(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子を、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法で増幅し、標的遺伝子量の初期の濃度を測定して、その増幅された標的遺伝子について、T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)方法、SSCP(single strand conformation)方法、またはCFLP(cleavase fragment length polymorphism)方法で、多型解析することにより初期の標的遺伝子の量及び該遺伝子の多型の構成比もしくはその量の測定を行う定量的多型解析方法において、
前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法を、下記の蛍光消光プローブをプライマーとして用いて反応を行い、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする定量的多型解析方法。
蛍光消光プローブ：その５’末端において、又はその５’末端のリン酸基において、6-joe、BODIPY TMR（商標）、BODIPY FL（商標）、BODIPY FL/C3（商標）、BODIPY FL/C6（商標）、Alexa 488（商標）、Alexa 532（商標）の何れかの蛍光色素で標識した当該プローブが当該末端部において標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブにハイブリダイゼーションした標的遺伝子の末端塩基対部分から１ないし３塩基離れて、標的遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計され、当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させる蛍光消光プローブ。
【請求項２】
前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法が、標的遺伝子の増幅反応を指数関数的増幅期で停止させるものである請求項１に記載の定量的多型解析方法。
【請求項３】
前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法が、下記の蛍光消光プローブをプライマーとして用いて反応を行い、蛍光色素の発光の減少量を測定するものである請求項１又は２に記載の定量的多型解析方法。
蛍光消光プローブ：その５’末端において、又はその５’末端のリン酸基において、6-joe、BODIPY TMR（商標）、BODIPY FL（商標）、BODIPY FL/C3（商標）、BODIPY FL/C6（商標）、Alexa 488（商標）、Alexa 532（商標）の何れかの蛍光色素で標識されており、当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端において当該プローブと標的遺伝子とのハイブリッド複合体の塩基対が少なくともＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計され、かつ当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させる蛍光消光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な定量的多型解析方法、それに用いるリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法、及びそれに用いる蛍光消光プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ方法（蛋白質・核酸・酵素；３５巻、１７号、１９９０年、共立出版株式会社）で標的遺伝子を増幅し、それを多型解析する方法は、格段の技術的改良がなされて、現在、医学等の各分野で広く活用されている（実験医学、１５巻、７号、１９９７年、羊土社）。そして、各種疾病、特に免疫に係る病気の遺伝子からの解明がなされ、成果が得られている。
【０００３】
しかしながら、従来の多型解析方法においては、定量性をもたないＰＣＲを用いてなされていたために、また配列の類似した遺伝子の中で一つの標的遺伝子のみを増幅させる（例えば、活性汚泥から抽出した全ＤＮＡから一つの特定微生物種の１６ＳｒＲＮＡの遺伝子（ＤＮＡ）配列だけを増幅させる）ほど特異性がないために、標的遺伝子を増幅する前の初期の遺伝子の量や多型の構成比まで解析することが出来なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、増幅前の標的遺伝子の量及び該遺伝子の多型の構成比の測定を簡便かつ迅速に行う新規な多型解析方法、当該方法に用いる新規な定量的ＰＣＲ方法、当該定量的ＰＣＲ方法に用いる蛍光消光プローブ、当該定量的ＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する新規な解析方法、定量的ＰＣＲ方法用試薬キット、定量的多型解析方法用試薬キット、定量的ＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なＰＣＲ方法のデータ解析のための記録媒体、定量的多型解析方法で得られるデータを解析する方法をコンピュータに実行させるための手順のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、定量的ＰＣＲ方法のための解析装置および定量的多型解析のための解析装置を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するにあたり鋭意努力した結果、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法（遺伝子増幅方法）を用いて標的遺伝子を増幅したのち、その標的遺伝子について多型の解析を行うことにより、増幅前の標的遺伝子の量と該遺伝子の多型の構成比の測定が簡便、迅速かつ定量性よく行うことができるという知見を得た。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、
１）標的遺伝子を、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法で増幅し、標的遺伝子量の初期の濃度を測定して、その増幅された標的遺伝子について、T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)方法、SSCP(single strand conformation)方法、またはCFLP(cleavase fragment length polymorphism)方法で、多型解析することにより初期の標的遺伝子の量及び該遺伝子の多型の構成比もしくはその量の測定を行う定量的多型解析方法において、前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法を、下記の蛍光消光プローブをプライマーとして用いて反応を行い、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする定量的多型解析方法、
蛍光消光プローブ：その５’末端において、又はその５’末端のリン酸基において、6-joe、BODIPY TMR、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、BODIPY FL/C6、Alexa 488、Alexa 532の何れかの蛍光色素で標識した当該プローブが当該末端部において標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブにハイブリダイゼーションした標的遺伝子の末端塩基対部分から１ないし３塩基離れて、標的遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計され、当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させる蛍光消光プローブ。
