(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ABG-Gly-D-Tyr-D-Lys(APC)-OH、ABG-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys (APC)-OH、[ABG-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(1/2DTPA)-OH]2からなる群から選択される抗体を放射性ヨウ素化するためのアミノポリカルボキシレート結合ペプチド複合物であって、
該ABGが抗体結合基であり、該APCがイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン−四酢酸、ジエチレントリアミン−五酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''−四酢酸、および1,4,7-トリアザシクロノナン−N,N',N''−三酢酸からなる群から選択されるアミノポリカルボキシレートであることを特徴とするアミノポリカルボキシレート結合ペプチド複合物。
【請求項２】
前記抗体結合基が４−（N−マレイミドメチル）−シクロへキサン−１−カルボニル部分であることを特徴とする、請求項1に記載のアミノポリカルボキシレート結合ペプチド複合物。
【請求項３】
前記Ｄ−リジン側鎖がアミド結合を介して前記アミノポリカルボキシレートのカルボン酸基に結合されることを特徴とする、請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート結合ペプチド複合物。
【請求項４】
前記Ｄ−リジン側鎖がチオウレア結合を介して１−（（４−ＩＴＣ）ベンジル）−ＤＴＰＡに結合され、該ＩＴＣはイソチオシアネート部分であることを特徴とする、請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート結合ペプチド複合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、放射免疫検出法と放射線免疫治療に使用される試薬の製造方法に関し、具体的には、in vivoにおける安定性を増大させ、主要部位における停留時間を延長させた放射性ヨウ素標識複合物の製造方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
放射性ヨウ素化モノクローナル抗体は、Amer. J. Med. 94: 297-312（1993）においてGoldenbergによって要約されているように、癌の診断と治療にとって重要である。このような用途のためのモノクローナル抗体とポリクローナル抗体に放射性ヨウ素を化学的に導入する数多くの方法がこの30年にわたって開発されている。タンパク質の放射性ヨウ素化に使用する化学的方法が比較的簡単であり、放射性ヨウ素は有用な物理的崩壊特性を有し、ヨウ素の同位体が購入可能なので、ヨウ素はこのような用途の放射性標識として好ましい。
【０００３】
有用なヨウ素同位体には、PentlowらのJournal of Nuclear Medicine, 37: 1557-62（1996）によって記載されている、放射性標識抗体に使用されているヨウ素-124、MartinらのCancer Investigation, 14: 560-71（1996）によって記載されている、術中プローブを使用した検出に使用されているヨウ素-125がある。これらのヨウ素同位体を使用することに関して、1つの懸念は放射性ヨウ素化抗体の循環時間が長いことであり、これによってバックグラウンドが高くなる。標準的な放射性ヨウ素化方法を使用するとき、高いバックグラウンドという問題は、標的細胞からの放射性ヨウ素の損失によってさらに悪化する。送達されたヨウ素の標的対非標的の比の悪さは、しばしば、高いバックグラウンドと放射性ヨウ素の損失の問題によって生ずる。従って、当分野の主要な目的は標的対非標的の比を改善することである。
【０００４】
Aronssonら、Nuclear Medicine and biology, 20: 133-44（1993）によって記載されているように、カスケードオージェ電子のために、ヨウ素-125は治療目的のために提案されている。明らかに、長寿命［t1/2、60日］の低エネルギー放射各種の最適な使用には、従来の放射性ヨウ素化方法では可能でない細胞内停留が達成されることが必要である。
【０００５】
癌細胞を標的にする抗体にヨウ素を結合するために種々の化学的方法が開発されている。これらの化学的方法はWilburのBioconjugate Chemistry 3: 433-70（1992）によって考察されている。最も一般的な結合方法は、細胞標的タンパク質の官能基と反応する求電子放射性ヨウ素種をその場所で製造することである。クロラミンTとヨードゲンなどの試薬は求電子ヨウ素を発生するために使用されている。タンパク質のチロシン基が通常ヨウ素化部位である。しかし、過酷な酸化剤または還元剤の存在により、細胞標的タンパク質の構造が損傷されることがある。このために、別の方法は小型の有機分子をヨウ素化し、ヨウ素化された種だけをタンパク質に結合することである。N-スクシニミジル3-（3-ヨード-4-ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ボルトン-ハンター（Bolton-Hunter）試薬）は後者の範疇の一例である。これらの方法と他の方法はWilburによって考察されている。
細胞標的タンパク質は、特定種類の細胞の表面を認識し、結合するタンパク質である。細胞標的タンパク質の一例は抗体であるが、主にある種の細胞種に結合する任意の他のタンパク質を使用することができる。
【０００６】
上記の放射性ヨウ素化方法を使用する場合の主要な欠点は、生体内脱ヨウ素現象である。生体内におけるタンパク質の内部移行とリソソーム処理の結果として、標識タンパク質は小型ペプチドに分解され、その放射性ヨウ素はヨードチロシン形態で、または低分子量ペプチド断片に結合したヨウ素として細胞から放出される。これらの所見はGeisslerらのCancer Research 52: 2907-2915（1992）とAxworthyらのJ. Nucl. Med. 30: 793（1989）によって報告されている。標的細胞からの放射性ヨウ素のこのような除去は、放射線診断と放射線治療へのヨウ素同位体の使用に重大な影響を与える。診断と治療に関連のある腫瘍と非腫瘍の識別と放射線治療に関連する腫瘍細胞上での長時間の同位体停留は生体内での脱ヨウ素化の発生によってかなり損なわれる。放射線免疫治療の検討に広範に使用されるヨウ素-131の8日の半減期を考慮するとこれは容易に認識される。例えば、この同位体で放射性ヨウ素化した抗体が代謝されて、結果として試薬の注射後最初の24〜120時間いないに標的細胞から同位体が除去される場合、長い半減期のこの同位体の治療に関する利点は失われる。すなわち、従来の放射性ヨウ素化の化学的方法の上記の欠点のために、有用な半減期のこの同位体が長時間の殺腫瘍作用に活用されない。
【０００７】
従来の化学的方法のこの欠点とは異なり、分子状ヨウ素の形態で細胞からヨウ素を放出する際のin vivoにおける脱ヨウ素酵素の作用は、放射性同位体蓄積に関する標的対非標的の比を最適化する問題に対してあまり重大ではない。WilburらのJournal of Nuclear Medicine, 30: 216-26（1989）によって考察されているように、研究者達はin vivoにおける脱ヨウ素酵素によって「脱ヨウ素化」しないヨウ素化タンパク質を製造することを試みている。しかし、これらの試みは、放射性ヨウ素の細胞内停留の改善を示していない。このような失敗の理由は、予想されたこととは異なり、無傷のヨードチロシンの代謝的クリアランスは、チロシンが脱ヨウ素化されて放射性ヨウ素を遊離する同位体のクリアランスより重要であるということである。
【０００８】
複合物からの許容できないほど速い放射性ヨウ素の放出を克服する1方法は、ヨウ素を代謝不可能な炭水化物に結合し、得られたものと抗体との複合物を形成することである。腫瘍細胞内でのタンパク質の異化作用後、放射性ヨウ素が炭水化物に安定に結合したままであり、従って細胞内に捕獲されている。「残存標識（residualizing labels）」と呼ばれるこれらの炭水化物標識は、StrobelらのArch. Biochem. Biophys 240: 635-45（1985）とAliらのCancer Research（suppl）50: 783s-88s（1990）によって抗体の場合に例示されている。しかし、モノクローナル抗体（Mabs）の標識化に適用する場合、これらの方法は以下の欠点の一方または両方を有する。それは、（1）非常に低い放射性ヨウ素化収率（3-6%）と（2）凝集物の形成（20%以下）である。複合体形成収率が低いと、タンパク質に十分量の放射性標識を導入するために大量の放射性ヨウ素を取り扱わなければならない。この方法により、放射能の安全性に関する懸念と大量の使用不可能な放射能廃棄物が生じる。結果として、この方法で得られる比活性が犠牲になる。さらに、凝集物の形成により腫瘍の取り込みが低下することがあり、肝臓での取り込みが増加し、それによって放射性標識方法の有効性が損なわれる。炭水化物に基づいた試薬を使用する場合、低い放射性標識収率と凝集物形成の二重の問題を小さくする進歩がなされない限り、放射免疫検出法と放射線免疫治療のための残存標識を使用する十分な利点が現実になり得ない。これらの問題に対処するために新規な基質と方法を使用することは、本発明の別の態様である。
【０００９】
この問題に対する周知の方法は、2官能性EDTAまたは2官能性DTPAなどの2官能性アミノポリカルボキシレートリガンドを使用して、インジウム-111またはイットリウムなどの放射性金属でタンパク質を標識することである。SteinらのCancer Research 55: 3132-39（1995）によってin vivoにおける動物実験で例示されているように、これらの放射性標識複合物は、腫瘍内での放射性金属の停留時間が長い。すなわち、アミノポリカルボキシレートとキレート形成した放射性金属イオンもin vivoにおいて残存標識として挙動する。このように、残存化の問題が、一般に、同様にこれらの標識を使用する技法に適応する。
【００１０】
