜20mlまで濃縮された。濃縮された酵素溶液は４℃で保存された。
1.6  非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過により得られたヘキソースオキシダーゼの調製物の組成が、ファルマシア・ファスト（Pharmacia Phast）システム上での非変性PAGEにより解析された。図２を参照。8〜25％勾配ゲルで泳動が行われ、製品説明書に従って蛋白質に対して銀染色が行われた。以下の分子量マーカーを含むキットもファルマシアから得られた。サイレグロブリン（669,000）；フェリチン（440,000）；カタラーゼ（232,000）；ラクトースデヒドロゲナーゼ（140,000）；およびアルブミン（67,000）。
ヘキソースオキシダーゼ活性に対する染色は、ソック（Sock）およびローリンガー（Rohringer）（1988）により、グルコースオキシダーゼについて説明されている方法により行われた。その原理としては、グルコースオキシダーゼまたはヘキソースオキシダーゼにより触媒される酸化還元反応が、テトラゾリウム塩の、有色、不溶性のホルマザンへの還元と組み合わされている。
電気泳動直後、ファストゲルは新しく調製された10mlの染色溶液に浸漬された。染色溶液は以下のものを含む：0.1M D-グルコース（またはD-ガラクトース）；85mMクエン酸/リン酸ナトリウムpH6.5；0.2mg/mlの3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）2,5-ジフェニル-テトラゾリウム臭化物（「チアゾリルブルー（thiazolyl blue）」、MTT、Sigma Chemicals、カタログ番号M2128）；および0.1mg/mlのN-メチルージベンゾピラジンメチル硫酸塩（「フェナジンメトサルフェート（phenazin methosulfate）」PMS、Sigma Chemicals、カタログ番号P9625）。ゲルは暗所室温で、発色した紫色のバンドが明確に可視化されるまで（通常５〜９０分）インキュベートされ、その後10％酢酸、5％グリセロールで洗浄され、風乾された。
図２のレーン１に銀染色されたゲルが示されている。図から明かなように、精製のこの段階では多数の蛋白質が存在した。しかしながら、酵素染色では、図２の矢印で示されたバンドのみが染色された（結果は示されていない）。
1.7  ゲル濾過
精製のこの段階は、カラム容量350mlのXK26/70カラム（2.6×66cm、ファルマシア）が装着されたFPLCシステム（ファルマシア）で行われた。カラムに、製品説明書に従い、セファクリルS-200HR（ファルマシア）が装填された。緩衝液は20mMトリス塩酸、500mM NaCl、pH7.5であり、流速は0.5ml/分であった。280nmでの紫外線吸収が記録された。2.5mlの画分が、FPLCの隣の冷蔵庫（４℃）に置かれたFRAC-100フラクションコレクター（ファルマシア）で回収された。ヘキソースオキシダーゼの濃縮された調製物はL7超遠心機（Beckman）でSW60スウィングバケットローター（Beckman）中30,000rpmで６０分４℃で遠心分離することにより透明とされた。上清の一部3.0〜4.0mlが5％グリセロール（Sigma Chemicals、カタログ番号G7757）と混合され、0.22μmの孔径の使い捨てフィルターユニット（ミリポア、カタログ番号SLGVO25BS）のフィルターに通され、カラムの挿入口に接続されたSA-5サンプルアプリケーター（ファルマシア）を用いてカラムにかけられた。ヘキソースオキシダーゼ活性を示す画分が上記のようなアッセイ方法を用いて同定され（10μl試料、インキュベーション時間１５分）、次の操作まで-18℃で別々に保存された。
紫外線プロフィールおよびヘキソースオキシダーゼの溶出位置は、図３に示されている。この図から明かなように、相当量の紫外線吸収物質がこの段階で排除された。非変性PAGEによる電気泳動および銀染色（図２、レーン２）から、この段階後、ほんの微量の混入混成物しか残っていないことが示された。
1.8  ゲル濾過分析による非変性ヘキソースオキシダーゼの分子量決定
非変性ヘキソースオキシダーゼの分子量が、セファクリルS-200スーパーファイン（ファルマシア）上でのゲル濾過により決定された。カラムの大きさ、緩衝液、流速および画分回収は上記のものと同一である。カラムのボイド容量（vo）の決定のためのブルーデキストラン、およびその後のカラムの算出のための標準蛋白質はファルマシアから得られた：オバルブミン（43,000）、アルブミン（67,000）、カタラーゼ（158,000）、およびアルドラーゼ（252,000）。ヘキソースオキシダーゼを含む試料は上記のようなDEAE-セファロースクロマトグラフィーにより得られた。標準蛋白質およびヘキソースオキシダーゼの溶出容量（ve）の決定を基礎として、対応するKav値（ve-vo/vt-vo）が計算された。最終的に標準蛋白質のKav値を対応するlog（分子量）値に対してプロットした。ヘキソースオキシダーゼのKav値は非変性分子量約110,000に相当した。これは、サリバン（Sullivan）およびイカワ（Ikawa）（1973）により見出された分子量約130,000とよく一致している。ケルシェンスタイナー（Kerschensteiner）およびクリッペンスタイン（Klippenstein）（1978）もまた、ゲル濾過による決定で、分子量140,000であると報告した。
1.9  陽イオン交換クロマトグラフィー
この工程は、S-セファロースファーストフロー（ファルマシア）を装填したHR5/5カラム（ファルマシア、0.5×5cm、カラム容量1.0ml）を装着したSMART微量精製クロマトグラフィーシステム（ファルマシア）で行われた。カラムは、A-緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、pH4.5（50mM酢酸をNaOHでpH4.5に合わせることによって調製））で平衡化された。勾配溶出のために用いられた緩衝液Bは、50mM酢酸ナトリウム、500mM NaCl、pH4.5を含んでいた。ゲル濾過からの画分は予め装填された；使い捨てのセファデックスG-25カラム（PD-10、ファルマシア）を25mM酢酸ナトリウム、pH4.5で平衡化、溶出して、脱塩がおこなわれた。高いヘキソースオキシダーゼ活性を有する６つのゲル濾過画分に由来する脱塩試料20mlが50mlのスーパーループ（Superloop）（ファルマシア）から流速250μl/分でカラムにかけられた。カラムはその後同流速で４カラム量の緩衝液Aで洗浄された。結合蛋白質は緩衝液Aから緩衝液Bへ5mlにわたる濃度勾配で溶出された。250μlの画分が勾配溶出間に回収され、上記のようにしてヘキソースオキシダーゼ活性アッセイが行われ（試料1μl、インキュベーション時間15分）、次に使用されるまで-18℃で保存された。
結果として得られたヘキソースオキシダーゼの調製物は、非変性のPAGEおよび銀染色（図２、レーン３）により解析された。少量の混入蛋白質も観察されたものの、ヘキソースオキシダーゼのバンドは、この時点で唯一の明確なバンドとなった。
1.10  ドデシル硫酸ナトリウムPAGE（SDS-PAGE）分析
ヘキソースオキシダーゼ活性を示したS-セファロースクロマトグラフィーからの画分はレムリ（Laemmli）（1970）に従ってSDS-PAGEによっても解析された。0.75mm厚の12.5％アクリルアミド/ビスアクリルアミド（37.5：1混合液）のミニゲルが、ミニ・プロテアンII（Mini-Protean II）装置（バイオラド（Bio-Rad））で泳動された。このゲルは0.1％のクーマシーブリリアントブルーR-250、10％酢酸、40％エタノールで染色され、10％酢酸、30％エタノールで脱色された。
電気泳動の結果は図４レーン１に示されている。精製されたヘキソースオキシダーゼ調製物は、それぞれ40kDおよび29kDの相対分子量の位置に強いバンドを示し、それぞれ60kDおよび25kDの位置に薄いバンドを示した。さらに、55kD-57kDの位置に二つの鋭い二重のバンドが観察された。
1.11  SDS-PAGEに続くブロッティングおよび炭水化物に対する染色
単離されたヘキソースオキシダーゼ中の炭水化物の存在は、DIGグリカン検出キット（べーリンガー・マンハイム（Boeringer Mannheim））で試験された。これは、ブロット上の糖複合体中の糖のマイクログラム量の検出のために設計されている。原理としては、炭水化物中の近接した水酸基がアルデヒドに酸化される。その後ジゴキシゲニンがアルデヒド基に共有結合され、引き続き抗ジゴキシゲニンーアルカリフォスファターゼ抗体結合体で検出される。
陽イオン交換クロマトグラフィーからの精製ヘキソースオキシダーゼは、上記のような12％のSDS-PAGEゲルで泳動され、標準的な手法に従いニトロセルロースにブロットされ、製品説明書に従ってグリカン検出キットで炭水化物が染色された。60kD、40kD、29kD、および25kDのヘキソースオキシダーゼバンドのいずれも染色されなかった。57kD-55kDの位置に鋭い二重のバンドのみが強く染色された（結果は示されていない）。57kD-55kDの位置の二重のバンドは、以下に説明されるように、後に残存混入物であることが明らかとなった。
従って、SDS-PAGEで見られるヘキソースオキシダーゼ成分はいずれもグリコシル化されていないことが結論付けられた。
1.12  等電点電気泳動
S-セファロースクロマトグラフィーからのヘキソースオキシダーゼ画分が集められ、セントリコン（Centricon）濃縮器（アミコン）で遠心限外濾過により濃縮され、アイソゲル（Isogel）アガロースプレート上、pH３〜１０で等電点フォーカシング（IEF）により製品説明書（FMC Bioproducts、Rockland、ME、米国）に従って解析された。pIマーカーの混合物（FMC Bioproducts）はヘキソースオキシダーゼ試料と平行して泳動された。この混合物はチトクロームＣ（pI=10.2）、ミオグロビン主/副バンド（7.4/7.0）、カルボニックアンヒドラーゼ（6.1）、β−ラクトグロブリンA/B（5.4/5.5）、オバルブミン（4.8）、グルコースオキシダーゼ（4.2）、およびアミログルコシダーゼ（3.6）からなる。ゲルはクーマシーブリリアントブルーR-250で染色された。図５のレーン１に示されているように、精製されたヘキソースオキシダーゼ調製物は、それぞれpI4.3および4.5の二つの変異体からなっていた。精製されたヘキソースオキシダーゼはまた、すでに調製されたポリアクリルアミドゲルpH3.5〜9.5（ファルマシア、Ampholine PAGplates）上で製品説明書に従って等電点フォーカシングによっても解析された。これらのゲルは上記非変性ポリアクリルアミドゲルに対して説明されているように、染色混合液中でのインキュベーションにより酵素活性に対して染色された。図５のレーン２に示されているように、両方のpI変異体は酵素学的に活性であった。
1.13  クロマトフォーカシング
最終段階としてS-セファロース上で精製されたヘキソースオキシダーゼのSDS-PAGEで、いくつかのバンドが観察されたことにより、一つまたは複数のバンドが残存混入物を表しているのではないかと考えられた。さらに、S-セファロースクロマトグラフィーは常に低回収率を示した。それゆえ、クロマトフォーカシングが、S-セファロースでの陽イオン交換クロマトグラフィーに代わって最終精製段階として導入された。
