(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性繊維芽細胞増殖因子、並びに、下記（１）、（２）、（３）及びこれらの糖類の薬学上許容できる塩からなる群から選ばれる、１種以上の糖類及び／又はその塩を有効成分として含んでなることを特徴とする、アポトーシス惹起抑制剤。
（１）ヘパラン硫酸
（２）ヘパリン
（３）ヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩ処理して得られるオリゴ糖であって、構成２糖単位として、GlcA-GlcNAc を２５〜２８％、GlcA-GlcNAc(6S) を１〜８％、GlcA-GlcNSを１２〜１５％、GlcA-GlcNS(6S)を３〜５％、IdoA(2S)-GlcNSを３５〜４０％及びIdoA(2S)-GlcNS(6S)を１１〜１４％を含有するオリゴ糖（ただし、GlcAはＤ−グルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、GlcNS(6S) はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６−硫酸を、IdoA(2S)はＬ−イズロン酸２硫酸をそれぞれ表す。）
【請求項２】
糸球体腎炎治療剤であることを特徴とする、請求項１記載のアポトーシス惹起抑制剤。
【請求項３】
上記アポトーシス惹起抑制剤において、（１）、（２）、（３）及びこれらの糖類の薬学上許容できる塩からなる群から選ばれる１種以上の糖類及び／又はその塩が、塩基性繊維芽細胞増殖因子１重量に対して、ウロン酸量で１×１０3 重量以上配合されてなることを特徴とする、請求項１又は２記載のアポトーシス惹起抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死の一種であるアポトーシスの惹起を伴う疾患、特に糸球体腎炎の治療剤に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死には、大きく分けて壊死（necrosis）とプログラムされた細胞死（programmed cell death）の２種類がある。
アポトーシスは、後者のプログラムされた細胞死の一種であり、通常の壊死は細胞の膨張やミトコンドリアの変化を伴うが、アポトーシスは細胞核の変化が顕著である。そして、特にアポトーシスを起こした細胞では、ヌクレオソーム単位でＤＮＡが断片化し、このＤＮＡに電気泳動を行うと、約１８０〜２００bpを単位としたＤＮＡの断片（いわゆるラダー）が観察されることが知られている。
【０００３】
壊死が種々の原因から起こる受動的な細胞死であるのに対し、アポトーシスは、一般的に発生過程や組織細胞の交替期に見られる、細胞の負の選択に関わる能動的な現象である。
そして、近年、このアポトーシスが正常な生命活動のみならず、種々の疾患に関連していることが次第に明らかになってきている。
【０００４】
例えば、糸球体腎炎にアポトーシスが関連していることが既に判明しており（Szabolcs M.J.et al.,JASN 5(3)844,1994 ）、アポトーシスの誘導がＨＩＶ感染患者において亢進しているという報告もある（Montagnier,L. et al.,Sixieme Colloque des Cent Gardes,9-17(1991)) 。また、薬剤耐性ウイルス性肝炎の肝障害においては、薬剤又はウイルスの感染によるアポトーシス亢進が、それらの肝障害に関与していると考えられており（Bursh,W. et al.,TiPS,13,245-251(1992))、循環器疾患や消化器疾患にもアポトーシスが関連しているものが存在することが報告されている。
【０００５】
また、その他にも形態異常、組織形成不全、組織の萎縮、腎芽細胞腫（腎臓のウイルムス腫瘍）、中毒や虚血による尿細管障害、脳虚血に伴う神経細胞の障害、筋萎縮性側索硬化症，アルツハイマー病，ハンチントン舞踏病やパーキンソン病等の神経細胞の変性性疾患、神経細胞発達性疾患（精神病）、免疫抑制剤や抗ガン剤の投与による胸腺細胞の障害、末梢Ｔ細胞の減少、免疫不全症、扁平苔癬、扁平疣贅、臓器移植や組織移植に伴う拒絶反応、細菌毒素，植物毒素や動物毒素による障害、萎縮性脱毛症等がアポトーシスが過剰に起きることによる疾患や障害として示唆されている。
このように、様々な疾患とアポトーシスとの関係が、現在種々の立場から検討されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記アポトーシスの惹起を有効に抑制する手段を見出すことができれば、アポトーシスの惹起を伴う疾患を治療し、又は予防することが可能になると考えられる。そこで、本発明が解決しようとする課題は、上記アポトーシスの惹起を抑制することで、アポトーシスの惹起を伴う疾患の治療手段を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題について鋭意検討を行った。その結果、細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖との複合体が、生体内におけるアポトーシスの惹起を抑制することを知見し、かかる複合体成分を配合したアポトーシスの惹起を伴う疾患の治療剤を提供するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子、並びに、下記（１）、（２）、（３）及びこれらの糖類の薬学上許容できる塩からなる群から選ばれる、１種以上の糖類及び／又はその塩を有効成分として含んでなることを特徴とするアポトーシス惹起抑制剤、を提供する発明である。
