(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１１４で示されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加され、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドを生産する機能を有する、放線菌ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７０。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをコード化する、遺伝子。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドをコード化して、以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−３４２で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｄ）（ｃ）の塩基配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加され、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項５】
エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性を有する、請求項１記載のポリペプチドのフラグメント。
【請求項６】
放線菌ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７０を培養し、当該培養物中に請求項１記載のポリペプチドを蓄積し、当該ポリペプチドを採取する過程より成る、ポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドの前駆体であり、以下の（ｅ）または（ｆ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｅ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１６０で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｆ）（ｅ）のアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換若しくは付加され、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性を有する、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７記載の前駆体ポリペプチドをコード化する、遺伝子。
【請求項９】
請求項７記載の前駆体ポリペプチドをコード化して、以下の（ｇ）または（ｈ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｇ）配列表の配列番号４に示す、塩基番号１−４８０で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｈ）（ｇ）の塩基配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加され、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする、遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）の感染症に有益な抗ウイルス剤、特に、ＨＩＶ−１の感染症を抑制し得るポリペプチド、当該ポリペプチドをコード化するＤＮＡ、及び当該ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＩＶ−１ウイルスにより引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対する治療法としては、現在、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤が使用されている。逆転写酵素阻害剤としては、ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ（ＡＺＴ，３’−ａｚｉｄｏ−２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ（ｄｄＩ，２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）、ｚａｌｃｉｔａｂｉｎ（ｄｄＣ，２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ｓｕｔａｖｕｄｉｎｅ（ｄ４Ｔ，２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙ−２’，３’−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ（３ＴＣ，３’−ｔｈｉａｃｙｔｉｄｉｎｅ）などのヌクレオチド系阻害剤と、非ヌクレオチド系阻害剤のｎｅｖｉｒａｐｉｎｅが用いられている。
【０００３】
ヌクレオチド系阻害剤は長期投与によって重篤な副作用を示すだけでなく、投与開始後、約一年で耐性株が出現することが知られている。一方、非ヌクレオチド系阻害剤は副作用は少ないが、作用の特異性が高いために、耐性株が早期に出現する。プロテアーゼ阻害剤としては現在、ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ、ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、ｉｎｄｉｎａｖｉｒなどが用いられている。プロテアーゼ阻害剤は単独でも良好な抗ウイルス活性を示すが、その効果はおおむね一時的で、ＨＩＶプロテアーゼのアミノ酸配列の変異による感受性の低下が見られる。加えて体内での安定性や、消化器障害などの副作用の点でも問題を抱えている。
【０００４】
