(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内壁を有し、容積の一部分の中に多孔質のポリマーマトリックス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含んでなる現場注型された三次元構造物を含む、第１の開放末端および第２の開放末端を有しそして容積を規定するハウジングであって、前記構造物は自己保持性であり且つハウジングの前記内壁の少なくとも一部分に付着しておりそして１０未満のアスペクト比を有する、上記ハウジング。
【請求項２】
前記ハウジングが、第１の開放末端及び、前記第１の開放末端から間隔をおいた第２の開放末端を有し、そして前記三次元構造物が前記第２の開放末端に隣接している、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項３】
前記アスペクト比が５未満である、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項４】
前記構造物を含む前記容積の前記の部分が０．１ミクロリッターないし１０ミリリッターである、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項５】
第１の末端及び、前記第１の末端から間隔をおいた第２の末端を有し、両者の間に前記構造物を伴う、ピペットの先端である、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項６】
前記第１の末端が前記第２の末端の内径よりも大きい内径を有する、請求の範囲第５項記載のハウジング。
【請求項７】
前記ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリル・コポリマー及びＰＶＤＦからなる群から選択される、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項８】
前記ポリマーがポリスルホンであり、そして前記ハウジングがポリオレフィンを含んでなる、請求の範囲第７項記載のハウジング。
【請求項９】
前記ポリオレフィンがポリプロピレンである、請求の範囲第８項記載のハウジング。
【請求項１０】
前記粒子がポリスチレンジビニルベンゼン・ビーズ、官能化ポリスチレンジビニルベンゼン・ビーズ、シリカ、ヒュームドシリカ、誘導シリカ及び活性炭素からなる群から選択される、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項１１】
前記三次元構造物が半透過性バリヤーを含んでなる、請求の範囲第１項記載のハウジング。
【請求項１２】
第１の開放末端および第２の開放末端を有するハウジングの内壁に付着している複合構造物を、前記ハウジング内に現場注型する方法であって、
ポリマーの溶液を形成すること、
注型溶液を形成するために前記溶液に粒子を添加すること、
前記ハウジング中に前記注型溶液を導入すること、並びに
前記ポリマーが、前記粒子を含んでなり且つ１０未満のアスペクト比を有する多孔質ポリマーマトリックスを形成するように、前記注型溶液を転相にさらすこと、
を含んでなる、上記方法。
【請求項１３】
前記溶液が溶媒中に前記ポリマーを溶解させることにより形成される、請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液が、前記ポリマーに対する溶媒及び非溶媒の混合物中に前記ポリマーを溶解することにより形成される、請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１５】
前記転相が、前記ポリマーがそれに不溶性である液体と、前記ハウジング中の前記注型溶液を接触させることにより惹起される、請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１６】
前記転相が、前記溶媒の蒸発により惹起される、請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１７】
内壁を有し、容積の一部分内に多孔質のポリマーマトリックスを含んでなる現場注型された三次元構造物を含む、第１の開放末端および第２の開放末端を有しそして容積を規定するハウジングであって、前記構造物は自己保持性であり且つハウジングの前記内壁の少なくとも一部分に付着しておりそして１０未満のアスペクト比を有する、上記ハウジング。
【請求項１８】
前記ハウジングが第１の開放末端及び、前記の第１の開放末端から間隔をあけた第２の開放末端を有し、そして前記構造物が前記第２の開放末端と隣接している、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【請求項１９】
前記アスペクト比が５未満である、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【請求項２０】
前記構造物を含む前記容積の前記部分が０．１ミクロリッターないし１０ミリリッターである、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【請求項２１】
第１の末端及び、前記第１の末端から間隔をあけた第２の末端を有し、両者の間に前記構造物を伴う、ピペットの先端である、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【請求項２２】
前記第１の末端が前記第２の末端の内径よりも大きい内径を有する、請求の範囲第２１項記載のハウジング。
【請求項２３】
前記ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリル・コポリマー及びＰＶＤＦからなる群から選択される、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【請求項２４】
前記ポリマーがポリスルホンであり、前記ハウジングがポリオレフィンを含んでなる、請求の範囲第２３項記載のハウジング。
【請求項２５】
前記ポリオレフィンがポリプロピレンである、請求の範囲第２４項記載のハウジング。
【請求項２６】
前記三次元構造物が半透過性のバリヤーを含んでなる、請求の範囲第１７項記載のハウジング。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
有効に分析することができる比較的濃厚なペプチドの試料を得るためにペプチド溶液から溶媒を除去したり、又は低分子量のイオン又は溶質を除去することが必要な生化学の技術分野において、多数の分析方法が開発されてきた。生化学／医薬品化学においては通常、塩、洗剤及びその他の汚染物を含まない純粋な被分析物が必要なので、液体試料中の高分子成分を濃縮及び／又は「脱塩」することが必要な、ペプチドのみならず概括的に高分子の種を伴う多数のその他の分析法もまた開発されてきた。これらの物質の存在は、それらがしばしば次の化学分析を妨害する点において有害の可能性がある。同様な状況が環境学的分野及び化学分析において存在する。
【０００２】
【従来の技術】
米国特許第４，７５５，３０１号は、濾過して乾燥させずに、高分子を濃縮するための遠心分離法及び機器につき公表している。半透過性の限外濾過膜は試料の溜めを濾液カップから分離し、機器が、固定された角度の遠心分離ローター内で使用される時、残留物のメニスカスが一番外側の濾液ダクトの一番外側の縁の遠心分離機の半径レベルに達すると、濾過が停止する様に、膜の下方の濾液ダクトが、膜の縁から十分内側に偏って配置されている。
【０００３】
