(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール性水酸基を有する化合物とα−１、４結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させて配糖体を製造するに際し、α−グルコシダーゼとしてバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のα−グルコシダーゼを用いることを特徴とする配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好熱性菌バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）由来のα−グルコシダーゼを利用した配糖体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
配糖体の製造方法として、従来、α−グルコシダーゼを用いて、マルトースをはじめとするマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン又は各種デンプン等のα−１、４結合を持つグルカンを糖供与体として製造する方法が報告されている（特開平４−１１２７９８号公報）が、この方法では、アルコール性水酸基を有する化合物を糖受容体とすることは報告されているものの、フェノール性水酸基及びフラボノイド類縁化合物を糖受容体とする配糖体の製造方法については、報告されていない。
【０００３】
また、アミラーゼの一種であるシクロデキストリン生成酵素を用いて配糖体を製造する方法も報告されている（日本農芸化学会誌Ｖｏｌ．６７、Ｎｏ．５、１９９３、Ｐ９３）が、この方法では、アルコール性水酸基を有する化合物の他に、フェノール性水酸基や、フラボノイド類縁化合物の配糖体を製造することができるものの、反応組成物が複雑になるため、もう１段酵素処理（グルコアミラーゼ処理）工程を経ねばならず、操作工程及びコストの面から問題が多かった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、操作工程が容易で、しかもアルコール性水酸基を有する化合物の他に、フェノール性水酸基を有する化合物やフラボノイド類縁化合物の配糖体を製造することのできる配糖体の製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）由来のα−グルコシダーゼが、水酸基を有する化合物に対して広く糖転移能を有するということを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明は、フェノール性水酸基を有する化合物とα−１、４結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させて配糖体を製造するに際し、α−グルコシダーゼとしてバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のα−グルコシダーゼを用いることを特徴とする配糖体の製造方法を要旨とするものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるフェノール性水酸基を有する化合物としては、ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、バニリン、カテコール、ピガノール、オイゲノール等が挙げられる。
【０００８】
また、本発明に用いられるα−１、４結合を持つグルカンとしては、例えば、マルトース等のマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各種デンプン等が挙げられる。
【０００９】
本発明に用いられるバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）由来のα−グルコシダーゼとしては、市販の酵素を用いてもよく（例えば、シグマ社製、Ｇ３６５１）、また、α−グルコシダーゼ産生能を有するバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）に属する細菌、例えばバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２７５）を培養することによって得られたものを用いてもよい。
【００１０】
以下、このバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３株の産生するα−グルコシダーゼの理化学的性質について説明する。
【００１１】
（１）作用
α−１、４結合を持つグルカンの存在下で、アルコール性水酸基を有する化合物、フェノール性水酸基を有する化合物又はフラボノイド類縁化合物等の水酸基に、α結合で糖転移を行う。
【００１２】
（２）至適ｐＨ
ａ．加水分解
ｐ−ニトロフェニル−α−グルコピラノシド（以下、ＰＮＰＧと略記する）を基質として各ｐＨのリン酸緩衝液（ただし、ｐＨ６．０以下では酢酸緩衝液を、ＰＨ９．０以上ではグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた）中で３０℃で１５分間反応させた結果、図１に示すとおり、至適ｐＨはｐＨ６．０であった。図１は、この酵素の加水分解活性のｐＨによる変化を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示している。なお、酵素活性は測定値が最高値を示したとき（ｐＨ６．０）の活性を１００とした相対活性で表した。
【００１３】
ｂ．糖転移
マルトースを糖供与体、ヒドロキノンを糖受容体として各ｐＨのリン酸緩衝液（ただし、ｐＨ６．０以下では酢酸緩衝液を、ＰＨ９．０以上ではグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた）中で、４０℃で３時間反応させた結果、図２に示すとおり、至適ｐＨは９．０であった。図２は、この酵素の糖転移活性のｐＨによる変化を示すグラフであり、縦軸に糖転移率を、横軸にｐＨを示している。なお、糖転移率は測定値が最高値を示したとき（ｐＨ９．０）の転移率を１００とした相対転移率で表した。
【００１４】
（３）作用適温の範囲
ＰＮＰＧを基質として０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で各温度で１５分間反応させた結果、図３に示すとおり、作用適温の範囲は３０〜６０℃であった。図３は、この酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示しており、酵素活性は４０℃での測定値を１００とした相対活性で表した。
【００１５】
（４）温度による失活の条件
１００℃において２０分間処理することにより完全に失活する。
【００１６】
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約５０、０００である。
【００１７】
