(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒＧ−ＣＳＦ投与動物の脾臓間質細胞の表面抗原を認識し、骨髄球様細胞と結合して骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する作用を有するモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする該骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起するための医薬。
【請求項２】
モノクローナル抗体が抗体断片であり、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する作用を有する請求項１記載の医薬。
【請求項３】
骨髄性白血病の治療剤である請求項１又は２記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨髄球様細胞と結合し、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する新規モノクローナル抗体ならびにその断片を有効成分とする医薬に関するものであり、更には、当該モノクローナル抗体を有効成分とする骨髄性白血病の治療薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、顆粒球コロニー刺激因子、例えば、遺伝子組換え型顆粒球コロニー刺激因子（ｒＧ−ＣＳＦ）は、主に顆粒球系細胞の分化、増殖を促進させる液性因子として知られているものであるが、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、このｒＧ−ＣＳＦを投与することにより、骨髄の造血亢進のみならず、脾臓でも著しい髄外造血が起こり造血幹細胞を始めとしてすべての造血前駆細胞が脾臓で増殖することが報告されている。そして、この脾臓での髄外造血のメカニズムとして、ｒＧ−ＣＳＦの刺激により脾臓の造血微小環境が変化し、造血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであると考えられた。
【０００３】
そこで、本発明者は、この脾臓での造血機能を解明するために、ｒＧ−ＣＳＦ連投後の脾臓の間質細胞に着目し、間質細胞を介したｒＧ−ＣＳＦによる造血機能亢進の解析を試みるべく、ｒＧ−ＣＳＦを連投したマウス脾臓より造血間質細胞株（ＣＦ−１細胞）を樹立し、かかる造血間質細胞を用いてその造血支持能を検討したところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー刺激活性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの造血幹細胞支持能が認められた〔Ｂｌｏｏｄ，８０，１９１４（１９９２）〕。
【０００４】
しかしながら、この脾臓間質細胞については、その一部が細胞株（ＣＦ−１細胞）として樹立されて、その細胞学的特性の検討等はなされているものの、これまでに、その細胞表面抗原を認識する特定の抗体を作製することは全く行われておらず、ましてやその特性等については未だ全く知られていない状況にあった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者は、脾臓間質細胞に関する前記したような知見とこれまでの研究成果を踏まえ、この脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねる中で、当該脾臓間質細胞株を感作抗原として使用してモノクローナル抗体を作製したところ、これまでに報告された例のない新規モノクローナル抗体が得られた。
【０００６】
そして、この取得されたモノクローナル抗体の特性について検討したところ、当該モノクローナル抗体は、驚くべきことに骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を有するものであること、更に、当該特性を利用して、骨髄性白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤として使用し得るものであることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、骨髄球様細胞と結合し、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起させる特性を有する新規モノクローナル抗体およびその断片を有効成分とする医薬を提供することを目的とするものであり、更には、当該モノクローナル抗体を有効成分とする骨髄性白血病の治療薬剤を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の医薬の有効成分に係るモノクローナル抗体（以下、本発明に係るモノクローナル抗体という）は、骨髄球様細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）〔核クロマチンＤＮＡがヌクレオソーム単位で切断（いわゆるラダー・フォーメーション）され、その結果、細胞を死に至らしめる現象で、細胞自滅とも云う〕を引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、これらを識別、同定する機能を有するものとして、あるいは骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起させる機能を有するものとして極めて有用なものである。尚、骨髄球様細胞には、リンパ球以外の細胞、例えば、好中球、巨核球、骨髄芽球、骨髄球、肥満細胞、マクロファージ、単球、赤芽球が含まれるが、本発明で云う骨髄球様細胞もこれと同義のものを意味する。従来、一般に、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を有するモノクローナル抗体は全く知られておらず、従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を有するすべてのモノクローナル抗体を包括するものとして定義される。
