(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳由来のガングリオシド含有試料を予めタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を除去し、逆相カラムで処理して脱塩した溶液を陰イオン交換体と接触させて陰イオン交換体にガングリオシドを吸着させた後、塩類含有メタノール溶液でガングリオシドを溶出させ、該溶出液中のガングリオシドを比色定量するガングリオシド定量法において、塩濃度が0.02M未満の塩類含有メタノール溶液でガングリオシドＧＭ３を溶出し、塩濃度が0.02M以上1.0M未満の塩類含有メタノール溶液でガングリオシドＧＤ３を溶出することを特徴とするガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３の定量法。
【請求項２】
(1)タンパク質分解酵素、(2)逆相カラム、(3)陰イオン交換体を充填したカラム、(4)塩濃度が0.02M未満の塩類含有メタノール溶液、(5)塩濃度が0.02M以上1.0M未満の塩類含有メタノール溶液、及び(6)ガングリオシド比色定量用発色試薬からなるガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３の定量キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳等の各種試料中に含まれており、感染防御や細胞分化等の生理機能を有するガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量する方法に関する。また、本発明は、このガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量する方法に使用する定量用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガングリオシドは、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称であり、種々の分子種が存在することが知られている。そして、乳由来のガングリオシドについては、永井ら(J. Biol. Chem., vol.261, pp.5625-5630, 1986) により形態が明らかにされている。
このガングリオシドの命名法としては、Svennerholm の命名法が汎用されている。すなわち、ガングリオシド中に含まれるシアル酸の分子数が１のガングリオシドをＧＭ、２のガングリオシドをＧＤ、３のガングリオシドをＧＴ、４のガングリオシドをＧＱ、５のガングリオシドをＧＰとそれぞれ命名し、さらに基本糖鎖の種類によって末尾に１〜４の数を付与することにより命名する。例えば、ガングリオシドＧＭ３は、脂質のセラミドに乳糖が結合し、かつ乳糖の非還元末端にシアル酸が１分子結合した構造を有しているガングリオシドであり、また、ガングリオシドＧＤ３は、ガングリオシドＧＭ３の非還元末端のシアル酸にさらにシアル酸が１分子結合した構造を有しているガングリオシドである。
【０００３】
近年、ガングリオシドに関する生化学的な研究が盛んに行われるようになってきている。そして、例えば、細胞分化、細胞増殖、神経機能、ガン化、ウイルスの感染防御等に関する多様な生理機能が明らかになり、ガングリオシドが生体にとって非常に重要な物質であることが判ってきている。
一方、乳等の各種試料中に含まれているガングリオシドを定量する方法としては、従来より、薄層クロマトグラフィー上で試料から抽出したガングリオシド画分を展開し、レソルシノール塩酸試薬で発色した後、デンシトメトリーで定量する方法が行われている(J. Neurochem., vol.21, p.829, 1973)。しかし、この方法でガングリオシドを定量するに際しては１〜２週間の時間を要し、また、精度の点でも誤差が大きい（±10％以上）という問題もあって、ガングリオシドに関する研究に支障をきたしている現状にある。したがって、各種試料中に含まれているガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量する方法の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上述したようなガングリオシドの定量に関する問題を解決するべく鋭意研究を進めていたところ、ガングリオシド含有試料の溶液を陰イオン交換体と接触させて陰イオン交換体にガングリオシドを吸着させた後、塩類を含有する有機溶媒で溶出することにより、ガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３を明瞭に分離することができることを見出し、このガングリオシドの各画分について、従来より行われているガングリオシドの比色定量法に従って定量することにより、試料中のガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量することができることを見出した。また、陰イオン交換体と接触させるガングリオシド含有試料については、予めタンパク質分解処理や脱塩処理を施しておくことが、ガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３を簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量するのに好ましいことも見出した。そして、このガングリオシドの定量を実施するに際して使用する定量用キットの好ましい構成を決定するに至り、本発明を完成した。
