(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症性ショックの治療のための医薬組成物であって、１又は複数の医薬として許容される賦形剤の存在下、TNF-R1の細胞外可溶性ドメイン、TBP-1を、DHEAとともに、含む前記組成物。
【請求項２】
敗血症性ショックの治療のためのキットであって、以下の：
TNF-R1の細胞外可溶性ドメイン、TBP-1を含有するパートＡ；及び
DHEAを含有するパートＢ；
を別個に含み、ここで、パートＡとパートＢは別個に又は順次に投与される、前記キット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、致死性バクテリア及びウイルス感染並びに自己免疫及び炎症性の病気の治療のための医薬組成物を作るためのステロイドホルモンと一緒のTNFレセプターの使用に関する。それは、上記治療のためのその活性成分の同時の、別個の又は連続的な使用のための前記医薬組成物にも関する。
特に、それは、敗血症性ショックの治療のための医薬組成物を製造するためのデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）又はその代謝物と一緒のTBP−１の使用に関する。
発明の背景
グラム陰性バクテリア又は内毒血症の結果としての敗血症性ショックは、適切な抗生物質療法はあるにしても重大な臨床状態のままである。
敗血症性ショックの致死的結果は、直接、病原体から生ずるよりもむしろ、TNF及びインターロイキン１（IL−１）のようなタンパク質因子により媒介される過大なホストの応答から生ずる。
腫瘍壊死因子（TNF）は、主に広範囲の生物効果を誘発する活性化マクロファージにより作られたサイトカインである。これらは、内毒素性ショック並びに炎症、免疫調節、増殖、細胞毒性及び抗ウイルス活性における重要な役割を含む。
TNFによって媒介される種々の細胞の応答の誘導は、その（TNF−Ｒ１とも呼ばれる）約55kDa及び（TNF−Ｒ２とも呼ばれる）77kDaの２つの別個の細胞表面レセプターとの相互作用によって始まる。各々TBP−１（TNF結合タンパク質−１）及びTBP−２（TNF結合タンパク質−２）と呼ばれるこれらのレセプターの細胞外の可溶性部分は単離され、クローンされている（EP特許308 378，398 327及びEP特許出願433 900を参照のこと）。
TNF媒介性内毒素性ショックの動物モデルにおけるいくつかの研究は、抗TNF抗体及び可溶性TNFレセプターの両方が、誘導された致死効果を打ち消すことができることを示した（例えばBentler，Bら、Science，229：869（1985）、Lesslauer，Wら、Eur．J．Immunol.，21：2883（1991），Evans，T．J.ら、J．Exp．Med.，180：2173（1994）及びMohler K．M.ら、J．Immunol．151：1548（1993））。
敗血症性ショックの実験モデルにおける尿のTBP−１及び（CHO及び大腸菌細胞の両方から得られる）組換えTBP−１の生体内保護効果は既に証明されている（Bertini．Rら、Eur．Cytokine Netu．4（1）；39（1993）及びYthier A．ら、Cytokines，5：459（1993）を参照のこと）。
DHEA（INN：プラステロン）は、テストステロン及びエストラジオール−17βを含む他のホルモンの生合成における中間体である副腎皮質のステロイドホルモンである。
DHEAの正確な生物学的機能はまだ明らかでない。実験及び疫学的データは、血清中の低レベルのDHEAと、アテローム硬化の心臓血管の病気（Barret−Connor，Dら、N．Engl．J．Med．315：1519（1986）を参照のこと）、癌（Gordon，G．B．ら、Cancer Res．51：1366（1991）を参照のこと）及び免疫不全ウイルス（HIV）感染（Villette．J．M．ら、J．Clin．Endocrinol．Metab．70：572（1990））からの病的状態と、の間の逆の関係を示唆する。
この薬剤の免疫調節活性も報告されており；特に、DHEAは、マウスモデルにおける全身性エリトマトーデスの発達を防ぐことが示されている（Lucas，J．ら、J．Clin．Invese．75：2091（1985））。
