(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ種子抽出物をＮＦ膜処理して得られた分子量が数百〜数千のプロアントシアニジンを主成分とすることを特徴とする静菌剤。
【請求項２】
酸性飲料に対して静菌作用を有する静菌剤であることを特徴とする請求項１記載の静菌剤。
【請求項３】
耐熱性好酸性菌に対して静菌作用を有する静菌剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の静菌剤。
【請求項４】
請求項１から３いずれか記載の静菌剤を静菌性有効量含有する飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所定のポリフェノールを主成分とする静菌剤、並びに、所定のポリフェノールが添加された静菌作用を具備する飲料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
赤ワインの常飲者に動脈硬化等の成人病（生活習慣病）が少ないというフレンチパラドックスという現象がよく知られているが、これは赤ワインに多く含まれるポリフェノールに起因するものであるということが提唱されている。また、このポリフェノールが有する疾病予防効果は、体内の活性酸素を抑制するという抗酸化機能に大きく起因するからではないかというようなことも言われている。
【０００３】
ポリフェノールについて、このような有用性が指摘されるようになったのは、多くのポリフェノールが備える抗酸化物質としての機能が大いに注目されたことに起因している。そして、酸化という現象それだけについて見てみた場合には、それが飲料の品質劣化の一因ともなっていることから、飲料業界の注目をも集めることになり、酸化防止剤としてのポリフェノールを飲料に添加することが本格的に検討されるようになった。
【０００４】
こうした中にあって、いくつかのポリフェノールについては、抗酸化剤としての飲料への添加が本格的に行われるようになってきたが、そのようになってきたのは、酸化による飲料の劣化が従来よりも問題視されるようになってきたことに加え、ポリフェノール自体が天然由来のものであり、健康志向の消費者に受け入れられやすいということも主な要因の一つとなっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ポリフェノールの抗酸化物質としての機能とその有用性がよく知られるようになると、いきおい、その抗酸化機能に基づく抽出原料、抽出方法、応用範囲に関しての研究が中心に進められるようになった。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
しかしながら、本発明者らがポリフェノ−ルに関して鋭意研究を重ねた結果、ポリフェノール（特に、プロアントシアニジンそれ自体及びプロアントシアニジンの近隣に抽出されてくる画分中のポリフェノール）が静菌作用を有するということが明らかになった。
【０００７】
更に、本発明者らは、所定の条件下、ＨＰＬＣでポリフェノールを分離した際に、ある画分が強力な静菌効果を有することをも併せて見出し、以下のような本発明を完成するに至った。即ち、本発明者らは、ポリフェノール画分の更なる分離により、従来よりも有効な静菌作用を有するポリフェノール画分を見出し、有効かつ有用な静菌剤及びそれを含有する飲料を提供することができるようになったのである。
【０００８】
より具体的には、本発明は、以下のような飲料及び静菌剤を提供する。
【０００９】
（１）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークであって、その内のメジャーなピークの中で、最後に溶出されるピークに相当する成分を主成分として含む静菌剤。なお、「メジャーなピーク」というのは、数あるピークの中でも、顕著に目立つものを意味する。
【００１０】
（２）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークであって、その内のメジャーなピークの中で、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤。
【００１１】
（３）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークであって、その内のメジャーなピークの中で、最後のほうに溶出されるピークに属し、かつ、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤。
【００１２】
（４）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離した場合に、より後に溶出されてくる画分をより多く含むように製造された静菌剤。
【００１３】
（５）  前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーはＨＰＬＣであることを特徴とする（１）から（４）いずれか記載の静菌剤。
【００１４】
（６）  前記ポリフェノール画分は、ブドウ種子を水／エタノールにより抽出して得られるポリフェノール画分であることを特徴とする（１）から（５）いずれか記載の静菌剤。
【００１５】
（７）  プロアントシアニジンを主成分とする静菌剤。
【００１６】
（８）  酸性飲料に対して静菌作用を有する静菌剤であることを特徴とする（１）から（７）いずれか記載の静菌剤
【００１７】
（９）  耐熱性好酸性菌に対して静菌作用を有する静菌剤であることを特徴とする（１）から（８）いずれか記載の静菌剤。
【００１８】
（１０）（１）から（９）いずれか記載の静菌剤を静菌性有効量含有する飲料。「静菌性有効量」は、静菌剤として使用するポリフェノールや画分の種類に応じて適宜決定する。