【０００５】
したがって、本発明は、乳等の各種試料中に含まれるガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３を簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、このガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３を簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量する方法に使用するガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３定量用キットを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従来より、種々のガングリオシドを定量するに際しては、まず、各ガングリオシドを明瞭に分画する必要があった。そこで、本発明者らは、各ガングリオシドに結合しているシアル酸の数に着目した。シアル酸は、分子内にカルボン酸を有しているので、負に帯電している。したがって、各ガングリオシドに結合しているシアル酸の数、すなわち、負電荷の数が異なるので、各ガングリオシドを陰イオン交換カラムで分離することができると考えた。そこで、シアル酸の結合数が異なる各ガングリオシドを含む試料を調製し、各ガングリオシドを陰イオン交換カラムで分離することができるかについて確認したところ、溶出液の塩濃度を変えることにより、迅速、かつ明瞭に各ガングリオシドを分離することができることが判った。
【０００７】
例えば、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及び遊離シアル酸を含む試料の場合、溶出液の塩濃度を 0.02M未満とすることによりガングリオシドＧＭ３のみを溶出することができ、その後、溶出液の塩濃度を 0.02M以上1.0M未満とすることによりガングリオシドＧＤ３のみを溶出することができ、そして、溶出液の塩濃度を1.0M以上とすることにより遊離シアル酸を溶出することができる。
【０００８】
ガングリオシドを含有する試料には、タンパク質やミネラル等の夾雑物を多く含むものもあるが、このような試料については、前処理として、予めタンパク質分解酵素でタンパク質を分解した後、有機溶媒でガングリオシドを抽出したり、逆相カラムで脱塩しておくことにより、迅速、かつ明瞭に各ガングリオシドを分離することができる。なお、タンパク質を分解する方法としては酵素処理以外に酸処理等の方法も考えられるが、酸処理等を行うとガングリオシド自体も同時に分解されてしまう危険性が高いので好ましくない。また、脱塩する方法としては透析処理等も考えられるが、透析処理等を行うとガングリオシドの収率が悪くなるので好ましくない。例えば、牛乳、母乳、粉乳、ホエー、バターミルク、バターオイル等に含まれる各ガングリオシド量を定量する場合には、上記したような前処理を行うことが好ましい。
【０００９】
本発明では、前処理したガングリオシド含有試料を、まず、陰イオン交換体と接触させて陰イオン交換体にガングリオシドを吸着させる。ここで使用する陰イオン交換体については特に限定はなく、ジエチルアミノエチル(DEAE)や第４級アミン等が用いられる。また、試料と陰イオン交換体とを接触させる方法についても特に限定はないが、例えば、Bond Elut SAX カラム (Varian社製）やSep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge (Millipore社製）等、陰イオン交換体を充填した市販のカラムを使用すると便利である。
【００１０】
次に、陰イオン交換体に吸着したガングリオシドを溶出液で溶出し、ガングリオシドを回収する。ここで使用する溶出液としては、塩類含有有機溶媒が好ましく、特に塩類含有メタノールが好ましい。使用する塩類については特に限定はなく、酢酸ナトリウムや酢酸カリウム等を例示することができる。そして、例えば、溶出液の塩濃度を 0.02M未満とすることによりガングリオシドＧＭ３のみを溶出することができ、その後、溶出液の塩濃度を 0.02M以上1.0M未満とすることによりガングリオシドＧＤ３のみを溶出することができる。
【００１１】
そして、このように溶出して回収した各ガングリオシドの画分について、従来より行われているガングリオシドの比色定量法に従い、定量することができる。なお、ガングリオシドの比色定量法としては、レソルシノール塩酸試薬を加えてガングリオシド中に含まれるシアル酸を発色させて定量する Miettinenらの方法(Acta Chem. Scand., vol.13, p.856, 1959)が良く知られている。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明では、以下のような手順によりガングリオシドを定量する。
（１）タンパク質分解及びガングリオシド抽出処理（前処理）
