(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４のいずれかで表される配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲ法によりアカシア属熱帯早生樹のゲノムＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡ長の違いによってAcacia auriculiformis、Acacia mangiumおよびこれらの種間雑種を早期に検定する方法。
【請求項２】
配列番号５で表される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６で表される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、ならびに／または
配列番号７で表される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８で表される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
を用いて、ＰＣＲ法によりアカシア属熱帯早生樹のゲノムＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡ長の違いによってAcacia auriculiformis、Acacia mangiumおよびこれらの種間雑種を早期に検定する方法。
【請求項３】
Acacia auriculiformis、Acacia mangiumおよびこれらの種間雑種を早期に検定するためのプライマーであって、配列番号１〜４のいずれかで表される配列を有するオリゴヌクレオチドからなる前記プライマー。
【請求項４】
Acacia auriculiformis、Acacia mangiumおよびこれらの種間雑種を早期に検定するためのプライマーセットであって、
配列番号５で表される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６で表される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、ならびに
配列番号７で表される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８で表される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
から選択される、前記プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱帯早生樹における種間雑種の早期検定方法に関し、更に詳しくは、林木育種上、有用である熱帯早生樹における種間雑種を遺伝子診断を用いて検定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アカシア属、ユーカリ属、フタバガキ科、マングローブ樹種、モルッカネムなどに代表される熱帯早生樹の育種は、成長量、耐病性、樹形及びセルロース含量などの産業利用面での有用形質に優れたものを選抜することがその基本となる。すなわち、選抜された個体由来の実生苗、あるいは挿し木や組織培養によって作出したクローン苗を用いて、優れた形質を有する人工林が作られる。紙パルプ原料としてのこれら熱帯早生樹の利用は、熱帯地域の既存天然林に因らない人工植林によって供給されており、原料の安定供給を考慮した場合においても育種技術を駆使したベトナム、タイ、インドネシアなどでの効率的な海外植林事業が必須である。こうした従来育種の流れにおいて、自然交雑に由来する種間交雑個体群の中に、親種に比較して優れた形質を有する場合があることが知られている。ある程度選抜育種の進んだ段階においては、今後、交雑育種を用いた植林が積極的に進められることが予想される。
交雑種の獲得においては、人工交配が可能である熱帯早生樹種では比較的容易であると考えられるが、花器の構造が複雑である場合などは、除雄作業が難しく、自然交配による種子の獲得が一般的であり、従って同一種間内での交配、あるいは自殖由来の種子が相当数混在する。従来育種では自然交配由来の実生苗の検定作業を設定し、一定期間育成させた後の形態的特徴の比較やアイソザイム分析により交雑種を同定しているのが一般的である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、形態による判定は、識別者の経験に基づく主観的判断であり、必ずしも正確な検定方法とは言い難い。また、アイソザイム分析においては、タンパク質を扱うために個体の生育条件や分析過程におけるプロテアーゼによる分解などの不確定要因により、必ずしも正確な判定が可能とは言えない。また一定期間、生育させる必要があることから、早期の選定は不可能であった。
本発明は以上のような課題にかんがみてなされたものであり、その目的は、遺伝子診断を用いた正確かつ早期の熱帯早生樹における種間雑種の検定方法の提供による育種の効率化を図ることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は熱帯早生樹における種間雑種の早期検定方法に関する発明であって、任意のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲ法により熱帯早生樹のゲノムＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡ長の違いによって、熱帯早生樹における種間雑種を早期に検定することを特徴とする。