【００１９】
（１１）  （１）から（９）いずれか記載の静菌剤の静菌作用をＮＦ膜処理により消失させる方法。
【００２０】
（１２）  ポリフェノールを含有する飲料であって、表２の条件下でＨＰＬＣをかけたときに、図１中のピーク３に相当する物質をポリフェノール画分の主成分として含有する飲料。
【００２１】
［用語の定義等］
「静菌」とは、細菌を殺傷する作用までもは有しないが、細菌の生育・増殖を抑制し、細菌の活動に基づく製品飲料の変敗を防止できる作用を有することをいい、「静菌剤」とは、飲料に添加された場合に飲料の風味等に悪影響を及ぼすことなく飲料中で静菌作用を発揮し得るものを意味する。
【００２２】
「酸性飲料」というのは、典型的にはｐＨが３．０〜３．５程度の果汁飲料であるが、ｐＨが３．０〜４．０付近に調整されているスポーツドリンクやアイソトニック飲料、健康飲料なども含まれる。
【００２３】
「耐熱性好酸性菌」というのは、上記のような「酸性飲料」の中で生育し、増殖する細菌（好酸性菌）の中でも、「酸性飲料」において一般的に行われている加熱殺菌処理によっても死滅しない耐熱性のものを意味し、飲料業界において静菌のターゲットとされるものである。ここで、好酸性菌の中でも耐熱性のもの(耐熱性好酸性菌)は芽胞を形成するが、本発明に係る静菌剤は飲料中に生残した芽胞の発芽による増殖の防止に有効に作用することが認められる。
【００２４】
［ＨＰＬＣ］
「逆相分離用液体カラムクロマトグラフィー」は、疎水性固定相と親水性移動相の組み合せにより分離を行うカラムクロマトグラフィーのことを意味するが、これを行う場合には、固定相として非極性な固体（普通はシリカゲルの表面に疎水性基（炭化水素鎖）を化学結合した物質）或いは表面が疎水性の合成高分子を用い、移動相として水または水溶液、或いは水と良く混合する有機溶媒と水との混合液を用いる。「逆相分離用液体カラムクロマトグラフィー」その典型的なものは、オクタデシル基を結合したシリカゲルを充填し、溶離液として緩衝溶液を使用した「ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）」であり、後述の実施例でもこれを採用している。
【００２５】
［ＮＦ膜処理］
「ＮＦ膜処理」とは、荷電型逆浸透膜もしくは荷電型限外濾過膜を利用して濾過する処理をいうが、これに使用されるナノ濾過膜は分画分子量が数百〜数千の荷電膜であり、電解質の透過を阻止する性質を有する。
【００２６】
［ポリフェノール画分の抽出］
ポリフェノールを含有するものであれば、ブドウや茶等、あらゆる植物を本発明の原料とすることができる。なお、ブドウに関しては、特に種子部分については、未利用副産物の利用ともなるため、種子部分を利用するのも得策である。なお、種子部分については、有用なポリフェノールが多く含有されていることも、当該有用なポリフェノールを効率良く抽出する方法も、様々な研究がなされ、本発明者らによっても知見されている（特願平１１−２０９５７８号）。
【００２７】
ポリフェノール画分の抽出は水やエタノール等を溶媒として行う。なお、その後、抽出物の精度を高めるべく、適宜、酵素の添加や遠心分離等を行うことも可能である。
【００２８】
「静菌作用をＮＦ膜処理により消失させる方法」
以下に示す実施例で明らかとなるように、静菌成分は高分子画分に存すると考えられる。この点、ＮＦ膜処理を経た透過液には、分子量が小さい画分しか存在し得ず、結果として静菌作用そのものが消滅していることになる。静菌作用を消滅させることは、本発明の別の側面として、ポリフェノール画分から静菌作用を消滅させて他の作用を引き立たせたり、或いは、ポリフェノール画分の静菌作用の調整を行ったりする場合に役立つ。
【００２９】
【発明の実施の形態】
［ポリフェノール類の検出］
ポリフェノール類の検出（定質・定量分析）は、常法に従って行う。ポリフェノール類の検出方法としては、例えば液体クロマトグラフィーによる分析法、酒石酸鉄法、Folin-Denis法などが挙げられる。後に示す実施例においては、ポリフェノール量は全てFolin-Denis法（タンニン酸換算）で測定した。
【００３０】
ポリフェノールというものそれ自体は、殆ど全ての植物に含まれる物質であり、また、ポリフェノール自体の種類も多いことから、研究の当初からその成分と機能との関係についての実証は難しかった。しかし、ポリフェノールに対する研究が進むにつれ、このポリフェノールの一種であるプロアントシアニジンという成分が極めて優れた抗酸化機能を有するということが見出され（例えば、特開平３−２００７８１号公報、特開平９−２２１４８４号公報、特開平１１−８０１４８号公報）、現在では、この成分を多く有するブドウ種子からの抽出物が、酸化防止剤として食品添加物の一つに登録され（厚生省告示第120号の既存添加物名簿第367号記載）、商業的に生産され、販売されるに至っている。
【００３１】
プロアントシアニジンを多く含有するポリフェノールとして商業的に入手可能なものとしては、市販品であるグラヴィノール（商品名）を挙げることができ、実施に際しては、これを使用するのが好適である。グラヴィノール（商品名）は、エタノール／水の混合溶媒を用いてブドウ種子からプロアントシアニジンを抽出したものであり、製品として一般に販売されているものである。なお、飲料の静菌剤としては、このグラヴィノールをそのまま使用してもよいし、或いは、さらに分離処理（例えば、先に述べたＨＰＬＣによる分離）を行って使用するようにしてもよい。
【００３２】
因みに、グラヴィノール（商品名）の主成分であるプロアントシアニジンは、ポリフェノールの一種として、以下の表に示すところに位置付けられる成分である。
【００３３】
【表１】
0003883776.tif 000002
