(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７０℃以上の温度におけるエステル及び／又は脂質の分解、合成、交換あるいはラセミ体エステルの光学分割のための超耐熱性エステラーゼの使用方法であって、該エステラーゼが、下記の（１）又は（２）のポリペプチドであることを特徴とする前記使用方法。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、３０〜９０℃の温度範囲において、少なくともＡｌａ−Ｐｈｅ、ｐ−ニトロフェニルラウリン酸エステル、ｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステル、N−アセチル−フェニルアラニン−パラニトロアニリド及びＮ−アセチル−ロイシン−パラニトロアニリドを基質とするペプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、至適ｐＨが８付近であり、分子量が約６３，０００であるポリペプチド。
【請求項２】
上記エステル及び／又は脂質が室温において固体状である場合、有機溶媒を添加することを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超耐熱性エステラーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、その製造方法、及びその使用方法に関する。詳しくは、本発明は、３０〜１００℃の範囲においてぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を共に有する超耐熱性エステラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
エステラーゼは、種々のエステルの分解、合成、交換あるいはラセミ体エステルの光学分割に用いられる。しかし、従来の酵素は常温菌が生産したものが多く、７０℃以上になるとほとんど失活してしまっていた。７０〜１００℃の温度範囲では、室温において固体状であるほとんどの油脂が液体状になるため、この範囲において活性を有するエステラーゼが得られれば、新規な利用法が開発されるものと思われる。しかし、７０℃以上で生育する好熱菌は一般にエーテル脂質を膜脂質とする古細菌に属し、エステルに作用するエステラーゼ、及びペプチドの分解、合成等に用いられるぺプチダーゼ活性を有する耐熱性酵素は得られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の常温菌由来の耐熱性ペプチダーゼおよびエステラーゼは、１００℃近い高温下では不安定であるため、反応は比較的低温（４０〜６０℃）で行う必要があった。
しかしながら、従来酵素的分解が低温でしか行えないことから、上記の室温において固体状で反応する方法しか利用することができなかった。そのため、反応速度が遅いという問題点があった。
１００℃近い高温下で上記の反応を行うと、基質の液化、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去等、多くの利点が考えられる。そこで、１００℃近い高温下で働き、さらに、その条件下で安定な酵素が渇望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、９０〜１００℃で生育する超好熱性菌に着目し、種々検討を行った。
まず、超好熱菌の膜脂質はエーテル脂質であるため、エステラーゼ遺伝子を見い出すことは、困難であることが予想された。そこで、脂質分解酵素であるリパーゼがエステラーゼ活性ももつことが知られているので、リパーゼモチーフ（GXSXGグリシンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子をスクリーニングすることとした。すなわち、超好熱性菌の遺伝子配列から、本酵素活性を示すと推測されるリパーゼモチーフ遺伝子との相同性検索を行い、アエロパイラム属菌においてリパーゼモチーフを持つ遺伝子を見出すことに成功した。
【０００５】
さらに、PCR反応で増幅したリパーゼモチーフを持つ遺伝子を大腸菌に導入し、85℃で３０分間加熱する等の活性な状態で目的の酵素を生産する条件を研究後、酵素タンパク質を生産し、この酵素が高温（９０〜９５℃）で安定で、かつ、３０〜１００℃の範囲において超耐熱性エステラーゼ活性及びぺプチダーゼ活性を共に有する２機能性の酵素活性を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。さらに、ここで得られた遺伝子を、他の微生物に組み込み、本酵素を多量に分泌生産することもできる。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の（Ａ）、（Ｂ）に示す超耐熱性エステラーゼの使用方法に関する。
