(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にゼロデッドタイムでデータを収集するデータ収集および測定デバイスであって、
ａ）フローアナライザと、
ｂ）前記フローアナライザの少なくとも１現象に対して多数の連続したサンプリング周期で入ってくるデータを受信して連続的に記憶するようにリンクされたデータ記憶領域、第１ポインタ、および第２ポインタを持つ循環バッファと、
ｃ）少なくとも１つのデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）と、を備え、
前記データ記憶領域は、それぞれが１サンプリング周期のデータを受信して記憶するよう構成されると共に、次の時間のサンプリング周期のデータを記憶するために次の順番のデータ記憶領域を提供する順でリンクされ、
前記第１ポインタは、前記次の時間のサンプリング周期のデータの前記次の順番のデータ記憶領域への受信および記憶を指示すると共に、前記データ記憶領域の全部にデータが入ると、前記次の時間のサンプリング周期のデータを受信して前記次の順番のデータ記憶領域にあるデータを上書きして記憶するよう指示し、
前記第２ポインタは、前記第１ポインタに従い受信および記憶される現時点のデータよりも設定追跡間隔遡ったサンプル周期のデータを記憶している前記データ記憶領域に指向され、該第２ポインタの指す前記データ記憶領域のデータを読み出して処理する前記ＤＳＰを１つ指示し、
該ＤＳＰによりデータを処理するかどうかを信号対雑音比しきい値を基準として決定すると共に、当該信号対雑音比しきい値に合わない、以前のデータを再試験して再処理するためのロジックをさらに含み、
前記次の時間のデータが保存されると、前記第１ポインタがその次の順番の前記データ記憶領域に進み、そして、前記第２ポインタの指す前記データ記憶領域のデータが処理されると、前記第２ポインタがその次の順番の前記データ記憶領域に進み、
これにより少なくとも１つの現象のデータを収集して処理することを特徴とするデータ収集および測定デバイス。
【請求項２】
前記フローアナライザがフローサイトメータである請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項３】
前記設定追跡間隔が少なくとも現象の最大発現時間に等しい請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項４】
前記設定追跡間隔が１０μｓ〜１００μｓである請求項３記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項５】
前記設定追跡間隔を使用者が指定する請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項６】
前記サンプリング周期は、使用者の指定する設定時間の長さである請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項７】
前記サンプリング周期がそれぞれ１００万分の１秒である請求項６記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項８】
前記サンプリング周期がそれぞれ１００万分の１秒より短い請求項６記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項９】
前記データ記憶領域の数を使用者が指定する請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１０】
前記データ記憶領域の数が少なくとも１０００である請求項９記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１１】
前記各データ記憶領域は、使用者の指定するサイズを有する請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１２】
前記各データ記憶領域のサイズが１２ビットから１６ビットである請求項１１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１３】
前記各データ記憶領域のサイズが１６ビットより大きい請求項１１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１４】
前記各データ記憶領域のサイズが１２ビットより小さい請求項１１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１５】
ＤＳＰが複数使用されており、これらＤＳＰによるデータ処理の順番が決められる請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１６】
前記ＤＳＰのデータ処理の順番を使用者が指定する請求項１５記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１７】
前記信号対雑音比しきい値を使用者が指定する請求項１記載のデータ収集および測定デバイス。
【請求項１８】
少なくとも１現象に対して実質的にゼロデッドタイムでデータを収集するフローアナライザであって、
当該フローアナライザで収集される少なくとも１つの現象に対する複数のサンプリング周期の入力データを受信して記憶するための複数のデータ記憶領域を有すると共に、これら複数のデータ記憶領域の少なくとも１つに、該データ記憶領域に記憶済みのデータがあればこれに上書きするようにして、当該フローアナライザの収集データを受信し記憶するよう所定の基準に従って指示するために使用される少なくとも１つの第１ポインタ、および、前記第１ポインタの指示により受信および記憶される現在のデータよりも前のサンプル周期によって以前に記憶されているデータを持つ前記複数のデータ記憶領域の少なくとも１つからデータを読み出すよう指示するために使用される少なくとも１つの第２ポインタ、を含む少なくとも１つの循環バッファと、
この循環バッファと連携し、前記第２ポインタの指示に応じて前記循環バッファの前記データ記憶領域の少なくとも１つからデータを受け取る少なくとも１つのプロセッサと、
を備え、
前記プロセッサによりデータを処理するかどうかを信号対雑音比しきい値を基準として決定すると共に、当該信号対雑音比しきい値に合わない、以前のデータを再試験して再処理するためのロジックを含み、
実質的にゼロデッドタイムで少なくとも１つの現象のデータを収集して処理することを特徴とするフローアナライザ。
【請求項１９】
フローサイトメータである請求項１８記載のフローアナライザ。
【請求項２０】