従来技術は、ヨウ素化可能な基が結合した非代謝性糖を使用することによってヨウ素標識を残存化する問題に対処している。チラミンと糖自体との間に代謝可能なペプチド結合が存在しないように、チラミンなどのヨウ素化可能な基を還元反応によって炭水化物に結合する。これらの従来技術の方法には2つの大きな問題がある。これらはタンパク質結合段階に存在する。Strobelらの方法（上記参照）である、1方法はラクトースから誘導された炭水化物付加物を使用し、最初にガラクトースオキシダーゼでこの付加物のガラクトース部分を酸化することによって、タンパク質と抗体をこれに結合する。SteinらのCancer Research, 55: 3132-3139（1995）によって記載されているように、通常、全体の収率は低い（3〜6%）。さらに、ラクトースはガラクトースオキシダーゼの不十分な基質である。Avigadらの（J. Biol. Chem. 237: 2736-2743, （1962））は、この酵素によって酸化される能力についてガラクトース含有炭化水素誘導体を調査したとき、ガラクトースオキシダーゼに対してラクトースはD-ガラクトースの親和性の半分より少ない親和性しかなかったことと、ガラクトースと比較して酸化が50倍遅いこととのデータを得た。従って、この不十分な段階が抗体への放射性同位体導入の全体的な低さに寄与する。
【００１１】
抗体に結合する際に関係する別の方法は、（ガラクトース部分に関係するガラクトースオキシダーゼ酸化などの）酵素によって選択的に誘導化される炭化水素の能力などの任意の特別な特性を使用するのではなく、ヨウ素化した炭化水素とタンパク質とを結合するクロス-リンカーとしてシアヌル酸塩化物を使用する。この方法は、タンパク質凝集物を形成するという重大な問題を有する。
【００１２】
シアヌル酸塩化物は、複合物を形成するために使用されているが、残念なことに、この試薬は3つの反応性塩素を有し、その結果凝集物を形成する。凝集物形成に関与する別の因子は残存性薬剤またはカップリング試薬もしくはその両方、特に還元的アミノ化によってタンパク質に結合する炭水化物残存性薬剤と結合することができる抗体内に多数のアミノ残基が存在することである。このような多数の結合によって凝集物が形成され、製造後の複合物混合物の放射性標識の比活性が低くなる。従って、凝集物を形成しないカップリング剤が必要とされる。
【００１３】
［発明の概要］
本発明は、抗体などの細胞標的タンパク質を標識するために有用なヨウ素化可能な複合物の製造方法と組成物を提供することによって上記の問題を解決する。このために、アミノポリカルボキシレート、任意に置換されたヨウ素化可能なフェニル誘導体と細胞標的タンパク質を結合する官能基を含むアミノポリカルボキシレート複合物を提供する。本発明者らは、細胞内に残存させるのに必要な成分を有する3部系分子（three-part molecule）を実現した。この3部系分子は、放射性ヨウ素原子を受け取り、タンパク質と共有結合してタンパク質複合物を形成し、動物にタンパク質複合物を投与したときに、細胞内にヨウ素を残存させることに有用な複合物の化学的な主題クラス（chemical thematic class）として表示される。
【００１４】
この主題のクラスには、ヨウ素化可能な基が非代謝性ペプチド結合を介してアミノポリカルボキシレート単位に結合した2官能性ヨウ素化可能なアミノポリカルボキシレートが含まれる。付加物を放射性ヨウ素化し、モノクローナル抗体または抗体断片などの細胞標的タンパク質と複合物形成し、それによって残存標識を生物特異的細胞標的タンパク質に導入する。これらの2官能性付加物はタンパク質への高い導入性と標的細胞への残存標識の高い導入性という優れた特性を有することを本発明者らは発見した。
【００１５】
本発明は、さらに、残存性標識−タンパク質複合物の質を改善し（凝集性を小さくした）、それによってin vivoにおける標識の非標的での蓄積（特に肝臓への）を低下する第2の主題の化学的クラスの炭化水素系試薬に関する。
また、本発明は両主題のクラスの残存性放射性ヨウ素標識複合物と、モノクローナル抗体、その断片と構築物などのタンパク質を含む標的ベクターとの容易な結合に関する。
【００１６】
第1のクラスに関する一実施態様において、in vivoにおいて放射能が残存されるように、非代謝性で放射性ヨウ素化されたペプチドをタンパク質標識のために使用する。これらの特別に作製された親水性ペプチドは、好ましくは、分子量が500より大きい（すなわち、5アミノ酸残基以上）。さらに好ましくは、ペプチドは分子量が1000〜4000（10〜40アミノ酸残基）であるが、40より多いアミノ酸が許容可能である場合もある。本発明に関して本明細書において使用される親水性ペプチドは、ペプチドが、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンとアルギニンなどの荷電極性アミノ酸単位またはセリンとスレオニンなどの極性であるアミノ酸単位を有することを意味する。これらの残基の多数の親水性酸性基とそれらの非代謝性ペプチド結合が存在することにより、リソソームによるタンパク質異化後に放射性標識の残存が可能になる。アスパラギン酸などの酸性アミノ酸残基は本発明に関して最も好ましい。
【００１７】
D-アミノ酸は、ペプチドと細胞標的タンパク質との結合部位とチロシンまたはチラミンに結合された放射性ヨウ素との間にペプチドを有する。最も詳細には、この領域では、2つの隣接するアミノ酸はL-アミノ酸ではない。本発明に関して、グリシンはL-アミノ酸である。このようにD-アミノ酸を使用することによって、放射性ヨウ素をタンパク質に結合するペプチド結合はリソソームで加水分解されない。
【００１８】
別の実施態様において、ヨウ素化可能な基を含有する2官能性アミノポリカルボキシレート系は、最初に、ペプチドmerにおいて異なるように保護された2つのアミノ基と天然でないD-アミノ酸単位からなるペプチド単位を合成することによって製造される。アミノポリカルボキシレート単位を追加し、次いでタンパク質クロスリンカーを追加することによってアミノ基を逐次的に作り上げることにより2官能性アミノポリカルボキシレートの合成が完了する。ペプチドは1つ以上の天然でないD-チロシン単位を有する。ペプチドのアミノ酸単位は非代謝性アミド結合を介して結合される。タンパク質結合基は（Mabsの酸化型炭化水素との部位特異的結合のための）アミノ残基、（タンパク質のリジン残基に結合可能な）イミデートまたはイソチオシアネート、（Mabsのチオールに特異的な）マレイミド、ブロモアセタミドまたはヨードアセタミド残基等であってもよい。ペプチド中のアミノ酸単位の数は2〜10で、好ましくは3であり、このうち、少なくとも1つはD-チロシンである。最後のD-チロシン単位の直後で、タンパク質結合クロスリンカーを導入するために使用されるアミノ酸は天然のL-アミノ酸であってもよい。アミノポリカルボキシレート単位はイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸）、TTHA（トリエチレンテトラアミン六酢酸）、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカンN, N', N'', N'''-四酢酸）または数多くの他のアミノポリカルボキシレートおよび容易に予想することができるそれらの誘導体の中で、例えば、イソチオシアネートベンジル-EDTA/DTPA/TTHA/DOTAなどのそれらの種々の骨格置換体であってもよい。
【００１９】
さらに別の実施態様では、ヨウ素化可能な2官能性アミノポリカルボキシレートは、チラミン基とタンパク質結合基をアミノポリカルボキシレートに結合することによって誘導される。プロテアーゼ感受性結合はこれらの構造物には関与しない。または、細胞標的タンパク質結合単位で骨格置換されたアミノポリカルボキシレートを対応する二無水物に変換し、次いでD-チロシンと反応させ、2つのD-チロシン残基を含有するものを得る。2官能性アミノポリカルボキシレートとD-チロシンとの間のアミド結合はプロテアーゼによって認識されないので、これらは異なる形態の残存性ヨウ素標識を構成する。
【００２０】
これら3つの実施態様の主要な特徴は、ヨウ素化したD-チロシン部分は、脱ヨウ素酵素の作用を受けないということである。この可能性は、DumasらのBiochem. Biophys. Acta 293: 36-47（1973）によって記載されている。
別の実施態様において、アミノポリカルボキシレートは、非代謝性結合、すなわちリソソーム内で容易に加水分解されない結合を形成する第1のリンカーによってフェニル誘導体に結合される。フェニル誘導体は、有利なことに、少なくとも1つの放射性ヨウ素で誘導体化される。この誘導体はまた、放射性ヨウ素化に対する基質の反応性を高めるメトキシまたはヒドロキシ基などの別の残基でも誘導体化され得る。
【００２１】
フェニル誘導体は、第1のリンカー結合のパラ位の第2のリンカーにさらに結合される。この第2の結合はアミドまたはチオウレアなどの非代謝性結合を介して生ずる。第2のリンカーは、好ましくは、ε窒素がフェニル誘導体とチオウレア結合を形成するリジンアミノ酸残基である。ベンジル、アルキル、アシル、イソシアネートとイソチオシアネートなどの多数の他の結合単位がε-リジン基上で置換可能である。
第2のリンカーは、細胞標的タンパク質の残基に結合することができる部分を有する。このような部分の例はマレイミド、チオイソシアネート、イソシアネート、ハロゲン化メチレン、アミンとカルボキシルである。結合する細胞標的タンパク質残基の例はアミン、カルボキシルとスルフヒドラール（sulfhydral）である。カルボジイミドは、好ましくは、カルボキシルをアミンに結合するために使用される。細胞標的タンパク質のスルフヒドラール残基に結合するマレイミド部分を有する第2のリンカーが最も好ましい。
【００２２】
第2のクラスの炭化水素系残存標識の実施態様において、ガラクトース単位を有し、ガラクトースオキシダーゼで容易に酸化され得るジサッカライドを使用する。この実施態様は、メリビオースから誘導された製剤によって例示される。すでにタンパク質結合基を有する炭化水素系残存標識を製造する別の例が提供される。これに関するさらに別の態様は、ヨウ素化され、誘導体化された炭水化物と反応するためのヒドラジド付加抗体を使用することに関係する。
【００２３】
第2のクラスの別の実施態様では、タンパク質結合部分を有するようにすでに誘導体化されたシアヌル酸塩化物誘導体と放射性ヨウ素化した炭水化物を反応させる。