このような限外濾過装置は通常、生物分子及び天然生成物の「精製」及び／又は試料の調製のために使用されている。このような方法が有効であるためには、問題の分子を保持するが、不純物を通過させるような膜を選択しなければならない。このシナリオは分子量が約１０，０００を超える被分析物に対しては比較的簡単であるが、分子量が約５０００未満の物質に対しては益々問題が増加している。その理由は、分子量が約５０００の被分析物を保持するために必要な膜の多孔度は非常に低いので水透過性（流量）が低くなり、処理時間が長くなり過ぎる事実による。例えば、３０，０００以上の分子量を有する被分析物に適する膜を使用している装置に対する具体的な遠心分離の「回転時間」は、約１時間であるが、一方、約１０００の分子量を有する被分析物に対しては６時間もの長時間が必要である可能性がある。更に、高い重力にこのように長時間さらすことはしばしば装置の故障をもたらす。
【０００４】
当該技術分野で今日一般的な試料の量は０．０１ないし１０ミクログラムの範囲にある。このような低い充填量においては、損失を回避するために効率の良い試料の取り扱いが重要である。このような少量の試料量の「微量分離」を処理するためには、試料の分離のための通常の方法及び装置は実際的ではない。更に、限外濾過は有効に濃縮及び脱塩ができるだけであり、従ってこの規模での吸着法の適用は、ミクロ−素材試料の調製への全く新規のアプローチを提供することができるであろう。試料調製装置を製造するための１種の通常の方法は、図１に示されるように、最初に、例えば繊維ガラス又はセルロースのシートから得られた、前以て切断された多孔質の栓をピペットの先端に挿入すること、次いで粗い（loose）粒子及び第２の多孔質の栓を追加すること、である。栓はピペットの先端中の定位置に粒子を保持する役目をする。しかし、栓はまた過剰な液体を捕捉し、それにより無駄な空間もしくは容積（すなわち、低い試料回収率、試料の持ち越し物によるような汚染、等をもたらす可能性がある媒質又はポリマーにより占拠されていない空間）を形成する。しかし、これらの方法は、前記の極めて少量の試料充填物に対して使用される１０ミリグラム以下の吸着剤を含む微量吸着装置を得るために、栓又は粒子のどちらかを充填する実際的な方法がないので、ピペットの先端のような極めて少量の液体の配達装置により使用することができない。
【０００５】
代替的には、微量試料調製装置を毛細管ピペット中に媒質を詰めることにより製造することができる。しかし、このような装置の流通性は具体的には低い。
【０００６】
更に、素材の吸着性の見地から、吸着性粉末は最大の性能を提供するが、それらは、ミリグラムの量で処理することは困難であるか又は実際に不可能である。ポリマーを基礎にした吸着性の膜シートは処理が比較的容易であるが、比較的少ない下部構造物の表面積の結果としてそれらの性能は乏しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、試料溶液からの分子を濃縮、精製及び／又は脱塩することができる試料調製装置を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
非常に少量の試料溶液からの分子を濃縮、精製及び／又は脱塩することができる試料調製装置を提供することが本発明のもう１種の目的である。
【０００９】
種々の形態の幾何学的構造の試料溶液からの分子を濃縮、精製及び／又は脱塩することができる試料調製装置を提供することが本発明のもう１種の目的である。
【００１０】
種々の形態の幾何学的構造の、非常に少量の試料溶液からの分子を濃縮、精製及び／又は脱塩することができる試料調製装置を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１１】
製造が簡単で経済的な試料調製装置を提供することがもう１種の更なる目的である。
【００１２】
種々のハウジングのサイズ又は幾何学的構造をもつハウジング中の粒子を注型する方法を提供することが本発明の更にもう１種の目的である。その中に注型されているハウジングの形態を採り、多孔質の栓の使用なしにそのハウジング中に保持することができる注型可能な膜を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１３】
支持体又は基材上に注型可能な膜を提供することが本発明のもう１種の目的である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
発明の要約
従来の当該技術分野の問題は、吸着性又は反応性媒質として、あるいはサイズに基づいた分離のために有用な、複合（充填された）及び／又は非充填構造物を現場で注型するための方法を提供している、本発明により克服された。１種の態様においては、構造物は一体式でそして／又は連続的である。本発明は種々の具体的なハウジングのサイズ及び形態に適用可能であり、種々の容積のハウジング中に媒質を付加する手段を提供する。本発明は、未だに三次元のポリマー構造を維持しながら、ポリマー中に実質的な量の媒質（沈澱された構造物の表面積の増加に応じて）の包含を可能にさせる。
【００１５】
第１の好ましい態様においては、複合構造物は図２Ｂに示されるもののような多孔質ポリマー支持体内に捕捉された粒子を含んでなり、図２Ａに示されるピペットの先端のような種々のサイズをもつハウジング中へ現場注型され、それにより微量素材の処理のための有効なプラットホームを提供する。粒子化学の適切な選択により、比較的大きい素材の充填物及び容積のみならず、数ミクロリッターの容積の１ミクログラム未満の試料素材充填物に対する選択的な結合／溶離クロマトグラフィー操作を含む、実際的にあらゆる分離又は精製操作を実施することができる。本発明は更に複合構造物並びに、それらを含む試料調製装置をも包含する。
【００１６】
第２の好ましい態様においては、自己保持性及び／又は自己支持性の可能性がある非充填構造物が適切なハウジング中にインサイチューで注型され、注型構造物が半透過性バリヤーとして働く、サイズに基づく分離のため、又は吸着のために使用することができる。本発明はまた図３に示されるもののように、これらの構造物を含むハウジングのみならずこれらの構造物も包含する。図３の装置は溜め、基底部、及び溜めと基底部との間にシールされた多孔質の布地を有する遠心分離装置である。本発明の構造物は多孔質の布地上に現場注型されている。装置は操作中は適切なバイアル中に入れられ、装置の流れは遠心力により駆動される。
【００１７】
【発明を実施するための最良の形態】
［発明の詳細な説明］
本明細書に使用される「膜」の語は、所望の用途に適した多孔度を有する、粒子を含むか又は含まない、透過性及び半透過性の三次元構造物を含む。本明細書で使用される「複合構造物」の語は、充填された膜を含む。
【００１８】
本発明の第一の好ましい態様においては、当業者は、生成される装置の所望の目的に応じて、複合構造物中に多数の異なる粒子を使用することができることを認識するであろう。吸着性装置の場合に理想的な装置は、早い吸着動力学、適用に対応した生産能力及び選択性をもち、適切な吸着剤による結合被分析物の溶離を可能にする。適切な吸着性複合構造物は、結合剤とともに付着されたクロマトフラフのビーズからなるもののような、ポリマーを結合し、粒子を充填した吸着性膜構造物である。適切なポリマーを結合し、粒子を充填した吸着性の膜は図４に示されている。この膜は約８０％ｗ／ｗのシリカ及び２０％ｗ／ｗのポリスルホン結合剤からなり、Millipore Corporationにより生産されている。同様な膜がピペット先端５０中に現場注型された図１６Ａに示されている。ペプチド、蛋白、核酸、及びその他の有機化合物のための種々の用途を収容するために、スチレンジビニル−ベンゼンを基礎にした媒質（例えばスルホン酸、第四級アミン等で修飾されないか又は誘導された）、シリカを基礎にした媒質（Ｃ2、Ｃ4、Ｃ6、Ｃ8又はＣ18又はイオン交換官能性で修飾されないか又は誘導された）を含む、その他の官能基で誘導されたその他のミクロンサイズの（例えば、１〜３０ミクロン）樹脂の粒子を含んでなる官能性複合構造物もまた好都合である。当業者は、特にペプチド以外の分子の群に対して、代替的選択性（例えば疎水性の相互作用、親和性、等）をもつその他のマトリックスもまた使用することができることを認識するであろう。