(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域と、
大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の複製必須領域と、
大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子と、
ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備え、
大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミドが、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＵＣ１１８であることを特徴とするビフィズス菌用シャトルベクター。
【請求項２】
ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子が、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea ）JCM 4748(ATCC 11635)株のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis ）のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）であることを特徴とする請求項１に記載のビフィズス菌用シャトルベクター。
【請求項３】
次の化１の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７５として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥ１、化２の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７６として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥ１β、化４の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７７として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ５、化３の制限酵素地図で示された前記プラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ５のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域の連結の方向のみが相違するプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ４、又は、化５の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７８として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔＨＣの何れかであることを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載のビフィズス菌用シャトルベクター。
【化１】
0003946300.tif 000014
【化２】
0003946300.tif 000015
【化３】
0003946300.tif 000016
【化４】
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【化５】
0003946300.tif 000018
【請求項４】
次のアミノ酸配列をコードするビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子。
Met-Ser-Val-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Lys-Trp-Asn-Pro-Met-Gly-Val-Pro-Ser-Pro-Ser-Gln-His-Gln-Thr-Ala-Glu-Arg-Leu-His-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-Gly-Pro-Pro-Trp-Glu-Lys-Thr-Asn-Lys-Ile-Thr-Pro-Ser-Leu-Ser-Arg-Thr-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala-Glu-Ser-Arg-Lys-Ile-Leu-Val-Arg-His-Ala-Gly-Gly-Glu-Thr-Leu-Gly-Phe-Glu-Pro-Ile-Lys-Leu-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-Cys-Gly-Gln-Pro-Val-Asp-Thr-Gly-Val-Gly-Val-Met-Thr-Asn-Gly-Glu-Lys-Ala-Arg-Phe-Thr-Gly-Thr-Met-Leu-Cys-Gly-Ser-Ile-Trp-Ala-Cys-Pro-Thr-Cys-Ser-Ala-Ile-Ile-Arg-His-Glu-Arg-Ala-His-Glu-Val-Ala-Leu-Ala-Ile-Gly-Asn-His-Ala-Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Ala-Ala-Ala-Asp-Gln-Trp-Gln-Ala-Glu-His-Glu-Gly-Gln-Arg-Leu-Pro-Pro-Glu-Leu-Met-Val-Ser-Asp-Ser-Phe-Gly-Asn-Tyr-Ile-Phe-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Arg-His-Asp-Arg-Thr-Met-Pro-Leu-Ala-Met-Thr-Leu-Asp-Ala-Ile-Leu-Lys-Gly-Trp-Thr-Lys-Met-Ile-Asn-Gly-Ser-Pro-Trp-Gln-Arg-Ala-Ser-Glu-Arg-Trp-Lys-Ile-Arg-Gly-Phe-Val-Arg-Ala-Ile-Glu-Ile-Thr-Tyr-Gly-Val-Asn-Gly-Trp-His-Pro-His-Ile-His-Phe-Val-Met-Phe-Leu-Asp-Gly-Asp-Leu-Asp-Asp-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Met-Gln-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Arg-Trp-Lys-Thr-Met-Val-Lys-Arg-Val-Ala-Lys-Ala-Tyr-Lys-Lys-Lys-Asp-Gly-Asn-Pro-Tyr-Asn-Val-Ala-Pro-Asn-Asp-Glu-His-Gly-Ile-Asp-Leu-Gln-Phe-Lys-Ser-Gly-Lys-Asp-Ala-Gly-Thr-Ala-Ala-Ala-Glu-Tyr-Ile-Thr-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Lys-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-Lys-Asn-Gly-Arg-Met-Gly-Ser-Val-Asn-Pro-Phe-Gln-Leu-Leu-Asp-Ser-Gly-Cys-Leu-Gly-Leu-Ser-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Asp-Leu-Trp-Leu-Glu-Tyr-Trp-Gln-Ala-Thr-Leu-Arg-Arg-Arg-Cys-Ile-Thr-Trp-Ser-Arg-Gly-Leu-Lys-Glu-Asp-Met-Glu-Val-Glu-Glu-Leu-Glu-Asp-Glu-Glu-Leu-Ala-Glu-Lys-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Leu-Val-Gly-Tyr-Val-Val-Pro-Asn-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp-Ile-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Glu-Thr-Leu-Ala-Asp-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Glu-Arg-Glu-Asp-Trp-Gln-Glu-Val-Ala-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Gly-Val-Ile-Leu-Thr-Asp-Glu-Gln-Gln-Asp-Ala-Ile-Ala-Asp-Gly-Glu-Ala-Lys-Pro-Gly-Asp-Tyr-Leu-Pro-Thr-Met-Ser-Val-Met-Val
