(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）培地表面に多孔性膜を設け、その上に麹菌を置いて通常の培養条件で培養するか、又は、空隙を有する包括固定剤中で麹菌を通常の培養条件で培養し、その後、
（Ｂ）菌体が付着生育した多孔性膜、又は、包括固定化菌体を、それぞれ、２糖類以上の澱粉系物質を含有し、水分活性が０．９２〜０．９８の培地において、４０〜４５℃で培養することにより、
グルコアミラーゼをコードするｇｌａ  Ｂ遺伝子を発現せしめて該酵素の酵素活性を高めること、を特徴とする麹菌の培養方法。
【請求項２】
（Ａ）工程の後、（Ｂ）工程において、菌体が付着生育した多孔性膜、又は、包括固定化菌体を、前者にあっては多孔性膜ごと、又は、後者にあっては包括固定化剤自体を取り出し、該２糖類以上の澱粉系物質を含有し、水分活性が０．９２〜０．９８の培地に移行せしめ、４０〜４５℃で培養すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ａ）工程の後、（Ｂ）工程において、菌体が付着生育した多孔性膜、包括固定化菌体はそのままにしておき、該２糖類以上の澱粉系物質を含有し、水分活性が０．９２〜０．９８の培地に交換し、４０〜４５℃で培養すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（Ｂ）工程において、該２糖類以上の澱粉系物質が、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、デキストリン、可溶性澱粉、粉砕白米、米粉から選ばれるすくなくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（Ｂ）工程において、食塩、ショ糖、マルトース、糖類から選ばれる溶解性の高い溶質を使用して水分活性を０．９２〜０．９８に低下せしめること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
培養が固体培養又は液体培養であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
多孔性膜の孔径又は包括空隙が０．２〜３μｍであること、を特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（Ｂ）工程において、該２糖類以上の澱粉系物質を含有し、水分活性が低い培地が液化白米であること、を特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で製造してなる培養物。
【請求項１０】
培養物が、培養物それ自体、培養液、それらの濃縮物、ペースト化物、又は乾燥物であること、を特徴とする請求項９に記載の培養物。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の培養物を含有してなること、を特徴とする液体麹。
【請求項１２】
請求項１１に記載の液体麹を使用すること、を特徴とする清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコアミラーゼ活性の高い液体麹の製造、及びそれを用いる清酒の効率的製造に関する。更に詳細には、本発明は、従来グルコアミラーゼ活性が低いために清酒醸造には実用し得なかった液体麹について、その酵素活性を大幅に高めることに成功したものであって、この新規液体麹を使用することにより、清酒醸造の全工程を液相で行うことが可能となり、きわめて効率的に清酒を醸造することが可能となったのである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の清酒醸造は、蒸米表面に麹菌（Aspergillus oryzae）の胞子を散布し、蒸米上で増殖させた米麹を用いて行われるのが常である。このような固体培養では、液体培養で行う方が、培養制御や品質管理がはるかに容易になるはずであるが、実際の清酒麹の製造は固体培養でしか行われていない。これは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ菌が麹培養のような固体培養では非常に多量のグルコアミラーゼを生産するが、液体培養ではその生産性が著しく低いという大きな欠点を有しているためである。しかるに、清酒醸造において、グルコアミラーゼはもろみ発酵に必要不可欠な酵素であって、この酵素活性が低い培養法では清酒用麹として使用することができない。したがって現在まで、液体培養によって清酒醸造に満足のできる麹（液体麹）を製造することはできなかった。