最近、米国ＡＩＤＳ臨床治験グループはＡＺＴとｄｄＩの併用、又はＡＺＴとｄｄＣの併用療法が、それまで第一選択療法とされていたＡＺＴ単独療法に比べて（１）延命効果  （２）ＡＩＤＳ発症阻止  （３）ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＣＤ）４陽性細胞数減少  の３指標のすべてにおいて、より良好な結果をもたらす事を報告した。また、プロテアーゼ阻害剤の併用についても報告が相次ぎ、２つの逆転写酵素阻害剤（例えばＡＺＴ＋ｄｄＩやＡＺＴ＋３ＴＣ）との併用ではいずれのプロテアーゼ阻害剤もきわめて強い抗ウイルス活性を発揮し、６０−９０％の症例で血中ウイルス量を検出限界以下に抑えることが分かった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、作用点や作用機構の異なる抗ＨＩＶ薬を多剤併用して、体内ウイルスを格段に低レベルに抑え込む事により、発症を阻止できる可能性が示唆された。しかし、多剤耐性のＨＩＶ−１株の出現や長期投与による副作用等の問題点も依然として残されている。また、多剤併用療法によってウイルスの増殖は抑制されるが、ウイルス感染細胞が完全に消失するわけではない。最近、ＨＩＶは長期間の潜伏期においても体内で大量に産生され、生体はそれに対する免疫的排除を繰り返すというウイルスと宿主の動的な均衡の姿が明らかとなった。従って、ＡＩＤＳ発症予防のためには、潜伏期でのウイルス複製を抑え血中ウイルス量を低く保つことが重要であり、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤に加えてＨＩＶの感染初期過程をはじめとするＨＩＶの生活環の逆転写酵素及びプロテアーゼ以外の部位をターゲットとした抗ＨＩＶ薬の開発が望まれている。
【０００６】
ＨＩＶの感染は、ＨＩＶ表面蛋白質であるｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ１２０（ｇｐ１２０）と、宿主細胞表面の受容体であるＣＤ４との結合を介して、宿主細胞に接着して細胞内へ侵入する事により成立する。したがって、ｇｐ１２０とＣＤ４の結合を阻害する物質はＨＩＶと細胞の接着を阻害し、ＨＩＶの感染を防御できると期待されるため、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を阻害する試みが試行された。一例として、可溶性のＣＤ４を遺伝子工学的に作成して、ヒトの体内に投与するような試みなども行なわれた。しかしながら、このような方法では試験管内では阻害活性が認められるものの、生体内では半減期が短いなどの理由で、抗ＨＩＶ活性は認められなかった。また、ヒトのＣＤ４をマウスの細胞に発現させても感染が起こらない事が明かとなり、第２の接着分子の存在が示唆されていた。
【０００７】
近年、この第２の受容体が、一群のケモカイン受容体であるとの報告が相次いだ。ＨＩＶは、マクロファージ指向性を示す株（Ｍ−トロピックＨＩＶ）とＴ細胞株指向性を示す株（Ｔ−トロピックＨＩＶ）の二つに大別されるが、これらのウイルス株間に見られる細胞指向性の差が、第２受容体の分子種の違いによる事が示された。すなわち、標的細胞が第２受容体としてＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５：Ｍ−トロピックＨＩＶ受容体）又は、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４：Ｔ−トロピックＨＩＶ受容体）のどちらを発現しているかの違いにより、決定されることが明らかとなった。これらの新たな知見から現在、ＨＩＶの標的細胞への侵入様式は次のように考えられている。まず、ｇｐ１２０とＣＤ４が結合し、続いて宿主細胞のＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４と結合する。これによりｇｐ１２０の構造が変化してｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ４１（ｇｐ４１）が裸出し、細胞膜に接着・侵入して巨細胞（シンシチウム）を形成する事により、感染が成立する。また、該当するケモカインはＨＩＶのケモカイン受容体への結合を競合的にブロックし、ＨＩＶの感染を抑制した。この一連の発見は感染と発症の機構の解明を加速しただけでなく、抗ＨＩＶ戦略にも新たな視点を提供した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、そのような機構に作用する抗ＨＩＶ薬物を得る目的で、エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１）を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する物質を、微生物の生産する代謝産物の中から探索した。その結果、新たに土壌から分離した、ストレインＫ９７−０００３菌株の培養液が、優れたＨＩＶ阻害活性を有することを見出した。尚、当該菌株はストレインＫ９７−０００３（ｓｔｒａｉｎＫ９７−０００３）として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７０）。
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明するが、これら好適形態の詳細な説明及び実施例は本発明の有効範囲を限定または制限する事を何ら意味するものではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明者らは、ストレインＫ９７−０００３菌株の培養液から、エンベロープ糖タンパク質を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する物質を分離精製した結果、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得た。この物質は従来全く知られていない事から、本物質をＫ９７−０００３ペプチドと命名した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を実質的に含み、エンベロープ糖タンパク質を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合を阻害して、抗ＨＩＶ活性を有するＫ９７−０００３ペプチドを提供するものである。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、前駆体である配列番号２における第４７番目のアラニン以降のアミノ酸配列を示したものである。
