(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアミノシクロヘキサン白金(II)と、一般式(A):
PEG−block−ポリ(carbo)   (A)
(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)鎖セグメントを表し、そしてポリ（carbo）はポリ(グルタミン酸)鎖セグメントおよびポリ(アスパラギン酸)鎖セグメントからなる群より選ばれるカルボキシル基有するポリマー鎖セグメントを表す。)
で示される構造を含んでなるブロック共重合体との配位錯体であって、ポリ（carbo）のカルボキシルアニオンと白金との結合を介してジアミノシクロヘキサン白金(II)が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体。
【請求項２】
ブロック共重合体が、下記一般式(1)または(2)またはそれらの塩である請求項1記載の
配位錯体:
【化１】
0003955992.tif 000007
上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R2はメチレン基またはエチレン基を表し、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、xは0〜5,000の整数であるが、xはnより大きくなく、そしてn-xおよびx個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが50%以上を占める。
【請求項３】
ブロック共重合体の構造が、下記一般式(1-a)または(2-a)で表される請求項1記載の配位錯体:
【化２】
0003955992.tif 000008
上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、n個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが５０%以上を占める。
【請求項４】
一般式(1-a)または(2-a)におけるR5の全てが水素原子またはアルカリ金属イオンを表す請求項３に記載の配位錯体。
【請求項５】
錯体が、水または、無機もしくは有機緩衝剤の水性媒体中で、ポリ(エチレングリコール)鎖セグメントをシェルとし、ポリ(グルタミン酸)鎖セグメントおよびポリ(アスパラギン酸)鎖セグメントからなる群より選ばれるポリマー鎖セグメントをコアとするナノ粒子にジアミノシクロヘキサン白金(II)が内包された形態にある、請求項1に記載の配位錯体。
【請求項６】
ジアミノシクロヘキサン白金(II)の白金(Pt)対該ブロック共重合体のカルボキシル基の当量比(Pt/COO-)が0.3〜１である請求項1に記載の配位錯体。
【請求項７】
ジアミノシクロヘキサン白金(II)と、一般式(1-a)または(2-a):
【化３】
0003955992.tif 000009
（上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、n個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが５０%以上を占める。）
で示される構造を含んでなるブロック共重合体との配位錯体であって、一般式(1-a)または(2-a)で表されるブロック共重合体のカルボキシルアニオンと白金との結合を介してジアミノシクロヘキサン白金(II)が該ブロック共重合体に固定化されており、ジアミノシクロヘキサン白金(II)の白金(Pt)対該ブロック共重合体のカルボキシル基の当量比(Pt/COO-)が0.3〜１である配位錯体。
【請求項８】
ジアクオジアミノシクロヘキサン白金(II)錯体(Diaquo DACH Platin)と、一般式(A):
PEG−block−ポリ(carbo)     (A)
(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)鎖セグメントを表し、そしてポリ（carbo）はポリ(グルタミン酸)鎖セグメントおよびポリ(アスパラギン酸)鎖セグメントからなる群より選ばれるポリマー鎖セグメントを表す。)
で示される構造を含んでなるブロック共重合体を、水性溶媒中で、Diaquo DACH Platin(II)の白金(Pt)と該ブロック共重合体のカルボキシルアニオンとの結合を形成することのできる、該Pt対該カルボキシル基の当量比及び条件下で反応させ、こうして得られるジアミノシクロヘキサン白金(II)と該共重合体との配位錯体を回収することを特徴とする請求項1に記載の配位錯体の製造方法。
【請求項９】
Diaquo DACH Platinが、水性溶媒中で、ジクロロ(1,2−ジアミノシクロヘキサン)白金(II)と硝酸銀とを反応させ、副生成物である塩化銀を除去して得られる水溶液中に存在するものである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
Ptとカルボキシル基の当量比が、0.１以上であり、そして反応温度5〜60℃である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
ブロック共重合体の構造が、下記一般式(1-a)または(2-a)で表される請求項８に記載の製造方法：
【化４】
0003955992.tif 000010
上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、n個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが５０%以上を占める。
【請求項１２】
ジアミノシクロヘキサン白金(II)と、一般式(A):
PEG−block−ポリ(carbo)     (A)
(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)鎖セグメントを表し、そしてポリ（carbo）はポリ(グルタミン酸)鎖セグメントおよびポリ(アスパラギン酸)鎖セグメントからなる群より選ばれるカルボキシル基を有するポリマー鎖セグメントを表す。)
