(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅用に全細胞含有サンプルを調製する方法であって、以下の工程を有する、
（ｉ）前記全細胞含有サンプルを、少なくとも一種類のドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液に接触させて核酸含有細胞を溶解する工程、
（ｉｉ）前記サンプルに対して、以下の式で表される少なくとも２つの鎖を有する非水溶性架橋化ポリヒドロキシル  ポリカルボン酸の一定量を添加する工程
【化１】
0003887014.tif 000009
ここで、各鎖におけるその少なくとも１つのマレオイル部分の１つのカルボニル基が、−ＨＮ［（Ｈ）ｐ（ＣＨ）２（ＯＨ）ｍ］ＮＨ−部分
に共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化部分を作り出す、
【化２】
0003887014.tif 000010
ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレンカルボン酸）鎖への架橋の比率が１：２〜２００：２であり、前記サンプル中のすべてのタンパク質を隔離するのに十分なものである、そして
（ｉｉｉ）前記サンプル中の核酸を回収する工程、ここで、この回収は、アルコール沈澱なしに行われる。
【請求項２】
対象の核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程を有する、
（ｉ）全細胞含有サンプルを、少なくとも一種類のドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液と接触させて核酸含有細胞を溶解させる工程、
（ｉｉ）前記サンプルに対して、以下の式で表される少なくとも２つの鎖を有する非水溶性架橋化ポリヒドロキシ  ポリカルボン酸の一定量を添加する工程
【化３】
0003887014.tif 000011
ここで、各鎖におけるその少なくとも１つのマレオイル部分の１つのカルボニル基が、−ＨＮ［（Ｈ）ｐ（ＣＨ）２（ＯＨ）ｍ］ＮＨ−部分
に共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化部分を作り出す、
【化４】
0003887014.tif 000012
ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは、１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレンカルボン酸）鎖への架橋の比率が１：２〜２００：２であり、前記サンプル中のすべてのタンパク質を隔離するのに十分なものである、
（ｉｉｉ）前記サンプル中の核酸を回収する工程、ここで、この回収は、アルコール沈澱なしで行われる、そして
（ｉｖ）前記核酸に対して、前記対象の核酸分子を特異的に増幅する増幅試薬を添加する工程。
【請求項３】
核酸増幅用に核酸含有細胞から核酸を回収するためのキットであって、以下のそれぞれについて各別のポーションを収納するように構成された容器手段を有する、
（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液、および
（ｉｉ）下記式の化合物のサンプル、
【化５】
0003887014.tif 000013
ここで，各鎖におけるその少なくとも１つのマレオイル部分の１つのカルボニル基が、−ＨＮ［（Ｈ）ｐ（ＣＨ）２（ＯＨ）ｍ］ＮＨ−部分
に共有結合して、その中で下記式の少なくとも１つの架橋化部分を作り出す、
【化６】
0003887014.tif 000014
ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレンカルボン酸）鎖への架橋の比率が１：２〜２００：２である。
【請求項４】
核酸増幅のために全細胞含有サンプルを調製する方法であって、以下の工程を有する、
（ｉ）前記全細胞含有サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液と接触させる工程、そして
（ｉｉ）前記サンプルに対して、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を、ドデシル硫酸ナトリウムの酵素抑制効果を抑制するのに十分な量だけ添加する工程。
【請求項５】
対象の核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程を有する、
（ｉ）前記対象の核酸分子を含む全細胞含有サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液と接触させる工程、
（ｉｉ）前記サンプルに対して、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を、ドデシル硫酸ナトリウムの酵素抑制効果を抑制するのに十分な量だけ添加する工程、そして
（ｉｉｉ）前記サンプルに対して、前記対象核酸分子を増幅させるための増幅試薬を添加する工程。
【請求項６】
核酸増幅用に核酸含有細胞から核酸を回収するためのキットであって、以下のそれぞれについて別々のポーションを収納するように構成された容器手段を有する、
（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム含有溶解緩衝液、そして
（ｉｉ）非フェニール基含有非イオン界面活性剤のサンプル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は核酸分子の純化に関する。より詳しくは、後の分析方法、特に、増幅アッセイに使用するための核酸分子の調製に関する。
