(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下の（ｉ）〜（vii）の特性を有するポリペプチド、
（ｉ）３７℃で測定時にｐＨ５．０〜８．５のｐＨ範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（ii）７．４〜８．５の範囲に等電点を有する、（iii）Tris−HCl緩衝液中Gly−pNAを用いてpH７．５で測定時に２０〜５５℃の温度範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（iv）Ala−pNA、Gly−pNA、Leu−pNA、Glu−pNA、Asp−pNA、Lys−pNA、Ile−pNA及びVal−pNAを加水分解する、（v）Phe−pNA及びPro−pNAを加水分解しない、（vi）フッ化フェニルメタンスルホニルにより阻害されず、EDTA、ジイソプロピルフルオロホスフェート、ｐ−クロロメルクリ安息香酸及びヨード酢酸によりわずかに阻害され、ｏ−フェナントロリンにより完全に阻害される、及び（vii）６７±５kDaの分子量を有する、
（ｂ）  （ｉ）配列番号：１の核酸配列又は（ii）その相補鎖と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、
（ｃ）  （ａ）の対立変異体、
（ｄ）  配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片であってアミノペプチダーゼ活性を有するもの、
からなる群から選択されるアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列又はその断片からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：１の核酸配列又はその相補鎖と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸配列によりコードされている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Sphingomonasに属する菌株から得られた、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
Sphingomonas capsulata菌株から得られた、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
大腸菌NRRL B−３００３２株に含まれるプラスミドpMRT００４．１−１４に含まれる核酸配列によりコードされる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：２のアミノペプチダーゼ活性の少なくとも２０％を有する、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する単離核酸。
【請求項１０】
成熟ポリペプチドをコードする配列番号１の核酸配列に少なくとも一つの変異を有する核酸配列を含有する単離核酸であって、前記変異核酸配列が配列番号２のアミノ酸３３〜６７４からなるポリペプチドをコードする、単離核酸。
【請求項１１】
（ａ）ＤＮＡを、配列番号：１の配列か、その相補鎖と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ｂ）前記核酸配列を単離することにより製造された、以下の（ｉ）〜（vii）の特性を有し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸、
（ｉ）３７℃で測定時にｐＨ５．０〜８．５のｐＨ範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（ii）７．４〜８．５の範囲に等電点を有する、（iii）Tris−HCl緩衝液中Gly−pNAを用いてpH７．５で測定時に２０〜５５℃の温度範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（iv）Ala−pNA、Gl y−pNA、Leu−pNA、Glu−pNA、Asp−pNA、Lys−pNA、Ile−pNA及びVal−pNAを加水分解する、（v）Phe−pNA及びPro−pNAを加水分解しない、（vi）フッ化フェニルメタンスルホニルにより阻害されず、EDTA、ジイソプロピルフルオロホスフェート、ｐ−クロロメルクリ安息香酸及びヨード酢酸によりわずかに阻害され、ｏ−フェナントロリンにより完全に阻害される、及び（vii）６７±５kDaの分子量を有する。
【請求項１２】
好適な発現宿主中で前記ポリペプチドの産生を誘導させる一つ以上の制御配列に作用可能に連結した請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸配列を含有する核酸構成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸構成物を含有する組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸構成物を含有する組換え宿主細胞。
【請求項１５】
変異核酸配列の製造方法であって、（ａ）少なくとも一つの変異を成熟ポリペプチドをコードする配列番号：１の配列に導入する工程であって、得られた変異核酸配列が配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４からなるポリペプチドをコードしている工程と、（ｂ）前記変異核酸配列を回収する工程を、含有する方法。（その他補正なし）
【請求項１６】
請求項１５の方法により製造された変異核酸。
【請求項１７】
ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドをコードする請求項１６に記載の変異核酸配列を含有する菌株を培養して前記ポリペプチドを含有する上清を得る工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、（ａ）菌株を培養して前記ポリペプチドを含有する上清を得る工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸構成物を含有する宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養する工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの産生を誘導する条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞が、成熟ポリペプチドをコードする配列番号：１の配列中に少なくとも一つの変異を有する配列番号：１の変異核酸配列を含有し、前記変異核酸配列が配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４からなるポリペプチドをコードするものである工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項２４】
親細胞の変異体の製造方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列を分断又は欠失させて、前記親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異細胞を得る工程を含有する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法により製造された変異細胞。
【請求項２６】
異質タンパク質をコードする核酸配列をさらに含有する請求項２５に記載の変異細胞。
【請求項２７】
異種ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）請求項２６に記載の変異細胞を、前記ポリペプチドの製造を誘導する条件下で培養する工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする単離核酸配列に関する。また、本発明は、前記核酸配列を含有する、核酸構成物、ベクター及び宿主細胞並びに前記ポリペプチドの製造方法及び前記ポリペプチドを用いた方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
種々の食品、例えば、スープ、ソース及び調味料は、タンパク質様物質の加水分解により得られたフレーバーを含有している。この加水分解を、通常強塩酸を用いておこなった後、水酸化ナトリウムで中和する。しかしながら、このような化学的加水分解では、加水分解中に得られたアミノ酸が著しく分解されるとともに、この化学反応の過程で有害な副産物が生成する。化学的加水分解により得られたフレーバーを使用することへの関心が高まり、酵素的加水分解法が開発された。
【０００３】
タンパク質様物質の酵素的加水分解は、高い加水分解度（DH）を得ることを目的としている。これは、通常、非特異作用タンパク質分解酵素（すなわち、非特異作用エンド及びエキソペプチダーゼ）の複合体を用いることにより達成される。例えば、WO９４／２５５８０は、Aspergillus oryzaeから得た非特異作用酵素剤を使用することによりタンパク質を加水分解する方法を記載している。特異作用タンパク質分解酵素は、このような酵素が不十分な程度の加水分解しか生じないことから、この目的には使用されてこなかった。
【０００４】
アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドは、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のN末端から一つ以上のアミノ酸残基の除去を触媒する。このようなポリペプチドは、International Union of Biochemistry and Molecular BiologyのEnzyme Classification Number E.C. ３.４.１１.に基づいて分類される。
【０００５】
WO９６／２８５４２は、分子量が３５kDaであるアミノペプチダーゼを開示している。JP−７−５０３４６３１（野田）は、Aspergillus oryzaeを含む黄色コウジカビから得られたロイシンアミノペプチダーゼを開示している。JP−７−４０２１７９８（財団法人野田産業）は、Aspergillus oryzae ４６０株（ATCC２０３８６）及びIAM２６１６株を含む多数の菌株を培養することにより調製したロイシンアミノペプチダーゼIIを添加することによる、ミソの製造を開示している。Aspergillus oryzae ４６０株は、多数のロイシンアミノペプチダーゼを産生し、それらのうちの３つが、ゲル濾過で求めた分子量がそれぞれ２６．５kDa、５６kDa及び６１kDaであることが知られている（それぞれNakada等、１９７２、Agricultural and Biological Chemistry、３７：７５７−７６５、Nakada等、１９７２、Agricultural and Biological Chemistry、３７：７６７−７７４、Nakada等、１９７２、Agricultural and Biological Chemistry、３７：７７５−７８２）。Penicillium citriumは、SDS−PAGEで求めた分子量が６５kDaである細胞内ロイシンアミノペプチダーゼを産生する（Kwon等、１９９６、Journal of Industrial Microbiology、１７：３０−３５）。
【０００６】
WO９７／０４１０８（Roehm）は、Aspergillus sojae ロイシンアミノペプチダーゼをコードするDNAを開示している。Chang及びSmith（１９８９、Journal of Biological Chemistry、２６４：６９７９−６９８３）は、Saccharomyces cerevisiae由来の液胞アミノペプチダーゼをコードする遺伝子の分子クローニング及び配列決定を開示している。Chang等（１９９２、Journal of Biological Chemistry、２６７：８００７−８０１１）は、Saccharomyces cerevisiae由来のメチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝子の分子クローニング及び配列決定を開示している。
【０００７】
所望の官能特性を有し且つ高度の加水分解でタンパク質加水分解産物を生成するには、一般的にペプチダーゼ活性の混合物を使用する必要がある。単独又は他の酵素と組み合わせて食品に使用されるタンパク質加水分解産物の官能特性及び加水分解度を向上するのに有用な活性を有する単一成分ペプチダーゼ酵素を提供することが望ましいであろう。
【０００８】
本発明の目的は、アミノペプチダーゼ活性を有する向上したポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする核酸を提供することである。
【０００９】
本発明によれば、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下の（ｉ）〜（vii）の特性を有するポリペプチド、
（ｉ）３７℃で測定時にｐＨ５．０〜８．５のｐＨ範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（ii）７．４〜８．５の範囲に等電点を有する、（iii）Tris−HCl緩衝液中Gly−pNAを用いてpH７．５で測定時に２０〜５５℃の温度範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（iv）Ala−pNA、Gly−pNA、Leu−pNA、Glu−pNA、Asp−pNA、Lys−pNA、Ile−pNA及びVal−pNAを加水分解する、（v）Phe−pNA及びPro−pNAを加水分解しない、（vi）フッ化フェニルメタンスルホニルにより阻害されず、EDTA、ジイソプロピルフルオロホスフェート、ｐ−クロロメルクリ安息香酸及びヨード酢酸によりわずかに阻害され、ｏ−フェナントロリンにより完全に阻害される、及び（vii）６７±５kDaの分子量を有する、
（ｂ）  （ｉ）配列番号：１の核酸配列又は（ii）その相補鎖と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、
（ｃ）  （ａ）の対立変異体、
（ｄ）  配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片であってアミノペプチダーゼ活性を有するもの、
からなる群から選択されるアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドが提供される。
【００１０】
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードする単離核酸配列、前記核酸配列を含有する核酸構成物、ベクター及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドの製造方法及び使用方法に関する。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
本明細書において、用語「アミノペプチダーゼ活性」とは、ペプチド、オリゴペプチド又はタンパク質のN末端からのアミノ酸の除去を触媒するペプチダーゼ活性を意味する。一般的な方法で定義されるアミノペプチダーゼ活性は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のN末端からアミノ酸Xを開裂することができる。ここで、Xは、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基を表すが、少なくともAla、Gly、Leu、Glu、Asp、Lys、Ile及び／又はValを表す。本発明のアミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、開裂されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に関しては非特異的でよいことが、理解されるであろう。本発明では、アミノペプチダーゼ活性は、４０５nmでのアラニンのp−ニトロアニリドの初期加水分解速度を測定することにより求める。
【００１２】
第一の実施態様によれば、本発明は、アミノペプチダーゼ活性を有する、配列番号：２（すなわち、成熟ポリペプチド）のアミノ酸３３〜６７４と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド（以下「相同性ポリペプチド」と称する）に関する。好ましい実施態様によれば、この相同性ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。本発明では、２つ以上のアミノ酸配列間の同一性は、BLAST２．０タンパク質データベースサーチプログラム（Altschul等、１９９７、Nucleic Acids Research、２５：３３８９−３４０２）により求める。これには、以下の要旨が付属している：blastall−p blastp−a４−e１０−E０−v５００−b２５０−I［query file］−d prot＿all（但し、−pはプログラム名を表し、−aは使用プロセッサ数を表し、−eは期待値を表し、−Eはgapを延長するのに要するコストを表し、−vは一ライン記載数を表し、−bは示される配列数を表し、−Iはquery fileを表し、−dはサーチに使用されるデータベースを表す）。
【００１３】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列又はその対立変異体又はアミノペプチダーゼ活性を有するその断片を含有する。より好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含有する。別の好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４（配列番号：２の成熟ポリペプチド）又はその対立変異体、又はアミノペプチダーゼ活性を有するその断片を含有する。別の好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４を含有する。別の好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列又はその対立変異体、又はアミノペプチダーゼ活性を有するその断片を含有する。別の好ましい実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４又はその対立変異体、又はアミノペプチダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸３８〜６５４からなる。