本発明の方法により、残存性ヨウ素標識によるタンパク質標識の効率がより大きくなる。本発明の方法はまた、凝集物の含量が低く、高品質で安定な放射性ヨウ素タンパク質複合製剤を提供する。他の目的と利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。
【００２４】
［詳細な説明］
本発明は、2つの化学的主題（chemical themes）を用いて、標識効率の低さと残存性の低さの問題を解決する。第1の化学的主題は、リソソーム酵素に対して安定な結合を介してフェニル誘導体にアミノポリカルボキシレートを結合することである。この主題を最初に詳細に説明する。第2の化学的主題は、少なくとも1つのカルボニル基とD-チロシンまたはチラミンを有するガラクトースの酸化型ジサッカライドを含む安定な酸化型ジサッカライド付加物である。第2の主題の酸化型ジサッカライドをその後に考察する。
【００２５】
第1の主題のクラスの複合物の有利な実施態様において、チロシンなどの誘導体化されたフェニル部分を含む1つ以上のアミノ酸にリジンを介してアミノポリカルボキシレートを直接結合する。他の有利な実施態様において、誘導体化したフェニル部分をアミノポリカルボキシレートに直接結合し、リジンをフェニル部分に結合する。リジンとフェニル誘導体との間のε-（4-p-チオウレアイルベンジル）結合が最も好ましい。
【００２６】
驚くべきことに、出願人は、本発明の主題により、少なくとも2つのペプチド−タンパク質結合部分を含むアミノポリカルボキシレート−ペプチド複合物を、in vivoにおいて優れた性能を発揮するほど高いレベルでタンパク質に導入することができることを発見した。2つのペプチド−マレイミド残基を有する複合物から製造されるタンパク質複合物製剤は目に見える沈殿を示さなかった。さらに、腫瘍の線量測定検討において、これらのタンパク質複合物は、1つのペプチド−マレイミド部分だけの残基で標識されたタンパク質複合物と比較して、かなり大きい残存性を示した。
【００２７】
本発明の化学的主題によるタンパク質複合物を製造し、細胞内でのタンパク質複合物の異化反応の結果、放射性ヨウ素が放出されないように放射性ヨウ素を導入した後に使用する。標的タンパク質を標識してタンパク質複合物を形成するのに好ましい複合物はD-アミノ酸を含有しない。ε-（4-p-チオウレアイルベンジル）-DTPA-リジンが最も好ましい。本発明の複合物はアミノポリカルボキシレートとフェニル誘導体を含有し、またL-リジンのε窒素との結合は非代謝性であるので、タンパク質複合物形態が細胞内へ流入した後に本発明の好ましい複合物は残存する。
【００２８】
他の好ましい実施態様において、複合物のベンゼン環は少なくとも1つのヒドロキシ残基またはメトキシ残基で置換される。この置換によりヨウ素化の効率がより高くなる。リジンの遊離アミノ基は、好ましくは、マレイミド残基に誘導体化され、この残基はタンパク質のシステインと反応することが好ましい。
別の好ましい実施態様は、ポリアミノカルボキシレート官能基とタンパク質反応性基との間にヨウ素化可能な部分をさらに導入する架橋部分である。この実施態様はポリアミノカルボキシレート間の非代謝性アミド結合を使用し、好ましくは、複合物をタンパク質に結合するマレイミド残基を有する。この実施態様のために、第1の結合単位は、芳香族環系の1つまたは2つの置換基によって求電子反応性を有する放射性ヨウ素化が可能な部分にさらに結合される。ヒドロキシまたはメトキシ残基は環系の求電子反応性を調節することが好ましいが、別の残基も周知である。芳香族環系は、ベンゼン環であることが好ましい。
【００２９】
芳香族環系部分は細胞標的タンパク質に結合されて、タンパク質反応性基を有する第2のリンカーを介してタンパク質複合物を形成する。第1のリンカーはタンパク質分解的消化に安定であり、好ましくは、D-アミノ酸を含む。第2のリンカーは、結合タンパク質と残存標識の複合物が標的細胞に流入し、細胞内のリソゾーム（lysozome）に流入するのに十分長い結合タンパク質に残存標識を結合する作用をする。従って、第2のリンカーは、任意に、L-アミノ酸の消化可能なペプチド配列を含んでもよい。
第1の主題による標識タンパク質のための複合物の1範疇はペプチドに基づいた新規なクラスの残存性複合物である。これらの残存性複合物は炭水化物に基づいたヨウ素標識を使用する際に遭遇される問題に対処する。
【００３０】
ペプチドに基づいた残存性複合物の使用は、天然でない他のアミノ酸に結合される天然でない1つ以上のD-チロシン単位からなるペプチドに関係する。これらのペプチドは、親水性を増すためにD-アスパラギン酸単位とD-グルタミン酸単位などの親水性アミノ酸を含有し、サイズは少なくともアミノ酸5残基であることが好ましい。これらのペプチドのアミノ末端残基はL-またはD-アミノ酸であってもよいが、ただし、L-アミノ酸の場合には、それは直接チロシンに結合されず、後のタンパク質との結合のためのタンパク質結合クロスリンカーに結合され得る。一旦放射性ヨウ素化され、タンパク質に結合されると、ヨウ素化されたペプチド単位は、関連タンパク質の結合および処理を介して細胞表面に結合されることにより細胞リソソーム内に残存される。非代謝性アミド結合、荷電アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基などの親水性アミノ酸残基並びにアミノ酸4残基より大きいサイズの存在は集合的にこのような残存性を可能にする。ペプチドのためのアスパラギン酸残基の使用は本発明に関しては最も好ましい。
【００３１】
複合物の構造は、ペプチドのカルボキシ末端にD-リジンを使用することによって変更されてもよい。この変更によって、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、トリエチレンテトラアミン六酢酸(TTHA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカンN, N', N'', N'''-四酢酸（DOTA）、1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N',N''-三酢酸（NOTA）等、並びにそれらのカルボキシルまたは骨格誘導体などの、アミノポリカルボキシレートを結合するためのε-アミン基を提供する。この実施態様において、カルボキシ末端のε-アミンとアミン末端のアミンは指定の位置にアミノ−ポリカルボキシレートとクロス−リンカーを結合するために異なるように保護される。ペプチドのD-アスパラギン酸は、任意に、他のアミノ酸で置換される。さらに別の変更は、チラミンなどの放射性ヨウ素化が可能な基とタンパク質結合部分を有する合理的なデザインのアミノポリカルボキシレート系である。
【００３２】
本発明の生成物は、タンパク質が内部移行され、処理された後の安定性を増強させる構造的な局面を処理する。腫瘍における放射性ヨウ素の停留時間を減少させるのはこのタンパク質処理であり、内部移行する抗体の場合ではさらに減少される。本発明者らは、アミノポリカルボキシレートとヨウ素化が可能なものに結合される非代謝性ペプチドテンプレートを作製することによってこの問題に対処する。タンパク質結合部分に結合されるD-チロシンに結合されるD-リジンにDTPAなどの極性基を結合することによって、プロテアーゼ抵抗性ペプチド結合の存在、親水性とサイズによってタンパク質処理後でもアミノポリカルボキシレート-D-リジン-［I-125］-D-チロシン部分の部分全体がリソソーム内に捕獲されていることを本発明は確実にする。これは、従来の放射性ヨウ素化タンパク質の異化物であり、容易にリソソームから逸脱し、腫瘍部位の放射能停留時間を減少させるヨードチロシンとは異なる。
【００３３】
放射性ヨウ素の残存を可能にする第２の化学的主題は、少なくとも1つのカルボニル基とD-チロシンまたはチラミンを有するガラクトースの酸化型ジサッカライドを含む安定な酸化型ジサッカライド付加物である。出願人らは、本発明の第２の化学的主題も、第１の主題と同様に、放射性形態の付加物が細胞内に残存するように、放射性ヨウ素原子で標識することができる付加物を提供することを見いだした。
細胞内に放射性原子を残存させるために酸化型炭水化物を使用する従来技術の方法により、標識タンパク質複合物が凝集することが多い。本発明の第２の主題による付加物を使用して作製したタンパク質−炭水化物複合物は2つの方法によって凝集物の形成を回避する。
【００３４】
第1の方法では、ガラクトース−含有炭水化物−チラミン（またはD-チロシン）付加物はさらにメリビオースを含有し、ガラクトースオキシダーゼによって酸化される。ガラクトースオキシダーゼに対するメリビオースの親和性はガラクトースの5倍高く、ガラクトースオキシダーゼに対する乳糖の親和性と比較して10倍高い。さらに、メリビオースはガラクトースとほぼ同じ速度で酸化される。結果として、炭水化物-チラミン（またはD-チロシン）付加物にメリビオースを含めることは、酸化段階で得られる全体的な処理収率を増加する。本発明の放射性ヨウ素化され、酸化された（ガラクトースオキシダーゼを使用した酸化）ジメリビイトールチラミンを使用したタンパク質の放射性ヨウ素化では18.7〜20.7%の全体的な導入率が達成された。これらの導入率は、放射性ヨウ素化し、酸化したジラクチトールチラミンを使用した同じタンパク質の放射性ヨウ素化で観察された収率より5〜10倍高い。
【００３５】
本発明の第２の主題による特に好ましい複合物は、ガラクトースオキシダーゼによって容易に酸化されるジメリビイトールチラミンである。さらに本発明は、本発明に関しては、タンパク質に付加される炭水化物の還元的結合段階の収率を増加させるヒドラジド付加抗体の使用に関係する。
【００３６】
本発明の酸化型炭水化物の場合の性能を改善するための第２の方法は、抗体などの標的タンパク質を複合物に結合してタンパク質複合物を作製するためにシアヌル酸塩化物を使用することである。シアヌル酸塩化物は2つ方法で使用される。それは、（1）より数が多いタンパク質の一次アミノ酸残基ではなく、好ましくは、カップリング剤と反応するタンパク質に1つまたは小数のより反応性のヒドラジド残基を導入することと、（2）タンパク質を残存性複合物に結合するためにシアヌル酸塩化物誘導体を使用することとである。本発明において使用されるように、非水性条件下で作製されたモノ置換シアヌル酸塩化物は、マレイミドなどのチオール反応性物を有し、チオール化したタンパク質に結合するために使用される。このシアヌル酸塩化物の第２の塩素は、チラミン残基のヒドロキシル基などのフェノール性ヒドロキシル基と反応するために使用されるが、チオール化タンパク質のチオール基は後の段階においてマレイミド基と反応する。第３の塩素は無反応性であり、要因ではない。従って、凝集物形成は少なくなり、作製された複合物の比活性は改善される。