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィズス菌と大腸菌とにおいて複製可能な新規のビフィズス菌用シャトルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、インビトロ（in vitro）の遺伝子操作においては、所望の外来遺伝子を宿主細胞内に移入させ、その遺伝子情報を発現させることのできる、宿主細胞に適合したベクターを使用することが必要とされる。
【０００３】
遺伝的な知見が集積していた大腸菌や枯草菌、酵母などでは、早くからベクターの開発が進められ、今日では一般的な遺伝子クローニングシステムとして確立されている。これら以外にも放線菌、動植物の培養細胞、乳酸菌等で各種のベクターが実用化されているが、ビフィズス菌のように開発の遅れているものもある。
【０００４】
ところで、ベクターとしての必須条件が、次の(1) 及び(2) の存在であることが知られている。
(1) 自己複製に必要な遺伝子配列、
(2) 外来遺伝子を挿入するための制限酵素の認識切断部位、
【０００５】
更に実用化のためには、例えば遺伝子操作を可能にし、且つ容易にするために、次の(3) 〜(8) 等の種々の条件を全て満たすような厳しい特性が要請されている。
(3) 形質転換体の検出等に必要なマーカー遺伝子の存在、
(4) 利用可能な制限酵素の種類とその認識切断部位の多様性、
(5) 形質発現の高効率性、
(6) 宿主細胞との適合性と宿主域、
(7) 宿主細胞内での安定性、
(8) 仮想される生物封じ込めに対する適応性、
【０００６】
前記のような特性を有する遺伝子操作におけるベクターに関しては、前述のように研究例の多い大腸菌（E.coli）の宿主−ベクター系にて最もよく開発されているが、大腸菌以外の微生物、例えば工業的に有用な微生物である枯草菌、抗生物質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用されている酵母等に関しても、宿主−ベクター系の開発研究が活発に行われているところである。
【０００７】
しかしながら、食品，医薬品，飼料等に利用されているビフィズス菌においての宿主−ベクター系の研究開発は依然として遅れているのが現状である。これは、ビフィズス菌が嫌気性菌であるために取り扱いが煩雑なこと、遺伝子組換え操作に使用することができるビフィズス菌由来のプラスミドや選択マーカーとして利用できる遺伝子の研究が少ないためである。
【０００８】
一方、微生物に外来ＤＮＡを導入する方法については、エンテロコッカス・フェカリス由来で広宿主域で接合伝達可能な公知のプラスミドｐＡＭβ１がビフィドバクテリウム属に属する１菌株に導入され、導入されたｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子が、このビフィドバクテリウム属に属する微生物で発現するとの報告がある（特開平２−１０７１９２号公報）。しかし、ｐＡＭβ１自身のＤＮＡサイズが２６．５ｋｂと大きく、導入頻度が著しく低いため、そのままではプラスミドベクターとしての使用が難しいという欠点があった。
【０００９】
また、近年になって、僅かであるがビフィズス菌のプラスミドの検索が進み、特開昭６３−１２３３８４号公報、特開平５−１３０８７６号公報、特開平７−２５５４８１号公報等でプラスミドベクターが作成されている。
【００１０】
しかしながら、これらはビフィズス菌ベクターとしての構造体を形作ってはいるものの、実際にビフィズス菌に導入が報告されているプラスミドベクターとしては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）Ｂ2577から分離されたｐＭＢ１（Jounal of General Microbiology,128,2121-2131,1982 ）を材料として作成されたｐＤＧ７（Letters in Applied Microbiology,11,220-223,1990 ）と、ｐＲＭ２（Plasmid,32,208-211,1994 ）との報告だけである。
【００１１】
最初にビフィズス菌の形質転換に成功したのは、ｐＲＭ２であるが、ビフィドバクテリウム・ロンガムに１μｇＤＮＡあたり、３．８×１０2 という低頻度であった。また、ｐＤＧ７については、作成された当初は、これを用いてビフィズス菌を形質転換することはできなかった。しかし、その後、形質転換に使用するビフィズス菌を４℃の特定のバッファー中で長時間インキュベーションした後に、エレクトロポレーションを行うことで、ｐＤＧ７でビフィズス菌が形質転換できることが報告された（ＥＰ−９４２０１７４６，Microbiology,142,109-114,1996 ）。ｐＤＧ７を用いたこの形質転換法は、種々のビフィズス菌を形質転換できるが、エレクトロポレーションに用いるビフィズス菌細胞の調製に時間と手間とが必要である等の欠点もある。
【００１２】
一方、この他にもビフィズス菌からの単離されているプラスミドとして、文献（Letters in Applied Microbiology,9,165-168,1989）のものや、更には、FEMS Microbiology Letters 110,11-20,1993) において開示されているビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）由来のプラスミドｐＮＢｂ１等があるが、これらを材料として未だ好適な宿主−ベクター系を構築した例はない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明はビフィズス菌の広範囲の種において発現可能であり、操作時の取り扱いも容易な新規なビフィズス菌用シャトルベクターを得ることを目的とし、更にベクターをビフィズス菌で複製させるビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子を得ることを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本請求項１に記載された発明に係るビフィズス菌用シャトルベクターでは、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域と、
大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の複製必須領域と、
大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子と、
ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備え、
大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミドが、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＵＣ１１８である。
【００１６】
本請求項２に記載された発明に係るビフィズス菌用シャトルベクターでは、請求項１に記載されたビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子が、サッカロポリスポラ・エリスレア（S.erythraea ）JCM 4748(ATCC 11635)株のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（E.faecalis）のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）である。
【００１７】
本請求項３に記載された発明に係るビフィズス菌用シャトルベクターでは、次の化６の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７５として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥ１、化７の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７６として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥ１β、化９の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７７として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０８株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ５、化８の制限酵素地図で示された前記プラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ５のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域の連結の方向のみが相違するプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔ４、又は、化１０の制限酵素地図で示された受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０７８として生命工学技術研究所に寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に含有されるプラスミドシャトルベクターｐＢＥΔＨＣの何れかであるものである。
