(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅花から抽出されたサフラワーイエローＢ色素を含有する溶液に酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素および過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素、およびグルコースを作用させることを特徴とするカルタミンの製造方法。
【請求項２】
酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素が糖類を基質とする酸化還元酵素であり、過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素がパーオキシダーゼである請求項１記載のカルタミンの製造方法。
【請求項３】
酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１または２記載のカルタミンの製造方法。
【請求項４】
さらに固定吸着担体を添加する請求項１ないし３記載のカルタミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紅花から抽出されたサフラワーイエローＢ色素を含有する溶液に酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素および過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素を作用させることを特徴とするカルタミンの製造方法に関する。製造されたカルタミンは、食品用色素、化粧品、医薬品などに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
ベニバナ(Carthamus tinctorius L.)はキク科の２年草木で、７月中旬にアザミ状の鮮黄色の花をつける。この花弁を摘み取り、乾燥、あるいはすりつぶして発酵させたものは鮮やかな紅色を呈し、紅花（コウカ）として古くから漢方薬や高級染料として珍重されてきている。しかしながら花弁中に含まれている色素としては水溶性の黄色色素（サフラワーイエローＡ，サフラワーイエローＢ，サフラワーイエローＣの各成分から成る）が約６０％と圧倒的に多く、有効に利用されている紅色色素であるカルタミンはわずかに０．４％〜０．６％の含有量でしかない。近年、赤ビートに比べて耐熱性や色調が優れていることから、食品用色素としてベニバナの紅色色素が注目されてきており、その効率的な抽出法とともにさらなる用途の拡大が検討されてきている。
現行の方法では、サフラワーイエローが水溶性であるのに対してカルタミンは難水溶性であることを利用し、花弁から黄色色素を水抽出した残さから紅色を取得する方法が用いられている。しかしながらカルタミン自体の含有量が極めて低いことから、高度に純化された紅色色素カルタミンの価格は高価となり、このことがさらなる用途の拡大を妨げている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、紅花の花弁中に大量に含まれる黄色色素のうち、最大約５０％近くを占めるサフラワーイエローＢ色素に酵素を作用させてカルタミンに変換し、短時間で効率よく紅色色素であるカルタミンを供給することができる製造方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、紅花から抽出されたサフラワーイエローＢ色素を含有する溶液に酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素および過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素、およびグルコースを作用させることを特徴とするカルタミンの製造方法に関する。
【０００５】
更に本発明は、酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素が糖類を基質とする酸化還元酵素であり、過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素がパーオキシダーゼである上記カルタミンの製造方法に関する。
【０００６】
更に本発明は、酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである上記カルタミンの製造方法に関する。
【０００７】
更に本発明は、反応液中に固定吸着担体を添加する上記カルタミンの製造方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のカルタミンの製造方法は、紅花から抽出されたサフラワーイエローＢ色素を含有する溶液に酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素および過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素を添加してｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ４〜９の緩衝液または水中で、約５〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度に１分〜１週間、好ましくは１分〜２４時間保持することによって容易に実施できる。
【０００９】
この時、反応を促進させたり、反応効率を高めたり、過酸化水素濃度を制御するために、酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素の基質を添加することが望ましい。さらに、サフラワーイエローＢ色素、各酸化還元酵素、および生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させてカルタミンの生成速度、生成効率を向上させるためにセルロースやキトサンなどを固定吸着担体として添加することが望ましい。
場合によっては、この反応液中に数分間酸素を通気させてもよく、逆に窒素ガスで脱酸素処理を行ってもよい。
【００１０】
本発明に用いる紅花は生花でも乾燥花でもよく、例えば「最上紅花」「中国紅花」「岡山１号」「イスラエル」「カリフォルニア」などが挙げられるが、紅花の種類に限定されることなく如何なる種類でもよい。
本発明に使用される紅花から抽出されたサフラワーイエローＢ色素を含有する溶液中の成分形態は、精製色素、アルコール抽出粗精製色素、生花、乾燥花、花弁破砕物などサフラワーイエローＢ色素が存在している状態であれば如何なる成分形態であってもよい。
【００１１】