【０００２】
背景および従来技術
特定の核酸分子の測定または、これら分子の発現の測定は、分析および臨床化学における非常に重要な側面をなす。この分野において、膨大な数の各種核酸アッセイが知られている。これらのアッセイのすべてが、共通の目的、即ち、サンプル中における特定の核酸分子の同定を有しているということができる。この目的を達成することによって、バクテリア又はウィルス感染などの感染の同定、組織の分類、個人の同定（いわゆる“ＤＮＡ指紋法”等が可能となる。
【０００３】
核酸アッセイにおける問題の１つは、目的とする物質、即ち、特定の核酸分子が、唯一又は非常に少ないコピーしか存在していないことにある。従って、所望の分子を実際に発見する可能性が最大となるように核酸分子を純化することに、多大な関心が持たれている。
【０００４】
核酸分子の純化として、古典的な技術が既に開発されている。これらの内で最も基本的なものの１つは、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他により、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２，ｐｐ．２８０−１）に記載されている。この方法は、プロテアーゼを使用して標的細胞を溶解し、その後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことを教示している。この方法は完了するのに非常に長い時間がかかり、しかも、危険な発ガン性物質を使用する。この方法に関する問題のいくつかが、ここに参考文献として含ませるミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）他、ＷＯ８９／０７６０３（１９８９年８月２４日）に記載されている。更に、上述のフェノール／クロロホルムに基づく方法は、例外なく、核酸分子をその溶媒から分離するために、エタノールやイソプロパノール等のアルコール沈澱剤を必要とする。所望の物質に対する損傷またはその物質の損失の危険性はきわめて高い。
【０００５】
この非常に基本的な技術において改良を続けることの必要性は、これを課題とする多数の特許および非特許刊行物を通じて見ることができる。これらの文献は、所望の核酸分子を得るための改良を目的としている。これらは、採用可能な数多くの各種アプローチを明示している。
【０００６】
例えば、カミンズ（Ｃｕｍｍｉｎｓ）の米国特許第５，２３１，０１５号は、溶解溶液中において金属イオンを使用することを教示している。このイオンは、自然発生する核酸分子ポリメラーゼに対する補因子である。その原理は、前記金属イオンが、元から存在するポリメラーゼが有する対象の核酸分子をコピーする潜在能力を改善するというものである。このような技術は、後に詳述する増幅方法において特に有用である。ファン・ネス（ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）他の米国特許第５，１３０，４２３号は、ＤＮＡの抽出において、ベンジルアルコール等のフェニール誘導体の使用における改良を主張している。コーラー（Ｋｏｌｌｅｒ）の米国特許第５，１２８，２４７号も同じ線に沿ったものであり、これは、細胞の溶解にカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤を使用し、その後、ヘパリン等の硫酸化多糖類タンパク質による処理を行うことを教示している。
【０００７】
マクファーレン（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ）の米国特許第５，０１０，１８３号は、核酸の純化において陽イオン界面活性剤を使用する技術を推奨しており、これに対して、米国特許第４，９０８，３１８号は、核酸分子を可溶化した後、界面活性剤で溶解を行い、その後、これらの核酸分子をスプーリング（ｓｐｏｏｌｉｎｇ）することを教示している。
【０００８】
リン（Ｌｉｎ）他の米国特許第５，２８４，９４０号は、増幅反応中におけるポリメラーゼインヒビタの活動を防止するためにトランスフェリン、グロブリン又は、血清アルブミンを使用することを示唆している。
【０００９】
上述した特許の大半は、後の増幅アッセイ、特に、周知のポリメラーゼ連鎖反応、“ＰＣＲ”技術での使用のためのサンプルの調製を扱っている。ここに参考文献として含ませるムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）他の米国特許第４，６８３，３０２号に記載されているように、この方法は、所望の核酸分子の複数コピーを、単数または複数種の核酸分子プライマを通して、サームス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）即ち、“Ｔａｑ”ポリメラーゼ等のポリメラーゼとの併用によっていかにして得ることが出来るかを示している。しかしながら、増幅された核酸分子を得る手順は、本質的に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他の手順と同じである。この技術の改良に対する要求は、例えば、ここに参考文献として合体する。カサリアル（Ｃａｓａｒｅａｌｅ）他の“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｆｏｒ  ＰＣＲ”ＰＣＲ法と応用（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ．１４９〜１５３）に見ることができる。