【０００３】
一方、近年において、米を液化することにより清酒を醸造する新しい技術が開発され、この方法を用いることにより、流動性のすぐれたもろみの造成がはじめて可能となった。（今安ら、農化、６３、ｐ．９７１−９７９、１９８９）。このもろみの流動化により、品質管理や発酵制御がビール醸造と同様に容易になり、目的の品質に応じた清酒の醸造が可能となった。この液化仕込みでは、掛米は液化されているため、高い流動性を示すが、麹は前述の理由から固体麹を使用せざるを得ず、したがって、清酒もろみの完全な流体化には麹をも液体化することが不可欠である。
【０００４】
このように、液体培養による麹の製造は、多くの利点を有するにもかかわらず、その酵素生産性、特にグルコアミラーゼ生産性が低いため、未だに実現されていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した技術の現状に鑑み、清酒醸造の全工程の液体化を視野に入れて、固体麹と同等又はそれ以上の酵素活性を有する液体麹の創製を目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記したように清酒醸造を満足する酵素活性を保持した麹の液体化が望まれていることから、液体培養でもグルコアミラーゼを高生産する培養条件の検討を最重要課題とし、その課題解決のために各方面から検討の結果、遺伝子レベルでのアプローチにより必須条件を見出すこととし、検討を開始した。
【０００７】
本発明者らは、固体培養において特異的に大量発現する新しいグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）を発見し、そのプロモーター及び蛋白質コード領域の塩基配列を決定した（特願平８−２６７７０１）。この遺伝子は、既にA. oryzaeからクローニングされているグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）（Agric, Biol. Chem., 55, 941-949）とは異なる新規遺伝子であることが確認された。このｇｌａＢ遺伝子は、固体培養で発現し、液体培養では殆んど発現しないという特徴を有しており、A. oryzae菌が固体培養でグルコアミラーゼを高生産する原因はこの遺伝子の働きであることが証明された（Y. Hataら、J. Ferment. Bioeng., 84, p.532-537, 1997 ）。
【０００８】
そこで本発明者らは、この新規ｇｌａＢ遺伝子の発現機構を解析し、本遺伝子を高発現させる要因を探れば液体培養でもグルコアミラーゼ活性の高い液体麹の生産が期待されるとの新しい視点にはじめてたった。従来よりA. oryzaeの液体培養においてグルコアミラーゼを高生産させる条件については、その探求に多くの試みがなされているが、未だに固体培養レベルにまで生産量を増大させる条件は見出されていない。これは、本菌株には２つのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ、ｇｌａＢ）があり、グルコアミラーゼの生産性からの検討だけでは、どちらの遺伝子の発現の増大なのかが区別できなかったことが一因と考えられる。
【０００９】
したがって、本発明者らは、固体培養でのグルコアミラーゼ高生産に直接関与するｇｌａＢ遺伝子の発現のみを、遺伝子レベルで解析することが可能となれば、従来のグルコアミラーゼ生産性の検討では発見できなかったｇｌａＢ遺伝子の特異的誘導条件が明らかとなり、液体麹の実用化が達成されるのではないかとの観点にたった。すなわち、液体麹を製造するためには、ｇｌａＢ遺伝子を液体培養で発現させることが必要であり、上記のように固体培養で発現する遺伝子であれば、液体培養でも発現させることが可能ではないかとの新しい観点にたち、改めて、ｇｌａＢ遺伝子を液体培養で発現せしめ、グルコアミラーゼを著量生産せしめることを新たに解決すべき課題として設定した。換言すれば、麹菌のｇｌａＢ遺伝子が液体培養において発現するための麹菌の培養条件を新たに設定することを解決すべき課題として設定したのである。
【００１０】
そこで先ず、ｇｌａＢ遺伝子がどのような環境条件下で発現しているか調べるため、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの解析を行った。すなわち、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの下流にレポータ遺伝子を連結し、そのレポータ遺伝子産物の活性をプロモータ発現の指標とする方法を採用した。