（１）ヘパラン硫酸
（２）ヘパリン
（３）ヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩ処理して得られるオリゴ糖であって、構成２糖単位として、GlcA-GlcNAc を２５〜２８％、GlcA-GlcNAc(6S) を１〜８％、GlcA-GlcNSを１２〜１５％、GlcA-GlcNS(6S)を３〜５％、IdoA(2S)-GlcNSを３５〜４０％及びIdoA(2S)-GlcNS(6S)を１１〜１４％を含有するオリゴ糖（ただし、GlcAはＤ−グルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、GlcNS(6S) はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６−硫酸を、IdoA(2S)はＬ−イズロン酸２硫酸をそれぞれ表す。）
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１６】
本発明において用い得る細胞増殖因子は、いずれかの糖鎖と結合してこの細胞増殖因子とこの糖鎖との複合体を形成することが可能である限りにおいて特に限定されない。そして、これらの細胞増殖因子の中でもヘパリン及び／又はヘパラン硫酸結合性細胞増殖因子が本発明への適用に関して好ましい。なお、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸結合性細胞増殖因子とは、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸に結合する性質を有する細胞増殖因子を意味し、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸に結合する性質を有する限りにおいて特に限定されるものではない。
【００１７】
具体的には、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ若しくはＦＧＦ−２）を、上記細胞増殖因子として挙げることができる。
【００１８】
そして、さらにこれらの中でも、bＦＧＦが下記に挙げるヘパリン及び／又はヘパラン硫酸等の特定のオリゴ糖構造を有する多糖との結合性に富み、上記細胞増殖因子として選択するのが特に好ましい。
また、上記のような天然型の細胞増殖因子の他に、安定化、薬理活性の強化、副作用の低減、吸収促進、細胞への親和性を向上させる等の目的で、化学的又は蛋白質工学的に修飾された細胞増殖因子を用いることも可能である。
【００１９】
なお、ここに挙げた細胞増殖因子はあくまで例示であり、特にこれらに本発明に適用可能な細胞増殖因子が限定されるものではない。
また、これらの細胞増殖因子は、各々の細胞増殖因子に固有の通常公知の調製法により調製して用いることも可能であり、市販されているものについては、その市販品を用いることも可能である。
【００２０】
なお、これらの細胞増殖因子は、全てが本来生体内に存在する物質であり、これらの増殖因子の本発明アポトーシス惹起抑制剤における投与量での安全性が推定される。
【００２１】
上記細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖は、選択した細胞増殖因子の種類に応じて選択することが可能である。言い換えれば、選択可能な糖鎖又は選択することが好ましい糖鎖は、細胞増殖因子によって個別的である。例えば、細胞増殖因子として、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ）を用いる場合には、Ｎ−スルホ−Ｄ−グルコサミン（以下、GlcNS と略記することもある。）残基とＬ−イズロン酸２硫酸（以下、IdoA(2S)と略記することもある。) 残基を多く含むオリゴ糖構造を有する糖鎖を選択するのが好ましい。
【００２２】
このような糖鎖として、特開平５−１４８３０５号公報に記載されているオリゴ糖を用いてもよい。この公報には、主な２糖単位がＬ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンであり、かつ８−１８糖で構成される繊維芽細胞増殖因子に結合するオリゴ糖及びその製造方法が記載されている。
【００２３】
なお、上記公報において主たる２糖単位とは、この２糖単位がオリゴ糖鎖の大半を占めるという意味ではなく、必須かつ比較的多く含むとの意味で上記公報において定義されており、このようなオリゴ糖鎖をも本発明における「細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖」として用いることができる。
このようなオリゴ糖鎖としてより具体的には、ｂＦＧＦを担体に結合させたアフィニティーカラムにヘパラン硫酸を添加し、このカラムに結合させたヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩで処理し、このカラムをＮａＣｌ等の塩で処理することにより溶出されるオリゴ糖鎖を例示することができる。
【００２４】