【００３４】
このプロアントシアニジンという物質は、カテキンが重合した縮合型タンニンであり、そして、それが備える強い抗酸化作用から、フランスにおいては医薬品（血管治療薬）として用いられているものでもある。
【００３５】
なお、プロアントシアニジンそれ自体に関しては、コーヒー飲料の品質安定法についての特許出願がなされてはいるが（特開平８‐２２８６８５号公報)、それは抗酸化作用を離れたものではなく、むしろその抗酸化作用に基づいた品質安定化を図ったものに過ぎない。
【００３６】
【実施例】
市販のグラヴィノール（商品名）を、下記の条件でＨＰＬＣにかけた。
【００３７】
【表２】
0003883776.tif 000003
【００３８】
その結果、図１に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００３９】
また、同じく市販のグラヴィノール（商品名）を、表２と同等の条件下でＨＰＬＣにかけたところ、図２に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００４０】
更に、液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物（特願平１１−２０９５７８号）を、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ、図３に示されるようなクロマトグラムが得られた。また、ブドウ種子から熱水抽出することにより得られたブドウ種子抽出物についてこれをＮＦ膜処理したものを、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ、図４に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００４１】
そして更に、お茶から得られたカテキンを、基本的には図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ（但し、溶出の速度を遅くするために２０分以降のグラジエント（アセトニトリルの添加量の増分（即ち、溶離液の極性の下げ方））を適宜小さくするようにした（表２の下部分の右端参照））、図５に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００４２】
これらの図から明らかなように、図１に示されるグラヴィノール（商品名）のＨＰＬＣクロマトグラムでは、メジャーなピークとして、「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」の３つのピークが得られており、これは図２のものも同様である。
【００４３】
そして、この中で最後に溶出されてくるメジャーピークである「ピーク３」と同様のピークは、液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである図３のものにも見られるが（図３中の「ピーク３’」）、熱水抽出したものをＮＦ膜処理した図４や、お茶から得られたカテキンのＨＰＬＣクロマトグラムである図５には見られない。
【００４４】
なお、最後に溶出されてくるメジャーピークである「ピーク３」（或いは「ピーク３’」）については、分子量が高いポリフェノールが多く含有されていると考えられる。
【００４５】
【実施例１】
ここでまず、市販のグラヴィノール（商品名）を、一般的な混濁タイプスポーツ飲料（果汁３％、可溶性固形分１Ｂｒｉｘ未満、ｐＨ約３．８）、混濁タイプ果汁飲料（果汁１０％未満、可溶性固形分７〜８Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．０）、透明タイプ果汁飲料（果汁１０％未満、可溶性固形分４〜５Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．２）のそれぞれに添加し、そこに耐熱性好酸性菌２種（ＤＳＭ2498株（Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH）、ＡＴＣＣ49025株（American  Type  Culture  Collection））を「胞子数１０００個／５００ｍｌ ＰＥＴボトル」の割合で接種し、経過を見た。各試験区の母数は３であり、菌が接種された飲料は、３７℃で１４日間放置された。
【００４６】
以下の表３に、本実施例に係る抽出物の添加量（但し、抽出物中に含まれる総ポリフェノールの濃度に換算してある）を変化させた場合の結果を示す。
【００４７】
【表３】
0003883776.tif 000004
【００４８】
この表３では、製品中での菌の増殖及びそれに伴う異味・異臭がしたものを＋としている（なお、表３中、「+」「-」の符号につき、カンマの左３つがＤＳＭ2498株の結果を、カンマの右３つがＡＴＣＣ49025株の結果を示す）。
【００４９】
この結果により、市販のグラヴィノール（商品名）においては、ポリフェノール濃度が１０ｐｐｍ以上となるように飲料に混合した場合には、飲料の種類を問わず、静菌効果があるということが分かる。
【００５０】
【実施例２】
次に、ポリフェノール画分を、上述したようにＨＰＬＣによって分離したときに得られるメジャーなピーク（「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」（図１））について、それぞれ静菌効果を比較してみることとした。そして、そのためにはまず、グラヴィノールをポリフェノール換算０.５％の溶液とし、その３６ｍｌをＨＰＬＣにより「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」の３画分に分離した。そして、分離された各部分について、回収後に濃縮・希釈をして7.2ｍｌとした。ピーク比較による回収率を、以下の表に示す。
