(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７の塩基配列からなる、師部特異的発現に関与するプロモーター。
【請求項２】
配列番号８の塩基配列からなる、師部特異的発現に関与するプロモーター。
【請求項３】
異種タンパク質を師部特異的に生産するトランスジェニック植物であって、配列番号７または８の塩基配列からなるプロモーター、および該プロモーターに発現可能に結合された該異種タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを得る工程；および得られたベクターを植物に導入する工程、を含む方法によって得られる、トランスジェニック植物。
【請求項４】
前記植物が、イネである、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
異種タンパク質を植物の師部に特異的に生産させる方法であって、
配列番号７または８の塩基配列からなるプロモーター、および該プロモーターに発現可能に結合された該異種タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを得る工程；および
得られたベクターを該植物に導入してトランスジェニック植物を得る工程
を含む、方法。
【請求項６】
前記植物が、イネである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃａ２＋／リン脂質結合ドメインを有し、そして好ましくはカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％のアミノ酸相同性を有する、イネ師部タンパク質、およびそれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物は、長距離輸送のための維管束において、２つの相補的な導管：木部および師部を使用している。例えば、イネの維管束は、並立維管束であり、そして師部および木部からなる。また、カボチャの場合、維管束は、両立維管束であり、そして内部および外部師部、形成層、および木部から構成されている。維管束の構造および生理学的位置は、植物種によってかなり異なっており、葉の師部への溶質輸送の経路およびメカニズムが、構造によって異なることが示唆されている（OparkaおよびTurgeon, Plant Cell, 11, 739-750 (1999)）。被子植物において、師部は、主として２つの細胞タイプである師部要素（ＳＥ）およびその関連の伴細胞（ＣＣ）から構成され、タンパク質、ｍＲＮＡ、アミノ酸、および巨大分子を、組織および器官に送達するための進化した長距離輸送システムとして機能する（Jorgensenら, Science, 279, 1486-1487 (1998)）。ＣＣには多くのミトコンドリアおよび遊離のリボソームが存在し、これらはＣＣの細胞質が異常に高い密度である原因であり、これによってＣＣと師部の他の細胞とが区別される。逆に、ＳＥは、同化転座について非常に特殊化されており、核、液胞、リボソーム、およびゴルジ体のようなほとんどの細胞内構造およびオルガネラは、師部要素発達中に分解されている（Sjolund, Plant Cell, 9, 1137-1146 (1997)）。
【０００３】
ＳＥおよびＣＣは、多くの分枝した原形質連絡によって連結される。約２００の可溶性タンパク質のうちのいくつかが師部で同定されており、これらのタンパク質は、連結する原形質連絡によってＳＥに入ると考えられている（Xoconostle-Cazaresら, Science, 283, 94-98 (1999)）。さらに、原形質連絡は、タンパク質ならびに内因性ＲＮＡ分子のような他の微小および巨大分子の長距離転座流への送達を媒介する。マイクロインジェクション実験によって、多くの師部タンパク質が、原形質連絡によるそれ自体の輸送を媒介する能力を有するという直接的な証拠が提供されている。このようなタンパク質の共通の特徴は、１ｋＤａから２０ｋＤａを超える値までの原形質連絡のサイズ排除を増加させる能力を有することである。しかし、ＳＥにおける師部タンパク質の機能または役割および巨大分子往来のメカニズムは、全く理解されていない。
【０００４】
また、近年、ウイルス移動タンパク質に類似するタンパク質ＣｍＰＰ１６の遺伝子がXoconostle-Cazaresら（Xoconostle-Cazaresら, (1999), 前出）によってカボチャ中で同定されている。ＣｍＰＰ１６メッセンジャーＲＮＡは、茎の師部組織に存在するが、タンパク質はＳＥ中に限定される。また、ＣｍＰＰ１６が細胞間を移動しそしてＲＮＡ輸送を媒介することが明らかになっている。これは、ＲＮＡ分子が師部を介して植物全体を循環し、そのためＲＮＡに基づく情報のスーパーハイウェイがあることを示唆している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
高等植物において、師部は、進化した長距離輸送システムに役割を果たすが、どの種類のタンパク質が、師部組織においてタンパク質およびポリヌクレオチドのような巨大分子の移行に関与するかは、ほとんど明らかにされていない。そのため、上記のような種々の植物種で発現されるウイルスＭＰに関連する師部タンパク質の機能または役割の解明が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明では、組織構造において双子葉性のカボチャとは異なる単子葉性のイネを材料として使用し、ウイルスＭＰに関連する師部タンパク質について鋭意検討を行った。その結果、ウイルスＭＰと相同性のある新規な師部タンパク質遺伝子、さらにカボチャＣｍＰＰ１６遺伝子と相同性のある新規な師部タンパク質遺伝子を単離し、発現させることに成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｃａ２＋／リン脂質結合ドメインを有する、イネ師部タンパク質を提供する。
