(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１記載のヌクレオチド配列を含む、分離精製したＤＮＡ断片。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ断片を含有するプラスミド。
【請求項３】
請求項２記載のプラスミドを含有する微生物。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡ断片を植物または藻類細胞に導入することを含む、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与する方法。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ断片が導入された、植物または藻類。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド配列あるいは配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、該単離ＤＮＡ分子は、それを発現する植物あるいは藻類の細胞にＮ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシ）フェニル−３、４、５、６−テトラヒドロフタルイミド若しくは７−フルオロ−６−［（３、４、５、６）−テトラヒドロフタルイミド］−４−（２−プロピニル）−１、４−ベンズオキサジン−３（２Ｈ）−オンに対する抵抗性を付与する。
【請求項７】
請求項６のＤＮＡ分子を含むプラスミド。
【請求項８】
請求項７のプラスミドを含む微生物。
【請求項９】
請求項６のＤＮＡ分子が導入され、該ＤＮＡ分子が発現されている植物あるいは藻類。
【請求項１０】
請求項６のＤＮＡ分子を植物若しくは藻類の細胞に導入し、該ＤＮＡ分子を発現している植物若しくは藻類にポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
関連出願
本願は、１９９５年７月２０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９０９８の一部継続出願である。
発明の分野
この発明は、植物および藻類細胞にポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与するＤＮＡ断片類、これらＤＮＡ断片類を含むプラスミド類および微生物類、これらＤＮＡ断片類を使用して植物および藻類細胞にポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する方法、並びにこのような除草剤に対する耐性を付与するためにこれらＤＮＡ断片類が導入された植物類および藻類に関するものである。
関連技術の記載
市販その他により入手可能な若干の種類の除草剤で有効成分として使用されている１群の周知の化合物は、光の存在下で除草活性を発揮するが、暗所では除草活性を発揮しない。このことが、それらに対する一般的名称としての光依存性またはポルフィリン性除草剤の語を導いた。最近、これらの除草剤が植物類および藻類において高濃度のポルフィリン蓄積を誘導することが示され、そのため、これらは現在「ポルフィリン蓄積型除草剤」［続医薬品の開発（翻訳：ザ・デベロップメント・オブ・メディカル・ドラッグ・プロダクツ；コンティニュエーション）、１８巻、農薬の開発ＩＩ、１６章、１６-１節；岩村俶、上野民雄および鴨下克三編、東京、広川書店刊］または単に「ポルフィリン性除草剤」と呼ばれている。エム・マトリンジェ、ジェイ・エム・カマドロ、ピー・ラッベ、、アール・スカラ（バイオケミカル・ジャーナル２６０巻２３１頁（１９８９年）およびエム・マトリンジェ・ジェイ・エム・カマドロ、ピー・ラッベ、、アール・スカラ（ＦＥＢＳレターズ２４５巻３５頁（１９８９年）は、ポルフィリン蓄積型除草剤（以下、ポルフィリン性除草剤ともいう）が単離したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（以下、「プロトックス」という）を阻害することを報告した。
ほとんどの作物用植物類はこれらのポルフィリン性除草剤に対する耐性を示さないので、このような作物が栽培されている場合これらの除草剤を農地で使用することができなかった。もしポルフィリン性除草剤に対して耐性をもつ作物を開発できたならば、これらの作物に対してこのような除草剤を使用できる。このことは作物の管理を容易にし、農業用途におけるこれらの除草剤の価値を高めるであろう。この理由から、作物用植物類に対してポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する方法を開発することが望ましい。
発明の要約
この目標を念頭において、この発明者らは、ポルフィリン性除草剤に特異的耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティのＲＳ-３と称する変異株について研究した。この藻類の野生株は、通常ポルフィリン性除草剤に高い感受性を持つ。この発明者等は、クラミドモナス・レインハルティのＲＳ-３株から単離した葉緑体断片類において、ポルフィリン性除草剤によるプロトックス活性の阻害が、野生株の葉緑体断片類におけるものより顕著に低いことを見出した。そこで、この発明者等は、ＲＳ-３変異株から単離した全核ＤＮＡからゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、ポルフィリン性除草剤に対する耐性の原因をなす遺伝子を含むクローン類を単離することに成功した。すなわち、この発明者等は、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物および藻類細胞に付与しうるＤＮＡ断片類を得ることができた。
したがって、この発明の一つの目的は、植物または藻類細胞中で発現されたときポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する、単離精製したＤＮＡ断片、上記ＤＮＡ断片を含むプラスミド類および微生物類を提供することである。この発明によるＤＮＡ断片は、好ましくは、藻類のゲノムを含むＤＮＡにおける１個またはそれ以上の部分のヌクレオチド配列を有するか、または藻類のゲノムにおける１個またはそれ以上の部分を含むＤＮＡのヌクレオチド配列に高い相同性を有するヌクレオチド配列を有する。
この発明の別の目的は、上記ＤＮＡ断片が発現される上記植物または藻類細胞に上記ＤＮＡ断片を導入することを含む、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与する方法；および、上記ＤＮＡ断片を導入し、それにより上記植物または藻類細胞に除草剤耐性を付与した、上記ＤＮＡ断片が発現される上記植物または藻類細胞である。
この発明の他の目的は、下記特徴：
ａ）ポルフィリン蓄積型除草剤に耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティの株から得たＤＮＡ断片に由来するヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩに対する制限部位を含み、図１（ａ）に示す制限地図を有し；
ｃ）分子の大きさが約３．４ｋｂであり；
ｄ）その中で発現されたときポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与すること、
を有する単離精製したＤＮＡ断片、またはその生物学的に機能する均等物を提供することである。
この発明の外の目的は、下記特徴：
ａ）ポルフィリン蓄積型除草剤に耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティの株から得たＤＮＡ断片に由来するヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩに対する制限部位を含み、図１（ｂ）に示す制限地図を有し；
ｃ）分子の大きさが約９．９ｋｂであり；
ｄ）その中で発現されたときポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与すること、
を有する単離精製したＤＮＡ断片、またはその生物学的に機能する均等物を提供することである。
この発明の他の目的は、下記特徴：
ａ）ポルフィリン蓄積型除草剤に耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティの株から得たＤＮＡ断片に由来するヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩに対する制限部位を含み、図１（ｃ）に示す制限地図を有し；
ｃ）分子の大きさが約１０．０ｋｂであり；
ｄ）その中で発現されたときポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与すること、
を有する単離精製したＤＮＡ断片、またはその生物学的に機能する均等物を提供することである。
この発明の外の目的は、下記特徴：
ａ）ポルフィリン蓄積型除草剤に耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティの株から得たＤＮＡ断片に由来するヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩに対する制限部位を含み、図１（ｄ）に示す制限地図を有し；
ｃ）分子の大きさが約１３．８ｋｂであり；
ｄ）その中で発現されたときポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与すること、
を有する単離精製したＤＮＡ断片、またはその生物学的に機能する均等物を提供することである。