【０００９】
かかるモノクローナル抗体は、基本的には、例えば、次のようにして作製することができる。
すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば、ｒＧ−ＣＳＦ投与動物の脾臓間質細胞を感作抗原として使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常のクローン化法を応用してクローン化することによって作製することができる。
【００１０】
本発明に係るモノクローナル抗体の作製方法は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、本発明者らによって培養細胞株として樹立されたｒＧ−ＣＳＦ投与マウスの脾臓間質細胞であるＣＦ−１細胞〔Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，１９１４（１９９２）〕を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前記細胞株を認識する本発明に係る抗体を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。しかしながら、本発明においては、かかる方法はあくまで一例に過ぎず、例えば、この場合、前記感作抗原としては、前記ＣＦ−１細胞に限らず、ＣＦ−１細胞の場合に準じて得られるヒト脾臓間質細胞由来の細胞株を使用することも適宜可能であり、前記ＣＦ−１細胞の場合と同様にして目的とするヒト骨髄球様細胞と結合するモノクローナル抗体を作製することができる。
【００１１】
このようなモノクローナル抗体の作製方法において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター等が好適なものとして使用される。
【００１２】
次に、免疫は、一般的方法により、例えば、前記ＣＦ−１細胞等の脾臓間質細胞を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することにより、行われる。より具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを、動物に１ヶ月毎に数回投与することが好ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。
【００１３】
次に、前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
【００１４】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）の方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができる。
【００１５】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に、所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００１６】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００１７】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常、数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実施される。
【００１８】
このようにして作製される本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００１９】
当該ハイブリドーマから本発明に係るモノクローナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した方法である。
【００２０】
更に、前記した方法により得られる抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製することができる。
【００２１】
本発明に係るモノクローナル抗体は、後記する実施例において具体的に示す固有の特性、すなわち骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する機能を有するものであれば、如何なるものであってもよく、当該機能を有するものであれば、感作抗原の種類を問わず本発明の範囲に含まれるものであり、本発明に係るモノクローナル抗体は、当該特性を利用して、骨髄性白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得るものである。
【００２２】
このような本発明に係るモノクローナル抗体の固有の特性を利用して骨髄性白血病治療薬剤等として使用するための具体的システムの構築、その改変および応用等は、当業者にとって自明の通常の方法を応用して実施されるものである限り、いずれも本発明の範囲に含まれるものであることは云うまでもない。
【００２３】
【実施例】
次に、本発明を参考例および実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【００２４】
参考例
脾臓間質細胞株の樹立とその性質
１）脾臓間質細胞株の樹立