【００１１】
本発明において、配列番号１で示されるアミノ酸配列を実質的に含む、Ｋ９７−０００３ペプチドをコード化するＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡとして、例えば配列番号３で示される塩基配列を含むものが挙げられる。更に、本発明は配列番号２で示されるアミノ酸配列を実質的に含む、Ｋ９７−０００３ペプチドの前駆体をコード化するＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡとして、例えば配列番号４で示される塩基配列を含むものが挙げられる。また、本発明は、放線菌に属し、Ｋ９７−０００３ペプチドを生産する能力を有する、ストレインＫ９７−０００３菌株を提供する。更に、本発明は、ストレインＫ９７−０００３菌株を培地に培養する事により、培養物中にＫ９７−０００３ペプチドを蓄積して、当該培養物からＫ９７−０００３ペプチドを採取することを特徴とする、Ｋ９７−０００３ペプチドの製造法を提供するものである。
【００１２】
ここで、「実質的に」とは、本発明のＫ９７−０００３ペプチドが天然の活性型Ｋ９７−０００３ペプチドの有する生物活性、特には、エンベロープ糖タンパク質発現ＨｅＬａ細胞とＣＤ４およびＣＸＣＲ４発現ＨｅＬａ細胞との融合を阻害する活性を有する限り、当該蛋白質に含まれるアミノ酸配列に１個叉は２個以上の置換、付加、欠失、挿入等の変異が生じてもよい事を意味する。また、本発明のＤＮＡが前記のＫ９７−０００３ペプチドを発現させる機能を保持する限り、当該遺伝子の塩基配列にこれらの変異に対応するコドン１個叉は２個以上の置換、付加、欠失、挿入等の変異が生じてもよいことを意味する。従って、例えば本発明のＫ９７−０００３ペプチド前駆体（配列番号２）に含まれるアミノ酸配列の第１（メチオニン）から４６番目（フェニルアラニン）の部分が欠失しているものなども、このアミノ酸配列の変化による蛋白質に含まれる。
【００１３】
従って、本発明において、Ｋ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列の一部が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドとは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上のアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチドを意味する。同様に、Ｋ９７−０００３ペプチド前駆体のアミノ酸配列の一部が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドとは、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上のアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００１４】
また、Ｋ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列をコード化する遺伝子の塩基配列と適切な条件下でハイブリダイズする遺伝子とは、配列表の配列番号３記載の塩基配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上の塩基配列の相同性を有する遺伝子を意味する。同様に、Ｋ９７−０００３ペプチド前駆体のアミノ酸配列をコード化する遺伝子の塩基配列と適切な条件下でハイブリダイズする遺伝子とは、配列表の配列番号４記載の塩基配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上の塩基配列の相同性を有する遺伝子を意味する。
【００１５】
なお、本発明のＫ９７−０００３ぺプチドに含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明のＤＮＡに含まれる。なお、上記の活性型Ｋ９７−０００３ペプチドとは、所謂成熟型のＫ９７−０００３ペプチドを意味し、Ｋ９７−０００３ペプチド前駆体とは、微生物外への分泌に用いられるシグナルペプチド配列領域を所謂成熟型のＫ９７−０００３ペプチドのＮ末端に有するものを意味する。
【００１６】
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０、６０アミノ酸部分を意味する。上記の、エンベロープ発現ＨｅＬａ細胞とＣＤ４及びＣＸＣＲ４発現ＨｅＬａ細胞との融合を阻害する物質Ｋ９７−０００３ペプチドを生産する能力を有する微生物は放線菌に属するが、当該物質Ｋ９７−０００３ペプチドの生産能を有するものであればよく、特に制限されることはないが、例えば本発明者らが分離したストレインＫ９７−０００３菌株は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状は下記のとおりである。
【００１７】
本発明者らが分離したストレインＫ９７−０００３菌株は、Ｋ９７−０００３ペプチドを生産する能力を有する微生物であり、当該菌株は以下のような菌学的性状を有する。当該菌株の栄養菌糸はオートミール寒天培地、栄養寒天培地上で中程度に発達し、分断が観察された。グルコース・硝酸塩寒天、シュークロース・硝酸塩寒天等の合成培地では生育しない。また、当該菌株の気菌糸はほとんどの培地で着生しないが、１０分の１濃度のＶ８ジュース寒天培地で僅かに着生が見られた。顕微鏡下の観察では、気菌糸は直線状を呈して、２０ヶ所以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の形は円柱状であり、その大きさは１．０×０．５μｍである。胞子の表面は平滑であり、菌核及び胞子嚢は見出されない。
【００１８】
