(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン５受容体α鎖のＮ末端アミノ酸から１〜３１３番目に存在するエピトープを認識し、かつインターロイキン５のヒトインターロイキン５受容体α鎖への結合を阻害する抗体。
【請求項２】
抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６であり、抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２であり、抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５である請求項１記載の抗体。
【請求項４】
抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９４記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９５記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項５】
抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９６記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９７記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項６記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項８】
ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）である請求項７記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）が生産する請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）が生産するモノクローナル抗体が認識するエピトープを認識する、請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
抗体がヒト型キメラ抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgGクラスである請求項１１記載のヒト型キメラ抗体。
【請求項１３】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG1サブクラスである請求項２または４記載のヒト型キメラ抗体KM１３９９。
【請求項１４】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG4サブクラスである請求項２または４記載のヒト型キメラ抗体KM７３９９。
【請求項１５】
請求項１３記載の抗体を生産する形質転換体KM1399（FERM BP-5650）。
【請求項１６】
請求項１４記載の抗体を生産する形質転換体KM7399（FERM BP-5649）。
【請求項１７】
抗体がヒト型CDR移植抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号１０２記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９９記載のアミノ酸配列を含む請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgGクラスである請求項１７または１８記載のヒト型CDR移植抗体。
【請求項２０】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG1サブクラスである請求項２、１７〜１９のいずれか１項に記載のヒト型CDR移植抗体KM８３９９。
【請求項２１】
抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG4サブクラスである請求項２、１７〜１９のいずれか１項に記載のヒト型CDR移植抗体KM９３９９。
【請求項２２】
請求項２０記載の抗体を生産する形質転換体KM8399（FERM BP-5648）。
【請求項２３】
請求項２１記載の抗体を生産する形質転換体KM9399（FERM BP-5647）。
【請求項２４】
抗体が、一本鎖抗体またはジスルフィド安定化抗体である請求項１〜６、９〜１４および１７〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒトインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項２６】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒトインターロイキン５受容体α鎖を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項２７】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒト好酸球を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項２８】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いて可溶性ヒトインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項２９】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有する医薬。
【請求項３０】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有する好酸球増多抑制剤。
【請求項３１】
請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有するアレルギー性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、慢性気管支喘息などの疾患の診断あるいは治療に有用であるヒトインターロイキン５受容体α鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体およびヒト化抗体ならびに該抗体を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、ならびに該モノクローナル抗体および該ヒト化抗体を用いてインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出する方法、ならびに該モノクローナル抗体およびヒト化抗体を用いる慢性気管支喘息等の診断および治療に関する。
背景技術
インターロイキン−５（以下、IL-5と称す）は、Ｔ細胞や肥満細胞などにより分泌されるリンホカインの一種である。マウスにおけるIL-5は、Ｂ細胞の分化および増殖因子、好酸球の分化および増殖因子として作用することが知られている。ヒトにおいては、主として好酸球の分化および増殖因子として作用することが知られている［アドバンシーズ・イン・イムノロジー（Advances in Immunology）,57145（1994）、ブラッド（Blood）,79,3101（1992）］。IL-5は好酸球などの細胞表面上に発現されている特異的な受容体（IL-5受容体）を介してその作用を発現する。IL-5受容体（以下、IL-5Rと称す）はヒト、マウスともに２種類の異なる蛋白質［α鎖（以下、IL-5Rαと称す）、β鎖（以下、IL-5Rβと称す）］により構成されることが明らかにされている。さらに、IL-5のIL-5Rへの結合はIL-5Rαによって担われており、IL-5Rβはそれ自体ではIL-5に対する結合能を示さないことが知られている［EMBO・ジャーナル（EMBO J.）,9,4367（1990）、同,10,2833（1991）、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）、同,175,341（1992）、セル（Cell）,66,1175（1991）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,89,7041（1992）］。また、IL-5Rβはインターロイキン-3（以下、IL-3と称す）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、GM-CSFと称す）などの受容体の構成成分であることが知られている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,87,9655（1990）、セル（Cell）,66,1165（1991）］。
好酸球は慢性気管支喘息をはじめとするアレルギー性疾患において増加することが知られている。慢性気管支喘息患者の気道には好酸球の著しい浸潤が認められること、好酸球自身が細胞傷害性を有する顆粒蛋白を含み、その蛋白の沈着が慢性気管支喘息患者の気道組織あるいはアトピー性皮膚炎患者の病変部位に認められることなどから好酸球は慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な働きをしているものと考えられ［アドバンシーズ・イン・イムノロジー（Adv.Immunol.）,39,177（1986）、イムノロジー・トゥデイ（Immunol.Today）,13,501（1992）］、その動態を把握することは臨床診断上有用である。一方、IL-5はヒトにおいては好酸球に対して特異的に作用することから、IL-5Rは好酸球に特異的に発現されているものと考えられ、IL-5Rはヒト好酸球特異的なマーカーとして利用することができる。さらに、IL-5RβはIL-3、GM-CSF等のサイトカイン受容体であることから、IL-5Rαが好酸球特異的マーカーであると考えられる。従って、抗ヒトIL-5Rα鎖抗体（以下、hIL-5Rα抗体と称す）を用いた免疫細胞染色などにより、特異的に好酸球を検出することができる。しかし、現在特異的に好酸球を検出することが可能な抗ｈIL-5Rα抗体は知られていない。
一方、実際に生体内において好酸球の増多、浸潤にIL-5が重要な働きをしていることは、IL-5遺伝子導入マウスにおいて著しい好酸球増多が認められること［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,172,1425（1990）、同,173,429（1991）、インターナショナル・イムノロジー（Int.Immunol.）,2,965（1990）］、喘息モデル動物における好酸球の組織浸潤が抗IL-5抗体の投与により抑制されること［アメリカン・レビュー・オブ・レスピレイトリー・ディジーズ（Am.Rev.Resir.Dis.）,147,548（1993）、同,148,1623（1993）］などから明らかにされている。また、ヒト慢性気管支喘息患者の気道粘膜組織、アトピー性皮膚炎患者の病変部位において、IL-5の発現が認められることも報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）,87,1541（1991）、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,173,775（1991）］。さらに、IL-5はヒト好酸球に対して試験管内での寿命延長作用を示すこと［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,143,2311（1989）］、好酸球選択的な活性化因子であること［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,167,219（1988）］などが明らかにされている。
以上のことから、IL-5Rに結合し、IL-5の生物活性を阻害できる抗体は好酸球の活性を抑制し、慢性気管支喘息などのアレルギー性疾患の治療に有用であることが期待される。IL-5の生物活性を阻害できる抗マウスIL-5Rα抗体［特開平3-108497、インターナショナル・イムノロジー（Int.Immunol.）,2,181（1990）］は、マウスIL-5Rをその細胞表面に多数発現しているIL-5依存性細胞を抗原として用いることにより作製されている。一方、ヒトの場合、IL-5Rを多数発現している細胞は知られておらず、好酸球においてもその発現は極めて低いことが報告されている［セルラー・イムノロジー（Cell.Immunol.）,133,484（1991）］。このため、抗マウスIL-5Rα抗体の作製と同様の方法により、同等の機能を有する抗ヒトIL-5Rα抗体を得ることは困難である。EMBO・ジャーナル［EMBO J.,14,3395（1995）］には、ヒトIL-5Rαに対する抗体としてα16と称する抗体の記載があるが、これはIL-5Rαに対する中和活性がないものである。
一方、ヒトIL-5Rαの遺伝子はヒト好酸球［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］、あるいはヒト前骨髄球系細胞（HL60）［セル（Cell）,66,1175（1991）、特開平6-78772］より調製したcDNAライブラリーをマウスIL-5RαのcDNAあるいはマウスIL-5Rαの部分アミノ酸配列［特開平6-54690、EMBO・ジャーナル（EMBO J.）,9,4367（1990）］を基に合成したオリゴDNAをプローブとしてスクリーニングすることにより得られている。このcDNAを宿主細胞に導入することにより、細胞表面にhIL-5Rαを発現した細胞が造成されているが、この細胞におけるhIL-5Rの発現レベルは一細胞あたり104分子以下と極めて少ない［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］。従って、この細胞を免疫原として用いて、抗hIL-5Rα抗体を作製した場合、宿主細胞由来の蛋白質に比較して、hIL-5Rαの相対的な量は極めて少なく、また、絶対的な蛋白量としても極めて少ないことは明らかである。また、マウスIL-5RαとヒトIL-5Rαの間にはアミノ酸レベルで80%近いホモロジーが認められること、マウスIL-5がヒトIL-5Rに対しても高い結合活性を示すこと［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］などから、被免疫動物として一般的に利用されるマウスやラットに対して、ヒトIL-5Rαは免疫原性が低いと考えられる。実際、hIL-5Rα発現細胞を免疫原として抗hIL-5Rα抗体を作製を行ったが、困難であった。
ヒト好酸球のcDNAライブラリーからのIL-5RαcDNAのクローニングにおいて、IL-5Rαの膜貫通領域以下を欠くＮ末端アミノ酸配列1〜313番目に相当する可溶性ヒトIL-5Rα（以下、shIL-5Rαと称す）をコードするcDNAが得られている［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］。shIL-5Rαを免疫原として用いて、抗hIL-5Rα抗体を作製した場合、IL-5の生物活性を阻害できる抗hIL-5Rα抗体を取得するためには、細胞表面に発現しているIL-5Rαと同様な高次構造を保持している、真核性宿主細胞より分泌生産されたshIL-5Rαを免疫原として用いることが必要である。また、同一蛋白においてもそのシグナルペプチドにより生産効率が著しく異なることが明らかにされていることから［蛋白質核酸酵素、35、2584（1990）］、分泌生産を行うにあたり、適切なシグナルペプチドを選択する必要がある。
先に述べたようにshIL-5Rαのみをコードするものと考えられているmRNAが好酸球で発現されていることが明らかにされている。マウスにおいてはIL-5Rは、好酸球のみならずＢ細胞などにおいても発現されており、かつヒトの場合と同様に、それらの細胞においてIL-5Rαの細胞外領域（以下、smIL-5Rαと称す）のみをコードするものと考えられているmRNAの発現が確認されている。また、IL-5Rを発現しているマウス慢性Ｂ細胞白血病株（BCLl）を移植されたマウス、あるいは、ヒト自己免疫疾患のモデルマウスの血液中にsmIL-5Rαが検出されることも報告されている［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（J.Immunol.Method）,167,289（1994）］。これらのことは、IL-5Rを発現している細胞の増多、活性化状態が血液中に分泌されているsmIL-5Rαの量に反映される可能性を示唆している。ヒトの場合、IL-5Rは好酸球に限られた発現をするものと考えられており、好酸球の増多、活性化が血液中などのshIL-5Rαの量に反映される可能性がある。従って、shIL-5Rαの定量を可能にすることは、臨床診断上有用と期待される。
以上のことから、ヒトIL-5Rαに特異的に結合するモノクローナル抗体が取得できればアレルギー性疾患の診断、治療に有用であると考えられるが、一般にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることによりヒト体内にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体ができてしまう。その結果、投与されたヒト以外の動物抗体と反応し、副作用を引き起こしたり［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J.Clin.Oncol.）,2,881（1984）、ブラッド（Blood）,65,1349（1985）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（J.Natl.Cancer Inst.）,80,932（1988）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,82,1242（1985）］、抗体がはやくクリアランスされたり［ジャーナル・オブ・ニュークレアー・メディシン（J.Nucl.Med.）,26,1011（1985）、ブラッド（Blood）,65,1349（1985）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（J.Natl.Cancer Inst.）,80,937（1988）］、抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,135,1530（1985）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）,46,6489（1986）］。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体（再形成ヒト抗体）のようなヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と称す）がヒト以外の動物抗体由来で定常領域（以下、C領域と称す）がヒト抗体由来である抗体であり［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,81,6851（1984）］、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が6倍のびることが報告されている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,86,4220（1989）］。ヒト型CDR移植抗体はヒト抗体のCDR［相補性決定領域；Complementarity Determining Region］をヒト以外の動物由来の抗体のCDRと置換した抗体であり［ネイチャー（Nature）,321,522（1986）］、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が4〜5倍伸びることが報告されている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.,147,1352（1991）］。しかしながら、これまでのところhIL-5Rαに対するヒト化抗体は報告されていない。
従って、ヒトIL-5Rαに対して特異的に結合するヒト化抗体は、ヒト体内に投与したときにヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体が生じないことによる、副作用の減少、および血中半減期の延長により、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患等に対する高い治療効果が期待される。
さらに、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、一本鎖抗体［サイエンス（Science）,242,423（1988）］あるいはジスルフィド安定化抗体［モレキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology）,32,249（1995）］といった、より小さな抗体分子の作製が行われている。一本鎖抗体やジスルフィド安定化抗体はモノクローナル抗体あるいはヒト化抗体に比べ、その分子量が小さいことから組織移行性、血中からのクリアランスに優れ、イメージング等への応用、さらにはトキシンとの複合体の作製も行われ、治療効果も期待されている［キャンサー・リサーチ（Cancer Research）,55,318（1995）］。ヒトIL-5Rα鎖特異的に結合する一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体ができれば、アレルギー疾患等に対する高い診断、治療効果が期待される。しかしながら、ヒトIL-5Rα鎖に対する一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体についてもこれまでのところ報告されていない。
発明の開示
本発明者らは、ヒトIL-5Rα鎖（以下、ヒトIL-5Rα鎖をhIL-5Rα鎖とも記す）の膜貫通領域以下を欠いた細胞外領域に相当する、Ｎ末端アミノ酸1〜313番目に存在するエピトープを認識するhIL-5Rα鎖に対する抗体が、免疫細胞染色によりヒトインターロイキン５受容体α鎖に特異的に反応すること、およびヒトインターロイキン５の生物活性を抑制することができることを見出した。これらの抗体を用いれば、前記アレルギー性疾患の診断、治療を行うことができる。
したがって、本発明は、ヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応する抗体を提供する。本発明における抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体などを含む。本発明におけるモノクローナル抗体は、hIL-5Rα鎖に特異的に反応するものであればいかなるものでもよいが、以下に述べる製造法によって確立したものが好適なものとしてあげられる。すなわち、hIL-5Rαタンパクを抗原として調製し、それらをマウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能な動物に免疫することにより、抗原特異性をもつ形質細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞株とを融合させ、モノクローナル抗体産生能を有したハイブリドーマを調製し、これを培養することにより、抗IL-5Rαモノクローナル抗体を取得できる。本発明のモノクローナル抗体としては、ヒトIL-5Rα鎖のＮ末端アミノ酸から１〜313番目に存在するエピトープを認識し、かつ免疫組織染色によりヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応するモノクローナル抗体、およびヒトIL-5Rα鎖のＮ末端アミノ酸から１〜313番目に存在するエピトープを認識し、かつIL-5の生物活性を抑制するモノクローナル抗体などをあげることができる。前者に属するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ株KM1257（FERM BP-5133）が生産するモノクローナル抗体KM1257、後者に属するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ株KM1259（FERM BP-5134）が生産するモノクローナル抗体KM1259およびハイブリドーマ株KM1486（FERM BP-5651）が生産するモノクローナル抗体KM1486が具体例としてあげられる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球などと免疫学的に反応する。また、本発明のモノクローナル抗体は、可溶性ヒトIL-5Rα鎖と免疫学的に反応する。したがって、本発明は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球および可溶性ヒトIL-5Rα鎖を免疫学的に検出、定量する方法も提供する。これらの検出、定量結果は、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の診断および治療に利用することができる。
さらに、本発明では、モノクローナル抗体以上に、副作用が少なく、血中半滅期が延期され、より治療薬として望ましいIL-5の生物活性を阻害するヒト化抗体を提供する。本発明におけるヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の総称である。
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体可変領域重鎖（以下、VHと称す）および可変領域軽鎖（以下、VLと称す）とヒト抗体の定常領域重鎖（以下、CHと称す）およびヒト抗体の定常領域軽鎖（以下、CLと称す）とからなる抗体を意味し、ヒト型CDR移植抗体とは、ヒトの抗体のVHおよびVLのCDR配列をヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。IL-5の生物活性を阻害する抗ｈIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応し、IL-5の生物活性を阻害できる抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体はいずれのイムノグロブリン（Ig）クラスに属するものでもよいがIgG型のものが好適であり、さらにIgG型に属するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4といったイムノグロブリンのC領域のいずれも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、CHがヒト抗体IgG1であり、抗体のVLが配列番号95記載のアミノ酸配列を含み、CLがヒト抗体κである抗体があげられ、KM1399と称するものが具体例としてあげられる。また、CHがヒト抗体IgG4であるヒト型キメラ抗体としてはKM7399と称するものが具体例としてあげられる。KM1399を生産する形質転換株としてはKM1399（FERM BP-5650）があげられる。KM7399を生産する形質転換株としてはKM7399（FERM BP-5649）があげられる。
また、IL-5の生物活性を阻害する抗hIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応し、IL-5の生物活性を阻害できるヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列をそれぞれ置換したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のヒト型CDR移植抗体の例としては、抗体のVHが配列番号72記載のアミノ酸配列を含み、CHがヒト抗体IgG1であり、抗体のVLが配列番号63記載のアミノ酸配列を含み、CLがヒト抗体κである抗体があげられ、KM8399と称するものが具体例としてあげられる。また、CHがヒト抗体IgG4であるヒト型CDR移植抗体としてはKM9399と称するものが具体例としてあげられる。KM8399を生産する形質転換株としてはKM8399（FERM BP-5648）があげられる。KM9399を生産する形質転換株としてはKM9399（FERM BP-5647）があげられる。
本発明のヒト化抗体は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球などと免疫学的に反応する。したがって、本発明は、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の診断および治療に利用することができる。
さらに、本発明ではヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示す一本鎖抗体（single chain Fv;以下、scFvと称す）あるいはジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv;以下、dsFvと称す）を提供する。
一本鎖抗体（scFv）とは、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと称す）を用いて連結した、VH−Ｌ−VLないしはVL−Ｌ−VHポリペプチドを示す。本発明のscFvに含まれるVHおよびVLは抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化抗体（dsFv）とはVHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［プロテイン  エンジニアリング（Protein Engineering）,7,697（1994）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるVHあるいはVLはマウス型抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
ヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示す一本鎖抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応する抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、一本鎖抗体発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のモノクローナル抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号95記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。本発明のヒト型CDR移植抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号102記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号99記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
ヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示すジスルフィド安定化抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応する抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のモノクローナル抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号95記載アミノ酸配列を含む抗体があげられる。
本発明のヒト型CDR移植抗体由来のジスルフィド安定化抗体の例としては、抗体のVHが配列番号102記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号99記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
以下に、ヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応する、あるいはヒトIL-5の生物活性を阻害する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体、ヒトIL-5の生物活性を阻害する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体、抗ヒトIL-5Rα鎖一本鎖抗体および抗ヒトIL-5Rα鎖ジスルフィド安定化抗体の製造法、ならびに該抗体によるヒトインターロイキン５受容体α鎖の検出および定量法について、説明する。
１．抗hIL-5Rαモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、hIL-5Rαを細胞表面に発現した細胞あるいはその細胞膜画分、または、hIL-5Rα発現細胞であるCTLL-2（h5 R）の細胞あるいはその細胞膜画分等を用いることができる。CTLL-2（h5 R）細胞は、既にクローニングされている完全長のhIL-5RαをコードするcDNA［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］を動物細胞用発現ベクター、たとえばpCAGGS［ジーン（Gene）,108,193（1991）］に組み込み、エレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］により該発現ベクターをマウスT細胞株であるCTLL-2に導入することにより造成されたhIL-5Rα発現細胞である。
また、hIL-5RαをコードするcDNAの全長もしくはその部分断片は、例えば、大腸菌などの原核性宿主細胞中で発現させるために、発現ベクター、たとえば市販のpGEX［ファルマシア（Pharmacia）社］、pETシステム［ノバジェン（Novagen）社］あるいは実施例1の（11）で述べるpMKex1などに組み込み、hIL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として発現させることができる。大腸菌により発現された蛋白質は、菌体を破砕した後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動または融合蛋白質の性質に応じたアフィニティ−クロマトグラフィーなどの方法により精製することができる。
IL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として発現させる方法としては、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞も用いることができる。
哺乳動物細胞の場合、例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、実施例1の（1）で述べるpAGE210等のベクター内にhIL-5RαをコードするcDNAの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、該蛋白質の発現ベクターを構築することができる。また、該cDNAがコードするhIL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として効率的な発現を行うためには、該cDNA中のシグナルペプチドをコードする塩基配列と真核性宿主中で高発現させることができる蛋白質のシグナルペプチドをコードする塩基配列とを入れ換えることが好ましい。公知の蛋白質シグナルペプチドとしては、例えばヒト成長ホルモン、抗ガンダリオシドGD3キメラ抗体KM871（特開平5-304989）などを用いることが好ましい。
このようにして構築した発現ベクターは宿主細胞にエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、リポフェクチン法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,84,7413（1987）］などの公知の方法を用いて導入することができる。これらの細胞を適当な培地中で培養することにより、細胞内あるいは培養上清中にhIL-5Rαの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白として生産することができる。培地としては、培養上清中に生産されたhIL-5Rαの部分断片あるいはその融合蛋白質の精製を容易にするため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。
また、昆虫細胞の場合、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットなどを用いて、hIL-5RαをコードするcDNAの全長または部分断片を組み込んだ組み換えバキュロウィルスを作製し、Sf9やSf21等の昆虫細胞（いずれもファーミンジェン社製）に該組み換えウィルスを感染させることにより、細胞内あるいは培養上清中にhIL-5Rαの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白として、生産させることができる［バイオテクノロジー（Bio/Technology）,6,47（1988）］。
動物細胞または昆虫細胞などにより生産されたhIL-5Rαの全長あるいは部分断片または融合蛋白は、既知の蛋白質精製方法、例えば塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法に従って培養上清などから精製し、抗原として供することができる。とくに免疫グロブリンの定常領域との融合蛋白質として生産された場合は、免疫グロブリンの定常領域に対して特異的な親和性を有するプロテインAなどを固定化したアフィニティーカラムを用いて精製することが好ましい。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよいが、本明細書中においては、マウスまたはラットを用いる例を説明する。3〜20週令のマウスまたはラットに、shIL-5RαあるいはhIL-5Rαを細胞表面に発現しているCTLL-2細胞［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］を抗原として免疫し、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、1回目の投与の後1〜2週間おきに5〜10回行う。各投与後3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊1976年］などで調べる。
免疫に用いたshIL-5RαまたはhIL-5Rαを細胞表面に発現している細胞に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給原として供する。
脾細胞と骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3〜7日目に、免疫したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1）［カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr.Topics Microbiol.Immunol.）,81,1（1978）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Europ.J.Immunol.）,6,511（1976）］、SP2/0-Ag14（SP-2）［ネイチャー（Nature）,276,269（1978）］、P3-X63-Ag8653（653）［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,123,1548（1979）］、P3-X63-Ag8（X63）［ネイチャー（Nature）,256,495（1975）］などが用いられる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地［RPMI-1640培地にグルタミン（1.5mM）、2-メルカプトエタノール（5×10-5M）、ジェンタマイシン（10μg/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製、10%）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに8-アザグアニン（15μg/ml）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
前記１（2）で免疫した抗体産生細胞と１（3）で得られた骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS（リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝5〜10：1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000（PEG-1000）2g、MEM2mlおよびジメチルスルホキシド（DMSO）0.7mlの混液0.2〜1ml/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにする。遠心分離（900rpm、5分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）およびアミノプテリン（4×10-7）を加えた培地］100ml中に懸濁する。
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり１（5）に述べる酵素免疫測定法により、前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rとの融合蛋白などの組み換え蛋白質に特異的に反応するウェルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し［1回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、2回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをマウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）マウスまたはラット抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体の選択
マウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、アンチボディズ［Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14（1988）］に述べられている方法などに従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗hIL-5Rα抗体あるいはすべての精製抗hIL-5Rα抗体の活性を測定することもできる。
前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rαとの融合蛋白などの組み換え蛋白質を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは１（6）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、hIL-5Rαに特異的に反応するものをマウス抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清もしくはそれらの精製抗体を第一抗体として反応させた場合には、第二抗体としてはビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用い、標識物質に応じた反応を行なうことにより検出を行う。
また、前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rαとの融合蛋白などの組み換え蛋白質を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清、抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清、もしくははそれらの精製抗体のいずれかと、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識したヒトIL-5とを混合して反応させた後、標識物質に応じた反応を行うことにより、ヒトIL-5のヒトIL-5Rαへの結合阻害活性を測定することができる。この方法を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行い、ヒトIL-5阻害活性の高いものを選択する。
（６）マウスまたはラットモノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する］した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、前記１（3）で得られたマウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×107〜5×106細胞/匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、5分）して固形分を除去後、40〜50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、プロテインＡ-カラムあるいはセルロファインGSL2000（生化学工業社製）のカラムに通塔し、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは280nmでの吸光度より算出する。
２．抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のC領域であるCHおよびCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築されたものである。ヒト抗体のC領域としては、例えば、ヒト抗体H鎖ではCγ1やCγ4、ヒト抗体L鎖ではCκ等の任意のヒト抗体のC領域を用いることができる。ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンより成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）101,1307（1987）］、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーターとエンハンサー［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Comun.）,149,960（1987）］、および免疫グロブリンH鎖のプロモーター［セル（Cell）,41,479（1985）］とエンハンサー［セル（Cell）,33,717（1983）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖、L鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Methods）,167,271（1994）］。
（２）ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得する。
抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体産生ハイブリドーマ等よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のC領域部分あるいはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とする抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、ヒト以外の動物の抗体のV領域の3'末端側の塩基配列とヒト抗体のC領域の5'末端側の塩基配列とからなるものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
（４）ヒト以外の動物の抗体のCDR配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成するVH及びVLは、配列の比較的保存された4個のフレームワーク領域（以下、FR領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ3個の相補性決定領域（CDR）から成っている［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］。そして各CDRアミノ酸配列（CDR配列）は、既知の抗体のV領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］と比較することにより同定することができる。
（５）ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
まず、目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRを移植するためのヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列をVH、VLそれぞれについて選択する。ヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のV領域のFRのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankに登録されているヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のV領域のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］があげられるが、充分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のアミノ酸配列と高い相同性を有することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列をコードするDNA配列と目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRのアミノ酸配列をコードするDNA配列を連結させて、VH、VLそれぞれのアミノ酸配列をコードするDNA配列を設計する。CDR移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計したDNA配列を得るためには、全DNA配列をカバーするように各鎖について数本の合成DNAを設計し、それらを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Polymerase Chain Reaction；以下、PCRと称す）を行う。PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから各鎖について、好ましくは、6本の合成DNAを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定し、目的のヒト型CDR移植抗体の各鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを含むプラスミドを取得する。また、約100塩基よりなる合成DNAを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをアニーリング、連結することで、目的のヒト型CDR移植抗体の各鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを構築することもできる。
（６）ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRのみをヒト抗体のV領域のFR間に、単純に移植しただけでは、その活性は基のヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている［バイオテクノロジー（BIO/TECHNOLOGY）,9,266（1991）］。そこでヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、あるいは抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させることが行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、X線結晶解析あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行っている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型CDR移植抗体の製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。
選択したヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマーを用いて前記２（５）に記載のPCRを行うことにより達成できる。PCR後の増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたcDNAを含むベクター（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、20〜35塩基からなる変異導入プライマーを用いたPCR変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするDNA配列を含む20〜35塩基からなるセンス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを含むプラスミドを鋳型として2段階のPCRを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたcDNAを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
（７）ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
前記２（１）のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH及びCLをコードする遺伝子の上流に、前記２（５）および２（６）で取得したヒト型CDR移植抗体のVH及びVLをコードするcDNAを挿入し、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型CDR移植抗体のVH及びVLのアミノ酸配列をコードするcDNAを構築するためのPCRの際に5'-及び3'-末端の合成DNAの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体のC領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
（８）ヒト化抗体の一過性（トランジェント）発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクター、および前記２（７）のヒト型CDR移植抗体発現ベクターあるいはそれらの改変ベクターをCOS-7細胞（ATCC CRL1651）に導入してヒト化抗体の一過性発現［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Methods in Nucleic Acids Res.）,CRC Press,p.283,1991］を行い、その活性を測定することができる。
COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Methods in Nucleic Acids Res.）,CRC Press,p.283,1991］、リポフェクション法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス［Proc.Natl.Acad.Sci.,84,7413（1987）］等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の酵素免疫測定法（ELISA法）等により測定することができる。
（９）ヒト化抗体の安定（ステーブル）発現および活性評価
前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよび前記２（７）のヒト型CDR移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法〔特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133,（1990）〕等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下DHFR遺伝子と称す）が欠損したCHO細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,77,4216,（1980）］、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、YB2/0細胞と称す）等があげられる。
ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418およびFCSを含むRPMI1640培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法などにより測定する。また、形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる［アンチボディズ（Antibodies）,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988］。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）［ネイチャー（Nature）,227,680,（1970）］やウエスタンブロッティング法［アンチボディズ（Antibodies）,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 12,1988］等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体のIL-5に対する阻害活性の測定は前記１（５）に記載の方法などにより測定することができる。
（１０）ヒト化抗体の使用方法
本発明のヒト化抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供されるヒト化抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。また、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内で免疫原性を示さず、その効果が長期間にわたり持続することが期待される。本発明のヒト化抗体は単独でまたは少なくとも１種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、ヒト化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
３．抗ヒトIL-5Rα一本鎖抗体の作製
（１）一本鎖抗体発現ベクターの構築
前記２（２）、２（５）および２（６）に記載のヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを一本鎖抗体発現用ベクターに挿入することによりヒト以外の動物の抗体の一本鎖抗体あるいはヒト型CDR移植抗体の一本鎖抗体の発現ベクターを構築することができる。ここで用いる一本鎖抗体発現用ベクターとしてはヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。一本鎖抗体を発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするcDNAを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
選択された発現用ベクターに、VH-L-VLあるいはVL-L-VH（Ｌはペプチドリンカー）からなる一本鎖抗体をコードするcDNAを適切なプロモーター、シグナルペプチドの下流に挿入することにより、目的の一本鎖抗体をコードするcDNAが挿入された一本鎖抗体発現ベクターを構築することができる。
一本鎖抗体をコードするcDNAは、VHをコードするcDNAとVLをコードするcDNAとを、両端に適当な制限酵素の認識配列を有するペプチドリンカーをコードする合成ＤＮＡを用いて連結することにより得ることができる。リンカーペプチドは、その付加がVH、VLの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、例えばPantolianoらにより示されたもの［バイオケミストリー（Biochemistry）、30、10117（1991）］あるいはそれを改変したものを用いることができる。
（２）一本鎖抗体の発現および活性評価
前記３（１）で構築した一本鎖抗体発現ベクターをエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3.133（1990）］等の方法により適切な宿主細胞へ導入することにより、目的の一本鎖抗体を生産する形質転換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれる一本鎖抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