乳等のガングリオシド含有試料に、市販のプロテアーゼＫ(Tritirachim album由来；ベーリンガー・マンハイム社製) やアクチナーゼ (Streptomyces griceus由来；コスモ・バイオ社製) 等のタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解した後、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 等の有機溶媒でガングリオシドを抽出して回収し、定量用の試料とする。
【００１３】
（２）脱塩処理（前処理）
ガングリオシド含有試料、又はタンパク質分解及びガングリオシド抽出処理を行ったガングリオシド含有試料を逆相カラムに通液し、ガングリオシドを逆相カラムの担体に吸着させた後、担体量の３倍量以上のイオン交換水で通液して脱塩する。そして、メタノールやクロロホルム：メタノール＝1:2 等の有機溶媒を溶出液として、担体に吸着しているガングリオシドを溶出し、回収して定量用の試料とする。
【００１４】
（３）陰イオン交換体処理
まず、ガングリオシド含有試料、又はタンパク質分解及びガングリオシド抽出処理や脱塩処理を行ったガングリオシド含有試料を陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体にガングリオシドを吸着させる。なお、陰イオン交換体と接触させるガングリオシド含有試料については、予め濃縮・乾固し、再度溶解して、陰イオン交換体と接触させても構わない。
【００１５】
次に、必要に応じて陰イオン交換体を溶媒で洗浄し、夾雑物を除去した後、酢酸ナトリウムや酢酸カリウム等の塩類を含有するメタノール等の塩類含有有機溶媒を溶出液として、陰イオン交換体に吸着しているガングリオシドを溶出し、回収する。なお、溶出液の塩濃度については、例えば、 0.02M未満とすることによりガングリオシドＧＭ３のみを溶出することができ、その後、溶出液の塩濃度を 0.02M以上1.0M未満とすることによりガングリオシドＧＤ３のみを溶出することができる。
【００１６】
この陰イオン交換体処理については、バッチ式で行っても良いが、陰イオン交換体を充填したカラムを使用することがより好ましい。そして、このような陰イオン交換体を充填したカラムとして、Bond Elut SAX カラム (Varian社製）やSep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge (Millipore社製）等が市販されている。
【００１７】
（４）比色定量
陰イオン交換体処理して回収した試料にレソルシノール塩酸試薬を加えて発色させた後、分光光度計で 580nmの吸光度を測定する。そして、同様にしてシアル酸の標品を発色させて作製した検量線から、ガングリオシド量を算出して定量する。なお、試料を発色させるに際しては、陰イオン交換体処理して回収した試料を予め濃縮・乾固した後、純水で溶解した試料を使用することが好ましい。
このようにして、ガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量することができる。なお、ガングリオシドを定量する為の従来法である薄層クロマトグラフィーとデンシトメトリーを用いる方法では、操作に１〜２週間要し、さらに定量値の誤差範囲も±10％以上であるのに対し、本発明の定量法では、約２日で操作が完了し、定量値の誤差範囲も±８％以内であるというように、非常に優れたガングリオシドの定量法であるといえる。
【００１８】
以下、本発明の定量法を実施するに際して使用するガングリオシド定量用キットを例示する。
市販のプロテアーゼＫ(Tritirachim album由来；ベーリンガー・マンハイム社製) やアクチナーゼ (Streptomyces griceus由来；コスモ・バイオ社製) 等のタンパク質分解酵素。
Bond Elut SAX カラム (Varian社製）やSep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge (Millipore社製）等の陰イオン交換カラム。
ガングリオシドＧＭ３溶出用0.01M 塩類含有メタノール溶液及びガングリオシドＧＤ３溶出用0.06M 塩類含有メタノール溶液。
レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたレソルシノール塩酸試薬。
【００１９】
また、上記したガングリオシド定量用キットに、さらにSep-Pak Vac C18 Cartridge (Millipore社製）等の逆相カラムを加えたガングリオシド定量用キットを例示することもできる。
【００２０】
次に、試験例及び実施例を示し、本発明を詳しく説明する。
【試験例１】
本試験例では、溶出液の塩濃度を変えることにより、陰イオンカラムでガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及び遊離シアル酸を明瞭に分画できるか否かを確認した。
【００２１】
