(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる膵臓機能改善剤であって、
該ベータセルリン蛋白質が配列番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有し；
該ムテインが、(1) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、または(3) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜９個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなる蛋白質であって、ベータセルリン様活性、膵臓ベータ細胞への分化促進作用、膵臓Ｆ細胞への分化促進作用及び／または耐糖能改善作用を有するものである膵臓機能改善剤。
【請求項２】
ベータセルリン蛋白質のムテインが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６からなる群から選ばれる少なくとも１つの配列番号で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質である請求項１記載の改善剤。
【請求項３】
ベータセルリン様活性が、線維芽細胞、血管平滑筋細胞及び／または網膜色素上皮細胞の細胞増殖促進作用を示す活性である請求項１記載の改善剤。
【請求項４】
ベータセルリン蛋白質のムテインが、(1) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１個〜４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸が他のアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列、または(3) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜９個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１記載の改善剤。
【請求項５】
ベータセルリン蛋白質のムテインが、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１２個または３０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１記載の改善剤。
【請求項６】
さらにアクチビンを含有する請求項１〜５記載の改善剤。
【請求項７】
ベータセルリン蛋白質またはそのムテインに対するアクチビンの含有割合が１：１０〜１０：１である請求項６記載の改善剤。
【請求項８】
糖尿病の予防・治療剤である請求項１〜７記載の改善剤。
【請求項９】
糖尿病における膵臓機能障害または老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症の予防・治療剤である請求項１〜７記載の改善剤。
【請求項１０】
ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤であって、
該ベータセルリン蛋白質が配列番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
を含有し；
該ムテインが、(1) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、または(3) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜９個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなる蛋白質であって、膵臓ベータ細胞への分化促進作用を有するものである分化促進剤。
【請求項１１】
ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる未分化型膵ガンの予防・治療剤であって、
該ベータセルリン蛋白質が配列番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有し；
該ムテインが、(1) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、または(3) 配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜９個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなる蛋白質であって、膵臓ベータ細胞への分化促進作用、膵臓Ｆ細胞への分化促進作用及び／または耐糖能改善作用を有するものである未分化型膵ガンの予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有する膵臓機能改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベータセルリン蛋白質（以下、ＢＴＣ蛋白質と略記する場合がある）は、トランスジェニックマウス由来膵臓ベータ腫瘍細胞が産生する蛋白性因子で、その全アミノ酸配列がｃＤＮＡの解析から明らかにされている〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604（1993）, Sasadaら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），190：1173（1993）〕。ＢＴＣ蛋白質は、当初マウス３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性をもつ因子として見いだされたが、その後、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対しても増殖促進活性を有することが見いだされた〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604（1993）〕。
天然に存在するヒトＢＴＣ蛋白質は極めて微量であり、また、これをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困難であった。しかし、最近、遺伝子工学的手法を駆使して、高純度のヒトＢＴＣ蛋白質が多量に、かつ比較的安価に生産されるようになった（特開平６−８７８９４）。そして、ＢＴＣ蛋白質が、創傷、潰瘍や血管奇形の治療、あるいは糖尿病において認められるアテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症のような平滑筋細胞増殖に起因する病気の治療に使用できる競合剤（例、抗体、偽ペプチド）の作成などに用いられることが報告されている（特開平４−３５２８００および特開平６−８７８９４）。