クロマトフォーカシングは、1mlのカラム容量でモノP（Mono P）HR/5/5カラム（0.5×5cm、ファルマシア）および試料をのせるための50mlのスーパーループ（Superloop）を装備したSMARTクロマトグラフィーシステムで行われた。pH5.0および3.5の間の間隔での分離に対する初期緩衝液は、塩酸でpH5.5に調整された25mMピペラジンであった。溶出は、ポリバッファー（Polybuffer）74（ファルマシア）を水で１０倍に希釈し、塩酸でpH3.5に合わせたものであった。カラムは製造者により推奨されるとおり、初期緩衝液で前処理され、平衡化された。
試料の調製は以下のように行われた。典型的な実験では、二つのゲル濾過操作からの最も適当な画分（2×4画分、20ml）が集められ、ゲル濾過で用いられた緩衝液（20mMトリス塩酸、500mMNaCl、pH7.5）で平衡化された、使い捨てのポリ・プレップ（Poly-prep）カラム（バイオラド）に装填された、1mlのフェニルセファロース6ファーストフロー（high sub、ファルマシア）に通した。この処理で、このイオン強度でゲルマトリックスに吸着した赤色蛋白質フィコエリスリンおよび他の着色物質の残存量がほとんど完全に除去され、それによって精製過程の他の段階では部分的にしか除けなかった混入物が排除された。フェニルセファロースカラムは使用後廃棄された。ヘキソースオキシダーゼ活性は、溶離液中に定量的に回収され、予め充填されたセファデックスG-25カラム（PD-10、ファルマシア）を初期緩衝液で平衡化し溶出することにより、脱塩された。
試料をのせるまえに、カラムに1mlの溶離液がのせられた。流速は0.5ml/分であった。試料をのせたのち、カラムを通して11mlの溶離液がのせられることによってpH勾配が形成された。pH勾配の溶出では250μlの44画分が集められた。ヘキソースオキシダーゼを含む画分は、上記のアッセイ方法（試料1μl、インキュベーション時間１５分）により同定され、次の使用まで-18℃で保存された。
クロマトフォーカシングにより精製されたヘキソースオキシダーゼは、非変性PAGEおよび銀染色（図２、レーン４）ならびにSDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルー染色（図４、レーン２）によって解析された。非変性PAGEにおいてヘキソースオキシダーゼのバンドは唯一の明確なバンドであり、混入物は非常に少量しか観察されなかった。SDS-PAGEによりこの精製方法が57kDと55kDのところの鋭い二重のバンドを除去できることが明らかに示された。S-セファロースクロマトグラフィー後に観察された25kDのバンドは、クロマトフォーカシング後では非常に薄かった。
結論としては、DEAEクロマトグラフィー、ゲル濾過およびクロマトフォーカシングによって得られたヘキソースオキシダーゼは非変性PAGEでは単一バンドを示した。SDS-PAGEでは40kDおよび29kDのところに強いバンド、60kDのところに弱いバンドが観察された。
60kD成分の強度は、40kDおよび29kDの構成物に比較して、異なる酵素調製物間でばらつきがあるので、29kDおよび40kDのポリペプチドは約60kDの前駆体の蛋白質分解産物から生じたものであるという仮説が得られた。これは上記のようなゲル濾過によって実際にみられる非変性分子量110,000〜120,000の酵素のホモダイマー構造の考え方と一致した。さらに、この仮説は、ゲル濾過での非変性分子量が140,000であり、SDS-PAGE中でのサブユニットの分子量が70,800であることを見いだしたケルシェンスタイナーおよびクリッペンスタインにより得られた結果と一致している（KerschensteinerおよびKlippenstein、1978）。
実施例２
ヘキソースオキシダーゼのペプチド断片の生成とアミノ酸配列解析
2.1  臭化シアンでの精製ヘキソースオキシダーゼの切断
この工程は、S-セファロース上での陽イオン交換クロマトグラフィーが最終精製段階としてまだ使用されていたときに行われた。
DEAEセファロース、セファクリルS-200、およびS-セファロース上での精製により得られたヘキソースオキシダーゼは、上記SMARTシステム中に設置されたセファデックスG-25スーパーファインを含む予め充填されたPC3.2/10高速脱塩カラム（ファルマシア、0.32x 10cm、カラム容量0.8ml）上で、緩衝液交換により揮発性緩衝液に移された。カラムは200mMの炭酸アンモニア（BDH、AnalaR）で平衡化し、溶出した。満足のいく回収を得るためには、注入の前にヘキソースオキシダーゼ試料に500mMの塩化ナトリウムを添加することが必須であった。
溶出され、緩衝液交換がなされたヘキソースオキシダーゼは1.5mlの微量遠心チューブに移され、スピードバック（Speedvac）濃縮器（Savant Instruments）中で凍結乾燥された。10mg/mgの臭化シアン（CNBr、ピアース（Pierce））の70％v/v蟻酸溶液200μl（プロメガ（Promega））が添加された。（プロメガからの試薬は「Probe Design（登録商標）ペプチド分離システム」カタログ番号V6030から得た）。このチューブは室温暗所で一晩インキュベートされた。この溶液はその後スピードバック（speed-vac）濃縮器で乾燥され、50μlの水に再懸濁されて再度乾燥された。
2.2  高分解能SDS-PAGEによる臭化シアン断片の分離およびポリビニリデンジフルオリド（PVDF）メンブレンへのエレクトロブロッティング
臭化シアン消化により生成したペプチドは、シェーガー（Schaegger）およびフォンジャゴウ（vonJagow）（1987）にしたがって高分解能SDS-PAGEにより分離された。このシステムは、低分子量ペプチド（20〜250アミノ酸残基）の分離に優れている。このゲルシステムは、16.5％の分離ゲル、10％のスペーサーゲル、および4％のスタッキングゲルからなり、すべてプロメガからの29：1のアクリルアミド/ビスアクリルアミド混合液で作製された。
0.75mm厚のミニゲルは、ミニ・プロテアンII（Mini-Protean II）装置（バイオラド）で泳動された。過硫酸アンモニウムおよびN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）はバイオラドから得た。SDSは、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（United States Biochemical）（超高純度）から得た。トリスはフルカ（Fluka）（カタログ番号93350）から得た。トリシンおよびチオグリケートナトリウムはプロメガから得た。グリシン（p.a.）、2-メルカプトエタノール（p.a.）およびボロモフェノールブルーはメルクから得たもので、グリセロールはGIBCO BRL（超高純度）から得た。0.1mMチオグリケートナトリウムは、分離の間にペプチドのアミノ末端の化学的阻害を防止するために、使用直前にカソード緩衝液に添加された。ゲルはチオグリコレートがアミノ反応性物質を除去できるように、６０分３０Ｖで前泳動された。
試料調製：乾燥された臭化シアンペプチド断片は63mMトリス塩酸、pH6.8、1％SDS、2.5％ 2-メルカプトエタノール、10％グリセロール、および0.0012％のブロモフェノールブルーを含む30μlのゲルローディング緩衝液中に再懸濁された。残存する蟻酸の含有量によって、撹拌の際に黄色へと変色した試料は、青色が回復するまで、1.0Mトリス塩基を1〜3μl添加することにより中性化された。試料はゲルにのせるまえに９５℃で５分間加熱することにより、変性された。分子量31,000と2,500の間の低範囲蛋白質分子量標準混合液（プロメガ）がヘキソースオキシダーゼペプチド試料と平行して泳動された。電気泳動は150Vの定電圧で行われた。
PVDFメンブレンへの電気泳動的転写は、ミニ・トランスブロット電気泳動トランスファー・セル（Mini Trans-Blot Electrophretic Transfer Cell）（バイオラド）中で、製品説明書に従って行われた。ゲルの大きさに切り取られた３枚のプロブロット（Problott）メンブレン（アプライド・バイオシステムズ（Appied Biosystems））はメタノール（メルク、p.a）で短時間濡らされ、ブロッティングのサンドイッチを組み立てるまで、転写緩衝液（25mMトリス、192mMグリシン、pH8.5、４℃に予冷）の中に浸漬された。電気泳動後、ゲルは転写バッファー中４℃で５分間インキュベートされ、その後以下の層を有する転写サンドイッチへと組み立てられた：ワットマン（Whatman）濾紙（3MM chr）、２枚のプロブロット（Problott）メンブレン、SDS-PAGEペプチド分離ゲル、３枚目のプロブロット、および最後の一枚のワットマン濾紙。このサンドイッチは電極を組み立てるときに、２枚のプロブロット・メンブレンが陽極の側に向けられた。予冷した転写緩衝液で満たす前に、冷却ユニットが緩衝液層の中に装備され、転写はその後室温で６０分間100Ｖの定電圧で行われた。転写の間、電流は約270mAから約400mAに増加した。
転写後メンブレンは水で１分間洗浄され、その後0.1％クーマシーブリリアントブルーR-250（バイオラド）、5％酢酸（メルク、p.a.）および45％メタノール（メルク、p.a.）を含む新鮮に調製された染色溶液100ml中で30〜45秒間染色された。その後メンブレンに対して、新鮮に調製された5％酢酸および45％メタノール約80mlで、各30〜60秒間、３回交換して脱色を行った。メンブレンは最終的に残存のグリシンを除くために水を３回交換して洗浄され、その後風乾された。それぞれ分子量が約2.5kD、9kD、および16kDであるよく分離された比較的大量のバンドが切り取られ、アミノ酸分析および配列解析にかけられた。
2.3  ヘキソースオキシダーゼの9kD臭化シアン断片のアミノ酸解析と配列決定
アミノ酸解析はイオン交換クロマトグラフィーおよびカラム後のo-フタルジアルデヒドでの誘導体化によって行われた。試料は6M塩酸、0.05％フェノールおよび0.05％のジチオジプロピオン酸（BarkholtおよびJensen、1989）中で、110℃で20時間加水分解された。オンラインPTH解析機（モデル120A）およびデータ解析システムを搭載したアプライド・バイオシステムズの自動蛋白質／ペプチド配列決定装置（モデル477A）で、このペプチドの配列が決定された。蛋白質配列決定用試薬はアプライド・バイオシステムズから得られた。アミノ酸解析およびペプチド配列解析は、デンマーク、コペンハーゲン大学蛋白質化学学部（Department of Protein Chemistry, University of Copenhagen）のアーネL.イェンセン（Arne L.Jensen）の厚意により行われた。
9kD断片の解析により同定されたペプチド配列は表2.1に示されている。
第一段階でのフェニルチオヒダントイン−チロシン（pTH-Tyr）の初期収量は22pmolであった。9K断片のアミノ酸組成は表2.2に示されている。
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2.4  調製用SDS-PAGEおよびPVDFメンブレンへのエレクトロブロッティング