少なくとも１つの現象に対して実質的にゼロデッドタイムでデータを収集するフローアナライザであって、
当該フローアナライザで収集される少なくとも１つの現象に対する複数のサンプリング周期による入力データを受信して記憶するために複数のデータ記憶領域を有し、現在受信し記憶しているデータよりも前のサンプル周期によって以前に記憶されているデータを含むと共に、前記複数のサンプリング周期を十分に遡れるような前記データ記憶領域のアドレッシング範囲を含む少なくとも１つのバッファと、
このバッファと連携して前記データ記憶領域の少なくとも１つからデータを受信する少なくとも１つのプロセッサと、
を備え、
現在のサンプリング周期よりも前のサンプリング周期によって以前に記憶されているデータを前記バッファから読み出し、該データを前記プロセッサにより処理するかどうかを信号対雑音比しきい値を基準として決定すると共に、当該信号対雑音比しきい値に合わない、以前のデータを再試験して再処理するロジックを含み、
実質的にゼロデッドタイムで少なくとも１つの現象のデータを収集して処理することを特徴とするフローアナライザ。
【請求項２１】
フローサイトメータである請求項２０記載のフローアナライザ。
【請求項２２】
少なくとも１つの現象に対して実質的にゼロデッドタイムでデータを収集するフローアナライザであって、
当該フローアナライザで収集される少なくとも１つの現象に対する複数のサンプリング周期による入力データを受信して記憶するために複数のデータ記憶領域を有し、現在受信し記憶しているデータよりも前のサンプル周期によって以前に記憶されているデータを含むと共に、前記複数のサンプリング周期を十分に遡れるような前記データ記憶領域のアドレッシング範囲を含む少なくとも１つのバッファ手段と、
該バッファ手段の前記データ記憶領域の少なくとも１つからデータを受信する少なくとも１つのプロセッサと、
を備え、
現在のサンプリング周期よりも前のサンプリング周期によって以前に記憶されているデータを前記バッファ手段から読み出し、該データを前記プロセッサにより処理するかどうかを信号対雑音比しきい値を基準として決定すると共に、当該信号対雑音比しきい値に合わない、以前のデータを再試験して再処理するロジックを含み、
実質的にゼロデッドタイムで少なくとも１つの現象のデータを収集して処理することを特徴とするフローアナライザ。
【請求項２３】
フローサイトメータである請求項２２記載のフローアナライザ。
【請求項２４】
フローアナライザにおいて少なくとも１つの現象に対し実質的にゼロデッドタイムでデータを収集する方法であって、
（ａ）前記フローアナライザで収集される少なくとも１つの現象に対する複数のサンプリング周期における入力データを、複数のデータ記憶領域を有する少なくとも１つの循環バッファで受信する段階、
（ｂ）前記複数のデータ記憶領域の少なくとも１つに、該データ記憶領域に記憶済みのデータがあればこれに上書きするようにして、前記フローアナライザの収集データを受信し記憶するよう所定の基準に従って指示するために使用される少なくとも１つの第１ポインタを利用して、前記循環バッファに入力データを記憶する段階、
（ｃ）前記第１ポインタの指示により受信および記憶される現在のデータよりも前のサンプル周期によって以前に記憶されているデータを持つ前記データ記憶領域の少なくとも１つから少なくとも１つのプロセッサによりデータが読み出されるよう、第２ポインタを利用して指示する段階、
（ｄ）前記第２ポインタの指示に応じて、前記循環バッファの前記データ記憶領域の少なくとも１つから前記プロセッサへデータを受信する段階、
（ｅ）前記プロセッサによりデータを処理するかどうかを信号対雑音比しきい値を基準として決定すると共に、当該信号対雑音比しきい値に合わない、以前のデータを再試験して再処理する段階、
（ｆ）少なくとも１つの現象のデータを実質的にゼロデッドタイムで収集し処理する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記フローアナライザがフローサイトメータである請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に、たとえば試験域の流体から粒子、細胞および現象間の背景雑音に関するデータを一時的に保存することで、フローアナライザその他の収集デバイスから得られる情報の量を増加する装置および方法に関する。特に本発明は、このようなデータを、後処理のために循環バッファまたは同様のバッファ、あるいは一時記憶可能領域へ一時的に保存することにより、ゼロデッドタイムを実現する装置および方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
フローサイトメトリは、狭い試験域に当てられた光ビームを通過する細胞および／または粒子の１以上の光パラメータを迅速に測定することで有用に使用される。フローサイトメトリについての背景情報は、たとえば、本書中で全体的に参照引用するＳｈａｐｉｒｏのＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）に詳しい。
【０００３】
従来のフローサイトメータにおいて、サンプル細胞および／または粒子を含むサンプル液は、結合流の中央へ向けてサンプルを引き込むシース(sheath)液のなすより速い流れの中央あるいはその近くに、サンプルチューブから導入される。流体力学的絞り込み(hydrodynamic focusing)として知られているこのプロセスは、フローセルまたはその他の試験域内の測定点の中央に細胞および／あるいは粒子を繰り返し送り込めるようにする。一般的に細胞および／または粒子は、フローセル中で浮遊状態にある。
【０００４】
連続波レーザが、浮遊液流として試験域を通る細胞および／または粒子にレーザビームの焦点を結ぶ。流動中の対象物にレーザービームが当たることである信号が発生し、それが検出器に検出される。たとえばこれらの信号は、個々の細胞および／または粒子の寸法に関する情報を示す前方散乱光(forward light scatter)の強度、個々の細胞および／または粒子の相対寸法および屈折特性に関する情報を示す側方散乱光(side light scatter)の強度を含んでいる。
【０００５】
検出器で感知されるその他の信号には、１以上の蛍光色素、および／または、たとえばトリプトファンその他の蛍光アミノ酸、あるいは、蛋白質等のペプチドや他の生体分子、合成分子に元々あるその他の分子など、その他の蛍光分子からの蛍光放射が含まれている。一般に、複数の異なる蛍光分子が分析機構内で反応するとき、蛍光放射のピークは、各蛍光放射のピーク間のスペクトルオーバーラップを最小化する、理想的には除くように選ばれる。