【化６】
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【化７】
0003946300.tif 000003
【化８】
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【化９】
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【化１０】
0003946300.tif 000006
【００１８】
本請求項４に記載されたビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子は、次のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
Met-Ser-Val-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Lys-Trp-Asn-Pro-Met-Gly-Val-Pro-Ser-Pro-Ser-Gln-His-Gln-Thr-Ala-Glu-Arg-Leu-His-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-Gly-Pro-Pro-Trp-Glu-Lys-Thr-Asn-Lys-Ile-Thr-Pro-Ser-Leu-Ser-Arg-Thr-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala-Glu-Ser-Arg-Lys-Ile-Leu-Val-Arg-His-Ala-Gly-Gly-Glu-Thr-Leu-Gly-Phe-Glu-Pro-Ile-Lys-Leu-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-Cys-Gly-Gln-Pro-Val-Asp-Thr-Gly-Val-Gly-Val-Met-Thr-Asn-Gly-Glu-Lys-Ala-Arg-Phe-Thr-Gly-Thr-Met-Leu-Cys-Gly-Ser-Ile-Trp-Ala-Cys-Pro-Thr-Cys-Ser-Ala-Ile-Ile-Arg-His-Glu-Arg-Ala-His-Glu-Val-Ala-Leu-Ala-Ile-Gly-Asn-His-Ala-Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Ala-Ala-Ala-Asp-Gln-Trp-Gln-Ala-Glu-His-Glu-Gly-Gln-Arg-Leu-Pro-Pro-Glu-Leu-Met-Val-Ser-Asp-Ser-Phe-Gly-Asn-Tyr-Ile-Phe-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Arg-His-Asp-Arg-Thr-Met-Pro-Leu-Ala-Met-Thr-Leu-Asp-Ala-Ile-Leu-Lys-Gly-Trp-Thr-Lys-Met-Ile-Asn-Gly-Ser-Pro-Trp-Gln-Arg-Ala-Ser-Glu-Arg-Trp-Lys-Ile-Arg-Gly-Phe-Val-Arg-Ala-Ile-Glu-Ile-Thr-Tyr-Gly-Val-Asn-Gly-Trp-His-Pro-His-Ile-His-Phe-Val-Met-Phe-Leu-Asp-Gly-Asp-Leu-Asp-Asp-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Met-Gln-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Arg-Trp-Lys-Thr-Met-Val-Lys-Arg-Val-Ala-Lys-Ala-Tyr-Lys-Lys-Lys-Asp-Gly-Asn-Pro-Tyr-Asn-Val-Ala-Pro-Asn-Asp-Glu-His-Gly-Ile-Asp-Leu-Gln-Phe-Lys-Ser-Gly-Lys-Asp-Ala-Gly-Thr-Ala-Ala-Ala-Glu-Tyr-Ile-Thr-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Lys-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-Lys-Asn-Gly-Arg-Met-Gly-Ser-Val-Asn-Pro-Phe-Gln-Leu-Leu-Asp-Ser-Gly-Cys-Leu-Gly-Leu-Ser-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Asp-Leu-Trp-Leu-Glu-Tyr-Trp-Gln-Ala-Thr-Leu-Arg-Arg-Arg-Cys-Ile-Thr-Trp-Ser-Arg-Gly-Leu-Lys-Glu-Asp-Met-Glu-Val-Glu-Glu-Leu-Glu-Asp-Glu-Glu-Leu-Ala-Glu-Lys-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Leu-Val-Gly-Tyr-Val-Val-Pro-Asn-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp-Ile-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Glu-Thr-Leu-Ala-Asp-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Glu-Arg-Glu-Asp-Trp-Gln-Glu-Val-Ala-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Gly-Val-Ile-Leu-Thr-Asp-Glu-Gln-Gln-Asp-Ala-Ile-Ala-Asp-Gly-Glu-Ala-Lys-Pro-Gly-Asp-Tyr-Leu-Pro-Thr-Met-Ser-Val-Met-Val
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域と、大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子と、ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備えたものであるため、大腸菌及びビフィズス菌で発現可能なシャトルベクターとして用いることができる。尚、本発明のシャトルベクターは当然ではあるが、外来遺伝子を挿入するための制限酵素の認識切断部位を一つ以上有する。
【００２０】
本発明のシャトルベクターを構成する成分の中のベクターをビフィズス菌で複製させるための複製開始点及び複製タンパク質を含む複製必須領域は、公知のものであるビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１に由来する（FEMS Microbiology Letters,110,11-20(1993) ）。
【００２１】
更に、本発明では、このプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域の塩基配列を決定し、複製タンパク質遺伝子を得た。具体的には後述する配列表の配列番号１に示された2997bpの遺伝子配列のうち、539bp から2020bpに示されたアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００２２】
また、本発明のベクターについて、ビフィズス菌に移入し組換え体を選択する際の選択マーカーとしては、ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子が用いられる。この抗生物質耐性遺伝子としては、ビフィズス菌で機能するものであればよく、グラム陽性菌由来のもの、放線菌又は乳酸菌又は乳酸球菌に由来のものから選ばれる。具体的には、放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（S.erythraea ）JCM4748(ATCC 11635) 株由来のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を用いた。このエリスロマイシン耐性遺伝子は塩基配列が公知となっており、遺伝子のＧＣ含量がビフィズス菌のそれに近いことが判明している（Gene,38,103-110(1985) ）。