この文献は、サンプル量の少なさ、応用の阻害、サンプルの安定性などを含むＰＣＲの本来的限界について論じている。カサリアル（Ｃａｓａｒｅａｌｅ）他は、熱と界面活性剤とを使用することによる核酸分子の単離の改善を報告している。使用した界面活性剤はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０であり、その化学名は、エチルフェノールポリ（エチレン グリコールエーテル）ｎであり、ここで“ｎ”は、通常約１１の整数である。その成功は、ＤＮＡ増幅の抑制を低下させたことによるものである。その他にも同様の主張をしているものがあり、例えば、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）他、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｐ．１９〜２１があり、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を、Ｔｗｅｅｎ  ２０と組み合わせて使用することによって、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を溶解剤に使用した溶解サンプル中においてＴａｑポリメラーゼの抑制を防止したとされている。ＳＤＳの効果は、増幅プロセスにおいて使用されるすべてのポリメラーゼを抑制することにある。前記界面活性剤の組合せによって、ＤＮＡとＭｇ２＋（Ｔａｑポリメラーゼのための補因子）が存在する場合に、３７℃において前述した問題を軽減することができたと主張されている。
【００１０】
ＳＤＳを中和するための界面活性剤の使用は、理論的には驚くべきことではない。ハーゼルベック（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ）他の“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｆ），ａｎｄ  Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ”，ｉｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：１〜４（１９８８）には、ＳＤＳの酵素に対する一般的抑制効果が記載されている。ハーゼルベック（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ）他は、更に、ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（オクチルフェノールポリ（エチレン グリコール エーテル）ｎ、ここで“ｎ”は約１０）が、リストアップされた酵素に対するＳＤＳの効果を抑制することを示している。但し、一般化はされておらず、事実、後述するように、増幅プロセスに対するＳＤＳのインパクトを除去することにおける界面活性剤の効果に関し、広く一般化することは不可能である。
【００１１】
上述した技術の大半が、本発明によって対象とされる問題の１つを指し示している。要約すると、細胞の溶解に使用され、これによって増幅のための核酸を遊離させる薬剤として、ドデシル硫酸ナトリウム、即ち“ＳＤＳ”が含まれることが多い。しかし、ＳＤＳには、増幅反応を行うために必要なポリメラーゼを抑制するという望ましくない副作用がある。
【００１２】
当該技術における更に別の問題は、可能な限り短時間で非常に純度の高い核酸サンプルを得ることにある。細胞が溶解されるとき、目標とする核酸分子以外の物質が放出されるが、これらの物質は汚染物質と見なさなければならない。全血液サンプルの場合、核酸の量に対して、放出されるタンパク質の量が多ければ特に重大な問題が生じる。ポルフィリン環含有化合物、特に、ヘムとその誘導体は、特に悪名高いポリメラーゼインヒビタである。これらの物質をサンプルから除去することが、非常に重要であることは明らかである。
【００１３】
上述したアルコール沈澱法は、不純物から核酸分子を分離する１つの方法である。出願人らは、この方法の欠点をここで繰り返すことはしないが、アルコール沈澱工程を必要とせずに、純度の高い核酸分子のサンプルを迅速かつ効率的に得られることが望ましい。このようにして純化された核酸分子が、即座に増幅プロセスに使用可能であるような方法を達成することが更に望ましい。
【００１４】
ここに、その全部を参考文献として含ませるクルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）の米国特許第５，２９４，６８１号には、水不溶性の架橋化ポリヒドロキシ ポリカルボキシル酸分子が記載されている。これらの分子は、
【００１５】
【化７】
0003887014.tif 000002
【００１６】
であり、ここで、各鎖におけるその少なくとも１つのマレオイル部分（Ｍａｌｅｏｙｌｍｏｉｅｔｙ）のカルボキシル基は、
−ＨＮ［（Ｈ）ｐ（ＣＨ２）（ＯＨ）ｍ］ＮＨ−部分
に共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化部分を作り出す。
【化８】
0003887014.tif 000003
【００１７】
ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレンカルボン酸（ａｌｋｙｌｅｎｅ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））鎖への架橋の比率が１：２〜２００：２であるものが水性媒質からのタンパク質の回収に有効であると記載されている。前記分子は、サンプル中のタンパク質を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）。ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥとして知られているこの特許に基づく製品が市販されている。しかし、この商品は、その中に使用されている特定の酸の概要を示しておらず、その特許に言及しているに過ぎない。
