(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原ＣＡ５５．１を認識する相補的決定領域（ＣＤＲｓ）を持つ抗体またはその断片、ここでＣＤＲｓは下記の配列を持っている：
ａ）  重鎖
CDR1  G Y W I H（配列ＩＤ番号：２７）
CDR2  E V N P S T G R S D Y N E K F K N（配列ＩＤ番号：２８）
CDR3  E R A Y G Y D D A M D Y（配列ＩＤ番号：２９）
ｂ）  軽鎖
CDR1  K S S Q S L L N S R T R K N Y L A（配列ＩＤ番号：３０）
CDR2  W A S T R T S（配列ＩＤ番号：３１）
CDR3  K Q S Y T L R T（配列ＩＤ番号：３２）。
【請求項２】
下記の構造を持つ抗体またはその断片：
重鎖配列（配列ＩＤ番号：３３）
0003962087.tif 000058
0003962087.tif 000059
および；
軽鎖配列（配列ＩＤ番号：３４）：
0003962087.tif 000060
または次に挙げるその構築物のいずれか一つ：
Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ  ＆  Ｖ−ｍｉｎ。
【請求項３】
ヒト適応化された請求の範囲２項記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
請求の範囲２項で定義される抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲２項で定義される抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
ポリヌクレオチドで形質変換された宿主細胞またはその宿主細胞から発育されたトランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物であって、当該ポリヌクレオチドは請求の範囲２項で定義される抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードしている上記宿主細胞または上記動物または上記植物。
【請求項７】
ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１。
【請求項８】
請求の範囲７項で定義されるハイブリドーマ５５．１により生産される抗体。
【請求項９】
ＮＣＩＭＢ番号４０６３８として寄託されたＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ。
【請求項１０】
ａ）  抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換し、および随意に形質転換された宿主細胞をトランスジェニック非ヒト哺乳類またはトランスジェニック植物に発育させ；
ｂ）  宿主細胞、トランスジェニック非ヒト哺乳類またはトランスジェニック植物を少なくとも可変領域の発現が行われる、および随意に分泌される条件下におき、および随意に；
ｃ）  少なくとも部分的に当該可変領域を精製することを含む、請求の範囲１、２および３項のいずれか１項で定義される抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域を製造する方法。
【請求項１１】
同一細胞で重鎖および軽鎖両方の可変領域が発現されおよび組み立てられて抗体またはその断片が形成される請求の範囲１０項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）  抗体の発現が行われる条件下、ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１を培地中で培養し、および；
ｂ）  培養培地から抗体５５．１を得、および随意に；
ｃ）  酵素的消化により抗体５５．１のＦ（ａｂ’）２断片を製造することを含むモノクローナル抗体５５．１またはそのＦ（ａｂ’）２断片の製造法。
【請求項１３】
毒素および請求の範囲１、２および３項のいずれか１項で定義される抗体またはその断片を含む免疫毒素複合体。
【請求項１４】
毒素および請求の範囲１、２および３項のいずれか１項で定義される抗体またはその断片を含む免疫毒素複合体、および医薬として受容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求の範囲１、２および３項のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を、抗体−、またはその断片−抗原複合体の形成を許容する条件下で試料と接触させることを含む、当該抗体またはその断片−抗原複合体の存在の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は癌の診断および治療に有用な新規腫瘍付随抗原（５５．１）に関する。
背景技術
正常細胞の腫瘍細胞への形質転換は細胞表面の炭水化物の変化を伴っていることが確立されている。多くのそのような細胞表面炭水化物構造は抗原として働いており、腫瘍改変構造はいわゆる腫瘍付随抗原の型を示している（Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌｓ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＨａｋａｍｏｒｉおよびＭａｒｃｕｓ編、１９８８、Ａｒｔｈｕｒ  Ｒ．Ｌｉｓｓ出版）。そのような抗原は例えば、ハイブリドーマ技術を用いる単一特異的抗体を発生させることにより開発されるであろう。モノクローナル抗体の単離および生成のためのハイブリドーマ技術は現在十分に確立されており、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により最初に記載されたものである。
腫瘍付随抗原はヒト腫瘍疾患に関連して報告されており、例えばＣＥＡ（胎児性癌抗原、Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１２１，４３９，１９６５）、ＣＡ１９．９を運んでいるＧＩＣＡ（胃腸癌抗原）、およびＣＡ５０上のＣ２４２．２エピトープ（Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，４２，８７７−８８２，１９８８）が示されている（特に胃腸癌腫において）。すべてのこれらの抗原は腫瘍細胞表面に存在し、血液血清でもまた証明することができる。
癌の処置において腫瘍付随抗原を標的とするそのような抗体を使用する概念は１０年以上に渡って評価されてきた（Ｈｅｒｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，７１７）。腫瘍の種々の化学的および生物的物質を標的とするために抗体が使用でき、そのような複合体はインビトロおよびインビボの両方の診断における多くの方法の基礎形成に特に貢献した。癌の治療における免疫複合体の使用もまた有望である（Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，１７５；Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，１０９８）。この方法は診断的応用よりも技術的によりきびしく、そのような免疫治療法で標的とされる腫瘍付随抗原は高度に腫瘍特異的であり、生存しているヒト組織において有意なレベルで発現されていてはならない。特異的に腫瘍がある組織に分布する性質とともに、腫瘍細胞それ自身における抗原の代謝的運命もまた重要な性質である。モノクローナル抗体およびその誘導体の種々の複合体の有効性は細胞の膜表面からの腫瘍付随抗原のインターナリゼーションの速度に依存していることが見いだされている。特にある種の複合体、すなわち免疫毒素は医薬として有効であるためには腫瘍細胞の表面からの抗原分子の迅速で連続的なインターナリゼーションを必要としている。免疫毒素または薬剤複合体に関連する使用では速い速度のインターナリゼーションまたはエンドサイトーシスが望まれるが、抗体指向性酵素プロドラッグ治療または放射線治療のような他の使用においてはそれは必須の特性ではない。
癌の処置に有用であるには、腫瘍付随抗原は一般的に：１）腫瘍細胞の大多数の表面上に有意なレベルで発現され（一般的に細胞当たり＞１０，０００分子）および２）生存正常組織では低レベルまたは検出されない程度で発現されていなければならないと信じられている。
癌診断および治療において有用な別のおよび改良された腫瘍付随抗原が求められている。
発明の開示
本発明はＣＡ５５．１と称される（本明細書で定義されるような）腫瘍付随抗原の発見に基づいている。本抗原は既知の腫瘍特異的抗原よりもある種の癌の免疫治療または診断においてより優れた標的となるいくつかの性質を示している。それは結腸直腸腫瘍の大多数で発現され、正常結腸組織では非常に弱く発現されるかまたは存在しない。さらに、細胞結合性ＣＡ５５．１に抗体が結合された後、そのようして形成された複合体は腫瘍細胞内に速い速度でエンドサイトーシスされるかまたはインターナリゼーションを受ける。
本発明の一つの態様に従うと抗原ＣＡ５５．１を認識する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を持つ抗原結合構造が提供され、ここで抗原は：
ａ）約４８から５２ｋＤ、約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋＤの範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を持つ３つの主な化学種；
ｂ）ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２２２）の膜分画中の細胞下の所在；
ｃ）複雑なＮ−結合炭水化物構造を持っており；
およびここで抗原結合構造は下記の性質の少なくとも一つをもっている：
ｉ）抗原結合構造はＣＡ５５．１抗原へのモノクローナル抗体５５．１（ＥＣＡＣＣ番号９３８１９０１）の結合を競合的に阻害するかまたは；
ｉｉ）バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に示されるようなペプチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は１０ｐＭまたはそれ未満の効率的な結合で抗原結合構造へ結合する（抗原結合構造で被覆された固相とインキュベートした場合）または；
ｉｉｉ）抗原結合構造と前もってインキュベートした場合、バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に示されるようなペプチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は２００ｎＭまたはそれ未満の有効濃度でＣＯＬＯ  ２０５細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２２２）で被覆された固相への抗原結合構造の結合を競合的に阻害する。
精製されたＣＡ５５．１でのレクチン結合研究から、ＣＡ５５．１炭水化物はガラクトースへα（２−６）またはα（２−３）で結合されたシアル酸残基を持たない複合体型のＮ−結合オリゴサッカライドであることが示されている。ＣＡ５５．１認識の試験（抗体５５．１の結合の競合的阻害）は下記の実施例７に示されている。ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）存在下での結合の測定は実施例１４に示されている。膜分画中の細胞下所在とは、実施例７．１ａに記載したような方法により全細胞から得られる膜分画に抗原が存在していることを意味している。
Ｍａｂ５５．１のその抗原への結合の新規アンタゴニストの探索においては、ファージマイナーコート蛋白質ｐIIIのＮ−末端上にランダムペプチド配列を示すＭ１３バクテリオファージのライブラリーを発生させ、ポリスチレン上に固定したＭａｂ５５．１でスクリーニングを行った。そのようなスクリーニングの結果、ｐIIIのＮ−末端で配列ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（一文字アミノ酸コード；配列ＩＤ番号：２６）を示すファージがＭａｂ５５．１のＣＯＬＯ  ２０５細胞上のその抗原への結合を阻害することが観察された。
マンノースー結合蛋白質コンカナバリンＡ（ｃｏｎ  Ａ）（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏ  ｌ８９，ｐｐ．５３９８−５４０２，１９９２；またＯｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ８９，ｐｐ．５３９３−５３９７，１９９２）および抗炭水化物Ｍａｂ（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ  １２８，ｐｐ．４３−４９，１９９３）のためのペプチドリガンドを含む炭水化物結合蛋白質についてスクリーニングしたライブラリーを示すファージペプチドから選択されているペプチド模倣物の文献に例がすでに存在する。ｃｏｎ  Ａを研究している二つのグループの独立した結果は選択されたペプチド配列に強い共通性を示しており（反復モチーフＹＰＹを含む）；Ｍａｂについてのスクリーニングでは反復モチーフＰＷＬＹが選択された。両方の炭水化物結合蛋白質により選択された芳香族側鎖は糖の環に類似の立体化学的コンフィグレーションでお互いに重なっているという推測がなされている。対称的に、Ｍａｂ５５．１により選択された構造は上記のリガンドの疎水的および立体配座特性が欠如しており、名義上環式ペプチドライブラリーから選択され、一つの集団内部で発生された直線状ペプチドライブラリーに対してのＭａｂ５５．１スクリーニングではなにも選択されなかった（他の群では直線状ペプチドライブラリーから結合物が選択された）。蛋白質配列データベースでの配列ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣの検索では既知のペプチドとの相同性は示されず、従ってＭａｂ５５．１により結合された配列は新規である。
抗原結合構造は一般的には抗体（またはその断片またはｓｃＦｖのような修飾抗体構築物）であり、ＣＡ５５．１を認識および結合するであろう蛋白質配列として定義される。好適には、ＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−５Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−６Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−７Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−８Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−９Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−１０Ｍであり、および特にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−１１Ｍである。抗原結合構造の蛋白質配列は通常免疫グロブリンまたは免疫グロブリンスーパーファミリーの免疫グロブリン領域から誘導され、完全に天然の分子、その断片または抗原への結合を可能にする免疫グロブリン折り畳みの構造特性のみを保持するように遺伝子工学で作られた化学種であろう。抗原結合構造は抗体５５．１のＣＤＲｓに基づいているのが好適である。ＣＤＲｓすなわち相補性決定領域（complementarity determining regions）は抗原抗体相互作用の特異性を決定するのに決定的であると仮定されている抗体可変領域の高頻度可変ループ内の配列である（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）；しかしながら、ここで定義されるＣＤＲｓには結合に寄与する骨格残基が含まれている。抗体５５．１に対し、ＣＤＲｓは他のマウス抗体の高頻度可変配列との相同性により決定された。
重鎖ＣＤＲｓは：
0003962087.tif 000002
である。
軽鎖ＣＤＲｓは：
0003962087.tif 000003
である。
本発明の一つの態様に従うと、抗原ＣＡ５５．１を認識する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を持つ抗原結合構造が提供され、ここでＣＤＲｓは以下の配列を持っている：
ａ）重鎖
0003962087.tif 000004
ｂ）軽鎖
0003962087.tif 000005
またはそれらの保存的類似体。
本発明の一つの態様に従うと下記の（随意にヒト適応化された）構造を持つ抗原結合構造が提供される：
重鎖配列（配列ＩＤ番号：３３）
0003962087.tif 000006
0003962087.tif 000007
および；
軽鎖配列（配列ＩＤ番号：３４）：
0003962087.tif 000008
またはそれらの以下の構築物の一つ：
Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ  ＆Ｖ−ｍｉｎまたは；
それらの保存的類似物（conservative analogue）。
本発明の別の態様に従うと、抗体の可変領域の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列が提供され、それはストリンジェント条件下、抗体５５．１（ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１）の重鎖または軽鎖のＣＤＲ３をコードしているポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。
好適には、ポリヌクレオチドは抗体５５．１の重鎖または軽鎖の二つの（特別には三つの）ＣＤＲ３をコードしている。ハイブリッド形成試験は下記実施例１０に示されている。
本発明の一つの態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造の重鎖または軽鎖の可変領域を少なくともコードしているポリヌクレオチド配列が提供される。
本発明の別の態様に従うと、前に定義されたようなポリヌクレオチド配列によりコードされている配列を持つ抗原結合構造が提供される。
本発明の別の態様に従うと、抗体５５．１（ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１）またはその保存的類似物の少なくとも一つのＣＤＲ３を持つ抗原結合構造が提供される。好適には、抗原結合構造は抗体５５．１またはその保存的類似物の少なくとも三つのＣＤＲ３（より好適には４ＣＤＲｓ、より好適には５ＣＤＲｓ、特別には６ＣＤＲｓ）を持っている。
保存的類似物とは抗原結合構造の結合特性を保持しているが、配列は一つまたはそれ以上の保存的アミノ酸が置換されて異なっている蛋白質配列である。本明細書の目的のためには保存的アミノ酸置換とは偶然に起こる確率（Ｄａｙｈｏｆｆｅｔ  ａｌ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９７１，ページ９５−９６および図９−１０により記載されているコンピューター法により定義されるような）より現実に起こる確率が１０倍よりも大きい置換である。
本発明の別の態様に従うと、前に記載されたような抗原結合構造を持つ抗体が提供される。
本発明の別の態様に従うと、ヒト適応化されていると特徴付けられる前記の抗体または抗体断片が提供される。
ヒト適応化された抗体、関連する断片または抗体結合構造とは抗原結合部位（相補性決定領域すなわちＣＤＲｓ）内および周辺は非ヒト由来アミノ酸配列を維持しているがヒト由来免疫グロブリン配列の構造枠で大部分は形成されているポリペプチドである。適当な方法論は例えばＷＯ  ９１／０９９６７、ＥＰ  ０３２８４０４およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ８６，１００２９，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ  １０，１（１９９２）に詳細に記載されており、ヒト適応化の別の方法では表面残基の抗体張りつけのような企図が行われている（ＥＰ  ５１９５９６，Ｍｅｒｃｋ／ＮＩＨ，Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ）。抗体５５．１のキメラヒト適応化抗体断片の調製は本明細書の実施例３に記載されている。
本発明の別の態様に従うと、ポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞または前に定義したような抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域をコードしたポリヌクレオチド配列を持つ宿主細胞から発育したトランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物が提供される。
本発明の別の態様に従うと、ＥＣＡＣＣ寄託物番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１およびその変異細胞株が提供される。
ハイブリドーマ５５．１はブタペスト条約に従って１９９３年８月１９日に寄託参照番号９３０８１９０１としてユーロピアン  コレクション  オブ  アニマル  セル  カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳ  センター  フォー  アプライド  マイクロバイオロジー  ＆  リサーチ、ポルトン  ダウン、サリスベリー、ウィルトシェア、ＳＰ４  ０ＪＧ、連合王国、に寄託された。
本発明の別の態様に従うと、ＮＣＩＭＢ番号４０６３８として寄託されたＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージおよびその変異株が提供される。
ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージはブタペスト条約に従って１９９４年５月１０日に寄託参照番号ＮＣＩＭＢ４０６３８としてザ  ナショナル  コレクションズ  オブ  インダストリアル  アンド  マリン  バクテリア、２３  Ｓｔ  メイチャー  ドライブ、アバディーン  ＡＢ２  １ＲＹ、スコットランド、連合王国、に寄託された。
本発明の別の態様に従うと：
ａ）  抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域をコードしたポリヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換し、随意に形質転換された細胞をトランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物へと発育させ；
ｂ）  宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物を少なくとも可変領域の発現、および随意に分泌を行う条件に置き、および随意に；
ｃ）  可変領域を少なくとも部分的に精製することからなる前に定義したような抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域を作製する方法が提供される。
本発明の別の態様に従うと：
ａ）  ＥＣＡＣＣ寄託物番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１をそれらからの抗体の発現が行われる条件下で培地で培養し、および；
ｂ）  培養培地から抗体５５．１を得、および随意に；
ｃ）  酵素的消化により抗体５５．１のＦ（ａｂ’）２断片を調製することからなるモノクローナル抗体５５．１の製造方法が提供される。
本発明の別の態様に従うと、エフェクター部分（好適には毒素、しかし酵素または放射活性リガンドでも）および前記のような抗原結合構造または抗体を含む複合体が提供される。
本発明の複合体は必ずしも一つのエフェクター分子および一つの抗体分子から成り立っているのではないことが理解されるであろう。例えば、複合体は抗体分子当たり一つ以上のエフェクター分子を含んでいてもよい。
エフェクター分子が毒素である場合、この毒素部分は一般的に細胞毒性を持つ成分を含んでおり、そのためインターナリゼーション後に細胞を殺すことができる。