【００１４】
配列番号：２の断片は、このアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から一つ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチドである。好ましくは、断片は、少なくとも５２４個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは少なくとも５７４個のアミノ酸残基を含み、最も好ましくは少なくとも６２４個のアミノ酸残基を含む。
【００１５】
対立変異体は、同じ染色体座を占有する遺伝子の二つ以上の代替形態のいずれかを示す。対立変異は、変異により自然に生じ、集団内で多型現象を生じる。遺伝子変異は、休止状態（コードされたポリペプチドに変化を生じない）であってもよいし、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしていてもよい。ポリペプチドの対立変異体は、遺伝子の対立変異体によりコードされたポリペプチドである。
【００１６】
相同性ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドとは、一つ以上のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び／又は異なるアミノ酸残基による一つ以上のアミノ酸残基の置換により異なっていてもよい。好ましくは、アミノ酸の変化は、小さなものであり、すなわち、タンパク質の折りたたみ及び／又は活性に顕著には影響しない保存的アミノ酸置換、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の小程度の欠失、アミノ末端メチオニン残基等の小程度のアミノ末端又はカルボキシル末端の延長、最大約２０〜２５残基の小リンカーペプチド、又はポリヒスチジントラクト、抗原エピトープ又は結合ドメイン等の正味電荷又は別の機能を変化させることにより精製を容易にする小程度の延長のようなものである。
【００１７】
保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）並びに小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群の範囲内のものである。一般的に特異的活性を変更しないアミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、例えば、H. Neurath及びR. L. Hill、１９７９、The Proteins、Academic Press、ニューヨークに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ala／Ser、Val／Ile、Asp／Glu、Thr／Ser、Ala／Gly、Ala／Thr、Ser／Asn、Ala／Val、Ser／Gly、Tyr／Phe、Ala／Pro、Lys／Arg、Asp／Asn、Leu／Ile、Leu／Val、Ala／Glu及びAsp／Gly並びにそれらの逆である。
【００１８】
第二の実施態様によれば、本発明は、低ストリンジェントな条件下、より好ましくは中ストリンジェントな条件下、さらにより好ましくは高ストリンジェントな条件下、最も好ましくは超高ストリンジェントな条件下で、配列番号：１の核酸配列又はその相補鎖又はアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードするそれらのサブ配列とハイブリダイズした核酸プローブと、同条件下でハイブリダイズした核酸配列によりコードされた、アミノペプチダーゼ活性を有する単離ポリペプチド（J. Sambrook、E. F. Fritsch及びT. Maniatus、１９８９、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor、ニューヨーク）、又は前記ポリペプチドの対立変異体及び断片（前記断片は、アミノペプチダーゼ活性を有する）に関する。
【００１９】
配列番号：１の核酸配列又はそのサブ配列及び配列番号：２のアミノ酸配列又はその断片を使用して核酸プローブを設計し、当該技術分野において周知の方法により異なる属又は種の菌株に由来するアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定及びクローニングすることができる。特に、このようなプローブを使用して、標準サザンブロット法に準じて意図する属又は種のゲノム又はcDNAとハイブリダイズして対応の遺伝子を同定及び単離することができる。このようなプローブは、配列全体よりもかなり短くできるが、長さが、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドでなければならない。もっと長いプローブを使用することもできる。DNAプローブとRNAプローブとの両方を使用できる。プローブは、典型的には、対応の遺伝子を検出するために、標識される（例えば、32P、3H、35S、ビオチン又はアビジンで標識）。このようなプローブは、本発明に包含される。
【００２０】
従って、このような他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAライブラリーを、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記プローブとハイブリダイズするDNAについてのスクリーニングに使用できる。このような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動又は他の分離法により分離できる。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAを、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料上に移し、固定化できる。配列番号：１と相同であるクローン又はDNAを固定するために、この担体材料を、サザンブロットに使用する。本発明では、ハイブリダイズは、核酸配列が、低〜超高ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される核酸配列又はその相補鎖に相当する核酸プローブとハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、X線フィルムを用いて検出される。
【００２１】
好ましい実施態様では、核酸プローブは、配列番号：２のポリペプチド又はそのサブ配列をコードする核酸配列である。別の好ましい実施態様では、核酸プローブは、配列番号：１である。別の好ましい実施態様では、アミノペプチダーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードする配列番号：１のヌクレオチド６７０〜２５９２である。別の実施態様によれば、核酸プローブは、大腸菌NRRL B−３００３２株に含有されるプラスミドpMRT００４．１−１４に含有され、配列番号：２のポリペプチドをコードする核酸配列である。別の好ましい実施態様によれば、核酸プローブは、大腸菌NRRL NRRL B−３００３２株に含有されるプラスミドpMRT００４．１−１４に含有される、配列番号：２の成熟ポリペプチド（すなわち、アミノ酸３３〜６７４）をコードする核酸配列である。
【００２２】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドである長いプローブの場合、低〜超高ストリンジェントな条件とは、標準サザンブロット法に準じて、４２℃、５X SSPE、０．３％SDS、２００μg／mlせん断及び変性したサケ精子DNA並びにそれぞれ低、中、高及び超高ストリンジェントなについて２５％、３５％又は５０％ホルムアミドの条件での予備ハイブリダイズ及びハイブリダイズを示す。
【００２３】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドである長いプローブの場合、担体材料を、最後に、２xSSC、０．２％SDSを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェント）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェント）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェント）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェント）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェント）及び最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェント）で、３回各々１５分間洗浄する。
【００２４】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブの場合には、ストリンジェントな条件は、標準サザンブロット法に準じて、０．９M NaCl、０．０９M Tris−HCl（pH７．６）、６mM EDTA、０．５％NP−４０、１xDenhardt溶液、１mMピロリン酸ナトリウム、１mM一塩基リン酸ナトリウム、０．１mM ATP及び１ml当たり０．２mgの酵母RNA中、Bolton及びMcCarthy（１９６２、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、４８：１３９０）による計算を使用して求めた計算値Tm未満の５〜１０℃での、予備ハイブリダイズ、ハイブリダイズ及び洗浄−後ハイブリダイズを示す。
【００２５】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブの場合には、担体材料を、６X SCC＋０．１％SDSで１５分間１回洗浄し、各々計算値Tm未満の５〜１０℃で６X SSCを用いて１５分間の条件で２回洗浄する。
【００２６】
第３の実施態様によれば、本発明は、以下の物理化学的性質を有する単離ポリペプチドに関する：（ａ）３７℃で測定時にｐＨ５．０〜８．５のｐＨ範囲でアミノペプチダーゼ活性を有する、（ｂ）７．４〜８．５の範囲に等電点を有する、（ｃ）Tris−HCl緩衝液中Gly−pNAを用いてpH７．５で測定時に２０〜５５℃の温度範囲においてアミノペプチダーゼ活性を有する、（ｄ）Ala−pNA、Gly−pNA、Leu−pNA、Glu−pNA、Asp−pNA、Lys−pNA、Ile−pNA及びVal−pNAを加水分解する、（ｅ）Phe−pNAもPro−pNAも加水分解しない、（f）フッ化フェニルメタンスルホニルにより阻害されず、EDTA、ジイソプロピルフルオロホスフェート、ｐ−クロロメルクリ安息香酸及びヨード酢酸によりわずかに阻害され、ｏ−フェナントロリンにより完全に阻害される、及び（g）６７±５kDaの分子量を有する。
【００２７】
好ましい実施態様によれば、このポリペプチドは、３７℃で測定時にpH５．０〜８．５のpH範囲、より好ましくはpH６．５〜８．０のpH範囲でアミノペプチダーゼ活性を示し、さらにより好ましくは３７℃で測定したときにpH７．０〜７．５のpH範囲で最も高いアミノペプチダーゼ活性を示す。
【００２８】
アミノペプチダーゼの等電点は変化してよい。調製したばかりの酵素の等電点は、活性染色法を用いて測定すると約８．４と推定されるが、等電点は、精製及び／又は保存の過程で、７．４〜８．５に変化する。この等電点の不安定性は、アミノペプチダーゼがそのアミノ末端から自己消化するためと思われる。
【００２９】
別の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは、分子量６７±５kDa、より好ましくは分子量６７±２kDaであり、Sphingomonas、より好ましくはSphingomonas capsulata、最も好ましくはSphingomonas capsulata IFO１２５３３に属する菌株から得られる。分子量は、Pharmacia（Uppsala、スウエーデン）製のFAST System装置により、１０〜１５％グラジエントゲルを用いてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により測定する。酵素の分子量は、分子量マーカーの回帰線から以下のように推定された：ホスホリラーゼb（９４kDa）、アルブミン（６７kDa）、オボアルブミン（４３kDa）、カーボニックアンヒドラーゼ（３０kDa）、トリプシンインヒビター（２０．１kDa）及びα−ラクトアルブミン（１４．４kDa）。
【００３０】
第４の実施態様によれば、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと免疫化学的同一性又は部分的免疫化学的同一性を有する単離ポリペプチドに関する。免疫化学的性質は、周知のオクタロニー二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同一性試験で求める。具体的には、免疫反応性であるか、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープと結合するポリクローナル抗体を含有する抗血清を、Harboe及びIngild、N. H. Axelsen J. Krφll及びB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、１９７３、第２３章、又はJohnstone及びThorpe、Immunochemistry in Practice、Blackwell Scientific Publications、１９８２（より具体的には第２７〜３１頁）に記載の方法に準じて、ウサギ（又は他の齧歯類動物）を免疫化することにより調製する。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、同一の様式、例えば、特異的な免疫化学的方法を用いた、沈殿の全融解、同一沈殿モルホロジー及び／又は同一電気泳動移動度で、抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性については、Axelsen、Bock及びKrφll、N. H. Axelsen、J. Krφll及びB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、１９７３、第１０章にさらに説明されている。部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、特異的免疫化学的方法を用いた、部分的同一様式、例えば、沈殿の部分融解、部分的に同一な沈殿のモルホロジー及び／又は部分的に同一な電気泳動移動度で、抗血清と反応するポリペプチドである。部分的免疫化学的同一性については、Bock及びAxelsen、N. H. Axelsen、J. Krφll及びB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、１９７３、第１１章にさらに説明されている。
【００３１】
また、上記抗体も、モノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、例えば、E. Harlow及びD. Lane編、１９８８、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、ニューヨークに記載の方法により、調製及び使用できる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノペプチダーゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも１００％を有する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、いずれの属の微生物から得てもよい。例えば、ポリペプチドには以下のものがある：グラム陽性細菌性ポリペプチド、例えば、Bacillusポリペプチド、例えば、Bacillus alkalophilusポリペプチド、Bacillus amyloliquefaciensポリペプチド、Bacillus brevisポリペプチド、Bacillus circulansポリペプチド、Bacillus coagulansポリペプチド、Bacillus lautusポリペプチド、Bacillus lentusポリペプチド、Bacillus licheniformisポリペプチド、Bacillus megateriumポリペプチド、Bacillus stearothermophilusポリペプチド、Bacillus subtilisポリペプチド、又はBacillus thuringiensisポリペプチド；Streptomycesポリペプチド、例えば、Streptomyces lividansポリペプチド又はStreptomyces murinusポリペプチド；又はグラム陰性細菌性ポリペプチド、例えば、E. coli又はPseudomonas sp.ポリペプチドでよい。
【００３４】
別の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは、Sphingomonasポリペプチド、例えば、Sphingomonas adhaesivaポリペプチド、Sphingomonas capsulataポリペプチド、Sphingomonas parapaucimobilisポリペプチド、Sphingomonas paucimobilisポリペプチド又はSphingomonas yanoikuyaeポリペプチドである。
【００３５】
さらなる好ましい実施態様によれば、Sphingomonas capsulataポリペプチドは、Sphingomonas capsulata IFO １２５３３ポリペプチド、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３６】