本明細書で使用される「粒子」の語は、金属粉末、プラスチック粉末（例えば、粉末化ポリスチレン）、通常の相のシリカ、ヒュームドシリカ及び活性炭素を含む破片（shards）、繊維及び粉末のみならず、規則的な（例えば、球形の）又は不規則な形態を有する粒子を包含することを意図されている。例えば、ポリスルホンポリマー中へのヒュームドシリカの添加は、増加した活性表面積をもたらし、種々の用途に適している。Amoco社によりUDEL P3500及びP1700の商品名で販売されているポリスルホンは、ポリプロピレン、ポリエチエレン及びそれらの混合物を含むポリオレフィンのハウジングに対する、生成される複合構造物の付着程度を考慮すると特に好ましい。その他の適切なポリマー結合剤は、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、アクリロニトリルＰＶＣコポリマー（“DYNEL”の商品名で市販されている）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ、“KYNAR”の商品名で市販されている）、ポリスチレン及び、ポリスチレン／アクリロニトリルコポリマー、等を含む。ハウジングに対する付着は、プラズマ処理又は化学的酸化によるようなハウジングのエッチング、ハウジングの内側のリムのような機械的補助、並びに、このような付着を促進する、ハウジング材料中への添加剤の包含、を含む、当業者に既知の手段により、これらの複合構造物により増強されるか又は類似の効果が達成され得る。付着は注型期間中の均一な沈澱を可能にする。
【００１９】
本発明に従う装置は、電荷、サイズ、親和性及び／又は疎水性により異なる被分析物を分別するために、異なる官能基をもつ樹脂材料を有する複数の複合構造物を取り入れることができ、代替的には、同様な結果を達成するために、異なる個々の官能性の膜を含む複数の装置を組み合わせて使用することができる。同様に、１種類以上の膜を適切なハウジング中に注型することができ、官能性は注型の前後に付加することができる。
【００２０】
本発明に従うと、本発明の構造物は、ポリマー転相法、空気注型（蒸発）及び熱転化により形成することができる。最小の付着を伴うか又は全く付着を伴わない系に対しては、形成された構造物を別々に調製し、適切なハウジング中に挿入し、そして機械的手段により現場に固定することができる。好ましい方法においては、形成された構造物は所望のハウジング内にインサイチューで注型される。これが、三次元の多孔質構造をまだ維持しながら、ポリマーマトリックス中に大量の媒質を含む能力をもたらす。膜の下部構造は粒子を網目に絡ませる支持網目として働き、従って濾板又は栓の必要を排除し、それにより、無駄な容積を最小化させるか又は排除すらする（膜の吸着性は吸着過程に寄与してもしなくてもよい）。しかし、所望の場合には、多孔質の濾板の栓を付加することができる。好ましくは、形成された膜又は複合構造物は、約２０未満の、より好ましくは約１０未満の、特には１未満のアスペクト比（平均の厚さに対する平均直径）を有する。例えば、吸着性ピペット先端に対しては、２以下の、より好ましくは１未満の、特には約０．００５〜０．５の間のアスペクト比が好ましい。この範囲内のアスペクト比は操作中の複合構造物中における試料の適切な滞在時間を提供する。
【００２１】
ポリマーの転相法においては、ポリマーの溶媒は急冷相又は転換相と混和性でなければならない。例えばＮ−メチルピロリドンはポリスルホン、ポリエーテルスルホン及びポリスチレンの適切な溶媒である。後者の場合、ポリスチレンのペレットはＮ−メチルピロリドン及び現場の事例に溶解させることができる。生成される構造物はポリオレフィンに基づいたハウジングの壁に良好な付着を示し、ポリスルホンに類似の吸着特徴を有する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、ブチロラクトン、及びスルファランもまた適切な溶媒である。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）はＰＶＤＦに適する溶媒である。水は好ましい沈澱剤である。ポリマー転相法は概括的に、ハウジング内のその注型溶液の容量を約２倍ないし３倍までの構造物の膨張をもたらす。
【００２２】
空気注型法においては、ポリマー結合剤のための揮発性溶媒が使用される。例えば酢酸セルロースの場合には、アセトンが適切な揮発性溶媒である。空気注型は概括的に、注型溶液の容量より小さい構造物をもたらす。この方法により、より高い駆動力を適用しなければならないことなく、充填構造物内の粒子は、収縮後に、網目の間の空間を通過させるために少なくとも約３０μでなければならない。
【００２３】
粒子量の上限は注型溶液の粘度により決定される。粒子の種類に応じて、ハウジング内に引き込むのに粘度が高過ぎる注型溶液をもたらさずに、４０％（ｗ／ｗ）までの粒子をポリマーに添加することができる。より高い粒子の充填は、より高い温度の使用により達成することができる。適切な粉末度は、多孔度を伴っても伴わなくても、平均直径が約１００ナノメーターないし約１００ミクロンの範囲の粒子を含む。
【００２４】
適切なハウジング材料は特に制約されず、プラスチック（ポリエチエレン及びポリプロピレンのような）、ガラス及びステンレス鋼を含む。ポリオレフィン及び特にポリプロピレンは、ポリスルホン及びなかでも、Amoco社から市販のUDEL P3500及びP1700ポリスルホンを含有する複合体が、その中で現場注型される時に、複合体構造物により生成される化学接着性の観点において、好ましいハウジング材料である。図１６Ｂは球状のシリカゲル及びポリスルホンにより調製されたその中に現場注型膜を有するポリプロピレンのピペット先端のハウジングとのこのような接着を示している。
【００２５】
適切なハウジング形態もまた、特に制約はされず、ピペット先端、ウェル、多数ウェルの配列、プラスチック及びガラスの空洞、Millipore Corporation社から市販されているMICROCON(R)微量濃縮機のような試料調製装置、等を含む。好ましいハウジングの形態は、操作中の流れのベクトルがクロマトグラフィーと同様に実質的に真っすぐであり、それにより非円筒形の形態で起こる可能性がある希釈性洗浄（dilutional washing）を最少にするか又は回避するので、実質的に円筒形である。約０．１μｌと約５ｍｌの間の容積をもつハウジングを現場注型のために使用することができるが、約１００μｌ未満の容積が好ましく、約０．１〜５０μｌの、好ましくは約０．２〜２０μｌの容積をもつものは特に好ましい。約５ミクロリッターのように小さい容積を有するピペット先端構造を使用することができる。ハウジングの壁に複合構造物の化学的付着が所望されるが、それが有意でないか、存在しない時は、ハウジング内の複合構造物を維持するために、クリンプ加工、プレス嵌め、ハウジング又はその一部の熱収縮、ハウジング又はその一部のプラズマ処理、あるいは、付着を促進するためにハウジング又はその一部を、エッチングのように化学的に処理すること、のような機械的手段を使用することができる。ハウジングの壁への付着の利点は、機械的手段なしに、ハウジングに複合構造物を「シール」する能力である。このようなシール（どんな方法であれ）は、操作中に試料がチャンネルを形成したりバイパスを形成することを防止する。好ましくは、本発明の構造物は約０．０５ないし約５ｍｍの最終床高さを有する。これにより、良好な洗浄性、単位容量当たりの良好な洗浄性、十分な密度を可能にし、栓の形成期間中、均一な沈澱をもたらす。
【００２６】
本発明の構造物はまた、適切な幾何学構造を有する通常の多数ウェル配列に、現場注型することができる。代替的には、図５Ａ〜５Ｄに示されるように、ウェル１２内の現場に本発明の構造物１１を注型することによるように、多数ウェル配列１０をハウジングとして使用することができる。代替的には、図５Ｂは、その中に現場注型構造物を含んだ複数のウェル１２（図５Ｄに拡大）を有する下部ドレン副集成体１３を示している。下部ドレン１３は、本発明の構造物を含む取り外し可能な「ブーツ」型の集成体を形成するように、スナップ止めによるようなあらゆる適切な手段により、溜め配列１０に、恒久的に又は取り外し可能に連結するようにさせることができる。便宜上、各下部ドレン１３は、使用者が用途に応じて適切な下部ドレン１３を選択するように、異なる化学性を有する粒子を含むポリマーマトリックスを含むことができる。代替的又は付加的に、粒子充填ポリマーマトリックスはウェルからウェルに異なる可能性がある。溜めのハウジング１０は複数の開放された孔でもよく、又は膜を含むこともできる。