また、本発明の第２の発明も熱帯早生樹における種間雑種の早期検定方法に関する発明であって、特定の配列を有するオリゴヌクレオチド、若しくはそれらに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲ法により熱帯早生樹のゲノムＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡ長の違いによって熱帯早生樹における種間雑種を早期に検定することを特徴とする。
本発明の第３の発明はプライマーに関する発明であって、配列表の配列番号５〜８で表される配列を有するオリゴヌクレオチド、若しくはそれらに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれかよりなることを特徴とする。
【０００５】
本発明者らは前記状況にかんがみ、より優れた熱帯早生樹種間雑種の検定方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、熱帯早生樹個々の遺伝子において塩基配列の差異を効率よく検出する方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明によれば、まずサンプルとなるアカシア属、ユーカリ属、フタバガキ科、マングローブ樹種、モルッカネムなどに代表される熱帯早生樹からＤＮＡを抽出した。サンプルからのＤＮＡの抽出はワグナー（Wagnar）らの方法を基本とし、本発明者らによって、より簡便となるような改良を加えた方法により行った。次に、該ゲノムＤＮＡに任意のオリゴヌクレオチドをプライマーとして作用させて、ＤＮＡを増幅させた。ＤＮＡの増幅はＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ）法により行った。そして、このようにして得られた増幅ＤＮＡについて、アガロースゲルあるいはアクリルアミドゲル電気泳動を用いてＤＮＡ長の差異を検出することにより熱帯早生樹種の識別を行った。
【０００７】
本発明は、特定の塩基配列に基づく情報などを一切必要とせず、任意のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。更に複数のオリゴヌクレオチドを用いれば、いかなる熱帯早生樹における種間雑種においても満足のいく検定方法となりうる。具体的には、ＤＮＡの塩基配列に基づいた再現性の高い確実な識別が可能であること、発芽後の実生の段階（播種より１ないし２週間）で識別できるため、従来育種における形態的特徴を識別するために要する育成時間（播種より少なくとも数ヵ月から半年以上を要する）及びこれに要する用地が不要であることが挙げられる。本発明により、従来林木育種法において必須とされてきた検定作業にかかる時間、費用、用地を大幅に省略した新規の林木育種法を提供できる。
【０００８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
なお、特に詳細の記述のない方法については、１９８２年、コールド  スプリング  ハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis) ほか著、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual)に従って行った。
【０００９】
また、以下の各実施例においては、Acacia auriculiformis(以下、A.aur と記す）、Acacia mangium（以下、A.man と記す）、及び既に形態上の識別によって確認されているA.aur とA.man 間の種間雑種（以下、雑種と記す）、未確認のA.aur とA.man 間の種間雑種を材料に用いた。
【００１０】
実施例１
＜材料と方法＞
ＰＣＲ法のための鋳型となる最適なＤＮＡ抽出法及びオリゴヌクレオチドの入手、並びにＤＮＡ増幅に好ましいＰＣＲ条件と試薬の一例を以下に記載する。下記条件を用いたＤＮＡ増幅の結果は以後の実施例に記載する。
【００１１】
＜ＤＮＡ抽出＞
各材料より約30mgの組織（葉，根あるいは茎の肥厚組織）を1.5 mlマイクロチューブ内に取り、次いでプラスチック製の破砕棒を使ってすり潰すように破砕した。その後の方法は原法に従い行った。ただし、原法と異なり、液体窒素を用いることなくかつDNA 抽出のすべてをマイクロチューブ内で一貫して行うことにより一度に多試料を扱うことが可能である。
【００１２】
＜オリゴヌクレオチドの入手＞
オリゴヌクレオチドは、ブリティッシュ・コロンビア大学（カナダ）から800 個購入して用いた。
【００１３】
＜任意のオリゴヌクレオチドを用いたDNA 増幅＞
抽出したゲノムDNA10ng 、dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 0.2mM（終濃度）、オリゴヌクレオチド0.15μM （終濃度）、Taq DNA polymerase〔ベーリンガー (Boehringer）社製〕 0.2ユニット（ units）及びTaq DNA polymeraseに添付の反応用バッファーを含むPCR 用反応液20μl について、変性のステップとして94℃で30秒間、アニーリングのステップとして45℃で30秒間、鎖伸長のステップとして72℃で１分間を１サイクルとし、計35サイクルのPCR 反応をサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いて行った。ただし、アニーリング温度から鎖伸長温度までの到達時間を２分間に設定した。PCR 産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供し、FMC のSYBR Green Iを用いて染色した後、UV照射にて視覚化した。A.aur あるいはA.man のゲノムDNA を用いて、800 個のオリゴヌクレオチドすべてについてPCR 反応におけるDNA 増幅の有無を確認した結果、何らかのバンドパターンを示すオリゴヌクレオチドを数百個検出した。