本発明の一本鎖抗体の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、一本鎖抗体が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することができ、次いで抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過を実行することにより達成することができる。また、宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、その細胞に浸透圧ショックを与え、限外濾過により濃縮することができ、次いで抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過を実行することにより達成することができる。不溶性であり、かつ顆粒（インクルージョン・ボディー）として存在している一本鎖抗体は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心と洗浄を繰り返し、例えばグアニジン−塩酸による可溶化、および再度一本鎖抗体の活性を有する構造へと導く操作、それに続く活性分子の精製によって達成することができる。
そして、精製された一本鎖抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
（３）一本鎖抗体の使用方法
本発明の一本鎖抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供される一本鎖抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。本発明の一本鎖抗体は単独でまたは少なくとも1種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、一本鎖抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、一本鎖抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、一本鎖抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
４．抗ヒトIL-5Rαジスルフィド安定化抗体の作製
（１）ジスルフィド安定化抗体の作製
ジスルフィド安定化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAあるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAのそれぞれの適切な位置の1アミノ酸残基に相当するDNA配列をシステイン残基に相当するDNA配列に改変し、発現および精製したのち、ジスルフィド結合を形成させることで作製することができる。アミノ酸残基のシステイン残基への改変は前記２（５）のPCRを用いた変異導入法により行うことができる。
得られた改変VHおよび改変VLをコードするcDNAを適切な発現用ベクターに挿入することによりジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターを構築することができる。ここで用いるジスルフィド安定化抗体発現用ベクターとしては改変VHおよび改変VLをコードするcDNAを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。ジスルフィド安定化抗体を形成させるためにジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターを発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするcDNAを発現用ベクターに挿入することでジスルフィド安定化抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
（２）ジスルフィド安定化抗体の発現、活性評価
前記４（１）で構築されたジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターあるいはジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターをエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］等の方法により宿主細胞へ導入することにより、目的のジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖を生産する形質転換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれるジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖の発現は前記１（５）に記載の方法等により確認することができる。
ジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、ジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することができ、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。また、宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、その細胞に浸透圧ショックを与え、限外濾過により濃縮することができ、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。不溶性であり、かつ顆粒（インクルージョン・ボディー）として存在しているジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心と洗浄の繰り返し、例えばグアニジン-塩酸による可溶化後、各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。
そして、精製されたジスルフィド安定化抗体H鎖とジスルフィド安定化抗体L鎖を混合し、活性を有する構造へと導く操作［refolding操作，モレキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology）,32,249（1995）］によりジスルフィド結合を形成させた後、抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過により活性を有するジスルフィド安定化抗体を精製することができる。ジスルフィド安定化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
（３）ジスルフィド安定化抗体の使用方法
本発明のジスルフィド安定化抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供されるジスルフィド安定化抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。本発明のジスルフィド安定化抗体は単独でまたは少なくとも1種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、一本鎖抗体またはジスルフィド安定化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ジスルフィド安定化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ジスルフィド安定化抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
５．抗ヒトIL-5Rα抗体を用いたヒトインターロイキン５受容体α鎖の検出および定量法
（１）抗ヒトIL-5Rα抗体を用いた免疫細胞染色
浮遊細胞についてはそのまま、付着細胞についてはトリプシンEDTAにて細胞をはがした後、免疫細胞染色用緩衝液（1%BSA、0.02%EDTA、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）などに懸濁し、1×105〜2×106個ずつに分注する。前記１（4）で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、前記２（9）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体形質転換株の培養上清、あるいは前記１（6）もしくは２（9）で得られた精製抗体、または該精製抗体を公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊  1985年）でビオチンなどの適当な標識物質により標識したものを0.1〜50μg/mlの濃度になるように免疫細胞染色用緩衝液あるいは10%動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したものを20〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間反応させる。前記１（4）で得られたマウス抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、前記２（9）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体形質転換株の培養上清あるいは前記１（6）もしくは前記２（9）で得られた精製抗体を反応させた場合、反応終了後免疫細胞染色用緩衝液で細胞を洗浄し、FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体、抗ラットイムノグロブリン抗体あるいは抗ヒトイムノグロブリン抗体を0.1〜50μg/ml程度の濃度を含む免疫細胞染色用緩衝液を50〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間遮光して反応させる。また、ビオチン標識した該モノクローナル抗体を反応させた場合、FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識したストレプトアビジンを50〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間遮光して反応させる。FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識した該モノクローナル抗体を反応させた場合、該モノクローナル抗体を0.1〜50μg/ml程度の濃度を含む免疫細胞染色用緩衝液を50〜500μlずつ分注し、水冷下で30分間遮光して反応させる。いずれの場合も、反応後はよく免疫細胞染色用緩衝液で洗浄し、セルソーターにより解析する。
（２）抗ヒトIL-5Rα抗体を用いたヒトIL-5依存性細胞の増殖抑制試験
得られた抗ヒトIL-5Ｒα抗体の生物活性阻害作用を示すために、ヒトIL-5依存性細胞を用いて、その細胞増殖に対する影響を検討することができる。評価方法としては、トリチウム標識チミジンの細胞内への取り込み、あるいは、セルカウンティングキットを用いた発色法などが挙げられる。ここでは、本発明で用いた発色法について述べる。
CTLL-2（h5R）細胞1×104個を50μlの正常培地に懸濁して96ウェル培養用プレートに分注する。ここに前記１（6）もしくは２（９）で得られた0.01〜50μg/mlの精製抗体溶液25μl、さらに0.4〜40ng/mlのヒトIL-5を含む正常培地を加えてCO2インキュベーター中、37℃、CO2 5%気流下で24〜72時間培養する。その後、セルカウンティングキット溶液を10μl／ウェルで加えてから３７℃、CO2５％気流下で４時間培養する。培養終了後、450nmの吸光度をマイクロウェルプレートリーダーEmax（モレキュラーデバイス社製）にて測定し、各抗体のCTLL-2（h5R）細胞増殖抑制活性を算出する。
（３）抗ヒトIL-5Rα抗体によるヒト好酸球の生存抑制
ポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）あるいはパーコール（percoll、ファルマシア社製）などの市販の血球分離用媒体を用いてヒト末梢血中より好酸球を含むヒト多形核白血球画分を調製する。正常培地に懸濁し、96、48あるいは24ウェル細胞培養用プレートに、得られた細胞を1×106〜1×107個／ウェル分注し、ヒトIL-5を最終濃度が0.001〜10ng/mlとなるように加える。さらに前記１（4）で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは前記２（９）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または前記１（6）あるいは２（９）で得られた精製抗体を加えCO2インキュベーター中、37℃、CO2 5%気流下で2〜5日間培養する。培養終了後、各ウェルから細胞標本を作製し、メイ・グリュントワルト・ギムザ染色法（染色法のすべて：医歯薬出版株式会社  1988年）などの方法にて染色し、好酸球の割合を求める。抗ヒトIL-5Rα抗体非存在下での好酸球の割合と該抗体存在下での好酸球の割合とを比較することにより、該モノクローナル抗体にIL-5依存性のヒト好酸球の生存延長に対する抑制活性があるか否か確認する。
（４）モノクローナル抗体によるshIL-5Rα定量
前記１（６）あるいは２（９）で得られた0.1〜50μg/mlの精製抗体を一次抗体としてプレートコートし、前記１（1）で得られた0.1〜10,000ng/mlの精製shIL-5Rα、もしくはヒト血清などの検体を反応させる。プレートをよく洗浄した後、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した前記１（6）あるいは２（９）で得られた精製抗体のうち一次抗体として使用した抗ヒトIL-5Rα抗体とは異なるエピトープを認識する抗ヒトIL-5Rα抗体を反応させた後、標識物質に応じた反応を行なう。精製shIL-5Rに対する反応性をもとに検量線を描き、検体中のshIL-5R濃度を算出する。
（５）ウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出
前記１（1）で得られた精製shIL-5RαをSDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により分画後、ポリビニリデンジフルオリド膜［以下、PVDF膜と称す（ミリポア社製）］に転写する。1〜10%牛血清アルブミン（BSA）を含むPBSに浸して４℃にて一晩放置してブロッキング後、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。該PVDF膜を前記１（5）で得られたハイブリドーマの培養上清あるいは前記１（6）で得られた精製抗体溶液に室温で２時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体または抗ラットイムノグロブリン抗体を含む溶液に該PVDF膜を室温で１時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。洗浄液をよく除いた後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行い、精製shIL-5Rαの分子量に一致する蛋白質と反応するか否かを確認する。
（６）shIL-5Rαの免疫沈降
96ウェルのELISA用プラスチックプレートに抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体をPBSなどで10〜1000倍に希釈したものを50〜200μl／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩あるいは室温にて２時間以上放置して吸着させる。PBSにて該プレートを洗浄後、１〜１０％のBSAなどを含むPBSなどを300μl／ウェルずつ分注して４℃にて一晩あるいは室温にて30分以上放置してブロッキングを行う。PBSにて該プレートを洗浄後、前記１（５）で得られたハイブリドーマの培養上清あるいは前記１（６）で得られた精製抗体溶液（0.01〜50μg/ml）を50〜200μl／ウェルずつ加え、４℃にて一晩放置して抗体を吸着させる。該プレートを洗浄後、前記１（１）で得られたshIL-5Rαを1%BSAを含むPBSなどで0.1〜100μg/mlの濃度に希釈したものを50〜200μl／ウェルずつ分注し、４℃で一晩反応させる。該プレートを0.05%Tweenを含むPBSなどで洗浄後、１〜５倍濃度のSDS-PAGE用サンプルバッファーを50〜200μl／ウェルずつ分注し、30分以上室温で振とうする。必要に応じPBSで希釈した後、該溶液を１レーン当たり5〜25μlずつ加えてSDS-PAGEにより分画後、定法に従いPVDF膜などに転写を行う。該PVDF膜を前記５（５）に示したような方法でウェスタンブロッティング法を行い、shIL-5Rαを検出する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpAGE210の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドpCAGGS-h5R.25制限地図を示した図である。
第３図は、プラスミドpAI234の造成工程を示した図である。
第４図は、プラスミドpAI230の造成工程を示した図である。
第５図は、プラスミドpAI282の造成工程を示した図である。
第６図は、プラスミドpAI283およびpAI285の造成工程を示した図である。
第７図は、プラスミドpAI284およびpAI289の造成工程を示した図である。
第８図は、プラスミドpAI294およびpAI295の造成工程を示した図である。
第９図は、プラスミドpAI299およびpAI301の造成工程を示した図である。
第10図は、プラスミドpAI292の造成工程を示した図である。
第11図は、プラスミドpAI297の造成工程を示した図である。
第12図は、プラスミドpMKex1の造成工程を示した図である。
第13図は、プラスミドpAI263の造成工程を示した図である。
第14図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびKM1259の酵素免疫測定法におけるヒトIL-5Rα−ヒト免疫グロブリン定常領域融合蛋白に対する結合反応性を示す。
第15図は、プラスミドpBSAの造成工程を示した図である。
第16図は、プラスミドpBSAEの造成工程を示した図である。
第17図は、プラスミドpBSH-Sの造成工程を示した図である。
第18図は、プラスミドpBSK-Hの造成工程を示した図である。
第19図は、プラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAの造成工程を示した図である。
第20図は、プラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEの造成工程を示した図である。
第21図は、プラスミドpBSH-SAEEおよびpBSK-HAEEの造成工程を示した図である。
第22図は、プラスミドpBSK-HAEESalの造成工程を示した図である。
第23図は、プラスミドpBSX-Sの造成工程を示した図である。
第24図は、プラスミドpBSX-SAの造成工程を示した図である。
第25図は、プラスミドpBSSCの造成工程を示した図である。
第26図は、プラスミドpBSMoの造成工程を示した図である。
第27図は、プラスミドpBSMoSの造成工程を示した図である。
第28図は、プラスミドpChiIgLA1Sの造成工程を示した図である。
第29図は、プラスミドpMohCκの造成工程を示した図である。
第30図は、プラスミドpBSMoSalの造成工程を示した図である。
第31図は、プラスミドpBSMoSalSの造成工程を示した図である。
第32図は、プラスミドpBShCγ1の造成工程を示した図である。
第33図は、プラスミドpMohCγ1の造成工程を示した図である。
第34図は、プラスミドpMoγ1SPの造成工程を示した図である。
第35図は、プラスミドpMoκγ1SPの造成工程を示した図である。
第36図は、プラスミドpKANTEX93の造成工程を示した図である。
第37図は、プラスミドpKANTEX1259Hの造成工程を示した図である。
第38図は、プラスミドpKANTEX1259の造成工程を示した図である。
第39図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。左側のMが高分子マーカー、1がKM1399、右側のMが低分子マーカー、1がKM1399の泳動パターンをそれぞれ示す。
第40図は、抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259と抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性を示す。縦軸は阻害活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●がKM1259、○がKM1399の活性をそれぞれ示す。
第41図は、プラスミドpT1259の造成工程を示した図である。
第42図は、プラスミドpT1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現による活性評価を示す。縦軸にヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性、横軸に一過性発現培養上清の希釈倍率をそれぞれ示す。
第43図は、プラスミドphKM1259HV0の造成工程を示した図である。
第44図は、プラスミドphKM1259LV0の造成工程を示した図である。
第45図は、プラスミドpKANTEX1259HV0の造成工程を示した図である。
第46図は、プラスミドpKANTEX1259HV0LV0の造成工程を示した図である。
第47図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。Mが分子量マーカー、1がKM8397の泳動パターンをそれぞれ示す。
第48図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●がKM1399、○がKM8397の活性をそれぞれ示す。
第49図は、一過性発現培養上清中の各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性を評価した結果を示す。縦軸は阻害活性、横軸は各サンプル名をそれぞれ示す。キメラ抗体KM1399の活性を100とした時の相対活性値をそれぞれ示す。
第50図は、精製した各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。上段の●がKM1399、○がHV.0LV.0、■がHV.2LV.0、□がHV.0LV.3、▲がHV.3LV.3、下段の●がKM1399、○がHV.1LV.0、■がHV.3LV.0、□がHV.0LV.4、▲がHV.1LV.4、△がHV.2LV.4、×がHV.3LV.4の活性をそれぞれ示す。
第51図は、プラスミドpBShCγ4の造成工程を示した図である。
第52図は、プラスミドpKANTEX1259γ4およびpKANTEX1259HV3LV0γ4の造成工程を示した図である。
第53図は、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体抗KM7399、ヒト抗体IgG4サブクラスのヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。左側のMが高分子マーカー、1がKM9399、2がKM7399、右側のMが低分子マーカー、1がKM9399、2がKM7399の泳動パターンをそれぞれ示す。
第54図は、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がKM1399、●がKM7399、□がKM8399、■がKM9399の活性をそれぞれ示す。
第55図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒトIL-5R遺伝子導入CTLL-2細胞との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す。
第56図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒトIL-5R遺伝子導入CTLL-2細胞のIL-5依存性増殖に対する抑制作用を検討した結果を示す。
第57図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259のヒト好酸球との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す。
第58図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒト好酸球生存抑制作用を検討した結果を示す。
第59図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびビオチン標識KM1259による可溶性ヒトIL-5Rα定量系に関して検討した結果を示す。
第60図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486を用いたウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出を行った結果を示す。
第61図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486を用いたshIL-5Rαの免疫沈降の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
１．抗原の調製
（１）動物細胞用発現ベクターpAGE210の構築
動物細胞用発現ベクターpAGE207（特開平6-46841）とpAGE148（特開平6-205694）を用いて、動物細胞用発現ベクターpAGE210の構築を以下のように行った。
プラスミドpAGE207あるいはpAGE148の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMジチオスレイトール（以下、DTTという）からなる緩衝液30μlに溶解し、さらに10単位のClaI、およびKpnI（いずれも宝酒造社製、以下、特別な指示がない限り、制限酵素は宝酒造社製）を加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、pAGE207からはSV40の初期プロモーターとエンハンサー（以下、PSEという）、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Apという）耐性遺伝子を含む4.7kbのDNA断片を約0.5μg、pAGE148からはジヒドロ葉酸還元酵素（以下、dhfrという）遺伝子を含む4.3kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
このようにして得られたpAGE207のClaI-KpnI断片50ngとpAGE148のKpnI-ClaI断片50ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液［66mMトリス−塩酸（pH7.5）、6.6mM塩化マグネシウム、10mM DTTおよび0.1mMアデノシン三リン酸（以下、ATPという）からなる緩衝液、以下同様］に溶解し、T4DNAリガーゼ（宝酒造社製、以下同様）200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第１図に示したプラスミドpAGE210を得た。
（２）shIL-5Rα発現ベクター構築を目的としたshIL-5RαcDNAのカセット化
shIL-5Rα発現ベクター構築のためshIL-5RαcDNAの5'および3'非翻訳領域の改変、並びに制限酵素認識配列の導入を以下に示す手順に従いPCR法［マニアティス（Maniatis）ら編集、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、14.2、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年］を用いて行った。プラスミドpCAGGS-h5R.25はshIL-5RαcDNAが公知のプラスミドpCAGGS［ジーン（Gene）,108,193（1991）］に第２図に示すように挿入されたものである［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］。このpCAGGS-h5R.25の3μgを30μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、shIL-5RαcDNAを含む1.4kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次に上記で得られたDNA断片1ngを50μlのPCR緩衝液［50mM塩化カリウム、10mMトリス−塩酸（pH8.3）、1.5mM塩化マグネシウム、0.2mMデオキシアデノシン三リン酸（以下、dATPという）、0.2mMデオキシグアノシン三リン酸（以下、dGTPという）、0.2mMデオキシシトシン三リン酸（以下、dCTPという）、0.2mMデオキシチミジン三リン酸（以下、dTTPという）からなる緩衝液］に溶解し、50pmolの配列番号１に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号２に示した塩基配列を有する合成DNA［いずれも自動DNA合成機；380A（アプライド・バイオシステムズ社；Applied Biosystems Co.,Ltd製）を用いて合成したもの、以下同様］、さらにベントDNAポリメラーゼ［ニューイングランド・バイオラボラトリーズ社（New England BioLabs.Inc.）製、以下同様］1.6単位を加えて、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下でパーキン・エルマー社製DNAサーマルサイクラーを用いて（以下同様）30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液10μlに100mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウムおよび10mM DTTからなる緩衝液2μl、8μlの蒸留水、10単位のHindIIIを加え37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿［マニアティス（Maniatis）ら編集、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、E.10、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年］によりDNA断片を回収し、20μlの20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
一方プラスミドpUC19（ファルマシア・バイオテク社）3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、HindIII 10単位を加えて37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、pUC19のHindIII/BamHI断片を約0.5μg回収した。
pUC19のHindIII/BamHI断片100ngとshIL-5RαcDNA断片50ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第３図に示したプラスミドpAI234を得た。