【００２７】
複合構造物及び、複合構造物を含む本発明の微量試料調製装置は、粒子の選択に応じて広範な種類の用途を有する。用途は例えば、分析の前のペプチド及び蛋白質の試料の調製、炭化水素の試料からのペプチドの除去、分析の前のアミノ酸の洗浄、微量反応のための固定化酵素、微量親和性クロマトグラフィーのための固定化リガンド、超らせん化及び切断プラスミドの単離、ＰＣＲ及びＤＮＡ生成物の清浄化、ＲＮＡ単離のための固定化オリゴｄＴ、染色終結剤の除去、元素分析のための試料調製、等を含む。当業者は、所望の用途に応じて、適切な粒子、ポリマー結合剤、粒子化学を選択し、幾何学的構造を形成することができるであろう。幾つかの場合には、同一の装置において粒子の混合物を使用することができる。代替的に又は追加的には、多数ウェル装置は各々の分離されたウェルに対して異なる化学性を有する可能性がある。
【００２８】
本発明の構造物が粒子で充填されていない態様においては、対称的又は非対称的半透過性構造物、あるいは対称的及び非対称的半透過性構造物の組み合わせ物を形成することができる。この態様においては、好ましい形成方法は、適切なハウジング内にインサイチューで注型して、サイズ又は吸着性（ポリマーの本性に応じて）に基づいた分離に適した自己保持性、自己支持性構造物を形成することである。粒子の使用なしに、吸着分離を実施するために、このような膜に官能価を付加することができる。例えば、酢酸セルロースを塩基とともに処理してセルロースを形成し、次に酸化剤によりそれを反応性にさせることができる。
【００２９】
インサイチューの形成法（充填構造物でも非充填構造物によっても）において、好ましい形成方法は、圧力が、例えば毛細管作用により又は真空源を使用することによる駆動力である場合のような、あらゆる適切な手段によりハウジング内に注型溶液を導入することによるような、溶媒交換による沈澱を伴う。ハウジングがピペット先端であるような態様においては、好ましい駆動力は携帯用ピペットである。ハウジング内の所望の容積が一旦、注型溶液で充填されると、ハウジング内の注型溶液は、ポリマーがハウジング内に沈澱するように、ポリマーがそれに不溶性の液体、好ましくは水と接触される。これは液体中にハウジングを浸漬させること、及び／又は真空によるような駆動力により、液体をハウジング内に引き込むことにより達成することができる。溶媒との水の交換により、構造物が沈澱する。当業者は、注型溶液を調製するために使用される溶媒及び非溶媒は種々の添加剤を含むことができることを認識するであろう。
【００３０】
沈澱剤とのポリマーの最初の接触時に、実際的に瞬間的な沈澱がおこり、それにより、半透過性バリヤー又は「スキン」を形成する。このようなバリヤーは図１７にハウジング６２の要素６０として示されている。このバリヤーは下部構造物の更なる沈澱の速度を遅らせる。一旦沈澱が終結すると、最初の半透過性バリヤー６０は、バリヤーの上方の地点でハウジングを切断すること、又は露出されたポリマーを削り取ることによるように、除去することができる。バリヤーは微量濾過膜として働くので、半透過性バリヤー６０は場合によっては、その場に残されて、非充填構造物により、サイズに基づく分離を実施することができる。
【００３１】
現場注型構造物はハウジングの形態を採り、クロマトグラフィーのカラムに類似の自己維持性の均質な構造物をもたらし、結合／溶離クロマトグラフィー（例えば、粒子がポリマーマトリックス中に含まれる時）又はその他の分析的もしくは生化学的方法に適した大きい表面積を提供する。適切な駆動力は遠心力、重力、圧力又は真空を含む。
【００３２】
以下の実施例は、本発明の目的及び利点を制限せず、具体的に表している。
【００３３】
【実施例１】
２０μｌのピペットの先端中の強力なカチオン交換（ＳＣＸ）シリカ
適切な小さい容器中に、７％（ｗ／ｗ）ＰＶＤＦ溶液（Pennwalt Corp, KYNAR 761）５グラムをＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中に調製した。これに、ＳＣＸ、２００Å、１５μｍの球状シリカ（Millipore,PN 85864）１グラムを添加し、スパチュラで完全に混合した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。２０μｌの溝付きポリプロピレンの使い捨てピペット先端を通常のＰ−２０Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を２０μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの末端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約０．５〜１μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は、等しい圧力が維持され、そしてピペット先端を取り外し、約５秒間６０℃で脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間の後に、プランジャーの圧力を解放し、水を先端中に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約０．５ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、約５分間、溶媒交換を実施させた。先端を水浴から取り出し、外側に付着したあらゆる沈澱ポリマーを削り落とした。先端を再度ピペットに取り付けて、液体を排出させた。流れが悪い時は、鋭い剃刀の刃で、先端を約０．２５ｍｍ切り落とすことができる。確実に、すべての溶媒を除去するために、約５ないし２０μｌの脱イオン水を数回、吸引、排出させた。
【００３４】
【実施例２】
通常の２００μｌのピペット先端中のＣ18シリカ
適切な小さい容器中に、６％（ｗ／ｗ）ポリスルホン溶液（Amoco, P3500）５グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。これに、Ｃ18、２００Å、１５μｍの球状シリカ（Millipore,PN 85058）２グラムを添加し、スパチュラで完全に混合した。混合物を室温で２時間、平衡化させ、次いで再度混合した。２００μｌの溝付きポリプロピレンの使い捨てピペット先端を通常のＰ−２００Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を２００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの末端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約２〜５μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は、等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、約５秒間、室温で脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間の後に、プランジャー上の圧力を解放し、水を先端中に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約０．５〜１ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、約５分間、溶媒交換を実施させた。先端を水浴から取り出し、外部に付いたあらゆる沈澱ポリマーを捩り落とした。先端をピペットに再度取り付けて、液体を排出させた。流れが悪い時は、鋭い剃刀の刃で、先端を約０．５ｍｍ切り落とす。確実に、すべての溶媒を除去するために、約５０ないし２００μｌの脱イオン水を数回、吸引、排出させた。
