(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される疎水結合あるいは静電結合した膜、及び該膜上に配置される生理活性物質を備え、そして：
１）前記疎水結合あるいは静電結合による膜がシランカップリング剤を用いて飽和蒸気法により形成された有機ケイ素膜である；
２）疎水結合による膜が金属とフッ素の化合物又は金属とフッ素の混合物を主成分とする膜である；か、又は
３）疎水結合による膜が金属と炭素の化合物又は金属と炭素の混合物を主成分とする膜である；
のいずれかであることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項２】
前記疎水結合あるいは静電結合が有機ケイ素膜を形成することを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項３】
前記有機ケイ素膜がシランカップリング剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項４】
透明基板上に配置される金属が金であることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項５】
疎水結合による膜が金属とフッ素の化合物又は金属とフッ素の混合物を主成分とすることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項６】
前記金属が金であることを特徴とする請求項５記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項７】
疎水結合による膜が金属と炭素の化合物又は金属と炭素の混合物を主成分とすることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項８】
前記金属が金であることを特徴とする請求項７記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項９】
疎水結合による膜がフッ素系ガスを含むプラズマに曝すことにより形成されることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項１０】
疎水結合による膜が炭素を含むプラズマに曝すことにより形成されることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項１１】
疎水結合による膜がフッ素含有有機化合物を主成分とすることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項１２】
透明基板上に金属膜を配置した後、該金属膜の上に疎水結合または静電結合により膜を形成し（ただし：
１）前記疎水結合あるいは静電結合による膜がシランカップリング剤を用いて飽和蒸気法により形成された有機ケイ素膜である；
２）疎水結合による膜が金属とフッ素の化合物又は金属とフッ素の混合物を主成分とする膜である；か、又は
３）疎水結合による膜が金属と炭素の化合物又は金属と炭素の混合物を主成分とする膜である；
のいずれかである。）、次いで該膜上に生理活性物質を配置することを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
抗原抗体反応に基づく表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定チップを用いて、生理活性物質を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床試験等で免疫反応を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサーが使用されている。
【０００３】
このような表面プラズモン共鳴を利用した測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般的に使用される測定チップは、図２に示すような構造を有する。即ち、ガラス基板１’上に成膜された金属膜２’の上に、多孔性材料５が形成されており、この多孔性材料５の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質が坦持又は固定されている。
【０００４】
この多孔性材料５としては、例えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが使用される（特開平３−１６４１９５号公報参照）。また、市販品（BIAcore 2000用、ファルマシアバイオセンサー社製）では、この多孔性材料５としてカルボキシメチルデキストランが用いられている。
【０００５】
しかしながら、測定対象物と実質的にかつ効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料５の表面に存在するだけであるため、多孔性材料５の内部に坦持又は固定されている生理活性物質は有効に機能せず、その分感度が低下することとなる。
【０００６】
また、生理活性物質を金属膜に固定する方法としては、ＬＢ（Langmuir-Blodgett）法が用いられる場合もあるが（特開平５ー２８８６７２号公報参照）、ＬＢ膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共に脱落するという問題がある。
これに関して、本出願人は先に特願平９-７３６４６号として出願したが、更により生理活性物質が金属膜と、より強固にかつ容易に結合する手段が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップにおいて、固定化する生理活性物質が金属膜と強固にかつ容易に結合する手段を見出すことにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、疎水結合或いは静電結合により金属膜上に生理活性物質を固定化させることが課題解決に有効であることを見出した。