（３）ヒト可溶性IL-5Rα発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と１（2）で得られたpAI234のshIL-5RαcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりshIL-5Rα発現ベクターpAI230の構築を以下のように行った。
pAGE210の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、9.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
pAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次にpAGE210のHindIII-BamHI断片300ngとpAI234のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第４図に示したプラスミドpAI230を得た。
（４）シグナル配列の改変
shIL-5Rαの動物細胞による効率的な生産を行うため、shIL-5RαをコードするcDNAに関してそのシグナル配列の改変をシグナル配列の3'末端側へのEcoRV認識配列の導入、続いて合成DNAを用いてヒト成長ホルモン［サイエンス（Science）,205,602（1979）］あるいは抗ガングリオシドGD3キメラ抗体KM871（特開平5-304989）のシグナルシークエンスへの改変を以下の手順に従って行った。
実施例１（2）で得られたプラスミドpAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
一方プラスミドpUC19の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、10単位のHincIIを加えて37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、pUC19のHincII断片を約0.5μg回収した。
上記で得たDNA断片約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号２に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号３に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。該反応液をアガロースゲルにて分画後、約0.9kbのhIL-5Rαの一部をコードするcDNA断片0.5μgを回収し、そのうち50ngのDNAとpUC19のHincII断片100ngとをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第５図に示したプラスミドpAI280を得た。得られたプラスミドpAI280の3μgを30μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加え、更に10単位のXbaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、2.8kbのDNA断片を約0.8μg回収した。
一方、プラスミドpAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のXbaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、0.8kbのDNA断片を約0.2μg回収した。
次にpAI280のXbaI-BamHI断片200ngとpAI234のXbaI-BamHI断片50ngとをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第５図に示したプラスミドpAI282を得た。このpAI282の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRVを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、0.9kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
配列番号４、５に示した塩基配列を有する合成DNAのそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。実施例１（2）で得られたpUC19のHindII-BamHI断片100ng、pAI282のEcoRV-BamHI断片50ng、上記の通りアニーリングを行った配列番号４および５に示した塩基配列を有する合成DNA50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、さらにT4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第６図に示したプラスミドpAI283を得た。
配列番号６および９に示した塩基配列を有する合成DNAをそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。該反応液に500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mM DTT、1mM EDTAからなる緩衝液2.5μl、10mM ATP溶液2.5μl、蒸留水9μl、さらにT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）5単位を加え37℃で2時間リン酸化反応を行った。これとは別に配列番号７および８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡをそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。
pUC19のHindIII-BamHI断片100ng、pAI282のEcoRV-BamHI断片50ng、上記のように調製した合成DNAをそれぞれ50ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第６図に示したプラスミドpAI285を得た。
（５）シグナル配列を改変したshIL-5Rα発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（4）で得られたpAI283あるいはpAI285のヒト可溶性IL-5RαcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりヒト可溶性IL-5Rα発現ベクターpAI284およびpAI289の構築を以下のとおり行った。
pAI283およびpAI285の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片をそれぞれ約0.3μg回収した。
pAGE210のHindIII-BamHI断片300ngとpAI283あるいはpAI285のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第７図に示したプラスミドpAI284およびpAI289を得た。
（６）ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域との融合蛋白の作製
ヒトIL-5Rαの細胞外領域とヒト免疫グロブリン定常領域（以下、Fcと称す）とが（Gly-Ser-Gly）4というアミノ酸配列のリンカーを介して結合された融合蛋白（以下、hIL-5Rα-Fcと称す）の作製を以下に示す手順に従って行った。
ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするcDNAはヒト型キメラ抗体H鎖発現用ベクターpChiIgHB2（特開平5-304989）上のヒトIgG1定常領域をコードする部分を用いた。まず、pChiIgHB2の約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号１０に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号１１に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液20μlに200mMトリス−塩酸（pH8.5）、100mM塩化マグネシウム、1000mM塩化カリウムおよび10mMからなる緩衝液2.5μl、蒸留水2.5μl、10単位のBamHIを加え37℃で4時間させた。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
実施例１（4）で得られたpAI283の約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号１２に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号１３に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液20μlに100mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウムおよび10mM DTTからなる緩衝液2.5μl、蒸留水2.5μl、10単位のHindIIIを加え37℃で4時間反応させた。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、該反応液をアガロース電気泳動により分画後、hIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含む1.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片50ng、hIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含むDNA断片50ng、pUC19のHindIII-BamHI断片100ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第８図に示したプラスミドpAI294を得た。
一方、実施例１（4）で得られたpAI285をテンプレートとして配列番号１３および１４に示した塩基配列を有する合成DNAをプライマーとして用いて上記と同様の条件でPCR反応を行い、反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、該反応液をアガロース電気泳動により分画後、ヒトIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含む1.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。得られたDNA断片50ng、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片50ng、pUC19のHindIII-BamHI断片100ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第８図に示したプラスミドpAI295を得た。
（７）融合蛋白発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（6）で得られたpAI294のhIL-5Rα-FcをコードするcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりhIL-5Rα-Fc発現ベクターpAI299の構築を以下のように行った。
プラスミドpAI294の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域の融合蛋白をコードするcDNAを含む1.7kbのDNA断片を約0.4μg回収した。
pAGE210のHindIII-BamHI断片100ngとpAI294のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第９図に示したプラスミドpAI299を得た。
また、上記と同様にしてpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（6）で得られたpAI295のhIL-5Rα-FcをコードするcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりhIL-5Rα-Fc発現ベクターpAI301の構築を行った。
（８）昆虫細胞によるshIL-5Rα発現を行うための組み換えウィルスの作製
昆虫細胞による蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組み換えウィルスの作製が必要であるが、その作製にはトランスファーベクターと呼ばれる目的蛋白質をコードするcDNAを特殊なプラスミドに組み込む過程と野生型ウィルスとトランスファーベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組み換えウィルスを取得する過程を経る。以上の過程についてファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号PM-21001K）を用いてそのマニュアルに従い以下の手順で行った。
実施例１（4）で得られたpAI285あるいは実施例１（6）で得られたpAI294の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20μlのDNAポリメラーゼＩ緩衝液［5mMトリス−塩酸（pH7.5）、1mM硫酸マグネシウム、0.01mM DTT、5μg/ml牛血清アルブミン、0.08mM dATP、0.08mM dGTP、0.08mM dCTP、0.08mM dTTPからなる緩衝液、以下同様］に溶解し、5単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片（宝酒造社製、以下同様）を加え、22℃で30分間反応させ、HindIII消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、shIL-5RαをコードするcDNAを含む約1.0kbのDNA断片を約0.3μg、ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域の融合蛋白をコードするcDNAを含む1.7kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次にファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに含まれるプラスミドpVL1393の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿法によりDNA断片を回収し、20μlのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、5単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片を加え、22℃で30分間反応させ、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のBglIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.6kbのDNA断片を約0.9μg回収した。
次に上記で得られたpVL1393のEcoRI（平滑末端）−BglII断片200nとpAI285あるいはpAI294のHindIII（平滑末端）−BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第10図および第11図に示したプラスミドpAI292およびpAI297を得た。
続く組み換えウィルスの作製はTMN-FHインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）にて培養した昆虫細胞Sf9（ファーミンジェン社製より入手）に線状バキュロウィルスDNA［バキュロゴールド・バキュロウィルスDNA（BaculoGoldbaculovirus DNA）、ファーミンジェン社製］および作製したトランスファーベクターDNAをリポフェクチン法にて導入すること［蛋白質核酸酵素、37,2701（1992）］により行い組み換えバキュロウィルスを以下のように作製した。
pAI292あるいはpAI297の1μgと線状バキュロウィルスDNAの20ngとを12μlの蒸留水に溶解し、さらにリポフェクチン6μlと蒸留水6μlとを混和したものを加え室温で15分間放置した。一方Sf9細胞1×106個を2mlのSf900-II培地［ギブコ（Gibco）社製］に懸濁し、直径35mmの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた。ここに上記のプラスミドDNA、線状バキュロウィルスDNAおよびリポフェクチン混和溶液全量を加え27℃で3日間培養後、組み換えウィルスを含む培養上清1mlを採取した。シャーレには新たにSf900-II培地1mlを加え、さらに27℃で3日間培養し組み換えウィルスを含む培養上清をさらに1.5ml得た。
次に蛋白発現に用いるために得られた組み換えウィルスを以下の手順で増殖させた。
Sf9細胞2×107個を10mlのSf900-II培地に懸濁し、175cm2フラスコ（グライナー社製）に入れて室温で1時間放置して細胞をフラスコに付着させた。放置後上清を除き新たに15mlのTMN-FHインセクトメディウムと上記の組み換えウィルスを含む培養上清のうち1mlを加え27℃で3日間培養した。培養後上清を1,500×gで10分間遠心分離して細胞を除き、蛋白発現に使用する組み換えウィルス溶液を得た。
得られた組み換えウィルス溶液についてウィルスの力価を以下の方法で算定した（ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアル）。Sf9細胞6×106個を4mlのSf900-II培地に懸濁し、直径60mmの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で1時間放置して細胞をシャーレに付着させた。次に上清を除き新たにSf900-II培地400μlとSf900-II培地で10,000倍に希釈した上記組み換えウィルス溶液を加え室温で1時間放置した後、培地を除き5mlの1%低融点アガロース［アガープラーク・アガロース（AgarplaqueAgarose）、ファーミンジェン社製］を含む培地［滅菌した1mlの5%アガープラークプラス・アガロース水溶液と4mlのTMN-FHインセクトメディウムを混和し、42℃に保温したもの］を該シャーレに流し込んだ。室温で15分間放置した後、乾燥を防ぐためビニルテープをシャーレにまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、27℃で6日間培養した。該シャーレに0.01%ニュートラルレッドを含むPBS1mlを加えさらに1日間培養した後、出現したプラークの数を数えた。以上の操作より該組み換えウィルス溶液はいずれも約1×107プラークフォーミングユニット/ml（以下、PFU/mlと表記する）のウィルスを含んでいることがわかった。
（９）動物細胞におけるshIL-5RαあるいはhIL-5Rα-Fcの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］を用いて行った。
実施例１（5）で得られたpAI289あるいは実施例１（7）で得られたpAI301の4μgを4×106個のdhfr遺伝子を欠損したCHO細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,77,4216（1980）］へ導入後、40mlのRPMI1640-FCS（10）［FCSを10%、7.5%NaHCO3を1/40量、200mM L−グルタミン溶液（ギブコ社製）を3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、5000units/mlペニシリンおよび5000μg/mlストレプトマイシン含有）を0.5%含むRPMI1640培地（日水製薬社製）］に懸濁し、96ウェルマイクロタイタープレートに200μl／ウェルずつ分注した。CO2インキュベーターで37℃、24時間培養した後、ハイグロマイシン（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して1〜2週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより細胞を回収し、0.5mg/mlハイグロマイシン、50nMメソトレキセート（以下、MTXと称す）を含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml／ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、50nM MTX耐性クローンを誘導した。
上記で得られた50nM MTX耐性クローンについて、0.5mg/mlハイグロマイシン、200nM MTXを含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml/ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、200nM MTX耐性クローンを誘導した。
さらに、上記で得られた200nM MTX耐性クローンについて、0.5mg/mlハイグロマイシン、500nM MTXを含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml／ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で１〜２週間培養して、500nM MTX耐性クローンを誘導した。
上記形質転換株をCHO細胞用無血清培地CHO-S-SFMII培地（ギブコ社製）に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、225cm2フラスコ（グライナー社製）に100mlずつ分注した。CO2インキュベーターで、37℃、5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。
hIL-5Rαの培養上清からの精製は以下のようにして行った。pAI289による形質転換株の培養液1リットルに塩化ナトリウム29.2g、1Mトリス−塩酸（pH7.4）20mlを加えた後、1N水酸化ナトリウム溶液を用いて該溶液のpHをpH7.4に調整した。カラムにコンカナバリンＡ−セファロース（ファルマシア社製）ゲル約10mlを充填し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液50mlで0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調製したshIL-5Rαを含む液を0.5ml/分の流速でコンカナバリンＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液80mlで0.5ml/分の流速で洗浄した後、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液15ml、0.5Mα−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液15mlを用いてα−メチルマンノサイドの濃度を0〜0.5Mまで直線的に変化させることによりコンカナバリンＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した（フラクション1〜30）。さらに、1Mα−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液20mlを通塔し、2mlずつ分画した（フラクション31〜40）。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクション10〜40までを回収した。該蛋白溶液をアミコン社製セントリコン−30を用いて約10倍に濃縮し、透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製shIL-5Rα（蛋白質濃度4mg/ml、3.5ml）を得た。
一方、hIL-5Rα-Fcは以下のようにして得た。カラムにプロテインＡ−セファロース・ゲル約5mlを充填し、50mlのPBSで洗浄を行った。洗浄後、上記のpAI301による形質転換株の培養液約1リットルを0.5ml/分の流速でプロテインＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに50mlのPBSでカラムを洗浄後、20mlの0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）を通塔しプロテインＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した。各フラクションには2Mトリス−塩酸（pH9.0）0.15mlを加えてpHを調整した。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを回収した。該蛋白溶液を透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして精製hIL-5Rα-Fc（蛋白質濃度1.8mg/ml、5.5ml）を得た。
（10）昆虫細胞によるshIL-5RαあるいはhIL-5Rα-Fcの発現
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに添付されているマニュアルに従い以下の手順によりshIL-5RαおよびhIL-5Rα-Fcの発現を行った。
培養液からのshIL-5RαおよびhIL-5Rα-Fcの回収はコンカナバリンＡ−セファロースとジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、あるいはプロテインＡ−セファロース（いずれもファルマシア・バイオテク社製）を用いてそれぞれ行った。
shIL-5Rαは以下のようにして得た。Sf9細胞6×106個を225cm2フラスコ（グライナー社製）に10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace's Insect Medium、ギブコ社製）45mlに懸濁し、27℃で3〜4日間培養した。培養上清を除き新たに10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム30mlと実施例１の１（8）で得られたトランスファーベクターpAI292由来の組み換えウィルスを約1×107PFU/mlの濃度で含む溶液を1ml加えた。さらに27℃で１日間培養した後、上清を除き新たにSf900-II培地45mlを加え２〜３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し1,500×gで10分間遠心分離を行い上清を得た。該培養液に最終濃度0.5Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、さらに1/50容量の1Mトリス−塩酸（pH7.4）を加えた後、該溶液のpHを1N水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.4に調整した。
カラムにコンカナバリンＡ−セファロース・ゲル約10mlを充填し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液50mlで0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調整したshIL-5Rαを含む培養液500mlを0.5ml/分の流速でコンカナバリンＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液80mlで0.5ml/分の流速で洗浄した後、1M  α−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液60mlを通塔しコンカナバリンＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に2mlずつ溶出液を分画した。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを44ml回収し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）に対して透析した。さらに900mlの上記のように調整したshIL-5Rαを含む培養液より同様の操作により、蛋白濃度の高いフラクションを40ml回収し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）に対して透析した。
透析後、上記の該蛋白溶液を合わせて10mlのジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース・ゲルを充填したカラムに通塔し、蛋白質を吸着させた。カラムからのshIL-5Rαの溶出は塩化ナトリウム濃度を0〜0.5Mまで直線的に変化させることにより行い、shIL-5Rαを高濃度に含むフラクションを4ml回収した。該蛋白溶液を透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製shIL-5Rα（蛋白質濃度400μg/ml、4.5ml）を得た。
一方、hIL-5Rα-Fcは以下のようにして得た。Sf9細胞6×106個を225cm2フラスコ（グライナー社製）に10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace's Insect Medium、ギブコ社製）45mlに懸濁し、27℃で3〜4日間培養した。培養上清を除き新たに10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム30mlと実施例１の１（8）で得られたトランスファーベクターpAI297由来の組み換えウィルスを約1×107PFU/mlの濃度で含む溶液を1ml加えた。さらに27℃で1日間培養した後、上清を除き新たにSf900-II培地45mlを加え2〜3日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し1,500×gで10分間遠心分離を行い上清を得た。
カラムにプロテインＡ−セファロース・ゲル約5mlを充填し、50mlのPBSで洗浄を行った。洗浄後上記のhIL-5Rα-Fcを含む培養液450mlを0.5ml/分の流速でプロテインＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに50mlのPBSでカラムを洗浄後、20mlの0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）を通塔しプロテインＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した。各フラクションには0.15mlの2Mトリス−塩酸（pH9.0）を加えてpHを調整した。各フラクションに含まれる蛋白濃度をバイオラッド社製蛋白濃度測定キットを用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを回収した。該蛋白溶液をアミコン社製セントリコン−30を用いて約3倍に濃縮し、透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製hIL-5Rα-Fc（蛋白質濃度0.4mg/ml、1.8ml）を得た。