【００１１】
具体的には、図１に示すような、形質転換用マーカーであるA. oryzae（硝酸還元酵素欠損変異株）のｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451, 1986）を含むベクターｐＮＧＵＳを作製した。そして、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に、ｇｌａＡあるいはｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域を挿入して、それぞれのプロモーター解析用プラスミドｐＮＧ−ＧＡ、ｐＮＧ−ＧＢを構築した。
【００１２】
これらのプラスミドによりA. oryzae（Aspergillus oryzae GLB-01：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８２６として寄託されている）のｎｉａＤ変異株（亜硝酸を資化できない変異株：Nitrate Reductase 欠損株）を形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｉで１コピーだけ導入された形質転換体をそれぞれ選択した。
【００１３】
これらの形質転換体を用いて、後記するところにしたがって様々な培養条件により培養し、生産されるＧＵＳ活性を測定し、両プロモーターの発現条件についての検討を行った。その結果、ｇｌａＢ遺伝子の発現は、アミラーゼの誘導基質である澱粉系物質の他に、培地の水分活性や培養温度、更には菌糸生育にストレスを与えることによっても誘導されることをはじめてつきとめた。
【００１４】
具体的には、次のような新知見が得られた。すなわち、マルトースや食塩等を培地に添加することによって、培地の水分活性を０．９５以下に低下させたところ、ｇｌａＡの発現に対してｇｌａＢの発現が飛躍的に上昇した。また、培養温度を３７℃から４２℃に上昇させることによっても、ｇｌａＢの発現のみが誘導された。更にまた、孔径０．４５μｍ以下のニトロセルロース膜やナイロン膜上で菌糸を生育させることによっても、ｇｌａＢの発現のみが２倍以上に上昇した。
【００１５】
しかしながら低水分活性や高い培養温度では、菌体の増殖が阻害されるため、菌体当たりの生産量は高いものの、培地当たりの総生産量は極めて低いし、条件によっては菌自体が死滅する場合もあって、結局、実用に供するには問題があった。そこで本発明者らは、鋭意各方面から研究を行った結果、最初は高い水分活性且つ低い温度で培養して菌体を増殖させ、次に、低水分活性培地へ移して高い温度で培養する２段階培養法、すなわち、培養相（フェーズ）を分割シフトする方法を考案した。
【００１６】
具体的には、澱粉を含む寒天培地上に孔径０．４５μｍのニトロセルロース膜をのせ、その上でA. oryzaeを３０℃で２日間培養後、菌糸の増殖した膜をマルトースにて水分活性を０．９４にまで低下せしめた寒天培地上に移し、更に４２℃で２日間培養した。その結果、この培養法によれば、寒天培地にもかかわらず、麹培養とほぼ同程度のｇｌａＢの発現が確認された。更に、グルコアミラーゼ活性においても、清酒麹とほぼ同程度の生産性が示された。
【００１７】
上記したところから、本発明者らは、ｇｌａＢ遺伝子の発現誘導条件として、澱粉系物質、水分活性、培養温度、菌糸生育ストレスがあることをはじめてつきとめ、これらの条件を含んだ培養を実際の麹菌について行うことにより、麹固体培養以外でも大量のグルコアミラーゼが生産されることを発見した。具体的には、A. oryzaeを０．４５μｍ以下の孔径の膜上や、空隙率を制限した包括固定化剤中で培養し、菌糸が充分に生育した時点で、先のｇｌａＢ発現の誘導条件に移して培養を行うことにより、ｇｌａＢ発現の誘導条件を効率的に利用して、液体培養であっても、充分固体培養レベルのグルコアミラーゼを生産できることを確認した。
【００１８】
すなわち本発明者らは、ｇｌａＢ遺伝子の発現条件について、澱粉系物質、低水分活性、高温処理、菌糸生育ストレスの４条件が必要であることをはじめてつきとめ、この新知見に基づき、実際の麹菌の培養にこれらの条件を適用したところ（つまり、これらの培養条件で実際の麹菌を培養したところ）、固体培養はもとよりのこと液体培養においても、著量のグルコアミラーゼの生産を実際に確認した。そして更に、このようにして得た液体培養物を液体麹として用いて清酒を醸造することにも成功した。
本発明は、これらの有用新知見に基ずき、更に検討の結果遂に完成されたものである。以下、本発明について詳しく説明する。
【００１９】