毒素部分および抗原結合構造はお互いに直接的に結合されていてもよいし、また間接的に結合されていてもよい。毒素部分および抗原結合構造は一般的に複合体の形が抗原結合構造のその標的細胞への結合を可能にするように結合される。都合がよいのは、毒素部分および抗原結合構造は複合体が標的細胞の外側では結合されているがしかしインターナリゼーション後に毒素部分が放出されるように、毒素部分および抗原結合構造が複合体が細胞外では安定であり、および細胞内では不安定なように結合される。従って、都合がよいのは複合体が細胞内切断可能／細胞外安定部位を持っていることである。
毒素部分が直接的に標的細胞結合部分に結合された複合体の例には、毒素部分のチオール基および抗原結合構造のチオール基間で形成されるジスルフィド架橋により毒素部分および抗原結合構造が結合されているものが含まれる。免疫毒素および他の複合体の製造および性質の詳細は欧州特許出願ＥＰ  ５２８  ５２７（公開番号）に与えられており、その内容はここに引例として含まれている。
本発明の別の態様に従うと、前記のような免疫毒素を含む医薬組成物が提供される。
用量および投与計画は、用いられた特定の毒素部分、標的細胞の集団、および患者の病歴に依存するであろうことを理解されたい。投与される複合体の用量は典型的には患者の体重ｋｇ当たり０．１から１ｍｇの範囲であろう。
本発明の複合体は普通医薬組成物の形で投与されるであろう。従って、本発明に従うと医薬として受容可能な希釈剤または担体を伴った複合体（前に定義したような）を含む医薬組成物も提供される。そのような処方の例は実施例９に与えられている。
本発明の医薬組成物は種々の剤形に処方されるであろう。一般的には、本発明の複合体は非経口で、好適には静脈内に投与されるであろう。特別の非経口医薬組成物は注射による投与に適した単一剤形に処方されるものである。従って、特に適した組成物には、医薬として受容可能な非経口担体または希釈剤を伴った免疫毒素の溶液、乳剤または懸濁剤が含まれる。適した担体または希釈剤には水性媒体（例えば水または塩溶液）および非水性媒体（例えば不揮発性油またはリポソーム）が含まれる。組成物は組成物中での複合体の安定性を促進する薬剤を含んでいてもよい。例えば、組成物は緩衝液（例えばトウィーン）を含んでいてもよい。複合体の濃度はいろいろであろうが、一般的には約１から１０ｍｇ／用量の濃度で処方されるであろう。
抗体５５．１は膵臓および結腸直腸腫瘍細胞に選択的であり、この抗体を含む複合体は強力な免疫毒素で結腸直腸腫瘍細胞に選択的であることが観察された。
本発明の別の態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造をコードしている発現ベクターが提供される。
本発明の別の態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域をコードしている発現ベクターが提供される。
哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、骨髄腫）は特定された結合活性を持つ蛋白質を生産するため、抗体ＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡおよびその断片の共発現のための宿主として使用されてきた（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ２，ｐ１３６−１４５、およびＡｄａｉｒ，Ｊ．，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ  １３０）。ｃＤＮＡはプラスミドに導入でき、染色体ＤＮＡ内へ組み込むことを可能にする。プラスミドはトランスフェクトされた宿主での維持のための選択可能マーカー、ｃＤＮＡからの転写を高レベルにするための有効な真核生物プロモーター、クローニングおよびポリアデニル化のための便利のよい制限酵素部位およびメッセージ安定化のための転写停止信号を必要とする。そのようなベクターのいくつかは文献に記載されており（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １０，ｐ１６９−１７５、およびＷｒｉｇｈｔ，Ａ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ  ２，ｐ１２５−１３５）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，図８参照）のようにそれらは市販品として入手可能であり、必要な基準を満たしている。
大腸菌においての抗体断片範囲の発現はよく知られている（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９２，ｖｏｌ  １３０，ｐ１５１−１８８、およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，ｖｏｌ  ５，ｐ２５６−２６２に総説がある）。ＦｄおよびＬ鎖の細胞内発現について記載されているが（Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓ．，１９８９，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ  ８５，ｐ５５３−５５７）、結合活性を生じるにはインビトロでの鎖の再折り畳みおよび再会合が必要とされる（Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  ９，ｐ１５７−１６２）。活性な抗体断片を得るより効率的な方法はペリプラズム分泌によるものである（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２４０，ｐ１０４１−１０４３）。抗体断片のＨおよびＬ鎖成分は単一プラスミドから共発現される。各々の抗体鎖は大腸菌ペリプラズムへ方向付ける細菌リーダーペプチドとともに提供され、ペリプラズムにおいてリーダーが切断され、遊離鎖が会合して可溶性で活性な抗体断片が生じる。この方法は発現された抗体が全抗体に会合する前にＥＲの内腔内へ渡される真核生物の天然の過程を模倣していると信じられている。この方法ではしばしば培養上清に結合活性が存在する。
本発明の別の態様に従うと、前記のようなベクターで形質転換された宿主細胞が提供され、それはその中における発現を両立できる。
本発明の別の態様に従うと、前に定義したようなポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞が提供される。
本発明の別の態様に従うと：
ａ）  少なくとも可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換し；
ｂ）  少なくとも可変領域の発現、および随意に分泌を行うような条件に宿主細胞をおき、および随意に；
ｃ）  可変領域を少なくとも部分精製することからなる前に定義したような抗原結合構造の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域を作製する方法が提供される。好適には、重鎖および軽鎖の両方が同一の宿主細胞で発現され、組み立てられて抗原結合構造を形成する。
いくつかの発現系はベクターによる宿主細胞の形質転換を含んでいる；そのような系は例えば大腸菌、酵母および哺乳類宿主においてよく知られている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０参照）。例えば、問題とする遺伝子（好適にはベクターから切り出され、好適には哺乳器官のプロモーターと共同して発現された蛋白質を動物のミルク内へ分泌させるようにする）が哺乳類接合体の前核内へ導入され（通常、前核の二つの核の一つ（通常雄核）の中へマイクロインジェクションにより）、その後養母内へ移植されるような発現の他の系も企図される。養母により生み出される動物の集団は染色体内へ組み込まれた導入遺伝子を運び、および発現するであろう。普通、組み込まれた遺伝子は通常の繁殖により子へ渡されるのでストックの即座の拡大が可能である。好適には、問題とする蛋白質は雌トランスジェニック動物のミルクから簡単に採取される。以下の文献を参照されたい：Ｓｉｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９−１８３；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８３０−８３４；ＵＳ  ４，８７３，１９１および；ＵＳ  ５，３２２，７７５。マウス胚の操作はＨｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８６、に記載されている。
例えば以下の文献に記載されているようなトランスジェニック植物技術もまた企図される：Ｓｗａｉｎ  Ｗ．Ｆ．（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ  ９：１０７−１０９；Ｍａ  Ｊ．Ｋ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４：１３１−１３８；Ｈｉａｔｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０７：７１−７５；Ｈｅｉｎ  Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ７：４５５−４６１；Ｄｕｅｒｉｎｇ  Ｋ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２８１−２９４。
望むなら、宿主遺伝子は以下に概説されているような、および例えば”Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３、に記載されているような標準的方法を用いて不活性化または修飾できる。標的遺伝子またはその一部は好適には遺伝子内に挿入された選択マーカー（Ｎｅｏのような）を持つベクター内へクローン化され、その機能が破壊される。ベクターは直線状にされ続いて胎児性幹（ＥＳ）細胞（例えばマウスの１２９／０１ａ系統から誘導されたもの）内へ形質転換され、以後相同性組換えが幹細胞の集団で起こる。遺伝子破壊を含む幹細胞を増殖させ、胚盤胞（例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから）内へ注入し、発育のために養母内へ移植する。キメラの子孫は被覆色マーカーにより同定できる。ＥＳ由来および宿主胚盤胞由来配偶子間の区別を可能にする遺伝子マーカーを持つマウスと交配させ、生殖系統へのＥＳ細胞の寄与を確かめるためキメラを繁殖させる。ＥＳ細胞由来配偶子の半分は遺伝子修飾を運んでいるであろう。遺伝子破壊を持つものを同定するために子孫をスクリーニング（例えばサザンブロッティングにより）した（子孫の約５０％）。これらの選択された子孫はヘテロ接合性であろうし、従って別のヘテロ接合体およびその後に選択されるホモ接合性の子孫（子孫の約２５％）と繁殖できる。ノックアウト遺伝子を持つ動物は、前核内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８）またはＥＳ細胞の脂質媒介トランスフェクション（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５  ２２−２９）のような既知の技術により産生されるトランスジェニック動物と交雑できて外因性ノックアウト遺伝子および外来性遺伝子置換を持つトランスジェニック動物が得られる。
標的化された遺伝子破壊を含むＥＳ細胞は特異的変換を含む標的遺伝子配列（好適には形質転換に先立ってベクター内へクローン化され直線状にされる）での形質転換によりさらに修飾できる。相同的組換えに続いて改造された遺伝子はゲノム内へ導入される。これらの胎児性幹細胞は次に前記のようにトランスジェニック動物の創造に使用される。
術語”宿主細胞”には例えば細菌、酵母、植物細胞および非ヒト哺乳類接合体、卵母細胞、胚盤胞、胎児性幹細胞およびトランスジェニック技術に適したその他の細胞のような発現技術に適した原核または真核細胞が含まれる。文脈によっては術語”宿主細胞”にはまた形質転換された非ヒト哺乳類接合体から発育されたトランスジェニック植物または哺乳動物、卵母細胞、胚盤胞、胎児性幹細胞およびトランスジェニック技術に適したその他の細胞も含まれる場合もある。
本発明の別の態様に従うと、
ａ）  ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１を培養し、および；
ｂ）  培養培地から抗体５５．１を得、および随意に；
ｃ）  酵素的消化により抗体５５．１のＦ（ａｂ’）２断片を調製することからなるモノクローナル抗体５５．１の製造方法が提供される。
本発明の別の態様に従うと、前記のような免疫複合体（immunoconjugate）の医薬として有効量をヒトまたは動物への投与することからなる処置を必要とするヒトまたは動物のそのような処置法が提供される。
本発明の別の態様に従うと、前記のような毒素および抗原結合構造を含む免疫毒素複合体（immunotoxin conjugate）の医薬として有効量を投与することからなる、抗原５５．１を示す細胞への毒素の標的化を必要とする哺乳類においてのそのような標的化の方法が提供される。ここに記載したように、複合体は胃腸腫瘍細胞を殺すことができる。従って、複合体（または”免疫毒素”）は毒素部分がその細胞毒性を発揮するように腫瘍細胞に毒素部分を送達できる。それ故、一般的に複合体は腫瘍細胞に結合することができ（腫瘍細胞への標的細胞結合部分を通して）、細胞内へ毒素部分を通過させることが可能である（すなわち、毒素部分を”インターナライズ（internalise）”することが可能である）。特に、有効な複合体は一般的に以下の特性を持っている：
１．  抗原結合構造は腫瘍細胞表面抗原と結合できなければならない。
２．  細胞表面抗原は腫瘍細胞上で高いコピー数で存在しなければならない、例えば少なくとも細胞当たり１万。
３．  抗原は正常細胞上で高いコピー数で発現されてはならない。
４．  抗体：抗原複合体は毒素部分がその活性を細胞内で発揮するように有効にインターナライズされねばならない。
５．  複合体は、腫瘍細胞へ毒素部分を送達するため十分長く血液中で無傷のまま残存する十分な安定性を持ち、ならびに一度毒素部分が細胞内部に入ると毒素部分を放出できるように十分切断可能であるように構築されなければならない。
一般に、そのための用量範囲は複合体の確立された毒性用量（例えば、最大耐性用量）に比例して決定される。共通して、この方法はヒトにも使用される。典型的には、用量範囲は５０−５０００μｇ／ｋｇであろう。
本発明の別の態様に従うと、診断的方法における前記のような抗体の使用が提供される。
一つの診断的方法は免疫アッセイである。本発明に従った新規抗体に基づくインビトロ試験のための免疫アッセイは、本発明の抗体を標識または非標識形で利用し、抗体と試験されるべき試料中の特定の抗原種との複合体形成を決定する本分野の通常の免疫学的技術に従って設計されるであろう。一つのケースにおいては、抗体が放射性標識、化学発光標識、蛍光標識または酵素標識のような検出可能な標識で標識されているであろう。もしくは、抗体は標識物質との複合体形成またはバイオセンサー法（例えば表面プラスモン（plasmon）共鳴に基づいて）のような非標識技術により検出される。試料は、例えば血清のような体液または組織試料（組織化学的アッセイ）の形であろう。
インビボでの診断のためには、本発明による抗体は、例えば放射性標識または重金属原子のように外部から検出可能な標識とともに提供されて患者に投与され、それにより体内における抗体の局在した蓄積が決定される。
癌のインビトロ診断のためには、測定可能な信号を発生させることができる西洋ワサビペルオキシダーゼおよび細菌ルシフェラーゼのような酵素、または直接的に検出および定量できる蛍光マーカーまたは放射性同位元素と抗原結合構造が結合できる。標準免疫アッセイ系において、そのような複合体は体の組織中のＣＡ５５．１の存在または不在を測定できる手段を提供し、結果として腫瘍疾患のための迅速で便利な試験が提供される。方法論の一般的記述は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓおよびＵＳ３６９０  ８３３４、ＵＳ３７９１  ９３２、ＵＳ３９１７  ８３７、ＵＳ３８５０  ５７８、ＵＳ３８５３  ９８７、ＵＳ３８６７  ５１７、ＵＳ３９０１  ６５４、ＵＳ３９３５  ０７４、ＵＳ３９８４  ５３３、ＵＳ３９９６  ３４５およびＵＳ４０９８  ８７６に含まれている。
癌のインビボ診断のためには、全身イメージングカメラにより検出できるイットリウム、テクネシウムまたはインジウムまたは重金属同位元素のような元素と抗原結合構造は結合できる（Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．（１９８７）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１６５，２９７−３０４参照）。
癌治療のためには、抗原結合構造はさらに修飾しなくても使用できるが、好適な実施態様ではＣＡ５５．１抗原を運ぶ癌細胞またはこれらの癌細胞のすぐ近傍の細胞を殺すことができる毒性薬剤と結合できる抗原結合構造が含まれている。好適な実施態様において、抗原結合構造はリシン、ジフェテリア毒素、スタフィロコッカス腸毒素、シュードモナス外毒素、アブリンまたは他のリボソーム不活性化蛋白質のような蛋白質毒素に結合されている。これらの蛋白質は抗原結合構造に化学架橋剤を用いて化学的に、または抗原結合構造のすべてまたは一部および蛋白質毒素のすべてまたは一部の単一直線状アミノ酸を含む融合蛋白質の構築により遺伝子的に結合されているであろう。ＣＡ５５．１は迅速にインターナライズされるので、蛋白質毒素は選択的に腫瘍細胞に入り込んで細胞の死をもたらす。
腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、抗原結合構造を直接的にまたは化学的誘導化により９０Ｙ、１３１Ｉおよび１１１Ｉｎのような高エネルギー放射性同位元素を含む大環式キレート剤と結合させることによっても達成できる。抗原結合構造は同位元素の腫瘍への局在化に働き、同位元素から放射される放射線はまわりの細胞のＤＮＡを破壊し、腫瘍を殺す。
腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、抗原結合構造をメトキシレート、クロラムブシル、アドリアマイシン、ダウノルブシンおよびビンクリスチンのような細胞毒性で細胞増殖抑制性薬剤と結合させることによっても達成できる。これらの薬剤は臨床で多年に渡って使用されてきたが、それらが提供される治療は非特異的毒性のためしばしば制限を受けている。これらの薬剤のＣＡ５５．１抗原結合構造への結合はこれらの薬剤を腫瘍部位に局在化させることを可能にし、骨髄または神経系のような他の組織においてのそのような薬剤の作用による受容できない副作用なしで腫瘍へ送達できる薬剤の量を増加させる。
腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、非毒性量のプロドラッグを強力な毒性薬剤化合物への変換を触媒できる酵素と抗原結合構造を結合させることによっても達成される。複合体の投与により腫瘍部位での酵素活性の局在化が高められる。続いてプロドラッグを投与すると毒性薬剤の局所的生成が起こり、腫瘍部位での選択的細胞死が起こる。この方法はＷＯ８０／０７３７８、ＵＳ４，９７５，２７８およびＷＯ８９／１０１４０に記載されている。
ＣＡ５５．１の使用の別の応用は、別の抗体（ＣＡ５５．１特異的抗体のイディオタイプ）を単離するために使用できる抗原結合構造の単離である。これらの抗体はＣＡ５５．１を運ぶ腫瘍への天然の免疫応答を誘発または押し上げる腫瘍ワクチンとして使用できる。この方法の例はＮｅｐｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．（１９８４）８１，２８６４により与えられている。
ＣＡ５５．１抗原結合構造を製造する技術は実施例１および実施例２記載されており、第一に抗原ＣＡ５５．１を運ぶ腫瘍細胞に対する数千のモノクローナル抗体が産生され、次にＣＡ５５．１と特異的に反応する特定の抗体でスクリーニングされる（実施例６）。この技術では一般的に、ＣＡ５５．１抗原またはＣＯＬＯ  ２０５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２２２，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．（１９７８）３８，１３４５５）のようなＣＡ５５．１発現細胞の細胞または膜試料で免疫されたげっし類の脾臓細胞とＳｐ／２（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８１）７３Ｂ，３）のようなげっし類骨髄腫細胞株との融合を用いて実施される。この融合の生成物はマウスＩｇＧ１５５．１抗体のようなげっし類モノクローナル抗体を発現するであろうげっし類ハイブリドーマ細胞株である。上記の使用において、特定の応用に対しては最も都合のよい抗原結合構造は必ずしもハイブリドーマ融合技術により産生されるそのままのげっし類モノクローナル抗体ではなく、ＣＡ５５．１に対する本来の結合特異性を保持する一方さらに修飾された分子が最良である。
特に、抗原結合構造単独でまたは複合体としてヒトにげっし類抗体のインビボ投与を繰り返すと患者にげっし類抗体に対する免疫応答がもたらされる；ＨＡＭＡ応答。繰り返し投与が必要であるならば、ＨＡＭＡ応答は医薬組成物の有効性を制限する。抗原結合構造の免疫原性はポリエチレングリコールのような親水性ポリマーによる抗原結合構造の化学的修飾により、または遺伝子工学の方法を用いて抗原結合構造をよりヒトに似せることにより減少するであろう。例えば、ＣＡ５５．１を結合するげっし類抗体の可変領域の遺伝子配列をヒト骨髄腫蛋白質の可変領域に置換することにより、組換え体キメラ抗体が産生される。これらの方法はＥＰ１９４２７６、ＥＰ０１２０６９４、ＥＰ０１２５０２３、ＥＰ０１７１４９６、ＥＰ０１７３４９４およびＷＯ８６／０１５３３に詳述されている。もしくは、ＣＡ５５．１結合げっし類抗体の相補性決定領域またはＣＤＲｓの遺伝子配列を単離または合成し、相同的ヒト抗体遺伝子の対応する配列領域で置換して本来のげっし類抗体の特異性を持つヒト抗体を生成させる。この方法はＥＰ０２３９４０、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９１／０９９６７に記載されている。もしくは、げっし類抗体の可変領域の多数の表面残基を相同的ヒト抗体で通常観察されるその残基に変化でき、残基の表面’化粧張り’を持ったげっし類抗体が生成され、それはヒトの体により自分自身だと認識されるであろう。この方法はＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９、により示されている。
多くの応用において、抗体結合構造の大きさを減少させて医薬組成物の組織浸透性およびその他の薬力学的性質を改良すると抗体結合の有効性が高められている。このことは抗体分子のＦｃ領域を酵素的に除去するか（実施例４）または遺伝子工学的方法により組換え体Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片を産生することにより（実施例３．３）達成できる。
遺伝子工学的方法は抗原結合構造の大きさをさらに減少させるために使用することができる。ＣＤＲｓを含むＦｖは遺伝子操作できて孤立して発現され、例えばジスルフィド架橋を用いて化学的に架橋された。もしくは、一つのドメインの天然のＣ−末端からのリンカーペプチド配列を持つＦｖドメインと他のドメインのＮ−末端と融合させてＦｖ構造を作り上げる軽鎖および重鎖両方のドメインが単一ポリペプチド鎖（ＳＣＦｖ）として作製される（実施例３．３およびＰＣＴ／ＵＳ／８７／０２２０８およびＵＳ４７０４６９２参照）。もしくは、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４により記載されているように単一Ｆｖドメインは単一ドメイン抗体またはｄＡｂを形成して孤立して発現されるであろう。抗原結合構造の別の型は国際特許出願ＷＯ９４／１２６２５（発明者Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｔｉｍｍｓ）に開示されているＶ−ｍｉｎ構築物である。