以下の工程は、ヘキソースオキシダーゼ調製物の40kDまたは29kDポリペプチドのいずれかに由来する特異的はアミノ酸配列を明らかにするために行われた。
調製用SDS-PAGEゲルはレムリ（Laemmli,U.K.、1970）の方法に従って泳動された。12.5％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（37.5：1の混合液）を含む0.75mm厚のミニゲルは、ミニ・プロテアンII（Mini-Protean II）装置（バイオラド）で泳動された。アクリルアミド（BDH、カタログ番号44313）およびN,N'-メチレン-ビス−アクリルアミド（BDH、カタログ番号44300）の溶液は、混合イオン交換樹脂（バイオラド、カタログ番号142-6425）上で保存された。全てのその他の試薬の供給源は上述の通りであった。
試料調製：クロマトフォーカシングからの画分はNMWL10,000および試料容量400μlのウルトラフリー（Ultra free）MCフィルターユニット（ミリポア、カタログ番号UFC3 LGC25）中で、４℃で遠心限外濾過により濃縮された。フィルターへの残存物は等量の125mMトリス塩酸、pH6.8、2％SDS、5％2-メルカプトエタノール、20％グリセロール、および0.0025％のブロモフェノールブルーを含むゲルローディング2X緩衝液と混合された。酸性ポリバッファー（Polybuffer）成分の含有量によって、撹拌の際に黄色へと変色した試料は、青色が回復するまで、1.0Mトリス塩基を1〜3μl添加することにより中性化された。試料は９５℃で５分間加熱することにより変性され、レーンあたり試料の一部約30μlがゲルにのせられた。
97,400から14,400の範囲の分子量を有する分子量マーカー蛋白質混合液（プロメガ）がヘキソースオキシダーゼ試料と平行して泳動された。電気泳動は、温度によって誘導される試料蛋白質の修飾の危険性を最小限とするため、ゲルあたり10mAという低電流で行われた。
PVDFメンブレンへの電気泳動的転写は、３枚のプロブロット（Problott）の代わりに１枚のイモビロン（Immobilon）Pメンブレン（ミリポア、カタログ番号IPVH15150）が用いられたことをのぞき、上記と同様にして行われた。サンドイッチは、電極の組立においてブロッティングメンブレンが陽極の方に向けられた。
転写後イモビロンPメンブレンは水で１０秒間洗浄され、その後0.025％クーマシーブリリアントブルーR-250、5％酢酸および40％メタノールを含む新鮮に調製された染色溶液100ml中45〜60秒間染色された。その後メンブレンに対して、新鮮に調製された5％酢酸および30％エタノール（96％ v/v、Danisco、デンマーク）250mlで２〜３分間脱色を行った。メンブレンは最終的に最終的に風乾され、４℃で保存された。
ブロット上のバンドのパターンはクロマトフォーカシングにより最終的に精製された後のSDS-PAGE分析において見られたパターンと同一であった。40kDおよび29kDの位置に強いバンド、加えて60kDの位置に薄いバンドを示した。
40kDおよび29kDの位置のバンドはブロットから切り出され、以下に説明されるとおり、アミノ酸分析およびメンブレンに結合したポリペプチドの酵素消化に用いられた。60Kの物質は、少量であったため、このポリペプチドのこれ以上の解析はできなかった。
2.5  ヘキソースオキシダーゼの40kDおよび29kDポリペプチドのアミノ酸分析
ヘキソースオキシダーゼの40kDおよび29kDの成分のアミノ酸組成は、表2.3に示されている。
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2.6  PVDFに結合したヘキソースオキシダーゼポリペプチドの酵素消化
PVDFに結合したヘキソースオキシダーゼポリペプチドの消化および結果として得られた蛋白質分解ペプチドの抽出は、フェルナンデス（Fernandez）ら（1992）およびフェルナンデスら（1994）に説明されているように行われた。
ヘキソースオキシダーゼの40kDポリペプチドの消化：約5μg（約125pmolに相当）と推定された全蛋白質量を有する11の40Kバンドが、クーマシーブルーで染色したPBDFメンブレンから切り出され、メタノールで１〜２分脱色され、水で２〜３分洗浄された。その後メンブレンのバンドは1x1mm片に賽の目に切られ、微量遠心チューブに移された。バックグラウンドの対照として、PVDFメンブレンのブランク領域が用いられた。賽の目に切られたメンブレン片は、1％（v/v）の水素処理したトリトンX-100（RTX-100、Sigma Chemicals、カタログ番号X-100R-PC、またはCalbiochem、蛋白質グレード、カタログ番号648464）、10％アセトニトリル（メルク、Gradient Grade Lichrosolv）、および100mMのトリス塩酸、pH8.0を含む50μlの消化緩衝液に漬けられた。消化のために選択された蛋白質分解酵素は、リジン残基のC-末端側でペプチド鎖を切断するエンドプロテイナーゼLys-C（endoLys-C）であった。endoLys-C（ベーリンガー・マンハイム、配列決定グレード、カタログ番号1047 825）の一部5μgが、20μlの水の添加によって再構成された。0.5μgに相当する酵素溶液2μl（酵素：基質比は1：10）が添加された。消化は37℃で22〜24時間行われた。
消化後、試料は５分間超音波槽（Elma transonic）で超音波処理され、微量遠心機で1700rpm５分間遠心分離され、上清はその後新しいチューブに移された。上記のとおり、50μlの消化緩衝液および100mlの0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA、ピアース、カタログ番号28902）での連続的な洗浄が超音波処理および遠心分離とともに行われた。すべての上清が集められ、結果として、200μlの抽出容量を得た。抽出物はペプチド精製まで-18℃で保存された。
ヘキソースオキシダーゼの29kDポリペプチドの消化は、アミノ酸分析に従うと2.4μg（約80pmol）の全蛋白質量を有する４つのバンドが使用されたことをのぞき、40kD成分に対して説明されたとおり行われた。
2.7  endoLys-Cで生成したペプチドの精製
ヘキソースオキシダーゼの40kDおよび29kDポリペプチドの消化により得られたペプチド断片は、SMARTクロマトグラフィーシステムで分離された。このシステムは、様々な波長のμピークモニター、および60バイアルに対する画分収集容器を装備していた。分離に使用された逆相カラムはシリカを基礎としたμRPC C2/C18 SC2.1/10という狭ボアカラムであった（ファルマシア、カラム口径2.1x100mm、粒子径3μm、平均孔径125オングストローム）。緩衝液は、A：ミリ-Q水中の0.1％TFA（ピアース）およびB：アセトニトリル（メルク、Gradient Grade Lichrosolv）中の0.1％TFAであった。緩衝液は濾過され、0.5μmのフルオロポアフィルター（ミリポア、カタログ番号FHLP04700）で真空濾過により脱気された。流速は100μl/分であった。溶離液の紫外線吸収は220nm、254nm、280nmでモニターされた。勾配は、0〜30％ B（0〜65分）、30〜60％ B（65〜95分）および60〜80％ B（95〜105分）であった。カラムはその後80％のBで10分間100μl/分で洗浄され、45分間200μl/分でA緩衝液で再度平衡化された。50μlの画分がt=15分からt=105分（3×60画分）の間集められ、アミノ酸配列分析を行うまで-18℃で保存された。
40kDポリペプチドのendoLys-C消化後に得られたペプチドマップが図６に示されている。この図に見られるように、消化およびHPLC分離によって、高いシグナル／ノイズ比を有するいくつかのよく分離されたピークが得られた。ブランクの試料の消化混合物の対応するクロマトグラム（示されていない）から、t=83より後に溶出するピークはペプチドでなく、試薬に由来するピークであり、おそらく紫外線吸収を有する水素処理したトリトンX-100またはクーマシー色素の残存影の混入物であることが示唆された。図６の1〜5と表示されたピークは以下の基準によりアミノ酸配列分析のために選択された：1）ピーク高、2）明かな純度、3）芳香族アミノ酸残基を示す高いA280：A220比および／またはA254：A220比（低い遺伝子コード縮合によるPCRプライマー配列の選択に最も有用である）、4）遅い溶出時間（比較的長いペプチドであることを示唆しうる）。
29kDのendoLys-Cペプチドのクロマトグラムは図７に示されている。明らかに、このヘキソースオキシダーゼ成分は、図６の40kD成分と比較して少数の明確なペプチド断片を生じた。クロマトグラムを比較したとき、両方の消化物に存在するいかなるペプチド断片の兆候もなかった。この知見はもし29kD鎖が40kDポリペプチドの蛋白質分解による変化によって生じるのであれば、40Kおよび29Kのヘキソースオキシダーゼ成分に共通なアミノ酸配列は存在しないことを示している。（40kD消化物に比べ、29kD消化物にはt=83以降に溶出されてくる混入物質を少量しか含まれない。この理由は、40kD消化はシグマ・ケミカルズ（Sigma Chemicals）からのトリトンX-100で行ったのに対し、29kD消化にはカルバイオケム（Calbiochem）の水素処理したトリトンX-100を用いたためである可能性がある。
29kDペプチドマップ（図７）において１および２と表示したピークに対応する画分が、アミノ酸配列決定にかけられた。
2.8  ヘキソースオキシダーゼの蛋白質分解により生じたペプチドのアミノ酸配列解析
図６のピーク１〜５（HOX-2、HOX-3、HOX-4、HOX-5およびHOX-6ペプチド）、ならびに図７のピーク１〜２（HOX-7およびHOX-8ペプチド）に相当する画分の解析によって同定されたペプチド配列が、以下の表2.4に示されている。PTHアミノ酸の初期回収量は、HOX-5ペプチドでの第一段階でのPTH-Tyrの46pmolからHOX-8ペプチドでの第二段階でのPTH-Ileの6pmolまでの範囲であった。選択されたピークそれぞれ254nmおよび280nmでの吸収から予想されるように、すべての配列決定されたペプチドは少なくとも一つの芳香族アミノ酸残基を含んでいた。
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不明確に同定された残基はかっこで示されている。
1）残基番号１５はAspまたはAsnのいずれかであると同定された。
2）残基番号１６はAspまたはAlaのいずれかであると同定された。
3）残基番号１５はArgまたはTrpのいずれかであると同定された。
HOX-2ペプチド = 配列番号：９
HOX-3ペプチド = 配列番号：10
HOX-4ペプチド = 配列番号：11
HOX-5ペプチド = 配列番号：12
HOX-6ペプチド = 配列番号：13
HOX-7ペプチド = 配列番号：14
HOX-8ペプチド = 配列番号：15
実施例３
コンドラス・クリスパスからのヘキソースオキシダーゼ遺伝子の単離
3.1  コンドラス・クリスパスからのRNAの精製