【００２３】
従って、本抗生物質耐性遺伝子はビフィズス菌内で発現する可能性が高いと考えられ、実際にビフィズス菌にこのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を用いて作出したプラスミドベクターｐＢＥ１をビフィズス菌内に移入した際には、組換え体の選択について、好適な結果が得られた。このプラスミドベクターｐＢＥ１は、9.05ｋｂの大きさを有し、前述の化６に示された制限酵素切断部位を有する。
【００２４】
しかしながら、ビフィズス菌での組換え体の選択マーカーは放線菌由来のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）に限定したものではなく、エンテロコッカス・フェカリス（E.faecalis）由来のｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）(J.Bacteriol.157,445-453,1984)をこのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）と入替えたベクターｐＢＥ１βでも可能であった。このプラスミドベクターｐＢＥ１βは、9.35ｋｂの大きさを有し、前述の化７に示された制限酵素切断部位を有する。
【００２５】
また、このシャトルベクターを大腸菌（E.coli）に導入し、ベクターＤＮＡを増幅する際に必要となる大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子とは、公知の大腸菌プラスミドから選択することができる。具体的には、大腸菌の複製必須領域及び選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐr ）は、公知の大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ 177由来のものが利用できる。更に、大腸菌を宿主とした時に高いプラスミドＤＮＡの収率が望めるｐＵＣ 118由来の複製必須領域を使用したシャトルベクターも作出できる。尚、ｐＵＣ 118を用いたものとしては、具体的にはｐＢＥΔＨＣが作出された。このｐＢＥΔＨＣは、7.15ｋｂの大きさを有し、前述の化１０に示された制限酵素切断部位を有する。
【００２６】
本発明のシャトルベクターの構築に際しては、先ず、放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（S. erythraea）JCM 4748株の染色体ＤＮＡを BamHIとKpnIで切断し、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む 1.4ｋｂの切断断片を公知の方法（Gene,38,103-110,1985）に従い単離した。次に、この遺伝子に化学合成したＳＤ配列を付加し、選択マーカーとしての機能発現がより確実なものとした。
【００２７】
更に、ＳＤ配列の直前にエリスロマイシン耐性遺伝子をビフィズス菌内で発現させるためのプロモータ配列として、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）の染色体に由来するプロモータ配列、もしくは、ビフィズス菌と同じグラム陽性菌であるところの枯草菌のファージＳＰＯ２に由来するプロモータ配列を連結した。
【００２８】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）に由来するプロモータ配列は例えば特開平５−１４６２９６号公報に開示されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片上の配列でよく、ここに示されているｐＴＩ−ＢＢＩ−３．８上の挿入ＤＮＡ断片をHaeIIIで切断し、 318塩基対のＤＮＡ断片を分離することで得られる。
【００２９】
一方、枯草菌ファージＳＰＯ２のプロモータ配列は、ファージＤＮＡを EcoRIで切断した時に生じる 0.3ｋｂのＤＮＡ断片を分離することで得られるが、このＤＮＡ断片を組込んだプラスミドであるｐＰＬ６０８の構造並びに、このプロモータを含む 0.3ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列は公知のものであり（Gene,22,45-57,1983）、また、ｐＰＬ６０８はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）からATCC 37108番の分譲を受ければよい。
【００３０】
一方、シャトルベクターの本体となる大腸菌プラスミドベクターとｐＮＢｂ１の複合体はｐＮＢｂ１上に１カ所のみの切断点を持つ制限酵素サイトを用いて両者を連結すればよい。即ち、大腸菌プラスミドベクター上のScaIサイトとｐＮＢｂ１上のScaIサイトを用いて両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。
【００３１】
このようにして作成した大腸菌プラスミドベクターとｐＮＢｂ１の複合体にプロモータ配列、ＳＤ配列等を付加したエリスロマイシン耐性遺伝子を更に連結し、前述のシャトルベクターｐＢＥ１を構築した。
【００３２】
本発明では、シャトルベクターｐＢＥ１のビフィズス菌（B.breve ）への移入には、エレクトロポレーション法を用いた。
【００３３】
また、ベクターを使用する場合には、一般に同じ構築要素からなるベクターであれば、そのベクターの大きさが小さいほど、形質転換頻度は高い。ｐＢＥ１は9.05ｋｂであり、宿主に移入するには多少大きい。このため、本発明では、更に形質転換頻度の高いベクターを構築するため、宿主内での複製に必要なプラスミドの領域を決定し、数種類のサイズのベクターを作成した。こうして作成されたベクター中で、最も形質転換頻度が高かったのは、ｐＢＥΔ４、ｐＢＥΔ５であり、プラスミドＤＮＡ重量あたりで、ｐＢＥ１より約５倍頻度は上昇した。このプラスミドｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５は各々 5.7ｋｂの大きさを有し、前述の化８及び化９に示された制限酵素切断部位を有する。
【００３４】
ｐＢＥΔ５はまた、広範囲のビフィズス菌において発現可能であり、少なくともビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B.pseudolongum）に対して、１μｇＤＮＡあたり１０2 〜１０4 の頻度で導入できることが確認された。
【００３５】
また、本発明ではシャトルベクターをビフィズス菌に移入する際に、宿主であるビフィズス菌の菌株によってプラスミドＤＮＡのメチル化の有無が、導入頻度に大きく影響することを明らかにした。即ち、ビフィズス菌シャトルベクターを大腸菌中で増幅する際に、ＤａｍメチレースとＤｃｍメチレースの活性を有する大腸菌を用いるか、ＤａｍメチレースとＤｃｍメチレースの活性を失った大腸菌を使い分けることによって、各種ビフィズス菌への導入効率をより上昇させることができる。尚、このメチレースの欠損大腸菌は、これらの遺伝子（ｄａｍ、ｄｃｍ）に欠損があり、各メチレース活性がないものであれば、何れの大腸菌を用いてもよく、分譲機関や商業的に容易に入手できる。
【００３６】
尚、今回作成した新規シャトルベクターｐＢＥ１は生命工学研究所に菌寄第１６０７５号（平成０９年０２月１０日付け寄託）として、ｐＢＥ１βは同じく菌寄第１６０７６号（平成０９年０２月１０日付け寄託）として、ｐＢＥΔ５は同じく菌寄第１６０７７号（平成０９年０２月１０日付け寄託）として、ｐＢＥΔＨＣは同じく菌寄第１６０７８号（平成０９年０２月１０日付け寄託）として既に寄託されている。尚、ｐＢＥΔ４とｐＢＥΔ５とは、プラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域の連結の方向のみが相違するため、ｐＢＥΔ５のみ寄託し、ｐＢＥΔ４の寄託は行わなかった。
【００３７】
【実施例】
以下に、上記シャトルベクターの作成について、実施例を示し、詳述する。
実施例１（プラスミドｐＮＢｂ１の分離）
下記の表１に示す組成を有するＭＩＬＳ培地（Letters in Applied Microbiology,9,165-168,1989）を用いてビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698株を培養した。
【００３８】
【表１】
0003946300.tif 000007