（Ａ）７０℃以上の温度におけるエステル及び／又は脂質の分解、合成、交換あるいはラセミ体エステルの光学分割のための超耐熱性エステラーゼの使用方法であって、該エステラーゼが、下記の（１）又は（２）のポリペプチドであることを特徴とする前記使用方法。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、３０〜９０℃の温度範囲において、少なくともＡｌａ−Ｐｈｅ、ｐ−ニトロフェニルラウリン酸エステル、ｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステル、N−アセチル−フェニルアラニン−パラニトロアニリド及びＮ−アセチル−ロイシン−パラニトロアニリドを基質とするペプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、至適ｐＨが８付近であり、分子量が約６３，０００であるポリペプチド。
（Ｂ）上記エステル及び／又は脂質が室温において固体状である場合、有機溶媒を添加することを特徴とする、上記（Ａ）に記載の使用方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を具体的に説明する。
本発明においてペプチダーゼ活性とは、ペプチドを分解する活性のことをいう。また、本発明においてエステラーゼ活性とは、エステルを分解する活性のことをいう。
【０００９】
本発明で使用した特に好適な超好熱性菌は、アエロパイラム属に属する好気性好熱性古細菌  アエロパイラム  ぺルニクス（登録番号ＪＣＭ９８２０）である。これら超好熱性細菌の遺伝子配列から本酵素活性を示すと思われる遺伝子を探した。具体的には、超好熱菌の膜脂質はエーテル脂質であるためにエステラーゼ遺伝子を見出すことは困難であることが予想された。一方、リパーゼは、エステラーゼ活性をももっている場合があることから、超好熱性菌の遺伝子配列から本酵素活性を示すと推測されるリパーゼモチーフ（GXSXGグリシンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子との相同性検索を行い、上記超好熱菌においてリパーゼモチーフを持つ遺伝子を見出した。得られた遺伝子をPCR反応で増幅し、抽出した後、タンパク質発現プラスミドpET 11a（Novagen社製）に挿入、そのプラスミドを大腸菌に組み込み、本酵素の生産を行った。但し、本発明において使用できるベクターはプラスミドに限定されるものではなく、宿主も大腸菌に限定されるものではない。いずれも当分野において通常使用されるもの、例えばpAUR101等のベクター、酵母菌、枯草菌等の宿主細胞を適宜選択して使用することができる。
生産された酵素は、界面活性剤を入れて抽出し、加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製する。
【００１０】
本発明のタンパク質は、ぺプチダーゼ及びエステラーゼ活性を有する超耐熱性エステラーゼであり、そのタンパク質をコードする遺伝子は例えば配列番号１のごとくであり、その遺伝子から推定されるアミノ酸配列は例えば配列番号２のようである。大腸菌によって生産されるタンパク質は、2.5%のトリトンX１００を加えて抽出し、抽出したタンパク質は、加熱処理により大腸菌タンパク質を沈澱させ、硫安塩析、陰イオン交換樹脂（ハイトラップQセファロース）、疎水性クロマトグラフで精製したタンパク質のゲルろ過より求めた分子量も58-69kDであったので、１量体で存在していた。精製したタンパク質は、分子量約63,000のタンパク質で、各種のジペプチド、アシルアミノペプチド、パラニトロフェノールエステル、トリブチリンを分解した。反応pHは７〜９で活性が高く至適pHは、８附近にあった。至適温度は５０℃であったが、９０℃でも５０℃の４０％の活性があった。
【００１１】
本発明の超耐熱性エステラーゼは、例えばアエロパイラム属に属する超耐熱性エステラーゼ生産菌を培地中で培養し、培養物から超耐熱性エステラーゼを採取することにより得ることができる。具体的な培養条件等は下記実施例に記載するが、当業者であればこれらの記載に基づいて培地等の培養条件の選択を適宜改変することができる。
【００１２】
本発明に係る超耐熱性エステラーゼはまた、
（i）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（ii）配列番号１に示すヌクレオチド配列において１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドであって、３０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