又は、
２）前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法が、標的遺伝子の増幅反応を指数関数的増幅期で停止させるものである前記１）に記載の定量的多型解析方法、又は、
３）前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法が、下記の蛍光消光プローブをプライマーとして用いて反応を行い、蛍光色素の発光の減少量を測定するものである前記１）又は２）に記載の定量的多型解析方法、
蛍光消光プローブ：その５’末端において、又はその５’末端のリン酸基において、6-joe、BODIPY TMR、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、BODIPY FL/C6、Alexa 488、Alexa 532の何れかの蛍光色素で標識されており、当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端において当該プローブと標的遺伝子とのハイブリッド複合体の塩基対が少なくともＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブの塩基配列が設計され、かつ当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させる蛍光消光プローブ。
を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
先ず、本発明において使用する用語を以下のように定義する。
“標的遺伝子”とは、存在量の測定・定量若しくは定量的検出の対象である核酸または遺伝子のことをいう。当該遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドからなっている。また当該遺伝子は、これらの各種遺伝子が混在していてもよく、また、タンパク質類、多糖類等の高分子化合物類、アミノ酸類、糖類、ヌクレオチド類、塩基類、ビタミン類、無機化合物類等の低分子化合物類が混在してもよい。また、細胞の中に存在していてもよい。すなわち、特別な制限はない。細胞は真核細胞、原核細胞を問わない。また、細胞は種々の細胞が混在していてもよい。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。例えば、複合微生物系または共生微生物系における解析目的の特定遺伝子である。なお、精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば市販されている精製キットなどを使用して行うことができる。
【０００８】
“ＰＣＲ”とは、ポリメラーゼ・チイン・リアクション（polymerase chain reaction）のことであり、現在、分子生物学、分子細胞学、遺伝子工学等などで常用されている反応である。
“定量的ＰＣＲ方法”とは、ＰＣＲ前の標的遺伝子の存在量を、ＰＣＲを行って測定もしくは検出する方法である。
“蛍光消光プローブ”とは、蛍光色素で標識された核酸プローブで標的遺伝子にハイブリダイズしたとき、蛍光強度が減少するように設計されたプローブである。
【０００９】
“ＰＣＲにおけるプライマー、核酸プローブおよびハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション”とは、現在、分子生物学、遺伝子工学等で使用されている用語と同じ意味である。
【００１０】
“多型”とは、生物学的多型（polymorphisms）のことであるが、本発明においては、特に、その多型をもたらしている遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子）の多型である。現在分子生物学で使用されている意味と同じである。
“多型解析”とは、遺伝子にはどのような多型があるかを分析・解析することである。
【００１１】
現在、上記の多型解析方法には、SSOP（sequence specific oligonucleotide probe）方法、RFLP（restriction fragment length polymorphism）方法、T-RFLP（terminal restriction fragment length polymorphism）方法、SSCP（single strand conformation）方法、MPH方法、CFLP(cleavase fragment length polymorphism）方法、SSP（ssequences specific primer）方法、PHFA（preferential homoduplex formation formation assay）方法、SBT（sequence based typing）方法（ＰＣＲ方法、利用の手引き、中外医学社、１９９８年；蛋白質・核酸・酵素；３５巻、１７号、１９９０年、共立出版株式会社；実験医学、１５巻、７号（増刊号）、１９９７年）などがあるが、本発明においては、現在多型解析に用いられている方法はすべて使用できるが、特にT-RFLP方法、またはCFLP方法が好適に使用できる。
【００１２】
以下、本発明を順を追って具体的に説明する。
本発明の第一の特徴は定量的遺伝子増幅方法である。定量的遺伝子増幅方法は、定量性を有する方法であればどの方法でも採用できる。例えば、ＰＣＲ方法が好適に採用できる。その中でも定量的ＰＣＲ方法もしくはリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法がより好ましい方法である。それらの中でも、特に蛍光消光プローブを用いる本発明の新規なリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法が好適に採用できる。
従来公知の定量的ＰＣＲ方法には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ、Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ等の方法などを挙げることができる。
【００１３】
これら従来公知の定量的ＰＣＲ方法は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しくはインターカレーターを用いて、Ｍｇイオンの存在下に、温度を低温、高温を繰り返しつつ標的遺伝子を増幅し、増幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニタリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。
【００１４】
本発明の蛍光消光プローブを用いる定量的ＰＣＲ方法は、蛍光色素で標識したプローブを用いる方法であるが、当該プローブが標的遺伝子とハイブリしたときに蛍光発色が減少若しくは消光するように設計されたプローブを用いる定量的ＰＣＲ方法である。
例えば、蛍光消光プローブは、その末端において蛍光色素で標識されており、当該プローブが当該末端部において標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブにハイブリダイゼーションした標的遺伝子の末端塩基対部分から１ないし３塩基離れて、標的遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列が設計され、当該プローブが標的標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させるものが好適である。それらの中でも、蛍光消光プローブが３’末端または５’末端において蛍光色素で標識されているものがより好適である。
【００１５】
