(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003963488.tif 000024
（式中、Ｒ*は−（ＣＨ2）n−（ＣＲ6Ｒ7）m−ＮＲ8Ｒ9であり、
ｎ＋ｍ＝０、１、または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6のアルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1、Ｒ4およびＲ5はＣ1〜6のアルキルである）より選択されるものであるＮＭＤＡ受容体拮抗薬活性を有する１−アミノアルキルシクロヘキサン化合物（ただし、1-メチルアミノ-1,3,3,5-テトラメチルシクロヘキサンを除く）、
および、それらの医薬的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ3はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ5はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ5はプロピルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ6またはＲ7はメチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ6またはＲ7はエチルである請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項１１】
該化合物は、
1-アミノ-1,3,3,5,5,-ペンタメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,3,5,5-テトラメチル-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-3,3-ジエチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-シス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-トランス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-エチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-プロピル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
Ｎ-メチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、および
Ｎ-エチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン
ならびに、任意の前述の化合物の医薬的に許容される塩
からなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項１２】
ＮＭＤＡ受容体拮抗薬によって緩和される症状の緩和のための、またはその免疫調節、抗マラリア、抗ボルナウイルス、または抗Ｃ型肝炎作用の治療のための医薬の製造のための式：
0003963488.tif 000025
（式中、Ｒ*は−（ＣＨ2）n−（ＣＲ6Ｒ7）m−ＮＲ8Ｒ9であり、
ｎ＋ｍ＝０，１，または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6のアルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1，Ｒ4およびＲ5はＣ1〜6のアルキルである）より選択される1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物の使用。
【請求項１３】
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１４】
Ｒ1はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１５】
Ｒ2はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１６】
Ｒ3はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ4はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１８】
Ｒ5はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項１９】
Ｒ5はプロピルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項２０】
Ｒ6またはＲ7はメチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項２１】
Ｒ6またはＲ7はエチルである請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項２２】
該化合物は、
1-アミノ-1,3,3,5,5,-ペンタメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,3,5,5-テトラメチル-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-3,3-ジエチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-シス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-トランス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-エチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-プロピル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
Ｎ-メチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、および
Ｎ-エチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、
ならびに、任意の前述の化合物の医薬的に許容される塩
からなる群より選択される請求の範囲第１２項に記載の使用。
【請求項２３】
式：
0003963488.tif 000026
（式中、Ｒ*は−（ＣＨ2）n−（ＣＲ6Ｒ7）m−ＮＲ8Ｒ9であり、
ｎ＋ｍ＝０，１，または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6のアルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1，Ｒ4およびＲ5はＣ1〜6のアルキルである）より選択されるものである1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物、および、それらの医薬的に許容される塩のＮＭＤＡ受容体拮抗薬の有効量、または免疫調節、抗マラリア、抗ボルナウイルス、または抗Ｃ型肝炎の有効量と、一つまたはそれ以上の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである請求の範囲第２３項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
Ｒ1はエチルである請求の範囲第２３項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
Ｒ2はエチルである請求の範囲第２３項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Ｒ3はエチルである請求の範囲第２３項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Ｒ4はエチルである請求の範囲第２３項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
１．発明の背景
ＮＭＤＡ受容体拮抗薬として全身性の活性を持つ１−アミノ−アルキルシクロヘキサン化合物、それを含む医薬組成物、それらの調製方法、およびグルタミン酸輸送障害を含むＣＮＳ疾患の治療方法に関するものである。
２．先行技術