（11）大腸菌によるshIL-5Rα部分断片の発現
大腸菌によるshIL-5Rα部分断片の発現は、以下に示す大腸菌用発現ベクターpMKex1にshIL-5Rα断片をコードするcDNAを含むDNA断片を挿入してpAI263を造成し、pAI263を大腸菌に導入することにより行った。
プラスミドpGHA2（特開昭60-221091）の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のClaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、プロモーター領域を含むpGHA2のEcoRI/ClaI断片を約0.3μg回収した。
プラスミドpTerm2（特開平2-227075）の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、10mMトリス−塩酸（pH8.4）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液、30μlと10単位のNsiIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、を含むpTerm2のEcoRI/NsiI断片を約0.8μg回収した。
pGHA2のEcoRI/ClaI断片の50ng、pTerm2のEcoRI/NsiI断片の100ngと配列番号15に示した合成DNAの100ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第12図に示したプラスミドpMKex1を得た。
一方、第3図で得られたpAI234の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のPstIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20μlのT4DNAポリメラーゼＩ緩衝液［33mMトリス−酢酸（pH8.0）、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT、0.01%BSAからなる緩衝液］に溶解し、5単位のT4DNAポリメラーゼＩ（宝酒造社製）を加え、12℃で15分間反応させ、PstI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、shIL-5Rα断片をコードするcDNAを含む約0.7kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
第１２図で得られた大腸菌用発現ベクターpMKex1の3μgを20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、更に10単位のEcoRVを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を約1.5μg回収した。
以上のようにして得られたshIL-5Rα断片をコードするcDNAの50ngとpMKex1のEcoRV/BamHI断片の100ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドpAI263を得た。
上記のプラスミドpAI263を大腸菌に導入し（Molecular Cloning.A Laboratory Manua1,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、200μg/mlのアンピシリンを含むLB培地400ml中で、37℃4時間培養後、0.5mMのIPTGを添加し、その後さらに37℃2時間培養した。培養液400mlを3,000×gで15分間遠心分離し、大腸菌を含む沈殿を100mlの緩衝液I［10mMトリス−塩酸（pH8.0）、1m MEDTA、150mM塩化ナトリウムからなる緩衝液］に懸濁した。再び遠心分離後、沈殿を7mlの緩衝液Iで懸濁し、超音波処理により菌体を破壊する。これを10,000×gで30分間遠心分離し、その沈殿を500μlSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー［6mMトリス−塩酸（pH6.8）、2%SDS、10%グリセロール、5% 2−メルカプトエタノールからなる緩衝液］に溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、分子量約27kDの精製shIL-5Rα断片を得た。
（12）ヒトIL-5Rαを発現した細胞の細胞膜画分の調製
hIL-5Rα遺伝子を導入したCTLL-2細胞［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］、あるいは対照としてのCTLL-2細胞［ATCC TIB 214］からの膜成分の調製を以下のようにして行った。
該細胞を遠心分離（1,200rpm、５分）し、PBSにて2回洗浄後、細胞破砕用緩衝液［20mM HEPES（pH7.4）、1mM EDTA、0.5mM PMSF、250mMシュークロースからなる緩衝液］に懸濁しホモゲナイザーを用いて破砕した。破砕後5,500rpmで15分間遠心分離して沈殿を除き、さらに35,000rpmで遠心分離して細胞膜画分を沈殿として回収した。
２．動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１の1（9）、1（10）、1（11）あるいは1（12）より得られた各種抗原50μgをそれぞれアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×109細胞とともに5週令雌BALB/cマウスあるいは雌SDラットに投与し、2週間後より50μgの蛋白質を1週間に1回、計4回投与した。眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清抗体価を実施例１の３に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスあるいはラットから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。この時、実施例１の1（12）で得られた細胞膜画分を抗原としてマウス13匹、ラット5匹を免疫したが、抗体価の強い上昇は認められなかった。また、実施例１の1（9）で得られたshIL-5Rαを免疫したラット5匹あるいは実施例１の１（10）で得られたshIL-5Rαを免疫したラット１０匹においても抗体価の十分な上昇は認められなかった。
脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
３．酵素免疫測定法
実施例１の1（9）あるいは1（10）で得られたshIL-5Rαを免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定は、抗原として、実施例１の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたhIL-5Rα-Fcを用いて以下に示す２種類の方法にしたがって行った。
（Ａ）96ウェルのEIA用プレート（グライナー社製）に、PBSで1μg/mlの濃度に希釈したhIL-5Rα-Fcおよび対照抗原として共通のヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗GD3キメラ抗体KM871を50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清およびハイブリドーマの培養上清を50μl/ウェルで分注し2時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリンあるいは抗ラットイムノグロブリン（DAKO社製）を50μl/ウェルで加えて室温、1時間反応させ、tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を用いて発色させOD415nmの吸光度を測定した（NJ2001;日本インターメッド社製）。
（Ｂ）さらに、IL-5に対する中和活性を有するモノクローナル抗体をより高い確率で選択する目的で、ビオチン標識したヒトIL-5と実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-Fcを利用し、IL-5の受容体への結合阻害活性を指標としてスクリーニングを以下の手順で行った。なお、ビオチン標識するのに用いた用いたヒトIL-5は、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ［Journal of Immunological Methods,125,233（1989）］に記載された方法により調製した。
ヒトIL-5のビオチン標識は、ピアース社のビオチン標識用試薬（Biotin-LC-Hydrazide）に添付されているプロトコールに従い以下の手順で行った。始めにPBSに溶解した1.6mg/mlのヒトIL-5を標識用緩衝液（100mM酢酸ナトリウム、0,02%NaN3、pH5.5）で平衡化したPD10カラム（ファルマシア社製）に通塔して塩交換を行い、蛋白質濃度の高い画分を1ml回収した。該ヒトIL-5溶液0.5mlに30mMメタ過ヨウ素酸を含む標識用緩衝液1mlを加え、遮光して30分間室温にて反応させた。反応終了後、標識用緩衝液で平衡化したPD10カラムに通塔して未反応のメタ過ヨウ素酸を除き、蛋白質濃度の高い画分を1.5ml回収した。ここに前述した5mMのビオチン標識用試薬を含む標識用緩衝液20μlを加え、さらに室温にて１時間反応させた。反応終了後、反応停止液（0.1Mトリス、pH7.5）を50μl加えた後、0.05%NaN3を含むPBSにて平衡化したPD10カラムに通塔して塩交換を行うとともに、未反応の試薬を取り除いた。得られたビオチン標識ヒトIL-5は4℃にて保存した。
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-FcをPBSで5μg/mlの濃度に希釈し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSにて洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。さらにtween-PBSにて洗浄直後、被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清およびハイブリドーマの培養上清と前述したビオチン標識ヒトIL-5をそれぞれ50μl/ウェルずつ分注し、4℃一晩反応させた。翌日tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンD（ニチレイ社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
また、実施例１の1（11）で得られたhIL-5Rα断片を免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として実施例１の1（11）の大腸菌により得られたhIL-5Rα断片を用いた。上記と同様の方法により大腸菌により生産したshIL-5Rαおよび対照抗原として大腸菌の菌体蛋白を吸着させたプレートを作製し、ハイブリドーマの培養上清および被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清の反応性を検討した。
さらに、実施例１の1（12）で得られたhIL-5Rαを発現した細胞の膜画分を免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として実施例１の1（12）で得られた細胞膜画分を用いた。上記と同様の方法によりIL-5Rα発現した細胞の膜画分および対照細胞の膜画分を吸着させたプレートを作製し、ハイブリドーマの培養上清および被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清の反応性を検討した。
４．マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
５．ハイブリドーマの作製
実施例１の2で得られたマウス脾細胞あるいはラット脾細胞と実施例１の4で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000（PEG-1000）2g、MEM培地2mlおよびDMSO 0.7mlの混液0.2〜1ml/108マウス脾細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離（900rpm、5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100ml中に懸濁した。
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間CO2 5%下で培養した。この培養上清を実施例１の3に記載した酵素免疫測定法で調べ、昆虫細胞培養上清より調製したhIL-5Rα-Fc、あるいは大腸菌により生産したshIL-5Rαに特異的に反応するウェルを選び、さらにHT培地と正常培地に換え、2回クローニングを繰り返して、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。
実施例１の1（11）で得られたhIL-5Rα断片を免疫したマウス6匹、あるいはラット8匹から得られたハイブリドーマ約4000クローンをスクリーニングした結果、抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を得、これをKM1074と名付けたが、IL-5Rα鎖に対する反応性は、後述する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1257、KM1259に比較して極めて弱いものであった。
一方、実施例１の１（9）で得られたshIL-5Rαあるいは実施例１の１（10）を免疫したマウス15あるいは20匹の中から高い抗体価を示した個体を１２あるいは６匹選択し、ハイブリドーマを作製した。10000クローン以上のハイブリドーマをスクリーニングし、後述する実施例３の１に示した方法においてhIL-5Rα発現細胞に対する特異的な反応性が認められる８１クローンの抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。この中で後述する実施例３の１に示す免疫細胞染色法において最も強い反応性を示したモノクローナル抗体は、KM1257であった。ハイブリドーマKM1257はFERM BP-5133として、平成７年６月１３日付けで工業技術院生命工学技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、以下、所在住所は同様）に寄託された。また、この８１クローンの中で後述する実施例３の２で示したIL-5の生物活性の強い阻害作用を示したものは６クローンのみであり、その中でも最も強い阻害活性を示したモノクローナル抗体は、KM1259およびKM1486であった。ハイブリドーマKM1259はFERM BP-5134として、平成７年６月１３日付けで、ハイブリドーマKM1486はFERM BP-5651として、平成８年９月３日付けで、それぞれ工業技術院生命工学技術研究所に寄託された。
モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486の反応性を第14図に示す。また、抗体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免疫測定法を行った。その結果KM1257、KM1259およびKM1486の抗体クラスは、すべてIgG1であった。
６．モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス（Balb/c）に5で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞／匹それぞれ腹腔内に注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8ml/匹）し、遠心分離（3,000rpm、5分間）して固形分を除去した後カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
実施例2.抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の製造
1. タンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の構築
ヒト化抗体のVH及びVLをコードするcDNAを、それぞれヒト抗体Cγ1をコードするcDNA及びヒト抗体CκをコードするcDNAの上流に挿入し、ヒト抗体IgG1,κ型のヒト化抗体を動物細胞で発現させるためのタンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクター、pKANTEX93を特開平2-257891に記載のプラスミドpSE1UK1SEd1-3を基にして以下のようにして構築した。構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用した。
（１）ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI及びEcoRI部位の改変
ヒト化抗体発現用ベクターにヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のV領域を制限酵素NotI-ApaI断片（VH）及びEcoRI-SplI断片（VL）でカセット式に挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターあるいはヒト型CDR移植抗体ヒト化抗体発現ベクターを構築可能とするために、プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI及びEcoRI部位の改変を以下のようにして行なった。
プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第15図に示したプラスミドpBSAを得た。
さらに得られたプラスミドpBSAの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第16図に示したプラスミドpBSAEを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSAEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液20μlに溶解し、10μlずつに分け、一つには更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加え、もう一つには更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて各々37℃で1時間反応させた。両反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約2.96kbのHindIII-SacII断片と約2.96kbのKpnI-HindIII断片を約0.3μg回収した。
次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）と10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.42kbのHindIII-SacII断片と約1.98kbのKpnI-HindIII断片を各々約0.2μg回収した。
次に、上記で得られたpSE1UK1SEd1-3のHindIII-SacII断片0.1μgとpBSAEのHindIII-SacII断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第17図に示したプラスミドpBSH-Sを得た。また、上記で得られたpSE1UK1SEd1-3のKpnI-HindIII断片0.1μgとpBSAEのKpnI-HindIII断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第18図に示したプラスミドpBSK-Hを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SおよびpBSK-Hの3μgを各々10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第19図に示したプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAの5μgを各々50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に1単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させ、部分消化した。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約5.38kbの断片と約4.94kbの断片を約0.5μg回収した。回収した各々の断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第20図に示したプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEの3μgを各々50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第21図に示したプラスミドpBSH-SAEEおよびpBSK-HAEEを得た。得られた各プラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、上記改変によりApaI、EcoRI部位ともに消失したことを確認した。
（２）ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流への制限酵素SalI部位の導入
ヒト化抗体発現用ベクターの抗体H鎖、L鎖の発現プロモーターを任意のプロモーターに変換可能とするために、プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流への制限酵素SalI部位の導入を以下のようにして行った。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSK-HAEEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NaeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグネシウムからなる緩衝液20μlに溶解し、更に1単位のアルカリフォスファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ、5'末端を脱リン酸化した。更に該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、10mMトリス-塩酸（pH8.0）、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる緩衝液（以下、TE緩衝液と称す）20μlに溶解した。該反応液の1μlと0.1μgのリン酸化SalIリンカー（宝酒造社製）を全量が20μlとなるように滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第22図に示したプラスミドpBSK-HAEESalを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流に一箇所の制限酵素SalI部位が導入されたことを確認した。
（３）ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（以下HSVtkと表記）遺伝子のポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変
プラスミドpSE1UK1SEd1-3のTn5カナマイシンフォスホトランスフェラーゼ遺伝子下流のHSVtk遺伝子ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変を以下のようにして行った。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSAの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の5μgを10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約4.25kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpBSAのSacII-XhoI断片0.1μgとpSE1UK1SEd1-3のSacII-XhoI断片を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第23図に示したプラスミドpBSX-Sを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSX-Sの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第24図に示したプラスミドpBSX-SAを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、HSVtk遺伝子ポリAシグナルの制限酵素ApaI部位が消失したことを確認した。
（４）ヒト化抗体L鎖発現ユニットの構築
モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの下流にヒト抗体CκをコードするcDNAが存在し、かつヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVLをコードcDNAをカセット式に挿入可能なヒト化抗体L鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCκを以下のようにして構築した。
プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ClaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、SacIおよびClaI消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第25図に示したプラスミドpBSSCを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSSCの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのKpnI-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、特開平6-205694に記載のプラスミドpAGE147の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーを含む約0.66kbのKpnI-XhoI断片を約0.3μg回収した。
次に、上記で得られたpBSSCのKpnI-XhoI断片0.1μgとpAGE147のKpnI-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第26図に示したプラスミドpBSMoを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.62kbのKpnI-HindIII断片を約1μg回収した。
次に、配列番号16、17に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpBSMo由来のKpnI-HindIII断片（3.66kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第27図に示したプラスミドpBSMoSを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認した。
次に、特開平5-304989に記載のプラスミドpChiIgLA1の3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位ずつの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）およびEcoRV（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.70kbのEcoRI-EcoRV断片を約1μg回収した。次に、配列番号18、19に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpChiIgLA1由来のEcoRI-EcoRV断片（9.70kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第28図に示したプラスミドpChiIgLA1Sを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSの3μgを20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HpaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのHpaI-EcoRI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたプラスミドpChiIgLA1Sの10μgを20mMトリス-酢酸（pH7.9）、50mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素NlaIV（ニューイングランド  バイオラブズ社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.41kbのNlaIV-EcoRI断片を約0.3μg回収した。
次に、上記で得られたpBSMoSのHpaI-EcoRI断片を0.1μgとpChiIgLA1SのNlaIV-EcoRI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第29図に示したプラスミドpMohCκを得た。
（５）ヒト化抗体H鎖発現ユニットの構築
モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの下流にヒト抗体Cγ1をコードするcDNAが存在し、かつヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHをコードcDNAをカセット式に挿入可能なヒト化抗体H鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCγ1を以下のようにして構築した。