【００１８】
クルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）は、その新規な分子のタンパク質からのＤＮＡの単離における一般的な使用について記載しているが、その方法については一般的にしか説明しておらず、常にグアニジウム チオシアネート水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｑｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、及び溶解剤について言及している。これらの方法は、すべて、アルコール等を使用した核酸の沈澱を併用する方法として報告されている。
【００１９】
従って、当該技術においては、望ましいタンパク質の分離が、望ましくないＤＮＡの沈澱と関連づけられているという別の問題がある。
【００２０】
今回、まず、ＳＤＳの界面活性剤に基づく不活性化についての一般化が、核酸の増幅のためのサンプルの調製においては不可能であるということが判った。これは、特に、非イオン界面活性剤について当てはまり、ここでは、“Ｔｒｉｔｏｎ”ファミリの界面活性剤などのフェニール基含有界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウムを抑制する作用がないということが判った。従って、本発明の一態様は、ドデシル硫酸ナトリウムを抑制するために、フェニール基を有さない非イオン界面活性剤のみを使用することが可能であり、これによって、全細胞からの核酸サンプルの純化の改善が達成されるという驚くべき認識に基づくものである。
【００２１】
本発明の第２の態様は、
【００２２】
【化９】
0003887014.tif 000004
【００２３】
下記の式の架橋化されたポリヒドロキシ  ポリカルボン酸であって、各鎖におけるその少なくとも１つのマレオイル部分の１つのカルボニル基が、
−ＨＮ［（Ｈ）Ｐ（ＣＨ２）（ＯＨ）ｍ］ＮＨ−部分
に共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化部分を作り出す。
【００２４】
【化１０】
0003887014.tif 000005
【００２５】
ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレンカルボン酸）鎖への架橋の比率が１：２〜２００：２であるものが核酸の純化のための方法に使用可能であり、これによってアルコール沈澱工程を除外することができる。これらの化合物の使用によってＳＤＳを抑制することもでき、従って、単体または、上述した界面活性剤と共に使用することができる。
【００２６】
これらの方法は、別々、あるいは一緒に使用することが可能である。本発明のこれら及びその他の態様は、以下の開示から理解されるであろう。
【００２７】
好適実施形態の詳細な説明
例１
この例は、後記の例２及び３において言及されているポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）を行うためのプロトコルを記載するものである。
サンプルの調製後、前記β−グロブリン遺伝子の１．５キロベースのセグメントを増幅した。サンプルに、次のＰＣＲ試薬を添加した。
蒸留水                ７０部
反応緩衝液            １０部
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２      ６部
サンプルＤＮＡ        １０部
ｄＮＴＰｓ              ２部
プライマＡ              １部
プライマＢ              １部
【００２８】
プライマＡの配列は、
0003887014.tif 000006
であった。
【００２９】
プライマＢの配列は、
0003887014.tif 000007
であった。
【００３０】
これらの試薬に、下記のサイクルプロトコルにおいて説明するように、０．５μｌのサームス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）を添加した。
第１サイクルは次の通りであった。
変成（９７℃、７分間）
アニーリング（５９℃、１分間）。
休止後、５９℃の温度を維持しながら、各サンプルに対して０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを添加。
重合化（７２℃、２分間）
これは一度行い、その後、下記を３０サイクル行った。
変成（９４℃、１分間）
アニーリング（６０℃、２．５分間）
重合化（７２℃、２分間）。
最後に、１サイクル延長を行った（７２℃、７分間）。ＤＮＡを、２．０％ＬＥアガロースゲル上で分画し、コントロールと共に、前記ゲルの一部であるレーンに分子量マーカを付けた。これらのゲルは、図面に示されているものであり以下の諸例において説明する。
【００３１】
例２
この実験とその後の実験のため、以下の試薬を使用した。
（ｉ）赤血球細胞溶解緩衝液：  １４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６５）；