本発明において麹菌を培養するに際して、その培地としては、特に、澱粉系物質を含有すること、水分活性が低いことが必要である。
本発明において、培地には炭素源として、澱粉系物質を含有せしめる。澱粉系物質としては、多糖類が使用され、例えばマルトース、イソマルトース、マルトトリオース、デキストリン、可溶性澱粉、粉砕白米、米粉等が単用又は２種以上併用される。
【００２０】
微生物が利用できる水分量（自由水）である水分活性は、本発明においては低い方がよく、０．９２〜０．９８（純水の蒸気圧に対する溶液の蒸気圧の相対湿度として表示）とするのが好適である。水分活性を低下せしめる方法としては、含有水分量を減らす方法のほか、食塩やショ糖、マルトース等糖類その他の溶質を添加する方法が適宜採用される。
【００２１】
液体溶液であっても、食塩やショ糖などの溶解性の高い溶質を添加することにより、固体麹レベルあるいはそれ以下にまで水分活性を低下させることが可能である。固体麹の最終水分活性は約０．９４であるが、例えば液体培地に食塩を８％あるいはマルトース５０％添加することにより、水分活性が０．９４まで低下する。したがって、液体麹においても、水分活性を低下せしめることができる。
【００２２】
培養温度は、高い方がよく、好適には２５〜４５℃、更に好適には３０〜４２℃とするのがよい。
【００２３】
本発明を実施するための菌糸生育ストレスを与える培養法としては、例えば、培地表面に多孔性膜を設け、その上に麹菌を置いて培養すればよい。その際、多孔質の孔径について厳格な規定はないが、０．７μｍ以下であればよく、０．４５μｍ以下であれば更に好適である。多孔性膜としては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等、麹菌の生育を阻害しない多孔性膜（精密濾過用メンブレン）であればすべてのものが使用可能である。
【００２４】
またあるいは、空隙を有する包括固定化剤中で麹菌を培養してもよい。空隙の孔径については、上記と同様にすればよい。この方法は、ゲルの細かい格子の中に麹菌糸あるいは胞子を取り込ませて固定化し、これを培養液中で（静置、攪拌、又は振とうしながら）培養したり、培養液や固体培地上に浮遊、載置して培養するものである。ゲルとしては、例えば、アルギン酸ナトリウム、コンニャク粉、ポリビニルアルコールゲル、ポリアクリルアミドゲル、寒天、カラギーナン、光架橋性樹脂等が例示される。
【００２５】
先に述べたように、本発明者らは、低水分活性と高温処理とは、それぞれ単独でもｇｌａＢ遺伝子の発現を特異的に上昇させることを見出したが、これら両因子を満たす培養条件では菌体の生育が全く認められなかった。そこで、このような苛酷な条件でも菌体を生育せしめることができる方法について各方面から検討を行った結果、培養相をシフトする方法、つまりフェーズ分割培養を開発するに至った。
【００２６】
フェーズ分割培養を実施するには、例えば先ずはじめに、通常の培地に多孔性膜（メンブレン）を敷き、ここで麹菌を通常の培養条件（例えば２８〜３２℃、１〜３時間）で培養した後、メンブレンに付着生育した菌体をメンブレンごと、低水分活性培地上に移行し、例えば４０〜４５℃といった高温で培養すればよい（メンブレントラスンファー培養法）。
【００２７】
包括法によって麹菌を固定化した場合も上記と同様であって、先ずはじめに麹エキス等通常の培地を用いて通常の培養条件（例えば２８〜３２℃、１〜２日間）で培養した後、固定化菌体を低水分活性培地上に移行し、例えば４０〜４５℃といった高温で培養することによって、フェーズ分割培養を実施することができる。
【００２８】
上記においては、メンブレンやゲルにおいて通常の培養条件で麹菌を培養した後、メンブレンやゲル自体を低水分活性培地に移行して高温培養したが、これとは逆に、メンブレンやゲル自体はそのままにしておき、培地を変換して高温培養してもよい。また、培養を終了した後であっても、メンブレンやゲルに付着している菌体は生存しているので、再利用することができる。
【００２９】
このように本発明者らが新たに開発した新規フェーズ分割培養法には、メンブレントランスファー培養法その他各種の態様が含まれるが、このフェーズ分割培養法によれば、通常麹菌が生育し得ない条件のもとでも麹菌の培養を継続することができ、固体培養及び液体培養のいずれにおいても可能である。
【００３０】
このようにして得た培養物は、ｇｌａＢ遺伝子が充分に発現した菌体から得られており、その結果グルコアミラーゼを著量含有しているため、各種の用途、例えば液体麹として利用することができる。この培養物は、そのままそれ自体で使用できるほか、固体部分を除去して培養液、そ（れら）の濃縮物、ペースト化物、乾燥物といった処理物も使用できる。