ガングリオシド含有試料の溶液として、ガングリオシドＧＭ３ 192μg(結合型シアル酸量48μg)、ガングリオシドＧＤ３ 119μg(結合型シアル酸量48μg)及び遊離シアル酸48μg を純水 100μl 中に溶解した後、クロロホルム 1,332μl とメタノール 666μl を加えたものを使用した。この試料溶液を担体量 500mgの陰イオン交換カラム (Bond Elut SAX カラム：Varian社製) に通液してガングリオシドをカラムに吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶液をカラムに通液してカラム中の夾雑物を除去した後、0.01M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液して溶出した画分、0.06M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液して溶出した画分及び 1.0M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液して溶出した画分を回収した。そして、これらの画分について薄層クロマトグラフィーで分析（展開条件；プレート：シリカゲル60(Merck社) 、展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水(60/35/8) 、発色試薬：レソルシノール塩酸試薬）したところ、0.01M 酢酸カリウム含有メタノール溶液で溶出した画分はガングリオシドＧＭ３画分、0.06M 酢酸カリウム含有メタノール溶液で溶出した画分はガングリオシドＧＤ３画分及び 1.0M 酢酸カリウム含有メタノール溶液で溶出した画分は遊離シアル酸画分であり、この陰イオンカラムを使用した方法により、ガングリオシドや遊離シアル酸が明瞭に分画できることが判った。その結果を図１に示す。
【００２２】
【試験例２】
本試験例では、試験例１で回収したガングリオシドＧＭ３画分及びガングリオシドＧＤ３画分中に含まれるそれぞれのガングリオシドを定量した。
【００２３】
各画分を濃縮・乾固した後、純水に溶解し、レソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmの吸光度を測定した。なお、レソルシノール塩酸試薬は、レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたものを使用した。
一方、遊離シアル酸の標品を０、１、５、10、15、20、30、40、50及び 100μg/mlの各濃度となるよう純水に溶解し、同様のレソルシノール塩酸試薬で発色させて分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmの吸光度を測定し、検量線を作製し、各ガングリオシド量を算出したところ、ガングリオシドＧＭ３画分に含まれるガングリオシドＧＭ３量は 189.8μg であり、また、ガングリオシドＧＤ３画分に含まれるガングリオシドＧＤ３量は 117.8μg であった。したがって、ガングリオシドＧＭ３の定量においては98.9％の精度であり、また、ガングリオシドＧＤ３の定量においては99.3％の精度であることが判った。
なお、本試験例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は半日程度であり、迅速、かつ良好な精度でガングリオシドＧＭ３及びガングリオシドＧＤ３を定量できることが示された。
また、本試験方法において試料１ｇ当たり１μｇ以上のガングリオシドが含まれている場合に定量が可能であった。
【００２４】
【実施例１】
ヒト母乳５mlにタンパク質分解酵素としてアクチナーゼ (Streptomyces griseus由来:20,000U/g, コスモ・バイオ社製) 50mgを加え、pHを８に調整して50℃で４時間のタンパク質分解処理を行った後、クロロホルム：メタノール：水＝4:8:3 の溶媒でガングリオシドを抽出し、遠心分離で沈澱したタンパク質を除去したガングリオシド画分を得た。
このガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、純水２mlに溶解した。次に、この溶液を担体量 500mgの逆相カラム（Bond Elut C18 カラム：Varian社製）に通液してガングリオシドを吸着させ、過剰の純水をカラムに通液して脱塩処理を行った後、メタノール20mlをカラムに通液してガングリオシド画分を溶出した。
【００２５】
この溶出したガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒に溶解し、担体量 500mgの陰イオン交換カラム（Bond Elut SAX カラム：Varian社製) に通液してガングリオシドをカラムに吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒をカラムに通液してカラム中の夾雑物を除去した後、0.01M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＭ３画分を溶出し、さらに、0.06M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＤ３画分を溶出した。そして、各溶出画分を濃縮・乾固した後、純水に溶解し、レソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定した。なお、各ガングリオシド量の定量は繰り返し５回行った。また、レソルシノール塩酸試薬については、レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたものを使用した。
【００２６】