実施例２の1（4）で得られたプラスミドpBSMoの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、30mM酢酸ナトリウム（pH5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸亜鉛および10%グリセロールからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させた。該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第30図に示したプラスミドpBSMoSalを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの上流の制限酵素XhoI部位が消失したことを確認した。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSalの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのKpnI-HindIII断片を約1μg回収した。
次に、配列番号20、21に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpBSMoSal由来のKpnI-HindIII断片（3.66kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第31図に示したプラスミドpBSMoSalSを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認した。
次に、特開平5-304989に記載のプラスミドpChiIgHB2の10μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素Eco52I（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、30mM酢酸ナトリウム（pH5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸亜鉛および10%グリセロールからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させた。該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑末端に変えた。エタノール沈殿後、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.99kbのApaI-平滑末端断片を約0.7μg回収した。
次に、プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、33mMトリス-酢酸（pH7.9）、10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SmaI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.0kbのApaI-SmaI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpChiIgHB2のApaI-平滑末端断片0.1μgとpBluescript SK（-）のApaI-SmaI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第32図に示したプラスミドpBShCγ1を得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBShCγ1の5μgを10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-SpeI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSalSの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのApaI-SpeI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpBShCγ1のApaI-SpeI断片0.1μgとpBSMoSalSのApaI-SpeI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第33図に示したプラスミドpMohCγ1を得た。
（６）タンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の構築
実施例２の1（1）〜（5）で得られた各種プラスミドを用いてタンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93を以下のようにして構築した。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSH-SAEEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約5.42kbのHindIII-SalI断片を約1μg回収した。
次に、実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSK-HAEEの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナル、SV40初期遺伝子ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子プロモーターを含む約1.98kbのKpnI-HindIII断片を約0.8μg回収した。
次に、実施例２の1（5）で得られたプラスミドpMohCγ1の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト化抗体H鎖発現ユニットを含む約1.66kbのKpnI-SalI断片を約0.8μg回収した。
次に、上記で得られたpBSH-SAEEのHindIII-SalI断片0.1μg、pBSK-HAEEのKpnI-HindIII断片0.1μgおよびpMohCγ1のKpnI-SalI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第34図に示したプラスミドpMoγ1SPを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpMoγ1SPの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）および制限酵素XhoIを加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.06kbのSalI-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、実施例２の1（2）で得られたプラスミドpBSK-HAEESalの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルを含む約1.37kbのKpnI-SalI断片を約0.7μg回収した。
次に、実施例２の1（4）で得られたプラスミドpMohCκの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト化抗体L鎖発現ユニットを含む約1.06kbのKpnI-XhoI断片を約0.7μg回収した。
次に、上記で得られたpMoγ1SPのSalI-XhoI断片0.1μg、pBSK-HAEESalのKpnI-SalI断片0.1μgおよびpMohCκのKpnI-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第35図に示したプラスミドpMoκγ1SPを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpMoκγ1SPの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で10分間反応させ、部分消化した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約8.49kbのSacII-XhoI断片を約0.2μg回収した。
次に、実施例２の1（3）で得られたプラスミドpBSX-SAの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約4.25kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpMoκγ1SPのSacII-XhoI断片0.1μgとpBSX-SAのSacII-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第36図に示したプラスミドpKANTEX93を得た。
２．抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体をコードするcDNAの単離、解析
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマからのmRNAの取得
インビトロジェン社製のmRNA抽出キットであるFast Trackを用い、キットに添付の使用説明書に従って、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486生産ハイブリドーマ（それぞれFERM BP-5133、FERM BP-5134、FERM BP-5651）の各１×108細胞より、それぞれmRNAを取得した。
（２）マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマのH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
実施例２の2（1）で取得したKM1257、KM1259およびKM1486のmRNAの各５μgから、cDNA Synthesis Kit（ファルマシア  バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端にEcoRIアダプターを有するcDNAをそれぞれ合成した。作製したそれぞれのcDNAの約６μgを10μlの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgG型抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をそれぞれ約0.1μg回収した。次に、それぞれの約1.5kbのcDNA断片0.1μgおよび約1.0kbのcDNA断片0.1μgと、Lambda ZAPIIベクター［Lambda ZAPIIベクターをEcoR Iで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ（Calf Intestine Alkaline Phosphatase）で処理したもの：ストラタジーン社製］1μgをT4リガーゼ緩衝液11.5μlに溶解し、T4 DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃にて24時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。それぞれの反応液のうち４μlを常法［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.95、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用してラムダファージにパッケージングし、これらを常法［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.95-107、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株XL1-Blue［バイオテクニクス（Biotechniques）,5,376（1987）］に感染させて、KM1257、KM1259およびKM1486のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブラリーとしてそれぞれ約４千個のファージクローンを取得した。
（３）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマのH鎖およびL鎖をコードするcDNAのクローニング
実施例２の2（2）で作製したそれぞれのファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.12、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］。各ニトロセルロースフィルターを用いてECLダイレクト・ヌクレイック・アシッド・ラベリング・アンド・ディテクション・システムズ（direct nucleic acid labelling and detection systems）（アマシャム社製）に添付の使用説明書に従い、マウス免疫グロブリンのC領域をコードするcDNA｛H鎖はマウスCγ1cDNAの断片［セル（Cell）,18,559（1979）］、L鎖はマウスCκcDNAの断片［セル（Cell）,22,197（1980）］｝をプローブとしてそれと強く結合したファージクローンを取得した。次に、Lambda ZAPIIベクター（ストラタジーン社製）に添付の使用説明書に従い、ファージクローンをプラスミドpBluescriptSK（-）に変換し、最終的にKM1257のH鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1257HおよびKM1257のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1257L、KM1259のH鎖をコードするcDNA含む組換えプラスミドpKM1259HおよびKM1259のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1259L、KM1486のH鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1486HおよびKM1486のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1486Lを取得した。
（４）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖をコードするcDNAのV領域の塩基配列の決定
実施例２の2（3）で得られた各マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖をコードするcDNAのV領域の塩基配列を、得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア  バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア  バイオテク社製）により電気泳動し、決定した。決定したそれぞれのcDNAの塩基配列より、KM1257、KM1259およびKM1486のH鎖およびL鎖のV領域のアミノ酸配列を決定した。配列番号22および配列番号92にKM1257のH鎖、配列番号23および配列番号93にKM1257のL鎖、配列番号24および配列番号94にKM1259のH鎖、配列番号25および配列番号95にKM1259のL鎖、配列番号26および配列番号96にKM1486のH鎖、配列番号27および配列番号97にKM1486のL鎖のそれぞれのV領域の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
（５）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のCDR配列の同定
実施例２の2（4）で決定した各マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のV領域のアミノ酸配列より、それぞれのH鎖およびL鎖のCDR配列を既知の抗体のV領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］と比較することによって同定した。配列番号28、29および30にKM1257のH鎖のCDR1、2および3、配列番号31、32および33にKM1257のL鎖のCDR1、2および3、配列番号34、35および36にKM1259のH鎖のCDR1、2および3、配列番号37、38および39にKM1259のL鎖のCDR1、2および3、配列番号40、41および42にKM1486のH鎖のCDR1、2および3、ならびに配列番号43、44および45にKM1486のL鎖のCDR1、2および3のそれぞれのアミノ酸配列を示す。
３．抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の製造
ヒトIL-5の生物活性を阻害する活性を有する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259に由来する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を以下のようにして製造した。
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259の構築
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93および実施例２の2で得られたプラスミドpKM1259HおよびpKM1259Lを用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259を以下のようにして構築した。
ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約12.75kbのApaI-NotI断片を約1μg回収した。次に、プラスミドpKM1259Hの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BanI（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.41kbのBanI-NotI断片を約0.5μg回収した。
次に、配列番号46、47に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mM ATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。
上記で得られたヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93由来のApaI-NotI断片0.1μgとプラスミドpKM1259H由来のBanI-NotI断片0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第37図に示したプラスミドpKANTEX1259Hを得た。
次に、得られたプラスミドpKANTEX1259Hの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEcoRI-SplI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドpKM1259Lの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素AvaII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.38kbのAvaII-EcoRI断片を約0.5μg回収した。
次に、配列番号48、49に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mM ATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミドpKANTEX1259H由来のEcoRI-SplI断片0.1μg、プラスミドpKM1259L由来のAvaII-EcoRI断片0.1μgおよびリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第38図に示したプラスミドpKANTEX1259を得た。
（２）pKANTEX1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
YB2/0細胞への抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1259の導入は宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133,（1990）］にて行った。
実施例２の3（1）で得られたpKANTEX1259の4μgを4×106個のYB2/0細胞へ導入後、RPMI1640-FCS（10）を96ウエルマイクロタイタープレートに200μl／ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養後、ジェネティシン（以下、G418と称す、ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加してさらに1〜2週間培養した。G418耐性を有する形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウエルより培養上清を回収し、上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性を以下に示すELISA法1あるいはELISA法2により測定した。
ELISA法1
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-FcをPBSで5μg/mlの濃度、あるいはさらに希釈した溶液を調整し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製した40μg/mlの各種抗ヒトIL-5Rα抗体を25μl／ウェル、さらに実施例１の３で調製した0.4μg/mlのビオチン標識ヒトIL-5を25μl／ウェル分注し、室温で4時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンD（ニチレイ社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。抗体を加えない場合の吸光度の値を阻害率0％とし、抗体のビオチン化標識IL-5に対する阻害率を次式により算出し、各サンプルを評価した。
0003946256.tif 000002
ELISA法2
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5RαをPBSで2μg/mlの濃度、あるいはさらに希釈した溶液を調整し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、形質転換株の培養上清、精製した各種の抗ヒトIL-5Rα抗体を50μl/ウェルで分注し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて500倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（アメリカン カレックス社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
培養上清中に抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性が認められた形質転換株について、0.5mg/ml G418、50nM MTX（シグマ社製）を含むRPMI1640-FCS（10）培地に懸濁し、5%CO2インキュベーター内で37℃、1〜2週間培養し、50nM MTX耐性を有する形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性を上記のELISA法により測定した。活性の認められた形質転換株については、上記と同様の培養方法により、さらにMTX濃度を100nM、200nMと上げて行き、0.5mg/ml G418、200nM MTX含むRPMI1640-FCS（10）培地で増殖可能でかつ、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株についてはさらに2回の限界希釈法によるクローニングを経て、最終的な抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株とした。抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の例としてはKM1399（FERM BP-5650）があげられ、それが生産する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体をKM1399と命名した。形質転換株KM1399はFERM BP-5650として、平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。形質転換クローンKM1399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の生産性は約5μg/106cells/24hrであった。
（３）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の培養上清からの精製
実施例２の3（2）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体生産株KM1399を0.5mg/ml G418、200nM MTX含むGIT培地（日本製薬社製）に1〜2×105細胞/mlとなるように懸濁し、175cm2フラスコ（グライナー社製）に200mlずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。該培養上清約1.0LよりプロセップA（バイオプロセシング社製）カラムを用いて精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399を約3mg取得した。精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の約4μgを、公知の方法［ネイチャー（Nature）,227,680（1970〕］に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第39図に示す。第39図に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型キメラ抗体の発現が確認された。また、精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（４）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法1）
抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法1により測定した。その結果を第40図に示す。第40図に示したように、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399は抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259と同等の強いヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
４．COS-7細胞（ATCC CRL1651）を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現
下記で述べる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体抗の各種バージョンの活性評価をより迅速に行なうために、pKANTEX1259およびその改変ベクターを用いてCOS-7細胞における抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現をリポフェクトアミン法を用いて以下のようにして行なった。
（1）pKANTEX1259の改変ベクターの構築
動物細胞における一過性発現の効率は導入された発現ベクターのコピー数に依存していることから、大きさのより小さい発現ベクターの方が発現効率がよいことが考えられた。そこでpKANTEX1259の抗体発現に影響を及ぼさないと考えられる領域を欠失させ、より小さな抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体発現ベクター、pT1259を以下のようにして構築した。
プラスミドpKANTEX1259の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素MluI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、制限酵素消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.60kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第41図に示したプラスミドpT1259を得た。
（2）pT1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現
1×105細胞/mlのCOS-7細胞をで6ウエルプレート（ファルコン社製）に2ml/ウェルずつ分注し、37℃で一晩培養した。100μlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）にpT1259の2μgを加え、更に100μlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）に10μlのリポフェクトアミン・リエージェント（LIPOFECTAMINE  Reagent,ギブコ社製）を添加した溶液を加え、室温で40分間反応させ、DNA-リポソームの複合体を形成させた。前記したCOS-7細胞を2mlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）で2回洗浄後、DNA-リポソームの複合体を含む溶液を添加し、37℃で7時間培養後、溶液を除去し、10%のFCSを含むDMEM培地（ギブコ社製）を2ml添加し、37℃で培養した。培養後、72時間の時点で培養上清を回収し、培養上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性評価を実施例２の3（2）に記載のELISA法1で行なった。その結果を第42図に示す。第42図に示したようにpT1259を導入したCOS-7細胞の培養上清中に濃度依存的な活性が見られ、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現が確認された。以上の結果より、pKANTEX93の大きさを小さくしたベクターを作製し、COS-7細胞に導入することで一過性発現系で各種発現ベクター由来のヒト化抗体の活性評価を行うことが可能であることが示された。また、後述する各種抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の活性を正確に比較するために、下記４（3）に記載のELISA法により一過性発現培養上清中の抗体濃度を測定した。