また、蛍光消光プローブは、その末端において蛍光色素で標識されており、当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端において当該プローブと標的遺伝子のハイブリッド複合体の塩基対が少なくともＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアー（ＧＣ塩基対）を形成するように、当該プローブの塩基配列が設計され、かつ当該プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、蛍光強度を減少させるものが好適である。それらの中でも、蛍光消光プローブが３’末端または５’末端において蛍光色素で標識されているものがより好適である。
【００１６】
この場合、標的遺伝子の塩基配列からどうしても５’または３’末端がＧまたはＣに設計できない場合は、標的遺伝子の塩基配列から設計したプライマーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に５’−グアニル酸または５’−シチジル酸を付加しても、本発明の目的は好適に達成できる。よって、本発明の蛍光消光プローブとは、標的遺伝子の塩基配列から設計したプローブの他に、当該プローブの３’または５’末端、好ましくは５’末端にに５’−グアニル酸または５’−シチジル酸を付加してなるプローブを含むものと定義する。
【００１７】
本発明において蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、プローブに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるもの、すなわち消光するものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）(FITC)若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）(TMR)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine）、テキサスレッド（Texas red）、ボデピー（BODIPY）FL（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）TMR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODIPY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）R6G（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げることができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY）FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6-jeo、ボデピー（BODIPY）FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なものとして挙げることができる。
【００１８】
本発明において用いる蛍光色素で標識したプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドで構成されており、その塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０である。そして、標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列のものであればよい。
【００１９】
本発明の蛍光色素で標識した蛍光消光プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチド製造方法で製造できる。化学合成法、またプラスミドベクター若しくはファージベクターなどを使用する微生物法などで調製できる（Tetrahedron letters、22巻、1859〜1862ページ、1981年；Nucleic acids Research、14巻、6227〜6245ページ、1986年）。なお、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製））。
蛍光消光プローブを定量的ＰＣＲ方法のプライマーとして使用する場合は、その調製において、フォワード（forward）型、リバース（reverse）型もしくはバックワード（backward）型のどちらに設計してもよい。
【００２０】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識するには、従来公知の標識法で行なうことができる（Nature Biotechnology、14巻、303〜308ページ、1996年；Applied and Environmental Microbiology、63巻、1143〜1147ページ、1997年；Nucleic acids Research、24巻、4532〜4535頁、1996年）。例えば、５’末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先ず、常法に従って５’末端を脱リンし、リボースの５’位炭素のＯＨ基にスペーサーもしくはリンカーとして−(CH2)n−SH、−（CH2）n-NH2などを導入する。また、リボースの５’または３’位のリン酸基にこれらのスペーサーもしくはリンカーを導入してもよい。それらのスペーサーもしくはリンカーに本発明の色素を結合させる。
【００２１】
これらの導入体は市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。この場合、ｎは３〜１２、好ましくは６〜１０である。このスペーサーもしくはリンカーのマーカプト基またはアミノ基に反応性を有する蛍光色素またはその誘導体を結合させることにより合成できる。このようにして合成される、蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは逆相などのクロマトグラフィーなどで精製して本発明の蛍光消光プローブとすることができる。
【００２２】
前記した本発明の蛍光消光プローブを使用する定量的ＰＣＲ方法により、短時間、簡便かつ特異的にで標的遺伝子を増幅することができる。そして、蛍光色素で５’末端が標識されている蛍光消光プローブを用いた場合は、蛍光色素で５’末端が標識された標的遺伝子が増幅されることになる。この場合、定量的ＰＣＲ方法を採用するが好適である（実験医学、１５巻、７号、１９９７年、羊土社）
【００２３】
使用する機器であるサーマルサイクラーは、現在市販されている各種の機器が便利に用いることができる。それは、リアルタイムモニタリングが可能かどうかを問わない。リアルタイムモニタリング可能な機器として、例えば、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System（SDS 7700）（Perkin Elmer Applied Biosytems社、USA）、LightCyclerTM Sytem（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なものとして挙げることができる。
【００２４】
遺伝子増幅は、従来公知の増幅反応条件で達成できる。増幅は一般に通常用いられている増幅度まで行うのがよい。標的遺伝子の増幅過程において、蛍光強度値を蛍光光度計で測定する。その変化量は増幅された遺伝子量に比例する。蛍光強度値の変化量を時間（ＰＣＲ方法の場合はサイクル数）の関数として、通常のグラフにプロットするとＳ字型（シグモイド）曲線になり、辺対数グラフにプロットすると、最初は指数関数と同様に直線状に増加し、その後穏やかなプラトーに達する曲線になる。