【００５１】
【表４】
0003883776.tif 000005
【００５２】
上記各画分の回収率を考慮し、グラヴィノール（商品名）のポリフェノール換算１０ｐｐｍ添加相当となるように、各画分を混濁タイプスポーツ飲料に添加した。この混濁タイプスポーツ飲料を５００ｍｌＰＥＴボトルに８５℃ホットパック充填後、耐熱性好酸性菌（ＤＳＭ2498株）を「胞子数１０００個／５００ｍｌＰＥＴボトル」の割合で接種し、閉栓した後に１分３０秒間転倒保持し、冷却した。
【００５３】
静菌の効果は、３５℃１４日間培養後、製品液１ｍｌの混釈培養により、菌の増殖の有無で確認した。また、いずれの画分が静菌作用を有するのかを一層明確にするため、単独添加、混合添加の双方を行った。
【００５４】
その結果、下表のような結果が得られた。
【００５５】
【表５】
0003883776.tif 000006
【００５６】
この表５では、製品中での菌の増殖があったものを＋としているが、この結果から明らかなように、単独添加、混合添加のいずれにおいても「ピーク３」の画分が飲料に添加されている場合に、菌の増殖が抑制されていることが認められた。
【００５７】
従って、上記実施例１によれば、グラヴィノール（商品名）に静菌作用があるということが立証され、この実施例２によれば、グラヴィノール（商品名）を逆相液体カラムクロマトグラフィーによって分離したときの最後に溶出される画分の中に静菌作用を備える成分が含まれているということが明らかになった。
【００５８】
よって、グラヴィノール（商品名）を逆相液体カラムクロマトグラフィーによって分離したときに最後に溶出される画分を常法に従って取り出し、当該画分の部分を飲料に添加することによって、飲料中において静菌作用を発現させることができることが明らかである。
【００５９】
【実施例３】
次に、異なる抽出方法で抽出したブドウ抽出物、並びに他のポリフェノールの静菌作用について、それらを相互に比較した。具体的には、（１）水／エタノールの混合溶媒を使用して抽出されたブドウ種子抽出物であるグラヴィノール（商品名）、（２）液化炭酸ガスで抽出されたブドウ種子抽出物、（３）熱水抽出されたブドウ種子抽出物をＮＦ膜濾過処理したブドウ種子抽出物、（４）緑茶カテキン製剤、をそれぞれ一般的な混濁タイプスポーツ飲料（果汁３％、可溶性固形分１Ｂｒｉｘ未満、ｐＨ約３．８）に添加し、そこに耐熱性好酸性菌（ＤＳＭ2498株）を「胞子数１０００個／５００ｍｌ ＰＥＴボトル」の割合で接種し、経過を見た。各試験区の母数は２であり、菌が接種された飲料は、３７℃で１４日間放置された。
【００６０】
以下の表６に、本実施例に係る抽出物の添加量（但し、抽出物中に含まれる総ポリフェノールの濃度に換算してある）を変化させた場合の結果を示す。
【００６１】
【表６】
0003883776.tif 000007
【００６２】
この表６では、製品中での菌の増殖及びそれに伴う異味・異臭がしたものを＋としている。
【００６３】
この結果から、ブドウ種子抽出物をＮＦ膜で濾過をした場合には、ブドウ種子抽出物中から静菌作用が消失してしまうということが分かる。上述したように、これは、最後に溶出されて来る「ピーク３」もしくは「ピーク３’」に相当するピークが、ＮＦ膜処理を経ることによって消失してしまうからであると考えられるため、この現象からも、「ピーク３」もしくは「ピーク３’」の部分に静菌作用があることの事実の裏付けがなされている。
【００６４】
同様に、緑茶カテキンに静菌作用が無いのは、元々「ピーク３」もしくは「ピーク３’」に相当するピークが存在しないためであると考えられる。
【００６５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明により、所定のものから所定のポリフェノールを採取し、或いは、ポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーで分離することにより、天然由来の飲料用静菌剤を製造することができ、この画分を飲料中に混合することにより静菌作用を有する飲料とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  市販のグラヴィノール（商品名）をＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である（表２参照）。
【図２】  市販のグラヴィノール（商品名）を、表２の条件下でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】  液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物を、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】  ブドウ種子から熱水抽出することにより得られたブドウ種子抽出物についてＮＦ膜処理したものを、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】  お茶から得られたカテキンを、表２の条件（下部分の右端）でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１】
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【図２】
0003883776.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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