（3）ELISA法による一過性発現培養上清中のヒト化抗体濃度の測定
96ウエルマイクロタイタープレートにヤギ抗ヒトIgG（γ-chain）抗体（医学生物学研究所製）をPBSにて400倍希釈した溶液を50μl／ウェルずつ分注し、4℃にて一晩反応させた。抗体溶液を除去後、100μl/ウエルの1%BSA-PBSで37℃、1時間反応させ、残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、これに一過性発現培養上清あるいは精製した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399を50μl/ウエル加え、室温で1時間反応させた。反応後、溶液を除去し、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトκL鎖抗体（ザイメット社製）を1%BSA-PBSにて500倍希釈した溶液を50μl/ウエル加え、室温で1時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
5. 抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造
ヒトIL-5の生物活性を阻害する活性を有するマウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の活性を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を以下のようにして製造した。
（１）既知のヒト抗体VHの共通配列を基礎とする抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVHをコードするcDNAの構築
カバットらは［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991、以下同様］、既知のさまざまなヒト抗体VHをFRの配列の相同性からサブグループI〜III（HSG I〜III）に分類し、各サブグループ毎に共通配列を同定した。そこで、それら共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選択するために、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のVHのFR配列と、各サブグループのヒト抗体VHの共通配列のFR配列との間の相同性を調べた（第１表）。
0003946256.tif 000003
その結果、サブグループIと最も相同性が高いことが確認され、サブグループIの共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法を用いて以下のようにして構築した。
配列番号50から55の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各DNAを最終濃度が0.1μMとなるように10mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、200μM dNTP、0.5μM M13primer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造社製）および2単位のTaKaRa TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）よりなる緩衝液50μlに加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサイクラー（PJ480、パーキン  エルマー社製）にセットし、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。該反応液をエタノール沈殿し、20μlのTE緩衝液に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.48kbの増幅断片を約0.2μg回収した。
次に、プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを33mMトリス-酢酸（pH7.9）、10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SmaI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグネシウムからなる緩衝液20μlに溶解し、更に1単位のアルカリフォスファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ、5'末端を脱リン酸化した。更に該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、20μlのTE緩衝液に溶解した。
次に、上記で得られたPCR後の増幅断片0.1μgとpBluescript SK（-）のSmaI断片0.1μg相当を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む第43図に示したプラスミドphKM1259HV0を得た。phKM1259HV0に含まれる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VH（以下HV.0と表記）の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号98に示した。
（２）既知のヒト抗体VLの共通配列を基礎とする抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVLをコードするcDNAの構築
カバットらは、既知のさまざまなヒト抗体VLをそのFRの配列の相同性からサブグループI〜IV（HSG I〜IV）に分類し、各サブグループ毎に共通配列を同定した。そこで、それら共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選択するために、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のVLのFR配列と、各サブグループのヒト抗体VLの共通配列のFR配列との間の相同性を調べた（第２表）。
0003946256.tif 000004
その結果、サブグループIと最も相同性が高いことが確認され、サブグループIの共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法を用いて以下のようにして構築した。
配列番号57から62の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各DNAを最終濃度が0.1μMとなるように10mMトリス-塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、200μM dNTP、0.5μM M13primer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造社製）および2単位のTaKaRa TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）よりなる緩衝液50μlに加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサイクラー（PJ480、パーキン  エルマー社製）にセットし、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。該反応液をエタノール沈殿し、20μlのTE緩衝液に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.43kbの増幅断片を約0.2μg回収した。
次に、上記で得られたPCR後の増幅断片0.1μgと実施例２の5（1）で得られたpBluescript SK（-）のSmaI断片0.1μg相当を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む第44図に示したプラスミドphKM1259LV0を得た。phKM1259LV0に含まれる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VL（以下LV.0と表記）の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号99に示した。
（３）既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV0LV0の構築
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93、実施例２の5（1）で得られたプラスミドphKM1259HV0および実施例２の5（2）で得られたプラスミドphKM1259LV0を用いて抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV0LV0を以下のようにして構築した。
プラスミドpKMh1259HV0の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.44kbのApaI-NotI断片を約0.5μg回収した。
次に、実施例２の3（1）で得られたヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93由来のApaI-NotI断片0.1μgと上記で得られたプラスミドphKM1259HV0由来のApaI-NotI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第45図に示したプラスミドpKANTEX1259HV0を得た。
次に、得られたプラスミドpKANTEX1259HV0の3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEcoRI-SplI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドphKM1259LV0の5μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.39kbのEcoRI-SplI断片を約0.5μg回収した。
上記で得られたプラスミドpKANTEX1259HV0由来のEcoRI-SplI断片0.1μgとプラスミドphKM1259LV0由来のEcoRI-SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第46図に示したプラスミドpKANTEX1259HV0LV0を得た。
（４）pKANTEX1259HV0LV0を用いた既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
pKANTEX1259HV0LV0を用いて既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のYB2/0細胞での発現を実施例２の3（2）に記載の方法に従って行った。
その結果、既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する形質転換株としてはKM8397があげられ、それが生産する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体をKM8397と命名した。形質転換株KM8397の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の生産性は約4μg/106cells/24hrであった。
（５）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の培養上清からの精製
実施例２の5（4）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体生産クローンKM8397を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、KM8397を約2mg取得した。精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第47図に示す。第47図に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、精製抗ヒトIL-5Rα鎖CDR移植抗体KM8397のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（６）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法2）
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した。その結果を第48図に示す。第48図に示したように、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397は抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399に比べ、ヒトIL-5Rα鎖に対して約1/2の反応性を有していることが示された。
６．抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のV領域のアミノ酸配列の改変による活性の上昇
実施例２の5で製造した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性は抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399に比べ、約1/2に低下した。そこで、KM8397のV領域のアミノ酸配列の改変による活性の上昇を以下のような方法で行った。
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVHのアミノ酸配列の改変
配列番号98に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVHのアミノ酸を変異させ、各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVHを作製した。変異させるアミノ酸としては抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259のV領域のコンピューター三次元構造モデルを参考にし、かつランダムに選択した。変異の導入方法としては変異導入プライマーを用いて実施例2の5項（1）に記載の方法を行い、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョンのVHをコードするcDNAを含むプラスミドを得た。
実際には、変異導入プライマーとして配列番号64に示した配列を用い、配列番号50、51、52、53、64、55の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号100に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン1のVH（以下HV.1と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV1を得た。HV.1のアミノ酸配列においてはマウス抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号64、66、67に示した配列を用い、配列番号50、51、66、67、64、55の塩基塩列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号101に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン2のVH（以下HV.2と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV2を得た。HV.2のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の46位のグルタミン酸、74位のスレオニン、95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、アルギニン、ロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号69、70、71に示した配列を用い、配列番号50、51、69、70、71、55の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号102に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン3のVH（以下HV.3と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV3を得た。HV.3のアミノ酸配列においてはマウス抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の40位のアラニン、46位のグルタミン酸、67位のアルギニン、72位のアラニン、74位のスレオニン、79位のアラニン、95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアルギニン、アラニン、リジン、セリン、アルギニン、バリン、ロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
結果として、HV.0、HV.1、HV.2、HV.3とバージョンが進むにつれて改変に伴うマウス抗体由来のアミノ酸の数が増加するようになっている。
（２）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVLのアミノ酸配列の改変
配列番号99に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVLのアミノ酸を変異させ、各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVLを作製した。変異させるアミノ酸としては抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のV領域のコンピューター三次元構造モデルを参考にし、かつランダムに選択した。変異の導入方法としては変異導入プライマーを用いて実施例2の5（1）に記載の方法を行い、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョンのVLをコードするcDNAを含むプラスミドを得た。
実際には、変異導入プライマーとして配列番号73、74、75に示した配列を用い、配列番号57、58、73、74、61、75の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号７６の１〜１０７番目に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン1のVL（以下LV.1と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV1を得た。LV.1のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の37位のグルタミン、45位のリジン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアルギニン、グルタミン酸、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号74、75、77、78に示した配列を用い、配列番号57、58、77、74、78、75の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号103に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン2のVL（以下LV.2と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV2を得た。LV.2のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の22位のスレオニン、37位のグルタミン、45位のリジン、77位のセリン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるグリシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号74、80、81、82、83に示した配列を用い、配列番号57、80、81、74、82、83の塩基配列を有する合成DNAを用いて5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号105に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン3のVL（以下LV.3と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV3を得た。LV.3のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の7位のセリン、8位のプロリン、22位のスレオニン、37位のグルタミン、38位のグルタミン、45位のリジン、77位のセリン、87位のチロシン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、スレオニン、グリシン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号80、83、85、86、87に示した配列を用い、配列番号57、80、85、86、87、83の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号106に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン4のVL（以下LV.4と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV4を得た。LV.4のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の7位のセリン、8位のプロリン、22位のスレオニン、37位のグルタミン、38位のグルタミン、44位のプロリン、45位のリジン、71位のフェニルアラニン、77位のセリン、87位のチロシン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、スレオニン、グリシン、アルギニン、リジン、バリン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、バリンにそれぞれ変えている。
結果として、LV.0、LV.1、LV.2、LV.3、LV.4とバージョンが進むにつれて改変に伴うモノクローナル抗体由来のアミノ酸の数が増加するようになっている。
（３）各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と実施例２の5（1）および（2）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の各種改変バージョンのV領域をコードするcDNAを含む各種プラスミドを用いて実施例２の5（3）に記載の方法に従い、各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターで用いた各種改変バージョンのV領域の組合せおよび発現ベクターの名称を第３表に示す。
0003946256.tif 000005
上記発現ベクターのうち、pKANTEX1259HV0LV0、pKANTEX1259HV1LV0、pKANTEX1259HV2LV0、pKANTEX1259HV0LV1、pKANTEX1259HV1LV1、pKANTEX1259HV2LV1、pKANTEX1259HV0LV2、pKANTEX1259HV1LV2、pKANTEX1259HV2LV2、pKANTEX1259HV0LV3、pKANTEX1259HV1LV3、pKANTEX1259HV2LV3およびpKANTEX1259HV3LV3の計13種類を実施例２の4（1）に記載の方法に従って一過性発現用のベクターに改変した。それら一過性発現用ベクターを用いて実施例２の4（2）に記載の方法に従い、各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の一過性発現を行った。コントロールとして同時に抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の一過性発現を行った。培養上清中のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を実施例２の3（2）に記載のELISA法1により測定し、また、培養上清中の抗体濃度を実施例２の4（3）に記載のELISA法により測定し、両者の値より各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の活性をヒト型キメラ抗体KM1399の活性を100としたときの相対活性値で第49図に示した。なお、図中では各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体はVHとVLの組合せで表示した。第49図よりVHに関してはHV.0、HV.1、HV.2、HV.3と改変が進むにつれて活性が高くなる傾向が認められ、VLに関してはLV.0、LV.3で活性が高く、LV.1、LV.2ではむしろ活性が低下する傾向が認められた。そこで、LV.0と各種改変VH、LV.3とHV.0、LV.3とHV.3、LV.3をさらに改変したLV.4と各種改変VH、の組合せの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体について精製抗体を用いたより正確な活性評価を以下のような方法で行った。
上記で述べた計10種類の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクター、すなわちpKANTEX1259HV0LV0、pKANTEX1259HV1LV0、pKANTEX1259HV2LV0、pKANTEX1259HV3LV0、pKANTEX1259HV0LV3、pKANTEX1259HV3LV3、pKANTEX1259HV0LV4、pKANTEX1259HV1LV4 pKANTEX1259HV2LV4および
pKANTEX1259HV3LV4を用いて実施例２の3（2）に記載の方法に従いYB2/0細胞での発現を行い、各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を2〜4μg/106cells/24hrの生産性で生産する形質転換株を得た。得られた各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する株を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を1〜2mg取得した。各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果、いずれの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体とも還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではいずれの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体も分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖CDR移植抗体のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、いずれも予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
上記で得られた各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した結果を第50図に示した。なお、図中では各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体はVHとVLの組合せで表示した。第50図に示したように10種類の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のうち、HV.3LV.0およびHV.3LV.4が抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体HV.3LV.0およびHV.3LV.4のアミノ酸配列を比較すると、HVについてはどちらもHV.3に示すアミノ酸配列を有するが、VLはLV.0とLV.4に示すアミノ酸配列である。LV.0がCDRを単純にヒト抗体のFRに移植した配列であるのに対して、LV.4は活性を高めるためにヒト抗体のFRの11残基のアミノ酸をモノクローナル抗体に見出されるアミノ酸に改変した配列である。しかし、第50図の結果から実際はアミノ酸残基の改変が活性の上昇にはほとんど寄与していない。これらの事実から、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有し、かつモノクローナル抗体由来のアミノ酸が少なくヒトに対する抗原性が低下することが期待されるHV.3LV.0を抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体とした。HV.3LV.0はKM8399と命名し、KM8399を生産する形質転換株KM8399はFERM BP-5648として、平成8年９月３日付で、工業技術院生命工学技術研究所に寄託された。
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の製造にあたっては、他のヒト型CDR移植抗体の製造と同様に、もととなる抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259のCDRのみを単純にヒト抗体のFRに移植した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397ではその活性がモノクローナル抗体KM1259の約1/2に低下してしまった。そこで上記のようにH鎖、L鎖のV領域のFRのいくつかのアミノ酸をモノクローナル抗体KM1259に見出されるアミノ酸に改変し、活性の上昇を検討した。改変の過程でVHに関しては改変に従い活性が上昇したが、一方、VLに関しては少数のアミノ酸残基の改変では、むしろ活性が低下し、改変残基数を増加させることにより活性は上昇するが、それは改変しないVLと同程度レベルまでしか上昇しないという結果が得られた。この原因についてはより詳細な解析（X線結晶解析等）を待たねばならないが、恐らく抗体のVHとVLの相互作用が関与しており、その結果は用いる個々の抗体で異なることが考えられる。こうした問題から現在でもすべての抗体に適応可能で効率的なヒト型CDR移植抗体の製造法は確立されておらず、本実施例のような試行錯誤が必要である。そして、こうした試行錯誤の積み重ねにより、より効率的なヒト型CDR移植抗体の製造法が確立されると考えられる。本実施例は、はじめての抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造の例であり、効率的なヒト型CDR移植抗体の製造における示唆を与えるものである。