【００３７】
両化学的主題による複合物は、タンパク質と共有結合を形成することができる官能基を介して細胞標的タンパク質に結合される。本発明に関するタンパク質官能基は、タンパク質のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基またはスルフヒドリルと反応することができる。マレイミドとスルフヒドリルシステイン残基を含む抗体タンパク質を含む複合物が最も好ましい。
本発明の一実施態様によると、ヨウ素の放射性同位体は非代謝的に基質に結合される。次いで、タンパク質の異化作用後、ヨウ素はリソソームの酸性環境内に捕獲される。腫瘍細胞などの標的細胞内の結果として得られる放射性ヨウ素の長時間の停留は標的器官線量測定と標的対非標的識別性の増加を容易にする。腫瘍標的に関しては、このような増加はより効率的な放射線診断と放射線治療を可能にする。
【００３８】
［定義］
以下の説明において数多くの用語が広範に使用される。本発明の理解を容易にするために本明細書において定義を示す。
リン酸緩衝液：本明細書において使用される「リン酸緩衝液」は、pH 6.0〜7.5に調節された0.1 Mリン酸ナトリウム水溶液をいう。
【００３９】
ヨウ素標識可能なフェニル誘導体：本明細書において使用される「ヨウ素標識可能なフェニル誘導体」は、求電子性ヨウ素化試薬による置換に対してそれを活性化する電子供与性置換体を有するベンゼン環である。このような置換体には、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシル基とアミン基が含まれることが好ましい。ヨウ素置換可能なフェニル誘導体には、例えば、チロシン、チラミンと他のフェノール性化合物、アニリン、アニソール等が含まれる。
【００４０】
複合物：本明細書において使用される「複合物」は、化学的主題1または主題2のどちらかによるタンパク質標識分子をいう。複合物は細胞標的タンパク質に共有結合され、放射性ヨウ素は、タンパク質複合物の形成の前に複合物に導入される。タンパク質複合物は、細胞内流入し、タンパク質複合物のタンパク質部分の分解の結果により残存する。
【００４１】
細胞標的タンパク質：本明細書において使用される「細胞標的タンパク質」は、望ましい種類の細胞に対する親和性を有するタンパク質である。このタンパク質は、一般に、高い親和性で、すなわち非標的細胞と比較して少なくとも10倍の親和性で標的細胞の表面に結合する。細胞標的タンパク質は本発明の複合物と共有結合して、タンパク質複合物を形成する。多くの場合、細胞標的タンパク質は抗体であるが、例えばレクチンのような他のタンパク質とペプチドホルモンも使用できる。
【００４２】
抗体：本明細書において使用される「抗体」は細胞標的タンパク質の一形態のであり、ネズミ類などのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、並びにそれらの抗原結合断片を含む。このような断片は、完全な抗体のFc断片を欠損したFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2を含む。このような断片はまた軽鎖可変領域である単離された断片、重鎖と軽鎖の可変領域である「Fv」断片、（sFv'）2断片（例えば、TaiらのCancer Research Supplement, 55: 5983-5989, 1995）と軽鎖と重鎖可変領域にペプチドリンカーが結合した組換え1本鎖ポリペプチド分子を含む。
【００４３】
タンパク質複合物：本明細書において使用される「タンパク質複合物」は、「細胞標的タンパク質複合物」とも呼ばれ、少なくとも1つの残存性複合物と細胞標的タンパク質を含む分子である。少なくとも1つの放射性ヨウ素原子を含有する完全な細胞標的タンパク質複合物は、例えば、抗体部分が残存性複合物との複合体形成前の結合と比較して、複合体形成後にほぼ同じかまたはごくわずかにだけ低い抗原結合能力を有する抗体のような標的タンパク質の免疫反応性を保持する。
【００４４】
残存性複合物：本明細書において使用される「残存性複合物」は、タンパク質に共有結合され、担体タンパク質の分解後にリソソームまたは他の細胞内コンパートメント内に捕獲されるように作製されている、主題1または主題2のどちらかによる放射性標識複合物である。一般に、残存性複合物は、それ自体はリソソーム内で容易に分解されない分子から合成される。一般に、これらのトレーサーは放射性炭水化物またはDTPAなどのアミノポリカルボキシレートの金属キレートであった。
【００４５】
任意の非代謝性炭水化物が本発明にとって好適である。ジメリビイトールチラミン（DMT）とメリビイトールチラミン（MT）はこの範疇の一部の例である。単独またはD-チロシンを付加した基質としての2官能性DTPA（またはEDTA）はアミノポリカルボキシレートの範疇を例示する。
【００４６】
本明細書に使用される「凝集物」は、望ましいタンパク質複合物以外に少なくとも1つの余分なポリペプチドを含む分子複合体である。余分なポリペプチドは共有手段によってタンパク質複合物に直接または間接的に結合される。凝集物の例は抗体タンパク質のダイマー、トリマーと他のマルチマーである。1抗体あたり2つ以上の残存性標識を含む巨大分子複合体は、残存性標識による抗体の過剰な標識によって、抗体の結合活性が低下する場合には、凝集物と考えられる。しかし、多数の残存性標識による細胞標的タンパク質の標識は、しばしば、作製後の抗体複合物の比活性を増す手段として望ましい。
本発明を使用する第１の化学的主題の4つの実施態様を以下のスキームI〜IVに示す。第２の化学的主題の３つの実施態様を以下のスキームV〜VIIに示す。
【００４７】
［スキームI］
ABG-[CL]-AA-[（D）-AA]m-[（D）Tyr]n-（D）-Lys-OH （式中、mとnは各々整数で、m＋n＝4-40であり、AAはアミノ酸であり、DはD-アミノ酸を示し、CLはクロスリンカーであり、ABGは抗体結合基である）。
1つ以上のD-チロシン残基、D-アスパラギン酸などの1つ以上の親水性アミノ酸と他のアミノ酸を含有するペプチドの作製は樹脂を使用することによって実施される。Fmoc保護された第1アミノ酸（任意に、D-リジンと示す）は、そのカルボキシル末端を介して、クロロトリエチル−塩化物樹脂などの樹脂支持体に固定される。ペプチドはアミノ酸の逐次的な追加によって作製され、各アミンはFmoc基によって保護され、カルボン酸は活性化される。各アミド結合を形成した後、Fmoc基を除去する。この除去によって、次のカルボキシル活性化され、Fmoc保護されたD-アミノ酸との結合が可能になる。ペプチドの集成はこのように順方向手法である。固相支持体から最終的なペプチドを遊離した後、アミン末端を好適なヘテロ2官能性またはホモ2官能性クロス-リンカーに結合する。これらのクロス-リンカーの多くは市販品を購入可能である。ペプチドの親水性を増すために、アスパラギン酸などの1つ以上の親水性アミノ酸を導入する。このように形成されたペプチドは5アミノ酸の最小サイズである。本発明により作製された代謝的に安定なD-チロシン含有親水性ペプチドは残存性ヨウ素標識として有用である。
（訂正の理由１）
原文第１７頁上から第１９行（空行は数えない）に、
0003965019.tif 000002
とあるのを、誤訳訂正前の翻訳文においては、
「本明細書において使用される「抗体」は細胞標的タンパク質の一形態のであり、ムリンなどのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、並びにそれらの抗原結合断片を含む。」
と訳出しておりました。出願人の過誤により、「murine」を「ムリン」と訳出していたものです。
用語「murine」は、小学館ランダムハウス英和大辞典（小学館発行、小学館ランダムハウス英和大辞典編集委員会編集、昭和５５年３月１５日第４刷）の第１６９０頁によれば、「ネズミ（ハツカネズミを含む）：ネズミ科またはネズミ亜科のげっ歯類動物の総称」とあり、本発明において、そのようなげっ歯類動物の総称を表すものとして用いるものであります。その発音記号（訂正の理由１の説明に必要な資料をご参照ください）から、「ミューリン」と読み、同様に上記の意味を表す用語として用いることはあっても、「ムリン」と読むことはなく、「ムリン」ではかかるげっ歯類動物の総称を意味することはないものと考えられます。
そこで、その部分を、
「本明細書において使用される「抗体」は細胞標的タンパク質の一形態のであり、ネズミ類などのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、並びにそれらの抗原結合断片を含む。」
と訂正しました。
（訂正の理由２）
原文第１９頁上から第３行（空行は数えない）に、
0003965019.tif 000003
とあるのを、誤訳訂正前の翻訳文においては、
「式中、mとnは各々整数で、m＋n＝-40であり、」
と訳出しており、出願人の過誤により数値範囲の一端である「4」が訳出されておりませんでした。
そこで、その部分を訳出し、
「式中、mとnは各々整数で、m＋n＝4-40であり、」
と訂正しました。
【００４８】
［スキームII］
【化１】
0003965019.tif 000004