ｒＧ−ＣＳＦ連続投与による脾臓間質細胞株は、ｒＧ−ＣＳＦ１００μｇ／ｋｇを５日間投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓細胞の初代培養から樹立された。すなわち、ｒＧ−ＣＳＦ投与後に無菌条件下に脾臓を摘出し、２５ｃｍ2 プラスチック・フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で６週間培養し、１０％非働化血清（ＦＢＳ）（三光純薬社製、東京）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で３７℃、５％ＣＯ2 のインキュベータ内で培養し、週２回新鮮培地に交換した。
【００２５】
コンフルエント培養から０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、Ｃａ−Ｍｇ−ｆｒｅｅ  ＰＢＳを用いて付着性細胞集団（間質細胞）を分取して別なフラスコに移した。この継代培養を週に約１〜２回繰り返した。初期の継代培養（１〜１０回目）での細胞のｓｐｌｉｔｒａｔｉｏは１／４〜１／８であったが、その後の比率は１／１６〜１／３２とした。約１０回目の継代培養後に間質細胞は均質な線維芽細胞様となった。２０回目の継代時に上述の方法で間質細胞を採集し、限界希釈法を用いて細胞のクローニングを２回繰返して間質細胞株（ＣＦ−１細胞株）を樹立した。
【００２６】
次いで、これらの細胞を１０％非働化ＦＢＳを加えたＩＭＤＭ５ｍｌを入れた２５ｃｍ2 フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）内で維持培養し、５日毎にｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ  １／３２で継代培養した。尚、他の哺乳動物についても、その脾臓間質細胞株を樹立することができ、例えば、ヒトの場合には、細胞をＳＶ−４０アデノウィルスベクターで形質転換すれば前述と同様の方法でヒト脾臓間質細胞株を樹立することが可能である〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４８，２４５（１９９１）〕。
【００２７】
２）ＣＦ−１細胞の特性
前記の如くして細胞株として樹立されたＣＦ−１細胞については、標準的な細胞化学的手法を用いてアルカリ・ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、α−ナフチルアセテイトエステラーゼおよびオイル・レッドＯを検索すると共に下記のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて免疫酵素組織化学検索によりその特性を検討した：ＭａｃＩ（Ｓｅｒｏ  Ｔｅｃ．社製）、第ＶＩＩＩ関連抗原（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、貪食能はラテックス・ビーズ（粒子径：１．０９μｍ，Ｓｉｇｍａ）を用い、また、脂肪細胞への分化能は、２５ｃｍ2 フラスコでコンフルエント培養後１０-6ｍｏｌ／ｌの燐酸ハイドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、４週間の培養で検討した。
【００２８】
その結果、ＣＦ−１細胞は、アルカリ・ホスファターゼ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＭａｃＩおよび貧食能は陰性であったが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンは陽性であった。ＣＦ−１細胞は、微かにリピッドを含むが、１０-6ｍｏｌ／ｌのハイドロコルチゾン存在下の４週間のコンフルエント培養によっても脂肪細胞には分化しなかった。これらのデータから、ＣＦ−１細胞は、前脂肪細胞、マクロファージおよび血管内皮細胞の特徴を備えていないと云えることから、これらとは異なる間質細胞由来であることが明らかとなった。
【００２９】
３）ＣＦ−１細胞による造血幹細胞の維持
造血幹細胞がＣＦ−１細胞によって維持されるか否かを検討するため、Ｔｉｌｌ＆ＭｃＣｕｌｌｏｃｈの方法によるＣＦＵ−Ｓ  ａｓｓａｙ（脾コロニー形成法）を行なった。マウス１０匹／群に９００ｃＧｙを照射（ＭＢＲ−１５２０Ｒ，Ｈｉｔａｃｈｉ社製，東京）した後、骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）（１．０×１０5 ／ｈｅａｄ、５．０×１０4 ／ｈｅａｄまたは２．５×１０4 ／ｈｅａｄ）およびＣＦ−１細胞（１．０×１０5 ／ｈｅａｄ）を静注し、１２日目に脾臓内のコロニー数を算えてＣＦＵ−Ｓ（脾臓コロニー）とした。
【００３０】
その結果、骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）とＣＦ−１細胞とを放射線照射したマウスに同時に移植すると、いずれのＢＭ細胞群についても脾コロニー数は、ＣＦ−１細胞を移植しなかったマウスに比し有意に増加し（１．４〜１．８倍）、また、ＢＭ細胞とＣＦ−１細胞とを同時に移植したマウスの移植後１２日目の生存率は、ＢＭ細胞を単独移植したマウスよりも高く、死亡率が低下することから、造血幹細胞がＣＦ−１細胞によって維持されることが明らかとなった。
【００３１】
実施例
モノクローナル抗体の作製
１）感作抗原と免疫法
感作抗原として、前述の参考例で取得したＣＦ−１細胞を用いて抗原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、三光純薬社製）、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を培地として使用し、５％ＣＯ2 インキュベーター中で３７℃の温度条件下で継代培養を行った。
【００３２】