さらに、ＢＴＣ蛋白質のｍＲＮＡは、脳以外の各種臓器、例えば肝臓、腎臓、膵臓などで検出されていることから、これらの臓器においても何らかの機能を果たしていると考えられるが、その機能の詳細はほとんど明らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
糖尿病は、高血糖が持続することにより様々な合併症が引き起こされることを特徴とする疾病である。この疾病は、インシュリン依存型、インシュリン非依存型およびその他に分類され、多様な成因によって起こると考えられているが、基本的にはインシュリン作用の不足により発症する。特に、インシュリン依存型糖尿病では産生されるインシュリン量の絶対的な不足がその原因となっている。このような状況において、糖尿病などを予防・治療するため、膵臓機能を改善する薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、公知のＢＴＣ蛋白質が多分化能を有する膵外分泌腺由来細胞に作用して、これをベータ細胞などへと分化させるという全く新規な活性を有することを見いだし、この知見に基づいてさらに研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる膵臓機能改善剤、
（２）ベータセルリン蛋白質が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６からなる群から選ばれる少なくとも１つの配列番号で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質である第（１）項記載の改善剤、
（３）ベータセルリン蛋白質が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質である第（１）項記載の改善剤、
（４）ベータセルリン蛋白質のムテインが、▲１▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個程度のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個程度のアミノ酸が他のアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列、または▲３▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜４０個程度のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である第（１）項記載の改善剤、
【０００５】
（５）ベータセルリン蛋白質のムテインが、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１２個または３０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質である第（１）項記載の改善剤、
（６）さらにアクチビンを含有する第（１）項〜第（５）項記載の改善剤、
（７）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインに対するアクチビンの含有割合が約１：１０〜１０：１である第（６）項記載の改善剤、
（８）糖尿病の予防・治療剤である第（１）項〜第（７）項記載の改善剤、
（９）糖尿病における膵臓機能障害または老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症の予防・治療剤である第（１）項〜第（７）項記載の改善剤、
（１０）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、
（１１）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインを含有してなる未分化型膵ガンの予防・治療剤、および
（１２）膵臓機能改善剤を製造するためのベータセルリン蛋白質またはそのムテインの使用を提供する。
【０００６】
さらに、本発明は、
（１３）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡを含有してなる膵臓機能改善剤、
（１４）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡを含有してなる未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、
（１５）ベータセルリン蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡを含有してなる未分化型膵ガンの予防・治療剤、および
（１６）膵臓機能改善剤を製造するためのベータセルリン蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡの使用を提供する。
【０００７】
本発明のＢＴＣ蛋白質またはそのムテインを含有する膵臓機能改善剤（以下、改善剤と略記する場合がある）、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤（以下、分化促進剤と略記する場合がある）または未分化型膵ガンの予防・治療剤に用いられるＢＴＣ蛋白質としては、ＢＴＣ様活性、すなわち線維芽細胞、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞などの細胞増殖促進作用を有する蛋白質であれば何れのものであってもよい。また、蛋白質以外の物質、例えば、発酵生産物、合成化合物、合成ペプチドなども用いることができる。また、ＢＴＣ蛋白質としては、天然由来のものでもよく、遺伝子工学的手法によって製造された組換え型蛋白質であってもよい。
天然由来のＢＴＣ蛋白質としては、例えば、ヒト、サル、マントヒヒ、チンパンジー、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＢＴＣ蛋白質が用いられ、なかでも、ヒト、マウス由来のものなどが好ましく、特にヒト由来のものが好適である。また、本発明の改善剤、分化促進剤または予防・治療剤を適用する対象動物と同じ動物由来のＢＴＣ蛋白質を用いるのが好ましい。すなわち、本発明の改善剤等をヒトに適用する場合は、ヒト由来のＢＴＣ蛋白質を用いるのが好ましい。
【０００８】