ＰＣＲ開始前の初期遺伝子量の定量性を向上させるための標的遺伝子の増幅の程度すなわち遺伝子増幅の反応を停止する時期は、多型系解析の目的に依存するので、特に限定されるものではない。すなわち、多型系の優先多型だけを解析する場合には、前記蛍光変化が観察され始めてから前記のプラトーに達する前までの任意の時間まで標的遺伝子を増幅させるのが好適である。最も好適には指数関数的増幅期（シグモイド曲線の中点（曲線の微分値が０になる点）に達する前）で反応を止めることである。しかし、多型系に含まれる多型全部を解析する場合、試行錯誤的に何回かの実験を行い、最良と考えられる増幅度を求め、反応系における多型を示す遺伝子全てが観察され得る程度まで増幅するのがよい。また増幅を複数回に分けて、すなわち複数の増幅度で実験を行い、総合的に結果を解析する方法も好適に採用される。それは、マイナーな多型は時間的に大きなラグ（遅延）を有するシグモイド曲線を描くようになるからである。
【００２５】
本発明の蛍光消光プローブをプライマーとして用いて、定量的ＰＣＲ方法、特にリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法を行った場合は、プライマーとしての蛍光消光プローブが標的遺伝子の増幅に次から次へと利用され、蛍光色素で５’末端が標識された標的遺伝子が増幅される。そして、増幅された標的遺伝子はお互いに対応する標的遺伝子とハイブリダイズする。ハイブリダイズすると、蛍光強度値が減少する。それで、蛍光強度の減少量をトーレスすることにより前記と同様にして最良な増幅度まで増幅反応を行えばよい。当該定量的ＰＣＲ方法も通常のＰＣＲ方法と同様の反応条件で反応を行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度が低濃度（１〜２ｍＭ）もしくは従来公知の高濃度（２〜４ｍＭ）である反応系で標的遺伝子の増幅を行うことができる。
【００２６】
前記の標的遺伝子の増幅反応前に、標準の遺伝子を用いて遺伝子の検量線を作成しておくのが好ましい。例えば、前記の本発明の蛍光消光プローブをプライマーとして用い、前記リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法を行った場合について記述する。
そして、蛍光強度の減少量をサイクル数の関数として、通常のグラフにプロットするとＳ字型（シグモイド）曲線になる。そして、減少速度の最も大きい時点のサイクル数と標的遺伝子量の初期のコピー数（ＰＣＲ開始前のコピー数）、すなわち初期の標的遺伝子とは指数関数的な関係にある。それらの時点のサイクル数とコピー数の関係の標準直線を作成しておけば、未知試料の標的遺伝子の最初のコピー数、すなわち最初の標的遺伝子量を求めることができる。
なお、前記の蛍光消光プローブを用いる定量的ＰＣＲ方法は、本発明者らによって開発された新規な方法である。
【００２７】
本発明の第二の特徴は、当該定量的ＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する新規な解析方法である。本発明の解析方法は、初期の標的遺伝子量をできるだけ正確に測定するには現在最も好適なものである。
【００２８】
先ず、データ解析方法について説明する。
当該方法は３つの特徴からなる。
第一の特徴は、各サイクルにおける増幅した遺伝子が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した遺伝子が蛍光消光プローブとハイブリダイズした、すなわちハイブリッド複合体を形成したときの反応系（例えば、アニーリン反応終了時の反応系、核酸伸長反応進行時またはその終了時の反応系）の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリリッド複合体が解離したときの反応系（例えば、変性反応終了時の反応系、アニーリング反応開始前の反応系）の蛍光強度値により補正する演算処理過程、すなわち、補正演算処理過程である。
【００２９】
補正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致するものであればどのようなものでもよいのであるが、具体的には、次の［数式１］あるいは［数式２］による処理過程を含むものを例示することができる。
【数１】
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n      ・・・［数式１］
【数２】
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n      ・・・［数式２］
［式中、
ｆn：［数式１］あるいは［数式２］により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した遺伝子が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した遺伝子がハイブリッド複合体を形成したときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリッド複合体が解離したときの反応系の蛍光強度値］。
なお、本過程においては、本過程で得られた補正演算処理値もしくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示および／または印字する過程を含むものである。
【００３０】
第二の特徴は、各サイクルにおける［数式１］あるいは［数式２］による補正演算処理値を次の［数式３］あるいは［数式４］に代入し、各サンプル間の蛍光変化割合すなわち蛍光消光率を算出し、それらを比較するデータ解析過程である。
【００３１】
【数３】
Ｆn＝ｆn／ｆa      ・・・［数式３］
【数４】
Ｆn＝ｆa／ｆn      ・・・［数式４］
［式中、
Ｆn：ｎサイクルにおける、［数式３］あるいは［数式４］により算出された蛍光変化割合すなわち蛍光消光率、
ｆn：［数式１］あるいは［数式２］による補正演算処理値
ｆa：［数式１］あるいは［数式２］による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、通常は例えば、１０〜４０サイクルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好適には２０〜３０サイクルのものが採用される。］。
なお、本過程においては、本過程で得られた算出値、比較値もしくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示および／または印字する過程を含むものであるが、［数式１］あるいは［数式２］による補正演算処理値については、それらの過程は含むものであっても、含まないものであってもよい。
【００３２】
第三の特徴は、i）［数式３］あるいは［数式４］により算出された蛍光変化割合すなわち蛍光消光率のデーターを用いて、［数式５］、［数式６］あるいは［数式７］による演算処理する過程、
【数５】
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）    ・・・［数式５］
【数６】
ｌｏｇb｛(１−Ｆn)×Ａ｝、ｌｎ｛(１−Ｆn)×ｂ｝    ・・・［数式６］
【数７】
ｌｏｇb｛(Ｆn−１)×Ａ｝、ｌｎ｛(Ｆn−１)×Ａ｝    ・・・［数式７］
【００３３】
［式中、
Ａ，ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のときは，｛(Ｆn−１)×Ａ｝は百分率（％）を表す。
Ｆn：［数式３］あるいは［数式４］により算出されたｎサイクルにおける蛍光変化割合すなわち蛍光消光率］、
【００３４】
ii）前記i）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
iii）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的遺伝子のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