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型のグルタミン酸受容体の拮抗作用は、潜在的に広範囲の治療応用がある[19]。ＮＭＤＡ受容体の機能的な阻害は、カチオンチャンネル内に存在する第一輸送部位、ストリキニーネ感受性グリシン部位（グリシンB）、ポリアミン部位、およびペニシリジン部位などの異なる認識部位における作用を通して達成される。このようなＮＭＤＡ受容体チャンネル遮断薬は、非競合的な“使用依存的”な方法で作用し、即ちそれらは通常、開放状態においてチャンネルを遮蔽するだけであることを意味する。この使用依存性は、受容体のより強い活性化は、より大きい拮抗作用を導くはずであるという多くの理由によって説明されてきた。このような作用モデルは、てんかん、虚血、および外傷など、ＮＭＤＡ受容体の過剰な活性化が予想される場合において、この拮抗作用のクラスが特に有用であるという意味も含んでいる。しかしながら、選択的な、高親和性の、強い使用依存性の非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬(+)-5-メチル-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾシクロヘプテン-5,10-イミンマレイン酸塩（(+)-MK-801）の主な臨床試験は、期待はずれのものだった。すなわち、臨床的な用量でいくらかの向精神薬面の効果はあったが、てんかんにおける臨床的な有効性は水準以下であった。これらの調査と、フェンシクリジンの乱用者が同様の向精神的症状を呈するという事実とから、ＮＭＤＡ受容体の非競合的拮抗薬は将来有望な臨床アプローチではないかもしれないという結論に至った。
しかしながら、より入念な電気物理学的な方法の使用によって、異なる非競合的拮抗薬の用量の間で共通点はないことが示され、これは受容体遮断薬の速度（オン−オフの速度論）およびこの効果の電圧依存性などのファクターが、例えば治療安全性などのインビボにおける薬力学的特徴を決定しうるためである。逆説的に、緩衝作用の低い薬剤は、高いものより親和性が良好である。このような所見は、医薬開発におけるＮＭＤＡ受容体の非競合的拮抗薬の概念を再認識するきっかけになった[19,22]。目下、このような薬剤の多くが様々な開発段階にあり、例えばカーバディロール（carvedilol）、ＡＤＣＩ、ＥＳ２４２Ｓ、レマセミド（remacemide）、フェルバメート（felbamate）、およびビュディピン（budipine）などである。一方で、例えばアマンタジン（amantadine）およびメマンチン（memantine）などの非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬は、これらは上記の基準を満たしており、それぞれパーキンソン病や痴呆の治療において数年間治療に使用されてきており、それらの各々の効能に応じて使用される治療的な用量において、実際にはまれにしか副作用を生じなかった。
上記証拠の観点から、我々は１−アミノアルキルシクロヘキサン構造に基づいた新規の非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬を開発してきた。現在の研究では、受容体結合分析、パッチクランプ実験、インビトロにおける興奮毒性、３種の痙攣モデルおよび２種の運動性障害モデルにおいて、これら１−アミノアルキルシクロヘキサン誘導体のＮＭＤＡ受容体拮抗薬特性を比較することに専念している。これら１−アミノアルキルシクロヘキサンの置換は、表６に詳細が述べられている。
本発明
現在、ある種の1-アミノアルキルシクロヘキサンが、顕著な、且つ予想できないＮＭＤＡ受容体拮抗薬活性を持つことが見出されている。前述の適性によって、この物質は、広範囲のグルタミン酸輸送障害を含むＣＮＳ疾患に対する治療に適しており、好ましくは、それらの医薬組成物の形状において適しており、これらは一つまたは二つ以上の医薬的に許容できる希釈剤、担体、または賦形剤と供に存在する。
本発明の目的
本発明の目的は、1-アミノアルキルシクロヘキサンＮＭＤＡ受容体拮抗薬である新規医薬化合物と、その医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、本発明によるこのような化合物およびこれらを含む医薬組成物を使用することによって、グルタミン酸輸送系の障害を含む望ましくないＣＮＳ疾患を治療、除去、症状の軽減、一時的緩和、または改善する新規の方法を提供することである。本発明の追加の目的は、前記１−アミノアルキルシクロヘキサン活性成分の製造方法を提供することである。追加の目的は以下で明らかになるであろうし、さらなる目的は当業者には明白にるであろう。
発明の概要
本発明でそれゆえに比較されるであろうことは、以下の言葉において要約される：
式：
0003963488.tif 000002
（式中、Ｒ*は-(CH2)n-(CR6R7)m-NR8R9であり、
ｎ＋ｍ＝０、１、または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6の低級アルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1，Ｒ4およびＲ5は低級アルキルである）
で表される化合物であって、
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである化合物；
Ｒ1はエチルである化合物；
Ｒ2はエチルである化合物；
Ｒ3はエチルである化合物；
Ｒ4はエチルである化合物；
Ｒ5はエチルである化合物；
Ｒ5はプロピルである化合物；
Ｒ6またはＲ7はメチルである化合物；
Ｒ6またはＲ7はエチルである化合物；および
1-アミノ-1,3,3,5,5,-ペンタメチルシクロヘキサン
1-アミノ-1,3,5,5-テトラメチル-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-3,3-ジエチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-シス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-トランス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-エチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-プロピル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
N-メチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、および
N-エチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン
から選択されるＮＭＤＡ受容体拮抗薬活性を有する1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物、ならびに前記の任意の化合物の医薬的に許容できる塩。
さらに、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬によって緩和される症状の緩和のための、またはその免疫調節、抗マラリア、抗ボルナウイルス、または抗Ｃ型肝炎作用のための動物の治療方法であって、前述の症状の緩和に有効な
式：
0003963488.tif 000003
（式中、Ｒ*は-(CH2)n-(CR6R7)m-NR8R9であり、
ｎ＋ｍ＝０、１、または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6の低級アルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1，Ｒ4およびＲ5は低級アルキルである）
より選択される1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物のある量を前記動物に投与する段階を含む治療方法であり、
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである方法；
Ｒ1はエチルである方法；
Ｒ2はエチルである方法；
Ｒ3はエチルである方法；
Ｒ4はエチルである方法；
Ｒ5はエチルである方法；
Ｒ5はプロピルである方法；
Ｒ6またはＲ7はメチルである方法；
Ｒ6またはＲ7はエチルである方法；
該化合物は、
1-アミノ-1,3,3,5,5,-ペンタメチルシクロヘキサン
1-アミノ-1,3,5,5-テトラメチル-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-3,3-ジエチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-シス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-トランス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-エチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-プロピル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
N-メチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、および
N-エチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン
からなる群より選択される1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物、ならびに前記の任意のものの医薬的に許容できる塩である治療方法
および
該化合物は、一つまたはそれ以上の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と組み合わせた化合物からなるそれらの医薬組成物の形態で投与される治療方法。
その上、一つまたはそれ以上の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と組み合わせた
式：
0003963488.tif 000004
（式中、Ｒ*は-(CH2)n-(CR6R7)m-NR8R9であり、
ｎ＋ｍ＝０，１，または２であり、
Ｒ1〜Ｒ9はそれぞれ独立して、水素原子、およびＣ1〜6のアルキルからなる群より選択され、少なくともＲ1，Ｒ4およびＲ5はアルキルである）
から選択される1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物の、効果的なＮＭＤＡ受容体拮抗薬の量における、または免疫調節、抗マラリア、抗ボルナウイルスもしくは抗Ｃ型肝炎の効果的な量におけるＮＭＤＡ受容体拮抗薬を含む医薬組成物であって；
Ｒ1〜Ｒ5はメチルである医薬組成物；
Ｒ1はエチルである医薬組成物；
Ｒ2はエチルである医薬組成物；
Ｒ3はエチルである医薬組成物；
Ｒ4はエチルである医薬組成物；
Ｒ5はエチルである医薬組成物；
Ｒ5はプロピルである医薬組成物；
Ｒ6またはＲ7はメチルである医薬組成物；
Ｒ6またはＲ7はエチルである医薬組成物；
該化合物は
1-アミノ-1,3,3,5,5,-ペンタメチルシクロヘキサン
1-アミノ-1,3,5,5-テトラメチル-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-3,3-ジエチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-シス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1,5,5-トリメチル-トランス-3-エチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-エチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
1-アミノ-1-プロピル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン、
N-メチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン、および
N-エチル-1-アミノ-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン
からなる群より選択される1-アミノアルキルシクロヘキサン化合物、
ならびに、前述の任意のものの医薬的に許容される塩である医薬組成物。
発明の詳細な説明
以下の詳細な説明、および詳細な実施例は、単に説明するためであって、本発明の範囲を限定するものではない。
0003963488.tif 000005
3-プロピル-5,5-ジメチル-2-シクロヘキセン-1-オンの調製(1-7)
マグネシウム90mgと1-ヨードプロパン90mmolをエーテル60mlに溶解したものから調製したヨウ化プロピルマグネシウムの撹拌溶液に、3-エトキシ-5,5-ジメチル-2-シクロヘキサン-1-オン[１]（5.04g，30mmol）のエーテル溶液を滴下して加えた。室温で１時間撹拌後、その反応混合物を５％硫酸で処理した。有機層を分離し、塩溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸留して、粗抽出オイルを得て、シリカゲルカラムでヘキサン−酢酸エチル混合物で抽出することで分離した。シクロヘキサン（1-7）を無色のオイルとして得た（2.0g，70％）。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.92（3H，t，J=7Hz）；1.03（6H，s）；1.3-1.75（2H，m）；2.16（2H，t，J=7Hz）；2.17（2H，d，J=1.5Hz）；2.21（2H，s）；および5.87ppm（1H，t，J=1.5Hz）
このようなシクロヘキサン１は、化合物２の調製に用いられた：
1-1（R1=R2=R3=H）［市販品を利用可能］、
1-2（R3=Me）*［市販品を利用可能］、
1-3（R2=R3=Me）［市販品を利用可能］、
1-4（R1=R2=Me）[２]、
1-5（R1=R2=R3=Me）［市販品を利用可能］、
1-6（R1=R2=Me，R3=Et）[３]。
＊省略した場合は、Ｒn=Ｈである。
その他の開始物質１は、同じ、または類似の方法で調製された。
シクロヘキサン２の一般的な調製方法
塩化銅(I)無水物（7.5mmol）をヨウ化アルキルマグネシウム（15〜18mmol）の冷却エーテル溶液に加えた。その混合物を不活性雰囲気中で５分撹拌し、2-シクロヘキサン-1-オン１（10mmol）のエーテル溶液-5℃以下の温度を維持しながら滴下して加えた。ケトンの添加が終了した後、反応混合物を１時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で慎重に中和した。伝統的なグリニャール反応の作用により、粗抽出物を得て、これをシリカゲルカラムで石油エーテル−酢酸エチル混合物で抽出して分離した。
化合物２の収率と1Ｈ ＮＭＲスペクトルデータは、表１に記載している。
このようなシクロヘキサン２を化合物３の調製に使用した。
2-1（R4=Me）*［市販品を利用可能］、
2-2（R4=Et）［４］、
2-3（R4=Pr）［５］、
2-4（R3=R4=Me）［６］、
2-5（R3=Me，R4=Et）［７］、
2-6（R3=Me，R4=Pr）［８］、
2-7（R1=R4=Me）［９］、
2-8（R2=R3=R4=Me）［10］、
2-9（R2=R3=Me，R4=Et）［11］、
2-13（R1=R2=R3=R4=Me）［市販品を利用可能］、
2-14（R1=R2=R3=Me，R4=Et）［10］、
2-15（（R1=R2=R3=Me，R4=Pr）［10］。
＊省略した場合は、Ｒn=Ｈである。
その他の中間体のシクロヘキサン２は、同じまたは類似の方法で合成された。シクロヘキサン２は、化合物３の調製に使用された。
アルキルシクロヘキサン３の一般的な調製方法
ヨウ化アルキルマグネシウム（3〜4等量）のエーテル溶液を、シクロヘキサン２の冷却エーテル溶液に滴下して加えた。その混合物を１時間室温で撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で慎重に分解した。伝統的なグリニャール反応の作用により、鏡像異性体のアルコール３の混合物を得て、これをシリカゲルカラムで石油エーテル−酢酸エチル混合物で抽出して分離した。
化合物３の収率と1Ｈ ＮＭＲスペクトルデータは、表２に記載している。
このようなシクロヘキサン３を化合物４の調製に使用した。
3-1（（R3）（R4）=R5=Me）*，［９］
すなわちＲ3またはＲ4およびＲ5はMeである、
3-4＝（R3=R4=Me，R5=Me）*［12］、
3-5（R3=R5=Me，R4=Et）［13］、
3-7（R1=R4=R5=Me）［14］、
3-8（R1=R3=R4=R5=Me）［10］、
3-13（R1=R2=R3=R4=R5=Me）［10］、
3-14（R1=R2=R3=R4=Me，R5=Et）［15］。
＊省略した場合は、Ｒn=Ｈである。
その他の中間体シクロヘキサン３は、同じ、または類似の方法で調製された。
1-アルキル-1-アジドシクロヘキサン４の一般的な調製方法
前記アルコール３を、1.7〜2Nのアジ化水素（10〜13等量）のクロロホルム溶液と混合し、氷浴で冷却した。TiCl4（1.2等量）のクロロホルム溶液を、温度を５℃以下に維持しながら滴下して加えた。その混合物を室温で24時間撹拌し、アルミナのカラムに流下し、クロロホルムで抽出した。溶媒を揮発させて、鏡像異性体アジド４を得て、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで軽油エーテルで抽出して分離した。
化合物４の収率と1Ｈ ＮＭＲスペクトルデータは、表３に記載している。
その他の中間体1-アルキル-1-アジドシクロヘキサン４は、同じ、または類似の方法によって調製される。
1-ニトロメチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン（６）の調製