この発明のその目的は、前記ＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物のいずれかを含むプラスミド類および微生物類と；植物または藻類細胞に、上記ＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を機能的に作動できるように導入し、その結果上記ＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物が上記植物または藻類細胞中で発現され、ＤＮＡ断片の発現が形質転換植物または藻類細胞にポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与することを含む、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与する方法を提供することである。この発明のＤＮＡ断片類により機能的に作動できるように形質転換されたインビトロ培養細胞は、ポルフィリン蓄積型除草剤に対して、少なくとも０．０１μＭの濃度、好ましくは０．０３μＭの濃度、最も好ましくは０．１μＭの除草剤濃度で耐性であるのが好ましい。試験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｂを使用する場合、濃度範囲は、好ましくは０．０１ないし０．３μＭ、さらに好ましくは０．０３ないし０．６μＭ、最も好ましくは０．１ないし０．３μＭである。その他の場合、範囲は０．０１ないし３０μＭ、さらに好ましくは０．０３ないし１０μＭ、最も好ましくは０．１ないし３μＭの間である。形質転換植物類またはその組織の耐性試験に用いる除草剤濃度は、これらの範囲の上端またはそれ以上であり、当業界で典型的な実験法により通常の技術者によって決定することができる。インビトロ細胞または形質転換植物類もしくは藻類体の除草剤耐性試験に用いる除草剤は、好ましくはＮ−フェニル−テトラヒドロフタルイミド化合物である。Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシ）フェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド（化合物Ａ）または７−フルオロ−６−［（３，４，５，６）−テトラヒドロフタルイミド］−４−（２−プロピニル）−１，４−ベンズオキサジン−３（２Ｈ）−オン（以下、「化合物Ｂ」という）が、この目的に特に好ましい。
この発明の他の目的は、上記ＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物が機能的に作動できるように導入されている植物類または藻類を提供することである。
この発明のさらに外の目的は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む単離精製ゲノムＤＮＡ断片；上記ＤＮＡ断片を含むプラスミド類および微生物類；ポルフィリン性除草剤耐性を、上記ｃＤＮＡが発現される植物または藻類細胞に付与する、上記ＤＮＡ断片によりコード化されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを導入することを含む、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与する方法；および、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する、上記ＤＮＡ断片によりコード化されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが導入された、上記ｃＤＮＡが発現される植物類または藻類を提供することである。
この発明のさらに外の目的は、組み換えプラスミドまたは形質転換微生物の作成、植物および藻類細胞にポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する関連ＤＮＡ配列の同定に有用なプローブの作成、およびポルフィリン蓄積型除草剤に対して耐性をもつ植物類または藻類の作成のための（除草剤耐性の）遺伝子マーカーとしての、本書中に開示したＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物のいずれかの使用を含む。
この発明のＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物は、以下「本件核酸断片類」または「本件ＤＮＡ断片類」と称する。具体的な個々の断片類は、その制限部位および分子の大きさにより指定する。
この発明は、上記ＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を含むプラスミド類（以下「本件プラスミド類」という）、これらＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を含む微生物類（以下「本件微生物類」という）、これらＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を含む植物類または藻類（以下「本件植物類」という）、並びにこれらＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を使用してポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を植物または藻類細胞に付与する方法を包含する。
本書中で使用する用語に関して述べると、「ＤＮＡ断片類」の語は、本件断片類だけでなく、これらの断片類の縮重異性体および遺伝学的に均等な修飾形態にも当てはまる。ここにおいて、「縮重異性体」は、そのヌクレオチドの塩基配列が元の断片類に縮重的な関係を持つ異性体；すなわち元の断片類と本質的に同一の遺伝情報を含む対応ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを意味するものとして用いる。ここにおいて、「遺伝学的に均等な修飾形態」は、塩基の変更、付加、または欠失を受けたが本質的に元の断片類と同一の固有遺伝情報を含むＤＮＡ断片類を意味するものとして用いる。
後者の具体例は、そのヌクレオチド配列が本件核酸断片類に高い相同性を示し、常用のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーション技術により容易に単離されるか、または既知のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅され、常用の形質転換技術により普通ポルフィリン蓄積型除草剤に対して感受性をもつ植物または藻類細胞に導入したときこれらの除草剤に対する耐性を付与する能力を有するＤＮＡ断片類を包含する。
「ポルフィリン蓄積型除草剤」または「ポルフィリン性除草剤」の語句は、光依存性除草剤、すなわち光の存在下では感受性植物を殺害するが、暗所では除草活性を示さず、適用された植物に高濃度のポルフィリン蓄積を誘導する化合物に当てはまる。これらの除草剤は、例えば、オキサディアゾン、フルプロパシル、［Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシ）フェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド］（以下化合物Ａという）、アシフルオルフェン、ラクトフェン、オキシフルオルフェンのようなジフェニルエーテル系除草剤、並びに以下のもの：ペンチル［２−クロロ−５−（シクロヘキサ−１−エン−１，２−ジカルボキシイミド）−４−フルオロフェノキシ］アセテート、７−フルオロ−６−［（３，４，５，６）−テトラヒドロフタルイミド］−４−（２−プロピニル）−１，４−ベンズオキサジン−３（２Ｈ）−オン（以下「化合物Ｂ」という）、６−［（３，４，５，６）−テトラヒドロフタルイミド］−４−（２−プロピニル）−１，４−ベンズオキサジン−３（２Ｈ）−オン、２−［７−フルオロ−３−オキソ−４−（２−プロピニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンズオキサジン−６−イル］ペルヒドロイミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−１，３−ジオン、２−［（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシ）フェニル）］ペルヒドロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾロ［１，２−ａ］ピリダジン−１，３−ジオン、２−［７−フルオロ−３−オキソ−４−（２−プロピニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンズオキサジン−６−イル］−５，６，７，８−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリジン−３Ｈ−オン、２−［３−オキソ−４−（２−プロピニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンズオキサジン−６−イル］−１−メチル−６−トリフルオロメチル−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン、２−［６−フルオロ−２−オキソ−３−（２−プロピニル）−２，３−ジヒドロベンズチアゾール−５−イル］−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド、１−アミノ−２−［３−オキソ−４−（２−プロピニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンズオキサジン−６−イル］−６−トリフルオロメチル−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンおよびこれらの化合物の類似体を包含する。
本件核酸断片類は、そのヌクレオチド配列の人工合成により作成することができる；しかし、さらに代表的には、ポルフィリン蓄積型除草剤に耐性を示す単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティのＲＳ-３と称する変異株から単離される。上記ＲＳ−３株は、登録番号ＣＣ−２６７４としてクラミドモナス・ジェネティックス・センター（宛名：アメリカ合衆国、２７７０８−１０００、ノースカロライナ州、ダラム、デューク・ユニバーシティ、ボックス９１０００、デパートメント・オブ・ボタニー、ＤＣＭＢグループ）に保存されている。したがって、ＲＳ−３株は分譲により公衆が入手することができる。下記に示すように、本件核酸断片類を含むプラスミド類を宿した微生物類もまた、ブタベスト条約の規定の下に寄託されており、それゆえ自由に入手できる。これらの微生物類に宿されたプラスミド類は、常用の技術により容易に抽出することができ、本件断片類は図１（ａ）−１（ｄ）に示す制限地図を参照して採取することができる。例えば、ＰＣＲまたはその他の部位指向性の突然変異誘発技術を用いてこれらの断片類に特異的改変を導入し、または本件核酸断片類に高い相同性を示す他のＤＮＡ断片類を単離するためのプローブとして、本件核酸断片類またはそれらに対応するｃＤＮＡ類、ＰＣＲ産物、またはオリゴヌクレオチド類を使用し、上記の同族体を生成することができる。