本発明に使用される酵素剤は、酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素と過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素である。これらの酵素剤濃度は、サフラワーイエローＢ色素量１ｇ当たりそれぞれ１〜１０万ユニットの活性量であればよい。
【００１２】
酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素はオキシダーゼとして総称され、例えば、グルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アリルアルコールオキシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、ピリドキシンオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、ヒドロキシアシドオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ここで、有効に過酸化水素を供給するために各酵素に対応する基質をサフラワーイエローＢ色素量に対して１０モル当量以下の範囲、好ましくは２モル当量以下で存在させることが望ましいが、場合によっては存在しなくてもよい。また、これらの酵素剤は、単独で使用することが望ましいが、場合によって複数の酵素を組み合わせて使用することもできる。
【００１３】
酸素を受容体として過酸化水素を生成する酸化還元酵素の好ましいものとしてグルコースオキシダーゼが挙げられる。グルコースオキシダーゼには、Aspergillus niger,Penicillium amagasakiense、Penicillium notatumなどの由来のものがあるが、これらに限定されるものではない。ここで、対応する基質はグルコースであり、サフラワーイエローＢ色素量に対して１０モル当量以下の範囲、好ましくは２モル当量以下で存在させることが望ましいが、場合によっては存在しなくてもよい。
【００１４】
過酸化水素を受容体とする酸化還元酵素にはカタラーゼ、パーオキシダーゼなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ここで、カタラーゼには、ウシ、ウマ、ヒトの肝臓や血球、ヒツジ、ネズミ、ブタ、ガマの肝臓、ホウレン草、Micrococcus lysodeikticus、Rhodopseudomonas spheroidusなどの細菌から精製されたものがあるが、これらに限定されるものではない。また、パーオキシダーゼには、西洋わさび、イチジク、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球などの由来のものがあるが、これらに限定されるものではない。これらの酵素剤は、単独で使用すること望ましいが、場合によって複数の酵素を組み合わせて使用することもできる。
【００１５】
本発明に使用される緩衝液は、０．００１〜５モル濃度であればよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、ピロリン酸ナトリウム緩衝液、グリシン−ナトリウム緩衝液、グッドバッファーなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
反応終了後、架橋デキストランであるファルマシア社製商品名セファデックスやシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー、セルロース粉末に一旦吸着させて分画する手法などを適宜選択して実施することにより、容易に精製カルタミンを得ることができる。
【００１７】
本発明の反応は、サフラワーイエローＢ色素が加水分解してカルタミン前駆体となる加水分解物とサフロミンＡ色素に分解し、前者がカルタミン前駆体を経てカルタミンとなる下記反応経路が推定される。
【００１８】
【化１】
0003965707.tif 000002
【００１９】
サフラワーイエローＢ色素の加水分解は、酸化還元酵素を添加して酵素反応を利用することが望ましいが、酵素を添加せずにｐＨ３〜１１、温度５〜６０℃でサフラワーイエローＢ色素を加水分解しておいてもよい。また、カルタミン前駆体をカルタミンに変換する場合も、酸化還元酵素が存在すれば反応が速く進行するが、空気酸化を利用してカルタミン前駆体をカルタミンに変換することも可能である。
【００２０】
本発明によるサフラワーイエローＢ色素からカルタミンへの変換経路は、以下の変換経路で進行すると推察される。
サフラワーイエローＢ色素が、酸素を受容体とする酸化還元酵素あるいは反応諸条件の影響を受けて、カルタミン前駆体を形成する加水分解物とサフロミンＡ色素に分解される。この時生成されたカルタミン前駆体を形成する加水分解物は、存在する酸素を受容体とする酸化還元酵素およびそれに対応する基質（例えばグルコースオキシダーゼの場合、グルコース）と、その結果生成される過酸化水素の複合的作用によりカルタミン前駆体を形成する。その後、過酸化水素とそれを受容体とする酸化還元酵素、すなわちパーオキシダーゼとの複合的作用によってカルタミンへと変換される。
【００２１】
本発明で得られたカルタミンは、固定吸着担体に吸着させて容易に回収される。例えば、ダイヤモンドシャムロックケミカル社のデュオライトＳ−３０、ＥＳ−３３、Ｓ−３７など、オルガノ株式会社のアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８など、三菱化成工業株式会社のダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＨＰ−４０など、北越炭素工業株式会社のＫＳ、ＨＳ、ＡＦ、Ｌ−１など、多糖類としてセルロース、キチン、キトサン、デンプン及びそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
さらに、サフラワーイエローＢ色素からカルタミンへの変換反応系中に、固定吸着担体を共存させることで、カルタミンの生成速度を促進させるだけでなく、その収量を増加させることも可能である。固定吸着担体の添加量は、乾燥花弁１Ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１Ｋｇが適当である。純化された色素を使用する場合、乾燥花弁中に含有されるサフラワーイエローＢ色素およびカルタミンの量に相当する吸着担体の量を算出して添加する。
次に、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。
【００２３】
【実施例１】