iv）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的遺伝子のコピー数を求める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、i）→ii）→iii）→iv）の順からなる過程が好適である。
【００３５】
前記i）〜iv）の各過程においては、各過程で得られた演算処理値もしくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示および／または印字する過程を含むものであってもよい。
なお、［数式１］あるいは［数式２］による補正演算処理値、［数式３］あるいは［数式４］による算出処理値は、各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示および／または印字されても、されなくてもよいので、それらの過程は必要に応じて追加すればよい。
【００３６】
また、本発明は、前記の定量的ＰＣＲ方法に用いる試薬キット、前記のデータ解析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。
また、本発明は、前記のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とするデータ解析装置である。
【００３７】
本発明の第三の特徴は、前記のようにして本発明の定量的ＰＣＲ方法で増幅された遺伝子について、多型を解析する方法である。
そこで、多型解析方法について具体的に説明する。多型解析の各種方法の中でもT-RFLP方法が本発明において好適に利用できる。そこで、本発明の一つの例として、蛍光消光プローブをプライマーとして用いる定量的ＰＣＲ方法、特にリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法で、遺伝子を増幅し、かつＰＣＲ前の初期遺伝子量を測定する。そして、その増幅産物について、T-RFLP方法で多型を解析する方法につて記述する。なお、蛍光消光プローブをプライマーとして用いて増幅された遺伝子は５’末端が本発明の蛍光色素で標識されている。
（１）先ず、増幅産物を制限酵素で消化する。このとき制限酵素としては、現在公知のどのようなものでも用いられるが、例えば、Bso FI、Hha I、Hph I、Mnl I、Rca I、Alu I、Msp Iなどを挙げることができる。これらの中でも好ましいものとしては、Hha I、Alu I、Msp Iなど、最も好ましいものとしては、Hha Iである。消化反応条件は現在公知の遺伝子ついての通常の条件でよい。例えば、制限酵素としてHha Iを選んだ場合、１０単位の制限酵素濃度にて、３７℃、６時間反応させる。
【００３８】
（２）前記ようにして消化された遺伝子断片について、加熱変性して、一本鎖化することが好適である。この変性処理も公知の通常の条件で行うことができる。例えば、９７℃、５分処理後、氷中にて冷却する。
【００３９】
（３）遺伝子断片の分析・解析
本発明の多型解析方法では、蛍光色素で標識された遺伝子断片だけを、電気泳動方法、ＨＰＬＣ方法、シーケンサー方法などで分析し、解析することになる。
すなわち、蛍光強度値で各バンド、各ピークを検出する。検出は現在市販されている通常の分析機器を使って行うことができる。例えば、ABI 373A（ABI社のシークエンサー）、ABI377（ABI社のシークエンサー）、Biofocus 3000（バイオラット社）などを挙げることができる。
【００４０】
本発明において、前記分析で、複数のバンド、または複数のピークが出現することは多型が存在することになる。シングルバンドまたはシングルピークの場合は多型が存在しないとになる。各バンドまたは各ピークの蛍光強度値の比は、とりもなおさず多型の存在比になる。前記の本発明の定量的ＰＣＲ方法ではＰＣＲを行う前の標的遺伝子の量が測定されるので、この測定値に前記の多型の比を乗ずれば、多型の初期存在量が求められることになる。
多型に関して、このようにしてデータを出す方法は、本発明の蛍光消光プローブを用いる定量的ＰＣＲ方法を使用することにより初めて可能になるものである。
また、前記の定量的ＰＣＲ方法のための試薬キットを含有するかもしくは添付させることにより、便利な定量的多型解析用試薬キットになる。
また、前記の多型解析方法で得られるデータを解析する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体におて、前記のリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲのデータ解析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを合わせ記録せることにより、コンピュータ読み取り可能な定量的多型解析方法のデータ解析のためのより便利な記録媒体になる。
また、量的多型解析方法のための手段を有する多型解析装置において、ＰＣＲ方法のためのデータ解析装置を併設させることにより、便利な多型解析装置になる。
【００４１】
【実施例】
次に実施例をもって、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本実施例をもって本発明は限定されるものではない。
実施例１
蛍光消光現象を有する本発明の蛍光消光プローブの標的遺伝子の塩基選択性、即ち、塩基特異性を検討した。下記に示す標的遺伝子（デオキシリボオリゴヌクレオチド）（３０ｍｅｒ）のpoly a〜jの１０種類をＤＮＡ合成機ABI 394(Perkin Elmer社製、米国）で調製した。
【００４２】
更に、上記の標的遺伝子に対応するデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーFLで標識した下記に示す本発明の蛍光消光プローブを調製した。
当該デオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基に、-(CH2)6−NH2を結合したものをメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits）F-6082（ボデピーFLのプロピオン酸サクシニジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinidyl esters）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入の前記デオキシリボオリゴヌクレオチドに作用させて下記のボデピーFLで標識した本発明の蛍光消光プローブprobe a〜d、及びf〜hを合成した。そして対応する標的遺伝子とハイブリダイゼーションしたときに、蛍光強度がどの程度減少するか（すなわち、消光の程度）を下記の条件下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。
【００４３】
なお、前記合成物の精製は以下のように行った。
合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。さらに逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２mMより目的物を５０％の収率で得た。
【００４４】
逆相クロマトグラフィーの条件：
溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント（gradient）用）：0.05N  TEAA 40%CH3CN
カラム：CAPCELL PAK C18; 6×250mm
溶出速度：1.0ml/min
温度：４０℃
検出：２５４nm
【００４５】
名称          標的遺伝子
poly a    5'ATATATATTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTT3'
poly b    5'ATATATATTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTT3'