この発明の適用性に関するそれ以上の範囲は、下記の詳細な説明および図面から明らかになろう。しかし、この発明の思想と範囲内における種々の変更と修飾がこの詳細な記載から当業者に明らかになるのであるから、下記の詳細な説明および具体例は、この発明の好ましい実施態様を示すものではあるが、単に説明のために示すものである。
【図面の簡単な説明】
この発明の上記およびその他の目的、特徴、および利点は、添付図面と下記の詳細な説明からさらによく理解されるが、これらはすべて説明のみを目的とするものであり、この発明の範囲を限定するものではない；図中、
図１（ａ）−１（ｄ）は、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する種々の大きさのクローンしたＤＮＡ断片類の制限地図を示す。断片類の大きさは図１（ｅ）中の数字（ｋｂ）で示す。略号：Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｓ＝ＳａｌＩ；Ｐ＝ＰｓｔＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｋ＝ＫｐｎＩ；Ｃ＝ＣｌａＩ。
図１（ａ）：Ｘｈｏ３．４と称する３．４ｋｂのＤＮＡ断片；
図１（ｂ）：Ｈｉｎｄ９．９と称する９．９ｋｂのＤＮＡ断片；
図１（ｃ）：Ｈｉｎｄ１０．０と称する１０．０ｋｂのＤＮＡ断片；
図１（ｄ）：Ｅｃｏ１３．８と称する１３．８ｋｂのＤＮＡ断片；
図１（ｅ）：コスミドクローン２９５５（Ｃｏｓ２９５５）に收容された約４０ｋｂのＤＮＡ断片。
図２は、Ｘｈｏ３．４断片を挿入断片として含むｐＢＳプラスミドの構造を示す。制限部位間の距離（ｋｂ）は挿入断片中の数字により示す。
図３は、Ｈｉｎｄ１０．０断片を挿入断片として含むｐＢＳプラスミドの構造を示す。制限部位間の距離（ｋｂ）は挿入断片中の数字により示す。図１（ｃ）および２にＰｓｔＩ部位を示す。
図４は、Ｅｃｏ１３．８断片を挿入断片として含むｐＢＳプラスミドの構造を示す。制限部位間の距離（ｋｂ）は挿入断片中の数字により示す。図１（ｄ）および２にＰｓｔＩ部位を示す。
発明の詳細な説明
以下に示すこの発明の詳細な説明は、当業者によるこの発明の実施を補助するために提供されるものである。ここに検討した実施態様の修飾および変更をこの発明による知見の思想または範囲を逸脱することなく当業者がなしうるかもしれないが、そうであるとしても以下の詳細な記載はこの発明を不当に制限するものと解釈されてはならない。
ここに引用した各文献の内容は、全体としてこの引用により本書中に含ませるものとする。
概観
本核酸断片類は、ジェイ・サンブルック、イー・エフ・フリッシュ、およびティー・マニアティス著、モレキュラー・クローニング第２版、コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ刊（１９８９年）のような刊行物に記載された常用の遺伝子操作プロトコールにより得られる。具体的に述べると、ゲノムＤＮＡを、イー・エイチ・ハリス著、ザ・クラミドモナス・ソース・ブック、６１０−６１３頁（第１２章）、サンディエゴ、アカデミック・プレス刊（１９８９年）記載のようなプロトコールにしたがって、変異株ＲＳ−３から抽出する。すなわち、クラミドモナス・レインハルティの細胞を溶解し、プロテーゼおよびＳＤＳまたはサルコシルのような界面活性剤処理によりＤＮＡを抽出する。次いで、ゲノムＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出、遠心分離などを含む常用技術により抽出して蛋白質を除き、その後ＤＮＡをエタノール沈殿により回収する。こうして得られたＤＮＡは、よう化ナトリウム・エチジウムブロミド密度勾配遠心分離によりさらに精製することができ、核のゲノムＤＮＡに相当する下端の主バンドを回収する。こうして得られた核のゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩのような適当な制限酵素を用いて部分消化する。こうして得られたＤＮＡ断片類の両端にＴ４リガーゼを使用してリンカーまたはアダプターを付加する。必要ならば、過剰の遊離リンカーまたはアダプターをゲルろ過により除き、次いで断片類をλファージに由来するもののような適当な市販のコスミドベクターまたはファージベクター挿入することができる。インビトロパッケージングにより生じたファージ粒子をエシエリキア・コリに遺伝子移入し、固形培地上にコロニーまたはプラークを作らせる。ハイブリドコスミドを收容する個々のエシエリキア・コリクローンを分離し維持することにより、または混合物中のエシエリキア・コリもしくはファージ粒子を分離し維持する常用の方法により、ゲノムＤＮＡライブラリーを得ることができる。
この発明前には、いずれかの植物または藻類の種からポルフィリン性除草剤耐性遺伝子が単離確認されたことはなかったので、このような遺伝子の推定ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成し、このプローブを放射性同位元素または蛍光標識でラベルし、これを本件ＤＮＡ断片類を含むゲノムＤＮＡクローンの選択に使用することにより、上記ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのは実際的でなかった。それゆえ、本件ＤＮＡ断片類を含むゲノムクローンは、ポルフィリン性除草剤に感受性をもつクラミドモナス・レインハルティ株を、この生物に通常使用される形質転換技術を用いて、コスミドライブラリーのゲノムＤＮＡで形質転換（ケイ・キンドル、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、８７巻１２２８頁（１９９０年）；ジェイ・イー・ボイントンおよびエヌ・ダブリュウ・ギルハム・メソッズ・イン・エンザイモロジー：レコンビナント・ＤＮＡ、第Ｈ部、アール・ウー編、カリフォルニア州、サンディエゴ、アカデミック・プレス刊、２１７巻５１０頁（１９９３年））してポルフィリン性除草剤に対する耐性を付与しうる核ゲノムＤＮＡ断片を含むハイブリドコスミド類を単離することによりスクリーニングした。こうして得られたハイブリッドコスミドクローンの制限地図を作成し、種々の制限断片をｐブルースクリプトベクターにサブクローンし、通常の感受性をもつクラミドモナス株に対してポルフィリン性除草剤耐性を付与したサブクローンを選択した。出発材料として本件ＤＮＡ断片類および本件プラスミド類を使用して、３．４ｋｂ断片のヌクレオチド配列をサンガーの方法（エフ・サンガー及びエイ・アール・クールソン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、９４巻４４１頁（１９７５年）；エフ・サンガー、ニクレンおよびエイ・アール・クールソン、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、７４巻５４６３頁（１９７７年））またはこの方法の改良法により決定した。これにより大きな９．９，１０．０、および１３．８ｋｂの断片またはこれらに対応するｃDNA類の配列は、同一の方法により決定することができる。ポルフィリン性除草剤耐性遺伝子の転写開始部位は、エム・ビナ−ステム等（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、７６巻７３１頁（１９７７年））並びにソルナー−ウエブおよびアール・エイチ・リーダー（セル、１８巻４８５頁（１９７８年））が報告したプライマー延長法を用いて、またはエイ・ジェイ・バークおよびピー・エイ・シャープ（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、７５巻１２７４頁（１９７８年））が報告したS１マッピング法により、これらの重複断片類の１種またはそれ以上中に位置を決定することができる。代表例をあげると、遺伝子発現の制御をつかさどるプロモーター配列類は、転写開始部位の約１kbないし１０kb上流の領域に見られる。ポルフィリン性除草剤耐性を付与する遺伝子のプロモーター領域は、標準的クラミドモナス形質転換技術（ケイ・キン���ル、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、８７巻１２２８頁（１９９０年））およびキメラレポーター構築物を使用して決定することができる。例えば、転写開始部位の上流の種々の長さの領域を、ＧＵＳまたは酵素学的に決定した抗生物質耐性コード化体のような適当な異種レポーター遺伝子に結合することができる。これらの構築物を、形質転換を使用してクラミドモナス・レインハルティに導入し、レポーター遺伝子の発現を監視することにより、最終的にポルフィリン性除草剤耐性を付与する遺伝子のプロモーター領域を決定することができる。さらに、転写終結配列は、１種またはそれ以上の重複したクローン化ゲノムＤＮＡ断片類内の、停止コドンの下流にある３'非コード領域中に見られるポリＡ付加シグナルのさらに下流に存在すると予想される。
除草剤耐性形質転換体は、３．４ｋｂ断片より約８０倍高い頻度でＲＳ−３の１３．８および１０．０ｋｂ断片から得られた。このことは、１３．８および１０．０ｋｂ断片が全コード化配列プラス上流および下流の制御要素を含み、除草剤感受性受容体株の核のゲノム中に非相同的およびランダムに組み込んでいることと符合する。逆に、３．４ｋｂ断片で見られた低い形質転換頻度は、この断片がＲＳ−３遺伝子の一部分のみを含んでおり、受容体の除草剤感受性ＲＳ−３遺伝子内に相同的組み換えにより組込まれ、発現されることと符合する。核ｎｉｔ−１遺伝子を用いた実験でオー・エイ・ソデインドおよびケイ・エル・キンドル（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、９０巻９１９９頁（１９９３年））が示したように、クラミドモナス・レインハルティの核形質転換体は、相同的組み換えよりも極めて大きな頻度でランダムな非相同的組み換えにより生じる。
以上の記載を下に示す実施例中に詳細な記載するが、この発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
クラミドモナス・レインハルティゲノムＤＮＡライブラリーの作成