【０００６】
一例として、理想的には蛍光放射のピークは５０μｍごとに異なるけれども、より小さい（あるいはより大きい）スペクトル分離も可能で、たとえば、２０、３０あるいは４０μｍを適用して有効に使用することもできる。ただし、スペクトル分離が大きいほど、各蛍光放射管の区別をより明確にすることができる。さらに、量子効率が蛍光分子を選択する際に考慮される。複数の異なる蛍光分子を使用する場合には、別々の検出器が各蛍光放射物の放射する異なった波長に同調させて使用される。２個以上の蛍光分子の励起波長は同じにもできるし、それぞれ異なる蛍光分子の励起スペクトルに一致させて異なる励起波長を使用することもできる。
【０００７】
分析作業で発生される光信号は出力計および／またはデータ記録手段へ送信される。たとえばデジタル信号プロセッサすなわち「ＤＳＰ」による信号処理が、測定された光信号における強度データが出力計および／またはデータ記録手段へ送信される前および／または後に実行され得る。
【０００８】
フローサイトメトリにおいて、１個の細胞または粒子がレーザその他の光源によるビームを通過する時に１つの現象が発生する。現象の進行につれ、散乱および／または蛍光放射による測定光は、細胞または粒子がビームに入ると増加し、ビームの中心で最大になり、ビームから外れるにしたがってわずかな値へと減少していく。
【０００９】
現状のフローサイトメータは通常、現象を測定するために、２つのシステムのうち１つを使用する。その１つのシステムは、ピークホールド回路を含むピーク検出器を使い、現象から得られる最大信号レベルを維持して、レーザビームを通過する細胞および／または粒子に関係する光学パラメータを測定する。ピーク検出器が現象を検出し測定すると、アナログ−デジタル「Ａ／Ｄ」変換器がその信号最大値をデジタル値に変換するのに十分な時間を取れるように、当該検出器はターンオフされる。ピーク検出器がオフにされている時間、すなわち「デッドタイム」の間は、レーザビーム内に発生している現象は検出されなくなる。
【００１０】
もう１つのシステムは、現象として収集されたピーク下の領域を測定する積分器を使用する。これら２つのどちらのシステムでも、１つの現象がデッドタイム中にサイトメータの光ビーム内に発生するときには、その現象は検出されなくなる。
【００１１】
通常は、非常に多くの現象に対して検出ロスはほんの少しだけなので、このような現象検出の欠落が影響の高い問題となることはない。ところが、希少、重要な現象の検出、たとえば１０００ないし１００万個の中の１個の特定の細胞または粒子の識別などを行わなければならない測定仕様で、現世代のフローサイトメータが検出および測定に使用されているときには、１回の希少な現象が検出されない可能性がある。スループットが高くなるほど、単位時間あたりにその重要な現象の検出をミスする確率が大きくなる。
【００１２】
フローサイトメトリにおいてサンプルの分類中に遭遇する問題に対する解決は、ここに参照引用するＣｏｒｉｏ等の米国特許第５，５５０，０５８号で提供されている。Ｃｏｒｉｏ等は、フローサイトメータで検出される現象の分類を弾力的に制御決定する手段を提供している。デッドタイム中に失われる現象を減らすために、使用者の選択可能なパラメータに従って現象が事前に選別される。ところが、Ｃｏｒｉｏ等の参照文献は、デッドタイムの現象喪失確率をゼロまで減らす手段を教示したり示唆するものではない。
【００１３】
このように、希少な現象、デッドタイムの現象を含めたいかなる現象をも失う確率をゼロに減らす手段を持つことができれば、フローサイトメータその他の解析機器を含むフローアナライザの技術にとって有益となる。
【００１４】
また、現象喪失確率を低減するシステムおよび／または方法を効果的に安価に提供することも望まれている。
【００１５】
さらに、たとえば１ｍｓ（ミリ秒）またはもっと短い時間あたりに１サンプルのようなほぼ１サンプリング周期の単位など、高いサンプリングレートに対し１つの現象を失う確率を減らすシステムおよび／または方法を効果的安価に提供することも望まれている。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題に鑑みた本発明の特徴および利点は、フローアナライザ、フローサイトメータおよびその他の測定デバイスのデッドタイムをゼロに減らす装置および方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の特徴および利点は、たとえば少なくとも１つのデジタル信号プロセッサその他のプロセッサによる処理まで光学データを保存する循環バッファを使用することにより、フローアナライザ、フローサイトメータおよびその他の測定デバイスにおけるデッドタイムをゼロに減少する手段を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる特徴および利点は、データ記憶領域のサイズ、データ記憶領域の数、サンプリングレート（および／またはその逆数：サンプリングまたはサンプル周期の長さ）、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）しきい値、および設定追跡間隔といった１以上のデータ収集、データ記憶およびデータ処理のパラメータを使用者に指定させられるようにするソフトウエアを提供することによって、フローアナライザ、フローサイトメータおよびその他の測定デバイスにおけるデッドタイムをゼロに減少する手段を提供することである。
【００１９】
本発明の特徴および利点は、１つの現象を失う確率を減らすシステムおよび／または方法を効果的に安価に提供することである。
【００２０】
本発明の別の特徴および利点は、高いサンプリングレートのときの１現象喪失確率を減らすシステムおよび／または方法を効果的に安価に提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる特徴および利点は、しきい値下のデータに特別なアルゴリズムを適用してより完全な現象ピークを再生成するように、潜在的に、順番の古いデータ記憶領域内のデータの再検査および再処理を行って時間を逆戻りすることで、データ解析能力を強化する能力を提供することである。
【００２２】
本発明は、測定デバイスにおけるデッドタイムを、ゼロまたは実質的にゼロに低減することのできる装置およびその装置の使用方法を提供する。当該装置は、１）循環バッファを含み、当該循環バッファはａ）測定域において発生する現象を測定する測定デバイスの継続している複数のサンプリング周期で入力データを受信して連続的に記憶するようにリンクされた複数のデータ記憶領域、ｂ）第１ポインタ（または第１論理ポインタ）、ｃ）第２ポインタ（または第２論理ポインタ）を有し、そして、２）少なくとも１個のデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）その他のデータプロセッサを含む。