3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン（2〜13）（1.54g，10mmol）およびエチレンジアミン（60mg）をニトロメタン（45ml）に溶解した溶液を、アルゴン雰囲気下で２５時間環流した。次に過量のニトロメタンを真空中で除去し、その残留物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン−酢酸エチル（６：１）混合物で抽出して分離した。1.2g（61％）のの６をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.96 and 1.03（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.34（2H，s，4-CH2）；1.82（2H，br s，6-CH2）；4.80（2H，s，CH2NO2）；and 5.64ppm（1H，br s，C=C-H）
エチル3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシリデン酢酸塩（ethyl3,3,5,5-tetramethylcyclohexylideneacetate）    （７）の調製
トリエチルホスホノ酢酸塩（49.32g，0.22mmol）を乾燥ＴＨＦ（180ml）に溶解した撹拌溶液に、アルゴン下で、氷水で冷却しながら、水素化ナトリウム（8.8g，0.22mol，60％ミネラルオイル懸濁液）を少しずつ加えた。１時間室温で撹拌した後、次に3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサノン（２〜13）（30.85g，0.2mol）の溶液を10分にわたって加え、生じた混合物を２２時間環流した。次に氷上に注ぎ（400g）、生産物をエーテル（4* 150ml）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。真空中で濃縮した後、オイル状の残留物を145℃で蒸留し（11mm）、36.8g（86％）の６をオイルとして得た。
1H NMR(CDCl3，TMS）δ：0.96 and 0.98（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.27（3H，t，CH3-エチル）；1.33（2H，m，シクロヘキサン4-CH2）；1.95 and 2.65（total 4H，both s，シクロヘキサン2,6-CH2）；4.14（2H，q，CH2-エチル）and 5.69ppm（1H，s，=C-H）
エチル3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル酢酸塩（８）の調製
エチル3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシリデンアセテート（７）（4.48g，20mmol）をエタノール（100mmol）に溶解した溶液を、10％Pd/C（0.22g，５質量％）上に、10気圧で18時間、水素化した。セライトTM（Celite TM）でろ過し、蒸発させて、オイルとして4.28g（95％）の８を得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.89 and 1.02（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.26（3H，t，J=7Hz，CH3-エチル）；0.6-1.55（7H，m，リングプロトン）；2.13（2H，m，2-CH2）；and 4.12ppm（2H，q，J=7Hz，CH2-エチル）
2-メチル-（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-プロパノール-2-オール（９）の調製
エチル3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル酢酸塩（８）（2.26，10mmol）をエーテル（20m1）に溶解した溶液を、2Mヨウ化メチルマグネシウムのエーテル（20ml）に溶解した溶液に、氷水で冷却しながら１５分にわたって加えた。その混合物を２時間環流し、飽和塩化アンモニウム水溶液で急冷した。一般的に処理した後、生産物をシリカゲルカラムでヘキサン−酢酸エチル（20：１）混合物で抽出し、1.7g（80％）の９をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.86 and 1.00（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.23（6H，s，α-CH3），；1.36（2H，d，J=5Hz，-CH2-）；0.6-2.04ppm（8H，m，リングプロトンand OH）
2-メチル-(3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-プロピル-2-アジド（10）の調製
三フッ化ホウ素エーテル酸塩（boron trifluoride etherate）（0.77g，0.69ml，5.44mmol）を、2-メチル-（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-プロパン-2-オール（９）（0.96g，4.53mmol）とトリメチルシリルアジド（0.63g，0.72ml，5.44mmol）とをベンゼン（10ml）に溶解した撹拌溶液に滴下して加えた。24時間室温で撹拌した後、その混合物を水（20ml）に注ぎ入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10ml）および生理的食塩水（10ml）で洗浄した。その溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。その粗抽出物を、シリカゲルカラムでヘキサンで抽出し、0.56g（52％）の10をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.87 and 1.01（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.27（6H，s，α-CH3）；1.36（2H，d，J=5Hz，-CH2-）；0.6-1.85ppm（7H，m，リングプロトン）
2-(3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-エタノール（11）の調製
エチル3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル酢酸（８）（1.8g，8.0mmol）をエーテル（30ml）に溶解した溶液を、水素化リチウムアルミニウム（0.9g，24,0mmol）をエーテル（30ml）に懸濁した撹拌溶液に滴下して加え、これを氷浴で冷却した。その反応混合物を３時間環流し、冷却し、残留した水素化リチウムアルミニウムを水で分解した。水層を分離し、エーテルで２回抽出した。結合したエーテル層を生理的食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させた。その粗抽出物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで、ヘキサン−酢酸エチル（４：１）混合物で分離し、1.2g（79％）の11をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.89 and 1.00（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.44（2H，q，J=7Hz，2-CH2）；0.55-1.95（8H，m，リングプロトンおよびOH）and 3.70ppm（2H，t，J=7Hz，CH2O）
2-(3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-エチルメタンスルホン酸塩（12）の調製
塩化メタンスルホニル（1.03g，0.7ml，90mmol）を乾燥ベンゼン（20ml）に溶解した溶液を、2-（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-エタノール（11）（1.1g，6.0mmol）とトリエチルアミン（1.2g，1.7ml，12mmo1）とをベンゼン（40ml）に溶解した撹拌溶液に、氷浴で冷却しながら加えた。その反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に短いシリカゲルカラムでろ過し、ベンゼンで抽出した。溶媒を揮発させて、1.48g（94％）の12をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.88 and 0.98（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.62（2H，q，J=7Hz，2-CH2）；0.65-2.0（7H，m，リングプロトン）3.0（3H，s，CH3-SO2）；and 4.29ppm（2H，t，J=7Hz，CH2O）
2-(3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-エチルアジド（13）の調製