【００３５】
【実施例３】
広い内径の１０００μｌ用ピペット先端中の６０Å、１０μｍの通常の相のシリカ
適切な小さい容器中に、６％（ｗ／ｗ）の酢酸セルロース溶液（Eastman Kodak、398-60）６グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。これに、６０Å、１０μｍの顆粒状シリカゲル（Davison, Grade 710）１グラムを添加し、スパチュラで完全に混合した。混合物を室温で２時間、平衡化させ、次いで再度混合した。広い内径の１０００μｌのポリプロピレンのピペットを通常のＰ−１０００Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を１０００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの先端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約１０〜２５μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は、等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、約５秒間、室温で脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間の後に、プランジャーの圧力を解放し、水を先端に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約１ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、約５分間、溶媒交換を実施させた。水浴から先端を取り出し、外部に付いたあらゆる沈澱ポリマーを削り落とした。先端をピペットに再度取り付けて、液体を排出させた。流れが悪い時は、鋭い剃刀の刃で、先端を約０．５ｍｍ切り落とす。確実に、すべての溶媒を除去するために、約２００ないし１０００μｌの脱イオン水を吸引、排出させた。
【００３６】
【実施例４】
広い内径の２００μｌのピペット先端中のヒュームドシリカ
適切な小さい容器中に、７．５％（ｗ／ｗ）のポリスルホン溶液（Amoco、P3500）８グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。これに、ヒュームドシリカ（Degussa，Aerosil 200）０．５グラムを添加し、スパチュラで完全に混合した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。２００μｌの広い内径のポリプロピレンのピペットを通常のＰ−２００Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を２００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの先端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約１０〜２５μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は、等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、室温で約５秒間、脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間の後に、プランジャーの圧力を解放し、水を先端に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約１ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、約５分間、溶媒交換を実施させた。水浴から先端を取り出し、外側に付いたあらゆる沈澱ポリマーを削り落とした。先端をピペットに再度取り付けて、液体を排出させた。流れが悪い時は、鋭い剃刀の刃で、先端を約０．５ｍｍ切り落とす。確実に、すべての溶媒を除去するために、約２００ないし１０００μｌの脱イオン水を吸引、排出させた。
【００３７】
【実施例５】
現場注型されたＣ18、１５μｍのシリカ粒子充填膜
小さい容器中に、６％（ｗ／ｗ）のポリスルホン溶液（Amoco、P3500）５グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。これに、Ｃ18、２００Å、１５μｍのシリカ（Millipore，PN 85864）２グラムを添加し、スパチュラで完全に混合した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。ピペット又は点眼器を使用して、２５〜５０μｌの注型溶液を適切な取り付け具（fixture）中に分散させた。このような装置の例は、Millipore Microcon又は９６ウェル濾板のウェルを含む（しかしそれらに限定はされない）。この方法で装置を準備する時は、各室は溶液を保持する透過性バリヤー（例えば、ポリプロピレンの布地、膜、等）を含まなければならない。添加後、単位装置を軽くたたいて、溶液が確実にバリヤー全表面を覆うようにさせる。装置を約２時間水中に浸漬させ、溶媒交換を促進させるために１５分毎に穏やかに撹拌した。この期間後に、単位装置を取り出して、適当に、遠心分離機又は真空マニホルドのどちらかの中に入れた。現場注型構造物を脱イオン水５００ないし１０００μｌで洗浄して溶媒除去を確実にした。
【００３８】
【実施例６】
粗い３０μｌのシリカを含む広い内径の１０００μｌ用ピペット先端中の注型された多孔質の末端の栓
適切な小さい容器中に、７．５％（ｗ／ｗ）のポリスルホン溶液（Amoco、P3500）５グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。１０００μｌ用の広い内径のポリプロピレンのピペットを通常のＰ−１０００Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を１０００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの先端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約２〜１０μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は、等しい圧力が維持され、先端を取り外し、約５秒間脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間の後に、プランジャーの圧力を解放し、水を先端に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約０．５ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、溶媒交換を約５分間実施させた。水浴から先端を取り出し、外側に付いたあらゆる沈澱ポリマーを削り落とした。先端をピペットに再度取り付けて、液体を排出させた。流れが悪い時は、鋭い剃刀の刃で、末端を約０．５ｍｍ切り落とす。確実に、すべての溶媒を除去するために、約１００ないし５００μｌの脱イオン水を吸引、排出させた。ピペットを取り外し、上部室内のあらゆる過剰な水分を綿布で取り除いた。３０μｍ（２５９Å）のシリカゲル５〜１０ｍｇを秤量してピペットの後部末端に注意して添加した。現場注型バリヤーの先端にシリカが収まるように、ピペットを軽くたたいた。必要な場合は、粒子の損失を防止するために上部室内に適切な多孔質の栓（綿又はポリプロピレン）を取り付ける。
【００３９】
【実施例７】