で示される構造を含んでなるブロック共重合体との配位錯体であって、ポリ（carbo）のカルボキシルアニオンと白金との結合を介してジアミノシクロヘキサン白金(II)が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体の抗腫瘍有効量と製薬学的に許容されるキャリヤーを含んでなる抗腫瘍用組成物。
【請求項１３】
ブロック共重合体が、下記一般式(1)または(2)またはそれらの塩である請求項１２記載の抗腫瘍用組成物：
【化５】
0003955992.tif 000011
上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R2はメチレン基またはエチレン基を表し、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、xは0〜5,000の整数であるが、xはnより大きくなく、そしてn-xおよびx個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが50％以上を占める。
【請求項１４】
さらに、抗腫瘍有効成分として、シスプラチンと、一般式(1-a)または(2-a）：
【化６】
0003955992.tif 000012
（上式中、R1は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は-(CH2)b-NH-を表し、bは１〜５の整数であり、L2は-(CH2)c-CO-を表し、cは１〜５の整数であり、R3はそれぞれ独立して、水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルカルボニル基、ベンズヒドリルカルボニル基、アクリロイル基およびメタクリロイル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表し、R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、t-ブチルオキシ基、メトキシ基、ベンズヒドリルオキシ基、アリルオキシ基およびビニルフェニルメトキシ基からなる群より選ばれる基を表し、R5はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオン、ベンジル基、ベンズヒドリル基およびC1-6アルキル基からなる群より選ばれる基を表し、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、但し、n個のR5中、水素原子またはアルカリ金属のイオンが５０%以上を占める。）
で示されるブロック共重合体とのシスプラチンの配位錯体が組み合わされた、請求項１２に記載の抗腫瘍用組成物。
【請求項１５】
ジアミノシクロヘキサン白金(II)の配位錯体とシスプラチンの配位錯体の比が、白金の重量を基準にして、１／３〜３／１で組み合わされる請求項１４に記載の抗腫瘍用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）とポリ（エチレングリコール）−ポリ（カルボン酸）ブロック共重合体との配位錯体、ならびに該配位錯体の製造方法および該配位錯体を有効成分として含んでなる抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】  白金化合物であるシスプラチンやその類似体であるカルボプラチン（シスプラチンの離脱基であるジクロライドが１，１−シクロブタンジカルボキシレートで置換された化合物に相当する）は、特に生殖器官の癌に有効であるとして、早くより臨床使用されている。他方、シスプラチンの離脱基である二つのアミン基（またはアミノ配位子）のジアミノシクロヘキサン（以下、ＤＡＣＨともいう。）による置換誘導体〔ジクロロジアミノシクロヘキサンプラチン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏ  ＤＡＣＨ  ｐｌａｔｉｎ）〕が良好な抗腫瘍活性を有し、かつ、安定な錯体であることは知られている。しかし、かようなＤＡＣＨ白金錯体は水に実質的に不溶性であることから、水溶性を改善すべく、該錯体のクロライド離脱基（または配位子）を多種多様なアニオン性配位子で置換した誘導体が提案されてきた。このような誘導体のあるものは、例えば、シスプラチン耐性Ｌ−１２１０白血病細胞に対して活性を示すことからさらに興味が持たれてきた。殊に、オキザレート置換ＤＡＣＨ白金錯体は、良好な水溶性を示すと同時に、高い治療係数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を有し、第三世代の抗腫瘍性白金化合物として臨床試験に供された（下記の非特許文献１、２および３参照）。
他方、上記誘導体の中には、オキザレートとは逆に、脂溶性を高めるために、２分子の高級脂肪酸によるカルボキシレート置換ＤＡＣＨ白金錯体を合成し、それらを安定にリポソーム内に封入したリポソーム複合体も提案されている（下記の非特許文献４参照）。
上記のオキザレート置換ＤＡＣＨ白金錯体〔Ｐｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｄａｃｈ）とも称する〕は、具体的には、非特許文献１の１８５６頁左欄で言及されているように、幾何異性体として、ｔｒａｎｓおよびｃｉｓ異性体が、さらにｔｒａｎｓ異性体は２つの光学異性体として、ｔｒａｎｓ−１およびｔｒａｎｓ−ｄ異性体も単離されている。これらのうちＰｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｔｒａｎｓ−１−ｄａｃｈ）またはｃｉｓ−［（１Ｒ２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミンーＮ，Ｎ’］オキザラト（２−）−０，０−白金（ＩＩ）（オキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とも称されている）は、水溶性が高く７．５ｍｇ／ｍＬ（３７℃における１．０Ｍ  ＫＣｌ水溶液中）の溶解性を示す。また、Ｐｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｄａｃｈ）は、腹水肉腫ザルコーマー１８０を移植した実験動物にたいして優れたＥＤ９０を示す。かようなオキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）に対し、オキザレートと同様にジカルボン酸であるが、２つのカルボキシル基の間にメチレン基が１個加入されていることで異なるマロネートを配位子とするＰｔ（ｍａｌｏｎａｔｏ）−（ｄａｃｈ）は、Ｐｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｄａｃｈ）に比べて、ＥＤ９０値を示すための薬物用量が約５倍以上になり（すなわち、薬効が五分の一以下になる）、治療係数がＰｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｃｉｓ−ｄａｃｈ）に比べて半分以下になることが報告されている（例えば、下記の非特許文献５参照）。