poly c    5'ATATATATTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTT3'
poly d    5'ATATATATTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTT3'
poly e    5'ATATATATTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTT3'
【００４６】
名称          標的遺伝子
poly f    5'ATATATATTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTT3'
poly g    5'ATATATATTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTT3'
poly h    5'ATATATATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTT3'
poly i    5'ATATATATTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT3'
poly j    5'ATATATATTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTT3'
【００４７】
名称            本発明の蛍光消光プローブ
probe a     3'TATATATAAAAAAAACAA5'-BODIPY FL/C6
probe b     3'TATATATAAAAAAAAACA5'-BODIPY FL/C6
probe c     3'TATATATAAAAAAAAAAC5'-BODIPY FL/C6
probe d     3'TATATATAAAAAAAAAAA5'-BODIPY FL/C6
【００４８】
名称            本発明の蛍光消光プローブ
probe f    3'TATATATAAAAAAAAGAA5'-BODIPY FL/C6
probe g    3'TATATATAAAAAAAAAGA5'-BODIPY FL/C6
probe h    3'TATATATAAAAAAAAAAG5'-BODIPY FL/C6
【００４９】
（１）ハイブリダイゼーション溶液のコンポーネント
合成ＤＮＡ                                  ３２０ｎＭ（終濃度）
核酸プローブ                                  ８０ｎＭ（終濃度）
ＮａＣｌ                                      ５０ｍＭ（終濃度）
ＭｇＣｌ2                                       １ｍＭ（終濃度）
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）          １００ｍＭ（終濃度）
ミリＱ純水                                      １．６９９２ｍｌ
終全量                                    ２．００００ｍｌ
（２）ハイブリダイゼーションの温度：５１℃
（３）測定条件：
励起光          ：５４３ｎｍ
測定蛍光色      ：５６９ｎｍ
【００５０】
【表１】
0003965872.tif 000002
【００５１】
その結果を表１に示した。表１から分かるように、蛍光色素で標識された蛍光消光プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部において、当該プローブと標的遺伝子とがハイブリダイゼーションした末端塩基対部分においてＧＣペアーを形成しているか、または末端塩基対部分から１〜３塩基離れて、標的遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることを示している。
【００５２】
実施例２
下記のような塩基配列の標的遺伝子（デオキシリボオリゴヌクレオチド）と本発明の蛍光消光プローブを調製した。標的遺伝子内のＧ及び本発明の核酸プローブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして調べ、その結果を表２にまとめた。
【００５３】
名称          標的遺伝子
poly k     5'TATATATATATTTTTGGGGG3'
poly l     5'TATATATATATTTTTTGGGG3'
poly m     5'TATATATATTTTTTTTTGGG3'
poly n     5'TATATATATTTTTTTTTTGG3'
poly o     5'TATATATATTTTTTTTTTTG3'
【００５４】
名称          標的遺伝子
poly p     5'TATATATATATTTTTCCCCC3'
poly q     5'TATATATATATTTTTTCCCC3'
poly r     5'TATATATATTTTTTTTTCCC3'
poly s     5'TATATATATTTTTTTTTTCC3'
poly t     5'TATATATATTTTTTTTTTTC3'
poly u     5'TATATATATTTTTTTTTTTT3'
【００５５】
名称            蛍光消光プローブ
probe k     3'ATATATATATAAAAACCCCC5'-BODIPY FL/C6
probe l     3'ATATATATATAAAAAACCCC5'-BODIPY FL/C6
probe m     3'ATATATATATAAAAAAACCC5'-BODIPY FL/C6
probe n     3'ATATATATATAAAAAAAACC5'-BODIPY FL/C6
probe o     3'ATATATATATAAAAAAAAAC5'-BODIPY FL/C6
【００５６】
名称            蛍光消光プローブ
probe p     3'ATATATATATAAAAAGGGGG5'-BODIPY FL/C6
probe q     3'ATATATATATAAAAAAGGGG5'-BODIPY FL/C6
probe r     3'ATATATATATAAAAAAAGGG5'-BODIPY FL/C6
probe s     3'ATATATATATAAAAAAAAGG5'-BODIPY FL/C6
probe t     3'ATATATATATAAAAAAAAAG5'-BODIPY FL/C6
probe u     3'ATATATATATAAAAAAAAAA5'-BODIPY FL/C6
【００５７】
【表２】
0003965872.tif 000003
【００５８】
表２から分かるように、蛍光消光プローブが標的遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部においてハイブリダイゼーション物の塩基対がＧとＣのペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることが分かる。
【００５９】
実施例３
下記のような塩基配列の標的遺伝子と蛍光消光プローブを調製した。標的遺伝子内の塩基種および蛍光消光プローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様にして調べ、その結果を表３にまとめた。
【００６０】
名称          標的遺伝子
poly W    5'CCCCCCTTTTTTTTTTTT 3'
poly X    5'GGGGGGAAAAAAAAAAAA 3'
poly Y    5'TTTTTTCCCCCCCCCCCC 3'