【０００８】
好ましい実施態様では、ＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％のアミノ酸相同性を有する、イネ師部タンパク質を提供する。このイネ師部タンパク質は、より好ましくは、カボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５６％、さらに好ましくは少なくとも約５８％のアミノ酸相同性を有する。
【０００９】
好ましい実施態様では、上記イネ師部タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
好ましい実施態様では、上記のイネ師部タンパク質において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する。
【００１１】
好ましい実施態様では、上記イネ師部タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
好ましい実施態様では、上記のイネ師部タンパク質において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する。
【００１３】
本発明はまた、上記のいずれかに記載のイネ師部タンパク質をコードする、ＤＮＡを提供する。
【００１４】
好ましい実施態様では、上記ＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を含む。
【００１５】
好ましい実施態様では、上記ＤＮＡは、配列番号３の塩基配列を含む。
【００１６】
好ましい実施態様では、上記ＤＮＡは、配列番号５の塩基配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、配列番号７の塩基配列を含む、プロモーターを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号８の塩基配列を含む、プロモーターを提供する。
【００１９】
なお、本発明のプロモーターは、遺伝子発現に関する機能に変更を生じさせない限り、塩基配列の置換、挿入、または欠失を有するプロモーターも含む。
【００２０】
本発明は、上記のいずれかのイネ師部タンパク質を、師部特異的に発現するように形質転換された、トランスジェニック植物を提供する。
【００２１】
好ましい実施態様では、上記トランスジェニック植物は、イネ、サトウキビ、トウモロコシ、およびメロンからなる群より選択される。
【００２２】
本発明はまた、上記トランスジェニック植物を用いて、上記のいずれかのイネ師部タンパク質を製造する方法を提供する。
【００２３】
本発明は、異種タンパク質を師部特異的に生産するトランスジェニック植物であって、師部特異的発現に関与するプロモーター、および該プロモーターに発現可能に結合された該異種タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを得る工程；および得られたベクターを植物に導入する工程、を含む方法によって得られる、トランスジェニック植物を提供する。
【００２４】
好ましい実施態様では、上記ベクターは、さらに、上記のいずれかのイネ師部タンパク質をコードするＤＮＡの全部または一部を含む。
【００２５】
さらに好ましい実施態様では、上記のいずれかのイネ師部タンパク質をコードするＤＮＡの全部または一部は、上記異種タンパク質をコードするＤＮＡと、融合タンパク質を発現するように結合されている。
【００２６】
好ましい実施態様では、上記師部特異的発現に関与するプロモーターは、配列番号７または８の塩基配列を含むプロモーターである。
【００２７】
好ましい実施態様では、上記植物は、イネ、サトウキビ、トウモロコシ、およびメロンからなる群より選択される。
【００２８】
好ましい実施態様では、上記異種タンパク質は、師部から師管へ分泌される。
【００２９】
本発明の別の局面では、異種タンパク質を植物の師部に特異的に生産させる方法であって、
師部特異的発現に関与するプロモーター、および該プロモーターに発現可能に結合された該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを得る工程；および
得られたベクターを該植物に導入してトランスジェニック植物を得る工程
を含む、方法を提供する。
【００３０】
好ましい実施態様では、上記ベクターは、さらに、上記のいずれかのイネ師部タンパク質をコードするＤＮＡの全部または一部を含む。
【００３１】
さらに好ましい実施態様では、上記のいずれかのイネ師部タンパク質をコードするＤＮＡの全部または一部は、上記異種タンパク質をコードするＤＮＡと、融合タンパク質を発現するように結合されている。
【００３２】
好ましい実施態様では、上記師部特異的発現に関与するプロモーターは、配列番号７または８の塩基配列を含むプロモーターである。
【００３３】
好ましい実施態様では、上記植物は、イネ、サトウキビ、トウモロコシ、およびメロンからなる群より選択される。
【００３４】
好ましい実施態様では、上記異種タンパク質は、師部から師管へ分泌される。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ＣｍＰＰ１６」とは、レッドクローバー壊死モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）に対する抗血清と交差反応し、カボチャ師部汁液から最初に同定され、ＲＣＮＭＶのウイルス移動タンパク質（ＭＰ）とある程度の配列類似性を有し、そしてＣａ２＋／リン脂質結合ドメインを含むタンパク質をいう（Xoconostle-Cazaresら, (1999), 前出）。ＣｍＰＰ１６のｍＲＮＡは、カボチャの茎の師部組織に存在するが、生産されたタンパク質はＳＥ中に限定される。また、ＣｍＰＰ１６は、細胞間を移動しそしてＲＮＡ輸送を媒介するという役割を果たすと考えられている。ここで、「ウイルス移動タンパク質（ＭＰ）」とは、植物ウイルスが発現するタンパク質であって、原形質連絡と相互作用して、ＭＰとウイルスの核酸との複合体の細胞間輸送を媒介する能力を有するタンパク質をいう。