濾過のための注型半透膜の栓
適切な容器中に、７．５％（ｗ／ｗ）のポリスルホン溶液（Amoco、P3500）５グラムをＮ−メチル−２−ピロリドン中に調製した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。１０００μｌ用の広い内径のポリプロピレンのピペットを通常のＰ−１０００Pipetman（Gilson、Ranin、等）に取り付け、容量調整を１０００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの先端を注型溶液中に挿入した。注意して観察しながら、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約２〜１０μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、過剰なポリマー溶液を払拭し、先端を約５秒間、脱イオン水浴中に浸漬させた。この短時間後に、プランジャーの圧力を解放し、水を先端に吸引してポリマーを沈澱させた。水位がポリマーの高さの約０．５ｃｍ上になった時、先端を浴中に押し出して、溶媒交換を約５分間実施させた。先端を再度ピペットに取り付けて、液体を排出させ、約１００〜２００μｌの脱イオン水で洗浄した。この方法で注型する時に、沈澱ポリマーはオリフィスに、濾過媒質として使用することができる、半透過性のスキンを有した。
【００４０】
【実施例８】
蒸発により調製された多孔質の３０μｌのシリカの栓
適切な容器中に、アセトン中１０％（ｗ／ｗ）の酢酸セルロース溶液（Eastman Kodak，398-60）５グラムを調製した。これに、メタノール１グラム、脱イオン水０．５グラム及び２５０Å、３０μｍのシリカ１グラムを添加した。混合物を室温で２時間平衡化させ、次いで再度混合した。１０００μｌ用の広い内径のポリプロピレンのピペットを通常のＰ−１０００Pipetman（Gilson）に取り付け、容量調整を１０００μｌに設定した。プランジャーを底まで圧し下げ、ピペットの末端を注型溶液中に挿入した。次いで、プランジャーをゆっくり上昇させて、注型溶液約５〜１０μｌで先端を充填させた。一旦先端が十分な液体を含んだ後は等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、過剰な液体を払拭し、そして先端をラック中において、約１６時間、溶媒を蒸発させた。この期間後に、約１０μｌの蒸留水で先端を洗浄した。
【００４１】
【実施例９】
熱転相により調製された多孔質ポリエチレン中の３０μｌのシリカの末端の栓
適切な容器に粒状ポリエチレン５グラム及び鉱油１００グラムを添加する。混合物を撹拌しながらホットプレート上で２５０℃に加熱する。プラスチックが液化する時に、２５０Å、３０μｍのシリカ４グラムを添加し、完全に混合する。充填剤用バルブの付いた１ｍｌ用目盛り付きガラスピペットを使用して、５０〜１００μｌの溶融物を吸引する。一旦先端が十分な液体を含むと、等しい圧力が維持され、そして先端を取り外し、過剰なプラスチックを払拭し、先端を室温まで放置冷却する。鉱油を抽出するために、ピペットを１時間、塩化メチレン浴に移す。次いでそれを取り出し、塩化メチレンを排出させ、空気乾燥させる。
【００４２】
【実施例１０】
ペプチド試料調製のためのＣ18シリカの２００μｌ用ピペットの先端
ＧｌｙＴｙｒ（１）、ＶａｌＴｙｒＶａｌ（２）、メチオニン・エンケファリン（３）、ロイシン・エンケファリン（４）及びアンギオテンシンII（５）（０．１％ＴＦＡ１００μｌ中）からなる混合物から各ペプチド約２．５μｇを、注型されたＣ18、２００Å、１５μｍの球状シリカ約５μｌを含むＰ２００のピペット先端に吸着させた。溶液を４回、吸引、排出させた。次いで先端を０．１％ＴＦＡ２００μｌで洗浄した。結合ペプチドを０．１％ＴＦＡ／水中の８０％アセトニトリルで溶離させた。溶離ペプチドを０．１％ＴＦＡ４部で希釈し、逆相ＨＰＬＣにより（２０分間にわたる５〜３０％のアセトニトリル線勾配）分析した。次いで、生成されたクロマトグラムを元の混合物のものと比較した（図６及び７を参照されたい）。期待のように、小さくて比較的親水性のＧｌｙＴｙｒ、ＶａｌＴｙｒＶａｌはＣ18に結合しなかった。残りの３種（吸着された）ペプチドの、溶離後の回収率は７０〜８５％の範囲内であった。
【００４３】
【実施例１１】
強力カチオン交換シリカ２００μｌのピペットの先端
５種のペプチド（実施例１０を参照されたい）（１０％氷酢酸１００μｌ中）からなる混合物からの各溶質約２．５μｇを、注型されたスルホン酸スチレンで被覆された、３００Å、１５μｍの球状シリカ約５μｌを含むＰ２００のピペット先端に吸着させた。４回の完全な吸引−引き出しサイクルと、それに続く２０％メタノール／１０ｍＭのＨＣｌ１００μｌのフラッシュの期間中に吸着が実施された。結合試料を１．４Ｎの水酸化アンモニウム／５０％メタノール２５μｌ容量で２回溶離させた。溶離試料を逆相ＨＰＬＣにより分析し、生成されたクロマトグラムを元の混合物のものと比較した（図６及び８を参照されたい）。強力カチオン交換先端が、ＧｌｙＴｙｒを除いてすべての試料成分を結合させた。この性能はスルホン酸のイオン交換樹脂の選択性と一致している。
【００４４】
【実施例１２】
２００μｌ用ピペット先端中の固定化酵素
トリプシンを、アルデヒドにより活性化された３００Å、１５μｍの球状シリカに共有結合させ、インサイチューの蛋白消化のためにＰ２００先端中に注型（２０μｌ）させた。先端内のトリプシン活性をＨＰＬＣにより、シトクロムの消化を監視することにより検定した。シトクロムｃの試料（１００ｍＭのTris、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８、３７℃の１００μｌ中１０μｇ）を１５分間、先端に吸引した。反応物をエッペンドルフ管中に排出／吸引サイクルにより４ｘ混合した。消化を３０分間にわたり、５〜４５％のアセトニトリルの線勾配を使用してＨＰＬＣにより分析した（図１０を参照されたい）。生成されたクロマトグラムは、９０％を超えるシトクロムが１５分後に消化されたことを示した（未消化シトクロムｃについては図９を参照されたい）。
【００４５】
【実施例１３】
２００μｌ用ピペット先端中の固定化蛋白質Ａ
再結合蛋白質Ａを、ウサギの免疫グロブリン（ＩｇＧ）の単離のために、アルデヒド活性化の、３００Å、１５μｍの球状シリカを含む、前注型されたＰ２００先端に結合させた。ＲＩＰバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭTris、ｐＨ８．０）中、１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ及びＢＳＡの試料１００μｌを、蛋白質Ａ固定化ビーズを含む注型容量４０μｌを含む先端を通って、６回循環させた。次いで、溶離の前に、ＲＩＰバッファー５容量で先端を洗浄した。結合ＩｇＧの吸着を、６Ｍの尿素で（２５μｌ容量を２回）実施した。吸着された試料をＳＤＳレムリ（Laemmli）サンプルのバッファー５０μｌで２ｘ希釈し、電気泳動分析の前に３分間沸騰させた。この前処理をまた、背景の対照として働く、ビーズを含まないでポリスルホンのみを含むブランクの先端に対しても実施した。電気泳動法を、示された１０〜１６％のアクリルアミドのゲル中で実施した（図１１を参照されたい）。試料は以下の通りである。レーン９：（ＭＷマーカー）、レーン１〜４：漸増量の蛋白質Ａ先端溶離試料、及びレーン５〜８：ブランクのポリスルホン先端からの溶離ＩｇＧ／ＢＳＡの漸増量。これらの結果は、最小の非特異的な吸着を伴う、ＩｇＧの蛋白質Ａ先端への選択的結合を示している。更に、ブランクの先端（レーン５〜８）は洗剤（ＲＩＰバッファー）の存在下でＩｇＧ又はＢＳＡのどちらの吸着も示さなかった。
【００４６】
【実施例１４】
超螺旋状ＤＮＡに対する６０Å、１０μｍ、１０００μｌのピペットの先端