上記種について、本発明は、公知の種名とは無関係に他の分類等価物を包含することが理解されるであろう。当業者は、適当な等価物の同一性を容易に認識するであろう。例えば、Sphingomonas capsulataはFlavobacterium capsulatumとしても知られており、Sphingomonas paucimobilisは、Flavobacterium devorans及びPseudomonas paucimobilisとしても知られており、Sphingomonas sp.はChromobacterium lividumとしても知られている。Sphingomonasの体系的分類の考察については、Yabuuchi等、１９９０、Microbiol. Immunol.、３４：９９−１１９を参照されたい。
【００３７】
これらの種の菌株は、多数の菌株保存機関、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center（NRRL）において一般に容易に入手できる。
【００３８】
さらに、このようなポリペプチドは、上記プローブを用いて自然物（例えば、土壌、コンポスト、水等）から単離された微生物を含む他の源から同定及び得ることができる。自然環境からの微生物を単離する方法は、当該技術分野において周知である。次に、核酸配列を、別の微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得ることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列をプローブ（類）を用いて検出したら、この配列を、当業者に公知の方法を利用することにより単離又はクローニングできる（例えば、上記Sambrook等、１９８９参照）。
【００３９】
上記で定義したように、「単離」ポリペプチドは、他の非アミノペプチダーゼポリペプチドを実質的に含まないポリペプチド、例えば、SDS−PAGEにより求めた純度が、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは約６０％、さらにより好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％、さらに最も好ましくは約９５％のポリペプチドである。
【００４０】
また、本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドには、別のポリペプチドがポリペプチド又はその断片のN末端又はC末端で融合している融合ポリペプチド又は開裂性融合ポリペプチドなどがある。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部分）を本発明の核酸配列（又はその一部分）に融合することにより生成される。融合ポリペプチドの製造方法は、当該技術分野において公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を連結して、それらがフレームにあり且つ融合ポリペプチドの発現が同様のプロモータ（類）及びターミネータの制御下にあるようにすることを含む。
【００４１】
核酸配列
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列に関する。好ましい実施態様によれば、核酸配列は、配列番号：１に記載のものである。別のより好ましい実施態様によれば、核酸配列は、大腸菌NRRL B−３００３２株に含有されるプラスミドpMRT００４．１−１４に含有される配列である。別のより好ましい実施態様によれば、核酸配列は、大腸菌NRRL B−３００３２株に含有されるプラスミドpMRT００４．１−１４に含有される配列番号：２の成熟ポリペプチド（すなわち、アミノ酸３３〜６７４）をコードする配列である。別の好ましい実施態様によれば、核酸配列は、成熟ポリペプチドをコードする配列番号：１のヌクレオチド６７０〜２５９２である。また、本発明は、遺伝子コードの縮重のため、配列番号：１とは異なる、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその成熟ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。また、本発明は、ホスホリパーゼ活性を有する配列番号：２の断片をコードする配列番号：１のサブ配列に関する。
【００４２】
配列番号：１のサブ配列は、５’端及び／又は３’端から一つ以上のヌクレオチドを欠失させたことを除いては配列番号：１に包含される核酸配列である。好ましくは、サブ配列は、少なくとも１５７２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７２２ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１８７２ヌクレオチドを含有する。
【００４３】
また、本発明は、配列番号：１の成熟ポリペプチドコード領域に少なくとも一つの変異を含む変異核酸配列に関する。この変異核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４からなるポリペプチドをコードする。
【００４４】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングする方法は、当該技術分野において公知であり、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製又はそれらの組み合わせなどがある。このようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば、周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又は発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用して共有の構造的特徴を有するクローンDNA断片を検出することによりおこなうことができる。例えば、Innis等、１９９０、PCR A Guide to Methods and Application、Academic Press、ニューヨークを参照されたい。他の核酸増幅法、例えば、リガーゼ連鎖反応（LCR）、連結活性化転写（LAT）及び核酸配列ベースド増幅（NASBA）を使用できる。核酸配列は、Sphingomonasの菌株、又は別の生物又は関連生物の菌株からクローニングでき、したがって、例えば、核酸配列のポリペプチドコード領域の対立変異体又は種変異体でよい。
【００４５】
ここで、用語「単離核酸配列」とは、実質的に他の核酸配列を含まない核酸配列、例えば、アガロース電気泳動により求めた純度が、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％である核酸配列である。例えば、単離核酸配列は、核酸配列をその自然位置から、増殖される異なる位置に再配置するために遺伝子工学において使用される標準クローニング法により得ることができる。クローニング法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸断片を切除及び単離する工程、断片をベクター分子に挿入する工程、及び組換えベクターを核酸配列の複数のコピー又はクローンを複製する宿主細胞に組込む工程を含む。核酸配列は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成物又は合成物、又はそれらの組み合わせから得たものでよい。
【００４６】
また、本発明は、活性ポリペプチドをコードする、配列番号：１の成熟ポリペプチドコード配列（すなわち、ヌクレオチド６７０〜２５９２）に対する相同性が、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９７％である核酸配列に関する。本発明では、２つの核酸配列間の相同性は、同一性テーブル及び以下の複配列パラメータ（Gapペナルティ１０及びgap長さペナルティ１０）を有するLASERGENE（商標）MEGALIGN（商標）ソフトウエア（DNASTAR社、Madison、ウィスコンシン州）を用いてWilbur−Lipman法（Wilbur及びLipman、１９８３、Proceedings of the National Academy of Science USA、８０：７２６−７３０）により求める。ペアワイズ配列パラメータは、Ktuple＝３、gapペナルティ＝３及びウインドーズ＝２０であった。
【００４７】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の変更が、上記ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要なことがある。ここで、ポリペプチドに「実質的に類似する」とは、ポリペプチドの非天然形態を意味する。これらのポリペプチドは、天然源から単離したポリペプチドとは、設計において多少異なる。例えば、指定部位突然変異誘発を用いて、特異的活性、熱安定性、最適pH等が異なる、ポリペプチドの変異体を合成することが重要なことがある。類似配列は、配列番号：１のポリペプチドコード部分として提供される核酸配列（例えば、そのサブ配列）に基づいて及び／又は核酸配列によりコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生を意図する宿主生物のコドンの使用に相当するヌクレオチド置換の導入、又は異なるアミノ酸配列を生じることのあるヌクレオチド置換の導入により構築できる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えば、Ford等、１９９１、Protein Expression and Purification、２：９５−１０７を参照されたい。
【００４８】
このような置換は、分子の機能にとって重要である領域の外におこなうことができ、且つ活性ポリペプチドを生じることは、当業者には明らかであろう。本発明の単離核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、したがって、好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当該技術分野において公知の方法、例えば、指定部位突然変異誘発又はアラニンスキャンニング突然変異誘発（例えば、Cunningham及びWells、１９８９、Science、２４４：１０８１−１０８５参照）により同定できる。後者の方法では、変異を分子中の全ての正に帯電した残基に導入し、得られた変異分子を、アミノペプチダーゼ活性について試験して、分子の活性に欠くことのできないアミノ酸残基を同定する。基質−酵素相互作用部位も、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識等の方法により求められる三次元構造の解析により求めることができる（例えば、de Vos等、１９９２、Science、２５５：３０６−３１２、Smith等、１９９２、Journal of Molecular Biology、２２４：８９９−９０４、Wlodaver等、１９９２、FEBS Letters、３０９：５９−６４参照）。
【００４９】
また、本発明は、低ストリンジェントな条件下、より好ましくは中ストリンジェントな条件下、さらにより好ましくは高ストリンジェントな条件下、最も好ましくは超高ストリンジェントな条件下で、配列番号：１の核酸配列又はその相補鎖とハイブリダイズした核酸プローブと、同条件下でハイブリダイズした核酸配列によりコードされた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、又は上記で定義したその対立変異体（上記Sambrook等、1989）に関する。
【００５０】
本発明は、（ａ）DNAを、配列番号：１の配列又はその相補鎖と低ストリンジェントな条件下、中ストリンジェントな条件下、高ストリンジェントな条件下、又は超高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして、（ｂ）前記核酸配列を単離することにより製造された、単離核酸に関する。
【００５１】
変異核酸配列の製造方法
さらに、本発明は、少なくとも一つの変異を配列番号：１の成熟ポリペプチドコード配列又はそのサブ配列に導入する工程を含有する、変異核酸配列の製造方法であって、得られた変異核酸配列が配列番号：２のアミノ酸３３〜６７４からなるポリペプチド又はアミノペプチダーゼ活性を有するその断片をコードする。
【００５２】
核酸配列に変異を導入して一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドにスイッチするのは、当該技術分野において公知の方法のいずれかを用いた指定部位突然変異誘発により達成できる。特に有用な方法は、意図するインサート及び所望の変異を含有する２つの合成プライマーを有する、スーパーコイル二本鎖DNAベクターを利用する方法である。各々ベクターの反対の鎖に相補であるヌクレオチドプライマーは、PfuDNAポリメラーゼによる温度サイクル中に延びる。プライマーを組込むと、付着ニックを含む突然変異プラスミドが発生する。温度サイクルに続いて、生成物を、メチル化及びヘミメチル化DNAに特異的なDpnIで処理して、親DNA鋳型を消化し且つ変異含有合成DNAについて選択する。当該技術分野において公知の他の方法を用いてもよい。
【００５３】
核酸構成物
また、本発明は、本発明の核酸配列を、一つ以上の制御配列であって、前記制御配列と適合する条件下で好適な発現宿主中で前記コード配列の発現を誘導させる制御配列に、作用可能に連結して含有する、核酸構成物に関する。発現は、転写、後転写性修飾、翻訳、後翻訳性修飾及び分泌を含むが、これらには限定されないポリペプチドの産生に関与するいずれの工程をも含むことが理解されるであろう。
【００５４】
ここで、「核酸構成物」とは、天然遺伝子から単離されるか、自然には存在しないであろう方法で組み合わせ及び並置させた核酸のセグメントを含有するように修飾した、核酸分子（一本鎖又は二本鎖）を意味する。この用語「核酸構成物」は、核酸構成物が、本発明のコード配列の発現に必要とする全ての制御配列を含有するときには、用語「発現カセット」と同義である。ここで使用される用語「コード配列」とは、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接規定する核酸配列の一部分を意味する。コード配列の境界は、一般的に、mRNAのオープンリーディングフレームの５’端の直ぐ上流に位置するリボソーム結合部位（原核生物）及びmRNAのオープンリーディングフレームの３’端のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA及び組換え核酸配列を含むことができるが、これらには限定されない。
【００５５】
本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列は、ポリペプチドが発現されるように種々の方法で操作できる。発現ベクターによっては、核酸配列をベクターに挿入する前に核酸配列を操作することが、望ましい又は必要なことがある。組換えDNA法を用いた核酸配列を変更する方法は、当該技術分野において周知である。
【００５６】
用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドの発現に必要又は有利である全ての成分を含んだものを意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても、外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナル配列及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらには限定されない。最小限、制御配列は、プロモータと、転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルとを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特異的制限部位を導入するためのリンカーを備えていてもよい。用語「作用可能に連結」とは、制御配列がポリペプチドの発現を誘導するように、DNA配列のコード配列に対して適当な位置に制御配列を配置する構成を意味する。
【００５７】
制御配列は、宿主細胞が認識して核酸配列を発現する核酸配列である適当なプロモータ配列でよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモータは、変異プロモータ、トランケートプロモータ及びハイブリッドプロモータを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示し且つ宿主細胞と同種又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる、いずれの核酸配列でもよい。
【００５８】
とりわけ細菌性宿主細胞において、本発明の核酸構成物の転写を誘導するのに好適なプロモータとしては、例えば、E. coli lac operon、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子（dagA）、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、Bacillus licheniformis α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、Bacillus stearothermophilusマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）、Bacillus amyloliquefaciensα−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子（penP）、Bacillus subtilis xylA及びxylB遺伝子及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa−Kamaroff等、１９７８、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、７５：３７２７−３７３１）、さらには、tacプロモータ（DeBoer等、１９８３、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、８０：２１−２５）から得たプロモータが挙げられる。さらなるプロモータについては、「Useful proteins from recombinant bacteria（組換えバクテリアからの有用なタンパク質）」、Scientific American、１９８０、２４２：７４−９４及び上記Sambrook等、１９８９に記載されている。