このオリゴ糖鎖は、通常８〜１８糖（分子量約１８００〜４０００）で、かつ構成２糖単位として、GlcA-GlcNAc を２５〜２８％程度、GlcA-GlcNAc(6S) を１〜８％程度、GlcA-GlcNSを１２〜１５％程度、GlcA-GlcNS(6S)を３〜５％程度、IdoA(2S)-GlcNSを３５〜４０％程度、IdoA(2S)-GlcNS(6S)を１１〜１４％程度含有するオリゴ糖を例示することができるが、これに限定されるものではない（GlcAはＤ−グルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、GlcNS(6S) はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６−硫酸をそれぞれ表す。）。
【００２５】
また、Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 5(25),343-354, 1993 （筆者：Ishihara, M.）には、
【化１】
0003963495.tif 000002
（式中、Ｒ1 は、−ＳＯ3- 又は−Ｈを表す。）
【００２６】
で表される６糖体構造が塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）に対して高い親和性を有することが記載されており、本発明ではこの６糖体構造を含有する糖鎖をも用いることができる。
【００２７】
また、同文献中には、完全にＮ−硫酸化されており、１０mer 以上のサイズとIdoA(2-O-S)-GlcNS(6-O-S)配列〔IdoA(2-O-S) は、Ｌ−イズロン酸・２−Ｏ−硫酸を、GlcNS(6-O-S)は、Ｄ−グルコサミン−ＮＨ−硫酸・６−Ｏ−硫酸を表す〕に富む構造についても、上記繊維芽細胞増殖因子に高い親和性を有することが記載されており、本発明ではこのような構造を含む糖鎖をも用いることができる。
【００２８】
上記のオリゴ糖構造部分と上記繊維芽細胞増殖因子とが結合して、生体外又は生体内で繊維芽細胞増殖因子と糖鎖との複合体が容易に形成される。
また、これらの糖鎖は、各々の糖鎖に固有の通常公知の調製法により調製して用いることも可能であり、市販されているものについては、その市販品を用いることも可能である。
【００２９】
上記オリゴ糖構造を有する糖鎖として、具体的には、
【化２】
0003963495.tif 000003
〔式中、Ｒ2 及びＲ4 は、−ＳＯ3- 又は−Ｈを表し、Ｒ3 は、−ＳＯ3- 又はＣＨ3 ＣＯ−を表す。Ｘ1 及びＸ2 は、−ＣＯＯ- 又は−Ｈを表す（Ｘ1 ，Ｘ2 は常に異なる。）。ｎは１以上の整数である。〕。
【００３０】
でその基本構造が表されるヘパラン硫酸又は
【化３】
0003963495.tif 000004
（式中、Ｒ5 ，Ｒ7 及びＲ8 は、−ＳＯ3- 又は−Ｈを表し、Ｒ6 は、−ＳＯ3- 又はＣＨ3 ＣＯ−を表す。Ｘ1 及びＸ2 並びにｎは、前記式（II）と同様である。）
でその基本構造が表されるヘパリンを用いることが可能であり、かつ好ましい。
【００３１】
このヘパラン硫酸又はヘパリンは、本発明アポトーシス惹起抑制剤中に単独で配合することも可能であるが、これらを共に配合することも可能である。なお、本発明で用いる糖鎖は、全てその糖鎖の性質又は製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えば、上記ヘパリンやヘパラン硫酸のような硫酸化多糖の場合には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩，カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩又はジエタノールアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学上許容できる塩を本発明において用いることができる。
【００３２】
また、ヘパリンのマウス（♂，♀）における急性毒性試験によるＬＤ50は、経口投与で５０００（mg／kg）以上、皮下又は腹腔内投与２５００（mg／kg）以上、静注で１０００（mg／kg）程度ということが知られている。また、ヘパラン硫酸は、その構造から、上記ヘパリンと同等又はそれ以上の安全性が推定される。
【００３３】
上記のように、本発明アポトーシス惹起抑制剤中に配合された細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖は、少なくともアポトーシスが関与する疾患部位において、上記細胞増殖因子及び上記糖鎖の複合体を形成し、かかる複合体が疾患に関連しているアポトーシスの惹起を制御し得る。すなわち、この複合体はエンドサイトーシスにより細胞質内に取り込まれ、最終的には細胞核に移行すると考えられており、細胞核に移行したこの複合体が、細胞核ＤＮＡに何らかの作用をして、ＤＮＡにプログラムされた細胞死（アポトーシス）の惹起を抑制するというメカニズムが考えられるが、詳細には不明な点も多い。
【００３４】
なお、例えばＦＧＦに、ヘパラン硫酸やヘパリン等のＦＧＦ結合性糖鎖が結合することにより、このＦＧＦが安定化され（プロテアーゼによる分解を受けにくくなる）、またＦＧＦの拡散性が増すことも知られている。本発明アポトーシス惹起抑制剤は、細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として含有する。そして、アポトーシスの惹起を伴う疾患部位において上記細胞増殖因子及び上記糖鎖が複合体を形成する限り、これらの細胞増殖因子と糖鎖とが、本発明アポトーシス惹起抑制剤中で既に複合体を形成しているか否かは特に問題とはならない。しかしながら、細胞増殖因子の製剤中での一般的な安定性を考慮すると、上記細胞増殖因子及び上記糖鎖の複合体を本発明アポトーシス惹起抑制剤に配合することが好ましい。
