(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体中に、（i）Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、（ii）ホスホエノールピルビン酸の生成能を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物の培養物、（iii）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させることにより得られるＮ−アセチルマンノサミン、および（iv）ホスホエノールピルビン酸の生成に必要なエネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項２】
配列番号1記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物がエシェリヒア属、ナイセリア属およびストレプトコッカス属から選ばれる属に属する微生物である、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】
エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項５】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびコリネバクテリウム・アセトアシドフィラムから選ばれる微生物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物を用いたＮ−アセチルノイラミン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法として、抽出法、分解法、酵素を利用した方法等が知られている。
抽出法としては、ウミツバメの巣などからの抽出する方法〔Carbohydrate Research, 56, 423 (1977)〕等が知られている。
【０００３】
分解法としては、大腸菌などが生産するＮ−アセチルノイラミン酸ポリマーであるコロミン酸を分解する方法〔J. Biochem., 82, 1425 (1977)〕等が知られている。
酵素を利用した方法としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いて製造する方法〔J. Am. Chem. Soc., 110, 6481 (1988)、J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988)〕、アルカリ条件下で、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを用いて製造する方法（米国特許第5,665,574号）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを用いて製造する方法〔Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991)、Carbohydrate Research, 306, 575 (1998)〕、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ、ホスホエノールピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いて製造する方法〔特開平10-4961、Glycobiology,
7, 697 (1997)〕が知られている。
【０００４】
上記Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法のいずれの方法においても、操作が煩雑あるいは、高価な原料であるピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸を必要とするため、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価な製造法は確立されていない。
【０００５】
これまでに、微生物の培養物または該培養物の処理物を利用してＮ−アセチルノイラミン酸を製造することが可能であることに関する記載あるいは示唆されるものはない。
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼに関しては、動植物由来のものが知られており、微生物ではエシェリヒア属に属する微生物にその活性のあることが知られている。エシェリヒア属に属する微生物であるエシェリヒア・コリにおいては、該酵素をコードする遺伝子ｎａｎＡも知られている〔Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)〕。
【０００６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼに関しては、エシェリヒア属、ナイセリア属、ストレプトコッカス属に属する微生物等において存在が知られており、エシェリヒア・コリにおいて該酵素をコードする遺伝子ｎｅｕＢが知られている〔J. Bacteriol., 177, 312 (1995)〕。
【０００７】
Ｎ−アセチルグルコサミン２-エピメラーゼに関しては、ブタおよびラットで該酵素の存在が知られており、ブタ由来の該酵素に関しては性質が調べられ〔Biochemistry, 17, 3363 (1970)〕、該酵素をコードする遺伝子〔J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)〕が取得されている。これまで、該酵素の活性を有する微生物は知られていない。
【０００８】
ピルビン酸の製造法としては、エシェリヒア・コリの変異株を用いたピルビン酸の製造法が知られている〔Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (1994)〕。
ホスホエノールピルビン酸の製造法としては、サッカロマイセス属などに属する微生物を用いたホスホエノールピルビン酸の製造法が知られている(特開平6-197778)。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸などの高価な原料を添加することなく、安価にＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、高価なＮ−アセチルマンノサミンを用いることなくＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物を利用することにより、安価な原料から効率的にＮ−アセチルノイラミン酸が生成することを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）  水性媒体中に、（i）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、（ii）上記（i）においてＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性を有する微生物を用いた場合にはピルビン酸の生成能を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、上記（i）においてＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物を用いた場合にはホスホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、（iii）Ｎ−アセチルマンノサミン、および（iv）ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成に必要なエネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１２】
（２）  Ｎ−アセチルマンノサミンが、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させることにより得られるＮ−アセチルマンノサミンである、上記（１）の製造法。
【００１３】
（３）  Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物である、上記（２）の製造法。
【００１４】
（４）  Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡがシネコシスティス(Synechocystis)属に属する微生物由来のＤＮＡである、上記（３）の製造法。
（５）  Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、上記（３）または（４）の製造法。
【００１５】
（ａ）  配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（６）  Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性を有する微生物がエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の製造法。
【００１６】
（７）  Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物がエシェリヒア属、ナイセリア属およびストレプトコッカス属から選ばれる属に属する微生物である、上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の製造法。
（８）  ピルビン酸の生成能を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセス属から選ばれる属に属する微生物である、上記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の製造法。
【００１７】
（９）  ホスホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセス属から選ばれる属に属する微生物である、上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の製造法。
（１０）  エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、上記（６）〜（９）のいずれか一つに記載の製造法。
【００１８】
（１１）コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびコリネバクテリウム・アセトアシドフィラムから選ばれる微生物である、上記（６）、（８）または（９）の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性を有する微生物としては、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いることができ、例えばエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
【００２０】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリ等をあげることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム等をあげることができる。
【００２１】
また、該酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換体を用いることもできる。該形質転換体として、エシェリヒア・コリ由来のｎａｎＡ遺伝子〔Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)〕を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的な例として、エシェリヒア・コリNM522/pTA3株等をあげることができる。エシェリヒア・コリNM522/pTA3株は、平成１２年８月２８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目３番（郵便番号３０５−８５６６）にFERM BP-7284として寄託されている。
【００２２】
本発明で用いられるＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性を有する微生物としては、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いることができ、例えばエシェリヒア属、ナイセリア属、ストレプトコッカス属に属する微生物をあげることができる。
【００２３】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリ等をあげることができる。
また、該酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換体を用いることもできる。該形質転換体として、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子〔J. Bacteriol., 177, 312 (1995)〕を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的な例として、エシェリヒア・コリNM522/pYP18株等をあげることができる。エシェリヒア・コリNM522/pYP18株は、平成１２年８月２８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7283として寄託されている。
【００２４】
ピルビン酸生成能を有する微生物としては、該生成活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いることができ、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエなどを例示することができる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、該活性を増強した微生物を用いることもできる。エシェリヒア・コリの変異株としては、Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (1994)記載の株をあげることができる。