【００３６】
本明細書において、「Ｃａ２＋／リン脂質結合ドメイン」とは、プロテインキナーゼＣファミリーに存在するＣａ２＋／リン脂質結合性（依存性）のＣ２ドメインをいう（Kopkaら, Plant Mol. Biol., 36, 627-637 (1998)）。
【００３７】
本明細書において、「イネ師部タンパク質」とは、イネの師部に特異的に発現するタンパク質をいう。特に、「本発明のイネ師部タンパク質」という場合は、「ＲＰＰ１６タンパク質」または「ＲＰＰ１７タンパク質」およびそれらの誘導体をいう。なお、「誘導体」とは、タンパク質の機能に影響を及ぼさなければ、このアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有しているタンパク質をいう。本明細書では、単に「ＲＰＰ１６タンパク質」または「ＲＰＰ１７タンパク質」という場合、それらの誘導体が含まれ得る。
【００３８】
本明細書において、「ＲＰＰ１６タンパク質」とは、Ｃａ２＋／リン脂質結合ドメインを有し、そして好ましくはカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％のアミノ酸相同性を有する、約１６ｋＤａの推定分子量を有するイネ師部タンパク質をいう。代表的には、ＣｍＰＰ１６タンパク質と５６％の相同性を有し、そして配列番号２のアミノ酸配列を有する、推定分子量１５．９ｋＤａのタンパク質が挙げられる（ＲＰＰ１６−１と命名）。ＲＰＰ１６−１の推定等電点（ｐＩ）は４．０６であり、酸性タンパク質である。タンパク質の機能に影響を及ぼさなければ、このアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。また、ＲＰＰ１６タンパク質は、「Ｒｐｐ１６−１遺伝子」と命名される塩基配列から発現され、この遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列であり得る。
【００３９】
本明細書において、「ＲＰＰ１７タンパク質」とは、Ｃａ２＋／リン脂質結合ドメインを有し、そして好ましくはカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％のアミノ酸相同性を有する、約１７ｋＤａの推定分子量を有するイネ師部タンパク質をいう。代表的には、配列番号４のアミノ酸配列を有するＲＰＰ１７−１（推定分子量１７．７ｋＤａ）および配列番号６のアミノ酸配列を有するＲＰＰ１７−２（推定分子量１７．４ｋＤａ）が挙げられ、これらはＣｍＰＰ１６タンパク質と５８％の相同性を有する。ＲＰＰ１７−１およびＲＰＰ１７−２の推定ｐＩは、それぞれ６．０５および６．２６であり、これらのタンパク質は中性タンパク質である。タンパク質の機能に影響を及ぼさなければ、これらのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。なお、ＲＰＰ１７−２は、ＲＰＰ１７−１から３アミノ酸が欠失したタンパク質である。また、ＲＰＰ１７−１およびＲＰＰ１７−２は、それぞれ「Ｒｐｐ１７−１遺伝子」および「Ｒｐｐ１７−２遺伝子」と命名される遺伝子から発現され、これらの遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号３および配列番号５の塩基配列であり得る。
【００４０】
本明細書において、「ＲＰＰ１６プロモーター」および「ＲＰＰ１７プロモーター」とは、それぞれ、単離したＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質の上流にある、プロモーター領域をいう。代表的には、それぞれ、配列番号７および配列番号８で示される塩基配列を有する。「ＲＰＰ１６プロモーター」は、ＲＰＰ１６タンパク質を、根では枝根に、茎では伴細胞（ＣＣ）および師部柔細胞に、および葉では伴細胞に特異的に発現するように、厳密に調節する。一方、「ＲＰＰ１７プロモーター」は、ＲＰＰ１７タンパク質を、根では枝根に、茎では伴細胞（ＣＣ）および師部柔細胞に、および葉では伴細胞、師部柔組織、および葉肉細胞に特異的に発現するように調節する。なお、本発明のプロモーターは、遺伝子発現に関する機能に変更を生じさせない限り、塩基配列の置換、挿入、または欠失を有するプロモーターも含む。また、本発明のプロモーターは、ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質のみを師部特異的に発現させるだけでなく、その制御下に発現可能に結合された異種物質をコードするＤＮＡについても師部特異的に発現させ得る。
【００４１】
本発明においては、ウイルスＭＰに関連する師部タンパク質ＣｍＰＰ１６と相同なタンパク質が存在しそして種々の植物種において発現されることを検討するために、両立維管束を有するカボチャとは異なって、並立維管束を有するイネを材料として使用した。また、分子生物学的実験手法（ＤＮＡの電気泳動、電気泳動したＤＮＡをゲルから回収する方法、制限酵素消化、ＰＣＲ、ＤＮＡの放射標識、ハイブリダイゼーション、塩基配列決定など）が用いられるが、これらの手法としては、例えば、Sambrookら, A Laboratory Manual，第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているような、当業者が通常用いる手法が採用される。種々の生化学、免疫学、植物組織学などの手法も、特に記載がないかぎり、当業者が通常用いる手法が用いられる。
【００４２】
