(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｆ）の特性を有するL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼ。
（ａ）作用: (S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸をL-α-ヒドロキシグルタル酸に加水分解する。
（ｂ）基質特異性：(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸に作用し、2-オキソテトラヒドロフラン-4,5-ジカルボン酸にも弱く作用する。
（ｃ）至適pH: pH 6.5〜7.5
（ｄ）至適温度: 25〜45 ℃
（ｅ）pH安定性: pH 6.5〜8.0
（ｆ）温度安定性: 〜50 ℃
（ｇ）分子量: ベックマン・ウルトラスフェロゲル SEC3000 (7.5mm × 30 cm)カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約79,000、SDS-PAGEにて41,000
【請求項２】
N-末端が以下のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼ。
Gln-Glu-Thr-Pro-Ser-Tyr-Val-Tyr-Val-Ser-Asn-Gly-Asp-Ser-Gly-Thr-Val-Thr-Ala-Tyr-Gln-Leu-Asp-
【請求項３】
エルウニア(Erwinia)に属し、請求項１又は２に記載のL-α-ヒドロキシグ ルタル酸γ-ラクトナーゼを産生する能力を有する菌株を栄養培地に培養し、上記L-α- ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１又は２に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸ラクトナーゼの製造法。
【請求項４】
栄養培地がクエン酸を含有するものである請求項３に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸ラクトナーゼの製造法。
【請求項５】
エルウニア・サイプリペデイ(Erwinia cypripedii)３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なラクトナーゼに関する。更に詳細には、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸(L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトン)を立体選択的に加水分解するラクトナーゼ、その製造法および該酵素生産能を有するエルウニア属に属する新菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般にラクトナーゼは、ラクトンをヒドロキシカルボン酸に加水分解する酵素の総称であり、ラクトン類からの光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造への応用が期待されている。これまでに報告されているラクトナーゼとしては、グルコノ-δ-ラクトンに作用する哺乳類の肝臓に由来するグルコノラクトナーゼ （非特許文献１）、4-ピリドキソラクトンに作用する4-ピリドキソラクトナーゼ（非特許文献２）、5-ピリドキソラクトンに作用する5-ピリドキソラクトナーゼ（非特許文献２）、アルドン酸ラクトンや芳香族ラクトンに広く作用するフザリウム・オキソスポラムに由来するラクトナーゼ（非特許文献３）、L-パントイルラクトンをL-パントテン酸に加水分解するアグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するラクトナーゼ（非特許文献４）などが知られている。
【０００３】
【非特許文献１】
J.Biol. Chem.,212, 677-685 (1955)
【非特許文献２】
J.Biol. Chem., 261, 15112-15114 (1986)
【非特許文献３】
Eur. J. Biochem., 209, 383-390 (1992)
【非特許文献４】
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1255-1262 (2000)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来より報告されているラクトナーゼは、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸に作用せず、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸からL-α-ヒドロキシグルタル酸を製造する場合は、副反応を伴い易く、また、後処理が必要な酸、或いはアルカリ加水分解に頼らざるを得ないものであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来技術の問題点を解消すべく、新たに(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸をL-α-ヒドロキシグルタル酸に加水分解するラクトナーゼ(以下、L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼと呼称する。)を微生物に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、本発明者らが土壌より新たに分離したエルウニア(Erwinia)に属する新菌株が新規L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを生産することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（５）に係るものである。
（１）下記の（ａ）〜（ｆ）の特性を有するL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼ。
（ａ）作用:(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸をL-α-ヒドロキシグルタル酸に加水分解する。
（ｂ）基質特異性：(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸に作用し、2-オキソテトラヒドロフラン-4,5-ジカルボン酸にも弱く作用する。
（ｃ）至適pH: pH 6.5〜7.5
（ｄ）至適温度: 25〜45 ℃
（ｅ）pH安定性: pH 6.5〜8.0
（ｆ）温度安定性:〜50 ℃
（ｇ）分子量: ベックマン・ウルトラスフェロゲル SEC3000 (7.5mm × 30 cm)カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約79,000、SDS-PAGEにて41,000
（２）N-末端が、以下のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼ。
Gln-Glu-Thr-Pro-Ser-Tyr-Val-Tyr-Val-Ser-Asn-Gly-Asp-Ser-Gly-Thr-Val-Thr-Ala-Tyr-Gln-Leu-Asp-