上記主題の一形態は、カルボキシル末端にD-リジンを含有し、このリジンのε-アミノ基を例えばEDTA、DTPA等などのアミノポリカルボキシレートに結合するペプチドを作製することである。スキームIIに示す一般構造において、mは0、1または2の値を有する整数である。ペプチド部分において、文字DはDアミノ酸を示し、AAはアミノ酸を示し、nは2〜40の整数である。ここではグリシンと示されているアミン末端は、抗体結合基ABGの末端であるクロス-リンカーCLに結合される。後者は、マレイミド、ハロアセタミド、イソチオシアネート、スクシンイミドエステル、イミデートエステル等などの任意のタンパク質結合基であってもよい。アミノポリカルボキシレートの置換体Rは水素またはペプチド部分が結合可能である4-イソチオシアネートベンジルなどの基である。DTPAの結合様式は、例えば、D-リジンのε-アミンとDTPA二無水物との反応によるアミド結合（上記の構造に示すように）を介し、またはイソチオシアネートベンジルDTPAとのイソチオウレア結合（ペプチドがRに結合されている）を介する。DTPAとリジンのε-アミンとの間のアミド結合またはイソチオウレア結合がリソソーム中では不活性（非代謝性）であることは、FrananoらのNucl. Med. Biol. 21: 1023-34（1994）他の研究から周知である。例えば、金属キレート形成物としてのDTPAなどのアミノポリカルボキシレートを介してインジウムまたはイットリウムによって放射性金属標識された抗体が残存されることも周知である。この現象は、Steinら（上記参照）等によって明らかにされているように、金属キレートの親水性並びにその荷電と分子量によるものであり、それらは全てリソソームコンパートメント内の残存性に寄与する。本発明は、残存性ヨウ素標識を作製する一方法として、ヨウ素化が可能で非代謝性であるペプチドテンプレートにアミノポリカルボキシレートを使用する。このためには、D-チロシンを結合することによってアミノポリカルボキシレートに結合されるD-リジンがアミノ末端に作製され、それによって全体的に不活性な付加物が作製され、ヨウ素化されて、前記ペプチドのアミン末端のクロス-リンカーを介して抗体に結合されると、残存性の放射性ヨウ素が形成される。放射性ヨウ素標識され、リンパ腫抗体LL2に結合されると、生成物は、インビトロにおいてリンパ腫細胞系統に対する停留時間と従来の方法で放射性ヨウ素標識された同抗体と比較した停留時間の延長に関して、インジウム-111で標識した同抗体に類似する（例−５を参照）。
【００４９】
この範疇のペプチドは、手動式で、または自動式ペプチド合成装置を使用して固相支持体に容易に合成することができる。アミノ酸単位の数は2〜40であってもよく、ただし、DTPA結合アミノ酸はD-リジンまたはD-アルギニンまたはD-オルニチンであり、また、このアミノ酸は直接D-チロシンに結合される。ペプチドが（比活性を増大させるために有用である）多数のD-チロシンを含有する場合、各チロシンはD-アミノ酸に結合される。ペプチドのアミン末端はL-アミノ酸またはD-アミノ酸であってもよく、抗体に結合するためのクロス-リンカーに結合される。
【００５０】
［スキームIII］
【化２】
0003965019.tif 000005
スキームIIIに示す反応列において、DTPAなどの置換アミノポリカルボキシレートが放射性ヨウ素を抗体に結合するために使用される。4-ニトロベンジルDTPA（n=0、1、２であるスキームIIIの左の構造）などの骨格置換DTPAが合成の理論的な出発点である。二無水物がニトロベンジルDTPAから製造され、DMSOまたはDMF中で塩基性で非水性条件下でD-チロシンで開環される。この基質のニトロベンジル基は、触媒的2段階水素化方法とチオホスゲンとの反応においてイソチオシアネートベンジル基に容易に変換される（生成物の構造は示していない）。この基質を最初に放射性ヨウ素化し、次いでpH8〜9で抗体に結合する。出発材料として二官能性DTPAによって例示されるが、この方法は、出発材料として二官能性EDTAまたは二官能性TTHAの使用に適用できる。
【００５１】
［スキームIV］
【化３】
0003965019.tif 000006
別の方法において、チラミンと細胞標的タンパク質結合部分がアミノポリカルボキシレート構造単位の一部を形成する。これは、示した反応スキームの二官能性構造物N,N-ビス（カルボキシメチル）-N'-[2-（p-ヒドロキシ-フェニル）エチル]-2-[p-イソチオシアネートベンジル]エチレンジアミンAとBによって例示される。簡単に説明すると、合成は、最初に、例えば、還元剤としてボランを使用することによってカルボキシル基をアルコールに還元し、次に、ジアルキル化し、DMSO中で塩化オキサリルを用いたスロアン（Sloan）酸化を介してアルコール基をアルデヒドに酸化し、次にチラミンに還元カップリングし、最後に、ニトロベンジル基をイソチオシアネートベンジル基に変換することによって、4-ニトロフェニルアラニンに細工をする（elaborating）ことに関係する。これらの残基を最初に放射性ヨウ素化し、次いで抗体のリジン基またはチオール化した抗体に結合する。製造された複合物中に塩基性アミノ酸およびカルボン酸基が存在することは、リソソームの酸性環境内での残存性を助ける。
【００５２】
［スキームV］
【化４】
0003965019.tif 000007
スキームVに示す反応列において、1つ以上のチオール基が、例示した2つの方法の一方によってモノクローナル抗体（Mab）などの細胞標的タンパク質内に導入される。第1の方法では、ジチオスレイトール（DTT）などのジスルフィド結合還元剤が、重鎖のジスルフィド結合の部分切断または完全な切断を実施する。または、1つ以上のチオール基がリンカーを用いて導入される。GovindanらによってBioconjugate Chemistry,7: 290-297,（1996）に記載されているように、スクシニミジル2-[N-（3'-メチル-3'-チオアセチル）ブタミジル]アセテート(１)などの保護された第三級チオールが好ましく、次いで、そのチオエステルをヒドロキシルアミンで切断する。
【化５】
0003965019.tif 000008
【００５３】
例えば、4-[4'-N-マレイミジル]-フェニル]ブチリルヒドラジン（MPBH、2）または4-（N-マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシヒドラジド（M2C2H、3）のようなマレイミド／ヒドラジドに複合物を使用して、得られたチオール化抗体をヒドラジドに結合する。
【化６】
0003965019.tif 000009
【００５４】
最後に、例えばガラクトースオキシダーゼによる酵素反応によって酸化されている例えば、ジメリビイトールチラミン（DMT、4）のような放射性ヨウ素化された炭水化物にヒドラジドを結合する。
【化７】
0003965019.tif 000010
この酸化された炭水化物は、任意に、還元アミノ化反応によってさらに安定化されて、放射性ヨウ素化されたDMT-Mab-複合物を形成する。
【００５５】
本発明の一利点は、リジン由来のものなどの単純な一級アミンから形成された酸化型炭水化物のシッフ塩基付加物とは異なり、本発明によるヒドラゾン複合物は、安定化のために、イミン（ヒドラゾン）官能基の還元を必要としないことである。ヒドラゾンは生理的条件下で加水分解されないが、シッフ塩基ははるかにより容易に加水分解される。
【００５６】
［スキームVI］
【化８】
0003965019.tif 000011
スキームVIに示す反応列において、例えば、DMTのような酸化型炭水化物は、例えばMPBH（2）またはM2C2H（3）のようなマレイミド／ヒドラジド複合物とカップリングしてマレイミドジメリビイトールチラミンを形成する。または、最初に2-アミノエチルカルバメートを酸化型ジメリビイトールチラミンまたは酸化型メリビイトールチラミンに結合し、次に残存する一級アミノ基を脱保護して、さらにマレイミドに変換することによってマレイミド基を導入する。チラミン残基はこの反応の前または後にヨウ素化される。上記の2つの方法の一方によって1つ以上のチオール基を細胞標的タンパク質に導入する。最後に、マレイミドを抗体に結合して、安定な放射性ヨウ素DMT-抗体複合物を形成する。
【００５７】
過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸塩を用いた酸化は炭水化物にアルデヒド官能基を形成することができるが、隣接する炭素原子に結合された2つ以上のケト基またはヒドロキシル基を含有する複合物はこれら2つの炭素の間で切断する傾向がある。過ヨウ素酸塩酸化は広範な異性体形成を生ずることがあり、また炭水化物鎖の分解を生ずることもある。これらの理由のために、他の構造変化を生ずることなく、1つのアルデヒド官能基を炭水化物に導入することができるガラクトースオキシダーゼなどの酵素を用いて炭水化物を酸化することが好ましい。
【００５８】
［スキームVII］
【化９】
0003965019.tif 000012
スキームVIIの反応列は、シアヌル酸二塩化物の塩素の置換を介した、DMT（4）またはMTなどの放射性標識チラミン炭水化物と置換シアヌル酸塩化物（CC）とのカップリングを示す。シアヌル酸塩化物の第１の塩素は非常に反応性で、モノ置換CCの第2塩素は幾分反応性が低いが、ジ置換CCの残りの塩素は比較的無反応性である。有利な一実施態様によると、モノ置換CCは非水性条件下で等モル量のCCとマレイミド含有アミン、例えばモノ置換CC類似物（CC類似物5、以下）から製造される。
【化１０】
0003965019.tif 000013
【００５９】
上記のモノ置換CCから、1つだけの塩素がI-125-DMTなどの放射性ヨウ素化された炭水化物との反応に容易に利用される。さらに、チオール反応性であるマレイミド基はその後チオール化された抗体と結合することができる。マレイミドに対するチオールの反応性の高さにより、抗体アミンとDMT-誘導体化CCとの遅延反応によって生ずる低収率と凝集の問題が解消される。
【００６０】
ヨウ素-125（I-125）放射性同位体がスキームI〜VIIに示す実施態様を例示しているが、本発明の方法は任意のヨウ素同位体に適用可能である。I-123は腫瘍の画像診断に使用するのに特に好ましく、ヨウ素-131（I-131）は腫瘍の治療に使用するのに特に好ましく、I-125は、例えば、術中、血管内または内視鏡的手法のための腫瘍縁の短時間検出に好ましい。
【００６１】
本発明のペプチドまたは炭水化物への放射性ヨウ素の導入は求電子置換反応によって実施される。この反応は迅速で、希薄な放射性ヨウ素溶液中でのカップリングを可能にする。反応は、一般に、ヨウ素イオンを酸化して、求電子放射性ヨウ素化試薬を形成することを必要とする。ハライドイオンを酸化するための方法は当技術上周知であり、Wilbur（上記を参照）によって記載されている。本発明はヨウ化ナトリウム／ヨードゲン組み合わせを例示しているが、本発明の方法はこの試薬の組み合わせに限定されない。
置換シアヌル酸塩化物の反応は、好ましくは、中性pHで実施される。中性pHはpH 4.5〜pH 9.5の間のpHと定義される。pH 6〜pH 8の中性pHが本発明には特に好ましい。
【００６２】