ＣｍＰＰ１６遺伝子に対する類似性検索は、適切なデータベースを用いて行われ得、例えば、本発明の場合は、イネで発現した配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおいてＢＬＡＳＴサーチを使用して行い得る。また、得られる推定アミノ酸配列を有するＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質に対するコンピュータサーチも、現在利用可能な種々の配列データベースを用いて行われ得る。さらに、系統発生分析を、現在利用可能な種々の方法に従って系統樹を作成して行ってもよい。
【００４３】
タンパク質構造については、例えば、フリーソフト  ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔを使用して分析し得る。これによって得られるＣｍＰＰ１６−１、ＣｍＰＰ１６−２、ＲＰＰ１７−１、およびＲＰＰ１７−２の推定等電点（ｐＩ）から、これらのタンパク質が推定の中性タンパク質であり、一方、ＲＰＰ１６−１の推定ｐＩから、これが推定の酸性タンパク質であることがわかる。タンパク質特性とともに系統発生分析の結果から、ＲＰＰ１６−１タンパク質は新規のタンパク質であり、ＲＰＰ１７タンパク質（ＲＰＰ１７−１およびＲＰＰ１７−２）はカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質の進化対応物と考えられる。
【００４４】
ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質は、種々の細胞で発現させることができる。適切な細胞としては、細菌、酵母、昆虫、植物、動物などの細胞が挙げられる。特に、大腸菌、酵母、イネ・タバコなどの植物が好ましい。
【００４５】
Ｒｐｐ１６遺伝子およびＲｐｐ１７遺伝子をこれらの細胞で発現させる際、当業者が通常用いる種々の方法で検出可能なタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。検出可能なタンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）などが挙げられる。特に、植物においてインサイチュでＲｐｐ１６遺伝子およびＲｐｐ１７遺伝子を発現させる場合は、植物に内在活性の見られないリポーター遺伝子を使用してもよい。植物への遺伝子導入のリポーター遺伝子としては、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｇｕｓＡ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００４６】
また、ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質と融合され得るタンパク質は、上記のような検出可能なタンパク質に限定されず、師部特異的に発現させることを目的とする任意の異種タンパク質であってもよい。
【００４７】
トランスジェニック植物の作成は、例えば、ＲＰＰ１６タンパク質またはＲＰＰ１７タンパク質を発現させるイネの場合、以下のように行われる。まず、ＲＰＰ１６タンパク質またはＲＰＰ１７タンパク質の推定プロモーター領域を含むゲノム配列を、プラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。ＲＰＰ１６またはＲＰＰ１７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流領域は、プローブとしてそれぞれのｃＤＮＡクローンを用いて、イネゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。それぞれのフランキング配列の推定プロモーター領域を、例えば、それぞれｐＢＩ１２１のベクターにサブクローニングする。各構築物を、例えば、エレクトロポレーション法またはAgrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来ベクターを使用してイネに導入して、ＲＰＰ１６タンパク質またはＲＰＰ１７タンパク質を発現するトランスジェニックイネ植物が得られ得る。得られたトランスジェニックイネ植物は、例えば、ハイグロマイシン含有培地で選択され、そしてイネゲノムへの遺伝子の導入は、ｇｕｓＡ遺伝子を指標としてＰＣＲ法またはサザン法によって確認できる。ＲＰＰ１６および／またはＲＰＰ１７タンパク質を発現するトランスジェニック植物は、イネ以外に、種々の植物で作成可能であり、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、およびメロンが好ましい。
【００４８】
また、ＲＰＰ１６プロモーターまたはＲＰＰ１７プロモーターの制御下に発現可能に結合された異種タンパク質をコードするＤＮＡを利用して、師部特異的に異種タンパク質を発現するトランスジェニック植物を作成することもできる。この異種タンパク質は、単独で、あるいはＲＰＰ１６またはＲＰＰ１７タンパク質全体または一部との融合タンパク質として発現され得る。あるいは、ＲＰＰ１６またはＲＰＰ１７タンパク質と別に発現されるが、発現後にこれらのタンパク質と相互作用するように発現されてもよい。
【００４９】
本発明により得られるＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質は、ＭＰに類似の構造を有し、師部特異的に発現し、その発現はそれぞれのプロモーターによって厳密に調節されている。そのため、これらのタンパク質の遺伝子および／またはその制御領域を利用して、トランスジェニック植物を作成し、その師部で異種物質を生産させ、その物質を師管へ輸送するという技術を開発することが可能である。例えば、師部において、産業価値のある物質を生産させることに加え、植物に耐病性または耐虫性を与える物質を生産させ、この物質を師管という長距離輸送経路を使用して植物全体に行き渡らせることが可能である。また、環境に負の影響を与える物質（重金属、環境ホルモンなど）の結合タンパク質を生産させ、環境浄化植物を育成できる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。