一方、遊離シアル酸の標品を０、１、５、10、15、20、30、40、50及び 100μg/mlの各濃度となるよう純水に溶解し、同様のレソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定して検量線を作製し、各ガングリオシド量を算出した。その結果、ヒト母乳中に含まれるガングリオシドＧＭ３量は 6.5±0.42μg/mlであり、また、ガングリオシドＧＤ３量は10.3±0.26μg/mlであった。
なお、本実施例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２日間であった。
【００２７】
【比較例１】
実施例１と同様のヒト母乳について、従来法である薄層クロマトグラフィーとデンシトメトリーによるガングリオシドの定量を繰り返し３回行ったところ、ガングリオシドＧＭ３量は 5.2±2.0 μg/mlであり、また、ガングリオシドＧＤ３量は 8.3±1.7 μg/mlであった。なお、本比較例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２週間であった。
実施例１と同じヒト母乳５mlに対して、標品のＧＭ３およびＧＤ３をそれぞれ50μｇづつ添加し、同様に定量を行った。その結果、評品無添加の母乳５ml中に含まれるガングリオシド量に対して、ＧＭ３は49μｇ、ＧＤ３は49.5μｇ増加しており、ＧＭ３の回収率は98％、ＧＤ３の回収率は99％であった。この結果から、本定量法により試料中に含まれているガングリオシドは収率よく抽出・分離され、かつ定量されていることが示された。
【００２８】
【実施例２】
ホエータンパク質濃縮物 (ＷＰＣ) 粉末 10gを水50mlに溶解した溶液にプロテアーゼＫ(Tritirachim album由来：30,000U/g,ベーリンガー・マンハイム社製) 500mg を加え、pHを８に調整して50℃で４時間のタンパク質分解処理を行った後、クロロホルム：メタノール：水＝4:8:3 の溶媒でガングリオシドを抽出し、遠心分離で沈澱したタンパク質を除去したガングリオシド画分を得た。
このガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、純水２mlに溶解した。次に、この溶液を担体量 500mgの逆相カラム(Sep-Pak Vac C18 Cartridge:Millipore社製）に通液してカラムにガングリオシドを吸着させ、過剰の純水をカラムに通液して脱塩処理を行った後、メタノール20mlをカラムに通液してガングリオシド画分を溶出した。
【００２９】
この溶出したガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒に溶解し、担体量 500mgの陰イオン交換カラム(Sep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge:Millipore社製）に通液してガングリオシドをカラムに吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒をカラムに通液してカラム中の夾雑物を除去した後、0.01M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＭ３画分を溶出し、さらに、0.06M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＤ３画分を溶出した。そして、各溶出画分を濃縮・乾固した後、純水に溶解し、レソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定した。なお、各ガングリオシド量の定量は繰り返し５回行った。また、レソルシノール塩酸試薬については、レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたものを使用した。
【００３０】
一方、遊離シアル酸の標品を０、１、５、10、15、20、30、40、50及び 100μg/mlの各濃度となるよう純水に溶解し、同様のレソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定して検量線を作製し、各ガングリオシド量を算出した。その結果、ＷＰＣ粉末中に含まれるガングリオシドＧＤ３量は 600.2±22.3μg/g であり、また、ガングリオシドＧＭ３量は検出限界以下であった。
なお、本実施例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２日間であった。
【００３１】
【比較例２】
実施例２と同様のＷＰＣ粉末について、従来法である薄層クロマトグラフィーとデンシトメトリーによるガングリオシドの定量を繰り返し３回行ったところ、ガングリオシドＧＤ３量は 576±90μg/mlであり、また、ガングリオシドＧＭ３量は検出限界以下であった。なお、本比較例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２週間であった。
【００３２】
【実施例３】
バターを80℃で溶解し、遠心分離でバターオイルを除去した後、凍結乾燥してバターカード粉末を調製した。このバターカード粉末1gを水５mlに溶解した溶液にプロテアーゼＫ(Tritirachim album由来:30,000U/g, ベーリンガー・マンハイム社製) 50mgを加え、pHを８に調整して50℃で４時間のタンパク質分解処理を行った後、クロロホルム：メタノール：水＝4:8:3 の溶媒でガングリオシドを抽出し、遠心分離で沈澱したタンパク質を除去したガングリオシド画分を得た。
このガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、純水２mlに溶解した。次に、この溶液を担体量 500mgの逆相カラム(Sep-Pak Vac C18 Cartridge:Millipore社製）に通液してガングリオシドをカラムに吸着させ、過剰の純水をカラムに通液して脱塩処理を行った後、メタノール20mlをカラムに通液してガングリオシド画分を溶出した。
【００３３】
この溶出したガングリオシド画分を濃縮・乾固した後、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒に溶解し、担体量 500mgの陰イオン交換カラム(Sep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge:Millipore社製）に通液してガングリオシドをカラムに吸着させた。次に、クロロホルム：メタノール：水＝60:30:4.5 の溶媒をカラムに通液してカラム中の夾雑物を除去した後、0.01M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＭ３画分を溶出し、さらに、0.06M 酢酸カリウム含有メタノール溶液をカラムに通液してガングリオシドＧＤ３画分を溶出した。そして、各溶出画分を濃縮・乾固した後、純水に溶解し、レソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定した。なお、各ガングリオシド量の定量は繰り返し５回行った。また、レソルシノール塩酸試薬については、レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたものを使用した。
【００３４】
一方、遊離シアル酸の標品を０、１、５、10、15、20、30、40、50及び 100μg/mlの各濃度となるよう純水に溶解し、同様のレソルシノール塩酸試薬で発色させ、分光光度計(U-2000:日立製作所製）で 580nmでの吸光度を測定して検量線を作製し、各ガングリオシド量を算出した。その結果、バターカード粉末中に含まれるガングリオシドＧＭ３量は 101.8±5.0 μg/g であり、また、ガングリオシドＧＤ３量は 2,116±138.5 μg/g であった。
なお、本実施例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２日間であった。
【００３５】
【比較例３】
実施例３と同様のバターカード粉末について、従来法である薄層クロマトグラフィーとデンシトメトリーによるガングリオシドの定量を繰り返し３回行ったところ、ガングリオシドＧＭ３量は90.6±11.7μg/mlであり、また、ガングリオシドＧＤ３量は 1,800±200 μg/mlであった。なお、本比較例においては、試料溶液の調製からガングリオシドの定量結果を得るまでに要した時間は２週間であった。
【００３６】
【実施例４】
以下のパーツからなるガングリオシド定量用キットを組み立てた。
（１）タンパク質分解酵素
アクチナーゼ (Streptomyces griseus由来:20,000U/g, コスモ・バイオ社製)
（２）陰イオン交換カラム
Bond Elut SAX カラム (担体量 500mg：Varian社製）
（３）ガングリオシドＧＭ３用溶出液：0.01M 酢酸カリウム含有メタノール
ガングリオシドＧＤ３用溶出液：0.06M 酢酸カリウム含有メタノール
（４）レソルシノール塩酸試薬
レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたもの
【００３７】
【実施例５】
以下のパーツからなるガングリオシド定量用キットを組み立てた。
（１）タンパク質分解酵素
プロテアーゼＫ(Tritirachim album由来:30,000U/g, ベーリンガー・マンハイム社製)
（２）逆相カラム
Sep-Pak Vac C18 Cartridge(担体量 500mg:Millipore社製）
（３）陰イオン交換カラム
Sep-Pak Vac Accell Plus QMA Cartridge(担体量 500mg:Millipore社製）
（４）ガングリオシドＧＭ３用溶出液：0.01M 酢酸カリウム含有メタノール
ガングリオシドＧＤ３用溶出液：0.06M 酢酸カリウム含有メタノール
（５）レソルシノール塩酸試薬
レソルシノール0.2gを純水20mlに溶解した後、0.1M硫酸銅0.25μl を加え、さらに濃塩酸80mlを加えたもの
【００３８】
【発明の効果】
本発明のガングリオシド定量法及びガングリオシド定量用キットを使用することにより、乳等の各種試料中に含まれているガングリオシドを簡便で迅速に、かつ良好な精度で定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１のガングリオシド画分の薄層クロマトグラムを示す。  0.01M, 0.06M及び1.0Mは、それぞれ0.01M, 0.06M及び1.0M酢酸カリウム含有メタノールで溶出した画分を示す。
【図１】
0003891635.tif 000002