【００５９】
また、制御配列は、転写を終了させるように宿主細胞により認識される配列である好適な転写ターミネーター配列でもよい。このターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’端に作用可能に連結される。選択された宿主細胞で機能するいずれのターミネーターも、本発明において使用できる。
【００６０】
また、制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域である好適なリーダー配列でもよい。このリーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’端に作用可能に連結される。選択された宿主細胞で機能するいずれのリーダー配列も、本発明で使用できる。
【００６１】
また、制御配列は、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導できるポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもよい。核酸配列のコード配列の５’端は、固有的に、翻訳リーディングフレームにおいて、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと自然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有していてもよい。または、コード配列の５’端は、コード配列に対して外来である、シグナルペプチドコード領域を含んでいてもよい。外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列が通常シグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされることがある。または、外来シグナルペプチドコード領域を、単純に天然のシグナルペプチドコード領域と置き換えてポリペプチドの分泌を高めてもよい。しかしながら、本発明では、発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に誘導するいずれのシグナルペプチドコード領域も使用できる。
【００６２】
細菌性宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、Bacillus NCIB １１８３７由来のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、Bacillus stearothermophilus α−アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformis サブチリシン遺伝子、Bacillus licheniformis β−ラクタマーゼ遺伝子、Bacillus stearothermophilus 中性タンパク質分解酵素遺伝子（nprT、nprS、nprM）又はBacillus subtilis prsA 遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen及びPalva、１９９３、Microbiological Reviews、５７：１０９−１３７に記載されている。
【００６３】
また、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもよい。得られたポリペプチドは、プロエンザイム又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒開裂により成熟活性ポリペプチドに転化できる。プロペプチドコード領域は、Bacillus subtilis アルカリ性タンパク質分解酵素遺伝子（aprE）又はBacillus subtilis 中性タンパク質分解酵素遺伝子（nprT）から得たものでよい。
【００６４】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在するときには、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置させ、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置させる。
【００６５】
また、宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現を調整できる調節配列を付加することが望ましいことがある。調節系としては、例えば、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に反応して遺伝子の発現をオン又はオフするものである。原核系における調節系は、lac、tac及びtrpオペレータ系を含む。調節配列の他の例には、遺伝子増幅できるものがある。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列と作用可能に連結される。
【００６６】
発現ベクター
また、本発明は、本発明の核酸配列と、プロモータと、転写停止シグナルと、翻訳停止シグナルとを含有する、組換え発現ベクターに関する。上記した種々の核酸配列及び制御配列を連結して、一つ以上の都合のよい制限部位を含んでいてそのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換をできるようにしてもよい、組換え発現ベクターを製造できる。別の態様によれば、本発明の核酸配列は、核酸配列又は上記配列を含有する核酸構成物を適当な発現ベクターに挿入することにより発現させてもよい。発現ベクターを作成する際、コード配列をベクターに位置させて、コード配列を発現に適当な制御配列に作用可能に連結するようにしてもよい。
【００６７】
組換え発現ベクターは、都合良く組換えDNA法に附することができ且つ核酸配列発現を生じることができる、いずれのベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターを導入する宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状プラスミドであっても、閉環プラスミドであってもよい。
【００６８】
ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち、複製が染色体複製とは無関係である染色体外エンティティとして存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体又は人工染色体でよい。ベクターは、自己複製を確保するいずれかの手段を含んでいてもよい。別の態様では、ベクターは、宿主細胞に導入したときに、ゲノムに組込まれ、組み込まれた染色体（類）といっしょに複製されるものでよい。さらに、単一のベクター又はプラスミドを使用してもよいし、２種以上のベクター又はプラスミドであって、いっしょに宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを含有するベクター又はプラスミドを使用してもよいし、トランスポゾンを使用してもよい。
【００６９】
本発明のベクターは、好ましくは形質転換細胞を容易に選択できるようにする一つ以上の選択性マーカーを含有する。選択性マーカーは、産生物が生物致死剤耐性又はウイルス耐性、重金属、原栄養体〜栄養要求性突然変異体等に対する耐性を提供する遺伝子である。細菌性選択性マーカーとしては、例えば、Bacillus subtilis又はBacillus licheniformisから得たdal遺伝子、又は、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するマーカーである。
【００７０】
本発明のベクターは、好ましくはベクターを宿主細胞ゲノムに安定に組込むここと又は細胞のゲノムとは無関係に細胞においてベクターの自律的複製を可能にする要素（類）を含有する。
【００７１】
宿主細胞ゲノムに組込むために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによりゲノムにベクターを安定に組込むためのベクターのいずれか他の要素に頼ってもよい。別の態様では、ベクターは、同種組換えにより宿主細胞のゲノムへの組込みを誘導する追加の核酸配列を含有してもよい。この追加の核酸配列により、ベクターは染色体（類）における宿主細胞ゲノムの正確な位置（類）に組込まれることができる。正確な位置に組み込まれる可能性を高めるために、組込み要素は、好ましくは同種組換えの確立を高めるために対応の標的配列と高度に相同性がある、１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、最も好ましくは８００〜１，５００塩基対等の十分な数の核酸を含有しなければならない。組込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同性があるいずれの配列でもよい。さらに、組込み要素は、非コード核酸配列であっても、コード核酸配列であってもよい。一方、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組込まれてもよい。
【００７２】
自律的複製のために、ベクターは、ベクターが当該宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製の起点をさらに含有することができる。細菌性複製起点には、例えば、大腸菌での複製が可能であるプラスミドpBR３２２、pUC１９，pACYC１７７及びpACYC１８４の複製の起点並びにBacillusでの複製が可能であるpUB１１０、pE１９４、pTA１０６０及びpAMβ１の複製の起点がある。複製の起点は、宿主細胞中で機能を温度感受性とする変異を有するものでもよい（例えば、Ehrlich、１９７８、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、７５：１４４３参照）。
【００７３】
本発明の核酸配列の複数のコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させてもよい。核酸配列のコピー数は、配列の少なくとも一つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに組込むことによるか、核酸配列に増幅性選択性マーカー遺伝子に含めることにより、細胞を適当な選択性薬剤の存在下で培養することにより選択性マーカー遺伝子の増幅コピーを含む細胞及びそれによる核酸配列の追加のコピーを選択できるようにすることにより増加させることができる。
【００７４】
上記した要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築する方法は、当業者には周知である（例えば、上記Sambrook等、１９８９参照）。
【００７５】
宿主細胞
また、本発明は、ポリペプチドの組換え産生に有利に使用される本発明の核酸配列を含有する組換え宿主細胞に関する。ベクターが染色体組込物としてか、上記したような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、本発明の核酸配列を含有するベクターを宿主細胞に導入する。用語「宿主細胞」とは、複製中に生じる変異のため親細胞とは同一ではない親細胞の子孫も包含する。どの宿主細胞を選択するかは、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源によって大きく異なる。
【００７６】
宿主細胞は、いずれの単細胞微生物、例えば、原核生物でもよい。有用な単細胞は、以下のバクテリア細胞が挙げられるが、これらには限定されない：グラム陽性バクテリア、例えば、Bacillus細胞、例えば、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis及びBacillus thuringiensis；Streptomyces細胞、例えば、Streptomyces lividans又はStreptomyces murinus、又はグラム陰性バクテリア、例えばE. coli及びPseudomonas sp.である。好ましい実施態様によれば、細菌性宿主細胞は、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilus又はBacillus subtilis細胞である。別の好ましい実施態様によれば、Bacillus細胞は、好アルカリ性Bacillusである。
【００７７】
ベクターを細菌性宿主細胞に導入するのは、例えば、コンピテント細胞（例えば、Young及びSpizizin、１９６１、Journal of Bacteriology、８１：８２３−８２９、又はDubnau及びDavidoff−Abelson、１９７１、Journal of Molecular Biology、５６：２０９−２２１参照）を用いた形質転換、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang及びCohen、１９７９、Molecular General Genetics、１６８：１１１−１１５参照）、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa及びDower、１９８８、Biotechniques、６：７４２−７５１参照）又は接合（例えば、Koehler及びThorne、１９８７、Journal of Bacteriology、１６９：５７７１−５２７８参照）により行うことができる。
【００７８】
製造方法
また、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、（a）野生型において前記ポリペプチドを産生できる菌株を培養して前記ポリペプチドを含む上清を得る工程と、（b）前記ポリペプチドを回収する工程とを含有する、方法に関する。好ましくは、菌株は、Sphingomonas属の菌株であり、より好ましくはSphingomonas capsulataの菌株である。
【００７９】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、（a）宿主細胞を前記ポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養する工程と、（b）得られたポリペプチドを回収する工程を、含有する方法に関する。
【００８０】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、（a）前記ポリペプチドの産生を誘導する条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞が、配列番号：１の核酸配列中に少なくとも一つの変異を有する配列番号：１の変異核酸配列を含んでなり、前記変異核酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものである工程と、（b）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法に関する。
【００８１】
本発明の製造方法によれば、細胞を、当該技術分野において公知の方法を用いて前記ポリペプチドの産生に適当な栄養培地で培養する。例えば、細胞は、実験室発酵槽又は工業的発酵槽で、好適な培地中、ポリペプチドが発現及び／又は単離される条件下で、振とうフラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、フェッドバッチ発酵又は固体状態発酵）により培養できる。培養は、当該技術分野において公知の方法において、炭素源、窒素源及び無機塩を含有する好適な栄養培地で生じる。好適な培地は、商業的に製造業者から入手してもよいし、公開されている組成に準じて調製してもよい（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ）。ポリペプチドを、栄養培地に分泌する場合には、ポリペプチドは、培地から直接回収できる。ポリペプチドを分泌しない場合には、細胞ライゼートから回収できる。
【００８２】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当該技術分野において公知の方法を用いて検出できる。これらの検出法には、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失が含まれる。例えば、酵素アッセイを使用して、ポリペプチドの活性を求めることができる。アミノペプチダーゼ活性を求める方法は、当該技術分野において公知である。上記したように、アミノペプチダーゼ活性は、アラニンのp−ニトロアニリドの初期加水分解速度を４０５nmで測定することにより求める。
【００８３】
得られたポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により回収できる。例えば、ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むがこれらには限定されない常法により栄養培地から回収できる。
【００８４】
本発明のポリペプチドは、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、クロマトフォーカシングクロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィ）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（例えば、Protein Purification、編者J.−C. Janson及びLars Ryden、VCH Publishers、ニューヨーク、１９８９参照）を含むがこれらには限定されない、当該技術分野において公知の種々の方法により精製できる。
【００８５】
植物
また、本発明は、本発明のアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換して回収可能な量でポリペプチドを発現及び産生するようにした、遺伝子導入植物、植物部分又は植物細胞に関する。ポリペプチドは、この植物又は植物部分から回収できる。別法として、組換えポリペプチドを含有する植物又は植物部分を、そのまま使用して、食物又は飼料の質を向上させるため、例えば、栄養価、嗜好性及びレオロジー特性を向上したり、抗栄養因子を破壊するのに使用できる。