【００５１】
（実施例１：イネからの新しいウイルスＭＰ様遺伝子の同定）
イネ植物（Oryza sativa L.cvs Nipponbare）を、温室で２８℃にて生育した。イネ若葉から、イネｃＤＮＡを、Kadowakiら（Kadowakiら, EMBO J., 15, 6652-6661 (1996)）に記載の手順によって抽出した。
【００５２】
ｃＤＮＡのスクリーニングために、ＣｍＰＰ１６ｃＤＮＡに対する類似性検索を、イネで発現した配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおいてＢＬＡＳＴサーチを使用して行い、そして２つのクラスの部分配列をピックアップした。２つのイネＥＳＴクローンＲ０３７４およびＥ６１１８７（それぞれＤＤＢＪ登録番号ＡＵ０３１６６３およびＣ７４９５５）のインサートＤＮＡ全長を、プローブとして使用した。これらのハイブリダイゼーションプローブを、増強された化学発光直接核酸標識システム（Amersham Pharmacia）を使用して標識し、続いてハイブリダイゼーション分析を行った。
【００５３】
その結果、３種のクローンを、ｃＤＮＡライブラリーから得た。得られたクローンのＤＮＡ配列を、蛍光染料プライマー（PE Biosystems）を使用してジデオキシチェーンターミネーション法によって決定した。これらのうちの１つは、配列番号１に示すヌクレオチド配列であり、１５．９ｋＤａの推定分子量を有する１４４アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。これを、１６ｋＤａイネ師部タンパク質（ＲＰＰ１６−１）と命名した（配列番号２）。他の２つのクローン（それぞれ配列番号３および配列番号５）は非常に類似しており、配列番号３に対して配列番号５は、ＯＲＦ配列内でわずかに９個のヌクレオチド欠失があったにすぎなかった。２つのクローンに含まれるＯＲＦは、１７．７ｋＤａの推定分子量を有する１５９アミノ酸残基、および１７．４ｋＤａの推定分子量を有する１５６アミノ酸残基をコードし、それぞれＲＰＰ１７−１およびＲＰＰ１７−２（それぞれ、配列番号４および配列番号６）と命名した。
【００５４】
次に、遺伝子コピー数を検討するために、サザンブロット分析を、以下のように行った。イネゲノムＤＮＡ（５μg）を、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、およびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして０．８％アガロースゲルによる電気泳動に供した。これらをアルカリ変性後にナイロンメンブランにトランスファーした。ハイブリダイゼーションプローブは、それぞれＲｐｐ１６−１ｃＤＮＡおよびＲｐｐ１７−１または２のｃＤＮＡについての、ｃＤＮＡの全体領域に対応するＤＩＧ標識したＰＣＲフラグメントであった。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、Ausubelら（Ausubelら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, New York: Wiley）に記載のように行った。フィルターをＸ線フィルム（富士フィルム）に曝露した。ハイブリダイズしたバンドを、製造業者の指示書に記載のように化学発光反応によって可視化した。その結果、単一バンドを観察し、これは、Ｒｐｐ１６遺伝子およびＲｐｐ１７遺伝子がイネゲノムにおいて単一コピー遺伝子であることを強く示唆した（データは示さず）。この結果はまた、Ｒｐｐ１７−１遺伝子およびＲｐｐ１７−２遺伝子の間の９個の塩基配列の差が、オルタナティブスプライシング事象に由来することを示唆する。
【００５５】
（実施例２：タンパク質ＲＰＰ１６−１、ＲＰＰ１７−１、およびＲＰＰ１７−２の特徴づけ）
カボチャＣｍＰＰ１６−１およびＣｍＰＰ１６−２の推定アミノ酸配列（これらはｃＤＮＡ（Xoconostle-Cazaresら, (1999), 前出）から推定）、レッドクローバー壊死モザイクウイルスの移動タンパク質（ＲＣＮＭＶのＭＰ）の推定アミノ酸配列（これはｃＤＮＡ（ＤＤＪＢ登録番号Ｐ１０８３８）から推定）と、イネＲＰＰ１６、ＲＰＰ１７−１、ならびにＲＰＰ１７−２の推定アミノ酸配列（これらはＲｐｐ１６−１、Ｒｐｐ１７−１、およびＲｐｐ１７−２のｃＤＮＡからそれぞれ推定）とのアラインメントを図１に示す。同一アミノ酸を反転によって示し、そして類似のアミノ酸に影をつけた。プロテインキナーゼＣ様Ｃａ２＋／リン脂質結合（Ｃ２）ドメインを、濃い線で示し、Ｃ２ドメインの３つのサブドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ）を、白の長方形で示した。配列の右の数字は、各タンパク質のアミノ酸位置を示す。
【００５６】
ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質の推定アミノ酸配列は、互いに５７％の類似性を共有し、そして両方のタンパク質ともＲＣＮＭＶのＭＰに局所的な相同性を有していた。Ｒｐｐ１６遺伝子およびＲｐｐ１７遺伝子からの推定アミノ酸配列は、カボチャＣｍＰＰ１６に対してそれぞれ５６％および５８％の類似性を示した。図１から明らかなように、モチーフサーチによれば、これらのタンパク質の保存的領域は、単一のＣａ２＋／リン脂質結合（Ｃ２）ドメイン（Kopkaら, (1998), 前出）を含んでいる。
【００５７】
次いで、タンパク質ＲＰＰ１６−１、ＲＰＰ１７−１、およびＲＰＰ１７−２についてのコンピュータサーチを、登録された配列データに対して行った。類似性のある配列として、Arabidopsis Thaliana（シロイヌナズナ）［ＤＤＪＢ登録番号ＣＡＢ７５９０５、ＡＡＦ３４８６０］、chickpea（ヒヨコマメ）［ＤＤＪＢ登録番号ＡＪ０１２６９２］、およびZea mays（トウモロコシ）［ＤＤＪＢ登録番号Ｕ６４４３７、ＡＦ１５２６０１］からの配列を、データベースからピックアップできた。しかし、これらの機能は知られていない。