具体的には、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６からなる群から選ばれる少なくとも１つの配列番号で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質などが用いられ、より具体的には、ヒト由来ＢＴＣ蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質（特開平６−８７８９４）などが用いられる。マウス由来ＢＴＣ蛋白質としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604（1993）〕などが用いられる。
また、これらＢＴＣ蛋白質は、アミノ酸のみで構成される単純蛋白質であってもよく、糖蛋白質，リポ蛋白質，ヘム蛋白質，金属蛋白質，フラビン蛋白質，リン蛋白質などの複合蛋白質であってもよい。糖蛋白質である場合、糖鎖としては、例えば、Ｄ−マンノース，Ｄ−ガラクトース，Ｌ−フルクトースなどの中性糖、Ｄ−グルコサミン，Ｄ−ガラクトサミンなどのアミノ糖、およびシアル酸などが挙げられる。
【０００９】
ＢＴＣ蛋白質のムテインとしては、例えば、上記のＢＴＣ蛋白質の少なくとも１個の構成アミノ酸が欠失している欠失型ムテイン、ＢＴＣ蛋白質の少なくとも１個の構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換している置換型ムテイン、ＢＴＣ蛋白質に少なくとも１個のアミノ酸が付加している付加型ムテインなどが用いられる。アミノ酸の欠失、置換または付加の数は、ＢＴＣ蛋白質が本来有する作用を失わない限り何個でもよい。
具体的には、▲１▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個程度のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の１〜４０個、好ましくは１〜９個程度のアミノ酸が他のアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列、または▲３▼配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１〜４０個、好ましくは１〜９個程度のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有する蛋白質などが用いられ、なかでも、次の部分アミノ酸配列、
▲１▼His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile（配列番号：３）、
▲２▼Gly Arg Cys Arg Phe Val Val（配列番号：４）、
▲３▼Glu Gln Thr Pro Ser Cys（配列番号：５）、および
▲４▼Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr（配列番号：６）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する蛋白質などが好ましい。
これらのムテインの中でも、欠失型ムテインなどが好ましく、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１〜４０個程度のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質などが好ましい。
【００１０】
より具体的には、ＢＴＣ蛋白質の欠失型ムテインとしては、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１２個または３０個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するヒトＢＴＣ蛋白質の欠失型ムテインなどが用いられる〔Watanabeら; ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），269：9966 (1994）〕。特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１２個または３０個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するヒトＢＴＣ蛋白質の欠失型ムテインが好適である。
その他のＢＴＣ蛋白質のムテインとしては、ＢＴＣ蛋白質のＮ末端がアシル化されたもの、グリコシル化されたもの、ポリエチレングリコール誘導体などの化学修飾されたものなど、ＢＴＣ蛋白質の有する作用を失わない限り何れのものでもよい。また、上記のＢＴＣ蛋白質またはそのムテインは、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。
上記のＢＴＣ蛋白質またはそのムテインの塩としては、とりわけ薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１１】
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤に用いられるＢＴＣ蛋白質またはそのムテインのうち、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＢＴＣ蛋白質、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から１２個または３０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有する欠失型ヒトＢＴＣムテイン、および配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウスＢＴＣ蛋白質は公知であるが、それら以外のＢＴＣ蛋白質およびそのムテインは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、上記ＢＴＣ蛋白質は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のペプチドまたは前駆体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチドまたは前駆体を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
【００１２】
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 ペプチドまたは前駆体の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドまたは前駆体を精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドまたは前駆体が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１３】