DHEAが、異なるウイルス：コクサッキーウイルスＢ４（Loria，R．M.ら、Ann．N．Y．Acad．Sci．293）、２型ヘルペスウイルス（Loria，R．M.ら、J．Med．Virol.，26：301（1988））、西ナイルウイルス（神経毒性シンドビスウイルス）及びセムリキ・ホレスト（Semliki Forest）ウイルス（Ben−Nathan，D.ら、Arch．Virol．20：263（1989））により誘導される致死的ウイルス感染に対する全身的耐性を制御することが証明されている。
DHEAが、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）により誘導される致死的バクテリア感染に対して同様の保護効果を有することも報告されている（Loria，R．M．らin Symposium Pharmaco-Clinique，Roussel-Uclaf 9：24（1989）を参照のこと）。
Danenberg，H．D.ら（Antimicrob．Agents Chemother，36：2275（1992））は、DHEAがリポポリサッカリド（LPS）のみ又はＤ−ガラクトサミンと組み合わせた腫瘍壊死因子アルファ（TNF−α）により誘導された敗血症性ショックからマウスを保護する能力を有することを報告した。LPS投与は、生体内及び試験管内の両方において、DHEAにより大きくブロックされた応答である高レベルのTNF−αを生じた。
発明の開示
本発明の主な対象は、致死的バクテリア及びウイルス感染並びに自己免疫及び炎症性の病気の治療のための医薬組成物を作るためのステロイドホルモンと組み合わせたTNFレセプターの使用である。
TNFレセプター及びステロイドホルモンは、同時に、別個に又は連続的に投与することができる。
本出願人は、実際、前記治療においてその２つの活性成分間の共力作用の効果があることを見い出した。
それゆえ本発明の他の対象は、医薬として許容される賦形剤と一緒に、有効量のTNFレセプター及び有効量のステロイドホルモンを、同時に、別個に、又は連続的に投与することにより、致死的バクテリア及びウイルス感染並びに自己免疫及び炎症性の病気を治療するための方法である。
本発明の更なる対象は、致死的バクテリア及びウイルス感染並びに自己免疫及び炎症性の病気の治療におけるその活性成分の同時の、別個の又は連続的な投与のための、１又は複数の医薬として許容される賦形剤の存在下で、TNFレセプター及びステロイドホルモンを含む医薬組成物である。
２つの活性成分の別個の又は連続的な使用の場合において、本発明の医薬組成物は、その各々が１又は複数の医薬として許容される賦形剤と一緒に２つの活性成分の一方を含む２つの異なる製剤からなるであろう。
このような活性成分の投与は、静脈内、筋肉又は皮下経路によって行うことができる。各々の成分の要求される血液レベルを確立し得る投与の他の経路は、本発明に含まれる。
上述の活性成分が適用される病気の非限定的例は、次のもの：敗血症性ショック、AIDS、慢性関節リウマチ、エリトマトーデス及び多発性硬化症である。特に好ましいのは、敗血症性ショックの治療である。
TNFレセプターは、好ましくは、TNF−Ｒ１の細胞外可溶性ドメイン、即ちTBP−１と、TNF−Ｒ２の細胞外可溶性ドメイン、即ちTBP−２と、の間で選択される。TBP−１が特に好ましい。組換えヒトTBP−１（ｒ−hTBP−１）は、本発明に従って有利に用いられる。
ステロイドホルモンは、コルチコステロイド又はアンドロゲンの両方であり得る。好ましくは、それはアンドロゲンである。より好ましくは、それは、適切な媒体、例えばリン脂質エマルション又はカルボキシメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドン中に分散されたDHEA又はその代謝物の１つである。
それゆえ、本発明の好ましい、実施形態は、敗血症性ショックの治療におけるｒ−hTBP−１及びDHEAの複合使用にある。この場合、本出願人は、ｒ−hTBP−１の有効投与量を少なくとも４倍、削減することが可能であることを見い出した。
上述の効果は、マウスの生体内実験で示された。
特に、ネズミモデルは、Ｄ−ガラクトサミンと組み合わせてリポポリザカリド（LPS）を投与することにより敗血症性ショックが誘導されることに従って、本発明に用いられた。
ヒトの治療のために、活性成分の好ましい投与量は、好ましくは24時間に４回の投与に分けた20mgのｒ−hTBP−１及び80mgのDHEAである。