上記の様なＤｉｃｈｌｏｒｏ  ＤＡＣＨ  ｐｌａｔｉｎの、所謂、低分子プロドラッグの他に、ポリマーを用いる高分子プロドラッグも提案されている（下記の非特許文献６参照）。非特許文献６には、かような高分子プロドラッグ系で用いることのできるポリマーの例として、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＨＰＭＡ）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）、酸化デキストラン（ＯＸ−Ｄｅｘ）等が挙げられているが、具体的には、酸化デキストランまたはカルボキシメチルーデキストラン（ＣＭ−Ｄｅｘ）を用いて作製したＤＡＣＨ白金錯体のポリマー複合体が提供されているだけである。さらに、非特許文献６には、ＯＸ−Ｄｅｘ複合体がＣＭ−Ｄｅｘ複合体に比べて、血清含有媒体中での実験腫瘍細胞に対する残存細胞毒性活性がより長期にわたり存在し、かつ、より高い細胞毒性を示すことも記載されている。そしてこのようなＯＸ−Ｄｅｘ複合体の優位性は、ＯＸ−Ｄｅｘの方が、ＣＭ−Ｄｅｘに比べて、ＤＡＣＨ白金錯体とのより強い配位結合を形成し、かつ、担持ポリマーの立体障害がより大きいことによる旨の示唆もある。
文献リスト
【非特許文献１】Ｏｌｉｖｉｅｒ  Ｒｉｘｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐｐ１８５５−１８６５，１９９６、特に、１８５５頁の要約部および１８５６頁左欄、典型的な誘導体については１８６２頁
【非特許文献２】Ｊｅａｎ  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３５（２０００）７５−９３
【非特許文献３】Ｅｒｉｃ  Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．１，２２７−２３５，２００２  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ  Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．５（２００２）
【非特許文献４】Ｒｏｍａｎ  Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３（１９９４）３７８−３８４
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ  Ｋｉｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｖｏｌ．２１，１３１５−１３１８，１９７８特に、１３１７頁表ＩＩＩおよびＩＶ
【非特許文献６】Ｙ．Ｏｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１０８５−１０９６（１９９６）
【発明の開示】
抗腫瘍性白金化合物として、オキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）は、Ｄｉｃｈｌｏｒｏ  ＤＡＣＨ  ｐｌａｔｉｎに比べて、水溶性が著しく向上し、効能が高く、しかも治療係数が高く安全に使用できる抗腫瘍性化合物であることが示唆されている。しかし、もし可能であるなら、オキザリプラチンよりもさらに安全に使用できる抗腫瘍性白金化合物が提供できれば、癌化学療法の進歩に貢献できるであろう。
本発明者等の幾人かは、先に、シスプラチンとポリ（エチレングリコール）鎖のセグメントとポリ（グルタミン酸）鎖のセグメントを有するブロック共重合体との配位錯体（「シスプラチン内包ポリマーミセル」ともいう。）が、シスプラチンそれ自体に比べ、シスプラチンの体外排泄を有意に遅延させ（または薬剤の血中半減期の上昇をもたらし）、しかも、優れた抗腫瘍活性を示し、低減した毒性も示すことを見出し特許出願した（国際公開番号：ＷＯ０２／２６２４１Ａ１参照）。
他方、上述したとおりＤＡＣＨ白金錯体では、アニオン性離脱基または配位子として、オキザレートとを担持するＰｔ（ｏｘａｌａｔｏ）−（ｄａｃｈ）錯体よりも、カルボキシル基間が一個のメチレン基により離れているマロネートとを担持するＰｔ（ｍａｌｏｎａｔｏ）−（ｄａｃｈ）錯体の方が抗腫瘍剤としての薬効が劣り、しかも治療係数も劣ることが知られている。なお、かかるポリマー複合体が臨床試験に供されていることを示唆する文献の存在を本発明者は知らない。
かような背景が存在するにも拘らず、本発明者等はＤＡＣＨ白金錯体とポリ（エチレングリコール）鎖のセグメントとポリ（グルタミン酸）鎖またはポリ（アスパラギン酸）鎖のセグメントを有するブロック共重合体との配位錯体（「ＤＡＣＨ白金錯体内包ミセル」ともいう。）の合成を試みてみた。
その結果、意外にもＤＡＣＨ白金錯体内包ミセルは、その配位子（該共重合体）中のアニオン性離脱基としての２個のカルボキシレート（またはカルボキシルアニオン）基の間が、オキザレートに比べて遥かに離れているか、または無秩序であるにも拘らず、高い抗腫瘍効果を有し、血中半減期もオキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とは比較にならないほど上昇し、しかもシスプラチン内包ポリマーミセルに比べて、生理的条件を模した、１０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で著しく長期にわたり安定なポリマーミセル構造を維持することが確認された。また、薬剤に結腸癌Ｃ−２６細胞を長期間（４８時間、７２時間）さらした場合の増殖阻害活性（ＩＣ５０）は、シスプラチン内包ポリマーミセルに比べＤＡＣＨ白金錯体内包ミセルの方が著しく高いことも確認できた。またさらに、カルボキシル基を側鎖に有する繰り返し単位がグルタミン酸以外のブロック共重合体であっても、場合によっては、ＤＡＣＨ白金錯体内包ミセルに匹敵しうる作用効果を示すものがあることも見出した。