本発明は以下の非制限的な実施例により例示され、そこで：
図１は血清含有培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩｇＧ濃度を示しており；
図２は無蛋白培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩｇＧ濃度を示しており；
図３はｐＩＣＩ１６４６のプラスミド地図を示しており；
図４はＣＡ５５．１のエンドサイトーシスを示しており；
図５は５５．１抗体−リシン複合体のインビボ抗腫瘍効果を示しており；
図６はＰＮＧアーゼ処理ＣＯＬＯ  ２０５細胞のウェスタンブロットの像を示しており；
図７Ａおよび７ＢはレクチンＤＳＡおよびＧＮＡによるウェスタンブロットの像を示しており；
図８はプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶの地図を示しており；
図９はＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）2発現を示すウェスタンブロットを示しており；
図１０はＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）2結合のＥＬＩＳＡデータを示しており；
図１１はｓｃＦｖ発現を示すウェスタンブロットを示しており；
図１２はｓｃＦｖ結合のＥＬＩＳＡデータを示しており；
図１３は５５．１抗体へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの直接結合の特異性を示しており；
図１４は競合アッセイにおけるＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの結合の特異性を示しており；
図１５および１６は抗体５５．１の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ配列を示している。成熟抗体鎖に存在する分泌リーダーペプチド配列の存在に注目されたい。リーダー配列は３文字アミノ酸コードでおよび成熟配列は１文字コードで示されている。
図１７は５５．１抗原の対する抗体発生のフローチャートを示している。
図１８は抗体検出に使用されたｃ−ｍｙｃ  ｔａｇの二本鎖ＤＮＡ配列を示している。
表１は血清含有培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩｇＧ濃度を示しており；
表２は無蛋白培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩｇＧ濃度を示しており；
表３は結腸直腸腫瘍との５５．１抗体反応性を示しており、および；
表４は５５．１抗体による正常組織染色の比率を示している。
略語：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）である。
0003962087.tif 000009
0003962087.tif 000010
0003962087.tif 000011
0003962087.tif 000012
実施例１ ５５．１抗体およびＣＡ５５．１と交差反応する抗体の製造
１９７６年のその発端からモノクローナル抗体の生成は癌細胞選択的抗原の研究に応用されてきた。完全に精製された抗原に対する抗体の生成と異なり、この方法ではより不純な抗原がマウスに免疫され、次に必要とされる特異性を持つ抗体が同定されるように段階的スクリーニングが適用される。この方法により同定された抗体は続いて当業者にはよく知られた方法により癌選択的抗原の同定に使用されるであろう。
抗原が同定されたら、類似の特異性を持つさらなる抗体を前記抗原の濃縮試料（実施例１１に記載した方法により調製されたような）で動物を免疫することにより発生させ、これらの動物の脾臓細胞を以下に記載するような適した骨髄腫細胞株と融合させ、得られたハイブリドーマは実施例６および７に記載した方法によりモノクローナル抗体５５．１と交差反応するモノクローナル抗体の産生でスクリーニングする。
１．１  ハイブリドーマ細胞株の確立および１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．００３の産生；確立された脾臓細胞の調製
ヒト結腸直腸癌腫細胞株［ＣＯＬＯ２０５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ，ＵＳＡから寄託番号第ＣＣＬ  ２２２として商業的に入手可能］を無血清培地で培養した。細胞が約７ｘ１０ｅ５の密度に達したときに採取し、免疫化のためＩｓｃｏｖｅｓ基本培地（蛋白質を含んでいない）で３回洗浄した。
８から１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．１ｍｌのリン酸緩衝化塩溶液に懸濁したＣＯＬＯ  ２０５細胞からの膜１００μｇおよび０．１ｍｌのフロイント完全アジュバントの初期用量で腹腔内へ免疫した。２週間後および４週間後に再度リン酸緩衝化塩溶液に懸濁したＣＯＬＯ  ２０５細胞からの膜１００μｇおよびフロイント不完全アジュバントで動物を追加免疫した。第二の追加免疫をして６週間後、マウスに１００μｇのＣＯＬＯ  ２０５膜をリン酸緩衝化塩溶液のみに懸濁して腹腔内へ最後の免疫化を行い、４日後に動物を殺して脾臓を除去した。脾臓はダルベッコ改良イーグル培地を脾臓袋に注入することにより単一細胞懸濁液まで解離させた。
１．２  ハイブリドーマの調製
上記の細胞懸濁液からの１．９５ｘ１０ｅ８の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから寄託番号第８５１１０５３号で入手可能）からの２．１３６ｘ１０ｅ７の骨髄腫細胞と混合した。チューブを遠心分離し、傾けてすべての液体を捨てた。続いてチューブに３７℃で撹拌しながら１ｍｌのＰＥＧ溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＰＥＧ１５００）を徐々に加え（一定に撹拌しながら１分以上かけて）、その後さらに１分間撹拌した。以下のスキームに従ってダルベッコ改良イーグル培地を加えることにより融合を停止させた：最初の２分間に２ｍｌ、続いての４分間に８ｍｌおよび２分以上かけてさらに１０ｍｌ。チューブは次に遠心分離し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ３０ｍｌに再懸濁した。５０μｌづつ６枚の９６ーウエル組織培養皿に分配した。２４時間後、ウェル当たり５０μｌの１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ、および２倍の強度のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補給物が加えられた。各々のウェルには７日後に２０００μｌの１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ、および１倍の強度のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補給物が加えられた。
１．３  抗体ハイブリドーマのスクリーニング
上記１３日目の疲弊培地をＣＯＬＯ  ２０５陽性／正常結腸陰性抗体について試験した。簡単に記すと、Ｎｕｎｃ  イムノプレート  マキシソープの二組のウェルをＣＯＬＯ  ２０５細胞（１０ｅ５細胞／ウェル；被覆容量１００μｌ）または正常結腸由来の膜（１０μｇ／ｍｌ、ウェル当たり１００μｌ）で被覆した。プレートを遠心分離し、１００μｌの０．２％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを加え室温で２０分インキュベートした。次にプレートをＰＢＳトゥイーンで洗浄し、０．１％ブタゼラチン含有ＰＢＳで遮断した（ウェル当たり２００μｌ）。上記１３日目の疲弊培地を両方の組のプレートの被覆ウェルへ加えた、５０μｌ／ウェル。室温で２時間インキュベーション後、０．１％トウィーン２０−ＰＢＳで希釈した（１／２０００）したペルオキシダーゼ複合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ラット血清蛋白質に吸着されたヤギ抗マウスＩｇＧ全分子、Ａ８９２４）をウェル当たり１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。１５μｌの３０％過酸化水素を加えた１００ｍｌのクエン酸／リン酸緩衝液、ｐＨ４．５に溶解した９０μｇＯＰＤの形の基質をウェル当たり１００μｌ加え、室温で１５分インキュベートした。５０μｌのクエン酸（０．５Ｍ）を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
特定の標的へ結合する能力でハイブリドーマの生成物をスクリーニングする場合、第一にはハイブリドーマの必要とされる所望の特性を反映し、および第二にはこれらの特性を持っているかもしれないハイブリドーマ生成物を排除しない（反応しない）第二の標識された抗種抗体の使用が便利である。特に５５．１発見の場合においては、さらなる研究によりＩｇＭモノクローナル抗体を排除するように努めた。なぜならこれらの分子は初期ヒト応答を起こし、一般的に低親和性であり特異性が低いからである。このことを達成するため、多くの市販で入手可能な抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ複合体のマウスＩｇＧとの反応能力をスクリーニングし、この特性を示す試料は廃棄した。しかしながら、ＩｇＧモノクローナル抗体のどんなサブクラスをも排除することを望んだわけではない。従って、次の工程は残った市販の複合体のマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３と反応する能力を決定することであった。マウスＩｇＭと反応せず、マウスＩｇＧのすべてのサブクラスと等しく反応するものは市販で入手可能な試料では見いだせなかった。このことを克服するため、特異的抗サブクラス複合体を加えることにより最高の抗マウスＩｇＧ試薬の能力を高めた。最終的な調製試料は四つのマウスＩｇＧのサブクラスを等しく認識した。
大体６００のハイブリドーマクローンが試験された。最初、これらの１６５がＣＯＬＯ  ２０５細胞と反応した。これらの内、４３が正常ヒト結腸膜とも反応することが示されたので廃棄された。残りのハイブリドーマの一つから確立されたクローンは１２０／４６６と名付けられＩｇＧ１クラスのイソタイプに分類された。１２０／４６６ハイブリドーマは次に多くのサブクローニング工程により結局、１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３．００３と名付けられた（５５．１として知られるようになる）クローンを生じる最終的で安定なモノクローナル抗体が生み出された。
即ち、１２０／４６６ハイブリドーマは最初クローン化されて１２０／４６６．０３４と呼ばれたクローンが生じた。このクローンは順にクローン化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７を形成し；このクローンは順にクローン化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７．０２３を形成し；このクローンは順にクローン化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３を形成し；このクローンは順にクローン化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３．００３を形成した。これらのクローニングのすべてにおいて、ハイブリドーマ懸濁液はヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）を補給した培養培地で２．５細胞／ｍｌの密度に希釈した。２００μｌ（１細胞）を９６ウェル培養皿の各々のウェルに加えた。５−７日後、単一細胞クローンが顕微鏡による視覚的検分により検出された。１７日目に培地を交換し、疲労培地の一部で上記のようなＥＬＩＳＡによりＣＯＬＯ  ２０５細胞とは結合するが正常膜とは結合しない抗体の量を分析した。ＣＯＬＯ  ２０５ＥＬＩＳＡで陽性の反応を示しながら正常細胞ＥＬＩＳＡでは陰性の反応を保持しているということに関して最良のクローンが選択され、さらなる開発までバイアルに入れて液体窒素で凍結された。
１２０／４６６．０３４．０１７のクローニングの試験は６６％の細胞がＣＯＬＯ  ２０５細胞と反応する抗体を生産した。１２０／４６６．０３４．０１７．０２３のクローニングの試験は１００％の細胞がＣＯＬＯ  ２０５細胞と反応する抗体を生産した。１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３のクローニングの試験は１００％の細胞がＣＯＬＯ  ２０５細胞と反応する抗体を生産した。クローニングに続いて、ＣＯＬＯ  ２０５細胞と反応し、正常ヒト結腸膜とは反応しないハイブリドーマが、５５．１を同定するために以下のような評価が行われた。
ハイブリドーマにより分泌された抗体（１０7の細胞を７５ｃｍ2のフラスコで約７日間増殖させた疲労培地）は原発性結腸腫瘍を持つ４人の異なった患者から得られた４つの結腸腫瘍からの組織切片の免疫組織学的検討により（実施例６に記載したような）評価された。これらの腫瘍の少なくとも二つと強く結合する（＋＋実施例６参照）抗体が１０人の異なった患者からの結腸直腸腫瘍切片のより大きな一団での反応性が免疫組織学により評価された。これらの腫瘍の少なくとも五つと強く（＋＋）結合する抗体がさらに評価された。
この段階で腫瘍の少なくとも５０％に強い反応性（＋＋）を与えるハイブリドーマ上清の最も高い希釈率を決定するため、ハイブリドーマ上清が１０の結腸直腸腫瘍の一団に対して滴定された。これは”作用濃度”と称され、正常組織の一連の集団をスクリーニングするのに用いられた。正常組織のスクリーニングを最小にするため、４工程正常組織スクリーニングカスケードが考案され、より決定的な組織が最初にスクリーニングされた。カスケード中の各々の工程において反応性基準に当てはまらない抗体を分泌するハイブリドーマは廃棄された。カスケードの工程、組織および選択基準は以下のようである：
0003962087.tif 000013
このスクリーニングカスケードは抗体５５．１の同定を導いた。
実施例２ 寄託された細胞株ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ  ９３０８１９０１からの５５．１抗体の調製
２．１  血清含有培地からの調製
液体窒素に貯蔵されている１ｍｌの低温保存アンプルを取り出し、３７度Ｃの水浴中で急速に融解させた。内容物は無菌１５ｍｌ遠心管に無菌的に移された。細胞は１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を穏やかに撹拌しながら滴加することにより再懸濁させた。懸濁液は５０ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を無菌的に除去してペレットは９５％空気５％二酸化炭素のガスを前もって満たした２５ｍｌの組織培養フラスコ中で１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに再懸濁した。フラスコは暗所にて３７℃でインキュベートした。
３日後、全フラスコの内容物をより大きな７５ｍｌフラスコに移し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで希釈することにより（最終生存密度＝２．５ｘ１０ｅ５細胞／ｍｌ）継代培養を行った。さらに１６２ｍｌフラスコへの拡張が同様の方法で実施されたが、ただしＦＣＳ濃度は５％へ減少させた。
精製のための培養上清液は４９０ｍｌおよび８５０ｍｌの回転瓶中、各々２５０ｍｌおよび５００ｍｌの回転培養により調製された。培養物は前もってガスを満たした回転瓶へ２．６ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種され、３ｒｐｍで回転され、３７℃でインキュベートされた。培養物は完全に発育させ、接種３０９時間後に採取したが、その時点での細胞生存度は０％であり、ＩｇＧ濃度は最高に達していた（表１および図１）。
２．２  無蛋白培地からの調製
５％ＦＢＳでの回転培養が蛋白質なしでの増殖および生産に適応され、ＦＢＳを補給したＧｉｂｃｏ無蛋白ハイブリドーマ培地II（ＰＦＨＭII）中で一連の操作が行われた。各々の連続する工程で５０％ＦＢＳ濃度を減少させ、健康な増殖を確立した後にさらに減少させる。培養物は３ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種され、適応過程の間は１ｘ１０ｅ６生存細胞／ｍｌより多く増殖させないようにした。一度蛋白質を含まない増殖から引き離したら、精製のための培養上清液は前記のように２５０ｍｌおよび５００ｍｌの回転培養により調製された。培養物は前もってガスを満たした回転瓶へ２．０ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種され、３ｒｐｍで回転され、３７℃でインキュベートされた。培養物は完全に発育させ、接種２３６時間後に採取したが、その時点での細胞生存度は０％であり、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度は最高に達していた（表２および図２参照）。
２．３  培養収集物の処理
収集後、回転培養上清液は６０ｇで３０分間遠心分離して透明な液とした。透明化上清液は精製まで暗所で４℃で無菌的に貯蔵された。
２．４  ５５．１の精製
プロテインＡに吸着させ、それから溶出させることにより細胞培養上清から５５．１抗体が単離された。
５リットルの５５．１抗体細胞上清（血清を含まない栄養培地で増殖させたもの、約８０ｍｇＡｂ／リットル）は撹拌しながら５６２．５ｇのグリシンおよび８７６．６ｇの塩化ナトリウムを加えることにより１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウムとした。溶液のｐＨは５Ｍ水酸化ナトリウムを加えて８．９に調整した。得られた溶液はプレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’Ｐｏｌｙｇａｒｄ’カートリッジフィルター）続いて０．４５μフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｄｉｓｋ  ＰＶＤＦカートリッジフィルター）をポンプで通過させることにより濾過した。
５００ｍｌのベッド容量で公称５００ｍｇのＩｇＧ受容力を持つＮｙｇｅｎｅプロテインＡカートリッジをペリスタポンプを用いて５００ｍｌ／分の流速で４ベッド容量の０．４５μ前濾過１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウムｐＨ８．９緩衝液で洗浄した。
Ｎｙｇｅｎｅカートリッジで続いて使用されるすべての緩衝液は前もって４．５μフィルターを通して濾過された。
濾過した５５．１培養上清（ｐＨ８．９）は同様に５００ｍｌ／分でカートリッジへポンプで注入し、すべてのメチルレッド培地指示薬がカートリッジから除去されるまで５ベッド容量のグリシン／塩緩衝液でカラムを洗浄した。カートリッジは次に同一の流速で１ベッド容量のＰＢＳで洗浄し、続いて２５０ｍｌ／分の流速を用い３ベッド容量の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）で５５．１抗体を溶出させ５０ｍｌの分画を集め、Ａｂの存在をＵＶ２８０ｎｍでモニターした。すべての抗体含有分画を集め、１Ｍ水酸化ナトリウムで中和した。
グリシン／塩カラム溶出液および洗浄液を再びプロテインＡカートリッジを通すと、続いてのクエン酸洗浄でさらに１５％の抗体が得られた。
集められたすべての抗体の緩衝液をＰＢＳ緩衝液に変換した。このバルク抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥは＞９０％の純度を示した（抗体の収量３６０ｍｇ）。
実施例３  組換えＤＮＡ技術の使用による抗体結合構造の生産
３．１  ５５．１重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ配列の決定
以下の実施例は５５．１ハイブリドーマからのｃＤＮＡライブラリーの構築、重鎖および軽鎖蛋白質をコードしている特定のｃＤＮＡの単離およびこれらのクローンの完全ＤＮＡ配列の決について記載している。
３．１（ａ）ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
真核細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡを単離するにはいくつかの方法がある（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第二版、１９８９年、８章ｐ３、以後Ｍａｎｉａｔｉｓとして示される）。そのような方法の一つはＰｈａｒｍａｃｉａからキットとして提供されており、比較的少ない数の細胞（１０7またはそれ未満）の溶解、続いてのオリゴｄＴカラムへのポリＡ＋  ｍＲＮＡの結合に依存している。望ましくない細胞成分は高温、高塩濃度でｍＲＮＡを溶出する前に低塩濃度で洗浄することにより除去される。
ｍＲＮＡはＱｕｉｃｋｐｒｅｐ  ｍＲＮＡキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）を用いて１０7の５５．１ハイブリドーマ細胞から調製された。ｍＲＮＡの濃度はＵｖｉｋｏｎ９３０分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により３００から２２０ｎｍまで試料を走査し、２６０ｎｍでの４０μｇ／ｍｌの吸光係数を用いて見積もられた。ｍＲＮＡは２．５μｇづつエタノール中で沈殿させて保存された。
３．１（ｂ）  ｃＤＮＡ合成およびクローニング
ｃＤＮＡ合成に使用された方法は、ｍＲＮＡからの逆転写続いてのＲＮエースＨ処理によるＤＮＡポリメラーゼＩによる第二の鎖のプライマー形成および合成に依存するＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｍａｎの方法に基づいている。ｃＤＮＡのその他の方法はＭａｎｉａｔｉｓ（８章）により総括されている。
ｍＲＮＡの試料５μｇは２．５μの胎盤ＲＮエース阻害剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を含みＲＮエースを含まない水で１０μｌにあわせた溶液に溶解したオリゴｄＴ（１２−１８ｍｅｒ混合物、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ．、０．５μｇ）と、７０℃でインキュベートし、続いて氷で冷却することにより準備された。第一の鎖のｃＤＮＡ合成は、４μｌの５ｘＨ−ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、２００ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）、２μｌの０．１Ｍ  Ｄｔｔ（ジチオスレイトール）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭ）、４μｌのスーパースクリプト逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を加え、４２℃で１時間インキュベートすることにより実施された。第二の鎖の反応には、１．５μｌのｄＮＴＰ混合物（上記）、９２．５μｌのＲＮエースを含まない水、３０μｌの５ｘ反応緩衝液（１２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4および０．５ｍｇ／ｍｌβ−ＮＡＤ）、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０ｕ．Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）、４μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（４０ｕ．Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）および１μｌのＲＮエースＨ（２．７ｕ．Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を加え、１６℃でさらに撹拌を２時間続けた。平滑端化ｃＤＮＡが合成されるのを確実にするため、２μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０ｕ．Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を添加した後、１６℃で５分間の最終的なインキュベーションを実施した。酵素活性は７０℃での１０分間のインキュベーションにより停止させた。