本発明は、以下の実施例により記載されるが、それらは本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。本実施例は、以下の図面を引用する。
図面の簡単な記載
図１：実験のネズミ敗血症性ショックにおけるDHEAの１回（250μｇ／マウス）又は繰り返し（４×62.5μｇ／マウス）注入と組み合わせたCHOr−hTBP−１（62.5μｇ／マウス）の保護効果を示す。
図２：LPS＋Ｄ−ガラクトサミンによって誘導された実験のネズミ敗血症性ショックにおける異なる投与量のCHOr−hTBP−１の保護効果を比較目的のため示す。ｒ−hTBP−１グループにおけるマウスの数は、対応する対照グループについて報告されるのと同じである。図２ａ及び２ｂは、LPS＋Ｄ−ガラクトサミンの接種後（各々）24及び48時間後に観察された結果を示す。
実施例１
LPS＋Ｄ−ガラクトサミン誘導性敗血症性ショックモデル
マウスの生体内で実験を行った。LPS（0.1μｇ／マウス）及びＤ−ガラクトサミン（18mg／マウス）の混合物のｉ．ｐ．投与により、敗血症性ショックを誘導した。
繰り返しの投与に基づくｒ−hTBP−１のための治療スケジュール（全投与量を、０及び３，６及び24時間後の時間に供した４回の投与に分けた）を採用した。CHOr−hTBP−１を、62.5及び125μｇ／マウスの投与レベル（全投与量）において、単独で又はDHEAと組み合わせてテストした。
LPS＋Ｄ−ガラクトサミンモデルにおけるDHEAの効果の測定
100〜2,000μｇ／マウスの間に含まれる投与量での敗血症性ショック誘導剤の前１時間及びそれと同時にｉ．ｐ．注入する一回の投与、並びに24時間以内に供される４回の注入に分けた全投与量（250μｇ／マウス）での繰り返し治療の両方で、DHEAをテストした。
ｒ−hTBP−１と組み合わせたDHEAの効果の測定
上述のDHEAの治療スケジュール（250〜1,500μｇ／マウスの投与量）を、62.5〜125μｇ／マウスの種々の総投与量（４回の投与に分割）でテストしたｒ−hTBP−１と組み合わせても行った。
材料
動物
Charles Riverからの６〜８週（体重約18〜20ｇ）のSPF雌BALB／ｃ同系交配マウスを、少なくとも７日の新環境順応の後、全ての研究を通して用いた。
全ての実験において特に示さなければ、マウスは各々10の動物のグループにランダムに分けた。
テスト薬剤
CHO組換えヒトTBP−１を、生物工学の分野で周知の方法に従って作った。
ｒ−hTBP−１バルクのタンパク質量を、実験を始める前に、Lowry法により決定した。
大腸菌リポポリサッカリドＯ55：Ｂ５はSigmaより供される。
Ｄ−（＋）−ガラクトサミンヒドロクロライド、99％はJanssenにより供される。
デヒドロエピアンドロステロンはSigmaより供される。
調薬
塩化ナトリウム0.9％（塩類溶液）はBafterにより製造される。
リン脂質エマルション（PLE）は、ホスファチジルコリン（71％）、ホスファチジルエタノールアミン（16％）、リゾホスファチジルコリン（7.5％）、スフィンゴミエリン（５％）及びホスファチジン酸（0.3％）から構成される。
方法
敗血症性ショックモデル（LPS＋Ｄ−ガラクトサミンモデル）
両方の物質を塩類溶液に溶かした。等量のこれらの物質を混合することにより、LPS（0.1μｇ／マウス）及びＤ−ガラクトサミン（18mg／マウス）の混合物を調製した。次にその混合物をｉ．ｐ．経路により動物に注入した。この投与量は、各々のグループについてマウスの総数に対する死んだマウスの数として計算して約80％の死亡率を示すように先の実験下で選択した。致死率を、処理後24，48，72及び96時間後並びに７日にモニターした。
ｒ−hTBP−１についての処理スケジュール
その薬剤を塩類溶液で希釈し、繰り返し投与、即ちLPS＋Ｄ−ガラクトサミンの接種直前にｉ．ｖ．で、並びに3.6及び24時間後にｓ．ｃ．で注入した。
DHEAについての処理スケジュール
単独又はｒ−hTBP−１と組み合わせてのDHEAの効果を、LPS＋Ｄ−ガラクトサミン注入に関して異なる時間に、一回のｉ．ｐ．投与後にアッセイし；特に、敗血症性ショック誘導剤の前１時間及びそれと同時に投与した。
DHEAを０（敗血症性ショック誘導）並びに3.6及び24時間後に投与する繰り返し処理スケジュールも研究した。最初に、DHEAを、塩類溶液中2.5％のアルコール及び10％のウサギ血清の混合物中でビヒクル化した。その溶解度を改良し、その調製物を標準化するために、そのステロイドを、塩類溶液中2.5％のアルコール及び10％リン脂質の混合物中に連続的に分散させた。