（３）エルウニア(Erwinia)に属し、請求項１又は２に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを産生する能力を有する菌株を栄養培地に培養し、上記L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１又は２に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸ラクトナーゼの製造法。
（４）栄養培地がクエン酸を含有するものである請求項３に記載のL-α-ヒドロキシグルタル酸ラクトナーゼの製造法。
（５）エルウニア・サイプリペデイ(Erwinia cypripedii)３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）菌株。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の上記L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼは、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸をL-α-ヒドロキシグルタル酸に加水分解する作用を有し、この作用自体従来全く知見のない新規酵素である。本発明のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼは、エルウニア属に属し、該酵素を産生する能力を有する菌株を栄養培地で培養することにより得られる。これは、本発明者等が新たに土壌より分離したエルウニア属に属する菌株が上記L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを有することを見いだしたことに基づく。
【０００７】
この菌株の菌学的性質は以下のとおりである。
1. 形態: グラム陰性、桿菌(0.7〜0.9×1.5〜2.5 μm)
2. 3 %KOHに対する感受性: 溶菌
3. アミノペプチターゼ: 陽性
4. オキシターゼ: 陰性
5. カタラーゼ: 陽性
6. 酸の生成: グルコース、フラクトース、マンノース、マルトース、キシロース、シュークロース、トレハロース、アラビノース、ラムノース、ガラクトース、イノシトールより酸を生成し、アドニトール、アラビトール、デュルシトール、エリスリトール、α-メチルグルコシドより酸を生成しない。
7.  ONPG試験: 陽性
8.  ADH試験: 陰性
9.  LDC試験: 陰性
10. ODC試験: 陰性
11  ウレアーゼ試験: 陰性
12. シモンズクエン酸試験: 陽性
13. フェニルアラニンデアミナーゼ試験: 陽性
14. 硫化水素の生成: 陰性
15. グルコースからのガスの生成: 陽性
16. ゼラチンの分解: 陰性
17.  DNAの分解: 陰性
18. ツィーン80の分解: 陰性
19. インドールの生成: 陰性
20. マロン酸の利用: 陽性
21. エスクリンの加水分解: 陽性
22.  MR試験: 陽性
23.  VP反応: 陰性
24. 硝酸塩の還元: 陽性
25. 脱窒反応: 陽性
【０００８】
本菌の脂肪酸組成は、腸内細菌科のそれとよく一致し、また、上記菌学的性質は公知のエルウニア・サイプリペディの特徴とよく一致する。しかし、本菌の16SrDNAの塩基配列は、エルウニア・サイプリペディのそれと98.5 %の相同性を示した。すなわち本菌株は、エルウニア・サイプリペディに属する新菌株であり、エルウニア・サイプリペディ314Bと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５)寄託されている。
【０００９】
本菌株を用いて本発明のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを生産蓄積させるための培養方法としては、液体培養法、固体培養法の何れでもよいが、好ましくは液体培養法が行われる。具体的に培養方法について述べると、液体培養培地の場合は、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地が挙げられる。
例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、 澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα-澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等が挙げられる。
【００１０】
更に、本発明においては、培地の炭素源としてクエン酸を添加することにより、L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼが著量生産され得る。
窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或いは大豆又は大豆粕等の抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
そして、無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム等のナトリウム塩が用いられる。
【００１１】
培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をpH2.0〜7.0の範囲、好ましくはpH5.0に調整し、温度10〜40℃の範囲、好ましくは、25〜30℃で実施し、通常1〜15日間培養するのが望ましいが、この条件以外にあっても微生物が生育し、目的とする酵素を生成する条件であれば特に制限されない。
ついで、培養液より菌体を集め、これを破砕することにより粗酵素液を得、更に硫安塩析又は有機溶媒沈殿等により酵素を回収する。その後、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、高純度のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼ標品を得ることができる。
【００１２】
このようにして得られたL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼの酵素化学的性質は以下のとおりであった。
（ａ）至適pH: pH 6.5〜7.5
（ｂ）至適温度: 25〜45 ℃
（ｃ）pH安定性: pH 6.5〜8.0 (95 %以上残存: 4 ℃, 24時間)
（ｄ）温度安定性: 〜50 ℃(50℃までの温度に10分間保っても、95 %以上の活性が残存(pH 7.0))
（ｅ）基質特異性: (S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸のほか、2-オキソテトラヒドロフラン-4,5-ジカルボン酸にも作用する。但し2-オキソテトラヒドロフラン-4,5-ジカルボン酸に対しては8 %の相対活性を示す。(R)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸、D-グルコノ-δ-ラクトン、D-及びL-ガラクトノ1,4-ラクトン、L-マンノノ-1,4-ラクトン、D-及びL-パントラクトン、γ-ブチロラクトン、γ-バレロラクトン、γ-カプロラクトンに作用せず。
（ｆ）分子量: ベックマン・ウルトラスフェロゲル SEC3000 (7.5mm × 30 cm)カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約79,000、SDS-PAGEにて41,000。