【００１４】
実施例２
＜アカシア種の識別＞
ベトナム社会主義共和国より植栽後３年間生育させたA.aur ４個体とA.man ４個体を入手し、ゲノムDNA 及び後記表１中の式(1) 〜(4) に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR を行った場合の両者の識別結果を示した（図１）。すなわち、図１はオリゴヌクレオチド(1) 〜(4) をプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。図中、a1からa4はA.aur を、m1からm4はA.man を、Ｍは宝酒造社製電気泳動マーカーφx174-HincII digestを示す。図中の矢印（黒）はA.aur に特異的なDNA バンド、矢印（白抜き）はA.man に特異的なDNA バンドを示す。
なお、表１中の式(1) 〜(4) で示す塩基配列は、後記配列表のそれぞれ配列番号１〜４に相当する。
【００１５】
【表１】
0003965751.tif 000002
【００１６】
図１に示すように、オリゴヌクレオチド（１）では、740bp の位置にA.aur に共通する特異的なバンド及び980bp の位置にA.man に共通する特異的なバンドを検出した。オリゴヌクレオチド（２）では、210bp の位置にA.aur に共通する特異的なバンド及び770bp の位置にA.man に共通する特異的なバンドを検出した。オリゴヌクレオチド（３) では、620bp の位置にA.man に共通する特異的なバンドを検出した。オリゴヌクレオチド（４）では、800bp の位置及び600bp の位置にA.aur に共通する特異的なバンドを検出した。これらの結果より、任意のオリゴヌクレオチドを用いて行ったPCR 反応による分析結果を単独あるいは複数比較して用いることによってA.aur 及びA.man の種間識別が可能であることが示された。
【００１７】
なお、個体別に詳しく比較すると、A.aur 及びA.man の双方でバンドの出現に差異が見られるが、これは林木特有の同一種間内におけるヘテロ性を反映した結果であると考えられる。これら個々の差異については本発明における技術的な支障とはなりえない。
【００１８】
実施例３
＜アカシア種間雑種の識別＞
実施例２で示した方法と同様に雑種（H1及びH2) に対する結果を示した( 図 2) 。すなわち図 2は、オリゴヌクレオチド(1) 〜(4) をプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。図中、a5及びa4はA.aur を、Ｈ１及びＨ２はA.aur とA.man 間の種間雑種を、ｍ３及びｍ５はA.man を、Ｍは宝酒造社製電気泳動マーカーφｘ174-Hincll digest を示す。図中の矢印（黒）はA.aur に特異的なＤＮＡバンド、矢印（白抜き）はA.man に特異的なＤＮＡバンドを示す。
図２に示すように、オリゴヌクレオチド（１）、並びにオリゴヌクレオチド（２）ではＨ１及びＨ２共にA.aur とA.man 各々特異的なバンド両方を検出した。オリゴヌクレオチド（３）ではＨ１及びＨ２共にA.man に特異的なバンドを検出した。オリゴヌクレオチド（４）ではＨ１及びＨ２共にA.aur に特異的なバンドを２本共検出した。これらの結果より、任意のオリゴヌクレオチドを用いて行ったＰＣＲ反応による分析によってA.aur 、A.man 及び雑種の識別が可能であることが示された。
【００１９】
実施例４
＜未確認雑種の検定＞
実施例２及び実施例３で得られた結果を基に、未確認ながら形態的特徴において雑種と判定された６個体（Ｈ３からＨ８）に対し、本発明による分析を行った（図３）。すなわち図３は、オリゴヌクレオチド（１）〜（４）をプライマーに用いてＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。図中、ａ５及びａ４はA.aur を、Ｈ３からＨ８はA.aur とA.man 間の未確認種間雑種を、ｍ３及びｍ５はA.man を、Ｍは宝酒造社製電気泳動マーカーφx174-HincII digestを示す。図中の矢印（黒）はA.aur に特異的なDNA バンド、矢印（白抜き）はA.man に特異的なDNA バンドを示す。
図３に示すように、実施例２及び実施例３と同様にA.aur とA.man に特異的なバンドを検出可能なオリゴヌクレオチド（１）、及び（２）を用いた結果、Ｈ６を除く５個体は、A.aur とA.man の特異的なバンド両方を検出した。Ｈ６はA.aur に特異的なバンドのみを検出した。次にオリゴヌクレオチド（３）を用いた結果、Ｈ６を除く５個体は、A.man の特異的なバンドを検出した。オリゴヌクレオチド（１）、及び（２）と同様、Ｈ６はA.man に特異的なバンドを検出しなかった。更にオリゴヌクレオチド（４）を用いた結果、６個体のすべてにおいてA.aur に特異的なバンドを２本共検出した。以上の結果を併せて用いることによって、これら６個体のうちＨ６を除く５個体は雑種であると判断された。Ｈ６については、A.aur である可能性が高いと言える。この結果が示すように、形態的特徴による識別は、必ずしも正確な判定法とは言い難く、この点において本発明による遺伝子レベルでの分析が有効であることが示された。
【００２０】
実施例５