イー．ビー．シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー．ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、第１６巻、第３１３頁、１９６６年）によって調べた、ストレインＫ９７−０００３菌株の培養性状を表１に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーシャン・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色標名と共に括弧内にそのコードを併せて記した。特記しない限り、以下に示すものは、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。
【００１９】
【表１−１】
0003962772.tif 000002
【００２０】
【表１−２】
0003962772.tif 000003
【００２１】
ストレインＫ９７−０００３菌株の生理学的諸性質は、以下の様である。
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天                            陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天              陰性
（ハ）グルコース・ペプトン・ゼラチン寒天      陰性
（ニ）トリプトン・イースト液                  陰性
（２）チロシナーゼ反応                          陰性
（３）硫化水素の生産                            陰性
（４）硝酸塩の還元                              陽性
（５）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）            陽性
（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）
（６）スターチの加水分解                        未生育
（７）脱脂乳の凝固（３７℃）                    陽性
（８）脱脂乳のペプトン化（３７℃）              陽性
（９）生育温度範囲                              １２〜３７℃
（１０）炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地）
ストレインＫ９７−０００３菌株は、炭素原としてグルコースを利用する。また当該菌株は、アラビノース、キシロース、ラフィノース、メリビオース、マンニトール、フルクトース、ラムノース、イノシトール及びシュークロースについては炭素原として利用しない。
（１１）セルロースの分解                          陰性
【００２２】
ストレインＫ９７−０００３菌株の菌学的性状を要約すると次の様である。当該菌株の細胞壁中のジアミノピメリン酸はメソ型である。生育培地の選択性については、当該菌株の栄養菌糸はオートミール寒天培地、栄養寒天培地上でよく発達し、分断が観察されたが、グルコース・硝酸塩寒天、シュークロース・硝酸塩寒天等の合成培地では生育しない。また、当該菌株の気菌糸は、１０分の１濃度のＶ８ジュース寒天培地で僅かに着生が見られた。気菌糸の形態は直線上であり、長い胞子鎖を形成する。胞子の表面は平滑である。培養上の特性として、当該菌株の栄養菌糸はベージュ系の色調を呈し、気菌糸はホワイト系の色調を呈する。これらの結果から当該菌株は、放線菌に属する１菌種であると判断された。
【００２３】
以上、Ｋ９７−０００３ペプチド生産菌について説明したが、菌の一般的性状として、当該菌株の菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではない。自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射または変異誘導物質、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工変異手段により変異する。このような人工的変異株及び自然変異株を含めて、Ｋ９７−０００３ペプチドを生産する能力を有し、放線菌に属する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの手法により細胞工学的に変異させた菌株も、本発明のＫ９７−０００３ペプチド生産菌として包含される。
【００２４】
本発明のＫ９７−０００３ペプチド生産菌の培養に際しては、放線菌の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。用いられる培地は微生物の資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地いずれも用いることができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、マルトース、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコール、メタン、エタン、プロパン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、グルタミン酸などのアミノ酸あるいはグリセロールなどが用いられる。
【００２５】
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、綿実油、大豆カゼイン、カザミノ酸、ファーマメディアなどが用いられる。無機物としてはリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩化コバルト、食塩などが用いられる。その他必要に応じて培地に微量の金属塩、ビタミン、サイアミンなど菌体の増殖あるいはＫ９７−０００３ペプチドの生産を促進する物質を加えることができる。また微生物が特定の物質を要求する場合は、生育に必要なものを加えることが必要である。これらのものはＫ９７−０００３ペプチドの生産に役立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
【００２６】