さらにまた、かようなＤＡＣＨ白金錯体内包ミセルとシスプラチン内包ポリマーミセルの組み合わせ使用は、相加ないし相乗的な抗腫瘍作用を示すことも確認された。
こうして、本発明は、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）と、一般式（Ａ）：
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）                  （Ａ）
（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そしてｃａｒｂｏは側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す）
で示される構造を含んでなるブロック共重合体との配位錯体であって、ｃａｒｂｏのカルボキシル基と白金との結合を介してジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体を、提供する。
また、かような配位錯体の製造方法、該配位錯体の抗腫瘍有効量と製薬学的に許容されるキャリヤーを含んでなる抗腫瘍性組成物も提供される。また、かようなジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）の錯体の抗腫瘍有効量を、それを必要とする患者（哺乳動物、特にヒト）に投与することを含んでなる腫瘍の治療方法も本発明の一態様として提供される。前記抗腫瘍性組成物および腫瘍の治療方法では、上述したＷＯ０２／２６２４１Ａ１に記載されたシスプラチン内包ポリマーミセル（または共重合体とシスプラチンの錯体）を、さらに組み合わせて使用する態様の発明も提供される。
このような本発明に従う、配位錯体は、ＤＡＣＨ白金錯体の誘導体の中でも最も優れた抗腫瘍剤といわれているオキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）よりも有意に優れた特性を有するだけでなく、例えば、先に本発明者等の幾人かが開発したシスプラチン内包ポリマーミセルの生理学的環境下（体液中等）での安定性からも予期できない程のはるかに優れた安定性を示す一方で、有意に優れた抗腫瘍活性も示す。さらに、肝臓への滞積性は遊離のシスプラチン（またはシスプラチンそれ自体）とほぼ同等であるにも拘らず、腫瘍への集積性は遊離のシスプラチンとは比較できないほど高い値を示す。したがって、本発明によれば既知の、通常毒性の高いことが知られている、抗腫瘍性白金化合物に比べ、例えば、極めて安全に使用でき、かつ、抗腫瘍として効能の高い、特異なタイプのＤＡＣＨ白金錯体の誘導体が提供できる。
本発明の具体的な記述
本発明に従う配位錯体は、Ｄｉｃｈｌｏｒｏ  ＤＡＣＨ  ｐｌａｔｉｎにおける離脱基（または配位子）クロライドがブロック共重合体の側鎖にカルボキシル基を有する１または２以上の繰り返し単位のカルボキシレートの少なくとも１個により置換されており、残りの離脱基はアクア化（水分子がその酸素原子の孤立電子対で白金イオンに配位している状態をいう）されていてもよい。そして、上記のクロライドの２個が２個のカルボキシレートにより置換されている場合、該２個のカルボキシレートは単一のポリマー分子の隣接もしくは相当隔離したものに由来するか、または複数のポリマー分子に由来することができる。限定されるものでないが、該配位錯体の構造式およびそれらが水性媒体溶媒中で形成するとみなせるＤＡＣＨ白金錯体内包ミセルの概念図を図１に示す。
ＤＡＣＨ白金錯体部分は、非特許文献１または４に記載されているとおり各種の異性体でありうるが、本発明の目的に従う限り、いずれか一種の異性体または各種異性体の混合物であることができる。
他方、上記の離脱基を置換するのに用いられるブロック共重合体は、親水性ポリマーセグメントとポリ（カルボン酸）セグメントを含んでなり、かつ、水性溶媒中でポリ（カルボン酸）セグメントのカルボキシレート（またはカルボキシルアニオン）がＤＡＣＨ白金錯体の白金（または白金イオン）と結合（所謂・配位結合）を形成できるものであれば、理論上いかなるブロック共重合体であってもよいが、好ましくは後述するものである。さらに、かかる共重合体は、水性溶媒中で親水性ポリマーセグメントからなる外層を形成するシェルとＤＡＣＨ白金錯体を固定したポリ（カルボン酸）セグメントからなる内部または中心層を形成するコアとのポリマーミセルを形成できるものが好ましい。
しかし、具体的には、親水性ポリマーセグメントとしてポリ（エチレングリコール）鎖またはポリ（エチレンオキシド）鎖セグメントを含んでなり、下記の一般式（Ａ）で示されるブロック共重合体を挙げることができる。
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）                  （Ａ）
上式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そしてｃａｒｂｏは側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。該ポリ（ｃａｒｂｏ）は、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、からなる群より選ばれるポリマー鎖由来であることができる。
本発明の目的上より好ましいブロック共重合体としては、下記の一般式（１）または（２）で示されるものまたはその塩を挙げることができる。
0003955992.tif 000002
上式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子もしくはアルカリ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、但し、ｘは０〜５，０００の整数であるが、ｘはｎより大きくなく、そしてｎ−ｘおよびｘ個のＲ５中、水素原子もしくはアルカリ金属のイオンが５０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは実質的に１００％を占める。