（ｉｉ）白血球細胞溶解緩衝液：  ６種類の選択肢の内の１つ、それぞれの選択肢において、１０ｍＭのＴｒｉｓと０．１％のＳＤＳとを添加した。これらの種々の塩濃度の１つを使用した（５０，１００又は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）。ｐＨは、６又は７であった。これによって、次の６種類の溶解緩衝液が調合された。
５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，
０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）
１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，
０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，
０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）。
【００３２】
各サンプルランにおいて、１ｍｌの前記赤血球細胞溶解緩衝液に、５００μｌの全血液を添加した。次に、この混合物を５分間、インキュベートし、その後、これを２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。インキュベーションの時間は、適宜変更可能である。これによって、ペレットと上清とが作られた。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの新しい赤血球細胞溶解緩衝液中にて再懸濁させた。この新しい溶液を、２５００ｒｐｍで３分間回転させた。その結果得られたペレットを、次に、前述の６種類の白血球細胞溶解緩衝液の１つの中で懸濁させた。この新しい懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。加熱後、サンプルを下記の選択肢の１つにおいて使用した。
【００３３】
例３
例２において調製した懸濁液に、７００μｌのＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを添加した。この混合物を、５分間インキュベートし、次に、遠心分離機でフルスピードで５分間回転させた。
【００３４】
サンプルを、例１で述べたようにして、ポリメラーゼ連鎖反応において使用した。増幅後、増幅産生物を、２．０％ＬＥのアガロースゲル上に流した。
【００３５】
その結果を、前記実験のゲルを示すここに添付の図１Ａ，１Ｂ及び１Ｃに示す。各ケースにおいて、
ゲルのレーン１は、分子量マーカを示している。
レーン２はコントロールである。
【００３６】
図１Ａにおいて、レーン３及び４は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥなしで、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６）を使用した場合の結果を示し、レーン５及び６は、前記緩衝液にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを添加した場合に得られた結果を示す。レーン７及び８において、緩衝液は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥなしの、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６）であった。レーン９及び１０においては、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを含む、高級塩緩衝液を使用した。
【００３７】
図１Ｂは、図１Ａに示した結果に対応するものであるが、ここではｐＨは７であった。図１Ｃには、図１Ａと図１Ｂとに対応する結果が示されている。しかし、ここでは、レーン３は、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳをｐＨ６で使用した。レーン４及び５は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥが使用されていることを除いては同じである。レーン６は、ｐＨが７であることを除いてはレーン３に対応している。レーン７は、ｐＨが７であることを除いてはレーン４及び５に対応している。
【００３８】
図１Ａ，１Ｂ及び１Ｃに示した結果は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した場合、信号が明白に改善されていることを示している。この結果は、前記濃度、あるいはｐＨとは独立したものであり、従って、その結果を、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥの存在のみに帰することができる。
【００３９】
例４
この実験は、非イオン界面活性剤をＳＤＳと組み合わせて使用した場合を記載する。これは、前者が後者の効果を中和し、これによってサンプルのＰＣＲ分析を可能にすることを示すものである。
【００４０】
５００μｌの全血液に、例３において説明した１ｍｌの赤血球細胞溶解緩衝液を添加した。これらの物質を、５分間振動（ｒｏｃｋｅｄ）（即ち、インキュベート）させ、その後、２５００ｒｐｍで５分間回転させた。前述した例２と同様、インキュベーションの時間は適宜変更可能である。前記ペレットに、追加の１ｍｌの赤血球細胞溶解緩衝液を添加し、その後、２５００ｒｐｍで３分間回転させた。
【００４１】
次に、得られたペレットに、５００μｌの白血球細胞溶解緩衝液を添加した。第１組のテストにおいて、この溶解緩衝液は以下の１つを有していた。
ａ．ＳＤＳのみ