多数の異なる種類のマレイミド-ヒドラジドが周知であり、当業者によって製造されることができ、本発明に好適である。上記に示す2種のマレイミド-ヒドラジド（2）と（3）が特に好ましい。他のマレイミド-ヒドラジドはマレイミドN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルから合成することができる。本発明の目的に有用な代表的なマレイミド-エステルは、3-マレイミド安息香酸N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル、β-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル、4-（N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボン酸3-スルホ-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルとβ-マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００６３】
腫瘍細胞表面マーカーに特異的な任意の抗体が本発明に有用である。この抗体は、好ましくは、特定の細胞種に対する親和性を有し、抗体の標的作用が腫瘍の画像診断または腫瘍の治療のために放射性ヨウ素を送達することを可能にする。SteinらのCancer Research50: 1330-36（1990）によって記載されているRS7などの内部移入性パンカルシノーマ（pancarcinoma）抗体、Pawlak-ByczkowskaらのCancer Research49: 4568-77（1989）によって記載されているLL2などの内部移入性リンパ腫抗体とHansenらのCancer Research71: 3478-85（1993）によって記載されているImmu-14などの抗癌胎児性抗原抗体が特に好ましい。ここでは3つ文献の全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。キメラ抗体、ヒト化抗体とヒト型の抗体並びに抗体断片も好ましい。
【００６４】
本発明の方法はスルフヒドリル含有一価抗体、例えばFab-SHまたはFab'-SHをカップリングするのに特に好ましい。その理由は、それらは、例えば、システイン、ジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール、ジチオナイト等のような適当な従来のジスルフィド還元剤を用いて二価F（ab）2またはF（ab'）2断片の還元切断によって作製することができるからである。還元は、好ましくは、pH 5.5〜9.5、好ましくは6.0〜6.8、さらに好ましくは6.1〜6.4で、例えばクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはリン酸緩衝液中で、有利には、不活性ガス雰囲気中で実施される。還元反応はより高いpHではより速いが、再酸化もより速い。還元反応は適当に早いが、チオール還元剤とジスルフィドの混合物の形成を含む再酸化が無視できるほどである最適なpHを選択する。免疫グロブリンタンパク質内の鎖内ジスルフィド結合を主に還元するように注意を払わなければならない。還元条件は各々個々の場合について最適化しなければならない。
【００６５】
二価抗体断片の切断は、例えば、FabまたはFab'断片が最適な程度に形成されるが、軽−重鎖切断を最小にするように条件を調節したサイズ排除HPLCによってモニターすることができる。サイジングゲルカラムの溶出液を直接使用してもよく、またはFab-SHまたはFab'-SH溶液を低温、例えば冷蔵庫内で、数日から数週間の間、好ましくはpH 3.5〜5.5、さらに好ましくはpH4.5〜5.0において、有利には窒素またはアルゴンのような不活性ガス雰囲気下において保管してもよい。
【００６６】
スキーム1、2と3のカップリング反応に好適な時間、温度、イオン強度、pH等の最適な反応条件は、最小回数の実験によって決定することができる。実際、本発明の主要な一利点は、マレイミドとのカップリング反応と置換シアヌル酸二塩化物とのカップリング反応が中性pHで容易に生ずることができることである。反応温度とイオン強度は同様に重大ではない。重要な考慮点は、使用する特異的抗体を変性させるような極端な反応条件を選択しないことである。
【００６７】
本発明は、例示的な例を参照して以下にさらに説明される。
［例］
例1〜10は、アミノポリカルボキシレートをリソソーム酵素に安定な結合を介してフェニル誘導体に結合する第1の化学的主題の実施態様である。例11〜18は、少なくとも1つのカルボニル基とD-チロシンまたはチラミンを有する、ガラクトースの酸化型ジサッカライドを含む酸化型ジサッカライド付加物の第2の化学的主題の実施態様である。
【００６８】
［例1.  （BOC）Gly-D-Tyr-（O-t but）-D-Lys-OHの製造］
Fmoc-D-リジン（Aloc）[0.325g; 0.72 mmol]を5mlの無水ジクロロメタン（CH2Cl2）に溶解し、0.55mlのジイソプロピルエチルアミン（DIEA）と混合する。次いで、この溶液を20mlのバイアル中の0.5gの2-クロロトリチルクロライド樹脂に添加し、内容物を18時間激しく振とうする。混合目的のためにスラリーに窒素を通気するため、またはカラムから溶液を排出し、樹脂をカラムに残すために使用することができるフリットと3栓ストップコックを取り付けたカラムアセンブリーに赤色のスラリーを乗せる。溶液を排出し、樹脂を40mlのCH2Cl2：MeOH：DITA（17：2：1）で3回洗浄し、40mlのCH2Cl2で3回洗浄し、40mlのDMFで2回、40mlのCH2Cl2で2回と40mlのMeOHで2回洗浄する。窒素気流下で樹脂を乾燥する。1：1（v/v）CH2Cl2-DMFに5%ピペリジンを加えたもの40mlを添加して10分間放置することによってFmoc基を切断し、溶液を排出し、続いてCH2Cl2-DMFに20%ピペリジンを加えたもので15分間切断する。これに続いて、40mlのDMF、40mlのイソプロパノール（IPA）、40mlのNMP（N-メチルピロリドン）、40mlのIPAと4×40mlのNMPを用いた洗浄サイクルを実施する。次いで、樹脂を1.8 mmolの活性化Fmoc-D-チロシン（O-t but）と40分間反応させる。活性化は、0.827 g（1.8 mmol）のFmoc-D-tyr（O-t but）、0.269gのHOBTを4mlのNMPに加えたものを使用して、透明な溶液に0.31mlのジイソプロピルカルボジイミド（DIC）を添加し、周囲温度で20分間放置することによって実施される。この期間後、3.6mmol（0.62 ml）のDIEAを添加し、反応を25分間継続する。Fmoc切断と洗浄順序の後に、上記のように洗浄順序を実施する。活性化BOC-グリシン（0.376gすなわち3mmolのBoc-グリシンから誘導）を使用した第2のカップリングを同様の方法で実施する。0.1547gのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）をCH2Cl2（40 ml）：AcOH（2 ml）とDIEA（5 ml）の混合物に加えた溶液を使用し、次に5mlのトリブチルチンハイドライドを添加することによってAloc基を除去する。通常の洗浄順序を実施した後、10mlの酢酸：トリフルオロエタノール-CH2Cl2（1：1：8v/v）を用いてペプチドを樹脂から切断する。切断したペプチド溶液を濃縮して、表題の複合物0.25gを得た（粘着性生成物）。この生成物は、m/e 523にM+Hピーク（陽イオンモード）を示し、m/e521にM-H（陰イオンモード）を示す分析用逆相HPLCエレクトロスプレー質量スペクトルで保持時間7.10分のピークを1つ示した。
【００６９】
［例2.  Gly-D-Tyr-D-Lys（ITC-Bz-DTPA）-OHの製造］
段階-１の生成物0.053g（0.1 mmol）を水-ジオキサン中でITC-Bz-DTPA（80% DTPA含量のものを81mg、20%過剰）と混合し、pHを8.5に調節する。溶液を37℃（浴）において2.5時間インキュベーションする。さらにITC-DTPA（41 mg）を添加し、pHを8.56に再調節する。次いで、溶液を同じ温度において2時間インキュベーションする。水（0.1%TFA）/90%アセトニトリル-水（0.1%TFA）の濃度勾配溶出を使用した逆相カラムでの分取用HPLC精製により、無色の固体として30 mgの（BOC）Gly-D-Tyr（O-tbut）-D-Lys（ITC-Bz-DTPA）-OHが得られる。分析用逆相HPLCは保持時間7.54分のピークを1つ示す。質量スペクトル分析はm/e1063にM+Hピーク（陽イオンモード）とm/e1061にM-Hピーク（陰イオンモード）を示した。次いで、材料をTFA/CH2Cl2/アニソールの混合物で1時間処理し、BOC-とTyr（O-tbut）保護基を切断する。反応混合物をエチルエーテルに添加することによって表題の複合物を沈殿させる。HPLCの保持時間は5.31分であった。質量スペクトル分析は907にAN M+Hピークと906にAN M-Hピークを示した。
【００７０】
［例3.  （MCC）Gly-D-Tyr-D-Lys（ITC-Bz-DTPA）-OHの製造］
実施例-２の生成物0.025ｇ(0.0138mmol)を0.1 Mリン酸ナトリウムpH 7.0の0.5mlに溶解する。これに、0.03gの市販のスルホスクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-1-カルボキシレート（SMCC）を添加し、pHを7.17に上昇させる。透明な溶液を1時間撹拌する。実施例-1と同じ濃度勾配溶出を使用した分取用逆相カラムでの分取HPLCにより、0.054gの表題の複合物[ここで、MCCは4-N-マレイミドメチル]-1-カルボニル部分を示す]を得る。精製後の材料の保持時間（分析用RPカラム）は6.36分である。エレクトロスプレー質量スペクトル分析はm/e1126にM+Hピークとm/e1124にM-Hピークを示した。
【００７１】
［例4.  例3の生成物の放射性ヨウ素化、DTT-還元型モノクローナル抗体IgG[LL2]との複合物形成とDTT-還元型モノクローナル抗体IgG[RS7]との複合物形成］