単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティのポルフィリン性除草剤耐性変異株ＲＳ-３（クラミドモナス・ジェネティックス・センター、ＧＢ−２６７４株）を、２００μＥ／ｍ2／秒の光合成活性照明下、０．０３μＭの化合物Ａを含む、７ｍＭＮＨ4Ｃｌ、０．４ｍＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３４ｍＭＣａＣｌ2／２Ｈ2Ｏ、２５ｍＭ燐酸カリウム、０．５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍｌ／ｌハトナー微量要素、および１ｍｌ／ｌ氷酢酸からなるＴＡＰ液体培地（イー・エイチ・ハリス、ザ・クラミドモナス・ソースブック、サンディエゴ、アカデミック・プレス、１９８９年、５７６−７７頁）中、混合栄養で５日間振盪培養した。初期定常増殖期の細胞を含む培養液６ｌ（７．６×１０6細胞／ｍｌ）を収穫した。細胞を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分間）で集め、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌからなるｐＨ８．０のＴＥＮ緩衝液５０ｍｌに再けんだくし、再遠心分離し、再びＴＥＮ緩衝液５０ｍｌに再けんだくした。これに２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５ｍｌ、２０％サルコシル５ｍｌ、およびプロテアーゼ（ベーリンガー・マンハイムＮｏ．１６５９２１）５ｇ、１Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、およびＣａＣｌ2０．１１ｇからなり脱イオン蒸留水で全容１００ｍｌにしたプロテアーゼ溶液４ｍｌを徐々に加えた。これを、溶液を４℃において２４時間びん中でゆっくり回動することにより混合した。次いでフェノール−ＣＩＡ（ＴＥＮ緩衝液であらかじんめ飽和し等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール、２４：１、ｖ／ｖと充分混合したフェノール）６０ｍｌを加え、同一のびん中で内容物を室温において１時間回動した。
次いで、内容物を遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間、室温）し、（上の）水層をとり、２倍容量の９５％（ｖ／ｖ）エタノールとゆっくりであるが完全に混合し、内容物を−２０℃で一夜静置してＤＮＡを沈殿させた。得られた沈殿を遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間、４℃）で集め、氷冷した７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄した。過剰のエタノールを除き、ＤＮＡの沈殿を窒素気流下室温で５分間乾燥した。
次いで、乾燥した沈殿を１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）６０ｍｌに溶解し、薄明下、以下のものを添加した：１０倍濃度ＴＥＮ緩衝液８ｍｌ、エチジウムブロミド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍｌ、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）９．８ｍｌ、およびよう化ナトリウム（ＮａＩ）飽和ＴＥＮ緩衝液１２０ｍｌ。容器を穏やかに倒立させることにより内容物を混合し、２５ｍｌを８個の遠心管にそれぞれ分配した。これらを、ベックマン７０Ｔｉローターで超遠心（４４，０００ｒｐｍ、４０時間、２０℃）した。超遠心後、核ＤＮＡからなる下端の主バンドを長波長ＵＶ照射で可視化し、大容量シリンジを使用して採取した。このバンドのＤＮＡを再びベックマン７０Ｔｉローターで超遠心（４４，０００ｒｐｍ、４４時間、２０℃）した。精製核ＤＮＡバンドは、上記と同様に採取した。
１−２容量のＴＥＮ緩衝液で飽和したイソアミルアルコールを加え、次いで（上の）アルコール層を捨てることにより、採取した核ＤＮＡの溶液からエチジウムブロミドを抽出した。この工程を３回繰り返した後、２．５倍容量の氷冷エタノールを加えることによりエチジウムブロミドを除去した核ＤＮＡを沈殿させた。採取した沈殿を氷冷９５％（ｖ／ｖ）エタノール中で２回洗浄し、少量の１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再溶解し、−２０℃で保存した。この試料の一部を１００倍に希釈し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度を測定することによりＤＮＡの濃度と純度を定量した。
こうして得たゲノムＤＮＡ２５μｇを、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、および１ｍＭジチオトレイトールを含有する１０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２７７μｌ中で制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ０．８３単位と３７℃において１５分間反応させることにより部分消化した。反応混合物を、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡した等容量のフェノール、次いで等容量のクロロホルムで抽出した。３Ｍ酢酸アンモニウムを加えて最終濃度０．４Ｍとし、次いで２倍容量の氷冷エタノールを加えた。溶液を充分混合し、試料を−２０℃で一夜保存後にDNAの沈殿が生成した。卓上遠心機で遠心（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して沈殿を採取し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で洗浄し、再遠心した。次いで、沈殿を（１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ／２Ｎａからなる）ＴＥ緩衝液２０μｌに再けんだくし、脱イオン蒸留水７０μｌ、０．５ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１ｍＭＥＤＴＡからなる１０倍濃厚ＣＩＡＰ緩衝液１０μｌ、およびＣＩＡＰ（子うし腸アルカリホスファターゼ）１単位を加えてＤＮＡを脱燐酸した。総容量１００μｌを３７℃で６０分間インキュベートし、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）３μｌを加え６８℃で１０分間熱処理して反応を停止させた。ＤＮＡを上記のようにフェノールおよびクロロホルム抽出し、酢酸アンモニウム含有エタノールを添加して沈殿させた。
沈殿を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、採取したＤＮＡをＴＥ緩衝液に再溶解して最終濃度０．５μｇ／ｍｌにした。次いで、市販コスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ−１（ストラタジーン社）を、製造元提供のＳｕｐｅｒＣｏｓ−１指示マニュアルに概説されたプロトコールにしたがって準備した。ベクターを制限酵素ＸｂａＩで消化し、ＣＩＡＰで脱燐酸し、制限酵素ＢａｍＨＩで再消化し、エタノール沈殿で回収し、ＴＥ緩衝液に再溶解して最終濃度１μｇ／ｍｌにした。調製したゲノムＤＮＡ断片２．５μｇを、調製したＳｕｐｅｒＣｏｓ−１ベクター１μｇに、反応緩衝液（１ｍＭＡＴＰ、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭＭｇＣｌ２、および１ｍＭジチオトレイトールからなる）２０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加えて４℃で一夜インキュベートすることにより連結した。次いで、こうして生成したハイブリッドコスミド０．５μｇを市販のインビトロファージパッケージングキット（ギガパックＩＩＸＬ、ストラタジーン社）を使用してエシエリキア・コリ感染能をもつλファージ粒子にパッケージした。次いで、このハイブリッドコスミドを收容したλファージを下記方法によりエシエリキア・コリＮＭ５５４株（ストラタジーン社）に形質導入し、これらのエシエリキア・コリ細胞に５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ平板培地（１０ｇ／ｌＮａＣｌ、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、ｐＨ７．５、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）上でコロニーを作らせた。形質導入のプロトコールは以下の通り：（１）エシエリキア・コリＮＭ５５４株の１コロニーを培地（５ｇ／ｌＮａＣｌ、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、ｐＨ７．４，０．２％（ｗ／ｖ）マルトース、１０ｍＭＭｇＳＯ４）５０ｍｌに接種し激しく振盪しながら３７℃で一夜培養した；（２）細胞を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）で集め、１０ｍＭＭｇＳＯ４に再けんだくしてＯＤ６００を０．５とし；（３）この細菌けんだく液２５μｌを上記で調製したハイブリッドコスミド收容ファージ粒子液の１／２０希釈液２５μｌと混合した。混合物を室温で３０分間静置してファージをエシエリキア・コリに感染させた。次いで、ＬＢ培地（１０ｇ／ｌＮａＣｌ、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス）２００μｌを加え、けんだく液を３７℃で１時間インキュベートしてアンピシリン耐性を発現させた。次いで、けんだく液を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ平板培地上にプレートし、３７℃で一夜インキュベート後コロニーを生成させた。アンピシリンマーカーの形質転換効率は１．７±０．１×１０5形質転換体／ＤＮＡμｇであった。こうして得たハイブリッドコスミド含有エシエリキア・コリのコロニーを滅菌した爪楊枝で個々に取り上げ、それぞれ５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地０．５ｍｌを含むマイクロタイター（ファルコン、２４穴）の穴へ移し、振とうせずに３７℃で２４時間インキュベートした。それにより個々のクローン１００８０を４２０マイクロタイタープレートに分離した。次いで、培地１８７．５μｌを各穴からとり、各８クローンを合わせて（合計１．５ｍｌ）１２６０のマイクロチューブに入れた。各マイクロチューブの細菌を遠心（��０，０００ｒｐｍ、５分間、室温）してペレットにし、ＤＮＡ抽出した。マイクロタイタープレートに残った細菌を、等容量の３０％（ｗ／ｖ）グリセリン添加後−７０℃で凍結した。次いで、これらのプレートを−２０℃で保存した。