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤には、上記したＢＴＣ蛋白質またはそのムテインの他に、アクチビンを配合することができる。
アクチビンは、卵胞刺激ホルモンの分泌を促進するホルモンとして知られており（実験医学，Vol.10，No.15，1992）、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢなどが用いられ、なかでも、アクチビンＡが好ましい。これらのアクチビンは市販のもの（オーストラル、バイオロジカル社製）を用いることができる。
アクチビン自体はＢＴＣ様活性を有していないが、ＢＴＣ蛋白質の作用を増強する作用を有しているので、ＢＴＣ蛋白質と併用するのが好ましい。
また、アクチビンは本発明の改善剤等に配合して用いるのが好ましいが、ＢＴＣ蛋白質とは別個に製剤化して、ＢＴＣ蛋白質を含有する製剤とアクチビンを含有する製剤とを併用することによって、ＢＴＣ蛋白質の作用を増強させることもできる。
【００１４】
本発明のＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡを含有する膵臓機能改善剤（以下、ＤＮＡ含有改善剤と略記する場合がある）、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤（以下、ＤＮＡ含有分化促進剤と略記する場合がある）または未分化型膵ガンの予防・治療剤（以下、ＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤と略記する場合がある）に用いられるＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡとしては、前述したＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードする塩基配列を含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した動物の細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した動物の細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した動物の細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来ＢＴＣ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（特開平６−８７８９４）などが用いられ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来ＢＴＣ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ〔シング（Shing）等；サイエンス（Science），259：1604（1993）〕などが用いられる。
【００１５】
ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＢＴＣ蛋白質またはそのムテインの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning ２nd（ジェー・サムブロック（J. Sambrook）等、Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年）に記載の方法などに従って行なわれる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。具体的には、特開平４−３５２８００、特開平６−８７８９４、サイエンス（Science），259：1604（1993）などに記載の方法あるいはそれに準ずる方法に従って、ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡのクローニングすることができる。
クローン化されたＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。具体的には、特開平４−３５２８００、特開平６−８７８９４、サイエンス（Science），259：1604（1993）などに記載の方法あるいはそれに準ずる方法に従って、ＢＴＣ蛋白質またはそのムテインをコードするＤＮＡの発現ベクターを製造することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のＢＴＣ蛋白質またはそのムテインを含有する膵臓機能改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤は、公知の製剤学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容される担体（希釈剤、賦形剤を含む）などを用いて製造することができる。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤を、例えば、注射用水溶液とする場合には、水溶性剤（例、蒸留水）、水溶性溶剤（例、生理食塩水、リンゲル液）、油性溶剤（例、ゴマ油、オリーブ油）などの溶剤、または所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例、ブドウ糖、転化糖）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）、保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノール）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）などの添加剤を用いて、通常の手段により製造することができる。
該注射用水溶液の液性は、ｐＨ約３〜８に、好ましくはｐＨ約５〜７に調整する。上記ｐＨ範囲に液性を調整するためには、例えば、希塩酸や希アルカリ（例、希水酸化ナトリウム、希炭酸水素ナトリウム）などを添加してもよい。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤におけるＢＴＣ蛋白質の含有量は、製剤全体に対して通常約１〜９５重量％、好ましくは約１０〜８０重量％、さらに好ましくは約２０〜７０重量％である。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤におけるアクチビンの含有量は、製剤全体に対して通常約９０重量％以下、好ましくは約８０重量％以下である。
ＢＴＣ蛋白質とアクチビンの配合割合は、通常約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：２〜２：１であるが、特に、約１：２の割合で使用するのが好ましい。