【００８６】
遺伝子導入植物は、双子葉植物又は単子葉植物（dicot又はmonocot）であることができる。単子葉植物としては、例えば、イネ科植物、例えば、草原草（青草、Poa）、飼料草、例えば、シノケグサ、ムギ、温帯草、例えば、Agrostis並びに穀物、例えば、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ及びトウモロコシ（コーン）がある。
【００８７】
双子葉植物としては、例えば、タバコ、マメ、例えば、ルビナス、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウ、豆及び大豆、アブラナ（Brassicaceae科）、例えば、カリフラワー、ナタネ並びに密接に関連したモデル生物Arabidopsis thalianaがある。
【００８８】
植物部分としては、例えば、茎、カルス、葉、根、実、種及び塊茎がある。これに関連して、特定の植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペロキシソーム及び細胞質も、植物部分であると考えられる。さらに、どのような組織起源であれ、いずれの植物細胞も、植物部分であると考えられる。
【００８９】
また、このような植物、植物部分及び植物細胞の後代も、本発明の範囲に含まれる。
【００９０】
本発明のポリペプチドを発現する遺伝子導入植物又は植物細胞は、当該技術分野において公知の方法に準じて構成できる。簡単に述べれば、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする一つ以上の発現構築物を植物宿主ゲノムに組込み、得られた変更植物又は植物細胞を遺伝子導入植物又は植物細胞中で増殖することにより構築される。
【００９１】
都合のよいことに、発現構築物は、選択された植物又は植物部分における核酸配列の発現に必要とされる適当な調節配列と作用可能に連結した本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸構成物である。さらに、発現構築物は、発現構築物を組込んだ宿主細胞を同定するのに有用な選択性マーカーと、構築物を当該植物に導入するのに必要なDNA配列（後者は、使用されるDNA導入法に依存する）とを含有することができる。
【００９２】
調節配列、例えば、プロモータ配列及びターミネーター配列並びに必要に応じてシグナル配列又はトランジット配列は、例えば、いつ、どこで、どのようにポリペプチドを発現するのが望ましいかに基づいて選択される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、構成的又は誘導的であっても、発育的、段階的又は組織特異的であってもよく、発現物は、種子又は葉等の特異的組織又は植物部分を標的としてもよい。調節配列は、例えば、Tague等、Plant、Phys.、８６、５０６、１９８８に記載されている。
【００９３】
構成的発現では、３５S−CaMVプロモータを使用できる（Franck等、１９８０、Cell、２１：２８５−２９４）。器官特異的プロモータは、例えば、種子、ジャガイモ塊茎及び果実等の貯蔵シンク組織（Edwards及びCoruzzi、１９９０、Annu. Rev. Genet.、２４：２７５−３０３）由来のプロモータ又は分裂組織等の代謝シンク組織（Ito等、１９９４、Plant Mol. Biol.、２４：８６３−８７８）由来のプロモータ、種子特異的プロモータ、例えば、コメ由来のグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモータ（Wu等、Plant and Cell Physiology、第３９巻、第８号、第８８５−８８９頁（１９９８））、Conrad U.等、Journal of Plant Physiology、第１５２巻、第６号、第７０８−７１１頁（１９９８）に記載のレグミンB４とVicia faba由来の未知の種子タンパク質遺伝子からのVicia fabaプロモータ、種子油ボディタンパク質由来のプロモータ（Chen等、Plant and Cell Physiology、第３９巻、第９号、第９３５−９４１頁（１９９８）、Brassica napus由来の貯蔵タンパク質napAプロモータ、又は例えば、WO９１／１４７７２に記載されている当該技術分野において公知の他の種子特異的プロモータでよい。さらに、プロモータは、葉特異的プロモータ、例えば、コメ又はトマト由来のrbcsプロモータ（Kyozuka等、Plant Physiology、第１０２巻、第３号、第９９１−１０００頁（１９９３）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモータ（Mitra，A.及びHiggins，DW、Plant Molecular Biology、第２６巻、第１号、第８５−９３頁（１９９４）、コメ由来aldP遺伝子プロモータ（Kagaya等、Molecular and General Genetics、第２４８巻、第６号、第６６８−６７４頁（１９９５）、又は傷誘導性プロモータ、例えば、ジャガイモpin２プロモータ（Xu等、Plant Molecular Biology、第２２巻、第４号、第５７３−５８８頁（１９９３）でもよい。
【００９４】
プロモータエンハンサー要素を使用して、植物中でポリペプチドのより高い発現性を達成してもよい。例えば、プロモータエンハンサー要素は、プロモータと、ポリペプチドをコードする核酸配列との間に位置させるイントロンでよい。例えば、Xu等、op citは、コメアクチン１遺伝子の第一イントロンを使用して発現を高めることを開示している。
【００９５】
選択性マーカー遺伝子及び発現構築物の他の部分は、当該技術分野において入手可能なものから選択できる。
【００９６】
核酸構成物を、Agrobacterium介在形質転換、ウイルス介在形質転換、ミクロインジェクション、パーティクルガン、バイオリスティック形質転換及びエレクトロポレーション（Gasser等、Science、２４４、１２９３；Potrykus、Bio／Techn.、８、５３５、１９９０；Shimamoto等、Nature、３３８、２７４、１９８９）をはじめとする、当該技術分野において公知の通常の方法に準じて植物ゲノムに組込まれる。
【００９７】
現在のところ、Agrobacterium tumefaciens介在遺伝子導入は、遺伝子導入双子葉植物を発生させるのに選択される方法である（Hooykas及びSchilperoort、１９９２、Plant Mol. Biol.、１９：１５−３８参照）が、これは単葉植物の形質転換にも使用できる。しかしながら、これらの植物には、他の形質転換法が一般的に好ましい。現在のところ、遺伝子導入単葉植物を発生させるのに選択される方法、胚カルス又は発育胚（Christou、１９９２、Plant J.、２：２７５−２８１；Shimamoto、１９９４、Curr. Opin. Biotechnol.、５：１５８−１６２；Vasil等、１９９２、Bio／Technology、１０：６６７−６７４）のパーティクルガン（形質転換DNAを被覆した顕微鏡的金又はタングステン粒子）である。単葉植物の形質転換法の別法に、Omirulleh S等、Plant Molecular biology、第２１巻、第３号、第４１５−４２８頁（１９９３）に記載されているプロトプラスト形質転換に基づくものがある。
【００９８】
形質転換に続いて、発現構築物を組込んだ形質転換物を選択し、当該技術分野において周知の方法により再生して全植物とする。
【００９９】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、（a）本発明のアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含有する遺伝子導入植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養する工程と、（b）前記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法に関する。
【０１００】
アミノペプチダーゼ活性の除去又は減少
また、本発明は、親細胞の変異細胞の製造方法であって、ポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列を分断又は欠失させて、同じ条件下で培養したときに、前記親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異細胞を得ることを含有する、方法に関する。
【０１０１】
減少したアミノペプチダーゼ活性を有する菌株は、細胞中でのアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの発現に必要な核酸配列の変更又は失活により都合良く構築できる。変更又は失活させる核酸配列は、例えば、アミノペプチダーゼ活性を示すのに欠くことのできないポリペプチド又はその一部分をコードする核酸配列でもよく、又は核酸配列は、核酸配列のコード配列からポリペプチドを発現するのに必要とする調節機能を有していてもよい。このような調節又は制御配列の一例として、プロモータ配列又はその機能部分、すなわち、ポリペプチドの発現に影響を及ぼすのに十分な部分を挙げることができる。変更できる他の制御配列は、上記した通りである。
【０１０２】
核酸配列の変更又は失活は、細胞を突然変異誘発させ、アミノペプチダーゼ産生能が減少した細胞を選択又はスクリーニングすることにより実施することができる。突然変異誘発（特異的でもランダムでもよい）は、例えば、好適な物理的又は化学的突然変異誘発剤を使用することによるか、好適なヌクレオチドを使用することによるか、DNA配列をPCR発生突然変異誘発に附することにより実施できる。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発剤を組み合わせて使用することにより実施してもよい。
【０１０３】
これに使用するのに好適な物理的又は化学的突然変異誘発剤としては、例えば、紫外（UV）線、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
【０１０４】
このような薬剤を使用するときには、突然変異誘発は、典型的には、突然変異誘発される細胞を選択された突然変異誘発剤の存在下で好適な条件下でインキュベーションし、減少したアミノペプチダーゼ活性又は産生能を有する細胞を選択することにより実施する。
【０１０５】
本発明のポリペプチドの産生能の変更又は失活は、転写又は翻訳に必要なポリペプチドをコードする核酸配列又は調節要素について、一つ以上のヌクレオチドを導入、置換又は除去することにより実施できる。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去又はオープンリーディングフレームの変化を生じるように、ヌクレオチドを挿入又は除去できる。このような変更又は失活は、当該技術分野において公知の方法に準じて、指定部位突然変異誘発又はPCR発生突然変異誘発によりおこなうことができる。原則として、変更は、生体内、すなわち、変更されるべき核酸配列を発現する細胞について直接実施できるが、変更は、以下に例示するように生体外で実施するのが好ましい。
【０１０６】
選択された宿主細胞による産生能を失活あるいは減少させる都合のよい一例として、遺伝子交換法又は遺伝子分断法に基づくものがある。例えば、遺伝子分断法では、意図する内因性遺伝子又は遺伝子断片に相当する核酸配列を、生体外で突然変異誘発させて欠損核酸配列を製造した後、宿主細胞を形質転換させて欠損遺伝子を産生する。相同組換えにより、欠損核酸配列を、内因性遺伝子又は遺伝子断片を交換する。欠損遺伝子又は遺伝子断片も、ポリペプチドをコードする遺伝子が変更されるか破壊された形質転換体を選択するのに使用できるマーカーをコードすることが、望ましいことがある。
【０１０７】
別法として、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の変更又は失活は、ポリペプチドコード配列に相補なヌクレオチド配列を用いて確立されたアンチセンス法により実施できる。より具体的には、細胞によりポリペプチドの産生は、細胞中で転写でき且つ細胞中で産生されるポリペプチドmRNAにハイブリダイズできる、ポリペプチドをコードする核酸配列に相補のヌクレオチド配列を導入することにより減少又は排除できる。このように、相補アンチセンスヌクレオチド配列がポリペプチドmRNAとハイブリダイズする条件下で、ポリペプチドの翻訳量を、減少又はなくする。
【０１０８】
本発明の方法により変更される細胞は、起源が、微生物、例えば、所望のタンパク質産物の産生に好適な真菌類の菌株（細胞に対して同種又は異種）であることが、好ましい。
【０１０９】
さらに、本発明は、親細胞の変異細胞であって、ポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列を分断又は欠失させて、前記親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異細胞を得ることを含有する、変異細胞に関する。
【０１１０】
このようにして作製したポリペプチド欠失変異細胞は、同種及び／又は異種ポリペプチドの発現に宿主細胞として特に有用である。したがって、本発明は、さらに、同種又は異種ポリペプチドの製造方法であって、（a）変異細胞をポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養する工程と、（b）上記ポリペプチドを回収する工程を、含有する方法に関する。ここで使用される用語「異種ポリペプチド」とは、宿主細胞に対してネイティブではないポリペプチド、修飾してネイティブ配列を変更したネイティブタンパク質、又は組換えDNA法により宿主細胞を操作して発現を定量的に変更したネイティブタンパク質を意味する。
【０１１１】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドだけでなく意図するタンパク質産物の両方を産生する細胞を発酵することにより、アミノペプチダーゼ活性を実質的に有さないタンパク質産物の製造方法に関する。この方法は、発酵中又は発酵後にアミノペプチダーゼ活性を阻害できる効果的な量の薬剤を発酵ブロスに添加し、意図する産物を発酵ブロスから回収し、必要に応じて、回収した産物をさらに精製することを含有する。この方法を、以下の実施例でより詳細に説明する。
【０１１２】
さらに別の態様によれば、本発明は、アミノペプチダーゼ活性を実質的に有さないタンパク質産物の製造方法であって、意図するタンパク質産物が本発明のポリペプチドをコードする細胞に存在するDNA配列によりコードされるものである、方法に関する。この方法は、産物の発現を可能とする条件下で細胞を培養する工程と、得られた培養ブロスをpH処理と温度処理とを組み合わせた処理に附して実質的にアミノペプチダーゼ活性を減少させるようにする工程と、培養ブロスから上記産物を回収する工程と、を含む。別法として、pH処理と温度処理とを組み合わせた処理は、培養ブロスから回収した酵素試料について実施してもよい。必要に応じて、pH処理と温度処理とを組み合わせた処理は、アミノペプチダーゼ阻害剤での処理と組み合わせて使用してもよい。
【０１１３】
本発明のこの態様によれば、アミノペプチダーゼ活性の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％を除去することができる。この方法を使用することにより、アミノペプチダーゼ活性を完全に除去することが意図される。
【０１１４】
pH処理と温度処理とを組み合わせた処理は、好ましくはpH６．５〜７．５の範囲、温度４０〜６０℃の範囲で、所望の効果を得るのに十分な時間（典型的には、３０〜６０分間で十分）で実施する。
【０１１５】
意図する産物の培養及び精製に使用される方法は、当該技術分野において公知の方法でよい。
【０１１６】
本発明によるアミノペプチダーゼ活性を実質的に有さない産物の製造方法は、特に酵素等の真菌性タンパク質における真核ポリペプチドの製造に使用されることが特に意図される。酵素は、例えば、デンプン分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酸化還元酵素又は植物細胞壁分解酵素から選択できる。このような酵素としては、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチノース分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼが挙げられる。また、アミノペプチダーゼ欠失細胞を使用して、ホルモン、成長因子、受容体等の医薬に使用することが意図される異種タンパク質を発現させてもよい。
【０１１７】
用語「真核ポリペプチド」とは、ネイティブポリペプチドだけでなく、これらのポリペプチド、例えば、アミノ酸置換、欠失又は付加又は他のこのような変更による活性、熱安定性、許容pH等を高めた酵素をも含むことが理解されるであろう。
【０１１８】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の方法により製造された実質的にアミノペプチダーゼ活性のないタンパク質産物に関する。
【０１１９】
用途
本発明のポリペプチドは、加水分解度及びフレーバーの発現を高めるために、タンパク質加水分解物の製造に用いることができる。
【０１２０】
また、本発明のポリペプチドは、酵素を失活させるのにも使用できる。
【０１２１】
さらに、本発明のポリペプチドは、ペプチド配列の特異的開裂が望ましい多数の目的に有用である。例えば、タンパク質又はペプチドのあるものは、成熟タンパク質のN末端に多数の追加のアミノ酸残基を含有する不活性前駆体の形態で合成される。本発明のポリペプチドは、このような前駆体タンパク質を活性化するのに必要な後翻訳処理を提供できる。
【０１２２】
シグナルペプチド
また、本発明は、タンパク質をコードする遺伝子を、配列番号：２のアミノ酸１〜３２からなるシグナルペプチドをコードする配列番号：１のヌクレオチド５７４〜６６９からなる核酸配列に作用可能に連結して含有する、核酸構成物であって、前記遺伝子が前記核酸配列に対して外来のものである、核酸構成物に関する。
【０１２３】
また、本発明は、組換え発現ベクター、及びこのような核酸構成物を含有する組換え宿主細胞に関する。