クローニングのためのｃＤＮＡを調製するため、上記溶液を等容量のフェノールで抽出し、得られた水相は蛋白質を除去するために等容量のフェノール：クロロホルム（５０：５０、ｖ：ｖ）で抽出し、カラム内にＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．から購入され、使用説明書に従って使用されるセファロースＣ４−ＬＢを用いるスパンカラムクロマトグラフィーで精製する。精製されたｃＤＮＡは次に５μｌのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）、１μｌのＡＴＰ溶液（５ｍＭ）および３μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）と混合し、１２℃で一夜インキュベートした。ｃＤＮＡ＋アダプターは次に１０μｌのＡＴＰ溶液（５ｍＭ）および１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによりリン酸化した。再び、溶液を等容量のフェノールおよびフェノール：クロロホルムで抽出し、スパンカラムクロマトグラフィーで精製して過剰のアダプターを除去した。この段階でｃＤＮＡは適当なプラスミドまたはファージベクター内へのクローニングが可能である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）がｃＤＮＡライブラリーの構築に使用された。このファージミドベクターは独特のＥｃｏＲＩクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、および二本鎖または一本鎖ＤＮＡの単離のためのＣｏｌＥＩおよびｆＩ複製開始点を持っている。５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−ＤＮＡを９０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液中、３７℃で４５分間３０ｕ  ＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で完全に消化した。５’−リン酸基を除くために２μｌのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（２ｕ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、３７℃でさらに３０分間インキュベーションを続けた。ホスファターゼ活性は７０℃での１０分間のインキュベーションにより破壊した。
５μｌのｃＮＭＡ＋アダプターは３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび１．５ｕＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む溶液中、１６℃にて２．５時間、２５ｎｇのＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで連結した。この反応液の５μｌおよび２．５μｌが各々１００μｌおよび５０μｌの受容能のある大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）の形質転換に使用された（この細胞に対して提供されたプロトコールを用いて）。形質転換された細胞は１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＩＴおよび０．２％Ｘ−ｇａｌを加えたＬ−寒天上に起き３７℃で一夜インキュベートした。ｃＤＮＡ挿入物を含むクローンが親プラスミドを含む細胞により発生される青色と比較して白色のコロニーを上記培地上に産生することに基づいて選択された。５０のバッチの２００の白色コロニーをＬ−寒天にアンピシリンを加えたプレート上のニトロセルロースディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ）上に二重に選びとった。フィルターを含まないプレートの第三の組は選択されたコロニーのマスター保存物を形成させるために画線培養された。３７℃で一夜インキュベーション後、ニトロセルロースフィルターを除去しＧｕｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、第１章、１０２ページ）に従って処理することによりその場所で細菌細胞を溶解した。種々の試薬（１０％ＳＤＳ２分、３Ｍ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ５分および１Ｍトリス、ｐＨ６．８  ２ｘ２分）に浸した３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ）上にこのフィルターをかぶせた。溶菌細胞を含んでいるフィルターは、２０ｘＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）で湿らせた３ＭＭ濾紙に移し、自動架橋にセットした（１２０，０００ジュール）Ｓｔｒａｒａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｌｔｄ．）中でＵＶ光へ暴露することによりＤＮＡをフィルターに架橋した。プロービング（下記参照）に使用する前にフィルターを風乾した。マスター保存物プレートは必要になるまで４℃で保存した。
３．１（ｃ）ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのために有効なプローブを発生させるため、５５．１重鎖および軽鎖の可変領域ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２３０  ｐ１３５０−１３５４）により単離された。このことは両方の鎖のＮ−末端蛋白質配列データが入手可能であったため可能であった（上記参照）。このデータは５’ＰＣＲプライマー（配列ＩＤ番号：１−４）の設計に使用された。各々の配列に対し二つのプライマーが合成され、一つは報告された配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第四版，１９８７，Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌａｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより出版、以後Ｋａｂａｔとして参照される）から決定されたマウスＶ−領域に最も共通して存在する配列に基づいており（配列ＩＤ番号：１および３）、および別のものはいくつかのコドン選択を包含するためにいくつかの塩基位置での宿重を含んでいる（配列ＩＤ番号：２および４）。３’末端のためのＰＣＲプライマー（配列ＩＤ番号：５および６）は各々Ｋａｂａｔにより報告されたＩｇＧ１のＣＨ１の５’領域およびＣκの３’末端と相補的である。重鎖イソタイプはアッセイにより（上記参照）決定されており、Ｎ−末端ＶＬ蛋白質配列は軽鎖がカッパイソタイプであったことを示した。これらの３’不変部領域はまた親譲りのスクリーニングプローブとして使用することができた。
３．１（ｄ）オリゴ合成
使用されたすべてのオリゴヌクレオチド配列はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂまたは３９４  ＤＮＡ合成機上、５’ジメトキシトリチル塩基−保護ヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−イソピロピルホスホロアミデートおよび制御された多孔性ガラス支持体に結合された保護ヌクレオシドから０．２μモルの規模でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．による使用説明書に従って製造された。
もしくは、オリゴヌクレオチドはＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈにより”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｍａｎｕａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｍ．Ｔ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，３５−８１）に記載された方法により手で製造できる。
各々合成されたオリゴヌクレオチドは固体支持体から切断後保護基を除去し、二重に蒸留した水（１ｍｌ）に溶解された。
３．１（ｅ）プローブ発生
可変部領域ＤＮＡ断片はＰＣＲを用いてｃＤＮＡから発生させた。１μｌのｃＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各々、１μＭの各々の適当なオリゴ対および２．５ｕＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を含む１００μｌの反応液に加えた。各々の反応液に１００μｌの鉱物油を層積し、９４℃で１．５分間、７２℃で２．０分間を２５サイクルおよび７２℃で１０分間インキュベートした。対照反応ではＤＮＡは組み込まれていなかった。
ＰＣＲ反応物は各々の試料５μｌを０．８％アガロース（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ゲルで走らせ、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＤＮＡを可視化することにより分析された。存在する５５．１ＤＮＡのすべてのＰＣＲで約４００ｂｐのバンドが存在し、可変部領域の増幅が成功したことを示している。対照反応におけるＤＮＡバンドの不在は使用された試薬には夾雑したＤＮＡが含まれていなかったことを示している。
各々のＰＣＲ生成物はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｌｔｄ）を使用して精製された。各々の反応液をコンセントレーターに加え、二回蒸留水を加えて液量を２ｍｌに増量した。ユニットを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、”流れ出た”ものは廃棄した。保持されたものは再び２ｍｌに希釈し、ユニットを再び遠心分離した。この過程は３回繰り返された。この方法により、増幅されたＤＮＡから過剰のオリゴおよび緩衝液成分が除去された。
増幅されたＶＨおよびＶＬ断片は重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクローンのための特異的ハイブリダイゼーションプローブの発生に使用された。放射性標識プローブは下記のようにＴ７  ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅキット（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）を用いて発生させた：５μｌ（約５０ｎｇ）の精製ＰＣＲ生成物を３２μｌの２回蒸留水に加え、１００℃で２分間インキュベートして二本鎖ＤＮＡを変性させた。この試料は氷上で冷却した後、１０μｌの試薬混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびランダムオリゴプライマー（主として９−ｍｅｒ）を含む緩衝化水溶液）、２μｌのα３２Ｐ  ｄＣＴＰ（２０μＣｉ  ３０００Ｃｉ／ナノモル、ＮＥＮ）、および１μｌのＴ７ポリメラーゼ（４−８ｕ）を加えた。反応液は３７℃で２０分間インキュベートした後、１０ｍｌの６ｘＳＳＣ（１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．２５％ＭａｒｖｅｌTM（脱脂乾燥牛乳粉末）を加え、プローブ溶液として使用された。
３．１（ｆ）ライブラリープロービング
選択されたクローン（上記）を含む処理フィルターは（二つのバッチ）９０ｍｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．２５％ＭａｒｖｅｌTM中、回転ガラス管を用いてＴｅｃｈｎｅ  ＨＢ−１ハイブリダイゼーションオーブンで６５℃にて３時間プリハイブリダイズされた。二つの組は各々次に１０ｍｌのプローブ溶液（一つの組はＶＨプローブで、他の組はＶＬで）中、同一の装置を用いて６５℃で一夜プローブを結合させた。インキュベーション後、各々の組のフィルターを同一装置を用いて１００ｍｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分、１００ｍｌの３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分、および１００ｍｌの１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄した。洗浄されたフィルターは風乾し、ファーストタングステン酸塩増感スクリーンとともにＨｙｐｅｒｆｉｌｍTM  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて−７０℃でオートラジオグラフィーを行った。Ｋｏｄａｋ自動フィルム処理機でフィルムを現像すると、二つの潜在的重鎖ｃＤＮＡクローンおよび一つの潜在的軽鎖ｃＤＮＡクローンが適切なプローブのハイブリダイゼーションにより明瞭に同定された。同定された抗体ｃＤＮＡクローンの頻度はハイブリドーマｃＤＮＡライブラリーに典型的なものであった（Ｌｅｖｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，１９８７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ  ５４，ｐ１６７−１７３）。
３．１（ｇ）ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析
ハイブリダイゼーションにより同定された潜在的重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクローンはマスタープレートから採取し大規模プラスミドＤＮＡ製造に使用された。各々のクローンは５００ｍｌ三角フラスコ中、アンピシリンを加えた２００ｍｌのＬ−ブロスへの接種に使用された。培養物は３７℃で一夜振とうさせてインキュベートした。増殖後、各々の培養からの細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心機およびＧＳ３ローターを用い４℃で１０分間５０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化した。各々の培養からの細胞ペレットは２０ｍｌＴＥ緩衝液に再懸濁し、オークリッジチューブ中Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターを用い４℃で１０分間２０００ｘｇで再び遠心分離した。各々の洗浄された細胞懸濁液を３ｍｌの氷冷２５％ショ糖、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、に再懸濁し氷上に放置した。新鮮なリソザイム溶液（１．０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、内容物をチューブを回転させることにより混合し、５分間インキュベーションを続けた。エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）溶液（１．０ｍｌ、０．５ｍＭ、ｐＨ８．５）を加え、内容物を穏やかに混合した。最後に、５．０ｍｌの氷冷トリトンＸ溶液（０．１％トリトンＸ−１００、６２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）を加えて内容物を穏やかに混合し氷上のインキュベーションをさらに１０分間続けた。細胞破片はＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターを用い４℃で３０分間３９，０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化した。プラスミドＤＮＡを含む上清に１６ｇの塩化セシウムおよび１５０μｌのエチジウムブロミド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、ＴＥ緩衝液を加えることにより液量を１８．５ｍｌとした。この溶液は１８．５ｍｌのクリンプトップ  ポリエチレン遠心管（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移した。遠心管を封じＳｏｒｖａｌｌ  ＴＶ８６５Ｂ（チタン、垂直）ローターおよびＯＴＤ６５Ｂ遠心機を用い１８℃で１６時間、１８０，０００ｘｇで遠心分離した。
遠心分離後、プラスミドＤＮＡは形成されたＣｓＣｌ／ＥｔＢＲ密度勾配中にはっきりしたオレンジ色のバンドとして認められた。管壁を刺し通すために皮下注射用の注射器を用いて濃度勾配液からプラスミドＤＮＡを取りだした。濃度勾配液から取りだした試料は３−４倍ＴＥ緩衝液で希釈し、等量のイソプロピルアルコールを加えて氷上で１０分間インキュベーションしてＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡはＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターを用い４℃にて１７，０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化し、上清は廃棄した。得られたペレットは７０％エタノール（ｖ／ｖ）で洗浄し、５分間再び遠心分離した。ペレットは次に真空下で乾燥し、１．８ｍｌのＴＥ緩衝液および２００μｌの酢酸ナトリウム溶液に再懸濁して等量のフェノールで抽出し、相の分離には１７，０００ｘｇ、２分間の遠心分離を用いた。水相を等量のフェノールで再び抽出した後、−２０℃で等量のエタノールを加え、氷上で１０分間インキュベートしてＤＮＡを沈澱させた。精製されたＤＮＡは上記のようにペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、ペレットを真空下で乾燥させた。乾燥ペレットは５００μｌの２回蒸留水に再懸濁し、希釈した試料の３００から２２０ｎｍをＵＶ分光光度計で走査し、５０μｇ／ｍｌ／ＯＤ  ２６０ｎｍの吸光係数を用いてＤＮＡ濃度を推定した。
この精製プラスミドＤＮＡはＤＮＡ配列分析に使用された。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙにより供給され、提供されるプロトコールに従うＳｅｑｕｅｎａｓｅキットのような独占的配列決定キットを用いるＳａｎｇｅｒのダイデオキシ鎖停止法（Ｐｒｏｃ．Ｎｓｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４，１９７７，ｐ５４６３）により二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ配列分析に使用できる。
重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクローンプラスミドＤＮＡの一部（２−４μｇ）がＤＮＡ配列分析に使用された。各々の試料は最初に０．２Ｍ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終容量１００μｌ）と室温で１０分間インキュベーションすることにより変性させた。変性ＤＮＡは１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および２７５μｌのエタノールを加え、氷上で１０分間インキュベーションして沈澱させた。沈澱したＤＮＡは前にプラスミドＤＮＡで記載したように回収された。変性ＤＮＡは、各々をＳｅｑｕｅｎａｓｅ反応緩衝液（４０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下、０．５ピコモルの適当なプライマーと６５℃で２分間、続いて徐々に３０℃以下に冷却するインキュベーションにより配列決定のためのプライマーを連結した。これらのプライマーが連結された鋳型は次に、１０％ＤＭＳＯが標識および停止混合物に添加されているプロトコールに従って配列決定反応で使用された。
配列決定反応は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ，１９７８，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．８７，ｐ１０７）後のオートラジオグラフィーにより分析された。
クローン化ｃＤＮＡの完全重鎖および軽鎖配列は以下に与えられている（Ｈ鎖ｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２３、アミノ酸は配列ＩＤ番号：３６であり図１５にそれら間の配置が与えられており、同様に配列ＩＤ番号：２４はＬ鎖ｃＤＮＡを示しており、配列ＩＤ番号：３７はアミノ酸配列を示しており、および図１６はそれらの間の配置を示している）。これらのコード配列の確実性は、精製された抗体蛋白質から演繹されたＮ−末端蛋白質配列と比較することにより確認された。ＤＮＡ配列からまた抗体がＩｇＧ１κイソタイプであることが確認された。
３．２ミエローマ細胞中での全５５．１抗体の発現
以下の実施例はｐＲｃ／ＣＭＶ内へクローン化した配列（図８）を用いたミエローマ細胞からの５５．１抗体の発現を記載している。
ｐＲｃ／ＣＭＶ（図８）は高レベル転写のためヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ゲネチシン硫酸（Ｇ４１８）耐性安定細胞株の分泌のためネオマイシン耐性遺伝子、プロモーター配列から下流の独特の制限酵素部位（ＨｉｎｄIII、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩおよびＡｐａＩ）およびクローニング部位の３’のウシ成長ホルモンからのポリアデニル化信号／転写停止配列を使用する。
３．２（ａ）ｐＲｃ／ＣＭＶ内へのサブクローニング
５５．１ｃＤＮＡは切り出し可能で無傷な、ＮｏｔＩ断片上のｐブルースクリプトベクターからのものである。各々の断片はその後、ＣＭＶプロモーターからの発現を可能にするために独立してｐＲｃ／ＣＭＶのＮｏｔＩ部位内へクローン化できる。
種々のＤＮＡの一部、ｐＲｃ／ＣＭＶ（３μｇ）、ｐ５５．１Ｈ（５μｇ）およびｐ５５．１Ｌ（１０μｇ）はＮｏｔＩ（５ｕ／μｇ）、１０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび０．１％トリトンＸ−１００を含む溶液中、３７℃で最低１時間インキュベートして別々に消化される。さらにｐＲｃ／ＣＭＶ  ＮｏｔＩ消化物はその後同一の溶液中、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（２ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）と８０℃で１５分間処理された。これは連結反応によるベクターの再環化を防止するためである。完全消化物はアガロースゲル電気泳動により分析され、適当なＤＮＡ断片（ｐＲｃ／ＣＭＶベクターバンド、５．５Ｋｂｐおよび５５．１ＨおよびＬ挿入物、１．５Ｋｂｐおよび８００ｂｐ）をゲルから切り出して上記のように精製した。