データ評価
最初の終了点は、敗血症性ショックの誘導後48時間における生存率であった。各々の処理グループ対対照及び処理グループ間の効果の比較は、片側検定のフィッシャーク抽出テストにより行った。他の時間点においても同じ比較を行った。各々の処理グループの結果は生存率（％）として表した。
結果
LPS＋Ｄ−ガラクトサミン前１時間に投与したDHEA
DHEA投与範囲調査実験の結果を表１に報告する。1,000μｇ／マウスまでのこの物質によって保護効果は発揮されず；対照的に、考慮された全ての時間点において2,000μｇ／マウスにおける完全な保護で、より高い投与量で統計的に有意な保護効果が得られた。
約50％の生存率を示すCHOr−hTBP−１の最適状態に及ばない投与量（125μｇ／マウス）を、DHEAの２つの最適状態に及ばない投与量（1,000及び1,500μｇ／マウス）と組み合わせて投与した場合、２つの物質間に付加的な効果が観察された（表２）。100％生存率が得られた最も高いDHEA投与量との組み合わせの結果は、ｒ−hTBP−１グループ（50％）及びDHEAグループ（40％）のそれと大きく異なった。
LPS＋Ｄ−ガラクトサミンと同時に投与したDHEA
塩類溶液10％ウサギ血清中に希釈した物質を敗血症性ショック誘導と同時に投与したDHEA投与範囲調査テストで得られた結果を表３に示す。
明らかな投与量−効果関係は見い出されなかったが、先の処理スケジュール（前１時間に投与したDHEA）による同じ投与量で観察されたのと比較して1,000μｇDHEAにより、より高い保護が形成された。
250μｇ／マウスのDHEAとの62.5μｇ／マウスのｒ−hTBP−１の組合せは、一回の処理に関して少し高い保護を誘導した（ｒ−hTBP−１及びDHEAについて各々20％及び30％、表４を参照）。DHEAの溶解度を改良するために、同じ組合せを10％リン脂質エマルション中でビヒクル化した場合、24時間でDHEA及びｒ−hTBP−１単独と比較してかなり高い生存率が得られたが、連続的に減少した。
LPS＋Ｄ−ガラクトサミン後のDHEAの繰り返し投与
250μｇ／マウスの投与量のDHEAを一回の注入で（表５、グループＤ）、又は４回の接種に分けて（敗血症性ショック誘導から０，３，６及び24時間に供したもの、グループＥ）投与した時に、各々の比較結果（48時間で30及び40％生存率）を得た。同様に、動物に一回の接種（表５、グループＦ）又は４回の注入に分けたもの（グループＧ）のいずれかとしての後の投与でのｒ−hTBP−１及びDHEAの組合せで注入した時に統計的に有意な差は見い出されなかった。
ｒ−hTBP−１グループにおいて得られた高い生存率のため、付加的効果は、組合せ処理したグループが対照及びDHEAグループからのみ大きく異なるという24及び48時間後のこれらのテストにおける証拠ではない。
しかしながら、組み合わせた治療は、72及び86時間後に統計的に有意な差が見い出されたので、ｒ−hTBP−１グループに関してより長い生存率を誘導することが強調されるはずである。
図１は、250μｇ／マウスの投与量のDHEAを１回の接種として、又は４回の接種に分けて（各々62.5μｇ）注入した表４及び５に報告した３つの実験の結果を組み合わせて得られたデータを報告する。
図２は、比較目的のため、LPS＋Ｄ−ガラクトサミンによって誘導された実験ネズミ敗血症性ショックにおけるCHOr−hTBP−１単独の異なる投与量の効果を報告する。ｒ−hTBP−１グループにおけるマウスの数は、対応する対照グループについて報告される数と同じである。図２ａ及び２ｂは、LPS＋Ｄ−ガラクトサミンの接種後（各々）24及び48時間後に観察された結果を示す。
全ての実験において、引き続いての研究のために、生存率の表を用いて生存率の割合（％）を計算した（Armitage P.，Cap XIV，Tavole di sopravvivenza in Statistica Medica．Feltrinelli，Milano）。DHEA＋ｒ−hTBP−１グループを他のグループと比較することにより、χ2テストを各々の観察時間に適用した。