【００３１】
本発明に係る培養物及び／又はその処理物は、グルコアミラーゼ活性が高く、各種の用途に広く使用することができ、例えば液体麹として広範に使用することができる。したがって本発明に係る液体麹は、清酒醸造やアルコール発酵等における酒母や各仕込段階で、従来用いられている固体麹の代りに広く使用することができる。もちろん、固体麹の一部代替品として液体麹を使用し、固体麹と液体麹を併用することももちろん可能である。
【００３２】
従来の麹利用工業においては、麹としては固体麹を使用せざるを得なかったため、機械化や工業化、連続作業等が非常に困難であったが、本発明によって麹の液状化がはじめて可能となったので、本発明の係る液体麹を使用することにより、各種の麹利用工業を効率化することがはじめて可能となった。
【００３３】
したがって、本発明に係る液体麹を使用することにより、近年開発された清酒の液化仕込における掛米の液化技術と結合することによって、清酒醸造の全工程を液相で実施することがはじめて可能となり、清酒醸造の連続工業化、効率化がはじめて可能となった。
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。
【００３４】
【実施例１】
プロモーター解析用プラスミドｐＮＧ−ＧＡ（ｇｌａＡ）、ｐＮＧ−ＧＢ（ｇｌａＢ）を A. oryzae に形質転換した後、ＧＵＳ活性の定量を行うため、導入プラスミドが宿主染色体上に単一コピーで相同組み換えした形質転換体を解析株とし、ｇｌａＡ、ｇｌａＢそれぞれ２株ずつ選択した。
【００３５】
ｇｌａＡ、ｇｌａＢの形質転換株、それぞれ２株ずつ（形質転換体１、形質転換体２）について、液体培養及び固体培養を行い、ＧＵＳ発現量を測定した。液体培地としては、改変ツァペックドックス培地（デンプン３％、０．３％  ＮａＮＯ3、０．２％  ＫＣｌ、０．１％  ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２％  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を用い、固体培地としては、精米歩合７０％の白米（日本晴）を使用した。なお、ＧＵＳアッセイは、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451 (1986)）にしたがって行った。得られた結果を下記表１に示す。
【００３６】
【表１】
0004011182.tif 000002
【００３７】
上記した、これらの形質転換体の液体培養と固体培養での菌体内ＧＵＳ活性の測定結果から明らかなように、同じプラスミドから得られた形質転換体は、各培養で同程度のＧＵＳ生産量を示した。
先ず、澱粉を炭素源とした液体培養では、ｇｌａＡプロモーターの形質転換体は１，０００（Ｕ／ｍｇ−蛋白質）以上のＧＵＳ活性を示したが、ｇｌａＢプロモーターの形質転換体はその約１０分の１の生産量しか示さなかった。一方、固体培養では、逆に、ｇｌａＢプロモーターはｇｌａＡの約２００倍のＧＵＳ発現量を示した。
この結果は、ｇｌａＢ遺伝子が固体培養で特異的に発現することを示すものであった。したがって、このプロモーター解析系によってｇｌａＢ遺伝子の発現条件の検討が可能であることが明らかとなった。
【００３８】
【実施例２】
実施例１で使用した各プロモーターの形質転換体１株（解析株）を、さまざまな炭素源を含むツァペックドックス培地にて（実施例１の液体培地において、澱粉にかえて各種炭素源を使用）、３０℃で３日間液体培養を行い、その菌体内のＧＵＳ活性を測定し、ｇｌａＡ、ｇｌａＢのプロモーター活性を比較した。得られた測定結果を下記表２に示す。
【００３９】
【表２】
0004011182.tif 000003
【００４０】
上記のように、ｇｌａＡ、ｇｌａＢ両プロモーターの発現に関する炭素源の影響について検討した結果、その発現はグルコースに比べてマルトースなど２糖以上の澱粉系物質によって誘導されており、ｇｌａＡ同様、ｇｌａＢプロモーターも澱粉系物質を主要制御因子とすることが判明した。
【００４１】
【実施例３】
マルトースを溶質として水分活性を低下させたプレート培地、すなわちマルトースを種々の濃度（２０〜６０％）に含むツァペックドックス寒天培地にて、解析株を培養し、ｇｌａＡ株、ｇｌａＢ株の菌体内のＧＵＳ活性を測定、比較することにより、ｇｌａＡ、ｇｌａＢプロモーターの発現に関与する水分活性の影響を検討した。なお、水分活性（Ａｗ）の測定は、水分活性測定装置（Rotronic社製、HygrosKop DP型）を用い、密閉セルに試料を入れて、セル内空間と平衝状態になったときの相対湿度を測定して行った。得られた結果を図２に示す。