別に、各々の５５．１ｃＤＮＡを上記のようにｐＲｃ／ＣＭＶベクターと連結する。連結されたＤＮＡは応答力のあるＤＨ５α細胞の形質転換に使用し、プラスミドＤＮＡ調製試料および５５．１ＨおよびＬ鎖挿入物を持つｐＲｃ／ＣＭＶクローンを同定するためのＮｏｔＩによる制限酵素分析のためにアンピシリン耐性クローンを採取した。続いてＰＣＲが適切なＮｏｔＩ挿入物を発現するために正しい配向の挿入物を持つクローンの同定に使用された。各々の推定クローンからの一つのクローンが１ｍｌの２回蒸留水に再懸濁される。細胞は６０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりペレット化し、上清の８００μｌを捨て、細胞ペレットは残りの２００μｌに再懸濁する。次に細胞を１００℃で１分間インキュベートして破壊し、不溶性物質は１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してペレットとする。透明化した上清の１μｌを、Ｔ７プロモータープライマー（配列ＩＤ番号：７）および内部Ｈ鎖のためのＨ鎖プライマー（配列ＩＤ番号：８）かまたは内部Ｌ鎖のためのＨＬプライマー（配列ＩＤ番号：６）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンおよび０．５ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）の２０μｌＰＣＲ反応に使用し、２０μｌの軽鉱物油（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．）を層積する。ＤＮＡを含まない対照反応が試薬溶液の夾雑物を検出するために組まれた。すべての反応液は９４℃で１．５分、５０℃で１．０分、７２℃で２分を２０サイクル、最後に７２℃で１０分プログラム可能熱制御機（Ｔｅｃｈｎｅ  ＰＨＣ−１）中でインキュベートする。ＰＣＲ生成物は全反応物を０．８％アガロースゲルで走らせることにより分析される。発現のために正しい断片配向を持つクローンは対照反応と比べたときにＰＣＲ生成物（Ｈ鎖では約９００ｂｐ、Ｌ鎖では約６００ｂｐ）の存在により同定される。正しくない断片配向のクローンは、両方のオリゴヌクレオチドが同じＤＮＡ鎖で開始するためＰＣＲ生成物を生成しない。正しい配向を持つ一つのＨ鎖クローンはｐＲｃ／５５．１Ｈと名付けられ、正しいＬ鎖クローンはｐＲｃ／５５．１Ｌである。
前記のような大規模プラスミド製造がこれらのクローンを用いて実施され、骨髄腫細胞のトランスフェクションに十分なＤＮＡが提供される。トランスフェクションに先だって、各々のプラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／５５．１Ｈ、ｐＲｃ／５５．１ＨおよびｐＲｃ／ＣＭＶ）の試料（５０μｇ）は、２５ｕ  ＢｇｌII、６ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＤＴを含む溶液中、３７℃で最低１時間ＢｇｌIIで完全に消化する。ＢｇｌIIは抗体配列および重要な制御要素の外側の点でプラスミドＤＮＡの直線状化を起こし、宿主ゲノム内への発現カセットの組み込みを容易にする。
３．２（ｂ）骨髄腫細胞のトランスフェクション
真核細胞内へのＤＮＡの導入にはいくつかの方法が存在する（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ  ２，ｐ１３６−１４５）。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱に代わって最近はエレクトロポレーションが日常的に使用される方法になってきた。しかしながら、前者の方法は染色体ＤＮＡ内へのプラスミドＤＮＡの組み込みが高頻度であるという利点を持っており、各々同一の耐性マーカーを運ぶ二つのプラスミドの同時トランスフェクションが必要とされるこの場合には好適である。ＨおよびＬ鎖を運ぶプラスミドの同時トランスフェクション後に生成されるＧ４１８耐性コロニーの集団は機能的抗体分子を発現するであろうことが期待される。ＮＳ０骨髄腫細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８１，７３Ｂ，ｐ３、ＥＣＡＣＣ  カタログ番号８５１１０５０３）は内因性分泌抗体蛋白質が存在しないので、この研究に適した宿主細胞である。
使用された方法はＧｏｒｍａｎ（１９８６，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌ．２，ｐ１４３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の方法に基づいている。非選択的培地中（ダルベッコ改良イーグル培地、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、に１０％のウシ胎児血清を加えたもの）、対数的に増殖しているＮＳ０細胞を、１０ｍｌの非選択的増殖培地を含む９ｃｍのペトリ皿に皿あたり５ｘ１０5の密度で播種し、３７℃で２４時間インキュベートする。６２ｍｌ  ＣａＣｌ2を含む０．５ｍｌの水溶液中、直線状化プラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ５５．１ＨおよびｐＲｃ５５．１Ｌ）を同じ比率で混合した（各々２．５、５または１０μｇ）。各々の混合物は次に連続的に撹拌しながら０．５ｍｌの２ｘＨＢＳ溶液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．８ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４６ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．１）へ滴加する。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱物の形成を助けるため混合物に空気を吹き込む。
ＮＳ０細胞から増殖培地を除き、１０ｍｌの無血清培地で洗浄し、それも廃棄された。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱物を１ｍｌの無血清培地とともにペトリ皿に加える。いくつかの異なった比率の二つの発現プラスミドが使用され、対照としてｐＲｃ／ＣＭＶが二つの異なった量で（５および１０μｇ）使用された。ＤＮＡを含まない対照もまた組み立てられる。細胞は沈澱物の存在下３７℃で、時々プレートの一部の乾燥を防ぐために揺れ動かしながら４時間インキュベートする。次に細胞から沈澱物を除き、３ｍｌの１５％のグリセロールを含む１ｘＨＢＳに置き換えて３７℃で１．５分経った後に１０ｍｌの無血清培地で洗浄する。細胞は次に１０ｍｌの非選択的培地中、３７℃で２４時間インキュベートする。
２４時間後に選択的培地（ＤＭＥＭに１０％ＦＣＳおよび１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８−ゲネチシン硫酸塩、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）をトランスフェクトした細胞に応用し、Ｇ４１８耐性コロニーが出現するまでこの選択的条件に細胞を維持する。コロニーを採取し、ＥＬＩＳＡによる抗体発現の分析のためＧ４１８選択下で継代培養する（下記参照）。
３．３  大腸菌での５５．１の断片の発現
以下の実施例は大腸菌中のプラスミドベクターからのキメラＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片（ヒト不可変領域とともに）および５５．１の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）の発現を記載している。
３．３（ａ）  ベクター系
大腸菌の周縁質内への抗体断片の分泌を可能にするプラスミド発現ベクターはいくつかのグループにより記載されている（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  ９，ｐ２７３−２７８。Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  １０，ｐ１６３−１６７。Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ  ９０，ｐ４５７−４６１）。これらは一般的に、選択された大腸菌宿主内での選択および複製を可能にするベクターバックグラウンド（ｐａＴ１５３、ｐＵＣ１９など）において、各々それ自身の分泌リーダー配列（ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡなど）を持つＦｄ’およびＬ鎖の共発現を指示する制御可能なプロモーター（ｌａｃ、ａｒａＢ、ｌｐｐなど）を含んでいる。Ｔｃ耐性遺伝子、Ｔ４転写停止配列およびｃｅｒ安定性機能（ｒｅｆ）を持つｐＡＴ１５３に基づくベクター内へ、サルモネラ チフィムリウムからのＰＣＲにより誘導されたａｒａＢ／Ｃプロモーター／レプレッサー要素を導入することによりそのようなベクターを構築した。二つのｐｅｌＢリーダー配列およびヒトＣＨ１およびＣＫ配列はｐＳＷ１ＦａｂＤ１．３（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ  １９６，ｐ１５１−１５５）から誘導された。さらに、ｐｅｌＢリーダー配列は特異的制限部位を導入するために部位特異的突然変異誘発により修飾された。Ｈ鎖断片の上流のｐｅｌＢ配列は特異的ＮｃｏＩ部位を導入するために修飾された、すなわち
0003962087.tif 000014
ここで下線を付けた塩基はＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を創り出すために本来の配列のＧがＣに置換されていることを示している。
上記のＮｃｏＩ部位を含む単一のｐｅｌＢリーダー配列および他のベクター特性を持つベクター（ｐＩＣＩ２６６）はブタペスト条約のもとＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＮＣＩＭＢ），２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２  １ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，Ｕ．Ｋ．に寄託された。
同様に、Ｌ鎖から上流の第二のｐｅｌＢリーダー配列内へ特異的ＳｆｉＩが導入された、すなわち
0003962087.tif 000015
ここで下線を付けた塩基はＳｆｉＩ部位（ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣ）を導入し、第二のＮｃｏＩ部位の創造を妨げるための塩基置換を示している。この文字変換はアミノ酸置換を余儀なくさせるが（ＭｅｔからＧｌｎ）、Ｃ−末端部分（Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ）はｏｍｐＡリーダーのものと同一であるので分泌には影響しないことが期待される。
これらの修飾はＶＨではＮｃｏＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片およびＶＬではＳｆｉＩ−ＸｈｏＩ断片上の適当なＣ領域の上流および枠内に抗体Ｖ領域の挿入を可能にする。このプラスミドはＮ−末端アミノ酸置換なしに異なった抗体のＶ領域が挿入できるという以前に記載されているベクターよりも便利な点を持っている。
ＣＨ１配列もまた二量化を促進するため、Ｌ鎖相互作用、完全なヒンジ領域およびＣＨ２内への伸長のためのｃｙｓ残基の再導入により本来のｐＳＷ１Ｆａｂベクターを修飾したものである。このことは本来の配列のＳａｌＩおよびＳｐｈＩ部位の間に合成オリゴヌクレオチド配列を挿入し（配列ＩＤ番号：９および１０）、続いて最初の挿入物のＰｍｌＩおよびＨｐａＩ部位の間にさらに合成オリゴヌクレオチド配列を挿入する（配列ＩＤ番号：１１および１２）ことにより達成される。
ＦｄおよびＬ鎖間の共有結合による相互作用を可能にするため、Ｃκ中のＣ−末端ｃｙｓ残基もまた部位特異性突然変異誘発により復元される。
プラスミドｐＩＣＩ１６４６は図２に示されている。
３．３（ｂ）５５．１Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２発現クローンの発生
３．３（ｂ）ｉ  ５５．１Ｖ領域断片の単離
合成オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：１３−１６）はＰＣＲを用いてｃＤＮＡクローンから５５．１ＶＨおよびＶＬ領域を単離するために設計された。その後のｐＩＣＩ１６４６へのクローニングを可能にするためにオリゴは適当なクローニング部位（ＶＨに対してはＮｃｏＩおよびＢｓｔＥIIおよびＶＬに対してはＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ）を導入する。
ＰＣＲは２００μＭ  ｄＮＴＰｓ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣ１2，０．０１％ゼラチンおよび２．５ｕＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む１００μｌの反応液に１５ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の５５．１ＨまたはＬ鎖ｃＤＮＡクローン）、１００ピコモルの各々のオリゴ（ＶＨに対しては配列ＩＤ番号：１３および１４、およびＶＬに対しては配列ＩＤ番号：１５および１６）を加え１００μｌの軽鉱物油を層積した。ＤＮＡを含まない対照反応が試薬溶液の夾雑物を検出するために組まれた。すべての反応液は９４℃で１．５分、５０℃で１．０分、７２℃で２分を２０サイクル、最後に７２℃で１０分プログラム可能熱制御機（Ｔｅｃｈｎｅ  ＰＨＣ−１）中でインキュベートした。ＰＣＲ生成物は５μｌの試料を０．８％アガロースゲルで走らせることにより分析された。
ＶＨおよびＶＬ断片を含むＰＣＲ反応液の残りはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００微量濃縮器を使用し、各々２ｍｌの２回蒸留水中１０００ｘｇで５分間で３回洗浄して（上記のように）過剰のオリゴを除去し、精製した。単離されたＶ領域断片を含む保持物をとり、７０％エタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム中、氷上に１０分間置いてＤＮＡを沈澱させた。各々のＤＮＡは次に１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレット化し、ペレットは７０％エタノールで洗浄して真空下で乾燥させた。
３．３（ｂ）ｉｉ  ５５．１ＶＨ断片の制限消化
ＰＣＲで単離した５５．１ＶＨ生成物は次に、１０ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび２５ｕのＢｓｔＥIIを含む２００μｌの溶液に懸濁し、６５℃で１時間インキュベートすることによりＢｓｔＥIIで消化された。この反応液は氷上で冷却し、ＮｃｏＩによる消化は緩衝液成分を２倍にし、５０ｕのＮｃｏＩを加えて３７℃で１時間インキュベーションすることにより実施された。消化されたＤＮＡはエタノールで沈澱させ、２０μｌの無菌２回蒸留水に懸濁した。消化された断片は次に０．７５％ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ゲルで電気泳動し、ゲルから精製された各々の断片は提供されたプロトコールに従ってフェノール抽出された。ＤＮＡは続いてエタノールで沈澱され１０μｌの無菌の蒸留水に再懸濁した。各々の断片の試料１μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動してＤＮＡ濃度を算定した。
３．３（ｂ）ｉｉｉ  ５５．１ＶＨ断片のｐＩＣＩ１６４６へのクローニング
ｐＩＣＩ１６４６の試料５μｇを上記５５．１ＶＨ断片と同じようにＢｓｔＥIIおよびＮｃｏＩで消化した。消化したＤＮＡは上記のように精製され、ＤＮＡ濃度が算定された。
１００ｎｇのＢｓｔＥII−ＮｃｏＩベクター断片、５０ｎｇのＢｓｔＥII−ＮｃｏＩ５５．１ＶＨ断片および２．５ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＡＴＰの中に含む１０μｌの結合反応液が準備された。結合反応液は１６℃で２時間インキュベートした後、その１μｌが応答能のある大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）２０μｌの形質転換に使用された（製造元から提供される使用説明書に従って）。形質転換された細胞は１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ寒天プレートにおかれ、３７℃で一夜インキュベートされた。
六つのテトラサイクリン耐性コロニーが寒天プレートから採取され、各々１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた１０ｍｌのＬブロス内へ接種された。これらの培養物は３７℃で、振とうしながら一夜インキュベートし、Ｍａｎｉａｔｉｓに明記されている（１章、ｐ３８）ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法を用いてプラスミドＤＮＡの調製に使用された。潜在的５５．１ＶＨクローンは、親プラスミドと比較した場合に特有のＤｒａIII制限部位を獲得していることに基づいて選択された。ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ密度勾配遠心分離を用いる大規模プラスミド製造が四つのそのようなクローンから実施され、クローンはＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）で提供されるようなＳａｎｇｅｒの方法に従ってＤＮＡ配列分析により証明された。正しい配列を持つ一つのクローンがｐＩＣＩ１６５５と名付けられた。
３．３（ｂ）ｉｖ  ５５．１ＶＬ断片のｐＩＣＩ１６５５へのサブクローニング
単離された５５．１ＶＬ断片およびｐＩＣＩ１６５５プラスミドＤＮＡ（各々約５μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣ１2、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む２００μｌの反応液中２５ｕのＳｆｉＩで１時間５０℃で消化した。その後、各々の消化物に２４ｕのＸｈｏＩを加えて３７℃で１時間インキュベーションを続けた。消化物は次にＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂で処理し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、２０μｌの無菌２回蒸留水に再懸濁し、０．７５％ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロースゲルで電気泳動し、上記のように適当なベクターおよびＶＬ断片が単離された。試料１μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し、単離されたＤＮＡ断片の濃度が算定された。
上記５５．１ＶＨで使用された条件下、結合液は１００ｎｇの  ｐＩＣＩ１６５５  ＳｆｉＩ−ＸｈｏＩ断片、５０ｎｇの５５．１  ＶＬ  ＳｆｉＩ−ＸｈｏＩ断片を含むように組み立てられた。結合液は１６℃で３時間インキュベートした後、その１μｌが応答能のある大腸菌ＤＨ５α細胞のテトラサイクリン耐性への形質転換に使用された。八つのテトラサイクリン耐性コロニーが小規模プラスミドＤＮＡ製造に選択された。これらのＤＮＡは親と比較した場合に特異的ＳｓｔＩ部位を喪失していることでスクリーニングされた。潜在的５５．１Ｆ（ａｂ’）２が大規模プラスミドＤＮＡ製造のために選ばれ、前に詳しく説明されたＤＮＡ配列データ分析により証明された。５５．１Ｖ領域ＤＮＡ配列を持つと予想された一つのクローンがｐＩＣＩ１６５６と名付けられた。
３．３（ｂ）ｖ  発現試験
抗体断片発現の分析にため、ｐＩＣＩ１６５６ＤＮＡが大腸菌株ＭＣ１０００（ＡＴＣＣ番号３９５３１）およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８）［Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，１９８０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ  １３８，ｐ１７９−２０７］の形質転換に使用された。これらはアラビノースを代謝できないａｒａ−株であり、ａｒａＢプロモーターからの発現の導入に使用された。これらの二つの株からの応答能のある細胞が調製され、Ｍａｎｉａｔｉｓが引用した方法（１章、ｐ７４−８４）に従ってテトラサイクリン耐性への形質転換された。各々の株の純粋なクローンが次に培養上清のウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる発現の分析に使用された。
３．３（ｂ）ｖｉ  培養上清の調製
ＭＣ１０００（ｐＩＣＩ１６５６）およびＭＣ１０６１（ｐＩＣＩ１６５６）は１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた１０ｍｌの２ｘＹＴブロスに接種され、振とうしながら３７℃で一夜インキュベートした。一夜培養物はテトラサイクリンを加えた１００ｍｌの２ｘＹＴブロス内に継代培養した（１００中１）。これらの培養物は３７℃で振とうしながら３時間インキュベートした。３時間後にインキュベーターのヒーターのスイッチを切り、放置して徐々に（約１時間）室温（２５℃）まで温度を下げた。各々の培養の１０ｍｌの試料を取り、ＯＤ540が測定された（約０．７）。試料を遠心分離してペレットとし（２５００ｘｇで１０分）、細胞および上清は前誘導試料として４℃で保存した。
アラビノース溶液（２０％  ｗ／ｖ）を１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で各々の培養液に加え、室温で３時間インキュベーションを続けた。その後、第二の試料１０ｍｌを取り、ＯＤ540が測定され（約０．８５）、試料は遠心分離して細胞ペレットとした。上清は４℃で保存された。
３．３（ｂ）ｖｉｉ  ウェスタンブロット分析
各々の上清試料の一部（１５μｌ）を等容量の還元剤を含む（５０ｍＭ  ＤＴＴ）または含まない試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％ショ糖および０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。試料は１００℃で１５分間インキュベートした後、マルチフォア装置（ＬＫＢ  Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ  ＡＢ）中で使用説明書に従って８−１８％アクリルアミド勾配ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓからのエクセルゲルシステム）で電気泳動を行った。電気泳動後、Ｎｏｖａｂｌｏｔ装置（ＬＫＢ  Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ  ＡＢ）を用い使用説明書に従って分離された蛋白質をＨｙｂｏｎｄ  Ｃ−Ｓｕｐｅｒ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）へ移した。ブロティング後、膜を風乾した。
抗体断片の存在はＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用い、抗ヒトＣκ抗体−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製品Ａ７１６４）を使用して検出された。
ウェスタンブロット分析の結果は図９に示されている。抗体断片の発現は、対照前誘導試料と比較して誘導後の試料では信号が存在することにより明瞭に検出された。還元剤存在下では、約２５ｋＤの単一のバンドが遊離軽鎖と一致した。還元剤非存在下では、約５０ｋＤおよび約１００ｋＤの追加のバンドが観察され、それらは抗体鎖が共有結合で会合したＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片と一致した。
３．３（ｂ）ｖｉｉｉ  ＥＬＩＳＡ分析