細胞は、１ｍＭＥＤＴＡ、ＰＢＳ処理後、軽いピペッティングによって培養フラスコより回収した。この細胞を約１×１０7 個／ｍｌの細胞数で１ｍＭＥＤＴＡ・ＰＢＳに懸濁し、浮遊させ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｍａｍｉｃｈ系ラット（７週令、♀、動物繁殖研究所）に免疫した。初回免疫には、約１×１０7 個／ｍｌの細胞１ｍｌをラット腹腔内に注射し、１ヶ月後に１×１０7 個／ｍｌの細胞１ｍｌを追加免疫した。更に、１ヶ月間隔にて１×１０7 個／ｍｌの細胞１ｍｌを数回追加免疫し、免疫されたラット抗体とＣＦ−１細胞との反応性を確認後、最終免疫として、１×１０8 個／ｍｌの細胞１ｍｌを免疫した。最終免疫３日後にラットを屠殺して脾臓を摘出した。
【００３３】
２）細胞融合
１匹のラットから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細胞を遠沈した後、ＩＭＤＭ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）中に懸濁し、浮遊させ、充分に洗浄を行った。一方、マウス・ミエローマ細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）〕を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、三光純薬社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）培地にて培養して得た細胞を、同様に前記ＩＭＤＭ培地で洗浄後、その１×１０8 個と、前記脾細胞２×１０8 個とを遠心管に入れ混合し、ポリエチレングリコール４０００（半井化学社製）によって常法〔Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従い細胞融合させた。
【００３４】
次いで、得られた融合細胞を、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地にて９６個のウエルプレートに分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中で３７℃で培養した。翌日よりＨＡＴ選択培地に徐々に置換させて培養を続けた。
培養開始後、上清を週２回の頻度に、それぞれ新しいＨＡＴ培地に代え、培養を継続し、増殖維持させた。
【００３５】
次に、このようにして得られた融合細胞を常法により限界希釈法を用いてクローニングした。すなわち、前記融合細胞の培養上清中の抗体を利用して、感作抗原との結合性を調べ、感作抗原と強い結合性を有するクローンだけを常法により限界希釈法を用いてクローニングした。
【００３６】
３）スクリーニング
融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使った間接蛍光抗体法により行った。
目的の抗体を産生するクローンのスクリーニングは、ターゲット細胞として、ＣＦ−１細胞を用いて行った。すなわち、反応バッファー〔２％ＦＢＳ，０．０２％ＮａＮ3 を含むＰＢＳ〕に懸濁した細胞を遠心し、ペレットとして回収した後、ハイブリドーマ培養上清１００μｌ中に浮遊させ（約１×１０6 個／１００μｌ）、４℃にて１時間反応させた。  前記バッファーにより１回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＦＣ）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を加えて１時間インキュベーションした。１回洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社製）にて解析した。
【００３７】
４）抗体の精製
前記３）でスクリーニングした融合細胞を常法に従って培養し、培養上清中に産生される抗体を常法により分離し、精製した。
すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原に対する抗体価の高かったウエルからハイブリドーマを採取し、組織培養プラスチックディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に広げて５％ＣＯ2 中で３７℃にて継代培養を行い、増殖させ、常法により精製することにより、モノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１を得た。
【００３８】
ＧＳＰＳＴ−１については、得られた細胞をプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ系ヌードマウス（８週令，♂，日本クレア社製）に腹腔内注入した。１０〜１４日後、産生された腹水を採取し、３３％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析した。また、ＢＭＡＰ−１抗体については、１０％ＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ培地にて、大量培養し、培養上清を濃縮後、３３％硫酸アンモニウムで塩析し、ＰＢＳで透析後、プロテインＡカラムキット（アマシャム社製）により再度精製し、ＰＢＳにより透析を行った。尚、上記の実施例においては、感作抗原として、前記ＣＦ−１細胞を使用した場合について例示したが、他の造血幹細胞支持能を有する間質細胞を使用した場合にも同様にしてモノクローナル抗体を作製することが可能であり、本発明においては、前記モノクローナル抗体に限らず、それと同様の特性を有するすべてのモノクローナル抗体、および当該モノクローナル抗体を産生するすべてのハイブリドーマを使用し得るものである。
【００３９】