【００３９】
ＭＩＬＳ培地 100mlを 120℃で15分間滅菌し、室温まで冷やした後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698株の培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、密栓し、37℃で16時間静置培養した。培養終了後、遠心分離（6,000rpm，15分）によって菌体を集めた。次いで、プラスミドを以下の方法により単離した。回収した菌体を２mlのソリューションＩ（50mM Tris-HCl ，ｐＨ 7.5、10mM EDTA 、 100μg/ml RNaseA ）に懸濁した後、 200μg/mlとなるようにリゾチームを加え、更に50μg/mlとなるように、Ｍ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業社製）を加え37℃で20分間保温した。
【００４０】
遠心分離（15,000rpm ，５分間）により、再び菌体を回収し、これを 0.4mlのソリューションＩに懸濁した。この菌体懸濁液に、 0.4mlのソリューションII（0.2N NaOH 、１％ SDS）を加え、穏やかに混合し、溶菌させた。更に、 2.55Mの酢酸カリウム溶液を 0.4ml加え、よく混合した。遠心分離（15,000rpm 、10分間）にかけ、上清を分取した。
【００４１】
この上清に等量のフェノール（ＴＥバッファーで飽和したもの）を加え、タンパク質の抽出を２度行った後、水層を分取し、1/10量の３Ｍ−酢酸ナトリウム溶液と、 2.5倍量のエタノールを加え、 -80℃で１０分間冷却した。これを遠心分離（15,000rpm ，10分間）し、沈殿を回収し、80％エタノールで洗浄後、真空乾燥した。沈殿を再びＴＥバッファー（10mM Tris-HCl ｐＨ 8.0、１mM EDTA ）２mlに溶解し、 1.9ｇの塩化セシウムと40μｌの臭化エチジウム溶液（10ｍg/ml）を加え、塩化セシウム／臭化エチジウムの濃度勾配遠心法によりプラスミドＤＮＡの精製を行った。これにより得られたｐＮＢｂ１のプラスミドＤＮＡは約２μｇであった。
【００４２】
図１は得られたプラスミドｐＮＢｂ１の制限酵素切断地図である。本プラスミドは既報（FEMS Microbiology Letter,110,11-20,1993 ）の通り、 5.6ｋｂで、図１に示す制限酵素断片部位が存在した。また、既報に示されていた制限酵素切断部位以外に、AccI，SacI，SmaIの切断部位が各１カ所、KpnI，XbaI，SalI，PstIの切断部位は存在しないことが新たに確認された。
【００４３】
実施例２（放線菌エリスロマイシン耐性遺伝子の単離とＳＤ配列、プロモータ配列の付加）
(1) 放線菌染色体ＤＮＡの調製
放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（S.erythraea ）JCM 4748株はペプトン・コーン培地（Japan collection of microorganisms,Catalogue of Streins,5th edition,1992）を用いて28℃、４日間、振盪培養した。
【００４４】
培養液より菌体を遠心分離によって集め、ＴＥバッファで洗浄後、Ａバッファ（２μg/mlリゾチーム、10％グルコース、50mM Tris-HCl ，ｐＨ 8.0，１mM EDTA ）に懸濁し、37℃で15分間保温した。10％ SDS溶液を1/10量加え、穏やかに混合し、溶菌させた。65℃、１時間保温した後、プロテネースＫ（終濃度 200μg/ml）を加え、37℃で３時間保温した。
【００４５】
保温後、ＴＥバッファーで飽和したフェノールを当量加え、15分間、ゆっくりと混合して、タンパク質を抽出した。遠心分離により水層を回収し、フェノール抽出を繰返す操作を３回行った。分取した水層に２倍量のエタノールを重層し、境界面に凝集したＤＮＡをガラス棒で巻取った。再びこのＤＮＡを少量のＴＥバッファーに溶解し、エタノールを重層してＤＮＡを巻取る操作を３回繰返した。少量のＴＥに巻取ったＤＮＡを溶解し、ＲＮａｓｅＡ（終濃度50μg/ml）を加え、37℃で30分間保温した。再びエタノールの重層とガラス棒による巻取り操作を３回繰返した。巻取ったＤＮＡは風乾した後、少量のＴＥバッファーに溶解した。
【００４６】
(2) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）の単離
放線菌（S.erythraea ）JCM 4748株のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）は、染色体ＤＮＡの BamHI切断とKpnI切断により生じる 1.4ｋｂのＤＮＡ断片に存在し、この部分の塩基配列は公知のものとなっている（Gene,38,103-110,1985）。
【００４７】
そこで、染色体ＤＮＡを BamHIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動法により、 1.4ｋｂに相当するＤＮＡ画分を得た。アガロースゲルからのＤＮＡの抽出はジーン・クリーン（ＢＩＯ１０１，ＵＳＡ）を用いた。抽出したＤＮＡと、 BamHIとKpnIで切断してアルカリホスファターゼ処理した大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１１９とを混合し、ＤＮＡリガーゼを用い、ライゲーションを行った。ライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０８をハナハン（Hanahan ）の方法により形質転換し、 100μg/mlのアンピシリンと 500μg/mlのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地（塩化ナトリウム 0.5％，トリプトン１％，酵母エキス 0.5％）の寒天平板培地に塗抹し、37℃で16時間培養し、生じたコロニーを選択した。
【００４８】
コロニーをアンピシリンとエリスロマイシンとを添加したＬＢ培地３mlに接種し、37℃16時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００４９】
プラスミドＤＮＡを BamHI、KpnI等の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片はエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）であることが確認された。得られたプラスミドをｐＵＣＥｍと命名した。図２は得られたプラスミドｐＵＣＥｍの構造を示す説明図である。
【００５０】
(3) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）へのＳＤ配列の付加
1.4ｋｂのＤＮＡ断片上でｅｒｍＥは BamHIサイトの直後が開始コドンとなっていることが判っている（Gene,38,103-110,1985）。このため、ｅｒｍＥの選択マーカー遺伝子としての機能発現をより確実とする目的で、化学合成したＳＤ配列をｅｒｍＥの直前に付加した。
【００５１】
図３はプラスミドｐＵＣＥｍ上のｅｒｍＥのＳＤ配列を合成ＤＮＡの挿入による変化した過程を示す説明図である。ｐＵＣＥｍをプラスミドベクター側のポリリンカー上の制限酵素サイトであるXbaIとｅｒｍＥのクローニングサイトである BamHIで切断した後、５’末端をリン酸化した５’−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧ−３’と、５’−ＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴ−３’という２本の相補的な配列をもつ合成ＤＮＡを２つのサイトの間に挿入し、Ｔ４リガーゼによりライゲーションし、ｐＵＣＳＤＥｍを作成した（図３参照）。
【００５２】
(4) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）へのプロモータ配列の付加
前項までに作成したプラスミドであるｐＵＣＥｍや、ｐＵＣＳＤＥｍは大腸菌を宿主とした場合、プラスミドベクター上のｌａｃプロモータによりｅｒｍＥは発現している。ビフィズス菌中でグラム陰性である大腸菌のプロモータが機能するという知見はないので、ビフィズス菌自身のプロモータ又はビフィズス菌と同じくグラム陽性菌である枯草菌のプロモーターをｐＵＣＳＤＥｍに挿入する操作を行った。
【００５３】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）より既に単離され、塩基配列の決定されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片（特開平５−１４６２９６号公報）からプロモーター類似の塩基配列の認められる部分を取出し使用した。このＤＮＡ断片は特開平５−１４６２９６号の配列表１における塩基番号2267から2584までで、この公報に開示されたプラスミドｐＴＩ−ＢＢＩ−３．８をHaeIIIで切断し 318塩基対のＤＮＡ断片を分離することで得た。