ＥＬＩＳＡアッセイの標準法は”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．およびｖａｎ  Ｋｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｈ．編、１５巻、”Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，１９８５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、に記載されている。他の情報源は”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｎから出版、である。
ＣＯＬＯ  ２０５細胞（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，１９７８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ  ３８，ｐ１３４５−１３５５，ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ３２２）への結合を検出するためＥＬＩＳＡで上清試料が使用された。ＣＯＬＯ  ２０５細胞は無血清培地（Ｚｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｍ１）で培養され９６ウェルマイクロタイタープレートへグルタルアルデヒド（０．１％  ｖ／ｖ  ＰＢＳ溶液）で固定された（ウェルあたり１０5細胞）。培養上清をウェルに加え、４℃で約７０時間インキュベートして抗体断片を結合させた。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．５％（ｖ／ｖ）トウィーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、抗ヒトＣκ抗体−ペルオキシダーゼ複合体（上記参照）が結合抗体断片の検出に使用された。色の発色にはｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．）が用いられ、それはＴｈｅｍｏＭａｘ  プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中、４９０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡの結果は図１０に示されている。５５．１抗体断片によるＣＯＬＯ  ２０５への特異的結合は誘導されたＭＣ１０００およびＭＣ１０６１（ｐＩＣＩ１６５４）培養上清をＣＯＬＯ  ２０５と異なった特異性を持つ他の抗体断片を発現する非誘導試料または対照と比較した。
３．３（ｃ）  ５５．１ｓｃＦＶの発生
ＰＣＲを用いる抗体からのｓｃＦＶ断片の迅速な発生が報告されている（Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  ９，ｐ１６５−１６９）。構築はＶ領域の折り畳みを活性なコンホメーションにする融通のきくペプチドリンカーによる抗体のＶＨおよびＶＬ領域の連結に依存している。リンカー断片を含む離れたＶＨおよびＶＬ領域はＰＣＲにより発生され、リンカー領域の相補性が続いてのＰＣＲにおいてのｓｃＦＶをコードする遺伝子の創造に使用される。
３．３（ｃ）ｉ  ５５．１ｓｃＦＶ発現クローンの構築
オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：１３および１６−２０）がＰＣＲプライマーとして働くように設計された。オリゴ２０は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー配列をコードしており、その３’末端に抗体ＶＬ領域の５’領域に相補性も持っている。オリゴ２１はリンカー配列の補体であり、抗体ＶＬ領域の３’領域に相補性を持っている。別のオリゴ（配列ＩＤ番号：２１）は５５．１ＶＬの３’領域と相補的であり、さらに読み枠内に翻訳停止コドンおよびＥｃｏＲＩクローニング部位を持つように設計された。
５５．１のＶＨおよびＶｌ領域は上記のようにＶＨに対してはオリゴ１３および１７、ＶＬに対してはオリゴ１６および１８を用いる５５．１Ｆ（ａｂ’）２発現クローンの構築においてのＰＣＲにより単離された。これらの断片（各々約０．２ピコモル）は２００μＭ  ｄＮＴＰｓ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣ１2，０．０１％ゼラチンおよび１．２５ｕ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む５０μｌのＰＣＲ反応液中でオリゴ１９および２０（各々０．１ピコモル）と混合し、５０μｌの軽鉱物油を層積した。Ｖ領域を含まない対照反応液もまた準備された。これらの反応液は９４℃で１分、６３℃で４分のインキュベーションを７サイクル行った。このインキュベーション後、１００ピコモルのオリゴ１３および２１および２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣ１2，０．０１％ゼラチンおよび１．２５ｕ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む溶液５０μｌを加え、９４℃で１．５分、５０℃で１．０分および７２℃で２．５分を２５サイクル最後に７２℃で１０分インキュベーションを行った。
アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ反応液の分析から、対照ＰＣＲ反応と比較して推定のｓｃＦＶ断片（約７５０ｂｐ）が存在していることが確認された。上記Ｆ（ａｂ’）２発現クローンの構築で説明した方法により本断片が精製され、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、ｐＩＣＩ１６４６内へクローニングされた。ｓｃＦｖを発現できるクローンはその後７５０ｂｐＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の存在により同定され、ＤＮＡ配列分析により確認された。
３．３（ｃ）ｉｉ  ｔａｇ配列の挿入
ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡでのｓｃＦｖ断片の検出は通常の試薬では不可能である。ｃ−末端にｔａｇペプチドを付加させると、そのような検出が容易になるであろう。９Ｅ１０と称されるデカペプチド（Ｍｕｎｒｏ，Ｓ．およびＰｅｌｈａｍ，Ｈ．，１９８６，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ  ４６，ｐ２９１−３００、ＥＣＡＣＣ番号８５１０２２０２、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １７９２）がそのような目的に使用できる。このｔａｇはプラスミドｐＳＷ１Ｄ１．３ＶＨ．ＶＫ．ｔａｇ（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ  ３４１，ｐ５４４−５４６）からのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片上で入手可能であり、または相補的オリゴヌクレオチドの対として合成できる（図１８および配列ＩＤ番号：２５および３５参照）。
ｐＳＷ１Ｄ１．３ＶＨ．ＶＫ．ｔａｇからのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片は精製され、上記のように常法によりＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｓｃＦｖ発現クローン内へクローン化された。ｓｃＦｖのｃ−末端でのｔａｇの存在はＤＮＡ配列分析により確認された。正しく構築された一つのクローンがｐＩＣＩ１６５７と名付けられた。
３．３（ｃ）  発現試験
ＭＣ１０００およびＭＣ１０６１株をｐＩＣＩ１６５７プラスミドＤＮＡで形質転換した後、発現の分析は上記のように培養上清のウェスタンブロット（図１１）およびＥＬＩＳＡアッセイ（図１２）で実施されるが、ただし、検出は抗体９Ｅ１０とのインキュベーション続いて酸化可能基質の添加に先立って抗マウス抗体−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品Ａ９０４４）と２時間さらにインキュベートされた。
実施例４ 酵素的に誘導されたＦ（ａｂ）２抗原結合構造の調製
５５．１抗体はパパインを用いる蛋白分解によりうまく切断され、以下に示したＦ（ａｂ）２断片が得られた。
１５ｍｇの５５．１を３ｍｇ／ｍｌの濃度で、３ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．５緩衝液に対し、４℃で一夜透析した。２ｍｇ（＝２００μｌ）パパイン［１０ｍｇ／ｍｌ懸濁液Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｍｂｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙカタログ番号１０８０１４、から得られた］を２００μｌの３ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭシステイン  ｐＨ５．５、で希釈し、３７度Ｃで３０分間インキュベートした。過剰のシステインを消化物のクロマトグラフィーにより還元パパインから除去した（５ｍｌのセファデックスＧ２５［Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］のカラムを用い、４度Ｃで３ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ塩化ナトリウム、緩衝液ｐＨ５．５、で溶出）。ＵＶ吸収［Ａ２９０ｎｍ］をモニターして溶出される還元パパインの分画を集めた。還元パパインの濃度は吸光係数２．５を用いて計算された。
抗体に対する酵素比３０対１で還元パパイン５００μｇを前もって透析した５５．１抗体に加えた。容器は次に窒素でパージし、混合物は水浴中３７℃で２０時間インキュベートした。０．５ｍｌの１００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドを加えて反応を停止させた。
粗消化物は４℃で一夜の透析により１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．９に交換し、５ｍｌのカラムのプロテインＡファーストフローセファロース［Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］（同一の溶媒で前もって平衡化）にのせた。カラムは３カラム容量のグリシン／塩緩衝液、３カラム容量の１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０および最後に３カラム容量の１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０で洗浄し、溶出液を２８０ｎｍでのｕｖ吸収でモニターし、分画を集めた。Ｆ（ａｂ）２はプロテインＡに結合しないのでグリシン／塩洗浄した分画に溶出されており、より小さな分画はリン酸洗浄で溶出され、および消化されていない抗体はクエン酸洗浄溶出された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された）。Ｆ（ａｂ）２含有分画をまとめ、保存のために３ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化塩溶液（リン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム  ｐＨ７．２）で透析した。
実施例５ 免疫複合体の製造
５．１  抗体５５．１免疫複合体
モノクローナル抗体５５．１（２００ｍｇ）のリン酸緩衝化塩溶液（リン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム  ｐＨ７．２）（４．４ｍｇ／ｍｌ）を４℃で膜濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜、Ａｍｉｃｏｎ  Ｌｔｄ．，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｕｃｓ．Ｕ．Ｋ．）して１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。濃縮液は０．５容量のホウ酸緩衝液（１００ｍＭホウ酸ナトリウム  ｐＨ９．１）で希釈した。蛋白質濃度は２８０ｎｍでの吸収をモニタリングにより決定され、混合溶液のｐＨは８．８＋／−０．１であった。
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（”リンカー”）を乾燥、再蒸留ジメチルホルムアミドまたはアセトニトリルに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。この液の一部（０．３５２ｍｌ；３．５２ｍｇのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートを含んでいる）を濃縮抗体溶液にすぐに加えた。得られる溶液を混合し、次に１５℃で１時間放置した。溶液は次に、過剰の試薬を除去し、緩衝液が誘導体化された抗体を交換させるため２．６ｘ５８ｃｍのＧ２５セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムによるゲル浸透クロマトグラフィー（５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８．０を２ｍｌ／分の流速で用いる）で脱塩した。もしくは反応生成物は十字流濾過により除去できる。脱塩され誘導体化された抗体はプールし、２８０ｎｍでのｕｖ吸収のモニタリングにより蛋白質濃度が決定された。リンカーによる誘導体化の程度は、過剰のジチオスレイトールを加え、３４３ｎｍで遊離チオピリジル基の放出をモニターすることにより決定された。誘導体化の程度は抗体モルあたり４から６のリンカー基であることが観察された。
組換え体リシンＡはリシンＡの溶液をｐＨ８のリン酸緩衝液中、過剰のジチオスレイトールで処理して還元し、十字流濾過により濃縮された。５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８．０を２ｍｌ／分の流速で用いる２．６ｘ５８ｃｍのＧ２５セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムによるゲル浸透クロマトグラフィーにより過剰の試薬を除去した。
組換え体リシンＡ（１９０ｍｇ）および誘導体化抗体（１９０ｍｇ）溶液を１：１（ｗ／ｗ）のリシンＡ／誘導体化抗体比で混合することにより組換え体リシンＡが誘導体化抗体に結合された。２０％  ｖ／ｖまでグリセロールを加え、容器をアルゴンでパージした。得られた溶液は１５℃に４０から６５時間維持された。
抗体上の過剰のリンカー基にキャップ形成させるため、システインを最終濃度０．２ｍＭまで加えた（抗体上のリンカー基に対して少なくとも１０倍モル過剰に）。この溶液は２０℃に２から３時間維持された。システインによるキャップ形成に続いて、生じた免疫毒素の試料は過剰のジチオスレイトールで処理し、反応の完了を定量化するために３４３ｎｍでモニターした。
複合体を含む溶液は膜濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜、Ａｍｉｃｏｎ  Ｌｔｄ．，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｕｃｓ．Ｕ．Ｋ．）し、５０ｍＭリン酸ナトリウム／２５ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を３ｍｌ／分の流速で用いる２．６ｘ５０ｃｍのゲル浸透クロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨＲ３００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に応用する。この工程の効率はカラム溶出液のｕｖ吸収の２８０ｎｍでのオンライン測定によりモニターされ、免疫毒素および非結合抗体が非結合リシンＡから分離された。免疫毒素および抗体の混合物を含むピークをプールし、２８０ｎｍでのｕｖ吸収のモニタリングにより蛋白質濃度が決定された。
非結合抗体および免疫毒素の両方を含む溶液は１Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ６．３に調整し、トリアジン色素マトリックスＭｉｍｅｔｉｃ  Ａ６ＸＬ（ＡＣＬ  ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ．）の８ｘ２６ｃｍのカラムを用い、１．５ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーを行った。カラムを１００ｍｌの出発緩衝液で洗浄して非結合抗体を溶出させ、免疫毒素は０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む出発緩衝液で溶出された。免疫毒素溶液はリン酸緩衝化塩溶液に対して透析し、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、４℃で保存した。
免疫毒素の純度はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により決定され、全部で４５ｍｇの免疫毒素は：５０から６０％のモノリシンＡ誘導体、１０から３０％のジリシンＡ誘導体、５から１５％のトリリシンＡ誘導体および＜１０％の非誘導体化抗体の組成であった。
もしくは、精製過程においてゲル濾過工程（残存ｒ−リシンＡの除去）および色素親和性クロマトグラフィー工程（残存５５．１抗体の除去）の順番を入れ換えてもよい。この変法においては、システインで未反応リンカー部分の遮断後すぐに（上記参照）複合体混合物は伝導度５ｍＳ未満の蒸留水で希釈される。１Ｍ酢酸でｐＨを６．０に調整し、膜濾過により溶液を透明化する。この溶液は色素リガンドカラムに加える（２．５ｍｌ  ゲル／ｍｇ  複合体形成混合物で使用されたｒ−リシンＡ）。カラムは次に０．６８％酢酸ナトリウムｐＨ６．０で非複合５５．１抗体がカラムから流し出されるまで洗浄する。免疫毒素および残存ｒ−リシンＡは２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、塩化ナトリウムに関して０．５Ｍでカラムから溶出されるであろう。この溶出液は螺旋形カートリッジ限外濾過システムを用いる十字流濾過により濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ＨＲのカラムに応用する（元々の結合反応に使用された抗体ｍｇごとに２．５ｍｌのゲルおよびカラムの全容量の＜５％の容量で）。カラムはリン酸緩衝化塩溶液のような適した処方の緩衝液で平衡化されるであろう。
５．２  抗体５５．１Ｆ（ａｂ）２免疫複合体
精製されたＦ（ａｂ）２断片は最初、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．カタログ番号Ｐ３４１５）で誘導体化された。８ｘモル過剰のＳＰＤＰアセトニトリル溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｇ／ｍｌの濃度で９０ｍｇのＦ（ａｂ）２蛋白質の５０ｍＭホウ酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．９の溶液に加えた。よく混合後、２４℃で６０分かき混ぜないで誘導化を進行させた。抗体断片モル当たり３から４の間の誘導体化レベルが得られた。
過剰のリンカーは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８．０で平衡化した２００ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるゲル浸透クロマトグラフィーで除去された。
１００ｍｇの還元剤を含まない精製リシンＡ鎖が誘導体化Ｆ（ａｂ）２断片の５０ｍＭリン酸緩衝液（２０％  ｖ／ｖ  グリセロール）に加えられた。容器は酸素を含まない窒素でパージして十分に撹拌した。結合反応は２４℃で４８時間放置して進行させた。
Ｆ（ａｂ）２断片上に残っている活性化リンカー基は結合反応混合物を４ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度で０．２Ｍのシステインで処理することにより遮断された。
結合反応後得られた２５ｍｇの複合体はリン酸緩衝化塩溶液ｐＨ７．２で平衡化した１５０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲカラムを用いるゲルクロマトゲラフィーを用いる前の実施例に記載したように残存するｒ−リシンＡおよびシステインから分離された。残存Ｆ（ａｂ）２は色素親和性クロマトグラフィー（ＡＣＬ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ）により除去された。５０ｍｌのＭｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅカラムは５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化された。複合体は５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５で溶出された。この方法の総収率は２０％であった。
実施例６ 抗体５５．１の選択性
免疫毒素の選択性は特に重要である；腫瘍付随抗原へ結合しないと有効性がなくなり、正常組織を標的化すると組織毒性を示す。選択性を評価するため、アセトン固定、凍結低温切片の高感度３段階間接免疫組織学を用いて抗体５５．１との反応性について多くのヒト正常および腫瘍組織がスクリーニングされた。
免疫組織学は切除手術または死後に得られたヒト組織について実施された。最適の形態および抗原性を保存するため、組織は可能な限り新鮮なものが得られ、小片に切り（約１ｃｍ2）、−８０℃で保存する前に液体窒素で急速に凍結させた。組織の６μｍ切片をクライオスタットで切断し、Ｖｅｃｔｏｒ結合スライド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）にマウントし、２分氷冷アセトンで固定した後、ホイルで包み−８０℃で保存した。スライドは室温で放置して霜をとった後、使用直前にホイルをとる。各々の切片はＰＡＰ  Ｐｅｎで形をとり、各々の切片に５μｇ／ｍｌのトリス緩衝化塩溶液（ＴＢＳ）で希釈した１００μｌの５５．１抗体、１００μｌのＭＯＰＣイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．カタログ番号Ｍ９２６９）をＴＢＳ中５μｇ／ｍｌで、または１００μｌのＬＰ３４（Ｄａｋｏ）のような関連する陽性対照を加えた。すべての続いてのインキュベーションは湿気を加えたチャンバー中、室温で３０分間実施され；すべての洗浄工程はＴＢＳ中２回行われた。インキュベーション後、スライドは１００μｌの第二抗体試薬（西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ  Ｐａｔｔｓ）に結合された１／５０ウサギ抗マウス免疫グロブリンを含む）で洗浄され、１／５正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）が各々の切片に加えられた。スライドは再びインキュベートし、ＴＢＳで洗浄した。最終検出抗体、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたブタ抗ウサギ免疫グロブリン（１／５正常ヒト血清−ＴＢＳで１／５０希釈）を各々の切片に加え、インキュベートして十分に洗浄した。ＤＡＢ基質は１ＤＡＢ錠剤（Ｓｉｇｍａ）と１７μｌの過酸化水素を１７ｍｌのＴＢＳに加え、Ｗｈａｔｍａｎ４番濾紙を通して滴加した。３分間インキュベーション後、過剰のＤＡＢを除き、スライドをＴＢＳで洗浄した。メーヤーのヘマトキシリンで逆染色後、切片をアルコールおよびキシレン中で脱水し、Ｅ−Ｚマウント（Ｓｈａｎｄｏｎ）にマウントした後、顕微鏡で試験した。
抗体結合領域は切片上茶色の染色により可視化されていた。得点システムが組織への５５．１抗体の結合の程度を評価するために使用された、
＋＋＋＝＞７５％の腫瘍に抗体結合
＋＋  ＝５０−７５％の腫瘍に抗体結合
＋    ＝２５−５０％の腫瘍に抗体結合
＋／−＝腫瘍細胞の小さな領域への非集中性結合
−    ＝染色なし