から得ることができる。すなわち、これらのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを作製し、適当な宿主に導入して形質転換体を得、この形質転換体を培地中で培養し、培養物から超耐熱性エステラーゼを採取することにより得ることができる。ここで、上記（ii）に示すポリヌクレオチドは、例えば部位特異的突然変異誘発等の当分野において通常使用される手段により得ることができ、また自然界から得ることもできる。タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいては、コドンの縮重や、コードされるタンパク質におけるアミノ酸の保存的置換等により、ヌクレオチド配列が異なる場合であってもそのコードするタンパク質の機能が同じか、類似することは周知である。また、種々の機能的に影響のない数十個程度の欠失体が存在することも良く知られており、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、酵素の機能を著しく損なうことなくこうした欠失体、置換体若しくは付加体を得ることができる。従って、本明細書において「複数個」とは、数十個、好ましくは数個を意味する。
【００１３】
本発明はまた、
（iii）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（iv）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、３０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有するポリペプチド
を提供する。ここで、上記（iv）に示すポリペプチドは、例えば部位特異的突然変異誘発等の当分野において通常使用される手段により得ることができ、また自然界から得ることもできる。上記したように、タンパク質においては、アミノ酸の保存的置換を始めとする欠失、置換若しくは付加により、機能が類似するタンパク質が得られることは周知である。また、例えばＮ末端またはＣ末端等で、種々の機能的に影響のない数十個程度の欠失体が存在することも良く知られており、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、酵素の機能領域を特定し、その機能を著しく損なうことなくこうした欠失体、置換体若しくは付加体を得ることができる。従って、本明細書において「複数個」とは、数十個、好ましくは数個を意味する。
【００１４】
本発明の超耐熱性エステラーゼは、例えば７０℃以上の温度におけるペプチド、エステル、及び／又は脂質の分解、合成、交換あるいはラセミ体エステルの光学分割のために使用することができる。上記ペプチド、エステル、及び／又は脂質は、特に限定されるものではないが、室温において固体状であるものが本発明において、例えばphe-Ala、Ala-Phe、Trp-Ala等のペプチドを基質として挙げることができる。固体状の基質を高濃度で反応する場合、ヘキサン、イソオクタン等の疎水性の有機溶媒を添加することにより反応速度を更に上げることができる。
【００１５】
【実施例】
実施例１  アエロパイラム  ぺルニクスゲノムDNAからの酵素遺伝子のクローニング
DNAデータベース（製品評価センターホームページhttp://www.mild.nite.go.jp/）からアエロパイラム・ペルニクス（APE1547）の情報を得、酵素遺伝子と推定される配列を選択した。具体的には、リパーゼモチーフ（GXSXGグリシンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子を探した。すなわち、超好熱性菌の遺伝子配列から本酵素活性を示すと推測されるリパーゼモチーフ遺伝子との相同性検索を行ってリパーゼモチーフ遺伝子を見出した。
【００１６】
得られた遺伝子配列情報から、アパープライマー（5'CTTACGACTATCTCAGCGCATTATAATGCCTGT3'（配列番号３））及びロアプライマー（5'TTGGAGCCTCCCGGCGGTGGATCCCTATCTCCT3'（配列番号４））を設計した。アエロパイラム  ぺルニクス（ＪＣＭ９８２０）から常法によって抽出精製したゲノムを鋳型とし、上記アパープライマー及びロアプライマーを用いてPCR増幅反応を実施した。
【００１７】
Ventポリメラーゼ１μl、Ventポリメラーゼバッファー１０μl、dNTP mix（２５ｍＭ）1.5μl、鋳型DNA溶液４μl、アパープライマー（１００μＭ）１μl、ロアプライマー（１００μＭ）１μl、蒸留水81.5μlを混合し、PCR反応を行った。反応条件は、変性を９４℃で1分、アニーリングを４８℃で２分、伸長を７０℃で３分とし、３５サイクルで行った。
【００１８】