【００５４】
この断片のプラスミドへの挿入は次の手順で行った。即ち、ｐＵＣＳＤＥｍをXbaIで切断した後、切断末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、末端をアルカリホスファターゼ処理した後、分離した 318塩基対の大きさを持つＤＮＡ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて連結させた。この反応をハナハン（Hanahan ）の方法により、大腸菌ＪＭ１０８に形質転換し、アンピシリン（ 100μg/ml）とエリスロマイシン（ 500μg/ml）を加えたＬＢ寒天平板培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。
【００５５】
平板上に生じたコロニーは大きいものと小さいものが認められたので、このうち大きなコロニーより、アンピシリンとエリスロマイシンとを含む３mlのＬＢ培地に菌を接種、培養し、アルカリ法でプラスミドを精製した。このプラスミドを複数の制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動法により解析したところ、目的の部位に約 300塩基対のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＵＣＰ１ＳＤＥｍと命名した。図４はプラスミドｐＵＣＰ１ＳＤＥｍの構造を示す説明図である。
【００５６】
一方、ビフィズス菌と同じグラム陽性菌の枯草菌では強いプロモーターであることが知られている枯草菌溶源化ファージＳＰ０２のプロモータをｐＵＣＳＤＥｍに挿入したプラスミドｐＵＣＰ２ＳＤＥｍは以下の手順で構築した。
【００５７】
ファージＳＰ０２のプロモーターは EcoRIの切断により生じる約 0.3ｋｂのＤＮＡ断片上にあることが知られているが、この断片を含む公知の枯草菌プラスミドベクターｐＰＬ６０８（Gene,22,45-57,1983）を EcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動法で分離することにより本断片を得た。ｐＵＣＳＤＥｍはXbaIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した後、アルカリホスファターゼ処理を行った。プロモーター断片はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した。両ＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、プロモーターの連結を行った。この反応液を大腸菌ＪＭ１０８に形質転換し、アンピシリン（ 100μg/ml）とエリスロマイシン（ 500μg/ml）を添加したＬＢ寒天平板培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。
【００５８】
平板上に生じたコロニーは大きなものと小さなものとが認められたので、大きなコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、複数の制限酵素で切断し解析した。その結果、本実験で得たｐＵＣＰ１ＳＤＥｍは、目的のプロモータを含むＤＮＡ断片を連結する過程で行ったＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理において、プロモータ断片とプラスミドとの連結部位の EcoRIとXbaI切断点は消失していたが、目的のプロモーターＤＮＡ断片はプラスミド上に挿入されていることが確認された。
【００５９】
実施例３（シャトルベクターｐＢＥ１の構築）
(1) 大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリリンカーの付与
図５はプラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリリンカーの付与を説明する説明図であり、ａ図は各操作を示す工程図、ｂ図はポリリンカーＤＮＡの塩基配列と制限酵素切断部位とを示す説明図である。ａ図に示す通り、ｐＡＣＹＣ１７７（3.94ｋｂ）をEco47IIIで切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いセルフライゲーションすることで、1.43ｋｂのEco47III断片を除去したｐＡＣＹＣΔ１（2.51ｋｂ）を得た。次に SacII切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑化した後、末端をリン酸化した８ｂａｓｅの HindIIIリンカー（５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’）をこの部分に挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結することで SacII切断部位を HindIII切断部位に変えた。
【００６０】
HindIIIとEco47IIIでこれを切断し、0.25ｋｂのＤＮＡ断片を除去した後、プラスミド部分の末端をアルカリホスファターゼで処理した。末端をリン酸化したｂ図に示すポリリンカーＤＮＡをこれに加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで先のプラスミドに挿入した（ｐＡＣＹＣΔ２ＰＬ；2.31ｋｂ）。ｐＡＣＹＣΔ２ＰＬをEco47IIIとＡａｔIIとで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションし、約1.75ｋｂのプラスミドｐＡＣＹＣΔＰＬを得た（図５ａ図）。
【００６１】
(2) ｐＡＣＹＣΔＰＬへのｐＮＢｂ１のクローニング
図６はｐＮＢｂ１のｐＡＣＹＣΔＰＬへのクローニング操作を示す工程図である。図に示す通り、(1) で得たｐＡＣＹＣΔＰＬをポリリンカー内のSacI切断部位において切断した後、アルカリホスファターゼ処理を行った。これに対し、ｐＮＢｂ１を同じくSacIで切断したものを加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＡＣＰＮＢ（7.35ｋｂ）を得た（図６中段）。
【００６２】
(3) ｐＡＣＰＮＢへのｅｒｍＥのクローニング
実施例２により得たｐＵＣＰ２ＳＤＥｍをPstIとKpnIとで切断し、アガロースゲル電気泳動法により分画し、プロモーター，ＳＤ配列，ｅｒｍＥが含まれる約1.65ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。一方、ｐＡＣＰＮＢをPstIとKpnIで切断し、アルカリホスファターゼ処理した。これら２つのＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、両者を連結し、ｐＢＥ１（9.05ｋｂ）を得た（図６後段）。
【００６３】
実施例４（シャトルベクターｐＢＥ１βの作製）
ビフィズス菌のＧＣ含量が６０％前後であるのに対し、ｐＢＥ１の作製にはＧＣ含量が約70％のｅｒｍＥをその選択マーカー遺伝子として使用した。ビフィズス菌中で遺伝子発現の有無がＧＣ含量に依存するか否か明らかにする目的でｅｒｍＥ部分を低いＧＣ含量のエリスロマイシン耐性遺伝子であるｅｒｍＡＭ（ＧＣ含量約33％）(Nucleic Acid Res.,15,3177,1987)と入れ換えたｐＢＥ１βを以下の手順で作製した。
【００６４】
エンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＡＭが組込まれているプラスミドｐＶＡ８３８（ATCCNo.37160）をAvaIと HindIIIで切断し、ｅｒｍＡＭを含む 1.7ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化し、ｐＵＣ１１９のSmaI切断部位に一度連結した。これを BamHIとKpnIで切断し、末端に BamHIとKpnI切断部位を持つｅｒｍＡＭのＤＮＡ断片を分離・精製した。
【００６５】
一方、ｐＢＥ１を BamHIとKpnIで切断し、ｅｒｍＥを含むＤＮＡ断片を除去した後、アルカリホスファターゼ処理し、先に分離・精製したｅｒｍＡＭを含む 1.7ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、これを連結した。得られたプラスミドをｐＢＥ１βとした。
【００６６】
実施例５．（ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）のエレクトロポレーション用細胞の調製）