アジ化ナトリウム（2.27g，34.2mmol）、2-（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシル）-エチルメタンスルホン酸塩（12）（1.46g，5.57mmol）、およびジメチルスルホキシド（20ml）の混合物を、室温４８時間撹拌し、水（50ml）で希釈し、エーテル（3*30ml）で抽出した。有機層を生理的食塩水（30ml）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させた。粗抽出物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで、ヘキサンで分離し、0.93g（80％）の13をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.87 and 0.99（total 12H，both s，シクロヘキサン3,5-CH3）；1.47（2H，q，J=7Hz，2-CH2）；0.55-1.9（7H，m，リングプロトン）and 3.31ppm（2H，t，J=7Hz，CH2N3）
N-ホルミル-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサミン（14-1）の調製
1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサノール（３〜13）（2.7g，15.6mmol）と、トリメチルシリルシアン化物（2.36g，23.8mmol）とをアルゴン下で酢酸（2.5ml）にしっかり撹拌した溶液に、-5℃以下を維持しながら98％硫酸（4.66g，47.6mmol）を加えた。その混合物を室温で２２時間撹拌し、次にそれを氷（100g）上に注ぎ入れ、50％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ〜７に中和し、エーテル（3*30ml）で抽出した。結合したエーテル層を生理的食塩水（50ml）で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。わずかに黄色の結晶残留物を、少量のアセトニトリルで処理し、ろ過し、2.5g（80％）の14〜１を白色結晶として得て、融点は104〜106℃であった。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.91 and 0.93（total 6H，both s，3,5-CH3eq；1.08（2H，m，2,6-CHeq）；1.13 and 1.15（total 6H，both s，3,5-CH3ax）；1.25（2H，m，4-CH2）；1.32 and 1.38（total 3H，both s，1-CH3）；1.70 and 2.12（total 2H，both d，14.7Hz，2,6-CHax）；5.30 and 5.60（total 1H，both br s，NH）；8.05 and 8.30ppm（total 1H，both d，2.0 and 12.7Hz，resp. HCO）
N-アセチル-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサミン（14-2）の調製
1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサノール（3-13）（3.0g，17.65mmol）を、アセトニトリル（20ml）に、しっかり撹拌した溶液に、発煙性硝酸（6ml）を45℃以下の温度を維持しながら滴下して加えた。その反応混合物を45〜50℃で６時間撹拌し、次に冷却し、水（30ml）に注ぎ入れ、アンモニウム水溶液で中和した。水層をエーテル（3*30ml）で抽出した。結合したエーテル層を生理的食塩水（30ml）で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し蒸発させた。粗抽出物を、冷アセトニトリルから結晶化し、2.23g（60％）の14-2を白色結晶として得て、融点は110℃であった。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.90 and 1.12（total 12H，both s，3,5-CH3）；1.33（3H，s，1-CH3）；1.88（3H，s，CH3C=O）；0.75-2.25（6H，m．リングプロトン）and 5,3ppm（1H，br s，NH）
N-メトキシカルボニル-N,1,3,3,5,5-ヘキサメチルシクロヘキサミン（15）の調製
N,1,3,3,5,5-ヘキサメチルシクロヘキサンアミン塩酸塩（5-20）（1.13g，5.13mmol）および炭酸ナトリウム（Na2CO3）（1.63g，15.4mmol）をＴＨＦ（30ml）に懸濁した溶液に、メチルクロロ蟻酸塩（0.97g，0.8ml，10.3mmol）を一部分を加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次に水（50ml）で希釈し、エーテル（3*30ml）で抽出した。結合した有機層を10％硫酸カリウム、生理的食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させた。粗抽出物をフラッシュクロマトグラフィーで、ヘキサン−酢酸エチル（6：1）混合物で抽出して精製し、0.90g（78％）の１５をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.93 and 1.07（total 12H，both s，3,5-CH3）；1.23（3H，s，1-CH3）；1.0-1.4（4H，m，4-CH2 and 2,6-CHeq）；2.56（2H，d，J=14Hz，2,6-CHax）；2.87（3H，s，CH3N）and 3.64ppm（3H，s，CH3O）
エチル（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシリデン）シアノ酢酸塩（（3,3,5,5-tetramethylcyclohexylidene）cyanoacetate）（16）の調製
3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサノン（2-13）（2.64g，17mmol）、エチルシアノ酢酸塩（1.93g，17mmol）、酢酸（0.2ml）、及び酢酸アンモニウム（0.2g）をベンゼン（6.4ml）に溶解した混合物をディーン−スターク装置（Dean-Stark apparatus）で１０時間環流した。このベンゼン（30ml）に生理的食塩水（30ml）を加え、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させた。粗抽出物をフラッシュクロマトグラフィーで、ヘキサンで抽出して精製し、2.0g（50％）の16をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：1.01（6H，s，3,5-CH3qd）；1.05（6H，s，3,5-CH3ax）；1.34（3H，t，J=7Hz，エチル-CH3）；1.42（2H，s，4-CH2）；2.46 and 2.79（total 4H，both s，2,6-CH2）；and 4.29ppm（2H，q，J=7Hz，CH2O）
（1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキシル）シアノ酢酸塩（17）の調製
マグネシウム（0.46g，19.2mmol）およびヨウ化メタン（2.84g，20mmol）から調製したヨウ化アルキルマグネシウムをエーテル（12ml）に溶解した冷溶液に、塩化銅（１）無水物（0.8g，8mmol）を加えた。その混合物を不活性ガス中で５分撹拌し、エチル（3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキシリデン）シアノ酢酸塩（16）（2g，8mmol）をエーテル（10ml）に溶解した溶液を、-15℃未満の温度に維持しながら滴下して加えた。ケトンを添加し終えた後、その反応混合物を３時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で慎重に中和した。伝統的なグリニャール反応を行い、粗生産物を得て、シリカゲルカラムで石油エーテル−酢酸エチル混合物（20：1）で抽出し、1.0g（47％）の17をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.98（9H，s，3,5-CH3eq and 1-CH3）；1.06（6H，s，3,5-CH3ax）；1.31（3H，t，J=7Hz，エチル-CH3）；1.2-1.5（6H，m，リングプロトン）；3.41（1H，s，α-CH）and 4.25ppm（2H，q，J=7Hz，CH2O）
1-シアノメチル-1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキサン（18）の調製