Ｋ９７−０００３ペプチド生産菌の大量培養には液体培地を用いた振盪培養法、通気撹拌培養法などが好ましい。培養温度は生産菌が発育し、Ｋ９７−０００３ペプチドを生産できる範囲で適用できる。培養はＫ９７−０００３ペプチド生産菌の性質に応じて、適宣選択して行なうことができる。培養物中のＫ９７−０００３ペプチドが培養液中に存在する場合には、菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法にしたがって、濾過、遠心分離などにより培養液中のＫ９７−０００３ペプチドと微生物菌体とを分離した後のＫ９７−０００３ペプチド溶液が使用される。Ｋ９７−０００３ペプチドが菌体内に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加してＫ９７−０００３ペプチドを可溶化して、水溶液として分離採取する。
【００２７】
このようにして得られたＫ９７−０００３ペプチド含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。ついでこの沈殿物を水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製しこれらの手段を用いて得られるＫ９７−０００３ペプチド含有溶液は、減圧濃縮、凍結乾燥等の処理にてより精製されたＫ９７−０００３ペプチドを得ることができる。Ｋ９７−０００３ペプチドは、合成ペプチドであることも可能である。
【００２８】
【実施例】
大腸菌を用いての遺伝子操作法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載されている方法に従った。また、市販のキットを使用した場合には、添付されている操作方法に従った。
【００２９】
１．ストレインＫ９７−０００３株の培養
寒天斜面培地で培養したストレインＫ９７−０００３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７０）を、グルコース２．０％、ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．１％、肉エキス０．４％、塩化ナトリウム０．２５％からなる液体培地 (ｐＨ７．６)を１００ｍｌ分注した５００ｍｌの三角フラスコ１本に一白金耳接種し、２７℃で３日間振盪培養して種培養液を得た。次いで、種培養液をグルコース２．０％、ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．１％、肉エキス０．４％、塩化ナトリウム０．２５％からなる液体培地（ｐＨ７．６）を２００ｍｌ分注した５００ｍｌの三角フラスコ２５本に２ｍｌずつ分注し、２７℃で３日間振盪培養した。
【００３０】
２．Ｋ９７−０００３ペプチドの精製
培養液は吸引濾過して、得られた上清をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラム（直径７５ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、東ソー製）に付し、通過液を回収した。次いで、この通過液をあらかじめ１０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＯＤＳカラム（直径５０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、（株）センシュー科学製）に付して、１０％アセトニトリル水溶液、２０％アセトニトリル水溶液、４０％アセトニトリル水溶液及び６０％アセトニトリル水溶液で、順次溶出した。ｇｐ１２０発現ＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４発現ＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害する活性のある画分を集めて、エバポレーターにてアセトニトリルを留去した。シンシチウム形成のアッセイについては後述する方法で行った。この溶液をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラム（直径５０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、東ソー製）に付して、５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で溶出した。シンシチウム形成の阻害活性を有する画分を集めて、あらかじめ５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＯＤＳカラム（直径３０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、（株）センシュー科学製）に付して、５％アセトニトリル水溶液及び６０％アセトニトリル水溶液を用いた９０分の直線濃度勾配で、２２５ｎｍの吸収を検出しながら、２．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出して活性画分を集めた。
【００３１】
得られた活性画分を集めてエバポレーターで溶媒を留去したところ、５０．１ｍｇの黄色粗物質を得た。これを８Ｍ尿素水溶液に溶解し、ガラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ）で濾過して、不溶物を除き、得られた濾液に蒸留水を加えて全量を４ｍｌとした。この溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＳＧ−１２０Ａ、内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂製）に数回に分けて付し、アセトニトリル−０．０１％  ＴＦＡ（１：９）及びアセトニトリル−０．０１％  ＴＦＡ（４５：５５）を用いて、４０分の直線濃度勾配法で２２０ｎｍの吸収を検出しながら、３．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して、３８分付近に溶出するピークを集めた。得られた画分を減圧濃縮して、Ｋ９７−０００３ペプチド２６．３ｍｇを得た。得られたペプチドを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した結果、当該ポリププチドの分子量は、約１４ＫＤａであった。（図１）。