【００２５】
ホスホエノールピルビン酸生成能を有する微生物としては、該生成活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いることができ、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエなどを例示することができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、特開平6-197778に記載の株をあげることができる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、該活性を増強した微生物を用いることもできる。
【００２６】
Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生物としては、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いることができ、例えば該酵素の活性を遺伝子組換え手法により増強した形質転換体をあげることができる。該形質転換体の具体例として、ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＥＰＩ１）を保有するエシェリヒア・コリ（FERM BP-4602：米国特許第5,795,767号）またはシネコシスティス属に属する微生物由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有するエシェリヒア・コリNM522/pYP16株等をあげることができる。エシェリヒア・コリNM522/pYP16株は、平成１２年８月２８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7282として寄託されている。
【００２７】
シネコシスティス属に属する微生物由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子としては、Synechocystis sp. PCC6803株の染色体に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている遺伝子をあげることができる。より具体的には、配列番号２で示される塩基配列を有する遺伝子(slr1975)をあげることができる。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、後述実施例に従い、本発明者らが初めて取得したものである。
【００２８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性およびピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失している活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
【００２９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造において用いることのできるＮ−アセチルマンノサミンとしては、市販品等の標品をあげることができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミンから、アルカリ条件下で化学的に、あるいはＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを用い酵素的に変換することにより得られるＮ−アセチルマンノサミンを用いることができる。更に、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、生成蓄積されたＮ−アセチルマンノサミンを含む標品、または該標品から精製されたＮ−アセチルマンノサミンを用いることができる。
【００３０】
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性、並びにピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルグルコサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失している活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
【００３１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造において用いることのできるＮ−アセチルグルコサミンとしては、市販品等の標品をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性およびホスホエノールピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物１種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失している活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
【００３２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性、並びにホスホエノールピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルグルコサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失している活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
【００３３】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成に際して用いる微生物は、増殖を伴なった状態で生成反応に供してもよいし、培養終了後の微生物の培養物またはその処理物を生成反応に供してもよい。
上述のように、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの製造において、遺伝子組換え微生物を利用することも可能であるが、該遺伝子を含むプラスミドを保有する微生物からのプラスミドＤＮＡの単離精製、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断、切断したＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮＡ断片の酵素的結合、組換え体ＤＮＡを用いた形質転換等、遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法〔例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）〕に準じて行うことができる。また、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(以下ＰＣＲと略す)は公知の方法〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕に従って行うことができる。
【００３４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの製造に関与する遺伝子を宿主内で発現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＰＣＲで該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより達成できる。
【００３５】
宿主細胞としては、細菌、酵母等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組込が可能で、目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３６】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、遺伝子の発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、目的とするＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３７】
発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティス社製）、pKK233-2、pKK223-3、pGEX-2T（いずれもアマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8、pQE-30（いずれもキアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK-（ストラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118（宝酒造社製）、pPAC31（WO98/12343）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３８】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３９】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４０】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli W1485、Escherichia coli NM522、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００４１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
【００４２】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００４３】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candida utilis等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
【００４４】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４５】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００４６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４７】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００４８】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４９】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
【００５０】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において用いられる微生物の量は、用いる各微生物各々について、湿菌体として１〜５００ｇ／ｌであり、好ましくは１〜３００ｇ／ｌである。
ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成に必要なエネルギー源としては、生成を促すものであればいずれも用いることができるが、好適にはグルコースやフラクトースなどをあげることができる。これらエネルギー源は、通常１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において用いられる微生物の培地、培養物等を水性媒体として用いることができる。
【００５２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５３】
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
【００５４】
水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。
反応液中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１．エシェリヒア・コリ由来のＮーアセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子発現株の造成
Escherichia coli W3110(ATCC27325)株をカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
【００５６】
配列番号３記載のＤＮＡプライマーと配列番号４記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００５７】
上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、Escherichia coli W3110(ATCC27325)株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATAGENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０サイクル繰り返すことにより行った。
【００５８】
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（バイオ101社製）により１．２ｋｂの断片を回収した。ｐＵＣ１９ ＤＮＡ〔Gene, 33, 103 (1985)〕０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．７ｋｂの断片を回収した。
【００５９】
該１．２ｋｂおよび２．７ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて、ピルビン酸生産能を有するEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【００６０】