このような酵素は、上記のようなバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）を培養、精製することにより得ることができる。
培養に用いられる培地としては、炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸等の有機酸類、さらに使用する細菌が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸及びグリセリン等が使用でき、窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用できる。さらに無機塩類として、例えば、カリウム、コバルト等の各塩類や、必要に応じて微量金属塩、コーンスティープリカー、ビタミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的培地が使用できる。
【００１８】
また、培養条件としては、これらの培地を用いて、３０〜６５℃、好ましくは４５〜６０℃、最適には５８℃で、２〜６時間、好気的に培養すればよい。
【００１９】
本発明に用いられるα−グルコシダーゼは、このようにして得られた菌体の菌体破砕液を、ゲルろ過クロマトグラフィー、疏水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いて精製することにより得ることができる。
【００２０】
本発明において、フェノール性水酸基を有する化合物とα−１、４結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させる際の、反応液中のフェノール性水酸基を有する化合物の濃度としては、０．１〜５０重量％であることが好ましく、特に好ましくは１〜１０重量％である。この場合、水に難溶な基質に対しては基質が溶解するように、アセトン、アセトニトリル等の水混和性有機溶媒を適当量添加してもよい。また、α−１、４結合を持つグルカンの濃度としては、１〜８０重量％が好ましく、特にこのましくは１０〜５０重量％である。また、酵素の添加量としては、５〜３０Ｕ／ミリリットルとなるように添加することが好ましく、特に１０〜２０Ｕ／ミリリットルとなるように添加することが好ましい。
【００２１】
反応条件としては、３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃で、３〜２０時間反応させればよい。
【００２２】
このようにして得られた配糖体は、反応後にグルコアミラーゼ処理等の後処理を行う必要は全くない。反応終了後は各種溶媒による抽出及び各種クロマトグラフィーによる精製により、配糖体の精製標品を得ることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、本発明におけるα−グルコシダーゼの活性及び糖転移率は以下のようにして測定した。
【００２４】
（１）α−グルコシダーゼ活性の測定
α−グルコシダーゼ酵素液（又は蒸留水に凍結乾燥した酵素を溶解したもの）を、１０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で０．００６〜０．０２２Ｕ／ミリリットルとなるように希釈して、酵素溶液を調整した。
【００２５】
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）１．０ミリリットルに、２０ｍＭのＰＮＰＧ溶液０．５ミリリットルを加え、３０℃で５分間インキュベーションした後、酵素溶液０．５ミリリットルを添加し、３０℃で正確に１５分間インキュベーションした。その後、０．２Ｍの炭酸ナトリウム溶液２．０ミリリットルを添加し、４００ｎｍにおける吸光度（Ｃ）を測定した。また、ブランクとして上記酵素溶液の代わりに精製水を用いて同様の操作を行って４００ｎｍにおける吸光度（Ｃｂ）を測定した。α−グルコシダーゼ活性（Ａ）は、以下の式より算出した。
【００２６】
【数１】
0003916682.tif 000002
【００２７】
なお、本発明においてα−グルコシダーゼ活性の１Ｕは、上記反応系で３０℃で１分間に１μｍｏｌのＰＮＰＧを加水分解できる酵素量と定義する。
【００２８】
（２）糖転移率の測定
α−１、４結合を持つグルカン（糖供与体）と水酸基を有する化合物（糖受容体）を含む８０ｍＭのほう酸緩衝溶液（ｐＨ９）に、α−グルコシダーゼを添加し、反応させた後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＯＤＳカラムＣ−１８（ミリポア社製）を用い、４０％のメタノール溶液で溶出し２５４ｎｍの吸光度により検出した）にて分析を行った。また、コントロールとして酵素無添加の溶液を調製し、同様の条件で分析を行った。糖転移率は、以下の式より算出した。
【００２９】
【数２】
0003916682.tif 000003
【００３０】
参考例１（α−グルコシダーゼの調製）
培地（グルコース  ０．３５重量％、酵母エキス  ０．３重量％、ペプトン  ０．２重量％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．０４重量％、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ  ０．０４重量％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．１重量％、ｐＨ７．８）２０リットルに、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２７５）を植菌し、５８℃で５時間培養を行った後、培養液を遠心分離してバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３の湿菌体約６０ｇを得た。
【００３１】
得られた湿菌体約６０ｇを２５ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ６）６００ミリリットルに懸濁した後、フレンチプレンス（大日本製薬社製）で菌体を破砕した。この菌体破砕液をＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍφ×１０ｃｍ、ファルマシア社製）にアプライし、２５ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ６）の０〜０．２ＭのＫＣｌ濃度勾配により溶出を行った。得られた活性画分を限外ろ過膜（旭化成社製）を用いて脱塩、濃縮を行った後、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー（５ｃｍφ×１０ｃｍ、ファルマシア社製）にアプライし、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）の０．８〜０Ｍの硫安濃度勾配により溶出を行った。得られた活性画分を限外ろ過膜（旭化成社製）を用いて脱塩、濃縮を行った後、凍結乾燥させることによりα−グルコシダーゼの精製標品約２００ｍｇを得た。このような方法で精製した酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを示した。