【０００９】
従来の金属表面に反応性単分子膜を介してタンパク質を反応固定する方法では、一端に反応性基を有し他端に金属表面上の酸化膜と反応し吸着される活性基を有する有機分子を用いて、金属表面に化学吸着法により反応性単分子膜を形成した後、前記反応性基を化学処理して-OH基を付加し、更にシアノブロマイド法やアルデヒド法を用いて、単分子膜表面をタンパク質のアミノ基と反応する官能基にタンパクのアミノ基を反応させて固定することを構成要件としているので、タンパク質を固定するための試薬が必要であり、その為に工程数が増え、反応に要する時間が多くかかるという欠点を有していた。
そこで、本発明では、化学結合（共有結合）に代えて疎水結合或いは静電結合を起こさせることにより、この欠点を解消させた。
【００１０】
疎水結合を起こさせる場合は、疎水表面を最外層に有する必要があるので、飽和アルキル鎖末端あるいはフッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を用いる。
疎水結合において、フッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を形成するためには、従来の薄膜形成技術である、スパッタ法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法、プラズマ重合法、ドライエッチング法、スピンコーティング法等が利用できる。
疎水結合の固定化手順を図１３に示す。
【００１１】
スパッタ法によってフッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を主成分とする薄膜を得るためには、金又は表面をフッ素化させた金を主体とするターゲットを用い、アルゴン、ネオン、キセノン、ヘリウム、窒素等のスパッターガス単独又はこれらのスパッターガスとフッ素、四フッ化炭素、六フッ化硫黄、三フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源となるガスとを組み合わせた雰囲気中で、直流又は高周波放電によりスパッター成膜する。このとき、必要に応じて酸素、窒素、炭酸ガス等の酸素源、窒素源、炭素源となるガスを混合することもできる。ここで、雰囲気ガスの組成、圧力、スパッター電力等の成膜条件を変えることにより、膜の組成、組織、構造等を変え、疎水性、屈折率、消衰係数を調整することができる。
【００１２】
真空蒸着法によってフッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を主成分とする薄膜を得るためには、タングステン製バスケット、タングステンメッキされたコイルまたはボート、カーボンるつぼ等による抵抗加熱法、又は、電子線照射によるいわゆるＥＢ蒸着法により、金、又は予めフッ素化させた金を蒸着源として用いる。
この際、フッ素、四フッ化炭素及びその他のフッ化炭素化合物、六フッ化硫黄及びその他のフッ化硫黄化合物、三フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源となるガスと、必要に応じて、酸素、窒素、炭酸ガス等の酸素源、窒素源、炭素源となるガスとの混合ガスを雰囲気とすることができる。この場合も、蒸着条件を変えることにより、膜の組成、組織、構造等を変え、疎水性、屈折率、消衰係数を調整することができる。
【００１３】
さらに、イオンプレーティング法によって、フッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を主成分とする薄膜を得るためには、金、又は予めフッ素化させた金を蒸着源として用い、フッ素、四フッ化炭素、六フッ化硫黄、三フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源となるガスと、必要に応じて、酸素、窒素、炭酸ガス等の酸素源、窒素源、炭素源となるガスとの混合ガスを雰囲気とすればよい。この場合も、成膜条件により、疎水性、屈折率、消衰係数を調整することができる。
【００１４】
ＣＶＤ法としては、金表面にシロキサン膜を主成分とする薄膜を形成するために、ヘキサメチレンジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）等のシロキサンモノマーをアルゴン等のキャリアーガスで導入し、酸素等の雰囲気中で化学気相成長（ＣＶＤ）法で成膜する。必要に応じて、フッ素含有シロキサンモノマーや四フッ化炭素等のフッ素源となるガスを混合することもできるし、また、シロキサンモノマーを入れずに、フッ素源ガス等を用いてフッ素化合物（プラズマ重合膜）を形成することもできる。ここで、雰囲気ガスの組成、圧力、電力等の成膜条件を変えることにより、膜の組成、組織、構造等を変え、疎水性等を調整することができる。
【００１５】
スピンコーティング法としては、例えばアモルファスフッ素樹脂である「サイトップ（アサヒガラス製）」を金属膜上に塗布することにより、ＳＰＲ基板として供することができる。
上記の説明は、フッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を対象に行ったが、フッ素の代わりに炭素を用いても同様である。
【００１６】
一方、疎水結合の一つとして、有機ケイ素膜を、シランカップリング剤を用いて、シランカップリング剤中の加水分解基を、金属膜２中の金属原子と結合させ、末端は生理活性物質と物理吸着による結合を生ぜしめる方法がある。これにより金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活性物質の三者は固定化される。
有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。
【００１７】