【００２３】
各データ記憶領域は、１サンプリング周期にデータを受けて記憶するように構成される。さらに、データ記憶領域は、次の時間のサンプリング周期のデータ記憶用に次の順番のデータ記憶領域を提供する順にリンクされる。第１ポインタは、次の順番のデータ記憶領域に対する次の時間のサンプリング周期のデータ受信および記憶を指示し、すべてのデータ記憶領域にデータが入ると、第１ポインタは、次の時間のサンプリング周期のデータを受信してこれを、循環バッファの最古データが入っている次の順番のデータ記憶領域にあるデータを上書きして記憶するよう指示する。
【００２４】
第２ポインタは、第１ポインタに関連付けられ、現時点から少なくとも設定追跡間隔前のサンプル周期のデータを記憶したデータ記憶領域へ指向され、当該第２ポインタは、その指向させられたデータ記憶領域のデータを読み取って処理するＤＳＰを少なくとも１個指示する。
【００２５】
現サンプリング周期で該当データが記憶されると、第１ポインタは次の順番のデータ記憶領域に進む。さらに、指向させられているデータ記憶領域のデータが処理されると第２ポインタは、次の順番のデータ記憶領域進行に追随して、データ処理のサイクルを繰り返すための次の順番のデータ記憶領域へ進む。
【００２６】
システムの順方向進行且つ前に収集したサンプルを得るのに十分な逆方向進行を可能にしたその他のバッファを、代わりに使用することもできる。たとえば、縦続接続のバッファが可能であり、ＦＩＦＯおよび逆方向キャッシュの組み合わせを本発明において代わりに使用することができる。
【００２７】
本発明の方法は、測定デバイス、特にフローサイトメータまたはその他のフローアナライザのようなフローセルを備えた測定デバイスにおいて発生する現象からデータを収集して処理するために上記装置を適用することを要する。
【００２８】
設定追跡間隔は、現象の最大発現時間に等しくまたはそれ以上で、多くの場合１０〜１００μｓの範囲に入るように、使用者が設定できる。循環バッファのデータ記憶領域の大きさおよび数も、使用者が指定する。データ記憶領域は、１２〜１６ビットに設定されることが多いが、所定の測定仕様用に調整してより大きいまたはより小さいサイズを使用し得る。データ記憶領域の数は、ほとんどの場合１０００以上に設定される。しかしながら、１０００より少ない数のデータ記憶領域を使用したほうが有利なこともあり得る。
【００２９】
サンプリングレート、および／またはその逆数であるサンプリング周期の長さも使用者が指定する。代表的なサンプリングレートは、各１μｓのサンプリング周期に等しい１００万／秒である。しかしながら、より大きい数値およびより小さい数値も所定の測定仕様に応じて利用できる。
【００３０】
複数のＤＳＰを使用するときには、各ＤＳＰの使用順序を使用者が指定してもよい。たとえば、１つのＤＳＰに循環バッファへ入るデータの記憶を制御させ、そして１以上のＤＳＰに、第２ポインタによる指示でデータ処理を取り扱わせるようにできる。
【００３１】
また、たとえば、２重または３重の縦続接続バッファなど、後処理を可能とする１個以上のキャッシュに各データ記憶領域から一時的にデータを（またはデータが欠落していることを）記憶する先入れ先出しバッファのような、循環バッファと同等機能のバッファを使用することもできる。
【００３２】
別の態様では、循環バッファまたは同等の機能をもつものにデータを入力するためにＤＳＰを使用する代わりに、たとえば４または５種の状態を有するステートマシーンとして、ＦＰＧＡ（フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）をプログラムしてもよい。
【００３３】
上記に示した本発明の要部特徴の大まかな概略は、１）本発明の構成要素に関するより詳細を開示している後述部分の理解を助け、２）該当技術に対する本発明の寄与度を簡潔に強調するために開陳されている。しかしながら、上記概略並びに後述する本発明の構成、配置および実施に関する用語および詳細は代表的なものであって限定的なものではないことは理解されるべきことであり、本発明は構成、配置および実施について他の実施形態も可能である。
【００３４】
当技術分野で通常の知識を有する者であれば、本開示に基づいて技術思想を理解し、本発明の目的を達成する他の構造および実施の方法を想到する基礎として容易に利用することができると思われる。したがって、当開示および請求範囲は、ここに記載した本発明の精神および範囲から外れない限りにおいて、均等な構造および実施を包含しているとみなされることが重要である。
【００３５】
本発明の概要を示した当該項の他の目的は、米国特許庁、さらには、特許または法律用語あるいは本書中の表現に不慣れな当分野の科学者、技術者および実施者を含む一般公衆が、粗い概観だけで当開示の特徴および本質を容易に理解できるようにすることにある。したがって、この項で強調することは、いかなる場合でも本発明の範囲を制限するものではない。
【００３６】
運用上の利点および各種の使用方を含めて本発明をより良く理解するために、本発明の好ましい実施形態を説明した後述の図面、記載事項および請求範囲が参照されるべきである。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明は、フローアナライザ、フローサイトメータおよびその他の測定デバイスにおいてデッドタイムをゼロないし本質的にゼロに低減するシステムおよび方法を提供する。好適には、本発明は、データ記憶領域のサイズ、データ記憶領域の数、サンプリングレート（および／またはその逆数：サンプリングまたはサンプル周期の長さ）、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）しきい値および設定追跡間隔といったデータ収集、データ記憶およびデータ処理のパラメータを１以上設定できる機能を使用者に提供する。
【００３８】
各データ記憶領域は、たとえば１以上のサンプリング周期でデータを受け取って記憶するように構成される。当該データ記憶領域は、次の時間のサンプリング周期のデータを次の順番のデータ記憶領域に記憶するように選択的にリンクされる。第１ポインタ（すなわち第１論理ポインタ）は、次の時間のサンプリング周期のデータを次の順番のデータ記憶領域に受信し記憶することを指示する。データ記憶領域すべてにデータが入れられると、第１ポインタは、次の時間のサンプリング周期のデータの受け取りと、標準の循環バッファがそうであるように、バッファの最も古いデータが入っている次の順番のデータ記憶領域に上書きしてデータを記憶することを指示する。