全ての時点において、組合せ治療は対照及びDHEAグループとかなり異なることを示すことに加えて、この分析は、ｒ−hTBP−１単独に対して組合せ治療でより長い生存時間が得られたことを確認した。２つの治療の組合せの間の統計的な差は見い出されなかったが、異なる時点における異なるレベルの有意性により反映されるより持続的な保護が、両方の薬剤を４回の注入に分けた場合に観察することができる。
結論
死からの大きな保護（70％生存率）が、LPS＋Ｄ−ガラクトサミン前１時間に注入した少なくとも1,500μｇ／マウスで見い出され、文献データを確認した。
DHEA（1,000及び1,500μｇ／マウス）及びｒ−hTBP−１（125μｇ／マウス、全投与量）の最適状態に及ばない投与量を組み合わせた場合、DHEA及びｒ−hTBP−１各々の２回の投与での各々０〜40％及び50％と比較して付加的な効果（90〜100％生存率）が得られた。
ｒ−hTBP−１（62.5μｇ／マウス）と組み合わせたより低い投与量のDHEA（250μｇ／マウス）でさえ、同様の結果が得られ（90〜100％生存率）、DHEAを一回の接種（250μｇ／マウス）でLPS＋Ｄ−ガラクトサミンと同時に注入した場合又は同投与量を敗血症性ショック誘導後０，３，６及び24時間の時に注入する４の接種物（62.5μｇ／各々）に分けた時の両方で、ｒ−hTBP−１に対してより長い保護（96時間まで）も供した。
ここでの発見は、DHEAとｒ−hTBP−１の組み合わせた治療がｒ−hTBP−１の投与量を少なくとも４倍削減することを示すことに特に関連する。
実施例２
医薬的製造の例
Ａ）ｒ−ｈ−TBP−１
材料
純粋なサッカロースph EurBp．Ph，Vord，NF．(Merck)；H3PO4 Subrapur (Merck)；分析用NaOH (Merck)；注入用の水。
バイアルDIN2R（ホウケイ酸ガラスタイプＩ）、ゴム栓（Pharmagummi W1816 V50）並びにアルミニウムリング及びFlip−offキャップ（Pharma−Metal GmbH）を容器として用いる。
（各々５mgのｒ−hTBP−１を含む1,000のバイアルについての）サッカロースを含むｒ−hTBP−１溶液の調製
出発サッカロース溶液を得るために、注入可能な水（800ml）にサッカロース（30.0ｇ）及びH3PO4（1.96ｇ）を溶かす。
ｒ−hTBP−１（５ｇ）のバルクをサッカロース溶液に加え、それを、そのpHを2.5μのNaOHにより7.0に調節した後に、1,000mlの最終容量にする。その溶液を0.22μｍ Duarapore滅菌フィルター（Millipore）を通してろ過する。その過程の間、その溶液温度を４℃〜８℃の間に維持する。
充填及び凍結乾燥
バイアルを１mlのｒ−hTBP−１滅菌溶液で満たし、凍結乾燥機に移し、そして６時間、−45℃に冷やす。凍結乾燥は、0.07mBarの真空下で−45℃の温度で始める。次のスキーム：10℃で12時間；次にそのサイクルが終わるまで＋35℃に従って加熱を行う。
Ｂ）DHEA
材料
純粋なマンニトールPh Eur．BP．FU．USP．FCC．E241（Merck）；H3PO4 Suprapur（Merck）；分析用NaOH（Merck）；注入用の水
バイアルDIN2R（ホウケイ酸ガラスタイプ１）、ゴム栓（Pharnagummi W1816 V50）及びアルミニウムリング及びFlip−offキャップ（Pharma−Metal GmbH）を容器として用いる。
（各々10mgのDHEAを含む1,000ｇのバイアルについての）マンニトールを含むDHEA溶液の調製
出発サッカロース溶液を得るために、注入可能な水（800ml）にマンニトール（45.0ｇ）及びH3PO4（1.96ｇ）を溶かす。
DHEA（20ｇ）のバルクをサッカロース溶液に加え、それを、そのpHを2.5μのNaOHにより7.0に調節した後に、1,000mlの最終容量にする。その溶液を0.22μｍ Duarapore滅菌フィルター（Millipore）を通してろ過する。その過程の間、その溶液温度を４℃〜８℃の間に維持する。
充填及び凍結乾燥
バイアルを１mlのDHEA滅菌溶液で満たし、凍結乾燥機に移し、そして６時間、−45℃に冷やす。凍結乾燥は、0.07mBarの真空下で−45℃の温度で始める。次のスキーム：＋20℃で12時間；次にそのサイクルが終わるまで＋35℃に従って加熱を行う。
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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