実施例２
ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用する種々の実験法を以下に記載する（方法Ａ、Ｂ、およびＣ）。
Ａ．ＤＮＡ抽出
実施例１で生成したゲノムＤＮＡライブラリー含有エシエリキア・コリからのコスミドＤＮＡの抽出、および形質転換対照として使用したプラスミドｐＡＲＧ７．８（アール・デビューキー、エス・パートン、アール・ディー・ロカイクス、ＥＭＢＯジャーナル、８巻２８０３頁（１９８９年））の抽出は、標準的抽出法（例えば、ジェイ・サムブルック、イー・エフ・フリッシュ、ティー・マニアティス、モレキュラー・クローニング、２版コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ、（１９８９年）、Ｉ巻１．３８−１．３９頁）によって実施した。具体的プロトコールの記載は以下の通り。
各マイクロチューブ内の細菌ペレットを溶液Ｉ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡからなる）１００μｌに完全にけんだくし、これに溶液ＩＩ（０．２ＮＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる）２００μｌを加えた。各マイクロチューブに栓をし、チューブを５−６回倒立させることにより内容物を穏やかに混合し、チューブを氷上において冷却した。次いで、氷冷した溶液ＩＩＩ（５Ｍ酢酸カリウム６０ｍｌ（ｐＨ４．８）６０ｍｌ、氷酢酸１１．５ｍｌ、および脱イオン蒸留水２８．５ｍｌからなる）１５０μｌを加え、内容物を充分混合し、チューブを氷上で５分間冷却した。次いで、チューブを卓上遠心機で遠心（１０，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）し、上清を採取した。採取した上清に等容量のフェノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ、ｐＨ７．５）を加え、ボルテックスで内容物を完全に混合し、チューブを再び卓上遠心機で遠心（１０，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）し、上清を採取した。クロロホルムで再抽出後、上清にエタノール９００ｍｌを加えて混合した。チューブを氷上で冷却してＤＮＡを沈殿させ、卓上遠心機で遠心（１２，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）して沈殿を採取した。沈殿を７０％（ｗ／ｖ）エタノール中で洗浄し、再び卓上遠心機で遠心（１２，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）して沈殿を採取した。過剰のエタノールを、チューブの栓をとり室温で１０分間エタノールを蒸発させることにより除去した。こうして採取した沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａからなる）５０μｌに再溶解してＤＮＡを可溶化した。
Ｂ．ガラスビーズ法による形質転換
ガラスビーズ法による形質転換を使用する場合、ケイ・キンドルが報告した方法（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、８７巻１２２８頁（１９９０年））にしたがった。実際に使用したプロトコールを以下に示す。
最初に、単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティＣＣ−４２５株（アルギニン要求性ａｒｇ−２、細胞壁欠損ｃｗ−１５）を、７ｍＭＮＨ4Ｃｌ、０．４ｍＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３４ｍＭＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２５ｍＭ燐酸カリウム−０．５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）、１ｍｌ／ｌハトナー微量要素、および１ｍｌ／ｌ氷酢酸からなるＴＡＰ液体培地（イー・エイチ・ハリス、ザ・クラミドモナス・ソースブック、サンディエゴ、アカデミック・プレス、１９８９年、５７６−７７頁に記載）＋５０μｇ／ｍｌアルギニン中、細胞密度が１−２×１０6細胞／ｍｌになるまで混合栄養で２日間培養した。培養液を遠心（８，０００×ｇ、１０分間、２０℃）して細胞を集め、少量のＴＡＰに再けんだくして最終密度２．８×１０8細胞／ｍｌにした。
滅菌ガラスビーズ（０．４５−０．５２ｍｍ）０．３ｇを入れた滅菌した小型試験管に、この細胞けんだく液０．３ｍｌ、プラスミド０．５−１．０μｇまたはライブラリーＤＮＡ１−２μｇ、および２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）０．１ｍｌを加え、穏やかに攪拌し、次いでボルテックスミキサーを用いて高速で１５秒間渦動させた。試験管を２分間静置し、さらに１５秒間同様に渦動させた。
次いで、細胞けんだく液を、固体培地（組成：ａ）形質転換マーカーとしてアルギニン要求性を使用する場合：ＴＡＰ培地＋１．５％（ｗ／ｖ）寒天；またはｂ）形質転換マーカーとしてポルフィリン性除草剤耐性を使用する場合：ＴＡＰ培地＋０．１μＭ化合物Ａ＋５０μｇ／μｌアルギニン＋１．５％（ｗ／ｖ）寒天）２枚上に１平板あたり０．２ｍｌでプレートし、照明下にコロニーを形成させた。
Ｃ．パーティクルガン法による形質転換
パーティクルガンによる形質転換のプロトコールを使用する場合、ジェイ・イー・ボイントンおよびエヌ・ダブリュー・ギルハムの報告（メソッズ・イン・エンザイモロジー：レコンビナントＤＮＡ・第Ｈ部、アール・ウー編、カリフォルニア州、サンディエゴ、アカデミック・プレス刊、２１７巻５１０頁（１９９３年））にしたがった。実際に使用したプロトコールを以下に記載する。
最初に、単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティＣＣ−４８株（アルギニン要求性ａｒｇ−２）を、７ｍＭＮＨ4Ｃｌ、０．４ｍＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３４ｍＭＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２５ｍＭ燐酸カリウム−０．５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）、１ｍｌ／ｌハトナー微量要素、および１ｍｌ／ｌ氷酢酸からなるＴＡＰ液体培地（イー・エイチ・ハリス、ザ・クラミドモナス・ソースブック、サンディエゴ、アカデミック・プレス、１９８９年に記載）＋５０μｇ／ｍｌアルギニン中、細胞密度が１．５−３×１０6細胞／ｍｌになるまで混合栄養で２日間培養した。培養液を遠心（８，０００×ｇ、１０分間、２０℃）して細胞を集め、少量のＨＳ培地（５００ｍｇ／ｌＮＨ4Ｃｌ、２０ｍｇ／ｌＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ／ｌＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１，４４０ｍｇ／ｌＫ2ＨＰＯ4、１．２ｇ／ｌ無水酢酸ナトリウム、１ｍｌ／ｌハトナー微量要素からなる）（イー・エイチ・ハリス、ザ・クラミドモナス・ソースブック、サンディエゴ、アカデミック・プレス、１９８９年に記載）に再けんだくして最終密度１．１４×１０8細胞／ｍｌにした。この細胞けんだく液１ｍｌを、４２℃に予熱したすでにＨＳ培地１ｍｌ＋０．２％寒天（ディフク・バクト・アガー）を含んでいる小型試験管に加えた。穏やかに混合後、けんだく液０．７ｍｌを、５０μｇ／μｌアンピシリンを含むＨＳＨＡ寒天（５００ｍｇ／ｌＮＨ4Ｃｌ、２０ｍｇ／ｌＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ／ｌＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１，４４０ｍｇ／ｌＫ2ＨＰＯ4、７２０ｍｇ／ｌＫ2ＨＰＯ4、２．４ｇ／ｌ無水酢酸ナトリウム、１ｍｌ／ｌハトナー微量要素からなる）（イー・エイチ・ハリス、ザ・クラミドモナス・ソースブック、サンディエゴ、アカデミック・プレス、１９８９年に記載）２枚上にそれぞれプレートし、暗所で乾燥して細胞を平板の表面上に固定した。
次に、マイクロチューブに金粒子６０ｍｇ（直径１μｍ、デュポン・バイオテクノロジー・システムズ、デラウエア州、ウイルミントン７５５６）およびエタノール１ｍｌを加え、ボルテックスミキサーを用いて最高速度で２分間渦動させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して金粒子を回収し、この洗浄操作を３回繰り返した。次いで、回収した金粒子を滅菌蒸留水１ｍｌに再けんだくした。粒子を同じ遠心操作で再び回収し、この洗浄工程を更に２回繰り返した。最後に、金粒子を滅菌蒸留水１ｍｌに再けんだくした。この粒子けんだく液５０μｌをマイクロチューブに加え、ボルテックスミキサーで攪拌しながら、これにＤＮＡ（１μｇ／μｌ）５μｌ、２．５ＭＣａＣｌ2５０μｌ、および０．１Ｍスペルミジン２０μｌを加えた。攪拌を３分間続け、その後遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して沈殿を回収した。沈殿した金粒子をエタノール２５０μｌを再けんだくし、再び同一の遠心操作により回収し、最後にエタノール６０μｌに再けんだくした。上記のように調製したクラミドモナス細胞に、こうして得たＤＮＡ被覆金粒子をパーティクルガンを用いて打ち込んだ。その直後に、細胞を寒天板の表面からガラス棒で穏やかにこすることによりＨＳ液体培地１．５ｍｌ中に回収した。このけんだく液の半量を２種類の選択寒天平板培地（組成：ａ）形質転換マーカーとしてアルギニン要求性を使用する場合：培地＋１．５％（ｗ／ｖ）寒天；ｂ）形質転換マーカーとしてポルフィリン蓄積型除草剤耐性を使用する場合：ＴＡＰ培地＋０．３μＭ化合物Ａ＋５０μｇ／μｌアルギニン＋１．５％（ｗ／ｖ）寒天）上にそれぞれ散布し、照明下にコロニーを形成させた（７５−９０μモルｍ-2秒-1）。