【００３９】
第２ポインタ（すなわち第２論理ポインタ）は、たとえば第１ポインタその他の基準に関連付けられた設定つまり予め決められた追跡間隔だけは少なくとも現時点より前のサンプル周期のデータを記憶しているデータ記憶領域へ指向される。該第２ポインタは、指向させられたデータ記憶領域のデータを読み出して処理する少なくとも１つのデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）その他のデータプロセッサを指示する。
【００４０】
現サンプリング周期で該当データが記憶されると、第１ポインタは、その次の順番のデータ記憶領域に進む。さらに、指向させられているデータ記憶領域のデータが処理されると、第２ポインタは、次の順番のデータ記憶領域への進行に追随して、データ処理のサイクルを繰り返す次の順番のデータ記憶領域へ進む。
【００４１】
本発明は、フローアナライザやフローサイトメータのような分析機器のデータ収集において重要なデータを含むサンプルが喪失したという私見に部分的に基づいている。結果的に、サイトメータの全体的正確性には疑問があるか改善しなければならない。すなわち、上述のようなある種の測定仕様では重要なサンプルが喪失していたと確信でき、時間的に遡って所定量のデータを得る能力を持ったアドレッシング可能なバッファが、フローアナライザやサイトメータの全体的正確性および効率を改善するだろうと予測した。
【００４２】
システムが順方向且つ以前に収集されたサンプルを得るため十分に逆方向へ進行できるようなアドレッシング可能なデータの範囲のものであれば、他のアドレッシング可能なバッファを代わりに使用することができる。たとえば、縦続接続バッファで可能なような、ＦＩＦＯおよび逆方向キャッシュの組み合わせを本発明において代わりに使用することができる。時間的に遡ることがバッファに要求されるサンプル数は測定仕様により変化するが、１サンプルから２０サンプル以上あれば問題ないと思われる。
【００４３】
図１には、３０個のデータ記憶領域を有する循環バッファ（「循環バッファ手段」あるいは「循環メモリ構造」としても参照する）１００の一実施形態を示す。３０個のデータ記憶領域は１０２〜１６０の一連の偶数番号で表す。第１ポインタ（すなわち第１論理ポインタ）１７０は、たとえば、フローアナライザ、フローサイトメータまたはその他の測定デバイスから循環バッファ１００へ次のデータが転送されるときに既存のデータ（もしあれば）を上書きすることによって、次のサンプル周期における次のデータが記憶されるべきデータ記憶領域を指示する。
【００４４】
第１ポインタ１７０は、１個のアスタリスク（＊）で示すように、本例の現時点で循環バッファの最も古いデータを記憶しているデータ記憶領域１０２へ指向されている。データが分析手順の始めに循環バッファへ転送されてくると、古いデータの上書き更新が実行され、新しいデータが循環バッファ１００のデータ記憶領域に連続的に加えられ、続いてリンクする次の時間のデータ記憶領域が生成される。
【００４５】
弧状の矢印１９０は、データの獲得および通常のデータ処理（つまり時間を遡った処理ではない）の両方が進められる順方向の時間の向きを示している。すなわち、データ記憶領域１０４は、図示の時点で２番目に古いデータを記憶しており、データ記憶領域１０６は３番目に古いデータを記憶し、というようにして、２個のアスタリスク（＊＊）で示したデータ記憶領域１６０に、最新のデータが記憶されている。サンプル周期で入ってくる次のデータの組は１０２の古いデータに上書きされる。
【００４６】
次のサンプル周期で循環バッファ１００に転送されてくる次のデータの組が到着する少し前に、第１ポインタ１７０は、各データ記憶領域に対し連続して最古（その時点で）のデータの上書きを指示するべくデータ記憶領域１０４へ進み、このようにして弧状矢印１９０で示す順方向の時間の向きへ連続的に進む。このプロセスが、次の時間のデータを記憶する次の順番のデータ記憶領域のシリーズを連続的に生成して更新する。
【００４７】
図１を再び参照して図示されているように、第２ポインタ（すなわち第２論理ポインタ）１８０は、循環バッファ１００のデータ記憶領域１５６へ指向させられている。第２ポインタ１８０は、たとえば、使用者が指定した信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）のしきい値にデータが達したときにＤＳＰその他のプロセッサ（図示せず）によって次に読み出して処理されるべきデータの入っている現時点のデータ記憶領域を指示する。当該ＤＳＰがデータ記憶領域１５６に記憶されているデータを読み出した後には、第２ポインタ１８０は、矢印１９０の方向、データ記憶領域１５８へ進み、以降同様にして順々に進む。上述したように、他のアドレッシング可能なバッファデバイスを使用した場合には、上記動作が連続的もしくは所定の線形方式または順番で実行されることが必須であることは求められない。
【００４８】
循環バッファあるいはその他のバッファのデータ記憶領域の数は、所定の測定仕様の要求に応じて多くまたは少なく、使用者により自在に指定される。たとえば、１０００のデータ記憶領域があれば、各１μｓのサンプリング周期を１０００個分保存するのに十分な手段が提供される。循環バッファ１００は１０００個のデータ記憶領域より多くすることも少なくすることもでき、そして、サンプリング周期の時間の長さも、１μｓより長くすることも短くすることもできる（すなわち、サンプリングレートを１００万／秒より大きくすることも小さくすることもできる）。
【００４９】
同様に、データ記憶領域のサイズは使用者が決めるか、所定の測定仕様に合わせて使用者が選ぶことができる。たとえば、一部の仕様では、データ記憶領域当たり１２〜１６ビットで十分であるが、複雑および／または振幅の大きな蛍光放射その他のピーク等、他の仕様では２０ビット超えることが必要になる。
【００５０】
本発明の実施に際して、第２ポインタ１８０で指示される、ＤＳＰが読み出して処理するデータの量（あるいはそのために必要な時間）と、第１ポインタ１７０で指示される、最古のデータに上書きする入力データの量（あるいはそのために必要な時間）との間は、１対１（つまり同期ステップ）で直接対応させる必要はない。
【００５１】