【００５８】
さらに、ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質についての系統樹を、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ４ａ（Swofford, (1998) PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), version 4. Sunderland, MA: Sinauer Associates）を使用するNeighbor-Joining Methodクラスタリング方法（SaitouおよびNei, Mol. Biol. Evol., 4, 406-425 (1987)）に従って作成し、ブートストラップ値を、10,000反復試験区について得た。得られるタンパク質系統発生図を図２に示す。枝の数字は、枝を支持するパーセンテージである。イネタンパク質の名称を四角で囲んで示した。結果は、ＲＰＰ１７タンパク質が、配列アラインメントにおいて、ＲＰＰ１６タンパク質よりもカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質とより密接に関連することを示唆する。
【００５９】
ＲＰＰ１６−１、ＲＰＰ１７−１、およびＲＰＰ１７−２のタンパク質の構造を、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔを使用して分析した。ＣｍＰＰ１６−１、ＣｍＰＰ１６−２、ＲＰＰ１７−１、およびＲＰＰ１７−２の推定等電点（ｐＩ）は、それぞれ６．１７、５．６６、６．０５、および６．２６であり、これは、これらのタンパク質が推定の中性タンパク質であることを示す。一方、ＲＰＰ１６−１の推定ｐＩは４．０６であり、ＲＰＰ１６−１が推定の酸性タンパク質であることを示す。タンパク質特性だけでなく系統発生分析の結果も、カボチャＣｍＰＰ１６タンパク質の進化的対応物がＲＰＰ１７タンパク質であることを示した。
【００６０】
（実施例３：タンパク質発現の免疫学的検討）
ＲＰＰ１６およびＲＰＰ１７タンパク質の発現を、免疫学的検出によって検討した。
【００６１】
まず、イネＲＰＰ１６およびＲＰＰ１７タンパク質に対する抗血清を、以下のように調製した。ＲＰＰ１６−１およびＲＰＰ１７−１の一部（それぞれ、アミノ酸位置；配列番号２の３９位〜１４４位およびアミノ酸位置；配列番号４の４３位〜１５９位）に対応するｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、ＧＳＴ遺伝子を含むｐＧＥＸ４Ｔ−３ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）にライゲートし、そしてそれぞれＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に形質転換した。ＧＳＴ／ＲＰＰ１６およびＧＳＴ／ＲＰＰ１７の各融合タンパク質を、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導した。各精製した融合タンパク質を、２週間隔で６回ウサギに注射した。抗血清を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラムを使用するアフィニティー精製によって精製した。抗ＲＰＰ１６抗血清および抗ＲＰＰ１７抗血清を用いて、ＲＰＰ１６−１タンパク質およびＲＰＰ１７−１タンパク質の発現をウエスタンブロット分析によって検出した。結果を、それぞれ図３の（ａ）および（ｂ）に示す。
【００６２】
図３において、矢印は、それぞれ（ａ）抗ＲＰＰ１６抗血清と反応した３０ｋＤペプチドおよび（ｂ）抗ＲＰＰ１７抗血清と反応した１７ｋＤペプチドを示す。約３０ｋＤａの分子量を有するペプチドを、抗ＲＰＰ１６抗血清を使用してイネ総タンパク質の可溶性画分で検出した（図３（ａ））。また、ＲＰＰ１７−１に対する免疫学的検出は、不溶性抽出物中に１７ｋＤａのタンパク質の存在を示した（図３（ｂ））。また、これらのタンパク質は、以下に示すように、別の植物にも普遍的に存在することが示された（図３（ｃ）および（ｄ））。
【００６３】
次に、イネ、サトウキビ、オオムギ、アズキ、アラビドプシス、メロン、およびタバコの各植物の葉を、５容量の抽出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；２ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；１０％グリセロール）中で微細粉末に粉砕し、１５，０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心分離し、そして上清を収集した（Ｓ１画分）。ペレット画分を、等容量の緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；２ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；１０％グリセロール；５０ｍＭ  ＫＣｌ；０．２％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁した。続いて、チューブを４℃にて３０分間回転し、そして１５，０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心分離し、そして上清を収集した（Ｓ２画分）。ペレット画分もまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥランニング緩衝液に懸濁した（不溶性画分）。各タンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｌｏｎ  ＰＶＤＦメンブラン（Millipore，日本）にトランスファーした。水溶性可溶性画分（Ｓ１）、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００可溶性画分（Ｓ２）、および不溶性画分（Ｍ）からの葉タンパク質を調製した。さらにイネ（レーン１）；オオムギ（レーン２）；サトウキビ（レーン３）；アラビドプシス（レーン４）；メロン（レーン５）；アズキ（レーン６）；およびタバコ（レーン７）のそれぞれについても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、（ａ）および（ｃ）については抗ＲＰＰ１６抗血清、ならびに（ｂ）および（ｄ）については抗ＲＰＰ１７抗血清を用いてウエスタンブロット分析を行った。
【００６４】
その結果、各植物の葉の可溶性画分（Ｓ１またはＳ２）において、イネのＲＰＰ１６と類似の構造を有するタンパク質を、サトウキビ、オオムギ、アズキ、メロン、およびアラビドプシスで検出した（図３（ｃ））。しかし、免疫学的分析で検出した可溶性の３０ｋＤａペプチドは、ＲＰＰ１６−１のｃＤＮＡ配列から推定した１５．９ｋＤａの質量よりも１４ｋＤａ大きかった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＰＰ１６−１産物（アミノ酸位置：配列番号２の３９位〜１４４位；Asp：9.52％；Glu：12.38％）も、１１．５ｋＤａタンパク質として示され、推定されたよりも５．５ｋＤａ大きかった（データは示さず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、酸性アミノ酸含量の高いタンパク質は、実際の分子量よりも遅く移動し、そのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が顕著に大きくなることが報告されている（Takanoら, Biochemistry, 27, 1964-1972 (1988)）。したがって、多くの酸性アミノ酸残基を有するＲＰＰ１６−１タンパク質（Asp：8.33％；Glu：11.11％）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて実際の分子サイズよりも大きいタンパク質として検出されていると考えられる。これらの結果は、タンパク質ブロットによって検出されるバンドが、Ｒｐｐ１６−１遺伝子の翻訳産物であることを強く示唆する。
【００６５】
ＲＰＰ１７タンパク質と類似の分子量を有するタンパク質もまた、サトウキビ、オオムギ、タバコ、メロン、およびアラビドプシスの葉の不溶性画分で検出した（図３（ｄ））。この結果は、ＲＰＰ１７タンパク質が、膜結合タンパク質であることを示唆する。
【００６６】
これらの結果は、ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質またはそのホモログが、高等植物全体を通して保存されることを示す。さらに、ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質は、タンパク質ゲル分析において全く異なるタンパク質特性を示すので、細胞内局在化の点で大きく異なるタンパク質である。
【００６７】
（実施例４：Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡを発現するトランスジェニック植物の生産およびインサイチュＧＵＳ染色）
ＲＰＰ１６−１タンパク質およびＲＰＰ１７−１タンパク質のそれぞれの推定プロモーター領域を含むゲノム配列を、プラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ＲＰＰ１６−１タンパク質およびＲＰＰ１７−１タンパク質のＯＲＦの上流領域は、２×１０５プラークのイネゲノムライブラリーを、プローブとしてそれぞれのｃＤＮＡクローンでスクリーニングすることによって得た。１．４ｋｂのＲＰＰ１６プロモーター領域（配列番号７）および２ｋｂのＲＰＰ１７プロモーター領域（配列番号８：ＲＰＰ１７−１およびＲＰＰ１７−２に共通の配列）を、それぞれｐＣＡＭＢＩＡ１３０１のｇｕｓＡ遺伝子の上流にインフレームでサブクローニングした。これらを、ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＡＭＶＩＡ１３０１プラスミド中のｇｕｓＡ遺伝子の上流にライゲートした。得られたプラスミドは、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来ベクターであり、これをAgrobacterium tumefaciens EHA105株（ZENECA MOGEN）に導入した。トランスジェニックイネ植物（Oryza sativa cvs Nipponbare）を、Toki（Toki, Plant Mol. Biol. Rep., 15, 16-21 (1997)）に記載のようにアグロバクテリウム媒介形質転換によって作成した。トランスジェニックイネ植物を、ハイグロマイシン含有培地で選択し、そしてイネゲノムへのｇｕｓＡ遺伝子の導入を、ＰＣＲによって確認した。４０以上の独立したトランスジェニック系統を、各構築物について得た。
【００６８】
ＧＵＳ遺伝子発現の分析は、ＧＵＳ活性の蛍光分析（Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387-405 (1987)）によって行った。トランスジェニックＲｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡ植物の根、茎、および葉では、いずれもＧＵＳ活性が認められ、ＧＵＳが発現していることを確認した。なお、ＧＵＳ活性は、イネ植物の非形質転換体では検出されなかった。