プラスミドｐＵＣ１９を含む大腸菌株ＪＭ１０９を１２〜１６時間３７℃で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアブロス（Luria broth）３〜５ｍｌ中で成長させた。１夜培養物１．５ｍｌを、室温で３０秒間最大ｇ力で回転されるミクロ遠心分離管中でペレット化させた。バクテリアペレットをそのままに残して、残留成長培地を除去した。次いで、プラスミドＤＮＡをビルンボイム及びドリー（Birnboim and Doly）のアルカリ分解法の変法を使用して単離した（Birnboim, H. C. and Doly,J. （1979）Nucleic Acids Res 7, 1513）。要約すると、バクテリアのペレットを、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡの５０μｌ中に渦巻きながら再懸濁させた。次いで、０．２ＮのＮａＯＨ、１％のドデシル硫酸ナトリウム１００μｌを添加した。生成した懸濁物を２分間室温で保温した。３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）１００μｌの添加後、懸濁物を渦巻き回転により混合し、次いで最大ｇ−力においてミクロ遠心分離機中で２分間回転させた。透明な分解物を新鮮なミクロ遠心分離管に移し、それに、ｐＨ５．６の２００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）中７Ｍのグアニジン塩酸（ＧｕＨＣｌ）を最終濃度及び容量を、それぞれ４．４Ｍ及び７００μｌまで添加した。生成した溶液を、Ｐ−１０００ピペットを使用して、約６０Å、１０μｍのシリカゲルを含む注型膜約６０μｌを含む１０００μｌのポリプロピレンのピペット先端中に吸引した。ＤＮＡ溶液とシリカ膜マトリックスとの間の集中的相互作用を可能にするために、溶液を、２〜２．５分間ピペットで出し入れさせた。次いで先端を８０％の試薬等級アルコール４００μｌで１度フラッシュさせた。残留アルコールをペーパータオル上に繰り返して排除することにより除去する。プラスミドＤＮＡを、ピペットで３ｘ出し入れすることにより、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）の１００μｌ中で先端から溶離させた。溶離分画をＴＥにより１００μｌの最終容量に調整した。６個の先端を評価した。プラスミドＤＮＡの回収を定量するために、非結合濾液２０％のみならず、溶離液２０％をアガロースゲル電気泳動により分析した（図１２を参照されたい）。ゲル上には既知の濃度のｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡの試料が含まれていた（レーン１〜４）。これらの実験の結果は、平均して、超螺旋プラスミド２．５ｍｇが回収されたことを示している（レーン５、７、９、１１）。
【００４７】
【実施例１５】
線状ＤＮＡに対する広い内径の２００μｌのピペット先端中の６０Å、１０μｍのシリカ
注型の６０Å、１０μｍのシリカ充填膜、約２０μｌを含む、２００μｌのポリプロピレンの広い内径のピペット先端の、線状ＤＮＡ断片（ＢｓｔＮＩ又はＭｓｐＩのどちらかで消化されたｐＢＲ３２２、ＤＮＡ断片ラダーを生成するため）又は、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩ（大きい線状制限断片を生成する）で制限されたプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ、を結合する能力を検定した。線状プラスミドＤＮＡ５μｇをＭＥＳ中ｐＨ５．６のＧｕＨＣｌと、最終濃度０．５Ｍ及び１５０μｌの最終容量になるように結合させた。使用前に、シリカ膜を含むＰ−２００先端を、ＭＥＳ中でｐＨ５．６の、０．５ＭのＧｕＨＣｌを２００μｌ中で（２ｘ）前以て平衡化させた。ＤＮＡ／ＧｕＨＣｌ溶液をピペット先端に吸引して、ＤＮＡ結合混合物と、シリカ充填膜マトリックスとの間の集中的相互作用を可能にさせるために１．５〜２．０分間出し入れを繰り返した。次いで、塩及びその他の汚染物を除去するために、８０％の試薬等級アルコール１２５μｌで先端を洗浄した。結合ＤＮＡを、３ｘのピペットによる出し入れにより、１００μｌのＴＥ中の先端マトリックスから溶離させた。ＤＮＡ回収率を測定するために、溶離液及び濾液をアガロースゲル電気泳動により分析した（図１３を参照されたい）。回収されたＤＮＡ量を定量するために、出発物質の１００％、７５％、５０％、及び２５％を表す試料をレーン１〜４に走らせた。レーン５、７、９＆１１は溶離液である。帯の強度の測定値は９５％を超える回収を示している。
【００４８】
【実施例１６】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡに対する広い内径の２００μｌのピペット先端中のヒュームドシリカ
ポリスルホンマトリックス中に固定化されたヒュームドシリカ約２０μｌを含む２００μｌの広い内径のポリプロピレンのピペット先端の能力を、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（５００ｂｐ）の精製に対して検定した。使用前に、ＴＥバッファー１００μｌで２ｘ先端をフラッシュし、次いでＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）２００ｍＭ中３ＭのＮａＩを５００μｌで平衡化させた。次いで貯留されたＰＣＲ原液（ＤＮＡ約３μｇ）から５０μｌの試料を３．０Ｍの最終ＮａＩ濃度まで、７ＭのＮａＩを混合させた。ＮａＩ溶液の添加後の総容量は１５０μｌであった。マトリックスと集中的に接触させるために、注型ヒュームドシリカ充填膜を含むＰ−２００先端から、試料を２〜３分間、吸引、排出させた。次いで、塩及びその他の汚染物を除去するために８０％の試薬等級アルコール１２５μｌで各先端を洗浄した。先端の中身をペーパータオル上に排出させることにより、残留アルコールを除去した。結合したＰＣＲ生成物を５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）中に溶離させた。ＤＮＡ回収率を算定するために、溶離物及び濾液をアガロースゲル電気泳動により分析した（図１４を参照されたい）。出発材料の１００％、７５％、５０％、及び２５％を表す充填物を対照としてレーン１〜４に走らせた。僅かなプライマー−ダイマー汚染を表す下部の帯の存在に注目されたい。ＮａＩとの、固定化ヒュームドシリカの使用は９０％を超える増幅ＤＮＡ回収率をもたらすように見える。更に、プライマー−ダイマー汚染物の減少があるように見える（レーン５、７、９、１１を参照されたい）。
【００４９】
【実施例１７】
ＤＮＡ単離のための２００μｌのピペット先端中の粗い３０ミクロンのシリカを含む注型された多孔質の末端の栓
多孔質の末端の栓として注型（７．５％）ポリスルホン約５〜１０μｌ並びに粗い２５０Å、３０μｍのシリカ２〜４ｍｇを含む２００μｌのピペット先端を、線状及び超螺旋状のプラスミドＤＮＡを結合する能力につき検定した。線状ＤＮＡに関しては、最初に、ｐＢＲ３２２を約５μｇを４５μｌのＴＥ（１０ｍＭのTris−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０中のＭｓｐＩで消化させ、次いでｐＨ５．６で２００ｍＭのＭＥＳバッファー中の７Ｍのグアニジン塩酸（ＧｕＨＣｌ）１００μｌと結合させた。溶液中のＧｕＨＣｌの最終濃度は４．７Ｍであった。生成された溶液を２００μｌのピペット先端に吸引し（１回）、約２分間、取り付けられた先端をもつpipetmanを逆にすることにより、シリカと集中的に接触させた。次いで、先端に吸着されたＤＮＡを洗浄し、実施例１５に記載のように溶離させた。出発物質の１００％、７５％、５０％、及び２５％を表す充填物を対照としてレーン１〜４に走らせた。このフォーマットを使用する実験からの結果は、７５％より高いＤＮＡ回収率を達成できることを示している（図１５、レーン５及び７を参照されたい）。
【００５０】