生育してきた形質転換体のコロニーより、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子ｎａｎＡを保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pTA3を取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドであるｐＴＡ３を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
【００６１】
実施例２．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で６時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００６２】
Escherichia coli NM522/pTA3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２５時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００６３】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に０．３４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００６４】
実施例３．エシェリヒア・コリ由来のＮーアセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子発現株の造成
Escherichia coli K235(ATCC13027)株をカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
【００６５】
配列番号５記載のＤＮＡプライマーと配列番号６記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６６】
上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、Escherichia coli K235(ATCC13027)株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATAGENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０サイクル繰り返すことにより行った。
【００６７】
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
【００６８】
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（バイオ101社製）により１．１ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ（WO98/12343）０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【００６９】
該１．１ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてホスホエノールピルビン酸生産能を有するEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【００７０】
生育してきた形質転換体のコロニーより、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子ｎｅｕＢを保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP18を取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子発現プラスミドであるｐＹＰ１8を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
【００７１】
実施例４．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で４時間培養した後、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。
該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００７２】
Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１９時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００７３】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１．４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００７４】
実施例５．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株を実施例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００７５】
Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株をグルコース ５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０． １ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ、およびビオチン ３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２５ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
【００７６】
該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。
該種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
【００７７】
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で６時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００７８】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に３．１ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００７９】
実施例６．シネコシスティス由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子発現株の造成
ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼのアミノ酸配列〔J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)〕をQueryとして、GenbankのBlast SearchおよびSynechocystis sp.(PCC6803)株のゲノム配列のデータベースであるCyanoBase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)において相同性検索（Similarity Search）を行った結果、該アミノ酸配列はrenin-binding proteinとの記載のあるSynechocystis sp.(PCC6803)由来の配列(slr1975)と高い相同性を示した。
【００８０】
Synechocystis sp.(PCC6803)株をJ. Gen. Microbiol., 111, 1 (1979)に記載の方法で培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した配列番号７および８に記載のＤＮＡをプライマーとして用いて、Synechocystis sp.(PCC6803)株の染色体ＤＮＡを鋳型として実施例１記載の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。
【００８１】
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
【００８２】
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（バイオ101社製）により１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００８３】
ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．２ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
【００８４】
該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより、Synechocystis sp.由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP16を取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＹＰ１６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
【００８５】
実施例７．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株を実施例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００８６】
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間培養した後、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。
該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００８７】
Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株を、実施例５記載の方法で培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Escherichia coli NM522/pTA3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００８８】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１．０ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００８９】
実施例８．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００９０】
Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１１時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００９１】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００９２】
実施例９．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００９３】
Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００９４】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に４．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００９５】
実施例１０．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００９６】
Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース １００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、アデニン ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２２時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてグルコース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００９７】
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１２．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。
【００９８】
【発明の効果】
本発明により、ピルビン酸などの高価な原料を添加することなくＮ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造できる。
【００９９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】はＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ発現プラスミドｐＴＡ３の造成工程を示す。
【図２】はＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ発現プラスミドｐＹＰ１８の造成工程を示す。
【図３】はＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ発現プラスミドｐＹＰ１６の造成工程を示す。
【符号の説明】
Ａｍｐr：アンピシリン耐性遺伝子
ＰL：ＰLプロモーター
ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー
Ｐlac：ｌａｃプロモーター
ｓｌｒ１９７５：Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子
ｎａｎＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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