シランカップリング剤とは、その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のある加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。本発明に使用できるシランカップリング剤は、上記定義に該当するものであればいかなるものでもよく、構造式ＣＦ3（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ3）3のトリフルオロメチルトリメトキシシラン、２、２、２ートリフルオロメチルトリメトキシシラン、３、３、３ートリフルオロプロピルトリメトキシシラン、４、４、４ートリフルオロブチルトリメトキシシラン、８、８、８ートリフルオロオクチルトリメトキシシラン、１８、１８、１８−トリフルオロオクタデシルトリメトキシシラン等、構造式ＣＦ3（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ2ＣＨ3）3 のトリフルオロメチルトリエトキシシラン、４、４、４−トリフルオロブチルトリエトキシシラン、アミノプロピルジエトキシメチルシラン、１８、１８、１８−トリフルオロオクタデシルトリエトキシシラン等、構造式ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ3）3 のメチルトリメトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、プロピルルトリメトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン等、構造式ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ2ＣＨ3）3のメチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン等を単独又は組み合わせて使用することができる。なお、上記構造式のｎはいずれも０〜１７の整数である。
【００１８】
次に、静電結合については、物理吸着法として金表面に生理活性物質を固定化するために、両者の間に硫黄化合物を用いることが可能であり、一般に硫黄化合物の中でも、操作性、緻密性、安定性などに鑑み、チオール、中でもアルカンチオールが本発明の場合、特に適している。なお、チオール化合物の場合疎水結合も可能である。
【００１９】
アルカンチオールとは、直鎖アルキル鎖の、一方の末端にメチル基、アミノ基、メルカプト基、トリフルオロ基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、他方の末端にＳＨ基を有する有機硫黄化合物のことをいう。
アルカンチオールとしては、疎水結合の場合、1-プロパンチオール、1-ブタンチオール、1-ヘキサデカンチオール等ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳＨ（ｎ=1〜15）の構造式を有するものである。また、静電結合の場合、メルカプト酢酸、3-メルカプトプロピオン酸等ＨＯＯＣ（ＣＨ2）ｎＳＨ（ｎ=1〜15）や、アミノエタンチオール等  Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳＨ（n=1〜15）が挙げられる。
【００２０】
ｐＨをアルカリ側に傾けることにより、末端カルボキシル基がアニオンリッチとなり、これが生理活性物質のプラス荷電を有する官能基（例えばリジン残基中のアミノ基）と静電結合を形成する。また、ｐＨを酸性側に傾けることにより、カチオンリッチとなり、これが生理活性物質のマイナス荷電を有する官能基（例えばアスパラギン酸残基中のカルボキシル基）と静電結合を形成する。
【００２１】
なお、静電結合による有機ケイ素膜の形成も可能である。例えば、シランカップリング剤として、構造式Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ3）3 のアミノメチルトリメトキシシラン、２ーアミノエチルトリメトキシシラン、３ーアミノプロピルトリメトキシシラン、４ーアミノブチルトリメトキシシラン、８ーアミノオクチルトリメトキシシラン、１８ーアミノオクタデシルトリメトキシシラン等、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣ2Ｈ5）3 のアミノメチルトリエトキシシラン、２ーアミノエチルトリエトキシシラン、３ーアミノプロピルトリエトキシシラン、５ーアミノペンチルトリエトキシシラン、８ーアミノオクチルトリメトキシシラン、１８ーアミノオクタデシルトリメトキシシラン等を用いることにより、ｐＨを酸性側に傾け、末端のアミノ基がカチオンリッチとなる。これに対して、マイナス荷電を有する官能基（カルボキシル基、スルフォニル基等）と４級化アミノ基が静電結合を形成する。なお、上記構造式のｎはいずれも０〜１７の整数である。静電結合の固定化手順を図１４に示す。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において用いる表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質及びそれを固定化する部分とを含む部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００２３】
本発明で用いる測定チップは、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される疎水結合又は静電結合した膜、及び該膜上に配置される生理活性物質を備えている。ここで、「透明基板上に配置される金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置されている場合のほか、金属膜が透明基板に直接接することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意である。「金属膜上に配置される疎水結合又は静電結合した膜」及び「該膜上に配置される生理活性物質」も上記と同様の意味である。