ｂ．Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のみ
ｃ．ＳＤＳ＋Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
ｄ．ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ２０
ｅ．Ｔｗｅｅｎ  ２０のみ
【００４２】
第２組のテストにおいて、下記のように、前記緩衝液にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥも添加した。
ａ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ、
その後Ｔｗｅｅｎ  ２０
ｂ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次にＴｗｅｅｎ  ２０、
その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ
ｃ．ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ２０（溶解緩衝液）、
次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ
ｄ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次に、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ
【００４３】
前記第１組のテストにおいて、サンプルに溶解緩衝液を添加し、その後、６５℃で５分間加熱し、その後、例１と同様にしてポリメラーゼ連鎖反応を行った。前記第２組のテストにおいて、まず、前記溶解緩衝液を添加し（“ａ”と“ｂ”と“ｄ”とにおいてはＳＤＳのみ、又は、“ｃ”においてはＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ２０）、次に、これらサンプルを第１組のテストと同様に加熱した。その後、残りの試薬を添加した（“ａ”においては、まずＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ、次に、Ｔｗｅｅｎ  ２０；“ｂ”においては、まずＴｗｅｅｎ  ２０、次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ；“ｃ”と“ｄ”においては、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥのみ）。
図２及び３にその結果を示す。
【００４４】
図２において、レーン１及び１１は分子量マーカである。レーン２及び３は、ＳＤＳのみを使用した場合に得られた結果である。レーン４及び５は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のみを使用した場合の結果である。レーン６及び７は、ＳＤＳとＴｒｉｔｏｎとの組合せ、そして、レーン８及び９は、ＳＤＳとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、同時にではなく、順番に使用した場合を示している。レーン１０はコントロールである。
【００４５】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合のレーン４及び５におけるバンドに注目されたい。しかし、ＳＤＳを使用したときにはバンドがなく、これは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がＳＤＳを不活性化することができなかったことを示している。
【００４６】
これに対して、図２ｂに示されている結果は、Ｔｗｅｅｎ  ２０は、確かにＳＤＳを不活性化したことを証明している。図２ｂにおいて、レーン１は、分子量マーカを示している。レーン２及び３は、ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ２０（同時使用）の使用を示している。レーン４及び５は、これらの物質を順番に使用した場合の結果を示している。レーン６及び７は、ＳＤＳのみを使用した場合の結果であり、レーン８及び９は、Ｔｗｅｅｎ２０のみの場合。レーン１０はコントロールである。
【００４７】
図３Ａ及び３Ｂにおいて、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した場合が示されている。図３Ａにおいて、レーン１は分子量マーカであり、レーン１２はコントロールである。レーン２及び３は、ＳＤＳとＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥとを使用し、レーン６及び７はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と組み合わせてＳＤＳを使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。レーン８および９においては、ＳＤＳの後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用し、その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した。レーン１０及び１１においては、ＳＤＳの後でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。図３Ｂにおいて、レーン１及び１２は図３Ａと同じである。レーン２及び３は、ＳＤＳの後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥと更にその後でＴｗｅｅｎ  ２０の使用を示している。レーン４及び５は、ＳＤＳの後でＴｗｅｅｎ２０と、更にその後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥの使用を示す。レーン６及び７は、ＳＤＳをＴｗｅｅｎ２０と使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。レーン８及び９はＳＤＳの使用後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用したものである。レーン１０及び１１は、ブランクであった。