PCR産物の確認は、PCR産物２μl、色素混合液２μl、TEバッファー５μl、及びＨバッファー１μlの計１０μlを混合し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動させ、UVイルミネーターによる可視化（３０分間）によって行った。目的とするバンドをマーカーとの比較によって決定した。
【００１９】
増幅したPCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（Quiagen）を用いて精製した。目的のバンドを含有するゲルを透明なチューブに入れ、重量を測定後、３容量のBuffer QGを添加し、２〜３分毎に攪拌しながら５０℃で１０分間インキュベートした。全てのゲルが溶解した後、溶媒の色を確認した。溶媒が黄色を示した場合は、１ゲル容量のイソプロパノールを添加して混合した。QIAquickスピンカラムを２ｍｌのチューブに入れ、これに0.5ｍｌのQGバッファーを添加して、4000rpmで１分間遠心分離した。次いで0.75ｍｌのPEバッファーを加えて再度4000rpmで１分間遠心分離し、フロースルーを捨て、カラムを更に13000rpmで１分間遠心分離した。その後QIAquickカラムを1.5ｍｌのチューブに入れて５０ｍｌの蒸留水を添加し、DNAを溶出させた。電気泳動で結果を確認した。
【００２０】
実施例２  酵素遺伝子による大腸菌の形質転換
上記実施例１  で増幅した遺伝子を制限酵素（NdeI及びBamHI）で消化し、同じ制限酵素で切断したベクターpET11a中に挿入した。まず、増幅したPCR産物５μl、BamHI１μl、NdeI１μl、バッファーＫ１μl、蒸留水２μlを混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでNdeI 0.5μlを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。分解反応を電気泳動で確認した。
【００２１】
次にQIAquick Gel Extraction Kitを用い、純粋なセグメントを得、サンプルをTEバッファー３０μl中に懸濁した。標的DNA５μl、Pub11a１μl、ligation solution I mix６０μlを混合し、１６℃で一晩静置した。
得られたプラスミドを用い、大腸菌XL2コンピテント細胞を形質転換した。
【００２２】
−８０℃に保存していたコンピテント細胞を氷上に置き、液状になったところで１００μlを氷冷したファルコンチューブにとり、1.7μlのメルカプトエタノールを添加した。軽く攪拌した後、時々攪拌しながら１０分間氷上に置いた。次にligation mixを添加し、氷上に３０分間置いた。４２℃で３０秒間の加熱後にすばやく氷上に戻し、そのまま２分間置いた。次いで９００μlのSOC培地を添加し、振とうしながら３７℃で１時間培養した。培養した細胞を、アンピシリン（５００×）２０μlを添加したプレート上にまき、各プレート２５０μlをクリーンベンチで風乾し、３７℃で一晩培養した。
【００２３】
実施例３  形質転換体の作製
形質転換体の細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２YT培地（１％酵母抽出物、1.6％トリプトン、0.5％NaCl含有）で３７℃で増殖させた。Plasmid Mini Purification Kit（Quiagen）を用いて形質転換細胞からプラスミドを得た。
【００２４】
具体的には、形質転換体を培養した培地を2000rpmで１５分間遠心分離した。上清を捨て、細菌ペレットを0.3ｍｌのP1バッファーに再懸濁し、0.3ｍｌのP2バッファーを添加して混合し、室温で５分間インキュベートした。次いでP3バッファーを添加して速やかに混合し、氷上で５分間インキュベートした後、１３００rpmで１０分間遠心分離した。上清をとり、１ｍｌQBTバッファーによって平衡化し、重力による流出によって空にしたQIAGEN-tip 20にのせ、重力によって樹脂内に侵入させた後、QCバッファーで洗浄し、次いで0.8QFバッファーでDNAを溶出させた。室温のイソプロパノール0.7容量でDNAを沈降させ、13000rpmで３０分間の遠心分離を行い、注意深く上清をとった。DNAを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、５分間風乾した後、３０μlのTEバッファーに溶解させた。
【００２５】
次に、制限酵素によってプラスミドを切り出した。目的の遺伝子を含有するプラスミド１μl、BamHI１μl、NdeI１μl、Ｋバッファー１μl、蒸留水６μlを混合し、３７℃で１時間インキュベートし、dye mix３μlを添加し、確認のために電気泳動を行った。
この結果、形質転換体に目的の遺伝子が含まれていることが確認された。
【００２６】
実施例４  酵素の精製１