【０１２４】
また、本発明は、タンパク質の製造方法であって、（a）タンパク質をコードする遺伝子を、配列番号：１のヌクレオチド５７４〜６６９からなるシグナルペプチドをコード領域に作用可能に連結して含む核酸構成物を含有する組換え宿主細胞であって、前記遺伝子が前記核酸配列に対して外来のものである組換え宿主細胞を、前記タンパク質の産生に好適な条件下で培養する工程と、（b）前記タンパク質を回収する工程、を含有する方法に関する。
【０１２５】
核酸配列は、他の制御配列を有する外来遺伝子に作用可能に連結できる。このような他の制御配列は、上記で説明した通りである。
【０１２６】
タンパク質は、いずれのタンパク質でもよい。さらに、タンパク質は、宿主細胞に対して、ネイティブでも異種であってもよい。ここでの用語「タンパク質」とは、コードされた産物の特定の長さを意味するものではなく、したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。また、用語「タンパク質」とは、２つ以上のポリペプチドが結合してコードされた産物を形成するものでもよい。また、タンパク質には、少なくとも２種の異なるタンパク質（それらのうちの一種以上は宿主細胞に対して異種であってもネイティブであってもよい）から得た部分又は完全ポリペプチド配列の組み合わせを含有するハイブリッドポリペプチドも含まれる。さらに、タンパク質には、上記したタンパク質及びハイブリッドタンパク質の天然対立及び設計変異体も含まれる。
【０１２７】
好ましくは、タンパク質は、ホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体又はその一部分、抗体又はその一部分、又はリポーターである。より好ましい実施態様によれば、タンパク質は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。さらにより好ましい実施態様によれば、タンパク質は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチノース分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【０１２８】
遺伝子は、原核生物、真核生物又は他の遺伝子源から得ることができる。本発明では、一定の源に関連して用語「から得た」とは、上記タンパク質が、その遺伝子源により産生されたものであるか、その遺伝子を挿入した細胞により産生されたものであることを意味する。
【０１２９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１３０】
実施例
実施例１：Sphingomonas capsulataからの粗製酵素エキス粉末の製造
Sphingomonas capsulata IFO １２５３３株を、スクロース０．５％と、ゼラチン１％と、酵母エキス０．５％と、コーンスティープリカー１％と、NaCl０．３％と、K2HPO4０．２％と、MgSO4７H2O０．１％とからなる培地３リットルを入れた５リットル発酵槽中で、通気及び攪拌しながら、３０℃で９時間培養した。菌体を、培養ブロスから集め、１０mM Tris−HCl（pH８．０）緩衝液で２回洗浄して、菌体４３g（湿潤重量）を得た。菌体を、１０mM Tris−HCl（pH８．０）緩衝液２００mlに懸濁し、リゾチーム及びTritonX−１００をそれぞれ最終濃度１mg／ml及び０．１％となるように添加することにより溶菌し、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。この溶液を、超音波処理した後、１５，０００ gで１０分間遠心分離した。上清を回収（２００ml）し、プロタミンスルフェートを最終濃度０．１％となるように添加して核酸を沈殿させた。得られた沈殿物を同様に遠心分離により捨て、得られた溶液を、粗製酵素エキスとして使用した。
【０１３１】
種々の合成ペプチドに対する粗製酵素エキスの活性を、表１に示すように測定した。得られた結果から、粗製酵素エキスは、ジペプチジルペプチダーゼIV、ロイシンアミノペプチダーゼ、グリシンアミノペプチダーゼ及びプロリルオリゴペプチダーゼ活性を有することが明らかとなった。
【０１３２】
0003979622.tif 000002
【０１３３】
等容積の冷アセトンを添加することにより、粗製酵素エキスを析出させた。酵素析出物を、小容量の１０mMリン酸（pH６．０）緩衝液に溶解し、不溶物を、遠心分離により除去した。得られた酵素を凍結乾燥して、粗製酵素粉末を得た。
【０１３４】
実施例２：粗製酵素粉末からのSphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIの精製
実施例１に記載の粗製酵素粉末を、２０mMリン酸（pH７．０）緩衝液に溶解し、試料の導電率が添加した緩衝液（２０mMリン酸、pH７．０）と同等となるまで希釈した。試料を、２０mMリン酸（pH７．０）緩衝液で予め平衡化したPharmacia Q−Sepharose又はMono Qカラムにローディングした。これらのカラムからの溶出液（フロースルー）を、以下で説明する方法によりアラニン−p−ニトロアニリド（Ala−pNA）を用いてアミノペプチダーゼ活性について評価した。
【０１３５】
ジメチルスルホキシドにAla−pNA１００mg／mlを添加して調製した原液を、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）緩衝液で希釈して濃度２mg／mlとした。アミノペプチダーゼとp−ニトロアニリドとの反応を、酵素溶液１０〜５０μlアリコットを、ミクロタイタープレートウエルに入れた基質溶液２００μlに添加することにより開始した。p−ニトロアニリドの初期加水分解速度を、THERMOmax Microplate Reader（Molecular Devices社、Sunnyvale、カリフォルニア州、米国）により、４０５nm、室温の条件で分析し、観察した。
【０１３６】
フロースルーには、アミノペプチダーゼ活性が存在した。このフロースルーを、DIAFLO（登録商標）PM１０限外濾過膜（Amicon社、米国）を備えたAmicon Spiral Ultrafiltration System（New Bedford、Amicon社、マサチュセッツ州、米国）を用いて濃縮後、得られた濃縮フロースルーのpHを、７０mM酢酸ナトリウム（pH４．０）緩衝液を用いてpH６．０に調整した。
【０１３７】
この濃縮フロースルーを、Pharmacia Mono S ５／５を予め充填した７ ５０mmカラム（Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）を５０mM MES（pH６．０）緩衝液で予め平衡化したものに適用した。画分を、上記したようにしてアミノペプチダーゼ活性について評価した。５０mM MES（pH６．０）緩衝液に添加して０〜０．２M NaClと濃度勾配をつけた溶離液で、結合アミノペプチダーゼ活性を溶離した。次に、顕著な活性を有する画分を、PM１０限外濾過膜を用いて再び濃縮した後、０．５M硫酸アンモニウムを含有する５０mMリン酸（pH７．０）緩衝液で平衡化した。
【０１３８】
次に、得られた濃縮試料を、０．５M硫酸アンモニウムを含有する５０mMリン酸（pH７．０）緩衝液で予め平衡化したPhenyl Superoseカラムにローディングした。０．５M硫酸アンモニウムを含有する５０mMリン酸緩衝液〜硫酸アンモニウムを含有しない５０mMリン酸緩衝液まで濃度勾配をつけた溶離液で、酵素を溶離した。活性画分を、プールした。
【０１３９】
精製アミノペプチダーゼのSDS−PAGE分析をおこなったところ、分子量が６７kDaである一つのバンドが現れた。この精製アミノペプチダーゼを、Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIと命名した。
【０１４０】
実施例３：粗製酵素粉末からのSphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIの精製
実施例１に記載の粗製酵素粉末を、蒸留水に溶解し、１５mMリン酸ナトリウム（pH６．０）緩衝液で予め平衡化したCM Sepharose CL−６Bカラム（Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）にローディングした。アミノペプチダーゼI活性を、１５mM〜６０mMリン酸ナトリウム（pH６．０）緩衝液の直線勾配を用いて溶離した。７．４mlの画分を集め、実施例２に記載のようにしてアミノペプチダーゼ活性について評価した。
【０１４１】
活性成分をプールし、１５mMリン酸（pH６．０）緩衝液に対して透析した。透析物を、順次、１５mMリン酸ナトリウム（pH６．０）緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムにローディングした。アミノペプチダーゼI活性を、１５mM〜３００mMリン酸ナトリウム（pH６．０）緩衝液の直線勾配を用いて溶離した。画分を集め、アミノペプチダーゼ活性について評価した。活性画分をプールし、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。
【０１４２】
実施例４：Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIの精製
Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIを、Sphingomonas capsulata IFO １２５３３株を、１リットル当たり、バクトペプトン１０gと、酵母エキス５gと、NaCl ３gと、K2HPO4 ２gと、MgSO4７H2O ０．１gと、グルコース５gと（別個にオートクレーブ処理した）とからなる培地１．５リットル中、１５時間、３１℃、２５０rpm、初期pH７．４５の条件で培養することにより得た培養ブロス上清から精製した。
【０１４３】
アミノペプチダーゼI活性を、実施例２と同様にしてアラニン−p−ニトロアニリド（Ala−pNA）を用いて測定した。
【０１４４】
遠心分離し、Whatmanガラスミクロ繊維フィルター（Whatman社、Maidstone、英国）を用いて濾過し、０．２２mmフィルターを備えたNalgene Filterwareを用いて濾過し、PM１０限外濾過膜を備えたAmicon Spiral Ultrafiltration Systemを用いて濃縮した培養ブロス上清（約１リットル）を、導電率及びpHがローディング緩衝液（５０mM MES pH６．０）と等しくなるまで１０mM リン酸ナトリウム（pH６．０）緩衝液で平衡化した。濾液は、５０mM MES（pH６．０）緩衝液で予め平衡化したSP−Sepharose、Fast Flow（Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）約１８０mlを含有する２４ ３９０mmカラムにローディングした。５０mM MES（pH６．０）緩衝液に添加して０〜０．２M NaClの濃度勾配をつけた溶離液２４０mlにより、アミノペプチダーゼI活性を有するタンパク質を溶離した。アミノペプチダーゼI活性を有する画分を、プールし、PM１０膜を用いて脱塩し、２０mMリン酸ナトリウム（pH７．０）緩衝液で平衡化した。
【０１４５】
次に、プールした溶液を、２０mMリン酸ナトリウム（pH７．０）緩衝液で予め平衡化したPharmacia MonoQ Beadsカラムにローディングした。アミノペプチダーゼI活性を有するタンパク質は、カラムに結合せず、フロースルーに集められた。フロースルーを、上記したPM１０膜システムを用いて濃縮し、pHを、７０mM酢酸ナトリウム（pH４．０）緩衝液により６．０に調整した。
【０１４６】
濃縮したフロースルーを、５０mM MES（pH６．０）緩衝液で予め平衡化したPharmacia Mono Sカラムにローディングした。５０mM MES（pH６．０）緩衝液に添加して０〜０．２M NaClの濃度勾配をつけた溶離液６０mlにより、アミノペプチダーゼを溶離した。次に、顕著なAla−pNA活性を有する画分を、プールし、濃縮し、上記したPM１０膜を用いて０．５M（NH4）2SO4を含有する５０mMリン酸（pH７．０）緩衝液で平衡化した。
【０１４７】
最後に、濃縮試料を、Pharmacia Phenyl Superose ５／５を予め充填した７ ５０mmカラム（Pharmacia Biotech社、Uppsala、スウェーデン）を０．５M（NH4）2SO4を含有する５０mMリン酸（pH７．０）緩衝液で予め平衡化したものにローディングした。アミノペプチダーゼI活性を有するタンパク質を、５０mMリン酸（pH７．０）緩衝液に添加して０．５〜０M（NH4）2SO4の濃度勾配をつけた溶離液３０mLで溶離した。アミノペプチダーゼ活性Iを含有する画分を、SDS−PAGEにより分析した後、プールした。
【０１４８】
精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIのSDS−PAGE分析では、分子量が６７kDaである一つのバンドが現れた。
【０１４９】
実施例５：Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI（６７kDa）のアミノ酸配列
実施例２に記載した精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIの試料を、８〜１６％Tris−グリシンSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、続いて、１０％メタノール中１０mM CAPS（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）（pH１１）を用いて２時間PVDF膜にブロット移行させた。PVDF膜を、４０％メタノール／１％酢酸中２０秒間０．１％Coommassie Blue R−２５０により染色し、５０％エタノールで脱染色してタンパク質バンドを観察した。６７kDaの主要なバンドを切除し、製造業者の使用説明書に準じてブロットカートリッジと液相TFAデリバリを用いて、Applied Biosystems Model ４７６A Protein Sequencerにより、アミノ末端の配列決定を行った。タンパク質は、Edman配列決定化学作用によりN末端ブロックされたことが分かった。
【０１５０】
実施例２に記載された精製アミノペプチダーゼIの１．０ml試料を、Savant Speed Vac AS１６０により乾燥した後、７０％ギ酸（水溶液）３００μlで再構成した。臭化シアンの数個の結晶を添加し、暗所において室温で一晩インキュベーションした。試料を、Speed Vacで再乾燥し、トリシン試料緩衝液（Novex社、San Diego、カリフォルニア州、米国）で再構成した。臭化シアン開裂断片を、１０〜２０％トリシンSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて４２kDa、３０kDa、１７kDa、１５kDa、１０kDa、６kDa及び４kDaのバンドに分離し、PVDF膜にブロット移行させた。６kDa、１０kDa、１５kDa、１７kDa、３０kDa及び４２kDaバンドを切除し、アミノ末端配列決定した。以下の配列である１５kDa、１０kDa及び６kDaバンドのN末端配列が得られた。
１５kDa：AVPIAHGVPDAQDVPYPG（配列番号：２）
１０kDa：AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI（配列番号：２）
６kDa：GSIGLEHHRSSENQQEPKSLTDWAA（配列番号：２）
【０１５１】
また、精製アミノペプチダーゼを、以下のようにしてエンドプロテイナーゼGlu−Cで部分消化した。２．５％SDSを含有する０．１２５M Tris−HCl（pH６．７）７．５μlを、濃縮アミノペプチダーゼ６０μlを０．１２５M Tris−HCl（pH６．７）添加したものに添加した。試料を、混合し、２分間煮沸した後、２３℃で１５分間冷却した。次に、０．１２５M Tris−HCl（pH６．７）にエンドプロテイナーゼGlu−C配列決定グレード（Boehringer Mannheim社、Indianapolis、インディアナ州）を４００μg／mlの濃度となるように添加したもの１０μlを、添加した。試料を、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、２X TricineSDS試料緩衝液（Novex社、San Diego、カリフォルニア州、米国）４５μlを添加し、試料を５分間煮沸した。
【０１５２】
ペプチド断片を、還元条件下、１０〜２０％Novex Tris−Tricineゲルを用いて分離した。ペプチドバンドを、４０kDa、３０kDa、２５kDa、２２kDa、２０kDa、１７kDa、１０kDa、６kDa、５kDa及び４kDaで切除した。４０kDa、３０kDa及び１０kDaバンドの配列決定をしたところ、これらが、非常に混合された状態にあることが分かった。しかしながら、１７kDa及び２２kDaバンドは混合物ではあったが、FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV（配列番号：２）からなる主配列であった。
【０１５３】
実施例６：Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI（６７kDa）の特性決定
ジメチルスルホキシド１ml当たり各々p−ニトロアニリド１００mgの原液を、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）緩衝液で希釈して２mg／ml濃度とした。基質が不完全に溶解する場合には、それらの懸濁液を使用した（下記表２に星印で示したもの）。５０mMリン酸ナトリウム（pH７．０）緩衝液に酵素溶液１０μlのアリコットを添加したものを、９６ウエルマイクロタイタープレートにいれた基質溶液１９０μlに添加することにより、Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIと各p−ニトロアニリドとの反応を開始した。p−ニトロアニリドの初期加水分解速度を、THERMOmax Microplate Reader（Molecular Devices社、Sunnyvale、カリフォルニア州、米国）により、４０５nm、２５℃の条件で分析、観察した。結果（表２）から、アミノペプチダーゼIは、Ala−pNAを好んで加水分解したが、Gly−pNAも加水分解したことが判明した。しかしながら、ジペプチド基質のうち、アミノペプチダーゼIは、Ala−Ala−pNAよりもGly−Phe−pNAを迅速に加水分解した。