（1,3,3,5,5-ペンタメチルシクロヘキシル）シアノ酢酸塩（17）（1g，3.7mmol）、塩化リチウム（0.05g）および水（0.15ml）をDMSO（2.5ml）に溶解した混合物を150〜160℃で４時間加熱した。その溶液を水（70ml）に注ぎ入れ、エーテル（4*20ml）で抽出した。エーテルを生理的食塩水（2*50ml）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させた。粗生産物をシリカゲルカラムで石油エーテル−酢酸エチル（20：1）混合物で抽出し、0.66g（94％）の18をオイルとして得た。
1H NMR（CDCl3，TMS）δ：0.98（9H，s，3,5-CH3eq and 1-CH3）；1.02（6H，s，3,5-CH3ax）；1.21（3H，s，リングプロトン）；1.31（3H，s，リングプロトン）and 2.31ppm（2H，s，CH2CN）IR（neat）ＶCN＝2242cm-1
アルキルシクロヘキサンアミン塩酸塩5-1〜5-25の一般的な調製方法
４、10、または13〜15、18のエーテル溶液を水素化リチウムアルミニウム（４等量）をエーテルに懸濁した撹拌溶液に滴下して加え、これを氷浴で冷却した。その反応混合物を、初期物質の変換が完了するまで、４、10、13の場合は室温で撹拌し、14、15、18の場合は環流した（薄層クロマトグラフィー  コントロール）。残留した塩化リチウムアルミニウムを水で分解して、水層を分離しエーテルで２回抽出した。結合したエーテル層を生理的食塩水で洗浄し、水酸化ナトリウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させた。得られたアミンを特性決定を行わずに塩酸で処理した。そのアミンのヘキサン溶液に塩化水素ガスを通すことによって、またはエーテルに溶解した１Ｎ塩化水素をそのアミン溶液に加えることによって、アミン塩酸塩を調製した。両方の場合において、溶媒は塩化水素を添加することで除去され、その残留物をヘキサンまたはアセトニトリルで処理し、結晶状の産物をろ過して得て、5-1〜5-25を極めて高い純度で得た。
化合物5-1〜5-25物理学的特性と収率は、表４にまとめた。
化合物5-1〜5-25の1H NMRスペクトルデータは、表５にまとめた。
追加の1-アミノアルキルシクロヘキサン、およびそれらの塩酸塩は、同じ、または類似の方法で調製された。該塩酸塩は、遊離塩基、または“酸を付加した塩”で開示したような、その他の酸を付加した塩に変換することができる。
3,3,5,テトラメチルシクロヘキシルメチルアミン塩酸塩（5-26）の調製
1-ニトロメチル-3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサン（6）（1.1g，5.63mmol）を、エタノール（140ml）およびクロロホルム（280ml）の混合物に溶解した溶液を、10％ Pd／C（280mg）上で、5atmで20時間水素化し、ろ過し、蒸発させた。粗生産物をエーテルで処理し、ろ過してエーテルで洗浄し、0.57g（50％）のアミン（5-26）を得た。
物理特性と化合物5-26の収率は、表４にまとめた。
化合物5-26の1H NMRスペクトルデータは、表５にまとめた。
アミン5-27を、公知の方法［16］によって調製した。
アミン5-28［17］を、対応するアジド［18］から一般的な方法で調製した。全ての物理的特性は、［17］に記載のデータとよく一致していた。
＊  ＊  ＊
調製された全ての化合物の純度は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（MN-OV-1，25m*0.53，df＝1.0μm，50〜270℃（10℃／min）によって調べられた。
＊  ＊  ＊
酸を付加した塩
通常の方法に従った酸を付加した塩の形成に適した酸として、塩酸、臭化水素酸、メタンスルホン酸、イソチオン酸、硫酸、リン酸、およびスルファミド酸からなる無機塩類、ならびに酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、および安息香酸からなる有機塩類が挙げられ、これらはほんの一例である。その他の医薬的に許容できる酸を付加した塩（acid addition salts）を調製することができ、必要であれば、一つの酸を付加した塩を、中和することによってその他の塩に変換することができ、例えば塩酸塩を遊離塩基にし、次に異なる選択された無機または有機塩類で再び酸性化し、その他の医薬的に許容できる酸を付加した塩を当業界で周知の塩として調製する。
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医薬組成物
本発明の活性成分は、一つまたはそれ以上の通常の補助剤、担体、希釈剤と共に、医薬組成物およびそれらの単位用量の形態にされ、さらにそのような形態では、被膜もしくは非被膜錠剤、もしくは充填カプセルなどの固体として、または、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、もしくはその同様のもので充填したカプセルなどの液体のような、全ての経口投与用として成形される；直腸内投与のための坐薬またはカプセル、または非経口（静脈内または皮下を含む）の無菌的な注射用溶液の形態において使用されうる。このような医薬組成物およびそれらの単位用量の形態は、通常のまたは特殊な適用において、追加の活性化合物または原理を用いて、または用いないで、通常のまたは新規の成分を含むことがあり、さらにこのような単位用量形態は、使用される１日の予定用量範囲に比例した、活性成分の任意の適切な効果的な量を含みうる。従って１錠剤あたり20〜100ミリグラム、またより広くは10〜250ミリグラムの活性成分を含む錠剤は、代表的な単位用量の形態に適している。
処理方法
それらの高い活性および低い毒性のために、同時に最も好ましい薬効指標を示しており、例えば動物（ヒトを含む）の体のような対象への、必要に応じて、それらに敏感な兆候や状態、またはこの応用における代表的なその他の兆候や状態の治療、軽減、もしくは改善、一時的緩和、または除去のために投与され、同様に好ましくは、一つまたはそれ以上の医薬的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤と同時に、または結合させた形態で投与され、特に好ましくは、経口、直腸内、または非経口（静脈内、または比かを含む）によって、またいくつかのケースにおいては局部的経路によっても、それらの医薬組成物の形態において有効量を投与されうる。適切な用量範囲は、投与の正確な方法、投与の形態、投与が目的とする効能、関与する目的物、その関与する目的物の体重、および担当の医師または獣医の選択と経験に従って、１日１〜1000ミリグラムで、好ましくは１日10〜500ミリグラム、および特に１日50〜500ミリグラムである。
代表的な医薬組成物の実施例
一般的に使用される溶媒、助剤、および担体の補助で、反応生成物は、錠剤、被膜錠剤、カプセル、点滴溶液、坐薬、注射および浸剤用製剤などに加工され、さらに経口、直腸内、非経口、および付加的経路によって治療的に適用されうる。代表的な医薬組成物を以下に示す。
（ａ）活性成分を含む経口投与に適した錠剤は、通常の錠剤作製技術によって調製される。
（ｂ）坐薬のために、任意の通常の坐薬ベースが活性成分の通常の製造工程によりそれらと結合する方法に使用され、例えば室温で固体で、体温またはその近傍の温度で溶解するポリエチレングリコールのようなものである。
（ｃ）非経口（静脈および皮下を含む）の無菌溶液のために、例えば塩化ナトリウムおよび再蒸留水などの通常の成分の一般的な量とともに、活性成分が、例えばろ過、アンプルまたは点滴静脈注射ボトルへの無菌充填、および高圧蒸気滅菌などの通常の方法に従って使用される。
その他の適した医薬組成物は、当業者にはすぐに明白となるであろう。
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これはゼラチンのカプセルに充填される。
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15mlの該溶液を、アルミニウムエアロゾル缶に充填し、投与量値でキャップをして、3.0バールでパージした。
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1.8mlの溶液は、接着性の焼成ホイルでカバーしてフリース上に置いた。そのシステムは保護用ライナーで覆われており、使用時に取り外される。
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ポリブチルシアノアクリレートのナノパーティクルは、水／0.1N塩酸／エタノール混合物を重合化溶媒として乳化重合することによって調製される。懸濁液中のナノパーティクルは、最終的に真空下で親液性化される。
薬理学−概要