【００３５】
なお、本発明アポトーシス惹起抑制剤は、細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として含むが、これらの細胞増殖因子と糖鎖とを個別に投与しても、上記の本発明アポトーシス惹起抑制剤において所望される効果と同様の効果を奏することが期待される。このことから、細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖とを同一製剤中に配合することなく、個別にこれらの細胞増殖因子又は糖鎖を製剤化したものを備えるアポトーシス関連疾患治療用のキットも本発明の所期の目的は達成され得る。
【００３６】
また、疾患部位において細胞増殖因子が既に存在する場合は、この細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖を投与することによっても、上記の本発明アポトーシス惹起抑制剤において所望される効果と同様の効果を奏することが期待される。さらに、これとは逆に疾患部位において細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖が既に存在する場合には、この糖鎖と結合可能な細胞増殖因子を投与することによっても、上記の本発明アポトーシス惹起抑制剤において所望される効果と同様の効果を奏することが期待される。このことから、疾患の状況によっては、細胞増殖因子又はこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として含む製剤によっても、上記の本発明アポトーシス惹起抑制剤において所望される効果と同様の効果を奏することが期待される。
【００３７】
本発明アポトーシス惹起抑制剤の適用となる疾患は、文字通り、腎糸球体又はメサンギウム細胞におけるアポトーシスの惹起を伴う疾患であれば、特に限定されるものではない。例えば、急性糸球体腎炎，慢性糸球体腎炎，糖尿病性腎炎，糸球体硬化症，狼瘡等に分類される糸球体腎炎を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明アポトーシス惹起抑制剤は、文字通り、腎糸球体又はメサンギウム細胞のアポトーシスの惹起を伴う疾患の治療に使用し得るが、純然とした治療目的のみならず、これらの疾患の予防目的にも用いることができる。すなわち、本発明アポトーシス惹起抑制剤は、これらの疾患の「予防剤」の概念をも包含する。
【００３９】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行段階に応じて、後述する剤形を本発明アポトーシス惹起抑制剤の剤形として適宜選択することが好ましい。
【００４０】
なお、剤形として注射剤を選択し、これを静注等する場合には、ヘパリンの血液凝固抑制作用に留意する必要があり、穿刺部の止血を確認する必要がある。このため、注射用製剤にする場合には、血液凝固抑制作用のないヘパラン硫酸を用いることが好ましい傾向がある。
【００４１】
本発明アポトーシス惹起抑制剤は、前述の細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。かかる製剤担体としては、使用形態に応じた製剤を調製するのに通常使用される充填剤，増量剤，結合剤，付湿剤，崩壊剤，界面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用することができる。
【００４２】
製剤組成物の形態は、これが上記した有効成分を効果的に含有し得る状態であれば特に限定されるものではなく、例えば錠剤，粉末剤，顆粒剤，丸剤等の固剤；液剤，懸濁剤，乳剤等の注射剤形態とすることも可能である。
また、使用前に適当な担体を添加することによって液状となし得る乾燥品とすることも可能である。
【００４３】
このように得られる医薬製剤は、その形態に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は静脈内投与，筋肉内投与，皮下投与，皮内投与，腹腔内投与等；固剤形態の医薬製剤は、経口投与又は経腸投与等により投与され得る。なお、腎糸球体又はメサンギウム細胞のアポトーシスの惹起を伴う疾患のうち、慢性疾患に対しては経口投与が特に好ましく、急性疾患に対しては静脈投与が好ましい。
【００４４】
本発明アポトーシス惹起抑制剤中の上述した有効成分の量及びこの製剤の投与量は、この製剤の投与方法，投与形態，使用目的，患者の具体的症状等によって個別的であり特に限定されない。また、本発明アポトーシス惹起抑制剤中の有効成分量は、１日成人１人当り糖鎖量として５０μg 〜５００mg程度、細胞増殖因子量として５５ng〜０．５mg程度となる範囲で投与するのが好ましい。また、上記製剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、２〜４回に分けて投与することも可能である。
【００４５】
なお、本発明アポトーシス惹起抑制剤の有効成分である細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖同士の配合比は、増殖因子に対する糖鎖の配合比率が十分に大きくないと所望する腎糸球体又はメサンギウム細胞のアポトーシスの惹起を伴う疾患の治療効果を発揮することが困難である。