BL21形質転換体のプレートから数個のコロニーをとり、１０ｍｌのYT培地中にまき、アンピシリン（５００×）２０μlを添加して攪拌しながら３７℃で一晩予備培養した。培養物１ｍｌをYT培地１００ｍｌにアンピシリン（５００×）２０μlと共に入れ、攪拌しながら３７℃でＡ600が0.6から1.0になるまで培養した。次いでIPTG １００ｍＭを培地１ｍｌ当たり１０μlの濃度で添加し、攪拌しながら約９時間培養を継続した。4500rpmで２０分間の遠心分離を行い、上清を除去して細胞を回収した。これを−２０℃で３０分間保存した後に室温で融解した。この細胞を、１０ｍＭ Tris-HClバッファー（ｐＨ8.0）３００μlに懸濁し、１ｍｇのDNaseIを添加して３７℃で３０分間加熱した。超音波処理を20分間行った後にTritonX-100を添加（最終濃度2.5％）し、８５℃で３０分間加熱した。
【００２７】
次いで15000rpmで１５分間遠心分離し、上清を回収した（粗酵素）。この上清４μlをとり、SDSバッファー４μlを添加した混合物から１μlをとって５分間沸騰させた。Phast System装置（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）及びPhastGel 10-15（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を用いてSDS-PAGEを行った。
【００２８】
実施例５  粗酵素液における酵素活性の確認
実施例４で得られた粗酵素液を用い、酵素活性の確認を行った。基質としてAla-Ala-Ala（４０ｍＭ）５０μl、粗酵素液５０μl、Tris-HClバッファー（ｐＨ8.0）９００μlを混合し、８５℃で１時間加熱した後、混合液から１２０μlをとり、９００μlのニンヒドリン溶液を添加し、再度８５℃で５分間加熱した。分解産物の検出のためにＡ505を検出した結果、酵素活性が確認された。
【００２９】
実施例６  酵素の精製２
実施例３で得られた形質転換細胞を81YT培地で培養し、実施例４と同じ条件下で酵素を抽出した。
粗酵素の溶液に(NH4)2SO4を添加してタンパク質を塩析し、7000rpmで２０分間遠心分離して上清を回収し、蒸留水を添加してタンパク質を溶解し、これを１０ｍＭのTris-HClバッファーを用い、４℃で一晩した。翌日バッファーを１回交換し、４℃で８時間静置した。
【００３０】
サンプルを7000rpmで２0分間遠心分離して沈殿を除いた後、HiTrap Q Sepharoseの５ｍｌのカラムにのせた。カラムに以下のバッファーを２ｍｌ／分の流速で４０分間流した。バッファーＡ：５０ｍＭ Tris-HCl、バッファーＢ：１Ｍ NaClを含有する５０ｍＭ Tris-HCl。得られた６ｍｌずつの各フラクションをSDS-PAGEにかけると共に酵素活性を確認し、活性の認められたフラクションを合わせて次の工程に進んだ。
【００３１】
選択したフラクションをPhenyl Sepharose 16/10カラムにのせ、以下のバッファーを1.5ｍｌ／分の流速で流した。バッファーＡ：1.8Ｍ (NH4)2SO4を含有する１００ｍＭ Na2HPO4、バッファーＢ：５０ｍＭ Na2HPO4。得られた６ｍｌずつの各フラクションをSDS-PAGEにかけると共に酵素活性を確認し、活性の認められたフラクションを合わせて次の工程に進んだ。
選択したフラクションをHiload superdex 26/60カラムにのせ、1.5ｍｌ／分の流速でバッファー（1Mの食塩を含む100mM Tris-HCl (pH8)）を流した。得られた６ｍｌずつの各フラクションをSDS-PAGEにかけると共に酵素活性を確認した。
酵素活性を有したフラクションを用いてHPLC（Macro-Prep se1000/40）にかけ、分子量を測定した。上記手順によって精製された酵素は６９ｋDと５８ｋDの間にあり、分子量約63,000のタンパク質であることが確認された。
【００３２】
実施例７  ペプチドの分解
実施例４で作製した酵素液５０μl、pH8.0のTris-HClバッファー９００μl、４０mMの下記表１に記載の各種のジペプチド若しくはトリペプチド溶液５０μlを混合し、８５℃で１時間反応させた。その後、反応混合液から１２０μlをとり、ニンヒドリン液９００μlを加えて８５℃で５分間加熱し、分解産物の検出のために、505nmの吸光度を測定した。
【００３３】
【表１】
0003994150.tif 000002
【００３４】
表１の結果から明らかなように、いずれのペプチドにおいても分解反応が観察されたが、アルギニン−フェニルアラニン（Ala-Phe）のジペプチドが最も良く反応した。Glu-Ala及びAsp-Alaも良く反応したが、これらは反応中の自己分解が見られ、酵素的分解のみの結果は得られなかった。
【００３５】
実施例８  エステルの分解