【００２４】
本発明の一例による測定チップの断面概略図を、有機ケイ素膜を形成する方法を例として図１に示す。
本実施例により用いられる測定チップは、透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機ケイ素膜３の表面に固定化された生理活性物質とを有する。
【００２５】
透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザー光等に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００２６】
金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜２に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２７】
金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好ましい。
金属膜２の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるのが好ましい。
【００２８】
有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くすることができ、良好な感度が得られるとともに、使用するシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コストの低減化を図ることができる。
【００２９】
また、有機ケイ素膜３は、最密充填構造をとるのが好ましい。最密充填構造とは、有機ケイ素膜３を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入する余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。最密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密度で均等に固定することができ、測定感度を向上させることができる。有機ケイ素膜３が最密充填構造をとるかどうかは、以下の方法により確認することができる。
【００３０】
プロピルエトキシシラン（シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシシランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシランの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておらず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測される。
【００３１】
有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いることにより形成させることができる。具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラビア法）などにより成膜することができる。本発明においては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和蒸気法を用いるのが好ましい。
【００３２】
飽和蒸気法においては、暴露時の温度、湿度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とするのが更に好ましい。
【００３３】
本発明における有機ケイ素膜３は、以下のような利点を有する。
▲１▼  生理活性物質を金属膜２に極めて近い位置に固定化することができるので、従来の測定チップを使用する場合よりも大幅に測定感度を向上させることができる。
▲２▼  成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理ができる。
▲３▼  シランカップリング剤の種類を変えることにより、物理吸着に適切な膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾が可能となる。
本発明の測定チップは、有機ケイ素膜３に、直接生理活性物質を固定して使用する。
【００３４】
生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１、１５７等に対する抗体等を使用することができる。
【００３５】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す。例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３６】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。
【００３７】
生理活性物質として抗体４を用いた場合、通常は抗体４のＦｃフラグメントが有機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、抗体は単分子層状態に形成される。但し、抗体４のＦａｂフラグメントが有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反応速度が低下するため、図３に示すようにＦａｂフラグメント（図３(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図３(b) ）を直接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反応速度を向上させてもよい。
【００３８】
生理活性物質４の厚さは、使用する生理活性物質自体の大きさにもよるが、100 〜3000Åであるのが好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。