【００４６】
例えば、細胞増殖因子に結合可能な糖鎖がヘパラン硫酸及び／又はヘパリンであり、細胞増殖因子が繊維芽細胞増殖因子である場合には、ヘパラン硫酸及び／又はヘパリン１重量に対して、繊維芽細胞増殖因子をウロン酸量で１×１０3 重量以上配合することが好ましい。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例等により本発明をより具体的に記載するが、かかる実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００４８】
〔試験例１〕アポトーシスの誘導試験
正常のウイスター・ラット（Wister rat：オス，体重２００g ）より、腎糸球体を滅菌操作下、２０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）加ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最小基本培地（ＤＭＥＭ）培地中でシービング（Sieving ）法（Stewark K.N. et al.,J.Pathol,163,265-272,1991 ）によって単離した。すなわち、上記ラットの腎臓を１７３μm ，１２５μm ，５３μm のステンレス製メッシュで順にラットの腎臓をすりおろし、上記５３μm のメッシュ上に残った腎糸球体を単離した。次いで、２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で単離したラットの腎糸球体を３７℃で初代培養した。
【００４９】
この初代培養したラットの腎糸球体にハブ毒（Snake venom from Trimeresurus,和光純薬株式会社製）を添加して（２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ培地中５μg ／ml）アポトーシスを誘導した（なお、ハブ毒によりアポトーシスが誘導されることについては既に報告されている）。
【００５０】
アポトーシスの誘導の有無は、実験群ごとのＤＮＡを抽出して（ＤＮＡを抽出する１群当りの細胞数は約１．０×１０7 個）、これを１．７％アガロース電気泳動にかけることにより判定した。
すなわち、前述のように、アポトーシスを起こした群は、ヌクレオソーム単位でＤＮＡが断片化する結果、約１８０〜２００b.p を単位としたＤＮＡの断片化（いわゆるラダー）が観察されるので、これらの断片の電気泳動写真上での有無を判定した。
【００５１】
このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図１の電気泳動写真で示す。
この電気泳動写真において、向かって左端のレーン（レーンａという）は、単離したラットの腎糸球体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳動にかけたレーンである。また向かって真ん中左のレーン（レーンｂという）は、単離後、３７℃で２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で１時間初代培養を行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。また、向かって真ん中右のレーン（レーンｃという）は、３７℃で２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で４時間初代培養を行ったラットの腎糸球体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳動にかけたレーンである。そして、向かって右端のレーン（レーンｄという）は、単離したラットの腎糸球体を２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中に移し、即培地基準で５μg ／mlの前記ハブ毒を添加し、４時間初代培養を行った場合のラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。
【００５２】
この電気泳動写真において、ハブ毒を添加しないレーンａ，ｂ，ｃは、たとえ初代培養を４時間行ってもＤＮＡの断片化は起こらないが、ハブ毒を添加したレーンｄは、初代培養後４時間でＤＮＡの断片化が起こり、アポトーシスが誘導されたことが判明した。
【００５３】
なお、ここでハブ毒の代わりに抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナル抗体（このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、オックスフォード大学のA.F.Williams博士より恵与された。）を単離したラットの腎糸球体に添加した場合も、上記とほぼ同様にアポトーシスを誘発することができた。
【００５４】
また、前記ウイスター・ラットにハブ毒又は抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナル抗体を静脈内投与することによっても、腎糸球体にアポトーシスを誘発することができた。
【００５５】