本発明に係るモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１を産生するハイブリドーマは、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｍａｍｉｃｈ系ラット脾細胞とマウス・ミエローマ細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を親細胞として作製された新規な融合細胞であり、公的微生物寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＢＭＡＰ−１（ラットマウス  ハイブリドーマ），受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８２として国際寄託されている。
【００４０】
５）抗体の性質
▲１▼抗体の反応性
（ＣＦ−１細胞に対する反応性）
上記のようにして得られたモノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１のＣＦ−１細胞に対する反応性について免疫蛍光分析（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により検討した結果を図１〜図３に示す。ここで、図１は、抗体非存在下のコントロール、図２は、ＧＳＰＳＴ−１とＣＦ−１細胞との結合性、図３は、ＢＭＡＰ−１とＣＦ−１細胞との結合性、の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。
図１〜図３から明らかなとおり、モノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１はＣＦ−１細胞に対して結合性を有しており、ＣＦ−１細胞の表面抗原を認識するものであることが分った。
【００４１】
（骨髄細胞に対する反応性）
次に、ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１の正常の骨髄細胞に対する反応性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社製）により検討した結果を図４〜図６に示す。ここで、図４は、抗体非存在下のコントロール、図５は、ＧＳＰＳＴ−１と骨髄細胞との結合性、図６は、ＢＭＡＰ−１と骨髄細胞との結合性、の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。
図４〜図６に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、骨髄細胞とは全く結合せず、ＢＭＡＰ−１は、すべての骨髄細胞と結合することが明らかとなった。
【００４２】
（骨髄性白血病細胞株（ＮＦＳ−６０）に対する反応性）
ＧＳＰＳＴ−１およびＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６６８７−６６９１（１９８５）〕に対する反応性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社製）により検討した結果を図７〜図１０に示す。ここで、図７は、抗体非存在下のコントロール、図８は、ＧＳＰＳＴ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性、図９は、市販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコントロール、図１０は、ＢＭＡＰ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。
図７〜図１０に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、ＮＦＳ−６０細胞とは反応せず、ＢＭＡＰ−１は、ＮＦＳ−６０細胞と結合することが明らかとなった。
【００４３】
（ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞に対する細胞増殖抑制試験）
ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞に対する作用を、Ｇ−ＣＳＦ１００ｎｇ／ｍｌおよびサイクロヘキシミド１０-9Ｍ存在下にて、ＭＴＴアッセイ法により検討した結果を図１１に示す。９６穴の培養プレートを用い、ＮＦＳ−６０細胞を４×１０3 ／ｗｅｌｌ／１００μｌに対し、ＢＭＡＰ−１は０，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１，１０，１００μｇ／ｍｌ濃度のものをそれぞれ１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、その２日後に、ＭＴＴ法により生細胞数を測定した。その結果、図１１に示すように、ＮＦＳ−６０細胞はＢＭＡＰ−１により著しく増殖が抑制されていることが明らかとなった。
【００４４】
▲２▼抗体のタイピング
次に、得られたモノクローナル抗体のＩｇＧのサブクラスをタイピングしたところ〔ラットＭｏｎｏ  Ａｂ−ＩＤ・Ｓｐキット（Ｚｙｍｅｄ社製）、およびビオチン標識マウス抗ラットＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を使用〕、ＧＳＰＳＴ−１はＩｇＧ２ａ、ＢＭＡＰ−１はＩｇＧ１であることが明らかとなった。
【００４５】
▲３▼骨髄移植阻害作用