ヨードゲンヨウ素化方法によって、実施例-３の生成物10ナノモルを1.72mCiのI-125-ヨウ化ナトリウムで放射性ヨウ素化する。標識した基質を第2のバイアルに移し、60nmolの4-ヒドロキシフェニル酢酸で処理し、次に予め、ジチオスレイトールで還元して、抗体の1つ以上の鎖内ジスルフィド結合の還元によってチオール基を形成しておいた0.6mgの抗リンパ腫抗体[LL2]と反応させる。1〜2時間の反応後、溶液をテトラチオネートナトリウム中で5mMにし、5分間インキュベーションし、0.1Mリン酸ナトリウムpH 7中でSephadexTMの50/80の遠心処理済みサイズ排除カラムで精製する。カラムに乗せた放射能量に基づいて、抗体結合材料の放射能の回収率37.4%が得られ、HPLCを介したサイズ排除クロマトグラフィーによって求めたとき、純度95%であった。この手法で得られた比活性は0.94 mCi/mgである。
【００７２】
この方法の一形態において、実施例-３の生成物10nmolを、酸化体としてクロラミンTを使用して、2.24 mCiのI-125ヨウ化ナトリウムで1〜2分間放射性ヨウ素化する。未使用の活性ヨウ素を4-ヒドロキシフェニル酢酸で中和し、ヨウ化カリウムで希釈し、0.5mgのDTT-還元型LL2と15〜40分間反応させる。検討とクロマトグラフィーは上記のようである。これにより、41%〜43%の全体収率が得られ、最終的な比活性は1.98〜2.09mCi/mgの範囲である。
【００７３】
例３の生成物（10 nmol）を酸化体としてヨードゲンを使用して1.46 mCiのNaI（I-125）で放射性ヨウ素化し、放射性ヨウ素化した材料をDTT-還元型RS7（0.5 mg）と複合物形成する。全体的な収率29.3%（精製後）で最終的な比活性1.0 mCi/mgが得られる。分析用SEC HPLCでの精製後の材料の分析は抗体に結合した>98%の放射能を示す。
【００７４】
［例５．  in vitroにおける結合実験］
例４の精製物を、37℃で維持した滅菌インキュベーターでラージ細胞（Raji cell）（ダルベッコ（Dulbecco）のダブルイーグル培地中106細胞/ml）と共にインキュベーションする。2時間後、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清の溶液を棄却する。細胞を冷却した培地で3回洗浄する。洗浄後の細胞を新鮮な培地に懸濁させ、インキュベーターに入れる。種々の経過時において、既知量の細胞懸濁液を取り出し、ペレット化し、細胞ペレットに結合している放射能を求める。対照実験はクロラミンT手法によって直接標識した同抗体（陰性対照）またはIn-111を用いて標識した同抗体（In-111アセテートで実施例-3の生成物を標識し、次に陽性対照としてDTT-還元型LL2と結合することによる）を使用することに関係する。実施例-４の生成物は、直接放射性ヨウ素化したLL2と比較することによって、より長時間ラージ細胞と結合していることが見いだされた。この停留時間はラージ細胞上でのIn-111の停留時間と一致する。[最初に結合したcpmの保持%：I-125標識LL2：94.7%（2時間）、63.8%（26時間）、51.1%（48時間）と35.4%（120時間）；In-111標識LL2：89.2%（2時間）、68.1%（26時間）、49.8%（48時間）と34.1%（120時間）。
【００７５】
同様の様式で、本発明の残存性標識で放射性ヨウ素化したR7（すなわち、実施例-３の生成物を放射性ヨウ素化し、DTT-還元型RS7に結合する）と従来の方法で放射性ヨウ素化したRS7のCalu3非小細胞性肺腺癌細胞系統とのインビトロにおける結合量を比較した。この例のデータは、残存性標識は、従来のヨウ素標識ものと比較して停留時間が明らかに延長していることを示した。
【００７６】
［例６.  ラモス（Ramos）ヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける例３の生成物から誘導した残存性I-125標識で標識したリンパ腫抗体LL2と従来のクロラミンT方法を使用してI-131で標識したリンパ腫抗体LL2の体内分布の比較］
ラモス（Ramos）腫瘍細胞系統を使用して4週齢雌ヌードマウス中で腫瘍を増殖させた。2週間後、腫瘍は約0.1〜0.2グラムのサイズに達する。この段階で、5匹のマウスからなる群に、両者とも同じバイアルに入れた2種のヨウ素標識（I-125残存性とI-131従来法）の各々約10μCiを投与した。二重標識により、抗体投与量と腫瘍サイズの変動が存在しないので、より正確な比較が得られる。動物は、標識抗体投与後、1日め、3日め、5日め、7日めと10日めに犠牲する。腫瘍を含む種々の器官を切除し、器官に結合している放射能を1グラムあたりの注射量の割合（%ID/g）として表す。この実施例から得られたデータは、従来法で製造した（CT方法）I-131標識に対する残存性I-125標識の付着の長時間の停留および優れた腫瘍と非腫瘍の比を示す。
【００７７】
[例7.  N,N-ビス（カルボキシメチル）-N'-[2-（p-ヒドロキシフェニル）エチル]-2-[p-イソチオシアネートベンジル]-エチレンジアミンAと対応するマレイミドBのスキームIVの製造]
4-ニトロフェニルアラニンをTHF中でボランで還元する。還流アセトニトリル中で2当量のtert-ブチルブロモアセテートと無水炭酸ナトリウムを反応させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製すると、収率67.9%のジアルキル化生成物が得られる。この生成物の400-MHzプロトンNMRスペクトルは構造帰属に十分一致する。この中間体（0.1 g）は、-78℃においてDMSO/塩化オキサリルを使用し、次にトリエチルアミンで処理することによって高収率でアルデヒドに酸化され、精製した生成物をシアノボロハイドライドナトリウムの水性メタノール溶液の存在下でチラミンと反応させる。このチラミン付加中間体（全体の収率70%）の特徴は、m/e 544のM+Hピーク（エレクトロスプレー質量スペクトル、陽イオンモード）である。アニリン誘導体の窒素基の触媒的水素化（生成物は質量スペクトルによって特徴づけられる）、次に2段階反応列（塩酸を使用したカルボキシル保護基の脱保護の3Mの塩酸中でのチオホスゲンとのその後の反応に関係する）により、イソチオシアネート誘導体Aが得られ、2段階（例-３に記載するように、エチレンジアミンとの反応、次いでSMCCによる処理）でマレイミド誘導体Bに変換される。
【００７８】
［例８.  I-125-標識AまたはI-125-標識B（スキームIVのAとB）を使用したリンパ腫抗体（LL2）の放射性ヨウ素化］
10nmolのA（Na125T/ヨードゲン）の放射性ヨウ素化、次に40nmolの水性フェノールによる未反応放射性ヨウ素の中和、pH8〜8.2、37℃で1.37 mgのLL2とのその後の3時間の反応によって導入率32.8%が得られる。比活性を増加するために、より少ない量の抗体を使用して実験を実施する。比活性が1.1mCi/mgでは導入率23.7%と比活性が1.4 mCi/mgでは導入率24.1％が得られる。凝集物の含量は2%と低かった。Bと還元型LL2（例-４におけるように還元を実施）を使用したとき、比活性0.95mCi/mgのとき28.4%の導入率が得られ、凝集は無視できるほどである。
【００７９】
［例９.  ダイマーペプチドの合成］
以下のように標準的なFmoc化学的方法によって、組成[(MCC)-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys-OH]2-（DTPA）を有するダイマーペプチド（「D-Dipep」）を固相で合成した。Fmoc-D-リジン（Aloc）を2-クロロトリチルクロライド樹脂に結合し、ペプチド鎖を2つ連続するD-チロシン（O-but）、次に（BOC）-D-アラニンを用いて作製した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（O）とトリブチルニンヒドリドを使用してAloc基を除去した。ペプチドをDTPA環状二無水物に結合した。軽微な酸性条件下でペプチドを樹脂から切断し、生成物を分取用逆相HPLCによって精製した。TFA-CH2Cl2-アニソールを使用したBOC-とTyr（O-t but）保護基の切断によって、ペプチド[D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys-OH]2-DTPAが生成し、市販のスルホスクスニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホーSMCC）で誘導体化した。分取用逆相HPLCによる精製により、Dipep[｛(MCC)-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys-OH｝2-（DTPA）（ここで、MCCは4-（N-マレイミヨードメチル）シクロヘキサン-1-カルボニル部分である）が得られる。合成列の全ての生成物は十分な純度を示し（分析用逆相カラムで1つのピーク）、エレクトロスプレー質量スペクトルによって同定され、適切な分子量を示した。
【００８０】
［例１０.  放射性標識とダイマーペプチドのモノクローナル抗体へのカップリング］
D-Dipepの約0.75mMの水性ストック溶液（〜pH5.6）を調製し、数個のバイアルに少量ずつ小分けし、冷凍保存した（-80℃）。放射性ヨウ素化は、〜5nmolのD-Dipep溶液と酸化体としてクロラミン-Ｔを使用して実施した。簡単に説明すると、Na125I（〜2mCi）を0.5MのPBS、pH 7.5で緩衝化し、次いでD-Dipep溶液（5 nmol）と20μgのクロラミン-Tで処理した。混合物を2分間インキュベーションし、次いでピペリジンで処理した。過剰の反応性ヨウ素を5mMの4-ヒドロキシフェニル酢酸で中和し、溶液をヨウ化カリウムで希釈し、30秒間インキュベーションした。ジスルフィド-還元型IgG（0.2〜0.3 mg）を次いで添加し、20〜25分間インキュベーションした。反応混合物を最終的にテトラチオネートナトリウム中で5mMにし、5分間インキュベーションし、遠心した-SECカラムで精製した。種々のモノクローナル抗体を用いて得られた標識の結果を以下の表に示す。
【００８１】
【表１】
0003965019.tif 000014
【００８２】
［in vivoにおける動物の生体内分布の検討］