単離糸球体のかわりに、“Haneda M. et al., Kidney Int., 44, 518-526(1993)”に記載された方法によって、ラットの単離糸球体から得たメサンギウム細胞を１０％（v/v）ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０中で培養し、トリプシンを用いる通常の方法で継代培養した培養メサンギウム細胞に、終濃度２００μg /ml の抗Ｔｈｙ−１．１抗体又は終濃度５μg/mlのハブ毒を添加し、添加後１２時間目にＤＮＡを抽出して１．７％アガロースゲル電気泳動を行った結果、いずれの場合もＤＮＡのラダーが検出された。このことから培養メサンギウム細胞も、抗Ｔｈｙ−１．１抗体やハブ毒によりアポトーシスを誘発することができることが明らかになった。
【００５６】
なお、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡのラダーを検出してアポトーシスの誘発を確認する方法の他に、組織切片を、Gavrieli等の方法（terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated nick end labeling method；J. Cell Biol., 119, 493-501 (1992)）を応用したApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit (Oncor, Gaithersburg, MD, USA 販売)を用いて染色することによってもアポトーシスの誘発を確認することができる。
【００５７】
すなわち、抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナル抗体を静脈内投与したラットの腎臓切片を、２０μl／ml プロテイナーゼ Ｋ(proteinase K)中で１５分間、室温でインキュベートして、その後で内在性のペルオキシダーゼを抑制するために切片を１．５％ 過酸化水素を含む無水メタノール中でインキュベートした。そして、この切片を、TaTとジゴキシゲニン(digoxigenin)−ｄＵＴＰを含む反応緩衝液中でインキュベートして、ジゴキシゲニンをペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody(ベーリンガー・マンハイム製)）と、基質として３，３−ジアミノベンジジン 四塩酸（3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB；シグマ社製)）を用いてアポトーシスによって断片化されたＤＮＡの末端が存在する部分を染色してアポトーシスの誘発を確認することができた。
なお、対照染色(counterstaining)はメチルグリーン(Methylgreen) で行い、光学顕微鏡で観察した。
【００５８】
その結果、メサンギウム細胞の部分に茶色の発色が見られた。このことは、メサンギウム細胞のＤＮＡが断片化し、その結果、露出したＤＮＡの末端が多量に発生したことを示すものであり、茶色に染色されたメサンギウム細胞がアポトーシスを起こしていることが示された。
【００５９】
〔試験例２〕アポトーシスの抑制試験
（１）上記試験例１と同様に単離したラットの腎糸球体を、５μg ／mlの濃度で試験例１で用いたハブ毒を添加した２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭを基本的な培地として初代培養を行った。
そして、初代培養後のラットの腎糸球体（細胞数は、約１．０×１０7 個）のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけて、ハブ毒によって誘導されるアポトーシスの抑制の有無を検討した。
【００６０】
このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図２の電気泳動写真で示す。
この電気泳動写真において、向かって左端のレーン（レーンｅという）は、単離したラットの腎糸球体を、３７℃で２０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）加ＤＭＥＭ中で４時間初代培養を行ったラットの腎糸球体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳動にかけたレーンである。向かって左から２番目のレーン（レーンｆという）は、上記のハブ毒添加培地中で初代培養を３７℃で４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。真中のレーン（レーンｇという）は、上記のハブ毒添加培地中に、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（生化学工業株式会社販売）を０．５ng／ml及びヘパリン（株式会社ミドリ十字販売）をウロン酸量で４ng／mlの割合で添加した培地で初代培養を３７℃で４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。向かって右から２番目のレーン（レーンｈという）は、前記レーンｇに関する条件中、ヘパリンの添加濃度をウロン酸量で４００ng／mlに変更して電気泳動にかけたレーンである。向かって右端のレーン（レーンｉという）は、前記レーンｈに関する条件中、ヘパリンの添加濃度をウロン酸量で４００００ng／mlに変更して電気泳動にかけたレーンである。
【００６１】