生理活性物質の固定化方法は常法によって行えばよく、例えば、所定量の生理活性物質を有機ケイ素膜３に所定時間接触させることにより固定化することができる。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量の生理活性物質を所定時間（所定量）流すことによっても固定化できる。
【００３９】
生理活性物質として抗体４を用いた場合であって、抗体４のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合には、パパインを用いて抗体４を部分分解した後、同様の処理を行えばよい。一方、抗体４のＦ(ａｂ')2 フラグメントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合には、ペプシンを用いて抗体４を部分分解した後、同様の処理を行えばよい。
【００４０】
このようにシランカップリング剤に直接生理活性物質を強固に固定化することにより、当該測定チップを洗浄しても生理活性物質の固定化を維持できるため、繰り返し測定に使用することができるという利点が得られる。
本発明の測定チップは、例えば、図４に示されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用することができる。
【００４１】
この表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明基板が上になるように設置する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出される。
【００４２】
光源８からは、測定チップ10の透明基板に向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出することができる。
【００４３】
上記のような構造によって、ある入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、図１に示されるような構成を有する測定チップを作製した。
透明基板としては、18mm×18mm、厚さ0.17mmのカバーグラス（松浪硝子工業社製）を使用した。この透明基板上に、スパッタリングによりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成した。スパッタリングは、クロムについては100 Ｗ，30秒間、金については100 Ｗ，150 秒間で行った。得られたクロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。
【００４５】
上記の金属膜を有する透明基板を、シランカップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機ケイ素膜を形成させた。まず、広口シャーレに原液のままのプロピルトリエトキシシラン及び3ーアミノプロピルトリエトキシシランを30ｍl 入れ、室温で24時間放置し、シャーレ内部をプロピルトリエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次に、上記で作製した透明基板を金属膜部分が露出するようにアルミ製のマスク（支持具）に固定し、このマスクをシャーレの開口部に載せ、60分間放置し、カバーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を形成させ、続いてその上に8.2×10-3mg/mlの濃度のＢＳＡ抗体を50ml滴下し、90分静置した。リンス後自然乾燥して測定チップを作製した。
【００４６】
この測定チップを、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置した。このセンサーは図４に示すような構造を有する。
【００４７】
抗体を固定化した測定チップを設置した測定セルに、0.01、0.1、1、10、100 nｇ/ｍｌに希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を各々流速５μl/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。この結果を図６に示す。図中、●は本発明によるチップでウシ血清アルブミンを測定した場合（実施例１）である。■は市販の測定チップでウシ血清アルブミンを測定した場合（比較例１）である。
【００４８】
図６に示すように、試料濃度と共鳴シグナルに正比例に類似した右肩上がりの関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測される。これより、本実施例による測定チップを用いれば、共鳴シグナルの値を測定することにより抗原を定量することができる。
【００４９】
（比較例１）
実施例１で使用したバイオセンサーに、該センサー用の市販の測定チップ（抗体未固定）をカートリッジブロックに設置した。この測定チップは、図５に示されるような構造を有する。
この測定チップが有する多孔性材料（カルボキシメチルデキストラン）を活性化するために、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（400 mM／H2O ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（100 mM／H2O ）との混合物35μl を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。次いで、50μg/mlの抗ヒトヘモグロビンＡ1ｃ抗体35μl を流速５μl/min で測定セルに流し込み、カルボキシメチルデキストランに抗ウシ血清アルブミン抗体を固定化した。その後、固定化した抗体をブロッキングするためにエタノールアミン35μl を流速５μl/min で測定セルに流し込み、次いで固定化されていない余分な抗体を洗い流すために、0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。