各ケースにおいて、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥは標的配列の増幅を容易にした。
【００４８】
上述した諸例は、核酸の増幅などのアッセイのために核酸分子を調製するための方法に関する本発明を記載するものである。本発明の一態様において、全細胞サンプルは、その中に含まれる核酸を放出させるために溶解される。その後、前述した、又、その開示内容をここに参考文献として含ませるクルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）の米国特許第５，２９４，６８１号に記載された少なくとも一種類の非水溶性の架橋化ポリヒドロキシポリカルボキシル酸を添加する。これらの物質を含有している試薬は、登録商標ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥのもとで入手可能であるが、その構造の詳細は、この製品からは知ることができない。しかし、前記クルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）特許には、前記ポリカルボキシル酸をいかにして得るかについての十分な詳述が含まれている。
【００４９】
前記ポリカルボキシル酸の添加後、サンプル中の核酸を、従来のそれらを沈澱させるためのアルコールの添加工程なしで、直接に回収することができる。その結果、所望の場合には、そのサンプルを、核酸増幅に必要な試薬と即座に接触させることができる。このような試薬としては、例えば、サームス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ヌクレオチドポリメラーゼや、例えばＰＷＯポリメラーゼのためのその他の等価な酵素がある。これらの試薬に、更に、多くの周知の核酸増幅のプロトコルに従って、例えば適当なプライマ、デオキシヌクレオチド、緩衝液などを含ませてもよい。核酸増幅のためのファミリの中には、現在では既に古典的となっているポリメラーゼ連鎖反応すなわち“ＰＣＲ”や、リガーゼ連続反応すなわち“ＬＣＲ”があり、これらのすべては当業者にとって知られているので、ここでリストアップする必要はない。
【００５０】
ここに記載した方法を使用して、核酸を含有するあらゆる細胞から核酸を得ることができる。（尚、この点に関して、例えば赤血球細胞は核酸を含んでいない）。ほ乳類細胞などの真核細胞が処理されることが好ましく、特に、ヒトの細胞が好ましい。このように処理可能な多数のヒト細胞の内、純化されたサンプルとして、あるいは、全血液サンプルの一部として、白血球細胞を処理することが特に好適である。
【００５１】
上記概説した調製方法は、種々な細胞タイプに適用可能である。前に挙げた技術によって示されているように、種々の細胞を各種溶解剤によって溶解し、その核酸を放出させることはよく知られている。従って、前記細胞サンプルを処理しているときには、１つは赤血球細胞用、もう１つは白血球細胞用の２つの異なった溶解緩衝液を利用すると便利である。ここでも、前に挙げた技術によって示されているように、様々な緩衝液は当業者にとって周知である。
【００５２】
前記ポリカルボキシル酸を使用するに当たって、溶解後、但し、そのポリカルボキシル酸を添加する前に、サンプルを加熱することが特に好ましい。この加熱は、好ましくは、約５０℃〜約７０℃の範囲の温度で、少なくとも１分間行われる。好ましくは、この加熱工程は、１０分間以下である。
【００５３】
更に、サンプルからの核酸の純度を更に高めるために、サンプルに対するポリカルボキシル酸の添加後に遠心分離工程を利用することも可能である。ここでも、遠心分離のプロトコルは周知である。
【００５４】
上記概説した本発明の方法による核酸の単離後、これらの核酸を後の使用のために保存することも可能であるし、あるいは、すぐに増幅を行うことも可能である。後者の場合、遊離された核酸分子のアリコットに対して直接増幅試薬を添加すると、反応が始まる。
【００５５】
本発明の別の態様は、例えば、（ｉ）非イオン性で、かつ、（ｉｉ）フェニール基を含まない界面活性剤の、ドデシル硫酸ナトリウム、即ち“ＳＤＳ”も含有する溶解緩衝液中での使用を例示した。ＳＤＳは、溶解剤において、標準的で、ほとんどいたるところに見られる物質である。前記諸例によって指摘したように、フェニール基を含有しない、非イオン界面活性剤を使用することによって、ＳＤＳによる酵素抑制の問題を避けることができるのである。
【００５６】