高度に純化されたサフラワーイエローＢ色素１００ｍｇ、グルコース５０ｍｇ、グルコースオキシターゼ５０ユニットおよびパーオキシダーゼ１００ユニットを、０．５Ｍクエン酸緩衝液２ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させるためにセルロース粉末を５０ｍｇ加えた。２５℃、ｐＨ５．７の反応条件で１５分間反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いでメタノールでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を十分に乾燥させカルタミンの精製標品を得た。収量は４１．８ｍｇであった。
ここで得られた精製カルタミン標品の赤外吸収スペクトル、紫外吸収スペクトル、質量分析および薄層クロマトグラフィーの分析結果は、既知カルタミンのそれと完全に一致した。
【００２４】
【実施例２】
紅花「カリフォルニア（黄花種）」の生花より７０％エタノール抽出によって得られたベニバナ黄色色素（サフラワーイエローＢ色素約１００ｍｇを含む）粗粉末１．５ｇ、グルコース１００ｍｇ、グルコースオキシダーゼ２５ユニットおよびパーオキシダーゼ２００ユニットを０．５Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着するためにセルロース粉末を１００ｍｇ加えた。２５℃、ｐＨ６．８の反応条件で撹拌しながら１時間反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、クエン酸を加えてｐＨを５〜６に調製し、反応液中のカルタミンをセルロース粉末に完全に吸着させた。このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いで８０％メタノールでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を十分に乾燥させカルタミンの精製標品を得た。収量は４１．３ｍｇであった。
ここで得られた精製カルタミン標品の赤外吸収スペクトル、紫外吸収スペクトル、質量分析および薄層クロマトグラフィーの分析結果は、既知カルタミンのそれと完全に一致した。
【００２５】
【実施例３】
高度に純化されたサフラワーイエローＢ色素１００ｍｇ、グルコースオキシターゼ５０ユニットおよびパーオキシダーゼ１００ユニットを、０．５Ｍクエン酸緩衝液２ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させるためにセルロース粉末を５０ｍｇ加えた。２５℃、ｐＨ５．７の反応条件で２４時間反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いでメタノールでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を十分に乾燥させカルタミンの精製標品を得た。収量は２８．８ｍｇであった。
ここで得られた精製カルタミン標品の赤外吸収スペクトル、紫外吸収スペクトル、質量分析および薄層クロマトグラフィーの分析結果は、既知カルタミンのそれと完全に一致した。
【００２６】
【実施例４】
中国新彊産紅花の乾燥花弁５ｇ、グルコース５００ｍｇ、グルコースオキシターゼ７５ユニットおよびパーオキシダーゼ１５００ユニットを、０．５Ｍクエン酸緩衝液１００ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させるためにセルロース粉末を２ｇ加えた。２５℃、ｐＨ５．７の反応条件で１８時間振とうさせながら反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いでジメチルホルムアミドでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を２００ｍｌのメスフラスコでメスアップし、５３０ｎｍの吸収強度を調べた。同時にグルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加しないで、同様の処理を行ない５３０ｎｍの吸収強度を比較した。グルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加した場合の方が添加しない場合より約２．５倍量のカルタミンが得られた。
【００２７】
【実施例５】
中国雲南産紅花の乾燥花弁５ｇ、グルコース５００ｍｇ、グルコースオキシターゼ７５ユニットおよびパーオキシダーゼ１５００ユニットを、０．５Ｍクエン酸緩衝液１００ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させるためにセルロース粉末を２ｇ加えた。２５℃、ｐＨ５．７の反応条件で１８時間振とうさせながら反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いでジメチルホルムアミドでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を２００ｍｌのメスフラスコでメスアップし、５３０ｎｍの吸収強度を調べた。同時にグルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加しないで、同様の処理を行ない５３０ｎｍの吸収強度を比較した。グルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加した場合の方が添加しない場合より約７倍量のカルタミンが得られた。
【００２８】
【実施例６】
山形産最上紅花の生花弁５ｇ、グルコース５００ｍｇ、グルコースオキシターゼ７５ユニットおよびパーオキシダーゼ１５００ユニットを、０．５Ｍクエン酸緩衝液１００ｍｌに溶解させ、生成されるカルタミンを安定に固定、吸着させるためにセルロース粉末を２ｇ加えた。２５℃、ｐＨ５．７の反応条件で１８時間振とうさせながら反応させた。反応液は黄色から紅色へと変化した。反応終了後、このセルロース粉末を濾別し、水洗いして水溶性不純物を除去し、次いでジメチルホルムアミドでカルタミンをセルロースから溶出した。この溶出液を２００ｍｌのメスフラスコでメスアップし、５３０ｎｍの吸収強度を調べた。同時にグルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加しないで、同様の処理を行ない５３０ｎｍの吸収強度を比較した。グルコース、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼを添加した場合の方が添加しない場合より約１０倍量のカルタミンが得られた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、従来、紅色色素としての有用性が高いにもかかわらず、高価で利用が制限されていたベニバナ色素を、ベニバナ花弁中に大量に含まれるサフラワーイエローＢから効果的にカルタミンに変換することができ、より安価に安定に供給することができる。