上記の実験方法は、ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。スクリーニング方法の詳細は、第１次、第２次および第３次スクリーニング工程に分けて下に示す。
１．第１次スクリーニング
受容体である単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティＣＣ−４２５株（アルギニン要求性ａｒｇ−２、細胞壁欠損ｃｗ−１５）を、ガラスビーズ法（詳細は上記参照）を用いてｐＡＲＧ７．８（プラスミドＤＮＡ）およびライブラリーＤＮＡ（４８個のクローンから抽出したＤＮＡ類の混合物）で形質転換した。各形質転換実験のうち半分の細胞（３．０×１０7細胞）を、アルギニン独立栄養性表現型で示される形質転換度数の測定に使用した。残りの半分（３．０×１０7細胞）を、ポルフィリン性除草剤に対する獲得耐性について試験した。この実験は１９８回繰り返し、ライブラリーの総計９，５０４個の個別クローンをスクリーニングした。スクリーニングした５．８×１０9細胞から総計７，０４６個のアルギニン独立栄養体を得た。これらすべてのアルギニン独立栄養性コロニーが真の形質転換体であると仮定すると、形質転換度数は平均して１．２×１０-6である。さらに、スクリーニングした５．８×１０9細胞からポルフィリン性除草剤耐性を示す（すなわち化合物Ａの存在下で発育する）１個のクローンが得られた。このコロニーはまた、アルギニン欠乏培地でも正常に発育し、液体培地中で培養すると運動性の喪失を示した。
ポルフィリン性除草剤耐性を示すコロニーを生じさせたコスミドを含む４８個のクローンのＤＮＡプールは、Ｃｏｓ２９５３−Ｃｏｓ３０００と称する。
２．第２次スクリーニング
受容体である単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティＣＣ−４８株（アルギニン要求性ａｒｇ−２）を、パーティクルガン法（詳細は上記参照）を用いて表１に示すＤＮＡ類で形質転換した。結果も表１に示す。
２４個のクローンＣｏｓ２９５３−Ｃｏｓ２９７６を含むＤＮＡプールによる形質転換は、化合物Ａに耐性を示すコロニーを生じさせ、ポルフィリン蓄積型除草剤耐性遺伝子がこのプール中に含まれるべきことを示した。
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３．第３次スクリーニング
受容体である単細胞緑藻類クラミドモナス・レインハルティＣＣ−４８株（アルギニン要求性ａｒｇ−２）を、パーティクルガン法（詳細は上記参照）を用いてＣｏｓ２９５３−Ｃｏｓ２９７６ＤＮＡプールを形成する各クローンから上記のように調製したハイブリッドコスミドＤＮＡで形質転換した。これらの結果を表２に示す。クローンＣｏｓ２９５５に含まれるハイブリッドコスミドによる形質転換のみが、化合物Ａに耐性を示すコロニーを生じさせた。
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この結果を確認するため、Ｃｏｓ２９５５からの精製ハイブリッドコスミドＤＮＡを、ミニカラムプラスミド精製法（キアゲン社）または塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて調製し、上記と同一のプロトコールを使用して形質転換実験を繰り返した。これらの結果を表３に示す。Ｃｏｓ２９５５ＤＮＡによる形質転換は、化合物Ａに耐性を示す数々のコロニーを再現的に生じさせ、ポルフィリン性除草剤耐性遺伝子がこのハイブリッドコスミドＤＮＡ中に含まれるべきことを示した。
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実施例３
制限地図の作成およびサブクローニング
クローンＣｏｓ２９５５から得たハイブリッドコスミドをＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法で精製した。精製したハイブリッドコスミドＤＮＡ（以下Ｃｏｓ２９５５ＤＮＡと称する）または下記のように分離したそのサブクローンを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩを単独または組み合わせて消化し、こうして生成した断片の大きさを０．８％アガロースゲル電気泳動（２５Ｖ、１５時間）で推定した。単独または２重消化における各断片の大きさを分析して制限地図を作成した。この結果を図１（ｅ）に示す。ＰｓｔＩ部位を、図１（ａ）に示す３．４ｋｂＤＮＡ断片中で決定した。Ｃｏｓ２９５５ＤＮＡは、下記の制限酵素に対する部位を含んでいる（順序通り、部位間の距離（ｋｂ）は括弧内に示す）：ＣｌａＩ（４．４）ＢａｍＨＩ（３．１）ＢａｍＨＩ（６．６）ＢａｍＨＩ（８．２）ＣｌａＩ（３．１）ＥｃｏＲＩ（１．４）ＸｈｏＩ（０．６）ＰｓｔＩ（０．５）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．４）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．５）ＢａｍＨＩ（０．１）ＳａｌＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．９）ＸｈｏＩ（５．１）ＨｉｎｄＩＩＩ（２．８）ＢａｍＨＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．８）およびＨｉｎｄＩＩＩ。ポルフィリン蓄積型除草剤耐性を付与するＣｏｓ２９５５中の核ＤＮＡ断片の分子全体の大きさ（核酸の長さ）は、約４０．４ｋｂである。
Ｃｏｓ２９５５および市販のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩＩＫＳ＋（ｐＢＳ、ストラタジーン社）を個々の制限酵素または２種の制限酵素の適当な組み合わせで切断し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片類をエタノール沈殿で採取した。ｐＢＳベクターを必要ならばＣＩＡＰ処理で脱燐酸し、Ｔ４リガーゼを用いてｐＢＳベクターと消化したコスミド２９５５ＤＮＡ断片類を連結した。このようにして得たハイブリッドプラスミドを、電気穿孔法（１２．５ＫＶ／ｃｍ、４．５ｍｓ）によりエシエリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に導入し、２％（ｗ／ｖ）Ｘ−ｇａｌを塗布したＬＢ寒天平板（１０ｇ／ｌＮａＣｌ、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、１．５％（ｗ／ｖ）寒天からなり、１ｍＭＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）上に散布した。これから白色のコロニーを分離した；すなわち、ｐＢＳベクターを取り入れ、したがってアンピシリン耐性であり、ｐＢＳベクターのクローニング部位に挿入されたＣｏｓ２９５５ｄ挿入断片に由来するＤＮＡ断片を有し、それゆえ色が白いクローンである。分離したコロニーをアンピシリンの存在下で培養し、次いでプラスミドＤＮＡをこれらのコロニーからアルカリ溶解法（ジェイ・サムブルック、イー・エフ・フリッシュ、ティー・マニアティス、モレキュラー・クローニング、２版コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ、（１９８９年）、Ｉ巻１．３８−１．３９頁）で単離した。単離したプラスミドをクローニングに使用した制限酵素（類）で再消化して挿入断片を切り離し、得られた挿入断片の大きさを再び０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（７５Ｖ、５時間）電気泳動で推定した。目的とする大きさの挿入断片が得られたら、正しいＤＮＡ断片がクローンされていることを確認するためにそれを更に制限酵素分析にかけた。このようにしてクローンされたＤＮＡ断片類を図１（ａ）−１（ｄ）に示す。ポルフィリン性除草剤耐性突然変異ｒｓ−３を含むクローンを同定するため、受容体であるクラミドモナス・レインハルティＣＣ−４８株（アルギニン要求性ａｒｇ−２）をパーティクルガン法（詳細については上記参照）によりＣｏｓ２９５５のｐＢＳサブクローンから得たＤＮＡで形質転換した。化合物Ａに耐性を付与できたＣｏｓ２９５５のｐＢＳサブクローンは、Ｅｃｏ１３．８、Ｈｉｎｄ１０．０、およびＸｈｏ３．４断片を含んでいた。これらの結果から、これらのＤＮＡ断片がポルフィリン性除草剤耐性突然変異ｒｓ−３を含むことが確認された。
除草剤耐性形質転換体は、３．４ｋｂ断片より約８０倍高い頻度でＲＳ−３の１３．８および１０．０ｋｂ断片から得られた（表４）。このことは、１３．８および１０．０ｋｂ断片が全コード化配列プラス上流および下流の制御要素を含み、除草剤感受性受容体株の核のゲノム中に非相同的およびランダムに組み込んでいることと符合する。逆に、３．４ｋｂ断片で見られた低い形質転換頻度は、この断片がＲＳ−３遺伝子の一部分のみを含んでおり、受容体の除草剤感受性ＲＳ−３遺伝子内に相同的組み換えにより組込まれ、発現されることと符合する。核ｎｉｔ−１遺伝子を用いた実験でオー・エイ・ソデインドおよびケイ・エル・キンドル（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ、９０巻９１９９頁（１９９３年））が示したように、クラミドモナス・レインハルティの核形質転換体は、相同的組み換えよりも極めて大きな頻度でランダムな非相同的組み換えにより生じる。
0003928074.tif 000005