【００３２】
３．Ｋ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列の決定
Ｋ９７−０００３ペプチドの一次構造を決定した。Ｋ９７−０００３ペプチドを還元ピリジルエチル化して、チオール基を保護した後に、トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ又はエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで消化して、生成したペプチド断片を自動エドマン分解（ＰＰＳＱ−１０プロテインシークエンサー、島津製作所）で分析を行った。得られた各々のペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列を連結して、Ｋ９７−０００３ペプチドの全アミノ酸配列を決定した。Ｋ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。アミノ酸配列データベース（ＰＩＲリリース５７、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴリリース３７、ＰＤＢリリース８５、ＤＡＤリリース５）を検索してところ、当該ペプチドの配列は、従来知られていないものであった。配列を決めたペプチド断片及び決定されたアミノ酸配列の位置を図２に示した。
【００３３】
４．Ｋ９７−０００３ペプチドをコードする遺伝子のクローニング
上記方法により決定されたＫ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列のうち、（１）Ｎ末端配列である、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｋ９７−０００３ペプチドにおける、アミノ酸配列番号１−７番目のアミノ酸）（２）Ｃ末端配列である、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（Ｋ９７−０００３ペプチドにおける、アミノ酸配列番号１０９−１１４番目のアミノ酸）に注目した。放線菌のコドン使用頻度を参考にして、これらのアミノ酸配列に対応する以下のような塩基配列のオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために合成した。
【００３４】
すなわち、センスプライマーとして5'-GCS TCS GTS ACS ATC CGS AAC-3' 、アンチセンスプライマーとして5'-CC SGT GTA CCA CTT CTG-3'を合成した。ストレインＫ９７−０００３菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記記載の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行なったところ、約３００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が認められた。この増幅断片を回収して、ＴクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＴクローニングサイトに、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造製）を用いて連結した。ライゲーション液の中において、大腸菌ｉｎｖαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換して、アンピシリン含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地上に出現したコロニーから、組み換えプラスミドを抽出した。組み換えプラスミドに挿入された断片の塩基配列を解析したところ、Ｋ９７−０００３ペプチドのアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列をコードする塩基配列が認められた。よってこのＤＮＡ断片を、Ｋ９７−０００３ペプチドをコード化する遺伝子の一部であると断定した。
【００３５】
ストレインＫ９７−０００３菌株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＭｂｏＩで部分消化して、約４０ｋｂの断片とした。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化したコスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）と連結して、Ｒｅａｄ・Ｔｏ・Ｇｏ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてファージ粒子にパッケージングした。
【００３６】
得られたファージ粒子を常法に従い、大腸菌ＸＬ−１  ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）に感染させた。ファージ溶液をアンピシリンを含有したＬＢ寒天培地上に、直径９ｃｍのシャーレ上に約１０００個の大腸菌コロニーが出現するようにまき、３０℃で一晩培養した。更に、ＨｉｇｈｂｏｎｄＮ＋（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を新しいアンピシリン（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地上にのせ、常法に従ってコロニーをナイロン膜上に移し取り、３０℃で一晩培養した。ナイロン膜に生育したコロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションを行なった。プローブとして用いたジゴキシゲニン標識ＤＮＡ断片は、上記記載の約３００ｂｐのＫ９７−０００３ペプチド遺伝子を含むクローン化ＤＮＡを鋳型として、新たに設計した以下のような２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ製）を用いて調製した。すなわち、センスプライマーとして、配列表の配列番号２の１ー１８番目に相当する、5'-GCC TCG GTG ACC ATC CGC -3'、またアンチセンスプライマーとして、配列番号２の２５８−２７４番目の相補配列に相当する、5'-T GTC GAG CAC GCG TCC-3' を使用した。ハイブリダイゼーションおよび陽性クローンの検出はＤＩＧ核酸検出キット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ製）を用いて行なった。