コンドラス・クリスパスの新鮮に採取された藻は、冷水で洗浄され、すぐに、さらに使用するまで、液体窒素で保存された。液体窒素で凍結させた約１５グラムのコンドラス・クリスパス葉状体が、乳鉢で細かい粉に均質化された。この均質化された凍結物質は、15mlの抽出緩衝液（8M塩酸グアニジン；20mMの2-（N-モルフォリノ）エタンスルフォン酸（MES）、pH7.0；20mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）；50mMのβ-メルカプトエタノール）を含む50mlチューブ（Nunc、カタログ番号339487）に移された。
チューブはボルテックスにより攪拌され、他に温度が示されない限り以下の工程中冷却状態（0℃）に保たれた。その後チューブはヘレウス・オムニフュージ（Heraeus Omnifuge）2.0RS中で２０分間6,000×gで遠心され、RNAを含む上清（約15ml）が注意深く集められ、予め冷却された50mlチューブに移された。1.5mlの2M酢酸ナトリウム、pH4.25、15mlの水飽和フェノール、および3mlのクロロフォルム：イソアミルアルコール（49：1）がRNA抽出物を含むチューブに添加された。
次に、チューブは1/2分間激しくボルテックスにより攪拌され、オムニフュージ（Omnifuge）で２０分間6,000×gチューブを遠心分離することにより、層が分離された。水層（約17ml）が30mlのコレックス（Corex）チューブ（Sorvall、カタログ番号00156）に移され、等量（すなわち約17ml）の冷イソプロパノールが加えられた。チューブは再びボルテックスにより攪拌され、-20℃で少なくとも１時間インキュベートされた。沈殿したRNAは予め冷却させたSS24ローターが取り付けられたソーバル（Sorvall）RC-5B遠心機を使用して、２０分間10,000rpmでの遠心分離によりペレット化された。上清が除かれ、沈殿したRNAは、4mlの0.3M酢酸ナトリウム、pH5.5に再懸濁され、12mlの96％エタノールが加えられた。
その後、このコレックス（Corex）チューブがボルテックスにより攪拌され、上記と同様に、再び-20℃で少なくとも１時間インキュベートし、その後２０分間の遠心分離によりRNAの２回目の沈殿化を行った。上清は注意深く取り除かれ、沈殿したRNAは２mlの0.15M酢酸ナトリウム、pH5.5に再懸濁された。その後８mlの4M酢酸ナトリウム、pH5.5が添加され、RNAは氷上３０分間沈殿させられ、上記と同様に、再度沈殿とした。RNAペレットは、70％エタノールで洗浄し、500μlの水で再懸濁した。再懸濁されたRNAは微量遠心チューブに移され、さらに使用されるまで-20℃で保存された。
RNAの純度および濃度は、サンブルック（Sambrook）ら（1989）に説明されているとおり、アガロースゲル電気泳動、および260nmおよび280nmでの吸光度測定により解析された。
3.2  コンドラス・クリスパスからのポリアデニル化RNAの単離
ポリアデニル化RNAは、オリゴdTを含む磁気ビーズ（mRNA精製キット（登録商標）中のDynabeads（登録商標）Oligo（dT）25、Dynal）を用いて全RNAから単離された。およそ100μgの全RNAが1mgのダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）Oligo（dT）25と混合され、ポリアデニル化RNAはmRNA精製キット（登録商標）のプロトコールに説明されているようにして単離された。ダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）で単離されたポリアデニル化RNAの回収量は1％と3％の間であった。
コンドラス・クリスパスからのポリアデニル化RNAの単離には、オリゴ（dT）セルロース（クロンテック（Clontech）、カタログ番号8832-2）、または予め充填されたカラム（mRNA分離キット（登録商標）、クロンテック、カタログ番号K1040-1）をmRNA分離キット（Separetor Kit）（登録商標）のプロトコールに説明されているようにして用いることを含む、別の方法が用いられた。オリゴ（dT）カラムで単離したポリアデニル化RNAの収量は最初の全RNAの0.1％と1％の間であった。オリゴ（dT）カラムで単離したポリアデニル化RNAは以下に説明するcDNA合成反応（3.4）で使用されたが、第一鎖cDNAの収量は極めて低かった（1％以下）。
ダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）で精製したRNAに比べオリゴ（dT）カラムで単離したRNAの低収量および低い性能は、全RNAの抽出における炭水化物またはプロテオグリカンの存在が原因と考えられる。炭水化物が混入した全RNA調製物はポリアデニル化RNAの精製を妨げ、cDNA合成を阻害することが示されており、それゆえ炭水化物が含まれないRNA精製法が開発されている（Groppeら、1993；Yehら）。しかしながら、これらの方法で精製したポリアデニル化RNAは、ダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）で精製したRNAほどcDNA合成反応で有効でなかった。従って、ダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）を用いて精製したポリアデニル化RNAが第一鎖cDNA合成反応の鋳型として用いられた（下記3.4参照）。
3.3  ヘキソースオキシダーゼ特異的オリゴヌクレオチド
合成オリゴヌクレオチドはヘキソースオキシダーゼペプチドHOX-2、HOX-3およびHOX4（表2.4）に由来するアミノ酸配列をもとに合成された（DNA technology、ApS、Forskerparken、DK-8000 Aarhus C、デンマーク）。表3.1はオリゴヌクレオチドおよびそれに対応するアミノ酸配列を示している。表3.1ではまた、DNA塩基配列決定またはPCRで使用されたプライマーのDNA配列も示されている。
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YがCまたはTのとき、RはAまたはG；WがAまたはTのとき、SはCまたはG；DがA、GまたはTのときNはA、C、GまたはT、I=デオキシイノシン。
Hox-2 = 配列番号：９
Hox2-3+ = 配列番号：１６
Hox-3 = 配列番号：１０
Hox3-2- = 配列番号：１７
Hox-4 = 配列番号：１１
Hox4-1+ = 配列番号：１８
Hox4-2- = 配列番号：１９
Hox5+ = 配列番号：２０
Hox5- = 配列番号：２１
Hox6+ = 配列番号：２２
Hox7- = 配列番号：２３
Hox8- = 配列番号：２４
Hox10- = 配列番号：２５
Hox11+ ： 配列番号：２６
Hox12- = 配列番号：２７
Hox13- = 配列番号：２８
Hox5'-1 = 配列番号：２９
3.4  cDNA合成およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
ポリアデニル化されたRNAは、市販のキットを用いた第一鎖cDNA合成反応における鋳型として使用された。Hox3-2-またはHox4-2-をプライマーとして、Maraton（登録商標）cDNA増幅キット（クロンテック、カタログ番号K1802-1）のプロトコールに説明されているように、約1μgのポリアデニル化されたRNAに対して逆転写反応を行った。引き続くPCR増幅では、キットのアンカーまたはアダプタープライマーが、それぞれヘキソースオキシダーゼ特異的プライマーHox3-2-またはHox4-2-に追加して使用された。使用された緩衝液および増幅の条件は本質的にはMaraton（登録商標）cDNA増幅キットのプロトコールに説明されているとおりである。94℃１分、55℃２分、および72℃２分で30サイクルにプログラムされたパーキン・エルマー・サーマルサイクラー（Perkin-Elmer Thermalcycler）480（登録商標）を用いてアンプリタック（AmpliTaq）（パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus））でPCR増幅が行われた。1％アガロースゲル（SeaPlaque（登録商標）GTG、FMC）中で5μlの反応混合液をゲル電気泳動することで、おおよその大きさがプライマーHox4-2-で600塩基対（bp）およびプライマーHox3-2-で700bpであるようなDNA断片が示された。
これらのDNA断片は市販のキット（QIAEX（登録商標）ゲル抽出キット、カタログ番号20020、QIAGEN）を用いてアガロースゲルから精製され、pT7 Blue T-ベクター・キット（Vector  Kit）（Novagen、カタログ番号69829-1）のプロトコールに説明されているように、50ngのプラスミドpT7 Blueにおよそ100ngの断片が連結された。大腸菌DH5α（Life Technologies、カタログ番号530-8258SA）または大腸菌NovaBlue（Novagen）が連結反応液で形質転換され、白色の組換え体コロニーがさらに解析された。
このようなコロニーからのプラスミドDNAはキアゲン・プラスミド・ミディ・キット（QIAGEN Plasmid Midi Kit）（QIAGEN、カタログ番号12143）を用いて精製され、シーケナーゼ（Sequenase）（Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit、USB）を用いてDNA配列解析にかけられた。DNA配列解析反応液はアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた（Sequencing Gel-Mix（登録商標）、Life Technologies）。700bp断片のDNA配列解析によって、234アミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームが示された。
以下の表3.2は、40kDポリペプチドからのペプチド配列すべて、すなわちHOX-2、HOX-3、HOX-4、HOX-5およびHOX-6が、このオープンリーディングフレームに由来する234アミノ酸配列に見いだされることを示している。従って、700bpの断片は、ヘキソースオキシダーゼ遺伝子の一部をコードしていると結論付けられた。600bpの断片のDNA配列は、700bp断片の近位の600bpと同一であることが示された（表3.2を参照）。
プライマーHox2-3+およびHox3-2-が、同様に、cDNA合成およびPCR増幅実験に使用された。約50ngのポリアデニル化RNAが3'-アンプリファインダー・レース・キット（Amplifinder（登録商標）RACE Kit）（クロンテック、カタログ番号K1801-1）のプロトコールに説明されているように、プライマーとしてHox3-2-を用いて逆転写された。引き続くPCR増幅においては、プライマーHox2-3+およびHox3-2-が使用された。使用された緩衝液および増殖の条件は、本質的にアンプリタック（AmpliTaq）ポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）および3'-アンプリファインダー・レース・キット（Amplifinder（登録商標）RACE Kit）について説明されたのと同様であった。PCR増幅反応液の5μlのゲル電気泳動により、407bpの大きさを有する断片が示された。