Ｅｃｏ１３．８は、ポルフィリン性除草剤に耐性を付与することができる、約１３．８ｋｂのＤＮＡ断片であり、下記の制限酵素に対する部位を含んでいる（順序通り、部位間の距離（ｋｂ）は括弧内に示す；この表示法は続けて使用する）：ＥｃｏＲＩ（１．４）ＸｈｏＩ（０．６）ＰｓｔＩ（０．５）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．４）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．５）ＢａｍＨＩ（０．１）ＳａｌＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．９）ＸｈｏＩ（５．１）ＨｉｎｄＩＩＩ（２．８）ＢａｍＨＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．８）およびＨｉｎｄＩＩＩ（０．１＞）ＫｐｎＩ。この断片に対する制限部位の地図を図１（ｄ）に示す。Ｈｉｎｄ１０．０は、ポルフィリン性除草剤に耐性を付与することができる、約１０．０ｋｂのＤＮＡ断片であり、下記の制限酵素に対する部位を含んでいる：ＥｃｏＲＩ（１．４）ＸｈｏＩ（０．６）ＰｓｔＩ（０．５）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．４）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．５）ＢａｍＨＩ（０．１）ＳａｌＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．９）ＸｈｏＩ（５．１）ＨｉｎｄＩＩＩ（０．１＞）ＫｐｎＩ。この断片に対する制限部位の地図を図１（ｃ）に示す。さらに、Ｈｉｎｄ１０．０断片は、制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ（２．８）ＢａｍＨＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．８）ＨｉｎｄＩＩＩを含む約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を削除した上記Ｅｃｏ１３．８断片の誘導体である。Ｈｉｎｄ９．９（図１（ｂ））は、約０．１ｋｂの断片を削除することによりＨｉｎｄ１０．０から誘導される（図１（ｂ）および図１（ｃ）参照）。Ｘｈｏ３．４は、ポルフィリン性除草剤に耐性を付与することができる、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片であり、制限酵素：ＸｈｏＩ（０．６）ＰｓｔＩ（０．５）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．４）ＰｓｔＩ（０．１）ＰｓｔＩ（０．５）ＢａｍＨＩ（０．１）ＳａｌＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．９）ＸｈｏＩに対する部位を含んでいる。この断片に対する制限部位の地図を図１（ａ）に示す。Ｘｈｏ３．４は、制限酵素部位ＸｈｏＩ（５．１）ＨｉｎｄＩＩＩ（２．８）ＢａｍＨＩ（０．２）ＳａｌＩ（０．８）ＨｉｎｄＩＩＩ（０．１＞）ＫｐｎＩを含む約９．１ｋｂのＤＮＡ断片および制限酵素部位ＥｃｏＲＩ（１．４）ＸｈｏＩを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を削除した上記Ｅｃｏ１３．８断片の誘導体である。
上記断片すなわちＥｃｏ１３．８、Ｈｉｎｄ１０．０、およびＸｈｏ３．４（図２−４参照）が挿入されたｐＢＳプラスミドを含むエシエリキア・コリ株類は、２７７０８−１０００、ノースカロライナ州、ダラム、デューク・ユニバーシティ、ボックス９１０００、リサーチ・ドライブ、ＬＳＲＣビルディング、ＤＣＭＢグループ、エリザベス・エイチ・ハリス博士方、クラミドモナス・ジェネティックス・センターに寄託されている。これらの寄託物は、それぞれ、Ｐ−５６３、Ｐ−５６４、およびＰ−５６６と名づけられている。Ｃｏｓ２９５５を含むエシエリキア・コリも、クラミドモナス・ジェネティックス・センターに、Ｐ−５６１の名で寄託されている。さらに、エシエリキア・コリＸＬ１−ＢＬＵＥ／Ｅｃｏ１３．８は、１９９５年７月１９日に、アメリカ合衆国、２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ブダペスト条約の規定下に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９８７０が付与された。
実施例４
Ｘｈｏ３．４ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の決定
実施例３記載のようにして得たＸｈｏ３．４ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を、α−35Ｓ−ｄＡＴＰラベルを使用して、サンガー酵素的配列決定法（シクエナーゼ・バージョン２．０キット、ＵＳＢ社）により決定した。このプロトコールを以下に記載する。
実施例４記載のようにして得たＸｈｏ３．４ｄ断片、この断片を含むプラスミド、またはＸｈｏ３．４断片の１．７ｋｂＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を含むプラスミド約５μｇを、０．２ＭＮａＯＨ、０．２ＭＥＤＴＡ中、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡをエタノール沈殿で採取し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄した。この沈殿に、脱イオン蒸留水７μｇ、シクエナーゼアニーリング用緩衝液（５倍濃度）２μｌ、プライマー１μｌを加えて、最終組成を４０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭＭｇＣｌ2、５０ｍＭＮａＣｌおよび５μｇ／ｌプライマーとした。この溶液を６５℃で２分間加熱し、３０分間を要して３０℃以下の室温に放冷した。次いで、溶液を氷上に置いた。この混合物に、０．１ＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）１μｌ、標識混合物（１．５μＭｄＧＴＰ、１．５μＭｄＣＴＰ、１．５μＭｄＴＴＰ含有）２μｌ、［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ（１０μＣｉ／ｍｌ、１０００Ｃｉ／ｍモル）０．５ｍｌ、およびシクエナーゼ・バージョン２．０Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ３単位を加えた。溶液をよく混合し、室温で約５分間反応させた。同時に、４本のマイクロチューブ個々にＧ、Ａ、Ｔ、およびＣをラベルし、これらに各ｄｄＮＴＰ反応溶液（８０μＭｄＧＴＰ、８０μＭｄＡＴＰ、８０μＭｄＴＴＰ、８０μＭｄＣＴＰ、５０μＭＮａＣｌ、および、ジデオキシｄＧＴＰ、ジデオキシｄＡＴＰ、ジデオキシｄＴＴＰ、またはジデオキシｄＣＴＰのいずれか８μＭからなる）２．５μｌを加えた。これらのチューブを３７℃で１時間予備インキュベートした。次いで、標識反応完了混合物３．５μｌをこれら４チューブのそれぞれに加え、すばやく混合し、３７℃で約５分間反応させた。反応停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、および０．０５％キシレンシアノールＦＦ含有）４μｌを加えて反応を停止させ、直ちに混合した。この試料を、８Ｍ尿素−６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（約６５ワット、約４時間）で分析し、ゲルを乾燥して、コダックＸＡＲ−５フィルムを感光させ、得られたオートラジオグラムから配列を決定した。得られたヌクレオチド配列を配列番号１に示す。
実施例５
ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する生物学的に機能する均等ＤＮＡ断片類
本書中に開示する核酸配列、またはその生物学的に機能する均等物のそれぞれは、この発明にしたがって使用することができる。本書中で使用する「生物学的に機能する均等物」の語句は、本書中に記載する特定の核酸配列と同一または類似の生物学的活性を示す、すなわち機能的に作動できてそれらが発現されるように植物または藻類細胞に導入したときそれらがポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する、核酸配列を指す。
例えば、本書に記載した核酸配列は、塩基の置換、追加、または欠失により改変して、インビトロおよびインビボでポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与する蛋白質を暗号化する、生物学上機能的に均等な核酸類を生成することができる。更に、遺伝学的暗号の縮重のため、本書に記載のものと実質的に同一のアミノ酸配列を暗号化しインビトロおよびインビボでポルフィリン性除草剤耐性を付与する別のＤＮＡ配列類を、この発明の実施に使用することができる。これらは、限定されるものではないが、本書に記載のゲノムＤＮＡ類、または蛋白質配列内に生理学上機能的に均等なアミノ酸残基を暗号化する別の暗号で置換することにより改変され、したがってサイレントな変化を生じる対応ｍＲＮＡ類もしくはｃＤＮＡ類の、全部または一部を含むヌクレオチド配列を含む。同様に、この発明により暗号化された、ポルフィリン性除草剤耐性を付与する蛋白質またはその誘導体は、限定されるものではないが、配列中の残基を機能的に均等なアミノ酸残基で置換してサイレントな変化を生じた改変配列を含めて、実質的に本書中に記載したＤＮＡ配列により暗号化されるアミノ酸配列の全部を含有するものを含む。例えば、配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を機能的均等物として作用しサイレントな改変を生じる、同様な極性をもつ他のアミノ酸で置換することができる。配列中のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するグループに属する他のものから選択することができる。例えば、代替え可能な非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。代替え可能な極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。代替え可能な陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
ゲノムＤＮＡ類の変異体、対応するｍＲＮＡ類またはｃＤＮＡ類、および本書中で意図されている蛋白質は、天然に産するゲノムＤＮＡ類、対応するｍＲＮＡ類またはｃＤＮＡ類、および本書中で検討した蛋白質に対して、７５％を超える相同性、好ましくは８５％を超える相同性、最も好ましくは９５％を超える相同性を有するべきである。この相同性を決定するには、２種の蛋白質（または核酸）を、対応する残基が最大数になるようにギャップと挿入を用いてならべる。（２種の蛋白質の）相同性は、対応するアミノ酸の数をアミノ酸総数プラスギャップおよび挿入で割り１００倍して得られる。