poly Z    5'AAAAAAGGGGGGGGGGGG 3'
【００６１】
名称            蛍光消光プローブ
probe  w      BODIPY FL/C6-5'AAAAAAAAAGGGGGG 3'
probe  x      BODIPY FL/C6-5'TTTTTTTTTCCCCCC 3'
probe  y      BODIPY FL/C6-5'GGGGGGGGGAAAAAA 3'
probe  z      BODIPY FL/C6-5'CCCCCCCCCTTTTTT 3'
【００６２】
【表３】
0003965872.tif 000004
表３から、本発明の蛍光消光プローブの蛍光強度の減少にＧが深く関与していることが分かる。
【００６３】
結果として、前記の実施例から、(A)蛍光色素で標識される蛍光消光プローブの末端がＣで構成され、標的遺伝子がハイブリダイゼーションしたとき、ＧＣペアーを形成する場合、(B)蛍光色素で標識される蛍光消光プローブの末端がＣ以外の塩基で構成されているとき、蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標的遺伝子の塩基との末端塩基ペアーより、標的遺伝子の３’末端側にＧが少なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度の減少率が大きいことが分かる。
【００６４】
実施例４
本発明の蛍光消光プローブに標識する色素の種類について、前記実施例と同様にして調べた。なお、当該プローブは、前記実施例３の蛍光消光プローブｚを、また、標的遺伝子は前記実施例３の標的遺伝子ｚを用いた。
その結果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用いる蛍光色素として好適なものは、FITC、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、6-joe、TMRなどを挙げることができる。
【００６５】
【表４】
0003965872.tif 000005
【００６６】
実施例５
蛍光色素BODIPY FLで修飾した蛍光消光プローブEu47FおよびEu1392Rの調製
（５−１）蛍光消光プローブEu47Fの合成
（5')CITAACACATGCAAGTCG(3')（I=inosine）の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基に、実施例１と同じようにしてボデピーFLで標識した蛍光消光プローブEu47Fを合成した。
【００６７】
（５−２）蛍光消光プローブEu1392Rの合成
（5')TTGTACACACCGCCCGTCA(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを用いて、前記（５−１）と同様にして、本発明の蛍光消光プローブEu1392Rの合成した。
【００６８】
実施例６
（６−１）大腸菌JM109株の培養
５３培地（組成：カゼインペプトン（カゼインのトリプシン消化物）、10g；酵母エキス、5g；グルコース、5g；食塩、5g；蒸留水、1000mL）用いて大腸菌JM109株を培養した（培地５０mL／２５０mL容コニカルフラスコ、３７℃、１２時間、振とう培養）。そして、培養液から菌体を集めた（遠心分離１０，０００rpm、５分、蒸留水で２回洗浄）。
【００６９】
（６−２）１６ＳｒＲＮＡのｃＤＮＡの調製
菌体から、SOGENキット（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを本キットのプロトコルに従って抽出した。
その後、BcaBESTTM  RNA PCRキット（宝酒造株式会社）を用い、本キットのプロトコルに従って、前記抽出液について、16sRNAを対象とした増幅と逆転写反応（RT-PCR）を公知の通常の条件で行った。その際、前記の本発明の蛍光消光プローブEu1392Rをプライマーとして用いた。続いて、RNAをRnase Hにより分解し（３０℃、２０分）、16SrRNA遺伝子の純粋なcDNAを得た。cDNA濃度をOliGreenR ssDNA Quantitationキット（Molecular Probes)を使用して測定した。
【００７０】
実施例７
（７−１）定量的ＰＣＲ、データ解析およびcDNAの検量線の作成
前記cDNA溶液について、本発明の蛍光消光プローブEu47FおよびEu1392Rをプラマーとして用い、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ反応を行った。なお、前者はフォワード（forward）型のプライマーとし、後者をリバース（reverseまたはbackward）型のプライマーとした。
リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ装置として、LightCyclerTM Sytem（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）を使用し、手順書記載の手順に従って反応を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRaTaqTM（宝酒造株式会社）を使用した。
【００７１】
ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。
0003965872.tif 000006
なお、cDNAは、図１の注に示される実験区のコピー数で実験を行った。MgCl2の最終濃度は２mMであった。
【００７２】
反応条件は次の如くであった。
0003965872.tif 000007
測定条件は次の如くであった。
励起光            ：      ５４３ｎｍ
測定蛍光色        ：      ５６９ｎｍ
【００７３】
前記の条件でリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲを行って、各サイクルの蛍光強度を実測した。その実測値を本発明のデーター解析方法に従って解析した。すなわち、次の過程でデータを処理した。
（ａ）各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プライマーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値（すなわち核酸伸長反応終了時（７２℃）の蛍光強度値）を、増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたものが完全に解離したときの反応系の蛍光強度値（すなわち核酸熱変性反応終了時（９６℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処理過程、すなわち、実測の蛍光強度値を［数式１］で補正した。
【数８】
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n      ・・・［数式１］
［式中、ｆn＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆhyb,n＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆden,n＝各サイクルの９６℃の蛍光強度値］
【００７４】
（ｂ）各サイクルにおける［数式１］における補正演算処理値を［数式３］に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光消光率を算出する演算処理過程、すなわち、下記の［数式１０］で演算処理する過程、
【数９】
Ｆn＝ｆn／ｆ25      ・・・［数式１０］
［式中、Ｆn＝各サイクルの演算処理値、ｆn＝［数式１］で得られた各サイクルの値、ｆ＝［数式１］で得られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。
［数式１０］は［数式３］において、ａ＝２５とした場合におけるものである。