以下に本発明の主な特徴及び態様を列挙する。
１． 容積を規定するハウジングで、前記ハウジングが、前記容積の一部分の中に、多孔質のポリマーマトリックス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含んでなる三次元構造物を含み、前記構造物が約１０未満のアスペクト比を有する。
２． 前記ハウジングが第１の開放末端及び、前記第１の開放末端から間隔をおいた第２の開放末端を有し、そして前記三次元構造物が前記第２の開放末端に隣接している、第１項記載のハウジング。
３． 前記アスペクト比が５未満である、第１項記載のハウジング。
４． 前記構造物を含む前記容積の前記の部分が約０．１ミクロリッターないし約１０ミリリッターである、第１項記載のハウジング。
５． 前記ハウジングが、その間に前記構造物を伴う、第１の末端及び、前記第１の末端から間隔をおいた第２の末端を有するピペットの先端である、第１項記載のハウジング。
６． 前記第１の末端が前記第２の末端の内径よりも大きい内径を有する、第５項記載のハウジング。
７． 前記ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリル・コポリマー及びＰＶＤＦからなる群から選択される、第１項記載のハウジング。
８． 前記ポリマーがポリスルホンであり、そして前記ハウジングがポリオレフィンを含んでなる、第７項記載のハウジング。
９． 前記ポリオレフィンがポリプロピレンである、第８項記載のハウジング。
１０． 前記粒子がポリスチレンジビニルベンゼン・ビーズ、官能化ポリスチレンジビニルベンゼン・ビーズ・シリカ、ヒュームドシリカ、誘導シリカ及び活性炭素からなる群から選択される、第１項記載のハウジング。
１１． 前記三次元構造物が半透過性バリヤーを含んでなる、第１項記載のハウジング。
１２． ハウジング内に複合構造物を注型する方法であって、前記方法が、
ポリマーの溶液を形成すること、
注型溶液を形成するために前記溶液に粒子を添加すること、
前記ハウジング中に前記注型溶液を導入すること、並びに
前記ポリマーに前記粒子を含んでなる多孔質ポリマーマトリックスを形成させるように、前記注型溶液を転相にさらすこと、
を含んでなる。
１３． 前記溶液が溶媒中に前記ポリマーを溶解させることにより形成される、第１２項記載の方法。
１４． 前記溶液が、前記ポリマーに対する溶媒及び非溶媒の混合物中に前記ポリマーを溶解することにより形成される、第１２項記載の方法。
１５． 前記転相が、前記ポリマーがそれに不溶性である液体と、前記ハウジング中の前記注型溶液を接触させることにより惹起される、第１２項記載の方法。
１６． 前記転相が、前記溶媒の蒸発により惹起される、第１２項記載の方法。
１７． 前記ハウジングから前記の多孔質ポリマーマトリックスを除去すること及び、第２のハウジング中に前記の多孔質ポリマーマトリックスを導入すること、を更に含んでなる、第１２項記載の方法。
１８． ハウジング内に膜を注型する方法であって、前記方法が、
ポリマーの溶液を形成すること、
前記ハウジング中に前記溶液を導入すること、並びに
前記ポリマーを前記ハウジング内に沈澱させるように、前記溶液を転相にさらすこと、
を含んでなる。
１９． 前記溶液が溶媒中に前記ポリマーを溶解することにより形成される、第１８項記載の方法。
２０． 前記転相が、前記ハウジング内の前記溶液を、前記ポリマーがそれに不溶性である液体と接触させることにより惹起される、第１８項記載の方法。
２１． 前記沈澱期間中に形成されるあらゆる半透過性バリヤーを除去することを更に含んでなる、第１８項記載の方法。
２２． 容積を規定するハウジングで、前記ハウジングが、前記容積の一部分内に、多孔質のポリマーマトリックスを含んでなる三次元構造物を含み、前記構造物が約１０未満のアスペクト比を有する。
２３． 前記ハウジングが第１の開放末端及び、前記の第１の開放末端から間隔をあけた第２の開放末端を有し、そして前記構造物が前記第２の開放末端と隣接している、第２２項記載のハウジング。
２４． 前記アスペクト比が５未満である、第２２項記載のハウジング。
２５． 前記構造物を含む前記容積の前記部分が約０．１ミクロリッターないし約１０ミリリッターである、第２２項記載のハウジング。
２６． 前記ハウジングが、それらの間に前記構造物を伴って、第１の末端及び、前記第１の末端から間隔をあけた第２の末端を有するピペットの先端である、第２２項記載のハウジング。
２７． 前記第１の末端が前記第２の末端の内径よりも大きい内径を有する、第２６項記載のハウジング。
２８． 前記ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリル・コポリマー及びＰＶＤＦからなる群から選択される、第２２項記載のハウジング。
２９． 前記ポリマーがポリスルホンであり、前記ハウジングがポリオレフィンを含んでなる、第２８項記載のハウジング。
３０． 前記ポリオレフィンがポリプロピレンである、第２９項記載のハウジング。
３１． 前記三次元構造物が半透過性のバリヤーを含んでなる、第２２項記載のハウジング。
【図の簡単な説明】
【００５１】
【図１】２個の多孔質の栓の間に粒子を集成した吸着性ピペット先端のスキーム図である。
【図２】図２Ａは本発明に従う現場注型法により調製された吸着性ピペット先端のスキーム図であり、
図２Ｂは粒子を充填された現場注型構造物の走査電子顕微鏡写真である。
【図３】その中に現場注型構造物が付加されているハウジングの更なる態様である。
【図４】球状シリカゲル及びポリスルホン結合剤により調製された粒子充填膜の走査電子顕微鏡写真である。
【図５】図５Ａは本発明の現場注型構造物に適するハウジングとしての多数ウェル配列を表し、
図５Ｂは図５Ａの多数ウェル配列とともに使用することができる下部ドレンの側面図であり、
図５Ｃは図５Ａの多数ウェル配列の１個のウェルの上面図であり、
図５Ｄは図５Ｂの下部ドレンのウェルの横断面図である。
【図６】５種のペプチドの混合物の逆相クロマトグラムである。
【図７】現場注型Ｃ18シリカを含むピペット先端から結合及び溶離された５種のペプチド混合物の逆相クロマトグラムである。
【図８】現場注型のスルホン酸スチレン被覆シリカを含むピペット先端から結合及び溶離された５種のペプチド混合物の逆相クロマトグラムである。
【図９】シトクロムｃの逆相クロマトグラムである。
【図１０】現場注型された固定化トリプシンビーズを含むピペット先端に１５分間暴露後のシトクロムｃの逆相クロマトグラムである。
【図１１】現場注型された固定化蛋白Ａのビーズを含むピペット先端から結合及び溶離されたウサギの免疫グロブリン−ｇ試料の電気泳動ゲルである。
【図１２】現場注型シリカを含む１０００μｌのピペット先端から結合及び溶離された超螺旋形プラスミドＤＮＡの電気泳動ゲルである。
【図１３】現場注型シリカを含む２００μｌのピペット先端から結合及び溶離された、１００〜２０００ｂｐの範囲の線状ＤＮＡ断片の電気泳動ゲルである。
【図１４】現場注型ヒュームドシリカを含む２００μｌのピペット先端から結合及び溶離された、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの電気泳動ゲルである。
【図１５】粗いシリカ及び現場注型膜バリヤーを含む２００μｌのピペット先端から結合及び溶離された線状のＤＮＡ断片の電気泳動ゲルである。
【図１６】図１６Ａは球状シリカゲル及びポリスルホン結合剤により調製された現場注型粒子充填膜を含むピペット先端の縦断面の走査電子顕微鏡写真であり、
図１６Ｂは球状シリカゲル及びポリスルホン結合剤により調製された現場注型粒子充填膜を含むピペット先端の横断面の走査電子顕微鏡写真である。
【図１７】現場注型された非充填の切断されていない膜を含むピペット先端の縦断面である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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