本発明の活性の原理、ならびにそれらの医薬的組成物およびそれを扱う方法は、特殊で冒険的で、予想できない特性によって特徴づけられており、ここで請求している“全体としての主題”を不明確にしている。該化合物と、その医薬的組成物は、標準的に用いる信用できる試験方法において、以下に示す価値のある特性と特徴を開示している：
それらは、迅速な遮蔽／非遮蔽速度論、および強電圧依存性を持つ、全身性の活性がある、非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬であり、従って、グルタミン酸輸送系の障害を含む、広範囲のＣＮＳ疾患を治療するために、生きている動物の宿主へ応用、または投与することによる、治療、除去、苦痛の軽減、一時的緩和、および応答状態の改善における有効性を持つ。
薬理学
インビトロ
受容対結合研究
雄スプラギーダウレイラット（Sprague-Dawley rat）（200〜250g）を断頭し、迅速にそれらの脳を取り出した。その皮質を切開し、ガラス−テフロンホモジナイザーを用い、20倍量の氷冷した0.32Mしょ糖液でホモジナイズした。そのホモジネートを、1000×ｇで10分遠心分離した。生じた沈殿を捨て、上清を20,000×ｇで20分遠心分離した。生じた沈殿を20倍量の蒸留水に再懸濁し、8000×ｇで20分遠心分離した。次に上清とバフィーコートを、50mmolトリス-HCl（pH8）中で、３回遠心分離（48,000×g，20分）した。全ての遠心分離段階は、４℃で行われた。50mMトリス-HCl（pH8.0）の５倍量で再懸濁した後、この膜懸濁液を迅速に-80℃で凍結した。分析の日に、該膜懸濁液を融解し、50mMトリス-HCl（pH8.0）で再懸濁し、48,000×ｇで20分遠心分離することを４回行うことで洗浄した。最終的な沈殿を分析用バッファーに懸濁した。この最終的な膜調製液中のタンパク量を、改良したローリー法によって測定した。本研究に用いられた最終的なタンパク濃度は250〜500μg/mlであった。
膜懸濁液を50mMトリス-HCl（pH8.0）で再懸濁し、インキュベーションした。［3H］-（+）-MK-801（23.9Ci/mmol，5nM）をグリシン（10μM）、グルタミン酸塩（10μM）、およびタンパク0.1〜0.25mg（総量は0.5ml）と共にバイアルに添加することでインキュベーションを開始し、様々な濃度の薬剤を試験した（10種の濃度を二連で試験した）。該インキュベーションを室温で120分継続し、使用した状態で常に平衡が達成していた。非特異的結合はラベルしていないMK-801（10μM）の添加によって調べた。インキュベーションは、ミリポアフィルターシステムを用いて終了した。そのサンプルを2.5mlの氷冷した分析用バッファーで、シュライヒャー＆シュエル（Schleicher＆Schuell）のガラス繊維フィルター上で一定吸引しながら３回リンスした。ろ過はできるだけ迅速に行われた。続いて分離とリンスを行い、該フィルターをシンチレーション液（5ml；Ultima Gold）へ置き、フィルター上に残存する放射線活性を通常の液体シンチレーションカウンター（ヒューレット  パッカード、リキッドシンチレーションアナライザー）で測定した。
パッチクランプ法
ラット胎児（E20〜E21）から海馬を採取して、次に氷上でカルシウムおよびマグネシウムフリーのハンクス液（Hank's buffered salt solution（Gibco））に移した。0.66％トリプシン／0.1％ DNA分解酵素（Sigma）とともに８分のプレインキュベーションに続いて、細胞を0.05％DNA分解酵素／0.3％オボムコイド（Sigma）中で機械的に遊離させた。その遊離細胞を次に18×gで１０分遠心分離し、最小培地（Gibco）中で再懸濁し、濃度150,000細胞・cm-2で、ポリ-L-リジン（Sigma）-プレコーテッドプラスティックペトリ皿（Falcon）上に載せた。該細胞を、５％ウシ胎児血清および５％ウマ血清（Gibco）を含む炭酸水素ナトリウム／HEPESバッファー最小培地で栄養添加し、37℃、５％二酸化炭素、95％湿度でインキュベーションした。その培養液は、シトシン-β-D-アラビノフラノシド（20μg，Sigma）との更なるグリア有糸分裂の阻害で、インビトロで約７日間後に完全に変換された。その後、該培養液を部分的に週２回変換した。
パッチクランプの実験記録は、EPC-７増幅器（List）の補助で、室温（20〜22℃）で、全ての細胞形態において、研磨ガラス電極（polished glass electrode）（4〜6m  Ω）を用いてこれら多くのものから得られた。試験物質は、一般的な流出量（10〜20ms変換時間）の、注文作製のファストスーパーフュージョンシステム（fast superfusion system）の切り替えチャンネルによって増幅された。細胞内溶液の組成は；CsCl（120），TEACI（20），EGTA（10），MgCl2（1），CaCl2（0.2），グルコース（10），ATP（2），cAMP（0.25）であり、ｐＨはCsOHまたはHClで7.3に調節した。細胞外溶液は、以下の基本的な組成（mM）；NaCl（140），KCl（3），CaCl2（0.2），グルコース（10），HEPES（10），スクロース（4.5），テトロドトキシン（TTX 3*10-4）からなる。１μｍのグリシンは、グリシンB受容体の約80〜85％の活性化がおこるのに十分な濃度であって、全ての溶液に存在する。安定した細胞から得られた結果だけを最終分析に用いており、すなわち、試験された拮抗薬による少なくとも75％の減少によってＮＭＤＡへの反応が回復することとした。
興奮毒性（excitotoxicity）
［23］に記載されている一般的な方法で、皮質ニューロンを解離して、17／18日齢ラット胎児（ウイスター系）の大脳皮質より得た。短時間トリプシン処理し、火造りのパスツールピペットで穏やかに細かく切断した後、その細胞懸濁液を遠心沈殿法によって洗浄した。B27（GIBCO）を添加した血清フリーの神経基礎溶液（Neurobasal medium）中で懸濁し、その後、５×104細胞／ウェルの濃度で、ポリ-L-リジン（Sigma；0.2mg/ml，20時間、４℃）で被膜し、かつラミニン（Sigma；２μg/ml，１時間、37℃）で被膜した96ウェルプレート（Falcon）上にプレーティングした。皮質ニューロンは、37℃、湿度10％、二酸化炭素／90％空気で維持された。プレーティングして１日後、グリア細胞増殖を阻害するために、５μＭのシトシン-β-D-アラビノフラノシド（Sigma）をそれぞれのウェルに添加した。インビトロでその培養液は４日後に初めて交換し、次に４日ごとに培養液の３分の２を星状細胞条件培地（astrocyte-conditioned medium）で置き換えた。12〜14日の皮質ニューロン培養物は、試験に用いられた。
新しく生まれたラットの星状細胞を、方法［24］に従って非酵素的に単離した。２日齢のラットからすばやく脳半球の両方を切開して取り出し、80μmガーゼでろ過し、パスツールピペットで破砕した。10％ウシ胎児血清（FCS，Hydone）、2mMグルタミン（Gibco）、および50μg/mlゲンタマイシンを補足したダルベッコ改変必須培地（Dulbecco's modified essentrial medium, DMEM， Gibco）で細胞懸濁液を作製し、未処理のプラスティックカルチャーフラスコ（Corning；75cm3）に移した。移してから２日後、該フラスコを回転式プラットフォームで10分間振とうし、小グリア細胞を除いた。その培養物を14日以内に融合させ、培養液を週に２回交換した。その後、グリア細胞の単層を広範囲にわたって血清フリーの神経基礎溶液（Gibco）で洗浄し、血清を取り除く。次にフラスコを数回振とうすることで、乏突起神経膠細胞とニューロンを取り除いた。調製した培地を主要な星状細胞から得るために、B27とグルタミンで補足した新鮮な神経基礎溶液で、培養物をインキュベートした。２〜３日ごとに、その調製した培地を新鮮な培地で４回まで交換した。
EAAへの露出は、100μMグルタミン酸塩を含む血清フリー神経基礎溶液中で行われ、薬剤が試験された。20時間のインキュベーション後、細胞毒効果を位相差顕微鏡下で形態学的に試験し、MTTテスト（Promega）を用いて生存率を測定することにより生化学的に定量した。この比色分析は、生細胞のミトコンドリアによるテトラゾリウム成分（MTT）の不溶性ホルマザンへの還元を測定するものである。皮質ニューロンを染色液と供に約１〜４時間インキュベーションした後、可溶化液を加えて細胞を溶解させ、着色生産物を可溶化させた（37℃、10％CO2、９０％相対湿度で、一晩インキュベーションした）。これらのサンプルを次にElisa plate reader（Thermomax, MWG, Biotech）を用いて570nmの波長で測定した。着色生産物の量は、生細胞の数と正比例していた。
インビボ
抗痙攣薬活性