（ｇ）阻害剤・賦活剤等: PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)、ヒドロキシアミン、O-フェナンスロリン、2,2'-ビピリジル、EDTA、N-エチルマレイミド、PCMB、硝酸銀、ヨードアセトアミド、Mn2+、Co2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+で実質的に阻害・賦活されない。N-ブロモスクシンイミド、Cu2+で阻害される。
【００１３】
また、本発明のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼのＮ末端のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
N-末端アミノ酸配列:Gln-Glu-Thr-Pro-Ser-Tyr-Val-Tyr-Val-Ser-Asn-Gly-Asp-Ser-Gly-Thr-Val-Thr-Ala-Tyr-Gln-Leu-Asp-
【００１４】
以上、エルウニア・サイプリペディ３１４Ｂ菌株を培養することにより得られたL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼについて詳述したが、本発明においては、 L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼの一部分或いは当該ラクトナーゼから1個または複数個のアミノ酸が欠失、又は付加され、及び／又は当該ラクトナーゼ中の1個または複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられているラクトナーゼであっても、本発明のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼの生物学的性質を有するものであれば、本発明に含まれる。
また、 本発明の新規L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼは、例えば、上記したように、エルウニア・サイプリペディ由来の菌株を培養することにより得られるが、当該ラクトナーゼのアミノ酸配列を解析し、それをコードするDNAを調製することにより遺伝子工学的に得ることもできる。
【００１５】
以下、実施例により本発明を詳述する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【実施例１】
下記の組成の液体培地に、エルウニア・サイプリペディ 314Bを接種後、30度で1日培養した。
培地: クエン酸 20.0、KH2PO4 3.0、(NH4)2SO4 2.0、酵母エキス 1.0、MgSO4・7H2O 0.3、CaCl2・2H2O 0.1、NaCl 0.1 g/l, pH 5.0
菌体を遠心分離により集め、50 mM Tris緩衝液(pH 7.0)で二回洗浄した後、Braun社製MSKセルホモゼェナイザーで破砕、遠心後の上清を粗酵素液とした。この粗酵素液に対し硫安を60 %飽和となるように加え、酵素を沈殿させた。沈殿した酵素を遠心により集め、4 MのNaClを含む50 mM Tris緩衝液(pH 7.0)に再溶解し、同じ緩衝液で平衡化したブチルトヨパールカラムに供した。吸着された活性画分を、移動相中のNaCl濃度を直線的に低下させることにより溶離した。得られた活性画分を10 mM Mes緩衝液(pH 7.0)で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲルEMD COO-カラムに吸着させ、次いで移動相中にNaClを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を10 mM リン酸緩衝液で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに吸着させ、移動相中のリン酸濃度を直線的に上げることにより、目的酵素を溶出させた。このようにして得られた酵素標品は、SDS-PAGEで単一バンドを与えた。本精製酵素を用いて、前述したとおりの酵素化学的性質を明らかにした。
【００１６】
【  実施例２】
25 mMの(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸を含む100 mMHepes緩衝液(pH 7.0)に対し、実施例1で得られたL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを0.9 U/mlとなるように加え、37℃に保った。反応液中の(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸およびα-ヒドロキシグルタル酸の濃度の経時変化を図Ｉに示す。
6時間後、全ての(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸はα-ヒドロキシグルタル酸に変換された。生成したα-ヒドロキシグルタル酸を、CHIRALPAK MA(+)(ダイセル社製)を用いた高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、全てがL-型であることが確認された。
なお、L-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼの活性の測定は下記方法によった。
〔活性測定法〕 125 mMの(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸を含む125mMのHepes緩衝液(pH 7.0)を基質溶液とする。基質溶液0.4 mlを37℃で3分間加温後、0.1 mlの酵素液を添加し反応を開始する。37℃で30分間反応後、沸騰水浴上に1分間置き、反応を停止する。
反応停止後、遠心分離し上清画分をGLサイエンス社製イナートシルODS-3カラム(4.6× 250 mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーで、酵素反応により生成したL-α-ヒドロキシグルタル酸を定量する。酵素1 Uは、上記条件下で、1分間に1μmolのL-α-ヒドロキシグルタル酸を遊離する酵素量とした。
【００１７】
【発明の効果】
本発明により、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸をL-α-ヒドロキシグルタル酸に加水分解する新規なラクトナーゼが提供される。本酵素は、微生物より得ることができ、本酵素は、食品分野、医薬分野などの様々な分野において有用に利用することができる。
【  図面の簡単な説明】
【図１】本発明のL-α-ヒドロキシグルタル酸γ-ラクトナーゼを(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸に作用させた場合における、(S)-5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸濃度とL-α-ヒドロキシグルタル酸濃度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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