この断片が、上記のように精製され、プラスミドpT7 Blueに挿入され、配列が決定された。この断片のDNA配列は、700bpの断片の遠位の407bpと同一であることが示された。
700および407bpの断片の下流のDNA配列は、3'-アンプリファインダー・レース・キット（Amplifinder（登録商標）RACE Kit）（クロンテック）を用いて、3'プライマーとしてキットのアンカープライマーを使用し、また遺伝子特異的5'プライマーとしてヘキソースオキシダーゼ特異的プライマーHox5+およびHox4+を使用することにより増幅された。増幅のための緩衝液および条件は上記と同様であった。PCRおよび反応混合液のアガロースゲルでの解析によって、約1.3kbの大きさの断片が示された。この断片は、上記のようにして単離され、DNA配列解析にかけられた。この1.3kｂの断片のDNA配列から、357アミノ酸のオープンリーディングフレームが示された。この357アミノ酸のリーディングフレームは、ペプチドHOX-1、HOX-3、HOX-4、HOX-5、HOX-7およびHOX-8のアミノ酸配列を含んでいた。それ故、1.3kbのDNA断片は、ヘキソースオキシダーゼの9kDのCNBr断片、29kDのポリペプチド、および40kDのポリペプチドの一部をコードしていた。
ヘキソースオキシダーゼの5'末端に特異的なプライマーであるHox5'-1は、推定される全ヘキソースオキシダーゼのオープンリーディングフレームを増幅するために、オリゴ（dT）プライマーとともに使用された。この遺伝子は、上記と同様に、PCRを用いて増幅され、pT7 Blueに挿入され、配列が決定された。この1.8 kb断片のDNA配列はわずかな違いはあるが、上記の断片のDNA配列と同一であった。これらの相違はPCR増幅中の誤った取込みにより起こりうるため、全長ヘキソースオキシダーゼ遺伝子が増幅され、少なくとも３つの独立したPCR増幅物から単離された。それ故、以下の表3.2に示されたDNA配列は、配列中のPCR誤差を排除するために、少なくとも３つの独立して由来するDNA配列からなっている。
上記の1.8 kbのDNA配列上のオープンリーディングフレームに由来するアミノ酸配列は、すべての上記HOXペプチド、すなわちHOX-1からHOX-8までを含むことが示された。したがって、1.8kBのDNA断片は、上記9kD、29kDおよび40kDのコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ断片をコードしている。これに由来するオープンリーディングフレームのポリペプチドの分子量は、ポリペプチドがヘキソースオキシダーゼ酵素の二量体分子のサブユニット（おそらくモノマー断片）であるという仮定と一致している。
3.5  コンドラス・クリスパスRNAのノーザンブロット解析
コンドラス・クリスパスから単離された全RNAのノーザンブロット解析を行った。RNAは上記と同様に（3.1）精製され、変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画され、サンブルック（Sambrook）ら（1989）に説明されているように、HybondC（Amersham）フィルター上にブロットされた。プライマーHox2-3+およびHox3-2-を用いて、上記と同様に、PCRにより400bpのDNA断片が合成された（3.4）。この断片が1.2％アガロースゲル（SeaPlaque（登録商標）GTG、FMC）から精製され、サンブルック（Sambrook）ら（上記）により説明されているように、32Pで標識された。この放射活性のあるヘキソースオキシダーゼ特異的ハイブリダイゼーションプローブが、ノーザンブロットのプローブとして使用された。ハイブリダイゼーションのための条件は以下のとおりである。
3.5.1  プレハイブリダイゼーションは65℃で２時間、10×Denhardt's溶液（0.1％Ficoll、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）、2×SSC（1x SSCは0.15M塩化ナトリウム、0.015M、クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、および50μg/mlの変性サケ精子DNAを含む緩衝液中で行われた。
3.5.2  ハイブリダイゼーションは65℃で少なくとも14時間、1×デンハルト（Denhardt's）溶液、2×SSC、0.1％デキストラン硫酸、50μg/mlの変性サケ精子DNAおよび32Pで標識したプローブ（およそ106dpm/ml）を含む緩衝液中で行われた。このフィルターは65℃で10分間、2×SSC、0.1％SDSで２回洗浄され、続いて65℃で10分間、1×SSC、0.1％SDSで２回洗浄された。65℃で10分間、0.2×SSC、0.1％SDSで最後の洗浄をした後、フィルターはサランラップでラップされ、Ｘ線フィルム（Kodak XAR2）に２日間、-80℃でSiemens-Titans HS増感スクリーンを用いて感光された。その結果、オートラジオグラム（図８）において、約2 kbの大きさのバンドが映し出されることが示された。
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0003917183.tif 000010
0003917183.tif 000011
上記の表3.2に示されたアミノ酸配列において、HOX-1からHOX-8ペプチドは太字または下線を引いたコードで示されている。太字のコードはペプチドのアミノ酸配列によって確認されたアミノ酸残基を示す。下線を引いたコードは核酸配列から由来するが、関連するHOXペプチドの配列によって確認されていないアミノ酸残基を示す。
HOX-1はアミノ酸残基461〜468、HOX-2は残基92〜114、HOX-3は残基219〜234、HOX4は残基189〜202、HOX-5は残基215〜218、HOX-6は残基8〜22、HOX-7は残基434〜444およびHOX-8は残基452〜460である。
実施例４
ピキア・パストリスでの組換えヘキソースオキシダーゼの産生
4.1  ピキア・パストリスにおける組換えヘキソースオキシダーゼの発現のためのベクターの構築
表3.2で示されているように、コンドラス・クリスパスのヘキソースオキシダーゼをコードするオープンリーディングフレームはピキア・パストリスの発現ベクターpPIC3（Research Corporation Technologies、Inc.、トゥーソン、アリゾナ85711〜3335）に挿入された。このプラスミドはピキア・パストリスからのアルコールオキシダーゼプロモーター（aox1プロモーター）および転写終結シグナル（図９のそれぞれaoxpおよびaoxt）を含む。ベクター中のhis4+遺伝子はHis+の組換えピキア・パストリス細胞の選択を可能にする。この発現カセットがピキア・パストリスに遺伝子導入されるとき、染色体DNAに組み込まれる。aox1プロモーターの下流に挿入されたコンドラス・クリスパスのヘキソースオキシダーゼ遺伝子を有する発現カセットを運ぶピキア・パストリス細胞では、aox1プロモーターの誘導剤であるメタノールの添加によって、ヘキソースオキシダーゼの産生が誘導されうる。ピキア・パストリスの変異体であるKM71は、主要なアルコールオキシダーゼ遺伝子であるaox1が欠失しているが、ヘキソースオキシダーゼ遺伝子の受容生物として使用されうる（クレッグ（Cregg）およびマデン（Madden）1987；チョップ（Tschopp）ら、1987）。しかしながら、ピキア・パストリスはもう一つのアルコールオキシダーゼaox2があり、これもまたメタノールで誘導されうる。従って、ヘキソース発現カセットで形質転換した組換えピキア・パストリスでは、メタノールを添加すると、２つのオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびアルコールオキシダーゼを産生するようになる。
発現ベクターpPIC3にヘキソースオキシダーゼ遺伝子を挿入するまえに、オープンリーディングの5'および3'の配列に修飾を加えた。一本鎖cDNAはPCRの鋳型として使用された。オープンリーディングフレームの5'端に特異的な合成オリゴヌクレオチドであるHox5'-1（表3.1）がコンドラス・クリスパスのヘキソースオキシダーゼをコードする配列の3'端に特異的なプライマー（Hox3'-1）とともにPCRプライマーとして使用された。プライマーHox3'-1は5'-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3'（配列番号：３２）という配列であった。PCR増幅はAmpliTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）のついているGeneAmp（登録商標）PCR試薬キットを用いて行われた。PCRプログラムは94℃30秒、55℃30秒、および72℃２分で30サイクルであった。反応混合液のゲル電気泳動によりおよそ1.7kbのバンドが示された。この1.7kbの断片はベクターpT7 Blue（Novagen）の中に挿入され（プラスミドpUPO150）、DNA配列決定を行った。
コンドラス・クリスパスヘキソースオキシダーゼをコードする断片はさらに、図９に示すようなピキア・パストリスの発現ベクターであるpPIC3（クレア（Clare）ら、1991）の中にサブクローンされた。ヘキソースオキシダーゼ遺伝子を運ぶプラスミドpT7 Blueは制限酵素NdeIで切断され、末端はサンブルック（Sambrook）ら（1989）によって本質的には説明されているように、クレノウDNAポリメラーゼで末端を平滑化された。DNAポリメラーゼの熱不活性化（サンブルック（Sambrook）ら、1989）の後で、DNAはさらにEcoRIで切断され、ヘキソースオキシダーゼを含むDNA断片が、平滑末端−EcoRIDNA断片としてアガロースゲル上で精製された（QIAEX（商標）、QIAGEN）。
ピキア・パストリス発現ベクターpPIC3は制限酵素SnaBIおよびEcoRIで切断され、アガロースゲルで精製された。精製されたベクターおよびヘキソースオキシダーゼをコードする断片は、サンブルック（Sambrook）ら（1989）によって本質的には説明されているように、大腸菌DH5α（Life Technologies）に遺伝子導入された。結果として生じるコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼを含む発現ベクター、pUPO153は、サブクローンの過程でヘキソースオキシダーゼ遺伝子に変異が起こっていないことを確認するためにDNA配列決定を行った。
プラスミドpUPO153は大腸菌DH5αから精製され、エレクトロポレーション（ピキア酵母発現システム、Phillips Petroleum Company）またはPichia Spheroplast Module（Invitrogen、サンジエゴ、米国、カタログ番号K1720-01）を用いて、ピキア・パストリスに導入された。メタノールの利用ができないピキア・パストリスの変異株KM71（遺伝子型、aox1::ARG4）、（クレッグ（Cregg）およびマデン（Madden）、1987；チョップ（Tschopp）ら、1987）が受容生物として使用された。ヒスチジンを含まないアガープレート上で選択された組換えピキア・パストリスのコロニーは、PCRでヘキソースオキシダーゼ遺伝子が存在するかどうかスクリーニングされた。ピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼプロモーターおよび転写終結シグナルに対して特異的なプライマー（Invitrogen、カタログ番号はそれぞれN710-02およびN720-02）に加えて、ヘキソースオキシダーゼ特異的なプライマー（表3.1）が使用された。