１ケージごとに５匹を収容したＮＭＲ雌マウス（18〜28g）を、最大電気ショック（MES）テスト、および運動障害テストに用いた。全ての動物は、１２時間の明−暗サイクル（午前６時にライトをつける）条件下、および調節された温度（20±0.5℃）で、自由に水と食物を与えられ続けた。全てのテストは、午前10時から午後５時の間に行われた。もしその他の状態（下記を参照）以外は、テストされた薬剤は痙攣の誘導の３０分前に腹腔内に注射された。全ての化合物は、0.9％生理的食塩水に溶解させた。
MESテストにおいて、骨格筋弛緩薬作用（牽引反射）および運動協調（回転軸）のテストも同時に行われた。牽引反射テストでは、マウスは前足を水平軸上に置きその10秒以内に四肢をワイヤー上に置くことを要求された。運動失調（運動協調）をテストするために、マウスは回転軸（5rpm）上に置かれ、１分間軸上に居続けることを要求された。これら全ての各テストの反復において基準を満たさなかったマウスだけが、骨格筋弛緩または運動失調の症状を現しているものとみなされた。これらのテストは、角膜電極によって適用されたMES（100Hz，0.5秒のショック持続時間、50mAのショック強さ、0.9msのインパルス持続時間、Ugo Basile）によって実行された。持続性引きつけの存在が記録された（体に対する最小角度である90度の角度で後ろ足を持続的に伸長）。その目的は、計数的な用量の反応に対してリッチフィード−ウィルコキソンテストを使用することで、記録された全てのパラメータ（抗痙攣薬活性、および運動性副作用）に対するED50を得ることである。副作用（運動失調または骨格筋弛緩作用）に対するED50を、電気ショック痙攣の拮抗薬のED50で割ったものが、薬効指標（therapeutic index；TI）として用いられた。
統計的解析
パッチクランプのIC50、興奮毒性、および結合性の研究において、グラフィットコンピュータープログラム（Grafit computer program）（Erithacus Software、イギリス）を用いて４つのパラメータの理論方程式に従って計算された。次に結合性の研究におけるKi値は、チェンとプルソフ（Cheng and Prusoff）に従って決定された。結合値は、３〜５回の計測の平均値±SEMである（それぞれ二連で測定した）。
インビボテストのぞれぞれにおいて、拮抗薬の４〜７用量を試験され（用量に対し、５〜８匹の実験動物）、０〜100％効果の集積に対するプロビット解析（リッチフィールド−ウィルコキソン）により段階的なＥＤ50を計算した。ＥＤ50は、95％信頼限界（Ｃ１）で表示された。ピアソンプロダクトモーメント相関分析（Pearson product moment correlation analysis）（Sigma Stat, Jandel Scientific）を用いて、インビトロで効力を、インビボで抗痙攣薬活性を比較した。
結果
結合性
全てのシクロヘキサンは、ラット皮質膜へＩＣ50４〜150μMの［3H］-（+）-MK-801結合を示し、その一方でチェン−プルソフ方程式で評価されたKi値は２倍低かった（表７参照）。
パッチクランプ
培養された海馬神経の、ＮＭＤＡ（70mVでグリシン１μＭの200μM）に対する定常状態内向き膜電流反応は、ＩＣ50が1.3〜99μMの試験されたシクロヘキサンによって拮抗作用を示した（表７）。ピークおよび定常状態電流は同程度に影響を受けており、それらの効果がグリシンB部位で起こっている見込みをなくしている。それらの遮蔽の明確な使用と電圧依存性によって、この拮抗作用の非競合的原理は強く支持されている。より弱い拮抗薬は、より速い速度、強い電圧依存性を示した。
興奮毒性
ほとんどの低いμＭ濃度のシクロヘキサンが、インビトロで効果的な神経防護作用があり、その際、その点でほとんど効力を有すると思われるMrz2/579を示した（表７参照）。ほとんどの化合物において、完全防護は20μMで得られた。
インビボ
抗痙攣活性
全てのシクロヘキサン誘導体が、マウスのMES誘導性痙攣を阻害し、その際ED50は腹腔内で3.6〜50mg/kgであった（表７）。また選択された化合物は、PTZ、およびNMDA誘導性痙攣に対しても試験され（方法は［20，21］を参照）、MESテストと効力を比較した（例えば、Mrz2/579は、PTZおよびNMDAで、それぞれＥＤ50が5.5および3.7mg/kgを示した。）。それらの抗痙攣性効力は、続く静脈内投与によって増加する（例えば、Mrz2/579 ED50は2.5mg/kg）。Mrz2/579はまた、続く皮下注射で活性化し、続く経口投与でいくらか効力が低下した（それぞれＥＤ50は46、およびmg/kgは13.7）。抗痙攣薬の範囲内での用量において、筋弛緩作用（牽引反射）および運動失調（回転軸テスト）をいくつかのシクロヘキサンで観察した。それらの大部分において、50mg/kgまで急性致死性は見られなかった。
相関分析
３つ全てのインビトロ分析の間で、非常に良く関連した相関性が見られた（全ての相関係数＞0.70、ｐ＜0.001）。インビトロにおける拮抗するＮＭＤＡ誘導性内向き電流、およびＮＭＤＡ誘導性毒性に対する防護の間でも、インビボの抗痙攣活性に関する良く関連した相関性が見られた（相関係数＞0.56、ｐ＜0.01）。
0003963488.tif 000023
シクロヘキサン誘導体、および標準的な非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬の［3H］-（+）-MK-801結合における効果は、ＮＭＤＡはパッチクランプ実験において電流を誘導し、培養した皮質ニューロン中のグルタミン酸毒性を誘導し、およびインビボのMES痙攣を誘導した。結合性Ki値は、３〜５回の実験の平均値±ＳＥＭである。パッチクランプおよびグルタミン酸毒性実験におけるＩＣ50（±ＳＥＭ）は、15〜85％阻害を現す少なくとも３点の濃度で、かつ濃度に対して少なくとも５つの細胞において決定された。MES誘導性引きつけにおいて、値はmg/kgのＥＤ50である（信頼限界の95％が括弧内に示されている）。
加えて、それらの少なくとも部分的なアミン置換によって、本発明の化合物はまた非ＮＭＤＡ効能への適用に効果的であり、免疫調節薬活性、抗マラリア効力、抗ボルナウイルス活性、および抗Ｃ型肝炎活性を示した。
＊  ＊  ＊
結論として、前述のことから本発明は、新規で、価値のある、かつ予想外の適用、および本発明の化合物の用途、ここで該化合物は本発明に従った活性成分を含むものであり、同様にそれらの新規の医薬組成物、およびそれらの調製方法、ならびにそれらを用いた治療方法、前述のより特に列挙された特徴および利点を提供するものである。
本発明の活性薬剤およびその組成物の高い活性は、報告したテスト結果により、低級動物と同様にヒトにおいても、その有用性の高い活性に基づく利用性を示唆している。しかしながらヒトにおける治療的な評価は完成していない。ヒトで使用するための本発明の範囲内に適合する任意の化合物または組成物が、頒布または市場に出回ることは、このような問題に対して責任を持ち、判断を下す権限を持つ、米国のフェデラル  フード  アンド  ドラッグ  アドミニストレーション（Federal Food and Drug Administration）のような政府機関によって、前もって承認を受けなければならないだろう。
結論
本発明の1-アミノ-アルキルシクロヘキサンは、迅速な遮蔽／非遮蔽速度論および強い電圧依存性を持つ、全身性の活性を持つ、非競合的ＮＭＤＡ受容体拮抗薬の新規のクラスを代表している。それらの比較的低い効力および関連した迅速な速度論の観点において、グルタミン酸輸送障害を含む広範囲のＣＮＳ疾患において、それらは有効な治療となるであろう。
従ってこれらの化合物は、動物体、特にヒトへの以下の疾患における応用を見出している。１．発作、外傷、酸素不足、低血糖、および肝性脳症中の虚血のような、急性興奮毒性。２．アルツハイマー病、血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、AIDS−網膜変質、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥーレット症状群、運動ニューロン疾患、ミトコンドリア機能異常、コルサコフ症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病などの、慢性の神経退行性疾患。３．例えば慢性疼痛、薬剤耐性、依存性、および麻薬中毒（例えば、オピエイド、コカイン、ベンゾジアゼピン、およびアルコール）などの中枢神経系における、長期の形成的な変化に関連する疾患。４．てんかん、遅発性ジスキネジー、精神分裂症、不安、うつ病、急性疼痛、痙性、および耳鳴り。５．加えて既に述べたように、それらの少なくとも部分的なアミン置換によって、本発明の化合物はまた非ＮＭＤＡ効能への適用に効果的であり、免疫調節薬活性、抗マラリア効力、抗ボルナウイルス活性、および抗Ｃ型肝炎活性を示す。
本発明は、実施の厳密な詳細に限定されるものではなく、また明白な変更や同等のものとして開示および説明された厳密な化合物、方法、工程、または実施形態は、当業者にとって明白であり、それゆえに本発明は、添付の請求項に合法的に一致している前範囲によってのみ限定される。
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