＜識別の簡略化＞
上記実施例に示した通り、任意のプライマーから得られるバンドパターンにより容易に雑種識別が可能であるが、更に識別を簡略的にすることを目的として、特異的バンドのみの増幅について検討した。
オリゴヌクレオチド（１）を用いて得られた特異的バンドをインビトロゲン社製のサブクローニングキット（TA cloning kit）を用いて、サブクローニングした後、アプライドバイオシステム社製のシークエンサーを用いてバンドの塩基配列を決定した。得られた塩基配列を基に、下記表２に示したプライマーの配列をデザインし、合成した。合成したプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、上記実施例で示された識別可能な特異的バンドのみを増幅できた（図４）。すなわち、図４はオリゴヌクレオチド（５）及びオリゴヌクレオチド（６）を混合した場合、並びにオリゴヌクレオチド（７）、オリゴヌクレオチド（８）を混合してプライマーに用いてＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。図中、ａ５及びａ４はA.aur を、Ｈ３からＨ８はA.aur とA.man 間の未確認種間雑種を、ｍ３及びｍ５はA.man を、Ｍは宝酒造社製電気泳動マーカーφｘ174-Hincll digest を示す。図中の矢印（黒）はA.aur に特異的なＤＮＡバンド、矢印（白抜き）はA.man に特異的なＤＮＡバンドを示す。
なお、表２中の式（５）〜（８）で示す塩基配列は、後記配列表のそれぞれ配列番号５〜８に相当する。
【００２１】
【表２】
0003965751.tif 000003
【００２２】
図４に示すように、図３におけるオリゴヌクレオチド（１）を用いて得られた結果がより明確に示された。すなわち、前例よりも更に明確かつ厳密な雑種識別が可能であることが示された。
【００２３】
【発明の効果】
林木育種において、今後、交雑育種が積極的に進められることが予想されるが、本発明を用いた種間交雑種の識別は、従来行われてきた形態的特徴等による識別に比べて、より正確で早期の熱帯早生樹における種間雑種の検定方法を提供できる。具体的には、ＤＮＡの塩基配列に基づいた再現性の高い確実な識別が可能であること、発芽後の実生の段階（播種より１ないし２週間）で識別できるため、従来育種における形態的特徴を識別するために要する育成時間（播種より少なくとも数ヵ月から半年以上を要する）、及びこれに要する用地が不要であることが挙げられる。本発明により、従来林木育種法において必須とされてきた検定作業にかかる時間、費用、用地を大幅に省略した新規の林木育種法を提供できる。
【００２４】
【配列表】
【００２５】
配列番号：１
配列の長さ：１０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣ        １０
【００２６】
配列番号：２
配列の長さ：１０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＧＣＧＴＧＡＣＣＣＧ        １０
【００２７】
配列番号：３
配列の長さ：１０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＣＧＣＡＧＧＴＣＡＣ        １０
【００２８】
配列番号：４
配列の長さ：１０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣ        １０
【００２９】
配列番号：５
配列の長さ：３０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴＣＧ  ３０
【００３０】
配列番号：６
配列の長さ：３０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＡＧＡＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＣＡＴ  ３０
【００３１】
配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＴＣ      ２０
【００３２】
配列番号：８
配列の長さ：２０
配列の型：
鎖の数：一本鎖
トロポジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：ＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡ      ２０
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴヌクレオチド（１）〜（４）をプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。
【図２】オリゴヌクレオチド（１）〜（４）をプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。
【図３】オリゴヌクレオチド（１）〜（４）をプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。
【図４】オリゴヌクレオチド（５）及びオリゴヌクレオチド（６）を混合した場合、並びにオリゴヌクレオチド（７）、オリゴヌクレオチド（８）を混合してプライマーに用いてPCR を行った後のアガロース電気泳動パターンの写真である。
【図１】
0003965751.tif 000004
【図２】
0003965751.tif 000005
【図３】
0003965751.tif 000006
【図４】
0003965751.tif 000007