より正確には、ポリ（オキシエチレン）ｎ−ソルビタン−モノラウレート、“ｎ”は通常２０、でありＴｗｅｅｎ２０と称され、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を使用することが好ましい。本発明において有用なその他の物質には、モノ−ラウレートではなくモノオレエートのＴｗｅｅｎ２０、Ｎ−（Ｄ−グルコ−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル）−Ｎ−メチルデカンアミドである“ＭＥＧＡ−１０”、Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコルアミド，１−０−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グリコピラノシド，１−０−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル（１?４）α−Ｄ−グルコピラノシド、６−０−（Ｎ−ヘプチル−カルバモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−（Ｄ−グルコ−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル）−Ｎ−メチルオクタンアミド、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドであるＤｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ラウリン酸シュクロースエステル“Ｂｒｉｊ−３５”又はドデシルポリ（オキシエチレングリコールエーテル）２３、“Ｇｅｎａｐｏｌ  Ｘ−０８０”又はイソトリデシルポリ（エチレン  グリコール  エーテル）ｎ、ここでｎは８、ポリエチレンコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｃｏｌ）−ポリプロピレングリコールーコポリマである“Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ＰＥ／Ｆ６８”、ポリエチレングリコール−ポリプロピレン  グリコール  コポリマである“Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ＰＥ／Ｆ１２７”、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、ここで“ｎ”は９、である“Ｔｈｅｓｉｔ”が含まれる。具体的に除外されるものは、その構造中にフェニール基を含む“Ｔｒｉｔｏｎ”界面活性剤である。この含まれるものと除外されるものとのリストはまだまだ続くが、以上挙げたものに加えてその他の非イオン界面活性剤も当業者にとって周知であると推定される。上述したポリカルボン酸の使用と同様に、上に挙げたもの全部を含めて、溶解が完了した後、それによって遊離された核酸分子を増幅反応に使用することができる。
【００５７】
尚、当業者は、本発明が、核酸分子を純化、回収および／又は増幅するのに使用されるキット（ｋｉｔｓ）をも含むものであることを理解するであろう。その最も広い範囲において、このようなキットは、ここに記載した物質の別のポーションとともに、単数または複数の溶解試薬のポーションを有する。例えば、本発明の一実施形態は箱などの容器手段を有し、この容器手段は、白血球細胞溶解剤と、ここに記載したポリカルボキシル酸とのそれぞれの別々のポーションを収納している。この第１実施形態を改変した別の実施形態において、前記溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウムを含有し、そのキットの第２アイテムは、非フェニール基含有非イオン界面活性剤である。これらのキットに、更に、サームス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ、あるいはその他の重合酵素のサンプルを含ませてもよい。これらのキットをＨＩＶアッセイやその他類似のテスト等の特定のシステムにおける使用に構成する場合には、関連するプライマの別のポーションも含ませることができる。
本発明のその他の特徴は当業者にとって明らかであり、ここに繰り返す必要はない。
【００５８】
尚、本明細書および諸例は本発明を例示するものであって限定するものではなく、本発明の精神および範囲内のその他の実施形態も当業者にとって自明であると理解される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトの白血球細胞ＤＮＡからの１．５キロベースのβ−グロブリンセグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応後に得られた結果を示す。
図１Ａは、塩濃度を変化させながらｐＨを一定（ｐＨ６）にした場合の効果に関する研究を示す。
図１Ｂは、ｐＨを一定（ｐＨ７）に維持して、塩濃度を変化させた場合に得られた結果を示す。
図１Ｃは、塩濃度を一定に保ち、ｐＨを変化させた場合の結果を示す。
図１Ａ及び１Ｂにおいて、使用した塩濃度は１００ｍＭと１５０ｍＭであり、図１Ｃにおいての濃度は５０ｍＭであった。図１Ａにおいて使用したｐＨは６であり、図１Ｂでは７、そして図１Ｃでは６と７との両方であった。
【図２】図２は、フェニール基含有非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用してドデシル硫酸ナトリウムの抑制を試みた場合に得られた結果を示す。
【図３】図３は、非フェニール基含有非イオン界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０をドデシル硫酸ナトリウムの抑制に使用した場合に得られた結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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