肺腺癌のCalu-3ヌードマウスモデルにおいて一連の動物実験を実施した。これは、I-125-Dpep-RS7、I-131-RS7（CT）従来法による標識、I-125-DLT-RS7とIn-111-Bz-DTPA-RS7の動物生体内分布を比較することに関係する。血液線量を1500 radに標準化したとき、放射性ヨウ素化Dpepにより標識したRS7抗体の腫瘍線量は従来法の放射性ヨウ素標識によるもの約400%であり、Y-90-標識RS7（In-111類似物Y-90腫瘍線量測定を評価する）のそれの140%であり、放射性ヨウ素化DLTで標識したRS7によるものの70%であった。正常な器官の取り込みは試験した3つの残存性標識について同様であった。ラモス（Ramos）主要のリンパ腫抗体（LL2）標的を比較する実験では（ヌードマウス異種移植片モデル）、放射性ヨウ素化D-Dipepで標識した抗体は、従来法でヨウ素化したLL2と比較して、腫瘍の線量測定（血中線量1500 radに標準化）が5.7倍良好であることが見いだされた。
【００８３】
[例１１.  I125D-Dipep標識抗体のin vivoにおける動物生体内分布の検討]  肺腺癌のCalu-3ヌードマウスモデルにおいてI125-標識抗体の生体内分布を検討した。個々のマウスにI125-Dpep-RS7複合物、I131-RS7（CT）従来法による標識、I125-DLT-RS7複合物およびIn111-Bz-DTPA-RS7複合物を投与した。得られたデータを1500 radの血液線量に標準化した。放射性ヨウ素化Dpepで標識したRS7抗体による放射能の腫瘍付着は、従来法による放射性ヨウ素標識による付着の約400%であった。この付着はまた、Y90-標識RS7（In111類似物Y90腫瘍線量測定を評価する）のそれの140%であり、放射性ヨウ素化DLTで標識したRS7によるものの70%であった。正常な器官の取り込みは試験した3つの残存性標識について同様であった。ラモス（Ramos）腫瘍のリンパ腫抗体（LL2）標的を比較するために別の実験を実施した（ヌードマウス異種移植片モデル）。この実験から得られたデータは、放射性ヨウ素化D-Dipepで標識した抗体は従来法でヨウ素化したLL2より5.7倍多く付着したことを示した（結果を血中線量1500 radに標準化する）。
【００８４】
2.23g（6.55mmol）のメリビオース、0.089g（0.657mmol）のチラミンと0.169g（2.63mmol）のシアノボロハイドライドナトリウムをホウ酸緩衝液pH 9、65℃において18時間使用して表題の生成物を製造する。溶液をpH 4.6まで酸性化し、0.05Mの酢酸アンモニウムpH 4.6で充填した2.5 cm（外径）と高さ10cmのダウエックス（Dowex）50-X2陽イオン交換樹脂カラムで精製する。溶出は同じ緩衝液を用い、次に1Lの水と1Lの1M水酸化アンモニウムによる流速2〜3ml/分の直線的な濃度勾配によって実施する。各4mlの画分を採取する。280nmでのUV吸光度による画分のアッセイにより溶出プロフィールが得られた。溶出プロフィールは1つのピークを含む。従って、60〜70の溶出液画分をプールし、溶媒を留去し、凍結乾燥して、表題の生成物と無機塩を含む無色固体0.98gを得る。水性溶液中のジメリビイトールリラミン含量を280nmの吸光度値を使用して求める。凍結乾燥した材料のエレクトロスプレー質量スペクトルはm/e 790に適切なM+Hピークを示す。
【００８５】
［例13.  I-125-DMTを使用したLL2の放射性ヨウ素化］
一実験において、10mmolのDMTをI-125（ヨードゲン方法）で標識する。次いで、ヨウ素化DMTを約10単位のガラクトースオキシダーゼを用いて30℃において2.5時間酸化する。酸化した125I-DMTに等モル（10 nmol）のLL2と20mMのシアノボロハイドライドナトリウムを同じ温度で18時間反応させる。導入率は18.7%であり、再現性がある（2回目の操作では20.7%）。
【００８６】
［例14.  実施例13の生成物とラージ細胞とのインビトロにおける結合］
対照として直接放射性ヨウ素化した抗体（クロラミン-T手法による）を使用して、例-５に記載されるものと同様に実験を実施する。結果は、対照と比較して、170倍の期間にわたって、ラージ細胞上の例-１０の生成物の有意な停留を明らかにした。
【００８７】
［例15.  スキームI：チオール化抗体のマレイミド含有ヒドラジド、次いで酸化型炭水化物との反応］
このスキームの第1の段階において、IgGジスルフィド結合をジチオスレイトールで還元する。簡単に説明すると、Paelak-ByczkowskaらのCancer Research49：4568-77（1989）に記載されている内部移入性抗リンパ腫抗体LL2の0.55 mlを等容量のリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4、0.5Mのホウ酸緩衝液pH 8.5の0.11 mlと0.4 g/mlのジチオスレイトールの水溶液6μlと混合する。反応混合物をボルテックスで混合し、室温で30分間インキュベーションする。次いで、還元されたタンパク質溶液をリン酸緩衝液pH 7.0で平衡化したSephadexTMの50/80樹脂に通過させて、サイズ排除クロマトグラフィーによってチオール還元酵素を精製する。
【００８８】
このスキームの第2の段階において、ヒドラジド基をLL2に導入する。ジメチルホルムアミドに溶解した10当量のヒドラジド-マレイミドM2C2Hを、IgGの各SH基について製造した抗体溶液に添加する。37℃において2時間インキュベーションを継続する。反応物を中和するために、50倍過剰モルのN-エチルマレイミドを添加し、37℃においてインキュベーションをさらに30分継続する。処理したIgGを次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【００８９】
このスキームの第３の段階において、IgGをジメリビイトール-125/131T-チラミンで複合物形成する。最初に、ジメリビイトールチラミンにヨードゲンを使用して放射性反応性ヨウ化ナトリウムで放射性ヨウ素化する。ヨウ素化したジメリビイトールチラミンを、StrobelらのArch. Biochem. Biophys. 240: 635-45（1985）によって要約されている手法の1つによってガラクトースオキシダーゼで酸化する。処理したIgGを、pH 7.7のリン酸緩衝液中で1：1のモル比で酸化されたジメリビイトールチラミンのアルデヒド基に複合体化する。2時間後、シアノボロハイドライドナトリウムを最終濃度20mMまで添加し、反応混合物をさらに1時間インキュベーションする。ジメリビイトール-125/131T-チラミンを含有する複合物を再度pH 7.4でサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【００９０】
［例16.  スキームI：抗体のチオール化とマレイミド含有ヒドラジドによるその後のカップリング］
このスキームの第1の段階において、少なくとも1つのチオール基をチオール化試薬との反応によって細胞標的タンパク質に導入する（１）。チオール化試薬を最終ジメチルホルムアミド濃度5%v/vまでジメチルホルムアミドに溶解する。製造した抗体のチオール含量はEllmanのアッセイによって求められる。チオール化した抗体をpH 7.5のリン酸緩衝液中で平衡させ、次いで4倍〜10倍過剰のマレイミド-ヒドラジド試薬M2C2Hと反応させる。抗体と試薬MPBHとの反応後、複合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。次いで、ヒドラジドを導入した抗体を酸化されたジメリビイトール-123T-チラミンに、上記の例15の段階2と3に概略を示す手法によって結合する。
【００９１】
［例17.  スキームII：マレイミド含有ヒドラジドの酸化型炭水化物への導入と次の抗体とのカップリング］
このスキームでは、酸化されたジラクチノール-123I-チラミンをpH 6〜pH 7のリン酸緩衝液中で2倍過剰のM2C2Hと共に1時間インキュベーションする。次いで、上記の例１または例２に記載するように製造したチオール化した抗体をインキュベーション混合物に添加する。周囲温度においてさらに30分間インキュベーション後、ヨードアセタミドを添加し、さらに30分間インキュベーションして、未反応チオールを中和する。シアノボロハイドライドナトリウムを最終濃度10mMまで添加し、1時間インキュベーションさせる。製造した抗体をサイズ排除クロマトグラフィーによって最終反応混合物から精製する。
【００９２】
［例18.  スキームIII：抗体と残存性標識とのアヌル酸二塩化物カップリング］
このスキームでは、置換されたシアヌル酸二塩化物を使用して、抗体を残存性標識に結合する。シアヌル酸二塩化物誘導体をジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドに溶解し、次いでジラクチノール-123I-チラミン水溶液に添加する。
【００９３】
シアヌル酸二塩化物類似物とのカップリングの場合には、シアヌル酸二塩化物類似物を最初に残存性標識と共に37℃において90分間インキュベーションする。冷却後、抗体のリン酸緩衝溶液を添加し、混合物を37℃において3時間インキュベーションする。抗体とカップリングするとき、最終反応物のpHがpH 7〜8であるように抗体の緩衝溶液のpHを調節する。チオール化した抗体とのカップリングの場合には最終pHは6〜7である。サイズ排除クロマトグラフィーによって抗体を他の反応物から精製する。
【００９４】
これらの実施例の各々について、タンパク質に導入されたI-123の量と回収されたタンパク質の量を測定することによって、複合物形成効率を求める。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で、分析用サイズ排除HPLCまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、製造されたIgGの分子サイズの分析によって、IgG凝集の程度を求める。
【００９５】
モル比を変更して、各々の反応条件下で形成された複合物の比活性、結合親和性と量を測定することによって、これらの反応における残存性試薬、抗体と他の試薬の最適量を求める。
上記の説明から、当技術分野の当業者は本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の用途と条件に適合するように本発明に種々の変更と改良を加えることができる。