【０１５４】
0003979622.tif 000003
【０１５５】
６７kDaアミノペプチダーゼIの最適pHを、以下のプロトコルを用いて求めた。酢酸ナトリウム４．２５gとTris（遊離塩基）３．７８gに蒸留水を添加して最終容積を２５０mlとし、３６．５〜３８％HClによりpHを８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、５．８０、５．５及び５．０に調整することにより、異なるpHの緩衝液を調製した。各pHの１０mlアリコットを、取り出した。DMSOにAla−pNAを１００mg／mlとなるように添加した溶液２０μl（容積）を、各緩衝液９８０μlに添加した。次に、基質添加後の緩衝液についてのpHを測定したところ、８．５、８．０、７．５７、７．３０、７．０９、６．６８、６．１４及び５．２５であった。基質濃度２mg／mlの別の溶液を、種々のpHで調製した。１０mM Tris−HCl（pH７．５）で５倍希釈した酵素溶液１０μlを種々のpHの基質２００μlに室温で添加することにより反応を開始し、４０５nmで観察した。
【０１５６】
表３に示す結果から、アミノペプチダーゼIは、５．３〜８．５の範囲、より好ましくは７．０〜７．５の範囲の最適pHを有することが明らかとなった（図１参照）。pH範囲５．２５〜８．５では、検出できるほどのAla−pNaの自己加水分解はなかった。pH５．５では、アミノペプチダーゼIにより触媒されたAla−pNAの加水分解は、見掛けKm及びVmaxが基質による酵素の活性化のために負の値を有する場合にはMichaelis−Menten速度論には従わなかった。pH７．５で、Kmは、２．５mMであった。
【０１５７】
0003979622.tif 000004
【０１５８】
５０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）緩衝液に基質としてAla−pNAを添加したものを用いて、３０〜５５℃にわたる温度範囲で、最適温度を求めた。結果から、アミノペプチダーゼIの最適温度範囲が、pH７．５で３５〜４６℃、より好ましくは４０〜４５℃であることが分かった（図２参照）。
【０１５９】
５０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）緩衝液中で酵素を２０分間温度範囲３５〜５５℃でインキュベーションした後、氷冷し、上記したようにしてpH７．５で基質としてAla−pNAを用いて残留活性を測定することにより、アミノペプチダーゼIの温度安定性を測定した。結果から、アミノペプチダーゼIは、pH７．５で、４０℃までは安定性約１００％であることが判明した（図３参照）。４５℃で、酵素は約６０％の残留活性を保持したが、５０℃では、酵素は、完全に失活した。
【０１６０】
実施例７：粗製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIのDH増加効果と精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIのDH増加効果との比較
Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI（６７kDa）のDH増加効果を、大豆タンパク質加水分解により評価し、実施例１に記載のようにして調製した粗製酵素粉末の性能と比較した。
【０１６１】
大豆タンパク質の加水分解度（DH）を、次にのようにして求めた。Adler−Nissen（１９８６、Enzymic Hydrolysis of Food Proteins、Elsevier Applied Science Publishers）に記載されているように定義されるDHを、実質的にChurch等、１９８３、Journal of Dairy Science、６６：１２１９−１２２７に記載されているようにして、Adler−Nissen、１９７９、Agricultural and Food Chemistry、２７：１２５６−１２６２により求められる補正係数を用いて、上清とOPA（o−フタルジアルデヒド、Sigma Chemical社、St．Louis、ミズーリ州）との反応により求めた。
【０１６２】
FLAVOURZYME １０００L（商標）の低バックグランド（基質タンパク質の１．５％）又は高バックグランド（基質タンパク質の６％）と、用量が基質タンパク質の１．５％のALCALASE ２．４L（登録商標）において、アミノペプチダーゼIを増加する用量で添加した。以下のようにして実験を実施した。
【０１６３】
加水分解を、１０ml規模で、５０℃、１８時間の条件で実施した。加水分解中にpHを再調整しない場合の初期pHは、７であった。酵素の失活を、水浴中８５℃で３分間実施した。基質濃度は、大豆ミール由来のタンパク質２％であった。基質を、水浴中８５℃、３分間の条件で熱処理した。上記したFLAVOURZYME １０００L（商標）及びALCALASE ２．４L（登録商標）とともに使用した酵素は、粗製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI粉末（実施例１参照）及び実施例４に記載の精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIであった。
【０１６４】
アミノペプチダーゼIの使用量は、pH７．５でのAla−pNAの加水分解により求めたアラニル−アミノペプチダーゼ単位（AAU）基準とした。アミノペプチダーゼIの１AAU単位は、Ala−pNAの９．１mM溶液中、pH７．５、２２℃、イオン強度＝０．０５の条件下、１分間当たりAla−pNAを１．０ミクロモル加水分解する酵素の量として定義される。
【０１６５】
精製アミノペプチダーゼIの特異的活性は、約１２AAU／mg酵素であった。したがって、例えば、大豆タンパク質２００mg当たり０．２４AAUの用量は、大豆タンパク質１kg当たり酵素０．１gに相当した。
【０１６６】
DHとAAUの用量との関係を、FLAVOURZYME（商標）の低バックグラウンド用量については図４に、FLAVOURZYME（商標）の高バックグラウンド用量については図５に示す。
【０１６７】
図４及び図５は、加水分解物が、最高AAU用量のアミノペプチダーゼI活性でほぼ飽和されたことを示している。粗製酵素は、低用量FLAVOURZYME（商標）に添加したときにDHを、４４％から７２％に増加させることができた。精製したアミノペプチダーゼIは、DHを６１〜６２％に増加させた。したがって、精製アミノペプチダーゼIのDH増加効果は、粗製酵素のDH増加効果の（６２−４４）／（７２−４４） １００％＝６４％であった。粗製酵素は、高用量のFLAVOURZYME（商標）に添加したときに、DHを６１％から７７％に増加させた。精製アミノペプチダーゼIは、DHを７１％に増加させた。したがって、精製アミノペプチダーゼIの増加効果は、粗製酵素の増加効果の（７１−６１）／（７７−６１） １００％＝６３％であった。
【０１６８】
アミノペプチダーゼIの添加の代替法は、より多くのFLAVOURZYME（商標）を添加することである。バックグラウンド用量１．５％に余分のFLAVOURZYME（商標）を０．５％添加したところ、DHが４４％から４８％に増加した。アミノペプチダーゼIの添加効果を計算すると、粗製酵素の効果の（６２−４８）／（７２−４８） １００％＝５８％であった。
【０１６９】
同様に、FLAVOURZYME（商標）のバックグラウンド用量６％に余分のFLAVOURZYME（商標）１％を添加したところ、DHが６１％から６３％に増加した。アミノペプチダーゼIの効果を計算したところ、粗製酵素の効果の（７１−６３）／（７７−６３） １００％＝５７％であった。
【０１７０】
得られた最高DHは、７７％であった。DH値は、可溶性タンパク質基準ではなくて総タンパク質基準であった。タンパク質の溶解度は、ほぼ８５％であった。したがって、可溶性タンパク質におけるDHは、１００％に極めて近い約９１％であった。
【０１７１】
AAU添加による個々の遊離アミノ酸（FAA）の相対増加率（％）を、表４に示す。Hyp、メチオニンスルホン酸、及びTrpは、極めて変動し、結果が不確実であるため、表には含めなかった。
【０１７２】
【表４】
0003979622.tif 000005
【０１７３】
これらの結果から、粗製又は精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIを添加したとき、Glyが最高の増加率を示したアミノ酸であることが分かった。増加した放出を示した他のアミノ酸は、Ala、Glu、Gln、Asp及びSerであったが、これらのアミノ酸については、粗製酵素は、おそらく粗製酵素中に他のアミノペプチダーゼが存在するためと思われるが、精製アミノペプチダーゼI単独よりも多く放出した。
【０１７４】
高用量のFLAVOURZYME（商標）により、高DH加水分解物が産生された。６７kDaのアミノペプチダーゼI又は粗製酵素を添加した低用量のFLAVOURZYME（商標）により、同じ高DH及びFAA放出が得られた。表４によれば、６７kDaアミノペプチダーゼIを添加した低用量のFLAVOURZYME（商標）により得られた加水分解物は、高用量のFLAVOURZYME（商標）単独により得られる加水分解物と比較して、とりわけGlyだけでなくAla、Glu及びAspをより高レベル有し、Met、Pro及びIleをより低レベルで有する。
【０１７５】
実施例８：ゼラチンの加水分解におけるSphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIのDH増加効果
Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIのDH増加効果を、ゼラチン加水分解により試験した。
【０１７６】
アミノペプチダーゼIを、実施例７で実施したようにして、低又は高バックグラウンドのFLAVOURZYME（商標）及びALCALASE（登録商標）に用量を増加させて添加した。
【０１７７】
エッペンドルフ管において、反応液２００μlを用いて加水分解を実施した。基質ゼラチン（Merck社）を、８５℃で５分間、蒸留水に溶解した。５０℃に冷却後、pHを６．５に調整した。酵素を添加後、最終ゼラチン濃度を２％に調整した。各反応における基質濃度を計算したところ、４mgであった。
【０１７８】
FLAVOURZYME（商標）及びALCALASE（登録商標）とともに使用した酵素は、実施例７と同様に粗製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIの粉末及び精製Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIであった。粗製酵素と精製酵素の両方のグリシンアミノペプチダーゼ単位（GAPU）を、基質としてGly−pNAを用いて、５０mM Tris−HCl（pH７．５）緩衝液中３７℃で測定した。アミノペプチダーゼIを、５０mM Tris−HCl（pH７．５）中３７℃で評価した。Gly−pNA（Bachem Feinchemikalien社、Bubendorf、スイス）を２．５mg／ml濃度で４０％ジオキサンに溶解し、１．５容積の５０mM Tris−HCl（pH７．５）を基質濃度１mg／mlに添加した。この酵素試料を、同じ緩衝液５００μlに希釈し、基質溶液１００μlを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。１M酢酸ナトリウム（pH４．０）緩衝液３００μlを添加することにより、反応を終了させた。ブランク反応については、停止溶液を酵素溶液に添加し、３７℃で５分間インキュベーション後、基質溶液を添加した。試料反応とブランク反応の両方について、吸光度（４１０nm）を測定した。酵素活性を、pNA（９，４８０M-1cm-1）について、４１０nmでのモル吸光係数を用いて計算した。GAPU１ユニットは、上記した条件下で１分間当たり３７℃でGly−pNAの１ミクロモルを加水分解する酵素量として定義した。使用した粗製アミノペプチダーゼI及び精製アミノペプチダーゼIの特異的活性は、それぞれ０．７２５GAPU／mg及び６．４５GAPU／mgであった。酵素を、表５のスキームにしたがって、タンパク質４mgに添加した。
【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
酵素／基質比を、酵素量（重量）の後の括弧内に示す。
【０１８１】
加水分解反応を、５０℃、１８時間の条件で実施した。酵素を８５℃、５分間の条件で失活した後、遠心分離した。DHを、OPA法を用いて、加水分解物の総タンパク質含量基準で計算した。
【０１８２】
図６及び図７に示した精製アミノペプチダーゼIのDH増加効果から、低FLAVOURZYME（商標）バックグラウンドに粗製及び精製酵素（０．２U／４mgゼラチン）を添加することにより、DHが３８％からそれぞれ６７％及び６１％に増加したことが明らかとなった。DH増加効果は、この用量でほとんど飽和した。
【０１８３】
FLAVOURZYME（商標）の用量を７％まで増加すると、対照DHは、４３％に増加した。しかしながら、精製アミノペプチダーゼIを用いて得られたDHは６１％であり、低FLAVOURZYME（商標）バックグラウンドで得られるものとほとんど一致した。
【０１８４】
これらの結果から、Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIは、タンパク質を極めて高DHに加水分解することが示された。さらに、アミノペプチダーゼIを用いて、他のタンパク質分解酵素の用量を減少させて同様のDHを得ることができる。
【０１８５】
実施例９：Sphingomonas capsulata B４６アミノペプチダーゼI遺伝子同定用プローブの調製
以下に示すSphingomonas capsulata B４６アミノペプチダーゼIの内部アミノ酸配列に基づいて、縮重プライマーを合成してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介してプローブを増幅し、Sphingomonas capsulata B４６アミノペプチダーゼIを同定した。
内部ペプチドAB０７１３：AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI（配列番号：２）  内部ペプチドAB０７８１：FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV（配列番号：２）
【０１８６】
以下に示す５５０−３９−１、５５０−２３−４及び５５０−３９−２と命名したプライマーを、以下の増幅反応に使用した。
５５０−２３−４：５’−gcrtcrtangcrtcncc−３’（配列番号：３）
５５０−３９−１：５’−aargaygarccnaaycc−３’（配列番号：４）
５５０−３９−２：５’−acyttytcrtcyttrtc−３’（配列番号：５）
【０１８７】
５０μlの容積で、５５０−３９−１及び５５０−２３−４又は５５０−３９−１及び５５０−３９−２のいずれかのプライマー５０pmol、Sphingomonas capsulata B４６染色体DNA（鋳型として）１μg、１X PCR緩衝液（Perkin−Elmer社、Foster City、カリフォルニア州）、各々２００MのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP並びに０．５UのAmpliTaq Gold（Perkin−Elmer社、Foster City、カリフォルニア州）を用いて増幅反応を準備した。Sphingomonas capsulata B４６染色体DNAを、Qiagen Genomic Handbook（Qiagen社、Chatsworth、カリフォルニア州）に記載のBacterial Isolation Protocolを用いて単離した。反応を、９５℃、１０分間の条件で１サイクル、各々９５℃、１分間、４４℃、１分間及び７２℃、１分間の条件で３５サイクル並びに７２℃、７分間の条件で１サイクルにプログラムしたStratagene Robocycler４０（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア州）でインキュベーションすることによりおこなった。
【０１８８】
プライマー５５０−３９−１及び５５０−３９−２を用いた増幅により１００bpと命名した１００bp産物が得られ、プライマー５５０−３９−１及び５５０−２３−４を用いた増幅により１９１bpと命名した１９１bp産物が得られた。両方のPCR産物を、個々に、製造業者の取扱説明書に準じて、TOPO／TAクローニングキット（Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州）からベクターpCR２．１／TOPOにクローニングした。Applied Biosystems Model ３７７ Sequencer（Applied Biosystems社、Foster City、カリフォルニア州）を用いた配列決定により、１００bp産物の配列が１９１bp産物に含まれており、アミノ酸配列AB０７１３がアミノ酸配列AB０７８１の約３０アミノ酸上流に位置することが分かった。
【０１８９】
次に、以下に記載の５５０−７１−２及び５５０−７９−１と命名された新しい非縮重プライマー組を使用して、９５℃、２分間の条件で１サイクル、各々９５℃、１分間、５６℃、１分間及び７２℃、１分間の条件で２５サイクル並びに７２℃、７分間の条件で１サイクルにプログラムしたStratagene Robocycler４０（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア州）により、製造業者の取扱説明書に準じて、Genius System PCR DIG Probe Synthesis Kit（Boehringer−Mannheim社、インディアナポリス、イリノイ州）を用いて１９１bpDIG標識プローブをPCR増幅した。
５５０−７１−２：５’−cttttcgtccttgtccagc−３’（配列番号：６）
５５０−７９−１：５’−gcgtcatatgcgtctcc−３’（配列番号：７）
【０１９０】
実施例１０：染色体ライブラリーのスクリーニング