たとえば、第１ポインタ１７０はサンプリングレート、たとえば１００万／秒のステップとした一定の進度で進む。データ記憶領域のデータが使用者の指定したＳ／Ｎしきい値に合わないときには、第２ポインタ１８０もサンプリングレートの進度で移動する。一方、データ記憶領域のデータが使用者の指定したＳ／Ｎしきい値に達したことにより、進行中の現象を指示するときには、第２ポインタ１８０は素早く次の順番のデータ記憶領域の次の時間のデータへ進む。データ記憶領域のデータが使用者の指定したＳ／Ｎしきい値に合致しない限り、最小で設定遅延時間τまたは設定追跡間隔が第１ポインタ１７０に対して維持され、その遅延時間は少なくとも１現象の最大発現時間、τmcに等しくされる。このように設定追跡間隔は、データ記憶領域のデータがＳ／Ｎしきい値に合わないときの最小遅延時間基準になる。
【００５２】
別の表現をすれば、τは、サンプリング周期で取得されたデータの循環バッファ１００への現在の転送と、τsec前に保存された不十分なＳ／ＮのデータのＤＳＰによる読み出しとの間に使用者が決定する遅延時間である。したがって、ＤＳＰは、次の入力データの組（次のサンプリング周期における）を記憶すべきデータ記憶領域を指示している第1ポインタ１７０から計測して、τmcに等しいかまたはこれより長い時間τだけ戻った点からデータを収集して検査するようにプログラムされる。
【００５３】
違う言い方をすれば、第１ポインタ１７０が次の順番のデータ記憶領域へ進むとき、直前のデータ記憶領域のデータがＳ／Ｎしきい値に合致していなければ第２ポインタ１８０も次のデータ記憶領域へ進む。しかし、そのデータがＳ／Ｎ比しきい値に達している場合は、当該現象に関係する後続の次の順番のデータ記憶領域のデータを読み出して処理することができるように、時間的に順方向の記憶領域のデータをＤＳＰに読み出させて処理させるべく、第２ポインタ１８０は迅速に先へ進む。このように、ある現象が検出されると第２ポインタ１８０は、弧状矢印１９０の示す方向で、当該現象に対する次の時間のデータをもつ次の順番のデータ記憶領域へ進む。したがって、第２ポインタ１８０は設定遅延時間τを「行き過ぎる」ことがあり得るが、τは少なくとも現象の最大発現時間に等しいので、第１ポインタ１７０を超えることはない。
【００５４】
別の実施形態では、第２ポインタ１８０が現象を処理するために素早く進むので、処理効率をあげるためにＤＳＰその他標準的プロセッサを複数使用することができる。このように複数のＤＳＰを使用する場合、使用者は、第２ポインタ１８０が当該現象のデータを記憶した一連のデータ記憶領域を進むのに合わせて、それら複数のＤＳＰの処理順を指定することができる。
【００５５】
さらに、より高精度の基準プロトコルまたはその他の基準プロトコルを、指定されたデータ記憶領域のデータが現象のピークに属するかどうか決めるために適用することができる。たとえば、一連のデータ記憶領域のデータの各組が使用者の指定したＳ／Ｎしきい値に合わないけれども、該一連のデータ記憶領域のデータの各組の値は、単調に増加するか、あるいは使用者の指定した量ごとに実質的に増加しており、および／または、少数のデータ記憶領域内におけるデータの組の増加がピークその他の認識可能な現象を満足すると、このときに第２ポインタ１８０は、その時の現象の発生に一致すると思われる（そのためのソフトウエアにプログラムされたロジックの効力で）データをもつ最初の順番のデータ記憶領域へ後退する。これにより、当該一連のデータ記憶領域のデータは、現象のピークの部分であるとして処理される。
【００５６】
これが、循環バッファあるいは機能的に同等な手段、すなわち、１現象の存在を確認するデータの連続時間を考慮して以前のデータを再検査する手段を有することが必要な理由である。これにより、本実施形態では、従来技術のフローアナライザおよびその他の測定デバイスを超える強力な追加的解析力が提供される。循環バッファという用語（そして「循環バッファ手段」および「循環メモリ構造」などのその他同様な表現）は、実行される複数の機能的能力に従って決められた順にリンクまたは連係するデータ記憶領域を備えたメモリ構造またはデバイスを指す。機能的能力の１つは、順にあるいは所定の方式で（たとえば、時間順またはその他可能なアドレッシング方式）、それらデータ記憶領域にデータの連続パケットを入れていく能力を含む。代わりの、あるいは追加される別の機能的能力は、データを保存する能力と、保存したデータを所定の方式で出力できると共に所定量後方または遡ったデータをデータ記憶領域から引き出せる能力と、である。
【００５７】
すべてのデータ記憶領域のそれぞれにデータパケットが入れられると、挿入順の第２サイクルは、最古のデータを有するデータ記憶領域のデータを次の時間のデータで上書きすることで始まり、続くサイクルすべてを同様に、各サイクルにおいて前のサイクルと同じ順番もしくは同じアドレッシング方式で、連続したデータパケットをデータ記憶領域へ転送していく。
【００５８】
第２の機能的能力は、ポインタ（たとえば第２ポインタ１８０）により、使用者の指定する１以上の基準ごとに連続するデータを考慮して時間を遡ってデータを再検査することである。さらに、上述した本発明に要求される機能的に均等な作用効果を達成するその他のバッファ構造（現在利用できるもの、将来開発されるものを含む）も、本発明の範囲であることを認識することが重要である。
【００５９】
限定するものではないが、２つの例をあげることができる。１）２重または３重の縦続接続のバッファ、および／または２）第２ポインタ１８０が次のデータ記憶領域へ進むときに各データ記憶領域からデータが転送される少なくとも１つのキャッシュを結合した先入れ先出しバッファである。さらに、上記２つの機能的能力を示すその他のバッファも本発明の範囲に含まれることは明白である。
【００６０】
図２には、図１の循環バッファ１００にデータを転送する処理ロジックを示す。段階２００は、最古のデータを有する循環バッファ１００の記憶領域へ第１ポインタ１７０が指示されていることを示す。段階２０２でサンプル周期Ｎになると、段階２０４で、センサが光学パラメータをサンプルして測定し、高速アナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）変換器がデータをデジタル化する。センサからデジタル変換された後のデータは、段階２０６で第１ポインタ１７０により指示されるデータ記憶領域に転送され、最古のデータが上書きされる。段階２００の第１ポインタ１７０のポジションから計測して１サンプル周期の長さ（サンプリング周波数の逆数）が経過すると、第１ポインタ１７０は、その時の循環バッファで最古データである後続のデータを有する次の順番のデータ記憶領域または所定のデータ記憶領域へ進む。次のサンプリング周期Ｎ＋１（段階２１２）で始まって、当該サイクル（段階２０４，２０６，２１０の連続した組み合わせ同等）が継続する。