pUPO153を含むピキア・パストリスKM71の試料はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、Germanyに、1996年５月23日、登録番号DSM10693として、寄託されている。
4.2  ピキア・パストリスの組換えヘキソースオキシダーゼの発現
aox1プロモーターと転写終結シグナルの間に挿入されたヘキソースオキシダーゼ遺伝子を有する発現カセットを保持しているピキア・パストリス株KM71は、振とうフラスコ内のMD（１リットルあたり1.34グラムのyeast nitrogen base（Difco、カタログ番号0919-15-3）、0.4mg/lのビオチン、0.1％アルギニン、および20g/lのグルコース）中で培養された。15mlの培養物を含む１リットルの振とうフラスコは３０℃300rpmで回転シェーカー内インキュベートされた。細胞がOD600=15〜20の濃度に達したら、細胞は6,000×gで１０分の遠心分離により回収され、等量（150ml）の誘導培地であるMM（1.34g/lのyeast nitrogen base、0.4mg/lのビオチン、0.1％のアルギニンおよび1％のメタノール）に再懸濁された。２日間の生育後、メタノールの消費および蒸発を補うためにさらにメタノール（0.5％）が加えられた。
誘導後３または４日で、細胞は遠心分離により回収され（6,000×g、１０分）、生育容量の約1/5の50mMトリス塩酸、pH7.5に再懸濁された。再懸濁された細胞は冷蔵し、FRENCH（登録商標）Press（SLM Instruments、Inc.、Rochester、N.Y.）で破砕した。
細胞を20KのFRENCH（登録商標）Pressure Cellの中で内部圧が20,000psiで回列させた。細胞抽出物は10,000×gで１０分、５℃で遠心分離により透明にした。ヘキソースオキシダーゼを含む上清は注意深く取り出され、以下に説明するような精製を行った。
4.3  ピキア・パストリスからの組換えヘキソースオキシダーゼの精製
4.3.1  第一段階、陰イオン交換クロマトグラフィー
フレンチ・プレス（FRENCH press）で均質化されたものからの透明な均質化物を、Q-セファロース、ハイ・パフォーマンス（High Performance）（ファルマシア）で予め充填された２本の5-ml HiTrap-Qカラムを装備したFPLCシステム上で、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムは直列につながれ、クロマトグラフィーは室温で行われた。カラムは緩衝液A：20mMトリス塩酸、pH7.5で平衡化された。試料をのせている間は流速は1.25mlであり、洗浄および溶出では2.5mlであった。試料をのせた後はカラムは30mlの緩衝液Aで洗浄された。吸着した蛋白質はその後、緩衝液Aから緩衝液B：20mMトリス塩酸、750mM NaCl、pH7.5への勾配200mlで溶出された。2mlの画分が洗浄および勾配溶出の間集められた。この画分は上記実施例1.3（試料10μl、インキュベーション時間１５分）で説明されているように、ヘキソースオキシダーゼ活性のアッセイが行った。この画分はまた、0.05Mのグルコースの代わりに0.5％のメタノールが基質として使われたことをのぞき、ヘキソースオキシダーゼアッセイと同一のアッセイにおいて、アルコールオキシダーゼ（AOX）についてアッセイが行われた。図１０に見られるように、活性パターンは、AOXおよびHOXは約400mMのNaClの塩濃度で共溶出されることを示した。ヘキソースオキシダーゼを含む画分は集められ、４℃で保存された。
4.3.2  第二段階、ゲル濾過
精製の第一段階で集められたもの（20〜30ml）はセントリプレップ（Centriprep）濃縮器（アミコン、米国、みかけの分子量カットオフ値30,000）中４℃で超遠心分離により約3.5mlまで濃縮された。濃縮されたヘキソースオキシダーゼの調製物は遠心分離により透明にされ、上清に最終濃度5％になるようにグリセロールが混合された。試料はカラムの入り口に接続されたSA-5試料アプリケーター（ファルマシア）を用いてカラムにのせた。ゲル濾過は350mlのカラム容量でXK 26/70カラム（2.6×66cm、ファルマシア）上４℃で行われた。カラムにはセファクリルS-200HR（ファルマシア）を製品説明書に従って充填した。緩衝液は20mMトリス塩酸、500mM NaCl、pH7.5であり、ペリスタルチックP1ポンプ（ファルマシア）が0.5ml/分にセットされた。280nmでの紫外線吸光度が記録された。2.5mlの画分が集められ、ヘキソースオキシダーゼおよびアルコールオキシダーゼ活性に対して上記で説明されているようにアッセイが行われた（試料10μl、インキュベーション時間１５分）。活性パターンから明らかにAOXおよびHOXの活性が分離されることを示されている。図１１参照。ピキア・パストリスのようなメチル資化性酵母由来のアルコールオキシダーゼが非変性の分子量が約600,000（サーム（Sahm）およびワグナー（Wagner）1973）であるが、一方HOXは1.8の項で説明したように非変性の分子量が約110,000〜130,000であるので、このゲル濾過の結果は期待されていたことであった。組換えHOXの溶出容量は、コンドラス・クリスパス（1.7および1.8の項）からの非変性のHOXに対して同じカラムで以前観察されていた溶出量と同一であった。すなわち、組換えHOXはコンドラス・クリスパスから直接単離された非変性のHOXと同じ分子量であることが明かである。ヘキソースオキシダーゼを含む画分が集められ、４℃で保存された。
4.3.3  第三段階、Mono Qカラムでの陽イオン交換クロマトグラフィー
上記第二段階から集められたものは、さらにMono Q HR 5/5カラムを装備したFPLCシステムでの陽イオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製が行われた（カラム量1ml）カラムは緩衝液A：20mMトリス塩酸、pH7.5で平衡化された。流速は1ml/分であった。第二段階から集められたものは予め充填されたセファデックスG-25カラム（PD-10、ファルマシア）上、緩衝液Aでのゲル濾過により脱塩された。試料をのせた後、カラムは30mlの緩衝液Aで洗浄された。吸着した蛋白質は、0％から100％までの緩衝液B：20mMトリス塩酸、500mMのNaCl、pH7.5の勾配20mlで溶出された。0.5mlの画分が集められ、上記と同様にしてヘキソースオキシダーゼ活性がアッセイされた（試料10μl、インキュベーション時間１５分）。ヘキソースオキシダーゼを含む画分は集められ、４℃で保存された。
4.3.4  第四段階、クロマトフォーカシング
上記第三段階から集められたものは、フェニルセファロース吸着段階を行わないことをのぞき、上記実施例1.13で説明したように、モノP（Mono P）HR 5/5カラム上でのクロマトフォーカシングにより精製された。非変性および組換えヘキソースオキシダーゼを比較すると、両方ともクロマトフォーカシングにより最終精製により得られた形態であるが、ピキア・パストリス由来組換えヘキソースオキシダーゼの特異的活性はコンドラス・クリスパスから単離された本来の形態のものと同一であった。ヘキソースオキシダーゼを含む画分は上記と同様にして、SDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルーR-250でゲルを染色することにより解析された。組換えヘキソースオキシダーゼの精製調製物は40kDおよび29kDに泳動する二つのバンドからなっていた。
結論として、組換えヘキソースオキシダーゼは宿主生物ピキア・パストリスから単離精製することができた。SDS-PAGEでは精製された組換え酵素はコンドラス・クリスパス由来の相当する本来の酵素と同じ40kDおよび29kDのところにバンドが示された。
4.4  ピキア・パストリス由来の組換えヘキソースオキシダーゼの特質
組換えヘキソースオキシダーゼ（rHOX）のペプチド断片の精製およびアミノ酸配列解析
精製したrHOXは、上記の実施例2.4と同様に、分取SDS-PAGEおよびPVDFメンブレンへのエレクトロブロッティングのために使用された。
得られた40kDおよび29kDのバンドは上記実施例2.5で説明したように、PVDFに結合したヘキソースオキシダーゼポリペプチドの酵素消化に供した。ペプチド断片は上記実施例2.7ので説明したように、逆相液体クロマトグラフィーにより分離された。分離がよく、大量にあるペプチドを選択し、上記実施例2.3で説明したように、自動エドマン分解（１０段階）によるアミノ酸配列解析を行った。得られたアミノ酸配列は表4.1に示されている。
0003917183.tif 000012
組換え40kDポリペプチドからのHOX-9ペプチド配列は、表3.2に示されているコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号：３０）におけるAspx8からAsn17まで同一の配列を示した。組換え29kDポリペプチドから得られたペプチド試料の配列解析は各段階で二つの残基が示されていた。アミノ酸配列の検証により、この試料に存在する二つのペプチドは、コンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼのアミノ酸配列にある、それぞれLeu434からGlu443およびTyr388からThr397に対応している。表3.2S参照（配列番号：３０）。
組換えヘキソースオキシダーゼから得られたペプチド配列は、コンドラス・クリスパス由来の本来のヘキソースオキシダーゼの相当するアミノ酸配列に同一であると結論付けることができた。
さらに、コンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ遺伝子で形質転換したピキア・パストリスで組換えヘキソースオキシダーゼを産生することができると結論付けられた。
4.4.1  基質特異性
ピキア・パストリスからの組換えヘキソースオキシダーゼ、およびコンドラス・クリスパスからの本来のヘキソースオキシダーゼの基質特異性は上記のアッセイで種々の糖を用いて、最終濃度0.1Mで比較された。相対速度は表4.2に示されている。
0003917183.tif 000013
表4.2に示されているように、組換えヘキソースオキシダーゼの基質特異性はほとんど本来の酵素のものと同一であった。しかしながら、二糖類の間の相対速度が両方の酵素の形態で、マルトース、セルビオース、およびラクトースの順で低下してはいたが、組換え酵素のほうがこれら二糖類を酸化する能力に置いて選択性が少ないように思われた。本来の酵素に対する結果はサリバン（Sullivan）ら（1973）により以前に報告されたデータとほぼ同一であった。