【００７５】
（ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの演算処理値を［数式６］による蛍光強度の変化率（減少率または消光率）の対数値を演算処理をする過程、すなわち、下記の［数式１１］で演算処理する過程、
【数１０】
ｌｏｇ10｛（１−Ｆn）×１００｝      ・・・［数式１１］
［式中、Ｆn＝［数式１０］で得られた値］。
［数式１１］は［数式６］において、ｂ＝１０，Ａ＝１００とした場合におけるものである。
【００７６】
上記の結果を図１に示した。
図１は、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の過程で計算された値を、サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
【００７７】
次に、図１のグラフを基に、次の（ｄ）および（ｅ）の過程で処理した。
（ｄ）前記（ｃ）の過程で処理されたデーターの内、０．２をスレッシュホールド（threshhold）し、その値に達したサイクル数を計算する過程。
（ｅ）前記（ｄ）の過程で計算した値をＸ軸に、反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフ、すなわち大腸菌cDNAの検量線（図２）を作成する過程。
図２は、本発明の定量的ＰＣＲ方法で得られるデータを、本発明のデータ解析方法、すなわち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の過程で処理した最終結果である。図２から未知コピー数の核酸試料について反応開始前のコピー数を精度よく求めることができることが分かる。
【００７８】
実施例８
（８−１）多型系（複合微生物系）の構築
（表５に示した１０種類の細菌菌株をDSMZ（Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）から購入し、前記の５３培地を用いて各々の菌株ついて別個に培養した。培養条件は前記大腸菌の場合と同様である。各々の培養液から菌体を集めた（遠心分離１０，０００ｒｐｍ、１０分、蒸留水で２回洗浄）。各々の菌体について、前記と同様にしてＳＯＧＥＮキット（ニッポンジーン社）を用いて全RNAを抽出した。
【００７９】
0003965872.tif 000008
【００８０】
１：Paracoccus pantotrophus
２：Sphingomonas natatoria
３：Bdellovibrio stolpii
４：Microbacterium imperiale
５：Pseudomonas fluorescens
６：Agromyces medislanum
７：Cellulomonas cellulans
８：Brevibacterium liquefaciens
９：Leminorella grimontii
１０：Rhodococcus luteus
【００８１】
その後、前記の大腸菌の場合と同様にして、それぞれの菌株の16SrRNA遺伝子の純粋なcDNAを得た。得られた１０菌株各々のcDNA濃度を前記の大腸菌の場合と同様にして測定した。cDNA濃度の判明した溶液について、蒸留水にて３００，０００copy/μLとなるように希釈した。１０菌株分について、希釈液を当量づつ混合したものを複合微生物系すなわち多型系（以下、多型系という。）とした。この多型系には、１０菌株分のｃＤＮＡがそれぞれ３００，０００copy/μLの濃度で含まれているので、全体として、３，０００，０００copy/μLの濃度cDNAが含有していることになる。
【００８２】
（８−２）リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ
前記多型系のcDNAについて、本発明の蛍光消光プローブEu47FおよびEu1392Rを菌株共通のプラマーとして用いて、前記大腸菌と同様にしてリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲを行った。
多型系のサンプルを、絶対量で３００，０００copy/２０μL（反応液全体２０μL）となるように反応液に添加した。多型系のリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲは、蛍光強度の減少が観察され、かつ遺伝子の指数関数的増幅期である２２サイクル数で反応を停止させた（図１参照）。スレッシュホールドを、log Rn（蛍光消光率）＝０．２と設定したときの、多型系について行ったリアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲの反応液のcDNAのコピー数は２８８，０００コピーであった（図２参照）。初期添加量すなわち理論値は３００，０００コピーであるから、本発明の方法によって作成された検量線は良好な定量性を示すことが確認された。
【００８３】
実施例９
多型解析
（９−１）T-RFLPによる解析
前記のようにしてＰＣＲ反応を行った後、増幅産物をカラム（MicroconPCR、Millipore Corporation Bedford、MA、USA）を用いて精製した。精製物を制限酵素Hha1（認識部位：GCG/C、／＝切断個所）でO/N（一晩）処理した。処理終了後、切断断片のみをカラム（Microcon及びMicropure-EZ、Millipore Corporation Bedford、MA、USA）で精製した。制限酵素処理後の各菌株のｃＤＮＡ断片の大きさは、表５に示した。
カラム精製を施したcDNA溶液について、加熱変性処理を行った後、シーケンサー（ABI PRISMTH 310、PE Applied Biosystems）にてT-RFLP解析を行った。そのピークパターンを図３に示した。各ピークを濃度が既知である標準BODIPY FL修飾断片を用いて定量した。各ピークのモル構成率を求めた結果、すべてのモル構成率は、９．４〜１０．８の範囲に収まっており、ＰＣＲ増幅効率の極端な差異認められなかった（表５参照）。定量的ＰＣＲで求めてた全ｃＤＮＡのコピー数にモル構成率を掛け、それぞれの菌株の初期のcDNAのコピー数を求めた（表５参照）。定量により求めたコピー数／初期添加コピーは０．８９〜１．０４（表５参照）であった。よって、本方法により多型系における多型の初期コピーを正確に定量できることが判明した。
【００８４】
【発明の効果】
本発明の定量的多型解析方法は、上記のような構成であるために次のような効果を有する。
１）標的遺伝子の量及び該遺伝子の多型の構成比の測定を簡便、迅速かつ定量性よく行うことができる。
２）本発明の定量的ＰＣＲ方法の一つは新規なものであり、かつ定量性が優れたものである。
３）定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する解析方法の一つも新規な方法であり、ＰＣＲ反応前の初期の遺伝子のコピー数を正確に求めることができる。
４）本発明の新規な定量的ＰＣＲ方法においては、増幅核酸は蛍光色素で標識されている。それで、多型の解析では蛍光色素をマーカとして分析できる。
５）２）〜４）の結果、特に定量性の優れた多型解析方法になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅曲線
実線：大腸菌のｃＤＮＡ；点線：多型系のｃＤＮＡ
１０2、１０3、１０4、１０5、１０6：コピー数を表示する。
【図２】  本発明のデータ解析方法によって作成されたｃＤＮＡの検量線
ａ：２８８０００コピー
【図３】  本発明の多型系のT-RFLPの解析パターン
ｂｐ：塩基数（base pair）
【図１】
0003965872.tif 000009
【図２】
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【図３】
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