その他の成分（担体など）の含有量は、ＢＴＣ蛋白質の作用を阻害しない限り、適宜選択することができるが、製剤全体に対して、通常約０.０１〜９０重量％、好ましくは約０.１〜８０重量％である。
【００１７】
製剤化にあたっては、ＢＴＣ蛋白質を含有する水溶液に、さらにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合し、液性をｐＨ約３〜８になるように調整すると、保存中のＢＴＣ蛋白質の活性の低下が少なく好都合である。
ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、本発明の改善剤等を臨床に適用するためには、非経口投与に用いられる程度の品質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を材料としてCohnのエタノール分画第６法によって分画精製したものなどが用いられる。また、安定化剤として、アセチルトリプトファン・ナトリウム、カプリル酸ナトリウムを含有するものであってもよい。ＨＳＡは、水溶液とした場合、水溶液１ｍｌ当たり約０.１ｍｇ〜５０ｍｇ、とりわけ約０.５ｍｇ〜２０ｍｇ含有させることが好ましい。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤の製剤化にあたっては、上記ＨＳＡに加えるに、さらにグリシン，グルタミン酸，アスパラギン酸，アラニン，プロリンなどのアミノ酸、モノアミノ脂肪族アミノ酸、環状アミノ酸、ブドウ糖，マンノースなどの単糖類、ソルビット，マンニットなどの糖アルコール類、およびこれらの生理学的に許容される配合できる塩もしくは誘導体の１種または２種以上を配合してもよい。
上記配合剤は、各成分を水溶液とする場合、水溶液１ｍｌ当たり、単糖類または糖アルコール類に関しては約１０〜１００ｍｇ、アミノ酸に関しては約５〜５０ｍｇ配合することが好ましい。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤を製剤化したもの（ＨＳＡを配合したもの）を溶液状態でｐＨ約５〜７になるように調整するために、グルタミン酸などの酸性アミノ酸を配合する場合には、該物質を上記所定量加えることにより所定の液性に調整でき、また、所望により、上記酸性アミノ酸を配合しない場合には、塩酸、リン酸などの鉱酸、もしくはコハク酸、酒石酸、クエン酸などの緩衝剤で所定の液性に調整する。
【００１８】
本発明の改善剤は低毒性であるので、膵臓機能障害や膵臓機能低下に対して安全な膵臓機能改善剤として使用することができる。具体的には、本発明の改善剤は、細胞分化促進因子として膵臓ベータ細胞の分化を促進する作用を有する。すなわち、本発明の改善剤は、未分化膵臓幹細胞に作用して、これを膵臓ベータ細胞へと分化させることができ、このようにして分化誘導されて生じた膵臓ベータ細胞は、インシュリンを分泌・産生することができる。また、本発明の改善剤は、未分化膵臓幹細胞を膵臓の他の細胞、例えばＦ細胞へと分化させることができ、このようにして分化誘導されて生じたＦ細胞は、パンクレアティックペプチド（以下、ＰＰと略称する場合がある）を産生することができる。さらには、本発明の改善剤はin vivoにおける耐糖能改善作用を有する。従って、本発明の改善剤は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害、老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症などの改善剤（予防・治療剤）としても有用である。
本発明の分化促進剤は低毒性であるので、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への安全な分化促進剤、インシュリン分泌促進剤などとして使用することができる。
本発明の未分化型膵ガンの予防・治療剤は低毒性であるので、未分化型膵ガンの安全な予防・治療剤として使用することができる。
【００１９】
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤の対象動物としては、例えば、ヒトまたは哺乳動物が挙げられ、具体的にはヒト、サル、マントヒヒ、チンパンジー、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラットなどが挙げられる。
本発明の改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤の投与方法としては、経口的、非経口的の何れであってもよいが、非経口的に行なうのが好ましい。例えば、静脈内注射または皮下注射することによって非経口的に行なうことができる。
本発明の改善剤または分化促進剤の使用量は投与対象、年齢、体重、健康状態、性別、投与時間、投与方法、膵臓機能障害の程度などによって異なるが、例えば、注射投与として用いる場合には、成人に対して、ＢＴＣ蛋白質量として、一日量約０.０２μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２μｇ〜２ｍｇ／ｋｇとなるように投与する。
本発明の未分化型膵ガンの予防・治療剤の使用量は、投与対象、年齢、体重、健康状態、性別、投与時間、投与方法、未分化型膵ガンの程度などによって異なるが、例えば、注射投与として用いる場合には、成人に対して、ＢＴＣ蛋白質量として、一日量約０.０２μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２μｇ〜２ｍｇ／ｋｇとなるように投与する。
【００２０】
本発明のＤＮＡ含有改善剤、ＤＮＡ含有分化促進剤またはＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤は、例えば、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記したＢＴＣ蛋白質またはそのムテインを含有する改善剤、分化促進剤または未分化型膵ガンの予防・治療剤と同様にして製造することができる。
本発明のＤＮＡ含有改善剤は低毒性であるので、膵臓機能障害や膵臓機能低下に対して安全な膵臓機能改善剤として使用することができる。具体的には、本発明の改善剤は、細胞分化促進因子として膵臓ベータ細胞の分化を促進する作用を有する。すなわち、本発明のＤＮＡ含有改善剤は、未分化膵臓幹細胞に作用して、これを膵臓ベータ細胞へと分化させることができ、このようにして分化誘導されて生じた膵臓ベータ細胞は、インシュリンを分泌・産生することができる。また、本発明のＤＮＡ含有改善剤は、未分化膵臓幹細胞を膵臓の他の細胞、例えばＰＰを産生するＦ細胞へと分化誘導させる作用も有する。さらには、本発明のＤＮＡ含有改善剤はin vivoにおける耐糖能改善作用を有する。従って、本発明のＤＮＡ含有改善剤は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害、老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症などの改善剤（予防・治療剤）としても有用である。