７．ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の製造
（１）ヒト抗体IgG4サブクラスのC領域（Cγ4）をコードするcDNAの単離、解析
健常人末梢血200mlより抗CD19抗体がコーティングされたダイナビーズ（DYNABEADS M-450 Pan-B（CD19）：日本ダイナル社製）およびDETACHaBEAD（日本ダイナル社製）を用い、添付の使用説明書に従って1.1×107個のB細胞を分離した。分離した細胞よりQuickPrep mRNA Purification Kit（ファルマシア  バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従ってmRNAを取得した。取得したmRNAの全量からTimeSaver cDNA Synthesis Kit（ファルマシア  バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従ってcDNAを合成した。得られたcDNAの全量を用いて、配列番号89、90に示したヒト抗体Cγ４をコードするcDNAの5'側と3'側に相同性を持つ配列［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Research）,14,1789（1986）］の合成DNAをプライマーとして実施例２の5（1）に記載のPCRを行った。PCRに用いた5'側と3'側のプライマーはその5'端にそれぞれ制限酵素ApaIとBamHIの認識配列を有しており、得られたcDNAをヒト化抗体発現ベクターに容易に挿入できるように設計した。PCR後の反応液をQIAquick PCR Purificanon Kit（キアジェン社製）を用いて精製後、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-BamHI断片を約0.5μg回収した。
次に、プラスミドpBluescriptSK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.0kbのApaI-BamHI断片を約2μg回収した。
上記で得られたPCR増幅断片のApaI-BamHI断片0.1μgとpBluescriptSK（-）のApaI-BamHI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的のヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含む第51図に示したプラスミドpBShCγ4を得た。
（２）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の発現ベクターの構築
実施例２の７（1）で得られたヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含むプラスミドpBShCγ4および実施例２の3（1）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の発現ベクターpKANTEX1259および実施例２の6（3）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0を用いて、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の発現ベクターを以下のようにして構築した。
ヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含むプラスミドpBShCγ4の4μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-BamHI断片を約1μg回収した。
次に、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の発現ベクターpKANTEX1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0の各3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。各反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。各反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、それぞれ約12.59kbのApaI-BamHI断片を約2μg回収した。
上記で得られたプラスミドpBShCγ4由来のApaI-BamHI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1259由来のApaI-BamHI断片0.1μg、また、プラスミドpBShCγ4由来のApaI-BamHI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1259HV3LV0由来のApaI-BamHI断片0.1μgをそれぞれ全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第52図に示したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259γ4およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0γ4を得た。
（３）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
実施例２の7（2）で得られたIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259γ4およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0γ4を用いてヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のYB2/0細胞での発現を実施例２の3（2）に記載の方法に従い行った。
その結果、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株としてはKM7399（FERM BP-5649）が得られ、それが生産するIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体をKM7399と命名した。KM7399を生産する形質転換株KM7399はFERM BP-5649として平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。形質転換株KM7399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399の生産性は約3μg/106cells/24hrであった。
また、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する形質転換株としてはKM9399（FERM BP-5647）が得られ、それが生産するIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体をKM9399と命名した。形質転換株KM9399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399の生産性は約7μg/106cells/24hrであった。KM9399を生産する形質転換株KM9399はFERM BP-5647として平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。
（４）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の培養上清からの精製
実施例２の7（3）で得られたIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体生産株KM7399およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体生産株KM9399を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、KM7399、KM9399をそれぞれ約1mg、5mg取得した。精製したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体KM7399、KM9399の各約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第53図に示す。第53図に示したように、還元条件下では各抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では各抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、精製したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体KM7399およびKM9399のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド  バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（５）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法2）
ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した。その結果を第54図に示す。第54図に示したように、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体はヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
実施例３．
１．抗hIL-5Rα抗体の特異性の確認
抗hIL-5Rαモノクローナル抗体および抗hIL-5Rαヒト化抗体の特異性を免疫細胞染色を用いて以下の手順に従い確認した。
CTLL-2細胞（ATCC TIB 214）にヒトIL-5R遺伝子を導入した細胞［以下、CTLL-2（h5R）細胞と称す］［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］、あるいは対照としてCTLL-2細胞5×105個を免疫細胞染色用緩衝液（1%BSA、0.02%EDTA、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）に懸濁して丸底96ウェルプレートに100μl／ウェルで分注した。４℃、350×gで1分間遠心分離後、上清を除き、10μg/ml  hIL-5Rα抗体を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、免疫細胞染色用緩衝液を200μl／ウェルで加え4℃、350×gで1分間遠心分離後上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさらに2回行った後、染色バッファーで30倍希釈したFITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体あるいはFITC標識抗ヒトイムノグロブリン抗体（いずれも和光純薬社製）を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を3回行った後フローサイトメーター（コールター社製）を用いて解析を行った。
結果を第55図に示す。モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399ともにCTLL-2細胞には反応せずCTLL-2（h5R）細胞に特異的に反応した。この結果、モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はhIL-5Rαを特異的に認識することが明らかとなった。
２．抗IL-5Rα抗体によるIL-5の生物活性の阻害作用
CTLL-2（h5R）細胞はヒトIL-5に依存して増殖応答を示す［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］ことから、得られた抗IL-5Rα抗体のCTLL-2（h5R）細胞におけるヒトIL-5依存性細胞増殖に対する影響を検討した。細胞増殖は、セルカウンティングキット（同仁化学研究所製）を用いて発色法にて評価を行った。
CTLL-2（h5R）細胞1×104個を50μlの正常培地に懸濁して96ウェル培養用プレートに分注した。これに正常培地で希釈した40μg/ml各種抗IL-5Rα抗体溶液25μl／ウェル、さらに実施例１の３の方法で調製した0.4ng/mlヒトIL-5を含む正常培地25μl／ウェルを混合し、CO2インキュベーター中、37℃で44時間培養した。さらに、セルカウンティングキット溶液を10μl／ウェルで加えてからCO2 ５％気流下、３７℃で４時間培養した。培養終了後、450nmの吸光度をマイクロウェルプレートリーダーEmax（モレキュラーデバイス社製）にて測定した。各抗体のCTLL-2（h5R）細胞増殖抑制活性を次式により算出した。
0003946256.tif 000006
結果を第５６図に示すが、モノクローナル抗体KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はいずれもCTLL-2（h5R）細胞のヒトIL-5依存性増殖を阻害したが、モノクローナル抗体KM1257にはこのような活性が認められなかった。
３．ヒト好酸球の免疫細胞染色
正常人血液より多形核白血球画分を調製し、3日間ヒトIL-5の存在下で培養し好酸球を濃縮した後に、フローサイトメーターを用いて抗hIL-5Rαモノクローナル抗体の反応性を検討した。
15ml容量のポリプロピレン製遠心管にポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）を4mlずつ8本に分注しそれぞれにヘパリン処理をした正常人血6mlを重層した。これを500×g、室温で30分間遠心分離して多形核白血球を分離、回収した。多形核白血球が1.25×107個/10mlとなるように正常培地に懸濁し、細胞培養用ディッシュ４枚に10mlずつ分注し、最終濃度が2ng/mlとなるようにヒトIL-5を加え、CO2インキュベーター中、37℃で3日間培養した。培養終了後細胞を遠心分離（1,200rpm、5分間）し、免疫細胞染色用緩衝液で5×106個/mlになるように細胞を懸濁し、5×105個を丸底96ウェルプレートに分注した。４℃、350×gで１分間遠心分離後上清を除き、公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊  1985年）でビオチン標識したモノクローナル抗体KM1259あるいは対照としてビオチン標識した抗ヒト顆粒球コロニー刺激因子モノクローナル抗体KM341［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）,53,1095（1989）］を10μg/mlの濃度で10%正常マウス血清を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、免疫細胞染色用緩衝液を200μl／ウェルに加え4℃、350×gで1分間遠心分離後上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさらに2回行った後、免疫細胞染色用緩衝液で10倍に希釈したフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社製）を50μl／ウェル加えて4℃で30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を3回行った後フローサイトメーター（コールター社製）にて前方散乱、90度散乱にて多形核白血球と認められる細胞に関して解析を行った。また、同じ細胞をメイ・グリュントワルト・ギムザ染色法（染色法のすべて：医歯薬出版株式会社1988年）にて染色し多形核白血球に関して観察したところ、75%が好酸球であることを確認した。
第５７図に得られたヒストグラムを示す。抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259は明らかな反応性を示した。解析した細胞の75%は好酸球であることが確かめられていることから、抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナルKM1259はヒト好酸球に対する反応性を有していることが確認された。
４．抗IL-5Rα抗体を用いたヒト好酸球の生存抑制
正常人血液より多形核白血球画分を調製し、ヒトIL-5の存在下での好酸球生存に対する抗IL-5Rα抗体の作用を検討した。
15ml容量のポリプロピレン製遠心管にポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）を4mlずつ15本に分注しそれぞれにヘパリン処理をした正常人血8mlを重層した。これを500×g、室温で30分間遠心分離して多形核白血球を分離、回収した。
9容量のパーコール溶液（Percoll、ファルマシア社製）に１容量の滅菌した1.5M食塩水を加えパーコールストック溶液を調製した。8容量のパーコールストック溶液に2容量の生理食塩水を加え80%パーコール溶液を調製し、6容量のパーコールストック溶液に4容量の生理食塩水を加え60%パーコール溶液を調製した。混在する単核球を除く目的で、15ml容量のポリプロピレン製遠心管２本に5mlの60%パーコール溶液を分注し、ここに先に得られたRPMI1640培地に懸濁した多形核白血球を重層し、500×g、室温で30分間遠心分離して沈殿した多形核白血球を分離、回収した。さらに混在する赤血球を除く目的で、5mlの80%パーコール溶液を2本の15ml容量のポリプロピレン製遠心管に分注し、ここに先に得られたRPMI1640培地に懸濁した多形核白血球を重層し、500×g、室温で30分間遠心分離してパーコール層に浮遊している多形核白血球を分離、回収した。
48ウェルの細胞培養用プレートに2×106個／ウェルの細胞を分注し、最終濃度0.1ng/mlのヒトIL-5を添加し、さらに最終濃度1μg/mlの各種抗IL-5Rα抗体をそれぞれ添加した。各抗体につき2ウェル培養し、各ウェルの液量は最終的に1mlとなるように調製した。CO2インキュベーター中、37℃で３日間培養し、培養終了後各ウェルから全量の細胞懸濁液を回収し、遠心分離（3,000rpm、１分間）して細胞を回収した。得られた細胞を100μlのPBSに懸濁し、そのうちの50μlを用いて細胞標本作製装置：サイトスピン3［Cytospin3、シャンドン（Shandon）社製］にて標本を作製した。メイ・グリュントワルト・ギムザ染色法にて染色後、各標本に関して200個の細胞を観察し、好酸球の数を求めた。
結果を第５８図に示すが、モノクローナル抗体KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はいずれもIL-5による好酸球寿命延長を抑制する活性が認められたが、モノクローナル抗体KM1257にはこのような活性が認められなかった。
５．抗hIL-5Rα抗体を用いたshIL-5Rαの検出
96ウェルのEIA用プレート（グライナー社製）に、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257を10μg/mlの濃度にPBSで希釈し、50μl/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1%牛血清アルブミン（BSA）を含むPBSを100μl/ウェル加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、1000〜0.1ng/mlの濃度に1%BSA-PBSで希釈した実施例１の1（9）で得られた精製shIL-5Rαを4℃で一晩反応させた。tween-PBSで洗浄後、公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊1985年）でビオチン標識した抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259を1μg/mlの濃度に1%BSA-PBSで希釈して50μl/ウェルずつ加えて室温にて2時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、4000倍に1%BSA-PBSで希釈したアビジン標識ペルオキシダーゼ（ニチレイ社製）50μl/ウェルを加えて室温にて1時間反応させた。tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度を測定した（NJ2001;日本インターメッド社製）。
結果を第５９図に示す。この結果、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびビオチン標識抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259を用いることによりshIL-5Rαを測定することができることが明らかとなった。
６．ウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出
実施例１の１（９）で述べたshIL-5Rαを2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファーあるいは2-メルカプトエタノールを含まないSDS-PAGE用サンプルバッファー中にて加熱変性させた。該溶液を市販のSDS-PAGE用グラジエントゲル（アトー社製）にて電気泳動した後、PVDF膜（ミリポア社製）に蛋白質を転写した。該PVDF膜を10%BSAを含むPBSに浸して４℃にて一晩放置してブロッキングを行い、ブロッキング終了後0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。該PVDF膜を実施例１の５で得られたハイブリドーマの培養上清に室温で２時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬社製）を1%BSA-PBSで1000倍希釈した溶液に該PVDF膜を室温で1時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。洗浄液をよく除いた後、ECL試薬（アマシャム社製）を該PVFD膜にかけ１分間反応させた。過剰量の試薬を除きプラスチックフィルムに該PVDF膜を挟んでX線フィルム感光用カセットに入れてECL用フィルムを感光させ、抗体の反応性を確認した。
結果を第６０図に示す。KM1257は反応性を示したが、KM1259、KM1486は反応性を示さなかった。
７．shIL-5Rαの免疫沈降
96ウェルのEIA用プラスチックプレートに抗マウスイムノグロブリン抗体（DAKO社製）をPBSで50倍希釈したものを200μl／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSAを含むPBSを300μl／ウェルずつ分注して室温で1時間放置し、ブロッキングを行った。PBSにて洗浄後、実施例で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体であるKM1257、KM1259あるいはKM1486の培養上清を200μlずつ加え、４℃にて一晩放置して抗体を吸着させた。プレートを洗浄後、実施例１の１で得られたshIL-5Rαを10μg/mlの濃度に1%BSAで希釈したものを50μlずつ分注し、４℃で一晩反応させた。プレートを0.05%Tweenを含むPBSにて洗浄後、５倍濃度の2-メルカプトエタノールを含まないSDS-PAGE用サンプルバッファー［0.31Mトリス（pH6.8）、10%SDS、50%グリセロール］あるいは2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー［0.31Mトリス（pH6.8）、10%SDS、50%グリセロール、25%  2-メルカプトエタノール］を50μl／ウェルずつ分注し、振とうしながら室温で２時間放置した。200μlのPBSに該反応液を加え、ヒートブロックにて加熱した後、市販のSDS-PAGE用グラジエントゲル（アトー社製）にて25μlの該溶液を分離した。電気泳動終了後、PVDF膜（ミリポア社製）に転写を行った。該PVDF膜を実施例３の６に示した方法でKM1257を用いてウェスタンブロッティングを行い、shIL-5Rαを検出した。
結果を第６１図に示す。KM1257、KM1259、KM1486ともにshIL-5Rαを免疫沈降することが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒト好酸球上に特異的に発現されていると考えられるヒトIL-5受容体α鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486が提供される。また、ヒト好酸球上に特異的に発現されていると考えられるヒトIL-5受容体α鎖に特異的に結合し、かつヒトIL-5の生物活性を阻害できるヒト化抗体KM1399、KM8399、KM7399およびKM9399が提供される。本発明の抗体は免疫細胞染色におけるヒト好酸球の免疫学的検出、IL-5の生物活性の阻害によるアレルギー性疾患の診断、治療等に有用である。特にヒト化抗体においてはモノクローナル抗体よりも免疫原性が低く、その効果が長期にわたり持続することが期待される。
配    列    表
配列番号：1
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
0003946256.tif 000007
配列番号：2
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
0003946256.tif 000008
配列番号：3
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
0003946256.tif 000009
配列番号：4
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
0003946256.tif 000010
配列番号：5
配列の長さ：84
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列：
0003946256.tif 000011
配列番号：6
配列の長さ：51
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列：
0003946256.tif 000012
配列番号：7
配列の長さ：58
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列：
0003946256.tif 000013
配列番号：8
配列の長さ：64
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列：
0003946256.tif 000014
配列番号：9
配列の長さ：41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列：
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配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
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配列：
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
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配列：
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配列の型：核酸
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
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存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
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鎖の数：一本鎖
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
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配列の長さ：421
配列の型：核酸
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
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配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
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配列番号：77
配列の長さ：92
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
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配列の型：核酸
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配列の種類：他の核酸 合成DNA
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
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特徴を決定した方法：S
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特徴を表す記号：domain
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
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配列番号：83
配列の長さ：91
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
0003946256.tif 000089
配列番号：84
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
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配列の型：アミノ酸
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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