【００６１】
分析処理が始まったばかりの場合には、上書きされるデータがないので初期のデータ記憶領域は空であるけれども、段階２００〜２０６と同様のステップが適用される。たとえば、サンプリングレートが１００万／秒であり、データ記憶領域が１０００であれば、このようなデータ記憶領域の空の状態は、実際には１０００分の１秒だけ存在する。
【００６２】
分析の目的のために、たとえば信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）が約２や３のしきい値あるいはその他のしきい値に等しいときなど、最小のデータ基準に基づいて、使用者により現象が決定される。Ｓ／Ｎしきい値は、サンプルの純度（たとえば、粒子の完全度が高いのか、それとも粒子の多くが細片に壊れているのか）および／または液の純度に対して補正するため、あるいは、サイトメトリックその他のフロー測定の読み取りやその他の測定デバイスからの読み取りにおけるバックグランドノイズに影響する他のシチュエーション（たとえば泡）に対して補正するために、増減させることができる。
【００６３】
実際に、Ｓ／Ｎしきい値は、予想される微少な信号振幅、特にバックグランド信号の振幅を含んでいる微少な信号振幅の範囲を反映するように調整し得る。図１の説明で上述したように、測定仕様に有益であるときにはさらに高精度のＳ／Ｎしきい値方式を採用することができる。
【００６４】
サンプリングレートも、たとえば１００万サンプリング周期／秒またはこれより大小など、使用者により選択される。一般に、オーバーサンプリングの設定レートが、平均的現象につきおおよそ８〜１２サンプリング周期、１現象につき最大でだいたい２０サンプリングの瞬間が生成されるように使用される。ただし、特殊な測定仕様にはより大きいあるいは小さい値を使ってもよく、たとえば複雑または広いマルチピーク蛍光放射スペクトルがある場合などは、現象当たり５０または１００サンプリング周期以上を有効に指定することもできる。
【００６５】
図３を参照して、図２の連続した段階２００，２０２，２０４，２０６，２１０で概要を示したように、新しいデータの測定、転送および記憶と時を同じくして、循環バッファ１００の所定域に記憶してあるデータに対するデータ処理が段階３００で始まる。段階３００で、第２ポインタ１８０は、「設定追跡間隔」としても上述した周期時間であるτｓｅｃ内に収集されたデータを記憶しているデータ記憶領域へ指向させられている。そして段階３０２でＤＳＰがそのデータを読み出し、段階３０４で、使用者の選択したＳ／Ｎしきい値に達したかどうかを判断し、段階３０６で処理が実行される。
【００６６】
Ｓ／Ｎ比しきい値に達していれば段階３０６でデータ記憶領域のデータが処理され、段階３３０で、第２ポインタ１８０が次の順番のデータ記憶領域へ進み、そして、当該記憶領域のデータがＳ／Ｎしきい値に達するかどうかが判断される。
【００６７】
一方、特定のデータ記憶領域のデータがＳ／Ｎ比しきい値に達しなければ、段階３４０で、連続したしきい値下のデータに上向きの傾向があるかどうかを確認するような、より高精度の基準分析方式が実行される。そして、その答えが「ＹＥＳ」であれば、段階３５０で第２ポインタ１８０が当該傾向の始まりのデータに戻り、段階３６０で、「傾向」を構成する一連のデータ記憶領域のデータを処理する。継いで、段階３７０で第２ポインタ１８０が次の時間のデータのあるデータ記憶領域に進み、「Ｓ／Ｎしきい値に達したか」を判断する段階３０４で始まるサイクルが再実行される。
【００６８】
段階３４０および／または３６０では、アルゴリズムを選択してあるいは追加して実行することができる。たとえば、Ｓ／Ｎしきい値に合わないデータに関してプロセッサ間（たとえばＤＳＰ間）の連携を推進する「微小信号検出アルゴリズム」である。このようなアルゴリズムは、たとえば、ＤＳＰが複数使用されているときに、進展中の現象ピークの部分を個々にもしくは集合して構成するであろう以前のデータへ協働して時間的に遡るべく各ＤＳＰを指示するものである。同様にこのようなアルゴリズムは、現象ピークの「終わり」の部分に対しても実行することができる。実際には、この種のアルゴリズムは、たとえば、最適化および／または平滑化および／または丸め込みおよび／または追加の信号処理を行う基礎を提供するその他のプログラムを含むことの可能な１以上の分析プログラムによって追加の精密検査を行う必要があることを知らせる。
【００６９】
これとは逆に、しきい値下のデータに上向きの傾向がなければ（または現象の長さ等、使用者指定のその他の基準に合致する場合には）、段階３０８で休止または待機となる。続いて段階３１０で、「遅延時間τが経過したか」が判断される。これは、第１ポインタ１７０に基づき測定されている現時点の前にτｓｅｃ以上、データ記憶領域にデータが収集され記憶されたかどうかということである。答えが「ＮＯ」であれば、さらに段階３０８で待機し、段階３１０へ戻って判断を繰り返す。答えが「ＹＥＳ」であれば、段階３２０へ行って、次の時間のデータを持つ次の順番のデータ記憶領域へ第２ポインタ１８０が進む。次に試験される所定のデータ記憶領域は、常に、今現在検査しているサンプリング周期直後のサンプリング周期、すなわち次の時間（図１の弧状矢印１９０の方向を参照）で記憶されたデータに一致する。これに伴って、データの読み出しと処理の新しいサイクルが始まる。
【００７０】
データの収集および処理のこのような多数のサイクルは、次の現象が発生する前に実行可能である。たとえば、１秒当たり１００万サンプリング周期（つまりサンプリングレート）があり、現在商業的に利用可能な最高速のレートである１秒当たり２０，０００個の細胞および／または粒子（「現象」）が読み込まれるとして、１０サンプリング周期が１つの現象のデータを収集するのに必要であれば、サンプル間の現象の無い平均時間は４０μｓほどになる。循環バッファ１００が１０００個のデータ記憶領域を有するように選択されるときには、これら１０００データ記憶領域のデータが１０００分の１秒の期間にわたるサンプリングを表す。
【００７１】
したがって、約４０μｓの平均無現象時間は、次の現象まで検出可能なデータの無い平均約４０サンプリング周期と言い換えられる。計算してみると、所定の時点で、１０００のデータ記憶領域を持つ循環バッファは約２０の現象｛１０００μｓ／（１０μｓ現象時間＋４０μｓ無現象時間）｝のデータを有することになる。現象間周期のデータを保持しているデータ記憶領域には、バックグランドノイズのデータが入っている。
【００７２】