【００４２】
上記した測定結果から明らかなように、マルトース濃度が増加し、水分活性が低下する（Ａｗ０．９８〜０．９２）につれ、ｇｌａＢの発現がｇｌａＡに比べて特異的に増加した。また、水分活性の低下には塩化ナトリウムを用いても同様にｇｌａＢの発現が特異的に増加したことにより、水分活性が低下させる種々の薬剤を使用しても同様な結果が期待される。しかし、水分活性を下げても良いが、菌体の増殖は阻害されることも確認された。
【００４３】
【実施例４】
ｇｌａＢの発現に関し、培養温度の影響について測定を行った。澱粉を含む寒天培地で培養温度を３０℃、３７℃、４０℃に設定し、麹菌を培養して、ｇｌａＡ株、ｇｌａＢ株の菌体内のＧＵＳ活性を比較した（図３）。その結果、図３のように４２℃という高温で、ＧＵＳの生産量が飛躍的に増加した。
【００４４】
【実施例５】
低水分活性と高温がそれぞれ単独でもｇｌａＢの発現を特異的に上昇させることが明らかとなったが、これらの両因子を満たす培養条件では菌体の生育が全く認められなかったため、両因子を同時に満たす培養法として、フェーズ分割培養（シフト培養ということもある）を行った。
【００４５】
フェーズ分割培養は、通常の培養条件下で生育した菌体について、これを低水分活性、高温の培養条件に移行して培養する方法であって、菌体の生育は確保しながら、ｇｌａＢを効率的に発現する、つまりＧＵＳを著量生産せしめる、ひいてはグルコアミラーゼを著量生産せしめる新規培養法である。
【００４６】
すなわち、通常プレート培地（実施例１の改変ツァペックドックス培地に寒天を１．５％添加した培地）上に多孔性膜（ニトロセルロースメンブレン：孔径０．４５μｍ）（アドバンテック東洋社製、Cellulose Nitrate A1045 を使用）を敷き、この上に麹菌の分生子を接種して３０℃で２日間培養した（通常培養）。その後、メンブレンに付着した菌体をメンブレンごと、５０％マルトースを含む低水分活性プレートへ移行後、さらに４２℃で２日間培養後ＧＵＳアッセイを行った（フェーズ分割培養）。
なお、シフトを行うことなく通常培養を継続したもの、つまり初期条件のまま一定条件で４日間プレート培養を行ったもの（一定培養）についても、同様にｇｌａＢの発現を検討するため、ＧＵＳアッセイを行った。
【００４７】
下記表３に、シフト培養法（メンブレントランスファー培養法ということもある）によるＧＵＳアッセイの結果を示した。上がメンブレンを用いずシフトを行わない一定条件下での一定培養、下がメンブレンを用いた低水分活性あるいは高温へのシフト培養である。その結果、フェーズ分割培養を行うことにより、低水分活性培地での高温培養が可能となり、両者の相乗効果によってｇｌａＢの発現のみが飛躍的に（約３０倍）増加した。また、ニトロセルロース膜に代えて他のセルロース膜、ナイロン膜のいずれもｇｌａＢが高発現することが確認された。
【００４８】
【表３】
0004011182.tif 000004
【００４９】
【実施例６】
多孔性膜面で培養することにより、ｇｌａＢの発現がどのような影響を受けるかを検討した（図４）。その結果、多孔性膜上で培養することに、通常の寒天培地よりｇｌａＢの発現が２倍以上に増加した。更にメンブレンのポアサイズの影響を検討した。その結果、図４に示したように、ｇｌａＡはポアサイズの影響を受けないのに対し、ｇｌａＢプロモーターのＧＵＳ発現量はメンブレンのポアサイズが減少するにつれて増加した。特に、麹菌糸の直径により近い０．４５μｍ以下のポアサイズの膜で、顕著な発現増加が確認された。このことは、ｇｌａＢの遺伝子発現には菌糸の伸長へのストレス（物理的ストレス）の関与を示すものである。
【００５０】
【実施例７】
澱粉、低水分活性、高温及び物理的ストレスの４つの因子を満たした培養法により、ｇｌａＢプロモーターはＧＵＳ活性においては麹固体培養レベルの値を与えたが、その際の各種酵素の生産量について検討した。なお、培地としては、実施例１の改変ツァペックドックス培地に寒天を１．５％加えたものに、水分活性低下剤として５０％マルトースを添加したものを使用した。実際の製麹に使用される野生株の麹菌（Aspergillus oryzae GLB-01（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８２６）を上記４つの因子を満たしたメンブレントランスファー培養後、メンブレンの下の寒天培地中に分泌される各種の酵素活性力価を測定した。得られた結果を下記表４に示す。なお、各酵素活性の測定は、「第四回改正  国税庁所定分析法注解」によった。