本発明の目的上より一層好ましいブロック共重合体としては、下記の一般式（１−ａ）または（２−ａ）で示されるものまたはその塩を挙げることができる。
0003955992.tif 000003
上式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ３は水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子もしくはアルカリ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、但し、ｎ個のＲ５中、水素原子もしくはアルカリ金属のイオンが５０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましく実質的に１００％を占める。
上記の一般式中の各基または部分の定義は、当業者が通常認識している意味または内容を有するものとして解釈されねばならない。限定されるものでないが、以下に、具体例を挙げる。
Ｒ１についていう、未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、または上記のカルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、本発明に従う配位錯体を形成した後に対応する保護された形態の基または部分から脱保護もしくは転換して生ぜしめ、次いで必要に応じ、適当な抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ７）２、Ｆ（ａｂ）、または葉酸、等）を共有結合し、そして該配位錯体に標的指向性を付与しるために利用できる。このような官能基を片末端に有するＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部の製造法によって、都合よく形成できる。
こうして形成されるＰＥＧセグメント部分とポリ（ｃａｒｂｏ）セグメント部分とは、一般式（Ａ）、（１）、（２）、（１−ａ）または（２−ａ）で示されるブロック共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。製造方法は特に限定されるものではないが、一般式（１）、（２）、（１−ａ）または（２−ａ）の錯体を製造する場合の一方法として、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を用いて、そのアミノ末端から、例えば、β一ベンジルーＬ一アスパルテートおよび／またはγ一ベンジルーＬ一グルタメートのＮ一カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖ベンジル基を他のエステル基に変換するか、または部分もしくは完全加水分解することにより目的のブロック共重合体を得る方法が挙げられる。この場合共重合体の構造は一般式（１）または（１−ａ）となり、連結基Ｌ１は用いたＰＥＧセグメントの末端構造に由来する構造となるが、好ましくは−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−表す（ここで、ｂは１〜５の整数である。）。
また、ポリ（カルボン酸）またはポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、予め用意したＰＥＧセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（２）または（２−ａ）に対応する構造となることもあり、連結基Ｌ２は特に限定されるものではないが、好ましくは−（ＣＨ２），−ＣＯ−を表す（ここで、ｃは１〜５の整数である。）。
一般式（１）、（２）、（１−ａ）または（２−ａ）中のＲ５は、それぞれ独立して水素原子またはカルボキシル基の保護基であることができる。カルボキシル基の保護基としては、限定されるものでないが、ベンジル、ベンズヒドリルまたはＣ１−６アルキル基が挙げられ、アルキル基の具体的なものとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルを挙げることができる。
Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子またはアミノ基の保護基、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチルまたはトリフルオロアセチル基等であることができ、また、ベンジルカルボニルまたはベンズヒドリルカルボニル基等の疎水性基であることができ、また、アクリロイルまたはメタクリルロイル基等の重合性基であることもできる。
Ｒ４はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基またはカルボキシル基の保護基、例えばベンジルオキシ、ｔ−ブチルオキシまたはメトキシ基等であることができ、また、ベンジルオキシまたはベンズヒドリルオキシ基等の疎水性基であることができ、また、アリルオキシまたはビニルフェニルメトキシ基等の重合性基であることもできる。かような重合性基は、本発明に従う、配位錯体からなるポリマーミセルを形成した後、重合させることによりポリマーミセルの構造をより堅牢にすることができる。しかし、本発明の薬物内包ポリマーミセルは、生理学的環境下で、通常、薬物をミセル外に放出する間はミセル構造を維持している場合が多いいので、かような重合反応に付する必要がないことが多い。
ｍおよびｎは、それぞれ５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００、特に好ましくは４０〜５００、および２〜５，０００、より好ましくは５〜１，０００、特に好ましくは１０〜２００である。したがって、本明細書では便宜上、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（カルボン酸）等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」の範疇に入るものも包合される概念として用いている。
またポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント、特に、ポリ（アスパラギン酸）の場合に存在しうる２種の繰り返し単位の構成割合を規定する、ｘは、０〜５，０００の整数（ただしｎより大きくない）であることができる。この場合、各繰り返し単位はランダムに分布していることも、ブロック状に分布していることもできる。
本発明の配位錯体は、好ましくは、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）の白金（Ｐｔ）対該ブロック共重合体のカルボキシル基（カルボキシルアニオン）の当量比（Ｐｔ／ＣＯＯ−）が０．０５以上より好ましくは０．１以上、特に好ましくは、０．３〜１．０または１．２である。該当量比の上限は、配位錯体としては、理論上２．０であることができるが、抗腫瘍剤とするときには本発明の目的に沿う限度において、ジアクオジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）錯体を該共重合と配位錯体を形成しているジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）錯体の他に、含んでいてもよい。本発明に従う、配位錯体は、例えば、図１に示されるように、ジアクオジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）錯体（Ｄｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ）と、一般式（Ａ）：
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ａ）
（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そしてｃａｒｂｏは側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。）
で示される構造を含んでなるブロック共重合体を、水性溶媒中で、Ｄｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ（ＩＩ）の白金（Ｐｔ）と該ブロック共重合体のカルボキシルアニオンとの結合を形成することのできる、Ｐｔとカルボキシル基の当量比および条件下で反応させ、こうして得られるジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）と該共重合体との配位錯体を回収することにより都合よく製造することができる。そして、Ｄｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎは、水性溶媒中で、ジクロロ（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）と硝酸銀とを反応させ、副生成物である塩化銀を除去して得られる水溶液中に存在する状態のまま、上記の錯体形成反応に付すことができる。ジクロロ（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）およびＤｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎは既知の化合物である（例えば、非特許文献５または２参照）。
反応条件としては、目的の配位錯体が得られる限りいかなる条件を設定してもよいが、Ｐｔ対カルボキシル基の当量比が、０．１以上、好ましくは、０．３以上となり、そして最大で１となるようにＤｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎとブロック共重合体の使用量を選び、そして両反応体が溶解または一部懸濁している濃度、反応温度５〜６０℃を選ぶのがよい。上記に言う、水性溶媒とは、水（特に、脱イオン水）または各種無機もしくは有機緩衝剤、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、エタノール等の水混和有機溶媒を、上記の錯体形成反応に悪影響を及ぼさない範囲で含んでいてもよい溶媒を意味する。生成した配位錯体は、通常、水性溶媒中で可溶化したポリマーミセル（通常、２０ｎｍ〜５００ｎｍの平均粒径を有する。動的光散乱法により測定した場合）であるので、ポリマーミセルを単離、精製する常法により、反応混合物から回収することができる。この方法の典型的なものとしては、限外濾過法、ダイアフィルトレーション、透析方法が挙げられる。
こうして単離、精製されたＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセル溶液は、そのまま滅菌処理、必要により、注射剤として適するそれ自体既知の助剤を添加して、注射剤としてもよく、また、ポリマーミセル溶液を濃縮後、例えば、凍結乾燥して、固体状の微小粉体としてもよい。該微小粉体は、再度、注射可能な溶液中にかなり高濃度で溶解でき、しかも、本発明に従うＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセルは、例えば、オキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）に比べても、極めて安全性が高く、ボーラス注入するための医薬製剤とすることもできる。前記微小粉体は、製薬学的に許容される、状されているキャリヤーと配合して、各種の投与形式に適合する剤形に加工することができる。かようなキャリヤーの代表例は、脱イオン水、一定のｐＨに緩衝化された水溶液、オリゴもしくはポリエチレングリコール、単糖もしくはオリゴ糖、糖アルコール、等であることができる。しかし、好ましくは、非経口的投与、特に静脈内もしくは皮下投与に適する剤形の組成物として提供する。
例えば静脈内投与をする場合の用量は、実験動物またはボランティアによる小実験を行い、それらの結果を考慮して、さらには患者の状態を考慮して専門医が決定するのが好ましい。しかし、限定されるものでないが、一般に、１日１回１．０〜１０００ｍｇ／ｍ２（患者の体表面積）であることができ、また、１０〜２００ｍｇ／ｍ２（患者の体表面積）を１日１回数日間連続投与し、一定期間休薬するか、または、５０〜５００ｍｇ／ｍ２（患者の体表面積）を１日１回投与した後、数日間休薬する等、投与スケジュールにより、適当な用量を選ぶことができる。