この電気泳動写真において、培地にハブ毒を添加しない系（レーンｅ）は、上記試験例１のレーンｃと同様にＤＮＡの断片化は起こらなかったことが示された。また、これに対して、培地にハブ毒を添加した系（レーンｆ）では、ラットの腎糸球体のアポトーシスの誘導によるＤＮＡの断片化が起こったことが示された。また、ハブ毒を添加した培地にさらにｂＦＧＦとヘパリンとを添加した系（レーンｇ，ｈ，ｉ）においては、ヘパリンの添加濃度が低い系（レーンｇ及びレーンｈ）ではＤＮＡの断片化が見られた。ただし、ここではいずれもほぼ等量のＤＮＡ（細胞数は約１．０×１０7 個）を、電気泳動にかけているが、レーンｇとレーンｈでは、レーンｈの方が断片化するＤＮＡの量が少ない傾向にあった。すなわち、レーンｈにおいてはアポトーシスの抑制がわずかではあるが認められた。また、ヘパリンをウロン酸量で４００００ng／ml培地中に添加した系（レーンｉ）においてはＤＮＡの断片化が著しく抑制されていることが示された。
【００６２】
よって、ヘパリンの添加量に対して用量依存的にアポトーシスが抑制され、特に、レーンｉの系における条件においてｂＦＧＦ及びヘパリンを作用させることによって、すなわち、ｂＦＧＦ１重量に対して、ヘパリンをウロン酸量で８×１０4 重量以上添加することによって、腎糸球体におけるアポトーシスの惹起を抑制し得ることが明らかになった。
【００６３】
（２）次に、添加する糖鎖の種類を変更して添加した場合のアポトーシスの抑制の有無を検討した。
各系とも、上記（１）記載のハブ毒添加培地を基本培地として初代培養を行った。すなわち、このハブ毒添加培地にｂＦＧＦを０．５ng／ml添加し、さらに種々の糖鎖をそれぞれウロン酸量で４μg ／ml添加して、これらの場合のアポトーシスの抑制効果について検討を行った。
【００６４】
このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図３の電気泳動写真で示す。
図３において、向かって左側のブロックの左側のレーン（レーンｊという）は、コンドロイチン−４−硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ）（生化学工業株式会社製）を添加した上記培地で初代培養を３７℃で４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。同ブロックの右側のレーン（レーンｋという）及び向かって右側のブロックの右側のレーン（レーンｎという）は、同じくヘパラン硫酸（生化学工業株式会社製）を添加した系について電気泳動にかけたレーンである。また、向かって右側のブロックの左側のレーン（レーンｌという）は、同じくケラタン硫酸（ＫＳ−Ｉ；生化学工業株式会社製）を添加した系について電気泳動にかけたレーンである。同ブロックの真中のレーン（レーンｍという）は、同じくヘパリン（株式会社ミドリ十字販売）を添加した系について電気泳動にかけたレーンである。
【００６５】
この電気泳動写真において、ヘパラン硫酸を培地中に添加した系（レーンｋ，ｎ）及びヘパリンを培地中に添加した系（レーンｍ）では、ＤＮＡがほとんど断片化されておらず、アポトーシスの惹起が抑制されたことが示されたが、その他の系（レーンｊ，ｌ）では、ＤＮＡが断片化されており、アポトーシスが惹起されていることが明らかになった。
【００６６】
上記とは別に、ラット培養メサンギウム細胞を無血清培地中で７２時間培養し、終濃度５μg／mlとなるように試験例１で用いたハブ毒を培地に添加し、同時に終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／mlのヒアルロン酸；終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／mlのデルマタン硫酸；終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／mlのヘパリン又は終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／mlのヘパラン硫酸を培地に添加し、更に１５時間培養した。培養後ＤＮＡを抽出して電気泳動にかけた結果、ヒアルロン酸又はデルマタン硫酸を添加した系についてはＤＮＡの断片化が見られたことから、アポトーシスが惹起されていることが明らかとなった。また、ヘパリン又はヘパラン硫酸を添加した系についてはＤＮＡの断片化は観察されなかったことからｂＦＧＦと、ヘパリン又はヘパラン硫酸の添加によってアポトーシスの惹起が抑制されることが明らかになった。
【００６７】
すなわち、この試験例２（２）において、種々の糖鎖（ここではグリコサミノグリカン）の中でも、ヘパリン又はヘパラン硫酸の添加によって特異的にアポトーシスの惹起を抑制し得ることが明らかになった。また、ｂＦＧＦ１重量に対してヘパリン又はヘパラン硫酸をウロン酸量で１×１０3 重量以上を添加することにより、アポトーシスの惹起を抑制し得ることも確認された。
【００６８】
なお、ヘパリン及びヘパラン硫酸は、繊維芽細胞増殖因子との結合ドメインである前述したオリゴ糖構造を有するという点において共通しており、この点より考えるとかかる結合ドメインと繊維芽細胞増殖因子とが結合して複合体を形成することが、アポトーシスの惹起の抑制という本発明アポトーシス惹起抑制剤の根本的な機能と密接に関わっていることが示唆された。
【００６９】
（３）さらに、ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖とｂＦＧＦに結合性を有さないオリゴ糖とを用いて、これらについてアポトーシス惹起の抑制効果の有無を検討した。