【００３７】
その結果、約１万個のコロニーから７個の陽性クローンを得た。陽性のクローンからプラスミドを回収し、制限酵素ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで別々に消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡをゲルからナイロン膜に転移して固定した後に、上述のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。１Ａ４、２Ａ３及び１０Ａ２と命名した３種のクローンから、プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片として、約７ｂｐのＡｐａＩ断片、約８００ｂｐのＢａｍＨＩ断片及び約３ｋｂのＫｐｎＩ断片が見い出された。図３に陽性クローンのうち、１Ａ４、２Ａ３、３Ａ７及び１０Ａ２のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。そこで、陽性クローンのプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩで消化して、１．０％アガロースゲル電気泳動で分画した。
【００３８】
ＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて約３ｋｂのＫｐｎＩ断片を回収し、ＫｐｎＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋と連結して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたサブクローンからプラスミドを回収して、挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図４に示す。また、サブクローンを各種制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーションで解析して、Ｋ９７−０００３ペプチド遺伝子を含む断片をＢａｍＨＩからＳｍａＩまでの約６００ｂｐ（図４の中において、バーで示す）に限定した。この領域を含む種々の制限酵素断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋にサブクローニングして、得られた組み換えプラスミドの塩基配列を解析した。
【００３９】
当該サブクローンを鋳型として、サーモシークエナーゼＴＭサイクルシークエンシングキット（島津製作所製）を用いて、添付された操作方法に従いＰＣＲを行なった。塩基配列の読み取りは自動蛍光式ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ２０００を用いた。塩基配列データはＧＥＮＥＴＹＸのＤＮＡ塩基配列連結プログラムを用いて連続した塩基配列に編集した。その結果、Ｋ９７−０００３ペプチド（配列番号１）の前駆体ペプチドをコード化する塩基配列（配列番号４）を得た。Ｋ９７−０００３ペプチドの前駆体とは、上述したように、微生物外への分泌に用いられるシグナルペプチドの配列領域を、Ｋ９７−０００３ペプチドのＮ末端に有するペプチドを意味する。そのようにして得た前駆体ペプチドの塩基配列データ（配列番号４）をアミノ酸配列に翻訳して、Ｋ９７−０００３ペプチド前駆体に示すアミノ酸配列（配列番号２）を得た。更に、Ｋ９７−０００３ペプチドをコード化する塩基配列を、配列表の配列番号３に示す。
【００４０】
５．シンシチウム形成の測定
９６穴プレート（ＩＷＡＫＩ  ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ９６ｗｅｌｌ）に、１．６×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬＴＲ細胞を５０μｌずつまき、リン酸緩衝生理食塩水で各段階に希釈した試料を、各穴に１０μｌずつ添加した。さらに、１．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＨｅＬａ１３５／ｅｎｖ（エンベロープ糖タンパク質：Ｔ−トロピックＨＩＶ−１由来）／Ｔａｔ細胞を、各穴に５０μｌずつまき、５％ＣＯ2気流下３７℃インキュベーターで２４時間培養した。その後培養液を除き、細胞溶解液を２０μｌずつ各穴に加えて、約１０分間室温で放置した。
【００４１】
その後、発色基質液１００μｌ（Ｚ−バッファー：８０μｌ＋４ｍｇ／ｍｌｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド：２０μｌ）を加えて、インキュベーター中において３７℃で反応させた。Ｚ−バッファーの組成は６０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、５０ｍＭ  ベーターメルカプトエタノールであり、ｐＨ７．０である。８０分後に反応停止液（２Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3 ）２５μｌを加えて、比色計（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅａｄｅｒ  ５１０）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から、シンシチウム形成能を下記の式より求めた。
シンシチウム形成能＝試料を添加した穴の吸光度／コントロールの吸光度×１００
このようにして得たシンシチウム形成能を５０％阻害するペプチド濃度（ＩＣ50）を、下記の表２に示す。