１８人の結腸直腸腫瘍の一団の研究からのデータは５５．１抗体は腫瘍の約８０％と強く結合することを示した（表３）。
染色のさらなる分析で、約５０％の腫瘍（＋＋および＋＋＋のスコアを持つもの）において、５０％以上の細胞が陽性に染色され、染色は基底面および成長点細胞で明かであることが示された。従って特定の腫瘍内の上皮細胞の大部分は標的化を受けるべきである。さらに、基底面発現は血液から抗体への有効な標的化を好むべきである。
表４に示したように，５５．１との反応性について大きな範囲のヒト正常組織がスクリーニングされた。そのような選択的抗体はまれであり；１０／６５，０００のみの抗体上清が発生またはスクリーンされたが、一方発明の５５．１はそのような最少程度の正常組織反応性を示した。
実施例７ ＣＡ５５．１への競合的結合のためのアッセイ
７．１（ａ）  可溶性ＣＯＬＯ  ２０５膜試料の生成
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。１０Ｅ９  ＣＯＬＯ  ２０５細胞のペレットを７ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２．５％トウィーン４０、１０ｍＭトリス、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮＥＭ、１００μＭペプスタチン、ｐＨ７．４）に懸濁して１０ｍｌの全量とした。得られた溶液は１時間氷浴中で撹拌した。次に細胞をホモジナイズし、４℃にて１０分間１５００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、４℃にて１時間１００，０００ｇで遠心分離した。ペレットに５ｍｌの可溶化緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、１０ｍＭ  ＮＥＭ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１ｍＭロイペプチン、ｐＨ７．４）を加え、得られた懸濁液は４℃で穏やかに３０分撹拌した。上清（可溶化ＣＯＬＯ  ２０５膜試料）を吸引し４℃で保存した。
７．１（ｂ）  競合ＥＬＩＳＡ
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。抗原保存溶液を作るため可溶化ＣＯＬＯ  ２０５膜試料を１対１００に被覆緩衝液（２０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で希釈した。マイクロタイタープレート上、測定当たりＭＡｂ当たり六つのウェルに５０μｌの抗原保存溶液を加えた。室温で２時間または４℃で一夜穏やかにかき混ぜる。５０μｌの固定緩衝液（０．５％グルタルアルデヒドを含む被覆緩衝液）を各々のウェルに加え、３分放置し、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）でプレートを洗浄する。２００μｌの遮断緩衝液（３％ＢＳＡを含む被覆緩衝液）を各々のウェルに加え、室温で１時間穏やかにかき混ぜる。ビオチンで標識されたＭＡｂの保存溶液（Ｃｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２６６，ｐ１４１５−１４２１）およびＴＥＳＴ  ＭＡｂは抗体緩衝液（１％ＢＳＡを含む被覆緩衝液）で調製する。これらの保存溶液を混合し下記の比で二つのＭＡｂ含む六つの抗体溶液を作製する；
抗体溶液１．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および  ２００ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ  ＭＡｂ
抗体溶液２．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および    ２０ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ  ＭＡｂ
抗体溶液３．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および      ２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ  ＭＡｂ
抗体溶液４．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および  ０．２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ  ＭＡｂ
抗体溶液５．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および０．０２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ  ＭＡｂ
抗体溶液６．２ｍｇ／ｍｌ５５．１
遮断工程の終わりにプレートをＴＢＳで洗浄し、１００μｌの各々の抗体溶液を各々の列の一つのウェルに入れる。プレートは室温で２時間穏やかにかき混ぜる。プレートをＴＢＳで洗浄し、１００μｌの第二抗体溶液（抗体緩衝液に１ｍｇ／ｍｌの抗ビオチンペルオキシダーゼ結合ＭＡｂ）を各々のウェルに加え、１時間穏やかにかき混ぜる。基質溶液を作るため９９．５ｍｌのクエン酸リン酸緩衝液（０．５ｇクエン酸、１．７ｇリン酸水素二ナトリウム１２水和物を１００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に）に０．５ｍｌの過酸化水素溶液（１ｇの尿素過酸化水素、２５ｍｌのクエン酸リン酸緩衝液）および８０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩を加えた。プレートをＴＢＳで洗浄し、各々のウェルに１００μｌの基質溶液を加えた。発色する色を４９５ｎｍでモニターする。０．７ＡＵＦＳの最大吸光度に達したら、各々のウェルに５０μｌの停止溶液を加え、プレートを５分穏やかにかき混ぜて最終吸光度を読みとる。発色した色がＴＥＳＴ  ＭＡｂ濃度依存性で減少したことからＴＥＳＴ  ＭＡｂによる５５．１の結合の阻害が示された。
実施例８ ＣＡ５５．１に対する免疫複合体のインビトロ活性
リシンＡと結合された場合、有効な免疫毒素をつくる抗体の必須な性質は、腫瘍細胞上の細胞膜決定基と結合すべきことであり、および蛋白合成を阻害し、細胞毒性を誘導するために細胞膜を通過してリボソームへリシンＡを容易に送達させることである。
５５．１抗原は、フローサイトメトリーを使用してＣＯＬＯ  ２０５を含むいくつかの結腸直腸腫瘍細胞上に高レベルで存在していることが示されている。ＣＯＬＯ  ２０５細胞がインターナリゼーションおよび細胞毒性研究に日常的に使用されてきた。抗体５５．１が組換え体リシンＡと複合された場合、ＣＯＬＯ  ２０５細胞に対して１ｘ１０-11ＭのＩＣ５０を持つ高度に強力な免疫毒素が作製された。
ＣＯＬＯ  ２０５に結合した５５．１のエンドサイトーシスは以下のように示された。ＣＯＬＯ  ２０５細胞の細胞懸濁液を培養培地中ｍｌ当たり２０００万細胞まで濃縮した。ヨード化抗体を１μｇ／ｍｌで加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞は２度４℃で遠心分離して洗浄し、新しい培地でｍｌあたり１００万まで希釈した。１．５ｍｌの細胞懸濁液を２４ウェル組織培養プレートに加え、続いて３７℃でインキュベーションを行った。１ｍｌの試料をとり間隔をあけて処理した。細胞および培地上清を遠心分離により分離した。いくつかの細胞ペレットは酸性化ペプシン（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２．５、１ｍｌ／ペレット３７℃で４０分）を用いて表面結合抗体を除去するように処理された。細胞は次に遠心分離して洗浄した。培地上清をＴＣＡで処理して蛋白に付随する放射活性を決定した。細胞ペレット、ペプシン処理細胞ペレット、培地および培地のＴＣＡ沈澱物のすべての放射活性を測定した。従って、表面、インターナリライズしたおよび脱落した抗体（分解生成物を含む）が定量化される。
対照のインターナリゼーションを起こさない抗体と比較すると、５５．１はＣＯＬＯ  ２０５細胞内へ効果的にインターナライズされており、約２５％の細胞結合抗体が４時間のインビトロインキュベーションで細胞膜を通過しており、２０時間のインキュベーション時間では４０％以上である（図４）。
５５．１：リシンＡのインビボ能力はヒト腫瘍増殖のモデルとして”ヌード”マウスの皮下異種移植により算定された。
最初の抗腫瘍試験は５ｘ１０ｅ６のＣＯＬＯ  ２０５細胞を左の脇腹に皮下に移植された１０匹のマウスの群で実施された。腫瘍は０．５−０．７ｃｍの直径まで増殖させた、通常移植後５−７日。この時点で１ｍｇ／ｋｇの５５．１：リシンＡ免疫毒素を１日一度静脈に３日間注射した。対照群は塩溶液のみを受け取った。
この投与計画は腫瘍退化の明瞭な証拠を与える非常に実質的な抗腫瘍応答を生み出し、および多少の動物においては完全に治癒した。そのような実験において、２／１０のマウスの腫瘍が完全に治癒した。残りのマウスの４／１０では中程度の増殖遅延（１０日）があり、４匹では腫瘍増殖の３０日以上の遅延があった（図５）。
従って、５５．１：リシンＡはインビボにおいて高度に強力で、選択的細胞毒性薬剤であり、固形腫瘍異種移植片内のＣＯＬＯ  ２０５細胞への標的化されおよびインターナリゼーションを受けている。そのようなモデルにおいて５５．１：リシンＡは５−フルオロウラシルのような通常の抗癌剤よりも活性である。
実施例９ 医薬組成物
以下の処方はヒトにおける治療目的に使用されるであろう本発明の免疫毒素を含む代表的な医薬剤形を例示している。
注射可能な溶液
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を含む注射のための無菌水溶液。
実施例１０ ５５．１  ＣＤＲ３  ＤＮＡ配列に関連したＤＮＡ配列のハイブリッド形成
１０．１  ハイブリッド形成試験
５５．１抗体重鎖遺伝子に関する配列を含む核酸を検出する方法。これらの核酸はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて上記のように膜に固定された細菌コロニーからのＤＮＡまたは真核細胞からのＤＮＡ／ＲＮＡのような、またはゲル電気泳動により分離されノーザン（Ｍａｎｉａｔｉｓ、７章、ｐ３９）またはサザン（Ｍａｎｉａｔｉｓ、９章、ｐ３１）ハイブリッド形成のためのように適した膜へ移されているような精製された核酸の断片のような種々の形で存在するであろう。
１０．２  ハイブリッド形成プローブ
ハイブリッド形成プローブは５５．１Ｈ鎖、より特別には可変領域から、特にはこの領域のＣＤＲ３のコード領域をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの断片から作製されるであろう。合成オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２２）またはその相補的配列がＣＤＲ３コード領域のための特異的プローブとして使用できる。
ハイブリッド形成プローブは合成オリゴヌクレオチドからＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの作用により３２Ｐ  ＡＴＰから放射活性５’リン酸基の付加により作製することができる。２０ピコモルのオリゴヌクレオチドを、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ  ＤＴＴ、７．５５Ｍ  ＡＴＰ、０．５５Ｍ  ｇ  ３２ＰＡＴＰおよび２．５ｕＴ４ポリヌクレオチド  キナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む２０μｌの反応液に加えた。反応液はハイブリッド形成に使用する前に３７℃で３０分および次ぎに７０℃で１０分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド（１１章）から、またはＤＮＡおよびＲＮＡ断片（１０章）からハブリッド形成プローブを作製する方法はＭａｎｉａｔｉｓにより与えられている。多くの特許、キットがこれらの方法のために入手可能である。
１０．３  ハイブリッド形成条件
核酸を含むフィルターは６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および０．２５％ＭａｒｖｅｌTMを含む１００ｍｌの溶液中、６５℃で最低１時間適した容器中でプリハイブリダイズされる。モデルＨＢ−１（Ｔｅｃｈｎｅ  Ｌｔｄ）のような特許ハイブリッド形成装置は実験の再現可能条件を提供する。
前ハイブリッド形成溶液を次に６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および０．２５％Ｍａｒｖｅｌおよび前記の作製されたオリゴヌクレオチドプローブを含む１０ｍｌのプローブ溶液に置換する。フィルターをこの溶液中６５℃で５分インキュベートした後、温度を徐々に３０℃以下に下げる。プローブ溶液を捨て、フィルターを１００ｍｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５分洗浄する。同一の新鮮な溶液中、３０℃で洗浄し。次に温度を１０℃づつ６０℃まで上げ各々５分間洗浄する。
洗浄後、フィルターを乾燥し写真像を高めるため急速タングステン酸塩増感スクリーンを用いて遮光フィルムカセット中，−７０℃でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のようなＸ線フィルムを露光させるのに使用する。フィルムは適当な期間（通常一夜）露光させた後、現像してフィルター上の放射活性領域の写真像を明らかにする。像を生み出すべきではない全く関連しない配列と比較して、関連する核酸配列は写真像の存在により同定される。理想的には関連する配列は最も高い洗浄温度（６０℃）で陽性として現れるであろう。しかしながら、関連する配列はより低い温度（５０、４０または３０℃）でのみ陽性を示してもよい。
これらの結果は使用されたプローブの性質にも依存するであろう。より長い核酸断片プローブはハイブルダイズするのに高い温度でのより長い時間を必要としないであろうが、より高い洗浄温度および／またはより低い温度で関連する配列と結合したまま残るかもしれない。混合または縮重オリゴヌクレオチドプローブではより低い温度およびより高いＮａ+濃度のようなより低いストリンジェント洗浄条件を必要とするであろう。ハイブリッド形成プロトコールに対する考察の議論はＭａｎｉａｔｉｓ（１１章）に与えられている。
実施例１１ ＣＡ５５．１腫瘍付随抗原の分析
１１．１  ＣＯＬＯ  ２０５細胞からのＣＡ５５．１の可溶化
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。１０Ｅ９  ＣＯＬＯ  ２０５細胞のペレットを７ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２．５％トウィーン４０、１０ｍＭトリス、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮＥＭ、１００μＭペプスタチン、ｐＨ７．４）に懸濁して１０ｍｌの全量とした。得られた溶液は１時間氷浴中で撹拌した。次に細胞をホモジナイズし、４℃にて１０分間１５００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、４℃にて１時間１００，０００ｇで遠心分離した。ペレットに５ｍｌの可溶化緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、１０ｍＭ  ＮＥＭ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１ｍＭロイペプチン、ｐＨ７．４）を加え、得られた懸濁液は４℃で穏やかに３０分撹拌した。上清（可溶化ＣＯＬＯ  ２０５膜試料）を吸引し４℃で保存した。
１１．２  ＣＡ５５．１の親和性による精製
Ｐｈａｒｍａｃｉａの標準プロトコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＮＢｒ  活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの添付書類、カタログ番号１７−０４３０−０１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＭＡｂをＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合させる。マトリックスは結合緩衝液（２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、ｐＨ７．０）で平衡化した。ＣＡ５５．１を含む細胞溶解物をマトリックスに加え４℃で一夜よく混合した。マトリックスは次に６カラム容量の洗浄緩衝液（２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。５５．１は３カラム容量の溶出緩衝液（２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５Ｍ  チオシアン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でマトリックスを洗浄することにより溶出させた。ＣＡ５５．１を含む分画は下記のように５５．１抗体を用いるウェスタンブロティングにより同定された。
１１．３  ＣＡ５５．１のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ＭＡｂ５５．１反応性を試験すべき試料をプリキャストＰｈａｒｍａｃｉａ  ＥｘｃｅｌＧｅｌTM（８−１８％グラジエントポリアクリルアミド）に加え、推奨されている条件を用い（６００ボルト、５０ｍＡおよび３０Ｗ  ９０分、１５℃、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＥｘｃｅｌＧｅｌ  Ｐａｃｋの添付書類、カタログ番号８０−１２５５−５３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）Ｐｈａｒｍａｃｉａにより示唆されているプロトコールで実施された。ゲルをベーキングプラスチックシートから除き２．５ｍＡ／ｃｍ２で１０−１２分ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットされた。エレクトロブロッティング後、ＰＶＤＦ膜を遮断緩衝液、ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に３％ＢＳＡを加えたもの、に移し、１時間穏やかにかき混ぜた。膜は簡単に抗体緩衝液（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ）で洗い、２ｍｇ／Ｌの濃度でＭＡｂ５５．１を含む抗体緩衝液に移した。ＰＶＤＦ膜は２時間穏やかにかき混ぜた。
膜を簡単にＭｉｌｌｉ−ＱTM水（高品度脱イオン水）で洗い、抗体緩衝液で３ｘ５分洗浄した。ＰＶＤＦ膜は次に西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されたＭＡｂ抗マウスを１ｍｇ／Ｌの濃度で含む抗体緩衝液に移した。ＰＶＤＦ膜は１時間穏やかにかき混ぜた。ＰＶＤＦ膜を簡単にＭｉｌｌｉ−ＱTM水で洗い、抗体緩衝液で３ｘ５分洗浄し、最後にＴＢＳで５分洗浄した。最後の洗浄工程が終了したとき、ＨＲＰ発色溶液（６０ｍｇ  ４−クロロ−１−ナフトールの氷冷メタノール（２０ｍｌ）溶液；使用５分前に作って暗所保存）およびペルオキシド溶液（１００ｍｌＴＢＳに６０μｌの氷冷３０％Ｈ2Ｏ2、使用直前に調製）を一緒に加え、膜はすぐに得られた溶液に移した。発色したら膜を２ｘ５分Ｍｉｌｌｉ−ＱTM水で洗浄して反応を停止させた。膜はティッシュペーパー上で風乾し、貯蔵された。
この実験の結果は図６に示されている。ＣＡ５５．１は約４８から５２ｋＤ、約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋＤの範囲で三つの優勢なバンド分子量のように振る舞った。
１１．４ＰＮＧエース処理、シアリダーゼ処理およびレクチンブロット
ＣＡ５５．１エピトープの炭水化物の性質は、酵素ＰＮＧエースＦおよびシアリダーゼのウェスタンブロット上のＣＡ５５．１への影響を示すことによりあらわされた。ＰＮＧエースＦは特異的にアスパラギン残基および隣接するＧｌｃＮＡｃ残基の間（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ）のＮ−結合オリゴサッカライドを切断し、この結合に局所的特異性であると考えられている。シアリダーゼは非還元末端シアール酸を切断し、アルファ２−＞３，６または８結合の範囲で特異的である。
１１．４  （ａ）  ＣＡ５５．１のＰＮＧエース処理
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。４０μｌのＣＯＬＯ  ２０５膜試料に４０μｌの変性緩衝液（４０ｍＭ  リン酸水素ナトリウム、０．５％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノール，ｐＨ７．５）を加え、得られた溶液は２分間煮沸した。冷後、２μｌのＮｏｎｉｄｅｔ  ＮＰ−４０を加えた（２．５％  ｖ／ｖ）。この溶液に２０単位のＰＮＧエースＦ（Ｎ  グリコシダーゼ  Ｆ，Ｅｘ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号９１３７８２）を加え、続いて１６０μｌの消化緩衝液（４０ｍＭリン酸水素ナトリウム、ｐＨ７．５）および１６０μｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ水を加えた。得られた溶液は３７℃で１８時間インキュベートした。
１１．４（ｂ）  ＣＡ５５．１のシアリダーゼ処理
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。シアリダーゼ（０．１ｕ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｘ−５０１１）を１０μｌの５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５に再懸濁した。得られた溶液は４０μｌのＣＯＬＯ  ２０５膜試料に加え、３７℃で１８時間インキュベートした。ＰＮＧエースおよびシアリダーゼ処理ＣＯＬＯ  ２０５膜試料および非処理膜試料は上記のようにウェスタンブロットを行った。
図６はウェスタンブロットの結果である。トラック１は非処理ＣＯＬＯ  ２０５膜試料、トラック２はＰＮＧエース処理試料およびトラック３はシアリダーゼ処理試料である。トラック１は三つの主ＭＡｂ陽性種、約４８から５２ｋＤ、約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋＤの分子量を示している。トラック２は検出可能な化学種を含んでいない。トラック３は約４８−５２ｋＤ、約５８−７２ｋＤおよび約８８−９２ｋＤの分子量を持つ５５．１陽性種を示している。トラック３において５５．１陽性種は対照試料のトラック１よりもより弱い染色であった；この減少は３７℃での１８時間の間に部分的な蛋白の沈澱によるものであると信じられている。
これらの結果はＣＯＬＯ  ２０５膜試料のＰＮＧエース処理はＭＡｂ５５．１の反応性を取り除くがシアリダーゼ処理は全くＭＡｂ反応性を取り除かなかった。それ故、ＭＡｂ５５．１はＮ−結合オリゴサッカライドを認識し、末端シアール酸残基は認識には必要ではない。
１１．４（ｃ）  アフィニティー精製ＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質のレクチンブロティング
ＣＡ５５．１抗原の炭水化物部分の部分構造は、特異的に種々の炭水化物モチーフを認識する蛋白質を使用することにより推論できる。これらの蛋白質またはレクチンは酵素で標識でき、それは可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥブロットから位置がわかる。