本発明のＤＮＡ含有分化促進剤は低毒性であるので、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への安全な分化促進剤、インシュリン分泌促進剤などとして使用することができる。
本発明のＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤は低毒性であるので、未分化型膵ガンの安全な予防・治療剤として使用することができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ含有改善剤、ＤＮＡ含有分化促進剤またはＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤の対象動物としては、例えば、ヒトまたは哺乳動物が挙げられ、具体的にはヒト、サル、マントヒヒ、チンパンジー、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラットなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡ含有改善剤、ＤＮＡ含有分化促進剤またはＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤の投与方法としては、経口的、非経口的の何れであってもよいが、非経口的に行なうのが好ましい。例えば、静脈内注射または皮下注射することによって非経口的に行なうことができる。
本発明のＤＮＡ含有改善剤、ＤＮＡ含有分化促進剤またはＤＮＡ含有未分化型膵ガンの予防・治療剤の投与量は、投与対象、年齢、体重、健康状態、性別、投与時間、投与方法、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例および試験例を示してさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
ヒトＢＴＣ蛋白質を含有する注射剤
ヒトＢＴＣ蛋白質２.５ｇを蒸留水１リットルに溶かし、これにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）１.１ｇを加えて溶かし、滅菌濾過してアンプル（容量５ミリリットル）に４ミリリットルずつ分注する。これを凍結乾燥機に入れて乾燥後、封をすると使用時溶解用のアンプルが得られる。使用に際しては、該アンプルを開封し、２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、皮下、静脈または筋肉内投与用注射剤とする。これを膵臓機能改善剤、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、または未分化型膵ガンの予防・治療剤として使用する。
【００２４】
【実施例２】
ヒトＢＴＣ蛋白質およびアクチビンＡを含有する注射剤
ヒトＢＴＣ蛋白質２.５ｇおよびアクチビンＡ１２.５ｇを蒸留水１リットルに溶かし、これにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）１.０ｇを加えて溶かし、滅菌濾過してアンプル（容量５ミリリットル）に４ミリリットルずつ分注する。これを凍結乾燥機に入れて乾燥後、封をすると使用時溶解用のアンプルが得られる。使用に際しては、該アンプルを開封し、２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、皮下、静脈または筋肉内投与用注射剤とする。これを膵臓機能改善剤、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、または未分化型膵ガンの予防・治療剤として使用する。
【００２５】
【実施例３】
ヒトＢＴＣ蛋白質をコードするＤＮＡを含有する注射剤
ヒトＢＴＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：７）２.５ｇを蒸留水１リットルに溶かし、これにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）１.１ｇを加えて溶かし、滅菌濾過してアンプル（容量５ミリリットル）に４ミリリットルずつ分注する。これを凍結乾燥機に入れて乾燥後、封をすると使用時溶解用のアンプルが得られる。使用に際しては、該アンプルを開封し、２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、皮下、静脈または筋肉内投与用注射剤とする。これを膵臓機能改善剤、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、または未分化型膵ガンの予防・治療剤として使用する。
【００２６】
【実施例４】
ヒトＢＴＣ蛋白質を含有する注射剤
ヒトＢＴＣ蛋白質０.５ｇを蒸留水１リットルに溶かし、これにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２.０ｇを加えて溶かし、滅菌濾過してアンプル（容量５ミリリットル）に４ミリリットルずつ分注する。これを凍結乾燥機に入れて乾燥後、封をすると使用時溶解用のアンプルが得られる。使用に際しては、該アンプルを開封し、２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、皮下、静脈または筋肉内投与用注射剤とする。これを膵臓機能改善剤、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、または未分化型膵ガンの予防・治療剤として使用する。
【００２７】
【実施例５】
ヒトＢＴＣ蛋白質およびアクチビンＡを含有する注射剤
ヒトＢＴＣ蛋白質２.５ｇおよびアクチビンＡ５.０ｇを蒸留水１リットルに溶かし、これにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）１.０ｇを加えて溶かし、滅菌濾過してアンプル（容量５ミリリットル）に４ミリリットルずつ分注する。これを凍結乾燥機に入れて乾燥後、封をすると使用時溶解用のアンプルが得られる。使用に際しては、該アンプルを開封し、２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、皮下、静脈または筋肉内投与用注射剤とする。これを膵臓機能改善剤、未分化膵臓幹細胞から膵臓ベータ細胞への分化促進剤、または未分化型膵ガンの予防・治療剤として使用する。