実施例９に記載のプローブ１９１bpを使用して、Sphingomonas capsulata B４６の染色体ライブラリーをスクリーニングした。Sau３A部分消化（５〜７kb）Sphingomonas capsulata B４６染色体DNAをベクターpSJ１６７８のBamHI部位（図８）に連結することにより、ライブラリーを構築した。Escherichia coli XL１ Blue MR（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア州）を、この染色体ライブラリーにより形質転換し、製造業者の取扱説明書に準じて、Genius DIG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling ＆ Detection System（Boehringer Mannheim Biochemicals社、Indianapolis、インディアナ州）を用いて調製したDIG標識１９１bpプローブを用いたコロニーリフトによりスクリーニングした。約５０００コロニーをスクリーニングした後、プローブにハイブリダイズした５コロニーと得られたプラスミドを、pMRT００４．１−７、pMRT００４．１−１４、pMRT００４．１−１５、pMRT００４．１−１６及びpMRT００４．１−１７と命名した。全ての陽性クローンから得たプラスミドDNAを、QIAGEN Miniprep Plasmid Kit（Qiagen社、Chatsworth、カリフォルニア州）を用いて調製した。１％アガロースゲル上での制限エンドヌクレアーゼPstIを用いたプラスミドDNAの制限解析により、プラスミドpMRT００４．１−７は約６kbのインサートを含み、プラスミドpMRT００４．１−１４は約５．６kbのインサートを含み、プラスミドpMRT００４．１−１５は約８．５kbのインサートを含み、プラスミドpMRT００４．１−１６は約８．６kbのインサートを含み、プラスミドpMRT００４．１−１７約７．２kbのインサートを含んでいることが分かった。このゲルを、さらに、DIG標識１９１bpプローブを用いて製造業者の取扱説明書に準じてGenius DIG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling ＆ Detection Systemによるサザンハイブリダイゼーションにより解析した。結果から、DIG標識１９１bpプローブは、pMRT００４．１−７、pMRT００４．１−１４、pMRT００４．１−１６及びpMRT００４．１−１７における約３５００bpの断片にハイブリダイズしたが、一方、pMRT００４．１−１５におけては、約１６００bp断片にしかハイブリダイズしなかったことが分かった。
【０１９１】
pMRT００４．１−７及びpMRT００４．１−１４からのプラスミドDNAを、QIAGEN Maxiprep Plasmid Kit（Qiagen社、Chatsworth、カリフォルニア州）を用いて調製した。次に、pMRT００４．１−７からのDNAを、配列決定に附した。DNA配列決定を、色素−ターミネーターケミストリーを用いたApplied Biosystems Model ３７７XL Automated DNA Sequencerにより実施した。連続的な配列を、製造業者の取扱説明書に準じて、トランスポゾン挿入法（Primer Island Transposition Kit、Perkin−Elmer／Applied Biosystems社、Foster City、カリフォルニア州）を用いて得た。得られた結果から、タンパク質のN末端の方向のアミノペプチダーゼI遺伝子の約３分の１がこのクローンから欠失していることが分かった。したがって、アミノペプチダーゼI遺伝子の残りを、AvaI、SphI及びEcoRIによる制限解析によりアミノペプチダーゼI遺伝子全体を含んでいると思われたクローンpMRT００４．１−１４を配列決定することにより得た。
【０１９２】
実施例１１：PCRによるSphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI遺伝子の単離
PCRを使用して、実施例１０に記載のクローンpMRT００４．１−１４からNruI／BglII断片としてSphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI遺伝子を単離した。以下に記載のプライマー５９１−３５−１及び５９１−３６−１を用いて、増幅を実施した。増幅反応は、５０μlの容積で、プライマー５９１−３５−１及び５９１−３６−１ ５０pmol、鋳型としてのpMRT００４．１−１４プラスミドDNA１０ng、１ PCR緩衝液（カリフォルニア州、Foster City、Perkin−Elmer社）、各々dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの２００μM、１μlのDMSO及び０．５UのAmpliTaq Gold（Perkin−Elmer社、Foster City、カリフォルニア州）を用いて準備した。反応は、９５℃、１０分間の条件で１サイクル、各々９５℃、１．５分間、５５℃、１．５分間及び７２℃、３分間の条件で３０サイクル並びに７２℃、７分間の条件で１サイクルにプログラムしたStratagene Robocycler４０（Stratagene社、La Jolla、カリフォルニア州）においてインキュベーションしておこなった。
５９１−３５−１：５’−cgaatcggccagatctccatcg−３’（配列番号：８）
５９１−３６−１：５’−gatcctggcgcagctcgcgaaggcgcagg−３’（配列番号：９）
【０１９３】
増幅により、２１００bpPCR産物が得られた。２１００bp産物を、製造業者の取扱説明書に準じてInvitrogen TOPO／TAクローニングキットによりpCR２．１／TOPOにクローニングして、上記と同様にして配列決定をした。この新規のクローンを、pMRT０１０−４と命名した。pMRT０１０−４から演繹したアミノ酸配列と、pMRT００４．１−１４からのアミノペプチダーゼIの公知のアミノ酸配列との比較から、これらが同一物であることが分かった。しかしながら、DNAレベルで、pMRT０１０−４は、アミノ酸位置１７０にサイレント点変異を含み、グリシンをコードするコドンggtが同様にグリシンをコードするggcに変化していた。
【０１９４】
アミノペプチダーゼIクローンは、６７３アミノ酸のポリペプチドをコードする２０１９bpのオープンリーディングフレームをコードしていた。ヌクレオチド配列（配列番号：１）及び推定アミノ酸配列（配列番号：２）を、図９に示す。最大C、最大Y、最大S及び平均Sがそれぞれ０．４２、０．３４、０．９５及び０．５５であるカットオフ値のSignalPプログラム（Nielsen等、１９９７、Protein Engineering、１０：１−６）を用いて、３２残基のシグナルペプチドを予測したところ、分泌アミノペプチダーゼIの分子量が約７０，６００ダルトンであることが分かった。したがって、成熟アミノペプチダーゼIは、６４１アミノ酸から構成されている。
【０１９５】
下記の要旨が付属しているBLAST２．０タンパク質データベースサーチプログラム（Altschul等、１９９７、Nucleic Acids Research、２５：３３８９−３４０２）を用いて、アミノペプチダーゼ配列の比較をおこなった：blastall−p blastp−a４−e１０−E０−v５００−b２５０−I［query file］−d prot＿all（但し、−pはプログラム名を表し、−aは使用プロセッサ数を表し、−eは期待値を表し、−Eはgapを延長するのに要するコストを表し、−vは１ライン記載数を表し、−bは示される配列数を表し、−Iはquery fileを表し、−dはサーチに使用されるデータベースを表す）。
【０１９６】
BLASTサーチから、Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼIがSynechocystis sp.からの仮定的６７kDaタンパク質と２３％の同一性で領域を共有していることが明らかとなった（受入番号Q５５４４９）。
【０１９７】
実施例１２：Sphingomonas capsulata アミノペプチダーゼI遺伝子のBacillus発現ベクターpPL２４１９CAsub２−Pter／４９８へのクローニング
Bacillus subtilisにおいてアミノペプチダーゼIを発現及び分泌するストラテジーとして、Bacillus組込みベクターに、強力プロモータ及びグラム陽性シグナル配列（フレーム中）の後ろのタンパク質の成熟領域をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子の領域をクローニングした。強力なプロモータであるPter及びBacillusプロテアーゼPD４９８（米国特許第５，６２１，０８９号）由来のグラム陽性シグナル配列をコードすることから、プラスミドpCAsub２−Pter／４９８を、発現及び分泌のために選択した。このプラスミドは、予め、プラスミドp４９８−５（米国特許第５，６２１，０８９号）をSphIで消化することにより構築し、Pter／４９８発現カセットを含有する２５００bp断片を、pIC２０R（Marsh等、１９８４、Gene、３２：４８１−４８５）のSphI部位にクローニングしてpIC２０R−Pter／４９８を生成した。次に、pSJ２８８２−Pter／４９８を、HindIII及びBamHIで消化し、Pter／４９８発現カセットを含む２５００bp断片を、pSJ２８８２（WO９８／２２５９８）のHindIII／BamHI部位にクローニングしてpSJ２８８２−Pter／４９８を生成した。pSJ２８８２−Pter／４９８を、HindIIIで消化し、Klenow断片で処理して平滑末端を作製した後、BamHIで消化した。次に、Pter／４９８発現カセットを含む２５００bp断片を、組込みベクターpCAsub２（WO９８／２２５９８）のNotI（Klenow断片によるフィリング）／BamHI部位にクローニングしてpCAsub２−Pter／４９８を生成した。
【０１９８】
アミノペプチダーゼI遺伝子を含む最終組込みベクターを作製するために、pCAsub２−Pter／４９８由来のプラスミドDNAを、MscI及びBglIIで消化し、pMRT０１０−４由来のプラスミドDNAを、NruI及びBglIIで消化した。pCAsub２−Pter／４９８由来の８０００bpMscI／BglII断片とpMRT０１０−４由来の２１００bpNruI／BglII断片とを、１％アガロースゲルにより単離し、製造業者の取扱説明書に準じて、QIAGEN Agarose DNA Gel Extraction Kit II（Qiagen社、Chatsworth、カリフォルニア州）で抽出した。これらの２つの断片を、迅速DNA Ligation Kit（Boehringer−Mannheim社、Indianapolis、インディアナ州）を用いて連結し組込みベクターpMRT０１４−１（図１０）を生成した後、これを、上記Petit等、１９９０の方法に準じてBacillus subtilis PL１８０１ spoIIE細胞に直接挿入して形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択した。Bacillus subtilis PL１８０１ spoIIEは、遺伝子apr及びnprが欠失するとともにspoIIE遺伝子にTn９１７が挿入されたBacillus subtilis １６８（Bacillus Stock Center、Columbus、オハイオ州）である。形質転換体を、クロラムフェニコールを５μg／ml含有するTryptone血液寒天ベース（TBAB）プレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベーションした。Bacillus subtilis １８０１Ile：：pMRT０１４−１と命名した形質転換体由来のゲノムDNAを、Qiagen Genomic Handbook（Qiagen社、Chatsworth、カリフォルニア州）に記載のBacterial Isolation Protocolを用いて単離した。Bacillus subtilis １８０１Ile：：pMRT０１４−１由来のゲノムDNAを、上記したようにして、Bacillus subtilis １６４Δ５（WO９８／２２５９８）に挿入して形質転換した。Bacillus subtilis A１６４Δ５：：pMRT０１４−１と命名した形質転換体を、クロラムフェニコールを３０μg／ml含むTBAB寒天プレートで３回増幅した。
【０１９９】
実施例１３：Bacillus subtilisにおけるSphingomonas capsulata B４６アミノペプチダーゼI遺伝子の発現
Bacillus subtilis A１６４Δ５：：pMRT０１４−１株を、スクロース１０％と、大豆粉４％と、無水リン酸二ナトリウム０．４２％と、プルロン酸０．０１％と、炭酸カルシウム０．５％とからなるPS−１培地５０mlを入れた２つの同じ振とうフラスコ中で、３７℃、２５０rpmの条件下で４日間培養した。さらに、組込みベクターを含むBacillus subtilis A１６４Δ５：：pCAsub２を、陰性対照として使用した。
【０２００】
各フラスコから１mlの試料を、２４時間、４８時間及び７２時間で取り出した。アミノペプチダーゼI組込みの生存度と安定性を、Luria−Bertani（LB）プレートへのプレーティング及び続いてのクロラムフェニコールを３０μg／ml含有するTBABへのパッチングにより確認した。各例において、組込みは、TBABプレートにパッチングしたコロニーが一晩で成長したことにより１００％安定であることが判明した。
【０２０１】
Novex８〜１６％Tris−Glycine Precast Gel−１．０mm   １２ウエル及びNovex DryEase Mini Gel Drying System（Novel Experimental Technology社、San Diego、カリフォルニア州）とを用いたSDS−PAGE分析を、製造業者の取扱説明書に準じて、各フラスコから得た上清１２μlについて実地して発現レベルを求めた。試験した菌株の発現レベルも、L−Ala−pNAを基質として用いたアミノペプチダーゼプレートアッセイにより分光光度分析法を用いて求めた。SDS−PAGEゲルデータにより、アミノペプチダーゼI発現がBacillus subtilis A１６４Δ５：：pMRT０１４−１について観察され、最高発現が４８時間であったことが、分光光度測定データが裏付けられた。
【０２０２】
生物材料の寄託
以下の生物材料を、ブダペスト条約に基づいて、Northern Regional Research Center、１８１５ University Street、Peoria、Ilinois、６１６０４のAgricultural Research Service Patent Culture Collectionに寄託し、以下の受け入れ番号が付与された。
寄託物：E. coli XL１ Blue MR pMRT００４．１−１４
受託番号：NRRL B−３００３２
寄託日：１９９８年６月１０日
【０２０３】
ここに記載され且つ請求の範囲に記載の発明は、ここに開示された具体的実施態様は本発明のいくつかの態様を例示することを意図しているので、具体的実施態様による範囲には限定されない。いずれの等価の実施態様も、本発明の範囲内であることが意図される。実際に、ここに示され且つ記載されているものの他に、本発明の種々の変形例も、上記説明から当業者には明らかであろう。このような変形例も、請求の範囲の範囲内であることが意図される。抵触の場合には、定義を含む本開示事項と照合して確認することにより明らかとなるであろう。
【０２０４】
種々の文献がここに引用されているが、これらの開示事項全体は、引用することにより、本明細書に組み込まれたものとする。
【０２０５】
【表６】
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  DMSOにAla−pNAを１００mg／mlの濃度で添加した溶液を使用して室温で測定したときのSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼの活性とpHとの関係を示す。
【図２】  ５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）中のSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼの活性と温度との関係を示す。
【図３】  ５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）中のSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼの活性と温度との関係を示す。
【図４】  Sphingomonas capsulata粗製酵素エキスとSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼとをそれぞれ低用量及び高用量Flavourzyme（商標）バックグラウンドに添加したときのDHに対する影響を示す。
【図５】  Sphingomonas capsulata粗製酵素エキスとSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼとをそれぞれ低用量及び高用量Flavourzyme（商標）バックグラウンドに添加したときのDHに対する影響を示す。
【図６】  Flavourzyme（商標）、Alcalase（登録商標）及びSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼの種々の組み合わせにより得られるDHを示す。
【図７】  Flavourzyme（商標）、Alcalase（登録商標）及びSphingomonas capsulataアミノペプチダーゼの種々の組み合わせにより得られるDHを示す。
【図８】  pSJ１６７８の制限地図である。
【図９】  Sphingomonas capsulata IFO １２５３３アミノペプチダーゼの核酸配列及び推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び配列番号：２）である。
【図１０】  pMRT０１４−１の制限地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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