次に、これらの抗体を用いて骨髄移植阻害実試験を行い、その特性について検討した。その結果を図１２〜図１３に示す。図１２〜図１３に示されるように、ＢＭＡＰ−１は、骨髄移植阻害効果を有するが、ＧＳＰＳＴ−１には、その効果は認められなかった。すなわち、致死量の放射線照射（９００ｃＧｙ）をしたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１．０×１０5 ／ｈｅａｄの骨髄細胞およびモノクローナル抗体を、尾静脈より投与し、脾臓コロニーの形成を観察したところ、上記の結果を得た。尚、図１３のＮｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄは、これらを投与しなかった場合を示す。
【００４６】
図１３に示されるように、ＢＭＡＰ−１が、骨髄移植阻害試験において、移植を完全に抑制するのは、このモノクローナル抗体が、骨髄細胞に反応しアポトーシスを引き起こすことに因るものであることが確認された。すなわち、ＢＭＡＰ−１産生のハイブリドーマをヌードマウスに腹腔内投与すると腹水がわずかに貯留する時期にマウスは死亡した。また、正常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５０μｇ／ｈｅａｄのＢＭＡＰ−１を静脈内投与することにより骨髄細胞がすべて死滅することが判明し、図１４にＢＭＡＰ−１静脈内投与６日後の骨髄細胞が死滅したことを裏付ける顕微鏡写真を示した。この顕微鏡写真から明らかなように、リンパ球ばかりでなく、好中球、巨核球、骨髄芽球、骨髄球、肥満細胞、マクロファージ、単球、赤芽球等（いわゆる骨髄球様細胞）が死滅していることが確認された。また、３０μｇ／ｈｅａｄのＢＭＡＰ−１を投与したマウスの骨髄細胞のＤＮＡを検討したところ、図１５に示すように、明らかにラダー・フォーメーションが認められ、ＢＭＡＰ−１の骨髄細胞に対する前記反応は、アポトーシスに因るものであることが確認された。
【００４７】
なお、ＢＭＡＰ−１抗体について、そのＩｇＧのＦｃ領域をペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）により切断し、Ｆ（ａｂ′）2 としてＧＰＣカラムにより精製した後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにその３３．５μｇ／ｈｅａｄ（完全なＩｇＧの５０μｇ／ｈｅａｄに相当する量）を静脈内投与した結果、骨髄において、骨髄細胞が死滅することが認められた。このことにより、ＢＭＡＰ−１による骨髄細胞の死滅には、抗体依存性細胞障害および補体依存性細胞障害は関与していないことが明らかとなった。
【００４８】
ところで、アポトーシスを引き起こす抗原としては、細胞表面蛋白質のＦａｓ抗原が既に報告されているが、このＦａｓ抗原は、胸腺、心臓、肝臓、肺、卵巣などでｍＲＮＡの発現が認められているが、骨髄ではそのｍＲＮＡがほとんど検出されないことから〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１２７４−１２７９（１９９２）〕、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原は、従来知られているＦａｓ抗原とは異なるものであることは明らかである。
【００４９】
更に、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、ＴＮＦレセプターか否かを明らかにするため、ＴＮＦに反応し細胞死を起こすＬ−９２９細胞を用い、ＢＭＡＰ−１の作用を検討した。マウスＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）の最終濃度は、０，１，１０，１００ｐｇ／ｍｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌとし、ＢＭＡＰ−１の最終濃度は、０，１０，１００ｐｇ／ｍｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１，１０μｇ／ｍｌとし、ＴＮＦαおよびＢＭＡＰ−１添加後２日目に、Ｌ−９２９細胞の生細胞数をＭＴＴ法により測定した。その結果、図１６、１７に示すように、ＴＮＦαによりＬ−９２９細胞は著明に減少するのに対し、ＢＭＡＰ−１はＬ−９２９細胞に対し作用を及ぼさなかった。従って、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原はＴＮＦレセプターでないことが明らかとなった。
【００５０】
ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗原であるか否かをフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社製）により検討した結果を図１８〜図２１に示す。ここで、図１８は、市販のラットＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコントロール、図１９は、抗マウスＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体（ラットＩｇＧ２ａ，ＢＭＡ社製）とＢＷＶ１細胞（ＢＷ５１４７細胞由来のマウスリンパ腫）との結合性、図２０は、市販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコントロール、図２１は、ＢＭＡＰ−１とＢＷＶ１細胞との結合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。その結果、ＢＭＡＰ−１はＢＷＶ１細胞を認識しないが、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体は、ＢＷＶ１細胞と反応した。
【００５１】