【００３２】
実施例１
糖受容体として、ヒドロキノン、バニリン、レゾルシノール、カテコール、ピロガノール、オイゲノール、３，４−ジメトキシフェノールを用いて、以下のようにして配糖体を製造した。
【００３３】
マルトース１０重量％、糖受容体２重量％（ステビオシドは１重量％）、参考例１で調製したα−グルコシダーゼの１０Ｕ／ミリリットル溶液を含む反応液１ミリリットルを４０℃で３時間反応させた。配糖体が製造されているかどうかは、ＴＬＣを用いて確認した。
その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003916682.tif 000004
【００３５】
表１からわかるように、本発明の方法によれば、フェノール性水酸基を有する化合物においても配糖体を製造することができた。
【００４２】
実施例２（ヒドロキノングルコシドの製造）
８０ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ９）５００ミリリットルにヒドロキノン１０ｇ及びマルトース５０ｇを溶解し、この溶液に参考例１で調製したα−グルコシダーゼを１０Ｕ／ミリリットルとなるように添加した。この溶液を４０℃で３時間反応させた後、１００℃で５分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は３０％であった。
【００４３】
次に、得られた反応物中の未反応の原料を酢酸エチルにより抽出除去した。水層画分を５０ミリリットルのＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通液し、ヒドロキノングルコシドを吸着させ、蒸留水１リットルでカラムを洗浄した後、５００ミリリットルのメタノールでヒドロキノングルコシドを溶出させた。得られたヒドロキノングルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによりヒドロキノングルコシドの粉末５．２ｇを得た。
【００４４】
得られたヒドロキノングルコシドをα−グルコシダーゼ（東洋紡社製、ＡＧＨ−２１１）で処理した後、ＨＰＬＣで分析を行ったところヒドロキノングルコシドのピークがなくなり、ヒドロキノンのピークが増加したことから、このヒドロキノングルコシドは、ヒドロキノンにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【００４８】
実施例３（３、４−ジメトキシフェニルグルコシドの製造）
８０ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ９）５００ミリリットルに３、４−ジメトキシフェノール１０ｇ及びマルトース５０ｇを溶解し、この溶液に参考例１で調製したα−グルコシダーゼを１０Ｕ／ミリリットルとなるように添加した。この溶液を４０℃で３時間反応させた後、１００℃で５分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は１２％であった。
【００４９】
次に、得られた反応物中の未反応の原料を酢酸エチルにより抽出除去した。水層画分を５０ミリリットルのＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通液し、３、４−ジメトキシフェニルグルコシドを吸着させ、蒸留水１リットルでカラムを洗浄した後、５００ミリリットルのメタノールで３、４−ジメトキシフェニルグルコシドを溶出させた。得られた３、４−ジメトキシフェニルグルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することにより３、４−ジメトキシフェニルグルコシドの粉末１．８ｇを得た。
【００５０】
得られた３、４−ジメトキシフェニルグルコシドをα−グルコシダーゼ（東洋紡社製、ＡＧＨ−２１１）で処理した後、ＨＰＬＣで分析を行ったところ３、４−ジメトキシフェニルグルコシドのピークがなくなり、３、４−ジメトキシフェノールのピークが増加したことから、この３、４−ジメトキシフェニルグルコシドは、３、４−ジメトキシフェノールにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【００５４】
実施例４（ヒドロキノングルコシドの製造）
８０ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ９）５００ミリリットルにヒドロキノン１０ｇ及びマルトース５０ｇを溶解し、この溶液にバチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のα−グルコシダーゼ（シグマ社製、Ｇ３６５１）を１０Ｕ／ミリリットルとなるように添加した。この溶液を４０℃で３時間反応させた後、１００℃で５分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は２８％であった。
【００５５】
次に、得られた反応物中の未反応の原料をクロロホルムにより抽出除去した。水層画分を５０ミリリットルのＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通液し、ヒドロキノングルコシドを吸着させ、蒸留水１リットルでカラムを洗浄した後、５００ミリリットルのメタノールでヒドロキノングルコシドを溶出させた。得られたヒドロキノングルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによりヒドロキノングルコシドの粉末４．６ｇを得た。
【００５６】
得られたヒドロキノングルコシドをα−グルコシダーゼ（東洋紡社製、ＡＧＨ−２１１）で処理した後、同様にＨＰＬＣで分析を行ったところヒドロキノングルコシドのピークがなくなり、ヒドロキノンのピークが増加したことから、このヒドロキノングルコシドは、ヒドロキノンにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、フェノール性水酸基を有する化合物の配糖体を簡便な工程により製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２７５）由来のα−グルコシダーゼの加水分解活性に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２７５）由来のα−グルコシダーゼの糖転移活性に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図３】バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）ＵＫ５６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２７５）由来のα−グルコシダーゼの活性に及ぼす温度の影響を示すグラフである。
【図１】
0003916682.tif 000005
【図２】
0003916682.tif 000006
【図３】
0003916682.tif 000007