本書中に開示した核酸断片類の生物学的に機能する均等物は、例えば、ジェイ・オスナ、エイチ・フローレス、およびエックス・ソベロン（クリティカル・レビュー・イン・マイクロバイオロジー、２０巻１０７−１１６頁（１９９４年））が報告したような突然変異技術により作成することができ、実施例２に記載したクラミドモナスの形質転換およびスクリーニングにしたがって選択することができる。
実施例６
クラミドモナス・レインハルティ以外の生物からのポルフィリン蓄積型
除草剤に対する耐性を付与するＤＮＡ類の単離
クラミドモナス・レインハルティから得たＲＳ−３遺伝子に対応するｃＤＮＡの推定アミノ酸配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、真性細菌類、らん藻類、藻類、および高等植物から均等な遺伝子またはｃＤＮＡを単離するために使用することができる。逆転写酵素（イー・エス・カワサキ、ＰＣＲプロトコールズ、３章２１頁、イニス等編、サン・ディエゴ、アカデミック・プレス（１９９０年））を使用するＰＣＲ技術およびこれらの宿重オリゴヌクレオチド類を、藻類および高等植物から得た均等ｃＤＮＡ類の増幅に使用することができ、これらはエム・ベバンが報告したｐＢＩＮ（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１２巻８７１１頁（１９８４年））もしくはゼット・スバブ等が報告したｐＺ５９７（プラント・モレキュラー・バイオロジー、１４巻１９７頁（１９９４年））のような双子葉植物用のまたはディー・ベッカーらが報告したｐＤＢＩ（プラント・ジャーナル、５巻２９９頁（１９９４年））もしくはブイ・バジルらが報告したｐＢＡＲＧＵＳ（バイオ／テクノロジー、１０巻６６７頁（１９９２年））を使用する単子葉植物用の適当な形質転換／発現ベクター中に容易にクローン化することができる。これらのベクター中のｃＤＮＡ類を発現する形質転換植物は、下記のような確立された技術を使用して分離することができる。別法として、縮重ヌクレオチドをλＺａｐＩＩ（ストラタジーン）のようなλファージベクター中の作物用植物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。対応するｃＤＮＡは、下記のような単子葉または双子葉作物用植物に導入するための適当な形質転換／発現ベクターに移入することができる。真性細菌またはらん藻類の場合、縮重オリゴヌクレオチドをゲノムライブラリーのスクリーニングに直接使用することができ、適当なコード化配列を下記のような作物用植物のためのこれら形質転換／発現ベクターの１つに移入することができる。
実施例７
ポルフィリン蓄積型除草剤耐性のための作物用植物および藻類の形質転換
本書中に記載した研究により、植物または藻類にポルフィリン性除草剤耐性を付与することができるＤＮＡ断片類を同定した。作物用植物は、これらのＤＮＡ断片類またはその生物学的に機能する均等物を導入することにより、ポルフィリン性除草剤に耐性にすることができる。この発明は、作物栽培中のポルフィリン性除草剤の使用を可能にし、したがってこのような作物に関する雑草の制御と栽培管理を容易にする。
クラミドモナスｒｓ−３耐性変異は優性（アール・サトウら、ＡＣＳシンポジウム・シリーズ、５５９巻、ポルフィリン性農薬、エス・オー・デュークおよびシー・エイ・レベイズ編、７章９１頁（１９９４年））であるため、適当な上流および下流調節配列の制御下にあり本件ＤＮＡ断片類に対応する全長ｃＤＮＡを、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を欠く作物用植物に導入して、作物用植物にポルフィリン性除草剤耐性を生じるためにＲＳ−３耐性遺伝子を利用できるようにすることができる。
双子葉作物用植物の場合、キメラＲＳ−３耐性構築物を、エム・ベバンが報告したｐＢＩＮ（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１２巻８７１１頁（１９８４年））またはゼット・スバブ等が報告したｐＺ５９７（プラント・モレキュラー・バイオロジー、１４巻１９７頁（１９９０年））のようなバイナリー・アグロバクテリウム・ベクターに挿入し、エイ・ヘケマら（ネイチャー、３０３巻１９７頁（１９８３年））らによるトリペアレンタル・メーティングによりアグロバクテリウムに移入し、カルベニシリンおよびカナマイシン含有培地上で同時培養することにより農学的に望ましい栽培品種の葉のディスクへ形質転換することができる。カナマイシン耐性カルスから苗条を再生させ、標準的植物組織培養プロトコール（エム・ベバン、ヌクレイック・アシッズ、リサーチ、１２巻８７１１頁（１９８４年））を使用して発根を誘導することができる。カナマイシン耐性植物は、ポルフィリン性除草剤耐性レベルについて検定し、耐性に関して予期される３：１優性分離を感受性栽培品種との交配で確認することができる。特定の作物種に対する育種システムに応じて、除草剤耐性形質転換体を自家受粉または感受性栽培品種との戻し交配で繁殖させて純系育成除草剤耐性系統を樹立することができる。この方法を適用できる双子葉植物の作物の例には、アルファルファ、いんげんまめ類、キャベツ、にんじん、クローバー、綿、種々のうり類、亜麻、えんどうまめ類および農業経営学上重要な豆科植物、ピーナッツ、胡椒、いも類、大豆類、ビート類、ひまわり、たばこおよびトマトが含まれる。
単子葉作物用植物の場合、Ａｄｈ１プロモーターおよびイントロンまたはＡｃｔ１プロモーター並びにｎｏｓターミネーターと融合した、ディー・ベッカーらが報告したｐＤＢＩ（プラント・ジャーナル、５巻２９９頁（１９９４年））またはブイ・バジルらが報告したｐＢＡＲＧＵＳ（バイオ／テクノロジー、１０巻６６７頁（１９９２年））のような単子葉植物用発現ベクター中に、全長ＲＳ−３ｃＤＮＡを構築物中のＧＵＳ遺伝子を置換して挿入することができる。種に応じて、キメラプラスミドを、胚形成カルス、未成熟胚、胚盤組織、未成熟花序、小胞子、またはプロトプラストに、パーティクルガン形質転換により導入し、両プラスミドにより暗号化されたｂａｒ遺伝子が耐性を付与するカルス、苗条、および植物を、グルフォシネートの存在下、選択条件下で再生させることができる。次いで、グルフォシネート耐性遺伝子導入植物は、ポルフィリン性除草剤耐性のレベルに関して検定し、耐性に関して予期される３：１優性分離を感受性栽培品種との交配で確認することができる。特定の作物種に対する育種システムに応じて、除草剤耐性形質転換体を自家受粉または感受性栽培品種との戻し交配で繁殖させて純系育成除草剤耐性系統を樹立することができる。この方法を適用できる単子葉植物の作物の例には、大麦、トウモロコシ、飼料作物、燕麦、玉ねぎ、稲、らい麦、もろこし類、砂糖きび、および小麦が含まれる。
このようなポルフィリン性除草剤耐性を獲得した作物用植物を栽培すると、これらの作物用植物に対するこのような除草剤の使用が便利になる。これは、簡単で有効性が高い雑草の管理を可能にし、農業用途におけるこれら除草剤の価値を高める。更に、本件ＤＮＡ断片類をプローブとして使用することにより、本件ＤＮＡ断片類に高度の相同性を示す他のＤＮＡ断片類を作物植物中に同定することが可能になるであろう。これは、その作物用植物がポルフィリン性除草剤に対する耐性をもつか否かを、除草剤で実際に処理する前に定性的および／または定量的に評価することが可能になるであろう。その上、この遺伝子は、植物の遺伝子操作研究および植物の分子生物学／バイオテクノロジーにおける耐性型遺伝子マーカーとして使用することができ、したがって大きな工業的用途を有するであろう。
以上、この発明を説明したが、これを多くの方法で変更できることは明らかであろう。このような変更は、この発明の精神と範囲からの逸脱と解すべきでなく、すべての当業者に自明な修飾は、下記請求項の範囲内に含むと解されるものである。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：サトウ・リョウ
ボイントン・ジョン・イー
ギルハム・ニコラス・ダブリュー
ハリス・エリザベス・エイチ
（ｉｉ）発明の名称：ポルフィリン蓄積型除草剤耐性遺伝子
（ｉｉｉ）配列の数：１
（ｉｖ）通信の宛名：
（Ａ）宛名：バーチ、スチュワート、コラッシュ・アンド・バーチ、エルエルピー
（Ｂ）街番地：ピー・オー・ボックス７４７
（Ｃ）市名：フォールス・チャーチ
（Ｄ）州名：バージニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：２２０４０−３４８７
（ｖ）コンピューター読み込み方式：
（Ａ）メディアの型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパーティブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフト：パテント・イン・リリース＃１．０、バージョン＃１．３０
（ｖｉ）本願データ：
（Ａ）出願番号：特許、新規
（Ｂ）出願日：１９９６年７月１９日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）原出願データ：
（Ａ）出願番号：特許ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９０９８
（Ｂ）出願日：１９９５年７月２０日
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名：マーフィー・ジュニア・ジェラルド・エム
（Ｂ）登録番号：２８，９７７
（Ｃ）件名／ファイル番号：２１８５−１５４Ｆ（ＰＣ）
（ｉｘ）遠隔通信情報：
（Ａ）電話：７０３−２０５−８０００
（Ｂ）ファックス：７０３−２０５−８０５０
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：無関係
（Ｄ）トポロジー：無関係
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：クラミドモナス・レインハルティ
（Ｂ）株名：ＲＳ−３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１
0003928074.tif 000006
0003928074.tif 000007
0003928074.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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