【００５１】
【表４】
0004011182.tif 000005
【００５２】
上記結果から明らかなように、液体培養で著しく生産量の低いグルコアミラーゼ活性も、ｇｌａＢ誘導条件を加えたフェーズ分割培養により、麹固体培養の生産量と同程度に上昇した。したがって、これら４つの因子を満足することにより、液体培養においても麹固体培養と同程度のグルコアミラーゼ生産が可能であることが確認された。
【００５３】
【実施例８】
フェーズ分割培養法を応用して、実際の清酒醸造に使用可能な液体麹の生産を行った。先ず、麹菌を包括空隙が約０．４５μｍになるようアルギン酸ナトリウムで固定化し、この固定化菌体を麹エキスにて３０℃で２日間振とう培養した。次に、培地を液化白米（水分活性０．９４％）に交換し、４２℃で２日間培養し、培地中のグルコアミラーゼ活性及びその他の酵素活性を測定した。得られた結果を下記表５に示す。
【００５４】
【表５】
0004011182.tif 000006
【００５５】
上記結果から明らかなように、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼともに固体麹とほぼ同程度の培養液が得られ、液体麹として使用可能であることが確認された。
【００５６】
【実施例９】
麹菌体をニトロセルロース膜面上で培養し、フェーズ分割培養を行った。先ず、ポアサイズ０．２μｍのニトロセルロース膜に麹菌を接種し、麹エキス液体培地上にこれを浮かべ、３０℃で２日間培養し、菌体が充分に生育した後、培地を先の液化白米に交換し、４２℃で２日間培養を続け、培地中のグルコアミラーゼ活性及びその他の酵素活性を測定した。得られた結果を下記表６に示す。
【００５７】
【表６】
0004011182.tif 000007
【００５８】
上記結果から明らかなように、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼともに固体麹とほぼ同程度の培養液が得られ、液体麹として使用可能であることが確認された。また、培養を終了した膜上の菌体は、充分に生存しており、再度またはそれ以上、麹エキスで培養することにより再利用することが可能であった。
【００５９】
【実施例１０】
実施例９において調製した液体麹を用い、全工程液相による清酒醸造を行った。すなわち、仕込み配合は、総米１ｋｇとし、液体麹仕込みは、汲み水の２０％を液体麹で代替し、総米はすべて掛米として液化白米を利用した。また、対照仕込みの麹歩合は２０％とした。図５にその発酵経過を示した。
【００６０】
その経過から明らかなように、固体麹を使用した対照仕込みと比較して、液体麹を用いた仕込みにおいても、ほとんど同程度の発酵経過を示した。また、両者の上槽酒においても、酒質の差異はほとんど認められず、液体麹を用いても充分に清酒醸造が可能であることが確認された。
【００６１】
上記したところから明らかなように、本発明によれば、液体培養によっても清酒醸造に必要充分なグルコアミラーゼ活性の高い麹を製造することができ、その結果、固体培養に比べて極めて精密な培養管理を行うことが可能となり、品質の高い麹を安定的に製造することができる。また、麹の液体化は、もろみを流動化させるばかりでなく、麹製造プロセス、ついては清酒醸造プロセスの省力化、効率化にも大きく貢献するものである。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によってｇｌａＢ遺伝子を液体培養においても発現させることにはじめて成功し、グルコアミラーゼ活性が高い培養物を得ることがはじめて可能となった。この培養物は、例えば液体麹として利用することができ、固体麹を使用する従来の清酒醸造の全工程を液相のままで進行せしめることが可能となり、本発明は、従来にない全く新規にしてしかも効率的な清酒醸造システムを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＵＳ発現プラスミドの構築図である。
【図２】ＧＵＳ生産に及ぼす培地の水分活性Ａｗの影響を示し、Ｂ／ＡはｇｌａＡとｇｌａＢプロモーターのそれぞれの形質転換体のＧＵＳ活性の比（％）を示すものである。
【図３】ＧＵＳ生産に及ぼす温度の影響を示す。
【図４】ＧＵＳ生産に及ぼすメンブレンの影響を示す。
【図５】液体麹を用いた清酒醸造における発酵経過を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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