4.4.2  ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムによる阻害
サリバン（Sullivan）およびイカワ（Ikawa）（1973）はコンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼはジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムにより強く阻害されることを報告した。ピキア・パストリス由来の組換えヘキソースオキシダーゼはこの銅結合化合物による阻害という点で、コンドラス・クリスパス由来の本来の酵素に比較された。サリバン（Sullivan）およびイカワ（Ikawa）（1973）によって説明されているように、0.1mMおよび0.01mMの二つの濃度での酵素アッセイに阻害剤が加えられた。結果は表4.3にまとめられている。
0003917183.tif 000014
表4.3から明かなように、組換えおよび本来のヘキソースオキシダーゼは、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムによる阻害を受けたときに同様に感受性を示した。さらに、この結果はサリバン（Sullivan）およびイカワ（Ikawa）（1973）によって報告されている本来のヘキソースオキシダーゼについてのデータと同様であった。
実施例５
大腸菌での組換えヘキソースオキシダーゼの産生
5.1  大腸菌での組換えヘキソースオキシダーゼ発現のためのベクターの構築
表3.2に示されているコンドラス・クリスパスのヘキソースオキシダーゼをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号：３０）は大腸菌の発現ベクターであるpET17b（Novagen、カタログ番号69726-1）に挿入された。このプラスミドは強い誘導可能なバクテリオファージT7プロモーターおよびT7転写終結シグナルを有する。これらの制御要素の間に挿入された遺伝子は、もしそのプラスミドを特別な大腸菌宿主細胞、例えばBL21（DE3）株（Novagen、カタログ番号69387-1）内で増殖させたならば、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加により発現される。
発現ベクターpET17bでの中に遺伝子を挿入するために、ヘキソースオキシダーゼ遺伝子は5'および3'末端のところで修飾された。ヘキソースオキシダーゼ遺伝子はヘキソースオキシダーゼ遺伝子の5'および3'末端に対して特異的なプライマーでPCRにより単離された。5'プライマー（Hox5'-2）はDNA配列5'-ATGAATTCGTGGGTCGAAGAGCCC-3'（配列番号：３３）であり、3'末端に特異的なプライマーはHox3'-1であった。コンドラス・クリスパス由来の一本鎖cDNAが鋳型として用いられた。PCR増幅は実施例4.1に説明したように、AmpliTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）で行われた。反応液のゲル電気泳動はおよそ1.7kbの大きさのバンドを示した。この1.7kbの断片はpT7 Blue（Novagen）ベクターに挿入され、その結果プラスミドpUPO161が得られた。
ヘキソースオキシダーゼ遺伝子の5'端の修飾、およびさらなる大腸菌発現ベクターへの遺伝子のサブクローニングは図１２に示されている。ATG翻訳開始のところでちょうどNdeI部位を挿入するたえに、PCRにより5'端が修飾された。5'-CAGGAATTCATATGGCTACTCTTCCCCAGAAAG-3'（配列番号：３４）という配列を有するオリゴヌクレオチドHox5'-4はオリゴヌクレオチドHox13-（配列番号：２８）（表3.1）とともに用いられた。PCR増幅は上記実施例4.1に説明されているように行われた。反応混合液は2％アガロースゲルで分画され、ヘキソースオキシダーゼ特異的な180bp断片が実施例3.4で説明したように精製された。180bpの断片は制限酵素ClaIおよびEcoRIで消化され、同じ酵素で消化されたpUPO161に連結され、プラスミドpUPO167を得た。
プラスミドpUPO167のヘキソースオキシダーゼ遺伝子はさらに、大腸菌のためのヘキソースオキシダーゼ発現ベクターを構築するためにサブクローンされた。プラスミドpUPO167は酵素NdeIおよびBamHIならびに酵素BamHIおよびSalIで切断された。最初の反応はヘキソースオキシダーゼの5'および中央の部分をコードする1.6kbの断片を生じ、一方酵素BamHIおよびSalIでの反応はヘキソースオキシダーゼ遺伝子の3'端をコードする200bpの断片を与えた。二つのヘキソースオキシダーゼ特異的断片は実施例3.4で説明したようにアガロースゲルで精製され、制限酵素NdeIおよびXhoIで消化したプラスミドpET17bに連結された。ヘキソースオキシダーゼ遺伝子を運ぶプラスミドpET17bはpUPO181と名付けられた。DNA配列解析により、単離およびクローニング過程ではヘキソースオキシダーゼ遺伝子には変異が導入されなかったことが分わかった。
5.2  大腸菌での組換えヘキソースオキシダーゼの発現
プラスミドpUPO181は標準的な形質転換手法（サンブルック（Sambrook）ら、1989）により大腸菌株BL21（DE3）（Novagen）に導入された。細胞は振とうフラスコ中、LB培地（サンブルック（Sambrook）ら、上記）で生育させた。細胞濃度がOD600=0.5となったところで、組換えヘキソースオキシダーゼを発現するために10-3MのIPTGの添加により細胞に誘導がかけられた。IPTGの添加後１時間で細胞は、上記実施例1.10に記載されているように、遠心分離により回収され、試料緩衝液に再懸濁され、SDS-PAGEに供した。
電気泳動の結果が図１３に示されている。プラスミドpUPO181からの組換えヘキソースオキシダーゼ酵素を発現する大腸菌の非生成物抽出液で、はっきりとした分子量62kのバンドを示した。この62kDのバンドは、オープンリーディングフレームから予測された翻訳産物と同じ分子量であった。非形質転換大腸菌細胞ではこのような62kDの蛋白質は示されなかった。
pUPO181を含む大腸菌BL21（DE3）の試料は「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、Germany」に、1996年５月23日、登録番号DSM10692として寄託されている。
実施例６
パン酵母での組換えヘキソースオキシダーゼの発現
6.1  パン酵母での組換えヘキソースオキシダーゼの発現ベクターの構築
表3.2に示されているコンドラス・クリスパスのヘキソースオキシダーゼをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号：３０）は酵母の発現ベクターであるpYES（Invitrogen、カタログ番号V825-20）に挿入された。プラスミドpYESはパン酵母で組換え蛋白質を誘導的に発現するために設計された高コピー数の染色体外ベクターである。このベクターは高いレベルで厳密に制御された転写のために、パン酵母のGal1遺伝子由来の上流の活性化およびプロモーター配列を含んでいる。転写終結シグナルはCYC1遺伝子由来である。
コンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼ遺伝子は、発現ベクターpYES2に遺伝子を挿入するために5'-および3'-末端に修飾が加えられた。ヘキソースオキシダーゼ遺伝子は実施例4.1（図９）に記載のプラスミドpUPO150から単離された。ヘキソースオキシダーゼ遺伝子は前記の平滑末端−EcoRIDNA断片で単離され、酵素PvuIIおよびEcoRIで消化されたプラスミドpYES2に挿入された（図１４）。得られたプラスミドであるpUPO155は、クローニングの過程でいかなる変異も起こらなかったことを確認するため、DNA配列解析に供した。
プラスミドpUPO155は大腸菌DH5αから精製され、エレクトロポレーションによってパン酵母に形質転換された（グレー（Grey）およびブレンデル（Brendel）1992）。PAP1500株（遺伝子型α、ura3-52trp1::GAL10-GAL4、lys2-801、leu2△1、his3△200、pep4::HIS3、prb1△1.6R、can1、GAL）が受容生物として使用された。
6.2  パン酵母での組換えヘキソースオキシダーゼの発現
プラスミドpUPO155を有するパン酵母株1500はペダーセン（Pedersen）（1996）により説明されているように、生育され、2％ガラクトース存在下で誘導された。誘導後３日後、実施例4.2で記載したように、細胞は遠心分離によって回収され、溶解した。粗精製抽出物に対し上記実施例1.3に記載のo-ジアニシジンアッセイによってヘキソースオキシダーゼ活性がアッセイされた。表6.1はヘキソースオキシダーゼ遺伝子を担持するパン酵母細胞が活性のあるヘキソースオキシダーゼを発現することができることを示している。
0003917183.tif 000015
プラスミドpUPO155を含むパン酵母株1500の試料はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、Germanyに、1996年５月23日、登録番号DSM10694として寄託されている。
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11. Rand, A.G. 1972。ラクトースから酸への直接の酵素的転化：グルコースオキシダーゼおよびヘキソースオキシダーゼ。Journal of Food Science 37：698〜701。
12. Sahm, H.およびwagner, F. 1973。メタノールの微生物の同化。Eur. J. Biochem. 36：250〜256。
13. Sambrook, J.、E.F.FritschおよびT. Maniatis 1989。モレキュラークローニング、実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY。
14. Schagger, HおよびG.von Jagow 1987。1から１００kDaの範囲で蛋白質を分離するためのトリシンードデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動法。Analytical Biochemistry 166：368〜379。
15. Sock, J.およびR. Rohringer 1988。転写メンブレンに固定化した補助的酵素をカップルする反応によるブロットした酵素の活性染色。Analytical Biochemistry171：310〜319。
16. Sullivan, J.D.およびM. Ikawa 1973。紅藻コンドラス・クリスパス由来のヘキソースオキシダーゼの精製および特徴。Biochemica et Biophysica Acta 309：11〜22。
17. Tschopp, J.F.、G. Sverlow、R. Kosson、W. Craig、およびL. Grinna 1987。メチル資化性酵母であるピキア・パストリスでのグルコシル化されたインベルターゼの高レベル分泌。Bio/Technology 5：1305〜1308。