１％のグルコース又はラクトースを含むＭＩＬＳ培地にて一昼夜37℃で、嫌気培養したビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）培養菌液を同じ組成の新しい培地に1/50接種し、37℃で嫌気培養した。培養液の濁度が 660ｎｍの波長で約 0.2になったところで集菌し、もとの液量と同量の０℃に冷却したグリセリン溶液（10％）で洗浄した。更に 1/2量のグリセリン溶液（10％）で２度洗浄した後、菌体を 0.4mlのグリセリン溶液（10％）に懸濁した。この菌体懸濁液は小分けにし、エタノール／ドライアイス上で凍結した後、 -80℃で保存した。本凍結菌体をエレクトロポレーションに使用したが、少なくとも２週間は使用可能であった。
【００６７】
実施例６（ｐＢＥ１及びｐＢＥ１βのビフィズス菌へのエレクトロポレーション）
エレクトロポレーションには、ジーンパルサーとパルスコントローラー（Bio-Rad Laboratories,USA）を使用した。この際、機械の内部抵抗２００Ω、コンデンサー容量２５μＦで固定し、電圧に関しては適宜変更した。実際の操作は以下の通り行った。実施例５により調製したビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）の凍結菌液を氷の上で溶解し、40μｌずつをマイクロ遠心チューブに分取した。１μｌ（１μg/μｌ）のプラスミドＤＮＡを加えて混合した後、氷上で冷却した専用キュベット（電極間 0.1ｃｍ幅）に40μｌを移し、電気パルスをかけた。パルス後は直ちに、菌液を小試験管内の窒素置換したＭＩＬＳ培地（細胞を調製したときと同じ糖を含む）３mlに懸濁した。37℃で３時間嫌気培養した後、選択用の薬剤を添加したＭＩＬＳ寒天培地（細胞を調製したときと同じ糖を含む）と混合し、混釈法により寒天平板上にまいた。この寒天平板をアネロパック（住友ガス化学社製）を用いて37℃で嫌気的に３〜４日間培養した。
【００６８】
先ず、ｐＢＥ１を用いてビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4065 とビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 に対するエレクトロポレーションの至適電圧を調べた。12ＫＶ／ｃｍから２ＫＶ刻みで24ＫＶ／ｃｍまで７点の電圧を取り、形質転換対数を計測したところ、YIT4064 は20ＫＶ／ｃｍで最高値が得られ、このときの形質転換体数は１μｇＤＮＡあたり 365個であった。一方、ｐＢＥ１βでは同条件で92個の形質転換体を得た。
【００６９】
これらの形質転換体より、実施例１に従ってプラスミドＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動法により大きさを調べたところ、用いたｐＢＥ１並びにｐＢＥ１βと一致することが判った。一方、何れの場合もビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4065 を宿主として、形質転換体は得られなかった。
【００７０】
実施例７（ｐＢＥ１の小型化による形質転換頻度の上昇）
ビフィズス菌シャトルベクターｐＢＥ１の小型化を図った。図７はプラスミドｐＢＥ１より小型化したプラスミドベクターにおける欠失領域を示す説明図である。ｐＢＥ１を材料にして、図７に示したｐＮＢｂ１に由来する部分に欠失を持つ４種類のプラスミドを作製した。尚、図７では欠失部分を細線で残した部分を太線で示した。
【００７１】
これらプラスミドがビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 を形質転換できるか否かを調べた。その結果、 1.4ｋｂのClaI−SacI領域を欠失したｐＢＥΔ１、 2.4ｋｂのClaI−BstXI 領域を欠失したｐＢＥΔ２、3.35ｋｂのClaI−BglI領域を欠失したｐＢＥΔ４では、各々形質転換体が得られたが、 2.8ｋｂの PvuII− BstXI領域を欠失したｐＢＥΔ３では得られなかった。
【００７２】
形質転換体の得られたもののうち最小のプラスミドは前述の化８及び化９の制限酵素地図に示すｐＢＥΔ４並びにｐＢＥΔ５であった。また、ｐＢＥΔ３やｐＢＥ１２（ｐＮＢｂ１を BglIIで切断することによって得られる 4.7ｋｂの BglII断片を、ｐＢＥ１のｐＮＢｂ１部分と入れ換えたもの）では、形質転換体が得られなかった点を考慮すると、ビフィズス菌中での複製に必要な領域はｐＮＢｂ１由来の2.25ｋｂのClaI−BglI断片上に存在し、且つ、断片上の制限酵素サイトである PvuII並びに BglIIサイト上に少なくともその一部が存在していると考えられる。
【００７３】
小型化した各プラスミドベクターの大きさ並びに形質転換効率を次の表２にまとめた。図８はプラスミドｐＢＥ１とｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５との関係を示す説明図である。得られた最小のプラスミドベクターｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５は、 5.7ｋｂの大きさで、当初のベクターであるｐＢＥ１の63％の大きさまで小型化できた（図８参照）。また、形質転換効率も１μｇＤＮＡあたりで最高2500まで上昇し、この場合、もとのｐＢＥ１より 5.3倍高い値を得ることができた。
【００７４】
【表２】
0003946300.tif 000008
【００７５】
実施例８（ｐＢＥΔＨＣの作製とエレクトロポレーションによるビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）への導入）
先の実施例で述べたｐＢＥ１，ｐＢＥ１β，ｐＢＥΔ４，ｐＢＥΔ５等は、大腸菌ベクター部分としてｐＡＣＹＣ１７７を使用している。ｐＡＣＹＣ１７７は大腸菌中でのコピー数がｐＵＣ１１８等に比べて低いため、大腸菌部分にｐＵＣ１１８を用いることで、大腸菌を宿主とした時に高いプラスミドＤＮＡの収率が望めるｐＢＥΔＨＣを作製した。
【００７６】
図９はプラスミドｐＢＥΔＨＣの作製を説明する説明図である。先ず、ｐＢＥΔ５をPstIと EcoRIで切断し、ｐＡＣＹＣ１７７に由来する部分を除き、ｅｒｍＥ領域とビフィズス菌複製領域とを備えたＤＮＡ断片を得た。これにPstIと EcoRIで切断したｐＵＣ１１８を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＢＥΔＨＣを得た。
【００７７】
大腸菌（E.coli）ＪＭ１０９中で増幅したｐＢＥΔＨＣを用い、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 に先と同様の条件でエレクトロポレーションを行ったところ、コントロールに用いたｐＢＥΔ５とほぼ同じ頻度で形質転換できた。
【００７８】
実施例９（種々ビフィズス菌へのプラスミドベクターの導入効率とプラスミドのメチル化の影響）
実施例７でビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 への導入効率が最も高かったｐＢＥΔ５を使用して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 以外のビフィズス菌についてその形質転換頻度を調べた。上記の実施例ではプラスミドＤＮＡを増幅するための大腸菌の宿主はＤＮＡメチレース遺伝子であるｄａｍとｄｃｍに欠損のない（ｄａｍ+ ，ｄｃｍ+ ）のＪＭ１０８又はＪＭ１０９を使用したが、以下の実験ではこれら２種類のＤＮＡメチレース遺伝子に欠損のある（ｄａｍ- ，ｄｃｍ- ）の大腸菌であるところのＪＭ１１０を宿主として増幅したプラスミドについてもその形質転換頻度を検討した。
【００７９】
ビフィドバクテリウム属のうち、ヒト糞便由来の菌種とヒト以外の動物に由来する菌種について、材料と方法の項に従って形質転換を検討した。その結果を次の表３に示す。
【００８０】
【表３】
0003946300.tif 000009
【００８１】
表３に示す通り、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4065 ，ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 ，ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC15700 （基準株），ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.lomgum）ATCC15707 （基準株），ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）ATCC15697 （基準株），ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B.pseudolongum）ATCC25526 （基準株）などの菌株で、形質転換体が得られた。