すなわち、ＥＨＳ(Engelbreth-Holm-Swarm)腫瘍由来のヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩにより消化させて得られる、ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖（以下、ｂＦＧＦ結合性オリゴ糖ともいう）とｂＦＧＦに結合性を有さないオリゴ糖（以下、ｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖ともいう）を特開平５−１４８３０５号公報に記載の方法で調製して、これらを用いた系についてアポトーシス惹起の抑制効果を検討した。
【００７０】
上記と同様に、ラット培養メサンギウム細胞を、無血清培地中で７２時間培養し、終濃度５μg／mlとなるように試験例１で用いたハブ毒を培地に添加し、同時に終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／mlのｂＦＧＦ結合性オリゴ糖、または終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg ／mlのｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖を培地に添加し、更に１５時間培養した。培養後ＤＮＡを抽出して電気泳動にかけた結果、ｂＦＧＦとｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖とを添加したものではＤＮＡの断片化が見られたが、ｂＦＧＦとｂＦＧＦ結合性オリゴ糖とを添加したものではＤＮＡの断片化は見られなかった。このことからｂＦＧＦとｂＦＧＦ結合性オリゴ糖を添加することによりアポトーシスの惹起が抑制されることが明らかとなった。
ｂＦＧＦとｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖とを添加したものではアポトーシスの惹起が抑制されなかったことから、アポトーシスの惹起の抑制のためにはｂＦＧＦのような細胞増殖因子と、ｂＦＧＦ結合性オリゴ糖のような、細胞増殖因子に結合性を有する糖鎖が必須であることが確認された。
【００７１】
〔実施例〕  本発明アポトーシス惹起抑制剤の調製
（１）カプセル剤の調製
ｂＦＧＦ                                         ０．０５mg
ヘパラン硫酸ナトリウム塩                           ５００mg
バレイショデンプン                                 １５０mg
軽質無水ケイ酸                                       ５０mg
ステアリン酸マグネシウム                             １０mg
乳糖                                               ２９０mg
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに２００mgずつ充填した。
【００７２】
（２）錠剤の調製
ｂＦＧＦ                              ０．０５mg
ヘパリンナトリウム                      ５００mg
バレイショデンプン                      １５０mg
結晶セルロース                            ６０mg
軽質無水ケイ酸                            ５０mg
ヒドロキシプロピルセルロース              ３０mg
ステアリン酸マグネシウム                  １５mg
乳糖                                    １９５mg
ｂＦＧＦ，ヘパリンナトリウム，乳糖，バレイショデンプン，結晶セルロース及び軽質無水ケイ酸を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースの１０％メタノール溶液を加えて練合造粒し、径０．８mmのスクリーンで押し出して顆粒を調製し、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウムを加えて圧縮成型し、２００mgの錠剤とした。
【００７３】
（３）注射剤の調製
ｂＦＧＦ                              ０．０１mg
ヘパラン硫酸ナトリウム塩                １００mg
これらを、ヘパラン硫酸ナトリウム塩濃度としてウロン酸量で終濃度５mg／mlとなるように、５％マンニトール水溶液で溶解し、これを無菌濾過した後、２mlずつアンプルに分注し密封して注射剤を調製した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、細胞死の一種であるアポトーシスの惹起を、腎糸球体又はメサンギウム細胞において伴う疾患、特に糸球体腎炎の治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１に対応する電気泳動写真。
【図２】試験例２（１）に対応する電気泳動写真。
【図３】試験例２（２）に対応する電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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