18. Yeh, K-W.、R.H. JuangおよびJ-C. Su。高い炭水化物含有量を有する植物からのRNA単離の迅速で効果的な方法。Focus 13：102〜103。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：Bioteknologisk Institut
（B）街路名：Anker Engelunds Vej 1
（C）市名：Lyngby
（D）国名：Denmark
（E）郵便番号：2800
（ii）発明の名称：組換えヘキソースオキシダーゼ、該酵素を産生する方法、および該酵素の利用
（iii）配列数：34
（iv）コンピューター読みとりフォーム：
（A）メディア形式：Floppy disk
（B）コンピューター：IBM PC compatible
（C）運転システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：8アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0003917183.tif 000016
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003917183.tif 000017
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：16アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0003917183.tif 000018
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0003917183.tif 000019
（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：4アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0003917183.tif 000020
（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0003917183.tif 000021
（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：11アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0003917183.tif 000022
（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：9アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0003917183.tif 000023
（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0003917183.tif 000024
（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：16アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
0003917183.tif 000025
（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
0003917183.tif 000026
（2）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：4アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
0003917183.tif 000027
（2）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
0003917183.tif 000028
（2）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：11アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
0003917183.tif 000029
（2）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：9アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
0003917183.tif 000030
（2）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：modified base; N=inosine
（B）存在位置：base pairs 3, 6 and 12
（C）特徴を決定した方法：commercially available
（D）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
0003917183.tif 000031
（2）配列番号：１７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：modified base; N=inosine
（B）存在位置：base pairs 6 and 12
（C）特徴を決定した方法：commercially available
（D）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：１７：
0003917183.tif 000032
（2）配列番号：１８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：modified base; N=inosine
（B）存在位置：base pairs 6 and 15
（C）特徴を決定した方法：commercially available
（D）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
0003917183.tif 000033
（2）配列番号：１９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：modified base; N=inosine
（B）存在位置：base pairs 3 and 9
（C）特徴を決定した方法：commercially available
（D）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
0003917183.tif 000034
（2）配列番号：２０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
0003917183.tif 000035
（2）配列番号：２１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
0003917183.tif 000036
（2）配列番号：２２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
0003917183.tif 000037
（2）配列番号：２３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
0003917183.tif 000038
（2）配列番号：２４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
0003917183.tif 000039
（2）配列番号：２５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
0003917183.tif 000040
（2）配列番号：２６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
0003917183.tif 000041
（2）配列番号：２７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
0003917183.tif 000042
（2）配列番号：２８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２８：
0003917183.tif 000043
（2）配列番号：２９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：２９：
0003917183.tif 000044
（2）配列番号：３０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1801塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：84..1721
（xi）配列の記載：配列番号：３０：
0003917183.tif 000045
0003917183.tif 000046
0003917183.tif 000047
0003917183.tif 000048
（2）配列番号：３１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：546アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３１：
0003917183.tif 000049
0003917183.tif 000050
0003917183.tif 000051
（2）配列番号：３２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：27塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：３２：
0003917183.tif 000052
（2）配列番号：３３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：３３：
0003917183.tif 000053
（2）配列番号：３４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：33塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号：３４：
0003917183.tif 000054
【図１】
0003917183.tif 000055
【図２】
0003917183.tif 000056
【図３】
0003917183.tif 000057
【図４】
0003917183.tif 000058
【図５】
0003917183.tif 000059
【図６】
0003917183.tif 000060
【図７】
0003917183.tif 000061
【図８】
0003917183.tif 000062
【図９】
0003917183.tif 000063
【図１０】
0003917183.tif 000064
【図１１】
0003917183.tif 000065
【図１２】
0003917183.tif 000066
【図１３】
0003917183.tif 000067
【図１４】
0003917183.tif 000068