本発明の配位錯体は、ジクロロ（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、Ｄｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎまたはオキザリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と同様の抗腫瘍活性スペクトルを有する。こうして、本発明は、上記の配位錯体を有効成分とする坑腫瘍剤も提供する。
本発明によれば、本発明に従う、ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセルまたはＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎと共重合体の錯体が有効である限り限定されないが、例えば、抗癌腫瘍、膀胱癌、腎孟・尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、胞肺癌、食道癌、子宮頸癌、神経芽細胞腫、胃癌、および直腸癌を挙げることができる。
本発明に従うＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセルまたは錯体は、他の抗腫瘍剤または抗癌剤と組み合わせて使用できる。これらの杭腫瘍剤としては、組み合わせ使用により悪影響が生じないものであるなら、如何なる薬剤であってもよいが、例えば、シタラビン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、タキソール、カルボプラチン、シスプラチン等であることができる。しかし、特に好ましいのは、上述した、ＷＯ０２／２６２４１Ａ１に記載されたシスプラチン内包ポリマーミセル（または共重合体とシスプラチンの錯体）、具体的には、抗腫瘍有効成分として、シスプラチンと、一般式（１−ａ）または（２−ａ）：
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（上式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ３は水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、但し、ｎ個のＲ５中、アルカリ金属のイオンが５０％以上を占める）
で示されるブロック共重合体とのシスプラチンの配位錯体またはその薬剤内包ポリマーミセルを、上記のＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセルまたはＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎと共重合体の錯体と組み合わせて使用するものが挙げられる。これらの組み合わせ比は、限定されないが、好ましくは、ＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセル（またはジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）の配位錯体）と該シスプラチンの配位錯体の比が、白金の重量を基準にして、１／３〜３／１であるか、特に、１／１〜３／１が好ましい。
これらの組み合わせは、組み合わされる２種以上の薬剤を同時もしくは時間を異にして、同一もしくは異なる投与経路にて患者に投与することができる。上記のＤＡＣＨ  Ｐｌａｔｉｎ内包ポリマーミセルと該シスプラチンの配位錯体の組み合わせは、一の製剤に組み合わせて都合よく、そして効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に従う、配位錯体およびそのポリマーミセルの概念図である。
図２は、ＤＡＣＨＰｔミセル（黒塗り四角）とＣＤＤＰミセル（三角）の相対的散乱光強度変化を示すグラフである。
図３は、１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１５０ｍＭ  ＮａＣｌ添加した溶液中のＤＡＣＨＰｔミセル（黒塗り四角）およびＣＤＤＰミセル（三角）からの白金の放出挙動を示すグラフである。
図４は、血漿（ａ）、各種器官（具体的には、腫瘍（ｂ）、腎臓（ｃ）および肝臓（ｄ））への薬物、ＤＡＣＨＰｔミセル（黒塗り四角）およびフリーのＣＤＤＰ（白抜き四角）の集積性を表すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を、特定の例によりさらに具体的に説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものでない。
【実施例１】ポリマーミセルの生成
本実施例で使用するブロック共重合体の構造式は次のとおりである。
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（１．ａ．）１９ｍｇのジクロロ（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ＤＡＣＨＰｔ）を１０ｍｌの蒸留水に懸濁し、１２．３ｍｇの硝酸銀と混合した（［ＡｇＮＯ３］／［ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ＤＡＣＨＰｔ］のモル比＝１．５）。混合液を、暗所で２４時間、２５℃に保持した。反応後に塩化銀の沈殿が析出した。次いで、反応混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心して塩化銀の沈殿を除去した。こうして得られるＤｉａｑｕｏ  ＤＡＣＨ  Ｐｔ含有上澄液を、０．２２μｍのフィルターを通して精製した。
（１．ｂ．）ポリ（エチレングリコール）セグメントの分子量が約１２，０００になるようなｍ値を有しｎが約３５である上記の構造式で表されるブロック共重合体（以下、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５という）２４．４ｍｇを、上記の（１．ａ．）で得られた精製上澄液１０ｍｌに加えた（「Ｄｉａｑｕｏ−ＤＡＣＨＰｔ」／［Ｇｌｕ］のモル比＝１）。