実施例４で作製した酵素液５０μl、pH７のリン酸バッファーに懸濁した１mMの各種のエステル９５０μlを混合し、８５℃で１時間反応させた。分解産物であるp-ニトロフェノールの検出のために、403nmの吸光度を測定した。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
表２の結果から明らかなように、いずれのエステルにおいても分解反応が観察されたが、ｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステル、及びｐ−ニトロフェニルラウリン酸エステルが最も良い基質であった。リパーゼ活性検出のためには、ｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステルが最も良い基質となり得ることが示された。
【００３８】
実施例９  PNAの分解
実施例４で作製した酵素液５０μl、pH8.0のTris-HClバッファー９００μl、４０mMの各種のペプチド溶液５０μlを混合し、８５℃で１時間反応させ、分解産物であるp-ニトロアニリドの検出のために、406nmの吸光度を測定した。
【００３９】
【表３】
0003994150.tif 000004
【００４０】
表３の結果から明らかなように、いずれのPNAにおいても分解反応が観察されたが、N-アセチル−フェニルアラニン−パラニトロアニリド及びN-アセチル−ロイシン−パラニトロアニリドが最も良い基質であった。
【００４１】
実施例１０  トリグリセリドの分解
トリブチリン１００μl、実施例４で作製した酵素液６００μlを８５℃で１６時間反応させた。反応液をクロマトグラフにかけると脂肪酸及びグリセリドのピークが検出された。そのため、本酵素にはリパーゼ活性もあることが解った。
【００４２】
実施例１１  至適温度の検討
酵素活性の至適温度の検討は、基質としてｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステルを用いた。該基質溶液（１ｍＭ、ｐＨ7.0）９５０μl及び実施例４で作製した酵素液５０μlを混合した計１ｍｌのサンプル７個を用意し、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、及び９０℃でそれぞれ５分間加熱した後、分解産物であるp-ニトロフェノールの検出のために、403nmの吸光度を検出した。結果を図１に示す。
図１の結果から明らかなように、本発明の酵素は４０〜６０℃の範囲で高い分解活性を示し、５０℃近辺に至適温度を有しているが、調べた３０〜９０℃の範囲のいずれにおいても分解活性を有していた。
【００４３】
実施例１２  至適ｐＨの検討
酵素活性における至適ｐＨの検討は、実施例１１と同様に基質としてｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステルを用いた。該基質溶液（１ｍＭ、ｐＨ7.0）９５０μl及び実施例４で作製した酵素液５０μlを混合した計１ｍｌのサンプル１２個を用意し、図２に示すｐＨにそれぞれ調製し、５０℃でそれぞれ５分間加熱した後、分解産物であるp-ニトロフェノールの検出のために、403nmの吸光度を検出した。結果を図２に示す。
図２の結果から明らかなように、本発明の酵素はｐＨ約６〜９の範囲において高い分解活性を示し、8.0近辺に至適ｐＨを有していた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、反応至適pHは８附近、至適温度は５０℃であるが、９０℃でも高活性である耐熱性ペプチダーゼ及びエステラーゼが提供される。さらに、酵素分子が安定であるという事から耐有機溶媒性の向上も期待できる。本発明の酵素により、高温下での、ペプチド及びエステルの加水分解また、その逆反応であるペプチド及びエステルの合成も可能になる。また、ラセミ体のペプチド及びエステルの光学分割も可能になり、従来不可能であった高温下におけるこれらの酵素的反応が可能となる。
【００４５】
【配列表】
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【００４６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：PCR用プライマー配列番号４：PCR用プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】反応における温度条件と本発明の酵素の分解活性との関係を示す。
【図２】反応におけるｐＨ条件と本発明の酵素の分解活性との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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