【００２８】
【試験例１】
インシュリン産生ベータ細胞への分化およびパンクレアチックポリペプチド産生Ｆ細胞への分化に及ぼすＢＴＣ蛋白質の効果
化学発癌剤で誘発された膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ〔Christophe; アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロギー（Am. J. Physiol.），266：G963（1994）〕を２０ｍＭ ヘーペス／ＮａＯＨ（ｐＨ７.４），５ｍＭ ＮａＨＣＯ3，１０％ 牛胎児血清および種々の濃度のヒトＢＴＣ蛋白質（配列番号：１）を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（フロー社，米国）を用いて、１０5細胞／ｍｌの濃度になるようにガラスカバースリップ上に播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で培養した。５日後に細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定し、０.１％ トライトンＸ-１００（商品名）で５分間処理した後、ブロッキングエース（森永乳業，日本）、一次抗体〔抗インシュリン抗体または抗パンクレアティックポリペプチド抗体〕、次いで二次抗体〔インドカルボシアニン共役（indocarbocyanine-conjugated）ろば抗ウサギＩｇＧ抗体またはインドカルボシアニン共役（indocarbocyanine-conjugated）ろば抗ギニピッグＩｇＧ抗体〕をインキュベートした。次に、細胞をCarl Zeiss社（NY, USA）製アキオフォート（Axiophoto）で検鏡した。その結果、〔図１〕の○で示したように、蛍光染色された細胞、すなわちインシュリンを産生するベータ細胞に分化した細胞数は、ＢＴＣ蛋白質の濃度に依存して増加し、２×１０-9ＭのＢＴＣ蛋白質存在下では最大約４％の細胞がインシュリンを産生するベータ細胞になることが分かった。また、〔図１〕の●で示したように、この時、約５％の細胞がパンクレアティックポリペプチド（ＰＰ）を産生するＦ細胞に分化することも判明した。
同様の結果は、ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡの解析からも得られた。すなわちＢＴＣ蛋白質存在下で、ＡＲ４２Ｊ細胞は、インシュリン ｍＲＮＡ、ＰＰ ｍＲＮＡ、グルコキナーゼ ｍＲＮＡ、グルコーストランスポーター２ ｍＲＮＡを合成するように分化したが、グルカゴン ｍＲＮＡは検出されなかった。
【００２９】
【試験例２】
インシュリンを産生するベータ細胞への分化に及ぼす種々の因子の効果
試験例１の場合と同一条件で、インシュリンを産生するベータ細胞への分化に及ぼす種々の因子の効果を調べた。結果の一部を〔図２〕に示したが、１×１０-9Ｍの濃度ではアクチビン（Activin）Ａ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ガストリン、コレシストキニンおよびＴＧＦ−βのいずれもＡＲ４２Ｊ細胞をインシュリンを産生するベータ細胞へと分化誘導しなかったが、ヒトＢＴＣ蛋白質（配列番号：１）は約２.５％のＡＲ４２Ｊ細胞をインシュリンを産生するベータ細胞へと分化誘導した。また、〔図２〕に示したように、２×１０-9ＭのアクチビンＡおよび１×１０-9ＭのＥＧＦ、あるいは２×１０-9ＭのアクチビンＡおよび１×１０-9ＭのＴＧＦ−αの存在下では，ＡＲ４２Ｊ細胞はインシュリンを産生するベータ細胞に分化しなかったが、２×１０-9ＭのアクチビンＡおよび１×１０-9ＭのヒトＢＴＣ蛋白質（Betacellulin）の存在下では約１０％のＡＲ４２Ｊ細胞がインシュリンを産生するベータ細胞に分化した。このことから、アクチビンＡがＢＴＣ蛋白質の分化誘導作用を増強することが分かった。
【００３０】
【試験例３】
インシュリン産生ベータ細胞に分化したＡＲ４２Ｊ細胞におけるインシュリンの分泌
試験例１と同一方法により１×１０5細胞／ｍｌの濃度で径６ｃｍのディッシュにＡＲ４２Ｊ細胞を播種し、１×１０-9Ｍ ヒトＢＴＣ蛋白質（配列番号：１）および２×１０-9Ｍ アクチビンＡ存在下で５日間培養した。次に、細胞をＤＭＥＭで洗い、１０μＭ トルブタマイド（tolbutamide）または４０ｍＭ カリウムイオン（high K+）存在下に５.５ｍＭ グルコースを含むクレブス−リンガーバイカーボネート緩衝液中で６０分間インキュベートした後、培養液を集め、培養液中のインシュリン濃度をＴＲ−ＩＦＭＡ（a time-resolved immunofluorometric assay system）〔ロップグリン（Lovgren）等;  「Alternative Immunoassays」 ダブリュー・ピー・コリンズ（W. P. Collins）著，John Whiley & Sons Ltd., 203頁、1985年〕を用いて測定した。〔図３〕に示したように、分化したＡＲ４２Ｊ細胞は、培養液中に有意のインシュリンを分泌しており、それは４０ｍＭの高濃度カリウムイオン（high K+）またはトルブタマイド（tolbuamide）で促進されることが分かった。
【００３１】
【試験例４】
糖尿病マウスにおけるＢＴＣ蛋白質の耐糖能改善作用
８週齢の雄ＩＣＲマウスにアロキサン膵部分潅流（１００ｍｇ／ｋｇ体重、上腸間膜動脈をクランプし、静脈（ｉ.ｖ.）投与して、膵頭部ベータ細胞を温存し、膵尾部ベータ細胞のみを破壊する）を行ない、糖尿病モデルマウスを作成した〔ダイアベット・フロンティア（Diabetes Frontier）7:285-286,(1966)および同誌7:287-288,(1966)）。この糖尿病マウスにアロキサン処置後、１日目よりヒトＢＴＣ蛋白質（配列番号：１）を１ｍｇ／ｋｇ体重／日で８週間連日皮下投与し、処置前と処置後２，４または８週後に腹腔内糖負荷試験（ipGTT）（２ｇ グルコース／ｋｇ体重）を行ない、負荷前および負荷後１および２時間の血糖値を測定するとともに、体重変化を経時的に測定した。その結果、アロキサン処置前０週後〔図４〕、アロキサン処置後４週後〔図５〕に腹腔内糖負荷試験を行なった場合では、ＢＴＣ蛋白質投与群と非投与群の間に差がなかった。しかし、〔図６〕に示したように、アロキサン処置後８週目に腹腔内糖負荷試験を行なった場合、ＢＴＣ蛋白質投与群（▲）における糖負荷１時間後の血糖値が、ＢＴＣ蛋白質非投与群（●）に比べて明らかに低下することが観察された。この結果から、ヒトＢＴＣ蛋白質が耐糖能改善作用を有することが明らかになった。なお、投与群、非投与群間のマウスの体重には有意差がなかった。
【００３２】
【試験例５】
ＢＴＣ蛋白質の膵臓癌細胞の増殖抑制作用