こうして得られた溶液を、３７℃で１２０時間撹搾した。溶液を透析バッグ〔分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）＝１０００〕に入れ、蒸留水に対して２４時間透析した。透析バッグ（膜）外の水は、透析開始後、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間および１２時間目に交換した。透析された溶液を、フィルター（ＭＷＣＯ＝１００，０００）を用いて限外ろ過した。
【実施例２】ポリマーミセルの特性
（２．ａ．）１０ｍＭ  ＰＢＳ中での安定性
実施例１に従って得られたポリマーミセル（以下、ＤＡＣＨＰｔミセルという）の安定性を、上記に用いたのと同一のブロック共重合体を用いて、上記のＷＯ０２／２６２４１Ａ１の実施例１に記載のとおりに生成したシスプラチン内包ポリマーミセル（以下、ＣＤＤＰミセルという。）の安定性と比較した。
ＣＤＤＰミセルは、要約すると、次のように調製した：
水中にシスプラチン（ＣＤＤＰ）を溶解させた（５ｍｍｏｌ／ｌ）。この溶液に上記の実施例１で用いたのと同じブロック共重合体を溶解させ（［ＣＤＤＰ］／［共重合体のＧｌｕ］＝１．０）。３７℃で７３時間反応させた。得られた溶液を限外濾過（ＭＷＣＯ＝１００，０００）を繰り返して精製した。動的光散乱（ＤＬＳ）の測定によりポリマーミセルが形成されていることを確認した。
まず、特定体積のミセル溶液を凍結乾燥し、次いで残渣を秤量することによりミセル濃度を決定した。ＤＡＣＨＰｔミセル溶液およびＣＤＤＰミセル溶液を、それぞれ１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１５０ｍＭ  ＮａＣｌ添加した溶液と混合し、１．５ｍｇ／ｍｌのミセル濃厚液を得た。これらの液を、暗所で３７℃にて保持した。両液を，それぞれサンプリングし、次いで、動的光散乱（ＳＬＳ）法で測定した。測定を２５℃で行い、９０°の角度の検出を行った。これらの液は、０．４５μｍのフィルターを通して精製した。
安定性アッセイの結果：
相対的散乱光強度変化、即ち、初期の散乱光強度から特定時点での散乱光強度を図２に示す。図２から、ＣＤＤＰミセルは約５０時間以内に解離するのに対し、ＤＡＣＨＰｔミセルは２５０時間まで安定であることが分かる。
（２．ｂ．）ミセルからの白金の放出
異なる温度における、１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１５０ｍＭ  ＮａＣｌ添加した溶液中のＤＡＣＨＰｔミセルおよびＣＤＤＰミセルからの白金の放出を透析法（膜のＭＷＣＯ＝１，０００）により評価した。硝酸銀を用いるｄｉｃｈｌｏｒｏ−ＤＡＣＨＰｔの予備処理をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中および水中の両方で行い、上記の（１．ｂ．）の方法に従い、２種のＤＡＣＨＰｔミセルを調製した。透析バッグの外液を特定の時間間隔でサンプリングし、白金の濃度を誘導プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ−ＭＳ）で測定した。
結果：
放出の結果を図３に示す。放出された白金は、ＣＤＤＰミセルとＤＭＦ中で予備処理した場合のＤＡＣＨＰｔミセルとは同様であった。水中で予備処理された場合のＤＡＣＨＰｔミセルは僅かに高い白金の放出を示した。また、ＤＡＣＨＰｔミセルはＣＤＤＰミセルと比較して１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で高い安定性を有するにも拘らず、ＣＤＤＰミセルと同様な白金リリース速度を示した。
（２．ｃ．）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性
マウス結腸２６（Ｃ−２６）細胞株に対する、遊離のＣＤＤＰ、ＣＤＤＰミセル、ＤＡＣＨＰｔミセル、異なる混合割合（１／３、１／１および３／１）におけるＤＡＣＨＰｔミセルとＣＤＤＰミセルの増殖阻害活性を、ＭＴＴ法で評価した。５０００個の細胞を、９６穴のマルチプレート中の１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地５０μｌにおいて培養した。４８時間および７２時間薬剤に細胞をさらした。ＭＴＴ溶液を加え、６時間後に０．０１Ｍ  ＨＣｌを添加した１０重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有溶液１５０μｌを加えた。次いで、２４時間後の５７０ｎｍにおける生成されたホルマザンの吸光度により細胞の生存度を測定した。これらの結果から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した結果を表１にまとめる。
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表より、ＤＡＣＨＰｔミセルはＣＤＤＰミセルより約１０倍高い細胞毒性（抗腫瘍性）を示すことが分かる。また、ミセルの組み合わせは、細胞毒性を増大させる。
（２．ｄ．）生体内分布
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３、雌、６週令、２０−２５ｇ）に、右側腹部からＣ−２６細胞（１×１０６）を皮下接種した。遊離のＣＤＤＰおよびＤＡＣＨＰｔミセル（各薬物１００μｇ）を尻尾の静脈から注入した。腫瘍接種後２１目目にマウスを犠牲にした。１、４、２４時間目に、腫瘍、肝臓、腎臓、を切除し、そして同時に血液を集め、ヘパリン化した。遠心で血液から血漿を分離し、温硝酸に溶解した。器官を秤量し，温硝酸に溶解した。溶液を乾燥した。塩酸を加えた直後にＩＣＰ−ＭＳで白金の量を測定した。結果を図４に示す。得られた結果から、ＤＡＣＨＰｔミセルは血流中を長期滞留し、正常組織に特異な集積を示すことなく、固形がんに効果的に集積することが分かる。
【産業上の利用可能性】  本発明の配位錯体は、ヒトの腫瘍の化学療法において安全に使用でき、しかも高い抗腫瘍活性を有するので、医療業、医薬製造業等で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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