好ましい実施形態において、検出されてデジタル化されたデータの複数のチャンネルの各々による同時のデータサンプル（たとえば単一のサンプリング周期による）は、単一のデータ記憶領域に記憶される。たとえば、第１チャンネル用の検出器は散乱した励起光のデータを収集して転送し、第２チャンネル用の検出器は第１蛍光色素の蛍光放射のデータを収集して転送し、第３チャンネル用の検出器は第２蛍光色素の蛍光放射のデータを収集して転送し、これらのデータがすべて単一のデータ記憶領域に記憶される。
【００７３】
使用者により指定される処理の命令によっては、複数のチャンネルによる同時のデータ用に、より多くのデータ記憶領域を使うようにすることもできる。たとえば、スペクトルの離れた３つの蛍光色素からの放射データを収集するために３つのチャンネルを使用可能であり、さらに、１つのチャンネルで前方散乱光を収集可能で、１つのチャンネルで側方散乱光を収集可能であって、これら５チャンネルのデータを処理する命令が使用者により指定されているとする。この場合、５つの異なるデータ記憶領域を、使用者の指定する記憶順で５チャンネルのデータを記憶するためにそれぞれ使用することができる。
【００７４】
別の実施形態においては、処理作業にしばしば相当の時間を要することになる問題を解決するため、第２ポインタ１８０に連携させて１個以上のＤＳＰを動作させることができる。たとえば、時間を消費するデジタルフィルタリング（たとえば標準の有限インパルス応答フィルタリングすなわち「ＦＩＲ」）および／またはノイズから取り出されたデータの品質改善によく使用される各種の波形解析手順に使用可能である。１個以上のＤＳＰが使用されるときには、使用者がＤＳＰその他の各プロセッサによる処理の順番を指定する。たとえば、第１ＤＳＰは次の順番のデータ記憶領域のデータを処理し、第２ＤＳＰはそのまた次の順番のデータ記憶領域のデータを処理する等である。本発明に従えばその他の構成も可能である。
【００７５】
本発明により、Ｓ／Ｎしきい値だけではなく、現象によるデータの多チャンネルの転送および処理の順序、複数のＤＳＰがある場合の処理順序、データ記憶領域の大きさ、データ記憶領域の数、および／または循環バッファの全体サイズを使用者が任意に指定できるようになっていることは有益である。これによれば、複合的放射ピーク、マルチデータ入力、またはその他の複雑なデータストリームの例において、使用者は、現在の使用状態に適したデータ記憶パラメータおよびその他のパラメータを容易に適用でき、したがって、極めて接近している時間に発生する１以上の現象によるデータにあり得る最大量を少なくとも収容するための効率的処理および十分なデータ記憶容量を確実にすることができる。
【００７６】
好ましい実施形態において、循環バッファ１００は、２以上のチャンネル（または複合分析仕様で３以上）による全入力データをそれぞれが保持する１０００個以上のデータ記憶領域を有する。最小構成の代表例は、励起光の散乱光を収集する第１チャンネル、第１蛍光色素の蛍光放射光を収集する第２チャンネル、および第２蛍光色素の蛍光放射光を収集する第３チャンネルを含む。しかしながら、測定仕様によっては、少なくて１チャンネルまたは多くて５以上のチャンネルが循環バッファ１００に入力データを提供し得る。チャンネルの上限は本発明では重要ではないが、５個を超えるチャンネルが本発明の範囲内なのは明らかである。
【００７７】
図４には、たとえばフローサイトメータのフローアナライザ４２０における循環バッファ１００の機能を概略的に示す。レーザ４００からのレーザビーム４０２は、フローキューベットの試験域４０４を通って粒子４０６に当たるように示されている。散乱、放射（たとえば蛍光放射）、屈折、あるいは生成される光４２２，４２４は、１以上の検出器４０８，４１０で検出され、そのデータ４２６，４２８が、対応するＦＡＤＣ（フィルタリング、増幅、およびデジタル変換）ユニット４１２，４１４へ転送される。ＦＡＤＣは、それぞれのデジタル化データ４３０，４３２を循環バッファ１００へ転送する。上述したプロセスにより、循環バッファ１００は、使用者の指定したＳ／Ｎしきい値に合致するデータ４３４を、最終データ処理のためにＤＳＰその他のデータプロセッサ４１６へ転送する。ＤＳＰその他のプロセッサ４１６で処理した結果が、最終的な出力４３６となって処理データ４１８とされる。循環バッファ１００は、ＤＳＰその他のプロセッサ４１６の一部に組み込まれるか、あるいは動作的にプロセッサ４１６に結合される場合があることは当然理解されよう。
【００７８】
さらに、循環バッファ１００に代えて、循環バッファ１００に関して上述した特徴を遂行する他のバッファ、たとえば、縦続接続バッファ、第２ポインタ１８０に指示されているデータを再読み出しおよび／または再処理するためのキャッシュを利用した先入れ先出しバッファを利用可能であることも当然理解される。
【００７９】
本発明はフローサイトメータ、フローアナライザ、その他のフロー測定デバイスなどへの適用を対象にしている。デジタル化した信号を迅速に保存した後に少なくとも１つのＤＳＰその他のプロセッサにより処理させる（時間を要する信号処理手順の実行に無現象期間を使用して）本発明の処理ロジックは、実際には、他の応用測定へも同様に適用することができる。
【００８０】
現仕様の一部分として以下に添付する付録は、本発明の一実施形態を実現するアセンブリ言語プログラムのコピーである。
【表１】
0003946444.tif 000002
【表２】
0003946444.tif 000003
【表３】
0003946444.tif 000004
【表４】
0003946444.tif 000005
【表５】
0003946444.tif 000006
【表６】
0003946444.tif 000007
【表７】
0003946444.tif 000008
【表８】
0003946444.tif 000009
【表９】
0003946444.tif 000010
【表１０】
0003946444.tif 000011
【表１１】
0003946444.tif 000012
【表１２】
0003946444.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による循環バッファの一実施形態である。
【図２】  フローアナライザからのデータを図１の循環バッファに書き込む一実施形態のフローチャートである。
【図３】  図１の循環バッファからデータを読み出して処理する一実施形態のフローチャートである。
【図４】  フローアナライザ内の循環バッファの機能を示すブロック図である。
【図１】
0003946444.tif 000014
【図２】
0003946444.tif 000015
【図３】
0003946444.tif 000016
【図４】
0003946444.tif 000017