以上のように、ＢＭＡＰ−１は、骨髄球様細胞にアポトーシスを引き起こす作用を有するものであることが実験的に確認されたが、本発明者の知るところによれば、前述の如く、従来、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体について報告された例はなく、かかる作用を有するモノクローナル抗体は、本発明者が見い出した新規なものである。そして、このＢＭＡＰ−１に代表される本発明に係るモノクローナル抗体の骨髄細胞に対するアポトーシス作用を利用することにより、当該モノクローナル抗体は、その抗原の発現が高いと考えられる骨髄性白血病細胞を死滅させることが可能であると考えられることから、かかる骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体は、骨髄性白血病治療薬等の医薬の有効成分として有用なものである。
【００５２】
以上、本発明に係るモノクローナル抗体の特性およびその医薬用途について実施例を示して具体的に説明したが、本発明で云うところの骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体は、前記具体例として例示したものが代表的なものとしてあげられるものの、必ずしもこれに限定されるものではなく、感作抗原の種類を問わず同様に作製された同様の特性および機能を有するすべてのモノクローナル抗体を包含するものであることは云うまでもない。尚、当該モノクローナル抗体の固有の特性を利用して骨髄性白血病治療薬剤等の医薬として使用するための具体的システムの構築、その改変および応用等は、当業者にとって自明の通常の方法を利用して実施される。
【００５３】
【発明の効果】
本発明に係るモノクローナル抗体は、骨髄球様細胞と結合し、骨髄球様細胞にアポトーシスを引き起こす作用を有することから、本発明によれば、当該特性を利用して、骨髄性白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得る医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存在下の対照，ＣＦ−１細胞）。
【図２】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１抗体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。
【図３】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。
【図４】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存在下の対照，骨髄細胞）。
【図５】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１抗体と骨髄細胞との結合性の解析。
【図６】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗体と骨髄細胞との結合性の解析。
【図７】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存在下の対照）。
【図８】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性。
【図９】イムノフルオレッセンスによる解析（ラットＩｇＧ１による対照）。
【図１０】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性。
【図１１】モノクローナル抗体の細胞増殖抑制試験（ＢＭＡＰ−１）。
【図１２】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（ＧＳＰＳＴ−１）。
【図１３】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（ＢＭＡＰ−１）。
【図１４】本発明に係るモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１投与６日後の死滅した骨髄細胞（２）、抗体非存在下の対照（１）、を示す説明図である〔骨髄標本（生物の形態）の顕微鏡写真（Ｈ．Ｅ．染色）（×４００）〕。
【図１５】本発明に係るモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１を投与した場合にみられる骨髄細胞のＤＮＡのラダー・フォーメーションを示す説明図である（電気泳動クロマトグラフィーの泳動写真）。
【図１６】ＴＮＦによる細胞障害試験。
【図１７】モノクローナル抗体の細胞障害試験（ＢＭＡＰ−１）。
【図１８】イムノフルオレッセンスによる解析（ラットＩｇＧ２ａによる対照）。
【図１９】イムノフルオレッセンスによる抗マウスＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体とＢＷＶ１細胞との結合性。
【図２０】イムノフルオレッセンスによる解析（ラットＩｇＧ１による対照）。
【図２１】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１とＢＷＶ１細胞との結合性。
【符号の説明】
ａ  ＢＭＡＰ−１投与したマウス胸腺のＤＮＡ（２４時間）
ｂ  ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（２４時間）
ｃ  ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（８時間）
ｄ  ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（４時間）
ｅ  無処理マウスの骨髄のＤＮＡ（骨髄細胞）
ｆ  分子量マーカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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