【００８２】
エレクトロポレーションにおける各菌株の至適電圧は、何れも16ＫＶ／ｃｍ以上の高い電圧の領域に存在した（表３）。ただし、ビフィドバクテリウム・ロンガム，ビフィドバクテリウム・インファンティス，ビフィドバクテリウム・シュードロンガムの各菌株では検討した電圧の最高値で最高の形質転換頻度を示したので、装置の上限電圧（25ＫＶ／ｃｍ）より高い電圧をかければ更によい結果が得られるかもしれない。また、菌株によっては使用するプラスミドＤＮＡのメチル化の有無が形質転換頻度に影響し、ｄａｍ- ，ｄｃｍ- の大腸菌で増殖したプラスミドでないと形質転換体が得られない菌株（B.breve YIT4065 ，B.lomgum ATCC15707，B.pseudolongum ATCC25526）、ｄａｍ+ ，ｄｃｍ+ の大腸菌で増殖したプラスミドの方が高い形質転換頻度を示した菌株（B.breve YIT4064 ，B.breve ATCC15700 ）、どちらのＤＮＡでも殆ど差のない菌株（B.infantis ATCC15697）に別けられた（表３参照）。
【００８３】
また、形質転換の最高値は菌株によって差があり、ｐＢＥΔ５  ＤＮＡ１μｇあたり１０2 〜１０4 であった（表３参照）。
【００８４】
以上のように、本研究におけるビフィズス菌プラスミドベクターは広くビフィズス菌種に利用できることが示された。また、ビフィズス菌への外来ＤＮＡの導入にそのＤＮＡ自身のメチル化の有無が影響し、これは菌株毎に異なることが以上から明らかになった。同様の現象は細菌では一般に制限修飾系として知られているが、ビフィズス菌へのＤＮＡの導入に関して同様の系が働くことについては、初めて見出されたものである。将来、プラスミドベクターの導入が困難な宿主に直面した際、Ｄａｍメチレース，Ｄｃｍメチレースに限らず、ＤＮＡメチル化酵素の種類や、強弱の異なる中間宿主でビフィズス菌用のプラスミドベクターを増幅することで、所望するビフィズス菌へこれを導入できる可能性を示唆している。
【００８５】
実施例１０（ｐＮＢｂ１の複製に必要な領域の塩基配列の決定）
プラスミドベクターの全塩基配列を明らかにすることは、そのプラスミドベクターの利便性を上げるために重要である。塩基配列が分かれば、各制限酵素サイトも明らかとなるため、プラスミドの改良や目的遺伝子のクローニングが容易になるからである。研究において作製したビフィズス菌用プラスミドベクターは、その材料のうち大腸菌複製必須領域と薬剤耐性遺伝子は既知のものであるため、塩基配列の明らかでない部分はビフィズス菌複製必須領域のみである。そこで、ビフィズス菌複製必須領域、即ち、ｐＮＢｂ１由来の 2.3ｋｂのClaI−BglI断片の塩基配列を解析した。
【００８６】
プラスミドベクターｐＢＥΔ５より、 2.3ｋｂのＤＮＡ断片をその連結に用いたリンカーのサイトSacIで切り出し、ｐＵＣ１１８のSacIサイトにクローニングした。ＤＮＡ断片の挿入方向が互いに逆向きのプラスミドを選び、各々Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を使用して挿入ＤＮＡ部分の段階的欠失を作製した。常法に従ってこれらから１本鎖ＤＮＡを調製し、蛍光色素プライマーとＰＣＲを用いたサイクルシークエンス法により塩基配列を決定した。耐熱製ポリメラーゼはＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を使用した。ＰＣＲ反応はアプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社製のマニュアルに従い、解析にはＡＢＩ社製３７３Ａ型シークエンサーを使用した。
【００８７】
決定した塩基配列は、後述する配列表の配列番号１に示した。決定された塩基配列の長さは2297ｂｐで、この領域内には1482ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。このＯＲＦの直前にはビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端付近の配列５’ＡＵＣＡＣＣＵＣＣＵＵＵＣＵ３’と相補する配列、所謂ＳＤ配列が認められ、更に上流にはプロモータ様配列も認められた。このことから、見出されたＯＲＦは何らかのポリペプチドをコードすると考えられた。また、ＯＲＦにコードされるポリペプチドの分子量は 54860と算出された。
【００８８】
先のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、「ＧＥＮＥＴＹＸ−ＣＤのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｖｅｒ．１１．２０（ソフトウエア開発株式会社）」を使用して、アミノ酸配列に相同性のあるタンパク質を検索した。その結果、最も高い相同性を示したものとして、ストレプトコッカス・リビダンス（Streptomyces lividans ）のプラスミドｐＩＪ１０１の複製タンパク質が見出された。
【００８９】
ｐＩＪ１０１はローリングサークル方式によって複製するプラスミドのうち、複製タンパク質の相同性などから、ｐＣ１９４，ｐＵＢ１１０，φＸ１７４等と同じグループとされており、ｐＮＢｂ１の複製タンパク質のアミノ酸配列中にもこれらのプラスミドの複製タンパク質のアクティブサイトと高い相同性の認められる領域が存在した。また、周辺領域でも相同性が認められた。このことから、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）のプラスミドｐＮＢｂ１はローリングサークル方式で複製するｐＩＪ１０１，φＸ１７４，ｐＣ１９４，ｐＵＢ１１０等と同じグループのプラスミドであることが示唆された。
【００９０】
一方、この領域の塩基配列が明らかになったことにより、ｐＢＥΔ４，ｐＢＥΔ５では外来ＤＮＡとクローニングできる１カ所切断の制限酵素サイトとしてAccIII， EcoRI，KpnI，Sse8387I，XhoI等があることが判った。一方、ｐＢＥΔＨＣでは EcoRI，KpnI，PstI，Sse8387I，XhoI等がクローニングサイトとして使用可能であることが明らかとなった。また、これら制限酵素を用いて各々のプラスミドＤＮＡを実際に切断し、切断点が１カ所であることを確認した。
【００９１】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明によるシャトルベクターは、多種類のビフィズス菌を形質転換できるので、これを用いることにより、外来遺伝子を種々のビフィズス菌に導入することが可能となる。また、その結果として、ビフィズス菌を種々の用途に利用する際に、より有用性の高い菌株を分子育種できるという効果がある。
【００９２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：2997
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve ）
株名：ATCC15698(pNBb1)
配列の特徴
特徴を表わす記号： -35 signal
存在位置：387..392
特徴を決定した方法：S
特徴を表わす記号： -10 signal
存在位置：410..415
特徴を決定した方法：S
特徴を表わす記号：RBS
存在位置：525..530
特徴を決定した方法：S
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：539..2020
特徴を決定した方法：S
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＮＢｂ１の制限酵素切断地図である。
【図２】プラスミドｐＵＣＥｍの構造を示す説明図である。
【図３】プラスミドｐＵＣＥｍ上のｅｒｍＥのＳＤ配列を合成ＤＮＡの挿入による変化した過程を示す説明図である。
【図４】プラスミドｐＵＣＰ１ＳＤＥｍの構造を示す説明図である。
【図５】プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリリンカーの付与を説明する説明図であり、ａ図は各操作を示す工程図、ｂ図はポリリンカーＤＮＡの塩基配列と制限酵素切断部位とを示す説明図である。
【図６】ｐＮＢｂ１のｐＡＣＹＣΔＰＬへのクローニング操作を示す工程図である。
【図７】プラスミドｐＢＥ１より小型化したプラスミドベクターにおける欠失領域を示す説明図である。
【図８】プラスミドｐＢＥ１とｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５との関係を示す説明図である。
【図９】プラスミドｐＢＥΔＨＣの作製を説明する説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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