【００４２】
６．細胞変性効果の抑制による抗ＨＩＶ活性の測定
ＨＩＶ感染による細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）の抑制より、抗ＨＩＶ活性を測定した。９６穴タイタープレートに、各種濃度のＫ９７−０００３ペプチドと共に、ＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞（２．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、多重感染度：０．０１）を感染直後に加えた。Ｋ９７−０００３ペプチドのＭＴ−４細胞に対する細胞毒性を知るために、ＨＩＶ非感染細胞を同様に、各種濃度のＫ９７−０００３ペプチドと共に培養を行なった。ＣＯ2インキュベーターで３７℃５日間培養した後、ＭＴＴ法により生存細胞数を測定した。
【００４３】
上記の方法により評価を行ったＫ９７−０００３ペプチドの生物活性を、放線菌ＷＫ−３４１９株由来のＨＩＶ阻害剤であるクロロペプチンと比較して、表２に示す。尚、クロロペプチンはｇｐ１２０−ＣＤ４結合の阻害により抗ＨＩＶ活性を示す事が知られている。表２において、以下の様な値により細胞変性効果を示す。
（１）ＥＣ50：ＨＩＶ感染による細胞傷害を５０％阻害する濃度であり、抗ＨＩＶ活性の指標である。
（２）ＣＣ50：Ｋ９７−０００３ペプチドによる５０％細胞傷害濃度であり、細胞毒性の指標である。
（３）ＳＩ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）：有効係数であり、ＣＣ50／ＥＣ50として計算した。
【００４４】
表２に示す様に、Ｋ９７−０００３ペプチドは低濃度（６０ｎＭ）においてシンシチウム形成を阻害し、抗ＨＩＶ活性（ＥＣ50：２３０ｎＭ）を示した。また、抗ＨＩＶ活性が認められる濃度では顕著な細胞障害は見られず（ＣＣ50：＞８μＭ）以上の結果からＫ９７−０００３ペプチドの有効性が認められた。
【００４５】
【表２】
0003962772.tif 000004
【００４６】
７．ＭＡＧＩアッセイによる抗ＨＩＶ活性の測定
更に、ベータガラクトシダーゼ活性を指標として遺伝子の活性化を測定する方法であるＭＡＧＩアッセイ（Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を用いて、Ｋ９７−０００３ペプチドの抗ＨＩＶ活性を測定した。このアッセイにおいて、ＨｅＬａ細胞にＣＤ４遺伝子とＨＩＶの補助受容体であるＣＣＲ５遺伝子を組み換えた細胞に、更にＨＩＶのエルティーアール（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）とベータガラクトシダーゼ遺伝子を導入した細胞を用いた。その様な細胞を用いる事により、細胞のＨＩＶ感染に伴いベータガラクトシダーゼが活性化するために、ベータガラクトシダーゼの基質であるＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−ガラクトシド）の呈色によりＨＩＶの感染を測定できる。ＭＡＧＩアッセイは、Ｒ．Ａｒａｋａｋｉらの方法（Ｒ．Ａｒａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ２，ｐ１７１９−１７２３）及びＪ．Ｋｉｍｐｔｏｎらの方法（Ｊ．Ｋｉｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ４，ｐ２２３２−２２３９）により行った。Ｋ９７−０００３ポリペプチドの、各種ＨＩＶに対する、感染阻止活性を表３に示す。
【００４７】
【表３】
0003962772.tif 000005
【００４８】
表３より、Ｋ９７−０００３ポリペプチドはＴ−トロピックＨＩＶのみならず、Ｍ−トロピックＨＩＶに対してもｎＭオーダーのＩＣ50値を示した。更に、Ｋ９７−０００３ポリペプチドは、ＨＩＶ−２に対しても、感染阻害活性を示した。その結果は、表２の結果と共に、Ｋ９７−０００３ポリペプチドがＨＩＶ感染を阻止する活性を有する事を示している。
【００４９】
本発明のＫ９７−０００３ペプチドは、Ｔ−トロピックエンベロープ糖タンパク質を発現したＨｅＬａ細胞と、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合によるシンシチウム形成を阻害し、また抗ＨＩＶ活性を示した。更に、Ｔ−トロピックＨＩＶのみならず、Ｍ−トロピックＨＩＶの感染をも防止する活性を示した。従って本発明により、ＡＩＤＳの予防、治療薬として利用することが可能なポリペプチドが与えられた。また、本発明のＫ９７−０００３ペプチドをコードする遺伝子は、組み換えＫ９７−０００３ペプチドの生産に利用することが可能であり、天然のＫ９７−０００３ペプチドと同様にＡＩＤＳの予防、治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ストレインＫ９７−０００３より精製したＫ９７−０００３ペプチドの、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の写真である。
【図２】図２は、Ｋ９７−０００３ペプチドの配列を決めた断片及び決定されたアミノ酸配列の位置を示す図である。
【図３】図３は、クローン化されたＫ９７−０００３ペプチド遺伝子の存在を示す、サザンハイブリダイゼーションの写真である。
【図４】図４は、ストレインＫ９７−０００３のＫ９７−０００３ペプチド遺伝子を含む、約３ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図及びＫ９７−０００３ペプチド遺伝子の位置と方向を示す図である。
【００５０】
【配列表】
0003962772.tif 000006
0003962772.tif 000007
0003962772.tif 000008
0003962772.tif 000009
【図１】
0003962772.tif 000010
【図２】
0003962772.tif 000011
【図３】
0003962772.tif 000012
【図４】
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