【００６９】
ＧＵＳ遺伝子発現の組織化学的分析については、ＧＵＳ染色によって以下のように行った。まず、葉、茎、および根のセグメントを、マイクロスライサーによって３０μｍの薄横断面の切片にし、次いで０．５ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸）および５％メタノールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で２〜２４時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、試料をエタノールで澄明にした。
【００７０】
結果の写真を図４に示す。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の写真は、それぞれＲｐｐ１６−ｇｕｓＡ発現植物の葉の横断面、その拡大写真、茎の横断面、および根の横断面である。（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）の写真は、それぞれＲｐｐ１７−ｇｕｓＡ発現植物の葉、茎、および根の横断面である。略号は、ＢＲ：枝根；ＣＲ：冠根；Ｐｈ：師部組織；およびＴＶＢ：横走維管束を示す。
【００７１】
根では、Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡ植物においては、根でＧＵＳ染色が認められたが、冠根よりも枝根においてＧＵＳ染色が著しかった。発現パターンを詳細に観察するために、マイクロスライサーによって根の組織切片を調製した。Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡの両方とも、ＧＵＳ染色が枝根の維管束組織で観察された。一方、Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡ植物からの皮層、表皮、および外皮層においては、ＧＵＳ染色は観察されなかった。
【００７２】
茎では、Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡの発現は、小および大維管束、特に師部および木部柔組織においてのみ検出された。
【００７３】
Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡ植物の葉身および葉鞘におけるＧＵＳ染色を検討した。葉組織切片を、マイクロスライサーによって葉身および葉鞘から調製し、ＧＵＳ染色を、縦走維管束および横走維管束で観察した。ＧＵＳ染色は、大維管束のＣＣでおよび小維管束でのみ観察され、染色から８時間目までは他の細胞タイプでは観察されなかった。ＧＵＳ染色は、２４時間後には、ＣＣにおいてならびに維管束鞘に続く柔組織および葉肉細胞において検出された。この結果は、ＧＵＳ酵素はＣＣで発現されるが、徐々にそれに続くアポプラスト、柔組織、および葉肉細胞に放出されるようにみえること、すなわち、柔組織および葉肉細胞で観察されるＧＵＳ染色が、ＧＵＳ反応産物の拡散の結果であることを示す。この結果はまた、ＣＣ特異的発現が、ＲＰＰ１６プロモーター領域によって厳密に調節されることも示す。
【００７４】
Ｒｐｐ１７−ｇｕｓＡ植物の葉身および葉鞘では、ＧＵＳ染色は、２〜２４時間後に、ＣＣ、柔組織、および葉肉細胞で検出されるが、ＧＵＳ染色は、特にＣＣおよび葉肉細胞で優先的に検出された。
【００７５】
以上の結果から、ｇｕｓＡ発現を制御するＲＰＰ１６プロモーターおよびＲＰ１７プロモーターが、根および茎において類似の発現パターンを示すことがわかった。また、Ｒｐｐ１６遺伝子およびＲｐｐ１７遺伝子の発現パターンが、根および茎では同じであるが、葉身および葉鞘では異なることが示唆された。
【００７６】
【発明の効果】
本発明により、ウイルス移動タンパク質（ＭＰ）に類似の構造を有する２種のタンパク質がイネに存在し；一方はカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％の相同性を有するＲＰＰ１７タンパク質であり、そして他方はウイルスＭＰ様のカボチャＣｍＰＰ１６タンパク質と少なくとも約５０％の相同性を有する新規なタンパク質であるＲＰＰ１６タンパク質であることが明らかになった。これらのタンパク質は、ＭＰに類似の構造を有し、師部特異的に発現し、その発現はそれぞれのプロモーターによって厳密に調節されている。そのため、これらのタンパク質の遺伝子およびその制御領域を利用して、師部で物質を生産させ、師管へ輸送するという技術を開発することが可能である。例えば、師部において、有用タンパク質を生産させたり、あるいは植物に耐病性または耐虫性を与える物質を生産させ、この物質を師管という長距離輸送経路を使用して植物全体に行き渡らせることが可能である。また、環境に負の影響を与える物質（重金属、環境ホルモンなど）の結合タンパク質を生産させ、環境浄化植物を育成できる。
【００７７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】カボチャＣｍＰＰ１６およびレッドクローバー壊死モザイクウイルスの移動タンパク質とイネＲＰＰ１６−１タンパク質、ＲＰＰ１７−１タンパク質、およびＲＰＰ１７−２タンパク質とのアラインメントを示す図である。
【図２】イネＲＰＰ１６−１タンパク質、ＲＰＰ１７−１タンパク質、ＲＰＰ１７−２タンパク質、および関連配列の系統発生分析の結果を示す図である。
【図３】ＲＰＰ１６タンパク質およびＲＰＰ１７タンパク質の電気泳動によるタンパク質ブロット分析の結果を示す写真である。
【図４】Ｒｐｐ１６−ｇｕｓＡおよびＲｐｐ１７−ｇｕｓＡ植物のＧＵＳ組織化学的検出の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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