ＡＲ４２Ｊのクローン７１細胞 約３×１０3個を２ｎＭのヒトＢＴＣ蛋白質（配列番号：１）および１％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて径３ｃｍのファルコンシャーレ（ベクトンディッキンソン、米国）に藩種した後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養し、経時的に細胞数の増加をコールターカウンターにより計測した。ヒトＢＴＣ蛋白質を含まない場合を対照とした。得られた結果を〔図７〕に示した。〔図７〕に示されているように、ヒトＢＴＣ蛋白質を含む培地（○）では、ヒトＢＴＣ蛋白質を含まない培地（●）に比べて、明らかにクローン７１細胞の増殖が抑えられていることが判明した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のＢＴＣ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを含有する膵臓機能改善剤は、未分化膵臓幹細胞に作用して、インシュリンを産生する膵臓ベータ細胞への分化を促進する作用を有する。また、未分化幹細胞を膵臓の他の細胞、例えば、パンクレアティックポリペプチドを産生するＦ細胞へと分化誘導させる作用も有する。本発明の膵臓機能改善剤は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害などの予防・治療剤として有用である。さらに、本発明の膵臓機能改善剤は、未分化型膵ガンの予防・治療剤としても有用である。
【００３４】
【配列表】
【配列番号：１】
0003945846.tif 000002
【００３５】
【配列番号：２】
0003945846.tif 000003
【００３６】
【配列番号：３】
0003945846.tif 000004
【００３７】
【配列番号：４】
0003945846.tif 000005
【００３８】
【配列番号：５】
0003945846.tif 000006
【００３９】
【配列番号：６】
0003945846.tif 000007
【００４０】
【配列番号：７】
0003945846.tif 000008
【００４１】
【配列番号：８】
0003945846.tif 000009
【００４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】インシュリンを産生するベータ細胞への分化およびパンクレアティックポリペプチド（ＰＰ）を産生するＦ細胞への分化に対するヒト・ベータセルリン蛋白質の濃度依存性を示す。横軸の〔Betacellulin〕（Ｍ）はヒト・ベータセルリン蛋白質の濃度（Ｍ）を示し、縦軸（Positive Cell）は全細胞に対する各ホルモンを産生した細胞の割合（％）を示す。○はインシュリンを産生するベータ細胞を、●はＰＰを産生する細胞を示す。
【図２】インシュリンを産生するベータ細胞への分化に及ぼす各種因子の効果を示す。縦軸は因子の名称を示し、横軸は全細胞に対するインシュリンを産生した細胞（Insulin Positive Cell）の割合（％）を示す。ActivinＡはアクチビンＡを、ＥＧＦは上皮成長因子を、ＴＧＦ-αはトランスフォーミング成長因子αを、Betacellulinはヒト・ベータセルリン蛋白質を示し、各濃度は１×１０-19Ｍである。ActivinＡ＋ＥＧＦ、ActivinＡ＋ＴＧＦ-αおよびActivinＡ＋Betacellulinは、それぞれ１×１０-19ＭのＥＧＦ、ＴＧＦ-αまたはBetacellulinに２×１０-19ＭのActivinＡを添加した場合を示す。
【図３】カリウムイオンまたはトルブタミド存在下におけるインシュリン産生ベータ細胞へ分化したＡＲ４２Ｊ細胞からのインシュリン分泌を示す。横軸のnone、highＫ+およびtolbutamideは、それぞれカリウムイオンならびにトルブタマイドの非存在下、４０ｍＭのカリウムイオン存在下、および１０μＭのトルブタマイド存在下を示す。縦軸（Insulin）は分泌したインシュリンの濃度（pg/mg・protein）を示す。
【図４】アロキサン処置前０週後に腹腔内糖負荷試験（ipGTT）を行なった時の糖尿病マウスにおけるヒト・ベータセルリン蛋白質の耐糖能改善作用を示す。横軸のTime(hour)は腹腔内への糖投与後の時間を示す。縦軸のBlood glucose(mg/ml)は血糖値を示す。○はアロキサン非処理マウスの、●はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質非投与マウスの、▲はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質投与マウスの結果を示す。
【図５】アロキサン処置４週後に腹腔内糖負荷試験（ipGTT）を行なった時の糖尿病マウスにおけるヒト・ベータセルリン蛋白質の耐糖能改善作用を示す。横軸のTime(hour)は腹腔内への糖投与後の時間を示す。縦軸のBlood glucose(mg/ml)は血糖値を示す。○はアロキサン非処理マウスの、●はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質非投与マウスの、▲はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質投与マウスの結果を示す。
【図６】アロキサン処置８週後に腹腔内糖負荷試験（ipGTT）を行なった時の糖尿病マウスにおけるヒト・ベータセルリン蛋白質の耐糖能改善作用を示す。横軸のTime(hour)は腹腔内への糖投与後の時間を示す。縦軸のBlood glucose(mg/ml)は血糖値を示す。○はアロキサン非処理マウスの、●はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質非投与マウスの、▲はアロキサン処理／ヒト・ベータセルリン蛋白質投与マウスの結果を示す。
【図７】ヒト・ベータセルリン蛋白質の膵臓癌細胞に対する増殖抑制作用を示す。横軸のＤａｙは培養日数を示す。縦軸のCell numberは膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ・クローン７１細胞の細胞数（×１０-3）を示す。○はヒトＢＴＣ蛋白質を含む培地で、●はヒトＢＴＣ蛋白質を含まない培地で培養した結果を示す。
【図１】
0003945846.tif 000010
【図２】
0003945846.tif 000011
【図３】
0003945846.tif 000012
【図４】
0003945846.tif 000013
【図５】
0003945846.tif 000014
【図６】
0003945846.tif 000015
【図７】
0003945846.tif 000016