使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。可溶化ＣＯＬＯ  ２０５膜試料は、ＭＡＢ５５．１結合アフィニティーカラムからの結合、洗浄および溶出によりＭａｂ５５．１陽性糖蛋白によりエンリッチされた。このエンリッチされた分画は（推奨された糖蛋白対照とともに）ウェスタンブロットを行い、Ｂｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＤＩＧ標識レクチンを用い、推奨プロトコールに従ってプローブを結合させた（ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１２１０２３８）。
図７は４つの対照およびＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質とダチュラ  ストラモニウム  アグルチニン（ＤＳＡ）およびガランサス  ニバリス  アグルチニン（ＧＮＡ）との反応性を示している。図７ＡはＤＳＡが二つの高分子量ＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質と交差反応することを示している、５８―７２ｋＤおよび８８ー９２ｋＤ、トラック６および７。最も低い分子量のＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質４８ー５２ｋＤとは交差反応性がないようである；この交差反応性の欠如は多分不十分な負荷のせいであろう。
図７ＢはＧＮＡとＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質の間には検出可能な交差反応性がないことを示している、トラック６および７。両方ともトラック７にはトラック６の５倍量が負荷されており、正しい交差反応性が糖蛋白質対照では観察された。
レクチンＤＳＡはガラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミンと交差反応する、このジサッカライドは複合体およびハイブリッドＮ−結合グルカンに存在している。ＤＳＡはまたＯ−結合グリカンにおいてもこのジサッカライドを認識する。レクチンＧＮＡは高マンノースおよびハイブリッドＮ−結合グリカンに観察される末端に結合されたマンノース残基と交差反応する。このレクチンはＯ−結合グリカンの末端マンノースとも交差反応するであろう。ＰＮＧエース処理ＣＯＬＯ  ２０５膜試料はＭＡｂ５５．１陽性ではないため、ＭＡｂ５５．１はＮ−結合グリカンを認識する。ＤＳＡと陽性の結果は、このグリカンがガラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミン  ジサッカライドを含んでいることを示している。ＧＮＡとの陰性の結果はＭＡｂ５５．１が末端マンノース基を含んでいず、従って高マンノースまたはハイブリッド型ではありえないことを示している。これらの結果は一緒になって，ＭＡｂ５５．１はガラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミンジサッカライド単位を含む複雑なＮ−結合グリカンを認識すること示している。
実施例１２ ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ配列を示すファージ（ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ）の繁殖、滴定および貯蔵
ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（ＮＣＩＭＢ番号４０６３８；配列ＩＤ番号：２６）は大腸菌Ｋ１２、株ＴＧ１（ファージとともにＮＣＩＭＢに寄託されている）中で以下のように繁殖させた。単一のコロニーからとったＴＧ１細胞はＦ線毛を維持するために最小培地寒天プレート（下記のように調製）上で維持され、２ｘＹＴ（酵母−トリプトン）ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中、振とうしながら３７℃で定常期まで液体培養で増殖させた。定常期培養物の一部（２ｍｌ）をとり、１００ｍｌ  ２ｘＹＴブロスを含む新しいフラスコに接種し、３７℃で振とうしながら半対数期まで増殖させた。ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（１０Ｅ１１プラーク形成単位）を培養液に加え、ファージが大腸菌のＦ線毛に吸着され、ウイルスＤＮＡの挿入を可能にするため、フラスコは３７℃で１０分間放置した。次にファージ複製を起こすため培養物は３７℃で振とうしながら５時間インキュベートした。ＳｏｒｖａｌｌＧＳＡまたは類似したローターを用い、４℃にて１００００ｒｐｍで遠心分離して細胞をファージ含有上清から分離した。残存する細胞を殺すため上清を６５℃に１５分加熱し、続いて２０％ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を培養上清１００ｍｌに対して２０ｍｌ加えた。混合物を激しく振り、ファージ粒子を沈澱させるため４℃で少なくとも４時間インキュベートした。上記のように遠心分離によりファージを集め、上清は廃棄して、ファージペレットは５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）に１００ｍｌの元々の上清当たり１ｍｌで再懸濁した。必要なら、ファージを上記のようにＰＥＧで再沈澱させ、より高度に精製された試料を得る。ファージはＴＢＳ中、０．０２％  ｗ／ｖのアジ化ナトリウム存在下−２０℃または４℃で貯蔵された、その後の生存性に相違は認められなかった。最小培地プレートは４００ｍｌの水に溶解した１．８％  ｗ／ｖ寒天（Ｄｉｆｃｏ）をオートクレーブにかけることにより調製された。約５０度まで冷却後、以下の成分が加えられた：５ｘＭ９塩（１００ｍｌ）；１Ｍ硫酸マグネシウム（５００マイクロリットル）；０．１Ｍ塩化カルシウム（５００マイクロリットル）；４ｍｇ／ｍｌチアミン（５００マイクロリットル）；２０％ｗ／ｖ  グルコース（５ｍｌ）。
実施例１３ ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの数の滴定
固相培養で増殖した大腸菌指示細胞に存在するプラーク形成単位の数から生存ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（配列ＩＤ番号：２６）の数が見積もられた。大腸菌株ＴＧ１細胞を上記のように半対数期まで増殖させ、その一部２００μｌを１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（ＴＢＳ−ＢＳＡ）で連続的に希釈したファージ５０μｌで感染させた。ファージの吸着およびウイルスＤＮＡの注入を可能にするため室温に１０分間放置し、０．７５％ｗ／ｖのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を含む２ｘＹＴブロスで４ｍｌに希釈して４８℃に維持した後、直ちに２０ｍｌの１．５％のＢａｃｔｏ−Ａｇａｒを含む２ｘＹＴブロスで前もって満たしておいた９０ｍｍの直径のペトリ皿内へ注いだ。プレートはファージプラークを発育させるため、３７℃で一夜インキュベートし、アッセイされている貯蔵懸濁液中の生存ファージの数を見積もるためプラークが計数された。
実施例１４ ＥＬＩＳＡによるＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ結合特異性の決定
１４．１  ＭＡｂ５５．１への直接結合の特異性
以下のようにポリスチレンに固定されたＭＡｂ５５．１（ＥＣＡＣＣ番号９３０８１９０１）、ＭＡｂ１９．９（ハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＮＳ１１１６ＮＤ）およびＭＡｂＣ２４２（Ｋａｂｉ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）への懸濁液中でのファージの直接結合により特異性が決定された。ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，ＵＫ）のウェルを、０．０２％のアジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．６（炭酸水素塩―アジド）中、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂ溶液５０μｌを用いて４℃で一夜被覆した。プレートは３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む炭酸水素塩ーアジド溶液４００マイクロリットルを使用して室温で２時間遮断させ、続いてウェル当たり３ｘ４００マイクロリットルのＴＢＳ−ＢＳＡで洗浄した（各々の洗浄は５分間続ける）。
連続的に希釈したＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージを抗体被覆プレートに加え、ＴＢＳ−ＢＳＡ溶液を１００マイクロリットル、４℃で一夜インキュベートした後、プレートを０．０５％  ｗ／ｖ  トウィーン２０を含むＴＢＳ−ＢＳＡ（ＴＢＡ−ＢＳＡ−トウィーン）で洗浄した（３ｘ４００マイクロリットル）。１：２５００に希釈したヒツジ抗−Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を各々のウェル当たり１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを再び３ｘ４００マイクロリットルのＴＢＡ−ＢＳＡ−トウィーンで洗浄し、２００マイクロリットルのＯＰＤ基質（２５ｍｌの０．１Ｍクエン酸ーリン酸緩衝液、ｐＨ５．０当たり１０ｍｇのオルト−フェニレンジアミン、１２．５マイクロリットルの３０％過酸化水素溶液を含んでいる）で発色させる。着色反応は５０マイクロリットルの０．５Ｍクエン酸の添加により停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読みとった。
結果（図１３）はＭＡｂ５５．１へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの結合は特異的であり、飽和した。ＭＡｂ５５．１へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの結合の５０％飽和は１００マイクロリットルの容量で２ｘ１０ｅ７のファージ投入により起こった。
アボガドロ数から（１モル溶液はリットル当たり６ｘ１０ｅ２３分子または１００マイクロリットル当たり６ｘ１０ｅ１９分子を含んでいるであろう）結合親和性が計算された。この数字を使うと、１００マイクロリットル当たり２ｘ１０ｅ７ファージは０．３ｐＭ全ファージ粒子または１．５ｐＭファージが表したペプチドの濃度に対応する（各々のＭ１３ファージ粒子上に約５ｐＩＩＩ分子が存在する）。従って、ＥＣ５０、すなわちＭＡｂ５５．１の５０％飽和に必要とされるペプチドーファージの濃度は１ｐＭの領域である。
１４．２  ＣＯＬＯ  ２０５競合アッセイにおけるＭＡｂ５５．１への結合の特異性
溶液中、ポリスチレン上に固定されたＭＡｂエピトープに対し、ＭＡｂ５５．１と競合するＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージのアッセイによる特異性が決定された。マイクロタイタープレートのウェルを、リン酸緩衝化塩溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中の１０５ＣＯＬＯ  ２０５細胞（ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ２２２）の１００マイクロリットルで３０分間被覆し、等量の１％  ｖ／ｖ  グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液を加えて固定化し、１０％  ｗ／ｖ  ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で２時間ブロックした、すべての操作は室温で行われた。プレートを３ｘ４分、ウェル当たり４００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄し、必要になるまで（被覆後１ヶ月後まで）４℃にて湿気を供給した箱内で保存した。
ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージを連続的に希釈して、ＭＡｂ５５．１、１９．９、およびＣ２４２と４℃で一夜インキュベートした、すべて２０マイクログラム／ｍｌ  １０％ｗ／ｖＢＳＡおよび０．００５％ｗ／ｖトウィーン２０を含むＰＢＳ２５０マイクロリットル（ファージ希釈緩衝液）、その後二重に、調製したＣＯＬＯ  ２０５プレートのウェル内へ１００マイクロリットルを加え、反応体間の相互作用を可能にするように室温で３時間インキュベートした。プレートを３ｘ５分０．０５％ｗ／ｖトウィーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−トウィーン緩衝液）で洗浄し、ウェルにファージ希釈緩衝液で１：１０００に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）１００マイクロリットルを加えた。プレートは室温で２時間インキュベートし、３ｘ５分ＰＢＳ−トウィーン緩衝液で洗浄し、ＯＰＤ基質で色を発色させた。
結果（図１４）はＭＡｂ５５．１はＣＯＬＯ  ２０５細胞に結合するが、まｂ１９．９およびＣ２４２の結合はＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージで阻害可能であった、ＩＣ５０は１００マイクロリットルの容量で１０ｅ１２のファージ投入量。
結合親和性の計算は上記のようにアボガドロ数から誘導された。もし溶質１００マイクロリットル当たり６ｘ１０ｅ１９分子が１モル溶液に対応するとすると、１００マイクロリットル中の１０ｅ１２ファージは全粒子の１６．７ｎＭまたはファージにより表されたペプチドで８０ｎＭに相当する。従ってＣＯＬＯ  ２０５細胞上の抗原へのＭＡｂ５５．１の結合の５０％阻害を達成するのに必要とされるファージの濃度、すなわちＩＣ５０は２０−１００ｎｍのオーダーであることが推定できる。
配列
読者が誤り、脱落またはその他の矛盾に出会った場合、優先権のある特許ＵＫ９３２４９１８．３（３．１２．９３出願）およびＵＫ９４１１０８９．７（３．６．９４出願）に開示されている核酸およびアミノ酸配列を特に参照されたい。
配列表
（１） 一般情報：
（ｉ） 出願者：
（Ａ）名称：ＺｅｎｅＣＡ  Ｌｉｍｉｔｅｄ
（Ｂ）ストリート：１５  スタンホープ  ゲート
（Ｃ）市：ロンドン
（Ｅ）国：英国
（Ｆ）郵便コード（ＺＩＰ）：ＳＷＩＰ  ３ＪＦ
（Ｇ）電話：０７０７  ３２３  ４００
（Ｈ）ファックス：０７０７  ３２３  ７４５４
（Ｉ）テレックス：９４０２８５００ＩＣＩＣＧ
（ｉｉ）発明の名称：蛋白質
（ｉｉｉ）配列の数：３７
（ｉｖ）コンピューターで読み取り可能な形：
（Ａ）メディウム型：フロッピィーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパーティブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．０、
バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（ｖｉ）前出願データ：
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９３２４８１９．３
（Ｂ）出願日：１９９３年１２月３日
（ｖｉ）前出願データ：
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９４１１０８９．７
（Ｂ）出願日：１９９４年６月３日
（２） 配列ＩＤ番号：１の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１：
0003962087.tif 000017
（２） 配列ＩＤ番号：２の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２：
0003962087.tif 000018
（２） 配列ＩＤ番号：３の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型、ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３：
0003962087.tif 000019
（２） 配列ＩＤ番号：４の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：４：
0003962087.tif 000020
（２） 配列ＩＤ番号：５の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：５：
0003962087.tif 000021
（２） 配列ＩＤ番号：６の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：６：
0003962087.tif 000022
（２） 配列ＩＤ番号：７の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：７：
0003962087.tif 000023
（２） 配列ＩＤ番号：８の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：８：
0003962087.tif 000024
（２） 配列ＩＤ番号：９の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：９：
0003962087.tif 000025
（２） 配列ＩＤ番号：１０の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１０：
0003962087.tif 000026
（２） 配列ＩＤ番号：１１の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１１：
0003962087.tif 000027
（２） 配列ＩＤ番号：１２の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１２：
0003962087.tif 000028
（２） 配列ＩＤ番号：１３の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１３：
0003962087.tif 000029
（２） 配列ＩＤ番号：１４の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１４：
0003962087.tif 000030
（２） 配列ＩＤ番号：１５の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１５：
0003962087.tif 000031
（２） 配列ＩＤ番号：１６の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１６：
0003962087.tif 000032
（２） 配列ＩＤ番号：１７の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１７：
0003962087.tif 000033
（２） 配列ＩＤ番号：１８の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１８：
0003962087.tif 000034
（２） 配列ＩＤ番号：１９の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１９：
0003962087.tif 000035
（２） 配列ＩＤ番号：２０の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２０：
0003962087.tif 000036
（２） 配列ＩＤ番号：２１の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２１：
0003962087.tif 000037
（２） 配列ＩＤ番号：２２の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２２：
0003962087.tif 000038
（２） 配列ＩＤ番号：２３の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１５７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２３：
0003962087.tif 000039
（２） 配列ＩＤ番号：２４の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：９４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２４：
0003962087.tif 000040
（２） 配列ＩＤ番号：２５の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２５：
0003962087.tif 000041
（２） 配列ＩＤ番号：２６の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２６：
0003962087.tif 000042
（２） 配列ＩＤ番号：２７の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２７：
0003962087.tif 000043
（２） 配列ＩＤ番号：２８の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２８：
0003962087.tif 000044
（２） 配列ＩＤ番号：２９の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２９：
0003962087.tif 000045
（２） 配列ＩＤ番号：３０の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３０：
0003962087.tif 000046
（２） 配列ＩＤ番号：３１の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３１：
0003962087.tif 000047
（２） 配列ＩＤ番号：３２の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３２：
0003962087.tif 000048
（２） 配列ＩＤ番号：３３の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４４５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３３：
0003962087.tif 000049
0003962087.tif 000050
（２） 配列ＩＤ番号：３４の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３４：
0003962087.tif 000051
（２） 配列ＩＤ番号：３５の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３５：
0003962087.tif 000052
（２） 配列ＩＤ番号：３６の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３６：
0003962087.tif 000053
0003962087.tif 000054
0003962087.tif 000055
（２） 配列ＩＤ番号：３７の配列情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子型：蛋白質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３７：
0003962087.tif 000056
0003962087.tif 000057
【図１】
0003962087.tif 000061
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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