【００５０】
抗体を固定化した測定チップを設置した測定セルに、実施例１と同様にして生理活性物質を流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。この結果を図６に示す。試料濃度と共鳴シグナルの間にほぼ正比例の関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測される。
【００５１】
図６において、比較例１の測定チップを使用した場合と実施例１の測定チップを使用した場合の共鳴シグナルを比較すると、実施例１の測定チップを使用した場合には、比較例１の測定チップを使用した場合のほぼ２倍の共鳴シグナル（RU）が計測された。従って、実施例１の測定チップを使用することにより、約２倍の感度で抗原等の定量が可能である。
【００５２】
〔試験例１〕
実施例１で作製した測定チップ及び比較例で用いた測定チップに対して、入射角θに対応する反射光の強度を測定した。この結果を図７に示す。図中の が実施例１で作製した測定チップの反射光強度曲線であり、……が比較例１で用いた測定チップの反射光強度曲線である。
図７に示すように、どちらの場合でも充分な程度の表面プラズモン共鳴が生じることがわかる。
以上は、有機ケイ素膜を形成する方法を例にとって、実施例及び試験例を説明したが、次に他の方法による金属膜の形成の実施例を説明する。
【００５３】
〔実施例２〕
図８に示すように、厚さ４５０Åを金成膜されたガラス基板上に、スパッタリング法で、以下に示す通りの条件で、金化合物膜を約５０Åの厚さに成膜し、その上に抗ＢＳＡ抗体を固定化する。
成膜装置  ；プレーナー型ＤＣマグネトロンスパッター装置
ターゲット；金
ガス及び流量；アルゴンガス７６sccm＋六フッ化硫黄ガス２４sccm
スパッター圧力；３ミリトール
スパッター電流；６アンペア
なお、ターゲットの金の代わりに、金属クロムを使用することも可能である。
【００５４】
〔実施例３〕
図９に示すように、ガラス基板に金を５００Å成膜後、ドライエッチング法で以下に示す通りの方法で、金表面を処理し、その上に抗ＢＳＡ抗体を固定化する。
成膜装置  ；平行平板型ＲＦドライエッチング装置
ガス及び流量；四フッ化炭素８０sccm＋酸素２０sccm
処理圧力；５０Ｐａ
投入電力；５００Ｗ
なお、ガスとして炭酸ガス１００sccmを使用してもよい。
【００５４】
〔実施例４〕
図１０に示すように、ガラス基板上に金を５００Å成膜後、ＣＶＤ法で以下に示す通りの方法で、シロキサン膜を形成後、その上に抗ＢＳＡ抗体を固定化する。
成膜装置  ；平行平板型ＲＦ方式ＣＶＤ装置
ガス及び流量；ＨＭＤＳＯ１０sccm    酸素３０sccm    アルゴン９０sccm
成膜時圧力；２００mTorr
投入電力；１００Ｗ
ＢＳＡ濃度と共鳴シグナルとの関係は図１１に示す。
静電結合の実施例を次に示す。
【００５５】
〔実施例５〕
実施例１と同様に透明基板としてカバーグラスを用い、この透明基板上にスパッタリングによりクロム層、次いで金からなる層を形成した。この金属膜を有する透明基板を、アルカンチオールのエタノール溶液に浸漬し、金属膜上にチオール膜を形成させた。まず、３０ｍｌサンプルびんでアルカンチオールをエタノールに溶かして１ｍＭに調整する。次に、上記で作製した透明基板をアルカンチオールエタノール溶液中に１時間浸漬する。その後、透明基板を引き上げエタノールでリンスした後、Ｎ2 または空気中で乾燥し、カバーグラスの金属膜上にチオール膜を形成させ、その上に８.２×１０-3ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＳＡ抗体を５０μｌ滴下し、９０分静置した。リンス後自然乾燥して測定チップを作製した。
この測定チップを、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置した。このセンサーは図４に示すような構造を有する。
ＢＳＡ濃度と共鳴シグナルとの関係は図１２に示す。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに生理活性物質を固定するに際して、金属膜と強固にかつ容易に結合することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図である。
【図２】従来の測定チップの概略断面図である。
【図３】本発明の別の例による測定チップの概略断面図である。
【図４】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの概念図である。
【図５】比較例１で使用した測定チップの概略断面図である。
【図６】実施例１及び比較例１で得られた、ＢＳＡ濃度と共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。
【図７】測定チップの反射光強度曲線を示すグラフである。
【図８】スパッタリング法による膜形成を示す図である。
【図９】ドライエッチング法による成膜構成を示す図である。
【図１０】ＣＶＤ法による成膜構成図である。
【図１１】実施例４におけるＢＳＡ濃度と共鳴シグナルとの関係を示す。
【図１２】実施例５におけるＢＳＡ濃度と共鳴シグナルとの関係を示す。
【図１３】疎水結合における抗体固定化手順を示す。
【図１４】静電結合における抗体固定化手順を示す。
【符号の説明】
１，１'…透明基板
２…金属膜
２'…金属膜
３…有機ケイ素膜
４，４'…生理活性物質
５…多孔性材料
６…共有結合膜
７…カートリッジブロック
71…測定セル
72，73…流路
８…光源
80…入射光
９…検出器
90…反射光
10…測定チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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